JP2001523956A

JP2001523956A - ヒトｃｄ６に対するモノクローナル抗体

Info

Publication number: JP2001523956A
Application number: JP54447798A
Authority: JP
Inventors: スターリング，ゲイリー・シー; シアダック，アンソニー・ダブリュー; ボーウェン，マイケル・エイ; アルフォ，アレハンドロ; バヨラト，ユルゲン; ボディアン，デイル・エル; スコニアー，ジョン・イー
Original assignee: ブリストル−マイヤーズ・スクイブ・カンパニー
Priority date: 1997-03-03
Filing date: 1998-02-20
Publication date: 2001-11-27
Also published as: EP0977991A1; AU747898B2; WO1998043089A1; US6372215B1; CA2282410A1; IL130864A0; EP0977991A4; AU6177098A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトＣＤ６（ｈＣＤ６）のＳＲＣＲドメインに対し特異的に結合し、かつ活性化白血球細胞癒着分子（ＡＬＣＡＭ）のｈＣＤ６への結合を実質的に抑制する能力を含む有利な性質を有する、抗体および他の結合作用物質を提供する。本発明の結合作用物質は、就中、ペプチド、およびｈＣＤ６にも結合しおよび／またはｈＣＤ６に結合するＡＬＣＡＭを調整する薬物のスクリーニング法に、並びに炎症および自己免疫疾患の世話や処置のための診断および治療法に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトＣＤ６に対するモノクローナル抗体技術分野ＣＤ６は、主にヒトＴ細胞および部分集合(subset)のＢ細胞により、並びに幾つかのＢ細胞慢性リンパ球性白血症およびニューロンにより発現される、重要な細胞表面タンパク質である［たとえば、Aruffoらの「J.Exp.Med.」（１７４：９４９、１９９１年）；Kamounらの「J.Immunol.」（１２７：９８７、１９８１年）；Mayerらの「J.Neuroimmunol.」（２９：１９３、１９９０年）参照］。ＣＤ６は、タイプＩマクロファージのスキヤベンジャー・レセプタ・システインの豊富なドメイン（ＳＲＣＲ）に相同する少なくとも１つのドメインを有することを特徴とするラージファミリーのタンパク質のメンバーである［マツモトらの「J. Exp.Med.」（１７３：５５、１９９１年）；およびResnickらの「Trends Bioche m.Sci.」（１９：５、１９９４年）］。このファミリーの他のメンバーとしては、ＣＤ５［Jonesらの「Nature」（３２３：３４６、１９８６年）］；シクロフィリンＣ［Friedmanらの「ＰＮＡＳ」（９０：６８１５、１９９３年）］；活性化した補体タンパク質Ｃ３ｂおよびＣ４ｂに結合する補体因子Ｉ［Goldbergerらの「J．Biol．Chem.」（２６２：１００６５、１９８７年）］；γ／δＴ細胞によって発現されるウシＷＣ−１［Wijingaardらの「J.Immunol.」（１４９：３２７３、１９９２年）］，およびＭ１３０［Lawらの「Eur.J.Immunol.」（２３：２３２０、１９９３年）］，マクロファージ活性化マーカが挙げられる。抗ＣＤ６モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を用いるブロッキング実験によれば、ＣＤ６はＴ細胞発育において、胸腺上皮（ＴＥ）細胞とのＴ細胞癒着性相互作用(adhesive interaction)を調節することにより、重要な役割を果たすことが示唆される［Patelらの「J.Exp.Med.」（１８１：１５６３−１５６８、１９９５年）］。付加的な実験では、Ｔ細胞活性化において、重要な付属分子として機能しうることが示された。たとえば、ある抗ＣＤ６ｍＡｂは、Ｔ細胞に対して直接的なミトゲンであり［Gangemiらの「J.Immunol.」（１４３：２４３９、１９８９年）およびBottらの「Int．Immunol.」（７：７８３、１９９３年）］、この場合、その他は抗ＣＤ３、抗ＣＤ２またはＰＭＡと共に、Ｔ細胞増殖を共同刺激することができる［Gangemiらの「J.Immunol.」（１４３：２４３９、１９８９年）；モリモトらの「J.Immur.」（１４０：２１６５−２１７０、１９８８年）；およびOsorioらの「Cell．Immunol.」（１５４：２３、１９９４年）］。なお、付加的なＣＤ６のＴ細胞活性化での役割の証拠については、Ｔ細胞活性化のあと、ＣＤ６はSerおよびThr残基で超ホスホリル化［Swackらの「Mol.Immunol.」（２６：１０３７−１０４９、１９８９年）；Swackらの「J.Biol.Chem.」（２６６：７１３７、１９９１年）；Cardenasらの「J.Immunol.」（１４５：１４５０−１４５５、１９９０年）］およびTyr残基でホスホリル化［Weeらの「J.Exp. Med.」（１７７：２１９−２２３、１９９３年）］されるようになることを示す実験から得られる。これらのおよび他の実験から、ＣＤ６はＴ細胞活性化およびシグナル形質導入の両方に影響を及ぼし、インビボでの未成熟および成熟Ｔ細胞機能両方の重要なモジュレータ（調整剤）として結論づけられる。成熟ＣＤ６タンパク質の細胞外ドメインは、３つのＳＲＣＲドメイン（以下、これらをＣＤ６Ｄ１、ＣＤ６Ｄ２およびＣＤ６Ｄ３と称し、ＣＤ６Ｄ３は該膜の近位ＳＲＣＲドメインに相当する）、次いで短い３３−アミノ酸ストーク（stal k）領域から成る。これらの細胞外ドメインは、短い膜内外ドメイン、次いで変わりやすい（変異の）長さの細胞質ドメインを介して、細胞膜に固定される［Ar uffoらの「J.Exp.Med.」（１７４：９４９、１９９１年）］。ＣＤ６−免疫グロブリン融合タンパクであって、ヒトＩｇＧ₁一定ドメインに融合するＣＤ６の選定細胞外ドメインを含有するもの（ＣＤ６−Ｒｇｓ）を用いる実験は、“活性化白血球細胞癒着分子”（ＡＬＣＡＭ）と呼ばれるＣＤ６リガンドの同定およびクローニングに導く［Weeらの「Cell．Immunol.」（１５８：３５３−３６４、１９９４年）；Patelらの「J.Exp.Med.」（１８１：１５６３ −１５６８、１９９５年）；Bowenらの「J.Exp.Med.」（１８１：２２１３−２２２０、１９９５年）］。ＡＬＣＡＭは、免疫グロブリン超遺伝子ファミリーのメンバーであり、かつニワトリ神経癒着分子ＢＥＮ／ＳＣ−１／ＤＭ−ＧＲＡＳＰ［Pourquieらの「ＰＮＡＳ」（８９：５２６１−５２６５、１９９２年）；タナカらの「Neuron」（５３５−５４５、１９９１年）；およびBurnsらの「Neuro n」（２０９−２２０）１９９１年）］およびラット・タンパクＫＧ−ＣＡＭ［P eduzziらの「Brain Res.」（６４０：２９６−３０７、１９９４年）］のヒト相同体であってもよい。ニワトリにおいて、ＢＥＮ／ＳＣ−１／ＤＭ−ＧＲＡＳＰは同種親和性相互作用を仲介することができ、かつ神経系における軸索成長にかかわり合うことが認められる。ＡＬＣＡＭは、ニューロンによって発現されることに加えて、ヒトTE細胞や種々の他の細胞種によっても発現され［Patelらの「J.Exp.Med.」（１８１：１５６３、１９９５年）］、かつ活性化白血球によっても一時的に発現される［Bowe nらの「J.Exp.Med.」（１８１：２２１３、１９９５年）］。特に、細胞癒着アッセイによって、ＣＤ６−ＡＬＣＡＭ相互作用は、胸腺細胞のＴＥ細胞への結合を仲介するのに、いく分か応答しうることが証明された［Bowenらの「J.Exp.Med .」（１８１：２２１３−２２２０、１９９５年）］。ヒトＡＬＣＡＭ発現のインビトロ動態の分析により、ミトゲン活性化末梢血液Ｔ細胞による発現は、刺激の７２時間後にピークに達し、かつ５〜８時間の間で検出できないレベルに戻ることが認められた。またニワトリのＢＥＮ／ＳＣ−１／ＤＭ−ＧＲＡＳＰは、活性化Ｔ細胞［Corbelらの「Cell Immunol.」（１４１：９９、１９９２年）］や造血先駆細胞(progenitor cells)によっても発現され、かつＮｇＣＡＭや他のタンパク質との異種親和性相互作用を仲介すること［DeBernardoらの「J.Cell.Bio l.」（１３３：６５７、１９９６年）］が認められている［Corbelらの「ＰＮＡＳ」（９３：２８４４、１９９６年）］。Ｔ細胞調節におけるＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用の役割の実験から、このレセプターリガンド対は、ＣＤ６発現細胞の胸腺上皮細胞への癒着を仲介できることが認められた［Bowenらの「J.Exp.Med. 」（１８１：２２１３、１９９５年）］。このおよび他の証拠は、ＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用がＴ細胞発育および活性化を調整するのに重要であることを示唆する。上述の知見は、ＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用がＴ細胞発育および活性化の調節に重要な役割を果すことを示すものであるが、当該分野でＣＤ６、およびヒトＣＤ６の、特にＡＬＣＡＭとの相互作用に関してさらなる発見および特性決定を求める必要が明らかに残されている。さらに詳しくは、ｈＣＤ６／ＡＬＣＡＭ結合相互作用を仲介するｈＣＤ６構造要素の他の特性決定や、ｈＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用を調整することができる、ｈＣＤ６結合作用物質などの特異的手段(spe cific tools)の必要がある。このような手段は、種々の診断用途、エクスビボ(e x vivo)処置、およびインビボ治療法に、たとえば患者の疾患状態に関連するＣＤ６−仲介応答を診断したり、移植組織物質からＣＤ６＋細胞のエクスビボ親和力除去を行ったり、ＣＤ６−仲介Ｔ細胞活性化のインビボ調整作用物質、たとえばインヒビターまたはエンハンサーを付与して、患者の炎症および自己免疫応答を調整するのに有用なものである。本発明は、これらの必要に取り組み、以下の説明から明らかとなる付加的な利点を提供する。発明の概要本発明は、ヒトＣＤ６（ｈＣＤ６）のＳＲＣＲドメインに対し特異的に結合する抗体および他の結合作用物質を提供する。本発明の好ましい観点において、ヒトＣＤ６ＳＲＣＲドメイン３（ＣＤ６Ｄ３）またはヒトＣＤ６ストーク・ドメイン（ＣＤ６Ｓ）に対し特異的に結合し、かつＣＤ６に結合する活性化白血球細胞癒着分子（ＡＬＣＡＭ）を抑制する、抗体および他の免疫グロブリン（自然のままや人工変性の抗体および抗体フラグメントを包含）が提供される。本発明のより詳細な観点では、抗ヒトＣＤ６結合作用物質は、以下に同定される実例の自然のままのモノクローナル抗体から選ばれ、かつグループ１（たとえばｍＡｂ５Ｄ４）；グループ２（たとえばｍＡｂ１０Ａ５）；グループ３（たとえばｍＡｂ１６Ａ３）；グループ４（たとえばｍＡｂ７Ｈ６）；グループ５（たとえばｍＡｂ１５Ｂ１２）；グループ６（たとえばｍＡｂｓ７Ｃ７および１３Ｃ３）；グループ７（たとえばｍＡｂｓ５Ｅ８および８Ａ７）；またはグループ８（たとえばｍＡｂｓ１０Ｄ１および１２Ａ５）と呼ばれる８つのＣＤ６結合サブグループの１つに含まれる。別法として、抗ヒトＣＤ６結合作用物質は、対応する自然のままの抗体と同一の重要なアミノ酸配列を示し、かつ対応する自然のままの抗体と同じＣＤ６結合特異性を実質的に保有する、変性免疫グロブリン、たとえば人間向きにした抗体、部位一方向性の変異誘発抗体、または化学的もしくは組換えで産生した抗体フラグメントから選ばれてよい。本発明の他の具体例において、特にｈＣＤ６に結合する付加的な結合作用物質を同定するスクリーニング法が提供される。これらの方法は、特にヒトＣＤ６ＳＲＣＲドメイン３（ＣＤ６Ｄ３）またはヒトＣＤ６ストーク・ドメイン（ＣＤ６Ｓ）に結合し、かつｈＣＤ６に結合するＡＬＣＡＭを抑制する、対照抗ｈＣＤ６モノクローナル抗体を、競合物質とされるテスト結合作用物質の存在下、ＣＤ６Ｄ２、ＣＤ６Ｄ３およびＣＤ６Ｓから選ばれる１種以上のｈＣＤ６ドメインからなる標的種と接触させることを必然的に伴なう。この接触工程は、テスト結合作用物質の非存在下の対照抗体と標的種の複合形成に好適な条件下で行なう。次に、ＣＤ６Ｄ３またはＣＤ６Ｓに対するテスト結合作用物質の特異的な結合活性の指示薬として、テスト結合作用物質の存在下の対照抗体と標的種の複合体形成を検出する。このスクリーニング法は、たとえば付加的なｈＣＤ６結合作用物質を同定し、特性決定するペプチドや小分子ライブラリー(libraries)の高処理量スクリーニングに有用である。また、これらのアッセイの好ましい抗体は、ＣＤ６結合サブグループの、グループ１（５Ｄ４）；グループ２（１０Ａ５）；グループ３（１６Ａ３）；グループ４（７Ｈ６）；グループ５（１５Ｂ１２）；グループ６（７Ｃ７，１３Ｃ３）；グループ７（５Ｅ８，８Ａ７）；またはグループ８（１０Ｄ１，１２Ａ５）、あるいはこれらの抗体のフラグメントもしくは他の人工変性形態から選ばれる。本発明の関連のある観点において、上記スクリーニング法は、標的種に結合するＡＬＣＡＭに好適な条件下、テスト結合作用物質の存在下、ＡＬＣＡＭを標的種に接触させる追加の工程によって適応される。その後、ＡＬＣＡＭ／ＣＤ６結合を調整するテスト結合作用物質の活性の指示薬として、ＡＬＣＡＭと標的種の複合形成を検出する。かかるスクリーニング法による選択に好ましいテスト結合作用物質としては、対照抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のペプチド擬態、並びにＣＤ６／ＡＬＣＡＭ結合相互作用を調整する能力が選択されうる他のペプチドおよび小分子種が挙げられる。本発明の他の観点において、患者の炎症または自己免疫応答を調整する方法、たとえば多発性硬化症あるいは移植組織拒絶に関係する反対応答を抑制する方法が提供される。これらの方法には、ヒトＣＤ６ＳＲＣＲドメイン３（ＣＤ６Ｄ３）またはヒトＣＤ６ストーク・ドメイン（ＣＤ６Ｓ）に対し特異的に結合し、かつｈＣＤ６に結合するＡＬＣＡＭを抑制する、治療上または薬理学的に有効量の抗ＣＤ６結合作用物質の患者への投与が含まれる。これらの方法での使用に好ましい抗ＣＤ６結合作用物質は、人間向きにしたモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、並びに対応する自然のままの抗体と同一の重要なアミノ酸配列を有し、かつ実質的に同じ結合特異性を共有する、抗体フラグメントや自然のままの抗体の変異誘発形態などの変性免疫グロブリンである。本発明のさらに付加的な観点において、インビトロおよびインビボアッセイで、ＣＤ６、ＣＤ６＋細胞、および／またはＣＤ６−仲介活性、たとえばＴ細胞活性化に関するＣＤ６活性を検出する診断用組成物および方法が提供される。これらの方法も同様に、ヒトＣＤ６ＳＲＣＲドメイン３（ＣＤ６Ｄ３）またはヒトＣＤ６ストーク・ドメイン（ＣＤ６Ｓ）に対し特異的に結合し、および／またはｈＣＤ６に結合するＡＬＣＡＭを抑制する抗ＣＤ６結合作用物質を使用する。図面の簡単な説明図１は、本発明における結合作用物質の特性決定に用いる、ＣＤ６と異なるＣＤ６−Ｒｇ融合タンパクに組込まれる種々のＳＲＣＲドメインを図式的に示す。図２は、抗体のＣＤ６＋細胞に対する特異的な結合活性と、ＡＬＣＡＭ−Ｉｇと該細胞の相互作用の抗体仲介ブロッキングを検出するフロー細胞（血球）計算走査を示す。図３および４は、ＣＤ６Ｄ１−３Ｒｇ融合タンパクに対する実例の抗ヒトＣＤ６Ｄ３／抗ヒトＣＤ６Ｓモノクローナル抗体の滴定曲線を示す。図５および６は、野性型ｈＣＤ６ＳＲＣＲＤ３または変異体タンパクに対する種々のＣＤ６結合サブグループ内の各種実例の抗ヒトＣＤ６Ｄ３／抗ヒトＣＤ６Ｓモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ結合アッセイ結果を示す。ｘ軸において下記表７に従って、変異体の数をかぞえる。ｙ軸にＯ．Ｄ．値を記録する。