ES2843683T3 - Uso de un ligando de CD6 y método basado en el mismo - Google Patents

Abstract

Anticuerpo Itolizumab para uso en el tratamiento de esclerosis múltiple en un sujeto que tiene un número aumentado de células T cooperadoras 17 (Th17) cuando se compara con un sujeto sano, en donde el uso suprime la producción del receptor de citoquina IL-23R, disminuyendo de esta manera la inflamación mediada por células Th17, causa una reducción de TNF-alfa, IFN-gamma, IL-6 e IL-17A en un fluido corporal del paciente y una reducción de la expresión de IL-23R en uno o más de monocitos, células T cooperadoras y células citolíticas naturales en un fluido corporal del paciente.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de un ligando de CD6 y método basado en el mismo

Campo técnico

La presente invención se refiere a un uso de un ligando de CD6. En particular, la presente invención se refiere al tratamiento de estados de enfermedad mediados por linfocitos T (células T) cooperadores 17 (Th17). En particular, la presente invención se refiere al uso de ligando anti-CD6, específicamente el anticuerpo itolizumab, para el tratamiento de estados de enfermedad mediados por linfocitos T Th17 autorreactivos, en particular esclerosis múltiple. El anticuerpo itolizumab usado en la presente invención además tiene utilidad en usos para modular una respuesta inmunitaria suprimiendo la producción de la citoquina IL-23R (receptor de interleuquina 23), disminuyendo de esta manera la inflamación mediada por células Th17.

Antecedentes de la divulgación

La siguiente discusión de los antecedentes de la divulgación se proporciona simplemente para ayudar al lector a entender los ligandos, composiciones, métodos y usos descritos en este documento, y no se admite para describir o constituir estado de la técnica.

La inmunidad protectora frente a ciertas enfermedades depende de la inducción diferencial de poblaciones de células T (linfocitos T) proinflamatorias específicas por células presentadoras de antígenos (CPA) del sistema inmunitario innato, tal como células dendríticas (CD) y macrófagos. Dos de tales poblaciones de células T, responsables de mediar la inmunidad celular a una amplia gama de patógenos, son células Th1 y Th17. Las poblaciones tanto de células Th1 como más recientemente Th17 han sido implicadas como mediadores de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias crónicas, y por tanto sirven como dianas celulares relevantes para agentes inmunosupresores. Además, las células dendríticas, como iniciadoras de las respuestas de células T, son una segunda diana celular para terapias diseñadas para combatir enfermedad inflamatoria.

La esclerosis múltiple (EM) es un trastorno autoinmunitario inflamatorio del sistema nervioso central (SNC), caracterizada por infiltrados inflamatorios de células T, células B, macrófagos y placas desmielinizantes focales en el SNC. Se ha mostrado que respuestas mediadas tanto por células Th1 como Th17 desempañan un papel en el desarrollo de la desmielinización inflamatoria. Las células T reactivas con mielina de pacientes de EM producen citoquinas consistentes con una respuesta mediada por Th1, mientras que estudios de micromatrices de lesiones de EM de pacientes demuestran expresión aumentada de IL-23R.

Un modelo relevante para estudiar los mecanismos de las respuestas inflamatorias autoinmunitarias, y en particular EM, es el modelo animal de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) de enfermedad desmielinizante inflamatoria que comparte cambios clínicos y neuropatológicos con la esclerosis múltiple (EM). Se ha aceptado durante muchos años que la EAE es en gran parte una enfermedad mediada por Th1 CD4+, aunque también se ha demostrado un papel patogénico para células T CD8+ en la inducción de EAE. Más recientemente, sin embargo, se ha demostrado que un subconjunto de células T productoras de IL-17 desempeña un papel crucial en la patogénesis de EAE. Mientras que hay algo de debate en la bibliografía, es probable que las células Th1 y Th17 cooperen para inducir el desarrollo de autoinmunidad específica de órgano.

CD6 es una proteína de superficie celular importante expresada predominantemente por células T humanas y un subconjunto de células B, así como por algunas leucemias linfocíticas crónicas de células B y neuronas [Aruffo et al., J. Exp. Med. 1991, 174:949; Kantoun et al., J. Immunol. 1981, 127:987; Mayer et al., J. Neuroimmunol. 1990. 29:193]. CD6 es un miembro de una gran familia de proteínas caracterizada por tener al menos un dominio homólogo al dominio rico en cisteína del receptor scavenger (SRCR) de macrófagos de tipo I [Matsumoto, et al., J. Exp. Med. 1991, 173:55 y Resnick et al., Trends Biochem. Sci. 1994, 19:5]. Otros miembros de esta familia incluyen CD5 [Jones et al., Nature.

1986, 323:346]; ciclofilina C [Friedman et al. 1993, PNAS 90:6815]; factor del complemento I, que se une a las proteínas del complemento activadas C3b y C4b [Goldberger, et al., J. Biol. Chem. 1987, 262:10065]; WC-1 bovina expresada por células T .tau./.delta [Wijingaard et al., J. Immunol. 1992, 149:3273] y M130 [Law et al., Eur J. Immunol.

1993, 23:2320], un marcador de activación de macrófagos.

Estudios de bloqueo usando anticuerpos monoclonales (Acm) anti-CD6 sugieren que CD6 desempeña un papel importante en el desarrollo de células T al regular interacciones adhesivas de células T con células epiteliales tímicas (TE) (Patel et al., J. Exp. Med. (1995) 181: 1563-1568). Estudios adicionales han mostrado que CD6 puede funcionar como una molécula accesoria importante en la activación de células T. Por ejemplo, ciertos Acm anti-CD6 son directamente mitogénicos para células T (Gangemi et al., J. Immunol. (1989) 143:2439; Bott et al., Int. Immunol. (1993) 7:783), mientras que otros son capaces de coestimular la proliferación de células T junto con anti-CD3, anti-CD2 o PMA (Gangemi et al., J. Immunol. (1989) 143:2439; Morimoto et al., J. Immunol. (1988) 140:2165-2170; Osorio et al., Cell. Immunol. (1994) 154:23). Aún evidencia adicional del papel de CD6 en la activación de células T viene de estudios que muestran que CD6 se hiperfosforila en residuos de Ser y Thr (Swack et al., Mol. Immunol. (1989) 26:1037-1049; Swack et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:7137; Cardenas et al., J. Immunol., 145:1450-1455 (1990)) y se fosforila en residuos de Tyr (Wee et al., J. Exp. Med. (1993) 177:219-223) después de la activación de células T. Estos y otros estudios implican a CD6 como un modulador importante para la función de células T tanto inmaduras como maduras in vivo, que afecta tanto a la activación de células T como la transducción de señales (De Wit, J., et al., Blood (2011) 118:6107-6114).

El documento WO 2009/113083 describe un anticuerpo anti-CD6, pero no discute o proporciona ninguna información con respecto al impacto del anticuerpo anti-CD6 en células Th17. Además, no hay discusión relativa a la disminución de IL-23 y/o IL-23R. No hay expectativa razonable para tratar un sujeto que tiene un número aumentado de células T cooperadoras 17 (Th17).

Jadidi-Niaragh et al, "Th17 cell, the new Player of Neuroinflammatory Process in Multiple Sclerosis" Scandianvian Journal of Immunology, V. 74, No 1, 9 de Junio, 2011, pp. 1-13 describe que la célula Th17 es un nuevo jugador en el proceso neuroinflamatorio en EM y que produce altos niveles de CD6 que aumenta la entrada de células T en el SNC. Sin embargo, este documento solo discute que CD6 es una molécula coestimuladora inducible por células Th17 y no proporciona orientación o sugerencia que inactivar la molécula CD6 tendría ningún efecto en reducir el efecto negativo causado por las células Th17 o reducir la expresión de IL-23R.

Toshimasa Aranami et al, "Th17 Cells and Autoimmune Encephalomyelitis (EAE/MS)", Allergology International, V. 57, No. 2, 1 de Enero, 2008, pp. 115-120 discute un aumento de células Th17, pero no hay correlación con respecto al uso de un anticuerpo contra CD6 para disminuir el nivel de inflamación mediada por células Th17.

Rostami et al. "Role of Th17 cells in the pathogenesis of CNS inflammatory demyelination", Journal of Neurological Sciences, V. 333, No. 1, 8 de Abril, 2013, pp 76-87, también discute un aumento de células Th17, pero de nuevo no hay correlación relacionándolo con el uso de un anticuerpo contra CD6 para disminuir el nivel de inflamación mediada por células Th17.

Breve descripción de las figuras acompañantes

Con el fin de que la divulgación se pueda entender fácilmente y poner en efecto práctico, ahora se hará referencia a formas de realización ejemplares ilustradas con referencia a las figuras acompañantes. Las figuras junto con la descripción detallada posterior, forman parte de la especificación, y sirven para ilustrar adicionalmente las formas de realización y explicar varios principios y ventajas, según la presente divulgación.

La figura 1 representa la inhibición de citoquinas Th1 y Th17 por el anticuerpo monoclonal humanizado Itolizumab en comparación con un anticuerpo control de isotipo, es decir, el anticuerpo monoclonal humanizado Nimotuzumab (“T1h”), en un ensayo de reacción de linfocitos mixtos.

Figura 2 : Un anticuerpo anti-CD6 de ratón específico del dominio 1 (anticuerpo sustituto a Itolizumab) muestra la inhibición de citoquinas Th1 y Th17. Esplenocitos de animales inducidos a EAE tratados con anticuerpo anti-CD6 de ratón, y un grupo tratado con anticuerpo de rata se estimularon en cultivo con un anticuerpo anti-CD3. El grupo tratado con el anticuerpo de rata mostró alta proliferación con liberación asociada de altas cantidades de citoquinas Th1 y Th17. Por otra parte, el grupo de animales tratado con anti-CD6 de ratón mostró proliferación disminuida y menor liberación de citoquinas específicas de Th1 y Th17 en este modelo de ratón de EM.

Figura 3: Sobreexpresión de CD6 en subconjuntos de células T CD4+ proinflamatorias:

(A) Se estimularon CMSP en condiciones Thnp (no polarizantes para células T CD4+) o Th17pol (polarizante de Th17), se recogió el sobrenadante de pocillos en cuadriplicado, se juntó y analizó usando ELISA para IFN-y secretado (citoquina distintiva de Th1) e IL-17 (citoquina distintiva de Th17). La razón de la concentración absoluta de IFN-y (triángulo vacío) o IL-17A (cuadrado relleno) en condiciones Th17pol y Thnp (Th17pol: Thnp) se representa a través de los días de análisis. (B) Los niveles absolutos de IFN-y (barras vacías) e IL-17 (barras sombreadas) el día 13 se comparan entre condiciones Th17pol y Thnp. Los datos mostrados son la media ± DE para pocillos de ELISA triplicados (p<0,001) (C) CMSP se dejaron sin estimular o se estimularon en condiciones Thnp o Th17pol. La expresión de CD25 en células T CD4+ se analizó el día 3. (D) CMSP se dejaron sin estimular (histograma sombreado) o se estimularon en condiciones Thnp (línea continua) o Th17pol (línea discontinua). La expresión de CD6 (usando biotina Itollizumab como reactivo de detección) se analizó el día 9 y se representó como histogramas superpuestos de CD6 seleccionados en células T CD4+. (E) Se calculó el aumento en veces en IFM de CD6 en células T C^d 4+ seleccionadas sobre no estimuladas, y se representó como un gráfico de barras para condiciones tanto Thnp (barra sombreada) como Th17pol (barra vacía) usando 3 anticuerpos diferentes como reactivo de detección de CD6, es decir, MEM98, MT605 e Itolizumab biotinilado. Los datos mostrados son la media ± DE (p<0,05). En los paneles A-C, los datos son representativos de 2 experimentos independientes de diferentes donantes y en los paneles D&E los datos son representativos de 2 experimentos independientes de 6 donantes diferentes.

