WO2017061602A1 - Ｃｄ１４７分子に特異的に結合する抗体およびその利用 - Google Patents

Ｃｄ１４７分子に特異的に結合する抗体およびその利用 Download PDF

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antibody
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human
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良和 黒澤
直樹 細見
富美子 野村
克志 甲田
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株式会社ペルセウスプロテオミクス
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to an antibody that specifically binds to human CD147 and use thereof.
  • CD147 is a type I membrane-type glycoprotein and is classified as an immunoglobulin-like superfamily. It has various physiological functions and plays an important role in, for example, spermatogenesis and neural networks, and has been reported to be associated with arteriosclerosis, rheumatism, and viral infection. In addition, expression has been observed in many cancer types, and it has been suggested that CD147 is related to cancer metastasis, invasion, and chemical drug resistance (Non-patent Document 1). CD147 is known to interact with integrins, monocarboxylate transporters (MCTs), cyclophilin A, caveolin-1 and the like (Non-Patent Document 2), and it can be seen that it plays a role in various situations.
  • MCTs monocarboxylate transporters
  • cyclophilin A cyclophilin A
  • caveolin-1 caveolin-1
  • an antibody that regulates the function of CD147 has been reported.
  • an antibody (ABX-CBL) that inhibits activation of T cells by binding to cyclophilin A, an antibody (UM-8D6) that suppresses VEGF production stimulation, and the like are known.
  • anti-CD147 mouse antibody HAb18 developed in China is well known.
  • Non-patent Document 5 There are reports that CD147 is significantly involved in the prognosis of patients with acute myeloid leukemia (Non-patent Document 5) and metastasis of colon cancer to lymph nodes (Non-patent Document 6). Presumed to be possible. However, no anti-CD147 antibody exhibiting an in vivo antitumor effect in an experiment using these cancer cell lines has been reported.
  • An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that specifically binds to human CD147 and to use it for treatment of various cancer types characterized by CD147 expression.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above problems, and have obtained a novel anti-CD147 monoclonal antibody having excellent antitumor activity in vivo against CD147-expressing cancer cells, and humanized antibodies thereof.
  • the present inventors have succeeded and found that the antibody has antitumor activity in a xenograft mouse model using colon cancer and leukemia cell lines that have not been attempted with existing anti-CD147 antibodies, and have completed the present invention.
  • the present anti-human CD147 monoclonal antibody was also found to react with cynomolgus CD147 and exhibit a strong antitumor effect against cancer cell lines that characterize the expression of CD147 antigen.
  • the present invention provides the following [1] to [16].
  • the heavy chain variable region has the sequence SYGIS (SEQ ID NO: 17) as CDR1, the sequence WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 18) as CDR2, the sequence GRGSYYAAFDI (SEQ ID NO: 19) as CDR3, and the CDR1 in the light chain variable region A fragment comprising the monoclonal antibody according to [1], which has the sequence KSSQSVLYSSNNNKNYLA (SEQ ID NO: 20), the sequence WASTRES (SEQ ID NO: 21) as CDR2, and the sequence QQYYSTPT (SEQ ID NO: 22) as CDR3, or an antigen-binding region thereof.
  • [3] The monoclonal antibody or the antigen-binding region thereof according to [1], which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in the variable region of the heavy chain and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 in the variable region of the light chain.
  • the heavy chain variable region has the sequence SYGMS (SEQ ID NO: 35) as CDR1, the sequence TISSGGSYTYYQDSIGG (SEQ ID NO: 36) as CDR2, the sequence GDWADY (SEQ ID NO: 37) as CDR3, and the CDR1 in the variable region of the light chain A fragment comprising the monoclonal antibody according to [1], which has the sequence KASQDINSYLS (SEQ ID NO: 38), the sequence RANRLVA (SEQ ID NO: 39) as CDR2, and the sequence LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 40) as CDR3.
  • [5] The monoclonal antibody or the antigen-binding region thereof according to [1], which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 in the variable region of the heavy chain and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 in the variable region of the light chain.
  • the heavy chain variable region has the sequence TYWIE (SEQ ID NO: 29) as CDR1, the sequence EFLPGSGSTNFNEKFKG (SEQ ID NO: 30) as CDR2, the sequence SGGNFGARFAS (SEQ ID NO: 31) as CDR3, and the CDR1 in the variable region of the light chain A fragment comprising the monoclonal antibody or the antigen-binding region thereof according to [1], which has the sequence RSSSKSLSNNGNTLYLY (SEQ ID NO: 32), the sequence RMSSLAS (SEQ ID NO: 33) as CDR2, and the sequence MQHLEYPFT (SEQ ID NO: 34) as CDR3.
  • [7] The fragment comprising the monoclonal antibody or the antigen-binding region thereof according to [1] having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 in the variable region of the heavy chain and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 in the variable region of the light chain.
  • a humanized anti-CD147 monoclonal antibody comprising an amino acid sequence including the CDR periphery of the variable region of the anti-CD147 monoclonal antibody according to any one of [2] to [7] and a human immunoglobulin amino acid sequence Or a fragment containing the antigen-binding region thereof.
  • the antibody according to [8], wherein the combination of the heavy chain variable region and the light chain variable region is 1) an amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 13 and 14, or 2) SEQ ID NOs: 15 and 16 A fragment comprising a humanized heavy chain and a humanized light chain anti-CD147 monoclonal antibody or antigen binding region thereof having the amino acid sequence shown.
  • One or more amino acids are substituted, deleted and added or inserted in the amino acid sequence of the antibody according to any one of [2] to [9], and the level of identity is at least 90% or more [1] A fragment comprising the anti-CD147 monoclonal antibody or the antigen-binding region thereof according to any one of to [9].
  • a pharmaceutical composition comprising the anti-CD147 monoclonal antibody according to any one of [1] to [12], a fragment containing the antigen-binding region thereof, or a conjugate antibody as an active ingredient.
  • Antitumor agent against tumor characterized by expression of human CD147 antigen comprising as an active ingredient the anti-CD147 monoclonal antibody according to any one of [1] to [12], a fragment containing the antigen-binding region thereof, or a conjugate antibody .
  • the anti-CD147 monoclonal antibody according to any one of [1] to [12], a fragment containing the antigen-binding region thereof, or a conjugate antibody for the production of an antitumor agent against a tumor characterized by the expression of human CD147 antigen Use of.
  • a method for killing a cell that characterizes the expression of a human CD147 antigen, which specifically binds to the human cell surface CD147 antigen on the cell according to any one of [1] to [12]
  • a cytotoxic method comprising killing the cells by binding to CD147, comprising administering a CD147 monoclonal antibody, a fragment containing the antigen-binding region thereof, or a conjugated antibody. .
  • [18] A method for treating a subject having a tumor characterized by the expression of a human CD147 antigen, wherein the subject specifically binds to human CD147 and any one of [1] to [12] An anti-CD147 monoclonal antibody, a fragment comprising the antigen-binding region thereof, or a conjugate antibody, wherein the tumor is killed by binding of the antibody or a fragment comprising the antigen-binding region thereof to CD147, How to treat a tumor.
  • the anti-human CD147 monoclonal antibody of the present invention or a fragment containing the antigen-binding region thereof is characterized by the expression of CD147 antigen such as leukemia, Burkitt lymphoma, B lymphoma, lung cancer, liver cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, and colon cancer. In vivo, it has a strong antitumor effect on tumors, and is useful as an anticancer agent for various cancer types.
  • FIG. 10 shows the reactivity of anti-CD147 antibody HAb18 according to Example 9 and CD147 in ELISA with PPAT082-03.
  • FIG. 10 is a graph showing an antitumor effect of an anti-CD147 antibody in a cancer-bearing mouse model of NCI-H929 cells, which is a cell line of B lymphoma according to Example 10.
  • FIG. 18 shows the results of HE staining of a tumor pathological section with the anti-CD147 antibody PPAT-082-03 in a HepG2 cell tumor-bearing mouse model according to Example 15.
  • the first isoform also known as “long isoform” or “isoform 1” is expressed as a precursor polypeptide of 385 amino acids, which is a signal represented by the first 21 residues. Has an array.
  • the second isoform also known as “isoform 2” is expressed as a 269 amino acid precursor polypeptide lacking the 23-139 amino acid sequence of the first isoform, which is also It has a signal sequence represented by the first 21 residues.
  • the second isoform is expressed in several normal tissues, and increased expression has been reported in many cancer types.
  • the third isoform consists of 176 amino acids from which the amino acid sequence 1 to 209 of the first isoform is deleted, and the fourth isoform differs in the amino acid sequence 1 to 11 of the first isoform.
  • Amino acids 12 to 191 are formed from 205 amino acids deleted.
  • the expression of the third and fourth isoforms is rarely seen in normal cells and tumor cells.
  • the first isoform is confirmed to be specifically expressed in the retina.
  • “CD147 antigen” or “CD147” mainly includes the second isoform.
  • the anti-CD147 antibodies of the invention bind to an epitope of human CD147 as set forth herein below, which human CD147 is either the first or second isoform of the cell surface antigen. Exist in the same position. If there is nothing before “CD147”, it means “human CD147”.
  • CD147 antigen is presented on the surface of various cell types. By “characterize expression” and “express” is intended that all or part of the CD147 antigen is exposed outside the cell.
  • the presented or expressed CD147 antigen can be fully or partially glycosylated.
  • CD147 epitope means a molecule (eg, a peptide) or a fragment of the molecule that can immunoreact with an anti-CD147 antibody, eg, a CD147 antigenic determinant recognized by a monoclonal antibody. Is included. CD147 antigen epitopes may be included in proteins, protein fragments, peptides and the like. An epitope is most commonly a protein, a short oligopeptide, an oligopeptide mimetic (ie, an organic compound that mimics the antibody binding properties of the CD147 antigen), or a combination thereof.
  • Antibody as used herein is a heterotetramer, typically about 150,000 daltons, consisting of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Defined as glycoprotein. Each light chain is covalently linked to the heavy chain by one disulfide bond to form a heterodimer. A heterotetramer is formed by a disulfide covalent bond between two identical heavy chains of such a heterodimer. The light and heavy chains are linked together by a single disulfide bond, but the number of disulfide bonds between the two heavy chains varies with the immunoglobulin isotype. Each heavy and light chain also has regularly spaced intrachain disulfide bridges.
  • Each heavy chain has a variable domain (V H ) at the end of the amino acid followed by 3 or 4 constant domains (C H 1, C H 2, C H 3, and C H 4), and C H 1 And a hinge region exists between C H 2.
  • Each light chain has two domains: an amino-terminal variable domain (V L ) and a carboxy-terminal constant domain (C L ).
  • V L domains are associated non-covalently with a V H domain, whereas the C L domain usually are covalently linked with C H 1 domain via a disulfide bond. It is believed that certain amino acid residues form an interface between the light chain variable domain and the heavy chain variable domain (Chothia et al., J MoI Biol 1985; 186: 651-663).
  • variable refers to the fact that a particular portion of a variable domain has a wide range of sequence differences between antibodies and is used for the binding and specificity of each particular antibody to that particular antigen. However, the variability is not evenly distributed throughout the variable domain of the antibody. The variability is concentrated in three segments called complementarity determining regions (CDRs) in both the light chain variable domain and the heavy chain variable domain. A more highly conserved part of the variable domain is called a framework region (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • CDR complementarity determining region
  • the three CDRs of each of the heavy and light chains are separated by a framework region (FR) containing sequences that tend to be less variable.
  • FR and CDR are arranged in the order of FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4.
  • the rough ⁇ -sheet configuration of FR brings the CDRs in each chain close to each other and close to each other. The resulting configuration contributes to the antigen binding site, but not all CDR residues are directly involved in antigen binding.
  • FR residues and Ig constant domains are not directly involved in antigen binding, but contribute to antigen binding and / or mediate antibody effector functions. Some FR residues are at least 3 by directly non-covalently binding to the epitope, interacting with one or more CDR residues, and affecting the boundary between the heavy and light chains. The method can have a significant effect on antigen binding. Constant domains are not directly involved in antigen binding, but include a variety of antibodies, including antibody-dependent cytotoxicity (ADCC), complement-dependent cytotoxicity (CDC), and antibody involvement in antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP). Mediates Ig effector function.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • ADCP antibody involvement in antibody-dependent cellular phagocytosis
  • the “fragment containing an antigen-binding region” includes a part of an intact antibody, preferably an antigen-binding fragment or a variable region of an intact antibody.
  • antigen-binding fragments include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 and Fv fragments; bispecific antibodies; linear antibodies (Zapata et. Al., Protein Eng 1995; 8 (10): 1057. -1062); single chain antibody molecules; as well as multispecific antibodies formed from antigen binding fragments.
  • Fab two identical antigen-binding fragments
  • Pepsin treatment yields an F (ab ') 2 fragment that has two antigen binding sites and can still crosslink with antigen.
  • “Fv” is the minimum antigen-binding fragment that contains a complete antigen recognition and binding site. In the two-chain Fv species, this region consists of a dimer of one heavy chain variable domain and one light chain variable domain that are tightly and non-covalently linked. In a single chain Fv species, one heavy chain variable domain and one light chain variable domain associate in a “dimeric” structure whose light and heavy chains are similar to the structure in a two chain Fv species. As such, it can be covalently linked by a flexible peptide linker. In this configuration, the three CDRs of each variable domain interact to define an antigen binding site on the surface of the V H -V L dimer. Together, the six CDRs provide antigen binding specificity for the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv that contains only three CDRs specific for the antigen) has the ability to recognize and bind the antigen, but has a lower affinity than the complete binding site.
  • Light chains of antibodies are of two distinct types (called kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ )), based on the amino acid sequences of their constant domains. Can be assigned to one.
  • immunoglobulins can be assigned to different classes. There are five major classes of human immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, and one or several of these, plus subclasses (isotypes) (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA and IgA2).
  • the heavy chain constant domains that correspond to the different classes of immunoglobulins are called alpha, delta, epsilon, gamma, and mu, respectively.
  • the subunit structures and three-dimensional configurations of different classes of immunoglobulins are well known. Different isotypes have different effector functions. For example, the human IgG1 and IgG3 isotypes mediate antibody-dependent cytotoxicity (ADCC) activity.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • Anti-tumor effect means an activity that inhibits the growth or survival of tumor cells. This inhibition of tumor cell growth or survival may be in vitro or in vivo.
  • the activity of reducing the number of tumor cells in vitro the activity of inhibiting the increase of the number of tumor cells, the activity of causing cell death of tumor cells, the ADCC activity, the CDC activity and the like can be mentioned.
  • In vivo activity to reduce tumor weight or volume activity to suppress tumor weight or volume increase, activity to promote tumor weight or volume decrease by other drugs, activity to suppress individual death due to tumor cells, etc. Is mentioned. 30% or more activity, preferably 50% or more activity, more preferably 80% or more activity, more preferably 90% or more activity, particularly preferably 95% or more activity compared to the solvent.
  • the antibody which has can be mentioned.
  • In vivo animal models include xenograft models in which cultured cancer cell lines derived from human cancer tissue are transplanted into immunodeficient mice such as nude mice, and syngeneic strains in which cultured mouse cancer cell lines are transplanted into wild-type mice having a normal immune system. Examples include transplantation models.
  • the xenograft model can be prepared by transplanting human cancer cell lines to various sites such as subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, intravenous, etc. of immunodeficient mice such as nude mice.
  • Cytotoxic drug refers to a substance that inhibits or prevents the function of cells and / or causes destruction of cells.
  • the term is intended to include chemotherapeutic agents as well as toxins (enzymatically active toxins of bacterial, fungal, plant or animal origin) and fragments thereof.
  • cytotoxic drugs can be coupled to an antibody, such as a humanized CD147 antibody, using known standard procedures and used, for example, to treat a patient for whom therapy with the antibody is indicated.
  • a “radioisotope” is a radionuclide such as I 131 , 1 125 , Y 90 and Re 186 and is coupled to an antibody, such as a humanized CD147 antibody, using known standard procedures, eg, by an antibody It can be used to treat patients for whom therapy is indicated.
  • a cancer cell expressing CD147 refers to acute lymphocytic leukemia, chronic leukemia, lymphoma (eg, Hodgkin's disease or non-Hodgkin's disease), multiple myeloma, carcinoma (eg, colon cancer, pancreatic cancer, liver cancer) Breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, squamous cell carcinoma, kidney cancer, lung cancer, or esophageal cancer), and the like.
  • lymphoma eg, Hodgkin's disease or non-Hodgkin's disease
  • carcinoma eg, colon cancer, pancreatic cancer, liver cancer
  • CD147-related disease means asthma, hypersensitivity pneumonia, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, ulcerative colitis, systemic lupus erythematosus, graft-versus-host disease, systemic inflammatory response syndrome, endometriosis, myocardial infarction , Arteriosclerosis, multiple sclerosis, Alzheimer's disease, liver fibrosis, neurofibrosis, HIV infection, meningitis, hepatitis and the like.
  • an antibody that binds to human CD147 can be produced by methods known to those skilled in the art.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, a CD147 protein or a CD147-expressing cell is used as a sensitizing antigen, and this is used to immunize a mammal according to a normal immunization method.
  • the obtained immune cells can be fused with a known parent cell by an ordinary cell fusion method, and monoclonal antibody-producing cells can be selected by an ordinary screening method.