図７は、変異体ｈＣＤ６ＳＲＣＲＤ３タンパクに対し、種々のモノクローナル抗体希釈での滴定曲線を示す。図８は、ＣＤ６Ｄ３／ＳＲｇ融合タンパクに対する実例の抗ヒトＣＤ６Ｄ２モノクローナル抗体の滴定曲線を示す。特別な具体例の説明Ｉ）結合作用物質本発明は、ヒトＣＤ６の第２ＳＲＣＲドメイン（ＣＤ６Ｄ２）、第３（膜近位）ＳＲＣＲドメイン（ＣＤ６Ｄ３）およびストーク・ドメイン（ＣＤ６Ｓ）の１つ以上に結合し、あるいはＡＬＣＡＭなどのＣＤ６リガンドに結合する、抗体、抗体フラグメントおよび他の結合作用物質を提供する。本発明の好ましい結合作用物質としては、ＣＤ６Ｄ２、ＣＤ６Ｄ３およびＣＤ６Ｓドメインの１つ以上に特異的に結合する、自然のままおよび変性した抗体およびそのフラグメントが挙げられる。これらのおよび他の結合作用物質の場合、特異的な結合が存在し、このとき、該作用物質のＣＤ６Ｄ２、ＣＤ６Ｄ３またはＣＤ６Ｄ３Ｓへの結合の解ＣＤ６Ｄ２、ＣＤ６Ｄ３またはＣＤ６Ｓに特異的に結合する抗体の能力は、親和力単独に基づき、または別法としてあるいは補充として、当該分野で公知の広範囲にわたるさまざまな抗体特異性アッセイのいずれかを用いて判定することができる。かかるアッセイの代表例としては、対向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、エンザイム−リンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドット・ブロット(Dot Blot)アッセイおよび抑制または競合アッセイが挙げられる。これらのおよび他の、抗体特異性および／または結合親和力を判定する方法については、HarlowおよびLane著の「Antibodies:A Laboratory Manual 」（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８８年）が参照される。本発明において有用な抗体としては、天然のままのポリクローナルおよびモノクローナル抗体、並びに対応する自然のままの抗体と実質的に同じＣＤ６Ｄ２、ＣＤ６Ｄ３およびＣＤ６Ｓドメイン結合特異性を保有する、遺伝学的に作成したおよび他の方法で変性した抗体が挙げられる。また抗体フラグメントも提供され、たとえばＦ(ａｂ')₂およびＦ(ａｂ')フラグメント、Ｆｖフラグメントおよび会合しない重鎖または軽鎖、およびＣＤ６Ｄ２、ＣＤ６Ｄ３またはＣＤ６Ｓに特異的に結合するシングル鎖抗体が含まれる。本明細書で用いる“自然のままの抗体 ”および“自然のままの抗体フラグメント”とは、通常の免疫法および精製の手順によって産生する抗体、並びに自然のままで完全状態の抗体から、たとえば化学的または酵素的分離によって誘導される抗体フラグメントを意味する。自然のままの抗体の産生の場合、１つ以上のＣＤ６ドメインからなり、好ましくは実質上純粋なあるいは単離した形状の、ＣＤ６タンパク、タンパク・フラグメントまたは融合タンパクを、動物、たとえばマウス、ラット、ウマ、ラビット、ヤギまたはブタに対して、該動物において免疫応答を起こさせるのに十分な量で投与する。好ましくは、免疫応答を高めるため、フロイント・アジュバントなどのアジュバント含有混合物で、ＣＤ６タンパク、タンパク・フラグメントまたは融合フラグメントを投与する。抗原の１回注射で、該動物において十分に抗体産生を誘発しうるが、一般には、最初に多量の注射を行った後、数週間から数ヶ月にわたって、１以上のブースター注射を行なうのが好ましい。次に動物から血液を採取し、凝固させ、次いで通常の技法、たとえば塩沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、親和力クロマトグラフィーまたは高性能液体クロマトグラフィーを用いて、血清から抗体を単離する。本発明の好ましい具体例において、モノクローナル抗体を用いる。モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗血清と比較して、産生の容易さおよび治療用量が少ないという利点を有するが、その理由は、所望の特異性を持つ抗体のみを使用するからである。モノクローナル抗体の産生法は、当該分野で周知であり、かつたとえばKohlerおよびMisteinの「Nature」（２５６：４９５、１９７５年）；「Eur.J.Iwunol.」(6：５１１−５１９、１９７６年）；およびHurrel J.G.R.著の「Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications」（ＣＲＣプレス・インコーポレイテッド、ＦＬ州ボカ・レイトン、１９８２年）に開示されている。好ましくは、本発明の抗体、抗体フラグメント、および他の結合作用物質は実質上純粋なあるいは単離した形状で提供される。本明細書で用いる“実質上純粋 ”および“単離した”とは、目的種が組成中に存在する主成分である（すなわち、モル基準で、他の個々の種より豊富にある）ことを意味する。好ましくは、目的種は存在する全高分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を構成する。より好ましくは、実質上純粋なまたは単離した形状の目的種は、組成中に存在する全高分子種の約８０〜９０％以上を構成するだろう。最も好ましくは、目的種は本質的同質性（通常の検出法によっては、組成中に異物種を検出できない程度）となるまで精製され、ここで、組成は本質的に単一の高分子種からなる。本発明の抗体、抗体フラグメント、および他の結合作用物質は好ましくは、ＡＬＣＡＭのｈＣＤ６への結合を特異的に抑制する。ＣＤ６に結合するＡＬＣＡＭを特異的に抑制するとは、結合作用物質の存在下で結合するＡＬＣＡＭが、結合作用物質の非存在下の対照アッセイにおいて結合するＡＬＣＡＭと比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５〜９０％またはそれ以上抑制されるように、結合作用物質が１つ以上の競合的結合アッセイにおいて結合するＡＬＣＡＭをブロックするかあるいは該ＡＬＣＡＭと競合することを意味する。ＣＤ６に結合するＡＬＣＡＭをブロックあるいは競合する能力は、種々の方法、たとえばBowen らの「J.Biol.Chem.」（２７１：１７３９０−１７３９６、１９９６年）に開示の、および後記実施例に記載の方法によって判定されてよい。ＣＤ６に結合するＡＬＣＡＭをブロックあるいは競合する能力は典型例として、抗体、抗体フラグメントまたは他の結合作用物質が、ＣＤ６エピトープにもしくはＣＤ６のＡＬＣＡＭ結合部位と構造的に重複する結合部位に、またはＣＤ６のＡＬＣＡＭ結合部位に対し十分近位にあるエピトープもしくは結合部位に結合して、立体化学的あるいはその他でＡＬＣＡＭのＣＤ６への結合を抑制することを示す。この点で結合作用物質の具体例としては、ＡＬＣＡＭをブロックし、本明細書に記載され、かつ以下の如く称せられるＣＤ６結合サブグループの１つのＣＤ６結合特性を有する、抗ヒトＣＤ６Ｄ３および抗ヒトＣＤ６Ｄ３−Ｓ抗体が挙げられる：グループ１（ｍＡｂ５Ｄ４が例示）；グループ２（ｍＡｂ１０Ａ５が例示）；グループ３（ｍＡｂ１６Ａ３が例示）；グループ４（ｍＡｂ７Ｈ６が例示）；グループ５（ｍＡｂ１５Ｂ１２が例示）；グループ６（ｍＡｂｓ７Ｃ７および１３Ｃ３が例示）；グループ７（ｍＡｂｓ５Ｅ８および８Ａ７が例示）；およびグループ８（ｍＡｂｓ１０Ｄ１および１２Ａ５が例示）。これらの異なるＣＤ６結合サブグループのそれぞれの実例となるｍＡｂｓを表示するハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている。詳しくは、１９９７年２月１９日に、以下に示すハイブリドーマが、メリーランド州ロックビル、パークラウン・ドライブ１２３０１のＡＴＣＣに寄託され、かつ表示の寄託名称(deposit designation)が指定された：（Ｈ６−２.７Ｃ７／名称ＨＢ１２２８８）；（Ｈ６−２.１０Ａ５／名称ＨＢ１２２８９）；（Ｈ６−２.１０Ｄ１／名称ＨＢ１２２９０）；（Ｈ６−２.５Ｄ４／名称ＨＢ１２２９１）；（Ｈ６−１.７Ｈ６／名称ＨＢ１２２９２）；（Ｈ６−２.１５Ｂ１２／名称ＨＢ１２２９３）；（Ｈ６−２.１４Ｈ２／名称ＨＢ１２２９４）；（Ｈ６−２.５Ｅ８／名称ＨＢ１２２９５）；および（Ｈ６−２. １６Ａ３／名称ＨＢ１２２９６）。本発明において提供される付加的な結合作用物質としては、たとえば本発明の自然のままの抗ヒトＣＤ６抗体と実質的に同じＣＤ６ドメイン特異性および結合親和力を共有する(share)、抗体フラグメントおよび組換え変性抗体が挙げられる。なお本発明において提供される付加的な結合作用物質としては、たとえば上述の抗ヒトＣＤ６抗体の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の擬態(mimetics)が挙げられ、該擬態はＣＤ６に結合するＡＬＣＡＭを抑制することもできる。別法として、本発明の結合作用物質は、ｈＡＬＣＡＭのＣＤ６結合ドメインのまたは十分近位の（すなわち、ｈＡＬＣＡＭの予測されるＡ'ＧＦＣＣ'Ｃ"面の内部または隣接した）ヒトＡＬＣＡＭに直接結合することによって、ＡＬＣＡＭ／ＣＤ６相互作用を干渉しうる［たとえば、Bajorathらの「Protein Science」（４：１６４４−１６４７、１９９５年）；Skonierらの「Biochmistry」（３５：１２２８７ −１２２９１、１９９６年）；およびSkonierらの「Biochemistry」（３５：１４７４３−１４７４８、１９９６年）参照］。この後者タイプの結合作用物質の具体例としては、対照抗ヒトＣＤ６Ｄ３または本発明の抗ヒトＣＤ６Ｓ抗体によって認識されるＣＤ６エピトープのペプチド擬態が挙げられ、かかるエピトープはＣＤ６のＡＬＣＡＭ結合部位と実質的配列の同一性を共有する。またこれらの特定擬態は、ＡＬＣＡＭによっても認識されることにより、該擬態はＡＬＣＡＭ結合のＣＤ６に対する競合的抑制を示す。かかる擬態は、たとえば、テスト擬態と抗ヒトＣＤ６対照抗体間のＣＤ６結合競合を検出する周知のアッセイに基づき、商業上入手しうるペプチドライブラリーから、型どおりのスクリーニングすることができ、その後、テスト擬態は、対照抗体によって、ＣＤ６に結合するＡＬＣＡＭを抑制しおよび／またはＡＬＣＡＭ結合抑制を調整する能力に基づき、型どおりに選択することができる。本発明の抗体、抗体フラグメントおよび他の結合作用物質が提供され、これらは、１つ以上のＣＤ６ドメインに結合するため、本明細書に開示の１つ以上の選択された抗ＣＤ６Ｄ２、抗ＣＤ６Ｄ３または抗ＣＤ６Ｓ対照抗体［たとえば結合グループとして指定の、グループ１（５Ｄ４）；グループ２（１０Ａ５）；グループ３（１６Ａ３）；グループ４（７Ｈ６）；グループ５（１５Ｂ１２）；グループ６（７Ｃ７、１３Ｃ３）；グループ７（５Ｅ８、８Ａ７）；およびグループ８（１０Ｄ１、１２Ａ５）から選ばれる１つ以上の対照抗体］によって、ＣＤ６結合を特異的に抑制する。競合はアッセイによって判定され、ここで、たとえば対照抗体とＣＤ６ドメイン間の複合形成に好適な条件下、一般に競合物質とされる“テスト抗体”または他の“テスト結合作用物質”の存在下および非存在下で、ＣＤ６Ｄ２、ＣＤ６Ｄ３およびＣＤ６Ｓドメインの１つ以上を含むＣＤ６またはＣＤ６−Ｒｇ融合タンパクからなる標的種への対照抗体の結合の測定で判定されるように、テスト下の抗体、抗体フラグメント、または他の結合作用物質は、１つ以上のＣＤ６ドメインを含有する標的種への対照抗体の特異的な結合を実質的に抑制する。多種類の競合的結合アッセイは、たとえばＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．４３７６１１０および４０１６０４３や上記HarlowおよびLaneの文献に記載の如く、公知でありかつ本発明において型どおりに実施することができる。かかるアッセイは典型例として、ＣＤ６ドメイン（たとえばＣＤ６Ｄ２、ＣＤ６Ｄ３および／またはＣＤ６Ｓを含む精製ＣＤ６または精製Ｒｇ融合タンパク）を含有する標的種、未標識付けテスト抗体または他のテスト結合作用物質、および標識付け対照抗体の使用を必要とする。標的種は、生物学的サンプル（たとえばＣＤ６＋細胞のサンプル）の形状で付与されてよく、あるいはＣＤ６−Ｒｇ融合タンパクを溶解してもしくは固体支持体等に結合させて含有する混合物などの人工混合物で付与されてもよい。競合的抑制は、テスト抗体または他のテスト結合作用物質の存在下で標的種に結合する標識の量を判定して判断される。通常、テスト抗体または結合作用物質は過剰に存在する。これらの競合アッセイによって同定される抗体および他の結合作用物質（“競合的結合作用物質”）としては、エピトープまたは対照抗体が結合する結合部位に結合する抗体、抗体フラグメントおよび他の結合作用物質、並びに起生するテスト結合作用物質と対照抗体間の競合的結合のため、エピトープまたは対照抗体が結合するエピトープに十分近位の結合部位に結合する抗体および他の結合作用物質が挙げられる。また本発明の抗ヒトＣＤ６抗体と競合する競合的結合作用物質としては、たとえば、対照抗体が結合するＣＤ６エピトープのペプチド擬態が挙げられ、該擬態は好ましくは、競合的ＡＬＣＡＭ／ＣＤ６結合アッセイにおいてＡＬＣＡＭに結合する。さらに付与的な競合的結合作用物質としては、対照抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のペプチド擬態が挙げられ、該擬態も好ましくは、ＡＬＣＡＭ／ＣＤ６結合を抑制する。好ましくは、本発明の競合的結合作用物質は、過剰に存在すると、選択した標的種への対照抗体の特異的結合を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは７５〜９０％もしくはそれ以上に抑制する。 II）自然のままおよび変性した抗ＣＤ６免疫グロブリンおよび抗体フラグメントの組換え産生抗体、または免疫グロブリンは概して、４つの共有結合したペプチド鎖からなる。たとえば、ＩｇＧ抗体は２つの軽鎖と２つの重鎖を有する。軽鎖のそれぞれは重鎖に共有結合する。各重鎖は順次、他方に共有結合して、免疫グロブリン立体配座としても知られている、“Ｙ”立体配置を形成する。これらの分子のフラグメント、または重鎖もしくは軽鎖単独でさえもＣＤ６に結合しうる。抗体、抗体のフラグメント、および個々の鎖もまた、本明細書で免疫グロブリンと称する。組換えＤＮＡ技法の周知の方法を用いて、本発明の免疫グロブリンを高レベルで産生しうる。加えて、自然のままの抗体および抗体フラグメントを型どおりに変性して、対応する親抗ＣＤ６免疫グロブリンと比べて実質的に同じようなまたは結合を高めた特異性および同様なＡＬＣＡＭブロック、または競合の活性を有する変性抗ＣＤ６免疫グロブリンを生成することができる。たとえば、自然のままの抗体をコードする遺伝子［たとえば、本明細書に記載のグループ１（５Ｄ４）；グループ２（１０Ａ５）；グループ３（１６Ａ３）；グループ４（７Ｈ６）；グループ５（１５Ｂ１２）；グループ６（７Ｃ７、１３Ｃ３）；グループ７（５Ｅ８、８Ａ７）；またはグループ８（１０Ｄ１、１２Ａ５）モノクローナル抗体をコードする遺伝子］を単離し、クローン化して１つ以上のポリヌクレオチド発現ベクターとし、そして該ベクターを組換え抗体の発現用の適当な宿主細胞系の中で形質転換させることができる。クローン化抗体をコードする遺伝子の発現は、抗体の収率の増加をもたらし、かつ結合特異性またはＡＬＣＡＭブロック機能の重大なロスを伴なわない変異および一定の両領域において、アミノ酸の置換、削除、付加および他の変性、たとえば人間向きにする変性を導入することにより、自然のままの免疫グロブリンの型どおりの変性をも可能ならしめる。抗ＣＤ６免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を、当該分野で公知の方法、たとえばSambrookらの「Molecular Cloning：A Laboratory Manual .」（２版、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ、１９８９年）；Berger & Kimmelの「Methods in Enzymology、Volume １５２、Guide to Molecular Cloni ng Techniques」（アカデミック・プレス・インコーポレイテッド、サンディエゴ、ＣＡ、１９８７年）；Ｃｏらの「J.Immunol.」