Figura 4: Itolizumab inhibe la activación y proliferación de células T en condiciones tanto Thnp como Th17pol: (A) Se estimularon CMSP en condiciones Thnp o Th17pol en presencia de Itolizumab o anticuerpo control. El día 3 las células se analizaron para expresión de CD25 en células T CD4+ seleccionadas. El % de células T CD4+CD25+ en CMSP estimuladas, se representa como gráficos de barras. Los datos mostrados son la media ± DE de 2 experimentos independientes de diferentes donantes. (B) Se estimularon CMSP marcadas con colorante CFSE en condiciones Thnp o Th17pol en presencia de Itolizumab o anticuerpo control. El día 3 las células se analizaron para dilución de CFSE en células T CD4+ seleccionadas. Los datos mostrados son de 1 experimento.

Figura 5: El tratam iento con Itolizumab produce reducción sustancial en la expresión de las citoquinas IL-17 e IFN-y en células estimuladas en condiciones polarizantes para Th17:

Se estimularon CMSP en condiciones Th17pol en presencia de Itolizumab o anticuerpo control. Los días 3, 6, 8 y 13, las células estimuladas en condiciones Th17pol con anticuerpo monoclonal control o Itolizumab, se reestimularon con PMA-ionomicina durante 5 horas y se analizó la expresión de citoquina intracelular IFN-y e IL-17A. Se muestran gráficos de puntos de citometría de flujo representativos (en células T CD3+ seleccionadas) el día 6 en el panel A. Los paneles B & C muestran el % de células T IFN-Y+ y células T IL-17A+ respectivamente, en presencia de Itolizumab (triángulo vacío) o anticuerpo control (circulo vacío) a través de los días obtenido de análisis de citometría de flujo. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes de donantes diferentes. Para analizar el nivel basal de citoquinas secretadas, se recogieron los sobrenadantes de pocillos cuadriplicados de CMSP estimuladas en condiciones Th17pol en presencia de Itolizumab (triángulo vacío) o anticuerpo control (circulo vacío). Evaluados mediante ELISA, los niveles secretados de (D) IFN-y y (E) IL-17A se representan a través de los días. En los paneles D y E los datos se muestran como la media DE (p<0,0001) y son representativos de 2 experimentos independientes de diferentes donantes.

Figura 6: Itolizumab produce reducción en marcadores distin tivos específicos de Th17:

(A) Se estimularon CMSP en condiciones Th17pol en presencia de anticuerpo control o Itolizumab y se analizaron el día 3 para expresión del factor de transcripción pSTAT3. Los datos mostrados son un histograma para pSTAT3 en células T CD4+ seleccionadas. (B) Las células estimuladas en condiciones Th17pol en presencia de anticuerpo control o Itolizumab se reestimularon con PMA-ionomicina durante 5 horas y se analizaron para expresión de citoquina intracelular IL-17A y factor de transcripción distintivo de Th17 RORyT. Se muestran gráficos de puntos representativos del día 6 de ROR^yT e IL-17A en células T CD3+ seleccionadas. (C) Los datos del panel B se representaron como como superposiciones de histogramas de IMF de RORyT en células T CD3+ seleccionadas estimuladas en condiciones Th17pol en presencia de anticuerpos control (histograma vacío) o Itolizumab (histograma con línea discontinua). Los datos mostrados son representativos de 2 experimentos similares independientes de diferentes donantes. (D) Para el experimento explicado en el panel A, se muestran gráficos de puntos representativos del día 6 de CCR6 e IL-17A en células T CD3+CCR6+ seleccionadas.

Compendio de la divulgación

En un aspecto, la presente invención se refiere al anticuerpo itolizumab para uso en el tratamiento de esclerosis múltiple en un sujeto que tiene un número aumentado de células T cooperadoras 17 (Th17) cuando se compara con un sujeto sano, en donde el uso suprime la producción del receptor de citoquina IL-23R, disminuyendo de esta manera la inflamación mediada por células Th17, produce una reducción de TNF-alfa, IFN-gamma, IL-6, e IL-17A en un fluido corporal del paciente y una reducción de la expresión de IL-23R en uno o más de monocitos, células T cooperadoras y células citolíticas naturales en un fluido corporal de un paciente.

En el presente documento se divulgan usos y composiciones dirigidos a tratar, incluyendo prevenir, una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto, así como tratar, incluyendo prevenir, rechazo de aloinjerto, y tratar, incluyendo prevenir, enfermedad del injerto contra el huésped. Un uso respectivo incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un ligando que se une específicamente a CD6.

La presente divulgación se refiere al tratamiento, incluyendo prevención, de estados de enfermedad mediados por linfocitos T (células T) cooperadores 17 (Th17) o cooperadores 1 (Th1). En particular, la presente divulgación se refiere al uso de un anticuerpo anti-CD6 para el tratamiento de estados de enfermedad mediados por linfocitos T Th17 y Th1 autorreactivos. La divulgación además tiene utilidad para modular una respuesta inmunitaria suprimiendo la producción de la citoquina IL-23R, disminuyendo mediante ello la inflamación mediada por células Th17.

Se divulga un ligando que específicamente se une a CD6 para uso en el tratamiento de (i) una enfermedad autoinmunitaria, (ii) rechazo de aloinjerto, o (iii) enfermedad del injerto contra el huésped en un sujeto. Se sabe o sospecha que el sujeto tiene un número aumentado de linfocitos T cooperadores 17 (Th17) cuando se compara con un sujeto sano. Estos linfocitos T Th17 pueden ser linfocitos T Th17 autorreactivos.

En algunas formas de realización del ligando que se une específicamente a CD6 se sabe o sospecha además que el sujeto tiene un número aumentado de células T cooperadoras 1 (Th1) cuando se compara con un sujeto sano. Estos linfocitos T Th1 pueden ser linfocitos T Th1 autorreactivos.

En algunas divulgaciones la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide. En algunas divulgaciones la enfermedad autoinmunitaria es enfermedad intestinal inflamatoria. La enfermedad autoinmunitaria puede ser, por ejemplo, enfermedad de Crohn. En algunas divulgaciones la enfermedad autoinmunitaria es colitis ulcerosa. La enfermedad autoinmunitaria es en algunas divulgaciones psoriasis. En algunas divulgaciones la enfermedad autoinmunitaria es síndrome de Sjogren. En algunas divulgaciones la enfermedad autoinmunitaria es espondilitis anquilosante. En algunas formas de realización la enfermedad autoinmunitaria es diabetes de tipo I.

En algunas divulgaciones el ligando es un anticuerpo tal como una inmunoglobulina. El anticuerpo puede, por ejemplo, ser una inmunoglobulina policlonal. En algunas divulgaciones el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas divulgaciones el anticuerpo es un anticuerpo completamente no humano. En algunas divulgaciones el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. El anticuerpo es en algunas divulgaciones un anticuerpo humanizado. En algunas divulgaciones el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano tal como una inmunoglobulina completamente humana. Un ejemplo ilustrativo de un anticuerpo humanizado es Itolizumab.

En algunas divulgaciones el ligando es un fragmento funcional de una inmunoglobulina. En algunas divulgaciones un fragmento funcional de inmunoglobulina respectivo es un fragmento Fab. En algunas divulgaciones el fragmento funcional de inmunoglobulina es un fragmento variable monocatenario (scFv). En algunas divulgaciones el fragmento funcional de inmunoglobulina es un nanocuerpo.

En algunas formas de realización el ligando que específicamente se une a CD6 está incluido en una composición farmacéutica. La composición farmacéutica incluye el ligando que específicamente se une a CD6 y al menos un diluyente, soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Se divulga una combinación de un ligando que se une específicamente a CD6 y un ligando que se une específicamente a CD3 para uso en el tratamiento de (i) una enfermedad autoinmunitaria, (ii) rechazo de aloinjerto, o (iii) enfermedad del injerto contra el huésped en un sujeto. Se sabe o sospecha que el sujeto tiene un número aumentado de linfocitos T cooperadores 17 (Th17) cuando se compara con un sujeto sano. Estos linfocitos T Th17 pueden ser linfocitos T Th17 autorreactivos.

Se divulga una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto que se sabe o sospecha que tiene un número aumentado de células Th17 cuando se compara con un sujeto sano. La composición farmacéutica incluye un ligando que específicamente se une a CD6 y al menos un diluyente, soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Se divulga una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto que se sabe o sospecha que tiene un número aumentado de células Th17 cuando se compara con un sujeto sano. La composición farmacéutica incluye un ligando que específicamente se une a CD6. La composición farmacéutica también incluye un ligando que específicamente se une a CD3. Además, la composición farmacéutica incluye al menos un diluyente, soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Descripción detallada de la divulgación

Definiciones

A menos que se indique otra cosa, los siguientes términos usados en este documento, incluyendo la descripción y las reivindicaciones, tienen las definiciones dadas a continuación.

La palabra “aproximadamente” como se usa en el presente documento se refiere a un valor que está dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular determinado por un experto en la materia, que dependerá en parte de cómo se mide o determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medida. Por ejemplo, “aproximadamente” puede significar en 1 o más de 1 desviación estándar, según la práctica en la técnica. El término “aproximadamente” también se usa para indicar que la cantidad o valor en cuestión puede ser el valor designado o algún otro valor que es aproximadamente el mismo. Se pretende que la frase transmita que valores similares fomentan resultados o efectos equivalentes según los ligandos, composiciones, métodos y usos descritos en el presente documento. En este contexto “aproximadamente” se puede referir a un intervalo por encima y/o debajo de hasta el 10 %. La palabra “aproximadamente” se refiere en algunas formas de realización a un intervalo por encima y debajo de un cierto valor que es hasta el 5 %, tal como hasta el 2 %, hasta el 1 %, o hasta el 0,5 % por encima o debajo de ese valor. En una forma de realización “aproximadamente” se refiere a un intervalo de hasta el 0,1 % por encima y debajo de un valor determinado.

El término “administrar”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier modo de transferir, administrar, introducir o transportar materia tal como un compuesto, por ejemplo, un compuesto farmacéutico, u otro agente tal como un antígeno, a un sujeto. Los modos de administración incluyen administración oral, contacto tópico, administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intranasal o subcutánea (cf. posteriormente). La administración “en combinación con” materia adicional tal como uno o más agentes terapéuticos incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

El término “anticuerpo” en general se refiere a una inmunoglobulina, un fragmento de la misma o una molécula de unión proteinacea con funciones de tipo inmunoglobulina (cf. posteriormente).

El término “ligando” como se usa en el presente documento se refiere a materia, tal como una molécula, en particular una molécula polimérica, que se puede unir a una molécula de ácido nucleico tal como una molécula de ADN o ARN, incluyendo una molécula de ARNm, así como un péptido, una proteína, un sacárido, un polisacárido o un lípido mediante una interacción que es suficiente para permitir que el agente forme un complejo con la molécula de ácido nucleico, péptido, proteína o sacárido, un polisacárido o un lípido, en general a través de enlace no covalente. En algunas divulgaciones el ligando es una molécula de APN. En algunas divulgaciones el ligando es una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinacea con funciones de tipo inmunoglobulina como se define posteriormente. En algunas divulgaciones el ligando es un aptámero. En algunas divulgaciones el ligando es específico para una diana particular. En algunas divulgaciones un ligando incluye una pluralidad de sitios de unión, cada sitio de unión es específico para una diana particular. Como un ejemplo ilustrativo, un ligando puede ser un agente proteinaceo con funciones de tipo inmunoglobulina con dos sitios de unión. Por ejemplo, puede ser un diacuerpo biespecífico, tal como un diacuerpo monocatenario biespecífico.

Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo quimérico” se refiere a un polipéptido inmunoglobulina o anticuerpo dominio que incluye secuencias de más de una especie. En un anticuerpo quimérico una cadena pesada o una cadena ligera puede contener una secuencia de región variable de una especie tal como humana y una secuencia de región constante de otra especie tal como ratón. Como ejemplo, un “anticuerpo quimérico” puede ser una inmunoglobulina que tiene regiones variables derivadas de un anticuerpo animal, tal como un anticuerpo de rata o ratón, fusionadas a otra molécula, por ejemplo, los dominios constantes derivados de un anticuerpo humano. El término “anticuerpo quimérico” se pretende que abarque anticuerpos en los que: (i) la cadena pesada es quimérica, pero la cadena ligera comprende las regiones V y C de solo una especie; (ii) la cadena ligera es quimérica, pero la cadena pesada comprende regiones V y C de solo una especie; y (iii) tanto la cadena pesada como la cadena ligera son quiméricas.

A este respecto, un “anticuerpo humanizado” como se usa en el presente documento es un polipéptido inmunoglobulina o anticuerpo dominio que contiene elementos estructurales de un anticuerpo humano y el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo no humano. Los “anticuerpos humanizados” contienen un número mínimo de residuos del anticuerpo no humano. Por ejemplo, pueden contener solo las regiones CDR del anticuerpo no humano, o solo esos residuos que hacen las regiones hipervariables del anticuerpo no humano. También pueden contener ciertos residuos de fuera de las regiones variables del polipéptido no humano, tal como residuos que son necesarios para mimetizar la estructura del anticuerpo no humano o para minimizar la interferencia estérica. Típicamente, un anticuerpo humanizado contiene un marco humano, al menos una CDR de un anticuerpo no humano, con cualquier región constante presente que sea sustancialmente idéntica a una región constante de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente el 85-90 %, tal como al menos el 95 % idéntica. Por tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las correspondientes partes de una o más secuencias de inmunoglobulina humana nativa. Además, los anticuerpos humanizados pueden contener residuos que no corresponden a los anticuerpos humanos o no humanos.

El término “detectar” o “que detecta”, así como el término “determinar” o “que determina” cuando se usa en el contexto de un biomarcador, se refiere a cualquier método que se pueda usar para detectar la presencia de un ácido nucleico (ADN y ARN) o una proteína/polipéptido. Cuando se usan en el presente documento en combinación con las palabras “nivel”, “cantidad” o “valor”, las palabras “detectar”, “que detecta”, “determinar” o “que determina” se entiende que en general se refiere a un nivel cuantitativo o cualitativo. Según esto, un uso divulgado en el presente documento puede incluir una cuantificación de células Th17 en números absolutos. Un uso divulgado en el presente documento también puede incluir una comparación que mide una cantidad relativa de células Th17, por ejemplo, comparada a una muestra de referencia de uno o más sujetos sanos. Como un ejemplo adicional, se pueden medir las cantidades absolutas de IL-17A o TNFa. Se puede analizar si una primera muestra contiene una mayor o una menor o la misma cantidad de IL-17A o TNFa que una segunda muestra. Los términos “valor”, “cantidad” y “nivel” también se refieren a la velocidad de síntesis de, por ejemplo, IL-17A, TNFa, IL-22, IL-17F, IL-21 o IL-6. La naturaleza exacta del “nivel”, “cantidad” o “valor” depende del diseño y componentes específicos del método analítico particular empleado para detectar células T o, por ejemplo, IL-17A, TNFa, IL-22, IL-17F, IL-21 o IL-6.

Una “cantidad eficaz” o una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un agente tal como un ligando, es una cantidad -ya sea como una dosis única o como parte de una serie de dosis- suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento o control del estado patológico relevante, o para retrasar o minimizar uno o más síntomas asociados con la presencia de la afección. Tal afección puede estar asociada con inmunosupresión, por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria.

Los términos “expresar” y “expresión” en referencia a un biomarcador se pretende que se entiendan en el significado normal como se usan en la técnica. Un biomarcador es expresado por una célula mediante transcripción de un ácido nucleico a ARNm, seguido por traducción a un polipéptido, que se pliega y posiblemente se procesa adicionalmente. Los biomarcadores discutidos en esta divulgación además son transportados a la superficie de la célula respectiva. Por tanto, la afirmación de que una célula expresa tal biomarcador indica que el biomarcador se encuentra en la superficie de la célula e implica que el biomarcador se ha sintetizado por la maquinaria de expresión de la célula respectiva. Según esto, el término “nivel de expresión” en el contexto de una población de células tal como células T se refiere al número o porcentaje de células que tienen el biomarcador de interés en su superficie celular. La determinación de la expresión se puede basar en el nivel de expresión normalizado de los biomarcadores. Los niveles de expresión se normalizan corrigiendo el nivel de expresión absoluto de un biomarcador por comparación de su expresión con la expresión de un gen que no es un biomarcador en el contexto de la invención. El nivel de expresión también se puede proporcionar como un nivel de expresión relativo.

Con respecto al respectivo proceso biológico mismo, los términos “expresión”, “expresión génica” o “expresar” se refieren la totalidad de rutas reguladoras que convierten la información codificada en la secuencia de ácido nucleico de un gen primero a ARN mensajero (ARNm) y después a proteína. Según esto, la expresión de un gen incluye su transcripción a ARNnh primario, el procesamiento de este ARNnh a ARN maduro y la traducción de la secuencia de ARNm a la correspondiente secuencia de aminoácidos de la proteína. En este contexto, también se indica que el término “producto génico” se refiere no solo a una proteína, incluyendo, por ejemplo, una proteína final (incluyendo una variante de ayuste de la misma) codificada por ese gen y una proteína precursora respectiva donde sea aplicable, sino también al respectivo ARNm, que se puede considerar como el primer “producto génico” durante el curso de la expresión génica.

Mediante “fragmento” en referencia a un polipéptido tal como una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinacea se quiere decir cualquier secuencia de aminoácidos presente en un polipéptido correspondiente, siempre que sea más corto que la secuencia de longitud completa y siempre que sea capaz de realizar la función de interés de la proteína -en el caso de una inmunoglobulina unirse específicamente a la diana deseada, por ejemplo, antígeno (CD6, por ejemplo). El término “fragmento de inmunoglobulina” se refiere a una porción de una inmunoglobulina, con frecuencia la región hipervariable y porciones de las cadenas pesada y ligera circundantes que muestran afinidad de unión específica para una molécula particular. Una región hipervariable es una porción de una inmunoglobulina que físicamente se une a la diana de polipéptido. Debido al uso en la técnica, los términos “fragmento de anticuerpo” y “fragmento de inmunoglobulina” se usan de forma intercambiable en el presente documento.

Un “fragmento funcional” como se usa en el presente documento, se refiere a un fragmento de una molécula tal como un péptido o una molécula de ácido nucleico, que retiene al menos una actividad biológica de la molécula de longitud completa. En el contexto de una inmunoglobulina un fragmento funcional es un fragmento inmunológicamente funcional. Típicamente, un fragmento funcional de un péptido es capaz de realizar sustancialmente las mismas funciones que esas del polipéptido intacto. Como se usa en este documento, la expresión “farmacéuticamente aceptable” se refiere a esos compuestos activos, materiales, composiciones, soportes y/o formas farmacéuticas que son, en el ámbito del juicio médico sólido, adecuados para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, acorde con una proporción beneficio/riesgo razonable.

Los términos “polipéptido” y “proteína” se refieren a un polímero de residuos de aminoácidos y no están limitados a cierta longitud mínima del producto. Donde se usan ambos términos al mismo tiempo, este nombrar dos veces representa el uso de ambos términos uno al lado del otro en la técnica.

El término “prevenir” en el contexto médico/biológico, es decir, en el contexto de un estado fisiológico, se refiere a disminuir la probabilidad de que un organismo contraiga o desarrolle un estado anómalo.

El término “específico” como se usa en el presente documento se entiende que indica que un ligando se dirige contra, se une a, o reacciona con un biomarcador divulgado en la presente solicitud, tal como CD6. Por tanto, estar dirigido a, unirse a o reaccionar con incluye que el ligando se une específicamente a, por ejemplo, CD6. El término “específicamente” en este contexto significa que el ligando reacciona con CD6, según sea aplicable, y/o una porción del mismo, pero al menos esencialmente no con otra proteína. El término “otra proteína” incluye cualquier proteína, incluyendo proteínas muy relacionadas con o que son homólogas a, por ejemplo, CD6 contra la que se dirige el ligando. El término “no se une esencialmente” significa que el ligando no tiene afinidad particular a otra proteína, es decir, muestra una reactividad cruzada de menos de aproximadamente el 30 %, cuando se compara con la afinidad a CD6. En algunas formas de realización el ligando muestra una reactividad cruzada de menos de aproximadamente el 20 %, tal como menos de aproximadamente el 10 %. En algunas formas de realización el ligando muestra una reactividad cruzada de menos de aproximadamente el 9, 8, o 7 %, cuando se compara con la afinidad a CD6. En algunas formas de realización, el ligando muestra una reactividad cruzada de menos de aproximadamente el 6 %, tal como menos de aproximadamente el 5 %, cuando se compara con la afinidad a, por ejemplo, CD6. Si el ligando reacciona específicamente como se define en el presente documento anteriormente se puede ensayar fácilmente, entre otros, comparando la reacción de un ligando respectivo con, por ejemplo, CD6, según sea aplicable, y la reacción del ligando con otra(s) proteína(s). El término “reconocer específicamente”, que se puede usar de forma intercambiable con los términos “dirigido a” o “reaccionar con” significa en el contexto de la presente divulgación que una molécula particular, en general una inmunoglobulina, un fragmento de inmunoglobulina o una molécula de unión proteinacea con funciones de tipo inmunoglobulina es capaz de interaccionar específicamente con y/o unirse a al menos dos, incluyendo al menos tres, tal como al menos cuatro o incluso más aminoácidos de un epítopo que se define en el presente documento. En general, la inmunoglobulina o molécula de unión proteinacea puede formar de esta manera un complejo con el respectivo epítopo de, por ejemplo, CD6. Tal unión se puede ejemplificar por la especificidad de un “principio de llave y cerradura”. La “unión específica” también se puede determinar, por ejemplo, según una inmunotransferencia, un ensayo ELISA, RIA, ECL, IRMA, FACS, IHQ y un barrido de péptidos.

El término “anticuerpo sustituto” como se usa en el presente documento se entiende que indica el anticuerpo sustituto para Itolizumab que se desarrolló internamente para estudiar los efectos de un anticuerpo anti-CD6 que se une al dominio 1 en ratones y se identifica como una IgG 2c anti-CD6 de ratón en rata. Tiene las propiedades equivalentes a Itolizumab como 1. Se une al dominio 1 de CD6 de ratón, 2. No compite con la unión a ALCA^m .3. Inhibe la proliferación de células T indiferenciadas de esplenocitos estimulados con anti CD3. 4. No se agota sistémicamente en ratones. 5. Tiene una afinidad comparable a la de T1h.

