JP6339015B2

JP6339015B2 - 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子

Info

Publication number: JP6339015B2
Application number: JP2014526469A
Authority: JP
Inventors: オリバーアスト，; ペーターブルエンカー，; タニヤファウチ，; アンフライモサー−グルントショーバー，; クリスティアーネイェーガー，; クリスティアンクライン，; エッケハルトメスナー，; パブロウマーニャ，
Original assignee: ロシュグリクアートアーゲー
Priority date: 2011-08-23
Filing date: 2012-08-21
Publication date: 2018-06-06
Anticipated expiration: 2032-08-21
Also published as: ECSP14013220A; PE20141521A1; IL268886B; HUE038225T2; EP2748201B1; TWI633121B; JP2014529402A; ES2659764T3; PT2748201T; CN103748114A; JP2017029156A; EP3321286B1; IL268886A; LT2748201T; ZA201309742B; DK2748201T3; TW201321413A; CA2837975A1; EA201400254A1; AU2012298537A1

Description

発明の分野
本発明は、一般に、Ｔ細胞を活性化するための二重特異性抗原結合分子に関するものである。また、本発明は、そのような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド、及びそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するため方法、及び疾患の治療においてこれらの二重特異性抗原結合分子を使用する方法に関する。

背景
個々の細胞又は特定の細胞型の選択的破壊は、様々な臨床設定において望ましい場合が多い。例えば、健常細胞及び組織を完全なままで損傷を受けない状態にしつつ、腫瘍細胞を特異的に破壊することは癌治療の主要な目標である。

これを達成する魅力的な方法は、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞に腫瘍細胞を攻撃させる、腫瘍に対する免疫応答を誘導することによる。ＣＴＬは、免疫系の最も強力なエフェクター細胞を構成するが、しかしそれらは従来の治療抗体のＦｃドメインによって媒介されるエフェクター機構によって活性化することができない。

この点で、一つの「腕」で標的細胞上の表面抗原に、第ニの「腕」でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化、不変成分に結合するように設計された二重特異性抗体は近年の関心となっている。その標的の両方に対するこのような抗体の同時結合は、任意の細胞傷害性Ｔ細胞及び標的細胞のその後の溶解の活性化を引き起こす、標的細胞とＴ細胞との間の一時的な相互作用を強制する。従って、免疫応答は、標的細胞へと向け直され、通常のＭＨＣ制限性の活性化に関連しているようなＴ細胞の特異性又は標的細胞によるペプチド抗原提示とは無関係である。これに関連して、ＣＴＬは、標的細胞がそれらに二重特異性抗体を提示したとき、すなわち免疫学的シナプスを模倣するときにおいてのみ活性化されることは重要である。特に望ましいのは、標的細胞の効率的な溶解を誘発するために、リンパ球の前処理又は同時刺激を必要としない二重特異性抗体である。

いくつかの二重特異性抗体フォーマットが開発されており、Ｔ細胞媒介性免疫療法のためのそれらの適合性を調べた。このうち、いわゆるＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞結合性(engager)）分子は非常によく特徴づけられ、既にクリニックでいくつかの有望であることが示されてきた(Nagorsen and Baeuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)に総説される）。２のｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合されるＢｉＴＥは、タンデムなｓｃＦｖ分子である。Ｔ細胞の係合のために評価される更なる二重特異性のフォーマットは、ダイアボディ(Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)）およびなタンデムダイアボディなどその誘導体(Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999))が挙げられる。より最近の開発は、二重特異性抗体フォーマットに基づいているが、更なる安定化のためのＣ末端ジスルフィド架橋を特徴としているいわゆるＤＡＲＴ（二重親和性再標的化）分子である(Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011))。全体がハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であり、また現在臨床試験において評価されつつあるいわゆるｔｒｉｏｍａｂは大きなサイズのフォーマットを表している (Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)に総説される）。

開発されている種々のフォーマットは、免疫療法におけるＴ細胞再指向(re-direction)及び活性化に起因する大きな可能性を示している。適切な二重特異性抗体を生成する目的は、決して些細なことでないが、抗体の有効性、毒性、適用性および生成可能性に関連して満たさなければならない多くの課題を伴う。

例えば、ＢｉＴＥ分子など小さな構築物は、−効率的にエフェクターと標的細胞を架橋できる一方−連続注入によって患者に投与されるためにそれらに要求される非常に短い血清半減期を有する。一方ＩｇＧ様フォーマットは−長い半減期という大きな利点を持ちながら−ＩｇＧ分子に固有の天然エフェクター機能に関連する毒性に悩まされる。それらの免疫原性の可能性は、有効な治療薬開発のために、ＩｇＧ様二重特異性抗体（特に非ヒトフォーマット）の別の望ましくない特徴である。最後に、二重特異性抗体の一般的な開発における主要な課題は、正確に構築された構築物の収率を低下させ、所望の二重特異性抗体を分離することが困難であり得る非機能性の多くの副産物をもたらす、同時発現の際の異なる特異性の抗体重鎖と軽鎖のミスペアリングに起因して、臨床的に十分な量および純度での二重特異性抗体構築物の産生であった。

Ｔ細胞媒介免疫療法のために現在利用可能な二重特異性抗体に関連した困難や欠点を考えると、そのような分子の新規な改良されたフォーマットの必要性が残っている。本発明は、良好な有効性および生成可能性を低毒性と好ましい薬物動態特性と組み合わせたＴ細胞活性化および再指向のために設計された二重特異性抗原結合分子を提供する。

第一の態様において、本発明は、その一方は活性化Ｔ細胞抗原への特異的結合が可能であるＦａｂ分子で、その他方は標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である、第一及び第二の抗原結合部分、及び安定な会合が可能な第一及び第二のサブユニットからなるＦｃドメインを含み；第一の抗原結合部分は、（ａ）Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖がペプチドリンカーによって連結された単鎖のＦａｂ分子、又は（ｂ）Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変又は定常領域の何れかが交換されるクロスオーバーＦａｂ分子である、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。

特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することが可能な一以下の結合部分がＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に存在する（即ち、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が活性化Ｔ細胞抗原に対する一価結合を提供する）。特定の実施態様において、第一の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。更により特定の実施態様において、第一の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域が交換されるクロスオーバーＦａｂ分子である。

幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第一及び第ニ抗原結合部分は、必要に応じてペプチドリンカーを介して互いに融合されている。このような一実施態様では、第二の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合される。別のこのような実施態様では、第一の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合される。更に他のこのような実施態様において、第二の抗原結合部分は、そのＦａｂ軽鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端へ融合される。一実施態様では第一の抗原結合部分はクロスオーバーのＦａｂ分子とであることを特徴とし、ここで（ｉ）第二の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合され、又は（ｉｉ）第一の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合されているかの何れかであり、更に第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は必要に応じてペプチドリンカーを介して互いに融合されてもよい。

一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第二の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第ニのサブユニットのＮ末端へ融合される。別の実施態様では、第一の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合される。

一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第一及び第二の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端へ各々融合される。

ある実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第三の抗原結合部分を含む。そのような一実施態様では、第三の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合される。特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原結合分子の第二及び第三の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に各々融合され、第一の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合されている。その他の特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原結合分子の第一及び第三の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に各々融合され、第二の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合されている。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、直接または適当なペプチドリンカーを介して融合され得る。一実施態様において、第二及び第三の抗原結合部分及びＦｃドメインは免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施態様において、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。さらにより特定の実施態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ_１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ_４サブクラスの免疫グロブリンである。

特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧのＦｃドメインである。特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ_１のＦｃドメインである。別の特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ_４のＦｃドメインである。更により特定の実施態様において、Ｆｃドメインはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ（Ｋａｂａｔの番号付け）を含むＩｇＧ_４のＦｃドメインである。特定の実施態様において、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。

特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、第一及び第二のＦｃドメインサブユニットの会合を促進する修飾を含む。特定のこのような実施形態において、Ｆｃドメインの第一サブユニットのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能である第一サブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起を生成し、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内突起が配置可能である第２のサブユニット内のＣＨ３ドメイン内に空洞を生成する。

特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、天然のＩｇＧ_１のＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示した。ある実施形態では、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を低下させ及び／又はエフェクター機能を低下させるように操作される。一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能を減少させる一以上のアミノ酸変異を含む。一実施態様において、Ｆｃ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能を減少させるＦｃドメイン中の一以上のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ番号付け）の群から選択される一以上の位置にてである。特定の実施態様において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３つのアミノ酸置換を含み、ここで前記アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである。そのような一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ_１のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ_１のＦｃドメインである。その他の実施態様において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる２つのアミノ酸置換を含み、ここで前記アミノ酸置換はＬ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇである。そのような一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ_４のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ_４のＦｃドメインである。

一実施態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩ、及び／又はＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様において、エフェクター機能は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。

特定の実施態様において、二重特異性抗原結合分子が結合可能である活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。他の実施態様において、二重特異性抗原結合分子が結合可能である標的細胞抗原は腫瘍細胞抗原である。一実施態様において、腫瘍細胞抗原は、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群から選択される。

本発明の別の態様によれば、本発明のＴ細胞を活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドを包含する。本発明はさらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の単離されたポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。幾つかの実施態様において、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。

別の態様では、ａ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養し、ｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を製造する方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法により製造されたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を包含する。

本発明はさらに、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。

また、本発明に包含されるのは、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的組成物を使用する方法である。一態様において、本発明は、医薬として使用するための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物を提供する。一態様では、それを必要とする個体における疾患の治療において使用のための本発明に係るＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。特定の実施態様において、疾患は癌である。

また、それを必要とする個体における疾患を治療するための医薬の製造のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用、並びに薬学的に許容される形態の本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物の治療上有効な量を該個体に投与することを含む個体における疾患を治療する方法が提供される。特定の実施態様において、疾患は癌である。上記実施態様の何れかにおいて、個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。

本発明はまた、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と標的細胞を接触させることを含む、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法を提供する。

本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の例示的な構成。（Ａ）「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕型」、及び（Ｂ）「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」分子の図。「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕型」分子において、Ｔ細胞標的Ｆａｂの軽鎖はリンカーにより重鎖へ融合され、一方「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」分子は腫瘍標的Ｆａｂ中にリンカーを有する。（Ｃ）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」分子の図。（Ｄ）「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」分子の図。（Ｅ）「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｆ）「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｇ）Ｃｒｏｓｓｆａｂが別の順番の「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」分子とＦａｂ成分（反転型）。（Ｈ）「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ軽鎖（ＬＣ）融合」分子の図。（Ｉ）「１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図。（Ｊ）「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、連結した軽鎖」分子の図。（Ｋ）「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、連結した軽鎖」分子の図。（Ｌ）「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型、連結した軽鎖」分子の図。（Ｍ）「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型、連結した軽鎖」分子の図。黒点：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインでの任意の修飾。「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕型」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号１、３、５を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）、及び「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号７、９、１１を参照）、非還元型（Ｃ）及び還元型（Ｄ）のＳＤＳＰＡＧＥ（４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ，ＮｕＰａｇｅインビトロジェン，クーマシー染色）。「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕型」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号１、３、５を参照）（Ａ）及び「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号７、９、１１を参照）（Ｂ）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬＧＥヘルスケア；２ｍＭＭＯＰＳｐＨ７．３，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；５０μｇのサンプルを注入）。「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕型」（抗ＥＧＦＲ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号４３、４５、５７を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）、及び「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」（抗ＥＧＦＲ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号１１、４９、５１を参照）、非還元型（Ｃ）及び還元型（Ｄ）のＳＤＳＰＡＧＥ（４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ，ＮｕＰａｇｅインビトロジェン，クーマシー染色）。「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕型」（抗ＥＧＦＲ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号４３、４５、４７を参照）（Ａ）及び「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」（抗ＥＧＦＲ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号１１、４９、５１を参照）（Ｂ）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬＧＥヘルスケア；２ｍＭＭＯＰＳｐＨ７．３，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；５０μｇのサンプルを注入）。（Ａ、Ｂ）「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」（抗ＦＡＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号１１、５１、５５を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）のＳＤＳＰＡＧＥ（４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ，ＮｕＰａｇｅインビトロジェン，クーマシー染色）。（Ｃ）「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」（抗ＦＡＰ／抗ｈｕＣＤ３）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬＧＥヘルスケア；２ｍＭＭＯＰＳｐＨ７．３，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；；５０μｇのサンプルを注入）。（Ａ）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号５、２１、２３を参照）、非還元型（レーン２）及び還元型（レーン３）；（Ｂ）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）は（配列番号５、１７、１９を参照）、非還元型（レーン２）、還元型（レーン３）；（Ｃ）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ｗｔ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号５、１３、１５を参照）、非還元型（レーン２）及び還元型（レーン３）；及び（Ｄ）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，Ｐ３２９ＧＬＡＬＡＮ２９７Ｄ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号５、２５、２７を参照）、非還元型（レーン２）及び還元型（レーン３）のＳＤＳＰＡＧＥ（１２％ビス／トリス、ＮｕＰａｇｅインビトロジェン、クーマシー染色）。（Ａ）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）は（配列番号５、２１、２３を参照）；（Ｂ）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）は（配列番号５、１７、１９を参照）；（Ｃ）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ｗｔ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）は（配列番号５、１３、１５を参照）；（Ｄ）は「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，Ｐ３２９ＧＬＡＬＡＮ２９７Ｄ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）は（配列番号５、２５、２７を参照）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデックス２００１０／３００ＧＬＧＥヘルスケア；２ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．３、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；５０μｇのサンプルを注入）。（Ａ、Ｂ）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ」（抗ＥＧＦＲ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号４５、４７、５３を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）のＳＤＳＰＡＧＥ（４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ，ＮｕＰａｇｅインビトロジェン，クーマシー染色）。（Ｃ）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ」（抗ＥＧＦＲ／抗ｈｕＣＤ３）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬＧＥヘルスケア；２ｍＭＭＯＰＳｐＨ７．３，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；５０ μｇのサンプルを注入）。（Ａ、Ｂ）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ」（抗ＦＡＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号５７、５９、６１を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）のＳＤＳＰＡＧＥ（４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ，ＮｕＰａｇｅインビトロジェン，クーマシー染色）。（Ｃ）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ」（抗ＦＡＰ／抗ｈｕＣＤ３）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬＧＥヘルスケア；２ｍＭＭＯＰＳｐＨ７．３，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；；５０μｇのサンプルを注入）。（Ａ、Ｂ）「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，Ｆｃ（ホール）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ／Ｆｃ（ｋｎｏｂ）ｗｔ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号５，２９、３１、３３を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）のＳＤＳＰＡＧＥ（４−１２％トリス−酢酸（Ａ）又は４−１２％のＢｉｓ／Ｔｒｉｓ（Ｂ），ＮｕＰａｇｅインビトロジェン，クーマシー染色）。（Ｃ）「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，Ｆｃ（ホール）Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ／Ｆｃ（ノブ）ｗｔ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬＧＥヘルスケア；１ｍＭＭＯＰＳｐＨ７．３，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；；５０μｇのサンプルを注入）。（Ａ、Ｂ）「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号３，５、２９、３３を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）のＳＤＳＰＡＧＥ（４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ，ＮｕＰａｇｅインビトロジェン，クーマシー染色）。（Ｃ）「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬＧＥヘルスケア；２ｍＭＭＯＰＳｐＨ７．３，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；；５０μｇのサンプルを注入）。（Ａ、Ｂ）「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｃｙＣＤ３）（配列番号３，５、３５、３７を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）のＳＤＳＰＡＧＥ（４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ，ＮｕＰａｇｅインビトロジェン，クーマシー染色）。（Ｃ）「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｃｙＣＤ３）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬＧＥヘルスケア；２ｍＭＭＯＰＳｐＨ７．３，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；；５０μｇのサンプルを注入）。（Ａ、Ｂ）「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型」（抗ＣＥＡ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号３３，６３、６５、６７を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）のＳＤＳＰＡＧＥ（４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ，ＮｕＰａｇｅインビトロジェン，クーマシー染色）。（Ｃ）「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型」（抗ＣＥＡ／抗ｈｕＣＤ３）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬＧＥヘルスケア；２ｍＭＭＯＰＳｐＨ７．３，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；；５０μｇのサンプルを注入）。（Ａ）「（ｓｃＦｖ）_２−Ｆｃ」及び「（ｄｓｓｃＦｖ）_２−Ｆｃ」（抗ＭＣＳＰ（ＬＣ００７）／抗ｈｕＣＤ３（Ｖ９））の熱安定性。０．０５°Ｃ／分で２５〜７５℃からの温度勾配で測定した動的光散乱。黒い曲線：「（ｓｃＦｖ）_２−Ｆｃ」；灰色曲線：「（ｄｓｓｃＦｖ）_２−Ｆｃ」。（Ｂ）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号５，２１，２３を参照）及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号３，５，２９，３３を参照）の熱安定性。０．０５°Ｃ／分で２５〜７５℃からの温度勾配で測定した動的光散乱。黒い曲線：「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」；灰色曲線：「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」。（Ａ）ヒトのＦｃγＲＩＩＩａを有する種々のＦｃ変異体との相互作用の測定、及び（Ｂ）腫瘍標的及びヒトＣＤ３γ（Ｇ_４Ｓ）_５ＣＤ３ε−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）を有するＴ細胞二重特異性構築物の同時結合についてのビアコアアッセイの設定。ヒトＭＣＳＰのＤ３ドメイン及びヒトＣＤ３γ（Ｇ_４Ｓ）_５ＣＤ３ε−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）へのＴ細胞二重特異性構築物の同時結合。（Ａ）「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３を参照）、（Ｂ）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号５，２１，２３を参照）。ヒトＥＧＦＲ及びヒトＣＤ３γ（Ｇ_４Ｓ）_５ＣＤ３ε−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）へのＴ細胞二重特異性構築物の同時結合。（Ａ）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号４５，４７，５３），（Ｂ）「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，片腕型」（配列番号４３，４５，４７），（Ｃ）「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，片腕反転型」（配列番号１１、４９、５１を参照）、及び（Ｄ）「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号４７、５３、２１３を参照）。ＦＡＣＳによって測定される、「（ｓｃＦｖ）_２」分子（５０ｎＭ）のＪｕｒｋａｔ細胞上に発現したＣＤ３（Ａ）への、又はＣｏｌｏ−３８細胞上のＭＣＳＰ（Ｂ）への結合。未処理細胞と二次抗体のみで染色された細胞と比較した平均蛍光強度が示される。ＦＡＣＳによって測定される、「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９）構築物（５０ｎＭ）のＪｕｒｋａｔ細胞上に発現したＣＤ３（Ａ）への、又はＣｏｌｏ−３８細胞上のＭＣＳＰ（Ｂ）への結合。参照の抗ＣＤ３ＩｇＧで処理された細胞（示されるように）、未処理細胞及び二次抗体のみで染色された細胞と比較した平均蛍光強度が示される。ＦＡＣＳによって測定される、「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，片腕型」（配列番号１、３、５を参照）及び「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，片腕反転型」（配列番号７、９、１１を参照）構築物（５０ｎＭ）のＪｕｒｋａｔ細胞上に発現したＣＤ３（Ａ）への、又はＣｏｌｏ−３８細胞上のＭＣＳＰ（Ｂ）への結合。参照の抗ＣＤ３又は抗ＭＣＳＰＩｇＧで処理された細胞（示されるように）、未処理細胞及び二次抗体のみで染色された細胞と比較した平均蛍光強度が示される。ＦＡＣＳによって測定される、「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９）二重特異性構築物及び対応する抗ＭＣＳＰＩｇＧの、Ｃｏｌｏ−３８細胞上のＭＣＳＰへの用量依存性結合。Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下で、指定されるように（腫瘍細胞に対するＰＢＭＣのＥ：Ｔ比＝１０：１）、１ｎＭの「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９）又は「（ｓｃＦｖ）_２」とともにインキュベーション後の、ヒトＴ細胞上の異なる活性化マーカーの表面発現レベル。示されるのは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞上での初期活性化マーカーＣＤ６９（Ａ）又は後期活性化マーカーＣＤ２５（Ｂ）のそれぞれ１５時間、又は２４時間のインキュベーション後の発現レベルである。Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下で、指定されるように（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、１ｎＭの「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９）又は「（ｓｃＦｖ）_２」とともにインキュベーション後の、ヒトＴ細胞上の後期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現レベル。示されるのは、５日間のインキュベーション後のＣＤ８^＋Ｔ細胞（Ａ）上又はＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｂ）上の後期活性化マーカーＣＤ２５の発現レベルである。ヒトのＭＣＳＰを発現するＭＶ−３腫瘍標的細胞の存在下または非存在下で（Ｅ：Ｔ比＝３：１）、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」二重特異性構築物（カニクイザルＣＤ３およびヒトＭＣＳＰを標的とする：配列番号３、５、３５、３７を参照）を示された濃度で４３時間インキュベートした後の、二つの異なる動物（カニクイザルネストル(cyno Nestor)、カニクイザルノブ(cyno Nobu））由来のカニクイザルＣＤ８^＋Ｔ細胞上の後期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現レベル。対照として、参照のＩｇＧ（抗カニクイザルＣＤ３ＩｇＧ、抗ヒトＩｇＧのＭＣＳＰ）又は非生理的な刺激であるＰＨＡ−Ｍを使用した。Ｕ８７ＭＧ腫瘍細胞の存在下で（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」ＣＤ３−ＭＣＳＰの二重特異性構築物（配列番号５、１７、１９を参照）により１８．５時間活性化されたヒトのパンＴ細胞によって分泌されるＩＦＮ−γレベル。対照として、対応する抗ＣＤ３ＩｇＧおよび抗ＭＣＳＰＩｇＧが投与される。ヒトパンＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、及び「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号５、２１、２３を参照）、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「（ｓｃＦｖ）_２」二重特異性分子及び対応するＩｇＧの．異なる濃度による２０時間の活性化に際してのＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。ヒトパンＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、及び二重特異性構築物及び対応するＩｇＧの．異なる濃度による２０時間の活性化に際してのＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。Ｆｃドメインが異なる（野生型Ｆｃドメイン（配列番号５、１３、１５を参照）又は（ＮＫ）エフェクター細胞機能を無効にするように変異されたＦｃドメインの何れかを有する）「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物：Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（配列番号５、２１、２３を参照）、Ｐ３２９ＧＬＡＬＡＮ２９７Ｄ（配列番号５、２５、２７）を参照）及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）構築物が比較された。ＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９を参照）構築物、「（ｓｃＦｖ）_２」分子又は対応するＩｇＧにより１８．５時間処置されたヒトパンＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）に際してのＣｏｌｏ−３８腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。ＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５，１７，１９を参照）構築物、「（ｓｃＦｖ）_２」分子又は対応するＩｇＧにより１８時間処置されたヒトパンＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）に際してのＣｏｌｏ−３８腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。ヒトパンＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、及びＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５，１７，１９を参照）構築物、「（ｓｃＦｖ）_２」分子又は対応するＩｇＧの異なる濃度による２３．５時間の活性化に際してのＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。ヒトパンＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、及びＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，片腕型」（配列番号１，３，５を参照），「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，片腕反転型」（配列番号７，９，１１を参照）又は「（ｓｃＦｖ）_２」構築物又は対応するＩｇＧの異なる濃度による１９時間の活性化に際してのＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」ＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物（配列番号５，２１，２１３を参照）、又は「（ｓｃＦｖ）_２」分子により２０時間処置されたヒトパンＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）に際してのＣｏｌｏ−３８腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。ヒトパンＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、及び二重特異性構築物及び対応するＩｇＧの．異なる濃度による２１時間の活性化に際してのＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。ＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３を参照）及び「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５，２９，３１，３３を参照）構築物、「（ｓｃＦｖ）_２」分子及び対応するＩｇＧが比較された。「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」ＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物（配列番号３，５，２９，３３）の１３５ｎｇ／ｍｌ又は１．３５ｎｇ／ｍｌによるヒトＴ細胞の活性化（Ｅ：Ｔ比＝２５：１）により誘導される異なる標的細胞（ＭＣＳＰ陽性結腸３８腫瘍標的細胞、骨髄又は脂肪組織に由来する間葉系幹細胞、又は胎盤由来の周皮細胞；示される通り）の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。ヒトＰＢＭＣ及び異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物（「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５，１７，１９を参照）及び「（ｓｃＦｖ）_２」）又は糖鎖操作型ＭＣＳＰＩｇＧ（ＧｌｙｃｏＭａｂ）との共培養に際して、２１時間の一晩のインキュベーション後に測定されたＣｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。エフェクターの標的細胞に対する比率は２５：１で固定（Ａ）又は示されるように変動させた（Ｂ）。ＰＢＭＣを、新鮮な血液（Ａ）またはバフィーコート（Ｂ）から単離した。カニクイザルＣＤ３及びヒトＭＣＳＰ（配列番号３、５、３５、３７）を標的とする「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物の時間依存細胞傷害作用。示されるのは、初代カニクイザルＰＢＭＣとの２４時間又は４３時間の共培養（Ｅ：Ｔ比＝３：１）に際してのヒトＭＣＳＰを発現するＭＶ−３細胞からのＬＤＨ放出である。対照として、参照のＩｇＧ（抗カニクイザルＣＤ３ＩｇＧおよび抗ヒトＭＣＳＰＩｇＧ）を同じモル濃度で使用した。ＰＨＡ−Ｍは、（非生理的な）Ｔ細胞活性化のための対照として機能した。異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物（「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３を参照）及び「（ｓｃＦｖ）_２」）で〜２６時間処置した、ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）に際してのｈｕＭＣＳＰ陽性ＭＶ−３メラノーマ細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。異なるＣＤ３−ＥＧＦＲ二重特異性構築物（「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号４５，４７，５３を参照），「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号４７，５３，２１３を参照）及び「（ｓｃＦｖ）_２」）又は参照のＩｇＧで１８時間処置された、ヒトパンＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）に際してのＥＧＦＲ陽性ＬＳ−１７４Ｔ腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。異なるＣＤ３−ＥＧＦＲ二重特異性構築物（「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕型」（配列番号４３，４５，４７を参照），「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」（配列番号１１，４９，５１を参照）、「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号４７，５３，２１３を参照）及び「（ｓｃＦｖ）_２」）又は参照のＩｇＧで２１時間処置された、ヒトパンＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）に際しての、ＥＧＦＲ陽性ＬＳ−１７４Ｔ腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。異なるＣＤ３−ＥＧＦＲ二重特異性構築物（「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕型」（配列番号４３，４５，４７を参照），「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」（配列番号１１，４９，５１を参照）及び「（ｓｃＦｖ）_２」）又は参照のＩｇＧで１６時間処置された、ヒトパンＴ細胞（Ａ）又はヒトナイーブＴ細胞（Ｂ）のどちらかとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）に際してのＥＧＦＲ陽性ＬＳ−１７４Ｔ腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。標的細胞に対するエフェクター比は５：１であった。異なるＣＤ３−ＦＡＰ二重特異性構築物（「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」（配列番号１１，５１，５５を参照），「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕型」（配列番号５７，６１，２１３を参照）、「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号５７，５９，６１を参照）及び「（ｓｃＦｖ）_２」）で〜１８時間処置された、ヒトパンＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）に際しての、ＦＡＰ陽性ＧＭ０５３８９繊維芽細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。６時間、標的細胞の存在下（Ａ）又は非存在下で（Ｂ）の、異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物（「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５，１７，１９を参照）及び「（ｓｃＦｖ）_２」）又は対応する対照のＩｇＧで処置されたＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーフォリンレベル並びにＣＤ１０７ａ／ｂの発現レベルのフローサイトメトリー分析ヒトパンＴ細胞は、Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下または非存在下でエフェクター対標的の比が５：１で異なる分子９．４３ｎＭのとインキュベートした。モネンシンは、タンパク質輸送を妨げることによって細胞内のタンパク質レベルを増加させるため、インキュベーションの最初の一時間後に添加した。示すように、ゲートは、全てのＣＤ１０７ａ／ｂ陽性細胞、パーフォリン陽性細胞又は二重陽性細胞の何れかで設定された。Ｃｏｌｏ−３８腫瘍細胞の存在下又は非存在下でエフェクター対標的細胞の比が５：１で、１ｎＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物（「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５，１７，１９を参照）又は「（ｓｃＦｖ）_２」）又は対応する対照のＩｇＧとのインキュベーションに際のＣＤ８^＋（Ａ）又はＣＤ４^＋（Ｂ）ヒトＴ細胞の何れかの相対的増殖。ＣＦＳＥ標識ヒトパンＴ細胞はＦＡＣＳによって特徴付けられた。相対的増殖レベルは、非増殖細胞の周りにゲートを設定し、そして参照として測定された全細胞数と比較してこのゲートの細胞数を用いて決定した。２４時間、Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下または非存在下で、１ｎＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物（「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５，１７，１９）又は「（ｓｃＦｖ）_２」）又は対応するＩｇＧで処置後の、ヒトＰＢＭＣの上清で測定された異なるサイトカインのレベル。標的細胞に対するエフェクター比は１０：１であった。２４時間、Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下または非存在下で、１ｎＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３を参照）又は「（ｓｃＦｖ）_２」）又は対応するＩｇＧで処置後の、ヒトＰＢＭＣの上清で測定された異なるサイトカインのレベル。異なる二重特異性構築物の中には、野生型Ｆｃドメイン（配列番号５、１３、１５を参照）又は（ＮＫ）エフェクター細胞機能を無効にするように変異されたＦｃドメイン（ＬＡＬＡ（配列番号５，１７，１９を参照），Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ（配列番号５，２，２３を参照）及びＰ３２９ＧＬＡＬＡＮ２９７Ｄ（配列番号５，２５，２７を参照））．の何れかを有する異なる「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物が存在した。ＣＥ−ＳＤＳ分析「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、連結した軽鎖」（配列番号３，５，２９，１７９を参照）のＳＤＳＰＡＧＥとして示される電気泳動。（レーン１：還元型、レーン２：非還元型）。「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、連結した軽鎖」（配列番号３，５，２９，１７９を参照）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー。２０μｇのサンプルを注入した。異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物で〜４４時間処置した、ヒトＰＢＭＣによる共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）に際してのＭＣＳＰ陽性ＭＶ−３腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅（「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３を参照）及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，連結したＬＣ」（配列番号３，５，２９，１７９）を参照）。ヒトＰＢＭＣを、健常ボランティアの新鮮な血液から単離した。異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物で〜２２時間処置した、ヒトＰＢＭＣによる共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）に際してのＭＣＳＰ陽性Ｃｏｌｏ−３８腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅（「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３を参照）及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，連結したＬＣ」（配列番号３，５，２９，１７９）を参照）。ヒトＰＢＭＣを、健常ボランティアの新鮮な血液から単離した。異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物で〜２２時間処置した、ヒトＰＢＭＣによる共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）に際してのＭＣＳＰ陽性Ｃｏｌｏ−３８腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅（「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３を参照）及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，連結したＬＣ」（配列番号３，５，２９，１７９）を参照）。ヒトＰＢＭＣを、健常ボランティアの新鮮な血液から単離した。異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物で〜２２時間処置した、ヒトＰＢＭＣによる共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）に際してのＭＣＳＰ陽性ＷＭ２６６−４細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅（「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３を参照）及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，連結したＬＣ」（配列番号３，５，２９，１７９）を参照）。ヒトＰＢＭＣを、健常ボランティアの新鮮な血液から単離した。ヒトＭＣＳＰを発現するＣｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下での１０ｎＭ，８０ｐＭ又は３ｐＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物（「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３を参照）及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，連結したＬＣ」（配列番号３，５，２９，１７９を参照）と２２時間インキュベート後の初期活性化マーカーＣＤ６９（Ａ）及び後期活性化マーカーＣＤ２５（Ｂ）の表面発現レベル。ＣＥ−ＳＤＳ分析（Ａ）１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ；ＶＬ／ＶＨ交換（ＬＣ００７／Ｖ９）（配列番号５，２９，３３，１８１を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）非還元型，ｂ）還元型。（Ｂ）１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓＭａｂ；ＣＬ／ＣＨ１交換（ＬＣ００７／Ｖ９）（配列番号５，２３，１８３，１８５を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型，ｂ）非還元型。（Ｃ）２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型；ＣＬ／ＣＨ１交換（ＬＣ００７／Ｖ９）（配列番号５，２３，１８３，１８７を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型，ｂ）非還元型。（Ｄ）２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ；ＶＬ／ＶＨ交換（Ｍ４−３ＭＬ２／Ｖ９）（配列番号３３，１８９，１９１，１９３を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型，ｂ）非還元型。（Ｅ）２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ；ＣＬ／ＣＨ１交換（Ｍ４−３ＭＬ２／Ｖ９）（配列番号１８３，１８９，１９３，１９５を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型，ｂ）非還元型。（Ｆ）２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型；ＣＬ／ＣＨ１交換（ＣＨ１Ａ１Ａ／Ｖ９）（配列番号６５，６７，１８３，１９７を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型，ｂ）非還元型。（Ｇ）２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ；ＣＬ／ＣＨ１交換（Ｍ４−３ＭＬ２／Ｈ２Ｃ）（配列番号１８９，１９３，１９９，２０１を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型，ｂ）非還元型。（Ｈ）２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型；ＣＬ／ＣＨ１交換（４３１／２６／Ｖ９）（配列番号１８３，２０３，２０５，２０７を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型，ｂ）非還元型。（Ｉ）「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、軽鎖融合」（ＣＨ１Ａ１Ａ／Ｖ９）（配列番号１８３，２０９，２１１，２１３を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型，ｂ）非還元型。（Ｊ）「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号５，２３、２１５、２１７を参照）、ＳＤＳＰＡＧＥ（４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ，ＮｕＰａｇｅインビトロジェン，クーマシー染色）、非還元型（左）及び還元型（右）。（Ｋ）「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号５，２３，２１５，２１９を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型，ｂ）非還元型。（Ｌ）「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＣＤ３３／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号３３，２１３、２２１、２２３を参照）、ＳＤＳＰＡＧＥ（４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ，ＮｕＰａｇｅインビトロジェン，クーマシー染色）、還元型（左）及び非還元型（右）。（Ｍ）「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＣＤ３３／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号３３，２２１，２２３，２２５を参照）、ＳＤＳＰＡＧＥ（４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ，ＮｕＰａｇｅインビトロジェン，クーマシー染色）、還元型（左）及び非還元型（右）。（Ｎ）「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＣＤ２０／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号３３，２２７，２２９，２３１を参照）、ＳＤＳＰＡＧＥ（４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ，ＮｕＰａｇｅインビトロジェン，クーマシー染色）、非還元型。二重特異性構築物（ＣＥＡ／ＣＤ３「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，反転型（ＶＬ／ＶＨ）」（配列番号３３，６３，６５，６７を参照）及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，反転型（ＣＬ／ＣＨ１）２（配列番号６５，６７，１８３，１９７を参照）のＪｕｒｋａｔ細胞により発現されるヒトＣＤ３に対する（Ａ）又はＬＳ−１７４Ｔ細胞により発現されるヒトＣＥＡに対する（Ｂ）結合。対照として、参照のＩｇＧの同等の最大濃度及び標識した２次抗体（ヤギ抗ヒトＦＩＴＣコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２Ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂ＃１０９−０９６−０９８）に起因するバックグラウンド染色も同様に評価した。ＦＡＣＳにより決定される、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ａ）により発現されるヒトＣＤ３に対する又はＷＭ２６６−４細胞により発現されるヒトＭＣＳＰに対する（Ｂ）、二重特異性構築物（ＭＣＳＰ／ＣＤ３「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３を参照）及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，反転型」（配列番号５，２３，１８３，１８７を参照））の結合。ＦＡＣＳにより決定される、更なる実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞により発現されるヒトＣＤ３に対する（Ａ）、及びＬＳ−１７４Ｔ細胞により発現されるヒトＣＥＡに対する（Ｂ）、「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ軽鎖融合」（配列番号１８３、２０９、２１１、２１３）の結合。ＦＡＣＳにより決定される、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ａ）により発現されるヒトＣＤ５に対する又はＷＭ２６６−４細胞により発現されるヒトＭＣＳＰに対する（Ｂ）、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５，２３，２１５，２１７を参照）及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，反転型」（配列番号５，２３，２１５，２１９を参照）構築物の結合。指定された濃度のＣＤ３／ＭＣＳＰ「１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ」（配列番号５，２３，１８３，１８５を参照），「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５，２９，３３，１８１を参照）及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３を参照）構築物で２４時間インキュベーション後のヒトＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上での初期活性化マーカーＣＤ６９（Ａ）又は後期活性化マーカーＣＤ２５（Ｂ）の表面発現レベル。アッセイは、示されているように、ＭＶ−３標的細胞の存在下または非存在下で行った。ｈｕＭＣＳＰ陽性ＭＶ−３腫瘍細胞の存在下又は非存在下で、〜４１時間、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５，２３，２１５，２１７）及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，反転型」（配列番号５，２３，２１５，２１９を参照）で処置したカニクイザルＰＢＭＣとの共培養の際の（ＥＴ比＝３：１、ＣＤ３＋の数に正規化）、２匹の異なるカニクイザルからのＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上の初期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現レベル（Ａ及びＢ）。ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，反転型（ＶＬ／ＶＨ）」（配列番号３３，６３，６５，６７を参照）対「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，反転型（ＣＬ／ＣＨ１）」（配列番号６５，６７，１８３，１９７を参照）構築物の異なる濃度による２８時間の活性化の際のＭＫＮ−４５（Ａ）又はＬＳ−１７４Ｔ（Ｂ）腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ（ＶＬ／ＶＨ）」（配列番号３３，６３，６５，６７を参照）対「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ（ＣＬ／ＣＨ１）」（配列番号６５，６７，１８３，１９７を参照）構築物の異なる濃度による２８時間の活性化の際のＷＭ２６６−４腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ（ＶＨ／ＶＬ）」（配列番号３３，６３，６５，６７を参照）対「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ（ＣＬ／ＣＨ１）」（配列番号６５，６７，１８３，１９７を参照）構築物の異なる濃度による２７時間の活性化の際のＭＶ−３腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。示されるように、ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び異なる濃度の「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３を参照），「１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ」（配列番号５，２３，１８３，１８５），及び「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５，２９，３３，１８１を参照）による２１時間の活性化に際して、ヒトＭＣＳＰ−陽性ＷＭ２６６−４（Ａ）又はＭＶ−３（Ｂ）腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び、「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂＬＣ融合」（配列番号１８３，２０９，２１１，２１３）の異なる濃度による２８時間の活性化の際のＭＫＮ−４５（Ａ）又はＬＳ−１７４Ｔ（Ｂ）腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び、「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂＬＣ融合」（配列番号１８３，２０９，２１１，２１３を参照）対非標的化「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」参照の異なる濃度による２４時間の活性化の際の、ＭＣ３８−ｈｕＣＥＡ腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ（Ｖ９）」（配列番号３，５，２９，３３を参照）及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，反転型（Ｖ９）」（配列番号５，２３，１８３，１８７を参照），「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ（抗ＣＤ３）」（配列番号５，２３，２１５，２１７を参照）及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，反転型（抗ＣＤ３）」（配列番号５，２３，２１５，２１９を参照）構築物で処置された、ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）に際して、ヒトＭＣＳＰ−陽性ＭＶ−３（Ａ）又はＷＭ２６６−４（Ｂ）腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。