（１４８：１１４９、１９９２年）に記載の方法に従って、単離し、クローン化する。本発明のある観点において、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、選択した抗ヒトＣＤ６産生ハイブリドーマのゲノムＤＮＡから、あるいは別法として、ハイブリドーマのＲＮＡの逆転写によって産生されるｃＤＮＡからクローン化される。クローニングは、通常の技法で行なわれ、該技法としてたとえばクローン化すべき遺伝子、または遺伝子のセグメントの側面にあるまたは一部をおおう配列にハイブリダイズする(h ybridize)ＰＣＲプライマー(primer)の使用が挙げられる。本発明に係る組換え構造体(construct)は、ハイブリドーマ細胞系によって発現される免疫グロブリンの完全で自然のままの抗ヒトＣＤ６免疫グロブリン重鎖および／または完全で自然のままの抗ヒトＣＤ６免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡセグメントで構成されてよい。別法として、自然のままの抗ヒトＣＤ６抗体の１つ以上のフラグメントのみをコードするＤＮＡセグメントが産生され、該１つ以上のフラグメントは、自然のままの免疫グロブリンと比べて実質的に同じようなまたは結合を高めたおよび／または同様なエフェクター(effector)活性を所有する。他の組換え構造体は、他の免疫グロブリン遺伝子のセグメントに融合する、自然のままの抗ヒトＣＤ６抗体のフラグメントをコードするハイブリドーマ細胞系免疫グロブリン遺伝子のセグメント、特にヒト一定領域配列のセグメント(重鎖および／または軽鎖)を含有する。ヒト一定領域配列は、これらに限定されないが、上記Kabatらの文献に列挙されるものを含む、種々の対照源から選択することができる。自然のままの抗ヒトＣＤ６免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡセグメントに加えて、対応する親抗ＣＤ６免疫グロブリンと比べて実質的に同じようなまたは結合を高めた特異性および同様なブロック活性を有する変性免疫グロブリンまたは抗体フラグメントを、当業者に公知の種々の組換えＤＮＡ技法、たとえば部位一方向性(site−directed)の変異誘発を用いて、容易に設計および製造することができる。かかる抗体フラグメントを含む変性免疫グロブリンは、好ましくは、対応する自然のままの抗ヒトＣＤ６免疫グロブリンまたは抗体フラグメントと実質的に同じ抗原結合特異性および／またはエフェクター機能を保持するだろうし、かつ対応する自然のままの免疫グロブリンまたは抗体フラグメントと比較して、高い結合親和力を示しうる。さらに、変性免疫グロブリンおよび抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列は、厳しい条件下でこれらの配列に対してハイブリダイゼーションを可能ならしめるように、元のハイブリドーマ・ゲノムまたはｃＤＮＡ配列と実質的に同一であることが好ましい。本発明の自然のままおよび変性した免疫グロブリンおよび抗体フラグメントの発現に好適な組換えポリヌクレオチド構造体としては、典型的に発現対照配列が包含され、たとえば所望のコード配列の１つ以上に操作可能に連結した、自然会合のまたは異種のプロモータ(promoter)領域が挙げられる。好ましくは、発現対照配列は、真核生物の宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションしうるベクターにおける真核生物のプロモータ系である。いったんベクターを適当な宿主細胞に入れると、該宿主細胞を、コード配列の発現のため、およびその後の、自然のままあるいは変性した抗ヒトＣＤ６免疫グロブリンまたは抗体フラグメントの収集および精製のために、適当な条件下に維持する。本発明での使用に好適な発現ベクターは一般に、宿主細胞において、エピソームとしてあるいは宿主染色体ＤＮＡの不可欠部分としてのいずれかで複製することができる。普通、発現ベクターは選択マーカ(marker)、たとえばアンピシリン耐性またはヒグロマイシン耐性を含有して、所定のＤＮＡ配列で形質転換した細胞の検出を可能にする。一般に、自然のままあるいは変性した抗ヒトＣＤ６免疫グロブリンまたは抗体フラグメントをコードするＤＮＡ配列をクローニングするのに、原核生物を使用することができる。E.coliは原核生物宿主の代表の１つであり、特に本発明のＤＮＡ配列をクローニングするのに有用である。他の宿主、たとえば酵母もまた、クローニングや発現の目的に有用である。Saccharomycesは、発現対照配列を有する適当なベクター、複製の起点、所望の末端配列を持つ、好ましい酵母宿主である。典型的なプロモータとしては、３−ホスホグリセレートキナーゼおよび他の解糖酵素が挙げられる。その他の中で、誘発性酵母プロモータとしては、アルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、およびマルトースおよびガラクトース利用の原因をなす酵素からのプロモータが挙げられる。哺乳類の細胞は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド・セグメントを発現する宿主細胞として、特に好ましい［たとえば、Winn ackerの「From Genes to Clones」（ＶＣＨパブリッシャーズ、ＮＹ、１９８７年）参照］。完全状態の異種タンパク質を分泌しうる幾つかの適当な宿主細胞系が開発されており、たとえばＣＨＯ細胞系、各種ＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞系、Ｌ細胞系および骨髄腫細胞系が挙げられる。かかる細胞はヒト以外が好ましい。これらの細胞の発現ベクターは、発現対照配列、たとえば複製の起点、プロモータ、エンハンサー［たとえばQueenらの「Immunol.Rev.」（８９：４９、１９８６年）参照］、および必要なプロセス情報部位、たとえばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター (terminator)配列を包含しうる。好ましい発現対照配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウィルス、ＳＶ４０、アデノウィルス、ウシの乳頭腫ウィルス属等由来のプロモータである［たとえば、Ｃｏらの「J.Immunol.」（１４８：１１４９、１９９２年）参照］。興味のあるＤＮＡセグメントをコードする免疫グロブリンを含有するベクターを、宿主細胞の種類に応じ、周知の方法によって宿主細胞に移すことができる。たとえば、原核生物細胞の場合、一般に塩化カルシウムのトランスフェクションを利用し、一方、他の細胞宿主の場合では、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション(electroporation)、リポフェクション(lipofection)、ビオリスチックス(biolistics)またはウィルスに基づくトランスフェクションを使用しうる。哺乳類細胞を形質転換するのに用いる他の方法としては、ポリブレン(polybre ne)、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、およびミクロ注入(microinjection)の使用が含まれる［たとえば上記Sambrookらの文献参照］。いったん発現すると、本発明の抗ヒトＣＤ６免疫グロブリンおよび抗体フラグメントを、当該分野の標準方法に従って精製することができ、これらの方法として、ＨＰＬＣ精製、画分カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等が含まれる［たとえば、Scopesの「Protein Purification」（スプリンガー-ベルラグ、ＮＹ、１９８２年）参照］。本明細書に記載の自然のままの抗ヒトＣＤ６免疫グロブリンおよび抗体フラグメントの多くは、結合特異性またはＡＬＣＡＭブロック機能のロスを伴なわずに（たとえば、ＣＤ６結合親和力の約１０⁷Ｍ^-1以下への減少もなく）、変異および一定の両領域において、重大でないアミノ酸置換、付加、削除および他の変性を受けることができる。通常、かかる変性を組み入れる免疫グロブリンおよび抗体フラグメントは、それらが誘導される自然のままの免疫グロブリンまたは抗体フラグメントに対し、実質的なアミノ酸配列の同一性を示す。好ましくは、本発明の自然のままの抗体から誘導される抗体の成熟した軽鎖（たとえば、グループ１（５Ｄ４）；グループ２（１０Ａ５）；グループ３（１６Ａ３）；グループ４（７Ｈ６）；グループ５（１５Ｂ１２）；グループ６（７Ｃ７、１３Ｃ３）；グループ７（５Ｅ８、８Ａ７）；またはグループ８（１０Ｄ１、１２Ａ５））は、対応する自然のままの抗体の成熟した軽鎖のアミノ酸配列に対し、実質的なアミノ酸配列の同一性を示す。同様に、本発明の変性した抗ＣＤ６免疫グロブリンの成熟した重鎖も、典型的に、対応する自然のままの抗体の成熟重鎖の配列に対し、実質的な配列の同一性を示す。ポリペプチドに適用される、語句“実質的な配列の同一性”とは、２つのポリペプチド配列が、最適に配列しているとき、たとえばデフォールト・ギャップ(default gap)重量を用いるＢＬＡＺＥ（情報遺伝学）ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムによって、少なくとも７０〜８５％配列の同一性、好ましくは少なくとも９０％配列の同一性、より好ましくは少なくとも９５％配列の同一性もしくはそれ以上（たとえば９９％配列の同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的な(conse rvative)なアミノ酸置換によって異なる。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指称する。たとえば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリンおよびトレオニン；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグルタミン；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リシン、アルギニンおよびヒスチジン；および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的なアミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。時には、本発明の変性した抗ＣＤ６免疫グロブリンとして、それが誘導される自然のままの抗ＣＤ６免疫グロブリンと比較して高い親和力を有するものを選択することができる。より一般的には、変性した抗ＣＤ６免疫グロブリンの親和力は、対応する自然のままの免疫グロブリンと比べ、２０〜５０倍大きいもしくは小さい範囲内、または実質的に同じ（すなわち、２〜５倍の大もしくは小の範囲内）であって、かかる親和力の差はたとえば、関連ＣＤ６ドメイン（たとえばＣＤ６Ｄ２、ＣＤ６Ｄ３および／またはＣＤ６Ｓを含む、精製ＣＤ６または精製ＣＤ６−Ｒｇ融合タンパク）を含有する標的種に対する、変性および自然のままの免疫グロブリンの比較結合によって判定される。ファージ−ディスプレー技法は、当該分野で周知の幾つかの強力な技法の１つを与え、これらの強力な技法は上記免疫グロブリンの選択に有用である［たとえばDowerらのＷＯ９１／１７２７１；McCaffertyらのＷＯ９２／０１０４７；およびHuseのＷＯ９２／０６２０４参照］。また本発明の変性抗ＣＤ６免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドは、自然のままの抗ＣＤ６抗体または抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチド“対照配列”との所定の配列関係に基づいて選択される。本明細書で用いる、ポリヌクレオチド“対照配列”は、配列比較の基準として用いる規定配列であり；対照配列は、たとえば自然のままの抗ＣＤ６ｍＡｂまたは抗体フラグメントをコードする全長のｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントとして、より大きな配列の部分集合であってもよい。一般に、対照配列は少なくとも２０ヌクレオチドの長さ、頻繁には少なくとも２５ヌクレオチドの長さであり、そして少なくとも５０ヌクレオチドの長さも少なくない。２つのポリヌクレオチドはそれぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部）を包含し、および（２）さらに２つのポリヌクレオチド間で異なる配列をも包含してもよいので、２つ（もしくはそれ以上）のポリヌクレオチド問の配列比較は、一般に、“比較窓（comparison window)”から２つのポリヌクレオチドの配列を比較して、配列の類似点の局部領域を同定および比較することにより、行なわれる。本明細書で用いる“比較窓”とは、少なくとも２０の隣接するヌクレオチド位置の概念的セグメントを指称し、ここで、ポリヌクレオチド配列を少なくとも２０の隣接ヌクレオチドの対照配列と比較することができ、また比較窓のポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適整列のため、対照配列（付加または削除を包含せず）と比較して、２０％もしくはそれ以下の付加または削除（すなわち、ギャップ）を包含してもよい。比較窓を整合する配列の最適整列は、Smith & Watermanの「Adv．Appl．Math．」（２：４８２、１９８１年）の局所相同アルゴリズムにより、Needleman & Wunschの「J．Mol． Biol．」（４８：４４３、１９７０年）の相同整合アルゴリズムにより、Pearson & Lipmanの「Proc．Natl．Acad．Sci．（ＵＳＡ）」（８５：２４４４、１９８８年）の類似点法の探索により、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理手段（ウイスコンシン・ジェネティックス・ソフトウェア・パッケージ・レリース７．０、ジェネティックス・コンピュータ・グループ、ＷＩ州マジソン、サイエンス・ドライブ５７５のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、または点検によって行うことができ、そして種々の方法で生じる最良の整列（すなわち、比較窓から最高割合の配列類似点をもたらす）を選択する。語句“配列の同一性”とは、２つのポリヌクレオチド配列が比較窓から同一である（すなわち、ヌクレオチド／ヌクレオチドを基準に）ことを意味する。語句“配列同一性の割合”は、以下の手順で算出される。すなわち、２つの最適に整列した配列を比較窓から比較し、両配列において同一の核酸塩基（たとえば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）が存在する位置の数を測定して調和した位置の数を得、該調和位置の数を比較窓の位置の総数（すなわち、窓寸法）で割り、次いでその商に１００を掛けることにより、配列同一性の割合が得られる。本発明の目的のため、変性抗ＣＤ６免疫グロブリンをコードする変異体ポリヌクレオチドは、自然のままの抗ＣＤ６抗体または抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチド対照配列に対し、実質的な配列同一性を提示する。本明細書で使用されかつポリヌクレオチドに適用される、“実質的同一性”とは、変性抗ＣＤ６免疫グロブリンをコードする変異体ポリヌクレオチドが、少なくとも２０ヌクレオチド位置の比較窓から、頻繁には少なくとも２０−５０ヌクレオチドの比較窓から、対照配列（たとえばグループ１（５Ｄ４）；グループ２（１０Ａ５）；グループ３（１６Ａ３）；グループ４（７Ｈ６）；グループ５（１５Ｂ１２）；グループ６（７Ｃ７、１３Ｃ３）；グループ７（５Ｅ８、８Ａ７）；またはグループ８（１０Ｄ１、１２Ａ５）をコードするゲノムまたはｃＤＮＡポリヌクレオチド）と比較して、少なくとも８５％の配列同一性、より通常は少なくとも９９％の配列同一性を提示することを意味し、ここで、配列同一性の割合は、比較窓から対照配列の２０％以下の総計になる削除または付加を含有しうる変異体ポリヌクレオチド配列に対し、対照配列を比較することにより、算出される。