CN107922495B - 结合egfrviii和cd3的双特异性抗体构建体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种双特异性抗体构建体，其包含结合靶细胞表面上的人EGFRVIII的第一结合结构域和结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域。此外，本发明提供编码所述抗体构建体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体以及经所述多核苷酸或载体转化或转染的宿主细胞。另外，本发明提供了一种生产本发明的抗体构建体的方法、所述抗体构建体的医疗用途以及包含所述抗体构建体的试剂盒。

Description

结合EGFRVIII和CD3的双特异性抗体构建体
本发明涉及一种双特异性抗体构建体，其包含结合靶细胞表面上的人EGFRVIII的第一结合结构域和结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域。此外，本发明提供编码所述抗体构建体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体以及由所述多核苷酸或载体转化或转染的宿主细胞。另外，本发明提供了一种生产本发明的抗体构建体的方法、所述抗体构建体的医疗用途以及包含所述抗体构建体的试剂盒。
EGFRvIII是由伴随EGFR基因扩增的基因重排引起的几种EGFR变体之一。EGFRvIII由EGFR的胞外结构域中267个氨基酸的框内缺失组成。EGFRvIII是人癌症中表皮生长因子(EGF)受体的最常见变体。在基因扩增的过程中，胞外结构域发生267个氨基酸的缺失，形成可以作为单克隆抗体的肿瘤特异性新表位新接合点。EGF受体的这种变体以独立于配体的方式通过组成型信号传导来促进肿瘤进展。还未发现EGFRvIII在任何正常组织上的表达。EGFRvIII表达的优异肿瘤选择性使得EGFRvIII成为用BiTE抗体构建体靶向的理想抗原。EGFRvIII对肿瘤进展的贡献表明癌细胞对EGFRvIII表达的依赖性，并且因此进一步支持其适合作为靶标。
已经显示EGFRvIII经常在两种类型的恶性中枢神经系统肿瘤(即多形性胶质母细胞瘤和间变性星形细胞瘤)中表达。对于这两种疾病，都存在未被满足的重要医疗需求。这点可以由护理标准下的恶劣总生存率例证，其中多形性胶质母细胞瘤的2年期总生存率为13.6％，而间变性星形细胞瘤的5年期总生存率为25.9％。目前，多形性胶质母细胞瘤的护理标准由肿瘤的手术切除组成，其最常受制于肿瘤的弥漫生长模式以及需要保留大脑的功能性重要区域。手术后接着进行辅助照射和化疗。对于根据目前的护理标准治疗的多形性胶质母细胞瘤和间变性星形细胞瘤，复发是常态，并且几乎在所有患者中最终都是致命的结果。
EGFRvIII在多形性胶质母细胞瘤和间变性星形细胞瘤中的表达组成性激活PI3激酶信号传导途径，并且与多形性胶质母细胞瘤和间变性星形细胞瘤中的恶化预后相关。还已经描述了EGFRvIII与CD133共表达并且限定多形性胶质母细胞瘤中的癌症干细胞群(Emlet等人，Cancer Res，2014，74(4)：1238-49)。此外，已经证实，通过细胞间抗原转移的机制，EGFRvIII可以转移到抗原阴性肿瘤细胞的细胞表面。通过这种机制，EGFRvIII的表达异质性(其已在一些多形性胶质母细胞瘤中显示)可以作为治疗功效的障碍被克服，特别是在使用EGFRvIII特异性BiTE抗体构建体的情况下，从而提供针对由细胞间抗原转移造成的潜在低水平靶抗原的作用补偿的高效细胞毒性模式。
EGFRvIII表达在其它几种肿瘤实体中也有描述(Wikstrand，CJ.等人，CancerResearch 55(14)：3140-3148(1995)；Ge H.等人，Int J Cancer.98(3)：357-61(2002)；Moscatello，G.等人，Cancer Res.55(23)：5536-9(1995)；Garcia de Palazzo，IE.等人，Cancer Res.53(14)：3217-20(1993)；Olapade-Olaopa，EO.等人，Br J Cancer.82(1)：186-94(2000))。因此，鉴于EGFRvIII的精确的肿瘤选择性，用EGFRvIII特异性BiTE抗体构建体治疗也可能对其它选择的癌症类型或亚型有益。潜在地选择待治疗的癌症类型、亚型或患者可以通过测试EGFRvIII在肿瘤中的表达的各种方法来指导。
由于仍然需要更多的可用于治疗与EGFRVIII过表达有关的实体瘤疾病(例如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、中枢神经系统癌)的选项，本文提供了通过双特异性抗体构建体来解决此问题的手段和方法，所述双特异性抗体构建体具有针对肿瘤靶细胞表面上的EGFRVIII的结合结构域和针对T细胞表面上的CD3的第二结合结构域。
因此，在第一方面，本发明提供一种双特异性抗体构建体，其包含结合靶细胞表面上的人和猕猴EGFRVIII的第一结合结构域和结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域，其中所述第一结合结构域包含如SEQ ID NO：157中所示的多肽和如SEQ ID NO：158中所示的多肽。
必须注意的是，除非上下文另外明确说明，否则如本文中所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”包括复数形式。因此，例如，提及“一种试剂”包括一种或多种此类不同的试剂，并且提及“该方法”包括提及本领域普通技术人员已知的可以被修改或替代本文所述的方法的等效步骤和方法。
除非另外指明，否则用在一系列要素之前的术语“至少”应被理解为指的是该系列中的每个要素。本领域技术人员仅利用常规实验就将认识到或能够确定本文所描述的本发明的具体实施方案的许多等效物。这些等效物旨在涵盖于本发明中。
无论在本文中何处使用，术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的要素的全部或任何其它组合”的含义。
如本文中所用，术语“约”或“近似”意指在给定值或范围的±20％以内，优选在±15％以内，更优选在±10％以内，并且最优选在±5％以内。
在整篇说明书和随附权利要求书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”和其变型如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为暗示包括陈述的整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”代替，或者有时当在本文中使用时，可以用术语“具有”代替。
当在本文中使用时，“由......组成”不包括未在所要求的要素中指定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由......组成”不排除不实质上影响该要求的基本和新颖特征的材料或步骤。
在本文中的每种情况下，术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一个可以用另外两个术语中的任一个来代替。
术语“抗体构建体”是指其中结构和/或功能基于例如全长或完整免疫球蛋白分子的抗体的结构和/或功能的分子。因此，抗体构建体能够结合其特定靶标或抗原。此外，根据本发明的抗体构建体包含允许靶结合的抗体最低结构要求。该最低要求可以例如被限定为存在至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)，优选存在所有6个CDR。本发明构建体所基于的抗体包括例如单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体和人抗体。
全长或完整抗体涵盖于根据本发明的“抗体构建体”的定义内，其还包括通过生物技术或蛋白质工程方法或处理产生的骆驼抗体和其它免疫球蛋白抗体。这些全长抗体可以是例如单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体和人抗体。同样在“抗体构建体”的定义内的是全长抗体的片段，如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab′、F(ab′)2或“r IgG”(“半抗体”)。根据本发明的抗体构建体还可以是抗体的修饰片段(也称为抗体变体)，如scFv、di-scFv或bi(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉链、scFab、Fab2、Fab3、双抗体、单链双抗体、串联双抗体(Tandab′s)、串联di-scFv、串联tri-scFv；“微抗体”，其结构示例如下：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2、((scFv)2-CH3+CH3)、((scFv)2-CH3)或(scFv-CH3-scFv)2；多抗体如三抗体或四抗体；以及单结构域抗体，如纳米抗体或仅包含一个可变结构域(其可以是VHH、VH或VL)的单可变结构域抗体，其独立于其它V区或结构域而特异性结合抗原或表位。
结合结构域通常可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；但是，它无须同时包含两者。例如，Fd片段具有两个VH区，并且经常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体片段、抗体变体或结合结构域的形式的其它实例包括：(1)Fab片段，具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab′)2片段，具有通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(3)具有VH和CH1两个结构域的Fd片段；(4)具有抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段；(5)具有VH结构域的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)；(6)分离的互补决定区(CDR)；和(7)单链Fv(scFv)，后者是优选的(例如，源自scFV文库)。根据本发明的抗体构建体的实施方案的实例描述于例如WO 00/006605、WO 2005/040220、WO2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US2014/0302037、WO 2014/144722、WO 2014/151910和WO 2015/048272中。
此外，术语“抗体构建体”的定义包括单价、二价和多价构建体，并且因此包括特异性结合仅一个抗原结构的单特异性构建体，以及通过不同的结合结构域特异性结合多于一个抗原结构(例如两个、三个或更多个)的双特异性和多特异性构建体。此外，术语“抗体构建体”的定义包括仅由一个多肽链组成的分子，以及由多于一个多肽链组成的分子，所述链可以是相同的(同二聚体、同三聚体或同寡聚体)或不同的(异二聚体、异三聚体或异寡聚体)。上述抗体及其变体或衍生物的实例尤其描述于Harlow和Lane，Antibodies alaboratory manual，CSHL Press(1988)和Using Antibodies：a laboratory manual，CSHLPress(1999)；Kontermann和Dübel，Antibody Engineering，Springer，第2版，2010以及Little，Recombinant Antibodies for Immunotherapy，Cambridge University Press2009中。
本发明的抗体构建体优选为“体外产生的抗体构建体”。该术语是指根据上述定义的抗体构建体，其中全部或部分可变区(例如，至少一个CDR)是在非免疫细胞选择(例如体外噬菌体展示)、蛋白质芯片或其中可以测试候选序列的抗原结合能力的任何其它方法中产生。因此，该术语优选不包括仅由动物免疫细胞中的基因组重排产生的序列。“重组抗体”是通过使用重组DNA技术或基因工程制造的抗体。
如本文中所用，术语“单克隆抗体(mAb)”或单克隆抗体构建体是指从基本上均质性抗体的群体(即，除了可以少量存在的可能的天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)外，构成该群体的个别抗体是相同的)获得的抗体。与通常包含针对不同决定簇(或表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，单克隆抗体高度特异性地针对抗原上的单一抗原性位点或决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们是通过杂交瘤培养合成，因此未被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示获自基本上均质的抗体群体的抗体特性，并且不应被解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。
为了制备单克隆抗体，可以使用提供由连续细胞系培养产生的抗体的任何技术。例如，待使用的单克隆抗体可以通过由Koehler等人，Nature，256：495(1975)最先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利第4,816,567号)。用于产生人单克隆抗体的其它技术的实例包括三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor，Immunology Today 4(1983)，72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.(1985)，77-96)。
然后可以使用标准方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离振子共振(BIACORETM)分析)筛选杂交瘤，以鉴别产生与特定抗原特异性结合的抗体的一种或多种杂交瘤。可以使用任何形式的相关抗原作为免疫原，例如重组抗原、天然存在的形式、其任何变体或片段，以及其抗原肽。在BIAcore系统中使用的表面等离振子共振可用于增加结合靶抗原(例如EGFRVIII或CD3ε)表位的噬菌体抗体的效率(Schier，Human AntibodiesHybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。
制备单克隆抗体的另一种示例性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体展示文库或核糖体展示文库。噬菌体展示描述于例如Ladner等人，美国专利第5,223,409号；Smith(1985)Science 228：1315-1317；Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中。
除了使用展示文库之外，可以使用相关抗原使非人动物，例如啮齿动物(如小鼠、仓鼠、兔或大鼠)免疫。在一个实施方案中，非人动物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可以使用人Ig(免疫球蛋白)基因座的大片段来工程改造缺乏小鼠抗体产生的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可以产生并选择衍生自具有所需特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见例如，XENOMOUSETM；Green等人(1994)Nature Genetics 7：13-21；US 2003-0070185；WO 96/34096和WO 96/33735。
还可以从非人动物获得单克隆抗体，然后使用本领域已知的重组DNA技术加以修饰，例如人源化、去免疫化、嵌合等。修饰的抗体构建体的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和力成熟”抗体(参见例如Hawkins等人，J.Mol.Biol.254，889-896(1992)和Lowman等人，Biochemistry 30，10832-10837(1991))和具有改变的效应功能的抗体突变体(参见例如美国专利5,648,260；Kontermann和Dübel(2010)，在上述引文中；和Little(2009)，在上述引文中)。
在免疫学中，亲和力成熟是其中B细胞在免疫反应期间产生对抗原的亲和力增加的抗体的过程。随着反复暴露于相同的抗原，宿主将产生亲和力相继更高的抗体。与天然原型一样，体外亲和力成熟是基于突变和选择的原理。体外亲和力成熟已被成功用于优化抗体、抗体构建体和抗体片段。使用辐射、化学诱变剂或易错PCR引入CDR内的随机突变。另外，可以通过链改组来增加遗传多样性。使用展示方法如噬菌体展示的两轮或三轮突变和选择通常产生具有低纳摩尔浓度范围内的亲和力的抗体片段。
所述抗体构建体的氨基酸替代变型的优选类型涉及替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生该变体的亲本抗体将具有改善的生物学性质。用于产生这种替代变体的方便方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简单来说，使几个高变区位点(例如6-7个位点)突变以在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。由此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒作为包封在每个颗粒内的M13的基因III产物的融合物展示。然后，如本文所公开，将噬菌体展示变体针对其生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。为了鉴别待修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴别对抗原结合有显著贡献的高变区残基。或者或另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴别结合结构域与例如人EGFRVIII之间的接触点可以是有益的。此类接触残基和相邻残基是根据本文阐述的技术进行替代的候选者。一旦产生这样的变体，就如本文所述对这组变体进行筛选，并且可以在一个或多个相关测定中选择具有优异性质的抗体用于进一步开发。
本发明的单克隆抗体和抗体构建体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列以及此类抗体的片段相同或同源，只要它们展现出所需的生物活性即可(美国专利第4,816,567号；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文中的目标嵌合抗体包括包含源自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体。已经描述了各种制备嵌合抗体的方法。参见例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.81：6851，1985；Takeda等人，Nature 314：452，1985；Cabilly等人，美国专利第4,816,567号；Boss等人，美国专利第4,816,397号；Tanaguchi等人，EP 0171496；EP 0173494；和GB 2177096。
还可以通过人T细胞表位的特异性缺失(称为“去免疫化”的方法)，使用例如WO98/52976或WO 00/34317中公开的方法来修饰抗体、抗体构建体、抗体片段或抗体变体。简而言之，可以针对结合MHC II类的肽分析抗体的重链和轻链可变结构域；这些肽代表潜在的T细胞表位(如WO 98/52976和WO 00/34317中所定义)。为了检测潜在的T细胞表位，可以应用被称为“肽穿线”的计算机建模方法，并且另外可以搜索人MHC II类结合肽的数据库中存在于VH和VL序列中的基序，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。这些基序与18个主要的MHC II类DR同种异型中的任一个结合，从而构成潜在的T细胞表位。检测到的潜在T细胞表位可以通过替代可变结构域中的少量氨基酸残基或优选通过单个氨基酸替代来消除。通常，进行保守替代。经常(但不仅限于)使用人种系抗体序列中位置上常见的氨基酸。人种系序列公开于例如Tomlinson等人(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；Cook，G.P.等人(1995)Immunol.Today Vol.16(5)：237-242；和Tomlinson等人(1995)EMBO J.14：14：4628-4638中。VBASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由Tomlinson，LA.等人，MRCCentre for Protein Engineering，Cambridge，UK编纂)。这些序列可以用作人序列的来源，例如，用于框架区和CDR。还可以使用共有的人框架区，例如如美国专利第6,300,064号中所述。
“人源化”抗体、抗体构建体、其变体或片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)是主要为人序列的抗体或免疫球蛋白，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。对于主要部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区(还有CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人(例如啮齿动物)物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠、仓鼠或兔)的高变区的残基置换。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基置换。此外，如本文所用的“人源化抗体”还可以包含未发现于受体抗体和供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步改善和优化抗体性能。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。有关更多细节，参见Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。
人源化抗体或其片段可以通过用来自人Fv可变结构域的等效序列置换不直接参与抗原结合的Fv可变结构域的序列来产生。用于产生人源化抗体或其片段的示例性方法由Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques 4：214；以及US 5,585,089、US 5,693,761、US 5,693,762、US 5,859,205和US 6,407,213提供。这些方法包括分离、操作和表达编码来自重链或轻链中的至少一个的全部或部分免疫球蛋白Fv可变结构域的核酸序列。这样的核酸可以从产生针对预定靶标的抗体的杂交瘤获得(如上所述)，以及从其它来源获得。然后可以将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆到合适的表达载体中。
人源化抗体还可以使用转基因动物如表达人重链和轻链基因但不能表达内源小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的小鼠来产生。Winter描述了可用于制备本文所述的人源化抗体的示例性CDR嫁接方法(美国专利第5,225,539号)。特定人抗体的所有CDR可以被非人CDR的至少一部分置换，或者仅一些CDR可以被非人CDR置换。只需要将人源化抗体结合预定抗原所需的CDR数量置换即可。
可以通过引入保守替代、共有序列替代、种系替代和/或回复突变来优化人源化抗体。这种改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域中已知的几种技术中的任一种来制备(例如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：7308-7312，1983；Kozbor等人，ImmunologyToday，4：7279，1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.，92：3-16，1982以及EP 239 400)。
术语“人抗体”、“人抗体构建体”和“人结合结构域”包括具有抗体区(例如基本上对应于本领域已知的人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区或可变和恒定结构域)的抗体、抗体构建体和结合结构域，包括例如由Kabat等人(1991)(在上述引文中)描述的那些。本发明的人抗体、抗体构建体或结合结构域可以例如在CDR中，特别是在CDR3中包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。所述人抗体、抗体构建体或结合结构域可以具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个经不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基置换的位置。如本文中所用的人抗体、抗体构建体和结合结构域的定义还考虑了完全人抗体，其仅包括非人工和/或遗传改变的人抗体序列，如可以通过使用诸如Xenomouse的技术或系统衍生的抗体序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体构建体是“分离的”或“基本上纯的”抗体构建体。当用于描述本文公开的抗体构建体时，“分离的”或“基本上纯的”是指从其生产环境的组分中鉴别、分离和/或回收的抗体构建体。优选地，抗体构建体不与或基本上不与来自其生产环境的所有其它组分结合。其生成环境的污染物组分(例如源自重组转染细胞的污染物)是通常将会干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。抗体构建体可以例如占给定样品中的总蛋白质的至少约5重量％，或至少约50重量％。应理解的是，根据情况，分离的蛋白质可以占总蛋白质含量的5重量％至99.9重量％。通过使用诱导型启动子或高表达启动子，可以制备具有显著更高浓度的多肽，从而以增加的浓度水平制备多肽。该定义包括在本领域已知的多种生物体和/或宿主细胞中产生抗体构建体。在优选的实施方案中，抗体构建体将(1)通过使用转杯式测序仪被纯化至足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(2)通过SDS-PAGE在非还原或还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色剂纯化至均匀。然而，通常将通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体构建体。
根据本发明，术语“结合结构域”表征与靶分子(抗原，在此分别为EGFRVIII和CD3)上的给定靶表位或给定靶位点(特异性)结合/相互作用或识别所述给定靶表位或给定靶位点的结构域。第一结合结构域(识别EGFRVIII)的结构和功能，以及优选还有第二结合结构域(识别CD3)的结构和/或功能是基于抗体(例如全长或完整的免疫球蛋白分子)的结构和/或功能。根据本发明，第一结合结构域的特征在于存在三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。第二结合结构域优选还包含允许靶结合的抗体最低结构要求。更优选地，第二结合结构域包含至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。设想第一和/或第二结合结构域由噬菌体展示或文库筛选方法产生或可由其获得，而不是通过将来自预先存在的(单克隆)抗体的CDR序列嫁接到支架中来产生或获得。
根据本发明，结合结构域是一种或多种多肽的形式。此类多肽可以包括蛋白质部分和非蛋白质部分(例如化学接头或化学交联剂如戊二醛)。蛋白质(包括其片段，优选生物活性片段和通常具有少于30个氨基酸的肽)包含经由共价肽键彼此偶联的两个或更多个氨基酸(产生氨基酸链)。如本文中所用的术语“多肽”描述了通常由多于30个氨基酸组成的一组分子。多肽可以进一步形成多聚体，例如二聚体、三聚体和更高级的寡聚体，即由多于一个多肽分子组成。形成此类二聚体、三聚体等的多肽分子可以是相同的或不同的。因此，此类多聚体的相应的更高级结构被称为同源或异源二聚体、同源或异源三聚体等。异源多聚体的一个实例是抗体分子，其天然存在形式由两条相同的轻多肽链和两条相同的重多肽链组成。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”还指天然修饰的肽/多肽/蛋白质，其中修饰是例如通过翻译后修饰如糖基化、乙酰化、磷酸化等来实现。当在本文中被提及时，“肽”、“多肽”或“蛋白质”还可以是经化学修饰的，例如聚乙二醇化。这样的修饰是本领域中熟知的，并且描述于下文中。
优选地，结合EGFRVIII的结合结构域和/或结合CD3的结合结构域是人结合结构域。包含至少一个人结合结构域的抗体和抗体构建体避免了与具有非人(如啮齿动物(例如鼠、大鼠、仓鼠或兔))可变区和/或恒定区的抗体或抗体构建体有关的一些问题。这种啮齿动物来源的蛋白质的存在可以导致抗体或抗体构建体的快速清除，或者可以导致患者产生针对抗体或抗体构建体的免疫反应。为了避免使用衍生自啮齿动物的抗体或抗体构建体，可以通过将人抗体功能引入啮齿动物以使其产生完全人抗体来产生人或完全人抗体/抗体构建体。
在YAC中克隆和重构兆碱基大小的人基因座并将其引入小鼠种系中的能力提供了阐明非常大的或粗略绘制的基因座的功能组分以及产生有用的人疾病模型的有力方法。此外，使用这种技术将小鼠基因座替代为其人等效物能够提供对发育期间人基因产物的表达和调控、与其它系统的通信以及其在疾病诱导和进展中的参与的独特理解。
这种策略的一种重要的实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入内源性Ig基因已经失活的小鼠中为研究抗体的程序化表达和组装的潜在机制及其在B细胞发育中的作用提供了机会。此外，这种策略可以为完全人单克隆抗体(mAb)的生产提供理想来源，从而成为实现人疾病的抗体治疗前景的重要里程碑。预期完全人抗体或抗体构建体使小鼠mAb或小鼠来源的mAb所固有的免疫原性和变应性反应最小化，从而增加施用的抗体/抗体构建体的功效和安全性。可以预期使用完全人抗体或抗体构建体在治疗需要重复化合物施用的慢性和复发性人疾病(例如炎症、自身免疫和癌症)中提供很大的优势。
实现这一目标的一种方法是用人Ig基因座的大片段工程改造具有小鼠抗体产生缺陷的小鼠品系，预期这些小鼠在小鼠抗体不存在的情况下将产生大的人抗体组库。大的人Ig片段将保持大的可变基因多样性以及抗体产生和表达的适当调节。通过利用小鼠机制实现抗体多样化和选择以及对人蛋白质的免疫耐受性的缺乏，在这些小鼠品系中再产生的人抗体组库应该产生针对包括人抗原在内的任何目标抗原的高亲和力抗体。使用杂交瘤技术，可以容易地产生和选择具有所需特异性的抗原特异性人mAb。结合第一代XenoMouse小鼠品系的产生展示了这种一般策略(参见Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994))。所述XenoMouse品系被包含分别为人重链基因座和κ轻链基因座的245kb和190kb大小的种系构型片段的酵母人工染色体(YAC)工程改造，所述片段含有核心可变区和恒定区序列。含有人Ig的YAC被证明与小鼠体系在抗体的重排和表达上相容，并且能够替代失活的小鼠Ig基因。这是由其诱导B细胞发育、产生完全人抗体的成人样人组库和产生抗原特异性人mAb的能力表现。这些结果还表明，引入含有更多数目的V基因的人Ig基因座的更大部分、额外的调控元件和人Ig恒定区可能重述具有对感染和免疫的人体液反应的特征的基本上完整的组库。Green等人的工作最近扩展到通过分别引入人重链基因座和κ轻链基因座的兆碱基大小的种系构型YAC片段来引入大于约80％的人抗体组库。参见Mendez等人，NatureGenetics 15：146-156(1997)和美国专利申请第08/759,620号。
XenoMouse小鼠的产生进一步讨论和描述于以下文献中：美国专利申请序列号07/466,008、序列号07/610,515、序列号07/919,297、序列号07/922,649、序列号08/031,801、序列号08/112,848、序列号08/234,145、序列号08/376,279、序列号08/430,938、序列号08/464,584、序列号08/464,582、序列号08/463,191、序列号08/462,837、序列号08/486,853、序列号08/486,857、序列号08/486,859、序列号08/462,513、序列号08/724,752和序列号08/759,620；以及美国专利第6,162,963号、6,150,584号、6,114,598号、6,075,181号和5,939,598号及日本专利第3 068 180 B2号、3 068 506 B2号和3 068 507 B2号。还参见Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)以及Green和Jakobovits，J.Exp.Med.188：483-495(1998)、EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310和WO 03/47336。