発明の詳細な説明
定義
本明細書において、用語は、以下に定義されていない限り、当技術分野で一般的に使用されるように使用される。

本明細書で使用しているように、用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリンおよびその誘導体、例えば、断片である。

用語「二重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、二つの抗原結合部位を含み、その各々は異なる抗原決定基に特異的である。ある実施態様において、二重特異性抗原は、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上に発現した２つの抗原決定基を同時に結合することが可能である。

本明細書で使用する用語「価」は、抗原結合分子中に指定された数の抗原結合部位の存在を示す。このように、用語「抗原への一価結合」とは、抗原結合分子中の抗原に特異的な一（一以下の）抗原結合部位の存在を示している。

「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、即ち１以上のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。天然の免疫グロブリン分子は、二つの抗原結合部位であって、典型的には単一の抗原結合部位を有するＦａｂ分子を有する。

本明細書で使用しているように、用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、標的部位、例えば特定のタイプの腫瘍細胞又は抗原決定基をもつ腫瘍間質に付着される実体（例えば第二抗原結合部分）を指向することが可能である。別の実施態様では、抗原結合部分は、例えばＴ細胞受容体複合体抗原などその標的抗原を介するシグナル伝達を活性化することができる。さらに本願明細書において定められるように、抗原結合部分には抗体およびその断片が含まれる。特定の抗原結合部分は、抗体の重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む抗体の抗原結合ドメインを含む。特定の実施態様において、抗原結合部分は、本明細書でさらに定義され、当技術分野で公知の抗体定常領域を含むことができる。有用な重鎖定常領域は、５のアイソタイプ：α，δ，ε，γ又はμを含む。有用な軽鎖定常領域は、２のアイソタイプ：κおよびλを含む。有用な軽鎖定常領域は、２つのアイソタイプ：κ及びλの何れかを含む。

本明細書で使用しているように、用語「抗原決定基」は「抗原」および「エピトープ」と同義で、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えばアミノ酸の隣接するストレッチ又は非連続アミノ酸の異なる領域から成り立つ立体配置的配位）を指し、抗原結合部分−抗原複合体を形成する。有用な抗原決定基は、例えば、ウイルス感染細胞の表面上で、他の疾患細胞の表面上で、血清中に遊離して、および／または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に見つけることができる。本明細書で抗原として参照されるタンパク質（例えばＭＣＳＰ、ＦＡＰ、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ３）と呼ばれるタンパク質は、他に示されない限り霊長類（例えば、ヒト）などを含む哺乳類及び齧歯類（例えばマウス及びラット）を含む任意の脊椎動物供給源からのタンパク質の任意の天然型とすることができる。特定の実施態様において、抗原はヒトタンパク質である。参照が本明細書の特定のタンパク質に言及する場合、この用語は、「全長」、未処理のタンパク質並びに細胞におけるプロセシングから生じるタンパク質の任意の形態を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。抗原として有用な例示的なヒトタンパク質は、限定されないが、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４としても知られているメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン７０），ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００１８８８．２）；セプラーゼとしても知られている線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ１２８８４，Ｑ８６Ｚ２９，Ｑ９９９９８，ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００４４５１）；癌胎児性抗原関連細胞接着分子５としても知られている癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０６７３１（バージョン１１９），ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００４３５４．２）；ｇｐ６７又はＳｉｇｌｅｃ−３としても知られるＣＤ３３（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ２０１３８，ＮＣＢＩ受託番号．ＮＰ＿００１０７６０８７，ＮＰ＿００１１７１０７９）；ＥｒｂＢ−１又はＨｅｒ１としても知られている上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ００５３，ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿９５８４３９，ＮＰ＿９５８４４０）、及びＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニット（ヒト配列はＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０７７６６（バージョン１３０），ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０００７２４．１，配列番号２６５；又はカニクイザル［カニクイザル］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９），ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１，配列番号２６６を参照）を含む。ある実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、異なる種からの活性化Ｔ細胞抗原または標的抗原間で保存されている活性化Ｔ細胞抗原又は標的細胞抗原のエピトープに結合する。

「特異的結合」とは、結合が抗原について選択的であり、不必要な又は非特異的相互作用と区別されうることを意味する。特定の抗原決定基に結合する抗原結合部分の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で解析される）(Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000))および伝統的な結合アッセイ(Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002))のいずれかによって測定することができる。一実施態様では、無関係のタンパク質への抗原結合部分の結合の程度は、例えばＳＰＲにより測定される場合、抗原に対する抗原結合部分の結合の約１０％未満である。ある実施態様において、抗原へ結合する抗原結合部分、又はその抗原結合部分を含む抗原結合分子は、解離定数（Ｋ_Ｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ，、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−^８Ｍ未満、例えば、１０−^８Ｍから１０−^１３Ｍ、例えば、１０−^９Ｍから１０−^１３Ｍ）である。

「親和性」とは、分子（例えば、受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離の比率である解離定数（Ｋ_Ｄ）および会合速度定数（ぞれぞれｋｏｆｆとｋｏｎ）で表すことができる。従って、同等の親和性は、速度定数の比が同じままである限り、別の速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で良く確立される方法によって測定することができる。親和性を測定するための特別な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。

「結合の減少」とは、例えばＦｃ受容体に対する結合の減少であり、例えばＳＰＲにより測定される場合、それぞれの相互作用の親和性の減少を指す。明確にするために、この用語はまた、親和性がゼロへの低下（又は分析法の検出限界以下）、即ち、相互作用の完全な撤廃をも含む。逆に、「結合の増加」は、それぞれの相互作用に対する結合親和性の増加を指す。

本明細書で使用する「活性化Ｔ細胞抗原」は、抗原結合分子との相互作用によりＴ細胞活性化を誘導することが可能である、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に発現する抗原決定基を意味する。具体的には、活性化Ｔ細胞抗原と抗原結合分子との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを誘発することにより、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞はＣＤ３である。

本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の一つ以上の細胞応答を指す。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、本明細書に記載の当該技術分野で知られている。
本明細書で使用する「標的細胞抗原」とは、例えば、癌細胞などの腫瘍の細胞又は腫瘍間質の細胞など標的細胞の表面上に提示される抗原決定基を意味する。

本明細書で使用しているように、抗原結合部分などに関して用語「第一」及び「第二」は、一より多くのタイプの部分がある場合に、便宜上区別するために用いる。これらの用語の使用は、特記しない限り、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特別な順番又は方向を指すためのものではない。

「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメイン（「Ｆａｂ重鎖」）及び軽鎖のＶＬおよびＣＬドメイン（「Ｆａｂ軽鎖」）からなるタンパク質を指す。

「融合」とはその成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、直接または一つ以上のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されていることを意味する。

本明細書で使用しているように、用語「単鎖」は、ペプチド結合によって線形に結合されるアミノ酸モノマーを含んでなる分子を指す。ある実施態様において、抗原結合部分の一つは、一本鎖Ｆａｂ分子、即ちＦａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖が、単一のペプチド鎖を形成するために、ペプチドリンカーによって連結されているＦａｂ分子である。特定のそのような実施態様において、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、一本鎖のＦａｂ分子においてＦａｂ重鎖のＮ末端に連結されている。

「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも称す）とは、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されるＦａｂ分子を意味し、即ちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域および重鎖定常領域からなるペプチド鎖及び重鎖可変領域および軽鎖定常領域からなるペプチド鎖を含む。明確にするために、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変領域が交換されるクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常領域を含むペプチド鎖は、クロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」とここでは言われる。逆に、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の定常領域が交換されるクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変領域を含むペプチド鎖は、クロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」とここでは言われる。

用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）がある。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインがある。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ），δ（ＩｇＤ），ε（ＩｇＥ），γ（ＩｇＧ），又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプの１つに割り当てることができ、そのうち幾つかは更にγ_１（ＩｇＧ_１），γ_２（ＩｇＧ_２），γ_３（ＩｇＧ_３），γ_４（ＩｇＧ_４），α_１（ＩｇＡ_１）及びα_２（ＩｇＡ_２）などのサブタイプに分割され得る。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結された２つのＦａｂ分子およびＦｃドメインから本質的になる。

用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第１１３巻， Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York),頁269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは２価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体のタンパク質分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。

「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全体に相補的であり特異的に結合する領域を含む抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、一以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により与えられうる。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。

本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは一般的に、超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分への参照において本明細書で互換的に使用される。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) and by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記述されており、そこで本定義は、相互に対して比較するときにアミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。にも関わらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを参照するために、何れかの定義の適用は、本明細書において定義され使用される用語の範囲内であることを意図されている。上記の引用文献の各々によって定義されるように、ＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基が、比較として以下の表１に記載されている。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列や大きさによって異なる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを日常的に決定することができる。

Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能である可変領域配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列それ自体を超えた任意の実験データに頼ることなく、任意の可変領域配列に対してこのＫａｂａｔの番号付けシステムを一義的に割り当てることができる。本明細書で用いる場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」とは、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)で明記されている番号付けシステムを指す。特記されない限り、抗体可変領域内の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの参照は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。

配列表のポリペプチド配列（即ち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５など）はＫａｂａｔの番号付けシステムに従って番号付けされてはいない。しかし、Ｋａｂａｔの番号付けを配列表の配列の番号に変換することは当業者の通常の技術の範囲内である。

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメインで構成される：ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３，及びＦＲ４。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。

抗体又はイムノコンジュゲートの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２に、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩＧＡ_１、及びＩｇＡ_２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、若干異なる場合があるものの、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端へ伸展するように定義されている。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991．本明細書で使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドの一つ、即ち、安定に自己会合可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧのＦｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧのＨＣ２及びＩｇＧのＣＨ３定常ドメインを含む。