  • a monoclonal antibody can be produced as follows. First, a CD147 protein is obtained according to the amino acid sequence of CD147 shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and this is used as a sensitizing antigen for antibody acquisition. That is, a gene sequence encoding human CD147 is inserted into a known expression vector system to transform an appropriate host cell, and then stable expression of CD147 on the surface of the host cell is produced, or from the culture supernatant The target CD147 protein is purified by a known method.
  • this purified CD147 protein or CD147 stably expressing cell is used as a sensitizing antigen.
  • a partial peptide of CD147 can be used as a sensitizing antigen.
  • the partial peptide can also be obtained by chemical synthesis according to the amino acid sequence of human CD147.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Animals such as mice, rats, hamsters, rabbits, monkeys and the like are used.
  • Immunization of animals with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected into a mammal intraperitoneally or subcutaneously.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, or the like, and mixed with an appropriate amount of an ordinary adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary, and emulsified.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline or the like
  • an ordinary adjuvant for example, Freund's complete adjuvant, if necessary, and emulsified.
  • the mammal is dosed several times every 4-21 days.
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • immune cells are collected from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferable immune cells include spleen cells.
  • Mammalian myeloma cells are used as parent cells to be fused with the immune cells.
  • This myeloma cell is known in various known cell lines such as P3 (P3 ⁇ 63Ag8.653) (Kearney et al., J Immunol 1979; 123: 1548-1550), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C Eur. J Immunol 1976; 6: 511-519), SP2 / 0 (Shulman, M. et al., Nature 1978; 276: 269-270) and the like are preferably used.
  • the cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method such as the method of Kohler and Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol 1981; 73: 3-46). It can carry out according to etc.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), or the like is used as the fusion promoter, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency as desired.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells can be arbitrarily set.
  • the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI-1640 culture medium suitable for growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other normal culture liquids used for this kind of cell culture can be used.
  • serum replacement fluid such as fetal bovine serum (FBS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture medium, and a PEG solution (for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000) preliminarily heated to about 37 ° C. is usually 30 to 60% (
  • the target fusion cell (hybridoma) is formed by adding at a concentration of w / v) and mixing. Subsequently, cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of the hybridoma are removed by sequentially adding an appropriate culture medium and centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma thus obtained is selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a sufficient time (usually several days to several weeks) for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die. Subsequently, a normal limiting dilution method is performed, and screening and single cloning of a hybridoma that produces the target antibody are performed.
  • a normal selective culture solution for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a sufficient time (usually several days to several weeks) for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die.
  • a normal limiting dilution method is performed, and screening and single cloning of a hybrido
  • an antibody that reacts with CD147 can be selected by FACS analysis using CD147 stably expressing cells used as a sensitizing antigen and cancer cells characterizing the expression of CD147.
  • An antibody that reacts with CD147 can also be selected by ELISA using purified CD147 protein.
  • a promising method for selecting an antibody to be used for treatment is FACS analysis using cancer cells that characterize the expression of CD147.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hybridoma is cultured according to a usual method and obtained as a culture supernatant, or the hybridoma is administered to a mammal compatible therewith to proliferate, and as ascites The method of obtaining is adopted.
  • the former method is suitable for obtaining highly pure antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • the anti-human CD147 monoclonal antibody of the present invention or an antigen-binding region thereof has the following properties a to c. a. Reacts against a human CD147 expressing cancer cell line. b. Reacts against cynomolgus monkey CD147 expressing cell lines. c. It exhibits antitumor activity in vivo against human CD147-expressing cancer cells.
  • the human CD147-expressing cancer cell line is synonymous with the above-described cancer cell expressing CD147.
  • iv vivo exhibits antitumor activity means that antitumor activity, for example, tumor weight or tumor, can be obtained by administering anti-human CD147 monoclonal antibody to animals (including humans) having human CD147-expressing cancer cells. It means that the effect
  • variable region of anti-human CD147 antibody Regarding the antibody that binds to human CD147 in the present invention , cloning of the variable region can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • mRNA encoding the variable region of anti-human CD147 antibody is isolated from the hybridoma producing anti-human CD147 antibody.
  • known methods such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry 1979; 18: 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal Biochem). 1987; 162: 156-159) etc. to prepare total RNA, and mRNA of interest is prepared using mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • Amplification of the antibody variable region gene can be carried out using SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) or the like using an oligonucleotide complementary to the constant region sequence of mouse IgG or mouse kappa chain as a primer.
  • cDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase Kit (Invitrogen) or the like, and the gene encoding the variable region is amplified by PCR using degenerate primer or the like using the prepared cDNA as a template. Can do.
  • the target DNA fragment is purified from the obtained PCR amplification product and ligated with vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector. Then, the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method such as the dideoxynucleotide chain termination method.
  • amino acid residues and CDRs of the light chain variable region and heavy chain variable region can be identified from the publicly available Kabat Database, IMGT (ImmunoGeneTics) Database, etc.
  • Examples of the anti-human CD147 monoclonal antibody of the present invention include the following PPAT-082-01, PPAT-082-02, and PPAT-082-03, and the variable regions thereof are as follows.
  • the variable region of the heavy chain has the sequence TYWIE (SEQ ID NO: 29) as the CDR1, the sequence EFLPGSGSTNFNEKFKG (SEQ ID NO: 30) as the CDR2, the sequence SGGNFGARFAS (SEQ ID NO: 31) as the CDR3, and the sequence RSSKSLLSNNGTYLY (as the CDR1 in the light chain variable region) SEQ ID NO: 32), a monoclonal antibody having the sequence RMSSLAS (SEQ ID NO: 33) as CDR2 and the sequence MQHLYPFT (SEQ ID NO: 34) as CDR3.
  • it is a human-derived monoclonal antibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 in the variable region of the heavy chain and the amino acid sequence of S
  • variable region of the heavy chain has the sequence SYGMS (SEQ ID NO: 35) as the CDR1, the sequence TISSGSYTYYQDSIGG (SEQ ID NO: 36) as the CDR2, the sequence GDWADY (SEQ ID NO: 37) as the CDR3, and the sequence KASQDINSYLS (as the CDR1 in the light chain variable region) SEQ ID NO: 38), a monoclonal antibody having the sequence RANRLVA (SEQ ID NO: 39) as CDR2 and the sequence LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 40) as CDR3.
  • a monoclonal antibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 in the variable region of the heavy chain and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 in the variable region of the light chain is preferable.
  • variable region of the heavy chain has the sequence SYGIS (SEQ ID NO: 17) as CDR1, the sequence WINPNSGGTNYAQKQQG (SEQ ID NO: 18) as CDR2, the sequence GRGSYYAFDI (SEQ ID NO: 19) as CDR3, and the sequence KSSQSVLYSSSNNKNYLA as the CDR1 in the variable region of the light chain ( SEQ ID NO: 20), monoclonal antibody having the sequence WASTRES (SEQ ID NO: 21) as CDR2 and the sequence QQYYSTPT (SEQ ID NO: 22) as CDR3.
  • a monoclonal antibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in the variable region of the heavy chain and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 in the variable region of the light chain is preferable.
  • the monoclonal antibody of the present invention or a fragment containing the antigen-binding region thereof has one or more amino acid substitutions, deletions, additions or insertions in the amino acid sequence, and the monoclonal antibody having a level of identity of at least 90% or more Or a fragment containing the antigen-binding region thereof is included.
  • humanized anti-CD147 antibody Preparation of humanized anti-CD147 antibody
  • One preferred embodiment of the antibody in the present invention includes a human antibody or a humanized antibody that binds to human CD147.
  • Humanized antibodies can be produced using known methods.
  • a humanized antibody is also called a reshaped human antibody, which is a non-human mammal such as a mouse antibody complementarity-determining region (CDR) grafted to a human antibody CDR.
  • CDR complementarity-determining region
  • a genetic recombination technique is also known (WO 96/02576).
  • the CDR when the CDR is derived from a mouse antibody, a DNA sequence designed to link the CDR of the mouse antibody and the framework region (FR) of the human antibody is used as a terminal region of both the CDR and FR. Synthesized by PCR using several oligonucleotides prepared to have overlapping portions as primers, or artificially synthesizing DNA encoding light chain variable region and heavy chain variable region genes Is also possible.
  • the framework region of the human antibody to be linked to the CDR is selected such that the complementarity determining region forms a favorable antigen binding site. If necessary, amino acids in the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the humanized antibody forms an appropriate antigen binding site (Sato K et al., Cancer Res 1993). 53: 851-856). In addition, some amino acids of CDR may be substituted with amino acids of human antibodies.
  • the constant region of a humanized antibody is that of a human antibody.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4 can be used for the heavy chain, and C ⁇ , C ⁇ can be used for the light chain.
  • the constant region of a human antibody may be modified to improve the stability of the antibody or its production.
  • Human antibodies used for humanization may be human antibodies of any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. In the present invention, it is preferable to use IgG, more preferably IgG1 or IgG3, particularly IgG1. Is preferred. IgG1 is effective when an antibody is used as an anticancer agent because it has high cytotoxic activity (Clark MR, Chemical immunology 1997; 65: 88-110).
  • amino acids in the variable region or the constant region may be substituted with other amino acids.
  • the antibody of the present invention may be an antibody with enhanced cytotoxic activity.
  • antibodies with enhanced cytotoxic activity include antibodies lacking fucose, antibodies in which bisecting N-acetylglucosamine (GlcNAc) is added to the sugar chain, and Fc ⁇ by substituting amino acids in the Fc region. Examples thereof include an antibody whose binding activity to a receptor is changed. These antibodies with enhanced cytotoxic activity can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • the origin of the CDR in the humanized antibody is not particularly limited and may be derived from any animal.
  • sequences of mouse antibody, rat antibody, rabbit antibody, camel antibody and the like can be used, but the CDR sequence of mouse antibody is preferable.
  • an antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter.
  • an expression control region for example, an enhancer or a promoter.
  • host cells are transformed with this expression vector to express the antibody.
  • the expression of the antibody gene may be achieved by separately incorporating polynucleotides encoding light or heavy chains into an expression vector and co-transforming host cells, or by using a single polynucleotide encoding light and heavy chains.
  • Host cells may be transformed by incorporating into the above expression vector (WO 94/11523).
  • humanization of antibodies it is usually difficult to perform humanization while maintaining the antigen-binding activity of the derived antibody.
  • the antigen-binding activity is demonstrated in the same manner as the derived mouse antibody.
  • humanized antibodies Since humanized antibodies have reduced antigenicity in the human body, they are useful when administered to humans for therapeutic purposes.
  • humanized anti-CD147 monoclonal antibody of the present invention or a fragment containing the antigen-binding region thereof examples include those around the CDR of the variable region of the anti-CD147 monoclonal antibodies (eg, PPAT-082-01, PPAT-082-02).
  • a humanized anti-CD147 monoclonal antibody consisting of an amino acid sequence containing it and an amino acid sequence of human immunoglobulin, or a fragment containing the antigen-binding region thereof is preferred.
  • the combination of heavy chain variable region and light chain variable region has 1) the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13 and 14, or 2) the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 15 and 16 More preferred are heavy chain and humanized light chain anti-CD147 monoclonal antibodies or fragments comprising the antigen binding region thereof.
  • humanized anti-CD147 monoclonal antibodies or fragments containing the antigen-binding region thereof one or more amino acid sequences are substituted, deleted, and added in the amino acid sequence, and the level of identity is at least 90% or more. And a fragment containing the humanized anti-CD147 monoclonal antibody or antigen binding region thereof.
  • ADCC activity and CDC activity measurement by anti-CD147 antibody As a preferable aspect of the anti-CD147 antibody of the present invention, an antibody having a high ADCC activity or an antibody having a high CDC activity against cells expressing CD147 can be mentioned.
  • Examples of cells expressing human CD147 include tumor cells such as HepG2 (ATCC HB-8065) and PC-3 (ATCC CRL-1435), cells incorporating a gene encoding human CD147, and the like. .
  • ADCC activity or CDC activity can be measured by methods known to those skilled in the art.
  • CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega
  • lactose dehydrogenase released from lysed cells It is possible to carry out by using. Although it does not specifically limit as specific conditions at the time of measuring ADCC activity, For example, it can measure using the conditions of an Example description.
  • the antibody of the present invention may be an antibody with enhanced cytotoxic activity.
  • antibodies with enhanced cytotoxic activity include antibodies lacking fucose, antibodies in which bisecting N-acetylglucosamine (GlcNAc) is added to the sugar chain, and Fc ⁇ by substituting amino acids in the Fc region. Examples thereof include an antibody whose binding activity to a receptor is changed. These antibodies with enhanced cytotoxic activity can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • Anti-CD147 Antibody Conjugated with Cytotoxic Drug Another embodiment of the present invention includes a conjugated antibody in which various molecules such as a cytotoxic drug are bound to anti-CD147 antibody.
  • cytotoxic drugs used in the present invention include duocarmycin, duocarmycin analogs and inducers, CC-1065, duocarmycin analogs based on CBI, and duocarls based on MCBI.
  • the anti-CD147 antibody conjugated with the cytotoxic drug in the present invention can be prepared by a known method by binding the above-mentioned drug and the anti-CD147 antibody.
  • the antibody and the drug may be directly bonded via a linking group or the like possessed by themselves, or may be indirectly bonded via a linker or other substance.
  • linking group when the drug is directly bonded examples include a disulfide bond using SH group and a bond via maleimide.
  • the intramolecular disulfide bond in the Fc region of the antibody and the disulfide bond of the drug are reduced, and both are bonded by a disulfide bond.
  • Another method is to introduce cysteine into the antibody by genetic engineering.
  • the linker preferably has one or more functional groups that react with the antibody or drug or both.
  • functional groups include amino groups, carboxyl groups, mercapto groups, maleimide groups, pyridinyl groups, and the like.
  • linkers include sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC), N-succinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC), ⁇ - Maleimidobutyric acid N-succinimidyl ester (GMBS), ⁇ -maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester (EMCS), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), N- ( ⁇ -maleimidoacetoxy) -succinimide Ester (AMAS), N-succinimidyl 4- (p-maleimidophenyl) -butyrate (SMPB), and N- (p-maleimidophenyl) isocyanate (PMPI), p-aminobenzyloxy Examples include, but are not limited to,
  • Anti-CD147 antibody conjugated with a radioisotope Another embodiment of the present invention includes a conjugated antibody in which a radioisotope is labeled with an anti-CD147 antibody. When used as an antitumor agent, it is preferable to label a cytotoxic radioactive metal element.
  • cytotoxic radioactive metal elements examples include yttrium 90 (90Y), rhenium 186 (186Re), rhenium 188 (188Re), copper 67 (67Cu), iron 59 (59Fe), strontium 89 (89Sr), gold 198 (198Au), mercury 203 (203Hg), lead 212 (212Pb), dysprosium 165 (165Dy), ruthenium 103 (103Ru), bismuth 212 (212Bi), bismuth 213 (213Bi), holmium 166 (166Ho), samarium 153 ( 153Sm) and lutetium 177 (177Lu).
  • 90Y, 153Sm, and 177Lu are preferable from the viewpoints of half-life, radiation energy, easy labeling reaction, labeling rate, and complex stability.
  • the antibody is reacted with a metal chelating reagent and then reacted with the radioactive metal element to form a complex.
  • the radioactive metal element is bound to the anti-CD147 antibody via a metal chelating reagent.
  • metal chelating reagents used for such complex formation include (1) 8-hydroxyquinoline, 8-acetoxyquinoline, 8-hydroxyquinaldine, quinolone compounds having a quinoline skeleton, norfloxacin, ofloxacin, spal Quinoline derivatives such as floxacin; (2) compounds such as chloranilic acid, aluminone, thiourea, tetraphenylarsonium chloride; (3) ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) and similar skeletons Dihydroxyethyl glycine, ethylenediaminediacetic acid, ethylenediaminedipropionate hydrochloride, isothiocyanobenzyl EDTA, isothiocyanobenzyl DTPA, methylisothiocyanobenzyl DTPA, cyclohexane Silisothiocyanobenzyl DTPA, maleimidopropyla
  • isothiocyanobenzyl DOTA, methylisothiocyanobenzyl DTPA, and cyclohexylisothiocyanobenzyl DTPA are easy to introduce metal chelates into antibodies, labeling rate, complex stability, etc. preferable.
  • the binding of the radioactive metal element to the anti-CD147 antibody can be performed according to a conventional method.
  • the reaction can be performed by reacting an anti-CD147 antibody with a metal chelate reagent, preparing a labeling precursor in advance, and then reacting with a radioactive metal element.
  • compositions The anti-CD147 monoclonal antibody, conjugated antibody or fragment containing the antigen-binding region thereof is useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition for tumors and diseases characterized by CD147 expression.
  • a pharmaceutical composition preferably contains a physiologically acceptable diluent or carrier in addition to the antibody or the like, and is a mixture with other drugs or other drugs such as antibiotics. May be.
  • Suitable carriers include, but are not limited to, physiological saline, phosphate buffered saline, phosphate buffered saline glucose solution, and buffered saline.
  • the routes of administration are oral routes and parenteral routes including intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal injection or delivery.
  • the effective amount administered as a combination of an effective amount of the antibody of the present invention and an appropriate diluent and a pharmacologically usable carrier is 0.1 mg to 100 mg per kg body weight at a time. It is administered at intervals of 8 weeks from the day.
  • Example 1 Production of the antigen according to Example 1 will be described.
  • Gene encoding cynomolgus monkey CD147 amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of extracellular domain corresponding to amino acid residues 22-207 of human CD147 with reference to amino acid information of cynomolgus monkey CD147 (Genbank accession number EHH59001.1) Was designed and synthesized artificially.