在替代方法中，包括GenPharm International，Inc.在内的其它公司采用了“微基因座(minilocus)”方法。在微基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的片段(单个基因)来模拟外源Ig基因座。因此，将一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区和第二恒定区(优选γ恒定区)形成为用于插入动物中的构建体。这种方法描述于Surani等人的美国专利第5,545,807号；Lonberg和Kay等人的美国专利第5,545,806号、5,625,825号、5,625,126号、5,633,425号、5,661,016号、5,770,429号、5,789,650号、5,814,318号、5,877,397号、5,874,299号和6,255,458号；Krimpenfort和Berns等人的美国专利第5,591,669号和6,023,010号；Berns等人的美国专利第5,612,205号、5,721,367号和5,789,215号；Choi和Dunn等人的美国专利第5,643,763号；以及GenPharm International的美国专利申请序列号07/574,748、序列号07/575,962、序列号07/810,279、序列号07/853,408、序列号07/904,068、序列号07/990,860、序列号08/053,131、序列号08/096,762、序列号08/155,301、序列号08/161,739、序列号08/165,699、序列号08/209,741中。还参见EP 0 546073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884以及美国专利第5,981,175号。进一步参见Taylor等人(1992)、Chen等人(1993)、Tuaillon等人(1993)、Choi等人(1993)、Lonberg等人(1994)、Taylor等人(1994)和Tuaillon等人(1995)、Fishwild等人(1996)。
Kirin也说明了从小鼠产生人抗体，其中通过微细胞融合引入了大段染色体或整个染色体。参见欧洲专利申请第773 288号和843 961号。Xenerex Biosciences正在开发一种用于人抗体的潜在产生的技术。在该技术中，用人淋巴细胞如B和/或T细胞重建SCID小鼠。小鼠然后用抗原免疫，并且可以对该抗原产生免疫反应。参见美国专利第5,476,996号、5,698,767号和5,958,765号。
人抗小鼠抗体(HAMA)反应已经促使该行业开始制备嵌合或其它方式的人源化抗体。然而，预期将会观察到某些人抗嵌合抗体(HACA)反应，特别是在抗体的慢性或多剂量使用中。因此，希望提供包含针对EGFRVIII的人结合结构域和针对CD3的人结合结构域的抗体构建体，以便消除HAMA或HACA反应的担忧和/或效应。
根据本发明，术语“(特异性)结合”、“(特异性)识别”、“(特异性)定向于”和“与...(特异性)反应”是指结合结构域与靶分子(抗原，在此分别为EGFRVIII和CD3)上的给定表位或给定靶位点相互作用或特异性相互作用。
术语“表位”是指结合结构域(例如抗体或免疫球蛋白，或抗体或免疫球蛋白的衍生物、片段或变体)特异性结合的抗原上的位点。“表位”是抗原性的，且因此术语表位在本文中有时也被称为“抗原结构”或“抗原决定簇”。因此，结合结构域是“抗原相互作用位点”。所述结合/相互作用也被理解为定义“特异性识别”。
“表位”可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。“线性表位”是其中氨基酸一级序列包含被识别表位的表位。线性表位通常包括在独特序列中的至少3个或至少4个，更通常地至少5个或至少6个或至少7个，例如约8个至约10个氨基酸。
与线性表位相反，“构象表位”是其中包含表位的氨基酸一级序列不是被识别的表位的唯一限定组分的表位(例如，其中氨基酸的一级序列不一定被结合结构域域识别的表位)。通常，构象表位相对于线性表位包含数量增加的氨基酸。关于构象表位的识别，结合结构域识别抗原，优选肽或蛋白质或其片段的三维结构(在本发明的上下文中，针对所述结合结构域中的一个的抗原结构包含在EGFRVIII蛋白内)。例如，当蛋白质分子折叠形成三维结构时，形成构象表位的某些氨基酸和/或多肽主链变成并置的，使抗体能够识别该表位。确定表位构象的方法包括但不限于x射线晶体学、二维核磁共振(2D-NMR)光谱法和定点自旋标记以及电子顺磁共振(EPR)光谱法。
以下描述了一种用于表位作图的方法：当人EGFRVIII蛋白中的区域(连续氨基酸延伸)与非人和非灵长类EGFRVIII抗原(例如小鼠EGFRVIII，但是其它动物如鸡、大鼠、仓鼠、兔等也是可以想到的)的相应区域交换/被其置换时，预期结合结构域的结合出现降低，除非结合结构域对所使用的非人、非灵长类EGFRVIII具有交叉反应性。相较于与人EGFRVIII蛋白中的相应区域的结合(其中与人EGFRVIII蛋白中的相应区域的结合被设定为100％)，所述降低优选为至少10％、20％、30％、40％或50％；更优选至少60％、70％或80％，并且最优选90％、95％或甚至100％。
确定靶抗原的特定残基对抗体构建体或结合结构域识别的贡献的另一种方法是丙氨酸扫描(参见例如Morrison KL和Weiss GA，Cur Opin Chem Biol.2001 Jun；5(3)：302-7)，其中待分析的每个残基被丙氨酸置换，例如通过定点诱变。使用丙氨酸是因为它具有非庞大的化学惰性的甲基官能团，但仍然模仿许多其它氨基酸所具有的二级结构参考。有时在需要保持突变残基的大小的情况下，可以使用庞大氨基酸如缬氨酸或亮氨酸。丙氨酸扫描是一项已经使用了很长时间的成熟技术。
结合结构域与表位或包含表位的区域之间的相互作用意味着结合结构域对特定蛋白质或抗原(在此分别为EGFRVIII和CD3)上的表位/包含表位的区域表现出可估计的亲和力，并且通常不表现出与除EGFRVIII或CD3外的蛋白质或抗原的显著反应性。“可估计的亲和力”包括以约10-6M(KD)或更强的亲和力结合。优选地，当结合亲和力为约10-12至10-8M、10-12至10-9M、10-12至10-10M、10-11至10-8M，优选约10-11至10-9M时，结合被视为特异性的。无论结合结构域是否与靶标特异性反应或结合，都可以容易地进行测试，尤其是通过将所述结合结构域和靶蛋白或抗原的反应与所述结合结构域和除EGFRVIII或CD3以外的蛋白质或抗原的反应进行比较。优选地，本发明的结合结构域本质上或基本上不结合除EGFRVIII或CD3以外的蛋白质或抗原(即，第一结合结构域不能结合除EGFRVIII外的蛋白质，且第二结合结构域不能结合除CD3外的蛋白质)。
术语“本质上/基本上不结合”或“不能结合”是指本发明的结合结构域不结合除EGFRVIII或CD3以外的蛋白质或抗原，即不显示超过30％，优选不超过20％，更优选不超过10％，特别优选不超过9％、8％、7％、6％或5％的与除EGFRVIII或CD3以外的蛋白质或抗原的反应性，其中与EGFRVIII或CD3结合分别被设定为100％。
据信特异性结合是通过结合结构域和抗原的氨基酸序列中的特定基序而实现。因此，结合是由于它们的一级、二级和/或三级结构以及所述结构的二级修饰而实现。抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用可以导致所述位点与抗原的简单结合。此外，抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用可以例如由于诱导抗原构象的改变、抗原的寡聚化等可选地或另外地地导致信号的引发。
本发明的双特异性抗体构建体的表位位于EGFR的氨基酸残基5和274之间的EGFRvIII特异性接合处，所述特异性接合由EGFR向剪接突变EGFRvIII的突变产生。该突变去除成熟EGFR序列的残基2-273，同时引入单个甘氨酸残基(见图1)。
在本发明的一个实施方案中，还优选第二结合结构域与人CD3ε结合并与普通狨(Callithrix jacchus)、绒顶柽柳猴(Saguinus Oedipus)或松鼠猴(Saimiri sciureus)CD3ε结合。
术语“可变”是指抗体或免疫球蛋白结构域的表现出序列可变性并涉及决定特定抗体(即，“可变结构域”)的特异性和结合亲和力的部分。可变重链(VH)和可变轻链(VL)的配对共同形成单个抗原结合位点。
可变性不是均匀地分布在整个抗体的可变区中；它集中在重链和轻链可变区各自的子结构域中。这些子结构域被称为“高变区”或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的更保守的(即非高变性)部分被称为“框架”区域(FRM或FR)，并在三维空间中提供六个CDR的支架以形成抗原结合表面。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRM区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其主要采用β折叠构型并通过三个高变区连接，这些高变区形成环连接，并且在一些情况下形成β折叠结构的部分。每条链中的高变区通过FRM紧密结合在一起，并与来自另一条链的高变区一起促进抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，在上述引文中)。
术语“CDR”是指其中三个构成轻链可变区的结合特征(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)且三个构成重链可变区的结合特征(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的互补决定区。CDR含有大部分负责抗体与抗原的特异性相互作用的残基，因此有助于抗体分子的功能活性：它们是抗原特异性的主要决定因素。
准确定义上的CDR边界和长度受不同分类和编号系统的限制。因此，可以由Kabat、Chothia、contact或任何其它边界定义(包括本文所述的编号系统)来引用CDR。尽管具有不同的边界，但这些系统各自在构成可变序列内的所谓“高变区”的部分中具有某些程度的重叠。根据这些系统的CDR定义因此可以在相对于相邻框架区的长度和边界区域上有所不同。参见例如Kabat(基于跨物种序列可变性的方法)、Chothia(基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法)和/或MacCallum(Kabat等人，在上述引文中；Chothia等人，J.Mol.Biol，1987，196：901-917；和MacCallum等人，J.Mol.Biol，1996，262：732)。表征抗原结合位点的另一个标准是由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用的AbM定义。参见例如，ProteinSequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains，见于AntibodyEngineering Lab Manual(编辑：Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg)。就两种残基鉴别技术限定重叠区域而非相同区域而言，它们可以被组合来定义混合CDR。但是，优选按照所谓的Kabat系统进行编号。
通常，CDR形成可被分类为规范结构的环结构。术语“规范结构”是指抗原结合(CDR)环所采用的主链构象。已经从比较结构研究中发现六个抗原结合环中的五个仅具有有限组库的可用构象。每个规范结构可以由多肽主链的扭转角来表征。因此，抗体之间的对应环可以具有非常相似的三维结构，尽管所述环的大部分具有高度的氨基酸序列可变性(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，1987，196：901；Chothia等人，Nature，1989，342：877；Martin和Thornton，J.Mol.Biol，1996，263：800)。此外，所采用的环结构与其周围的氨基酸序列之间存在联系。特定规范类别的构象由环的长度以及位于环内和保守框架内(即环外)关键位置的氨基酸残基决定。因此，可以基于这些关键氨基酸残基的存在来分配到特定的规范类别。
术语“规范结构”还可以包括关于抗体线性序列的考虑，例如，Kabat分类法(Kabat等人，在上述引文中)。Kabat编号方案(系统)是一种以一致性方式对抗体可变结构域的氨基酸残基进行编号的广泛采用的标准，并且也是应用于本发明的优选方案，如本文中其它地方所述。还可以使用额外的结构考虑来确定抗体的规范结构。例如，Kabat编号没有充分反映的那些差异可以用Chothia等人的编号系统来描述和/或通过其它技术(例如晶体学和二维或三维计算机建模)来揭示。因此，可以将给定的抗体序列归到规范类别中，所述类别允许尤其是鉴别适当的底座序列(例如，基于期望在库中包括各种规范结构)。在文献中描述了抗体氨基酸序列的Kabat编号和如Chothia等人(在上述引文中)描述的结构考虑及其对解释抗体结构的规范方面的影响。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型在本领域中是众所周知的。关于抗体结构的综述，参见Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Harlow等人编辑，1988。
轻链的CDR3，特别是重链的CDR3，可以构成轻链和重链可变区内的抗原结合中的最重要决定簇。在一些抗体构建体中，重链CDR3似乎构成抗原和抗体之间的主要接触区域。其中单独改变CDR3的体外选择方案可用于改变抗体的结合特性或决定哪些残基对抗原结合起作用。因此，CDR3通常是抗体结合位点内的分子多样性的最大来源。例如，H3可以短至两个氨基酸残基或多于26个氨基酸。
在经典的全长抗体或免疫球蛋白中，每个轻链(L)通过一个共价二硫键连接至重链(H)，而两条H链通过一个或多个二硫键(取决于H链同种型)彼此连接。最靠近VH的CH结构域通常被指定为CH1。恒定(“C”)结构域不直接参与抗原结合，但表现出各种效应功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体激活。抗体的Fc区包含在重链恒定结构域内并且例如能够与位于细胞表面的Fc受体相互作用。
组装和体细胞突变后的抗体基因的序列是高度变化的，并且估计这些变化的基因编码1010个不同的抗体分子(Immunoglobulin Genes，第2版，Jonio等人编辑，AcademicPress，San Diego，CA，1995)。因此，免疫系统提供了免疫球蛋白的组库。术语“组库”是指完全或部分衍生自编码至少一种免疫球蛋白的至少一个序列的至少一个核苷酸序列。所述序列可以通过重链的V、D和J片段以及轻链的V和J片段的体内重排而产生。或者，可从响应于例如体外刺激而发生重排的细胞产生所述序列。或者，部分或全部序列可以通过DNA剪接、核苷酸合成、诱变和其它方法获得，参见例如美国专利5,565,332。组库可以仅包括一个序列或可以包括多个序列，包括遗传多样性集合中的序列。
如本文中所用，术语“双特异性”是指“至少双特异性的”抗体构建体，即所述抗体构建体包含至少第一结合结构域和第二结合结构域，其中第一结合结构域结合一种抗原或靶标(在此为EGFRVIII)，并且第二结合结构域结合另一种抗原或靶标(在此为CD3)。因此，根据本发明的抗体构建体包含对至少两种不同抗原或靶标的特异性。本发明的术语“双特异性抗体构建体”还包括多特异性抗体构建体如三特异性抗体构建体，后者包括三个结合结构域，或具有多于三种(例如四种、五种)特异性的构建体。
鉴于根据本发明的抗体构建体是(至少)双特异性的，它们不是天然存在的，并且与天然存在的产物显著不同。因此“双特异性”抗体构建体或免疫球蛋白是包含至少两个具有不同特异性的不同结合位点的人工杂交抗体或免疫球蛋白。双特异性抗体构建体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。参见例如Songsivilai&Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)。
本发明的抗体构建体的至少两个结合结构域和可变结构域可以包含或可以不包含肽接头(间隔肽)。根据本发明，术语“肽接头”包含使本发明的抗体构建体的一个(可变和/或结合)结构域和另一(可变和/或结合)结构域的氨基酸序列彼此连接的氨基酸序列。这种肽接头的基本技术特征是它不包含任何聚合活性。在合适的肽接头中有在美国专利4,751,180和4,935,233或WO 88/09344中所述的肽接头。肽接头还可以用于将其它结构域或模块或区域(如半衰期延伸结构域)连接至本发明的抗体构建体。
在使用接头的情况下，该接头优选具有足以确保第一和第二结构域的每一个能够相互独立地保持其差异结合特异性的长度和序列。对于连接本发明的抗体构建体中的至少两个结合结构域(或两个可变结构域)的肽接头而言，仅包含少数氨基酸残基(例如12个氨基酸残基或更少)的肽接头是优选的。因此，优选具有12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸残基的肽接头。设想的具有少于5个氨基酸的肽接头包含4、3、2或1个氨基酸，其中富含Gly的接头是优选的。在所述“肽接头”的上下文下，特别优选的“单个”氨基酸是Gly。因此，所述肽接头可以由单个氨基酸Gly组成。肽接头的另一个优选实施方案的特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly4Ser(SEQ ID NO：1)或其聚合物，即(Gly4Ser)x，其中x是1或更大(例如2或3)的整数。优选的接头示于SEQ ID NO：1-9中。包含不存在二级结构促进因素的所述肽接头的特征是本领域中已知的并且描述于例如Dall′Acqua等人(Biochem.(1998)37，9266-9273)；Cheadle等人(Mol Immunol(1992)29，21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB(1995)9(1)，73-80)中。另外不促进任何二级结构的肽接头是优选的。所述结构域的彼此连接可以例如通过基因工程来实现，如实施例中所述。用于制备融合和可操作性连接的双特异性单链构建体并在哺乳动物细胞或细菌中表达所述构建体的方法是本领域中熟知的(例如WO 99/54440或Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001)。
如上文所述，本发明提供了优选的实施方案，其中抗体构建体是选自由以下组成的组的形式：(scFv)2、scFv-单结构域mAb、双抗体和任何这些形式的寡聚体。
根据特别优选的实施方案，并且如所附实施例中所述，本发明的抗体构建体是“双特异性单链抗体构建体”，更优选是双特异性“单链Fv”(scFv)。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成接头(如上文所述)将它们连接起来，使得它们能够作为其中VL和VH区配对形成单价分子的单一蛋白质链被制得；参见例如Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：5879-5883)。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整或全长抗体相同的方式评估片段的功能。单链可变片段(scFv)因此为通常用约10至约25个氨基酸、优选约15至20个氨基酸的短接头肽连接的免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白。接头通常富含甘氨酸以具有柔性，以及丝氨酸或苏氨酸以具有可溶性，且可连接VH的N端与VL的C端，反之亦然。此蛋白尽管去除了恒定区且引入了接头但保留了原始免疫球蛋白的特异性。
双特异性单链分子是本领域中已知的，并且描述于WO 99/54440；Mack，J.Immunol.(1997)，158，3965-3970；Mack，PNAS，(1995)，92，7021-7025；Kufer，CancerImmunol.Immunother.，(1997)，45，193-197；
Figure BPA0000256090320000231
Blood，(2000)，95，6，2098-2103；Brühl，Immunol.，(2001)，166，2420-2426；Kipriyanov，J.Mol.Biol.，(1999)，293，41-56中。所描述的用于产生单链抗体的技术(尤其参见美国专利4,946,778；Kontermann和Dübel(2010)，在上述引文中；和Little(2009)，在上述引文中)可以适合于产生特异性识别选定靶标的单链抗体构建体。
二价(也称为双价)或双特异性单链可变片段(具有(scFv)2形式的bi-scFvs或di-scFvs)可以通过连接两个scFv分子(例如利用如上所述的接头)进行工程改造。如果这两个scFv分子具有相同的结合特异性，则所得的(scFv)2分子将优选被称为二价的(即，其具有针对相同靶表位的两个效价)。如果两个scFv分子具有不同的结合特异性，则所得的(scFv)2分子将优选被称为双特异性的。可以通过产生具有两个VH区和两个VL区的单一肽链来完成连接，以产生串联scFv(参见例如Kufer P.等人，(2004)Trends inBiotechnology 22(5)：238-244)。另一种可能性是产生具有肽接头的scFv分子，所述接头肽对于两个可变区折叠在一起而言太短(例如约5个氨基酸)，从而迫使scFv二聚化。这种类型被称为双抗体(参见例如Hollinger、Philipp等人，(1993年7月)Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 90(14)：6444-8.)。
根据本发明的抗体构建体的另一个优选实施方案，与靶抗原EGFRVIII或CD3结合的结合结构域的重链(VH)和轻链(VL)不经由上述肽接头直接连接，而是由于如上针对双抗体所述形成双特异性分子而形成结合结构域。因此，CD3结合结构域的VH链可以通过这种肽接头与EGFRVIII结合结构域的VL融合，而EGFRVIII结合结构域的VH链通过这种肽接头与CD3结合结构域的VL融合。
单结构域抗体仅包含一个(单体)抗体可变结构域，其能够独立于其它V区或结构域而选择性结合特定抗原。第一个单结构域抗体是从发现于骆驼中的重链抗体工程改造而来，并且这些抗体被称为VHH片段。软骨鱼类也有重链抗体(IgNAR)，从其中可以获得被称为VNAR片段的单结构域抗体。替代方法是将常见免疫球蛋白(例如来自人或啮齿动物)的二聚体可变结构域分解成单体，从而获得作为单结构域Ab的VH或VL。虽然目前对单结构域抗体的大多数研究是基于重链可变结构域，但是衍生自轻链的纳米抗体也展现出与靶表位特异性结合。单结构域抗体的实例被称为sdAb、纳米抗体或单可变结构域抗体。
因此，(单结构域mAb)2是由(至少)两个单结构域单克隆抗体(其独立地选自包含VH、VL、VHH和VNAR的组)组成的单克隆抗体构建体。接头优选为肽接头的形式。类似地，“scFv-单结构域mAb”是由如上所述的至少一个单结构域抗体和如上所述的一个scFv分子组成的单克隆抗体构建体。同样，接头优选为肽接头的形式。
T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导免疫中发挥核心作用的一类淋巴细胞(其本身是一种白细胞)。存在几个T细胞的亚组，每个亚组都有独特的功能。T细胞可以通过细胞表面上的T细胞受体(TCR)的存在而区别于其它淋巴细胞例如B细胞和NK细胞。TCR负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原，并且由两个不同的蛋白质链组成。在95％的T细胞中，TCR由α(alpha)和β(beta)链组成。当TCR与抗原肽和MHC(肽/MHC复合物)接合时，T淋巴细胞通过由相关酶、共受体、专用衔接分子和活化或释放的转录因子介导的一系列生化事件而激活。
CD3受体复合物是一种蛋白质复合物，并由四条链组成。在哺乳动物中，所述复合物含有CD3γ(gamma)链、CD3δ(delta)链和两条CD3ε(epsilon)链。这些链与T细胞受体(TCR)和所谓的ζ(zeta)链缔合，形成T细胞受体CD3复合物，并在T淋巴细胞中产生活化信号。CD3γ(gamma)、CD3δ(delta)和CD3ε(epsilon)链是含有单个细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3分子的细胞内尾部含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或简称为ITAM的单个保守基序，其对于TCR的信号传导能力是必需的。CD3ε分子是在人体中由位于11号染色体上的CD3E基因编码的多肽。CD3ε最优选的表位包含在人CD3ε胞外结构域的氨基酸残基1-27内。
通过由多特异性，至少双特异性的抗体构建体募集T细胞进行的靶细胞的重新定向裂解包括溶细胞突触形成以及穿孔素和粒酶的递送。接合的T细胞能够连续裂解靶细胞，且不受干扰肽抗原加工和呈递或克隆T细胞分化的免疫逃逸机制的影响；参见，例如，WO2007/042261
可以以各种方式测量由EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体介导的细胞毒性。参见实施例1。效应细胞可以是例如经刺激的富集的(人)CD8阳性T细胞或未经刺激的(人)外周血单核细胞(PBMC)。如果靶细胞源自猕猴，或表达猕猴EGFRVIII或经猕猴EGFRVIII转染，则效应细胞也应该是源自猕猴的，例如猕猴T细胞系，例如4119LnPx。靶细胞应该表达EGFRVIII，例如人或猕猴EGFRVIII(至少其胞外结构域)。靶细胞可以是经EGFRVIII(例如人或猕猴EGFRVIII)稳定或瞬时转染的细胞系(例如CHO)。或者，靶细胞可以是EGFRVIII阳性天然表达细胞系，如人成胶质细胞瘤细胞系U87或DK-MG。对于在细胞表面上表达更高水平EGFRVIII的靶细胞系，预期EC50值通常较低。效应细胞与靶细胞(E∶T)的比率通常为约10∶1，但也可以变化。EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性可以在51-铬释放测定(孵育时间约18小时)中或在基于FACS的细胞毒性测定(孵育时间约48小时)中测量。也可以修改所述测定的孵育时间(细胞毒性反应)。其它测量细胞毒性的方法是技术人员所熟知的，并且包括MTT或MTS测定；基于ATP的测定，包括生物发光测定；磺基罗丹明B(SRB)测定、WST测定、克隆形成测定和ECIS技术。
由本发明的EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体介导的细胞毒性活性优选在基于细胞的细胞毒性测定中测量。也可以在51-铬释放测定中测量该细胞毒性活性。该细胞毒性活性由EC50值表示，其对应于半数最大有效浓度(诱导位于基线与最大值的中间的细胞毒性反应的抗体构建体浓度)。优选地，EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体的EC50值为≤5000pM或≤4000pM，更优选≤3000pM或≤2000pM，甚至更优选≤1000pM或≤500pM，甚至更优选≤400pM或≤300pM，甚至更优选≤200pM，甚至更优选≤100pM，甚至更优选≤50pM，甚至更优选≤20pM或≤10pM，并且最优选≤5pM。
上述给定的EC50值可以在不同的测定中测量。本领域技术人员知道，与未经刺激的PBMC相比，当使用经刺激的/富集的CD8+ T细胞作为效应细胞时，可预期EC50值会较低。此外可以预期，与低靶表达大鼠相比，当靶细胞表达高数量的靶抗原时，EC50值较低。例如，当使用经刺激的/富集的人CD8+ T细胞作为效应细胞(并且使用经EGFRVIII转染的细胞如CHO细胞或EGFRVIII阳性人胶质母细胞瘤细胞系U87或DK-MG作为靶细胞)时，EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体的EC50值优选≤1000pM，更优选≤500pM，甚至更优选≤250pM，甚至更优选≤100pM，甚至更优选≤50pM，甚至更优选≤10pM，并且最优选≤5pM。当使用人PBMC作为效应细胞时，EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体的EC50值优选≤5000pM或≤4000pM(特别是当靶细胞为EGFRVIII阳性人胶质母细胞瘤细胞系U87或DK-MG时)，更优选≤2000pM(特别是当靶细胞为经EGFRVIII转染的细胞如CHO细胞时)，更优选≤1000pM或≤500pM，甚至更优选≤200pM，甚至更优选≤150pM，甚至更优选≤100pM，并且最优选≤50pM或更低。当使用诸如LnPx4119的猕猴T细胞系作为效应细胞并使用经猕猴EGFRVIII转染的细胞系如CHO细胞作为靶细胞系时，EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体的EC50值优选≤2000pM或≤1500pM，更优选≤1000pM或≤500pM，甚至更优选≤300pM或≤250pM，甚至更优选≤100pM，并且最优选≤50pM。
优选地，本发明的EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体不诱导/介导或基本不诱导/介导EGFRVIII阴性细胞如CHO细胞的裂解。术语“不诱导裂解”、“基本不诱导裂解”、“不介导裂解”或“基本不介导裂解”是指本发明的抗体构建体不诱导或介导超过30％，优选不超过20％，更优选不超过10％，特别优选不超过9％、8％、7％、6％或5％的EGFRVIII阴性细胞的裂解，由此EGFRVIII阳性人胶质母细胞瘤细胞系U87或DK-MG(见上文)的裂解被设定为100％。这通常适用于浓度高达500nM的抗体构建体。技术人员知道如何不费力地测量细胞裂解。此外，本说明书教导了如何测量细胞裂解的具体说明。
单个EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体的单体和二聚体同种型之间细胞毒性活性的差异被称为“效力差异”。该效力差异可以例如被计算为分子的单体和二聚体形式的EC50值之间的比率，参见实施例1.8。本发明的EGFRVIII×CD3双特异性抗体构建体的效力差异为优选≤5，更优选≤4，甚至更优选≤3，甚至更优选≤2，进一步优选≤1，并且最优选≤0.3。
本发明的抗体构建体的第一和/或第二(或任何其它)结合结构域优选对于灵长类哺乳动物的成员具有跨物种特异性。例如跨物种特异性CD3结合结构域描述于WO 2008/119567中。根据一个实施方案，除了分别与人EGFRVIII和人CD3结合之外，第一和/或第二结合结构域还将结合灵长类动物的EGFRVIII/CD3，这些灵长类动物包括(但不限于)新世界灵长类动物(例如普通狨、绒顶柽柳猴或松鼠猴)、旧世界灵长类动物(如狒狒和猕猴)、长臂猿、猩猩和非人人亚科。设想与靶细胞表面上的人EGFRVIII结合的本发明抗体构建体的第一结合结构域还至少结合猕猴EGFRVIII，和/或结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域还至少结合猕猴CD3。优选的猕猴是食蟹猴(Macaca fascicularis)。还设想了猕猴(恒河猴)。
在本发明的一个方面，第一结合结构域与人EGFRVIII结合并进一步结合猕猴EGFRVIII，例如食蟹猴EGFRVIII，并且更优选结合猕猴细胞的表面上表达的猕猴EGFRVIII。优选的食蟹猴EGFRVIII示于SEQ ID NO：234中。第一结合结构域对猕猴EGFRVIII的亲和力优选≤15nM，更优选≤10nM，甚至更优选≤5nM，甚至更优选≤1nM，甚至更优选≤0.5nM，甚至更优选≤0.1nM，且最优选≤0.05nM或甚至≤0.01nM。
优选地，根据本发明的抗体构建体结合猕猴EGFRVIII相对于结合人EGFRVIII的亲和力差距[ma EGFRVIII：hu EGFRVIII](例如通过BiaCore或通过Scatchard分析所测定)为＜100，优选＜20，更优选＜15，进一步优选＜10，甚至更优选＜8，更优选＜6，且最优选＜2。根据本发明的抗体构建体结合猕猴EGFRVIII相对于结合人EGFRVIII的亲和力差距的优选范围是在0.1与20之间，更优选在0.2与10之间，甚至更优选在0.3与6之间，甚至更优选在0.5与3之间或0.5与2.5之间，且最优选在0.5与2之间或在0.6与2之间。
在本发明的抗体构建体的一个实施方案中，第二结合结构域与人CD3ε结合并与普通狨、绒顶柽柳猴或松鼠猴CD3ε结合。优选地，第二结合结构域与这些CD3ε链的胞外表位结合。还设想到第二结合结构域与人和猕猴CD3ε链的胞外表位结合。CD3ε最优选的表位包含在人CD3ε胞外结构域的氨基酸残基1-27内。甚至更明确地，所述表位包含至少氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu。普通狨和绒顶柽柳猴都是属于狨猴科的新世界灵长类动物，而松鼠猴是属于卷尾猴科的新世界灵长类动物。
对本发明的抗体构建体而言，特别优选的是，结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含VL区，所述VL区包含选自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：
(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：27中所示的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQID NO：28中所示的CDR-L2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：29中所示的CDR-L3；
(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：117中所示的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：118中所示的CDR-L2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：119中所示的CDR-L3；和
(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：153中所示的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：154中所示的CDR-L2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：155中所示的CDR-L3。
在本发明的抗体构建体的另一个优选实施方案中，结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含VH区，所述VH区包含选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3：
(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：12中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQID NO：13中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：14中所示的CDR-H3；
(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：30中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQID NO：31中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：32中所示的CDR-H3；