「Ｆｃドメインの第一及び第二のサブユニットの会合を促進する修飾」とは、ホモ二量体を形成するＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの同一のポリペプチドとの会合を減少又は防止するペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書において使用される会合を促進する修飾は、会合が望まれる２つのＦｃドメインサブユニット（すなわちＦｃドメインの第一及び第２サブユニット）のそれぞれに対して行われた別々の修飾を特に含み、該修飾は２つのＦｃドメインのサブユニットの会合を促進するように互いに相補的である。例えば、会合促進修飾は、その会合をそれぞれ立体的又は静電気的に好ましくするために、Ｆｃドメインの一方又は双方の構造又は電荷を改変しうる。従って、（ヘテロ）二量体化が、各サブユニットの各々に融合した更なる成分（例えば抗原結合部分）が同一ではないという意味で非同一であるかもしれない、第一Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと第二Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの間に生じる。幾つかの実施態様では、会合促進修飾は、Ｆｃドメイン中にアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。

「エフェクター機能」なる用語は、抗体に言及して使用される場合、抗体のＦｃ領域に起因するそれらの生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例は：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化を含む。

本明細書で使用される場合、「操作(engineer, engineered, engineering)」なる用語は、天然に生じるか又は組換えのポリペプチド又はその断片のペプチド骨格の何れかの修飾又は翻訳後修飾を含むと考えられる。操作は、アミノ酸配列の、糖鎖付加パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、並びにこれらのアプローチの組合せを含む。

「アミノ酸変異」なる用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。最終構築物が所望の特徴、例えばＦｃ受容体への結合の減少又は別のペプチドとの会合の増加を有することを条件として、置換、欠失、挿入、及び修飾の何れかの組合せが最終構築物に到達するために成されても良い。アミノ酸配列欠失及び挿入は、アミノ酸のアミノ−及び／又はカルボキシル−末端欠失及び挿入を含む。特定のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特性を変更する目的のために、非保存的アミノ酸置換、即ち一のアミノ酸を、異なる構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸と置換することが特に所望される。アミノ酸置換は、２０の標準的アミノ酸の非天然に生じるアミノ酸又は天然に生じるアミノ酸誘導体による置換を含む（例えば４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）。アミノ酸変異は、当分野でよく知られた遺伝学的又は化学的方法を使用して生成されうる。遺伝学的方法は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含みうる。化学的修飾など、遺伝子工学以外の方法によるアミノ酸の側鎖基の改変方法がまた有用でありうることが意図される。本明細書において同一のアミノ酸変異を示すために様々な名称が使用されてもよい。例えば、Ｆｃドメインの位置３２９のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ_３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示すことができる。

本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」はアミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線形に結合される単量体（アミノ酸）から成る分子を指す。「ポリペプチド」なる用語は、２以上のアミノ酸の何れかの鎖を指し、特定長の産物を指すものではない。このように、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２以上アミノ酸の鎖を指すために使用される何れかの他の用語が、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」なる用語はこれらの何れかの用語の代わりに又は互換的に使用されうる。「ポリペプチド」なる用語は、限定するものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、知られている保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、又は非天然に生じるアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指す。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか又は組換え技術によって生産され得るが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳される必要はない。それは化学合成を含む何れかの方法において生成されうる。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、又は２，０００以上のアミノ酸のサイズでありうる。ポリペプチドは定められた三次元構造を有しうるが、それらは必ずしもこのような構造を有する必要はない。定められた三次元構造を有するポリペプチドはフォールドしたと言及され、定められた三次元構造を持たないが多数の異なるコンホメーションをとりうるポリペプチドはアンフォールドとして言及される。

「単離された」ポリペプチド又は変異体、又はその誘導体は、その天然環境中にはないポリペプチドを意図する。特定レベルの精製は必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然環境から除去することができる。何れかの好適な技術によって分離、分画化、又は部分的又は実質的に精製される天然又は組換えポリペプチドのように、宿主細胞において発現された組換え生産されたポリペプチド及びタンパク質は、本発明の目的のために単離されることが考えられる。
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように、得られる。

「ポリヌクレオチド」なる用語は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウィルス由来ＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合又は非一般的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含みうる。「核酸分子」なる用語は、ポリヌクレオチドに存在する何れかの一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。

「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、それの天然環境から採られた核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例は、異種性宿主細胞に維持された組換えポリヌクレオチド又は溶液中における（部分的又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドを含む。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含有する細胞に含有されるポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は染色体外に、又はそれの染色体上の位置と異なる染色体上の位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のインビボ又はインビトロＲＮＡ転写物、並びにプラス及びマイナス鎖形態、及び二本鎖形態を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成的に生産されたこのような分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節要素であるか又はそれを含みうる。

本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌクレオチドにつき最大で５つの点変異を含みうることを除けば、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図している。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％までが欠失されたり、又は別のヌクレオチド置換され得、または参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％までの多数のヌクレオチドが参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位置又はそれらの位置の間のどこでも起こり得、参照配列中の残基中に個別に散在するか又は参照配列内における一以上の隣接グループ中に散在している。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、従来法により、上記のものような既知のコンピュータプログラムを用いて決定することができる。
「発現カセット」なる用語は、標的細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸要素を伴う、組換え又は合成によって生成されるポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込まれうる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、他の配列の中でもとりわけ、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。ある実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。

「ベクター」又は「発現ベクター」なる用語は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞において作動的に関連した特定の遺伝子の発現を導入する及び指向するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、多量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。一旦発現ベクターが標的細胞内に入ると、遺伝子にコードされたリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞の転写及び／又は翻訳機構によって生産される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。宿主細胞は、本発明で使用される二重特異性抗原結合分子を産生するために使用することができる任意のタイプの細胞システムである。宿主細胞は、培養細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞などの哺乳類培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、わずかな例を挙げると、しかしまた、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織の中に含まれる細胞も含む。

「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる結合後に、エフェクター機能を遂行させるために受容体を持つ細胞を刺激するシグナル伝達イベントを誘発させるＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。

抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞による抗体被覆標的細胞の溶解をもたらす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が、Ｎ末端にあるタンパク質部分を一般に介してＦｃ領域に特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、用語「ＡＤＣＣの減少」は、標的細胞を取り囲む培地中で、上に定義されたＡＤＣＣのメカニズムによって、所定の時間内に、抗体の所定の濃度で溶解される標的細胞の数の減少、及び／又はＡＤＣＣのメカニズムによって、所定の時間内に、所定の数の標的細胞の溶解を達成するために必要とされる、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の濃度の増加のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの減少は、同じ標準的な産生、精製、製剤、及び保存の方法（当業者に公知である）を使用して、同じ型の宿主細胞によって産生されるが、操作されていない、同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに関連している。例えば、そのＦｃドメインにＡＤＣＣを減少させるアミノ酸置換を含む抗体により媒介されるＡＤＣＣの減少は、Ｆｃドメインのアミノ酸置換を持たない同一抗体により媒介されるＡＤＣＣに関連する。ＡＤＣＣを測定するための好適なアッセイは、当該分野で周知である（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０８２５１５又はＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３を参照）。

「有効な量」の薬剤とは、投与される細胞又は組織において生理学的変化をもたらすために必要な量を指す。

薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的に有効な量の薬剤は例えば、疾患の有害作用を除去、低下、遅延、最小化又は防止させる。
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。特に、個体又は被検体はヒトである。

用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。

「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。

本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する(treat)」または「治療している(treating)」など文法上の変形）は、治療されている個体における疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。

用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。

実施態様の詳細な説明
本発明の第一の態様において、一方が活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子であり、他方が標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第一及び第二の抗原結合部分、及び安定な会合が可能な第一及び第二のサブユニットからなるＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供され；
ここで第一の抗原結合部分は、
（ａ）Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖がペプチドリンカーによって連結されている前記単鎖Ｆａｂ分子、又は
（ｂ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常領域の何れかが交換されるクロスオーバーＦａｂ分子である。

Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のフォーマット
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の構成要素は、様々な立体配置で相互に融合することができる。例示的な立体配置を図１に示す。

幾つかの実施態様では、第一の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合される。

特定の実施態様では、第一の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合される。特定のこのような実施形態において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一及び第二の抗原結合部分、第一及び第二のサブユニットからなるＦｃドメイン、および任意で一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、ここで第一の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端で第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第二の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合されている。更により具体的な実施態様において、第一の抗原結合部分は、単鎖Ｆａｂ分子である。あるいは、特定の実施態様において、第一の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。場合によっては、第一抗原結合部分がクロスオーバーＦａｂ分子である場合、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合されてもよい。

別のそのような一実施態様では、第一の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合される。具体的なこのような実施形態において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一及び第二の抗原結合部分、第一及び第二のサブユニットからなるＦｃドメイン、および任意で一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、ここで第一及び第二の抗原結合部分の各はＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端へ融合される。更により具体的な実施態様において、第一の抗原結合部分は、単鎖Ｆａｂ分子である。あるいは、特定の実施態様において、第一の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。

更に他のこのような実施態様において、第二の抗原結合部分は、そのＦａｂ軽鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端へ融合される。特定のこのような実施形態において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一及び第二の抗原結合部分、第一及び第二のサブユニットからなるＦｃドメイン、および任意で一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、ここで第一の抗原結合部分はＦａｂ軽鎖のＮ末端で第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＣ末端に融合され、第二の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合されている。更により具体的な実施態様において、第一の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。

他の実施態様では、第一の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合される。

具体的なそのような実施態様では、第二の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合される。特定のこのような実施形態において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一及び第二の抗原結合部分、第一及び第二のサブユニットからなるＦｃドメイン、および任意で一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、ここで第二の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端で第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第一の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合されている。更により具体的な実施態様において、第一の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。場合によっては、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合されてもよい。

特にこれらの実施態様のうち、第一の抗原結合部分は活性化Ｔ細胞抗原への特異的結合が可能である。他の実施態様において、第一の抗原結合部分は標的細胞抗原への特異的結合が可能である。

抗原結合部分は、直接又は一つ以上のアミノ酸、典型的には約２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインへ又はお互いに融合され得る。ペプチドリンカーは、当技術分野で知られ、本明細書に記載されている。適切な、非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ，（ＳＧ_４）_ｎ，（Ｇ_４Ｓ）_ｎ又はＧ_４（ＳＧ_４）_ｎペプチドリンカーが挙げられる。「ｎ」は一般には１と１０の間、典型的には２から４の間の数である。互いに第一及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を融合するために特に好適なペプチドリンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_２である。第一及び第二の抗原結合部分のＦａｂの重鎖を連結するのに適した典型的なペプチドリンカーは、ＥＰＫＳＣ（Ｄ）−（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号１５０と１５１）である。さらに、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含んでもよい。特に、抗原結合部分がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に融合される場合、それは、免疫グロブリンのヒンジ領域またはその一部（追加のペプチドリンカーの有無にかかわらず）を介して融合されてもよい。

標的細胞の抗原への特異的結合が可能である単一抗原結合部分を持つＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（例えば図１Ａ、１Ｂ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｈ、１Ｉ、１Ｋ又は１Ｍ）は、特に高親和性の抗原結合部分の結合後に標的細胞抗原の内在化が予想される場合には有用である。このような場合には、標的細胞抗原に特異的な一以上の抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内在化を強化することができ、それによってその利用可能性を低減することができる。

他の多くのケースにおいては、しかしながら、例えば、標的部位への標的化を最適化するために又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために、標的細胞抗原に特異的な一又は複数の抗原結合部分を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を有することが有利であろう（図１Ｃ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｊまたは１Ｌに示す例を参照）。

従って、ある実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第三の抗原結合部分を更に含む。一実施態様において、第三の抗原結合部分は、第一又は第二の抗原結合部分と同一の標的細胞抗原に特異的に結合することが可能である。具体的な実施態様において、第一の抗原結合部分は、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することが可能であり、かつ第二及び第三抗原結合部分は標的細胞抗原に特異的に結合することが可能である。

一実施態様では、第三の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合される。特定の実施態様において、第二及び第三の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に各々融合され、第一の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合されている。そのような一つの実施態様において、第一の抗原結合部分は、単鎖Ｆａｂ分子である。特定のそのような実施態様において、第一の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。場合によっては、第一抗原結合部分がクロスオーバーＦａｂ分子である場合、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合されてもよい。

第二及び第三の抗原結合部分は、Ｆｃドメインに直接またはペプチドリンカーを介して融合させることができる。特定の実施態様において、第二及び第三の抗原結合部分は、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインへ各々融合される。具体的な実施形態において、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ_１ヒンジ領域である。一実施態様において、第二及び第三の抗原結合部分及びＦｃドメインは免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施態様において、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。さらにより特定の実施態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ_１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ_４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施態様において、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。別の実施態様において、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子及び活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することが可能な抗原結合部分から本質的になり、ここで抗原結合部分は、単鎖のＦａｂ分子又はクロスオーバーＦａｂ分子、特に免疫グロブリン重鎖の一方のＮ末端に必要に応じてペプチドリンカーを介して融合したクロスオーバーＦａｂ分子である。

代替的な実施態様において、第一及び第三の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端へ各々融合され、第二の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合されている。特定のこのような実施形態において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一第二及び第三の抗原結合部分、第一及び第二のサブユニットからなるＦｃドメイン、および任意で一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、ここで第二の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端で第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第一の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第一サブユニットのＮ末端へ融合され、第三の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第二サブユニットのＮ末端へ融合される。特定のそのような実施態様において、第一の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。場合によっては、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合されてもよい。

本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一部において、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖、及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は、任意でリンカーペプチドを介して互いに融合される。第一及び第二の抗原結合部分の立体配置に応じて、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ−末端にそのＣ−末端で融合されてもよく、又は第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端にそのＣ−末端で融合されてもよい。第一及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖の融合は非対応のＦａｂ重鎖と軽鎖の誤対合を更に減少させ、また、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一部の発現に必要なプラスミドの数を減少させる。

ある実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一のＦａｂ軽鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をペプチドリンカーと共有し、それが同様に第一のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ２（−ＣＨ４））、及び第二のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第二のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を更に含む。ある実施態様において、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。

幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一のＦａｂ軽鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をペプチドリンカーと共有し、それが同様に第一のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様に第二のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第二のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を更に含む。これらの実施態様によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第三のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、及び第三のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を更に含みうる。ある実施態様において、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。

ある実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一のＦａｂ軽鎖可変領域が第一のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖）、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ２（−ＣＨ４））、及び第二のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆａｂ重鎖可変領域がＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＬ）、及びＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を含む。ある実施態様において、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。

ある実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一のＦａｂ重鎖可変領域が第一のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖）、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ２（−ＣＨ４））、及び第二のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆａｂ軽鎖可変領域がＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＨ１）、及びＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を含む。ある実施態様において、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。

幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一のＦａｂ軽鎖可変領域が第一のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖）、それが同様に第二のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。他の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一のＦａｂ重鎖可変領域が第一のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖）、それが同様に第二のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＬ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。更に他の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第二のＦａｂ重鎖が第一のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様に第一のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖）、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。他の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第二のＦａｂ重鎖が第一のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様に第一のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖）、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。

これらの実施態様の幾つかにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆａｂ重鎖可変領域がＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ−ＣＬ）、及びＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を含む。その他のこれらの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆａｂ軽鎖可変領域がＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＨ１）、及びＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を含む。更に他のこれらの実施態様にて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆａｂ軽鎖可変領域がＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するペプチド（ＶＬ−ＣＨ１−ＶＬ−ＣＬ）、Ｆａｂ重鎖可変領域がＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＬ−ＶＬ−ＣＬ）、Ｆａｂ軽鎖ポリペプチドがＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ−ＶＬ−ＣＨ１）、又はＦａｂ軽鎖ポリペプチドがＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ−ＶＨ−ＣＬ）を更に含む。

これらの実施態様によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第三のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、及び第三のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を更に含みうる。ある実施態様において、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。

一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第二のＦａｂ軽鎖が第一のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様に第一のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（すなわち、軽鎖定常領域が重鎖定常領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ軽鎖）（ＶＬ−ＣＬ−ＶＬ−ＣＨ１）、第二のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、及び第一の重鎖可変領域が第一のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＬ）を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第二のＦａｂ軽鎖が第一のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様に第一のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（すなわち、軽鎖可変領域が重鎖可変領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ軽鎖）（ＶＬ−ＣＬ−ＶＨ−ＣＬ）、第二のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、及び第一の軽鎖可変領域が第一のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＨ１）を含む。これらの実施態様によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第三のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、及び第三のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を更に含みうる。ある実施態様において、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。

上記実施態様の何れかによれば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の構成要素（例えば、エフェクター部分、抗原結合部分、Ｆｃドメイン）は、直接または様々なリンカー、特に、一以上のアミノ酸を含み、典型的には、本明細書に記載されているか、又は当技術分野で知られている約２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを融合されていてもよい。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ，（ＳＧ_４）_ｎ，（Ｇ_４Ｓ）_ｎ又はＧ_４（ＳＧ_４）_ｎペプチドリンカーを含み、ｎは一般に、１と１０の間、典型的には２と４の数である。

Ｆｃドメイン
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含むポリペプチド鎖の対からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、二量体であり、その各サブユニットは、ＣＨ_２及びＣＨ_３ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。一実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一又は複数のＦｃドメインを含む。

本発明に係る一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧのＦｃドメインである。特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ_１のＦｃドメインである。別の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ_４のＦｃドメインである。より具体的な実施態様において、Ｆｃドメインは位置Ｓ２２８（Ｋａｂａｔ番号付け）でのアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ_４のＦｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ_４抗体のインビトロでのＦａｂの腕交換を減少させる (Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)を参照）。更なる特定の実施態様において、Ｆｃドメインはヒトである。ヒトＩｇＧ_１のＦｃドメインの例示的な配列は配列番号１４９に与えられる。

ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの修飾
本発明に係るＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なる抗原結合部分を含み、よってＦｃドメインの２つのサブユニットは典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及び続く二量体化は、２つのポリペプチドの複数の可能な組合せをもたらす。よって組換え発現でＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率と純度を向上させるために、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインへ所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することは有利であろう。

従って、具体的な実施態様において、本発明に係るＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインはＦｃドメインの第一及び第二のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。従って、一実施態様では、前記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。

特定の実施態様において、前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一つにおけるノブ修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方におけるホール修飾を含む、いわゆるノブ・イントゥ・ホール(knob into hole)修飾である。

ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、本方法は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、突起が空洞内に配置することができるように、第一のポリペプチドの界面での突起（「ノブ」）及び第二ポリペプチドの界面における対応する空洞（「穴」）を導入することを含む。突起は、第一のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。突起と同一又はより小さい大きさの相補的な空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置換することによって第二ポリペプチドの界面に作成される。

従って、特定の実施形態において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第一サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第二のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能である第一サブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、及びＦｃドメインの第二のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいｔ、アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより第一のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が配置可能である第二のサブユニット内のＣＨ３ドメイン内の空洞を生成する。
突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を改変することにより、例えば部位特異的突然変異誘発により、またはペプチド合成により作製することができる。

具体的な実施態様において、Ｆｃドメインの第一サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６でトレオニン残基がトリプトファン残基と置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第二サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置４０７でチロシン残基がバリン残基と置換される（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様において、Ｆｃドメインの第二サブユニットにおいて、さらに位置３６６でトレオニン残基がセリン残基と置換され（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８でロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）。

更なる実施態様において、Ｆｃドメインの第一サブユニットにおいて、位置３５４でセリン残基がシステイン残基と置換され（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第二サブユニットにおいて、位置３４９でチロシン残基がシステイン残基と置換される（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、更に二量体を安定化させる(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。

特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原に結合可能な抗原結合部分は、（「ノブ」修飾を含む）Ｆｃドメインの第一サブユニットへ（場合によっては標的細胞抗原へ結合可能な抗原結合部分を介して）融合される。理論に縛られることを望まないが、活性化Ｔ細胞抗原に結合しうる抗原結合部分の、Ｆｃドメインのノブを含むサブユニットへの融合は、活性化Ｔ細胞抗原に結合することができる二つの抗原結合部分を含む抗原結合分子の生成（２つのノブ含有ポリペプチドの立体的な衝突）を（さらに）最小限に抑えるであろう。

代わりの実施態様において、Ｆｃドメインの第一及び第二サブユニットの会合を促進する修飾は、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載されるように、静電的ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの界面にて、荷電したアミノ酸残基による一又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。

Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメインの修飾
Ｆｃドメインは、その標的組織における良好な蓄積及び好ましい組織−血液分配比率に寄与する長い血清半減期を含む好ましい薬物動態学的特性をＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に付与する。しかし、同時期に、好適な抗原保有細胞に対するよりもむしろＦｃ受容体を発現する細胞に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の所望されない標的化を導く。更に、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出につながる可能性があり、抗原結合部分の長い半減期とＴ細胞活性化特性が組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化及び全身投与の際に重篤な副作用をもたらす。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体を持つ）免疫細胞は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の潜在的破壊に起因してＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効性を低下させうる。

従って、特定の実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、天然型ＩｇＧ_１のＦｃドメインと比べた場合、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。そのような一実施態様において、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、天然型ＩｇＧ_１のＦｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ_１のＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性が５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満を示し、及び／又は天然型ＩｇＧ_１のＦｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ_１のＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一実施態様において、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）はＦｃ受容体に実質的に結合しない及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃγ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も特異的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様において、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌からなる群から選択される一又は複数である。特定の実施態様において、エフェクター機能とはＡＤＣＣである。一実施態様において、Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ_１のＦｃドメインと比較した場合、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に類似の結合親和性を示す。ＦｃＲｎに対する実質的に類似の結合親和性は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）が、天然型ＩｇＧ_１のＦｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ_１のＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の、ＦｃＲｎに対しての約７０％を超える、特に約８０％を超える、より具体的には約９０％を超える結合親和性を示すときに達成される。

ある実施形態では、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を低下させ及び／又はエフェクター機能を低下させるように操作される。特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインはＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる一以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、同一の一以上のアミノ酸置換がＦｃドメインの２つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様において、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を減少させる。一実施態様において、アミノ酸置換は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍減少させる。Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を減少させる複数のアミノ酸変異が存在する実施態様において、これらのアミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は更に少なくとも５０倍減少させ得る。一実施態様において、操作されたＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、非操作型Ｆｃドメインを含んでなるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と比較した場合、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満、具体的には１０％未満、より具体的には５％未満の結合親和性を示す。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃγ受容体である。幾つかの実施態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。幾つかの実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も特異的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体の各々に対する結合が減少する。幾つかの実施態様において、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性もまた減少する。一実施態様において、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎへの実質的に類似な結合、すなわち、前記受容体への免疫グロブリンの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含んでなるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）が、ＦｃＲｎに対し、非操作型形態のＦｃドメイン（又は前記非操作型形態のＦｃドメインを含んでなるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の約７０％より大きな結合親和性を呈する場合に達成される。Ｆｃドメイン又は前記Ｆｃドメインを含む本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約８０％を越える、又は更に約９０％を越えるそのような活性を示す場合がある。ある実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して低下したエフェクター機能を有するように操作される。エフェクター機能の増加は、限定されないが、以下の一つ又は複数を含み得る：抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシスの増加、標的結合抗体の架橋の増加、樹状細胞成熟の増加、又はＴ細胞プライミングの増加。一実施態様において、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下、及びサイトカイン分泌の低下から選択される一又は複数である。特定の実施態様において、エフェクター機能の低下とはＡＤＣＣの低下である。一実施態様において、ＡＤＣＣの低下は、非操作型Ｆｃドメイン（又は非操作型Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。

一実施態様において、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９からなる群から選択される位置でアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９からなる群から選択される位置でアミノ酸置換を含む。幾つかの実施態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。そのような一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ_１のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ_１のＦｃドメインである。一実施態様において、Ｆｃドメインは位置Ｐ３２９でのアミノ酸置換を含む。より特異的な実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９でのアミノ酸置換、及びＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む。より特異的な実施態様では、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む。更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインはアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ」）を含む。そのような一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ_１のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ_１のＦｃドメインである。ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３に記載され、その全体が参照により本明細書に援用されるように、アミノ酸置換の「Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ」の組み合わせは、ＩｇＧ_１のＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほとんど完全に消滅させる。ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３はまた、このような変異体Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合またはエフェクター機能などその特性を決定するための方法を記載する。

ＩｇＧ_４抗体は、ＩｇＧ_１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及びエフェクター機能の減少を呈示する。従って、いくつかの実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ_４のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_４Ｆｃドメインである。一実施態様において、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又はそのエフェクター機能を更に低下させるために、一実施態様において、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインは、位置Ｌ２３５でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。その他の実施態様において、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインは、位置Ｐ２３９でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施態様において、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む。このようなＩｇＧ_４のＦｃドメイン変異体とそのＦｃγ受容体結合特性はＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

特定の実施態様において、天然型ＩｇＧ_１Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能を低下を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ及び必要に応じてＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ，Ｌ２３５Ｅ及び必要に応じてＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ_４Ｆｃドメインである。

