KR20180023951A - 항Aggrus 모노클로널 항체, CLEC-2와의 결합에 필요한 Aggrus의 영역, 및 Aggrus-CLEC-2 결합저해제의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

CLEC-2와의 결합에 관여하는 새로운 Aggrus의 도메인을 탐색하여, 당해 도메인을 인식하는 모노클로널 항체를 얻었다. 새롭게 찾아낸 PLAG4 도메인이, CLEC-2와의 결합에 중요한 것, 또한 이 영역을 인식하는 모노클로널 항체를 창제했다. 이 항체를 사용한 신규의 Aggrus-CLEC-2 결합저해제, 혈소판 응집억제제, 암전이억제제를 제공할 수 있다.

Description

항Aggrus 모노클로널 항체, CLEC-2와의 결합에 필요한 Aggrus의 영역, 및 Aggrus-CLEC-2 결합저해제의 스크리닝 방법

[0001] 본 발명은, Aggrus와 CLEC-2의 결합에 관여하는 Aggrus의 영역, 및 당해 영역을 인식하는 항체에 관한 것이다. 또한, 당해 Aggrus의 영역을 포함하는 펩티드나 모노클로널 항체를 포함하는 Aggrus-CLEC-2 결합저해제, 및 이것을 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다. 또한, 당해 영역에의 결합을 지표로 하는 의약의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

[0002] 암은 세포가 무질서하게 증식하는 것을 특징으로 하는 질환이지만, 암의 치사율을 규정하는 큰 요인은, 암이 발생한 원발소에서의 증식이라기보다는, 전이소에 있어서의 증식이다. 실제로 전이암으로 진단된 환자의 5년 생존율은 20% 이하로 알려져 있어, 암전이의 억제는 임상상 큰 과제로 되어 있다.

[0003] 암의 혈행성 전이에는, 암세포 의존적인 혈소판 응집이 관여하고 있는 것이 예전부터 임상상 인정되어 있었다. 본 발명자의 그룹은, 혈소판 응집 유도 활성을 나타내는 고전이 암세포주를 수립하고, 고전이 암세포주의 세포막 표면 상에 발현하여 있는 혈소판 응집을 유도하는 인자 Aggrus를 동정했다(특허문헌 1, 비특허문헌 1).

[0004] 혈소판 응집 촉진 인자 Aggrus(podoplanin, gp44, T1α 등으로도 알려졌다)는, I형 막관통 단백질이며, 편평상피암, 중피종, 카포지 육종, 정소종양, 뇌종양, 또는 방광암과 같은 다양한 암에서 발현이 증가하고 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 2∼13).

[0005] 최근, 혈소판 상에 발현하여 있는 C형 렉틴 유사 수용체(CLEC-2)가 Aggrus의 카운터파트 수용체의 하나인 것이 동정되었다(비특허문헌 14). 종양 세포 상에서 발현하여 있는 Aggrus에 CLEC-2가 결합하면 혈장 성분이 없어도 혈소판에서 혈소판 응집의 시그널이 활성화되어, 혈소판 응집이 유도되는 것이 알려져 있다. 즉, Aggrus와 CLEC-2의 결합을 저해하는 물질은, 혈소판 응집을 억제하여, 암의 전이를 억제한다고 생각할 수 있다. 따라서, Aggrus와 CLEC-2의 결합을 저해하는 물질은, 암이나 혈전증의 치료에의 응용이 기대된다. 실제로 본 발명자들은, Aggrus에 대한 모노클로널 항체나 저분자 화합물에 의해서, Aggrus와 CLEC-2의 상호 작용이 저해되어, 혈소판 응집이나 암전이가 억제되는 것을 개시하고 있다(특허문헌 2, 3, 비특허문헌 15).

[0006] 모노클로널 항체는, 세포 표면 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 표적 세포에 면역학적 응답을 일으킬 수 있다. 이 반응을 이용해서, 많은 모노클로널 항체가 암치료나 면역 질환의 치료에 사용되고 있다. 모노클로널 항체는, 중화, 항체의존성 세포 장애 활성(antibody-dependent cellular cytotoxicity; ADCC), 및 보체의존성 세포 장애 활성(complement-dependent cytotoxicity; CDC)의 세 대표적인 작용 양식을 통해서 치료 효과를 나타낸다.

[0007] 이때까지, 본 발명자들은, 수립한 하이브리도마가 산생하는 항Aggrus 모노클로널 항체, P2-0, MS-1, MS-3, MS-4는 모두 Aggrus-CLEC-2의 결합을 저해하는 중화 항체이고, ADCC 활성 비의존적으로 혈소판 응집 억제, 암전이 억제, 종양 증식 억제 작용을 나타내는 것을 명백히 하고 있다(특허문헌 2).

[0008] 이들 네 항체 중 Aggrus-CLEC-2의 결합을 저해하는 활성이 높은 P2-0과 MS-1 항체는, 모두 PLAG 도메인(Platelet-Aggregation stimulating domain) 영역 내의 아미노산을 에피토프로서 인식하는 항체이다. PLAG 도메인이란, 인간, 마우스, 래트로 종을 초월해서 보존되어 있는 EDXXVTPG를 공통 서열로 하는 아미노산 서열이다. PLAG 도메인은, 근접한 영역에 PLAG1∼PLAG3까지 3회 반복하여 존재하는 아미노산 서열이고, 인간 Aggrus의 경우, 아미노산 서열의 29∼54번째의 영역에 존재한다.

[0009] PLAG 도메인은 세포 외에 존재하고, 혈소판 응집 활성에 관련된 것이 알려져 있다. 또한, Aggrus와 CLEC-2와의 공결정 구조 해석의 결과, Aggrus의 47번째의 글루탐산과 48번째의 아스파라긴산에 더하여, 52번째의 트레오닌에 부가되어 있는 시알산이 CLEC-2의 107∼157번째의 영역 중에 존재하는 네 아르기닌과 결합하여 있는 것이 나타나 있다(비특허문헌 16). 본 발명자들이 창제한 P2-0과 MS-1 항체도, 이 Aggrus-CLEC-2 결합 영역과 중복하는 Aggrus의 아미노산 서열의 45∼49번째의 영역을 에피토프로서 인식하고 있다. 또한, MS-3, MS-4 항체는 Aggrus-CLEC-2 결합 영역에 근접하는 Aggrus의 아미노산 서열의 54∼61번째의 영역을 에피토프로서 인식하고 있다.

일본 특개2004-350677호 공보 국제공개 2012/128082호 일본 특개2013-71916호 공보

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[0012] 그러나, 이하에 나타내는 바와 같이, Aggrus와 CLEC-2와의 공결정 구조 해석의 결과, 명백해져 있던 CLEC-2와의 결합에 관한 Aggrus의 48번째의 아스파라긴산을 알라닌 치환한 Aggrus 변이체여도, CLEC-2에 결합하는 것이 명백해졌다. 또한, Aggrus의 48번째의 아스파라긴산을 알라닌 치환한 Aggrus 변이체에 의한 혈소판 응집에 관해서도, 혈소판 응집이 개시하기까지의 시간의 지연이 인정되지만, 최종적으로는 혈소판 응집이 일어나는 것이 확인되었다.

[0013] 또한, 본 발명자들은, Aggrus에 대한 모노클로널 항체나 저분자 화합물에 의해서, Aggrus와 CLEC-2의 상호 작용이 저해되어, 혈소판 응집이 억제되고, 또한 암전이가 억제되는 것을 개시하고 있지만(특허문헌 2, 3), 이들 모노클로널 항체나 저분자 화합물은 혈소판 응집 개시 시간의 지연 효과는 있지만, Aggrus에 의한 혈소판 응집을 완전히 억제할 수는 없었다. 즉, Aggrus와 CLEC-2의 결합 부위가 기지의 PLAG 도메인 이외의 영역에도 존재할 가능성이 시사된다.

[0014] 본 발명은, Aggrus와 CLEC-2의 결합에 관여하는 새로운 도메인의 탐색을 행하여, 당해 도메인에 결합하는 모노클로널 항체를 얻는 것을 과제로 한다. 또한, 당해 도메인에 결합하는 화합물을 탐색함에 의해, 암의 증식과 전이, 혈소판 응집을 억제하는 화합물의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

[0015] 본 발명은 이하에 나타내는 Aggrus의 영역을 인식하는 모노클로널 항체, 이것을 산생하는 하이브리도마, CLEC-2와의 결합에 필요한 Aggrus의 영역, Aggrus-CLEC-2 결합저해제, 의약 조성물, 검사용 시약, Aggrus-CLEC-2 결합저해제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

[0016] (1) 서열 번호 1(GIRIEDLPT)에 의해 표시되는 아미노산 서열 중 적어도 5잔기의 서열로 이루어지는 Aggrus의 영역에 결합하는 모노클로널 항체, 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트.

(2) 수탁번호 NITE P-02070(PG4D1), 또는 NITE P-02071(PG4D2)의 하이브리도마에 의해 산생되는, (1) 기재의 모노클로널 항체, 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트.

(3) 키메라화 또는 인간화된 (1)에 기재된 모노클로널 항체, 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트.

(4) 수탁번호 NITE P-02070, 또는 NITE P-02071의 하이브리도마.

(5) (1)∼(3) 중 어느 한 항에 기재된 모노클로널 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 포함하는 Aggrus-CLEC-2 결합저해제.

(6) 또한 서열 번호 2(GAEDDVVTPGTSEDRYK)에 의해 표시되는 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 모노클로널 항체, 그 키메라화 항체, 그 인간화 항체, 및/또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 적어도 하나 포함하는 것을 특징으로 하는 (5)에 기재된 Aggrus-CLEC-2 결합저해제.

(7) 상기 서열 번호 2의 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 상기 모노클로널 항체가, P2-0, MS-1, MS-3, 및/또는 MS-4인 것을 특징으로 하는 (6)에 기재된 Aggrus-CLEC-2 결합저해제.

(8) (1)∼(3) 중 어느 한 항에 기재된 모노클로널 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 포함하는 혈소판 응집 억제, 혈전 억제, 암진전·전이 억제, 항염증을 위한 의약 조성물.

(9) 또한 서열 번호 2(GAEDDVVTPGTSEDRYK)에 의해 표시되는 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 모노클로널 항체, 그 키메라화 항체, 그 인간화 항체, 및/또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 적어도 하나 포함하는 것을 특징으로 하는 (8)에 기재된 의약 조성물.

(10) 상기 서열 번호 2의 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 상기 모노클로널 항체가, P2-0, MS-1, MS-3, 및/또는 MS-4인 것을 특징으로 하는 (9)에 기재된 의약 조성물.

(11) (1)∼(3) 중 어느 한 항에 기재된 모노클로널 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 포함하는 Aggrus 발현을 검출하기 위한 검사용 시약.

(12) CLEC-2의 결합에 필요한 PLAG4 도메인과 중복하는 Aggrus의 영역으로서, 서열 번호 1(GIRIEDLPT)에 의해 나타나는 것을 특징으로 하는 영역.

(13) (12)에 기재된 CLEC-2의 결합에 필요한 PLAG4 도메인과 중복하는 Aggrus의 영역으로서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 3(RIEDL)에 의해 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 영역.

(14) (12), 또는 (13)의 영역을 포함하는 펩티드로 이루어지는 Aggrus-CLEC-2 결합저해제.

(15) (12), 또는 (13)의 영역을 포함하는 펩티드를 유효 성분으로 하는 혈소판 응집 억제, 혈전 억제, 암진전·전이 억제, 항염증을 위한 의약 조성물.

(16) CLEC-2와 Aggrus의 결합저해제의 스크리닝 방법으로서, 서열 번호 1(GIRIEDLPT)에 의해 표시되는 아미노산 서열 중 적어도 5잔기의 서열로 이루어지는 Aggrus 에피토프에의 결합을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 저해제 스크리닝 방법.

(17) (16)에 기재된 스크리닝 방법으로서, 서열 번호 3(RIEDL)에 의해 나타나는 아미노산 서열에의 결합을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 저해제 스크리닝 방법.

(18) CLEC-2와 Aggrus의 결합저해제의 스크리닝 방법으로서, 서열 번호 4(EDXXTS)에 의해 나타나는 아미노산 서열에의 결합을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 저해제 스크리닝 방법.

[0017] 본 발명자들은, Aggrus와 CLEC-2의 결합에 필요한 새로운 PLAG 도메인을 찾아냄에 의해, 당해 영역에 결합하는 새로운 모노클로널 항체를 얻을 수 있었다. 당해 영역에 결합하는 모노클로널 항체는 Aggrus와 CLEC-2의 결합을 강하게 저해하므로, 암이나 혈전증의 치료에 유효한 것이 기대된다. 또한, 새로운 PLAG 도메인을 표적으로 하는 항암제의 스크리닝도 가능하게 된다.

도 1의 A는 Aggrus 변이체를 사용한 중화 항체의 인식 부위의 검증 결과를 나타내는 도면.
도 1의 B는 인간 Aggrus 아미노산 서열 중의 PLAG 도메인을 나타내는 도면.
도 2의 A는 CHO 세포에 도입한 Aggrus 야생형, Aggrus 변이체 단백질의 발현량, 및 CLEC-2 단백질과의 결합을 나타내는 도면.
도 2의 B는 혈소판 응집에 대한 48번째의 아미노산 변이 D48A의 효과를 나타내는 도면.
도 3의 A는 포유류 Aggrus 아미노산 서열의 상동성을 나타내는 도면.
도 3의 B는 PLAG 도메인의 컨센서스 서열을 나타내는 도면.
도 4의 A는 Aggrus 변이체의 단백질 발현을 나타내는 도면.
도 4의 B는 CHO 세포에 도입한 Aggrus 야생형, Aggrus 변이체 단백질의 발현량, 및 CLEC-2 단백질과의 결합을 나타내는 도면.
도 4의 C는 혈소판 응집에 대한 48번째의 아미노산 변이 D48A, 82번째의 아미노산 변이체 D82A, 48번째와 82번째의 아미노산의 이중 변이 D48A/D82A의 효과를 나타내는 도면.
도 4의 D는 PLAG 도메인 결실 변이체를 모식적으로 나타내는 도면.
도 4의 E는 CHO 세포에 도입한 Aggrus 결실 변이체 단백질의 발현량, 및 CLEC-2 단백질과의 결합을 나타내는 도면.
도 5의 A는 CHO 세포에 도입한 Aggrus 야생형, Aggrus 점변이체 단백질의 발현량, 및 CLEC-2 단백질과의 결합을 정량적으로 나타내는 도면.
도 5의 B는 CHO 세포에 도입한 Aggrus 야생형, Aggrus 결실 변이체 단백질의 발현량, 및 CLEC-2 단백질과의 결합을 정량적으로 나타내는 도면.
도 5의 C는 혈소판 응집에 대한 D48A, D82A, D48A/D82A의 효과를 나타내는 도면.
도 6의 A-B는 PLAG4 도메인(EDXXTS)의 81번째의 글루탐산, 82번째의 아스파라긴산, 85번째의 트레오닌의 CLEC-2 결합에의 관여를 나타내는 도면.
도 7의 A는 항Aggrus 모노클로널 항체의 에피토프 해석을 나타내는 도면.
도 7의 B는 포유류 세포에 발현하여 있는 Aggrus에 대한 항체의 반응성을 나타내는 도면.
도 7의 C는 Aggrus 발현 세포에 대한 항Aggrus 모노클로널 항체의 반응성을 나타내는 도면.
도 8의 A-B는 PG4D1, PG4D2 항체의 인식 부위를 검토한 도면.
도 8의 C는 PG4D1 항체의 반응성을 검토한 도면.
도 8의 D는 PG4D2 항체의 반응성을 검토한 도면.
도 9의 A-B는 항Aggrus 모노클로널 항체에 의한 Aggrus-CLEC-2의 결합 저해를 나타내는 도면.
도 10의 A는 항Aggrus 모노클로널 항체에 의한 Aggrus-CLEC-2의 결합 저해를 나타내는 도면.
도 10의 B는 PLAG3과 PLAG4 도메인을 각각 인식하는 항체가 Aggrus에 결합할 때에 상호 간섭하지 않는 것을 나타내는 도면.
도 10의 C는 PLAG3과 PLAG4 도메인을 각각 인식하는 항체에 의해, Aggrus와 CLEC-2와의 결합이 완전히 억제되는 것을 나타내는 도면.
도 11의 A는 PLAG4 도메인을 인식하는 항Aggrus 모노클로널 항체에 의한 Aggrus-CLEC-2의 결합 저해를 나타내는 도면.
도 11의 B는 PLAG4 도메인을 인식하는 항Aggrus 모노클로널 항체에 의한 혈소판 응집의 억제를 나타내는 도면.
도 12의 A는 PLAG4 도메인을 인식하는 항Aggrus 모노클로널 항체와 PLAG3 도메인을 인식하는 항Aggrus 모노클로널 항체에 의한 혈소판 응집의 억제를 나타내는 도면.
도 12의 B는 PLAG4 도메인을 인식하는 항Aggrus 모노클로널 항체와 PLAG3 도메인을 인식하는 항Aggrus 모노클로널 항체와의 병용에 의한 혈소판 응집의 억제를 나타내는 도면.
도 13의 A-B는 PLAG4 도메인을 인식하는 항Aggrus 모노클로널 항체에 의한 폐에의 혈행성 전이의 억제를 나타내는 도면.
도 14의 A-B는 PG4D1 항체와 PG4D2 항체에 의한 폐에의 혈행성 전이를 억제하는 것을 나타내는 도면.
도 15는 LC-SCC-015 세포의 폐전이를 억제하는 PG4D2 항체의 효과를 나타내는 도면.
도 16은 폐편평상피암 세포 PC-10의 종양 증식에 대한 PG4D2 항체의 억제 효과를 나타내는 도면.
도 17의 A는 키메라화 PG4D2 항체의 Aggrus에 대한 결합을 나타내는 도면.
도 17의 B는 키메라화 PG4D2 항체가 Aggrus-CLEC-2 결합을 억제하는 것을 나타내는 도면.
도 18의 A는 골육종 절편의 HE 염색도.
도 18의 B는 PG4D1 항체와 PG4D2 항체가, D2-40 항체보다도 감도 좋게 골육종을 인식하는 것을 나타내는 도면.

