CN107614524B - 治疗 - Google Patents

治疗 Download PDF

Info

Publication number
CN107614524B
CN107614524B CN201680024425.3A CN201680024425A CN107614524B CN 107614524 B CN107614524 B CN 107614524B CN 201680024425 A CN201680024425 A CN 201680024425A CN 107614524 B CN107614524 B CN 107614524B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
antibody
variable region
chain variable
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680024425.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107614524A (zh
Inventor
V·特里帕蒂
R·谢里丹
J·格瑞坞德
S·莫斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UCL Business Ltd
Original Assignee
UCL Business Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by UCL Business Ltd filed Critical UCL Business Ltd
Publication of CN107614524A publication Critical patent/CN107614524A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107614524B publication Critical patent/CN107614524B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供了特异性地结合至人Lrg1的抗体或其片段。

Description

治疗
技术领域
本发明涉及特异性地结合至富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1(LRG1)并且特别是人Lrg1的抗体。
背景技术
视网膜血管系统的异常重塑是危及视力的病症比如糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病、年龄相关性黄斑变性和黄斑毛细血管扩张的突出特征。这些血管改变它们自身表现为从已有视网膜血管的新毛细血管生长(血管发生)和现有血管的血管畸形的发展(例如毛细血管扩张)二者。这些疾病中的此致病性血管重塑是失明的主要贡献因素。
类似的血管病理学和功能紊乱也伴随着肿瘤生长，其中血管发生允许实体瘤的增大和生长，以及其转移性扩散。
在1977年鉴定了富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1(Lrg1基因识别符：HGNC：29480；Entrez Gene：116844；Ensembl：ENSG00000171236；UniProtKB：P02750)(Haupt&Baudner,1977)并且在1985年确定了其一级结构(Takahashi et al,1985)。Lrg1在小鼠和人之间是高度进化保守的，人Lrg1的多克隆抗体是商业上可获得的并且存在转化生长因子β1(TGFβ1)、TGFβ受体II(TGFβRII)和Lrg1在某些疾病中的水平伴随增加的报道(Sun et al,1995；Li et al,2007)。其它团队已经将Lrg1认定为某些疾病的生物标志物(US 2005/0064516；WO 2008/092214)和认定为细胞色素c的配体(US 2007/0184503)。Lynch等(2012)证明微RNA-335(miR-335)靶向Lrg1，其通过降低肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化状态导致成神经细胞瘤细胞的减少的迁移和侵袭。
本发明人先前已经显示富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1是用于调节致病性血管重塑——特别是在眼中和在展示血管增生的肿瘤中——的可成药的(drugable)靶标。因此，本发明人预测拮抗Lrg1可能在治疗发生致病性血管重塑或致病性血管发生的病症中，特别是在眼病症比如新生血管AMD、糖尿病性视网膜病和早产儿视网膜病中是有用的(WO 2011/027129)。由本发明人出版的Wang et al(2013)还公开了Lrg1参与血管重塑，和在TGFβ信号传导复合物内阻断Lrg1具有使TGFβ转向远离致病性血管化的可能性。
本发明人先前还已经发现Lrg1对赘生细胞以及免疫细胞功能具有直接作用，并且因此可以通过直接地影响这些细胞在癌症的治疗和/或预防中被用作靶标。本发明人已经展现了靶向Lrg1对赘生细胞具有直接作用，并且因此靶向Lrg1还可以被用于治疗和/或预防癌症，其通过对癌细胞的此直接作用，具体地通过下调赘生细胞的增殖，而不是通过对肿瘤血管化的作用。他们还已经发现Lrg1修改了有助于原致癌(pro-oncogenic)环境的免疫细胞性质(WO2013132267)。
许多癌症的标志是结构和功能异常的血管系统，其降低肿瘤灌注并且增强缺氧、侵袭和转移(Carmeliet and Jain,2011)。肿瘤中的血管正常化是发展中领域，以便改进细胞毒性药物的递送和对整个肿瘤而不仅仅是其外周的免疫疗法(Carmeliet and Jain,2011)(Maes et al.,2014)。对于有效的递送细胞毒素和免疫疗法，需要适当灌注的和成熟的血管。此外，缺氧是转移、促进差的细胞接合和将癌细胞迁移入循环的动因(driver)。因而增加肿瘤的氧合可以发挥作用以降低肿瘤成为转移性的可能性。缺氧还对宿主免疫系统具有不利影响，致使其不易受免疫反应影响。具有改进的血管系统的任何肿瘤将变得更易接受治疗并且降低缺氧。因此，对鉴定可以使肿瘤的血管系统正常化的药剂存在期望。
许多疾病被表征为存在缺氧组织，包括缺血性心脏病、糖尿病和眼的数种疾病。存在增加受这些病症影响的组织的氧合以使血管系统正常化，从而取得临床益处的动因。
发明内容
本发明人现在已经创造出具有令人惊讶的特性的结合人Lrg1的抗体。本发明人已经生产出适合用于疗法的抗体。本发明的抗体具有治疗和临床相关的性质。本发明的抗体特异性地结合至人Lrg1。
培养结合至人Lrg1的102种小鼠抗体(mAb)的初始群组。物种交叉反应性和结合动力学分析缩小了潜在的治疗性抗体的范围(field)。三种榜样(lead)抗体15C4、3A11和4H2经历体外和体内分析以测定它们的治疗功效。抗体15C4被测序和人源化。
本发明的抗体展示出对人Lrg1的高亲和力，其被定义为1nM或更小。具体而言，抗体15C4令人惊讶地展示出皮摩尔范围中的亲和力，产生与Lrg1的近似不可逆的结合。
本发明的抗体在激光诱发的脉络膜新生血管化(CNV)的小鼠和大鼠模型中引起血管发生的阻断。本发明的抗体在血管发生的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养模型中引起血管生长的阻断。
本发明的抗体展示出与来自其它生物体的Lrg1较低的交叉反应性。
本发明人已经发现敲除Lrg1在实体瘤中的表达引起肿瘤中小血管数目的减少。此减少与肿瘤大小的减小、肿瘤中增殖细胞数目的减少和其余血管上周细胞覆盖度的增加相关联。总的来说，结果指示敲除Lrg1表达发挥作用以限制血管发生而且使肿瘤血管系统正常化。
另外，本发明人也已经发现Lrg1拮抗物降低肿瘤生长并且使其余肿瘤的血管系统正常化。这些数据表明Lrg1的拮抗物可以被用于降低转移性扩散。Lrg1的拮抗物可以被用于改进抗癌和细胞毒性药物/生物制品对肿瘤的递送和功效。
通过Lrg1拮抗物使血管系统正常化还将允许治疗它在其中将对增加血管化有用的疾病。使用Lrg1拮抗物的治疗将降低混乱的和不成熟的血管形成。使用促血管发生剂的后续治疗将改进功能成熟的血管化。这样的治疗将被用于组织受缺氧影响的任何疾病或存在畸形血管的疾病。这样的疾病包括局部缺血、缺血性心脏病、糖尿病、缺血性中风、血管性痴呆、短暂性缺血发作、二尖瓣疾病、慢性心房颤动、心肌病、急性肢体缺血、外周肢体缺血、血栓症、血管闭塞、胸腔出口综合征、动脉粥样硬化、低血糖、心动过速、低血压、镰状细胞病、冻疮、动静脉畸形、血管破裂和贫血。
因此，本发明提供了：
抗体或其片段，其特异性地结合至人Lrg1并且其包括选自SEQ ID NO:21至26的至少一种CDR。
在另一个实施方式中，抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO:23和26的至少一种CDR。
在另一个实施方式中，抗体或其片段，其中抗体或其片段包括SEQ ID NO:23和26的CDR。
在另一个实施方式中，抗体或其片段，其中抗体或其片段包括如下的CDR：
(a)SEQ ID NO:21、22和23；或
(b)SEQ ID NO:24、25和26。
在另一个实施方式中，抗体或其片段，其中抗体或其片段包括SEQ ID NO:21、22、23、24、25和26的CDR。
在另一个实施方式中，抗体或其片段，其中抗体或其片段包括：
(a)SEQ ID NO:1、5、7、9、11或13的重链可变区氨基酸序列；
(b)(a)的至少7个氨基酸的片段，其中抗体或片段保留特异性地结合至Lrg1的能力；或
(c)与(a)的序列具有至少70％氨基酸序列同一性的(a)的变体，其中抗体或片段保留特异性地结合至Lrg1的能力。
在另一个实施方式中，抗体或其片段，其中抗体包括：
(a)SEQ ID NO:2、15、17或19的轻链可变区氨基酸序列；
(b)(a)的至少7个氨基酸的片段，其中抗体或片段保留特异性地结合至Lrg1的能力；或
(c)与(a)的序列具有至少70％同一性——氨基酸同一性——的(a)的变体，其中抗体或片段保留特异性地结合至Lrg1的能力。
在另一个实施方式中，根据前述权利要求中任一项的抗体或其片段，其中抗体包括：
(a)SEQ ID NO:1的重链可变区和SEQ ID NO:2的轻链可变区；或
(b)SEQ ID NO:1的重链可变区和SEQ ID NO:15的轻链可变区；或
(c)SEQ ID NO:1的重链可变区和SEQ ID NO:17的轻链可变区；或
(d)SEQ ID NO:1的重链可变区和SEQ ID NO:19的轻链可变区；或
(e)SEQ ID NO:5的重链可变区和SEQ ID NO:2的轻链可变区；或
(f)SEQ ID NO:5的重链可变区和SEQ ID NO:15的轻链可变区；或
(g)SEQ ID NO:5的重链可变区和SEQ ID NO:17的轻链可变区；或
(h)SEQ ID NO:5的重链可变区和SEQ ID NO:19的轻链可变区；或
(i)SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:2的轻链可变区；或
(j)SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:15的轻链可变区；或
(k)SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:17的轻链可变区；或
(l)SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:19的轻链可变区；或
(m)SEQ ID NO:9的重链可变区和SEQ ID NO:2的轻链可变区；或
(n)SEQ ID NO:9的重链可变区和SEQ ID NO:15的轻链可变区；或
(o)SEQ ID NO:9的重链可变区和SEQ ID NO:17的轻链可变区；或
(p)SEQ ID NO:9的重链可变区和SEQ ID NO:19的轻链可变区；或
(q)SEQ ID NO:11的重链可变区和SEQ ID NO:2的轻链可变区；或
(r)SEQ ID NO:11的重链可变区和SEQ ID NO:15的轻链可变区；或
(s)SEQ ID NO:11的重链可变区和SEQ ID NO:17的轻链可变区；或
(t)SEQ ID NO:11的重链可变区和SEQ ID NO:19的轻链可变区；或
(u)SEQ ID NO:13的重链可变区和SEQ ID NO:2的轻链可变区；或
(v)SEQ ID NO:13的重链可变区和SEQ ID NO:15的轻链可变区；或
(w)SEQ ID NO:13的重链可变区和SEQ ID NO:17的轻链可变区；或
(x)SEQ ID NO:13的重链可变区和SEQ ID NO:19的轻链可变区。
在另一个实施方式中，抗体或其片段，其特异性地结合至Lrg1，包括SEQ ID NO:1、5、7、9、11或13的CDR和/或SEQ ID NO:2、15、17或19的CDR。
在另一个实施方式中，抗体或其片段，其特异性地结合至Lrg1的氨基酸GNKLQVLGKDLLLPQ(SEQ ID NO:30)，并且阻断Lrg1活性。
本发明的抗体还可以被用于治疗血管增生性病症。本发明的抗体还可以被用于治疗癌症。本发明的抗体可以与细胞毒性化合物或抗癌剂被组合施用。
本发明还涉及与抗血管发生剂组合的Lrg1的拮抗物，其用于治疗癌症。
本发明还涉及与促血管发生剂组合的Lrg1的拮抗物，其用于血管系统畸形的组织的血管再通方法。
序列表简述
SEQ ID NO:1是抗体15C4的重链的可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是抗体15C4的轻链的可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是抗体15C4的重链的可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4是抗体15C4的轻链的可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5是变体VH1——抗体15C4的重链的可变区的人源化变体——的重链的可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是变体VH1——抗体15C4的重链的可变区的人源化变体——的重链的可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7是变体VH2——抗体15C4的重链的可变区的人源化变体——的重链的可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是变体VH2——抗体15C4的重链的可变区的人源化变体——的重链的可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9是变体VH3——抗体15C4的重链的可变区的人源化变体——的重链的可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是变体VH3——抗体15C4的重链的可变区的人源化变体——的重链的可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11是变体VH4——抗体15C4的重链的可变区的人源化变体——的重链的可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是变体VH4——抗体15C4的重链的可变区的人源化变体——的重链的可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13是变体VH5——抗体15C4的重链的可变区的人源化变体——的重链的可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是变体VH5——抗体15C4的重链的可变区的人源化变体——的重链的可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15是变体VK1——抗体15C4的轻链的可变区的人源化变体——的轻链的可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是变体VK1——抗体15C4的轻链的可变区的人源化变体——的轻链的可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:17是变体VK2——抗体15C4的轻链的可变区的人源化变体——的轻链的可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是变体VK2——抗体15C4的轻链的可变区的人源化变体——的轻链的可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:19是变体VK3——抗体15C4的轻链的可变区的人源化变体——的轻链的可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是变体VK3——抗体15C4的轻链的可变区的人源化变体——的轻链的可变区的核苷酸序列。
SEQ ID NO:21、22和23分别是上面描述的抗体的重链的CDR 1、2和3。
SEQ ID NO:24、25和26分别是上面描述的抗体的轻链的CDR 1、2和3。
SEQ ID NO:27是示例性重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28是示例性重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29是示例性轻链恒定区氨基酸序列。
SEQ ID NO:30是人Lrg1的表位的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31是人Lrg1的氨基酸序列。
附图说明
图1：结合至重组小鼠Lrg1的抗体的直方图。数据显示与小鼠Lrg1的交叉反应性在针对人Lrg1培养的mAb之中是不常见的。在此实验中，mAb在100nM下进行评价并且大多数未能生成背景以上的反应单位(Response Unit)(纵轴)。
图2：基质胶(Matrigel)试验中管形成的抑制。在存在100nM mAb的情况下，HUVEC被平板接种在基质胶上并且培养过夜。封闭性兔多克隆抗体(pAb)还在40nM和80nM下进行评价。在4H2的情况下观察到40％阻断并且在15C4的情况下是60％。
图3：小鼠跖骨试验中血管发生的抗体阻断。柱形图显示了通过mAb 3A11和15C4的阻断的定量。显示了代表性图像，包括PBS正常化对照的图像。
图4：靶标的抗体特异性。针对(1)来自MDA-MB细胞的条件培养基、(2)人玻璃体和(3)全人血清的样品测试mAb 3A11、15C4和4H2。
图5：激光诱发的CNV的大鼠模型中血管发生的抗体阻断。柱形图显示了通过mAb15C4、4H2和5F12的阻断的定量。显示了代表性图像。
图6：血管发生的共培养模型中血管生长的抗体阻断。HUVEC与人成纤维细胞共培养14天，并且然后被固定和使用针对PECAM的抗体进行免疫染色。阿瓦斯汀(Avastin)被包括作为阳性对照，并且所有四种mAb在10、25、50、100和200nM下进行测试。对于在24-孔培养板中的n-8个单独的孔收集数据。显示了来自25nM孔的代表性图像。
图7：抗人Lrg1竞争ELISA。稀释系列的测试抗体与固定浓度的生物素化小鼠15C4竞争结合至重组人Lrg1。使用链亲和素-过氧化物酶缀合物和TMB底物检测结合的生物素化小鼠15C4。上图-小鼠15C4抗体，瞬时表达的(TT)嵌合抗体和对照抗体(VH1/Vk0；VH1——SEQ ID NO:5，Vk0——SEQ ID NO:2，和VH0/Vk1；VH0——SEQ ID NO:1，Vk1——SEQ ID NO:15)。下图-小鼠15C4抗体、稳定表达的(NS0克隆1F6)与瞬时表达的(TT)嵌合抗体和不相关的IgG4抗体(阴性对照)。
图8：B16/F0和LL/2肿瘤中的Lrg1和血管发生。图8A上图-B16/F0小鼠黑素瘤细胞的图像，图8A中图-野生型和Lrg1敲除小鼠中B16/F0肿瘤的共染色的CD31(血管)和DAPI(细胞核)切片的图像。图8A下图-野生型和Lrg1敲除小鼠中B16/F0肿瘤的血管数目的柱形图。图8B上图-LL/2小鼠肺癌细胞的图像，图8B中图-野生型和Lrg1敲除小鼠中LL/2肿瘤的共染色的CD31(血管)和DAPI(细胞核)切片的图像。图8B下图-野生型和Lrg1敲除小鼠中LL/2肿瘤的血管数目的柱形图。
图9：B16/F0和LL/2肿瘤中的Lrg1和血管发生。图9左图-Lrg1敲除(左柱/血管大小)和野生型(右柱/血管大小)中血管大小对血管数目的柱形图。图9中图-肿瘤大小随着时间的图，野生型，上面的线，Lrg1敲除，下面的线。图9右图，在野生型和Lrg1敲除中通过磷酸组蛋白H3的存在鉴定的增殖细胞/mm2的柱形图。
图10：失去Lrg1导致增加的周细胞覆盖度。图10左图，从野生型和Lrg1敲除小鼠选取的B16/F0肿瘤中血管架构的重建。α-SMA是周细胞的标志物，CD31是内皮细胞的标志物，胶原IV是血管的标志物。由Lrg1图像清楚在Lrg1敲除肿瘤的血管上存在增加的周细胞的覆盖度。图10柱形图-B16/F0和LL/2肿瘤中周细胞覆盖度的定量。
图11：15C4重演了Lrg1无效表型。图11(A)全部CD31阳性目标/mm2。(B)根据横截面填充面积/mm2合并的血管大小。(C)根据15C4和IgG处理的小鼠的大小合并的血管的百分数。在15C4处理的肿瘤中观察到更小的血管，正因如此，与IgG对照比较，观察到血管大小分布中显著的差异(双因子方差分析，P<0.0001)。
图12：15C4驱动肿瘤血管的正常化，并且因而重复Lrg1KO表型。来自在野生型(WT)、Lrg1敲除(KO)、或使用IgG或15C4处理的野生型小鼠中培养的B16F0肿瘤的冰冻切片的血管的免疫染色。切片标记有内皮标志物CD31的抗体，或周细胞标志物αSMA或NG-2的抗体。显示了代表性图像的最大强度投影，其中3个通道水平地分割。使用Zeiss 710共聚焦显微镜上的40×物镜拍摄图像。
图13：内皮和周细胞标志物的共定位的定量。使用抗LRG1封闭性抗体15C4治疗C57BL6小鼠中的B16F0肿瘤增加内皮和周细胞共定位。内皮通过CD31表达进行鉴定；周细胞通过αSMA或NG2表达进行鉴定。数据被表示为与一种或多种周细胞标志物共定位的全部内皮的百分数。(A)全部周细胞共定位，p＝0.04，秩和检验；(B)αSMA共定位，p＝0.02，秩和检验；(C)NG2共定位。IgG N＝10，15C4 N＝13。
图14-15C4加强顺铂的细胞毒性活性：对肿瘤大小的作用。(A)与IgG和顺铂对照比较，使用15C4与顺铂组合处理的B16/F0肿瘤展示出肿瘤生长的显著降低(双因子方差分析，P<0.005)。(B)与IgG和媒介对照比较，使用15C4处理的肿瘤展示出类似的生长速率。
图15-15C4加强顺铂的细胞毒性活性：增加的凋亡水平。顺铂和IgG或15C4处理的肿瘤在4℃下在4％PFA中浸泡固定过夜，并且然后在4℃下在30％蔗糖中浸泡过夜。肿瘤组织然后被OCT包埋和冷冻用于切片(40μm)。根据制造商方案(Merk Millipore,USA)使用ApopTag原位凋亡检测试剂盒进行TUNEL试验。
图16-15C4加强顺铂的细胞毒性活性：增加的凋亡水平。在肿瘤切片中进行DNA双链断裂标志物γ-H2AX的染色，其指示顺铂诱发的DNA损伤。与IgG和顺铂对照中相比，在使用15C4与顺铂组合处理的肿瘤中观察到具有γ-H2AX转化灶的显著更多的核(单侧学生T检验，P<0.05)。
图17-15C4抑制激光诱发的脉络膜新生血管化的小鼠模型中的病变形成。左边的图像显示了在三次激光烧伤被施加至视网膜色素上皮后7天，正常照明(眼底)下和荧光照明下典型的野生型小鼠视网膜。在全身给药荧光素后～60秒(早期FFA)和再次全身给药后～7分钟(晚期FFA)捕捉荧光图像。在产生激光的同时，动物接受对照IgG(上图)或15C4(下图)的眼内注射。早期FFA图像显示了病变的大小，并且晚期图像显示荧光素渗漏入视网膜。对于2.5、5和10μg剂量下的15C4，以及2和4μg下的艾力亚(Eylea)定量病变大小，并且％阻断是相对于在对照中观察的平均病变大小的测量值。在最右边，使用单独的和组合的艾力亚和马伽西珠单抗(Magacizumab)(均在2μg下)进行类似的分析。
图18–在激光诱发的CNV中通过马伽西珠单抗剂量依赖性抑制病变形成。紧接着激光凝固视网膜色素上皮之后，野生型C57B6小鼠被麻醉和接受多种剂量的马伽西珠单抗、艾力亚、或二者组合的玻璃体内注射。在7天后(以使得血管病变形成)，小鼠被再次麻醉和通过荧光素血管造影(FFA)检查。早期FFA图像(在90s后拍摄)显示了病变部位处血管化的程度。测量早期图像中的病变区域允许定量，其中百分数病变大小针对IgG4对照进行归一化。
图19-15C4降低D25采集的JR5558小鼠(D14–D24)中的病变形成。从D14每3天以50mg/kg IP施用15C4或IgG。在D25采集眼并且使用胶原IV进行RPE/脉络膜染色。对于两个组进行病变数目的计数和数据定量。
图20-马伽西珠单抗的生物化学性质。上图-分析尺寸排阻色谱，其显示了单峰和没有聚集体。SDS-PAGE，其显示了还原(泳道1)和非还原(泳道2)抗体。下图–抗hLRG1竞争ELISA。稀释系列的每种纯化抗体与固定浓度的生物素化小鼠15C4竞争结合至重组hLRG1。使用链亲和素-过氧化物酶和TMB底物检测结合的生物素化小鼠15C4。
图21-马伽西珠单抗的去免疫(De-immunisation)。上图-测试和对照抗体的SDS-PAGE凝胶。1μg的嵌合抗体(a)、完全人源化抗体(b)或临床基准对照人源化抗体A33(c)作为非还原(仅对于嵌合测试抗体和人源化测试抗体-泳道1)和还原(泳道2)样品在200V下在NuPage 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen,Paisley,UK)上运行35min。凝胶使用InstantBlue(Expedeon,Cambridge,UK)进行染色并且大小标志物(kDa)是预染色的蛋白质标准品Fermentas PageRuler Plus(Thermo Scientific,Loughborough,UK)。
下图-健康供体T细胞增殖反应的概述。显示了在EpiScreenTM时程第5-8天期间的阳性T细胞反应(P)。诱发具有SI≥2.00的增殖的样品——其是显著的(p<0.05)——被认为是阳性(还显示了临界反应*SI≥1.90，p<0.05)。用于增殖的阳性T细胞反应的频率在栏的底部处被显示为百分数。