ある実施態様において、ＦｃドメインのＮ−グリコシル化は除かれている。そのような一つの実施態様において、Ｆｃドメインは位置Ｎ２９７でのアミノ酸変異、とりわけアラニンでアスパラギンを置換するアミノ酸置換（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸でアスパラギンを置換するアミノ酸置換（Ｎ２９７Ｄ）を含む。

本明細書中及びＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３に記述されたＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の減少を伴うＦｃドメインはまた、一以上のＦｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の置換を持つものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５と２９７のアラニンへの置換を持ついわゆる「ＮＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、二以上のアミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７で置換を持つＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１）。

変異型Ｆｃドメインは、当技術分野で知られている遺伝子的又は化学的方法を用いて、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法は、コードするＤＮＡ配列、ＰＣＲ、遺伝子合成等の部位特異的変異誘発を含むことができる。正しいヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって検証することができる。

Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）など標準的な計測機器を使用してＥＬＩＳＡによって又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって容易に決定することができ、そのようなＦｃ受容体は、組換え発現によって得ることができる。適切なこのような結合アッセイが本明細書に記載されている。代わりに、ＦｃドメインまたはＦｃ受容体に対するＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞などを使用して評価することができる。

Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイが本明細書に記載されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号：Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); U.S. Patent No. 5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記述されている。あるいは、非放射性アッセイ法（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ^ＴＭ非放射性細胞毒性アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ(Promega, Madison, WI)を参照）を用いることができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示される動物モデルにおいてインビボで評価することができる。

幾つかの実施態様において、補体成分に対する、具体的にはＣ１ｑに対するＦｃドメインの結合が低下する。従って、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように操作される幾つかの実施態様において、前記低下たエフェクター機能は低下したＣＤＣを含む。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がＣ１ｑに結合することができ、それ故にＣＤＣ活性を有するかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)；及びCragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004))。

抗原結合部分
本発明の抗原結合分子は二重特異性であり、すなわちそれは、２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することが可能な少なくとも２つの結合部分を含む。本発明によれば、抗原結合部分はＦａｂ分子である（すなわち、各々が可変および定常領域を含む重鎖及び軽鎖からなる抗原結合ドメイン）。一実施態様において、前記Ｆａｂ分子はヒトである。別の実施態様において、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。また別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常領域を含む。

抗原結合部分の少なくとも一つは、単鎖のＦａｂ分子とクロスオーバーＦａｂ分子である。このような修飾は、異なるＦａｂ分子からの重鎖および軽鎖の誤対合を防ぎ、それによって組換え生産における本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率および純度を向上させることができる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に有用な特定の単鎖Ｆａｂ分子において、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、ペプチドリンカーによりＦａｂ重鎖のＮ末端に連結されている。機能的抗原結合部分を形成するために、ペプチドリンカーはＦａｂ重鎖および軽鎖の配置を可能とする。

Ｆａｂ重及び軽鎖を連結するための適切なペプチドリンカーとしては、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_６−ＧＧ（配列番号１５２）又は（ＳＧ_３）_２−（ＳＥＧ_３）_４−（ＳＧ_３）−ＳＧ（配列番号１５３）を含む。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子において、Ｆａｂ軽鎖の定常領域とＦａｂ重鎖は交換される。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に有用な別のクロスオーバーＦａｂ分子において、Ｆａｂ軽鎖の可変領域とＦａｂ重鎖は交換される。

本発明に係る特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、及び活性化Ｔ細胞抗原に同時に結合することが可能である。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原及び活性化Ｔ細胞抗原に同時に結合することによって、Ｔ細胞および標的細胞を架橋することができる。さらにより特定の実施態様において、このような同時結合は標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解をもたらす。一実施態様において、このような同時結合はＴ細胞の活性化をもたらす。他の実施態様において、そのような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現の群から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答をもたらす。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の活性化Ｔ細胞抗原への結合は、標的細胞抗原への同時結合を伴わず、Ｔ細胞活性化をもたらさない。

一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞へのＴ細胞の細胞傷害活性を再指向し得る。特定の実施態様において、前記再指向は、標的細胞及び／又はＴ細胞の特異性によって媒介されるＭＨＣ−ペプチド抗原提示とは無関係である。

特に、本発明の実施態様の何れかに記載のＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞はＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋Ｔ細胞、特にＣＤ８^＋Ｔ細胞である。

活性化Ｔ細胞抗原結合部分
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、活性化Ｔ細胞抗原（本明細書では「活性化Ｔ細胞抗原結合部分」と称す）に結合可能な少なくとも一の抗原結合部分を含む。特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合可能な一以下の抗原結合部分を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は活性化Ｔ細胞抗原への一価結合を提供する。活性化Ｔ細胞抗原結合部分は通常のＦａｂ分子又は修飾型Ｆａｂ分子の何れか、すなわち単鎖又はクロスオーバーＦａｂ分子の何れかである。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる標的細胞抗原に特異的に結合可能な一以上の抗原結合部分が存在する一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に特異的に結合可能な抗原結合部分は好ましくは修飾型Ｆａｂ分子である。

特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３、特にヒトＣＤ３（配列番号２６５）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号２６６）、最も具体的にはヒトＣＤ３である。特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分はヒト又はカニクイザルＣＤ３に対して交差反応性である（すなわち特異的に結合する）。幾つかの実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３のイプシロンサブユニットである。

一実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分はＣＤ３のエピトープの結合についてモノクローナル抗体Ｈ２Ｃ（ＰＣＴ公報ＷＯ２００８／１１９５６７に記載）と競合可能である。別の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分はＣＤ３のエピトープの結合についてモノクローナル抗体Ｖ９(Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992)及び米国特許第６，０５４，２９７号に記載）と競合可能である。更に別の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分はＣＤ３のエピトープの結合についてモノクローナル抗体ＦＮ１８(Eur J Immunol 19, 981-984 (1986)に記載）と競合可能である。特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分はＣＤ３のエピトープの結合についてモノクローナル抗体ＳＰ３４(Pessano et al., EMBO J 4, 337-340 (1985)に記載）と競合可能である。一実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分はモノクローナル抗体ＳＰ３４と同じＣＤ３のエピトープに結合する。一実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号１６３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６７の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号１６９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号１７７に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。

特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２４９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２５１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２５３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２５７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。一実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２４９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２５１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２５３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２５７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６１の軽鎖ＣＤＲ３を含む抗原結合部分とＣＤ３のエピトープへの結合を競合することができる。一実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２４９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２５１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２５３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２５７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６１の軽鎖ＣＤＲ３を含む抗原結合部分と同じＣＤ３のエピトープへ結合する。更なる実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２５５に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号２６３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２５５の重鎖可変領域配列及び配列番号２６３の軽鎖可変領域配列を含む抗原結合部分とＣＤ３のエピトープへの結合を競合することができる。一実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２５５の重鎖可変領域配列及び配列番号２６３の軽鎖可変領域配列を含む抗原結合部分と同じＣＤ３のエピトープへ結合を競合する。別の実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２５５の重鎖可変領域配列のヒト化バージョン、及び配列番号２６３の軽鎖可変領域配列のヒト化バージョンを含む。一実施態様において、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２４９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２５１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２５３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２５７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６１の軽鎖ＣＤＲ３、及びヒト重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク配列を含む。

標的細胞抗原結合部分
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞の抗原（本明細書では「標的細胞抗原結合部分」と称す）に結合可能な少なくとも一の抗原結合部分を含む。ある実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に結合することができる２つの抗原結合部分を含む。特定のそのような実施態様において、これらの抗原結合部分の各々は同じ抗原決定基に特異的に結合する。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に結合することができる２つ以下の抗原結合部分を含む。

標的細胞抗原結合部分は一般に、特定の抗原決定基に結合し、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を標的部位へ、例えば抗原決定基を持つ特定の型の腫瘍細胞へと指向することができるＦａｂ分子である。

ある実施態様において、標的細胞抗原結合部分は、腫瘍細胞又はウイルス感染細胞上に提示された抗原など、病状と関連した抗原を指向する。適切な抗原は、例えば、細胞表面抗原であるが、細胞表面受容体に限定されるものではない。特定の実施態様において、抗原はヒト抗原である。特定の実施態様において、腫瘍細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群から選択される。

特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的である少なくとも一の抗原結合部分を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＭＣＳＰのエピトープに対する結合においてモノクローナル抗体ＬＣ００７（配列番号２３９及び２４７、及び全体が参照により本明細書に組み入れられる欧州特許出願ＥＰ１１１７８３９３．２を参照）と競合可能な少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。一実施態様において、ＭＣＳＰに特異的である抗原結合部分は、配列番号６９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号７１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号７３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号７７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様において、ＭＣＳＰに特異的である抗原結合部分は、配列番号７５に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号８３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＭＣＳＰのエピトープに対する結合においてモノクローナル抗体Ｍ４−３ＭＬ２（配列番号２３９及び２４７、及び全体が参照により本明細書に組み入れられる欧州特許出願ＥＰ１１１７８３９３．２を参照）と競合可能な少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。一実施態様において、ＭＣＳＰに特異的な抗原結合部分は、モノクローナル抗体Ｍ４−３ＭＬ２と同じＭＣＳＰのエピトープに結合する。一実施態様において、ＭＣＳＰに特異的である抗原結合部分は、配列番号２３３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２３７の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２４１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様において、ＭＣＳＰに特異的である抗原結合部分は、配列番号２３９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、特に約９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号２４７に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、特に約９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、ＭＣＳＰに特異的な抗原結合部分は、モノクローナル抗体Ｍ４−３ＭＬ２の親和性成熟バージョンの重鎖および軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様において、ＭＣＳＰに特異的な抗原結合部分は、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ又は七つ、特に二つ、三つ、四つ、五つのアミノ酸置換を有する配列番号２３９の重鎖可変領域配列；及び一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ又は七つ、特に二つ、三つ、四つ、五つのアミノ酸置換を有する配列番号２４７の軽鎖可変領域配列を含む。ＭＣＳＰ、特にヒトＭＣＳＰへの結合が保存されていることを条件として、可変領域配列内の任意のアミノ酸残基は、ＣＤＲ領域内のアミノ酸残基を含む異なるアミノ酸で置換されていてもよい。好ましい変異体は、無置換の可変領域配列を含む抗原結合部分の結合親和性と少なくとも同等（または強い）ＭＣＳＰに対する結合親和性を有するものである。

一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１のポリペプチド配列、配列番号３のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。更なる実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号７のポリペプチド配列、配列番号９のポリペプチド配列、及び配列番号１１のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１３のポリペプチド配列、配列番号１５のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。更に別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１７のポリペプチド配列、配列番号１９のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２１のポリペプチド配列、配列番号２３のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２５のポリペプチド配列、配列番号２７のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２９のポリペプチド配列、配列番号３１のポリペプチド配列、配列番号３３のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２９のポリペプチド配列、配列番号３のポリペプチド配列、配列番号３３のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３５のポリペプチド配列、配列番号３のポリペプチド配列、配列番号３７のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３９のポリペプチド配列、配列番号３のポリペプチド配列、配列番号４１のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。更に別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２９のポリペプチド配列、配列番号３のポリペプチド配列、配列番号５のポリペプチド配列、及び配列番号１７９のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５のポリペプチド配列、配列番号２９のポリペプチド配列、配列番号３３のポリペプチド配列、及び配列番号１８１のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５のポリペプチド配列、配列番号２３のポリペプチド配列、配列番号１８３のポリペプチド配列、及び配列番号１８５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５のポリペプチド配列、配列番号２３のポリペプチド配列、配列番号１８３のポリペプチド配列、及び配列番号１８７のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３３のポリペプチド配列、配列番号１８９のポリペプチド配列、配列番号１９１のポリペプチド配列、及び配列番号１９３のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１８３のポリペプチド配列、配列番号１８９のポリペプチド配列、配列番号１９３のポリペプチド配列、及び配列番号１９５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１８９のポリペプチド配列、配列番号１９３のポリペプチド配列、配列番号１９９のポリペプチド配列、及び配列番号２０１のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５のポリペプチド配列、配列番号２３のポリペプチド配列、配列番号２１５のポリペプチド配列、及び配列番号２１７のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５のポリペプチド配列、配列番号２３のポリペプチド配列、配列番号２１５のポリペプチド配列、及び配列番号２１９のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号７０，配列番号７２，配列番号７４，配列番号７６，配列番号７８，配列番号８０，配列番号８２，配列番号８４，配列番号２３４，配列番号２３６，配列番号２３８，配列番号２４０，配列番号２４２，配列番号２４４，配列番号２４６，配列番号２４８，配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番号１０，配列番号１２，配列番号１４，配列番号１６，配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番号３６，配列番号３８，配列番号４０，配列番号４２，配列番号１８０，配列番号１８２，配列番号１８４，配列番号１８６，配列番号１８８，配列番号１９０，配列番号１９２，配列番号１９４，配列番号１９６，配列番号２００，配列番号２０２，配列番号２１６，配列番号２１８及び配列番号２２０の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。

一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的である少なくとも一の抗原結合部分を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＥＧＦＲのエピトープに対する結合をモノクローナル抗体ＧＡ２０１と競合することができる、少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。例えば、参照によりその全体が援用されるＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８２５１５を参照。一実施態様において、ＥＧＦＲに特異的である抗原結合部分は、配列番号８５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号８９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号９３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様において、ＥＧＦＲに特異的である抗原結合部分は、配列番号９１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号９９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。

更に別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号４３のポリペプチド配列、配列番号４５のポリペプチド配列、及び配列番号４７のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。更なる実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号４９のポリペプチド配列、配列番号５１のポリペプチド配列、及び配列番号１１のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。更に別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５３のポリペプチド配列、配列番号４５のポリペプチド配列、及び配列番号４７のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。

特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号８６，配列番号８８，配列番号９０，配列番号９２，配列番号９４，配列番号９６，配列番号９８，配列番号１００，配列番号４４，配列番号４６，配列番号４８，配列番号５０，配列番号５２，配列番号５４及び配列番号１２の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。

一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的である少なくとも一の抗原結合部分を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＦＡＰのエピトープに対する結合をモノクローナル抗体３Ｆ２と競合することができる、少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。例えば、参照によりその全体が援用されるＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０２０００６を参照。一実施態様において、ＦＡＰに特異的である抗原結合部分は、配列番号１０１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０５の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様において、ＦＡＰに特異的である抗原結合部分は、配列番号１０７に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号１１５に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
更に別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５５のポリペプチド配列、配列番号５１のポリペプチド配列、及び配列番号１１のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。更なる実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５７のポリペプチド配列、配列番号５９のポリペプチド配列、及び配列番号６１のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。

特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１０２，配列番号１０４，配列番号１０６，配列番号１０８，配列番号１１０，配列番号１１２，配列番号１１４，配列番号１１６，配列番号５６，配列番号５８，配列番号６０，配列番号６２，配列番号５２及び配列番号１２の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。

特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的である少なくとも一の抗原結合部分を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＥＡのエピトープに対する結合をモノクローナル抗体ＢＷ４３１／２６（ＥＰ１６０８９７、及びBosslet et al., Int J Cancer 36, 75-84 (1985)に記載）と競合可能な少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＥＡのエピトープに対する結合をモノクローナル抗体ＣＨ１Ａ１Ａ（配列番号１２３及び１３１を参照）と競合することができる、少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。参照によりその全体が援用されるＰＣＴ特許公開番号ＷＯ２０１１／０２３７８７を参照。一実施態様において、ＣＥＡに特異的な抗原結合部分は、モノクローナル抗体ＣＨ１Ａ１Ａと同じＣＥＡのエピトープに結合する。一実施態様において、ＣＥＡに特異的である抗原結合部分は、配列番号１１７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１２５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２７の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２９の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様において、ＣＥＡに特異的である抗原結合部分は、配列番号１２３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、特に約９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号１３１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、特に約９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、ＣＥＡに特異的な抗原結合部分は、モノクローナル抗体ＣＨ１Ａ１Ａの親和性成熟バージョンの重鎖および軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様において、ＣＥＡに特異的な抗原結合部分は、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ又は七つ、特に二つ、三つ、四つ、五つのアミノ酸置換を有する配列番号１２３の重鎖可変領域配列；及び一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ又は七つ、特に二つ、三つ、四つ、五つのアミノ酸置換を有する配列番号１３１の軽鎖可変領域配列を含む。ＣＥＡ、特にヒトＣＥＡへの結合が保存されていることを条件として、可変領域配列内の任意のアミノ酸残基は、ＣＤＲ領域内のアミノ酸残基を含む異なるアミノ酸で置換されていてもよい。好ましい変異体は、無置換の可変領域配列を含む抗原結合部分の結合親和性と少なくとも同等（または強い）ＣＥＡに対する結合親和性を有するものである。

一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号６３のポリペプチド配列、配列番号６５のポリペプチド配列、配列番号６７のポリペプチド配列、及び配列番号３３のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５のポリペプチド配列、配列番号６７のポリペプチド配列、配列番号１８３のポリペプチド配列、及び配列番号１９７のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１８３のポリペプチド配列、配列番号２０３のポリペプチド配列、配列番号２０５のポリペプチド配列、及び配列番号２０７のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１８３のポリペプチド配列、配列番号２０９のポリペプチド配列、配列番号２１１のポリペプチド配列、及び配列番号２１３のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。

特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１１８，配列番号１２０，配列番号１２２，配列番号１２４，配列番号１２６，配列番号１２８，配列番号１３０，配列番号１３２，配列番号６４，配列番号６６，配列番号６８，配列番号３４，配列番号１８４，配列番号１９８，配列番号２０４，配列番号２０６，配列番号２０８，配列番号２１０，配列番号２１２及び配列番号２１４の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。

一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３３に特異的である少なくとも一の抗原結合部分を含む。一実施態様において、ＣＤ３３に特異的である抗原結合部分は、配列番号１３３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１３７の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様において、ＣＤ３３に特異的である抗原結合部分は、配列番号１３９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号１４７に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。

一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３３のポリペプチド配列、配列番号２１３のポリペプチド配列、配列番号２２１のポリペプチド配列、及び配列番号２２３のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３３のポリペプチド配列、配列番号２２１のポリペプチド配列、配列番号２２３のポリペプチド配列、及び配列番号２２５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。

特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１３４，配列番号１３６，配列番号１３８，配列番号１４０，配列番号１４２，配列番号１４４，配列番号１４６，配列番号１４８，配列番号３４，配列番号２１４，配列番号２２２，配列番号２２４及び配列番号２２６の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。

ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２及び２６４に明記される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるものを、その機能性断片又は変異体を含み、含む。

本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は別の手段を介して会合することができ、機能性Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を形成しうる。例えば、抗原結合部分の軽鎖部分は、抗原結合部分、Ｆｃドメインサブユニット及び任意で別の抗原結合部分（の一部）の重鎖部分を含んでなるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分に由来する別々のポリヌクレオチドによりコードされ得る。共発現されたとき、重鎖ポリペプチドが軽鎖ポリペプチドと会合し、抗原結合部分を形成する。別の実施例では、２つのＦｃドメインサブユニットの一方、及び場合によっては一以上の抗原結合部分（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方、及び場合によっては抗原結合部分（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分に由来する別々のポリヌクレオチドによりコードされ得る。共発現されると、Ｆｃドメインのサブユニットが会合しＦｃドメインを形成する。

ある実施態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一及び第二の抗原結合部分、及び２つのサブユニットからなるＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の断片をコードし、ここで第一の抗原結合部分は、一本鎖のＦａｂ分子であることを特徴とする。一実施態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一の抗原結合部分、及びＦｃドメインのサブユニットをコードしている。より具体的な実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、単鎖Ｆａｂ分子がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。別の実施態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第二の抗原結合部分の重鎖、及びＦｃドメインのサブユニットをコードしている。更に具体的な実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に別の実施態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一の抗原結合部分、第二の抗原結合部分の重鎖、及びＦｃドメインのサブユニットをコードしている。より特定の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、単鎖Ｆａｂ分子がＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。

ある実施態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一及び第二の抗原結合部分、及び２つのサブユニットからなるＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の断片をコードし、ここで第一の抗原結合部分はクロスオーバーＦａｂ分子であることを特徴とする。一実施態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一の抗原結合部分の重鎖、及びＦｃドメインのサブユニットをコードしている。より特定の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ軽鎖可変領域がＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。別の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖可変領域がＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。別の実施態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第二の抗原結合部分の重鎖、及びＦｃドメインのサブユニットをコードしている。更に具体的な実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に別の実施態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一の抗原結合部分の重鎖、第二の抗原結合部分の重鎖、及びＦｃドメインのサブユニットをコードしている。より特定の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ軽鎖可変領域がＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。別の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖可変領域がＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に別の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖がＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に別の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖がＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。

更なる実施態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第三の抗原結合部分の重鎖、及びＦｃドメインのサブユニットをコードしている。更に具体的な実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。

更なる実施態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合部分の軽鎖をコードする。幾つかの実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ軽鎖可変領域がＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。他の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖可変領域がＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に他の実施態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一の抗原結合部分の軽鎖、第二の抗原結合部分の軽鎖をコードしている。より特定の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖可変領域がＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ軽鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。別の特定の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ軽鎖がＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に別の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ軽鎖可変領域がＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ軽鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に別の特定の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ軽鎖がＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。

別の実施態様において、本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を指向し、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号７５、８３、９１、９９、１０７、１１５、１２３、１３１、１３９、１４７、１６９、１７７、２３９、２４７、２５５及び２６３に示される可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様において、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを指向し、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９及び２３１に示されるポリペプチド配列をコードする配列を含む。別の実施態様において、本発明は本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを更に指向し、ここで該ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２又は２６４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。別の実施態様において、本発明は本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで該ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２又は２６４に示される核酸配列を含む。別の実施態様において、本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を指向し、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号７５、８３、９１、９９、１０７、１１５、１２３、１３１、１３９、１４７、１６９、１７７、２３９、２４７、２５５及び２６３のアミノ酸配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％，又は９９％同一である可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様において、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを指向し、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９又は２３１のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％，又は９９％同一であるポリペプチド配列をコードする配列を含む。本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を包含し、ここで該ポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を有する配列番号７５、８３、９１、９９、１０７、１１５、１２３、１３１、１３９、１４７、１６９、１７７、２３９、２４７、２５５又は２６３の可変領域配列をコードする配列を含む。本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを包含し、ここで該ポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を有する配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９又は２３１のポリペプチド配列をコードする配列を含む。
ある実施態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよい。

組換え方法
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え生産のために、例えば上述したように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法は、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボでの組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989);及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部でもよく、核酸断片でありうる。発現ベクターは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコーディング領域）がプロモーター及び／又は他の転写又は翻訳コントロール要素と作動可能に関連してクローン化される発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在するならばそれはコーディング領域として考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム、結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコーディング領域の一部ではない。二以上のコーディング領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば単一ベクター上に、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば別個の（異なる）ベクター上に存在してもよい。更に、何れかのベクターは単一のコーディング領域を有し得、又は二以上のコーディング領域を有し得、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解切断により最終タンパク質へ翻訳後的又は共翻訳的に分けられる一又は複数のポリタンパク質をコードしうる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）、又は変異体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合又は非融合された異種性コーディング領域をコードしうる。異種性コーディング領域は、限定するものではないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメインを含む。作動的関係とは、遺伝子産物の発現を制御性配列の影響又はコントロール下に置かれるように、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコーディング領域が一又は複数の制御性配列と関連する場合である。２つのＤＮＡ断片（例えばポリペプチドコーディング領域及びそれと関連するプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらし、２つのＤＮＡ断片間の連鎖の性質が遺伝子産物の発現を指示する発現制御性配列の能力を干渉しないか又は転写されるＤＮＡ鋳型の能力を干渉しない場合に「作動的に関連」する。このように、プロモーターがその核酸の転写に影響できる場合に、プロモーター領域はポリペプチドをコードする核酸と作動的に関連するだろう。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターでありうる。プロモーターに加えて、他の転写コントロール要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を支持するためにポリヌクレオチドと作動的に関連していてもよい。好適なプロモーター及び他の転写コントロール領域がここに開示される。様々な転写コントロール領域が当業者に知られている。これらは、限定するものではないが、脊椎動物細胞において機能する転写コントロール領域、例えば限定するものではないがサイトメガロウイルスからのプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、イントロン−Ａと併せて前初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）を含む。他の転写コントロール領域は、脊椎動物遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビン、並びに真核生物細胞における遺伝子発現をコントロールできる他の配列を含む。更なる好適な転写コントロール領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えばプロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、様々な転写コントロール要素が当業者に知られている。これらは、限定するものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、及びウィルス系由来の要素（特に、内部リボソーム進入部位、又はＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列としても知られる）を含む。発現カセットはまた、他の特性、例えば複製起源、及び／又は染色体組込み要素、例えばレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）を含みうる。

