CN110475789A - 抗平足蛋白抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段,其在序列号1表示的人平足蛋白的氨基酸序列中的包含Thr85的区域具有表位,且Thr85附加有含有唾液酸的O型糖链。
Description
技术领域
本发明涉及新型抗平足蛋白抗体等。
背景技术
平足蛋白(podoplanin)是作为血小板聚集因子及转移促进因子而为人所知的粘蛋白型糖蛋白,并且是在C末端具有跨膜部位的I型跨膜蛋白。
已知平足蛋白在脑肿瘤、间皮瘤、睾丸肿瘤、卵巢癌、及各种扁平上皮癌(口腔癌、鼻咽癌、喉头癌、食道癌、肺癌、皮肤癌、宫颈癌)等中高水平表达。因此,期待抗平足蛋白抗体在平足蛋白高水平表达的癌(肿瘤)中显示抗癌作用(抗肿瘤活性)。因此,需求对于平足蛋白的特异性、亲和性更高的抗体、识别平足蛋白的新型抗体等。
本申请发明人近年来开发了对癌细胞显示特异反应性的单克隆抗体制备技术(CasMab法)。通过CasMab法,能够制备下述抗体医药品:在癌细胞和正常细胞中表达相同氨基酸序列的膜蛋白的情况下,利用糖链等翻译后修饰的区别,仅对癌细胞进行攻击(非专利文献1~3)。
迄今为止,针对平足蛋白制备了多种癌细胞特异性抗体(专利文献1、非专利文献3~4)。针对平足蛋白的癌细胞特异性抗体对于癌型平足蛋白高水平表达的肺癌、食道癌、脑肿瘤、恶性间皮瘤等的癌细胞显示高反应性,但完全不与正常型平足蛋白高水平表达的淋巴管内皮细胞、肺泡上皮细胞、肾上皮细胞反应。迄今为止利用CasMab法开发的单克隆抗体具有强ADCC/CDC活性,在小鼠的癌移植片模型中显示高抗肿瘤效果,因此,不仅显示针对癌症的特异性,还显示出作为抗体医药的可能性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2015/053381号
非专利文献
非专利文献1:Kato Y,Ogasawara S,Oki H,Goichberg P,Honma R,Fujii Y,Kaneko MK.LpMab-12 Established by CasMab Technology Specifically DetectsSialylated O-glycan on Thr52 of Platelet Aggregation-stimulating Domain ofHuman Podoplanin.PLoS One,11(3),e0152912,2016
非专利文献2:Kato Y,Kunita A,Abe S,Ogasawara S,Fujii Y,Oki H,FukayamaM,Nishioka Y和Kaneko MK.The chimeric antibody chLpMab-7targeting humanpodoplanin suppresses pulmonary metastasis via ADCC and CDC rather than viaits neutralizing activity.Oncotarget,36003-36018,2015
非专利文献3:Kato Y和Kaneko MK.A Cancer-specific Monoclonal AntibodyRecognizes the Aberrantly Glycosylated Podoplanin.Sci Rep.,4,5924,2014
非专利文献4:Kaneko MK,Yamada S,Nakamura T,Abe S,Nishioka Y,Kunita A,Fukayama M,Fujii Y,Ogasawara S,Kato Y*.Antitumor activity of chLpMab-2,ahuman-mouse chimeric cancer-specific antihuman podoplanin antibody,viaantibody-dependent cellular cytotoxicity.Cancer Med.,DOI:10.1002/cam4.1049
发明内容
发明所要解决的课题
本发明所要解决的课题为提供可用作医药、诊断剂及试剂的新型抗平足蛋白抗体。
用于解决课题的手段
获知了通过本发明建立的PMab-117抗体及其修饰抗体在表位中包含附加于人平足蛋白的Thr85的O型糖链(含有唾液酸)。另外,获知了PMab-117抗体及其修饰抗体在人平足蛋白表达的癌细胞中为强阳性,但在正常细胞中反应性低,因此是癌细胞特异性抗体。迄今为止,于人平足蛋白的Thr85附加有糖链的情况完全没有得到证实,并且,也完全没有建立在表位中包含附加有O型糖链的Thr85的抗体,因此,PMab-117是具有新型表位的癌细胞特异性抗平足蛋白抗体。
即,本发明如下所述。
〔1〕
癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段,其在序列号1表示的人平足蛋白的氨基酸序列中的包含Thr85的区域具有表位,且Thr85附加有含有唾液酸的O型糖链。
〔2〕
如〔1〕所述的癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段,其在序列号1表示的人平足蛋白的氨基酸序列中的第78位至第85位的区域(IRIEDLPT)具有表位。
〔3-1〕
癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段,
其具有以下的6个CDR的氨基酸序列中的至少1者,或者
具有在以下的6个CDR的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失的氨基酸序列中的至少1者,或者
具有与以下的6个CDR的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列中的至少1者:
重链CDR1:GFTFSNAAMY(序列号2)
重链CDR2:RIRSKPNNYATYYTDSVKG(序列号3)
重链CDR3:TVGGNNYAAAY(序列号4)
轻链CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLE(序列号5)
轻链CDR2:KVSNRFS(序列号6)
轻链CDR3:FQVTHDPFT(序列号7)。
〔3-2〕
如〔1〕或〔2〕所述的癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段,
其具有以下的6个CDR的氨基酸序列中的至少1者,或者
具有在以下的6个CDR的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失的氨基酸序列中的至少1者,或者
具有与以下的6个CDR的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列中的至少1者:
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重链CDR2:RIRSKPNNYATYYTDSVKG(序列号3)
重链CDR3:TVGGNNYAAAY(序列号4)
轻链CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLE(序列号5)
轻链CDR2:KVSNRFS(序列号6)
轻链CDR3:FQVTHDPFT(序列号7)。
〔4-1〕
癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段,其包含:
包含序列号8或10表示的氨基酸序列的重链;
包含下述氨基酸序列的重链,所述氨基酸序列在序列号8或10表示的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失;
包含与序列号8或10表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列的重链;
包含序列号9或11表示的氨基酸序列的轻链;
包含下述氨基酸序列的轻链,所述氨基酸序列在序列号9或11表示的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失;或者