[0019] 본 발명의 항Aggrus 모노클로널 항체, 또는 기능적 단편이란, 새롭게 찾아낸 Aggrus의 PLAG4 도메인과 중복하는 영역을 에피토프로서 인식하는 항체를 말하며, 기능적 단편이란 원래의 항체와 실질적으로 같은 항원특이성을 갖는 항체의 단편을 말하는 것으로 한다.

[0020] 본 발명의 Aggrus에 대한 모노클로널 항체의 호적한 예로서는, 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터(NITE-NPMD(292-0818 일본국 지바현 기사라즈시 가즈사 가마타리2-5-8 122호실)에 수탁번호 NITE P-02070, NITE P-02071로서 2015년 7월 14일부로 기탁된 하이브리도마가 산생하는 모노클로널 항체를 들 수 있다. 또한, 이들과 동등한 결합특이성을 구비한 다른 항체도 본 발명의 항Aggrus 모노클로널 항체로서 바람직하다.

[0021] 또한, 본 발명에 있어서 모노클로널 항체란, 얻어진 하이브리도마에 의해서 산생되는 항체뿐만 아니라, 유전자 재조합 기술을 이용해서 제작된 인간형 키메라 항체(이하, 키메라화 항체로 기재하는 경우도 있다), 또는 인간형 CDR(상보성 결정 영역, Complementarity Determining Region) 이식 항체(이하, 인간화 항체로 기재하는 경우도 있다) 등, 인간에 투여했을 경우 안전성이 담보되어 있는 항체 전반을 포함하는 것으로 한다.

[0022] 인간형 키메라 항체란, 항체의 가변 영역(이하, V 영역으로 하는 경우도 있다)이 인간 이외의 동물의 항체이고, 정상 영역(이하, C 영역으로 하는 경우도 있다)이 인간 항체인 항체를 말한다(비특허문헌 17). 인간형 CDR 이식 항체란, 인간 이외의 동물의 항체의 V 영역 중의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체의 적절한 위치에 이식한 항체이다(비특허문헌 18). 키메라화 항체나 인간화 항체는, 인간에 투여했을 경우, 인간 이외의 동물의 항체에 비하여, 부작용이 적고, 그 치료 효과가 장기간 지속한다. 또한, 키메라화 항체나 인간화 항체는 유전자 재조합 기술을 이용해서 다양한 형태의 분자로서 제작할 수 있다. 모노클로널 항체로부터 키메라화 항체나 인간화 항체를 제작하는 방법은 공지의 방법을 사용할 수 있다.

[0023] 항체의 기능적 단편에는, Fab, Fab', F(ab')₂, 단쇄 항체(scFv), 디설피드 안정화 V 영역 단편(dsFv), 또는 CDR을 포함하는 펩티드 등의 항체의 기능적 단편이 포함된다. 항체의 기능적 단편은, 펩신, 또는 파파인 등의 효소에 의해서 소화하는 등 공지의 방법에 의해서 얻을 수 있다.

[0024] 본 발명은, 다른 태양에 있어서, 모노클로널 항체, 또는 그 프래그먼트를 포함하는 Aggrus-CLEC-2 결합저해제, 혈소판 응집억제제, 항암제로서 사용하는 의약 조성물을 제공할 수 있다. 혈소판 응집억제제는, 예를 들면, 뇌경색, 또는 심근경색과 같은 혈전증을 처치하기 위하여 사용할 수 있다. 항암제로서는, 암전이 억제제로서뿐만 아니라, 암의 진전, 암에 기인하는 염증을 억제하기 위하여 사용할 수 있다. 암, 또는 종양은, 지금까지 Aggrus 분자의 발현의 증가가 인정되어 있는 암, 즉 편평상피암, 섬유육종, 중피종, 카포지 육종, 정소종양, 뇌종양, 또는 방광암에 대해서 호적하게 작용하는 것을 기대할 수 있다.

[0025] 본 발명의 의약 조성물의 제형의 종류로서는, 펩티드, 항체 의약의 경우에는, 예를 들면, 비경구제인 주사제로서 사용하는 것이 일반적이다. 또한, 스크리닝에 의해 얻어진 화합물 등의 경우에는, 주사제뿐만 아니라, 경구제, 비경구제로서 투여할 수 있다. 경구제로서는, 예를 들면, 정제, 분말제, 환제, 산제, 과립제, 연·경캡슐제, 필름코팅제, 펠렛제, 설하제, 페이스트제 등을 들 수 있다. 또한, 비경구제로서는, 주사제 외에, 좌제, 경피제, 연고제, 외용액제 등을 들 수 있다. 그러나, 여기에 든 제형에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 있어서 투여 경로, 투여 대상에 있어서 적의(適宜) 최적의 제형을 선택할 수 있다. 또한, 유효 성분으로서, 본 발명의 항Aggrus 항체를 사용하는 경우에는, 제제 중의 0.1∼99.9중량% 함유할 수 있다.

[0026] 약제의 유효 성분의 투여량은, 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법에 따라서 적의 최적한 투여량을 판단할 수 있다. 경구 투여의 경우에는, 일반적으로는, 환자에 대해서, 1일당 0.1㎍∼1000㎎, 바람직하게는 1.0㎍∼100㎎, 보다 바람직하게는 1.0㎎∼50㎎ 투여하는 것이 바람직하다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 그 일회 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 따라서도 서로 다르지만, 예를 들면 주사제의 형태로, 일반적으로는, 환자에 대해서, 1일당 0.01∼30㎎ 정도, 바람직하게는 0.1∼20㎎ 정도, 보다 바람직하게는 0.1∼10㎎ 정도를 정맥 주사에 의해 투여하는 것이 호적하다. 그러나, 최종적으로는, 환자의 연령이나 체중, 증상 등을 고려해서 의사의 판단에 의해 결정할 수 있다.

[0027] 또한, PLAG4 도메인을 인식하는 항체와, PLAG2부터 PLAG3에 걸친 영역을 인식하는 항체를 병용해서 사용하면, Aggrus와 CLEC-2와의 결합을 거의 완전히 저해하는 것이 명백해졌다. 따라서, 이들 CLEC-2와 Aggrus의 결합에 관한 두 영역을 인식하는 항체를 병용함에 의해서, 보다 강한 혈소판 응집 억제, 암전이 억제 효과를 기대할 수 있다.

[0028] 본 발명자들은, 이미, 상술과 같이 Aggrus의 PLAG2 및 PLAG3을 포함하는 영역인 Aggrus의 45∼61번째의 영역(서열 번호 2)을 에피토프로서 인식하는 모노클로널 항체를 얻었다. 구체적으로는, Aggrus의 45∼49번째의 영역을 인식하는 P2-0, 및 MS-1 항체, 53∼58번째의 영역을 인식하는 MS-3 항체, 53∼61번째의 영역을 인식하는 MS-4 항체이다. 이미, 본 발명자들은, 키메라화한 P2-0 항체가 마우스 모델을 사용한 실험계에서 암전이 억제 작용을 구비하고 있는 것을 개시하고 있지만(특허문헌 2), 이 영역을 인식하는 모노클로널 항체를 임상에 응용하는 경우에는, 키메라화, 또는 인간화한 항체를 사용하면 된다. 이들 모노클로널 항체 중 적어도 어느 하나와, 본 발명의 항체를 병용해서 사용함에 의해, 보다 높은 효과를 나타내는 것을 기대할 수 있다. 병용하는 2종의 항체를 키메라화 항체, 인간화 항체로서 사용함에 의해, 혈전증이나 암의 치료에 적용했을 경우에, 보다 강한 효과를 기대할 수 있다.

[0029] 또한, 본 발명의 Aggrus를 인식하는 항체는, 암의 검사에 사용할 수 있다. Aggrus의 발현이, 암의 혈행성 전이에 관여하고 있는 것은 이미 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 항체를 사용해서 암조직, 혹은 혈중을 순환하는 암세포의 Aggrus의 발현을 검출함에 의해서, 예후 예측을 행할 수 있다. 암조직, 또는 암세포에서의 Aggrus 발현의 확인은, 본 발명의 항체를 사용한 ELISA, FACS 등 공지의 면역 측정법을 사용할 수 있다. 또한, Aggrus를 발현하여 있는 암이면, 본 발명의 항체를 유효 성분으로서 포함하는 의약에 의한 치료 효과를 기대할 수 있다.

[0030] 본 발명의 스크리닝 방법은, Aggrus와 CLEC-2와의 결합을 저해하는 물질을 탐색하고, 혈소판 응집이나 암의 전이를 억제하는 화합물을 제공하는 것을 과제로 한다. 예를 들면, 본 발명의 스크리닝 방법은 이하와 같이 해서 행할 수 있다. 화합물 어레이나 화합물 라이브러리를 사용해서, 본 발명에 있어서 새롭게 동정된 CLEC-2와의 결합에 관여하는 Aggrus의 아미노산 서열과 상호 작용하는 화합물을 탐색한다. 스크리닝에 사용하는 CLEC-2와의 결합에 관여하는 Aggrus의 영역으로서는, 본 발명의 항체가 인식하는 GIRIEDLPT(서열 번호 1) 중 적어도 5잔기의 서열, 특히, 높은 결합력을 나타내는 항체가 얻어진 영역인 RIEDL(서열 번호 3)을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, PLAG4 도메인의 PLAG 컨센서스 서열 EDXXTS(서열 번호 4)를 사용해도 된다. CLEC-2와의 결합에 관여하는 Aggrus의 영역은 짧은 영역이므로, 합성 펩티드를 사용해도, 당해 영역을 포함하는 재조합체를 대장균이나 동물 세포 등에서 발현시켜서 사용해도 된다.

[0031] 또한, 본 발명자들이 발견해서 보고하여 있는 바와 같이, Aggrus와 CLEC-2의 상호 작용에는 Aggrus의 아미노산 45∼61의 PLAG2, PLAG3 도메인에 걸친 영역도 관여하고 있다(특허문헌 2, 3). 따라서, 이 부위를 결실 또는 변이시키고, 본 발명에 관한 Aggrus의 신규로 찾아낸 CLEC-2 결합 영역에서만 CLEC-2와 결합하는 재조합체를 대장균이나 동물 세포 등에서 발현시켜서 사용해도 된다.

[0032] 또한, 대장균이나 동물 세포 등에서 발현시킨 야생형의 Aggrus에, P2-0, MS-1, MS-3 또는 MS-4 항체를 반응시켜서 이 부위를 마스크하고, 본 발명에 관한 Aggrus의 신규로 찾아낸 CLEC-2 결합 영역에서만 CLEC-2와 결합하도록 해도 된다. 화합물에 결합한 펩티드나 재조합체는, 본 발명의 항Aggrus 모노클로널 항체를 사용해서 검출할 수 있다. 상기 방법은 예시이고, 이에 한하지 않으며 공지의 스크리닝 방법을 적용해도 되는 것은 물론이다.

[0033] 또한, 본 발명의 항체가 인식하는 영역(에피토프)에 당쇄를 부여해서 합성하여 투여함에 의해서, Aggrus와 CLEC-2의 결합을 경합 저해하는 것을 기대할 수 있다. 따라서, 항체가 인식하는 영역을 포함하는 펩티드에 당쇄를 부여하여, Aggrus와 CLEC-2와의 결합저해제로서 사용할 수 있다. 이것에 의해, 펩티드 자체를 혈소판 응집의 억제제, 암전이 억제제로서 사용하는 것도 가능하게 된다. 또, 당쇄의 부여는, 인간형의 당쇄를 효모를 사용해서 부여하는(비특허문헌 19) 등, 공지의 방법을 사용해서 행할 수 있다.

이하, 실시예를 나타내면서, 본 발명을 상세히 설명한다.

(실시예 1)

[0034] 보고되어 있는 중화 항체의 인식 부위의 검증

본 발명자들은 이미, CLEC-2와의 결합을 저해하여, 혈소판 응집 억제 작용, 및 암전이 억제 작용이 있는 항Aggrus 모노클로널 항체를 개시하고 있다(특허문헌 2, 비특허문헌 20). 이들 모노클로널 항체의 에피토프는, PLAG2, PLAG3 도메인에 걸친 영역을 인식하는 항체였다.

[0035] 우선, 이들 중화 항체의 인식 부위의 검증을 행했다. Chinese Hamster Ovary(CHO) 세포에, 이하의 플라스미드를 도입하여, 인간 Aggrus, 및 Aggrus 변이체를 발현시켰다. 인간 Aggrus 유전자는 야생형 Aggrus cDNA(GenBank No.AB127958.1)를 사용하고, 벡터는 pcDNA3(라이프테크놀로지스사제)을 사용해서 통상의 방법에 의해 PCR로 증폭하여 클로닝했다.

[0036] 중화 항체의 인식 부위의 검토에 사용한 컨스트럭트는 이하와 같다. 유전자를 도입하고 있지 않은 pcDNA3 벡터만(mock), 야생형 인간 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드(Aggrus-WT), 45번째의 글리신을 알라닌으로 치환한 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드(Aggrus-G45A), 48번째의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환한 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드(Aggrus-D48A), 49번째의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환한 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드(Aggrus-D49A)를 구축하고 CHO 세포에 도입하여, 단백질을 안정적으로 발현시켰다. 각 플라스미드를 도입한 CHO 세포는 이하, 각각 CHO/mock, CHO/Aggrus-WT, CHO/Aggrus-G45A, CHO/Aggrus-D48A, CHO/Aggrus-D49A로 한다.

[0037] 각 세포로부터 세포 용해액을 조제하고, D2-40, MS-1, P2-0, NZ-1의 4종의 항Aggrus 모노클로널 항체를 사용하여, 웨스턴 블롯 분석을 행했다. D2-40 항체(AbD Serotec사제)는, Aggrus 중화 활성이 없는 마우스 모노클로널 항체이고, MS-1 항체, P2-0 항체는 본 발명자들이 창제한 중화 활성을 갖는 마우스 모노클로널 항체이다. 또한, NZ-1 항체(AngioBio사제)는, Aggrus 중화 활성을 갖는 래트 모노클로널 항체이다. 결과를 도 1의 A에 나타낸다.

[0038] Aggrus 중화 활성이 없는 D2-40 항체는, 도입한 야생형 및 1아미노산 치환형의 Aggrus 단백질을 모두 인식했다. 즉, CHO/mock 이외의 세포에서 시그널이 인정된다. 또한, Aggrus 야생형, Aggrus 변이체에서 단백질 발현량이 거의 일치하여 있는 것이 확인되었다. 또, 영동(泳動)한 세포 용해액 중의 단백질량이 같다는 것은, α-tubulin을 인식하는 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석의 결과(도 1의 A)로부터도 명백하다.

