ES2884211T3 - Construcciones de anticuerpos biespecíficos que unen DLL3 y CD3 - Google Patents

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Abstract

Una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a DLL3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T y CD3 de macaco, en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 260, en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 258, en donde el primer dominio de unión comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionada del grupo que consiste en: a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 31, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 32, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 33, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 34, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 35 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 36; b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 41, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 42, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 43, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 44, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 45 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 46; c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 51, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 52, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 53, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 54, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 55 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 56; d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 61, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 62, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 63, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 64, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 65 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 66; e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 71, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 72, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 73, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 74, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 75 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 76; f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 81, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 82, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 83, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 84, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 85 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 86; g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 91, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 92, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 93, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 94, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 95 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 96; h) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 101, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 102, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 103, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 104, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 105 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 106; e i) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 111, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 112, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 113, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 114, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 115 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 116.

Description

DESCRIPCIÓN
Construcciones de anticuerpos biespecíficos que unen DLL3 y CD3
La presente invención se refiere a una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a DLL3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T como se define en las reivindicaciones. Además, la invención proporciona un polinucleótido que codifica la construcción de anticuerpo, un vector que comprende dicho polinucleótido y una célula huésped transformada o transfectada con dicho polinucleótido o vector como se define en las reivindicaciones. Además, la invención proporciona un procedimiento para la producción de la construcción de anticuerpo de la invención, un uso médico de dicha construcción de anticuerpo y un kit que comprende dicha construcción de anticuerpo como se define en las reivindicaciones.
El cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) es una forma agresiva de cáncer de pulmón con un mal pronóstico y opciones terapéuticas limitadas, que representa aproximadamente el 15% de todos los cánceres de pulmón recientemente diagnosticados y equivale a aproximadamente 25.000 casos nuevos en los EE.UU. y 180.000 casos nuevos en todo el mundo al año. Las tasas de supervivencia se han mantenido bajas durante varias décadas, y solo el 5% de los pacientes con SCLC sobreviven cinco años, en gran parte debido a la falta de nuevas terapias para combatir esta forma de cáncer de pulmón. La mayoría de los pacientes presentan una enfermedad en estadio extenso, mientras que aproximadamente un tercio de los pacientes presentan una enfermedad en estadio limitado, definido por la presencia de tumores en un solo lado del tórax y que encajan en un solo campo de radiación. Estos estadios afectan a los regímenes terapéuticos disponibles, con enfermedad en estadio limitado tratada con quimioterapia y radiación y enfermedad en estadio extenso tratada con quimioterapia sola. Los tumores metastásicos diseminados con características similares al linfoma son un sello distintivo del SCLS. El primer diagnóstico conocido de pacientes con SCLC lo describió como una enfermedad del sistema linfático, que no se reconoció como cáncer de pulmón hasta 1926, lo que destaca parte de la naturaleza única de los tumores de SCLC en comparación con otros tumores sólidos.
Los pacientes suelen responder bien a la terapia actual de primera línea, que incluye etopósido y cisplatino, pero invariablemente recaen rápidamente con la enfermedad quimiorresistente, para la cual no hay opciones terapéuticas disponibles actualmente. El pronóstico en el entorno refractario recidivante es extremadamente precario, con una progresión rápida de la enfermedad y una supervivencia mediana corta de menos de seis meses. Además, los pacientes con SCLC tienen altas tasas de comorbilidades, que incluyen hipertensión, enfermedad cardíaca, diabetes y síndromes paraneoplásicos. Estos, junto con la edad típicamente avanzada de los pacientes con SCLC, afectan a la capacidad de los pacientes para soportar regímenes de quimioterapia severos, lo que limita adicionalmente las opciones de tratamiento.
Una modalidad de anticuerpo biespecífico, que comprende un scFv que reconoce CD3 expresado en células T y otro scFv que reconoce un antígeno asociado al tumor, ha mostrado una eficacia prometedora en la clínica, con altas tasas de respuesta en neoplasias hematológicas malignas, tales como B-ALL refractaria (Topp, M.S. et al. Blood, 2012. 120 (26): p. 5185-5187), resultando en la aprobación de Blincyto. Si bien aún no se ha demostrado la eficacia de las terapias que implican células T en una indicación de tumor sólido, el SCLC puede representar una indicación de tumor sólido prometedora para la modalidad de anticuerpo biespecífico diana del tumor CD3 x, dada la naturaleza diseminada de la enfermedad. Por lo tanto, un acoplador de células T biespecífico que dirige las células T contra un antígeno tumoral específico presenta una nueva oportunidad como una nueva opción terapéutica en el tratamiento del SCLC.
DLL3 se identificó actualmente como un antígeno tumoral específico para SCLC mediante secuenciación de próxima generación, comparando la prevalencia de ARNm de DLL3 en un panel de tumores primarios de pacientes y una gran colección de tejidos normales. El nivel de expresión de DLL3 en tumores SCLC fue moderado, pero muy prevalente, con aproximadamente el 90% de los tumores analizados mostrando evidencia de la expresión de DLL3 por RNA-seq. A diferencia de los tumores de SCLC, los tejidos normales mostraron una expresión muy baja de la transcripción de DLL3, con niveles pequeños detectados en los testículos, el nervio óptico y el cerebelo. La comparación de líneas celulares de SCLC y tumores por RNA-seq mostró niveles de expresión similares, mientras que la cuantificación de la expresión de DLL3 en la superficie celular en líneas celulares de SCLC indicó niveles de expresión por debajo de 5000 DLL3 por célula, con niveles de expresión típicos por debajo de 2000 DLL3/célula. La expresión de la proteína DLL3 fue confirmada por IHC, en que el 86% de los tumores de SCLC mostraron tinción positiva para DLL3, con un patrón de tinción homogéneo y membranoso. Aparte de una tinción muy tenue en el cerebelo, todos los demás tejidos normales fueron negativos para la tinción de DLL3.
DLL3 es un ligando Notch no canónico, que funciona de manera autónoma celular para inhibir la señalización de Notch, uniéndose a Notch en posición cis, bloqueando así las interacciones de célula a célula y la internalización de Notch en la célula diana, un sello distintivo de la señalización de Notch canónica. La función principal de DLL3 es la somitogénesis durante el desarrollo embrionario. Los ratones con inactivaciones de DLL3 muestran defectos segmentarios en el esqueleto axial y el desarrollo craneal y neuronal. Los defectos de patrón somítico también se observan en seres humanos con determinadas mutaciones de DLL3 de la línea germinal, lo que resulta en una afección denominada disostosis espondilocostal.
DLL3 ha sido propuesta previamente en métodos para diagnosticar y tratar el glioma, además del SCLC, utilizando un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) (documento WO 2013/126746). El uso de un enfoque basado en ADC para DLL3 puede tener limitaciones, dados los bajos niveles de expresión de la proteína en la superficie celular y el rendimiento reducido de los ADCs contra dianas con baja expresión. Además, las moléculas de ADC muestran a menudo toxicidad relacionada con la ojiva libre, probablemente como resultado de la degradación del enlazador, lo que da como resultado limitaciones de dosis máxima tolerada y potenciales impactos sobre la eficacia no relacionados con la diana elegida para el anticuerpo. Es menos probable que esto sea un problema para una molécula biespecífica que se aplica a las células T, modificada para acoplar a DLL3 y CD3 simultáneamente, dada la sensibilidad requerida de las células T para sus dianas, y se ha demostrado una citotoxicidad in vitro muy potente en líneas celulares que expresan varios cientos de proteínas diana por célula. Adicionalmente, el tamaño habitualmente más pequeño de una construcción de anticuerpo que se acopla a células T biespecíficas en comparación con un anticuerpo normal (IgG de longitud completa) puede mejorar la penetración tisular y aumentar la potencia debido al acoplamiento más eficiente de las dianas DLL3 y CD3, lo que resulta en una formación de sinapsis mejorada entre la célula T y la célula tumoral diana.
El SCLC sigue siendo una importante necesidad médica insatisfecha y se requieren nuevas opciones terapéuticas para mejorar las perspectivas de esta considerable población de pacientes. La modalidad de anticuerpo biespecífico arriba comentada está clínicamente validada y, como tal, una construcción de anticuerpo que fija como objetivo DLL3 y CD3 representa una nueva posibilidad prometedora para el tratamiento del SCLC y una oportunidad para mejorar la supervivencia de los pacientes que padecen esta afección. El documento WO2014/125273 describe reactivos de unión a DLL3 para el tratamiento y/o diagnóstico de cáncer. En particular, el documento WO2014/125273 describe la lisis celular de células que expresan DMS79 DLL3 mediante la activación de células T por anticuerpos policlonales anti-DLL3-anti-CD3 biespecíficos. Como todavía existe la necesidad de disponer de opciones adicionales para el tratamiento de enfermedades tumorales o cancerosas relacionadas con la sobre-expresión de DLL3, se proporcionan medios y métodos para la solución de este problema en forma de una construcción de anticuerpo biespecífico con un dominio de unión dirigido a DLL3 y un segundo dominio de unión dirigido a CD3 en células T.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a la DLL3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a la CD3 humana en la superficie de una célula T, en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se muestra en SEQ ID NO: 260, y en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se muestra en SEQ ID NO: 258 como se define en las reivindicaciones. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a DLL3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T, en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se muestra en SEQ ID NO: 260, y en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se muestra en SEQ ID NO: 259 como se define en las reivindicaciones.
Debe tenerse en cuenta que, como se utiliza en esta memoria, las formas en singulares "un", "una" y "el", “la” incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un reactivo" incluye uno o más de dichos reactivos diferentes y la referencia al "método" incluye una referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos en la técnica que podrían modificarse o sustituirse por los métodos descritos en esta memoria.
A menos que se indique lo contrario, la expresión «al menos» que precede a una serie de elementos debe entenderse que se refiere a cada uno de los elementos de la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar, utilizando únicamente una experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita en esta memoria. Se pretende que equivalentes de este tipo estén incluidos en la presente invención.
El término "y/o" siempre que se utilice en esta memoria incluye el significado de "y", "o" y "todos o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término".
El término "aproximadamente" o "alrededor", tal como se utiliza en esta memoria significa dentro de ± 20%, preferiblemente dentro de ± 15%, más preferiblemente dentro de ± 10% y lo más preferiblemente dentro de ± 5% de un valor o intervalo dado.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprenden" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapa. Cuando se utiliza en esta memoria, la expresión "que comprende" puede sustituirse con la expresión "que contiene" o "que incluye" o, a veces, cuando se utiliza en esta memoria, con la expresión "que tiene".
Cuando se utiliza en esta memoria, "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se utiliza en esta memoria, "que consiste esencialmente en" no excluye materiales o etapas que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación.
En cada caso en esta memoria, cualquiera de las expresiones "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" puede reemplazarse por cualquiera de las otras dos expresiones.
La expresión "construcción de anticuerpo" se refiere a una molécula en la que la estructura y/o función se basa(n) en la estructura y/o función de un anticuerpo, por ejemplo, de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o entera. Por lo tanto, una construcción de anticuerpo es capaz de unirse a su diana o antígeno específico. Además, una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención comprende los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo que permiten la unión de la diana. Este requisito mínimo se define por la presencia de al menos tres CDRs de la cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y las tres CDRs de la cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH), es decir, de todas las seis CDRs. Los anticuerpos en los que se basan las construcciones de acuerdo con la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, recombinantes, quiméricos, desinmunizados, humanizados y humanos.
Dentro de la definición de "construcciones de anticuerpos" de acuerdo con la invención se encuentran los anticuerpos de longitud completa o enteros que también incluyen anticuerpos de camélidos y otros anticuerpos de inmunoglobulina generados por métodos o procedimientos biotecnológicos o de modificación de proteínas. Estos anticuerpos de longitud completa pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, recombinantes, quiméricos, desinmunizados, humanizados y humanos. También dentro de la definición de "construcciones de anticuerpos" están los fragmentos de anticuerpos de longitud completa, tales como VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 o "r IgG" ("medio anticuerpo"). Las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención también pueden ser fragmentos modificados de anticuerpos, también denominados variantes de anticuerpos, tales como scFv, di-scFv o bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-cremallera, scFab, Fab2, Fab3, diacuerpos, diacuerpos de cadena sencilla, diacuerpos en tándem (Tandab), di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem, "minicuerpos" ejemplificados por una estructura que es la siguiente: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2, ((scFv)2-CH3 CH3), ((scFv)2-CH3) o (scFv-CH3-scFv)2, multicuerpos tales como triacuerpos o tetracuerpos, y anticuerpos de un solo dominio, tales como nanocuerpos o anticuerpos de un solo dominio variable que comprenden simplemente un dominio variable, que puede ser VHH, VH o VL, que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones o dominios V. Formatos preferidos adicionales de las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención son cuerpos cruzados, maxicuerpos, construcciones hetero Fc y construcciones mono Fc. Más adelante se describirán en esta memoria ejemplos de esos formatos.
Un dominio de unión puede comprender típicamente una región variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo; sin embargo, no tiene por qué comprender ambos. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones VH y a menudo conservan alguna función de unión a antígeno del dominio de unión a antígeno intacto. Ejemplos adicionales para el formato de fragmentos de anticuerpos, variantes de anticuerpos o dominios de unión incluyen (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; (2) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región de bisagra; (3) un fragmento Fd que tiene los dos dominios VH y CH1; (4) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (5) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que tiene un dominio VH; (6) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, y (7) un Fv de cadena sencilla (scFv), siendo este último preferido (por ejemplo, derivado de una colección de scFv). Ejemplos de realizaciones de construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención se describen, p. ej., en los documentos WO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014/0302037, WO2014/144722, WO 2014/151910 y WO 2015/048272.
Además, la definición de la expresión "construcción de anticuerpo" incluye construcciones monovalentes, bivalentes y polivalentes / multivalentes y, por lo tanto, construcciones monoespecíficas, que se unen específicamente a una sola estructura antigénica, así como construcciones biespecíficas y poliespecíficas / multiespecíficas, que se unen específicamente a más de una estructura antigénica, p. ej., dos, tres o más, a través de distintos dominios de unión. Además, la definición de la expresión "construcción de anticuerpo" incluye moléculas que consisten en una sola cadena polipeptídica, así como moléculas que consisten en más de una cadena polipeptídica, cuyas cadenas pueden ser idénticas (homodímeros, homotrímeros u homo-oligómeros) o diferentes (heterodímero, heterotrímero o heterooligómero). Ejemplos de los anticuerpos arriba identificados y variantes o derivados de los mismos se describen, inter alia en Harlow y Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) y Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann y Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2a ed. 2010 y Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.
Las construcciones de anticuerpos de la presente invención son preferiblemente "construcciones de anticuerpos generadas in vitro". Esta expresión se refiere a una construcción de anticuerpo de acuerdo con la definición anterior, en que toda o parte de la región variable (p. ej., al menos una CDR) se genera en una selección de células no inmunes, p. ej., una presentación de fagos in vitro, chip de proteína o cualquier otro método en el que se puede testar la capacidad de las secuencias candidatas de unirse a un antígeno. Por lo tanto, esta expresión excluye preferiblemente las secuencias generadas únicamente por transposición genómica en una célula inmune en un animal. Un "anticuerpo recombinante" es un anticuerpo elaborado mediante el uso de tecnología de ADN recombinante o ingeniería genética.
La expresión "anticuerpo monoclonal" (mAb) o construcción de anticuerpo monoclonal, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales y/o post-modificaciones de traducción (p. ej., isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico o determinante en el antígeno, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (o epítopos). Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque son sintetizados por el cultivo de hibridoma y, por tanto, no están contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador «monoclonal» indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo por método particular alguno.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede utilizarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar se pueden producir mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975), o se pueden producir mediante métodos de ADN recombinante (véase, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 4.816.567). Ejemplos de técnicas adicionales para producir anticuerpos monoclonales humanos incluyen la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técnica del hibridoma EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77- 96).
A continuación, los hibridomas se pueden rastrear utilizando métodos estándares, tales como el ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) y el análisis de resonancia de plasmones superficial (BIACORE™), para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno específico. Puede utilizarse cualquier forma del antígeno relevante como inmunógeno, p. ej., antígeno recombinante, formas que se producen de forma natural, cualquier variante o fragmento del mismo, así como un péptido antigénico del mismo. La resonancia de plasmones superficiales, tal como se emplea en el sistema BIAcore puede utilizarse para aumentar la eficacia de los anticuerpos de fago que se unen a un epítopo de un antígeno diana, tal como DLL3 o CD3 épsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).
Otro método ejemplar para preparar anticuerpos monoclonales incluye el rastreo de colecciones de expresión de proteínas, p. ej., colecciones de presentación de fagos o presentación de ribosomas. La presentación de fagos se describe, por ejemplo, en Ladner et al., Patente de EE.Uu . N° 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).
Además del uso de colecciones de presentación, el antígeno relevante puede utilizarse para inmunizar un animal no humano, p. ej., un roedor (tal como un ratón, hámster, conejo o rata). En una realización, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible modificar cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los loci de Ig humana (inmunoglobulina). Utilizando la tecnología de hibridomas, pueden producirse y seleccionarse anticuerpos monoclonales específicos para antígeno derivados de los genes con la especificidad deseada. Véase, p. ej., XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21, documentos US 2003-0070185, WO 96/34096 y WO 96/33735.
También puede obtenerse un anticuerpo monoclonal de un animal no humano y luego modificarse, p. ej., humanizarse, desinmunizarse, volverse quimérico, etc., utilizando técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Ejemplos de construcciones de anticuerpos modificados incluyen variantes humanizadas de anticuerpos no humanos, anticuerpos "madurados por afinidad" (véase, p. ej., Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) y Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)) y mutantes de anticuerpos con función o funciones efectoras alteradas (véase, p. ej., Patente de EE.UU. 5.648.260, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit. y Little (2009), loc. cit.).
En inmunología, la maduración por afinidad es el proceso mediante el cual las células B producen anticuerpos con mayor afinidad por el antígeno durante el curso de una respuesta inmune. Con exposiciones repetidas al mismo antígeno, un huésped producirá anticuerpos de afinidades sucesivamente mayores. Al igual que el prototipo natural, la maduración por afinidad in vitro se basa en los principios de mutación y selección. La maduración por afinidad in vitro se ha utilizado con éxito para optimizar anticuerpos, construcciones de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Las mutaciones aleatorias dentro de las CDRs se introducen utilizando radiación, mutágenos químicos o PCR propensa a errores. Además, la diversidad genética se puede incrementar mediante la transposición de la cadena. Dos o tres rondas de mutación y selección utilizando métodos de presentación tales como la presentación de fagos generalmente dan como resultado fragmentos de anticuerpos con afinidades en el intervalo nanomolar bajo.
Un tipo preferido de variación por sustitución de aminoácidos de las construcciones de anticuerpos implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (p. ej., un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la o las variantes resultantes seleccionadas para un desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo'parental a partir del cual se generan. Una forma conveniente de generar variantes de sustitución de este tipo implica la maduración por afinidad utilizando presentación de fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (p. ej., 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de anticuerpos así generadas se presentan de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos en forma de fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada una de las partículas. Las variantes presentadas en fagos se rastrean luego para determinar su actividad biológica (p. ej., afinidad de unión) tal como se describe en esta memoria. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para la modificación, se puede realizar una mutagénesis de exploración de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión del antígeno. Alternativa, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el dominio de unión y, p. ej., la DLL3 humana. Residuos de contacto de este tipo y residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en esta memoria. Una vez que se generan variantes de este tipo, el panel de variantes se somete a rastreo tal como se describe en esta memoria y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para su posterior desarrollo.
Los anticuerpos monoclonales y las construcciones de anticuerpos de la presente invención incluyen específicamente anticuerpos «quiméricos» (inmunoglobulinas) en las que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la o las cadenas es/son idénticas u homólogas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que ya que exhiben la actividad biológica deseada (Patente de EE.UU. N° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en esta memoria incluyen anticuerpos "primitizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (p. ej., mono del Viejo Mundo, simio, etc.) y secuencias de región constante humana. Se ha descrito una diversidad de enfoques para preparar anticuerpos quiméricos. Véase, p. ej., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América 81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., Patente de EE.UU. N° 4.816.567; Boss et al., Patente de EE.UU. N° 4.816.397; Tanaguchi et al., documentos EP 0171496; EP 0173494; y GB 2177096.
Un anticuerpo, construcción de anticuerpo, fragmento de anticuerpo o variante de anticuerpo también puede modificarse mediante deleción específica de epítopos de células T humanas (un método denominado "desinmunización") mediante los métodos descritos, por ejemplo, en los documentos WO 98/52976 o WO 00/34317. Brevemente, los dominios variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo pueden analizarse en busca de péptidos que se unen a MHC de clase II; estos péptidos representan epítopos de células T potenciales (como se define en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de epítopos de células T potenciales, se puede aplicar un enfoque de modelado informático denominado "enhebrado de péptidos" y, además, se puede buscar en una base de datos de péptidos de unión a MHC de clase II humanos los motivos presentes en las secuencias VH y VL, como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos principales de DR del MHC de clase II y, por tanto, constituyen epítopos potenciales de células T. Los epítopos de células T potenciales detectados pueden eliminarse sustituyendo pequeños números de residuos de aminoácidos en los dominios variables, o preferiblemente, mediante sustituciones de un solo aminoácido. Típicamente, se realizan sustituciones conservadoras. A menudo, pero no exclusivamente, se puede utilizar un aminoácido común a una posición en las secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana. Las secuencias de la línea germinal humana se describen, p. ej. en Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol.
16 (5): 237-242; y Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14:4628- 4638. El directorio V BASE proporciona un directorio completo de secuencias de regiones variables de inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido). Estas secuencias se pueden utilizar como una fuente de secuencia humana, p. ej., para regiones marco y CDRs. También se pueden utilizar regiones de armazón humano consenso, por ejemplo, como se describe en la Patente de EE.UU. N° 6.300.064.
Los anticuerpos, construcciones de anticuerpos, variantes o fragmentos de los mismos "humanizados" (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) son anticuerpos o inmunoglobulinas de secuencias principalmente humanas, que contienen (a) secuencia(s) mínima(s) derivada(s) de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable (también CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (p. ej., roedor) (anticuerpo donante), tales como ratón, rata, hámster o conejo que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, residuos de la región marco (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, "anticuerpos humanizados", tal como se utiliza en esta memoria, también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
Pueden generarse anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos reemplazando secuencias del dominio variable Fv que no están directamente implicadas en la unión de antígenos con secuencias equivalentes de dominios variables Fv humanos. Morrison (1985) Science 229: 1202-1207 proporciona métodos ejemplares para generar anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos; por Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214; y por los documentos US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; y US 6.407.213. Esos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican todo o parte de los dominios variables Fv de inmunoglobulina de al menos uno de una cadena pesada o ligera. Dichos ácidos nucleicos pueden obtenerse de un hibridoma que produzca un anticuerpo contra una diana predeterminada, tal como se describió arriba, así como de otras fuentes. El ADN recombinante que codifica la molécula de anticuerpo humanizado puede luego clonarse en un vector de expresión apropiado.
Anticuerpos humanizados también se pueden producir utilizando animales transgénicos, tales como ratones, que expresan genes de cadena pesada y ligera humana, pero que son incapaces de expresar los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endógena de ratón. Winter describe un método de injerto de CDR ejemplar que puede utilizarse para preparar los anticuerpos humanizados descritos en esta memoria (Patente de EE.UU. N° 5.225.539). Todas las CDRs de un anticuerpo humano particular pueden reemplazarse por al menos una parte de una CDR no humana, o solo algunas de las CDRs pueden reemplazarse por CDRs no humanas. Solo es necesario reemplazar el número de CDRs requeridas para la unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.
Un anticuerpo humanizado puede optimizarse mediante la introducción de sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia consenso, sustituciones de la línea germinal y/o mutaciones inversas. Moléculas de inmunoglobulina alteradas de este tipo se pueden preparar mediante cualquiera de varias técnicas conocidas en la técnica (p. ej., Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América, 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982, y documento Ep 239400).
La expresión "anticuerpo humano", "construcción de anticuerpo humano" y "dominio de unión humano" incluye anticuerpos, construcciones de anticuerpos y dominios de unión que tienen regiones de anticuerpos, tales como regiones o dominios variables y constantes que corresponden sustancialmente a secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas en la técnica. incluyendo, por ejemplo, los descritos por Kabat et al. (1991) (loc. cit.).). Los anticuerpos, las construcciones de anticuerpos o los dominios de unión humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p. ej. mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDRs y, en particular, en CDR3. Los anticuerpos, las construcciones de anticuerpos o los dominios de unión humanos pueden tener al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones reemplazadas por un residuo de aminoácido que no está codificado por la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana. La definición de anticuerpos humanos, construcciones de anticuerpos y dominios de unión, tal como se utiliza en esta memoria también contempla anticuerpos completamente humanos, que incluyen solo secuencias humanas de anticuerpos alteradas no artificialmente y/o genéticamente, ya que se pueden derivar utilizando tecnologías o sistemas tales como el Xenomouse.
En algunas realizaciones, las construcciones de anticuerpos de la invención son construcciones de anticuerpos "aisladas" o "sustancialmente puras". "Aislado" o "sustancialmente puro", cuando se utiliza para describir las construcciones de anticuerpos descritas en esta memoria, significa una construcción de anticuerpos que ha sido identificada, separada y/o recuperada de un componente de su entorno de producción. Preferiblemente, la construcción de anticuerpo está libre o sustancialmente libre de asociación con todos los demás componentes de su entorno de producción. Los componentes contaminantes de su entorno de producción, tales como el resultante de células transfectadas recombinantes, son materiales que típicamente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. Las construcciones de anticuerpos pueden, p. ej., constituir al menos aproximadamente el 5%, o al menos aproximadamente el 50% en peso de la proteína total en una muestra dada. Se entiende que la proteína aislada puede constituir del 5% al 99,9% en peso del contenido total de proteína, dependiendo de las circunstancias. El polipéptido se puede preparar a una concentración significativamente mayor mediante el uso de un promotor inducible o un promotor de alta expresión, de modo que se produzca a niveles de concentración incrementados. La definición incluye la producción de una construcción de anticuerpo en una amplia diversidad de organismos y/o células huésped que se conocen en la técnica. En realizaciones preferidas, la construcción de anticuerpo se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. Sin embargo, normalmente se preparará una construcción de anticuerpo aislado mediante al menos una etapa de purificación.
La expresión "dominio de unión" caracteriza en relación con la presente invención un dominio que (específicamente) se une a / interactúa con / reconoce un epítopo diana dado o un sitio diana dado en las moléculas diana (antígenos), aquí: DLL3 y CD3, respectivamente. La estructura y función del primer dominio de unión (que reconoce a DLL3), y preferiblemente también la estructura y/o función del segundo dominio de unión (que reconoce a CD3), se basa(n) en la estructura y/o función de un anticuerpo, p. ej., de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o completa. De acuerdo con la invención, el primer dominio de unión se caracteriza por la presencia de tres CDRs de la cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y tres CDRs de la cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). El segundo dominio de unión preferiblemente también comprende los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo que permiten la unión de la diana. Más preferiblemente, el segundo dominio de unión comprende al menos tres CDRs de la cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y/o tres CDRs de la cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). Se prevé que el primer y/o segundo dominio de unión se produzca o se pueda obtener mediante métodos de rastreo de fagotecas o presentación de fagos en lugar de injertar secuencias de CDR de un anticuerpo (monoclonal) preexistente en un armazón.
De acuerdo con la presente invención, los dominios de unión están en forma de uno o más polipéptidos. Dichos polipéptidos pueden incluir partes proteicas y partes no proteicas (p. ej., enlazadores químicos o agentes reticulantes químicos tales como glutaraldehído). Las proteínas (incluidos fragmentos de las mismas, preferiblemente fragmentos biológicamente activos, y péptidos, que habitualmente tienen menos de 30 aminoácidos) comprenden dos o más aminoácidos acoplados entre sí mediante un enlace peptídico covalente (dando como resultado una cadena de aminoácidos). El término "polipéptido", tal como se utiliza en esta memoria, describe un grupo de moléculas, que habitualmente consiste en más de 30 aminoácidos. Los polipéptidos pueden formar, además, multímeros tales como dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir, que consisten en más de una molécula de polipéptido. Las moléculas de polipéptido que forman este tipo de dímeros, trímeros, etc. pueden ser idénticas o no idénticas. Las correspondientes estructuras de orden superior de multímeros de este tipo se denominan, en consecuencia, homodímeros o heterodímeros, homotrímeros o heterotrímeros, etc. Un ejemplo de un heteromultímero es una molécula de anticuerpo que, en su forma que aparece en la naturaleza, consiste en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas. Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" también se refieren a péptidos / polipéptidos / proteínas modificados de forma natural, en donde la modificación se efectúa, p. ej., mediante modificaciones postraduccionales, tales como glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Un "péptido", "polipéptido" o "proteína" cuando se le alude en esta memoria también puede modificarse químicamente, tal como pegilarse. Modificaciones de este tipo son bien conocidas en la técnica y se describen más adelante en esta memoria.
Preferiblemente, el dominio de unión que se une a DLL3 y/o el dominio de unión que se une a CD3 son dominios de unión humanos. Los anticuerpos y las construcciones de anticuerpos que comprenden al menos un dominio de unión humano evitan algunos de los problemas asociados con los anticuerpos o las construcciones de anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes no humanas tales como de roedores (p. ej., murino, rata, hámster o conejo). La presencia de proteínas de este tipo derivadas de roedores puede conducir al rápido aclaramiento de los anticuerpos o construcciones de anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo o la construcción de anticuerpos por parte de un paciente. Para evitar el uso de anticuerpos o construcciones de anticuerpos derivados de roedores, se pueden generar anticuerpos / construcciones de anticuerpos humanos o completamente humanos mediante la introducción de la función de anticuerpos humanos en un roedor, de modo que el roedor produzca anticuerpos completamente humanos.