图22-15C4表位中不变的残基。跨越脊椎动物物种的表位保守。使用重叠的肽通过肽作图确定由人LRG1中的15C4识别的LRG1表位。该图显示了此序列与一系列其它物种中LRG1氨基酸序列的直向同源区的比对。高度保守的残基被加框，并且每个物种相对于人的序列同一性的程度在右侧显示，对于马伽西珠单抗的强制性临床前安全和毒理学研究，在选择合适的物种的背景下，信息是相关的。
具体实施方式
本发明涉及结合至Lrg1的抗体。本发明还涉及这样的抗体的用途，比如治疗用途。抗体优选地特异性地结合至Lrg1，即它们结合至Lrg1但是它们不结合或以较低的亲和力结合至其它分子。如本文使用的术语Lrg1指的是人Lrg1。人Lrg1的序列在SEQ ID NO:31中陈述。本发明的抗体对来自其它哺乳动物的Lrg1——例如灵长类或鼠例如小鼠或大鼠Lrg1——可以具有一些结合亲和力。随着结合表位伴随系统发生距离变得更不保守，本发明的抗体对来自其它物种的Lrg1的结合亲和力渐进地变得更弱。
本发明的抗体阻断Lrg1的功能。Lrg1的阻断涵盖其活性或功能的任何降低，这导致降低的血管增生作用，包括内皮细胞增殖、周细胞缺失(drop-out)、内皮细胞死亡、血管重塑、血管发生、毛细血管扩张和血管渗漏。
例如，Lrg1的阻断可以经由阻断其与ALK1、TGFβRII和/或TGFβ的相互作用。Lrg1的阻断还可以导致降低的TGFβ的生物利用度。
阻断涵盖总体和部分降低Lrg1活性或功能二者，例如总体或部分预防ALK1-Lrg1、TGFβRII-Lrg1和/或TGFβ-Lrg1相互作用。例如，本发明的封闭性抗体可以降低Lrg1的活性10至50％、至少50％或至少70％、80％、90％、95％或99％。
可以通过任何合适的手段测量Lrg1活性或功能的阻断。例如，可以通过测量对Smad5磷酸化的作用来测定ALK1-Lrg1、TGFβRII-Lrg1和/或TGFβ-Lrg1相互作用的阻断，其基于Smad5磷酸化的特性是ALK1活化途径而不是ALK5活化途径。
Lrg1的阻断还可以经由如下被测量：测量血管发生的试验，例如体外试验，比如基质胶中的血管生长、来自主动脉环的血管生长；和体内试验，比如测量视网膜血管发生(例如激光诱发的脉络膜新生血管化、氧诱发的视网膜病)的那些。
阻断可以经由任何合适的机制发生，例如任何直接的ALK1-Lrg1、TGFβRII-Lrg1和/或TGFβ-Lrg1相互作用。
术语“结合活性”和“结合亲和力”想要指的是抗体分子结合或不结合至靶标的倾向。可以通过测定抗体和其靶标的解离常数(Kd)来量化结合亲和力。类似地，可以在如下的方面定义抗体与其靶标结合的特异性：与关于抗体和另一种非靶标分子的解离常数比较，抗体对其靶标的比较性解离常数(Kd)。
通常，抗体关于靶标的Kd将2倍，优选地5倍，更优选地10倍小于关于另一种非靶标分子比如不相关的材料或环境中附随的材料的Kd。更优选地，Kd将是50倍更小，甚至更优选地100倍更小，和又更优选地200倍更小。
此解离常数的值可以通过熟知的方法直接测定，并且甚至对于复杂的混合物可以通过方法比如例如在Caceci et al.(Byte 9:340-362,1984)中陈述的那些计算。例如，可以使用双过滤器硝酸纤维素过滤器结合试验比如由Wong&Lohman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5428-5432,1993)公开的那些建立Kd。
用于评价Lrg1的结合亲和力的一种方法是通过ELISA。评价配体比如抗体对靶标的结合能力的其它标准试验是本领域已知的，包括例如，蛋白质印迹、RIA、和流式细胞术分析。也可以通过本领域已知的标准试验评估抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)，比如表面等离子体共振，例如通过BiacoreTM系统分析。
可以通过本领域技术人员已知的方法测量本发明的抗体与其靶标的结合亲和力，例如通过表面等离子体共振。一种类型的表面等离子体共振是Biacore。优选地，本发明的抗体具有1nM或更小的对Lrg1的结合亲和力。优选地，本发明的抗体具有0.5nM或更小、0.1nM或更小、50pM或更小、10pM或更小、5pM或更小或2pM或更小的对Lrg1的结合亲和力。
可以进行竞争性结合试验，其中将抗体与靶标的结合和该靶标的另一种已知的配体——比如另一种抗体——对靶标的结合进行比较。发生50％抑制的浓度被称为Ki。在理想的条件下，Ki等价于Kd。Ki值将绝不小于Kd，所以Ki的测量可以被方便地替代以提供Kd的上限。
本发明的抗体特异性地结合至Lrg1。“特异性地结合”意思是抗体以与结合至另一种靶标相比更大的亲和力结合至Lrg1。本发明的抗体优选地能够以如下亲和力结合至其靶标：所述亲和力与其结合至另一种非靶标分子的亲和力相比是至少两倍、10倍、50倍、100倍或更大。
本发明的抗体通常结合至与具有SEQ ID NO 1和2的重和轻链可变区序列的抗体相同的表位。在一个实施方式中，本发明的抗体结合至Lrg1的表位GNKLQVLGKDLLLPQ(SEQID NO:30)或包括Lrg1的GNKLQVLGKDLLLPQ(SEQ ID NO:30)的表位。如本文使用的，术语“表位”通常指的是靶抗原上由免疫受体比如抗体识别的位点。优选地，它是源自或作为蛋白质的一部分的短肽。可以由肽的氨基酸和对应的DNA序列的知识，以及由特定氨基酸的性质(例如，大小、电荷等)和密码子词典鉴定表位，而不需要过度的实验。参见，例如，IvanRoitt,Essential Immunology,1988；JanisKuby,Immunology,1992，例如，pp.79-81。
可以通过常规方法鉴定表位的位置。例如，可以通过评估抗体结合至不同片段或变体Lrg1多肽的能力测定表位的一般位置。还可以使用常规方法——比如在实施例中描述的那些——测定Lrg1内与抗体接触的特异性氨基酸。例如，抗体和靶标分子可以被组合并且抗体/靶标复合物可以被结晶。复合物的晶体结构可以被测定并且用于鉴定抗体和其靶标之间的相互作用的特异性位点。表位可以是连续的氨基酸序列或不连续的氨基酸序列。
本发明的抗体可以结合至与本发明的另一种抗体相同的表位或区。例如，在已知本发明的一种抗体时，通过将它们与Lrg1的结合和已知的抗体与Lrg1的结合进行比较，可以鉴定本发明的其它抗体。
本发明的抗体可以是如下抗体：其结合至与具有SEQ ID NO 1和2的序列的本文描述的抗体相同的Lrg1中的表位。本发明的抗体可以包括重链和/或轻链。
本发明的抗体可以具有与本发明的另一种抗体交叉竞争结合至如本文描述的Lrg1的能力。例如，本发明的抗体可以与本文描述的一种或多种抗体——例如具有SEQ IDNO 1和2的序列的抗体——交叉竞争结合至Lrg1或至由抗体结合的Lrg1的合适的片段或变体。优选地，本发明的抗体可以与抗体15C4交叉竞争。可以基于它们与本发明的已知抗体交叉竞争的能力在标准的结合试验中鉴定这样的交叉竞争抗体。例如，BIAcore分析、ELISA试验或流式细胞术可以被用于展现交叉竞争。这样的交叉竞争可以表明两种抗体结合至相同或相似的表位。
因此可以通过如下方法鉴定本发明的抗体：其包括评估测试抗体是否能够与本发明的已知抗体交叉竞争靶标分子上的结合位点的结合试验。用于进行竞争性结合试验的方法是本领域熟知的。例如它们可以包含使本发明的已知抗体和靶标分子在抗体可以结合至靶标分子的条件下接触在一起。抗体/靶标复合物可以然后与测试抗体接触，并且可以评估测试抗体能够从抗体/靶标复合物置换本发明的抗体的程度。可选的方法可以包含使测试抗体与靶标分子在允许抗体结合的条件下接触，然后添加能够结合该靶标分子的本发明的抗体，并且评估本发明的抗体能够从抗体/靶标复合物置换测试抗体的程度。
测试抗体抑制本发明的抗体与靶标结合的能力展现了测试化合物可以与本发明的抗体竞争结合至靶标，并且因而测试抗体结合至与本发明的已知抗体相同的Lrg1蛋白上的表位或区。在这样的方法中被鉴定为与本发明的已知抗体交叉竞争的测试抗体也是根据本发明的潜在抗体。测试抗体可以在与本发明的已知抗体相同的区中结合Lrg1并且与本发明的已知抗体交叉竞争的事实表明测试抗体可以在与已知的抗体相同的结合位点处充当配体和测试抗体可以因此模拟已知的抗体的活动。
本发明的已知抗体可以是如本文描述的抗体，比如如本文描述的Lrg1抗体中的一种或保留结合至Lrg1的能力的如本文描述的其任何变体或片段。本发明的抗体可以结合至与如本文描述的一种或多种抗体或保留结合至Lrg1的能力的如本文描述的其任何变体或片段相同的表位。
可以参考抗体与不是靶标的分子的结合评估特异性结合。通过比较抗体结合至靶标和结合至另一种分子的能力，可以完成此比较。可以如上面在Kd或Ki的评估中描述的完成此比较。在这样的比较中使用的另一种分子可以是不是靶标分子的任何分子。优选地，另一种分子不等同于靶标分子。优选地，靶标分子不是靶标分子的片段。
如本文提及的术语“抗体”包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即，“抗原-结合部分”)或单链。抗体指的是糖蛋白，其包括通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(κ)(L)链，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在本文缩写为VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(在本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。重和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。VH和VL区可以被进一步细分为高可变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区，称为框架区(FR)。抗体的恒定区可以调节免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和典型补体系统的第一组分(Clq)。
本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一个实施方式中，本发明的抗体是单克隆抗体。多克隆抗体是源自不同的B细胞系的抗体。多克隆抗体可以包括针对特异性抗原的不同免疫球蛋白分子的混合物。多克隆抗体可以包括结合至抗原分子内的一种或多种不同表位的不同免疫球蛋白分子。可以通过常规方法产生多克隆抗体比如使用感兴趣的抗原进行免疫。例如，可以使用人Lrg1免疫能够表达人抗体序列的小鼠。血液可以随后被去除并且纯化Ig级分。
单克隆抗体是彼此相同并且对特定表位具有单一的结合特异性和亲和力的免疫球蛋白分子。可以通过各种技术产生本发明的单克隆抗体(mAb)，包括常规单克隆抗体方法，例如在“Monoclonal Antibodies；A manual of techniques”,H Zola(CRC Press,1988)和在“Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Application”,SGRHurrell(CRC Press,1982)中描述的那些。
术语抗体的“抗原-结合部分”指的是保留特异性地结合至抗原比如Lrg1的能力的抗体的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原-结合功能可以由全长抗体的片段执行。在术语抗体的“抗原-结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括Fab片段、F(ab')2片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段和分离的互补决定区(CDR)。单链抗体比如scFv和重链抗体比如VHH和骆驼抗体也意欲被涵盖在术语抗体的“抗原-结合部分”内。可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且可以以与完整抗体相同的方式对片段进行实用性筛选。
本发明的抗体或抗体片段优选地包括是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4区的Fc区。本发明的抗体或抗体片段优选地包括是IgG1区的Fc区。本发明的抗体或抗体片段优选地包括是IgG2区的Fc区。本发明的抗体或抗体片段优选地包括是IgG3区的Fc区。本发明的抗体或抗体片段优选地包括是IgG4区的Fc区。
可以通过例如标准的ELISA或蛋白质印迹测试本发明的抗体与靶蛋白的结合。ELISA试验也可以被用于筛选显示与靶蛋白的阳性反应性的杂交瘤。还可以通过监测抗体与表达靶蛋白的细胞的结合——例如通过流式细胞术——测定抗体的结合特异性。
通过测定抗体是否结合至其它蛋白质，可以进一步研究本发明的抗体对靶蛋白的特异性。例如，在期望产生特异性地结合Lrg1或Lrg1的特定部分——例如表位——的抗体时，通过测定抗体是否还结合至其它分子或缺少感兴趣的部分的Lrg1的修饰形式，可以评估抗体的特异性。
一旦合适的抗体已经被鉴定和选择，可以通过本领域已知的方法鉴定抗体的氨基酸序列。可以使用简并引物克隆编码抗体的基因。可以通过常规方法重组地产生抗体。
“多肽”以其最宽泛的含义在本文使用以指的是两个或多个亚基氨基酸、氨基酸类似物、或其它模拟肽的化合物。术语“多肽”因而包括短肽序列以及较长的多肽和蛋白质。如本文使用的，术语“氨基酸”指的是天然和/或非天然或合成氨基酸——包括甘氨酸和D或L旋光异构体二者，以及氨基酸类似物和模拟肽。
本发明人已经鉴定了如在实例中描述的抗体。本发明涵盖这些抗体和保留这些抗体的一种或多种活性的其变体和片段。这些抗体的活性包括结合至Lrg1的能力。
此抗体的合适的片段或变体将保留结合至Lrg1的能力。它将优选地保留特异性地结合至Lrg1的能力。它将优选地保留特异性地结合至与其衍生自的抗体——例如具有SEQID NO:1和2的序列的抗体——相同的Lrg1分子的表位或区的能力。
根据本发明的多肽或抗体“片段”可以通过截短制成，例如通过从多肽的N和/或C末端去除一个或多个氨基酸。可以以此方式从N和/或C端去除高至10、高至20、高至30、高至40或更多个氨基酸。还可以通过一个或多个内部缺失生成片段。
本发明的抗体可以是，或包括抗体或其变体的片段。本发明的抗体可以是或可以包括如上面进一步讨论的这些抗体或其变体的抗原结合部分。例如，本发明的抗体可以是这些抗体或其变体中的一种的Fab片段或可以是衍生自这些抗体或其变体中的一种的单链抗体。
本发明的特定抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:1和2中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:1和15中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:1和17中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:1和19中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:5和2中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:5和15中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:5和17中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:5和19中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:7和2中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:7和15中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:7和17中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:7和19中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:9和2中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:9和15中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:9和17中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:9和19中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:11和2中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:11和15中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:11和17中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:11和19中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:13和2中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:13和15中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:13和17中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的另一种抗体的重和轻链的可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:13和19中给出。VH链的CDR在SEQ ID NO:21、22和23中显示。VL链的CDR在SEQ ID NO:24、25和26中显示。
本发明的抗体可以包括SEQ ID NO:1、5、7、9、11或13的VH氨基酸序列，或任何其片段或变体。本发明的抗体可以包括SEQ ID NO:2、15、17或19的VL氨基酸序列或任何其片段或变体。
本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:1的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:2的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:1的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:15的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:1的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:17的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:1的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:19的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:5的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:2的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:5的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:15的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:5的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:17的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:5的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:19的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:7的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:2的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:7的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:15的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:7的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:17的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:7的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:19的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:9的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:2的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:9的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:15的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:9的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:17的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:9的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:19的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:11的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:2的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:11的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:15的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:11的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:17的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:11的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:19的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:13的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:2的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:13的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:15的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:13的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:17的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
可选地，本发明的抗体可以包括(a)SEQ ID NO:13的VH氨基酸序列，或其片段或变体和(b)SEQ ID NO:19的VL氨基酸序列，或其片段或变体二者。
本发明的抗体可以包括上面显示的VL或VH氨基酸序列中的一种的片段。例如，本发明的抗体可以包括来自所述VL或VH氨基酸序列的至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少18、至少20或至少25个连续氨基酸的片段。这样的片段将优选地保留上面讨论的一种或多种功能，比如结合至Lrg1的能力。
本发明的抗体可以包括来自本文鉴定的任一种特异性抗体的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR序列。
在一个实施方式中，本发明的抗体是如下抗体：其特异性地结合至Lrg1，并且包括SEQ ID NO:1、5、7、9、11或13的CDR和/或SEQ ID NO:2、15、17或19的CDR。
本发明的抗体可以包括如上面描述的任一种特异性抗体的CDR序列中的一个或多个。本发明的抗体可以包括所述特异性抗体的一个或多个重链CDR序列和可选地或额外地一个或多个轻链CDR序列。本发明的抗体可以包括上面描述的特异性抗体的重链CDR序列中的一个、两个或所有三个和可选地或额外地所述特异性抗体的轻链CDR序列中的一个、两个或所有三个。本发明的抗体可以包括上面描述的特异性抗体的所有六个CDR序列。举例而言，本发明的抗体可以包括SEQ ID NO:21、22、23、24、25和26中的一种或多种。本发明的抗体可以包括SEQ ID NO:21、22和23中的一种、两种或所有三种和/或SEQ ID NO:24、25和26中的一种、两种或所有三种。本发明的抗体可以包括SEQ ID NO:21、22、23、24、25和26中的所有六种。
本发明的抗体可以可选地包括这些重或轻链可变区或CDR序列中的一种的变体。例如，变体可以是任何上面的氨基酸序列的置换、缺失或添加变体。
变体抗体可以包括来自上面讨论的特异性序列和片段的1、2、3、4、5、高至10、高至20、高至30或更多个氨基酸置换和/或缺失，同时维持本文描述的抗体的活性。“缺失”变体可以包括例如，1、2、3、4或5个单独氨基酸或氨基酸比如2、3、4或5个氨基酸的一个或多个小组的缺失。“置换”变体优选地包含将一个或多个氨基酸替换为相同数目的氨基酸并且完成保守氨基酸置换。例如，氨基酸可以被置换为具有类似性质的可选的氨基酸，例如，另一种碱性氨基酸、另一种酸性氨基酸、另一种中性氨基酸、另一种带电氨基酸、另一种亲水性氨基酸、另一种疏水性氨基酸、另一种极性氨基酸、另一种芳香族氨基酸或另一种脂肪族氨基酸。可以被用于选择合适的置换的20种主要氨基酸的一些性质如下：