[0039] MS-1 항체 및 P2-0 항체는, 야생형의 Aggrus는 인식하지만 1아미노산 치환형의 Aggrus 단백질, Aggrus-G45A, Aggrus-D48A, Aggrus-D49A의 인식이 약하여, 이들 아미노산 부위가 항체 인식에 필수인 것을 알 수 있다. 특히, P2-0 항체도 MS-1 항체도, 48번째의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환한 D48A는 전혀 인식할 수 없다. PLAG 도메인 중의 48번째의 아스파라긴산이, 항체에 의한 인식에는 중요한 것이 시사되었다.

[0040] 또한, Aggrus 중화 활성이 있는 래트 모노클로널 항체 NZ-1 항체도 1아미노산 치환형의 Aggrus 단백질의 인식이 약하다. 따라서, 중화 활성을 발휘하기 위해서는, 변이를 도입한 Aggrus의 45번째부터 49번째까지의 영역, 즉 PLAG2부터 PLAG3에 걸친 부위(도 1의 B 참조)가 중요한 것이 시사되었다.

(실시예 2)

[0041] CLEC-2와의 상호 작용 및 혈소판 응집 유도에 관한 Aggrus의 부위의 검토

(1) CLEC-2 결합에 있어서의 Aggrus의 48번째의 아스파라긴산의 역할 검토

CHO 세포에, 인간 Aggrus 및 그 변이체 cDNA를 도입한 플라스미드를 도입하여, 48번째의 아스파라긴산의 역할의 검토를 행했다. 상기에서 제작한 야생형 Aggrus 발현 세포주 CHO/Aggrus-WT 및 그 변이체 발현 CHO 세포주 CHO/AggrusD48A, 및 48번째의 아스파라긴산을 글루탐산으로 치환한 CHO/Aggrus-D48E, 아스파라긴으로 치환한 CHO/Aggrus-D48N을 사용하여, FACS법에 의해 CLEC-2와의 반응성을 검토했다.

[0042] 우선, 유전자 도입주, CHO/Aggrus-WT, CHO/Aggrus-D48E, CHO/Aggrus-D48N, CHO/Aggrus-D48A에 있어서의 Aggrus 발현량을 검토했다. 구체적으로는, 이들 유전자 도입주를 배양 용기로부터 회수하고, PBS로 세정한 후에 1.5×10⁵cells/ml의 세포 밀도로 조제하고, D2-40 항체를 첨가하고, 30분간 빙상에서 반응시켰다. 그 후, 세포를 PBS로 세정하고, 이차항체로서 Alexa488 표식된 항마우스 IgG 항체(라이프테크놀로지스사제)를 첨가하고, 빙상에서 추가로 30분간 반응시켰다. 마지막으로, 세포를 3회 PBS로 세정한 후에, Cytomics FC500(Beckman Coulter사제)으로 해석을 행했다(도 2의 A 좌측 패널, 백발(白拔)의 산). 또, 컨트롤은, D2-40 항체 대신에 컨트롤 마우스 항체(시그마사제)를 각각의 세포에 반응시키고, 상기와 마찬가지의 조작을 행한 결과이다(도 2의 A 좌측 패널, 까맣게 칠한 산).

[0043] CLEC-2와의 반응성은, 이하와 같이 해서 검토했다. 유전자 도입주를 마찬가지로 해서 1.5×10⁵cells/ml의 세포 밀도로 조제한 것에, (His)₁₀ 태그 부착 재조합 CLEC-2 단백질(rCLEC-2; R&D Systems사제)을 첨가하고, 30분간 빙상에서 반응시켰다. PBS로 세정한 후에 His 태그를 인식하는 형광 표식된 이차항체(QIAGEN사제)를 첨가하고, 빙상에서 추가로 30분간 반응시켰다. 또, (His)₁₀ 태그 부착 재조합 CLEC-2 단백질은 포유 동물 세포로부터 정제된 것이고, 당쇄에 의해 수식되어 있다. 세포를 3회 PBS로 세정한 후에, 마찬가지로 Cytomics FC500으로 해석을 행했다(도 2의 A 우측 패널, 백발의 산). 또, 컨트롤은, (His)₁₀ 태그 부착 재조합 CLEC-2 단백질 대신에 PBS만을 첨가하고, 상기와 마찬가지의 조작을 행한 결과이다(도 2의 A 우측 패널, 까맣게 칠한 산).

[0044] Aggrus, 및 Aggrus 변이체 단백질의 발현은 도 2의 A 좌측 패널에, CLEC-2와의 결합은 도 2의 A 우측 패널에 나타낸다. 도 2의 A 좌측 패널의 백발의 산은 D2-40 항체에 의해서, 야생형 Aggrus, 또는 Aggrus 변이체를 염색한 결과를 나타낸다. 까맣게 칠한 산은 컨트롤 마우스 항체에 의한 결과를 나타낸다. 도 2의 A 좌측 패널의 백발의 산에서 나타내는 정점의 위치의 형광 강도가 거의 같으므로, Aggrus 단백질의 각 유전자 도입주에 있어서의 세포막 상에서의 발현 레벨이 거의 일치하여 있는 것이 확인되었다.

[0045] 도 2의 A 우측 패널은, 야생형 또는 1아미노산 치환형의 Aggrus를 발현하여 있는 세포에, 재조합 CLEC-2가 결합하는지를 해석한 것이다. 상술과 같이, 백발의 산은, CHO 세포 표면에 발현하여 있는 야생형 Aggrus, 또는 Aggrus 변이체에 결합하여 있는 재조합 CLEC-2를 항His 항체에 의해 검출한 결과를 나타내고 있다. 까맣게 칠한 산은 CLEC-2 단백질 대신에 PBS만을 첨가한 컨트롤의 결과를 나타내고 있다.

[0046] 48번째의 아스파라긴산을 같은 산성아미노산인 글루탐산으로 치환한 D48E(CHO/Aggrus-D48E)는 야생형(CHO/Aggrus-WT)과 거의 동일하게 CLEC-2가 결합한다. 그러나, 중성아미노산으로 치환한 D48N(CHO/Aggrus-D48N) 또는 D48A 변이체(CHO/Aggrus-D48A)에 대해서는 CLEC-2의 결합력의 감소가 관찰되었다. 그러나, 어느 변이체도 결합을 완전히 잃지 않고, 어느 정도 CLEC-2가 결합하는 것이 명백해졌다.

[0047] (2) Aggrus의 48번째의 아스파라긴산의 혈소판 응집에 있어서의 역할 검토

상술과 같이 CLEC-2는, Aggrus와 결합하는 혈소판 상의 리셉터이다. Aggrus는 혈소판 상의 CLEC-2와 결합함으로써 혈소판 응집 유도 시그널을 전달한다. CLEC-2와의 결합이 약해진 D48A 변이체(CHO/Aggrus-D48A)는 혈소판 응집 유도 활성이 약해지는 것이 예상되었기 때문에, 혈소판 응집 억제 시험으로 확인했다. 구체적으로는, MCM HEMA TRACER 313M(엠·씨·메디컬샤제)을 사용해서 분석을 행했다. 당해 분석법은 광투과율의 모니터링에 의한 마우스 세정 혈소판을 사용한 in vitro 혈소판 응집 분석법이다.

[0048] 도 2의 B에 나타내는 바와 같이, CHO/mock 세포에는 혈소판 응집을 유도하는 활성은 인정되지 않지만, 야생형 Aggrus를 발현시킨 CHO/Aggrus-WT에서는 혈소판과 섞고 나서 약 6분 후에 응집이 개시되었다. 한편, CLEC-2와의 결합력이 약해진 CHO/Aggrus-D48A와 혈소판을 혼화했을 경우, 약 14분 후부터밖에 응집이 인정되지 않아, 혈소판 응집의 개시가 약 8분 지연한다. 이 결과는, CLEC-2와의 결합력이 약해졌다는 도 2의 A의 결과를 지지하고 있음과 함께, CLEC-2와의 결합에는 이때까지 동정되어 있던 PLAG3의 도메인 이외의 부위가 관여하고 있고, 그 부위를 개재한 CLEC-2와의 결합에 의해 혈소판 응집이 유도되어 있을 가능성을 시사하는 것이다.

(실시예 3)

[0049] CLEC-2와의 결합에 관한 신규 PLAG4 도메인의 발견

포유류의 계통수(도 3의 A 하측 패널)로부터, 인간(Homo sapiens, 서열 번호 5), 보노보(Pan paniscus, 서열 번호 6), 붉은털원숭이(Macaca mulatta, 서열 번호7), 돼지(Sus scrofa, 서열 번호 8), 향유고래(Physeter catodon, 서열 번호 9), 소(Bos Taurus, 서열 번호 10), 개(Canis lupus familiaris, 서열 번호 11), 박쥐(Myotis brandtii, 서열 번호 12), 래트(Rattus norvengicus, 서열 번호 13), 마우스(Mus musculus, 서열 번호 14)의 Aggrus 단백질의 아미노산 서열의 상동성을 검토했다.

[0050] 도 3의 A는, 각 동물의 Aggrus 단백질의 상동성이 높은 부분을 나열한 것이다. 또, 각 동물의 Aggrus 단백질의 서열은 도 3의 A 하측에 나타내는 GenBank accession No.의 서열에 의한다. 그 결과, 이때까지 보고된 PLAG 도메인 1∼3에 유사한, 포유류에서 고도로 보존되어 있는 PLAG4 도메인을 찾아냈다(도 3의 A). 도 3의 B에 PLAG 도메인의 컨센서스 서열(서열 번호 15) 및 PLAG1∼PLAG4의 서열(서열 번호 16∼19)을 나타낸다. 인간PLAG4는, CLEC-2와의 결합에 관련 있다고 보고되어 있는 고도로 보존되어 있는 글루탐산과 그것에 이은 아스파라긴산의 ED 서열, 또한 당쇄 부가 부위인 트레오닌T가 보존되어 있었다. 단, ED 서열과 T의 사이의 아미노산 수는, PLAG4 도메인에서는 이때까지 동정해 온 3아미노산이 아니라 2아미노산으로 되어 있다는 차이를 찾아냈다.

(실시예 4)

[0051] 신규 PLAG4 도메인의 CLEC-2와의 상호 작용 및 혈소판 응집 유도능에 있어서의 역할의 검토

(1) 수립한 Aggrus 변이체의 발현량 검토

신규의 PLAG 도메인으로 추정된 PLAG4 도메인 내에 아미노산 변이를 갖는 PLAG4 변이체를 CHO 세포에 유전자 도입했다. 구체적으로는, pcDNA3 벡터에 PLAG4 영역 내의 아미노산인 82번째의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환한 인간 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드(Aggrus-D82A), 48번째의 아스파라긴산과 82번째의 아스파라긴산을 모두 알라닌으로 치환한 인간 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드(Aggrus-D48A/D82A)를 CHO 세포에 도입하여, 단백질을 안정적으로 발현시켰다. 각 플라스미드를 도입한 CHO 세포는 이하, CHO/Aggrus-D82A, CHO/Aggrus-D48A/D82A로 한다.

[0052] CHO/mock, CHO/Aggrus-WT, CHO/Aggrus-D48A, CHO/Aggrus-D82A, CHO/Aggrus-D48A/D82A 세포주로부터, 각각 세포 용해액을 조제했다. 각 세포 용해액을 사용해서 D2-40 항체로 웨스턴 블롯 분석을 행했다. 그 결과, 도입한 야생형 및 변이형의 Aggrus 단백질의 발현이 CHO/mock 이외의 세포에서 인정됨과 함께, 그 발현량이 거의 일치하여 있는 것이 확인되었다(도 4의 A).

[0053] (2) PLAG3과 PLAG4의 CLEC-2와의 결합에 있어서의 역할 검토

이들 CHO의 유전자 안정 발현주를 사용해서, 실시예 2와 마찬가지로, FACS법에 의해 Aggrus 발현량의 확인과 CLEC-2와의 반응성을 검토했다. 도 4의 B 좌측 패널은, 도 2의 A와 마찬가지로, 백발의 산이 D2-40 항체를 반응시켜서 야생형 Aggrus, 또는 Aggrus 변이체를 염색한 결과를, 까맣게 칠한 산은, D2-40 항체 대신에 컨트롤 마우스 항체(시그마사제)를 반응시킨 결과를 나타내고 있다. 도 4의 B(좌측 패널)에 나타내는 바와 같이, Aggrus 단백질의 각 유전자 도입주에 있어서의 세포막 상에서의 발현 레벨이 거의 일치하여 있는 것이, 각 패널의 백발의 산에서 나타내는 정점의 위치의 형광 강도가 거의 같은 것으로부터도 확인되었다.

[0054] 도 4의 B 우측 패널은, 실시예 2와 마찬가지로 해서 CLEC-2와의 결합을 FACS법에 의해 해석한 것이다. 백발의 산은, CHO 세포 표면에 발현하여 있는 야생형 Aggrus, 또는 Aggrus 변이체에 결합하여 있는 (His)₁₀ 태그 부착 재조합 CLEC-2를 His 태그를 인식하는 형광 표식된 이차항체에 의해 검출한 결과를 나타내고 있다. 또, 까맣게 칠한 산은, (His)₁₀ 태그 부착 재조합 CLEC-2 단백질 대신에 컨트롤 마우스 항체를 첨가하고, 상기와 마찬가지의 조작을 행한 결과이다.

[0055] 82번째의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환한 D82A 변이체(CHO/Aggrus-D82A)의 CLEC-2와의 결합은, 48번째의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환한 D48A 변이체(CHO/Aggrus-D48A)와의 결합 이상으로 감약(減弱)하여 있는 것이 명백해졌다(도 4의 B, 우측 패널). 또한, 48번째의 아스파라긴산과 82번째의 아스파라긴산을 모두 알라닌으로 치환한 D48A/D82A 이중 변이체(CHO/Aggrus-D48A/D82A)는, 전혀 CLEC-2와 결합하지 않는 것이 명백해졌다. 이들 결과는, Aggrus 상의 새롭게 찾아낸 PLAG4 도메인이, PLAG3 도메인과 함께 CLEC-2와의 결합에 중요한 역할을 하고 있는 것을 시사하고 있을 뿐만 아니라, PLAG4가 PLAG3보다도 CLEC-2와의 결합에 있어서 주요한 역할을 하고 있는 것을 시사하고 있다.

[0056] (3) PLAG3과 PLAG4의 혈소판 응집에 있어서의 역할 검토

PLAG4 도메인이 CLEC-2와의 결합에 중요한 역할을 맡고 있는 것이 명백해졌으므로, 다음으로 PLAG4 도메인의 혈소판 응집에 있어서의 역할을 검토했다. 상술과 같이, Aggrus는 혈소판 상의 CLEC-2와 결합함으로써 혈소판 응집 유도 시그널을 전달한다. PLAG4 도메인 내의 아미노산 변이가 혈소판 응집을 억제하거나, 실시예 2에 기재된 혈소판 응집 억제 시험에 의해서, Aggrus 의존적인 혈소판 응집의 유도 활성을 검토했다. 결과를 도 4의 C에 나타낸다.

[0057] CHO/Aggrus-D48A, CHO/Aggrus-D82A, CHO/Aggrus-D48A/D82A 변이체 발현 세포를 사용하여, 실시예 2와 마찬가지로 해서 각 변이체 발현 세포의 혈소판 응집능을 검토했다. 각 변이체 발현 세포의 혈소판 응집 유도 활성은, CLEC-2와의 결합력에 비례하고, D82A 변이체는 D48A 변이체보다도 혈소판 응집 유도 활성이 약하여, D48A/D82A 이중 변이체는 혈소판 응집 유도 활성을 나타내지 않는 것이 명백해졌다(도 4의 C). 따라서, 신규로 동정한 PLAG4는, Aggrus 의존적인 혈소판 응집에 주요한 역할을 하고 있는 것이 명백해졌다.

