WO2017010463A1 - 抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体、ＣＬＥＣ－２との結合に必要なＡｇｇｒｕｓの領域、及びＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤のスクリーニング方法 - Google Patents

抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体、ＣＬＥＣ－２との結合に必要なＡｇｇｒｕｓの領域、及びＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤のスクリーニング方法 Download PDF

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貴哉 関口
高木　聡
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Definitions

  • the present invention relates to an Aggrus region involved in binding between Aggrus and CLEC-2, and an antibody that recognizes the region.
  • the present invention relates to an Aggrus-CLEC-2 binding inhibitor containing a peptide containing the region of Aggrus and a monoclonal antibody, and a pharmaceutical composition containing the same. Furthermore, it is related with the screening method of the pharmaceutical which uses the coupling
  • Cancer is a disease characterized by the random growth of cells, but the major factor that governs cancer mortality is growth in the metastatic focus rather than in the primary focus where the cancer has occurred. is there. It is said that the 5-year survival rate of patients actually diagnosed with metastatic cancer is 20% or less, and suppression of cancer metastasis has become a major clinical issue.
  • Non-Patent Document 1 It has long been clinically recognized that cancer cell-dependent platelet aggregation is involved in hematogenous metastasis of cancer.
  • the inventor's group established a highly metastatic cancer cell line exhibiting platelet aggregation-inducing activity, and identified the factor Aggrus that induces platelet aggregation expressed on the cell membrane surface of the highly metastatic cancer cell line (patent) Document 1, Non-Patent Document 1).
  • Platelet aggregation-promoting factor Aggrus (also known as podoplanin, gp44, T1 ⁇ , etc.) is a type I transmembrane protein and has various types such as squamous cell carcinoma, mesothelioma, Kaposi's sarcoma, testicular tumor, brain tumor, or bladder cancer It is known that expression increases in cancer (Non-Patent Documents 2 to 13).
  • Non-patent Document 14 a C-type lectin-like receptor (CLEC-2) expressed on platelets is one of the Aggrus counterpart receptors. It is known that when CLEC-2 binds to Aggrus expressed on tumor cells, platelet aggregation signals are activated in platelets without plasma components, and platelet aggregation is induced. That is, it is considered that a substance that inhibits the binding between Aggrus and CLEC-2 suppresses platelet aggregation and suppresses metastasis of cancer. Therefore, a substance that inhibits the binding between Aggrus and CLEC-2 is expected to be applied to the treatment of cancer and thrombosis.
  • CLEC-2 C-type lectin-like receptor expressed on platelets
  • Monoclonal antibodies can specifically bind to cell surface antigens and cause an immunological response to target cells. Using this reaction, many monoclonal antibodies are used for cancer treatment and immune disease treatment. Monoclonal antibodies are mediated through three typical modes of action: neutralization, antibody-dependent cytotoxicity (ADCC), and complement-dependent cytotoxicity (CDC). Shows therapeutic effect.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • the P2-0 and MS-1 antibodies which inhibit the binding of Aggrus-CLEC-2, are both antibodies that recognize amino acids in the PLAG domain (Platelet-Aggregation stimulating domain) region as epitopes It is.
  • the PLAG domain is an amino acid sequence having a common sequence of EDXXVTPG that is conserved across human, mouse and rat species.
  • the PLAG domain is an amino acid sequence that is repeated three times from PLAG1 to PLAG3 in an adjacent region, and in the case of human Aggrus, it exists in the 29th to 54th region of the amino acid sequence.
  • PLAG domain exists extracellularly and is involved in platelet aggregation activity.
  • sialic acid added to the 52nd threonine in addition to 47th glutamic acid and 48th aspartic acid of Aggrus is 107 to 157 of CLEC-2. It is shown that it binds to four arginines present in the second region (Non-patent Document 16).
  • the P2-0 and MS-1 antibodies created by the present inventors also recognize the 45th to 49th regions of the amino acid sequence of Aggrus overlapping with this Aggrus-CLEC-2 binding region as an epitope.
  • the MS-3 and MS-4 antibodies recognize the 54th to 61st region of the amino acid sequence of Agrus adjacent to the Aggrus-CLEC-2 binding region as an epitope.
  • the present inventors disclose that the interaction between Aggrus and CLEC-2 is inhibited, platelet aggregation is suppressed, and cancer metastasis is further suppressed by monoclonal antibodies and low molecular weight compounds against Aggrus.
  • Patent Documents 2 and 3 these monoclonal antibodies and low molecular weight compounds have the effect of delaying the platelet aggregation start time, but could not completely inhibit platelet aggregation by Aggrus. That is, it is suggested that the binding site between Aggrus and CLEC-2 may exist in a region other than the known PLAG domain.
  • An object of the present invention is to search for a new domain involved in the binding between Aggrus and CLEC-2 and to obtain a monoclonal antibody that binds to the domain. It is another object of the present invention to provide a screening method for a compound that suppresses cancer growth and metastasis and platelet aggregation by searching for a compound that binds to the domain.
  • the present invention includes the following monoclonal antibody that recognizes the Aggrus region, the hybridoma that produces the antibody, the Aggrus region necessary for binding to CLEC-2, the Aggrus-CLEC-2 binding inhibitor, the pharmaceutical composition, and the test reagent
  • the present invention relates to a method for screening an Aggrus-CLEC-2 binding inhibitor.
  • a monoclonal antibody that binds to an Aggrus region consisting of a sequence of at least 5 residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (GIRIEDLPT), or a fragment consisting of a functional fragment thereof.
  • An Aggrus-CLEC-2 binding inhibitor comprising the monoclonal antibody according to any one of (1) to (3) or a fragment comprising a functional fragment thereof.
  • at least one fragment comprising a monoclonal antibody recognizing an epitope present in the region represented by SEQ ID NO: 2 (GAEDDVVTPGTSEDRYK), a chimeric antibody thereof, a humanized antibody thereof, and / or a functional fragment thereof is included.
  • the Aggrus-CLEC-2 binding inhibitor according to (5) which is characterized in that (7)
  • the monoclonal antibody that recognizes an epitope present in the region of SEQ ID NO: 2 is P2-0, MS-1, MS-3, and / or MS-4 (6) Aggres-CLEC-2 binding inhibitors.
  • composition for platelet aggregation inhibition, thrombus inhibition, cancer progression / metastasis inhibition, anti-inflammation comprising the monoclonal antibody or the functional fragment thereof according to any one of (1) to (3) object.
  • at least one fragment comprising a monoclonal antibody recognizing an epitope present in the region represented by SEQ ID NO: 2 (GAEDDVVTPGTSEDRYK), a chimerized antibody, a humanized antibody, and / or a functional fragment thereof The pharmaceutical composition according to (8).
  • the monoclonal antibody that recognizes an epitope present in the region of SEQ ID NO: 2 is P2-0, MS-1, MS-3, and / or MS-4 (9) Pharmaceutical composition.
  • a test reagent for detecting Aggrus expression comprising the monoclonal antibody according to any one of (1) to (3) or a fragment comprising a functional fragment thereof.
  • An Aggrus-CLEC-2 binding inhibitor comprising a peptide comprising the region of (12) or (13).
  • a pharmaceutical composition for platelet aggregation inhibition, thrombus inhibition, cancer progression / metastasis inhibition, anti-inflammation comprising as an active ingredient a peptide comprising the region of (12) or (13).
  • a screening method for a CLEC-2 / Aggrus binding inhibitor using as an index the binding to an Aggrus epitope comprising at least 5 residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (GIRIEDLPT) An inhibitor screening method characterized by the above.
  • the screening method according to (16), wherein binding to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (RIEDL) is used as an index.
  • a screening method for a binding inhibitor of CLEC-2 and Aggrus wherein the binding to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (EDXXTS) is used as an index.
  • the present inventors have found a new PLAG domain necessary for the binding of Aggrus and CLEC-2, and have thus obtained a new monoclonal antibody that binds to the region.
  • a monoclonal antibody that binds to this region strongly inhibits the binding between Aggrus and CLEC-2, and is therefore expected to be effective in the treatment of cancer and thrombosis. Furthermore, it becomes possible to screen for anticancer agents targeting new PLAG domains.
  • the figure which shows a PLAG domain deletion mutant typically.
  • the figure which shows the epitope analysis of an anti-Aggrus monoclonal antibody The figure which shows the reactivity of the antibody with respect to Aggrus expressed in the mammalian cell. The figure which shows the reactivity of the anti-Aggrus monoclonal antibody with respect to an Aggrus expression cell.
  • the anti-Aggrus monoclonal antibody or functional fragment of the present invention refers to an antibody that recognizes as a epitope a region that overlaps with the newly discovered Aggres PLAG4 domain, and the functional fragment is substantially different from the original antibody.
  • the monoclonal antibody against Aggrus of the present invention includes the National Institute for Product Evaluation and Technology, Patent Microorganism Depositary Center (NITE-NPMD (292-0818, 2-5-8, Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan), Room 122 ) Include monoclonal antibodies produced by hybridomas deposited on July 14, 2015 as NITE P-02070 and NITE P-02071, and other antibodies having binding specificity equivalent to these are also available.
  • the anti-Aggrus monoclonal antibody of the present invention is preferred.
  • the monoclonal antibody is not only an antibody produced by the obtained hybridoma, but also a human chimeric antibody (hereinafter, referred to as a chimerized antibody) produced using a gene recombination technique. ), Or a human CDR (Complementarity Determining Region) transplanted antibody (hereinafter sometimes referred to as a humanized antibody), etc. Shall be included.
  • the variable region of an antibody (hereinafter sometimes referred to as V region) is an antibody of an animal other than a human, and the constant region (hereinafter also referred to as C region) is a human antibody. It refers to an antibody (Non-patent Document 17).
  • the human CDR-grafted antibody is an antibody obtained by grafting the CDR amino acid sequence in the V region of an antibody of a non-human animal into an appropriate position of the human antibody (Non-patent Document 18).
  • chimerized antibodies and humanized antibodies When administered to humans, chimerized antibodies and humanized antibodies have fewer side effects than those of non-human animals, and their therapeutic effects last for a long time.
  • chimerized antibodies and humanized antibodies can be prepared as molecules of various forms using gene recombination techniques. A known method can be used for producing a chimerized antibody or a humanized antibody from a monoclonal antibody.
  • Functional fragments of antibodies include functional fragments of antibodies such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , single chain antibodies (scFv), disulfide stabilized V region fragments (dsFv), or peptides containing CDRs. included.
  • a functional fragment of an antibody can be obtained by a known method such as digestion with an enzyme such as pepsin or papain.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition used as an Aggrus-CLEC-2 binding inhibitor, platelet aggregation inhibitor, or anticancer agent containing a monoclonal antibody or a fragment thereof.
  • Platelet aggregation inhibitors can be used, for example, to treat thrombosis such as cerebral infarction or myocardial infarction.
  • As an anticancer agent it can be used not only as a cancer metastasis inhibitor but also for suppressing cancer progression and inflammation caused by cancer.
  • Cancer is a cancer that has increased expression of the Aggrus molecule so far, ie squamous cell carcinoma, fibrosarcoma, mesothelioma, Kaposi's sarcoma, testicular tumor, brain tumor, or bladder cancer It can be expected to work suitably.
  • a peptide or antibody drug for example, it is generally used as an injection that is a parenteral.
  • a compound obtained by screening it can be administered not only as an injection but also as an oral or parenteral agent.
  • oral preparations include tablets, powders, pills, powders, granules, soft / hard capsules, film coating agents, pellets, sublingual agents, and pastes.
  • parenterals include suppositories, transdermal agents, ointments, external liquids, and the like.
  • the anti-Aggrus antibody of the present invention when used as an active ingredient, it can be contained at 0.1 to 99.9% by weight in the preparation.
  • the dose of the active ingredient of the drug can be determined appropriately depending on the administration subject, target organ, symptom, and administration method.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., but for example, in the form of an injection, It is suitable to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection.
  • the final decision can be made based on the judgment of the doctor in consideration of the age, weight, symptoms, etc. of the patient.
  • the present inventors have already obtained a monoclonal antibody that recognizes the 45th to 61st region (SEQ ID NO: 2) of Aggrus, which is a region containing PLAG2 and PLAG3 of Aggrus, as an epitope as described above.
  • SEQ ID NO: 2 a monoclonal antibody that recognizes the 45th to 61st region of Aggrus, which is a region containing PLAG2 and PLAG3 of Aggrus, as an epitope as described above.
  • P2-0 that recognizes the 45th to 49th region of Aggrus, and MS-1 antibody, MS-3 antibody that recognizes the 53th to 58th region, and MS that recognizes the 53th to 61st region -4 antibody.
  • the present inventors have already disclosed that the chimerized P2-0 antibody has an effect of suppressing cancer metastasis in an experimental system using a mouse model (Patent Document 2).
  • a chimeric or humanized antibody When the monoclonal antibody to be applied is clinically applied, a chimeric or humanized antibody may be used. By using at least any one of these monoclonal antibodies in combination with the antibody of the present invention, it can be expected to produce a higher effect. By using the two types of antibodies used in combination as chimerized antibodies and humanized antibodies, a stronger effect can be expected when applied to the treatment of thrombosis and cancer.
  • the antibody recognizing Aggrus of the present invention can be used for cancer testing. It is already known that Aggrus expression is involved in hematogenous metastasis of cancer. Therefore, prognosis can be predicted by detecting the expression of Aggrus in cancer tissue or cancer cells circulating in the blood using the antibody of the present invention. Confirmation of Aggrus expression in cancer tissues or cancer cells can be performed using a known immunoassay method such as ELISA or FACS using the antibody of the present invention. Furthermore, if it is a cancer expressing Aggrus, the therapeutic effect by a medicine containing the antibody of the present invention as an effective component can be expected.
  • An object of the screening method of the present invention is to search for a substance that inhibits the binding between Aggrus and CLEC-2 and provide a compound that suppresses platelet aggregation and cancer metastasis.
  • the screening method of the present invention can be performed as follows. A compound that interacts with the amino acid sequence of Agrus involved in binding to CLEC-2 newly identified in the present invention is searched using a compound array or compound library.
  • a sequence of at least 5 residues of GIRIEDLPT (SEQ ID NO: 1) recognized by the antibody of the present invention, in particular, an antibody exhibiting high binding strength is obtained. It is preferable to use RIEDL (SEQ ID NO: 3), which is the defined region.
  • PLAG4 domain PLAG consensus sequence EDXXTS (SEQ ID NO: 4) may be used. Since the Aggrus region involved in binding to CLEC-2 is a short region, a synthetic peptide may be used, or a recombinant containing the region may be expressed in Escherichia coli or animal cells.
  • P2-0, MS-1, MS-3 or MS-4 antibody is reacted with wild-type Aggrus expressed in Escherichia coli or animal cells to mask this site, and the novel Aggrus according to the present invention can be masked. It is also possible to bind to CLEC-2 only in the CLEC-2 binding region found in (1). Peptides and recombinants bound to the compound can be detected using the anti-Aggrus monoclonal antibody of the present invention. The above method is an exemplification, and it goes without saying that a known screening method may be applied.
  • a sugar chain can be added to a peptide containing a region recognized by an antibody and used as a binding inhibitor between Aggrus and CLEC-2.
  • the sugar chain can be imparted by a known method such as imparting a human-type sugar chain using yeast (Non-patent Document 19).
  • Verification inventors' recognition site for neutralizing antibodies reported already, inhibits the binding of CLEC-2, platelet aggregation inhibitory action, and discloses an anti Aggrus monoclonal antibody of cancer metastasis inhibitory action (Patent Document 2, Non-Patent Document 20).
  • the epitopes of these monoclonal antibodies were antibodies that recognize the region spanning the PLAG2 and PLAG3 domains.
  • the recognition sites of these neutralizing antibodies were verified.
  • the following plasmids were introduced into Chinese Hamster Overy (CHO) cells to express human Aggrus and Aggrus mutants.
  • the human Aggrus gene was amplified by PCR using a wild-type Aggrus cDNA (GenBank No. AB127958.1) and the vector was pcDNA3 (manufactured by Life Technologies), and cloned.
  • the constructs used for examining the recognition site of the neutralizing antibody are as follows. Only pcDNA3 vector not incorporating gene (mock), plasmid (Aggrus-WT) incorporating wild type human Aggrus cDNA, plasmid incorporating Aggrus cDNA in which 45th glycine is substituted with alanine (Aggrus-G45A), 48th A plasmid (Aggrus-D48A) in which Aggruss cDNA in which aspartic acid was substituted with alanine was incorporated, and a plasmid (Aggrus-D49A) in which 49th aspartic acid was substituted in alanine were constructed and introduced into CHO cells. The protein was stably expressed.
  • CHO / mock The CHO cells into which each plasmid has been introduced are hereinafter referred to as CHO / mock, CHO / Aggrus-WT, CHO / Aggrus-G45A, CHO / Aggrus-D48A, and CHO / Aggrus-D49A.
  • a cell lysate was prepared from each cell, and Western blot analysis was performed using four types of anti-Aggrus monoclonal antibodies D2-40, MS-1, P2-0, and NZ-1.
  • the D2-40 antibody (AbD manufactured by Serotec) is a mouse monoclonal antibody having no Aggrus neutralizing activity
  • the MS-1 antibody and the P2-0 antibody are mouse monoclonal antibodies having neutralizing activity created by the present inventors. is there.
  • the NZ-1 antibody (manufactured by AngioBio) is a rat monoclonal antibody having an Aggrus neutralizing activity. The results are shown in FIG. 1A.
  • the D2-40 antibody having no Aggrus neutralizing activity recognized all of the introduced wild-type and 1-amino acid substituted Aggrus proteins. That is, a signal is observed in cells other than CHO / mock. In addition, it was confirmed that the protein expression levels were almost the same in the wild type Aggrus and the Aggrus mutant. In addition, it is clear from the result (FIG. 1A) of the Western blot analysis using the antibody which recognizes (alpha) -tubulin that the amount of proteins in the electrophoresed cell lysate is the same.
  • the MS-1 antibody and the P2-0 antibody recognize wild-type Aggrus but weakly recognize 1-amino acid-substituted Aggrus protein, Aggrus-G45A, Aggrus-D48A, and Aggrus-D49A. It turns out to be essential.
  • neither the P2-0 antibody nor the MS-1 antibody can recognize D48A in which the 48th aspartic acid is substituted with alanine. It was suggested that the 48th aspartic acid in the PLAG domain is important for antibody recognition.
  • rat monoclonal antibody NZ-1 antibody having neutralizing activity of Aggrus is also weak in recognition of single amino acid substitution type Aggrus protein. Therefore, in order to exert neutralizing activity, it was suggested that the region from the 45th to the 49th region of Aggruss into which the mutation was introduced, that is, the region from PLAG2 to PLAG3 (see FIG. 1B) is important.
  • the reactivity with CLEC-2 was examined as follows.
  • the transgenic strain was prepared to a cell density of 1.5 ⁇ 10 5 cells / ml in the same manner, (His) 10-tagged recombinant CLEC-2 protein; was added (rCLEC-2 R & D Systems) For 30 minutes on ice. After washing with PBS, a fluorescently labeled secondary antibody (QIAGEN) that recognizes the His tag was added, and the mixture was further reacted on ice for 30 minutes.
  • the (His) 10- tagged recombinant CLEC-2 protein was purified from mammalian cells and modified with sugar chains. The cells were washed three times with PBS, and similarly analyzed with Cytomics FC500 (FIG. 2A, right panel, open mountain). The control is the result of adding PBS instead of the (His) 10- tagged recombinant CLEC-2 protein and performing the same operation as above (FIG. 2A right panel, black-filled mountain).
  • FIG. 2A left panel Expression of Aggrus and Aggrus mutant protein is shown in FIG. 2A left panel, and binding to CLEC-2 is shown in FIG. 2A right panel.
  • a white peak in the left panel of FIG. 2A shows the result of staining wild-type Aggrus or an Aggrus mutant with the D2-40 antibody.
  • the black-filled mountain shows the result of the control mouse antibody. Since the fluorescence intensity at the position of the apex indicated by the white peak in the left panel of FIG. 2A is almost the same, it was confirmed that the expression levels on the cell membrane in each gene-transfected strain of Aggrus protein were almost identical .
  • FIG. 2A right panel is an analysis of whether recombinant CLEC-2 binds to cells expressing wild type or 1 amino acid substitution type Aggrus.
  • the white peaks indicate the results of detection of wild-type Aggrus expressed on the surface of CHO cells or recombinant CLEC-2 bound to the Aggrus mutant with an anti-His antibody.
  • the black-filled mountain shows the result of the control in which only PBS was added instead of the CLEC-2 protein.
  • D48E (CHO / Aggrus-D48E), in which the 48th aspartic acid is replaced with glutamic acid, which is the same acidic amino acid, binds CLEC-2 in the same manner as the wild type (CHO / Aggrus-WT).
  • CHO / Aggrus-WT wild type
  • D48N (CHO / Aggrus-D48N)
  • D48A mutant (CHO / Aggrus-D48A) substituted with neutral amino acids.
  • CLEC-2 is a receptor on platelets that binds to Aggrus. Aggrus transmits a platelet aggregation-inducing signal by binding to CLEC-2 on platelets.
