ES2876348T3 - Constructos de anticuerpos biespecíficos que se unen a EGFRVIII y a CD3 - Google Patents

Abstract

Un constructo de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a EGFRVIII humano y de macaco en la superficie de una célula diana, y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T, en el que el primer dominio de unión comprende una región variable de cadena pesada (VH) como se representa en SEQ ID NO: 157 y una región variable de cadena ligera (VL) como se representa en SEQ ID NO: 158.

Description

DESCRIPCIÓN

Constructos de anticuerpos biespecíficos que se unen a EGFRVIII y a CD3

La presente invención se refiere a un constructo de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a EGFRVIII humano en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T como se define en las reivindicaciones. Además, la invención proporciona un polinucleótido que codifica el constructo de anticuerpo, un vector que comprende dicho polinucleótido, y una célula hospedante transformada o transfectada con dicho polinucleótido o vector como se define en las reivindicaciones. Además, la invención proporciona un procedimiento para la producción del constructo de anticuerpo de la invención, un uso médico de dicho constructo de anticuerpo, y un kit que comprende dicho constructo de anticuerpo como se define en las reivindicaciones.

EGFRvIII es una de varias variantes de EGFR que son causadas por reordenamiento génico acompañado de amplificación del gen EGFR. EGFRvIII consiste en una supresión en el marco de 267 aminoácidos en el dominio extracelular de EGFR. EGFRvIII es la variante más común del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) en cánceres humanos. Durante el proceso de amplificación génica, se produce una supresión de 267 aminoácidos en el dominio extracelular, creando una nueva unión que puede servir como neoepítopo específico de tumor para anticuerpos monoclonales. Esta variante del receptor de EGF contribuye a la progresión del tumor a través de la señalización constitutiva de una manera independiente del ligando. No se conoce que EGFRvIII se exprese en ningún tejido normal. La excelente selectividad tumoral de la expresión de EGFRvIII establece a EGFRvIII como un antígeno ideal para su selección como diana con un constructo de anticuerpo BiTE. La contribución de EGFRvIII a la progresión tumoral sugiere una dependencia de las células cancerosas de la expresión de EGFRvIII, y por lo tanto respalda aún más su idoneidad como diana.

Se ha demostrado que EGFRvIII se expresa con frecuencia en dos tipos de tumores malignos del sistema nervioso central, a saber, el glioblastoma multiforme y el astrocitoma anaplásico. Para ambas enfermedades, existe una importante necesidad médica insatisfecha. Esto se ejemplifica por la escasa supervivencia general bajo el estándar de atención con 13,6% a los 2 años para el glioblastoma multiforme, y 25,9% a los 5 años para el astrocitoma anaplásico. Actualmente, el estándar de atención para el glioblastoma multiforme consiste en la resección quirúrgica del tumor, que a menudo se ve obstaculizado por el patrón de crecimiento difuso del tumor y el requisito de preservar regiones funcionalmente esenciales del cerebro. La cirugía va seguida de irradiación y quimioterapia adyuvantes. Para el glioblastoma multiforme y el astrocitoma anaplásico tratados según el estándar actual de atención, la recurrencia es la norma, con un resultado eventualmente mortal en prácticamente todos los pacientes.

La expresión de EGFRvIII en el glioblastoma multiforme y el astrocitoma anaplásico activa constitutivamente la ruta de señalización de la cinasa Pl3 y se asocia con un peor pronóstico en el glioblastoma multiforme y el astrocitoma anaplásico. También se ha descrito que EGFRvIII se coexpresa con CD133 y define una población de células madre cancerosas en glioblastoma multiforme (Emlet et al., Cancer Res, 2014, 74(4):1238-49). Además, se ha demostrado que, mediante el mecanismo de una transferencia de antígeno intercelular, EGFRvIII puede transferirse a la superficie celular de células tumorales negativas al antígeno. Mediante este mecanismo, la heterogeneidad de expresión de EGFRvIII, que se ha demostrado para algunos casos de glioblastoma multiforme, podría superarse como un obstáculo para la eficacia del tratamiento, especialmente en el caso de utilizar un constructo de anticuerpo BiTE específico de EGFRvIII, que proporciona un modo citotóxico altamente eficaz de acción que compensa los niveles potencialmente bajos de antígeno diana logrados por la transferencia de antígeno intercelular.

La expresión de EGFRvIII también se ha descrito en varias otras entidades tumorales (Wikstrand, CJ. et al., Cancer Research 55(14): 3140-3148 (1995); Ge H. et al., Int J Cancer. 98(3):357-61 (2002); Moscatello, G. et al., Cancer Res.

55(23):5536-9 (1995); Garcia de Palazzo, IE. et al., Cancer Res. 53(14):3217-20 (1993); Olapade-Olaopa, EO. et al., Br J Cancer. 82(1): 186-94 (2000)). Por lo tanto, dada la exquisita selectividad tumoral de EGFRvIII, el tratamiento con un constructo de anticuerpo BiTE específico de EGFRvIII también podría ser beneficioso en otros tipos o subtipos de cáncer seleccionados. La selección potencial de tipos, subtipos o pacientes de cáncer para el tratamiento podría estar guiada por diversos métodos que evalúan la expresión de EGFRvIII en el tumor. El documento WO2008/119567 describe reactivos de unión a EGFR para uso en el tratamiento del cáncer. En particular, el documento WO2008/119567 describe constructos biespecíficos que comprenden un dominio de unión a CD3 específico de especies cruzadas y un dominio de unión a EGFRvIII.

Como todavía existe la necesidad de disponer de opciones adicionales para el tratamiento de las enfermedades de tumores sólidos relacionadas con la sobreexpresión de EGFRVIII, tales como glioblastoma, astrocitoma, meduloblastomas, carcinomas de mama, carcinomas de pulmón de células no pequeñas, carcinomas de ovario, carcinomas de próstata, sistema nervioso central, se proporcionan aquí medios y métodos para la solución de este problema en forma de un constructo de anticuerpo biespecífico que tiene un dominio de unión dirigido a EGFRVIII en la superficie de las células diana tumorales y un segundo dominio de unión dirigido a CD3 en la superficie de células T.

De este modo, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un constructo de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a EGFRVIII humano y de macaco en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T, en el que el primer dominio de unión comprende una región variable de cadena pesada (VH) como se representa en SEQ ID NO: 157 y una región variable de cadena ligera (VL) como se representa en SEQ ID NO: 158.

Debe tenerse en cuenta que, como se usa aquí, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a “un reactivo” incluye uno o más de dichos reactivos diferentes, y la referencia a “el método” incluye una referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos en la técnica que podrían modificarse o sustituirse por los métodos descritos aquí.

A menos que se indique lo contrario, la expresión “al menos” que precede a una serie de elementos debe entenderse que se refiere a todos los elementos de la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar, utilizando únicamente experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita aquí. Se pretende que tales equivalentes estén incluidos en la presente invención.

El término “y/o”, siempre que se use aquí, incluye el significado de “y”, “o” y “todos o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término”.

El término “alrededor de” o “aproximadamente”, como se usa aquí, significa dentro de ±20%, preferiblemente dentro de ±15%, más preferiblemente dentro de ±10%, y lo más preferible dentro de ±5% de un valor o intervalo dado.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra “comprender” y variaciones tales como “comprende” y “que comprende” implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas señalados, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Cuando se usa aquí, la expresión “que comprende” puede sustituirse por la expresión “que contiene” o “que incluye”, o algunas veces, cuando se usa aquí, por la expresión “que tiene”.

Cuando se usa aquí, “que consiste en” excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se usa aquí, “que consiste esencialmente en” no excluye materiales o etapas que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación.

En cada caso aquí, cualquiera de las expresiones “que comprende”, “que consiste esencialmente en” y “que consiste en” puede reemplazarse por cualquiera de las otras dos expresiones.

La expresión “constructo de anticuerpo” se refiere a una molécula en la que la estructura y/o función se basa en la estructura y/o función de un anticuerpo, por ejemplo, de una molécula de inmunoglobulina completa o de longitud completa. Por tanto, un constructo de anticuerpo es capaz de unirse a su diana o antígeno específico. Además, un constructo de anticuerpo según la invención comprende los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo que permiten la unión a la diana. Este requisito mínimo puede definirse por la presencia de al menos las tres CDR de cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y las tres CDR de cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH), es decir, de las seis CDR. Los anticuerpos en los que se basan los constructos según la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, recombinantes, quiméricos, desinmunizados, humanizados y humanos.

Dentro de la definición de “constructos de anticuerpos” según la invención están los anticuerpos completos o de longitud completa que también incluyen anticuerpos de camélidos y otros anticuerpos de inmunoglobulina generados por métodos o procedimientos biotecnológicos o de ingeniería de proteínas. Estos anticuerpos de longitud completa pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, recombinantes, quiméricos, desinmunizados, humanizados y humanos. También dentro de la definición de “constructos de anticuerpos” están los fragmentos de anticuerpos de longitud completa, tal como VH, VHH, VL, (s) dAb, Fv, Fd, Fab, Fab’, F(ab’)2 o “rIgG” (“medio anticuerpo”). Los constructos de anticuerpos según la invención también pueden ser fragmentos modificados de anticuerpos, también denominados variantes de anticuerpos, tales como scFv, di-scFv o bi (s) -scFv, scFv-Fc, scFv-cremallera, scFab, Fab2, Fab3, diacuerpos, diacuerpos monocatenarios, diacuerpos en tándem (Tandab), di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem, “minicuerpos” ejemplificados por una estructura que es la siguiente: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2, ((scFv)2-CH3 CH3), ((scFv)2-CH3) o (scFv-CH3-scFv)2, y multicuerpos tales como triacuerpos o tetracuerpos, y anticuerpos de un solo dominio tales como nanocuerpos o anticuerpos de un solo dominio variable que comprenden solo un dominio variable, que puede ser VHH, VH o VL, que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones o dominios V.

Un dominio de unión puede comprender típicamente una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH); sin embargo, no tiene por qué comprender ambos. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones VH, y a menudo retienen alguna función de unión a antígeno del dominio intacto de unión a antígeno. Ejemplos adicionales para el formato de fragmentos de anticuerpos, variantes de anticuerpos o dominios de unión incluyen (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; (2) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la región bisagra; (3) un fragmento Fd que tiene los dos dominios VH y CH1; (4) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (5) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que tiene un dominio VH; (6) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, y (7) un Fv de cadena sencilla (scFv), siendo este último preferido (por ejemplo, derivado de una biblioteca de scFv). Ejemplos de realizaciones de constructos de anticuerpos según la invención se describen, por ejemplo, en los documentos WO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014/0302037, WO2014/144722, WO 2014/151910, y WO 2015/048272.

Además, la definición de la expresión “constructo de anticuerpo” incluye constructos monovalentes, bivalentes y polivalentes/multivalentes y, de este modo, constructos monoespecíficos, que se unen específicamente a una sola estructura antigénica, así como constructos biespecíficos y poliespecíficos/multiespecíficos, que se unen específicamente a más de una estructura antigénica, por ejemplo, dos, tres o más, a través de distintos dominios de unión. Además, la definición de la expresión “constructo de anticuerpo” incluye moléculas que consisten en solo una cadena polipeptídica, así como moléculas que consisten en más de una cadena polipeptídica, cadenas las cuales pueden ser idénticas (homodímeros, homotrímeros u homooligómeros) o diferentes (heterodímero, heterotrímero o heterooligómero). Ejemplos de anticuerpos, y variantes identificados anteriormente, o derivados de los mismos se describen, entre otros, en Harlow y Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) y Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann y Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2a ed. 2010, y Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.

Los constructos de anticuerpos de la presente invención son preferiblemente "constructos de anticuerpos generados in vitro”. Esta expresión se refiere a un constructo de anticuerpo según la definición anterior en el que toda o parte de la región variable (por ejemplo, al menos una CDR) se genera en una selección de células no inmunes, por ejemplo, una presentación de fagos in vitro, chip de proteína, o cualquier otro método en el que las secuencias candidatas puedan evaluarse para determinar su capacidad para unirse a un antígeno. De este modo, esta expresión excluye preferiblemente secuencias generadas únicamente por reordenamiento genómico en una célula inmunitaria en un animal. Un “anticuerpo recombinante” es un anticuerpo obtenido mediante el uso de tecnología de ADN recombinante o ingeniería genética.

La expresión “anticuerpo monoclonal” (mAb) o constructo de anticuerpo monoclonal, como se usa aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales y/o modificaciones posteriores a la traducción (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, y se dirigen contra un único sitio antigénico o determinante en el antígeno, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (o epítopos). Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos debido a que son sintetizados por el cultivo de hibridomas, y por lo tanto no están contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo por ningún método particular.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar pueden prepararse mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patent il.S. n° 4.816.567). Ejemplos de técnicas adicionales para producir anticuerpos monoclonales humanos incluyen la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72), y la técnica de hibridoma con EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96).

A continuación, los hibridomas se pueden cribar usando métodos estándar, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el análisis de resonancia de plasmones superficiales (BIACORE™), para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno específico. Se puede usar cualquier forma del antígeno relevante como inmunógeno, por ejemplo, antígeno recombinante, formas naturales, cualquier variante o fragmento del mismo, así como un péptido antigénico del mismo. La resonancia de plasmones superficiales, como se emplea en el sistema de BIAcore, se puede usar para aumentar la eficiencia de los anticuerpos de fagos que se unen a un epítopo de un antígeno diana, tal como EGFRVIII o CD3 épsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).

Otro método ejemplar para preparar anticuerpos monoclonales incluye el cribado de bibliotecas de expresión de proteínas, por ejemplo, bibliotecas de presentación de fagos o presentación de ribosomas. La presentación de fagos se describe, por ejemplo, en Ladner et al., patente U.S. n°. 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991), y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

Además del uso de bibliotecas de presentación, el antígeno relevante se puede usar para inmunizar a un animal no humano, por ejemplo, un roedor (tal como un ratón, hámster, conejo o rata). En una realización, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible manipular razas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los loci de Ig (inmunoglobulina) humana. Usando la tecnología de hibridomas, se pueden producir y seleccionar anticuerpos monoclonales específicos de antígeno derivados de los genes con la especificidad deseada. Véanse, por ejemplo, XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21, documentos US 2003-0070185, WO 96/34096, y WO 96/33735.

Un anticuerpo monoclonal también se puede obtener a partir de un animal no humano, y después se puede modificar, por ejemplo, humanizar, desinmunizar, hacer quimérico, etc., usando técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Los ejemplos de constructos de anticuerpos modificados incluyen variantes humanizadas de anticuerpos no humanos, anticuerpos “madurados por afinidad” (véanse, por ejemplo, Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) y Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)), y mutantes de anticuerpos con función o funciones efectoras alteradas (véanse, por ejemplo, Patente US 5.648.260, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit. y Little (2009), loc. cit.).

En inmunología, la maduración por afinidad es el proceso mediante el cual las células B producen anticuerpos con mayor afinidad por el antígeno durante el curso de una respuesta inmune. Con exposiciones repetidas al mismo antígeno, un hospedante producirá anticuerpos de afinidades sucesivamente mayores. Como el prototipo natural, la maduración por afinidad in vitro se basa en los principios de mutación y selección. La maduración por afinidad in vitro se ha utilizado con éxito para optimizar anticuerpos, constructos de anticuerpos, y fragmentos de anticuerpos. Las mutaciones aleatorias dentro de las CDR se introducen mediante radiación, mutágenos químicos o PCR propensa a errores. Además, la diversidad genética se puede aumentar mediante el barajado de cadenas. Dos o tres rondas de mutación y selección utilizando métodos de presentación, como la presentación de fagos, generalmente dan como resultado fragmentos de anticuerpos con afinidades en el intervalo nanomolar bajo.

Un tipo preferido de variación por sustitución de aminoácidos de los constructos de anticuerpos implica la sustitución de uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la o las variantes resultantes seleccionadas para un desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo parental a partir del cual se generan. Una forma conveniente de generar tales variantes de sustitución implica la maduración por afinidad usando presentación de fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de anticuerpos así generadas se presentan de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes presentadas en fagos se seleccionan entonces para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se describe aquí. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para la modificación, se puede realizar una mutagénesis de barrido de alanina para identificar los restos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión al antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el dominio de unión y, por ejemplo, EGFRVIII humano. Dichos restos de contacto y restos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas aquí. Una vez que se generan tales variantes, el panel de variantes se somete a cribado como se describe aquí, y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para su desarrollo adicional.

Los anticuerpos monoclonales y constructos de anticuerpos de la presente invención incluyen específicamente anticuerpos (inmunoglobulinas) “quiméricos” en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la o las cadenas son idénticas u homólogas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada (patente U.S. n° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés aquí incluyen anticuerpos “primitizados” que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del Viejo Mundo, simio, etc.) y secuencias de región constante humana. Se han descrito una variedad de enfoques para preparar anticuerpos quiméricos. Véanse, por ejemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 81:6851,1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., patente U.S. n° 4.816.567; Boss et al., patente U.S. n° 4.816.397; Tanaguchi et al., documentos EP 0171496; EP 0173494; y GB 2177096.

Un anticuerpo, constructo de anticuerpo, fragmento de anticuerpo o variante de anticuerpo también puede modificarse mediante la eliminación específica de epítopos de células T humanas (un método denominado “desinmunización”) mediante los métodos descritos, por ejemplo, en los documentos WO 98/52976 o WO 00/34317. Brevemente, los dominios variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo pueden analizarse en busca de péptidos que se unen al MHC de clase II; estos péptidos representan epítopos potenciales de células T (como se define en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de posibles epítopos de células T, se puede aplicar un enfoque de modelado informático denominado “hebramiento de péptidos”, y además se puede buscar en una base de datos de péptidos de unión al MHC de clase II humanos los motivos presentes en las secuencias VH y VL, como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos principales de DR de MHC de clase II, y constituyen así epítopos potenciales de células T. Los epítopos de células T potenciales detectados pueden eliminarse sustituyendo pequeños números de restos de aminoácidos en los dominios variables, o preferiblemente, mediante sustituciones de un solo aminoácido. Normalmente, se realizan sustituciones conservativas. A menudo, pero no exclusivamente, puede usarse un aminoácido común a una posición en las secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana. Las secuencias de la línea germinal humana se describen, por ejemplo, en Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; y Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14:4628-4638. El directorio V BASE proporciona un directorio completo de secuencias de regiones variables de inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Estas secuencias se pueden usar como fuente de secuencia humana, por ejemplo, para regiones estructurales y CDRs. También se pueden utilizar regiones estructurales humanas de consenso, por ejemplo, como se describe en la patente US n°. 6.300.064.

Los anticuerpos, constructos de anticuerpos, variantes o fragmentos de los mismos “humanizados” (tales como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) son anticuerpos o inmunoglobulinas de secuencias principalmente humanas, que contienen (a) secuencia o secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región hipervariable (también CDR) del receptor son reemplazados por restos de una región hipervariable de una especie no humana (por ejemplo, roedor) (anticuerpo donante) tales como ratón, rata, hámster o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región estructural (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los restos no humanos correspondientes. Además, “anticuerpos humanizados”, como se usa aquí, también puede comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar y optimizar aún más el comportamiento de los anticuerpos. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para obtener más detalles, véanse Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

Los anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos pueden generarse reemplazando secuencias del dominio variable Fv que no están directamente implicadas en la unión al antígeno con secuencias equivalentes de dominios variables Fv humanos. Los métodos ejemplares para generar anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos se proporcionan por Morrison (1985) Science 229:1202-1207; por Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; y por los documentos US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; y US 6.407.213. Esos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican todos o parte de los dominios variables de inmunoglobulina Fv de al menos uno de una cadena pesada o ligera. Dichos ácidos nucleicos pueden obtenerse de un hibridoma que produce un anticuerpo contra una diana predeterminada, como se describe anteriormente, así como de otras fuentes. El ADN recombinante que codifica la molécula de anticuerpo humanizado puede entonces clonarse en un vector de expresión apropiado.

Los anticuerpos humanizados también se pueden producir usando animales transgénicos tales como ratones que expresan genes de cadena pesada y ligera humana, pero que son incapaces de expresar los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endógena de ratón. Winter describe un método de injerto de CDR ejemplar que puede usarse para preparar los anticuerpos humanizados descritos aquí (patente U.S. n° 5.225.539). Todas las CDR de un anticuerpo humano particular pueden reemplazarse por al menos una parte de una CDR no humana, o solo algunas de las CDR pueden reemplazarse por CDR no humanas. Solo es necesario reemplazar el número de CDR requeridas para la unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.

Un anticuerpo humanizado puede optimizarse mediante la introducción de sustituciones conservativas, sustituciones de secuencias consenso, sustituciones de la línea germinal, y/o mutaciones inversas. Dichas moléculas de inmunoglobulina alteradas se pueden preparar mediante cualquiera de varias técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982, y documento EP 239400).

La expresión “anticuerpo humano”, “constructo de anticuerpo humano” y “dominio de unión humano” incluye anticuerpos, constructos de anticuerpos y dominios de unión que tienen regiones de anticuerpos tales como regiones o dominios variables y constantes que corresponden sustancialmente a secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, las descritas por Kabat et al. (1991) (loc. cit.). Los anticuerpos humanos, los constructos de anticuerpos o los dominios de unión de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR, y en particular, en CDR3. Los anticuerpos humanos, los constructos de anticuerpos o los dominios de unión pueden tener al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones reemplazadas por un resto de aminoácido que no está codificado por la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana. La definición de anticuerpos humanos, constructos de anticuerpos y dominios de unión, como se usa aquí, también contempla anticuerpos completamente humanos, que incluyen solo secuencias humanas de anticuerpos alteradas no artificial y/o genéticamente, ya que pueden derivarse usando tecnologías o sistemas tales como Xenomouse.

En algunas realizaciones, los constructos de anticuerpos de la invención son constructos de anticuerpos “aislados” o “sustancialmente puros”. “Aislado” o “sustancialmente puro”, cuando se usa para describir los constructos de anticuerpos descritos aquí, significa un constructo de anticuerpo que se ha identificado, separado y/o recuperado de un componente de su entorno de producción. Preferiblemente, el constructo de anticuerpo está libre o sustancialmente libre de asociación con todos los demás componentes de su entorno de producción. Los componentes contaminantes de su entorno de producción, tal como el que resulta de las células transfectadas recombinantes, son materiales que normalmente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. Los constructos de anticuerpos pueden constituir, por ejemplo, al menos alrededor de 5%, o al menos alrededor de 50% en peso de la proteína total en una muestra dada. Se entiende que la proteína aislada puede constituir de 5% a 99,9% en peso del contenido total de proteína, dependiendo de las circunstancias. El polipéptido se puede preparar a una concentración significativamente mayor mediante el uso de un promotor inducible o un promotor de alta expresión, de modo que se produzca a niveles de concentración aumentados. La definición incluye la producción de un constructo de anticuerpo en una amplia variedad de organismos y/o células hospedantes que se conocen en la técnica. En realizaciones preferidas, el constructo de anticuerpo se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. Sin embargo, normalmente se preparará un constructo de anticuerpo aislado mediante al menos una etapa de purificación.

La expresión “dominio de unión” caracteriza, en relación con la presente invención, un dominio que (específicamente) se une a/interactúa con/reconoce un epítopo diana dado o un sitio diana dado en las moléculas diana (antígenos), aquí: EGFRVIII y CD3, respectivamente. La estructura y función del primer dominio de unión (que reconoce EGFRVIII), y preferiblemente también la estructura y/o función del segundo dominio de unión (que reconoce CD3), se basan en la estructura y/o función de un anticuerpo, por ejemplo, de una molécula de inmunoglobulina completa o de longitud completa. Según la invención, el primer dominio de unión se caracteriza por la presencia de tres CDR de cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y tres CDR de cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). El segundo dominio de unión preferiblemente también comprende los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo que permiten la unión de la diana. Más preferiblemente, el segundo dominio de unión comprende al menos tres CDR de cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y/o tres CDR de cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). Se prevé que el primer y/o segundo dominio de unión se produzca o se pueda obtener mediante métodos de cribado de bibliotecas o de presentación de fagos en lugar de injertar secuencias de CDR de un anticuerpo (monoclonal) preexistente en un armazón.