La capacidad de clonar y reconstruir loci humanos del tamaño de una megabase en YACs e introducirlos en la línea germinal del ratón proporciona un enfoque poderoso para dilucidar los componentes funcionales de loci muy grandes o mapeados de forma burda, así como para generar modelos útiles de enfermedades humanas. Además, el uso de una tecnología de este tipo para la sustitución de loci de ratón con sus equivalentes humanos podría proporcionar conocimientos únicos sobre la expresión y regulación de productos génicos humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas y su participación en la inducción y progresión de enfermedades.
Una aplicación práctica importante de una estrategia de este tipo es la "humanización" del sistema inmune humoral del ratón. La introducción de loci de inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los que los genes de Ig endógenos han sido inactivados ofrece la oportunidad de estudiar los mecanismos subyacentes a la expresión programada y al ensamblaje de anticuerpos, así como su papel en el desarrollo de las células B. Además, dicha estrategia podría proporcionar una fuente ideal para la producción de anticuerpos monoclonales (mAbs) completamente humanos - un hito importante para cumplir la promesa de la terapia con anticuerpos en enfermedades humanas. Se espera que los anticuerpos o las construcciones de anticuerpos completamente humanos minimicen las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a los mAbs de ratón o derivatizados de ratón y, por lo tanto, aumenten la eficacia y seguridad de las construcciones de anticuerpos/anticuerpos administradas. Se puede esperar que el uso de anticuerpos o construcciones de anticuerpos completamente humanos proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación, autoinmunidad y cáncer, que requieren administraciones repetidas de compuestos.
Un enfoque hacia este objetivo fue diseñar cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los loci de Ig humana en previsión de que este tipo de ratones producirían un gran repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de anticuerpos de ratón. Los grandes fragmentos de Ig humana preservarían la gran diversidad genética variable, así como la regulación adecuada de la producción y expresión de anticuerpos. Al explotar la maquinaria del ratón para la diversificación y selección de anticuerpos y la falta de tolerancia inmunológica a las proteínas humanas, el repertorio de anticuerpos humanos reproducidos en estas cepas de ratón debería producir anticuerpos de alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluidos los antígenos humanos. Utilizando la tecnología de hibridomas, se podrían producir y seleccionar fácilmente mAbs humanos específicos para antígenos con la especificidad deseada. Esta estrategia general se demostró en relación con la generación de las primeras cepas de ratón XenoMouse (véase Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)). Las cepas de XenoMouse se modificaron con cromosomas artificiales de levadura (YACs) que contenían fragmentos de configuración de la línea germinal de un tamaño de 245 kb y 190 kb del locus de la cadena pesada humana y del locus de la cadena ligera kappa, respectivamente, que contenían secuencias de la región central variable y constante. Los YACs que contienen Ig humana demostraron ser compatibles con el sistema de ratón tanto para el reordenamiento como para la expresión de anticuerpos y eran capaces de sustituir los genes de Ig de ratón inactivados. Esto se demostró por su capacidad para inducir el desarrollo de células B, para producir un repertorio humano de tipo adulto de anticuerpos completamente humanos y para generar mAbs humanos específicos para antígenos. Estos resultados también sugirieron que la introducción de porciones más grandes de los loci de Ig humana que contienen un mayor número de genes V, elementos reguladores adicionales y regiones constantes de Ig humana podría recapitular sustancialmente el repertorio completo que es característico de la respuesta humoral humana a la infección y la inmunización. El trabajo de Green et al. se amplió recientemente a la introducción de más de aproximadamente el 80% del repertorio de anticuerpos humanos mediante la introducción de fragmentos YAC de configuración de línea germinal de tamaño megabase de los loci de cadena pesada humana y loci de cadena ligera kappa, respectivamente. Véase, Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).
La producción de los ratones XenoMouse se comenta y describe adicionalmente en la patente de EE.UU. N° 6.673.986, las Pat. de EE.UU. N° 6.162.963; 6.150.584; 6.114.598; 6.075.181 y 5.939.598, así como las solicitudes de patente de EE.UU. subyacentes y las Patentes japonesas N°s 3068 180 b 2, 3068 506 B2 y 3068 507 B2. Véase también Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), documentos EP 0463 151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310 y WO 03/47336.
En un enfoque alternativo, otros, incluido GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque de "minilocus". En el enfoque de minilocus, se imita un locus de Ig exógeno mediante la inclusión de trozos (genes individuales) del locus de Ig. Por lo tanto, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu y una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) se transforman en una construcción para la inserción en un animal. Este enfoque se describe en la Pat. de EE.UU. N° 5.545.807 expedida a Surani et al. y la Pat. de EE.UU. N25.545.806; 5,625,825; 5.625.126; 5.633.425; 5,661,016; 5.770.429; 5.789.650; 5.814.318; 5.877.397; 5.874.299; y 6.255.458 cada una expedida a Lonberg y Kay, Pat, de EE.UU. 5.591.669 y 6.023.010 expedida a Krimpenfort y Berns, Pat. de EE.UU. N° 5.612.205; 5.721.367; y 5.789.215 expedida a Berns et al., y la Pat. de EE.UU. N° 5.643.763 expedida a Choi y Dunn. Este enfoque se describe con más detalle en GenPharm International Pat. de EE.UU. N°s 5.569.825, 5.789.650, 5.545.806, 5.661.016, 5.814.318 y 5.364.079, así como las solicitudes de patente subyacentes. Véanse también los documentos EP 0546 073 B1, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884 y la Pat de EE.UU. N° 5.981.175. Véanse, además, Taylor et al. (1992), Chen et al. (1993), Tuaillon et al. (1993), Choi et al. (1993), Lonberg et al. (1994), Taylor et al. (1994) y Tuaillon et al. (1995), Fishwild et al. (1996).
Kirin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los que, a través de la fusión de microcélulas, se han introducido grandes trozos de cromosomas o cromosomas completos. Véanse las Solicitudes de Patente Europea N°s 773288 y 843961. Xenerex Biosciences está desarrollando una tecnología para la generación potencial de anticuerpos humanos. En esta tecnología, los ratones SCID se reconstituyen con células linfáticas humanas, p. ej., células B y/o T. Luego, los ratones son inmunizados con un antígeno y pueden generar una respuesta inmune contra el antígeno. Véanse las Pat. de EE.UU. N° 5.476.996; 5.698.767; y 5.958.765.
Las respuestas de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) han conducido a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o humanizados de otro modo. Sin embargo, se espera que se observen determinadas respuestas de anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA), particularmente en las utilizaciones crónicas o multidosis del anticuerpo. Por lo tanto, sería deseable proporcionar construcciones de anticuerpos que comprendan un dominio de unión humano contra DLL3 y/o un dominio de unión humano contra CD3 con el fin de viciar preocupaciones y/o efectos de la respuesta de HAMA o HACA.
Las expresiones "(específicamente) se une a", “(específicamente) reconoce", "se dirige (específicamente) a" y "(específicamente) reacciona con” significan de acuerdo con esta invención que un dominio de unión interactúa o interactúa específicamente con un epítopo dado un sitio diana dado en las moléculas diana (antígenos), aquí: DLL3 y CD3, respectivamente.
El término "epítopo" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicamente un dominio de unión, un anticuerpo o inmunoglobulina, o un derivado, fragmento o variante de un anticuerpo o una inmunoglobulina. Un "epítopo" es antigénico y, por lo tanto, al término epítopo se le alude a veces también en esta memoria como "estructura antigénica" o "determinante antigénico". Por lo tanto, el dominio de unión es un "sitio de interacción con el antígeno". También se entiende que dicha unión/interacción define un "reconocimiento específico".
"Epítopos" pueden formarse tanto por aminoácidos contiguos como por aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína. Un "epítopo lineal" es un epítopo en el que una secuencia primaria de aminoácidos comprende el epítopo reconocido. Un epítopo lineal incluye típicamente al menos 3 o al menos 4, y más habitualmente, al menos 5 o al menos 6 o al menos 7, por ejemplo, aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos en una secuencia única.
Un "epítopo conformacional", en contraste con un epítopo lineal, es un epítopo en el que la secuencia primaria de los aminoácidos que comprende el epítopo no es el único componente definitorio del epítopo reconocido (p. ej., un epítopo en el que la secuencia primaria de aminoácidos es no necesariamente reconocido por el dominio de unión). Típicamente, un epítopo conformacional comprende un mayor número de aminoácidos con relación a un epítopo lineal. Con respecto al reconocimiento de epítopos conformacionales, el dominio de unión reconoce una estructura tridimensional del antígeno, preferiblemente un péptido o proteína o fragmento del mismo (en el contexto de la presente invención, la estructura antigénica para el primer dominio de unión está comprendida dentro de la proteína DLL3). Por ejemplo, cuando una molécula de proteína se pliega para formar una estructura tridimensional, determinados aminoácidos y/o la cadena principal polipeptídica que forma el epítopo conformacional se yuxtaponen, permitiendo que el anticuerpo reconozca el epítopo. Métodos para determinar la conformación de epítopos incluyen, pero no se limitan a, cristalografía de rayos X, espectroscopía de resonancia magnética nuclear bidimensional (2D-RMN) y espectroscopía de marcación de espín dirigida al sitio y resonancia paramagnética electrónica (EPR).
En lo que sigue se describe un método para el mapeo de epítopos: Cuando una región (un tramo de aminoácidos contiguo) en la proteína DLL3 humana se intercambia / reemplaza por su región correspondiente de un antígeno DLL3 no humano y no primate (p. ej., DLL3 de ratón, pero también podrían concebirse otros, tales como pollo, rata, hámster, conejo, etc.), se espera que ocurra una disminución en la unión del dominio de unión, a menos que el dominio de unión sea de reacción cruzada para la DLL3 no humana, no de primates utilizada. Preferiblemente, dicha disminución es de al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50%; más preferiblemente al menos 60%, 70% u 80%, y lo más preferiblemente 90%, 95% o incluso 100% en comparación con la unión a la región respectiva en la proteína DLL3 humana, por lo que la unión a la región respectiva en la proteína humana, por lo que la unión a la región respectiva en la proteína DLL3 humana se establece en 100%. Se prevé que las quimeras DLL3 humana / DLL3 no humana mencionadas anteriormente se expresen en células CHO. También se prevé que las quimeras DLL3 humana / DLL3 no humana se fusionen con un dominio transmembrana y/o dominio citoplásmico de una proteína unida a membrana diferente, tal como EpCAM.
En un método alternativo o adicional para el mapeo de epítopos, se pueden generar varias versiones truncadas del dominio extracelular de DLL3 humana con el fin de determinar una región específica que sea reconocida por un dominio de unión. En estas versiones truncadas, los diferentes dominios / sub-dominios o regiones DLL3 extracelulares se suprimen gradualmente, comenzando desde el extremo N. Las versiones de DLL3 truncadas que se generaron y utilizaron en el contexto de la presente invención se representan en la Figura 1. Se prevé que las versiones DLL3 truncadas se expresen en células CHO. También se prevé que las versiones DLL3 truncadas se fusionen con un dominio de transmembrana y/o dominio citoplásmico de una proteína unida a membrana diferente, tal como EpCAM. También se prevé que las versiones de DLL3 truncadas abarquen un dominio de péptido señal en su extremo N, por ejemplo, un péptido señal derivado del péptido señal de la cadena pesada de IgG de ratón. Además, se prevé que las versiones de DLL3 truncadas abarquen un dominio v5 en su extremo N (siguiendo al péptido señal) que permite verificar su correcta expresión en la superficie de la célula. Se espera que se produzca una disminución o una pérdida de unión con aquellas versiones de DLL3 truncadas que ya no abarcan la región DLL3 que es reconocida por el dominio de unión. La disminución de la unión es preferiblemente de al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; más preferiblemente de al menos 60%, 70%, 80% y lo más preferiblemente de 90%, 95% o incluso 100%, por lo que la unión a la proteína DLL3 humana completa (o su región o dominio extracelular) se establece en 100%. En el Ejemplo 2 se describe un método para testar esta pérdida de unión.
Un método adicional para determinar la contribución de un residuo específico de un antígeno diana al reconocimiento por una construcción de anticuerpo o dominio de unión es el escaneo de alanina (véase, p. ej., Morrison KL & Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. junio de 2001; 5(3):302-7), en que cada uno de los residuos a analizar se reemplaza por alanina, p. ej., mediante mutagénesis dirigida al sitio. La alanina se utiliza debido a su grupo funcional metilo no voluminoso y químicamente inerte que, no obstante, imita las referencias de estructura secundaria que poseen muchos de los otros aminoácidos. A veces, se pueden utilizar aminoácidos voluminosos, tales como valina o leucina, en los casos en los que se desee la conservación del tamaño de los residuos mutados. El escaneo de alanina es una tecnología madura que ha sido utilizada durante un largo período de tiempo.
La interacción entre el dominio de unión y el epítopo o la región que comprende el epítopo implica que un dominio de unión exhiba una afinidad apreciable por el epítopo / la región que comprende el epítopo en una proteína o antígeno particular (aquí: DLL3 y CD3, respectivamente) y, en general, no exhiba una reactividad significativa con proteínas o antígenos distintos de DLL3 o CD3. "Afinidad apreciable" incluye la unión con una afinidad de aproximadamente 10-6 M (KD) o mayor. Preferiblemente, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es de aproximadamente 10-12 a 10-8 M, 10-12 a 10-9 M, 10-12 a 10-10 M, 10-11 a 10-8 M, preferiblemente de aproximadamente 10-11 a 10-9 M. El que un dominio de unión reaccione específicamente o se una a una diana se puede testar fácilmente, inter alia, comparando la reacción de dicho dominio de unión con una proteína o antígeno diana con la reacción de dicho dominio de unión con proteínas o antígenos distintos de DLL3 o CD3. Preferiblemente, un dominio de unión de la invención no se une esencial o sustancialmente a proteínas o antígenos distintos de DLL3 o CD3 (es decir, el primer dominio de unión no es capaz de unirse a proteínas distintas de DLL3 y el segundo dominio de unión no es capaz de unirse a proteínas distintas de CD3).
La expresión "no se une esencialmente / sustancialmente" o "no es capaz de unirse" significa que un dominio de unión de la presente invención no se une a una proteína o antígeno distinto de DLL3 o CD3, es decir, no muestra una reactividad de más del 30%, preferiblemente no más del 20%, más preferiblemente no más del 10%, de manera particularmente preferida no más del 9%, 8%, 7%, 6% o 5% con proteínas o antígenos distintos de DLL3 o CD3, por lo que la unión a DLL3 o CD3, respectivamente, se establece en 100%.
También se prevé que las construcciones de anticuerpos de la presente invención se unan a una isoforma de DLL3 humana que tiene una o ambas de las siguientes mutaciones puntuales de DLL3: F172C y L218P. Véase el Ejemplo 5.
Se cree que la unión específica se efectúa mediante motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno. Por lo tanto, la unión se consigue como resultado de su estructura primaria, secundaria y/o terciaria, así como como resultado de modificaciones secundarias de dichas estructuras. La interacción específica del sitio de interacción del antígeno con su antígeno específico puede resultar en una simple unión de dicho sitio al antígeno. Además, la interacción específica del sitio de interacción del antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado, alternativa o adicionalmente, el inicio de una señal, p. ej., debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc.
Las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención se unen a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 260, correspondiente a un tramo de aminoácido que abarca las regiones EGF-3 y EGF-4 como se define en las reivindicaciones. También se generaron otros grupos de aglutinantes anti-DLL3 y sus especificidades de unión a DLL3 se identificaron durante el mapeo de epítopos (véase el Ejemplo 2).
El grupo más grande de aglutinantes generados reconoció un epítopo dentro del dominio DSL. Sin embargo, ninguna de esas construcciones de anticuerpos cumplió los criterios de suficiente actividad citotóxica en un ensayo inicial de citotoxicidad basado en 51Cr de 18 horas con células T CD8+ humanas estimuladas como células efectoras y células CHO transfectadas con hu DLL3 como células diana.
En un ensayo de citotoxicidad adicional inicial de 48 horas basado en FACS (utilizando PBMC humanas no estimuladas como células efectoras y células CHO transfectadas con hu DLL3 como células diana), los aglutinantes que reconocieron un epítopo de DLL3 dentro del extremo N de la proteína tenían valores de CE50 entre 1455 y 1580 pM. En el presente contexto, estos valores no se consideran adecuados para anticuerpos biespecíficos que se proporcionan para un uso terapéutico en la dirección del sistema inmune de un paciente, más específicamente la actividad citotóxica de las células T, contra las células cancerosas.
Finalmente, se generó otro grupo de aglutinantes y se caracterizó por su actividad citotóxica en una diversidad de ensayos. El mapeo de epítopos de estos aglutinantes reveló una especificidad por un epítopo de DLL3 comprendido dentro de la región EGF-5 y, en cierta medida, también dentro de la región EGF-6 (para más detalles, véase el Ejemplo 2). Una vista general de los datos generados en los diferentes ensayos de citotoxicidad (véanse los Ejemplos 8.3, 8.5, 8.6 y 8.7) para estos aglutinantes denominados DLL3-18, DLL3-19, DLL3-20 y DLL3-21 reveló lo siguiente: Si bien no todos los aglutinantes fallan en todos los ensayos en términos de valores de CE50 favorables, todo el grupo presenta claramente un rendimiento inferior si se compara con las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención. Esta observación se resalta con un sombreado más oscuro de los resultados que se muestran en las Tablas 6-9.
En resumen, se puede afirmar claramente que las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención (que se unen a un epítopo de DLL3 comprendido dentro de la región como se muestra en SEQ ID NO: 260) muestran, con mucho, el mejor rendimiento de actividad en comparación con una diversidad de otros grupos de aglutinantes de DLL3 que tienen diferentes especificidades de epítopo. En otras palabras, las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención se presentan con una relación epítopo-actividad favorable, por lo que respaldan una potente actividad citotóxica mediada por construcciones de anticuerpos biespecíficos.
En un aspecto, la presente invención proporciona una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a DLL3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T y CD3 de macaco, en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se muestra en SEQ ID NO: 260, en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 258, en donde el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo biespecífico de la invención comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionada del grupo que consiste en:
a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 31, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 32, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 33, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 34, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 35 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 36;
b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 41, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 42, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 43, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 44, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 45 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 46;
c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 51, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 52, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 53, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 54, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 55 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 56;
d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 61, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 62, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 63, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 64, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 65 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 66;
e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 71, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 72, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 73, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 74, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 75 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 76;
f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 81, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 82, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 83, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 84, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 85 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 86;
g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 91, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 92, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 93, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 94, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 95 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 96;
h) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 101, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 102, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 103, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 104, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 105 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 106, e
i) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 111, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 112, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 113, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 114, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 115 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 116.
El término "variable" se refiere a las porciones de los dominios de anticuerpo o de inmunoglobulina que exhiben variabilidad en su secuencia y que están implicadas en la determinación de la especificidad y afinidad de unión de un anticuerpo particular (es decir, el "dominio o dominios variables"). El emparejamiento de una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) juntas forma un único sitio de unión al antígeno.
La variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos; se concentra en sub-dominios de cada una de las regiones variables de la cadena pesada y ligera. Estos sub-dominios se denominan "regiones hipervariables" o "regiones determinantes de la complementariedad" (CDRs). Las porciones más conservadas (es decir, no hipervariables) de los dominios variables se denominan regiones "marco" (FRM o FR) y proporcionan un armazón para las seis CDRs en el espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas que se producen de forma natural comprenden cada uno cuatro regiones FRM (FR1, FR2, FR3 y FR4), que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de la lámina p. Las regiones hipervariables en cada una de las cadenas se mantienen juntas en estrecha proximidad por el FRM y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno (véase Kabat et al., loc. cit.).
Los términos "CDR", y su plural "CDRs", se refieren a la región determinante de la complementariedad, de las cuales tres constituyen el carácter de unión de una región variable de la cadena ligera (CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3) y tres componen el carácter de unión de una región variable de la cadena pesada (CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3). Las CDRs contienen la mayoría de los residuos responsables de las interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno y, por lo tanto, contribuyen en la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: son los principales determinantes de la especificidad del antígeno.
Los límites y las longitudes de la definición exacta de CDR están sujetos a diferentes sistemas de clasificación y numeración. Por lo tanto, Kabat, Chothia, contacto o cualquier otra definición de límites pueden hacer referencia a las CDRs, incluyendo el sistema de numeración descrito en esta memoria. A pesar de los diferentes límites, cada uno de estos sistemas tiene cierto grado de solapamiento en lo que constituye las denominadas "regiones hipervariables" dentro de las secuencias variables. Por tanto, las definiciones de CDR de acuerdo con estos sistemas pueden diferir en longitud y áreas límites con respecto a la región de marco adyacente. Véase, por ejemplo, Kabat (un enfoque basado en la variabilidad de secuencia entre especies), Chothia (un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo) y/o MacCallum (Kabat etal., loc. cit.; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; y MacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Aún otro patrón más para caracterizar el sitio de unión al antígeno es la definición de AbM utilizada por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase, p. ej, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. En: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. y Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). En la medida en que dos técnicas de identificación de residuos definan regiones de solapamiento, pero no regiones idénticas, se pueden combinar para definir una CDR híbrida. Sin embargo, se prefiere la numeración de acuerdo con el denominado sistema Kabat.
Típicamente, las CDRs forman una estructura de bucle que se puede clasificar como estructura canónica. La expresión "estructura canónica" se refiere a la conformación de la cadena principal que es adoptada por los bucles de unión a antígeno (CDR). A partir de estudios estructurales comparativos, se ha descubierto que cinco de los seis bucles de unión a antígeno tienen solo un repertorio limitado de conformaciones disponibles. Cada una de las estructuras canónicas puede caracterizarse por los ángulos de torsión de la cadena principal polipeptídica. Los bucles correspondientes entre anticuerpos pueden, por lo tanto, tener estructuras tridimensionales muy similares, a pesar de la alta variabilidad de la secuencia de aminoácidos en la mayoría de las partes de los bucles (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin y Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Además, existe una relación entre la estructura de bucle adoptada y las secuencias de aminoácidos que la rodean. La conformación de una clase canónica particular está determinada por la longitud del bucle y los residuos de aminoácidos que residen en posiciones clave dentro del bucle, así como dentro del marco conservado (es decir, fuera del bucle). Por lo tanto, la asignación a una clase canónica particular se puede realizar en función de la presencia de estos residuos de aminoácidos clave.
La expresión "estructura canónica" también puede incluir consideraciones en cuanto a la secuencia lineal del anticuerpo, por ejemplo, según se cataloga por Kabat (Kabat et al., loc. cit.). El esquema (sistema) de numeración de Kabat es un patrón ampliamente adoptado para numerar los residuos de aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo de una manera consistente y es el esquema preferido aplicado en la presente invención como también se menciona en otra parte de esta memoria. También se pueden utilizar consideraciones estructurales adicionales para determinar la estructura canónica de un anticuerpo. Por ejemplo, aquellas diferencias que no se reflejan completamente en la numeración de Kabat pueden describirse mediante el sistema de numeración de Chothia et al. y/o revelarse por otras técnicas, por ejemplo, cristalografía y modelado computacional bidimensional o tridimensional. Por consiguiente, una secuencia de anticuerpo dada puede colocarse en una clase canónica que permite, entre otras cosas, identificar secuencias de chasis apropiadas (p. ej., basándose en el deseo de incluir una diversidad de estructuras canónicas en una colección). La numeración de Kabat de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo y consideraciones estructurales según se describen por Chothia et al., loc. cit. y sus implicaciones para la construcción de aspectos canónicos de la estructura del anticuerpo, se describen en la bibliografía. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas en la técnica. Para una revisión de la estructura del anticuerpo, véase Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988.
La CDR3 de la cadena ligera y, en particular, la CDR3 de la cadena pesada pueden constituir los determinantes más importantes en la unión del antígeno dentro de las regiones variables de la cadena ligera y pesada. En algunas construcciones de anticuerpos, la CDR3 de la cadena pesada parece constituir el área principal de contacto entre el antígeno y el anticuerpo. Pueden utilizarse esquemas de selección in vitro en los que se varía CDR3 solo para variar las propiedades de unión de un anticuerpo o determinar qué residuos contribuyen a la unión de un antígeno. Por lo tanto, la CDR3 es típicamente la mayor fuente de diversidad molecular dentro del sitio de unión del anticuerpo. H3, por ejemplo, puede ser tan corto como dos residuos de aminoácidos o más de 26 aminoácidos.
En un anticuerpo o una inmunoglobulina de longitud completa clásico, cada una de las cadenas ligeras (L) está enlazada a una cadena pesada (H) por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están enlazadas entre sí por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del Isotipo de la cadena H. El dominio CH más próximo a VH se designa habitualmente como CH1. Los dominios constantes ("C") no están directamente implicados en la unión del antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la citotoxicidad mediada por células y dependiente de anticuerpos y la activación del complemento. La región Fc de un anticuerpo está comprendida dentro de los dominios constantes de la cadena pesada y es, por ejemplo, capaz de interactuar con receptores Fc localizados en la superficie de la célula.
La secuencia de genes de anticuerpos después del ensamblaje y la mutación somática es muy variada, y se estima que estos genes variados codifican 1010 moléculas de anticuerpos diferentes (Immunoglobulin Genes, 2a ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Por consiguiente, el sistema inmune proporciona un repertorio de inmunoglobulinas. El término "repertorio" se refiere a al menos una secuencia de nucleótidos derivada total o parcialmente de al menos una secuencia que codifica al menos una inmunoglobulina. La o las secuencias se pueden generar mediante la transposición in vivo de los segmentos V, D y J de las cadenas pesadas y los segmentos V y J de las cadenas ligeras. Alternativamente, la secuencia o secuencias se pueden generar a partir de una célula en respuesta a la cual se produce la transposición, p. ej., estimulación in vitro. Alternativamente, parte o todas las secuencias se pueden obtener mediante corte y empalme de ADN, síntesis de nucleótidos, mutagénesis y otros métodos, véase, p. ej., la Patente de EE.UU. 5.565.332. Un repertorio puede incluir solo una secuencia o puede incluir una pluralidad de secuencias, incluidas las de una colección genéticamente diversa.
Una construcción de anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación también se puede definir como una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión (preferiblemente humano) que se une a DLL3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T, en donde el primer dominio de unión se une al mismo epítopo de DLL3 como un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en DLL3-4, DLL3-5, DLL3-6, DLL3-7, DLL3-8, DLL3-9 y DLL3-10, es decir, un anticuerpo que comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionada del grupo que consiste en:
a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 31, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 32, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 33, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 34, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 35 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 36;
b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 41, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 42, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 43, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 44, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 45 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 46;
c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 51, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 52, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 53, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 54, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 55 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 56;
d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 61, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 62, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 63, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 64, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 65 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 66;
e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 71, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 72, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 73, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 74, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 75 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 76;
f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 81, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 82, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 83, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 84, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 85 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 86, y
g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 91, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 92, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 93, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 94, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 95 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 96.
Se puede medir si una construcción de anticuerpo se une o no al mismo epítopo de DLL3 que otra construcción de anticuerpo dada, p. ej., mediante mapeo de epítopos con moléculas diana quiméricas o truncadas, p. ej., como se describe arriba en esta memoria y en el Ejemplo 2.
Una construcción de anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación también se puede definir como una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión (preferiblemente humano) que se une a DLL3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T, en donde el primer dominio de unión compite por la unión con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en DLL3-4, DLL3-5, DLL3-6, DLL3-7, DLL3-8, DLL3-9 y DLL3-10, es decir, un anticuerpo que comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionada del grupo que consiste en los arriba descritos.
El que una construcción de anticuerpo compita o no por la unión con otra construcción de anticuerpo dada, se puede medir en un ensayo de competencia tal como un ELISA competitivo o un ensayo de competencia basado en células. También se pueden utilizar micropartículas (perlas) acopladas a avidina. De manera similar a una placa ELISA recubierta de avidina, cuando se hace reaccionar con una proteína biotinilada, cada una de estas perlas se puede utilizar como un sustrato sobre el cual se puede realizar un ensayo. El antígeno se recubre sobre una perla y luego se recubre con el primer anticuerpo. Se añade el segundo anticuerpo y se determina cualquier unión adicional. La lectura se realiza mediante citometría de flujo.
En una realización de la invención, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 435 y SEQ ID NO: 529.
En una realización adicional, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 436 y SEQ ID NO: 530.
En otra realización, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende una región VH y una región VL seleccionada del grupo que consiste en pares de una región VH y una región VL como se representa en las SEQ ID NOs: 37+38; SEQ ID NOs: 47+48; SEQ ID NOs: 57+58; SEQ ID NOs: 67+68; SEQ ID NOs: 77+78; SEQ ID NOs: 87+88; SEQ ID NOs: 97+98; SEQ ID NOs: 107+108; SEQ ID NOs: 117+118; SEQ ID NOs: 435+436; y SEQ ID NOs: 529+530.
En aún una realización adicional, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 437 y SEQ ID NO: 531.
Los primeros dominios de unión anteriores (que están especificados por sus CDRs, región VH y región VL y combinaciones de los mismos) se caracterizan como dominios de unión que se unen a un epítopo DLL3 comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 258.
El término "biespecífico", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una construcción de anticuerpo que es "al menos biespecífica", es decir, comprende al menos un primer dominio de unión y un segundo dominio de unión, en el que el primer dominio de unión se une a un antígeno o diana (aquí: DLL3), y el segundo dominio de unión se une a otro antígeno o diana (aquí: CD3). Por consiguiente, las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención comprenden especificidades para al menos dos antígenos o dianas diferentes. La expresión "construcción de anticuerpos biespecíficos" de la invención también abarca construcciones de anticuerpos multiespecíficos, tales como construcciones de anticuerpos triespecíficos, las últimas incluyen tres dominios de unión, o construcciones que tienen más de tres (por ejemplo, cuatro, cinco...) especificidades.