本発明のポリヌクレオチド及び核酸コーディング領域は、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコーディング領域を伴い得る。例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする核酸の上流に配置されうる。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは一旦粗面小胞体を横切って成長するタンパク質鎖の排出が開始すると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドはポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを一般的に有し、それはポリペプチドの分泌又は「成熟」形態を生産するために翻訳ポリペプチドから切断されることを認識しているだろう。ある実施態様では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用され、又はその配列の機能的誘導体であって、それに作動的に関連したポリペプチドの分泌を指示する能力を保持した機能的誘導体が使用される。あるいは、異種性哺乳類シグナルペプチド、又はその機能性誘導体が使用されうる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列と置換されうる。分泌シグナルペプチドの例示的なアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を、配列番号１５４〜１６２に示す。

後の精製を容易にし又はＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の標識化における補助のために使用されうる短タンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチドの中又は末端に含まれうる。

更なる実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞が提供される。ある実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、単独で又は組合せにおいて、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関して本明細書に記載されている特徴の何れかを組み込みうる。一つのそのような実施態様において、宿主細胞は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされる）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片を生成するよう操作できる何れかの種類の細胞システムを指す。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の複製及び発現の補助に好適な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入され得、大量のベクター含有細胞が、臨床利用のための十分な量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得るため大規模発酵槽での播種により増殖されうる。好適な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、ポリペプチドは、特に糖鎖付加が必要でない場合、細菌において生産されうる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^ＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞(Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、また、トランスジェニック生物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞を含む。一実施態様では、宿主細胞は真核生物細胞、好ましくは哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。

これらのシステムにおいて外来遺伝子を発現させるための標準的な技術は当分野で知られている。抗体等の抗原結合ドメインの重又は軽鎖のどちらかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重及び軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖の他方をまた発現するように操作されうる。

一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を産生する方法が提供され、該方法は、本明細書に与えられるように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）からＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収することを含む。

Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の構成要素は一般にお互いに融合される。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その成分が、お互いに直接的に又はリンカー配列を介して互いに間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成および長さは、当該技術分野において周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験され得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の別々の構成要素間のリンカー配列の例は、本明細書に与えられる配列中に見いだされる。さらなる配列はまた、所望であれば、融合体の個々の成分を分離するための切断部位、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を組み込むことが含まれていてもよい。

ある実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一又は複数の抗原結合部分は、抗原決定基に結合できる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域が、天然に又は非天然に生じる抗体及びその断片の一部を形成し、及びそれに由来しうる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生産する方法は、当分野でよく知られている（例えばHarlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照）。非天然に生じる抗体は、固相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組換え的に生産されるか（例えば米国特許第４，１８６，５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含んでなるコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５，９６９，１０８号を参照）によって得られうる。

何れかの動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域が、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子で用いることができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものでありうる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がヒトでの使用を意図する場合、抗体の定常領域はヒトに由来するキメラ形態の抗体が使用され得る。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体がまた、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，５６５，３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、限定するものではないが（ａ）非ヒト（例えばドナー抗体）ＣＤＲの、ヒト（例えば、レシピエント抗体）フレームワーク及び定常領域への、決定的なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保つのに重要なもの）の有無におけるグラフティング、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に決定的な残基）のみの、ヒトフレームワーク及び定常領域へのグラフティング、又は（ｃ）全非ヒト可変ドメインの移植（ただし、表面残基の置換によりヒト様セクションでそれらを「覆う」）を含む。ヒト化抗体およびそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 米国特許第５，５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号及び第７，０８７，４０９号; Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 31(3):169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）； Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）； Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって生成されるヒトモノクローナル抗体の部分を形成し、それから得られることができる（例えばMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生産するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製されうる（例えばLonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成されうる（例えば、Hoogenboom等 in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien等， ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); 及びMcCafferty等, Nature 348, 552-554; Clackson等, Nature 352, 624-628 (1991)を参照）。ファージは典型的には、抗体断片を短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として又はＦａｂ断片としてディスプレイする。

ある実施態様では、本発明に有用な抗原結合部分は、例えば米国特許出願公開番号２００４／０１３２０６６（この全内容を出典明記によってここに援用する）に開示される方法に従い、増強された結合親和性を有するように操作される。特定の抗原決定基に結合する本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００システムで解析される）(Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000))および伝統的な結合アッセイ(Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002))のいずれかによって測定することができる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメイン、例えばＣＤ３への結合についてＶ９抗体と競合する抗体を同定するために使用されうる。ある実施態様では、このような競合する抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ（例えば線状又はコンホメーションエピトープ）に結合する抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。典型的な競合アッセイにおいて、固定化抗原（例えばＣＤ３）は、抗原（例えばＶ９抗体）に結合する第一の標識された抗体、及び抗原へ結合について第一の抗体と競合するその能力について試験されている第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。もし、固定化抗原に結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、抗原への結合に対して、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。

本明細書で記載のように調製されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等によって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性等の要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用されうる。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、実施例に本質的に記載されるようにＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を単離するために使用されうる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含む様々なよく知られた分析方法の何れかによって決定されうる。例えば、実施例に記載されるように発現される重鎖融合タンパク質は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで実証されるようにインタクトで、正しく会合していると示された（例えば図２を参照）。３つのバンドはおよそ分子量２５０００、分子量５００００及び分子量７５０００で分離され、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の軽鎖、重鎖及び重鎖／軽鎖融合タンパク質の予測された分子量に対応する。

アッセイ
本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、または特徴づけることができる。

親和性アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の親和性は、実施例に記載の方法に従って、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）のような標準的な器具類を使用して決定することができ、そしてそのような受容体又は標的タンパク質は、組換え発現によって得ることができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合を、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価することができる。結合親和性を測定するための具体的な実例であり、例示的な実施態様は、以下及び下記実施例に記載されている。

一実施態様によれば、Ｋ_Ｄは２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥヘルスケア）を使用して表面プラズモン共鳴によって測定される。

Ｆｃ部分とＦｃ受容体との相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグ付組換えＦｃ受容体が、ＣＭ５チップ上に固定化された抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社）によって捕捉され、二重特異性構築物は分析物として使用される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＧＥヘルスケア）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で４０μｇ／ｍｌに希釈し、結合したタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ６５００になるように５μｌ／分の流速で注入した。リガンドの注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。続いて、Ｆｃ受容体は６０秒間４又は１０ｎＭで捕捉される。動力学測定のために、二重特異性構築物の４倍段階希釈（５００ｎＭから４０００ｎＭ）が、ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥヘルスケア、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で２５℃で約３０μｌ／分の流量で１２０秒間注入される。

標的抗原に対する親和性を決定するため、二重特異性構築物は、抗ペンタＨｉｓ抗体について記載したように活性化ＣＭ５センサーチップ表面に固定化されている抗ヒトＦａｂ特異的抗体（ＧＥヘルスケア）に捕捉される。結合したタンパク質の最終的な量は約１２０００ＲＵである。二重特異性構築物は３００ｎＭで９０秒間で捕捉される。標的抗原は、３０μｌの／分の流速で２５０〜１０００ｎＭの濃度範囲で１８０秒間フローセルを通過する。解離は１８０秒間モニターされる。

バルクの屈折率の差は、参照フローセル上で得られた応答を差し引くことにより補正される。定常状態応答を用いて、ラングミュア結合等温線の非線形曲線フィッティングによって解離定数ＫＤを導出した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) （ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）エバリュエーションソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）はｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として算出される。例えば、Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照。

活性のアッセイ
実施例に記載のように、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生物学的活性は、様々なアッセイによって測定することができる。生物学的活性は、例えばＴ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞におけるシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞における活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍退縮および／または生存の改善の誘導を含み得る。

組成物、製剤、及び投与の経路
更なる態様において、本発明は、例えば下記の治療方法の何れかにおける使用のための、本明細書に提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れかを含んでなる薬学的組成物を提供する。一実施態様において、薬学的組成物は本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的に許容される担体を含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れか及び少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを含む。

更に提供されるのは、インビトロでの投与に適した形態の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法であり、該方法は（ａ）本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得て、（ｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を少なくとも一の薬学的に許容される担体と処方し、それによりＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がインビボでの投与用に処方される。

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体中に溶解又は分散された治療的に有効な量の一又は複数のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的に又は薬理学的許容可能な」なる語句は、用いられる投与量及び濃度ではレシピエントに一般的に非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に適宜投与された時に、有害な、アレルギー性の又は他の望まない応答をもたらさない分子実体及び組成物を指す。少なくとも一つのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び場合によっては更なる活性成分を含有する薬学的組成物の調製は、本開示に照らして当業者によく知られており、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990に例示され、出典明記によってここに援用する。更に、動物（例えばヒト）投与では、調製物が、生物学的基準のＦＤＡオフィス(FDA Office of Biological Standards)又は他の国において対応する当局によって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度標準を満たすべきであることが理解されるだろう。好ましい組成物は凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、当業者に知られているありとあらゆる溶剤、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、同様な物質及びその組合せを含む（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照（出典明記によってここに援用する））。何れかの一般的な担体が活性成分と不適合である場合を除き、治療的又は薬学的組成物におけるその使用が意図される。

組成物は、それが固体、液体又はエアロゾル形態で投与されるか、またそれが注射などの投与経路のために無菌である必要があるかに依存して、異なるタイプの担体を含みうる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（及び何れかの追加の治療剤）は、当業者に知られているように、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、脾臓内に、腎内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍内に、眼球内に、経口で、局所的に、局在的に、吸入によって（例えば、エアロゾル吸入）、注射によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を浸す限局灌流によって直接、カテーテルによって、洗浄(lavage)によって、クリームにおいて、液体組成物（例えばリポソーム）において、又は他の方法によって、又は前述の何れかの組合せによって投与されうる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照（出典明記によってここに援用する））。非経口投与、特に静脈内注射が、発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子などのポリペプチド分子の投与に最も一般的に使用される。

非経口組成物は、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、くも膜下腔内又は腹腔内注射による投与のために設計されたものを含む。注射では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、水溶液中、好ましくは生理学的適合したバッファー、例えばＨａｎｋｓ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、又は生理学的緩衝生理食塩水中に処方されうる。溶液は、懸濁、安定及び／又は分散剤などのフォーミュラトリー剤を含みうる。あるいは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌発熱性物質除去蒸留水の構成用に粉末形態でありうる。滅菌注射溶液は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて下に挙げる様々な他の成分を伴う適切な溶媒中に必要量で組み入れることによって調製される。滅菌は、例えば滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成されうる。一般的に分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基礎分散培地及び他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射溶液、懸濁液又はエマルションの調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分＋任意の追加の所望成分の粉末を、先に滅菌−濾過されたその液体培地から得る真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体培地は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は注射の前に十分な生理食塩水又はグルコースでまず等張にされるべきである。組成物は、製造及び保管の条件下で安定でなければならなく、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。内毒素汚染は安全なレベル、例えば０．５ｎｇ／ｍｇ未満のタンパク質で最小限に保たれるべきであることが理解されるだろう。適な薬学的に許容可能な担体は、限定するものではないが；リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、ソルビトール、デキストランなど、懸濁液の粘度を増加させる化合物を含有しうる。場合によっては、懸濁液は、高濃縮液の調製を可能にするために、適切な安定剤又は化合物の溶解度を増加させる薬剤をまた含有しうる。更に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製されうる。適切な親油性溶媒又はビヒクルは、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばエチルクリート(ethyl cleats)又はトリグリセリド、又はリポソームを含む。

活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ−粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。これらの技術は、上掲のRemington's Pharmaceutical Sciences 18th editionに開示されている。徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はその組合せの組成物における使用によって実施されうる。

前述の組成物に加えて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はまた、デポー調製物として処方されうる。そのように長く作用する製剤は、インプラント術（例えば皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射によって投与されうる。従って、例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、適切なポリマー又は疎水性材料（例えば許容可能な油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂とともに、又は難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤化されうる。

本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含んでなる薬学的組成物は、慣習的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、凍結乾燥プロセスによって製造されうる。薬学的組成物は、薬剤的使用可能な調製物へのタンパク質の加工を容易にする一又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を使用して、一般的な方法において製剤化されうる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。

Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態の組成物に製剤化されうる。薬学的に許容可能な塩は、遊離酸又は塩基の生物学的活性を実質的に保った塩である。これらは酸付加塩、例えばタンパク質組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、又は塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸などの有機酸で形成されるものを含む。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインなどの有機塩基から得られうる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性及び他のプロトン性溶媒中において溶けやすい傾向がある。

治療方法及び組成物
本明細書に与えられるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れかは治療的方法で用いることができる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、免疫治療剤として、例えば癌の治療において使用することができる。

治療的方法において使用のために、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。

一態様において、医薬として使用のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。更なる態様において、医薬として使用のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。ある実施態様において、治療の方法において使用のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。一実施態様において、本発明は、それを必要としている個体において、疾患の治療に使用のために、本明細書に記載されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。ある実施態様において、本発明は、個体にＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法に使用のためのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。ある実施態様において、治療すべき疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様において、疾患は癌である。ある実施態様において、本方法は、少なくとも一の更なる治療剤、例えば、治療すべき疾患が癌である場合には抗癌剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。一実施態様において、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導に使用するため、本明細書に記載されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。ある実施態様において、本発明は、標的細胞の溶解を誘導するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量を個体に投与することを含む、個体において標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法において使用のためのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトである。

更なる態様にて、本発明は、医薬の製造または調製における本明細書に報告されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一実施態様において、医薬は、それを必要とする個体における疾患の治療のためである。更なる実施態様において、本医薬は、疾患を有する個体に、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。ある実施態様において、治療すべき疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様において、疾患は癌である。一実施態様において、本方法は、少なくとも一の更なる治療剤、例えば、治療すべき疾患が癌である場合には抗癌剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためである。更に別の実施態様にて、本医薬は、標的細胞の溶解を誘導するために本医薬の有効量を個体に投与することを含む、個体における標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法で使用するためである。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトであり得る。

更なる態様にて、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、このような疾患を有する個体に対して、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を投与することを含む。一実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物が前記個体に投与される。ある実施態様において、治療すべき疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様において、疾患は癌である。ある実施態様において、本方法は、少なくとも一の更なる治療剤、例えば、治療すべき疾患が癌である場合には抗癌剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトであり得る。

更なる態様において、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法を提供する。本発明はまた、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と標的細胞を接触させることを含む。更なる態様にて、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法が提供される。一つのそのような実施態様において、本方法は、標的細胞の溶解を誘導するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量を個体に投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。

ある実施態様において、治療すべき疾患は、増殖性疾患、特に癌である。癌の非限定的例は、膀胱癌、脳癌、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前立腺癌、血液癌、皮膚癌、扁平上皮癌、骨癌、及び腎臓癌を含む。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を使用して治療できる他の細胞増殖障害は、限定するものではないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系の新生物を含む。また含まれるのは、前癌性の状態又は病変及び癌転移を含む。ある実施態様では、癌は、腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、脳癌、頭頸部癌から成る群から選択される。当業者は、多くの場合において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が治癒ではなく、部分的恩恵のみをもたらしうることを認識するだろう。幾つかの実施態様では、何らかの利益を有する生理学的変化がまた治療的に有益であると考えら得る。従って、幾つかの実施態様では、生理学的変化をもたらすＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量が、「有効な量」又は「治療的に有効な量」と考えられる。治療を必要とする被験体、患者、又は個体は典型的には哺乳動物、より具体的にはヒトである。

幾つかの実施態様では、有効量の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が細胞に投与される。他の実施態様では、治療的に有効な量の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、疾患の治療のために個体に投与される。

疾患の予防又は治療のためには、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、投与の経路、患者の体重、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、前の又は同時の治療介入、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に対する患者の臨床的履歴及び応答性、及び担当医の判断に依存する。何れの場合も、投与に責任のある実践者が、個々の被験体に対し、組成物中の活性成分の濃度及び適切な用量を決定するだろう。限定するものではないが、単回又は様々な時間点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールが、ここで考えられる。

Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、患者に対して、単回、又は一連の治療に渡って適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の１つの例示される用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的な例では、用量はまた、投与あたり約１マイクログラム／ｋｇ／体重から、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重まで又はそれ以上、及びその中で導きだされる何れかの範囲を含む。ここで挙げた数値から導きだされる範囲の非限定的な例は、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲が、上記の数値に基づき投与されうる。このように、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数（又はその何れかの組合せ）の用量が、患者に投与されうる。このような用量は、間欠的に、例えば毎週又は３週間毎に投与されうる（例えば、患者は約２〜約２０、又は例えば約６用量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を受ける）。初期の高負荷投与量の後に一以上の低投与量が投与され得る。しかしながら、他の投与量レジメンも有益であり得る。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターされる。

本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は一般的に、意図した目的を達成するために有効な量において使用されるだろう。疾患状態を治療又は防止するための使用では、発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその薬学的組成物は、治療的に有効な量において投与又は適用される。治療的に有効な量の決定は、特にここに提供される詳細な開示の考慮のもと、十分に当業者の能力の範囲内である。

全身性投与では、治療的に有効な用量は最初に、細胞培養アッセイなどのインビトロアッセイから推定されうる。次いで用量は、細胞培養において決定されるＩＣ_５０を含む循環濃度範囲を得るために、動物モデルにおいて組み立てられうる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用されうる。

最初の投与量はまた、当分野においてよく知られている技術を使用して、インビボデータ、例えば動物モデルから推定されうる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化できるだろう。

投与量及び間隔は、治療効果を維持するのに十分なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の血漿レベルを提供するために、個々に調整されうる。注射による投与のための通常の患者の投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日の複数回投与によって達成されうる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣによって測定されうる。

局所投与又は選択的取込みの場合、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度と関連しない場合がある。当業者は、過度な実験をすることなく、治療的に有効な局所投与量を最適化できるだろう。

治療的に有効な用量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は一般的に、実質的な毒性をもたらすことなく治療効果を提供するだろう。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物において標準的な手順によって決定できる。細胞培養アッセイ及び動物研究は、ＬＤ_５０（集団の５０％に致死性である用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効である用量）を決定するために使用できる。毒性及び治療効果間の用量比は、比ＬＤ_５０／ＥＤ_５０として表現される治療指数である。高い治療指数を示すＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が望ましい。一実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用に好適な投与量の範囲の策定に使用されうる。投与量は好ましくは、ほとんどあるいは全く毒性の無いＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、様々な要因、例えば採用される剤形、利用される投与経路、被験体の状態などに応じて、この範囲内において変わりうる。正確な処方、投与の経路及び投与量は、患者の状態を考慮してそれぞれの医師によって選択されうる。（例えばFingl等, 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1（出典明記によってその全体をここに援用する）を参照）。

本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子で治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全などに対し、どのように及びいつ投与を終了、中断、調整するかを知っているだろう。逆に、主治医はまた、臨床反応が十分でない場合、治療を高レベルに調整することを知っているだろう（毒性を除く）。目的の障害の管理における投与量の程度は、治療される状態の重症度、投与の経路などによって様々だろう。状態の重症度は、例えば標準的な予後評価方法によって一部には評価されうる。さらに、用量及びおそらくは投与頻度はまた、個々の患者の年齢、体重及び反応によって様々だろう。

他の薬剤及び治療
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、治療において一又は複数の他の薬剤との組合せにおいて投与されうる。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が少なくとも１つのさらなる治療剤と同時投与することができる。「治療剤」なる用語は、治療を必要としている個体における症状又は疾患を治療するために投与される何れかの薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療されている特定の徴候に好適な何れかの活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補活性を伴うものを含みうる。ある実施態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞分裂阻害剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導物質に対する細胞の感受性を増加させる薬剤である。特定の実施態様では、追加の薬剤は、抗癌剤、例えば微小管撹乱物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管新生剤である。

このような他の薬剤は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。

上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一または別々の組成物に含まれている）、及び、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は放射線療法と組み合わせても使用することができる。

製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上ないしは容器に付随するラベルないしはパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ＩＶ液バッグ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び／又は診断するために有効な組成物単独又は他の組成物と組み合わせる組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含有する組成物を中に収容する第一の容器と（ｂ）更なる細胞障害剤又は別の治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器をさらに含んでもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。

以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。

一般的な方法
組換えＤＮＡ技術
Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に既述されるように、標準的な方法がＤＮＡを操作するために使用された。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の塩基配列に関する一般情報については次に与えられる：Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th ed., NIH Publication No. 91-3242.

ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定した。

遺伝子合成
必要な場合、所望の遺伝子は、適切な鋳型を使用してＰＣＲによって生成するか、又は自動化遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物からＧｅｎｅａｒｔＡＧ(Regensburg, Germany)によって合成された。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、オリゴヌクレオチドプライマーを最も近いホモログからの配列に基づいて設計し、遺伝子を適切な組織に由来するＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを標準のクローニング／シークエンシングベクターにクローン化した。プラスミドＤＮＡを形質転換した細菌から精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニング遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中にサブクローニングできるように適切な制限部位を伴って設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含んでいた。配列番号１５４から１６２は、それらをコードする典型的なリーダーペプチドおよびポリヌクレオチド配列をそれぞれ提供する。

ＰＢＭＣからの初代ヒトパンＴ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、地方血液銀行から、または健康なヒトのドナーからの新鮮な血液から得られた濃縮されたリンパ球調製物（バフィーコート）からヒストパック密度遠心分離によって調製した。簡単に説明すると、血液は滅菌ＰＢＳで希釈し、慎重にヒストパック勾配上に重ねた（Ｓｉｇｍａ，Ｈ８８８９）。室温で４５０×ｇで３０分間遠心分離した後（ブレーキオフに切り替え）、ＰＢＭＣを含有する界面相の上の血漿の一部を廃棄した。ＰＢＭＣを、新しい５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移し、チューブをＰＢＳで５０ｍｌの総体積に充填した。本混合物を４００×ｇで１０分間室温で遠心分離した（ブレーキをオンに切り替え）。上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（３５０×ｇで１０分間４℃での遠心分離工程）。得られたＰＢＭＣ集団は自動的に計数され（ＶｉＣｅｌｌ）、アッセイが開始されるまで３７℃で５％ＣＯ_２でインキュベーター中で１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に保管された。

ＰＢＭＣからのＴ細胞濃縮は、製造業者の指示に従って、パンＴ細胞単離キットＩＩ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ＃１３０−０９１−１５６）を用いて行った。簡潔には、細胞ペレットを１０万個の細胞あたり４０μｌの冷緩衝液で希釈し（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ、滅菌濾過）、４℃で１０分間千万細胞あたり１０μｌのビオチン抗体カクテルでインキュベートした。３０μｌの冷緩衝液と１０万個の細胞あたり２０μｌの抗ビオチン磁気ビーズを添加し、その混合物を４℃でさらに１５分間インキュベートした。細胞は現在の体積の１０−２０倍を添加し、続く１０分間３００×ｇでの遠心分離工程により洗浄した。最大１００万個の細胞を、５００μｌの緩衝液中に再懸濁した。非標識ヒトパンＴ細胞の磁気分離は、製造業者の指示に従ってＬＳカラム（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ＃１３０−０４２−４０１）を用いて行った。得られたＴ細胞集団は自動的に計数され（ＶｉＣｅｌｌ）、アッセイ開始まで（２４時間より長くはない）、インキュベーター中で３７℃で５％ＣＯ_２でＡＩＭ−Ｖ培地中に保存された。

ＰＢＭＣからの初代ヒト天然型Ｔ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、地方血液銀行から、または健康なヒトのドナーからの新鮮な血液から得られた濃縮されたリンパ球調製物（バフィーコート）からヒストパック密度遠心分離によって調製した。ＰＢＭＣからのＴ細胞の濃縮は、製造者の指示に従って、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃからのナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞単離キット（＃１３０−０９３−２４４）を用いて行ったが、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の最後の単離工程をスキップした（初代ヒトパンＴ細胞の単離についての記述も参照）。

脾細胞からのマウスパンＴ細胞の単離
脾臓を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離し、ＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）を含むＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳＣチューブ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ＃１３０−０９３−２３７）に移し、そして製造業者の指示に従ってＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離剤を用いて解離し単細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液は、解離していない残った組織粒子を除去するために、プリセパレーションフィルターに通した。４℃で４分間、４００×ｇで遠心分離した後、赤血球を溶解するためにＡＣＫ溶解緩衝液を添加した（室温で５分間のインキュベーション）。残りの細胞は、ＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、計数し、マウスパンＴ細胞の単離のために使用した。陰性（磁気）選択を、製造業者の指示に従って、パンＴ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ＃１３０−０９０−８６１）を用いて行った。得られたＴ細胞集団は自動的に計数し（ＶｉＣｅｌｌ）、直ちに更なるアッセイのために使用した。