[0058] PLAG4 도메인의 중요성을 확인하기 위하여, PLAG1, 3, 4 도메인을 각각 결실한 변이체를 CHO 세포에 유전자 도입했다. 구체적으로는, pcDNA3 벡터에 PLAG1 영역 내의 29 내지 34번째의 아미노산을 결실한 인간 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드(Aggrus-Δ29-34), PLAG3 영역 내의 47 내지 52번째의 아미노산을 결실한 인간 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드(Aggrus-Δ47-52), PLAG4 영역 내의 81 내지 85번째의 아미노산을 결실한 인간 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드(Aggrus-Δ81-85), PLAG3 영역 내의 47 내지 52번째와 PLAG4 영역 내의 81 내지 85번째의 아미노산을 양쪽 결실한 인간 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드(Aggrus-Δ47-52/Δ81-85)를 CHO 세포에 유전자 도입하여, 단백질을 안정적으로 발현시켰다(도 4의 D 참조). 각 플라스미드를 도입한 CHO 세포는 이하, CHO/Aggrus-Δ29-34, CHO/Aggrus-Δ47-52, CHO/Aggrus-Δ81-85, CHO/Aggrus-Δ47-52/Δ81-85로 한다.

[0059] CHO/Aggrus-Δ29-34, CHO/Aggrus-Δ47-52, CHO/Aggrus-Δ81-85, CHO/Aggrus-Δ47-52/Δ81-85 변이체 발현 세포주를 사용하여, 실시예 2와 마찬가지로, FACS법에 의해 Aggrus 발현량의 확인과 CLEC-2와의 반응성을 검토했다(도 4의 E). 또 본 검토에서는, Aggrus 발현량의 검토에 D2-40 항체가 아니라, 시판의 FL-162 항체(산타크루즈바이오테크놀로지사제)를 사용했다. 또한, 이차항체로서 Alexa488 표식된 항토끼 IgG 항체(라이프테크놀로지스사제)를 사용했다(도 4의 E 좌측 패널). 또, 컨트롤로서는, FL-162 항체 대신에 컨트롤 토끼 항체(산타크루즈바이오테크놀로지사제)를 각각의 세포에 반응시키고, 상기와 마찬가지의 조작을 행한 결과이다. 백발의 산은, FL-162 항체를 반응시켜서 PLAG 도메인 결실 Aggrus 변이체를 염색한 결과를, 까맣게 칠한 산은, FL-162 항체 대신에 컨트롤 토끼 항체를 반응시킨 결과를 나타내고 있다. 도 4의 E(좌측 패널)에 나타내는 바와 같이, Aggrus 단백질의 각 유전자 도입주에 있어서의 세포막 상에서의 발현 레벨이 거의 일치하여 있는 것이, 각 패널의 백발의 산에서 나타내는 정점의 위치의 형광 강도가 거의 같은 것으로부터도 확인되었다.

[0060] 도 4의 E 우측 패널은, 실시예 2와 마찬가지로 해서 CLEC-2와의 결합을 FACS법에 의해 해석한 것이다. 백발의 산은, CHO 세포 표면에 발현하여 있는 PLAG 도메인 결실 Aggrus 변이체에 결합하여 있는 (His)₁₀ 태그 부착 재조합 CLEC-2를 His 태그를 인식하는 형광 표식된 이차항체에 의해 검출한 결과를 나타내고 있다. 또, 까맣게 칠한 산은, (His)₁₀ 태그 부착 재조합 CLEC-2 단백질 대신에 PBS를 첨가하고, 상기와 마찬가지의 조작을 행한 결과이다.

[0061] CLEC-2와의 상호 작용은, 도 4의 B에 나타내는 점변이체의 데이터와 동일한 바와 같이, PLAG4 도메인 결실 변이체(CHO/Aggrus-Δ81-85)의 CLEC-2와의 결합은, PLAG3 도메인 결실 변이체(CHO/Aggrus-Δ47-52)와의 결합 이상으로 감약하여 있는 것이 명백해졌다. 또한, PLAG3 도메인과 PLAG4 도메인을 모두 결실한 이중 변이체(CHO/Aggrus-Δ47-52/Δ81-85)는, 전혀 CLEC-2와 결합하지 않는 것이 명백해졌다.

[0062] 이들 결과는, Aggrus 상의 새롭게 찾아낸 PLAG4 도메인이, PLAG3 도메인과 함께 CLEC-2와의 결합에 중요한 역할을 하고 있는 것을 시사하고 있을 뿐만 아니라, PLAG4가 PLAG3보다도 CLEC-2와의 결합에 있어서 주요한 역할을 하고 있는 것을 재확인하는 것이다.

(실시예 5)

[0063] 신규 PLAG4 도메인의 CLEC-2와의 상호 작용 및 혈소판 응집 유도능에 있어서의 역할의 정량적 해석

(1) PLAG3과 PLAG4의 CLEC-2와의 결합에 있어서의 역할 검토

Aggrus 발현량과 CLEC-2와의 반응성을 정량적으로 해석했다. 구체적으로는, 실시예 4(도 4의 B 참조)에서 행한 FACS법을 사용한 Aggrus 발현량의 확인과 CLEC-2와의 반응성의 검토를 3회 반복해서 행하여 평균화했다. CHO/Aggrus-WT의 백발의 산에서 나타내는 정점의 위치의 형광 강도의 평균값을 1로 했을 때의, Aggrus 변이체 단백질의 발현량을 그래프로 나타낸다. Aggrus 야생형의 발현량과 비교한 통계 해석의 결과, Aggrus 변이체 단백질(D48A, D82A, D48A/D82A)의 발현량에 유의차는 나지 않고(ns로 표기), 발현량이 거의 일치하여 있는 것이 나타났다(도 5의 A, 좌측 패널). 또한, CLEC-2와의 반응성을 나타내는 백발의 산에서 나타내는 정점의 위치의 형광 강도의 평균값을 1로 했을 때의 Aggrus 변이체 단백질의 CLEC-2와의 반응성을 그래프로 나타냈다. Aggrus 야생형의 CLEC-2와의 반응성을 1로 하면, Aggrus 변이체 단백질(D48A, D82A, D48A/D82A)의 CLEC-2와의 반응성은 유의하게 감소(**, P<0.01; ***, P<0.001)하여 있는 것이 나타나(도 5의 A, 우측 패널), 실시예 4의 결과가 재현되었다.

[0064] Aggrus 결실 변이체에 대해서도, 상기와 마찬가지로 Aggrus 발현량과 CLEC-2와의 반응성을 정량적으로 해석했다(도 5의 B). 실시예 4(도 4의 E 참조)에서 행한 FACS법을 사용한 Aggrus 발현량의 확인과 CLEC-2와의 반응성의 검토를 3회 반복해서 행하여 평균화했다. CHO/Aggrus-WT의 백발의 산에서 나타내는 정점의 위치의 형광 강도의 평균값을 1로 했을 때의, Aggrus 결실 변이체 단백질의 발현량을 그래프로 나타낸다. Aggrus 야생형의 발현량과 비교한 통계 해석의 결과, Aggrus 결실 변이체 단백질(Δ29-34, Δ47-52, Δ81-85, Δ47-52/Δ81-85)의 발현량에 유의차는 나지 않고(ns로 표기), 발현량이 거의 일치하여 있는 것이 나타났다(도 5의 B, 좌측 패널). 한편, CLEC-2와의 반응성은 결실 변이체에서 유의하게 감소하여 있는 것이 확인되었다. 도 4의 E 우측 패널에 있어서, CLEC-2와의 반응성을 나타내는 백발의 산에서 나타내는 정점의 위치의 형광 강도의 평균값을 1로 했을 때의, Aggrus 결실 변이체 단백질의 CLEC-2와의 반응성을 그래프로 나타낸다. Aggrus 야생형의 CLEC-2와의 반응성을 1로 하면, Aggrus 결실 변이체 단백질(Δ29-34, Δ47-52, Δ81-85, Δ47-52/Δ81-85)의 CLEC-2와의 반응성은, Δ29-34의 경우를 제외하고 모두 유의하게 감소(**, P<0.01)하여 있는 것이 나타나(도 5의 B, 우측 패널), 실시예 4의 결과가 재현되었다.

[0065] (2) PLAG3과 PLAG4의 혈소판 응집에 있어서의 역할 검토

다음으로, CHO/mock, CHO/Aggrus-WT, CHO/Aggrus-D48A, CHO/Aggrus-D82A, CHO/Aggrus-D48A/D82A 변이체 발현 세포를 사용하여, 실시예 2와 마찬가지로 해서 각 변이체 발현 세포의 혈소판 응집능을 검토했다. 각 변이체 발현 세포의 혈소판 응집 유도 활성은, CLEC-2와의 결합력에 비례하고, D82A 변이체는 D48A 변이체보다도 혈소판 응집 유도 활성이 약하다는 도 4의 C의 재현성이 확인되었다. 또한, D48A/D82A 이중 변이체 발현 세포는 CHO/mock와 마찬가지로 혈소판 응집 유도 활성을 나타내지 않는 것이 명백해졌다(도 5의 C). 따라서, 신규로 동정한 PLAG4는, Aggrus 의존적인 혈소판 응집에 주요한 역할을 하고 있는 것이 재확인되었다.

(실시예 6)

[0066] PLAG4 도메인 중의 E81, D82, T85의 CLEC-2 결합에의 관여

신규로 동정한 PLAG4 도메인에는, PLAG3 도메인에 유사한 EDXXT 모티프가 존재한다. PLAG4 도메인 중의 81번째의 글루탐산(E), 82번째의 아스파라긴산(D), 85번째의 트레오닌(T)(도 6의 B(우측 패널, 밑줄을 그은 아미노산))의 CLEC-2와의 결합에의 직접적인 관여를 해석했다. pcDNA3 벡터에 81번째의 글루탐산을 알라닌으로 치환한 인간 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드를 도입한 CHO 세포(CHO/Aggrus-E81A), 82번째의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환한 인간 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드를 도입한 CHO 세포(CHO/Aggrus-D82A), 85번째의 트레오닌을 알라닌으로 치환한 인간 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드를 도입한 CHO 세포(CHO/Aggrus-T85A)를 사용해서 FACS에 의해 해석했다. 또, 컨트롤로서, 야생형 인간 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드를 도입한 CHO 세포(CHO/Aggrus-WT), 및, PLAG3 도메인 중의 47번째의 글루탐산, 48번째의 아스파라긴산, 52번째의 트레오닌(도 6의 A(우측 패널, 밑줄을 그은 아미노산))을 각각 알라닌으로 치환한 인간 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드를 도입한 CHO 세포(CHO/Aggrus-E47A, CHO/Aggrus-D48A, CHO/Aggrus-T52A)도 제작하여, 마찬가지로 해석했다.

[0067] 야생형 또는 변이형 Aggrus 발현 CHO 세포를 사용해서, 실시예 2와 마찬가지로, FACS법에 의해 Aggrus 발현량의 확인과 CLEC-2와의 반응성을 검토했다. 도 2와 마찬가지로, 백발의 산이 D2-40 항체를 반응시켜서 야생형 Aggrus, 또는 Aggrus 변이체를 염색한 결과를, 까맣게 칠한 산은, D2-40 항체 대신에 컨트롤 마우스 항체(시그마사제)를 반응시킨 결과를 나타내고 있다. 도 6의 A(좌측 패널)와 도 6의 B(좌측 패널)에 나타내는 바와 같이, Aggrus 단백질의 각 유전자 도입주에 있어서의 세포막 상에서의 발현 레벨이 거의 일치하여 있는 것이, 각 패널의 백발의 산에서 나타내는 정점의 위치의 형광 강도가 거의 같은 것으로부터도 확인되었다.

[0068] 도 6의 A(우측 패널)와 도 6의 B(우측 패널)는, 실시예 2와 마찬가지로 해서, 각 변이체의 CLEC-2와의 결합을 FACS법에 의해 해석한 것이다. 백발의 산은, CHO 세포 표면에 발현하여 있는 야생형 Aggrus, 또는 Aggrus 변이체에 결합하여 있는 (His)₁₀ 태그 부착 재조합 CLEC-2를 His 태그를 인식하는 형광 표식된 이차항체에 의해 검출한 결과를 나타내고 있다. 또, 까맣게 칠한 산은, (His)₁₀ 태그 부착 재조합 CLEC-2 단백질 대신에 컨트롤 마우스 항체를 첨가하고, 상기와 마찬가지의 조작을 행한 결과이다.

[0069] CLEC-2와의 상호 작용에 관해서는, PLAG3 도메인 중의 47번째의 글루탐산, 48번째의 아스파라긴산, 52번째의 트레오닌을 각각 알라닌으로 치환한 인간 Aggrus 변이체의 CLEC-2와의 결합은, 야생형에 비하여 같은 정도로 감약하여 있었다. 따라서, 이들 세 아미노산이 CLEC-2와의 결합에 관여하고 있는 것이 확인되었다(도 6의 A, 우측 패널). 또한 그 상동 부위인 PLAG4 도메인 중의 81번째의 글루탐산, 82번째의 아스파라긴산, 85번째의 트레오닌을 각각 알라닌으로 치환한 인간 Aggrus 변이체의 CLEC-2와의 결합은, 야생형 및 PLAG3 도메인 중의 47번째의 글루탐산, 48번째의 아스파라긴산, 52번째의 트레오닌을 각각 알라닌으로 치환한 인간 Aggrus에 비해서도 같은 정도 이상으로 감약하여 있는 것이 명백해졌다(도 6의 B, 우측 패널).

[0070] 이들 결과는, Aggrus 상에 새롭게 찾아낸 PLAG4 도메인 중의 81번째의 글루탐산, 82번째의 아스파라긴산, 85번째의 트레오닌이, PLAG3 도메인 중의 47번째의 글루탐산, 48번째의 아스파라긴산, 52번째의 트레오닌과 마찬가지로 CLEC-2와의 결합에 관여하고 있는 것을 나타내고 있다. 또한, 서열 번호 4에서 나타내는 EDXXTS(PLAG4 도메인)가 CLEC-2와의 결합에 중요한 역할을 하고 있는 것이 명백해졌다.

(실시예 7)

[0071] 신규 PLAG4 도메인을 인식하는 항인간 Aggrus 모노클로널 항체 산생 하이브리도마의 제작

이하와 같이 해서, PLAG4 도메인을 인식하는 항인간 Aggrus 모노클로널 항체를 산생하는 하이브리도마를 제작했다.

[0072] (1) 면역원

인간 Aggrus cDNA의 76번째의 트레오닌잔기로부터 89번째의 트레오닌잔기(서열 : Thr Gly Ile Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Ser Glu Ser Thr)까지의 부위를 12회 또는 40회 반복한 것을 pGEX-6P3 벡터(GE Healthcare사제)에 클로닝하여, GST 태그 부착의 면역원을 얻었다. 이 플라스미드로 대장균 BL21(DE3)을 형질 전환하여, 발현된 GST 태그 융합 재조합 단백질을 Glutathione Sepharose로 정제했다.

[0073] (2) 감작

6주령의 자성 BALB/c 마우스(니혼찰스리버로부터 구입)에, 얻어진 면역원 100㎍/마리와 TiterMax Gold(TiterMax USA사제)의 혼화 용액을 경부 피하 투여했다. 추가 면역을 위하여, 격주로 면역원 100㎍/마리를 복강 내에 합계 9회 투여했다. 또한, 일부의 감작에 있어서는, 자성 BDF-1 마우스(니혼크레아로부터 구입)의 미근부에 2회 투여하는 방법으로 검토했다.

[0074] (3) 하이브리도마의 수립

통상의 방법에 따라서, 면역한 마우스로부터 비장 세포 또는 장골 림프절 세포를 채취하고, 폴리에틸렌글리콜4000을 사용해서, 마우스 미엘로마 세포주 P3U1과 융합시켰다. 히포크산틴, 아미노프테린, 및 티미딘을 포함하는 에스크론 클로닝 메디움(에이디아가부시키가이샤제) 중에서 배양함으로써, 융합한 하이브리도마를 증식시켜, PLAG4 도메인 영역에 대한 항체를 산생하는 PG4D1과 PG4D2를 포함하는 복수 개의 하이브리도마를 수립시키는 것에 성공했다. 장골 림프절 세포로부터는, 6G42A4와 9D62D6을 포함하는 복수 개의 하이브리도마를 수립시키는 것에 성공했다.

