JP2002505097A - 治療薬としてのｃｄ１４７結合分子 - Google Patents

治療薬としてのｃｄ１４７結合分子

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Abstract

(57)【要約】 本発明で、本発明者らはＴ細胞、B細胞および/または単球のような特定の細胞で発現される分子CD147が、種々の疾病の治療に利用できることを発見した。特に本発明者らは、CD147に結合し、補体の結合などによってそのような細胞を殺す抗体が、疾病の治療に有効であることを示した。そのような治療が有効な疾病には、対宿主性移植片病(GVDH)、臓器移植拒絶の疾病（腎移植、眼球移植などを含むがこれらに限定されることはない）、癌（血液の癌（白血病およびリンパ腫）、膵臓などを含むがこれらに限定されることはない）、自己免疫疾患、炎症性疾患、その他が含まれるが、これらに限定されることはない。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 1．発明の概要 本発明に従い、本発明者らは、T細胞、B細胞、および／または単球などの特定
の細胞上に発現されるようなCD147分子を、種々の疾患の治療のための標的とし て用いうることを見いだした。特に、本発明者らは、CD147と結合し、例えば補 体結合を介して、このような細胞の死滅を引き起こす抗体が疾患の治療に有効で
あることを示す。このような治療が有効と思われる疾患には、移植片対宿主病（
GVHD）、臓器移植拒絶反応（腎移植、眼科的移植などを非制限的に含む）、癌（
血液（すなわち、白血病およびリンパ腫）および膵臓の癌を非制限的に含む）、
自己免疫疾患（ループスを非制限的に含む）、炎症性疾患（関節炎）などが非制
限的に含まれる。
【０００２】2．技術の背景 1982年頃にUCLAのグループは、マウスに急性白血病細胞による免疫処置を行っ
た後に、ハイブリドーマの作製、ならびに免疫細胞および正常リンパ球に対する
抗体の毒性をアッセイする微量細胞傷害試験におけるハイブリドーマのスクリー
ニングを行うことにより、ヒト白血病細胞に対する細胞傷害性をもつ抗体を作製
したと報告した。その開示の全体が参照として本明細書に組み入れられる、米国
特許第5,330,896号および第5,643,740号を参照のこと。腫瘍細胞に対しては細胞
傷害性であるが正常細胞（活性化T細胞、活性化B細胞および単球を除く。これら
も死滅する）に対する毒性はないハイブリドーマが1種類回収された。この種の ハイブリドーマはクローニングおよび単離がなされ、HB 8214としてATCCに寄託 されている。このハイブリドーマによって発現されるモノクローナル抗体はCBL1
と命名されたが、これはマウスIgMである。このグループはさらに、この抗体が 、活性化および非活性化細胞の両方の細胞質中に存在すると思われる抗原決定基
と反応することを示した。しかし、この抗原決定基は、活性化T細胞、活性化B細
胞、ならびに休止および活性化単球を含む特定の循環血中細胞（circulating ce
ll）のみの細胞外膜上に存在し、その他の循環血中非活性化細胞の細胞外表面に
は存在しないように思われる。
【０００３】 また、このグループは、このような観察結果の原因となる抗原を単離すること
も試みた。以上の特許では、CBL-1抗体によって認識される抗原決定基を以下の ような分子として特徴づけている： （i）腫瘍細胞および活性化リンパ球の細胞膜上および細胞質中に存在する、 （ii）刺激されていない正常末梢血リンパ球の細胞質中に存在するが、これら
の細胞が抗原またはマイトジェンによって刺激されると、前記抗原が細胞膜上に
も出現する、 （iii）マイトジェンによりインビトロで活性化されたリンパ球上に存在する 、 （iv）ATCC番号HB8214のハイブリドーマ細胞系によって産生されるCBL1モノク
ローナル抗体と結合しうる、 （v）腫瘍細胞および活性化リンパ球によって産生される自己分泌増殖因子と して機能する、 （vi）腫瘍細胞の膜表面と結合し、これらの細胞および一連のリンパ系細胞の
増殖を刺激する、 （vii）増殖中の癌細胞がある培地中、ならびに活性化リンパ球がみられる癌 および疾患の患者の血清中に存在する、ならびに （viii）分子量がほぼ15,000ダルトンである。
【０００４】 UCLAグループの論文および特許と対比して、CBL1抗体が結合する抗原の同定に
関してこれを上回る結果は得られていない。しかし、CBL1抗体は、移植片対宿主
病（GVHD）および腎移植拒絶反応を含む種々の疾患の患者において有効であった
。例えば、ヘスロップ（Heslop）ら、The Lancet 346：805〜806（1995）（GVHD
）、ベナミン（Benamin）、Clinical Trial Monitor Abstract 13385号（1995）
、タカハシ（Takahashi）ら、The Lancet 2：1155〜1158（1983）（腎同種移植 片拒絶反応）、タカハシ（Takahashi） Transplantation Proceedings 17：10〜
12（1985）（腎同種移植片拒絶反応）、オエイ（Oei）ら、Transplantation Pro
ceedings 17：13〜16（1985）（腎同種移植片拒絶反応）を参照されたい。この ような研究に関して、安全性に関する懸念および交差反応性の所見は認められな
かった。以下の論文は、CBL1抗体のそのほかの特徴に関するものである：ビリン
グ（Billing）ら、Hybridoma 1：303〜311（1982）、ビリングら、Clin. Exp. I
mmunol. 49：142〜148（1982）、チャテルジー（Chatterjee）ら、Hybridoma 1 ：369〜377（1982）、ビリング（Billing R.）およびチャテルジー（Chatterjee
S.）、Transplantation Proceedings 15：649〜650（1983）、キヌカワ（Kinuk
awa T.）およびテラサキ（Terasaki P.I.）、Transplantation Proceedings 1：
993〜998（1985）、ビリング、モノクローナル抗体：腫瘍および移植における診
断的および治療的使用（Monoclone Antibody：Diagnostic and Therapeutic Use
in Tumor and Transplantation）、第9章、85〜90（Chatterjee編、PSG Publ.
Co., Inc.（1985））、ビリング、モノクローナル抗体：腫瘍および移植におけ る診断的および治療的使用、第2章、11〜19（Chatterjee編、PSG Publ. Co., In
c.（1985）。
【０００５】 ヒト移植片対宿主病（GVHD）は、マテー（Mathe）らによって1960年に初めて 記載された（Matheら「Nouveaux essais de greffe de moelle osseuse homolog
ue apres irradiation totale chez des enfants atteints de leucemie aigue
en remission. Le probleme du syndrome secondaire chez l'homme」、Rev Fr
Etud Clin Biol 15：115〜161（1960））。GVHDは本質的には、ドナー細胞と宿 主組織との間の免疫学的反応の臨床症状である。この臨床的症候群は皮疹、胃腸
症状および肝機能障害からなり、通常は同種骨髄移植から2週間以内に認められ る。この免疫異常の発生には、免疫適格ドナー細胞による宿主抗原の認識、免疫
抑制状態にある宿主（レシピエント）、およびドナーとレシピエントとの間に同
種抗原の差があることが必要である。免疫適格ドナー細胞は成熟T細胞であり（F
errara ILおよびDeeg HJ、「移植片対宿主病（Graft versus Host Disease）」N
EJM 324：667（1991）、疾患の臨床的重症度は患者に移植されたT細胞の数と相 関する（Ferrara ILおよびDeeg HJ、「移植片対宿主病（Graft versus Host Dis
ease）」、NEJM 324：667（1991）。
【０００６】 急性GvHDの臨床像には、皮膚炎、黄疸および胃腸症状が含まれる。これらの症
状は単独で起こることも併発することもあり、その程度も軽症から生命にかかわ
るものまでさまざまである。皮膚症状は最もよくみられる症状である。皮膚症状
のうち最も重症な症状には、第三度熱傷に類似した水疱性病変が含まれる。黄疸
はビリルビンの上昇によって生じ、その他の肝酵素の上昇は伴うことも伴わない
こともある。胃腸症状には水様下痢が含まれる。この下痢は大量および血性のこ
とがあり、生命にかかわる体液および電解質の喪失の原因となるほか、感染路と
もなる。重症イレウスを来す患者もある。上部消化管症状は少ない。これは、食
欲不振、消化不良、食物不耐性および悪心／嘔吐を呈する。胃腸症状がみられる
患者の大部分には完全静脈栄養（TPN）による援助が必要である。
【０００７】 予防のため、およびおそらくは治療のためともなる戦略は、ドナー骨髄からの
T細胞の除去またはそれらの活性化の阻止に向けて行われるべきであり、時にそ のように行われる。しかし、T細胞枯渇骨髄（T-depleted marrow）では移植失敗
率が高く、これは一般に致死的である。T細胞枯渇骨髄に関するもう1つの懸念は
、原疾患が白血病と診断された骨髄移植患者における再発率が高いことである。
ドナーT細胞により媒介される移植片対白血病効果（graft versus leukemia eff
ect）も、同種骨髄移植におけるT細胞枯渇骨髄の使用の妨げとなる。
【０００８】 臨床的に重大な急性GVHD（グレードII〜IV）は、HLA遺伝子型が同一な同胞か ら骨髄を移植された患者の最大50％に生じる。血縁関係にはないが型が一致する
ドナーを用いた場合には、調査によっては発生率が80％に上昇している。HLA不 適合の程度が大きいほど、GVHDの発生率および重症度は高まる。
【０００９】 急性GvHDに対する最も重要な治療は予防である。予防策には、免疫抑制療法の
使用およびドナー細胞のT細胞枯渇が含まれる。「標準的な」一次治療はグルコ コルチコイドからなる。患者の約20〜25％で著効が得られるが、反応が得られな
い患者の転帰は不良である。ステロイド治療の継続を必要とする患者は、ステロ
イド使用に伴う有害反応のすべてを起こしやすい。これらの有害反応には、感染
症へのかかりやすさ、消化管出血、代謝状態の変化、高血圧などが含まれる。
【００１０】 グルココルチコイド、シクロスポリン、メトトレキサート、シクロホスファミ
ドはいずれも、GVHDの予防ならびに治療に用いられている。抗胸腺細胞グロブリ
ン（ATG）は長年にわたって用いられている。これらの薬剤はすべて極めて強い 毒性を示すおそれがある。抗インターロイキン-2などのモノクローナル抗体およ
び抗CD5リシンなどのイムノトキシンも用いられているが、奏功の度合いは限定 的であることが明らかになっている。ヒト化抗TACはGVHDの予防に用いられたが 、治療法としては失敗に終わっている。
【００１１】 CBL1がGVHDの治療に有効なことが示されているため、本発明者らはCBL1抗体に
対する別の研究に着手した。このような付加的な研究に関連して、本発明者らは
今回、CBL1抗体が実際にT細胞、B細胞、および／または単球などの特定の細胞上
に発現されるようなCD147抗原と結合し、補体依存性細胞傷害（殺細胞）の過程 を介して効果を示すと思われることを示した。
【００１２】 CD147は免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーの一員であり、種々の組織 における数多くの種類の細胞上で発現される。これは当初、ヒトBasigin（塩基 性免疫グロブリンスーパーファミリー（basic immunogloblinスーパーファミリ ー）にちなむ）と命名され、1991年前後に初めてクローニングされた（Miyauchi
ら、J Biochem（Tokyo）110：770〜774（1991）、Kanekuraら、Cell Struct Fu
nct 16：23〜30（1991）、Miyauchiら、J Biochem（Tokyo）110：770〜774（199
1））。この分子は約269アミノ酸からなり（Miyauchiら、J Biochem（Tokyo）11
0：770〜774（1991））、分子量の約40％を炭水化物が占める糖蛋白質であり、 脱グリコシル化された状態の予想分子量はほぼ27KDであって、完全にグリコシル
化された状態の分子量は43〜66kDの間である（Kanekuraら、Cell Struct Funct
16：23〜30（1991））。Basigin遺伝子は染色体19p13.3上にマッピングされてい
る（Kanameら、Cytogenet Cell Genet 64：195〜197（1993））。
【００１３】 この分子は、以下のものを含む、他の数多くの分子と相同性または同一性を有
することが同定されている： マウスBasigin（Miyauchiら、J Biochem（Tokyo）107：316〜323（1990）、Jo
sephら、Adv Exp Med Biol 342：389〜391（1993）、Kanameら、J Biochem（Tok
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rmatol 106：1260〜1265（1996））、 RET-PE2（Finnemannら、Invest Ophthalmol Vis Sci 38：2366〜2374（1997）
）、 Oka血液型抗原（Springら、Eur J Immunol 27：891〜897（1997））、および 1W5（Seulbergerら、EMBO J 9：2151〜2158（1990））。
【００１４】 実際に、ソウルバーガー（Seulberger）ら、Neurosci Lett 140：93〜97（199
2）は、HT7、ニューロセリン、Basigin、gp42およびOX-47が、血液脳関門内皮、
上皮組織関門およびニューロン上に存在する、発生的に調節される免疫グロブリ
ン様表面糖蛋白質の個々の分子の名称であることを示している。さらに、カシン
ラーク（Kasinrerk）ら、J Immunol 149：847〜854（1992）は、ヒト白血球活性
化抗原M6がIgスーパーファミリーの一員であり、ラットOX47、マウスBasiginお よびニワトリHT7抗原の種相同体であることを示した。EMMPRINはM6抗原およびヒ
トBasiginと同一であることが示された（Biswasら、Cancer Res SS：434（1995 ））。ヒトEMMPRLNの遺伝子に関してさらに特徴分析を行っているグオウ（Guo）
ら、「腫瘍細胞表面にあるマトリックスメタロプロテイナーゼ誘導因子であるヒ
トEMMPRINの特徴分析（Characterization of the gene for human EMMPRIN、a t
umor cell surface inducer of matrix metalloproteinases）」、Gene 220：99
〜108（1998）も参照されたい。
【００１５】 関連分子との相同性により、CD147は数多くの生理的過程、疾患および／もし くは状態における役割を果たすことが示されている、またはそのようにみなされ
ている。例えば、この分子に関して想定されている初期の役割は、血液脳関門に
おける活性である。このような関連性は、ニワトリHT7抗原に関して最初に示さ れた（Risauら、EMBO J 5：3179〜3183（1986）、Albrechtら、Brain Res 535：
49〜61（1990）、Seulbergerら、EMBO J 9：2151〜2158（1990）、Janzerら、Ad
v Exp Med Biol 331：217〜221（1993）、Lobrinusら、Brain Res Dev 70：207 〜211（1992）、Ungerら、Adv Exp Med Biol 331：211〜215（1993））。同様の
関連性はニューロセリンについても認められた（Schlosshauer B & Herzog KH J
Cell Biol 110：1261〜1274（1990）、Schlosshauer B Development 113：129 〜140（1991）、Schlosshauer B BioEssays 15：341〜346（1993）、Schlosshau
erら、Eur J Cell Biol 68：159〜166（1995））。本分子は種々の細胞の発生お
よび活性化にも関与することが示されており、これには例えば、リンパ球活性化
キラー細胞（LAK）の活性化（Imbodenら、J Immunol 143：3100〜3103（1989） ）、T細胞の活性化（Patersonら、Mol Immunol 24：1281〜1290（1987）、Kirsc
hら、Tissue Antigens 50：147〜152（1997））、白血球の活性化（Fossumら、E
ur J Immunol 21：671〜679（1991）、Fossumら、Eur J Immunol 21：671〜679 （1991））および単核食細胞の活性化（Mizukamiら、J Immunol 147：1331〜133
7（1991））がある。その他の調節性、シグナル伝達性および認識機能も想定さ れており、これには例えば、MHC機能（Miyauchiら、J Biochem（Tokyo）107：31
6〜323（1990））、シグナル伝達および膜輸送（Kasinrerkら、J Immunol 149：
847〜854（1992）、Berditchevskiら、J Biol Chem 272：29174〜29180（1997）
）、細胞認識（Fadool JM & Linser PJ Dev Dyn 196：252〜262（1993）、Kanam
eら、Cytogenet Cell Genet 64：195〜197（1993））、細胞接着（Miyauchiら、
J Biochem（Tokyo）110：770〜774（1991）、Seulbergerら、Neurosci Lett 140
：93〜97（1992）、Josephら、Adv Exp Med Biol 342：389〜391（1993）、Sudo
uら、J Biochem（Tokyo）117：271〜275（1995））、細胞間刺激およびマトリッ
クスメタロプロテイナーゼ合成（Biswasら、Cancer Res 55：434（1995））、組
織リモデリング（Guoら、J Biol Chem 272：24〜27（1997））、代謝ならびに精
子の発生および成熟（Petruszakら、J Cell Biol 114：917〜927（1991）、Nehm
eら、J Cell Biol 120：687〜694（1993）、Cesario MM & Bartles JR J Cell S
ci 107：561〜570（1994）、Cesarioら、Dev Biol 169：473〜486（1995））が ある。CD147は網膜の発生および疾患にも一定の役割を果たすと思われ、これに ついてはマーモースタイン（Marmorstein）ら、「網膜色素上皮の形態形成：網 膜変性疾患の解明に向けて（Morphogenesis of the retinal pigment epitheliu
m：toward understanding retinal degenerative diseases）」、Ann N Y Acad
Sci 857：1〜12（1998）（N-CAMおよびEMMPRINが、光受容器の生存のために必要
なその他のRPE機能において重要な分子である可能性を示唆している）を参照さ れたい。マーモースタイン（Marmorstein）ら、「側底シグナル認識の抑制に起 因する網膜色素上皮におけるN-CAMおよびEMMPRlNの頂極性（Apical polarity of
N-CAM and EMMPRlN in retinal pigment epithelium resulting from suppress
ion of basolateral signal recognition）」、J Cell Biol 142：697〜710（19
98）も参照のこと。
【００１６】 また、本分子の慢性関節リウマチおよび反応性関節炎（Felzmannら、J Clin I
mmunol 11：205〜212（1991）、Gaddら、Rheumatol Int 12：153〜157（1992） ）ならびに腎疾患（Schusterら、Biochim Biophys Acta 1311：13〜19（1996） ）との関連も検討されている。さらに、本分子と癌との間に一定の明確な相関が
あることも示されている（Biswas、Biochem Biophys Res Commun 109：1026（19
82）、Miyauchiら、J Biochem（Tokyo）110：770〜774（1991）、Biswasら、Can
cer Res 55：434（1995）、Guoら、J Biol Chem 272：24〜27（1997）、Guoら、
J Biol Chem 272：24〜27（1997））。リム（Lim）ら「腫瘍由来EMMPRlN（細胞 外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導物質）はMAPK p38を介してコラゲナー
ゼ転写を刺激する（Tumor derived EMMPRlN（extracellular matrix metallopro
teinase inducer）stimulates collagenase transcription through MAPK p38）
」、FEBS Lett 441：88〜92（1998）、ファンデンオード（van den Oord）ら、 「皮膚の良性および悪性色素細胞病変におけるゼラチナーゼBおよび細胞外マト リックスメタロプロテイナーゼ誘導物質EMMPRlNの発現（Expression of gelatin
ase B and the extracellular matrix metalloproteinase inducer EMMPRlN in
benign and malignant pigment cell lesions of the skin）」、Am J Pat hol
151：665〜70（1997）、Poletteら、「ヒト肺癌および乳癌における腫瘍コラゲ ナーゼ刺激因子（TCSF）の発現および局在（Tumor collagenase stimulatory fa
ctor（TCSF）expressionおよびlocalization in ヒトlungおよびbreast cancers
）」、J Histochem Cytochem 45：703〜9（1997）も参照されたい。
【００１７】 Basigin遺伝子がノックアウトされたマウスモデルが検討されている（Igakura
ら、Biochem Biophys Res Commun 224：33〜36（1996））。この研究からは、本
分子は血液脳関門において必ずしも活性化されていないことが示された。しかし
、この研究により、リンパ球活性化のほか、刺激臭に対する異常応答に関連して
相互作用の増強が示された。その後の研究により、このようなモデルでは知覚お
よび記憶機能にある種の異常があることが示された。ナルハシ（Naruhashi）ら 、Biochem Biophys Res Commun 236：733〜737（1997））。
【００１８】 CD147の発現との関連では、ウッドヘッド（Woodhead）ら「見張り役からメッ センジャーへ：単球から樹状細胞への転移に関する詳細な表現型分析（From sen
tinel to messenger：an extended phenotypic analysis of the monocyte to d
endritic cell transition）」、Immunology 94：552〜9（1998）は、CD147が樹
状細胞上に発現されることを示しており、ガナダン（Ghannadan）ら「トルイジ ンブルーおよびCD抗体の複合染色によるヒト皮膚マスト細胞の表現型特徴分析（
Pherotypic characterization of human skin mast cell by combined staining
with toluidine blue and CD antibody ）」J Invest Dermatol 111：689〜95 （1998）は、一群のCD抗原（CD147を含む）が包皮マスト細胞で検出可能なこと を示しており、ムチン（Mutin）ら「培養上皮細胞の免疫学的表現型：細胞表面 分子の定量的分析（Immunologic phenotype of cultured endothelial cell：qu
antitative analysis of cell surface molecules）」、Tissue Antigens 50：4
49〜58（1997）は、培養上皮細胞（HUVEC）の細胞表面分子の定量的分析につい て考察している。
【００１９】 以上の考察から、CD147は種々の疾患の治療のための標的として有用な可能性 があるとみられている。しかし同時に、CD147は種々の組織に広く分布する数多 くの細胞の内部および表面で発現される。例えば、Oka血液型抗原は事実上すべ ての細胞上で発現される（Williamsら、Immunogenetics 27：322〜329（1988） ）。OX-47は、ほとんどの未熟細胞、内皮細胞および興奮性膜を有する細胞上に 存在することが示されている（Fossumら、Eur J Immunol 21：671〜679（1991）
）。同様に、Basiginは内皮細胞内だけでなく、脾臓、小腸、腎臓および肝臓を 含む種々の組織中で比較的高レベルに発現され、精巣でも少量発現されることが
明らかになっている（Kanekuraら、Cell Struct Funct 16：23〜30（1991））。
CE9はラット肝細胞上で広く発現される（Scott U & Hubbard AL J Biol Chem 26
7：6099〜6106（1992））。ソイルバーガー（Seulberger）ら、Neurosci Lett 1
40：93〜97（1992）は、HT7分子（ニューロセリン、Basigin、gp42およびOX-47 と同じもの）が、血液脳関門、脈絡叢（血液-CNS液関門）、網膜上皮（血液-眼 関門）、ニューロン、尿細管、いくつかの内皮、上皮および上皮組織関門で発現
されることを示している。CE9抗原（OX-47抗原と一致することが示されている）
は、何らかの程度で、事実上すべてのラット組織中で発現される（Nehmeら、Bio
chem J 310：693〜698（1995））。このように広範な組織に分布することから、
それを発現する細胞を抑制または死滅させるあらゆる治療法の安全性に関しては
数多くの懸念が伴うと考えられる。
【００２０】 CD147に、例えば分子のグリコシル化の差異または選択的スプライシングなど に由来するさまざまな形態が存在すると思われることを示す所見もいくつか得ら
れている（Kanekuraら、Cell Struct Funct 16：23〜30（1991）（Basigin）、S
chlosshauer B Development 113：129〜140（1991）（ニューロセリン）、Fadoo
l JM & Linser PJ J Neurochem 60：1354〜136（1993）（5A11／HT7）、Nehmeら
、J Cell Biol 120：687〜694（1993）（CE9）、DeCastroら、J lnvest Dermato
l 106：1260〜1265（1996）（EMMPRIN）、Springら、Eur J Immunol 27：891〜8
97（1997）（Oka））。
【００２１】発明の概要 本発明の第1の局面によれば、抗体がCBL1でないという条件付きで、補体を結 合させるアイソタイプ、およびIgMモノクローナル抗体ABX-CBLによる結合を受け
るCD147上のエピトープと結合する可変領域を有する、単離されたモノクローナ ル抗体が提供される。1つの好ましい態様において、抗体は補体の存在下で、活 性化T細胞、活性化B細胞および単球からなる群より選択される細胞を選択的に死
滅させるが、休止期T細胞および休止期B細胞に対しては実質的に無毒である。も
う1つの好ましい態様において、抗体はヒト抗体である。もう1つの好ましい態様
において、抗体は、マウスIgM、マウスIgG2a、マウスIgG2b、マウスIgG3、ヒトI
gM、ヒトIgG1およびヒトIgG3からなる群より選択されるエピトープを有する。
【００２２】 本発明の第2の局面によれば、抗体がCBL1でないという条件付きで、補体を結 合させるアイソタイプ、ならびに活性化T細胞、活性化B細胞および休止期または
活性化単球の集団上のCD147と結合する可変領域を有し、補体の存在下で、補体 依存性殺細胞作用を介してこのような集団を選択的に枯渇させるが、その他の細
胞に対しては実質的に無毒である、単離された抗体が提供される。1つの好まし い態様において、抗体は補体の存在下で、活性化T細胞、活性化B細胞および単球
からなる群より選択される細胞を選択的に死滅させるが、休止期T細胞および休 止期B細胞に対しては実質的に無毒である。もう1つの好ましい態様において、抗
体はヒト抗体である。もう1つの好ましい態様において、抗体は、マウスIgM、マ
ウスIgG2a、マウスIgG2b、マウスIgG3、ヒトIgM、ヒトIgG1およびヒトIgG3から なる群より選択されるエピトープを有する。
【００２３】 本発明の第3の局面によれば、抗体がCBL1でないという条件付きで、以下の特 徴を有する単離されたモノクローナル抗体が提供される：CD147と結合する；ウ ェスタンブロット上でCEM細胞可溶化物に対して図1に示すものと類似した結合を
示す；アイソタイプがマウスIgM、マウスIgG2a、マウスIgG2b、マウスIgG3、ヒ トIgM、ヒトIgG1およびヒトIgG3からなる群より選択される；CD147との結合に関
してABX-CBLと競合する；hn-RNP-k蛋白質と交差反応する；RVRSを含むCD147上の
共通配列と結合する；MLRアッセイで補体の存在下のみにおいて活性化T細胞、活
性化B細胞および単球を選択的に死滅させる；ならびに、補体の有無にかかわら ず、CD55およびCD59を発現する細胞に対しては実質的に無毒である。
【００２４】 本発明の第4の局面によれば、抗体がCBL1でないという条件付きで、以下を含 む、疾患の治療のために抗CD147抗体を選択するための方法が選択される：CD147
と結合し、補体と結合しうる抗体の作製、以下の性質の1つまたは複数に関する 抗体のアッセイ：CD147との結合に関するABX-CBLとの競合、MLRアッセイで補体 の存在下のみにおいて活性化T細胞、活性化B細胞および単球を選択的に死滅させ
うること、ならびに補体の有無によらず、CD55およびCD59を発現する細胞に対し
て実質的に無毒であること。1つの好ましい態様において、本方法は、図1に提示
されるものと同様の様式で、ウェスタンブロット上のCEM細胞可溶化物との結合 に関して抗体をアッセイすることを含む。もう1つの好ましい態様において、本 方法は、ペプチド中の共通配列RXRSとの結合に関して抗体をアッセイすることを
含む。もう1つの好ましい態様において、本方法は、hn-RNP-k蛋白質との交差反 応に関して抗体をアッセイすることを含む。もう1つの好ましい態様において、 本方法は、COS細胞および大腸菌細胞によって発現されるCD147の一形態との結合
に関して抗体をアッセイすることを含む。
【００２５】 本発明の第5の局面によれば、疾患の予防または重症度の軽減のための方法で あって、補体を結合させるアイソタイプ、ならびに活性化T細胞、活性化B細胞お
よび休止期または活性化単球の集団上のCD147と結合する可変領域を有し、補体 の存在下で補体依存性殺細胞作用を介してこのような集団を選択的に枯渇させる
一方で、補体の有無によらず、その他の細胞に対して実質的に無毒である抗体を
、抗体がCBL1でないという条件付きで、このような治療を必要とする対象に対し
て提供することを含む方法が提供される。1つの好ましい態様において、抗体は ヒト抗体である。もう1つの好ましい態様において、抗体は、マウスIgM、マウス
IgG2a、マウスIgG2b、マウスIgG3、ヒトIgM、ヒトIgGiおよびヒトIgG3からなる 群より選択されるアイソタイプを有する。
【００２６】 本発明の第6の局面によれば、GVHDの予防または重症度の軽減のための方法で あって、補体を結合させるアイソタイプ、ならびに活性化T細胞、活性化B細胞お
よび休止期または活性化単球の集団上のCD147と結合する可変領域を有し、補体 の存在下で補体依存性殺細胞作用を介してこのような集団を選択的に枯渇させる
一方で、その他の細胞に対して実質的に無毒である抗体を、抗体がCBL1でないと
いう条件付きで、このような治療を必要とする対象に対して提供することを含む
方法が提供される。1つの好ましい態様において、抗体はヒト抗体である。もう1
つの好ましい態様において、抗体は、マウスIgM、マウスIgG2a、マウスIgG2b、 マウスIgG3、ヒトIgM、ヒトIgGiおよびヒトIgG3からなる群より選択される。
【００２７】 本発明の第7の局面によれば、共通配列RVRSHを含むCD147上のエピトープと結 合するモノクローナル抗体であって、CBL1ではない抗体が提供される。1つの好 ましい態様において、抗体はヒト抗体である。
【００２８】 本発明の第8の局面によれば、RXRS、RXRSH、RVRSおよびRVRSHからなる群より 選択される配列を含む、単離されたペプチドが提供される。1つの好ましい態様 において、ペプチドは抗体産生のために用いられる。
【００２９】 本発明の第9の局面によれば、CD147と結合するヒトモノクローナル抗体が提供
される。
【００３０】好ましい態様の詳細な説明 本発明の考察 医薬品（pharmaceutical agent）ABX-CBLは、CBL1抗体を発現するハイブリド ーマ細胞系に由来する。CBL1は、T細胞急性リンパ芽球性白血病細胞系（T-ALL）
CEMによる免疫処置を受けたBalb／cマウスにおいて産生された、マウスIgM、抗 ヒトリンパ芽球性モノクローナル抗体である（Billingら「ヒト芽球細胞および 単球に共通する種々の共通抗原と反応するモノクローナル抗体および異種抗体（
Monoclonal and heteroantibody reacting with different common antigens co
mmon to human blast cells and monocytes）」Hybridoma 1：303〜311（1982）
）。脾細胞の融合およびHAT培地中での選択の後に、ハイブリドーマ含有ウェル からの上清を、CEM細胞との反応性に関する微量細胞傷害アッセイ法（microcyto
xicity assay）によってスクリーニングした。このアッセイ法で陽性と判定され
たハイブリドーマを、休止期（resting）リンパ球と芽球細胞とを識別する能力 に関してさらにスクリーニングした。さらなる検討のためにCBL1を選択したのは
、それが芽球細胞に対する選択性を示したためである（Billingら「ヒト芽球細 胞および単球に共通する種々の共通抗原と反応するモノクローナル抗体および異
種抗体（Monoclonal and heteroantibody reacting with different common ant
igens common to human blast cells and monocytes）」Hybridoma 1：303〜311
（1982））。CBL1抗体は、HB 8214としてACTTに寄託されている。
【００３１】 本出願の譲受人であるアブジェニックス社（Abgenix, Inc.、Fremont、CA）は
、1997年にCBL1を獲得し、HB 8214としてATCCに寄託されているこのハイブリド ーマ系が完全には純粋でないことを明らかにした。これは実際には、一方がIgG を産生し、もう一方がIgMを産生する、2つの異なるハイブリドーマ系の混合物で
あった。サブクローニングの後に、純粋なIgM産生細胞ならびに純粋なIgG産生細
胞が得られた。本明細書で説明する一連のインビトロ実験を通じて、このIgM抗 体が、従来はCBL1ハイブリドーマによるものとされてきた活性を媒介することが
示された。混合リンパ球反応アッセイ法（MLR）において、補体媒介性細胞溶解 を阻害する生物活性を示したのはこのIgMのみであった。本明細書で考察する通 り、この阻害は特異的および補体依存性であるため、阻害の機序は抗体を介した
補体依存性細胞傷害（CDC）によるものである。このため、本明細書で述べる従 来の技法を用いる本発明者らの研究と関連して、本発明者らは、このIgMのみを 産生する細胞系を作製するためにこの系統のサブクローニングを行った。さらに
、CBL1抗体を発現するHB 8214細胞系は、最初のハイブリドーマ細胞系を調製す るために用いた骨髄腫融合パートナーであるP3骨髄腫細胞系に由来すると思われ
る第2のκ軽鎖（MOPC-21）を有していた。本発明者らがサブクローニングしたハ
イブリドーマ細胞系は両方の軽鎖を保有および発現し、ABX-CBL抗体は両方の軽 鎖を含むと思われる。IgM抗体は一般に、重鎖および軽鎖の二量体が5つ会合した
五量体構造をもつ。ABX-CBL抗体には2本の軽鎖があることから、本発明者らは、
ABX-CBL抗体のIgM五量体構造はこの両方の軽鎖を、ホモ二量体、ヘテロ二量体な
らびにホモおよびヘテロ二量体の組み合わせによる五量体が形成されるような種
々の比率で含むと考えている。
【００３２】 前臨床的および臨床的開発に用いるためのABX-CBL抗体を製造するために、本 発明者らは、グッドウィンバイオテクノロジー社（Goodwin Biotechnology、Pla
ntation、Florida）による契約製造を通じて、ホローファイバー（hollow fiber
）細胞培養技術を用いた。増殖培地は、ギブコライフテクノロジーズ社（Gibco
Life Technologies）によって供給される無血清配合物HYBRIDOMA-SFMである。
【００３３】 ABX-CBLのマスターセルバンク（Master Cell Bank）（MCB）の安定性は、単細
胞サブクローニングによって決定した。95％を上回る安定性を示す細胞を、単細
胞コロニー産生細胞用としてサブクローニングした。また、ABX-CBL MCBは、培 養下で130世代以上にわたり安定した抗体産生も示した。ホローファイバー型バ イオリアクター中での製造工程は約40日間の増殖工程であり、これはほぼ130世 代に相当する。
【００３４】 細胞培養上清からのモノクローナル抗体の一次精製は、プロテインAアフィニ ティークロマトグラフィーによって行う。ウイルスの不活性化段階としては、溶
出後に低pHでのインキュベーションを行う。材料を陰イオン交換クロマトグラフ
ィーによってさらに精製する。これによってプロテインAが残留し、DNAが除去さ
れる。精製工程における最終段階は、ウイルスをさらに除去するための材料の濾
過である。
【００３５】 製剤化された医薬品原体は、バイアルに入れるまで2〜8℃で保存する。無菌的
方法を用いて、液体形状にある抗体をバルク用容器から5mLのガラス製バイアル に注ぐ。バイアルは2〜8℃で保存および搬送する。ABX-CBLは、T-ALL（急性リン
パ芽球性白血病）細胞系（CEM）に対して産生させたマウスIgM、抗ヒトリンパ芽
球性モノクローナル抗体である。ABX-CBLは、20mMクエン酸ナトリウムおよび120
mM塩化ナトリウム、pH 6.0中に処方される。
【００３６】 本明細書で用いられる「ABX-CBL」という用語は、ATCCにHB 8214として寄託さ