Según la presente invención, los dominios de unión están en forma de uno o más polipéptidos. Dichos polipéptidos pueden incluir partes proteicas y partes no proteicas (por ejemplo, enlazadores químicos o agentes de reticulación químicos tales como glutaraldehído). Las proteínas (incluyendo fragmentos de las mismas, preferiblemente fragmentos biológicamente activos, y péptidos, que normalmente tienen menos de 30 aminoácidos) comprenden dos o más aminoácidos acoplados entre sí mediante un enlace peptídico covalente (dando como resultado una cadena de aminoácidos). El término “polipéptido”, como se usa aquí, describe un grupo de moléculas, que normalmente consisten en más de 30 aminoácidos. Los polipéptidos pueden formar además multímeros tales como dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir, que consisten en más de una molécula de polipéptido. Las moléculas de polipéptido que forman tales dímeros, trímeros, etc. pueden ser idénticas o no idénticas. Las correspondientes estructuras de orden superior de dichos multímeros se denominan, en consecuencia, homo- o heterodímeros, homo- o heterotrímeros, etc. Un ejemplo de un heteromultímero es una molécula de anticuerpo que, en su forma natural, consiste en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas. Los términos “péptido”, “polipéptido” y “proteína” también se refieren a péptidos/polipéptidos/proteínas modificados naturalmente en los que se efectúa la modificación, por ejemplo, mediante modificaciones post-traduccionales como glicosilación, acetilación, fosforilación, y similares. Un “péptido”, “polipéptido” o “proteína”, cuando cita aquí, también puede modificarse químicamente, tal como pegilarse. Tales modificaciones son bien conocidas en la técnica, y se describen a continuación aquí.

Preferiblemente, el dominio de unión que se une a EGFRVIII y/o el dominio de unión que se une a CD3 son dominios de unión humanos. Los anticuerpos y los constructos de anticuerpos que comprenden al menos un dominio de unión humano evitan algunos de los problemas asociados con los anticuerpos o los constructos de anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes no humanas, tales como de roedores (por ejemplo, murino, rata, hámster o conejo). La presencia de tales proteínas derivadas de roedores puede conducir a la eliminación rápida de los anticuerpos o constructos de anticuerpos, o puede conducir a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo o el constructo de anticuerpo por parte de un paciente. Para evitar el uso de anticuerpos o constructos de anticuerpos derivados de roedores, se pueden generar anticuerpos/constructos de anticuerpos humanos o completamente humanos mediante la introducción de la función del anticuerpo humano en un roedor, de modo que el roedor produzca anticuerpos completamente humanos.

La capacidad de clonar y reconstruir loci humanos del tamaño de una megabase en YAC e introducirlos en la línea germinal del ratón proporciona un enfoque poderoso para dilucidar los componentes funcionales de loci muy grandes o cartografiados de forma burda, así como para generar modelos útiles de enfermedades humanas. Además, el uso de dicha tecnología para la sustitución de loci de ratón por sus equivalentes humanos podría proporcionar conocimientos únicos sobre la expresión y regulación de productos génicos humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas, y su participación en la inducción y progresión de enfermedades.

Una aplicación práctica importante de tal estrategia es la “humanización” del sistema inmunológico humoral del ratón. La introducción de loci de inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los que se han inactivado los genes de Ig endógenos ofrece la oportunidad de estudiar los mecanismos subyacentes a la expresión programada y al ensamblaje de anticuerpos, así como su papel en el desarrollo de las células B. Además, tal estrategia podría proporcionar una fuente ideal para la producción de anticuerpos monoclonales (mAb) completamente humanos - un hito importante para cumplir la promesa de la terapia con anticuerpos en enfermedades humanas. Se espera que los anticuerpos o constructos de anticuerpos completamente humanos minimicen las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a los mAb de ratón o derivatizados de ratón, y de este modo aumenten la eficacia y seguridad de los anticuerpos/constructos de anticuerpos administrados. Se puede esperar que el uso de anticuerpos o constructos de anticuerpos completamente humanos proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación, autoinmunidad y cáncer, que requieren administraciones repetidas de compuestos.

Un enfoque hacia este objetivo fue diseñar razas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los loci de Ig humana en previsión de que tales ratones producirían un gran repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de anticuerpos de ratón. Los grandes fragmentos de Ig humana preservarían la gran diversidad genética variable, así como la regulación adecuada de la producción y expresión de anticuerpos. Al explotar la maquinaria del ratón para la diversificación y selección de anticuerpos y la falta de tolerancia inmunológica a las proteínas humanas, el repertorio de anticuerpos humanos reproducidos en estas razas de ratón debería producir anticuerpos de alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluyendo los antígenos humanos. Usando la tecnología de hibridomas, se podrían producir y seleccionar fácilmente mAb humanos específicos de antígeno con la especificidad deseada. Esta estrategia general se demostró en relación con la generación de las primeras razas de ratón XenoMouse (véase Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)). Las razas de XenoMouse se manipularon con cromosomas artificiales de levadura (YAC) que contenían fragmentos de configuración de la línea germinal de 245 kb y 190 kb del locus de la cadena pesada humana y del locus de la cadena ligera kappa, respectivamente, que contenían secuencias de las regiones variable y constante centrales. Los YAC que contienen Ig humana demostraron ser compatibles con el sistema de ratón tanto para el reordenamiento como para la expresión de anticuerpos, y eran capaces de sustituir los genes de Ig de ratón inactivados. Esto se demostró por su capacidad para inducir el desarrollo de células B, para producir un repertorio humano de tipo adulto de anticuerpos completamente humanos, y para generar mAb humanos específicos de antígeno. Estos resultados también sugirieron que la introducción de porciones más grandes de los loci de Ig humana que contienen un mayor número de genes V, elementos reguladores adicionales, y regiones constantes de Ig humana podría recapitular sustancialmente el repertorio completo que es característico de la respuesta humoral humana a la infección y la inmunización. El trabajo de Green et al. se amplió recientemente a la introducción de más de aproximadamente el 80% del repertorio de anticuerpos humanos mediante la introducción de fragmentos YAC de configuración de línea germinal de tamaño de megabase de los loci de cadena pesada humana y loci de cadena ligera kappa, respectivamente. Véase Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

La producción de los ratones XenoMouse se analiza y describe con más detalle en la patente U.S. n° 6.673.986, las patentes U.S. nos 6.162.963; 6.150.584; 6.114.598; 6.075.181, y 5.939.598, así como las solicitudes de patente US subyacentes y las patentes japonesas nos 3068 180 B2, 3068506 B2 y 3068 507 B2. Véanse también Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), documentos EP 0463 151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310, y WO 03/47336.

En un enfoque alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque de “minilocus”. En el enfoque de minilocus, un locus de Ig exógeno se imita mediante la inclusión de piezas (genes individuales) del locus de Ig. De este modo, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu, y una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) se forman en un constructo para la inserción en un animal. Este enfoque se describe en la patente U.S. n° 5.545.807 de Surani et al., y en las patentes U.S. nos 5.545.806; 5.625.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; 5.770.429; 5.789.650; 5.814.318; 5.877.397; 5.874.299; y 6.255.458 cada una de Lonberg y Kay, en las patentes U.S. nos 5.591.669 y 6.023.010 de Krimpenfort y Berns, en las patentes U.S. nos 5.612.205; 5.721.367; y 5.789.215 de Berns et al., en la patente U.S. no 5.643.763 de Choi y Dunn. Este enfoque se describe con más detalle en las patentes U.S. nos 5.569.825; 5.789.650; 5.545.806; 5.661.016; 5.814.318, y 5.364.079 de GenPharm International, así como en las solicitudes de patente subyacentes. Véanse también los documentos EP 0546 073 B1, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884, y la patente U.S. n25.981.175. Véanse además Taylor et al.(1992), Chen et al.(1993), Tuaillon et al.(1993), Choi et al.(1993), Lonberg et al.(1994), Taylor et al.(1994), y Tuaillon et al.(1995), Fishwild et al.(1996).

Kirin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los que, mediante la fusión de microcélulas, se han introducido grandes fragmentos de cromosomas o cromosomas completos. Véanse las solicitudes de patente europea nos 773288 y 843961. Xenerex Biosciences está desarrollando una tecnología para la generación potencial de anticuerpos humanos. En esta tecnología, los ratones SCID se reconstituyen con células linfáticas humanas, por ejemplo, células B y/o T. Los ratones se inmunizan entonces con un antígeno, y pueden generar una respuesta inmune contra el antígeno. Véanse las patentes U.S. nos 5.476.996; 5.698.767; y 5.958.765.

Las respuestas de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) han llevado a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o humanizados de otro modo. Sin embargo, se espera que se observarán ciertas respuestas de anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA), particularmente en las utilizaciones crónicas o multidosis del anticuerpo. De este modo, sería deseable proporcionar constructos de anticuerpos que comprendan un dominio de unión humano contra EGFRVIII y/o un dominio de unión humano contra CD3 con el fin de eliminar preocupaciones y/o efectos de la respuesta HAMA o HACA.

Las expresiones “se une (específicamente) a”, “reconoce (específicamente)”, “está dirigido (específicamente) a”, y “reacciona (específicamente) con” significan, según esta invención, que un dominio de unión interactúa o interactúa específicamente con un determinado epítopo o un sitio diana dado en las moléculas diana (antígenos), aquí: EGFRVIII y CD3, respectivamente.

El término “epítopo” se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicamente un dominio de unión, tal como un anticuerpo o inmunoglobulina, o un derivado, fragmento o variante de un anticuerpo o una inmunoglobulina. Un “epítopo” es antigénico, y de este modo, el término epítopo a veces también se denomina aquí “estructura antigénica” o “determinante antigénico”. De este modo, el dominio de unión es un “sitio de interacción con el antígeno”. También se entiende que dicha unión/interacción define un “reconocimiento específico”.

Los “epítopos” pueden formarse tanto por aminoácidos contiguos como por aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína. Un “epítopo lineal” es un epítopo en el que una secuencia primaria de aminoácidos comprende el epítopo reconocido. Un epítopo lineal incluye típicamente al menos 3 o al menos 4, y más habitualmente, al menos 5 o al menos 6 o al menos 7, por ejemplo, alrededor de 8 a alrededor de 10 aminoácidos en una secuencia única.

Un “epítopo conformacional”, en contraste con un epítopo lineal, es un epítopo en el que la secuencia primaria de los aminoácidos que comprende el epítopo no es el único componente definitorio del epítopo reconocido (por ejemplo, un epítopo en el que la secuencia primaria de aminoácidos no es necesariamente reconocida por el dominio de unión). Normalmente, un epítopo conformacional comprende un mayor número de aminoácidos con respecto a un epítopo lineal. Con respecto al reconocimiento de epítopos conformacionales, el dominio de unión reconoce una estructura tridimensional del antígeno, preferiblemente un péptido o proteína o fragmento del mismo (en el contexto de la presente invención, la estructura antigénica para uno de los dominios de unión está comprendida dentro de la proteína EGFRVIII). Por ejemplo, cuando una molécula de proteína se pliega para formar una estructura tridimensional, ciertos aminoácidos y/o el esqueleto polipeptídico que forma el epítopo conformacional se yuxtaponen permitiendo que el anticuerpo reconozca el epítopo. Los métodos para determinar la conformación de epítopos incluyen, pero no se limitan a, cristalografía de rayos X, espectroscopía de resonancia magnética nuclear bidimensional (RMN 2D), y espectroscopía de marcado de espín dirigido al sitio y resonancia paramagnética electrónica (EPR).

Un método para el cartografiado de epítopos se describe a continuación: Cuando una región (un tramo de aminoácidos contiguos) en la proteína EGFRVIII humana se intercambia/reemplaza por su región correspondiente de un antígeno EGFRVIII no humano y no de primate (por ejemplo, EGFRVIII de ratón, pero también se pueden concebir otros como de pollo, rata, hámster, conejo, etc.), se espera que ocurra una disminución en la unión del dominio de unión, a menos que el dominio de unión sea de reacción cruzada para el EGFRVIII no humano y no de primate usado. Preferiblemente, dicha disminución es al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50%; más preferiblemente al menos 60%, 70% u 80%, y lo más preferible 90%, 95% o incluso 100% en comparación con la unión a la región respectiva en la proteína EGFRVIII humana, por lo que la unión a la región respectiva en la proteína EGFRVIII humana se establece para que sea el 100%.

Un método adicional para determinar la contribución de un resto específico de un antígeno diana al reconocimiento por un constructo de anticuerpo o dominio de unión es el barrido de alanina (véase, por ejemplo, Morrison KL y Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. 2001 Jun; 5(3):302-7), en el que cada resto a analizar se reemplaza por alanina, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio. La alanina se utiliza debido a su grupo funcional metilo no voluminoso y químicamente inerte que, sin embargo, imita las referencias de estructura secundaria que poseen muchos de los otros aminoácidos. A veces, se pueden usar aminoácidos voluminosos, tales como valina o leucina, en los casos en que se desee la conservación del tamaño de los restos mutados. El barrido de alanina es una tecnología madura que se ha utilizado durante un largo período de tiempo.

La interacción entre el dominio de unión y el epítopo o la región que comprende el epítopo implica que un dominio de unión exhibe una afinidad apreciable por el epítopo/la región que comprende el epítopo en una proteína o antígeno particular (aquí: EGFRVIII y CD3, respectivamente), y, generalmente, no exhibe una reactividad significativa con proteínas o antígenos distintos de EGFRVIII o CD3. La “afinidad apreciable” incluye la unión con una afinidad de alrededor de 10-6 M (KD) o más fuerte. Preferiblemente, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es de alrededor de 10-12 a 10-8 M, 10-12 a 10-9 M, 10-12 a 10-10 M, 10-11 a 10-8 M, preferiblemente de alrededor de 10-11 a 10-9 M. Si un dominio de unión reacciona específicamente o se une a una diana se puede evaluar fácilmente, entre otros, comparando la reacción de dicho dominio de unión con una proteína o antígeno diana con la reacción de dicho dominio de unión con proteínas o antígenos distintos de EGFRVIII o CD3. Preferiblemente, un dominio de unión de la invención no se une esencial o sustancialmente a proteínas o antígenos distintos de EGFRVIII o CD3 (es decir, el primer dominio de unión no es capaz de unirse a proteínas distintas de EGFRVIII, y el segundo dominio de unión no es capaz de unirse a proteínas distintas de CD3).

La expresión “no se une esencialmente/sustancialmente” o “no es capaz de unirse” significa que un dominio de unión de la presente invención no se une a una proteína o antígeno distinto de EGFRVIII o CD3, es decir, no muestra reactividad de más del 30%, preferiblemente no más del 20%, más preferiblemente no más del 10%, particularmente de forma preferible no más del 9%, 8%, 7%, 6% o 5% con proteínas o antígenos distintos de EGFRVIII o CD3, por lo que la unión a EGFRVIII o CD3, respectivamente, se establece para que sea 100%.

Se cree que la unión específica se efectúa mediante motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno. Así, la unión se consigue como resultado de su estructura primaria, secundaria y/o terciaria, así como el resultado de modificaciones secundarias de dichas estructuras. La interacción específica del sitio de interacción del antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado una simple unión de dicho sitio al antígeno. Además, la interacción específica del sitio de interacción del antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado, alternativa o adicionalmente, el inicio de una señal, por ejemplo, debido a la inducción de un cambio de conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc.

El epítopo del constructo de anticuerpo biespecífico de la invención está ubicado en la unión específica de EGFRVIII entre los restos de aminoácidos 5 y 274 de EGFR, que resulta de la mutación de EGFR con respecto a la mutación de empalme EGFRvIII. Esta mutación elimina los restos 2-273 de la secuencia de EGFR madura al tiempo que introduce un único resto de glicina (véase la figura 1).

También se prefiere en una realización de la invención que el segundo dominio de unión se una a CD3 épsilon humano y a CD3 épsilon de Callithrix jacchus, Saguinus Edipo o Saimirí sciureus.

El término “variable” se refiere a las porciones del anticuerpo o dominios de inmunoglobulina que exhiben variabilidad en su secuencia y que están involucradas en la determinación de la especificidad y afinidad de unión de un anticuerpo particular (es decir, el o los “dominios variables”). El apareamiento de una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) juntas forma un único sitio de unión al antígeno.

La variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos; se concentra en subdominios de cada una de las regiones variables de cadena pesada y ligera. Estos subdominios se denominan “regiones hipervariables” o “regiones determinantes de la complementariedad” (CDR). Las porciones más conservadas (es decir, no hipervariables) de los dominios variables se denominan regiones “estructurales” (FRM o FR) y proporcionan un andamiaje para las seis CDR en el espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas de origen natural comprenden cada uno cuatro regiones FRM (FR1, FR2, FR3 y FR4), que adoptan en gran medida una configuración de hoja b, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de la hoja b. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por la FRM y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno (véase Kabat et al., loc. cit.).

Los términos “CDR”, y su plural “CDRs”, se refieren a la región determinante de la complementariedad de las cuales tres componen el carácter de unión de una región variable de cadena ligera (CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3) y tres componen el carácter de unión de una región variable de cadena pesada (CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3). Las CDR contienen la mayoría de los restos responsables de las interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno, y por tanto contribuyen a la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: son los principales determinantes de la especificidad por el antígeno.

Los límites y longitudes exactos definitorios de las CDR están sujetos a diferentes sistemas de clasificación y numeración. Por lo tanto, las CDR se pueden definir mediante Kabat, Chothia, contact, u otras definiciones de límites, incluyendo el sistema de numeración descrito aquí. A pesar de los diferentes límites, cada uno de estos sistemas tiene algún grado de superposición en lo que constituye las denominadas “regiones hipervariables” dentro de las secuencias variables. Por tanto, las definiciones de CDR según estos sistemas pueden diferir en longitud y áreas de límite con respecto a la región de estructura adyacente. Véase, por ejemplo, Kabat (un enfoque basado en la variabilidad de secuencia entre especies), Chothia (un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígenoanticuerpo), y/o MacCallum (Kabat et al., loc. cit.; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; y MacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Otro estándar más para caracterizar el sitio de unión al antígeno es la definición de AbM utilizada por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase, por ejemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. En: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). En la medida en que dos técnicas de identificación de restos definan regiones de superposición, pero no regiones idénticas, se pueden combinar para definir una CDR híbrida. Sin embargo, se prefiere la numeración según el denominado sistema de Kabat.

Normalmente, las CDR forman una estructura de bucle que se puede clasificar como estructura canónica. La expresión “estructura canónica” se refiere a la conformación de la cadena principal que adoptan los bucles de unión a antígeno (CDR). A partir de estudios estructurales comparativos, se ha encontrado que cinco de los seis bucles de unión a antígeno tienen solo un repertorio limitado de conformaciones disponibles. Cada estructura canónica se puede caracterizar por los ángulos de torsión del esqueleto polipeptídico. Los bucles correspondientes entre anticuerpos pueden, por lo tanto, tener estructuras tridimensionales muy similares, a pesar de la alta variabilidad de la secuencia de aminoácidos en la mayoría de las partes de los bucles (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin y Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Además, existe una relación entre la estructura de bucle adoptada y las secuencias de aminoácidos que la rodean. La conformación de una clase canónica particular está determinada por la longitud del bucle y los restos de aminoácidos que residen en posiciones clave dentro del bucle, así como dentro de la región estructural conservada (es decir, fuera del bucle). Por lo tanto, la asignación a una clase canónica particular se puede realizar en función de la presencia de estos restos de aminoácidos clave.

La expresión “estructura canónica” también puede incluir consideraciones en cuanto a la secuencia lineal del anticuerpo, por ejemplo, según lo catalogado por Kabat (Kabat et al., loc. cit.). El esquema (sistema) de numeración de Kabat es un estándar ampliamente adoptado para numerar los restos de aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo de una manera consistente, y es el esquema preferido aplicado en la presente invención como también se menciona aquí en otra parte. También se pueden usar consideraciones estructurales adicionales para determinar la estructura canónica de un anticuerpo. Por ejemplo, aquellas diferencias que no se reflejan completamente en la numeración de Kabat pueden describirse mediante el sistema de numeración de Chothia et al. y/o revelado por otras técnicas, por ejemplo, cristalografía y modelado computacional bidimensional o tridimensional. En consecuencia, una secuencia de anticuerpo determinada puede colocarse en una clase canónica que permite, entre otras cosas, identificar secuencias de chasis apropiadas (por ejemplo, basado en el deseo de incluir una variedad de estructuras canónicas en una biblioteca). La numeración de Kabat de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo y consideraciones estructurales como se describe por Chothia et al., loc. cit., y sus implicaciones para construir aspectos canónicos de la estructura del anticuerpo, se describen en la bibliografía. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas en la técnica. Para una revisión de la estructura del anticuerpo, véase Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988.

La CDR3 de la cadena ligera y, en particular, la CDR3 de la cadena pesada pueden constituir los determinantes más importantes en la unión al antígeno dentro de las regiones variables de la cadena ligera y pesada. En algunos constructos de anticuerpos, la CDR3 de cadena pesada parece constituir el área principal de contacto entre el antígeno y el anticuerpo. Los esquemas de selección in vitro, en los que se varía CDR3 sola, se pueden usar para variar las propiedades de unión de un anticuerpo o determinar qué restos contribuyen a la unión de un antígeno. Por tanto, la CDR3 es típicamente la mayor fuente de diversidad molecular dentro del sitio de unión del anticuerpo. H3, por ejemplo, puede ser tan corto como dos restos de aminoácidos, o más de 26 aminoácidos.

En un anticuerpo o inmunoglobulina de longitud completa clásica, cada cadena ligera (L) está unida a una cadena pesada (H) por un enlace de disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están unidas entre sí por uno o más enlaces de disulfuro dependiendo del isotipo de la cadena H. El dominio CH más próximo a VH se suele designar como CH1. Los dominios constantes (“C”) no están directamente implicados en la unión al antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la citotoxicidad mediada por células y dependiente de anticuerpos y la activación del complemento. La región Fc de un anticuerpo está comprendida dentro de los dominios constantes de la cadena pesada, y es, por ejemplo, capaz de interactuar con receptores Fc ubicados en la superficie celular.

La secuencia de genes de anticuerpos después del ensamblaje y la mutación somática es muy variada, y se estima que estos genes variados codifican 1010 moléculas diferentes de anticuerpos (Immunoglobulin Genes, 2a ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). En consecuencia, el sistema inmunológico proporciona un repertorio de inmunoglobulinas. El término “repertorio” se refiere a al menos una secuencia nucleotídica derivada total o parcialmente de al menos una secuencia que codifica al menos una inmunoglobulina. La o las secuencias pueden generarse por reordenamiento in vivo de los segmentos V, D y J de las cadenas pesadas, y los segmentos V y J de las cadenas ligeras. Alternativamente, la o las secuencias se pueden generar a partir de una célula en respuesta a la cual se produce el reordenamiento, por ejemplo, estimulación in vitro. Alternativamente, parte o la totalidad de la o las secuencias puede obtenerse mediante corte y empalme de ADN, síntesis de nucleótidos, mutagénesis, y otros métodos; véase, por ejemplo, la patente U.S. 5.565.332. Un repertorio puede incluir solo una secuencia o puede incluir una pluralidad de secuencias, incluyendo aquellas de una colección genéticamente diversa.

El término “biespecífico”, como se usa aquí, se refiere a un constructo de anticuerpo que es “al menos biespecífico”, es decir, comprende al menos un primer dominio de unión y un segundo dominio de unión, en el que el primer dominio de unión se une a un antígeno o diana (aquí: EGFRVIII), y el segundo dominio de unión se une a otro antígeno o diana (aquí: CD3). Por consiguiente, los constructos de anticuerpos según la invención comprenden especificidades para al menos dos antígenos o dianas diferentes. La expresión “constructo de anticuerpo biespecíficos” de la invención también abarca constructos de anticuerpos multiespecíficos tales como constructos de anticuerpos inespecíficos, incluyendo estos últimos tres dominios de unión, o constructos que tienen más de tres (por ejemplo, cuatro, cinco ...) especificidades.