ヘパリン化血液からの初代カニクイザルＰＢＭＣの単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健常カニクイザルドナーからの新鮮な血液から密度遠心分離により以下のように調製した：ヘパリン添加血液を滅菌ＰＢＳで１：３に希釈し、リンホプレップ培地（ＡｘｏｎＬａｂ＃１１１４５４５）を、滅菌ＰＢＳで９０％に希釈した。希釈した血液の二のボリュームが希釈された濃度勾配の１のボリューム上に重層され、ＰＢＭＣ画分は、室温で、ブレーキなしで、５２０×ｇで３０分間遠心分離した。ＰＢＭＣのバンドを新規５０ｍｌファルコンチューブに移し、滅菌ＰＢＳで４℃で４００×ｇで１０分間の遠心分離によって洗浄した。血小板を除去するために、１回の低速遠心分離を行った（１５０×ｇで１５分間、４℃）。得られたＰＢＭＣの集団は自動的に計数され（ＶｉＣｅｌｌ）、直ちに更なるアッセイに使用した。

標的細胞
ＭＣＳＰ標的二重特異性抗原結合分子の評価のため、以下の腫瘍細胞を使用した：悪性黒色腫の転移部位由来でヒトＭＣＳＰを高レベルで発現するヒトメラノーマ細胞株ＷＭ２６６−４（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６７６）；及び中程度のレベルのヒトＭＣＳＰを発現するヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３（Radboud大学ナイメーヘン医療センターからの贈り物）。

ＣＥＡ標的二重特異性抗原結合分子の評価のため、以下の腫瘍細胞を使用した：ヒトＣＥＡを非常に高いレベルで発現するヒト胃癌細胞株ＭＫＮ４５（ＤＳＭＺＡＣＣ番号４０９）；ヒトＣＥＡを中程度から低レベル発現させるヒトの女性の白人結腸腺癌細胞株ＬＳ−１７４Ｔ（ＥＣＡＣＣ番号８７０６０４０１）；ヒトＣＥＡを（非常に）低いレベルで発現するヒト上皮膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４６９）；及び安定的にヒトＣＥＡを表現するようにに社内で設計されたマウス大腸癌細胞株ＭＣ３８−ｈｕＣＥＡ。

さらに、ヒトＴ細胞白血病細胞株、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１５２）が、異なる二重特異性構築物の細胞上のヒトＣＤ３への結合を評価するために使用された。

実施例１：
二重特異性抗原結合分子の調製、精製および特性評価
重鎖及び軽鎖の可変領域配列は、各レシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとともに、フレーム内でサブクローニングされた。抗体の発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、合成ポリＡシグナル配列は、ＣＤＳの３’末端に位置する。加えて、各ベクターは、ＥＢＶＯｒｉＰ配列を含んでいた。

分子は、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物の発現ベクターをコトランスフェクトすることにより産生された。指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞は、リン酸カルシウム法を用いてトランスフェクトされた。あるいは、懸濁液中で増殖しているＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によりトランスフェクトされた。「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕型／片腕反転型」構築物の調製のために、細胞は対応する発現ベクターを１：１：１（「ベクトター重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクター重鎖−ｓｃＦａｂ」）の比でトランスフェクトされた。「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物の調製のために、細胞は対応する発現ベクターを１：２：１（「ベクトター重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクター重鎖−ｓｃＦａｂ」）の比でトランスフェクトされた。「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物の調製のために、細胞は対応する発現ベクターを１：１：１：１（「ベクトター第二重鎖」：「ベクター第一軽鎖」：「ベクター軽鎖ＣｒｏｓｓＦａｂ」；「ベクター第一重鎖−重鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」）の比でトランスフェクトされた。「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物の調製のために、細胞は対応する発現ベクターを１：１：１：１（「ベクトター第二重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクター第一重鎖−重鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」：「ベクター軽鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」）の比でトランスフェクトされた。「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、軽鎖に連結」構築物の調製のために、細胞は対応する発現ベクターを１：１：１：１（「ベクトター重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクター重鎖（ＣｒｏｓｓＦａｂ−Ｆａｂ−Ｆｃ）」：「軽鎖に連結したベクター」）の比でトランスフェクトされた。「１＋１Ｃｒｏｓｓｆａｂ」構築物の調製のために、細胞は対応する発現ベクターを１：１：１：１（「ベクトター第一重鎖」：「ベクター第二重鎖」：「ベクター第一軽鎖」：「ベクター第二軽鎖」）の比でトランスフェクトされた。「１＋１Ｃｒｏｓｓｆａｂ」構築物の調製のために、細胞は対応する発現ベクターを１：１：１：１（「ベクトター第一重鎖」：「ベクター第二重鎖」：「ベクター第一軽鎖」：「ベクター第二軽鎖」）の比でトランスフェクトされた。

リン酸カルシウムを用いたトランスフェクションのため、細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを補填したＤＭＥＭ培養培地を使用してＴフラスコ中で付着単層培養として増殖させ、それらが５０から８０％の間で集密になったときにトランスフェクトした。Ｔ１５０フラスコの遺伝子導入では、ＦＣＳ（最終１０％Ｖ／Ｖで）を補填した２５ｍｌのＤＭＥＭ培養培地に遺伝子導入の２４時間前に１５００万細胞を播種し、細胞を５％ＣＯ_２大気のインキュベーターに３７℃で一晩配した。遺伝子導入される各Ｔ１５０フラスコに対して、ＤＮＡ、ＣａＣｌ_２及び水の溶液を、対応する比率で分配された９４μｇの全プラスミドベクターＤＮＡ、４６９μｌの最終容量までの水及び４６９μｌの１ＭのＣａＣｌ_２溶液を混合することによって調製した。この溶液に、９３８μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４溶液（ｐＨ７．０５）を加え、直ぐに１０秒間混合し、室温で２０秒間静置した。懸濁液を、２％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを補填した１０ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりにＴ１５に加えた。続いて、更なる１３ｍｌのトランスフェクション培地を加えた。細胞を約１７から２０時間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートし、ついで培地を２５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳに置換した。条件培養培地を２１０×ｇでの１５分の遠心分離によって培地交換から約７日後に収集し、滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを加え、４℃に維持した。

ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いたトランスフェクションのため、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を、無血清ＣＤＣＨＯ培地中で懸濁液中で培養した。５００ｍｌの振とうフラスコ中での生産のため、４億のＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのため、細胞を、２１０Ｘｇで５分間遠心分離し、上清を２０ｍｌの予め温めたＣＤＣＨＯ培地で置換した。発現ベクターを２０ｍｌのＣＤＣＨＯ培地中で最終的に２００μｇのＤＮＡの量まで混合した。５４０μｌのＰＥＩを加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、続いて室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌのフラスコに移し、振盪し、５％ＣＯ_２大気を含むインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、１６０ミリリットルのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のフィード１（ロンザ社）を添加した。７日間培養後、上清を精製のために２１０Ｘｇで１５分間遠心分離することにより収集し、溶液を滅菌ろ過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％ｗ／ｗの最終濃度まで補充し４℃で保存した。

分泌タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィー工程によって細胞培養上清から精製した。

アフィニティークロマトグラフィー用に、上清を、２５ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、又は４０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したハイトラッププロテインＡＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍｌ、ＧＥヘルスケア）にロードした。非結合タンパク質は、少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５で洗浄し、続いて６カラム容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ５．４５を用いた洗浄工程により除去した。次いで、カラムを２０ｍｌの１０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０で洗浄し、標的タンパク質は、６カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出した。あるいは、標的タンパク質は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５から２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ２．５までの２０カラム容量にわたる勾配を用いて溶出した。タンパク質溶液を、０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８を１／１０加えて中和した。標的タンパク質を、２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．７の１００ｍＭグリシン溶液で平衡化したハイロードスーパーデックス２００カラム（ＧＥヘルスケア）へロードする前に濃縮し、濾過した。１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂの精製のために、カラムをｐＨ６．０の２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム溶液で平衡化した。

精製されたタンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。二重特異性構築物の純度と分子量は、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオスレイトール）の存在下および非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クマシー（インビトロジェンからのＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅ^ＴＭＳａｆｅＳｔａｉｎ）による染色をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（インビトロジェン、米国）を用いて、製造者の指示（４−１２％トリス−アセテートゲル又は４〜１２％ビス−トリス）に従って用いた。あるいは、分子の純度と分子量は、製造業者の指示に従ってＣａｌｉｐｅｒＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩシステム(Caliper Lifescience)を用いて還元剤の存在下および非存在下でＣＥ−ＳＤＳ分析によって分析した。

タンパク質サンプルの凝集体含有量は、スーパーデックス２００１０／３００ＧＬ分析用サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア）を用いて、２５℃で、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ_３、ｐＨ７．３のランニング緩衝液（ｗ／ｖ）中で分析した。あるいは、抗体のサンプルの凝集体含有量は、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ分析用サイズ排除カラム（東ソー）を用いて、２５℃で、２５ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４、１２５のＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％のＮａＮ_３、ｐＨ６．７のランニング緩衝液（ｗ／ｖで）中で分析した。

図２〜１４は、ＳＤＳＰＡＧＥ及び分析用サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示し、表２Ａは、プロテインＡの後の収率、凝集体含有量、及び異なる二重特異性構築物の調製物中の最終モノマー含有量を示している。

図４７は、抗ＣＤ３／抗ＭＣＳＰ二重特異性「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、連結した軽鎖」構築物のＣＥ−ＳＤＳ分析の結果を示す（配列番号３、５、２９、及び１７９を参照）。２μｇのサンプルを分析のために使用した。図４８は、最終生成物（２０μｇのサンプルが注入された）の分析用サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。

図５４は、様々な構築物のＣＥ−ＳＤＳおよびＳＤＳＰＡＧＥ分析の結果を示し、表２Ａは、プロテインＡの後の収率、凝集体含有量、及び異なる二重特異性構築物の調製物中の最終モノマー含有量を示している。
対照として、二重特異性抗原結合分子は、従来技術のタンデムｓｃＦｖ形態（「（ｓｃＦｖ）_２」）でＦｃドメインへタンデムｓｃＦｖを融合（「（ｓｃＦｖ）_２−Ｆｃ」）することによって生成した。分子は、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中で産生され、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって、続いてサイズ排除クロマトグラフィー工程によって、本発明の二重特異性抗原結合分子について上述したのと類似の方法で精製した。高い凝集体形成に起因して、一部のサンプルは、高モノマー含量を有するタンパク質を得るために、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．７で平衡化した、ハイロード・スーパーデックス２００カラム（ＧＥヘルスケア）から溶出して濃縮したサンプルをスーパーデックス１０／３００ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア）に適用することによって更に精製する必要があった。続いて、タンパク質濃度、純度及び分子量、及び凝集体含有量を上記のように決定した。

対照分子の最初の精製工程の後の収率、凝集体含有量、及び最終的な単量体の含有量を表２Ｂに示す。最初の精製工程（プロテインＡ）の後の凝集体含有量の比較は、「（ｓｃＦｖ）_２−Ｆｃ」及びジスルフィド結合型「（ｄｓｓｃＦｖ）_２−Ｆｃ」分子と比較して、ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ及びＩｇＧｓｃＦａｂ構築物の優れた安定性を示している。

タンパク質の熱安定性は、動的光散乱（ＤＬＳ）によりモニターした。１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を含む３０ｇの濾過タンパク質サンプルをダイナプロプレートリーダー(Wyatt Technology Corporation; USA)へ重複して適用した。温度は、０．０５℃／分で２５から７５℃へと上昇させ、半径と全散乱強度を収集した。結果を図１５及び表２Ｃに示す。「（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）分子では、２つの凝集点が４９℃と６８℃で観察された。「（ｄｓｓｃＦｖ）_２−Ｆｃ」構築物は導入されたジスルフィド架橋の結果として、凝集温度が上昇した（５７℃）（図１５Ａ、表２Ｃ）。「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物の両方とも６０℃以上の温度で凝集しており、「（ｓｃＦｖ）_２−Ｆｃ」及び「（ｄｓｓｃＦｖ）_２−Ｆｃ」形態と比較して優れた熱安定性を実証している（図１５Ｂ、表２Ｃ）。
実施例２：
Ｆｃ受容体および標的抗原結合の表面プラズモン共鳴分析
方法
全ての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、２５℃でＢｉａｃｏｒｅＴ１００上で、ＨＢＳ−ＥＰをランニング緩衝液として（０．０１ＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、ビアコア、フライブルグ／ドイツ）実施した。

異なるＦｃ変異体のＦｃＲ結合の解析
アッセイの設定を図１６Ａに示す。ヒトのＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８及びマウスＦｃγＲＩＶとの異なるＦｃ変異体の相互作用を分析するため、抗ペンタＨｉｓ抗体（キアゲン）の約６，５００共鳴単位（ＲＵ）の直接カップリングが、標準的なアミンカップリングキット（ビアコア、フライブルグ／ドイツ）を使用して、ｐＨ５．０でＣＭ５チップ上で行われる。ＨｕＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８−Ｋ６Ｈ６及びｍｕＦｃγＲＩＶ−ａｖｉＨｉｓ−ビオチンは６０秒間４又は１０ｎＭで捕捉される。

異なるＦｃ変異体を含む構築物は、３０μｌの／分の流速で１０００ｎＭの濃度で１２０秒間フローセルを通過する。解離は２２０秒間監視される。バルクの屈折率の差は、参照フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正される。ここで、Ｆｃ変異体は固定化抗ペンタＨｉｓ抗体を持つ表面上を飛行するが、その上にはＨｕＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８−Ｋ６Ｈ６又はｍｕＦｃγＲＩＶ−ａｖｉＨｉｓ−ビオチンよりむしろＨＢＳ−ＥＰが注入されている。ヒトＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８及びマウスＦｃγＲＩＶの親和性は５００〜４０００ｎＭの範囲の濃度を用いて野生型Ｆｃで決定された。

定常状態応答を用いて、ラングミュア結合等温線の非線形曲線フィッティングによって解離定数ＫＤを導出した。速度定数は、数値積分により１：１ラングミュア結合に反応速度式を適合するビアコアＴ１００評価ソフトウェア（ｖＡＡ、ビアコアＡＢ、ウプサラ／スウェーデン）を使用して導出された。

結果
Ｆｃ変異体のヒトＦｃγＲＩＩＩａおよびマウスＦｃγＲＩＶとの相互作用は、表面プラズモン共鳴によってモニターした。捕捉したｈｕＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８−Ｋ６Ｈ６及びｍｕＦｃγＲＩＶ−ａｖｉＨｉｓビオチンへの結合は、野生型（ｗｔ）Ｆｃドメインを持つ構築物と比較した場合、全ての解析されたＦｃ変異体で有意に減少した。

ヒトＦｃγ受容体への結合が最小であるＦｃ変異体はＰ３２９ＧＬ２３４ＡＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）及びＰ３２９ＧＬＡＬＡＮ２９７Ｄであった。ＬＡＬＡ変異だけがｈｕＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８−Ｋ６Ｈ６への結合を抑制するのに十分ではなかった。ＬＡＬＡ変異だけを運ぶＦｃ変異体はヒトＦｃγＲＩＩＩａに対して２．１００ｎＭの残留結合親和性を有していたが、一方ｗｔＦｃはヒトＦｃγＲＩＩＩａ受容体に６００ｎＭの親和性で結合した（表３）。両方のＫ_Ｄ値は、単一の濃度を用いて、１：１結合モデルによって誘導した。

ヒトＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８及びマウスＦｃγＲＩＶへの親和性は、ｗｔＦｃについてのみ分析できた。Ｋ_Ｄ値が、表３に一覧される。マウスＦｃγＲＩＶへの結合は分析された全てのＦｃ変異体についてほぼ完全に排除された。

腫瘍抗原とＣＤ３に対する同時結合の分析
Ｔ細胞活性化二重特異性構築物の腫瘍抗原及びヒトＣＤ３εへの同時結合の分析は、標準的なカップリング手順を用いて、センサーチップＳＡ上でＮＳＣＰのビオチン化ＭＣＳＰＤ３ドメインの１６５０共鳴単位（ＲＵ）の直接カップリングによって行った。ヒトＥＧＦＲは、標準的なアミノ酸カップリング手順を使用して固定化した。８０００ＲＵを、ｐＨ５．５でＣＭ５センサーチップ上に固定化した。アッセイの設定を図１６Ｂに示す。

異なるＴ細胞の二重特異性構築物は２００ｎＭで６０秒間で捕捉された。続いて、ヒトＣＤ３γ（Ｇ_４Ｓ）_５ＣＤ３ε−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）を２０００ｎＭの濃度で６０秒間４０μｌ／分の流速で通過させた。組換えＣＤ３εが、捕捉されたＴ細胞二重特異性構築物を含まないＭＣＳＰ又はＥＧＦＲの固定化Ｄ３ドメインを持つを表面上を飛行する、参照フローセル上で得られる応答を減算することにより、バルクの屈折率の差を補正した。

結果
腫瘍抗原およびヒトＣＤ３εの両方への同時結合は、表面プラズモン共鳴によって分析した（図１７、図１８）。全ての構築物は、腫瘍抗原およびＣＤ３に同時に結合することができた。大部分の構築物において、ヒトＣＤ３εの注入後結合レベル（ＲＵ）は、構築物だけを注射した後に達成された結合レベルよりも高く、腫瘍抗原及びヒトＣＤ３εの両方が構築物に結合されたことを反映している。

実施例３：
細胞上のそれぞれの標的抗原への二重特異性構築物の結合
異なる二重特異性構築物の、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１５２）上のＣＤ３、及び標的細胞上のそれぞれの腫瘍抗原への結合を、ＦＡＣＳにより決定した。簡潔には、細胞を回収し、計数し、生存率を調べた。ウェル（０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中、９０μｌ）当たり０．１５〜０．２百万細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、指定された濃度の二重特異性構築物、及び対応するＩｇＧ対照物（１０μｌ）と４℃で３０分間インキュベートした。より良い比較のために、全ての構築物及びＩｇＧ対照物は、同じモル濃度に標準化した。インキュベーション後、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、０．１％ＢＳＡを含有する１５０μｌのＰＢＳで洗浄し、再懸濁し、更にＦＩＴＣ又はＰＥコンジュゲート二次抗体１２μＬ／ウェルとともに４℃で３０分間インキュベートした。結合した構築物はＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＳｏｆｔｗａｒｅＦＡＣＳＤｉｖａ）を用いて検出した。「（ｓｃＦｖ）_２」分子は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出した（Ｌｕｃｅｒｎａ，＃ＲＨＩＳ−４５Ｆ−Ｚ）。他の全ての分子について、ＦＴＩＣ又はＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２Ｆｒａｇｍｅｎｔヤギ抗ヒトＩｇＧのＦｃγＦｒａｇｍｅｎｔＳｐｅｃｉｆｉｃ（それぞれ、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂ＃１０９−０９６−０９８／作業溶液１：２０、又は＃１０９−１１６−１７０／作業溶液１：８０）を用いた。細胞は、０．１％のＢＳＡを含む１２０μｌ／ウェルのＰＢＳを添加し、５分間３５０×ｇで遠心分離することにより洗浄した。第二の洗浄工程は、０．１％のＢＳＡを含有する１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで実施した。特に断らない限り、細胞を、暗所で４℃で１５分間、１００μｌ／ウェルの固定緩衝液（ＢＤ＃５５４６５５）を用いて固定し、４００×ｇで６分間遠心分離し、サンプルをＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩで測定するまで０．１％ＢＳＡを含有する２００μｌ／ウェルのＰＢＳ中に保持した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算した。

第一の実験では、ヒトＭＣＳＰ及びヒトＣＤ３を標的とする別の二重特異性構築物を、Ｊｕｒｋａｔ、ヒトＴ細胞白血病細胞に発現したヒトＣＤ３へ、又はＣｏｌｏ３８ヒトメラノーマ細胞上のヒトＭＣＳＰへの結合についてフローサイトメトリーにより分析した。
結果は、図１９−２１に示され、二重特異性分子、対照のＩｇＧ、二次抗体のみとインキュベートし、又は未処理のままの細胞の平均蛍光強度を示している。

図１９に示すように、「（ｓｃＦｖ）_２」分子の両方の抗原結合部分、すなわち、ＣＤ３（図１９１Ａ）及びＭＣＳＰ（図１９Ｂ）において、明確な結合シグナルが対照サンプルと比較して観察される。

「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」分子（配列番号５、１７、１９）はＣｏｌｏ−３８細胞上のｈｕＭＳＣＰへ良好な結合を示している。ＣＤ３部分は、参照の抗ヒトＣＤ３ＩｇＧをよりわずかに良好にＣＤ３を結合する（図２０Ｂ）。

図２１Ａに示すように、２つの「１＋１」構築物は、細胞上のヒトＣＤ３に匹敵する結合シグナルを示す。参照抗ヒトＣＤ３ＩｇＧは若干弱いシグナルを与える。加えて、試験された両方の構築物（「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕型」（配列番号１，３，５）及び「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」（配列番号７，９，１１））は細胞上のヒトＭＣＳＰに匹敵する結合を示している（図２１Ｂ）。参照抗ヒトＭＣＳＰＩｇＧで得られた結合シグナルは若干弱い。

別の実験において、精製された「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」二重特異性構築物（配列番号５，１７，１９）及び対応する抗ヒトＭＣＳＰＩｇＧは、二重特異性構築物がその「腕」の片方又は両方を介してＭＣＳＰへ結合するのかどうかを決定するために、Ｃｏｌｏ−３８ヒトメラノーマ細胞上のヒトＭＣＳＰへの用量依存性結合についてフローサイトメトリーによって分析された。図２２に示すように、「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物はＭＣＳＰＩｇＧと同じ結合パターンを示している。

更に別の実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞により発現されるヒトＣＤ３に対して、又はＬＳ−１７４Ｔ細胞により発現されるヒトＣＥＡに対して、Ｃｒｏｓｓｆａｂ断片において、ＶＬ／ＶＨ（配列番号３３、６３、６５、６７を参照）又はＣＬ／ＣＨ１交換（配列番号６６、６７、１８３、１９７を参照）の何れかを有するＣＤ３／ＣＥＡ「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型」の二重特異性構築物の結合を評価した。対照として、対応するＩｇＧの同等の最大濃度及び標識した２次抗体（ヤギ抗ヒトＦＩＴＣコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２Ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂ＃１０９−０９６−０９８）に起因するバックグラウンド染色も同様に評価した。図５５に示すように、両方の構築物は、細胞上のヒトＣＥＡ並びにヒトＣＤ３に良好な結合を示している。計算されたＥＣ５０の値は、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型（ＶＬ／ＶＨ）」構築物及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型（ＣＬ／ＣＨ１）」構築物についてそれぞれ４．６及び３．９ｎＭ（ＣＤ３）、及び９．３及び６．７ｎＭ（ＣＥＡ）であった。

別の実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞により発現されるヒトＣＤ３に対して、又はＷＭ２６６−４細胞により発現されるヒトＭＣＳＰに対して、ＣＤ３／ＭＣＳＰ「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３を参照）構築物及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，反転型」（配列番号５，２３，１８３，１８７を参照）構築物の結合を評価した。図５６は、細胞上のＭＣＳＰへの両方の構築物の結合は比較的良かったが、一方ＣＤ３に対して「反転型」の構築物の結合は、他の構築物に比べて減少したことを示している。計算されたＥＣ５０の値は、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型」構築物及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物についてそれぞれ６．１及び１．６６ｎＭ（ＣＤ３）、及び０．５７及び０．９５ｎＭ（ＭＣＳＰ）であった。

更なる実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞により発現されるヒトＣＤ３に対して、及びＬＳ−１７４Ｔ細胞により発現されるヒトＣＥＡに対して、「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ軽鎖（ＬＣ）融合」構築物（配列番号１８３、２０９、２１１、２１３）の結合を評価した。対照として、対応する抗ＣＤ３及び抗ＣＥＡのＩｇＧの同等の最大濃度及び標識した２次抗体（ヤギ抗ヒトＦＩＴＣコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２Ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂ＃１０９−０９６−０９８）に起因するバックグラウンド染色も同様に評価した。図５７に示すように、ＣＥＡに対する「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂＬＣ融合」の結合は非常に減少するように見えるが、一方ＣＤ３への結合は参照のＩｇＧに少なくとも匹敵した。