れた元の細胞系に由来する、精製された反応性IgM抗体を指して用いられる。ABX
-CBLの重鎖および軽鎖の配列は上記に考察されており、それぞれ配列番号：18お
よび配列番号：19として提示されている。
【００３７】 本発明者らは今回、CBL1抗体およびABX-CBLの活性物質（active agent）が、T
細胞、B細胞および／または単球などのある種の細胞上に発現されるようなCD147
抗原と結合することを示した。このことから、CD147抗原は種々の疾患を治療す るための標的として用いうると考えられる。CBL1抗体は上記の疾患の治療におい
て患者に有効であること、および本明細書で考察する結果に基づくことにより、
CD147に基づくほかの治療薬も同様に有効であることが予想される。このように して、本発明者らは、本発明に従い、T細胞、B細胞および／または単球などのあ
る種の細胞上に発現されるようなCD147分子を種々の疾患の治療に用いうること を見いだした。特に、本発明者らは、CD147と結合し、補体活性化を通じてこの ような細胞の死滅をもたらす抗体が、疾患の治療に有効であることを示した。こ
のような治療が有効と思われる疾患には、以下の疾患が非制限的に含まれる：移
植片対宿主病（GVHD）、臓器移植拒絶反応（腎移植、眼科的移植などを非制限的
に含む）、癌（血液（すなわち、白血病およびリンパ腫）および膵臓の癌を非制
限的に含む）、自己免疫疾患（ループスを非制限的に含む）、炎症性疾患（関節
炎）など。
【００３８】 上記の通り、CBL1がCD147と結合することはこれまで示されていなかった。さ らに、CBL1抗体が結合する特定のエピトープまたは抗原は不明であり、少なくと
もその特徴は比較的解明されていなかった。このため、CBL1抗体の安全性および
治療効果は明らかであることから、本発明者らは、CBL1および本発明者らのABX-
CBL抗体が結合する抗原またはエピトープを正確に決定することに関心を抱いた 。さらに本発明者らは、特にGVHDの治療との関連で、CBL1抗体が効果を発揮する
様式をさらに解明することにも関心を抱いた。
【００３９】 ATCCにHB 8214として寄託されている基準としたハイブリドーマ系は完全には 純粋でなかった。この系統は1種類のIgG抗体および1種類のIgM抗体を産生した。
混合リンパ球反応アッセイ法（MLR）において、補体媒介性細胞溶解を阻害する 生物活性を示したのはIgMのみであった。本明細書で考察する通り、この阻害は 特異的および補体依存性であるため、阻害の機序は抗体を介した補体依存性細胞
傷害（CDC）によるものである。このため、本明細書で述べる本発明者らの研究 と関連して、本発明者らは、このIgMのみを産生する細胞系を作製するためにこ の系統のサブクローニングを行った。さらに、CBL1抗体を発現するHB 8214細胞 系は、最初のハイブリドーマ細胞系を調製するために用いた骨髄腫融合パートナ
ーであるP3骨髄腫細胞系に由来すると思われる第2のκ軽鎖（MOPC-21）を有して
いた。本発明者らがサブクローニングしたハイブリドーマ細胞系は両方の軽鎖を
保有および発現し、ABX-CBL抗体は両方の軽鎖を含むと思われる。IgM抗体は一般
に、重鎖および軽鎖の二量体が5つ会合した五量体構造をもつ。ABX-CBL抗体には
2本の軽鎖があることから、本発明者らは、ABX-CBL抗体のIgM五量体構造はこの 両方の軽鎖を、ホモ二量体、ヘテロ二量体ならびにホモおよびヘテロ二量体の組
み合わせによる五量体が形成されるような種々の比率で含むと考えている。
【００４０】 CBL1およびABX-CBLの結合におけるMOPC-21軽鎖の役割は不明であった。本発明
者らの研究と関連して、本発明者らは、例えば、ABX-CBL軽鎖またはMOPC-21軽鎖
のみを発現するハイブリドーマ・サブクローンの調製などにより、MOPC-21軽鎖 の役割を明らかにすることを試みた。本発明者らが用いたアプローチの一つは、
軽鎖シャッフリングを行うためにABX-CBLハイブリドーマをマウス骨髄腫細胞系 と融合させることであった。MOPC-21軽鎖またはABX-CBL軽鎖のみを発現するハイ
ブリドーマを作製することにより、本発明者らは、ABX-CBL結合における2種類の
軽鎖の役割を区別するためのいくつかの特徴分析を行うことが可能となった。
【００４１】 定義 別に定義する場合を除き、本発明に関連して用いる科学用語および専門用語は
、当業者により一般に理解されている意味をもつものとする。さらに、文脈によ
って別の必要性が生じる場合を除き、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用
語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される細胞および組織培
養、分子生物学、ならびに蛋白質およびオリゴ-またはポリヌクレオチド化学お よびハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法、ならびにそれらの技
術は当技術分野で周知のものであり、一般に用いられる。組換えDNA、オリゴヌ クレオチドの合成ならびに組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔法、リポ
フェクション法など）には、標準的な技法を用いる。酵素反応および精製法は、
製造者の仕様書に従って行われるか、当技術分野で一般に行われる通りに、また
は本明細書の記載の通りに行われる。上記の技法および手順は一般に、当技術分
野で周知の従来の方法に従って、本明細書の全体を通じて引用または考察される
種々の一般的およびより詳細な参考文献における記載の通りに行われる。例えば
、本明細書に参照として組み入れられる、サムブルック（Sambrook）ら、分子ク
ローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）（
第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（19
89））を参照されたい。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学ならびに
医薬品および製薬化学に関連して用いられる命名法、ならびにそれらの実験手順
および技術は、当技術分野で周知のものであり、一般に用いられる。化学合成、
化学分析、製剤、配合および送達、ならびに患者の治療には、標準的な技法が用
いられる。
【００４２】 本開示に従って用いられる以下の用語は、別に指示する場合を除き、以下の意
味を有すると理解されるべきである：
【００４３】 本明細書で用いられる「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム
、cDNAもしくは合成物に由来するポリヌクレオチドまたはその何らかの組み合わ
せを意味するものとし、その由来により、「単離されたポリヌクレオチド」は（
1）「単離されたポリヌクレオチド」が天然の状態で見いだされるポリヌクレオ チドの全体または一部を伴っていない、（2）天然の状態で結合していないポリ ヌクレオチドと機能的に結合している、または（3）天然の状態ではより長い配 列の一部としてみられないものである。
【００４４】 本明細書で言及される「単離された蛋白質」という用語は、cDNA、組換えRNA もしくは合成物に由来する蛋白質またはその何らかの組み合わせを意味するもの
とし、その由来により、「単離された蛋白質」は（1）天然の状態で見いだされ る蛋白質を伴っていない、（2）同じ供給源からの他の蛋白質を含まない、例え ばマウス蛋白質を含まない、（3）異なる種からの細胞によって発現される、ま たは（4）天然の状態でみられないものである。
【００４５】 「ポリペプチド」という用語は、本明細書において、天然の蛋白質、断片また
はポリペプチド配列の類似体を指して用いられる。このため、天然の蛋白質、断
片および類似体は、ポリペプチド属の分子種である。
【００４６】 本明細書で対象に適用して用いられる「天然型の」という用語は、対象が自然
界で認められるという事実を指す。例えば、自然界にある供給源から単離しうる
生物体（ウイルスを含む）中に存在し、実験室での人為的操作などによる意図的
な改変を受けていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然型であ
る。
【００４７】 本明細書で用いる「機能的に結合した」という用語は、そのように記載された
複数の構成要素の位置が、それらが意図する様式で機能することを許容する関係
にあることを意味する。コード配列と「機能的に結合した」制御配列は、制御配
列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるような様式で結合している
。
【００４８】 本明細書で用いる「制御配列」という用語は、それらと連結したコード配列の
発現およびプロセシングが生じるために必要なポリヌクレオチド配列を意味する
。このような制御配列の性質は宿主生物によって異なり、原核生物ではこのよう
な制御配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含
み、真核生物では一般にこのような制御配列はプロモーターおよび転写終結配列
を含む。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現およびプロセ
シングのために必須であるすべての構成要素を含み、さらに、例えばリーダー配
列および融合パートナー配列などの、その存在が好都合であるその他の構成要素
も含みうるものとする。
【００４９】 本明細書に対して言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレ
オチドもしくはデオキシヌクレオチド、または改変型のいずれかの種類のヌクレ
オチドである、長さが少なくとも10塩基の重合型ヌクレオチドを意味する。この
用語には、一本鎖型および二本鎖型のDNAが含まれる。
【００５０】 本明細書に対して言及される「オリゴヌクレオチド」という用語には、天然型
および非天然型のオリゴヌクレオチド結合によって互いに結合した天然型および
改変型のヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドとは、一般に長さが200 塩基またはそれ未満であるポリヌクレオチドのサブセットである。好ましくはオ
リゴヌクレオチドは長さ10〜60塩基であり、最も好ましくは長さ12、13、14、15
、16、17、18、19または20もしくは40塩基である。プローブ用などのオリゴヌク
レオチドは通常は一本鎖であるが、遺伝子変異体の作製に用いるなどのためには
オリゴヌクレオチドは二本鎖であってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、
センスオリゴヌクレオチドでもアンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。
【００５１】 本明細書に対して言及される「天然型ヌクレオチド」という用語には、デオキ
シリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが含まれる。本明細書に対して言及
される「改変型ヌクレオチド」という用語には、糖の部分が修飾または置換され
たヌクレオチドなどが含まれる。本明細書に対して言及される「オリゴヌクレオ
チド結合」という用語には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホス
ホロセレノエート（phosphoroselenoate）、ホスホロジセレノエート（phosphor
odiselenoate）、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）、ホス ホルアニラデート（phoshoraniladate）、ホスホロアミデート（phosphoroamida
te）などのオリゴヌクレオチド結合が含まれる。例えば、それらの開示が参照と
して本明細書に組み入れられる、ラプランシュ（LaPlanche）ら、Nucl. Acids R
es. 14：9081（1986）、ステック（Stec）ら、J. Am. Chem. Soc. 106：6077（1
984）、スタイン（Stein）ら、NucI. Acids Res. 16：3209（1988）、ゾン（Zon
）ら、Anti-Cancer Drug Design 6：539（1991）、ゾン（Zon）ら、オリゴヌク レオチドおよび類似体：実践的アプローチ（Oligonucleotides and Analogues：
A Practical Approach）、pp.87〜108（F. Eckstein編、Oxford University Pre
ss、Oxford England（1991））、ステック（Stec）ら、米国特許第5,151,510号 、ウールマン（Uhlmann）およびペイマン（Peyman） Chemical Reviews 90：543
（1990）を参照されたい。必要に応じて、オリゴヌクレオチドには検出用の標識
を含めることが可能である。
【００５２】 本明細書に対して言及される「選択的にハイブリダイズする」という用語は、
検出可能および特異的に結合することを意味する。本発明に係るポリヌクレオチ
ド、オリゴヌクレオチドおよびその断片は、非特異的核酸との検出可能な結合の
量が最小化されるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、核酸鎖と選択的
にハイブリダイズする。選択的ハイブリダイゼーション条件を実現するためには
、当技術分野で知られた、本明細書で考察する高ストリンジェンシー条件を用い
ることができる。一般に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよ
び断片と関心対象の核酸との間の核酸配列相同性は少なくとも80％であり、より
典型的には、好ましくは少なくとも85％、90％、95％、99％および100％という さらに高い相同性を有すると考えられる。2つのアミノ酸配列は、それらの配列 の間に部分的または完全な一致がみられるならば相同的である。例えば、85％の
相同性とは、2つの配列が最も整合するように整列化した場合にアミノ酸の85％ が一致することを意味する。最も高い整合性を得る際には（整合させる2つの配 列のいずれかに）ギャップが許容されるが、ギャップの長さは5またはそれ未満 であることが好ましく、2またはそれ未満であることがさらに好ましい。または および好ましくは、2つの蛋白質配列（または、それらに由来する長さが少なく とも30アミノ酸のポリペプチド配列）は相同であり、この用語は本明細書におい
て、変異データ行列を用い、ギャップペナルティを6またはそれ以上としてALIGN
プログラムを用いて得られたそれらの整列化スコアが（標準偏差単位で）5を上 回る場合に用いられる。デイホフ（Dayhoff, MO.）、蛋白質配列および構造アト
ラス（Atlas of Protein Sequence and Structure）、pp.101〜110（第5巻、Nat
ional Biomedical Research Foundation（1972））およびこの巻の補遺2、pp.1 〜10を参照されたい。2つの配列またはその部分は、ALIGNプログラムを用いてそ
れらのアミノ酸を最適に整列化したときの一致率が50％以上である場合に、より
好ましく相同である。「対応する」という用語は、本明細書において、ポリヌク
レオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全体もしくは一部と相同である（す
なわち、同一であって、進化的に厳密な関連がない）こと、またはポリペプチド
配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味して用いられる。これに対
して、「相補的である」という用語は、本明細書において、相補配列が参照ポリ
ヌクレオチド配列の全体または一部と相同であることを意味して用いられる。例
えば、ヌクレオチド配列「TATAC」は参照配列「TATAC」と対応し、参照配列「GT
ATA」と相補的である。
【００５３】 以下の用語は、2つまたはそれ以上のポリヌクレオチドもしくはアミノ酸配列 の間の配列の関係を説明するために用いられる：「参照配列」「比較域（compar
ison window）」「配列同一性」「配列一致率」および「実質的同一性」。「参 照配列」は、配列比較のための基盤として用いる規定された配列であり、参照配
列は、例えば、配列表に示されたある配列の完全長cDNAまたは遺伝子配列のセグ
メントのような、比較的長い配列のサブセットでもよく、完全長cDNAまたは遺伝
子配列を含んでもよい。一般に、参照配列の長さは少なくとも18ヌクレオチドま
たは6アミノ酸であり、長さが少なくとも24ヌクレオチドまたは8アミノ酸である
ことも多く、長さが少なくとも48ヌクレオチドまたは16アミノ酸であることもし
ばしばである。2つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、互いに（1）2つ の分子間で類似性のある配列（すなわち、完全なポリヌクレオチドまたはアミノ
酸配列の一部）を含みうる、および（2）2つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸
配列の間で異なる配列をさらに含みうるため、2つ（またはそれ以上の）分子間 の配列の比較は、典型的には、配列類似性のある局所的領域を同定および比較す
るための「比較域」にわたる2つの分子の配列の比較によって行われる。本発明 書で用いる「比較域」とは、少なくとも18の連続したヌクレオチド位置または6 アミノ酸配列の概念的セグメントを意味し、このポリヌクレオチド配列またはア
ミノ酸配列は少なくとも18個の連続したヌクレオチドまたは6アミノ酸配列であ る参照配列と比較され、2つの配列の最適な整列化のために、比較域におけるポ リヌクレオチド配列の一部は、参照配列（付加および欠失を含まない）と比較し
て20％またはそれ未満の付加、欠失、置換など（すなわち、ギャップ）を含みう
る。比較域を整列化させるための配列の最適な整列化は、スミス（Smith）およ びウォーターマン（Waterman） Adv. Appl. Math. 2：482（1981）の局所的相同
性アルゴリズムにより、ニードルマン（Needleman）およびブンシュ（Wunsch）
J. Mol. Biol. 48：443（1970）の相同性整列化アルゴリズムにより、ピアソン （Pearson）およびリップマン（Lipman） Proc. Natl. Acad Sci.（US.A.）85：
2444（1988）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ・イ
ンプリメンテーション（Wisconsin Geneticsソフトウエアパッケージ・リリース
7.0（Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、Wis.）のGAP、BES
TFIT、FASTAおよびTFASTA、GeneworksまたはMacVectorソフトウエアパッケージ ）により、または検査によって行うことができ、種々の方法によって生じた最善
の整列化（すなわち、比較域にわたる相同性の比率が最も高くなるもの）を選択
する。
【００５４】 「配列同一性」という用語は、2つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が 比較域にわたって同一である（すなわち、個々のヌクレオチドまたは残基のレベ
ルで）ことを意味する。「配列一致率」という用語は、最適に整列化された2つ の配列を比較域にわたって比較し、一致する位置の数を得るために両方の配列で
同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、UまたはI）または残基がみられる位置の
数を決定し、一致した位置の数を比較域における位置の総数（すなわち、セグメ
ントサイズ）で割り、配列一致率を得るためにその結果に100を掛けることによ って算出される。本明細書で用いる「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレ
オチドまたはアミノ酸が、少なくとも18ヌクレオチド（6アミノ酸）の位置から なる比較域にわたっての、しばしば少なくとも24〜48ヌクレオチド（8〜16アミ ノ酸）の位置からなる比較域にわたっての参照配列との比較により、少なくとも
85％の配列一致率を有し、好ましくは少なくとも90〜95％の配列一致率、より一
般的には少なくとも99％の配列一致率を有する配列を含むという、ポリヌクレオ
チドまたはアミノ酸配列の特性を表し、ここで配列一致率は比較域の各位置にわ
たる参照配列との比較によって算出され、配列一致率は、参照配列と、比較域に
わたって全体で参照配列の20％またはそれ未満の欠失または付加を含みうる配列
とを比較することによって算出される。参照配列はより長い配列のサブセットで
あってもよい。
【００５５】 本明細書で用いる20種の通常のアミノ酸およびそれらの略号は、慣例的な用法
に従う。参照として本明細書に組み入れられる、免疫学―一つの総合体（Immuno
logy - A Synthesis）（第2版、ES. GolubおよびD.R. Gren編、Sinauer Associa
tes、Sunderland、Mass.（1991））を参照されたい。20種の通常のアミノ酸の立
体異性体（例えば、D-アミノ酸）、α,α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸
などの人工的アミノ酸、乳酸およびその他の一般的でないアミノ酸も、本発明の
ポリペプチドのための適した構成要素となりうる。通常でないアミノ酸の例には
以下のものが含まれる：4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、 ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、N-アセチ
ルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、
σ-N-メチルアルギニン、ならびにその他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例 えば、4-ヒドロキシプロリン）。本明細書で用いられるポリペプチドの表記法で
は、標準的な用法および慣習に従い、左側がアミノ末端の向きであり、右側がカ
ルボキシ末端の向きである。
【００５６】 同様に、別に特記する場合を除き、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側が5'末
端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側は5'方向を意味する。新生RNA転 写物の5'から3'側への付加を転写方向と呼び、RNAと同じ配列を有し、RNA転写物
の5'末端に対して5'側にあるDNA鎖上の配列領域を「上流配列」と呼び、RNAと同
じ配列を有し、RNA転写物の3'末端に対して3'側にあるDNA鎖上の配列領域を「下
流配列」と呼ぶ。
【００５７】 ポリペプチドに対して用いる「実質的同一性」という用語は、初期設定ギャッ
プウェイト値を用いるGAPまたはBESTFITプログラムなどによって最適に整列化し
た場合に、2つの配列が少なくとも80％の配列一致率を有し、好ましくは少なく とも90％の配列一致率、より好ましくは少なくとも95％の配列一致率、最も好ま
しくは少なくとも99％の配列一致率を有することを意味する。同一でない残基位
置は、保存的アミノ酸置換による違いであることが好ましい。保存的アミノ酸置
換とは、類似した側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を
有するアミノ酸の一群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイ
シンであり、脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の一群はセリンおよび トレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の一群はアスパラギンおよ
びグルタミンであり、芳香族アミノ酸を有するアミノ酸の一群はフェニルアラニ
ン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の一群
はリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、イオウ含有側鎖を有するアミノ
酸の一群はシステインおよびメチオニンである。好ましいアミノ酸置換の群は以
下の通りである：バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン 、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、およ びアスパラギン-グルタミン。
【００５８】 本明細書で考察する通り、抗体または免疫グロブリン分子におけるアミノ酸配
列のわずかな変化は、そのアミノ酸配列における変化が少なくとも75％、より好
ましくは少なくとも80％、90％、95％、最も好ましくは99％を維持している限り
、本発明に包含されるものと考えられる。特に、保存的アミノ酸置換は考慮の対
象である。保存的置換とは、それらの側鎖、側鎖が類似したアミノ酸のファミリ
ー内で起こるもののことである。遺伝子にコードされるアミノ酸は一般に以下の
ファミリーに分類される：（1）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸、（2）塩
基性＝リジン、アスパラギン酸、ヒスチジン、（3）非極性＝アラニン、バリン 、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプ
トファン、および（4）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、シ ステイン、トレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは以下のものである
：セリンおよびトレオニンは脂肪族-ヒドロキシファミリーであり、アスパラギ ンおよびグルタミンはアミド含有ファミリーであり、アラニン、バリン、ロイシ
ンおよびイソロイシン脂肪族ファミリーであり、およびフェニルアラニン、トリ
プトファンおよびチロシンは芳香族ファミリーである。例えば、ロイシンをイソ
ロイシンまたはバリンでその部分のみを交換し、アスパラギン酸をグルタミン酸
で、トレオニンをセリンで、または同様にアミノ酸を構造的に類似したアミノ酸
で交換しても、特にその交換がフレームワーク部位内のアミノ酸でない場合には
、その結果得られる分子の結合性または特性に大きな影響は生じないであろうこ
とが十分に予想される。アミノ酸の変化によって機能的ペプチドが生じるか否か
は、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることによって容易に明らかにな
る。アッセイについては本明細書で詳細に説明する。当業者は、抗体または免疫
グロブリン分子の断片もしくは類似体を容易に調製することができる。断片また
は類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界
の近傍にみられる。構造的および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／また
はアミノ酸配列データを公的または所有権のある配列データベースと比較するこ
とによって同定しうる。コンピュータ化された比較法を用いて、構造および／ま
たは機能が知られているその他の蛋白質でみられる配列モチーフまたは蛋白質立
体構造ドメインと予想される部位を同定することが好ましい。フォールディング
によって既知の三次元構造をとる蛋白質配列を同定するための方法は知られてい
る。ボウイ（Bowie）ら、Science 253：164（1991）。したがって、上記の例は 、本発明による構造的および機能的ドメインを規定するために用いうる配列モチ
ーフおよび立体構造を当業者が認識しうることを示している。
【００５９】 好ましいアミノ酸置換は以下のようなものである：（1）蛋白質分解に対する 感受性を低下させる、（2）酸化に対する感受性を低下させる、（3）蛋白質複合
体の形成のための結合親和性を変化させる、（4）結合親和性を変化させる、お よび（5）このような類似体のその他の物理化学的または機能的特性を付与また は改変する。類似体には、天然型ペプチド配列以外の種々の突然変異配列が含ま
れうる。例えば、天然型配列に単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは保存
的アミノ酸置換）を加えることができる（分子間接触を生じるドメインの外側に
あるポリペプチド部分におけるものが好ましい）。保存的アミノ酸置換は、親配
列（parent sequence）の構造的特徴を実質的に変化させない必要がある（例え ば、置換アミノ酸は親配列にみられるヘリックス、または親配列を特徴づけるそ
の他の種類の二次構造を破壊するようなものではあるべきでない）。当技術分野
で認識されているポリペプチドの二次構造および三次構造は、蛋白質、構造およ
び分子的原理（Proteins、StructuresおよびMolecular Principles）（Creighto
n編、W. H. Freeman and Company、New York（1984））、蛋白質構造入門（Intr
oduction to Protein Structure）（C. BrandenおよびJ. Tooze編、Garland Pub
lishing、New York、N.Y.（1991））およびソーントン（Thornton）ら、Nature
354：105（1991）に記載されており、これらはそれぞれ参照として本明細書に組
み入れられる。
【００６０】 本明細書で用いられる「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端および
／またはカルボキシ末端に欠失を有するものの、残ったアミノ酸配列が、例えば
完全長cDNA配列などから推定される天然型配列における対応する位置と同一であ
るようなポリペプチドを意味する。断片は典型的には少なくとも5、6、8または1
0アミノ酸長であり、好ましくは少なくとも14アミノ酸長、より好ましくは少な くとも20アミノ酸長、通常は少なくとも50アミノ酸長であって、さらにより好ま
しくは少なくとも70アミノ酸長である。本明細書で用いられる「類似体」という
用語は、推定されるアミノ酸配列の一部と実質的同一性のある少なくとも25アミ
ノ酸のセグメントから構成され、以下の特性の少なくとも1つを有するポリペプ チドを意味する：（1）適した結合条件下でのCD147との特異的結合、（2）CD147
のリガンドもしくは受容体との結合を改変する能力、または（3）インビトロま たはインビボでCD147発現細胞の死滅または増殖阻害をもたらす能力。典型的に は、ポリペプチド類似体は天然型配列からみて保存的アミノ酸置換（または付加
もしくは欠失）を含む。類似体は典型的には少なくとも20アミノ酸長、好ましく
は少なくとも50アミノ酸長またはそれ以上であり、しばしば完全長の天然型ポリ
ペプチドと同じ長さでありうる。
【００６１】 ペプチド類似体は、鋳型ペプチドと類似した特性を備えた非ペプチド薬として
製薬業界で一般に用いられている。これらのタイプの非ペプチド薬は「ペプチド
模倣薬（peptido mimeticsまたはpeptidomimetics）」と呼ばれている。フォー シュロー（Fauchere）、J. Adv. Drug Res. 15：29（1986）、ヴェーバー（Vebe
r）およびフライディンガー（Freidinger）TINS p.392（1985）ならびにエバン ス（Evans）ら、J. Med. Chem. 30：1229（1987）、これらは参照として本明細 書に組み入れられる。このような化合物はしばしば、コンピュータを用いる分子
モデリングを利用して開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似した
ペプチド模倣薬は、同等な治療または予防効果を得るために用いることができる
。一般に、ペプチドミメティクスはヒト抗体などの模範ポリペプチド（すなわち
、生化学的特性または薬理活性を有するポリペプチド）と構造的に類似している
が、1つまたは複数のペプチド結合が、当業者に周知の方法により、CH2NH--、--
CH2S--、--CH2-CH2--、--CH=CH--（シスおよびトランス）、--COCH2--、--CH(OH
)CH2--および-CH2SO--からなる群より選択される結合によって選択的に置換され
ている。より安定性の高いペプチドを作製するために、共通配列の1つまたは複 数のアミノ酸を同じ種類のD-アミノ酸（例えば、L-リジンの代わりにD-リジン）
によって体系的に置換することが可能である。さらに、例えば、ペプチドを環化
する分子内ジスルフィド結合を形成しうる内部システイン残基の付加などによる
、当技術分野で知られた方法（RizoおよびGierasch Ann. Rev. Biochem. 61：38
7（1992）、これは参照として本明細書に組み入れられる）により、共通配列ま たは実質的に同一な共通配列の変形物を含む拘束的ペプチド（constrained pept
ide）も作製することもできる。
【００６２】 「抗体」または「抗体ペプチド」とは、完全な抗体（intact antibody）、ま たは特異的結合に関して完全な抗体と競合するその結合断片を意味する。結合断
片は、組換えDNA技術により、または完全な抗体の酵素的もしくは化学的切断に よって作製される。結合断片には、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvおよび一本鎖抗体が
含まれる。「二重特異性」または「二価」抗体以外の抗体では、それぞれの結合
部位は同一であると考えられている。抗体は、過剰量の抗体が、カウンター受容
体と結合した受容体の量を少なくとも約20％、40％、60％または80％、より一般
的には約85％を上回って減少させる（インビトロ競合結合アッセイ法における測
定による）場合に、受容体のカウンター受容体との付着を実質的に阻害するとい
う。
【００６３】 「エピトープ」という用語には、免疫グロブリンまたはT細胞受容体と特異的 に結合しうる任意の蛋白質決定基が含まれる。エピトープ決定基は通常、アミノ
酸、糖またはその他の糖質側鎖などの化学的活性をもつ分子群からなり、一般に
特定の三次元構造上の特性ならびに特定の荷電特性を有する。解離定数が1μM未
満、好ましくは100nM未満、最も好ましくは10nM未満である場合に、抗体は抗原 と特異的に結合するという。
【００６４】 「作用物質（agent）」という用語は、化合物、化合物の混合物、生体高分子 、または生物材料から作製された抽出物を意味する。
【００６５】 本明細書で用いられる「標識」または「標識された」という用語は、例えば、
放射性標識されたアミノ酸の取り込み、または目印となるアビジン（例えば、光
学的方法または比色法によって検出しうる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むス
トレプトアビジン）によって検出しうるビオチン化部分（moiety）のポリペプチ
ドとの付着などによる、検出マーカー（detectable marker）の取り込みを意味 する。状況によっては、標識またはマーカーが治療薬であってもよい。当技術分
野ではさまざまなポリペプチドおよび糖蛋白質の標識の方法が知られており、そ
れらを用いることができる。ポリペプチドに対する標識の例には、以下のものが
非制限的に含まれる：放射性同位元素または放射性核種（例えば、3H、14C、15N
、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I）、蛍光標識（例えば、FITC、ローダミ ン、ランタニドリン）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β- ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光物質
、ビオチン基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ
（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメ
イン、エピトープタグ）。いくつかの態様においては、想定される立体障害を軽
減するために、種々の長さのスペーサー（spacer arm）を介して標識を付着させ
る。
【００６６】 本明細書で用いられる「医薬品（pharmaceutical agent) または薬物（drug）
」という用語は、患者に適切に投与された場合に望ましい治療効果を誘発しうる
化合物または組成物を意味する。本明細書のその他の化学用語は、例えば、マグ
ローヒル化学用語辞典（The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms）（Pa
rker、S編.、McGraw-Hill、San Francisco（1985））、これは参照として本明細
書に組み入れられる）にある通り、当技術分野における慣例的用法に従って用い
られる。
【００６７】 本明細書で用いられる「休止期T細胞および休止期B細胞に対して実質的に無毒
である」という用語は、好ましくは、補体の存在下における抗体による休止期細
胞の枯渇レベルが、活性化TおよびB細胞の枯渇レベルに比べて少なくとも2分の1
未満であることを意味する。より好ましくは、休止期細胞の細胞枯渇レベルは、
活性化細胞の枯渇レベルと比べて少なくとも5分の1未満である。さらに、休止期
細胞の枯渇が全く検出されないことが最も好ましい。
【００６８】 ABX-CBL抗原の同定および特徴分析 本発明者らは、ABX-CBL抗体が結合する抗原の同定および特徴分析を行うため に、（i）イムノアフィニティー精製によるアプローチ、および（ii）古典的蛋 白質精製によるアプローチという2つの主要なアプローチを試みた。
【００６９】イムノアフィニティー精製 本発明者らは、CBL1抗体が結合した抗原のイムノアフィニティー精製について
検討した。CBL1抗体が結合した抗原は、フォーリー（Foley）ら、Cancer 18：52
2〜529（1965）により得られたTリンパ芽球細胞系であり、ATCC（Rockville、MD
）（ATCC番号CCL-119）から入手可能なCEM細胞上に高発現されるように思われた
。天然型のABX-CBL抗体を用いるイムノアフィニティー精製は、ABX-CBL抗体が五
量体構造をもつIgM抗体であり、インビトロで非特異的相互作用を生じやすいと いう事実が妨げとなった。このため、本発明者らはCEM細胞に対するヒトIgG2抗 体を調製し、CEM細胞との結合アッセイ法におけるABX-CBL抗体との競合に関して
検討した。この種のヒト抗体は、それらの開示の全体が参照として本明細書に組
み入れられるメンデス（Mendez）ら、Nature Genetics 15：146〜156（1997）お
よび1996年12月3日に提出された米国特許出願第08／759,620号に従い、ゼノマウ
ス（XenoMouse）（登録商標） に対してCEM細胞による免疫処置を行った後に融 合を行い、ABX-CBL抗体を用いるFACS競合アッセイ法においてその結果得られた ハイブリドーマの上清をCEM細胞に対してスクリーニングすることによって調製 した。FACS競合アッセイ法では、FITCで標識したABX-CBL抗体のCEM細胞との結合