Dado que los constructos de anticuerpos según la invención son (al menos) biespecíficos, no se producen de forma natural, y son marcadamente diferentes de los productos de origen natural. Un constructo de anticuerpo “biespecífico” o inmunoglobulina es por tanto un anticuerpo híbrido artificial o inmunoglobulina que tiene al menos dos sitios de unión distintos con diferentes especificidades. Los constructos de anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una variedad de métodos que incluyen la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab’. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990).

Los al menos dos dominios de unión y los dominios variables del constructo de anticuerpo de la presente invención pueden comprender o no enlazadores peptídicos (péptidos espaciadores). La expresión “enlazador peptídico” comprende, según la presente invención, una secuencia de aminoácidos mediante la cual las secuencias de aminoácidos de un dominio (variable y/o de unión) y de otro dominio (variable y/o de unión) del constructo de anticuerpo de la invención están ligadas entre sí. Una característica técnica esencial de tal péptido enlazador es que no comprende ninguna actividad de polimerización. Entre los enlazadores peptídicos adecuados se encuentran los descritos en las Patentes U.S. 4.751.180 y 4.935.233 o WO 88/09344. Los enlazadores peptídicos también pueden usarse para unir otros dominios o módulos o regiones (tales como dominios que extienden la vida media) al constructo de anticuerpo de la invención.

En el caso de que se use un enlazador, este enlazador es preferiblemente de una longitud y secuencia suficientes para asegurar que cada uno de los dominios primero y segundo puedan retener, independientemente entre sí, sus especificidades de unión diferenciales. Para los enlazadores peptídicos que conectan los al menos dos dominios de unión (o dos dominios variables) en el constructo de anticuerpo de la invención, se prefieren aquellos enlazadores peptídicos que comprenden solo un número reducido de restos de aminoácidos, por ejemplo 12 restos de aminoácidos o menos. De este modo, se prefieren enlazadores peptídicos de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 restos de aminoácidos. Un enlazador peptídico contemplado con menos de 5 aminoácidos comprende 4, 3, 2 o un aminoácido, en el que se prefieren los enlazadores ricos en Gly. Un aminoácido “único” particularmente preferido en el contexto de dicho “enlazador peptídico” es Gly. Por consiguiente, dicho enlazador peptídico puede consistir en un solo aminoácido Gly. Otra realización preferida de un enlazador peptídico se caracteriza por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, es decir, Gly4Ser (SEQ ID NO: 1), o polímeros de la misma, es decir, (Gly4Ser)x, en el que x es un número entero de 1 o mayor (por ejemplo, 2 o 3). Los enlazadores preferidos se representan en las SEQ ID NOs: 1-9. Las características de dicho enlazador peptídico, que comprenden la ausencia de promoción de estructuras secundarias, son conocidas en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Dall’Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) y Raag y Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). Se prefieren los enlazadores peptídicos que además no promueven ninguna estructura secundaria. Se puede proporcionar la ligación de dichos dominios entre sí, por ejemplo, por ingeniería genética, como se describe en los ejemplos. Los métodos para preparar constructos monocatenarios biespecíficos fusionados y enlazados operativamente y expresarlos en células de mamíferos o bacterias son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, documento WO 99/54440 o Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001).

Como se describe aquí anteriormente, la invención proporciona una realización preferida en la que el constructo de anticuerpo está en un formato seleccionado del grupo que consiste en (scFv)2, scFv-mAb de dominio único, diacuerpos, y oligómeros de cualquiera de esos formatos.

Según una realización particularmente preferida, y como se documenta en los ejemplos adjuntos, el constructo de anticuerpo de la invención es un “constructo de anticuerpo monocatenario biespecífico”, más preferiblemente un “Fv monocatenario” (scFv) biespecífico. Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético - como se describe anteriormente - que les permite obtenerse como una única cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se aparean para formar una molécula monovalente; véase, por ejemplo, Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se evalúan para determinar la función de la misma manera como se hace para los anticuerpos completos o de longitud completa. Un fragmento variable monocatenario (scFv) es, por tanto, una proteína de fusión de la región variable de la cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL) de las inmunoglobulinas, normalmente conectada con un péptido enlazador corto de alrededor de diez a alrededor de 25 aminoácidos, preferiblemente alrededor de 15 a 20 aminoácidos. El enlazador suele ser rico en glicina para la flexibilidad, así como en serina o treonina para la solubilidad, y puede conectar el extremo N-terminal de la VH con el extremo C-terminal de la VL, o viceversa. Esta proteína conserva la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y la introducción del enlazador.

Las moléculas monocatenarias biespecíficas se conocen en la técnica, y se describen en el documento WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (véase, entre otros, la patente US 4.946.778, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit. y Little (2009), loc. cit.) se puede adaptar para producir constructos de anticuerpos monocatenarios que reconocen específicamente (una) diana o dianas elegidas.

Los fragmentos variables monocatenarios bivalentes (también denominados divalentes) o biespecíficos (bi-scFvs o discFvs que tienen el formato (scFv)2 pueden modificarse mediante ingeniería para enlazar dos moléculas de scFv (por ejemplo, con enlazadores como se describe aquí anteriormente). Si estas dos moléculas de scFv tienen la misma especificidad de unión, la molécula resultante (scFv)2 se denominará preferiblemente bivalente (es decir, tiene dos valencias para el mismo epítopo diana). Si las dos moléculas de scFv tienen diferentes especificidades de unión, la molécula resultante (scFv)2 se denominará preferiblemente biespecífica. El enlace se puede realizar produciendo una sola cadena peptídica con dos regiones VH y dos regiones VL, produciendo las scFv en tándem (véase, por ejemplo, Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22(5):238-244). Otra posibilidad es la creación de moléculas de scFv con péptidos enlazadores que son demasiado cortos para que las dos regiones variables se plieguen juntas (por ejemplo, alrededor de cinco aminoácidos), lo que obliga a las scFv a dimerizarse. Este tipo se conoce como diacuerpos (véase, por ejemplo, Hollinger, Philipp et al., (julio 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8.).

Según una realización y también preferida del constructo de anticuerpo de la invención, la cadena pesada (VH) y la cadena ligera (VL) de un dominio de unión que se une al antígeno diana EGFRVIII o CD3 no están conectadas directamente a través de un enlazador peptídico como se describe anteriormente, pero el dominio de unión se forma debido a la formación de una molécula biespecífica como se describe para el diacuerpo. De este modo, la cadena VH del dominio de unión a CD3 puede fusionarse con la VL del dominio de unión a EGFRVIII mediante tal enlazador peptídico, mientras que la cadena VH del dominio de unión a EGFRVIII se fusiona a la VL del dominio de unión a CD3 mediante dicho enlazador peptídico.

Los anticuerpos de dominio único comprenden meramente un dominio variable de anticuerpo (monomérico) que puede unirse selectivamente a un antígeno específico, independientemente de otras regiones o dominios V. Los primeros anticuerpos de dominio único se diseñaron a partir de anticuerpos de cadena pesada que se encuentran en los camélidos, y se denominan fragmentos V^h H. Los peces cartilaginosos también tienen anticuerpos de cadena pesada (IgNAR) a partir de los cuales se pueden obtener anticuerpos de dominio único denominados fragmentos V^nar. Un enfoque alternativo es dividir los dominios variables diméricos de las inmunoglobulinas comunes, por ejemplo, de seres humanos o roedores, en monómeros, obteniendo así VH o VL como un Ab de dominio único. Aunque la mayor parte de la investigación sobre anticuerpos de dominio único se basa actualmente en dominios variables de cadena pesada, también se ha demostrado que los nanocuerpos derivados de cadenas ligeras se unen específicamente a epítopos diana. Los ejemplos de anticuerpos de dominio único se denominan sdAb, nanocuerpos o anticuerpos de dominio variable único.

Un (mAb de dominio único)2 es, por tanto, un constructo de anticuerpo monoclonal compuesto por (al menos) dos anticuerpos monoclonales de dominio único, que se seleccionan individualmente del grupo que comprende VH, VL, V^hH y V^nar. El enlazador está preferiblemente en forma de enlazador peptídico. De manera similar, un “scFv-mAb de dominio único” es un constructo de anticuerpo monoclonal compuesto por al menos un anticuerpo de dominio único como se describe anteriormente y una molécula de scFv como se describe anteriormente. De nuevo, el enlazador está preferiblemente en forma de enlazador peptídico.

Las células T o linfocitos T son un tipo de linfocito (en sí mismo un tipo de glóbulo blanco) que desempeña un papel central en la inmunidad mediada por células. Hay varios subconjuntos de células T, cada uno con una función distinta. Las células T se pueden distinguir de otros linfocitos, tales como las células B y las células NK, por la presencia de un receptor de células T (TCR) en la superficie celular. El TCR es responsable de reconocer los antígenos unidos a las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), y está compuesto por dos cadenas de proteínas diferentes. En el 95% de las células T, el TCR consiste en una cadena alfa (a) y beta (p). Cuando el TCR interactúa con el péptido antigénico y el MHC (complejo péptido/MHC), el linfocito T se activa a través de una serie de eventos bioquímicos mediados por enzimas asociadas, correceptores, moléculas adaptadoras especializadas, y factores de transcripción activados o liberados.

El complejo del receptor CD3 es un complejo proteico, y está compuesto por cuatro cadenas. En los mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3g (gamma), una cadena CD35 (delta), y dos cadenas CD3s (épsilon). Estas cadenas se asocian con el receptor de células T (TCR) y la denominada cadena Z (zeta) para formar el complejo receptor de células T-CD3 y generar una señal de activación en los linfocitos T. Las cadenas CD3g (gamma), CD35 (delta) y CD3s (épsilon) son proteínas de la superficie celular muy relacionadas de la superfamilia de inmunoglobulinas que contienen un único dominio de inmunoglobulina extracelular. Las colas intracelulares de las moléculas de CD3 contienen un único motivo conservado, conocido como motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina o ITAM, para abreviar, que es esencial para la capacidad de señalización del TCR. La molécula de CD3 épsilon es un polipéptido que en los seres humanos está codificada por el gen CD3E que reside en el cromosoma 11. El epítopo más preferido de CD3 épsilon está comprendido dentro de los restos de aminoácidos 1 -27 del dominio extracelular de CD3 épsilon humano.

La lisis redirigida de células diana mediante el reclutamiento de células T por un constructo de anticuerpo multiespecífico, al menos biespecífico, implica la formación de sinapsis citolítica y la liberación de perforina y granzimas. Las células T acopladas son capaces de lisis de células diana en serie, y no se ven afectadas por mecanismos de escape inmunológico que interfieren con el procesamiento y presentación del antígeno peptídico, o con la diferenciación de células T clonales; véase, por ejemplo, el documento WO 2007/042261.

La citotoxicidad mediada por constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 se puede medir de diversas formas. Véase el Ejemplo 1. Las células efectoras pueden ser, por ejemplo, células T positivas para CD8 (humanas) enriquecidas estimuladas o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (humanas) no estimuladas. Si las células diana son de origen macaco, o expresan o se transfectan con EGFRVIII de macaco, las células efectoras también deben ser de origen macaco, tal como una línea de células T de macaco, por ejemplo 4119LnPx. Las células diana deben expresar (al menos el dominio extracelular de) EGFRVIII, por ejemplo EGFRVIII humano o de macaco. Las células diana pueden ser una línea celular (tal como CHO) que se transfecta de forma estable o transitoria con EGFRVIII, por ejemplo EGFRVIII humano o de macaco. Alternativamente, las células diana pueden ser una línea celular expresadora natural positiva para EGFRVIII, tal como la línea celular de glioblastoma humano U87 o DK-MG. Por lo general, se espera que los valores de EC50 sean más bajos con las líneas celulares diana que expresan niveles más altos de EGFRVIII en la superficie celular. La relación de efectora a célula diana (E:T) suele ser alrededor de 10:1, pero también puede variar. La actividad citotóxica de los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 se puede medir en un ensayo de liberación de cromo 51 (tiempo de incubación de alrededor de 18 horas) o en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS (tiempo de incubación de alrededor de 48 horas). También son posibles modificaciones del tiempo de incubación del ensayo (reacción citotóxica). Otros métodos para medir la citotoxicidad son bien conocidos por los expertos, y comprenden ensayos de MTT o de MTS, ensayos basados en ATP que incluyen ensayos bioluminiscentes, ensayo de sulforrodamina B (SRB), ensayo WST, ensayo clonogénico, y la tecnología ECIS.

La actividad citotóxica mediada por los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 de la presente invención se mide preferiblemente en un ensayo de citotoxicidad basado en células. También se puede medir en un ensayo de liberación de cromo 51. Está representada por el valor de EC⁵⁰, que corresponde a la mitad de la concentración efectiva máxima (concentración del constructo de anticuerpo que induce una respuesta citotóxica a mitad de camino entre la línea de base y la máxima). Preferiblemente, el valor de EC⁵⁰ de los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 es <5000 pM o <4000 pM, más preferiblemente <3000 pM o <2000 pM, incluso más preferiblemente <1000 pM o <500 pM, incluso más preferiblemente <400 pM o <300 pM, incluso más preferiblemente <200 pM, incluso más preferiblemente <100 pM, incluso más preferiblemente <50 pM, incluso más preferiblemente <20 pM o <10 pM, y lo más preferible <5 pM.

Los valores de EC⁵⁰ dados anteriormente se pueden medir en diferentes ensayos. El experto es consciente de que se puede esperar que el valor de EC⁵⁰ sea menor cuando se usan células T CD8+ estimuladas/enriquecidas como células efectoras, en comparación con PBMC no estimuladas. Además, se puede esperar que los valores de EC⁵⁰ sean más bajos cuando las células diana expresan un número elevado del antígeno diana en comparación con una rata de baja expresión de la diana. Por ejemplo, cuando se usan células T CD8+ humanas estimuladas/enriquecidas como células efectoras (y como células diana se usan células transfectadas con EGFRVIII, tales como células CHO, o una línea celular de glioblastoma humano positiva para EGFRVIII U87 o DK-MG), el valor de EC⁵⁰ del constructo de anticuerpo biespecífico EGFRVIIIxCD3 es preferiblemente <1000 pM, más preferiblemente <500 pM, incluso más preferiblemente <250 pM, incluso más preferiblemente <100 pM, incluso más preferiblemente <50 pM, incluso más preferiblemente <10 pM, y los más preferible <5 pM. Cuando se usan PBMC humanas como células efectoras, el valor de CE⁵⁰ del constructo de anticuerpo biespecífico EGFRVIIIxCD3 es preferiblemente <5000 pM o <4000 pM (en particular cuando las células diana son una línea celular de glioblastoma humano positiva para EGFRVIII U87 o DK-MG), más preferiblemente <2000 pM (en particular cuando las células diana son células transfectadas con EGFRVIII tales como células CHO), más preferiblemente <1000 pM o <500 pM, incluso más preferiblemente <200 pM, incluso más preferiblemente <150 pM, incluso más preferiblemente <100 pM, y lo más preferible <50 pM, o menos. Cuando una línea de células T de macaco, como LnPx4119 se usa como células efectoras, y una línea de células transfectadas con EGFRVIII de macaco tales como las células CHO se usa como línea de células diana, el valor de EC⁵⁰ del constructo de anticuerpo biespecífico EGFRVIII xCD3 es preferiblemente <2000 pM o <1500 pM, más preferiblemente <1000 pM o <500 pM, incluso más preferiblemente <300 pM o <250 pM, incluso más preferiblemente <100 pM, y lo más preferible <50 pM.

Preferiblemente, los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 de la presente invención no inducen/median la lisis, o no inducen/median esencialmente la lisis, de células negativas para EGFRVIII tales como células CHO. Las expresiones “no inducen la lisis”, “no inducen esencialmente la lisis”, “no median la lisis” o “no median esencialmente la lisis”, significa que un constructo de anticuerpo de la presente invención no induce o media la lisis de más de 30%, preferiblemente no más de 20%, más preferiblemente no más de 10%, particularmente de forma preferible no más de 9%, 8%, 7%, 6% o 5% de células negativas para EGFRVIII, en la que la lisis de una célula de glioblastoma humano positiva para EGFRVIII U87 O DK-MG (ver anteriormente) se ajusta para que sea 100%. Esto generalmente se aplica a concentraciones del constructo de anticuerpo de hasta 500 nM. El experto sabe cómo medir la lisis celular sin más preámbulos. Además, la presente memoria descriptiva enseña instrucciones específicas sobre cómo medir la lisis celular.

La diferencia en la actividad citotóxica entre la isoforma monomérica y la dimérica de los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIII xCD3 individuales se denomina “brecha de potencia”. Esta brecha de potencia puede calcularse, por ejemplo, como una relación entre los valores de EC⁵⁰ de la forma monomérica y dimérica de la molécula; véase el ejemplo 1.8. Las brechas de potencia de los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 de la presente invención son preferiblemente < 5, más preferiblemente < 4, incluso más preferiblemente < 3, incluso más preferiblemente < 2, además preferiblemente < 1, y lo más preferible < 0,3.

El primero y/o el segundo (o cualquier otro) dominio o dominios de unión del constructo de anticuerpo de la invención son preferiblemente de especies cruzadas específicas para miembros del orden de primates de mamíferos. Los dominios de unión a CD3 específicos de especies cruzadas se describen, por ejemplo, en el documento WO 2008/119567. Según una realización, el primer y/o el segundo dominio de unión, además de unirse a EGFRVIII humano y CD3 humano, respectivamente, también se unirán a EGFRVIII/CD3 de primates, incluyendo (pero sin limitarse a) primates del nuevo mundo (tales como Callithrixjacchus, Saguinus Oedipus or Saimirí sciureus), primates del viejo mundo (tales como babuinos y macacos), gibones, orangutanes, y homínidos no humanos. Se prevé que el primer dominio de unión del constructo de anticuerpo de la invención que se une a EGFRVIII humano en la superficie de una célula diana también se une al menos a EGFRVIII de macaco, y/o el segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T también se une al menos a CD3 de macaco. Un macaco preferido es Macaca fascicularis. También está prvisto Macaca mulata (Rhesus).

En un aspecto de la invención, el primer dominio de unión se une a EGFRVIII humano y además se une a EGFRVIII de macaco, tal como EGFRVIII de Macaca fascicularis, y más preferiblemente, a EGFRVIII de macaco expresado en la superficie de las células de macaco. En SEQ ID NO: 234 se representa un EGFRVIII de Macaca fascicularis preferido. La afinidad del primer dominio de unión por EGFRVIII de macaco es preferiblemente <15 nM, más preferiblemente <10 nM, incluso más preferiblemente <5 nM, incluso más preferiblemente <1 nM, incluso más preferiblemente < 05 nM, incluso más preferiblemente <0,1 nM, y lo más preferible <0,05 nM, o incluso <0,01 nM.

Preferiblemente, la brecha de afinidad de los constructos de anticuerpos según la invención para la unión de EGFRVIII de macaco frente a EGFRVIII humano [ma EGFRVIII:hu EGFRVIII] (según se determina, por ejemplo, por BiaCore o por análisis de Scatchard) es <100, preferiblemente <20, más preferiblemente <15, más preferiblemente <10, incluso más preferiblemente <8, más preferiblemente <6, y lo más preferiblemente <2. Los intervalos preferidos para la brecha de afinidad de los constructos de anticuerpos según la invención para la unión de EGFRVIII de macaco frente a EGFRVIII humano están entre 0,1 y 20, más preferiblemente entre 0,2 y 10, incluso más preferiblemente entre 0,3 y 6, incluso más preferiblemente entre 0,5 y 3, o entre 0,5 y 2,5, y lo más preferible entre 0,5 y 2, o entre 0,6 y 2.

En una realización del constructo de anticuerpo de la invención, el segundo dominio de unión se une a CD3 épsilon humano y a CD3 Épsilon de Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus o Saimiri sciureus. Preferiblemente, el segundo dominio de unión se une a un epítopo extracelular de estas cadenas épsilon de CD3. También se prevé que el segundo dominio de unión se una a un epítopo extracelular de la cadena épsilon de CD3 humano y de Macaca. El epítopo más preferido de CD3 épsilon está comprendido dentro de los restos de aminoácidos 1 -27 del dominio extracelular de CD3 épsilon humano. Incluso más específicamente, el epítopo comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu. Callithrix jacchus and Saguinus oedipus son primates del nuevo mundo pertenecientes a la familia de Callitrichidae, mientras que Saimiri sciureus es un primate del nuevo mundo perteneciente a la familia de Cebidae.

Es particularmente preferido para el constructo de anticuerpo de la presente invención que el segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T comprenda una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas de:

(a) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 27 del documento WO 2008/119567, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 28 del documento WO 2008/119567, y CDR-L3 como se representa en SEQ ID n O: 29 del documento WO 2008/119567;

(b) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 117 del documento WO 2008/119567, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 118 del documento WO 2008/119567, y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 119 del documento WO 2008/119567; y

(c) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 153 del documento WO 2008/119567, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 154 del documento WO 2008/119567, y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 155 del documento WO 2008/119567.

En una realización alternativa preferida del constructo de anticuerpo de la presente invención, el segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:

(a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 12 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 13 del documento WO 2008/119567, y CDR-H3 como se representa en SEQ ID n O: 14 del documento WO 2008/119567;

(b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 30 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 31 del documento WO 2008/119567, y CDR-H3 como se representa en SEQ ID n O: 32 del documento WO 2008/119567;

(c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 48 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 49 del documento WO 2008/119567, y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 50 del documento WO 2008/119567;

(d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 66 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 67 del documento WO 2008/119567, y CDR-H3 como se representa en SEQ ID n O: 68 del documento WO 2008/119567;

(e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 84 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 85 del documento WO 2008/119567, y CDR-H3 como se representa en SEQ ID n O: 86 del documento WO 2008/119567;

(f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 102 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID n O: 103 del documento WO 2008/119567, y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 104 del documento WO 2008/119567;

(g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 120 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 121 del documento WO 2008/119567, y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 122 del documento WO 2008/119567;

(h) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 138 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 139 del documento WO 2008/119567, y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 140 del documento WO 2008/119567;

(i) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 156 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 157 del documento WO 2008/119567, y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 158 del documento WO 2008/119567; y

(j) CDR-H1 como se muestra en SEQ ID NO: 174 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 175 del documento WO 2008/119567, y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 176 del documento WO 2008/119567.

Se prefiere además para el constructo de anticuerpo de la presente invención que el segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T comprenda una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL como se representa en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 102 (véase también SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 o 165 del documento WO 2008/119567).

Alternativamente, se prefiere que el segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T comprenda una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH como se representa en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 101 (véase también SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 o 181 del documento WO 2008/119567).

Más preferiblemente, el constructo de anticuerpo de la presente invención se caracteriza por el segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T que comprende una región VL y una región VH seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 17 o 21 del documento WO 2008/119567, y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 15 o 19 del documento WO 2008/119567;

(b) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 35 o 39 del documento WO 2008/119567, y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 33 o 37 del documento WO 2008/119567;

(c) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 53 o 57 del documento WO 2008/119567, y una región VH como se representa en SEQ Id NO: 51 o 55 del documento WO 2008/119567;

(d) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 71 o 75 del documento WO 2008/119567, y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 69 o 73 del documento WO 2008/119567;

(e) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 89 o 93 del documento WO 2008/119567, y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 87 o 91 del documento WO 2008/119567;

(f) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 107 o 111 del documento WO 2008/119567, y una región Vh como se representa en SEQ ID NO: 105 o 109 del documento WO 2008/119567;

(g) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 125 o 129 del documento WO 2008/119567, y una región VH como se representa en s Eq ID NO: 123 o 127 del documento WO 2008/119567;

(h) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 143 o 147 del documento WO 2008/119567, y una región VH como se representa en s Eq ID NO: 141 o 145 del documento WO 2008/119567;

(i) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 161 o 165 del documento WO 2008/119567, y una región Vh como se representa en SEQ ID NO: 159 o 163 del documento WO 2008/119567; y

(j) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 179 o 183 del documento WO 2008/119567, y una región Vh como se representa en SEQ ID NO: 177 o 181 del documento WO 2008/119567.