Dado que las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención son (al menos) biespecíficas, no se producen de forma natural y son marcadamente diferentes de los productos que se producen de forma natural. Una construcción de anticuerpo o inmunoglobulina "biespecífico" es, por lo tanto, un anticuerpo híbrido artificial o inmunoglobulina que tiene al menos dos sitios de unión distintos con diferentes especificidades. Construcciones de anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una diversidad de métodos que incluyen la fusión de hibridomas o el enlace de fragmentos Fab’. Véase, p. ej., Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990).
Los al menos dos dominios de unión y los dominios variables de la construcción de anticuerpo de la presente invención pueden comprender o no enlazadores peptídicos (péptidos espaciadores). La expresión "enlazador peptídico" comprende, de acuerdo con la presente invención, una secuencia de aminoácidos mediante la cual las secuencias de aminoácidos de un dominio (variable y/o de unión) y otro dominio (variable y/o de unión) de la construcción de anticuerpos de la invención están enlazados entre sí. Una característica técnica esencial de un enlazador peptídico de este tipo es que no comprende actividad de polimerización alguna. Entre los enlazadores peptídicos adecuados se encuentran los descritos en las Patentes de EE.UU. 4.751.180 y 4.935.233 o el documento WO 88/09344. Los enlazadores peptídicos también se pueden utilizar para fijar otros dominios o módulos o regiones (tales como dominios que extienden la semivida) a la construcción de anticuerpo de la invención.
En el caso de que se utilice un enlazador, este enlazador es preferiblemente de una longitud y secuencia suficientes para asegurar que cada uno de los dominios primero y segundo puedan, independientemente uno de otro, conservar sus especificidades de unión diferenciales. Para los enlazadores peptídicos que conectan los al menos dos dominios de unión (o dos dominios variables) en la construcción de anticuerpos de la invención, se prefieren aquellos enlazadores peptídicos que comprenden solo un pequeño número de residuos de aminoácidos, p. ej. 12 residuos de aminoácidos o menos. Por lo tanto, se prefieren enlazadores peptídicos de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 residuos de aminoácidos. Un enlazador peptídico contemplado con menos de 5 aminoácidos comprende 4, 3, 2 o uno o más aminoácidos, en donde se prefieren enlazadores ricos en Gly. Un aminoácido "único" particularmente preferido en el contexto de dicho "enlazador peptídico" es Gly. Por consiguiente, dicho enlazador peptídico puede consistir en un solo aminoácido Gly. Otra realización preferida de un enlazador peptídico se caracteriza por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, es decir, Gly4Ser (SEQ ID NO: 286), o polímeros de la misma, es decir (Gly4Ser)x, en que x es un número entero de 1 o mayor (p. ej., 2 o 3). Enlazadores preferidos se representan en SEQ ID NOs: 285-293. Las características de dicho enlazador peptídico, que comprenden la ausencia de la promoción de estructuras secundarias, son conocidas en la técnica y se describen, p. ej., en Dall’Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21 -30) y Raag y Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). Se prefieren enlazadores peptídicos que, además, no fomenten estructuras secundarias. El enlace de dichos dominios entre sí puede proporcionarse, p. ej. mediante ingeniería genética, como se describe en los ejemplos. Métodos para preparar construcciones de cadena sencilla biespecíficas fusionadas y operativamente enlazadas y para expresarlas en células de mamífero o bacterias son bien conocidos en la técnica p. ej., documento WO 99/54440 o Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001).
Como se describe arriba en esta memoria, la invención proporciona una realización preferida, en donde la construcción de anticuerpo está en un formato seleccionado del grupo que consiste en (scFv)2 , mAb de dominio único scFv, diacuerpos y oligómeros de cualquiera de los formatos antes mencionados. La expresión «está en un formato» no excluye que la construcción pueda modificarse adicionalmente, p. ej. mediante unión o fusión con otros restos, tal como se describe en esta memoria.
De acuerdo con una realización particularmente preferida, y como se documenta en los ejemplos adjuntos, la construcción de anticuerpo de la invención es una "construcción de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico", más preferiblemente un "Fv de cadena sencilla" biespecífico (scFv). Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético - como se describe anteriormente en esta memoria - que les permite fabricarse como una cadena de proteína única, en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar una molécula monovalente; véase, p. ej., Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci Estados Unidos de América 85:5879-5883). Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y la función de los fragmentos se evalúa de la misma manera que los anticuerpos completos o de longitud completa. Un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) es, por lo tanto, una proteína de fusión de la región variable de la cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL) de inmunoglobulinas, habitualmente conectada con un péptido enlazador corto de aproximadamente diez a aproximadamente 25 aminoácidos, preferiblemente aproximadamente 15 a 20 aminoácidos. El enlazador es habitualmente rico en glicina para la flexibilidad, así como en serina o treonina para la solubilidad, y puede conectar el extremo N del VH con el extremo C del VL, o viceversa. Esta proteína conserva la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y la introducción del enlazador.
Moléculas de cadena sencilla biespecíficas son conocidas en la técnica y se describen en el documento WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (véase, inter alia, la Patente de EE.UU. 4.946.778, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit. y Little (2009), loc. cit.) pueden adaptarse para producir construcciones de anticuerpos de cadena sencilla que reconocen específicamente (una) diana(s) elegida(s).
Fragmentos variables bivalentes (también denominados divalentes) o biespecíficos de cadena sencilla (bi-scFv o discFv que tienen el formato (scFv) 2 pueden modificarse mediante el enlace de dos moléculas scFv ( p. ej., con enlazadores tal como se describió anteriormente en esta memoria). Si estas dos moléculas scFv tienen la misma especificidad de unión, la molécula de (scFv) 2 resultante se denominará preferiblemente bivalente (es decir, tiene dos valencias para el mismo epítopo diana). Si las dos moléculas de scFv tienen diferentes especificidades de unión, la molécula de (scFv) 2 resultante se denominará preferiblemente biespecífica. El enlace se puede realizar produciendo una sola cadena peptídica con dos regiones VH y dos regiones VL, produciendo scFv en tándem (véase, p. ej., Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22(5):238-244). Otra posibilidad es la creación de moléculas scFv con péptidos enlazadores que son demasiado cortos como para que las dos regiones variables se plieguen (p. ej, aproximadamente cinco aminoácidos), lo que obliga a los scFv a dimerizarse. Este tipo se conoce como diacuerpos (véase p. ej., Hollinger, Philipp et al., (julio de 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8.).
De acuerdo con otra realización preferida de la construcción de anticuerpos de la invención, la cadena pesada (VH) y la cadena ligera (VL) de un dominio de unión (que se une al antígeno diana DLL3 o a CD3) no están conectadas directamente a través de un enlazador peptídico. como se describió arriba, sino que los dominios de unión se forman como se describe para el diacuerpo. Por lo tanto, la VH del dominio de unión de CD3 puede fusionarse con la VL del dominio de unión de DLL3 mediante un enlazador peptídico, y la VH del dominio de unión de DLL3 se fusiona con la VL del dominio de unión de CD3 mediante un enlazador peptídico de este tipo.
Los anticuerpos de dominio único comprenden simplemente un dominio variable de anticuerpo (monomérico) que es capaz de unirse selectivamente a un antígeno específico, independientemente de otras regiones o dominios V. Los primeros anticuerpos de dominio único se modificaron a partir de anticuerpos de cadena pesada que se encuentran en los camélidos, y a estos se les denomina fragmentos VhH. Los peces cartilaginosos también tienen anticuerpos de cadena pesada (IgNAR), a partir de los cuales se pueden obtener anticuerpos de dominio único denominados fragmentos Vnar. Un enfoque alternativo es dividir los dominios variables diméricos de inmunoglobulinas comunes, p. ej., de seres humanos o roedores en monómeros, obteniendo así VH o VL como un Ab de dominio único. Aunque la mayoría de las investigaciones sobre anticuerpos de dominio único se basan actualmente en dominios variables de cadena pesada, también se ha demostrado que los nanocuerpos derivados de cadenas ligeras se unen específicamente a epítopos diana. Ejemplos de anticuerpos de dominio único se denominan sdAb, nanocuerpos o anticuerpos de dominio variable único.
Un (mAb de dominio único) 2 es, por lo tanto, una construcción de anticuerpo monoclonal compuesta por (al menos) dos anticuerpos monoclonales de dominio único, que se seleccionan individualmente del grupo que comprende VH, VL, VhH y Vnar. El enlazador está preferiblemente en forma de un enlazador peptídico. De forma similar, un "mAb de dominio único scFv" es una construcción de anticuerpo monoclonal compuesto por al menos un anticuerpo de dominio único como se describe arriba y una molécula de scFv como se describe arriba. De nuevo, el enlazador está preferiblemente en forma de un enlazador peptídico.
Se prevé, además, que la presente invención proporcione una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a DLL3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T y CD3 de macaco, en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 260, en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 259, en donde el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo biespecífico de la invención comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionada del grupo que consiste en:
a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 121, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 122, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 123, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 124, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 125 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 126;
b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 132, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 134, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 136;
c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 141, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 142, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 143, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 144, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 145 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 146;
d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 151, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 152, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 153, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 154, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 155 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 156, y
e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 161, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 162, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 163, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 164, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 165 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 166;
f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 439, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 134, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 136;
g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 440, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 134, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 136;
h) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 132, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 441, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 136;
i) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 132, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 442, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 136;
j) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 132, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 443, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 136;
k) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 132, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 444, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 136;
l) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 439, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 441, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 136, y
m) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 440, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 442, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 136.
En una realización, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID
NO: 449, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 454, y SEQ ID NO: 455.
En una realización adicional, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 138, SEQ
ID NO: 148, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO:
459, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465, SEQ
ID NO: 466, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469, y SEQ ID NO: 470.
En otra realización, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende una región
VH y una región VL seleccionada del grupo que consiste en pares de una región VH y una región VL como se representa en las SEQ ID NOs: 127+128; SEQ ID NOs: 137+138; SEQ ID NOs: 147+148; SEQ ID NOs: 157+158;
SEQ ID NOs: 167+168; SEQ ID NOs 137+456; SEQ ID NOs 137+457; SEQ ID NOs 137+458; SEQ ID NOs 137+459 SEQ ID NOs 137+460; SEQ ID NOs 445+138; SEQ ID NOs 446+138; SEQ ID NOs 447+138; SEQ ID NOs 445+460;
SEQ ID NOs 448+461; SEQ ID NOs 449+462; SEQ ID NOs 450+463; SEQ ID NOs 450+464; SEQ ID NOs 450+465 SEQ ID NOs 450+466; SEQ ID NOs 450+467; SEQ ID NOs 450+468; SEQ ID NOs 451+463; SEQ ID NOs 452+463 SEQ ID NOs 453+463; SEQ ID NOs 451+468; SEQ ID NOs 454+469; y SEQ ID NOs 455+470.
En una realización adicional, el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 139, SEQ
ID NO: 149, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO:
474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQ
ID NO: 481, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO:
487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 492, y SEQ ID NO: 493.
Los primeros dominios de unión anteriores (que están especificados por sus CDRs, región VH y región VL y combinaciones de los mismos) se caracterizan como dominios de unión que se unen a un epítopo DLL3 comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 259.
Una construcción de anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación también se puede definir como una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión (preferiblemente humano) que se une a DLL3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T, en donde el primer dominio de unión se une al mismo epítopo de DLL3 como un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en DLL3-13, DLL3-14 y DLL3-15, es decir, un anticuerpo que comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1,
CDR-L2 y CDR-L3 seleccionada del grupo que consiste en:
a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 121, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 122, CDR-H3
como se representa en SEQ ID NO: 123, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 124, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 125 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 126;
b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 132, CDR-H3
como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 134, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 136, y
c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 141, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 142, CDR-H3
como se representa en SEQ ID NO: 143, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 144, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 145 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 146.
Una construcción de anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación también se puede definir como una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión (preferiblemente humano) que se une a DLL3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T, en donde el primer dominio de unión compite por la unión con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en DLL3-13, DLL3-14 y DLL3-15, es decir, un anticuerpo que comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y c Dr -H3 y una región v L que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionada del grupo que consiste en los arriba descritos.
También se prevé que la construcción de anticuerpo de la invención tenga, además de su función de unirse a las moléculas diana DLL3 y CD3, una función adicional. En este formato, la construcción de anticuerpos es una construcción de anticuerpos trifuncional o multifuncional que se fija como objetivo a las células diana mediante la unión a DLL3, mediando en la actividad de las células T citotóxicas a través de la unión de CD3 y proporcionando una función adicional, tal como un dominio constante Fc completamente funcional que media en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, a través del reclutamiento de células efectoras tales como las células NK, un marcador (fluorescente, etc.), un agente terapéutico tal como una toxina o un radionucleido, y/o medios para potenciar la semivida en suero, etc.
Ejemplos de medios para prolongar la semivida en suero de las construcciones de anticuerpos de la invención incluyen péptidos, proteínas o dominios de proteínas, que están fusionados o fijados de otra manera a las construcciones de anticuerpos. El grupo de péptidos, proteínas o dominios de proteínas incluye péptidos que se unen a otras proteínas con un perfil farmacocinético preferido en el cuerpo humano, tal como la albúmina sérica (véase el documento WO 2009/127691). Un concepto alternativo de péptidos de este tipo que prolongan la semivida incluye péptidos que se unen al receptor de Fc neonatal (FcRn, véase el documento WO 2007/098420), que también se pueden utilizar en las construcciones de la presente invención. El concepto de fijar dominios más grandes de proteínas o proteínas completas incluye, p. ej., la fusión de albúmina de suero humano, variantes o mutantes de albúmina de suero humano (véanse los documentos WO 2011 /051489, WO 2012/059486, WO 2012/150319, WO 2013/135896, WO 2014/072481, WO 2013/075066) o dominios de los mismos, así como la fusión de la región constante de inmunoglobulinas (dominios Fc) y variantes de las mismas. Variantes de dominios Fc de este tipo pueden optimizarse / modificarse con el fin de permitir el apareamiento deseado de dímeros o multímeros, para abolir la unión al receptor Fc (p. ej., el receptor Fcy) o por otras razones. Un concepto adicional conocido en la técnica para prolongar la semivida de pequeños compuestos proteicos en el cuerpo humano es la pegilación de esos compuestos, tales como la construcción de anticuerpos de la presente invención.
En una realización preferida, las construcciones de anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención pueden enlazarse (p. ej., mediante enlace peptídico) con un participante en la fusión (tal como una proteína o polipéptido o péptido), p. ej., con el fin de prolongar la semivida en suero de la construcción. Estos participantes en la fusión pueden seleccionarse de albúmina de suero humano ("HSA" o "HALB") así como variantes de secuencia de los mismos, péptidos que se unen a HSA, péptidos que se unen a FcRn ("FcRn BP") o construcciones que comprenden una región Fc (derivada de anticuerpo). Secuencias ejemplares de estos participantes en la fusión se representan en SEQ ID NOs: 295-341. En general, los participantes en la fusión se pueden enlazar al extremo N o al extremo C de las construcciones de anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención, ya sea directamente (p. ej., mediante enlace peptídico) o mediante un enlazador peptídico tal como (GGGGS)n (en donde "n" es un número entero de 2 o mayor, p. ej., 2 o 3 o 4). Enlazadores peptídicos adecuados se representan en las SEQ ID NOs: 285-293.
Por lo tanto, una construcción de anticuerpo preferida de acuerdo con la presente invención comprende:
(a) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493, y SEQ ID NO: 531;
o un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 285-293; y
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 431, y SEQ ID NO: 434; y
o opcionalmente, una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO: 294;
(b) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493, y SEQ ID NO: 531;
o un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 285-293;
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 431, y SEQ ID NO: 434; o opcionalmente, un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 285-293;
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 295 y 301-330; y
o opcionalmente, una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO: 294;
(c) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:
o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos QRFVTGHFGGLX1 PANG (SEQ ID NO: 296), en donde X1 es Y o H; y
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493, y SEQ ID NO: 531; o un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 285-293;
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 431, y SEQ ID NO: 434; o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO: 298) o QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO: 300); y
o opcionalmente, una etiqueta His, tal como la representada en SEQ ID NO: 294;
(d) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 411, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 429, y SEQ ID NO: 432; o un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 292; o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 6 8 , SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 8 8 , SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 470, y SEQ ID NO: 530,, seguido de un residuo de serina en el extremo C; o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 331, y un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 454, y SEQ ID NO: 455, y SEQ ID NO: 529;
o un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ SEQ ID NO: 292;
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 385, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 430, y SEQ ID NO: 433, seguido de un residuo de serina en el extremo C; y
o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 332;
(e) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 411, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 429, y SEQ ID NO: 432;
o un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 292;
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 6 8 , SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 8 8 , SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 470, y SEQ ID NO: 530; y
o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 333; y
un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 157, y SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 455, y SEQ ID NO: 529;
o un enlazador peptídico que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ SEQ ID NO:
292;
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 385, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 430, y SEQ ID NO: 433, seguido de un residuo de serina en el extremo C; y
o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 334;
(f) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493, y SEQ ID NO: 531;
o un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 285-293;
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 431, y SEQ ID NO: 434; o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 335; y un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 336;
(g) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493, y SEQ ID NO: 531; y
o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 337; y
un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 431, y SEQ ID NO: 434; y
o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 338;
(h) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493, y SEQ ID NO: 531; y
o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 339; y
un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 431, y SEQ ID NO: 434; y
o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 340; o
(i) un polipéptido que comprende, en el siguiente orden comenzando desde el extremo N:
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493, y SEQ ID NO: 531;
o un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 285-293;
o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 431, y SEQ ID NO: 434; y
o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 341.
Por ejemplo, una construcción de anticuerpo biespecífico preferida de la presente invención comprende o consiste en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en:
SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236,
SEQ ID NO: 237; SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, y SEQ ID NO: 251.
Como se describió arriba, varias construcciones de anticuerpos preferidas de la invención se modifican mediante fusión con otro resto, tal como albúmina o variantes de albúmina. Si estas construcciones de fusión se caracterizan por sus propiedades, tales como, en particular, su afinidad por la diana o actividad citotóxica, la persona experta sabrá que se puede esperar que construcciones de fusión similares o construcciones de anticuerpos biespecíficos no modificados tengan propiedades similares (o posiblemente incluso mejores). Por ejemplo, si una construcción de anticuerpo biespecífico fusionado con albúmina tiene una actividad citotóxica apreciable o deseable o afinidad por la diana, se puede esperar que se observe la misma / similar o incluso una mayor actividad citotóxica / afinidad por la diana para la misma construcción sin albúmina.
De acuerdo con otra realización preferida, la construcción de anticuerpo biespecífico de la invención comprende (además de los dos dominios de unión) un tercer dominio que comprende dos monómeros polipeptídicos, cada uno de los cuales comprende una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, en donde dichos dos polipéptidos (o monómeros polipeptídicos) están fusionados entre sí mediante un enlazador peptídico. Preferiblemente, dicho tercer dominio comprende en un orden N- a C-terminal: bisagra-CH2-CH3-enlazador-bisagra-CH2-CH3. Las secuencias de aminoácidos preferidas para dicho tercer dominio se representan en las SEQ ID NOs: 541-548. Cada uno de dichos monómeros polipeptídicos tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 533-540, o que es al menos un 90% idéntica a esas secuencias. En otra realización preferida, el primer y segundo dominios de unión de la construcción de anticuerpo biespecífico de la invención se fusionan al tercer dominio mediante un enlazador peptídico que se selecciona, por ejemplo, del grupo que consiste en SEQ ID
Nos: 285, 286, 288, 289, 290, 292 y 293.
En línea con la presente invención, una «bisagra» es una región de bisagra de IgG. Esta región se puede identificar por analogía utilizando la numeración de Kabat, véanse las posiciones 223-243 de Kabat. En línea con lo anterior, el requisito mínimo para una "bisagra" son los residuos de aminoácidos correspondientes al tramo de secuencia de IgG1 de D231 a P243 de acuerdo con la numeración de Kabat. Los términos CH2 y CH3 se refieren a las regiones constantes 2 y 3 de la cadena pesada de inmunoglobulina. Estas regiones también pueden identificarse por analogía utilizando la numeración de Kabat, véanse las posiciones de Kabat 244-360 para CH2 y las posiciones de Kabat 361 -478 para CH3. Se entiende que existe alguna variación entre las inmunoglobulinas en términos de su región Fc de
IgG1 , región Fc de IgG2 , región Fc de IgG3 , región Fc de IgG4 , región Fc de IgM, región Fc de IgA, región Fc de IgD y región Fc de IgE (véase, p. ej., Padlan, Molecular Immunology, 31 (3), 169-217 (1993)). La expresión monómero Fc se refiere a las dos últimas regiones constantes de la cadena pesada de IgA, IgD e IgG, y a las últimas tres regiones constantes de la cadena pesada de IgE e IgM. El monómero Fc también puede incluir la bisagra N-terminal flexible con respecto a estos dominios. Para IgA e IgM, el monómero Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, la porción Fc comprende los dominios de inmunoglobulina CH2 y CH3 y la bisagra entre los dos primeros dominios y CH2. Aunque los límites de la porción Fc de una inmunoglobulina pueden variar, un ejemplo de una porción Fc de cadena pesada de IgG humana que comprende una bisagra funcional, dominio CH2 y CH3 puede definirse, p. ej., para comprender los residuos D231 (del dominio bisagra) a P476 (del extremo C del dominio CH3), o D231 a L476, respectivamente, para IgG4 , en donde la numeración es de acuerdo con Kabat.
Por lo tanto, la construcción de anticuerpos de la invención puede comprender en un orden N- a C-terminal:
(a) el primer dominio de unión;
(b) un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ
ID NOs: 286, 292 y 293;
(c) el segundo dominio de unión;
(d) un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ
ID NOs: 285, 286, 288, 289, 290, 292 y 293;
(e) el primer monómero polipeptídico del tercer dominio (que comprende una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3);
(f) un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ
ID NOs: 550, 551, 552 y 553; y
(g) el primer monómero polipeptídico del tercer dominio (que comprende una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3).
También se prefiere que la construcción de anticuerpo de la invención comprenda en un orden N- a C-terminal:
• el primer dominio de unión que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ D NO: 129, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO 437, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO 476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO 482, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493, y SEQ ID NO: 531;
• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 286, 292 y 293;
• el segundo dominio de unión que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 431, y SEQ ID NO: 434;
• un enlazador peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 285, 286, 288, 289, 290, 292 y 293; y
• el tercer dominio de unión que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 541-548.
Por lo tanto, en una realización preferida, la construcción de anticuerpo de la presente invención comprende o consiste en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 523, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, y SEQ ID NO: 528.
La tabla de secuencias (Tabla 18) también proporciona variaciones de secuencia de los aglutinantes denominados DLL3-4 y DLL3-14. Las mutaciones puntuales que se insertaron en estas variantes de secuencia se identifican de acuerdo con la posición de esta mutación dentro de la molécula scFv respectiva. Se entiende que también es posible una forma alternativa de identificar estas posiciones, dependiendo del polipéptido de referencia, que también podría ser la región CDR o la región VH/VL. Por ejemplo, la variante denominada DLL3-4-001 tiene una doble mutación G44C-G243C en su molécula scFv (SEQ ID NO: 437). Esto se traduce en una mutación G44C en la cadena VH correspondiente (SEQ ID NO: 435) y en una mutación G101C en la cadena VL correspondiente (SEQ ID NO: 436).
Modificaciones covalentes de las construcciones de anticuerpos también se incluyen dentro del alcance de esta invención y, en general, pero no siempre, se realizan de forma postraduccional. Por ejemplo, varios tipos de modificaciones covalentes de la construcción de anticuerpo se introducen en la molécula haciendo reaccionar residuos de aminoácidos específicos de la construcción de anticuerpo con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales.
Los residuos de cisteinilo se hacen reaccionar más comúnmente con a-haloacetatos (y aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Residuos de cisteinilo también se derivatizan por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-p-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, 2-piridil disulfuro de metilo, pcloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.
Residuos de histidilo se derivatizan por reacción con pirocarbonato de dietilo a pH 5,5-7,0, ya que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. También es útil bromuro de parabromofenacilo; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0. Residuos lisinilo y amino terminales se hacen reaccionar con anhídridos succínicos u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres, tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y reacción catalizada por transaminasas con glioxilato.
Residuos de arginilo se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como con el grupo épsilon-amino de la arginina.
La modificación específica de residuos de tirosilo se puede realizar, con particular interés, en la introducción de marcadores espectrales en residuos de tirosilo mediante reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Más comúnmente, se utilizan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Residuos de tirosilo se yodan utilizando 125I o 131I para preparar proteínas marcadas para uso en radioinmunoensayo, siendo adecuado el método de cloramina T arriba descrito.
Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente por reacción con carbodiimidas (R’-N=C=N- R’), en que R y R’ son grupos alquilo opcionalmente diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten en residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.
La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular las construcciones de anticuerpos de la presente invención con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para uso en una diversidad de métodos. Agentes de reticulación comúnmente utilizados incluyen, p. ej., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3’-ditiobis(propionato de succinimidilo) y maleimidas bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1,8 -octano. Agentes derivatizantes tales como 3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato de metilo producen compuestos intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en presencia de luz. Alternativamente, las matrices reactivas insolubles en agua, tales como hidratos de carbono activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos como se describe en las Pat. de EE.UU. N°s 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440 se emplean para la inmovilización de proteínas.
Residuos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan con frecuencia a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquier forma de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención.
Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente de las construcciones de anticuerpos incluidas dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación de la proteína. Como se conoce en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender tanto de la secuencia de la proteína (p. ej., la presencia o ausencia de residuos de aminoácidos de glicosilación particulares, comentados más adelante) como de la célula u organismo huésped en el que se produce la proteína. Sistemas de expresión particulares se comentan más adelante.
La glicosilación de polipéptidos está típicamente enlazada a N o a O. Enlazada a N se refiere a la fijación del resto hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la fijación enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación enlazada a O se refiere a la fijación de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación a la construcción de anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos arriba descritas (para los sitios de glicosilación enlazados a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia de partida (para los sitios de glicosilación enlazados a O). Para mayor facilidad, la secuencia de aminoácidos de una construcción de anticuerpo se altera preferiblemente mediante cambios al nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido en bases preseleccionadas de modo que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otro medio de aumentar el número de restos de hidratos de carbono en la construcción del anticuerpo es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción de la proteína en una célula huésped que tiene capacidades de glicosilación para la glicosilación enlazada a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el o los azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330, y en Aplin y Wriston, 1 9 8 1 , CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306.
La eliminación de restos de hidratos de carbono presentes en la construcción del anticuerpo de partida se puede realizar de forma química o enzimática. La desglicosilación química requiere la exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría o de todos los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja intacto el polipéptido. La desglicosilación química está descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. La escisión enzimática de restos de hidratos de carbono en polipéptidos se puede lograr mediante el uso de una diversidad de endo- y exo-glicosidasas tal como se describe por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138: 350. La glicosilación en sitios potenciales de glicosilación se puede prevenir mediante el uso del compuesto tunicamicina como se describe por Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem.
257:3105. La tunicamicina bloquea la formación de enlaces proteína-N-glicósido.
También se contemplan en esta memoria otras modificaciones de la construcción de anticuerpo. Por ejemplo, otro tipo de modificación covalente de la construcción de anticuerpo comprende enlazar la construcción de anticuerpo a diversos polímeros no proteicos, que incluyen, pero no se limitan a diversos polioles, tales como polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, de la manera recogida en las Patentes de EE.UU. N2s 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. Además, como se conoce en la técnica, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos en diversas posiciones dentro de la construcción del anticuerpo, p. ej., con el fin de facilitar la adición de polímeros tales como PEG.
En algunas realizaciones, la modificación covalente de las construcciones de anticuerpos de la invención comprende la adición de uno o más marcadores. El grupo de marcaje se puede acoplar a la construcción de anticuerpo vía brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. Se conocen en la técnica diversos métodos para marcar proteínas y se pueden utilizar para realizar la presente invención. El término "marcador" o "grupo de marcaje" se refiere a cualquier marcador detectable. En general, los marcadores se clasifican en una diversidad de clases, dependiendo del ensayo en el que se han de detectar - los siguientes ejemplos incluyen, pero no se limitan a:
a) marcadores isotópicos, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados, tales como radioisótopos o radionucleidos (p. ej., 3 H, 14C, 15N, 35 S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111 In, 125 I, 131 I)
b) marcadores magnéticos (p. ej., partículas magnéticas)
c) restos activos redox
d) colorantes ópticos (incluyendo, pero no limitados a cromóforos, fósforos y fluoróforos), tales como grupos fluorescentes (p. ej., FlTc, rodamina, fósforos de lantánidos), grupos quimioluminiscentes y fluoróforos que pueden ser de "molécula pequeña" fluorescentes o proteicos fluorescentes
e) grupos enzimáticos (p. ej., peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina)
f) grupos biotinilados
g) epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un informador secundario (p. ej., secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopo, etc.)
Por «marcador fluorescente» se entiende cualquier molécula que pueda detectarse vía sus propiedades fluorescentes inherentes. Marcadores fluorescentes adecuados incluyen, pero no se limitan a fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilcumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, Amarillo Lucifer, Azul CascadaJ Rojo Texas, IAEDAn S, EDANS, BODIPY FL, LC Rojo 640, Cy 5, Cy 5.5, Le Rojo 705, Oregon verde, los colorantes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633,
Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Azul Cascade, Amarillo Cascade y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, Rodamina, y Rojo Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Colorantes ópticos adecuados, incluyendo los fluoróforos, se describen en Molecular Probes Handbook de Richard P. Haugland.