の阻害を、単独の場合およびCEM細胞に対する反応性をもつヒト抗体を含むハイ ブリドーマ上清の存在下の両方に関して分析した。
【００７０】 このようにして4種類のハイブリドーマクローンが単離され、それらがCEM細胞
との結合においてABX-CBL抗体と高度に競合することが明らかになった。ハイブ リドーマクローンのうち、2.6.1と命名された1種類をその後の分析のために選択
した。本発明者らは、2.6.1ハイブリドーマを含むハイブリドーマのそれぞれに 関してSCIDマウスに腹水を生じさせ、標準的な条件を用いるプロテインAアフィ ニティー精製工程を用いて2.6.1抗体を精製した。精製された2.6.1抗体から、本
発明者らはイムノアフィニティーカラムを調製した。カラムの調製のためには、
精製した2.6.1抗体を、製造者の仕様書に従ってCNBr活性化セファロース-4Bと結
合させた。約2.0gの活性化セファロースに対して約8.4mgの抗体が結合した。本 発明者らはCEM細胞の細胞可溶化物をカラムに通し、結合した成分を溶出させた 。溶出産物をウェスタンブロット法ならびにABX-CBL抗体および2.6.1抗体の両方
によるプローブ検索によって分析した。予備的データに基づくと、2.6.1抗体は 約45〜55KDの幅の広いバンドに含まれる単一分子または複数の分子に対して最も
強く結合したが、これに対して、約45〜55KDの同様の幅広いバンドに対してABX-
CBL抗体が示した結合の強度は低かった。分取ゲル電気泳動およびエレクトロブ ロッティング法により、本発明者らは45〜55KDバンドの部分を単離し、部分的ア
ミノ酸配列を入手した（35／40残基）。この結果得られた配列情報を蛋白質デー
タベース検索（Protein Identification Resourse（PIR）R47.0、1995年12月） によって解析したところ、配列比較データからこの分子がCD147であることが示 された。
【００７１】蛋白質の精製およびシークエンシング ABX-CBL抗体が結合する抗原の特徴分析に関する本発明者らの研究に関連して 、本発明者らは、ABX-CBLがウェスタンブロット上で35KDおよび62KDの比較的狭 いバンドに局在する分子に対して顕著に結合することを見いだした。この35KDバ
ンドは、培養期間および完全には解明されていないその他の条件に応じて、調製
のたびごとに変化するように思われた。このため、本発明者らは、この62KDの物
質をまず精製した。N末端はブロックされているため、本発明者らは蛋白質をCNB
rで切断し、切断の結果得られたペプチドのうち2種類のシークエンシングを行っ
た。この結果得られた配列情報を蛋白質データベース検索（Protein Identifica
tion Resourse（PR）R47.0、1995年12月）によって解析したところ、配列比較デ
ータからこの分子がヘテロリボ核蛋白質k（hnRNP-k）であることが示された。こ
の種の分子は細胞内成分の一つであるため、ABX-CBL抗体が細胞外成分を認識し たように思われたという観察結果とは一致しない。しかしながら、この分子が同
定されたことは、エピトープの解明などの点で、ABX-CBLのCD147との結合に関す
る理解をさらに深める意味では有用と考えられる。
【００７２】 同じような理由から35KDバンドの特徴分析も行うことができる。このようなア
プローチにおいて、35KD分子は、上記の62KDバンドに関して用いたものと同様の
様式で精製可能である。45〜55KD CD147バンドに含まれる物質との間に存在しう
る構造的差異をさらに解明するために、35KDバンドからの精製物質の特徴分析を
行うこともできる。この物質がCD147であることを示すため、またはABX-CBLのCD
147との結合に関するエピトープ情報を明らかにするために、35KDバンドに含ま れる物質のシークエンシングを行うことも可能である。
【００７３】CD147結合のさらなる解明およびABX-CBLのエピトープ分析 上記の通り、ABX-CBL抗体のCD147分子との結合の解明については別の領域での
検討もなされている。本発明者らは、ABX-CBL抗体の安全性および有効性からみ て、ABX-CBL抗体のCD147との結合を模倣する分子、特に抗体は、同程度の安全性
を有すると考えている。このため、ABX-CBL抗体のCD147との結合をさらに解明す
る目的で、本発明者らは上記の点を解明するための実験を計画またはデザインし
た。本発明者らの実験は、（i）CD147のクローニングおよび真核（COS）細胞に おける発現、（ii）原核（大腸菌）細胞における発現、ならびに（iii）ファー ジディスプレイ法を用いてのランダムペプチドライブラリーのスクリーニング、
を含む。
【００７４】CD147のクローニングおよびCOS細胞での発現 本発明者らは、ジャーカット（Jurkat）ライブラリー（Stratagene）からCD14
7 cDNAをクローニングし、トランスフェクション用の構築物を調製し、COS細胞 に対してCD147 cDNAによるトランスフェクションを行った。上記のABX-CBL抗体 、2.6.1抗体およびファーミンゲン社（Pharmingen）の抗体を用いるFACS分析お よびウェスタンブロット法を用いて、トランスフェクト細胞をCD147発現に関し て分析した。CD147 cDNAによるトランスフェクションを受けたCOS細胞は、FACS およびウェスタンブロット分析のそれぞれにおいてそれぞれの抗体に対する結合
を示した。これに対して、対照ベクターによるトランスフェクションを受けたCO
S細胞は、2.6.1およびABX-CBL抗体のそれぞれとの結合に関して陰性であった。 ファーミンゲン社（Pharmingen）の抗体に関しては、FACSでは対照ベクターによ
るトランスフェクションを受けた細胞である程度のバックグラウンド染色が認め
られたが、ウェスタンブロット分析では結合は認められなかった。トランスフェ
クト細胞は、FACSではバックグラウンド値を上回る顕著な結合を示し、ウェスタ
ンブロット分析でも陽性であった。本発明者らの結果により、ABX-CBLおよび2.6
.1抗体がCD147と結合することが確かめられた。
【００７５】大腸菌細胞におけるCD147の発現 わずかな改変を加えたベクターを用いて、本発明者らは大腸菌細胞に対しても
CD147 cDNAによるトランスフェクションを行った。このようなトランスフェクシ
ョンを受けた大腸菌細胞は、ABX-CBL、2.6.1およびファーミンゲン社（Pharming
en）の各抗体のウェスタンブロット分析によって示された通り、CD147分子を発 現することができた。原核細胞である大腸菌細胞では、発現されたCD147はグリ コシル化されないと考えられるため、大腸菌によって発現されるCD147の分子量 は、グリコシル化されていないCD147の予想分子量である約27KDに近いはずであ る。事実、いずれの場合も、ウェスタンブロット分析での3種類の抗体の結合は 約27〜30KDの間のバンドに対して観察された。
【００７６】 このデータは、ABX-CBLおよび2.6.1抗体がCD147と結合することをさらに裏づ ける。さらにこの知見は、ABX-CBLのCD147との結合が糖質結合に直接基づくもの
ではないこと、すなわちABX-CBLがCD147上の糖質エピトープとは直接結合しない
ことを示している。しかし、この種のデータは、CD147の結合が糖質の存在また はグリコシル化によって影響を受ける可能性を否定するものではない。
【００７７】ファージディスプレイを用いたスクリーニング ABX-CBL抗体のCD147との結合をさらに解明するために、本発明者らはファージ
ディスプレイ実験を試みた。この種の実験は、ABX-CBLおよび2.6.1抗体との結合
に関してランダムペプチドを発現するファージライブラリーのパニングを行い、
結合するペプチドを単離しうるかどうかを検討することによって行った。これが
成功すれば、結合するペプチドからある種のエピトープ情報を収集することが可
能である。
【００７８】 ランダムペプチドを発現するファージライブラリーは概して、バクテリオファ
ージM13システムに基づくものをニューイングランドバイオラブス（New England
Biolabs）社から購入した（7量体および12量体ライブラリー、それぞれPh.D.-7
Peptide 7-mer Library KitおよびPh.D.-12 Peptide 12-mer Library Kit）。7
量体（7-mer）ライブラリーは約2.0×109種の独立クローンからなる多様性を有 し、すべてを網羅するわけではないが、最大で208＝1.28×109通りの7量体配列 に相当する。12量体（12-mer）ライブラリーは約1.9×109種の独立クローンを有
し、考えられる配列空間（sequence space）である2012＝4.1×1015通りの12量 体配列のうちごく一部をサンプリングしたものに相当する。適切な抗体を捕捉す
るための抗体（2.6.1抗体の場合はヤギ抗ヒトIgG Fc、ABX-CBL抗体の場合はヤギ
抗マウスμ鎖）でプレートをコーティングした後に洗浄するという製造者の推奨
に従い、7量体および12量体ライブラリーのそれぞれのパニングまたはスクリー ニングを行った。結合したファージを0.2M グリシン-HCl、pH 2.2で溶出させた 。一定のストリンジェンシー（0.5％Tween）で選択／増幅を3回行った後、本発 明者らはDNAシークエンシングを用いて、ABX-CBL抗体に対する反応性をもつ7量 体ライブラリーからの合計5クローンおよび12量体ライブラリーからの合計6クロ
ーン、ならびに2.6.1抗体に対する反応性をもつ7量体および12量体ライブラリー
のそれぞれからの合計6クローンずつに関する特徴分析を行った。ペプチドの反 応性はELISAによって判定した。ペプチドのエピトープ分析に関する補足的な考 察については、スコット（Scott, J.K.）およびスミス（Smith, G.P.） Science
249：386〜390（1990）、クビルラ（Cwirla）ら、PNAS USA 87：6378〜6382（1
990）、フェルシ（Felici）ら、J. Mol. Biol. 222：301〜310（1991）およびク
ワバラ（Kuwabara）ら、Nature Biotechnology 15：74〜78（1997）も参照され たい。
【００７９】 2.6.1抗体のCD147との反応性に関する共通配列は直ちに明らかとはならなかっ
た。しかし、アミノ酸配列of CD147のアミノ酸配列に対して、特徴分析がなされ
た7量体および12量体配列の配列整列化を行うことにより、CD147中の残基番号17
7から残基番号188までの単一の配列（ITLRVRSH（配列番号：1））に対して多数 のマッチングが得られた。特に、7量体のそれぞれは、CD147のこの配列中の3個 またはそれ以上の残基に対して配列の一致（*で表す）を含んでいた：
【００８０】7量体配列
【００８１】 さらに、12量体のうち4つはCD147のこの配列中の3個またはそれ以上の残基に 対して配列の一致（*で表す）を含んでおり、12量体ペプチドの1番は4カ所で一 致し、12量体ペプチドの2番は6カ所で一致していた：12量体配列
【００８２】 これらの結果は、配列が決定されたクローンのうち10種に存在するRXRS（配列
番号：11）が共通配列であることを示している。このため、本発明者らは、CD14
7の残基169〜183にわたって以下の配列を有する（-OHはカルボキシ末端を表す）
合成ペプチドを調製した（AnaSpec Incorporated、San Jose、CAによる）：
【００８３】 以下にCD147のアミノ酸配列を示すが、ここでは二重下線によって15量体ペプ チドの配列を示すとともに、RXRSH（配列番号：13）共通配列を太字で示してい る。さらに、CD147のN結合型グリコシル部位を下線およびイタリック体によって
示している：CD147配列
【００８４】 15量体ペプチドをELISAを用いてアッセイしたところ、ABX-CBL抗体がこのペプ
チドと特異的に結合することが明らかになった。さらに、2.6.1抗体および対照 マウスIgM抗体はいずれもこのペプチドと結合しなかった。しかし、CD147抗原と
15量体ペプチドとの間の競合試験に基づけば、ABX-CBL抗体の15量体ペプチドと の結合が測定可能であったのは15量体ペプチドをプレート上にコーティングした
場合のみであり、ペプチドが溶液中にある場合にはそうでなかった。事実、ABX-
CBL抗体をプレートにコーティングしたこのペプチドまたはCD147抗原のいずれか
に対して結合させる競合実験では、それが高濃度の場合にも、溶液中のこのペプ
チドによってABX-CBL抗体は除去または置換されなかった。にもかかわらず、ABX
-CBL抗体の15量体ペプチドとの結合は、CD147抗原および上記の陽性ファージ調 製物によって特異的競合を受けることが可能であり、一方、非特異的抗原（すな
わち、細胞膜またはヒト血漿から単離されたL-セレクチン）および上記の陰性フ
ァージ調製物では競合を受けなかった。同様に、プレインキュベーションを用い
た競合アッセイでも、ABX-CBL抗体のCD147抗原との結合は、陰性ファージ調製物
と対比して陽性ファージ調製物では特異的競合を受けた。
【００８５】 これらの結果は、共通配列RXRSHを含むCD147中の配列はABX-CBL抗体のCD147と
の結合に重要であるが、ABX-CBLのCD147との結合をすべて説明するものではない
ことを示している。事実、このデータは、プレートと結合した場合に15量体ペプ
チドに共通配列が含まれるか、または反応性ファージ物質がファージのコート蛋
白質に係留された場合の方が溶液中の遊離ペプチドよりもABX-CBL抗体とより強 固に結合するという可能性も示唆する。以上を総合すると、何らかの特定の理論
または作用様式に拘束される意図はないものの、CD147は溶液中の15量体ペプチ ドが十分に模倣しえないある種の立体構造をとると考えることができる。しかし
ながら、上記のエピトープ情報は、ABX-CBL抗体がCD147と結合する様式の理解の
ため、および治療標的としてのCD147に対するその他の候補分子の作製のために 重要である。
【００８６】 CD147中にRXRSH共通配列が存在するという上記の結果に加えて、本発明者らが
、ABX-CBLが同じく結合すると思われるhn-RNIP-k蛋白質における共通配列の存在
を探索したことを指摘することにも興味がもたれる。この種の分析は、上記のフ
ァージ由来ペプチドに対する配列整列化によって行った。2つの配列に、統計的 に興味深い一致があることが判明した：
【００８７】 第1に、7量体ペプチドの4番との間に5アミノ酸の一致（*によって表す）がみ られた：
【００８８】 第2に、12量体ペプチドの1番との間に5アミノ酸の一致（*によって表す） が みられた：
【００８９】 このような配列を二重下線によって示した上で、hn-RNP-k蛋白質のアミノ酸配
列を以下に提示する。さらに、hn-RINP-k蛋白質の配列中にはRXR配列モチーフが
数多く存在するため、それらも下線によって示す：hn-RNP-k蛋白質配列
【００９０】 何らかの特定の理論または作用様式に拘束されることは望まないが、ABX-CBL 抗体のhn-RNP-k蛋白質との結合は、蛋白質中にこれらのモチーフが存在すること
によって一部は説明される。
【００９１】抗原の同定および分析の結果の考察 ABX-CBL抗体の45〜55KDバンドとの結合の強度が、CEM細胞可溶化物中の35KDバ
ンドとの結合よりも低かったことを指摘することは興味深い。しかし、ABX-CBL 抗体に関する何らかの特定の理論または作用様式に拘束されることは望まないが
、この35KDバンドは別のエピトープを表すか、またはCD147の代替的形態である 可能性があると考えられる。事実、上記の通り、文献にはCD147の選択的スプラ イシングまたはグリコシル化の差異に関する証拠が示されている。例えば、カネ
クラ（Kanekura）ら、Cell Struct Funct 16：23〜30（1991）（Basigin）、シ ュロスハウアー（Schlosshauer B） Development 113：129〜140（1991）（ニュ
ーロセリン）、ファドゥール（Fadool） JM & Linser PJ J Neurochem 60：1354
〜136（1993）（5A11／HT7）、ネーメ（Nehme）ら、J Cell Biol 120：687〜694
（1993）（CE9）、デカストロ（DeCastro）ら、J lnvest Dermatol 106：1260〜
1265（1996）（EMMPRIN）、スプリング（Spring）ら、Eur J Immunol 27：891〜
897（1997）（Oka）を参照されたい。事例証拠からは、35KDバンドがCD147の単 一グリコシル化型である可能性が示されている。カネクラ（Kanekura）ら、Cell
Struct Funct 16：23〜30（1991）参照。さらに、市販の2種類の抗CD147抗体（
RDI、Flanders、NJから販売されているRDI-CBL535（抗CD147IgG2抗体）、および
Pharmingen、San Diego、CAから販売されている36901A（抗CD147IgG1抗体））に
よって得られたウェスタンブロットをABX-CBLおよび2.6.1抗体と比較することに
より、市販の抗体のそれぞれが、分子量が35KD前後であって、ABX-CBL抗体によ って認識される35KDと類似すると思われる分子を認識することが示された。しか
し、45〜55KDの幅広いバンドの方が強度は上回った。図1参照。
【００９２】 予備的データに基づくもう1つの興味深い観察結果は、上記のイムノアフィニ ティー精製において、2.6.1抗体からの溶出産物をABX-CBL抗体によってプローブ
検索した場合には、ウェスタンブロットで35KDバンドが認められなくなったこと
である。より正確にいえば、ABX-CBL抗体は45〜55KDの幅広いバンドと比較的低 い強度で結合するように思われた。
【００９３】 さらに、ファージディスプレイ実験における本発明者らの結果は、ABX-CBL抗 体および2.6.1抗体が異なるエピトープと結合することを示している。しかし、 大腸菌細胞におけるCD147の発現に関する本発明者らの研究、およびファージデ ィスプレイ研究に基づくと、ABX-CBL抗体はCD147のある蛋白質エピトープを認識
すると思われ、グリコシル化のみがABX-CBLのCD147との結合の原因であるとは思
われない。
【００９４】 とはいえ、以上のすべてを総合して考えると、本発明者らの結果およびデータ
は、ABX-CBL抗体がCD147抗原と結合することを示している。しかし、ABX-CBL抗 体は、2.6.1または市販の抗体によって認識されるものとは異なるエピトープを 優先的に認識するように思われる。ABX-CBL抗体がCD147抗原と結合するという本
発明者らの所見は、特定の細胞上に発現されるCD147の一形態が、疾患の治療の ための有力な治療標的であることを示している。
【００９５】 CD147療法の様式の機能的解明 上記の通り、CBL1抗体は患者のGVHDの治療に広く用いられている。実際に数多
くのGVHD患者がCBL1抗体を用いて治療されており、成功率も高い。角膜移植およ
び腎臓移植に関する試験では、同程度の有効性が示されている。さらに、安全上
の懸念および副作用の徴候も認められていない。上記の通り、CD147が人体の種 々の組織および細胞で広く発現されていることを考えれば、これは驚くべきこと
である。CD147に対する抗体が種々の副作用を引き起こす可能性を懸念する向き もあると思われる。このため、本発明者らは、GVHDの好転（reversal）に関する
モデルに対象を絞り、CBL1抗体が疾患の治療をもたらす機序を検討することも試
みた。この機序を解き明かすことは、CBL1抗体が患者に有効な理由の解明に役立
つと思われ、CBL1抗体が結合する抗原であるCD147を疾患の治療に用いるやり方 に関する理解ももたらすと考えられる。
【００９６】 疾患の治療におけるCBL1抗体の安全性および特異性についてはいくつかの説明
が考えられる。これらには（i）補体媒介性殺細胞（補体依存性細胞傷害、CDC）
には独特の役割がある、（ii）活性化されつつあるある種の細胞はCBL1結合およ
び殺細胞に対する感受性が高くなる、（iii）ある種の細胞集団には、CBL1誘発 性CDCに対する抵抗性を細胞に付与する特定の保護要素が存在する、（iv）特定 の細胞集団（これはCDCにも関係しうる）ではCD147の発現レベルが高い、および
（v）CBL1抗体は、特定の細胞集団（上記の通り）の表面に発現される特定形態 のCD147と結合する、などが非制限的に含まれる。以下では、これらの役割のそ れぞれについて詳細に考察する。
【００９７】補体媒介性殺細胞 補体媒介性殺細胞（補体依存性細胞傷害、CDC）はCBL1抗体との関連でこれま でに研究されているが、本発明者らはその役割をさらに詳細に検討した。
【００９８】CBL1に関する従来の検討 上記のUCLAのグループ（例えば、米国特許第5,330,896号および第5,643,740号
を参照）は、CBL1抗体はある種の活性化細胞集団を死滅させることによって作用
するが、非活性化細胞とは反応しないという一定の証拠を提示している。例えば
、微量細胞傷害アッセイでは、CBL1抗体が活性化リンパ球を死滅させるが、非活
性化リンパ球およびその他の正常細胞は死滅させないことが開示されている。さ
らに、以上の特許は、細胞の死滅が補体媒介性殺細胞によって起こることを開示
している。
【００９９】CDCの役割のさらなる提示 本発明者らの研究において、本発明者らは実際に、CBL1およびABX-CBLが補体 媒介性殺細胞によって作用することを示している。本発明者らは、本発明者らの
研究において混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法または改変型MLRアッセイ法を
用いてきた。MLRアッセイ法は、同種反応性Tリンパ球の増殖をアッセイするため
のインビトロシステムを提供する。このため、MLRアッセイ法は、骨髄移植術（B
MT）を受けた患者におけるGVHDの優れたモデルとなる。MLRアッセイ法では、2つ
の個体から得たMHCの合致しないリンパ球を共培養する。アッセイ法は典型的に は、一方の患者からのリンパ球を例えば放射線照射によって失活させ（「刺激細
胞（stimulator）」）、もう一方の患者からのリンパ球が「応答細胞（Responde
r）」として作用して増殖および高度の芽球化反応を生じうるように設定される 。適当な期間にわたり共培養を行った後に培地にトリチウム標識チミジン（［3H
］チミジン）を添加し、応答側リンパ球のDNAへの標識の取り込みをモニターす ることにより、細胞増殖の程度を定量化することができる。
【０１００】 本発明者らの研究では、MLRまたはConA誘導リンパ球増殖アッセイ法において 、CBL1抗体のみ、アイソタイプを一致させた対照マウスIgM抗体のみ（図2）また
は補体（ヒトまたはウサギ）のみを用いた場合は、T細胞の増殖阻害には無効で あった。図2〜5参照。しかし、補体ならびにCBL1および／またはABX-CBL抗体が 存在すると、T細胞の増殖は用量依存的な様式で阻害された。図2〜5参照。同じ アッセイ法において、ヒトIgG2抗体2.6.1は単独でも補体と組み合わせた場合に もT細胞の増殖阻害に無効であった。図5参照。γ-2アイソタイプである2.6.1抗 体は、CBL1またはABX-CBL抗体などのIgM抗体と比べて補体媒介性細胞溶解におけ
る効果が弱いことが周知であるため、これは予想されたことであった。
【０１０１】細胞活性化レベルの役割 本発明者らは、活性化されつつあるある種の細胞でABX-CBL結合および細胞に 対する感受性が高まるか否かも検討した。
【０１０２】 本発明者らは実際に、本発明者らの研究において、ABX-CBL抗体が結合する抗 原を発現するものと同じ細胞集団で、T細胞活性化マーカーであるCD25（IL-2受 容体のα2サブユニット）が高レベルに発現されると思われることを示した。図6
参照。この所見は、活性化細胞がMLRアッセイ法に関連して枯渇したか否かを検 出するための有用なマーカーとなる。ABX-CBLのみ、補体のみ、またはABX-CBLお
よび補体を組み合わせて用いるMLRアッセイ法を行ったところ、CD25を発現する 細胞集団が枯渇したのはABX-CBLおよび補体を併用した実験のみであった。図7〜
11参照。特に図8はCD25の発現レベルが低い細胞を示している。種々の細胞集団 の選択的死滅について図10〜12に示す。
【０１０３】CDCにおけるCD147の密度および発現レベルの役割 本発明者らは、特定の細胞集団（CDCにも関係すると考えられるもの）におけ るCD147の発現レベルが相対的に高いか否かも考察した。
【０１０４】 末梢血単核細胞（PBMC）およびABX-CBL抗体を用いるフローサイトメトリー試 験において、本発明者らは、補体を添加する前に、CD147の発現レベルが高い細 胞集団と低い細胞集団があることに着目した。補体の添加後にみられたのは、上
記の低レベル発現細胞に対応すると思われる細胞集団であった。これらの結果は
、細胞表面上のCD147発現レベルの密度の指標になるように思われた。CDCにおい
て密度は、補体カスケード誘発における最初の段階である抗体の変形を可能とす
る付加的な抗原結合部位を提供することにより、重要な役割を果たす可能性があ
る。抗体が変形するとclq因子がまず結合し、カスケードが進行する。
【０１０５】 細胞集団におけるCD147の発現レベル（または密度）がABX-CBL抗体の治療効果
に役割を果たすか否かは、種々の細胞集団におけるCD147分子の発現レベルを分 析することによって解析できる。実験は一般に、既知の量のCD147抗原を表面に 有するビーズを調製し、ビーズ上の種々の抗原量に関して約10〜20のデータポイ
ントを得る目的で、FACS（FITC標識抗CD147IgG抗体を使用）により分析すること
によって行われる。この種のデータから線形回帰曲線を調製する。その後には、
CD147抗原を発現する細胞をFACSにかけ、細胞表面上の抗原の相対量を線形回帰 曲線から算出することが可能である。
【０１０６】細胞集団における保護要素の存在および役割 本発明者らは、ABX-CBL結合および補体結合により誘発されるCDCを阻害する特
定の細胞集団におけるある種の細胞保護要素の間に相関があるか否かも検討した
。
【０１０７】 この研究と関連して、本発明者らは、ABX-CBL抗体が結合する種々の細胞を検 討し、このような細胞が（i）死滅するか否か、および（ii）そうであれば、そ の機序は補体媒介性細胞溶解と類似するか否か、について考察した。本発明者ら
はこの実験で、ABX-CBL抗体の種々の細胞との結合（および、このような細胞上 に発現されるABX-CBL抗体が結合する抗原）について探索した。続いて、ABX-CBL
が結合すると思われる細胞を、ABX-CBL抗体および補体を用いる処理により、補 体媒介性細胞溶解に関して検討した。ABX-CBL抗体がそれぞれ結合する、2つのT 細胞株（CEMおよびジャーカット細胞）、1つの単球株（U937細胞）および3つの 腫瘍細胞株（A431（上皮）、5W948（結腸）およびMDA468（乳房））を検討した 。このような細胞系での発現にもかかわらず、ABX-CBL抗体は死滅させる細胞に 対して極めて特異的であり、これはCEM T細胞株およびU937単球株に限定された 。図13参照。本発明者らは以下の2種類の内皮細胞株も分析した：（i）ECV-304 （ATCC CRL-1998）は、一見正常と思われるヒト臍帯静脈から樹立された自然形 質転換による不死化ECであり、ECの特徴を備える、（ii）HUVEC-C（ATCC CRL-17
30）は、正常ヒト臍帯静脈に由来するEC株である。本発明者らはFACSを用いて、
ECV-304およびHUVEC-C株のそれぞれが2.6.1、ファーミンゲン（Pharmingen）お よびABX-CBL抗体により陽染されることを見いだしたが、このことは、これらのE
Cが表面上にCD147を発現することを示唆する。それぞれ図15および16。続いて本
発明者らはアラマーブルー（Alamarblue）に基づくインビトロCDCアッセイ法を 行い、いずれのEC株とも、ヒト補体の存在下にてABX-CBL媒介性CDCに対する抵抗
性を有することを示した。それぞれ図17および18参照。
【０１０８】 CD147を発現するすべての細胞が補体の存在下でABX-CBL抗体によって死滅する
とは思われない理由をさらに解明するために、本発明者らはこのような細胞にお
けるCD46、CD55およびCD59の発現を探った。CD46（細胞膜補因子蛋白質、MCP） 、CD55（崩壊促進因子、DAF）およびCD59（膜侵襲複合体阻害因子、MACI）はそ れぞれ、補体阻害分子であるとみなされている。例えば、リスジュースキー（Li
szewski）ら、Annu. Rev. Immunol. 9：431（1991）およびラブランド（Lovelan
d）ら「複数の補体調節分子CD46、CD55およびCD59の協調的機能（Coordinate fu
nctions of multiple complement regulating molecules, CD46, CD55 and CD59
」Transpl. Proc. 26：1070（1994）はCD46に関し、キノシタ（Kinoshita）ら「
正常個体および発作性夜間ヘモグロビン尿症患者の末梢血における崩壊促進因子
の分布（Distribution of decay-accelerating factor in the peripheral bloo
d of normal individuals and patients with paroxysmal noctumal hemoglobin
uria）」J. Exp. Med 162：75（1985）およびラブランド（Loveland）ら「複数 の補体調節分子CD46、CD55およびCD59の協調的機能（Coordinate functions of
multiple complement regulating molecules, CD46, CD55 and CD59」Transpl.
Proc. 26：1070（1994）はCD55に関し、ホイットロー（Whitlow）ら「T細胞 活 性化に関与する細胞表面分子H19はヒト補体によるチャンネル形成を阻害する（H
19, a surface membrane molecule involved in T-cell activation, inhibits
channel formation by human complement）」Cell. Immunol. 126：176（1990）
、ラブランド（Loveland）ら「複数の補体調節分子CD46、CD55およびCD59の協調
的機能（Coordinate functions of multiple complement regulating molecules
, CD46, CD55 and CD59」Transpl. Proc. 26：1070（1994）およびデーヴィス（
Davies, A.）およびラハマン（Lachmann, P.J.）「補体性溶解に対する膜防御：
CD59の構造および生物特性（Membrane defense against complement lysis：the
structure and biological properties of CD59）」Immunol. Res. 12：258（1
993）はCD59に関するものであり、参照されたい。このため、本発明者らは、検 討した上記の細胞系の表面上でのこれらの分子のいずれかまたは両方の発現に差
異があるか否かを考察した。実際には、CEM株およびU937株を除くすべての細胞 で、両方の分子が発現されていた。また、内皮細胞系であるECV-304は、CD46、C
D55およびCD59の3つをすべて発現した。それぞれ図19および20参照。これに対し
て、CEM株はCD59のみを発現し、U937系はCD55のみを発現した。図14参照。この データは、ABX-CBLによって選択的に除去され、その結果、本発明による抗CD147
の標的となる細胞の予測につながる点で有用である。
【０１０９】ABX-CBL／CD147に基づく治療法の機能に関する考察 以上から、CBL1およびABX-CBLが、補体の活性化によって細胞を死滅させるよ うに作用することは明らかである。ABX-CBLおよび補体の併用によって死滅する のは活性化T細胞（CD4+およびCD8+の両方）、活性化B細胞および単球のみであり
、休止期T細胞およびB細胞に対しては、この種の細胞が活性化細胞と同じレベル
ではCD147を発現しないため、影響を及ぼさない。ABX-CBLおよび補体によって単
球も死滅することを指摘しておくことは重要である。ABX-CBLは、通常であればT
細胞をさらに活性化させると思われるエフェクター細胞（活性化T-およびB細胞 ）および抗原提示細胞（単球およびB細胞）を選択的に枯渇させることから、こ のデータは、GVHDなどの疾患におけるABX-CBL療法の作用の説明となる。
【０１１０】 この点からみて、ABX-CBL抗体、およびCD147を標的とする将来の治療分子の作
用様式は、上記に考察した機能的特徴、すなわち（i）補体媒介性細胞溶解、（i
i）細胞活性化、（iii）細胞表面上のCD147の発現レベルおよび／またはCD147の
密度、ならびに（iv）細胞表面上で1つまたは複数の補体阻害分子の発現がみら れないこと、のそれぞれと少なくとも部分的には関係するか、またはそれぞれに
依存すると思われる。したがって、この情報を用いることにより、CD147に基づ く治療法の有効性を予測するための機能的アッセイ法を設計することが可能であ
る。
【０１１１】 実際に、ABX-CBLの結合および効果を模倣することが望ましいことは、ABX-CBL
抗体の予備的な組織内分布試験から明らかに示されている。この試験によれば、
ABX-CBLはさまざまな組織全体にわたって広く分布している。しかし、分布の大 半は非特異的結合によるものと思われる。しかしながら、内皮細胞（細静脈、細
動脈、ただし毛細血管床は含まれない）、平滑筋および一部の中皮では特異的結
合が存在すると思われる。また、リンパ細網組織にも結合すると思われるが、そ
の染色は大リンパ球、おそらくは活性化芽球に限定されるように思われる。実施
した試験からは、細胞内染色を細胞外染色と区別することは困難であった。一定
量の細胞質染色が明瞭に認められたが、これはhn-RNP-k結合に関係する可能性が
ある。
【０１１２】 結果の考察：治療薬のデザインのためのABX-CBL抗体の使用 ABX-CBL抗体を用いた上記のインビトロ研究を、ABX-CBL抗体が本明細書のCD14
7抗原と会合することと考え合わせることにより、補体媒介性細胞死を引き起こ しうるCD147に対する抗体が、疾患の治療に向けた有効なアプローチを提供しう るという初めての証拠が得られる。さらに、CD147の体内における広範な分布お よび発現、ならびにCBL1およびABX-CBL抗体が多くの組織と会合することを示す 組織結合に関する情報からみて、CBL1およびABX-CBLが、例えば、ある種の細胞 上で発現される形態のCD147に対して特異的であるか、もしくは補体媒介性殺細 胞に関連するその他の因子が特定の組織に対するCBL1およびABX-CBL抗体の効果 を制限するか、またはおそらくはこれらの組み合わせがなければ、CBL1抗体に関
するこれまでの優れた臨床経験とは合致しない。
【０１１３】CD147に基づく治療薬の作製のための基準 上記の内容から、ABX-CBL抗体が、CD147に基づくその他の治療薬を開発するた
めの強力なツールになることは明らかである。第1に、CBL1およびABX-CBL抗体の
安全性が今日までに示されているため、ABX-CBL抗体の結合をできるだけ近く模 倣することが望ましい。第2に、CBL1抗体は明らかに有効であるため、少なくと も最初は、すべての新薬が補体結合および細胞溶解を媒介することが望ましい。
したがって、CD147に基づくその他の治療薬に関しては、治療薬候補においてABX
-CBLの結合（すなわち構造面）および作用様式（すなわち機能面）をシミュレー
トすることにより、安全性および有効性を期待しうると考えられる。
【０１１４】構造的検討 ABX-CBL結合の構造面をシミュレートまたは模倣することに関して、本発明者 らは、ABX-CBLと同様の様式でCD147と結合する抗体を容易に作製しうると考えて
いる。上記の情報から、本発明者らは、ABX-CBLのCD147との結合の詳細には少な
くとも3つのレベルがあることを認識している：（i）ABX-CBLは、選択的ではな い可能性もあるが、活性化T細胞、活性化B細胞および単球からなる群より選択さ
れる細胞集団上で発現されるCD147の一形態と結合する、（ii）ABX-CBLはウェス
タンブロット分析において62KDおよび35KDの分子種と明瞭かつ特異的な結合を示
す、ならびに（iii）ABX-CBLは、共通配列RXRSHによって規定されるCD147上のエ
ピトープ（およびおそらくはhn-RNP-k蛋白質上の同様のエピトープ）に対して極
めて特異的であると思われる。さらに、ABX-CBLは、競合試験により、CD147に対
する別の抗体候補の「構造的」比較、スクリーニングまたはそれに関する機能的
アッセイ法として役立てるために用いることができる。
【０１１５】 理解されるであろう通り、上記の情報は、別の抗体候補を作製するための極め
て有用な情報となる。言い換えれば、上記の特徴の1つまたは複数を有して作製 された抗体候補は、ABX-CBL抗体と類似した活性を有する可能性が高くなる。類 似した特徴の数が非常に多い抗体候補はABX-CBL抗体と極めて似ていると考えら れ、このため、ABX-CBL抗体と同様の安全性および有効性データを示す可能性が 高いと思われる。
【０１１６】 さらに、上記の通り、本発明者らは、ABX-CBLの結合を解明するためにデザイ ンされたある種の実験、例えば、以下のものにより、ABX-CBL抗体のCD147との結
合に関してさらなる情報を得ることができると考えている：
【０１１７】 ・ABX-CBL抗体のCD147との結合に関するさらなるマッピング実験 1つのこのよ うな一連の実験は、CD147と結合したABX-CBL抗体をプロテアーゼで切断し、その
結果生じた産物を質量分析によって精査し、必要に応じて工程を反復する枯渇実
験に関する。もう1つのこのような一連の実験は、ABX-CBL抗体によって認識され
る35KD分子種の単離、精製および解明に関する。これを実現する1つの方法は、6
2KD分子種（hn-RNP-k蛋白質）に関連して上記に考察した35KD分子の古典的精製 によるものである。もう1つのアプローチは、例えばABX-CBL抗体のFab断片など の作製によって35KDバンドのイムノアフィニティー精製を行い、2.6.1抗体を用 いて行うイムノアフィニティー精製に関連して上記に考察したカラムにそれを結
合させることである。
【０１１８】 ・CD147の細胞発生の解明に向けた実験 例えば、細胞表面上のCD147の発生は、
「パルスチェイス（pulse-chase）」実験によって調べることができる。このよ うな実験では、培養下（Met(-)培地）で増殖中の細胞（CEM細胞など）に対して 、細胞の蛋白質合成過程に標識が組み入れられるように、S35-Metによって十分 な期間（および種々の期間）にわたる「パルス刺激」を行う。その後、細胞を「
放射性標識を含まない（cold）」培地によって洗浄し、細胞表面上のCD147の免 疫沈降およびオートラジオグラフィーを行うことが可能である。選択的スプライ
シングの可能性、グリコシル化の程度、および発現されたCD147分子の発生に関 するその他の差異に関する情報を得ることができる。
【０１１９】 ・CD147を種々のグリコシダーゼと反応させ（例えば、Mizukamiら、J. Immunol.