(실시예 8)

[0075] 신규 PLAG4 도메인을 인식하는 항인간 Aggrus 모노클로널 항체의 성상 해석

(1) 에피토프의 탐색

인간 Aggrus cDNA로부터 시그널 펩티드 부위를 포함하는 아미노 말단 24아미노산을 제거한 것을 pGEX-6P-3 벡터에 클로닝해서 GST 태그 부착의 야생형 Aggrus 단백질 발현 벡터를 제작했다. 이하, 발현한 재조합 단백질을 ΔN24-WT로 한다. 또한, 면역원인 76 내지 89번째의 아미노산에 상당하는 코돈을 Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technology사제)를 사용해서 1개소씩 알라닌을 코딩하는 코돈으로 치환하여, 알라닌 변이형 Aggrus 발현 벡터를 제작했다. 이하, 재조합 변이체는, 예를 들면 76번째의 아미노산인 트레오닌(T)을 알라닌(A)으로 변이시킨 것이면, ΔN24-T76A와 같이 표기한다.

[0076] BL21(DE3) 대장균을 제작한 플라스미드에 의해 형질 전환해서 배양했다. 대장균 파쇄액을 샘플로서 사용하여, 웨스턴 블롯 법에 의해, 재조합 인간 Aggrus 단백질에 대한 MS-1, PG4D1, PG4D2, 6G42A4, 9D62D6, 항GST(alpha-GST) 항체(Abcam사제)의 반응성을 검토했다. 그 결과, 도 7의 A에 나타내는 바와 같이, MS-1 항체와 항GST 항체는 변이체를 포함하는 모든 Aggrus 단백질을 인식했지만, PG4D1 항체와 PG4D2 항체는, 79번째의 아르기닌으로부터 83번째의 류신에 걸친 5아미노산을 각각 알라닌으로 치환한 Aggrus 변이체에 대해서는 낮은 반응성밖에 나타내지 않았다. 또한, 6G42A4 항체와 9D62D6 항체는, 77번째의 글리신으로부터 83번째의 류신에 걸친 7아미노산을 각각 알라닌으로 치환한 Aggrus 변이체에 대해서, 80번째의 이소류신을 알라닌으로 치환한 것을 제외하고, 낮은 반응성밖에 나타내지 않았다. 또한 9D62D6 항체는, 84번째의 프롤린을 알라닌으로 치환하면, 인식능이 감약하는 것이 명백해졌다.

[0077] 따라서, 도 7의 A의 하단에 나타내는 바와 같이, 제작된 항체가 인식하는 영역은, 백발 문자로 나타낸 77번째부터 84번째까지의 펩티드 부분(서열 : Gly Ile Arg Ile Glu Asp Leu Pro)이고, PG4D1 항체와 PG4D2 항체가 인식하는 최소의 에피토프는, 79번째부터 83번째까지의 펩티드 부분(서열 : Arg Ile Glu Asp Leu)이고, 도 3의 B에 나타낸 PLAG 도메인에 호몰로지가 있는 신규의 PLAG4 도메인(81번째 내지 85번째의 서열(도 7의 A 중, 점선으로 둘러싸인 서열 : Glu Asp Leu Pro Thr)과 일부 오버랩하고 있는 것이 명백해졌다.

[0078] (2) 포유류 세포에 발현하여 있는 Aggrus에의 반응성의 검토

포유류 세포에서 발현하여 있는 인간 Aggrus는, 대장균에 발현시킨 Aggrus와는 서로 다르고, 다수의 당쇄가 부가되어 있는 것이 알려져 있다. 신규로 창제된 PG4D1 항체와 PG4D2 항체의 포유류 세포에서 발현하여 있는 인간 Aggrus에의 반응성을, 표면 플라스몬 공명 해석 장치 Biacore X100(GE Healthcare사제)를 사용해서 검토했다. 카르복시메틸덱스트란 코트 처리가 실시된 센서 칩 CM5 상에 아민커플링법으로 포유 동물 세포로부터 시판의 정제 재조합 Aggrus 단백질(인간 IgG1 Fc 태그 부착의 단백질 : R&D Systems사제)을 고정화하여, 520RU(PG4D1 항체의 어세이용) 또는 600RU(PG4D2 항체의 어세이용) 상당의 고정화량을 얻었다.

[0079] 25도, 30㎕/분의 유속의 조건 하에서, HBS-EP+버퍼(GE Healthcare사제)를 유로에 채워서 측정을 행했다. 구체적으로는, PG4D1 항체와 PG4D2 항체를 6.25nM, 12.5nM, 25nM, 50nM, 100nM로 희석하고, Aggrus 단백질이 고정화된 센서 칩 CM5 상에 60초간 흘려보내서 결합 반응을 관찰하고, 계속해서 HBS-EP+버퍼를 120초간 흘려보내서 해리 반응을 관찰했다. 측정에 의해 얻어진 데이터를 도 7의 B에 나타낸다.

[0080] 창제된 항체는 모두 Aggrus 단백질을 인식해서 결합하는 것(결합 속도 정수(k_a)=3×10⁴), 또한 세정용의 HBS-EP+버퍼를 흘려보내도 해리 반응이 거의 보이지 않고, 해리 속도 정수(k_d)는 사용한 Biacore X100의 계측 한계 이하, 즉 k_d값은 ≤10^-5이었다. 따라서, PG4D1 항체와 PG4D2 항체의 해리 정수(K_D)는 ≤3×10^-10M이라는 값으로 되고, 매우 강한 결합을 나타내는 것이 명백해졌다.

[0081] (3) Aggrus 발현 세포에 대한 인식능

MS-1 항체는, mRNA 레벨에서의 Aggrus 발현이 인정되는 인간 방광편평상피암 세포주 UM-UC-5 세포나 인간 섬유육종 세포주 HT1080 세포 등을 거의 인식할 수 없다. 그 때문에, MS-1 항체에서 치료 대상으로 되는 암의 종류는 한정적이다. 새롭게 창제한 PG4D1 항체와 PG4D2 항체를 사용하여, MS-1 항체가 인식할 수 없는 UM-UC-5 세포, HT1080 세포 표면에 발현하여 있는 Aggrus를 인식할 수 있는지 검토를 행했다. UM-UC-5 세포, HT1080 세포를, PG4D1 항체와 PG4D2 항체를 일차항체로서 사용하고, 이차항체로서 Alexa488 표식된 항마우스 IgG 항체를 사용하여 FACS에 의해 해석했다. 그 결과, PG4D1 항체, PG4D2 항체는, MS-1 항체에서는 인식할 수 없었던 UM-UC-5 세포, HT1080 세포도 인식할 수 있는 것이 확인되었다(도 7의 C).

(실시예 9)

[0082] 신규 PLAG4 도메인을 인식하는 항인간 Aggrus 모노클로널 항체의 인식 부위의 검토와 반응성

실시예 8(도 7의 A 참조)에서는, 대장균에 발현시킨 인간 Aggrus 단백질에 대한 반응성을 검토했다. 그 결과, 도 7의 A의 하단에 나타내는 바와 같이, PG4D1 항체와 PG4D2 항체가 인식하는 영역은, 백발 문자로 나타낸 77번째부터 84번째까지의 펩티드 부분(서열 : Gly Ile Arg Ile Glu Asp Leu Pro)인 것이 나타나 있었다. 그래서, 포유류 세포에 발현시킨 당쇄를 포함하는 Aggrus에 대한 인식능과 그 인식 부위를 확인하기 위하여, CHO 세포에 도입한 Aggrus 야생형, Aggrus 변이체 단백질, Aggrus 결실 변이체 단백질의 세포 용해액을 샘플로서 사용하여, 웨스턴 블롯 법에 의해, PG4D1 항체, PG4D2 항체의 반응성을 검토했다.

[0083] 그 결과, 도 8의 A에 나타내는 바와 같이, PG4D1 항체와 PG4D2 항체는, PLAG4 도메인에 상당하는 81번째 내지 85번째의 5아미노산을 결실시킨 Aggrus 변이체를 인식하지 않는 것이 확인되었다. 또한, 도 8의 B에 나타내는 바와 같이, PG4D1 항체는 PLAG4 도메인 중의 82번째의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환한 D82A-Aggrus 변이체를 인식하지 않는데 대하여, PG4D2 항체는 D82A-Aggrus 변이체를 약하게 인식하는 것이 확인되었다. 이것은 도 7의 A에서 나타낸 대장균에 발현시킨 인간 Aggrus 단백질에 대한 반응성을 조사한 결과에서도 PG4D2 항체는 D82A-Aggrus 변이체를 약하게 인식하는 사실에 부합하여 있었다. 또, 영동한 세포 용해액 중의 단백질 농도가 같은 것은, α-tubulin을 인식하는 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석의 결과(도 8의 A, B)로부터도 명백하다.

[0084] 실시예 8(도 7의 B 참조)에서는, 비특이적인 결합인지의 여부의 검토가 행해져 있지 않았기 때문에, PG4D1 항체(서브클래스는 마우스 IgG1)와 PG4D2 항체(서브클래스는 마우스 IgG2a)의 인간 Aggrus에의 반응성을 표면 플라스몬 공명 해석 장치 Biacore X100(GE Healthcare사제)을 사용해서 검토할 때에, 컨트롤 마우스 IgG1(시그마사제), 컨트롤 마우스 IgG2a(시그마사제)도 비교 대상으로서 더하여 검토를 행했다(도 8의 C, D). 구체적으로는, 카르복시메틸덱스트란 코트 처리가 실시된 센서 칩 CM5 상에 아민커플링법으로 시판의 정제 재조합 Aggrus 단백질(인간 IgG1 Fc 태그 부착의 단백질 : R&D Systems사제)을 고정화하여, 562.2RU(PG4D1 항체의 어세이용) 상당의 고정화량을 얻었다. 25도, 30㎕/분의 유속의 조건 하에서, HBS-EP+버퍼(GE Healthcare사제)를 유로에 채워서 측정을 행했다. 구체적으로는, 컨트롤 마우스 IgG1(Control IgG1)을 3.7nM, 11.1nM, 33.3nM, 100nM, 300nM로 희석하고, Aggrus 단백질이 고정화된 센서 칩 CM5 상에 60초간 흘려보내서 결합 반응을 관찰하고, 계속해서 HBS-EP+버퍼를 1800초간 흘려보내서 해리 반응을 관찰했다. 계속해서, 같은 센서 칩 CM5를 사용해서 PG4D1 항체를 같은 조건에서 흘려보내서 결합 반응을 관찰했다. 측정에 의해 얻어진 데이터를 도 8의 C에 나타낸다.

[0085] 다음으로, 562.6RU(PG4D2 항체의 어세이용) 상당의 고정화량을 얻은 센서 칩 CM5에 대해서, 최초로 컨트롤 마우스 IgG2a(Control IgG2a), 계속해서 PG4D2 항체를 같은 조건에서 흘려보내서 결합 반응을 관찰했다. 측정에 의해 얻어진 데이터를 도 8의 D에 나타낸다.

[0086] 컨트롤 마우스 IgG1과 컨트롤 마우스 IgG2a는 모두 Aggrus를 고정화한 센서 칩에 결합하지 않는 것이 확인된데 대하여, PG4D1 항체와 PG4D2 항체는 모두 실시예 8(도 7의 B 참조)과 마찬가지의 강한 결합이 확인되었기 때문에, PG4D1 항체와 PG4D2 항체의 Aggrus 고정화 센서 칩에의 결합은 비특이적인 결합이 아닌 것이 증명되었다. 또한, 본 어세이에 있어서의 PG4D1 항체와 PG4D2 항체의 해리 정수(K_D)도 실시예 8(도 7의 B 참조)과 같은, ≤3×10^-10M이라는 값으로 되고, 매우 강한 결합을 나타내는 것이 명백해졌다.

(실시예 10)

[0087] PG4D1과 PG4D2 항체에 의한 Aggrus와 CLEC-2와의 결합 저해

(1) 알파 스크린법에 의한 검토

비방사성의 호모니지어스 근접 어세이인 알파 스크린(등록상표)법을 사용해서, 본 발명에서 얻어진 모노클로널 항체 PG4D1, PG4D2의 Aggrus와 CLEC-2와의 결합에 대한 저해 효과를 해석했다.

[0088] 1ng의 정제 재조합 Aggrus 단백질(인간 IgG1 Fc 태그 부착의 단백질, R&D Systems사제)과 30ng의 정제 재조합 CLEC-2 단백질((His)₁₀ 태그 부착의 단백질; rCLEC-2, R&D Systems사제)을 96구멍 플레이트에 분주(分注)하고, 거기에 컨트롤 마우스 IgG1(시그마사제), 컨트롤 마우스 IgG2a(시그마사제), MS-1, PG4D1, PG4D2, 6G42A4, 9D62D6 항체를 최종 농도가 12.5㎍/mL∼5ng/mL로 되도록 첨가했다. 첨가 후, 26도에서 1시간 반응시키고, 그 후에 AlphaLISA Universal Buffer로 희석한 Nickel Chelate Alpha Screen Donor Beads와 Protein A AlphaLISA Acceptor Beads를 첨가하고, 추가로 26도에서 1시간 반응시킨 후에, Envision(Perkin Elmer사제)을 사용해서 680㎚의 파장의 레이저로 여기(勵起)했다.

[0089] 여기에 의해 Donor Beads가 산소를 일중항 상태로 변환하고, 이 일중항 상태의 산소가 근접하는 억셉터 비드에 포함되는 형광 물질을 활성화함으로써, 615㎚의 형광 시그널이 방출된다. 즉, Nickel Chelate Alpha Screen Donor Beads에 결합하여 있는 His 태그가 부여되어 있는 CLEC-2 단백질과, Protein A AlphaLISA Acceptor Beads에 결합하여 있는 Fc 태그가 부여되어 있는 재조합 Aggrus 단백질이 근접해 있으면 형광 시그널이 방출된다. 따라서, 이 형광 시그널을 정량함으로써, Aggrus와 CLEC-2의 결합 상태를 정량하는 것이 가능하게 된다.

[0090] 항체 무첨가 시의 형광 시그널 강도를 100%로 하면, 도 9의 A에 나타내는 바와 같이, 첨가한 PG4D1 항체, PG4D2 항체, MS-1 항체는 모두 농도 의존적으로 Aggrus와 CLEC-2의 결합을 저해하는 것이 확인되었다. 특히 PG4D1 항체와 PG4D2 항체는 MS-1 항체보다도 그 저해 활성이 강한 것이 명백해졌다. 또한, 6G42A4, 9D62D6 항체에도 Aggrus와 CLEC-2의 결합을 저해하는 활성은 인정되었지만, 그 효과는 MS-1 항체보다도 약했다(도 9의 B).

[0091] 이 결과는, 항체가 에피토프로서 인식하는 영역인 77번째부터 84번째까지의 펩티드 부분이, CLEC-2와 Aggrus와의 결합에 중요한 것을 나타내고 있다. 또한, 점변이체를 사용한 실시예 6의 해석으로부터, 85번째의 트레오닌이 CLEC-2와 Aggrus와의 결합에 중요한 것은 명백하다. 따라서, 77번째부터 85번째까지의 아미노산 서열(서열 번호 1 : GIRIEDLPT)이, Aggrus와 CLEC-2와의 결합에 중요한 서열이라고 결론지을 수 있었다.

[0092] 서열 번호 1로 나타나는 영역은, Aggrus와 CLEC-2와의 결합에 필요한 영역이고, 또한, PG4D1 항체, PG4D2 항체가 인식하는 서열 번호 3(RIEDL)은 그 코어 영역이라고 생각할 수 있다. 따라서, 서열 번호 1, 또는 서열 번호 3을 포함하는 펩티드를 합성하여 투여하면, CLEC-2와 Aggrus의 결합을 저해하여, CLEC-2와 Aggrus의 결합을 저해할 수 있다. CLEC-2와 Aggrus와의 결합을 저해할 수 있으면, 혈소판 응집을 억제하여, 암의 진전, 전이를 억제할 수 있으므로 당해 영역을 유효 성분으로 하는 의약 조성물로 된다.

[0093] 경합 저해에 필요한 펩티드로서는, 서열 번호 1, 또는 3을 포함하는 펩티드이면 되지만, 펩티드의 합성이나 작용을 고려하면 너무 큰 펩티드가 아닌 편이 바람직하다. 구체적으로는, 서열 번호 1, 또는 3을 포함하고, 이들 펩티드로부터 수 아미노산∼수 10아미노산 정도 긴 서열의 펩티드인 것이 바람직하고, 서열 번호 1 또는 3의 펩티드 서열 그 자체인 것이 보다 바람직하다.

[0094] (2) FACS법에 의한 검토

PG4D1 항체, PG4D2 항체에 의한 Aggrus와 CLEC-2의 결합 저해를 FACS에 의해 해석했다. CHO/Aggrus-WT 세포와, 재조합 CLEC-2(rCLEC-2)와의 결합을 항Aggrus 모노클로널 항체가 저해하는지 해석을 행했다. 검출은 재조합 CLEC-2의 His 태그를 인식하는 항체를 사용해서 행하고 있다.