También se prefiere en relación con el constructo de anticuerpo de la presente invención un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T que comprende una región VL como se representa en SEQ ID NO: 102 y una región VH como se representa en SEQ iD NO: 101.

Según una realización preferida del constructo de anticuerpo de la presente invención, los dominios de unión, y en particular el segundo dominio de unión (que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T), tienen el siguiente formato: los pares de regiones VH y regiones VL tienen el formato de un anticuerpo monocatenario (scFv). Las regiones VH y VL están dispuestas en el orden VH-VL o VL-VH. Se prefiere que la región VH esté ubicada en el N-terminal de una secuencia enlazadora, y la región VL esté ubicada en el C-terminal de la secuencia enlazadora.

Una realización preferida del constructo de anticuerpo de la presente invención descrito anteriormente se caracteriza por el segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO : 100 y SEQ ID NO: 103 (véanse también SEQ ID NOs: 23, 25, 41,43, 59, 61,77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187 de WO 2008/119567).

También se prevé que el constructo de anticuerpo de la invención tenga, además de su función de unirse a las moléculas diana EGFRVIII y CD3, una función adicional. En este formato, el constructo de anticuerpo es un constructo de anticuerpo trifuncional o multifuncional que se dirige a las células diana mediante la unión a EGFRVIII, mediando la actividad de las células T citotóxicas a través de la unión de CD3 y proporcionando una función adicional, tal como un dominio constante Fc completamente funcional que media la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mediante el reclutamiento de células efectoras tales como las células NK, un marcador (fluorescente, etc.), un agente terapéutico tal como una toxina o un radionúclido, y/o medios para mejorar la vida media en suero, etc.

Los ejemplos de medios para prolongar la vida media en suero de los constructos de anticuerpos de la invención incluyen péptidos, proteínas o dominios de proteínas, que están fusionados o unidos de otra manera a los constructos de anticuerpos. El grupo de péptidos, proteínas o dominios de proteínas incluye péptidos que se unen a otras proteínas con perfil farmacocinético preferido en el cuerpo humano, tal como la albúmina sérica (véase el documento WO 2009/127691). Un concepto alternativo de tales péptidos que prolongan la vida media incluye péptidos que se unen al receptor Fc neonatal (FcRn, véase el documento WO 2007/098420), que también se puede utilizar en los constructos de la presente invención. El concepto de unir dominios más grandes de proteínas o proteínas completas incluye, por ejemplo, la fusión de seroalbúmina humana, variantes o mutantes de seroalbúmina humana (véanse los documentos WO 2011/051489, WO 2012/059486, WO 2012/150319, WO 2013/135896, WO 2014/072481, WO 2013/075066) o dominios de los mismos, así como la fusión de la región constante de inmunoglobulinas (dominios Fc) y variantes de los mismos. Tales variantes de dominios Fc se pueden optimizar/modificar para permitir el apareamiento deseado de dímeros o multímeros, para abolir la unión al receptor Fc (por ejemplo, el receptor Fcg), o por otras razones. Un concepto adicional conocido en la técnica para extender la vida media de pequeños compuestos proteicos en el cuerpo humano es la pegilación de esos compuestos tales como el constructo de anticuerpo de la presente invención.

En una realización preferida, el constructo de anticuerpos de la invención se describe como sigue:

(a) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9; y

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:

19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103; y

• opcionalmente una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO 10;

(b) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9;

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:

19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103;

• opcionalmente un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9;

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs:

104-134; y

• opcionalmente una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO 10;

(c) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos QRFVTGHFGGLXiPANG (SEQ ID NO: 135), en la que Xi es Y o H; y

un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159;

un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9;

un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103;

un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO: 137) o QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO: 139); y

opcionalmente una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO 10;

(d) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N

un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID. NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 101;

un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8;

un polipéptido que tiene un aminoácido de SEQ ID NO: 158;

un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 140; y

n polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157;

un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8;

un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID. NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 102, y un resto de serina en el extremo C; un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 141;

e) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID. NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 101;

un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8;

un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158;

un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 142; y

un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157;

un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8;

un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID. NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 102, y un resto de serina en el extremo C; un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 143;

f) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9; y

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:

19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103; y

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 144; y

un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 145;

(g) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159; y

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 146; y

un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:

19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103; y

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 147;

(h) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159;

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 148; y

un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:

19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103; y

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 149; o

(i) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9; y

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:

19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103; y

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 150.

(j) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9; y

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:

19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1,2, 4, 5, 6, 8 y 9; y

• teniendo el tercer dominio una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs:

181-188.

Como se describió anteriormente, varios constructos de anticuerpos preferidos de la invención se modifican mediante fusión con otro resto, tal como albúmina o variantes de albúmina. Si estos constructos de fusión se caracterizan por sus propiedades, en particular su afinidad por la diana o actividad citotóxica, la persona experta sabrá que se puede esperar que constructos de fusión similares o constructos de anticuerpos biespecíficos no modificados tengan propiedades similares (o incluso mejores). Por ejemplo, si un constructo de anticuerpo biespecífico fusionado con albúmina tiene una actividad citotóxica o afinidad por la diana apreciable o deseable, se puede esperar que se observará la misma/similar o incluso una mayor actividad citotóxica/afinidad por la diana por el constructo sin albúmina.

Según otra realización preferida, el constructo de anticuerpo biespecífico de la invención comprende (además de los dos dominios de unión) un tercer dominio que comprende dos monómeros polipeptídicos, comprendiendo cada uno una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, en el que dichos dos polipéptidos (o monómeros polipeptídicos) se fusionan entre sí mediante un enlazador peptídico. Preferiblemente, dicho tercer dominio comprende, en un orden N­ a C-terminal: bisagra-CH2-CH3-enlazador-bisagra-CH2-CH3. Las secuencias de aminoácidos preferidas para dicho tercer dominio se representan en las SEQ ID NOs: 181-188. Cada uno de estos dos monómeros polipeptídicos tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 173-180, o que es al menos 90% idéntica a esas secuencias. En otra realización preferida, el primer y segundo dominios de unión del constructo de anticuerpo biespecífico de la invención se fusionan con el tercer dominio mediante un enlazador peptídico que se selecciona, por ejemplo, del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9.

Según la presente invención, una “bisagra” es una región de bisagra de IgG. Esta región se puede identificar por analogía usando la numeración de Kabat; véanse las posiciones 223-243 de Kabat. Según lo anterior, el requisito mínimo para una “bisagra” son los restos de aminoácidos correspondientes al tramo de secuencia de IgG1 de D231 a P243 según la numeración de Kabat. Los términos CH2 y CH3 se refieren a las regiones constantes 2 y 3 de la cadena pesada de inmunoglobulina. Estas regiones también pueden identificarse por analogía usando la numeración de Kabat; véanse las posiciones de Kabat 244-360 para CH2 y las posiciones de Kabat 361-478 para CH3. Se entiende que existe alguna variación entre las inmunoglobulinas en términos de su región Fc de IgG1, región Fc de IgG2, región Fc de IgG3, región Fc de IgG4, región Fc de IgM, región Fc de IgA, región Fc de IgD y región Fc de IgE (véase, por ejemplo, Padlan, Molecular Immunology, 31(3), 169-217 (1993)). El término monómero de Fc se refiere a las dos últimas regiones constantes de cadena pesada de IgA, IgD e IgG, y las últimas tres regiones constantes de cadena pesada de IgE e IgM. El monómero de Fc también puede incluir la bisagra N-terminal flexible para estos dominios. Para IgA e IgM, el monómero de Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, la porción Fc comprende los dominios de inmunoglobulina CH2 y CH3 y la bisagra entre los dos primeros dominios y CH2. Aunque los límites de la porción Fc de una inmunoglobulina pueden variar, se puede definir un ejemplo de una porción Fc de cadena pesada de IgG humana que comprende una bisagra funcional, dominio CH2 y CH3, por ejemplo, para comprender los restos D231 (del dominio bisagra) a P476 (del extremo C-terminal del dominio CH3), o D231 a L476, respectivamente, para IgG4, en el que la numeración es según Kabat.

Por tanto, el constructo de anticuerpo de la invención puede comprender, en un orden N- a C-terminal:

(a) el primer dominio de unión;

(b) un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9;

(c) el segundo dominio de unión;

(d) un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1,2, 4, 5, 6, 8 y 9;

(e) el primer monómero polipeptídico del tercer dominio (que comprende una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3);

(f) un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 192, 193, 194, y 195; y

(g) el segundo monómero polipeptídico del tercer dominio (que comprende una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3).

También se prefiere que el constructo de anticuerpo de la invención comprenda, en un orden N- a C-terminal:

• el primer dominio de unión que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 159;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9;

• el segundo dominio de unión que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64 , SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103 (véanse también las SEQ ID NOs: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187 del documento WO 2008/119567);

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 6, 8 y 9; y

• el tercer dominio que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs:

181-188.

Por tanto, en una realización preferida, el constructo de anticuerpo de la presente invención comprende o consiste en un polipéptido representado en SEQ ID NO: 189 o 190.

En una realización del constructo de anticuerpo de la invención, el constructo de anticuerpo comprende o consiste en un polipéptido como se representa en SEQ ID NO: 160.

Las modificaciones covalentes de los constructos de anticuerpos también se incluyen dentro del alcance de esta invención, y generalmente, pero no siempre, se realizan de manera post-traduccional. Por ejemplo, varios tipos de modificaciones covalentes del constructo de anticuerpo se introducen en la molécula haciendo reaccionar restos de aminoácidos específicos del constructo de anticuerpo con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los restos N- o C-terminales.

Los restos de cisteinilo se hacen reaccionar más comúnmente con a-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los restos de cisteinilo también se derivatizan por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-b-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metilo y 2-piridilo, pcloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los restos de histidilo se derivatizan por reacción con pirocarbonato de dietilo a pH 5,5-7,0 debido a que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. También es útil el bromuro de parabromofenacilo; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0. Los restos de lisinilo y amino terminales se hacen reaccionar con anhídridos succínicos u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los restos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar restos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y reacción catalizada por transaminasas con glioxilato.

Los restos de arginilo se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivatización de los restos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como con el grupo épsilon-amino de la arginina.

La modificación específica de restos de tirosilo puede realizarse, con particular interés introduciendo marcadores espectrales en restos de tirosilo mediante reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Más comúnmente, N-acetilimidizol y tetranitrometano se utilizan para formar especies de O-acetil tirosilo y 3-nitroderivados, respectivamente. Los restos de tirosilo se yodan usando 125I o 131I para preparar proteínas marcadas para uso en radioinmunoensayo, siendo adecuado el método de cloramina T descrito anteriormente.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente por reacción con carbodiimidas (R’-N=C=N--R’), en las que R y R’ son grupos alquilo opcionalmente diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los restos de aspartilo y glutamilo se convierten en restos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones de amonio.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular los constructos de anticuerpos de la presente invención a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para uso en una variedad de métodos. Los agentes reticulantes comúnmente utilizados incluyen, por ejemplo, 1, 1 -bis (diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3’-ditiobis(propionato de succinimidilo), y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes derivatizantes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato producen intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en presencia de luz. Alternativamente, las matrices reactivas insolubles en agua, tales como los hidratos de carbono activados con bromuro de cianógeno, y los sustratos reactivos como se describen en las patentes U.S. nos 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440 se emplean para la inmovilización de proteínas.

Los restos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan frecuentemente a los correspondientes restos de glutamilo y aspartilo, respectivamente. Como alternativa, estos restos se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquiera de las formas de estos restos cae dentro del alcance de esta invención.

Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de restos de serilo o treonilo, metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, p. 79-86), acetilación de la amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente de los constructos de anticuerpos incluida dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación de la proteína. Como se conoce en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender tanto de la secuencia de la proteína (por ejemplo, la presencia o ausencia de restos de aminoácidos de glicosilación particulares, discutidos a continuación), como de la célula u organismo hospedante en el que se produce la proteína. Los sistemas de expresión particulares se analizan a continuación.

La glicosilación de polipéptidos está típicamente ligada a N u O. Ligada a N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. De este modo, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al constructo de anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación ligados a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más restos de serina o treonina a la secuencia de partida (para los sitios de glicosilación ligados a O). Para mayor facilidad, la secuencia de aminoácidos de un constructo de anticuerpo se altera preferiblemente a través de cambios a nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido en bases preseleccionadas de modo que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio de aumentar el número de restos de hidratos de carbono en el constructo de anticuerpo es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos por cuanto no requieren la producción de la proteína en una célula hospedante que tenga capacidades de glicosilación para la glicosilación ligada a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el o los azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) restos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330, y en Aplin y Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., p. 259-306.

La eliminación de los restos de hidratos de carbono presentes en el constructo de anticuerpo de partida se puede realizar química o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría o de todos los azúcares excepto el azúcar enlazante (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja intacto el polipéptido. La desglicosilación química se describe por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. La escisión enzimática de restos de hidratos de carbono en polipéptidos se puede lograr mediante el uso de una variedad de endo- y exoglicosidasas, como se describe por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. La glicosilación en sitios potenciales de glicosilación puede prevenirse mediante el uso del compuesto tunicamicina, como se describe por Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. La tunicamicina bloquea la formación de enlaces proteína-N-glicósido.

También se contemplan aquí otras modificaciones del constructo de anticuerpo. Por ejemplo, otro tipo de modificación covalente del constructo de anticuerpo comprende unir el constructo de anticuerpo a diversos polímeros no proteicos, que incluyen, pero no se limitan a, diversos polioles tales como polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos, o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, de la manera expuesta en las patentes U.S. nos 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. Además, como se conoce en la técnica, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos en diversas posiciones dentro del constructo de anticuerpo, por ejemplo, para facilitar la adición de polímeros tal como PEG.

En algunas realizaciones, la modificación covalente de los constructos de anticuerpos de la invención comprende la adición de uno o más marcadores. El grupo marcador se puede acoplar al constructo de anticuerpo vía brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir posibles impedimentos estéricos. En la técnica se conocen diversos métodos para marcar proteínas, y se pueden usar para llevar a cabo la presente invención. El término “marcador” o “grupo marcador” se refiere a cualquier marcador detectable. En general, los marcadores se clasifican en una variedad de clases, según el ensayo en el que se van a detectar - los siguientes ejemplos incluyen, pero no se limitan a:

a) marcadores isotópicos, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados, tales como radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)

b) marcadores magnéticos (por ejemplo, partículas magnéticas)

c) restos activos redox

d) colorantes ópticos (incluyendo, pero sin limitarse a, cromóforos, fósforos y fluoróforos) tales como grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), grupos quimioluminiscentes, y fluoróforos que pueden ser fluoróforos de tipo “pequeña molécula” o fluoróforos proteicos

e) grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina)

f) grupos biotinilados

g) epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un informador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas epitópicas, etc.).

Por “marcador fluorescente” se entiende cualquier molécula que pueda detectarse vía sus propiedades fluorescentes inherentes. Los marcadores fluorescentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilcumarinas, pireno, verde de Malaquita, estilbeno, Amarillo Lucifer, Cascade BlueJ, Rojo Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, verde Oregón, los tintes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, Rodamina y Rojo Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Los colorantes ópticos adecuados, incluyendo los fluoróforos, se describen en Molecular Probes Handbook por Richard P. Haugland.

Los marcadores fluorescentes proteicos adecuados también incluyen, pero no se limitan a, proteína fluorescente verde, que incluye una especie Renilla, Ptilosarcus o Aequorea de GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Número de Acceso Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferasa (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), p-galactosidasa (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) y Renilla (documentos WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, patentes U.S. nos 5.292.658; 5.418.155; 5.683.888; 5.741.668; 5.777.079; 5.804.387; 5.874.304; 5.876.995; 5.925.558).

Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas de unión al ADN (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), y desde entonces se han encontrado en una variedad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas se encuentran péptidos de origen natural y derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan. Ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles se describen en la solicitud PCT WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada de la proteína D de tensioactivo de pulmón (SPD) descrita en Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a la misma se describe en Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. En un enfoque, las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento de anticuerpo anti-EGFRVIII o derivado fusionado a un péptido de cremallera de leucina se expresan en células hospedantes adecuadas, y los fragmentos de anticuerpo anti-EGFRVIII oligomérico soluble o derivados que se forman se recuperan del sobrenadante del cultivo.

El constructo de anticuerpo de la invención también puede comprender dominios adicionales, que son por ejemplo, útiles en el aislamiento de la molécula o se refieren a un perfil farmacocinético adaptado de la molécula. Los dominios útiles para el aislamiento de un constructo de anticuerpo se pueden seleccionar de motivos peptídicos o restos introducidos de forma secundaria, que se pueden capturar en un método de aislamiento, por ejemplo, una columna de aislamiento. Las realizaciones no limitantes de dichos dominios adicionales comprenden motivos peptídicos conocidos como la etiqueta Myc, la etiqueta HAT, la etiqueta HA, la etiqueta TAP, la etiqueta GST, el dominio de unión a quitina (la etiqueta CBD), la proteína de unión a maltosa (la etiqueta MBP), la etiqueta Flag, la etiqueta Strep y variantes de la misma (por ejemplo, etiqueta StrepII), y la etiqueta His. Se prefiere que todos los constructos de anticuerpos descritos aquí caracterizados por las CDR identificadas comprendan un dominio de etiqueta His, que generalmente se conoce como una repetición de restos de His consecutivos en la secuencia de aminoácidos de una molécula, preferiblemente de cinco, y más preferiblemente de seis restos de His (hexa-histidina). La etiqueta His puede ubicarse, por ejemplo, en el extremo N- o C-terminal del constructo de anticuerpo, preferiblemente está ubicada en el extremo C-terminal. Lo más preferible, una etiqueta de hexahistidina (HHHHHH, véase SEQ ID NO: 10) se une mediante un enlace peptídico al extremo C-terminal del constructo de anticuerpo según la invención.

El primer dominio de unión del constructo de anticuerpo de la presente invención se une al EGFRVIII humano en la superficie de una célula diana. La secuencia de aminoácidos preferida de EGFRVIII humano está representada por NOs: 231, 232 y 233. Por tanto, el primer dominio de unión según la invención se une preferiblemente a EGFRVIII cuando se expresa mediante células o líneas celulares de expresión natural, y/o mediante células o líneas celulares transformadas o transfectadas (estable/transitoriamente) con EGFRVIII. En una realización preferida, el primer dominio de unión también se une a EGFRVIII cuando se usa EGFRVIII como molécula “diana” o “ligando” en un ensayo de unión in vitro, tal como de BIAcore o de Scatchard. La “célula diana” puede ser cualquier célula procariota o eucariota que exprese EGFRVIII en su superficie; preferiblemente, la célula diana es una célula que es parte del cuerpo humano o animal, tal como una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer de páncreas, una célula de mesotelioma, una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer gástrico, y una célula de cáncer de mama triple negativo.

La afinidad del primer dominio de unión por EGFRVIII humano es preferiblemente <20 nM, más preferiblemente <10 nM, incluso más preferiblemente <5 nM, incluso más preferiblemente <2 nM, incluso más preferiblemente <1 nM, incluso más preferiblemente <06 nM, incluso más preferiblemente <05 nM, y lo más preferible <04 nM. La afinidad puede medirse, por ejemplo, en un ensayo BIAcore o en un ensayo de Scatchard, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos. Otros métodos para determinar la afinidad también son bien conocidos por los expertos; véanse, por ejemplo, los Ejemplos adjuntos.

También se contemplan modificaciones en la secuencia de aminoácidos de los constructos de anticuerpos descritos aquí. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del constructo de anticuerpo. Las variantes de las secuencias de aminoácidos de los constructos de anticuerpos se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico de los constructos de anticuerpos, o mediante síntesis de péptidos. Todas las modificaciones de las secuencias de aminoácidos descritas a continuación deberían dar como resultado un constructo de anticuerpo que aún retiene la actividad biológica deseada (unión a EGFRVIII y a CD3) de la molécula parental no modificada.

El término “aminoácido” o “resto de aminoácido” se refiere típicamente a un aminoácido que tiene su definición reconocida en la técnica, tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: alanina (Ala o A); arginina (Arg o R); asparagina (Asn o N); ácido aspártico (Asp o D); cisteína (Cys o C); glutamina (Gln o Q); ácido glutámico (Glu o E); glicina (Gly o G); histidina (His o H); isoleucina (He o I): leucina (Leu o L); lisina (Lys o K); metionina (Met o M); fenilalanina (Phe o F); prolina (Pro o P); serina (Ser o S); treonina (Thr o T); triptófano (Trp o W); tirosina (Tyr o Y); y valina (Val o V), aunque se pueden usar aminoácidos modificados, sintéticos o raros según se desee. Generalmente, los aminoácidos se pueden agrupar por tener una cadena lateral apolar (por ejemplo, Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); una cadena lateral cargada negativamente (por ejemplo, Asp, Glu); una cadena lateral cargada positivamente (por ejemplo, Arg, His, Lys); o una cadena lateral polar sin carga (por ejemplo, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp y Tyr).

Las modificaciones de aminoácidos incluyen, por ejemplo, supresiones y/o inserciones y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoácidos de los constructos de anticuerpos. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución se realiza para llegar al constructo final, siempre que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-traduccionales de los constructos de anticuerpos, tal como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación.

Por ejemplo, se pueden insertar o eliminar 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos en cada una de las CDR (por supuesto, dependiendo de su longitud), mientras que se pueden insertar o suprimir 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 25 aminoácidos en cada una de las FR. Preferiblemente, las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que oscilan en longitud desde 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 restos a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones de un solo resto de aminoácidos o de múltiples restos de aminoácidos dentro de la secuencia. Una variante de inserción del constructo de anticuerpo de la invención incluye la fusión al N-terminal o al C-terminal del constructo de anticuerpo de una enzima, o la fusión a un polipéptido que aumenta la vida media en suero del constructo de anticuerpo.

Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las CDR de la cadena pesada y/o ligera, en particular las regiones hipervariables, pero también se contemplan las alteraciones de FR en la cadena pesada y/o ligera. Las sustituciones son preferiblemente sustituciones conservativas como se describe aquí. Preferiblemente, se pueden sustituir 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aminoácidos en una CDR, mientras que se pueden sustituir 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 25 aminoácidos en las regiones estructurales (FR), dependiendo de la longitud de la CDR o FR. Por ejemplo, si una secuencia de CDR comprende 6 aminoácidos, se prevé que se sustituyan uno, dos o tres de estos aminoácidos. De manera similar, si una secuencia de CDR comprende 15 aminoácidos, se prevé que se sustituyan uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de estos aminoácidos.

Un método útil para la identificación de ciertos restos o regiones de los constructos de anticuerpos que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se denomina “mutagénesis de barrido de alanina” como se describe por Cunningham y Wells en Science, 244: 1081 -1085 (1989). Aquí, un resto o grupo de restos diana dentro del constructo de anticuerpo se identifica o identifican (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el epítopo.

Aquellas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan entonces introduciendo variantes adicionales u otras en, o para, los sitios de sustitución. De este modo, mientras que el sitio o región para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar u optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se puede realizar un barrido de alanina o mutagénesis aleatoria en un codón o región diana, y las variantes de constructo de anticuerpo expresadas se criban para la combinación óptima de actividad deseada. Las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados del ADN que tienen una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, mutagénesis del cebador M13 y mutagénesis por PCR. El cribado de los mutantes se realiza utilizando ensayos de actividades de unión a antígenos, tal como la unión a EGFRVIII o a CD3.