Ａ）人間向きにした抗体診断および治療目的のため、一般に、患者（たとえば人間患者）と同系の、あるいは同系の一定領域を含有する抗ＣＤ６抗体または抗体フラグメントを使用することが好ましい。この理由から、ヒトの処置には、遺伝学的に設計した抗体が一般に使用される。組換えヒト抗体または人間向きにした非ヒト（すなわち、キメラ）抗体の産生方法は、たとえばCabillyらのＵ.Ｓ.特許Ｎｏ.４８１６５６７；RobinsonらのＷＯ８７／０２６７１；およびNeumaierのＷＯ９０／００６１６に開示されている。要するに、ヒトの一定領域遺伝子は、適当なヒトまたは非ヒトの変異領域遺伝子と接合する。たとえば、ネズミの親モノクローナル抗体の抗原結合部位（ＣＤＲｓ、または相補性決定領域）を示すアミノ酸配列が、ヒト変異領域のフレームワーク（framework）配列に対しＤＮＡレベルでグラフトしている。このプロセスは、“人間向き化”として公知である。この技法の方法は当該分野で公知であり、かつたとえばJonesらの「Nature」（３２６：５２２−５２５、１９８６年）；Riechmannらの「Nature」（３２２：３２３−３２７、１９８８年）；およびQueenらの「Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ」（８６：１００２９−１００３３、１９８９年）に開示されている。このようにキメラ化した、ポリヌクレオチドをコードする免疫グロブリンは、通常の操作に従って人間向き免疫グロブリンを発現するように培養した宿主細胞にトランスフェクションする。別法として、モノクローナル抗体産生細胞を、クローン化ヒト一定領域遺伝子、および相同性組換えで生じるキメラ抗体遺伝子と共にトランスフェクションしてもよい。このように、構造の重要部分がヒトであるモノクローナル抗体を組立てることは可能であり、これにより、ヒト患者への多重投与により好適である抗体を付与する。別法として、たとえばリンカー（li nker）・ポリペプチドを介して、変異重鎖配列に変異軽鎖配列が接合して一般的になる組換えポリペプチドの発現によって、単鎖抗体を発生させてもよい。単鎖抗体を産生する方法は、当該分野で公知であり、かつたとえば、Davisらの「Bio Technology」（９：１６５−１６９、１９９１年）に開示されている。本発明の人間向き抗体を産生する好ましい方法は、ヒト変異ドメイン・フレームワークへのマウスＣＤＲｓの置換を必要とする。この技法は、ヒト変異ドメイン・フレームワークが、ＣＤＲｓが由来するマウスの変異フレームワークに対して、同一もしくは類似の立体配座をとる場合に、得られる免疫グロブリンの正しい空間配向の保持をもたらすのに最もありそうである。これは以下の手順によって達成される。すなわち、ＣＤＲｓが誘導されるネズミのフレームワーク・ドメインとの高度な配列同一性を、そのフレームワーク配列が示すヒト抗体から、ヒト変異ドメインを得ることによる。重鎖および軽鎖の変異フレームワーク領域は、同じまたは異なるヒト抗体配列から誘導することができる。ヒト抗体配列は、天然産出ヒト抗体の配列、あるは幾つかのヒト抗体の合意（consensus）配列であってもよい［たとえばKettleboroughらの「Protein Engineering」（４：７７３、１９９１年）；およびKolbingerらの「Protein Engineering」（６：９７１、１９９３年）参照］。好適なヒト抗体配列の同定は、公知のヒト抗体の対応する配列と、たとえばマウスの変異領域のアミノ酸配列とのコンピュータ比較によって容易に行なうことができる。かかる比較は、当該分野で周知であり、かつたとえば、不自然な立体配座拘束および結合親和力の付随するロスをもたらしうる、ヒト変異フレームワーク領域を持つ非ヒトＣＤＲ領域の不自然な近位を避けるために用いられる。免疫グロブリン分子の三次元イメージをもたらすコンピュータ・ハードウェアおよびソフトウェアが広く利用できる。一般に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖またはそのドメインの解明構造体から出発してつくられる。モデルとすべき鎖を、解明した三次元構造の鎖またはドメインとの、アミノ酸配列を比較し、そして最大の配列類似性を示す鎖またはドメインを、分子モデルの構成の出発ポイントとして選択する。モデルにされる免疫グロブリン鎖またはドメインの実際のアミノ酸と、出発構造体のそれの相違を考慮に入れて、解明出発構造体を変性する。次いで変性構造体を、複合免疫グロブリンに組立てる。最後に、エネルギーの最小限度により、および全ての原子が互いに適切な距離内にあることおよび結合長さと角度が化学的に許容しうる限度内にあることを確認することによって、モデルを精製する。さらに以下で述べるアミノ酸置換を導入するとき、構造体を示す追加のモデルを構成することができる。上述の如く、本発明の人間向きの抗体は、ヒト免疫グロブリンからの変異フレームワーク領域とマウス免疫グロブリンからの相補性決定領域を包含する。選択した抗ＣＤ６免疫グロブリン、および適当なヒト受容体免疫グロブリンの相補性決定領域を同定すれば、次工程は、もしいくらかあれば、これらの成分からのいずれの残基をも置換して、得られる人間向き抗体の特性を最適化すべきかを判定することである。一般に、ネズミによるヒトアミノ酸残基の置換は最小限度にすべきであるが、それは、ネズミ残基の導入がヒトのＨＡＭＡ応答を引き出す抗体の危険を増大するからである。置換用のアミノ酸は、ＣＤＲ立体配座および／または抗原への結合に関するそれらの可能な影響に基づき選択される。かかる可能な影響の調査は、モデリング（modelling）、特定位置のアミノ酸の特性の検査、または特定アミノ酸の置換または変異誘発の効果の観察所見による。抗ヒトＣＤ６免疫グロブリン変異フレームワーク領域と対応ヒト変異フレームワーク領域間のアミノ酸が異なる場合、アミノ酸が（１）抗原に直接、非共有結合し、（２）ＣＤＲ領域に隣接し、上記Chothiaらが提案した別定義下のＣＤＲ領域の一部であり、あるいは逆に、ＣＤＲ領域と相互作用し（たとえばＣＤＲ領域の約３Å内にあり）、および／または（３）Ｖ_L−Ｖ_H界面に加わることが道理にかなって予期されるとき、ヒトフレームワーク・アミノ酸を一般に、対応マウスアミノ酸で置換すべきである。他の置換用候補（candidates）は、該位置のヒト免疫グロブリンに対し異型の受容体ヒトフレームワーク・アミノ酸である。これらのアミノ酸は、より代表的なヒト免疫グロブリンの対応位置からアミノ酸で置換することができる。別法として、マウス免疫グロブリンの対応位置からのアミノ酸を、ヒトフレームワーク領域に導入することができ、このとき、かかるアミノ酸は対応位置のヒト免疫グロブリンを代表する。一般に、上記判定基準を満たすアミノ酸の全てもしくはほとんどの置換が望ましい。しかしながら、ときどき、個々のアミノ酸が上記判定基準に適合するかどうかについて、ある程度のあいまいさがあり、この場合、別の変異体免疫グロブリンを産生し、所望の結合特異性を試験（その一方は該個々の置換を有し、他方は有さない）されてよい。人間向き抗体のＣＤＲ領域は通常、対応する自然のままのネズミ抗ヒトＣＤ６抗体の対応ＣＤＲ領域と実質的に同じ、より普通には同一である。しかしながら、時として、ＣＤＲ領域において１つ以上の残基を置換することが望まれる。たとえば、実例の結合基（たとえばｍＡｂ５Ｄ４で例示されるグループ１；ｍＡｂ１０Ｄ５で例示されるグループ２；ｍＡｂ１６Ａ３で例示されるグループ３；ｍＡｂ７Ｈ６で例示されるグループ４；ｍＡｂ１５Ｂ１２で例示されるグループ５；ｍＡｂｓ７Ｃ７および１３Ｃ３で例示されるグループ６：ｍＡｂｓ５Ｅ８および８Ａ７で例示されるグループ７；およびｍＡｂｓ１０Ｄ１および１２Ａ５で例示されるグループ８）の中の２つのｍＡｂｓのＣＤＲ領域内の対応位置で異なる残基は、特に保存的置換が必要なとき、結合親和力のロスがほとんどもしくは全くない他のものに代えて１つを置換されてよい。別法として、非常に高い結合親和力を示すおよび／またはＡＬＣＡＭ結合を非常に有効に抑制するｍＡｂｓからのＣＤＲ残基を、置換した抗体により高い親和力結合を付与する潜在的結果を伴なって、他の抗ヒトＣＤ６抗体のＣＤＲ領域内で置換されてもよい。通常は望ましくないが、時折、得られる人間向き免疫グロブリンの結合親和力にかなりの影響を及ぼすことなく、ＣＤＲ残基の１つ以上の保存的アミノ酸置換を行なうことは可能である。上述の特異的なアミノ酸置換のため以外では、人間向き免疫グロブリンのフレームワーク領域は通常、それらが誘導されるヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同じ、より普通には同一である。勿論、フレームワーク領域のアミノ酸の多くは、抗体の特異性または親和力に対しほとんどもしくは全く直接的には寄与しない。このように、フレームワーク残基の個々の保存的置換の多くを、得られる人間向き免疫グロブリンの特異性または親和力のかなりの変化を伴なわずに、容認することができる。しかしながら、一般に、このような置換は望ましくない。人間向き免疫グロブリンのＣＤＲおよびフレームワーク成分を概念的に選択すれば、かかる免疫グロブリンを産生する種々の方法が利用できる。コードの退化のため、種々の核酸配列が各免疫グロブリン・アミノ酸配列をコードするだろう。所望の核酸配列は、新たな固相ＤＮＡ合成により、または所望のポリヌクレオチドの初期調製変異体のＰＣＲ変異誘発により産生することができる。オリゴヌクレオチド−仲介変異誘発は、本発明の免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドの置換、削除（欠失）および挿入変異体を調製する好ましい方法である［たとえば、Adelmanらの「ＤＮＡ」（２：１８３、１９８３年）参照］。要するに、ポリヌクレオチドをコードする標的免疫グロブリンは、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって、単一ストランドＤＮＡテンプレートに変えられる。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチド・プライマーを取り入れ、そしてポリヌクレオチドをコードする標的免疫グロブリンにおいて選択変性（selected alteration）をコードする、テンプレートの完全な第二相補性ストランドを合成する。上述の如く産生した人間向き抗体の変異セグメントは典型例として、免疫グロブリン一定領域（Ｆｃ）、たとえばヒト免疫グロブリンの少なくとも一部に連結する。ヒト一定領域ＤＮＡ配列は、種々のヒト細胞から、しかし好ましくは、不滅のＢ細胞から周知の操作に従って単離することができる［たとえば、上記Kaba tらの文献；およびＷＯ８７／０２６７１参照］。通常、抗体は軽鎖および重鎖両方の一定領域を含有する。重鎖一定領域は通常、ＣＨ１、ヒンジ（hinge）、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４領域を包含する。Ｂ）二官能性抗体および抗体パネル（panels）またモノクローナル抗体を用い、周知の方法に従って、各免疫グロブリン分子に２つの独立した抗原結合部分が存在する二官能性抗体を発生させることができる。加えて、また単鎖抗体からも二特異的抗体を構成することができる。この技法も、たとえばＡ．Georgeの「The Second Annual ＩＢＣ International Conference on Antibody Engineering」（１２月、１６−１８、１９９１年、サンディエゴ、ＣＡ）に記載の如く、当該分野で公知である。また本発明で使用する抗ヒトＣＤ６抗体および抗体フラグメントは、望ましいようにコンバインして、ＣＤ６に結合するＡＬＣＡＭを抑制しうる抗体または抗体フラグメントのパネルを形成することもできる。本明細書で用いる語句“パネル”とは、異なるドメインまたはエピトープ特異性を有する２つ以上の抗体または抗体フラグメントの組合せを意味する（たとえば、結合してＣＤ６ドメインを分離し、あるいは単一ＣＤ６ドメイン内でエピトープを分離する）。 II）抗ヒトＣＤ６免疫グロブリンおよび抗体フラグメントの診断および治療用途Ａ）診断本発明の抗ヒトＣＤ６抗体、抗体フラグメントおよび他の結合作用物質は、治療または診断上興味のある化合物および標識成分の輸送用の、標的またはイメージ作用物質として使用しうる。他の多くの遺伝子のように、免疫グロブリン遺伝子は、分離した官能性領域を含有し、それぞれは１つ以上の明瞭な生物学的活性を有する。従って、本発明の免疫グロブリン遺伝子は、周知の方法に従って、他の遺伝子からの官能性領域に融合して、新しい特性または特性組合せを有する融合タンパク（たとえばイムノトキシン）を産生することができる。かかる化合物としては、これらに限定されるものではないが、トキシン類、細胞増殖抑制性化合物、またはその潜在的機能が内因性プロ酵素を活性化し、もしくは外因性源から加わるプロ酵素を活性化し、もしくはプロドラッグの酵素開裂部位を活性化しうるプロ酵素が挙げられる。さらに、抗ヒトＣＤ６レセプタ抗体および抗体フラグメントは、たとえば該抗体を放射性ヌクレオチド、染料、蛍光化合物等で標識付けることにより、イメージ作用物質として使用することができる。この用途の具体例としては、炎症部位のイメージングが挙げられ、この場合、ＣＤ６発現を検出しおよび／またはＣＤ６が仲介する炎症または自己免疫応答の性質や程度の診断もしくは治療上のインジケーター（指示薬）として定量化しうる。本明細書に開示の本発明の抗体、その結合フラグメントおよび他の結合作用物質は特に、診断目的のためＣＤ６およびＣＤ６＋細胞の存在および／または活性を検出するのに有用である。患者からの診断サンプル（たとえば血液サンプル、または炎症もしくは自己免疫活性の疑いのある部位から採取した組織生検材料）におけるＣＤ６＋細胞の存在は、異常な炎症もしくは自己免疫応答を診断し、かつ以下に述べる治療法の開始の必要のシグナルを送ることができる。診断は、患者から診断サンプルを取り出し、該サンプルのＣＤ６＋発現または活性を定性的もしくは定量的に査定することによって、達成することができる。たとえば、炎症もしくは自己免疫疾患の危険のある患者からの血液サンプルのＣＤ６＋細胞の数を、かかる危険のない正常な患者の対照サンプルのＣＤ６＋細胞レベルと（または実際の対照サンプルを使用せず、ＣＤ６＋細胞の確立した正常レベルと）比較することができる。同様に、ＣＤ６＋細胞によるＣＤ６発現（発現のパターンおよびレベルの両方を含む）は、たとえば本発明の人間向き抗ＣＤ６またはその結合フラグメントを用い、たとえば固定細胞の免疫組織化学染色法または細胞抽出物のウェスタン（Western）吸取法により、診断サンプルにおいて評価することができる。これらの方法を行うに際し、抗体または他の結合作用物質を直接的に標識付けるか、あるいはより典型的として抗体の場合では、たとえば所望の抗原−モノクローナル抗体複合体に向けられる酵素−共役二次抗体により、二次的に標識付けされてよい。また診断は、本発明の抗ヒトＣＤ６抗体、抗体フラグメントおよび他の結合作用物質のインビボ投与を行った後、たとえばインビボ・イメージングの公知方法に従ってこれら結合作用物質の検出を行うことによっても達成することができる。投与される結合作用物質の濃度は、標的ＣＤ６ドメインを発現する細胞への該作用物質の結合が、バックグランド・シグナルと比較して検出できる程度に十分であるべきである。診断の試液は、たとえばカメラ・イメージング用の放射性同位元素、または磁気共鳴もしくは電子スピン共鳴イメージング用常磁性同位元素で標識付けることができる。細胞サンプルにおけるかかる細胞による、あるいは各人からイメージされ、臨床上確立された正常レベルの範囲から外れる、ＣＤ６＋またはＣＤ６発現のレベルの変化（典型的には増加）は、サンプルを得た各人の望ましくない炎症または自己免疫応答反応の存在を示しおよび／またはかかる反応を現わす（またはかかる反応が進行する）各人の疾病素質を示すことができる。