JP6847434B2 - 抗ポドプラニン抗体 - Google Patents
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Description
ポドプラニンは、脳腫瘍、中皮腫、精巣腫瘍、卵巣がん、及び各種扁平上皮がん(口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺がん、皮膚がん、子宮頸がん)などに高発現していることが知られている。したがって、抗ポドプラニン抗体は、ポドプラニンが高発現しているがん(腫瘍)において抗がん作用(抗腫瘍活性)を示すことが期待される。そのため、ポドプラニンに対する特異性や親和性がより高い抗体や、ポドプラニンを認識する新規抗体などが求められている。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔1〕
配列番号:1で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列におけるThr85を含む領域にエピトープを有し、Thr85はシアル酸含有O型糖鎖が付加されている、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
〔2〕
配列番号:1で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列における78番目から85番目の領域(IRIEDLPT)にエピトープを有する、〔1〕に記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
〔3−1〕
以下の6つのCDRのアミノ酸配列を少なくとも1つ有するか、
以下の6つのCDRのアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を少なくとも1つ有するか、
以下の6つのCDRのアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を少なくとも1つ有する、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント:
重鎖CDR1:GFTFSNAAMY(配列番号:2)
重鎖CDR2:RIRSKPNNYATYYTDSVKG(配列番号:3)
重鎖CDR3:TVGGNNYAAAY(配列番号:4)
軽鎖CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLE(配列番号:5)
軽鎖CDR2:KVSNRFS(配列番号:6)
軽鎖CDR3:FQVTHDPFT(配列番号:7)。
〔3−2〕
以下の6つのCDRのアミノ酸配列を少なくとも1つ有するか、
以下の6つのCDRのアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を少なくとも1つ有するか、
以下の6つのCDRのアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を少なくとも1つ有する、〔1〕又は〔2〕に記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント:
重鎖CDR1:GFTFSNAAMY(配列番号:2)
重鎖CDR2:RIRSKPNNYATYYTDSVKG(配列番号:3)
重鎖CDR3:TVGGNNYAAAY(配列番号:4)
軽鎖CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLE(配列番号:5)
軽鎖CDR2:KVSNRFS(配列番号:6)
軽鎖CDR3:FQVTHDPFT(配列番号:7)。
〔4−1〕
配列番号:8又は10で表されるアミノ酸配列を含む重鎖;
配列番号:8又は10で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖;
配列番号:8又は10で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖;
配列番号:9又は11で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖;
配列番号:9又は11で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖;又は、
配列番号:9又は11で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、
を含む、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
〔4−2〕
配列番号:8又は10で表されるアミノ酸配列を含む重鎖;
配列番号:8又は10で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖;
配列番号:8又は10で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖;
配列番号:9又は11で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖;
配列番号:9又は11で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖;又は、
配列番号:9又は11で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、
を含む、〔1〕から〔3−2〕のいずれかにがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
〔5〕
Fc領域に1以上のN型糖鎖が結合し、該N型糖鎖の還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない、〔1〕から〔4−2〕のいずれかに記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
〔6〕
〔3〕又は〔4〕に記載のアミノ酸配列のいずれか1つをコードする核酸。
〔7〕
〔6〕に記載の核酸を含む発現ベクター。
〔8〕
〔7〕に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
〔9〕
〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む医薬組成物。