(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：48中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQID NO：49中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：50中所示的CDR-H3；
(d)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：66中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQID NO：67中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：68中所示的CDR-H3；
(e)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：84中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQID NO：85中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：86中所示的CDR-H3；
(f)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：102中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：103中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：104中所示的CDR-H3；
(g)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：120中所示的CDR-H1、如WO 2O08/119567的SEQ ID NO：121中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：122中所示的CDR-H3；
(h)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：138中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：139中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：140中所示的CDR-H3；
(i)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：156中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：157中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：158中所示的CDR-H3；和
(j)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：174中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：175中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：176中所示的CDR-H3。
对本发明的抗体构建体而言，进一步优选的是，结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含选自由以下所组成的组的VL区：如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：81、SEQ IDNO：90、SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：102中所示的VL区(还参见WO 2008/119567的SEQ IDNO：35、39、125、129、161或165)。
另外优选的是，结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含选自由以下所组成的组的VH区：如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：98和SEQ IDNO：101中所示的VH区(还参见WO 2008/119567的SEQ ID NO：15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181)。
更优选地，本发明的抗体构建体的特征在于：结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含选自由以下所组成的组的VL区和VH区：
(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：17或21中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：15或19中所示的VH区；
(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：35或39中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：33或37中所示的VH区；
(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：53或57中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：51或55中所示的VH区；
(d)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：71或75中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：69或73中所示的VH区；
(e)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：89或93中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：87或91中所示的VH区；
(f)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：107或111中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：105或109中所示的VH区；(g)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：125或129中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：123或127中所示的VH区；(h)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：143或147中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：141或145中所示的VH区；(i)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：161或165中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：159或163中所示的VH区；
(j)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：179或183中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：177或181中所示的VH区。
对本发明的抗体构建体而言还优选的是，结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含如SEQ ID NO：102中所示的VL区和如SEQ ID NO：101中所示的VH区。
根据本发明的抗体构建体的优选实施方案，结合结构域，特别是第二结合结构域(其结合T细胞表面上的人CD3)具有以下形式：成对的VH区和VL区为单链抗体(scFv)的形式。VH和VL区按VH-VL或VL-VH的顺序排列。优选的是，VH区位于接头序列的N端，而VL区位于接头序列的C端。
本发明的上述抗体构建体的优选实施方案的特征在于结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含选自由以下所组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ IDNO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103(还参见WO 2008/119567的SEQ IDNO：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187)。
还设想本发明的抗体构建体除了其结合靶分子EGFRVIII和CD3的功能之外还具有进一步的功能。在此形式中，抗体构建体是三功能或多功能抗体构建体，其通过以下方式发挥作用：经由结合到EGFRVIII而靶向靶细胞，经由CD3结合而调节细胞毒性T细胞活性，以及经由募集如NK细胞的效应细胞、标记(荧光等)、诸如毒素或放射性核素的治疗剂和/或延长血清半衰期的物质等而提供另一功能(诸如调节抗体依赖性细胞毒性的完全功能性Fc恒定域)。
延长本发明的抗体构建体的血清半衰期的手段的实例包括融合或以其他方式连接至抗体构建体的肽、蛋白质或蛋白质结构域。肽、蛋白质或蛋白质结构域的组包括结合到人体中具有优选药代动力学特性的其他蛋白质(诸如血清白蛋白)的肽(参见WO 2009/127691)。此类半衰期延长的肽的替代性概念包括结合到新生儿Fc受体(FcRn，参见WO2007/098420)的肽，其也可用在本发明的构建体中。连接蛋白质的较大结构域或完整蛋白质的概念包括例如融合人血清白蛋白、人血清白蛋白的变体或突变体(参见WO 2011/051489、WO 2012/059486、WO 2012/150319、WO 2013/135896、WO 2014/072481、WO 2013/075066)或其结构域以及融合免疫球蛋白的恒定区(Fc结构域)及其变体。Fc结构域的此类变体可经优化/修饰以允许二聚体或多聚体的所需配对，从而消除Fc受体结合(例如Fcγ受体)或用于其他原因。本领域已知的延长小型蛋白质化合物在人体中的半衰期的另一个概念是诸如本发明的抗体构建体的化合物的聚乙二醇化。
在一个优选的实施方案中，对本发明的抗体构建体的描述如下：
(a)多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
●具有SEQ ID NO：159的氨基酸序列的多肽；
●具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；和
●具有选自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103组成的组的氨基酸序列的多肽；以及
●任选的His标签，如SEQ ID NO 10中所示的His标签；
(b)多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
●具有SEQ ID NO：159的氨基酸序列的多肽；
●具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；
●具有选自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103组成的组的氨基酸序列的多肽；
●具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的任选肽接头；
●具有选自由SEQ ID NO：104-134组成的组的氨基酸序列的多肽；和
●任选的His标签，如SEQ ID NO 10中所示的His标签；
(c)多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
●具有氨基酸序列QRFVTGHFGGLX1PANG(SEQ ID NO：135)的多肽，其中X1是Y或H；和
●具有SEQ ID NO：159的氨基酸序列的多肽；
●具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；
●具有选自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103组成的组的氨基酸序列的多肽；
●具有氨基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO：137)或QRFCTGHFGGLHPCNG(SEQID NO：139)的多肽；以及
任选的His标签，如SEQ ID NO 10中所示的His标签；
(d)多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
●具有选自由SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：44、SEQID NO：53、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：101组成的组的氨基酸序列的多肽；
●具有SEQ ID NO：8中所示的所述氨基酸序列的肽接头；
●具有SEQ ID NO：158的氨基酸的多肽；
●具有SEQ ID NO：140中所示的氨基酸序列的多肽；以及
多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
●具有SEQ ID NO：157的氨基酸序列的多肽；
●具有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的肽接头；
●具有选自由SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：45、SEQID NO：54、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：102组成的组的氨基酸序列和位于C端的丝氨酸残基的多肽；
●具有SEQ ID NO：141中所示的氨基酸序列的多肽；
(e)多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
●具有选自由SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：44、SEQID NO：53、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：101组成的组的氨基酸序列的多肽；
●具有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的肽接头；
●具有SEQ ID NO：158的氨基酸序列的多肽；
●具有SEQ ID NO：142中所示的氨基酸序列的多肽；以及
多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
●具有SEQ ID NO：157的氨基酸序列的多肽；
●具有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的肽接头；
具有选自由SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：54、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：99和SEQID NO：102组成的组的氨基酸序列和位于C端的丝氨酸残基的多肽；
●具有SEQ ID NO：143中所示的氨基酸序列的多肽；
(f)多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
●具有SEQ ID NO：159的氨基酸序列的多肽；
●具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；和
●具有选自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103组成的组的氨基酸序列的多肽；以及
●具有SEQ ID NO：144中所示的氨基酸序列的多肽；和具有SEQ ID NO：145中所示的氨基酸序列的多肽；
(g)多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
●具有SEQ ID NO：159的氨基酸序列的多肽；和
●具有SEQ ID NO：146中所示的氨基酸序列的多肽；以及
多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
●具有选自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103组成的组的氨基酸序列的多肽；以及
●具有SEQ ID NO：147中所示的氨基酸序列的多肽；
(h)多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
●具有SEQ ID NO：159的氨基酸序列的多肽；
●具有SEQ ID NO：148中所示的氨基酸序列的多肽；以及
多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
●具有选自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103组成的组的氨基酸序列的多肽；以及
●具有SEQ ID NO：149中所示的氨基酸序列的多肽；或
(i)多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
●具有SEQ ID NO：159的氨基酸序列的多肽；
●具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；和
●具有选自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103组成的组的氨基酸序列的多肽；以及
●具有SEQ ID NO：150中所示的氨基酸序列的多肽；
(j)多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
●具有SEQ ID NO：159的氨基酸序列的多肽；
●具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；和
●具有选自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103组成的组的氨基酸序列的多肽；
●具有选自由SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8和9组成的组的氨基酸序列的肽接头；以及
具有选自由SEQ ID NO：181-188组成的组的氨基酸序列的第三结构域。
如上所述，本发明的几种优选的抗体构建体通过与另一部分例如白蛋白或白蛋白变体融合而被修饰。如果这些融合构建体针对其特性(具体地讲，靶标亲和力或细胞毒性活性)进行表征，则技术人员将意识到，可预期类似的融合构建体或未修饰的双特异性抗体构建体具有类似(或甚至更佳的)特性。例如，如果与白蛋白融合的双特异性抗体构建体具有可估计或所需的细胞毒性活性或靶标亲和力，则可预期，对于无白蛋白的构建体将观测到相同/类似或甚至更高的细胞毒性活性/靶标亲和力。
根据另一个优选的实施方案，本发明的双特异性抗体构建体包含(除了两个结合结构域之外)含有两个多肽单体的第三结构域，所述多肽单体各自包含铰链、CH2和CH3结构域，其中所述两个多肽(或多肽单体)经由肽接头彼此融合。优选地，所述第三结构域按从N端到C端的顺序包含：铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。所述第三结构域的优选氨基酸序列示于SEQ ID NO：181-188中。所述两个多肽单体中的每一个优选具有选自由SEQ ID NO：173-180组成的组的氨基酸序列或与那些序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体构建体的第一和第二结合结构域经由例如选自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8和9组成的组的肽接头与第三结构域融合。
根据本发明，“铰链”为IgG铰链区。该区域可通过使用Kabat编号的类比而鉴别，参见Kabat位置223-243。根据上文，对“铰链”的最小需要是与根据Kabat编号的D231至P243的IgG1序列段对应的氨基酸残基。术语CH2和CH3是指免疫球蛋白重链恒定区2和3。这些区域也可通过使用Kabat编号的类比而鉴别，参见CH2的Kabat位置244-360和CH3的Kabat位置361-478。应当理解，就其IgG1Fc区、IgG2Fc区、IgG3Fc区、IgG4Fc区、IgM Fc区、IgA Fc区、IgDFc区和IgE Fc区而言，在免疫球蛋白之间存在一些变化(参见例如Padlan，MolecularImmunology，31(3)，169-217(1993))。术语Fc单体是指IgA、IgD和IgG的最后两个重链恒定区，和IgE和IgM的最后三个重链恒定区。Fc单体也可包括这些结构域的N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc单体可包括J链。对于IgG，Fc部分包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3和前两个结构域与CH2之间的铰链。尽管免疫球蛋白的Fc部分的边界可以变化，但包含功能性铰链、CH2和CH3结构域的人IgG重链Fc部分的实例可被定义为例如分别包含用于IgG4的残基(铰链结构域的)D231至(CH3结构域C端的)P476或D231至L476，其中编号根据Kabat。
因此，本发明的抗体构建体可以按从N端到C端的顺序包含：
(a)第一结合结构域；
(b)具有选自由SEQ ID NO：SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；
(c)第二结合结构域；
(d)具有选自由SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8和9组成的组的氨基酸序列的肽接头；
(e)第三结构域的第一多肽单体(包含铰链、CH2和CH3结构域)；
(f)具有选自由SEQ ID NO：192、193、194和195组成的组的氨基酸序列的肽接头；以及
(g)第三结构域的第二多肽单体(包含铰链、CH2和CH3结构域)。
还优选的是，本发明的抗体构建体按从N端到C端的顺序包含：
●具有选自由SEQ ID NO：159组成的组的氨基酸序列的第一结合结构域；
●具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；
●第二结合结构域，其具有选自由以下所组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103(还参见WO 2008/119567的SEQ ID NO：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187)；
●具有选自由SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8和9组成的组的氨基酸序列的肽接头；以及
●具有选自由SEQ ID NO：181-188组成的组的氨基酸序列的第三结构域。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明的抗体构建体包含SEQ ID NO：189或190中所示的多肽或由所述多肽组成。
在本发明的抗体构建体的一个实施方案中，所述抗体构建体包含如SEQ ID NO：160中所示的多肽或由所述多肽组成。
抗体构建体的共价修饰也包括在本发明的范围内，并且通常但不一定在翻译后进行。例如，通过使抗体构建体的特定氨基酸残基和能够与选定的侧链或N端或C端残基反应的有机衍生剂反应，将抗体构建体的几种类型的共价修饰引入到分子中。
半胱氨酰残基最常与α-卤代乙酸酯(和相应的胺)如氯乙酸或氯乙酰胺反应，得到羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酰残基还通过与以下物质反应而衍生化：溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑。
组氨酰残基通过与pH 5.5-7.0的焦碳酸二乙酯反应而衍生化，因为该试剂对组氨酰侧链是相对特异性的。对溴苯甲酰甲基溴也是有用的；反应优选在pH 6.0的0.1M二甲胂酸钠中进行。赖氨酰基和氨基末端残基与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。用这些试剂进行衍生化具有逆转赖氨酰残基的电荷的作用。适于使含α-氨基残基衍生化的其它试剂包括亚胺酯如甲基吡啶亚胺酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸盐的反应。
精氨酰残基通过与一种或多种常规试剂，尤其是苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮反应而被修饰。由于胍官能团的高pKa，因此精氨酸残基的衍生化需要反应在碱性条件下进行。此外，这些试剂可以与赖氨酸基团以及精氨酸ε-氨基反应。
可以进行酪氨酰残基的特异性修饰，特别关注的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入酪氨酰残基中。最常见的是，N-乙酰咪唑和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。用125I或131I碘化酪氨酰残基以制备用于放射免疫测定的标记蛋白质，上述氯胺T法是合适的。
羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳化二亚胺(R′-N＝C＝N--R′)反应而经选择性修饰，其中R和R′任选为不同的烷基，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳化二亚胺。此外，天冬氨酰和谷氨酰残基通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。
使用双官能性试剂衍生化可用于将本发明的抗体构建体交联到用于各种方法中的水不溶性支持基质或表面上。常用的交联剂包括例如1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如与4-叠氮基水杨酸的酯)、同双官能性亚胺酯(包括二琥珀酰亚胺酯如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯))和双官能性马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷。衍生剂如3-[(对-叠氮基苯基)二硫代]丙亚胺甲酯产生能够在光存在下形成交联的光激活中间体。或者，使用如美国专利第3,969,287号、3,691,016号、4,195,128号、4,247,642号、4,229,537号和4,330,440号中所述的反应性水不溶性基质(如溴化氰活化的碳水化合物)和反应性底物进行蛋白质固定。
谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基通常分别脱酰胺成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。或者，这些残基在弱酸性条件下脱酰胺。这些残基的任一种形式都属于本发明的范围。
其它修饰包括：脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structureand Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，1983，第79-86页)；N端胺的乙酰化和任何C端羧基的酰胺化。
包括在本发明范围内的抗体构建体的另一种类型的共价修饰包括改变蛋白质的糖基化模式。如本领域中已知，糖基化模式可以取决于蛋白质的序列(例如，下文讨论的特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在)或其中产生蛋白质的宿主细胞或生物体。下文讨论了特定的表达系统。
多肽的糖基化通常是N-连接或O-连接型。N-连接是指碳水化合物部分连接到天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是用于碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因此，多肽中存在这些三肽序列中的任一个均产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接到羟氨基酸，虽然也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸，但最常使用丝氨酸或苏氨酸。
通过改变氨基酸序列以使其含有一个或多个上述三肽序列方便地完成向抗体构建体添加糖基化位点(针对N-连接糖基化位点)。还可以通过向起始序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用其替代来进行改变(针对O-连接糖基化位点)。为了方便起见，抗体构建体的氨基酸序列优选通过在DNA水平上的改变而改变，特别是通过使编码多肽的DNA在预选碱基处突变，从而产生将被翻译成所需氨基酸的密码子。
增加抗体构建体上碳水化合物部分的数量的另一种手段是通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶联。这些方法是有利的，因为它们不需要在具有针对N-连接和O-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。根据所使用的偶联方式，糖可以附接至(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基如半胱氨酸的巯基；(d)游离羟基如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基；(e)芳族残基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于WO 87/05330以及Aplin和Wriston，1981，CRCCrit.Rev.Biochem.，第259-306页中。
去除存在于起始抗体构建体上的碳水化合物部分可以通过化学方法或酶方法完成。化学去糖基化作用需要将蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。这种处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以外的大部分或所有糖裂解，而使多肽保持完整。Hakimuddin等人，1987，Arch.Biochem.Biophys.259：52和Edge等人，1981，Anal.Biochem.118：131描述了化学去糖基化。多肽上的碳水化合物部分的酶促裂解可以通过使用各种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现，如Thotakura等人，1987，Meth.Enzymol.138：350所述。如Duskin等人，1982，J.Biol.Chem.257：3105所述，可以通过使用衣霉素化合物防止潜在糖基化位点的糖基化。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。
本文还考虑了抗体构建体的其它修饰。例如，抗体构建体的另一种类型的共价修饰包括将抗体构建体连接至各种非蛋白质聚合物，包括但不限于各种多元醇如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物，连接方式为美国专利第4,640,835号、4,496,689号、4,301,144号、4,670,417号、4,791,192号或4,179,337号中所述的方式。另外，如本领域中已知，可以在抗体构建体内的不同位置进行氨基酸替代，例如为了便于添加聚合物如PEG。
在一些实施方案中，本发明的抗体构建体的共价修饰包括添加一个或多个标记。标记基团可以经由各种长度的间隔臂与抗体构建体偶联，从而减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法是本领域中已知的并且可以用于实施本发明。术语“标记”或“标记基团”是指任何可检测的标记。一般来说，标记分成多种类别，具体取决于检测标记的测定，以下实例包括但不限于：
a)同位素标记，其可以是放射性同位素或重同位素，例如放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、89Zr、90Y、99Tc、111In、125I、131I)
b)磁性标记(例如磁性颗粒)
c)氧化还原活性部分
d)光学染料(包括但不限于发色团、磷光体和荧光团)，例如荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、化学发光基团以及可以是“小分子”荧光素或蛋白质荧光素的荧光团
e)酶促基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)
f)生物素化基团
g)由二级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)
“荧光标记”是指可以通过其固有的荧光特性检测到的任何分子。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿(Malacite green)、芪、萤光黄、级联蓝J(Cascade Blue J)、德克萨斯红(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒冈绿(Oregongreen)、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、AlexaFluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、级联蓝、级联黄(Cascade Yellow)和R-藻红蛋白(PE)(MolecularProbes，Eugene，OR)、FITC、罗丹明和德克萨斯红(Pierce，Rockford，IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science，Pittsburgh，PA)。合适的光学染料(包括荧光团)描述于RichardP.Haugland的Molecular Probes Handbook中。