Figure GDA0002856221510000211
Figure GDA0002856221510000221
优选的“衍生物”或“变体”包括替换天然存在的氨基酸的那些，在序列中出现的氨基酸是其结构类似物。在序列中使用的氨基酸还可以是衍生的或修饰的，例如标记的，条件是抗体的功能不被显著不利的影响。
使用定点诱变、随机诱变、或酶促裂解和/或核酸连接的已知技术，在抗体合成期间或通过产生后修饰，或当抗体处于重组形式时，可以制备如上面描述的衍生物和变体。
优选地，根据本发明的变体抗体具有如下氨基酸序列，其与本文公开的抗体的VL和/或VH结构域或其片段具有大于60％，或大于70％，例如75或80％，优选地大于85％，例如大于90、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性。跨越相关SEQ ID NO序列的全长或在序列的一部分内，比如跨越20、30、50、75、100、150、200或更多个氨基酸，可以见到此水平的氨基酸同一性，这取决于全长多肽的大小。
优选地，变体抗体包括如本文描述的一个或多个CDR序列。
与氨基酸序列相关，“序列同一性”指的是当以下列参数使用ClustalW(Thompsonet al.,1994,supra)进行评估时具有规定值的序列：
成对比对参数-方法：精确的，矩阵：PAM，缺口空位罚分(Gap open penalty)：10.00，缺口延伸罚分(Gap extension penalty)：0.10；
多重比对参数-矩阵：PAM，缺口空位罚分：10.00，延迟的％同一性：30，罚分的末端缺口(Penalize end gaps)：开启，缺口分离距离(Gap separation distance)：0，负矩阵：无，缺口延伸罚分：0.20，残基特异性缺口罚分：开启，亲水性缺口罚分：开启，亲水性残基：G、P、S、N、D、Q、E、K、R。特定残基处的序列同一性意欲包括仅仅被衍生化的相同残基。
本发明因而提供了如下抗体：其具有特异性VH和VL氨基酸序列和维持这些VH和VL结构域的功能或活性的其变体和片段。
因此，本发明的抗体可以包括：
(a)SEQ ID NO:1、5、7、9、11或13的重链可变区氨基酸序列；
(b)(a)的至少7个氨基酸的片段，其中抗体或片段保留特异性地结合至Lrg1的能力；或
(c)与(a)的序列具有至少70％氨基酸序列同一性的(a)的变体，其中抗体或片段保留特异性地结合至Lrg1的能力。
本发明的抗体可以包括：
(a)SEQ ID NO:2、15、17或19的轻链可变区氨基酸序列；
(b)(a)的至少7个氨基酸的片段，其中抗体或片段保留特异性地结合至Lrg1的能力；或
(c)与(a)的序列具有至少70％同一性——氨基酸同一性——的(a)的变体，其中抗体或片段保留特异性地结合至Lrg1的能力。
如上面说明的，本发明的抗体可以结合至与本发明的另一种抗体相同的表位或区。因而，将看到这样的抗体可以结合至与本文描述的任何特异性抗体、片段和变体相同的Lrg1的表位或区。
本发明的抗体可以用于治疗癌症。优选的是高比例的本发明的抗体或片段在将所述抗体或片段局部施用至肿瘤部位之后将在肿瘤微环境内体内保留延长的时段。即，优选的是抗体或片段展示从肿瘤部位降低地泄漏入血管或淋巴循环。优选地，施用至肿瘤部位的至少30％的抗体剂量在施用后四小时被保留在肿瘤部位中，更优选地，至少40％的剂量在施用后四小时被保留，和更优选地，至少50％的剂量在施用后四小时被保留。通过将抗体注入鼠模型中的肿瘤和在施用后测量抗体随着时间的血清水平，可以研究肿瘤微环境中的抗体保留。可选地，可以使用注入鼠模型中的肿瘤的放射性标记的抗体测量抗体的分布。
肿瘤微环境中的体内pH比健康组织显著酸性更强。如与健康组织的7.2至7.4比较，肿瘤的范围被报道为pH 6.5至7.2或6.6至7.0附近。此酸度主要是由于遭受短期或长期缺氧的肿瘤区中的无氧糖酵解——其由具有减弱的、混乱的血流的组织不善的(poorlyorganized)血管系统造成，和有氧糖酵解(Warburg效应)——一种常见的癌症表型性质，其中甚至在存在氧的情况下使用糖酵解代谢途径。考虑到此酸度，优选的是本发明的抗体具有高等电点，因为相对于具有较低等电点的类似抗体，这将导致肿瘤微环境中改进的保留。
可以通过任何合适的方法测定抗体的等电点。它可以在体外被测定，例如通过电泳方法。可选地，可以由基本原理计算等电点。在此情况下，得到的等电点通常被称为理论等电点。存在用于理论等电点的计算机计算的众多软件程序，例如GP-MAW(版本9.2，来自Lighthouse Data)。本发明的抗体优选地具有9.0或以上的理论等电点(pI)，优选地9.1或以上，更优选地9.2或以上，最优选地9.25或以上。
本发明还涉及编码本发明的抗体的多核苷酸。因而，本发明的多核苷酸可以编码如本文描述的任何抗体或片段。术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文可交换地使用并且指的是任意长度的核苷酸——脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸——的聚合物形式，或其类似物。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段，信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。可以以分离的或纯化的形式提供本发明的多核苷酸。
“编码”选择的多肽的核酸序列是如下核酸分子：当被置于适当的调控序列的控制下时，其在体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)为多肽。通过5'(氨基)端处的起始密码子和3'(羧基)端处的翻译终止密码子确定编码序列的边界。出于本发明的目的，这样的核酸序列可以包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒、原核DNA或RNA的基因组序列，和甚至合成DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3'位。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸包括编码如上面描述的VH或VL氨基酸序列的序列。多核苷酸可以编码如本文描述的特异性抗体的VH或VL序列。例如，本发明的多核苷酸可以编码包括SEQ ID NO:1、5、7、9、11或13的序列的多肽；或可以编码包括SEQ ID NO:2、15、17或19的序列的多肽；或如上面描述的任何其变体或片段。
这样的多核苷酸可以由SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14；或SEQ ID NO:4、16、18或20中任一种的核酸序列构成或包括SEQ ID NO:3、6、8、10、12或14；或SEQ ID NO:4、16、18或20中任一种的核酸序列。
本发明的多核苷酸可以包括如下二者的序列或由其构成：SEQ ID NO:3和4；SEQID NO:3和16；SEQ ID NO:3和18；SEQ ID NO:3和20；SEQ ID NO:6和4；SEQ ID NO:6和16；SEQ ID NO:6和18；SEQ ID NO:6和20；SEQ ID NO:8和4；SEQ ID NO:8和16；SEQ ID NO:8和18；SEQ ID NO:8和20；SEQ ID NO:10和4；SEQ ID NO:10和16；SEQ ID NO:10和18；SEQ IDNO:10和20；SEQ ID NO:12和4；SEQ ID NO:12和16；SEQ ID NO:12和18；SEQ ID NO:12和20；SEQ ID NO:14和4；SEQ ID NO:14和16；SEQ ID NO:14和18；或SEQ ID NO:14和20。
合适的多核苷酸序列可以可选地是这些特异性多核苷酸序列中的一种的变体。例如，变体可以是任何上面的核酸序列的置换、缺失或添加变体。变体多核苷酸可以包括来自在序列表中给出的序列的1、2、3、4、5、高至10、高至20、高至30、高至40、高至50、高至75或更多个核酸置换和/或缺失。
合适的变体可以至少70％同源于本文描述的核酸序列中的任一种的多核苷酸，优选地与其至少80或90％和更优选地至少95％、97％或99％同源。优选地，这些水平下的同源性和同一性至少关于多核苷酸的编码区存在。测量同源性的方法是本领域熟知的并且本领域技术人员将理解在本上下文中基于核酸同一性计算同源性。这样的同源性将在至少15，优选地至少30，例如至少40、60、100、200或更多个连续核苷酸的区内存在。这样的同源性可以在未修饰的多核苷酸序列的全长内存在。
测量多核苷酸同源性或同一性的方法是本领域已知的。例如UWGCG程序包提供了BESTFIT程序，其可以被用于计算同源性(例如在其默认设置上使用)(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12.p387-395)。
PILEUP和BLAST算法也可以被用于计算同源性或排列序列(通常在其默认设置上使用)，例如如在Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S,F et al(1990)J Mol Biol 215:403-10中描述的。
用于执行BLAST分析的软件是通过美国国家生物技术信息中心(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公开获得的。此算法包含首先通过鉴定查询序列中长度W的短词(word)——当与数据库序列中相同长度的词比对时，其匹配或满足一些正值阈值分数T——来鉴定高分序列对(HSP)。T被称为相邻词(neighbourhood word)分数阈值(Altschulet al,supra)。这些起始相邻词命中(hit)充当用于起始检索的种子(seed)以发现包含它们的HSP。词命中沿着每个序列在两个方向中延伸直到累积的比对分数可以被增加。当累积的比对分数转到零或以下——其由于一个或多个负分残基比对的累积；或到达任一个序列的末端时，词命中在每个方向中的延伸停止。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用如下作为默认值：11的词长(W)，50的BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoffand Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919)比对(B)，10的期望值(E)，M＝5，N＝4，和两条链进行比较。
BLAST算法执行两个序列之间相似性的统计学分析；参见例如，Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787。由BLAST算法提供的相似性的一种测量是最小和概率(smallest sum probability)(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生的可能性的指示。例如，如果第一序列与第二序列的比较中的最小和概率小于大约1，优选地小于大约0.1，更优选地小于大约0.01，和最优选地小于大约0.001，序列被认为相似于另一个序列。
同源物与相关多核苷酸中的序列可以区别在于小于3、5、10、15、20或更多个突变(其每个可以是置换、缺失或插入)。这些突变可以在同源物的至少30，例如至少40、60或100或更多个连续核苷酸的区内进行测量。
在一个实施方式中，借助遗传密码中的冗余性，变体序列可以从在序列表中给出的特异性序列变化。DNA密码具有4种主要的核酸残基(A、T、C和G)并且使用这些“拼写”三字母密码子，其代表在生物体的基因中编码的氨基酸(蛋白质)。沿着DNA分子的密码子的线性序列被翻译为由那些基因编码的蛋白质(一种或多种)中的氨基酸的线性序列。密码是高度简并的，其中61种密码子编码20种天然氨基酸并且3种密码子代表“终止”信号。因而，大部分氨基酸由多于一种密码子编码——事实上数种由四种或更多种不同的密码子编码。本发明的变体多核苷酸因此可以编码与本发明的另一种多核苷酸相同的多肽序列，但是由于使用不同的密码子编码相同的氨基酸，可以具有不同的核酸序列。
根据本发明的多核苷酸“片段”可以通过截短制成，例如通过从多核苷酸的一个或两个末端去除一个或多个核苷酸。可以以此方式从多核苷酸的3’和/或5’末端去除高至10、高至20、高至30、高至40、高至50、高至75、高至100、高至200或更多个氨基酸。还可以通过一个或多个内部缺失生成片段。这样的片段可以衍生自如本文描述的序列或可以衍生自如本文描述的变体多核苷酸。优选地，这样的片段的长度在30和300个残基之间，例如30至300、30至200、30至100、100至200或200至300个残基。可选地，本发明的片段可以是更长的序列，例如包括本发明的全长多核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
本发明的抗体可以因而由编码并且能够表达该抗体的多核苷酸的形式产生或以该形式递送。在抗体包括两条或更多条链时，本发明的多核苷酸可以编码一条或更多条抗体链。例如，本发明的多核苷酸可以编码抗体轻链、抗体重链或二者。可以提供两种多核苷酸，其中之一编码抗体轻链并且其中的另一种编码对应的抗体重链。这样的多核苷酸或多核苷酸对可以被一起表达，以便生成本发明的抗体。
可以根据本领域熟知的方法合成本发明的多核苷酸，如通过在Sambrook et al(1989,Molecular Cloning-a laboratory manual；Cold Spring Harbor Press)中的实例描述的。
可以以表达盒的形式——其包括可操作地连接至插入序列的控制序列——提供本发明的核酸分子，因而允许体内表达本发明的抗体。这些表达盒又通常在载体(例如，质粒或重组病毒载体)内提供。这样的表达盒可以被直接施用至宿主对象。可选地，包括本发明的多核苷酸的载体可以被施用至宿主对象。优选地，使用遗传载体制备和/或施用多核苷酸。合适的载体可以是如下任何载体：其能够携带足够量的遗传信息，并且允许表达本发明的多肽。
本发明因而包括表达载体，其包括这样的多核苷酸序列。这样的表达载体在分子生物学的领域中常规地构建并且可以例如包含使用质粒DNA和适当的起始子、启动子、增强子和其它元件，比如例如可能必需的多腺苷酸化信号，并且其以正确的取向定位，以便允许表达本发明的肽。其它合适的载体对本领域技术人员将是显而易见的。就进一步的实例而言，在这方面，我们指的是Sambrook et al。
本发明还包括已经被修饰以表达本发明的抗体的细胞。这样的细胞包括瞬时的，或优选地稳定的高级真核细胞系，比如哺乳动物细胞或昆虫细胞；低级真核细胞，比如酵母；或原核细胞比如细菌细胞。可以通过插入载体或表达盒——其编码本发明的抗体——修饰的细胞的具体实例包括哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、NS0和COS细胞。优选地，选择的细胞系将是不仅稳定而且允许成熟的糖基化的那种。
可以使用常规方法培养本发明的这样的细胞系以产生本发明的抗体，或可以在治疗上或预防上使用本发明的这样的细胞系以将本发明的抗体递送至对象。可选地，多核苷酸，本发明的表达盒或载体可以被离体施用至来自对象的细胞，并且细胞然后返回至对象的身体。
在另一方面，本发明提供了组合物和制剂，其包括本发明的分子，比如本文描述的抗体、多核苷酸、载体和细胞。例如，本发明提供了与药学上可接受的载体一起配制的药物组合物，其包括本发明的一种或多种分子，比如本发明的一种或多种抗体。
如本文使用的，“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适合肠胃外，例如静脉内、眼内、肌肉内或皮下施用(例如，通过注射或输注)。
本发明的抗体的直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内递送——通常通过注射——可以是优选的。递送至视网膜、视网膜下空间或玻璃体内空间可以是优选的。
取决于施用途径，抗体可以被包衣在材料中以保护抗体免受可能使抗体失活或变性的酸和其它自然条件的作用。
优选的药学上可接受的载体包括水性载体或稀释剂。可以在本发明的药物组合物中采用的合适的水性载体的实例包括水、缓冲水和盐水。其它载体的实例包括乙醇、多元醇(比如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其合适的混合物、植物油比如橄榄油、和可注射的有机酯比如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料比如卵磷脂，通过在分散的情况下维持需要的粒度，和通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。在许多情况下，将优选地在组合物中包括等渗剂，例如，糖，多元醇比如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。
本发明的药物组合物还可以包括药学上可接受的抗氧化剂。这些组合物还可以包含佐剂比如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过如下二者防止微生物的存在：在前的灭菌程序，和包括多种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等。还期望在组合物内包括等渗剂，比如糖、氯化钠等。此外，可注射的药物形式的延长吸收可以由包括延迟吸收的药剂比如单硬脂酸铝和明胶引起。
治疗性组合物在制造和储存的条件下通常必需是无菌的和稳定的。组合物可以被配制为溶液、微乳液、脂质体、或对高药物浓度合适的其它有序结构。
通过在适当的溶剂——其根据需要具有上面例举的成分之一或组合——中以需要量并入活性剂(例如抗体)，接着灭菌微过滤，可以制备无菌的、可注射的溶液。通常，通过将活性剂并入无菌媒介——其包含基础分散介质和需要的来自上面列举的那些的其它成分——来制备分散液。在用于制备无菌的、可注射的溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性剂加上来自其先前的无菌过滤的溶液的任何额外期望的成分的粉末。
本发明的药物组合物可以包括额外的活性成分以及本发明的抗体。如上面提及的，本发明的组合物可以包括本发明的一种或多种抗体。它们还可以包括额外的治疗剂或预防剂。
也在本发明的范围内的是试剂盒，其包括本发明的抗体或其它组合物和使用说明。试剂盒可以进一步包含一种或多种额外的试剂，比如如上面讨论的额外的治疗剂或预防剂。
根据本发明的抗体可以被用于疗法。在治疗应用中，抗体或组合物以足以治愈、减轻或部分地停滞病症或其症状中的一种或多种的量被施用至已经遭受障碍或病症的对象。这样的治疗性治疗可以导致疾病症状的严重度的减小，或无症状期的频率或持续时间的增加。适于完成此的量被定义为“治疗有效量”。出于给定的目的，有效量将取决于疾病或损伤的严重度以及对象的重量和一般状态。如本文使用的，术语“对象”包括任何人。
原则上可以根据本发明治疗、预防或改善发生Lrg-1介导的血管增生的任何病症。如本文使用的“血管增生”、“血管增生性”、“血管增生性病症”和类似的术语涵盖与血管或血管组织或细胞的异常或有害发育相关的任何和所有病理学。例如，致病性血管发生(形成新的血管，例如经由来自已有血管的新的毛细血管生长)和血管畸形(例如毛细血管扩张，形成扩张的、弯曲的和不完全的血管，微动脉瘤)二者可以被预防或降低，新生血管化和血管内皮细胞增殖也可以被预防或降低。而且，如本领域已知的，瘤生长需要形成新的血管以给生长的肿瘤提供血液供应。发生Lrg-1介导的血管增生的肿瘤因此也是可以根据本发明进行治疗、预防或改善的病症。
优选地，对正常的，例如发展的血管化，尤其是在视网膜中发展的血管化不存在作用或存在最小作用。眼血管增生性病症的治疗是优选的实施方式。在病症之中可以被治疗的是：糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病、黄斑毛细血管扩张、年龄相关性黄斑变性或脉络膜新生血管化。因此，在一个实施方式中，本发明提供了本发明的抗体，或其片段，其用于治疗血管增生性病症。本发明还提供了治疗血管增生性病症的方法，其包括给个体施用本发明的抗体，或其片段。本发明还提供了本发明的抗体，或其片段，其用于制造用于治疗治疗血管增生性病症的药物。
还可以实现肿瘤，通常是实体瘤的治疗。因此，在一个实施方式中，本发明提供了本发明的抗体，或其片段，其用于治疗癌症。本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括给个体施用本发明的抗体，或其片段。本发明还提供了本发明的抗体，或其片段，其用于制造用于治疗治疗癌症的药物。
癌症可以是展示实体瘤的癌症。癌症可以是脑癌、乳腺癌、肾癌、结肠直肠癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、宫颈癌、骨癌、卵巢癌、睾丸癌或肝癌。
在具体的实施方式中，本发明的抗体可以被连接(直接地或间接地)至另一个部分。另一个部分可以是治疗剂比如细胞毒性部分或药物。另一个部分可以是可检测的标记。另一个部分可以是结合部分，比如肿瘤-特异性抗体或特异于治疗性靶标——优选地，与癌症相关联的治疗性靶标，该靶标不是人Lrg1——的多肽结合结构域。得到的双特异性分子可以用于治疗癌症。
因而，作为实例，本发明的抗体，或其抗原结合片段可以被连接(直接地或间接地)至特异于人VEGF的多肽结合结构域。
本发明的抗体可以是双特异性抗体。本发明的抗体可以是结合人Lrg1和人VEGF的双特异性抗体。本发明的抗体可以是结合人Lrg1和人PDGF的双特异性抗体。本发明的抗体可以是结合人Lrg1和人抗补体因子D Fab的双特异性抗体。本发明的抗体可以是结合人Lrg1和人PDGFR的双特异性抗体。本发明的抗体可以是结合人Lrg1和人Tie2酪氨酸激酶抑制剂的双特异性抗体。
治疗剂或可检测的标记可以被直接地附加至本发明的抗体，例如通过化学缀合。将药剂或标记缀合至抗体的方法是本领域已知的。例如，碳二亚胺缀合(Bauminger&Wilchek(1980)Methods Enzymol.70,151-159)可以被用于将各种药剂——其包括阿霉素——缀合至抗体或肽。水溶性碳二亚胺1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)对将功能部分缀合至结合部分是特别有用的。
也可以使用用于将部分缀合至抗体的其它方法。例如，可以使用高碘酸钠氧化，接着是适当的反应物的还原性烷基化，也可以使用戊二醛交联。然而，认识到不管选择哪种产生本发明的缀合物的方法，必需做出如下决定：抗体维持其靶向能力并且功能部分维持其相关功能。
细胞毒性部分可以是直接和/或间接细胞毒性的。“直接细胞毒性”的意思是部分是其自身是细胞毒性的那种。“间接细胞毒性”的意思是部分是如下一种：虽然其不是自身细胞毒性的，但是可以诱发细胞毒性，例如通过其对进一步的分子的作用或通过对其的进一步作用。细胞毒性部分可以仅当细胞内时是细胞毒性的并且优选地当细胞外时不是细胞毒性的。
优选地，本发明提供了抗体或抗原-结合片段，或其变体、融合物或衍生物，其中细胞毒性部分是直接细胞毒性化学治疗剂。任选地，细胞毒性部分是直接细胞毒性多肽。细胞毒性化学治疗剂是本领域熟知的。
细胞毒性剂还可以被单独地施加至本发明的抗体。
细胞毒性化学治疗剂，比如抗癌剂，包括：烷化剂，其包括氮芥比如双氯乙基甲胺(HN2)、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(L-沙可来新)和瘤可宁；亚乙基亚胺和甲基蜜胺比如六甲蜜胺、噻替哌；烷基磺酸酯比如白消安；亚硝基脲比如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)和链脲霉素(链脲菌素)；和三氮烯比如达卡巴嗪(decarbazine)(DTIC；二甲基三氮烯咪唑-羧酰胺)；抗代谢物，其包括叶酸类似物比如甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)；嘧啶类似物比如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)、氟尿苷(氟脱氧尿苷；FUdR)和阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)；和嘌呤类似物和相关的抑制剂比如巯嘌呤(6-巯嘌呤；6-MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；TG)和喷司他丁(2’-脱氧助间型霉素)。天然产品，其包括长春花生物碱比如长春花碱(VLB)和长春新碱；表鬼臼毒素比如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素比如放线菌素(放线菌素D)、柔红霉素(道诺霉素；红比霉素)、阿霉素、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素C)；酶比如L-天冬酰胺酶；和生物反应修饰剂比如干扰素alphenome。混杂的药剂，其包括铂配位复合物比如顺铂(cis-DDP)和卡铂；蒽二酮比如米托蒽醌和蒽环类；取代的脲比如羟基脲；甲基肼衍生物比如丙卡巴肼(N-甲基肼，MIH)；和肾上腺皮质抑制剂比如米托坦(o,p’-DDD)和氨鲁米特；紫杉醇和类似物/衍生物；和激素激动剂/拮抗物比如氟他胺和他莫昔芬。
在本发明的一个实施方式中，细胞毒性部分是细胞毒性肽或多肽部分，其导致细胞死亡。细胞毒性肽和多肽部分是本领域熟知的并且包括，例如，蓖麻毒蛋白、相思豆毒素、假单胞菌外毒素、组织因子等。用于将它们连接至靶向部分比如抗体的方法也是本领域已知的。在WO 96/06641中将其它核糖体失活蛋白描述为细胞毒性剂。假单胞菌外毒素也可以被用作细胞毒性多肽。某些细胞因子比如TNFα和IL-2也可以被用作细胞毒性剂。
如果以足够的剂量递送，某些放射性原子也可以是细胞毒性的。因而，细胞毒性部分可以包括放射性原子，其在使用中将足够数量的放射性递送至靶位点，以便于是细胞毒性的。合适的放射性原子包括磷-32、碘-125、碘-131、铟-111、铼-186、铼-188或钇-90、或发射足够的能量以破坏相邻的细胞、细胞器或核酸的任何其它同位素。优选地，本发明的药剂中放射性原子的同位素和密度为使得大于4000cGy(优选地至少6000、8000或10000cGy)的剂量被递送至靶位点，并且优选地，递送至靶位点处的细胞和其细胞器，特别是细胞核。