最後の実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞により発現されるヒトＣＤ３に対して、又はＷＭ２６６−４細胞により発現されるヒトＭＣＳＰに対して、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５、２３、２１５、２１７を参照）構築物及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，反転型」（配列番号５、２３、２１５、２１９を参照）構築物の結合を決定した。図５８に示すように、ヒトＣＤ３への結合は、他の構築物と比較して「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型」では減少したが、ヒトＭＣＳＰへの結合は同等に良好であった。計算されたＥＣ５０の値は、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型」構築物についてそれぞれ１０．３及び３２．０ｎＭ（ＣＤ３）、及び３．１及び３．４ｎＭ（ＭＣＳＰ）であった。

実施例４：
二重特異性構築物の係合時の一次ヒトＴ細胞上の表面活性化マーカーのＦＡＣＳ分析
精製されたｈｕＭＣＳＰ−ｈｕＣＤ３標的二重特異性「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号５，１７，１９）及び「（ｓｃＦｖ）_２」分子は、ヒトＭＣＳＰ発現腫瘍細胞の存在下でＣＤ８^＋Ｔ細胞の後期活性化マーカーＣＤ２５又は初期表面活性化マーカーＣＤ６９を上方制御するその潜在能力についてフローサイトメトリーによって試験した。

簡潔には、ＭＣＳＰ陽性Ｃｏｌｏ−３８細胞を細胞解離緩衝液で回収し、計数し、そして生存率についてチェックした。細胞はＡＩＭ−Ｖ培地中でｍｌあたり０．３×１０^６（生存可能）細胞へと調整され、ウェル当たりこの細胞懸濁液の１００μｌを、（示されるように）丸底９６ウェルプレートにピペットで入れた。（希釈した）二重特異性構築物の５０μｌを細胞を含むウェルに加え、最終濃度１ｎＭを得た。ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を健常ドナーの新鮮な血液から単離し、ＡＩＭ−Ｖ培地中でｍｌあたり６×１０^６（生存可能）細胞へと調整した。この細胞懸濁液５０μｌをアッセイプレート（上記参照）の各ウェルに添加し、最終Ｅ：Ｔ比：１０：１を得た。二重特異性構築物が排他的に腫瘍抗原ｈｕＭＣＳＰを発現する標的細胞の存在下でＴ細胞を活性化できるかどうかを分析するために、ウェルには、それぞれの二重特異性分子の１ｎＭ、並びに標的細胞は無いがＰＢＭＣが含まれているウェルが含まれた。

３７℃、５％ＣＯ_２で１５時間（ＣＤ６９）又は２４時間（ＣＤ２５）インキュベートした後、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳを１５０μＬ／ウェルで２回洗浄した。ＣＤ８（マウスＩｇＧ１、κ、クローンＨＩＴ８ａ；ＢＤ＃５５５６３５）、ＣＤ６９（マウスＩｇＧ１、クローンＬ７８；ＢＤ＃３４０５６０）及びＣＤ２５（マウスＩｇＧ１、κ、クローンＭ−Ａ２５１、ＢＤ＃５５５４３４）のための表面染色は供給業者の提案に従って、３０分間、４℃で行った。細胞を、１００μｌ／ウェルの固定緩衝液（ＢＤ＃５５４６５５）を用いて２回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳを１５０μｌ／ウェルで、４℃で１５分間固定した。遠心分離後、サンプルは０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳの２００μｌ／ウェルに再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ装置（ＳｏｆｔｗａｒｅＦＡＣＳＤｉｖａ）を用いて分析した。

図２３は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞上での初期活性化マーカーＣＤ６９（Ａ）又は後期活性化マーカーＣＤ２５（Ｂ）のそれぞれ１５時間、又は２４時間のインキュベーション後の発現レベルを示す。両方の構築物が、標的細胞の存在下で排他的に両方の活性化マーカーの上方制御を誘導する。「（ｓｃＦｖ）_２」分子はこのアッセイにおいて、「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物よりもわずかにより活性であるように見える。

精製されたｈｕＭＣＳＰ−ｈｕＣＤ３標的二重特異性「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」及び「（ｓｃＦｖ）_２」分子は、ヒトＭＣＳＰ発現腫瘍細胞の存在下で、ＣＤ８^＋Ｔ細胞又はＣＤ４^＋Ｔ細胞上の後期活性化マーカーＣＤ２５又は初期表面活性化マーカーＣＤ２５を上方制御するその潜在能力についてフローサイトメトリーによって更に試験した。実験手順としては、上述したように、ヒトパンＴエフェクター細胞をＥ：Ｔ比が５：１で、及び５日間のインキュベーション時間を用いた。

図２４は、両方の構築物が、ＣＤ８^＋（Ａ）並びにＣＤ４^＋（Ｂ）Ｔ細胞の双方の標的細胞の存在下で排他的にＣＤ２５の上方制御を誘導することを示している。「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物は、「（ｓｃＦｖ）_２」分子と比較して、このアッセイにおいて、ＣＤ２５の上方制御をあまり誘導しないように見える。一般に、ＣＤ２５の上方制御はＣＤ４^＋Ｔ細胞上よりもＣＤ８^＋上でより顕著である。

別の実験において、精製された「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」標的カニクイザルＣＤ３およびヒトＭＣＳＰ（配列番号３、５、３５、３７）は、腫瘍標的細胞の存在下でＣＤ８^＋Ｔ細胞の表面活性化マーカーＣＤ２５を上方制御するその潜在能力について分析された。簡潔には、ヒトＭＣＳＰを発現するＭＶ−３腫瘍標的細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、洗浄し、２％ＦＣＳ及び１％グルタマックスを含むＤＭＥＭに再懸濁した。ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、各抗体希釈は指示された濃度で添加された（図２５）。二重特異性構築物と異なるＩｇＧ対照物を同じモル濃度に調整した。２匹の健常動物の血液から単離したカニクイザルＰＢＭＣエフェクター細胞は、最終Ｅ：Ｔ比が３：１となるように添加した。３７℃、５％ＣＯ^２で４３時間インキュベートした後、細胞を５分間、３５０×ｇで遠心分離し、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ８（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ＃１３０−０８０−６０１）及びＣＤ２５（ＢＤ＃５５７１３８）の表面染色は供給者の提案に従って行った。細胞を、１００μｌ／ウェルの固定緩衝液（ＢＤ＃５５４６５５）を用いて２回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳを１５０μｌ／ウェルで、４℃で１５分間固定した。遠心分離後、サンプルは０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳの２００μｌ／ウェルに再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ装置（ＳｏｆｔｗａｒｅＦＡＣＳＤｉｖａ）を用いて分析した。

図２５に示すように、二重特異性構築物は、標的細胞のみの存在下でのみＣＤ８^＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の濃度依存性の上方制御がを誘導する。抗カニクイザルＣＤ３ＩｇＧ（クローンＦＮ−１８）はまた、架橋されずにＣＤ８^＋Ｔ細胞上のＣＤ２５上方制御がを誘導することができる（カニクイザルネストル(cyno Nestor)で得られたデータを参照）。二重特異性構築物の最大濃度で（標的細胞の非存在下で）カニクイザルＴ細胞の過剰活性化は全く無い。

別の実施態様において、ＣＤ３−ＭＣＳＰ「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、連結した軽鎖」（配列番号３、５、２９、１７９）を、腫瘍標的細胞の存在下でＣＤ８^＋Ｔ細胞上の後期活性化マーカーＣＤ２５又は初期活性化マーカーＣＤ６９を上方制御するその潜在能力についてＣＤ３−ＭＣＳＰ「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３）と比較した。（上記のように単離された）一次ヒトＰＢＭＣは、ＭＣＳＰ陽性Ｃｏｌｏ３８標的細胞の存在下または非存在下で少なくとも２２時間、指定された濃度の二重特異性構築物とともにインキュベートした。簡潔には、０．３百万の初代ヒトＰＢＭＣをＭＣＳＰ陽性標的細胞（又は培地）を含む、平底９６ウェルプレートのウェルごとに蒔いた。標的細胞に対する最終的なエフェクター比（Ｅ：Ｔ）は１０：１であった。細胞を３７℃、５％のＣＯ_２で指定されたインキュベーション時間、二重特異性構築物及び対照物を示された濃度でインキュベートした。エフェクター細胞は、ＣＤ８、およびＣＤ６９やＣＤ２５について染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩにより分析した。

図５３は、この実験の結果を示す。（連結した軽鎖の有無にかかわらず）２つの２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ分子間で、ＣＤ６９（Ａ）又はＣＤ２５上方制御（Ｂ）について有意差は検出されなかった。

更に別の実験では、ＣＤ３／ＭＣＳＰ「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物（配列番号５、２９、３３、１８１を参照）は、腫瘍標的細胞の存在下で、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞上のＣＤ６９又はＣＤ２５を上方制御するそれらの潜在能力について、「１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ」構築物（配列番号５、２３、１８３、１８５を参照）と比較された。アッセイは、上記のように、ヒトＭＣＳＰを発現するＭＶ−３腫瘍細胞の存在下又は非存在下で２４時間のインキュベーション時間で実施した。

図５９に示すように、「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物は「１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子よりもより顕著な活性化マーカーの上方調節を誘導した。

最終実験では、ＣＤ３／ＭＣＳＰ「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物（配列番号５、２３、２１５、２１７を参照）及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型」構築物（配列番号５、２３、２１５、２１９を参照）は、腫瘍標的細胞の存在下で、二匹の異なるカニクイザル由来のＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋Ｔ細胞上のＣＤ２５を上方制御するそれらの潜在能力について評価された。アッセイは、上記のように、ヒトＭＣＳＰを発現するＭＶ−３腫瘍細胞の存在下又は非存在下で、Ｅ：Ｔ比が３：１で４１時間のインキュベーション時間で実施した。

図６０に示すように、両方の構築物は、濃度依存的に、二つの形態の間に有意差なく、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞上でＣＤ２５を上方制御することができた。抗体を含まずかつ標的細胞を含まない対照サンプルは、標的でない抗体を含むサンプルに匹敵するシグナルを与えた（図示しない）。

実施例５：
ＣＤ３二重特異性構築物によるヒトパンＴ細胞の活性化の際のインターフェロン−γの分泌
精製された「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」標的ヒトＭＣＳＰ及びヒトＣＤ３（配列番号５、１７、１９）は、上清中へのヒトインターフェロン（ＩＦＮ）−γの放出により測定される、ヒトＭＣＳＰ陽性Ｕ−８７ＭＧ細胞の存在下でＴ細胞活性化を誘導するその潜在能力について分析された。対照として、同じモル濃度に調整した抗ヒトＭＣＳＰ及び抗ヒトＣＤ３ＩｇＧを使用した。簡潔には、ｈｕＭＣＳＰ発現Ｕ−８７ＭＧ神経膠芽腫、星状細胞腫の標的細胞（ＥＣＡＣＣ８９０８１４０２）を、細胞解離緩衝液で回収し、洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン＃１２０５５−０９１）中に再懸濁した。ウェル当たり２００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、各抗体希釈は最終濃度１ｎＭを得るように添加された。バフィーコートから単離したヒトパンＴエフェクター細胞は、最終Ｅ：Ｔ比が５：１となるように添加された。３７℃、５％ＣＯ^２で１８．５時間の一晩インキュベーション後、アッセイプレートを３５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を新しい９６ウェルプレートに移した。上清中のヒトＩＦＮ−γのレベルは、製造業者の説明書（ベクトン・ディッキンソンからのＢＤＯｐｔＥＩＡヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキットＩＩ、＃５５０６１２）に従いＥＬＩＳＡにより測定した。

図２６に示すように、参照ＩｇＧは、ＩＦＮ−γ分泌の誘導が弱いか全く示さないが、一方「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物は、ＩＦＮ−γを分泌するヒトＴ細胞を活性化することができる。

実施例６：
Ｔ細胞上のＣＤ３及び腫瘍細胞上のＭＣＳＰ又はＥＧＦＲを標的とした架橋された二重特異性構築物によって媒介される再指向されたＴ細胞の細胞傷害性（ＬＤＨ放出アッセイ）
最初の一連の実験において、抗原結合部分の細胞上のそれぞれの標的抗原への結合を介した構築物の架橋時に、腫瘍標的細胞におけるＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するその潜在能力について、ＣＤ３及びＭＣＳＰを標的とする二重特異性構築物を分析した（図２７−３８）。

一つの実験において、ヒトＣＤ３及びヒトＭＣＳＰを標的とする精製された「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号５、２１、２３）構築物及び「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３）構築物、及び対応する「（ｓｃＦｖ）_２」分子が比較された。簡潔には、ｈｕＭＣＳＰを発現するＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト黒色腫標的細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン＃１２０５５−０９１）中に再懸濁した。ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、構築物の各々の希釈は指示された濃度で添加された。全ての構築物とそれに対応する対照のＩｇＧを、同じモル濃度に調整した。ヒトパンＴエフェクター細胞は、最終Ｅ：Ｔ比が５：１となるように添加された。ヒトパンＴ細胞の活性化の陽性対照として、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（シグマ＃Ｌ８９０２、インゲンマメから単離したイソレクチンの混合物）を用いた。正規化のために、標的細胞（＝１００％）の最大溶解を、１％トリトンＸ−１００の最終濃度で標的細胞のインキュベーションによって決定した。最小限の溶解（＝０％）は、任意の構築物又は抗体を含まずにエフェクター細胞とともに同時インキュベートした標的細胞を指す。３７℃、５％ＣＯ_２で２０時間の一晩のインキュベーションの後、製造業者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（ロシュ・アプライド・サイエンス、＃１１６４４７９３００１）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定した。

図２７に示すように、両方の「２＋１」構築物が、「（ｓｃＦｖ）_２」分子に匹敵し、標的細胞のアポトーシスを誘導する。

更に、精製された「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３）構築物及び「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物（それらはＦｃドメインが異なる）、並びに「（ｓｃＦｖ）_２」分子が比較された。Ｆｃドメイン内の異なる変異（示されるようにＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）、Ｐ３２９Ｇ及び／又はＮ２９７Ｄ）は、野生型（ｗｔ）のＦｃドメインを含む構築物により誘導される（ＮＫ）エフェクター細胞機能を低減又は消失する。実験手順は、上記のように記載された。

図２８は、全ての構築物が、「（ｓｃＦｖ）_２」分子に匹敵し、標的細胞のアポトーシスを誘導することを示す。

図２９は、腫瘍標的細胞においてＴ細胞誘導アポトーシスを誘導するその潜在能力について、精製された「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号５，１７，１９）及び「（ｓｃＦｖ）_２」分子の比較の結果を示す。実験手順としては、上述したように、ｈｕＭＣＳＰ発現Ｃｏｌｏ−３８ヒトメラノーマ標的細胞をＥ：Ｔの比率が５：１で用いて、及び１８．５時間の一晩のインキュベーションを用いた。図に示すように、「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物は「（ｓｃＦｖ）_２」分子に匹敵する細胞傷害活性を示している。

同様に、図３０は、ｈｕＭＣＳＰを発現するＣｏｌｏ−３８ヒトメラノーマ標的細胞をＥ：Ｔ比を５：１で用い、及び１８時間のインキュベーション時間を用いた、精製された「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物（配列番号５、１７、１９）および「（ｓｃＦｖ）_２」分子の比較の結果を示す。図に示すように、「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物は「（ｓｃＦｖ）_２」分子に匹敵する細胞傷害活性を示している。

図３１は、ｈｕＭＣＳＰを発現するＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒトメラノーマ標的細胞をＥ：Ｔ比を５：１で用い、及び２３．５時間の一晩のインキュベーションを用いた、精製された「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物（配列番号５、１７、１９）および「（ｓｃＦｖ）_２」分子の比較の結果を示す。図に示すように、構築物は「（ｓｃＦｖ）_２」分子に匹敵し、標的細胞におけるアポトーシスを誘導する。「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物は最高濃度で有効性の減少を示している。

更に、両方の標的に対して一価である異なる二重特異性構築物、ヒトＣＤ３及びヒトＭＣＳＰ、並びに対応する「（ｓｃＦｖ）_２」分子は、Ｔ細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの潜在能力について分析した。図３２は、ｈｕＭＣＳＰを発現するＣｏｌｏ−３８ヒトメラノーマ標的細胞をＥ：Ｔ比を５：１で用い、及び１９時間のインキュベーション時間を用いた、「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕型」（配列番号１、３、５）及び「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」（配列番号７、９、１１）構築物の結果を示す。図に示すように、このアッセイでは、両方の「１＋１」構築物は「（ｓｃＦｖ）_２」分子よりも活性が弱いが、「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕型」分子は「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」分子に対して優れている。

図３３は、ｈｕＭＣＳＰを発現するＣｏｌｏ−３８ヒトメラノーマ標的細胞をＥ：Ｔ比を５：１で用い、及び２０時間のインキュベーション時間を用いた、「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物（配列番号５、２１、２１３）の結果を示す。図に示すように、「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物は「（ｓｃＦｖ）_２」分子よりも細胞傷害活性が弱い。

更なる実験において、精製された「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３）、「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５，２９，３１，３３）及び「（ｓｃＦｖ）_２」分子は、細胞上の両方の標的抗原であるＣＤ３及びＭＣＳＰの結合を介した構築物の架橋の際、腫瘍標的細胞のＴ細胞誘導アポトーシスを誘導するそれらの潜在能力について分析された。、ｈｕＭＣＳＰを発現するＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒトメラノーマ標的細胞を標的細胞として用い、Ｅ：Ｔ比は５：１で、インキュベーション時間は２０時間であった。結果は図３４に示す。「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物は、「（ｓｃＦｖ）_２」分子に匹敵し、標的細胞のアポトーシスを誘導する。一価と二価の「ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」形態の比較では、二価のものがより強力であることを明らかに示している。

更に別の実験では、精製された「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３）構築物が、異なる（腫瘍）標的細胞のＴ細胞誘導アポトーシスを誘導するその潜在能力について分析された。簡潔には、ＭＣＳＰ陽性Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞、間葉系幹細胞（骨髄由来、ロンザ＃ＰＴ−２５０１又は脂肪組織、インビトロジェン＃Ｒ７７８８−１１５）又は周皮細胞（胎盤由来；ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ＃Ｃ−１２９８０）が、示されているように、細胞解離バッファーで回収され、洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン＃１２０５５から０９１）に再懸濁された。ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、各抗体希釈は指示された濃度で添加された。健常ドナーの新鮮な血液から単離したヒトＰＢＭＣエフェクター細胞は、最終Ｅ：Ｔ比が２５：１を得るように添加した。３７℃、５％ＣＯ_２で４時間のインキュベーションの後、製造業者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（ロシュ・アプライド・サイエンス、＃１１６４４７９３００１）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定した。

図３５に示すように、著しいＴ細胞媒介性細胞傷害はＣｏｌｏ−３８細胞のみで観察された。この結果は、ＭＣＳＰの有意なレベルを発現するＣｏｌｏ−３８細胞と一致しているが、一方間葉系幹細胞および周皮細胞は非常に弱くＭＣＳＰを発現する。

精製された「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号５、１７、１９）構築物及び「（ｓｃＦｖ）_２」分子はまた、Ｆｃドメインのフコシル化Ｎグリカンの割合が低下している糖鎖操作型抗ヒトＭＣＳＰＩｇＧ抗体（ＭＣＳＰＧｌｙｃｏＭａｂ）とも比較された。この実験では、ｈｕＭＣＳＰを発現するＣｏｌｏ−３８ヒトメラノーマ標的細胞及びヒトＰＢＭＣエフェクター細胞が、Ｅ：Ｔ比が２５：１で固定して（図３６Ａ）、又は２０：１から１：１０の異なるＥ：Ｔ比でのどちらかで用いられた（図３６Ｂ）。異なる分子が、図３６Ａに示された濃度で、又は１６６７ｐＭの固定濃度で用いられた（図３６Ｂ）。読み出しは、２１時間のインキュベーション後に行った。図３６Ａ及びＢに示すように、両方の二重特異性構築物は、ＭＳＣＰＧｌｙｃｏＭａｂよりも高い効力を示している。

別の実験において、精製された「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」標的カニクイザルＣＤ３及びヒトＭＣＳＰ（配列番号３、５、３５、３７）を分析した。簡潔には、ヒトＭＣＳＰを発現するＭＶ−３腫瘍標的細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、洗浄し、２％ＦＣＳ及び１％グルタマックスを含むＤＭＥＭに再懸濁した。ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、構築物又は参照ＩｇＧの各々の希釈が指示された濃度で添加された。二重特異性構築物と異なるＩｇＧ対照物を同じモル濃度に調整した。健常カニクイザルの血液から単離したカニクイザルＰＢＭＣエフェクター細胞は、最終Ｅ：Ｔ比が３：１となるように添加された。３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間又は４３時間のインキュベーションの後、製造業者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（ロシュ・アプライド・サイエンス、＃１１６４４７９３００１）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定した。

図３７に示すように、二重特異性構築物は、標的細胞から濃度依存的なＬＤＨ放出を誘導する。効果は２４時間後より４３時間後に強い。抗ｃｙｎｏＣＤ３のＩｇＧ（クローンＦＮ−１８）もまた、架橋されることなく、標的細胞のＬＤＨ放出を誘導することができる。

図３８は、標的細胞としてＭＣＳＰを発現するヒトメラノーマ標的細胞を、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、Ｅ：Ｔ比を１０：１で用い、及び２６時間のインキュベーション時間を用いた、精製された「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物（配列番号３，５，２９，３３）および「（ｓｃＦｖ）_２」構築物の比較の結果を示す。図に示すように、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物は「（ｓｃＦｖ）_２」分子よりもＥＣ５０の観点でより強力である。

２回目の一連の実験において、抗原結合部分の細胞上のそれぞれの標的抗原への結合を介した構築物の架橋時に、腫瘍標的細胞におけるＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するその潜在能力について、ＣＤ３及びＥＧＦＲを標的とする二重特異性構築物を分析した（図３９−４１）。

一つの実験において、ヒトＣＤ４７及びヒトＭＣＳＰを標的とする精製された「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号４５、４７、５３）構築物及び「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号４７，５３，２１３）構築物、及び対応する「（ｓｃＦｖ）_２」分子が比較された。簡潔には、ヒトＥＧＦＲを発現するＬＳ−１７４Ｔ腫瘍標的細胞を、トリプシンで回収し、洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン＃１２０５５−０９１）中に再懸濁した。ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、各抗体希釈は指示された濃度で添加された。全ての構築物とそれに対応する対照のＩｇＧを、同じモル濃度に調整した。ヒトパンＴエフェクター細胞は、最終Ｅ：Ｔ比が５：１となるように添加された。ヒトパンＴ細胞の活性化の陽性対照として、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（シグマ＃Ｌ８９０２）を用いた。正規化のために、標的細胞（＝１００％）の最大溶解を、１％トリトンＸ−１００の最終濃度で標的細胞のインキュベーションによって決定した。最小限の溶解（＝０％）は、任意の構築物又は抗体を含まずにエフェクター細胞とともに同時インキュベートした標的細胞を指す。３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間の一晩のインキュベーションの後、製造業者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（ロシュ・アプライド・サイエンス、＃１１６４４７９３００１）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定した。

図３９に示すように、「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物は「（ｓｃＦｖ）_２」分子に匹敵する細胞毒性活性を示すが、一方「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物は活性が弱い。

別の実験において、精製された「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕型」（配列番号４３，４５，４７）、「「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」（配列番号１１，４９，５１）、「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号４７，５３，２１３）及び「（ｓｃＦｖ）_２」分子を比較した。実験条件は、インキュベーション時間が２１時間であることを除いて、上述の通りであった。

図４０に示すように、このアッセイにおいて「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物は「（ｓｃＦｖ）_２」分子よりもわずかに低い細胞傷害活性を示している。両方の「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，片腕型（反転型）」構築物は「（ｓｃＦｖ）_２」分子よりも明らかに活性が低い。

更なる実験において、精製された「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕型」（配列番号４３，４５，４７）、及び「「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ、片腕反転型」（配列番号１１，４９，５１）構築物及び「（ｓｃＦｖ）_２」分子を比較した。この実験のインキュベーション時間は１６時間で、その結果は図４１に示される。ヒトパンＴ細胞とインキュベートすると、両方の「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，片腕型（反転型）」構築物は「（ｓｃＦｖ）_２」分子よりも活性が弱いが、標的細胞から濃度依存的なＬＤＨ放出を示している（図４１Ａ）。ＬＳ−１７４Ｔ腫瘍細胞のＰＢＭＣから単離されたナイーブＴ細胞との共培養の際、構築物は定常活性のみを有しており、そのうちで最も活性なのは「（ｓｃＦｖ）_２」分子であった（図４１Ｂ）。