  • Each of these synthetic genes was inserted into a pCXN3 vector to prepare a human or cynomolgus CD147 expression vector.
  • the expression vector was transiently transfected into FreeStyle-293F cells (Invitrogen). Thereafter, the flask was cultured for 1 week, and the culture supernatant was used as a sample for purification by passing through a His-Trap HP column (GE), and various extracellular domain CD147-His proteins were replaced with PBS. It was confirmed that the extracellular domain CD147-His was purified by Western blotting using SDS-PAGE and anti-His tag antibody (Qiagen).
  • Example 2 Production of anti-CD147 monoclonal antibody by mouse immunization according to Example 2 will be described.
  • the homology between human and cynomolgus monkey or mouse extracellular domain CD147 (see Genbank accession number NP_0010706652.1) is as high as 78% between human and cynomolgus monkey as shown in FIGS. 1 and 2, and 47 between human and mouse. % And not high. Therefore, it is considered that antibodies against human or cynomolgus monkey, or both types of CD147 can be obtained by immunizing mice with human or cynomolgus monkey extracellular domain CD147-His.
  • immunization was started from 6 to 8 weeks of age using Balb / c mice as immunized animals.
  • the extracellular domain CD147-His was intraperitoneally administered with 50 ⁇ g / head, pertussis toxin 100 ng / head and emulsified with Freud's complete adjuvant or Titer Max. Two weeks later, CD147-His 25 ⁇ g / head was boosted with an emulsion of Freud's incomplete adjuvant or Titer Max. Three days before cell fusion, final immunization was performed with extracellular domain CD147-His 25 ⁇ g / head in PBS.
  • RPMI1640 medium was added to dilute PEG1500, and PEG1500 was removed by centrifugation. A cell pellet carefully suspended in 10% FBS / RPMI1640 medium was seeded on a 96-well plate at 100 ⁇ L / well and cultured overnight. The next day, RPMI 1640 medium (HAT medium) containing 10% FBS / 1x HAT media supplement / 1x BM-consolidated H1 Hybridoma cloning supplement was added at 100 ⁇ L / well. Two to four days after the fusion day, half of the culture medium was replaced with fresh HAT medium, and screening was performed using the culture supernatant after 8 days.
  • the blocking solution was removed, the plate was washed with PBS / 0.05% Tween-20, 50 ⁇ L / well of a hybridoma well culture supernatant diluted 5 or 50 times with a blocking solution was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour.
  • 50 ⁇ L / well of HRP-labeled anti-mouse IgG (H + L) antibody diluted 5000 times with 10% Block Ace / TBS was added and allowed to react at room temperature for 1 hour. .
  • 50 ⁇ L / well of TMB reagent was added and allowed to react at room temperature for 5 minutes.
  • human CD147 is a prostate cancer cell line, PC-3 (ATCC CRL-1435), and a Burkitt lymphoma cell line.
  • Raji (ATCC CCL-86) was analyzed for cynomolgus monkey CD147 by HSC-F (JCRB cell bank JCRB1164), which is an HSV immortalized T cell.
  • HSC-F JCRB cell bank JCRB1164
  • each of the hybridoma clones producing the human anti-human CD147 monoclonal antibody of the present invention has a symbol.
  • the term “antibody” after the symbol means an antibody produced by each hybridoma, or a recombinant antibody produced by a host cell carrying an antibody gene isolated from the hybridoma.
  • the name of the hybridoma clone may represent the name of an antibody within a range that is clear from the context.
  • Example 3 The cloning of the variable region of the anti-human CD147 antibody according to Example 3 will be described. Using total RNA prepared from two cultured positive hybridomas as a template, cDNA was synthesized using SuperScriptIII First Strand Synthesis System (Invitrogen) according to the attached instructions. Amplification of the heavy chain variable region was performed by PCR using Extag polymerase (Takara Bio) as a template using a forward primer containing a degenerate sequence of a nucleic acid encoding a heavy chain signal sequence and a reverse primer specific to the heavy chain constant region. .
  • Extag polymerase Takara Bio
  • Amplification of the light chain variable region was performed by PCR using Extag polymerase as a template using a forward primer containing a degenerate sequence of a nucleic acid encoding a light chain signal sequence and a reverse primer specific to the light chain constant region.
  • the amplified PCR product was purified from a single band of agarose gel electrophoresis using QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), and then cloned into pGEM-T easy vector (Promega) to determine the base sequence.
  • the amino acid residues and CDRs of the chain variable region and the light chain variable region were identified. Table 1 (heavy chain) and 2 (light chain) show the amino acid residues and the respective CDR sequences of the variable regions of the heavy and light chains of the antibody.
  • Example 4 The production of anti-CD147 monoclonal antibody using the human antibody phage library according to Example 4 will be described.
  • bonded with CD147 was implemented using the cancer cell which is expressing CD147 strongly.
  • MIApaca-2 (ATCC CRL-1420), which is a pancreatic cancer cell line highly expressing CD147, was cultured by an arbitrary method. Thereafter, the cells are collected, washed with chilled PBS, and mixed with a 1 ⁇ 10 13 cfu human antibody phage library (see Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 2005-185281, WO2008 / 007648, and WO2006 / 090750).
  • reaction solution 1% BSA, 0.1% NaN 3 , MEM
  • a reaction solution 1% BSA, 0.1% NaN 3 , MEM
  • the reaction solution was divided into two, and each layer was layered on a 0.6 mL organic solution (dibutyl phthalate cyclohexane 9: 1) prepared in advance, and centrifuged for 2 minutes (3000 rpm) with a microcentrifuge. The supernatant was discarded, and the cells that had settled to the bottom of the tube were suspended in 0.7 mL of 1% BSA / MEM and overlaid with 0.7 mL of an organic solvent. Similarly, the supernatant was discarded by centrifugation, and the cells were suspended in 0.3 mL of PBS and frozen in liquid nitrogen.
  • the frozen cells were thawed at 37 ° C., infected with 20 mL of E. coli DH12S having an OD of 0.5 for 1 hour, and a portion thereof was spread on an ampicillin plate to calculate the titer of the recovered phage.
  • Phage-infected Escherichia coli was cultured overnight at 30 ° C. in 600 mL of 2 ⁇ YTGA medium (2 ⁇ YT, 200 ⁇ g / mL ampicillin sulfate, 1% glucose). 10 mL of this overnight culture was mixed with 200 mL of 2 ⁇ YTA medium (2 ⁇ YT, 200 ⁇ g / mL ampicillin sulfate), cultured at 37 ° C.
  • 2nd screening was performed using the extracellular domain antigen of human CD147.
  • Antigen was prepared to 50 ⁇ g / mL with PBS, 100 ⁇ L / well was added to Immuno Module / Stripe Plates (NUNK), and allowed to stand at 4 ° C. overnight. Thereafter, the antigen solution was discarded, 200 ⁇ L / well of a blocking solution (5% skim milk / PBS) was added, and blocking was performed at 37 ° C. for 2 hours.
  • 1 ⁇ 10 10 1st screening phage prepared with 5% skim milk / PBS was mixed with Immuno Module / Stripe Plates excluding the blocking solution, and reacted at room temperature for 2 hours.
  • the plate was washed 10 times with PBS, and 0.2 M Glycine HCl (pH 3.0) was added to 100 ⁇ L / well to collect phages.
  • the recovered phage was infected with 20 mL of E. coli DH12S having an OD of 0.5 for 1 hour, and the phage was prepared in the same manner as in the 1st screening, and this was used as a 2nd screening phage.
  • the final positive phage clone was selected from the reactivity of the antigen antibody by ELISA using the CD147 antigen.
  • human or cynomolgus monkey extracellular domain CD147-His was prepared with PBS to 10 ⁇ g / mL, added to Immuno Module / Stripe Plates (NUNK) at 50 ⁇ L / well, and allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours. . Thereafter, the antigen solution was discarded, and 200 ⁇ L / well of blocking solution (5% skim milk / PBS) was added, followed by blocking at 37 ° C. for 2 hours.
  • the blocking solution was removed, the plate was washed with PBS, 100 ⁇ L / well of the culture supernatant prepared from the 4th screening was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing 5 times with PBS, 100 ⁇ L / well of 1 ⁇ g / mL Rabbit anti-cp3 antibody diluted with PBS / 0.05% Tween 20 was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing 5 times with PBS, 100 ⁇ L / well of HRP-labeled anti-Rabbit IgG (H + L) antibody diluted 2000 times with PBS / 0.05% Tween 20 was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • PPAT-082-04 was prepared with reference to the sequence of the anti-CD147 monoclonal human antibody (SEQ ID NOs: 177 and 181) described in Japanese Patent No. 5382629.
  • the amino acid residues and the respective CDR sequences of the variable regions of the heavy and light chains of the two human antibodies are shown in Table 1 (heavy chain) and Table 2 (light chain).
  • Table 1 dasheavy chain
  • Table 2 light chain
  • the light chain of PPAT-082-04 is a ⁇ chain, it is shown in Table 2 including its constant region.
  • Example 5 The production of the anti-CD147 humanized antibody according to Example 5 will be described.
  • Human antibody sequence data published by IMGT was obtained, and consensus sequences were identified by dividing into light chain variable regions and heavy chain variable regions.
  • the resulting heavy chain variable region amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 11, and the light chain variable region amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
  • antibodies PPAT-082-01 and 02 transplanted amino acid residues centered on the CDRs of the heavy chain and the light chain.
  • the humanized antibody shown in 2) was designed. 1) hPPAT-082-01 2) hPPAT-082-02
  • Table 3 shows the amino acid sequences of each heavy chain variable region and light chain variable region for each designed humanized antibody.
  • Example 6 A method for preparing a chimeric antibody and a human antibody of anti-human CD147 antibody according to Example 6 will be described. Encodes the amino acid sequences of the variable regions of the light and heavy chains of antibodies PPAT-082-01 and PPAT-082-02 obtained from mouse immunization, and antibodies PPAT-082-03 and PPAT-082-04 from phage, respectively. Genes were synthesized artificially. Expression in which a heavy chain variable region gene is inserted into a pCXN3 vector into which a constant region gene derived from human IgG1 is incorporated, and a light chain variable region gene is inserted into a pCXN3 vector into which a constant region gene from human ⁇ chain is incorporated A vector was prepared.
  • an expression vector is prepared by inserting a gene obtained by artificially synthesizing the constant region gene derived from human ⁇ chain after the variable region gene into the pCXN3 vector did.
  • Expression vectors incorporating the heavy chain variable region and light chain variable region genes were simultaneously introduced into FreeStyle-293F cells (Invitrogen) to produce mouse-human chimeric antibodies and human antibodies.
  • the mouse-human chimeric antibodies containing the variable regions of the mouse antibodies PPAT-082-01 and PPAT-082-02 are named cPPAT-082-01 and cPPAT-082-02, respectively.
  • each produced antibody was secreted into the culture supernatant, it was purified with a Protein G column, further purified with an anion column or gel filtration column, and replaced with PBS.
  • the purified two chimeric antibodies and two human antibodies were confirmed to react with human and cynomolgus monkey CD147 by FACS analysis as in Example 2.
  • FIG. 3 the results show that cPPAT-082-01 and cPPAT-082-02 mouse-human chimeric antibody and PPAT-082-03 human antibody bind to HSC-F and Raji cells in a concentration-dependent manner.
  • the human antibody of PPAT-082-04 did not react with HSC-F. Therefore, it was found that all the antibodies produced inherited the same characteristics as the original antibody, at least the reaction with the CD147 antigen.
  • Example 7 The antitumor effect in the K562 transplantation model which is a cell line of chronic myelogenous leukemia by the anti-CD147 antibody according to Example 7 will be described. 6 weeks old C.I. B. 17 / Icr-scidJc1 mice (CLEA, Japan) and K562 cells (ATCC CCL-432) at 5 ⁇ 10 6 mice per mouse in a solution of MatriGel (BD) and RPMI 1640 (ratio 1: 1). Injection into the subcutaneous side. On the day when the tumor volume reached an average of 230 mm 3 , cPPAT-082-01, cPPAT-082-02, PPAT-082-03, or PPAT-082-04 dissolved in PBS was injected intravenously.
  • the dose was 15 mg / kg of anti-CD147 antibody per mouse, and 5 mice were administered twice a week for 5 times.
  • PBS without antibody was injected intravenously.
  • the relationship between the elapsed date and time and the tumor volume (average value) is shown in FIG.
  • the tumor volume increased day by day, but in all of the groups administered with 15 mg / kg of the anti-CD147 antibody, the tumor volume did not change much from the initial antibody administration or showed a decrease. Therefore, the anti-tumor effect was confirmed by anti-CD147 antibody administration.
  • Example 8 The antitumor effect in the SW480 transplantation model which is a colon cancer cell line by the anti-CD147 antibody according to Example 8 will be described.
  • 6 weeks old C.I. B. 17 / Icr-scidJc1 mice (CLEA Japan) were injected subcutaneously in the ventral region with 5 ⁇ 10 6 SW480 cells (ATCC CCL-280) per mouse in a solution of RPMI1640.
  • cPPAT-082-01, cPPAT-082-02, PPAT-082-03, or PPAT-082-04 anti-CD147 antibody was injected intravenously.
  • the dose was 15 mg / kg of anti-CD147 antibody per mouse, and 5 mice were administered twice a week for 5 times.
  • PBS without antibody was injected intravenously.
  • the relationship between elapsed date and time and tumor volume (average value) is shown in FIG.
  • the degree of increase in tumor volume was delayed as compared with the PBS administration group, and it was confirmed that the anti-CD147 antibody has an antitumor effect.
  • Example 9 The production of the target antibody HAb18 according to Example 9 and confirmation of the reactivity with CD147 will be described.
  • the CD147 antibody is known as the name of HAb18, and a therapeutic agent for liver cancer (Licartin) labeled with radioactive I-131 on the F (ab ′) 2 fragment of the antibody is approved only in China.
  • a gene encoding the heavy chain and light chain variable region amino acid sequences as in Example 6 Were artificially synthesized to produce antibodies and purified.
  • Table 4 shows the amino acid sequences of the variable regions of the heavy chain (SEQ ID NO: 41) and light chain (SEQ ID NO: 42). Further, as described in Example 2, the purified HAb18 was confirmed to be reactive with CD147 in an ELISA in which extracellular domain human CD147-His or cynomolgus monkey CD147-His was solid-phased. As shown in FIG. 6 of the result, HAb18 was found to react with human CD147 but not with cynomolgus CD147. This suggests that HAb18 differs in epitope from antibodies other than PPAT-082-04.
  • Example 10 The antitumor effect in the NCI-H929 transplantation model, which is a cell line of B lymphoma, produced by the anti-CD147 antibody according to Example 10 will be described. 6 weeks old C.I. B. 17 / Icr-scidJc1 mice with 5 ⁇ 10 6 NCI-H929 cells (ATCC CRL-9068) per mouse, ventral in a solution of MatriGel (BD) and RPMI 1640 (ratio 1: 1) It was injected subcutaneously. On the day the tumor volume reached an average of 141 mm 3 , HAb-18, or PPAT082-03 anti-CD147 antibody was injected intravenously.
  • BD MatriGel
  • RPMI 1640 ratio 1: 1
  • the dose was 15 mg / kg of anti-CD147 antibody per mouse, and each mouse was administered to 3 mice, 4 times a week.
  • PBS without antibody was injected intravenously.
  • the relationship between the elapsed date and time and the tumor volume (average value) is shown in FIG.
  • the increase in tumor volume was delayed as compared with the PBS-administered group, confirming that the anti-CD147 antibody has an antitumor effect.
  • the antitumor effects of PPAT-082-03 and HAb18 were comparable.
  • Example 11 The dose dependence of the anti-CD147 antibody of the antitumor effect in the K562 transplantation model according to Example 11 will be described. 8 weeks old C.I. B. 17 / Icr-scidJc1 mice were injected subcutaneously in the ventral region with 5 ⁇ 10 6 K562 cells per mouse in a solution of MatriGel and RPMI 1640 (ratio 1: 1). On the day the tumor volume reached an average of 117 mm 3 , PPAT-082-03 anti-CD147 antibody was injected intravenously. The doses of anti-CD147 antibody were administered four times once a week to five mice each at three concentrations of 0.12, 0.6, and 3 mg / kg per mouse.
  • HAb-18 was intravenously injected at 0.6 mg / kg and PBS containing no antibody.
  • the relationship between the elapsed date and time and the tumor volume (average value) is shown in FIG.
  • the tumor In the group to which 3 mg / kg of PPAT-082-03 was administered, the tumor almost disappeared, and no recurrence was observed in the subsequent follow-up.
  • the anti-tumor effects of PPAT-082-03 and HAb18 administered at 0.6 mg / kg were comparable, showing a decrease in tumor volume, and subsequent follow-up showed signs of recurrence.
  • PPAT-082-03 administered with 0.12 mg / kg was almost the same as the PBS-administered group, and no antitumor effect could be observed.
  • Example 12 The dose dependence of the anti-CD147 antibody of the antitumor effect in the HepG2 transplantation model, which is a liver cancer cell line according to Example 12, will be described. 8 weeks old C.I. B. 17 / Icr-scidJc1 mice were injected subcutaneously in the ventral region with 8 ⁇ 10 6 HepG2 cells (ATCC HB-8065) in a solution of RPMI 1640. On the day tumor volumes reached an average of 110 mm 3 , PPAT-082-03 anti-CD147 antibody was injected intravenously. The doses were 0.2, 1 and 5 mg / kg of anti-CD147 antibody per mouse for 5 mice each once a week for 4 times.