  • the D48A mutant (CHO / Aggrus-D48A), whose binding to CLEC-2 was weakened, was expected to have a weak platelet aggregation-inducing activity, and was confirmed by a platelet aggregation inhibition test.
  • analysis was performed using MCM HEMA TRACER 313M (manufactured by MC Medical). The analysis method is an in vitro platelet aggregation analysis method using mouse washed platelets by monitoring light transmittance.
  • CHO / mock cells have no activity to induce platelet aggregation, but CHO / Aggrus-WT in which wild-type Aggrus is expressed begins aggregation about 6 minutes after mixing with platelets. It was done.
  • CHO / Aggrus-D48A with weak binding power to CLEC-2 and platelets are mixed, aggregation is observed only after about 14 minutes, and the start of platelet aggregation is delayed by about 8 minutes.
  • FIG. 2A supports the result of FIG. 2A that the binding force with CLEC-2 was weakened, and the binding to CLEC-2 involved sites other than the PLAG3 domain that had been identified so far. This suggests the possibility that platelet aggregation is induced by binding to CLEC-2 via the site.
  • FIG. 3A shows a sequence of highly homologous portions of the Aggrus protein of each animal.
  • the sequence of Aggrus protein of each animal is GenBank accession No. shown in FIG. Depending on the array.
  • FIG. 3B shows the consensus sequence of PLAG domain (SEQ ID NO: 15) and the sequences of PLAG1 to PLAG4 (SEQ ID NOs: 16 to 19).
  • Human PLAG4 preserved the highly conserved glutamic acid reported to be involved in binding to CLEC-2, followed by the ED sequence of aspartic acid, and threonine T, which is a glycosylation site. However, the difference was found that the number of amino acids between the ED sequence and T was 2 amino acids instead of the 3 amino acids identified so far in the PLAG4 domain.
  • a plasmid in which human Aggrus cDNA in which the 82nd aspartic acid which is an amino acid in the PLAG4 region is substituted with alanine is incorporated into a pcDNA3 vector, the 48th aspartic acid and the 82nd aspartic acid
  • Both plasmids (Aggrus-D48A / D82A) incorporating human Aggrus cDNA substituted with alanine were introduced into CHO cells to stably express the protein.
  • the CHO cells into which each plasmid has been introduced are hereinafter referred to as CHO / Aggrus-D82A and CHO / Aggrus-D48A / D82A.
  • Cell lysates were prepared from CHO / mock, CHO / Aggrus-WT, CHO / Aggrus-D48A, CHO / Aggrus-D82A, and CHO / Aggrus-D48A / D82A cell lines, respectively.
  • Western blot analysis was performed with D2-40 antibody using each cell lysate. As a result, it was confirmed that the expression of the introduced wild-type and mutant Aggrus proteins was observed in cells other than CHO / mock, and the expression levels were almost uniform (FIG. 4A).
  • the right panel of FIG. 4B shows the analysis of binding to CLEC-2 by the FACS method in the same manner as in Example 2.
  • Open circles indicate that the wild-type Aggrus expressed on the surface of CHO cells, or a 10- tagged recombinant CLEC-2 bound to Aggrus mutant (His) is a fluorescently labeled secondary that recognizes the His tag. The result detected by the antibody is shown.
  • the mountains filled in with black are the results of adding the control mouse antibody instead of the (His) 10- tagged recombinant CLEC-2 protein and performing the same operation as above.
  • Binding of the 82nd aspartic acid with alanine to the D82A mutant (CHO / Aggrus-D82A) with CLEC-2 is the same as the D48A mutant with the 48th aspartic acid substituted with alanine (CHO / Aggrus-D48A). It became clear that it was attenuated more than the coupling
  • PLAG3 role study PLAG4 domain in platelet aggregation PLAG4 was investigated its role in the fact that revealed to play an important role in binding to CLEC-2, then platelet aggregation PLAG4 domain .
  • Aggrus transmits a platelet aggregation-inducing signal by binding to CLEC-2 on platelets.
  • the amino acid mutation in the PLAG4 domain suppresses platelet aggregation or the platelet aggregation-inhibitory test described in Example 2 examined the activity of inducing Aggrus-dependent platelet aggregation. The results are shown in FIG. 4C.
  • each mutant-expressing cell was examined in the same manner as in Example 2.
  • the platelet aggregation-inducing activity of each mutant-expressing cell is proportional to the binding force with CLEC-2, the D82A mutant has a weaker platelet aggregation-inducing activity than the D48A mutant, and the D48A / D82A double mutant induces platelet aggregation It was revealed that there was no activity (FIG. 4C). Therefore, it was revealed that newly identified PLAG4 plays a major role in Aggrus-dependent platelet aggregation.
  • a mutant lacking each of the PLAG1, 3 and 4 domains was introduced into CHO cells. Specifically, a plasmid (Aggrus- ⁇ 29-34) in which the human Aggrus cDNA from which the 29th to 34th amino acids in the PLAG1 region were deleted was inserted into the pcDNA3 vector, and the 47th to 52nd amino acids in the PLAG3 region were deleted.
  • Plasmid (Aggrus- ⁇ 47-52) in which human Aggrus cDNA was incorporated, a plasmid in which human Aggrus cDNA lacking the 81st to 85th amino acids in PLAG4 region was deleted (Aggrus- ⁇ 81-85), 47 in PLAG3 region
  • a plasmid (Aggrus- ⁇ 47-52 / ⁇ 81-85) incorporating human Aggrus cDNA from which amino acids 81 to 85 in the PLAG4 region are deleted is introduced into CHO cells, and the protein is stably Expressed ( (See FIG. 4D).
  • CHO / Aggrus- ⁇ 29-34 The CHO cells introduced with each plasmid are hereinafter referred to as CHO / Aggrus- ⁇ 29-34, CHO / Aggrus- ⁇ 47-52, CHO / Aggrus- ⁇ 81-85, and CHO / Aggrus- ⁇ 47-52 / ⁇ 81-85.
  • control rabbit antibody made by Santa Cruz Biotechnology
  • the white circles indicate the results of staining with the FL-162 antibody to react with the PLAG domain-deleted Aggrus mutant
  • the black circles indicate the results of reacting with the control rabbit antibody instead of the FL-162 antibody.
  • FIG. 4E left panel
  • the expression level on the cell membrane of each of the gene-transfected strains of Aggrus protein is almost the same, indicating that the fluorescence intensity at the apex position indicated by the white mountain in each panel is the same. It was confirmed from the fact that they were almost the same.
  • the right panel of FIG. 4E is an analysis of binding to CLEC-2 by the FACS method in the same manner as in Example 2. Open circles are labeled with a PLAG domain-deleted Aggrus mutant expressed on the surface of CHO cells (His) 10- tagged recombinant CLEC-2 fluorescently labeled secondary antibody that recognizes the His tag The results detected by. Incidentally, blacked mountain is (His) results with the addition of PBS instead of 10 tagged recombinant CLEC-2 protein, were performed similar to the above operation.
  • the interaction with CLEC-2 is similar to the point mutant data shown in FIG. 4B, with the PLAG4 domain deletion mutant (CHO / Aggrus- ⁇ 81-85) binding to the CLEC-2 lacking the PLAG3 domain deficiency. It was revealed that the protein was attenuated more than the binding with the loss mutant (CHO / Aggrus- ⁇ 47-52). Furthermore, it was revealed that the double mutant (CHO / Aggrus- ⁇ 47-52 / ⁇ 81-85) lacking both the PLAG3 domain and the PLAG4 domain does not bind to CLEC-2 at all.
  • the expression level of the Aggrus mutant protein (D48A, D82A, D48A / D82A) is not significantly different (denoted as ns), and the expression level is almost uniform.
  • the graph shows the reactivity of the Aggrus mutant protein with CLEC-2 when the average value of the fluorescence intensity at the position of the apex indicated by the white peak indicating the reactivity with CLEC-2 is 1.
  • the Aggrus expression level and the reactivity with CLEC-2 were quantitatively analyzed in the same manner as described above (FIG. 5B). Confirmation of the expression level of Aggrus using the FACS method performed in Example 4 (see FIG. 4E) and examination of reactivity with CLEC-2 were repeated three times and averaged.
  • the graph shows the expression level of the Aggrus deletion mutant protein when the average value of the fluorescence intensity at the position of the apex indicated by the white peak of CHO / Aggrus-WT is 1.
  • a CHO cell (CHO / Aggrus-E81A) into which a plasmid into which the 81st glutamic acid was substituted with alanine was introduced into the pcDNA3 vector, a plasmid into which the 82nd aspartic acid was substituted with alanine and a plasmid into which the human Aggrus cDNA had been incorporated
  • FACS analysis was performed using the introduced CHO cells (CHO / Aggrus-D82A) and CHO cells (CHO / Aggrus-T85A) into which a plasmid incorporating human Aggrus cDNA in which the 85th threonine was substituted with alanine was introduced.
  • CHO cells (CHO / Aggrus-WT) into which a plasmid incorporating wild-type human Aggrus cDNA was introduced, 47th glutamic acid, 48th aspartic acid, 52nd threonine in the PLAG3 domain (FIG.
  • CHO cells (CHO / Aggrus-E47A, CHO / Aggrus-D48A, CHO / Aggrus-T52A) into which plasmids incorporating human Aggrus cDNA each having 6A (right panel, underlined amino acid) substituted with alanine are also introduced.
  • 6A right panel, underlined amino acid
  • the Aggrus expression level was confirmed by the FACS method and the reactivity with CLEC-2 was examined in the same manner as in Example 2. Similar to FIG. 2, the result of staining the wild-type Aggrus or the Aggrus mutant by reacting the D2-40 antibody with the white mountain is black, and the mountain filled with black is the control mouse antibody ( The result of reacting Sigma) is shown. As shown in FIG. 6A (left panel) and FIG. 6B (left panel), the white levels of each panel indicate that the expression levels of the Aggrus protein on the cell membrane are almost the same. This was also confirmed from the fact that the fluorescence intensity at the apex position was almost the same.
  • FIG. 6A (right panel) and FIG. 6B (right panel) are analysis of the binding of each mutant to CLEC-2 by the FACS method in the same manner as in Example 2.
  • Open circles indicate that the wild-type Aggrus expressed on the surface of CHO cells, or a 10- tagged recombinant CLEC-2 bound to Aggrus mutant (His) is a fluorescently labeled secondary that recognizes the His tag. The result detected by the antibody is shown.
  • blacked mountain is (His) results were added 10 tagged recombinant CLEC-2 control mouse antibody in place of the protein was carried out similar to the above operation.
  • the binding to CLEC-2 of the human Aggrus mutant in which the 47th glutamic acid, the 48th aspartic acid and the 52th threonine in the PLAG3 domain were each substituted with alanine was It was attenuated to the same extent. Therefore, it was confirmed that these three amino acids are involved in the binding to CLEC-2 (FIG. 6A, right panel). Furthermore, the binding to CLEC-2 of the human Aggrus mutant in which the 81st glutamic acid, 82th aspartic acid, and 85th threonine in the PLAG4 domain, which is the homologous site, are each substituted with alanine is found in the wild type and PLAG3 domains.
  • hybridoma producing anti-human Aggrus monoclonal antibody recognizing novel PLAG4 domain was produced as follows.
  • Spleen cells or iliac lymph node cells were collected from immunized mice and fused with mouse myeloma cell line P3U1 using polyethylene glycol 4000 according to the conventional method of hybridoma establishment .
  • Esclone Cloning Medium manufactured by Aedia Co., Ltd.
  • hypoxanthine, aminopterin, and thymidine We succeeded in establishing individual hybridomas.
  • a plurality of hybridomas including 6G42A4 and 9D62D6 were successfully established from iliac lymph node cells.
  • E. coli was transformed with the prepared plasmid and cultured.
  • the reactivity of MS-1, PG4D1, PG4D2, 6G42A4, 9D62D6, and anti-GST (alpha-GST) antibody (manufactured by Abcam) against recombinant human Aggrus protein was examined by Western blotting using E. coli disrupted solution as a sample. .
  • the MS-1 antibody and the anti-GST antibody recognized all Aggrus proteins including the mutants, but the PG4D1 antibody and the PG4D2 antibody were separated from the 79th arginine to the 83rd leucine.
  • the region recognized by the prepared antibody is the 77th to 84th peptide parts (sequence: Gly Ile Arg Ile Glu Asp Leu Pro) indicated by white letters.
  • the minimal epitope recognized by the PG4D1 and PG4D2 antibodies is the 79th to 83rd peptide part (sequence: Arg Ile Glu Asp Leu), and a new PLAG4 domain having homology to the PLAG domain shown in FIG. 3B (It became clear that it partially overlaps with the 81st to 85th sequences (the sequence surrounded by the dotted line in FIG. 7A: Glu Asp Leu Pro Thr).
  • HBS-EP + buffer (GE Healthcare) under the conditions of a flow rate of 25 degrees and 30 ⁇ L / min.
  • the PG4D1 antibody and the PG4D2 antibody are diluted to 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, and 100 nM, and flowed on the sensor chip CM5 on which the Aggrus protein is immobilized to observe the binding reaction, Subsequently, HBS-EP + buffer was allowed to flow for 120 seconds to observe the dissociation reaction. Data obtained by the measurement is shown in FIG. 7B.
  • association rate constant (k a) 3 ⁇ 10 4)
  • dissociation rate constant (k d ) 3 ⁇ 10 4
  • the dissociation rate constant (k d ) was below the measurement limit of Biacore X100 used, that is, the k d value was ⁇ 10 ⁇ 5 . Therefore, the dissociation constant (K D ) of the PG4D1 antibody and the PG4D2 antibody was a value of ⁇ 3 ⁇ 10 ⁇ 10 M, and it was revealed that very strong binding was exhibited.
  • MS-1 antibody almost recognizes human bladder squamous cell carcinoma cell line UM-UC-5 cells and human fibrosarcoma cell line HT1080 cells in which Aggrus expression at the mRNA level is observed. Can not. Therefore, the types of cancer to be treated with MS-1 antibody are limited.
  • PG4D1 antibody and PG4D2 antibody it was investigated whether Aggrus expressed on the surface of UM-UC-5 cells and HT1080 cells that cannot recognize MS-1 antibody can be recognized.
  • UM-UC-5 cells and HT1080 cells were analyzed by FACS using PG4D1 antibody and PG4D2 antibody as primary antibodies and Alexa488-labeled anti-mouse IgG antibody as secondary antibodies. As a result, it was confirmed that the PG4D1 antibody and the PG4D2 antibody can also recognize UM-UC-5 cells and HT1080 cells that could not be recognized by the MS-1 antibody (FIG. 7C).
  • Example 8 Examination of the recognition site and reactivity of the anti-human Aggrus monoclonal antibody recognizing the novel PLAG4 domain
  • the reactivity of human Aggrus protein expressed in E. coli was examined.
  • the regions recognized by the PG4D1 antibody and the PG4D2 antibody are the 77th to 84th peptide portions indicated by white letters (sequence: Gly Ile Arg Ile Glu Asp Leu Pro). It was shown that.
  • the PG4D1 antibody and the PG4D2 antibody did not recognize the Aggrus mutant in which the 81st to 85th 5 amino acids corresponding to the PLAG4 domain were deleted.
  • the PG4D1 antibody does not recognize the D82A-Aggrus mutant in which the 82nd aspartic acid in the PLAG4 domain is substituted with alanine, whereas the PG4D2 antibody weakly recognizes the D82A-Aggrus mutant. It was confirmed.
  • Example 8 since it was not examined whether or not the binding was nonspecific, reaction of PG4D1 antibody (subclass is mouse IgG1) and PG4D2 antibody (subclass is mouse IgG2a) to human Aggrus
  • PG4D1 antibody subclass is mouse IgG1
  • PG4D2 antibody subclass is mouse IgG2a
  • a commercially available purified recombinant Aggrus protein (protein with human IgG1, Fc tag: R & D Systems, Inc.) is immobilized on the sensor chip CM5 that has been subjected to carboxymethyl dextran coating treatment by an amine coupling method.
  • An immobilization amount equivalent to 562.2 RU (for assay of PG4D1 antibody) was obtained.
  • the measurement was performed by filling the flow path with HBS-EP + buffer (GE Healthcare) under the conditions of a flow rate of 25 degrees and 30 ⁇ L / min.
  • control mouse IgG1 (Control IgG1) was diluted to 3.7 nM, 11.1 nM, 33.3 nM, 100 nM, and 300 nM, and flowed onto sensor chip CM5 on which Aggrus protein was immobilized for 60 seconds to perform a binding reaction. Then, HBS-EP + buffer was allowed to flow for 1800 seconds to observe the dissociation reaction. Subsequently, the PG4D1 antibody was flowed under the same conditions using the same sensor chip CM5, and the binding reaction was observed. Data obtained by the measurement is shown in FIG. 8C.
  • Inhibition of binding between Aggrus and CLEC-2 by PG4D1 and PG4D2 antibodies (1) by using the AlphaScreen (TM) method is a homogeneous proximity assay study nonradioactive by AlphaScreen method, the inhibitory effect on the binding of Aggrus and CLEC-2 monoclonal antibody PG4D1, PG4D2 obtained in the present invention was analyzed.
  • Donor Beads converts oxygen to a singlet state and activates a fluorescent substance contained in an acceptor bead close to the oxygen in the singlet state, whereby a fluorescence signal of 615 nm is emitted. That is, CLEC-2 protein with His tag attached to Nickel Chelate AlphaScreen Donor Beads and recombinant Aggrus protein with Fc tag attached to Protein A AlphaLISA Acceptor Beads are close A fluorescent signal is emitted. Therefore, it is possible to quantify the binding state between Aggrus and CLEC-2 by quantifying this fluorescent signal.
  • the added PG4D1, PG4D2, and MS-1 antibodies all inhibit the binding of Aggrus and CLEC-2 in a concentration-dependent manner.
  • PG4D1 antibody and PG4D2 antibody were found to have stronger inhibitory activity than MS-1 antibody.
  • the 6G42A4 and 9D62D6 antibodies also showed activity to inhibit the binding of Aggrus and CLEC-2, but the effect was weaker than that of the MS-1 antibody (FIG. 9B).
  • the region represented by SEQ ID NO: 1 is a region necessary for binding between Aggrus and CLEC-2, and further, SEQ ID NO: 3 (RIEDL) recognized by the PG4D1 antibody and PG4D2 antibody is considered to be the core region thereof. . Therefore, when a peptide containing SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 is synthesized and administered, the binding between CLEC-2 and Aggrus can be inhibited, and the binding between CLEC-2 and Aggrus can be inhibited. If the binding between CLEC-2 and Aggrus can be inhibited, platelet aggregation can be suppressed and cancer progression and metastasis can be suppressed, so that the pharmaceutical composition containing the region as an active ingredient is obtained.
  • SEQ ID NO: 3 RIEDL
  • the peptide necessary for competitive inhibition may be any peptide containing SEQ ID NO: 1 or 3, but it is preferable that the peptide is not so large in consideration of peptide synthesis and action. Specifically, it is preferably a peptide comprising SEQ ID NO: 1 or 3 and having a sequence several to several tens of amino acids longer than these peptides, more preferably the peptide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 itself.
  • CHO / Aggrus-WT cells were collected from the culture vessel, washed with PBS, and then adjusted to a cell density of 1.5 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • mouse control IgG 100 ⁇ g / mL: w / o rCLEC-2 or rCLEC-2 alone sample
  • PG4D1 antibody 100 ⁇ g / mL: PG4D1 + rCLEC-2 sample
  • PG4D2 antibody 100 ⁇ g / mL: PG4D2 + rCLEC
  • MS-1 antibody 100 ⁇ g / mL: MS-1 + rCLEC-2 sample
  • the cells were washed with PBS, and then 0.4 ⁇ g / mL (His) 10- tagged recombinant CLEC-2 protein (rCLEC-2) purified from mammalian cells was applied to samples other than w / or rCLEC-2. Added and allowed to react on ice for 30 minutes. After washing with PBS, a secondary antibody recognizing a fluorescently labeled His tag was added and allowed to react for another 30 minutes on ice. Finally, the cells were washed 3 times with PBS and analyzed with Cytomics FC500. As a result, as shown in FIG.
  • the PG4D1 antibody and the PG4D2 antibody inhibit the binding of rCLEC-2 to the Aggrus-expressing cells in the same manner as the MS-1 antibody, and the inhibitory activity is stronger than that of the MS-1 antibody. Therefore, it was confirmed that the peak was greatly shifted to the left.
  • MS-1 antibody recognizes the region from PLAG2 to PLAG3 domain (see FIG. 1), whereas PG4D1 antibody and PG4D2 antibody recognize the vicinity of PLAG4 domain (see FIG. 7).
  • DyLight594-labeled MS-1 antibody and DyLight594-labeled PG4D2 antibody were prepared. Specifically, the MS-1 antibody and the PG4D2 antibody were fluorescently labeled according to the instructions of DyLight 594 Microscale Antibody Labeling Kit (manufactured by Life Technologies).