El término “sujeto” como se usa en el presente documento, también tratado como un individuo, se refiere a un humano o animal no humano, en general un mamífero. Un sujeto puede ser una especie de mamífero tal como un conejo, un ratón, una rata, una cobaya, un hámster, un perro, un gato, un cerdo, una vaca, una cabra, una oveja, un caballo, un mono, un simio o un ser humano. Por tanto, los métodos, usos y composiciones descritos en este documento son aplicables a enfermedades tanto humanas como veterinarias. La muestra se ha obtenido del sujeto. Donde la misma es una muestra de fluido corporal o una muestra de biopsia, se puede obtener usando técnicas convencionales rutinariamente empleadas en la técnica. Por tanto, se entiende que las conclusiones extraídas de los niveles de expresión en la muestra y las decisiones basadas en las mismas se refieren al sujeto del que se ha tomado la muestra. Donde el sujeto es un ser humano vivo que recibe cuidado médico para una enfermedad o afección, también se trata como un “paciente”.

Los términos “tratamiento” y “tratar” como se usan en el presente documento, se refieren a una medida profiláctica o preventiva que tiene un efecto terapéutico y previene, ralentiza (aminora), o al menos parcialmente alivia o abroga un estado anómalo, incluyendo patológico, en el organismo de un sujeto. Esos en necesidad de tratamiento incluyen los que ya tiene el trastorno, así como los propensos a tener el trastorno o esos en los que el trastorno se va a prevenir (profilaxis). En general el tratamiento reduce, estabiliza o inhibe la evolución de un síntoma que está asociado con la presencia y/o evolución de una enfermedad o estado patológico. El término “administrar” se refiere a un método de incorporar un compuesto en células o tejidos de un sujeto. El término “efecto terapéutico” se refiere a la inhibición o activación de factores que producen o contribuyen al estado anómalo. Un efecto terapéutico alivia a algún grado uno o más de los síntomas de un estado anómalo o enfermedad. El término “estado anómalo” se refiere a una función en las células o tejidos de un organismo que se desvía de sus funciones normales en ese organismo. Un estado anómalo se puede referir, entre otros, a proliferación celular, diferenciación celular, o supervivencia celular.

Los términos “comprender”, “incluir”, “contener”, “tener” etc., se deben leer de forma expansiva o abierta y sin limitación. Las formas singulares tal como “un”, “una”, “el” o “la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente indique otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a un “vector” incluye un único vector, así como una pluralidad de vectores, ya sean iguales -por ejemplo, el mismo operón- o diferentes. Asimismo, la referencia a “célula” incluye una única célula, así como una pluralidad de células. A menos que se indique de otra manera, el término “al menos” precediendo una serie de elementos se debe entender que se refiere a cada elemento en la serie. Los términos “al menos uno” y “al menos uno de incluyen, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, o cinco o más elementos. Se entiende además que se pueden usar ligeras variaciones por encima y debajo de un intervalo indicado para alcanzar sustancialmente los mismos resultados como un valor dentro del intervalo. Además, a menos que se indique de otra manera, la divulgación de intervalos se pretende como un intervalo continuo que incluye cada valor entre los valores mínimo y máximo.

El ámbito y significado de cualquier uso de un término será aparente del contexto específico en que se usa el término. Se dan ciertas definiciones adicionales para términos seleccionados usados a lo largo de este documento en el contexto apropiado de la descripción detallada, según sea aplicable. A menos que se defina de otra manera, todos los otros términos científicos y técnicos usados en la descripción, figuras y reivindicaciones tienen su significado normal como entiende comúnmente un experto en la materia.

Usos para tratar una enfermedad

Los presentes inventores hicieron el sorprendente descubrimiento de que la coestimulación mediada por un anticuerpo anti CD6 con un anticuerpo anti-CD3 es de alta significancia, y aparentemente más significativa en comparación con la coestimulación inducida por anti CD28/CD3, que sensibiliza células T indiferenciadas para el desarrollo estable de Th17 fomentando la expresión de IL-23R. Por tanto, el anticuerpo anti-CD6 tiene actividad inmunosupresora y actúa para suprimir selectivamente enfermedad autoinmunitaria inflamatoria mediada por Th1 y Th17 (células T productoras de IL-23R).

Sin querer estar vinculado a una teoría, los inventores predicen que IL-23R se expresa por células presentadoras de antígeno, tal como células dendríticas y macrófagos. La expresión de IL-23R por las células presentadoras de antígeno inclina la respuesta de células T resultante lejos de la expansión de células T con un fenotipo Th1 y Th17 que pueden en algunos casos volverse células T autorreactivas que median afecciones autoinmunitarias e inflamatorias crónicas.

Las terapias actuales para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias crónicas, tal como esclerosis múltiple, se enfocan principalmente en el uso de esteroides y otros AINE, que son no específicos y tienen efectos secundarios graves. En particular, ciertos de tales tratamientos actúan principalmente para suprimir la expresión o actividad funcional de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa). Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal quimérico INFLIXIMAB (Remicade®) se dirige a la función de TNF-alfa. Aunque eficaces en ciertos pacientes, tales tratamientos anti-TNF-alfa pueden ser ineficaces cuando se trata a ciertos pacientes, o ciertas afecciones autoinmunitarias, o más, también podrían producir la aparición de efectos secundarios indeseables.

Los inventores han identificado la utilidad de un ligando o composición de la presente divulgación en el tratamiento de enfermedades y afecciones mediadas por Th1 y/o Th17, en particular afecciones autoinmunitarias o inmunitarias, que se producen donde respuestas anómalas de Th1 y/o Th17 se producen debido a la aparición de células T Th1 y/o Th17 autorreactivas.

Un sujeto que se va a tratar según la presente divulgación se sabe o sospecha que tiene un número aumentado de células T Th17 cuando se compara con un sujeto sano. Las células T Th17 se nombraron según su producción de la citoquina distintiva IL-17A. Además, las células T Th17 también producen IL-17F, IL-21, IL-22, GM-CSF, TNFa e IL-6.

En un aspecto, la presente invención se refiere al anticuerpo itolizumab para uso en el tratamiento de esclerosis múltiple en un sujeto que tiene un número aumentado de células T cooperadoras 17 (Th17) cuando se compara con un sujeto sano, en donde el uso suprime la producción del receptor de citoquina IL-23R, disminuyendo de esta manera la inflamación mediada por células Th17, produce una reducción de TNF-alfa, IFN-gamma, IL-6, e IL-17A en un fluido corporal del paciente y una reducción de la expresión de IL-23R en uno o más de monocitos, células T cooperadoras y células citolíticas naturales en un fluido corporal del paciente.

La presencia de un número aumentado de células T Th17 en un sujeto se puede detectar analizando las células T presentes en un fluido corporal en un sujeto o un fluido corporal obtenido de un sujeto.

La presencia de un número aumentado de células T Th17 en un sujeto se puede detectar analizando el nivel de citoquinas que se sabe producen las células T Th17. Según esto en algunas formas de realización un número aumentado de células T Th17 en un sujeto se puede detectar detectando el nivel de IL-17A en el sujeto y comparando el nivel con el nivel de IL-17A en un sujeto sano. En algunas formas de realización un número aumentado de células T Th17 en un sujeto se puede detectar detectando el nivel de TNFa en el sujeto y comparando el nivel con el nivel de TNFa en un sujeto sano. En algunas formas de realización un número aumentado de células T Th17 en un sujeto se puede detectar detectando el nivel de IL-6 en el sujeto y comparando el nivel con el nivel de TNFa en un sujeto sano. En algunas formas de realización un número aumentado de células T Th17 en un sujeto se puede detectar detectando el nivel de interferón gamma (IFN-y) en el sujeto y comparando el nivel con el nivel de interferón gamma en un sujeto sano.

Un ligando divulgado en el presente documento específicamente se une a CD6. “CD6” es una abreviatura de “grupo de diferenciación 6”. La proteína también se llama antígeno de diferenciación de células T CD6, así como T12 o TPl2o. CD6 es en algunas formas de realización la proteína de ratón del no. de registro de SwissProt/UniProt Q61003 (Versión 117 del 9 de julio, 2014). En algunas formas de realización CD6 es la proteína humana con el no. de registro de SwissProt/UniProt P30203 (versión 125 del 9 de julio, 2014). En algunas formas de realización CD6 es la isoforma d de la proteína humana CD6 que tiene el no. de registro de SwissProt/UniProt Q8WWJ4 (versión 59 del 16 de abril, 2014). En algunas formas de realización CD6 es la isoforma c de la proteína humana CD6 que tiene el no. de registro de SwissProt/UniProt Q8WWJ6 (versión 59 del 16 de abril, 2014). En algunas formas de realización CD6 es la isoforma b de la proteína humana CD6 que tiene el no. de registro de SwissProt/UniProt Q8WWJ3 (versión 59 del 16 de abril, 2014). En algunas formas de realización CD6 es la isoforma e de la proteína humana CD6 que tiene el no. de registro de SwissProt/UniProt Q8WWJ7 (versión 60 del 16 de abril, 2014). En algunas formas de realización CD6 es la proteína humana con el no. de registro de SwissProt/UniProt Q8N4Q7 (versión 66 del 16 de abril, 2014). En algunas formas de realización CD6 es la isoforma CRA d de la proteína humana CD6, que tiene el no. de registro de SwissProt/UniProt G5E973 (versión 26 del 9 de julio, 2014). En algunas formas de realización CD6 es la proteína de rata con el no. de registro de SwissProt/UniProt Q5FVU4 (versión 69 del 9 de julio, 2014). En algunas formas de realización CD6 es la proteína de macaco rhesus (Macaca mulatta) con el no. de registro de SwissProt/UniProt H9ZFC2 (versión 7 del 16 de abril, 2014).

En algunas formas de realización, se analiza la expresión de IL-23R en células sanguíneas y/o células dendríticas del sujeto. En algunas formas de realización, se analiza el nivel de uno o más de TNF-alfa, IFN-gamma, IL-6 e IL-17A en un fluido corporal del paciente. En una reacción de linfocitos mixtos, se observa que la citoquina de Th1 y Th17 IL-17A se reduce en presencia de T1h como se ilustra en la figura 1. En modelos animales que usan anticuerpo sustituto para el dominio 1 de CD6, se observa la reducción en citoquinas de Th1 y Th17 (IL17A) como se ilustra en la figura 2.

Se puede usar cualquier método disponible para detectar la presencia de un ácido nucleico o una proteína en el contexto de la presente invención. Tal método puede incluir establecer procedimientos estándar bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de tales técnicas incluyen, pero no están limitados a, RT-PCR, ensayo de protección de RNasa, análisis de Northern, análisis de inmunotransferencia, ELISA, radioinmunoensayo o ensayo de titulación de fluorescencia. Evaluar la cantidad de un biomarcador tal como IL-17, IFN-gamma o TNF-alfa en una célula puede incluir evaluar la cantidad de un ácido nucleico, por ejemplo, ARN, en una célula que codifica el biomarcador respectivo. Se puede usar una sonda de ácido nucleico para ensayar una muestra por cualquier método de hibridación común para detectar la cantidad de moléculas de ácido nucleico del biomarcador. Con el fin de obtener sondas de ácido nucleico se puede llevar a cabo síntesis química. Las sondas de ácido nucleico sintetizadas se pueden usar primero como cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) llevada a cabo según técnicas de PCR reconocidas, esencialmente según protocolos estándar de PCR utilizando el molde apropiado, con el fin de obtener la sonda respectiva. Un experto en la materia será capaz fácilmente de diseñar tal sonda basándose en las secuencias disponibles para el biomarcador. La sonda de hibridación se puede marcar por técnicas de marcaje estándar tal como con un radiomarcador, marcador enzimático, marcador fluorescente, marcador de biotina-avidina, quimioluminiscencia o una nanopartícula. Después de la hibridación, las sondas se pueden visualizar usando una técnica estándar.