  • HAb-18 was intravenously injected at 1 mg / kg and PBS containing no antibody.
  • the relationship between the elapsed date and time and the tumor volume (average value) is shown in FIG.
  • the tumor volume decreased early, and the third administration ( On day 34), it almost disappeared, and no recurrence was observed in the subsequent long-term follow-up.
  • the anti-CD147 antibody has an antitumor effect.
  • the antitumor effects of PPAT-082-03 and HAb18 administered at 1 mg / kg were comparable.
  • the PPAT-082-03 0.2 mg / kg administration group has a slower increase in tumor volume than the PBS administration group, and the anti-CD147 antibody of PPAT-082-03 has an antitumor effect even at this concentration.
  • the PPAT-082-03 0.2 mg / kg administration group has a slower increase in tumor volume than the PBS administration group, and the anti-CD147 antibody of PPAT-082-03 has an antitumor effect even at this concentration
  • Example 13 The measurement of ADCC activity according to Example 13 will be described.
  • Preparation of recombinant human CD16 stably expressing KHYG-1 A cell line stably expressing human CD16 was cultured as an effector cell in KHYG-1 (JCRB cell bank JCRB0156), a natural killer-like cell line, in RPMI1640 medium in the presence of IL-2. .
  • the cells were collected immediately before use and suspended in 2.5% FBS / RPMI1640 (no phenol red) medium.
  • mice Preparation of mouse bone marrow cell solution
  • the femur of BALB / c mice was aseptically collected, and the bone marrow cells present in the femur were collected in RPMI 1640 medium using a 25G injection needle. This was passed through a 40 ⁇ m filter and then centrifuged (500 ⁇ G, 5 minutes, 20 ° C.) to prepare the cells in 10% FBS / RPMI1640 medium containing IL-2 and GM-CSF at 2.0 ⁇ 10 6 cells / mL. The cells were differentiated into effector cells by culturing for 6 days. Immediately before use, the cells were peeled off with a cell scraper and collected, and suspended in 2.5% FBS / RPMI1640 (no phenol red) medium.
  • ADCC measurement (LDH method) The kit reagent for ADCC activity was performed using CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega) according to the attached procedure. Specifically, the CD147 antibody cPPAT-082-1-01, PPAT-082-03 or HAb18 is added to each cell line to a final concentration of 0.004, 0.016, 0.25, 1, 4 ug / mL. As shown in Table 5, the effector of the KHYG-1 cell line stably expressing human CD16 was added at 25 uL / well as shown in Table 5 and cultured at 37 ° C. in 5% CO 2 for 4 hours.
  • mouse bone marrow cell-derived effector cell 25 uL / well was added to HepG2 cells, and further CD147 antibody cPPAT-082-01, -02, PPAT-082-03 or HAb18 was added in a final concentration of 0.03, 0.3, 3 ug / mL at 25 uL / well, respectively, and cultured in the same manner. Lysis buffer was added to the maximum well 30 minutes before the end of the culture. After 4 hours of culture, only 50 uL of the supernatant was collected by centrifugation at 250 ⁇ g for 4 minutes, and a new plate was transferred.
  • A is the A492 value of the well to which both the antibody and the effector cell were added
  • B is the A492 value of the well to which both the antibody and the effector cell were added without the target cell (background of the effector cell)
  • C was the antibody and the effector cell Well A492 value (target cell background) without both added
  • D indicates maximum well A492 value representing 100% LDH release.
  • the A492 values of A, B, C, and D are subtracted from the background A492 value of only the medium without cells.
  • the test was performed in duplicate, and an average value was calculated for ADCC activity (%).
  • the result is shown in FIG.
  • All CD147 antibodies showed ADCC activity against HepG2, SW480 and PC-3, but cPPAT-082-01 was less active than the other three antibodies.
  • All antibodies also showed ADCC activity against HepG2 when mouse bone marrow cells were used as effector cells. From this, it was found that ADCC activity is involved in the antitumor effect in the mouse HepG2 transplantation model.
  • Example 14 The measurement of CDC activity according to Example 14 will be described. Preparation of target cells Cultured HepG2, lung cancer cell lines PC-9 (RIKEN BRC RCB4455) and PC-3 were detached from the dish using trypsin-EDTA (Life Tech), and 96 cells as shown in Table 6. The solution was dispensed into each well of a well U-bottom plate (Thermo) and cultured for 1 day. On the next day of measurement, the cells were washed with 2.5% FBS / RPMI1640 (no phenol red) medium 150 uL / well, and 50 uL / well was added. On the day of measurement, K562 cells were washed with 2.5% FBS / RPMI1640 (without phenol red) medium 150 uL / well in addition to the number of cells shown in Table 6 and then added with 50 uL / well.
  • FBS / RPMI1640 no phenol red
  • CDC measurement (LDH method) The kit reagent for CDC activity was carried out using CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega) according to the attached procedure in the same manner as ADCC activity. Specifically, the CD147 antibody cPPAT-082-01, -02, PPAT-082-03 or HAb18 is added to each cell line at a final concentration of 0.1, 1,10 ug / mL at 25 uL / well, respectively. In addition, a solution prepared by adding complement (Babbit rabbit serum, Cedarlane) so that the final dilution ratio was as shown in Table 6 was added at 25 uL / well and incubated at 37 ° C. in 5% CO 2 for 2 hours. .
  • Lysis buffer was added to the maximum well 30 minutes before the end of the culture. After 4 hours of culture, only 50 uL of the supernatant was collected by centrifugation at 250 ⁇ g for 4 minutes, and a new plate was transferred. The substrate solution was added 50 uL / well, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Stop solution 50 uL / well was added, A492 was measured (A620 was measured as a reference), and% cytotoxicity was determined by the same formula as in Example 115. The result is shown in FIG. The CD147 antibody cPPAT-082-01 did not show CDC activity against any cell line.
  • cPPAT-082-02 and HAb18G showed weak CDC activity, and PPAT-082-03 showed higher CDC activity.
  • PPAT-082-03 showed CDC activity. Based on the above, it was found that PPAT-082-03 has a CDC activity superior to HAb18G and other antibodies.
  • Example 15 The pathological findings of the tumor in the HepG2 transplantation model by PPAT-082-03 of the anti-CD147 antibody according to Example 15 will be described. 8 weeks old C.I. B. 17 / Icr-scidJc1 mice were injected subcutaneously in the ventral region with 8 ⁇ 10 6 HepG2 cells per mouse in a solution of RPMI 1640. On the day when the tumor volume reached an average of 147 mm 3 , it was intravenously injected with 5 mg / kg of anti-CD147 antibody of PPAT-082-03. HepG2 tumors were collected before antibody administration and 6, 18, 30, 48, 72, and 96 hours after administration, and HE staining was performed. A part of the result is shown in FIG.
  • the antibody of the present invention can be used as an antitumor agent.

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Abstract

ヒトＣＤ１４７に特異的に結合するモノクローナル抗体の提供、ＣＤ１４７発現を特徴づけられる多彩な癌種に対する治療への利用。　次のａ～ｃの性質を有する、ヒトＣＤ１４７に対するモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。 ａ．ヒトＣＤ１４７発現がん細胞株に対して反応する、 ｂ．カニクイザルＣＤ１４７発現細胞株に対して反応する、 ｃ．ヒトＣＤ１４７発現がん細胞に対してｉｎ　ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示す。

Description

ＣＤ１４７分子に特異的に結合する抗体およびその利用
　本発明は、ヒトＣＤ１４７に特異的に結合する抗体およびその利用に関する。
　ＣＤ１４７はタイプＩ膜型の糖タンパク質であり、免疫グロブリン様スーパーファミリーに分類される。多彩な生理的機能を持ち、例えば精子形成や神経ネットワークなどで重要な役割を果たすと共に、動脈硬化やリウマチ、ウィルス感染などへの関連が報告されている。また、多くのがん種において発現が認められており、がんの転移や浸潤、化学薬剤耐性にもＣＤ１４７の関連が示唆されている（非特許文献１）。ＣＤ１４７はインテグリンやｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ（ＭＣＴｓ）やシクロフィリンＡ、カベオリン－１などと相互作用することが知られており（非特許文献２）、さまざまな状況下で役割を果たしていることが伺える。
　ＣＤ１４７の機能を調節する抗体が報告されている。例えば、シクロフィリンＡとの結合によるＴ細胞の活性化を阻害する抗体（ＡＢＸ－ＣＢＬ）やＶＥＦＧ産生刺激を抑制する抗体（ＵＭ－８Ｄ６）などが知られている。その中でも、中国で開発された抗ＣＤ１４７マウス抗体ＨＡｂ１８がよく知られている。ＨＡｂ１８のＦ（ａｂ’）フラグメントに放射性元素ヨード１３１（Ｉ－１３１）を標識したＬｉｃａｒｔｉｎ（商標）は肝細胞癌に対する治療薬として中国国内でのみ承認されており、さらにＨＡｂ１８のキメラ化およびＦｃにフコースの付加を欠損させた抗体は、肺細胞株への細胞障害活性が増強された事が報告されている（非特許文献３、４）。
　急性骨髄性白血病の患者での予後（非特許文献５）や、大腸がんのリンパ節への転移（非特許文献６）にＣＤ１４７が大きく関与しているという報告があり、治療のターゲットになりうると推測される。しかし、実際にこれらのがん細胞株を用いた実験でｉｎ　ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を示す抗ＣＤ１４７抗体は報告されていない。
Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　２００５；６５：３１９３－３１９９ Ｋａｔｈｒｙｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ　Ｍｏｌ　Ｐａｔｈｏｌ　２００７；８３：２８３－２９５ Ｚｈｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏ　Ｔｈｅｒ　２００６；５：３１８－３２２ Ｚｈｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒ　２０１５；１４：１６２－１７３ Ｊｕｆａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｐｎ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏ　２０１０；４０：１０４６－１０５２ Ｔａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｐａｔｈｏｌ　２０１４；７：７４３２－７４４１
　本発明は、ヒトＣＤ１４７に特異的に結合するモノクローナル抗体の提供、ＣＤ１４７発現を特徴づけられる多彩な癌種に対する治療への利用を課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、ＣＤ１４７発現癌細胞に対してｉｎ　ｖｉｖｏで優れた抗腫瘍活性を持つ新規抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体、及びそのヒト化抗体の取得に成功し、当該抗体が、既存の抗ＣＤ１４７抗体では試みられていない大腸がんや白血病の細胞株を用いたゼノグラフトマウスモデルにおいて抗腫瘍活性を有することを見出し、本発明を完成した。
　本発明抗ヒトＣＤ１４７モノクローナル抗体は、カニクイザルＣＤ１４７にも反応し、ＣＤ１４７抗原の発現を特徴付けるがん細胞株に対して強い抗腫瘍効果を示すことが判明した。
　すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔１６〕を提供するものである。
〔１〕次のａ～ｃの性質を有する、ヒトＣＤ１４７に対するモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
ａ．ヒトＣＤ１４７発現がん細胞株に対して反応する、
ｂ．カニクイザルＣＤ１４７発現細胞株に対して反応する、
ｃ．ヒトＣＤ１４７発現がん細胞に対してｉｎ　ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示す。
〔２〕重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＹＧＩＳ（配列番号１７）、ＣＤＲ２として配列ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１８）、ＣＤＲ３として配列ＧＲＧＳＹＹＡＦＤＩ（配列番号１９）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡ（配列番号２０）、ＣＤＲ２として配列ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号２１）、ＣＤＲ３として配列ＱＱＹＹＳＴＰＴ（配列番号２２）を有する〔１〕に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
〔３〕重鎖の可変領域に配列番号４のアミノ酸配列と、軽鎖の可変領域に配列番号８のアミノ酸配列を有する〔１〕に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
〔４〕重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＹＧＭＳ（配列番号３５）、ＣＤＲ２として配列ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＱＤＳＩＫＧ（配列番号３６）、ＣＤＲ３として配列ＧＤＷＡＤＹ（配列番号３７）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳ（配列番号３８）、ＣＤＲ２として配列ＲＡＮＲＬＶＡ（配列番号３９）、ＣＤＲ３として配列ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号４０）を有する〔１〕に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
〔５〕重鎖の可変領域に配列番号６のアミノ酸配列と、軽鎖の可変領域に配列番号１０のアミノ酸配列を有する〔１〕に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
〔６〕重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＴＹＷＩＥ（配列番号２９）、ＣＤＲ２として配列ＥＦＬＰＧＳＧＳＴＮＦＮＥＫＦＫＧ（配列番号３０）、ＣＤＲ３として配列ＳＧＧＮＦＧＡＲＦＡＳ（配列番号３１）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＲＳＳＫＳＬＬＳＮＮＧＮＴＹＬＹ（配列番号３２）、ＣＤＲ２として配列ＲＭＳＳＬＡＳ（配列番号３３）、ＣＤＲ３として配列ＭＱＨＬＥＹＰＦＴ（配列番号３４）を有する〔１〕に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
〔７〕重鎖の可変領域に配列番号５のアミノ酸配列と、軽鎖の可変領域に配列番号９のアミノ酸配列を有する〔１〕に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