放射性原子可以以已知的方式被附加至抗体，抗原-结合片段，其变体、融合物或衍生物。例如，EDTA或另一种螯合剂可以被附加至结合部分并且被用于附加111In或90Y。可以使用125I或131I直接标记酪氨酸残基。
细胞毒性部分可以是合适的间接细胞毒性多肽。在特别优选的实施方式中，间接细胞毒性多肽是具有酶促活性并且可以将无毒的和/或相对无毒的前药转化为细胞毒性药物的多肽。在抗体的情况下，此类型的系统通常被称为ADEPT(抗体导向酶前药疗法(Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy))。系统需要抗体将酶促部分定位至患者身体中期望的位点，并且在允许酶有时间在该位点处定位后，施用是酶的底物的前药，催化作用的最终产物是细胞毒性化合物。该方法的目标是最大化药物在期望的位点处的浓度和最小化药物在正常组织中的浓度。在优选的实施方式中，细胞毒性部分能够将非细胞毒性前药转化为细胞毒性药物。
使用如本文描述的靶向酶的系统的酶和前药可以是先前提出的任何那些。细胞毒性物质可以是任何现有抗癌药物比如烷基化剂；在DNA中插入的药剂；抑制任何关键酶比如二氢叶酸还原酶、胸苷合成酶、核糖核苷酸还原酶、核苷激酶或拓扑异构酶的药剂；或通过与任何其它细胞组成相互作用引起细胞死亡的药剂。依托泊苷是拓扑异构酶抑制剂的实例。
报道的前药系统包括在下面的表2中列举的那些。
表2
Figure GDA0002856221510000321
Figure GDA0002856221510000331
用于形成酶促部分的一部分的合适的酶包括：外肽酶，比如羧肽酶G、G1和G2(用于谷氨酰化芥前药)，羧肽酶A和B(用于MTX基前药)和氨肽酶(用于2-α-氨酰基(aminocyl)MTC前药)；内肽酶，比如例如纤溶酶(用于凝血酶前药)；水解酶，比如磷酸酶(例如碱性磷酸酶)或硫酸酯酶(例如芳基硫酸酯酶)(用于磷酸化或硫酸化前药)；酰胺酶，比如青霉素酰胺酶和芳酰基酰胺酶；内酰胺酶，比如β-内酰胺酶；糖苷酶，比如β-葡糖醛酸酶(用于β-葡糖醛酸(glucuronomide)蒽环类)、α-半乳糖苷酶(用于苦杏仁苷)和β-半乳糖苷酶(用于β-半乳糖蒽环类)；脱氨酶，比如胞嘧啶脱氨酶(用于5FC)；激酶，比如尿激酶和胸苷激酶(用于丙氧鸟苷)；还原酶，比如硝基还原酶(用于CB1954和类似物)、偶氮还原酶(用于偶氮苯芥)和DT-心肌黄酶(用于CB1954)；氧化酶，比如葡萄糖氧化酶(用于葡萄糖)、黄嘌呤氧化酶(用于黄嘌呤)和乳过氧化物酶；DL-消旋酶、催化性抗体和环糊精。
优选地，前药与细胞毒性药物比较是相对无毒的。通常，如在合适的体外细胞毒性测试中测量的，它具有小于10％的毒性，优选地小于1％的毒性。
可能的是能够将前药转化为细胞毒性药物的部分在与本发明的药剂其余部分分离时是活性的，但是其仅当(a)其与本发明的药剂其余部分组合和(b)本发明的药剂被附加至靶细胞、与靶细胞相邻或在靶细胞中内化时，它才必须是活性的。
当每个部分是多肽时，两个部分可以通过任何交联多肽的常规方式连接在一起。例如，抗体，抗原-结合片段，其变体、融合物或衍生物可以富含巯醇基团和进一步的部分，其与能够与那些巯醇基团反应的双官能剂反应，例如，碘乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)。酰胺和硫醚键——例如使用m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯取得的——与二硫键比较在体内通常更稳定。
可选地，可以通过重组DNA技术产生抗体，抗原-结合片段，其变体、融合物或衍生物为融合化合物，由此某长度的DNA包括编码本发明的药剂的两个部分的各自的区，所述区彼此相邻或由编码肽连接体肽——其不破坏药剂的期望的性质——的区分隔。可信地，药剂的两个部分可以完全地或部分地重叠。
细胞毒性部分可以是放射敏化剂。放射敏化剂包括氟嘧啶、胸苷类似物、羟基脲、吉西他滨、氟达拉滨、烟酰胺、卤代嘧啶、3-氨基苯甲酰胺、3-氨基苯二甲酰胺、依他硝唑(etanixadole)、哌莫硝唑和米索硝唑。而且，将基因递送入细胞可以使它们放射敏化，例如递送p53基因或细胞周期蛋白D。经照射之后，进一步的部分可以是成为细胞毒性的或释放细胞毒性部分的一种。例如，当被适当地照射时，硼-10同位素释放细胞毒性的α颗粒。类似地，细胞毒性部分可以是在光动力学疗法中有用的一种，比如光敏素。
细胞毒性剂可以是细胞骨架药物比如紫杉酚。
进一步的部分可以包括是直接或间接细胞毒性的核酸分子。例如，核酸分子可以是反义寡核苷酸，其在定位于靶位点之后能够进入细胞并导致其死亡。因此，寡核苷酸可以是阻止必需基因的表达的一种，或导致引起凋亡的基因表达的改变的一种。可选地，细胞毒性部分是编码直接和/或间接细胞毒性多肽的核酸分子。合适的寡核苷酸的实例包括在bc1-2、DNA聚合酶α和拓扑异构酶IIα处导向的那些。肽核酸在替换常规核酸中可以是有用的。
抗体，抗原-结合片段，其变体、融合物或衍生物可以被包括在递送媒介中用于将核酸递送至靶标。递送媒介可以是任何合适的递送媒介。例如，它可以是包含核酸的脂质体，或它可以是能够递送核酸的病毒或病毒样颗粒。在这些情况下，待递送的分子通常在递送媒介的表面上存在。例如，抗体或片段可以在脂质体的外表面中存在，并且待递送的核酸可以在脂质体的内部中存在。作为另一个实例，病毒载体比如逆转录病毒或腺病毒载体被改造，使得结合部分被附加至或位于病毒颗粒的表面，因而使病毒颗粒能够靶向至期望的位点。可以使用免疫脂质体(抗体导向脂质体)。在用于制备免疫脂质体的一种方法中，根据Martin&Papahadjopoulos(1982)J.Biol.Chem.257,286-288的方法合成MPB-PE(N-[4-(p-马来酰亚胺苯基)-丁酰基]-磷脂酰乙醇胺)。MPB-PE被并入脂质体双层以允许抗体或其片段与脂质体表面的共价偶联。脂质体便利地装载有用于递送至靶细胞的DNA或其它遗传构建体，例如，通过在DNA或其它遗传构建体的溶液中形成所述脂质体，接着在高至0.8MPa的氮气压力下通过具有0.6μm和0.2μm孔径的聚碳酸酯膜过滤器连续挤出。在挤出后，通过在80,000×g下超速离心45min从游离的DNA构建体分离截留的DNA构建体。脱氧缓冲液中新制备的MPB-PE-脂质体与新制备的抗体(或其片段)混合，并且在4℃下在氮气气氛中实施偶联反应，恒定的颠倒搅拌过夜。通过在80,000×g下超速离心45min从未缀合的抗体分离免疫脂质体。免疫脂质体可以被腹膜内注射或直接注射入肿瘤。
递送至靶位点的核酸可以是直接地或间接地导致细胞毒性的任何合适的DNA。例如，核酸可以编码对细胞是细胞毒性的核酶，或它可以编码能够将基本无毒的前药转化为细胞毒性药物的酶(此后者系统有时被称为GDEPT：基因导向酶前药疗法)。合适的核酶包括聚合酶、脱磷酸化酶、和限制性核酸内切酶。核酶的合适的靶标包括转录因子比如c-fos和c-myc、和bcl-2。关于酶和前药的选择的类似考量如应用于上面描述的的ADEPT系统一样应用于GDEPT系统。递送至靶位点的核酸可以编码直接细胞毒性多肽。
连接至抗体的治疗剂可以包括多肽或编码多肽的多核苷酸，所述多肽不是直接或间接细胞毒性的，但是具有治疗益处。这样的多肽的实例包括抗增殖性或抗炎性细胞因子，和抗增殖性、免疫调节性或影响凝血的因子，其在医学中——例如在癌症的治疗中——可以具有益处。药剂可以有用地是血管发生的抑制剂比如肽血管生长抑素或内皮抑素。药剂还可以有用地是将前体多肽转化为血管生长抑素或内皮抑素的酶。人基质金属蛋白酶比如巨噬细胞弹性蛋白酶、明胶酶和间质溶解素(stromolysin)将纤溶酶原转化为血管生长抑素。纤溶酶原是血管生长抑素的前体。
抗体可以被连接至可检测的标记。“可检测的标记”的意思是当将抗体施用入患者之后而位于靶位点时，抗体被连接至可以被检测到——通常由身体外和靶标定位的位点非侵入性地检测到——的部分。因而，抗体在成像和诊断中可以是有用的。
通常，标记是或包括在成像中有用的放射性原子。合适的放射性原子包括用于闪烁照相术研究的99mTc和123I。其它标记包括，例如，用于磁共振成像(MRI)的自旋标记比如123I(再一次)、131I、111In、19F、13C、15N、17O、钆、锰或铁。明显地，足够量的适当的原子同位素必须被连接至抗体，以便分子可容易地检测出。
可以以已知的方式并入放射性或其它标记。例如，抗体或其片段可以是生物合成的或可以使用合适的氨基酸前体通过化学氨基酸合成来合成，所述氨基酸前体包含，例如，替换氢的氟-19。例如，可以经由多肽中的半胱氨酸残基附加标记比如99mTc、123I、186Rh、188Rh和111In。可以经由赖氨酸残基附加钇-90。优选地，可检测的标记包括放射性原子，比如，锝-99m或碘-123。
可选地，可检测的标记可以选自：碘-123；碘-131；铟-111；氟-19；碳-13；氮-15；氧-17；钆；锰；铁。
在一个实施方式中，本发明的抗体能够选择性地结合至直接或间接细胞毒性部分或可检测的标记。因而，在此实施方式中，抗体被连接至如下部分：其选择性地结合至是细胞毒性的或可容易地检测的进一步的化合物或组分。
本发明的抗体或片段，或包括所述抗体或片段的组合物可以使用本领域已知的各种方法中的一种或多种经由一种或多种施用途径被施用。如技术人员将领会的，施用途径和/或模式将取决于期望的结果变化。用于本发明的抗体或组合物的优选的施用途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文使用的短语“肠胃外施用”意思是不同于肠内和外用施用的施用模式，其通常通过注射。可选地，本发明的抗体或组合物可以经由非肠胃外途径——比如外用、表皮或粘膜施用途径——被施用。局部施用也是优选的，包括癌周、瘤旁、瘤内、病灶内、病灶周、腔内输注、囊内施用、和吸入。
在一个优选的实施方式中，抗体通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内递送被施用。通常，此施用通过注射。
本发明的抗体的合适剂量可以由专业医师确定。本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得一定量的活性成分，其对取得具体的患者、组合物、和施用模式期望的治疗反应是有效的，而对患者无毒性。选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括采用的具体组合物的活性，施用途径，施用时间，抗体的排泄速率，治疗的持续时间，与采用的具体组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料，被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和先前病史，和医学领域熟知的类似因素。
例如，本发明的抗体的合适剂量可以在大约0.1μg/kg至大约100mg/kg待治疗的患者的体重的范围中。例如，合适的剂量可以是大约1μg/kg至大约10mg/kg体重/周、大约100μg/kg至大约10mg/kg体重/周或大约10μg/kg至大约5mg/kg体重/周。
合适的剂量可以是大约1μg/kg至大约10mg/kg体重/天、大约100μg/kg至大约10mg/kg体重/天或大约10μg/kg至大约5mg/kg体重/天。
对于注射入眼，合适的剂量可以是大约100μg至10mg/注射，或大约1mg至10mg/注射，或大约1mg至5mg/注射。
可以调节给药方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注，可以随着时间施用数个分剂量或可以随着治疗情况的紧急状态指示成比例地降低或增加剂量。尤其有利的是为了便于施用和剂量的均匀性，以剂量单位形式配制肠胃外组合物。如本文使用的剂量单位形式指的是适合作为待治疗的对象的单一剂量的物理离散单位；每个单位包含计算以产生期望的治疗效果的预定数量的活性化合物连同必需的药物载体。
可以以单次剂量或以多次剂量施用抗体。可以经由相同或不同的途径施用多次剂量并且施用至相同或不同的位置。可选地，在需要较小频率施用的情况下，可以作为缓释制剂施用抗体。剂量和频率可以取决于抗体在患者中的半衰期和期望的治疗持续时间而变化。施用剂量和频率也可以取决于治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，可以在长时期内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。在治疗性应用中，可以施用相对高的剂量，例如直到患者显示部分或完全改善疾病的症状。
可以以大量不同的方式实现两种或更多种药剂的组合施用。在一个实施方式中，抗体和另一种药剂可以在单个组合物中被一起施用。在另一个实施方式中，抗体和另一种药剂可以作为组合疗法的一部分在单独的组合物中被施用。例如，抗体可以在另一种药剂之前、之后或与其同时被施用。本发明的抗体可以与细胞毒性剂、抗癌剂、肿瘤靶向抗体、靶向疗法、途径抑制剂或其它免疫调节性抗体——其靶向例如PD-1、PD-L1、CD137、GITR、OX40、CTLA-4、CD27、HVEM、LtBR、LAG3、PDGF、抗补体因子D Fab、PDGFR和Tie2酪氨酸激酶抑制剂——组合施用或与其依次施用。进一步，本发明的抗体还可以与局部辐射组合。
本发明的抗体可以与VEGF的拮抗物组合施用。本发明的抗体可以与抗VEGF抗体或VEGF的可溶性受体比如阿柏西普(艾力亚)，或抗VEGF抗体比如贝伐单抗(阿瓦斯汀)或雷珠单抗(Ranibizumab)(诺适得(Lucentis))组合施用。
本发明的抗体可以与刺激免疫系统的抗癌剂组合施用。本发明的抗体可以与刺激免疫系统的抗癌剂比如细胞因子组合施用。本发明的抗体可以与树突细胞——其已经被刺激以起始针对表达肿瘤抗原的细胞的细胞毒性反应——组合施用。本发明的抗体可以与T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞——其已经被初次免疫以攻击癌性细胞——组合施用。本发明的抗体可以与T细胞——其已经被遗传改造以识别肿瘤抗原——组合施用。本发明的抗体可以与自体免疫增强疗法组合施用。
本发明人已经发现敲除Lrg1在实体瘤中的表达引起肿瘤中小血管数目的减少。此减少与肿瘤大小的减小、肿瘤中增殖细胞数目的减少和其余血管上周细胞覆盖度的增加相关联。总的来说，结果指示敲除Lrg1表达起作用以使肿瘤血管系统正常化。
另外，本发明人也已经发现Lrg1拮抗物降低肿瘤生长并且使其余肿瘤的血管系统正常化。这些数据将表明Lrg1的拮抗物可以被用于降低转移性扩散。Lrg1的拮抗物可以被用于改进抗癌和细胞毒性药物和细胞对肿瘤的递送和功效。
Lrg1驱动肿瘤中混乱的血管系统。Lrg1驱动混乱的VEGF血管发生，其中血管是非生理学的。然而，Lrg1在发展的血管发生中不被上调。与任何其它抗癌药物——其实例在本文被描述——组合，可以使用Lrg1的拮抗物治疗具有异常血管系统的任何肿瘤以使肿瘤的血管系统正常化。例如，Lrg1的拮抗物可以与VEGF拮抗物组合使用以治疗肿瘤。可以使用Lrg1的拮抗物共同治疗任何肿瘤。
Lrg1拮抗物包括结合至Lrg1的抗体、通过结合至Lrg1阻断Lrg1功能的肽和模拟肽、结合至Lrg1的小分子抑制剂、抑制Lrg1表达的双链RNA、靶向Lrg1的适配体和核酶。优选的拮抗物包括Lrg1的肽片段、抑制Lrg1表达的双链RNA、抑制Lrg1表达的适配体和结合Lrg1的抗体。
在本发明的实施方式中，Lrg1的拮抗物可以被用于预防癌症转移。
在本发明的实施方式中，Lrg1的拮抗物可以与刺激免疫系统的抗癌剂组合施用。本发明的Lrg1拮抗物可以与刺激免疫系统的抗癌剂比如细胞因子组合施用。本发明的Lrg1拮抗物可以与树突细胞——其已经被刺激以起始针对表达肿瘤抗原的细胞的细胞毒性反应——组合施用。本发明的Lrg1拮抗物可以与T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞——其已经被初次免疫以攻击癌性细胞——组合施用。本发明的Lrg1拮抗物可以与T细胞——其已经被遗传改造以识别肿瘤抗原——组合施用。本发明的Lrg1拮抗物可以与自体免疫增强疗法组合施用。
在本发明的实施方式中，如本文描述的本发明的抗体Lrg1可以被用于预防转移。
在本发明的实施方式中，Lrg1的拮抗物组合VEGF抑制剂用于治疗VEGF抑制剂抗性肿瘤或眼病症。
在本发明的实施方式中，根据本发明的抗体或其片段可以与抗血管发生化合物组合使用。
在本发明的实施方式中，根据本发明的抗体或其片段可以与抗癌剂组合使用。
在本发明的进一步的实施方式中，抗血管发生化合物是血管内皮生长因子(VEGF)的拮抗物。
在进一步的实施方式中，VEGF的拮抗物是抗VEGF抗体。
在进一步的实施方式中，VEGF的拮抗物是阿柏西普(艾力亚)。
在进一步的实施方式中，VEGF的拮抗物是贝伐单抗(阿瓦斯汀)或雷珠单抗(诺适得)。
本发明人已经显示阻断Lrg1改进组织中血管的生理学状态，减少混乱的血管的存在。一般而言，阻断Lrg1活性对血管再通将是有利的，其与促血管发生药物协同。通过Lrg1拮抗物使血管系统正常化还将允许治疗疾病，其中它对增加血管化将是有用的。使用Lrg1拮抗物的治疗将减少混乱的和不成熟的血管形成。使用促血管发生剂的后续治疗将改进功能成熟的血管化。这样的治疗对治疗组织受缺氧影响的任何疾病或存在畸形血管的疾病将是有用的。这样的疾病包括局部缺血、缺血性心脏病、糖尿病、缺血性中风、血管性痴呆、短暂性缺血发作、二尖瓣疾病、慢性心房颤动、心肌病、急性肢体缺血、外周肢体缺血、血栓症、血管闭塞、胸腔出口综合征、动脉粥样硬化、低血糖、心动过速、低血压、镰状细胞病、冻疮、动静脉畸形、血管破裂和贫血。
可以与Lrg1拮抗物协同使用的促血管发生剂包括VEGF、bFGF(成纤维细胞生长因子)、PLGF(胎盘生长因子)和血管生成素2。
本发明提供了用于血管系统畸形的组织的血管再通方法的Lrg1的拮抗物。本发明提供了Lrg1的拮抗物，其与促血管发生剂协同用于血管系统畸形的组织的血管再通方法。本发明提供了血管系统畸形的组织的血管再通方法，其包括给个体施用Lrg1的拮抗物。本发明提供了血管再通方法，其包括给个体施用Lrg1的拮抗物协同促血管发生剂。本发明提供了Lrg1的拮抗物，其与促血管发生剂协同用于制造用于血管系统畸形的组织的血管再通方法的药物。
在本发明的实施方式中，血管再通方法是如上面描述的组织受缺氧影响的疾病。
通过下列实施例进一步说明本发明，实施例不应当被解释为是进一步限制性的。遍及本申请引用的所有附图和所有参考文献、专利和公布的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。
实施例
生成102种针对人Lrg1的候选mAb并且所有均经受下列测试：使用全血清的物种交叉反应、基质胶试验(使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC))、HUVEC共培养试验、对人和小鼠Lrg1二者的重组形式使用Biacore的亲和力测定、和小鼠跖骨血管发生试验。然后在下列测试中检查最有希望的mAb的子集：小鼠和大鼠二者中激光诱发的脉络膜新生血管化、使用分级的全血清的物种交叉反应性分析、通过ELISA的亲和力测定、通过蛋白质印迹的靶标的特异性、通过TGFβ阻断Lrg1介导的Smad5的活化的能力。
实施例1-使用全血清的物种交叉反应
在方案中通过ELISA实施物种交叉反应，其中多层板(multiwall plate)涂覆有rhLrg1，并且肝提取自小鼠、大鼠、兔、猴、狗和猫。然后使用100nM下的每种mAb探测板，接着是碱性磷酸酶(alk-phos)缀合的二次抗体和显色反应。mAb 4H2被观察到针对小鼠和大鼠二者(但是针对大鼠Lrg1具有更优越的反应性)，以及猫、狗、猕猴和兔具有交叉反应性。抗体4H2、3A11或15C4均没有展示出与啮齿动物Lrg1的强的交叉反应性。
实施例2–使用Biacore的亲和力测量
Biacore被用于测量抗体与人Lrg1的结合亲和力、缔合和解离常数。人Lrg1被固定化在Biacore芯片上，并且mAb以20-100nM范围内的浓度穿过。2nM的截短结合亲和力值被用于分离可能的候选抗体用于进一步的调查。三种抗体15C4、4H2和3A11以格外高的亲和力结合。
Biacore还用于检查所有mAb对重组小鼠Lrg1的亲和力。在这些实验中，与人Lrg1分析所做的一样，小鼠Lrg1被固定化在Biacore芯片上并且mAb以100nM穿越。图1显示当在该浓度下测试时，仅3种mAb引发可测量的反应单位。数据显示在针对人Lrg1培养的抗体之中，与小鼠Lrg1的交叉反应是不寻常的。
基于结合亲和力和物种交叉反应性，在初期淘汰了大量初始的102种mAb，这意味着可能使用个体mAb而不是集合(pool)进行后续的功能调查。淘汰的迭代过程导致四种有希望的候选3A11、15C4、4H2和5F12的详细检查。
实施例3-基质胶试验
在基质胶试验中测试抗体抑制管形成的能力。在存在100nM mAb的情况下，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)被平板接种在基质胶上并且培养过夜。也评价封闭性兔多克隆Lrg1抗体。在mAb 4H2的情况下观察到管形成的40％阻断并且在mAb 15C4的情况下是60％(图2)。在此试验中观察到HUVEC的批次之间的变化性，当在100nM下使用时，通过3A11和15C4的抑制在一些情况下>80％，其比得上在兔多克隆抗体的情况下观察到的～80％抑制。在4H2的情况下的阻断从未超过～50％。
实施例4-离体试验中的功能测试-小鼠跖骨血管发生试验
在此试验中，使用外植的E16.5小鼠跖骨测试mAb的功能阻断活性。血管由胚胎骨自发地生长以形成关于例如血管长度、口径和分支点可以容易量化的2D-网络。在小鼠跖骨试验中，在12天的培养期间给培养基添加100nM下的mAb，每两天补充培养基和mAb。在实验结束时，固定样品并且对血小板内皮细胞粘附分子(PECAM)进行免疫染色，并且使用Imaris软件量化血管网络，同时归一化至磷酸盐缓冲盐水(PBS)对照。
图3显示15C4和3A11在此试验中抑制血管发生，对于15C4达到～40％的最大值。4H2和5F12没有作用，但是注意5F12不识别小鼠Lrg1和4H2非常弱地识别。本发明人先前已经显示在来自Lrg1-/-小鼠的跖骨中观察到仅～25％血管发生的抑制(Wang et al.,2013)。因而15C4和3A11的作用可能反映理论最大作用。
实施例5-对人Lrg1的特异性
为了评价榜样mAb对人Lrg1的特异性，针对来自MDA-MB人肿瘤细胞系的条件培养基、人玻璃体液的样品、和全人血清的样品进行每种的蛋白质印迹分析。图4显示3A11和15C4强烈地识别条件培养基和玻璃体中Lrg1在50kD处的单一条带。4H2在印迹上效果较差，但是也显示对Lrg1的特异性。玻璃体样品中单一条带的鉴定表明治疗性施用这些mAb的适用性。
实施例6-结合动力学
在如下实验中使用Biacore检查四种榜样mAb：其中人Lrg1被固定化在芯片上，并且mAb以20-100nM范围内的浓度穿过。下面的表格概括了动力学数据。
Figure GDA0002856221510000421
4种候选抗体对人Lrg1的结合亲和力是：3A11 1.7pM，15C4 1.2pM，4H2 930pM和5F12 59pM。3A11和具体而言15C4显示了对人Lrg1非常高的亲和力。
实施例7-大鼠激光诱发的脉络膜新生血管化(CNV)中的功能测试
测试几种抗体阻断大鼠中CNV的能力。在这些实验中，在产生激光的同时，玻璃体内注射mAb，眼在7天之后被取回用于分析(图5)。在将4mg mAb或对照IgG玻璃体内递送入两只眼的同时，6-8周龄的Long Evans大鼠每只接受5次视网膜激光烧伤。每种mAb使用四只大鼠，通过胶原IV染色分析所有总计40个病变并且量化新生血管面积。结果显示观察到对于15C4、4H2和5F12而非3A11的血管发生的功能阻断。对于3A11缺乏作用应当考虑鉴于其与啮齿动物Lrg1的弱的交叉反应性。还测试血管内皮生长因子(VEGF)-封闭性抗体并且发现在试验中没有功能作用。还在大鼠激光模型中测试阿瓦斯汀(数据未显示)并且观察到没有作用，其与具有低大鼠VEGF亲和力的阿瓦斯汀一致。
前四种mAb在跖骨和CNV模型中展示出功能活性。这些mAb和具体而言15C4具有治疗和临床相关性质。已经确定Lrg1基因敲除在跖骨试验中导致血管发生的仅～25％降低，这表明25％抑制应当是通过抗体阻断可取得的最大值。然而，15C4优于此值，并且3A11与其接近。在CNV模型中，4μg的15C4或4H2在眼内注射之后产生有效的阻断，而抗大鼠VEGF-封闭性mAb则不。
假设25μl的玻璃体体积和150kD的mAb分子量，4μg的剂量将被预期生成～1.0μM的直接眼内浓度。然而，注射的mAb的眼内浓度已知快速地下降，所以一旦CNV开始发育(几天后)，mAb的有效浓度不可避免地更低。而且，诺适得被注射入患有新生血管AMD的患者以给予～2.6μM的玻璃体浓度。策略因此基于临床相关的治疗性给药。
实施例8-血管发生的HUVEC共培养模型
测试抗体4H2、15C4和3A11以查看它们是否在血管发生的共培养模型中引发血管生长的抑制。HUVEC与人成纤维细胞共培养14天，并且然后被固定和使用针对PECAM的抗体进行免疫染色。阿瓦斯汀作为阳性对照被包括，并且在10、25、50、100和200nM下测试所有四种mAb。结果在图6中显示。存在来自此实验的两个重要的观察。第一个是3A11在此试验中是相对无效的，并且第二个是15C4和4H2是同等有效的。
4H2和15C4被发现是有希望的治疗药剂并且因此适合人源化。4H2具有对人Lrg1较低的亲和力(但是它仍以高亲和力结合)但是显示与啮齿动物Lrg1更好的交叉反应性，使得未来的毒理学测试更直接。另一方面，15C4具有对人Lrg1高得多的亲和力，但是在血管发生的体内啮齿动物模型中与4H2相比是更不有效的。
实施例9：候选抗体的表位作图
实施4H2、15C4和3A11抗体的表位作图。抗体-抗原相互作用在免疫学中是关键事件。因此，抗原中表位或免疫显性区的识别代表潜在的抗体发育的表征中重要的步骤。识别这样的表位的最高效的方式之一是通过使用感兴趣的纯化的多克隆或单克隆抗体，或复合生物混合物(即血清/血浆)培育在肽微阵列上显示的抗原衍生的肽的集。
通过如下进行肽-抗体结合的测定：使用ProArray
Figure GDA0002856221510000441
肽微阵列培育血清或抗体样品，接着使用荧光标记的二次抗体进行培育。
单独地合成所有肽，并且然后使用ProImmune的专利技术结合至ProArray
Figure GDA0002856221510000442
载玻片表面(slide surface)。此最佳过程确保肽以如此方式在阵列上呈递，以便于严密地模拟对应的蛋白质区的性质，规避游离的肽自身固有的生理化学变化和制作相容的、组合的肽和蛋白质阵列平台。测试分析物(肽或蛋白质)以离散的斑点被分配至ProArray
Figure GDA0002856221510000443
载玻片上，并且合适的gal文件使得准确排列的得到的阵列特征能够返回至沉积的分析物。
使用经验证的封闭缓冲液封闭ProArray