更なる実験において、精製された「「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，片腕反転型」（配列番号１１，５１，５５）、「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（５７，６１，２１３）及び「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（５７，５９，６１）標的ＣＤ３及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及び対応する「（ｓｃＦｖ）_２」分子が、細胞上でそれぞれの標的抗原への両方の標的化部分の結合を介した構築物の架橋の際、ヒトＦＡＰ発現性線維芽細胞ＧＭ０５３８９細胞中でＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するその潜在能力について分析した。簡潔には、ヒトＧＭ０５３８９標的細胞を前日トリプシンにより回収し、洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン＃１２０５５−０９１）中に再懸濁した。ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、細胞を回収して付着することを可能にするよう、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、細胞を遠心分離し、上清を廃棄し、新鮮な培地、並びに構築物または参照ＩｇＧのそれぞれの希釈を示された濃度で添加した。全ての構築物とそれに対応する対照のＩｇＧを、同じモル濃度に調整した。ヒトパンＴエフェクター細胞は、最終Ｅ：Ｔ比が５：１となるように添加された。ヒトパンＴ細胞の活性化の陽性対照として、５μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（シグマ＃Ｌ８９０２）を用いた。正規化のために、標的細胞（＝１００％）の最大溶解を、１％トリトンＸ−１００の最終濃度で標的細胞のインキュベーションによって決定した。最小限の溶解（＝０％）は、任意の構築物又は抗体を含まずにエフェクター細胞とともに同時インキュベートした標的細胞を指す。３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間の更なる一晩のインキュベーションの後、製造業者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（ロシュ・アプライド・サイエンス、＃１１６４４７９３００１）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定した。

図４２に示すように、「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物は、ＥＣ５０値の観点から「（ｓｃＦｖ）_２」分子に匹敵する細胞傷害活性を示している。このアッセイにおいて、の「１＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ，片腕反転型」構築物は他の構築物よりも活性が低い。

実験の別の組において、ＣＤ３／ＭＣＳＰ「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、連結した軽鎖」（配列番号３、５、２９、１７９）をＣＤ３／ＭＣＳＰ「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３を参照）に対して比較した。簡潔には、標的細胞（ヒトＣｏｌｏ−３８、ヒトＭＶ−３又はＷＭ２６６−４メラノーマ細胞）を、アッセイの日に細胞解離緩衝液で（又はアッセイが開始された１日前にトリプシンで）回収し、洗浄し、適切な細胞培養培地、（２％ＦＣＳ及び１％グルタマックスを含むＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁した。ウェル当たり２００００−３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、各抗体希釈は指示されたように（三通り）添加された。エフェクター細胞としてのＰＢＭＣは、最終のエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比が１０：１となるように添加された。全ての構築物と対照が同じモル濃度に調整され、インキュベーション時間は２２時間であった。ＬＤＨ放出の検出と正規化は上述のように行った。

図４９から５２は、ＭＶ−３メラノーマ細胞（図４９）、Ｃｏｌｏ−３８細胞（図５０及び５１）又はＷＭ２６６−４細胞（図５２）で行った４つのアッセイの結果を示す。図４９に示すように、連結された軽鎖を有する構築物は、標的細胞としてＭＶ−３細胞を用いたアッセイにおいて連結された軽鎖の無いものに比較して弱かった。図５０及び５１に示すように、連結された軽鎖を有する構築物は、標的細胞として高ＭＣＳＰ発現性Ｃｏｌｏ−３８細胞を用いたアッセイにおいて連結された軽鎖の無いものに比較して強かった。最後に、図５２に示すように、高ＭＣＳＰ発現ＷＭ２６６−４細胞を標的細胞として使用したとき２つの構築物間に有意な差はなかった。

別の実験において、Ｃｒｏｓｓｆａｂ断片においてＶ領域（ＶＬ／ＶＨ，配列番号３３，６３，６５，６７を参照）又はＣ領域（ＣＬ／ＣＨ１，配列番号６５，６７，１８３，１９７を参照）のどちらかが交換された、２つのＣＥＡ標的化「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型」構築物が比較された。エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、及びヒトＣＥＡを発現する標的細胞を用いて上記のようにアッセイを実施した。標的細胞（ＭＫＮ−４５またはＬＳ−１７４Ｔ腫瘍細胞）を、トリプシン−ＥＤＴＡ（ＬｕＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃２５３００−０９６）で回収し、洗浄し、１％のグルタマックス（ＬｕＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃３５０５００８７）、２％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン＃４２４０４０４２）中で再懸濁した。ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、二重特異性構築物が指示された濃度で添加された。全ての構築物とそれに対応する対照のＩｇＧを、同じモル濃度に調整した。ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞は、最終のＥ：Ｔ比が１０：１を得るように添加され、インキュベーション時間は２８時間であった。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用して計算した。

図６１に示すように、ＣＬ／ＣＨ１交換を有する構築物は、ＶＬ／ＶＨ交換を有する構築物よりも、両方の標的細胞株においてわずかに良好な活性を示す。計算されたＥＣ５０値は、それぞれ、ＣＬ／ＣＨ１−交換構築物及びＶＬ／ＶＨ交換構築物について、それぞれＭＫＮ−４５細胞上で１１５及び２４３ｐＭ、及びＬＳ−１７４Ｔ細胞での６７３及び９５５ｐＭであった。

同様に、Ｃｒｏｓｓｆａｂ断片においてＶ領域（ＶＬ／ＶＨ，配列番号３３，１８９，１９１，１９３を参照）又はＣ領域（ＣＬ／ＣＨ１，配列番号１８３，１８９，１９３，１９５を参照）のどちらかが交換された、２つのＭＣＳＰ標的化「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ、反転型」構築物が比較された。エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、及びヒトＭＣＳＰを発現する標的細胞を用いて上記のようにアッセイを実施した。標的細胞（ＷＭ２６６−４）を、細胞解離緩衝液（ＬｕＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１３１５１０１４）で回収し、洗浄し、１％のグルタマックス（ＬｕＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃３５０５００８７）、２％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン＃４２４０４０４２）中で再懸濁した。ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、構築物が指示された濃度で添加された。全ての構築物とそれに対応する対照のＩｇＧを、同じモル濃度に調整した。ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞は、最終のＥ：Ｔ比が１０：１を得るように添加され、インキュベーション時間は２６時間であった。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用して計算した。

図６２に示すように、２つの構築物は同等の活性を示し、ＣＬ／ＣＨ１交換を持つ構築物はわずかに低いＥＣ５０値を有する（ＶＬ／ＶＨ交換の構築物についての１６．８ｐＭに比べＣＬ／ＣＨ１交換の構築物について１２．９ｐＭ）。

図６３は、ヒトＭＣＳＰを発現するＭＶ−３標的細胞を用いて実施した類似のアッセイの結果を示す。再び、両方構築物は同等の活性を示し、ＣＬ／ＣＨ１交換を持つ構築物はわずかに低いＥＣ５０値を有する（ＶＬ／ＶＨ交換の構築物のおよそ８２．２ｐＭに比べＣＬ／ＣＨ１交換の構築物のおよそ１１．７ｐＭ）。死滅曲線が化合物の高い濃度でプラトーに達しなかったため、正確なＥＣ５０値を計算することができなかった。

更なる実験において、ＣＤ３／ＭＣＳＰ「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３，５，２９，３３を参照）及び「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５，２９，３３，１８１を参照）構築物は、ＣＤ３／ＭＣＳＰ「１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ」（配列番号５，２３，１８３，１８５を参照）と比較された。アッセイは、上記のように、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣ、ＷＭ２６６−４又はＭＶ−３標的細胞（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）を用い、２１時間のインキュベーション時間で実施した。

図６４に示すように、このアッセイにおいて「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物は最も強力な分子であり、「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」及び「１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ」が続く。このランキングは、高ＭＣＳＰ発現性ＷＭ２６６−４細胞に比べ、中程度のレベルのＭＣＳＰを発現する、ＭＶ−３細胞で更にいっそう顕著である。計算されたＥＣ５０の値は、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」、「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」及び「１＋１ＣｒｏｓｓＭａｂ」のぞれぞれについて、ＭＶ−３では９．２，４０．９及び８８．４ｐＭ、ＷＭ２６６−４細胞では、３３．１，２８．４及び５３．９ｐＭであった。

更なる実験において、異なる濃度の「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂＬＣ融合」構築物（配列番号１８３，２０９，２１１，２１３）は、ＭＫＮ−４５またはＬＳ−１７４Ｔ腫瘍標的細胞及びヒトＰＢＭＣエフェクター細胞をＥＴ比を１０：１で用いて、２８時間のインキュベーション時間で試験された。図６５に示すように、「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂＬＣ融合」構築物はＭＫＮ−４５標的細胞で、計算されたＥＣ５０が２１３ｐＭでアポトーシスを誘導したが、一方ＬＳ−１７４Ｔ細胞では計算されたＥＣ５０は１．５６ｎＭであり、一定時間内における二重特異性構築物の効力に対する異なる腫瘍抗原発現レベルの影響を示している。

更に別の実験において、「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂＬＣ融合」構築物（配列番号１８３，２０９，２１１，２１３）は非標的化「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」分子と比較された。ＭＣ３８−ｈｕＣＥＡ腫瘍細胞とヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び２４時間のインキュベーション時間を用いた。図６６に示すように、「１＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂＬＣ融合」構築物は標的細胞のアポトーシスを、濃度依存的に誘導し、算出されたＥＣ５０値が約３．２ｎＭであった。これに対して、非標的化「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」は、最高濃度においてのみ標的細胞の抗原非依存性Ｔ細胞媒介性殺傷を示した。

最後の実験で、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ（Ｖ９）」（配列番号３，５，２９，３３）、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，反転型（Ｖ９）」（配列番号５，２３，１８３，１８７）、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ（抗ＣＤ３）」（配列番号５，２３，２１５，２１７）、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，反転型（抗ＣＤ３）」（配列番号５，２３，２１５，２１９）を、ヒトＭＣＳＰ陽性ＭＶ−３またはＷＭ２６６−４腫瘍細胞、及びヒトＰＢＭＣを用いて（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）、約２４時間のインキュベーション時間で比較した。図６７に示すように、「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ，反転型」構築物のＴ細胞媒介性殺傷は、両方のＣＤ３バインダーにおいて「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂｔ」構築物によって誘導されるものと等しいか又は僅かに強いように見える。算出されたＥＣ５０値は以下であった：

実施例７：
ＣＤ１０７ａ／ｂアッセイ
精製された「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物（配列番号５，１７，１９）及び「（ｓｃＦｖ）_２」分子は、双方ともヒトＭＣＳＰ及びヒトＣＤ３を標的とするが、ヒトＭＣＳＰ発現腫瘍細胞の存在下または非存在下で細胞内のパーフォリンレベルについて及びＣＤ１０７ａを上方制御するその潜在能力について、フローサイトメトリーによって試験した。

簡潔には、第一日に、ウェル当たり３００００のＣｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞を、丸底９６ウェルプレートに播種し、それらを付着させるために３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。説明したように、初代ヒトパンＴ細胞は、バフィーコートから１日目または２日目に単離した。

２日目に、ウェルあたり０１５万エフェクター細胞が最終Ｅ：Ｔ比が５：１となるように添加された。ＦＩＴＣがコンジュゲートしたＣＤ１０７ａ／ｂ抗体、並びに異なる二重特異性構築物及び対照が添加された。異なる二重特異性分子及び抗体を最終濃度９．４３ｎＭを得るように同モル濃度に調整し３７℃、５％ＣＯ_２での１時間のインキュベーション工程後に、モネンシンは、分泌を阻害するだけでなく、エンドソームおよびリソソーム内のｐＨを中和するために添加した。５時間の追加のインキュベーション時間の後、細胞は表面ＣＤ８発現について、３０分間、４℃で染色した。細胞を、染色緩衝液（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ）で洗浄し、固定し、ＢＤゴルジストップを含むＢＤＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍＰｌｕｓキット（ＢＤバイオサイエンス＃５５４７１５）を使用して２０分間透過処理した。細胞を１×ＢＤのＰｅｒｍ／洗浄緩衝液を用いて２回洗浄し、パーフォリンのための細胞内染色は、３０分間、４℃で行った。１×ＢＤのＰｅｒｍ／洗浄緩衝液での最終洗浄工程後、細胞をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩで分析した（全ての抗体は、ＢＤバイオサイエンス又はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した）。

示すように、ゲートは、全てのＣＤ１０７ａ／ｂ陽性細胞、パーフォリン陽性細胞又は二重陽性細胞の何れかで設定された（図４３）。「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物はＴ細胞を活性化し、標的細胞の存在下でのみＣＤ１０７ａ／ｂ及び細胞内のパーフォリンレベルを上方制御することができるが（図４３Ａ）、「（ｓｃＦｖ）_２」分子は標的細胞の存在下でもまたＴ細胞の活性化の（弱い）誘導を示している（図４３Ｂ）。二価の参照の抗ＣＤ３ＩｇＧは、「（ｓｃＦｖ）_２」分子又は他の二重特異性構築物と比較して活性化化合物のレベルの低下をもたらす。

実施例８：
増殖分析
精製された「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」（配列番号５，１７，１９）及び「（ｓｃＦｖ）_２」分子は、双方ともヒトＣＤ３及びヒトＭＣＳＰを標的とするが、ヒトＭＣＳＰ発現腫瘍細胞の存在下または非存在下でＣＤ８^＋又はＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を誘導するその潜在能力について、フローサイトメトリーによって試験した。

簡潔には、新たに単離したヒトパンＴ細胞を温かいＰＢＳ１ｍｌ当たり１００万個の細胞に調整し、１０分間、室温で１μＭのＣＦＳＥで染色した。染色液は、１０％ＦＣＳ及び１％グルタマックスを含むＲＰＭＩ１６４０培地を添加することによって倍増させた。更に２０分間、室温でインキュベーション後、細胞を残りのＣＦＳＥを除去するために予め温めた培地で３回洗浄した。ＭＣＳＰ陽性Ｃｏｌｏ−３８細胞を細胞解離緩衝液で回収し、計数し、そして生存率についてチェックした。細胞はＡＩＭ−Ｖ培地中でｍｌあたり０．２×１０^６（生存可能）細胞へと調整され、ウェル当たりこの細胞懸濁液の１００μｌを、（示されるように）丸底９６ウェルプレートにピペットで入れた。（希釈した）二重特異性構築物の５０μｌを細胞を含むウェルに加え、最終濃度１ｎＭを得た。ＣＦＳＥ染色したヒトパンＴエフェクター細胞を、ＡＩＭ−Ｖ培地１ｍｌ当たり２×１０^６（生存）細胞へと調整した。この細胞懸濁液５０μｌをアッセイプレート（上記参照）の各ウェルに添加し、最終Ｅ：Ｔ比：５：１を得た。二重特異性構築物が腫瘍抗原ｈｕＭＣＳＰを発現する標的細胞の存在下でのみＴ細胞を活性化できるかどうかを分析するために、ウェルには、それぞれの二重特異性分子の１ｎＭ、並びに標的細胞は無いがＰＢＭＣが含まれているウェルが含まれた。３７℃、５％ＣＯ_２で５日間インキュベートした後、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳを１５０μＬ／ウェルで２回洗浄した。ＣＤ８（マウスＩｇＧ１、κ；クローンＨＩＴ８ａ；ＢＤ＃５５５６３５）、ＣＤ４（マウスＩｇＧ１、κ；ＲＰＡ−Ｔ４；ＢＤ＃５６０６４９）又はＣＤ２５（マウスＩｇＧ１、κ；クローンＭ−Ａ２５１；ＢＤ＃５５５４３４）のための表面染色は供給業者の提案に従って、３０分間、４℃で行った。細胞を、０．１％ＢＳＡを含有する１５０μｌの／ウェルＰＢＳで２回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳの２００μｌ／ウェルに再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ装置（ＳｏｆｔｗａｒｅＦＡＣＳＤｉｖａ）を用いて分析した。相対的増殖レベルは、非増殖細胞の周りにゲートを設定し、そして参照として測定された全細胞数と比較してこのゲートの細胞数を用いて決定した。

図４４は、図４４は、すべての構築物は、「（ｓｃＦｖ）_２」分子に匹敵して標的細胞のみの存在下でのみ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（Ａ）又はＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｂ）の増殖を誘導することを示す。一般に、このアッセイでは活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞は活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも増殖する。

実施例９：
サイトカイン放出アッセイ
精製された「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物（配列番号５，１７，１９）及び「（ｓｃＦｖ）_２」分子は、双方ともヒトＭＣＳＰ及びヒトＣＤ３を標的とするが、腫瘍標的細胞の存在下または非存在下でサイトカインのＴ細胞媒介デノボ分泌を誘導するそれらの能力について分析した。

簡潔には、ヒトＰＢＭＣはバフィーコートから単離し、０．３×百万個の細胞を、丸底９６ウェルプレートに播いた。ヒトＭＣＳＰを発現するＣｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞が、最終的なＥＴ比１０：１を得るように添加した。二重特異性構築物及びＩｇＧ対照が１ｎＭ最終濃度で添加され、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。翌日、細胞を３５０×ｇで５分間遠心分離し、そして上清をその後の分析のため新しい深型ウェル９６ウェルプレートに移した。ＣＢＡ分析は、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ（ＢＤ＃５５１８０９）を用いて、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩのため製造業者の指示に従って行った。

図４５は、上清中に測定された様々なサイトカインのレベルを示す。標的細胞の存在下でＴ細胞の活性化の際に分泌される主要なサイトカインは、ＩＦＮ−γである。「（ｓｃＦｖ）_２」分子は「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物よりもＩＦＮ−γの僅かに高いレベルを誘導する。同様の傾向は、ヒトＴＮＦで見出される可能性があるが、このサイトカインの全体的なレベルは、ＩＦＮ−γに比べてはるかに低かった。標的細胞の存在（または非存在）下でＴ細胞の活性化の際に、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−１０およびＩＬ−４）の有意な分泌はなかった。Ｃｏｌｏ−３８標的細胞の非存在下で、ＴＮＦ分泌の非常に弱い誘導が観察され、それは「（ｓｃＦｖ）_２」分子で処理したサンプルで最高であった。

第二の実験では、ヒトＭＣＳＰおよびヒトＣＤ３を標的とする精製された以下の二重特異性構築物を分析した：「２＋１ＩｇＧＣｒｏｓｓｆａｂ」構築物（配列番号３、５、２９、３３）、「（ｓｃＦｖ）_２」分子、並びに野生型または変異型（示されているようにＬＡＬＡ、Ｐ３２９Ｇ及び／又はＮ２９７Ｄ）Ｆｃドメインの何れかを含む異なる「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」分子。簡潔には、健康なドナーからの２８０μｌの全血を、深型ウェルの９６ウェルプレートのウェルあたりに播いた。ヒトのＭＣＳＰを表現する３００００のＣｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞、並びに様々な二重特異性構築物及びＩｇＧ対照を１ｎＭの最終濃度で添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートし、次いで、３５０Ｘｇで５分間遠心分離した。その後の分析のために上清を新しい深型ウェルの９６ウェルプレートに移した。ＣＢＡ分析は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩについての製造業者の指示に従って、以下のＣＢＡフレックスセット(Flex Set)：ヒトグランザイムＢ（ＢＤ＃５６０３０４）、ヒトＩＦＮ−γフレックスセット（ＢＤ＃５５８２６９）、ヒトＴＮＦフレックスセット（ＢＤ＃５５８２７３）、ヒトＩＬ−１０フレックスセット（ＢＤ＃５５８２７４）、ヒトＩＬ−６フレックスセット（ＢＤ＃５５８２７６）、ヒトＩＬ−４フレックスセット（ＢＤ＃５５８２７２）、ヒトＩＬ−２フレックスセット（ＢＤ＃５５８２７０）の組み合わせを用いて実施した。

図４６は、上清中に測定された様々なサイトカインのレベルを示す。Ｃｏｌｏ−３８腫瘍細胞の存在下で分泌された主要なサイトカインは、ＩＬ−６、続いてＩＦＮ−γであった。加えて、標的細胞の存在下でＴ細胞の活性化の際に、グランザイムＢのレベルは非常に増加した。一般的に、「（ｓｃＦｖ）_２」分子は、標的細胞の存在下で高いレベルのサイトカインの分泌を誘導した（図４６、Ａ及びＢ）。標的細胞の存在（または非存在）下でＴ細胞の活性化の際に、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−１０およびＩＬ−４）の有意な分泌はなかった。

このアッセイにおいて、標的細胞の非存在下でさえも、異なる「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物により誘発されるＩＦＮ−γの弱い分泌があった（図４６、Ｃ及びＤ）。これらの条件下で、野生型または変異Ｆｃドメインを有する「２＋１ＩｇＧｓｃＦａｂ」構築物の間で有意な相違は観察できなかった。

前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。

Claims

一方がＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子であり、他方が標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第一及び第二の抗原結合部分、及び安定な会合が可能な第一及び第二のサブユニットからなるＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって；
第一の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常領域の何れかが交換されるクロスオーバーＦａｂ分子であり；
（ｉ）第二の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合し、かつ第一の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合し、又は（ｉｉ）第一の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合し、かつ第二の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合し；かつ
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ＣＤ３への特異的結合が可能な一以下の抗原結合部分を含む、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
第一及び第二の抗原結合部分、Ｆｃドメイン、及び任意選択的に１又は複数のペプチドリンカーから本質的になる、請求項１に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第三の抗原結合部分を含む、請求項１に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
第三の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合している、請求項３に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
第二及び第三の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に各々融合され、第一の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合している、請求項３又は４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
第一及び第三の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に各々融合され、第二の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合している、請求項３又は４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
第二及び第三の抗原結合部分及びＦｃドメインが、免疫グロブリン分子の一部である、請求項５に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
前記免疫グロブリン分子が、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである、請求項７に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
第一の抗原結合部分、第二の抗原結合部分、第三の抗原結合部分、及び安定な会合が可能な第一及び第二のサブユニットからなるＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
（ｉ）第一の抗原結合部分が、ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、第二及び第三の抗原結合部分が、各々標的細胞抗原への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり；
（ｉｉ）第一の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常領域の何れかが交換されるクロスオーバーＦａｂ分子であり；かつ
（ｉｉｉ）第二及び第三の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端へ各々融合している、かつ第一の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、２〜２０のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して、第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合している、又は
第一及び第三の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端へ各々融合している、かつ第二の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、２〜２０のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して、第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合している；かつ
（ｉｖ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、ＣＤ３への特異的結合が可能な一以下の抗原結合部分を含む、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
（ｉｉ）第一の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域が交換されるクロスオーバーＦａｂ分子である、請求項９に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
ＦｃドメインがＩｇＧのＦｃドメインである、請求項１から１０の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
ＦｃドメインがＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４のＦｃドメインである、請求項１から１１の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
ＦｃドメインがヒトのＦｃドメインである、請求項１から１２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第一及び第二のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項１から１３の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
Ｆｃドメインの第一のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第二のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能である第一のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、及びＦｃドメインの第二のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより、第一のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が配置可能である第二のサブユニット内のＣＨ３ドメイン内の空洞を生成する、請求項１４に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較して、ＦｃドメインがＦｃ受容体への結合親和性の低下、及び／又はエフェクター機能の低下を示す、請求項１から１５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる一以上のアミノ酸置換を含む、請求項１から１６の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
前記一以上のアミノ酸置換がＬ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９（ＥＵ番号付け）の群から選択される一以上の位置においてである、請求項１７記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性化Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）である、請求項１８に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体である、請求項１６から１９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
エフェクター機能が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項１６から１９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
標的細胞抗原が、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）からなる群から選択される、請求項１から２１の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
請求項１から２２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド。
請求項２３に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
発現ベクターである、請求項２４に記載のベクター。
請求項２３に記載の単離されたポリヌクレオチド、又は請求項２４又は２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
ａ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で請求項２６に記載の宿主細胞を培養し、ｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む、請求項１から２２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法。
請求項１から２２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
医薬としての使用のための、請求項１から２２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は請求項２８に記載の薬学的組成物。
必要としている個体における疾患の治療における使用のための、請求項１から２２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は請求項２８に記載の薬学的組成物。
疾患が癌である、請求項３０に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物。
必要としている個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１から２２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用。
疾患が癌である、請求項３２に記載の使用。
請求項１から２２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物の治療的有効量を含む、個体における疾患を治療するための医薬。
前記疾患が癌である、請求項３４に記載の医薬。
Ｔ細胞の存在下で標的細胞と接触させられる、請求項１から２２の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む、標的細胞の溶解を誘導するための薬剤。