〔８〕〔２〕～〔７〕のいずれかに記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体の可変領域のＣＤＲ周辺を含むアミノ酸配列と、ヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列とからなる、ヒト化された抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
〔９〕〔８〕に記載の抗体であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせが、１）配列番号１３および１４で示されるアミノ酸配列、または、２）配列番号１５および１６で示されるアミノ酸配列を有する、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
〔１０〕〔２〕～〔９〕いずれかに記載の抗体のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失および付加または挿入され、同一性のレベルが少なくとも９０％以上である〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
〔１１〕〔１〕～〔１０〕いずれかに記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片に、細胞傷害性薬物を結合させたコンジュゲート抗体。
〔１２〕〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片に、放射性同位元素を標識させたコンジュゲート抗体。
〔１３〕〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体、その抗原結合領域を含む断片またはコンジュゲート抗体を有効成分として含む医薬組成物。
〔１４〕〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体、その抗原結合領域を含む断片またはコンジュゲート抗体を有効成分として含むヒトＣＤ１４７抗原の発現を特徴づける腫瘍に対する抗腫瘍剤。
〔１５〕ヒトＣＤ１４７抗原の発現を特徴づける腫瘍を治療するための、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体、その抗原結合領域を含む断片またはコンジュゲート抗体。
〔１６〕ヒトＣＤ１４７抗原の発現を特徴づける腫瘍に対する抗腫瘍剤製造のための、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体、その抗原結合領域を含む断片またはコンジュゲート抗体の使用。
〔１７〕ヒトＣＤ１４７抗原の発現を特徴づける細胞を殺傷するための方法であって、該細胞にヒト細胞表面ＣＤ１４７抗原と特異的に結合する〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体、その抗原結合領域を含む断片またはコンジュゲート抗体を投与することを特徴とする、該抗体またはその抗原結合領域を含む断片がＣＤ１４７に結合することで該細胞を殺傷させる、細胞傷害方法。
〔１８〕ヒトＣＤ１４７抗原の発現により特徴づけられる腫瘍を有する対象者を治療するための方法であって、該対象者に、ヒトＣＤ１４７と特異的に結合する〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体、その抗原結合領域を含む断片またはコンジュゲート抗体を投与することを特徴とする、該抗体又はその抗原結合領域を含む断片のＣＤ１４７への結合により該腫瘍を殺傷させる、腫瘍の治療方法。
　本発明の抗ヒトＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片は、白血病やバーキットリンパ腫、Ｂリンパ腫、肺がん、肝癌、膵臓がん、前立腺がん、大腸がんなどのＣＤ１４７抗原の発現を特徴づけられる腫瘍に対するｉｎ　ｖｉｖｏで強い抗腫瘍効果を示し、多様な癌種への抗がん剤として有用である。
実施例２に係るヒトＣＤ１４７とカニクイザルＣＤ１４７のアミノ酸配列を並列した結果を示す図である。 実施例２に係るヒトＣＤ１４７とマウスＣＤ１４７のアミノ酸配列を並列した結果を示す図である。 実施例６に係るヒトのバーキットリンパ腫の細胞株であるＲａｊｉ細胞とカニクイザルのＨＳＶ不死化Ｔ細胞であるＨＳＣ－Ｆ細胞に対する抗ＣＤ１４７抗体のＦＡＣＳ反応性の結果を示す図である。 実施例７に係る慢性白血病の細胞株であるＫ５６２細胞の担癌マウスモデルでの抗ＣＤ１４７抗体による抗腫瘍効果を示す図である。 実施例８に係る大腸がんの細胞株であるＳＷ４８０細胞の担癌マウスモデルでの抗ＣＤ１４７抗体による抗腫瘍効果を示す図である。 実施例９に係る抗ＣＤ１４７抗体ＨＡｂ１８とＰＰＡＴ－０８２－０３によるＥＬＩＳＡでのＣＤ１４７との反応性を示す図である。 実施例１０に係るＢリンパ腫の細胞株であるＮＣＩ－Ｈ９２９細胞の担癌マウスモデルでの抗ＣＤ１４７抗体による抗腫瘍効果を示す図である。 実施例１１に係るＫ５６２細胞の担癌マウスモデルでの抗ＣＤ１４７抗体による用量依存性の抗腫瘍効果を示す図である。 実施例１２に係る肝癌の細胞株であるＨｅｐＧ２細胞の担癌マウスモデルでの抗ＣＤ１４７抗体による用量依存性の抗腫瘍効果を示す図である。 実施例１３に係る各がん細胞に対するＣＤ１４７抗体によるＡＤＣＣ活性を示す図である。 実施例１４に係る各がん細胞に対する抗ＣＤ１４７抗体によるＣＤＣ活性を示す図である。 実施例１５に係るＨｅｐＧ２細胞の担癌マウスモデルでの抗ＣＤ１４７抗体ＰＰＡＴ－０８２－０３による腫瘍病理切片をＨＥ染色した結果を示す図である。
　以下、この発明の実施の形態について詳細に説明する。
１．定義
　本明細書で使用する用語の定義は以下のとおりである。
　ヒトＣＤ１４７は４つのアイソフォームが同定されている。第１のアイソフォーム（「長いアイソフォーム」または「アイソフォーム１」としてもまた公知である）は、３８５個のアミノ酸の前駆ポリペプチドとして発現され、これは最初の２１残基によって表されるシグナル配列を有する。第２のアイソフォーム（「アイソフォーム２」としてもまた公知である）は、第１のアイソフォームの２３～１３９番目のアミノ酸配列が欠損した２６９個のアミノ酸の前駆ポリペプチドとして発現され、これも最初の２１残基によって表されるシグナル配列を有する。第２アイソフォームはいくつかの正常組織で発現が認められ、多くのがん種で発現の亢進が報告されている。第３のアイソフォームは第１のアイソフォームの１～２０９番目のアミノ酸配列が欠損した１７６個のアミノ酸から成り、第４のアイソフォームは第１のアイソフォームの１～１１番目のアミノ酸配列が異なり、１２～１９１番目のアミノ酸が欠損した２０５個のアミノ酸から形成される。第３と４のアイソフォームの発現はまれに正常細胞や腫瘍細胞で見られる程度である。第１のアイソフォームは網膜に特異的に発現が確認されている。
　本発明では、「ＣＤ１４７抗原」または「ＣＤ１４７」は、主に第２のアイソフォームを包含する。本発明の抗ＣＤ１４７抗体は、本明細書中で以下に示されるようにヒトＣＤ１４７のエピトープに結合し、このヒトＣＤ１４７は、この細胞表面抗原の第１のアイソフォームまたは第２のアイソフォームのいずれかのうちの同じ位置に存在する。また、「ＣＤ１４７」の前に付したものがなければ、「ヒトＣＤ１４７」を意味する。
　ＣＤ１４７抗原は、種々の細胞型の表面に提示される。「発現を特徴付ける」および「発現する」により、ＣＤ１４７抗原のうちのすべてまたは一部が、細胞の外側に曝露されることが意図される。提示または発現されたＣＤ１４７抗原は、完全にまたは部分的にグリコシル化され得る。
　本明細書中で用いる「ＣＤ１４７エピトープ」とは、抗ＣＤ１４７抗体と免疫反応することができる分子（例えば、ペプチド）または該分子の断片を意味し、例えば、モノクローナル抗体により認識されるＣＤ１４７抗原決定基が含まれる。ＣＤ１４７抗原エピトープはタンパク質、タンパク質断片、ペプチドなどに含まれていてよい。エピトープは最も一般的には、タンパク質、短いオリゴペプチド、オリゴペプチド模倣物（すなわち、ＣＤ１４７抗原の抗体結合特性を模倣する有機化合物）、またはそれらの組合せである。
　「抗体」とは、本明細書では、２本の同一の軽（Ｌ）鎖と２本の同一の重（Ｈ）鎖からなる、典型的には約１５０，０００ダルトンの、ヘテロ四量体糖タンパク質として定義される。各軽鎖は１つのジスルフィド結合によって重鎖と共有結合で連結されて、ヘテロ二量体を形成している。そのようなヘテロ二量体の２本の同一の重鎖間のジスルフィド共有結合によってヘテロ四量体が形成される。軽鎖と重鎖は１つのジスルフィド結合によって一緒に連結されるが、２本の重鎖間のジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのアイソタイプにより変化する。それぞれの重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔をあけて配置された鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、アミノ酸の末端に、可変ドメイン（ＶH）、その後に３または４つの定常ドメイン（ＣH１、ＣH２、ＣH３、およびＣH４）を有し、ＣH１とＣH２の間にヒンジ領域が存在する。各軽鎖は２つのドメイン、すなわち、アミノ末端の可変ドメイン（ＶL）とカルボキシ末端の定常ドメイン（ＣL）を有する。ＶLドメインはＶHドメインと非共有結合で会合しており、一方ＣLドメインは通常はジスルフィド結合を介してＣH１ドメインと共有結合で連結されている。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメイン間の界面を形成していると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　ＭｏＩ　Ｂｉｏｌ　１９８５；１８６：６５１－６６３）。
　「可変」とは、可変ドメインの特定の部分が抗体間で広範囲にわたって配列が異なり、その特定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合および特異性に使用される事実をいう。しかし、その可変性は、抗体の可変ドメインの全体にわたって均一に分布しない。可変性は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方で相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる３つのセグメントに集中する。可変ドメインのうち、より高度に保存される部分は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）と呼ばれる。
　「相補性決定領域（ＣＤＲ）」とは、可変ドメイン内のある種の配列が抗体間で配列が大きく異なり、その特異的抗原決定基に対する特定の各抗体の結合および特異性に直接関与するある種の残基を含むということを示す。軽鎖可変ドメインでも重鎖可変ドメインでも、３つのセグメントに集中している。ＣＤＲはＫａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５thＥｄ．Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，１９９３：Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．の配列比較により定義される。Ｋａｂａｔにより定義されているように、ＣＤＲ－Ｌ１は軽鎖可変ドメインの２４～３４残基付近に、ＣＤＲ－Ｌ２は５０～５６残基付近に、そしてＣＤＲ－Ｌ３は８９～９７残基付近に位置し、ＣＤＲ－Ｈ１は重鎖可変ドメインの３１～３５付近、ＣＤＲ－Ｈ２は５０～６５付近、そしてＣＤＲ－Ｈ３は９５～１０２付近に位置する。
　重鎖および軽鎖の各々の３つのＣＤＲは、変動が少ない傾向にある配列を含むフレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられている。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ末端～カルボキシ末端までは、ＦＲとＣＤＲは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４の順で並んでいる。ＦＲの大まかなβ－シート配置は各鎖内のＣＤＲを互いと近接させるととともに、互いのＣＤＲと近接させる。この結果生じた配置は抗原結合部位に寄与するが、全てのＣＤＲ残基が必ずしも直接抗原結合に関与するわけではない。
　ＦＲ残基およびＩｇ定常ドメインは抗原結合には直接関与しないが、抗原結合に寄与し、かつ／または抗体エフェクター機能を媒介する。いくつかのＦＲ残基は、エピトープと直接非共有結合すること、１以上のＣＤＲ残基と相互作用すること、また、重鎖と軽鎖の間の境界に影響を及ぼすことによる、少なくとも３つの方法で抗原結合に有意な作用を持ち得る。定常ドメインは抗原結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）における抗体の関与など、種々のＩｇエフェクター機能を媒介する。
　「抗原結合領域を含む断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合フラグメントまたは可変領域を含む。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａ　ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ　１９９５；８（１０）：１０５７－１０６２）；単鎖抗体分子；ならびに抗原結合フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化により、各々単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合フラグメント（「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる）、および残りの「Ｆｃ」フラグメント（この名称は、容易に結晶化する能力を反映する）が生成される。ペプシン処理により、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが得られ、これは、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原と架橋結合し得る。
　「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗原結合フラグメントである。２本の鎖（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ）のＦｖ種では、この領域は、固く非共有結合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとのダイマーからなる。単鎖のＦｖ種では、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとが、その軽鎖と重鎖とが２本の鎖のＦｖ種における構造に類似する「ダイマーの」構造に会合し得るように、フレキシブルなペプチドリンカーによって共有結合され得る。この構成において、各々の可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶH－ＶLダイマーの表面における抗原結合部位を規定する。合わせて、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でも、抗原を認識し結合する能力を有するが、完全な結合部位よりは親和性は低い。
　任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明らかに異なる型（カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる）の一方に割り当てられ得る。
　それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンが異なるクラスに割り当てられ得る。ヒト免疫グロブリンの５つの主要なクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、そしてこれらの１または数個か、さらにサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２）に分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有する。例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ３アイソタイプは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の活性を媒介する。
　「抗腫瘍効果」は、腫瘍細胞の増殖または生存を阻害する活性を意味する。この腫瘍細胞の増殖または生存の阻害は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、また、ｉｎ　ｖｉｖｏでもよい。例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞の数を減少させる活性、腫瘍細胞の数の増加を阻害する活性、腫瘍細胞の細胞死を引き起こす活性、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性などが挙げられる。ｉｎ　ｖｉｖｏでは腫瘍の重量または体積を減少させる活性、腫瘍の重量または体積の増加を抑制させる活性、他薬剤による腫瘍の重量または体積の減少を促進させる活性、腫瘍細胞による個体死亡を抑制する活性等が挙げられる。溶媒と比較して抗体による効果が、３０％以上の活性、好ましくは５０％以上の活性、より好ましくは８０％以上の活性、さらに好ましくは９０％以上の活性、特に好ましくは９５％以上の活性を有する抗体を挙げることができる。
　Ｉｎ　ｖｉｖｏの動物モデルとしては、ヌードマウス等の免疫不全マウスにヒト癌組織由来の培養細胞株を移植した異種移植モデル、培養マウス癌細胞株を正常な免疫系を有する野生型マウスへ移植した同系移植モデルなどがあげられる。
　異種移植モデルはヌードマウス等の免疫不全マウスの皮下、皮内、腹腔内、静脈内等様々な部位にヒト癌細胞株を移植することにより作製することができる。
　「細胞傷害性薬物」とは、細胞の機能を阻害するまたは妨げ、かつ／または細胞の破壊を生じる物質を指す。この用語は化学療法薬ならびに毒素（細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素）およびそのフラグメントを含むものとする。このような細胞傷害性薬物は、既知の標準的手順を用いて例えばヒト化ＣＤ１４７抗体などの抗体とカップリングさせ、例えば抗体による療法が指示される患者の治療に使用することができる。
　「放射性同位元素」とは、Ｉ131、１125、Ｙ90およびＲｅ186などの放射性核種であり、既知の標準的手順を用いて例えばヒト化ＣＤ１４７抗体などの抗体とカップリングさせ、例えば抗体による療法が指示される患者の治療に使用することができる。
　「ＣＤ１４７の発現をするがん細胞」とは、急性リンパ球性白血病、慢性白血病、リンパ腫（例えば、ホジキン病または非ホジキン病）、多発性骨髄腫、癌腫（例えば、大腸癌、膵臓癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、腎癌、肺癌、または食道癌）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　「ＣＤ１４７関連疾患」とは、喘息、過敏性肺炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、全身性炎症性応答症候群、子宮内膜症、心筋梗塞、動脈硬化症、多発性硬化症、アルツハイマー病、肝臓線維症、神経線維症、ＨＩＶ感染症、髄膜炎、肝炎などが挙げられるが、これらに限定されない。
２．抗体の作製方法
　本発明において、ヒトＣＤ１４７に結合する抗体は当業者に公知の方法により作成することができる。例えば、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＣＤ１４７タンパク質またはＣＤ１４７発現細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって哺乳動物を免疫する。得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞を選択することができる。
　具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。まず、配列番号１または２に示されるＣＤ１４７のアミノ酸配列にしたがってＣＤ１４７タンパク質を取得し、これを抗体取得の感作抗原として使用する。すなわち、ヒトＣＤ１４７をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞の表面上のＣＤ１４７安定発現を作製する、または培養上清中から目的のＣＤ１４７タンパク質を公知の方法で精製する。
　次に、この精製ＣＤ１４７タンパク質やＣＤ１４７安定発現細胞を感作抗原として用いる。あるいは、ＣＤ１４７の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトＣＤ１４７のアミノ酸配列にしたがって化学合成により得ることも可能である。
　感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。
　感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４～２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
　このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
　前記免疫細胞と融合すべき親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｋｅａｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｉｍｍｎｏｌ　１９７９；１２３：１５４８－１５５０）、ＮＳ－１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１９７６；６：５１１－５１９）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　１９７８；２７６：２６９－２７０）等が好適に使用される。
　前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　１９８１；７３：３－４６）等に準じて行うことができる。
　より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１～１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ－１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清補液を併用することもできる。
　細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００～６０００程度）を通常３０～６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
　このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日～数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
　標的とするタンパク質に対する抗体を作製する別の方法として、特許４８７０３４８号に記載されているように、１０００億個もの独立したクローンからなる巨大なヒト抗体ライブラリーを作製し、それを利用した癌細胞及び組織の細胞膜表面に存在するタンパク質（細胞表面抗原）に対する抗体の網羅的取得法がある。スクリーニングの抗原として、精製した細胞外領域を有する可溶性の膜タンパク質を使用することができる。
　スクリーニングは、感作抗原として用いたＣＤ１４７安定発現細胞やＣＤ１４７の発現を特徴付けるがん細胞を用いたＦＡＣＳ解析により、ＣＤ１４７に反応する抗体を選抜することができる。また精製ＣＤ１４７タンパク質を用いたＥＬＩＳＡによっても、ＣＤ１４７に反応する抗体を選抜することができる。本発明における抗体の好ましい態様として治療に用いる抗体の選抜として有望な方法は、ＣＤ１４７の発現を特徴付けるがん細胞を用いたＦＡＣＳ解析である。
　このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