〔10〕
抗がん活性を有する物質を結合させた〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む医薬組成物。
〔11〕
腫瘍の予防又は治療剤である、〔9〕又は〔10〕に記載の医薬組成物。
〔12〕
配列番号:1で表されるアミノ酸配列を有し、Thr85にシアル酸含有O型糖鎖が付加されている、ヒトポドプラニン。
〔13〕
以下のアミノ酸配列を有し、
IRIEDLPT(配列番号:12)
Thrにシアル酸含有O型糖鎖が付加されている、糖ペプチド。
本発明によれば、医薬、診断薬及び試薬として有用な、新規な抗ポドプラニン抗体を提供することができる。
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、配列番号:1で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列におけるThr85を含む領域にエピトープを有し、Thr85はシアル酸含有O型糖鎖が付加されている、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体である。O型糖鎖は、O−結合型糖鎖ともいう。
可変領域のうち、直接抗原と接触する領域は特に変化が大きく、相補性決定領域(complementarity−determining region:CDR)と呼ばれる。CDR以外の比較的変異の少ない部分をフレームワーク(framework region:FR)と呼ぶ。軽鎖と重鎖の可変領域には、それぞれ3つのCDR(重鎖CDR1〜3、及び軽鎖CDR1〜3)が存在する。
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリなどの非ヒト動物を免疫して作製したものであってもよいし、組換え抗体であってもよく、キメラ型抗体(キメラ抗体)、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体などであってもよい。キメラ型抗体(キメラ抗体)とは、異なる種に由来する抗体の断片が連結された抗体をいう。
「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体に特徴的なアミノ酸配列で、ヒト抗体の対応する位置を置換した抗体を意味し、例えば、マウス又はラットを免疫して作製した抗体の重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれ4つのフレームワーク領域(FR)を含むその他のすべての領域がヒト抗体に由来する抗体などが挙げられる。かかる抗体は、CDR移植抗体と呼ばれる場合もある。用語「ヒト化抗体」は、ヒト型キメラ抗体を含む場合もある。
ヒトポドプラニンのアミノ酸配列における78番目から85番目の領域(78−IRIEDLPT−85)にエピトープを有する本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、ペプチドと糖鎖の両方をエピトープに含んで認識する抗体である。
78−IRIEDLPT−85で表されるアミノ酸配列は、配列番号:1で表されるヒトポドプラニンにおける78番目から85番目のアミノ酸に相当する。そして、Tは、配列番号:1のアミノ酸配列における85位のスレオニン(Thr85)に相当する。
本発明においては、抗ポドプラニン抗体のエピトープである、Thrにシアル酸含有O型糖鎖が付加されているIRIEDLPT(配列番号:12)で表される糖ペプチドも提供する。また、本発明は、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を有し、Thr85にシアル酸含有O型糖鎖が付加されている、ヒトポドプラニンを提供する。
重鎖CDR1:GFTFSNAAMY(配列番号:2)
重鎖CDR2:RIRSKPNNYATYYTDSVKG(配列番号:3)
重鎖CDR3:TVGGNNYAAAY(配列番号:4)
軽鎖CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLE(配列番号:5)
軽鎖CDR2:KVSNRFS(配列番号:6)
軽鎖CDR3:FQVTHDPFT(配列番号:7)
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、配列番号:1で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列におけるThr85を含む領域にエピトープを有し、Thr85はシアル酸含有O型糖鎖が付加されている、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体であって、上記6つのCFRの少なくとも1つを有することが好ましい。当該抗ポドプラニン抗体は、、配列番号:1で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列における78番目から85番目の領域(78−IRIEDLPT−85)であって、85位のスレオニンにシアル酸含有O型糖鎖が付加されているヒトポドプラニンの糖ペプチド部分にエピトープを有することがより好ましい。
本発明に係る抗ポドプラニン抗体が、6つのCDRを含む場合、当該抗ポドプラニン抗体は、配列番号:2〜4で表される重鎖CDR1〜3及び配列番号:5〜7で表される軽鎖CDR1〜3を有する。
非天然アミノ酸としては、例えば、主鎖の構造が天然型と異なる、α,α−二置換アミノ酸(α−メチルアラニン等)、N−アルキル−α−アミノ酸、D−アミノ酸、β−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸(ノルロイシン、ホモヒスチジン等)、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸(「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジン等)、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸(システイン酸等)などが挙げられるが、これらに限定されない。
アミノ酸の欠失、置換又は付加の位置は、CDRとしての機能が保持される限り、アミノ酸が欠失、置換又は付加されるCDR配列のどこであってもよい。