Figure GDA0002856221510000444
载玻片以减少血清的非特异性结合。它们然后使用测试样品进行培育，接着使用特异性荧光标记的二次抗体进行培育。在数次清洗步骤后，ProArray
Figure GDA0002856221510000445
阵列被干燥和使用高分辨率荧光微阵列扫描系统进行扫描。
合成代表LRG1的重叠肽并且印刷在ProArray
Figure GDA0002856221510000446
微阵列载玻片上，在选择的鼠IgG对照旁边。使用鼠单克隆抗体样品4H2、15C4和3A11培育载玻片以鉴定推定的表位。从由赞助者提供的序列合成代表LRG1的重叠肽文库。生成重叠10个氨基酸的15-mer合成肽。
使用抗体样品培育包含固定化肽的ProArray
Figure GDA0002856221510000447
载玻片。所有培育载玻片导致高于3×背景的阳性阈值水平的可检测的信号(定义为高于对应的阴性对照特征的3×平均信号强度的平均信号强度)。在所有样品中检测到鼠IgG阳性对照。在对照培育上，在任何肽和二次检测抗体之间没有观察到显著的相互作用。因此，没有表位由于非特异性结合至二次检测抗体而被废弃。
全长Lrg1在所有稀释的4H2、15C4和3A11抗体下被鉴定为结合物(binder)。
一种肽被鉴定为三种4H2、15C4和3A11抗体的靶点(hit)，GNKLQVLGKDLLLPQ(SEQID NO:30)，Lrg1的氨基酸221-235。
实施例10-抗体15C4的人源化。
克隆和测序来自15C4杂交瘤的可变区基因，其导致鉴定VH和Vκ每个的单个独特的序列。鉴定的可变区基因被克隆入载体以生成嵌合抗体，其包括与人IgG4(S241P)重链恒定区和κ轻链恒定区组合的鼠可变区。额外地，使用Composite Human AntibodyTM技术设计一系列的五种人源化VH区和三种人源化Vκ区。
嵌合抗体在HEK EBNA细胞中瞬时表达并且在NS0小鼠骨髓瘤细胞中稳定表达，进行纯化并且在竞争ELISA试验中测试结合至人Lrg1。Nunc Immuno MaxiSorp 96孔平底微滴定板(Fisher，目录号DIS-971-030J)在+4℃下在0.1N碳酸钠缓冲液(NaHCO3)中预涂覆有0.2μg/ml hLrg1(由UCL供应)过夜。第二天，使用PBST清洗板1次并且在室温下使用3％BSA/PBS封闭1小时。在使用PBST清洗3次后，100μg/ml至0.13μg/ml的三倍稀释系列的嵌合小鼠或对照抗体与恒定浓度的生物素化小鼠15C4(0.4μg/ml，最终浓度)预混合，添加至板并且在室温下培育1.5小时。在3次PBST清洗之后，使用链亲和素-HRP(Sigma，目录号S5512)和TMB底物(Invitrogen，目录号00-2023)检测生物素化mAb的结合。使用3M HCl停止反应，在Dynex Technologies MRX TC II酶标仪上读取450nm下的吸光度并且标绘结合曲线。
嵌合和小鼠抗体的比较(图7)显示对于小鼠15C4，嵌合和对照抗体具有非常类似的结合概况，并且IC50值在2倍内。这指示正确的可变区序列已经被鉴定和克隆。不相关的人IgG4抗体没有竞争结合至人Lrg1。
实施例11-序列信息的概述
对于下面描述的每种抗体，CDR在氨基酸序列中是粗体的和加下划线的。
抗体15C4
可变重链(VH)氨基酸序列-SEQ ID NO:1
Figure GDA0002856221510000461
可变轻链(VL)氨基酸序列-SEQ ID NO:2
Figure GDA0002856221510000462
可变重链(VH)核苷酸序列SEQ ID NO:3
CAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGATGAGGTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGTAAGGCTTCTGGCTATACATTCAGTGGCTACTGGATGAACTGGGTGAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTTCAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAATTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCACCCTAACATCTGAGGACTCTGCGATCTATTTCTGTGCAAGATCGATTACTACGGTAGTCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
可变轻链(VL)核苷酸序列SEQ ID NO:4
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGTCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCCAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTTTATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAATTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATACTGCAACATATTACTGTCAGCACAGTTGGGAGATGCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACDR氨基酸序列
VH CDR：CDR1：GYWMN(SEQ ID NO:21)
CDR2：QIYPGDGDTNYNGKFKG(SEQ ID NO:22)
CDR3：SITTVVLDY(SEQ ID NO:23)
VL CDR：CDR1：RASQSVSTSGYSFMH(SEQ ID NO:24)
CDR2：YASNLES(SEQ IFD NO:25)
CDR3：QHSWEMPLT(SEQ ID NO:26)
人源化15C4抗体
可变重链(VH)氨基酸序列VH1-SEQ ID NO:5
Figure GDA0002856221510000471
可变重链(VH)核苷酸序列VH1-SEQ ID NO:6
GTTGCTACGCGTGTCCACTCCCAGGTTCAACTGGTGCAGTCTGGGGATGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCTTCTGGCTATACATTCAGTGGCTACTGGATGAACTGGGTGAAACAGGCCCCTGGACAGGGTCTTCAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAATTCAAGGGTCGGGCCACAATCACTGCCGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCACCCTAACATCTGAGGACTCTGCGATCTATTTCTGTGCAAGATCGATTACTACGGTAGTCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACCGTCACGGTCTCCTCAGGTAAGCTTTCTGGG
CDR氨基酸序列
VH CDR：CDR1：GYWMN(SEQ ID NO:21)
CDR2：QIYPGDGDTNYNGKFKG(SEQ ID NO:22)
CDR3：SITTVVLDY(SEQ ID NO:23)
可变重链(VH)氨基酸序列VH2-SEQ ID NO:7
Figure GDA0002856221510000472
可变重链(VH)核苷酸序列VH2-SEQ ID NO:8
GTTGCTACGCGTGTCCACTCCCAGGTTCAACTGGTGCAGTCTGGGGATGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCTTCTGGCTATACATTCAGTGGCTACTGGATGAACTGGGTGAAACAGGCCCCTGGACAGGGTCTTCAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAATTCAAGGGTCGGGCCACAATCACTGCCGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCTCCCTAACATCTGAGGACACCGCGATCTATTTCTGTGCAAGATCGATTACTACGGTAGTCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACCGTCACGGTCTCCTCAGGTAAGCTTTCTGGG
CDR氨基酸序列
VH CDR：CDR1：GYWMN(SEQ ID NO:21)
CDR2：QIYPGDGDTNYNGKFKG(SEQ ID NO:22)
CDR3：SITTVVLDY(SEQ ID NO:23)
可变重链(VH)氨基酸序列VH3-SEQ ID NO:9
Figure GDA0002856221510000481
可变重链(VH)核苷酸序列VH3-SEQ ID NO:10
GTTGCTACGCGTGTCCACTCCCAGGTTCAACTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCTTCTGGCTATACATTCAGTGGCTACTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGTCTTCAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAATTCAAGGGTAGAGTGACAATCACTGCCGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCTCCCTAACATCTGAGGACACCGCGATCTATTTCTGTGCAAGATCGATTACTACGGTAGTCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGCTTTCTGGG
CDR氨基酸序列
VH CDR：CDR1：GYWMN(SEQ ID NO:21)
CDR2：QIYPGDGDTNYNGKFKG(SEQ ID NO:22)
CDR3：SITTVVLDY(SEQ ID NO:23)
可变重链(VH)氨基酸序列VH4-SEQ ID NO:11
Figure GDA0002856221510000482
可变重链(VH)核苷酸序列VH4-SEQ ID NO:12
GTTGCTACGCGTGTCCACTCCCAGGTTCAACTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCTTCTGGCTATACATTCAGTGGCTACTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAATTCAAGGGTAGAGTGACAATCACTGCCGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCTCCCTAACATCTGAGGACACCGCGATCTATTACTGTGCAAGATCGATTACTACGGTAGTCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGCTTTCTGGG
CDR氨基酸序列
VH CDR：CDR1：GYWMN(SEQ ID NO:21)
CDR2：QIYPGDGDTNYNGKFKG(SEQ ID NO:22)
CDR3：SITTVVLDY(SEQ ID NO:23)
可变重链(VH)氨基酸序列VH5-SEQ ID NO:13
Figure GDA0002856221510000491
可变重链(VH)核苷酸序列VH5-SEQ ID NO:14
GTTGCTACGCGTGTCCACTCCCAGGTTCAACTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCTTCTGGCTATACATTCAGTGGCTACTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAATTCAAGGGTAGAGTGACAATCACTGCCGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCTCCCTACGGTCTGAGGACACCGCGGTGTATTACTGTGCAAGATCGATTACTACGGTAGTCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGCTTTCTGGG
CDR氨基酸序列
VH CDR：CDR1：GYWMN(SEQ ID NO:21)
CDR2：QIYPGDGDTNYNGKFKG(SEQ ID NO:22)
CDR3：SITTVVLDY(SEQ ID NO:23)
可变轻链(VL)氨基酸序列VK1-SEQ ID NO:15
Figure GDA0002856221510000492
可变轻链(VL)核苷酸序列VK1-SEQ ID NO:16
CTCCCAGGCGCGCGATGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGACTCCTTAGCTGTATCTCTGGGTGAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCCAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTTTATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAATTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGGAGGAGGATTTCGCAACATATTACTGTCAGCACAGTTGGGAGATGCCTCTCACGTTCGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTGAGTAGAATTTAAACTTTGCTTCCTCAGTTGGATCCCGC
CDR氨基酸序列
VL CDR：CDR1：RASQSVSTSGYSFMH(SEQ ID NO:24)
CDR2：YASNLES(SEQ IFD NO:25)
CDR3：QHSWEMPLT(SEQ ID NO:26)
可变轻链(VL)氨基酸序列VK2-SEQ ID NO:17
Figure GDA0002856221510000501
可变轻链(VL)核苷酸序列VK2-SEQ ID NO:18
CTCCCAGGCGCGCGATGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGACTCCTTAGCTGTATCTCTGGGTGAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCCAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTTTATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAATTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCCGAGGATTTCGCAACATATTACTGTCAGCACAGTTGGGAGATGCCTCTCACGTTCGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTGAGTAGAATTTAAACTTTGCTTCCTCAGTTGGATCCCGC
CDR氨基酸序列
VL CDR：CDR1：RASQSVSTSGYSFMH(SEQ ID NO:24)
CDR2：YASNLES(SEQ IFD NO:25)
CDR3：QHSWEMPLT(SEQ ID NO:26)
可变轻链(VL)氨基酸序列VK3-SEQ ID NO:19
Figure GDA0002856221510000502
可变轻链(VL)核苷酸序列VK3-SEQ ID NO:20
CTCCCAGGCGCGCGATGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGACTCCTTAGCTGTATCTCTGGGTGAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCCAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTTTATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTGCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCCGAGGATTTCGCAACATATTACTGTCAGCACAGTTGGGAGATGCCTCTCACGTTCGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTGAGTAGAATTTAAACTTTGCTTCCTCAGTTGGATCCCGC
CDR氨基酸序列
VL CDR：CDR1：RASQSVSTSGYSFMH(SEQ ID NO:24)
CDR2：YASNLES(SEQ IFD NO:25)
CDR3：QHSWEMPLT(SEQ ID NO:26)
本发明的抗体的示例性恒定区
恒定重链(CH)氨基酸序列(Igγ2-4_HUMAN)–SEQ ID NO:27
在Mueller J.P.et al.Molecular Immunology vol.34no.6pp 441-452,1997中公布
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
恒定重链(CH)氨基酸序列(Igγ-1_Uniprot登录号：P01857_HUMAN)–SEQ ID NO: 28
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
恒定轻链(CL)氨基酸序列(Igκ链C区Genbank登录号：AAA58989.1_HUMAN)–SEQ ID NO:29
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
人Lrg1的氨基酸序列，NCBI ref：NP_443204.1-SEQ ID NO:31
在实施例9中鉴定的Lrg1的表位是粗体的和加下划线的。
Figure GDA0002856221510000511
Figure GDA0002856221510000521
包括重链可变区VH5和κ轻链可变区VK3的人源化15C4抗体被称为马伽西珠单抗。
实施例12-在Lrg1敲除小鼠中和存在Lrg1拮抗物的情况下肿瘤血管化的正常化
B16/F0和LL/2人肿瘤细胞系被移植入野生型和Lrg1敲除小鼠。
当与野生型小鼠比较时，得到的B16/F0和LL/2肿瘤显示Lrg1敲除中血管数目的减小(图8)，CD31(分化抗原簇(cluster of differentiation)31)是血管的标志物，DAPI是细胞核的标志物。肿瘤的目视检查表明存在较少的小血管。
当血管数目和大小被定量时，显示当与野生型小鼠比较时在Lrg1敲除中存在较小的血管数目的不成比例的减少，大量损失较小的血管(图9)。肿瘤大小显著地降低并且每个肿瘤发现显著较少的分裂细胞，如通过磷酸化组蛋白H3的存在测量的(图9)。
在存在以50mg/kg的浓度使用的抗体15C4的情况下，在野生型小鼠的B16/F0和LL/2肿瘤中模拟这些结果。
采集粘附细胞系B16/F0并且在100μl PBS中1×106个细胞的单细胞悬浮液被皮下注射入C57Bl/6小鼠的下背。使用卡尺每隔一天测量肿瘤，并且使用式：V＝(4/3)×π×(L/2)×(W/2)×(H/2)计算体积。在限定的时间间隔处或在肿瘤达到2000mm3后处死小鼠。使用15C4或IgG的治疗在三天后以50mg/kg通过腹膜内注射开始，并且每3天重复一次。通过肿瘤切片上的CD31免疫组织化学鉴定血管(图11)。在15C4治疗的肿瘤中观察到较少的小血管，正因如此，观察到与IgG对照比较血管大小分布中显著的差异(双因子方差分析，P<0.0001)。
有趣地，还发现当与野生型小鼠比较时，损失Lrg1在Lrg1敲除中导致大和小血管二者上增加的周细胞覆盖度——血管成熟的一种迹象(图10)。α-SMA(平滑肌肌动蛋白)是周细胞的标志物。图像显示在Lrg1敲除中存在较少的未被周细胞覆盖的血管。
在存在抗体15C4的情况下，还在B16/F0肿瘤中模拟这些结果。使用抗LRG1封闭性抗体15C4治疗C57BL6小鼠中的B16F0肿瘤增加内皮和周细胞共定位。通过CD31表达鉴定内皮；通过αSMA或NG2表达(以染色图像在图12中显示和在图13中定量)鉴定周细胞。
这些结果指示在存在抗体15C4的情况下，在Lrg1敲除小鼠的肿瘤中和在野生型小鼠的肿瘤中，血管是更功能性和成熟的。
实施例13-15C4加强顺铂的细胞毒性活性
采集粘附细胞系B16/F0并且100μl PBS中1×106个细胞的单细胞悬浮液被皮下注射入C57Bl/6雄性小鼠的下背。使用15C4或IgG的治疗在三天后以50mg/kg通过腹膜内注射开始，并且每3天重复一次。次佳剂量的顺铂(2.5mg/kg)每隔一天通过腹膜内注射被施用给荷载肿瘤——其具有0.5cm3的平均大小——的小鼠。使用卡尺每隔一天测量肿瘤，并且使用式：V＝(4/3)×π×(L/2)×(W/2)×(H/2)计算体积。
与IgG和顺铂对照比较，使用15C4与顺铂组合治疗的肿瘤展示出肿瘤生长的显著降低(双因子方差分析，P<0.005)(图14A)。与IgG和媒介对照比较，使用15C4治疗的肿瘤展示出类似的生长速率(图14B)。
顺铂和IgG或15C4治疗的肿瘤在4℃下在4％PFA中浸泡固定过夜，并且然后在4℃下在30％蔗糖中浸泡过夜。肿瘤组织然后被OCT包埋和冷冻用于切片(40μm)。根据制造商方案(Merk Millipore,USA)使用ApopTag原位凋亡检测试剂盒进行TUNEL试验。与IgG和顺铂对照相比，在使用15C4与顺铂组合治疗的肿瘤中观察到显著更多的凋亡(单侧学生T检验，P<0.05)(图15)。
DNA双链断裂标志物γ-H2AX在肿瘤切片中被染色，其指示顺铂诱发的DNA损伤。与IgG和顺铂对照相比，在使用15C4与顺铂组合治疗的肿瘤中观察到显著更多的具有γ-H2AX转化灶的核(单侧学生T检验，P<0.05)(图16)。
实施例14-激光诱发的CNV的小鼠模型。
15C4剂量反应分析并与艾力亚比较。
实验被实施为15C4对激光诱发的脉络膜新生血管化的小鼠模型中的病变形成的作用。发现15C4在激光诱发的脉络膜新生血管化的小鼠模型中抑制病变形成(图17)。
图17左边的图像显示了在三次激光烧伤被施加至视网膜色素上皮后7天，正常照明(眼底)下和荧光照明下典型的野生型小鼠视网膜。在全身给药荧光素后～60秒(早期FFA)和再次给药后～7分钟(晚期FFA)捕捉荧光图像。在产生激光的同时，动物接受对照IgG(上图)或15C4(下图)的眼内注射。早期FFA图像显示了病变的大小，并且晚期图像显示荧光素渗漏入视网膜。对于2.5、5和10μg剂量下的15C4，以及2和4μg下的艾力亚定量病变大小，并且％阻断是相对于在对照中观察的平均病变大小的测量值。在右边，使用单独的和组合的艾力亚和马伽西珠单抗(均在2μg下)进行类似的分析。这些实验显示在此模型中，15C4和人源化抗体马伽西珠单抗均以与VEGF阻断剂艾力亚类似的功效抑制病变形成。
在激光诱发的CNV中通过马伽西珠单抗剂量依赖性抑制病变形成
紧接着激光凝固视网膜色素上皮之后，野生型C57B6小鼠被麻醉和接受多种剂量的马伽西珠单抗、艾力亚、或二者组合的玻璃体内注射。在7天后(以使得血管病变形成)，小鼠被再次麻醉和通过荧光素血管造影(FFA)检查。早期FFA图像(在90s后拍摄)显示了病变部位处血管化的程度。测量早期图像中的病变区域允许定量，其中百分数病变大小针对IgG4对照进行归一化(图18)。
与对照比较，使用马伽西珠单抗的治疗——单独地或与艾力亚组合地二者——导致病变大小的显著降低(图18)。
15C4降低JR5558小鼠中的病变形成。
图19还显示当使用15C4治疗时JR5558小鼠中病变数目的降低。从D14每3天以50mg/kg IP施用15C4或IgG。在D25采集眼并且使用胶原IV进行RPE/脉络膜染色。对于两个组进行病变数目的计数和数据定量。在存在15C4的情况下，与对照小鼠相比存在显著较少的病变。
实施例15-马伽西珠单抗的生物化学性质
调查马伽西珠单抗的性质。实施分析尺寸排阻色谱，其显示了单峰和没有聚集体(图20)。实施抗hLRG1竞争ELISA。稀释系列的每种纯化抗体与固定浓度的生物素化小鼠15C4竞争结合至重组hLRG1。使用链亲和素-过氧化物酶和TMB底物检测结合的生物素化小鼠15C4。这是分析步骤，其中数种人源化变体针对嵌合15C4进行测试，以便鉴定保留最佳结合特性的那些。VH5/Vk3_3B6克隆(随后命名为马伽西珠单抗)展示出与嵌合15C4类似的结合概况并且因此被选择为榜样抗体(图20)。
图21上图指示在非还原和还原条件下，马伽西珠单抗在SDS-PAGE上产生与对抗体期望的那些一致的蛋白质条带。
图21下图显示T细胞增殖试验的结果，以检测马伽西珠单抗是否是去免疫的。结果显示马伽西珠单抗(人源化抗体)未能在任何20种供体T细胞样品中引发增殖反应，其与被成功地去免疫的抗体一致。
参考文献
Haupt H.,et al.Physiol Chem.358,639-46(1977).
Takahashi N.,et al.；Proc Natl Acad Sci USA.82,1906-10(1985).
Sun D.,et al.Cancer Lett.89,73-9(1995).
Li X.,et al,Neurosci.Lett.413,141-144(2007).
Wang,X.,et al.Nature 499,306-311(2013).
Carmeliet P.and Jain R.K.Nat.Rev.Drug Discov.10,417-427(2011)
Maes H.,et al.Cancer Cell 26,190-206(2014).
Caceci et al.Byte 9,340-362,(1984).
Wong&Lohman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5428-5432,(1993).
Ivan Roitt,Essential Immunology,1988；
Janis Kuby,Immunology,1992e.g.,pp.79-81.