別法として、本発明の結合作用物質を含む診断の試液は、一定の血統および発育起点の細胞を同定し、分類する分化マーカとして使用することができる。このような細胞−分類の特異的検出は、たとえば望ましくない炎症または自己免疫応答の組織病理学診断に使用することができる。Ｂ）治療用組成物および処置方法また本発明は、患者の炎症および自己免疫反応を調整するため、ＣＤ６に結合するＡＬＣＡＭを調整しおよびその他ＣＤ６発現および活性に影響を及ぼす、本発明の免疫グロブリンおよび他の結合作用物質の能力を有効利用する、治療用組成物および処置方法を提供する。上述の如く、ＣＤ６は初期Ｔ細胞発育、活性化およびシグナル形質導入の重要な調節剤である。ＣＤ６の活性および発現は順次、ＡＬＣＡＭとの結合相互作用によって仲介される。たとえば、ＴＥ細胞へのＴ細胞癒着の促進におけるＣＤ６の活性は、ＣＤ６に結合するＡＬＣＡＭによって仲介され、およびＣＤ６トランスフェクションＣＯＳ細胞の抗ＡＬＣＡＭｍＡｂによる前処理は、このＣＤ６仲介癒着を抑制する［たとえばBowenらの「J．Ex p．Med．」（１８１：２２１３−２２２０、１９９５年）参照］。従って、ＣＤ６に結合するＡＬＣＡＭを新規メカニズムによって抑制する、本発明の抗ヒトＣＤ６Ｄ３および抗ヒトＣＤ６Ｄ３−Ｓ抗体、抗体フラグメントおよび他の結合作用物質は、患者のＴ細胞仲介炎症および自己免疫応答を防止または実質的に減少させるため、インビボでのＴＥ細胞とのＣＤ６仲介Ｔ細胞癒着性相互作用を抑制するのに使用されるだろう。この文脈（context）での好ましい結合作用物質は、インビトロ・アッセイの前スクリーニングにより、たとえば上記Bowenらの文献に記載のＣＤ６＋ＣＯＳ細胞トランスフェクタント／ＴＥ細胞癒着アッセイを適応させることによって選択されるだろう。治療用結合作用物質の別の選択は、候補の治療用結合作用物質の存在および非存在下、Ｔ細胞活性化にかかわる、Se rおよびThr残基のＣＤ６ホスホリル化［Swackらの「Mol．Immunol．」（２６：１０３７−１０４９、１９８９年）］および／またはTyr残基のＣＤ６ホスホリル化［Weeらの「J．Exp．Med．」（１7７：２１９−２２３、１９９３年）］を調整する候補の結合作用物質の活性を分析することによって、型どおりに行なうことができる。本発明の組成物および方法を用いる処置を受ける傾向にある、炎症および自己免疫障害によって生じる疾患および症状としては、多発性硬化症、髄膜炎、脳炎、発作、他の脳外傷、潰瘍性大腸炎やクローン（Crohn）病を含む炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、喘息、急性若年発症型糖尿病、ＡＩＤＳ痴呆、アテローム動脈硬化、腎炎、網膜炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、心筋虚血および急性白血球 − 仲介肺傷害が挙げられる。さらに本発明の抗体および他の結合作用物質の治療用途に関する他の指摘として、器官または移植片の拒絶反応の危険が含まれる。近年にわたり、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓および骨髄などの組織や器官を移植する外科技法の効率における改善がかなりに行われている。主な未解決の問題は多分、移植された同種移植片あるいは器官に対するレシピエント（recipient）の免疫耐性を誘発させるのに満足な作用物質の欠如と思われる。同種異系の細胞または器官を宿主に移植するとき（すなわち、ドナーおよびドニー（donee）は同種からの異なる個人である）、宿主免疫系は移植片における異質の抗原に対する免疫応答（対宿主性移植片病）を開始（mount）して、移植された組織の破壊に導くことが起こりうる。ＣＤ６発現または活性を調整する抗体および他の結合作用物質は、就中、ドニーの同種抗原−誘発免疫応答をブロックするのに使用することができ、これによって、移植された組織または器官の破壊を助長しうるＣＤ６仲介メカニズムを防止または減少させる［たとえばPaulらの「Transplant International」（９：４２０−４２５、１９９６年）；Georczynskiらの「Immunology」（８７：５７３−５８０、１９９６年）；Georcyznskiらの「Transplant Immunol．」（３：５５−６１、１９９５年）；Yangらの「Transplantation」（６０：７１−７６、１９９５年）；Andersonらの「ＡＰＭＩＳ」（１０２：２３−２７、１９９４年）参照］。この文脈において、抗ＣＤ６ｍＡｂｓは、腎臓または骨髄の同種移植片の拒絶反応を経験する患者の免疫抑制剤として作用することが認められる［ Kirkmanらの「Transplantation」（３６：６００、１９８３年）；およびReinhe rzらの「Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ」（７９：６０４７、１９８２年）参照］。ＣＤ６発現または活性を調整する、本発明の抗体および他の結合作用物質の関連用途として、“対宿主性移植片”病（ＧＶＨＤ）に必然的に伴なう免疫応答の調整が含まれる［たとえばSchlegelらの「J．Immunol．」（１５５：３８５６− ３８６５、１９９５年）参照］。ＧＶＨＤは、免疫受容能力のある細胞を同種異系のレシピエントに転移するときに起こる、潜在的に致命的な病気である。この状況において、ドナーの免疫受容能細胞はレシピエントの組織を攻撃するかもしれない。皮膚、腸上皮および肝臓の組織は、頻繁な標的であり、かつＧＶＨＤの経過中に破壊しうる。この病気は、骨髄移植などで免疫組織を移植しているときに、特に厳しい問題を提示するが、同様に心臓および肝臓移植片を含む、他のケースにおいて、厳しさの少ないＧＶＨＤの報告もなされている。本発明の治療用作用物質は、就中、ドナーＴ細胞の活性化をブロックするのに用いられ、これにより、宿主の標的細胞を崩壊する能力を干渉する。本発明の抗体および他の結合作用物質の特に好ましい用途は、多発性硬化症の処置である。多発性硬化症は、米国において約２５００００〜３５００００人に影響を及ぼす、進行性の神経学的自己免疫病である。多発性硬化症は、一定の白血球が、神経線維を被覆する絶縁鞘のミエリンを攻撃し、その破壊を起こす、特異的な自己免疫反応の結果であると考えられる。多発性硬化症の動物モデルにおいて、白血球の内皮への癒着をブロックするモノクローナル抗体は、中枢神経系の炎症、次いで起こる動物の麻痺を防止することが認められる。加えて、本発明に関係しないとはいえ、ＣＤ６に対してｍＡｂｓを用いるインビボ実験によれば、ＣＤ６は多発性硬化症の患者において重要な免疫調整効果を有することが示唆される［たとえば、Haflerらの「Neurology」（３６：７７７、１９８６年）参照］。多発性硬化症や他の処置適応症にとって、本発明の好ましい結合作用物質は、上述の人間向きｍＡｂｓおよび抗体フラグメントである。これらの結合作用物質は、既に動物モデルにおいて有効であることが認められているマウス抗体を上回る幾つかの利点を付与する：１）ヒト免疫系は、人間向き抗体のフレームワークまたは一定領域を異質と認めるべきでなく、従って、かかる注入抗体に対する抗体応答は、完全に異質のマウス抗体あるいは部分異質のキメラ抗体に対してよりも少なくあるべきである。２）人間向き抗体のエフェクター部はヒトであるため、それはヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用しうる。３）注入されたマウス抗体は、正常なヒト抗体のヒト循環の半減期よりもはるかに短い半減期を有することが報告されている（Shawらの「J．Immunol．」（１３８：４５３４−４５３８、１９８７年）］。拒絶された人間向き抗体は、天然産出ヒト抗体に本質的に等しい半減期を有し、より小さいかつより少ない頻繁な用量を可能ならしめる。本発明の結合作用物質は、先に列挙した炎症および自己免疫障害（多発性硬化症、炎症性腸疾患、喘息、アテローム動脈硬化、慢性関節リウマチ、器官または移植片の拒絶反応および対宿主性移植病を含む）の予防および／または治療処置用の医薬組成物に加えることができる。治療適用において、かかる病気の疑いのある、あるいはかかる病気に既にかかっている患者に対し、該医薬組成物を、かかる病気やその合併症の症状を治癒、あるいは少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与する。これを遂行するのに適切な量は、治療上もしくは医薬上有効な用量として定義される。予防適用において、特定の病気にかかりやすい、さもなければその危険のある患者に対し、該医薬組成物を、該病気の危険を削減または開始を遅延させるのに十分な量で投与する。かかる量は、予防上有効な用量として定義される。多発性硬化症が緩解した患者において、ＮＭＲイメージング（映像）により、あるいは場合によっては、患者が観察する前症状指示により、危険を査定することができる。予防または治療処置に用いる、本発明の結合作用物質を取り入れた医薬組成物は、種々の形状で提供される。好ましい形状は、意図される投与型式および治療適用といった型どおりの変化に左右される。該医薬組成物は概して、所望の処方に応じて、医薬的に許容でき、非毒性の担体あるいは希釈剤を包含し、動物またはヒト投与用の医薬組成物を配合するのに一般に用いられる広範囲の輸送ビヒクルが含まれる。適当な担体および希釈剤は、当該結合作用物質の生物学的活性（たとえば結合特異性、親和力または安定性）を重大なまでに損なわないように選択される。かかる希釈剤の具体例は、蒸留水、生理学的食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液およびハンク液である。加えて、該医薬組成物もしくは製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療性、非免疫抗原性の安定化剤等を包含してもよい。医薬組成物は、予防および／または治療処置に際して、非経口投与、局所投与、静脈注射、経口投与、または皮下注射、筋肉内局所投与、たとえばエーロゾルもしくは経皮投与によって投与される。本発明のタンパク様物質は、経口投与後に消化管の通過で残存しうるが、皮下注射、静脈注射、筋肉注射、デポット（depo t）注入による腹腔内投与；あるいは移植形成（inplant preparation）による投与が好ましい。医薬組成物は、投与法に応じて、種々の単位投与剤形で投与することができる。たとえば、経口投与の場合に好適な単位投与剤形としては、粉剤、錠剤、丸剤、カプセル剤およびロゼンジが挙げられる。上記状況の処置のため、本発明組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、および他の投与薬物を含む、数多くの異なるファクターに応じて、変化するだろう。このように、処置投与量は安全性と薬効を最適化するよう滴定する必要がある。これらの組成物は、獣医学用途およびヒトの臨床用途の場合、他の治療剤、すなわち生理学的に許容しうる担体と同様に、哺乳類に対して投与されてよい。一般に、投与量は宿主体重の約０.０００１〜１００mg／kg 、より一般には０.０１〜５mg／kgの範囲である。好ましい処置レジメにおいて、抗体は体重１kg当り１〜５mg抗体の用量で、静脈内注入または皮下注射によって投与される。この用量は、２〜８週間の間隔で繰り返される。この範囲内で、好ましい処置レジメは、体重１kg当り３mg抗体で、４週間間隔で繰り返す。本発明の人間向き抗体および他の結合作用物質は、急性および慢性炎症に対して、有効量の他の治療剤といっしょに使用することができる。かかる他の治療剤は、癒着分子（インテグリン、セレクチン、および免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリー・メンバーを含む）の抗体および他の拮抗剤を包含する。本発明の抗体および他のブロック作用物質と組合せて使用できる他の抗炎症剤としては、シトキンの他の抗体および非抗体拮抗剤、たとえばインターロイキンＩＬ−１〜ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子α＆β、インターフェロンα，βおよびγ、腫瘍増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）および顆粒球・単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられる。同様に、ケモキネの抗体および他の拮抗剤、たとえばＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ランテス（rantes）、エキソタキシン（exotaxin）およびＩＬ−８も、ＮＳＡＩＤＳ、ステロイドおよび炎症の他の小分子インヒビターなどの抗炎症薬と同様、本発明の結合作用物質と組合せて使用しうる。Ｃ）付加的用途また本発明の抗体および他の結合作用物質は、ＣＤ６の親和性精製にも有用である。たとえば、抗体を固形支持体に固定し、該支持体にＣＤ６を含有する分散タンパク質の溶液を通して、溶液中の他のタンパク質からＣＤ６を分離することができる。かかる方法で得られる精製したＣＤ６またはそのフラグメントは数多くの目的に、たとえば他の抗ＣＤ６抗体を産生するワクチンあるいはイムノゲンとして使用することができる。また本発明の抗体および抗体フラグメントは、たとえば人間向き抗体による動物の免疫処置によって、イディオタイプ抗体を産生するのにも有用である。ヒト抗体への結合がＣＤ６またはそのフラグメントによって抑制される抗イディオタイプ抗体が選択される。抗イディオタイプ抗体およびＣＤ６またはＣＤ６フラグメントは共に人間向き免疫グロブリンに結合するので、抗イディオタイプ抗体はエピトープの“内部イメージ”を表わし、従って、ＣＤ６のリガンドを置換しうる。Ｔ細胞活性化の実験および調整の手段としての用途以外に、抗ＣＤ６抗体および抗体フラグメントは、臨床環境において、たとえば細胞を分離する免疫−親和性カラムを用いる移植の前に、ドナー物質（たとえば骨髄）からＣＤ６＋細胞をパージする（purge）親和性精製剤として使用しうる。本発明に関係しない抗ＣＤ６ｍＡｂを用いてＴ細胞から骨髄がパージされた患者は、急性および慢性ＧＶＨ病両方の発生率のかなりの減少を示し、かつ移植後の免疫抑制剤による予防処置の必要がない［Soifferらの「J．Clin．Oncol．」（１０：１１９１、１９９２年）参照］。以下に示す実施例は、例示のものであって、限定されるものではない。実施例Ｉ公知の抗ヒトＣＤ６モノクローナル抗体のドメイン特異性：公知の抗ヒトＣＤ６抗体のＣＤ６ドメイン特異性をＥＬＩＳＡアッセイで判定し、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合する１つ以上のＣＤ６ドメイン（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３およびストーク）を含む切断(truncated)融合タンパク(Ｒｇ融合タンパク)のパネルに対する抗体の結合を検出し、定量する。ここで用いる各Ｒｇ融合タンパクの産生および精製(使用する各種ＣＤ６−Ｒｇ融合タンパクに取り入れたＣＤ６ＳＲＣＲドメインは図１に示される)は、Bowenらの「J.Biol.Chem.」（２７１：１７３９０ −１７３９６、１９９６年）の開示に準じて行った。要するに、ヒトＣＤ６の個々のもしくはグループのドメインをコードする相補性ＤＮＡフラグメントは、たとえばAruffoらの「Cell」(６１：１３０３−１３１３、１９９０年)、およびKuenerらの「J.Immunol.」(１５５：４９１７−４９３５、１９９５年)に記載の、トロンビンーヒトＩｇＧ１カセット（Ｒｇ融合タンパク）あるいはトロンビン−マウスＩｇＧ２ａカセットで融合を仲介する、適当な制限部位を有するオリゴヌクレオチドを用い、ポリメラーゼ鎖反応方法によって産生する。以下に示すＣＤ６融合タンパク（これらも、ＣＤ５アミノーターミナル分泌配列を使用）は、出版配列(published sequences)［Aruffoらの「J.Exp.Med.」