包含与序列号9或11表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列的轻链。
〔4-2〕
如〔1〕至〔3-2〕中任一项所述的癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段,其包含:
包含序列号8或10表示的氨基酸序列的重链;
包含下述氨基酸序列的重链,所述氨基酸序列在序列号8或10表示的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失;
包含与序列号8或10表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列的重链;
包含序列号9或11表示的氨基酸序列的轻链;
包含下述氨基酸序列的轻链,所述氨基酸序列在序列号9或11表示的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失;或者,
包含与序列号9或11表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列的轻链。
〔5〕
如〔1〕至〔4-2〕中任一项所述的癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段,其中,在Fc区域结合有1个以上的N型糖链,在该N型糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺上未结合有岩藻糖。
〔6〕
核酸,其编码〔3〕或〔4〕中记载的氨基酸序列中的任一者。
〔7〕
表达载体,其含有〔6〕所述的核酸。
〔8〕
转化体,其含有〔7〕所述的表达载体。
〔9〕
医药组合物,其含有〔1〕至〔5〕中任一项所述的癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段作为有效成分。
〔10〕
医药组合物,其含有结合了具有抗癌活性的物质的〔1〕至〔5〕中任一项所述的癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段作为有效成分。
〔11〕
如〔9〕或〔10〕所述的医药组合物,所述医药组合物为肿瘤的预防或治疗剂。
〔12〕
人平足蛋白,其具有序列号1表示的氨基酸序列,且于Thr85附加有含有唾液酸的O型糖链。
〔13〕
糖肽,其具有以下的氨基酸序列,且于Thr附加有含有唾液酸的O型糖链:
IRIEDLPT(序列号12)。
发明效果
通过癌细胞特异性抗体,能够癌细胞特异性地发挥抗癌活性,因此,可得到副作用被降低至极限的医药。另外,也可用于递送以癌细胞作为靶标的药剂,作为诊断剂、试剂的有用性也高。
根据本发明,可提供可用作医药、诊断剂及试剂的新型抗平足蛋白抗体。
附图说明
[图1]示出了人平足蛋白的氨基酸序列(序列号1)。
[图2]示出了使用了PMab-117及NZ-1的流式细胞术中的用EC800(Sony公司)测定荧光强度而得的结果。
[图3]示出了chPMab-117的重链DNA序列(序列号13)。
[图4]示出了chPMab-117的轻链DNA序列(序列号14)。
[图5]示出了chPMab-117的重链氨基酸序列(序列号8)。
[图6]示出了chPMab-117的轻链氨基酸序列(序列号9)。
[图7]示出了使用了chPMab-117的流式细胞术中的用EC800(Sony公司)测定荧光强度而得的结果。
[图8]示出了chPMab117-mG2a的重链DNA序列(序列号15)。
[图9]示出了chPMab117-mG2a的轻链DNA序列(序列号16)。
[图10]示出了chPMab117-mG2a的重链氨基酸序列(序列号10)。
[图11]示出了chPMab117-mG2a的轻链氨基酸序列(序列号11)。
[图12]示出了使用了chPMab117-mG2a的流式细胞术中的用EC800(Sony公司)测定荧光强度而得的结果。
[图13]示出了人平足蛋白的N末端缺失突变体的、使用了PMab-117的流式细胞术中的用EC800(Sony公司)测定荧光强度而得的结果。
[图14]示出了人平足蛋白的N末端缺失突变体的、使用了chPMab-117的流式细胞术中的用EC800(Sony公司)测定荧光强度而得的结果。
[图15]示出了人平足蛋白的各种糖链异常株的、使用了PMab-117及chPMab-117的流式细胞术中的用EC800(Sony公司)测定荧光强度而得的结果。
[图16]示出了第75位以后的全部Ser/Thr取代为丙氨酸的人平足蛋白的、使用了PMab-117、chPMab-117及NZ-1的流式细胞术中的用EC800(Sony公司)测定荧光强度而得的结果。
[图17]示出了第77位至第89位的全部氨基酸取代为丙氨酸的人平足蛋白的、使用了PMab-117、chPMab-117及NZ-1的流式细胞术中的用EC800(Sony公司)测定荧光强度而得的结果。
具体实施方式
(抗平足蛋白抗体)
本发明涉及的抗平足蛋白抗体是在序列号1表示的人平足蛋白的氨基酸序列中的包含Thr85的区域具有表位、且Thr85附加有含有唾液酸的O型糖链的癌细胞特异性抗平足蛋白抗体。O型糖链也称为O-连接型糖链。
本说明书中所谓“抗体”,是指介由一对二硫键稳定化的2条重链(H链)与2条轻链(L链)缔合而成的结构。重链由重链可变区VH、重链恒定区CH1、CH2、CH3、及位于CH1与CH2之间的铰链区组成,轻链由轻链可变区VL和轻链恒定区CL组成。其中,由VH和VL组成的可变区片段(Fv)直接参与抗原结合,是赋予抗体多样性的区域。另外,将由VL、CL、VH、CH1组成的抗原结合区域称为Fab区域,将由铰链区、CH2、CH3组成的区域称为Fc区域。
可变区中,直接与抗原接触的区域变化尤其大,被称为互补性决定区(complementarity-determining region:CDR)。将CDR以外的突变较少的部分称为框架区(framework region:FR)。在轻链和重链的可变区各自存在3个CDR(重链CDR1~3、及轻链CDR1~3)。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体可以是单克隆抗体,也可以是多克隆抗体。另外,本发明的抗平足蛋白抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgD、IgE中的任一种同种型。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体可以是对小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、鸡等非人动物进行免疫而制备的抗体,可以是重组抗体,也可以是嵌合型抗体(嵌合抗体)、人源化抗体、完全人源化抗体等。所谓嵌合型抗体(嵌合抗体),是指将来源于不同物种的抗体的片段连结而成的抗体。
所谓“人源化抗体”,表示用非人源抗体的特征性氨基酸序列取代人抗体的对应位置而得到的抗体,例如,可举出具有对小鼠或大鼠进行免疫而制备的抗体的重链CDR1~3及轻链CDR1~3、且包括重链及轻链各自的4个框架区(FR)在内的其他全部区域来自人抗体的抗体等。上述抗体有时也被称为CDR移植抗体。术语“人源化抗体”有时也包括人型嵌合抗体。
本说明书中,抗平足蛋白抗体的所谓“抗原结合片段”,是指抗平足蛋白抗体的片段、且是与平足蛋白结合的片段。具体而言,可举出由VL、VH、CL及CH1区域组成的Fab;2个Fab于铰链区介由二硫键连结的F(ab’)2;由VL及VH组成的Fv;将VL及VH介由人工的多肽接头连结而成的单链抗体即scFv,以及双价(diabody)型、scDb型、tandem scFv型、亮氨酸拉链型等的双特异性抗体等,但不限于这些。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体优选在序列号1表示的人平足蛋白的氨基酸序列中的第78位至第85位的区域(78-IRIEDLPT-85)、即于85位的苏氨酸上附加有含有唾液酸的O型糖链的人平足蛋白的糖肽部分具有表位。