Marcadores fluorescentes proteicos adecuados también incluyen, pero no se limitan a proteína verde fluorescente, que incluye una especie Renilla, Ptilosarcus o Aequorea de GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Número de Acceso a Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8 a Planta, Montreal, Quebec, Canadá H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferasa (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), p galactosidasa (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América 85:2603-2607) y Renilla (documentos WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, Patentes de EE.UU. N°s 5.292.658; 5.418.155; 5.683.888; 5.741.668; 5.777.079; 5.804.387; 5.874.304; 5.876.995; 5.925.558).
Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que fomentan la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas de unión al ADN (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), y desde entonces se han encontrado en una diversidad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas se encuentran péptidos que se producen de forma natural y derivados de los mismos que dimerizan o trimerizan. En la solicitud PCT WO 94/10308 se describen ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles, y la cremallera de leucina derivada de la proteína tensioactiva pulmonar D (SPD) descrita en Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga condensada a la misma se describe en Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. En un enfoque, las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento de anticuerpo DLL3 o derivado condensado a un péptido de cremallera de leucina se expresan en células huésped adecuadas, y los fragmentos de anticuerpo DLL3 oligoméricos solubles o derivados que se forman se recuperan del sobrenadante del cultivo.
La construcción de anticuerpo de la invención también puede comprender dominios adicionales, que son, p. ej., útiles en el aislamiento de la molécula o se relacionan con un perfil farmacocinético adaptado de la molécula. Dominios de ayuda para el aislamiento de una construcción de anticuerpo pueden seleccionarse de motivos peptídicos o restos introducidos de forma secundaria, que pueden capturarse en un método de aislamiento, p. ej., una columna de aislamiento. Realizaciones no limitantes de dominios adicionales de este tipo comprenden motivos peptídicos conocidos como etiqueta Myc, etiqueta HAT, etiqueta HA, etiqueta TAP, etiqueta GST, dominio de unión a quitina (etiqueta CBD), proteína de unión a maltosa (etiqueta MBP), etiqueta Flag, etiqueta Strep y variantes de las mismas (p. ej., etiqueta Strepll) y etiqueta His. Se prefiere que todas las construcciones de anticuerpos descritas en esta memoria caracterizadas por las CDRs identificadas comprendan un dominio de etiqueta His, que generalmente se conoce como una repetición de residuos de His consecutivos en la secuencia de aminoácidos de una molécula, preferiblemente de cinco y más preferiblemente de seis residuos His (hexa-histidina). La etiqueta His puede ubicarse, p. ej., en el extremo N o C de la construcción de anticuerpo, preferiblemente está ubicada en el extremo C. Lo más preferiblemente, una etiqueta de hexa-histidina (HHHHHH) se enlaza mediante un enlace peptídico al extremo C de la construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención.
El primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la presente invención se une a DLL3 humano en la superficie de una célula diana dentro de la región según se define en las reivindicaciones. La secuencia de aminoácidos preferida de DLL3 humana está representada por SEQ ID NO: 252. Se entiende que la expresión «en la superficie», en el contexto de la presente invención, significa que el dominio de unión se une específicamente a un epítopo comprendido dentro del dominio extracelular de DLL3 (ECD DLL3). Por lo tanto, el primer dominio de unión de acuerdo con la invención se une preferiblemente a DLL3 cuando se expresa mediante células o líneas celulares que se expresan de forma natural, y/o mediante células o líneas celulares transformadas o transfectadas (establemente/transitoriamente) con DLL3. En una realización preferida, el primer dominio de unión también se une a DLL3 cuando DLL3 se utiliza como una molécula «diana» o «ligando» en un ensayo de unión in vitro tal como BIAcore o Scatchard. La "célula diana" puede ser cualquier célula procariota o eucariota que exprese DLL3 en su superficie; preferiblemente, la célula diana es una célula que forma parte del cuerpo humano o animal, tal como una DLL3 específica que expresa una célula cancerosa o tumoral.
La expresión "ECD DLL3" se refiere a una forma de DLL3 que está esencialmente libre de dominios transmembrana y citoplasmático de DLL3. El experto en la materia entenderá que el dominio transmembrana identificado para el polipéptido DLL3 de la presente invención se identifica de acuerdo con los criterios empleados rutinariamente en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrófobo. Los límites exactos de un dominio transmembrana pueden variar, pero lo más probable en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio específicamente mencionado en esta memoria. Un ECD DLL3 humano preferido se muestra en SEQ ID NO: 253.
La afinidad del primer dominio de unión para DLL3 humana es preferiblemente < 20 nM, más preferiblemente < 10 nM, incluso más preferiblemente < 5 nM, incluso más preferiblemente < 2 nM, incluso más preferiblemente < 1 nM, incluso más preferiblemente < 0,6 nM, incluso más preferiblemente < 0,5 nM, y lo más preferiblemente < 0,4 nM. La afinidad se puede medir, por ejemplo, en un ensayo BIAcore o en un ensayo Scatchard, p. ej. como se describe en los Ejemplos. La persona experta también conoce bien otros métodos para determinar la afinidad.
Las células T o linfocitos T son un tipo de linfocito (en sí mismo un tipo de glóbulo blanco) que juegan un papel central en la inmunidad mediada por células. Existen subconjuntos de células T, cada uno con una función distinta. Las células T se pueden distinguir de otros linfocitos, tales como células B y células NK, por la presencia de un receptor de células T (TCR) en la superficie celular. El TCR es el responsable de reconocer antígenos unidos a las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y está compuesto por dos cadenas de proteínas diferentes. En el 95% de las células T, el TCR consiste en una cadena alfa (a) y beta (p). Cuando el TCR interactúa con el péptido antigénico y el MHC (complejo péptido / MHC), el linfocito T se activa a través de una serie de eventos bioquímicos mediados por enzimas asociadas, co-receptores, moléculas adaptadoras especializadas y factores de transcripción activados o liberados.
El complejo del receptor CD3 es un complejo proteico y está compuesto por cuatro cadenas. En los mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3y (gamma), una cadena CD35 (delta) y dos cadenas CD3s (épsilon). Estas cadenas se asocian con el receptor de linfocitos T (TCR) y la denominada cadena Z (zeta) para formar el complejo receptor de linfocitos T CD3 y generar una señal de activación en los linfocitos T. Las cadenas CD3y (gamma), CD35 (delta) y CD3s (épsilon) son proteínas de la superficie celular muy relacionadas de la superfamilia de inmunoglobulinas que contienen un único dominio de inmunoglobulina extracelular. Las colas intracelulares de las moléculas de CD3 contienen un único motivo conservado, conocido como un motivo de activación de inmunorreceptor basado en tirosina o ITAM para abreviar, que es esencial para la capacidad de señalización del TCR. La molécula de CD3 épsilon es un polipéptido que en seres humanos está codificada por el gen CD3E que reside en el cromosoma 11. El epítopo más preferido de CD3 épsilon está comprendido dentro de los residuos de aminoácidos 1-27 del dominio extracelular de CD3 épsilon humano.
La lisis redirigida de células diana mediante el reclutamiento de células T por una construcción de anticuerpo multiespecífica, al menos biespecífica, implica la formación de sinapsis citolíticas y el suministro de perforina y granzimas. Las células T comprometidas son capaces de lisis de células diana en serie y no se ven afectadas por mecanismos de escape inmunes que interfieran con el procesamiento y presentación del antígeno peptídico o la diferenciación de células T clonales; véase, por ejemplo, el documento WO 2007/042261.
La citotoxicidad mediada por construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 se puede medir de diversas formas. Véanse los Ejemplos 8,1 a 8,7. Las células efectoras pueden ser, p. ej., células T CD8 positivas (humanas) enriquecidas estimuladas o células mononucleares de la sangre periférica (humanas) no estimuladas (PBMC). Si las células diana son de origen macaco o expresan o son transfectadas con DLL3 de macaco, las células efectoras también deberían ser de origen macaco, tal como una línea de células T de macaco, p. ej., 4119LnPx. Las células diana deberían expresar (al menos el dominio extracelular de) DLL3, p. ej., DLL3 humana o de macaco. Las células diana pueden ser una línea celular (tal como CHO) que se transfectan de forma estable o transitoria con DLL3, p. ej., DLL3 humana o de macaco. Alternativamente, las células diana pueden ser una línea celular de expresión natural DLL3 positiva, tal como la línea celular de carcinoma de pulmón humano SHP-77. Habitualmente, se espera que los valores de CE50 sean más bajos con las líneas celulares diana que expresan niveles más altos de DLL3 en la superficie celular. La relación entre la célula efectora a diana (E:T) es habitualmente de aproximadamente 10:1, pero también puede variar. La actividad citotóxica de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 se puede medir en un ensayo de liberación de cromo 51 (tiempo de incubación de aproximadamente 18 horas) o en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS (tiempo de incubación de aproximadamente 48 horas). También son posibles modificaciones del tiempo de incubación del ensayo (reacción citotóxica). Otros métodos para medir la citotoxicidad son bien conocidos por la persona experta y comprenden ensayos MTT o MTS, ensayos basados en ATP, incluyendo ensayos bioluminiscentes, el ensayo de sulforrodamina B (SRB), el ensayo WST, ensayo clonogénico y la tecnología ECIS.
La actividad citotóxica mediada por las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de la presente invención se mide preferiblemente en un ensayo de citotoxicidad basado en células. También se puede medir en un ensayo de liberación de cromo 51. Se representa por el valor de CE50 , que corresponde a la concentración efectiva media máxima (concentración de la construcción de anticuerpo que induce una respuesta citotóxica a medio camino entre la línea base y el máximo). Preferiblemente, el valor de CE50 de las construcciones de anticuerpo biespecífico DLL3xCD3 es < 5000 pM o < 4000 pM, más preferiblemente < 3000 pM o < 2000 pM, incluso más preferiblemente < 1 0 0 0 pM o < 500 pM, incluso más preferiblemente < 400 pM o < 300 pM, incluso más preferiblemente < 2 0 0 pM, incluso más preferiblemente < 100 pM, incluso más preferiblemente < 50 pM, incluso más preferiblemente < 20 pM o < 10 pM, y lo más preferiblemente < 5 pM.
Los valores de CE50 arriba dados se pueden medir en diferentes ensayos. La persona experta en la materia es consciente de que se puede esperar que un valor de CE50 sea menor cuando se utilizan células T CD8 + estimuladas / enriquecidas como células efectoras, en comparación con PBMC no estimuladas. Además, se puede esperar que los valores de CE50 sean más bajos cuando las células diana expresan un número elevado del antígeno diana en comparación con una rata de baja expresión diana. Por ejemplo, cuando se utilizan células T CD8 + estimuladas / enriquecidas humanas como células efectoras (y, o bien células transfectadas con DLL3 tales como células CHO o una línea celular de carcinoma de pulmón humana DLL3 positiva SHP-77 se utilizan como células diana), el valor de CE50 de la construcción de anticuerpo biespecífico DLL3 xCD3 es preferiblemente < 1000 pM, más preferiblemente < 500 pM, incluso más preferiblemente < 250 pM, incluso más preferiblemente < 100 pM, incluso más preferiblemente < 50 pM, incluso más preferiblemente < 10 pM, y lo más preferiblemente < 5 pM. Cuando se utilizan PBMCs humanas como células efectoras, el valor de CE50 de la construcción de anticuerpo biespecífico DLL3xCD3 es preferiblemente < 5000 pM o < 4000 pM (en particular cuando las células diana son una línea de células de carcinoma de pulmón humana SHP-77 DLL3 positiva, más preferiblemente < 2000 pM (en particular, cuando las células diana son células transfectadas con DLL3, tales como células CHO), más preferiblemente < 1000 pM o < 500 pM, incluso más preferiblemente < 200 pM, incluso más preferiblemente < 150 pM, incluso más preferiblemente < 100 pM, y lo más preferiblemente < 50 pM o menos. Cuando una línea de células T de macaco, tal como LnPx4119, se utiliza como células efectoras, y una línea de células de macaco transfectadas con DLL3, tales como las células CHO, se utiliza como línea celular diana, el valor de CE50 de la construcción de anticuerpo biespecífico DLL3 xCD3 es preferiblemente < 2000 pM o < 1500 pM, más preferiblemente < 1000 pM o < 500 pM, incluso más preferiblemente < 300 pM o < 250 pM, incluso más preferiblemente < 100 pM, y lo más preferiblemente < 50 pM.
Preferiblemente, las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de la presente invención no inducen / median en la lisis o no inducen / median esencialmente en la lisis de células DLL3 negativas tales como células CHO. La expresión "no induce la lisis", "no induce esencialmente la lisis", "no median la lisis" o "no media esencialmente en la lisis" significa que una construcción de anticuerpo de la presente invención no induce o media en la lisis de más del 30 %, preferiblemente no más del 20%, más preferiblemente no más del 10%, de manera particularmente preferida no más del 9%, 8 %, 7%, 6 % o 5% de células DLL3 negativas, por lo que la lisis de una línea celular SHP-77 de carcinoma de pulmón humano DLL3 positiva (véase arriba) se establece en 100%. Esto se aplica habitualmente a concentraciones de la construcción de anticuerpo de hasta 500 nM. La persona experta sabe cómo medir la lisis celular sin más preámbulos. Además, la presente memoria descriptiva enseña instrucciones específicas sobre cómo medir la lisis celular.
A la diferencia en la actividad citotóxica entre la isoforma monomérica y la dimérica de construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 individuales se la alude como "hueco de potencia". Este hueco de potencia puede calcularse, p. ej como la relación entre los valores de CE50 de la forma monomérica y dimérica de la molécula, véase el Ejemplo 15. Los huecos de potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de la presente invención son preferiblemente < 5, más preferiblemente < 4, incluso más preferiblemente < 3, incluso más preferiblemente < 2 y lo más preferiblemente < 1.
El primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención es preferiblemente específico para especies cruzadas para miembros del orden mamíferos de primates. Dominios de unión a CD3 específicos para especies cruzadas se describen, por ejemplo, en el documento WO 2008/119567. De acuerdo con una realización, el primer dominio de unión, además de unirse a DLL3 humana, también se unirá a DLL3 de primates, incluyendo (pero no limitado a) primates del Nuevo Mundo (tales como Callithrixjacchus, Saguinus Oedipuso Saimirísciureus), primates del Viejo Mundo (tales como babuinos y macacos), gibones, orangutanes y homininae no humanos. Se prevé que el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención que se une a DLL3 humana en la superficie de una célula diana también se una al menos a DLL3 de macaco. El segundo dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T también se une a CD3 de macaco. Un macaco preferido es Macaca fascicularis. También se prevé Macaca mulatta (Rhesus). Dominios de unión a CD3 específicos para especies cruzadas se describen, por ejemplo, en el documento WO 2008/119567. Además, cualquier dominio o dominios de unión adicionales de la construcción de anticuerpo de la invención es o son preferiblemente específicos para especies cruzadas para miembros del orden mamíferos de primates.
La construcción de anticuerpo biespecífico de la invención comprende un primer dominio de unión que se une a DLL3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T y CD3 de macaco, en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 260 como se define en las reivindicaciones.
En un aspecto de la invención, el primer dominio de unión se une a DLL3 humana y, además, se une a DLL3 de macaco, tal como DLL3 de Macaca fascicularis, y más preferiblemente, al ECD de DLL3 de macaco. Una DLL3 de Macaca fascicularis preferida se representa en SEQ ID NO: 271. Un ECD de DLL3 de macaco preferido se representa en SEQ ID NO: 272. La afinidad del primer dominio de unión para DLL3 de macaco es preferiblemente < 15 nM, más preferiblemente < 10 nM, incluso más preferiblemente < 5 nM, incluso más preferiblemente < 1 nM, incluso más preferiblemente < 0,5 nM, incluso más preferiblemente < 0,1 nM y lo más preferiblemente < 0,05 nM o incluso < 0,01 nM.
Preferiblemente, el hueco de afinidad de las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención para la unión de DLL3 de macaco frente a DLL3 humana [ma DLL3: hu DLL3] (según se determina, p. ej. mediante BiaCore o mediante análisis de Scatchard) está entre 0,1 y 10, más preferiblemente entre 0,2 y 5, incluso más preferiblemente entre 0,3 y 4, incluso más preferiblemente entre 0,5 y 3 o entre 0,5 y 2,5, y lo más preferiblemente entre 0,5 y 2 o entre 0,6 y 2. Véanse los Ejemplos 3 y 4.
En una realización de la construcción de anticuerpo de la invención, el segundo dominio de unión se une a CD3 épsilon humana y a CD3 épsilon de Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus o Saimiri sciureus. Preferiblemente, el segundo dominio de unión se une a un epítopo extracelular de estas cadenas de CD3 épsilon. También se prevé que el segundo dominio de unión se una a un epítopo extracelular de la cadena de CD3 épsilon humana y de Macaca. El epítopo más preferido de CD3 épsilon está comprendido dentro de los residuos de aminoácidos 1-27 del dominio extracelular de CD3 épsilon humana. Incluso más específicamente, el epítopo comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu. Callithrix jacchus y Saguinus oedipus son ambos primates del Nuevo Mundo pertenecientes a la familia Callitrichidae, mientras que Saimiri sciureus es un primate del Nuevo Mundo perteneciente a la familia Cebidae.
Es particularmente preferido para la construcción de anticuerpos de la presente invención que el segundo dominio de unión que se une a CD3 humana y CD3 de macaco sobre la superficie de una célula T comprenda una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionada de:
(a) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 27 del documento WO 2008/119567, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 2 8 del documento WO 2008/119567 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID n O: 29 del documento WO 2008/119567;
(b) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 117 del documento WO 2008/119567, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 118 del documento WO 2008/119567 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 119 del documento WO 2008/119567; y
(c) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 153 del documento WO 2008/119567, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 154 del documento WO 2008/119567 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 155 del documento WO 2008/119567.
En una realización alternativamente preferida de la construcción de anticuerpo de la presente invención, el segundo dominio de unión que se une a CD3 humana sobre la superficie de una célula T y CD3 de macaco comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, seleccionado de:
(a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 12 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ iD NO: 13 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 14 del documento WO 2008/119567;
(b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 30 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ iD NO: 31 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 32 del documento WO 2008/119567;
(c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 48 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 49 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 50 del documento WO 2008/119567;
(d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 6 6 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ iD NO: 67 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 6 8 del documento WO 2008/119567;
(e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 84 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ iD NO: 85 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 8 6 del documento WO 2008/119567;
(f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 102 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 103 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 104 del documento WO 2008/119567;
(g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 120 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 121 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 122 del documento WO 2008/119567;
(h) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 138 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 139 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 140 del documento WO 2008/119567;
(i) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 156 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 157 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 158 del documento WO 2008/119567; y
(j) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 174 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 175 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 176 del documento WO 2008/119567.
Además, para la construcción de anticuerpos de la presente invención se prefiere que el segundo dominio de unión que se une a CD3 humana sobre la superficie de una célula T y CD3 de macaco comprenda una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL como se muestra en SEQ ID. NO: 35, 39, 125, 129, 161 o 165 del documento WO 2008/119567.
Alternativamente, se prefiere que el segundo dominio de unión que se une a CD3 humana sobre la superficie de una célula T y CD3 de macaco comprenda una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH como se representa en SEQ ID. NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 o 181 del documento WO 2008/119567.
Más preferiblemente, la construcción de anticuerpo de la presente invención se caracteriza por el segundo dominio de unión que se une a CD3 humana sobre la superficie de una célula T y CD3 de macaco que comprende una región VL y una región VH seleccionada del grupo que consiste en:
(a) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 17 o 21 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 15 o 19 del documento WO 2008/119567;
(b) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 35 o 39 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 33 o 37 del documento WO 2008/119567;
(c) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 53 o 57 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 51 o 55 del documento WO 2008/119567;
(d) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 71 o 75 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 69 o 73 del documento WO 2008/119567;
(e) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 89 o 93 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 87 o 91 del documento WO 2008/119567;
(f) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 107 o 111 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 105 o 109 del documento WO 2008/119567;
(g) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 125 o 129 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 123 o 127 del documento WO 2008/119567;
(h) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 143 o 147 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 141 o 145 del documento WO 2008/119567;
(i) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 161 o 165 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 159 o 163 del documento WO 2008/119567; y
(j) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 179 o 183 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 177 o 181 del documento WO 2008/119567.
De acuerdo con una realización preferida de la construcción de anticuerpo de la presente invención, los dominios de unión y, en particular, el segundo dominio de unión (que se une a CD3 humana sobre la superficie de una célula T) tienen el siguiente formato: Los pares de regiones VH y VL están en el formato de un anticuerpo de cadena sencilla (scFv). Las regiones VH y VL están dispuestas en el orden VH-VL o VL-VH. Se prefiere que la región VH esté posicionada en el extremo N de una secuencia de enlazador, y que la región VL esté posicionada en el extremo C de la secuencia de enlazador.
Una realización preferida de la construcción de anticuerpo de la presente invención arriba descrita se caracteriza por el segundo dominio de unión que se une a CD3 humana sobre la superficie de una célula T y CD3 de macaco que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 23, 25, 41,43, 59, 61,77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187 del documento WO 2008/119567.
Por lo tanto, en una realización, la construcción de anticuerpo de la invención comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 438 y SEQ ID NO: 532 Estas construcciones de anticuerpos tienen un primer dominio de unión que se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región representada en SEQ ID NO: 258.
En una realización alternativa, la construcción de anticuerpo de la invención comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 170; SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 515, y SEQ ID NO: 516 Estas construcciones de anticuerpos tienen un primer dominio de unión que se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región representada en SEQ ID NO: 259.
También se contemplan modificaciones en la secuencia de aminoácidos de las construcciones de anticuerpos descritas en esta memoria. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de la construcción de anticuerpo. Variantes de la secuencia de aminoácidos de las construcciones de anticuerpos se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico de las construcciones de anticuerpos o mediante síntesis de péptidos. Todas las modificaciones de la secuencia de aminoácidos descritas más adelante deberían dar como resultado una construcción de anticuerpo que aún conserve la actividad biológica deseada (unión a DLL3 y a CD3) de la molécula parental no modificada.
El término "aminoácido" o la expresión "residuo de aminoácido" se refiere típicamente a un aminoácido que tiene su definición reconocida en la técnica, tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: alanina (Ala o A); arginina (Arg o R); asparagina (Asn o N); ácido aspártico (Asp o D); cisteína (Cys o C); glutamina (Gln o Q); ácido glutámico (Glu o E); glicina (Gly o G); histidina (His o H); isoleucina (He o I): leucina (Leu o L); lisina (Lys o K); metionina (Met o M); fenilalanina (Phe o F); prolina (Pro o P); serina (Ser o S); treonina (Thr o T); triptófano (Trp o W); tirosina (Tyr o Y); y valina (Val o V), aunque se pueden utilizar aminoácidos modificados, sintéticos o raros según se desee. Generalmente, los aminoácidos se pueden agrupar por tener una cadena lateral apolar (p. ej., Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); una cadena lateral cargada negativamente (p. ej., Asp, Glu); una cadena lateral cargada positivamente (p. ej., Arg, His, Lys); o una cadena lateral polar no cargada (p. ej., Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp y Tyr).
Modificaciones de aminoácidos incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de las construcciones de anticuerpos. Se realiza cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, con la condición de que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos postraduccionales de las construcciones de anticuerpos, tales como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación.
Por ejemplo, se pueden insertar o eliminar 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos en cada una de las CDRs (por supuesto, dependiendo de su longitud), mientras que 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 1 8 , 19, 20 o 25 aminoácidos se pueden insertar o eliminar en cada una de las FRs. Preferiblemente, las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 1 0 residuos a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intra-secuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Una variante de inserción de la construcción de anticuerpo de la invención incluye la fusión al extremo N o al extremo C de la construcción de anticuerpo de una enzima o la fusión a un polipéptido que aumenta la semivida en suero de la construcción de anticuerpo.
Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las CDRs de la cadena pesada y/o ligera, en particular las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de la FR en la cadena pesada y/o ligera. Las sustituciones son preferiblemente sustituciones conservativas tal como se describe en esta memoria. Preferiblemente, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 aminoácidos pueden estar sustituidos en una CDR, mientras que 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 aminoácidos pueden estar sustituidos en las regiones marco (FRs), dependiendo de la longitud de la CDR o FR. Por ejemplo, si una secuencia de CDR comprende 6 aminoácidos, se prevé que uno, dos o tres de estos aminoácidos estén sustituidos. De manera similar, si una secuencia de CDR comprende 15 aminoácidos, se prevé que uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de estos aminoácidos estén sustituidos.
Un método útil para la identificación de determinados residuos o regiones de las construcciones de anticuerpos que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells en Science, 244: 1081 -1085 (1989). Aquí, se identifica un residuo o grupo de residuos diana dentro de la construcción del anticuerpo (p. ej., residuos cargados, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplaza por un aminoácido neutro o cargado negativamente (lo más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el epítopo.
Esas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan luego introduciendo variantes adicionales u otras en, o para los sitios de sustitución. Por lo tanto, aunque el sitio o la región para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminada, la naturaleza de la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar u optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se puede realizar un barrido de alanina o una mutagénesis aleatoria en un codón o región diana, y las variantes de construcción de anticuerpos expresadas se rastrean en cuanto a la combinación óptima de actividad deseada. Técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados del ADN que tienen una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, mutagénesis del cebador M13 y mutagénesis por PCR. El rastreo de los mutantes se realiza utilizando ensayos de actividades de unión a antígenos, tales como la unión de DLL3 o CD3.
Generalmente, si los aminoácidos están sustituidos en una o más o en todas las CDRs de la cadena pesada y/o ligera, se prefiere que la secuencia "sustituida" obtenida sea entonces al menos 60% o 65%, más preferiblemente 70% o 75%, incluso más preferiblemente 80% u 85%, y de manera particularmente preferida 90% o 95% idéntica a la secuencia de CDR "original". Esto significa que depende de la longitud de la CDR hasta qué punto es idéntica a la secuencia "sustituida". Por ejemplo, una CDR que tiene 5 aminoácidos es preferiblemente un 80% idéntica a su secuencia sustituida con el fin de tener al menos un aminoácido sustituido. Por consiguiente, las CDRs de la construcción de anticuerpo pueden tener diferentes grados de identidad con sus secuencias sustituidas, p. ej., CDRL1 puede tener un 80%, mientras que CDRL3 puede tener un 90%.
Sustituciones (o reemplazos) preferidas son sustituciones conservadoras. Sin embargo, se prevé cualquier sustitución (incluida la sustitución no conservadora o una o más de las "sustituciones ejemplares" enumeradas en la Tabla 1, que figura más adelante) siempre que la construcción de anticuerpo conserve su capacidad para unirse a DLL3 a través del primer dominio de unión y a CD3 o CD3 épsilon a través del segundo dominio de unión y/o sus CDRs tienen una identidad con la secuencia entonces sustituida (al menos 60% o 65%, más preferiblemente 70% o 75%, incluso más preferiblemente 80% u 85%, y de manera particularmente preferida 90% o 95% idéntica a la secuencia CDR "original").
Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si sustituciones de este tipo dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe más adelante en referencia a clases de aminoácidos, y los productos pueden seleccionarse para una característica deseada.
Tabla 1: Sustituciones de aminoácidos
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Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de la construcción de anticuerpos de la presente invención se logran seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal polipeptídica en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Los residuos que se producen de forma natural se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) de carácter ácido: asp, glu; (4) de carácter básico: asn, gin, his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Cualquier residuo de cisteína que no esté implicado en el mantenimiento de la conformación adecuada de la construcción de anticuerpo puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación aberrante. A la inversa, se pueden añadir enlace(s) de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente en los casos en los que el anticuerpo sea un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).
Para las secuencias de aminoácidos, la identidad y/o similitud de secuencia se determina utilizando técnicas estándares conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, el algoritmo de identidad de secuencia local de Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2: 482, el algoritmo de alineación de identidad de secuencia de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. Estados Unidos de América 85: 2444, implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), el programa de secuencia Best Fit descrito por Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res.
12:387-395, preferiblemente utilizando la configuración predeterminada o mediante inspección. Preferiblemente, FastDB calcula el porcentaje de identidad en base a los siguientes parámetros: penalización por desajuste de 1; penalización por hueco de 1; penalización por tamaño de hueco de 0,33; y penalización de unión de 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.
Un ejemplo de algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineamientos progresivos por pares. También puede trazar un árbol que muestre las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear el alineamiento. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351 -360; el método es similar al descrito por Higgins y Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153. Parámetros útiles de PILEUP que incluyen un peso de hueco predeterminado de 3,00, un peso de longitud de hueco predeterminado de 0,10 y huecos finales ponderados.
Otro ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito en: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; y Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América 90:5873- 5787. Un programa BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST-2 que se obtuvo de Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. WU-BLAST-2 utiliza varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se establecen en los valores predeterminados. Los parámetros ajustables se establecen con los siguientes valores: intervalo de solapamiento = 1, fracción de solapamiento = 0,125, umbral de palabra (T) = II. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y son establecidos por el propio programa dependiendo de la composición de la secuencia particular y la composición de la base de datos particular contra la cual se busca la secuencia de interés; sin embargo, los valores pueden ajustarse para aumentar la sensibilidad.
Un algoritmo útil adicional es BLAST con huecos de acuerdo con lo informado por Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. BLAST con huecos utiliza puntuaciones de sustitución BLOSUM-62; parámetro de umbral T establecido en 9; el método de dos aciertos para activar extensiones sin huecos, cobra longitudes de hueco de k a un coste de 10+k; Xu se establece en 16 y Xg se establece en 40 para la fase de búsqueda de la base de datos y en 67 para la fase de salida de los algoritmos. Los alineamientos con huecos se activan mediante una puntuación correspondiente a aproximadamente 2 2 bits.