Un método de detección usado en el contexto de la presente invención puede incluir una amplificación de la señal causada por el ácido nucleico o proteína, tal como una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o el uso del sistema biotina-estreptavidina, por ejemplo, en forma de una conjugación a una inmunoglobulina, como también se explica en más detalle posteriormente. El método de detección puede, por ejemplo, incluir el uso de un anticuerpo, por ejemplo, una inmunoglobulina, que se puede ligar a un marcador unido, tal como, por ejemplo, en análisis de inmunotransferencia o ELISA. Donde se desee, se puede usar una inmunoglobulina intracelular para detección. Algunas o todas las etapas de la detección pueden ser parte de un sistema de detección automatizado. Los ejemplos ilustrativos de tales sistemas son plataformas de PCR en tiempo real automatizadas, plataformas de aislamiento de ácidos nucleicos automatizadas, analizadores de productos de PCR y sistemas de detección en tiempo real. Como se ha indicado anteriormente, el término “anticuerpo”, como se usa en el presente documento, se entiende que incluye una inmunoglobulina y un fragmento de inmunoglobulina que es capaz de unirse específicamente a una proteína seleccionada, por ejemplo, L-selectina o una proteína específica para células T, así como a una respectiva molécula de unión proteinacea con funciones de tipo inmunoglobulina. Un anticuerpo, por ejemplo, puede ser un dominio de tipo EGF, un dominio Kringle, un dominio de fibronectina de tipo I, un dominio de fibronectina de tipo II, un dominio de fibronectina de tipo III, un dominio PAN, un dominio Gla, un dominio SRCR, un dominio Kunitz/inhibidor de tripsina pancreática bovina, tendamistat, un dominio de inhibidor de serina proteasa de tipo Kazal, un dominio Trefoil (tipo P), un dominio del factor de von Willebrand de tipo C, un dominio de tipo anafilotoxina, un dominio CUB, una repetición de tiroglobulina de tipo I, un dominio de clase A de receptor de LDL, un dominio Sushi, un dominio Link, un dominio de trombospondina de tipo I, un dominio de inmunoglobulina o un dominio de tipo inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo dominio o un anticuerpo de cadena pesada de camello), un dominio de lectina de tipo C, un dominio MAM, un dominio del factor de von Willebrand de tipo A, un dominio de somatomedina B, un dominio de núcleo de cuatro disulfuros de tipo WAP, un dominio F5/8 de tipo C, un dominio de hemopexina, un dominio SH2, un dominio SH3, un dominio de tipo EGF de tipo laminina, un dominio C2, un “kappacuerpo” (Ill. et al., Protein Eng (1997) 10, 949-957), un "minicuerpo" (Martin et al., EMBO J (1994) 13, 5303-5309), un "diacuerpo" (Holliger et al., PNa S U.S.A. 90, 6444-6448 (1993)), una "janusina" (Traunecker et al., EMBO J (1991) 10, 3655-3659 o Traunecker et al., Int J Cancer (1992) Supl 7, 51-52), un nanocuerpo, una adnectina, una tetranectina, un microcuerpo, una afilina, un aficuerpo o una anquirina, una cristalina, una knotina, ubiquitina, una proteína con dedo de zinc, una proteína autofluorescente, una anquirina o proteína de repetición de anquirina o una proteína de repetición rica en leucina (cf. también posteriormente).

Una medida de un nivel o cantidad se puede, por ejemplo, basar en medios espectroscópicos, fotoquímicos, fotométricos, fluorométricos, radiológicos, enzimáticos o termodinámicos. Un ejemplo de un método de detección espectroscópico es espectroscopia de correlación de fluorescencia. Un método fotoquímico es, por ejemplo, entrecruzamiento fotoquímico. El uso de marcadores fotoactivos, fluorescentes, radioactivos o enzimáticos, respectivamente, son ejemplos para métodos de detección fotométricos, fluorométricos, radiológicos y enzimáticos. Un ejemplo de un método de detección termodinámico es calorimetría de titulación isotérmica. Como un ejemplo ilustrativo de un marcador, un protocolo detallado del uso de puntos cuánticos semiconductores, biofuncionalizados, solubles en agua se ha dado por Lidke et al. (Current Protocols in Cell Biology, [2007] Supl. 36, 25.1.1-25.1.18). Tales puntos cuánticos tienen una fotoestabilidad particularmente alta, lo que permite seguir su localización durante minutos a horas a días. Típicamente son nanopartículas fluorescentes. Puesto que diferentes tipos de puntos cuánticos se pueden excitar por una única línea láser se puede realizar marcaje multicolor. La detección se puede, por ejemplo, llevar a cabo convenientemente en diferentes canales de fluorescencia de un citómetro de flujo. Un punto cuántico se puede acoplar a un ligando de IL-17, IFN-gamma o TNF-alfa.

La medida usada en general se selecciona que sea de una sensibilidad que permita la detección de las células que expresan el biomarcador de interés, por ejemplo, IL-17, IFN-gamma o TNF-alfa, en el intervalo de un valor umbral seleccionado, en particular de una sensibilidad que permita determinar si células que expresan IL-17, IFN-gamma o TNF-alfa están por debajo del valor umbral. Típicamente, un ligando de IL-17, IFN-gamma o TNF-alfa, respectivamente, se pueden usar en combinación con un marcador detectable. Tal ligando de IL-17, IFN-gamma o TNF-alfa tiene una afinidad y especificidad detectables para IL-17, IFN-gamma o TNF-alfa, respectivamente. Típicamente, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es mayor de 10-6 M. Un ligando de, por ejemplo, IL-17, IFN-gamma, TNF-alfa, o IL-23R, respectivamente, tiene en algunas formas de realización una afinidad de aproximadamente 10'8 M o mayor, o de aproximadamente 10'9 M o mayor.

Un ligando respectivo de, por ejemplo, IL-17, IFN-gamma, TNF-alfa, o IL-23R, así como un ligando para otra proteína característica de célula seleccionada, puede ser una inmunoglobulina, un fragmento de la misma o una molécula de unión proteinacea con funciones de tipo inmunoglobulina. Un fragmento de anticuerpo en general contiene una región de unión a antígeno o variable. Los ejemplos de fragmento de anticuerpos (recombinantes) son fragmentos de inmunoglobulina tal como fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos Fv monocatenarios (scFv), diacuerpos o anticuerpo dominio (Holt, L.J., et al., Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490). Un ejemplo de una molécula de unión proteinacea con funciones de tipo inmunoglobulina es una muteína basada en un polipéptido de la familia lipocalina (documento WO 03/029462, Beste et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 1898-1903). Las lipocalinas, tal como la proteína de unión a bilina, la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos humana, la apolipoproteína D humana o glucodelina, poseen sitios de unión a ligandos naturales que se pueden modificar de modo que se unen a pequeñas regiones de proteínas seleccionadas conocidas como haptenos. Los ejemplos de otras moléculas de unión proteinaceas son los denominados glucuerpos (véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 96/23879 o Napolitano, E.W., et al., Chemistry & Biology (1996) 3, 5, 359-367), proteínas basadas en el andamiaje de anquirina (Mosavi, L.K., et al., Protein Science (2004) 13, 6, 1435-1448) o andamiaje cristalino (por ejemplo, solicitud internacional de patente WO 01/04144), las proteínas descritas en Skerra, J. Mol. Recognit. (2000) 13, 167-187, AdNectinas, tetranectinas y avímeros. Los avímeros contienen los llamados dominios A que se producen como series de múltiples dominios en varios receptores de superficie celular (Silverman, J., et al., Nature Biotechnology (2005) 23, 1556-1561). Las adnectinas, derivadas de un dominio de fibronectina humana, contienen tres bucles que se pueden manipular para unión de tipo inmunoglobulina a dianas (Gill, D. S. & Damle, N.K., Current Opinion in Biotechnology (2006) 17, 653-658). Las tetranectinas, derivadas de la respectiva proteína homotrimérica humana, también contienen regiones en bucle en un dominio de lectina de tipo C que se puede manipular para unión deseada (ibid.). Los peptoides, que pueden actuar como ligandos de proteína, son oligo(N-alquil) glicinas que se diferencian de los péptidos en que la cadena lateral está conectada al nitrógeno amida más que a un átomo de carbono. Los peptoides son típicamente resistentes a proteasas y otras enzimas modificantes, y tienen una permeabilidad celular mucho mayor que los péptidos (véase, por ejemplo, Kwon, Y.-U., y Kodadek, T., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 1508-1509). Un anticuerpo adecuado puede, en algunas formas de realización, también ser un anticuerpo multiespecífico que incluye varios fragmentos de inmunoglobulina.

Una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinacea con funciones de tipo inmunoglobulina puede estar PEGilada o hiperglucosilada si se desea. En algunas formas de realización, una molécula de unión proteinacea con funciones de tipo inmunoglobulina es una proteína de fusión de una de las moléculas de unión proteinaceas ejemplares anteriores y un dominio de unión a albúmina, por ejemplo, un dominio de unión a albúmina de la proteína G estreptocócica. En algunas formas de realización, una molécula de unión proteinacea con funciones de tipo inmunoglobulina es una proteína de fusión de un fragmento de inmunoglobulina, tal como un diacuerpo monocatenario, y un dominio de unión a inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio de unión a inmunoglobulina bacteriano. Como ejemplo ilustrativo, un diacuerpo monocatenario se puede fusionar al dominio B de la proteína A estafilocócica como se describe por Unverdorben et al. (Protein Engineering, Design & Selection [2012] 25, 81-88).

Según una divulgación, se divulga un método de tratar o prevenir una enfermedad autoinmunitaria que está producida por células Th1 y/o Th17 autorreactivas, el método incluye las etapas de:

- proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que incluye un anticuerpo anti-CD6; y - administrar dicho anticuerpo a un sujeto en necesidad de tal tratamiento en una cantidad suficiente para suprimir la activación de linfocitos T cooperadores 17 (células T Th17) y/o linfocitos T cooperadores 1 (células T Th1).

En algunas formas de realización determinar el nivel de expresión del gen de interés incluye determinar el nivel de transcripción a ARNm. El ARN que codifica la proteína de interés en la muestra, tal como IL-17, IFN-gamma, TNF-alfa o IL-23R se puede amplificar usando cualquier técnica de amplificación disponible, tal como reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incluyendo PCR multiplex, PCR anidada y PCR específica de mutación resistente a amplificación (ARMS) (también llamada PCR específica de alelo (AS-PCR), amplificación por círculo rodante (RCA), amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), reacción en cadena de la ligasa (LCR), reacción en cadena de replicasa QB, amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación mediada por transcripción (TMA), y amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA), incluyendo amplificación por desplazamiento de la hebra de genoma (WGSDA), amplificación por desplazamiento de hebra múltiple (MSDA) y amplificación por desplazamiento de la hebra específica de gen (GS-MSDA). La detección de los productos de amplificación obtenidos se puede realizar de numerosas maneras conocidas en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, métodos electroforéticos tal como electroforesis en gel de agarosa en combinación con una tinción tal como tinción con bromuro de etidio. En otras formas de realización, el uso de la invención está acompañado por detección en tiempo real, tal como PCR en tiempo real. En estas formas de realización se sigue la evolución temporal del proceso de amplificación. Un medio para la detección en tiempo real comúnmente usado en la técnica implica la adición de un colorante antes del proceso de amplificación. Un ejemplo de tal colorante es el colorante fluorescente SYBR Green, que emite una señal de fluorescencia solo cuando está unido a ácidos nucleicos bicatenarios.