合适的蛋白质荧光标记还包括但不限于绿色荧光蛋白，包括GFP的海肾(Renilla)、海笔(Ptilosarcus)或多管水母(Aequorea)种(Chalfie等人，1994，Science263：802-805)；EGFP(Clontech Laboratories，Inc，Genbank登录号U55762)；蓝色荧光蛋白(BFP，Quantum Biotechnologies，Inc.1801 de Maisonneuve Blvd.West，8th Floor，Montreal，Quebec，Canada H3H 1J9；Stauber，1998，Biotechniques 24：462-471；Heim等人，1996，Curr.Biol.6：178-182)；增强型黄色荧光蛋白(EYFP，Clontech Laboratories，Inc.)；萤光素酶(Ichiki等人，1993，J.Immunol.150：5408-5417)；β-半乳糖苷酶(Nolan等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2603-2607)和海肾(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019；美国专利第5,292,658号；5,418,155号；5,683,888号；5,741,668号；5,777,079号；5,804,387号；5,874,304号；5,876,995号；5,925,558)。
亮氨酸拉链结构域是促进包含亮氨酸拉链结构域的蛋白质的寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初是在几种DNA结合蛋白中被鉴别出(Landschulz等人，1988，Science 240：1759)，并且从此以后在各种不同的蛋白质中被发现。已知的亮氨酸拉链中有二聚或三聚的天然存在的肽及其衍生物。在PCT申请WO 94/10308中描述了适用于产生可溶性寡聚蛋白的亮氨酸拉链结构域的实例，并且Hoppe等人，1994，FEBS Letters 344：191描述了衍生自肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链。在Fanslow等人，1994，Semin.Immunol.6：267-78中描述了使用修饰的亮氨酸拉链以允许与其融合的异源蛋白质进行稳定的三聚化。在一种方法中，在合适的宿主细胞中表达包含与亮氨酸拉链肽融合的EGFRVIII抗体片段或衍生物的重组融合蛋白，并且从培养物上清液回收形成的可溶性寡聚EGFRVIII抗体片段或衍生物。
本发明的抗体构建体还可以包含额外的结构域，其例如有助于分子的分离或与分子的适应性药代动力学特征有关。有助于分离抗体构建体的结构域可以选自肽基序或二次引入部分，它们可以在分离方法例如分离柱中被捕获。此类额外结构域的非限制性实施方案包括称为Myc标签、HAT标签、HA标签、TAP标签、GST标签、几丁质结合结构域(CBD标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP标签)、Flag标签、Strep标签及其变体(例如StrepII标签)和His标签的肽基序。由所鉴别的CDR表征的所有本文公开的抗体构建体优选包含His标签结构域，其一般称为分子的氨基酸序列中连续His残基的重复序列，优选五个且更优选六个His残基(六组氨酸)的重复序列。His标签可位于例如抗体构建体的N端或C端，其优选位于C端。最优选的是，六组氨酸标签(HHHHHH)(SEQ ID NO：10)经由肽键连接至根据本发明的抗体构建体的C端。
本发明的抗体构建体的第一结合结构域与靶细胞表面上的人EGFRVIII结合。人EGFRVIII的优选氨基酸序列由NO：231、232和233表示。因此，当EGFRVIII由天然表达细胞或细胞系表达和/或由经EGFRVIII转化或(稳定/瞬时)转染的细胞或细胞系表达时，根据本发明的第一结合结构域优选结合EGFRVIII。在优选实施方案中，当在体外结合测定如BIAcore或Scatchard中使用EGFRVIII作为“靶标”或“配体”分子时，第一结合结构域也结合EGFRVIII。“靶细胞”可以是在其表面上表达EGFRVIII的任何原核或真核细胞；优选地，靶细胞是人或动物体的一部分的细胞，例如卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、间皮瘤细胞、肺癌细胞、胃癌细胞和三阴性乳腺癌细胞。
第一结合结构域对人EGFRVIII的亲和力优选≤20nM，更优选≤10nM，甚至更优选≤5nM，甚至更优选≤2nM，甚至更优选≤1nM，甚至更优选≤0.6nM，甚至更优选≤0.5nM，且最优选≤0.4nM。亲和力可以例如在BIAcore测定或Scatchard测定中测量，例如如实施例中所述。测定亲和力的其它方法也是技术人员所熟知的；参见例如所附的实施例。
还考虑了本文所述的抗体构建体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改善抗体构建体的结合亲和力和/或其它生物特性。通过将适当的核苷酸变化引入抗体构建体核酸内或通过肽合成来制备抗体构建体的氨基酸序列变体。所有以下描述的氨基酸序列修饰应该产生仍保留未修饰的母体分子的所需生物学活性(与EGFRVIII和CD3结合)的抗体构建体。
术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常是指具有其本领域公认定义的氨基酸，例如选自由以下组成的组的氨基酸：丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(He或I)；亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；和缬氨酸(Val或V)，但是也可以根据需要使用修饰的、合成的或稀有的氨基酸。通常，氨基酸可以分组为具有非极性侧链(例如，Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；带负电的侧链(例如，Asp、Glu)；带正电的侧链(例如，Arg、His、Lys)；或不带电的极性侧链(例如，Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。
氨基酸修饰包括例如抗体构建体的氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或替代。进行缺失、插入和替代的任何组合以获得最终构建体，只要该最终构建体具有所需的特征。氨基酸变化也可改变抗体构建体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
例如，可以在每个CDR中插入或缺失1、2、3、4、5或6个氨基酸(当然，取决于CDR的长度)，而在每个FR中可以插入或删除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸。优选地，氨基酸序列插入包括向含有一百个或更多个残基的多肽插入的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基的氨基和/或羧基端融合体，以及具有单个或多个氨基酸残基的序列内插入。本发明的抗体构建体的插入变体包括与酶的抗体构建体的N端或C端的融合体或与延长抗体构建体的血清半衰期的多肽的融合体。
最受关注的替代诱变位点包括重链和/或轻链的CDR，特别是高变区，但也考虑重链和/或轻链的FR改变。替代优选是如本文所述的保守替代。优选地，在CDR中可以替代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，而在框架区(FR)中可以替代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸，这取决于CDR或FR的长度。例如，如果CDR序列包含6个氨基酸，则设想替代这些氨基酸中的一个、两个或三个。类似地，如果CDR序列包含15个氨基酸，则设想替代这些氨基酸中的1、2、3、4、5或6个。
鉴别抗体构建体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085(1989)描述。在这里，鉴别抗体构建体内的一个残基或靶标残基的组(例如带电残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)且由中性或带负电氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)置换以影响氨基酸与表位的相互作用。
然后通过在替代位点处或为替代位点引入另外的或其它变体来精确识别那些展现对替代的功能敏感性的氨基酸位置。因此，虽然用于引入氨基酸序列变化的位点或区域是预定的，但突变本身的性质不需要预先确定。例如，为了分析或优化给定位点处的突变的性能，可以在靶密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，且针对所需活性的最优组合筛选所表达的抗体构建体变体。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点进行替代突变的技术是众所周知的，例如M13引物诱变和PCR诱变。使用抗原结合活性(例如EGFRVIII或CD3结合)的测定来筛选突变体。
通常，如果替代在重链和/或轻链的一个或多个或全部CDR中的氨基酸，则优选的是，随后获得的“经替代”序列与“原始”CDR序列具有至少60％或65％，更优选70％或75％，甚至更优选80％或85％，并且特别优选90％或95％同一性。这意味着与“经替代”序列相同的程度取决于CDR的长度。例如，具有5个氨基酸的CDR优选与其替代序列具有80％同一性，以便替代至少一个氨基酸。因此，抗体构建体的CDR可以与其替代序列具有不同程度的同一性，例如CDRL1可以具有80％，而CDRL3可以具有90％。
优选的替代(或置换)是保守替代。然而，只要抗体构建体保留其经由第一结合结构域结合EGFRVIII和经由第二结合结构域结合CD3或CD3ε的能力和/或其CDR与随后的替代序列具有同一性(与“原始”CDR序列具有至少60％或65％，更优选70％或75％，甚至更优选80％或85％，并且特别优选90％或95％同一性)，则设想任何替代(包括非保守替代或来自下表1中列出的“示例性替代”中的一个或多个)。
保守替代在表1中的“优选替代”标题下示出。如果这些替代导致生物学活性的改变，则可以引入表1中称为“示例性替代”的或如下文关于氨基酸类别所进一步描述的更实质的改变，并且针对所需特征筛选产物。
表1：氨基酸替代
Figure BPA0000256090320000511
本发明的抗体构建体的生物特性的实质改变可通过对替代进行选择而实现，所述替代在其对维持(a)替代区域中多肽主链的结构，例如折叠或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性或(c)侧链的体积的作用上显著不同。天然存在的残基可根据共同的侧链性质而分组：(1)疏水性残基：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性残基：cys、ser、thr；(3)酸性残基：asp、glu；(4)碱性残基：asn、gin、his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；和(6)芳族残基：trp、tyr、phe。
非保守替代将需要用这些类别之一的成员置换另一个类别。任何不参与维持抗体构建体的适当构象的半胱氨酸残基可以通常用丝氨酸替代，以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可以将半胱氨酸键添加到抗体中以提高其稳定性(特别是在抗体是抗体片段如Fv片段的情况下)。
对于氨基酸序列，序列同一性和/或相似性是通过使用本领域中已知的标准技术来确定，包括但不限于局部序列同一性算法(Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482)；序列同一性比对算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443)；相似搜索法(Pearson和Lipman，1988，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.85：2444)；这些算法的计算机实现(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.)；由Devereux等人，1984，Nucl.AcidRes.12：387-395描述的Best Fit序列程序，优选使用默认设置或通过检查。优选地，通过FastDB基于以下参数计算百分比同一性：错配罚分1；空位罚分1；空位大小罚分0.33；和连接罚分30(“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis”，MacromoleculeSequencing and Synthesis，Selected Methods and Applications，第127-149页(1988)，Alan R.Liss，Inc。
可用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进式成对比对从一组相关序列中产生多重序列比对。它也可以绘制用于产生比对的显示聚类关系的树状图。PILEUP使用Feng和Doolittle，1987，J.Mol.Evol.35：351-360的渐进式比对方法的简化形式；该方法类似于Higgins和Sharp，1989，CABIOS 5：151-153所描述的方法。有用的PILEUP参数包括默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10和加权末端空位。
有用算法的另一个实例是BLAST算法，其描述于：Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410；Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402；和Karin等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5787中。特别有用的BLAST程序是从Altschul等人，1996，Methods in Enzymology 266：460-480获得的WU-BLAST-2程序。WU-BLAST-2使用数个搜索参数，其中大多数被设置为默认值。使用以下值设定可调节的参数：重叠跨度＝1；重叠分数＝0.125；单词阈值(T)＝II。HSP S和HSP S2参数是动态值，并且由程序本身根据特定序列的组成和搜索目标序列的特定数据库的组成来确定；然而，可以调整这些值以提高灵敏度。
另一种可用的算法是由Altschul等人，1993，Nucl.Acids Res.25：3389-3402报道的空位BLAST(gapped BLAST)。空位BLAST使用BLOSUM-62替代计分；阈值T参数设为9；两命中法(two-hit method)用于触发无空位延伸，电荷空位长度k，代价为10+k；Xu设为16，且对于数据库搜索阶段Xg设定为40，对于算法输出阶段Xg设为67。空位比对通过对应于约22比特的分值触发。
通常，各个变体CDR与本文描述的序列之间的氨基酸同源性、相似性或同一性为至少60％，并且更通常具有优选至少65％或70％，更优选至少75％或80％，甚至更优选至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％的递增同源性或同一性。类似地，将相对于本文所鉴别的结合蛋白的核酸序列的“核酸序列同一性百分比(％)”定义为候选序列中与抗体构建体的编码序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。具体方法是利用设置为默认参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块，其中重叠跨度和重叠分数被分别设置为1和0.125。
通常，编码各个变体CDR的核苷酸序列与本文描述的核苷酸序列之间的核酸序列同源性、相似性或同一性为至少60％，并且更通常具有优选至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％和几乎100％的递增同源性或同一性。因此，“变体CDR”是与本发明的亲本CDR具有指定的同源性、相似性或同一性的变体，并且共享生物功能，包括但不限于亲本CDR的特异性和/或活性的至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体构建体与人种系的同一性百分比为≥70％或≥75％，更优选≥80％或≥85％，甚至更优选≥90％，并且最优选≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％或甚至≥96％。与人抗体种系基因产物的同一性被认为是降低治疗性蛋白在治疗期间引发患者对药物的免疫反应的风险的重要特征。Hwang和Foote(“Immunogenicity of engineered antibodies”；Methods 36(2005)3-10)证实了减少药物抗体构建体的非人部分可以降低治疗期间在患者中诱导抗药物抗体的风险。通过比较临床评估的抗体药物的详尽数量与相应的免疫原性数据，发现趋势为抗体V区的人源化使得蛋白质比携带未改变的非人V区的抗体(平均23.59％的患者)具有更低的免疫原性(平均5.1％的患者)。因此，与人序列具有较高程度的同一性对于抗体构建体形式的基于V区的蛋白质疗法是期望的。为了测定种系同一性，可使用Vector NTI软件将VL的V区与人种系V区段和J区段的氨基酸序列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)进行比对，且氨基酸序列通过将相同的氨基酸残基除以VL的氨基酸残基的总数以百分比计算。对于VH片段(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)也是如此，不过VH CDR3由于其高度多样性和缺少现有的人种系VH CDR3比对伙伴而可以被排除。然后可以使用重组技术来增加与人抗体种系基因的序列同一性。
在另一个实施方案中，本发明的双特异性抗体构建体在标准研究级条件下(例如在标准两步纯化方法中)表现出高单体产量。优选地，根据本发明的抗体构建体的单体产量为≥0.25mg/L上清液，更优选≥0.5mg/L上清液，甚至更优选≥1mg/L上清液，并且最优选≥3mg/L上清液。
同样地，可以测定二聚体抗体构建体同种型的产量及因此测定抗体构建体的单体百分比(即，单体：(单体+二聚体))。单体和二聚体抗体构建体的产率和单体百分比计算值可以例如在来自滚瓶中的标准化研究级生产的培养物上清液的SEC纯化步骤中获得。在一个实施方案中，抗体构建体的单体百分比为≥80％，更优选≥85％，甚至更优选≥90％，且最优选≥95％。
在一个实施方案中，抗体构建体具有≤5或≤4，更优选≤3.5或≤3，甚至更优选≤2.5或≤2，并且最优选≤1.5或≤1的优选血浆稳定性(有血浆下的EC50与无血浆下的EC50的比率)。抗体构建体的血浆稳定性可以通过在37℃下将所述构建体在人血浆中孵育24小时，然后在51-铬释放细胞毒性测定中进行EC50测定来测试。细胞毒性测定中的效应细胞可以是经刺激的富集的人CD8阳性T细胞。靶细胞可以例如是经人EGFRVIII转染的CHO细胞。效应细胞对靶细胞(E∶T)的比率可以被选为10∶1。用于此目的的人血浆库来源于通过涂覆有EDTA的注射器收集的健康供体的血液。通过离心除去细胞组分，收集上层血浆相，然后合并。作为对照，在即将进行细胞毒性测定之前，将抗体构建体在RPMI-1640培养基中稀释。血浆稳定性被计算为EC50(血浆孵育后)与EC50(对照)的比率。参见实施例7。
此外优选的是，本发明抗体构建体具有低单体-二聚体转化率。可以在不同条件下测量转化率并通过高效尺寸排阻色谱法进行分析。参见实施例5。例如，可以在培养箱中将抗体构建体的单体同种型在37℃和250μg/ml的浓度下孵育7天。在这些条件下，本发明的抗体构建体优选具有≤2.5％，更优选≤2％，进一步优选≤1.5％，进一步优选≤1％，更优选≤0.5％和最优选≤0.25％的二聚体百分比。基于EvIII-2的双特异性抗体构建体显示出1.56％的二聚体转化率，而本发明的基于EvIII-1的双特异性抗体构建体显示出在针对该特征的最优选限值的上限处的转化率。
还优选的是，本发明的双特异性抗体构建体在多次冻融循环后呈现极低的二聚体转化率。例如，将抗体构建体单体在例如通用配制缓冲液中调整至250μg/ml的浓度，并进行三次冻融循环(在-80℃下冷冻30分钟，随后在室温下解冻30分钟)，接着进行高效SEC测定以已经转化成二聚体抗体构建体的初始单体抗体构建体的百分比。例如，在三次冻融循环之后，双特异性抗体构建体的二聚体百分比优选≤2.5％，更优选≤2％，进一步优选≤1.5％，进一步优选≤1％，且最优选≤0.5％。基于EvIII-2的双特异性抗体构建体不满足优选范围(2.53％的二聚体)，而本发明的基于EvIII-1的双特异性抗体构建体显示出在针对该特征的最优选限值的上限处的转化率(0.59％的二聚体)。
本发明的双特异性抗体构建体优选显示其中聚集温度≥45℃或≥50℃，更优选≥51℃、≥52℃、≥53℃或≥54℃，甚至更优选≥56℃或≥57℃，以及最优选≥58℃或≥59℃的有利热稳定性。热稳定性参数可以如下根据抗体聚集温度来测定：将浓度为250μg/ml的抗体溶液转移到一次性比色杯中，并放置于动态光散射(DLS)装置中。将样品以0.5℃/min的加热速率从40℃加热到70℃，并不断采集半径测量值。将指示蛋白质的熔融和聚集的半径增加用于计算抗体的聚集温度。参见实施例6。
或者，可以通过差示扫描量热法(DSC)测定温度熔融曲线以确定抗体构建体的固有生物物理学蛋白质稳定性。这些实验使用MicroCal LLC(Northampton，MA，U.S.A)VP-DSC装置进行。与仅含有制剂缓冲液的样品相比，从20℃至90℃记录含有抗体构建体的样品的能量吸收。将抗体构建体在例如SEC运行缓冲液中调整至250μg/ml的最终浓度。为了记录相应的熔融曲线，逐步提高整体样品温度。在每个温度T下记录样品和配制缓冲液参照物的能量吸收。将样品的能量吸收Cp(kcal/mole/℃)减去参考值的差值针对相应的温度作图。熔融温度定义为出现能量吸收的第一最大值时的温度。
还设想本发明的EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体具有≤0.2，优选≤0.15，更优选≤0.12，甚至更优选≤0.1或甚至≥0.09，以及最优选≤0.08或≥0.07的浊度(在将纯化的单体抗体构建体浓缩至2.5mg/ml并孵育过夜后，通过OD340测量)。参见实施例7。双特异性抗体构建体EvIII-2显示出几乎为3的相当高的浊度(在将纯化的单体抗体构建体浓缩至2.5mg/ml并孵育过夜后，通过OD340测量)，而只有基于EvIII-1的双特异性抗体构建体明显地在可用于药物制剂的所需蛋白质化合物的范围内；参见实施例7中的表3。
在另一个实施方案中，根据本发明的抗体构建体在酸性pH下是稳定的。抗体构建体在非生理pH如pH5.5(进行例如阳离子交换色谱法所需的pH)下表现出的耐受性越高，从离子交换柱洗脱的抗体构建体相对于加载的蛋白质总量的回收率越高。抗体构建体从pH5.5的离子(例如，阳离子)交换柱的回收率优选≥30％，更优选≥40％，更优选≥50％，甚至更优选≥60％，甚至更优选≥70％，甚至更优选≥80％，甚至更优选≥90％，甚至更优选≥95％，且最优选≥99％。
此外，设想本发明的双特异性抗体构建体表现治疗功效或抗肿瘤活性。这可以例如在如下面的晚期人肿瘤异种移植模型的实例中所公开的研究中进行评估：
在研究的第1天，将人EGFRVIII阳性癌细胞系(例如人胶质母细胞瘤细胞系U87或DK-MG)的5×106个细胞皮下注射到雌性NOD/SCID小鼠的右背侧。当平均肿瘤体积达到约100mm3时，通过将约2×107个细胞注射到动物的腹腔中，将体外扩增的人CD3阳性T细胞移植到小鼠体内。媒介物对照组1的小鼠不接受效应细胞，并且用作与媒介物对照组2(接受效应细胞)进行比较的非移植对照，以监测单独的T细胞对肿瘤生长的影响。当平均肿瘤体积达到约200mm3时，开始抗体治疗。治疗开始当天每个治疗组的平均肿瘤大小与任何其它组均不应有统计学差异(方差分析)。用0.5mg/kg/天的EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体通过静脉推注约15至20天来治疗小鼠。在研究期间通过卡尺测量肿瘤，并通过肿瘤体积(TV)的组间比较来评估进展。通过以T/C％＝100×(分析组的中值TV)/(对照组2的中值TV)计算TV来确定肿瘤生长抑制T/C[％]。
本领域技术人员知道如何修改或调整本研究的某些参数，例如注射的肿瘤细胞数量、注射部位、移植的人T细胞的数量、待施用的双特异性抗体构建体的量以及时间轴，同时仍实现有意义和可再现的结果。优选地，肿瘤生长抑制T/C[％]为≤70或≤60，更优选≤50或≤40，甚至更优选≤30或≤20，且最优选≤10或≤5或甚至≤2.5。
本发明进一步提供了编码本发明的抗体构建体的多核苷酸/核酸分子。
多核苷酸是由13个或更多个共价结合在链中的核苷酸单体组成的生物聚合物。DNA(如cDNA)和RNA(如mRNA)是具有不同生物功能的多核苷酸的实例。核苷酸是用作核酸分子如DNA或RNA的单体或亚单元的有机分子。核酸分子或多核苷酸可以是双链和单链、线性和环状。它优选包含在载体中，所述载体优选包含在宿主细胞中。所述宿主细胞例如在经本发明的载体或多核苷酸转化或转染后能够表达抗体构建体。为此，将所述多核苷酸或核酸分子与控制序列可操作地连接。
遗传密码是籍以将遗传物质(核酸)中编码的信息翻译成蛋白质的一组规则。活细胞中的生物解码是通过核糖体实现，核糖体使用tRNA分子运载氨基酸且一次读取mRNA的三个核苷酸而以mRNA规定的次序连接氨基酸。密码定义了这些核苷酸三联体(称为密码子)的序列如何指定在蛋白质合成期间接着将添加哪种氨基酸。除了一些例外，核酸序列中的三核苷酸密码子指定单个氨基酸。因为绝大多数基因用完全相同的密码编码，所以这个特定的密码通常被称为规范或标准遗传密码。虽然遗传密码决定了给定编码区的蛋白质序列，但其它基因组区能够影响这些蛋白质产生的时间和地点。
此外，本发明提供了包含本发明的多核苷酸/核酸分子的载体。
载体是用作将(外来)遗传物质转移至细胞中的运载工具的核酸分子。术语“载体”包括但不限于质粒、病毒、粘粒和人工染色体。通常，工程改造的载体包含复制起点、多克隆位点和可选择标记。载体本身通常是核苷酸序列，通常是DNA序列，其包含插入物(转基因)和作为载体“主链”的较大序列。除了转基因插入物和主链以外，现代载体还可以包含其它特征：启动子、遗传标记、抗生素抗性、报道基因、靶向序列、蛋白质纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体专门用于在靶细胞中表达转基因，并且通常具有控制序列。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一个核酸序列产生功能关系时，核酸是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与该序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则其与编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并处于阅读阶段。但是，增强子不必是连续的。连接通过在适宜的限制性位点处连接来完成。如果此类位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
“转染”是向靶细胞中故意引入核酸分子或多核苷酸(包括载体)的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。转导通常用于描述由病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染通常涉及打开细胞膜中的瞬时孔隙或“空洞”，以允许摄取物质。转染可使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与产生脂质体(其与细胞膜融合且将其货物沉积到内部)的物质混合来进行。
术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌以及非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，其因通过细胞膜从其环境直接吸收且随后并入外源性遗传物质(核酸分子)而引起。转化可由人工方式实现。为使转化发生，细胞或细菌必须处于感受态，其可作为对环境条件(诸如饥饿和细胞密度)的时间限制性反应而发生。
此外，本发明提供了经本发明的多核苷酸/核酸分子或载体转化或转染的宿主细胞。
如本文所用，术语“宿主细胞”或“受体细胞”旨在包括可为或已为载体、外源性核酸分子和编码本发明的抗体构建体的多核苷酸的受体和/或抗体构建体本身的受体的任何单独的细胞或细胞培养物。将相应物质引入细胞中借助转化、转染等方法进行。术语“宿主细胞”也旨在包括单个细胞的子代或可能的子代。因为后续世代中由于天然、偶然或故意突变或由于环境影响可能发生某些修饰，所以实际上此类子代可能不与亲本细胞完全相同(在形态或基因组或总DNA互补序列上)，但仍包括在如本文所用的术语的范围内。适合的宿主细胞包括原核或真核细胞，且也包括但不限于细菌、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞，诸如昆虫细胞和哺乳动物细胞，例如鼠科动物、大鼠、猕猴或人。
本发明的抗体构建体可以在细菌中产生。表达后，将本发明的抗体构建体以可溶级分与大肠杆菌细胞糊分离，并且可以通过例如亲和色谱法和/或尺寸排阻法使其纯化。最终纯化可以按照类似于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法进行。
除了原核生物之外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是本发明抗体构建体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属、种和菌株在本文中通常是可用的并且是有用的，诸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、魏氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24178)、瓦尔特克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(EP402 226)；巴斯德毕赤酵母(EP 183 070)；念珠菌属；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP244 234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，例如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌如脉孢菌属、青霉属、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属宿主如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
适用于表达本发明的糖基化抗体构建体的宿主细胞来源于多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经确定了来自诸如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的宿主的许多杆状病毒毒株和变体以及相应的许可性昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒株是可以公开获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕(Bombyx mori)NPV的Bm-5毒株，并且此类病毒可以用作根据本发明的本文的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。
还可以使用棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、拟南芥和烟草的植物细胞培养物作为宿主。可用于在植物细胞培养物中产生蛋白质的克隆和表达载体是本领域技术人员已知的。参见例如Hiatt等人，Nature(1989)342：76-78；Owen等人(1992)Bio/Technology10：790-794；Artsaenko等人(1995)The Plant J 8：745-750；和Fecker等人(1996)PlantMol Biol 32：979-986。
然而，最受关注的是脊椎动物细胞，并且脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已经成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是经SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(亚克隆以用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CVI ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，1413 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL5 1)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y Acad.Sci.(1982)383：44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤系(Hep G2)。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于生产本发明的抗体构建体的方法，所述方法包括在允许表达本发明的抗体构建体的条件下培养本发明的宿主细胞，并从培养物中回收所产生的抗体构建体。
如本文中所用，术语“培养”是指细胞在培养基中在适当条件下的体外维持、分化、生长、增殖和/或繁殖。术语“表达”包括涉及产生本发明抗体构建体的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