Generalmente, la homología, similitud o identidad de aminoácidos entre las CDRs variantes individuales son al menos el 60% de las secuencias representadas en esta memoria, y más típicamente con homologías o identidades preferiblemente crecientes de al menos 65% o 70%, más preferiblemente al menos 75% u 80%, incluso más preferiblemente al menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y casi 100%. De manera similar, el "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" con respecto a la secuencia de ácido nucleico de las proteínas de unión identificadas en esta memoria se define como el porcentaje de residuos de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de nucleótidos en la secuencia codificante de la construcción del anticuerpo. Un método específico utiliza el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 configurado con los parámetros predeterminados, con el intervalo de solapamiento y la fracción de solapamiento configurados en 1 y 0,125, respectivamente.
Generalmente, la homología, similitud o identidad de la secuencia de ácido nucleico entre las secuencias de nucleótidos que codifican CDRs variantes individuales y las secuencias de nucleótidos representadas en esta memoria son al menos del 60%, y más típicamente con homologías o identidades preferiblemente crecientes de al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 8 6 %, 87%, 8 8 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% y casi 100%. Por lo tanto, una "CDR variante" es una con la homología, similitud o identidad especificadas con la CDR original de la invención, y comparte la función biológica, que incluye, pero no se limita a 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 8 6 %, 87%, 8 8 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la especificidad y/o actividad de la CDR parental.
En una realización, el porcentaje de identidad con la línea germinal humana de las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención es > 70% o > 75%, más preferiblemente > 80% o > 85%, incluso más preferiblemente > 90% y lo más preferiblemente > 91 %, > 92%, > 93%, > 94%, > 95% o incluso > 96%. Véase el Ejemplo 7. Se cree que la identidad con los productos génicos de la línea germinal de anticuerpos humanos es una característica importante para reducir el riesgo de que las proteínas terapéuticas provoquen una respuesta inmunitaria contra el fármaco en el paciente durante el tratamiento. Hwang y Foote ("Immunogenicity of engineered antibodies"; Methods 36 (2005) 3-10) demuestran que la reducción de porciones no humanas de construcciones de anticuerpos farmacológicos conduce a una disminución del riesgo de inducir anticuerpos anti-fármacos en los pacientes durante el tratamiento. Al comparar un número exhaustivo de fármacos de anticuerpos evaluados clínicamente y los datos de inmunogenicidad respectivos, se muestra la tendencia de que la humanización de las regiones V de los anticuerpos haga que la proteína sea menos inmunogénica (promedio del 5,1% de los pacientes) que los anticuerpos que llevan regiones V no humanas no alteradas. (promedio 23,59% de los pacientes). Por lo tanto, es deseable un mayor grado de identidad con las secuencias humanas para las terapias con proteínas basadas en la región V en forma de construcciones de anticuerpos. Para este propósito de determinar la identidad de la línea germinal, las regiones V de VL pueden alinearse con las secuencias de aminoácidos de los segmentos V y J de la línea germinal humana (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) utilizando el software Vector NTI y la secuencia de aminoácidos calculada dividiendo los residuos de aminoácidos idénticos por el número total de residuos de aminoácidos de la VL en porcentaje. Lo mismo puede ser para los segmentos VH (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) con la excepción de que la CDR3 de VH puede ser excluida debido a su alta diversidad y a la falta de participantes en el alineamiento de CDR3 de VH de la línea germinal humana existente. A continuación, pueden utilizarse técnicas recombinantes para aumentar la identidad de secuencia con genes de la línea germinal de anticuerpos humanos.
En una realización adicional, las construcciones de anticuerpos biespecíficos de la presente invención exhiben altos rendimientos de monómeros en condiciones de escala de investigación estándar, p. ej., en un proceso de purificación estándar de dos etapas. Preferiblemente, el rendimiento de monómero de las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención es > 0,25 mg/L de sobrenadante, más preferiblemente > 0,5 mg/L, incluso más preferiblemente > 1 mg/L y lo más preferiblemente > 3 mg/L de sobrenadante.
De igual manera, se puede determinar el rendimiento de las isoformas de la construcción de anticuerpo dimérico y, por lo tanto, el porcentaje de monómero (es decir, monómero: (monómero dímero)) de las construcciones de anticuerpos. La productividad de las construcciones de anticuerpos monoméricos y diméricos y el porcentaje de monómero calculado pueden, p. ej., obtenerse en la etapa de purificación SEC del sobrenadante de cultivo a partir de la producción estandarizada a escala de investigación en botellas rotativas. En una realización, el porcentaje de monómero de las construcciones de anticuerpos es > 80%, más preferiblemente > 85%, incluso más preferiblemente > 90% y lo más preferiblemente > 95%.
En una realización, las construcciones de anticuerpos tienen una estabilidad en plasma preferida (relación de CE50 con plasma a CE50 sin plasma) de < 5 o < 4, más preferiblemente < 3,5 o < 3, incluso más preferiblemente < 2,5 o < 2, y lo más preferiblemente < 15 o < 1. La estabilidad en plasma de una construcción de anticuerpo se puede testar mediante la incubación de la construcción en plasma humano a 37°C durante 24 horas, seguido de la determinación de CE50 en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51. Las células efectoras en el ensayo de citotoxicidad se pueden estimular en células T CD8 positivas humanas enriquecidas. Las células diana pueden, p. ej., ser células CHO transfectadas con DLL3 humana. La relación entre la célula efectora a diana (E:T) se puede elegir como 10:1. El conjunto de plasma humano utilizado para este propósito se deriva de la sangre de donantes sanos recogida con jeringas recubiertas con EDTA. Los componentes celulares se eliminan por centrifugación y la fase plasmática superior se recoge y posteriormente se agrupa. Como control, las construcciones de anticuerpos se diluyen inmediatamente antes del ensayo de citotoxicidad en medio RPMI-1640. La estabilidad en plasma se calcula como la relación de CE50 (después de la incubación en plasma) a CE50 (control). Véase el Ejemplo 11.
Además, se prefiere que la conversión de monómero a dímero de las construcciones de anticuerpos de la invención sea baja. La conversión se puede medir en diferentes condiciones y analizar mediante cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento. Véase el Ejemplo 9. Por ejemplo, la incubación de las isoformas monoméricas de las construcciones de anticuerpos se puede llevar a cabo durante 7 días a 37°C y concentraciones de p. ej., 100 pg/ml o 250 pg/ml en una incubadora. Bajo estas condiciones, se prefiere que las construcciones de anticuerpos de la invención muestren un porcentaje de dímeros que sea < 5%, más preferiblemente < 4%, incluso más preferiblemente < 3%, incluso más preferiblemente < 2,5%, incluso más preferiblemente < 2%, incluso más preferiblemente < 1,5%, y lo más preferiblemente < 1% o < 0,5% o incluso 0%.
También se prefiere que las construcciones de anticuerpos biespecíficos de la presente invención presenten una conversión de dímeros muy baja después de un cierto número de ciclos de congelación/descongelación. Por ejemplo, el monómero de la construcción de anticuerpo se ajusta a una concentración de 250 pg/ml, p. ej., en un tampón de formulación genérico y se somete a tres ciclos de congelación/descongelación (congelación a -80°C durante 30 min seguido de descongelación durante 30 min a temperatura ambiente), seguido de SEC de alto rendimiento para determinar el porcentaje de construcción de anticuerpo inicialmente monomérico, que se había convertido en una construcción de anticuerpo dimérico. Preferiblemente, los porcentajes de dímeros de las construcciones de anticuerpos biespecíficos son < 5%, más preferiblemente < 4%, incluso más preferiblemente < 3%, incluso más preferiblemente < 2,5%, incluso más preferiblemente < 2%, incluso más preferiblemente < 1,5%, y lo más preferiblemente < 1% o incluso < 0,5%, por ejemplo, después de tres ciclos de congelación/descongelación.
Las construcciones de anticuerpos biespecíficos de la presente invención muestran preferiblemente una termoestabilidad favorable con temperaturas de agregación > 45°C o > 50°C, más preferiblemente > 52°C o > 54°C, incluso más preferiblemente > 56°C o > 57°C y lo más preferiblemente > 58°C o > 59°C. El parámetro de termoestabilidad se puede determinar en términos de temperatura de agregación de anticuerpos de la siguiente manera: La solución de anticuerpo a una concentración de 250 pg/ml se transfiere a una cubeta de un solo uso y se coloca en un dispositivo de Dispersión Dinámica de la Luz (DLS). La muestra se calienta de 40°C a 70°C a una tasa de calentamiento de 0,5°C/min con adquisición constante del radio medido. El aumento del radio que indica la fusión de la proteína y la agregación se utiliza para calcular la temperatura de agregación del anticuerpo. Véase el Ejemplo 10.
Alternativamente, las curvas de temperatura de fusión se pueden determinar mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar las estabilidades biofísicas intrínsecas de las proteínas de las construcciones de anticuerpos. Estos experimentos se realizan utilizando un dispositivo VP-DSC de MicroCal LLC (Northampton, MA, EE.UU.). La absorción de energía de una muestra que contiene una construcción de anticuerpo se registra de 20°C a 90°C en comparación con una muestra que contiene solo el tampón de formulación. Las construcciones de anticuerpos se ajustan a una concentración final de 250 pg/ml, p. ej., en tampón de desarrollo SEC. Para el registro de la curva de fusión respectiva, la temperatura total de la muestra se aumenta escalonadamente. A cada temperatura T se registra la absorción de energía de la muestra y la referencia del tampón de formulación. Se representa la diferencia en la absorción de energía Cp (kcal/mol/°C) de la muestra menos la referencia frente a la temperatura respectiva. La temperatura de fusión se define como la temperatura en el primer máximo de absorción de energía.
Además, se prevé que las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de la invención no reaccionen de forma cruzada con (es decir, no se unan esencialmente a) los parálogos de DLL3 humana DLL1 y/o DLL4. Además, se prevé que las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de la invención no reaccionen de forma cruzada con (es decir, no se unan esencialmente a) los parálogos de DLL3 de macaco / cyno DLL1 y/o DLL4. Véase el Ejemplo 6.
También se prevé que las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3 xCD3 de la invención tengan una turbidez (medida por DO340 después de la concentración de la construcción de anticuerpos monoméricos purificados a 2,5 mg/ml e incubación durante la noche) de < 0,2, preferiblemente de < 0,15, más preferiblemente de < 0,12, incluso más preferiblemente de < 0,1 y lo más preferiblemente de < 0,08. Véase el Ejemplo 12.
También se prevé que las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de la invención no se internalicen o no experimenten una internalización significativa por parte de la célula diana. La tasa de internalización se puede ensayar, p. e j, como se describe en el Ejemplo 16. Preferiblemente, la tasa de internalización (p. ej., medida como una disminución de la citotoxicidad) es < 20% después de una (pre-)incubación de 2 horas de la construcción de anticuerpo con la célula diana, más preferiblemente < 15%, incluso más preferiblemente < 10% y lo más preferiblemente < 5%.
Además, se prevé que la DLL3 desprendida o soluble no perjudique significativamente la eficacia o la actividad biológica de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de la invención. Esto se puede medir, p. ej., en un ensayo de citotoxicidad en el que se añade al ensayo DLL3 soluble en concentraciones crecientes, p. ej., a 0 nM - 0,3 nM - 0,7 nM - 1 nM - 3 nM - 7 nM - 12 nM. El valor de CE50 de la construcción de anticuerpo testada no debería incrementarse significativamente en presencia de DLL3 soluble. Véase el Ejemplo 17.
En una realización adicional, la construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención es estable a pH ácido. Cuanto más tolerante se comporte la construcción de anticuerpos a un pH no fisiológico, tal como pH 5,5 (un pH que se requiere para ejecutar, p. ej., una cromatografía de intercambio catiónico), mayor será la recuperación de la construcción de anticuerpos eluida de una columna de intercambio iónico en relación con la cantidad total de proteína cargada. La recuperación de la construcción de anticuerpo de una columna de intercambio iónico (p. ej., catiónico) a pH 5,5 es preferiblemente > 30%, más preferiblemente > 40%, más preferiblemente > 50%, incluso más preferiblemente > 60%, incluso más preferiblemente > 70%, incluso más preferiblemente > 80%, incluso más preferiblemente > 90%, incluso más preferiblemente > 95% y lo más preferiblemente > 99%. Véase el Ejemplo 13.
Además, se prevé que las construcciones de anticuerpos biespecíficos de la presente invención exhiban eficacia terapéutica o actividad antitumoral. Esto puede, p. ej., ser evaluado en un estudio tal como se describe en el siguiente ejemplo de un modelo de xenoinjerto de tumor humano en estadio avanzado:
El día 1 del estudio, 5 x 106 células de una línea celular de cáncer DLL3 positiva humana (p. ej., SHP-77) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco dorsal derecha de ratones NOD/SCID hembras. Cuando el volumen medio del tumor alcanza aproximadamente 100 mm3, se trasplantan células T positivas para CD3 humanas expandidas in vitro a los ratones mediante inyección de aproximadamente 2 x 107 células en la cavidad peritoneal de los animales. Los ratones del grupo de control de vehículo 1 no reciben células efectoras y se utilizan como un control no trasplantado para comparar con el grupo de control de vehículo 2 (que reciben células efectoras) para vigilar el impacto de las células T solas sobre el crecimiento del tumor. El tratamiento con anticuerpos comienza cuando el volumen medio del tumor alcanza aproximadamente 200 mm3. El tamaño medio del tumor de cada uno de los grupos de tratamiento el día de inicio del tratamiento no debería ser estadísticamente diferente de cualquier otro grupo (análisis de varianza). Los ratones se tratan con 0,5 mg/kg/día de una construcción de anticuerpo biespecífico DLL3xCD3 mediante inyección de bolo intravenosa durante aproximadamente 15 a 20 días. Los tumores se miden con un calibre durante el estudio y se evalúa el progreso mediante la comparación entre grupos de los volúmenes de los tumores (TV). La inhibición del crecimiento del tumor T/C [%] se determina calculando TV como T/C% = 100 x (TV mediana del grupo analizado) / (TV mediana del grupo de control 2).
La persona experta sabe cómo modificar o adaptar determinados parámetros de este estudio, tal como el número de células tumorales inyectadas, el sitio de inyección, el número de células T humanas trasplantadas, la cantidad de construcciones de anticuerpos biespecíficos que se administrarán y los plazos, sin dejar de llegar a un resultado significativo y reproducible. Preferiblemente, la inhibición del crecimiento del tumor T/C [%] es < 70 o < 60, más preferiblemente < 50 o < 40, incluso más preferiblemente < 30 o < 20 y lo más preferiblemente < 10 o < 5 o incluso < 2,5.
La invención proporciona, además, un polinucleótido que codifica una construcción de anticuerpo de la invención.
Un polinucleótido es un biopolímero compuesto por 13 o más monómeros de nucleótidos unidos covalentemente en una cadena. El ADN (tal como ADNc) y el ARN (tal como ARNm) son ejemplos de polinucleótidos con una función biológica distinta. Los nucleótidos son moléculas orgánicas que sirven como monómeros o subunidades de moléculas de ácido nucleico, tales como ADN o ARN. La molécula de ácido nucleico o polinucleótido puede ser de doble cadena y de cadena sencilla, lineal y circular. Preferiblemente está comprendida en un vector que preferiblemente está comprendido en una célula huésped. Dicha célula huésped es capaz, p. ej., después de la transformación o transfección con el vector o el polinucleótido de la invención, de expresar la construcción de los anticuerpos. Para ese propósito, el polinucleótido o la molécula de ácido nucleico se enlaza operativamente con secuencias de control.
El código genético es el conjunto de reglas mediante las cuales la información codificada dentro del material genético (ácidos nucleicos) se traduce en proteínas. La descodificación biológica en las células vivas se logra mediante el ribosoma que enlaza los aminoácidos en un orden especificado por el ARNm, utilizando moléculas de ARNt para llevar aminoácidos y leer los tres nucleótidos del ARNm a la vez. El código define cómo las secuencias de estos tripletes de nucleótidos, denominados codones, especifican qué aminoácido se añadirán a continuación durante la síntesis de proteínas. Con algunas excepciones, un codón de tres nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico especifica un solo aminoácido. Debido a que la gran mayoría de genes son codificados con exactamente el mismo código, a este código particular se le alude a menudo como código genético canónico o estándar. Si bien el código genético determina la secuencia de proteínas para una región codificante dada, otras regiones genómicas pueden influir en cuándo y dónde se producen estas proteínas.
Además, la invención proporciona un vector que comprende un polinucleótido de la invención.
Un vector es una molécula de ácido nucleico que se utiliza como un vehículo para transferir material genético (extraño) a una célula. El término "vector" abarca, pero no se limita a - plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. En general, los vectores modificados comprenden un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple y un marcador seleccionable. El vector en sí mismo es generalmente una secuencia de nucleótidos, habitualmente una secuencia de ADN, que comprende una inserción (transgén) y una secuencia más grande que sirve como la "columna vertebral" del vector. Los vectores modernos pueden abarcar características adicionales además de la inserción del transgén y una columna vertebral: promotor, marcador genético, resistencia a antibióticos, gen informador, secuencia de fijación de objetivo, etiqueta de purificación de proteínas. Los vectores denominados vectores de expresión (construcciones de expresión) son específicamente para la expresión del transgén en la célula diana y generalmente tienen secuencias de control.
La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante enlazada operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.
Un ácido nucleico está "operativamente enlazado" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o conductor secretor está operativamente enlazado al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente enlazado a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente enlazado a una secuencia codificante si está situado para facilitar la traducción. Generalmente, "operativamente enlazado" significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y, en el caso de un conductor secretor, son contiguas y están en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La vinculación se logra mediante ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si no existe este tipo de sitios, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.
La "transfección" es el proceso de introducir deliberadamente moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos (incluyendo los vectores) en células diana. El término se utiliza principalmente para métodos no virales en células eucariotas. La transducción se utiliza a menudo para describir la transferencia mediada por virus de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos. La transfección de células animales implica típicamente la apertura de poros transitorios o "agujeros" en la membrana celular, para permitir la absorción de material. La transfección se puede llevar a cabo utilizando fosfato de calcio, por electroporación, por exprimido celular o mezclando un lípido catiónico con el material para producir liposomas, que se fusionan con la membrana celular y depositan su carga en el interior.
El término "transformación" se utiliza para describir la transferencia no viral de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos (incluyendo vectores) a bacterias, y también a células eucariotas no animales, incluyendo células vegetales. La transformación es, por lo tanto, la alteración genética de una célula eucariota bacteriana o no animal resultante de la captación directa a través de la o las membranas celulares de su entorno y la incorporación posterior de material genético exógeno (moléculas de ácido nucleico). La transformación se puede efectuar por medios artificiales. Para que ocurra la transformación, las células o bacterias deben estar en un estado de competencia, lo que podría ocurrir como una respuesta limitada en el tiempo a condiciones del entorno tales como la inanición y la densidad celular.
Además, la invención proporciona una célula huésped transformada o transfectada con la molécula de polinucleótido/ácido nucleico o con el vector de la invención.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "célula huésped" o "célula receptora" pretende incluir cualquier célula individual o cultivo celular que pueda o puedan ser o haya o hayan sido receptoras de vectores, moléculas de ácido nucleico exógenas y polinucleótidos que codifican la construcción de anticuerpos de la presente invención; y/o receptores de la propia construcción de anticuerpo. La introducción del material respectivo en la célula se lleva a cabo mediante transformación, transfección y similares. La expresión «célula huésped» también pretende incluir la progenie o la progenie potencial de una sola célula. Debido a que determinadas modificaciones pueden producirse en las generaciones sucesivas debido a una mutación natural, accidental o deliberada o debido a influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico o total) a la célula parental, pero todavía está incluido dentro del alcance del término como se utiliza en esta memoria. Células huésped adecuadas incluyen células procariotas o eucariotas y también incluyen, pero no se limitan a bacterias, células de levaduras, células de hongos, células vegetales y células animales, tales como células de insectos y células de mamíferos, p. ej., ratones, ratas, macacos o seres humanos.
La construcción de anticuerpos de la invención se puede producir en bacterias. Después de la expresión, la construcción de anticuerpo de la invención se aísla de la pasta de células de E. co lien una fracción soluble y se puede purificar mediante, p. ej., cromatografía de afinidad y/o exclusión por tamaño. La purificación final se puede llevar a cabo de forma similar al procedimiento para purificar el anticuerpo expresado, p. ej., en células CHO.
Además de los procariotas, microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para la construcción de anticuerpos de la invención. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es el más comúnmente utilizado entre los microorganismos huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, un cierto número de otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en esta memoria, tales como Schizosaccharomyces pombe, huéspedes de Kluyveromyces, tales como K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402 226); Pichia pastoris (documento EP 183 070); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos, tales como Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y huéspedes de Aspergillus, tales como A. nidulans y A. niger.
Células huéspedes adecuadas para la expresión de la construcción de anticuerpos glicosilados de la invención se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirales y las correspondientes células huéspedes de insectos permisivas de huéspedes, tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx morí. Una diversidad de cepas virales para transfección está disponible públicamente, p. ej., la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y virus de este tipo se pueden utilizar como el virus de esta memoria de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
También se pueden utilizar como huéspedes cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, Arabidopsis y tabaco. Los expertos en la técnica conocen vectores de clonación y expresión útiles en la producción de proteínas en cultivos de células vegetales. Véase, p. ej. Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750, y Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.
Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un proceso de rutina. Ejemplos de líneas celulares huéspedes de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36 : 59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América 77: 4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CVI ATCC Cc L 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas (m Dc K, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, 14138065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL5 1); células t Ri (Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).
En una realización adicional, la invención proporciona un procedimiento para la producción de una construcción de anticuerpo de la invención, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula huésped de la invención bajo condiciones que permitan la expresión de la construcción de anticuerpo de la invención y recuperar la construcción de anticuerpo producida a partir del cultivo.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "cultivo" se refiere al mantenimiento, diferenciación, crecimiento, proliferación y/o propagación in vitro de células bajo condiciones adecuadas en un medio. El término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción de una construcción de anticuerpo de la invención que incluye, pero no se limita a transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.
Cuando se utilizan técnicas recombinantes, la construcción de anticuerpos se puede producir intracelularmente, en el espacio periplásmico o se puede secretar directamente al medio. Si la construcción de anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, los desechos en partículas, ya sean células huésped o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un proceso para aislar anticuerpos que son secretados al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los desechos celulares se pueden eliminar mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de sistemas de expresión de este tipo se concentran generalmente primero utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.
La construcción de anticuerpo de la invención, preparada a partir de las células huéspedes se puede recuperar o purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatito, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad. Otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatografía -enfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que se ha de recuperar. En los casos en los que la construcción de anticuerpo de la invención comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación.
La cromatografía de afinidad es una técnica de purificación preferida. La matriz a la que está fijado el ligando de afinidad suele ser agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Matrices mecánicamente estables, tales como el vidrio de poros controlado o el poli (estirendivinil) benceno, permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa.
Además, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una construcción de anticuerpo de la invención o una construcción de anticuerpo producida de acuerdo con el procedimiento de la invención.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "composición farmacéutica" se refiere a una composición que es adecuada para la administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. La composición farmacéutica particularmente preferida de esta invención comprende una o una pluralidad de la o las construcciones de anticuerpos de la invención, preferiblemente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende, además, formulaciones adecuadas de uno o más soportes, estabilizadores, excipientes, diluyentes, solubilizantes, tensioactivos, emulsionantes, conservantes y/o adyuvantes (farmacéuticamente eficaces). Constituyentes aceptables de la composición son preferiblemente no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, pero no se limitan a composiciones líquidas, congeladas y liofilizadas.
Las composiciones de la invención pueden comprender un soporte farmacéuticamente aceptable. En general, tal como se utiliza en esta memoria, "soporte farmacéuticamente aceptable" significa todas y cada una de las soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles, disolventes, tampones, p. ej., solución salina tamponada con fosfato (PBS), agua, suspensiones, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, liposomas, medios de dispersión y recubrimientos, que son compatibles con la administración farmacéutica, en particular con la administración parenteral. El uso de medios y agentes de este tipo en composiciones farmacéuticas es bien conocido en la técnica, y las composiciones que comprenden soportes de este tipo se pueden formular mediante métodos convencionales bien conocidos.
Determinadas realizaciones proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden la construcción de anticuerpo de la invención y, además, uno o más excipientes, tales como los descritos ilustrativamente en esta sección y en otras partes de esta memoria. Los excipientes se pueden utilizar en la invención a este respecto para una amplia diversidad de propósitos, tales como ajustar las propiedades físicas, químicas o biológicas de las formulaciones, tales como el ajuste de la viscosidad, y/o los procedimientos de la invención para mejorar la efectividad y/o estabilizar formulaciones de este tipo y procedimientos contra la degradación y el deterioro debido, por ejemplo, a las tensiones que se producen durante la fabricación, el transporte, el almacenamiento, la preparación previa al uso, la administración y posteriormente.
En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación con el propósito de modificar, mantener o preservar, p. ej., el pH, la osmolaridad, viscosidad, claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición (véase REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edición, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company). En realizaciones de este tipo, materiales de formulación adecuados pueden incluir, pero no se limitan a:
• aminoácidos, tales como glicina, alanina, glutamina, asparagina, treonina, prolina, 2-fenilalanina, incluyendo aminoácidos cargados, preferiblemente lisina, acetato de lisina, arginina, glutamato y/o histidina
• agentes antimicrobianos, tales como agentes antibacterianos y antifúngicos
• antioxidantes, tales como ácido ascórbico, metionina, sulfito de sodio o hidrógeno-sulfito de sodio;
• tampones, sistemas tampón y agentes tamponadores que se utilizan para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente más bajo, típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8 o 9; ejemplos de tampones son borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos, succinato, fosfato, histidina y acetato; por ejemplo, tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5;
• disolventes no acuosos, tales como propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo;
• soportes acuosos, incluyendo agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo medios salinos y tamponados;
• polímeros biodegradables, tales como poliésteres;
• agentes conferidores de consistencia, tales como manitol o glicina;
• agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA);
• agentes isotónicos y retardadores de la absorción;
• agentes complejantes, tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-betaciclodextrina);
• cargas;
• monosacáridos; disacáridos; y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, manosa o dextrinas); los hidratos de carbono pueden ser azúcares no reductores, preferiblemente trehalosa, sacarosa, octasulfato, sorbitol o xilitol;
• proteínas (de bajo peso molecular), polipéptidos o soportes proteicos, tales como albúmina de suero humano o bovino, gelatina o inmunoglobulinas, preferiblemente de origen humano;
• agentes colorantes y aromatizantes;
• agentes reductores que contienen azufre, tales como glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol y tiosulfato de sodio;
• agentes diluyentes;
• agentes emulsionantes;
• polímeros hidrofílicos (tales como polivinilpirrolidona);
• contraiones formadores de sales, tal como sodio;
• conservantes, tales como agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares; ejemplos son: cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno);
• complejos metálicos, tales como complejos de Zn-proteína;
• disolventes y co-disolventes (tales como glicerol, propilenglicol o polietilenglicol);
• azúcares y alcoholes de azúcar, tales como trehalosa, sacarosa, octasulfato, manitol, sorbitol o xilitol estaquiosa, manosa, sorbosa, xilosa, ribosa, mioinisitosa, galactosa, lactitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol, ciclitoles (p. ej., inositol), polietilenglicol; y alcoholes de azúcar polihídricos;
• agentes de suspensión;
• tensioactivos o agentes humectantes, tales como pluronics, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos, tales como polisorbato 20, polisorbato, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal; los tensioactivos pueden ser detergentes, preferiblemente con un peso molecular de > 1,2 KD y/o un poliéter, preferiblemente con un peso molecular de > 3 KD; ejemplos no limitantes de detergentes preferidos son Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 y Tween 85; ejemplos no limitantes de poliéteres preferidos son PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 y PEG 5000;
• agentes potenciadores de la estabilidad, tales como sacarosa o sorbitol;
• agentes potenciadores de la tonicidad, tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol, sorbitol;
• vehículos de suministro parenteral, incluyendo solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, lactato de Ringer o aceites fijos;
• vehículos de suministro intravenoso que incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los que se basan en dextrosa de Ringer).
Es evidente para los expertos en la técnica que los diferentes constituyentes de la composición farmacéutica (p. ej., los arriba enumerados) pueden tener diferentes efectos, por ejemplo, y el aminoácido puede actuar como un tampón, un estabilizador y/o un antioxidante; manitol puede actuar como agente conferidor de consistencia y/o agente potenciador de la tonicidad; cloruro sódico puede actuar como vehículo de suministro y/o agente potenciador de la tonicidad; etc.
Se prevé que la composición de la invención podría comprender, además del polipéptido de la invención definido en esta memoria, agentes biológicamente activos adicionales, dependiendo del uso pretendido de la composición. Agentes de este tipo pueden ser fármacos que actúan sobre el sistema gastrointestinal, fármacos que actúan como citostáticos, fármacos que previenen la hiperuriquemia, fármacos que inhiben las inmunorreacciones (p. ej., corticosteroides), fármacos que modulan la respuesta inflamatoria, fármacos que actúan sobre el sistema circulatorio y/o fármacos, tales como citoquinas conocidas. en la técnica. También se prevé que la construcción de anticuerpo de la presente invención se aplique en una co-terapia, es decir, en combinación con otro medicamento contra el cáncer.
En determinadas realizaciones, un experto en la técnica determinará la composición farmacéutica óptima dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración pretendida, el formato de suministro y la dosis deseada. Véase, por ejemplo, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. En determinadas realizaciones, composiciones de este tripo pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de eliminación in vivo de la construcción de anticuerpo de la invención. En determinadas realizaciones, el vehículo o soporte principal en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o soporte adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en las composiciones para administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplares adicionales. En determinadas realizaciones, la construcción de anticuerpos de las composiciones de la invención se puede preparar para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, en determinadas realizaciones, la construcción de anticuerpo de la invención se puede formular como un liofilizado utilizando excipientes apropiados tales como sacarosa.
Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para uso en esta invención pueden proporcionarse en forma de una solución acuosa apirógena, parenteralmente aceptable, que comprende la construcción de anticuerpo deseada de la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que la construcción de anticuerpo de la invención se formula como una solución isotónica estéril, debidamente conservada. En determinadas realizaciones, la preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), perlas o liposomas, que pueden proporcionar liberación controlada o sostenida del producto que puede suministrarse mediante inyección de depósito. En determinadas realizaciones, también se puede utilizar ácido hialurónico, que tiene el efecto de fomentar una duración sostenida en la circulación. En determinadas realizaciones, se pueden utilizar dispositivos de suministro de fármacos implantables para introducir la construcción de anticuerpo deseada.
Composiciones farmacéuticas adicionales resultarán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que implican la construcción de anticuerpo de la invención en formulaciones de suministro/liberación sostenida o controlada. Los expertos en la técnica también conocen técnicas para formular una diversidad de otros medios de suministro sostenido o controlado, tales como soportes de liposomas, micropartículas bio-erosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional WO9315722, que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para el suministro de composiciones farmacéuticas. Preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos moldeados, p. ej., películas o microcápsulas. Matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas (tal como se describe en la Pat. De EE.UU. N° 3.773.919 y en la Publicación de Solicitud de Patente Europea N° EP 058481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2: 547-556), poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etileno y acetato de vinilo (Langer et al., 1981, supra) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (Publicación de Solicitud de Patente Europea N° EP 133.988). Composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas que pueden prepararse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América 82:3688-3692; Publicaciones de Solicitud de Patente Europea N°s EP 036.676; EP 088.046 y EP 143.949.
La construcción de anticuerpo también se puede atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente), en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Técnicas de este tipo se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed., (1980).
Las composiciones farmacéuticas utilizadas para la administración in vivo se proporcionan típicamente en forma de preparaciones estériles. La esterilización se puede lograr mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización utilizando este método puede realizarse antes o después de la liofilización y reconstitución. Composiciones para administración parenteral se pueden almacenar en forma liofilizada o en solución. Composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene una lumbrera de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
Otro aspecto de la invención incluye la construcción de anticuerpos auto-tamponadores de las formulaciones de la invención, que pueden utilizarse como composiciones farmacéuticas tal como se describe en la solicitud de patente internacional WO 06138181A2. Hay disponibles una diversidad de exposiciones sobre la estabilización de proteínas y materiales de formulación y métodos útiles a este respecto, tales como Arakawa et al., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution" en: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter y Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002) y Randolph et al., "Surfactant-protein interactions", Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002), véanse particularmente las partes pertinentes a los excipientes y procedimientos de los mismos para formulaciones de proteínas auto-tamponadoras de acuerdo con la presente invención, especialmente en lo que respecta a productos y procedimientos farmacéuticos de proteínas para usos veterinarios y/o médicos humanos.
Sales se pueden utilizar de acuerdo con determinadas realizaciones de la invención para, por ejemplo, ajustar la fuerza iónica y/o la isotonicidad de una formulación y/o para mejorar la solubilidad y/o estabilidad física de una proteína u otro ingrediente de una composición de acuerdo con la invención. Como es bien sabido, los iones pueden estabilizar el estado nativo de las proteínas uniéndose a residuos cargados en la superficie de la proteína y protegiendo a los grupos cargados y polares en la proteína y reduciendo la fuerza de sus interacciones electrostáticas, atractivas y repelentes. Los iones también pueden estabilizar el estado desnaturalizado de una proteína uniéndose, en particular, a los enlaces peptídicos desnaturalizados (--CONH) de la proteína. Además, la interacción iónica con grupos cargados y polares en una proteína también puede reducir las interacciones electrostáticas intermoleculares y, con ello, prevenir o reducir la agregación e insolubilidad de las proteínas.
Las especies iónicas difieren significativamente en sus efectos sobre las proteínas. Se ha desarrollado un cierto número de clasificaciones categóricas de iones y sus efectos sobre las proteínas que pueden utilizarse en la formulación de composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención. Un ejemplo es la serie Hofmeister, que clasifica los solutos iónicos y no iónicos polares por su efecto sobre la estabilidad conformacional de las proteínas en solución. Los solutos estabilizadores se denominan "cosmotrópicos". Los solutos desestabilizadores se denominan "caotrópicos". Los cosmótropos se utilizan comúnmente en concentraciones elevadas (p. ej., sulfato de amonio > 1 molar) para precipitar proteínas de la solución ("precipitación salina"). Los caótropos se utilizan comúnmente para dentaduras postizas y/o para solubilizar proteínas ("salazón"). La efectividad relativa de los iones para "salar" y “precipitar” define su posición en la serie de Hofmeister.
Los aminoácidos libres se pueden utilizar en la construcción de anticuerpos de las formulaciones de la invención de acuerdo con diversas realizaciones de la invención como agentes conferidores de consistencia, estabilizadores y antioxidantes, así como otros usos estándares. Se pueden utilizar lisina, prolina, serina y alanina para estabilizar proteínas en una formulación. La glicina es útil en la liofilización para asegurar la estructura y propiedades correctas de la torta. La arginina puede ser útil para inhibir la agregación de proteínas, tanto en formulaciones líquidas como liofilizadas. La metionina es útil como un antioxidante.
Polioles incluyen azúcares, p. ej., manitol, sacarosa y sorbitol y alcoholes polihídricos, tales como, por ejemplo, glicerol y propilenglicol y, para los propósitos de la discusión en esta memoria, polietilenglicol (PEG) y sustancias relacionadas. Los polioles son cosmotrópicos. Son agentes estabilizantes útiles en formulaciones tanto líquidas como liofilizadas para proteger proteínas de los procesos de degradación física y química. Polioles también son útiles para ajustar la tonicidad de las formulaciones. Entre los polioles útiles en realizaciones seleccionadas de la invención se encuentra el manitol, comúnmente utilizado para asegurar la estabilidad estructural de la torta en formulaciones liofilizadas. Asegura estabilidad estructural a la torta. Generalmente se utiliza con un lioprotector, p. ej., sacarosa. El sorbitol y la sacarosa se encuentran entre los agentes preferidos para ajustar la tonicidad y como estabilizadores para proteger frente a las tensiones de congelación-descongelación durante el transporte o la preparación de cargas durante el procedimiento de fabricación. Los azúcares reductores (que contienen grupos aldehído o cetona libres), tales como glucosa y lactosa, pueden glicar los residuos de lisina y arginina de la superficie. Por lo tanto, generalmente no se encuentran entre los polioles preferidos para uso de acuerdo con la invención. Además, los azúcares que forman especies reactivas de este tipo, tales como sacarosa, que se hidroliza a fructosa y glucosa en condiciones ácidas y, en consecuencia, engendra glicación, tampoco se encuentran entre los polioles preferidos de la invención a este respecto. El PEG es útil para estabilizar proteínas y como un crioprotector y puede utilizarse en la invención a este respecto.
Realizaciones de la construcción de anticuerpos de las formulaciones de la invención comprenden, además, tensioactivos. Las moléculas de proteína pueden ser susceptibles a la adsorción sobre superficies y a la desnaturalización y la consiguiente agregación en las interfaces aire-líquido, sólido-líquido y líquido-líquido. Estos efectos se incrementan generalmente a la inversa con la concentración de las proteínas. Estas interacciones deletéreas se incrementan generalmente a la inversa con la concentración de proteína y típicamente son exacerbadas por la agitación física, tales como la generada durante el transporte y la manipulación de un producto. Los tensioactivos se utilizan de forma rutinaria para prevenir, minimizar o reducir la adsorción superficial. Tensioactivos útiles en la invención a este respecto incluyen polisorbato 20, polisorbato 80, otros ésteres de ácidos grasos de polietoxilatos de sorbitán y poloxámero 188. Los tensioactivos también se utilizan comúnmente para controlar la estabilidad conformacional de las proteínas. El uso de tensioactivos a este respecto es específico para proteínas, ya que cualquier tensioactivo dado estabilizará típicamente algunas proteínas y desestabilizará otras.
Los polisorbatos son susceptibles a la degradación oxidativa y, a menudo, tal como se suministran, contienen cantidades suficientes de peróxidos para provocar la oxidación de las cadenas laterales de residuos de proteínas, especialmente metionina. En consecuencia, los polisorbatos deberían utilizarse con cuidado y, cuando se utilizan, deben emplearse en su concentración efectiva más baja. A este respecto, los polisorbatos ejemplifican la regla general de que los excipientes deben utilizarse en sus concentraciones efectivas más bajas.
Realizaciones de la construcción de anticuerpos de las formulaciones de la invención comprenden, además, uno o más antioxidantes. Hasta cierto punto, la oxidación perjudicial de proteínas se puede prevenir en las formulaciones farmacéuticas manteniendo niveles adecuados de oxígeno y temperatura ambientales y evitando la exposición a la luz. También se pueden utilizar excipientes antioxidantes para prevenir la degradación oxidativa de proteínas. Entre los antioxidantes útiles a este respecto se encuentran los agentes reductores, los captadores de oxígeno/radicales libres y los agentes quelantes. Antioxidantes para uso en formulaciones de proteínas terapéuticas de acuerdo con la invención son preferiblemente hidrosolubles y mantienen su actividad durante la vida útil de un producto. EDTA es un antioxidante preferido de acuerdo con la invención a este respecto. Los antioxidantes pueden dañar las proteínas. Por ejemplo, agentes reductores, tales como glutatión en particular, pueden alterar los enlaces disulfuro intramoleculares. Por lo tanto, los antioxidantes para uso en la invención se seleccionan para, entre otras cosas, eliminar o reducir suficientemente la posibilidad de que ellos mismos dañen las proteínas en la formulación.
Formulaciones de acuerdo con la invención pueden incluir iones metálicos que son co-factores de proteínas y que son necesarios para formar complejos de coordinación de proteínas, tales como el zinc, necesario para formar determinadas suspensiones de insulina. Los iones metálicos también pueden inhibir algunos procesos que degradan proteínas. Sin embargo, los iones metálicos también catalizan procesos físicos y químicos que degradan proteínas. Se pueden utilizar iones magnesio (10-120 mM) para inhibir la isomerización del ácido aspártico a ácido isoaspártico. Los iones Ca+2 (hasta 100 mM) pueden aumentar la estabilidad de la desoxirribonucleasa humana. Sin embargo, Mg+2, Mn+2 y Zn+2 pueden desestabilizar la rhDNasa. De manera similar, Ca+2 y Sr+2 pueden estabilizar el Factor VIII, éste puede ser desestabilizado por Mg+2, Mn+2 y Zn+2 Cu+2 y Fe+2, y su agregación puede incrementarse por iones Al+3.
Realizaciones de la construcción de anticuerpo de las formulaciones de la invención comprenden, además, uno o más conservantes. Los conservantes son necesarios cuando se desarrollan formulaciones parenterales multidosis que implican más de una extracción del mismo recipiente. Su función principal es inhibir el crecimiento microbiano y asegurar la esterilidad del producto durante la vida útil o el período de uso del producto farmacológico. Los conservantes de uso común incluyen alcohol bencílico, fenol y m-cresol. Aunque los conservantes tienen una larga historia de uso con parenterales de moléculas pequeñas, el desarrollo de formulaciones de proteínas que incluyan conservantes puede ser un desafío. Los conservantes tienen casi siempre un efecto desestabilizador (agregación) sobre las proteínas, y esto se ha convertido en un factor importante para limitar su uso en formulaciones de proteínas multidosis. Hasta la fecha, la mayoría de los fármacos proteicos se han formulado para un solo uso. Sin embargo, cuando son posibles formulaciones de dosis múltiples, tienen la ventaja adicional de permitir la conveniencia del paciente y una comerciabilidad incrementada. Un buen ejemplo es el de la hormona del crecimiento humana (hGH), en donde el desarrollo de formulaciones conservadas ha conducido a la comercialización de presentaciones de pluma inyectable multiusos más convenientes. Actualmente, se encuentran disponibles en el mercado al menos cuatro de estos dispositivos de pluma que contienen formulaciones conservadas de hGH. Norditropin (líquido, Novo Nordisk), Nutropin AQ (líquido, Genentech) y Genotropin (liofilizado - cartucho de doble cámara, Pharmacia & Upjohn) contienen fenol, mientras que Somatrope (Eli Lilly) está formulado con m-cresol. Es necesario considerar varios aspectos durante la formulación y el desarrollo de formas de dosificación conservadas. Debe optimizarse la concentración eficaz de conservante en el producto farmacológico. Esto requiere testar un conservante dado en la forma de dosificación con intervalos de concentraciones que confieren eficacia antimicrobiana sin comprometer la estabilidad de la proteína.
Como era de esperar, el desarrollo de formulaciones líquidas que contienen conservantes es más desafiante que las formulaciones liofilizadas. Productos liofilizados pueden liofilizarse sin el conservante y pueden reconstituirse con un diluyente que contenga conservante en el momento de su uso. Esto acorta el tiempo durante el cual un conservante está en contacto con la proteína, minimizando significativamente los riesgos de estabilidad asociados. Con las formulaciones líquidas, la eficacia y la estabilidad de los conservantes deben mantenerse durante toda la vida útil del producto (aproximadamente de 18 a 24 meses). Un punto importante a tener en cuenta es que la eficacia del conservante debe demostrarse en la formulación final que contiene el fármaco activo y todos los componentes del excipiente.
Las construcciones de anticuerpos descritas en esta memoria también se pueden formular como inmuno-liposomas. Un ''liposoma'' es una pequeña vesícula compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivo que es útil para el suministro de un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas. Liposomas que contienen la construcción de anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América, 77: 4030 (1980); Pat. de EE.UU. N°s 4.485.045 y 4.544.545; y documento WO 97/38731. Los liposomas con tiempo de circulación potenciado se describen en la Patente de EE.UU. N° 5.013.556. Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab’ de la construcción de anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar con los liposomas tal como se describe en Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Opcionalmente, el liposoma contiene un agente quimioterapéutico. Véase Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).
Una vez formulada la composición farmacéutica, puede almacenarse en viales estériles en forma de una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, cristal o en forma de un polvo deshidratado o liofilizado. Formulaciones de este tipo se pueden almacenar en una forma lista para Estados Unidos de Américar o en una forma (p. ej., liofilizada) que se reconstituye antes de la administración.
La actividad biológica de la composición farmacéutica definida en esta memoria se puede determinar, por ejemplo, mediante ensayos de citotoxicidad tal como se describe en los siguientes ejemplos, en el documento WO 99/54440 o por Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12). "Eficacia" o "eficacia in vivo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la respuesta a la terapia por la composición farmacéutica de la invención, utilizando, p. ej., criterios de respuesta NCI estandarizados. El éxito o la eficacia in vivo de la terapia utilizando una composición farmacéutica de la invención se refiere a la eficacia de la composición para su propósito pretendido, es decir, la capacidad de la composición para provocar el efecto deseado, es decir, el agotamiento de células patológicas, p. ej. células tumorales. La eficacia in vivo puede vigilarse mediante métodos estándares establecidos para las entidades patológicas respectivas que incluyen, pero no se limitan a recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación de células activadas por fluorescencia, aspiración de médula ósea. Además, se pueden utilizar diversos parámetros químicos clínicos específicos de la enfermedad y otros métodos estándares establecidos. Además, la tomografía asistida por computadora, los rayos X, la tomografía por resonancia magnética nuclear (p. ej., para la evaluación de la respuesta basada en los criterios del Instituto Nacional del Cáncer) [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Informe de un taller internacional para estandarizar los criterios de respuesta para los linfomas no Hodgkin. Grupo de trabajo internacional patrocinado por NCI. J Clin Oncol. abril de 1999; 17(4):1244]), tomografía por emisión de positrones, recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación de células activadas por fluorescencia, aspiración de médula ósea, biopsias/histologías de ganglios linfáticos, y se pueden utilizar diversos parámetros químicos clínicos específicos para el linfoma (p. ej., lactato deshidrogenasa) y otros métodos estándares establecidos.
Otro desafío importante en el desarrollo de fármacos tales como la composición farmacéutica de la invención es la modulación predecible de las propiedades farmacocinéticas. Para este fin, se puede establecer un perfil farmacocinético del fármaco candidato, es decir, un perfil de los parámetros farmacocinéticos que afectan la capacidad de un fármaco particular para tratar una afección determinada. Parámetros farmacocinéticos del fármaco que influyen en la capacidad de un fármaco de tratar una determinada enfermedad incluyen, pero no se limitan a: semivida, volumen de distribución, metabolismo hepático de primer paso y grado de unión al suero sanguíneo. La eficacia de un agente farmacológico dado puede verse influida por cada uno de los parámetros arriba mencionados.
"Semivida" significa el tiempo en el que el 50% de un fármaco administrado se elimina a través de procesos biológicos, p. ej., metabolismo, excreción, etc. Por "metabolismo hepático de primer paso" se entiende la propensión de un fármaco a metabolizarse en el primer contacto con el hígado, es decir, durante su primer paso a través del hígado. "Volumen de distribución" significa el grado de retención de un fármaco en los diversos compartimientos del cuerpo, tales como, p. ej., espacios intracelulares y extracelulares, tejidos y órganos, etc. y la distribución del fármaco dentro de estos compartimientos. "Grado de unión al suero sanguíneo" significa la propensión de un fármaco a interactuar y unirse a proteínas del suero sanguíneo, tales como albúmina, lo que conduce a una reducción o pérdida de la actividad biológica del fármaco.
Los parámetros farmacocinéticos también incluyen biodisponibilidad, tiempo de retardo (Tlag), Tmáx, tasas de absorción, mayor inicio y/o Cmáx para una cantidad dada de fármaco administrado. "Biodisponibilidad" significa la cantidad de un fármaco en el compartimiento sanguíneo. "Tiempo de espera" significa el tiempo de demora entre la administración del fármaco y su detección y mensurabilidad en sangre o plasma. "Tmáx" es el tiempo después del cual se alcanza la concentración sanguínea máxima del fármaco, y "Cmáx" es la concentración sanguínea máxima obtenida con un fármaco dado. El tiempo necesario para alcanzar la concentración sanguínea o tisular del fármaco que se requiere para su efecto biológico está influenciado por todos los parámetros. Los parámetros farmacocinéticos de las construcciones de anticuerpos biespecíficos que presentan especificidad de especies cruzadas, que pueden determinarse en pruebas preclínicas con primates no chimpancés, como se esbozó anteriormente, también se recogen, p. ej., en la publicación de Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).
Una realización proporciona la construcción de anticuerpo de la invención o la construcción de anticuerpo producida de acuerdo con el procedimiento de la invención para uso en la prevención, el tratamiento o la mejoría de un tumor o enfermedad cancerosa o de una enfermedad cancerosa metastásica.
Las formulaciones descritas en esta memoria son útiles como composiciones farmacéuticas en el tratamiento, la mejoría y/o prevención de la afección médica patológica tal como se describe en esta memoria en un paciente que lo necesite. El término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Tratamiento incluye la aplicación o administración de la formulación al cuerpo, un tejido aislado o una célula de un paciente que tiene una enfermedad/trastorno, un síntoma de una enfermedad/trastorno o una predisposición a una enfermedad/trastorno, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, paliar, mejorar o afectar la enfermedad, el síntoma de la enfermedad o la predisposición a la enfermedad.
El término "mejora", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a cualquier mejora del estado patológico de un paciente que tiene un tumor o cáncer o un cáncer metastásico tal como se especifica más adelante en esta memoria, mediante la administración de una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención a un sujeto que lo necesite. Una mejora de este tipo también puede verse como una ralentización o detención de la progresión del tumor o cáncer o cáncer metastásico del paciente. El término "prevención", tal como se utiliza en esta memoria, significa evitar la aparición o reaparición de un paciente que tiene un tumor o cáncer o un cáncer metastásico como se especifica más adelante en esta memoria, mediante la administración de una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención a un sujeto en necesidad de la misma.
El término "enfermedad" se refiere a cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con la construcción de anticuerpo o la composición farmacéutica descrita en esta memoria. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicos y agudos, incluyendo aquellas afecciones patológicas que predisponen al mamífero a la enfermedad en cuestión.
Una "neoplasia" es un crecimiento anormal de tejido que, por lo general, pero no siempre, forma una masa. Cuando también forma una masa, se la alude comúnmente como un "tumor". Las neoplasias o tumores pueden ser benignos, potencialmente malignos (precancerosos) o malignos. Las neoplasias malignas se denominan comúnmente cáncer. Por lo general, invaden y destruyen el tejido circundante y pueden formar metástasis, es decir, se diseminan a otras partes, tejidos u órganos del cuerpo. Por lo tanto, la expresión "cáncer metastásico" abarca metástasis a otros tejidos u órganos distintos del tumor original. Los linfomas y las leucemias son neoplasias linfoides. Para los fines de la presente invención, también están abarcados por los términos "tumor" o "cáncer".
En una realización preferida de la invención, el tumor o la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a (o consiste en) cáncer de pulmón, preferiblemente SCLC, tumor o cáncer de mama, cervical, de colon, colorrectal, endometrial, de cabeza y cuello, de hígado, de ovario, de páncreas, de próstata, de piel, gástrico, de testículo, de tiroides, suprarrenal, renal, vesical, uterino, esofágico, urotelial y cerebral, linfoma, carcinoma y sarcoma, y una enfermedad de cáncer metastásico derivada de cualquiera de los precedentes.
Más específicamente, el tumor o la enfermedad cancerosa se puede seleccionar del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), glioma, glioblastoma, melanoma, cáncer de próstata neuroendocrino, cáncer de páncreas neuroendocrino, hepatoblastoma, y carcinoma hepatocelular. La enfermedad del cáncer metastásico se puede derivar de cualquiera de los anteriores.
Las expresiones "sujeto que lo necesita" o "que necesita tratamiento" incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos en los que se debe prevenir el trastorno. El sujeto necesitado o "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.
La construcción de anticuerpos de la invención se diseñará generalmente para vías y métodos de administración específicos, para dosificaciones y frecuencias de administración específicas, para tratamientos específicos de enfermedades específicas, con intervalos de biodisponibilidad y persistencia, entre otras cosas. Los materiales de la composición se formulan preferiblemente en concentraciones que son aceptables para el lugar de administración.
Por lotanto, las formulaciones y composiciones pueden diseñarse de acuerdo con la invención para suministro mediante cualquier vía de administración adecuada. En el contexto de la presente invención, las vías de administración incluyen, pero no se limitan a
• vías tópicas (tales como epicutánea, inhalatoria, nasal, oftálmica, auricular/aural, vaginal, mucosal);
• vías enterales (tales como oral, gastrointestinal, sublingual, sublabial, bucal, rectal); y
• vías parenterales (tales como intravenosa, intraarterial, intraósea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular, epidural, intratecal, subcutánea, intraperitoneal, extra-amniótica, intraarticular, intracardíaca, intradérmica, intralesional, intrauterina, intravesical, intravítrea, transdérmica, intracosal, intrasinovial, intraluminal).
Las composiciones farmacéuticas y la construcción de anticuerpo de esta invención son particularmente útiles para la administración parenteral, p. ej., suministro subcutáneo o intravenoso, por ejemplo, mediante inyección, tal como inyección en bolo, o mediante infusión, tal como infusión continua. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar utilizando un dispositivo médico. Se describen ejemplos de dispositivos médicos para administrar composiciones farmacéuticas en las Patentes de EE.UU. N°S 4.475.196; 4.439.196; 4.447.224; 4.447. 233; 4.486.194; 4.487.603; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 5.064.413; 5.312.335; 5.312.335; 5.383.851; y 5.399.163.
En particular, la presente invención proporciona una administración ininterrumpida de la composición adecuada. Como un ejemplo no limitativo, la administración ininterrumpida o sustancialmente ininterrumpida, es decir, continua puede realizarse mediante un pequeño sistema de bomba que lleva el paciente para medir la entrada de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. La composición farmacéutica que comprende la construcción de anticuerpo de la invención se puede administrar utilizando dichos sistemas de bomba. Sistemas de bomba de este tipo son generalmente conocidos en la técnica y comúnmente se basan en el intercambio periódico de cartuchos que contienen el agente terapéutico que se ha de infundir. Cuando se cambia el cartucho en un sistema de bomba de este tipo, puede producirse una interrupción temporal del flujo ininterrumpido de otro modo de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. En tal caso, la fase de administración antes del reemplazo del cartucho y la fase de administración después del reemplazo del cartucho aún se considerarían dentro del significado de los medios farmacéuticos y los métodos de la invención juntos constituyen una "administración ininterrumpida" de un agente terapéutico de este tipo.
La administración continua o ininterrumpida de las construcciones de anticuerpos de la invención puede ser intravenosa o subcutánea por medio de un dispositivo de suministro de fluido o un pequeño sistema de bomba que incluye un mecanismo de impulsión de fluido para sacar fluido de un depósito y un mecanismo de actuación para activar el mecanismo de impulsión. Sistemas de bomba para administración subcutánea pueden incluir una aguja o una cánula para penetrar la piel de un paciente y administrar la composición adecuada al cuerpo del paciente. Dichos sistemas de bomba pueden fijarse o adherirse directamente a la piel del paciente independientemente de una vena, arteria o vaso sanguíneo, permitiendo con ello un contacto directo entre el sistema de bomba y la piel del paciente. El sistema de bomba se puede colocar en la piel del paciente durante 24 horas hasta varios días. El sistema de bomba puede ser de pequeño tamaño con un depósito para pequeños volúmenes. Como un ejemplo no limitativo, el volumen del depósito para la composición farmacéutica adecuada a administrar puede estar entre 0,1 y 50 ml.
La administración continua también puede ser transdérmica mediante un parche que se coloca sobre la piel y se reemplaza a intervalos. Un experto en la técnica conoce los sistemas de parches para el suministro de fármacos adecuados para este propósito. Cabe señalar que la administración transdérmica es especialmente adecuada para la administración ininterrumpida, ya que el intercambio de un primer parche agotado se puede realizar ventajosamente simultáneamente con la colocación de un segundo parche nuevo, por ejemplo, en la superficie de la piel inmediatamente adyacente al primer parche agotado e inmediatamente antes de retirar el primer parche agotado. No surgen problemas de interrupción del flujo o fallo de la celda de energía.
Si la composición farmacéutica se ha liofilizado, el material liofilizado se reconstituye primero en un líquido apropiado antes de la administración. El material liofilizado se puede reconstituir en, p. ej., agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS) o la misma formulación en la que había estado la proteína antes de la liofilización.
Las composiciones de la presente invención se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada que se puede determinar, p. ej., mediante estudios de aumento de la dosis mediante la administración de dosis crecientes de la construcción de anticuerpo de la invención que exhibe la especificidad entre especies descrita en esta memoria para primates que no son chimpancés. por ejemplo macacos. Como se expuso arriba, la construcción de anticuerpo de la invención que exhibe especificidad entre especies descrita en esta memoria puede utilizarse ventajosamente en forma idéntica en pruebas preclínicas en primates que no son chimpancés y como fármaco en seres humanos. El régimen de dosificación lo determinará el médico tratante y los factores clínicos. Como es bien conocido en la técnica médica, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, la superficie corporal, la edad, el compuesto particular que se ha de administrar, el sexo, la hora y la vía de administración, la salud general y otros. fármacos que se administran al mismo tiempo.
La expresión "dosis eficaz" o "dosificación eficaz" se define como una cantidad suficiente para lograr o al menos lograr parcialmente el efecto deseado. La expresión "dosis terapéuticamente eficaz" se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece la enfermedad. Cantidades o dosis eficaces para este uso dependerán de la afección a tratar (la indicación), la construcción del anticuerpo administrado, el contexto y los objetivos terapéuticos, la gravedad de la enfermedad, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al agente terapéutico, la vía de administración, el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y/o el estado (la edad y salud general) del paciente, y el estado general del sistema inmune del propio paciente. La dosis adecuada se puede ajustar de acuerdo con el criterio del médico tratante, de modo que se pueda administrar al paciente una vez o durante una serie de administraciones, y con el fin de obtener el efecto terapéutico óptimo.
Una dosificación típica puede variar desde aproximadamente 0,1 pg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg o más, dependiendo de los factores arriba mencionados. En realizaciones específicas, la dosificación puede variar desde 1,0 pg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, opcionalmente desde 10 pg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg o desde 100 pg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de una construcción de anticuerpo de la invención preferiblemente da como resultado una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia o duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad o una prevención del deterioro o discapacidad debidos a la aflicción de la enfermedad. Para el tratamiento de tumores que expresan DLL3, una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de anticuerpo de la invención, p. ej., una construcción de anticuerpo anti-DLL3/anti-CD3, inhibe preferiblemente el crecimiento celular o el crecimiento del tumor en al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80% o al menos aproximadamente un 90% con relación a los pacientes no tratados. La capacidad de un compuesto de inhibir el crecimiento del tumor puede evaluarse en un modelo animal predictivo de la eficacia en tumores humanos.
La composición farmacéutica se puede administrar como un único agente terapéutico o en combinación con terapias adicionales tales como terapias contra el cáncer según sea necesario, p. ej., otros fármacos proteicos y no proteicos. Estos fármacos pueden administrarse simultáneamente con la composición que comprende la construcción de anticuerpo de la invención como se define en esta memoria o por separado antes o después de la administración de dicha construcción de anticuerpo en intervalos y dosis definidos oportunamente.
La expresión "dosis eficaz y no tóxica", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una dosis tolerable de una construcción de anticuerpo de la invención que es lo suficientemente alta como para provocar el agotamiento de las células patológicas, la eliminación del tumor, la reducción del tumor o la estabilización de la enfermedad sin o esencialmente sin efectos tóxicos importantes. Dosis eficaces y no tóxicas de este tipo pueden determinarse, p. ej., mediante estudios de aumento de la dosis descritos en la técnica y deben estar por debajo de la dosis que induce efectos secundarios adversos graves (toxicidad limitante de la dosis, DLT).