同一性は80%以上であって、CDRとしての機能を保持する限り特に限定されないが、例えば85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、99%以上とすることができる。
本明細書において、配列番号:2〜7のいずれかで表されるアミノ酸配列と「80%以上の同一性を有する」とは、配列番号:2〜7のいずれかで表されるアミノ酸配列と変異した配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列を比較して、一致が最大になるようにアライメントしたときに、共通するアミノ酸残基の数が、配列番号:2〜7のいずれかで表されるアミノ酸配列のアミノ酸数の80%以上であることを意味する。
配列番号:8又は10で表されるアミノ酸配列を含む重鎖;
配列番号:8又は10で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖;又は、
配列番号:8又は10で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含むことが好ましい。
配列番号:8で表されるアミノ酸配列は、chPMab−117のキメラ型抗体の重鎖のアミノ酸配列であり、配列番号:10で表されるアミノ酸配列は、chPMab−117−mG2aのキメラ型抗体の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号:9又は11で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖;
配列番号:9又は11で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖;又は、
配列番号:9又は11で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含むことが好ましい。
配列番号:9で表されるアミノ酸配列は、chPMab−117のキメラ型抗体の軽鎖のアミノ酸配列であり、配列番号:11で表されるアミノ酸配列は、chPMab−117−mG2aのキメラ型抗体の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号:8で表されるアミノ酸配列を含む重鎖;及び
配列番号:9で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖;を含むことがより好ましく、
配列番号:8で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖;及び
配列番号:9で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖;を含んでいてもよく、
配列番号:8で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖;及び
配列番号:9で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖;を含んでいてもよい。
配列番号:10で表されるアミノ酸配列を含む重鎖;及び
配列番号:11で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖;を含むことがより好ましく、
配列番号:10で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖;及び
配列番号:11で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖;を含んでいてもよく、
配列番号:10で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖;及び
配列番号:11で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖;を含んでいてもよい。
例えばIgG抗体のFc領域には、N型糖鎖の結合部位が2ヶ所存在し、この部位に複合型糖鎖が結合している。N型糖鎖とは、Asn−X−Ser/Thr配列のAsnに結合する糖鎖をいい、Asnに結合した共通した構造Man3GlcNAc2(−Asn)を有する。非還元末端の2つのマンノース(Man)に結合する糖鎖の種類により、高マンノース型、混成型、及び複合型などに分類される。
N型糖鎖の還元末端のN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)にはフコースが結合し得るが、フコースが結合していない場合、結合している場合に比較してADCC活性が著しく上昇することが知られている。このことは例えば、国際公開第2002/031140号に記載されており、その開示は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
ADCC活性が著しく向上することにより、抗体を医薬として用いる場合に投与量を少なくすることができるので、副作用を軽減させることが可能であると共に、治療費も低減させることができる。
本明細書において、「抗がん活性を有する物質」とは、腫瘍サイズの低下(遅延又は停止)、腫瘍の転移の阻害、腫瘍増殖の阻害(遅延又は停止)、及びがんと関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも1つを生じさせる物質を意味する。具体的には、毒素、抗がん剤、ラジオアイソトープなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、本発明に係る抗ポドプラニン抗体をコードする核酸も包含する。核酸は、天然の核酸であっても人工の核酸であってもよく、例えば、DNA、RNA、DNAとRNAのキメラが挙げられるが、これらに限定されない。抗ポドプラニン抗体をコードする核酸の塩基配列は、当業者が公知の方法又はそれに準ずる方法に従って決定することができ、公知の方法又はそれに準ずる方法で調製することができる。
以下の6つのCDRのアミノ酸配列、
以下の6つのCDRのアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列、
以下の6つのCDRのアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
重鎖CDR1:GFTFSNAAMY(配列番号:2)
重鎖CDR2:RIRSKPNNYATYYTDSVKG(配列番号:3)
重鎖CDR3:TVGGNNYAAAY(配列番号:4)