[0095] 구체적으로는, CHO/Aggrus-WT 세포를 배양 용기로부터 회수하고, PBS로 세정한 후에 1.5×10⁵cells/ml의 세포 밀도로 조제했다. 100㎕의 반응 용액에, 마우스 컨트롤 IgG(100㎍/mL : w/o rCLEC-2 또는 rCLEC-2 alone의 샘플), PG4D1 항체(100㎍/mL : PG4D1+rCLEC-2 샘플), PG4D2 항체(100㎍/mL : PG4D2+rCLEC-2 샘플), MS-1 항체(100㎍/mL : MS-1+rCLEC-2 샘플)를 첨가하고, 30분간 빙상에서 반응시켰다. 다음으로 세포를 PBS로 세정하고, 그 후 포유 동물 세포로부터 정제한 0.4㎍/mL (His)₁₀ 태그 부착 재조합 CLEC-2 단백질(rCLEC-2)을 w/o rCLEC-2 이외의 샘플에 첨가하고, 30분간 빙상에서 반응시켰다. PBS로 세정 후에, 형광 표식된 His 태그를 인식하는 이차항체를 첨가하고, 빙상에서 추가로 30분간 반응시켰다. 마지막으로, 세포를 3회 PBS로 세정한 후에, Cytomics FC500으로 해석을 행했다. 그 결과, 도 10의 A에 나타내는 바와 같이, PG4D1 항체와 PG4D2 항체는, MS-1 항체와 마찬가지로 rCLEC-2의 Aggrus 발현 세포에의 결합을 저해함과 함께, 그 저해 활성은 MS-1 항체보다도 강하기 때문에 피크가 크게 좌측으로 시프트하고 있는 것이 확인되었다.

[0096] MS-1 항체는 PLAG2로부터 PLAG3 도메인에 걸친 영역을 인식하는데 대하여(도 1 참조), PG4D1 항체와 PG4D2 항체는 PLAG4 도메인 근방을 인식한다(도 7 참조). 그래서, PG4D1 항체 또는 PG4D2 항체가 Aggrus에 결합했을 때의 MS-1 항체의 Aggrus 인식능의 변화를 검토했다. DyLight594 표식한 MS-1 항체와 DyLight594 표식한 PG4D2 항체를 제작했다. 구체적으로는, DyLight 594 Microscale Antibody Labeling Kit(라이프테크놀로지스사제)의 설명서에 따라서, MS-1 항체와 PG4D2 항체에 형광 표식했다.

[0097] CHO/Aggrus-WT 세포주를 배양 용기로부터 회수하고, PBS로 세정한 후에 1.5×10⁵cells/ml의 세포 밀도로 조제하고, DyLight594 표식한 MS-1 항체 또는 DyLight594 표식한 PG4D2 항체를 첨가하고, 30분간 빙상에서 반응시켰다. 일부의 샘플에는, DyLight594 표식한 항체를 첨가할 때에, 무표식의 MS-1 항체 또는 PG4D2 항체를 첨가했다. 그 후에, 세포를 3회 PBS로 세정한 후에, Cytomics FC500으로 해석을 행했다. 또, 까맣게 칠한 산은, 형광 표식한 항체 대신에 무표식의 컨트롤 마우스 항체(시그마사제)를 각각의 세포에 반응시키고, 상기와 마찬가지의 조작을 행한 결과이다.

[0098] 도 10의 B(가장 위의 패널)에 나타내는 바와 같이, MS-1 항체와 PG4D2 항체의 DyLight594 표식은 충분히 행해져 있기 때문에, 백발의 피크가 까맣게 칠한 산으로부터 우측으로 시프트하고 있었다. DyLight594 표식한 MS-1 항체의 CHO/Aggrus-WT 세포에의 반응성은, 무표식의 MS-1 항체를 공존시키면 그 무표식의 MS-1 항체의 농도 의존적으로 저해되지만(도 10의 B 좌측 패널, 중단), 무표식의 PG4D2 항체를 공존시켜도 저해되지 않았다(도 10의 B 좌측 패널, 하단). 또한, DyLight594 표식한 PG4D2 항체의 CHO/Aggrus-WT 세포에의 반응성은, 무표식의 PG4D2 항체를 공존시키면 그 무표식의 PG4D2 항체의 농도 의존적으로 저해되지만(도 10의 B 우측 패널, 하단), 무표식의 MS-1 항체를 공존시켜도 저해되지 않았다(도 10의 B 우측 패널, 중단). 따라서, MS-1 항체와 PG4D2 항체는 각각 PLAG3과 PLAG4 도메인을 인식하고, 그것에 의해서 Aggrus와 CLEC-2의 결합을 저해하고 있는 것, 환언하면 PLAG3과 PLAG4 도메인은 독립해서 CLEC-2와의 결합에 관여하고 있는 것이 시사되었다.

[0099] MS-1 항체와 PG4D2 항체는, 각각 PLAG3과 PLAG4 도메인을 인식해서 CLEC-2의 결합을 저해하고 있는 것이라면, MS-1 항체와 PG4D2 항체를 병용함으로써, Aggrus와 CLEC-2의 결합을 완전히 저해할 수 있을 가능성을 생각할 수 있다. 그래서, 그 가능성을 검증하기 위하여, MS-1 항체 단독과 MS-1 항체에 더하여 PG4D2 항체를 병용했을 때의 Aggrus와 CLEC-2의 결합을 FACS에 의해 해석했다. CHO/Aggrus-WT 세포와, 재조합 CLEC-2(rCLEC-2)와의 결합을 MS-1 항체와 PG4D2 항체가 저해하는지 해석을 행했다. 검출은 재조합 CLEC-2를 His 태그를 인식하는 항체를 사용해서 행하고 있다(도 10의 C).

[0100] 구체적으로는, CHO/Aggrus-WT 세포를 배양 용기로부터 회수하고, PBS로 세정한 후에 1.5×10⁵cells/ml의 세포 밀도로 조제했다. 100㎕의 반응 용액에, 마우스 컨트롤 IgG(100㎍/mL : w/o rCLEC-2 또는 rCLEC-2 alone의 샘플), PG4D2 항체(100㎍/mL : PG4D2+rCLEC-2 샘플), PG4D2 항체와 MS-1 항체(각 100㎍/mL : PG4D2+MS-1+rCLEC-2 샘플)를 첨가하고, 30분간 빙상에서 반응시켰다. 다음으로 세포를 PBS로 세정하고, 그 후 포유 동물 세포로부터 정제한 0.4㎍/mL (His)₁₀ 태그 부착 재조합 CLEC-2 단백질(rCLEC-2)을 w/o rCLEC-2 이외의 샘플에 첨가하고, 30분간 빙상에서 반응시켰다. PBS로 세정 후에, 형광 표식된 His 태그를 인식하는 이차항체를 첨가하고, 빙상에서 추가로 30분간 반응시켰다. 마지막으로, 세포를 3회 PBS로 세정한 후에, Cytomics FC500으로 해석을 행했다. 그 결과, 도 10의 C에 나타내는 바와 같이, PG4D2 항체와 MS-1 항체를 병용함으로써, PG4D2 항체 단독과 비교해서, rCLEC-2의 결합이 강하게 저해되어, 피크가 크게 좌측으로 시프트하고 있는 것이 확인되었다.

[0101] 따라서, PG4D1 항체 또는 PG4D2 항체가 인식하는 PLAG4 도메인은, PLAG3 도메인과는 독립해서 CLEC-2와의 결합에 관여하고 있는 것, PLAG4 도메인을 인식하는 항체와 PLAG3 도메인을 인식하는 항체를 병용함으로써, 보다 강력한 CLEC-2 결합의 억제가 보이는 것이 명백해졌다.

(실시예 11)

[0102] Aggrus 변이체를 사용한 PG4D1과 PG4D2 항체에 의한 CLEC-2 결합의 억제와 혈소판 응집의 억제의 해석

(1) CLEC-2와의 결합의 억제

Aggrus는 혈소판 상의 CLEC-2와 결합함으로써 혈소판 응집 유도 시그널을 전달한다. PG4D1 항체 또는 PG4D2 항체가 인식하는 PLAG4 도메인이 CLEC-2와의 결합 및 혈소판 응집에 직접적으로 관여하고 있는 것을 해석했다. pcDNA3 벡터에 PLAG3 도메인 내의 48번째의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환한 인간 Aggrus cDNA를 도입한 플라스미드를 도입한 CHO 세포(CHO/Aggrus-D48A)를 사용해서 검토했다. Aggrus-D48A를 발현하는 변이체를 사용함에 의해서, Aggrus의 PLAG3 도메인의 CLEC-2에 대한 결합의 관여를 고려할 필요가 없고, PLAG4 도메인과 CLEC-2와의 결합을 평가할 수 있다. PLAG4 도메인이 CLEC-2와 Aggrus와의 결합에 직접적으로 관여하고 있는지 FACS에 의해 해석했다.

[0103] CHO/Aggrus-D48A 세포를 배양 용기로부터 회수하고, PBS로 세정한 후에 1.5×10⁵cells/ml의 세포 밀도로 조제했다. 100㎕의 반응 용액에, PBS(w/o rCLEC-2 또는 Add no antibody의 샘플), 각종 농도로 PG4D1 항체(도 11의 A 좌측 패널), PG4D2 항체(도 11의 A 우측 패널)를 첨가하고, 30분간 빙상에서 반응시켰다. 그 후에 세포를 PBS로 세정하고, 포유 동물 세포로부터 정제한 (His)₁₀ 태그 부착 재조합 CLEC-2 단백질(rCLEC-2) 0.4㎍/mL를 w/o rCLEC-2 이외의 샘플에 첨가하고, 30분간 빙상에서 반응시켰다. PBS로 세정 후에, 형광 표식된 His 태그를 인식하는 이차항체를 첨가하고, 빙상에서 추가로 30분간 반응시켰다. 마지막으로, 세포를 3회 PBS로 세정한 후에, Cytomics FC500으로 해석을 행했다. 도 11의 A에 나타내는 바와 같이, PG4D1 항체 또는 PG4D2 항체를 첨가함에 의해, rCLEC-2의 Aggrus 발현 세포에의 결합을 농도 의존적으로 저해함과 함께, 100㎍/mL의 농도로 첨가한 경우에는 거의 완전히 rCLEC-2의 결합을 저해하는 것이 명백해졌다. 따라서, PG4D1 항체 또는 PG4D2 항체가 인식하는 PLAG4 도메인이 CLEC-2와의 결합에 직접적으로 관여하고 있는 것이 명백해졌다.

[0104] (2) 혈소판 응집의 억제

다음으로, 혈소판 응집 억제 시험에서 PLAG4 도메인의 CLEC-2에 대한 결합을 확인했다. 구체적으로는, MCM HEMA TRACER 313을 사용한 광투과율의 모니터링에 의한 마우스 세정 혈소판을 사용한 in vitro 혈소판 응집 분석을 행했다. 도 11의 B에 나타내는 바와 같이, CHO/Aggrus-D48A 세포는 혈소판 응집을 유도하지만, 50ng/mL의 PG4D2 항체를 첨가해 두면 혈소판 응집이 일어나지 않게 되는 것이 관찰되었다(도 11의 B). 또한, 여기에서는 나타내지 않지만 PG4D1 항체를 사전에 첨가해 두어도, 거의 마찬가지의 혈소판 응집 저해 효과가 확인되었다. 따라서, PG4D1 항체 또는 PG4D2 항체가 인식하는 PLAG4 도메인이 혈소판 응집에 직접적으로 관여하고 있는 것, 또한 새롭게 창제된 항체는 PLAG4 도메인에 결합해서 그 도메인을 덮음으로써 혈소판 응집을 저해하는 중화 항체인 것이 명백해졌다.

[0105] 혈소판 응집 억제 시험에서, PLAG4 도메인을 인식하는 PG4D1 항체 또는 PG4D2 항체, PLAG3 도메인을 인식하는 MS-1 항체의 차이의 검토와, PG4D2 항체와 MS-1 항체의 병용 효과를 검토했다. CHO/Aggrus-WT 세포를 사용하여, 상기와 마찬가지로 in vitro 혈소판 응집 분석을 행했다. 도 12의 A에 나타내는 바와 같이, CHO/Aggrus-WT 세포는 혈소판 응집을 유도하지만, 10㎍/mL의 MS-1 항체, PG4D1 항체, PG4D2 항체를 첨가하면 컨트롤 항체(Control IgG) 첨가 시에 비해서 혈소판 응집이 개시되는 시간이 늦어지는 것이 관찰되었다(도 12의 A). 또한, PG4D1 항체와 PG4D2 항체의 혈소판 응집 억제 활성은 MS-1 항체의 혈소판 응집 억제 활성보다도 강하고, 그 때문에 응집 개시까지의 시간이 지연하고 있는 것이 명백해졌다.

[0106] 또한, CHO/Aggrus-WT 세포 의존적인 혈소판 응집은, 10㎍/mL의 MS-1 항체와 10㎍/mL의 PG4D2 항체를 병용하면, PG4D2 항체 단독 첨가 시에 비하여, 거의 완전히 혈소판 응집을 저해하는 것이 확인되었다(도 12의 B). 따라서, PG4D1 항체 또는 PG4D2 항체가 인식하는 PLAG4 도메인과 MS-1 항체가 인식하는 PLAG3 도메인의 양쪽이 혈소판 응집에 관여하고 있는 것이 명백해졌다.

(실시예 12)

[0107] PG4D1과 PG4D2 항체에 의한 폐에의 혈행성 전이 억제

인간 Aggrus를 발현하여 있는 CHO 세포를 누드 마우스의 미정맥으로부터 도입하면, 약 20일 후에 폐전이 결절을 형성하는 것이 알려져 있다. 또한, 본 발명자들은, Aggrus 의존적인 폐전이는 MS-1 항체에 의해 억제되는 것을 이미 개시하고 있다(특허문헌 2). 그래서, 세포 이식 1일 전에, 본 발명의 항Aggrus 항체를 투여함에 의해, Aggrus 의존적인 혈행성 전이를 저해하는지 해석했다.

[0108] 6주령의 자성 BALB/c-nu 누드 마우스(찰스리버재팬으로부터 구입)를 사용해서 해석을 행했다. 종양 세포인 CHO/Aggrus-WT 세포 이식 1일 전에, 마우스 미정맥으로부터, 10㎍/마우스의 용량으로 컨트롤 마우스 항체(시그마사제), MS-1 항체, PG4D1 항체, 또는 PG4D2 항체를 투여했다. 익일, CHO/Aggrus-WT 세포를 배양 용기로부터 회수하고, PBS로 세정한 후에 2.5×10⁶cells/ml의 세포 밀도로 조제하고, 100㎕/마우스로 미정맥으로부터 이식했다. 도 13에 나타내는 바와 같이, PG4D1 항체와 PG4D2 항체를 종양 이식 전일에 투여함에 의해, MS-1 항체를 종양 이식 전일 투여한 경우와 마찬가지로 CHO/Aggrus-WT 세포의 폐전이가 현저히 억제되었다. 따라서, PG4D1 항체와 PG4D2 항체는 Aggrus 중화 활성이 있을 뿐만 아니라, Aggrus 의존적인 혈행성 전이를 강하게 억제하는 것이 나타났다.

[0109] 마찬가지의 검토를 각 항체의 서브클래스가 일치하여 있는 아이소 타입 매치인 컨트롤 항체를 사용해서 행했다. 또한 본 검토에서는, 5주령의 자성 BALB/c-nu 누드 마우스(찰스리버재팬으로부터 구입)를 각 군 8마리 사용해서 행했다. 종양 세포인 CHO/Aggrus-WT 세포 이식 1일 전에, 마우스 미정맥으로부터, 10㎍/마우스의 용량으로 컨트롤 마우스 IgG1(Control IgG1, 시그마사제), 컨트롤 마우스 IgG2a(Control IgG2a, 시그마사제), PG4D1 항체, PG4D2 항체, MS-1 항체를 투여했다. 익일, CHO/Aggrus-WT 세포를 배양 용기로부터 회수하고, PBS로 세정한 후에 2.5×10⁶cells/ml의 세포 밀도로 조제하고, 100㎕/마우스로 미정맥으로부터 이식했다. 19일 후에 폐를 적출하여 해석했다. 도 14의 A에 나타내는 바와 같이 피크르산을 사용한 염색 후의 사진을 촬영함과 함께, 폐 표면의 전이 결절수의 카운트를 행했다(도 14의 B). PG4D1 항체와 PG4D2 항체를 종양 이식 전일에 투여함에 의해, MS-1 항체의 경우와 마찬가지로 CHO/Aggrus-WT 세포의 폐전이가 각 아이소 타입 매치인 컨트롤 항체 투여군과 비교해서, 유의하게 억제되는(**, P<0.01) 것이 확인되었다.