当使用重组技术时，抗体构建体可在细胞内、在周质空间中产生，或者直接分泌到培养基中。如果抗体构建体在细胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤除去微粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了用于分离被分泌至大肠杆菌周质空间的抗体的方法。简言之，在约30分钟内，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在的情况下将细胞糊解冻。细胞碎片可通过离心去除。当抗体被分泌至培养基中时，通常首先使用市售的蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元)浓缩来自此类表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂诸如PMSF可包括在任何上述步骤中以抑制蛋白水解，并可包含抗生素来防止偶然污染物的生长。
从宿主细胞制备的本发明的抗体构建体可使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱来回收或纯化。取决于待回收的抗体，也可使用用于蛋白质纯化的其它技术，诸如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的色谱，肝素SEPHAROSETM上的色谱、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的色谱、色谱-聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。当本发明的抗体构建体包含CH3结构域时，Bakerbond ABX树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用于纯化。
亲和色谱是优选的纯化技术。亲和配体所附接的基质最常见地是琼脂糖，但其它基质也是可用的。机械稳定性基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯允许比可用琼脂糖获得更快的流速和更短的处理时间。
此外，本发明提供了包含本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体的药物组合物。对于本发明的药物组合物，优选的是，抗体构建体的均质性≥80％，更优选≥81％、≥82％、≥83％、≥84％或≥85％，进一步优选≥86％、≥87％、≥88％、≥89％或≥90％，进一步优选≥91％、≥92％、≥93％、≥94％或≥95％，最优选≥96％、≥97％、≥98％或≥99％。
如本文中所用，术语“药物组合物”涉及适合用于向患者，优选人患者施用的组合物。本发明的特别优选的药物组合物优选地以治疗有效量包含一种或多种本发明的抗体构建体。优选地，药物组合物还包含一种或多种(药学上有效的)载体、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的合适制剂。组合物的可接受的成分优选在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
本发明组合物可包含药学上可接受的载体。一般地，如本文中所用，“药学上可接受的载体”意指任何和所有的含水和非含水溶液、无菌溶液、溶剂、缓冲剂例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液、水、悬浮液、乳剂诸如油/水乳剂，各种类型的润湿剂、脂质体、分散介质和包衣，其与药物施用相容，特别是与肠胃外施用相容。此类介质和药剂在药物组合物中的使用是本领域公知的，包含此类载体的组合物可通过公知的常规方法配制。
某些实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体构建体以及另外的一种或多种赋形剂，诸如在本部分和本文其它地方说明性描述的赋形剂。就这一点而言，赋形剂可在本发明中用于各种目的，诸如调节制剂的物理、化学或生物学性质，诸如调节粘度和/或用于本发明的方法以改善有效性和/或稳定此类配制剂和工艺，防止由于例如在制造、运输、储存、使用前准备、施用期间和之后发生的胁迫而导致的降解和腐败。
在某些实施方案中，药物组合物可含有用于改变、维持或保持例如组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透目的的制剂材料(参见，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，(A.R.Genrmo，编辑)，1990，Mack Publishing Company)。在此类实施方案中，合适的制剂材料可包括但不限于：
●氨基酸诸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、脯氨酸、2-苯丙氨酸，包括带电荷的氨基酸，优选赖氨酸、醋酸赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和/或组氨酸
●抗微生物剂诸如抗菌剂和抗真菌剂
●抗氧化剂诸如抗坏血酸、甲硫氨酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠；
●缓冲液、缓冲体系和缓冲剂，其用于将组合物保持在生理pH或稍低的pH下，通常在约5至约8或9的pH范围内；缓冲剂的实例是硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸、琥珀酸盐、磷酸盐、组氨酸和醋酸盐；例如约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的醋酸盐缓冲液；
●非水溶剂诸如丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油和可注射有机酯诸如油酸乙酯；
●含水载体，包括水、酒精/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质；
●可生物降解的聚合物诸如聚酯；
●填充剂诸如甘露醇或甘氨酸；
●螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；
●等渗和吸收延缓剂；
●络合剂诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)
●填料；
●单糖；二糖；和其它碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；碳水化合物可以是非还原糖，优选海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、山梨糖醇或木糖醇；
●(低分子量)蛋白质、多肽或蛋白质性质的载体，诸如人或牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，优选人来源的；
●着色剂和调味剂；
●含硫还原剂，诸如谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、[α]-单硫代甘油和硫代硫酸钠
●稀释剂；
●乳化剂；
●亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮)
●成盐抗衡离子诸如钠；
●防腐剂诸如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等；实例为：苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯基乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)。
●金属复合物诸如锌-蛋白复合物；
●溶剂和助溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；
●糖类和糖醇，诸如海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、甘露糖醇、山梨糖醇或木糖醇水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油、环醇类(例如，肌醇)、聚乙二醇；和多元糖醇；
●助悬剂；
●表面活性剂或润湿剂诸如普朗尼克类、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯类诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、曲拉通、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊；表面活性剂可以是去垢剂，优选具有＞1.2KD的分子量和/或聚醚，优选具有＞3KD的分子量；优选洗涤剂的非限制性实例是吐温20、吐温40、吐温60、吐温80和吐温85；优选聚醚的非限制性实例是PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000和PEG 5000；
●稳定性增强剂诸如蔗糖或山梨糖醇；
●张力增强剂诸如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨糖醇；
●肠胃外递送媒介物，包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油；
●静脉内递送媒介物，包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的补充剂)。
对于本领域技术人员来说显而易见的是，药物组合物(例如，上面列出的那些组合物)的不同成分可具有不同的作用，例如，氨基酸可充当缓冲剂、稳定剂和/或抗氧化剂；甘露醇可充当填充剂和/或张力增强剂；氯化钠可充当递送媒介物和/或张力增强剂；等等
设想了本发明的组合物，除了本文定义的本发明的多肽以外，还可包含其它生物活性剂，这取决于组合物的预期用途。此类试剂可能是作用于胃肠系统的药物，充当细胞抑制剂的药物，预防高尿酸血症的药物，抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)，调节炎症反应的药物，作用于循环系统的药物和/或本领域中已知的药剂诸如细胞因子。还设想了，本发明的抗体构建体被用于共同疗法，即与另一种抗癌药物组合。
在某些实施方案中，最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预期的施用途径、递送形式和所需剂量来确定。参见，例如REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上。在某些实施方案中，此类组合物可影响本发明的抗体构建体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在某些实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载体本质上可以是含水的或非含水的。例如，合适的媒介物或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人造脑脊髓液，可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其它物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是进一步的示例性媒介物。在某些实施方案中，本发明组合物的抗体构建体可通过将具有所需纯度的选定组合物与任选制剂(REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES，同上)以冻干饼或水溶液的形式混合来制备用于储存。另外，在某些实施方案中，可以使用合适的赋形剂诸如蔗糖将本发明的抗体构建体配制成冻干物。
当设想虑肠胃外施用时，用于本发明的治疗性组合物可以以无热原的、肠胃外可接受的水溶液的形式提供，所述水溶液包含在药学上可接受的媒介物中的本发明的所需抗体构建体。用于肠胃外注射的特别合适的媒介物是无菌蒸馏水，其中本发明的抗体构建体被配制成适当保存的无菌等渗溶液。在某些实施方案中，制备可涉及将可提供可通过储库注射递送的产品的受控或持续释放的药剂(诸如可注射微球体、生物可侵蚀颗粒、聚合物化合物(诸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体)与所需的分子一起配制。在某些实施方案中，也可使用透明质酸，其具有促进循环持续时间的作用。在某些实施方案中，可植入药物递送装置可用于引入所需的抗体构建体。
另外的药物组合物对于本领域技术人员是显而易见的，包括涉及持续或受控递送/释放制剂中的本发明的抗体构建体的制剂。用于配制各种其它持续或受控递送手段(诸如脂质体载体、生物可侵蚀微粒或多孔珠粒和储库注射)的技术也是本领域技术人员已知的。参见，例如，国际专利申请第PCT/US93/00829号，其描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的受控释放。持续释放制剂可包括成型制品形式(例如，薄膜或微胶囊)的半透性聚合物基质。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯(如美国专利第3,773,919号和欧洲专利申请公开第EP 058481号中公开的)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等，1983，Biopolymers 2：547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277和Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，1981，同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开第EP 133,988号)。持续释放组合物还可包括可通过本领域已知的几种方法中的任一种制备的脂质体。参见，例如，Eppstein等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；欧洲专利申请公开第EP 036,676号、第EP 088,046号和第EP 143,949号。
还可将抗体构建体包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)制备的微胶囊包、胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳剂中。此类技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Oslo，A.编辑，(1980)中。
用于体内施用的药物组合物通常作为无菌制剂提供。灭菌可通过无菌滤膜过滤完成。当将组合物冻干时，可在冻干和重构之前或之后进行使用该方法的灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或溶液储存。通常将肠胃外组合物放入具有无菌入口的容器(例如具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)中。
本发明的另一个方面包括可用作药物组合物的本发明制剂的自我缓冲抗体构建体，如国际专利申请WO 06138181A2(PCT/US2006/022599)中所述的。关于蛋白质稳定化以及用于这方面的制剂材料和方法的各种各样的阐述是可获得的，诸如Arakawa等，“Solventinteractions in pharmaceutical formulations，”Pharm Res.8(3)：285-91(1991)；Kendrick等，RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS：THEORY ANDPRACTICE，Carpenter和Manning，编辑Pharmaceutical Biotechnology.13：61-84(2002)中的“Physical stabilization of proteins in aqueous solution”和Randolph等，“Surfactant-protein interactions”，Pharm Biotechnol.13：159-75(2002)，特别地参见涉及用于根据本发明的自我缓冲蛋白质制剂的赋形剂及其方法，尤其是关于用于兽医和/或人医学用途的蛋白质药物产品和方法的部分。
根据本发明的某些实施方案，可使用盐例如以调节制剂的离子强度和/或等渗性和/或改善根据本发明的组合物的蛋白质或其它成分的溶解度和/或物理稳定性。如所公知的，离子可通过与蛋白质表面上带电荷的残基结合，通过屏蔽蛋白质中的带电荷的极性基团和降低其静电相互作用的强度、吸引力和排斥作用而稳定蛋白质的天然状态。离子还可通过特别地与蛋白质的变性肽键联(--CONH)结合来稳定蛋白质的变性状态。此外，与蛋白质中带电荷的极性基团的离子相互作用也可减小分子间静电相互作用，从而防止或减少蛋白质的聚集和不溶性。
离子种类在其对蛋白质的作用方面有显著的不同。已开发了许多可用于配制根据本发明的药物组合物的离子及其对蛋白质的作用的分类排序。一个实例是霍夫迈斯特系列，其通过对它们对溶液中蛋白质的构象稳定性的影响将离子和极性非离子溶质分级。稳定溶质被称为“亲液”。去稳定溶质被称为“离液”。通常以高浓度(例如，＞1摩尔硫酸铵)使用亲液剂以从溶液中沉淀蛋白质(“盐析”)。离液剂通常用于使蛋白变性和/或使蛋白质增溶(“盐溶”)。离子对“盐溶”和“盐析”的相对有效性限定了它们在霍夫迈斯特系列中的位置。
游离氨基酸可在根据本发明的各种实施方案的本发明的抗体构建体制剂中用作填充剂、稳定剂和抗氧化剂以及其它标准用途。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于稳定制剂中的蛋白质。甘氨酸用于冻干以确保正确的滤饼结构和性质。在液体和冻干制剂中，精氨酸可用于抑制蛋白质聚集。甲硫氨酸可用作抗氧化剂。
多元醇包括糖类，例如甘露糖醇、蔗糖和山梨醇和多元醇诸如，例如甘油和丙二醇，以及为了本文论述的目的，聚乙二醇(PEG)和相关物质。多元醇是亲液的。它们是液体和冻干制剂中有用的稳定剂，以保护蛋白质免受物理和化学降解过程的影响。多元醇也用于调节制剂的张力。在本发明的选择的实施方案中有用的多元醇是甘露醇，通常用于确保冻干制剂中滤饼的结构稳定性。其确保滤饼的结构稳定性。其通常与冻干保护剂例如蔗糖一起使用。山梨糖醇和蔗糖是用于调节张力和用作稳定剂以在运输期间或在制造过程中制备团块时防止冻融胁迫的试剂中的优选试剂。还原糖类(其含有游离的醛或酮基团)，诸如葡萄糖和乳糖，可将表面赖氨酸和精氨酸残基糖化。因此，它们通常不在根据本发明使用的优选多元醇当中。另外，在这一点而言，形成此类反应性种类的糖类，诸如蔗糖(其在酸性条件下水解成果糖和葡萄糖，并因此产生糖化作用)也不在本发明的优选多元醇当中。PEG对于稳定蛋白质和作为冷冻保护剂是有用的，并且可在这方面用于本发明。
本发明制剂的抗体构建体的实施方案还包含表面活性剂。蛋白质分子可易于吸附在表面上，并在气-液、固-液和液-液界面上变性和随后聚集。这些效应通常与蛋白质浓度成反比。这些有害的相互作用通常与蛋白质浓度成反比，并且通常通过物理搅拌(诸如在产品的运输和处理过程中产生的物理搅拌)加剧。表面活性剂通常用于防止、最小化或减少表面吸附。在这方面，本发明中有用的表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨糖醇聚乙氧基化物的其它脂肪酸酯和泊洛沙姆188。表面活性剂还通常用于控制蛋白质构象稳定性。表面活性剂在这方面的用途是蛋白质特异性的，因为任何给定的表面活性剂通常会稳定一些蛋白质并使其它蛋白质去稳定。
聚山梨醇酯易于氧化降解，并且通常在供应时含有足够量的过氧化物以引起蛋白质残基侧链尤其是甲硫氨酸的氧化。因此，应谨慎使用聚山梨醇酯，使用时应以其最低有效浓度使用。在这一方面，聚山梨醇酯举例说明了赋形剂应当以其最低有效浓度使用的一般规则。
本发明的抗体构建体的实施方案还包含一种或多种抗氧化剂。在某种程度上，可以通过维持适当水平的环境氧气和温度以及通过避免暴露于光而在药物制剂中防止蛋白质的有害氧化。也可使用抗氧化剂赋形剂来防止蛋白质的氧化降解。在这一方面，有用的抗氧化剂中有还原剂、氧/自由基清除剂和螯合剂。用于根据本发明的治疗性蛋白质制剂中的抗氧化剂优选是水溶性的，并且在整个产品的保存期限内保持其活性。在这一方面，EDTA是根据本发明的优选抗氧化剂。抗氧化剂可以破坏蛋白质。例如，还原剂，特别是诸如谷胱甘肽，可以破坏分子内二硫键联。因此，选择用于本发明的抗氧化剂以，尤其，消除或充分降低其本身破坏制剂中的蛋白质的可能性。
根据本发明的制剂可包括金属离子，所述离子是蛋白质辅因子并且是形成蛋白质配位络合物所必需的，诸如形成某些胰岛素悬浮液所必需的锌。金属离子还可抑制一些降解蛋白质的过程。然而，金属离子也催化降解蛋白质的物理和化学过程。镁离子(10-120mM)可用于抑制天冬氨酸异构化成异天冬氨酸。Ca+2离子(高达100mM)可提高人脱氧核糖核酸酶的稳定性。然而，Mg+2、Mn+2和Zn+2会使rhDN酶去稳定。类似地，Ca+2和Sr+2可以稳定因子VIII，其可被Mg+2、Mn+2和Zn+2、Cu+2和Fe+2去稳定，并且可通过Al+3离子增加其聚集。
本发明制剂的抗体构建体的实施方案还包含一种或多种防腐剂。当开发多剂量肠胃外制剂时防腐剂是必需的，所述开发涉及从同一容器进行多于一次提取。它们的主要功能是抑制微生物生长并在整个药物产品的保存期限或使用期限内确保产品无菌性。常用防腐剂包括苯甲醇、苯酚和间-甲酚。虽然防腐剂在小分子肠胃外使用方面有着悠久的历史，但包含防腐剂的蛋白质制剂的开发可具有挑战性的。防腐剂几乎总是对蛋白质具有不稳定作用(聚集)，并且这已成为限制其在多剂量蛋白质制剂中使用的主要因素。迄今为止，大多数蛋白质药物仅配制为一次性使用。然而，当多剂量制剂是可能的时候，它们具有使患者方便和增加适销性的额外有利方面。一个很好的实例是人生长激素(hGH)的多剂量制剂，其中保存制剂的开发已导致更方便、多用途的注射笔呈现的商业化。目前市场上至少有四种含有hGH的保存制剂的此类笔装置。诺德欣(Norditropin)(液体，Novo Nordisk)、NutropinAQ(液体，Genentech)及Genotropin(冻干--双室药筒，Pharmacia&Upjohn)含有苯酚，而Somatrope(Eli Lilly)与间-甲酚一起配制。保存剂型的配制和开发过程中需要考虑几个方面。必须优化药品中有效的防腐剂浓度。这需要测试剂型中给定的防腐剂的赋予抗微生物效力而不损害蛋白质稳定性的浓度范围。
正如可以预料的那样，含有防腐剂的液体制剂的开发比冻干制剂更具挑战性。冷冻干燥的产品可以在没有防腐剂的情况下冻干，并且在使用时用含有防腐剂的稀释剂重构。这缩短了防腐剂与蛋白质接触的时间，显著地使相关的稳定性风险降至最低。对于液体制剂，应在整个产品保存期限(约18至24个月)内保持防腐效力和稳定性。重要的一点是，防腐剂的有效性应该在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终制剂中得到证明。
本文公开的抗体构建体也可以配制成免疫脂质体。“脂质体”是由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，其可用于将药物递送至哺乳动物。脂质体的组分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。含有抗体构建体的脂质体通过本领域已知的方法制备，诸如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；美国专利第4,485,045号和和第4,544,545号；以及W0 97/38731中所描述的。具有延长的循环时间的脂质体公开于美国专利第5,013,556号中。特别有用的脂质体可通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。将脂质体挤出通过具有限定孔径的过滤器以产生具有需直径的脂质体。可如Martin等，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)所述，通过二硫键交换反应将本发明的抗体构建体的Fab′片段缀合至脂质体。将化学治疗剂任选地包含在脂质体内。参见Gabizon等J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
一旦配制了药物组合物，可将其作为溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体、晶体或作为脱水或冻干粉储存在无菌小瓶中。此类制剂可以以即用形式或以在施用前重构的形式(例如，冻干的)储存。
本文所定义的药物组合物的生物活性可以例如通过细胞毒性测定来测定，如在WO99/54440中的实施例中或由Schlereth等(Cancer Immunol.Immunother.20(2005)，1-12)所描述的。如本文中所用，“功效”或“体内功效”是指使用例如标准化的NCI反应标准，对通过本发明的药物组合物的治疗的反应。使用本发明的药物组合物的治疗的成功或体内功效是指组合物对其预期目的的有效性，即组合物引起其所需作用的能力，即病理性细胞(例如，肿瘤细胞)的耗竭。体内功效可通过针对相应的疾病实体的已建立的标准方法来监测，包括但不限于白细胞计数、差异、荧光激活细胞分选术、骨髓抽吸。另外，可使用各种疾病特异性临床化学参数和其它建立的标准方法。此外，计算机辅助X线断层摄影术、X射线、核磁共振断层摄影术(例如，用于基于国家癌症研究所标准的反应评估[Cheson BD，HorningSJ，Coiffier B，Shipp MA，Fisher RI，Connors JM，Lister TA，Vose J，Grillo-Lopez A，Hagenbeek A，Cabanillas F，Klippensten D，Hiddemann W，Castellino R，Harris NL，Armitage JO，Carter W，Hoppe R，Canellos GP.Report of an international workshopto standardize response criteria for non-Hodgkin′s lymphomas.NCI SponsoredInternational Working Group.J Clin Oncol.1999年4月；17(4)：1244])、正电子发射断层扫描术、白细胞计数、差异、荧光激活细胞分选术、骨髓抽吸、淋巴结活组织检查/组织学，并且可使用各种淋巴瘤特异性临床化学参数(例如乳酸脱氢酶)和其它已建立的标准方法。
药物诸如本发明的药物组合物的开发中的另一个主要挑战是可预测的药代动力学性质的调节。为此目的，可以建立候选药物的药代动力学特征，即影响特定药物治疗给定病况的能力的药代动力学参数的特征。影响药物治疗某些疾病实体的能力的药物的药代动力学参数包括但不限于：半衰期、分布体积、肝首过代谢和血清结合度。给定药物的功效可以受到上述每个参数的影响。
“半衰期”意指其中通过生物过程如代谢、排泄等消除50％施用的药物所用的时间。“肝首过代谢”是指药物在首次接触肝脏时(即在其首次通过肝脏期间)被代谢的倾向。“分布体积”意指药物在身体内不同隔室的保留程度，如例如细胞内与细胞外间隙、组织和器官等，以及药物在这些隔室内的分布。“血清结合度”意指药物与血清蛋白诸如白蛋白相互作用并与其结合，从而导致该药物生物活性的降低或丧失的倾向。
药代动力学参数还包括给定量的施用的药物的生物利用度、滞后时间(Tlag)、Tmax、吸收率、多发(more onset)和/或Cmax。“生物利用度”意指血液隔室中的药物量。“滞后时间”意指药物施用与其在血液或血浆中检测出及可测得之间的时间延搁。“Tmax”是药物达到最大血药浓度所需要的时间，“Cmax”是对于给定药物获得的最大血药浓度。达到其生物作用所需的药物的血液或组织浓度的时间受所有参数影响。也在例如Schlereth等的出版物(Cancer Immunol.Immunother.20(2005)，1-12)中阐述了表现出跨物种特异性的双特异性抗体构建的药代动力学参数(其可如上所概述的，在临床前动物测试中在非黑猩猩灵长类动物中进行测定)。
一个实施方案提供了本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的用于预防、治疗或改善肿瘤或癌症疾病或转移性癌症疾病的抗体构建体。
根据本发明的优选实施方案，所述肿瘤或癌症疾病是实体瘤疾病。
本文所述的制剂可用作药物组合物，用于在有此需要的患者中治疗、改善和/或预防如本文所述的病理医学病况。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施。治疗包括将所述制剂施加或施用于患有疾病/病症、疾病/病症的症状或具有对疾病/病症的倾向的患者的身体、分离的组织或细胞，目的是治愈、愈合、缓解、减轻、改变、补救、改善、增进或影响疾病、该疾病的症状或罹患该疾病倾向。
如本文中所用，术语“改善”是指通过向有此需要的受试者施用根据本发明的抗体构建体而对患有如下文所述的肿瘤或癌症或转移性癌症的患者的疾病状态的任何改善。此类改善也可以被看作是患者的肿瘤或癌症或转移性癌症的进展的减缓或停止。如本文中所用，术语“预防”意指通过向有此需要的受试者施用根据本发明的抗体构建体而使患者避免发生或再发生患如下文所述的肿瘤或癌症或转移性癌症。
术语“疾病”是指将受益于利用本文所述的抗体构建体或药物组合物的治疗的任何病况。这包括慢性和急性病况或疾病，包括使哺乳动物易患所述疾病的那些病理状况。
“肿瘤”是组织的异常生长，通常但不总是形成肿块。当也形成肿块时，通常将其称为“肿瘤”。赘生物或肿瘤或可以是良性的，可能是恶性的(癌前)或恶性的。恶性赘生物通常被称为癌症。它们通常侵入并破坏周围的组织，并可能形成转移灶，即它们扩散到身体的其它部位、组织或器官。因此，术语“转移性癌症”包括与除原始肿瘤的组织或器官相比至其它组织或器官的转移。淋巴瘤和白血病是淋巴赘生物。为了本发明的目的，它们也被术语“肿瘤”或“癌症”涵盖。
在本发明的优选实施方案中，肿瘤或癌症疾病是实体瘤疾病，并且转移性癌症疾病可以衍生自任何上述疾病。
结合本发明，优选肿瘤或癌症疾病选自由以下各项组成的组：胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、中枢神经系统癌。更优选地，肿瘤或癌症疾病是多形性胶质母细胞瘤(GBM)或间变性星形细胞瘤。转移性癌症疾病可以衍生自任何上述疾病。
本发明还提供用于治疗或改善肿瘤或癌症疾病或转移性癌症疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体的步骤。
术语“有需要的受试者”或“需要治疗的”的那些受试者包括已经患有病症的那些受试者以及其中将要预防疾病的那些受试者。有需要的受试者或“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其它哺乳动物受试者。
通常将针对特定的施用途径和方法，特定的施用剂量和频率，特定疾病的特定治疗，生物利用度和持久性范围等来设计本发明的抗体构建体。组合物的材料优选以对于施用部位是可接受的浓度来进行配制。
因此可根据本发明设计制剂和组合物以通过任何合适的施用途径递送。在本发明的上下文中，施用途径包括但不限于
●局部途径(诸如表皮、吸入、经鼻、经眼、经耳/耳部、经阴道、经粘膜)；
●肠途径(诸如口服、胃肠道、舌下、唇下、口腔、直肠)；和
●肠胃外途径(诸如静脉内、动脉内、骨内、肌内、大脑内、脑室内、硬膜外、鞘内、皮下、腹膜内、羊膜外、关节内、心内、真皮内、病灶内、子宫内、膀胱内、玻璃体内、经皮肤、鼻内、经粘膜、滑膜内、管腔内)。
本发明的药物组合物和抗体构建体特别适用于肠胃外施用，例如皮下或静脉内递送，例如通过注射诸如推注，或通过输注诸如连续输注。药物组合物可使用医疗装置来施用。用于施用药物组合物的医疗装置的实例描述于美国专利第4,475,196号、第4,439,196号、第4,447,224号、第4,447,233号、第4,486,194号、第4,487,603号、第4,596,556号、第4,790,824号、第4,941,880号、第5,064,413号、第5,312,335号、第5,312,335号、第5,383,851号和第5,399,163号。
特别地，本发明提供了合适组合物的不间断施用。作为非限制性实例，可通过患者佩戴的用于计量治疗剂至患者体内的流入的小型泵系统来实现不间断或基本不间断的，即连续施用。包含本发明的抗体构建体的药物组合物可通过使用所述泵系统施用。此类泵系统在本领域中通常是已知的，并且通常依靠定期更换含有待输注的治疗剂的药筒。当在此类泵系统中更换药筒时，其它情况下的治疗剂不间断流入患者体内的现象可能会发生暂时中断。在这种情况下，仍将药筒更换前的施用阶段和药筒更换后的施用阶段视为在本发明的药学方式和方法的含义内，并一同构成此类治疗剂的一个“不间断施用”。
本发明的抗体构建体的连续或不间断施用可以是通过流体递送装置或小型泵系统的方式进行在静脉内或皮下进行的，所述流体递送装置或小型泵系统包括用驱动流体从储存器中流出的流体驱动机制和用于致动驱动机制的致动机制。用于皮下施用的泵系统可包括用于穿透患者皮肤并将合适的组合物递送至患者体内的针或套管。所述泵系统可独立于静脉、动脉或血管直接固定或附接至患者的皮肤，从而允许泵系统与患者皮肤之间直接接触。可将泵系统附接于患者的皮肤24小时至数天。所述泵系统可以是小型尺寸，并具有供小容积使用的储存器。作为非限制性实例，用于待施用的合适药物组合物的储存器的容积可在0.1与50ml之间。
连续施用还可通过佩戴在皮肤上并每隔一段时间更换的贴片进行经皮肤施用。本领域技术人员知道适用于该目的的药物递送的贴片系统。值得注意的是，经皮肤施用尤其适用于不间断施用，因为可以有利地同时完成用完第一贴片后的新的第二贴片的更换，例如，将第二贴片放置于紧邻用完的第一贴片的皮肤表面并紧接着移除用完的第一贴片。不会出现流动中断或电池故障的问题。
如果药物组合物已被冻干，则首先在施用之前在合适的液体中重构冻干的材料。可在例如抑菌注射用水(BWFI)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或与冻干前蛋白质的相同制剂中重构冻干的材料。
可以以合适的剂量向受试者施用本发明的组合物，所述剂量可以例如通过剂量递增研究(通过向非黑猩猩灵长类动物(例如猕猴)施用递增剂量的表现出本文所述的跨物种特异性的本发明的抗体构建体)来确定。如上所述，表现出本文所述的跨物种特异性的本发明的抗体构建体可有利地以相同的形式用于在非黑猩猩灵长类动物中进行的临床前测试，以及作为人的药物使用。给药方案由主治医师和临床因素决定。如在医学领域中公知的，用于任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用的时间和途径、一般健康状况以及同时施用的其它药物。