  • the CHO / Aggrus-WT cell line is recovered from the culture vessel, washed with PBS, adjusted to a cell density of 1.5 ⁇ 10 5 cells / ml, and added with DyLight594-labeled MS-1 antibody or DyLight594-labeled PG4D2 antibody And reacted on ice for 30 minutes.
  • unlabeled MS-1 antibody or PG4D2 antibody was added when the DyLight594 labeled antibody was added.
  • the cells were washed 3 times with PBS, and then analyzed with Cytomics FC500.
  • the black-filled peaks are the results of reacting each cell with an unlabeled control mouse antibody (manufactured by Sigma) instead of the fluorescently labeled antibody and performing the same operation as above.
  • the DyLight 594 labeling of the MS-1 antibody and the PG4D2 antibody was sufficiently performed, so that the white peak was shifted to the right from the black-filled mountain.
  • the reactivity of DyLight594-labeled MS-1 antibody to CHO / Aggrus-WT cells is inhibited depending on the concentration of the unlabeled MS-1 antibody in the presence of the unlabeled MS-1 antibody (Fig. 10B left panel, middle panel), even when unlabeled PG4D2 antibody was allowed to coexist, it was not inhibited (FIG. 10B left panel, lower panel).
  • the reactivity of DyLight594-labeled PG4D2 antibody to CHO / Aggrus-WT cells is inhibited depending on the concentration of the unlabeled PG4D2 antibody in the presence of the unlabeled PG4D2 antibody (FIG. 10B right panel, (Lower panel), even when unlabeled MS-1 antibody was allowed to coexist, it was not inhibited (FIG. 10B, right panel, middle panel). Therefore, the MS-1 antibody and the PG4D2 antibody recognize PLAG3 and PLAG4 domains, respectively, thereby inhibiting the binding of Aggrus and CLEC-2. In other words, PLAG3 and PLAG4 domains are independently CLEC-2 and It was suggested that it is involved in the binding.
  • the MS-1 antibody and the PG4D2 antibody recognize the PLAG3 and PLAG4 domains and inhibit the binding of CLEC-2, respectively, the MS-1 antibody and the PG4D2 antibody can be used together to obtain Aggrus and CLEC-2.
  • CHO / Aggrus-WT cells were collected from the culture vessel, washed with PBS, and then adjusted to a cell density of 1.5 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • mouse control IgG 100 ⁇ g / mL: sample of w / or rCLEC-2 or rCLEC-2 alone
  • PG4D2 antibody 100 ⁇ g / mL: PG4D2 + rCLEC-2 sample
  • PG4D2 antibody and MS-1 antibody 100 ⁇ g / mL: PG4D2 + MS-1 + rCLEC-2 sample
  • the cells were washed with PBS, and then 0.4 ⁇ g / mL (His) 10- tagged recombinant CLEC-2 protein (rCLEC-2) purified from mammalian cells was applied to samples other than w / or rCLEC-2. Added and allowed to react on ice for 30 minutes. After washing with PBS, a secondary antibody recognizing a fluorescently labeled His tag was added and allowed to react for another 30 minutes on ice. Finally, the cells were washed 3 times with PBS and analyzed with Cytomics FC500. As a result, as shown in FIG. 10C, by using the PG4D2 antibody and the MS-1 antibody together, the binding of rCLEC-2 was strongly inhibited and the peak was greatly shifted to the left as compared with the PG4D2 antibody alone. It was confirmed.
  • His 10- tagged recombinant CLEC-2 protein
  • the PLAG4 domain recognized by the PG4D1 antibody or PG4D2 antibody is involved in the binding to CLEC-2 independently of the PLAG3 domain, and the antibody recognizing the PLAG4 domain and the antibody recognizing the PLAG3 domain are used in combination. Thus, it was revealed that stronger suppression of CLEC-2 binding was observed.
  • CHO / Aggrus-D48A cells were collected from the culture vessel, washed with PBS, and then adjusted to a cell density of 1.5 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • PBS w / or CLEC-2 or Add no antibody sample
  • PG4D1 antibody FIG. 11A left panel
  • PG4D2 antibody FIG. 11A right panel
  • the cells were washed with PBS, and 0.4 ⁇ g / mL of recombinant CLEC-2 protein (rCLEC-2) with 10 tag purification (rHis) purified from mammalian cells was added to samples other than w / or CLEC-2. For 30 minutes on ice. After washing with PBS, a secondary antibody recognizing a fluorescently labeled His tag was added and allowed to react for another 30 minutes on ice. Finally, the cells were washed 3 times with PBS and analyzed with Cytomics FC500. As shown in FIG.
  • the PLAG4 domain recognized by the PG4D1 antibody or PG4D2 antibody is directly involved in platelet aggregation, and the newly created antibody binds to the PLAG4 domain and covers the domain to inhibit platelet aggregation. It was revealed to be a neutralizing antibody.
  • CHO / Aggrus-WT cells which are tumor cells
  • control mouse antibody manufactured by Sigma
  • MS-1 antibody MS-1 antibody
  • PG4D1 antibody PG4D2 antibody
  • PG4D2 antibody was administered from the tail vein of the mouse at a dose of 10 ⁇ g / mouse.
  • CHO / Aggrus-WT cells were collected from the culture vessel, washed with PBS, adjusted to a cell density of 2.5 ⁇ 10 6 cells / ml, and transplanted from the tail vein at 100 ⁇ L / mouse. As shown in FIG.
  • CHO / Aggrus-WT cells were collected from the culture vessel, washed with PBS, adjusted to a cell density of 2.5 ⁇ 10 6 cells / ml, and transplanted from the tail vein at 100 ⁇ L / mouse. After 19 days, the lungs were removed and analyzed. As shown in FIG. 14A, photographs after staining with picric acid were taken and the number of metastatic nodules on the lung surface was counted (FIG. 14B).
  • the PG4D1 antibody and the PG4D2 antibody not only have an activity of neutralizing Aggrus-dependent platelet aggregation, but also strongly suppress Aggrus-dependent hematogenous metastasis.
  • Platelet aggregation has been reported to be involved in the formation of metastasis niches (formation of metastasis microenvironment) of cancer cells, and it is considered that PG4D1 and PG4D2 antibodies have an inhibitory effect on niche formation related to metastasis. It is done.
  • PG4D1 antibody and PG4D2 antibody exert a metastasis-suppressing effect by inhibiting the growth of metastatic cancer in the metastatic organ. It is suggested that
  • the human lung squamous cell carcinoma cell line LC-SCC-015 established by the present inventors was identified as a 5-week-old male CB- It was performed by transplanting 3 mice in each group to 17 SCID mice (purchased from Charles River Japan). Specifically, one day before transplantation of LC-SCC-015 cells, which are tumor cells, control mouse IgG2a (Mouse IgG2a, manufactured by Sigma) and PG4D2 antibody were administered from the mouse tail vein at a dose of 30 ⁇ g / mouse.
  • LC-SCC-015 cells were collected from the culture vessel, washed with PBS, adjusted to a cell density of 2.5 ⁇ 10 6 cells / ml, and transplanted from the tail vein with 100 ⁇ L / mouse.
  • the lungs were removed 31 days later, and the number of metastatic nodules on the lung surface was counted after staining with picric acid (FIG. 15). It was confirmed that when the PG4D2 antibody was administered on the day before tumor transplantation, lung metastasis was significantly suppressed even when compared with the control mouse IgG2a antibody administration group (*, P ⁇ 0.05).
  • the PG4D2 antibody is not only active in neutralizing Aggrus-dependent platelet aggregation, but Aggrus-dependent platelet aggregation is also present in the pulmonary metastasis of the established human lung squamous cell carcinoma cell line LC-SCC-015. Confirmed to be involved in metastasis. It was shown that the PG4D2 antibody suppresses lung metastasis of LC-SCC-015 cells by strongly suppressing Aggrus-dependent hematogenous metastasis.
  • PG4D2 antibody has an inhibitory effect on niche formation related to metastasis. Furthermore, since it has been clarified that platelets are also involved in tumor growth in the primary lesion, PG4D2 antibody also exerts a metastasis-suppressing effect by inhibiting the growth of metastatic cancer in the metastasis organ. It is suggested.
  • a human lung squamous cell carcinoma cell line PC-10 was obtained from a 5-week-old male NOD SCID mouse (NOD.CB17-Prkdcscid / J; Charles (Purchased from River Japan) and transplanted to 4 or 5 animals in each group.
  • NOD.CB17-Prkdcscid / J; Charles (Purchased from River Japan) transplanted to 4 or 5 animals in each group.
  • the mice were distributed so that the average tumor volume of each group was almost uniform.
  • the start date of antibody administration was defined as day 0, and the same amount of antibody was administered on the following days 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24.
  • NOD SCID mice which are severe combined immunodeficient mice.
  • Nude mice used in Example 12 and SCID mice used in Example 13 are mice lacking T cells and B cells, whereas NOD SCID mice lack T cells and B cells.
  • NK activity is also reduced. Therefore, it is considered that the anti-tumor effect of the neutralized antibody of Aggrus observed in the experiment of Example 14 using NOD SCID mice does not depend on the ADCC activity or CDC activity of the antibody. It is suggested that the antibodies that recognize PLAG3 and PLAG4 domains used here inhibit the release of various growth factors from platelets by neutralizing the platelet aggregation-inducing activity of Aggrus, resulting in inhibition of growth. It was.
  • the PG4D2 antibody does not directly kill PC-10 cells but indirectly suppresses tumor growth by depleting growth factors. That is, it was shown that the antibody recognizing the PLAG4 domain not only suppresses hematogenous metastasis as shown in Example 12 and Example 13, but also suppresses tumor growth of the primary lesion.
  • the antigen recognition site of PG4D2 antibody is gene cloned and linked to a gene encoding the Fc site of human IgG4 to thereby produce an IgG4 type human-mouse chimerized PG4D2 antibody (
  • An IgG1-type human-mouse chimerized PG4D2 antibody (Ch.PG4D2-IgG1) was prepared by linking Ch.PG4D2-IgG4SP) to a gene encoding the Fc site of human IgG1.
  • FIG. 17A shows the results of examining the reactivity of each antibody to Aggrus in the same manner as in Example 2 using CHO / Aggrus-WT cells.
  • the left panel shows that PG4D2 antibody, which is a mouse antibody not chimerized with CHO / Aggrus-WT cells, was reacted at the concentration shown in the figure, and after washing with PBS, Alexa488-labeled anti-mouse IgG (anti-antibody IgG) was used as a secondary antibody. The result of reacting mouse IgG-Alexa488) is shown.
  • the middle panel shows that CHO / Aggrus-WT cells were reacted with IgG4-type human-mouse chimerized PG4D2 antibody (Ch.PG4D2-IgG4SP) at the concentrations indicated in the figure, and Alexa 488 as secondary antibody after washing with PBS.
  • the result of reacting labeled anti-human IgG (anti-human IgG-Alexa488) is shown.
  • the right panel shows that CHO / Aggrus-WT cells were reacted with IgG1-type human-mouse chimerized PG4D2 antibody (Ch.PG4D2-IgG1) at the concentration shown in the figure, and after washing with PBS, Alexa 488 as a secondary antibody.
  • the result of reacting labeled anti-human IgG is shown. Chimerized Ch. PG4D2-IgG4SP and Ch. Both PG4D2-IgG1 were confirmed to be reactive to Aggrus.
  • FIG. 17B shows the results of analyzing the binding inhibition between Aggrus and CLEC-2 by FACS, as in Example 10.
  • Non-chimerized mouse antibody PG4D2 antibody (FIG. 17B top), IgG4 type human-mouse chimerized PG4D2 antibody (Ch.PG4D2-IgG4SP) (bottom left of FIG. 17B), IgG1 type human-mouse chimerized PG4D2 antibody
  • the assay was performed using (Ch.PG4D2-IgG1) (lower right of FIG. 17B).
  • an antibody having the same species and antibody subclass was used as a control antibody.
  • Control mouse IgG2a manufactured by Sigma
  • Control human IgG4 (manufactured by Sigma)
  • Control human IgG1 (manufactured by Sigma) were used.
  • the IgG4-type human-mouse chimerized PG4D2 antibody (Ch.PG4D2-IgG4SP) exhibits almost the same Aggrus neutralizing activity as the original non-chimerized mouse antibody PG4D2, but IgG1-type human- The mouse chimerized PG4D2 antibody (Ch.PG4D2-IgG1) had slightly weaker Aggrus neutralizing activity. Therefore, Ch. PG4D2-IgG1 required a larger amount of antibody than the original PG4D2 antibody for inhibition of binding to CLEC-2. When PG4D2-IgG1 was reacted at 60 ⁇ g / mL, the binding of rCLEC-2 to Aggrus could be sufficiently inhibited.
  • This tissue array includes chondrosarcoma, osteosarcoma and Ewing's Sarcoma tissue samples, 2 cases each, 4 sections, and pheochromocytoma as a tissue marker. It is possible to analyze protein expression in tumor tissues of patients with different stages and the like by immunostaining. In two cases of osteosarcoma on this slide, the ability to recognize osteosarcoma by immunostaining of D2-40, PG4D1, and PG4D2 was examined.
  • D2-40 antibody (DAKO: product number M3619, Anti-podoplanous mouse monoclonal antibody), PG4D1 antibody (5 mg / ml), and PG4D2 antibody (5 mg / ml) as the primary antibody.
  • D2-40 antibody product number M3619, Anti-podoplanous mouse monoclonal antibody
  • PG4D1 antibody (5 mg / ml)
  • PG4D2 antibody 5 mg / ml
  • I went. Specifically, washing with water after deparaffinization, immersion in 0.3% hydrogen peroxide / methanol at room temperature for 10 minutes, and washing with PBS for 5 minutes were repeated three times. Thereafter, the plate was immersed in blocking one P (Nacalai Tesque # 05999-84) for 15 minutes at room temperature and then washed with PBS for 5 minutes.
  • D2-40 antibody was used as the primary antibody
  • the antibody diluted 1/100 with PBS was reacted at 4 degrees for 16 hours.
  • the PG4D1 or PG4D2 antibody was used as the primary antibody
  • a 1/1000 dilution with PBS final antibody concentration 5 ⁇ g / ml
  • D2-40 antibody is a culture supernatant, it is difficult to convert to gram, so select the antibody concentration so that the staining degree in the control tissue is the same for all antibodies as shown below. It is carried out.
  • the T264a slide which is a Tissue array, contains the tumor tissues of 2 cases of osteosarcoma as described above, and the tumor tissues of A3 and A6 shown in FIG. 18A are the first osteosarcoma case (10-year-old male), The tumor tissues B1 and B4 are derived from the second osteosarcoma case (21-year-old woman).
  • FIG. 18B when the staining degree of the control tumor tissue (Pheochromocytoma) located at D7 is almost identical, the staining degree of immunostaining using the PG4D1 antibody and the PG4D2 antibody is D2-40.
  • the staining is well compared with the degree of staining of the antibody, and it can be seen that the PG4D1 antibody and the PG4D2 antibody have higher ability to recognize osteosarcoma than the D2-40 antibody. Therefore, it is suggested that it is useful at least as a growth inhibitor / metastasis inhibitor of osteosarcoma.
  • the expression of Aggrus can be confirmed in mRNA, it may not be detected in the antibody, and there is a concern that the application of the Aggrus antibody to treatment is limited.
  • the present inventors have shown that PG4D1 antibody and PG4D2 antibody recognize human bladder squamous cell carcinoma cell line UM-UC-5 cells that cannot recognize MS-1 antibody and human fibrosarcoma cell line HT1080 cells. (FIG. 7C).
  • the mechanism of whether or not Aggrus can be recognized is unknown depending on the type of cancer, etc., but the binding of PG4D1 antibody and PG4D2 antibody has been verified in the experimental system using at least the osteosarcoma and cell lines shown here. It can be applied to treatment of bladder squamous cell carcinoma, fibrosarcoma, and lung squamous cell carcinoma.
  • the anti-Aggrus antibody that binds to the region represented by SEQ ID NO: 1 inhibits the binding of Aggrus to CLEC-2, suppresses platelet aggregation, suppresses cancer progression, and metastasis. . Furthermore, it becomes possible to screen a drug that inhibits the binding with CLEC-2 using the binding between this region and CLEC-2 as an index.

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Abstract

ＣＬＥＣ‐２との結合に関与する新たなＡｇｇｒｕｓのドメインを探索し、当該ドメインを認識するモノクローナル抗体を得た。新たに見出したＰＬＡＧ４ドメインが、ＣＬＥＣ‐２との結合に重要であること、さらにこの領域を認識するモノクローナル抗体を創製した。この抗体を用いた新規のＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤、血小板凝集抑制剤、がん転移抑制剤を提供することができる。

Description

抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体、ＣＬＥＣ－２との結合に必要なＡｇｇｒｕｓの領域、及びＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤のスクリーニング方法
　本発明は、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合に関与するＡｇｇｒｕｓの領域、及び該領域を認識する抗体に関する。また、該Ａｇｇｒｕｓの領域を含むペプチドやモノクローナル抗体を含むＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤、及びこれを含む医薬組成物に関する。さらに、該領域への結合を指標とする医薬のスクリーニング方法に関する。
　がんは細胞が無秩序に増殖することを特徴とする疾患であるが、がんの致死率を規定する大きな要因は、がんが発生した原発巣での増殖というよりは、転移巣における増殖である。実際に転移がんであると診断された患者の５年生存率は２０％以下と言われており、がん転移の抑制は臨床上大きな課題となっている。
　がんの血行性転移には、がん細胞依存的な血小板凝集が関与していることが古くから臨床上認められていた。本発明者のグループは、血小板凝集誘導活性を示す高転移がん細胞株を樹立し、高転移がん細胞株の細胞膜表面上に発現している血小板凝集を誘導する因子Ａｇｇｒｕｓを同定した（特許文献１、非特許文献１）。
　血小板凝集促進因子Ａｇｇｒｕｓ（ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ、ｇｐ４４、Ｔ１α等としても知られる。）は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、扁平上皮癌、中皮腫、カポジ肉腫、精巣腫瘍、脳腫瘍、又は膀胱癌といった様々ながんで発現が増加していることが知られている（非特許文献２～１３）。
　最近、血小板上に発現しているＣ型レクチン様受容体（ＣＬＥＣ‐２）がＡｇｇｒｕｓのカウンターパート受容体の一つであることが同定された（非特許文献１４）。腫瘍細胞上で発現しているＡｇｇｒｕｓにＣＬＥＣ‐２が結合すると血漿成分がなくとも血小板で血小板凝集のシグナルが活性化され、血小板凝集が誘導されることが知られている。すなわち、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を阻害する物質は、血小板凝集を抑制し、がんの転移を抑制すると考えられる。したがって、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を阻害する物質は、がんや血栓症の治療への応用が期待される。実際に本発明者らは、Ａｇｇｒｕｓに対するモノクローナル抗体や低分子化合物によって、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の相互作用が阻害され、血小板凝集やがん転移が抑制されることを開示している(特許文献２、３、非特許文献１５）。
　モノクローナル抗体は、細胞表面抗原に特異的に結合することができ、標的細胞に免疫学的応答を引き起こすことができる。この反応を利用して、多くのモノクローナル抗体ががん治療や免疫疾患の治療に用いられている。モノクローナル抗体は、中和、抗体依存性細胞障害活性（antibody-dependent cellular cytotoxicity;　ＡＤＣＣ）、及び補体依存性細胞障害活性（complement-dependent cytotoxicity;　ＣＤＣ）の３つの代表的な作用様式を介して治療効果を示す。
　これまでに、本発明者らは、樹立したハイブリドーマが産生する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体、Ｐ２－０、ＭＳ－１、ＭＳ－３、ＭＳ－４はいずれもＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２の結合を阻害する中和抗体であり、ＡＤＣＣ活性非依存的に血小板凝集抑制、がん転移抑制、腫瘍増殖抑制作用を示すことを明らかにしている（特許文献２）。
　これら４つの抗体のうちＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２の結合を阻害する活性の高いＰ２－０とＭＳ－１抗体は、いずれもＰＬＡＧドメイン（Platelet-Aggregation stimulating domain）領域内のアミノ酸をエピトープとして認識する抗体である。ＰＬＡＧドメインとは、ヒト、マウス、ラットと種を超えて保存されているＥＤＸＸＶＴＰＧを共通配列とするアミノ酸配列である。ＰＬＡＧドメインは、近接した領域にＰＬＡＧ１～ＰＬＡＧ３まで３回繰り返し存在するアミノ酸配列であり、ヒトＡｇｇｒｕｓの場合、アミノ酸配列の２９～５４番目の領域に存在する。
　ＰＬＡＧドメインは細胞外に存在し、血小板凝集活性に関わることが知られている。また、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との共結晶構造解析の結果、Ａｇｇｒｕｓの４７番目のグルタミン酸と４８番目のアスパラギン酸に加え、５２番目のスレオニンに付加されているシアル酸がＣＬＥＣ‐２の１０７～１５７番目の領域中に存在する４つのアルギニンと結合していることが示されている（非特許文献１６）。本発明者らが創製したＰ２－０とＭＳ－１抗体も、このＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合領域と重複するＡｇｇｒｕｓのアミノ酸配列の４５～４９番目の領域をエピトープとして認識している。また、ＭＳ－３、ＭＳ－４抗体はＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合領域に近接するＡｇｇｒｕｓのアミノ酸配列の５４～６１番目の領域をエピトープとして認識している。
特開２００４－３５０６７７号公報 国際公開２０１２／１２８０８２号 特開２０１３－７１９１６号公報
Kato Y. et al., 2003, J. Biol. Chem., Vol.278, p.51599-51605. Kato, Y. et al., 2005, Tumour. Biol. Vol.26, p.195-200. Martin-Villar, E. et al., 2005, Int. J. Cancer, Vol.113, p.899-910. Yuan P. et al., 2006, Cancer, Vol.107, p.563-569. Wicki, A. et al., 2006, Cancer Cell, Vol.9, p.261-272. Kimura, N. & Kimura, I., 2005, Pathol. Int., Vol.55, p.83-86. Fukunaga, M., 2005, Histopathology, Vol.46, p.396-402. Kato, Y. et al., 2004, Oncogene, Vol.23, p.8552-8556. Mishima, K. et al., 2006, Acta Neuropathol., Vol.111, p.563-568. Mishima, K. et al., 2006, Acta Neuropathol., Vol.111, p.483-488. Yuan, P. et al., 2006, Cancer, Vol.107, p.563-569. Kunita, A. et al., 2007, Am. J. Pathol., Vol.170, p.1337-1347. Takagi, S. et al., 2014, Int. J. Cancer, Vol.134, p.2605-2614. Suzuki-Inoue, K. et al. 2007, J. Biol. Chem., Vol.282, p.25993-26001. Fujita N.& Takagi, S., 2012, J. Biochem., Vol.152, p.407-413. Nagae, M. et al., 2014, Structure, Vol.22, p.1711-1721. Morrison, S.L. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.81,p.8651-6855. Jones, P.T. et al., 1986, Nature, Vol.321, p.522-525. Amano, K. et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.105,p.3232-3237. Takagi, S. et al., 2013, PLoS One Vol. 8, e73609.