Típicamente, se usa una etiqueta o marcador detectable. Tal marcador o etiqueta se puede incluir en un ácido nucleico que incluye la secuencia que se va a amplificar. Un marcador también se puede incluir en un cebador o una sonda. También se puede incorporar en el producto de amplificación en el curso de la reacción. En algunas formas de realización tal compuesto marcador, por ejemplo, incluido en un ácido nucleico, es una etiqueta ópticamente detectable, un fluoróforo o un cromóforo. Un ejemplo ilustrativo de un compuesto marcador es 6-carboxifluorescína (FAM).

Como ejemplo ilustrativo, se puede usar PCR en tiempo real para determinar el nivel de ARN que codifica la proteína de interés en la muestra, tal como IL-17, IFN-gamma, TNF-alfa o IL-23R. Tal procedimiento de PCR se lleva a cabo con detección en tiempo real, de modo que se sigue la evolución temporal del proceso de amplificación. La PCR se caracteriza por una amplificación logarítmica de las secuencias diana. Para la amplificación de ARN, se usa una transcripción inversa-PCR. El diseño de cebadores y sondas requeridos para detectar la expresión de un biomarcador de la invención está dentro de las capacidades de un experto en la materia. En algunas formas de realización el ARN de la muestra se aísla en condiciones sin RNasa y después se convierte a ADN a través del uso de una transcriptasa inversa. La transcripción inversa se puede realizar antes del análisis de RT-PCR o simultáneamente, en un único recipiente de reacción. Las sondas de RT-PCR son oligonucleótidos que tienen una fracción fluorescente, también llamado colorante indicador, unido al extremo 5' y una fracción amortiguadora acoplada al extremo 3' (o viceversa). Estas sondas típicamente se diseñan para hibridar a una región interna de un producto de PCR. En el estado no hibridado, la proximidad de las moléculas de flúor y amortiguación previene la detección de la señal fluorescente de la sonda. Durante la amplificación por PCR, cuando la polimerasa replica un molde al que se une una sonda de RT-PCR, la actividad 5'-3' nucleasa de la polimerasa corta la sonda. Mediante ello las fracciones fluorescente y amortiguadora se desacoplan.

La fluorescencia aumenta después en cada ciclo, de una manera proporcional a la cantidad de corte de sonda. La señal de fluorescencia emitida de la reacción se puede medir o seguir a lo largo del tiempo usando equipo que está comercialmente disponible usando técnicas rutinarias y convencionales. La cuantificación de ARN biomarcador en una muestra que se evalúa se puede realizar por comparación de la señal de amplificación a la de una o más curvas patrón donde cantidades conocidas de ARN se evalúan de una manera similar. En algunas formas de realización, la diferencia en expresión del biomarcador se mide como la diferencia en tiempo de ciclo de PCR hasta alcanzar una fluorescencia umbral, o “dCT”.

En algunas divulgaciones de un uso divulgado en el presente documento, se trata una enfermedad autoinmunitaria. En ciertas formas de realización de la presente divulgación, la composición divulgada en el presente documento suprime tanto una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T cooperadores 17 (Th17) como una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T cooperadores 1 (Th1). En ciertas divulgaciones, la enfermedad que está mediada por las células T autorreactivas es una enfermedad autoinmunitaria o enfermedad inflamatoria crónica.

La enfermedad autoinmunitaria tratada con el uso de la invención es esclerosis múltiple (EM). En algunas divulgaciones la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide (AR). En algunas divulgaciones la enfermedad autoinmunitaria es enfermedad intestinal inflamatoria (EII) tal como enfermedad de Crohn. La enfermedad inmunitaria puede ser en algunas divulgaciones colitis ulcerosa. En algunas divulgaciones la enfermedad autoinmunitaria es diabetes de tipo I. En algunas divulgaciones la enfermedad autoinmunitaria es psoriasis.

La enumeración o discusión de un documento previamente publicado en esta especificación no se debe tomar necesariamente como un reconocimiento de que el documento es parte del estado de la técnica o es conocimiento general común.

Los ligandos, composiciones, métodos y usos ilustrativamente descritos en el presente documento se pueden practicar adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no específicamente divulgados en el presente documento. Además, los términos y expresiones empleados en el presente documento se han usado como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención en el uso de tales términos y expresiones de excluir ningún equivalente de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, pero se reconoce que son posibles varias modificaciones. Por tanto, se debe entender que aunque los presentes ligandos, composiciones, métodos y usos se han divulgado específicamente mediante formas de realización ejemplares y características opcionales, la modificación y variación de los ligandos, composiciones, métodos y usos representados en las mismas divulgadas en el presente documento puede ser recurrida por los expertos en la materia, y que tales modificaciones y variaciones se considera que están dentro del ámbito de los ligandos, composiciones, métodos y usos divulgados.

Los ligandos, composiciones, métodos y usos se han descrito en sentido amplio y genérico en el presente documento. Cada una de las especies más estrechas y agrupamientos subgenéricos que están en la divulgación genérica también forman parte de los ligandos, composiciones, métodos y usos. Esto incluye la descripción genérica de los ligandos, composiciones, métodos y usos con una condición o limitación negativa que elimina cualquier objeto del género, independientemente de si el material eliminado se enumera específicamente en el presente documento o no.

Otras formas de realización están en las reivindicaciones adjuntas. Además, donde características o aspectos de los ligandos, composiciones, métodos y usos se describen en términos de grupos de Markush, los expertos en la materia reconocerán que los ligandos, composiciones, métodos y usos también se describen de esta manera en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush.

Con el fin de que los ligandos, composiciones, métodos y usos se puedan entender fácilmente y poner en efecto práctico, ahora se describirán formas de realización particulares mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1:

Reacción de linfocitos mixtos y análisis de citoquinas:

Preparación de CMSP:

Se recogen 30 ml de sangre de un donante sano. Las CMSP se aíslan por centrifugación en gradiente de densidad de FICOLL estándar. Eliminación de monocitos y organización del ensayo de derivación de células dendríticas: Estas células se incuban en un incubador de CO2 durante dos horas. Los monocitos se dejan adherir a la superficie plástica. Las células no adheridas (LSP) se retiran posteriormente de las botellas. Todas las botellas se lavan con 1XPBS una vez. Se añaden 20 ml de medio de CD (hecho de 50 ml de solución madre, 10 pl de GMSCF y 5 pl de IL-4 en 50 ml de medio de ensayo) a cada botella. Las botellas se mantienen en incubador de CO2 durante 6 días.

Tratamiento de LPS a células dendríticas en crecimiento:

El día 6, se añade medio de CD con LPS a cada botella (la concentración final de LPS en la botella es 4 pg/ml) y se mantiene de vuelta en el incubador de CO2 durante 40-48 horas.

Preparación de células para ensayo de linfocitos mixtos:

Preparación de CD:

Después del tratamiento con LPS la suspensión celular (CD) se recogen de las dos botellas. Cada botella se lava con 1XPBS una vez. La suspensión celular se centrifuga a 1500 rpm durante 5 minutos y se reconstituye en 3 ml de medio. Las CD tratadas con LPS se cuentan y reconstituyen en medio según requisitos del ensayo.

Preparación de LSP:

Siguiendo el mismo protocolo que se ha mencionado antes, se realiza separación en Ficoll después de recoger sangre de otro individuo sano. Después de la eliminación de monocitos las células no adheridas (LSP) se recogen y centrifugan a 1500 rpm durante 5 minutos y se reconstituyeron en 5 ml de medio. Los LSP se cuentan y reconstituyen a 1,0 X 106 células/ml.

Tratamiento con SEB a células dendríticas:

Preparación de SEB: La concentración madre de SEB es 1 mg/ml. De la solución madre se disuelven 3 pl de SEB en 3 ml de medio para conseguir solución de trabajo de SEB 1 pg/ml. Tratamiento: Según el protocolo estandarizado 0,06 x 106 CD se tratan con 0,6 pg de SEB. Se hace una solución madre de 0,1 x 106 células/ml (CD maduradas tratadas con LPS). De esta, se disuelven 600 pl de suspensión celular en 2,4 ml de medio de ensayo (el volumen total de suspensión celular es 3 ml que contiene 0,02 x 106 células/ml). Esto se centrifuga a 1500 rpm durante 5 minutos y se añaden 600 pl de SEB (1 pg/ml) al precipitado. Esto se incuba dentro de un incubador de CO2 a 37°C durante 20 minutos. Se añade exceso de medio (2 ml) al tubo después de la incubación y se lava a 1500 rpm durante 5 min. El sobrenadante se desecha y las células se lavan de nuevo con 3 ml de medio. Por último, el precipitado se disuelve en 3 ml de medio de ensayo.

Tratamiento con mitomicina C a LSP:

Se hace solución de mitomicina de 25 pg/ml a partir de la solución madre de mitomicina de 1 mg/ml. Se tratan 0,5 x 106 LSP con 500 pl de mitomicina 25 pg/ml durante 30 min dentro de un incubador de CO2 a 37°C. Se añade exceso de medio (2 ml) al mismo después de la incubación y las células se lavan a 1500 rpm durante 5 min. El sobrenadante se desecha y las células se lavan de nuevo con 3 ml de medio.

Ensayo de RLM - Inhibición de la proliferación:

El ensayo RLM se realiza a un proporción CD:LSP = 1:50. El control negativo usado es Nimotuzumab. Después de 6 días la placa se lee con azul alamar. El sobrenadante de una placa paralela se toma y se ensaya para citoquinas usando un kit de CBA humano de Th1, Th2 y Th17 (BD biosciences, Pharmingen, EE UU) se usa según la instrucción del fabricante. La concentración de las citoquinas se determina a partir de un estándar suministrado junto con el kit. Todas las muestras se analizaron con un citómetro de flujo Cyan-ADP, Beckman Coulter con el software Summit 4.3. Resultados: Se observa diferencia significativa en las citoquinas clave evaluadas en presencia de Itolizumab en comparación con el grupo tratado con control (Nimotuzumab). La citoquina determinante de Th17 media, IL17 se reduce casi el 50 %.

Ejemplo 2:

Inducción de EAE y tratamiento:

Se inmunizaron ratones por vía subcutánea el día 0 con 200 |jl de emulsión consistente en 20 |jg de MOG 35-55 en PBS combinado con un volumen igual de CFA que contenía 500 jg de M. tuberculosis H37Ra destruida con calor. La emulsión se inyectó en uno del dorso inferior, y seguido por una inyección intravenosa de 100 j l de toxina de B. pertussis (0,2 jg/100 j l) en PBS 0,01 M a través de la vena lateral de la cola. La dosis de refuerzo de 100 j l de toxina de B. pertussis se dio el día 3. Los ratones se reinmunizaron el día 7 con 200 j l de emulsión MOG/CFA inyectada por vía subcutánea en el otro flanco. El día 14 los ratones se aleatorizaron y agruparon como ratones control y tratados con anti CD6. El grupo de ratones tratados se inyectaron con Acm anti-CD6 de ratón (R&DSystem)/10D1260 jg/100 jl/dosis, por vía intraperitoneal en días alternos. Los ratones control fueron inyectados con la misma dosis de Acm anti-IgG de rata. Los ratones se observaron para síntomas de EAE. La gravedad y el inicio de la enfermedad en el grupo control y tratado se puntuó como puntuación clínica desde el día 14 al 32 en una escala de 5 puntos como 0, normal, 0,5 cola rígida; 1, cola flácida; 1,5, cola flácida con incapacidad de enderezarse; 2, parálisis de una extremidad; 2,5, parálisis de una extremidad y debilidad de la otra extremidad; 3, parálisis completa de ambas extremidades posteriores; 4, moribundo; 5, muerte. Se calculó la puntuación clínica media añadiendo las puntuaciones clínicas para un grupo y dividiendo por el número total de ratones en ese grupo. La inducción de la enfermedad en ratones era mayor del 95 %.