术语“有效剂量”或“有效药剂量”被定义为足以实现或至少部分实现所需效果的量。术语“治疗有效剂量”被定义为足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的该疾病及其并发症的量。对该用途有效的量或剂量将取决于待治疗的病况(适应症)、递送的抗体构建体、治疗背景和目标、疾病的严重程度、先前的治疗、患者的临床病史和对治疗剂的反应、施用途径、患者的体型(体重、体表面或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)以及患者自身免疫系统的一般状态。可根据主治医生的判断，调整适当的剂量，从而使得该剂量可以一次施用于患者或者以一系列施药施用于患者，以获得最佳的治疗效果。
取决于上述因素，常用剂量范围可为约从0.1μg/kg至高达约30mg/kg或更高。在具体的实施方案中，剂量范围可为从1.0μg/kg直至约20mg/kg，任选地从10μg/kg直至约10mg/kg或从100μg/kg直至约5mg/kg。
治疗有效量的本发明的抗体构建体优选导致疾病症状严重度的降低，疾病无症状期的频率或持续时间的增加或由于疾病折磨而损伤或残疾的预防。为了治疗表达EGFRVIII的肿瘤，治疗有效量的本发明的抗体构建体，例如抗EGFRVIII/抗CD3抗体构建体优选抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％(相对于未治疗的患者)。可在预测在人肿瘤中的功效的动物模型中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。
药物组合物可以作为单独的治疗剂或根据需要与其它治疗剂诸如抗癌疗法(例如，其它蛋白质性质和非蛋白质性质的药物)组合施用。这些药物可以与包含如本文定义的本发明的抗体构建体的组合物同时施用，或者在以所限定时间间隔和剂量施用所述抗体构建体之前或之后单独施用。
如本文中所用，术语“有效且无毒的剂量”是指本发明的抗体构建体的可耐受剂量，所述剂量足够高从而引起病理细胞耗竭、肿瘤消除、肿瘤缩小或疾病的稳定，而不具有或基本上不具有较大毒性作用。此类有效且无毒的剂量可以例如通过本领域描述的剂量递增研究来测定，且该剂量应低于诱导严重不良副事件的剂量(剂量限制性毒性，DLT)。
如本文中所用，术语“毒性”是指表现为不良事件或严重不良事件的药物毒性作用。这些副事件可能是指对于药物缺乏整体耐受性和/或在施用后缺乏局部耐受性。毒性还可包括由药物引起的致畸或致癌作用。
如本文中所用，术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义在直接施药后(局部耐受)以及用药后的一个较长时期内药物的施用不会诱导严重不良事件。“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”可以在如治疗和随访期间定期进行评价。测量包括临床评价，例如器官的表现，以及实验室异常情况的筛查。可进行临床评价，并根据NCI-CTC和/或MedDRA标准记录/编码相对于正常结果的偏差。器官的表现可以包括诸如过敏/免疫学、血液/骨髓、心律失常、凝血等的标准，如阐述于例如不良事件术语标准第3.0版(CTCAE)中。可以进行测试的实验室参数包括例如血液学、临床化学、凝血功能概况和尿液分析以及其它体液诸如血清、血浆、淋巴液或脊髓液、脑脊液等的检查。因此可以例如通过体格检查、成像技术(即超声、x射线、CT扫描、磁共振成像(MRI))、其它测量及与技术设备(即心电图)、生命体征，通过测量实验室参数和记录不良事件来评价价安全性。例如，可通过组织病理学和/或组织化学方法来检查根据本发明的用途和方法中的非黑猩猩灵长类动物的不良事件。
上述术语也在例如Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6；ICH Harmonised Tripartite Guideline；ICH SteeringCommittee会议(1997年7月16日召开)中被提及。
在另外的实施方案中，本发明提供了包含本发明的抗体构建体、根据本发明的方法产生的抗体构建体、本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或发明的宿主试剂盒。
在本发明的上下文中，术语“试剂盒”意指一起被包装在容器、接受器或其它容器中的两种或更多种组分，其中一种对应于本发明的抗体构建体、药物组合物、载体或宿主细胞。因此，试剂盒可以被描述为足以实现特定目标的一组产品和/或器具，其可以作为单个单元销售。
该试剂盒可以包含任何适当形状、尺寸和材料(优选防水的，例如塑料或玻璃)的一个或多个容器(诸如小瓶、安瓿、容器、注射器、瓶子、袋子)，其以适当的施用剂量包含本发明的抗体构建体或药物组合物(参见上文)。所述试剂盒可另外包含使用指导(例如以小册子或说明书的形式)、施用本发明的抗体构建体的手段(诸如注射器、泵、浸泡器等)、用于重构本发明的抗体构建体的手段和/或用于稀释本发明的抗体构建体的手段。
本发明还提供了用于单剂量施用单元的试剂盒。本发明的试剂盒还可含有包含干燥/冻干抗体构建体的第一接受器和包含含水制剂的第二接受器。在本发明的某些实施方案中，提供了含有单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和lyosyringes)的试剂盒。
图式显示：
图1：
发现于胶质母细胞瘤中的N端缺失267个氨基酸的肿瘤特异性EGFR突变体EGFRvIII的示意图。
图2
靶结合物EvIII-2及其衍生物与共价连接的V区EvIII-1的序列比较。
图3
按照标准研究级生产进行的EvIII-1和EvIII-2纯化
图4
EvIII-1和EvIII-2单体：还原型SDS-PAGE。
图5
通过流式细胞术显示的EvIII-1和EvIII-2双特异性抗体构建体的交叉反应性：与人以及猕猴EGFRvIII和CD3结合
图6
EvIII-1和EvIII-2双特异性抗体构建体与EGFRvIII转染细胞以及人胶质母细胞瘤细胞系U87的结合
图7
经刺激的人CD8 T细胞针对经人EGFRvIII转染的CHO细胞的细胞毒性活性。18小时51铬释放测定。效应细胞：经刺激的富集的人CD8 T细胞。靶细胞：经EGFRvIII转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞(E∶T)比率：10∶1
图8
经刺激的人CD8 T细胞针对人胶质母细胞瘤细胞系U87的细胞毒性活性：(a)18小时51铬释放测定。效应细胞：经刺激的富集的人CD8 T细胞。靶细胞：vIII高阳性U87细胞。效应细胞与靶细胞(E∶T)比：10∶1；(b)18小时基于FACS的测定。效应细胞：经刺激的富集的人CD8 T细胞。靶细胞：hu EGFRvIII高阳性U87胶质瘤细胞。效应细胞与靶细胞(E∶T)比率：10∶1。
图9
经刺激的人CD8 T细胞针对表达天然EGFRvIII抗原的人肿瘤细胞系：胶质母细胞瘤细胞系DK-MG的细胞毒性活性：18小时51铬释放测定。效应细胞：经刺激的富集的人CD8 T细胞。靶细胞：DK-MG细胞。效应细胞与靶细胞(E∶T)比率：10∶1。
图10
猕猴T细胞系针对经猕猴EGFRvIII转染的CHO细胞的细胞毒性活性：48小时基于FACS的细胞毒性测定。效应细胞：猕猴CD3+LnPx4119。靶细胞：经猕猴EGFRvIII转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞(E∶T)比率：10∶1。
图11
双特异性抗体构建体在人血浆中孵育24小时后的稳定性：18小时基于51Cr的测定。效应细胞：经刺激的富集的人CD8 T细胞。靶细胞：经hu EGFRvIII转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞(E∶T)比率：10∶1。抗体构建体如所示
图12
通过高分辨率阳离子交换色谱法CIEX分析的EGFRvIII抗体构建体的蛋白质均质性。
图13
在疏水相互作用色谱法(HIC)中以流通模式测试的双特异性抗体构建体的表面疏水性。
图14
在250μg/ml和37℃下孵育7天后的单体至二聚体的转化。用HP-SEC进行分析。
图15
在250μg/ml和37℃下进行三次冻融循环后的单体至二聚体的转化。用HP-SEC进行分析。
图16：
EvIII-1xCD3-scFc构建体与经人EGFR转染的CHO细胞以及人CD3+T细胞系HPBaLL的FACS结合分析。红线表示用2μg/ml纯化单体蛋白孵育的细胞，其随后用小鼠抗I2C抗体和PE标记的山羊抗小鼠IgG检测抗体孵育。黑色直方图线反映阴性对照：仅用抗12C抗体以及PE标记的检测抗体孵育的细胞。
图17：
由重定向至作为效应细胞的CD56消耗的未经刺激的人PBMC和作为靶细胞的经人EGFR转染的CHO细胞的EvIII-1xCD3-scFc构建体诱导的细胞毒性活性。(实施例1.2)
实施例：
以下实施例举例说明本发明。这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。本发明仅受权利要求限制。
实施例1
细胞毒性活性
在五种体外细胞毒性测定中分析了本发明的EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体将效应T细胞针对表达EGFRVIII的靶细胞重定向的效力：
●在18小时51Cr释放测定(效靶比10∶1)中测量EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体将经刺激的人CD8+效应T细胞针对经人EGFRVIII转染的CHO细胞重定向的效力。图7
●在18小时51Cr释放测定(效靶比10∶1)中测量EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体将经刺激的人CD8+效应T细胞针对EGFRVIII阳性人胶质母细胞瘤细胞系U87重定向的效力。图8
●在48小时基于FACS的细胞毒性测定中测量EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体在不存在和存在可溶性EGFRVIII的情况下将未经刺激的人PBMC(CD14-/CD56-)中的T细胞针对经人EGFRVIII转染的CHO细胞重定向的效力(效靶比为10∶1)。图6和表6
●在48小时基于FACS的细胞毒性测定中测量EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体将未经刺激的人PBMC(CD14-/CD56-)中的T细胞针对EGFRVIII阳性人胶质母细胞瘤细胞系U87重定向的效力。图8
●为了确认交叉反应性EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体能够将猕猴T细胞针对经猕猴EGFRVIII转染的CHO细胞重定向，使用猕猴T细胞系LnPx4119作为效应T细胞进行48小时基于FACS的细胞毒性测定(效靶比为10∶1)。图10
实施例1.1
使用经刺激的人T细胞进行铬释放测定
如下所述获得富集CD8+T细胞的经刺激的T细胞。用最终浓度为1μg/ml的市售抗CD3特异性抗体(OKT3，Orthoclone)在37℃下涂覆有盖培养皿(直径145mm，Greiner bio-one GmbH，Kremsmünster)1小时。通过一次PBS洗涤步骤去除未结合的蛋白质。将在120ml具有稳定化谷氨酰胺/10％FCS/IL-2 20U/ml(
Figure BPA0000256090320000861
Chiron)的RPMI 1640中的3-5×107个人PBMC添加到预涂覆的有盖培养皿中并刺激2天。在第三天，收集细胞并用RPMI 1640洗涤一次。添加IL-2至最终浓度为20U/ml，并在如上所述的相同细胞培养基中再培养细胞一天。根据制造商的方案，通过使用Dynal-Beads消耗CD4+T细胞和CD56+NK细胞来富集CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
将经Cyno EGFRVIII或人EGFRVIII转染的CHO靶细胞用PBS洗涤两次，并在37℃下在最终体积为100μl的具有50％FCS的RPMI中用11.1MBq51Cr标记60分钟。随后，用5ml RPMI将标记的靶细胞洗涤3次，然后用于细胞毒性测定。在96孔板中，在总体积为200μl的补充型RPMI中以10∶1的E∶T比进行测定。使用起始浓度为0.01-1μg/ml的纯化的双特异性抗体构建体和其三倍稀释液。所述测定的孵育时间为18小时。细胞毒性被确定为上清液中释放的铬相对于最大裂解(添加Triton-X)和自发裂解(无效应细胞)的差异的相对值。一式四份地进行所有测量。在Wizard 3”γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH，
Figure BPA0000256090320000862
Germany)中进行上清液中的铬活性的测量。使用针对Windows的Prism 5(版本5.0，GraphPadSoftware Inc.，San Diego，California，USA)进行结果分析。通过分析程序从S形剂量反应曲线计算的EC50值用于比较细胞毒性活性。
实施例1.2
将经刺激的人效应T细胞针对经人EGFRVIII转染的CHO细胞重定向的效力
在51-铬(51Cr)释放细胞毒性测定中使用经人EGFRVIII转染的CHO细胞作为靶细胞以及经刺激的人CD8+ T细胞作为效应细胞分析根据本发明的EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。如实施例1.1中所述来进行该实验。
EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体对经人EGFRVIII转染的CHO细胞显示非常有效的细胞毒性活性，该活性在1位数皮摩尔浓度的范围内。
实施例1.3
将经刺激的人效应T细胞针对EGFRVIII阳性人细胞系人胶质母细胞瘤细胞系DK-MG重定向的效力
在51-铬(51Cr)释放细胞毒性测定中使用EGFRVIII阳性人胶质母细胞瘤细胞系DK-MG作为靶细胞来源以及经刺激的人CD8+ T细胞作为效应细胞分析EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。如实施例1.1中所述来进行该测定。
与使用经刺激的富集的人CD8+ T淋巴细胞作为效应细胞以及经人EGFRVIII转染的CHO细胞作为靶细胞的51-铬释放测定的结果一致，本发明的EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体对天然表达靶细胞也具有有效的细胞毒性活性；见图9。
实施例1.4
用未经刺激的人PBMC进行基于FACS的细胞毒性测定
效应细胞的分离
通过Ficoll密度梯度离心从富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层)(采集输血用血的血库的副产物)制备人外周血单核细胞(PBMC)。血沉棕黄层由当地血库提供，并且PBMC在血液采集的当天制备。在进行Ficoll密度离心和用杜氏PBS(Gibco)充分洗涤后，将剩余的红细胞通过与红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、100μM EDTA)一起孵育而从PBMC中去除。在以100xg离心PBMC后，经由上清液去除血小板。剩余的淋巴细胞主要包括B淋巴细胞和T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞。在含有10％FCS(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中将PBMC保持培养在37℃/5％CO2下。
CD14+和CD56+细胞的消耗
为了消耗CD14+细胞，使用人CD14 MicroBeads(Milteny Biotec，MACS，#130-050-201)，并且使用人CD56 MicroBeads(MACS，#130-050-401)消耗NK细胞。进行PBMC计数并在室温下以300xg离心10分钟。弃去上清液，并将细胞团再悬浮于MACS分离缓冲液[80μL/107个细胞；PBS(Invitrogen，#20012-043)、0.5％(v/v)FBS(Gibco，#10270-106)、2mM EDTA(Sigma-Aldrich，#E-6511)]中。添加CD14 MicroBeads和CD56 MicroBeads(20μL/107个细胞)，并在4-8℃下孵育15分钟。用MACS分离缓冲液(1-2mL/107个细胞)洗涤细胞。离心(见上文)后，弃去上清液并将细胞再悬浮于MACS分离缓冲液(500μL/108个细胞)中。然后使用LS柱(Miltenyi Biotec，#130-042-401)分离CD14/CD56阴性细胞。在37℃的培养箱中，将不含CD14+/CD56+细胞的PBMC培养在补充有10％FBS(Biochrom AG，#S0115)、1x非必需氨基酸(Biochrom AG，#K0293)、10mM Hepes缓冲液(Biochrom AG，#L1613)、1mM丙酮酸钠(Biochrom AG，#L0473)和100U/mL青霉素/链霉素(Biochrom AG，#A2213)的RPMI完全培养基(即RPMI1640；Biochrom AG，#FG1215)中直到需要时。
靶细胞标记
为了在流式细胞术测定中分析细胞裂解，使用荧光膜染料DiOC18(DiO)(MolecularProbes，#V22886)标记作为靶细胞的经人EGFRVIII或猕猴EGFRVIII转染的CHO细胞，并将其与效应细胞区分开来。简言之，收获细胞，用PBS洗涤一次，并在含有2％(v/v)FBS和膜染料DiO(5μL/106个细胞)的PBS中调整至106个细胞/mL。在37℃下孵育3分钟后，将细胞在完全RPMI培养基中洗涤两次，并将细胞数量调整至1.25×105个细胞/mL。使用0.5％(v/v)等渗EosinG溶液(Roth，#45380)测定细胞活力。
基于流式细胞术的分析
该测定被设计用于在EGFRVIII双特异性抗体构建体的连续稀释液的存在下量化经cyno EGFRVIII或人EGFRVIII转染的CHO细胞的裂解。将等体积的DiO标记靶细胞和效应细胞(即，不含CD14+细胞的PBMC)混合，产生10∶1的E∶T细胞比率。将160μl该悬浮液转移到96孔板的每个孔中。添加40μL连续稀释的EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体和阴性对照双特异性抗体构建体(识别不相关靶抗原的基于CD3的双特异性抗体构建体)或RPMI完全培养基(作为另外的阴性对照)。由双特异性抗体介导的细胞毒性反应在含7％CO2的加湿培养箱中进行48小时。然后将细胞转移至新的96孔板中，并通过添加最终浓度为1μg/mL的碘化丙啶(PI)监测靶细胞膜完整性的丧失。PI是一种不可透过膜的染料，通常被活细胞排斥，而死细胞将其吸收并且变得可通过荧光发射来鉴别。
在FACSCanto II仪器(来自Becton Dickinson)上通过流式细胞术测量样品，并通过FACSDiva软件(来自Becton Dickinson)进行分析。靶细胞鉴别为DiO阳性细胞。PI阴性靶细胞分类为活靶细胞。根据下式计算细胞毒性百分比：
Figure BPA0000256090320000901
n＝事件的数量
使用GraphPad Prism 5软件(Graph Pad Software，San Diego)绘制细胞毒性百分比对相应双特异性抗体构建体浓度的曲线图。使用用于评估具有固定希尔斜率的S形剂量反应曲线的四参数逻辑回归模型分析剂量反应曲线，并计算EC50值。
实施例1.5
在不存在和存在可溶性EGFRVIII的情况下将未经刺激的人PBMC针对经人EGFRVIII转染的CHO细胞重定向的效力
在基于FACS的细胞毒性测定中使用经人EGFRVIII转染的CHO细胞作为靶细胞以及未经刺激的人PBMC细胞作为效应细胞分析EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。如以上实施例1.4中所述进行该测定。
意料之中地，与使用经刺激的人CD8+ T细胞的细胞毒性测定(参见实施例1.2)相比，在使用未经刺激的PBMC作为效应细胞的细胞毒性测定中，EC50值通常更高。
实施例1.6
将未经刺激的人PBMC针对EGFRVIII阳性人胶质母细胞瘤细胞系U87或DK-MG细胞重定向的效力
另外，在基于FACS的细胞毒性测定中使用EGFRVIII阳性人胶质母细胞瘤细胞系U87或DK-MG作为靶细胞来源以及未经刺激的人PBMC细胞作为效应细胞分析EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。如以上实施例1.4中所述进行该测定。结果示于图8和图9中。
实施例1.7
将猕猴T细胞针对猕猴EGFRVIII表达CHO细胞重定向的效力
在基于FACS的细胞毒性测定中使用经猕猴(cyno)EGFRVIII转染的CHO细胞作为靶细胞以及猕猴T细胞系4119LnPx(Knappe等人，Blood 95：3256-61(2000))作为效应细胞来源分析EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。如上所述进行经猕猴EGFRVIII转染的CHO细胞的靶细胞标记和基于51Cr释放的细胞毒性活性分析。
结果示于图10中。本发明的EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体诱导来自细胞系4119LnPx的猕猴T细胞有效地杀死经猕猴EGFRVIII转染的CHO细胞。
实施例1.8
双特异性抗体构建体的单体和二聚体同种型之间的效力差异
为了测定单个EGFRVIIIxCD3双特异性抗体构建体的单体和二聚体同种型之间的细胞毒性活性差异(称为效力差异)，使用纯化的双特异性抗体构建体单体和二聚体如上所述(实施例1.1)进行18小时51-铬释放细胞毒性测定。效应细胞是经刺激的富集的人CD8+ T细胞。靶细胞为经hu EGFRVIII转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞(E∶T)的比率为10∶1。效力差异被计算为EC50值之间的比率。
实施例2
在人血浆中孵育24小时后的稳定性
将纯化的双特异性抗体构建体在人血浆库中以1∶5的比率在37℃下在2-20μg/ml的最终浓度下孵育96小时。在用血浆孵育后，在使用起始浓度为0.01-0.1μg/ml的经刺激的富集的人CD8+ T细胞和经人EGFRVIII转染的CHO细胞并以10∶1的效应细胞与靶向细胞(E∶T)比率进行的51-铬释放测定(如实施例1.1中所述的测定)中比较抗体构建体。包括未经孵育的刚解冻的双特异性抗体构建体作为对照。
结果如图11所示；抗体构建体EvIII-2具有约2的血浆稳定性(EC50血浆/EC50对照)。出人意料的是，本发明的双特异性抗体构建体确实几乎不显示转化。
实施例3
通过高分辨率阳离子交换色谱法分析蛋白质均质性
通过高分辨率阳离子交换色谱法(CIEX)分析本发明抗体构建体的蛋白质均质性。
用50ml结合缓冲液A(20mM磷酸二氢钠、30mM NaCl、0.01％辛酸钠；pH 5.5)稀释50μg抗体构建体单体，并将40ml该溶液施加到与
Figure BPA0000256090320000921
Micro FPLC装置(GE Healthcare，Germany)连接的1ml BioPro SP-F柱(YMC，Germany)中。样品结合后，用额外的结合缓冲液进行洗涤步骤。对于蛋白质洗脱，施加10倍柱体积的使用缓冲液B(20mM磷酸二氢钠、1000mMNaCl、0.01％辛酸钠；pH 5.5)直至50％缓冲液B的线性递增盐梯度。在280、254和210nm的吸光度下监测整个运行过程。分析是通过记录在
Figure BPA0000256090320000922
Unicorn软件运行评估表中的280nm信号的峰积分完成。
结果示于图12中。几乎所有测试的抗体构建体均具有≥95％的非常有利的均质性(主峰的曲线下面积(＝AUC))。
实施例4
由HIC Butyl测量的表面疏水性
在疏水相互作用色谱法(HIC)中以流通模式测试本发明的双特异性抗体构建体的表面疏水性。
用通用配制缓冲液将50μg抗体构建体单体稀释至500μl的终体积(10mM柠檬酸、75mM赖氨酸HCl、4％海藻糖；pH 7.0)，并施加到与
Figure BPA0000256090320000931
Purifier FPLC系统(GEHealthcare，Germany)连接的1ml丁基琼脂糖FF柱(GE Healthcare，Germany)中。在280、254和210nm的吸光度下监测整个运行过程。分析是通过记录在
Figure BPA0000256090320000932
Unicorn软件运行评估表中的280nm信号的峰积分完成。通过比较蛋白质信号的上升和下降的面积和速度来评估洗脱行为，从而指示BiTE白蛋白融合物与基质的相互作用的强度。
抗体构建体具有良好的洗脱行为，大多是快速且完整的；见图13。
实施例5
在(i)三次冻融循环和(ii)以250μg/ml孵育7天后的单体至二聚体转化
使双特异性EGFRVIIIxCD3抗体单体构建体经受不同的应力条件，然后进行高效SEC以确定已经转化成二聚体抗体构建体的最初单体抗体构建体的百分比。
(i)用通用配制缓冲液将25μg单体抗体构建体调整至250μg/ml的浓度，然后在-80℃下冷冻30分钟，随后在室温下解冻30分钟。经过三次冻融循环后，通过HP-SEC测定二聚体含量。
(ii)用通用配制缓冲液将25μg单体抗体构建体调整至250μg/ml的浓度，然后在37℃下孵育7天。通过HP-SEC测定二聚体含量。
将高分辨率SEC柱TSK凝胶G3000 SWXL(Tosoh，Tokyo-Japan)连接到配备有A905自动取样器的
Figure BPA0000256090320000933
Purifier 10 FPLC(GE Lifesciences)上。柱平衡和运行缓冲液由调节至pH 6.6的100mM KH2PO4-200mM Na2SO4组成。将抗体溶液(25μg蛋白质)施加到经过平衡的柱上，并在7MPa的最大压力下以0.75ml/min的流速进行洗脱。在280、254和210nm的吸光度下监测整个运行过程。分析是通过记录在
Figure BPA0000256090320000941
Unicorn软件运行评估表中的210nm信号的峰积分完成。通过二聚体峰的面积除以单体峰加二聚体峰的总面积来计算二聚体含量。
结果示于以下图14和图15中。本发明的EVIII-1xCD3双特异性抗体构建体在三次冻融循环后呈现0.59％的二聚体百分比(图15)，并且在37℃下孵育7天后的二聚体百分比为0.26％，而EvIII-1xCD3双特异性抗体构建体在孵育7天后显示出1.56％的较高值，并且在三次冻融循环后显示出2.53％的较高值。
实施例6
热稳定性
如下测定抗体聚集温度：将40μl的250μg/ml抗体构建体溶液转移到一次性比色杯中，并置于Wyatt动态光散射装置DynaPro Nanostar(Wyatt)中。将样品以0.5℃/min的加热速率从40℃加热到70℃，并不断采集半径测量值。指示蛋白质的熔融和聚集的半径增加被随DLS装置一起递送的软件包用来计算抗体构建体的聚集温度。
表2：通过DLS(动态光散射)测定的双特异性抗体构建体的热稳定性
EGFRVIII HALB BiTE 热稳定性DLS T<sub>A</sub>[℃]
EvIII-1 51.6
EvIII-2 51.2
实施例7
2500μg/ml抗体浓度下的浊度
将1ml浓度为250μg/ml的纯化的抗体构建体溶液通过自旋浓缩单元浓缩至2500μg/ml。在5℃下储存16小时后，通过针对通用配制缓冲液的OD340nm吸光度测量值来测定抗体溶液的浊度。
结果示于下表3中。本发明的EvIII-1抗体构建体具有≤0.03的极有利浊度，而EvIII-2抗体构建体呈现明显的浊度，这表明在药物组合物中配制这种分子时不太有利的特性。
表3：浓度至2.5mg/ml过夜后抗体构建体的浊度
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Figure ISB0000170930020001331
Figure ISB0000170930020001341
Figure ISB0000170930020001351
Figure ISB0000170930020001361
Figure ISB0000170930020001371
Figure ISB0000170930020001381
Figure ISB0000170930020001391
Figure ISB0000170930020001401
Figure ISB0000170930020001411
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Figure ISB0000170930020001431
Figure ISB0000170930020001441
Figure ISB0000170930020001451
Figure ISB0000170930020001461
Figure ISB0000170930020001471
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Figure ISB0000170930020001501
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Figure ISB0000170930020001531
Figure ISB0000170930020001541
Figure ISB0000170930020001551
Figure ISB0000170930020001561
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Figure ISB0000170930020001581
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Figure ISB0000170930020001601
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Figure ISB0000170930020001651
Figure ISB0000170930020001661
Figure ISB0000170930020001671
Figure ISB0000170930020001681
Figure ISB0000170930020001691
Figure ISB0000170930020001701
Figure ISB0000170930020001711
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Figure ISB0000170930020001751
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Figure ISB0000170930020001791
Figure ISB0000170930020001801
Figure ISB0000170930020001811
Figure ISB0000170930020001821
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Figure ISB0000170930020001841
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Figure ISB0000170930020001861
Figure ISB0000170930020001871
Figure ISB0000170930020001881
Figure ISB0000170930020001891
Figure ISB0000170930020001901
Figure ISB0000170930020001911
Figure ISB0000170930020001921
Figure ISB0000170930020001931
Figure ISB0000170930020001941
Figure ISB0000170930020001951
Figure ISB0000170930020001961
Figure ISB0000170930020001971
Figure ISB0000170930020001981
Figure ISB0000170930020001991
Figure ISB0000170930020002001
Figure ISB0000170930020002011
Figure ISB0000170930020002021
Figure ISB0000170930020002031
Figure ISB0000170930020002041
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Figure ISB0000170930020002101
Figure ISB0000170930020002111
Figure ISB0000170930020002121
Figure ISB0000170930020002131
Figure ISB0000170930020002141
Figure ISB0000170930020002151
Figure ISB0000170930020002161
Figure ISB0000170930020002171
Figure ISB0000170930020002181
Figure ISB0000170930020002191
Figure ISB0000170930020002201
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Figure ISB0000170930020002221
Figure ISB0000170930020002231
Figure ISB0000170930020002241
Figure ISB0000170930020002251
Figure ISB0000170930020002261
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Figure ISB0000170930020002291
Figure ISB0000170930020002301
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Figure ISB0000170930020002321
Figure ISB0000170930020002331
Figure ISB0000170930020002341
Figure ISB0000170930020002351
Figure ISB0000170930020002361
Figure ISB0000170930020002371
Figure ISB0000170930020002381