在人平足蛋白的氨基酸序列中的第78位至第85位的区域(78-IRIEDLPT-85)具有表位的本发明涉及的抗平足蛋白抗体是在表位中包含肽和糖链这二者而进行识别的抗体。
78-IRIEDLPT-85表示的氨基酸序列相当于序列号1表示的人平足蛋白中的第78位至第85位的氨基酸。并且,T相当于序列号1的氨基酸序列中的85位的苏氨酸(Thr85)。
本发明中还提供作为抗平足蛋白抗体的表位的糖肽,所述糖肽由IRIEDLPT(序列号12)表示,且于Thr附加有含有唾液酸的O型糖链。另外,本发明提供人平足蛋白,其具有序列号1表示的氨基酸序列,且于Thr85附加有含有唾液酸的O型糖链。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体可具有以下的6个CDR中的至少1者。这些CDR为PMab-117的CDR序列。
重链CDR1:GFTFSNAAMY(序列号2)
重链CDR2:RIRSKPNNYATYYTDSVKG(序列号3)
重链CDR3:TVGGNNYAAAY(序列号4)
轻链CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLE(序列号5)
轻链CDR2:KVSNRFS(序列号6)
轻链CDR3:FQVTHDPFT(序列号7)
本发明涉及的抗平足蛋白抗体为在序列号1表示的人平足蛋白的氨基酸序列中的包含Thr85的区域具有表位、且Thr85附加有含有唾液酸的O型糖链的癌细胞特异性抗平足蛋白抗体,优选具有上述6个CFR中的至少1者。该抗平足蛋白抗体更优选在序列号1表示的人平足蛋白的氨基酸序列中的第78位至第85位的区域(78-IRIEDLPT-85)、即于85位的苏氨酸上附加有含有唾液酸的O型糖链的人平足蛋白的糖肽部分具有表位。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体只要包含6个CDR中的至少1者即可,可包含6个CDR中的多个CDR,例如,可包含2个以上、3个以上、4个以上、5个以上或6个。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体包含6个CDR的情况下,该抗平足蛋白抗体具有序列号2~4表示的重链CDR1~3及序列号5~7表示的轻链CDR1~3。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体包含序列号2~4表示的重链CDR1~3及序列号5~7表示的轻链CDR1~3中任一者的情况下,可在其至少1者中包含具有1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失的氨基酸序列。
本说明书中,“氨基酸”以其最广泛的含义使用,除了天然氨基酸以外,还包括人造的氨基酸突变体、衍生物。氨基酸有时也以惯用的单字母记号或三字母记号表示。作为本说明书中的“氨基酸”,可举出天然蛋白质性L-氨基酸、非天然氨基酸、具有作为氨基酸特征的本领域已知特性、经化学合成的化合物等。
作为非天然氨基酸,可举出例如主链的结构与天然型不同的α,α-二取代氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、N-烷基-α-氨基酸、D-氨基酸、β-氨基酸、α-羟基酸、侧链的结构与天然型不同的氨基酸(正亮氨酸、高组氨酸等)、在侧链具有多余的亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸、高苯丙氨酸、高组氨酸等)、及侧链中的羧酸官能团被磺酸基取代的氨基酸(半胱氨酸等)等,但不限于这些。
本说明书中“具有1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失”的情况下,对于所添加、取代或缺失的氨基酸的个数而言,只要结果得到的多肽保持作为CDR的功能则没有特别限定,可设为例如1个、2个、3个或4个。可“具有1个氨基酸的添加、取代或缺失”,可“具有1~2个氨基酸的添加、取代或缺失”,可“具有1~3个氨基酸的添加、取代或缺失”,也可“具有1~4个氨基酸的添加、取代或缺失”。
对于氨基酸的缺失、取代或添加的位置而言,只要可保持作为CDR的功能,则可以是要缺失、取代或添加氨基酸的CDR序列的任意位置。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体包含序列号2~4表示的重链CDR1~3及序列号5~7表示的轻链CDR1~3中任一者的情况下,其至少1者可包含与序列号2~4表示的重链CDR1~3及序列号5~7表示的轻链CDR1~3的对应氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列。
本说明书中,所谓“具有80%以上的同源性”,表示将突变前的氨基酸序列与具有自该氨基酸序列突变的序列的多肽的氨基酸序列以一致率为最大的方式进行对比时,共通的氨基酸残基的数目为突变前的氨基酸序列的氨基酸数目的80%以上。
只要同源性为80%以上、且保持作为CDR的功能则没有特别限定,可设为例如85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、99%以上。
本说明书中,所谓与序列号2~7中任一者表示的氨基酸序列“具有80%以上的同源性”,表示将序列号2~7中任一者表示的氨基酸序列与具有突变序列的多肽的氨基酸序列进行比较、以一致率为最大的方式进行对比时,共通的氨基酸残基的数目为序列号2~7中任一者表示的氨基酸序列的氨基酸数目的80%以上。
包含在重链CDR1~3及轻链CDR1~3的氨基酸序列中添加、取代、或缺失氨基酸而得到的氨基酸序列的CDR、与重链CDR1~3及轻链CDR1~3的氨基酸序列具有80%以上的同源性CDR可使用位点特异性突变导入法、随机突变导入法、链替换法、CDR步移(CDRwalking)法等已知的方法来制备。本领域技术人员熟知,根据这些方法,利用噬菌体展示法将在CDR中具有各种突变的抗体或抗体片段呈递至噬菌体表面,并使用抗原进行筛选,由此可得到亲和性更为成熟的CDR(例如,Wu等,PNAS,95:6037-6042(1998);Schier,R.等,J.Mol.Bio.263:551-567(1996);Schier,R.等,J.Mol.Biol.255:28-43(1996);Yang,W.P.等,J.Mol.Biol.,254:392-403(1995)。)。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体优选包含:
包含序列号8或10表示的氨基酸序列的重链;
包含下述氨基酸序列的重链,所述氨基酸序列在序列号8或10表示的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失;或者
包含与序列号8或10表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列的重链。
序列号8表示的氨基酸序列为chPMab-117的嵌合型抗体的重链的氨基酸序列,序列号10表示的氨基酸序列为chPMab-117-mG2a的嵌合型抗体的重链的氨基酸序列。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体优选包含:
包含序列号9或11表示的氨基酸序列的轻链;
包含下述氨基酸序列的轻链,所述氨基酸序列在序列号9或11表示的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失;或者
包含与序列号9或11表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列的轻链。
序列号9表示的氨基酸序列为chPMab-117的嵌合型抗体的轻链的氨基酸序列,序列号11表示的氨基酸序列为chPMab-117-mG2a的嵌合型抗体的轻链的氨基酸序列。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体更优选包含:
包含序列号8表示的氨基酸序列的重链;及
包含序列号9表示的氨基酸序列的轻链,
也可包含:
包含下述氨基酸序列的重链,所述氨基酸序列在序列号8表示的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失;及
包含下述氨基酸序列的轻链,所述氨基酸序列在序列号9表示的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失,
也可包含:
包含与序列号8表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列的重链;及
包含与序列号9表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列轻链。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体更优选包含:
包含序列号10表示的氨基酸序列的重链;及
包含序列号11表示的氨基酸序列的轻链,
也可包含:
包含下述氨基酸序列的重链,所述氨基酸序列在序列号10表示的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失;及
包含下述氨基酸序列的轻链,所述氨基酸序列在序列号11表示的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失,
也可包含:
包含与序列号10表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列的重链;及
包含与序列号11表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列的轻链。
本说明书中,在重链或轻链的氨基酸序列中添加、取代或缺失1个至多个氨基酸的情况下,添加、取代或缺失的氨基酸的数目可设为例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。其他术语如上文所述。
本说明书中,所谓与序列号8~11中任一者表示的氨基酸序列“具有80%以上的同源性”,表示将序列号8~11中任一者表示的氨基酸序列与具有突变序列的多肽的氨基酸序列进行比较、以一致率为最大的方式进行对比时,共通的氨基酸残基的数目为序列号8~11中任一者表示的氨基酸序列的氨基酸数目的80%以上。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体可以是在Fc区域结合有1个以上的N型糖链、在该N型糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺上未结合有岩藻糖的抗体。N型糖链也称为N-连接型糖链。
例如,IgG抗体的Fc区域中,存在2处N型糖链的结合位点,在该位点结合有复合型糖链。所谓N型糖链,是指与Asn-X-Ser/Thr序列中的Asn结合的糖链,具有与Asn结合的共通结构Man3GlcNAc2(-Asn)。根据与非还原末端的2个甘露糖(Man)结合的糖链的种类,分类为高甘露糖型、杂合型、及复合型等。
尽管可在N型糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上结合有岩藻糖,但已知在未结合有岩藻糖的情况下,ADCC活性较之结合有岩藻糖的情况而言显著上升。该情况记载于例如国际公开第2002/031140号中,其公开的全部内容通过参考并入本说明书中。
通过显著提高ADCC活性,从而在将抗体用作医药时能够减少施予量,因此,能够减轻副作用,并且还可降低治疗费用。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体可结合具有抗癌活性的物质进行使用。
本说明书中,所谓“具有抗癌活性的物质”,是指使以下情况中的至少一种发生的物质:肿瘤尺寸的缩小(延缓或终止)、对肿瘤转移的阻碍、对肿瘤增殖的阻碍(延缓或终止)、及与癌症相关的一种或多种症状的缓解。具体而言,可举出毒素、抗癌剂、放射性同位素等,但不限于这些。
作为具有抗癌活性的毒素,可举出例如绿脓杆菌外毒素(PE)或其细胞毒性片段(例如PE38)、白喉毒素、蓖麻毒素A等。具有抗癌活性的毒素仅针对将毒素与抗平足蛋白抗体一同摄入的细胞、即表达平足蛋白的癌细胞而发挥毒性,因此,具有不对周围的细胞造成不良影响、能够得到特异性效果的优点。本发明涉及的抗平足蛋白抗体与在肿瘤细胞中表达的抗平足蛋白特异性结合,因此是有用的。
作为抗癌剂,可举出例如阿霉素、道诺霉素、丝裂霉素、顺铂、长春新碱、表阿霉素、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、阿克拉霉素、氮芥、环磷酰胺、博来霉素、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长春碱、长春地辛、他莫昔芬、地塞米松等低分子化合物、激活免疫活性细胞的细胞因子(例如人白细胞介素2、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、人巨噬细胞集落刺激因子、人白细胞介素12)等蛋白等。
作为具有抗癌活性的放射性同位素,可举出32P、14C、125I、3H、131I、211At、90Y等。放射性同位素对于抗平足蛋白抗体所结合的细胞、即表达平足蛋白细胞周围的细胞也发挥毒性。一般而言,肿瘤细胞不是均匀的,且并非全部肿瘤细胞均表达平足蛋白,因此,为了杀死周围的平足蛋白阴性的肿瘤细胞,放射性同位素是有用的。需要说明的是,在结合放射性同位素的情况下,抗平足蛋白抗体可以为Fab、scFv等低分子抗体的形式。
可利用已知的方法使具有抗癌活性的物质与抗平足蛋白抗体直接结合。另外,例如,可将具有抗癌活性的物质包封至表面以抗平足蛋白抗体进行了修饰的脂质体等运载体。
具有抗癌活性的物质为蛋白质、多肽的情况下,可将编码本发明涉及的抗平足蛋白抗体的核酸(后述)与编码具有抗癌活性的物质的DNA连结,并插入至合适的表达载体,由此使其作为具有抗癌活性的物质与抗平足蛋白抗体的融合蛋白而表达。
(核酸)
本发明也包括编码本发明涉及的抗平足蛋白抗体的核酸。核酸可以是天然的核酸,也可以是人工的核酸,可举出例如DNA、RNA、DNA与RNA的杂合体,但不限于这些。本领域技术人员可按照已知的方法或基于已知方法的方法来确定编码抗平足蛋白抗体的核酸的碱基序列,并利用已知的方法或基于已知方法的方法进行制备。
本发明涉及的核酸可以是编码下述氨基酸序列的核酸:
以下的6个CDR的氨基酸序列;
在以下的6个CDR的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失的氨基酸序列;
与以下的6个CDR的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列;
重链CDR1:GFTFSNAAMY(序列号2)
重链CDR2:RIRSKPNNYATYYTDSVKG(序列号3)
重链CDR3:TVGGNNYAAAY(序列号4)
轻链CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLE(序列号5)
轻链CDR2:KVSNRFS(序列号6)
轻链CDR3:FQVTHDPFT(序列号7);
序列号8或10表示的氨基酸序列;
在序列号8或10表示的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失的氨基酸序列;
与序列号8或10表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列;
序列号9或11表示的氨基酸序列;
在序列号9或11表示的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失氨基酸序列;或者
与序列号9或11表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列。
作为编码本发明涉及的抗平足蛋白抗体的核酸,可举出例如序列号13表示的编码chPMab-117的重链的DNA、序列号14表示的编码chPMab-117的轻链的DNA、序列号15表示的编码chPMab117-mG2a的重链的DNA、序列号16表示的编码chPMab117-mG2a的轻链的DNA等,但不限于这些。