Generalmente, si los aminoácidos están sustituidos en una o más o en todas las CDR de la cadena pesada y/o ligera, se prefiere que la secuencia “sustituida” obtenida en ese momento sea al menos 60% o 65%, más preferiblemente 70% o 75%, incluso más preferiblemente 80% u 85%, y particularmente de forma preferible 90% o 95% idéntica a la secuencia de CDR “original”. Esto significa que depende de la longitud de la CDR hasta qué punto es idéntica a la secuencia “sustituida”. Por ejemplo, una CDR que tiene 5 aminoácidos es preferiblemente 80% idéntica a su secuencia sustituida para tener al menos un aminoácido sustituido. Por consiguiente, las CDR del constructo de anticuerpo pueden tener diferentes grados de identidad con sus secuencias sustituidas, por ejemplo, CDRL1 puede tener 80%, mientras que CDRL3 puede tener 90%.

Las sustituciones (o reemplazos) preferidas son sustituciones conservativas. Sin embargo, se prevé cualquier sustitución (incluyendo la sustitución no conservativa o una o más de las “sustituciones ejemplares” enumeradas en la Tabla 1, a continuación) siempre que el constructo de anticuerpo conserve su capacidad para unirse a EGFRVIII a través del primer dominio de unión y a CD3 o a CD3 épsilon a través del segundo dominio de unión, y/o sus CDR tengan una identidad con la secuencia sustituida entonces (al menos 60% o 65%, más preferiblemente 70% o 75%, incluso más preferiblemente 80% u 85%, y particularmente de forma preferible 90% o 95% idéntica a la secuencia de CDR “original”).

Las sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1 bajo el encabeza de “sustituciones preferidas”. Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse cambios más sustanciales, denominados “sustituciones ejemplares” en la Tabla 1, o como se describe más adelante en referencia a las clases de aminoácidos, y los productos pueden seleccionarse para una característica deseada.

Tabla 1: Sustituciones de aminoácidos

Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del constructo de anticuerpo de la presente invención se logran seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una hoja o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilo neutro: cys, ser, thr; (3) ácido: asp, glu; (4) básico: asn, gln, his, lys, arg; (5) restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Cualquier resto de cisteína que no esté implicado en el mantenimiento de la conformación adecuada del constructo de anticuerpo puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación aberrante. Por el contrario, se pueden añadir enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (en particular cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).

Para las secuencias de aminoácidos, la identidad y/o similitud de secuencia se determina utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, el algoritmo de identidad de secuencia local de Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, el algoritmo de alineación de identidad de secuencia de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BeSt FIT, FAs Ta , y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), el programa de secuencia Best Fit descrito por Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395, preferiblemente utilizando la configuración predeterminada, o mediante inspección. Preferiblemente, el porcentaje de identidad se calcula mediante FastDB basándose en los siguientes parámetros: penalización por emparejamiento erróneo de 1; penalización por espacio de 1; penalización por tamaño de espacio de 0,33; y penalización por unión de 30 “Current Methods in Sequence Comparison and Analysis” Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, p. 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

Un ejemplo de algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones progresivas por pares. También puede trazar un árbol que muestre las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35: 351 -360; el método es similar al descrito por Higgins y Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153. Parámetros útiles de PILEUP que incluyen un peso de espacio por defecto de 3,00, un peso de longitud de espacio por defecto de 0,10, y espacios finales ponderados.

Otro ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito en: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; y Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787. Un programa BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST-2 que se obtuvo de Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. WU-BLAST-2 utiliza varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se ajustan a los valores por defecto. Los parámetros ajustables se establecen con los siguientes valores: intervalo de superposición = 1, fracción de superposición = 0,125, umbral de palabra (T) = II. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos, y son establecidos por el propio programa dependiendo de la composición de la secuencia particular y la composición de la base de datos particular contra la cual se busca la secuencia de interés; sin embargo, los valores pueden ajustarse para aumentar la sensibilidad.

Un algoritmo útil adicional es BLAST con espacios según se da a conocer por Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res.

25:3389-3402. BLAST con espacios utiliza puntuaciones de sustitución BLOSUM-62; parámetro de umbral T se ajusta a 9; el método de dos aciertos para activar extensiones sin espacios, cobra longitudes de espacio de k un coste de 10+k; Xu se establece en 16, y Xg en 40 para la etapa de búsqueda de la base de datos, y en 67 para la etapa de salida de los algoritmos. Las alineaciones con espacios se activan mediante una puntuación correspondiente a alrededor de 22 bits.

Generalmente, la homología, similitud o identidad de aminoácidos entre CDR variantes individuales son al menos el 60% de las secuencias representadas aquí, y más típicamente con homologías o identidades preferiblemente crecientes de al menos 65% o 70%, más preferiblemente al menos 75% u 80%, incluso más preferiblemente al menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y casi 100%. De manera similar, el “porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico” con respecto a la secuencia de ácido nucleico de las proteínas de unión identificadas aquí se define como el porcentaje de restos de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de nucleótidos en la secuencia codificante del constructo de anticuerpo. Un método específico utiliza el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 ajustado a los parámetros por defecto, con el intervalo de superposición y la fracción de superposición ajustados a 1 y 0,125, respectivamente.

Generalmente, la homología, similitud o identidad de la secuencia de ácido nucleico entre las secuencias nucleotídicas que codifican CDR variantes individuales y las secuencias nucleotídicas representadas aquí son al menos 60%, y más típicamente con homologías o identidades preferiblemente crecientes de al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, y casi 100%. De este modo, una “CDR variante” es aquella con la homología, similitud o identidad especificadas con la CDR original de la invención, y comparte la función biológica, que incluye, pero no se limita a, al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la especificidad y/o actividad de la CDR parental.

En una realización, el porcentaje de identidad con la línea germinal humana de los constructos de anticuerpos según la invención es > 70% o > 75%, más preferiblemente > 80% o > 85%, incluso más preferiblemente > 90%, y lo más preferible > 91%, > 92%, > 93%, > 94%, > 95% o incluso > 96%. Se cree que la identidad con los productos génicos de la línea germinal de anticuerpos humanos es una característica importante para reducir el riesgo de que las proteínas terapéuticas provoquen una respuesta inmunitaria contra el fármaco en el paciente durante el tratamiento. Hwang y Foote (“Immunogenicity of engineered antibodies”; Methods 36 (2005) 3-10) demuestran que la reducción de porciones no humanas de constructos de anticuerpos farmacológicos conduce a una disminución del riesgo de inducir anticuerpos antifármacos en los pacientes durante el tratamiento. Al comparar un número exhaustivo de fármacos de anticuerpos evaluados clínicamente y los datos de inmunogenicidad respectivos, se muestra la tendencia de que la humanización de las regiones V de los anticuerpos hace que la proteína sea menos inmunogénica (promedio 5,1% de los pacientes) que los anticuerpos que portan regiones V no humanas inalteradas (promedio 23,59% de los pacientes). Por tanto, es deseable un mayor grado de identidad con las secuencias humanas para las sustancias terapéuticas proteicas basadas en la región V en forma de constructos de anticuerpos. Para este fin de determinar la identidad de la línea germinal, las regiones V de VL pueden alinearse con las secuencias de aminoácidos de los segmentos V y J de la línea germinal humana (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) usando el software Vector NTI, y la secuencia de aminoácidos se calculó dividiendo los restos de aminoácidos idénticos entre el número total de restos de aminoácidos de la VL en porcentaje. Lo mismo puede ocurrir para los segmentos VH (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/), con la excepción de que puede excluirse la CDR3 de VH debido a su alta diversidad y la falta de parejas de alineación de CDR3 de VH de línea germinal humana existentes. Entonces, se pueden usar técnicas recombinantes para aumentar la identidad de secuencia con genes de línea germinal de anticuerpos humanos.

En una realización adicional, los constructos de anticuerpos biespecíficos de la presente invención exhiben altos rendimientos de monómeros en condiciones de escala de investigación estándar, por ejemplo, en un procedimiento de purificación estándar de dos etapas. Preferiblemente, el rendimiento de monómero de los constructos de anticuerpos según la invención es > 0,25 mg/l de sobrenadante, más preferiblemente > 0,5 mg/l, incluso más preferiblemente > 1 mg/l, y lo más preferible > 3 mg/l de sobrenadante.

Asimismo, se puede determinar el rendimiento de las isoformas de los constructos de anticuerpos diméricos y, por tanto, el porcentaje de monómeros (es decir, monómero: (monómero dímero)) de los constructos de anticuerpos. La productividad de los constructos de anticuerpos monoméricos y diméricos y el porcentaje de monómero calculado pueden, por ejemplo, obtenerse en la etapa de purificación SEC del sobrenadante de cultivo a partir de la producción estandarizada a escala de investigación en botellas giratorias. En una realización, el porcentaje de monómero de los constructos de anticuerpos es > 80%, más preferiblemente > 85%, incluso más preferiblemente > 90%, y lo más preferible > 95%.

En una realización, los constructos de anticuerpos tienen una estabilidad plasmática preferida (relación de EC50 con plasma a EC50 sin plasma) de < 5 o < 4, más preferiblemente < 3,5 o < 3, incluso más preferiblemente < 2,5 o < 2, y lo más preferible < 1,5 o < 1. La estabilidad en plasma de un constructo de anticuerpo se puede evaluar mediante la incubación del constructo en plasma humano a 37°C durante 24 horas, seguido de la determinación de la EC50 en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51. Las células efectoras en el ensayo de citotoxicidad pueden estimularse con células T positivas para CD8 humanas enriquecidas. Las células diana pueden ser, por ejemplo, células CHO transfectadas con EGFRVIII humano. La relación de célula efectora a célula diana (E:T) se puede escoger como 10:1. El conjunto de plasma humano utilizado para este fin deriva de la sangre de donantes sanos recolectada con jeringas recubiertas con EDTA. Los componentes celulares se eliminan mediante centrifugación, y la fase plasmática superior se recoge y posteriormente se agrupa. Como control, los constructos de anticuerpos se diluyen inmediatamente antes del ensayo de citotoxicidad en medio RPMI-1640. La estabilidad del plasma se calcula como la relación de EC50 (después de la incubación del plasma) a EC50 (control). Veáse el Ejemplo 7.

Además, se prefiere que la conversión de monómero a dímero de los constructos de anticuerpos de la invención sea baja. La conversión se puede medir en diferentes condiciones y analizar mediante cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento. Véase el Ejemplo 5. Por ejemplo, la incubación de las isoformas monoméricas de los constructos de anticuerpos se puede llevar a cabo durante 7 días a 37°C y concentraciones de 250 mg/ml en una incubadora. En estas condiciones, se prefiere que los constructos de anticuerpos de la invención muestren un porcentaje de dímero que sea <2,5%, más preferiblemente <2%, más preferiblemente <1,5%, más preferiblemente <1%, más preferiblemente <0,5%, y lo más preferible <0,25%. Mientras que el constructo de anticuerpo biespecífico basado en EvMI-2 muestra una tasa de conversión de dímero de 1,56%, el constructo de anticuerpo biespecífico basado en EvIM-1 de la invención muestra una tasa de conversión en el límite superior del límite más preferido para esta característica.

También se prefiere que los constructos de anticuerpos biespecíficos de la presente invención presenten una conversión de dímero muy baja después de varios ciclos de congelación/descongelación. Por ejemplo, el monómero del constructo de anticuerpo se ajusta a una concentración de 250 mg/ml, por ejemplo, en amortiguador de formulación genérico, y se somete a tres ciclos de congelación/descongelación (congelación a -80°C durante 30 min, seguido de descongelación durante 30 min a temperatura ambiente), seguido de SEC de alto rendimiento para determinar el porcentaje de constructo de anticuerpo inicialmente monomérico, que se ha convertido en un constructo de anticuerpo dimérico. Preferiblemente, los porcentajes de dímeros de los constructos de anticuerpos biespecíficos son <2,5%, más preferiblemente <2%, más preferido £1,5%, incluso preferiblemente <1%, y lo más preferible <0,5%, por ejemplo, después de tres ciclos de congelación/descongelación. Si bien el constructo de anticuerpo biespecífico basado en EvIII-2 no cumple el intervalo preferido (2,53% de dímero), el constructo de anticuerpo biespecífico basado en EvIII-1 de la invención muestra una tasa de conversión en el límite superior del límite más preferido para esta característica (0,59 % de dímero).

Los constructos de anticuerpos biespecíficos de la presente invención muestran preferiblemente una termoestabilidad favorable, con temperaturas de agregación de >45°C o >50°C, más preferiblemente >51°C, >52°C, >53°C o >54°C, incluso más preferiblemente >56°C o >57°C, y lo más preferible >58°C o >59°C. El parámetro de termoestabilidad se puede determinar en términos de temperatura de agregación del anticuerpo de la siguiente manera: La disolución de anticuerpo a una concentración de 250 mg/ml se transfiere a una cubeta de un solo uso y se coloca en un dispositivo de dispersión dinámica de luz (DLS). La muestra se calienta de 40°C a 70°C a una velocidad de calentamiento de 0,5°C/min con adquisición constante del radio medido. El aumento del radio que indica la fusión de la proteína y la agregación se usa para calcular la temperatura de agregación del anticuerpo. Véase el Ejemplo 6.

Alternativamente, las curvas de temperatura de fusión se pueden determinar mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar las estabilidades biofísicas intrínsecas de las proteínas de los constructos de anticuerpos. Estos experimentos se realizan usando un dispositivo VP-DSC MicroCal LLC (Northampton, MA, U.S.A). La absorción de energía de una muestra que contiene un constructo de anticuerpo se registra desde 20°C hasta 90°C en comparación con una muestra que contiene solo el amortiguador de formulación. Los constructos de anticuerpos se ajustan a una concentración final de 250 mg/ml, por ejemplo, en el amortiguador de procesamiento de SEC. Para el registro de la curva de fusión respectiva, la temperatura total de la muestra se incrementa gradualmente. A cada temperatura T se registra la absorción de energía de la muestra y la referencia del amortiguador de formulación. La diferencia en la absorción de energía Cp (kcal/mol/°C) de la muestra menos la referencia se representa frente a la temperatura respectiva. La temperatura de fusión se define como la temperatura en el primer máximo de absorción de energía.

También se prevé que los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVINxCD3 de la invención tengan una turbidez (medida por OD340 después de la concentración del constructo de anticuerpo monomérico purificado a 2,5 mg/ml e incubación durante la noche) de < 0,2, preferiblemente de < 0,15, más preferiblemente de < 0,12, incluso más preferiblemente de < 0,1, o incluso >0,09, y lo más preferible de < 0,08 o >0,07. Véase el Ejemplo 7. Si bien el constructo de anticuerpo biespecífico Evlll-2 muestra una turbidez bastante alta (según se mide mediante OD340 después de la concentración del constructo de anticuerpo monomérico purificado hasta 2,5 mg/ml y una incubación durante la noche) de casi 3, solo el constructo de anticuerpo biespecífico basado en Evlll-1 está claramente dentro del espectro deseado para compuestos proteicos factibles para formulación farmacéutica; véase la Tabla 3 en el Ejemplo 7.

En una realización adicional, el constructo de anticuerpo según la invención es estable a pH ácido. Cuanto más tolerante se comporte el constructo de anticuerpo a un pH no fisiológico, tal como pH 5,5 (un pH que se requiere para realizar, por ejemplo, una cromatografía de intercambio catiónico), mayor será la recuperación del constructo de anticuerpo eluido de una columna de intercambio iónico con respecto a la cantidad total de proteína cargada. La recuperación del constructo de anticuerpo a partir de una columna de intercambio iónico (por ejemplo, catiónica) a pH 5,5 es preferiblemente > 30%, más preferiblemente > 40%, más preferiblemente > 50%, incluso más preferiblemente > 60%, incluso más preferiblemente > 70%, incluso más preferiblemente > 80%, incluso más preferiblemente > 90%, incluso más preferiblemente > 95%, y lo más preferible > 99%.

Además, se prevé que los constructos de anticuerpos biespecíficos de la presente invención exhiban eficacia terapéutica o actividad antitumoral. Esto puede ser evaluado, por ejemplo, en un estudio como se describe en el siguiente ejemplo de un modelo de xenoinjerto de tumor humano en estadio avanzado:

El día 1 del estudio, se inyectan por vía subcutánea 5x106 células de una línea celular de cáncer humana positiva para EGFRVIII (por ejemplo, línea celular de glioblastoma humano U87 o DK-MG) en el flanco dorsal derecho de ratones hembra NOD/SClD. Cuando el volumen tumoral medio alcanza alrededor de 100 mm3, se trasplantan células T positivas para CD3 humanas expandidas in vitro a los ratones mediante la inyección de alrededor de 2x107 células en la cavidad peritoneal de los animales. Los ratones del grupo 1 de control de vehículo no reciben células efectoras, y se utilizan como control no trasplantado para la comparación con el grupo 2 de control de vehículo (que recibe células efectoras) para monitorizar el impacto de las células T solas sobre el crecimiento tumoral. El tratamiento con anticuerpos comienza cuando el volumen medio del tumor alcanza alrededor de 200 mm3. El tamaño medio del tumor de cada grupo de tratamiento el día de inicio del tratamiento no debe ser estadísticamente diferente de cualquier otro grupo (análisis de varianza). Los ratones se tratan con 0,5 mg/kg/día de un constructo de anticuerpo biespecífico EGFRVIIIxCD3 mediante inyección de bolo intravenoso durante alrededor de 15 a 20 días. Los tumores se miden con un calibre durante el estudio, y se evalúa el progreso mediante la comparación entre grupos de los volúmenes tumorales (TV). La inhibición del crecimiento tumoral T/C [%] se determina calculando TV como T/C% = 100 x (TV mediana del grupo analizado)/(TV mediana del grupo 2 de control).

El experto sabe cómo modificar o adaptar ciertos parámetros de este estudio, tal como el número de células tumorales inyectadas, el lugar de la inyección, el número de células T humanas trasplantadas, la cantidad de constructos de anticuerpos biespecíficos que se administrarán, y los plazos, sin dejar de llegar a un resultado significativo y reproducible. Preferiblemente, la inhibición del crecimiento tumoral T/C [%] es < 70 o < 60, más preferiblemente < 50 o < 40, incluso más preferiblemente < 30 o < 20, y lo más preferible < 10 o < 5 o incluso < 2,5.

La invención proporciona además un polinucleótido que codifica un constructo de anticuerpo de la invención.

Un polinucleótido es un biopolímero compuesto por 13 o más monómeros nucleotídicos enlazados covalentemente en una cadena. El ADN (tal como ADNc) y el ARN (tal como ARNm) son ejemplos de polinucleótidos con una función biológica distinta. Los nucleótidos son moléculas orgánicas que sirven como monómeros o subunidades de moléculas de ácido nucleico como el ADN o el ARN. La molécula de ácido nucleico o polinucleótido puede ser bicatenario y monocatenario, lineal y circular. Preferiblemente está comprendido en un vector que preferiblemente está comprendido en una célula hospedante. Dicha célula hospedante es, por ejemplo, después de la transformación o transfección con el vector o el polinucleótido de la invención, capaz de expresar el constructo de anticuerpo. Para ese fin, el polinucleótido o la molécula de ácido nucleico se une operativamente con secuencias de control.

El código genético es el conjunto de reglas mediante las cuales la información codificada dentro del material genético (ácidos nucleicos) se traduce en proteínas. La decodificación biológica en las células vivas se logra mediante el ribosoma que une los aminoácidos en un orden especificado mediante ARNm, utilizando moléculas de ARNt para transportar aminoácidos y leer el ARNm, tres nucleótidos a la vez. El código define cómo las secuencias de estos tripletes de nucleótidos, denominados codones, especifican qué aminoácido se añadirá a continuación durante la síntesis de proteínas. Con algunas excepciones, un codón de tres nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico especifica un solo aminoácido. Debido a que la gran mayoría de los genes están codificados con exactamente el mismo código, este código en particular a menudo se denomina código genético canónico o estándar. Si bien el código genético determina la secuencia de proteínas para una región codificante determinada, otras regiones genómicas pueden influir en cuándo y dónde se producen estas proteínas.

Además, la invención proporciona un vector que comprende un polinucleótido de la invención.

Un vector es una molécula de ácido nucleico que se utiliza como vehículo para transferir material genético (extraño) a una célula. El término “vector” abarca - pero no se restringe a - plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. En general, los vectores manipulados mediante ingeniería comprenden un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple, y un marcador seleccionable. El vector en sí mismo es generalmente una secuencia nucleotídica, comúnmente una secuencia de ADN, que comprende un inserto (transgén) y una secuencia más grande que sirve como “columna vertebral” del vector. Los vectores modernos pueden abarcar características adicionales además del inserto transgénico y una columna vertebral: promotor, marcador genético, resistencia a antibióticos, gen informador, secuencia de direccionamiento, etiqueta de purificación de proteínas. Los vectores denominados vectores de expresión (constructos de expresión) son específicamente para la expresión del transgén en la célula diana, y generalmente tienen secuencias de control.

La expresión “secuencias de control” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente enlazada en un organismo hospedante particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.

Un ácido nucleico está “operativamente enlazado” cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretor está operativamente enlazado al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente enlazado a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente enlazado a una secuencia codificante si está posicionado para facilitar la traducción. Generalmente, “operativamente enlazado” significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. El enlazamiento se logra mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se utilizan los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional.

La “transfección” es el procedimiento de introducir deliberadamente moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos (incluyendo los vectores) en las células diana. El término se usa principalmente para métodos no virales en células eucariotas. La transducción se usa a menudo para describir la transferencia mediada por virus de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos. La transfección de células animales normalmente implica la apertura de poros transitorios o “orificios” en la membrana celular, para permitir la absorción de material. La transfección se puede realizar usando fosfato de calcio, por electroporación, por exprimido celular, o mezclando un lípido catiónico con el material para producir liposomas, que se fusionan con la membrana celular y depositan su carga en el interior.

El término “transformación” se utiliza para describir la transferencia no viral de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos (incluyendo vectores) a bacterias, y también a células eucariotas no animales, incluyendo células vegetales. Por tanto, la transformación es la alteración genética de una célula eucariota bacteriana o no animal resultante de la captación directa a través de la o las membranas celulares desde su entorno y la incorporación posterior de material genético exógeno (moléculas de ácido nucleico). La transformación se puede realizar por medios artificiales. Para que ocurra la transformación, las células o bacterias deben estar en un estado de competencia, lo que podría ocurrir como una respuesta de tiempo limitado a condiciones ambientales tales como el hambre y la densidad celular.

Además, la invención proporciona una célula hospedante transformada o transfectada con el polinucleótido o con el vector de la invención.

Como se usan aquí, las expresiones “célula hospedante” o “célula receptora” pretenden incluir cualquier célula individual o cultivo celular que pueda o puedan ser o haya o hayan sido receptores de vectores, moléculas de ácido nucleico exógenas, y polinucleótidos que codifican el constructo de anticuerpo de la presente invención; y/o receptores del propio constructo de anticuerpo. La introducción del material respectivo en la célula se lleva a cabo mediante transformación, transfección, y similares. La expresión “célula hospedante” también pretende incluir la progenie o la progenie potencial de una sola célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en las generaciones sucesivas debido a una mutación natural, accidental o deliberada, o debido a influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser completamente idéntica (en morfología o en complemento genómico o de ADN total) a la célula madre, pero todavía está incluida dentro del alcance de la expresión como se usa aquí. Las células hospedantes adecuadas incluyen células procariotas o eucariotas, y también incluyen, pero no se limitan a, bacterias, células de levadura, células de hongos, células vegetales, y células animales tales como células de insectos y células de mamíferos, por ejemplo, murinas, de rata, de macacos o humanas.