Thompson et al.Nucleic Acids Res.25,4876-4882(1994).
Devereux,J.et al.Nucl.Acids Res.12,387–395(1984).
Altschul S.F.Mol.Evol.36,290-300(1993).
Altschul,S.F.et al.,J.Mol.Biol.,215,403-410(1990).
Henikoff,S.and Henikoff,J.G.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,10915-10919(1992).
Karlin,S.and Altschul,S.F.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993).
序列表
<110> UCL商业公司
<120> 治疗
<130> N401301WO
<150> GB1503438.2
<151> 2015-02-27
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15C4可变重链
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asp Glu Val Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Thr Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ile Thr Thr Val Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15C4可变轻链
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Phe Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Met Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 15C4可变重链
<400> 3
caggttcaac tgcagcagtc tggggatgag gtggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60
tcctgtaagg cttctggcta tacattcagt ggctactgga tgaactgggt gaaacagagg 120
cctggacagg gtcttcagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac 180
aatggaaaat tcaagggtaa agccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcaccctaac atctgaggac tctgcgatct atttctgtgc aagatcgatt 300
actacggtag tccttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
<210> 4
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 15C4可变轻链
<400> 4
gacattgtgc tgacacagtc tcctgtttcc ttagctgtat ctctgggtca gagggccacc 60
atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctggct atagttttat gcactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaattc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gatgcctctc 300
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4可变重链VH1
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Asp Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Thr Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ile Thr Thr Val Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4可变重链VH1
<400> 6
gttgctacgc gtgtccactc ccaggttcaa ctggtgcagt ctggggatga ggtgaagaag 60
cctgggtcct cagtgaaggt gtcctgtaag gcttctggct atacattcag tggctactgg 120
atgaactggg tgaaacaggc ccctggacag ggtcttcagt ggattggaca gatttatcct 180
ggagatggtg atactaacta caatggaaaa ttcaagggtc gggccacaat cactgccgac 240
aaatccacca gcacagccta catgcagctc agcaccctaa catctgagga ctctgcgatc 300
tatttctgtg caagatcgat tactacggta gtccttgact actggggcca aggcaccacc 360
gtcacggtct cctcaggtaa gctttctggg 390
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15c4可变重链VH2
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Asp Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ile Thr Thr Val Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4可变重链VH2
<400> 8
gttgctacgc gtgtccactc ccaggttcaa ctggtgcagt ctggggatga ggtgaagaag 60
cctgggtcct cagtgaaggt gtcctgtaag gcttctggct atacattcag tggctactgg 120
atgaactggg tgaaacaggc ccctggacag ggtcttcagt ggattggaca gatttatcct 180
ggagatggtg atactaacta caatggaaaa ttcaagggtc gggccacaat cactgccgac 240
aaatccacca gcacagccta catggagctc agctccctaa catctgagga caccgcgatc 300
tatttctgtg caagatcgat tactacggta gtccttgact actggggcca aggcaccacc 360
gtcacggtct cctcaggtaa gctttctggg 390
<210> 9
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4可变重链VH3
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ile Thr Thr Val Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4可变重链VH3
<400> 10
gttgctacgc gtgtccactc ccaggttcaa ctggtgcagt ctggggctga ggtgaagaag 60
cctgggtcct cagtgaaggt gtcctgtaag gcttctggct atacattcag tggctactgg 120
atgaactggg tgcggcaggc ccctggacag ggtcttcagt ggattggaca gatttatcct 180
ggagatggtg atactaacta caatggaaaa ttcaagggta gagtgacaat cactgccgac 240
aaatccacca gcacagccta catggagctc agctccctaa catctgagga caccgcgatc 300
tatttctgtg caagatcgat tactacggta gtccttgact actggggcca aggcaccacg 360
gtcaccgtct cctcaggtaa gctttctggg 390
<210> 11
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4可变重链VH4
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ile Thr Thr Val Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4可变重链VH4
<400> 12
gttgctacgc gtgtccactc ccaggttcaa ctggtgcagt ctggggctga ggtgaagaag 60
cctgggtcct cagtgaaggt gtcctgtaag gcttctggct atacattcag tggctactgg 120
atgaactggg tgcggcaggc ccctggacag ggtcttgagt ggattggaca gatttatcct 180
ggagatggtg atactaacta caatggaaaa ttcaagggta gagtgacaat cactgccgac 240
aaatccacca gcacagccta catggagctc agctccctaa catctgagga caccgcgatc 300
tattactgtg caagatcgat tactacggta gtccttgact actggggcca aggcaccacg 360
gtcaccgtct cctcaggtaa gctttctggg 390
<210> 13
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4可变重链VH5
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ile Thr Thr Val Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4可变重链VH5
<400> 14
gttgctacgc gtgtccactc ccaggttcaa ctggtgcagt ctggggctga ggtgaagaag 60
cctgggtcct cagtgaaggt gtcctgtaag gcttctggct atacattcag tggctactgg 120
atgaactggg tgcggcaggc ccctggacag ggtcttgagt ggattggaca gatttatcct 180
ggagatggtg atactaacta caatggaaaa ttcaagggta gagtgacaat cactgccgac 240
aaatccacca gcacagccta catggagctc agctccctac ggtctgagga caccgcggtg 300
tattactgtg caagatcgat tactacggta gtccttgact actggggcca aggcaccacg 360
gtcaccgtct cctcaggtaa gctttctggg 390
<210> 15
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4可变轻链VK1
<400> 15
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Phe Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Glu Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Met Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 16
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4可变轻链VK1
<400> 16
ctcccaggcg cgcgatgtga cattgtgctg acacagtctc ctgactcctt agctgtatct 60
ctgggtgaga gggccaccat ctcatgcagg gccagccaaa gtgtcagtac atctggctat 120
agttttatgc actggtacca acagaaacca ggacagccac ccaaattcct catcaagtat 180
gcatccaacc tagaatctgg ggtccctgcc aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac 240
ttcaccctca ccatctcttc tctgcaggag gaggatttcg caacatatta ctgtcagcac 300
agttgggaga tgcctctcac gttcggccag gggaccaagc tggagatcaa acgtgagtag 360
aatttaaact ttgcttcctc agttggatcc cgc 393
<210> 17
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4可变轻链VK2
<400> 17
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Phe Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Met Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4可变轻链VK2
<400> 18
ctcccaggcg cgcgatgtga cattgtgctg acacagtctc ctgactcctt agctgtatct 60
ctgggtgaga gggccaccat ctcatgcagg gccagccaaa gtgtcagtac atctggctat 120
agttttatgc actggtacca acagaaacca ggacagccac ccaaattcct catcaagtat 180
gcatccaacc tagaatctgg ggtccctgcc aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac 240
ttcaccctca ccatctcttc tctgcagccc gaggatttcg caacatatta ctgtcagcac 300
agttgggaga tgcctctcac gttcggccag gggaccaagc tggagatcaa acgtgagtag 360
aatttaaact ttgcttcctc agttggatcc cgc 393
<210> 19
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4可变轻链VK3
<400> 19
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Met Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4可变轻链VK3
<400> 20
ctcccaggcg cgcgatgtga cattgtgctg acacagtctc ctgactcctt agctgtatct 60
ctgggtgaga gggccaccat ctcatgcagg gccagccaaa gtgtcagtac atctggctat 120
agttttatgc actggtacca acagaaacca ggacagccac ccaaactgct catcaagtat 180
gcatccaacc tagaatctgg ggtccctgcc aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac 240
ttcaccctca ccatctcttc tctgcagccc gaggatttcg caacatatta ctgtcagcac 300
agttgggaga tgcctctcac gttcggccag gggaccaagc tggagatcaa acgtgagtag 360
aatttaaact ttgcttcctc agttggatcc cgc 393
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4 VH CDR1
<400> 21
Gly Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4 VH CDR2
<400> 22
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4 VH CDR3
<400> 23
Ser Ile Thr Thr Val Val Leu Asp Tyr
1 5
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4 VL CDR1
<400> 24
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4 VL CDR2
<400> 25
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化15C4 VL CDR3
<400> 26
Gln His Ser Trp Glu Met Pro Leu Thr
1 5
<210> 27
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 恒定重链
<400> 27
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 28
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 恒定重链
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 29
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 恒定轻链
<400> 29
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位
<400> 30
Gly Asn Lys Leu Gln Val Leu Gly Lys Asp Leu Leu Leu Pro Gln
1 5 10 15
<210> 31
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人Lrg1
<400> 31
Met Ser Ser Trp Ser Arg Gln Arg Pro Lys Ser Pro Gly Gly Ile Gln
1 5 10 15
Pro His Val Ser Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ser
20 25 30
Ala Trp Gly Val Thr Leu Ser Pro Lys Asp Cys Gln Val Phe Arg Ser
35 40 45
Asp His Gly Ser Ser Ile Ser Cys Gln Pro Pro Ala Glu Ile Pro Gly
50 55 60
Tyr Leu Pro Ala Asp Thr Val His Leu Ala Val Glu Phe Phe Asn Leu
65 70 75 80
Thr His Leu Pro Ala Asn Leu Leu Gln Gly Ala Ser Lys Leu Gln Glu
85 90 95
Leu His Leu Ser Ser Asn Gly Leu Glu Ser Leu Ser Pro Glu Phe Leu
100 105 110
Arg Pro Val Pro Gln Leu Arg Val Leu Asp Leu Thr Arg Asn Ala Leu
115 120 125
Thr Gly Leu Pro Pro Gly Leu Phe Gln Ala Ser Ala Thr Leu Asp Thr
130 135 140
Leu Val Leu Lys Glu Asn Gln Leu Glu Val Leu Glu Val Ser Trp Leu
145 150 155 160
His Gly Leu Lys Ala Leu Gly His Leu Asp Leu Ser Gly Asn Arg Leu
165 170 175
Arg Lys Leu Pro Pro Gly Leu Leu Ala Asn Phe Thr Leu Leu Arg Thr
180 185 190
Leu Asp Leu Gly Glu Asn Gln Leu Glu Thr Leu Pro Pro Asp Leu Leu
195 200 205
Arg Gly Pro Leu Gln Leu Glu Arg Leu His Leu Glu Gly Asn Lys Leu
210 215 220
Gln Val Leu Gly Lys Asp Leu Leu Leu Pro Gln Pro Asp Leu Arg Tyr
225 230 235 240
Leu Phe Leu Asn Gly Asn Lys Leu Ala Arg Val Ala Ala Gly Ala Phe
245 250 255
Gln Gly Leu Arg Gln Leu Asp Met Leu Asp Leu Ser Asn Asn Ser Leu
260 265 270
Ala Ser Val Pro Glu Gly Leu Trp Ala Ser Leu Gly Gln Pro Asn Trp
275 280 285
Asp Met Arg Asp Gly Phe Asp Ile Ser Gly Asn Pro Trp Ile Cys Asp
290 295 300
Gln Asn Leu Ser Asp Leu Tyr Arg Trp Leu Gln Ala Gln Lys Asp Lys
305 310 315 320
Met Phe Ser Gln Asn Asp Thr Arg Cys Ala Gly Pro Glu Ala Val Lys
325 330 335
Gly Gln Thr Leu Leu Ala Val Ala Lys Ser Gln
340 345
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 南非小猿和猕猴Lrg1表位
<400> 32
Gly Asn Lys Leu Gln Glu Leu Gly Lys Asp Leu Ile Val Pro Gln
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠Lrg1表位
<400> 33
Gly Asn Arg Leu Gln Arg Leu Glu Asp Ser Leu Leu Ala Pro Gln
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠Lrg1表位
<400> 34
Gly Asn Arg Leu Gln Arg Leu Glu Ala Gly Leu Leu Ala Pro Gln
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 豚鼠Lrg1表位
<400> 35
Gly Asn Arg Leu Gln Val Leu Glu Glu Asp Leu Leu Ser Pro Gln
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鸡Lrg1表位
<400> 36
Gly Asn Gln Leu Arg Ala Leu Pro Pro Thr Leu Phe Ala Pro Thr
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 猪Lrg1表位
<400> 37
Gly Asn Arg Leu Gln Val Leu Glu Glu Gly Phe Leu Ala Pro Gln
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 绵羊Lrg1表位
<400> 38
Gly Asn Arg Leu Arg Val Leu Gly Glu Gly Leu Leu Ala Pro Gln
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 猫Lrg1表位
<400> 39
Gly Asn Arg Leu Ser Gln Leu Pro Val Glu Leu Leu Glu Pro Leu
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 狗Lrg1表位
<400> 40
Gly Asn Arg Leu Gln Val Leu Glu Glu Gly Leu Leu Ala Pro Gln
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 牛Lrg1表位
<400> 41
Gly Asn Arg Leu Gln Val Leu Gly Glu Gly Leu Leu Ala Pro Gln
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 斑马鱼Lrg1表位
<400> 42
Gln Asn Lys Ile Gln Thr Leu Asp Val Lys Ala Phe Ser Gly Ser
1 5 10 15