　しかしながら、以下に示すように、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との共結晶構造解析の結果明らかとなっていたＣＬＥＣ‐２との結合に関わるＡｇｇｒｕｓの４８番目のアスパラギン酸をアラニン置換したＡｇｇｒｕｓ変異体でも、ＣＬＥＣ‐２に結合することが明らかとなった。また、Ａｇｇｒｕｓの４８番目のアスパラギン酸をアラニン置換したＡｇｇｒｕｓ変異体による血小板凝集に関しても、血小板凝集が開始するまでの時間の遅延が認められるものの、最終的には血小板凝集が起こることが確認された。
　さらに、本発明者らは、Ａｇｇｒｕｓに対するモノクローナル抗体や低分子化合物によって、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の相互作用が阻害され、血小板凝集が抑制され、さらにがん転移が抑制されることを開示しているが(特許文献２、３)、これらモノクローナル抗体や低分子化合物は血小板凝集開始時間の遅延効果はあるが、Ａｇｇｒｕｓによる血小板凝集を完全に抑制することはできなかった。すなわち、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合部位が既知のＰＬＡＧドメイン以外の領域にも存在する可能性が示唆される。
　本発明は、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合に関与する新たなドメインの探索を行い、当該ドメインに結合するモノクローナル抗体を得ることを課題とする。さらに、当該ドメインに結合する化合物を探索することにより、がんの増殖と転移、血小板凝集を抑制する化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
　本発明は以下に示すＡｇｇｒｕｓの領域を認識するモノクローナル抗体、これを産生するハイブリドーマ、ＣＬＥＣ－２との結合に必要なＡｇｇｒｕｓの領域、Ａｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤、医薬組成物、検査用試薬、Ａｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤のスクリーニング方法に関する。
（１）配列番号１（ＧＩＲＩＥＤＬＰＴ）により表されるアミノ酸配列のうち少なくとも５残基の配列からなるＡｇｇｒｕｓの領域に結合するモノクローナル抗体、又はその機能的断片からなるフラグメント。
（２）受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２０７０（ＰＧ４Ｄ１）、又はＮＩＴＥ　Ｐ－０２０７１（ＰＧ４Ｄ２）のハイブリドーマにより産生される、（１）記載のモノクローナル抗体、又はその機能的断片からなるフラグメント。
（３）キメラ化又はヒト化された（１）記載のモノクローナル抗体、又はその機能的断片からなるフラグメント。
（４）受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２０７０、又はＮＩＴＥ　Ｐ－０２０７１のハイブリドーマ。
（５）（１）～（３）のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含むＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤。
（６）さらに配列番号２（ＧＡＥＤＤＶＶＴＰＧＴＳＥＤＲＹＫ）により表される領域に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体、そのキメラ化抗体、そのヒト化抗体、及び／又はその機能的断片からなるフラグメントを少なくとも１つ含むことを特徴とする（５）記載のＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤。
（７）前記配列番号２の領域に存在するエピトープを認識する前記モノクローナル抗体が、Ｐ２－０、ＭＳ－１、ＭＳ－３、及び／又はＭＳ－４であることを特徴とする（６）記載のＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤。
（８）（１）～（３）のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含む血小板凝集抑制、血栓抑制、がん進展・転移抑制、抗炎症のための医薬組成物。
（９）さらに配列番号２（ＧＡＥＤＤＶＶＴＰＧＴＳＥＤＲＹＫ）により表される領域に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体、そのキメラ化抗体、そのヒト化抗体、及び／又はその機能的断片からなるフラグメントを少なくとも１つ含むことを特徴とする（８）記載の医薬組成物。
（１０）前記配列番号２の領域に存在するエピトープを認識する前記モノクローナル抗体が、Ｐ２－０、ＭＳ－１、ＭＳ－３、及び／又はＭＳ－４であることを特徴とする（９）記載の医薬組成物。
（１１）（１）～（３）のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含むＡｇｇｒｕｓ発現を検出するための検査用試薬。
（１２）ＣＬＥＣ‐２の結合に必要なＰＬＡＧ４ドメインと重複するＡｇｇｒｕｓの領域であって、配列番号１（ＧＩＲＩＥＤＬＰＴ）により表されることを特徴とする領域。
（１３）（１２）記載のＣＬＥＣ‐２の結合に必要なＰＬＡＧ４ドメインと重複するＡｇｇｒｕｓの領域であって、前記アミノ酸配列が配列番号３（ＲＩＥＤＬ）により表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする領域。
（１４）（１２）、又は（１３）の領域を含むペプチドからなるＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤。
（１５）（１２）、又は（１３）の領域を含むペプチドを有効成分とする血小板凝集抑制、血栓抑制、がん進展・転移抑制、抗炎症のための医薬組成物。
（１６）ＣＬＥＣ‐２とＡｇｇｒｕｓの結合阻害剤のスクリーニング方法であって、配列番号１（ＧＩＲＩＥＤＬＰＴ）により表されるアミノ酸配列のうち少なくとも５残基の配列からなるＡｇｇｒｕｓエピトープへの結合を指標とすることを特徴とする阻害剤スクリーニング方法。
（１７）（１６）記載のスクリーニング方法であって、配列番号３（ＲＩＥＤＬ）により表されるアミノ酸配列への結合を指標とすることを特徴とする阻害剤スクリーニング方法。
（１８）ＣＬＥＣ‐２とＡｇｇｒｕｓの結合阻害剤のスクリーニング方法であって、配列番号４（ＥＤＸＸＴＳ）により表されるアミノ酸配列への結合を指標とすることを特徴とする阻害剤スクリーニング方法。
　本発明者らは、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合に必要な新たなＰＬＡＧドメインを見出したことにより、当該領域に結合する新たなモノクローナル抗体を得ることができた。当該領域に結合するモノクローナル抗体はＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を強く阻害することから、がんや血栓症の治療に有効であることが期待される。さらに、新たなＰＬＡＧドメインを標的とする抗がん剤のスクリーニングも可能となる。
Ａｇｇｒｕｓ変異体を用いた中和抗体の認識部位の検証結果を示す図。 ヒトＡｇｇｒｕｓアミノ酸配列中のＰＬＡＧドメインを示す図。 ＣＨＯ細胞に導入したＡｇｇｒｕｓ野生型、Ａｇｇｒｕｓ変異体タンパク質の発現量、及びＣＬＥＣ‐２タンパク質との結合を示す図。 血小板凝集に対する４８番目のアミノ酸変異Ｄ４８Ａの効果を示す図。 哺乳類Ａｇｇｒｕｓアミノ酸配列の相同性を示す図。 ＰＬＡＧドメインのコンセンサス配列を示す図。 Ａｇｇｒｕｓ変異体のタンパク質発現を示す図。 ＣＨＯ細胞に導入したＡｇｇｒｕｓ野生型、Ａｇｇｒｕｓ変異体タンパク質の発現量、及びＣＬＥＣ‐２タンパク質との結合を示す図。 血小板凝集に対する４８番目のアミノ酸変異Ｄ４８Ａ、８２番目のアミノ酸変異体Ｄ８２Ａ、４８番目と８２番目のアミノ酸の二重変異Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａの効果を示す図。 ＰＬＡＧドメイン欠失変異体を模式的に示す図。 ＣＨＯ細胞に導入したＡｇｇｒｕｓ欠失変異体タンパク質の発現量、及びＣＬＥＣ‐２タンパク質との結合を示す図。 ＣＨＯ細胞に導入したＡｇｇｒｕｓ野生型、Ａｇｇｒｕｓ点変異体タンパク質の発現量、及びＣＬＥＣ‐２タンパク質との結合を定量的に示す図。 ＣＨＯ細胞に導入したＡｇｇｒｕｓ野生型、Ａｇｇｒｕｓ欠失変異体タンパク質の発現量、及びＣＬＥＣ‐２タンパク質との結合を定量的に示す図。 血小板凝集に対するＤ４８Ａ、Ｄ８２Ａ、Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａの効果を示す図。 ＰＬＡＧ４ドメイン（ＥＤＸＸＴＳ）の８１番目のグルタミン酸、８２番目のアスパラギン酸、８５番目のスレオニンのＣＬＥＣ‐２結合への関与を示す図。 抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体のエピトープ解析を示す図。 哺乳類細胞に発現しているＡｇｇｒｕｓに対する抗体の反応性を示す図。 Ａｇｇｒｕｓ発現細胞に対する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体の反応性を示す図。 ＰＧ４Ｄ１、ＰＧ４Ｄ２抗体の認識部位を検討した図。 ＰＧ４Ｄ１抗体の反応性を検討した図。 ＰＧ４Ｄ２抗体の反応性を検討した図。 抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体によるＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２の結合阻害を示す図。 抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体によるＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２の結合阻害を示す図。 ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４ドメインを各々認識する抗体がＡｇｇｒｕｓに結合する際に相互に干渉しないことを示す図。 ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４ドメインを各々認識する抗体により、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との結合が完全に抑制されることを示す図。 ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体によるＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２の結合阻害を示す図。 ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体による血小板凝集の抑制を示す図。 ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体とＰＬＡＧ３ドメインを認識する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体による血小板凝集の抑制を示す図。 ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体とＰＬＡＧ３ドメインを認識する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体との併用による血小板凝集の抑制を示す図。 ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体による肺への血行性転移の抑制を示す図。 ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体による肺への血行性転移を抑制することを示す図。 ＬＣ-ＳＣＣ-０１５細胞の肺転移を抑制するＰＧ４Ｄ２抗体の効果を示す図。 肺扁平上皮がん細胞ＰＣ-１０の腫瘍増殖に対するＰＧ４Ｄ２抗体の抑制効果を示す図。 キメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体のＡｇｇｒｕｓに対する結合を示す図。 キメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体がＡｇｇｒｕｓ-ＣＬＥＣ-２結合を抑制することを示す図。 骨肉腫切片のＨＥ染色図。 ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体が、Ｄ２-４０抗体よりも感度よく骨肉腫を認識することを示す図。
　本発明の抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体、又は機能的断片とは、新たに見出されたＡｇｇｒｕｓのＰＬＡＧ４ドメインと重複する領域をエピトープとして認識する抗体をいい、機能的断片とは元の抗体と実質的に同じ抗原特異性を有する抗体の断片をいうものとする。
　本発明のＡｇｇｒｕｓに対するモノクローナル抗体の好適な例としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ-ＮＰＭＤ（２９２－０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２０７０、ＮＩＴＥ　Ｐ－０２０７１として２０１５年７月１４日付で寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が挙げられる。また、これらと同等の結合特異性を備えた他の抗体も本発明の抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体として好ましい。
　また、本発明においてモノクローナル抗体とは、得られたハイブリドーマによって産生される抗体だけではなく、遺伝子組換え技術を利用して作製されたヒト型キメラ抗体（以下、キメラ化抗体と記載することもある。）、あるいはヒト型ＣＤＲ（相補性決定領域、Complementarity Determining Region）移植抗体（以下、ヒト化抗体と記載することもある。）等、ヒトに投与した場合安全性の担保されている抗体全般を含むものとする。
　ヒト型キメラ抗体とは、抗体の可変領域（以下、Ｖ領域ということもある。）がヒト以外の動物の抗体であり、定常領域（以下、Ｃ領域ということもある。）がヒト抗体である抗体をいう（非特許文献１７）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶ領域中のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（非特許文献１８）。キメラ化抗体やヒト化抗体は、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物の抗体に比べ、副作用が少なく、その治療効果が長期間持続する。また、キメラ化抗体やヒト化抗体は遺伝子組換え技術を利用して様々な形態の分子として作製することができる。モノクローナル抗体からキメラ化抗体やヒト化抗体を作製する方法は公知の方法を用いることができる。
　抗体の機能的断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、もしくはＣＤＲを含むペプチドなどの抗体の機能的断片が含まれる。抗体の機能的断片は、ペプシン、又はパパインなどの酵素によって消化する等公知の方法によって得ることができる。
　本発明は、別の態様において、モノクローナル抗体、又はそのフラグメントを含むＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤、血小板凝集抑制剤、抗がん剤として用いる医薬組成物を提供することができる。血小板凝集抑制剤は、例えば、脳梗塞、又は心筋梗塞のような血栓症を処置するために用いることができる。抗がん剤としては、がん転移抑制剤としてだけではなく、がんの進展、がんに起因する炎症を抑制するために用いることができる。がん、又は腫瘍は、今までにＡｇｇｒｕｓ分子の発現の増加が認められているがん、すなわち扁平上皮癌、繊維肉腫、中皮腫、カポジ肉腫、精巣腫瘍、脳腫瘍、又は膀胱癌に対して好適に作用することが期待できる。
　本発明の医薬組成物の剤型の種類としては、ペプチド、抗体医薬の場合には、例えば、非経口剤である注射剤として用いるのが一般的である。また、スクリーニングにより得られた化合物等の場合には、注射剤だけではなく、経口剤、非経口剤として投与することができる。経口剤としては、例えば、錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等があげられる。また、非経口剤としては、注射剤の他に、坐剤、経皮剤、軟膏剤、外用液剤等を挙げることができる。しかし、ここに挙げた剤型に限ることはなく、当業者において投与経路、投与対象において適宜最適の剤型を選択することができる。また、有効成分として、本発明の抗Ａｇｇｒｕｓ抗体を用いる場合には、製剤中の０．１～９９．９重量％含有することができる。
　薬剤の有効成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法によって適宜最適な投与量を判断することができる。経口投与の場合には、一般的には、患者に対して、１日につき０．１μｇ～１０００ｍｇ、好ましくは１．０μｇ～１００ｍｇ、より好ましくは１．０ｍｇ～５０ｍｇ投与するのが好ましい。非経口的に投与する場合には、その一回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形態で、一般的には、患者に対して、１日につき０．０１～３０ｍｇ程度、好ましくは０．１～２０ｍｇ程度、より好ましくは０．１～１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好適である。しかしながら、最終的には、患者の年齢や体重、症状等を考慮して医師の判断により決定することができる。
　また、ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗体と、ＰＬＡＧ２からＰＬＡＧ３にわたる領域を認識する抗体を併用して用いると、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との結合をほぼ完全に阻害することが明らかとなった。したがって、これらＣＬＥＣ‐２とＡｇｇｒｕｓの結合に関わる２つの領域を認識する抗体を併用することによって、より強い血小板凝集抑制、がん転移抑制効果を期待することができる。
　本発明者らは、すでに、上述のようにＡｇｇｒｕｓのＰＬＡＧ２及びＰＬＡＧ３を含む領域であるＡｇｇｒｕｓの４５～６１番目の領域（配列番号２）をエピトープとして認識するモノクローナル抗体を得ている。具体的には、Ａｇｇｒｕｓの４５～４９番目の領域を認識するＰ２－０、及びＭＳ－１抗体、５３～５８番目の領域を認識するＭＳ－３抗体、５３～６１番目の領域を認識するＭＳ－４抗体である。すでに、本発明者らは、キメラ化したＰ２－０抗体がマウスモデルを用いた実験系でがん転移抑制作用を備えていることを開示しているが（特許文献２）、この領域を認識するモノクローナル抗体を臨床に応用する場合には、キメラ化、又はヒト化した抗体を用いればよい。これらモノクローナル抗体のうち少なくともいずれか１つと、本発明の抗体とを併用して用いることにより、より高い効果を奏することが期待できる。併用する２種の抗体をキメラ化抗体、ヒト化抗体として用いることにより、血栓症やがんの治療に適用した場合に、より強い効果を期待することができる。
　また、本発明のＡｇｇｒｕｓを認識する抗体は、がんの検査に用いることができる。Ａｇｇｒｕｓの発現が、がんの血行性転移に関与していることはすでに知られている。したがって、本発明の抗体を用いてがん組織、あるいは血中を循環するがん細胞のＡｇｇｒｕｓの発現を検出することによって、予後予測を行うことができる。がん組織、あるいはがん細胞でのＡｇｇｒｕｓ発現の確認は、本発明の抗体を用いたＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ等公知の免疫測定法を用いることができる。さらに、Ａｇｇｒｕｓを発現しているがんであれば、本発明の抗体を有効性分として含む医薬による治療効果を期待することができる。
　本発明のスクリーニング方法は、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との結合を阻害する物質を探索し、血小板凝集やがんの転移を抑制する化合物を提供することを課題とする。例えば、本発明のスクリーニング方法は以下のようにして行うことができる。化合物アレイや化合物ライブラリを用いて、本発明において新たに同定されたＣＬＥＣ‐２との結合に関与するＡｇｇｒｕｓのアミノ酸配列と相互作用する化合物を探索する。スクリーニングに用いるＣＬＥＣ‐２との結合に関与するＡｇｇｒｕｓの領域としては、本発明の抗体が認識するＧＩＲＩＥＤＬＰＴ（配列番号１）のうち少なくとも５残基の配列、特に、高い結合力を示す抗体が得られた領域であるＲＩＥＤＬ（配列番号３）を用いることが好ましい。また、ＰＬＡＧ４ドメインのＰＬＡＧコンセンサス配列ＥＤＸＸＴＳ（配列番号４）を用いてもよい。ＣＬＥＣ‐２との結合に関与するＡｇｇｒｕｓの領域は短い領域であることから、合成ペプチドを用いても、当該領域を含む組換え体を大腸菌や動物細胞などで発現させて用いてもよい。
　さらには、本発明者らが発見し報告しているように、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の相互作用にはＡｇｇｒｕｓのアミノ酸４５～６１のＰＬＡＧ２、ＰＬＡＧ３ドメインにわたる領域も関与している(特許文献２、３)。したがって、この部位を欠失あるいは変異させ、本発明に関わるＡｇｇｒｕｓの新規に見出されたＣＬＥＣ‐２結合領域のみでＣＬＥＣ‐２と結合する組換え体を大腸菌や動物細胞などで発現させて用いてもよい。
　また、大腸菌や動物細胞などで発現させた野生型のＡｇｇｒｕｓに、Ｐ２－０、ＭＳ－１、ＭＳ－３またはＭＳ－４抗体を反応させてこの部位をマスクし、本発明に関わるＡｇｇｒｕｓの新規に見出されたＣＬＥＣ‐２結合領域のみでＣＬＥＣ‐２と結合するようにしても良い。化合物に結合したペプチドや組換え体は、本発明の抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体を用いて検出することができる。上記方法は例示であり、これに限らず公知のスクリーニング方法を適用してよいことはいうまでもない。
　また、本発明の抗体が認識する領域（エピトープ）に糖鎖を付与して合成し投与することによって、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を競合阻害することが期待できる。よって、抗体が認識する領域を含むペプチドに糖鎖を付与し、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との結合阻害剤として用いることができる。これにより、ペプチド自体を血小板凝集の抑制剤、がん転移抑制剤として用いることも可能となる。なお、糖鎖の付与は、ヒト型の糖鎖を酵母を用いて付与する（非特許文献１９）等、公知の方法を用いて行うことができる。
　以下、実施例を示しながら、本発明を詳細に説明する。
報告されている中和抗体の認識部位の検証
　本発明者らはすでに、ＣＬＥＣ‐２との結合を阻害し、血小板凝集抑制作用、及びがん転移抑制作用のある抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体を開示している（特許文献２、非特許文献２０）。これらモノクローナル抗体のエピトープは、ＰＬＡＧ２、ＰＬＡＧ３ドメインにわたる領域を認識する抗体であった。
　まず、これら中和抗体の認識部位の検証を行った。Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）細胞に、以下のプラスミドを導入し、ヒトＡｇｇｒｕｓ、及びＡｇｇｒｕｓ変異体を発現させた。ヒトＡｇｇｒｕｓ遺伝子は野生型Ａｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．　ＡＢ１２７９５８．１）を用い、ベクターはｐｃＤＮＡ３（ライフテクノロジーズ社製）を用いて常法によりＰＣＲで増幅しクローニングした。
　中和抗体の認識部位の検討に用いたコンストラクトは以下のとおりである。遺伝子を組み込んでいないｐｃＤＮＡ３ベクターのみ（ｍｏｃｋ）、野生型ヒトＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ）、４５番目のグリシンをアラニンに置換したＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Ｇ４５Ａ）、４８番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ）、４９番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４９Ａ）を構築しＣＨＯ細胞に導入し、タンパク質を安定的に発現させた。各プラスミドを導入したＣＨＯ細胞は以下、各々ＣＨＯ／ｍｏｃｋ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｇ４５Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４９Ａという。
　各細胞から細胞溶解液を調製し、Ｄ２－４０、ＭＳ－１、Ｐ２－０、ＮＺ-１の４種の抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体を用い、ウェスタンブロット分析を行った。Ｄ２-４０抗体（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）は、Ａｇｇｒｕｓ中和活性の無いマウスモノクローナル抗体であり、ＭＳ－１抗体、Ｐ２－０抗体は本発明者らが創製した中和活性を有するマウスモノクローナル抗体である。また、ＮＺ-１抗体（ＡｎｇｉｏＢｉｏ社製）は、Ａｇｇｒｕｓ中和活性を有するラットモノクローナル抗体である。結果を図１Ａに示す。