编码chPMab-117及chPMab117-mG2a的各CDR的核酸被包含于序列号13~16中任一者表示的DNA序列中。
(表达载体)
本发明还包括含有本发明涉及的核酸的表达载体。表达载体可根据要使用的宿主细胞而适当选择,可举出例如质粒、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、花椰菜花叶病毒载体、烟草花叶病毒载体等植物病毒载体、粘粒、YAC、EBV来源的附加体等。可使用已知的方法(利用限制性内切酶的方法等)将本发明涉及的核酸插入这些表达载体。
对于本发明涉及的表达载体而言,除了含有本发明涉及的核酸、例如编码本发明涉及的抗平足蛋白抗体的核酸以外,可还含有调节抗体基因表达的启动子、复制起点、筛选标记基因等。启动子及复制起点可根据宿主细胞和载体的种类适当选择。
(转化体)
本发明包括含有本发明涉及的载体的转化体。转化体可通过将本发明涉及的载体转染至合适的宿主细胞而得到。作为宿主细胞,可使用例如哺乳类细胞(CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、HeLa细胞、Vero细胞等)、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞(酵母属、曲霉属等)之类的真核细胞、大肠杆菌(E.Coli)、枯草芽孢杆菌等原核细胞等。
(抗平足蛋白抗体的制造方法)
本发明涉及的抗平足蛋白抗体的制造方法没有限定,例如,对于抗平足蛋白单克隆抗体而言,可通过以下方法获得:从用平足蛋白或其片段进行了免疫的非人哺乳动物分离出产生抗体的细胞,使其与骨髓瘤细胞等融合而制备杂交瘤,并对该杂交瘤产生的抗体进行纯化。另外,抗平足蛋白多克隆抗体可从用平足蛋白或其片段进行了免疫的动物的血清中获得。另外,对于本发明涉及的抗平足蛋白抗体而言,在对非人动物进行免疫时,也可使用附加有与Thr85结合的糖链以外的糖链的平足蛋白。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体的制造方法中使用的平足蛋白或其片段具有序列号1表示的人平足蛋白的氨基酸序列中的包含Thr85的区域,且Thr85附加有含有唾液酸的O型糖链。优选的是,具有序列号1表示的人平足蛋白的氨基酸序列中的第78位至第85位的区域(IRIEDLPT),且Thr85附加有含有唾液酸的O型糖链。
使用基因重组法制备本发明涉及的抗平足蛋白抗体的情况下,例如,使用含有编码本发明涉及的抗平足蛋白抗体的核酸的表达载体对合适的宿主进行转化,在合适的条件下培养该转化体而使抗体表达,按照已知的方法分离纯化即可。
作为分离纯化方法,可举出例如使用了蛋白A等的亲和柱、其他色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析等,可将这些方法适当组合。
与规定的表位的序列结合的抗体可使用本领域技术人员已知的方法或基于已知方法的方法制备。例如,将包含表位序列的肽固定于固相运载体,检测该肽与多种抗体的结合,由此可得到与同表位特异性结合的抗体。
此处,作为“多种抗体”,可使用以抗原蛋白或其局部肽对动物进行免疫而得到的抗体,也可使用通过噬菌体展示法制备的抗体文库或抗体片段文库。使用基于噬菌体展示法的文库的情况下,通过将包含表位序列的肽固定于固相运载体并重复淘选,也可得到与同表位特异性结合的抗体。
人型嵌合抗体及人CDR移植抗体可通过以下方法制备:由人以外的动物的产生抗体的杂交瘤的mRNA将抗体基因克隆化,利用基因重组技术将其与人抗体基因的一部分连结。
人型嵌合抗体的情况下,利用逆转录酶从产生小鼠抗体的杂交瘤的mRNA合成cDNA,通过PCR克隆重链可变区(VH)及轻链可变区(LH),对序列进行分析。接着,从一致率高的抗体碱基序列来制备含有前导序列的5’引物,利用5’引物和可变部3’引物,通过PCR从上述cDNA克隆从信号序列到可变区3’末端为止的序列。另一方面,克隆人IgG1的重链及轻链的恒定区,针对重链和轻链分别将来源于小鼠抗体的可变区与来源于人抗体的恒定区通过利用了PCR的重叠悬挂(Overlapping Hanging)法连结,并进行扩增。将得到的DNA插入至合适的载体,对其进行转化,从而可得到人型嵌合抗体。
人CDR移植抗体的情况下,选择与要使用的小鼠抗体可变部同源性最高的人抗体可变部并进行克隆化,利用使用了Megaprimer法的位点选择性突变导入,改变CDR的碱基序列。构成框架区的氨基酸序列在人源化后无法实现与抗原的特异性结合的情况下,可将框架区的部分氨基酸从人型转换为大鼠型。
包含在原本的序列中具有1或2个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列的CDR、包含与原本的序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列的CDR可使用位点特异性突变导入法、随机突变导入法、链替换法、CDR步移法等已知的方法制备。
本领域技术人员熟知,根据这些方法,利用噬菌体展示法将在CDR中具有各种突变的抗体或抗体片段呈递至噬菌体表面,并使用抗原进行筛选,由此可得到亲和性更为成熟的CDR(例如,Wu等,PNAS,95:6037-6042(1998);Schier,R.等,J.Mol.Bio.263:551-567(1996);Schier,R.等,J.Mol.Biol.255:28-43(1996);Yang,W.P.等,J.Mol.Biol.,254:392-403(1995)。)。本发明也包括含有利用这样的方法成熟的CDR的抗体。
作为其他抗体的制造方法,有由来源于经过曲古柳菌素A处理的鸡B细胞的DT40细胞株获得产生抗体的细胞株的Adlib法(Seo,H.等,Nat.Biotechnol.,6:731-736,2002)、对破坏了小鼠抗体基因且导入了人抗体基因的KM小鼠进行免疫来制备人抗体的方法(Itoh,K.等,Jpn.J.Cancer Res.,92:1313-1321,2001;Koide,A.等,J.Mol.Biol.,284:1141-1151,1998)等,这些方法也可应用于生产本发明涉及的抗体。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体的抗原结合片段可使用编码该片段的DNA通过上述方法实现表达,另外,也可在得到全长抗体后用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶进行处理,进行片段化。
对于本发明涉及的抗平足蛋白抗体而言,氨基酸序列、分子量、等电点、糖链的有无、形态可能根据制备方法、纯化方法的不同而不同。但是,只要得到的抗体具有与本发明涉及的抗平足蛋白抗体同等的功能,则包含在本发明中。例如,使本发明涉及的抗平足蛋白抗体在大肠杆菌等原核细胞中表达的情况下,在原本的抗体的氨基酸序列N末端附加甲硫氨酸残基。本发明也包括该抗体。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体为具有在还原末端的N-乙酰葡糖胺上未结合有岩藻糖的N型糖链的抗体的情况下,该抗体可按照已知的方法或基于已知方法的方法来制造。该抗体的制造方法记载于例如国际公开第2002/031140号、日本特开2009-225781号公报中,其公开的全部内容通过参考并入本说明书。
具体而言,例如可通过以下方法得到:使用含有编码本发明涉及的抗平足蛋白抗体的DNA的载体,将参与GDP-岩藻糖的合成的酶的活性、或α-1,6-岩藻糖基转移酶的活性降低或欠缺的细胞进行转化,培养得到的转化体,然后纯化作为目标的抗平足蛋白抗体。
作为参与GDP-岩藻糖的合成的酶,可举出例如GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMP)、GDP-酮-6-脱氧甘露糖3,5-表异构酶4-还原酶(Fx)、GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶(GFPP)。
此处,细胞没有特别限定,优选哺乳动物细胞,可使用例如上述使酶活性降低或缺失的CHO细胞。