El término "toxicidad", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a los efectos tóxicos de un fármaco que se manifiestan en eventos adversos o eventos adversos graves. Estos eventos secundarios pueden referirse a una falta de tolerabilidad del fármaco en general y/o una ausencia de tolerancia local después de la administración. La toxicidad también podría incluir efectos teratogénicos o cancerígenos provocados por el fármaco.
El término "seguridad", la expresión "seguridad in vivo" o el término "tolerabilidad", tal como se utiliza en esta memoria define la administración de un fármaco sin inducir eventos adversos graves directamente después de la administración (tolerancia local) y durante un período más largo de aplicación del fármaco. "Seguridad", "seguridad in vivo" o "tolerabilidad" pueden evaluarse, p. ej., a intervalos regulares durante el tratamiento y el período de seguimiento. Las mediciones incluyen evaluación clínica, p. ej., manifestaciones orgánicas y rastreo de anomalías de laboratorio. Se puede llevar a cabo una evaluación clínica y desviaciones de los hallazgos normales se pueden registrar/codificar de acuerdo con los estándares NCI-CTC y/o MedDRA. Las manifestaciones de órganos pueden incluir criterios tales como alergia/inmunología, sangre/médula ósea, arritmia cardíaca, coagulación y similares, como se recoge, p. ej., en los Criterios de Terminología Común para eventos adversos v3.0 (CTCAE). Parámetros de laboratorio que pueden testarse incluyen, por ejemplo, hematología, química clínica, perfil de coagulación y análisis de orina y examen de otros fluidos corporales, tales como suero, plasma, líquido linfoide o cefalorraquídeo, líquido y similares. Por lo tanto, la seguridad puede evaluarse, p. ej., mediante examen físico, técnicas de formación de imágenes (es decir, ultrasonidos, rayos X, tomografías computarizadas, formación de Imágenes por Resonancia Magnética (MRI), otras medidas con dispositivos técnicos (es decir, electrocardiograma), signos vitales, midiendo parámetros de laboratorio y registrando efectos adversos. Por ejemplo, eventos adversos en primates no chimpancés en los usos y métodos de acuerdo con la invención pueden examinarse mediante métodos histopatológicos y/o histoquímicos.
A los términos y expresiones de arriba también se les alude, p. e j, en la evaluación preclínica de la seguridad de productos farmacéuticos derivados de la biotecnología S6; Directriz Tripartita Armonizada de la ICH; Reunión del Comité Directivo de la ICH el 16 de julio de 1997.
En una realización adicional, la invención proporciona un kit que comprende una construcción de anticuerpos de la invención, una construcción de anticuerpos producida de acuerdo con el procedimiento de la invención, un polipéptido de la invención, un vector de la invención y/o una célula huésped de la invención.
En el contexto de la presente invención, el término "kit" significa dos o más componentes - uno de los cuales corresponde a la construcción del anticuerpo, la composición farmacéutica, el vector o la célula huésped de la invención - empaquetados juntos en un envase, recipiente o de otro modo. Por lo tanto, un kit puede describirse como un conjunto de productos y/o utensilios que son suficientes para lograr un determinado objetivo, que pueden comercializarse como una sola unidad.
El kit puede comprender uno o más recipientes (tales como viales, ampollas, envases, jeringas, botellas, bolsas) de cualquier forma, tamaño y material apropiados (preferiblemente impermeable al agua, p. ej. plástico o vidrio) que contienen la construcción de anticuerpo o la composición farmacéutica de la presente invención en una dosificación apropiada para la administración (véase arriba). El kit puede contener adicionalmente instrucciones de uso (p. ej., en forma de un folleto o manual de instrucciones), medios para administrar la construcción de anticuerpo de la presente invención, tal como una jeringa, bomba, infusor o similares, medios para reconstituir la construcción de anticuerpo de la invención y/o medios para diluir la construcción de anticuerpo de la invención.
La invención también proporciona kits para una unidad de administración de dosis única. El kit de la invención también puede contener un primer receptor que comprende una construcción de anticuerpo seca/liofilizada y un segundo receptor que comprende una formulación acuosa. En determinadas realizaciones de esta invención, se proporcionan kits que contienen jeringas precargadas de una sola cámara y de múltiples cámaras (p. ej. jeringas líquidas y liojeringas).
Las Figuras muestran:
Figura 1 Representación esquemática de las construcciones DLL3 ECD/DLL3 truncadas expresadas en células CHO para mapeo de epítopos. El dominio transmembrana y el intracelular se derivan de EpCAM. Véase el Ejemplo 1.
Figura 2 Mapeo de epítopos de las construcciones de anticuerpo anti-DLL3. Ejemplos de construcciones de anticuerpos biespecíficos que reconocen el dominio EGF-3 y el dominio EGF-4, respectivamente, detectados por mapeo de epítopos. El eje x representa PE-A (PE = ficoeritrina, A = área de señal) y el eje y representa los recuentos. Véase el Ejemplo 2.
Figura 3 Reactividad cruzada de construcciones de anticuerpos anti-DLL3, según se detectan por citometría de flujo: unión a DLL3 y CD3 humanas y de macaco. El eje x representa FL2-H y el eje y representa los recuentos. Véase el Ejemplo 5.
Figura 4 Análisis de construcciones de anticuerpos anti-DLL3 por citometría de flujo: no unión a parálogos humanos DLL1 y DLL4. El eje x representa FL1-H y el eje y representa los recuentos. Véase el Ejemplo 6.
Figura 5 Estabilidad de las construcciones de anticuerpos anti-DLL3 después de la incubación durante 96 horas en plasma humano. Véase el Ejemplo 11.
Figura 6 Hueco de potencia entre la isoforma monomérica y la dimérica de las construcciones de anticuerpos anti-DLL3. Véase el Ejemplo 15.
Figure 7 Ensayo de internalización in vitro, llevado a cabo como se describe en el Ejemplo 16. Se preincubó la construcción de anticuerpo en células diana (SHP-77) en ausencia de células T con el fin de medir la pérdida de construcción de anticuerpo debido a la internalización. Los resultados sugieren que no se produce una internalización significativa. Los resultados obtenidos con una diana control que es bien conocida por su internalización se muestran para comparación a la derecha.
Figura 8 Resultados del estudio de eficacia de xenoinjerto de ratón del modelo SHP-77 (Fig. 8A) y del modelo WM266-4 (Fig. 8B). El volumen del tumor se representa frente al tiempo. Véase el Ejemplo 18.
Figura 9 Farmacocinética de diferentes construcciones de anticuerpos HLE (fusión de albúmina en la Fig. 9A y fusiones de Fc en la Fig. 9B) según se determina en el Ejemplo 20.
Ejemplos:
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención. Estos Ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de esta invención. La presente invención está limitada únicamente por las reivindicaciones.
Ejemplo 1
Generación de células CHO que expresan DLL3 de tipo salvaje y truncada
El dominio extracelular del antígeno DLL3 se puede subdividir en diferentes sub-dominios o regiones que se definen, a los efectos de los Ejemplos 1 y 2, por las siguientes posiciones de aminoácidos:
Péptido señal: 1-26
Extremo N: 27-175
DSL: 176-215
EGF-1: 216-249
EGF-2: 274-310
EGF-3: 312-351
EGF-4: 353-389
EGF-5: 391-427
EGF-6: 429-465
Para la construcción de las moléculas DLL3 truncadas utilizadas para el mapeo de epítopos, las secuencias de los respectivos ocho dominios extracelulares (péptido señal más extremo N, DSL, EGF1, EGF2, EGF3, EGF4, EGF5 y EGF6) de DLL3 humana se eliminaron escalonadamente del antígeno, comenzando desde el extremo N. Se generaron las siguientes moléculas; véase también la Figura 1:
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Para la generación de células CHO que expresan DLL3 humana, de macaco cynomolgus ("cyno") y etiquetada con V5 N-terminal humana truncada, las respectivas secuencias codificantes para ECD DLL3 humana (SEQ ID NO: 253; véase también el número de acceso de GeneBank NM_016941), ECD DLL3 cyno (SEQ ID NO: 272) y las siete versiones de ECD DLL3 etiquetadas con V5 N-terminales humanas truncadas (véase arriba) se clonaron en un plásmido designado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141­ 150). Para la expresión en la superficie celular de DLL3 humana y cyno se utilizó el péptido señal original, y para la expresión en la superficie celular de la DLL3 N-terminal humana truncada se utilizó un péptido señal de la cadena pesada de IgG de ratón, seguido de una etiqueta V5. Todas las secuencias ECD DLL3 mencionadas fueron seguidas en marco por la secuencia codificante de un enlazador Ser/Gly artificial seguida de un dominio derivado del dominio de transmembrana/intracelular de EpCAM humana (aminoácidos 266-314 de la secuencia publicada con el número de acceso en GenBank NM_002354). Todos los procesos de clonación se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándares (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2001)). Para cada una de las construcciones se transfectó un plásmido correspondiente en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariótica, tal como describe por Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566.
La expresión de DLL3 humana y cyno en células CHO se verificó en un ensayo FACS utilizando un anticuerpo DLL3 anti-humano IgG2b de ratón monoclonal. La expresión de las siete versiones truncadas de ECD DLL3 humana se verificó utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón IgG2a anti-etiqueta v5. El anticuerpo monoclonal unido se detectó con un Fc-gamma-PE de IgG anti-ratón. Como control negativo, las células se incubaron con el anticuerpo de control de isotipo en lugar del primer anticuerpo. Las muestras se midieron mediante citometría de flujo.
Ejemplo 2
Mapeo de epítopos de construcciones de anticuerpo anti-DLL3
Células transfectadas con DLL3 humana y con las moléculas de DLL3 humana truncadas (véase el Ejemplo 1) se tiñeron con extracto periplásmico bruto y sin diluir que contenía construcciones de anticuerpos DLL3xCD3 biespecíficos (con el dominio de unión a CD3 denominado 12C) condensado a una albúmina humana (variante 1), en PBS/FCS al 1,5%. Las moléculas unidas se detectaron con un anticuerpo de dominio de unión anti-CD3 monoclonal de ratón interno (50 pl) seguido de una IgG anti-ratón Fc-gamma-PE (1:100, 50 pl; Jackson Immunoresearch n° 115­ 116-071) Todos los anticuerpos se diluyeron en PBS/FCS al 1,5%. Como control negativo, las células se incubaron con PBS/FCS al 2% en lugar del extracto periplásmico. Las muestras se midieron mediante citometría de flujo.
Las regiones que fueron reconocidas por los respectivos dominios de unión de DLL3 se indican en la tabla de secuencias (Tabla 18). Se mapearon ligantes que eran específicos para un epítopo ubicado dentro del extremo N de DLL3, dentro del dominio DSL y dentro de los diferentes dominios EGF.
La Figura 2 muestra dos ligantes ejemplares que se unen a un epítopo DLL3 comprendido dentro de la región EGF-3 (pérdida de la señal FACS en las respectivas construcciones de DLL3 truncadas que no comprenden EGF-3). La Figura 2 muestra también dos aglutinantes ejemplares que se unen a un epítopo DLL3 comprendido dentro de la región EGF-3 (pérdida de la señal FACS en las respectivas construcciones de DLL3 truncadas que no comprenden EGF-4).
Algunos de los aglutinantes se describen como específicos para un epítopo localizado en la región denominada EGF-5/[6]. Los corchetes están destinados a indicar que la señal FACS del aglutinante está disminuida (es decir, ni está completamente presente ni se pierde completamente) para la construcción DLL3 truncada que tiene solo el dominio EGF-6 a la izquierda (última construcción en la Figura 1).
Las construcciones DLL3xCD3 biespecíficas utilizadas en los siguientes Ejemplos se eligen de aquellas construcciones que tienen "I2C" como dominio de unión a CD3 y que tienen una fusión C-terminal con una albúmina de suero humano de tipo salvaje, véase, p. ej., SEQ ID Nos: 224-230, 233 -235, 238-241.
Ejemplo 3
Determinación basada en Biacore de la afinidad del anticuerpo por DLL3 humana y de cynomolgus
Se realizaron experimentos de análisis Biacore utilizando proteínas de fusión recombinantes humanas/de cyno ECD DLL3 con albúmina de pollo para determinar la unión a la diana de las construcciones de anticuerpos de la invención.
En detalle, los chips sensores CM5 (GE Healthcare) se inmovilizaron con aproximadamente 600-800 UR del antígeno recombinante respectivo utilizando tampón acetato pH 4,5 de acuerdo con el manual del fabricante. Las muestras de construcción de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 se cargaron en una serie de diluciones de las siguientes concentraciones: 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM y 3,13 nM diluidas en tampón de desarrollo HBS-EP (GE Healthcare). El caudal fue de 30 pl/min durante 3 min, luego se aplicó tampón de desarrollo durante 8 min a 20 min de nuevo a un caudal de 30 pl/ml. La regeneración del chip se realizó utilizando una solución de glicina 10 mM, NaCl 10 mM, pH 1,5. Los conjuntos de datos se analizaron utilizando el software BiaEval. En general, se realizaron dos experimentos independientes.
Las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de acuerdo con la invención mostraron afinidades muy altas por DLL3 humana en el intervalo subnanomolar (con la excepción de DLL3-13 que tiene un valor KD en el intervalo nanomolar de un dígito muy bajo). La unión a DLL3 de macaco fue equilibrada, mostrando también afinidades en intervalos similares. Los valores de afinidad así como el hueco de afinidad calculada se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2: Afinidades de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 por DLL3 humana y de macaco según se determina por análisis Biacore, así como los huecos de afinidad entre especies calculados.
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Además, se confirmó en un ensayo Biacore que la unión de las construcciones de anticuerpos biespecíficos tanto a CD3 humana como a CD3 de macaco estaba en un intervalo nanomolar bajo de 2 dígitos (datos no mostrados).
Ejemplo 4
Análisis basado en Scatchard de la afinidad de la construcción de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 por DLL3 humana y de macaco en células positivas para el antígeno diana y determinación del hueco de afinidad entre especies
Las afinidades de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 con las células CHO transfectadas con DLL3 humana o de macaco también se determinaron mediante análisis de Scatchard como el método más fiable para medir los posibles huecos de afinidad entre DLL3 humana y de macaco. Para el análisis de Scatchard, se realizan experimentos de unión por saturación utilizando un sistema de detección monovalente para determinar con precisión la unión monovalente de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 a la línea celular respectiva.
2 x 104 células de la línea celular respectiva (línea celular CHO que expresa de forma recombinante DLL3 humana, la línea celular CHO que expresan de forma recombinante DLL3 de macaco) se incubaron cada una con 50 pl de una serie de dilución triplete (doce diluciones a razón de 1:2) de la respectiva construcción de anticuerpo biespecífico DLL3xCD3 (hasta que se alcanza la saturación) comenzando a 10-20 nM, seguido de 16 h de incubación a 4°C bajo agitación y una etapa de lavado residual. Luego, las células se incubaron durante otra hora con 30 pl de una solución de conjugado CD3xALEXA488. Después de una etapa de lavado, las células se resuspendieron en 150 pl de tampón FACS que contenía formaldehído al 3,5%, se incubaron durante 15 min adicionales, se centrifugaron, se resuspendieron en tampón FACS y se analizaron utilizando una máquina FACS Cantoll y el software FACS Diva. Los datos se generaron a partir de dos conjuntos independientes de experimentos, cada uno de los cuales utilizó triplicados. Se calculó el análisis de Scatchard respectivo para extrapolar la unión máxima (Bmáx). Se determinaron las concentraciones de construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 a la unión semi-máxima reflejando las respectivas Kds. Los valores de las mediciones por triplicado se representaron como curvas hiperbólicas y como curvas en forma de S para demostrar los intervalos de concentraciones adecuados desde la unión mínima hasta la óptima.
Los valores representados en la Tabla 3 se derivaron de dos experimentos independientes por construcción de anticuerpo biespecífico DLL3xCD3. El análisis de Scatchard basado en células confirmó que las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de la invención tienen una afinidad subnanomolar por DLL3 humana y DLL3 mac y presentan un pequeño hueco de afinidad entre especies cyno/ser humano de alrededor de 1.
Tabla 3: Afinidades (KD) de construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 según se determinan en el análisis de Scatchard basado en células con el hueco de afinidad calculada KD DLL3 de macaco/KD DLL3 ser humano. Las construcciones de anticuerpos se midieron en dos experimentos independientes,
cada uno utilizando triplicados.
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Ejemplo 5
Unión biespecífica y reactividad cruzada entre especies
Para la confirmación de la unión a DLL3 y CD3 humanas y a DLL3 y CD3 de cyno, se testaron las construcciones de anticuerpos biespecíficos de la invención mediante citometría de flujo utilizando
• células CHO transfectadas con DLL3 humana, con una isoforma de DLL3 humana artificial (caracterizada por las mutaciones puntuales F172C y L218P) y con DLL3 de macaco, respectivamente,
• la línea celular de carcinoma de pulmón humano positivo para DLL3 humana SHP-77,
• línea celular de leucemia de células T humanas que expresan CD3 HPB-all (DSMZ, Braunschweig, ACC483), y
• línea de células T que expresan CD3 de cynomolgus LnPx 4119
Para la citometría de flujo, se incubaron 200.000 células de las líneas celulares respectivas durante 60 min a 4°C con 50 gl de construcción de anticuerpo biespecífico purificado a una concentración de 5 gg/ml. Las células se lavaron dos veces en PBS/FCS al 2% y luego se incubaron con un anticuerpo de ratón interno (2 gg/ml) específico para la parte de unión a CD3 de las construcciones de anticuerpos biespecíficos durante 30 min a 4°C. Después del lavado, se detectaron anticuerpos de ratón unidos con un Fcy-PE anti-ratón de cabra (1:100) durante 30 min a 4°C. Las muestras se midieron mediante citometría de flujo. Se utilizaron células CHO no transfectadas como control negativo.
Los resultados se muestran en la Figura 3. Las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de la invención tiñeron células CHO transfectadas con DLL3 humana, la isoforma DLL3 artificial y con DLL3 de cyno, y también tiñeron la línea celular de carcinoma de pulmón humano positivo para DLL3 humana SHP-77 (expresador natural). Las líneas de células T humanas y de cyno que expresan CD3 también fueron reconocidas por las construcciones de anticuerpos biespecíficos. Además, no hubo tinción de las células de control negativas (CHO no transfectadas, datos mostrados en el Ejemplo 6).
Ejemplo 6
Confirmación de la ausencia de unión a parálogos humanos
Los parálogos DLL3 humanos DLL1 y DLL4 se transfectaron de forma estable en células CHO. Las secuencias de los parálogos como se utilizan en el presente Ejemplo se identifican en el listado de secuencias (SEQ ID NOs: 283 y 284). La expresión de proteínas se confirmó en análisis FACS con anticuerpos específicos para los respectivos parálogos: los anticuerpos fueron MAB1818 anti-humano de DLL1 (R&D; 5 gg/ml) y MAB1506 anti-humano de DLL4 (R&D; 5 gg/ml) para DLL4.
El ensayo de citometría de flujo se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 5, con la excepción de que se detectaron anticuerpos de ratón unidos con un FITC anti-ratón de cabra (1:100). Los resultados se muestran en la Figura 4. El análisis confirmó que ninguna de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de la invención reacciona de forma cruzada con los parálogos DLL3 humanos DLL1 y DLL4.
Ejemplo 7
Identidad con la línea germinal humana
Con el fin de analizar la identidad/similitud de la secuencia de las construcciones de anticuerpos con los genes de la línea germinal del anticuerpo humano, los dominios de unión de DLL3 de la invención se alinearon como sigue: se alineó la VL completa, incluyendo todas las CDRs; se alineó la VH completa, incluyendo las CDRs 1 y 2, pero excepto que la CDR3 se alineó contra los genes de la línea germinal de anticuerpos humanos (Vbase). Se pueden encontrar más detalles en la memoria descriptiva de esta solicitud. Los resultados se muestran en la Tabla 4 que figura a continuación:
Tabla 4: Identidad de VH y VL con la línea germinal humana
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Ejemplo 8
Actividad citotóxica
La potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de la invención para redirigir las células T efectoras contra las células diana que expresan DLL3 se analizó en cinco ensayos de citotoxicidad in vitro:
• Se midió la potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 para redirigir células T efectoras CD8+ humanas estimuladas contra células CHO transfectadas con DLL3 humanas en un ensayo de liberación de cromo 51 de 18 horas.
• Se midió la potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 para redirigir células T efectoras CD8+ humanas estimuladas contra la línea celular SHP-77 de carcinoma de pulmón humano DLL3 positiva en un ensayo de liberación de cromo 51 de 18 horas.
• Se midió la potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 para redirigir las células T en PBMC humanas no estimuladas contra células CHO transfectadas con DLL3 humanas en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas.
• Se midió la potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 para redirigir las células T en PBMC humanas no estimuladas contra la línea celular SHP-77 humana DLL3 positiva en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas.
• Para confirmar que las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de reacción cruzada son capaces de redirigir las células T de macaco contra las células CHO transfectadas con DLL3 de macaco, se realizó un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con una línea de células T de macaco como células T efectoras.
Ejemplo 8,1
Ensayo de liberación de cromo con células T humanas estimuladas
Se obtuvieron células T estimuladas enriquecidas con células T CD8+ como se describe en lo que sigue. Se revistió una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) con un anticuerpo específico anti-CD3 disponible comercialmente (OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 qg/ml durante 1 hora a 37°C. La proteína no unida se eliminó mediante una etapa de lavado con PBS. 3 - 5 x107 PBMC humana se añadieron a la placa de Petri recubierta previamente en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10% / IL-220 U/ml (Proleukin®, Chiron) y se estimularon durante 2 días. Al tercer día, las células se recogieron y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 hasta una concentración final de 20 U/ml y las células se cultivaron de nuevo durante un día en el mismo medio de cultivo celular que antes. Los linfocitos T CD8+ citotóxicos (CTLs) se enriquecieron mediante el agotamiento de las células T CD4+ y las células NK CD56+ utilizando Dynal-Beads de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las células diana CHO transfectadas con DLL3 de cyno o DLL3 humana se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 ql de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente, las células diana marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y luego se utilizaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 200 ql de RPMI complementado con una relación E:T de 10:1. Se utilizó una concentración inicial de 0,01 - 1 qg/ml de construcción de anticuerpo biespecífico purificado y diluciones triples de la misma. El tiempo de incubación del ensayo fue de 18 horas. La citotoxicidad se determinó como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante con relación a la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las mediciones se realizaron por cuadriplicado. La medición de la actividad de cromo en los sobrenadantes se realizó en un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los resultados se llevó a cabo con Prism 5 para Windows (versión 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.) Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis a partir de las curvas de respuesta a la dosis sigmoidea se utilizaron para comparar la actividad citotóxica.
Ejemplo 8,2
Potencia de redirigir células T efectoras humanas estimuladas contra células CHO transfectadas con DLL3 humana
La actividad citotóxica de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de acuerdo con la invención se analizó en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 (51Cr) utilizando células CHO transfectadas con DLL3 humana como células diana, y células T CD8+ humanas estimuladas como células efectoras. El experimento se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 8.1.
Los resultados se muestran en la Tabla 5. Las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 mostraron una actividad citotóxica muy potente contra células CHO transfectadas con DLL3 humanas en el intervalo picomolar de 1 dígito.
Tabla 5: Valores CE50 [pM] de construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 analizados en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 (51Cr) utilizando células CHO transfectadas con DLL3 humana como células diana, y células T CD8 humanas estimuladas como células efectoras.
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Ejemplo 8,3
Potencia de redirigir células T efectoras humanas estimuladas contra la línea celular de carcinoma de pulmón humano SHP-77 DLL3 positiva
La actividad citotóxica de construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 (51Cr) utilizando la línea celular SHP-77 de carcinoma de pulmón humano DLL3 positiva como fuente de células diana y células T CD8+ humanas estimuladas como células efectoras. El ensayo se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 8.1.
De acuerdo con los resultados de los ensayos de liberación de cromo 51 con linfocitos T CD8+ humanos enriquecidos estimulados como células efectoras y células CHO transfectadas con DLL3 humanas como células diana, las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de la presente invención también son potentes en la actividad citotóxica contra células diana del expresador natural (véase la Tabla 6).
Tabla 6: Valores de CE50 [pM] de construcciones de anticuerpos biespecíficos
CLL3xCD3 analizadas en un ensayo de citotoxicidad de liberación de 51-cromo (£,Cr)
con la línea celular de carcinoma de pulmón humana SHP-77 positiva para DLL3 como
fuente de células diana y células T CD8 humanas enriquecidas estimuladas como
células efectoras. Filas 1-10 Construcciones de anticuerpos de acuerdo con la
invención que se unen a un epítopo DLL3 comprendido dentro de la región según se
representa en SEQ ID NO: 260 (Filas 1-7: Construcciones de anticuerpos que se unen
a un epítopo DLL3 comprendido dentro de la región EGF-3.Filas 8-10: Construcciones
de anticuerpos que se unen a un epítopo DLL3 comprendido dentro de la región
EGF-4). Filas 11-14: Construcciones de anticuerpos que se unen a un epítopo DLL3
que está comprendido dentro de la región EGF-5[E.GF-6]
Figure imgf000055_0001
Ejemplo 8,4
Ensayo de citotoxicidad basado en FACS con PBMC humanas no estimuladas
Aislamiento de células efectoras
Se prepararon células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) humana mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll a partir de preparaciones de linfocitos enriquecidos (capas leucocitarias), un producto secundario de los bancos de sangre que recogen sangre para transfusiones. Las capas leucocitarias fueron suministradas por un banco de sangre local y las PBMC se prepararon el mismo día de la extracción de sangre. Después de la centrifugación de densidad Ficoll y extensos lavados con PBS de Dulbecco (Gibco), los eritrocitos restantes se eliminaron de las PBMC por medio de incubación con tampón de lisis de eritrocitos (NH4 CI 155 mM, KHCO3 10 mM, EDTA 100 mM). Las plaquetas se eliminaron mediante el sobrenadante tras la centrifugación de PBMC a 100 x g. Los linfocitos restantes abarcan principalmente linfocitos B y T, células NK y monocitos. PBMC se mantuvieron en cultivo a 37°C/5% de CO2 en medio Rp MI (Gibco) con FCS al 10% (Gibco).
Agotamiento de células CD14+ y CD56+
Para el agotamiento de células CD14+, se utilizaron microperlas CD14 humanas (Milteny Biotec, MACS, n° 130-050­ 201), para el agotamiento de microperlas CD56 humanas de células NK (MACS, n° 130-050-401). Se contaron las PBMC y se centrifugaron durante 10 min a temperatura ambiente con 300 x g. El sobrenadante se desechó y el sedimento de células se resuspendió en tampón de aislamiento MACS [80 pL/107 células; PBS (Invitrogen, n° 20012­ 043), FBS al 0,5% (v/v) (Gibco, n° 10270-106), EDTA 2 mM (Sigma-Aldrich, n° E-6511)]. Se añadieron microperlas CD14 y microperlas CD56 (20 pL/107células) y se incubaron durante 15 min a 4 - 8°C. Las células se lavaron con tampón de aislamiento MACS (1-2 mL/107 células). Después de la centrifugación (véase arriba), el sobrenadante se desechó y las células se resuspendieron en tampón de aislamiento MACS (500 pL/108 células). A continuación, se aislaron células negativas para CD14/CD56 utilizando Columnas LS (Miltenyi Biotec, n° 130-042-401). Se cultivaron células PBMC sin CD14+/CD56+ en medio completo RPMI, es decir, RPMI1640 (Biochrom a G, n° FG1215) complementado con FBS al 10% (Biochrom AG, n° S0115), 1 x aminoácidos no esenciales (Biochrom AG, n° K0293), tampón Hepes 10 mM (Biochrom AG, n° L1613), piruvato de sodio 1 mM (Biochrom AG, n° L0473) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Biochrom AG, n° A2213) a 37°C en una incubadora hasta que se necesite.
Marcaje de células diana
Para el análisis de la lisis celular en ensayos de citometría de flujo se utilizó el colorante de membrana fluorescente DiOC18 (DiO) (Molecular Probes, n° V22886) para marcar células CHO transfectadas con DLL3 humana o DLL3 de macaco como células diana y distinguirlas de las células efectoras. Brevemente, se recogieron las células, se lavaron una vez con PBS y se ajustó a 106 células/mL en PBS que contiene FBS al 2% (v/v) y el colorante de membrana DiO (5 pL/106 células). Después de la incubación durante 3 min a 37°C, las células se lavaron dos veces en medio RPMI completo y el número de células se ajustó a 1,25 x 105 células/mL. La vitalidad de las células se determinó utilizando una solución de EosinaG isotónica al 0,5% (v/v) (Roth, n° 45380).
Análisis basado en citometría de flujo
Este ensayo se diseñó para cuantificar la lisis de células CHO transfectadas con DLL3 de cyno o humanas en presencia de diluciones en serie de construcciones de anticuerpos biespecíficos de DLL3. Se mezclaron volúmenes iguales de células diana marcadas con DiO y células efectoras (es decir, PBMC sin células CD14+), dando como resultado una relación de células E:T de 10:1. Se transfirieron 160 pl de esta suspensión a cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 40 pL de diluciones en serie de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 y un control negativo biespecífico (una construcción de anticuerpo biespecífico basado en CD3 que reconoce un antígeno diana irrelevante) o medio completo RPMI como un control negativo adicional. La reacción citotóxica mediada por anticuerpos biespecíficos prosiguió durante 48 horas en una incubadora humidificada con 7% de CO2. Luego, las células se transfirieron a una nueva placa de 96 pocillos y se vigiló la pérdida de integridad de la membrana de la célula diana añadiendo yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 1 pg/mL. El PI es un colorante impermeable a la membrana que normalmente se excluye de las células viables, mientras que las células muertas lo absorben y se vuelven identificables por emisión fluorescente.