Claims (30)

1.抗体或其片段，其特异性地结合至人Lrg1并且其包括SEQ ID NO:21、22、23、24、25和26的CDR。
2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包括SEQ ID NO:1、5、7、9、11或13的重链可变区氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体包括
SEQ ID NO:2、15、17或19的轻链可变区氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体包括：
(a)SEQ ID NO:1的重链可变区和SEQ ID NO:2的轻链可变区；或
(b)SEQ ID NO:1的重链可变区和SEQ ID NO:15的轻链可变区；或
(c)SEQ ID NO:1的重链可变区和SEQ ID NO:17的轻链可变区；或
(d)SEQ ID NO:1的重链可变区和SEQ ID NO:19的轻链可变区；或
(e)SEQ ID NO:5的重链可变区和SEQ ID NO:2的轻链可变区；或
(f)SEQ ID NO:5的重链可变区和SEQ ID NO:15的轻链可变区；或
(g)SEQ ID NO:5的重链可变区和SEQ ID NO:17的轻链可变区；或
(h)SEQ ID NO:5的重链可变区和SEQ ID NO:19的轻链可变区；或
(i)SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:2的轻链可变区；或
(j)SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:15的轻链可变区；或
(k)SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:17的轻链可变区；或
(l)SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:19的轻链可变区；或
(m)SEQ ID NO:9的重链可变区和SEQ ID NO:2的轻链可变区；或
(n)SEQ ID NO:9的重链可变区和SEQ ID NO:15的轻链可变区；或
(o)SEQ ID NO:9的重链可变区和SEQ ID NO:17的轻链可变区；或
(p)SEQ ID NO:9的重链可变区和SEQ ID NO:19的轻链可变区；或
(q)SEQ ID NO:11的重链可变区和SEQ ID NO:2的轻链可变区；或
(r)SEQ ID NO:11的重链可变区和SEQ ID NO:15的轻链可变区；或
(s)SEQ ID NO:11的重链可变区和SEQ ID NO:17的轻链可变区；或
(t)SEQ ID NO:11的重链可变区和SEQ ID NO:19的轻链可变区；或
(u)SEQ ID NO:13的重链可变区和SEQ ID NO:2的轻链可变区；或
(v)SEQ ID NO:13的重链可变区和SEQ ID NO:15的轻链可变区；或
(w)SEQ ID NO:13的重链可变区和SEQ ID NO:17的轻链可变区；或
(x)SEQ ID NO:13的重链可变区和SEQ ID NO:19的轻链可变区。
5.抗体或其片段，其特异性地结合至Lrg1，其包括SEQ ID NO:1、5、7、9、11或13的CDR和SEQ ID NO:2、15、17或19的CDR。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或其片段，其以1nM或更小的亲和力结合至Lrg1。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或其片段，其包括是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4区的Fc区。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段或scFv抗体。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段，其缀合至额外的部分。
10.多核苷酸或包括所述多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其片段的重链或轻链可变区。
11.宿主细胞，其表达根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其片段。
12.组合物，其包括根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其片段，以及至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其片段在制造用于治疗血管增生性病症的药物中的用途。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其片段在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
15.根据权利要求14所述的抗体或其片段的用途，其中所述癌症选自脑癌、乳腺癌、肾癌、结肠直肠癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、宫颈癌、骨癌、卵巢癌、睾丸癌和肝癌。
16.根据权利要求13所述的抗体或其片段的用途，其中所述血管增生性病症包括新生血管化、血管内皮细胞增殖、血管发生、毛细血管扩张或微动脉瘤。
17.根据权利要求13所述的抗体或其片段的用途，其中所述血管增生性病症是眼的血管增生性病症。
18.根据权利要求17所述的抗体或其片段的用途，其中眼的病症选自糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病、黄斑毛细血管扩张、年龄相关性黄斑变性或脉络膜新生血管化。
19.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其片段在制造用于治疗展示出血管增生的肿瘤的药物中的用途。
20.根据权利要求19所述的抗体或其片段的用途，其中所述肿瘤选自脑瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、结肠直肠肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤、头颈肿瘤、胃肿瘤、胰腺肿瘤、皮肤肿瘤、宫颈肿瘤、骨肿瘤、卵巢肿瘤、膀胱肿瘤和肝肿瘤。
21.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其片段与抗血管发生化合物组合在制造用于治疗血管增生的药物中的用途。
22.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其片段与抗癌剂组合在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
23.根据权利要求21所述的抗体或其片段的用途，其中所述抗血管发生化合物是血管内皮生长因子(VEGF)的拮抗物或VEGF的可溶性受体。
24.根据权利要求23所述的抗体或其片段的用途，其中所述VEGF拮抗物是抗VEGF抗体。
25.根据权利要求23所述的抗体或其片段的用途，其中所述VEGF拮抗物是阿柏西普。
26.根据权利要求21所述的抗体或其片段的用途，其用于制造治疗眼的血管增生性病症的药物。
27.根据权利要求23所述的抗体或其片段的用途，其中所述VEGF拮抗物是贝伐单抗或雷珠单抗。
28.根据权利要求21所述的抗体或其片段的用途，其用于制造治疗癌症的药物。
29.根据权利要求28所述的抗体或其片段的用途，其中所述癌症选自脑癌、乳腺癌、肾癌、结肠直肠癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、宫颈癌、骨癌、卵巢癌、睾丸癌和肝癌。
30.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其片段与细胞毒性化合物或免疫治疗剂组合在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
CN201680024425.3A 2015-02-27 2016-02-22 治疗 Active CN107614524B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB201503438A GB201503438D0 (en) 2015-02-27 2015-02-27 Antibodies
GB1503438.2 2015-02-27
PCT/GB2016/050439 WO2016135462A1 (en) 2015-02-27 2016-02-22 Treatment