尽管也存在利用上述方法而得到的抗体组合物含有在还原末端的N-乙酰葡糖胺上结合有岩藻糖的抗体的情况,但结合有岩藻糖的抗体的比例为抗体总体的20重量%以下,优选为10重量%以下,进一步优选为5重量%以下,最优选为3重量%以下。
另外,具有在还原末端的N-乙酰葡糖胺上未结合有岩藻糖的N型糖链的抗体可通过以下方法获得:将含有编码本发明涉及的抗平足蛋白抗体的DNA的载体导入昆虫卵,孵化并使昆虫成长,根据需要进行交配来制备转基因昆虫,从该转基因昆虫或其分泌物中提取抗平足蛋白抗体。作为昆虫,可使用蚕,该情况下,可从茧中提取抗体。
尽管也存在利用该方法而得到的抗体组合物也含有在还原末端的N-乙酰葡糖胺上结合有岩藻糖的抗体的情况,但结合有岩藻糖的抗体的比例为抗体总体的20重量%以下,优选为10重量%以下,进一步优选为5重量%以下,最优选为3重量%以下。
(本发明涉及的抗平足蛋白抗体的活性)
抗体医药的药效机制基于抗体所具有的2种生物活性。一种为靶抗原特异性的结合活性,即通过结合而中和靶抗原分子的功能的活性。靶抗原分子的功能的中和介由Fab区发挥。
另一种为被称为效应器(effector)活性的抗体生物活性。效应器活性介由抗体的Fc区以抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity;ADCC)、补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity;CDC)、直接诱导凋亡等形式发挥。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体的活性可通过以下的方法来测定。
(1)结合活性
抗体的结合活性可通过已知的方法,例如ELISA(酶联免疫吸附测定法)、EIA(酶免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)、荧光抗体法、FACS法等进行测定。
(2)ADCC活性
所谓ADCC活性,是指本发明涉及的抗平足蛋白抗体结合至靶细胞的细胞表面抗原时,其Fc部分与具有Fcγ受体的细胞(效应器细胞)介由Fcγ受体而结合,从而对靶细胞赋予不良影响的活性。
ADCC活性可通过将表达平足蛋白的靶细胞、效应器细胞与本发明涉及的抗平足蛋白抗体混合并测定ADCC的水平而得知。作为效应器细胞,可利用例如小鼠脾细胞、从人末梢血、骨髓中分离的单核细胞。作为靶细胞,可使用例如平足蛋白阳性间皮瘤细胞、平足蛋白阳性胶质母细胞瘤细胞。将靶细胞预先用51Cr等标记,向其添加本发明涉及的抗平足蛋白抗体并进行孵育,然后添加相对于靶细胞而言为合适的比例的效应细胞并进行孵育。孵育后,采集上清液,可通过对上清液中的上述标记进行计测来测定ADCC活性。
(3)CDC活性
所谓CDC活性,是指由补体系统带来的细胞毒活性。
CDC活性可通过在ADCC活性的试验中使用补体代替效应器细胞来测定。
(4)肿瘤增殖抑制活性
肿瘤增殖抑制活性可利用肿瘤模型动物进行测定。例如,将肿瘤移植至小鼠的皮下,并施予本发明涉及的抗平足蛋白抗体。可通过对非施予组和施予组中的肿瘤组织的体积进行比较来测定肿瘤增殖抑制效果。
需要说明的是,肿瘤增殖抑制活性可以产生抑制细胞个体的增殖的结果,也可以产生诱导细胞死亡的结果。
(医药组合物)
本发明涉及的抗平足蛋白抗体可用于表达平足蛋白的肿瘤的预防或治疗。本发明涉及的医药组合物含有本发明涉及的抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段作为有效成分,还含有药学上允许的运载体、添加物。
本发明涉及的抗平足蛋白抗体可用于以肿瘤细胞作为靶标的药物的递送。本发明涉及的医药组合物可含有结合了具有抗癌活性的物质的抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段作为有效成分,可还含有药学上允许的运载体、添加物。
作为运载体及添加物的例子,可举出水、盐水、磷酸缓冲液、右旋糖、甘油、乙醇等药学上允许的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、表面活性剂等,但不限于这些。
本发明涉及的医药组合物可制成各种形态,例如液剂(例如注射剂)、分散剂、悬浮剂、片剂、丸剂、粉末剂、栓剂等。优选形态为注射剂,并优选以非经口的形式(例如静脉内、经皮、腹腔内、肌肉内)施予。
本发明涉及的医药组合物对于平足蛋白相关的疾病、例如肿瘤、血栓症、动脉硬化症等的治疗是有效的。
作为平足蛋白相关的肿瘤,可举出脑肿瘤、间皮瘤、睾丸肿瘤、卵巢癌、及扁平上皮癌等。此处,扁平上皮癌包括口腔癌、鼻咽癌、喉头癌、食道癌、肺癌、皮肤癌、宫颈癌,但不限于这些。
本发明也包括平足蛋白相关的疾病的治疗方法,其包括施予治疗有效量的本发明涉及的抗平足蛋白抗体的步骤。
本说明书中,所谓治疗有效量,表示所治疗的疾病的一种或多种症状基于所述量而得到某种程度缓解的作用物质的量。抗癌剂的情况下,表示显示出以下情况中的至少一种的量:肿瘤尺寸的缩小;对肿瘤转移的阻碍(延缓或终止);对肿瘤增殖的阻碍(延缓或终止)、及与癌症相关的一种或多种症状的缓解。
具体而言,本发明涉及的抗平足蛋白抗体的施予量为例如0.025~50mg/kg、优选为0.1~50mg/kg,更优选为0.1~25mg/kg,进一步优选为0.1~10mg/kg或0.1~3mg/kg,但不限于此。
(标志物、诊断剂)
平足蛋白在特定的肿瘤细胞中高水平表达。本发明涉及的抗平足蛋白抗体可用于癌症、尤其是脑肿瘤、间皮瘤、睾丸肿瘤、卵巢癌、及各种扁平上皮癌(口腔癌、鼻咽癌、喉头癌、食道癌、肺癌、皮肤癌、宫颈癌)等平足蛋白高水平表达的癌症的诊断。本发明涉及的抗平足蛋白抗体与肿瘤细胞特异性结合,因此对于诊断尤其有用。
本发明也包括含有本发明涉及的抗平足蛋白抗体的癌症诊断剂、本发明涉及的抗平足蛋白抗体用于诊断癌症的用途、使用本发明涉及的抗平足蛋白抗体的癌症诊断方法。
本说明书中引用的所有专利文献及非专利文献的全部内容通过参考并入本说明书。
另外,本说明书中,关于作为本发明涉及的抗平足蛋白抗体记载的内容,可将本发明涉及的抗平足蛋白抗体替换成本发明涉及的抗平足蛋白抗体的抗原结合片段而进行理解。
实施例
以下,基于实施例及比较例具体地说明本发明,但本发明不限于实施例。本领域技术人员能够在不脱离本发明宗旨的情况下将本发明变更为各种方式,这些变更也包含在本发明的范围内。
1.新型的针对糖肽表位的抗平足蛋白抗体的建立
对大鼠进行合计4次(每10天1次)免疫,每次1×108个LN229/hPDPN细胞。利用ELISA(酶联免疫吸附测定)法,筛选与从癌细胞株纯化得到的重组蛋白反应的抗体。
将筛选出的癌细胞特异性抗平足蛋白抗体命名为PMab-117(大鼠IgM,kappa)。
重组蛋白如以下这样进行纯化。
静置培养LN229/hPDPN细胞,回收合计10g。添加10mL的0.5%Triton/PBS溶液,在冰上通过吹吸细胞而进行可溶化。将经可溶化得到的溶液以15,000rpm离心30分钟。将上清液添加至抗FLAG抗体(M2)的亲和柱(Sigma-Aldrich公司)1mL,于4℃使其反应18小时。用10mL的PBS洗涤3次,各添加0.1mg/mL的FLAG肽(Sigma-Aldrich公司)1mL,使吸附于柱的重组蛋白溶出。以OD280测定吸光度,浓缩溶出的级分,将最终浓度调节为0.1mg/mL。
ELISA法如以下这样实施。
将纯化的平足蛋白1mg/mL在96孔板(Nunc MaxiSorp;Thermo FisherScientific,Inc.)上于37℃固相化30分钟,使用SuperBlock/PBST(Thermo FisherScientific,Inc.),于37℃封闭30分钟。同样地,使来自小鼠杂交瘤的培养上清液、抗大鼠IgG-HRP(Dako Corp.)于37℃、30分钟的条件下依次反应,用TMB-Ultra(Thermo FisherScientific,Inc.)使其显色。使用微孔板检测仪(Bio-Rad Laboratories,Inc.),测定吸光度(OD655 nm)。
2.使用了PMab-117的流式细胞术