147：1331〜1337（1991）、Schlosshauer Development 113：129〜140（1991）
、FadoolおよびLinser J．Neurochemistry 60：1354〜1364（1993）を参照）、A
BX-CBLの種々の形態との結合を検討することにより、ABX-CBLのCD147との結合に
対するグリコシル化の程度の役割に関する実験を行うこともできる。
【０１２０】機能的検討 本発明に従い、抗体候補の「構造」の要件（すなわち、抗体のCD147との結合 に関して）が満たされれば、またはそれを満たすか否かの判定と並行して、本発
明者らは、候補抗体がABX-CBL抗体と同様の様式で作用する可能性が高いか否か を判定するために用いうる、ABX-CBL抗体のインビボでの有効性にとって重要と 思われる詳細な機能的基準を提供する。このような特徴には（i）CDCによる殺細
胞、（ii）細胞集団上のCD147分子の密度または発現に対する明らかな作用、お よび（iii）細胞集団に対する保護的因子（例えば、CD46、CD55およびCD59）の 役割、が含まれる。
【０１２１】 認識されると思われるが、上記の情報は、別の抗体候補を作製するための極め
て有用な情報となる。言い換えれば、上記の特徴の1つまたは複数を有して作製 された抗体候補は、ABX-CBL抗体と類似した活性を有する可能性が高くなる。類 似した特徴の数が非常に多い抗体候補はABX-CBL抗体と極めて似ていると考えら れ、このため、ABX-CBL抗体と同様の安全性および有効性データを示す可能性が 高いと思われる。
【０１２２】インビボ・モデル 上記の特徴のそれぞれは、構造的にせよ機能的にせよ、本質的にはインビトロ
で検討しうる。しかし、当然ながら、治療薬候補を臨床開発へと進める前には、
抗体候補の作用がインビボで安全および有効と考えられることを確認するための
インビボでのデータを得ることが望ましい。GVHDに関しては、治療薬候補のヒト
での作用をかなり予測しうることが示されている動物モデルがいくつかある。こ
のようなモデルには以下のものが含まれる：
【０１２３】 ・マウスモデル（Hakim FT & Mackall CL「免疫系：移植片対宿主病の作動因子 および標的（The Immune System：Effector and Target of Graft-Versus-Host
Disease）」、移植片対宿主病Graft-vs.Host Disease（Ferraraら編、第2版、Ma
rcel Dekker, Inc.、NY（1997））。
【０１２４】 ・イヌモデル（Storbら、Blood 89：3048〜3054（1997）、Yuら、Bone Marrow T
ransplantation 17：649〜653（1996）、Raffら、Transplantation 54：813〜82
0（1992）およびDeegら、Transplantation 37：62〜65（1984））。
【０１２５】 ・霊長類皮膚移植片モデル（Chatterjeeら、Hybridoma 1：369〜377（1982）な らびにBilling R.およびChatterjee S. Transplantation Proceedings 15：649 〜650（1983））。
【０１２６】 認識されると思われるが、このようなモデルが予測に役立つためには、抗体候
補がその動物におけるCD147の内因的形態に対する反応性をもつ必要がある。
【０１２７】 抗体の作製 CD147を標的とする治療用分子を作製するための優れたモデルは、抗体の産生 と関連がある。抗体は比較的容易に作製することができ、スクリーニングも容易
に行える。近年では、従来のマウス抗体からトランスジェニック動物によって産
生されるヒト抗体に至るまで、さまざまな「タイプ」の抗体を作製することが可
能になっている。この領域では、ディスプレイ法（例えばファージ）によって抗
体を作製することもでき、マウス抗体または他の抗体をヒト化することなども可
能である。これらの技法のいくつかは以下に説明する。
【０１２８】 免疫処置法による抗体の作製に関しては、古典的および先進的な免疫処置法の
いずれも用いうる。古典的とは、動物に単に抗原による免疫処置を行い、リンパ
球を骨髄腫細胞と融合させ、それによるハイブリドーマをスクリーニングするこ
とを意味する。先進的とは、免疫処置の方式にバイアスを加えるか、または単に
ハイブリドーマを形成させる代わりに、リンパ球を直接用いてディスプレイライ
ブラリーを作製し、例えばファージまたはその他のディスプレイ技術を用いてス
クリーニングすることを意味する。このような技法は当技術分野では一般的であ
り、以下でさらに詳細に考察する。免疫処置にバイアスを加えることに関しては
、CD147で免疫処置を行った後に、上記の15量体ペプチドなどのペプチドによる 免疫処置を行うことが可能である。この様式では、選択されたエピトープなどに
対する特異性および親和性を有する抗体が作製される確率が高くなる。このため
、CD147中にある上記のRXRSH共通配列に対する特異性をもつ抗体を、さらに容易
に作製することが可能になると考えられる。このような免疫処置法を、標準的な
融合およびスクリーニング手順または先進的なスクリーニング手順と組み合わせ
て用いうることは理解されると思われる。もう1つの一連の先進的な免疫処置法 は、免疫処置を行おうとする動物における抗原提示の技法（すなわちDEC系）お よび免疫応答を増強させるための技法（すなわち、CD140系）に関する。
【０１２９】トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製 トランスジェニック動物などからの完全ヒト抗体の作製は極めて興味深い。完
全ヒト抗体は、マウスまたはマウス由来のMabに固有の免疫原性およびアレルギ ー性応答を最小限に抑え、これにより、投与される抗体の有効性および安全性を
高めると考えられる。完全ヒト抗体の使用は、抗体の反復投与をしばしば必要と
する炎症、自己免疫および癌などの慢性および再発性のヒト疾患の治療において
かなりの利益をもたらすと考えられる。
【０１３０】 ヒト抗体の作製に関連して用いられているアプローチの1つは、マウスがマウ ス抗体を生じずに多様なヒト抗体を産生するように、マウス抗体の産生に欠陥が
ある一方でヒトIg遺伝子座の長い断片を有するマウス系統を作製することである
。長いヒトIg断片は、可変遺伝子の広範な多様性、さらには抗体の産生および発
現の適切な調節の維持に働く。抗体の多様化および選択、ならびにヒト蛋白質に
対する免疫寛容を失わせるためにマウス機構を活用することにより、これらのマ
ウス系統で再現されたヒト抗体のレパートリーから、ヒト抗原を含む関心対象の
任意の抗原に対する高親和性抗体が得られる。ハイブリドーマ技術を用いること
により、望ましい特異性を備えた抗原特異的ヒトMabを容易に産生させ、選択す ることが可能である。
【０１３１】 この一般的な戦略は、1994年に発表された最初のゼノマウス（XenoMouse）系 統の作出に関連して示された。グリーン（Green）ら、Nature Genetics 7：13〜
21（1994）を参照されたい。ゼノマウス（XenoMouse）系統は、可変および定常 領域のコア配列を含む、ヒト重鎖およびκ軽鎖遺伝子座のそれぞれ245kbおよび1
90kbのサイズの生殖細胞系コンフィギュレーション断片による組換え操作を受け
たものである。同上。ヒトIgを含む酵母人工染色体（YAC）は、抗体の再配列お よび発現の双方に関してマウス系への適合性があることが実証されており、不活
性化されたマウスIg遺伝子の置換も可能であった。このことは、それらがB細胞 の発生を誘導し、完全ヒト抗体のヒト成体様レパートリーを産生し、抗原特異的
ヒトMabを産生する能力をもつことによって示された。これらの結果は、より数 多くのV遺伝子、付加的な調節要素およびヒトIg定常領域を含むより長いヒトIg 遺伝子座を導入することにより、感染および免疫処置に対するヒト体液性応答の
特徴をなす実質的に完全なレパートリーが再現される可能性があることも示唆す
る。
【０１３２】 この種のアプローチは、1990年1月12日に提出された米国特許出願第07／466,0
08号、1990年11月8日に提出された第07／610,515号、1992年7月24日に提出され た第07／919,297号、1992年7月30日に提出された第07／922,649号、1993年3月15
日に提出された第08／031,801号、1993年8月27日に提出された第08／112,848号 、1994年4月28日に提出された第08／234,145号、1995年1月20日に提出された第0
8／376,279号、1995年4月27日に提出された第08／430,938号、1995年6月5日に提
出された第08／464,584号、1995年6月5日に提出された第08／464,582号、1995年
6月5日に提出された第08／463,191号、1995年6月5日に提出された第08／462,837
号、1995年6月5日に提出された第08／486,853号、1995年6月5日に提出された第0
8／486,857号、1995年6月5日に提出された第08／486,859号、1995年6月5日に提 出された第08／462,513号、1996年10月2日に提出された第08／724,752号、およ び1996年12月3日に提出された第08／759,620号において詳細に考察および描写さ
れている。1996年6月12日に交付刊行された欧州特許第EP 0463151B1号、1994年2
月3日に刊行された国際特許出願・国際公開公報第94／02602号、1996年10月31日
に刊行された国際特許出願・国際公開公報第96／34096号、および1996年4月29日
に提出されたPCT（特許協力条約）出願第PCT／U596／05928号も参照されたい。 上記に引用したそれぞれの特許および出願の開示は、その全体が参照として本明
細書に組み入れられる。
【０１３３】 1つの代替的なアプローチにおいて、ジェンファームインターナショナル社（G
enPharm International, Inc.）を含む他の者は、「ミニ遺伝子座（minilocus）
」法を用いている。ミニ遺伝子座法では、Ig遺伝子座からの複数の小片（個々の
遺伝子）を含めることにより、外来性Ig遺伝子座を模倣する。このため、1つま たは複数のVH遺伝子、1つまたは複数のDH遺伝子、1つまたは複数のJH遺伝子、μ
定常領域、および第2の定常領域（好ましくはγ定常領域）が、動物に挿入する ための構築物（construct）中に形成される。この手法は、スラニ（Surani）ら に対する米国特許第5,545,807号、いずれもロンバーグ（Lonberg）およびケイ（
Kay）に対する米国特許第5,545,806号、第5,625,825号、第5,661,016号、第5,63
3,425号および第5,625,126号、ダン（Dunn）およびチョイ（Choi）に対する米国
特許第5,643,763号、ケイ（Kay）に対する米国特許第5,612,205号、クリンペン フォート（Krimpenfort）およびバーンズ（Berns）に対する米国特許第5,545,80
7号、ならびにジェンファームインターナショナル社（GenPharm International,
Inc.）による米国特許出願である1990年8月29日に提出された第07／574,748号 、1990年8月31日に提出された第07／575,962号、1991年12月17日に提出された第
07／810,279号、1992年3月18日に提出された第07／853,408号、1992年6月23日に
提出された第07／904,048号、1992年12月16日に提出された第07／990,860号、19
93年4月26日に提出された第08／053,131号、1993年7月22日に提出された第08／0
96,762号、1993年11月18日に提出された第08／155,301号、1993年12月3日に提出
された第08／161,739号、1993年12月10日に提出された第08／165,699号、1994年
3月9日に提出された第08／209,741号、1995年10月10日に提出された第08／544,4
04号に記載されており、それらの開示は参照として本明細書に組み入れられる。
また、その開示の全体が参照として本明細書に組み入れられる、1997年4月17日 に刊行された国際特許出願・国際公開公報第97／13852号、1994年11月10日に刊 行された国際公開公報第94／25585号、1993年7月24日に刊行された国際公開公報
第93／12227号、1992年12月23日に刊行された国際公開公報第92／22645号、1992
年3月19日に刊行された国際公開公報第92／03918号も参照されたい。さらに、そ
の開示の全体が参照として本明細書に組み入れられる、テイラー（Taylor）ら、
1992、チェン（Chen）ら、1993、トゥアイロン（Tuaillon）ら、1993、チョイ（
Choi）ら、1993、ロンバーグ（Lonberg）ら（1994）、テイラーら（1994）、お よびトゥアイロンら（1995）も参照されたい。
【０１３４】 上記に引用し、英国医学研究会議（Medical Research Council）（「MRC」） に譲渡されたスラニ（Surani）らの発明者らは、ミニ遺伝子座法の使用により、
Ig遺伝子座を有するトランスジェニックマウスを作製した。上記に引用したジェ
ンファームインターナショナル社の業績の発明者らであるロンバーグおよびケイ
は、本発明者の先例にならって、内因性マウスIg遺伝子座の不活性化とスラニら
の業績の実質的な重複物との組み合わせを提案している。
【０１３５】 ミニ遺伝子座法の1つの利点は、Ig遺伝子座の一部を含む構築物の作製および 動物への導入を迅速に行いうることである。しかし、これを相殺する程度に、ミ
ニ遺伝子座法には理論的にみて、少数のV、DおよびJ遺伝子を含めることによっ て導入される多様性が不十分であるとの重大な欠点がある。事実、発表された研
究はこの懸念を裏づけるように思われる。ミニ遺伝子座法を用いて作製された動
物のB細胞発生および抗体産生は阻害されていると考えられる。このため、本発 明者らは、より大きな多様性の実現を目的として、および動物の免疫レパートリ
ーを再構築するための努力において、Ig遺伝子座の大部分を導入することを一貫
して主張してきた。
【０１３６】 上記の技術を用いることにより、例えば、CD147発現細胞、CD147それ自体、CD
147の種々の形態、そのエピトープまたはペプチド、およびそれに対する発現ラ イブラリー（米国特許第5,703,057号を参照）に対するヒト抗体を、上記の活性 に関して上述した通りに、それらによるトランスジェニックマウスの免疫処置、
ハイブリドーマの形成およびその結果得られたハイブリドーマのスクリーニング
によって作製しうることは理解されると思われる。
【０１３７】 事実、上記の技術を用いることにより、本発明者らは、アブジェニクス社（Ab
genix, Inc.）、Fremontから入手しうるゼノマウス（XenoMouse）（登録商標） 系統のトランスジェニックマウス（Mendezら（1997）、前記および1996年12月3 日に提出された米国特許出願第08／759,620号を参照）に対する免疫処置によっ て、CD147と結合する一群のヒトモノクローナル抗体を調製した。この種の抗体 を、CD147との結合に関するABX-CBLとの競合能に関してさらにスクリーニングし
た。このような一群では、ヒトIgG2およびヒトIgM抗体がいずれもCD147と結合し
て検出され、CD147との結合に関するABX-CBLとの競合能も有していた。このよう
な抗体を発現するハイブリドーマを以下の通りに命名した：
【０１３８】 IgM：CEM 10.1 C3、CEM 10.1 G10、CEM 10.12 F3、CEM 10.12 G5 CEM 13.12、CE
M 13.5、および IgG2：2.4.4、2.1.1、2.3.2、2.6.1。
【０１３９】 上記の抗体のそれぞれに対して、対応するハイブリドーマからそれらをコード
するcDNAをRT-PCRによって単離することにより、シークエンシングを行った。生
殖系遺伝子を同定し、抗体の配列を生殖系配列と比較した。生殖系遺伝子の同定
結果を以下の表に示す。
【０１４０】
【表１】
【０１４１】 VH、D、JH、VκおよびJκ遺伝子の生殖系配列はジェンバンク（GenBank）から
入手可能である。アミノ酸配列における体細胞変異を確認するために、いくつか
の抗体の配列を生殖系V遺伝子セグメントの転写物と比較した。このような配列 の比較を図44から46までに示す。抗体のそれぞれおよびそれらに関するcDNAおよ
び蛋白質転写物を図24から33までに示す。さらに、カバット計数法（Kabat numb
ering scheme）による抗体の重鎖およびκ軽鎖のCDRを図34から43までに示す。
【０１４２】 上記の抗体のCDRが抗体の抗原との結合に関して一般に極めて重要であること は理解されると思われる。したがって、抗原のエピトープとの抗体の結合を変化
させない種々のFRおよびその他の改変を抗体内および抗体に対して加えうること
は理解されると考えられる。このため、抗体の活性における重要な因子の1つは 、抗体が結合する抗原上のエピトープである。エピトープ結合が保存されている
限り、さまざまな形で抗体の一次配列が改変されてもほとんど問題にはならない
と考えられる。このため、本明細書で配列が考察される場合には、抗体の配列が
抗原上の有効なエピトープをまず規定するが、抗原によってエピトープがいった
ん同定された後には、同じエピトープと結合する任意の抗体が本明細書において
考慮されるものとする。
【０１４３】 実施した数多くの試験に鑑みて、2.6.1 IgM抗体をさらなる開発のために選択 した。理解されるであろう通り、IgMはすべて一価のものとして産生される。こ のため、完全なヒト多量体IgM抗体を調製するために、本発明者らはヒト軟膜細 胞からヒトJ鎖遺伝子をクローニングし、2.6.1κ軽鎖 cDNAおよびJ鎖cDNAを含む
第1の発現ベクターならびに2.6.1重鎖cDNAを含む第2の発現ベクターを調製し、D
HFRチャイニーズハムスター卵巣細胞に対してこの2種類のベクターによるコトラ
ンスフェクションを行って、多量体IgMを発現するクローンを選択した。
【０１４４】 図50に示す通り、この2.6.1 IgM＋J鎖抗体はADCCにおける作用能を示した。
【０１４５】ヒト化およびディスプレイ技術 ヒト抗体の作製に関して上記に考察した通り、免疫原性の低い抗体を作製する
ことが有利である。これはある程度までは、ヒト化の技法および適切なライブラ
リーを用いるディスプレイ法によって達成することができる。マウス抗体または
他の種に由来する抗体を、当技術分野で周知の技法を用いてヒト化または霊長類
化しうることは理解されると思われる。例えば、ウィンター（Winter）およびハ
リス（Harris） Immunol Today 14：43〜46（1993）ならびにライト（Wright） ら、Crit、Reviews in Immunol. 12125〜168（1992）を参照されたい。さらに、
ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ
および当技術分野で周知の技法を用いるその他の技法を非制限的に含むディスプ
レイタイプの技術によってヒト抗体または他の種に由来する抗体を作製し、この
結果得られた分子を、親和性成熟などの当技術分野で周知の技法などによってさ
らに成熟させることもできる。ライト（Wright）およびハリス（Harris）、前記
、ヘインズ（Hanes）およびプルクタウ（Plucthau） PNAS USA 94：4937〜4942 （1997）（リボソームディスプレイ法）、パームリー（Parmley）およびスミス （Smith） Gene 73：305〜318（1988）（ファージディスプレイ）、スコット（S
cott） TIBS 17：241〜245（1992）、クィルラ（Cwirla）ら、PNAS USA 87：637
8〜6382（1990）、ラッセル（Russel）ら、Nucl. Acids Research 21：1081〜10
85（1993）、ホーガンブーム（Hoganboom）ら、Immunol. Reviews 130：43〜68 （1992）、ならびにチスウェル（Chiswell）およびマッカファティ（McCafferty
） TIB TECH 10：80〜84（1992）。ヒト以外の抗体を作製するためにディスプレ
イ技術を用いる場合には、このような抗体を上記の通りにヒト化しうる。
【０１４６】 これらの技法を用いて、CD147発現細胞、CD147それ自体、CD147の種々の形態 、そのエピトープまたはペプチド、およびそれに対する発現ライブラリー（米国
特許第5,703,057号を参照）に対する抗体を作製することができ、その後に、上 記の活性に関して上述した通りにそれらをスクリーニングすることが可能である
。
【０１４７】 さらに、ABX-CBL抗体を発現する寄託されたハイブリドーマ細胞系から得られ る活性抗体の配列はこれまで知られていない。CBL1抗体の活性をもたらす実体が
IgM抗体であったという本発明者らの上記の所見、およびMOPC21軽鎖の有無は抗 体の活性に有利にも有害にもならないと思われるという事実に鑑みて、本発明者
らは、IgM（ABX-CBL）を産生するハイブリドーマからRT-PCRによって重鎖および
κ軽鎖をクローニングし、cDNAのシークエンシングを行った。重鎖およびκ軽鎖
のcDNA配列ならびにその蛋白質転写物を含む、以上のシークエンシング研究の結
果を以下に示す：
【０１４８】ABX-CBL重鎖のヌクレオチド配列 ABX-CBL重鎖の蛋白質配列 ABX-CBL軽鎖の蛋白質配列
【０１４９】 認識されると思われるが、この配列を利用することにより、ABX-CBL抗体のヒ ト化物（humanized version）を調製することが可能である。一般的には、従来 の技法を用いて、CDRをコードするヌクレオチド配列をヒトフレームワーク（FR ）配列中に組み入れる。または、CDRの周囲のフレームワーク領域内のアミノ酸 残基（すなわち、CDR1周囲のFR1およびFR2、CDR2周囲のFR2およびFR3、ならびに
／またはCDR3周囲のFR3およびFR4における残基）を、従来の技法を用いて、それ
をコードするcDNAの変異誘発によって改変する。いずれの場合にも、一般的には
続いて、ヒト化されたκ軽鎖および重鎖をコードする改変型cDNAを、直接的に、
コトランスフェクションにより、または1996年10月11日に提出された米国特許出
願第08／730,639号または1998年4月23日に刊行された国際特許出願・国際公開公
報第98／16654号に記載された細胞間融合法を用いて、発現用の細胞系（すなわ ち、NSO、CHOなど）に導入する。その後に、ヒト化抗体を発現させ、結合および
その他の属性に関してアッセイする。要望または必要に応じて、抗体の結合性ま
たはその他の属性を改善するために、分子をDNAレベルで反復的に改変すること ができる。例えば、場合によっては、結合性を改善するためにヒトFR内にマウス
配列を再び導入することが必要である。ヒト化に関する優れた段階的入門および
従来のヒト化が当技術分野に導入された経緯の説明が、インターネット上のhttp
://www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/で提供されている。
【０１５０】 一般に、ヒト化キメラ抗体を調製するためには、同時または工程の間に、定常
領域をマウスIgMから別のヒト定常領域（J鎖を含む、または含まない、上記のヒ
トIgM定常領域）へと入れ換える。
【０１５１】抗体治療薬に関するほかの基準 上記の通り、ABX-CBL抗体の機能は、その作用様式の少なくとも一部にとって 重要であるように思われる。機能とは例えば、ABX-CBL抗体の活性がCDCであるこ
とを意味する。したがって、CD147に対する治療薬候補としての抗体の作製に関 しては、抗体が補体を結合させ、CDCに関与しうることが望ましい。これが可能 な抗体のアイソタイプは数多くあり、これには以下のものが非制限的に含まれる
：マウスIgM、マウスIgG2a、マウスIgG2b、マウスIgG3、ヒトIgM、ヒトIgG1およ
びヒトIgG3。作製される抗体はこのようなアイソタイプを最初から備えている必
要はなく、抗体は作製時には任意のアイソタイプを有することができ、その後に
当技術分野で周知の従来の技法を用いて抗体にアイソ転換を加えうることは理解
されると考えられる。このような技法には、特に、直接組換え法（例えば、米国
特許第4,816,397号を参照）、細胞間融合法（例えば、1996年10月11日に提出さ れた米国特許出願第08／730,639号を参照）の使用が含まれる。
【０１５２】 細胞間融合法では、任意の望ましいアイソタイプを備えた重鎖を有する骨髄腫
またはその他の細胞系、および軽鎖を有するもう1つの骨髄腫またはその他の細 胞系を調製する。このような細胞をその後に融合させ、完全な抗体を発現する細
胞株を単離することが可能である。
【０１５３】 例えば、本明細書で述べた2.6.1抗体は、ヒト抗CD147 IgG2抗体である。この ような抗体がCD147分子に対して望ましい結合を示す場合には、同じ可変領域（ これは抗体の特異性および一部の親和性を規定する）を維持したままで、ヒトIg
M、ヒトIgG1またはヒトIgG3アイソタイプへのアイソタイプ転換を容易に加えう ると考えられる。このような分子は、ABX-CBL抗体と同様の様式で、補体を結合 させ、CDCに関与しうると考えられる。
【０１５４】 このため、上記の望ましい「構造的」属性を満たす抗体候補が作製されれば、
アイソタイプ転換により、望ましい「機能的」属性の少なくともある程度をこれ
に付与することが一般に可能である。
【０１５５】 その他の治療薬の設計および作製 本発明に従い、CD147に関するABX-CBL抗体の活性に基づくことにより、二重特
異性抗体、イムノトキシンおよび放射性標識治療薬などの先進的抗体治療薬、一
群のペプチド治療薬、遺伝子治療、特に体内でのもの、アンチセンス治療薬なら
びに低分子を非制限的に含む、通常の抗体成分（moiety）の範囲を超えた他の治
療手段を設計することも今や可能である。
【０１５６】 先進的抗体治療薬の作製に関しては、二重特異性抗体、イムノトキシンまたは
放射性標識治療薬などの使用により、本発明者らがABX-CBL抗体の機能に必要で あることを示した殺細胞に関する補体依存性を回避することが可能であると思わ
れる。
【０１５７】 例えば、二重特異性抗体に関しては、（i）一方がCD147に対する特異性を有し
、もう一方が互いに結合する第2の分子に対する特異性を有する2つの抗体、（ii
）CD147に対して特異的な第1の鎖および第2の分子に対して特異的な第2鎖を有す
る単一の抗体、または（iii）CD147およびもう一方の分子に対する特異性を有す
る単鎖抗体、を含む二重特異性抗体を作製することができる。このような二重特
異性抗体は当技術分野で周知の技法を用いて作製可能であり、例えば（i）およ び（ii）に関しては、例えばファンガー（Fanger）ら、Immunol Methods 4：72 〜81（1994）ならびにライト（Wright）およびハリス（Harris）、前記を参照さ
れたく、（iii）に関しては、例えばトラウネッカー（Traunecker）ら、Int. J.