　Ａｇｇｒｕｓ中和活性の無いＤ２-４０抗体は、導入した野生型及び１アミノ酸置換型のＡｇｇｒｕｓタンパク質をすべて認識した。すなわち、ＣＨＯ／ｍｏｃｋ以外の細胞でシグナルが認められる。また、Ａｇｇｒｕｓ野生型、Ａｇｇｒｕｓ変異体でタンパク質発現量がほぼ揃っていることが確認された。なお、泳動した細胞溶解液中のタンパク質量が同じであることは、α-ｔｕｂｕｌｉｎを認識する抗体を用いたウェスタンブロット分析の結果（図１Ａ）からも明らかである。
　ＭＳ-１抗体並びにＰ２-０抗体は、野生型のＡｇｇｒｕｓは認識するが１アミノ酸置換型のＡｇｇｒｕｓタンパク質、Ａｇｇｒｕｓ－Ｇ４５Ａ、Ａｇｇｒｕｓ－Ｄ４８Ａ、Ａｇｇｒｕｓ－Ｄ４９Ａの認識が弱く、これらアミノ酸部位が抗体認識に必須であることがわかる。特に、Ｐ２-０抗体もＭＳ-１抗体も、４８番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したＤ４８Ａは全く認識することができない。ＰＬＡＧドメイン中の４８番目のアスパラギン酸が、抗体による認識には重要であることが示唆された。
　また、Ａｇｇｒｕｓ中和活性があるラットモノクローナル抗体ＮＺ-１抗体も１アミノ酸置換型のＡｇｇｒｕｓタンパク質の認識が弱い。したがって、中和活性を発揮するためには、変異を導入したＡｇｇｒｕｓの４５番目から４９番目までの領域、すなわちＰＬＡＧ２からＰＬＡＧ３にかけての部位（図１Ｂ参照）が大事であることが示唆された。
ＣＬＥＣ‐２との相互作用ならびに血小板凝集誘導に関わるＡｇｇｒｕｓの部位の検討
（１）ＣＬＥＣ‐２結合におけるＡｇｇｒｕｓの４８番目のアスパラギン酸の役割検討
　ＣＨＯ細胞に、ヒトＡｇｇｒｕｓ及びその変異体ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入して、４８番目のアスパラギン酸の役割の検討を行った。上記で作製した野生型Ａｇｇｒｕｓ発現細胞株ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ及びその変異体発現ＣＨＯ細胞株ＣＨＯ／ＡｇｇｒｕｓＤ４８Ａ、及び４８番目のアスパラギン酸をグルタミン酸に置換したＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ｅ、アスパラギンに置換したＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ｎを用い、ＦＡＣＳ法によりＣＬＥＣ‐２との反応性を検討した。
　まず、遺伝子導入株、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ｅ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ｎ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８ＡにおけるＡｇｇｒｕｓ発現量を検討した。具体的には、これら遺伝子導入株を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に１．５×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製し、Ｄ２-４０抗体を添加し、３０分間氷上で反応させた。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、二次抗体としてＡlｅｘａ４８８標識された抗マウスＩｇＧ抗体（ライフテクノロジーズ社製）を添加し、氷上でさらに３０分間反応させた。最後に、細胞を３回ＰＢＳで洗浄した後に、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で解析を行なった（図２Ａ左パネル、白抜きの山）。なお、コントロールは、Ｄ２-４０抗体の代わりにコントロールマウス抗体（シグマ社製）を各々の細胞に反応させ、上記と同様な操作を行なった結果である（図２Ａ左パネル、黒く塗りつぶした山）。
　ＣＬＥＣ‐２との反応性は、以下のようにして検討した。遺伝子導入株を同様にして１．５×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製したところに、（Ｈｉｓ）１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質（ｒＣＬＥＣ‐２；Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、３０分間氷上で反応させた。ＰＢＳで洗浄した後にＨｉｓタグを認識する蛍光標識された二次抗体（ＱＩＡＧＥＮ社製）を添加し、氷上でさらに３０分間反応させた。なお、（Ｈｉｓ）１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質は哺乳動物細胞から精製されたものであり、糖鎖により修飾されている。細胞を３回ＰＢＳで洗浄した後に、同様にＣｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ５００で解析を行なった（図２Ａ右パネル、白抜きの山）。なお、コントロールは、（Ｈｉｓ）１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質の代わりにＰＢＳのみを添加し、上記と同様な操作を行なった結果である（図２Ａ右パネル、黒く塗りつぶした山）。
　Ａｇｇｒｕｓ、及びＡｇｇｒｕｓ変異体タンパク質の発現は図２Ａ左パネルに、ＣＬＥＣ‐２との結合は図２Ａ右パネルに示す。図２Ａ左パネルの白抜きの山はＤ２-４０抗体によって、野生型Ａｇｇｒｕｓ、又はＡｇｇｒｕｓ変異体を染色した結果を示す。黒く塗りつぶした山はコントロールマウス抗体による結果を示す。図２Ａ左パネルの白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度がほぼ同じであることから、Ａｇｇｒｕｓタンパク質の各遺伝子導入株における細胞膜上での発現レベルがほぼ一致していることが確認された。
　図２Ａ右パネルは、野生型又は１アミノ酸置換型のＡｇｇｒｕｓを発現している細胞に、組換えＣＬＥＣ‐２が結合するかを解析したものである。上述のように、白抜きの山は、ＣＨＯ細胞表面に発現している野生型Ａｇｇｒｕｓ、又はＡｇｇｒｕｓ変異体に結合している組換えＣＬＥＣ‐２を抗Ｈｉｓ抗体により検出した結果を示している。黒く塗りつぶした山はＣＬＥＣ‐２タンパク質の代わりにＰＢＳのみを添加したコントロールの結果を示している。
　４８番目のアスパラギン酸を同じ酸性アミノ酸であるグルタミン酸に置換したＤ４８Ｅ（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ｅ）は野生型（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ）とほぼ同じようにＣＬＥＣ‐２が結合する。しかし、中性アミノ酸に置換したＤ４８Ｎ（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ｎ）あるいはＤ４８Ａ変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ）に対してはＣＬＥＣ‐２の結合力の減少が観察された。しかし、いずれの変異体も結合が完全に失われることはなく、ある程度ＣＬＥＣ‐２が結合することが明らかとなった。
（２）Ａｇｇｒｕｓの４８番目のアスパラギン酸の血小板凝集における役割検討
　上述のようにＣＬＥＣ‐２は、Ａｇｇｒｕｓと結合する血小板上のレセプターである。Ａｇｇｒｕｓは血小板上のＣＬＥＣ‐２と結合することで血小板凝集誘導シグナルを伝達する。ＣＬＥＣ‐２との結合が弱くなったＤ４８Ａ変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ）は血小板凝集誘導活性が弱くなることが予想されたため、血小板凝集抑制試験で確認した。具体的には、ＭＣＭ　ＨＥＭＡ　ＴＲＡＣＥＲ　３１３Ｍ（エム・シー・メディカル社製）を用いて分析を行った。該分析法は光透過率のモニタリングによるマウス洗浄血小板を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ血小板凝集分析法である。
　図２Ｂに示すように、ＣＨＯ／ｍｏｃｋ細胞には血小板凝集を誘導する活性は認められないが、野生型Ａｇｇｒｕｓを発現させたＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴでは血小板と混ぜてから約６分後に凝集が開始された。一方で、ＣＬＥＣ‐２との結合力が弱まったＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａと血小板を混和した場合、約１４分後からしか凝集が認められず、血小板凝集の開始が約８分遅延する。この結果は、ＣＬＥＣ‐２との結合力が弱まったという図２Ａの結果を支持しているとともに、ＣＬＥＣ‐２との結合にはこれまで同定されていたＰＬＡＧ３のドメイン以外の部位が関与しており、その部位を介したＣＬＥＣ‐２との結合により血小板凝集が誘導されているという可能性を示唆するものである。
ＣＬＥＣ‐２との結合に関わる新規ＰＬＡＧ４ドメインの発見
　哺乳類の系統樹（図３Ａ下パネル）から、ヒト（Homo sapiens、配列番号５）、ボノボ（Pan paniscus、配列番号６）、アカゲザル（Macaca mulatta、配列番号７）、ブタ（Sus scrofa、配列番号８）、マッコウクジラ（Physeter catodon、配列番号９）、ウシ（Bos Taurus、配列番号１０）、イヌ（Canis lupus familiaris、配列番号１１）、コウモリ（Myotis brandtii、配列番号１２）、ラット（Rattus norvengicus、配列番号１３）、マウス（Mus musculus、配列番号１４）のＡｇｇｒｕｓタンパク質のアミノ酸配列の相同性を検討した。
　図３Ａは、各動物のＡｇｇｒｕｓタンパク質の相同性の高い部分を並べたものである。なお、各動物のＡｇｇｒｕｓタンパク質の配列は図３Ａ下に示すＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．の配列による。その結果、これまでに報告のあるＰＬＡＧドメイン１～３に類似した、哺乳類で高度に保存されているＰＬＡＧ４ドメインを見出した（図３Ａ）。図３ＢにＰＬＡＧドメインのコンセンサス配列（配列番号１５）及びＰＬＡＧ１～ＰＬＡＧ４の配列（配列番号１６～１９）を示す。ヒトＰＬＡＧ４は、ＣＬＥＣ‐２との結合に関わると報告されている高度に保存されているグルタミン酸とそれに続くアスパラギン酸のＥＤ配列、さらに糖鎖付加部位であるスレオニンＴが保存されていた。ただし、ＥＤ配列とＴの間のアミノ酸数は、ＰＬＡＧ４ドメインではこれまでに同定してきた３アミノ酸ではなく２アミノ酸になっているという違いが見出された。
新規ＰＬＡＧ４ドメインのＣＬＥＣ‐２との相互作用ならびに血小板凝集誘導能における役割の検討
（１）樹立したＡｇｇｒｕｓ変異体の発現量検討
　新規のＰＬＡＧドメインであると推定されたＰＬＡＧ４ドメイン内にアミノ酸変異を有するＰＬＡＧ４変異体をＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。具体的には、ｐｃＤＮＡ３ベクターにＰＬＡＧ４領域内のアミノ酸である８２番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ８２Ａ）、４８番目のアスパラギン酸と８２番目のアスパラギン酸を共にアラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ）をＣＨＯ細胞に導入し、タンパク質を安定的に発現させた。各プラスミドを導入したＣＨＯ細胞は以下、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ８２Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａという。
　ＣＨＯ／ｍｏｃｋ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ８２Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ細胞株より、それぞれ細胞溶解液を調製した。各細胞溶解液を用いてＤ２-４０抗体でウェスタンブロット分析を行なった。その結果、導入した野生型及び変異型のＡｇｇｒｕｓタンパク質の発現がＣＨＯ／ｍｏｃｋ以外の細胞で認められるとともに、その発現量がほぼ揃っていることが確認された（図４Ａ）。
（２）ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４のＣＬＥＣ‐２との結合における役割検討
　これらＣＨＯの遺伝子安定発現株を用いて、実施例２と同様に、ＦＡＣＳ法によりＡｇｇｒｕｓ発現量の確認とＣＬＥＣ‐２との反応性を検討した。図４Ｂ左パネルは、図２Ａと同様に、白抜きの山がＤ２-４０抗体を反応させて野生型Ａｇｇｒｕｓ、又はＡｇｇｒｕｓ変異体を染色した結果を、黒く塗りつぶした山は、Ｄ２-４０抗体の代わりにコントロールマウス抗体（シグマ社製）を反応させた結果を示している。図４Ｂ（左パネル）に示すように、Ａｇｇｒｕｓタンパク質の各遺伝子導入株における細胞膜上での発現レベルがほぼ一致していることが、各パネルの白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度がほぼ同じであることからも確認された。
　図４Ｂ右パネルは、実施例２と同様にしてＣＬＥＣ‐２との結合をＦＡＣＳ法により解析したものである。白抜きの山は、ＣＨＯ細胞表面に発現している野生型Ａｇｇｒｕｓ、又はＡｇｇｒｕｓ変異体に結合している（Ｈｉｓ）１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２をＨｉｓタグを認識する蛍光標識された二次抗体により検出した結果を示している。なお、黒く塗りつぶした山は、（Ｈｉｓ）１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質の代わりにコントロールマウス抗体を添加し、上記と同様な操作を行なった結果である。
　８２番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したＤ８２Ａ変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ８２Ａ）のＣＬＥＣ‐２との結合は、４８番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したＤ４８Ａ変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ）との結合以上に減弱していることが明らかとなった（図４Ｂ、右パネル）。さらに、４８番目のアスパラギン酸と８２番目のアスパラギン酸を共にアラニンに置換したＤ４８Ａ／Ｄ８２Ａ二重変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ）は、全くＣＬＥＣ‐２と結合しないことが明らかとなった。これらの結果は、Ａｇｇｒｕｓ上の新たに見出されたＰＬＡＧ４ドメインが、ＰＬＡＧ３ドメインとともにＣＬＥＣ‐２との結合に重要な役割を果たしていることを示唆しているだけでなく、ＰＬＡＧ４がＰＬＡＧ３よりもＣＬＥＣ‐２との結合において主要な役割を果たしていることを示唆している。
（３）ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４の血小板凝集における役割検討
　ＰＬＡＧ４ドメインがＣＬＥＣ‐２との結合に重要な役割を担っていることが明らかになったことから、次にＰＬＡＧ４ドメインの血小板凝集における役割を検討した。上述のように、Ａｇｇｒｕｓは血小板上のＣＬＥＣ‐２と結合することで血小板凝集誘導シグナルを伝達する。ＰＬＡＧ４ドメイン内のアミノ酸変異が血小板凝集を抑制するか、実施例２に記載の血小板凝集抑制試験によって、Ａｇｇｒｕｓ依存的な血小板凝集の誘導活性を検討した。結果を図４Ｃに示す。
　ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ８２Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ変異体発現細胞を用い、実施例２と同様にして各変異体発現細胞の血小板凝集能を検討した。各変異体発現細胞の血小板凝集誘導活性は、ＣＬＥＣ‐２との結合力に比例し、Ｄ８２Ａ変異体はＤ４８Ａ変異体よりも血小板凝集誘導活性が弱く、Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ二重変異体は血小板凝集誘導活性を示さないことが明らかとなった（図４Ｃ）。よって、新規に同定したＰＬＡＧ４は、Ａｇｇｒｕｓ依存的な血小板凝集に主要な役割を果たしていることが明らかとなった。
　ＰＬＡＧ４ドメインの重要性を確認するために、ＰＬＡＧ１、３、４ドメインを各々欠失した変異体をＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。具体的には、ｐｃＤＮＡ３ベクターにＰＬＡＧ１領域内の２９から３４番目のアミノ酸を欠失したヒトＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Δ２９-３４）、ＰＬＡＧ３領域内の４７から５２番目のアミノ酸を欠失したヒトＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２）、ＰＬＡＧ４領域内の８１から８５番目のアミノ酸を欠失したヒトＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Δ８１-８５）、ＰＬＡＧ３領域内の４７から５２番目とＰＬＡＧ４領域内の８１から８５番目のアミノ酸を両方欠失したヒトＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド（Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２／Δ８１-８５）をＣＨＯ細胞に遺伝子導入し、タンパク質を安定的に発現させた（図４Ｄ参照）。各プラスミドを導入したＣＨＯ細胞は以下、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ２９-３４、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ８１-８５、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２／Δ８１-８５という。
　ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ２９-３４、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ８１-８５、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２／Δ８１-８５変異体発現細胞株を用い、実施例２と同様に、ＦＡＣＳ法によりＡｇｇｒｕｓ発現量の確認とＣＬＥＣ‐２との反応性を検討した（図４Ｅ）。なお本検討では、Ａｇｇｒｕｓ発現量の検討にＤ２-４０抗体ではなく、市販のＦＬ-１６２抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社製）を使用した。また、二次抗体としてＡlｅｘａ４８８標識された抗ウサギＩｇＧ抗体（ライフテクノロジーズ社製）を用いた（図４Ｅ左パネル）。なお、コントロールとしては、ＦＬ-１６２抗体の代わりにコントロールウサギ抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社製）を各々の細胞に反応させ、上記と同様な操作を行なった結果である。白抜きの山は、ＦＬ-１６２抗体を反応させてＰＬＡＧドメイン欠失Ａｇｇｒｕｓ変異体を染色した結果を、黒く塗りつぶした山は、ＦＬ-１６２抗体の代わりにコントロールウサギ抗体を反応させた結果を示している。図４Ｅ（左パネル）に示すように、Ａｇｇｒｕｓタンパク質の各遺伝子導入株における細胞膜上での発現レベルがほぼ一致していることが、各パネルの白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度がほぼ同じであることからも確認された。
　図４Ｅ右パネルは、実施例２と同様にしてＣＬＥＣ‐２との結合をＦＡＣＳ法により解析したものである。白抜きの山は、ＣＨＯ細胞表面に発現しているＰＬＡＧドメイン欠失Ａｇｇｒｕｓ変異体に結合している（Ｈｉｓ）１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２をＨｉｓタグを認識する蛍光標識された二次抗体により検出した結果を示している。なお、黒く塗りつぶした山は、（Ｈｉｓ）１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質の代わりにＰＢＳを添加し、上記と同様な操作を行なった結果である。
　ＣＬＥＣ‐２との相互作用は、図４Ｂに示す点変異体のデータと同じように、ＰＬＡＧ４ドメイン欠失変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ８１-８５）のＣＬＥＣ‐２との結合は、ＰＬＡＧ３ドメイン欠失変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２）との結合以上に減弱していることが明らかとなった。さらに、ＰＬＡＧ３ドメインとＰＬＡＧ４ドメインを共に欠失した二重変異体（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Δ４７-５２／Δ８１-８５）は、全くＣＬＥＣ‐２と結合しないことが明らかとなった。
　これらの結果は、Ａｇｇｒｕｓ上の新たに見出されたＰＬＡＧ４ドメインが、ＰＬＡＧ３ドメインとともにＣＬＥＣ‐２との結合に重要な役割を果たしていることを示唆しているだけでなく、ＰＬＡＧ４がＰＬＡＧ３よりもＣＬＥＣ‐２との結合において主要な役割を果たしていることを再確認するものである。
新規ＰＬＡＧ４ドメインのＣＬＥＣ‐２との相互作用ならびに血小板凝集誘導能における役割の定量的解析
（１）ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４のＣＬＥＣ‐２との結合における役割検討
　Ａｇｇｒｕｓ発現量とＣＬＥＣ‐２との反応性を定量的に解析した。具体的には、実施例４（図４Ｂ参照）で行ったＦＡＣＳ法を用いたＡｇｇｒｕｓ発現量の確認とＣＬＥＣ‐２との反応性の検討を３回繰り返して行い平均化した。ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴの白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度の平均値を１とした時の、Ａｇｇｒｕｓ変異体タンパク質の発現量をグラフに示す。Ａｇｇｒｕｓ野生型の発現量と比較した統計解析の結果、Ａｇｇｒｕｓ変異体タンパク質（Ｄ４８Ａ、Ｄ８２Ａ、Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ）の発現量に有意差はつかず（ｎｓと表記）、発現量がほぼ揃っていることが示された（図５Ａ、左パネル）。また、ＣＬＥＣ‐２との反応性を示す白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度の平均値を１とした時のＡｇｇｒｕｓ変異体タンパク質のＣＬＥＣ‐２との反応性をグラフに示した。Ａｇｇｒｕｓ野生型のＣＬＥＣ‐２との反応性を１とすると、Ａｇｇｒｕｓ変異体タンパク質（Ｄ４８Ａ、Ｄ８２Ａ、Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ）のＣＬＥＣ‐２との反応性は有意に減少（＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１）していることが示され（図５Ａ、右パネル）、実施例４の結果が再現された。
　Ａｇｇｒｕｓ欠失変異体についても、上記と同様にＡｇｇｒｕｓ発現量とＣＬＥＣ‐２との反応性を定量的に解析した（図５Ｂ）。実施例４（図４Ｅ参照）で行ったＦＡＣＳ法を用いたＡｇｇｒｕｓ発現量の確認とＣＬＥＣ‐２との反応性の検討を３回繰り返して行い平均化した。ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴの白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度の平均値を１とした時の、Ａｇｇｒｕｓ欠失変異体タンパク質の発現量をグラフに示す。Ａｇｇｒｕｓ野生型の発現量と比較した統計解析の結果、Ａｇｇｒｕｓ欠失変異体タンパク質（Δ２９-３４、Δ４７-５２、Δ８１-８５、Δ４７-５２／Δ８１-８５　）の発現量に有意差はつかず（ｎｓと表記）、発現量がほぼ揃っていることが示された（図５Ｂ、左パネル）。一方、ＣＬＥＣ‐２との反応性は欠失変異体で有意に減少していることが確認された。図４Ｅ右パネルにおいて、ＣＬＥＣ‐２との反応性を示す白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度の平均値を１とした時の、Ａｇｇｒｕｓ欠失変異体タンパク質のＣＬＥＣ‐２との反応性をグラフに示す。Ａｇｇｒｕｓ野生型のＣＬＥＣ‐２との反応性を１とすると、Ａｇｇｒｕｓ欠失変異体タンパク質（Δ２９-３４、Δ４７-５２、Δ８１-８５、Δ４７-５２／Δ８１-８５）のＣＬＥＣ‐２との反応性は、Δ２９-３４の場合を除き全て有意に減少（＊＊，Ｐ＜０．０１）していることが示され（図５Ｂ、右パネル）、実施例４の結果が再現された。
（２）ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４の血小板凝集における役割検討
　次に、ＣＨＯ／ｍｏｃｋ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ８２Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ変異体発現細胞を用い、実施例２と同様にして各変異体発現細胞の血小板凝集能を検討した。各変異体発現細胞の血小板凝集誘導活性は、ＣＬＥＣ‐２との結合力に比例し、Ｄ８２Ａ変異体はＤ４８Ａ変異体よりも血小板凝集誘導活性が弱いという図４Ｃの再現性が確認された。さらに、Ｄ４８Ａ／Ｄ８２Ａ二重変異体発現細胞はＣＨＯ／ｍｏｃｋと同様に血小板凝集誘導活性を示さないことが明らかとなった（図５Ｃ）。よって、新規に同定したＰＬＡＧ４は、Ａｇｇｒｕｓ依存的な血小板凝集に主要な役割を果たしていることが再確認された。