軽鎖CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLE(配列番号:5)
軽鎖CDR2:KVSNRFS(配列番号:6)
軽鎖CDR3:FQVTHDPFT(配列番号:7)
配列番号:8又は10で表されるアミノ酸配列
配列番号:8又は10で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列
配列番号:8又は10で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
配列番号:9又は11で表されるアミノ酸配列
配列番号:9又は11で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列、又は、
配列番号:9又は11で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸であってよい。
chPMab−117及びchPMab117−mG2aのCDRのそれぞれをコードする核酸は、配列番号:13〜16のいずれかで表されるDNA配列に含まれている。
本発明は、本発明に係る核酸を含む発現ベクターも包含する。発現ベクターは、使用する宿主細胞にあわせて適宜選択することができ、例えば、プラスミド、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、カリフラワーモザイクウイルスベクターやタバコモザイクウイルスベクター等の植物ウイルスベクター、コスミド、YAC、EBV由来エピソームなどが挙げられる。これらの発現ベクターには、公知の方法(制限酵素を利用する方法など)で、本発明に係る核酸を挿入することができる。
本発明は、本発明に係るベクターを含む形質転換体を包含する。形質転換体は、本発明に係るベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトすることによって得ることができる。宿主細胞としては、例えば、哺乳類細胞(CHO細胞、COS細胞、ミエローマ細胞、HeLa細胞、Vero細胞等)、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞(サッカロミセス属、アスペルギルス属等)といった真核細胞や、大腸菌(E.Coli)、枯草菌等の原核細胞などを用いることができる。
本発明に係る抗ポドプラニン抗体の製造方法は限定されないが、例えば、抗ポドプラニンモノクローナル抗体は、ポドプラニン又はその断片で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞などと融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、抗ポドプラニンポリクローナル抗体は、ポドプラニン又はその断片で免疫した動物の血清から得ることができる。また、本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、非ヒト動物を免疫する際、Thr85に結合する糖鎖以外の糖鎖を付加したポドプラニンを用いてもよい。
本発明に係る抗ポドプラニン抗体の製造方法において用いられるポドプラニン又はその断片は、配列番号:1で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列におけるThr85を含む領域を有し、Thr85はシアル酸含有O型糖鎖が付加されている。好ましくは、配列番号:1で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列における78番目から85番目の領域(IRIEDLPT)を有し、Thr85はシアル酸含有O型糖鎖が付加されている。
単離精製方法としては、例えば、プロテインA等を用いたアフィニティーカラム、その他のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析などが挙げられ、これらを適宜組み合わせることができる。
ここで、「複数の抗体」としては、動物を抗原タンパク質又はその部分ペプチドで免疫することによって得たものを用いてもよいし、ファージディスプレイ法によって作製した抗体ライブラリ又は抗体フラグメントライブラリを用いてもよい。ファージディスプレイ法によるライブラリを用いる場合、エピトープ配列を含むペプチドを固相担体に固定しパニングを繰り返すことによって、同エピトープに特異的に結合する抗体を得ることもできる。
ヒト型キメラ抗体の場合、マウス抗体を産生するハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素によりcDNAを合成し、重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(LH)をPCRでクローニングして配列を解析する。次に、一致率の高い抗体塩基配列から、リーダー配列を含む5’プライマーを作製し、5’プライマーと可変部3’プライマーによって上記cDNAから、シグナル配列から可変領域の3’末端までをPCRでクローニングする。一方で、ヒトIgG1の重鎖及び軽鎖の定常領域をクローニングし、重鎖と軽鎖それぞれについて、マウス抗体由来可変領域と、ヒト抗体由来定常領域とをPCRによるOverlapping Hanging法で連結し、増幅する。得られたDNAを適当なベクターに挿入し、これを形質転換して、ヒト型キメラ抗体を得ることができる。
元の配列において、1又は2個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列からなるCDRや、元の配列に80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるCDRは、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、チェーンシャフリング法、CDRウォーキング法などの公知の方法を用いて作製され得る。
これらの方法により、ファージディスプレイ法によってCDRに種々の変異を有する抗体又は抗体断片をファージ表面に提示させ、抗原を使用してスクリーニングすることにより、より親和性が成熟したCDRを得られることが当業者によく知られている(例えば、Wu et al.,PNAS,95:6037−6042(1998);Schier,R. et al.,J.Mol.Bio.263:551−567(1996);Schier,R. et al.,J.Mol.Biol.255:28−43(1996);Yang,W.P. et al.,J.Mol.Biol.,254:392−403(1995)。)。本発明は、このような方法で成熟させたCDRを含む抗体も包含する。