Cancer（補遺）7：51〜52（1992）を参照されたい。いずれの場合にも、第2の 特異性は、CD16もしくはCD64（例えば、Deoら、18：127（1997）を参照）または
CD89（例えば、Valeriusら、Blood 90：4485〜4492（1997）を参照）を非制限的
に含む、重鎖活性化受容体に対して付与することが可能である。上記の内容に従
って調製された二重特異性抗体は、CD147を発現する細胞、特にABX-CBL抗体が有
効な細胞を死滅させる可能性が高いと考えられる。
【０１５８】 イムノトキシンに関しては、当技術分野で周知の技法を用いて、イムノトキシ
ンとして作用するように抗体に改変を加えることができる。例えば、ヴィテッタ
（Vitetta） Immunol Today 14：252（1993）参照。また、米国特許第5,194,594
号も参照されたい。放射性標識抗体に関しては、当技術分野で周知の技法を用い
て、この種の改変型抗体も容易に調製することができる。例えば、ジュンガンス
（Junghans）ら、癌の化学療法および生物療法（Cancer Chemotherapy and Biot
herapy） 655〜686（第2版、ChafnerおよびLongo編、Lippincott Raven（1996）
）参照。また、米国特許第4,681,581号、第4,735,210号、第5,101,827号、第5,1
02,990号（RE 35,500）、第5,648,471号および第5,697,902号も参照されたい。 イムノトキシンおよび放射性標識分子のそれぞれは、CD147を発現する細胞、特 にABX-CBL抗体が有効な細胞を死滅させる可能性が高いと考えられる。
【０１５９】 治療用ペプチドの作製に関しては、CD147、およびABX-CBL抗体などのそれに対
する抗体に関する構造情報の利用（低分子に関して以下に考察する）またはペプ
チドライブラリーのスクリーニングにより、CD147に対する治療用ペプチドを作 製しうる。ペプチド治療薬の設計およびスクリーニングは、ホーテン（Houghten
）ら、Biotechniques 13：412〜421（1992）、ホーテン（Houghten） PNAS USA
82：5131〜5135（1985）、ピナラ（Pinalla）ら、Biotechniques 13：901〜905 （1992）、ブレーク（Blake）およびリッチ-デービス（Litzi-Davis）BioConjug
ate Chem. 3：510〜513（1992）で考察されている。イムノトキシンおよび放射 性標識分子を、抗体に関する上記のペプチド成分に関するものと同様の様式で調
製することも可能である。
【０１６０】 CD147分子（またはスプライス変異体もしくは代替的形態などの一形態）が疾 患過程において機能的作用をもつと仮定すれば、従来の技法により、それに対す
る遺伝子またはアンチセンス治療薬を設計することも可能であると考えられる。
この種のものは、CD147の機能を調節するために用いうる。本発明の知見との関 連により、それに関する機能的アッセイ法の設計および使用が可能となる。アン
チセンス治療薬に関する設計および戦略は、国際特許出願・国際公開公報第94／
29444号に詳細に考察されている。遺伝子治療に関する設計および戦略はよく知 られている。しかし特に、体内のものに関する遺伝子治療法の使用は特に有益な
ことが明らかになると考えられる。例えば、チェン（Chen）ら、Human Gene The
rapy 5：595〜601（1994）およびマラスコ（Marasco） Gene Therapy 4：11〜15
（1997）を参照されたい。遺伝子治療に関する一般的な設計および考慮すべき点
は、国際特許出願・国際公開公報第97／38137号にも考察されている。
【０１６１】 低分子治療薬も本発明による考慮の対象である。本発明に基づき、CD147の活 性を調節するような薬物を設計することができる。CD147分子の構造、およびABX
-CBL抗体、CD46、CD55、CD59などの本発明による他の分子とのその相互作用から
突き止められた知見を用いて、別の様式の治療薬を合理的に設計することが可能
である。この点に関しては、薬物探索作業に対象を絞ったX線結晶解析、コンピ ュータ利用（または支援）分子モデリング（CAMM）、定量的または定性的な構造
-活性関連（QSAR）および類似の技術などの合理的薬物設計法を用いうる。合理 的設計により、CD147の活性を改変または調節するために用いることが可能な分 子またはその特定形態と相互作用しうる蛋白質または合成物の構造の予測が可能
となる。このような構造は化学合成することも生体システム中で発現させること
も可能である。このアプローチは、キャプセイ（Capsey）ら、ヒト用の遺伝子組
換え治療薬（Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs）（Stockton
Press、NY（1988））で概説されている。さらに、高スループットスクリーニン グ作業などのスクリーニングプログラムにおいて、コンビナトリアルライブラリ
ーを設計および合成し、用いることも可能である。
【０１６２】 治療的投与および剤形 本発明による治療的実体の投与が、移行、送達、忍容性などを改善するために
製剤中に混和される適した担体、賦形剤および作用物質とともになされるであろ
うことは理解されると考えられる。薬剤師の全員に知られている処方集であるレ
ミントン薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）（第15版、Mack Publis
hing Company、Easton、PA（1975））、特にブラウグ（Blaug）、シーモア（Sey
mour）によるその87章を参照すれば、多数の適切な剤形を見いだしうる。これら
の剤形には、例えば、粉剤、ペースト剤、軟膏、ゼリー剤、蝋剤、油剤、脂質、
脂質（陽イオン性または陰イオン性）含有ビヒクル（Lipofectin（登録商標）な
ど）、DNA複合体、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型乳剤、カルボワ ックス乳剤（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲルならびにカ
ルボワックスを含む混合物が含まれる。製剤中の有効成分が剤形によって失活せ
ず、剤形が投与経路との生理的適合性および忍容性を有する限りにおいて、上記
の混合物の任意のものを本発明による治療および治療法に用いてよい。パウエル
（Powell）ら「非経口製剤用の賦形剤に関する概説（Compendium of excipients
for parenteral formulations）」PDA J Pharm Sci Technol. 52：238〜311（1
998）および薬剤師に周知の賦形剤および担体に関するその引用文献も参照され たい。
【０１６３】実施例 実施した実験および得られた結果を含む以下の実施例は、例示のみを目的とし
て提供するものであり、本発明の範囲を制限するものとみなされるべきではない
。
【０１６４】実験1 ヒト抗体の作製 ヒト抗体は、その開示が参照として本明細書に組み入れられる、メンデス（Me
ndez）ら、Nature Genetics 15：146〜156（1997）および1996年12月6日に提出 された米国特許出願第08／759,620号に従い、ゼノマウス（XenoMouse）に対して
CEM細胞による免疫処置を行った後に融合を行い、その結果得られたハイブリド ーマの上清を、ABX-CBL抗体を用いる競合アッセイ法においてCEM細胞に対してス
クリーニングすることによって調製した（実施例2）。
【０１６５】実験2 ABX-CBL抗原のイムノアフィニティー精製 本発明者らは、CBL1抗体が結合した抗原のイムノアフィニティー精製について
検討した。CBL1およびABX-CBL抗体が結合した抗原は、CEM細胞上に高発現される
ように思われた。天然型のABX-CBL抗体を用いるイムノアフィニティー精製は、A
BX-CBL抗体が五量体構造をもつIgM抗体であるという事実が妨げとなった。この ため、本発明者らはCEM細胞に対するヒトIgG2抗体を調製し（実施例1）、続いて
融合を行い、その結果得られたハイブリドーマ上清のCEM細胞に対するスクリー ニングを行った上で、FACSを用いるCEM細胞による結合アッセイ法においてABX-C
BL抗体との競合に関して検討した。FACS競合アッセイ法では、FITCで標識したAB
X-CBL抗体のCEM細胞との結合の阻害を、単独の場合および抗CEMヒト抗体の存在 下の両方に関して分析した。
【０１６６】 本発明者らは、CEM細胞と結合する上にCEM細胞との結合においてABX-CBL抗体 と高度に競合するモノクローナル抗体を産生する4種類のハイブリドーマクロー ンを融合物から単離した。2.6.1と命名されたハイブリドーマクローンの1つが、
最も競合性が強いように思われた。
【０１６７】 本発明者らは、2.6.1ハイブリドーマを含むハイブリドーマのそれぞれに関し てSCIDマウスに腹水を生じさせ、標準的な条件を用いるプロテインAアフィニテ ィー精製工程を用いて2.6.1抗体を精製した。精製された2.6.1抗体から、本発明
者らはイムノアフィニティーカラムを調製した。カラムの調製のためには、精製
した2.6.1抗体を、製造者の仕様書に従ってCNBr活性化セファロース-4Bと結合さ
せた。約2.0gの活性化セファロースに対して約8.4mgの抗体が結合した。本発明 者らはCEM細胞の細胞可溶化物をカラムに通し、結合成分を溶出させた。溶出産 物を、SDS-PAGE電気泳動、ウェスタンブロット法、ELISAおよびCEM可溶化物に対
するバイアコア（BiaCore）反応性によって分析した。
【０１６８】 CEM細胞可溶化物から精製された溶出産物は、2.6.1抗体およびABX-CBL抗体の それぞれとの反応後のウェスタンブロット分析で本発明者らが認めた45〜55KDに
対応する幅広いバンドに関する本発明者らのシークエンシングにより、CD147で あることが示された。図1から見てとれる通り、2.6.1抗体は約45〜55KDの幅の広
いバンドに含まれる単一分子または複数の分子に対して最も強く結合したが、こ
れに対して、約45〜55KDの同様の幅広いバンドに対してABX-CBL抗体が示した結 合の強度はこれよりも低かった。
【０１６９】 パーキンエルマー（Perkin Elmer）社のシークエンサーを用いて、分取ゲル電
気泳動およびエレクトロブロッティング法によって単離された45〜55KDバンドの
部分に関するシークエンシングを行った。本発明者らは、この分子の部分的アミ
ノ酸配列を入手した（35から40残基の間）。この結果得られた配列情報を蛋白質
データベース検索（Protein Identification Resourse（PIR）R47.0、1995年12 月）によって解析したところ、配列比較データからこの分子がCD147であること が示された。
【０１７０】 CEM可溶化物に対するウェスタンブロットは一般に以下の通りに行った： CEM細胞を10mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、1％Triton X-100およびプロテアー
ゼ阻害剤中にてホモジェネート化し、5×108細胞／mlのCEM抽出物を得た。この 抽出物（5μl）を12％SDS-PAGEゲル上での電気泳動にかけ、続いてPVDFに対して
ブロッティングを行った。抗体染色のための調製としてブロットを切断して5つ の細片とした。第1の抗体による染色はすべて1％ゼラチン／PBST緩衝液中にて1 μg／mlの濃度で行った。APで標識した第2の抗体は同じ緩衝液中に1：1000希釈 して用いた。ウサギ抗マウスhnRNP-k蛋白質抗体はワシントン大学（University
of Washington）のカロル・ボムスチク博士（Karol Bomstzyk）から供与された 。ABX-CBL、ファーミンゲン（Pharmingen）および2.6.1抗体のそれぞれについて
は本明細書中に詳細に記載されている。
【０１７１】実験3 62KDバンドの精製 62KDバンドに含まれる物質を精製するために、約3×1010個の細胞からCEM全細
胞可溶化物を調製した。可溶化物を抽出および濃縮して約3.8mgの蛋白質を得た 。回収した蛋白質の一部を一連のクロマトグラフィーの段階にかけた：サイズ排
除、陰イオン交換、疎水相互作用、逆相およびミクロボア（microbore）逆相。 それぞれの段階では、ウェスタンブロット上でABX-CBL抗体との結合が認められ た画分を次の段階へと進めた。ミクロボア逆相クロマトグラフィーの後、約5×1
0-6gの蛋白質が回収され、この蛋白質の一部をゲル電気泳動およびエレクトロブ
ロッティングにかけ、純度約90％の62KD蛋白質を得た。
【０１７２】 N末端配列の直接解読を試みたが、この分子のN末端はブロックされていた。こ
のため、この材料をCNBrで消化し、分取ゲル電気泳動およびエレクトロブロッテ
ィング法を行い、約12KDおよび32.5KDのバンドを得た。ブロッティングがなされ
た断片のシークエンシングを行い、その結果得られた配列結果を蛋白質データベ
ース検索（Protein Identification Resourse（PR）R47.0、1995年12月）によっ
て解析した。配列比較データから、この分子がヘテロリボ核蛋白質k（hnRNP-k）
であり、12KDバンドが残基360およびその上流（メチオニン359以降）を有し、32
.5KDバンドが残基43およびその上流（メチオニン42以降）を有することが示され
た。
【０１７３】実験4 CD147 ELISAアッセイ法 本発明者らは、CEM細胞可溶化物から入手した濃縮精製抗原を用いて、分泌型 または膜結合型のCD147の発現を検出するための特異的ELISAアッセイ法を開発し
た。本アッセイ法において、本発明者らは、CD147抗原（例えば、CEM細胞可溶化
物からアフィニティー精製されたCD147抗原）をプレートのウェル中に固定した 。抗原の結合は、従来の方法を用いて行いうる。その後には従来の技法を用いて
、抗原を含むプレートを、それと反応する抗体を検出するために用いることがで
きる。本発明者らは、市販の抗CD147抗体（RDI、Flanders、NJから販売されてい
るRDI-CBL535（マウス抗CD147 IgG2b抗体）およびPharmingen、San Diego、CAか
ら販売されている36901A（マウス抗CD147IgG1抗体））のそれぞれ、ABX-CBL抗体
および本発明者らが実施例2で作製したヒト抗体がこのアッセイ法において特異 的に反応することを示した。
【０１７４】 本ELISAアッセイ法は、CD147抗原と結合する抗体を検出するためのスクリーニ
ング系として有用である。
【０１７５】実験5 35KDバンドの役割に関する知見 上記の通り、事例証拠からは、35KDバンドがCD147の単一グリコシル化型に対 応する可能性が示されている。カネクラ（Kanekura）ら、Cell Struct Funct 16
：23〜30（1991）参照。さらに、市販の2種類の抗CD147抗体（RDI、Flanders、N
Jから販売されているRDI-CBL535（抗CD147IgG2抗体）、およびPharmingen、San
Diego、CAから販売されている36901A（抗CD147IgG1抗体））によって得られたウ
ェスタンブロットをABX-CBLおよび2.6.1抗体と比較することにより、市販の抗体
のそれぞれが、分子量が35KD前後であって、ABX-CBL抗体によって認識される35K
Dと類似すると思われる分子を認識することが示されたことは興味深い。図1参照
。もう1つの興味深い観察結果は、上記のイムノアフィニティー精製において、2
.6.1抗体からの溶出産物をABX-CBL抗体によってプローブ検索した場合には、ウ ェスタンブロットで35KDバンドが認められなくなったことである。より正確にい
えば、ABX-CBL抗体は45〜55KDの幅広いバンドと比較的低い強度（図1に示された
ものと同様）で結合するように思われた。この知見は、ABX-CBL抗体が2.6.1抗体
および市販の抗体よりもCD147上の異なるエピトープまたは異なる形態のCD147と
優先的に結合する可能性を示している。
【０１７６】実験6 補体媒介性殺細胞 上記のUCLAのグループ（例えば、米国特許第5,330,896号および第5,643,740号
を参照）は、CBL1抗体はある種の活性化細胞集団を死滅させることによって作用
するが、非活性化細胞とは反応しないという一定の証拠を提示している。例えば
、微量細胞傷害アッセイ法では、CBL1抗体が活性化リンパ球を死滅させることに
よって作用するが、非活性化リンパ球およびその他の正常細胞は死滅させないこ
とが開示されている。
【０１７７】 この実験に関しては、以下の材料および手順を用いた： 混合リンパ球反応 混合リンパ球反応（MLR）は、細胞性応答におけるTリンパ球の増殖をアッセイ
するためのインビトロ系である。細胞性応答は、エフェクター細胞傷害機能のイ
ンビトロアッセイ法であるが、これは実験動物における移植片対宿主反応によっ
てインビボでアッセイすることも可能である。MLRにおいて同種反応性Tリンパ球
を共培養すると、細胞は高度の高度の芽球化反応および細胞増殖を生じる。この
ため、MLRは、トリチウム標識チミジン（［3H］チミジン）を培地に添加し、分 裂中のリンパ球のDNAへの標識の取り込みをモニターすることによって定量化し うる。
【０１７８】 CBL-1およびABX-CBL抗体の機能および特性を評価するために、本発明者らは、
CBL- 1およびABX-CBLがリンパ球増殖応答を阻害する能力を検討することを目的 としてMLRを用いた。HLAが一致しない2つの個体から、フィコール-パーク（Fico
ll-Paque）勾配遠心によって末梢血単核細胞を単離した。同種反応性Tリンパ球 を混合（1：1）し、インビトロで6日間にわたり共培養した（96穴プレートの各 ウェル当たりの細胞数は合計5×105細胞）。一方の個体のリンパ球には培養前に
3000ラドの放射線照射を行った。培養を終える24時間前に、培養物に対してCBL-
1およびABX-CBL抗体＋10％ウサギ補体または25％ヒト補体のいずれかを加えた。
培養物には［3H］メチルチミジン（Amersham）によるパルス刺激を一晩加え、6 日目に回収した。リンパ球増殖応答は ［3H］チミジンの取り込みを測定するこ とによって判定した。抗体非存在下のcpm値から抗体存在下のcpm値を差し引き、
抗体非存在下のcpm値によって割った値として、阻害率を算出した。
【０１７９】 ConA刺激によるリンパ球増殖 ヒトPBMCを上記の通りに単離し、マイトジェンであるコンカナバリンA（ConA ）により、5μg／mlの濃度で48時間刺激した。培養を終える24時間前に、培養物
に対して10％補体とともに、または単独で抗体を添加した。培養物には［3H］チ
ミジンによるパルス刺激を一晩加え、翌日に回収した。リンパ球増殖応答は ［3 H］チミジンの取り込みを測定することによって判定した。抗体非存在下のcpm値
から抗体存在下のcpm値を差し引き、抗体非存在下のcpm値によって割った値とし
て、阻害率を算出した。
【０１８０】 細胞表面分子のFACS分析 種々の表面分子の細胞表面発現に関する免疫蛍光染色およびFACSvantage（Bec
ton Dickinson、San Jose、CA）による分析は記載されている（FACScanマニュア
ル。Becton Dickinson、San Jose、CA）。抗CD3-PE、抗CD4-PE、抗CD8-PE、抗CD
14-PE、抗CD20-PE、抗CD25-FITCおよび抗CD25-PEの各モノクローナル抗体はベク
トンディッキンソン社（Becton Dickinson）から購入した。抗CD55-FITCおよび 抗CD59-FITCはファーミンゲン社（Pharmingen）（San Diego、CA）から購入した
。ABX-CBLおよびcem2.6.1には、アブジェニクス社（Abgenix）でそれぞれFITCお
よびPEを結合させた。
【０１８１】 アラマーブルーを用いる補体依存性細胞傷害アッセイ法 補体依存性細胞傷害（CDC）アッセイ法は、以前の記載の通りに行った（Gazza
no-Santoroら「抗CD20抗体に関する非放射性補体依存性細胞傷害アッセイ（A no
n-radioactive complement-dependent cytotoxicity assay for anti-CD20 mono
clonal antibody）」J. Immunol. Methods 202：163〜171（1997）。106細胞／m
lの細胞懸濁液50ml、種々の濃度の抗体50μl、および10％ウサギ補体またはヒト
補体50μlを平底96穴ウェル培養プレートに添加し、37℃、5％CO2下にて2時間イ
ンキュベートした。続いてアラマーブルー（Alamar blue）（Accumed Internati
onal）50μlを添加し（最終濃度10％）し、さらに5時間インキュベーションを続
けた。振盪機上でプレートを10分間にわたり室温に冷却し、励起波長530nm、発 光波長590nmとして96ウェル蛍光光度計を用いて蛍光強度を判読した。結果は相 対蛍光単位（RFU）の形で表示した。
【０１８２】 本発明者らの研究で、本発明者らは、CBL1およびABX-CBLが補体媒介性殺細胞 を介して作用することを示した。MLRまたは改変MLRアッセイ法（ConA誘導リンパ
球増殖アッセイ法）において、CBL1抗体のみ、アイソタイプを一致させた対照マ
ウスIgM抗体のみ（図2）または補体（ヒトまたはウサギ）のみを用いた場合は、
T細胞の増殖阻害には無効であった。図2〜5参照。しかし、補体ならびにCBL1お よび／またはABX-CBL抗体が存在すると、T細胞の増殖は用量依存的な様式で阻害
された。図2〜5参照。同じアッセイ法において、ヒトIgG2抗体2.6.1は単独でも 補体と組み合わせた場合にもT細胞の増殖阻害に無効であった。図5参照。γ-2ア
イソタイプである2.6.1抗体は、CBL1またはABX-CBL抗体などのIgM抗体と比べて 補体介在性細胞溶解における効果が弱いことが周知であるため、これは予想され
たことであった。
【０１８３】 ABX-CBLおよび補体の併用によって死滅するのは活性化T細胞（CD4+およびCD8+ の両方）、活性化B細胞および単球のみであり、休止期T細胞およびB細胞に対し ては、この種の細胞が活性化細胞と同じレベルではCD147を発現しないため、影 響を及ぼさない。ABX-CBLおよび補体によって単球も死滅することを指摘してお くことは重要である。ABX-CBLは、通常であればT細胞をさらに活性化させると思
われるエフェクター細胞（活性化T-およびB細胞）および抗原提示細胞（単球お よびB細胞）を選択的に枯渇させることから、このデータは、GVHDなどの疾患に おけるABX-CBL療法の作用の説明となる。
【０１８４】実験7 細胞活性化に関する知見 実験6に記載した技法を用いて、本発明者らは本発明者らの研究において、ABX
-CBL抗体が結合する抗原を発現するものと同じ細胞集団で、T細胞活性化マーカ ーであるCD25マーカーが高レベルに発現されると思われることも示した。図6参 照。この所見は、活性化細胞がMLRアッセイ法に関連して枯渇したか否かを検出 するための有用なマーカーとなる。種々の活性化細胞集団を用いるMLRアッセイ 法を行ったところ、CD25を発現する細胞集団が枯渇したのはABX-CBLおよび補体 を併用した場合のみであった。図7〜11参照。種々の細胞集団の選択的死滅につ いて図10〜12に示す。
【０１８５】実験8 CD147の発現レベルに関する知見 本発明者らは、特定の細胞集団（CDCにも関係すると考えられるもの）におけ るCD147の発現レベルが相対的に高いか否かも考察した。
【０１８６】 末梢血単核細胞（PBMC）およびABX-CBL抗体を用いるフローサイトメトリー試 験において、本発明者らは、補体を添加する前に、CD147の発現レベルが高い細 胞集団と低い細胞集団があることに着目した。補体の添加後にみられたのは、上
記の低レベル発現細胞に対応すると思われる細胞集団であった。これらの結果は
、細胞表面上のCD147発現レベルの密度の指標になるように思われた。CDCにおい
て密度は、補体カスケード誘発における最初の段階である抗体の変形を可能とす
る付加的な抗原結合部位を提供することにより、重要な役割を果たす可能性があ
る。抗体が変形するとclq因子がまず結合し、カスケードが進行する。
【０１８７】 細胞集団におけるCD147の発現レベル（または密度）がABX-CBL抗体の治療効果
に役割を果たすか否かは、種々の細胞集団におけるCD147分子の発現レベルを分 析することによってアッセイしうる。実験は一般に、既知の量のCD147抗原を表 面に有するビーズを調製し、ビーズ上の種々の抗原量に関して約10〜20のデータ
ポイントを得る目的で、FACS（FITC標識抗CD147IgG抗体を使用）により分析する
ことによって行われる。この種のデータから線形回帰曲線を調製する。その後に
は、CD147抗原を発現する細胞をFACSにかけ、細胞表面上の抗原の相対量を線形 回帰曲線から算出することが可能である。
【０１８８】実験9 補体阻害分子の役割に関する知見 さらに、ABX-CBL抗体の作用様式の細胞特異性を検討する目的で、ABX-CBL抗体
が結合する種々の細胞を調べ、このような細胞が補体媒介性細胞溶解と類似した
様式で死滅するか否かを検討した。この研究と関連して、本発明者らは、ABX-CB
L抗体が結合する種々の細胞を検討し、このような細胞が（i）死滅するか否か、
および（ii）そうであれば、その機序は補体介在性細胞溶解と類似するか否か、
について考察した。本発明者らはこの実験で、ABX-CBL抗体の種々の細胞との結 合（および、このような細胞上に発現されるABX-CBL抗体が結合する抗原）につ いて探索した。続いて、ABX-CBLが結合すると思われる細胞を、ABX-CBL抗体およ
び補体を用いる処理により、補体介在性細胞溶解に関して検討した。ABX-CBL抗 体がそれぞれ結合する、2つのT細胞株（CEMおよびジャーカット細胞）、1つの単
球株（U937細胞）および3つの腫瘍細胞株（A431（上皮）、5W948（結腸）および
MDA468（乳房））を検討した。このような細胞系での発現にもかかわらず、ABX-
CBL抗体は死滅させる細胞に対して極めて特異的であり、これはCEM T細胞株およ
びU937単球株に限定された。図13参照。本発明者らは以下の2種類の内皮細胞株 も分析した：（i）ECV-304（ATCC CRL-1998）は、一見正常と思われるヒト臍帯 静脈から樹立された自然形質転換による不死化ECであり、ECの特徴を備える、（
ii）HUVEC-C（ATCC CRL-1730）は、正常ヒト臍帯静脈に由来するEC株である。本
発明者らはFACSを用いて、ECV-304およびHUVEC-C株のそれぞれが2.6.1、ファー ミンゲン（Pharmingen）およびABX-CBL抗体により陽染されることを見いだした が、このことは、これらのECが表面上にCD147を発現することを示唆する。それ ぞれ図15および16。続いて本発明者らはアラマーブルー（Alamarblue）に基づく
インビトロCDCアッセイ法を行い、いずれのEC株とも、ヒト補体の存在下にてABX
-CBL介在性CDCに対する抵抗性を有することを示した。それぞれ図17および18参 照。
【０１８９】 CD147を発現するすべての細胞が補体の存在下でABX-CBL抗体によって死滅する
とは思われない理由をさらに解明するために、本発明者らはこのような細胞にお
けるCD46、CD55およびCD59の発現を探った。CD46（細胞膜補因子蛋白質、MCP） 、CD55（崩壊促進因子、DAF）およびCD59（膜侵襲複合体阻害因子、MACI）はそ れぞれ、補体阻害分子であるとみなされている。例えば、リスジュースキー（Li
szewski）ら、Annu. Rev. Immunol. 9：431（1991）およびラブランド（Lovelan
d）ら「複数の補体調節分子CD46、CD55およびCD59の協調的機能（Coordinate fu
nctions of multiple complement regulating molecules, CD46, CD55 and CD59
」Transpl. Proc. 26：1070（1994）はCD46に関し、キノシタ（Kinoshita）ら「
正常個体および発作性夜間ヘモグロビン尿症患者の末梢血における崩壊促進因子
の分布（Distribution of decay-accelerating factor in the peripheral bloo
d of normal individuals and patients with paroxysmal noctumal hemoglobin
uria）」J. Exp. Med 162：75（1985）およびラブランド（Loveland）ら「複数 の補体調節分子CD46、CD55およびCD59の協調的機能（Coordinate functions of
multiple complement regulating molecules, CD46, CD55 and CD59」Transpl.
Proc. 26：1070（1994）はCD55に関し、ホイットロー（Whitlow）ら「T細胞 活 性化に関与する細胞表面分子H19はヒト補体によるチャンネル形成を阻害する（H
19, a surface membrane molecule involved in T-cell activation, inhibits
channel formation by human complement）」Cell. Immunol. 126：176（1990）
、ラブランド（Loveland）ら「複数の補体調節分子CD46、CD55およびCD59の協調
的機能（Coordinate functions of multiple complement regulating molecules
, CD46, CD55 and CD59」Transpl. Proc. 26：1070（1994）およびデーヴィス（
Davies, A.）およびラハマン（Lachmann, P.J.）「補体性溶解に対する膜防御：
CD59の構造および生物特性（Membrane defense against complement lysis：the
structure and biological properties of CD59）」Immunol. Res. 12：258（1
993）はCD59に関するものであり、参照されたい。このため、本発明者らは、検 討した上記の細胞系の表面上でのこれらの分子のいずれかまたは両方の発現に差
異があるか否かを考察した。実際には、CEM株およびU937株を除くすべての細胞 で、両方の分子が発現されていた。また、内皮細胞系であるECV-304は、CD46、C
D55およびCD59の3つをすべて発現した。それぞれ図19および20参照。これに対し
て、CEM株はCD59のみを発現し、U937系はCD55のみを発現した。図14参照。この データは、ABX-CBLによって選択的に除去され、その結果、本発明による抗CD147
の標的となる細胞の予測につながる点で有用である。
【０１９０】実験10 真核細胞におけるCD147のクローニングおよび発現、ならびに抗体の結 合 本実験において、本発明者らは、ジャーカットザップ（Jurkat Zapp）発現フ ァージミドDNA（Stratagene）と組み合わせてPCRを用いることにより、完全長CD
147 cDNAをクローニングした。
【０１９１】 ミヤウチ（Miyauchi）ら、J. Biochem. 110：770〜774（1991）（ジェンバン クアクセッション番号D45131）により報告されたCD147配列に基づき、以下のPCR
プライマーを用いた：
【０１９２】 269アミノ酸のCD147蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを有す
る949塩基対のPCR産物が単離された。このPCR産物をEcoRIおよびApaIで消化し、
哺乳類発現ベクターpWBFNP（図21）およびpBKCMV（Stratagene）（図22）（lac プロモーターおよび1300位と1098位との間のlacZ ATGを除去するためにNheI／Sp
eIで消化した）のEcoRIおよびApal部位と連結させて、それぞれベクターCD147／
pWBFNPおよびCD147／pBKCMV（delta-NheI／SpeI）を得た。以上の構築物におい て、CD147の真核生物での発現は、サイトメガロウイルス（CMV）前初期プロモー
ターであるCD147／pWBFNP、CD147／pBKCMV（delta-NheI／SpeI）および対照ベク
ターによって駆動される。CAPO4法により、pWBFNPおよびpBKCMVによるサル腎（C
OS-7）細胞の一時的トランスフェクションを行った。細胞を60時間後に回収し、
PBSで洗浄した後に抗ABX-CBLFITC、抗CEM2.6.1.／抗HuIgG-FITCまたは抗CD147-F
ITC（Pharmingen）で染色して、FACS分析およびウェスタンブロット分析によっ て分析した（図23A参照）。ブロットは実施例3に記載した手順を用いて作製した
。
【０１９３】 FACS分析の結果、3種類の抗体すべてで特異的細胞表面染色の増加が認められ たのは、CD147 cDNA（CD147／pWBFNPおよびCD147／pBKCMV（delta-NheI／SpeI）
）を発現するベクターによるトランスフェクションを受けたCOS細胞上でのみで あることが判明した。CD147 cDNAによるトランスフェクションを受けたCOS細胞 は、FACSおよびウェスタンブロット分析のそれぞれにおいて各抗体との結合を呈
した。これに対して、対照ベクターによるトランスフェクションを受けたCOS細 胞は、2.6.1およびABX-CBL抗体のそれぞれとの結合に関して陰性であった。ファ
ーミンゲン社（Pharmingen）の抗体に関しては、FACSでは対照ベクターによるト
ランスフェクションを受けた細胞である程度のバックグラウンド染色が認められ
たが、ウェスタンブロット分析では結合は認められなかった。トランスフェクト
細胞は、FACSではバックグラウンド値を上回る顕著な結合を示し、ウェスタンブ
ロット分析でも陽性であった。本発明者らの結果により、ABX-CBLおよび2.6.1抗
体がCD147と結合することが確かめられた。
【０１９４】実験11 真核細胞におけるCD147のクローニングおよび発現、ならびに抗体の結 合 わずかな改変を加えたベクターを用いて、本発明者らは大腸菌細胞に対しても
CD147 cDNAによるトランスフェクションを行った。この実験では、CD147 cDNAを
上記の通りに作製し、pBKCMV（Stratagene）（図22）中へのサブクローニングを
行った。CD147／pBKCMVプラスミドDNAの大腸菌株XL1-Blue MRF'（Strategene） への形質転換導入を行った。カナマイシン50μg／mlを添加したLB培地中で培養 物を増殖させ、OD600が0.7となった時点で1mMイソプロピル-β-D-チオ-ガラクト
ピラノシド（IPTG）の存在下でさらに3時間培養した。細胞を遠心処理によって 回収し、-20℃で保存した。このようなトランスフェクションを受けた大腸菌細 胞は、ABX-CBL、2.6.1およびファーミンゲン社（Pharmingen）の各抗体のウェス
タンブロット分析によって示された通り、CD147分子を発現することができた。 原核細胞である大腸菌細胞では、発現されたCD147はグリコシル化されないと考 えられるため、大腸菌によって発現されるCD147の分子量は、グリコシル化され ていないCD147の予想分子量である約27KDに近いはずである。事実、いずれの場 合も、ウェスタンブロット分析での3種類の抗体の結合は約27〜30KDの間のバン ドに対して観察された。
【０１９５】 このデータは、ABX-CBLおよび2.6.1抗体がCD147と結合することをさらに裏づ ける。さらにこの知見は、ABX-CBLのCD147との結合が糖質結合に直接基づくもの
ではないこと、すなわちABX-CBLがCD147上の糖質エピトープとは直接結合しない
ことを示している。しかし、この種のデータは、CD147の結合が糖質の存在また はグリコシル化によって影響を受ける可能性を否定するものではない。
【０１９６】実験12 エピトープ分析 ABX-CBL抗体のCD147に対する結合をさらに解析するために、本発明者らはファ
ージディスプレイ実験を行った。実験では、ランダムにペプチドを発現するファ
ージライブラリーをABX-CBL抗体および2.6.1抗体に対してパンニングして、結合
する抗体の単離を試みた。成功すれば、結合するペプチドからエピトープ情報が
得られることになる。
【０１９７】 一般的には、バクテリオファージM13系に基づくランダムにペプチドを発現す るファージライブラリーは、New England Biolabs社から購入した（それぞれ7量
体および12量体のライブラリー、Ph.D.-7ペプチド7量体ライブラリーキット、お
よびPh.D.-12ペプチド12量体ライブラリーキット）。7量体のライブラリーは、 約2.0 x 109の独立したクローンに対応し、これは想定される207＝1.28 x 109の
7量体配列のほとんどすべてに対応している。12量体のライブラリーには約1.9 x
109の独立したクローンが含まれており、これは2012＝4.1 x 1015の想定される
12量体の配列のごく一部のみに対応している。7量体と12量体のライブラリーの それぞれは、製造元の推奨する方法にしたがって、適当な抗体（2.6.1抗体には ヤギ抗ヒトIgG Fc、ABX-CBL抗体にはヤギ抗マウスμ鎖）をとらえるために、抗 体でコートされたプレート上でパンニングまたはスクリーニングした後、洗浄し
た。結合したファージは、0.2 MグリシンHCl、pH 2.2で溶出した。一定のストリ
ンジェント（0.5％Tween）で3回選択/増幅を行った後、DNA配列決定によって、A
BX-CBL抗体に反応するクローンを7量体ライブラリーから5個および12量体ライブ
ラリーから6個、ならびに2.6.1抗体と反応するクローンを7量体ライブラリーお よび12量体ライブラリーからそれぞれ6個解析した。ペプチドに対する反応性はE
LISAで測定した。ペプチドのエピトープ分析に関する詳しい考察は、Scott, J.K
.およびSmith, G.P. Science 249:386-390 (1990)；Cwirlaら、PNAS USA 87:637
8-6382 (1990); Feliciら、J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991)、およびKuwabar
aら、Nature Biotechnology 15:74-78 (1997)参照。
【０１９８】 CD147と2.6.1抗体の反応性から、コンセンサス配列は直ちに明らかとはならな
かった。しかし、解析された7量体および12量体の配列をCD147のアミノ酸配列に
対して整列させると、CD147の177番目の残基から188番目の残基の間の単一の配 列にいくつかの一致が見られた（ITLRVRSH（配列番号：1））。特に、すべての7
量体は、CD147のこの配列内の3個またはそれ以上の残基と一致（*で表示）する 配列を含んでいた。7量体の配列
【０１９９】 さらに、12量体のうちの4個は、CD147のこの配列内に3個またはそれ以上の残 基と一致（*で表示）する配列を含んでおり、12量体の1番とは4個、2番は6個の 一致を含んでいた。12量体の配列
【０２００】 これらの結果は、配列決定されたクローンのうち10個に共通するRXRS（配列番
号：11）というコンセンサス配列があることを示す。このため、本発明者らは以
下のような配列（-OHはカルボキシ末端を示す）を持つCD147の残基169〜183位の
合成ペプチドを調製した（AnaSpec Incorporated、カリフォルニア州、サンノゼ
）。
【０２０１】 以下にCD147のアミノ酸配列が示されているが、15量体ペプチドの配列には二 重下線、RXRSH（配列番号：13）コンセンサス配列は太字で示されている。さら に、CD147のN-グリコシレーション部位と想定される部分は、イタリック体で表 示されて下線がつけられている。CD147配列
【０２０２】 この15量体ペプチドは、ELISAを用いて測定し、ABX-CBL抗体はこのペプチドに
特異的に結合することが示された。さらに、2.6.1抗体も対照のマウスIgM抗体も
このペプチドには結合しなかった。しかし、CD147抗原とこの15量体のペプチド との競合試験によると、ABX-CBL抗体の15量体への結合は、この15量体ペプチド が溶液中ではなく、プレートにコートされているときにのみ測定できる。ペプチ
ドまたはCD147抗原でコートされたプレートにABX-CBL抗体が結合する競合実験で
は、高濃度でも溶液中のペプチドでは、ABX-CBL抗体は除去または置換されない 。しかしながら、この15量体へのABX-CBL抗体の結合は、CD147抗原および上述の
陽性のファージ調製物では特異的に競合されるが、非特異的抗原（すなわち、ヒ
ト血漿または細胞膜から単離されたL−セレクチン）または上述の陰性ファージ 調製物では競合されない。同様に、CD147抗原へのABX-CBL抗体の結合は、プレイ
ンキュベーションを用いた競合測定法では、陰性のファージ調製物と比較して、
陽性のファージ調製物によって特異的な競合を受ける。
【０２０３】 これらの結果は、コンセンサス配列RXRSHを含むCD147内の配列はCD147へのABX
-CBL抗体の結合に重要ではあるが、CD147へのABX-CBL抗体の結合を完全に説明す
るものではないことを示す。実際、このデータは、プレートに結合したときの15
量体のペプチド中、またはファージコート蛋白質に結合した反応性のファージ材
料中に含まれるコンセンサス配列は、溶液中の遊離ペプチドよりもABX-CBL抗体 へ強く結合することも示唆している。これらを合わせると、特定の理論や操作様
式にとらわれる意図はないが、CD147は溶液中の15量体とはあまり似ていない特 定の立体構造をとっている可能性がある。しかし、上述のエピトープについての
情報は、ABX-CBL抗体のCD147への結合様式を理解し、治療の標的としてCD147に 対する他の候補分子を作製するために重要である。
【０２０４】 CD147内のRXRSHコンセンサス配列の存在に関する上述の結果に加え、ABX-CBL が結合すると思われるhn-RNP-k蛋白質内にこのコンセンサス配列の存在を探索し
た。この分析は、上述のファージ由来のペプチドに対して配列を整列化させて行
った。統計的に興味深い一致を有する2つの配列が見出された。
【０２０５】 第一に、4番の7量体ペプチドと5つのアミノ酸の一致（*で表示）が見られた：
【０２０６】 第2に、1番の12量体と5つのアミノ酸の一致（*で表示）が見られた：
【０２０７】 hn-RNP-k蛋白質のアミノ酸配列は以下に示されており、これらの配列には二重
下線がつけられている。また、RXRのモチーフもいくつかhn-RNP-k蛋白質配列に 存在しており、これらには下線がつけられている：hn-RNP-k蛋白質配列
【０２０８】 特定の理論や操作様式にとらわれる意図はないが、hn-RNP-k蛋白質に対するAB
X-CBL抗体の結合は、この蛋白質内にこれらのモチーフが存在することによって 、部分的に説明できる可能性がある。
【０２０９】実験13 CD147の発現と抗体の結合 ABX-CBLの結合の模倣における望ましさと有効性は、ABX-CBL抗体の組織分布の
予備研究に基づいている。この研究ではABX-CBLはさまざまな組織にわたって、 広く分布している。しかし、分布の大部分は非特異的結合によると考えられる。
しかしながら、内皮細胞（小静脈、小動脈、ただし毛細血管床は除く）、平滑筋
、および一部の中皮では特異的結合があると思われる。また、リンパ細網組織に
も結合していると思われるが、染色されるのは、おそらく活性化芽細胞である大
型のリンパ球に限られていると思われる。行われた試験では、細胞内染色と細胞
外染色を区別することは困難だった。ある程度の細胞質染色は明らかに観察され
ており、これはhn-RNP-k結合と関連している可能性がある。
【０２１０】実験14 ABX-CBL抗体におけるMOPC21 L鎖活性の活性分析 ABX-CBL抗体活性におけるMOPC21 L鎖の役割を調べるために、2つの技法が用い
られた。いずれの場合にも、IgM抗体を産生する細胞株からMOPC21 L鎖を分離し ようと試みた。第1の技法では、ABX-CBL IgM産生株と別の細胞株（NSO）を融合 させて分離を行った。第2の技法では、自然喪失変異体によって分離を試みた。 融合テクニックは成功したが、第2の技法における実験は中止した。
【０２１１】 融合法では一般に、NSO細胞にピューロマイシンを含むベクターをトランスフ ェクションして、ピューロマイシン+NSO細胞株を作製した。ABX-CBL IgM産生株 はHAT培地中で増殖させ、ピューロマイシン+NSO細胞株と融合させた。
【０２１２】 一般に、融合は以下の技法と手順によって行われた。
【０２１３】 細胞の調製 融合の前に、融合に使用する親細胞株を高DMEM, 10% FBS, 1%非必須アミノ酸 、1%ペニシリン・ストレプトマイシンおよび1% L-グルタミンを含む培地で増殖 させ、維持した。
【０２１４】 融合の前日に、各親細胞株を調製し、約105細胞/mlの細胞密度となるように分
割した。融合当日には、細胞を計数し、各親細胞株の細胞数が約1.5〜2.5 x 105 細胞/mlの範囲内であると仮定して融合を開始した。5 x 106細胞を提供するのに
十分な量の親細胞株を培地から取り出し、50 ml の遠心管に添加し、1200 rpmで
約5分遠心して細胞を沈殿させた。細胞の調製と同時に、不完全DMEM, PEG、およ
び二重選択培地をインキュベーター槽中であらかじめ温めた。沈殿させた細胞は
20 mlの不完全DMEM中に再懸濁し、再び沈殿させた。その後、細胞を5 mlの不完 全DMEM中に再懸濁し、2つの親細胞株を1本の試験管に集め、再度沈殿させて、両
方の親細胞株を含む沈殿を形成させた。この沈殿を10 mlの不完全DMEMに再懸濁 し、再び沈殿させた。沈殿からすべての上清を取り除き、融合の準備が整った。
【０２１５】 融合 上清をすべて除去した後、撹拌しながら1分間かけてPEG-1500 1 mlを沈殿の上
に添加した。PEGの添加が完了したら、ピペットで1分間穏やかに撹拌を続けるか
、懸濁した沈殿を1分間静置した。その後、不完全DMEM 10 mlをゆっくりと撹拌 しながら5分間かけて沈殿の上に添加した。混合液を約1200 rpmで5分間遠心し、
その後上清を吸引し、10 ml の完全二重選択培地を細胞に添加して穏やかに撹拌
した。その後細胞を10枚の96ウェルのマイクロプレートに100μl/ウェルで播種 し、インキュベーター（37℃、10％CO2）中に1週間静置した。1週間後に、各ウ ェルに100μlの完全二重選択培地を添加した。
【０２１６】 二重選択培地は、親細胞株で使用されるマーカー遺伝子によって調製された。
大部分の実験では、ピューロマイシン、ヒグロマイシン、ヒポキサンチン、およ
びチミジン耐性を与える選択可能マーカーが使用された。NS/0細胞を完全に殺す
ために必要な濃度は、死滅曲線を利用して決定し、ピューロマイシンは6μg/ml 、ヒグロマイシンは350μg/mlを使用することになった。HPRT耐性については、 標準的な条件でSigma社の提供するHAT培地サプリメントを使用した。
【０２１７】 本件では、細胞はピューロマイシン+/HAT耐性で選択された。各クローンは、 選択性によって選び、96ウェルプレートで増殖させ、プレートを分割した（フリ
ーザーストック1/2、増殖1/2）。製造元の指示にしたがって、Qiagen 96ウェルR
NA単離キットを用いて、増殖プレートから総RNAを単離した。プライマーはMOPC2
1およびABX-CBLκ鎖の保存された部位に基づいてデザインされたが、これは以下
のような各々の鎖の独特の制限酵素部位を含む断片を増幅するものである。
【０２１８】 したがって、上述のプライマーを増幅し、適切な制限酵素で消化すれば、MOPC
21またはABX-CBLの存在の有無がアガロースゲル電気泳動により容易に検出でき る。上述の技法を用いて、MOPC21 L鎖の発現は失ったがABX-CBLκ鎖の発現を保 持している変異体が少なくとも6つ得られた。ABX-CBLκ鎖の発現を失ったがMOPC
21の発現を保持している変異体は直接には得られなかった。しかし、ABX-CBL L 鎖をごく少量しか生産しない細胞株を単離し、これをサブクローニングした。こ
れは不均質なMOPC21/ABX-CBL L鎖の生産細胞とMOPC21 L鎖のみの生産株の混在し
た細胞株であることが分かった。このため、サブクローニング後、MOPC21のみの
生産細胞を単離した。
【０２１９】 MOPC21のL鎖のみおよびABX-CBL L鎖のみを含む抗体を比較したところ、MOPC21
L鎖の有無は抗体結合または抗体の性質に実質的に影響を与えないという結論が
支持された。しかし、MOPC21 L鎖のみを含む抗体は、ウェスタンブロットではCE
M細胞またはCD147への結合がそれほど強くなかった。
【０２２０】実験15 CD147に対するヒト抗体の作製と解析 実験1にしたがって、完全にヒトの抗CD147抗体のパネルを作製した。抗体は、
ELISAでCD147に対する結合について、およびFACsでABX-CBLとの競合能力につい てスクリーニングした。そのような抗体のいくつかでは、配列決定も行った。抗
体の配列は、生殖細胞系のV遺伝子部分の転写物と比較してアミノ酸配列におけ る体細胞変異を調べた。この配列比較は図44〜46に示されている。各々の抗体の
cDNA配列および蛋白質転写物は、図24〜33に示されている。さらに、抗体のH鎖 およびκL鎖のCDRは、Kabatの番号付けによって図34〜43に示されている。
【０２２１】 本発明者らが行ったいくつかの試験、特にABX-CBLおよびいくつかの抗体の間 の競合試験を考慮して、2.6.1 IgM抗体をさらに開発することを選択した。
【０２２２】実験16 IgG1, IgMおよび多量体IgM抗体の作製のための2.6.1発現ベクターの作 製 2.6.1抗体がCBL1およびABX-CBL抗体と同様にADCCで作用する能力を調べるため
に、本発明者らは2.6.1抗体のIgMおよびIgG1アイソタイプの調製を試みた。2.6.