El constructo de anticuerpo de la invención se puede producir en bacterias. Después de la expresión, el constructo de anticuerpo de la invención se aísla de la pasta celular de E. co lien una fracción soluble, y se puede purificar mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad y/o exclusión por tamaño. La purificación final se puede llevar a cabo de forma similar al procedimiento para purificar el anticuerpo expresado, por ejemplo, en células CHO.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son hospedantes de clonación o expresión adecuados para el constructo de anticuerpo de la invención. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es el más comúnmente utilizado entre los microorganismos hospedantes eucariotas inferiores. Sin embargo, varios otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles aquí, tales como Schizosaccharomyces pombe, hospedantes de Kluyveromyces tales como K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402 226); Pichia pastoris (documento EP 183 070); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongtos filamentosos tales como Neurospora, Penicillium, Tolypocladium; y hospedantes de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células hospedantes adecuadas para la expresión del constructo de anticuerpo glicosilados de la invención derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales y las correspondientes células hospedantes de insectos permisivas de hospedantes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Existe una variedad de cepas virales para transfección disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus se pueden usar como virus aquí según la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar como hospedantes cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, Arabidopsis y tabaco. Los expertos en la técnica conocen los vectores de clonación y expresión útiles en la producción de proteínas en cultivos de células vegetales. Véanse, por ejemplo, Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750, y Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.

Sin embargo, el interés ha sido mayor en las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas de células hospedantes de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36 : 59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CVI At CC Cc L 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC c RL1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas (m Dc K, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, 14138065); tumor mamario de ratón (Mm T 060562, At Cc CCL5 1); células TRI cells (Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

En una realización adicional, la invención proporciona un procedimiento para la producción de un constructo de anticuerpo de la invención, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula hospedante de la invención en condiciones que permitan la expresión del constructo de anticuerpo de la invención y recuperar el constructo de anticuerpo producida a partir del cultivo.

Como se usa aquí, el término “cultivar” se refiere al mantenimiento, diferenciación, crecimiento, proliferación y/o propagación in vitro de células en condiciones adecuadas en un medio. El término “expresión” incluye cualquier etapa implicada en la producción de un constructo de anticuerpo de la invención, que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación post-transcripcional, traducción, modificación post-traduccional, y secreción.

Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el constructo de anticuerpo se puede producir intracelularmente, en el espacio periplasmático, o se puede segregar directamente en el medio. Si el constructo de anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, los desechos en partículas, ya sean células hospedantes o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se segregan al espacio periplasmático de E. coli. Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante alrededor de 30 min. Los desechos celulares se pueden eliminar mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo se segrega en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasas, tal como PMSF, en cualquiera de las etapas anteriores, para inhibir la proteólisis, y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.

El constructo de anticuerpo de la invención preparado a partir de las células hospedantes puede recuperarse o purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad. También están disponibles, dependiendo del anticuerpo a recuperar, otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromato-enfoque, SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de amonio. Cuando el constructo de anticuerpo de la invención comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación.

Una técnica de purificación preferida es la cromatografía de afinidad. La matriz a la que se une el ligando de afinidad es a menudo agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Las matrices mecánicamente estables, tales como el vidrio de poro controlado o el poli(estirendivinil)benceno, permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa.

Además, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un constructo de anticuerpo de la invención o un constructo de anticuerpo producido según el procedimiento de la invención. Se prefiere para la composición farmacéutica de la invención que la homogeneidad del constructo de anticuerpo sea > 80%, más preferiblemente > 81%, > 82%, > 83%, > 84% o > 85%, preferiblemente aún > 86% , > 87%, > 88%, > 89% o > 90%, aún más preferiblemente, > 91%, > 92%, > 93%, > 94% o > 95% y lo más preferible > 96%, > 97%, > 98% o > 99%.

Como se usa aquí, la expresión “composición farmacéutica” se refiere a una composición que es adecuada para la administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. La composición farmacéutica particularmente preferida de esta invención comprende uno o varios de los constructos de anticuerpos de la invención, preferiblemente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende además formulaciones adecuadas de uno o más vehículos, estabilizadores, excipientes, diluyentes, solubilizantes, tensioactivos, emulsionantes, conservantes y/o adyuvantes (farmacéuticamente eficaces). Los constituyentes aceptables de la composición son preferiblemente no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, pero no se limitan a, composiciones líquidas, congeladas, y liofilizadas.

Las composiciones de la invención pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable. En general, como se usa aquí, “vehículo farmacéuticamente aceptable” significa todas y cada una de las disoluciones acuosas y no acuosas, disoluciones estériles, disolventes, amortiguadores, por ejemplo, disoluciones salinas amortiguadas con fosfato (PBS), agua, suspensiones, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, liposomas, medios de dispersión y recubrimientos, que son compatibles con la administración farmacéutica, en particular con la administración parenteral. El uso de tales medios y agentes en composiciones farmacéuticas es bien conocido en la técnica, y las composiciones que comprenden tales vehículos pueden formularse mediante métodos convencionales bien conocidos.

Ciertas realizaciones proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden el constructo de anticuerpo de la invención y además uno o más excipientes tales como los descritos ilustrativamente en esta sección y en otras partes de la presente. Los excipientes se pueden usar en la invención a este respecto para una amplia variedad de fines, tales como ajustar las propiedades físicas, químicas o biológicas de las formulaciones, tales como el ajuste de la viscosidad, y/o los procedimientos de la invención para mejorar la efectividad y/o estabilizar tales formulaciones y procedimientos contra la degradación y el deterioro debido, por ejemplo, a las tensiones que se producen durante la fabricación, el transporte, el almacenamiento, la preparación previa al uso, la administración, y posteriores.

En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación con el fin de modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición (véase, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18” Edición, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company). En tales realizaciones, los materiales de formulación adecuados pueden incluir, pero no se limitan a:

• aminoácidos tales como glicina, alanina, glutamina, asparagina, treonina, prolina, 2-fenilalanina, incluyendo aminoácidos cargados, preferiblemente lisina, acetato de lisina, arginina, glutamato y/o histidina

• antimicrobianos tales como agentes antibacterianos y antifúngicos

• antioxidantes tales como ácido ascórbico, metionina, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio;

• amortiguadores, sistemas de amortiguador y agentes amortiguadores, que se utilizan para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente más bajo, típicamente dentro de un intervalo de pH de alrededor de 5 a alrededor de 8 o 9; ejemplos de amortiguadores son borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos, succinato, fosfato, histidina y acetato; por ejemplo, amortiguador de Tris de alrededor de pH 7,0­ 8,5, o amortiguador de acetato de alrededor de pH 4,0-5,5;

disolventes no acuosos tales como propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo;

vehículos acuosos que incluyen agua, disoluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, que incluyen disolución salina y medios amortiguados;

polímeros biodegradables tales como poliésteres;

agentes para dar volumen tales como manitol o glicina;

agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA);

agentes isotónicos y retardadores de la absorción;

agentes complejantes tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina) • cargas;

monosacáridos; disacáridos; y otros hidratos de carbonos (tales como glucosa, manosa o dextrinas); los hidratos de carbono pueden ser azúcares no reductores, preferiblemente trehalosa, sacarosa, octasulfato, sorbitol o xilitol; proteínas (de bajo peso molecular), polipéptidos o vehículos proteinosos tales como seroalbúmina humana o bovina, gelatina o inmunoglobulinas, preferiblemente de origen humano;

agentes colorantes y aromatizantes;

agentes reductores que contienen azufre, tales como glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol, y tiosulfato de sodio

agentes diluyentes;

agentes emulsionantes;

polímeros hidrófilos tal como polivinilpirrolidona)

contraiones formadores de sal tal como sodio;

conservantes tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, y similares; los ejemplos son: cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno);

complejos metálicos tales como complejos de Zn-proteína;

disolventes y codisolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol);

azúcares y alcoholes de azúcar, tales como trehalosa, sacarosa, octasulfato, manitol, sorbitol, o xilitol, estaquiosa, manosa, sorbosa, xilosa, ribosa, mioinisitosa, galactosa, lactitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol, ciclitoles (por ejemplo, inositol) polietilenglicol; y alcoholes de azúcar polihidroxilados;

• agentes de suspensión;

• tensioactivos o agentes humectantes tales como pluronics, PEG, ásteres de sorbitano, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal; los tensioactivos pueden ser detergentes, preferiblemente con un peso molecular de > 1,2 KD y/o un poliáter, preferiblemente con un peso molecular de > 3 KD; ejemplos no limitantes de detergentes preferidos son Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 y Tween 85; ejemplos no limitantes de poliáteres preferidos son PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 y PEG 5000;

• agentes potenciadores de la estabilidad tales como sacarosa o sorbitol;

• agentes potenciadores de la tonicidad tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol, sorbitol;

• vehículos de suministro parenteral que incluyen disolución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, disolución de Ringer lactada, o aceites fijos;

• vehículos para el suministro intravenoso que incluyen reponedores de líquidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en la dextrosa de Ringer).

Es evidente para los expertos en la técnica que los diferentes constituyentes de la composición farmacéutica (por ejemplo, los enumerados anteriormente) pueden tener diferentes efectos, por ejemplo, y el aminoácido puede actuar como amortiguador, estabilizador y/o antioxidante; el manitol puede actuar como agente para dar volumen y/o agente potenciador de la tonicidad; el cloruro de sodio puede actuar como vehículo de suministro y/o agente potenciador de la tonicidad; etc.

Se prevé que la composición de la invención podría comprender, además del polipáptido de la invención definido aquí, agentes biológicamente activos adicionales, dependiendo del uso pretendido de la composición. Dichos agentes pueden ser fármacos que actúan sobre el sistema gastrointestinal, fármacos que actúan como citostáticos, fármacos que previenen la hiperuricemia, fármacos que inhiben las inmunorreacciones (por ejemplo, corticosteroides), fármacos que modulan la respuesta inflamatoria, fármacos que actúan sobre el sistema circulatorio, y/o agentes tales como citocinas conocidas en la técnica. También se prevé que el constructo de anticuerpo de la presente invención se aplique en una co-terapia, es decir, en combinación con otro medicamento contra el cáncer.

En ciertas realizaciones, un experto en la técnica determinará la composición farmacéutica óptima dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración pretendida, el formato de administración y la dosis deseada. Véase, por ejemplo, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, más arriba. En ciertas realizaciones, tales composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de aclaramiento in vivo del constructo de anticuerpo de la invención. En determinadas realizaciones, el vehículo o portador principal en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, disolución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en las composiciones para administración parenteral. La disolución salina amortiguada neutra o la disolución salina mezclada con seroalbúmina son vehículos ejemplares adicionales. En determinadas realizaciones, el constructo de anticuerpo de las composiciones de la invención se puede preparar para su almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, más arriba) en forma de torta liofilizada o disolución acuosa. Además, en determinadas realizaciones, el constructo de anticuerpo de la invención puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para uso en esta invención pueden proporcionarse en forma de una disolución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos que comprende el constructo de anticuerpo deseado de la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que el constructo de anticuerpo de la invención se formula como una disolución isotónica estéril, debidamente conservada. En determinadas realizaciones, la preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), perlas o liposomas, que pueden proporcionar liberación controlada o sostenida del producto que puede administrarse mediante inyección de depósito. En ciertas realizaciones, también se puede usar ácido hialurónico, que tiene el efecto de promover una duración sostenida en la circulación. En determinadas realizaciones, se pueden usar dispositivos implantables de suministro de fármacos para introducir el constructo de anticuerpo deseado.

Las composiciones farmacéuticas adicionales resultarán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo las formulaciones que implican el constructo de anticuerpo de la invención en formulaciones de suministro/liberación sostenida o controlada. Los expertos en la técnica también conocen técnicas para formular una variedad de otros medios de administración sostenida o controlada, tales como portadores de liposomas, micropartículas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional WO9315722, que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para el suministro de composiciones farmacéuticas. Las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas (como se describen en la patente U.S. n° 3.773.919 y en la Publicación de Solicitud de Patente Europea n° EP 058481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etileno-acetato de vinilo (Langer et al., 1981, más arriba), o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (Publicación de Solicitud de Patente Europea n° EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas que se pueden preparar mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

82:3688-3692; Publicación de Solicitud de Patente Europea nos EP 036.676; EP 088.046 y EP 143.949.

El constructo de anticuerpo también se puede atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente), en sistemas coloidales de suministro de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed., (1980).

Las composiciones farmacéuticas utilizadas para la administración in vivo se proporcionan típicamente como preparaciones estériles. La esterilización se puede lograr mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización que usa este método puede realizarse antes o después de la liofilización y reconstitución. Las composiciones para administración parenteral se pueden almacenar en forma liofilizada o en disolución. Las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

Otro aspecto de la invención incluye formulaciones autoamortiguantes del constructo de anticuerpo de la invención, que pueden usarse como composiciones farmacéuticas, como se describe en la solicitud de patente internacional WO 06138181A2. Existe una variedad de exposiciones disponibles sobre estabilización de proteínas y materiales y métodos de formulación útiles a este respecto, tales como Arakawa et al., “Solvent interactions in pharmaceutical formulations”, Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., “Physical stabilization of proteins in aqueous solution” en: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), y Randolph et al., “Surfactant-protein interactions”, Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002); véanse particularmente las partes pertinentes a excipientes y procedimientos de los mismos para formulaciones de proteínas autoamortiguantes según la presente invención, especialmente en cuanto a productos y procedimientos farmacéuticos proteicos para usos médicos veterinarios y/o humanos.

Las sales pueden usarse según ciertas realizaciones de la invención para, por ejemplo, ajustar la fuerza iónica y/o la isotonicidad de una formulación y/o para mejorar la solubilidad y/o estabilidad física de una proteína u otro ingrediente de una composición según la invención. Como es bien sabido, los iones pueden estabilizar el estado nativo de las proteínas uniéndose a los restos cargados en la superficie de la proteína y protegiendo los grupos cargados y polares en la proteína y reduciendo la fuerza de sus interacciones electrostáticas, interacciones atractivas y repulsivas. Los iones también pueden estabilizar el estado desnaturalizado de una proteína uniéndose, en particular, a los enlaces peptídicos desnaturalizados (-CONH) de la proteína. Además, la interacción iónica con grupos cargados y polares en una proteína también puede reducir las interacciones electrostáticas intermoleculares y, de ese modo, prevenir o reducir la agregación e insolubilidad de las proteínas.

Las especies iónicas difieren significativamente en sus efectos sobre las proteínas. Se han desarrollado una serie de clasificaciones categóricas de iones y sus efectos sobre las proteínas que pueden usarse en la formulación de composiciones farmacéuticas según la invención. Un ejemplo es la serie de Hofmeister, que clasifica los solutos iónicos y no iónicos polares por su efecto sobre la estabilidad conformacional de las proteínas en disolución. Los solutos estabilizadores se denominan “kosmotrópicos”. Los solutos desestabilizadores se denominan “caotrópicos”. Los kosmótropos se utilizan comúnmente a altas concentraciones (por ejemplo, sulfato de amonio > 1 molar) para precipitar proteínas de la disolución (“precipitación salina”). Los caótropos se utilizan comúnmente para desnaturalizar y/o solubilizar proteínas (“salazón”). La efectividad relativa de los iones para “solubilizar” y “precipitar” las proteínas define su posición en la serie de Hofmeister.

Los aminoácidos libres se pueden utilizar en las formulaciones del constructo de anticuerpo de la invención según diversas realizaciones de la invención como agentes para dar volumen, estabilizadores, y antioxidantes, así como otros usos estándar. Se pueden usar lisina, prolina, serina y alanina para estabilizar proteínas en una formulación. La glicina es útil en la liofilización para asegurar la estructura y propiedades correctas de la torta. La arginina puede ser útil para inhibir la agregación de proteínas, tanto en formulaciones líquidas como liofilizadas. La metionina es útil como antioxidante.

Los polioles incluyen azúcares, por ejemplo, manitol, sacarosa y sorbitol, y alcoholes polihidroxilados tales como, por ejemplo, glicerol y propilenglicol, y, para los fines de la discusión aquí, polietilenglicol (PEG) y sustancias relacionadas. Los polioles son kosmotrópicos. Son agentes estabilizantes útiles en formulaciones tanto líquidas como liofilizadas para proteger las proteínas de los procedimientos de degradación física y química. Los polioles también son útiles para ajustar la tonicidad de las formulaciones. Entre los polioles útiles en realizaciones seleccionadas de la invención está el manitol, comúnmente utilizado para asegurar la estabilidad estructural de la torta en formulaciones liofilizadas. Asegura estabilidad estructural a la torta. Generalmente se usa con un lioprotector, por ejemplo, sacarosa. El sorbitol y la sacarosa se encuentran entre los agentes preferidos para ajustar la tonicidad y como estabilizadores para proteger contra las tensiones por congelación-descongelación durante el transporte o la preparación de cantidades voluminosas durante el procedimiento de fabricación. Los azúcares reductores (que contienen grupos aldehído o cetona libres), tales como la glucosa y la lactosa, pueden glicar restos de lisina y arginina superficiales. Por lo tanto, generalmente no se encuentran entre los polioles preferidos para uso según la invención. Además, los azúcares que forman tales especies reactivas, tales como sacarosa, que se hidroliza a fructosa y glucosa en condiciones ácidas, y en consecuencia engendra glicación, tampoco se encuentran entre los polioles preferidos de la invención a este respecto. El PEG es útil para estabilizar proteínas y como crioprotector, y puede usarse en la invención a este respecto.

Las realizaciones de las formulaciones del constructo de anticuerpo de la invención comprenden además tensioactivos. Las moléculas de proteína pueden ser susceptibles a la adsorción en superficies y a la desnaturalización y la consiguiente agregación en las interfaces aire-líquido, sólido-líquido, y líquido-líquido. Estos efectos generalmente escalan inversamente con la concentración de proteínas. Estas interacciones dañinas generalmente escalan inversamente con la concentración de proteína, y típicamente se exacerban por la agitación física, tal como la generada durante el transporte y manipulación de un producto. Los tensioactivos se utilizan de forma rutinaria para prevenir, minimizar o reducir la adsorción superficial. Los tensioactivos útiles en la invención a este respecto incluyen polisorbato 20, polisorbato 80, otros ésteres de ácidos grasos de polietoxilatos de sorbitán, y poloxámero 188. Los tensioactivos también se usan comúnmente para controlar la estabilidad conformacional de las proteínas. El uso de tensioactivos a este respecto es específico de la proteína ya que cualquier tensioactivo dado estabilizará típicamente algunas proteínas y desestabilizará otras.

Los polisorbatos son susceptibles a la degradación oxidativa, y a menudo, como se suministran, contienen cantidades suficientes de peróxidos para provocar la oxidación de las cadenas laterales de restos de proteínas, especialmente metionina. En consecuencia, los polisorbatos deben usarse con cuidado, y cuando se usan, deben emplearse en su concentración efectiva más baja. A este respecto, los polisorbatos ejemplifican la regla general de que los excipientes deben usarse en sus concentraciones efectivas más bajas.

Las realizaciones de las formulaciones del constructo de anticuerpo de la invención comprenden además uno o más antioxidantes. Hasta cierto punto, la oxidación perjudicial de las proteínas se puede prevenir en las formulaciones farmacéuticas manteniendo niveles adecuados de oxígeno y temperatura ambientales y evitando la exposición a la luz. También se pueden usar excipientes antioxidantes para prevenir la degradación oxidativa de proteínas. Entre los antioxidantes útiles a este respecto están los agentes reductores, los depuradores de oxígeno/radicales libres, y los agentes quelantes. Los antioxidantes para uso en formulaciones de proteínas terapéuticas según la invención son preferiblemente solubles en agua y mantienen su actividad durante la vida útil de un producto. El EDTA es un antioxidante preferido según la invención a este respecto. Los antioxidantes pueden dañar las proteínas. Por ejemplo, los agentes reductores, tal como la glutationa en particular, pueden alterar los enlaces de disulfuro intramoleculares. De este modo, los antioxidantes para uso en la invención se seleccionan para, entre otros, eliminar o reducir suficientemente la posibilidad de que ellos mismos dañen las proteínas en la formulación.

Las formulaciones según la invención pueden incluir iones metálicos que son cofactores de proteínas y que son necesarios para formar complejos de coordinación de proteínas, tal como el cinc, necesario para formar ciertas suspensiones de insulina. Los iones metálicos también pueden inhibir algunos procesos que degradan las proteínas. Sin embargo, los iones metálicos también catalizan procesos físicos y químicos que degradan las proteínas. Se pueden usar iones de magnesio (10-120 mM) para inhibir la isomerización del ácido aspártico a ácido isoaspártico. Los iones Ca+2 (hasta 100 mM) pueden aumentar la estabilidad de la desoxirribonucleasa humana. Sin embargo, Mg+2, Mn+2 y Zn+2 pueden desestabilizar la rhDNasa. Del mismo modo, Ca+2 y Sr+2 pueden estabilizar el Factor VIII, puede ser desestabilizado por Mg+2, Mn+2 y Zn+2, Cu+2 y Fe+2, y su agregación puede incrementarse por iones Al+3.

Las realizaciones de las formulaciones del constructo de anticuerpo de la invención comprenden además uno o más conservantes. Los conservantes son necesarios cuando se desarrollan formulaciones parenterales multidosis que implican más de una extracción del mismo recipiente. Su función principal es inhibir el crecimiento microbiano y asegurar la esterilidad del producto durante la vida útil o el período de uso del producto farmacéutico. Los conservantes de uso común incluyen alcohol bencílico, fenol y m-cresol. Aunque los conservantes tienen una larga historia de uso con sustancias parenterales de tipo molécula pequeña, el desarrollo de formulaciones de proteínas que incluyan conservantes puede ser un desafío. Los conservantes casi siempre tienen un efecto desestabilizador (agregación) sobre las proteínas, y esto se ha convertido en un factor importante para limitar su uso en formulaciones de proteínas multidosis. Hasta la fecha, la mayoría de los medicamentos proteicos se han formulado para un solo uso. Sin embargo, cuando son posibles las formulaciones multidosis, tienen la ventaja añadida de permitir la comodidad del paciente y una mayor comerciabilidad. Un buen ejemplo es el de la hormona del crecimiento humana (hGH), en la que el desarrollo de formulaciones conservadas ha llevado a la comercialización de presentaciones de pluma inyectable multiusos más convenientes. Actualmente están disponibles en el mercado al menos cuatro de estos dispositivos de pluma que contienen formulaciones conservadas de hGH. Norditropin (líquido, Novo Nordisk), Nutropin AQ (líquido, Genentech) y Genotropin (liofilizado - cartucho de doble cámara, Pharmacia & Upjohn) contienen fenol, mientras que Somatrope (Eli Lilly) está formulado con m-cresol. Es necesario considerar varios aspectos durante la formulación y desarrollo de formas farmacéuticas conservadas. Debe optimizarse la concentración eficaz de conservante en el producto farmacéutico. Esto requiere evaluar un conservante dado en la forma de dosificación con intervalos de concentración que confieren eficacia antimicrobiana sin comprometer la estabilidad de la proteína.

Como era de esperar, el desarrollo de formulaciones líquidas que contienen conservantes es más desafiante que las formulaciones liofilizadas. Los productos liofilizados pueden liofilizarse sin el conservante y reconstituirse con un diluyente que contenga conservante en el momento de su uso. Esto acorta el tiempo durante el cual un conservante está en contacto con la proteína, minimizando significativamente los riesgos de estabilidad asociados. Con las formulaciones líquidas, la eficacia y la estabilidad de los conservantes deben mantenerse durante toda la vida útil del producto (alrededor de 18 a 24 meses). Un punto importante a tener en cuenta es que la eficacia del conservante debe demostrarse en la formulación final que contiene el fármaco activo y todos los componentes del excipiente.

Los constructos de anticuerpos descritos aquí también se pueden formular como inmunoliposomas. Un “liposoma” es una pequeña vesícula compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivo, que es útil para la administración de un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas. Los liposomas que contienen el constructo de anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); patentes US nos 4.485.045 y 4.544.545; y documento WO 97/38731. Los liposomas con mayor tiempo de circulación se describen en la patente US n° 5.013.556. Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab’ del constructo de anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286­ 288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Opcionalmente, el liposoma contiene un agente quimioterapéutico. Véase Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).

Una vez que se ha formulado la composición farmacéutica, se puede almacenar en viales estériles como una disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido, cristal, o como un polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones pueden almacenarse en una forma lista para uso o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstituye antes de la administración.