具体的には、例えば、本発明に係る抗ポドプラニン抗体をコードするDNAを含むベクターを用いて、GDP−フコースの合成に関与する酵素の活性、又はα−1,6−フコシルトランスフェラーゼの活性が低下又は欠失した細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養した後、目的とする抗ポドプラニン抗体を精製することによって得ることができる。
GDP−フコースの合成に関与する酵素としては、例えば、GDP−mannose 4,6−dehydratase(GMP)、GDP−keto−6−deoxymannose 3,5−epimerase,4−reductase(Fx)、GDP−beta−L−fucose pyrophosphorylase(GFPP)が挙げられる。
ここで、細胞は特に限定されないが、哺乳動物細胞が好ましく、例えば上記酵素活性を低下又は欠失されたCHO細胞を用いることができる。
上記方法によって得られる抗体組成物は、還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合している抗体を含む場合もあるが、フコースが結合している抗体の割合は、抗体全体の20重量%以下、好ましくは10重量%以下、さらに好ましくは5重量%以下、最も好ましくは3重量%以下である。
この方法によって得られる抗体組成物も、還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合している抗体を含む場合もあるが、フコースが結合している抗体の割合は、抗体全体の20重量%以下、好ましくは10重量%以下、さらに好ましくは5重量%以下、最も好ましくは3重量%以下である。
抗体医薬の薬効メカニズムは、抗体が有する2つの生物活性に基づいている。1つは標的抗原特異的な結合活性であり、結合することによって標的抗原分子の機能を中和する活性である。標的抗原分子の機能の中和はFab領域を介して発揮される。
本発明に係る抗ポドプラニン抗体の活性は、以下の方法で測定することができる。
抗体の結合活性は公知の方法、例えば、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)、蛍光抗体法、FACS法などで、測定することができる。
ADCC活性とは、標的細胞の細胞表面抗原に本発明に係る抗ポドプラニン抗体が結合した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞(エフェクター細胞)がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
ADCC活性は、ポドプラニンを発現している標的細胞とエフェクター細胞と本発明に係る抗ポドプラニン抗体を混合し、ADCCの程度を測定することによって知ることができる。エフェクター細胞としては、例えば、マウス脾細胞、ヒト末梢血や骨髄から分離した単球核を利用することができる。標的細胞としては、例えばポドプラニン陽性中皮腫細胞やポドプラニン陽性膠芽腫細胞を用いることができる。標的細胞をあらかじめ51Crなどで標識し、これに本発明に係る抗ポドプラニン抗体を加えてインキュベーションし、その後標的細胞に対して適切な比のエフェクター細胞を加えてインキュベーションを行う。インキュベーション後、上清を採取し、上清中の上記標識をカウントすることにより、測定することが可能である。
CDC活性とは、補体系による細胞障害活性を意味する。
CDC活性は、ADCC活性の試験において、エフェクター細胞に代えて補体を用いることにより測定することができる。
腫瘍増殖抑制活性は、腫瘍モデル動物を利用して測定することができる。例えば、マウスの皮下に腫瘍を移植し、本発明に係る抗ポドプラニン抗体を投与する。非投与群と投与群における腫瘍組織の体積を比較することにより、腫瘍増殖抑制効果を測定することができる。
なお、腫瘍増殖抑制活性は、個々の細胞の増殖を抑制する結果生じるものであっても、細胞死を誘導する結果生じるものであってもよい。
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、ポドプラニンを発現する腫瘍の予防又は治療に用いてもよい。本発明に係る医薬組成物は、本発明に係る抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含み、さらに薬学的に許容できる担体や添加物を含む。
ポドプラニンが関連する腫瘍としては、脳腫瘍、中皮腫、精巣腫瘍、卵巣がん、及び扁平上皮がんなどが挙げられる。ここで、扁平上皮がんには、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺がん、皮膚がん、子宮頸がんが含まれるがこれらに限定されない。
本明細書において、治療有効量とは、治療する疾患の一つ又は複数の症状が、それによりある程度緩和される作用物質の量を意味する。抗がん剤の場合、腫瘍サイズの低下;腫瘍の転移の阻害(遅延又は停止);腫瘍増殖の阻害(遅延又は停止)、及びがんと関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも1つを示す量を意味する。
具体的には、本発明に係る抗ポドプラニン抗体の投与量は、例えば、0.025〜50mg/kg、好ましくは0.1〜50mg/kgであり、より好ましくは0.1〜25mg/kg、さらに好ましくは0.1〜10mg/kg又は0.1〜3mg/kgとすることができるが、これに限定されない。
ポドプラニンは特定の腫瘍細胞において高発現している。本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、がん、特に脳腫瘍、中皮腫、精巣腫瘍、卵巣がん、及び各種扁平上皮がん(口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺がん、皮膚がん、子宮頸がん)などポドプラニンが高発現するがんの診断に有用である。本発明に係る抗ポドプラニン抗体が腫瘍細胞特異的に結合するので、診断に特に有用である。
本発明は、本発明に係る抗ポドプラニン抗体を含むがんの診断薬、がんの診断のための本発明に係る抗ポドプラニン抗体の使用、本発明に係る抗ポドプラニン抗体を用いるがんの診断方法をも包含する。