1抗体のIgG2からIgG1へのアイソタイプスイッチングは比較的簡単だったが、2.6
.1抗体の多量体IgMへのスイッチングには、別の段階が必要である。
【０２２３】 認識されるように、XenoMouse動物から作製されたすべてのIgMは一価抗体であ
る。したがって、完全にヒトの多量体IgM抗体を調製するためには、まずヒトの 軟膜細胞からヒトのJ鎖遺伝子をクローニングする必要があった。ヒトJ鎖cDNAの
配列は以下に示されており、5'の非翻訳領域は太字でイタリック体で下線がつけ
られている。
【０２２４】 J鎖遺伝子には以下の配列のヒトJ鎖がコードされている。
【０２２５】 ヒト軟膜細胞からのRT-PCR調製物からヒトJ鎖DNAを増幅するために、表示され
ているクローニング用の制限酵素部位を付け加えた以下のプライマーがデザイン
された。
【０２２６】 RT-PCRによって単離されたJ鎖cDNAおよび2.6.1κ遺伝子は上述のプライマーを
用いて増幅され、オープンリーディングフレームに159アミノ酸のJ鎖蛋白質がコ
ードされている500塩基対のPCR産物が単離された。PCR産物はTAクローニングキ ット（Invitrogen社）にクローニングされたが、この両端にはEcoRI制限酵素部 位が含まれていた。このベクターをEcoRIで消化し、その産物をEcoRIで切断しCI
Pで処理したpWBFNP MCS（図47）にクローニングした。インサートの方向性は、 方向によって異なるサイズの断片を生成するPvuIIによる消化によって決定した 。（PvuII部位は図47に示すようにpWBFNP MCSベクター中、およびJ鎖インサート
の421の位置に存在する。）このベクターはpWBJ1と呼ばれた。
【０２２７】 2.6.1κ鎖を以下のプライマーを用い、VJCKインサートの両端にEcoRI部位を提
供するTAクローニングキットを使用して、RT-PCRによって増幅した。 κ鎖の配列が決定された。κcDNAをEcoRIで消化し、これをpWBFNP MCSのEcoRI部
位へクローニングした。方向性は、pWBFNP MCS中のNotI部位およびκインサート
中の243の位置のPstI部位（図33）をNotIおよびPstIで消化して、断片のサイズ によって決定された。このベクターはpWBK1と呼ばれた。
【０２２８】 J鎖発現カセットをpWBJ1からpWBK1中へ挿入するために、pWBK1をPacIで切断し
、末端を平滑にし、AvrIIで再度切断した。pWBJ1はSpeIで切断後、末端を平滑に
し、AvrIIで再度切断した。末端を平滑にしたSpeI/AvrII断片を、末端を平滑に したpWBK1のPacI/AvrII断片中へクローニングして、pWBK1(J)が得られた。pWBK1
(J)には、2.6.1κ鎖およびJ鎖の両方の発現カセットが含まれていた。
【０２２９】 pWBK1(J)をベクターpWB DHFR（NotIにDHFRを含む）のNotI消化物をpWBK1(J)の
NotI部位へクローニングすることによって、DHFR耐性を含むようにさらに修飾し
た。
【０２３０】 IgG1発現ベクターを作製するために、2.6.1 H鎖を以下のプライマーを用いて 、TAクローニングベクター（Invitrogen社）を使用したRT-PCRによって増幅した
。 得られた産物にはVDJのcDNA配列のみが含まれており、定常領域は含まれていな かった。配列は、配列決定によって確認された。このベクターを用いて、以下の
ようにしてIgG1発現ベクターが調製された。
【０２３１】 pWBFNP MCSをEcoRIで消化、CIP処理し、上述のTAベクターのEcoRI消化物をこ のベクター中にクローニングした。方向性は、挿入を確認するNheI消化、および
その後のNotI消化によるサイズによって決定した。このベクターはpWBVDJ261Nhe
Iと呼ばれた。pWBVDJ261NheIをXhoIで切断し、末端を平滑にしてNheIで再度切断
した。ヒトのγ1構築物は、NheIとEcoRI部位の間にγ1定常領域を含み、EcoRIで
切断後末端を平滑にしてNheIで再度切断したpWBFNPベクターからクローニングし
た。このベクターはpWBVDJ261G1（またはpWBIgG1）と呼ばれた。ピューロマイシ
ンカセットは、HindIIIで切断後、末端を平滑にして再度AvrIIで切断したpIK6.1
+puroベクター（図48）からクローニングした。pWBIgG1はPacIで切断し、末端を
平滑にしてAvrIIで再度切断し、そこにピューロマイシンカセットをクローニン グした。このベクターはpWBIgG1 Puroと呼ばれた。
【０２３２】 IgM発現ベクターを作製するために、2.6.1 H鎖は、以下のプライマーを用いて
、TAクローニングベクター（Invitrogen社）を使用したRT-PCRによって増幅され
た。 得られた産物にはVDJのcDNA配列のみ含まれており、定常領域は含まれていなか った。配列は、配列決定によって確認された。このベクターを用いて、以下のよ
うにしてIgM発現ベクターを調製した。
【０２３３】 pWBFNP MCSをEcoRIで消化、CIP処理し、上述のTAベクターのEcoRI消化物をこ のベクター中にクローニングした。方向性は、挿入を確認するBamHI消化および その後のNotI消化によるサイズによって決定した。このベクターはpWBVDJ261Bam
HIと呼ばれた。
【０２３４】 ヒトMu構築物を、Mendezら（1997）、前記、および1996年12月3日出願の米国 特許出願第08/759,620号に記載されるようにして、以下のプライマーを用いて、
TAクローニングベクター（Invitrogen社）を使用したRT-PCRによって、酵母の人
工染色体構築物YAC 2CMからPCR増幅した。
【０２３５】 ベクターpWBVDJ261BamHIはBamHIで切断し、XhoIで再度切断された。Muインサ ートを含むTAクローニングベクターはBamHIおよびXhoI（TA中の別の部位）によ って切断し、pWBVDJ261BamHIのBamHI/XhoI部位にクローニングされた。得られた
ベクターはpWBVDJ261IgM（またはpWBIgM）と呼ばれた。このベクターには、pWBI
gG1 Puroの作製について上記に説明したのと同様な方法で、さらにピューロマイ
シンカセットが挿入された。得られたベクターはpWBIgM Puroと呼ばれた。
【０２３６】実験17 2.6.1 IgG1抗体を発現する細胞株の作製 2.6.1 IgG1抗体を発現する細胞株を作製するために、DHFR- CHO細胞に、エレ クトロポレーションによってpWBIgG1 PuroベクターおよびpWBK1 DHFRベクターを
コトランスフェクションした。これは、約 2 x 107 DHFR- CHO細胞のストックを
用いて、290 V, 960μFDで、200μgの直鎖状にしたプラスミドDNAおよび200μg のキャリアDNAを用いたエレクトロポレーションにより行った。細胞をα+培地に
播種し、2日間増殖させた。10 cmディッシュ中で、8 x 105細胞が4μg/mlのピュ
ーロマイシンを含む選択培地、α-培地に播種された。4〜5日間細胞をインキュ ベートした後、10 cmのディッシュあたり5 x 105細胞で0.5μM MTXを含むα-培 地に移された。選択のために約14日間細胞をインキュベートし、その後クローン
を選び、増殖させて、CD147への結合能力とIgG1の存在を測定した。
【０２３７】 CD147に特異的に結合するγ1アイソタイプの2.6.1抗体を発現する多くのクロ ーンが回収された。
【０２３８】実験18 2.6.1多量体IgM抗体を発現する細胞株の作製 2.6.1多量体IgM抗体を発現する細胞株を作製するために、本発明者らはDHFR-
CHO細胞に、pWBIgM PuroベクターおよびpWBK1(J) DHFRベクターをエレクトロポ レーションによってコトランスフェクションした。実験18と同じ技法が使用され
た。
【０２３９】 CD147に特異的に結合する多量体Muアイソタイプの2.6.1抗体を発現する多くの
クローンが回収された。
【０２４０】実験19 2.6.1 IgG1および多量体IgM抗体の解析 2.6.1 IgG1および多量体IgM抗体の機能を評価するために、本発明者らはいく つかの測定法で抗体を測定した。2.6.1 IgG1および多量体IgM抗体の各々は、CBL
1およびABX-CBLと同様に、CEM細胞およびCD25+活性化ヒト末梢血細胞に結合した
。これらの抗体は、上述の方法と同様にして、効力および溶解測定法で測定され
た。これらの実験では、2.6.1多量体IgM抗体は、CBL1およびABX-CBLとほぼ同程 度の活性を持っていた。さらに、2.6.1多量体IgM抗体は、図50に示すように、AD
CC中で作用する能力を持っていた。
【０２４１】実験20 2.6.1多量体IgM抗体の親和性測定 ABX-CBLおよびいくつかの他の形態の2.6.1抗体を比較した2.6.1多量体IgM抗体
の親和性も調べた。親和性の測定は、Mendezら（1997）、前記、および1996年12
月3日出願の米国特許出願第08/759,620号に記載されるようにして行われた。結 果は以下の表に示されている。
【表２】
【０２４２】実験21 ABX-CBL抗体を用いたヒトの臨床試験 ABX-CBLのフェーズII臨床試験 A. 背景 上述のように、CBL1抗体で肯定的な結果が観察されたため、ABX-CBL抗体を利 用した臨床試験を行った。最初のものは、ステロイド耐性GVHDの患者において、
4用量のABX-CBLの複数回の静脈内輸液を調べるフェーズII、多施設、オープンラ
ベル、用量漸増試験だった。試験では、少なくとも3日間のコルチコステロイド 治療に応答しない急性GVDH患者で、改良IBMTR重症度指数（Rowlingsら、「対宿 主性移植片病の分類のためのIBMTR重症度指数：glucksberg分類との後ろ向き比 較(IBMTR severity index for grading acute graft-versus-host disease: ret
rospective comparison with glucksberg grade)」 British Journal of Haemat
ology 97:855-864 (1997)によって少なくともBの重症度指数を持つ患者が対象と
なった。この試験では、7日間の誘導後、2週間にわたって週2回の維持用量を投 与するという方法で、4つの異なる用量が、用量漸増デザインで静脈投与された 。治療後8週間にわたって、患者の追跡が行われた。長期安全性の追跡も行われ た。
【０２４３】 試験は以下のような3つの主目的と4つの副次的目的を持ってデザインされた。
【０２４４】 主目的(i) ステロイド耐性急性GVHDの患者におけるABX-CBLの複数回投与安全 性を評価する；(ii) ステロイド耐性急性GVHDの患者におけるABX-CBLのIV最大耐
量を決定する；および (iii) ステロイド耐性急性GVHDの患者におけるABX-CBLの
複数回投与の薬物動態を決定する。
【０２４５】 副次的目的 (i) ステロイド耐性急性GVHDの患者におけるABX-CBLの4つの用量 の臨床的有効性を評価する；(ii) ABX-CBLの用量反応を評価する；(iii) ABX-CB
Lの複数回投与を受けた急性GVHDの患者における長期安全性を評価する；および
(iv) 複数の用量のABX-CBLの複数回投与を受けた急性GVHDの患者における長期生
存率を評価する。
【０２４６】 ABX-CBLの用量の決定は必須だと考えられた。上述のように、CBL1抗体を用い た最初の試験には、精製されていない腹水が用いられた。したがって、患者に投
与された材料中の抗体濃度は不明だった。さらに、CBL1はIgMのみならずIgGも産
生する細胞株で生産したものであるため、患者に投与されたIgM抗体の濃度は、 さらに不明だった。
【０２４７】 上述の目的を評価するために、以下の用量のコホートを持つ4コホートの試験 計画が策定された。 コホート1：0.01 mg/kg コホート2：0.1 mg/kg コホート3：0.3 mg/kg コホート4：1.0 mg/kg
【０２４８】 すべてのコホートの患者には、最高11回のABX-CBLの静脈内輸液が行われた。A
BX-CBLはシリンジポンプを用いて2時間かけて輸液された。投与スケジュールは 次の通りだった：7日間は毎日、その後2週間にわたって週2回。次の用量のコホ ートに進む前に、安全性の評価が行われた。4つのコホート全体で27人の患者が 対象となった。
【０２４９】 試験中、0.3 mg/kgのABX-CBLを投与されている第3コホートの患者に有害事象 が観察された。ここでは、数人の患者が筋痛または筋痛様の症状を経験した。そ
の結果、第3コホート（0.3 mg/kg）が最大耐量だと決定された。したがって、第
4用量コホートの用量は0.2 mg/kgに引き下げられ、実際に使用された用量は以下
のようになった。 コホート1：0.01 mg/kg コホート2：0.1 mg/kg コホート3：0.3 mg/kg コホート4：0.2 mg/kg
【０２５０】 患者が試験に参加するための基準は以下の通りだった。 ・1歳またはそれ以上 ・100日以内に幹細胞移植 ・重症度指数がB, CまたはDのステロイド耐性急性GVHD ・治験責任医師、スポンサーの医療モニター、およびFDAが合意した場合を除き 、30日以内に治験薬または治験用具の経験なし ・GCSFまたはGMCSF存在下または非存在下でANC＞500/mm3
【０２５１】 患者はスクリーニングされ、選択基準を満たせば、治療コホートに割り当てら
れた。標準的な幹細胞移植後治療は継続された。
【０２５２】 投与が開始したら、患者には7日間、毎日その用量のABX-CBLが輸液され（誘導
プログラムと呼ぶ）、その後2週間にわたり週2回輸液された（維持プログラムと
呼ぶ）。輸液後、8週間にわたって安全性と臨床効果のための追跡が行われた（4
週間は週1回診察、その4週後に1回）。さらに、少なくとも1回のABX-CBLの輸液 を受けた患者は、ABX-CBLの長期安全性および長期生存率を評価するための追跡 プログラムに参加することが予定された。
【０２５３】 安全性は治験期間中の有害事象、およびABX-CBLの輸液時の生命徴候のモニタ ーによって評価した。さらに、患者は頻繁に検診を受け、広範囲にわたる検査を
受けた。検査には、下記に述べるように定期的に行われる全血球算定、Ｔ細胞サ
ブセット、血清化学、および尿分析が含まれていた。イソ酵素を含む基線CPKは 、すべての患者について測定し、輸液に関連して何らかの有害事象を経験した患
者は、CPKとイソ酵素を再度分析した。さらに、ELISAによってヒト抗マウス抗体
(HAMA)応答のモニターも行った。さらに、各コホートの患者うち、5人ずつはpK プロファイルのために薬物動態用血液試料を分析することとした。
【０２５４】 ABX-CBLの臨床効果は、改良IBMTR重症度指数（Rowlingsら、「対宿主性移植片
病の分類のためのIBMTR重症度指数：glucksberg分類との後ろ向き比較(IBMTR se
verity index for grading acute graft-versus-host disease: retrospective
comparison with glucksberg grade)」 British Journal of Haematology 97:85
5-864 (1997)に基づいた急性GVHDの全体のスコア、応答時間、応答持続期間、急
性GVHDの再燃の時期と発生率、および入院期間の変化を評価して決定した。
【０２５５】B. プロトコール手順 治験では、以下の試験、観察スケジュール、治験薬の調製が用いられた。
【表３】 試験および観察スケジュール ^ この診察は、治験薬の輸液後ではなく同種幹細胞移植の100日後である。 * 無作為化前の7日以内に行っていなければ測定（患者が16歳以上ならばECG） C/A Ｃ＝完全PE、A=簡略PE 1 身長は初回診察時のみ 2 無作為化要請の48時間以内に測定 3 基線を測定、患者が輸液に関連した有害事象を経験すれば測定（プロトコー ル参照） 4 血清妊娠試験は、妊娠可能な女性で実行（プロトコール参照） 5 結果が治験薬の輸液開始から8時間を越えていれば測定 6 輸液開始前（最高10分）、輸液開始後1時間はq 15分、その後は輸液開始後90
，120，180，240，300，および360分に生命徴候（T, P, R, BP）を測定 7 輸液開始前に測定（最高12時間） 8 初回輸液開始直前、および初回輸液の完了後は以下の時点で測定：15分、30 分、1、2，4，8，12，18，および24時間（第2回輸液前）および9日目および20日
目の輸液の完了後4時間（指定患者のみ） 9 4週および6週のみ 10 治験終了時に＋ならば長期追跡で測定 11 GVHDの状況および現在の治療 12 進行中のAEを解消 13 患者が以前にマウス由来の製品の投与を受けたことがある場合にはHAMAを測
定。患者が治験に参加するためにはこれが陰性である必要がある。マウス製品の
投与を受けたことがない場合には、0日目の輸液開始前に測定。
【０２５６】 治験では、改良IBMTR重症度指数のスコア決定は同一の医師が行うことが好ま しかった。
【０２５７】 以下の検査が各臨床施設（地元の検査室）で行われることとされた。 * 基線、および輸液に関連したAEを経験した患者すべてで輸液後CPKを測定
【０２５８】 さらに、以下の検査が中央試験室で行われた。 ・Ｔ細胞サブセット（CD3, 4, 8）およびCD19：リンパ球数、％、およびCD4:CD8
比
【０２５９】 さらに、以下の検査がAbgenix, Inc.で行われた。 ・HAMAのELISA ・pK（少なくとも5患者/コホートで、以前にマウス製品を投与された患者を含め
る）
【０２６０】 治験薬(ABX-CBL)は以下のように調製し、投与された。
【０２６１】 ABX-CBLは蛋白質であるため、泡立たないように穏やかに取り扱う必要がある 。泡が立つと蛋白質の変性が起きる可能性があるので、取り扱い、調製、および
投与時に泡立たないようにすることは重要である。薬剤師によって治験薬の投与
量の調製が行われた。各投与量は無作為化の前の患者の体重および患者の割り当
てられたコホートに基づいており、11回の輸液ではすべて同用量が投与される。
薬剤師がシリンジとフィルター（フィルターはAbgenixが提供）を調製し、これ を投与のために患者ユニットに届けた。
【０２６２】 輸液設定：輸液用シリンジは、無菌法を用いて調製された。適切な量の治験薬
をシリンジに取り、その後、計算された体積の発熱物質なしの0.9％塩化ナトリ ウム溶液、USP（生理食塩水）を取った。0.22ミクロンの蛋白質低結合性フィル ターを取り付け、製造元の指示にしたがって、液体の損失を抑えるためにチュー
ブのプライミングを行った。
【０２６３】 輸液体積：各輸液（0.01，0.1，0.3，0.2 mg/kg）で輸液される溶液の総体積 （治験薬＋生理食塩水）は、kgで表した患者の体重と等しかった。以下はその例
である。
【表４】
【０２６４】 以下の計算式を用いて、各投与時の治験薬と生理食塩水の体積が決定された。 a. 必要な投与量＝患者の体重X mg/kg (mg/kgは割り当てコホートによる) b. 必要なABX-CBL体積＝投与量/治験薬濃度（1 mg/mL） c. 必要なバイアル数＝必要なABX-CBL体積（上記b）/5 mL（各バイアルには5 mL
のABX-CBLが含まれている） d. 投与される総体積：すべての治療コホートについて、患者はkgで表した自分 の体重と等しい体積の投与を受けた（15 kgの患者は15 mL、70 kgの患者は70 mL
等）
【表５】
【０２６５】 ラベルが付けられ、充填された輸液用シリンジが輸液用に患者ユニットに送ら
れたが、治験薬および/または生理食塩水の漏れを防ぐために、輸液セットのす べてのクランプが閉じていることが確認された。すべてのキャップが閉じられ、
閉鎖系が維持された。スポンサーが輸液用シリンジのラベルを提供し、このラベ
ルには以下の事項が含まれている。 ・患者の試験IDおよびイニシャルを記入する欄 ・治験薬が調製された日時および有効期限の日時を記録する欄 ・治験薬と輸液セットの調製をした者のイニシャルを記載する欄 ・輸液方法 「注意：新薬 - 連邦法により治験目的のみに限定されている」 シリンジポンプによって2時間かけて輸液を投与すること 他の薬剤と混合しないこと* ・総体積に基づいた輸液速度を指定する欄。体積が70 mLの場合には、輸液速度 は35 mL/時になる。
【０２６６】 治験薬を調製する者に、ラベルの上述の情報を記載する責任があった。
【０２６７】 大部分の患者には留置中央ラインが付けられていたため、ABX-CBLの輸液のた めの専用ラインがある限り、輸液のために新しいカテーテルは不要だった。ABX-
CBL投与中には、そのポートまたはIVラインからは他の薬剤は輸液されなかった 。中央ラインが利用できない場合には、ABX-CBLは末梢静脈ラインから輸液する こともできた。治験であるため、ABX-CBLは他の薬剤とは混合されなかった。別 の薬剤がそのポートから以前に輸液された場合には、3〜5 ccの生理食塩水（カ テーテルのサイズ、使用する内腔、および患者のサイズによる）で内腔をフラッ
シュして、ラインから残存薬剤を除去し、薬剤師の調製した新しい輸液装置が、
輸液のためにそのポートまたは三方活栓（別のラインと共有しない）に取り付け
られた。
【０２６８】 このプロトコールは4つの試験期間（スクリーニング、治療、治療の追跡、長 期追跡）から構成される。
【０２６９】 1. スクリーニング期 スクリーニング期は患者または患者の保護者がインフォームドコンセントに署
名した日に始まり、治療の割当通知で終了する。幹細胞移植の最高100日後まで 、患者はこの試験への参加のスクリーニングの対象となり得る。ステロイド耐性
急性GVHDを発症しなかった患者は、試験の対象とはならない。
【０２７０】 各患者はIRBの承認したインフォームドコンセントを理解し、署名しなくては ならない。患者が未成年の場合には、患者の保護者がインフォームドコンセント
に署名する。
【０２７１】 インフォームドコンセントに署名された後、治療の割当の要請前に以下の手順
を完了する必要がある。これらの手順の結果は特に記載のないかぎり、8時間未 満であった。手順には次のものが含まれる： a. 完全な病歴 b. 完全な身体検査で、体重（試験期間全体に渡り治験薬の必要量を決定するた めに使用される体重となる）および身長を含む。 c. 生命徴候（口腔温、安静時脈拍、呼吸、血圧） d. 治療割当要請の30日前からの幹細胞移植治療歴および薬剤歴 e. 急性GVHDの改良IBMTR重症度指数 f. 併発症の評価 g. カルノフスキーの尺度(KPS)（年齢≧16歳）またはランスキー尺度（年齢＜16
） h. 無作為化の前48時間以内に得られていない場合には以下の検査： - 白血球分画および血小板を含むCBC - 血清化学（付録V参照） - 基線CPK-IIIイソ酵素(mm) - 血清妊娠試験。妊娠可能年令でない女性、または治験責任医師が幹細胞移植の
ためのコンディショニングのために不妊と判断する女性には割愛できる - 尿分析 i. 過去7日以内に実施していない場合にはCXR j. 16歳以上のすべての患者につき、過去7日以内に実施していない場合にはECG k. 以前にマウスキメラ製品または完全なマウス製品の投与を受けたすべての患 者について、Abgenixによる陽性HACA/HAMA判定のために血清検体を採取する。こ
の試料はドライアイスに詰めて翌日配達便でAbgenixに出荷され、結果は通常Abg
enixが試料を受領してから24時間以内に得られた。
【０２７２】 上記が完了し、患者が治療対象になり得ると治験責任医師が判断したら、臨床
施設は（ファックスにて）スポンサーにコホート割当てを要請した。通常、臨床
施設は要請後3時間以内にファックスで治療の割当の通知を受けた。
【０２７３】 2. 治療期間 治療期間は臨床施設が患者の治療割当てを受領したときに始まり、患者が輸液
プログラム（11用量）を完了したときに終了した。この期間は、通常は最大3週 間だった。投与が開始されると、患者は「治験中」とされ、10週目の診察手順が
完了するか、治験を脱退した場合に「治療終了」とされた。
【０２７４】 3. 0週目、0日目輸液前手順 以下の診察手順が行われている間に、薬剤師が輸液用に治験薬を調製した。 a. 併用薬また併発症の情報更新 b. 以前のスコアが輸液開始の8時間以上前に得られたものであれば、改良IBMTR 重症度指数 c. 以下の目的のための採血 ・白血球分画および血小板を含むCBC（以前の結果が治験薬の輸液開始の＞8時間
前の場合） ・血清化学（以前の結果が治験薬の輸液開始の＞8時間前の場合） ・CD3, 4, 8 & 19 ・基線HAMA（選択のためのスクリーニングでHAMAのための採決が行われた患者に
は不要） ・輸液開始の10分前までの基線pK試料（指定患者のみ）
【０２７５】治験薬の輸液手順 輸液の最大総体積が患者の体重とコホート割当てに依存するように（治験薬と
生理食塩水の体積の合計）、薬剤師が治験薬を調製した。治験薬は、通常2時間 かけて輸液され、患者は輸液時およびその後の4時間の間、輸液に対する望まし くない反応がないか監視された。治験薬の輸液開始時から、患者は有害事象に関
して連続的に監視された。スポンサーは輸液に関する有害事象（サイトカイン放
出症候群：発熱、悪寒、硬直/震え、低血圧、および発疹または過敏症反応；発 熱、悪寒、徐脈/心停止、呼吸停止、急性呼吸不全症候群、発疹/じんま疹、汎血
球減少、肝臓トランスアミナーゼ上昇、ならびに関節痛/筋痛）が疑われるとき には直ちに通知された。輸液反応が疑われ、患者が筋痛または何らかの筋肉の問
題を経験した場合には、CPK-IIIイソ酵素(mm)が測定された。
【０２７６】輸液時の生命徴候 輸液中には、輸液開始直前（輸液開始前10分以内）、輸液時の最初の1時間は1
5分ごと（4回）、その後は輸液開始の90分後、および輸液完了時（輸液開始の12
0分後）に、生命徴候（T, P, R, BP）を測定した。通常、生命徴候はその後4時 間は1時間に一回（輸液開始後180，240，300，および360分の4回）測定した。輸
液時の生命徴候の完了後は、臨床施設で使われる確立されたガイドラインにした
がって生命徴候はモニターされた。
【０２７７】薬物動態用血液試料 pK分析用の血液は、各コホートで少なくとも5人の患者から採取された。以前 にマウス製品の投与を受けたことのある治験参加患者には、すべてpK評価を行っ
た。通常、血液試料は初回輸液の完了後、次の時点で採取された；15分、30分、
1、2、4、8、12、18、24時間。輸液後24時間の試料は、ABX-CBLの2回目の輸液開
始前に採取された。
【０２７８】 4. 0週目、1〜6日目 患者には連続7日間にわたり治験薬が毎日輸液された（誘導プログラム）。2回
目以後の輸液は、初回輸液とほぼ同時刻（±60分）に開始された。投与量は、参
加前の体重に基づいており、そのため、治療期間を通して患者には同じ用量が投
与された。治療期間のいずれかの時点でECGまたはCXRを行った患者のデータは収
集されたが、それ以外の定期的なECGおよびCXRは不要だった。この期間に行われ
た生検についても同様である。
【０２７９】 特に記載がないかぎり、各輸液開始前12時間以内に以下の手順が行われた。 a. 簡略型身体検査（付録II参照） b. 体重 c. KPSまたはランスキー尺度 d. 改良IBMTR重症度指数 e. 併用薬または併発症の情報更新 f. 有害事象の評価 g. 以下の目的の採血（地元の検査室と中央検査室で処理される試験については 付録V参照） ・白血球分画および血小板を含むCBC ・血清化学 ・CD3, 4, 8, および19 ・指定患者のみ薬物動態試料、1日目の輸液開始前にのみ採取（初回輸液後24時 間の試料となる）
【０２８０】治験薬の輸液 治験薬は上述の手順で2時間かけて輸液された。輸液反応が疑われ、患者が筋 痛または何らかの筋肉の問題を経験した場合には、CPK-IIIイソ酵素(mm)が測定 された。
【０２８１】輸液時の生命徴候 初回輸液で記載されたスケジュールにしたがって、生命徴候（T, P, R, BP） が測定された。
【０２８２】 5. 1週目（9および13日目） 誘導プログラムが完了したら、患者には2週間にわたって週2回治験薬が輸液さ
れた（維持プログラム）。維持プログラムの各輸液の開始時刻は、通常、初回輸
液（0日）の±60分だった。特に記載がないかぎり、通常、輸液開始前12時間以 内に次の手順が行われた。 a. 簡略型身体検査 b. 体重 c. KPSまたはランスキー尺度 d. 改良IBMTR重症度指数 e. 併用薬または併発症の情報更新 f. 有害事象の評価 g. 尿分析（9日目のみ） h. 以下の目的の採血（地元の検査室と中央検査室で処理される試験については 付録V参照） ・白血球分画および血小板を含むCBC ・血清化学 ・CD3, 4, 8, および19（9日目のみ） ・HAMA（9日目のみ）
【０２８３】治験薬の輸液 治験薬はやはり上述の手順で2時間かけて輸液された。輸液反応が疑われ、患 者が筋痛または何らかの筋肉の問題を経験した場合には、CPK-IIIイソ酵素(mm) が測定された。
【０２８４】輸液時の生命徴候 上述のように生命徴候が測定された。
【０２８５】薬物動態試料 9日目の輸液完了の4時間後にpK分析用血液試料が採取された。
【０２８６】 6. 2週目（16および20日目） 維持プログラム（連続2週間、週2回投与）の2週目に当たる。各輸液の開始時 刻は、通常、0日目の輸液の±60分だった。特に記載がないかぎり、通常、輸液 開始前12時間以内に次の手順が行われた。 a. 簡略型身体検査 b. 体重 c. KPSまたはランスキー尺度 d. 改良IBMTR重症度指数 e. 併用薬または併発症の情報更新 f. 有害事象の評価 g. 尿分析（16日目のみ） h. 以下の目的の採血（地元の検査室と中央検査室で処理される試験については 付録V参照） ・白血球分画および血小板を含むCBC ・血清化学 ・CD3, 4, 8, および19（16日目のみ）
【０２８７】治験薬の輸液 治験薬は上述の手順で2時間かけて輸液された。輸液反応が疑われ、患者が筋 痛または何らかの筋肉の問題を経験した場合には、CPK-IIIイソ酵素(mm)が測定 された。
【０２８８】輸液時の生命徴候 上述のように生命徴候が測定された。
【０２８９】薬物動態試料 20日目の輸液完了の4時間後にpK分析用血液試料が採取された。
【０２９０】 7. 治療追跡期間（3週〜10週目） 治療追跡期間は、20日目の診察が完了した時点から、10週目の診察の完了まで
続いた。この期間には5回に診察があった。10週目の診察を完了した時点で、患 者は「治験終了」とされた。この治験期間中に患者が臨床施設から退院した場合
には、診察に変えて電話で評価を完了するための最大限の努力が払われた。3，4
，5，６および10週目は治療追跡の診察で、安全性、有効性または再発の兆候が 評価された。部分的または完全な応答を示し、GVHDの再燃が見られる患者は、試
験から撤退することが認められ、別のオープンラベルの特別治療プロトコールに
参加した。治療追跡期間に得られたすべての生検、ECGおよび/またはCXRは、各 臨床施設で指定される通り、通常の患者の診察時に行われ、データが収集された
。筋痛または何らかの筋肉の問題という輸液に関連する有害事象を経験し、mm（
筋壊死または炎症で上昇するイソ酵素）レベルが上昇した患者は、試験の残りの
期間を通してCPK-III (mm)試料を採取した。
【０２９１】 8. 3週目（23日目） この日の診察では、以下の手順が行われた。 a. 完全な身体検査、生命徴候、体重 b. KPSまたはランスキー尺度 c. 改良IBMTR重症度指数 d. 併用薬または併発症の情報更新 e. 有害事象の評価 f. 入院状態（入院か退院か） g. 以下の目的の採血 ・白血球分画および血小板を含むCBC ・血清化学（付録V参照） ・CD3, 4, 8, および19