La actividad biológica de la composición farmacéutica definida aquí se puede determinar, por ejemplo, mediante ensayos de citotoxicidad, como se describe en los siguientes ejemplos, en el documento WO 99/54440 o por Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12). “Eficacia” o "eficacia in vivo", como se usa aquí, se refiere a la respuesta a la terapia mediante la composición farmacéutica de la invención, usando, por ejemplo, criterios de respuesta NCI estandarizados. El éxito o eficacia in vivo de la terapia que utiliza una composición farmacéutica de la invención se refiere a la eficacia de la composición para su fin previsto, es decir, la capacidad de la composición de provocar su efecto deseado, es decir, el agotamiento de las células patológicas, por ejemplo, células tumorales. La eficacia in vivo se puede monitorizar mediante métodos estándar establecidos para las entidades patológicas respectivas que incluyen, pero no se limitan a, recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación de células activada por fluorescencia, aspiración de médula ósea. Además, pueden usarse varios parámetros químicos clínicos específicos de la enfermedad y otros métodos estándar establecidos. Además, se puede usar tomografía asistida por ordenador, rayos X, tomografía por resonancia magnética nuclear (por ejemplo, para la evaluación de la respuesta basada en criterios del National Cancer Institute [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin’s lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr;17(4):1244]), tomografía por emisión de positrones, recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación celular activada por fluorescencia, aspiración de médula ósea, biopsias/histologías de ganglios linfáticos, y diversos parámetros químicos clínicos específicos del linfoma (por ejemplo, lactato deshidrogenasa) y otros métodos estándar establecidos.

Otro desafío importante en el desarrollo de fármacos tales como la composición farmacéutica de la invención es la modulación predecible de las propiedades farmacocinéticas. Para este fin, se puede establecer un perfil farmacocinético del fármaco candidato, es decir, un perfil de los parámetros farmacocinéticos que afectan la capacidad de un fármaco particular para tratar una afección determinada. Los parámetros farmacocinéticos del fármaco que influyen en la capacidad de un fármaco para tratar una determinada entidad patológica incluyen, pero no se limitan a: vida media, volumen de distribución, metabolismo hepático de primera pasada, y grado de unión al suero sanguíneo. La eficacia de un fármaco determinado puede verse influida por cada uno de los parámetros mencionados anteriormente.

“Vida media” significa el tiempo en el que el 50% de un fármaco administrado se elimina mediante procesos biológicos, por ejemplo, metabolismo, excreción, etc. Por “metabolismo hepático de primera pasada” se entiende la propensión de un fármaco a metabolizarse tras el primer contacto con el hígado, es decir, durante su primera pasada a través del hígado. “Volumen de distribución” significa el grado de retención de un fármaco en los diversos compartimentos del cuerpo, como, por ejemplo, espacios intracelulares y extracelulares, tejidos y órganos, etc., y la distribución del fármaco dentro de estos compartimentos. “Grado de unión al suero sanguíneo” significa la propensión de un fármaco a interactuar y unirse a proteínas del suero sanguíneo, tal como albúmina, lo que conduce a una reducción o pérdida de la actividad biológica del fármaco.

Los parámetros farmacocinéticos también incluyen biodisponibilidad, tiempo de retardo (Tlag), Tmax, tasas de absorción, mayor inicio y/o Cmax para una determinada cantidad de fármaco administrada. “Biodisponibilidad” significa la cantidad de un fármaco en el compartimento sanguíneo. “Tiempo de retraso” significa el retraso de tiempo entre la administración del fármaco y su detección y mensurabilidad en sangre o plasma. “Tmax” es el tiempo después del cual se alcanza la concentración sanguínea máxima del fármaco, y “Cmax” es la concentración sanguínea máxima obtenida con un fármaco dado. El tiempo necesario para alcanzar la concentración del fármaco en sangre o tejido necesaria para su efecto biológico depende de todos los parámetros. Los parámetros farmacocinéticos de los constructos de anticuerpos biespecíficos que presentan especificidad entre especies, que pueden determinarse en ensayos preclínicos con animales en primates no chimpancés como se describe anteriormente, también se exponen, por ejemplo, en la publicación de Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).

Una realización proporciona el constructo de anticuerpo de la invención o el constructo de anticuerpo producido según el procedimiento de la invención para uso en la prevención, tratamiento o mejora de un tumor o enfermedad cancerosa o de una enfermedad cancerosa metastásica.

Según una realización preferida de la invención, dicho tumor o enfermedad cancerosa es una enfermedad de tumor sólido.

Las formulaciones descritas aquí son útiles como composiciones farmacéuticas en el tratamiento, mejora y/o prevención de la afección médica patológica como se describe aquí en un paciente que lo necesite. El término “tratamiento” se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. El tratamiento incluye la aplicación o administración de la formulación al cuerpo, un tejido aislado, o una célula de un paciente que tiene una enfermedad/trastorno, un síntoma de una enfermedad/trastorno, o una predisposición a una enfermedad/trastorno, con el fin de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, reducir, o afectar la enfermedad, el síntoma de la enfermedad, o la predisposición a la enfermedad.

El término “mejora”, como se usa aquí, se refiere a cualquier mejora del estado de enfermedad de un paciente que tiene un tumor o cáncer o un cáncer metastásico como se especifica a continuación aquí, mediante la administración de un constructo de anticuerpo según la invención a un sujeto que lo necesite. Tal mejora también puede verse como una ralentización o detención de la progresión del tumor o cáncer o cáncer metastásico del paciente. El término “prevención”, como se usa aquí, significa evitar la manifestación o recidiva de un paciente que tiene un tumor o cáncer o un cáncer metastásico como se especifica a continuación aquí, mediante la administración de un constructo de anticuerpo según la invención a un sujeto que lo necesite.

El término “enfermedad” se refiere a cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con el constructo de anticuerpo o la composición farmacéutica descrita aquí. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicos y agudos, incluyendo aquellas patologías que predisponen al mamífero a la enfermedad en cuestión.

Una “neoplasia” es un crecimiento anormal de tejido, que generalmente, pero no siempre, forma una masa. Cuando también forma una masa, comúnmente se le llama “tumor”. Las neoplasias o tumores pueden ser benignos, potencialmente malignos (precancerosos) o malignos. Las neoplasias malignas se denominan comúnmente cáncer. Por lo general, invaden y destruyen el tejido circundante, y pueden formar metástasis, es decir, se diseminan a otras partes, tejidos u órganos del cuerpo. Por tanto, la expresión “cáncer metastásico” engloba las metástasis a otros tejidos u órganos distintos al del tumor original. Los linfomas y las leucemias son neoplasias linfoides. Para los fines de la presente invención, también están englobados por los términos “tumor” o “cáncer”.

En una realización preferida de la invención, el tumor o enfermedad cancerosa es una enfermedad de tumor sólido, y el cáncer metastásico puede derivar de cualquiera de la anterior.

Las enfermedades tumorales o cancerosas preferidas en relación con esta invención se seleccionan de un grupo que consiste en glioblastoma, astrocitoma, meduloblastomas, carcinomas de mama, carcinomas de pulmón de células no pequeñas, carcinomas de ovario, carcinomas de próstata, carcinomas del sistema nervioso central. Más preferiblemente, el tumor o la enfermedad cancerosa es un glioblastoma multiforme (GBM) o un astrocitoma anaplásico. La enfermedad del cáncer metastásico puede derivar de cualquiera de las anteriores.

Las expresiones “sujeto que lo necesita” o “que necesita tratamiento” incluyen a aquellos que ya padecen el trastorno, así como a aquellos en los que se debe prevenir el trastorno. El sujeto necesitado o “paciente” incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

El constructo de anticuerpo de la invención se diseñará generalmente para vías y métodos de administración específicos, para dosis y frecuencias de administración específicas, para tratamientos específicos de enfermedades específicas, con intervalos de biodisponibilidad y persistencia, entre otros. Los materiales de la composición se formulan preferiblemente en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración.

De este modo, las formulaciones y composiciones pueden diseñarse según la invención para su administración mediante cualquier vía de administración adecuada. En el contexto de la presente invención, las vías de administración incluyen, pero no se limitan a

• vías tópicas (tales como epicutánea, inhalatoria, nasal, oftálmica, auricular/auditiva, vaginal, mucosal);

• vías enterales (tales como oral, gastrointestinal, sublingual, sublabial, bucal, rectal); y

• vías parenterales (tales como intravenosa, intraarterial, intraósea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular, epidural, intratecal, subcutánea, intraperitoneal, extraamniótica, intraarticular, intracardíaca, intradérmica, intralesional, intrauterina, intravesical, intravítrea, transdérmica, intranasal, transmucosal, intrasinovial, intraluminal).

Las composiciones farmacéuticas y el constructo de anticuerpo de esta invención son particularmente útiles para la administración parenteral, por ejemplo, administración subcutánea o intravenosa, por ejemplo, mediante inyección, tal como inyección en bolo, o mediante infusión, tal como infusión continua. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar usando un dispositivo médico. Ejemplos de dispositivos médicos para administrar composiciones farmacéuticas se describen en las patentes U.S. nos 4.475.196; 4.439.196; 4.447.224; 4.447.233; 4.486.194; 4.487.603; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 5.064.413; 5.312.335; 5.312.335; 5.383.851; y 5.399.163.

En particular, la presente invención proporciona una administración ininterrumpida de la composición adecuada. Como ejemplo no limitativo, la administración ininterrumpida o sustancialmente ininterrumpida, es decir, continua, se puede realizar mediante un pequeño sistema de bomba que lleva el paciente para medir la entrada de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. La composición farmacéutica que comprende el constructo de anticuerpo de la invención puede administrarse usando dichos sistemas de bomba. Dichos sistemas de bomba son generalmente conocidos en la técnica, y comúnmente se basan en el intercambio periódico de cartuchos que contienen el agente terapéutico a infundir. Cuando se cambia el cartucho en tal sistema de bomba, puede producirse una interrupción temporal del flujo ininterrumpido de otro modo de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. En tal caso, la fase de administración antes del reemplazo del cartucho y la fase de administración después del reemplazo del cartucho todavía se considerarían dentro del significado de los medios farmacéuticos y los métodos de la invención, y juntas constituyen una “administración ininterrumpida” de dicho agente terapéutico.

La administración continua o ininterrumpida de los constructos de anticuerpos de la invención puede ser intravenosa o subcutánea por medio de un dispositivo de suministro de fluido o un pequeño sistema de bomba que incluye un mecanismo de conducción de fluido para expulsar el fluido de un depósito y un mecanismo de actuación para activar el mecanismo de conducción. Los sistemas de bomba para administración subcutánea pueden incluir una aguja o una cánula para penetrar en la piel de un paciente y administrar la composición adecuada en el cuerpo del paciente. Dichos sistemas de bomba pueden fijarse o adherirse directamente a la piel del paciente independientemente de una vena, arteria o vaso sanguíneo, permitiendo así un contacto directo entre el sistema de bomba y la piel del paciente. El sistema de bomba se puede colocar en la piel del paciente durante 24 horas hasta varios días. El sistema de bomba puede ser de pequeño tamaño, con un depósito para pequeños volúmenes. Como ejemplo no limitativo, el volumen del depósito para la composición farmacéutica adecuada a administrar puede estar entre 0,1 y 50 ml.

La administración continua también puede ser transdérmica mediante un parche que se coloca sobre la piel y se reemplaza a intervalos. Un experto en la técnica conoce los sistemas de parche para la administración de fármacos adecuados para este fin. Cabe señalar que la administración transdérmica es especialmente adecuada para la administración ininterrumpida, ya que el intercambio de un primer parche agotado se puede realizar ventajosamente de forma simultánea con la colocación de un segundo parche nuevo, por ejemplo, en la superficie de la piel inmediatamente adyacente al primer parche agotado e inmediatamente antes de retirar el primer parche agotado. No surgen problemas de interrupción del flujo o fallo de la celda de energía.

Si la composición farmacéutica se ha liofilizado, el material liofilizado se reconstituye primero en un líquido apropiado antes de la administración. El material liofilizado se puede reconstituir en, por ejemplo, agua bacteriostática para inyección (BWFI), disolución salina fisiológica, disolución salina amortiguada con fosfato (PBS), o la misma formulación en la que había estado la proteína antes de la liofilización.

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada que se puede determinar, por ejemplo, mediante estudios de aumento de dosis mediante la administración de dosis crecientes del constructo de anticuerpo de la invención que muestra la especificidad entre especies descrita aquí para primates que no son chimpancés, por ejemplo, macacos. Como se expuso anteriormente, el constructo de anticuerpo de la invención que exhibe especificidad entre especies descrita aquí puede usarse ventajosamente en forma idéntica en ensayos preclínicos en primates que no son chimpancés y como fármaco en seres humanos. El régimen de dosificación lo determinará el médico tratante y los factores clínicos. Como es bien sabido en la técnica médica, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, la superficie corporal, la edad, el compuesto particular que se va a administrar, el sexo, la hora y la vía de administración, la salud general, y otros fármacos administrados al mismo tiempo.

La expresión “dosis eficaz” o “dosificación eficaz” se define como una cantidad suficiente para lograr o al menos lograr parcialmente el efecto deseado. La expresión “dosis terapéuticamente eficaz” se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece la enfermedad. Las cantidades o dosis eficaces para este uso dependerán de la afección a tratar (la indicación), el constructo de anticuerpo administrado, el contexto y los objetivos terapéuticos, la gravedad de la enfermedad, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al agente terapéutico, la vía de administración, el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y/o estado (la edad y salud general) del paciente, y el estado general del propio sistema inmunológico del paciente. La dosis adecuada se puede ajustar según el criterio del médico tratante de modo que se pueda administrar al paciente una vez o durante una serie de administraciones, y con el fin de obtener el efecto terapéutico óptimo.

Una dosis típica puede oscilar desde alrededor de 0,1 mg/kg hasta alrededor de 30 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En realizaciones específicas, la dosis puede oscilar desde 1,0 mg/kg hasta alrededor de 20 mg/kg, opcionalmente desde 10 mg/kg hasta alrededor de 10 mg/kg, o desde 100 mg/kg hasta alrededor de 5 mg/kg.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un constructo de anticuerpo de la invención da como resultado preferiblemente una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia o duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o discapacidad debidos a la aflicción de la enfermedad. Para tratar tumores que expresan EGFRVIII, una cantidad terapéuticamente eficaz del constructo de anticuerpo de la invención, por ejemplo, un constructo de anticuerpo anti-EGFRVIII/anti-CD3, preferiblemente inhibe el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, en al menos alrededor de 80%, o al menos alrededor de 90% con respecto a los pacientes no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral puede evaluarse en un modelo animal predictivo de la eficacia en tumores humanos.

La composición farmacéutica se puede administrar como única terapia o en combinación con terapias adicionales tales como terapias contra el cáncer según sea necesario, por ejemplo, otros fármacos proteicos y no proteicos. Estos fármacos pueden administrarse simultáneamente con la composición que comprende el constructo de anticuerpo de la invención como se define aquí o por separado antes o después de la administración de dicho constructo de anticuerpo en intervalos y dosis definidos oportunos.

La expresión “dosis eficaz y no tóxica”, como se usa aquí, se refiere a una dosis tolerable de un constructo de anticuerpo de la invención que es lo suficientemente alta como para causar el agotamiento de las células patológicas, la eliminación del tumor, la reducción del tumor o la estabilización de la enfermedad sin o esencialmente sin efectos tóxicos importantes. Estas dosis eficaces y no tóxicas se pueden determinar, por ejemplo, mediante estudios de escalada de dosis descritos en la técnica, y deben estar por debajo de la dosis que induce efectos secundarios adversos graves (toxicidad limitante de dosis, DLT).

El término “toxicidad”, como se usa aquí, se refiere a los efectos tóxicos de un fármaco que se manifiestan en eventos adversos o eventos adversos graves. Estos eventos secundarios pueden referirse a una falta de tolerabilidad del fármaco en general y/o una falta de tolerancia local después de la administración. La toxicidad también podría incluir efectos teratogénicos o cancerígenos causados por el fármaco.

El término “seguridad”, "seguridad in vivo" o “tolerabilidad”, como se usa aquí, define la administración de un fármaco sin inducir eventos adversos graves directamente después de la administración (tolerancia local) y durante un período más largo de aplicación del fármaco. La 'seguridad”, “seguridad in vivo" o “tolerabilidad” se pueden evaluar, por ejemplo, a intervalos regulares durante el tratamiento y el período de seguimiento. Las medidas incluyen la evaluación clínica, por ejemplo, las manifestaciones orgánicas, y la detección de anomalías de laboratorio. Se puede realizar una evaluación clínica, y las desviaciones con respecto a hallazgos normales se pueden registrar/codificar según los estándares de NCI-CTC y/o MedDRA. Las manifestaciones de órganos pueden incluir criterios tales como alergia/inmunología, sangre/médula ósea, arritmia cardíaca, coagulación, y similares, como se establece, por ejemplo, en los Common Terminology Criteria for adverse events v3.0 (CTCAE). Los parámetros de laboratorio que pueden evaluarse incluyen, por ejemplo, hematología, química clínica, perfil de coagulación, y análisis de orina y examen de otros fluidos corporales tales como suero, plasma, fluido linfoide o espinal, licor, y similares. De este modo, la seguridad se puede evaluar, por ejemplo, mediante examen físico, técnicas de diagnóstico por imágenes (es decir, ultrasonido, rayos X, tomografías computeizadas, resonancia magnética (MRI), otras medidas con dispositivos técnicos (es decir, electrocardiograma), signos vitales, midiendo parámetros de laboratorio y registrando eventos adversos. Por ejemplo, los efectos adversos en primates que no son chimpancés, en los usos y métodos según la invención, pueden examinarse mediante métodos histopatológicos y/o histoquímicos.

Los términos anteriores también se citan, por ejemplo, en la Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997.

En una realización adicional, la invención proporciona un kit que comprende un constructo de anticuerpo de la invención, un constructo de anticuerpo producido según el procedimiento de la invención, un polinucleótido de la invención, un vector de la invención, y/o una célula hospedante de la invención.

En el contexto de la presente invención, el término “kit” significa dos o más componentes - uno de los cuales corresponde al constructo de anticuerpo, la composición farmacéutica, el vector, o la célula hospedante de la invención - empaquetados juntos en un envase, recipiente o de otra manera. Por tanto, un kit puede describirse como un conjunto de productos y/o utensilios que son suficientes para lograr un determinado objetivo, que se pueden comercializar como una sola unidad.

El kit puede comprender uno o más recipientes (tales como viales, ampollas, envases, jeringas, botellas, bolsas) de cualquier forma, tamaño y material apropiados (preferiblemente a prueba de agua, por ejemplo, plástico o vidrio) que contienen el constructo de anticuerpo o la composición farmacéutica de la presente invención en una dosis apropiada para la administración (véase anteriormente). El kit puede contener además instrucciones de uso (por ejemplo, en forma de folleto o manual de instrucciones), medios para administrar el constructo de anticuerpo de la presente invención, tales como una jeringa, bomba, infusor, o similares, medios para reconstituir el constructo de anticuerpo de la invención, y/o medios para diluir el constructo de anticuerpo de la invención.

La invención también proporciona kits para una unidad de administración de dosis única. El kit de la invención también puede contener un primer recipiente que comprende un constructo de anticuerpo seco/liofilizado y un segundo recipiente que comprende una formulación acuosa. En determinadas realizaciones de esta invención, se proporcionan kits que contienen jeringas precargadas de una y varias cámaras (por ejemplo, jeringas de líquido y liojeringas). Las Figuras muestran:

Figura 1:

Representación esquemática de EGFRvIII, que es un mutante de EGFR específico de tumor que se encuentra en el glioblastoma con una supresión de 267 aminoácidos en el extremo N-terminal.

Figura 2

Comparación de secuencias del EvIII-2 ligante diana y su derivado con las regiones V de EvIII-1 conectadas covalentemente.

Figura 3

Purificación de Evlll-1 y Evlll-2 siguiendo la producción a escala de investigación estándar

Figura 4

Monómero de Evlll-1 y Evlll-2: SDS-PAGE reductor

Figura 5

Reactividad cruzada de constructos de anticuerpos biespecíficos Evlll-1 y Evlll-2 mostrada mediante citometría de flujo: Unión a EGFRvIII y CD3 humanos y de macaco

Figura 6

Unión de constructos de anticuerpos biespecíficos Evlll-1 y Evlll-2 a células transfectadas con EGFRvIII, así como a la línea celular de glioblastoma humano U87

Figura 7

Actividad citotóxica de células T CD8 humanas estimuladas contra células CHO transfectadas con EGFRvIII humano. Ensayo de liberación de 51cromo de 18 horas. Células efectoras: células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas. Células diana: células CHO transfectadas con EGFRvIII. Relación de efectora a célula diana (E:T): 10:1

Figura 8

Actividad citotóxica de células T CD8 humanas estimuladas contra la línea celular de gliomablastoma humano U87: (a) ensayo de liberación de 51cromo de 18 horas. Células efectoras: células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas. Células diana: células U87 muy positivas para vIII. Relación de efectora a célula diana (E:T): 10:1; (b) Ensayo basado en FACS de 18 horas. Células efectoras: células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas. Células diana: células de glioma U87 altamente positivas de hu EGFRvIII. Relación de efectora a célula diana (E:T): 10:1.

Figura 9

Actividad citotóxica de células T CD8 humanas estimuladas contra una línea de células tumorales humanas que expresan EGFRvIII nativo. Antígeno: línea celular de glioblastoma DK-MG: ensayo de liberación de 51cromo de 18 horas. Células efectoras: células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas. Células diana: células DK-MG. Relación de efectora a célula diana (E:T): 10:1.

Figura 10

Actividad citotóxica de una línea de células T de macaco contra células CHO transfectadas con EGFRvIII de macaco: ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Células efectoras: CD3+ LnPx4119 de macaco. Células diana: células CHO transfectadas con EGFRvIII de macaco. Relación efectora a célula diana (E:T): 10:1 Figura 11

Estabilidad de los constructos de anticuerpos biespecíficos después de la incubación durante 24 horas en plasma humano: ensayo basado en 51Cr de 18 horas. Células efectoras: células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas. Células diana: células CHO transfectadas con hu EGFRvIII. Relación de efectora a célula diana (E:T): 10:1. constructos de anticuerpos como se indica

Figura 12

La homogeneidad proteica de los constructos de anticuerpos de EGFRvIII analizada mediante cromatografía de intercambio catiónico de alta resolución CIEX

Figura 13

La hidrofobia superficial de los constructos de anticuerpos biespecíficos ensayada en cromatografía de interacción hidrófoba HIC en modo de flujo continuo

Figura 14

Conversión de monómero en dímero después de 7 días de incubación a 250 mg/ml y 37°C. Analizado con HP-SEC. Figura 15

Conversión de monómero en dímero después de tres ciclos de congelación/descongelación a 250 mg/ml y 37°C. Analizado con HP-SEC.

Figura 16:

Análisis de unión mediante FACS del constructo EvIII-1xCD3-scFc a células CHO transfectadas con el EGFR humano así como con la línea de células T CD3+ humanas HPBaLL. La línea roja representa células incubadas con 2 mg/ml de proteína monomérica purificada que posteriormente se incuban con el anticuerpo anti-I2C de ratón y el anticuerpo de detección anti-IgG de ratón de cabra marcado con PE. La línea negra del histograma refleja el control negativo: células solo incubadas con el anticuerpo anti-I2C y el anticuerpo de detección marcado con PE Figura 17:

Actividad citotóxica inducida por el constructo EvIII-1xCD3-scFc redirigida a PBMC humanas no estimuladas empobrecidas en CD56 como células efectoras y células CHO transfectadas con EGFR humano como células diana. (Ejemplo 1.2)

Ejemplos:

Los siguientes ejemplos ilustran la invención. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de esta invención. La presente invención está limitada únicamente por las reivindicaciones.