Figure ISB0000170930020002391
Figure ISB0000170930020002401
Figure ISB0000170930020002411
Figure ISB0000170930020002421
Figure ISB0000170930020002431
Figure ISB0000170930020002441
Figure ISB0000170930020002451
Figure ISB0000170930020002461
Figure ISB0000170930020002471
Figure ISB0000170930020002481
Figure ISB0000170930020002491
Figure ISB0000170930020002501
Figure ISB0000170930020002511
Figure ISB0000170930020002521
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Figure ISB0000170930020002541
Figure ISB0000170930020002551
Figure ISB0000170930020002561
Figure ISB0000170930020002571
Figure ISB0000170930020002581
Figure ISB0000170930020002591
Figure ISB0000170930020002601
Figure ISB0000170930020002611
Figure ISB0000170930020002621
Figure ISB0000170930020002631
Figure ISB0000170930020002641
Figure ISB0000170930020002651
Figure ISB0000170930020002661
Figure ISB0000170930020002671
Figure ISB0000170930020002681
Figure ISB0000170930020002691
Figure ISB0000170930020002701
Figure ISB0000170930020002711

Claims (25)

1.一种双特异性抗体构建体，其包含(i)结合靶细胞表面上的人和猕猴EGFRVIII的第一结合结构域，所述第一结合结构域包含VH区和VL区，和(ii)结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域，所述第二结合结构域包含VH区和VL区，其中所述第一结合结构域的VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO:157所示，并且所述第一结合结构域的VL区的氨基酸序列如SEQID NO:158所示。
2.根据权利要求1所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体是选自由以下组成的组的形式：(scFv)2、scFv-单结构域mAb、双抗体和任何这些形式的寡聚体。
3.根据权利要求1所述的抗体构建体，其中所述第二结合结构域与人CD3ε结合并且与普通狨、绒顶柽柳猴或松鼠猴CD3ε结合。
4.根据权利要求1所述的抗体构建体，其中所述第二结合结构域与人CD3ε结合并与普通狨、绒顶柽柳猴或松鼠猴CD3ε结合，并且包含：
(i)VL区，所述VL区包含如SEQ ID NO:11所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:12所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:13所示的CDR-L3；和VH区，所述VH区包含如SEQ ID NO:14所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:15所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:16所示的CDR-H3；
(ii)VL区，所述VL区包含如SEQ ID NO:20所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:21所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:22所示的CDR-L3；和VH区，所述VH区包含如SEQ ID NO:23所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:24所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:25所示的CDR-H3；
(iii)VL区，所述VL区包含如所SEQ ID NO:29所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:30所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:31所示的CDR-L3；和VH区，所述VH区包含如SEQ ID NO:32所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:33所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:34所示的CDR-H3；
(iv)VL区，所述VL区包含如SEQ ID NO:38所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:39所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:40所示的CDR-L3；和VH区，所述VH区包含如SEQ ID NO:41所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:42所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:43所示的CDR-H3；
(v)VL区，所述VL区包含如SEQ ID NO:47所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:48所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:49所示的CDR-L3；和VH区，所述VH区包含如SEQ ID NO:50所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:51所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:52所示的CDR-H3；
(vi)VL区，所述VL区包含如SEQ ID NO:56所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:57所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:58所示的CDR-L3；和VH区，所述VH区包含如SEQ ID NO:59所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:60所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:61所示的CDR-H3；
(vii)VL区，所述VL区包含如SEQ ID NO:65所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:66所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:67所示的CDR-L3；和VH区，所述VH区包含如SEQ ID NO:68所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:69所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:70所示的CDR-H3；
(viii)VL区，所述VL区包含如SEQ ID NO:74所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:75所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:76所示的CDR-L3；和VH区，所述VH区包含如SEQ ID NO:77所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:78所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:79所示的CDR-H3；
(ix)VL区，所述VL区包含如SEQ ID NO:83所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:84所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:85所示的CDR-L3；和VH区，所述VH区包含如SEQ ID NO:86所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:87所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:88所示的CDR-H3；
(x)VL区，所述VL区包含如SEQ ID NO:92所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:93所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:94所示的CDR-L3；和VH区，所述VH区包含如SEQ ID NO:95所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:96所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:97所示的CDR-H3；或
(xi)VH区和VL区，所述VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO:101所示，并且所述VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO:102所示。
5.根据权利要求1所述的抗体构建体，所述抗体构建体包含：
(a)多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
(i)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:159所示；
(ii)肽接头，其中所述肽接头的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:1-9中任一个所示的氨基酸序列；和
(iii)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列；以及
(iv)任选地，His标签，其中所述His标签的氨基酸序列如SEQ ID NO 10所示；
(b)多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
(i)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:159所示；
(ii)肽接头，其中所述肽接头的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:1-9中任一个所示的氨基酸序列；
(iii)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列；
(iv)任选地，肽接头，其中所述肽接头的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:1-9中任一个所示的氨基酸序列；
(v)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:134所示；和
(vi)任选地，His标签，其中所述His标签的氨基酸序列如SEQ ID NO 10所示；
(c)多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
(i)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如氨基酸序列QRFVTGHFGGLX1PANG(SEQ ID NO:135)所示，其中X1是Y或H；
(ii)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:159所示；
(iii)肽接头，其中所述肽接头的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:1-9中任一个所示的氨基酸序列；
(iv)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列；
(v)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如氨基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO:137)或QRFCTGHFGGLHPCNG(SEQ ID NO:139)所示；以及
(vi)任选地，His标签，所述His标签的氨基酸序列如SEQ ID NO 10所示；
(d)第一多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
(i)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:89、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列；
(ii)肽接头，其中所述肽接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
(iii)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:158所示；和
(iv)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:140所示；
以及第二多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
(i)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:157所示；
(ii)肽接头，其中所述肽接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
(iii)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列由选自如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27、SEQID NO:36、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQID NO:90、SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列和位于C端的丝氨酸残基组成；和
(iv)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:141所示；
(e)第一多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
(i)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:89、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:101组成的组所示的氨基酸序列；
(ii)肽接头，其中所述肽接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
(iii)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:158所示；和
(iv)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:142所示；
以及第二多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
(i)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:157所示；
(ii)肽接头，其中所述肽接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
(iii)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列由选自如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27、SEQID NO:36、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:81、SEQID NO:90、SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列和位于C端的丝氨酸残基组成；和
(iv)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:143所示；
(f)第一多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
(i)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:159所示；
(ii)肽接头，其中所述肽接头的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:1-9中任一个所示的氨基酸序列；和
(iii)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列；以及
(iv)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:144所示；
和第二多肽，所述第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:145所示；
(g)第一多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
(i)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:159所示；和
(ii)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:146所示；
以及第二多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
(i)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列；以及
(ii)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:147所示；
(h)第一多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
(i)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:159所示；和
(ii)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:148所示；
以及第二多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
(i)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列；以及
(ii)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:149所示；
(i)多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
(i)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:159所示；
(ii)肽接头，其中所述肽接头的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:1-9中任一个所示的氨基酸序列；和
(iii)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列；以及
(iv)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:150所示；或者
(j)多肽，其从N端开始按以下顺序包含：
(i)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:159所示；
(ii)肽接头，其中所述肽接头的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:1-9中任一个所示的氨基酸序列；
(iii)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列；
(iv)肽接头，其中所述肽接头的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:1、2、4、5、6、8和9所示的氨基酸序列；以及
(v)第三结构域，所述第三结构域的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:181-188中任一个所述的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的抗体构建体，其包含如SEQ ID NO:160中所示的多肽或由所述多肽组成。
7.一种多肽，其包含：
(a)第一结合结构域，其与人和猕猴的表皮生长因子受体VIII(EGFRVIII)结合，并包含：重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:157所示，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:158所示；和
(b)第二结合结构域，其与人CD3结合，并包含：VL区和VH区，所述VL区包含如SEQ IDNO:92所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:93所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:94所示的CDR-L3；所述VH区包含如SEQ ID NO:95所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:96所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:97所示的CDR-H3。
8.根据权利要求7所述的多肽，其包含：(a)第一结合结构域，其与人和猕猴EGFRVIII结合，并包含：VH和VL，所述第一结合结构域的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:157所示，所述第一结合结构域的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:158所示；和(b)第二结合结构域，其与人CD3结合，并包含：VH和VL，所述第二结合结构域的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:98所示，所述第二结合结构域的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:99所示。
9.根据权利要求7所述的多肽，其包含：(a)第一结合结构域，所述第一结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:159所示；和(b)第二结合结构域，所述第二结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:100所示。
10.根据权利要求7所述的多肽，还包含His标签，所述His标签的氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示。
11.根据权利要求7所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:160所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的多肽，还包含His标签，所述His标签的氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示。
13.根据权利要求11所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列从N端开始按以下顺序包含：如SEQ ID NO:160所示的氨基酸序列，和如SEQ ID NO:10所示的His标签氨基酸序列。
14.根据权利要求11所述的多肽，还包含单链Fc(scFc)，其中所述scFc的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:181-188中任一个所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求11所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:189所示。
16.根据权利要求11所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:190所示。
17.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-6中任一项所定义的抗体构建体或如权利要求7-16中任一项所定义的多肽。
18.一种载体，其包含如权利要求17所定义的多核苷酸。
19.一种宿主细胞，所述宿主细胞经如权利要求18所定义的载体转化或转染。
20.一种生产根据权利要求1至6中任一项所述的抗体构建体或如权利要求7-16中任一项所定义的多肽的方法，所述方法包括在允许表达如权利要求1至6中任一项所定义的抗体构建体或如权利要求7-16中任一项所定义的多肽的条件下培养如权利要求19所定义的宿主细胞，以及从培养物回收所产生的抗体构建体或多肽。
21.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗体构建体或根据权利要求7-16中任一项所述的多肽。
22.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体构建体或根据权利要求7-16中任一项所述的多肽在制备用于治疗或改善肿瘤或癌症疾病或转移性癌症疾病的药物组合物中的用途。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述肿瘤或癌症疾病选自由以下组成的组：胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、中枢神经系统癌或衍生自任何上述疾病的转移性癌症疾病。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述肿瘤或癌症疾病是胶质母细胞瘤。
25.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗体构建体或根据权利要求7-16中任一项所述的多肽。
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10981998B2 (en) 2008-10-01 2021-04-20 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
EP2370467B1 (en) * 2008-10-01 2016-09-07 Amgen Research (Munich) GmbH Cross-species-specific pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, endosialinxcd3, epcamxc d3, igf-1rxcd3 or fapalpha xcd3 bispecific single chain antibody
JO3519B1 (ar) 2013-01-25 2020-07-05 Amgen Inc تركيبات أجسام مضادة لأجل cdh19 و cd3
EP3174901B1 (en) 2014-07-31 2019-06-26 Amgen Research (Munich) GmbH Optimized cross-species specific bispecific single chain antibody constructs
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TW202346349A (zh) 2015-07-31 2023-12-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Dll3及cd3抗體構築體
TWI717375B (zh) 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
JP2019506398A (ja) * 2016-01-21 2019-03-07 ファイザー・インク 上皮増殖因子受容体変異体ｉｉｉおよびｃｄ３の単一および二重特異性抗体およびそれらの使用
NZ744821A (en) 2016-01-21 2023-06-30 Pfizer Chimeric antigen receptors targeting epidermal growth factor receptor variant iii
EA201891753A1 (ru) 2016-02-03 2019-01-31 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкции антител к psma и cd3, вовлекающие т-клетки
KR20240118898A (ko) 2016-02-03 2024-08-05 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 Bcma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물
EA039859B1 (ru) * 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
UY37829A (es) 2017-08-03 2019-01-31 Amgen Inc Muteínas de interleucina 21 y métodos de tratamiento
EP4403175A3 (en) 2017-09-08 2024-10-02 Amgen Inc. Inhibitors of kras g12c and methods of using the same
ES2941740T3 (es) 2018-01-12 2023-05-25 Amgen Inc Anticuerpos anti-PD-1 y métodos de tratamiento
EP3773623A4 (en) * 2018-04-06 2022-01-05 The Regents of The University of California TRANS ANTIGEN TARGETING IN HETEROGENIC CARCINOMA AND METHOD OF USING IT
UY38326A (es) * 2018-08-03 2020-01-31 Amgen Inc Constructos de anticuerpos para cldn18.2 y cd3
CN112955471B (zh) * 2018-12-07 2022-11-22 江苏恒瑞医药股份有限公司 Cd3抗体及其药物用途
JP7090780B2 (ja) * 2018-12-21 2022-06-24 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ３に結合する抗体
EP3897847A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to cd3
US20220411516A1 (en) * 2019-11-07 2022-12-29 Amgen Inc. Dosage regimen for anti-egfrviii agents
US11938152B2 (en) 2020-08-06 2024-03-26 Kedar N Prasad High-dose antioxidants in cancer treatment
EP4210748A1 (en) * 2020-09-11 2023-07-19 Amgen Inc. Materials and methods to reduce protein aggregation
EP4247850A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Simcere Innovation, Inc. Armed dual car-t compositions and methods for cancer immunotherapy
WO2023064927A1 (en) * 2021-10-15 2023-04-20 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable polypeptide complex