Las muestras se midieron mediante citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizaron con el software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson). Las células diana se identificaron como células positivas para DiO. Las células diana PI negativas se clasificaron como células diana vivas. El porcentaje de citotoxicidad se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:
Figure imgf000056_0001
n = número de eventos
Utilizando el software GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego), se representó gráficamente el porcentaje de citotoxicidad frente a las concentraciones de construcciones de anticuerpos biespecíficos correspondientes. Las curvas de respuesta a la dosis se analizaron con los cuatro modelos de regresión logística paramétrica para la evaluación de las curvas de respuesta a la dosis sigmoidea con pendiente de colina fija y se calcularon los valores de CE50.
Ejemplo 8,5
Potencia de redirigir PBMC humanas no estimuladas contra células CHO transfectadas con DLL3 humana La actividad citotóxica de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS, utilizando células CHO transfectadas con DLL3 humana como células diana, y PBMC humanas no estimuladas como células efectoras. El ensayo se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 8.4 anterior.
Los resultados de los ensayos de citotoxicidad basados en FACS con PBMC humanas no estimuladas como células efectoras y células CHO transfectadas con DLL3 humana como dianas se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7: Valores CE50 [pM] de construcciones de anticuerpos biespecíficos
DLL3xCD3 según se mielen en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS
de 48 horas con PBMC humanas no estimuladas como células efectoras y
células CHO transfectadas con DLL3 humana como células diana
Filas 1-7: Construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención que se
unen a un epítopo DLL3 comprendido dentro de la región EGF-3. Filas 8-10:
Construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención que se unen a un
epítopo DLL3 comprendido dentro de la región EGF-4. Filas 11-14:
Construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención que se unen a un
epítopo DLL3 comprendido dentro de la región EGF-5/[EGF-6].
Figure imgf000057_0001
Como era de esperar, los valores de CE50 fueron generalmente más altos en los ensayos de citotoxicidad con PBMC no estimuladas como células efectoras en comparación con los ensayos de citotoxicidad utilizando células T CD8+ humanas estimuladas (véase el Ejemplo 8.2).
Ejemplo 8,6
Potencia de redirigir PBMC humanas no estimuladas contra la línea celular de carcinoma de pulmón humano SHP-77 positiva para DLL3
La actividad citotóxica de construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 se analizó adicionalmente en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS utilizando la línea celular SHP-77 de carcinoma de pulmón humano positiva para DLL3 como fuente de células diana y PBMC humanas no estimuladas como células efectoras. El ensayo se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 8.4 anterior. Los resultados se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8: Valores CE5Ú JpM] de construcciones de anticuerpos Diespetifkos DLL3xCQ3
según se miden en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de *18 horas con P8MC
humanas no estimuladas como células efecto ras y la línea celular SHP-77 humana
como rúente de células dsana
Filas i-10 Construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención que se unen a
un epitopo DLL3 comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO
260 (Filas 1-7: Construcciones de anticuerpos que se unen a un epitopo DLL3
comprendido dentro de la región EGF-3. Filas 8-10: Construcciones de anticuerpos
que se unen a un epitopo DLL3 comprendido dentro de la región EGF-4) pilas 11-14 Construcciones de anticuerpos que se unen a un epitopo DLL3 que está comprendido
dentro de la región EGF-5.'[EGF-6]
Figure imgf000058_0001
Ejemplo 8,7
Potencia de redirigir células T de macaco contra células CHO que expresan DLL3 de macaco
Finalmente, se analizó la actividad citotóxica de construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS, utilizando células CHO transfectadas con DLL3 de macaco (cyno) como células diana, y la línea de células T de macaco 4119LnPx (Knappe et al. Blood 95:3256-61 (2000)) como fuente de células efectoras. El marcaje de células diana de células CHO transfectadas con DLL3 de macaco y el análisis basado en citometría de flujo de la actividad citotóxica se realizó como se describió arriba.
Los resultados se muestran en la Tabla 9. Se indujeron células T de macaco de la línea celular 4119LnPx para matar eficazmente células CHO transfectadas con DLL3 de macaco mediante construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de acuerdo con la invención. Las construcciones de anticuerpos presentaron potentes valores de CE50 picomolares de 2 dígitos en este ensayo, lo que confirma que son muy activos en el sistema de los macacos.
Tabla 9: Valores CESO [pM] de construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3
según se miden en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas con la
línea de células T 4119LnPx de macaco como células efectoras y células CHO
transfectadas con DLL3 de macaco como células diana.
Filas 1-10: Construcciones de anticuerpos de acuerdo con la Invención que se unen a
un epítopo DLL3 comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO:
260. (Filas 1-7: Construcciones de anticuerpos que se unen a un epítopo DLL3
comprendido dentro de la región EGF-3. Filas 8-10: Construcciones de anticuerpos
que se unen a un epítopo DLL3 comprendido dentro de la región EGF-4). Filas 11-14:
Construcciones de anticuerpos que se unen a un epítopo DLL3 que está comprendido
dentro de la región EGF-5/[EGF-6].
Figure imgf000059_0002
Figure imgf000059_0001
Ejemplo 9
Conversión de monómero a dímero después de (i) tres ciclos de congelación/descongelación y (ii) 7 días de incubación a 250 gg/ml
La construcción monomérica de anticuerpo DLL3xCD3 biespecífico se sometió a diferentes condiciones de estrés seguidas de SEC de alto rendimiento para determinar el porcentaje de construcción de anticuerpo inicialmente monomérico, que se había convertido en una construcción de anticuerpo dimérico.
(i) Se ajustaron 25 gg de la construcción de anticuerpo monomérico a una concentración de 250 gg/ml con tampón de formulación genérico y luego se congelaron a -802C durante 30 min seguido de descongelación durante 30 min a temperatura ambiente. Después de tres ciclos de congelación/descongelación, se determinó el contenido de dímero mediante HP-SEC.
(ii) Se ajustaron 25 gg de construcción de anticuerpo monomérico a una concentración de 250 gg/ml con tampón de formulación genérico seguido de incubación a 37°C durante 7 días. El contenido de dímero se determinó mediante HP-SEC.
Se conectó una columna SEC TSK Gel G3000 SWXL de alta resolución (Tosoh, Tokio-Japón) a un Purificador Ákta 10 FPLC (GE Lifesciences) equipado con un muestreador automático A905. El equilibrio de la columna y el tampón de desarrollo consistieron en KH2PO4 100 mM - Na2SO4 200 mM ajustado a pH 6,6. Se aplicó la solución de anticuerpo (25 gg de proteína) a la columna equilibrada y se llevó a cabo la elución a un caudal de 0,75 ml/min a una presión máxima de 7 Mpa. Todo el ciclo se vigiló a una absorbancia óptica de 280, 254 y 210 nm. El análisis se realizó mediante la integración de picos de la señal de 210 nm registrada en la hoja de evaluación de ejecución del software Ákta Unicorn. El contenido de dímero se calculó dividiendo el área del pico de dímero por el área total del pico de monómero más pico de dímero.
Los resultados se muestran en la Tabla 10 que figura más adelante. Las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de la invención se presentaron con porcentajes de dímero del 0,0% después de tres ciclos de congelación/descongelación, y con porcentajes de dímero de < 2% después de 7 días de incubación a 37°C.
Tabla 10: Porcentaje de construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 monoméricos frente a diméricos según se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento (HP-SEC).
Figure imgf000060_0001
Ejemplo 10
Termoestabilidad
La temperatura de agregación de anticuerpos se determinó como sigue: 40 pl de solución de construcción de anticuerpos a 250 pg/ml se transfirieron a una cubeta de un solo uso y se colocaron en un dispositivo Wyatt Dynamic Light Scattering DynaPro Nanostar (Wyatt). La muestra se calienta de 40°C a 70°C a una tasa de calentamiento de 0,5°C/min con adquisición constante del radio medido. El aumento del radio que indica la fusión de la proteína y la agregación se utilizó por el paquete de software suministrado con el dispositivo DLS para calcular la temperatura de agregación de la construcción de anticuerpos.
Todas las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 testadas de la invención mostraron estabilidad térmica con temperaturas de agregación > 45°C, tal como se muestra en la Tabla 11 que figura más adelante. El grupo de construcciones de anticuerpos que se unen a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región EGF-4 (como se representa en SEQ ID NO: 259) incluso tenía una estabilidad térmica de > 50°C, más precisamente, de 2:54°C.
Tabla 11: Termoestabilidad de las construcciones de anticuerpos biespecíficos según se determina por DLS (dispersión dinámica de la luz)
Figure imgf000060_0002
Ejemplo 11
Estabilidad después de la incubación durante 24 horas en plasma humano
Construcciones de anticuerpos biespecíficos purificados se incubaron en una relación de 1:5 en una agrupación de plasma humano a 37°C durante 96 horas a una concentración final de 2-20 gg/ml. Después de la incubación con plasma, las construcciones de anticuerpos se compararon en un ensayo de liberación de cromo 51 con células T CD8+ humanas enriquecidas estimuladas y células CHO transfectadas con DLL3 humanas a una concentración inicial de 0,01-0,1 gg/ml y con una relación de célula efectora a diana (E:T) de 10:1 (ensayo como se describe en el Ejemplo 8.1). Se incluyeron como controles construcciones de anticuerpos biespecíficos recién descongelados, no incubados.
Los resultados se muestran en la Tabla 12 que figura más adelante; en la Figura 5 también se muestran resultados ejemplares para las dos construcciones de anticuerpos DLL-4 y DLL-14. Todas las construcciones de anticuerpos testadas tenían una estabilidad en plasma muy favorable (CE50 plasma / CE50 control) de < 2,5. El grupo de construcciones de anticuerpos que se unen a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región EGF-4 (como se representa en SEQ ID NO: 259) incluso tenía una estabilidad en plasma de < 1,5, más precisamente, de < 1,1.
Tabla 12: Valores de CE50 de las construcciones de anticuerpos con y
sin incubación de plasma y valor de plasma / control calculado
Figure imgf000061_0001
Ejemplo 12
Turbidez a una concentración de anticuerpo de 2500 gg/ml
1 ml de solución de construcción de anticuerpo purificada de una concentración de 250 gg/ml se concentró mediante unidades de concentración por centrifugación a 2500 gg/ml. Después de 16 h de almacenamiento a 5°C, se determinó la turbidez de la solución de anticuerpo mediante medición de la absorción óptica a DO340 nm frente al tampón de formulación genérico.
Los resultados se muestran en la Tabla 13 que figura más adelante. Todas las construcciones de anticuerpos testadas tienen una turbidez muy favorable de < 0,1, con la excepción de una construcción con una turbidez ligeramente superior a 0,1. El grupo de construcciones de anticuerpos que se unen a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región EGF-4 (como se representa en SEQ ID NO: 259) incluso tiene una turbidez de < 0,08.
Tabla 13: Turbidez de las construcciones de anticuerpos
después de la concentración a 2,5 mg/ml durante la noche
Figure imgf000061_0002
Figure imgf000062_0001
Ejemplo 13
Homogeneidad de proteínas mediante cromatografía de intercambio catiónico de alta resolución
La homogeneidad de las proteínas de las construcciones de anticuerpos de la invención se analizó mediante cromatografía de intercambio catiónico de alta resolución CIEX.
50 pg de monómero de construcción de anticuerpo se diluyeron con 50 ml de tampón de unión A (dihidrógeno-fosfato de sodio 20 mM, NaCl 30 mM, octanato de sodio al 0,01%, pH 5,5) y se aplicaron 40 ml de esta solución a una columna de 1 ml de BioPro SP-F (YMC, Alemania) conectada a un dispositivo Ákta Micro FPLC (GE Healthcare, Alemania). Después de la unión de la muestra, se llevó a cabo una etapa de lavado con tampón de unión adicional. Para la elución de proteínas se aplicó un gradiente de sal creciente lineal utilizando tampón B (dihidrógeno-fosfato de sodio 20 mM, NaCl 1000 mM, octanato de sodio al 0,01%, pH 5,5) hasta un 50% de tampón B sobre 10 volúmenes de columna. Todo el ciclo se vigiló a una absorbancia óptica de 280, 254 y 210 nm. El análisis se realizó mediante la integración de picos de la señal de 280 nm registrada en la hoja de evaluación de ejecución del software Ákta Unicorn.
Los resultados se muestran en la Tabla 14 que figura más adelante. Todas las construcciones de anticuerpos testadas tienen una homogeneidad muy favorable de > 80% (área bajo la curva (= AUC) del pico principal). El grupo de construcciones de anticuerpos que se unen a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región EGF-3 (como se representa en SEQ ID NO: 258) incluso tiene una turbidez de > 90%.
Tabla 14: Homogeneidad de proteínas de las construcciones de anticuerpos
(% de AUC del pico principal)
Figure imgf000062_0002
Ejemplo 14
Hidrofobicidad de la superficie medida por HIC Butilo
La hidrofobicidad de la superficie de las construcciones de anticuerpos biespecíficos de la invención se testó en cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en modo de flujo continuo.
50 pg de monómero de construcción de anticuerpo se diluyeron con tampón de formulación genérico hasta un volumen final de 500 pl (ácido cítrico 10 mM, lisina HCl 75 mM, trehalosa al 4%, pH 7,0) y se aplicaron a una columna de butil sefarosa FF de 1 ml (GE Healthcare, Alemania) conectado a un Purificador Ákta sistema FPLC (GE Healthcare, Alemania). Todo el ciclo se vigiló a una absorbancia óptica de 280, 254 y 210 nm. El análisis se realizó mediante la integración de picos de la señal de 280 nm registrada en la hoja de evaluación de ejecución del software Ákta Unicorn. El comportamiento de elución se evaluó comparando el área y la velocidad de aumento y disminución de la señal de la proteína, lo que indica la fuerza de interacción de la fusión de albúmina BiTE con la matriz.
Las construcciones de anticuerpos tuvieron un buen comportamiento de elución, que fue en su mayoría rápido y completo.
Ejemplo 15
Hueco de potencia entre la isoforma monomérica y la dimérica de las construcciones de anticuerpos biespecíficas
Con el fin de determinar la diferencia en la actividad citotóxica entre la isoforma monomérica y la dimérica de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 individuales (a la que se alude como hueco de potencia), se llevó a cabo un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 de 18 horas como se describe arriba en esta memoria (Ejemplo 8.1) con monómero y dímero de construcción de anticuerpo biespecífico purificado. Las células efectoras se estimularon con células T CD8+ humanas enriquecidas. Las células diana fueron células CHO transfectadas con hu DLL3. La relación célula efectora a diana (E:T) fue 10:1. El hueco de potencia se calculó como la relación entre los valores de CE50.
Los resultados se muestran en la Tabla 15 que figura más adelante; en la Figura 6 también se muestran resultados ejemplares para las dos construcciones de anticuerpos DLL-4 y DLL-14. Los huecos de potencia de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 testadas estaban entre 0,2 y 1,0. Por lo tanto, no hay dímero sustancialmente más activo en comparación con su monómero respectivo.
Tabla 15: Hueco de potencia entre la isoforma monomérica y la dimérica
Figure imgf000063_0001
Ejemplo 16
Ensayo de internalización in v itro
Se midieron los cambios en la potencia de la construcción de anticuerpo biespecífico DLL3xCD3 en función de la preincubación de la construcción en las células diana en ausencia de células T. Si la construcción de anticuerpo se internaliza, debería sufrir degradación lisosomal. La concentración efectiva debería disminuir con el tiempo y, por lo tanto, la potencia aparente también debería disminuir. El efecto se observa con otras dianas, por lo que este es un fenómeno conocido, pero no se observó impacto alguno con la construcción de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3. El ensayo se llevó a cabo de la siguiente manera:
Células T se contaron y se diluyeron a una concentración de 1 x 105 / ml en medio de ensayo. Se contaron las células SHP-77 y se sembraron en placas a razón de 2500 células por pocillo (cpw). La construcción de anticuerpo se diluyó en serie 1:2 (con Bravo), a una concentración inicial de 100 nM. La construcción de anticuerpo se añadió a las placas de ensayo de cultivo para permitir 0 horas, 1 hora o 2 horas de incubación antes de la adición de las células T. Luego, las células T se sembraron a razón de 25000 cpw y el ensayo se incubó durante 48 horas a 37°C. La supervivencia de las células SHP-77 se analizó con el sistema Steady-Glo® (25 pl/pocillo). Los resultados se muestran en la Figura 7 y sugieren que no hay internalización significativa de la construcción de anticuerpo DLL3-4 x CD3 (I2C).
Ejemplo 17
Estudio de diseminación
Con el fin de analizar si la actividad citotóxica de las construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 de la invención se ve significativamente afectada por la presencia de DLL diseminada, se llevó a cabo el siguiente ensayo: células T se contaron y se diluyeron a una concentración de 1 x 105 / ml en medio de ensayo. Células SHP-77 se contaron y se diluyeron a una concentración de 1,25 x 105/ml en medio de ensayo con concentraciones crecientes de DLL3 soluble entre 0,3 nM y 12 nM. Las células SHP-77 se sembraron en placas a razón de 2500 células por pocillo (cpw) y las células T se añadieron a razón de 25000 cpw. La construcción de anticuerpo se diluyó en serie 1:2 (con Bravo) y se añadió al ensayo de cultivo (con Bravo). La incubación tuvo lugar durante 48 horas a 37°C. La supervivencia de las células SHP-77 se analizó con el sistema Steady-Glo® (25 pl/pocillo).
Ejemplo 18
Estudio de eficacia del xenoinjerto de ratón
La actividad anti-tumor de una construcción de anticuerpo biespecífico HLE DLL3xCD3 (SEQ ID NO: 517) se ensayó en un modelo de ratones NOD/SCID hembras a los que se inyectaron por vía subcutánea el día 1 del estudio 5x106 células de SCLC (SHP- 77 luc) positivas para DLL3 humanas o 5x106 células de melanoma positivas para DLL3 humanas (WM 266-4). Células efectoras (2x107 células T CD3+ humanas vivas expandidas y activadas in vitro) se inyectaron por vía intraperitoneal el día 12. El inicio del tratamiento fue el día 16 (WM 266-4) o el día 18 (SHP-77 luc). La construcción de anticuerpo se administró cuatro veces cada cinco días (q5dx4) mediante inyecciones i.v. de bolo. Los grupos de tratamiento fueron los siguientes:
• Modelo SCLC (SHP-77 luc) / 7 ratones por grupo
o Grupo tratado con vehículo con células T
o Construcción de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3: 10 mg/kg por administración • Modelo de melanoma (WM266-4) / 9 ratones por grupo
o Grupo tratado con vehículo con células T
o Construcción de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3: 10 mg/kg por administración o Construcción de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3: 2 mg/kg por administración
Los tumores se midieron con un calibre durante el estudio y se evaluó el progreso mediante la comparación entre grupos de los volúmenes de los tumores (TV). La inhibición del crecimiento del tumor T/C [%] el día x se determina calculando el volumen del tumor como T/C% = 100 x (TV mediano del grupo analizado) / (TV mediano del grupo de control) y los valores calculados se representan en la siguiente tabla 16:
Tabla 16: Valores de T/C de los estudios de xenoinjerto de ratón con células SHP-77 luc y células WM266-4
Figure imgf000064_0001
Los resultados se muestran además en las Figuras 8A y 8B. Se mostró una inhibición significativa del crecimiento del tumor en ambos modelos de tumor y en los dos niveles de dosis testados de 2 y 10 mg/kg.
Ejemplo 19
Estudio exploratorio de toxicología en cyno
Se llevó a cabo un estudio exploratorio de toxicología con una construcción de anticuerpo biespecífico DLL3xCD3 sin semivida extendida (SEQ ID NO: 554). Tres monos cynomolgus hembras fueron dosificados vía infusión i.v. continua durante 16 días (5, 15 y 45 gg/kg/ día durante 3 días cada uno, seguido de 100 gg/kg/día durante 7 días). En observaciones clínicas relacionadas con el artículo de ensayo no se observaron cambios en la temperatura corporal, consumo de alimentos o peso corporal.
De acuerdo con las expectativas para la farmacología de una construcción de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3, las poblaciones de linfocitos T circulantes (linfocitos T totales, linfocitos T auxiliares y T citotóxicos, células NK, linfocitos B y linfocitos T activados CD25+) se redujeron el primer día de la dosificación y permanecieron más bajos durante la duración del estudio en todos los animales. Los marcadores de activación (CD69 y CD25 en las células T activadas) aumentaron el día 1, pero no en momentos posteriores del estudio.
Resumiendo, la construcción de anticuerpo biespecífico DLL3xCD3 fue muy bien tolerada incluso a la dosis más alta testada (100 gg/kg/d, > 300 x CE50 ).
Ejemplo 20
Estudios PK cyno
Se realizó un estudio PK cyno con monos cynomolgus machos sin tratamiento previo. Se administraron tres construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 (I2C) condensados con albúmina diferentes (DLL3-4, DLL3-6 y DLL3-14) como bolo i.v. único a una concentración de 12 gg/kg. Para cada una de las moléculas se utilizó un grupo de dos animales.
Se realizó un estudio PK cyno separado en las mismas condiciones, pero con DLL3-4 en diferentes versiones de fusión Fc.
Se recogieron muestras de sangre antes de la dosis y a las 0,05, 0,5, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168, 240 y 336 horas después de la dosis. Se preparó suero para la determinación de las concentraciones séricas de las moléculas en un inmunoensayo. El ensayo se realizó capturando las construcciones de anticuerpos a través de su resto diana, mientras que para la detección se utilizó un anticuerpo dirigido contra la parte de la construcción que se une a CD3. Los perfiles de concentración sérica-tiempo se utilizaron para determinar los parámetros PK. Los parámetros farmacocinéticos se determinaron utilizando métodos estándares de análisis no compartimental (NCA). Se evaluaron los siguientes parámetros PK: AUCinf (área bajo la curva de concentración sérica-tiempo), Vss (volumen de distribución en estado estacionario), CL (aclaramiento sistémico) y t1 /2 terminal (semivida terminal). Para todas las construcciones de anticuerpos, los niveles séricos fueron cuantificables para todos los momentos en todos los animales después de su administración. No se realizaron observaciones clínicas en ninguno de los animales tratados.
La farmacocinética de las construcciones de anticuerpos testadas se muestra en la Figura 9, y los parámetros de PK se resumen como la media de n = 2 en la tabla 17 que figura más adelante.
Las construcciones condensadas con albúmina mostraron un perfil PK favorable consistente con un programa de dosificación una o dos veces a la semana en un paciente humano. Se observó un perfil PK incluso más favorable que apoya la dosificación una vez a la semana o incluso una dosificación cada dos semanas con una construcción de fusión Fc (scFc).
Tabla 17: Parámetros farmacocinéticos de variantes de HLE
de construcciones de anticuerpos biespecíficos DLL3xCD3 en monos cynomolgus
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Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a DLL3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T y CD3 de macaco, en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 260, en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 258, en donde el primer dominio de unión comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionada del grupo que consiste en:
a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 31, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 32, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 33, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 34, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 35 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 36;
b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 41, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 42, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 43, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 44, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 45 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 46;
c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 51, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 52, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 53, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 54, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 55 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 56;
d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 61, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 62, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 63, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 64, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 65 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 66;
e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 71, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 72, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 73, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 74, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 75 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 76;
f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 81, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 82, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 83, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 84, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 85 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 86;
g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 91, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 92, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 93, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 94, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 95 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 96;
h) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 101, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 102, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 103, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 104, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 105 y CDR-L3 como se representa en SeQ ID NO: 106; e
i) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 111, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 112, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 113, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 114, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 115 y CDR-L3 como se representa en SeQ ID NO: 116.
2. La construcción de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer dominio de unión se une, además, a DLL3 de macaco, preferiblemente a DLL3 de Macaca fascicularis.
3. La construcción de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el segundo dominio de unión se une a CD3 épsilon humana y a CD3 épsilon de Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus o Saimiri sciureus.
4. La construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la construcción de anticuerpo está en un formato seleccionado del grupo que consiste en (scFv)2 , mAb de dominio único scFv, diacuerpos y oligómeros de los formatos anteriores.
5. La construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el primer dominio de unión comprende
a) una región VH seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 435 y SEQ ID NO: 529; y/o
b) una región VL seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 436 y SEQ ID NO: 530.
6. La construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el primer dominio de unión comprende
a) una región VH y una región VL seleccionada del grupo que consiste en pares de una región VH y una región VL como se representa en las SEQ ID NOs: 37+38; SEQ ID NOs: 47+48; SEQ ID NOs: 57+58; SEQ ID NOs: 67+68; SEQ ID NOs: 77+78; SEQ ID NOs: 87+88; SEQ ID NOs: 97+98; SEQ ID NOs: 107+108; SEQ ID NOs: 117+118; SEQ ID NOs: 435+436; y SEQ ID NOs: 529+530, y/o
b) un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 437 y SEQ ID NO: 531.
7. La construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 438 y SEQ ID NO: 532.
8. Una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a DLL3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T y CD3 de macaco, en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 260, en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de DLL3 que está comprendido dentro de la región como se representa en SEQ ID NO: 259, en donde el primer dominio de unión comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionada del grupo que consiste en:
a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 121, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 122, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 123, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 124, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 125 y CDR-L3 como se representa en SeQ ID NO: 126;
b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 132, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 134, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SeQ ID NO: 136;
c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 141, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 142, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 143, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 144, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 145 y CDR-L3 como se representa en SeQ ID NO: 146;
d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 151, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 152, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 153, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 154, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 155 y CDR-L3 como se representa en SeQ ID NO: 156;
e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 161, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 162, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 163, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 164, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 165 y CDR-L3 como se representa en SeQ ID NO: 166;
f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 439, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 134, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SeQ ID NO: 136;
g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 440, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 134, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SeQ ID NO: 136;
h) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 132, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 441, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SeQ ID NO: 136;
i) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 132, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 442, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SeQ ID NO: 136;
j) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 132, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 443, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SeQ ID NO: 136;
k) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 132, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 444, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SeQ ID NO: 136;
l) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 439, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 441, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SeQ ID NO: 136; y
m) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 131, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 440, CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 133, CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 442, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 135 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 136.
9. La construcción de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el primer dominio de unión se une, además, a DLL3 de macaco, preferiblemente a DLL3 de Macaca fascicularis.
10. La construcción de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en donde el segundo dominio de unión se une a CD3 épsilon humana y a CD3 épsilon de Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus o Saimiri sciureus.
11. La construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde la construcción de anticuerpo está en un formato seleccionado del grupo que consiste en (scFv)2 , mAb de dominio único scFv, diacuerpos y oligómeros de los formatos anteriores.
12. La construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde el primer dominio de unión comprende
a) una región VH seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 454, y SEQ ID NO: 455; y/o
b) una región VL seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469, y SEQ ID NO: 470.
13. La construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde el primer dominio de unión comprende
a) una región VH y una región VL seleccionada del grupo que consiste en pares de una región VH y una región VL como se representa en SEQ ID NOs: 127+128; SEQ ID NOs: 137+138; SEQ ID NOs: 147+148; SEQ ID NOs: 157+158; SEQ ID NOs: 167+168; SEQ ID NOs 137+456; SEQ ID NOs 137+457; SEQ ID NOs 137+458; SEQ ID NOs 137+459; SEQ ID NOs 137+460; SEQ ID NOs 445+138; SEQ ID NOs 446+138; SEQ ID NOs 447+138; SEQ ID NOs 445+460; SEQ ID NOs 448+461; SEQ ID NOs 449+462; SEQ ID NOs 450+463; SEQ ID NOs 450+464; SEQ ID NOs 450+465; SEQ ID NOs 450+466; SEQ ID NOs 450+467; SEQ ID NOs 450+468; SEQ ID NOs 451+463; SEQ ID NOs 452+463; SEQ ID NOs 453+463; SEQ ID NOs 451+468; SEQ ID NOs 454+469; y SEQ ID NOs 455+470; y/o
b) un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 492, y SEQ ID NO: 493.
14. La construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 170; SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 515, y SEQ ID NO: 516.
15. La construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende o consiste en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los representados en SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 523, SEQ ID NO: 524.
16. Un polinucleótido que codifica una construcción de anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
17. Un vector que comprende un polinucleótido según se define en la reivindicación 16.
18. Una célula huésped transformada o transfectada con el polinucleótido según se define en la reivindicación 16 o con el vector según se define en la reivindicación 17.
19. Un procedimiento para la producción de una construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula huésped según se define en la reivindicación 18 bajo condiciones que permitan la expresión de dicha construcción de anticuerpo y recuperar la construcción de anticuerpo producida a partir del cultivo.
20. Una composición farmacéutica que comprende una construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o producida de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 19.
21. La construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o producida de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 19 para uso en la prevención, el tratamiento o la mejoría de un tumor o enfermedad cancerosa o de una enfermedad cancerosa metastásica.
22. La construcción de anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el tumor o la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, preferiblemente SCLC, tumor o cáncer de mama, cervical, de colon, colorrectal, endometrial, de cabeza y cuello, de hígado, de ovario, de páncreas, de próstata, de piel, gástrico, de testículo, de tiroides, suprarrenal, renal, vesical, uterino, esofágico, urotelial y cerebral, linfoma, carcinoma y sarcoma, y una enfermedad de cáncer metastásico derivada de cualquiera de los precedentes.
23. Un kit que comprende una construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, una construcción de anticuerpo producida de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 19, un polinucleótido como se define en la reivindicación 16, un vector como se define en la reivindicación 17 y/o una célula huésped como se define en la reivindicación 18.
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