　当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従って培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
３．本発明モノクローナル抗体の性質
　本発明の抗ヒトＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域は、次のａ～ｃの性質を有する。
ａ．ヒトＣＤ１４７発現がん細胞株に対して反応する。
ｂ．カニクイザルＣＤ１４７発現細胞株に対して反応する。
ｃ．ヒトＣＤ１４７発現がん細胞に対してｉｎ　ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示す。
　このようなａ～ｃの性質を有する抗ヒトＣＤ１４７モノクローナル抗体は、従来報告されていない。
　ここで、ヒトＣＤ１４７発現がん細胞株は、前述のＣＤ１４７の発現をするがん細胞と同義である。また、ｉｖ　ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示すとは、ヒトＣＤ１４７発現がん細胞を有する動物（ヒトを含む）に対して抗ヒトＣＤ１４７モノクローナル抗体を投与することにより、抗腫瘍活性、例えば腫瘍重量または腫瘍体積を減少させる作用が得られることを意味する。
４．抗ヒトＣＤ１４７抗体の可変領域のクローニング
　本発明におけるヒトＣＤ１４７に結合する抗体について、可変領域のクローニングは当業者に公知の方法により作成することができる。
　具体的には、抗ヒトＣＤ１４７抗体を産生するハイブリドーマから、抗ヒトＣＤ１４７抗体の可変領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９７９；１８：５２９４－５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９８７；１６２：１５６－１５９）等により行ってｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
　得られたｍＲＮＡから抗体可変領域をコードする遺伝子を増幅させる。抗体可変領域の遺伝子の増幅は、マウスＩｇＧまたはマウスκ鎖の定常領域配列に相補的なオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）等を用いて行うことができる。または、得られたｍＲＮＡから逆転写酵素　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いてｃＤＮＡを合成し、作製したｃＤＮＡを鋳型として、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｐｒｉｍｅｒ等を用いたＰＣＲ法により可変領域をコードする遺伝子を増幅することができる。
　得られたＰＣＲ増幅物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
　ＤＮＡの塩基配列は公開されているＫａｂａｔ　ＤａｔａｂａｓｅやＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）Ｄａｔａｂａｓｅ等により、軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸残基とＣＤＲ等を同定することができる。
　本発明の抗ヒトＣＤ１４７モノクローナル抗体の例としては、次のＰＰＡＴ－０８２－０１、ＰＰＡＴ－０８２－０２及びＰＰＡＴ－０８２－０３が挙げられ、その可変領域は、次のとおりである。
（１）ＰＰＡＴ－０８２－０１
　重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＴＹＷＩＥ（配列番号２９）、ＣＤＲ２として配列ＥＦＬＰＧＳＧＳＴＮＦＮＥＫＦＫＧ（配列番号３０）、ＣＤＲ３として配列ＳＧＧＮＦＧＡＲＦＡＳ（配列番号３１）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＲＳＳＫＳＬＬＳＮＮＧＮＴＹＬＹ（配列番号３２）、ＣＤＲ２として配列ＲＭＳＳＬＡＳ（配列番号３３）、ＣＤＲ３として配列ＭＱＨＬＥＹＰＦＴ（配列番号３４）を有するモノクローナル抗体である。好ましくは、重鎖の可変領域に配列番号５のアミノ酸配列と、軽鎖の可変領域に配列番号９のアミノ酸配列を有するヒト由来のモノクローナル抗体である。
（２）ＰＰＡＴ－０８２－０２
　重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＹＧＭＳ（配列番号３５）、ＣＤＲ２として配列ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＱＤＳＩＫＧ（配列番号３６）、ＣＤＲ３として配列ＧＤＷＡＤＹ（配列番号３７）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳ（配列番号３８）、ＣＤＲ２として配列ＲＡＮＲＬＶＡ（配列番号３９）、ＣＤＲ３として配列ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号４０）を有するモノクローナル抗体である。好ましくは、重鎖の可変領域に配列番号６のアミノ酸と、軽鎖の可変領域に配列番号１０のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体である。
（３）ＰＰＡＴ－０８２－０３
　重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＹＧＩＳ（配列番号１７）、ＣＤＲ２として配列ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１８）、ＣＤＲ３として配列ＧＲＧＳＹＹＡＦＤＩ（配列番号１９）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡ（配列番号２０）、ＣＤＲ２として配列ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号２１）、ＣＤＲ３として配列ＱＱＹＹＳＴＰＴ（配列番号２２）を有するモノクローナル抗体である。好ましくは、重鎖の可変領域に配列番号４のアミノ酸配列と、軽鎖の可変領域に配列番号８のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体である。
　本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片には、前記のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失および付加または挿入され、同一性のレベルが少なくとも９０％以上であるモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片が含まれる。
５．抗ＣＤ１４７抗体のヒト化作製
　本発明において抗体の好ましい態様の一つとして、ヒトＣＤ１４７に結合するヒト抗体やヒト化抗体を挙げることができる。ヒト化抗体は既知の方法を用いて製造することができる。
　ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体のＣＤＲへ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（ＷＯ　９６／０２５７６号公報）。
　具体的には、例えばＣＤＲがマウス抗体由来である場合には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲおよびＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する、または人工的に軽鎖可変領域および重鎖可変領域の遺伝子をコードするＤＮＡを合成することも可能である。
　ＣＤＲと連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するもの等が選択される。必要に応じ、ヒト化抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　１９９３；５３：８５１－８５６）。また、ＣＤＲの一部のアミノ酸をヒト抗体のアミノ酸に置換してもよい。
　ヒト化抗体の定常領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えば重鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、軽鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体の定常領域を修飾してもよい。ヒト化の際に用いられるヒト抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど如何なるアイソタイプのヒト抗体でもよいが、本発明においてはＩｇＧを用いることが好ましく、さらにＩｇＧ１又はＩｇＧ３が好ましく、特にＩｇＧ１が好ましい。ＩｇＧ１は高い細胞傷害活性を有している点で抗体を抗癌剤として利用する場合に有効である（Ｃｌａｒｋ　ＭＲ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１９９７；６５：８８－１１０）。
　なお、ヒト化抗体を作製した後に、可変領域や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。
　さらに、本発明の抗体は細胞傷害活性が増強された抗体でもよい。細胞傷害活性が増強された抗体としては、例えば、フコースが欠損した抗体、糖鎖にバイセクティング（ｂｉｓｅ　ｃｔｉｎｇ）Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が付加した抗体、Ｆｃ領域のアミノ酸を置換することによりＦｃγ受容体との結合活性を変化させた抗体などを挙げることができる。これら細胞傷害活性が増強された抗体は当業者に公知の方法で作製することができる。
　ヒト化抗体におけるＣＤＲの由来は特に限定されず、どのような動物由来でもよい。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体などの配列を用いることが可能であるが、好ましくはマウス抗体のＣＤＲ配列である。
　目的とする抗ＣＤ１４７のヒト化抗体の可変領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望のヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
　本発明で使用される抗ＣＤ１４７抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
　抗体遺伝子の発現は、軽鎖または重鎖をコードするポリヌクレオチドを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいは軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ　９４／１１５２３　号公報）。
　抗体のヒト化において、通常、由来となった抗体の抗原結合活性を維持したままヒト化を行うことは困難であるが、本発明においては、由来となったマウス抗体と同様に抗原結合活性を有するヒト化抗体の取得に成功した。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、治療目的などでヒトに投与する場合に有用である。
　本発明のヒト化された抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片としては、前記の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体（例えば、ＰＰＡＴ－０８２－０１、ＰＰＡＴ－０８２－０２）の可変領域のＣＤＲ周辺を含むアミノ酸配列とヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列とからなるヒト化された抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片が好ましい。
　より具体的には、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせが、１）配列番号１３および１４で示されるアミノ酸配列、または２）配列番号１５および１６で示されるアミノ酸配列を有する、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片がより好ましい。
　なお、これらのヒト化抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片においても、前記のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸配列が置換、欠失および付加され、同一性のレベルが少なくとも９０％以上であるヒト化抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片が含まれる。
６．抗ＣＤ１４７抗体によるＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性測定
　本発明の抗ＣＤ１４７抗体の好ましい態様としては、ＣＤ１４７を発現する細胞に対して高いＡＤＣＣ活性を有する抗体または高いＣＤＣ活性を有する抗体を挙げることができる。
　ヒトＣＤ１４７を発現する細胞としては、例えば、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ　ＨＢ-８０６５)やＰＣ－３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１４３５）などの腫瘍細胞、ヒトＣＤ１４７をコードする遺伝子を組み込まれた細胞などを挙げることができる。
　ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性の測定方法は、当業者に公知の方法により行うことが可能であり、例えば、溶解した細胞から遊離されるラクトースデヒドゲナーゼを測定するＣｙｔｏＴｏｘ９６　Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いることにより行うことが可能である。ＡＤＣＣ活性を測定する際の具体的な条件としては、特に限定されないが、例えば、実施例記載の条件を用いて測定することができる。
　さらに、本発明の抗体は細胞障害活性が増強された抗体でもよい。細胞障害活性が増強された抗体としては、例えば、フコースが欠損した抗体、糖鎖にバイセクティング（bise cting)Ｎ－アセチルグルコサミン(GlcNAc)が付加した抗体、Ｆｃ領域のアミノ酸を置換することによりFcγ受容体との結合活性を変化させた抗体などを挙げることができる。これら細胞障害活性が増強された抗体は当業者に公知の方法で作製することができる。
７．細胞傷害性薬物をコンジュゲートした抗ＣＤ１４７抗体
　本発明の別の実施態様として、抗ＣＤ１４７抗体に細胞傷害性薬物などの各種分子と結合させた、コンジュゲート抗体を挙げることができる。
　本発明で用いられる細胞傷害性薬物の例としては、デュオカルマイシン、デュオカルマイシンのアナログ及び誘導剤、ＣＣ－１０６５、ＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＭＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＣＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ドキソルビシン、ドラスタチン、メイタンシン、メイタンシンアナログ、ＤＭ１，ＤＭ２，ＤＭ３，ＤＭ４、ＤＭＩ、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５－フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、ビンクリスチン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ８－アセチルスペルミジン並びにカンプトセシン等を挙げることができるが、これだけに限定されるわけではない。
　本発明における細胞傷害性薬物をコンジュゲートした抗ＣＤ１４７抗体は、前記の薬物と抗ＣＤ１４７抗体とを結合し、公知の方法により作製できる。抗体と薬物は、それら自身が有する連結基などを介して直接結合されてもよいし、また、リンカーや他の物質を介して間接的に結合されてもよい。
　薬物が直接結合される場合の連結基は、例えばＳＨ基を用いたジスルフィド結合やマレイミドを介する結合が挙げられる。例えば、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合と、薬物のジスルフィド結合を還元して、両者をジスルフィド結合にて結合する。また、マレイミドを介する方法もある。また別の方法として、抗体内にシステインを遺伝子工学的に導入する方法もある。
　抗体と薬物を、他の物質（リンカー）を介して間接的に結合することも可能である。リンカーには、抗体または薬剤または両方と反応する官能基を１または２種類以上有することが望ましい。官能基の例としてはアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、マレイミド基、ピリジニル基等を挙げることができる。
　リンカーの例としては、スルフォスクシイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、γ－マレイミド酪酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）－スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）－ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ－（ｐ－マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボンイル（ＰＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル４（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）及びＮ－スクシンイミジル（４－イオド－アセチル）アミノ安息香酸エステル（ＳＩＡＢ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、このリンカーは例えば、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（Ａｌａ－Ｐｈｅ）のようなペプチドリンカーであってもよいし、上記にあげたリンカーをそれぞれ適宜組み合わせて使用しても良い。
　薬物と抗体との結合方法に関しては、例えば、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ；６８（２２）９２８０（２００８）、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；２６（８）９２５（２００８）、Ｂｉｏ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；１９、１６７３（２００８）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ；６８（１５）６３００（２００８）、又は特表２００８－５１６８９６号公報などに記載の方法に準じて行うことができる。
８．放射性同位元素をコンジュゲートした抗ＣＤ１４７抗体
　本発明の別の実施態様として、抗ＣＤ１４７抗体に放射性同位元素を標識させたコンジュゲート抗体を挙げることができる。抗腫瘍剤として用いる場合には、細胞傷害性放射性金属元素を標識するのが好ましい。このような細胞傷害性放射性金属元素としては、例えばイットリウム９０（９０Ｙ）、レニウム１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム１８８（１８８Ｒｅ）、銅６７（６７Ｃｕ）、鉄５９（５９Ｆｅ）、ストロンチウム８９（８９Ｓｒ）、金１９８（１９８Ａｕ）、水銀２０３（２０３Ｈｇ）、鉛２１２（２１２Ｐｂ）、ジスプロシウム１６５（１６５Ｄｙ）、ルテニウム１０３（１０３Ｒｕ）、ビスマス２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス２１３（２１３Ｂｉ）、ホルミウム１６６（１６６Ｈｏ）、サマリウム１５３（１５３Ｓｍ）、ルテチウム１７７（１７７Ｌｕ）などを挙げることができる。これらの放射性金属元素の中でも、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕが、半減期、放射線エネルギー、容易な標識反応、標識率、錯体の安定性等の点から好ましい。
　これらの放射性金属元素を抗ＣＤ１４７抗体に結合させるには、該抗体に金属キレート試薬を反応させ、これに放射性金属元素を反応させて錯体とするのが好ましい。このようにして得られたコンジュゲート抗体は、放射性金属元素が金属キレート試薬を介して抗ＣＤ１４７抗体に結合している。
　このような錯体形成に用いられる金属キレート試薬の例としては、例えば（１）８－ヒドロキシキノリン、８－アセトキシキノリン、８－ヒドロキシキナルジン、キノリン骨格を有するキノロン系化合物であるノルフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン等のキノリン誘導体；（２）クロラニル酸、アルミノン、チオ尿素、テトラフェニルアルソニウムクロライド等の化合物；（３）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびこれらに類似した骨格を有するジヒドロキシエチルグリシン、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸塩酸塩、イソチオシアノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、マレイミドプロピルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＤＴＰＡ；（４）１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ等を挙げることができるが、これだけに限定されるわけではない。
　これらの金属キレート試薬のうち、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡが金属キレートの容易な抗体への導入反応、標識率、錯体の安定性等の点で好ましい。
　抗ＣＤ１４７抗体への放射性金属元素の結合は、常法に従って行うことができる。例えば抗ＣＤ１４７抗体に金属キレート試薬を反応させ、予め標識前駆体を調製しておき、次いで放射性金属元素を反応させることにより行うことができる。
９．医薬組成物
　前記の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体、コンジュゲート抗体またはその抗原結合領域を含む断片は、ＣＤ１４７の発現を特徴づける腫瘍や疾患に対する医薬組成物の有効成分として有用である。
　このような医薬組成物は、好ましくは、前記抗体等に加えて、生理学的に許容され得る希釈剤またはキャリアを含んでおり、他の抗体または抗生物質のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。投与経路は、経口ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または配薬を含む非経腸的ルートである。
　この場合、本発明の抗体の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得るキャリアとの組合せとして投与される有効量は、１回につき体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ～１００ｍｇであり、２日から８週間間隔で投与される。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に技術的範囲が限定されるものではない。
実施例１