ＰＬＡＧ４ドメイン中のＥ８１、Ｄ８２、Ｔ８５のＣＬＥＣ‐２結合への関与
　新規に同定したＰＬＡＧ４ドメインには、ＰＬＡＧ３ドメインに類似したＥＤＸＸＴモチーフが存在する。ＰＬＡＧ４ドメイン中の８１番目のグルタミン酸（Ｅ）、８２番目のアスパラギン酸（Ｄ）、８５番目のスレオニン（Ｔ）（図６Ｂ（右パネル、下線を引いたアミノ酸））のＣＬＥＣ‐２との結合への直接的な関与を解析した。ｐｃＤＮＡ３ベクターに８１番目のグルタミン酸をアラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－Ｅ８１Ａ）、８２番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－Ｄ８２Ａ）、８５番目のスレオニンをアラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－Ｔ８５Ａ）を用いてＦＡＣＳにより解析した。なお、コントロールとして、野生型ヒトＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＡｇｇｒｕｓーＷＴ）、および、ＰＬＡＧ３ドメイン中の４７番目のグルタミン酸、４８番目のアスパラギン酸、５２番目のスレオニン（図６Ａ（右パネル、下線を引いたアミノ酸））を各々アラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－Ｅ４７Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－Ｄ４８Ａ、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－Ｔ５２Ａ）も作製し、同様に解析した。
　野生型あるいは変異型Ａｇｇｒｕｓ発現ＣＨＯ細胞を用いて、実施例２と同様に、ＦＡＣＳ法によりＡｇｇｒｕｓ発現量の確認とＣＬＥＣ‐２との反応性を検討した。図２と同様に、白抜きの山がＤ２‐４０抗体を反応させて野生型Ａｇｇｒｕｓ、又はＡｇｇｒｕｓ変異体を染色した結果を、黒く塗りつぶした山は、Ｄ２‐４０抗体の代わりにコントロールマウス抗体（シグマ社製）を反応させた結果を示している。図６Ａ（左パネル）と図６Ｂ（左パネル）に示すように、Ａｇｇｒｕｓタンパク質の各遺伝子導入株における細胞膜上での発現レベルがほぼ一致していることが、各パネルの白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度がほぼ同じであることからも確認された。
　図６Ａ（右パネル）と図６Ｂ（右パネル）は、実施例２と同様にして、各変異体のＣＬＥＣ‐２との結合をＦＡＣＳ法により解析したものである。白抜きの山は、ＣＨＯ細胞表面に発現している野生型Ａｇｇｒｕｓ、又はＡｇｇｒｕｓ変異体に結合している（Ｈｉｓ）１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２をＨｉｓタグを認識する蛍光標識された二次抗体により検出した結果を示している。なお、黒く塗りつぶした山は、（Ｈｉｓ）１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質の代わりにコントロールマウス抗体を添加し、上記と同様な操作を行なった結果である。
　ＣＬＥＣ‐２との相互作用に関しては、ＰＬＡＧ３ドメイン中の４７番目のグルタミン酸、４８番目のアスパラギン酸、５２番目のスレオニンを各々アラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ変異体のＣＬＥＣ‐２との結合は、野生型に比べ同程度に減弱していた。したがって、これら３つのアミノ酸がＣＬＥＣ‐２との結合に関与していることが確認された（図６Ａ、右パネル）。さらにその相同部位であるＰＬＡＧ４ドメイン中の８１番目のグルタミン酸、８２番目のアスパラギン酸、８５番目のスレオニンを各々アラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ変異体のＣＬＥＣ‐２との結合は、野生型およびＰＬＡＧ３ドメイン中の４７番目のグルタミン酸、４８番目のアスパラギン酸、５２番目のスレオニンを各々アラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓに比べても同程度以上に減弱していることが明らかとなった（図６Ｂ、右パネル）。
　これらの結果は、Ａｇｇｒｕｓ上に新たに見出されたＰＬＡＧ４ドメイン中の８１番目のグルタミン酸、８２番目のアスパラギン酸、８５番目のスレオニンが、ＰＬＡＧ３ドメイン中の４７番目のグルタミン酸、４８番目のアスパラギン酸、５２番目のスレオニンと同様にＣＬＥＣ‐２との結合に関与していることを示している。また、配列番号４で示すＥＤＸＸＴＳ（ＰＬＡＧ４ドメイン）がＣＬＥＣ‐２との結合に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
新規ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗ヒトＡｇｇｒｕｓモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
　以下のようにして、ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗ヒトＡｇｇｒｕｓモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製した。
（１）免疫原
　ヒトＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡの７６番目のスレオニン残基から８９番目のスレオニン残基（配列：Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ）までの部位を１２回または４０回繰り返したものをｐＧＥＸ-６Ｐ３ベクター（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にクローニングし、ＧＳＴタグ付きの免疫原を得た。このプラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、発現されたＧＳＴタグ融合組換えタンパク質をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにて精製した。
（２）感作
　６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバーより購入）に、得られた免疫原１００μｇ／匹とＴｉｔｅｒＭａｘ　Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ　ＵＳＡ社製）の混和溶液を頸部皮下投与した。追加免疫のために、隔週で免疫原１００μｇ／匹を腹腔内に計９回投与した。また、一部の感作においては、雌性ＢＤＦ－１マウス（日本クレアより購入）の尾根部に２回投与する方法で検討した。
（３）ハイブリドーマの樹立
　常法に従って、免疫したマウスより脾臓細胞または腸骨リンパ節細胞を採取し、ポリエチレングリコール４０００を用いて、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と融合させた。ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含むエスクローン　クローニングメディュウム（エーディア株式会社製）中で培養することで、融合したハイブリドーマを増殖させ、ＰＬＡＧ４ドメイン領域に対する抗体を産生するＰＧ４Ｄ１とＰＧ４Ｄ２を含む複数個のハイブリドーマを樹立させることに成功した。腸骨リンパ節細胞からは、６Ｇ４２Ａ４と９Ｄ６２Ｄ６を含む複数個のハイブリドーマを樹立させることに成功した。
新規ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗ヒトＡｇｇｒｕｓモノクローナル抗体の性状解析
（１）エピトープの探索
　ヒトＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡからシグナルペプチド部位を含むアミノ末端２４アミノ酸を除去したものをｐＧＥＸ-６Ｐ-３ベクターへクローニングしてＧＳＴタグ付きの野生型Ａｇｇｒｕｓタンパク質発現ベクターを作製した。以下、発現した組換えタンパク質をΔＮ２４-ＷＴという。また、免疫原である７６から８９番目のアミノ酸に相当するコドンをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて１ヶ所ずつアラニンをコードするコドンへと置換し、アラニン変異型Ａｇｇｒｕｓ発現ベクターを作製した。以下、組換え変異体は、例えば７６番目のアミノ酸であるスレオニン（Ｔ）をアラニン（Ａ）に変異させたものであれば、ΔＮ２４－Ｔ７６Ａのように表記する。
　ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌を作製したプラスミドにより形質転換して培養した。大腸菌破砕液をサンプルとして用い、ウェスタンブロット法により、組換えヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質に対するＭＳ-１、ＰＧ４Ｄ１、ＰＧ４Ｄ２、６Ｇ４２Ａ４、９Ｄ６２Ｄ６、抗ＧＳＴ（ａｌｐｈａ-ＧＳＴ）抗体（Ａｂｃａｍ社製）の反応性を検討した。その結果、図７Ａに示すように、ＭＳ-１抗体と抗ＧＳＴ抗体は変異体を含む全てのＡｇｇｒｕｓタンパク質を認識したが、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体は、７９番目のアルギニンから８３番目のロイシンにかけての５アミノ酸を各々アラニンに置換したＡｇｇｒｕｓ変異体に対しては低い反応性しか示さなかった。また、６Ｇ４２Ａ４抗体と９Ｄ６２Ｄ６抗体は、７７番目のグリシンから８３番目のロイシンにかけての７アミノ酸を各々アラニンに置換したＡｇｇｒｕｓ変異体に対して、８０番目のイソロイシンをアラニンに置換したものを除き、低い反応性しか示さなかった。さらに９Ｄ６２Ｄ６抗体は、８４番目のプロリンをアラニンに置換すると、認識能が減弱することが明らかとなった。
　よって、図７Ａの下段に示すように、作製された抗体の認識する領域は、白抜き文字で示した７７番目から８４番目までのペプチド部分（配列：Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ）であり、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体が認識する最小のエピトープは、７９番目から８３番目までのペプチド部分（配列：Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ）であり、図３Ｂに示したＰＬＡＧドメインにホモロジーのある新規のＰＬＡＧ４ドメイン（８１番目から８５番目の配列（図７Ａ中、点線で囲った配列：Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ）と一部オーバラップしていることが明らかとなった。
（２）哺乳類細胞に発現しているＡｇｇｒｕｓへの反応性の検討
　哺乳類細胞で発現しているヒトＡｇｇｒｕｓは、大腸菌に発現させたＡｇｇｒｕｓとは異なり、多数の糖鎖が付加されていることが知られている。新規に創製されたＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体の哺乳類細胞で発現しているヒトＡｇｇｒｕｓへの反応性を、表面プラズモン共鳴解析装置Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｘ１００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて検討した。カルボキシメチルデキストランコート処理が施されたセンサーチップＣＭ５上にアミンカップリング法にて哺乳動物細胞から市販の精製組換えＡｇｇｒｕｓタンパク質（ヒトＩｇＧ１　Ｆｃタグ付きのタンパク質：Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を固定化し、５２０ＲＵ（ＰＧ４Ｄ１抗体のアッセイ用）あるいは６００ＲＵ（ＰＧ４Ｄ２抗体のアッセイ用）相当の固定化量を得た。
　２５度、３０μＬ／分の流速の条件下で、ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファー（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を流路に満たして測定を行なった。具体的には、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭに希釈し、Ａｇｇｒｕｓタンパク質が固定化されたセンサーチップＣＭ５上に６０秒間流して結合反応を観察し、引き続きＨＢＳ－ＥＰ＋バッファーを１２０秒間流して解離反応を観察した。測定により得られたデータを図７Ｂに示す。
　創製された抗体はいずれもＡｇｇｒｕｓタンパク質を認識して結合すること（結合速度定数（ｋａ）＝３×１０４）、また洗浄用のＨＢＳ－ＥＰ＋バッファーを流しても解離反応がほとんど見られず、解離速度定数（ｋｄ）は使用したＢｉａｃｏｒｅ　Ｘ１００の計測限界以下、すなわちｋｄ値は≦１０－５であった。よって、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体の解離定数（ＫＤ）は≦３×１０－１０Ｍという値となり、非常に強い結合を示すことが明らかとなった。
（３）Ａｇｇｒｕｓ発現細胞に対する認識能
　ＭＳ-１抗体は、ｍＲＮＡレベルでのＡｇｇｒｕｓ発現が認められるヒト膀胱扁平上皮がん細胞株ＵＭ-ＵＣ-５細胞やヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０細胞などをほとんど認識できない。そのため、ＭＳ-１抗体で治療対象となるがんの種類は限定的である。新たに創製したＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を用い、ＭＳ-１抗体が認識できないＵＭ-ＵＣ-５細胞、ＨＴ１０８０細胞表面に発現しているＡｇｇｒｕｓを認識できるか検討を行った。ＵＭ-ＵＣ-５細胞、ＨＴ１０８０細胞を、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を一次抗体として用い、二次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識された抗マウスＩｇＧ抗体を用いＦＡＣＳにより解析した。その結果、ＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体は、ＭＳ－１抗体では認識することのできなかったＵＭ-ＵＣ-５細胞、ＨＴ１０８０細胞をも認識できることが確認された（図７Ｃ）。
新規ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗ヒトＡｇｇｒｕｓモノクローナル抗体の認識部位の検討と反応性
　実施例８（図７Ａ参照）では、大腸菌に発現させたヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質に対する反応性を検討した。その結果、図７Ａの下段に示すように、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体の認識する領域は、白抜き文字で示した７７番目から８４番目までのペプチド部分（配列：Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ）であることが示されていた。そこで、哺乳類細胞に発現させた糖鎖を含むＡｇｇｒｕｓに対する認識能とその認識部位を確認するために、ＣＨＯ細胞に導入したＡｇｇｒｕｓ野生型、Ａｇｇｒｕｓ変異体タンパク質、Ａｇｇｒｕｓ欠失変異体タンパク質の細胞溶解液をサンプルとして用い、ウェスタンブロット法により、ＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体の反応性を検討した。
　その結果、図８Ａに示すように、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体は、ＰＬＡＧ４ドメインに相当する８１番目から８５番目の５アミノ酸を欠失させたＡｇｇｒｕｓ変異体を認識しないことが確認された。また、図８Ｂに示すように、ＰＧ４Ｄ１抗体はＰＬＡＧ４ドメイン中の８２番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したＤ８２Ａ‐Ａｇｇｒｕｓ変異体を認識しないのに対し、ＰＧ４Ｄ２抗体はＤ８２Ａ-Ａｇｇｒｕｓ変異体を弱く認識することが確認された。これは図７Ａで示した大腸菌に発現させたヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質に対する反応性を調べた結果でもＰＧ４Ｄ２抗体はＤ８２Ａ‐Ａｇｇｒｕｓ変異体を弱く認識する事実に符合していた。なお、泳動した細胞溶解液中のタンパク質濃度が同じであることは、α‐ｔｕｂｕｌｉｎを認識する抗体を用いたウェスタンブロット分析の結果（図８Ａ、８Ｂ）からも明らかである。
　実施例８（図７Ｂ参照）では、非特異的な結合か否かの検討が行われていなかったため、ＰＧ４Ｄ１抗体（サブクラスはマウスＩｇＧ１）とＰＧ４Ｄ２抗体（サブクラスはマウスＩｇＧ２ａ）のヒトＡｇｇｒｕｓへの反応性を表面プラズモン共鳴解析装置Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｘ１００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて検討する際に、コントロールマウスＩｇＧ１（シグマ社製）、コントロールマウスＩｇＧ２ａ（シグマ社製）も比較対象として加えて検討を行った（図８Ｃ、８Ｄ）。具体的には、カルボキシメチルデキストランコート処理が施されたセンサーチップＣＭ５上にアミンカップリング法にて市販の精製組換えＡｇｇｒｕｓタンパク質（ヒトＩｇＧ１　Ｆｃタグ付きのタンパク質：Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を固定化し、５６２．２ＲＵ（ＰＧ４Ｄ１抗体のアッセイ用）相当の固定化量を得た。２５度、３０μＬ／分の流速の条件下で、ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファー（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を流路に満たして測定を行なった。具体的には、コントロールマウスＩｇＧ１（Ｃｏｎｔｒｏｌ　ＩｇＧ１）を３．７ｎＭ、１１．１ｎＭ、３３．３ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭに希釈し、Ａｇｇｒｕｓタンパク質が固定化されたセンサーチップＣＭ５上に６０秒間流して結合反応を観察し、引き続きＨＢＳ－ＥＰ＋バッファーを１８００秒間流して解離反応を観察した。引き続き、同じセンサーチップＣＭ５を用いてＰＧ４Ｄ１抗体を同条件で流して結合反応を観察した。測定により得られたデータを図８Ｃに示す。
　次に、５６２．６ＲＵ（ＰＧ４Ｄ２抗体のアッセイ用）相当の固定化量を得たセンサーチップＣＭ５に対して、最初にコントロールマウスＩｇＧ２ａ（Ｃｏｎｔｒｏｌ　ＩｇＧ２ａ）、引き続きＰＧ４Ｄ２抗体を同条件で流して結合反応を観察した。測定により得られたデータを図８Ｄに示す。
　コントロールマウスＩｇＧ１とコントロールマウスＩｇＧ２ａはともにＡｇｇｒｕｓを固定化したセンサーチップに結合しないことが確認されたのに対し、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体はともに実施例８（図７Ｂ参照）と同様な強い結合が確認されたため、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体のＡｇｇｒｕｓ固定化センサーチップへの結合は非特異的な結合ではないことが証明された。また、本アッセイにおけるＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体の解離定数（ＫＤ）も実施例８（図７Ｂ参照）と同じ、≦３×１０-１０Ｍという値となり、非常に強い結合を示すことが明らかとなった。
ＰＧ４Ｄ１とＰＧ４Ｄ２抗体によるＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との結合阻害
（１）アルファスクリーン法による検討
　非放射性のホモジニアス近接アッセイであるアルファスクリーン（登録商標）法を用いて、本発明で得られたモノクローナル抗体ＰＧ４Ｄ１、ＰＧ４Ｄ２のＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２との結合に対する阻害効果を解析した。
　１ｎｇの精製組換えＡｇｇｒｕｓタンパク質（ヒトＩｇＧ１　Ｆｃタグ付きのタンパク質、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）と３０ｎｇの精製組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質（（Ｈｉｓ）１０タグ付きのタンパク質；ｒＣＬＥＣ‐２、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を９６穴プレートに分注し、そこにコントロールマウスＩｇＧ１（シグマ社製）、コントロールマウスＩｇＧ２ａ（シグマ社製）、ＭＳ-１、ＰＧ４Ｄ１、ＰＧ４Ｄ２、６Ｇ４２Ａ４、９Ｄ６２Ｄ６抗体を最終濃度が１２．５μｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬになるように添加した。添加後、２６度で１時間反応させ、その後にＡｌｐｈａＬＩＳＡ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｂｕｆｆｅｒで希釈したＮｉｃｋｅｌ　Ｃｈｅｌａｔｅ　ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ　Ｄｏｎｏｒ　ＢｅａｄｓとＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ＡｌｐｈａＬＩＳＡ　Ａｃｃｅｐｔｏｒ　Ｂｅａｄｓを添加し、さらに２６度で１時間反応させた後に、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて６８０ｎｍの波長のレーザーで励起した。
　励起によりＤｏｎｏｒ　Ｂｅａｄｓが酸素を一重項状態に変換し、この一重項状態の酸素が近接するアクセプタービーズに含まれる蛍光物質を活性化することで、６１５　ｎｍの蛍光シグナルが放出される。すなわち、Ｎｉｃｋｅｌ　Ｃｈｅｌａｔｅ　ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ　Ｄｏｎｏｒ　Ｂｅａｄｓに結合しているＨｉｓタグが付与されているＣＬＥＣ‐２タンパク質と、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ＡｌｐｈａＬＩＳＡ　Ａｃｃｅｐｔｏｒ　Ｂｅａｄｓに結合しているＦｃタグが付与されている組換えＡｇｇｒｕｓタンパク質が近接していれば蛍光シグナルが放出される。したがって、この蛍光シグナルを定量することで、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合状態を定量することが可能となる。
　抗体無添加時の蛍光シグナル強度を１００％とすると、図９Ａに示すように、添加したＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体、ＭＳ-１抗体はすべて濃度依存的にＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を阻害することが確認された。特にＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体はＭＳ-１抗体よりもその阻害活性が強いことが明らかとなった。また、６Ｇ４２Ａ４、９Ｄ６２Ｄ６抗体にもＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を阻害する活性は認められたが、その効果はＭＳ-１抗体よりも弱かった（図９Ｂ）。
　この結果は、抗体がエピトープとして認識する領域である７７番目のから８４番目までのペプチド部分が、ＣＬＥＣ-２とＡｇｇｒｕｓとの結合に重要であることを示している。また、点変異体を用いた実施例６の解析から、８５番目のスレオニンがＣＬＥＣ－２とＡｇｇｒｕｓとの結合に重要であることは明らかである。したがって、７７番目から８５番目までのアミノ酸配列（配列番号１：ＧＩＲＩＥＤＬＰＴ）が、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ－２との結合に重要な配列であると結論付けられた。
　配列番号１で表される領域は、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ-２との結合に必要な領域であり、さらに、ＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体が認識する配列番号３（ＲＩＥＤＬ）はそのコア領域であると考えられる。したがって、配列番号１、又は配列番号３を含むペプチドを合成し投与すれば、ＣＬＥＣ-２とＡｇｇｒｕｓの結合を阻害し、ＣＬＥＣ-２とＡｇｇｒｕｓの結合を阻害できる。ＣＬＥＣ-２とＡｇｇｒｕｓとの結合を阻害することができれば、血小板凝集を抑制し、がんの進展、転移を抑制することができるので当該領域を有効成分とする医薬組成物となる。
　競合阻害に必要なペプチドとしては、配列番号１、又は３を含むペプチドであればよいが、ペプチドの合成や作用を考慮するとあまり大きいペプチドではない方が好ましい。具体的には、配列番号１、又は３を含み、これらペプチドより数アミノ酸～数１０アミノ酸程度長い配列のペプチドであることが好ましく、配列番号１又は３のペプチド配列そのものであることがより好ましい。