Ensayo de proliferación mediado por receptor de células T (CD3)

Los ratones se sacrificaron el día 30. Se evaluaron el bazo y la sangre de cada ratón. Los bazos obtenidos del mismo grupo de ratones se juntaron para experimentos in vitro. Los esplenocitos (0,2x106 células/pocillo) obtenidos de ratones inmunizados con MOG, control y tratados con Acm anti CD6 se estimularon con Acm anti-CD3 pre-recubierto (2,5 jg/m l) en placas de 96 pocillos (Nunc). Se usaron esplenocitos en pocillos sin recubrir como células control sin estimular. Las células se incubaron durante 3 días. El día 3 se añadió azul alamar (30 jl/pocillo; Invitrogen). Después de incubación durante la noche las placas se leyeron a 530/590 nm usando un lector de placas Biotek Synergy a la mañana siguiente. Los datos se representaron como valores de unidad de fluorescencia relativa (UFR) media de esplenocitos sin estimular y estimulados de ambos grupos.

Análisis de citoquinas

Para el análisis de citoquinas se usó la misma organización del ensayo de proliferación. Brevemente, los esplenocitos (0,2x106 células/pocillo) obtenidos de ratones inmunizados con MOG, control y tratados con Acm anti CD6 se estimularon con Acm anti-CD3 pre-recubierto (2,5 jg/m l) en placas de 96 pocillos (Nunc). Se usaron esplenocitos en pocillos sin recubrir como células control sin estimular. El día 3 los sobrenadantes se recogieron y conservaron a -80°C hasta que se realizó la medida de citoquinas usando un kit de citoquinas inflamatoria (interleuquina-6, interleuquina-10, interleuquina-12p70, interferón-Y, factor de necrosis tumoral-a) en una matriz de perlas citométricas (CBA) (Bd Biosciences, EE UU) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, 50 j l de población de perlas mixtas con intensidades de fluorescencia discretas y recubiertas con anticuerpos de captura específicos para citoquinas se añadieron a 50 j l de sobrenadante, y 50 j l de reactivo de detección con ficoeritrina para anticuerpos de citoquinas inflamatorias. Simultáneamente, estándares para cada citoquina (0-5000 pg/ml) se mezclaron también con las perlas de captura de citoquinas y reactivo de detección con ficoeritrina. Las mezclas agitadas en el vórtex se dejaron incubar durante 2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Las perlas se lavaron y adquirieron en citómetro de flujo (CyAnDMADP, Dako). Se derivaron curvas patrón de los estándares de citoquinas suministrados con el kit y se calculó la cantidad (pg/ml) de la respectiva citoquina usando gráficos estándar.

Para la detección de interlequina-17A se usó el kit de ensayo de conjunto flexible (BD Biosciences, EE UU) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, 50 j l de solución de perlas de captura recubiertas con anticuerpos de captura específicos para IL-17A se añadió a 50 j l de sobrenadante o estándar (0-5000 pg/ml) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron e incubaron con 50 j l de reactivo de detección con ficoeritrina durante 1 hora a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron y adquirieron en citómetro de flujo (CyAnDMADP, Dako). Se derivó la curva patrón de los estándares de citoquinas suministrados con el kit y se calculó la cantidad (pg/ml) de IL-17A usando un gráfico estándar.

Resultados: Los ratones tratados con anticuerpo anti-CD6 de ratón mostraron mejora clínica significativa sobre el grupo tratado con anticuerpo de rata. Se observó diferencia estadísticamente significativa en el grupo tratado con anti CD6 de ratón en comparación con el grupo control tratado con IgG de rata para las siguientes citoquinas TNFa, IL6, IFNy e IL17.

Ejemplo 3:

Método:

1. Cultivo de CMSP humanas para polarización de Th17

Se recogió sangre humana de voluntarios sanos después de firmar un formulario de consentimiento informado y las CMSP (células mononucleares de sangre periférica) se separaron por centrifugación en gradiente de densidad estándar sobre Ficoll Paque (GE Healthcare Bio-sciences AB, Upsala, Suecia). Las CMSP se contaron y plaquearon en placas de fondo plano de 96 pocillos, a una densidad de 0,1 millones de células por pocillo y se estimularon con perlas recubiertas con anti-CD3/anti-CD28 (cada anticuerpo recubría perlas a una concentración final de 5 ng por 0,1 millones de células por pocillo) en condiciones no polarizantes (Thnp) y polarizantes de Th17 (Th17pol). En condiciones Th17pol, se añadieron citoquinas y factores de crecimiento polarizantes a una concentración final de: IL-1p 10 ng/ml, IL-6 10 ng/ml, TGF-p 15 ng/ml, lL-23 10 ng/ml, anti-IL-4 l0 pg/ml y anti-IFN-Y 2,5 pg/ml. Se añadieron Itolizumab o anticuerpo control de isotipo irrelevante (control) a las células en condiciones tanto Thnp como Th17pol a una concentración final de 40 pg/ml. Las células se cultivaron en un incubador de CO2 a 37°C durante 13 días y se cogieron muestras en varios puntos de tiempo (día 3, día 6, día 8 y día 13) para análisis de citoquinas, marcadores de superficie celular e intracelulares. Para células que se cultivaban continuamente, 50 pl de medio se sustituyeron con medio RPMI completo que contenía IL-2 2 ng/ml para condición Thnp e IL-2 2 ng/ml junto con IL-23 10 ng/ml para condición Th17pol los días 6 y 10.

2. Análisis de citoquinas

En cada punto de tiempo, se recogieron 100 pl de sobrenadante celular y se juntaron de pocillos cuadriplicados y se congelaron a -80°C. El análisis de citoquinas se realizó según las instrucciones del fabricante usando los kits Human IFN-y Quantikine SixPak (SIF50) y Human IL-17 (IL-17A) (Quantikine SixPak (S1700) de R&D Systems. La absorbancia se leyó a 450/630 nm usando un lector SpectraMax M5e, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE UU.

3. Análisis de citometría de flu jo

Tinción de marcadores de superficie celular: En cada punto de tiempo, las células de pocillos cuadruplicados se recogieron y bloquearon con inhibidor de unión del receptor de Fc humano y se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Las células se centrifugaron y resuspendieron en tampón de tinción (s Bf al 2 % en 1XPBS) que contenía los anticuerpos para marcadores de superficie celular (por ejemplo, CD4, CD8, CD25, CD6). La adquisición y el análisis de las muestras se realizaron usando un citómetro de flujo Cyan-ADP con el software Summit versión 4.3 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE UU). Los linfocitos se seleccionaron por dispersión frontal y lateral y se seleccionaron adicionalmente en células T CD4+.

4. Análisis estadísticos

Se usó software GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE UU) para todos los análisis estadísticos. La significación estadística se determinó usando la prueba de la t para datos independientes seguida por el método de Holm-Sidk, con alfa = 5,000 % (Figura 3B).

Resultados:

Activación de células T y sobreexpresión de CD6 en condiciones polarizantes de Th17

Como se muestra en la figura 3A, para el día 13 el aumento en niveles de IL-17 secretada era 3-4 veces mayor que la subida en liberación de IFN-y en células estimuladas en condiciones Th17pol (CMSP estimuladas con anti-CD3/anti-CD28 en presencia de citoquinas polarizantes de Th17, Th17pol) en comparación con células Thnp (CMSP estimuladas con anti-CD3/anti-CD28, condición no polarizante; Thnp). Las concentraciones absolutas de IL-17 e IFN-Y el día 13 se muestran en la figura 3B. El IFN-y liberado por las células estimuladas en condición Th17pol era significativamente bajo en comparación con Las células Thnp. Similarmente, estas células Th17pol mostraron un aumento de 3-4 veces en niveles de IL-17 secretada en comparación con células Thnp. Estos resultados indican que en condiciones Th17pol se inició un cambio hacia células Th17 tan pronto como el día 3 con establecimiento total el día 13. Había activación similar de células T CD4+ el día 3, como se indica por la sobreexpresión de CD25 (IL-2Ra) en condiciones Thnp, así como Th17pol (Figura 3C).

La expresión de superficie de receptores de CD6 en células T CD4+ aumentó después de 48 horas de estimulación y se sostuvo hasta el día 12/13, el final del experimento de polarización. El análisis representativo el día 9, como superposición de histogramas para expresión de CD6 en células T CD4+ para un donante se muestra en la figura 3D. Itolizumab biotinilado (anti-CD6 humano) como un reactivo de detección, identificó sobreexpresión de CD6 en el 13­ 30 % y el 25-35 % de células T CD4+ en condiciones Thnp y Th17pol, respectivamente (Figura 3D). Como se muestra en la figura 3E (datos de 6 donantes diferentes), las células T CD4+ Thnp y Th17pol mostraron aumento consistente en la IFM de CD6 sobre las células sin estimular. El aumento en la expresión de CD6 también se confirmó con el uso de anticuerpos anti-CD6 que se unen al dominio 1 comercialmente disponibles (clones MEM98 y MT605, Figura 3E). El aumento en la IFM de CD6 en células Th17pol sobre Thnp (Figura 3D y E) está en línea con artículos de clones de células Th17 derivadas de muestras clínicas que sobreexpresan CD6 en comparación con células Th1 (Brucklacher-Waldert, Stuerner et al. 2009). Esta sobreexpresión no estaba solo limitada a células T CD4+, sino que también se observó en células T CD8+ activadas.

Ejemplo 4:

Método:

1. Cultivo de CMSP humanas para polarización de Th17: Igual al descrito en el ejemplo 3. El experimento se llevó a cabo solo hasta el día 3 y el día 6 en este caso particular.

2. Marcaje con CFSE y ensayo de proliferación de células T

Se incubaron CMSP con colorante CFSE a una concentración final de 5 pM a 37°C, incubador de CO2 durante 15 minutos (con agitación intermitente), se centrifugaron y resuspendieron en medio completo y de nuevo se incubaron a 37°C, incubador de CO2 durante 30 minutos para la estabilización. Las células se lavaron y estimularon en condiciones Thnp y Th17pol con anticuerpo control o Itolizumab. El día 3 tras la estimulación las células se analizaron para dilución de CFSE en células T CD4+ usando citometría de flujo.

3. Análisis de citometría de flu jo

Tinción de marcadores de superficie celular: En cada punto de tiempo, las células de pocillos cuadruplicados se recogieron y bloquearon con inhibidor de unión del receptor de Fc humano y se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Las células se centrifugaron y resuspendieron en tampón de tinción (s Bf al 2 % en 1XPBS) que contenía los anticuerpos para marcadores de superficie celular (por ejemplo, CD4, CD8, CD25). La adquisición y el análisis de las muestras se realizaron usando un citómetro de flujo Cyan-ADP con el software Summit versión 4.3 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE UU). Los linfocitos se seleccionaron por dispersión frontal y lateral y se seleccionaron adicionalmente en células T CD4+.

Resultados:

Itolizumab se asocia con inhibición de la activación de células T y proliferación en condiciones Thnp y Th17pol.

Previamente se ha descrito una disminución del 50-55 % en la expresión de CD25 en células coestimuladas con anti-CD3, así como anti-CD3 y ALCAM en presencia de Itolizumab (Nair, Melarkode et al. 2010). Aquí, se muestra que, hay reducción significativa en la expresión de CD25 en células T CD4+ estimuladas (~50 % de reducción) en condiciones Thnp y Th17pol en presencia de Itolizumab (Figura 4A). Esto implicaría que el anticuerpo en varios contextos de estimulación es capaz de inhibir consistente y similarmente la activación de células T.