　実施例１に係る抗原の作製を説明する。ヒトＣＤ１４７の第２のアイソフォームであるアミノ酸情報（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９４０９９１．１）のアミノ酸残基２２－２０７番目までの細胞外ドメインのＣＤ１４７のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする遺伝子とそれに続く８ｘＨｉｓタグをコードする遺伝子を設計し、人工的に合成した。カニクイザルＣＤ１４７のアミノ酸情報（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号　ＥＨＨ５９００１．１）を参照にして、ヒトＣＤ１４７のアミノ酸残基２２－２０７番目に相当する細胞外ドメインのカニクイザルＣＤ１４７アミノ酸配列（配列番号２）をコードする遺伝子＋８ｘＨｉｓを設計し、人工的に合成した。これらの合成遺伝子をそれぞれｐＣＸＮ３ベクターに挿入して、ヒトまたはカニクイザルＣＤ１４７発現ベクターを作製した。発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ－２９３Ｆ細胞（ｉｎ　ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に一過性トランスフェクションした。その後１週間のフラスコ培養をして、その培養上清をサンプルとしＨｉｓ－Ｔｒａｐ　ＨＰカラム（ＧＥ社）に通すことにより精製し、各種の細胞外ドメインＣＤ１４７－Ｈｉｓ蛋白質はＰＢＳに置換した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび抗Ｈｉｓ　ｔａｇ抗体（キアゲン社）を使ったウエスタンブロティング法により、細胞外ドメインＣＤ１４７－Ｈｉｓが精製されたことを確認した。
実施例２
　実施例２に係るマウス免疫による抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体の作製を説明する。ヒトとカニクイザルまたはマウスの細胞外ドメインＣＤ１４７（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号　ＮＰ＿００１０７０６５２．１参照）との相同性は図１と図２に示すようにヒトとカニクイザル間では７８％と高く、ヒトとマウス間では４７％であり高くない。従って、ヒトまたはカニクイザルの細胞外ドメインＣＤ１４７－Ｈｉｓをマウスに免疫することでヒトまたはカニクニザル、または両種のＣＤ１４７に対する抗体が得られると考えられる。ヒトとカニクイザルＣＤ１４７の両方を認識するモノクローナル抗体を取得するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫動物として、６～８週齢より免疫を開始した。
　初回免疫では、細胞外ドメインＣＤ１４７－Ｈｉｓは５０μｇ／ｈｅａｄと百日咳毒素　１００ｎｇ／ｈｅａｄおよびフロイト完全アジュバントまたはＴｉｔｅｒ　Ｍａｘでエマルジョン化したものを腹腔内に投与した。２週間後に、ＣＤ１４７－Ｈｉｓ　２５μｇ／ｈｅａｄをフロイト不完全アジュバントまたはＴｉｔｅｒ　Ｍａｘでエマルジョン化したもので追加免疫した。細胞融合を行う３日前に、ＰＢＳ中の細胞外ドメインＣＤ１４７－Ｈｉｓ　２５μｇ／ｈｅａｄで最終免疫を施した。
　細胞融合は脾臓細胞を摘出し、マウスミエローマＰ３－Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１を混合し、ＰＥＧ１５００（ロッシュ・ダイアグノティック社）を用いて使用説明書に従って実施した。ＲＰＭＩ１６４０培地を加えＰＥＧ１５００を希釈し、遠心操作によりＰＥＧ１５００を除去した。細胞ペレットを慎重に１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地にて懸濁したものを１００μＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレートに播種し、一晩培養した。翌日、１０％ＦＢＳ／１ｘ　ＨＡＴ　ｍｅｄｉａ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ／１ｘ　ＢＭ－ｃｏｎｄｉｍｅｄ　Ｈ１　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＨＡＴ培地）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。融合日から２、４日後に培養液の半分を新しいＨＡＴ培地に交換し、８日後にその培養上清を用いて、スクリーニングを実施した。
　スクリーニングは細胞外ドメインＣＤ１４７－Ｈｉｓを固相したＥＬＩＳＡを行った。ヒトまたはサルの細胞外ドメインＣＤ１４７－ＨｉｓをＰＢＳで２．０μｇ／ｍＬになるようにそれぞれ調製し、Ｃｏｓｔａｒ　Ｐｌａｔｅ（ＣＯＲＮＩＮＧ）５０μＬ／ｗｅｌｌに添加し、４℃で通夜静置した。翌朝、抗原液を捨て、ブロッキング液（４０％　Ｂｌｏｃｋ　Ａｃｅ／ＴＢＳ）１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除き、ＰＢＳ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０により洗浄し、ブロッキング液で５倍または５０倍希釈したハイブリドーマｗｅｌｌの培養上清を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０で５回洗浄後、１０％　Ｂｌｏｃｋ　Ａｃｅ／ＴＢＳで５０００倍希釈したＨＲＰ標識　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０で５回洗浄後、ＴＭＢ試薬を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し室温で５分間反応させた。２ＮＨ2ＳＯ4を５０μＬ／ｗｅｌｌ加え、発色反応を停止した。その後、Ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒにて４５０ｎｍ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅとして６２０ｎｍ）の吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳで検討した結果、多数の陽性ハイブリドーマｗｅｌｌを得た。
　陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した。最終的に細胞表面上のＣＤ１４７との反応できるモノクローナル抗体を選定するために、ヒトＣＤ１４７に関しては前立腺がんの細胞株であるＰＣ－３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１４３５）とバーキットリンパ腫の細胞株であるＲａｊｉ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－８６）を、カニクイザルＣＤ１４７に関してはＨＳＶ不死化Ｔ細胞であるＨＳＣ－Ｆ（ＪＣＲＢ細胞バンクＪＣＲＢ１１６４）によるＦＡＣＳ解析を行った。その結果、両ＣＤ１４７に強く反応する２つの陽性クローンＰＰＡＴ－０８２－０１とＰＰＡＴ－０８２－０２を取得した。
　なお、本実施例を含め以下のいずれの実施例中、並びに実施例における試験結果として示した表または図中においては、各々の本発明のヒト抗ヒトＣＤ１４７モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンは記号を用いて命名した。また、当該記号の次に「抗体」を付したものは、それぞれのハイブリドーマにより産生される抗体、または当該ハイブリドーマから単離された抗体遺伝子を保持する宿主細胞により生産された組換え抗体を意味する。また文脈上明らかな範囲において、ハイブリドーマクローンの名称が抗体の名称をあらわす場合がある。
実施例３
　実施例３に係る抗ヒトＣＤ１４７抗体の可変領域のクローニングを説明する。培養した２つの陽性ハイブリドーマから調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡを鋳型として、のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIII  Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて添付説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。重鎖可変領域の増幅は、重鎖シグナル配列をコードする核酸の縮重配列を含むフォワードプライマーと重鎖定常領域特異的なリバースプライマーを用いてＥｘＴａｇ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）によりｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲした。軽鎖可変領域の増幅は、軽鎖シグナル配列をコードする核酸の縮重配列を含むフォワードプライマーと軽鎖定常領域特異的なリバースプライマーを用いてＥｘＴａｇ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによりｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲした。増幅したＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、アガロースゲル電気泳動のシングルバンドから精製した後、ｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙベクター（プロメガ社）へクローニングして塩基配列の決定を行い、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸残基およびＣＤＲを同定した。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸残基と各ＣＤＲ配列を、表１（重鎖）と表２（軽鎖）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例４
　実施例４に係るヒト抗体ファージライブラリーによる抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体の作製を説明する。まずはＣＤ１４７を強く発現しているがん細胞を利用して、ＣＤ１４７に結合するファージ抗体の１ｓｔスクリーニングを実施した。ＣＤ１４７強発現である膵臓癌細胞株であるＭＩＡｐａｃａ－２（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１４２０）を任意の方法で培養した。その後細胞を回収し、冷却したＰＢＳで洗浄した後、１×１０13ｃｆｕのヒト抗体ファージライブラリー（特開２００５－１８５２８１号公報、ＷＯ２００８／００７６４８号公報、ＷＯ２００６／０９０７５０号公報を参照）を混ぜ、最終容積１．６ｍＬになるように反応液（１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3、ＭＥＭ）を添加し、４℃にて４時間ゆっくり回転させて反応させた。反応終了後、反応液を二つに分け、それぞれ事前に用意した０．６ｍＬの有機溶液（ｄｉｂｕｔｙｌ　ｐｈｔｈａｌａｔｅ　ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ９：１）に重層し、マイクロ遠心機により２分間遠心（３０００ｒｐｍ）した。上清を捨て、チューブの底に沈降した細胞を０．７ｍＬの１％ＢＳＡ／ＭＥＭで懸濁し、更に０．７ｍＬの有機溶媒に重層した。同じように遠心により上清を捨て、細胞を０．３ｍＬのＰＢＳで懸濁し、液体窒素で凍結した。
　凍結した細胞を３７℃で融解し、これをＯＤ　０．５の大腸菌ＤＨ１２Ｓ　２０ｍＬに１時間感染させ、その一部をアンピシリンプレートに蒔いて回収されたファージのｔｉｔｅｒを算出した。ファージ感染大腸菌は６００ｍＬの２ｘＹＴＧＡ培地（２ｘＹＴ，２００μｇ／ｍＬ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ｓｕｌｆａｔｅ，１％　ｇｌｕｃｏｓｅ）にて３０℃で通夜培養した。この通夜培養１０ｍＬを２ｘＹＴＡ培地（２ｘＹＴ，２００μｇ／ｍＬ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ｓｕｌｆａｔｅ）２００ｍＬと混ぜ、３７℃にて１．５時間培養後ヘルパーファージＫＯ７を１ｘ１０11入れ、３７℃にて１時間培養したのち、８００ｍＬの２ｘＹＴＧＡＫ（２ｘＹＴ，２００μｇ／ｍＬ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ｓｕｌｆａｔｅ，０．０５％　ｇｌｕｃｏｓｅ，　５０μｇ／ｍＬ　ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を入れて３０℃にて通夜培養した。これを８０００ｒｐｍにて１０分間遠心して上清１Ｌを調製、それに２００ｍＬのＰＥＧ液（２０％　ｐｏｌｙｅｔｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ　６０００，２．５Ｍ　ＮａＣｌ）を混ぜてよくかきまぜたのち、８０００ｒｐｍ　１０分間の遠心を行うことでファージを沈殿させた。これを１０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、その一部を使用して大腸菌感染数を調べた。これが１ｓｔスクリーニングのファージである。
　次に、ヒトＣＤ１４７の細胞外ドメイン抗原を用いて２ｎｄスクリーニングを行った。
　ＰＢＳで５０μｇ／ｍＬになるように抗原を調製し、Ｉｍｍｕｎｏ　Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐ　Ｐｌａｔｅｓ（ＮＵＮＫ）に１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で通夜静置した。その後、抗原液を捨て、ブロッキング液（５％　スキムミルク／　ＰＢＳ）２００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、３７℃で２時間ブロッキングを行った。
　次にブロッキング液を除いたＩｍｍｕｎｏ　Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐ　Ｐｌａｔｅｓ　に５％　スキムミルク／　ＰＢＳ　で調製した１×１０10の１ｓｔスクリーニングファージを混合し、２時間室温で反応させた。
　反応終了後、ＰＢＳにて１０回洗浄し、０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ　ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を１００μＬ／ｗｅｌｌに添加してファージを回収した。回収したファージはＯＤ０．５の大腸菌ＤＨ１２Ｓ　２０ｍＬに１時間感染させ１ｓｔスクリーニング時と同様にファージの調製を行い、これを２ｎｄスクリーニングファージとした。
　３ｒｄスクリーニングでは、カニクイザルＣＤ１４７細胞外ドメイン抗原と２ｎｄスクリーニングのファージを使用し、上記２ｎｄスクリーニングと同じ工程を行った。さらにもう一度カニクイザルＣＤ１４７細胞外ドメイン抗原を用いた４ｔｈスクリーニングとして、一連の操作を繰り返した。
　最終的な陽性ファージクローンは、ＣＤ１４７抗原を用いたＥＬＩＳＡによる抗原抗体の反応性から選定した。すなわち、ヒトまたはカニクイザルの細胞外ドメインＣＤ１４７－ＨｉｓをＰＢＳで１０μｇ／ｍＬになるようにそれぞれ調製し、Ｉｍｍｕｎｏ　Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐ　Ｐｌａｔｅｓ（ＮＵＮＫ）に５０μＬ／ｗｅｌｌに添加し、３７℃で２時間静置した。その後、抗原液を捨て、ブロッキング液（５％　スキムミルク／ＰＢＳ）　２００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除き、ＰＢＳにより洗浄し、上記４ｔｈスクリーニングより調製した培養上清を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した１μｇ／ｍＬ　Ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－ｃｐ３抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、更にＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２０００倍希釈したＨＲＰ標識ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＯＰＤ　ｉｎ　０．１Ｍクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ５．１）＋０．０１％Ｈ2Ｏ2　を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し室温で５分間反応させた。２ＮＨ2ＳＯ4を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、発色反応を停止した。その後、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果からヒトおよびカニクイザル細胞外ドメインＣＤ１４７抗原の両タンパク質に陽性反応を示すファージクローンを選別し、そのＤＮＡ配列を解析した。それぞれのＣＤＲ配列を確認し、独立配列を有するものを分類した結果、ヒト抗体１つ　ＰＰＡＴ－０８２－０３を取得できた。また特許５３８２６９２号に記載の抗ＣＤ１４７モノクローナルヒト抗体の配列（配列番号１７７および１８１）を参考にしてＰＰＡＴ－０８２－０４を作製した。その２つのヒト抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸残基と各ＣＤＲ配列を、表１（重鎖）と表２（軽鎖）に示す。但し、ＰＰＡＴ－０８２－０４の軽鎖はλ鎖のため、その定常領域も含めて表２に示す。
実施例５
　実施例５に係る抗ＣＤ１４７ヒト化抗体の作製を説明する。ＩＭＧＴより公開されているヒト抗体の配列データを入手し、軽鎖可変領域、重鎖可変領域に分けてコンセンサス配列を同定した。その結果の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１１、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１２に示す。これらのヒト抗体コンセンサス配列のフレームワーク領域のアミノ酸残基を参照として、抗体ＰＰＡＴ－０８２－０１と０２は、重鎖および軽鎖の各ＣＤＲを中心としてアミノ酸残基を移植し、下記の１）と２）に示すヒト化抗体を設計した。
　１）ｈＰＰＡＴ－０８２－０１
　２）ｈＰＰＡＴ－０８２－０２
　設計したそれぞれのヒト化抗体について、それぞれの重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例６
　実施例６に係る抗ヒトＣＤ１４７抗体のキメラ抗体とヒト抗体の調製方法を説明する。マウス免疫から取得した抗体ＰＰＡＴ－０８２－０１とＰＰＡＴ－０８２－０２、ファージからの抗体ＰＰＡＴ－０８２－０３とＰＰＡＴ－０８２－０４のそれぞれの軽鎖と重鎖の可変領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子を人工的に合成した。ヒトＩｇＧ１由来の定常領域の遺伝子が組み込まれたｐＣＸＮ３ベクターに重鎖可変領域の遺伝子を、ヒトκ鎖由来の定常領域の遺伝子が組み込まれたｐＣＸＮ３ベクターに軽鎖可変領域の遺伝子をそれぞれ挿入した発現ベクターを作製した。ＰＰＡＴ－０８２－０４の軽鎖のアミノ酸配列をコードする遺伝子に関しては、可変領域の遺伝子の後にヒトλ鎖由来の定常領域の遺伝子を人工的に合成した遺伝子をｐＣＸＮ３ベクターに挿入した発現ベクターを作製した。重鎖可変領域と軽鎖可変領域の遺伝子をそれぞれ組み込んだ発現ベクターを同時にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ－２９３Ｆ細胞（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入して、マウス－ヒトのキメラ抗体とヒト抗体を産生させた。マウス抗体であるＰＰＡＴ－０８２－０１とＰＰＡＴ－０８２－０２の可変領域を含むマウス－ヒトのキメラ抗体は、ｃＰＰＡＴ－０８２－０１とｃＰＰＡＴ－０８２－０２とそれぞれ命名する。産生したそれぞれの抗体は、培養上清中に分泌されているのでＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇカラムで精製し、さらに陰イオンカラムまたはゲル濾過カラムにより精製し、ＰＢＳに置換した。精製した２つのキメラ抗体と２つヒト抗体は、実施例２のように、ＦＡＣＳ解析よりヒトとカニクイザルＣＤ１４７と反応性を確認した。その結果を示す図３のように、ｃＰＰＡＴ－０８２－０１とｃＰＰＡＴ－０８２－０２のマウス－ヒトのキメラ抗体とＰＰＡＴ－０８２－０３のヒト抗体はＨＳＣ－ＦとＲａｊｉ細胞に濃度依存的に結合したが、ＰＰＡＴ－０８２－０４のヒト抗体はＨＳＣ－Ｆとは反応しなかった。従って、作製したすべての抗体は元の抗体と同じ特性、少なくともＣＤ１４７抗原との反応を継承している事が分かった。
実施例７
　実施例７に係る抗ＣＤ１４７抗体による慢性骨髄性白血病の細胞株であるＫ５６２移植モデルにおける抗腫瘍効果を説明する。生後６週齢のＣ．Ｂ．１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄＪｃ１マウス（日本クレア）に、Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－４３２）をマウス１匹当たり５×１０6個で、ＭａｔｒｉＧｅｌ（ＢＤ社）とＲＰＭＩ１６４０（比率１対１）の溶液中で腹側部皮下へ注射した。腫瘍体積が平均２３０ｍｍ3に達した日に、ＰＢＳに溶解したｃＰＰＡＴ－０８２－０１、ｃＰＰＡＴ－０８２－０２、ＰＰＡＴ－０８２－０３、またはＰＰＡＴ－０８２－０４を静脈注射した。投与量は抗ＣＤ１４７抗体をマウス１匹当たり１５ｍｇ／ｋｇをそれぞれ５個体のマウスに週２回で５回投与した。比較として、抗体を含まないＰＢＳを静脈注射した。経過日時と腫瘍体積（平均値）関係を図４に示す。ＰＢＳ投与群は日を追って腫瘍体積が増加したが、抗ＣＤ１４７抗体１５ｍｇ／ｋｇを投与された群すべては５匹すべて腫瘍体積は初回抗体投与時からあまり変化していない、もしくは減少を示した。従って、抗ＣＤ１４７抗体投与において抗腫瘍効果が確認された。
実施例８
　実施例８に係る抗ＣＤ１４７抗体による大腸がんの細胞株であるＳＷ４８０移植モデルにおける抗腫瘍効果を説明する。生後６週齢のＣ．Ｂ．１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄＪｃ１マウス（日本クレア）に、ＳＷ４８０細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－２８０）をマウス１匹当たり５×１０6個で、ＲＰＭＩ１６４０の溶液中で腹側部皮下へ注射した。腫瘍体積が平均２７０ｍｍ3に達した日に、ｃＰＰＡＴ－０８２－０１、ｃＰＰＡＴ－０８２－０２、ＰＰＡＴ－０８２－０３、またはＰＰＡＴ－０８２－０４の抗ＣＤ１４７抗体を静脈注射した。投与量は抗ＣＤ１４７抗体をマウス１匹当たり１５ｍｇ／ｋｇをそれぞれ５個体のマウスに週２回で５回投与した。比較として、抗体を含まないＰＢＳを静脈注射した。経過日時と腫瘍体積（平均値）関係を図５に示す。抗ＣＤ１４７抗体１５ｍｇ／ｋｇを投与された群では５匹すべてにおいて、ＰＢＳ投与群より腫瘍体積の増加度合は遅延しており、抗ＣＤ１４７抗体は抗腫瘍効果があることが確認された。
実施例９
　実施例９に係る対象抗体ＨＡｂ１８の作製およびＣＤ１４７との反応性の確認を説明する。ＨＡｂ１８の名称としてＣＤ１４７抗体が知られており、その抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントに放射性Ｉ－１３１標識した肝がんの治療薬（Ｌｉｃａｒｔｉｎ）が中国国内のみで承認されている。未標識でのＨＡｂ１８との薬効を比較するために、特表２００６－５２５９４６に記載されている遺伝子配列情報から、実施例６と同様に重鎖と軽鎖の可変領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子を人工的に合成し、抗体を作製し、精製した。その重鎖（配列番号４１）と軽鎖（配列番号４２）の可変領域のアミノ酸配列を表４に示す。また精製したＨＡｂ１８は、実施例２で記載したように細胞外ドメインのヒトＣＤ１４７-ＨｉｓまたはカニクイザルＣＤ１４７-Ｈｉｓを固相したＥＬＩＳＡにてＣＤ１４７との反応性を確認した。その結果の図６に示したように、ＨＡｂ１８はヒトＣＤ１４７との反応が認められたが、カニクイザルＣＤ１４７との反応は認められなかった。このことから、ＨＡｂ１８はＰＰＡＴ－０８２－０４以外の抗体とはエピトープが異なる事が示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例１０