（２）ＦＡＣＳ法による検討
　ＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体によるＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合阻害をＦＡＣＳにより解析した。ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ細胞と、組換えＣＬＥＣ‐２（ｒＣＬＥＣ‐２）との結合を抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体が阻害するか解析を行った。検出は組換えＣＬＥＣ‐２のＨｉｓタグを認識する抗体を用いて行っている。
　具体的には、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ細胞を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に１．５×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製した。１００μＬの反応溶液に、マウスコントロールＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ：ｗ／ｏ　ｒＣＬＥＣ‐２あるいはｒＣＬＥＣ‐２　ａｌｏｎｅのサンプル）、ＰＧ４Ｄ１抗体（１００μｇ／ｍＬ：ＰＧ４Ｄ１＋ｒＣＬＥＣ‐２サンプル）、ＰＧ４Ｄ２抗体（１００μｇ／ｍＬ：ＰＧ４Ｄ２＋ｒＣＬＥＣ‐２サンプル）、ＭＳ-１抗体（１００μｇ／ｍＬ：ＭＳ-１＋ｒＣＬＥＣ‐２サンプル）を添加し、３０分間氷上で反応させた。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、その後哺乳動物細胞から精製した０．４　μｇ／ｍＬ（Ｈｉｓ）１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質（ｒＣＬＥＣ‐２）をｗ／ｏ　ｒＣＬＥＣ‐２以外のサンプルに添加し、３０分間氷上で反応させた。ＰＢＳで洗浄後に、蛍光標識されたＨｉｓタグを認識する二次抗体を添加し、氷上でさらに３０分間反応させた。最後に、細胞を３回ＰＢＳで洗浄した後に、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ５００で解析を行なった。その結果、図１０Ａに示すように、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体は、ＭＳ-１抗体と同様にｒＣＬＥＣ‐２のＡｇｇｒｕｓ発現細胞への結合を阻害するとともに、その阻害活性はＭＳ-１抗体よりも強いためにピークが大きく左にシフトしていることが確認された。
　ＭＳ-１抗体はＰＬＡＧ２からＰＬＡＧ３ドメインにわたる領域を認識するのに対し（図１参照）、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体はＰＬＡＧ４ドメイン近傍を認識する（図７参照）。そこで、ＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体がＡｇｇｒｕｓに結合した際のＭＳ-１抗体のＡｇｇｒｕｓ認識能の変化を検討した。ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識したＭＳ-１抗体とＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識したＰＧ４Ｄ２抗体を作製した。具体的には、ＤｙＬｉｇｈｔ　５９４　Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社製）の説明書に従って、ＭＳ-１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体に蛍光標識した。
　ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ細胞株を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に１．５×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製し、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識したＭＳ-１抗体又はＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識したＰＧ４Ｄ２抗体を添加し、３０分間氷上で反応させた。一部のサンプルには、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識した抗体を添加する際に、無標識のＭＳ-１抗体又はＰＧ４Ｄ２抗体を添加した。その後に、細胞を３回ＰＢＳで洗浄した後に、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ５００で解析を行なった。なお、黒く塗りつぶした山は、蛍光標識した抗体の代わりに無標識のコントロールマウス抗体（シグマ社製）を各々の細胞に反応させ、上記と同様な操作を行なった結果である。
　図１０Ｂ（一番上のパネル）に示すように、ＭＳ-１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体のＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識は十分に行われているため、白抜きのピークが黒く塗りつぶした山より右にシフトしていた。ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識したＭＳ-１抗体のＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ細胞への反応性は、無標識のＭＳ-１抗体を共存させるとその無標識のＭＳ-１抗体の濃度依存的に阻害されるが（図１０Ｂ左パネル、中段）、無標識のＰＧ４Ｄ２抗体を共存させても阻害されなかった（図１０Ｂ左パネル、下段）。また、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識したＰＧ４Ｄ２抗体のＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ細胞への反応性は、無標識のＰＧ４Ｄ２抗体を共存させるとその無標識のＰＧ４Ｄ２抗体の濃度依存的に阻害されるが（図１０Ｂ右パネル、下段）、無標識のＭＳ-１抗体を共存させても阻害されなかった（図１０Ｂ右パネル、中段）。よって、ＭＳ-１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体は各々ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４ドメインを認識し、そのことによってＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を阻害していること、言い換えるとＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４ドメインは独立してＣＬＥＣ‐２との結合に関与していることが示唆された。
　ＭＳ-１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体は、各々ＰＬＡＧ３とＰＬＡＧ４ドメインを認識してＣＬＥＣ‐２の結合を阻害しているのであれば、ＭＳ-１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を併用することで、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合を完全に阻害できる可能性が考えられた。そこで、その可能性を検証するために、ＭＳ-１抗体単独とＭＳ-１抗体に加えＰＧ４Ｄ２抗体を併用した際のＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ‐２の結合をＦＡＣＳにより解析した。ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ細胞と、組換えＣＬＥＣ‐２（ｒＣＬＥＣ‐２）との結合をＭＳ-１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体が阻害するか解析を行った。検出は組換えＣＬＥＣ‐２をＨｉｓタグを認識する抗体を用いて行っている（図１０Ｃ）。
　具体的には、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ細胞を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に１．５×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製した。１００μＬの反応溶液に、マウスコントロールＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ：ｗ／ｏ　ｒＣＬＥＣ‐２あるいはｒＣＬＥＣ‐２　ａｌｏｎｅのサンプル）、ＰＧ４Ｄ２抗体（１００μｇ／ｍＬ：ＰＧ４Ｄ２＋ｒＣＬＥＣ‐２サンプル）、ＰＧ４Ｄ２抗体とＭＳ-１抗体（各１００μｇ／ｍＬ：ＰＧ４Ｄ２＋ＭＳ-１＋ｒＣＬＥＣ‐２サンプル）を添加し、３０分間氷上で反応させた。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、その後哺乳動物細胞から精製した０．４　μｇ／ｍＬ（Ｈｉｓ）１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質（ｒＣＬＥＣ‐２）をｗ／ｏ　ｒＣＬＥＣ‐２以外のサンプルに添加し、３０分間氷上で反応させた。ＰＢＳで洗浄後に、蛍光標識されたＨｉｓタグを認識する二次抗体を添加し、氷上でさらに３０分間反応させた。最後に、細胞を３回ＰＢＳで洗浄した後に、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ５００で解析を行なった。その結果、図１０Ｃに示すように、ＰＧ４Ｄ２抗体とＭＳ-１抗体を併用することで、ＰＧ４Ｄ２抗体単独と比較して、ｒＣＬＥＣ‐２の結合が強く阻害され、ピークが大きく左にシフトしていることが確認された。
　したがって、ＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体が認識するＰＬＡＧ４ドメインは、ＰＬＡＧ３ドメインとは独立してＣＬＥＣ‐２との結合に関与していること、ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗体とＰＬＡＧ３ドメインを認識する抗体を併用することで、より強力なＣＬＥＣ‐２結合の抑制が見られることが明らかとなった。
Ａｇｇｒｕｓ変異体を用いたＰＧ４Ｄ１とＰＧ４Ｄ２抗体によるＣＬＥＣ‐２結合の抑制と血小板凝集の抑制の解析
（１）ＣＬＥＣ‐２との結合の抑制
　Ａｇｇｒｕｓは血小板上のＣＬＥＣ‐２と結合することで血小板凝集誘導シグナルを伝達する。ＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体が認識するＰＬＡＧ４ドメインがＣＬＥＣ‐２との結合ならびに血小板凝集に直接的に関与していることを解析した。ｐｃＤＮＡ３ベクターにＰＬＡＧ３ドメイン内の４８番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したヒトＡｇｇｒｕｓ　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－Ｄ４８Ａ）を用いて検討した。Ａｇｇｒｕｓ－Ｄ４８Ａを発現する変異体を用いることによって、ＡｇｇｒｕｓのＰＬＡＧ３ドメインのＣＬＥＣ‐２に対する結合の関与を考慮する必要がなく、ＰＬＡＧ４ドメインとＣＬＥＣ‐２との結合を評価することができる。ＰＬＡＧ４ドメインがＣＬＥＣ‐２とＡｇｇｒｕｓとの結合に直接的に関与しているかＦＡＣＳにより解析した。
　ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－Ｄ４８Ａ細胞を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製した。１００μＬの反応溶液に、ＰＢＳ（ｗ／ｏ　ｒＣＬＥＣ‐２あるいはＡｄｄ　ｎｏ　ａｎｔｉｂｏｄｙのサンプル）、種々の濃度でＰＧ４Ｄ１抗体（図１１Ａ左パネル）、ＰＧ４Ｄ２抗体（図１１Ａ右パネル）を添加し、３０分間氷上で反応させた。その後に細胞をＰＢＳで洗浄し、哺乳動物細胞から精製した（Ｈｉｓ）１０タグ付き組換えＣＬＥＣ‐２タンパク質（ｒＣＬＥＣ‐２）０．４μｇ／ｍＬをｗ／ｏ　ｒＣＬＥＣ‐２以外のサンプルに添加し、３０分間氷上で反応させた。ＰＢＳで洗浄後に、蛍光標識されたＨｉｓタグを認識する二次抗体を添加し、氷上でさらに３０分間反応させた。最後に、細胞を３回ＰＢＳで洗浄した後に、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ５００で解析を行なった。図１１Ａに示すように、ＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体を添加することにより、ｒＣＬＥＣ‐２のＡｇｇｒｕｓ発現細胞への結合を濃度依存的に阻害するとともに、１００μｇ／ｍＬの濃度で添加した場合にはほぼ完全にｒＣＬＥＣ‐２の結合を阻害することが明らかとなった。よって、ＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体が認識するＰＬＡＧ４ドメインがＣＬＥＣ‐２との結合に直接的に関与していることが明らかとなった。
（２）血小板凝集の抑制
　次に、血小板凝集抑制試験でＰＬＡＧ４ドメインのＣＬＥＣ‐２に対する結合を確認した。具体的には、ＭＣＭ　ＨＥＭＡ　ＴＲＡＣＥＲ　３１３を用いた光透過率のモニタリングによるマウス洗浄血小板を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ血小板凝集分析を行なった。図１１Ｂに示すように、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－Ｄ４８Ａ細胞は血小板凝集を誘導するが、５０ｎｇ／ｍＬのＰＧ４Ｄ２抗体を添加しておくと血小板凝集が起こらなくなることが観察された（図１１Ｂ）。また、ここでは示さないがＰＧ４Ｄ１抗体を事前に添加しておいても、ほぼ同様な血小板凝集阻害効果が確認された。よって、ＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体が認識するＰＬＡＧ４ドメインが血小板凝集に直接的に関与していること、さらに新たに創製された抗体はＰＬＡＧ４ドメインに結合してそのドメインを覆うことで血小板凝集を阻害する中和抗体であることが明らかとなった。
　血小板凝集抑制試験で、ＰＬＡＧ４ドメインを認識するＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体、ＰＬＡＧ３ドメインを認識するＭＳ-１抗体の差異の検討と、ＰＧ４Ｄ２抗体とＭＳ‐１抗体の併用効果を検討した。ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ細胞を用い、上記と同様にｉｎ　ｖｉｔｒｏ血小板凝集分析を行なった。図１２Ａに示すように、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ細胞は血小板凝集を誘導するが、１０μｇ／ｍＬのＭＳ-１抗体、ＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体を添加するとコントロール抗体（Ｃｏｎｔｒｏｌ　ＩｇＧ）添加時に比べて血小板凝集が開始される時間が遅くなることが観察された（図１２Ａ）。また、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体の血小板凝集抑制活性はＭＳ‐１抗体の血小板凝集抑制活性よりも強く、そのために凝集開始までの時間が遅延していることが明らかとなった。
　さらに、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ細胞依存的な血小板凝集は、１０μｇ／ｍＬのＭＳ‐１抗体と１０μｇ／ｍＬのＰＧ４Ｄ２抗体を併用すると、ＰＧ４Ｄ２抗体単独添加時に比べ、ほぼ完全に血小板凝集を阻害することが確認された（図１２Ｂ）。よって、ＰＧ４Ｄ１抗体あるいはＰＧ４Ｄ２抗体が認識するＰＬＡＧ４ドメインとＭＳ-１抗体が認識するＰＬＡＧ３ドメインの両方が血小板凝集に関与していることが明らかとなった。
ＰＧ４Ｄ１とＰＧ４Ｄ２抗体による肺への血行性転移抑制
　ヒトＡｇｇｒｕｓを発現しているＣＨＯ細胞をヌードマウスの尾静脈より導入すると、約２０日後に肺転移結節を形成することが知られている。また、本発明者らは、Ａｇｇｒｕｓ依存的な肺転移はＭＳ-１抗体により抑制されることをすでに開示している（特許文献２）。そこで、細胞移植１日前に、本発明の抗Ａｇｇｒｕｓ抗体を投与することにより、Ａｇｇｒｕｓ依存的な血行性転移を阻害するか解析した。
　６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕヌードマウス（チャールズリバージャパンより購入）を用いて解析を行った。腫瘍細胞であるＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ細胞移植１日前に、マウス尾静脈より、１０μｇ／マウスの用量でコントロールマウス抗体（シグマ社製）、ＭＳ－１抗体、ＰＧ４Ｄ１抗体、又はＰＧ４Ｄ２抗体を投与した。翌日、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ細胞を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製し、１００μＬ／マウスで尾静脈より移植した。図１３に示されるように、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を腫瘍移植前日に投与することにより、ＭＳ－１抗体を腫瘍移植前日投与した場合と同様にＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ細胞の肺転移が顕著に抑制された。したがって、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体はＡｇｇｒｕｓ中和活性があるだけでなく、Ａｇｇｒｕｓ依存的な血行性転移を強く抑制することが示された。
　同様の検討を各抗体のサブクラスが一致しているアイソタイプマッチなコントロール抗体を用いて行った。また本検討では、５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕヌードマウス（チャールズリバージャパンより購入）を各群８匹用いて行った。腫瘍細胞であるＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ細胞移植１日前に、マウス尾静脈より、１０μｇ／マウスの用量でコントロールマウスＩｇＧ１（Ｃｏｎｔｒｏｌ　ＩｇＧ１、シグマ社製）、コントロールマウスＩｇＧ２ａ（Ｃｏｎｔｒｏｌ　ＩｇＧ２ａ、シグマ社製）、ＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体、ＭＳ－１抗体を投与した。翌日、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ細胞を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製し、１００μＬ／マウスで尾静脈より移植した。１９日後に肺を摘出し解析した。図１４Ａに示すようにピクリン酸を用いた染色後の写真を撮るとともに、肺表面の転移結節数のカウントを行った（図１４Ｂ）。ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を腫瘍移植前日に投与することにより、ＭＳ－１抗体の場合と同様にＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ－ＷＴ細胞の肺転移が各アイソタイプマッチなコントロール抗体投与群と比較して、有意に抑制される（＊＊，Ｐ＜０．０１）ことが確認された。
　したがって、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体はＡｇｇｒｕｓ依存的な血小板凝集を中和する活性があるだけでなく、Ａｇｇｒｕｓ依存的な血行性転移を強く抑制することが示された。血小板凝集は、がん細胞の転移ニッチの形成（転移微小環境の形成）に関わることが報告されており、このことからＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体は転移に関わるニッチ形成の阻害効果があるものと考えられる。さらに血小板は原発巣における腫瘍増殖にも関わっていることが明らかとなっているため、転移がんの転移臓器内での増殖をＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体が抑制することで転移抑制効果を発揮していることが示唆される。
ＰＬＡＧ４ドメイン認識抗体ＰＧ４Ｄ２がＬＣ-ＳＣＣ-０１５細胞の肺転移を抑制する効果の実証
　本発明者らが樹立したヒト肺扁平上皮がん細胞株ＬＣ-ＳＣＣ-０１５を、５週齢の雄性ＣＢ-１７　ＳＣＩＤマウス（チャールズリバージャパンより購入）に各群３匹移植して行った。具体的には、腫瘍細胞であるＬＣ-ＳＣＣ-０１５細胞移植１日前に、マウス尾静脈より、３０μｇ／マウスの用量でコントロールマウスＩｇＧ２ａ（Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ２ａ、シグマ社製）、ＰＧ４Ｄ２抗体を投与した。翌日、ＬＣ-ＳＣＣ-０１５細胞を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後に２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調製し、１００μＬ／マウスで尾静脈より移植した。３１日後に肺を摘出し、ピクリン酸を用いた染色後に肺表面の転移結節数のカウントを行った（図１５）。ＰＧ４Ｄ２抗体を腫瘍移植前日に投与すると、コントロールマウスＩｇＧ２ａ抗体投与群と比較しても有意に肺転移を抑制することが確認された（＊，　Ｐ＜０．０５）。
　ＰＧ４Ｄ２抗体はＡｇｇｒｕｓ依存的な血小板凝集を中和する活性があるだけではなく、樹立したヒト肺扁平上皮がん細胞株ＬＣ-ＳＣＣ-０１５の肺転移においてもＡｇｇｒｕｓ依存的な血小板凝集が血行性肺転移に関与していることが確認された。ＰＧ４Ｄ２抗体はＡｇｇｒｕｓ依存的な血行性転移を強く抑制することによりＬＣ-ＳＣＣ-０１５細胞の肺転移を抑制していることが示された。
　血小板凝集は、がん細胞の転移ニッチの形成（転移微小環境の形成）に関わることが報告されている。このことから、ＰＧ４Ｄ２抗体は転移に関わるニッチ形成の阻害効果もあるものと考えられる。さらに血小板は原発巣における腫瘍増殖にも関わっていることが明らかとなっているため、転移がんの転移臓器内での増殖をＰＧ４Ｄ２抗体が抑制することで転移抑制効果を発揮していることも示唆される。
ＰＬＡＧ４ドメイン認識抗体ＰＧ４Ｄ２によるＰＣ-１０細胞の腫瘍増殖を抑制する効果の検証
　ヒト肺扁平上皮がん細胞株ＰＣ-１０を、５週齢の雄性ＮＯＤ　ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７-Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ；チャールズリバージャパンより購入）に各群４または５匹に移植した。ＰＣ-１０細胞移植後１１日後の腫瘍体積がほぼ８０　ｍｍ３前後となった時点で、各群の腫瘍体積の平均がほぼ均等となるようにマウスを振り分けた。その後、マウス尾静脈より、コントロールマウスＩｇＧ２ａ（Ｃｏｎｔｒｏｌ　ＩｇＧ２ａ、シグマ社製）を２００　μｇ／ｍｏｕｓｅ（ｎ＝５）、ＰＧ４Ｄ２抗体を１００　μｇ／ｍｏｕｓｅ（ｎ＝４）、ＭＳ-１抗体を１００　μｇ／ｍｏｕｓｅ（ｎ＝５）、ＰＧ４Ｄ２抗体とＭＳ-１抗体を各１００　μｇで合計２００　μｇ／ｍｏｕｓｅ（ｎ＝４）の用量で投与した。抗体投与開始日を０日とし、その後の３、７、１０、１４、１７、２１、２４日に同量の抗体投与を行った。
　図１６に示すように、ＰＧ４Ｄ２抗体あるいはＭＳ-１抗体を投与した群は、コントロールマウス抗体投与群に比較して腫瘍増殖が抑制された。その傾向はＰＧ４Ｄ２抗体とＭＳ-１抗体を併用した場合も同様であった。また、併用による腫瘍抑制効果の増強がわずかに認められた。なお、ＰＧ４Ｄ２抗体を投与した群（ＰＧ４Ｄ２抗体投与群とＰＧ４Ｄ２抗体とＭＳ-１抗体の併用群）では、各群１匹ずつで腫瘍の完全な退縮が認められたが、これはＰＣ-１０細胞の特異性あるいはマウスの個体差によるものである可能性も考慮し、腫瘍体積の平均値などの算出には加えていない。ただ、ＰＧ４Ｄ２抗体を投与した群のみ腫瘍退縮が認められたことは、ＰＧ４Ｄ２抗体にはＭＳ-１抗体とは異なる強い抗腫瘍効果がある可能性もある。
　ここでは、重度複合免疫不全マウスであるＮＯＤ　ＳＣＩＤマウスを使用して検討している。実施例１２で使用したヌードマウスや実施例１３で使用したＳＣＩＤマウスは、Ｔ細胞とＢ細胞が欠如しているマウスであるのに対し、ＮＯＤ　ＳＣＩＤマウスはＴ細胞とＢ細胞が欠如しているだけでなく、ＮＫ活性も低下している。したがって、ＮＯＤ　ＳＣＩＤマウスを用いた実施例１４の実験で認められたＡｇｇｒｕｓ中和抗体の抗腫瘍効果は、抗体のＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性に依存しているものではないと考えられる。ここで用いたＰＬＡＧ３、ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗体は、Ａｇｇｒｕｓの血小板凝集誘導活性を中和することで血小板からの各種増殖因子の遊離を阻害し、その結果増殖阻害を引き起こしていることが示唆された。よって、ＰＧ４Ｄ２抗体は直接的にＰＣ-１０細胞を殺しているのではなく、間接的に増殖因子を枯渇させることで原発巣の腫瘍増殖を抑制していることが示唆された。すなわち、ＰＬＡＧ４ドメインを認識する抗体は、実施例１２及び実施例１３で示したように血行性転移を抑制するだけでなく、原発巣の腫瘍増殖も抑制することが示された。
ヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体によるＡｇｇｒｕｓ中和活性の検討
　ＰＧ４Ｄ２抗体の抗原認識部位を遺伝子クローニングし、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部位をコードする遺伝子と連結することでＩｇＧ４タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ４ＳＰ）を、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部位をコードする遺伝子と連結することでＩｇＧ１タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ１）を作製した。
　図１７Ａは、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ細胞を用い、実施例２と同様に、各抗体のＡｇｇｒｕｓへの反応性を検討した結果を示す。左パネルは、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ細胞とキメラ化していないマウス抗体であるＰＧ４Ｄ２抗体を図中に示してある濃度で反応させ、ＰＢＳでの洗浄後に２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ（ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ-Ａｌｅｘａ４８８）を反応させた結果を示している。中央パネルは、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ細胞をＩｇＧ４タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ４ＳＰ）を図中に示してある濃度で反応させ、ＰＢＳでの洗浄後に２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗ヒトＩｇＧ（ａｎｔｉ-ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ-Ａｌｅｘａ４８８）を反応させた結果を示している。右パネルは、ＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ-ＷＴ細胞をＩｇＧ１タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ１）を図中に示してある濃度で反応させ、ＰＢＳでの洗浄後に２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗ヒトＩｇＧを反応させた結果を示している。キメラ化したＣｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ４ＳＰとＣｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ１は、ともにＡｇｇｒｕｓへ反応性を示していることが確認された。
　図１７Ｂは、実施例１０と同様に、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ-２の結合阻害をＦＡＣＳにより解析した結果を示す。キメラ化していないマウス抗体であるＰＧ４Ｄ２抗体（図１７Ｂ上）、ＩｇＧ４タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ４ＳＰ）（図１７Ｂ下左）、ＩｇＧ１タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ１）（図１７Ｂ下右）を用いてアッセイを行った。なお、各アッセイにおいては、種及び抗体のサブクラスが同じ抗体をコントロール抗体として用いた。具体的には。Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ２ａ（シグマ社製）、Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ４（シグマ社製）、Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ１（シグマ社製）を用いた。
　その結果、　ＩｇＧ４タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ４ＳＰ）は元のキメラ化していないマウス抗体であるＰＧ４Ｄ２抗体とほぼ同等なＡｇｇｒｕｓ中和活性を示すが、ＩｇＧ１タイプのヒト‐マウスキメラ化ＰＧ４Ｄ２抗体（Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ１）はＡｇｇｒｕｓ中和活性が少し弱かった。そのため、Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ１は、ＣＬＥＣ-２との結合阻害に元のＰＧ４Ｄ２抗体よりも多くの抗体量を必要としたが、Ｃｈ．ＰＧ４Ｄ２-ＩｇＧ１を６０　μｇ／ｍＬで反応させればｒＣＬＥＣ-２のＡｇｇｒｕｓへの結合を十分に阻害できた。
骨肉腫組織切片を用いたＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を用いた免疫染色
　ＵＳ　Ｂｉｏｍａｘ社より、Ｂｏｎｅ　ａｎｄ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｔｕｍｏｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　４　ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｔｕｍｏｒ　（２　ｅａｃｈ　ｏｆ　ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ，　ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ　ａｎｄ　Ｅｗｉｎｇ’ｓ　ｓａｒｃｏｍａ），　ｑｕａｄｒｕｐｌｅ　ｃｏｒｅｓ　ｐｅｒ　ｃａｓｅ（製品番号Ｔ２６４ａ）を購入し、常法に従いＨＥ染色を行った（図１８Ａ）。
　このＴｉｓｓｕｅ　ａｒｒａｙには、軟骨肉腫（Ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ）、骨肉腫（Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）、ユーイング肉腫（Ｅｗｉｎｇ’ｓ　Ｓａｒｃｏｍａ）の組織サンプルが各２症例ずつ、１症例４つの切片と、組織マーカーとして褐色細胞腫（Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）が配置されており、病期等が異なる患者の腫瘍組織でのタンパク質発現を免疫染色により解析することが可能である。このスライドに載っている骨肉腫２症例において、Ｄ２－４０、ＰＧ４Ｄ１、ＰＧ４Ｄ２の免疫染色法による骨肉腫認識能を検討した。
　一次抗体としてＤ２-４０抗体（ＤＡＫＯ社：製品番号Ｍ３６１９、Ａｎｔｉ-ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＰＧ４Ｄ１抗体（５　ｍｇ／ｍｌ）、ＰＧ４Ｄ２抗体（５　ｍｇ／ｍｌ）を用いて免疫染色を以下の方法にて行った。具体的には、脱パラフィン後に水洗し、０．３％過酸化水素水／メタノールに室温で１０分間浸し、ＰＢＳにて５分間洗浄することを３回繰り返した。その後にブロッキングワンＰ（ナカライテスク社製　＃０５９９９-８４）に室温で１５分間浸したのちにＰＢＳにて５分間洗浄した。その後に一次抗体としてＤ２-４０抗体を使用する場合はＰＢＳで１／１００希釈したものを４度で１６時間反応させた。一次抗体としてＰＧ４Ｄ１あるいはＰＧ４Ｄ２抗体を使用する場合はＰＢＳで１／１０００希釈したもの（最終抗体濃度５　μｇ／ｍｌ）を４度で１６時間反応させた。Ｄ２-４０抗体は、培養上清であるためにグラム換算が困難であることから、下記に示すようにコントロール組織での染色度合いがすべての抗体で同等となるような抗体濃度を選択して染色を行っている。ＰＢＳにて５分間洗浄することを３回繰り返した後に、二次抗体としてＯｎｅ-Ｓｔｅｐ　Ｐｏｌｙｍｅｒ-ＨＲＰ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ社製　＃ＨＫ５９５-５０Ｋ）に室温で１５分間反応させた。ＰＢＳにて５分間洗浄することを３回繰り返した後に、ＤＡＢ（商品名Ｓｕｐｅｒ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ＤＡＢ　（Ｒｅａｄｙ　ｔｏ　ｕｓｅ）、ＢｉｏＧｅｎｅｘ社製　＃ＨＫ５４２-ＸＡＫ）にて５分間発色させた。水洗した後に核をマイヤーヘマトキシリン溶液（武藤化学株式会社製　＃３０００-２）に１分間漬けることで対比染色し、その後に水洗、脱水、透徹、封入を常法に従い行った。
　Ｔｉｓｓｕｅ　ａｒｒａｙであるＴ２６４ａスライドには、上述のように骨肉腫２症例の腫瘍組織が載っており、図１８Ａに示すＡ３とＡ６の腫瘍組織は１番目の骨肉腫症例（１０歳男性）であり、Ｂ１とＢ４の腫瘍組織は２番目の骨肉腫症例（２１歳女性）に由来している。図１８Ｂに示すように、Ｄ７に位置するコントロール腫瘍組織（Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）への染色度合いがほぼ一致している染色度合いで比較すると、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体を用いた免疫染色の染色度合いはＤ２-４０抗体の染色度合いと比較してよく染まっており、ＰＧ４Ｄ１抗体とＰＧ４Ｄ２抗体はＤ２-４０抗体よりも骨肉腫認識能が高いことがわかる。したがって、少なくとも骨肉腫の増殖阻害薬・転移阻害薬として有用であることが示唆される。
　ｍＲＮＡではＡｇｇｒｕｓの発現が確認できるにもかかわらず、抗体では検出されないことがあり、Ａｇｇｒｕｓ抗体の治療への応用が限定的なものであることが懸念されていた。例えば、本発明者らは、ＭＳ-１抗体が認識できないヒト膀胱扁平上皮がん細胞株ＵＭ-ＵＣ-５細胞や、ヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０細胞をＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体が認識することを示している（図７Ｃ）。がんの種類等によって、Ａｇｇｒｕｓを認識できる場合とできない場合の機序は不明であるが、ＰＧ４Ｄ１抗体、ＰＧ４Ｄ２抗体は少なくともここで示した骨肉腫、細胞株を用いた実験系で結合が検証されている膀胱扁平上皮がん、線維肉腫、肺扁平上皮がんでは治療への適用が可能であると考えられる。
　以上示してきたように、配列番号１により表される領域に結合する抗Ａｇｇｒｕｓ抗体は、ＡｇｇｒｕｓとＣＬＥＣ-２との結合を阻害し、血小板凝集を抑制し、がんの進展、転移を抑制する。さらに、この領域とＣＬＥＣ-２との結合を指標として、ＣＬＥＣ-２との結合を阻害する医薬をスクリーニングすることが可能となる。
受託番号
　　　　ＮＩＴＥ　Ｐ－０２０７０
　　　　ＮＩＴＥ　Ｐ－０２０７１
[規則26に基づく補充 27.07.2016]　
Figure WO-DOC-FIGURE-RO134

Claims (18)

  1. 　配列番号１（ＧＩＲＩＥＤＬＰＴ）により表されるアミノ酸配列のうち少なくとも５残基の配列からなるＡｇｇｒｕｓの領域に結合するモノクローナル抗体、又はその機能的断片からなるフラグメント。
  2. 　受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２０７０（ＰＧ４Ｄ１）、又はＮＩＴＥ　Ｐ－０２０７１（ＰＧ４Ｄ２）のハイブリドーマにより産生される、請求項１記載のモノクローナル抗体、又はその機能的断片からなるフラグメント。
  3. 　キメラ化又はヒト化された請求項１記載のモノクローナル抗体、又はその機能的断片からなるフラグメント。
  4. 受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２０７０、又はＮＩＴＥ　Ｐ－０２０７１のハイブリドーマ。
  5. 　請求項１～３のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含むＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤。
  6. 　さらに配列番号２（ＧＡＥＤＤＶＶＴＰＧＴＳＥＤＲＹＫ）により表される領域に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体、そのキメラ化抗体、そのヒト化抗体、及び／又はその機能的断片からなるフラグメントを少なくとも１つ含むことを特徴とする請求項５記載のＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤。
  7. 　前記配列番号２の領域に存在するエピトープを認識する前記モノクローナル抗体が、Ｐ２－０、ＭＳ－１、ＭＳ－３、及び／又はＭＳ－４であることを特徴とする請求項６記載のＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤。
  8. 　請求項１～３のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含む血小板凝集抑制、血栓抑制、がん進展・転移抑制、抗炎症のための医薬組成物。
  9. 　さらに配列番号２（ＧＡＥＤＤＶＶＴＰＧＴＳＥＤＲＹＫ）により表される領域に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体、そのキメラ化抗体、そのヒト化抗体、及び／又はその機能的断片からなるフラグメントを少なくとも１つ含むことを特徴とする請求項８記載の医薬組成物。
  10. 　前記配列番号２の領域に存在するエピトープを認識する前記モノクローナル抗体が、Ｐ２－０、ＭＳ－１、ＭＳ－３、及び／又はＭＳ－４であることを特徴とする請求項９記載の医薬組成物。
  11. 　請求項１～３のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含むＡｇｇｒｕｓ発現を検出するための検査用試薬。
  12. 　ＣＬＥＣ‐２の結合に必要なＰＬＡＧ４ドメインと重複するＡｇｇｒｕｓの領域であって、
    　配列番号１（ＧＩＲＩＥＤＬＰＴ）により表されることを特徴とする領域。
  13. 　請求項１２記載のＣＬＥＣ‐２の結合に必要なＰＬＡＧ４ドメインと重複するＡｇｇｒｕｓの領域であって、
    　前記アミノ酸配列が配列番号３（ＲＩＥＤＬ）により表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする領域。
  14. 　請求項１２、又は１３の領域を含むペプチドからなるＡｇｇｒｕｓ－ＣＬＥＣ‐２結合阻害剤。
  15. 　請求項１２、又は１３の領域を含むペプチドを有効成分とする血小板凝集抑制、血栓抑制、がん進展・転移抑制、抗炎症のための医薬組成物。
  16. 　ＣＬＥＣ‐２とＡｇｇｒｕｓの結合阻害剤のスクリーニング方法であって、
    　配列番号１（ＧＩＲＩＥＤＬＰＴ）により表されるアミノ酸配列のうち少なくとも５残基の配列からなるＡｇｇｒｕｓエピトープへの結合を指標とすることを特徴とする阻害剤スクリーニング方法。
  17. 　請求項１６記載のスクリーニング方法であって、
    　配列番号３（ＲＩＥＤＬ）により表されるアミノ酸配列への結合を指標とすることを特徴とする阻害剤スクリーニング方法。
  18. 　ＣＬＥＣ‐２とＡｇｇｒｕｓの結合阻害剤のスクリーニング方法であって、
    　配列番号４（ＥＤＸＸＴＳ）により表されるアミノ酸配列への結合を指標とすることを特徴とする阻害剤スクリーニング方法。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106947744A (zh) * 2017-03-14 2017-07-14 福州迈新生物技术开发有限公司 一株分泌抗平足蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
WO2018179302A1 (ja) * 2017-03-30 2018-10-04 国立大学法人東北大学 抗ポドプラニン抗体
WO2019081714A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 Vib Vzw POSITIVE MACROPHAGES TO PODOPLANIN
JP6737482B1 (ja) * 2019-03-15 2020-08-12 公益財団法人がん研究会 抗ポドプラニン抗体
WO2020188836A1 (ja) 2019-03-15 2020-09-24 公益財団法人がん研究会 抗ポドプラニン抗体

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107849138B (zh) * 2015-07-15 2021-06-29 公益财团法人癌研究会 抗Aggrus单克隆抗体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012128082A1 (ja) * 2011-03-22 2012-09-27 公益財団法人がん研究会 マウス抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体
WO2015053381A1 (ja) * 2013-10-10 2015-04-16 幸成 加藤 抗ポドプラニン抗体

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4721633B2 (ja) 2002-10-11 2011-07-13 財団法人癌研究会 血小板凝集促進活性を有する物質
CN1778822A (zh) * 2004-11-24 2006-05-31 中国人民解放军第二军医大学 C型凝集素样受体l1的单克隆抗体及其制备和应用
JP2013071916A (ja) 2011-09-28 2013-04-22 General Incorporated Association Pharma Valley Project Supporting Organization ３−アリールオキシクロモン化合物を有効成分とする血小板凝集抑制剤
CN107849138B (zh) * 2015-07-15 2021-06-29 公益财团法人癌研究会 抗Aggrus单克隆抗体及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012128082A1 (ja) * 2011-03-22 2012-09-27 公益財団法人がん研究会 マウス抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体
WO2015053381A1 (ja) * 2013-10-10 2015-04-16 幸成 加藤 抗ポドプラニン抗体

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KATO Y. ET AL.: "Abstract 663: Development of a cancer-specific monoclonal antibody LpMab-2 specific for cancer-tye podoplanin", CANCER RESEARCH, vol. 74, no. 19, 2014, XP055345544, Retrieved from the Internet <URL:http://cancerres.aacrjournals.org/content/74/19_Supplement/663> [retrieved on 20160831] *
KATO Y. ET AL.: "Molecular analysis of the pathophysiological binding of the platelet aggregation-inducing factor podoplanin to the C-type lectin-like receptor CLEC-2", CANCER SCI., vol. 99, no. 1, 2008, pages 54 - 61, XP002550988, ISSN: 1347-9032 *
KATO Y. ET AL.: "Novel Monoclonal Antibody LpMab- 17 Developed by CasMab Technology Distinguishes Human Podoplanin from Monkey Podoplanin.", MONOCLON. ANTIB. IMMUNODIAGN. IMMUNOTHER., vol. 35, no. 2, April 2016 (2016-04-01), pages 109 - 116, XP055345554, ISSN: 2167-9436 *
MATSUI K. ET AL.: "Epitope-Specific Antibodies to the 43kD Glomerular Membrane Protein Podoplanin Cause Proteinuria and Rapid Flattening of Podocytes.", J. AM. SOC. NEPHROL., vol. 9, 1998, pages 2013 - 2026, XP055345547, ISSN: 1046-6673 *
OKI H. ET AL.: "Characterization of Monoclonal Antibody LpMab-3 Recognizing Sialylated Glycopeptide of Podoplanin", MONOCLON. ANTIB. IMMUNODIAGN. IMMUNOTHER., vol. 34, no. 1, 2015, pages 44 - 50, XP055345541, ISSN: 2167-9436 *
OKI H. ET AL.: "Characterization of Monoclonal Antibody LpMab-7 Recognizing Non-PLAG Domain of Podoplanin", MONOCLON ANTIB. IMMUNODIAGN. IMMUNOTHER., vol. 34, no. 3, June 2015 (2015-06-01), pages 174 - 180, XP055345536, ISSN: 2167-9436 *
SEKIGUCHI T. ET AL.: "Targeting a novel domain in podoplanin for inhibiting platelet-mediated tumor metastasis.", ONCOTARGET, vol. 7, no. 4, January 2016 (2016-01-01), pages 3934 - 3946, XP055345553, ISSN: 1949-2553 *
ZIMMER G. ET AL.: "Molecular characterization of gp40, a mucin-type glycoprotein from the apical plasma membrane of Madin-Darby canine kidney cells (type I).", BIOCHEM. J., vol. 326, no. 1, 1997, pages 99 - 108, XP002110714, ISSN: 0264-6021 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106947744A (zh) * 2017-03-14 2017-07-14 福州迈新生物技术开发有限公司 一株分泌抗平足蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
WO2018179302A1 (ja) * 2017-03-30 2018-10-04 国立大学法人東北大学 抗ポドプラニン抗体
CN110475789A (zh) * 2017-03-30 2019-11-19 国立大学法人东北大学 抗平足蛋白抗体
JPWO2018179302A1 (ja) * 2017-03-30 2020-02-06 国立大学法人東北大学 抗ポドプラニン抗体
EP3674324A4 (en) * 2017-03-30 2021-04-07 Tohoku University ANTI-PODOPLANIN ANTIBODIES
US11306152B2 (en) 2017-03-30 2022-04-19 Tohoku University Anti-podoplanin antibody
CN110475789B (zh) * 2017-03-30 2023-12-05 国立大学法人东北大学 抗平足蛋白抗体
WO2019081714A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 Vib Vzw POSITIVE MACROPHAGES TO PODOPLANIN
JP6737482B1 (ja) * 2019-03-15 2020-08-12 公益財団法人がん研究会 抗ポドプラニン抗体
WO2020188836A1 (ja) 2019-03-15 2020-09-24 公益財団法人がん研究会 抗ポドプラニン抗体
KR20210141794A (ko) 2019-03-15 2021-11-23 고에키자이단호진 간겐큐카이 항포도플라닌 항체
US11530266B2 (en) 2019-03-15 2022-12-20 Japanese Foundation For Cancer Research Anti-podoplanin antibody

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