通过流式细胞术调查了抗平足蛋白抗体(PMab-117;大鼠IgM,kappa)针对平足蛋白表达株的反应性。首先,使PMab-117(培养上清液)与表达了人平足蛋白的各种细胞株于4℃反应30分钟,然后使抗大鼠IgG-Oregon Green抗体(Thermo Fisher Scientific,Inc.)于4℃反应30分钟。作为阴性对照,仅使用了二抗。
使用EC800(Sony公司)测定了荧光强度。结果示于图2。
PMab-117对于胶质母细胞瘤(LN319)、肺癌(PC-10)等的癌细胞上的平足蛋白显示出高反应性,但完全不与肾上皮细胞(HEK-293T)反应。另一方面,抗平足蛋白抗体的NZ-1抗体不仅对于LN319、PC-10显示高反应性,对于HEK-293T也显示出高反应性。由该结果表明,PMab-117为癌细胞特异性。
3.人嵌合型PMab-117(chPMab-117)的制备、和氨基酸序列及抗体基因的碱基序列
的确定
使用QIAGEN RNeasy mini kit(QIAGEN K.K.)从1×106个抗平足蛋白抗体(PMab-117;大鼠IgM,kappa)的杂交瘤细胞提取总RNA。使用SuperScript III First-StrandSyntheses kit(Thermo Fisher Scientific,Inc.)从1μg总RNA来合成cDNA。以下的实验中,使用cDNA作为模板。
为了制备人嵌合型PMab-117(chPMab-117),通过PCR扩增编码PMab-117的VH区域的DNA,组入至保持了编码人IgG1的CH1、铰链区、CH2、CH3区域的DNA的pCAG载体(pCAG-CHhG1/PMab-117HVH(G418))。另外,通过PCR扩增编码PMab-117的VL区域的DNA,组入至保持了编码人kappa链的CK区域的DNA的pCAG载体(pCAG-hIgCKb/PMab-117LVL(博来霉素))。
H链的扩增中使用了以下的引物。
InF.HindIII-chP117H:CGGTATCGAT AAGCTTAGTA TGTTGGTGCT GCAG(序列号17)
InFr.chP117HVH-BamHI:GGCCCTTGGT GGATCCTGAA GAGACAGTGA CCAG(序列号18)
L链的扩增中使用了以下的引物。
InF.HindIII-P117L:CGGTATCGATAAGCTTAAAATGAAAGTGCCTGTTAG(序列号19)
InFr.chP117LVL-BamHI:ATGGTGCAGCGGATCCCCGTTTTATTTCCAACTTC(序列号20)
PCR反应中使用了QIAGEN HotStar HiFidelity Polymerase Kit(QIAGEN K.K.)。温度条件如下:最初为95℃、5分钟;然后为35个下述循环:94℃、15秒,50℃、1分钟,72℃、1分钟;最后为72℃、10分钟。扩增得到的PCR产物使用QIAGEN PCR purification kit进行纯化,由载体引物确定碱基序列。
从碱基序列预测氨基酸序列。将chPMab-117的重链DNA序列、轻链DNA序列、重链氨基酸序列及轻链氨基酸序列作为序列号13、14、8及9示于图3~图6。
<PMab-117的CDR>
PMab-117的重链CDR1~3及轻链CDR1~3的氨基酸序列如序列号2~7所示。
重链CDR1:GFTFSNAAMY(序列号2)
重链CDR2:RIRSKPNNYATYYTDSVKG(序列号3)
重链CDR3:TVGGNNYAAAY(序列号4)
轻链CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLE(序列号5)
轻链CDR2:KVSNRFS(序列号6)
轻链CDR3:FQVTHDPFT(序列号7);
4.利用chPMab-117的流式细胞术
通过流式细胞术调查了人嵌合型PMab-117(chPMab-117)针对平足蛋白表达株的反应性。首先,使chPMab-117(10μg/mL)与表达了人平足蛋白的各种细胞株于4℃反应30分钟,进而,使抗大鼠IgG-Oregon Green抗体(Thermo Fisher Scientific,Inc.)、抗人IgG-FITC抗体(Thermo Fisher Scientific,Inc.)分别于4℃反应30分钟。作为阴性对照,仅使用了二抗。
使用EC800(Sony公司)测定了荧光强度。结果示于图7。
chPMab-117对于胶质母细胞瘤(LN319)、肺癌(PC-10)等的癌细胞上的平足蛋白显示出高反应性,但完全不与平足蛋白高水平表达的肾上皮细胞(HEK-293T)反应。与PMab-117的结果(图2)同样地,表明chPMab-117为癌特异性抗体。
5.小鼠嵌合型PMab-117(chPMab117-mG2a)的制备
将PMab-117的H链和L链的可变区和小鼠IgG2a的恒定区组入至pCAG载体(InvivoGen公司),制备小鼠嵌合型PMab-117(chPMab117-mG2a)的表达质粒。
H链的扩增中使用了以下的引物。
InF.HindIII-chP117H:CGGTATCGAT AAGCTTAGTATGTTGGTGCT GCAG(序列号17)
InFr.P117HVH-mG2a:GGCTGTTGTTTTGGCTGAAG AGACAGTGAC CAGA(序列号21)
L链的扩增中使用了以下的引物。
InF.HindIII-P117L:CGGTATCGATAAGCTTAAAATGAAAGTGCCTGTTAG(序列号19)
InF.mIgCKter-NotI:TCTAGAGTCG CGGCCGCCTA ACACTCATTC CTGT(序列号22)
将chPMab117-mG2a的重链DNA序列、轻链DNA序列、重链氨基酸序列及轻链氨基酸序列作为序列号15、16、10及11示于图8~图11。
6.利用chPMab117-mG2a的流式细胞术
利用脂质体转染法将chPMab117-mG2a的H链、L链的质粒导入ExpiCHO细胞株(Thermo Fisher Scientific,Inc.),在培养上清液中使chPMab117-mG2a的重组抗体表达。在自导入基因起2天后回收培养上清液,使其与LN319细胞于4℃反应30分钟,进而使抗小鼠IgG-FITC抗体(Thermo Fisher Scientific,Inc.)于4℃反应30分钟。作为阴性对照,仅使用了二抗。
使用细胞分析仪EC800(Sony公司)测定了荧光强度。结果示于图12。
chPMab117-mG2a与chPMab117同样地,对于胶质母细胞瘤细胞(LN319)的平足蛋白显示出高反应性。
7.PMab-117的表位解析-1
获知了PMab-117为癌特异性抗体(CasMab),因此,对其识别序列(表位)进行了分析。
人平足蛋白的N末端缺失突变体如下所述。
dN23:N末端为第23位的氨基酸的全长平足蛋白
dN37:N末端为第37位的氨基酸的缺失突变体
dN46:N末端为第46位的氨基酸的缺失突变体
dN55:N末端为第55位的氨基酸的缺失突变体
dN65:N末端为第65位的氨基酸的缺失突变体
dN75:N末端为第75位的氨基酸的缺失突变体
dN85:N末端为第85位的氨基酸的缺失突变体
dN95:N末端为第95位的氨基酸的缺失突变体
使PMab-117(培养上清液)、chPMab-117(10μg/mL)与这些缺失突变体于4℃反应30分钟,进而使抗大鼠IgG-Oregon Green抗体(Thermo Fisher Scientific,Inc.)、抗人IgG-FITC抗体(Thermo Fisher Scientific,Inc.)分别于4℃反应30分钟。作为阴性对照,仅使用了二抗。
使用EC800(Sony公司)测定了荧光强度。结果示于图13及图14。
由于反应性在dN85(N末端为第85位的氨基酸的缺失突变体)消失,因此可知PMab-117的表位的N末端起始于第75位~第85位之间。
8.PMab-117的表位解析-2
使PMab-117(培养上清液)、chPMab-117(10μg/mL)与人平足蛋白的各种糖链异常株于4℃反应30分钟,进而使抗大鼠IgG-Oregon Green抗体(Thermo Fisher Scientific,Inc.)、抗人IgG-FITC抗体(Thermo Fisher Scientific,Inc.)分别于4℃反应30分钟。作为阴性对照,仅使用了二抗。