また、本明細書において、本発明に係る抗ポドプラニン抗体として記載している内容は、本発明に係る抗ポドプラニン抗体を本発明に係る抗ポドプラニン抗体の抗原結合フラグメントと読み換えて理解することができる。
ラットに合計4回(10日間に1回)、LN229/hPDPN細胞を1x108個ずつ免疫した。ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)法により、がん細胞株から精製したリコンビナントタンパク質に反応する抗体をスクリーニングした。
選択されたがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体を、PMab-117(rat IgM, kappa)と名付けた。
LN229/hPDPN細胞を静置培養し、合計10 g回収する。0.5% Triton/PBS溶液を10 mL添加し、氷上で細胞をピペッティングにより可溶化した。可溶化した溶液を15,000 rpm, 30分遠心した。上清をanti-FLAG抗体(M2)のアフィニティーカラム(シグマアルドリッチ社)1 mLに加え、4℃で18時間反応させた。10 mLのPBSで3回洗浄し、0.1 mg/mLのFLAG peptide(シグマアルドリッチ社)を1 mLずつ添加し、カラムに吸着したリコンビナントタンパク質を溶出させた。OD280で吸光度を測定し、溶出したフラクションを濃縮し、最終濃度を0.1 mg/mLに調整した。
精製したポドプラニン1 mg/mLを96 well plate(Nunc MaxiSorp; サーモフィッシャー社)に37℃で30分固相化し、SuperBlock/PBST(サーモフィッシャー社)を用いて、37℃で30分ブロッキングを行った。同様に、マウスハイブリドーマ由来の培養上清、anti-rat IgG-HRP (ダコ社)を37℃30分の条件で順次反応させ、TMB-Ultra(サーモフィッシャー社)で発色させた。マイクロプレートリーダー(バイオラッド社)を用いて、吸光度の測定(OD655nm)を行った。
抗ポドプラニン抗体(PMab-117;rat IgM, kappa)のポドプラニン発現株に対する反応性をフローサイトメトリーにて調べた。まず、ヒトポドプラニンを発現した各種細胞株に、PMab-117(培養上清)を4℃で30分反応させ、さらに抗rat IgG-Oregon Green抗体(サーモフィッシャー社)を4℃で30分反応させた。ネガティブコントロールとして二次抗体のみを用いた。
蛍光強度をEC800(Sony社)で測定した。結果を図2に示す。
PMab-117は、膠芽腫(LN319)や肺がん(PC-10)などのがん細胞上のポドプラニンに高反応性を示したが、腎上皮細胞(HEK-293T)には全く反応しなかった。一方、抗ポドプラニン抗体のNZ-1抗体は、LN319やPC-10だけでなく、HEK-293Tにも高い反応性を示した。この結果から、PMab-117はがん細胞特異的であることが示された。
抗ポドプラニン抗体(PMab-117;rat IgM, kappa)のハイブリドーマ細胞1×106個からQIAGEN RNeasy mini kit(キアゲン社)を使用してトータルRNAを抽出した。トータルRNA 1μgからSuperScript III First-Strand Syntheses kit(サーモフィッシャー社)を使用してcDNA合成を行った。以下の実験では、cDNAを鋳型として使用した。
ヒトキメラ型PMab-117(chPMab-117)を作製するために、PMab-117のVH領域をコードするDNAをPCRで増幅し、ヒトIgG1のCH1、ヒンジ領域、CH2、CH3領域をコードするDNAを保持したpCAGベクターに組み込んだ(pCAG-CHhG1/PMab-117HVH(G418))。また、PMab-117のVL領域をコードするDNAをPCRで増幅し、ヒトkappa鎖のCK領域をコードするDNAを保持したpCAGベクターに組み込んだ(pCAG-hIgCKb/PMab-117LVL(zeocin))。
H鎖の増幅に以下のプライマーを使用した。
InF.HindIII-chP117H:CGGTATCGAT AAGCTTAGTA TGTTGGTGCT GCAG(配列番号:17)
InFr.chP117HVH-BamHI:GGCCCTTGGT GGATCCTGAA GAGACAGTGA CCAG(配列番号:18)
L鎖の増幅に以下のプライマーを使用した。
InF.HindIII-P117L:CGGTATCGATAAGCTTAAAATGAAAGTGCCTGTTAG(配列番号:19)
InFr.chP117LVL-BamHI:ATGGTGCAGCGGATCCCCGTTTTATTTCCAACTTC(配列番号:20)
PCR反応にはQIAGEN HotStar HiFidelity Polymerase Kit(キアゲン社)を使用した。温度条件は、最初に95℃5分、次に94℃15秒、50℃1分、72℃1分を35サイクル、最後に72℃10分とした。増幅したPCR産物はQIAGEN PCR purification kitにて精製し、ベクタープライマーから塩基配列の決定を行った。
塩基配列からアミノ酸配列を予測した。chPMab-117の重鎖DNA配列、軽鎖DNA配列、重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列、を、配列番号:13、14、8及び9として、図3〜図6に示す。
<PMab-117のCDR>
PMab-117の重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列は、配列番号:2〜7のとおりであった。
重鎖CDR1:GFTFSNAAMY(配列番号:2)
重鎖CDR2:RIRSKPNNYATYYTDSVKG(配列番号:3)
重鎖CDR3:TVGGNNYAAAY(配列番号:4)
軽鎖CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLE(配列番号:5)
軽鎖CDR2:KVSNRFS(配列番号:6)
軽鎖CDR3:FQVTHDPFT(配列番号:7);
ヒトキメラ型PMab-117(chPMab-117)のポドプラニン発現株に対する反応性をフローサイトメトリーにて調べた。まず、ヒトポドプラニンを発現した各種細胞株に、chPMab-117(10 μg/mL)を4℃で30分反応させ、さらに抗rat IgG-Oregon Green抗体(サーモフィッシャー社)、抗human IgG-FITC抗体(サーモフィッシャー社)をそれぞれ4℃で30分反応させた。ネガティブコントロールとして二次抗体のみを用いた。