(１７４：９４９−９５２、１９９１年)］に従って、以下のアミノ酸：ＣＤ６Ｒｇ／ｍＩｇＧ２ａ，Ａｓｐ²⁵−Ａｒｇ³⁹⁷；ＣＤ６Ｄ１−２Ｒｇ，Ａｓｐ²⁵−Ａｌａ²⁷¹；ＣＤ６Ｄ２−ＳＲｇ，Ｇｌｕ¹⁵⁸−Ａｒｇ³⁹⁷；ＣＤ６Ｄ２Ｒｇ、Ｇｌｕ¹⁶⁸−Ａｌａ²⁷¹，ＣＤ６Ｄ３−ＳＲｇ，Ｓｅｒ²⁸⁰−Ａｒｇ³⁹⁷を含有し、ＣＤ６Ｄ１−３Ｒｇを前記Weeらの「Cell Immunol.」（１５８：３５３−３６４、１９９４年）の記載に準じて構成し、またＭｅｔ¹−Ｓｅｒ³⁶¹を含有する。ＣＤ５Ｒｇの産生は、Aruffoらの「Cell」（６１：１３０３−１３１３、１９９０年）の記載に準じる。全てのＣＤ６−Ｒｇタンパクは、ＣＯＳ細胞の一時的トランスフェクションにより産生し、タンパク質Ａ−セルファロース(Serpharose)クロマトグラフィーにより精製する。マウスＩｇＧタンパク質標準液に対して、ブラッドフォード(Bra dford)の色素結合法（ＣＡ州ハーキュルズのBio-Rad）を用いて、タンパク質濃度を測定する。融合タンパクを分析するため、一時的トランスフェクションＣＯＳ細胞を³⁵Ｓトランスラベル(translabel)（ＩＬ州エーリントン・ハイツの Amersham Corp.）でパルスし、精製したタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析する。化学量論の結合測定用のＣＤ６−Ｒｇ融合タンパクからＩｇ末尾(tail)を除去するため、トロンビン（ＭＯ州セントルイスのSigma）を用い、タンパク質／トロンビン比５０：１（ｗ／ｗ）にて室温でタンパク質を１時間消化する。次いでタンパク質Ａ−Sepharoseを用い、Ｉｇ末尾を親和性クロマトグラフィーで除去し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析する。抗体のＣＤ６ドメイン特異性を判定するＥＬＩＳＡアッセイを行なうため、イムロン(Immulon)IIＥＩＡ平板(ＶＡ州アレキサンドリアのDynatech Laboratorie s Inc.)を、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の各融合タンパクの２００ｎｇ／ｍｌ溶液の７５μｌ／ウェル(well)で被覆し、４℃で一夜培養する。後の工程は全て、室温で行なう。被覆剤を除去し、平板を、０．０５％のツィーン(Tween)２０含有のＰＢＳ（ＰＢＳ−ツィーン）で２回洗い、ウェルをブロック剤で２時間ブロックする[脱イオン水中１：１０に希釈した、検体希釈液(ＷＡ州レッドモンドのGenetic Systems Corp.)]。ブロック剤を除去し、ウェルをＰＢＳ−ツィーンで２回洗う。抗ＣＤ６抗体を検体希釈液中５μｇ／ｍｌに希釈し、各融合タンパクについて正副の平板とし（５０μｌ／ウェル）、平板を１時間培養する。未結合の抗体を吸引し、平板を３００μｌ／ウェルのＰＢＳ−ツィーンで４回洗った後、検体希釈液に希釈した、ワサビダイコン・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＡＬ州バーミンガムのSouthern Biotech)の７５μｌ／ウェルを全てのウェルに１時問にわたって加える。未結合のＨＲＰ試液を除去し、平板をＰＢＳ−ツィーンで５回洗う。３０％Ｈ₂Ｏ₂溶液０．０１５％含有の０．１Ｍシトレート緩衝液（ｐＨ５．５）中に１：１００希釈した、１００μｌ／ウェルのテトラメチルベンジジン(ＷＡ州レッドモンドのGenetic Systems Corp.)を加えて、結合ＨＲＰ標識付け試液を検出する。平板を１５分間培養し、５０μｌ／ウェルの１Ｎ硫酸を加え、反応を止める。Ｂｉｏ−ＴｅｋインストルメントＥＬ３１２ミクロプレート・リーダーにて、４５０／６３０ｎｍで光学濃度を測定する。これらのＥＬＩＳＡアッセイにおいて、関係しないが同様に構成される、ヒトＩｇＧ１（ＣＤ４０−Ｒｇ）に融合したヒトＣＤ４０の細胞外領域からなる融合タンパクの混入によって、抗ＣＤ６抗体の非特異的結合を照査する(controlled for)。これらアッセイの結果を、下記表１に要約する。例外なく、全ての抗体は、ＣＤ６の第１ドメイン含有の３つの融合タンパクと反応するが、第２、第３およびストークのドメインの種々の組合せ含有の残りの融合タンパクとは反応しない。このパターンの反応性によれば、実験した全ての抗体がＣＤ６の第１ドメインについて特異性を有することが示される。実施例II 公知抗ヒトＣＤ６モノクローナル抗体のＣＤ６／ＡＬＣＡＭ結合相互作用に対するブロック活性のテスト：上記ＣＤ６ドメイン特異性を検定し、かつＣＤ６の第１ドメインに結合することが認められる公知抗体のそれぞれについてさらに、ＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用を抑制する能力の基準として、ＣＤ６を発現する細胞へのＡＬＣＡＭＲｇ融合タンパクの結合を抑制する能力を評価する。正副の丸底９６ウェル平板（ＮＹ州イサカのCorning）に２×１０⁵／ウェルのＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（ＣＤ６＋ヒトＴ細胞白血病系）を加え、平板を４℃にて２５０ｘｇで５分間遠心分離する。培地を取出し、抗ＣＤ６ｍＡｂｓを１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（１０％ＦＣＳ−Isco ve's）含有のＩＭＤＭ中２０μｇ／ｍｌに希釈し、これを両平板のウェルに５０ μｌ／ウェルで加える。ヒトＣＤ６−ｍＩｇ（免疫区分参照）で免疫化したマウスからの血清の１：１００希釈溶液が正対照として使用でき、一方、負対照として正常なマウス血清、抗ヒトＣＤ４（メーン州ウェストブロードのImmunotech）および抗ヒトＣＤ７１(Immunotech)を含める。氷にて３０分の培養後、全てのウェルに２％ＦＣＳ−Iscove'sを１５０μｌ／ウェルで加え、平板を４℃にて２５０ｘｇで５分間遠心分離する。抗体を除去した後、１平板のウェルは藻紅素（ＰＥ）共役ヤギ抗ネズミＩｇＧ（Southern Biotechnology）の１：２００希釈溶液（２％ＦＣＳ−Iscove's中）５０μｌを受容し、一方、第２平板のウェルは可溶性ＡＬＣＡＭ−Ｉｇ融合タンパク［ＡＬＣＡＭＶＶＣＣＲｇ；Bowenらの「J .Biol.Chem.」（１９９６年）］の１μｇ／ｍｌ溶液５０μｌを受容する。各平板を氷にて３０分間培養した後、全てのウェルに冷２％ＦＣＳ−Iscove'sを１５０μｌ／ウェルで加え、再度、平板を４℃にて２５０ｘｇで５分間遠心分離する。第１平板の未結合ＰＥ試液を除去し、細胞をさらに冷２％ＦＣＳ−Iscove'sで２回洗い、２００μｌ／ウェルの冷２％ＦＣＳ−Iscove'sに再度懸濁状態で放置する。第２平板の未結合ＡＬＣＡＭ−Ｉｇ融合タンパクを除去し、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役ロバ抗ヒトＩｇＧ（ＰＡ州ウェスト・グローブのJackson Immuno Research Inc.）の１：１００希釈溶液５０μｌを全てのウェルに加える。氷にてさらに３０分の培養後、ウェルを冷２％ＦＣＳ−Iscove'sで３回洗い、２００μｌ／ウェルの冷２％ＦＣＳ−Iscove 'sに再度懸濁状態で放置する。その後、両平板からの細胞について、ＦＡＣＳ缶（ＣＡ州マウンテン・ビュウのBecton Dickinson）にて流れ血球計算法により、特異的ｍＡｂ結合（ＰＥシグナル−第１平板）および細胞とのＡＬＣＡＭ−Ｉｇ相互作用のｍＡｂ仲介ブロッキング（ＦＩＴＣシグナル−第２平板）を分析する。この分析の結果を、下記表２に示す。ドメイン・マッピング(mapping)実験に弱い、かつ時間によって活性を失ったと思われるｍＡｂＭＢＧ６を除いて、通用しているアッセイを行い、抗ＣＤ６抗体および免疫マウス血清の全ては、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を全く十分に染色した。しかしながら、免疫マウス血清のみが、ＡＬＣＡＭ融合タンパクのこれらの細胞への結合をブロックすることができた。表２中、＊）（一次抗体結合の平均蛍光強度）−（二次抗体のみの平均蛍光強度）＊＊）マイナスの抑制率は、一次抗体なしの場合（培地のみ）に見られるものと比較して、高いＡＬＣＡＭＲｇ結合を表わす。実施例III 抗ヒトＣＤ６ｍＡｂｓの産生と選択：Ａ．免疫法６−８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＮＹ州ジャーマンタウンのTaconic）を、ネズミＩｇＧ２ａ抗体（ｈＣＤ６−ｍＩｇ）のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合するヒトＣＤ６の細胞外の３つのＳＲＣＲドメインとショート膜近位ストーク・ドメインからなる、精製した組換えヒトＣＤ６−Ｒｇ融合タンパクで免疫化する（上記Bowenらの「J.Biol.Chem.」］。タンパク質２５μｇのRibi アジュバント中エマルジョン（トータル１００μｌ）［Ｒ−７３０；ＭＴ州ハミルトンのRibi ImmunoChem Reseach Inc.］を用いて、腹腔内に一次免疫化を行なう。１９日目に同様な免疫化（但し、タンパク質５０μｇ使用）を行なう。３０日目、マウスの１匹に、１００μｌのリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５０μ ｇタンパク質の静脈内の前融合ブースター注射を受容せしめる。このマウスは、第１融合用に使用した（Ｈ６−１）。３７日目、別のマウスに同一のブースター免疫化を受容せしめ、第２融合に用いた（Ｈ６−２）。第２免疫化の１週間後のこれら後者２匹のマウスから得た血清サンプルは、ｈＣＤ６−ｈＩｇ［上記Bowe nらの文献］および関係しないが同様な構成の融合タンパク，ｈＣＤ４０−ｈＩｇ［Hollenbaughらの「ＥＭＢＯＪ.」（１１：４３１３−４３２１、１９９２年）］を用いて行ったＥＬＩＳＡで示されるように、融合タンパクのヒトＣＤ６タンパクに特異的なかなりの滴定濃度のＩｇＧ抗体を有していた。Ｂ融合前融合ブースターの３日後、脾臓および全ての確認可能なリンパ節から細胞を取り、Laneの「J.Immunol.Methods」（８１：２２３−２２８、１９８５年）の方法に従い、Ｐ３×６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞［Kearneyらの「J.Immunol .」（１２３：１５４８−１５５０、１９７９年）］を用いて、白血球と骨髄腫細胞の比３：１で融合させる。Ｈ６−１の場合、得られる融合後細胞懸濁物を１５の９６−ウェル培養平板に、ハイブリドーマ発育培地［Iscove's M odified Dulbecco's Medium、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ−Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０％ハイポリスのBoehringer Mannheim）、およびＨＡＴ（１００μＭヒポキサンチン；０．４μＭアミノプテリン；１６μＭチミジン）を補給］の存在下、約１．０４ ×１０⁵細胞／ウェルの濃度で接種する。融合後の３日目と６日目に、ウェルに対して上澄み液の半分に代えて、新しいハイブリドーマ培地を供給し、９日目に抗ヒトＣＤ６特異的抗体を検定する。Ｈ６−２の場合、融合後の細胞懸濁物を２０の９６−ウェル平板に、ハイブリドーマ発育培地中約１．２４×１０⁵細胞／ウェルの濃度で接種する。融合後の４日目と６日目に、ウェル供給を行い、８日目に特異的抗体を検定する。Ｃ．スクリーニング１．ｈＣＤ６特異的ウェルの同定ａ）Ｈ６−１融合全ウェルからの細胞培養上澄み液について最初に、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒトＣＤ６−Ｉｇ融合タンパクに結合する能力の分析によって、ヒトＣＤ６への特異的反応性を検査する。ヒトＣＤ６−Ｉｇタンパクは、マウスの免疫化に用いたｈＣＤ６−ｍＩｇと本質的に同一であった。但し、ネズミ・ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインと取り替えた［ＣＤ６Ｒｇ；上記Bowenらの文献］。Ｈ６−１のアッセイの場合、イムロン(Immulon)IIＥＩＡ平板に、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中のＣＤ６Ｒｇの５００ｎｇ／ｍｌ溶液の７５μｌ／ウェルを被覆し、４℃で一夜培養する。被覆剤を除去し、ウェルをブロック剤［検体希釈液（ＷＡ州レッドモンドのGenetic Sy stems Corp.）、脱イオン水に１：１０希釈］で１時間ブロックする。ブロック剤を除去し、ウェルを０．０５％ツィーン２０含有のＰＢＳ（ＰＢＳ−ツィーン）で２回洗う。次いで、培養上澄み液を５０μ／ウェルで、アッセイ平板上で複製平板とし、平板を１時間培養する。上澄み液を吸引し、平板を１％ＦＣＳ含有のＰＢＳの１５０μｌ／ウェルで１回洗う。培養上澄み液の除去後、ウェルをＰＢＳ−ツィーンで３回洗い、次いで全ウェルに１時間にわたり、検体希釈液に希釈した７５μｌ／ウェルのワサビダイコン・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＣＡ州カマリロのBiosourse International Inc.）を加える。未結合のＨＲＰ試液を除去し、平板をＰＢＳ−ツィーンで４回洗う。結合ＨＲＰ標識付け試液に、０．０１５％の３０％Ｈ₂Ｏ₂溶液含有の、０．１Ｍシトレート緩衝液（ｐＨ５．５）に１：１００希釈した１００μｌ／ウェルのテトラメチルベンジジン（ＷＡ州レッドモンドのGenetic Systems Corp.）を加えて、映像化する。平板を１５分間培養し、５０μｌ／ウェルの３Ｎ硫酸を加えて、反応を止める。Ｂｉｏ−ＴｅｋインストルメンツＥＬ３１２ミクロプレート・リーダーにて光学濃度を４５０／６３０ｎｍで測定する。次に、ｈＣＤ６−ｈＩｇと反応したウェルからの上澄み液について、ＣＤ６＋細胞に結合し、ＡＬＣＡＭのＣＤ６＋細胞との相互作用をブロックする能力を評価する。最初に、同じアッセイで結合とブロッキングを調べる。後のアッセイで、それらを別個に査定する。最初のアッセイで、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞，我々が先に高レベルのＣＤ６を発現することを示したヒトＴ細胞白血病系を用いた。丸底９６−ウェル平板（ＮＹ州イチカのCorning）に、１×１０⁵／ウェルの細胞を加え、平板を４℃にて２５０ｘｇで５分問遠心分離する。培養培地を除去し、個々のウェルに冷ハイブリドーマ上澄み液を５０μｌ／ウェルで加える。氷上の３０分培養後、全てのウェルに２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（２％ＦＣＳ−Iscove's）含有の冷ＩＭＤＭを１５０μｌ／ウェルで加え、平板を４℃にて２５０ｘｇで５分間遠心分離する。上澄み液の除去後、各ウェルに藻紅素(ＰＥ)共役ヤギ抗ネズミＩｇＧ（Southern Biotechnology）の１：２００希釈液（２％ＦＣＳ−Iscove's中）５０μｌおよび可溶性ＡＬＣＡＭ−Ｉｇ融合タンパク（ＡＬＣＡＭＶＶＣＣＲｇ；上記Bowenらの文献）の１μｇ／ｍｌ溶液５０μｌを受容せしめる。平板を氷上で３０分間培養した後、全てのウェルに冷２％ＦＣＳ−Iscove'sを１５０μｌ／ウェルで加え、再度平板を４℃にて、２５０ｘｇで遠心分離する。未結合のＰＥ試液およびＡＬＣＡＭ−Ｉｇ融合タンパクを除去し、全てのウェルに、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役ロバ抗ヒトＩｇＣ（ＰＡ州ウエスト・グローブのJackson Immuno Research Inc.）の１：１００希釈液５０μｌを加える。さらに氷上で３０分の培養後、ウェルを冷２％ＦＳＣ−Iscove 'sで３回洗い、２００μｌ／ウェルの冷２％ＦＳＣ−Isocove'sに懸濁状態で放置する。