【０２９２】 9. 4週目（30±1日目） この日の診察では、以下の手順が行われた。 a. 完全な身体検査、生命徴候、体重 b. KPSまたはランスキー尺度 c. 改良IBMTR重症度指数 d. 併用薬または併発症の情報更新 e. 有害事象の評価 f. 入院状態（入院/通院、または退院） g. 尿分析 h. 以下の目的の採血 ・白血球分画および血小板を含むCBC ・血清化学（付録V参照） ・CD3, 4, 8, 19 ・HAMA
【０２９３】 10. 5週目（37±1日目） この日の診察では、以下の手順が行われた。 a. 完全な身体検査、生命徴候、体重 b. KPSまたはランスキー尺度 c. 改良IBMTR重症度指数 d. 併用薬または併発症の情報更新 e. 有害事象の評価 f. 入院状態（入院/通院、または退院） g. 以下の目的の採血 ・白血球分画および血小板を含むCBC ・血清化学（付録V参照） ・CD3, 4, 8, 19
【０２９４】 11. 6週目（44±1日目） この日の診察では、以下の手順が行われた。 a. 完全な身体検査、生命徴候、体重 b. KPSまたはランスキー尺度 c. 改良IBMTR重症度指数 d. 併用薬または併発症の情報更新 e. 有害事象の評価 f. 入院状態（入院/通院、または退院） g. 尿分析 h. 以下の目的の採血 ・白血球分画および血小板を含むCBC ・血清化学（付録V参照） ・CD3, 4, 8, 19 ・HAMA
【０２９５】 12. 10週目（72±2日目） この日の診察が完了すると、患者は「治験終了」とされた。
【０２９６】 この日の診察では、以下の手順が行われた。 a. 完全な身体検査、生命徴候、体重 b. KPSまたはランスキー尺度 c. 改良IBMTR重症度指数 d. 併用薬または併発症の情報更新 e. 有害事象の評価 f. 入院状態（入院/通院、または退院） g. 尿分析 h. 以下の目的の採血 ・白血球分画および血小板を含むCBC ・血清化学（付録V参照） ・CD3, 4, 8, 19 ・HAMA（HAMA陽性のすべての患者には、長期追跡期間にもHAMA用採血が必要）
【０２９７】 13. その他の診察時点（幹細胞移植の100日後） 大部分の患者は、幹細胞移植の100日後に評価された。この診察と本プロトコ ールとの順序は、幹細胞移植後、いつ急性GVHDが発症したかによって、患者ごと
に異なる。100日目がいつであるかにはかかわらず、この日の診察では以下の手 順が実行された（患者が臨床施設から退院した場合には、患者への電話連絡およ
びかかりつけの医師から情報を得るための最大限の努力がなされた。） a. 簡略型身体検査、生命徴候、体重 b. KPSまたはランスキー尺度 c. 改良IBMTR重症度指数 d. 併用薬または併発症の情報更新 e. 有害事象の評価 f. 入院状態（入院/通院、または退院） g. 以下の目的の採血 ・白血球分画および血小板を含むCBC ・血清化学（付録V参照）
【０２９８】 14. 長期追跡期間 長期追跡期間は、10週目の診察の完了の次の日に始まり、10年間または患者が
追跡の同意を撤回するまで継続する予定である。長期追跡期間の主目的はABX-CB
Lの長期安全性を調べ、長期生存率を調べることである。患者は10週目の診察以 後、6ヶ月ごとに評価される。評価は、電話インタビューまたは診察で行われる 。長期追跡データは、患者/保護者が書面で同意した場合には、かかりつけの医 師からスポンサーAbgenix, Inc.が得ることもできる。すべてのデータは、患者 の試験IDを用いてデータベースに入力される。電話または診察時に、以下の情報
が得られる。 a. 患者の健康状態の本人評価、最後の「治験中」の診察時に進行していたAEの 終了も含む。 b. 以下のいずれかの発生 ・死亡 ・日和見感染症 ・他の免疫障害 ・他の癌 ・先天異常 ・女性で妊娠している場合には、赤ん坊の状態（妊娠後） c. 患者が前回の診察/電話以後、他の研究（治験薬および/または器具）に参加 しているかどうか
【０２９９】 臨床施設の移植チームによって長期追跡データが得られる場合には、電話/診 察から10仕事日以内に、診察時の評価のコピーがスポンサーにファックスされる
。
【０３００】c. HAMAの決定 この測定は、ヒト被験者におけるABX-CBLの免疫原性を調べ、ヒト血清におけ るヒト抗ABX-CBL抗体（ヒト抗mCBL抗体）（ヒト抗マウス抗体、HAMA、応答）を 検出するためにデザインされた。
【０３０１】 材料： 陰性対照、HAMA陰性血清のプール（Pacific, Irwin Blood Centerの血液セン ター、カリフォルニア州サンフランシスコ）、試験済みプール、-20℃保存 陽性対照、HAMA陽性血清のプール（ABX-CBLでXenoMouseマウス（Abgenix, Inc
.）を免疫、血清の採取とプール）、-20℃保存 ABX-CBL、5μg/50μL（100μg/mL）、Abgenix、ロット番号097-104-1，-20℃ 保存または同等品 ビオチン化ABX-CBL（ABX-CBL-ビオチン）、Abgenix、ロット番号J090-112また
は同等品 ストレプトアビジン-HRP，Southern Biotechnology、カタログ番号7100-05ま たは同等品 O-フェニレンジアミン二塩酸（OPD）基質錠剤、20 mg、Sigma、カタログ番号P
-7288または同等品 O-フェニレンジアミン二塩酸（OPD）基質錠剤、10 mg、Sigma、カタログ番号P
-8287または同等品 過酸化水素水、30％、Sigma、カタログ番号H-1009または同等品 脱イオン逆浸透精製水（DiH2O）または同等品
【０３０２】 ELISAプレートのコート：ABX-CBL 5μg/50μL（100μg/mL）のバイアルを室温
で2〜5分解凍する。低速で3〜5秒ボルテックス撹拌する。15 mLのコニカルチュ ーブ中で、48μLのABX-CBL 5μg/50μL（100μg/mL）を12 mLのコーティング緩 衝液（16.8 gNaHCO3/1.8 L DiWater、5N NaOHによりpH 9.6）に添加する。コー ティング溶液を低速で3〜5秒ボルテックス撹拌する。コーティング溶液を試薬槽
に入れる。マルチチャネルピペッターを用いて、100μLのコーティング溶液を各
ウェルに添加する。プラスチックプレートシーラーを用いてプレートを被い、2 〜8℃で16〜24時間インキュベートする。プレートウォッシャーを用いて、1X洗 浄緩衝液（10 Lの10X PBS中 50 mL Tween 20を10倍希釈）でプレートを洗う。マ
ルチチャネルピペッターを用いて、各ウェルに100μLのブロッキング緩衝液（40
0 mL 10 X PBS中20 g BSA、0.4 g Thimerosal、4 mL Tween 20を4 L DiWaterに 希釈）を添加する。プレートシーラーでプレートを被い、室温で1時間インキュ ベートする。
【０３０３】 陽性対照の調製：陽性対照（HAMA陽性血清）1バイアルを室温で10〜20分解凍 する。陽性対照を低速で3〜5秒ボルテックス撹拌する。気泡を避ける。20μLの 陽性対照を、微量遠心チューブ中で180μLのブロッキング緩衝液に添加する。低
結合96ウェルプレートのウェルA1およびA2では、上述の希釈した陽性対照20μL を、180μLのブロッキング緩衝液中に入れる。混合する。溶液を5回出し入れし て十分に混合する。気泡を避ける。陽性対照の2倍の連続希釈を調製する。注： 各プレートには、1列目および2列目に陽性対照が2重に含まれているようにする 。以下の手順は1プレートについてのものである。上述のプレートのウェルB3、B
4からH3、H4までに、ブロッキング緩衝液100μLを添加する。マルチチャネルピ ペッターを用いて、ウェルA1およびA2中の溶液100μLを、それぞれB1およびB2に
移す。100μLを5回出し入れして十分に混合する。気泡を避ける。ウェルB1およ びB2中の溶液100μLを、それぞれC1およびC2に移す。100μLを5回出し入れして 十分に混合する。気泡を避ける。各列の希釈を続け、最後の希釈がG列（ウェルG
1およびG2）になるようにする。H列のブロッキング緩衝液はブランク対照として
残しておく。
【０３０４】 陰性対照の調製：陰性対照を室温で20〜30分解凍する。低速で3〜5秒ボルテッ
クス撹拌をしてから、ELISAプレートに移す。980μLのブロッキング緩衝液に陰 性対照を20μL入れて希釈する。
【０３０５】 試料調製：注1：血清試料は、指定の場所で調製する。注2：血清の取り扱い時
は手袋を着用し、ユニバーサルプレコーション（普遍的予防措置）を順守する。
血清試料を室温で20〜30分間解凍し、低速で3〜5秒ボルテックス撹拌する。20μ
Lの血清試料をタイターチューブ中で980μLのブロッキング緩衝液に添加し、50 倍希釈する。50μLの溶液を5回出し入れして希釈試料を十分に混合する。気泡を
避ける。プレートウォッシャーを用いてステップ7.3.2でコートされたELISAプレ
ートを洗う。50μLの陽性対照、陰性対照、試料、およびブランクを上述のよう にELISAプレートに移す。プラスチックプレートシーラーを用いてELISAプレート
を被い、室温で2時間インキュベートする。低速でプレートを震盪する。
【０３０６】 ABX-CBL-ビオチンの調製：注：各ELISAプレートには最低10 mLの希釈されたAB
X-CBL-ビオチンが必要である。最終希釈は、試薬の力価によって調整できる。AB
X-CBL-ビオチンを低速で3〜5秒間ボルテックス撹拌する。微量遠心チューブ中で
、1.485 mLのブロッキング緩衝液に15μLのABX-CBL-ビオチンを入れて希釈する 。希釈率は100倍である。100倍希釈のABX-CBL-ビオチン1200μLを10.80 mLのブ ロッキング緩衝液に入れて希釈する。希釈率は1000倍になる。低速で3〜5秒間ボ
ルテックス撹拌する。プレートウォッシャーを用いてコートされたELISAプレー トを洗う。マルチチャネルピペッターを用いて1000倍希釈のABX-CBL-ビオチン10
0μLをELISAプレートの各ウェルに添加する。プラスチックプレートシーラーで プレートを被い、室温で1時間インキュベートする。
【０３０７】 ストレプトアビジン-HRPの調製：注：各ELISAプレートには最低10 mLの希釈さ
れたストレプトアビジン-HRPが必要である。最終希釈は、試薬の力価によって調
整できる。ストレプトアビジン-HRPを低速で3〜5秒間ボルテックス撹拌する。微
量遠心チューブ中で、990μLのブロッキング緩衝液に10μLのストレプトアビジ ン-HRPを入れて希釈する。希釈率は100倍である。100倍希釈のストレプトアビジ
ン-HRP 250μLを12.25 mLのブロッキング緩衝液に入れて希釈する。希釈率は500
0倍になる。低速で3〜5秒間ボルテックス撹拌する。プレートウォッシャーを用 いてコートされたELISAプレートを洗う。マルチチャネルピペッターを用いて500
0倍希釈のストレプトアビジン-HRP 100μLをELISAプレートの各ウェルに添加す る。室温でプレートを15分間インキュベートする。
【０３０８】 基質溶液の調製：注1：各ELISAプレートには最低10 mLの基質溶液が必要であ る。注2：基質溶液は使用前に新しく調製する。12 mLの基質溶液を調製するため
には、10 mg OPD錠剤1錠および12μLの30％過酸化水素水をコニカルチューブ中 で基質緩衝液12 mLに添加する。室温に3〜5分放置して、錠剤を溶解する。プレ ートに添加する前に3〜5秒ボルテックス撹拌する。プレートウォッシャーを用い
て上述のELISAプレートを洗う。マルチチャネルピペッターを用いて100μLの基 質溶液を各ウェルに添加し、15分間インキュベートする。マルチチャネルピペッ
ターを用いて、50μLの停止溶液（2 M H2SO4）を各ウェルに添加する。
【０３０９】 ELISAプレートの測定：波長を492 nmに設定し、測定前に5秒間プレートを混合
するようにオートミックス機能をチェックする。差し引き機能（L1をチェック）
を用いて計算されたブランク値を差し引く。試料と対照は緩衝液ブランクに対し
て比較する。SPECTRAmax 250分光光度計を用いて、反応停止の30分以内にプレー
トの測定を行う。
【０３１０】 上述のように、本測定法は本臨床試験の患者の試料に使用されたが、HAMA応答
が陽性となった患者はいなかった。
【０３１１】D. pKの決定 薬物動態(pK)試験について本測定法が使用され、ヒト血清中のABX-IL8の存在 が測定された。
【０３１２】 材料： ABX-CBL、抗マウスCBL抗体、5μg/50μL（100μg/mL）、Abgenix、ロット番号
69-21-4または同等品 高、中、低陽性対照、ABX-CBL：69-21-3、69-21-2、69-21-1または同等品 ヤギ抗マウスIgM、Caltag、カタログ番号M31500、ロット番号3501または同等 品 ヤギ抗マウスIgM-HRP、caltag、カタログ番号M31507、ロット番号2301または 同等品 正常ヒト血清 O-フェニレンジアミン二塩酸（OPD）基質錠剤、20 mg、Sigma、カタログ番号P
-7288または同等品 O-フェニレンジアミン二塩酸（OPD）基質錠剤、10 mg、Sigma、カタログ番号P
-8287または同等品 過酸化水素水、30％、Sigma、カタログ番号H-1009または同等品 脱イオン逆浸透精製水（DiH2O）または同等品
【０３１３】 ここで使用される緩衝液および溶液は、特に記載がないかぎり、HAMA測定法で
説明された緩衝液および溶液と同一である。
【０３１４】 ELISAプレートのコート：注：各ELISAプレートには最低10 mLのコーティング 溶液が必要である。2〜8℃の冷蔵庫からヤギ抗マウスIgM (1 mg/mL)のバイアル を取り出す。室温に2〜5分放置する。低速で3〜5秒ボルテックス撹拌する。15 m
Lのコニカルチューブ中で、15 mLのコーティング緩衝液中に3μLのヤギ抗マウス
IgM (1 mg/mL)を添加する。コーティング溶液を低速で3〜5秒ボルテックス撹拌 する。コーティング溶液を試薬槽に入れる。マルチチャネルピペッターを用いて
、100μLのコーティング溶液を各ウェルに添加する。プラスチックプレートシー
ラーを用いてプレートを被い、2〜8℃で16〜24時間インキュベートする。プレー
トウォッシャーを用いて、1X洗浄緩衝液でプレートを洗う。
【０３１５】 ELISAプレートのブロッキング：マルチチャネルピペッターを用いて、200μL のブロッキング緩衝液を各ウェルに添加する。プラスチックプレートシーラーを
用いてプレートを被い、室温で1時間インキュベートする。
【０３１６】 標準の調製：注１：セクション8.4および8.6（8.4.4.1および8.6.3を除く）で
使用されたブロッキング緩衝液には、非処理ヒト被験者の血清が1％含まれてい る。各プレートには最低9 mLのブロッキング緩衝液が必要である。1％ヒト血清 を含むブロッキング緩衝液を10 mL作製するためには、コニカルチューブ中で9.9
mLのブロッキング緩衝液に100μLの血清を添加する。低速で3〜5秒ボルテック ス撹拌する。ABX-CBL標準（100μg/mL）1バイアルを室温で10〜20分かけて解凍 する。100μg/mLのABX-CBLを低速で3〜5秒ボルテックス撹拌する。気泡を避ける
。
【０３１７】 標準の初回希釈：1チャネルピペットを用いて、1.7 mL微量遠心チューブ中で 、40μLの100μg/mLストックを360μLのブロッキング緩衝液に添加する。十分混
合する。これは10倍希釈で、10μg/mLになる。1チャネルピペットを用いて、1.7
mL微量遠心チューブ中で、この10倍希釈（10μg/mL）40μLを460μLのブロッキ
ング緩衝液に添加する。十分混合する。この希釈で濃度は800 ng/mLになる。希 釈した標準を低速で3〜5秒ボルテックス撹拌して混合する。気泡を避ける。標準
の2倍の連続希釈を調製する。注：各ブランクの締結後鵜ELISAプレートには、1 列目および2列目に標準が2重に含まれているようにする。以下の手順は1プレー トについてのものである。上述のプレートのウェルB1、B2からH1、H2までに、ブ
ロッキング緩衝液100μLを添加する。800 ng/mLの標準200μLをウェルA1およびA
2に移す。マルチチャネルピペッターを用いて、ウェルA1およびA2中の溶液100μ
Lを、それぞれB1およびB2に移す。100μLの溶液を5回出し入れして十分に混合す
る。気泡を避ける。ウェルB1およびB2中の溶液100μLを、それぞれC1およびC2に
移す。100μLの溶液を5回出し入れして十分に混合する。気泡を避ける。各列の 希釈を続け、最後の希釈がH1およびH2になるようにする。
【０３１８】 陽性対照の調製：注：各プレートに高、中、低対照1バイアルが必要である。 高、中、低対照1バイアルを室温で10〜20分解凍する。低速で対照を3〜5秒ボル テックス撹拌してからELISAプレートに移す。
【０３１９】 試料調製：血清試料を室温で30分間解凍する。希釈前に低速で3〜5秒ボルテッ
クス撹拌する。20μLの血清試料をブランクプレートのA列中で180μLのブロッキ
ング緩衝液（1％血清なし）に添加して、10倍希釈する。100μLの溶液を5回出し
入れして希釈試料を十分に混合する。気泡を避ける。試料の2倍の連続希釈を調 製する。マルチチャネルピペッターを用いて、100μLのブロッキング緩衝液をB 列からH列に添加する。ステップ8.6.3の希釈試料100μLをB列に移す。上述のよ うに混合する。試料100μLをB列からC列、C列からD列となるようにH列まで移す 。移した後は100μLの溶液を5回出し入れして十分に混合する。気泡を避ける。 プレートウォッシャーを用いて1X洗浄緩衝液でプレートを洗う。50μLの希釈標 準、対照、および試料をブランクプレートからELISAプレートに移す。H列から始
めて、G列へとなるようにA列まで行う。緩衝液ブランクのウェル追加は、プレー
トテンプレートをチェックする。プラスチックプレートシーラーを用いてプレー
トを被い、室温で2時間インキュベートする。
【０３２０】 HRP結合検出抗体の調製：注：各プレートには最低10 mLの希釈されたHRP結合 抗体が必要である。ヤギ抗マウスIgM-HRPを低速で3〜5秒間ボルテックス撹拌す る。15 mLのコニカルチューブ中で、12 mLのブロッキング緩衝液に8μLのヤギ抗
マウスIgM-HRPを入れて1500倍希釈する。ボルテックス撹拌する。プレートウォ ッシャーを用いて1X洗浄緩衝液でプレートを洗う。マルチチャネルピペッターを
用いて希釈されたヤギ抗マウスIgM-HRP（ステップ8.10.2） 100μLをプレートの
各ウェルに添加する。プラスチックプレートシーラーを用いてプレートを被い、
室温で1時間インキュベートする。
【０３２１】 基質溶液の調製：注1：各プレートには最低10 mLの基質溶液が必要である。注
2：基質溶液は使用前に新しく調製する。12 mLの基質溶液を調製するためには、
10 mg OPD錠剤1錠および12μLの30％過酸化水素水をコニカルチューブ中で基質 緩衝液12 mLに添加する。室温に3〜5分放置して、錠剤を溶解する。プレートに 添加する前に3〜5秒ボルテックス撹拌する。プレートウォッシャーを用いて1X洗
浄緩衝液でプレートを洗う。マルチチャネルピペッターを用いて100μLの基質溶
液を各ウェルに添加し、15分間インキュベートする。
【０３２２】 ELISA反応の停止：マルチチャネルピペッターを用いて、50μLの停止溶液を各
ウェルに添加する。
【０３２３】 ELISAプレートの測定：波長を492 nmに設定し、測定前に5秒間プレートを混合
するようにオートミックス機能をチェックする。差し引き機能（L1をチェック）
を用いて計算されたブランク値を差し引く。標準、対照、および試料は緩衝液ブ
ランクに対して比較する。SPECTRAmax 250分光光度計または同等の分光光度計を
用いて、反応停止から30分以内にプレートの測定を行う。Molecular Devices SP
ECTRAmax 250マイクロプレート分光光度計の操作と保守。
【０３２４】 データ分析：標準のODを用いて標準曲線を計算する。計算には「4パラメータ ーフィット」を用いる。試料および対照の濃度は、標準曲線からソフトウェアが
自動的に計算する。測定が有効となるためには、以下の基準が満たされなくては
ならない：標準、対照、および試料にはOD＜4.0のみ使用。測定対照（高、中、 低）の結果を比較する。対照の値は、期待される濃度の20％以内に入り、変動係
数(CV)≦20％である必要がある。ST03とST06の間の標準のCVは≦20％でなくては
ならない。測定の標準曲線の相関係数は≧0.990でなくてはならない。
【０３２５】 本臨床試験において、ABX-CBL抗体の薬物動態を決定するために本測定法が使 用された。上述の測定を用いたpKの予備的結果は図1に示されている。
【０３２６】E. 結果 ここでは、ABX-CBLによる急性GVHD患者の治療において観察された結果を記述 する。
【０３２７】 治験には4つの用量レベルを合わせて27人の患者が参加した。高い用量のコホ ートの採用前に、低い用量が完了した。元の第3コホート（0.3 mg/kg）の用量の
治療を受けた患者が筋痛または筋痛様症状を示した。Abgenixはこれが最大耐量 （MTD）だと判断し、最後の用量を1.0 mg/kgから0.2 mg/kgに修正した（MTDおよ
びMTDの前の用量の中間）。
【０３２８】 4つの用量のコホートの患者の適用の後、追加の患者は0.15 mg/kg〜0.2 mg/kg
の用量レベルとされた。1999年1月13日時点で、44人の患者（17人の追加患者） が参加している。これらの17人の追加患者のデータ収集は継続中である。このデ
ータは整い次第発表する。
【０３２９】 本明細書に記述されるすべてのデータは、重篤有害事象(SAE)のまとめを除き 、すべて最初の27人の患者に基づくものである。SAEのまとめは1999年1月13日現
在のすべての患者に関する。
【０３３０】 有効性の評価のためには、患者は最低4回のABX-CBLの輸液を受けなくてはなら
なかった。参加した27人の患者のうち、23人がこの基準に当てはまった。コホー
ト1（非有効用量）の患者を除くと、全体の応答率は73％で平均持続期間は32日 だった。
【０３３１】 筋痛を除き、ABX-CBLは十分に耐容性だった。すべての患者はHAMA陰性のまま であり、ABX-CBLに対する過敏症の報告はなかった。
【０３３２】 1. 人口統計学 参加した27人の患者のうち、21人は成人（16歳またはそれ以上）で、6人は小 児患者だった（表4）。24人の患者は同種骨髄移植を受け、残りの3人は末梢血幹
細胞の移植を受けた。移植日から治験参加までの平均期間は、48日だった。治験
開始時に7人の患者はIBMTRスコアがBで、10人はC、10人はDだった（表５）。表6
は有効性を評価した23人の患者の基線スコアを示す。
【表６】
【表７】
【表８】
【０３３３】 2. 有効性 本治験の対象となる患者は、IBMTRスコアが少なくともBだった。IBMTRスコア が少なくとも2段階低下した患者は、応答者と見なされた。低下してスコアがな くなった患者、すなわち急性GVHDが見られなくなった患者は、完全な応答者とみ
なされた。4回以上のABX-CBLの輸液を受けた患者のみが、有効性の分析の対象と
なった。（表7）
【表９】 * 1人の患者はABX-CB-9702プロトコールにおいて追加のABX-CBL治療に応答した が、上述の表には含まれていない。
【０３３４】 全体では、27人の患者のうち13人（57％）がABX-CB-9701においてABX-CBLに応
答した。平均持続期間は36日だった。以下に記載するプロトコールに転向した1 人の患者は、追加の治療に応答した。これにより、全体の応答率は61％になる。
試験開始時の仮定では、0.01 mg/kgの用量は、非有効用量であるというものだっ
た。この用量では効果がないと仮定すると、応答率は73％（15人の患者のうち11
人）となる。この仮定を用いると、平均応答持続期間は32日になる。
【０３３５】 応答の持続期間は、用量が上がると長くなる。1人の患者[0108]は、第1コホー
ト中で持続期間については大きくはずれたアウトライアーだった。この患者の持
続期間は少なくとも59日だった。持続期間は、もっと長い可能性もあるが、試験
は72日目に終了した。
【０３３６】 ［患者0816］は初回輸液時に0.3 mg/kg用量レベルで重度の筋痛を経験した。 この患者は、以後の輸液は0.2 mg/kgに用量を低下させて継続した。用量の変更 のため、この患者は有効性は0.2 mg/kgコホートで、安全性は0.3 mg/kgで評価さ
れた。
【０３３７】 最低用量の患者では1人のみ、最高用量の患者では2人とも72日目まで治験を継
続した。0.1 mg/kg用量の6人の患者のうちの4人は治験を完了し、0.2 mg/kg用量
の7人のうち4人が完了した。完全な応答を示したすべての患者は、72日目までこ
の治験を継続した。
【０３３８】 3. 安全性 用量にかかわらず、ABX-CBLの投与を受けたすべての患者が安全性の評価の対 象となった。筋痛を除いて、ABX-CBLは耐容性が高く、筋痛が用量限定毒性（DLT
）となった。筋痛の発生率は、投与用量が上がるにつれ、上昇した。これにより
、最大耐量（MTD）は0.3 mg/kgとされた。筋痛の開始は輸液開始後20〜60分の範
囲で、輸液完了後1〜2時間以内に通常は解消した。何らかの筋痛を経験した14人
の患者のうち、2人は筋痛のため治験から脱退しなくてはならなかった。筋痛が 継続した1人の患者を除き、すべての筋痛は後遺症なく解消した。この最後の症 例は評価・解明中である。表6は重症度と用量ごとに筋痛の発生率を示したもの である。「無関係」または「考えにくい」という筋痛の有害事象を示した患者、
および基線で筋痛を持つ患者は、この表には含まれていない。
【表１０】 W/D = 筋痛のため治験から脱退
【０３３９】 Abgenixは筋痛の因果関係および相互関係の調査を継続している。筋痛を発症 した患者の素因として、以下の原因は除外された。 ・電解質の変化 ・応答者、非応答者 ・移植の種類 ・ドナーの種類 ・ステロイド用量
【０３４０】 11人の患者で、ABX-CBLに関して11例の重篤有害事象が報告された。5例の「重
篤な」事象はすべて筋痛に関連しているが、ABX-CBLと「おそらく」関係がある と記されている。1例の「原因不明の肝障害」は、「疑われる」と記載されてい る。残りのSAEは「考えにくい」または「無関係」と記載されている。
【０３４１】 おそらくABX-CBLに関連があるとされた例が23例、疑われるものが7例あった。
その他は「考えにくい」または「無関係」と報告された。
【０３４２】 「おそらく」関係がある23例の有害事象のうち、2例以外はすべて筋痛に関連 していた。1人の患者は中等度の「疲労」を経験したが、後遺症なく解消した。 もう1人は中等度の「溶血」を経験し、解消したが、肝機能検査(LFT)上昇という
後遺症が観察された。
【０３４３】 ABX-CBLとの関係が「疑われる」とされた7つの事象のうち、1例は重度、4例は
中等度、および2例は軽度だったが、すべて後遺症なく解消した。重度の事象は 「浮腫」だった。4つの中等度の事象は4人の患者に発生したもので、「尿酸の中
等度の低下」、「発熱/悪寒」、「低血圧」および「発熱」だった。2つの軽度の
事象は2人の患者に発生し、「治験薬後微熱」および「悪寒」だった。
【０３４４】 27人の患者すべてのHAMA試験は、患者の最後の診察まで陰性だった。
【０３４５】 初回輸液の直前および試験期間全体にわたり定期的に、リンパ球数が検査され
た。ABX-CB-9701に参加した患者のうちの約50％は、BMTおよび進行中のGVHDの両
方から派生する免疫無防備状態のために、評価ができなかった。幹細胞移植後の
患者は、コンディショニングおよび急性GVHDによる免疫不全状態の再燃のために
、免疫不全になっている。現在までのところ、ABX-CBLはＴ細胞数に対して都合 の悪い効果は示さないと考えられる。
【０３４６】ABX-CBLのフェーズII臨床試験（レスキュープロトコール） 患者が上述のフェーズII臨床試験を完了するにつれ、GVDHの再燃を経験する患
者にABX-CBL投与を継続するための、第2のフェーズII継続試験を開始した。継続
試験は、以前にABX-CBLの投与を受けた急性GVDH患者のためのオープンラベル臨 床試験としてデザインされた。上述のように、グレードII/III/IVの重症度の急 性GVDHの患者が対象となった。
【０３４７】 この試験では、すべての患者が最高7回までのABX-CBLの静脈投与を受ける（初
回治療コース）。投薬は連続する7日間にわたり、シリンジポンプを用いて2時間
かけて輸液される。投与量は0.2 mg/kg（ほぼ上述の臨床試験で効果的に使用さ れた用量）である。初回治療コースで治療効果（完全または部分的な応答）が観
察されたら、慢性GVHDの開始前、または初回移植の200日後のいずれか早いほう よりも前に、第2回治療コースの受けることができる。ABX-CBLによる第2回治療 コースは、医療モニターおよび治験責任医師との話し合いによって、ケースバイ
ケースで取り扱われる。
【０３４８】 この治験の目的は以下の通りである： 急性GVDHの患者におけるABX-CBL継続投与の安全性を評価する。 急性GVDHの再燃のあった患者または以前にABX-CBL治療が失敗した患者におい て、ABX-CBLの治療を繰り返す臨床効果を評価する。 より低い用量のABX-CBLで臨床効果を示さなかった患者の治療を行う、および/
または、急性GVDHの再燃を経験しているABX-CBL応答者に治療を提供する。 ABX-CBLの初回治療後の再燃率を評価する。
【０３４９】 初回臨床試験に関して上記に説明された手順はすべて、わずかな修正を加えて
この試験でも使用された。
【０３５０】投与量、投与プログラム、およびABX-CBLによる治療 上述の考察および結果を考慮すると、ABX-CBLは、GVDHおよびリンパ細胞が有 害または望ましくなく活性化する同様の他の疾病原因に対して、十分な治療を提
供する。本明細書に説明された結果は、約0.1 mg/kgより多く約0.4 mg/kgより少
ないABX-CBL抗体の投与が、そのような疾病原因の治療に有効であることを示す 。用量は、好ましくは、約0.1 mg/kg〜約0.3 mg/kg、さらに好ましくは約0.15 m
g/kg〜約0.2 mg/kgである。さらに、本明細書で開示された、誘導プログラム（ 複数回の毎日の輸液、本明細書では7日間毎日）後に維持プログラム（定期的輸 液、本明細書では2週間にわたり週2回）という投与プログラムは、GVDHの寛解を
助けると思われ、疾病の再燃と再燃の間の患者のGVDHの重症度を確かに低下させ
る。
【０３５１】 理解されるように、本発明で詳細に説明された精製ABX-CBL、および本明細書 に説明されたような他の抗CD147抗体のいずれも同様に有効である。
【０３５２】 GVDHに加え、本発明に記載される治療薬は、活性化Ｔ細胞、B細胞、または単 球の有害な存在が病因となる疾病に関して有効である可能性がある。たとえば、
GVDHはそのような疾病の1つである。しかし、多くの炎症性疾患および自己免疫 疾患も、そのような病因を持っている。さらに、本発明の治療法は、以下の病因
に有効である可能性があるが、これらに限定されることはない：対宿主性移植片
病(GVDH)、臓器移植拒絶の疾病（腎移植、眼球移植などを含むがこれらに限定さ
れることはない）、癌（血液の癌（白血病およびリンパ腫）、膵臓などを含むが
これらに限定されることはない）、自己免疫疾患、炎症性疾患（関節炎、慢性関