蛍光強度をEC800(Sony社)で測定した。結果を図7に示す。
chPMab-117は、膠芽腫(LN319)や肺がん(PC-10)などのがん細胞上のポドプラニンに高反応性を示したが、ポドプラニン強発現の腎上皮細胞(HEK-293T)には全く反応しなかった。PMab-117の結果(図2)と同様に、chPMab-117ががん特異的抗体であることが示された。
PMab-117のH鎖とL鎖の可変領域をマウスIgG2aの定常領域をpCAGベクター(インビボージェン社)に組み込み、マウスキメラ型PMab-117(chPMab117-mG2a)の発現プラスミドを作製した。
H鎖の増幅に以下のプライマーを使用した。
InF.HindIII-chP117H:CGGTATCGAT AAGCTTAGTA TGTTGGTGCT GCAG(配列番号:17)
InFr.P117HVH-mG2a:GGCTGTTGTT TTGGCTGAAG AGACAGTGAC CAGA(配列番号:21)
L鎖の増幅に以下のプライマーを使用した。
InF.HindIII-P117L:CGGTATCGATAAGCTTAAAATGAAAGTGCCTGTTAG(配列番号:19)
InF.mIgCKter-NotI:TCTAGAGTCG CGGCCGCCTA ACACTCATTC CTGT(配列番号:22)
ExpiCHO細胞株(サーモフィッシャー社)にリポフェクション法によりchPMab117-mG2aのH鎖、L鎖のプラスミドを導入し、培養上清中にchPMab117-mG2aのリコンビナント抗体を発現させた。培養上清を遺伝子導入から2日後に回収し、4℃で30分、LN319細胞と反応させ、さらに抗mouse IgG-FITC抗体(サーモフィッシャー社)を4℃で30分反応させた。ネガティブコントロールとして、二次抗体のみを用いた。
蛍光強度をCell Analyzer EC800(Sony社)で測定した。結果を図12に示す。
chPMab117-mG2aは、chPMab117と同様に、膠芽腫細胞(LN319)のポドプラニンに高反応性を示した。
PMab-117はがん特異的抗体(CasMab)であることが分かったため、その認識配列(エピトープ)の解析を行った。
ヒトポドプラニンのN末deletion mutantは以下の通りである。
dN23:N末が23番目のアミノ酸の完全長のポドプラニン
dN37:N末が37番目のアミノ酸のdeletion mutant
dN46:N末が46番目のアミノ酸のdeletion mutant
dN55:N末が55番目のアミノ酸のdeletion mutant
dN65:N末が65番目のアミノ酸のdeletion mutant
dN75:N末が75番目のアミノ酸のdeletion mutant
dN85:N末が85番目のアミノ酸のdeletion mutant
dN95:N末が95番目のアミノ酸のdeletion mutant
これらのdeletion mutantに、PMab-117(培養上清)、chPMab-117(10 μg/mL)を4℃で30分反応させ、さらに抗rat IgG-Oregon Green抗体(サーモフィッシャー社)、抗human IgG-FITC抗体(サーモフィッシャー社)をそれぞれ4℃で30分反応させた。ネガティブコントロールとして二次抗体のみを用いた。
蛍光強度をEC800(Sony社)で測定した。結果を図13及び図14に示す。
dN85(N末が85番目のアミノ酸のdeletion mutant)で反応性が消失したことから、PMab-117のエピトープのN末が、75番目〜85番目の間から開始することが分かった。
ヒトポドプラニンの各種糖鎖不全株に、PMab-117(培養上清)、chPMab-117(10 μg/mL)を4℃で30分反応させ、さらに抗rat IgG-Oregon Green抗体(サーモフィッシャー社)、抗human IgG-FITC抗体(サーモフィッシャー社)をそれぞれ4℃で30分反応させた。ネガティブコントロールとして二次抗体のみを用いた。
蛍光強度をEC800(Sony社)で測定した。結果を図15に示す。
ヒトポドプラニンのシアル酸欠損株やガラクトース欠損株に対する反応が消失したことから、PMab-117のエピトープには、O型糖鎖に付加したシアル酸が含まれることが分かった。
75番目以降のすべてのSer/Thrのアラニン置換のヒトポドプラニンに、PMab-117(培養上清)、chPMab-117(10μg/ml)を4℃で30分反応させ、さらに抗rat IgG-Oregon Green抗体(サーモフィッシャー社)、抗human IgG-FITC抗体(サーモフィッシャー社)をそれぞれ4℃で30分反応させた。ネガティブコントロールとして二次抗体のみ、ポジティブコントロールとしてNZ-12を用いた。
蛍光強度をEC800(Sony社)で測定した。結果を図16に示す。
T85Aに対し、PMab-117の反応性が消失した。よって、PMab-117のエピトープには、Thr85が含まれていることが示された。
77番目から89番目のすべてのアミノ酸のアラニン置換のヒトポドプラニンに、PMab-117(10 μg/mL)、chPMab-117(10 μg/mL)を4℃で30分反応させ、さらに抗rat IgG-Oregon Green抗体(サーモフィッシャー社)、抗human IgG-FITC抗体(サーモフィッシャー社)をそれぞれ4℃で30分反応させた。ネガティブコントロールとして二次抗体のみ、ポジティブコントロールとしてNZ-12を用いた。
蛍光強度をEC800(Sony社)で測定した。結果を図17に示す。
I78A, I80A, D82A, T85Aに対し、PMab-117の反応性が消失し、E81Aに対しPMab-117の反応性が減弱した。また、I78A, I80A, E81A, D82A, T85Aに対し、chPMab-117の反応性が消失した。よって、PMab-117のエピトープには、Ile78, Ile80, Glu81, Asp82, Thr85の5つのアミノ酸が含まれていることが示された。
以上より、ヒトポドプラニンのThr85を含む糖ペプチドが、がん特異性を示す重要な標的であることが分かった。