次いで、ＦＡＣＳ缶（ＣＡ州マウンテン・ビュウのBecton Dickinson）にて流れ血球計算法で、細胞について特異的ｍＡｂ結合（ＰＥシグナル）および細胞とのＡＬＣＡＭ−Ｉｇ相互作用のｍＡｂ仲介ブロッキング（ＦＩＴＣシグナル）を分析する。この方法によって、ＥＬＩＳＡ正のウェルの多くは、ＣＤ６＋細胞に結合しないことが認められ、抗体が融合タンパクの非自然形状のＣＤ６またはＩｇ末尾を認識することが示される。しかしながら、上澄み液の大半は実際に細胞に結合し、これらの中で約３５％以上が、ＡＬＣＡＭ−Ｉｇ結合の抑制率２４％以上を示した。一例として、図１から、マスター・ウェル上澄み液１０Ｂ１および５Ｅ８は共にＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を明るく染色するが、５Ｅ８のみがこれらの細胞とＡＬＣＡＭ−Ｉｇの相互作用を有効にブロックしうることが証明される。ｂ）Ｈ６−２融合Ｈ６−２の上澄み液の一次検査は、Ｈ６−１の場合に類似するが、但し、第１ドメインに対比するものとして、ＣＤ６の第２または第３ドメインに特異的な抗ＣＤ６抗体を含有するウェルをより容易に同定できるように設計されている。２０の融合平板の内３つを、タンパク質の被覆濃度が２００ｎｇ／ｍｌである以外は、上記に準じて正確に、ＣＤ６Ｒｇにスクリーニングする。残りの平板の内９つについては、ＣＤ６Ｄ２−ＳＲｇ（ＣＤ６の第２および第３細胞外ＳＲＣＲドメインとショート膜近位ストーク・ドメインを含有）にスクリーニングし、一方、他の８つをＣＤ６Ｄ３−ＳＲｇ（ＣＤ６の第３細胞外ＳＲＣＲドメインとストーク・ドメインを含有）にて検定する。切断タンパク質の両方を２００ｎｇ／ｍｌの濃度で平板に被覆する。この変性以外は、上述のアッセイを行なう。次いで、テストした融合タンパクのいずれかと反応する全ての上澄み液について、Ｈ６−１の場合の記載に準じ、ＣＤ６＋細胞に結合し、ＡＬＣＡＭとＣＤ６＋細胞の相互作用をブロックする能力をテストする。結果はＨ６−１の結果にかなり類似し、融合タンパクの正ウェルの約２４％がＡＬＣＡＭＲｇ結合の２５％以上の抑制率を示した。実施例IV 新規抗ヒトＣＤ６モノクローナル抗体のドメイン特異性：ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞へのＡＬＣＡＭＲｇ結合の最も完全な抑制率を示す、上記同定したマスター・ウェル上澄み液を用い、初期ドメイン特異性テストを行なう。次に、これらの抗体−含有上澄み液がＣＤ６のいずれのドメインに対して特異的結合を示すかを判定するため、商業上入手しうるワークショップ(workshop) の抗ＣＤ６ｍＡｂｓに対してドメイン特異性を指定する(assign)のに先に利用した、切断(truncated)ＣＤ６Ｒｇ融合タンパクのパネルで同じＥＬＩＳＡを用いて評価する。１０のマスター・ウェル上澄み液を、それぞれ正味(neat)濃度および正副でテストする。結果を下記表３に示す。ウェルＨ６−１．７Ｈ６、Ｈ６−２．８Ａ７、Ｈ６−２．１０Ｄ１、Ｈ６−２．１３Ｃ３、Ｈ６−２．１６Ａ３およびＨ６−２．１５Ｂ１２からの上澄み液は、ＣＤ６Ｄ１−２ＲｇまたはＣＤ６Ｄ２Ｒｇと反応しなかったが、強くＣＤ６Ｄ３−ＳＲｇ、ＣＤ６Ｄ２ −ＳＲｇおよびＣＤ６Ｒｇを認識した。この反応性プロフィールは、これらの抗体のそれぞれによって認識されるエピトープが、第３膜−近位ＳＲＣＲドメイン、ストーク・ドメインまたはこれら両ドメインの要素からなる部位に位置することを示唆した。これらの上澄み液のそれぞれは、ＣＤ６Ｄ１−３Ｒｇと弱く反応あるいは全く反応しなかった。この所見と他の融合タンパクデータとの組合せは、表向きとして、主にストーク領域の抗体の反応性エピトープの配置への賛成意見を述べるものである。しかしながら、ヒトＣＤ６Ｄ１−３Ｒｇタンパクは前に、ＡＬＣＡＭに対してＣＤ６−Ｒｇよりも約１０００倍も少ない親和力で結合することが認められていたので［Bowenらの「J.Biol.Chem.」（２７１：１７３９０−１７３９６、１９９６年）］、この実験で用いたＣＤ６Ｄ１−３Ｒｇタンパクは、特に第３ドメインにおいて、立体配座的に妥協している(compr omised)ように思われる。このように、これら最初の６抗体に関して、第３ドメインに対するドメイン指定(assignment)を、除外することはできない。残りの４つのマスター・ウェルからの上澄み液は、やや少し複雑な反応性プロフィールを示した。マスター・ウェルＨ６−２．５Ｄ４のプロフィールは、ＣＤ６Ｄ２ＲｇタンパクおよびひょっとしてＣＤ６Ｄ１−２Ｒｇタンパクとの弱い反応性の付加を除いて、上記のそれにかなり類似し、２つの抗ＣＤ６抗体のありそうな存在が示唆され、１つはＤ３／Ｓドメインに対する特異性を持ち、他は第２ドメインに向けられる非常に低い滴定量の抗体である。マスター・ウェルＨ６−２．５Ｅ８、Ｈ６−２．７Ｃ７およびＨ６−２．１２Ａ５のプロフィールは、ＣＤ６Ｄ２Ｒｇを除き、全ての融合タンパクが認識されるという点で、互いに極めて類似する。この複雑なプロフィールは、Ｄ３／Ｓドメインに特異的な１つの抗体およびＣＤ６の第ＩＳＲＣＲドメインに対し特異性を持つ抗体の存在に最も適合した。上記の反応性プロフィールに基づき、１０全てのＣＤ６／ＡＬＣＡＭブロッキング・マスター・ウェル上澄み液は、最小限としてＣＤ６の第３ＳＲＣＲおよびストーク・ドメインを含有する融合タンパクに対して強い反応性を示した。この所見から、ヒトＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用に対してブロッキング活性を有するとして同定された抗体は、ＣＤ６の膜近位Ｄ３−Ｓドメイン内のエピトープに対して特異的に結合することが示される。この所見はさらに、Ｈ６−１およびＨ６ −２からの残りのマスター・ウェル上澄み液の場合の類似のドメイン特異性マッピングによって支持される。例外なく、ＡＬＣＡＭＲｇのＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への結合を抑制する能力を明らかに示す上澄み液はいずれも、ＣＤ６Ｄ３−ＳＲｇ融合タンパクとも反応した。さらに、第１または第２ＳＲＣＲドメインのみ、あるいは該２ドメインの組合せに対する特異性を明らかに示す上澄み液は、ＡＬＣＡＭＲｇとＣＤ６の相互作用を抑制することはできなかった。次いで、上記マスター・ウェルのそれぞれでハイブリドーマを産生する特異的抗体を、ＨＡＴを欠くハイブリドーマ発育培地で希釈（dilution）を制限することによってクローン化する。得られるウェルＨ６−２．５Ｅ８、Ｈ６−２．７Ｃ７およびＨ６−２．１２Ａ５からのクローンを、全長ＣＤ６ＲｇおよびＣＤ６Ｄ３−ＳＲｇタンパクの両方でＥＬＩＳＡにてスクリーニングする。前者融合タンパクで正および後者融合タンパクで負であるクローンは暫定的に、ＣＤ６の第１ＳＲＣＲドメインに対し特異性を有すると考えられ、一方、両タンパク質と反応するものをＤ３−Ｓ特異性と指定した。残りのマスター・ウェルからのクローンを、ＣＤ６Ｄ３−ＳＲｇ融合タンパクのみでＥＬＩＳＡにてスクリーニングする。Ｄ１またはＤ３−Ｓに特異的なクローンを、マスター・ウェルＨ６−２．７Ｃ７およびＨ６−２．１２Ａ５から単離する。他のマスター・ウェルからは、抗Ｄ３−Ｓ特異的クローンのみが得られる。次いで、ＣＤ６Ｄ３−ＳＲｇ融合タンパクと反応性の各マスター・ウェルからの代表的クローンを、ＣＤ６融合タンパクの全パネルにて、ドメイン特異性を指定するため、ＥＬＩＳＡで調べる。この分析の結果を下記表４に示し、ＣＤ６の第２ＳＲＣＲドメインに特異的なｍＡｂｓをクローン化しながら単離した、別の抗Ｄ３／ＳｍＡｂ（Ｈ６−２．１０Ａ５）の場合に得た結果（実施例７参照）も併記する。全てのｍＡｂｓは予想通り、ＣＤ６Ｒｇ、ＣＤ６Ｄ２−ＳＲｇおよびＣＤ６Ｄ３−ＳＲｇタンパクを認識したが、ＣＤ６Ｄ１−２Ｒｇ、ＣＤ６Ｄ２Ｒｇおよび関係しない対照ＣＤ４０Ｒｇタンパクと反応せず、パターンはＣＤ６の第３ＳＲＣＲおよび／またはストーク・ドメインに対するドメイン特異性指定に一致した。これらの抗Ｄ３／ＳｍＡｂｓを産出するマスター・ウェルにて、オリジナルのドメイン特異性テストで見られるものと同様、クローン化ｍＡｂｓとＣＤ６Ｄ１−３Ｒｇタンパクの反応性もまた、他の第３ＳＲＣＲドメイン含有タンパク質と比較して、弱乃至極めて弱であった。ＣＤ６Ｄ１−３へのｍＡｂｓ５Ｄ４、５Ｅ８、７Ｃ７、８Ａ７、１３Ｃ３および１６Ａ３の結合は、これらのｍＡｂｓが、ストーク領域とは全く異なり、第３ＳＲＣＲドメインに特異的であると結論づけるのに十分、相当のものであった。残りのｍＡｂｓの場合、特異性はＣＤ６Ｄ３−Ｓドメインへの指定レベルに対してのみ、集合的に判定し、但し、これらの抗体がＣＤ６Ｄ３、ＣＤ６Ｓ、または該２ドメインがオーバーラップする接点内でエピトープを認識する可能性を残しておく。全ての抗Ｄ３／ＳｍＡｂｓに対するドメイン特異性指定を、表５に要約する。この表には、アイソストリップ（IsoStrip）テストキットを用い各ｍＡｂで行ったアイソタイプ分析の結果が含まれる［ＩＮ州インディアナポリスのBoehringer Mannheim］。５Ｄ４（ＩｇＧ_2a）および１６Ａ３（ＩｇＧ_2b）を除いて、全てはＩｇＧ₁アイソタイプを有した。ＣＤ６＋細胞に結合し、ＡＬＣＡＭＲｇのＣＤ６＋細胞への結合を抑制するクローナル抗Ｄ３／Ｓ上澄み液の能力の評価を、先の市販／workshop抗ＣＤ６ｍＡｂｓの場合の記載に準じて、表６に示す。全てはほぼ同等のレベルでＣＤ６＋細胞を染色し、観察される染色のレベルは、幾つかの市販抗ＳＲＣＲドメイン１ｍＡｂｓの場合に見られるものに類似した。加えて、全てはＡＬＣＡＭＲｇとＣＤ６＋ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の相互作用を完全にブロックし、これは上記実施例Ｉの抗ＳＲＣＲドメイン１ｍＡｂｓの場合に見られるものとは著しく異なる。表６中、＊）（抗体結合の平均蛍光強度）−（ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に結合する二次抗体のみの平均蛍光強度）＊＊）マイナス％の抑制率は、一次抗体なしの場合（培地のみ）に見られるものと比較して、高いＡＬＣＡＭＲｇ結合を示す。実施例Ｖ抗ヒトＣＤ６Ｄ３−ＳｍＡｂｓの中の結合サブグループ：ＣＤ６Ｄ１−３Ｒｇタンパクへの抗Ｄ３／ＳｍＡｂｓの変異結合は、これらのｍＡｂｓの幾つかがＤ３／Ｓドメイン内の異なるエピトープを認識することを示唆した。これらの結合サブグループを明確にするため、先のドメイン特異性テストの場合に略述したＥＬＩＳＡフォーマットを用い、ＣＤ６Ｄ１−３Ｒｇタンパクに対し逐次４倍希釈で、各ｍＡｂ上澄み液を滴定する。抗ネズミＩｇサンドイッチＥＬＩＳＡを用いる、各上澄み液の抗体濃度の予備分析によれば、上澄み液間のＩｇ濃度において４倍差を越えることのないことがわかった。従って、抗体の滴定プロフィールの主な差が最も起りうるのは、融合タンパク内の異なるエピトープの認識に基づくと考えられる。ｍＡｂ結合を監視するため、抗ネズミＩｇＧＦｃ特異的第二工程試液を用い、異なる抗ＣＤ６Ｄ３／Ｓ抗体の滴定プロフィールを図２に示す。Ｍａｂ１６Ａ３は明らかにユニークな滴定曲線を有したのに対し、ｍＡｂｓ７Ｃ７および１３Ｃ３は、それらの曲線の形状やＣＤ６Ｄ１−３Ｒｇとの大きな反応性に基づき似ているようであった。残りのｍＡｂｓは全て、特異性の少ない融合タンパクを認識し、５Ｄ４、５Ｅ８および８Ａ７のみがかなりの結合を証明し、かつ類似の滴定曲線をもたらす。１つのＩｇＧアイソタイプの第二工程試液の潜在的偏りを他のものに対してコントロールするため、抗ネズミ・カッパ軽鎖第二工程試液を用いてアッセイを繰り返す（ｍＡｂｓの全ては以前に、IsoStripテストの使用でこの種の軽鎖を有することが認められている）。図４に示されるように、ｍＡｂｓ７Ｃ７および１３Ｃ３も、それらのＣＤ６Ｄ１−３Ｒｇの大きな認識の点で極めて似ているようであった。またＭａｂｓ５Ｅ８および８Ａ７は、それらの非常によく似た、タンパク質の中間認識に基づくグループに属するようであった。他のｍＡｂｓは、このフォーマットで乏しい結合を証明した。これらのデータを合わせると、抗Ｄ３／ＳｍＡｂｓの中で少なくとも５つの違った結合サブグループが示され、該グループは以下の通り、違う滴定プロフィールを特徴とし、かつ分類される。グループＡ−１６Ａ３グループＢ−７Ｃ７、１３Ｃ３グループＣ−５Ｄ４グループＤ−５Ｅ８、８Ａ７グループＥ−７Ｈ６、１０Ａ５、１０Ｄ１、１２Ａ５、１５Ｂ１２実施例VI 変異分析によって判定した抗ヒトＣＤ６Ｄ３／Ｓ抗体中のＣＤ６結合サブグループ：抗Ｄ３／ＳｍＡｂｓに対するエピトープ特異性を査定する独立した方法を行い、この場合、第３ＳＲＣＲドメインにシングル、あるいは１つのケースでダブルの点変異を有する変異体ＣＤ６Ｄ３−ＳＲｇタンパクを使用する。さらに詳しくは、ｍＡｂｓ５Ｄ４、１０Ａ５、１６Ａ３、７Ｈ６、１５Ｂ１２、７Ｃ７、１３Ｃ３、５Ｅ、８Ａ７、１０Ｄ１および１２Ａ５をＥＬＩＳＡで試験し、２５の変異体ＣＤ６Ｄ３−Ｓ融合タンパクのパネルに結合するそれらの能力に基づいてグループ分けした。これらの変異体の、変異体番号並びに列挙した残基のオリジナル（左）および置換した（右）アミノ酸の対応する記号によるリストを、下記表７に記す。表７に記載のＣＤ６変異に影響される抗Ｄ３／Ｓ抗体の結合活性を検出するＥＬＩＳＡアッセイは一般に、上記Bowenらの文献の方法に従って行なう。要するに、イムロン１平板に、carb／bicarb緩衝液中１μｇ／ｍｌのロバ抗ヒトＩｇＧ（Jackson）を５０μｌ／ウェルにて、室温で一夜被覆する。サンプルを３００ μｌ／ウェルのＰＢＳ（Gibco）／０．０５％ツイーン２０（Biorad）で２回洗う。１００μｌ／ウェルのGenetic Systems Specimen Diluentを用いてブロッキングを行い、室温で１．５時間培養した後、３００μｌ／ウェルのＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０で２回洗う。次いで、０．５μｇ／ｍｌの［ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（Gibco）に希釈］ＣＤ６変異体上澄み液の５０μｌ／ウェルを加え、室温で１．５時間培養し、試験ｍＡｂｓのそれぞれにつき正副で実施する。この培養工程後、サンプルを再度、３００μｌ／ウェルのＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０で３回洗う。次に、Genetic Systems Specimen Diluentに１：５希釈した、５０μｌ／ウェルの抗ＣＤ６ｍＡｂ上澄み液を加え、室温で１．５時間培養する。再度、サンプルを３００μｌ／ウェルのＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０で４回洗う。１００μｌ／ウェルのGenetic Systems Ch romagen／Buffered Substrate（Chromagen：緩衝液＝１：１００）を用いて、発色（developing）を行い、室温にて約15分あるいはブルー色になるまで培養する。１００μｌ／ウェルの１Ｎ−Ｈ₂ＳＯ₄で反応を止め、光学濃度（ＯＤｓ）を４５０および６３０ｎｍで測定する。ＣＤ６Ｄ３−Ｓ点変異体のＥＬＩＳＡアッセイの結果を図５および６に示す。特に、ｍＡｂｓの全ては変異体１、３、７、８、１０、１４、１６−２０、２４および２５に結合したが、ｍＡｂｓの中で変異体２、４、９、１５および２１− ２３のいずれに対しても結合を示すものはなかった。グループ１抗体（ｍＡｂ５Ｄ４で例示）およびグループ２抗体（ｍＡｂ１０Ａ５で例示）の場合は、変異体２４（Ｓ３６３Ｋ）に結合する能力が特徴で、これら２グループのメンバーの中で、広範囲の希釈で滴定すると、ｍＡｂ１０Ａ５が最も強い結合を示した。ハイブリドーマ上澄み液におけるｍＡｂの濃度が同等であることを証明する対照として、変異体１７（Ｎ３４５Ｑ）へのｍＡｂ５Ｄ４結合は１０Ａ５結合に対応した。さらにＣＤ６結合サブグループについて、変異体ＥＬＩＳＡアッセイで明示し、該アッセイから、グループ３抗体（ｍＡｂ１６Ａ３で例示）とグループ４抗体（ｍＡｂ７Ｈ６で例示）は、変異体６（Ｐ２９６Ｒ）に結合しないことが判明した。