使用EC800(Sony公司)测定了荧光强度。结果示于图15。
由于针对人平足蛋白的唾液酸缺陷株、半乳糖缺陷株的反应消失,因此可知在PMab-117的表位中包含附加于O型糖链的唾液酸。
9.PMab-117的表位解析-3
使PMab-117(培养上清液)、chPMab-117(10μg/ml)与第75位以后的全部Ser/Thr取代为丙氨酸的人平足蛋白于4℃反应30分钟,进而使抗大鼠IgG-Oregon Green抗体(ThermoFisher Scientific,Inc.)、抗人IgG-FITC抗体(Thermo Fisher Scientific,Inc.)分别于4℃反应30分钟。作为阴性对照仅使用了二抗,作为阳性对照使用了NZ-12。
使用EC800(Sony公司)测定了荧光强度。结果示于图16。
对于T85A,PMab-117的反应性消失。因此,表明在PMab-117的表位中包含Thr85。
10.PMab-117的表位解析-4
使PMab-117(10μg/mL)、chPMab-117(10μg/mL)与第77位至第89位的全部氨基酸取代为丙氨酸的人平足蛋白于4℃反应30分钟,进而使抗大鼠IgG-Oregon Green抗体(ThermoFisher Scientific,Inc.)、抗人IgG-FITC抗体(Thermo Fisher Scientific,Inc.)分别于4℃反应30分钟。作为阴性对照仅使用了二抗,作为阳性对照使用了NZ-12。
使用EC800(Sony公司)测定了荧光强度。结果示于图17。
对于I78A、I80A、D82A、T85A,PMab-117的反应性消失,对于E81A,PMab-117的反应性减弱。另外,对于I78A、I80A、E81A、D82A、T85A,chPMab-117的反应性消失。因此,表明在PMab-117的表位中包含Ile78、Ile80、Glu81、Asp82、Thr85这5个氨基酸。
根据图15,在PMab-117的表位中包含含唾液酸的O型糖链,进而,根据图16,在PMab-117的表位中包含人平足蛋白的Thr85,因此,表明在PMab-117的表位中,附加有含有唾液酸的O型糖链的Thr85是必需的。此外,将Thr85周边的氨基酸替换为丙氨酸,对PMab-117、chPMab-117、NZ-12的反应性进行了调查。根据图17,判明了就PMab-117的表位而言,Ile78、Ile80、Glu81、Asp82、Thr85这5个氨基酸是特别重要的。
由以上可知,人平足蛋白的含有Thr85的糖肽是显示癌特异性的重要靶标。
产业上的可利用性
本发明涉及的抗平足蛋白抗体及其抗原结合片段可用作医药、诊断剂及试剂,具有产业上的可利用性。
序列表自由文本
序列号1表示人平足蛋白的氨基酸序列。
序列号2表示PMab-117的重链CDR1的氨基酸序列。
序列号3表示PMab-117的重链CDR2的氨基酸序列。
序列号4表示PMab-117的重链CDR3的氨基酸序列。
序列号5表示PMab-117的轻链CDR1的氨基酸序列。
序列号6表示PMab-117的轻链CDR2的氨基酸序列。
序列号7表示PMab-117的轻链CDR3的氨基酸序列。
序列号8表示chPMab-117的重链氨基酸序列。
序列号9表示chPMab-117的轻链氨基酸序列。
序列号10表示chPMab117-mG2a的重链氨基酸序列。
序列号11表示chPMab117-mG2a的轻链氨基酸序列。
序列号12表示相当于序列号1表示的人平足蛋白的氨基酸序列的第78位至第85位的区域的氨基酸序列。
序列号13表示chPMab-117的重链DNA序列。
序列号14表示chPMab-117的轻链DNA序列。
序列号15表示chPMab117-mG2a的重链DNA序列。
序列号16表示chPMab117-mG2a的轻链DNA序列。
序列号17表示用于H链的扩增的引物InF.HindIII-chP117H。
序列号18表示用于H链的扩增的引物InFr.chP117HVH-BamHI。
序列号19表示用于L链的扩增的引物InF.HindIII-P117L。
序列号20表示用于L链的扩增的引物InFr.chP117LVL-BamHI。
序列号21表示用于H链的扩增的引物InFr.P117HVH-mG2a。
序列号22表示用于L链的扩增的引物InF.mIgCKter-NotI。
Claims (13)
1.癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段,其在序列号1表示的人平足蛋白的氨基酸序列中的包含Thr85的区域具有表位,且Thr85附加有含有唾液酸的O型糖链。
2.如权利要求1所述的癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段,其在序列号1表示的人平足蛋白的氨基酸序列中的第78位至第85位的区域(IRIEDLPT)具有表位。
3.癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段,其具有以下的6个CDR的氨基酸序列中的至少1者,或者
具有在以下的6个CDR的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失的氨基酸序列中的至少1者,或者
具有与以下的6个CDR的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列中的至少1者:
重链CDR1:GFTFSNAAMY(序列号2)
重链CDR2:RIRSKPNNYATYYTDSVKG(序列号3)
重链CDR3:TVGGNNYAAAY(序列号4)
轻链CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLE(序列号5)
轻链CDR2:KVSNRFS(序列号6)
轻链CDR3:FQVTHDPFT(序列号7)。
4.癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段,其包含:
包含序列号8或10表示的氨基酸序列的重链;
包含下述氨基酸序列的重链,所述氨基酸序列在序列号8或10表示的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失;
包含与序列号8或10表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列的重链;
包含序列号9或11表示的氨基酸序列的轻链;
包含下述氨基酸序列的轻链,所述氨基酸序列在序列号9或11表示的氨基酸序列中包含1个至多个氨基酸的添加、取代或缺失;或者
包含与序列号9或11表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列的轻链。
5.如权利要求1至4中任一项所述的癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段,其中,在Fc区域结合有1个以上的N型糖链,在所述N型糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺上未结合有岩藻糖。
6.核酸,其编码权利要求3或4中记载的氨基酸序列中的任一者。
7.表达载体,其含有权利要求6所述的核酸。
8.转化体,其含有权利要求7所述的表达载体。
9.医药组合物,其含有权利要求1至5中任一项所述的癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段作为有效成分。
10.医药组合物,其含有结合了具有抗癌活性的物质的权利要求1至5中任一项所述的癌细胞特异性抗平足蛋白抗体或其抗原结合片段作为有效成分。
11.如权利要求9或10所述的医药组合物,所述医药组合物为肿瘤的预防或治疗剂。
12.人平足蛋白,其具有序列号1表示的氨基酸序列,且于Thr85附加有含有唾液酸的O型糖链。
13.糖肽,其具有以下的氨基酸序列,且于Thr附加有含有唾液酸的O型糖链:
IRIEDLPT。
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