De forma similar a la inhibición de la activación de células T, se observó que Itolizumab también inhibía la proliferación de células T (~38 % en Thnp y ~62 % de reducción en condición Th17pol) (indicado por el número reducido de células con CFSE baja) que confirma el papel inhibidor de Itolizumab en activación y proliferación de células T (Figura 4B).

Ejemplo 5:

Método:

1. Cultivo de CMSP humanas para polarización de Th17: Igual al descrito en el ejemplo 3

2. Análisis de citometría de flu jo

La tinción de citoquinas intracelulares para IL-17A e IFN-y se realizó como sigue. En el punto de tiempo del análisis, las células se dejaron sin estimular o se estimularon con 50 ng/ml de PMA y 1 pg/ml de ionomicina en presencia de BD Golgi Stop Plug™ y se incubaron durante 5 horas a 37°C. Las células se recogieron y lavaron en tampón de tinción y se bloquearon con inhibidor de unión del receptor de Fc humano. Después de la tinción de marcadores de superficie, las células se resuspendieron en tampón fijación/permeabilización BD Cytofix/Cytoperm™, y se realizó la tinción intracelular según las instrucciones del fabricante. La adquisición y el análisis de las muestras se realizaron usando un citómetro de flujo Cyan-ADP con el software Summit versión 4.3 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE UU). Los linfocitos se seleccionaron por dispersión frontal y lateral y se seleccionaron adicionalmente en células T CD3+ como se menciona en los experimentos respectivos.

3. Análisis de citoquinas

En cada punto de tiempo, se recogieron 100 pl de sobrenadante celular y se juntaron de pocillos cuadriplicados y se congelaron a -80°C. El análisis de citoquinas se realizó según las instrucciones del fabricante usando los kits Human IFN-y Quantikine SixPak (SIF50) y Human IL-17 (IL-17A) (Quantikine SixPak (S1700) de R&D Systems. La absorbancia se leyó a 450/630 nm usando un lector SpectraMax M5e, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE UU.

4. Análisis estadísticos

Se uso software GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE UU) para todos los análisis estadísticos. La significación estadística se determinó usando la prueba de la t para datos independientes seguida por el método de Holm-Sidk, con alfa = 5,000 % (Figuras 5 D y E).

Resultados:

Itolizumab se asocia con reducción en citoquinas distintivas de Th17

En condiciones Th17pol se comparó la expresión intracelular de citoquinas distintivas de Th1 (IFN-y) y Th17 (IL-17A) entre células tratadas con anticuerpo control y con Itolizumab. El gráfico de puntos representativo del día 6, muestra solo expresión mínima tanto de IFN-y como de IL-17A tras el tratamiento con Itolizumab, en comparación con los controles (Figura 5 A). También se observaron reducciones similares, con tratamiento con Itolizumab en condiciones Thnp.

El estudio de la evolución temporal a través de los días 3, 6, 8 y 13 demostró disminución máxima en IFN-^y intracelular los días 6 y 8 (Figura 5B). De forma similar, la inhibición máxima (80-90 %) de IL-17A intracelular por Itolizumab también se observó en estos días (Figura 5C). Una correspondiente correlación y disminución en la liberación de IFN-Y e IL-17, tras el tratamiento con Itolizumab (evaluado midiendo citoquinas secretadas) también se observó (Figuras 5D y E). El patrón similar de inhibición para ambas citoquinas intracelulares medido también como las citoquinas secretadas confirmó el efecto de Itolizumab en estos dos subconjuntos Th de efectores principales.

Ejemplo 6:

Método:

1. Cultivo de CMSP humanas para polarización de Th17: Igual al descrito en el ejemplo 3

2. Análisis de citometría de flu jo

La tinción intracelular para pSTAT3 se realizó como sigue. En el punto de tiempo del análisis las células se recogieron y lavaron en tampón de tinción y se bloquearon con inhibidor de unión del receptor de Fc humano. Después de la tinción de marcador de superficie (CD4), las células se fijaron con PFA al 2 % (l00 pl para cada pocillo de tinción) y se incubaron a 4°C durante 15-20 minutos. Las células se lavaron con PBS, dos veces y se permeabilizaron con metanol helado al 100 %. Se añadieron 500 pl de metanol helado mientras se agitaban con el vórtex suavemente las células y se incubaron a 4°C durante 20 min. Después de centrifugación, a 4°C a ~250 x g durante 5 minutos, el metanol se decantó y las células se resuspendieron en tampón de tinción. Se diluyeron los anticuerpos para la tinción intracelular en tampón de tinción y se añadieron a las diluciones apropiadas y las placas se incubaron a 4°C durante 30 min. Las células se lavaron tres veces en tampón de tinción y se resuspendieron en 1x PBS y se adquirieron (todos los lavados se hicieron a 4°C).

La tinción de citoquina intracelular para IL-17A y el factor de transcripción RORyT se realizó como sigue. En el punto de tiempo del análisis, las células se dejaron sin estimular o se estimularon con 50 ng/ml de PMA y 1 pg/ml de ionomicina en presencia de BD Golgi Stop Plug™ y se incubaron durante 5 horas a 37°C. Las células se recogieron y lavaron en tampón de tinción y se bloquearon con inhibidor de unión del receptor de Fc humano. Después de la tinción de marcador de superficie (CD3), las células se resuspendieron en tampón fijación/permeabilización BD Cytofix/Cytoperm™, y se realizó la tinción intracelular según las instrucciones del fabricante.

La tinción de citoquina intracelular para IL-17A y el marcador de superficie CCR6 y CD3 se realizó como sigue. En el punto de tiempo del análisis, las células se dejaron sin estimular o se estimularon con 50 ng/ml de PMA y 1 pg/ml de ionomicina en presencia de BD Golgi Stop Plug™ y se incubaron durante 5 horas a 37°C. Las células se recogieron y lavaron en tampón de tinción y se bloquearon con inhibidor de unión del receptor de Fc humano. Después de la tinción de marcador de superficie (CD3 y CCR6), las células se resuspendieron en tampón fijación/permeabilización BD Cytofix/Cytoperm™, y se realizó la tinción intracelular según las instrucciones del fabricante.

La adquisición y el análisis de las muestras se realizaron usando un citómetro de flujo Cyan-ADP con el software Summit versión 4.3 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE UU). Los linfocitos se seleccionaron por dispersión frontal y lateral y se seleccionaron adicionalmente en células T CD4+o CD3+ como se menciona en los paneles respectivos.

Resultados:

Reducción en los marcadores específicos de Th17 d istintivos en presencia de Itolizumab

La diferenciación de Th17 implica la combinación sinérgica de los factores de transcripción pSTAT3 y RORyT (Annunziato, Cosmi et al. 2007; Bettelli, Korn et al. 2008; de Wit, Souwer et al. 2011). Previamente se ha descrito la reducción mediada por Itolizumab en la expresión de pSTAT3 en células T activadas (Nair, Melarkode et al. 2010) que se confirmó adicionalmente en el presente estudio (Figura 6A). También se muestra, en condiciones Th17pol hay una reducción sustancial en células T doble positivas para IL-17A y RORyT en presencia de Itolizumab en comparación con células tratadas con anticuerpo control. Correlacionando con la inhibición pico de las citoquinas efectoras (Figura 5B-E), los inventores observan una reducción sustancial en estas células dobles positivas (70-80 % de reducción) e IFM de ROR^yT total el día 6 (Figura 6B y 6C, respectivamente). También se observó una tendencia similar el día 8. CCR6 es un marcador de superficie distintivo para células Th17 (Liu y Rohowsky-Kochan 2008; Singh, Zhang et al.

2008). Por tanto, era de interés evaluar la expresión de CCR6 en céluals T productoras de IL-17 y el efecto de Itolizumab en ellas. Analizadas el día 6, en condiciones Th17pol, se observó el 50-60 % de reducción en la expresión de células T CD3+ CCR6+IL-17A+ (positivas dual) en presencia de Itolizumab en comparación con el control (Figura 6D). También se observaron reducciones similares el día 10.

Mientras que las células T CCR6+ son o bien células de memoria o Treg (Yamazaki, Yang et al. 2008) todas estas células no son células Th17 productoras de IL-17 (Sallusto, Lenig et al. 1998; Liao, Rabin et al. 1999; Kleinewietfeld, Puentes et al. 2005). Itolizumab tuvo poco impacto en las IL-17'CCR6+ (células no Th17). Esta observación es distinta de la disminución observada en IFM de RORyT total en presencia de Itolizumab en comparación con los controles (Figura 6C), lo que sugiere que Itolizumab podría disminuir la expresión del factor de transcripción ROR^yT, pero afecta solo al subconjunto IL-17+ de células T de expresión de CCR6. Estos experimentos demuestran que Itolizumab inhibe la activación y diferenciación de células Th17 al inhibir los factores de transcripción clave pSTAT3, RORyT junto con células T ROR^yT+ IL-17A+ y CCR6+IL-17A+ (Figura 6) a través de los días.

Referencias:

Annunziato, F., L. Cosmi, et al. (2007). "Phenotypic and functional features of human Th17 cells." J Exp Med 204(8): 1849-61.

Bettelli, E., T. Korn, et al. (2008). "Induction and effector functions of T(H)17 cells." Nature 453(7198): 1051-7.

Brucklacher-Waldert, V., K. Stuerner, et al. (2009). "Phenotypical and functional characterization of T helper 17 cells in multiple sclerosis." Brain 132(Pt 12): 3329-41.

De Wit, J., Y. Souwer, et al. (2011). "CD5 costimulation induces stable Th17 development by promoting IL-23R expression and sustained STAT3 activation." Blood 118(23): 6107-14.

Kleinewietfeld, M., F. Puentes, et al. (2005). "CCR6 expression defines regulatory effector/memory-like cells within the CD25(+)CD4+ T-cell subset." Blood 105(7): 2877-86.

Liao, F., R. L. Rabin, et al. (1999). "CC-chemokine receptor 6 is expressed on diverse memory subsets of T cells and determines responsiveness to macrophage inflammatory protein 3 alpha." J Immunol 162(1): 186-94.

Liu, H. y C. Rohowsky-Kochan (2008). "Regulation of IL-17 in human CCR6+ effector memory T cells." J Immunol 180(12): 7948-57.

Nair, P., R. Melarkode, et al. (2010). "CD6 synergistic co-stimulation promoting proinflammatory response is modulated without interfering with the activated leucocyte cell adhesion molecule interaction." Clin Exp Immunol 162(1): 116-30. Sallusto, F., D. Lenig, et al. (1998). "Flexible programs of chemokine receptor expression on human polarized T helper 1 and 2 lymphocytes." J Exp Med 187(6): 875-83.

Singh, S. P., H. H. Zhang, et al. (2008). "Human T cells that are able to produce IL-17 express the chemokine receptor CCR6." J Immunol 180(1): 214-21.

Yamazaki, T., X. O. Yang, et al. (2008). "CCR6 regulates the migration of inflammatory and regulatory T cells" J Immunol 181(12) 8391-401.

Claims (1)

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo Itolizumab para uso en el tratamiento de esclerosis múltiple en un sujeto que tiene un número aumentado de células T cooperadoras 17 (Th17) cuando se compara con un sujeto sano, en donde el uso suprime la producción del receptor de citoquina IL-23R, disminuyendo de esta manera la inflamación mediada por células Th17, causa una reducción de TNF-alfa, IFN-gamma, IL-6 e IL-17A en un fluido corporal del paciente y una reducción de la expresión de IL-23R en uno o más de monocitos, células T cooperadoras y células citolíticas naturales en un fluido corporal del paciente.