節リウマチを含むがこれらに限定されることはない）、その他。
【０３５３】実験22 動物モデルのためのマウスGP42に結合する代用抗体 上述のように、本発明に関連して特定の動物モデルが考慮された。最も単純な
動物モデルはマウスである。2.6.1抗体はマウスgp42（バシジンまたはマウスCD1
47）に結合しなかった。したがって、そのようなモデルで使用するために、ABX-
CBLおよび/または2.6.1抗体の代用抗体として利用できるラット抗マウスgp42抗 体の作製した。以下は、ラットの免疫に使用された融合蛋白質の調製に用いられ
たクローニング戦略と、作製された抗体の予備的解析である。以下に記載のクロ
ーニング戦略は、図51および図52にさらに詳細に示されている。
【０３５４】 Hu-CD147IgG2融合蛋白質のクローニング Miyauchiら、J. Biochem. 110:770-774 (1991)の報告したCD147配列（ジェン バンクアクセッション番号D45131）に基づいて、以下のPCRプライマーが利用さ れた：
【０３５５】 CD147の細胞外ドメインのアミノ末端の202アミノ酸残基をコードするCD147/pB
KCMVプラスミドDNAテンプレートから、 626bpのPCR産物が増幅された。このPCR 産物をEcoRIおよびNheIで消化し、EcoRIおよびNheIで消化したpIK1.1Hu-CD4IgG2
発現ベクターに連結した。得られた構築物pIKHu-CD147IgG2には、HuIgG2のヒン ジCH2およびCH3ドメインとインフレームのCD147のN-末端202アミノ酸およびCD4 の細胞外ドメインの最後の4つのC末端残基から構成される融合蛋白質がコードさ
れている。
【０３５６】 Mu-GP42IgG2融合蛋白質のクローニング Kanekuraら、Cell Struct. Funct. 16:23-30 (1991) の報告したGP42配列（ジ
ェンバンクアクセッション番号Y16256）に基づいて、以下のPCRプライマーが利 用された。 マウスリンパ節cDNAから659bpのPCR産物が増幅され、これはGP42の細胞外ドメイ
ンのアミノ末端の206アミノ酸残基をコードしていた。このPCR産物をEcoRIおよ びNheIで消化し、EcoRIおよびNheIで消化したpIK1.1Hu-CD4IgG2発現ベクターに 連結して、pIKMu-GP42 IgG2を作製した。
【０３５７】 安定CHO細胞株工学 pIKHu-CD147IgG2およびpIKMu-GP42 IgG2のEcoRI/Blg2断片を、EcoRI/Blg2で消
化したpWBFNP DHFR発現ベクターにクローニングした。pWBFNP DHFRはpWBFNPの誘
導体で、そのNotI部位にSV40プロモーター/エンハンサーの転写制御にあるDHFR
cDNAおよびSV40ポリAがクローニングされたものである。得られた構築物Hu-CD14
7IgG2 DHFRおよびMu-GP42 IgG2 DHFRは、CaPO4を用いたトランスフェクションに
よって、DHFR欠損CHO細胞株に導入された。外在性のチミジン、グリシン、およ びプリンの非存在下で成長する能力によって安定株が選択された。SDS-PAGEで融
合蛋白質の分泌レベルが上昇していると判断されるクローンは、無血清培地中で
スピナーフラスコ用に懸濁培養に適応させた。融合蛋白質Mu-GP42IgG2およびHu-
CD147IgG2は、プロテインAクロマトグラフィーによって培地から精製された。
【０３５８】 融合蛋白質の作成後、通常の方法によってラットを免疫し、やはり通常の方法
でハイブリドーマを作製した。そのハイブリドーマが分泌する抗体は、特定の動
物モデル、特にマウスモデルで代用抗体として利用することができる。
【０３５９】参照としての組み入れ 特許、特許出願、論文、参考書などを含む本明細書に引用されるすべての参照
文献、およびそれらに引用される参考文献は、参照としてその全体が本明細書に
組み入れられる。
【０３６０】等価物 上述の説明、図面、および実施例は、本発明の特定の好ましい態様を詳述する
もので、本発明者らが想定する最善の様式を記述したものである。しかし、本明
細書で上記がいかに詳細に思われても、本発明は多くのやり方で実施でき、本発
明は添付の特許請求の範囲およびそれに相当するものにしたがって解釈すべきで
ある。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、個々の抗体のCEM細胞膜抽出可溶化物との結合を示す12％
SDS-PAGE／ウェスタンブロットである。レーンA：ウサギ抗マウスhn-RNP-K蛋白 質抗体、レーンB：ABX-CBL抗体、レーンC：2.6.1抗体（本明細書ではcem2.6およ
びABX-Rb2とも呼ぶ）、レーンD：抗CD147抗体（Pharmingen）、およびレーンE：
抗CD147抗体（RDI）。試料：CEM細胞抽出物 5マイクロリットル。
【図２】 図2A〜2Bは、ATCC寄託番号HB 8214のハイブリドーマ細胞系によ り産生されたCBL1抗体から得られた成分の分析結果である。このデータは、HB 8
214ハイブリドーマによって産生されるCBL1 IgM抗体が、補体の存在下でMLRを阻
害する有効成分であることを示している。
【図３】 図3は、CBL1との比較により、種々のCBL1サブクローンからの抗 体を用いてのMLRの阻害を比較したグラフである。
【図４】 図4は、ウサギおよびヒト補体の存在下におけるABX-CBLを用いて
のMLR阻害を比較したグラフである。
【図５】 図5は、MLRアッセイ法におけるABX-CBL抗体および2.6.1抗体（ce
m 2.6とも呼ばれる）の活性を比較したグラフである。このデータは、2.6.1抗体
が有効な阻害物質ではないことを示している。
【図６】 図6A〜6B：CD147およびCD25の同時発現を示す、活性化リンパ球 のFACS分析。
【図７】 図7A〜7D：刺激時のCD25の選択的アップレギュレーション、なら
びにABX-CBLおよび補体による処理後の同じ細胞の特異的枯渇を示す、PBMCのFAC
S分析。図7A：非処理PBMC。図7Bおよび7D：ConAで刺激したPBMC。図7C：Conkで 刺激し、続いてABX-CBL＋補体で処理したPBMC。
【図８】 図8A〜8Dは、 刺激時のCD25のアップレギュレーション、ならび にABX-CBLおよび補体による処理後の同じ細胞の特異的枯渇を示す、PBMCのFACS 分析の結果を比較したものである。図8A：PBMC＋ConA、図8B：CBL-1のみ／培地 、図8C：補体のみ／培地、図8D：CBL-1＋補体／培地. M1：CD25高値（枯渇）、M
2：CD25低値（枯渇せず）、M3：CD25なし（null）（枯渇せず）。
【図９】 図9A〜9Dは、刺激時のCD25およびCD147の選択的アップレギュレ ーションを示す、PBMCのもう一つの一連のFACS分析を示している。
【図１０】 図10A〜10Fは、ABX-CBLおよび補体による処理の前後の活性化T
細胞（図10A〜10B）、活性化単球（図10C〜10D）、および活性化B細胞（図10E〜
10F）の比較を示したものであり、ABX-CBLおよび補体による処理後の同じ細胞の
特異的枯渇を示している。
【図１１】 図11A〜11Fは、ABX-CBLおよび補体による処理の前後の活性化T
細胞（図11A〜11B）、活性化B細胞（図11C〜11D）および活性化単球（図11E〜11
F）のサブポピュレーションに関する同様の比較である。このデータは、ABX-CBL
および補体による処理後に同じ細胞が特異的に枯渇することを示している。
【図１２】 図12は、白血球サブポピュレーションを枯渇させることがABX-
CBLの作用機序であることを示したものである。表では、細胞種、表面マーカー および補体依存性細胞傷害（CDC）による白血球サブポピュレーションの枯渇を 比較している。
【図１３】 図13は、ABX-CBLおよび補体で細胞を処理した後の細胞、細胞 種、CD147発現およびCDCを比較した表である。このデータは、このような処理に
よって、CD147を発現する細胞のすべてが死滅するわけではないことを示してい る。
【図１４】 図14は、CBL-1+細胞上でのCDC抵抗性分子の発現の概要をまと めた表である。チャートでは、細胞、細胞種、CD147発現、ABX-CBLおよび補体で
細胞を処理した後のCDC、ならびに補体阻害分子CD55およびCD59を比較している 。このデータは、このような処理の後に死滅するのは、これらの細胞のうち、CD
55およびCD59をともに発現しない細胞のみであることを示している。
【図１５】 図15A〜15Cは、ヒト内皮細胞系ECV-304上でのCD147の発現を示
すFACS分析の結果を提示している。
【図１６】 図16A〜16Cは、ヒト内皮細胞系HUVEC-C上のCD147の発現を示す
FACS分析の結果を提示している。
【図１７】 図17は、ヒト内皮細胞系ECV-304に対するABX-CBLおよび補体の
効果を、CEM細胞に対するそれらの効果と比較して示したグラフである。
【図１８】 図18は、ヒト内皮細胞系HUVEC-Cに対するABX-CBLおよび補体の
効果を、CEM細胞に対するそれらの効果と比較して示したグラフである。
【図１９】 図19A〜19Cは、ヒト内皮細胞系ECV-304上での補体阻害分子CD4
6、CD55およびCD59の発現を示すFACS分析の結果を提示している。
【図２０】 図20A〜20Cは、ヒト内皮細胞系HUVEC-C上での補体阻害分子CD4
6、CD55およびCD59の発現を示すFACS分析の結果を提示している。
【図２１】 図21は、CD147 cDNAのクローニングおよびCOS細胞内での発現 のために用いたベクターの模式図である。
【図２２】 図22は、CD147 cDNAのクローニングならびにCOSおよび大腸菌 細胞内での発現のために用いたpBK-CMVファージミドベクターの模式図である。
【図２３】 図23は、COS細胞（図23A）および大腸菌（図23B）内で発現さ れたCD147のSDS-PAGE／ウェスタンブロットである。図23A〜23B：抗体：ファー ミンゲン（Pharmingen）（パネルA）、2.6.1（パネルB）およびABX-CBL（パネル
C）。図23A：CEM細胞膜抽出物 5μL（レーン1）、対照ベクターによるトランス フェクションを受けたCOS細胞抽出物 7.5μL（レーン2）、CD147によるトランス
フェクションを受けたCOS細胞抽出物 7.5μL（レーン3）。図23B：クローン1：C
D147によるトランスフェクションを受けたが、誘導は受けていないもの（レーン
1）、クローン1：CD147によるトランスフェクションを受け、誘導を受けたもの （レーン2）、クローン5：対照ベクターによるトランスフェクションを受けたが
誘導を受けていないもの（レーン3）、クローン5：対照ベクターによるトランス
フェクションを受け、誘導を受けたもの（レーン4）。
【図２４〜３３】 図24〜33は、以下の抗体の、またはそれに関する重鎖お
よびκ鎖のcDNAおよび蛋白質の配列である：CEM 10.1 C3（図24）、CEM 10.1 G1
0（図25）、CEM 10.12 F3（図26）、CEM 10.12 G5（図27）、CEM 13.12（図28）
、CEM 13.5（図29）、2.4.4（図30）、2.1.1（図31）、2.3.2（図32）および2.6
.1（図33）。
【図３４〜４３】 図34〜43は、CDRの位置を示す、以下の抗体の、または それに関する重鎖およびκ鎖の蛋白質配列である：CEM 10.1 C3（図34）、CEM 1
0.1 G10（図35）、CEM 10.12 F3（図36）、CEM 10.12 G5（図37）、CEM 13.12（
図38）、CEM 13.5（図39）、2.4.4（図40）、2.1.1（図41）、2.3.2（図42）お よび2.6.1（図43）。
【図４４】 図44A〜44Bは、生殖系V領域（segment）遺伝子に対する整列化
を示す、CBL-1特異的ハイブリドーマに由来するヒト重鎖のアミノ酸配列および 構造を示している。
【図４５および４６】 図45A〜45Cおよび図46は、生殖系V領域遺伝子に対 する整列化を示す、CBL-1特異的ハイブリドーマに由来するヒトκ鎖のアミノ酸 配列および構造を示している。
【図４７】 図47は、本発明によるある種の構築物（construct）の作製お よびクローニングのために用いたベクターpWBFNP MCSの制限地図である。
【図４８】 図48は、本発明によるある種の構築物の作製およびクローニン
グのために用いたベクターpIK6.1+Puroの制限地図の模式図である。
【図４９】 図49は、MLRアッセイ法の阻害に関するABX-CBL抗体および2.6.
1多量体IgM抗体（ABX-Rb2とも呼ばれる）の活性の比較を示したものであり、2.6
.1多量体IgM抗体がMLRの阻害に有効であることを示している。C：ウサギ補体。
【図５０】 図50A〜50Fは、動物モデルにおける使用を目的とするサロゲー
ト抗体の作製に関連して用いるための、CD147-IgG2およびgp42-IgG2融合蛋白質 の作製に関連して用いたクローニング戦略のさらなる詳細を提示したものである
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/02 Ａ６１Ｐ 37/02 37/02 37/06 37/06 37/08 37/08 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 コルバラン ホセ アール． アメリカ合衆国 カリフォルニア州 フォ スター シティー ウィリアムズ レーン 125 (72)発明者 カルウェル アラン アール． アメリカ合衆国 カリフォルニア州 カー ルスバド ヘムロック アベニュー 290 Ａ (72)発明者 グリーン ラリー エル． アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン フランシスコ クレストライン ドライ ブ 70 アパートメント 12 (72)発明者 ヘイルズ ジョアンナ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 フレ モント セルマ アベニュー 5180 (72)発明者 ヘイブリラ ナンシー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 オー クランド マーリン コブ ６ (72)発明者 イワノフ ウラジミール イー． アメリカ合衆国 カリフォルニア州 フレ モント タナガー コモン 4275 (72)発明者 リパニ ジョン エイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア州 リバ ーモア ラトゥール アベニュー 2263 (72)発明者 リュー クィアング アメリカ合衆国 カリフォルニア州 フォ スター シティー ウィリアムズ レーン 55 (72)発明者 ウェバー リチャード エフ． アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン フランシスコ パチェコ ストリート 2537 (72)発明者 ヤン クシャオ−ドン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 パロ アルト ブライアント ストリート 2833

Claims (61)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 抗体がCBL1でないという条件付きで、補体を結合させるアイ ソタイプ、およびIgMモノクローナル抗体ABX-CBLによる結合を受けるCD147上の エピトープと結合する可変領域を有する、単離されたモノクローナル抗体。
  2. 【請求項2】 抗体が補体の存在下で、活性化T細胞、活性化B細胞および単 球からなる群より選択される細胞を選択的に死滅させるが、休止期T細胞および 休止期B細胞に対しては実質的に無毒である、請求項1記載の抗体。
  3. 【請求項3】 ヒト抗体である、請求項1記載の抗体。
  4. 【請求項4】 アイソタイプがマウスIgM、マウスIgG2a、マウスIgG2b、マウ
    スIgG3、ヒトIgM、ヒトIgG1およびヒトIgG3からなる群より選択される、請求項1
    記載の抗体。
  5. 【請求項5】 ヒト抗体である、請求項2記載の抗体。
  6. 【請求項6】 アイソタイプがマウスIgM、マウスIgG2a、マウスIgG2b、マウ
    スIgG3、ヒトIgM、ヒトIgG1およびヒトIgG3からなる群より選択される、請求項2
    記載の抗体。
  7. 【請求項7】 抗体がCBL1でないという条件付きで、補体を結合させるアイ ソタイプ、ならびに活性化T細胞、活性化B細胞および休止期または活性化単球の
    集団上のCD147と結合する可変領域を有し、補体の存在下で、補体依存性殺細胞 作用を介してこのような集団を選択的に枯渇させるが、その他の細胞に対しては
    実質的に無毒である、単離されたモノクローナル抗体。
  8. 【請求項8】 ヒト抗体である、請求項7記載の抗体。
  9. 【請求項9】 アイソタイプがマウスIgM、マウスIgG2a、マウスIgG2b、マウ
    スIgG3、ヒトIgM、ヒトIgG1およびヒトIgG3からなる群より選択される、請求項7
    記載の抗体。
  10. 【請求項10】 抗体がCBL1でないという条件付きで、以下の特徴を有する、
    単離されたモノクローナル抗体： （a）CD147と結合する、 （b）ウェスタンブロット上でCEM細胞可溶化物に対して図1に示すものと類似 した結合を示す、 （c）アイソタイプがマウスIgM、マウスIgG2a、マウスIgG2b、マウスIgG3、ヒ
    トIgM、ヒトIgG1およびヒトIgG3からなる群より選択される、 （d）CD147との結合に関してABX-CBLと競合する、 （e）hn-RNP-k蛋白質と交差反応する、 （f）RVRSを含むCD147上の共通配列と結合する、 （g）MLRアッセイで補体の存在下のみにおいて活性化T細胞、活性化B細胞およ
    び単球を選択的に死滅させる、ならびに （h）補体の有無にかかわらず、CD55およびCD59を発現する細胞に対しては実 質的に無毒である。
  11. 【請求項11】 抗体がCBL1でないという条件付きで、疾患の治療のための抗
    CD147抗体を選択するための下記の段階を含む方法： CD147と結合し、補体と結合しうる抗体を製造する段階、 以下の特性の1つまたは複数に関して抗体を解析する段階： （a）CD147との結合に関するABX-CBLとの競合 （b）MLRアッセイで補体の存在下のみにおいて活性化T細胞、活性化B細胞お
    よび単球を選択的に死滅させる能力、ならびに （c）補体の有無にかかわらず、CD55およびCD59を発現する細胞に対しては 実質的に無毒であること。
  12. 【請求項12】 以下の特性をさらに含む、請求項11記載の方法： （d）ウェスタンブロット上でCEM細胞可溶化物に対して図1に示すものと類似 した様式で結合すること。
  13. 【請求項13】 以下の特性をさらに含む、請求項11記載の方法： （e）ペプチド中のRXRSという共通配列との結合。
  14. 【請求項14】 以下の特性をさらに含む、請求項11記載の方法： （f）hn-RNP-k蛋白質と交差反応する。
  15. 【請求項15】 以下の特性をさらに含む、請求項11記載の方法： （g）COS細胞および大腸菌細胞によって発現されるCD147の一形態との結合。
  16. 【請求項16】 抗体がCBL1でないという条件付きで、補体を結合させるアイ
    ソタイプ、ならびに活性化T細胞、活性化B細胞および休止期または活性化単球の
    集団上のCD147と結合する可変領域を有し、補体の存在下で、補体依存性殺細胞 作用を介してこのような集団を選択的に枯渇させるが、その他の細胞に対しては
    実質的に無毒である抗体を提供することを含む、疾患を治療するための方法。
  17. 【請求項17】 抗体がヒト抗体である、請求項16記載の方法。
  18. 【請求項18】 アイソタイプがマウスIgM、マウスIgG2a、マウスIgG2b、マ ウスIgG3、ヒトIgM、ヒトIgG1およびヒトIgG3からなる群より選択される、請求 項16記載の方法。
  19. 【請求項19】 抗体がCBL1でないという条件付きで、補体を結合させるアイ
    ソタイプ、ならびに活性化T細胞、活性化B細胞および休止期または活性化単球の
    集団上のCD147と結合する可変領域を有し、補体の存在下で、補体依存性殺細胞 作用を介してこのような集団を選択的に枯渇させるが、その他の細胞に対しては
    実質的に無毒である抗体を提供することを含む、GVHDを治療するための方法。
  20. 【請求項20】 抗体がヒト抗体である、請求項19記載の方法。
  21. 【請求項21】 アイソタイプがマウスIgM、マウスIgG2a、マウスIgG2b、マ ウスIgG3、ヒトIgM、ヒトIgG1およびヒトIgG3からなる群より選択される、請求 項19記載の方法。
  22. 【請求項22】 抗体がCBL1でないという条件付きで、共通配列RVRSHを含むC
    D147上のエピトープと結合するモノクローナル抗体。
  23. 【請求項23】 ヒト抗体である、請求項22記載の抗体。
  24. 【請求項24】 RXRS、RXRSH、RVRSおよびRVRSHからなる群より選択される配
    列を含む、単離されたペプチド。
  25. 【請求項25】 抗体の製造を目的とする、請求項24記載のペプチドの使用。
  26. 【請求項26】 CD147と結合するヒトモノクローナル抗体。
  27. 【請求項27】 活性化T細胞、B細胞または単球の有害な存在を特徴とする原
    因を有する疾患の治療のためのキットであって、 （a）薬学的に許容しうる担体中に一定量の抗CD147抗体を含む液体製剤、およ
    び （b）抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kgまでの範囲の用量で提供されるよう な、活性化T細胞、B細胞または単球の有害な存在を特徴とする原因を有する疾患
    に罹患した患者に対する該製剤の投与に関する指示、 を含むキット。
  28. 【請求項28】 抗体がABX-CBLを含む、請求項27記載のキット。
  29. 【請求項29】 指示が、各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kg
    までの範囲の用量で提供されるような一連の投与における抗体の投与に関する指
    示をさらに含む、請求項27記載のキット。
  30. 【請求項30】 疾患がGVHDを含む、請求項27記載のキット。
  31. 【請求項31】 活性化T細胞、B細胞または単球の有害な存在を特徴とする原
    因を有する疾患の治療に用いるための製造物品であって、 （a）滅菌バイアル、 （b）バイアル中に含まれる薬学的に許容しうる担体中にある抗CD147モノクロ
    ーナル抗体、および （c）各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kgまでの範囲の用量で 提供されるような様式で、このような疾患に罹患した患者に対して抗体を投与す
    るための指示 を含む、製造物品。
  32. 【請求項32】 抗体がABX-CBLを含む、請求項31記載の物品。
  33. 【請求項33】 指示が、各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kg
    までの範囲の用量で提供されるような一連の投与における抗体の投与に関する指
    示をさらに含む、請求項31記載の物品。
  34. 【請求項34】 疾患がGVHDを含む、請求項31記載のキット。
  35. 【請求項35】 活性化T細胞、B細胞または単球の有害な存在を特徴とする原
    因を有する疾患の治療のためのキットであって、 （a）薬学的に許容しうる担体中にABX-CBLと命名された抗CD147抗体の一定量 を含む液体製剤、および （b）各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kgまでの範囲の用量で 提供されるような一連の投与における、活性化T細胞、B細胞または単球の有害な
    存在を特徴とする原因を有する疾患に罹患した患者に対する該製剤の投与に関す
    る指示、 を含むキット。
  36. 【請求項36】 指示が、各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kg
    までの範囲の用量で提供されるような一連の投与における抗体の投与に関する指
    示をさらに含む、請求項35記載のキット。
  37. 【請求項37】 疾患がGVHDを含む、請求項35記載のキット。
  38. 【請求項38】 活性化T細胞、B細胞または単球の有害な存在を特徴とする原
    因を有する疾患の治療に用いるための製造物品であって、 （a）滅菌バイアル、 （b）バイアル中に含まれる薬学的に許容しうる担体中にあるABX-CBLと命名さ
    れた抗CD147モノクローナル抗体、および （c）各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kgまでの範囲の用量で 提供されるような様式で、このような疾患に罹患した患者に対して抗体を投与す
    るための指示 を含む、製造物品。
  39. 【請求項39】 指示が、各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kg
    までの範囲の用量で提供されるような一連の投与における抗体の投与に関する指
    示をさらに含む、請求項38記載の物品。
  40. 【請求項40】 疾患がGVHDを含む、請求項38記載の物品。
  41. 【請求項41】 （a）薬学的に許容しうる担体中に一定量の抗CD147抗体を含
    む液体製剤、および （b）各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kgまでの範囲の用量で 提供されるような一連の投与における、GVHDに罹患した患者に対する該製剤の投
    与に関する指示 を含む、GVHDの治療のためのキット。
  42. 【請求項42】 抗体がABX-CBLを含む、請求項41記載のキット。
  43. 【請求項43】 指示が、各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kg
    までの範囲の用量で提供されるような一連の投与における抗体の投与に関する指
    示をさらに含む、請求項41記載のキット。
  44. 【請求項44】 （a）滅菌バイアル、 （b）バイアル中に含まれる薬学的に許容しうる担体中にある抗CD147モノクロ
    ーナル抗体、および （c）各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kgまでの範囲の用量で 提供されるような様式で、GVHDに罹患した患者に対して抗体を投与するための指
    示 を含む、GVHDの治療に用いるための製造物品。
  45. 【請求項45】 抗体がABX-CBLを含む、請求項44記載の物品。
  46. 【請求項46】 指示が、各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kg
    までの範囲の用量で提供されるような一連の投与における抗体の投与に関する指
    示をさらに含む、請求項44記載の物品。
  47. 【請求項47】 （a）薬学的に許容しうる担体中にABX-CBLと命名された抗CD
    147抗体の一定量を含む液体製剤、および （b）各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kgまでの範囲の用量で 提供されるような一連の投与における、GVHDに罹患した患者に対する該製剤の投
    与に関する指示 を含む、GVHDの治療のためのキット。
  48. 【請求項48】 指示が、各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kg
    までの範囲の用量で提供されるような一連の投与における抗体の投与に関する指
    示をさらに含む、請求項47記載のキット。
  49. 【請求項49】 （a）滅菌バイアル、 （b）バイアル中に含まれる薬学的に許容しうる担体中にあるABX-CBLと命名さ
    れた抗CD147モノクローナル抗体、および （c）各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kgまでの範囲の用量で 提供されるような様式で、GVHDに罹患した患者に対して抗体を投与するための指
    示 を含む、GVHDの治療に用いるための製造物品。
  50. 【請求項50】 指示が、各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kg
    までの範囲の用量で提供されるような一連の投与における抗体の投与に関する指
    示をさらに含む、請求項49記載の物品。
  51. 【請求項51】 薬学的に許容しうる希釈剤、緩衝液または賦形剤中にABX-CB
    Lと命名された抗CD147モノクローナル抗体を含む薬学的組成物。
  52. 【請求項52】 抗体が約0.1mg／kgから約0.2mg／kgまでの用量で提供される
    、請求項51記載の薬学的組成物。
  53. 【請求項53】 活性化T細胞、B細胞または単球の有害な存在を特徴とする原
    因を有する疾患の治療のための方法であって、薬学的に許容しうる担体中に一定
    量の抗CD147抗体を含む液体製剤を、このような疾患に罹患した患者に対して投 与することを含む方法。
  54. 【請求項54】 抗体がABX-CBLを含む、請求項53記載の方法。
  55. 【請求項55】 投与が、各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kg
    までの範囲の用量で提供されるように行われる、請求項53記載の方法。
  56. 【請求項56】 疾患がGVHDを含む、請求項53記載の方法。
  57. 【請求項57】 薬学的に許容しうる担体中に一定量の抗CD147抗体を含む液 体製剤をGVHDに罹患した患者に対して投与することを含む、GVHDの治療のための
    方法。
  58. 【請求項58】 抗体がABX-CBLを含む、請求項57記載の方法。
  59. 【請求項59】 投与が、各投与において抗体が約0.1mg／kgから約0.3mg／kg
    までの範囲の用量で提供されるように行われる、請求項57記載の方法。
  60. 【請求項60】 重鎖が、配列番号：23、配列番号：25、配列番号：27、配列
    番号：29、配列番号：31、配列番号：33、配列番号：35、配列番号：37、配列番
    号：39、配列番号：40および配列番号： からなる群より選択されるアミノ酸配
    列を有する、請求項26記載のヒト抗体。
  61. 【請求項61】 軽鎖が、配列番号：24、配列番号：26、配列番号：28、配列
    番号：30、配列番号：32、配列番号：34、配列番号：36、配列番号：38、および
    配列番号：41からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項26記載の
    ヒト抗体。
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