[0110] 따라서, PG4D1 항체와 PG4D2 항체는 Aggrus 의존적인 혈소판 응집을 중화하는 활성이 있을 뿐만 아니라, Aggrus 의존적인 혈행성 전이를 강하게 억제하는 것이 나타났다. 혈소판 응집은, 암세포의 전이 니치의 형성(전이 미소 환경의 형성)에 관한 것이 보고되어 있고, 이로부터 PG4D1 항체와 PG4D2 항체는 전이에 관한 니치 형성의 저해 효과가 있는 것으로 생각할 수 있다. 또한 혈소판은 원발소에 있어서의 종양 증식에도 관련되어 있는 것이 명백해져 있기 때문에, 전이암의 전이 장기 내에서의 증식을 PG4D1 항체와 PG4D2 항체가 억제함으로써 전이 억제 효과를 발휘하고 있는 것이 시사된다.

(실시예 13)

[0111] PLAG4 도메인 인식 항체 PG4D2가 LC-SCC-015 세포의 폐전이를 억제하는 효과의 실증

본 발명자들이 수립한 인간 폐편평상피암 세포주 LC-SCC-015를, 5주령의 웅성 CB-17 SCID 마우스(찰스리버재팬으로부터 구입)에 각 군 3마리 이식해서 행했다. 구체적으로는, 종양 세포인 LC-SCC-015 세포 이식 1일 전에, 마우스 미정맥으로부터, 30㎍/마우스의 용량으로 컨트롤 마우스 IgG2a(Mouse IgG2a, 시그마사제), PG4D2 항체를 투여했다. 익일, LC-SCC-015 세포를 배양 용기로부터 회수하고, PBS로 세정한 후에 2.5×10⁶cells/ml의 세포 밀도로 조제하고, 100㎕/마우스로 미정맥으로부터 이식했다. 31일 후에 폐를 적출하고, 피크르산을 사용한 염색 후에 폐 표면의 전이 결절수의 카운트를 행했다(도 15). PG4D2 항체를 종양 이식 전일에 투여하면, 컨트롤 마우스 IgG2a 항체 투여군과 비교해도 유의하게 폐전이를 억제하는 것이 확인되었다(*, P<0.05).

[0112] PG4D2 항체는 Aggrus 의존적인 혈소판 응집을 중화하는 활성이 있을 뿐만 아니라, 수립한 인간 폐편평상피암 세포주 LC-SCC-015의 폐전이에 있어서도 Aggrus 의존적인 혈소판 응집이 혈행성 폐전이에 관여하고 있는 것이 확인되었다. PG4D2 항체는 Aggrus 의존적인 혈행성 전이를 강하게 억제함에 의해 LC-SCC-015 세포의 폐전이를 억제하고 있는 것이 나타났다.

[0113] 혈소판 응집은, 암세포의 전이 니치의 형성(전이 미소 환경의 형성)에 관한 것이 보고되어 있다. 이로부터, PG4D2 항체는 전이에 관한 니치 형성의 저해 효과도 있는 것으로 생각할 수 있다. 또한 혈소판은 원발소에 있어서의 종양 증식에도 관련되어 있는 것이 명백해져 있기 때문에, 전이암의 전이 장기 내에서의 증식을 PG4D2 항체가 억제함으로써 전이 억제 효과를 발휘하고 있는 것도 시사된다.

(실시예 14)

[0114] PLAG4 도메인 인식 항체 PG4D2에 의한 PC-10 세포의 종양 증식을 억제하는 효과의 검증

인간 폐편평상피암 세포주 PC-10을, 5주령의 웅성 NOD SCID 마우스(NOD.CB17-Prkdcscid/J; 찰스리버재팬으로부터 구입)에 각 군 4 또는 5마리에 이식했다. PC-10 세포 이식 후 11일 후의 종양 체적이 거의 80㎣ 전후로 된 시점에서, 각 군의 종양 체적의 평균이 거의 균등하게 되도록 마우스를 나눴다. 그 후, 마우스 미정맥으로부터, 컨트롤 마우스 IgG2a(Control IgG2a, 시그마사제)를 200㎍/mouse(n=5), PG4D2 항체를 100㎍/mouse(n=4), MS-1 항체를 100㎍/mouse(n=5), PG4D2 항체와 MS-1 항체를 각 100㎍으로 합계 200㎍/mouse(n=4)의 용량으로 투여했다. 항체 투여 개시일을 0일로 하고, 그 후의 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24일에 동량의 항체 투여를 행했다.

[0115] 도 16에 나타내는 바와 같이, PG4D2 항체 또는 MS-1 항체를 투여한 군은, 컨트롤 마우스 항체 투여군에 비교해서 종양 증식이 억제되었다. 그 경향은 PG4D2 항체와 MS-1 항체를 병용한 경우도 마찬가지였다. 또한, 병용에 의한 종양 억제 효과의 증강이 약간 인정되었다. 또, PG4D2 항체를 투여한 군(PG4D2 항체 투여군과 PG4D2 항체와 MS-1 항체의 병용군)에서는, 각 군 1마리씩에서 종양의 완전한 퇴축이 인정되었지만, 이것은 PC-10 세포의 특이성 혹은 마우스의 개체차에 의한 것일 가능성도 고려하여, 종양 체적의 평균값 등의 산출에는 더하지 않았다. 단, PG4D2 항체를 투여한 군에서만 종양 퇴축이 인정된 것은, PG4D2 항체에는 MS-1 항체와는 서로 다른 강한 항종양 효과가 있을 가능성도 있다.

[0116] 여기에서는, 중도 복합 면역 부전 마우스인 NOD SCID 마우스를 사용해서 검토하고 있다. 실시예 12에서 사용한 누드 마우스나 실시예 13에서 사용한 SCID 마우스는, T 세포와 B 세포가 결여하여 있는 마우스인데 대하여, NOD SCID 마우스는 T 세포와 B 세포가 결여하여 있는 뿐만 아니라, NK 활성도 저하하여 있다. 따라서, NOD SCID 마우스를 사용한 실시예 14의 실험에서 인정된 Aggrus 중화 항체의 항종양 효과는, 항체의 ADCC 활성이나 CDC 활성에 의존하고 있는 것이 아니라고 생각할 수 있다. 여기에서 사용한 PLAG3, PLAG4 도메인을 인식하는 항체는, Aggrus의 혈소판 응집 유도 활성을 중화함으로써 혈소판으로부터의 각종 증식 인자의 유리를 저해하고, 그 결과 증식 저해를 일으키고 있는 것이 시사되었다. 따라서, PG4D2 항체는 직접적으로 PC-10 세포를 죽이고 있는 것이 아니라, 간접적으로 증식 인자를 고갈시킴으로써 원발소의 종양 증식을 억제하고 있는 것이 시사되었다. 즉, PLAG4 도메인을 인식하는 항체는, 실시예 12 및 실시예 13에서 나타낸 바와 같이 혈행성 전이를 억제할 뿐만 아니라, 원발소의 종양 증식도 억제하는 것이 나타났다.

(실시예 15)

[0117] 인간-마우스 키메라화 PG4D2 항체에 의한 Aggrus 중화 활성의 검토

PG4D2 항체의 항원 인식 부위를 유전자 클로닝하고, 인간 IgG4의 Fc 부위를 코딩하는 유전자와 연결함으로써 IgG4 타입의 인간-마우스 키메라화 PG4D2 항체(Ch.PG4D2-IgG4SP)를, 인간 IgG1의 Fc 부위를 코드하는 유전자와 연결함으로써 IgG1 타입의 인간-마우스 키메라화 PG4D2 항체(Ch.PG4D2-IgG1)를 제작했다.

[0118] 도 17의 A는, CHO/Aggrus-WT 세포를 사용하여, 실시예 2와 마찬가지로, 각 항체의 Aggrus에의 반응성을 검토한 결과를 나타낸다. 좌측 패널은, CHO/Aggrus-WT 세포와 키메라화하여 있지 않은 마우스 항체인 PG4D2 항체를 도면 중에 나타내고 있는 농도로 반응시키고, PBS로의 세정 후에 2차항체로서 Alexa488 표식 항마우스 IgG(anti-mouse IgG-Alexa488)를 반응시킨 결과를 나타내고 있다. 중앙 패널은, CHO/Aggrus-WT 세포를 IgG4 타입의 인간-마우스 키메라화 PG4D2 항체(Ch.PG4D2-IgG4SP)를 도면 중에 나타내고 있는 농도로 반응시키고, PBS로의 세정 후에 2차항체로서 Alexa488 표식 항인간 IgG(anti-human IgG-Alexa488)를 반응시킨 결과를 나타내고 있다. 우측 패널은, CHO/Aggrus-WT 세포를 IgG1 타입의 인간-마우스 키메라화 PG4D2 항체(Ch.PG4D2-IgG1)를 도면 중에 나타내고 있는 농도로 반응시키고, PBS로의 세정 후에 2차항체로서 Alexa488 표식 항인간 IgG를 반응시킨 결과를 나타내고 있다. 키메라화한 Ch.PG4D2-IgG4SP와 Ch.PG4D2-IgG1은, 모두 Aggrus에 반응성을 나타내고 있는 것이 확인되었다.

[0119] 도 17의 B는, 실시예 10과 마찬가지로, Aggrus와 CLEC-2의 결합 저해를 FACS에 의해 해석한 결과를 나타낸다. 키메라화하여 있지 않은 마우스 항체인 PG4D2 항체(도 17의 B 상), IgG4 타입의 인간-마우스 키메라화 PG4D2 항체(Ch.PG4D2-IgG4SP)(도 17의 B 하 좌측), IgG1 타입의 인간-마우스 키메라화 PG4D2 항체(Ch.PG4D2-IgG1)(도 17의 B 하 우측)를 사용해서 어세이를 행했다. 또, 각 어세이에 있어서는, 종 및 항체의 서브클래스가 같은 항체를 컨트롤 항체로서 사용했다. 구체적으로는. Control mouse IgG2a(시그마사제), Control human IgG4(시그마사제), Control human IgG1(시그마사제)을 사용했다.

[0120] 그 결과, IgG4 타입의 인간-마우스 키메라화 PG4D2 항체(Ch.PG4D2-IgG4SP)는 원래의 키메라화하여 있지 않은 마우스 항체인 PG4D2 항체와 거의 동등한 Aggrus 중화 활성을 나타내지만, IgG1 타입의 인간-마우스 키메라화 PG4D2 항체(Ch.PG4D2-IgG1)는 Aggrus 중화 활성이 조금 약했다. 그 때문에, Ch.PG4D2-IgG1은, CLEC-2와의 결합 저해에 원래의 PG4D2 항체보다도 많은 항체량을 필요로 했지만, Ch.PG4D2-IgG1을 60㎍/mL로 반응시키면 rCLEC-2의 Aggrus에의 결합을 충분히 저해할 수 있었다.

(실시예 16)

[0121] 골육종 조직 절편을 사용한 PG4D1 항체와 PG4D2 항체를 사용한 면역 염색

US Biomax사로부터, Bone and cartilage malignant tumor tissue microarray, containing 4 cases of malignant tumor(2 each of chondrosarcoma, osteosarcoma and Ewing's sarcoma), quadruple cores per case(제품번호 T264a)를 구입하고, 통상의 방법에 따라 HE 염색을 행했다(도 18의 A).

[0122] 이 Tissue array에는, 연골육종(Chondrosarcoma), 골육종(Osteosarcoma), 유잉육종(Ewing's Sarcoma)의 조직 샘플이 각 2증례씩, 1증례 네 절편과, 조직 마커로서 갈색 세포종(Pheochromocytoma)이 배치되어 있고, 병기 등이 서로 다른 환자의 종양 조직에서의 단백질 발현을 면역 염색에 의해 해석하는 것이 가능하다. 이 슬라이드에 놓여 있는 골육종 2증례에 있어서, D2-40, PG4D1, PG4D2의 면역 염색법에 의한 골육종 인식능을 검토했다.

[0123] 일차항체로서 D2-40 항체(DAKO사 : 제품번호 M3619, Anti-podoplanin mouse monoclonal antibody), PG4D1 항체(5㎎/ml), PG4D2 항체(5㎎/ml)를 사용해서 면역 염색을 이하의 방법으로 행했다. 구체적으로는, 탈파라핀 후에 수세하고, 0.3% 과산화수소수/메탄올에 실온에서 10분간 담구고, PBS로 5분간 세정하는 것을 3회 반복했다. 그 후에 블로킹원P(나카라이테스크샤제 #05999-84)에 실온에서 15분간 담근 후에 PBS로 5분간 세정했다. 그 후에 일차항체로서 D2-40 항체를 사용하는 경우는 PBS로 1/100 희석한 것을 4도에서 16시간 반응시켰다. 일차항체로서 PG4D1 또는 PG4D2 항체를 사용하는 경우는 PBS로 1/1000 희석한 것(최종 항체 농도 5㎍/ml)을 4도에서 16시간 반응시켰다. D2-40 항체는, 배양상청이기 때문에 그램 환산이 곤란하므로, 하기에 나타내는 바와 같이 컨트롤 조직에서의 염색 정도가 모든 항체에서 동등하게 되는 바와 같은 항체 농도를 선택해서 염색을 행하고 있다. PBS로 5분간 세정하는 것을 3회 반복한 후에, 이차항체로서 One-Step Polymer-HRP(BioGenex사제 #HK595-50K)에 실온에서 15분간 반응시켰다. PBS로 5분간 세정하는 것을 3회 반복한 후에, DAB(상품명 Super Sensitive DAB(Ready to use), BioGenex사제 #HK542-XAK)로 5분간 발색시켰다. 수세한 후에 핵을 마이어헤마톡실린 용액(무토가가쿠가부시키가이샤제 #3000-2)에 1분간 담금으로써 대비 염색하고, 그 후에 수세, 탈수, 투철, 봉입(封入)을 통상의 방법에 따라 행했다.

[0124] Tissue array인 T264a 슬라이드에는, 상술과 같이 골육종 2증례의 종양 조직이 놓여 있고, 도 18의 A에 나타내는 A3과 A6의 종양 조직은 1번째의 골육종 증례(10세 남성)이고, B1과 B4의 종양 조직은 2번째의 골육종 증례(21세 여성)에 유래하고 있다. 도 18의 B에 나타내는 바와 같이, D7에 위치하는 컨트롤 종양 조직(Pheochromocytoma)에의 염색 정도가 거의 일치하여 있는 염색 정도로 비교하면, PG4D1 항체와 PG4D2 항체를 사용한 면역 염색의 염색 정도는 D2-40 항체의 염색 정도와 비교해서 잘 물들어 있어, PG4D1 항체와 PG4D2 항체는 D2-40 항체보다도 골육종 인식능이 높은 것을 알 수 있다. 따라서, 적어도 골육종의 증식 저해약·전이 저해약으로서 유용한 것이 시사된다.

[0125] mRNA에서는 Aggrus의 발현을 확인할 수 있음에도 불구하고, 항체에서는 검출되지 않는 경우가 있어, Aggrus 항체의 치료에의 응용이 한정적인 것임이 우려되고 있었다. 예를 들면, 본 발명자들은, MS-1 항체가 인식할 수 없는 인간 방광편평상피암 세포주 UM-UC-5 세포나, 인간 섬유육종 세포주 HT1080 세포를 PG4D1 항체, PG4D2 항체가 인식하는 것을 나타내고 있다(도 7의 C). 암의 종류 등에 따라서, Aggrus를 인식할 수 있는 경우와, 할 수 없는 경우의 기전은 불명하지만, PG4D1 항체, PG4D2 항체는 적어도 여기에서 나타낸 골육종, 세포주를 사용한 실험계에서 결합이 검증되어 있는 방광편평상피암, 섬유육종, 폐편평상피암에서는 치료에의 적용이 가능하다고 생각할 수 있다.