Ejemplo 1

Actividad citotóxica

La potencia de los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 de la invención para redirigir las células T efectoras contra las células diana que expresan EGFRVIII se analizó en cinco ensayos de citotoxicidad in vitro: • La potencia de los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 para redirigir células T efectoras CD8+ humanas estimuladas contra células CHO transfectadas con EGFRVIII humano se midió en un ensayo de liberación de 51cromo de 18 horas (Relación de efectora a diana 10:1). Figura 7

• La potencia de los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 para redirigir células T efectoras CD8+ humanas estimuladas contra la línea celular U87 de glioblastoma humano positivo para EGFRVIII se midió en un ensayo de liberación de 51Cr de 18 horas (Relación efectora a diana 10:1). Figura 8

• La potencia de los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 para redirigir las células T en PBMC humanas no estimuladas (CD14-/CD56-) contra células CHO transfectadas con EGFRVIII humano en ausencia y presencia de EGFRVIII soluble se midió en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas (Relación efectora a diana 10:1). Figura 6 y Tabla 6

• La potencia de los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 para redirigir las células T en PBMC humanas no estimuladas (CD14-/CD56-) contra la línea celular U87 de glioblastoma humano positivo para EGFRVIII se midió en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Figura 8

• Para confirmar que los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 con reactividad cruzada son capaces de redirigir células T de macaco contra células CHO transfectadas con EGFRVIII de macaco, se realizó un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con una línea de células T de macaco LnPx4119 como células T efectoras (Relación efectora a diana 10:1). Figura 10

Ejemplo 1.1

Ensayo de liberación de cromo con células T humanas estimuladas

Células T estimuladas enriquecidas para células T CD8+ se obtuvieron como se describe a continuación. Se recubrió una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmunster) con un anticuerpo específico anti-CD3 disponible comercialmente (OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 mg/ml durante 1 hora a 37°C. La proteína no unida se eliminó mediante una etapa de lavado con PBS. Se añadieron 3-5 x 107 PBMC humanas a la placa de Petri revestida previamente en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada/10% de FCS/IL-2 20 U/ml (Proleukin®, Chiron), y se estimularon durante 2 días. Al tercer día, las células se recogieron y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 hasta una concentración final de 20 U/ml, y las células se cultivaron de nuevo durante un día en el mismo medio de cultivo celular como antes. Los linfocitos T CD8+ citotóxicos (CTL) se enriquecieron mediante el agotamiento de células T CD4+ y células NK CD56+ utilizando Dynal-Beads según el protocolo del fabricante. Las células diana CHO transfectadas con EGFRVIII de Cyno o con EGFRVIII humano se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 ml de RPMI con 50% de FCS durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente, las células diana marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI, y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 200 ml de RPMI suplementado, con una relación E:T de 10:1. Se usó una concentración inicial de 0,01 - 1 mg/ml de constructo de anticuerpo biespecífico purificado y diluciones triples del la misma. El tiempo de incubación del ensayo fue 18 horas. La citotoxicidad se determinó como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante con respecto a la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron por cuadriplicado. La medida de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realizó en un contador gamma Wizard 3” (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los resultados se llevó a cabo con Prism 5 para Windows (versión 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA). Para la comparación de la actividad citotóxica, se usaron los valores de EC50 calculados por el programa de análisis a partir de las curvas sigmoideas de respuesta frente a la dosis.

Ejemplo 1.2

Potencia para redirigir células T efectoras humanas estimuladas contra células CHO transfectadas con EGFRVIII humano

La actividad citotóxica de los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 según la invención se analizó en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 (51Cr) usando células CHO transfectadas con EGFRVIII humano como células diana, y células T CD8+ humanas estimuladas como células efectoras. El experimento se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1.1.

Los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 mostraron una actividad citotóxica muy potente contra células CHO transfectadas con EGFRVIII humano en el intervalo picomolar de 1 dígito.

Ejemplo 1.3

Potencia para redirigir células T efectoras humanas estimuladas contra la línea celular humana positiva para EGFRVIII línea celular de glioblastoma humano DK-MG

La actividad citotóxica de los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 (51Cr) usando la línea celular DK-MG de glioblastoma humano positiva para EGFRVIII como fuente de células diana, y células T CD8+ humanas estimuladas como células efectoras. El ensayo se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1.1.

Según los resultados de los ensayos de liberación de cromo 51 con linfocitos T CD8+ humanos enriquecidos estimulados como células efectoras y células CHO transfectadas con EGFRVIII humano como células diana, los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 de la presente invención también son potentes en actividad citotóxica contra células diana expresadoras naturales; véase la figura 9.

Ejemplo 1.4

Ensayo de citotoxicidad basado en FACS con PBMC humanas no estimuladas

Aislamiento de células efectoras

Se prepararon células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll a partir de preparaciones de linfocitos enriquecidos (capas leucocitarias), un producto secundario de los bancos de sangre que recogen sangre para transfusiones. Un banco de sangre local suministró capas leucocitarias, y se prepararon PBMC el mismo día de la extracción de sangre. Después de la centrifugación de densidad Ficoll y lavados extensivos con PBS de Dulbecco (Gibco), los eritrocitos restantes se eliminaron de PBMC mediante incubación con amortiguador de lisis de eritrocitos (NH4Cl 155 mM, KHCO3 10 mM, EDTA 100 mM). Las plaquetas se eliminaron a través del sobrenadante tras la centrifugación de PBMC a 100 x g. Los linfocitos restantes comprenden principalmente linfocitos B y T, células NK y monocitos. Las PBMC se mantuvieron en cultivo a 37°C/5% de CO2 en medio RPMI (Gibco) con 10% de FCS (Gibco).

Agotamiento de células CD14+ y CD56+

Para el agotamiento de células CD14+, se usaron microperlas de CD14 humano (Milteny Biotec, MACS, n° 130-050­ 201), para el agotamiento de células NK, se utilizaron microperlas de CD56 humano (MACS, n° 130-050-401). Se contaron las PBMC y se centrifugaron durante 10 min a temperatura ambiente con 300 x g. El sobrenadante se descartó, y el pelete celular se resuspendió en amortiguador de aislamiento MACS [80 ml/107 células; PBS (Invitrogen, n° 20012-043), 0,5% de FBS (v/v) (Gibco, n° 10270-106), EDTA 2 mM (Sigma-Aldrich, n° E-6511)]. Se añadieron microperlas de CD14 y microperlas de CD56 (20 ml/107 células), y se incubaron durante 15 min a 4-8°C. Las células se lavaron con amortiguador de aislamiento MACS (1-2 ml/107 células). Después de la centrifugación (véase anteriormente), el sobrenadante se descartó, y las células se resuspendieron en amortiguador de aislamiento MACS (500 ml/108 células). A continuación, se aislaron células negativas para CD14/CD56 usando Columnas LS (Miltenyi Biotec, n° 130-042-401). Se cultivaron PBMC sin células CD14+/CD56+ en medio completo RPMI, es decir, RPMI1640 (Biochrom AG, n° FG1215) suplementado con 10% de FBS (Biochrom AG, n° S0115), 1x aminoácidos no esenciales (Biochrom AG, n° K0293), amortiguador Hepes 10 mM (Biochrom AG, n° L1613), piruvato de sodio 1 mM (Biochrom AG, n° L0473), y penicilina/estreptomicina 100 U/ml (Biochrom AG, n° A2213), a 37°C en una incubadora hasta que sea necesario.

Marcaje de células diana

Para el análisis de lisis celular en ensayos de citometría de flujo, se usó el colorante de membrana fluorescente DiOC18 (DiO) (Molecular Probes, n° V22886) para marcar células c HO transfectadas con EGFRVIII humano o EGFRVIII de macaco como células diana y distinguirlas de las células efectoras. Brevemente, las células se recolectaron, se lavaron una vez con PBS y se ajustaron a 106 células/ml en PBS que contiene 2% (v/v) de FBS y el colorante de membrana DiO (5 ml/106 células). Después de la incubación durante 3 min a 37°C, las células se lavaron dos veces en medio RPMI completo, y el número de células se ajustó a 1,25 x 105 células/ml. La vitalidad de las células se determinó utilizando una disolución de EosinaG isotónica al 0,5% (v/v) (Roth, n° 45380).

Análisis basado en citometría de flujo

Este ensayo se diseñó para cuantificar la lisis de células CHO transfectadas con EGFRVIII de cino o humano en presencia de diluciones en serie de constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIII. Se mezclaron volúmenes iguales de células diana marcadas con DiO y células efectoras (es decir, PBMC sin células CD14+), dando como resultado una relación de células E:T de 10:1. Se transfirieron 160 ml de esta suspensión a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 40 ml de diluciones en serie de los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 y un control negativo biespecífico (un constructo de anticuerpo biespecífico basado en CD3 que reconoce un antígeno diana irrelevante) o medio completo RPMI como control negativo adicional. La reacción citotóxica mediada por anticuerpos biespecíficos se desarrolló durante 48 horas en una incubadora humidificada con 7% de CO2. Después, las células se transfirieron a una nueva placa de 96 pocillos, y la pérdida de la integridad de la membrana de las células diana se monitorizó mediante la adición de yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 1 mg/ml. El PI es un tinte impermeable a la membrana que normalmente se excluye de las células viables, mientras que las células muertas lo absorben y se vuelven identificables por emisión fluorescente.

Las muestras se midieron mediante citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron con el software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson). Las células diana se identificaron como células positivas para DiO. Las células diana PI negativas se clasificaron como células diana vivas. El porcentaje de citotoxicidad se calculó según la siguiente fórmula:

n _{células dianamuertas}

Citotoxicidad [%] = x 100

n _{célulasdiana}

n = número de eventos

Utilizando el software GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego), se representó gráficamente el porcentaje de citotoxicidad frente a las concentraciones de constructo de anticuerpo biespecífico correspondientes. Las curvas de respuesta a la dosis se analizaron con los cuatro modelos de regresión logística paramétrica para la evaluación de las curvas sigmoideas de respuesta a la dosis con pendiente de Hill fija, y se calcularon los valores de EC50.

Ejemplo 1.5

Potencia para redirigir PBMC humanas no estimuladas contra células CHO transfectadas con EGFRVIII humano en ausencia y en presencia de EGFRVIII soluble

La actividad citotóxica de los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS utilizando células CHO transfectadas con EGFRVIII humano como células diana, y PBMC humanas no estimuladas como células efectoras. El ensayo se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1.4 anterior.

Como era de esperar, los valores de EC50 fueron generalmente más altos en los ensayos de citotoxicidad con PBMC no estimuladas como células efectoras en comparación con los ensayos de citotoxicidad que utilizan células T CD8+ humanas estimuladas (véase el Ejemplo 1.2).

Ejemplo 1.6

Potencia para redirigir PBMC humanas no estimuladas contra la línea celular U87 de glioblastoma humano positiva para EGFRVIII o células DK-MG

La actividad citotóxica de los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 se analizó además en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS usando la línea celular U87 de glioblastoma humano positiva para EGFRVIII o DK-MG como fuente de células diana y PBMC humanas no estimuladas como células efectoras. El ensayo se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1.4 anterior. Los resultados se muestran en las Figuras 8 y 9.

Ejemplo 1.7

Potencia para redirigir las células T de macaco contra células CHO que expresan EGFRVIII de macaco

La actividad citotóxica de los constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS utilizando células CHO transfectadas con EGFRVIII de macaco (cyno) como células diana, y la línea de células T de macaco 4119LnPx (Knappe et al. Blood 95:3256-61 (2000)) como fuente de células efectoras. El marcaje de células diana de células CHO transfectadas con EGFRVIII de macaco y el análisis basado en liberación de 51Cr de la actividad citotóxica se realizaron como se describió anteriormente.

Los resultados se muestran en la Figura 10. Se indujeron células T de macaco de la línea celular 4119LnPx para exterminar eficazmente células CHO transfectadas con EGFRVIII de macaco mediante constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 de la invención.

Ejemplo 1.8

Brecha de potencia entre la isoforma monomérica y la dimérica de los constructos de anticuerpos biespecíficos Para determinar la diferencia en la actividad citotóxica entre la isoforma monomérica y la dimérica de constructos de anticuerpos biespecíficos EGFRVIIIxCD3 individuales (denominada brecha de potencia), se llevó a cabo un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 de 18 horas como se describe anteriormente (Ejemplo 1.1) con monómero y dímero de constructo de anticuerpo biespecífico purificado. Las células efectoras fueron células T CD8+ humanas enriquecidas estimuladas. Las células diana fueron células CHO transfectadas con hu EGFRVIII. La relación entre la efectora y la célula diana (E:T) fue 10:1. La brecha de potencia se calculó como la relación entre los valores de EC50. Ejemplo 2

Estabilidad después de la incubación durante 24 horas en plasma humano

Los constructos de anticuerpos biespecíficos purificados se incubaron en una relación de 1:5 en una combinación de plasma humano a 37°C durante 96 horas a una concentración final de 2-20 mg/ml. Después de la incubación con plasma, los constructos de anticuerpos se compararon en un ensayo de liberación de cromo 51 con células T CD8+ humanas enriquecidas estimuladas y células CHO transfectadas con EGFRVIII humano a una concentración inicial de 0,01-0,1 mg/ml y con una relación de efectora a célula diana (E:T) de 10:1 (ensayo como se describe en el Ejemplo 1.1). Se incluyeron como controles constructos de anticuerpos biespecíficos recién descongelados, no incubados.

Los resultados se muestran en la Figura 11; El constructo de anticuerpo EvII I-2 tenía una estabilidad plasmática (EC50 plasma/EC50 control) de alrededor de 2. Sorprendentemente, el constructo de anticuerpo biespecífico de la invención no mostró casi ninguna conversión.

Ejemplo 3

Homogeneidad de proteínas mediante cromatografía de intercambio catiónico de alta resolución

La homogeneidad de las proteínas de los constructos de anticuerpos de la invención se analizó mediante cromatografía de intercambio catiónico de alta resolución CIEX. Se diluyeron 50 mg de monómero de constructo de anticuerpo con 50 ml de amortiguador de unión A (dihidrogenofosfato de sodio 20 mM, NaCl 30 mM, octanato de sodio al 0,01%, pH 5,5), y se aplicaron 40 ml de esta disolución a una columna BioPro SP-F de 1 ml (YMC, Alemania) conectada a un dispositivo Ákta Micro FPLC (GE Healthcare, Alemania). Después de la unión de la muestra, se llevó a cabo una etapa de lavado con más amortiguador de unión. Para la elución de proteínas, se aplicó un gradiente de sal creciente lineal usando amortiguador B (dihidrogenofosfato de sodio 20 mM, NaCl 1000 mM, octanato de sodio al 0,01%, pH 5,5) hasta 50% de amortiguador B, sobre 10 volúmenes de columna. Todo el ciclo se controló a una absorbancia óptica de 280, 254 y 210 nm. El análisis se realizó mediante la integración de picos de la señal de 280 nm registrada en la hoja de evaluación de ejecución del software Ákta Unicorn.

Los resultados se muestran en la Figura 12. Casi todos los constructos de anticuerpo ensayados tienen una homogeneidad muy favorable de > 95% (área bajo la curva (= AUC) del pico principal).

Ejemplo 4

Hidrofobia superficial medida por HIC Butyl

La hidrofobia superficial de los constructos de anticuerpos biespecíficos de la invención se evaluó en cromatografía de interacción hidrófoba HIC en modo de flujo continuo. Se diluyeron 50 mg de monómero de constructo de anticuerpo con amortiguador de formulación genérico hasta un volumen final de 500 ml (ácido cítrico 10 mM, lisina HCl 75 mM, trehalosa al 4%, pH 7,0), y se aplicaron a una columna de butil sefarosa FF de 1 ml (GE Healthcare, Alemania) conectada a un sistema Ákta Purifier FPLC (GE Healthcare, Alemania). Todo el ciclo se monitorizó a una absorbancia óptica de 280, 254 y 210 nm. El análisis se realizó mediante la integración de picos de la señal de 280 nm registrada en la hoja de evaluación de ejecución del software Ákta Unicorn. El comportamiento de elución se evaluó comparando el área y la velocidad de aumento y disminución de la señal de la proteína, lo que indica la fuerza de interacción de la fusión de albúmina BiTE con la matriz.

Los constructos de anticuerpos tuvieron un buen comportamiento de elución, que fue en su mayoría rápido y completo; véase la figura 13.

Ejemplo 5

Conversión de monómero a dímero después de (i) tres ciclos de congelación/descongelación y (ii) 7 días de incubación a 250 mg/ml

El constructo monomérico de anticuerpo EGFRVIIIxCD3 biespecífico se sometió a diferentes condiciones de estrés seguidas de SEC de alto rendimiento para determinar el porcentaje de constructo de anticuerpo inicialmente monomérico, que se había convertido en un constructo de anticuerpo dimérico.

(i) Se ajustaron 25 mg del constructo de anticuerpo monomérico a una concentración de 250 mg/ml con amortiguador de formulación genérico, y después se congelaron a -80°C durante 30 min, seguido de descongelación durante 30 min a temperatura ambiente. Después de tres ciclos de congelación/descongelación, se determinó el contenido de dímero mediante HP-SEC.

(ii) Se ajustaron 25 mg de constructo de anticuerpo monomérico a una concentración de 250 mg/ml con amortiguador de formulación genérico seguido de incubación a 37°C durante 7 días. El contenido de dímero se determinó mediante HP-SEC.

Se conectó una columna SEC TSK Gel G3000 SWXL de alta resolución (Tosoh, Tokio-Japón) a un Ákta Purifier 10 FPLC (GE Lifesciences) equipado con un muestreador automático A905. El amortiguador de equilibrado y de recorrido de la columna consistió en KH2PO4 100 mM - Na2SO4 200 mM, ajustado a pH 6,6. La disolución de anticuerpo (25 mg de proteína) se aplicó a la columna equilibrada, y la elución se llevó a cabo a un caudal de 0,75 ml/min a una presión máxima de 7 MPa. El experimento completo se monitorizó a una absorbancia óptica de 280, 254 y 210 nm. El análisis se realizó mediante la integración de picos de la señal de 210 nm registrada en la hoja de evaluación de ejecución del software Ákta Unicorn. El contenido de dímero se calculó dividiendo el área del pico de dímero entre el área total del pico de monómero más dímero.

Los resultados se muestran en las Figuras 14 y 15 a continuación. Los constructos de anticuerpos biespecíficos EVIII-1xCD3 de la invención se presentaron con porcentajes de dímero de 0,59% después de tres ciclos de congelación/descongelación (Figura 15), y con porcentajes de dímero de 0,26% después de 7 días de incubación a 37°C mientras que el constructo de anticuerpo biespecífico Evlll-1 xCD3 mostró valores más altos de 1,56% después de 7 días y 2,53% después de tres ciclos de congelación/descongelación.

Ejemplo 6

Termoestabilidad

La temperatura de agregación del anticuerpo se determinó como sigue: se transfirieron 40 pl de disolución de constructo de anticuerpo a 250 pg/ml a una cubeta de un solo uso, y se colocaron en un dispositivo Wyatt Dynamic Light Scattering DynaPro Nanostar (Wyatt). La muestra se calentó de 40°C hasta 70°C, a una velocidad de calentamiento de 0,5°C/min, con adquisición constante del radio medido. El paquete de software suministrado con el dispositivo DLS utilizó el incremento del radio, que indica la fusión de la proteína y la agregación, para calcular la temperatura de agregación del constructo de anticuerpo.

Tabla 2: Termoestabilidad de los constructos de anticuerpos biespecíficos según lo determinado por DLS (dispersión dinámica de luz)

Ejemplo 7

Turbidez a una concentración de anticuerpo de 2500 pg/ml

1 ml de disolución de constructo de anticuerpo purificada de una concentración de 250 pg/ml se concentró mediante unidades de concentración por centrifugación hasta 2500 pg/ml. Después de 16 horas de almacenamiento a 5°C, se determinó la turbidez de la disolución de anticuerpo mediante medida de absorción óptica a OD340 nm frente al amortiguador de formulación genérico.

Los resultados se muestran en la Tabla 3 a continuación. Mientras que el constructo de anticuerpo Evlll-1 de la invención tenía una turbidez extremadamente favorable de <0,03, el constructo de anticuerpo Evlll-2 mostró una turbidez significativa, lo que es indicativo de características menos favorables en la formulación de dicha molécula en una composición farmacéutica.

Tabla 3: Turbidez de los constructos de anticuerpos después de la concentración hasta 2,5 mg/ml durante la noche

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un constructo de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a EGFRVIII humano y de macaco en la superficie de una célula diana, y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T, en el que el primer dominio de unión comprende una región variable de cadena pesada (VH) como se representa en SEQ ID NO: 157 y una región variable de cadena ligera (VL) como se representa en SEQ ID NO: 158.

2. El constructo de anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el constructo de anticuerpo está en un formato seleccionado del grupo que consiste en (scFv)2, un mAb de dominio único scFv, diacuerpos y oligómeros de esos formatos.

3. El constructo de anticuerpo según las reivindicaciones 1 o 2, en el que el segundo dominio de unión se une a CD3 épsilon humano y a CD3 épsilon de Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus or Saimirí sciureus.

4. El constructo de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende:

(a) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9; y

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103; y

• opcionalmente una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO 10;

(b) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9;

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103;

• opcionalmente un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9;

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 104-134; y

• opcionalmente una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO 10;

(c) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos QRFVTGHFGGLX1PANG (SEQ ID NO: 135), en la que X1 es Y o H; y

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9;

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103;

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO: 137) o QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO: 139); y

• opcionalmente una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO 10;

(d) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID. NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 101;

• un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8;

• un polipéptido que tiene un aminoácido de SEQ ID NO: 158;

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 140; y

un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157;

• un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8;

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID. NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 102, y un resto de serina en el extremo C;

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 141;

(e) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID. NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 101;

• un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8;

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158;

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 142; y

un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8;

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID. NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 102, y un resto de serina en el extremo C;

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 143;

(f) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9; y

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103; y

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 144; y un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 145;

(g) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159; y

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 146; y

un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103; y

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 147;

(h) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159;

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 148; y

un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103; y

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 149; o

(i) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9; y

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103; y

• un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 150, o

(j) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden, comenzando desde el extremo N:

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-9; y

• un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103;

• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1,2, 4, 5, 6, 8 y 9; y

• teniendo el tercer dominio una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 181-188.

5. El constructo de anticuerpo según la reivindicación 4, que comprende o consiste en un polipéptido como se representa en SEQ ID NO: 160.

6. El constructo de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, que comprende además una etiqueta His como se representa en la SEC ID NO: 10 unida al extremo C-terminal del constructo de anticuerpo.

7. Un polinucleótido que codifica un constructo de anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

8. Un vector que comprende un polinucleótido como se define en la reivindicación 7.

9. Una célula hospedante transformada o transfectada con el polinucleótido como se define en la reivindicación 7 o con el vector como se define en la reivindicación 8.

10. Un procedimiento para la producción de un constructo de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula hospedante como se define en la reivindicación 9, en condiciones que permitan la expresión del constructo de anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y recuperar del cultivo el constructo de anticuerpo producido.

11. Una composición farmacéutica que comprende un constructo de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o producido según el procedimiento de la reivindicación 10.

12. El constructo de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o producido según el procedimiento de la reivindicación 10, para uso en la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad tumoral o cancerosa, o una enfermedad de cáncer metastásico.

13. El constructo de anticuerpo para uso según la reivindicación 12, en el que la enfermedad tumoral o cancerosa se selecciona del grupo que consiste en glioblastoma, astrocitoma, meduloblastomas, carcinomas de mama, carcinomas de pulmón de células no pequeñas, carcinomas de ovario, carcinomas de próstata, carcinomas del sistema nervioso central, o una enfermedad de cáncer metastásico derivada de cualquiera de los anteriores.

14. El constructo de anticuerpo para uso según la reivindicación 12, en el que el la enfermedad tumoral o cancerosa es un glioblastoma multiforme (GBM).

15. Un kit que comprende un constructo de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un constructo de anticuerpo producido según el procedimiento de la reivindicación 10, un polinucleótido como se define en la reivindicación 7, un vector como se define en la reivindicación 8, y/o una célula hospedante como se define en la reivindicación 9.