グループ３およびグループ４抗体は共に、変異体２４（Ｓ３６３Ｋ）を認識したが、広範囲の希釈で滴定すると、ｍＡｂ１６Ａ３はｍＡｂ７Ｈ６と同様に、結合しなかった。再度、ｍＡｂ濃度の対照として、ｍＡｂｓ１６Ａ３および７Ｈ６の両方について、変異体２５（Ｎ３３９Ｄ／Ｎ３４５Ｄ）において類似の結合を示すことを明らかにした。さらに、ＣＤ６結合サブグループの特性決定により、グループ５抗体（ｍＡｂ１５Ｂ１２で例示）は、試験ｍＡｂｓのいずれにも認識されない（図５）変異体（２、４、９、１５および２１−２３）を除く、全ての変異体タンパクに結合する能力で区別されることが示される。抗Ｄ３／Ｓ抗体の３つの付加的サブグループをＥＬＩＳＡ／ＣＤ６変異体アッセイで確認し、グループ６抗体（ｍＡｂｓ７Ｃ７および１３Ｃ３で例示）、グループ７抗体（ｍＡｂｓ５Ｅ８および８Ａ７で例示）およびグループ８抗体（ｍＡｂｓ１０Ｄ１および１２Ａ５で例示）は、変異体５、１２および１３に結合しないことを証明した（図６）。変異体６への結合は、これらのグループを細分する。グループ７およびグループ８抗体は、グループ６と同様に、この変異体を認識しなかった。加えて、これらのｍＡｂｓは、ストーク領域を欠くｈＣＤ６Ｄ３融合タンパクについて異なる結合特性を有した。ＣＤ６変異体／ＥＬＩＳＡアッセイで試験した抗Ｄ３／Ｓ抗体のパネル中の種々の結合サブグループのさらに明確な特性は、図５および６に示す結果によって証明される。これらの結果に従って、試験した２５のＣＤ６変異体のパネルに対する違ったサブグループ結合パターン（たとえば結合変異体の同一性と数、および／またはたとえば野生型結合の％で表示する結合のレベル）に基づき、結合サブグループを変化するレベルに区別することができる。加えて、ＣＤ６Ｄ１−３Ｒｇタンパク（実施例Ｖ；図４）に関する滴定分析およびＣＤ６Ｄ３−Ｓ点変異体に関するＥＬＩＳＡ結果は、ＣＤ６結合サブグループ１−８を特色付ける特異的結合パターンを規定することに関して、互いに良好に一致する。さらに抗Ｄ３／Ｓ結合サブグループ間の示差結合パターンを規定する付加的データを、本発明の特定ｍＡｂｓの場合に図７に示す結果によって例証されるように、滴定分析で供給する。これらのアッセイは、上記滴定アッセイに従って行い、但し、上澄み液をGenetic Systemsの検体希釈液に、最初は１：２で始め、次いで連続的に１：４まで希釈することによって、ｍＡｂｓを滴定した。図から認められるように、これらのアッセイ・データは、ＣＤ６Ｄ１−３Ｒｇタンパク（実施例Ｖ；図４）に関する滴定分析およびＣＤ６Ｄ３−Ｓ点変異体のＥＬＩＳＡデータと一緒に、集合して、試験した抗Ｄ３／ＳｍＡｂｓのパネルに下記の８つの結合サブグループが存在することを証明する。グループ１−５Ｄ４グループ２−１０Ａ５グループ３−１６Ａ３グループ４−７Ｈ６グループ５−１５Ｂ１２グループ６−７Ｃ７、１３Ｃ３グループ７−５Ｅ８、８Ａ７グループ８−１０Ｄ１、１２Ａ５これら結合サブグループのメンバーは特に、本発明において、たとえば別々のエピトープ部位でＣＤ６に結合しおよび／または違った結合特性を持つ、およびＣＤ６の違ったエピトープ部位を認識しまたはＣＤ６にユニークな方法で結合する付加的結合作用物質を同定しかつ特色付ける高特異的な結合作用物質として有用である。加えて、これらの結合サブグループは、ＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用を調整する異なる活性を示し、並びにＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用を調整する異なる活性を有する他の結合作用物質を同定しかつ特色付ける結合作用物質としても有用である。この点について、ＣＤ６結合サブグループのうちいくらかは、ＣＤ６−Ｄ３および／またはＣＤ６−Ｓドメイン内の違ったエピトープ部位を認識することが予想されるが、他のサブグループではオーバーラップするエピトープ部位、または親和力もしくはＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用を調整する可能性が変化する同じエピトープ部位を認識するだろう。実施例VII ＣＤ６の第２ＳＲＣＲドメインに特異的な抗体の同定および特性決定：ＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用のより強力にブロックするマスター・ウェルのドメイン特異性およびクローニングの評価に続いて、残りのマスター・ウェル上澄み液の全てを、ＥＬＩＳＡベースのドメイン特異性分析に付す。これらのテスト結果は、いくつかの上澄み液を同定し、それらの融合タンパクパネルに関する反応性プロフィールは、上記上澄み液がＣＤ６の第２ＳＲＣＲドメイン（ＣＤ６Ｄ２）に対して向けられる抗体を含有することを示唆した。かかる幾つかのウェルの代表的な結果を、下記表８に示す。全ては、ＣＤ６Ｒｇ、ＣＤ６Ｄ２−ＳＲｇ、ＣＤ６Ｄ１−２Ｒｇおよび最も重要なＣＤ６Ｄ２Ｒｇとの反応性を明確に示した。興味あることに、６例のうち４つのＣＤ６Ｄ１−３Ｒｇタンパクとの反応は乏しく、これも、抗Ｄ３／Ｓ抗体の場合に以前から注目されているように、構造の充全性の問題の可能性を示唆する。またＨ６−２．１０Ａ５上澄み液は、ＣＤ６のＤ３／Ｓドメインに対して向けられる第２抗体の存在を証明した。表８に示すマスター・ウェルのそれぞれからハイブリドーマを産生する特異的抗体を、上記に準じてクローン化する。クローンからの上澄み液をＣＤ６Ｄ２Ｒｇ融合タンパクにてＥＬＩＳＡでスクリーニングし、但し、Ｈ６−２．１０Ａ５からのクローンは例外として、ＣＤ６Ｄ３−ＳＲｇタンパクにてスクリーニングする。Ｈ６−２．１０Ａ５を除いて、マスター・ウェルのそれぞれから抗ＣＤ６Ｄ２Ｒｇクローンを首尾よく単離する。しかしながら、抗ＣＤ６Ｄ３−ＳＲｇクローンは後者のマスター・ウェルから単離した。抗ＣＤ６Ｄ２Ｒｇクローンの代表例に対するＥＬＩＳＡによる全ＣＤ６融合タンパク・ドメイン特異性テストの結果を、表９に示す。上述の如く、抗ＣＤ６Ｄ３−ＳＲｇクローンの類するデータが前記表４に示される。抗ＣＤ６Ｄ２Ｒｇ抗体の全ては、ＣＤ６の第２ＳＲＣＲドメイン含有の融合タンパクのいずれとも十分に反応し、そして関係しないＣＤ４０Ｒｇタンパクを認識するものはなかった。これに基づき、第２ＳＲＣＲドメインに対するこれらｍＡｂｓ（すなわち、抗Ｄ２ｍＡｂｓ）のドメイン特異性指定を決定した。しかしながら、ｍＡｂｓの内２つ（Ｈ６−２．５Ｆ７およびＨ６−２．１４Ｈ２）はＣＤ６Ｄ３−ＳＲｇタンパクと弱くかつ首尾一貫して反応するが、他のものは反応しなかったことへの注目に興味がある。この理由は明らかでないが、少なくとも２つの異なるエピトープが抗Ｄ２ｍＡｂｓによって認識され、従って、抗Ｄ２ｍＡｂｓの２サブグループが単離（Ｈ６−２．５Ｆ７およびＨ６−２．１４Ｈ２からなるグループ１と、Ｈ６−１．５Ｅ１、Ｈ６−１．１２Ｆ１０およびＨ６−１．１５Ｄ７からなるグループ２）されたという所見が証拠となる。この結論の裏付として、ＣＤ６Ｄ３−ＳＲｇタンパクについて抗Ｄ２上澄み液の全ＥＬＩＳＡベースの滴定を行った。図８に示されるように、グループ１ｍＡｂｓはこのタンパク質と、飽和可能、滴定可能な方法で反応し、一方、グループ２ｍＡｂｓは該タンパク質をほとんど認識しなかった。これらの結果はグループ１上澄み液における高い濃度に基づくものでないが、それは、抗マウスＩｇサンドイッチＥＬＩＳＡがグループ１上澄み液と比較して、グループ２上澄み液に高い免疫グロブリンレベルを示すからである。次に、これら５つのｍＡｂｓを含有するクローン上澄み液について、上記市販／workshop抗ＳＲＣＲドメイン１ｍＡｂｓおよび融合マスター・ウェル上澄み液の場合の記載に準じ、ＣＤ６＋細胞への結合と、ＣＤ６＋細胞へのＡＬＣＡＭＲｇ結合をブロックする能力を評価した。表６に示されるように、５つのｍＡｂｓの全ては、ＣＤ６＋ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を同等なレベルで、抗Ｄ１および抗Ｄ３／ＳｍＡｂｓの場合に見られる程度まで染色した。抗Ｄ３／ＳｍＡｂｓと異なり、抗Ｄ２ｍＡｂｓはＡＬＣＡＭＲｇとＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の相互作用をブロックすることができず、事実、幾つかの抗Ｄ１ｍＡｂｓの場合に注目されるように、このレセプタ／リガンド相互作用を実際に高めているようであった。グループ１およびグループ２抗Ｄ２ｍＡｂｓ間に結合およびブロック能力に明らかな差異はなかった。５つの抗Ｄ２ｍＡｂｓのネズミＩｇＧサブ分類について、上記のIsoStripテストを用いて決定した。５つのｍＡｂｓの全ては、ＩｇＧ₁アイソタイプを有することが判明した。以上の通り、本発明について、理解の明瞭化を目的として例証および実施例のつもりである程度詳細に説明したが、当業者であれば、上記と同じ発明的コンセプトを用いる本発明の他の実施態様および改変が可能であることを理解するであろう。従って、本発明は上記の開示によって制限されるべきでなく、かつ後記の請求の範囲によってその技術的範囲が決定されるべきものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ボーウェン，マイケル・エイアメリカ合衆国08540ニュージャージー州プリンストン、ウエスト・カントリー・サイド・ドライブ86番 (72)発明者アルフォ，アレハンドロアメリカ合衆国08502ニュージャージー州ベル・メッド、チェストン・コート33番 (72)発明者バヨラト，ユルゲンアメリカ合衆国98037ワシントン州リンウッド、サーティセブンス・アベニュー 17406番 (72)発明者ボディアン，デイル・エルアメリカ合衆国19201ペンシルベニア州パオーリ、サウス・バレー・ロード50番 (72)発明者スコニアー，ジョン・イーアメリカ合衆国98107ワシントン州シアトル、トゥエンティフィフス・ノース・ウエスト6749番

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトＣＤ６ＳＲＣＲドメイン３（ＣＤ６Ｄ３）またはヒトＣＤ６ストーク・ドメイン（ＣＤ６Ｓ）に対し特異的に結合し、かつＣＤ６に結合する活性化白血球細胞癒着分子（ＡＬＣＡＭ）を抑制する抗ヒトＣＤ６結合作用物質。２．抗ＣＤ６Ｄ３もしくは抗ＣＤ６Ｓモノクローナル抗体またはそのフラグメントである請求の範囲１に記載の抗ヒトＣＤ６結合作用物質。３．モノクローナル抗体が、Ａ）グループ１（５Ｄ４）；グループ２（１０Ａ５）；グループ３（１６Ａ３）；グループ４（７Ｈ６）；グループ５（１５Ｂ１２）；グループ６（７Ｃ７，１３Ｃ３）；グループ７（５Ｅ８，８Ａ７）；もしくはグループ８（１０Ｄ１，１２Ａ５）；またはＢ）上記Ａから選ばれた抗体と実質的なアミノ酸配列の同一性を示し、かつ該抗体と実質的に同じＣＤ６結合特異性を保有する変性免疫グロブリンから選ばれる請求の範囲２に記載の抗ヒトＣＤ６結合作用物質。４．抗体またはそのフラグメントが、ＣＤ６Ｄ３−ＳＲｇに特異的に結合する請求の範囲２に記載の抗ヒトＣＤ６結合作用物質。５．モノクローナル抗体が、ヒト向きにしたモノクローナル抗体である請求の範囲２に記載の抗ヒトＣＤ６結合作用物質。６．モノクローナル抗体が、ヒト一定ドメインに操作可能に連結するマウス変異ドメインからなるヒト−マウス・キメラ抗体である請求の範囲４に記載の抗ヒトＣＤ６結合作用物質。７．ヒトＣＤ６（ｈＣＤ６）に特異的に結合する結合作用物質を同定するスクリーニング法であって、ヒトＣＤ６ＳＲＣＲドメイン３（ＣＤ６Ｄ３）またはヒトＣＤ６ストーク・ドメイン（ＣＤ６Ｓ）に特異的に結合し、かつヒトＣＤ６（ｈＣＤ６）に結合する活性化白血球細胞癒着分子（ＡＬＣＡＭ）を抑制する、対照抗ヒトＣＤ６モノクローナル抗体を、テスト結合作用物質の存在下、テスト結合作用物質の非存在下の対照抗体と下記標的種の複合形成に好適な条件下で、ＣＤ６Ｄ２、ＣＤ６Ｄ３およびＣＤ６Ｓから選ばれる１種以上のｈＣＤ６ドメインからなる標的種と接触させ；次いでＣＤ６Ｄ３またはＣＤ６Ｓに対するテスト結合作用物質の特異的な結合活性の指示薬として、テスト結合作用物質の存在下の対照抗体と標的種の複合形成を検出する工程から成るスクリーニング法。８．テスト結合作用物質が抗体である請求の範囲７に記載のスクリーニング法。９．テスト結合作用物質がペプチドである請求の範囲７に記載のクスリーニング法。１０．対照抗体がグループ１（５Ｄ４）；グループ２（１０Ａ５）；グループ３（１６Ａ３）；グループ４（７Ｈ６）；グループ５（１５Ｂ１２）；グループ６（７Ｃ７，１３Ｃ３）；グループ７（５Ｅ８，８Ａ７）；またはグループ８（１０Ｄ１，１２Ａ５）から選ばれる請求の範囲７に記載のスクリーニング法。１１．標的種がＣＤ６＋細胞のサンプルからなる請求の範囲７に記載のスクリーニング法。１２．標的種がＣＤ６Ｒｇ、ＣＤ６Ｄ１−３ＲｇおよびＣＤ６Ｄ２−ＳＲｇから選ばれる請求の範囲８に記載のスクリーニング法。１３．さらに、ＡＬＣＡＭをテスト結合作用物質の存在下、ＡＬＣＡＭが標的種に結合するのに好適な条件下で標的種と接触させ、次いでＡＬＣＡＭ／ＣＤ６結合を調整するテスト結合作用物質の活性の指示薬として、ＡＬＣＡＭと標的種の複合形成を検出する工程を包含する請求の範囲７に記載のスクリーニング法。１４．テスト結合作用物質が、対照抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のペプチド擬態である請求の範囲７に記載のスクリーニング法。１５．テスト結合作用物質が、標的種に対する対照抗体の特異的結合を少なくとも２５％抑制する請求の範囲７に記載のスクリーニング法。１６．患者の炎症または自己免疫応答を抑制する方法であって、ヒトＣＤ６ＳＲＣＲドメイン３（ＣＤ６Ｄ３）またはヒトＣＤ６ストーク・ドメイン（ＣＤ６Ｓ）に対し特異的に結合し、かつＣＤ６に結合する活性化白血球細胞癒着分子（ＡＬＣＡＭ）を抑制する、治療上有効量の抗ＣＤ６結合作用物質を患者に投与する工程から成る方法。１７．抗ＣＤ６結合作用物質がモノクローナル抗体である請求の範囲１６に記載の方法。１８．抗体がヒト向きにしたモノクローナル抗体である請求の範囲１７に記載の方法。１９．抗体が、ヒト一定ドメインに操作可能に連結するマウス変異ドメインからなるヒト−マウス・キメラ抗体である請求の範囲１７に記載の方法。２０．炎症または自己免疫応答が、患者の多発性硬化症の症状である請求の範囲１７に記載の方法。２１．ヒトＣＤ６ＳＲＣＲドメイン３（ＣＤ６Ｄ３）またはヒトＣＤ６ストーク・ドメイン（ＣＤ６Ｓ）に対し特異的に結合し、かつＣＤ６に結合する活性化白血球細胞癒着分子（ＡＬＣＡＭ）を抑制する、抗ヒトＣＤ６免疫グロブリン。２２．グループ１モノクローナル抗体のサブグループ結合パターンを示す請求の範囲２１に記載の抗ヒトＣＤ６免疫グロブリン。２３．グループ２モノクローナル抗体のサブグループ結合パターンを示す請求の範囲２１に記載の抗ヒトＣＤ６免疫グロブリン。２４．グループ３モノクローナル抗体のサブグループ結合パターンを示す請求の範囲２１に記載の抗ヒトＣＤ６免疫グロブリン。２５．グループ４モノクローナル抗体のサブグループ結合パターンを示す請求の範囲２１に記載の抗ヒトＣＤ６免疫グロブリン。２６．グループ５モノクローナル抗体のサブグループ結合パターンを示す請求の範囲２１に記載の抗ヒトＣＤ６免疫グロブリン。２７．グループ６モノクローナル抗体のサブグループ結合パターンを示す請求の範囲２１に記載の抗ヒトＣＤ６免疫グロブリン。２８．グループ７モノクローナル抗体のサブグループ結合パターンを示す請求の範囲２１に記載の抗ヒトＣＤ６免疫グロブリン。２９．グループ８モノクローナル抗体のサブグループ結合パターンを示す請求の範囲２１に記載の抗ヒトＣＤ６免疫グロブリン。３０．抗ＣＤ６Ｄ３もしくは抗ＣＤ６Ｓモノクローナル抗体またはそのフラグメントである請求の範囲２１に記載の抗ヒトＣＤ６免疫グロブリン。３１．免疫グロブリンが、Ａ）グループ１（５Ｄ４）；グループ２（１０Ａ５）；グループ３（１６Ａ３）；グループ４（７Ｈ６）；グループ５（１５Ｂ１２）；グループ６（７Ｃ７，１３Ｃ３）；グループ７（５Ｅ８，８Ａ７）；もしくはグループ８（１０Ｄ１，１２Ａ５）；またはＢ）上記Ａから選ばれた抗体と実質的なアミノ酸配列の同一性を示し、かつ該抗体と実質的に同じＣＤ６結合特異性を保有する変性免疫グロブリンから選ばれるモノクローナル抗体である請求の範囲２１に記載の抗ヒトＣＤ６結合作用物質。