　実施例１０に係る抗ＣＤ１４７抗体によるＢリンパ腫の細胞株であるＮＣＩ－Ｈ９２９移植モデルにおける抗腫瘍効果を説明する。生後６週齢のＣ．Ｂ．１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄＪｃ１マウスに、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－９０６８）をマウス１匹当たり５×１０6個で、ＭａｔｒｉＧｅｌ（ＢＤ社）とＲＰＭＩ１６４０（比率１対１）の溶液中で腹側部皮下へ注射した。腫瘍体積が平均１４１ｍｍ3に達した日に、ＨＡｂ-１８、またはＰＰＡＴ－０８２－０３の抗ＣＤ１４７抗体を静脈注射した。投与量は抗ＣＤ１４７抗体をマウス１匹当たり１５ｍｇ／ｋｇをそれぞれ３個体のマウスに週１回で４回投与した。比較として、抗体を含まないＰＢＳを静脈注射した。経過日時と腫瘍体積（平均値）関係を図７に示す。２つの抗ＣＤ１４７抗体１５ｍｇ／ｋｇを投与された群では３匹すべてにおいて、ＰＢＳ投与群より腫瘍体積の増加度合は遅延しており、抗ＣＤ１４７抗体は抗腫瘍効果があることが確認された。ＰＰＡＴ－０８２－０３とＨＡｂ１８との抗腫瘍効果は同等程度であった。
実施例１１
　実施例１１に係るＫ５６２移植モデルにおける抗腫瘍効果の抗ＣＤ１４７抗体の用量依存性を説明する。生後８週齢のＣ．Ｂ．１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄＪｃ１マウスに、Ｋ５６２細胞をマウス１匹当たり５×１０6個で、ＭａｔｒｉＧｅｌとＲＰＭＩ１６４０（比率１対１）の溶液中で腹側部皮下へ注射した。腫瘍体積が平均１１７ｍｍ3に達した日に、ＰＰＡＴ－０８２－０３の抗ＣＤ１４７抗体を静脈注射した。投与量は抗ＣＤ１４７抗体をマウス１匹当たり０．１２、０．６、３ｍｇ／ｋｇの３種の濃度でそれぞれ５個体のマウスに週１回で４回投与した。比較として、ＨＡｂ-１８を０．６ｍｇ／ｋｇと、抗体を含まないＰＢＳを静脈注射した。経過日時と腫瘍体積（平均値）関係を図８に示す。ＰＰＡＴ－０８２－０３の３ｍｇ／ｋｇを投与された群では腫瘍がほぼ消失し、その後の経過観察でも再発は認められなかった。０．６ｍｇ／ｋｇを投与されたＰＰＡＴ－０８２－０３とＨＡｂ１８の抗腫瘍効果は同等程度であり、腫瘍体積の減少が見られ、その後の経過観察では再発の兆しが認められた。０．１２ｍｇ／ｋｇを投与されたＰＰＡＴ－０８２－０３では、ＰＢＳ投与群とほぼ変わらず、抗腫瘍効果を認める事ができなかった。
実施例１２
　実施例１２に係る肝癌の細胞株であるＨｅｐＧ２移植モデルにおける抗腫瘍効果の抗ＣＤ１４７抗体の用量依存性を説明する。生後８週齢のＣ．Ｂ．１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄＪｃ１マウスに、ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ　ＨＢ－８０６５）をマウス１匹当たり８×１０6個で、ＲＰＭＩ１６４０の溶液中で腹側部皮下へ注射した。腫瘍体積が平均１１０ｍｍ3に達した日に、ＰＰＡＴ－０８２－０３の抗ＣＤ１４７抗体を静脈注射した。投与量は抗ＣＤ１４７抗体をマウス１匹当たり０．２、１、５ｍｇ／ｋｇをそれぞれ５個体のマウスに週１回で４回投与した。比較として、ＨＡｂ-１８を１ｍｇ／ｋｇと、抗体を含まないＰＢＳを静脈注射した。経過日時と腫瘍体積（平均値）関係を図９に示す。抗ＣＤ１４７抗体のＰＰＡＴ－０８２－０３を５ｍｇ／ｋｇと１ｍｇ／ｋｇをそれぞれ投与された群、およびＨＡｂ１８　１ｍｇ／ｋｇを投与された群において、腫瘍体積が早期に減少しており、投与３回目（３４日目）時にはほぼ消失しており、その後の長期の経過観察でも再発が認められなかった。抗ＣＤ１４７抗体は抗腫瘍効果があることが確認された。1ｍｇ／ｋｇ投与のＰＰＡＴ－０８２－０３とＨＡｂ１８との抗腫瘍効果は同等程度であった。ＰＰＡＴ－０８２－０３　０．２ｍｇ／ｋｇ投与群は、ＰＢＳ投与群よりも腫瘍体積の増加度合は遅延しており、この濃度においてもＰＰＡＴ－０８２－０３の抗ＣＤ１４７抗体は抗腫瘍効果があることが確認された。
実施例１３
　実施例１３に係るＡＤＣＣ活性の測定を説明する。
組み換えヒトＣＤ１６安定発現ＫＨＹＧ－１の調製
　ＩＬ－２存在下ＲＰＭＩ１６４０培地中でナチュラルキラー様細胞株であるＫＨＹＧ-1（ＪＣＲＢ細胞バンク　ＪＣＲＢ０１５６）にヒトＣＤ１６を安定発現した細胞株をエフェクター細胞として培養した。使用直前に細胞を回収し、２．５％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０（フェノールレッドなし）培地に懸濁した。
マウス骨髄細胞溶液の調製
　ＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿骨を無菌的に回収し大腿骨の中に存在する骨髄細胞を、２５Ｇ注射針を用いてＲＰＭＩ１６４０培地で採取した。これを４０μmフィルターに通した後に遠心（５００ｘＧ、５分間、２０℃）して、細胞を２．０ｘ１０6細胞/ｍＬにＩＬ－２とＧＭ－ＣＳＦを含む１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地中に調製し、６日間培養することでｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌに分化させた。使用直前にセルクレーパーで細胞を剥がし回収し、２．５％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０（フェノールレッドなし）培地に懸濁した。
標的細胞の調製
　培養したＨｅｐＧ２、ＳＷ４８０、ＰＣ－３細胞を、トリプシン-ＥＤＴＡ(Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ社)を用いてディッシュから剥離し、表５のように９６ウェルＵ字底プレート(Ｔｈｅｒｍｏ社)の各ウェルに分注し、1日間培養した。測定する翌日に、２．５％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０（フェノールレッドなし）培地 １５０ｕＬ／ｗｅｌｌで洗浄した後、４０ｕＬ／ｗｅｌｌを加えた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
ＡＤＣＣ測定（ＬＤＨ法）
　ＡＤＣＣ活性のｋｉｔ試薬は、ＣｙｔｏＴｏｘ９６　Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、添付手順書に従って実施した。具体的には、各細胞株にＣＤ１４７抗体ｃＰＰＡＴ－０８２－０１，－０２，ＰＰＡＴ－０８２－０３またはＨＡｂ１８を最終濃度が ０．００４、０．０１６，０．２５，１，４ｕｇ／ｍＬになるように、それぞれ２５ｕＬ／ｗｅｌｌで加え、その上にヒトＣＤ１６安定発現ＫＨＹＧ－１細胞株のｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌを表５のように ２５ｕＬ／ｗｅｌｌで加え、５％ＣＯ２中、３７℃で４時間培養した。
　また、マウス移植モデルでの抗腫瘍効果の機序としてのＡＤＣＣ活性を調査するために、表５のように、ＨｅｐＧ２細胞に対してマウス骨髄細胞由来のｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌ　２５ｕＬ／ｗｅｌｌを加え、さらにＣＤ１４７抗体ｃＰＰＡＴ－０８２－０１，－０２，ＰＰＡＴ－０８２－０３またはＨＡｂ１８を最終濃度が０．０３、０．３、３ｕｇ／ｍＬになるように、それぞれ２５ｕＬ／ｗｅｌｌで加えて同様に培養した。
　培養終了予定の３０分前に、ｍａｘｉｍｕｍ　ｗｅｌｌにｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒを添加した。培養４時間後、２５０ｘｇ ４分間の遠心で上清５０ｕＬのみ回収し新しいプレートを移し、基質液 ５０ｕＬ／ｗｅｌｌを添加して室温　３０分間遮光して放置した。ストップ液 ５０ｕＬ／ｗｅｌｌを添加し、Ａ４９２を測定し(Ａ６２０はレファレンスとして測定)、％細胞毒性を求めた。
　　　　％細胞毒性＝（Ａ－Ｂ－Ｃ）／（Ｄ－Ｃ）ｘ１００
　Ａは抗体とｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌの両方を添加したｗｅｌｌのＡ４９２値、Ｂは標的細胞なしで抗体とｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌの両方を添加したｗｅｌｌのＡ４９２値（ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌのバックグラウンド）、Ｃは抗体とｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌの両方を添加しなかったｗｅｌｌのＡ４９２値（標的細胞のバックグラウンド）、Ｄは１００％ＬＤＨの放出を表すｍａｘｉｍｕｍ　ｗｅｌｌのＡ４９２値を示す。またＡ，Ｂ，Ｃ，ＤのＡ４９２値は、細胞なしの培地のみのバックグランドＡ４９２値を差し引いている。試験は二重に行い、ＡＤＣＣ活性（％）について平均値を算出した。
　その結果を図１０に示す。どのＣＤ１４７抗体もＨｅｐＧ２やＳＷ４８０、ＰＣ－３に対してＡＤＣＣ活性を示したが、ｃＰＰＡＴ－０８２－０１は、他の３つの抗体より活性は低かった。マウス骨髄細胞をエフェクター細胞とした時もすべての抗体はＨｅｐＧ２に対してＡＤＣＣ活性を認めた。このことからマウスＨｅｐＧ２移植モデルでの抗腫瘍効果には、ＡＤＣＣ活性が関与している事が分かった。
実施例１４
　実施例１４に係るＣＤＣ活性の測定を説明する。
標的細胞の調製
　培養したＨｅｐＧ２、肺がんの細胞株であるＰＣ-９（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ　ＲＣＢ４４５５）、ＰＣ－３を、トリプシン-ＥＤＴＡ(Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ社)を用いてディッシュから剥離し、表６のように９６ウェルＵ字底プレート(Ｔｈｅｒｍｏ社)の各ウェルに分注し、1日間培養した。測定する翌日に、２．５％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０（フェノールレッドなし）培地 １５０ｕＬ／ｗｅｌｌで洗浄した後、５０ｕＬ／ｗｅｌｌを加えた。Ｋ５６２細胞は測定する当日に、表６のｃｅｌｌ数でｗｅｌｌに加えて、２．５％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０（フェノールレッドなし）培地 １５０ｕＬ／ｗｅｌｌで洗浄した後、５０ｕＬ／ｗｅｌｌを加えた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
ＣＤＣ測定（ＬＤＨ法）
　ＣＤＣ活性のｋｉｔ試薬は、ＡＤＣＣ活性と同様にＣｙｔｏＴｏｘ９６　Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、添付手順書に従って実施した。具体的には、各細胞株にＣＤ１４７抗体ｃＰＰＡＴ－０８２－０１，－０２，ＰＰＡＴ－０８２－０３またはＨＡｂ１８を最終濃度が ０．１、１，１０ｕｇ／ｍＬになるように、それぞれ２５ｕＬ／ｗｅｌｌで加え、その上に補体（Ｂａｂｙ　ｒａｂｂｉｔ　ｓｅｒｕｍ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ社）を最終希釈倍率が表６のようになるように調製した溶液を ２５ｕＬ／ｗｅｌｌで加え、５％ＣＯ２中、３７℃で２時間培養した。
　培養終了予定の３０分前に、ｍａｘｉｍｕｍ　ｗｅｌｌにｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒを添加した。培養４時間後、２５０ｘｇ ４分間の遠心で上清５０ｕＬのみ回収し新しいプレートを移し、基質液 ５０ｕＬ／ｗｅｌｌを添加して室温　３０分間遮光して放置した。ストップ液 ５０ｕＬ／ｗｅｌｌを添加し、Ａ４９２を測定し(Ａ６２０はレファレンスとして測定)、％細胞毒性を実施例１１５と同じ計算式で求めた。
　その結果を図１１に示す。ＣＤ１４７抗体ｃＰＰＡＴ－０８２－０１は、どの細胞株に対してもＣＤＣ活性は認められなかった。ＨｅｐＧ２やＰＣ－３に対して、ｃＰＰＡＴ－０８２－０２やＨＡｂ１８Ｇは弱いＣＤＣ活性を、ＰＰＡＴ－０８２－０３はそれ以上のＣＤＣ活性を示した。Ｋ５６２とＰＣ－９に対しては、ＰＰＡＴ－０８２－０３のみＣＤＣ活性を認めた。以上の事から、ＰＰＡＴ－０８２－０３はＨＡｂ１８Ｇや他の抗体よりも優れたＣＤＣ活性を有している事が分かった。
実施例１５
　実施例１５に係る抗ＣＤ１４７抗体のＰＰＡＴ－０８２－０３によるＨｅｐＧ２移植モデルにおける腫瘍の病理所見を説明する。生後８週齢のＣ．Ｂ．１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄＪｃ１マウスに、ＨｅｐＧ２細胞をマウス１匹当たり８×１０6個で、ＲＰＭＩ１６４０の溶液中で腹側部皮下へ注射した。腫瘍体積が平均１４７ｍｍ3に達した日に、ＰＰＡＴ－０８２－０３の抗ＣＤ１４７抗体５ｍｇ／ｋｇで静脈注射した。抗体投与前、投与後６、１８、３０、４８、７２、９６時間後のＨｅｐＧ２の腫瘍を採取して、ＨＥ染色を実施した。その結果の一部を図１２に示し、まとめを表７に示す。ＰＰＡＴ－０８２－０３の投与によって、分葉状形態のＨｅｐＧ２の腫瘍は増殖が抑えられて、かつアポトーシスや好中球やマクロファージの浸潤が認められた。その後９６時間後には腫瘍体積自体の減少が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　本発明の抗体は、抗腫瘍剤として利用することができる。

Claims (18)

  1. 　次のａ～ｃの性質を有する、ヒトＣＤ１４７に対するモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
    ａ．ヒトＣＤ１４７発現がん細胞株に対して反応する、
    ｂ．カニクイザルＣＤ１４７発現細胞株に対して反応する、
    ｃ．ヒトＣＤ１４７発現がん細胞に対してｉｎ　ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示す。
  2. 　重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＹＧＩＳ（配列番号１７）、ＣＤＲ２として配列ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１８）、ＣＤＲ３として配列ＧＲＧＳＹＹＡＦＤＩ（配列番号１９）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡ（配列番号２０）、ＣＤＲ２として配列ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号２１）、ＣＤＲ３として配列ＱＱＹＹＳＴＰＴ（配列番号２２）を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
  3. 　重鎖の可変領域に配列番号４のアミノ酸配列と、軽鎖の可変領域に配列番号８のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
  4. 　重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＹＧＭＳ（配列番号３５）、ＣＤＲ２として配列ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＱＤＳＩＫＧ（配列番号３６）、ＣＤＲ３として配列ＧＤＷＡＤＹ（配列番号３７）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳ（配列番号３８）、ＣＤＲ２として配列ＲＡＮＲＬＶＡ（配列番号３９）、ＣＤＲ３として配列ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号４０）を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
  5. 　重鎖の可変領域に配列番号６のアミノ酸配列と、軽鎖の可変領域に配列番号１０のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
  6. 　重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＴＹＷＩＥ（配列番号２９）、ＣＤＲ２として配列ＥＦＬＰＧＳＧＳＴＮＦＮＥＫＦＫＧ（配列番号３０）、ＣＤＲ３として配列ＳＧＧＮＦＧＡＲＦＡＳ（配列番号３１）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＲＳＳＫＳＬＬＳＮＮＧＮＴＹＬＹ（配列番号３２）、ＣＤＲ２として配列ＲＭＳＳＬＡＳ（配列番号３３）、ＣＤＲ３として配列ＭＱＨＬＥＹＰＦＴ（配列番号３４）を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
  7. 　重鎖の可変領域に配列番号５のアミノ酸配列と、軽鎖の可変領域に配列番号９のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
  8. 　請求項２～７のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体の可変領域のＣＤＲ周辺を含むアミノ酸配列と、ヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列とからなる、ヒト化された抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
  9. 　請求項８に記載の抗体であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせが、１）配列番号１３および１４で示されるアミノ酸配列、または、２）配列番号１５および１６で示されるアミノ酸配列を有する、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
  10. 　請求項２～９のいずれか１項に記載の抗体のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失および付加または挿入され、同一性のレベルが少なくとも９０％以上である請求項１～９のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片に、細胞傷害性薬物を結合させたコンジュゲート抗体。
  12. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片に、放射性同位元素を標識させたコンジュゲート抗体。
  13. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体、その抗原結合領域を含む断片またはコンジュゲート抗体を有効成分として含む医薬組成物。
  14. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体、その抗原結合領域を含む断片またはコンジュゲート抗体を有効成分として含むヒトＣＤ１４７抗原の発現を特徴づける腫瘍に対する抗腫瘍剤。
  15. 　ヒトＣＤ１４７抗原の発現を特徴づける腫瘍を治療するための、請求項１～１２のいずれかに記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体、その抗原結合領域を含む断片またはコンジュゲート抗体。
  16. 　ヒトＣＤ１４７抗原の発現を特徴づける腫瘍に対する抗腫瘍剤製造のための、請求項１～１２のいずれかに記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体、その抗原結合領域を含む断片またはコンジュゲート抗体の使用。
  17. 　ヒトＣＤ１４７抗原の発現を特徴づける細胞を殺傷するための方法であって、該細胞にヒト細胞表面ＣＤ１４７抗原と特異的に結合する請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体、その抗原結合領域を含む断片またはコンジュゲート抗体を投与することを特徴とする、該抗体またはその抗原結合領域を含む断片がＣＤ１４７に結合することで該細胞を殺傷させる、細胞傷害方法。
  18. 　ヒトＣＤ１４７抗原の発現により特徴づけられる腫瘍を有する対象者を治療するための方法であって、該対象者に、ヒトＣＤ１４７と特異的に結合する請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＣＤ１４７モノクローナル抗体、その抗原結合領域を含む断片またはコンジュゲート抗体を投与することを特徴とする、該抗体又はその抗原結合領域を含む断片のＣＤ１４７への結合により該腫瘍を殺傷させる、腫瘍の治療方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019022187A1 (ja) 2017-07-27 2019-01-31 第一三共株式会社 抗ｃｄ１４７抗体
RU2785293C2 (ru) * 2017-07-27 2022-12-06 Дайити Санкио Компани, Лимитед Антитело против cd147

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002505097A (ja) * 1998-03-03 2002-02-19 アブジェニックス インク． 治療薬としてのｃｄ１４７結合分子
JP2012506369A (ja) * 2008-09-29 2012-03-15 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｃｄ１４７抗体、方法及び使用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002505097A (ja) * 1998-03-03 2002-02-19 アブジェニックス インク． 治療薬としてのｃｄ１４７結合分子
JP2012506369A (ja) * 2008-09-29 2012-03-15 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｃｄ１４７抗体、方法及び使用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOCH, CHRISTIAN ET AL.: "T cell activation-associated epitopes of CD 147 in regulation of the T cell response, and their definition by antibody affinity and antigen density", INTERNATIONAL IMMUNOLOGY, vol. 11, no. 5, 1 May 1999 (1999-05-01), pages 777 - 786, XP055373859 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019022187A1 (ja) 2017-07-27 2019-01-31 第一三共株式会社 抗ｃｄ１４７抗体
KR20200032185A (ko) 2017-07-27 2020-03-25 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 cd147 항체
US11459387B2 (en) 2017-07-27 2022-10-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-CD147 antibody
RU2785293C2 (ru) * 2017-07-27 2022-12-06 Дайити Санкио Компани, Лимитед Антитело против cd147
US11661451B2 (en) 2017-07-27 2023-05-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-CD147 antibody

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