配列番号:2 PMab−117の重鎖CDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号:3 PMab−117の重鎖CDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号:4 PMab−117の重鎖CDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号:5 PMab−117の軽鎖CDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号:6 PMab−117の軽鎖CDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号:7 PMab−117の軽鎖CDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号:8 chPMab−117の重鎖アミノ酸配列を示す。
配列番号:9 chPMab−117の軽鎖アミノ酸配列を示す。
配列番号:10 chPMab117−mG2aの重鎖アミノ酸配列を示す。
配列番号:11 chPMab117−mG2aの軽鎖アミノ酸配列を示す。
配列番号:12 配列番号:1で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列の78番目から85番目の領域に相当するアミノ酸配列を示す。
配列番号:13 chPMab−117の重鎖DNA配列を示す。
配列番号:14 chPMab−117の軽鎖DNA配列を示す。
配列番号:15 chPMab117−mG2aの重鎖DNA配列を示す。
配列番号:16 chPMab117−mG2aの軽鎖DNA配列を示す。
配列番号:17 H鎖の増幅に使用したプライマーInF.HindIII−chP117Hを示す。
配列番号:18 H鎖の増幅に使用したプライマーInFr.chP117HVH−BamHIを示す。
配列番号:19 L鎖の増幅に使用したプライマーInF.HindIII−P117Lを示す。
配列場号:20 L鎖の増幅に使用したプライマーInFr.chP117LVL−BamHIを示す。
配列番号:21 H鎖の増幅に使用したプライマーInFr.P117HVH−mG2aを示す。
配列番号:22 L鎖の増幅に使用したプライマーInF.mIgCKter−NotIを示す。
Claims (11)
- 配列番号:1で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列におけるThr85を含む領域にエピトープを有し、Thr85はシアル酸含有O型糖鎖が付加されている、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 配列番号:1で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列における78番目から85番目の領域(IRIEDLPT)にエピトープを有し、Thr85はシアル酸含有O型糖鎖が付加されている、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 以下の6つのCDRのアミノ酸配列を有する、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント:
重鎖CDR1:GFTFSNAAMY(配列番号:2)
重鎖CDR2:RIRSKPNNYATYYTDSVKG(配列番号:3)
重鎖CDR3:TVGGNNYAAAY(配列番号:4)
軽鎖CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLE(配列番号:5)
軽鎖CDR2:KVSNRFS(配列番号:6)
軽鎖CDR3:FQVTHDPFT(配列番号:7)。 - 以下の6つのCDRのアミノ酸配列を有し:
重鎖CDR1:GFTFSNAAMY(配列番号:2)
重鎖CDR2:RIRSKPNNYATYYTDSVKG(配列番号:3)
重鎖CDR3:TVGGNNYAAAY(配列番号:4)
軽鎖CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLE(配列番号:5)
軽鎖CDR2:KVSNRFS(配列番号:6)
軽鎖CDR3:FQVTHDPFT(配列番号:7)
配列番号:8又は10で表されるアミノ酸配列を含む重鎖;
配列番号:8又は10で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖;又は、
配列番号:8又は10で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖;及び、
配列番号:9又は11で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖;
配列番号:9又は11で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖;又は、
配列番号:9又は11で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、
を含む、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。 - Fc領域に1以上のN型糖鎖が結合し、該N型糖鎖の還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない、請求項1から4のいずれか1項に記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 請求項3又は4に記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸。
- 請求項6に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項7に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
- 請求項1から5のいずれか1項に記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む医薬組成物。
- 抗がん活性を有する物質を結合させた請求項1から5のいずれか1項に記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む医薬組成物。
- 腫瘍の予防又は治療剤である、請求項9又は10に記載の医薬組成物。
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