[0126] 이상 나타내 온 바와 같이, 서열 번호 1에 의해 나타나는 영역에 결합하는 항Aggrus 항체는, Aggrus와 CLEC-2와의 결합을 저해하여, 혈소판 응집을 억제하여, 암의 진전, 전이를 억제한다. 또한, 이 영역과 CLEC-2와의 결합을 지표로 해서, CLEC-2와의 결합을 저해하는 의약을 스크리닝하는 것이 가능하게 된다.

[0127] 수탁번호

NITE P-02070

NITE P-02071

[0128]

SEQUENCE LISTING <110> Japanese Foundation for Cancer Research <120> Aggrus monoclonal antibody <130> S15053PCT <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Ile Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Ala Glu Asp Asp Val Val Thr Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr 1 5 10 15 Lys <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Ile Glu Asp Leu 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 4 Glu Asp Xaa Xaa Thr Ser 1 5 <210> 5 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Trp Lys Val Ser Ala Leu Leu Phe Val Leu Gly Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 Trp Val Leu Ala Glu Gly Ala Ser Thr Gly Gln Pro Glu Asp Asp Thr 20 25 30 Glu Thr Thr Gly Leu Glu Gly Gly Val Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp 35 40 45 Asp Val Val Thr Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr Lys Ser Gly Leu 50 55 60 Thr Thr Leu Val Ala Thr Ser Val Asn Ser Val Thr Gly Ile Arg Ile 65 70 75 80 Glu Asp Leu Pro Thr Ser Glu Ser Thr Val His Ala Gln Glu Gln Ser 85 90 95 Pro Ser Ala Thr Ala Ser Asn Val Ala Thr Ser His Ser Thr Glu Lys 100 105 110 Val Asp Gly Asp Thr Gln Thr Thr Val Glu Lys Asp Gly Leu Ser Thr 115 120 125 Val Thr Leu Val Gly Ile Ile Val Gly Val Leu Leu Ala Ile Gly Phe 130 135 140 <210> 6 <211> 144 <212> PRT <213> Pan paniscus <400> 6 Met Trp Lys Val Ser Ala Leu Leu Phe Val Leu Gly Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 Trp Val Leu Ala Glu Gly Ala Ser Thr Gly Gln Pro Glu Asp Asp Thr 20 25 30 Glu Thr Thr Gly Leu Glu Gly Gly Phe Ala Val Pro Gly Ala Glu Asp 35 40 45 Asp Val Val Thr Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr Lys Ser Gly Leu 50 55 60 Thr Thr Leu Val Ala Thr Ser Val Asn Ser Val Thr Gly Ile Arg Ile 65 70 75 80 Glu Asp Leu Pro Thr Ser Glu Ser Thr Val His Ala Gln Glu Gln Ser 85 90 95 Pro Ser Ala Thr Ala Ser Asn Val Ala Thr Ser His Ser Thr Glu Lys 100 105 110 Val Asp Gly Asp Thr Gln Thr Thr Val Glu Lys Asp Gly Leu Ala Thr 115 120 125 Val Thr Leu Val Gly Ile Ile Val Gly Val Leu Leu Ala Ile Gly Phe 130 135 140 <210> 7 <211> 144 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 7 Met Trp Lys Val Ser Ala Leu Leu Phe Val Leu Gly Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 Trp Val Leu Ala Glu Gly Ala Ser Thr Gly Gln Pro Glu Asp Asp Ile 20 25 30 Glu Thr Thr Gly Met Glu Gly Gly Val Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp 35 40 45 Asp Val Val Thr Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr Lys Ser Gly Leu 50 55 60 Thr Thr Pro Val Ala Thr Ser Val Asn Ser Val Thr Asp Ile His Ile 65 70 75 80 Glu Asp Leu Pro Thr Pro Glu Ser Thr Val His Ala Gln Gly Gln Ser 85 90 95 Pro Ser Thr Thr Ala Ser Asn Val Ala Thr Ser His Ser Thr Asp Lys 100 105 110 Val Asp Gly Asp Thr Gln Thr Ala Ile Glu Lys Asp Gly Leu Ala Thr 115 120 125 Val Thr Leu Val Gly Ile Ile Val Gly Val Leu Leu Ala Ile Gly Phe 130 135 140 <210> 8 <211> 141 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 8 Met Trp Lys Val Pro Val Leu Leu Phe Val Leu Gly Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 Trp Val Leu Ala Glu Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Asp Gly Val 20 25 30 Thr Pro Gly Val Glu Gly Ser Ser Lys Ala Ser Pro Gly Val Glu Asp 35 40 45 Tyr Thr Val Thr Pro Arg Thr Arg Glu Glu Pro Tyr Ala Thr Pro Leu 50 55 60 Val Pro Thr Arg Thr Lys Gly Thr Thr Gly Ser Pro Thr Glu Asp Val 65 70 75 80 Phe Thr Val Gly Ser Thr Thr His Ser His Lys Gly Ser Gln Ser Thr 85 90 95 Thr Thr Gln Asn Val Val Thr Ser Gln Ser His Asp Lys Gly Asp Glu 100 105 110 Glu Lys Ser Lys Thr Val Thr Lys Asp Gly Leu Gly Thr Val Thr Leu 115 120 125 Val Gly Ile Thr Val Gly Val Leu Leu Ala Ile Gly Phe 130 135 140 <210> 9 <211> 143 <212> PRT <213> Physeter catodon <400> 9 Met Trp Lys Gly Pro Val Leu Phe Phe Val Leu Gly Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 Trp Val Leu Ala Glu Ala Ser Thr Val Arg Pro Glu Asp Gly Met Thr 20 25 30 Thr Gly Val Glu Asn Gly Lys Ala Thr Pro Gly Val Glu Asp His Val 35 40 45 Glu Thr Pro Gly Ala Ser Gly Glu Pro His Glu Ser Ala Gly Leu Thr 50 55 60 Ala Pro Met Pro Thr Arg Thr Lys Ser Met Thr Glu Val His Lys Glu 65 70 75 80 Asp Leu Pro Thr Ala Glu Ser Thr Ile His Ser Gln Gly Gln Ser Gln 85 90 95 Ser Thr Thr Thr Leu Asn Val Ala Thr Ser Gln Ser Pro Gly Lys Thr 100 105 110 Asp Gly Glu Lys Pro Thr Thr Val Glu Lys Gly Gly Ser Ser Thr Val 115 120 125 Thr Leu Val Gly Ile Ile Val Gly Val Leu Leu Ala Ile Gly Phe 130 135 140 <210> 10 <211> 152 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 10 Met Trp Lys Val Pro Val Leu Phe Phe Ile Leu Gly Ser Ala Ser Phe 1 5 10 15 Trp Val Leu Ala Glu Gly Ala Ser Thr Val Arg Pro Glu Asp Asp Val 20 25 30 Thr Thr Gly Val Thr Ser Glu Lys Thr Thr Leu Gly Val Glu Asp Tyr 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ala Ala Ser Lys Glu Ser Leu Ala Thr Pro Met Pro 50 55 60 Ala Gly Thr Glu Asn Val Ser His Asp His Arg Glu Asp Leu Pro Thr 65 70 75 80 Ala Glu Gly Thr Thr Ala Glu Gly Thr Thr Ala Lys Ser Thr Pro Ala 85 90 95 Arg Ser Thr Pro Ala Arg Ser Thr Thr Thr Val Leu Thr Arg Val Pro 100 105 110 Ala Thr Ser His Ser Gln Gly Lys Thr Asp Gly Glu Lys Pro Lys Ser 115 120 125 Thr Gln Lys Gly Gly Leu Ser Val Gly Thr Leu Val Gly Ile Ile Val 130 135 140 Gly Val Leu Val Gly Ile Ala Val 145 150 <210> 11 <211> 151 <212> PRT <213> Canis lupus <400> 11 Met Trp Arg Val Pro Val Leu Leu Leu Val Leu Gly Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Arg Val Pro Ala Ala Gly Ala Ser Thr Val Arg Pro Asp Asp Ile Ile 20 25 30 Pro Gly Val Glu Asp Ser Val Val Thr Pro Gly Thr Glu Asp Ser Val 35 40 45 Val Thr Pro Gly Ala Glu Asp Asn Val Val Thr Asp Gly Ala Thr Glu 50 55 60 Glu Pro Tyr Glu Ser Gly Leu Thr Pro Leu Val Thr Lys Asn Thr Glu 65 70 75 80 Ser Val Thr Asp Leu His Leu Glu Asp Gly Pro Thr Gln Glu Ser Thr 85 90 95 Val His Ala Lys Glu Glu Ser Gln Ser Thr Thr Thr Leu Asn Val Val 100 105 110 Thr Ser His Ser Arg Glu Lys Val Gly Glu Asp Thr Glu Thr Thr Val 115 120 125 Glu Lys Asp Gly Leu Ala Thr Val Thr Leu Val Gly Ile Ile Val Gly 130 135 140 Val Leu Leu Ala Ile Gly Phe 145 150 <210> 12 <211> 140 <212> PRT <213> Myotis brandtii <400> 12 Met Trp Lys Ala Arg Val Leu Leu Leu Val Trp Gly Ser Ala Leu Leu 1 5 10 15 Trp Ala Pro Ala Gly Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Glu Asp Glu Ala 20 25 30 Thr Thr Ala Ser Met Glu Asn Gly Met Val Thr Pro Gly Val Gly Gly 35 40 45 Asn Thr Met Thr Pro Gly Ala Ser Glu Gln Ser His Lys Pro Val Gly 50 55 60 Phe Thr Ser Gln Val Pro Thr Asn Thr Lys Arg Thr Asp Thr Pro Ile 65 70 75 80 Glu Asp Leu Pro Thr Thr Glu Ser Thr Gly His Ala Gln Glu Glu Thr 85 90 95 Gln Ser Thr Thr Ala Leu Asn Gly Ala Thr Ser His Pro Arg Glu Asp 100 105 110 Thr Gln Thr Thr Gly Ala Lys Asp Gly Phe Ser Thr Gly Thr Leu Ile 115 120 125 Gly Ile Ile Val Gly Val Leu Leu Gly Ile Gly Phe 130 135 140 <210> 13 <211> 148 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 13 Met Trp Thr Ala Pro Val Leu Leu Trp Val Leu Gly Ser Val Trp Phe 1 5 10 15 Trp Asp Ser Ala Gln Gly Gly Ala Ile Gly Ala Leu Glu Asp Asp Leu 20 25 30 Val Thr Pro Gly Pro Gly Asp Asp Met Val Asn Pro Gly Leu Glu Asp 35 40 45 Arg Ile Glu Thr Thr Asp Thr Thr Gly Glu Leu Asp Lys Ser Thr Ala 50 55 60 Lys Ala Pro Leu Val Pro Thr Gln Pro Pro Ile Glu Glu Leu Pro Thr 65 70 75 80 Ser Gly Thr Ser Asp His Asp His Lys Glu His Glu Ser Thr Thr Thr 85 90 95 Val Lys Ala Val Thr Ser His Ser Thr Asp Lys Lys Thr Thr His Ser 100 105 110 Asn Arg Asp Asn Ala Gly Gly Glu Thr Gln Thr Thr Asp Lys Lys Asp 115 120 125 Gly Leu Ala Val Val Thr Leu Val Gly Ile Ile Ile Gly Val Leu Leu 130 135 140 Ala Ile Gly Phe 145 <210> 14 <211> 154 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Met Trp Thr Val Pro Val Leu Phe Trp Val Leu Gly Ser Val Trp Phe 1 5 10 15 Trp Asp Ser Ala Gln Gly Gly Thr Ile Gly Val Asn Glu Asp Asp Ile 20 25 30 Val Thr Pro Gly Thr Gly Asp Gly Met Val Pro Pro Gly Ile Glu Asp 35 40 45 Lys Ile Thr Thr Thr Gly Ala Thr Gly Gly Leu Asn Glu Ser Thr Gly 50 55 60 Lys Ala Pro Leu Val Pro Thr Gln Arg Glu Arg Gly Thr Lys Pro Pro 65 70 75 80 Leu Glu Glu Leu Ser Thr Ser Ala Thr Ser Asp His Asp His Arg Glu 85 90 95 His Glu Ser Thr Thr Thr Val Lys Val Val Thr Ser His Ser Val Asp 100 105 110 Lys Lys Thr Ser His Pro Asn Arg Asp Asn Ala Gly Asp Glu Thr Gln 115 120 125 Thr Thr Asp Lys Lys Asp Gly Leu Pro Val Val Thr Leu Val Gly Ile 130 135 140 Ile Val Gly Val Leu Leu Ala Ile Gly Phe 145 150 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 15 Glu Asp Xaa Xaa Val Thr Pro Gly 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Glu Asp Asp Thr Glu Thr Thr Gly 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Gly Gly Val Ala Met Pro Gly 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu Asp Asp Val Val Thr Pro Gly 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Asp Leu Pro Thr Ser Glu 1 5

Claims (18)

1. 서열 번호 1(GIRIEDLPT)에 의해 표시되는 아미노산 서열 중 적어도 5잔기의 서열로 이루어지는 Aggrus의 영역에 결합하는 모노클로널 항체, 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트.
2. 제1항에 있어서,
   수탁번호 NITE P-02070(PG4D1), 또는 NITE P-02071(PG4D2)의 하이브리도마에 의해 산생되는, 모노클로널 항체, 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트.
3. 제1항에 있어서,
   키메라화 또는 인간화된 모노클로널 항체, 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트.
4. 수탁번호 NITE P-02070, 또는 NITE P-02071의 하이브리도마.
5. 제1항 내지 제3중 어느 한 항에 기재된 모노클로널 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 포함하는 Aggrus-CLEC-2 결합저해제.
6. 제5항에 있어서,
   또한 서열 번호 2(GAEDDVVTPGTSEDRYK)에 의해 표시되는 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 모노클로널 항체, 그 키메라화 항체, 그 인간화 항체, 및/또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 적어도 하나 포함하는 것을 특징으로 하는 Aggrus-CLEC-2 결합저해제.
7. 제6항에 있어서,
   상기 서열 번호 2의 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 상기 모노클로널 항체가, P2-0, MS-1, MS-3, 및/또는 MS-4인 것을 특징으로 하는 Aggrus-CLEC-2 결합저해제.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로널 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 포함하는 혈소판 응집 억제, 혈전 억제, 암진전·전이 억제, 항염증을 위한 의약 조성물.
9. 제8항에 있어서,
   또한 서열 번호 2(GAEDDVVTPGTSEDRYK)에 의해 표시되는 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 모노클로널 항체, 그 키메라화 항체, 그 인간화 항체, 및/또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 적어도 하나 포함하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
10. 제9항에 있어서,
    상기 서열 번호 2의 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 상기 모노클로널 항체가, P2-0, MS-1, MS-3, 및/또는 MS-4인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로널 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 포함하는 Aggrus 발현을 검출하기 위한 검사용 시약.
12. CLEC-2의 결합에 필요한 PLAG4 도메인과 중복하는 Aggrus의 영역으로서,
    서열 번호 1(GIRIEDLPT)에 의해 표시되는 것을 특징으로 하는 영역.
13. 제12항에 기재된 CLEC-2의 결합에 필요한 PLAG4 도메인과 중복하는 Aggrus의 영역으로서,
    상기 아미노산 서열이 서열 번호 3(RIEDL)에 의해 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 영역.
14. 제12항 또는 제13항의 영역을 포함하는 펩티드로 이루어지는 Aggrus-CLEC-2 결합저해제.
15. 제12항 또는 제13항의 영역을 포함하는 펩티드를 유효 성분으로 하는 혈소판 응집 억제, 혈전 억제, 암진전·전이 억제, 항염증을 위한 의약 조성물.
16. CLEC-2와 Aggrus의 결합저해제의 스크리닝 방법으로서,
    서열 번호 1(GIRIEDLPT)에 의해 표시되는 아미노산 서열 중 적어도 5잔기의 서열로 이루어지는 Aggrus 에피토프에의 결합을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 저해제 스크리닝 방법.
17. 제16항에 기재된 스크리닝 방법으로서,
    서열 번호 3(RIEDL)에 의해 표시되는 아미노산 서열에의 결합을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 저해제 스크리닝 방법.
18. CLEC-2와 Aggrus의 결합저해제의 스크리닝 방법으로서,
    서열 번호 4(EDXXTS)에 의해 표시되는 아미노산 서열에의 결합을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 저해제 스크리닝 방법.

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