WO2024067222A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-04 Nona Biosciences (Suzhou) Co., Ltd. Cd3-targeting antibody and use thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103694350A (zh) * 2007-04-03 2014-04-02 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性CD3-ε结合结构域
CN104114578A (zh) * 2011-11-15 2014-10-22 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 Bcma和cd3的结合分子
CN104119439A (zh) * 2003-06-27 2014-10-29 艾默根佛蒙特有限公司 针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
WO2015018527A1 (en) * 2013-08-07 2015-02-12 Affimed Therapeutics Ag ANTIBODY BINDING SITES SPECIFIC FOR EGFRvIII

Family Cites Families (215)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4447A (en) 1846-04-04 Car- wheel
US233A (en) 1837-06-14 Improvement in plows
US3180193A (en) 1963-02-25 1965-04-27 Benedict David Machines for cutting lengths of strip material
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4195128A (en) 1976-05-03 1980-03-25 Bayer Aktiengesellschaft Polymeric carrier bound ligands
US4330440A (en) 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
CA1093991A (en) 1977-02-17 1981-01-20 Hideo Hirohara Enzyme immobilization with pullulan gel
US4229537A (en) 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
ATE87659T1 (de) 1986-09-02 1993-04-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
AU612370B2 (en) 1987-05-21 1991-07-11 Micromet Ag Targeted multifunctional proteins
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US5159016A (en) 1987-12-28 1992-10-27 Nippon Petrochemicals Company, Limited Process for preparing thermoplastic resin composition
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5292658A (en) 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
FR2664073A1 (fr) 1990-06-29 1992-01-03 Thomson Csf Moyens de marquage d'objets, procede de realisation et dispositif de lecture.
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5612205A (en) 1990-08-29 1997-03-18 Genpharm International, Incorporated Homologous recombination in mammalian cells
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992015673A1 (en) 1991-03-11 1992-09-17 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning and expression of renilla luciferase
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993015722A1 (en) 1992-02-07 1993-08-19 Syntex (Usa) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous microparticles
AU4541093A (en) 1992-06-18 1994-01-24 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
CA2140638C (en) 1992-07-24 2010-05-04 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
NZ257942A (en) 1992-10-23 1996-04-26 Immunex Corp Preparing a mammalian protein by expression of a fusion protein containing a leucine zipper domain
US5981175A (en) 1993-01-07 1999-11-09 Genpharm Internation, Inc. Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US7045128B2 (en) 1993-05-24 2006-05-16 Immunex Corporation Antibodies against flt3-ligand
NZ314644A (en) 1993-05-24 2000-11-24 Immunex Corp Use of flt3-ligands as a growth stimulator of stem cells in the transplantation of tissue
ATE400651T1 (de) 1993-09-10 2008-07-15 Univ Columbia Verwendung von grünem fluoreszenzprotein
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US5777079A (en) 1994-11-10 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
EP1709970A1 (en) 1995-04-27 2006-10-11 Abgenix, Inc. Human antibodies against EGFR, derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
DK0859841T3 (da) 1995-08-18 2002-09-09 Morphosys Ag Protein/(poly)peptidbiblioteker
AU718138B2 (en) 1995-08-29 2000-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Chimeric animal and method for constructing the same
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5804387A (en) 1996-02-01 1998-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)
US5876995A (en) 1996-02-06 1999-03-02 Bryan; Bruce Bioluminescent novelty items
US5925558A (en) 1996-07-16 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
CA2273194C (en) 1996-12-03 2011-02-01 Abgenix, Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
US6458547B1 (en) 1996-12-12 2002-10-01 Prolume, Ltd. Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
AU765703B2 (en) 1998-03-27 2003-09-25 Bruce J. Bryan Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics, high throughput screening and novelty items
CZ302070B6 (cs) * 1998-04-21 2010-09-29 Micromet Ag Jednoretezcový multifunkcní polypeptid, polynukleotid, vektor obsahující tento polynukleotid, bunka transfekovaná tímto polynukleotidem, prostredek obsahující tento polypeptid, polynukleotid nebo vektor a jejich použití a zpusob identifikace aktiváto
ES2207278T3 (es) 1998-07-28 2004-05-16 Micromet Ag Heterominicuerpos.
US7254167B2 (en) 1998-10-30 2007-08-07 Broadcom Corporation Constellation-multiplexed transmitter and receiver
JP2002534959A (ja) 1998-12-08 2002-10-22 バイオベーション リミテッド 免疫原性タンパク質の改変方法
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
US7230167B2 (en) 2001-08-31 2007-06-12 Syngenta Participations Ag Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor
ES2645698T3 (es) 2001-11-30 2017-12-07 Amgen Fremont Inc. Animales transgénicos que portan genes de cadena ligera de Ig humana
US8486859B2 (en) 2002-05-15 2013-07-16 Bioenergy, Inc. Use of ribose to enhance plant growth
US7904068B2 (en) 2003-06-06 2011-03-08 At&T Intellectual Property I, L.P. System and method for providing integrated voice and data services utilizing wired cordless access with unlicensed spectrum and wired access with licensed spectrum
KR100995031B1 (ko) 2003-10-01 2010-11-19 엘지전자 주식회사 다중입력 다중출력 시스템에 적용되는 신호 전송 제어 방법
US7622571B2 (en) 2003-10-03 2009-11-24 The University Of Texas System, Board Of Regents Methods and compositions for Mycoplasma pneumoniae exotoxins
AU2004283850C1 (en) 2003-10-16 2011-11-03 Amgen Research (Munich) Gmbh Multispecific deimmunized CD3-binders
DE602006017460D1 (de) 2005-03-14 2010-11-25 Omron Tateisi Electronics Co Programmierbares Steuersystem
BRPI0611901A2 (pt) 2005-06-14 2012-08-28 Amgen, Inc composição, liofilizado, kit, e, processo para preparar uma composição
US8234145B2 (en) 2005-07-12 2012-07-31 International Business Machines Corporation Automatic computation of validation metrics for global logistics processes
BRPI0604215A (pt) 2005-08-17 2007-04-10 Biosigma Sa método para projetar oligonucleotìdeos para técnicas de biologia molecular
EP3178850B1 (en) 2005-10-11 2021-01-13 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
JP2007122396A (ja) 2005-10-27 2007-05-17 Hitachi Ltd ディスクアレイ装置及びその障害対応検証方法
TW200745163A (en) 2006-02-17 2007-12-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Peptides that block the binding of IgG to FcRn
US7919297B2 (en) 2006-02-21 2011-04-05 Cornell Research Foundation, Inc. Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase
US7574748B2 (en) 2006-03-07 2009-08-18 Nike, Inc. Glove with support system
NZ572745A (en) 2006-04-21 2010-05-28 Fountainhead Llc Buoyant wetland system
US7990860B2 (en) 2006-06-16 2011-08-02 Harris Corporation Method and system for rule-based sequencing for QoS
US8430938B1 (en) 2006-07-13 2013-04-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Control algorithm for autothermal reformer
KR101146588B1 (ko) 2006-08-11 2012-05-16 삼성전자주식회사 Ｆｉｎ 구조체 및 이를 이용한 핀 트랜지스터의 제조방법
CN101507045B (zh) 2006-08-30 2013-02-13 日本电气株式会社 便携式设备及用于其的壳体
GB0618329D0 (en) 2006-09-18 2006-10-25 Ykk Europ Ltd Slider for fluid tight slide fastener
CN100589507C (zh) 2006-10-30 2010-02-10 华为技术有限公司 一种拨号提示系统及方法
US7466008B2 (en) 2007-03-13 2008-12-16 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. BiCMOS performance enhancement by mechanical uniaxial strain and methods of manufacture
EP2132437B2 (en) 2007-03-30 2018-10-03 Vestas Wind Systems A/S Wind turbine with pitch control
KR101589759B1 (ko) 2007-04-03 2016-01-29 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 종간 특이적 ｃｄ３―입실론 결합 도메인
EP2144930A1 (en) 2007-04-18 2010-01-20 ZymoGenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
BRPI0811857A2 (pt) 2007-05-14 2014-10-21 Biogen Idec Inc Regiões fc (scfc) de cadeia simples, polipeptídeos de aglutinação que as compreendem e métodos relacionados.
US8209741B2 (en) 2007-09-17 2012-06-26 Microsoft Corporation Human performance in human interactive proofs using partial credit
US8464584B2 (en) 2007-10-19 2013-06-18 Food Equipment Technologies Company, Inc. Beverage dispenser with level measuring apparatus and display
DE102008057648A1 (de) 2007-11-29 2009-06-04 Luk Lamellen Und Kupplungsbau Beteiligungs Kg Kraftübertragungsvorrichtung, insbesondere zur Leistungsübertragung zwischen einer Antriebsmaschine und einem Abtrieb
EP2072971A1 (en) 2007-12-17 2009-06-24 Services Pétroliers Schlumberger Variable throat venturi flow meter
US8376279B2 (en) 2008-01-23 2013-02-19 Aurora Flight Sciences Corporation Inflatable folding wings for a very high altitude aircraft
JP2011516603A (ja) 2008-04-17 2011-05-26 アブリンクス エン．ヴェー． 血清タンパク質と結合することが可能なペプチド、並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド
US7922649B2 (en) 2008-08-08 2011-04-12 Walch John R Unitized penile erection system and tissue expander
US8053131B2 (en) 2008-08-14 2011-11-08 Hyundai Motor Company Apparatus and method for determining deterioration of a fuel cell and method for preventing deterioration of the same
KR101009644B1 (ko) 2008-08-26 2011-01-19 삼성모바일디스플레이주식회사 레이저 열전사용 도너 기판 및 이를 이용한 유기전계발광소자의 제조방법
US10981998B2 (en) 2008-10-01 2021-04-20 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
BRPI1011478B1 (pt) 2009-03-04 2018-01-30 Nissan Motor Co.,Ltd “catalisador purificador de gás de exaustão e método para a fabricação do mesmo”
US8463191B2 (en) 2009-04-02 2013-06-11 Qualcomm Incorporated Beamforming options with partial channel knowledge
UY32560A (es) 2009-04-29 2010-11-30 Bayer Schering Pharma Ag Inmunoconjugados de antimesotelina y usos de los mismos
AU2010311332B2 (en) 2009-10-30 2015-04-23 Albumedix Ltd. Albumin variants
EA027502B1 (ru) 2009-12-23 2017-08-31 Зиниммуне Гмбх Антитела против flt3 и способы их применения
CA2800173C (en) 2010-05-21 2019-05-14 Ulrik Nielsen Bi-specific fusion proteins
US20130225496A1 (en) 2010-11-01 2013-08-29 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin Variants
EP3228315B1 (en) 2010-11-10 2020-11-25 Amgen Research (Munich) GmbH Prevention of adverse effects caused by cd3 specific binding domains
TW202323302A (zh) 2010-11-30 2023-06-16 日商中外製藥股份有限公司 細胞傷害誘導治療劑
WO2012088461A2 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Biogen Idec Inc. Linker peptides and polypeptides comprising same
WO2012150319A1 (en) 2011-05-05 2012-11-08 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
JPWO2012153373A1 (ja) 2011-05-10 2014-07-28 パナソニック株式会社 振幅・直交度誤差補償装置
WO2013026837A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
NO2748201T3 (zh) 2011-08-23 2018-05-12
SG11201402365RA (en) 2011-11-16 2014-06-27 Amgen Inc Methods of treating epidermal growth factor deletion mutant viii related disorders
WO2013075066A2 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Proteins with improved half-life and other properties
SI2794658T1 (sl) 2011-12-19 2017-05-31 Synimmune Gmbh Bispecifična molekula protitelesa
JP6407726B2 (ja) 2012-03-01 2018-10-24 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハーＡＭＧＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ）ＧｍｂＨ 長寿命ポリペプチド結合分子
MX2014010278A (es) 2012-03-16 2015-03-05 Novozymes Biopharma Dk As Variantes de albumina.
AU2013271428B2 (en) 2012-06-07 2016-08-04 Duke University Human bispecific EGFRvIII antibody engaging molecules
WO2014004549A2 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
KR20150036606A (ko) 2012-07-13 2015-04-07 자임워크스 인코포레이티드 항-cd3 구조체를 포함하는 이중특이적 비대칭 이형이합체
MX2015005363A (es) 2012-11-08 2015-11-06 Novozymes Biopharma Dk As Variantes de albumina.
EP3620473A1 (en) 2013-01-14 2020-03-11 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
JO3519B1 (ar) 2013-01-25 2020-07-05 Amgen Inc تركيبات أجسام مضادة لأجل cdh19 و cd3
KR102282761B1 (ko) 2013-02-26 2021-07-30 로슈 글리카트 아게 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
KR20150143458A (ko) 2013-03-06 2015-12-23 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 항-C-MET 탠덤 Fc 이중특이적 항체
US9580486B2 (en) 2013-03-14 2017-02-28 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
CA2903258C (en) 2013-03-15 2019-11-26 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
US20140308285A1 (en) 2013-03-15 2014-10-16 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
SI2970449T1 (sl) 2013-03-15 2019-11-29 Amgen Res Munich Gmbh Enoverižne vezavne molekule, ki vsebujejo N-terminalni ABP
JP6071725B2 (ja) 2013-04-23 2017-02-01 カルソニックカンセイ株式会社 電気自動車の駆動力制御装置
US10053514B2 (en) * 2013-07-09 2018-08-21 Duke University Human bispecific EGFRvIII and CD3 antibody engaging molecules
US20160257748A1 (en) 2013-09-25 2016-09-08 Amgen Inc. V-c-fc-v-c antibody
MX2016007958A (es) 2013-12-17 2016-08-03 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd3 y metodos de uso.
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof
CA2952540C (en) 2014-07-31 2022-06-21 Amgen Research (Munich) Gmbh Bispecific single chain antibody construct with enhanced tissue distribution
EP3174901B1 (en) * 2014-07-31 2019-06-26 Amgen Research (Munich) GmbH Optimized cross-species specific bispecific single chain antibody constructs
KR102317315B1 (ko) 2014-08-04 2021-10-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
JP2017529853A (ja) 2014-09-25 2017-10-12 アムジエン・インコーポレーテツド プロテアーゼにより活性化可能な二重特異性タンパク質
EA201791139A1 (ru) 2014-11-26 2018-04-30 Ксенкор, Инк. Гетеродимерные антитела, которые связывают cd3 и опухолевые антигены
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
AU2016214978B2 (en) 2015-02-05 2021-12-09 The University Of Queensland Targeting constructs for delivery of payloads
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI717375B (zh) 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TW202346349A (zh) 2015-07-31 2023-12-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Dll3及cd3抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
US9552854B1 (en) * 2015-11-10 2017-01-24 Intel Corporation Register files including distributed capacitor circuit blocks
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
KR20240118898A (ko) 2016-02-03 2024-08-05 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 Bcma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물
EA201891753A1 (ru) 2016-02-03 2019-01-31 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкции антител к psma и cd3, вовлекающие т-клетки
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
US11284893B2 (en) 2019-04-02 2022-03-29 Covidien Lp Stapling device with articulating tool assembly

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104119439A (zh) * 2003-06-27 2014-10-29 艾默根佛蒙特有限公司 针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
CN103694350A (zh) * 2007-04-03 2014-04-02 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性CD3-ε结合结构域
CN104114578A (zh) * 2011-11-15 2014-10-22 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 Bcma和cd3的结合分子
WO2015018527A1 (en) * 2013-08-07 2015-02-12 Affimed Therapeutics Ag ANTIBODY BINDING SITES SPECIFIC FOR EGFRvIII

Also Published As

Publication number Publication date
IL256872B1 (en) 2023-12-01
HK1249523A1 (zh) 2018-11-02
TN2017000548A1 (en) 2019-04-12
CR20180065A (es) 2018-05-29
BR112018001374A2 (pt) 2018-09-11
CN107922495A (zh) 2018-04-17
JP2018524997A (ja) 2018-09-06
CY1124384T1 (el) 2022-07-22
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