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107614524A CN107614524A (zh) 2018-01-19
CN107614524B true CN107614524B (zh) 2021-08-10

Family

ID=52876316

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680024425.3A Active CN107614524B (zh) 2015-02-27 2016-02-22 治疗

Country Status (9)

Country Link
US (2) US10556007B2 (zh)
EP (1) EP3262069B1 (zh)
JP (1) JP6925274B2 (zh)
CN (1) CN107614524B (zh)
CA (1) CA2977888A1 (zh)
ES (1) ES2831651T3 (zh)
GB (1) GB201503438D0 (zh)
PL (1) PL3262069T3 (zh)
WO (1) WO2016135462A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11339222B2 (en) * 2016-06-03 2022-05-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. KLRG1 antagonist signaling therapy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011027129A1 (en) * 2009-09-04 2011-03-10 Ucl Business Plc Treatment of vasculoproliferative conditions
WO2013132267A1 (en) * 2012-03-09 2013-09-12 Ucl Business Plc Treatment of cancer

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996006641A1 (en) 1994-08-29 1996-03-07 Prizm Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of vascular endothelial growth factor with targeted agents
AU5087799A (en) 1998-07-06 2000-01-24 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods of inhibiting proliferative diseases by inhibiting tgf-beta mediated angiogenesis
WO2005027733A2 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Ppd Biomarker Discovery Sciences, Llc Biological markers for diagnosing multiple sclerosis
KR101390127B1 (ko) 2005-09-07 2014-05-13 암젠 프레몬트 인코포레이티드 액티빈 수용체 유사 키나제-1에 대한 인간 모노클로날 항체
US7416850B2 (en) 2006-01-25 2008-08-26 Jemmerson Ronald R Cytochrome c and leucine-rich alpha-2-glycoprotein-1 assays, methods and antibodies
AU2007299804A1 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. MiR-200 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
EP2104734A2 (en) 2006-12-08 2009-09-30 Asuragen, INC. Mir-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
CA2671270A1 (en) 2006-12-29 2008-07-17 Asuragen, Inc. Mir-16 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
WO2008092214A1 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Minomic International Limited Biomarkers for diabetes
EP2167138A2 (en) 2007-06-08 2010-03-31 Asuragen, INC. Mir-34 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
BRPI0817063A2 (pt) 2007-11-09 2015-03-24 Genentch Inc "métodos de inibição, para o tratamento de uma condição patológica, para a inibição de linfagiogênese tumoral, de inibição ou prevenção,de desorganização, para inibição de crescimento de tumor, de tratamento, de acentuação da eficácia de um agente anti-angiogênese e antagonista de alk-1
WO2009070805A2 (en) 2007-12-01 2009-06-04 Asuragen, Inc. Mir-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
EP2462164A2 (en) 2009-08-04 2012-06-13 Biosystems International SAS Lung cancer biomarkers
SI2835053T1 (sl) * 2010-03-12 2016-09-30 Genzyme Corporation Kombinirana terapija za zdravljenje raka dojke
WO2013177386A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Biotherapeutics Inc. Biomarkers for predicting response to tweak receptor (tweakr) agonist therapy

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011027129A1 (en) * 2009-09-04 2011-03-10 Ucl Business Plc Treatment of vasculoproliferative conditions
WO2013132267A1 (en) * 2012-03-09 2013-09-12 Ucl Business Plc Treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
US20180028609A1 (en) 2018-02-01
US10556007B2 (en) 2020-02-11
JP6925274B2 (ja) 2021-08-25
GB201503438D0 (en) 2015-04-15
US20200330591A1 (en) 2020-10-22
WO2016135462A1 (en) 2016-09-01
JP2018511306A (ja) 2018-04-26
ES2831651T3 (es) 2021-06-09
EP3262069A1 (en) 2018-01-03
PL3262069T3 (pl) 2021-04-19
CA2977888A1 (en) 2016-09-01
WO2016135462A8 (en) 2017-09-21
CN107614524A (zh) 2018-01-19
EP3262069B1 (en) 2020-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6827583B2 (ja) Ｄｌｌ３及びｃｄ３に結合する二重特異性抗体構築物
KR102688969B1 (ko) Bcma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물
TWI796283B (zh) Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
CN109476734B (zh) Cd70和cd3的抗体构建体
CN107922495B (zh) 结合egfrviii和cd3的双特异性抗体构建体
KR20180101623A (ko) Psma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물
KR20180104137A (ko) 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물
KR20180030852A (ko) Flt3 및 cd3을 위한 항체 작제물
CN114230667A (zh) 抗cd3抗体、抗cd123抗体和与cd3和/或cd123特异性结合的双特异性抗体
KR20150134322A (ko) Ｃｄｈ19 및 ｃｄ3에 대한 항체 작제물
CA2500978A1 (en) Antibodies and cyclic peptides which bind cea (carcinoembryonic antigen) and their use as cancer therapeutics
CN116063541A (zh) 用于cdh3和cd3的双特异性抗体构建体
CN111630067A (zh) 针对muc17和cd3的双特异性抗体构建体
JP2022547850A (ja) 抗ｔｉｇｉｔ免疫阻害剤及び応用
JP2022523710A (ja) Ｃｄ４４に特異的な抗体
JP2022514693A (ja) Ｍｕｃ１８に特異的な抗体
JP2022514786A (ja) Ｍｕｃ１８に特異的な抗体
CN107614524B (zh) 治疗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: England Atsushi

Applicant after: UCL BUSINESS PLC

Address before: England Atsushi

Applicant before: UCL Business PLC

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant