KR101410521B1 - 다가 면역글로불린-계 생동성 어셈블리들 - Google Patents

다가 면역글로불린-계 생동성 어셈블리들 Download PDF

Info

Publication number
KR101410521B1
KR101410521B1 KR1020087017349A KR20087017349A KR101410521B1 KR 101410521 B1 KR101410521 B1 KR 101410521B1 KR 1020087017349 A KR1020087017349 A KR 1020087017349A KR 20087017349 A KR20087017349 A KR 20087017349A KR 101410521 B1 KR101410521 B1 KR 101410521B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
antigen
cancer
binding
antibodies
Prior art date
Application number
KR1020087017349A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20080097995A (ko
Inventor
치엔-싱 창
데이비드 골든버그
에드문드 로씨
Original Assignee
아이비씨 파마슈티컬스, 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2006/010762 external-priority patent/WO2006107617A2/en
Priority claimed from US11/389,358 external-priority patent/US7550143B2/en
Priority claimed from PCT/US2006/012084 external-priority patent/WO2006107786A2/en
Priority claimed from PCT/US2006/025499 external-priority patent/WO2007046893A2/en
Priority claimed from US11/478,021 external-priority patent/US7534866B2/en
Application filed by 아이비씨 파마슈티컬스, 인코퍼레이티드 filed Critical 아이비씨 파마슈티컬스, 인코퍼레이티드
Publication of KR20080097995A publication Critical patent/KR20080097995A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101410521B1 publication Critical patent/KR101410521B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6879—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin having two or more different antigen-binding sites, e.g. bispecific or multispecific immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Abstract

본 발명은 다중 작용기성들 및/또는 결합 특이성들을 가질 수 있는 정의된 조성물들의 안정적으로 묶여진 구조들에 대한 방법들 및 조성물들에 관한 것이다. 바람직한 실시예들은 하나 이상의 IgG 항체 단편들을 포함하며 단일특이성 또는 이중특이성일 수 있는 육량체의 안정적으로 묶여진 구조들에 관한 것이다. 개시된 방법들 및 조성물들은 거의 모든 작용기성 및/또는 결합 특이성의 안정적으로 묶여진 구조들을 획득하는 용이하고 일반적인 방법을 제공한다. 안정적으로 묶여진 구조들은 예를 들어, 암 또는 자가면역 질병의 치료를 위한 진단 및/또는 치료용으로 피검자들에게 투여될 수 있다. 안정적으로 묶여진 구조들은 약물들, 효소들, 방사성핵종들, 치료제들 및/또는 진단제들과 같은 다양한 알려진 작동체들과 결합하고/하거나 접합될 수 있다.
다가 면역글로불린-계 생동성 어셈블리들(multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies), 안정적으로 묶여진 구조(stably tethered structure), 이량체화 및 도킹 구역(dimerization and docking domain: DDD), 고정 구역(anchoring domain: AD), 모듈형 소단위체(modular subunit)

Description

다가 면역글로불린-계 생동성 어셈블리들{MULTIVALENT IMMUNOGLOBULIN-BASED BIOACITIVE ASSEMBLIES}
관련출원
본 출원은 2006년 3월 24일 출원된 PCT/US2006/010762; 2006년 3월 29일에 출원된 PCT/US2006/012084; 2006년 6월 29일 출원된 PCT/US2006/025499; 2006년 3월 24일에 출원된 미국 출원 번호 제11/389,358호; 2006년 3월 28일에 출원된 제11/391,584호 및 2006년 6월 29일에 출원된 제 11/478,021호의 일부 계속 출원이며; 상기 출원들은 2006년 3월 14일에 출원된 가출원인 미국 특허출원 제 60/782,332호; 2005년 10월 19일에 출원된 제60/728,292호 및 2005년 12월 16일에 출원된 60/751,196에 우선권을 주장하였다, 본 출원은 2005년 12월 16일에 출원된 가출원인 미국 특허출원 제60/751,196호 및 2006년 11월 6일에 출원된 제60/864,530호에 35 U.S.C. § 119(e)하의 우선권을 주장한다. 상기 인용된 출원들의 각각의 내용은 여기에 그대로 참고로 포함된다.
다중 기능들 또는 결합 특이성들을 가지는 항체-계 제제들의 생성을 위한 기존의 기술들은 수많은 제한들을 겪고 있다. 재조합 공학에 의하여 생성되는 작용제들에 대하여, 그러한 제한들은 높은 제조 비용, 낮은 발현 수율들, 혈청 불안정성, 응집체들(aggregates) 또는 해리되지 않은 소단위체들(subunits)의 형성으로 이어지는 용액의 불안정성, 다중 생성물 행태들의 존재로 인한 불확정한 배치 조성물, 오염된 부산물들, 입체 인자들 또는 변형된 입체구조들 등으로 기인하는 감소된 작용기 활성들 또는 결합 친화도/화합력(avidity)을 포함할 수 있다. 화학적 교차의 다양한 방법들에 의하여 생성된 작용제들에 대하여, 높은 제조 비용과 정제된 생성물의 불균질성은 두 가지 중요한 제한들이다.
최근에 하나 이상의 항원성 결정인자와 결합할 수 있는 항체들 또는 다른 결합 모이어티들(에피토프들이라고도 칭함)에의 관심이 증가해 왔다. 일반적으로, 자연발생적인 항체들과 모노클론성 항체들은 동일한 에피토프를 인식하는 두 가지 항원 결합 사이트들을 가진다. 이와는 달리, 이작용기성(bifunctional) 또는 이중특이성(bispecific) 항체들(이하, 이중특이성 항체들이라는 용어만 전체적으로 사용)은 두 가지 상이한 에피토프들과 결합할 수 있는 합성 또는 유전적으로 조작된 구조들이다. 따라서, 두 가지 상이한 항원 결정인자들과 결합하는 능력은 동일한 분자 구조체 내에 존재한다.
이중특이성 항체들은 수많은 생물의학적인 응용들에 유용하다. 예를 들어, 종양 세포 표면 항원과 T-세포 표면 수용체에 대한 결합 사이트들을 지닌 이중특이성 항체는 T 세포들에 의한 특이적인 종양 세포들의 용균을 지시할 수 있다. 신경아교종들을 인식하는 이중특이성 항체들과 T 세포들 상의 CD3 에피토프는 인간 환자들의 뇌 종양들을 치료하는 데 성공적으로 이용되어 왔다(Nitta, et al. Lancet. 1990; 355:368-371). 더 최근에는, "이중특이성 T-세포 인게이저 들(engagers)"(BiTEs)이라고 칭하는 이중특이성 항체들의 새로운 클래스는 생물학적 활성들에 대한 작동 세포들(effector cells)의 보충(recruitment)을 포함하는 대부분의 종양-표적 이중특이성 항체들의 제한들을 극복하는 것으로 보고되었다(Kufer, et al. Trends in Biotechnol. 2004; 22: 238-244). BiTe들은 표적 세포들 상 및 유연한(flexible) 폴리펩티드 링커를 통하여 직렬로 결합된 T 세포들 상의 CD3 상의 표면 항원에 대항하여 지시된 두 가지 상이한 단일-사슬 Fc 단편들(scFvs)로 구성된 재조합 이중특이성 단일-사슬 항체들이다(Mack, et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1995; 92: 7021-7025). BiTe들은 포유류 세포들 내에서 생성되며 다른 CD3-지시된 이중특이성 항체들과는 다르게 작동 T 세포들의 사전 또는 공통자극에 대한 임의의 요구조건 없이 표적 세포들을 죽이는 인간 말초 T 림프구들을 효과적으로 재지시할 수 있다(Mack, et al. J Immonol. 1997; 158: 3965-3970; Loffler, et al. Blood. 2000; 95: 2098-2103). 10 내지 100 pg/㎖(~0.1 내지 2 pM) 정도의 BiTE 농도들은 시험관 내에서의 최대반응의 절반값(half-maximal) 표적 세포 용균을 달성하기에 충분한 것으로 보여지며(Dreier, et al. Int J Cancer. 2002; 100: 690-697) 종양 성장은 쥐 모델들에서 마이크로그램 이하의 양으로 방지될 수 있다(Dreier, et al. J Immunol. 2003; 170: 4397-4404; Schlereth et al. Cancer Res. 2005; 65: 2882-2889).
이중특이성 항체들을 생성하는 수많은 방법들이 알려져 있다. 이중특이성 및 다중-특이성 항체들의 구성(construction)과 사용에 대한 방법들이 예를 들어 2004년 2월 11일에 출원된 미국특허출원공개 제20050002945호에 개시되어 있으며, 그것 의 전체 내용이 여기에 참고로 포함되어 있다. 이중특이성 항체들은 그 각각이 상이한 항원 사이트를 인식하는 모노클론성 항체를 생성하는 두 가지 상이한 혼성세포들(hydromas)의 융합을 포함하는 쿼드로마 방법에 의하여 생성될 수 있다(Milstein and Cuello, Nature, 1983; 305:537-540). 융합된 혼성세포들은 두 개의 상이한 중사슬과 두 개의 상이한 경사슬들을 합성할 수 있으며, 이들이 무작위로 결합하여 10 개의 상이한 항체 구조들의 불균질한 개체군을 내어 놓으며, 전체 항체 분자들의 1/8에 이르는 그들 중 하나만이 이중특이적이므로, 설령 가능하다 하더라도 비용 효과적이지 않을 다른 형태들로부터 더 정제되어야된다. 또한, 융합된 혼성세포들은 종종 양친 혼성세포들보다 세포유전학적으로 덜 안정적이기 때문에, 생성 세포 계통의 발생을 더 문제가 있는 것으로 만든다.
이중특이성 항체들을 생성하는 다른 방법은 두 개의 상이한 모노클론성 항체들을 화학적으로 묶는 불균질이작용기성(heterobifunctional) 가교제들을 사용하여, 그 결과로 생성한 혼성 접합체는 두 개의 상이한 표적들과 결합할 것이다(Staerz, et al. Nature. 1985; 314:628-631; Perez, et al. Nature. 1985; 316:354-356). 이러한 접근법에 의하여 발생된 이중특이성 항체들은 본질적으로 조직들로 서서히 확산하며 순환으로부터 급속히 제거되는 두 개의 IgG 분자들의 불균질한 접합체들이다. 이중특이성 항체들은 두 개의 양친 모노클론성 항체들의 각각이 각각의 절반 분자들(half molecules)로 환원되어 생성될 수도 있으며, 이후 이들이 혼합되어 재산화하여 혼성 구조를 얻는다(Staerz and Bevan. Proc Natl Acad Sci USA. 1986; 83:1453-1457). 다른 접근법은 적절한 링커들을 사용하여 화학적으 로 교차하는 두 개 또는 세 개의 따로 정제된 Fab의 단편들을 포함하는 것이다. 예를 들어, European Patent Application 0453082는 이(bi-) 또는 삼(tri-)특이성 항체-유사 구조들의 생성에 트라이-말레이미드(tri-maleimide) 화합물의 응용을 개시하였다. 연결 구조를 통하여 삼 또는 사 Fab 단편들을 서로서로 공유적으로 연결시켜 삼 및 사가 단일특이성 항원-결합 단백질들을 제제하는 방법은 U.S. Pat. No. 6,511,663에서 제공된다. 이러한 모든 화학적 방법들은 높은 제조 비용, 힘든 생산 과정, 광범위한 정제 공정들, 낮은 수율들(<20 %) 및 불균질한 생성물들로 인하여 상업적 발전에는 바람직하지 않다는 것이다.
다른 방법들은 레트로바이러스-유도된 셔틀 벡터들(shuttle vectors)을 통하여 선택가능한 상이한 표지들이 이후 융합되는 각각의 양친 혼성세포들로 유전자 도입되는 것에 의하거나(DeMonte, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1990, 87:2941-2945); 또는 상이한 항체의 중 및 경사슬 유전자들을 함유하는 발현 플라스미드들이 있는 혼성세포 세포 계통의 전달감염에 의하여 혼성세포들을 발생시키는 효율을 개선시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법들은 상술한 필연적인 정제 문제들과도 직면한다.
항체 중사슬 불변부의 영역(region)으로 삽입된 상보적인 상호작용 구역들(domains)에 의하여 회합하는 동일하거나 상이한 항체들로부터 Fab 단편들로 구성된 재조합 이중특이성 항체를 생성하는 방법은 U.S. Pat. No. 5,582,996에 기술되어 있다. 상보적인 상호작용 구역들은 상호적인 류신 지퍼들(reciprocal leucine zippers) 또는 하나가 양으로 일련의 양으로 전하된 아미노산 잔기들을 함유하고 다른 하나가 일련의 음으로 전하된 아미노산 잔기들을 함유하는 펩티드 펩티드 체절들의 한 쌍으로부터 선택된다. 그러한 방법의 한 가지 제한은 융합된 상보적인 상호작용 구역들을 함유하는 개별적인 Fab 소단위체들은 소단위체들 양쪽 모두가 조합되지 않는 한 그 표적 항원들에 대해 훨씬 감소된 친화도를 가지는 듯하다는 것이다.
재조합 DNA 기술에 의하여 생성된 항체들의 분리된 VH와 VL 구역들은 결합 능력을 지닌 이량체(재조합 Fv 단편)을 형성하도록 서로간에 쌍을 이룰 수 있다(U.S. Pat. No. 4,642,334). 그러나, 그러한 비-공유적으로 회합된 분자들은 임의의 실용적인 사용을 가지는 생리학적인 조건들 하에서 충분히 안정적이지 않다. 동족 VH와 VL 구역들은 결합 활성을 지닌 단일-사슬 Fv(scFv)을 형성하는 적절한 조성물과 길이(주로 12 개를 초과하는 아미노산 잔기들로 구성됨)의 펩티드 링커와 함께 이어질 수 있다. scFv들을 제조하는 방법들은 U.S. Pat. No. 4,946,778 및 U.S. Pat. No. 5,132,405에 개시되어 있다. 펩티드 링커의 길이를 12 개 미만의 아미노산 잔기들로 감소시키면 동일한 사슬 상에 VH와 VL 구역들의 짝짓는 것을 방지하고 다른 사슬들 상의 상보적인 구역들을 지닌 VH와 VL 구역들이 강제로 짝짓게 하여, 작용성 다합체들을 형성하게 한다. 3 내지 12 개의 아미노산 잔기들 사이의 링커로 이어진 VH와 VL 구역들의 폴리펩티드 사슬들은 현저하게는 이량체들(다이어바디들(diabodies)로 칭함)을 형성한다. 0 내지 2 개의 아미노산 잔기들 사이의 링커 들과 함께, 삼합체들(트리어바디(triabody)로 칭함)과 사합체들(테트라바디(tetrabody))가 선호되지만, 정확한 올리고머화의 패턴들은 조성물뿐만 아니라 V-구역들(VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH)의 배향성, 거기에 더하여 링커 길이에 의존하는 듯하다.
단일특이성 다이어바디들, 트리어바디들 및 다가성들을 지닌 테트라바디들은 5 개의 이하의 아미노산 잔기들로 구성된 펩티드 링커들을 사용하여 구해진다. 짧은 펩티드 링커에 의하여 연결된 하나의 항체로부터 VH 구역 내지 다른 항체의 VL 구역으로 구성된 각각의 scFv인 두 개의 상이한 scFv들의 이형이량체들인 이중특이성 다이어바디들도 하나의 시스트론에는 VH1-링커-VL2를 포함하는 재조합 유전자 구조체를 함유하고 다른 시스트론에는 VH2-링커-VL1을 포함하는 제 2 조합 유전자 구조체를 함유하는 이시스트론성(dicistronic) 발현 벡터를 사용하여 제작될 수 있다(Holliger, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90: 6444-6448; Atwell, et al. Mol Immunol. 1996; 33:1301-1302; Holliger, et al. Nature Biotechnol. 1997; 15: 632-631; Helfrich, et al. Int. J Cancer. 1998; 76: 232-239; Kipriyanov, et al. Int J Cancer. 1998; 77: 763-772; Holliger, et al. Cancer Res. 1999; 59: 2909-2916).
더 최근에는, 이중특이성이 있는 사가 직렬 다이어바디(탠댑(tandab)이라 칭함)도 보고되었다(Cochlovius, et al. Cancer Res. 2000; 60: 4336-4341). 이중특이성 탠댑은 두 개의 동일한 폴리펩티드들의 이량체로서, 그 각각은 자체-회합시에 두 가지 상이한 특이성들의 각각에 대한 두 개의 잠재적인 결합 사이트들의 형성을 용이하게 하는 배향성으로 연결된 두 개의 상이한 항체들(VH1, VL1, VH2, VL2)의 네 개의 변이 구역들을 함유한다.
지금까지, 이중특이성 또는 삼중특이성 트리아바디들을 발현시키는 벡터를 구조하는 것은 달성되지 않았다. 그러나, 콜렉틴 목 영역(collectin neck region)을 포함하는 폴리펩티드들은 삼이량체화하는 것으로 보고되었다(Hoppe, et al. FEBS Letters. 1994; 344: 191-195). 콜렉틴의 목 영역을 함유하는 융합 단백질들로부터 단형삼량체들(homotrimers) 또는 이형삼량체들(heterotrimers)의 생성은 U.S. Pat. No. 6,190,886에 개시되어 있다.
링커 길이를 달리하여 다가 및 다중특이성의 scFv-계 작용제들을 제조하는 방법들이 U.S. Pat. No. 5,844,094, U.S. Pat. No. 5,844,094, U.S. Pat. No. 5,837,242 및 WO98/44001에 개시되어 있다. 폴리펩티드 사슬 중 하나는 적어도 두 개의 항체들로부터 VH 구역들을 포함하고 나머지 하나는 해당 VL 구역들을 포함하는 두 개의 폴리펩티드 사슬들을 구성하여 다가 및 다중특이성의 scFv-계 작용제들을 제조하는 방법들은 U.S. Pat. No. 5,989,830과 U.S. Pat. No. 6,239,259에 개시되어 있다. 종래 기술 방법들에 의하여 다가 및 다중특이성의 scFv-계 작용제들을 발생시키는 것과 관련된 종종 발생하는 공통적인 문제들은 낮은 발현 레벨들, 불균질한 생성물 형태들, 응집체로 되는 용액의 불안정성, 혈청의 불안정성 및 손상된 친화도이다.
Fab의 CH1과 CL의 c-말단들이 동일하거나 상이한 모노클론성 항체들로부터 유도된 scFv로 각각 융합되는 재조합으로 생성된 이특이성 또는 삼중특이성 항체는 U.S. Pat. No. 6,809,185에 기술되어 있다. 이러한 "트리어바이" 기술의 중요한 결점들은 부가되는 scFv들의 손상된 결합 친화도, 생성물 형태들의 불균일성 및 응집 되는 용액의 불안정성을 포함한다.
따라서, 정의된 조성물, 균일한 순도 및 불변성 친화도의 단일특이성 또는 다중 특이성들 또는 작용기성들(functionalities) 중 어느 하나의 다가 구조들을 제작하고 광범위한 정제 단계들을 요하지 않으면서 높은 수율로 생성될 수 있는 방법에 대한 업계의 요구가 여전히 존재한다. 또한, 그러한 구조들은 생체 내 응용들이 가능할 수 있을 만큼 혈청 내에서 충분히 안정도 되어야 한다. 구조하고/하거나 상대적으로 순수한 형태로 얻기가 쉬운 단일특이성 또는 다중 특이성들 또는 작용기성들의 안정한 다가 구조들에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 단일특이성 및/또는 단기능성일 수 있거나 다중 작용성 또는 결합 특이성들을 가질 수 있고 시험관 내뿐만 아니라 생체 내 응용에 적당한 안정적으로 묶여진 구조들을 발생시키는 기반 기술(platform technology)을 개시한다. 바람직한 실시예들에서, 그러한 안정적으로 묶여진 구조들은 하나는 이량체화 및 도킹 구역(dimaerization and docking domain: DDD)과 나머지 하나는 고정 구역(anchoring domain: AD)인 두 개의 상이한 펩티드 서열들 사이의 특이적인 상호작용들을 통하여 여기에 A와 B로 칭해진 두 개의 성분들의 복합체들로서 생성된다. 더 바람직한 실시예들에서, 상기 DDD 서열들(도 1에서 DDD1과 DDD2에 대해 도시됨)은 cAMP-의존성 단백질 키나아제(PKA)의 조절(R) 소단위체들로부터 유래하며, 상기 AD 서열들(도 2에서 AD1과 AD2에 대해 도시됨)은 PKA의 R 소단위체들과의 화합을 매개하는 다양한 A-키나아제 고정 단백질들(AKAPs)에서 발견되는 특이적 영역으로부터 유래한다. 그러나, 당업자는 다른 이량체화 및 도킹 구역들 및 고정 구역들이 알려져 있으며 그러한 임의의 알려진 구역들이 청구된 당해 사항의 범위 내에 이용될 수 있음을 알 것이다. 개시된 방법들과 조성물들은 상기 DDD/AD 연결 시스템(coupling system)을 지닌 임의의 두 개의 복합체들의 사이트-지시된 공유 또는 비-공유 화합을 가능하게 한다. 상기 DDD의 구조적 특성인 X-형 네 개의 나선 번들 이량체화 모티프(X-type four helix bundle dimerization motif)는 S100 단백질들(예를 들어, S100B 및 캘시클린(calcyclin)) 및 전사 인자들의 간세포 핵인자(HNF) 과(예를 들어, HNF-1α 및 HNF-1β)와 같은 다른 클래스의 단백질들에서 발견된다. S100 단백질들은 종양발생과 같은 생물학적 활성들을 가지는 것과 같이, 이들은 그러한 이용에 바람직하지 않을 수 있다.
신호 전달 또는 전사 활성화 중 어느 하나에 관련된 300 종이 넘는 단백질들은 이량체화 계면 상에 존재하는 X-형 네 개의 나선 번들의 변이를 가진 멸균 α 모티프(SAM)로 칭해진 65 내지 70 개의 아미노산들의 모듈을 함유한다. S100B에 대하여, 이러한 X-형 네 개의-나선 번들은 마이크로몰 친화도를 지닌 c-말단 조절 구역(367 내지 388 개의 잔기들)으로부터 유래한 두 개의 p53 펩티드들에 각각의 이량체가 결합되는 것을 가능하게 한다(Rustandi, et al. Biochemistry. 1998; 37:1951 - 1960). 유사하게는, HNF-1α의 N-말단 이량체화 구역은 HNF-p1의 이량체를 통하여 DCoH(HNF-1에 대한 이량체화 공통인자)의 이량체와 화합하는 것을 보였다(Rose, et al. Nature Struct Biol. 2000; 7: 744-748). 다른 실시예들에서, 이러한 자연발생적 시스템들은 청구된 방법들 및 조성물들 내에서 이용되어 다중 작용성 또는 결합 특이성들을 지닌 안정한 다합체 구조들을 제공할 수 있다. 예를 들어, 큐티나제와 포스포산염들과 같은 효소와 그 기질/억제제 사이의 다른 결합 사건들도 이용되어 이후에 공유적으로 안정화되는("잠금" 단계) 두 개의 화합하는 성분들을 발생시킬 수 있다("도킹" 단계).
잠재적으로 이용되는 다른 AD 서열들은 특허 출원 계열 번호. US20003/0232420A1에서 찾을 수 있으며, 그 전체 내용이 여기에 참고로 포함되어 있다.
대표적인 실시예들에서, 이원 복합체의 일 성분인 A는 스페이서 기를 통한 재조합 공학 또는 화학적 접합에 의하여 A라고 칭해지는 A의 전구체와 DDD 서열을 연결시켜 생성되어, 이하 a라고 칭해지는 A/DDD의 구조가 생성된다. a의 DDD 서열이 이량체의 동시적 형성을 달성하기 때문에, 따라서 A는 a 2 로 구성되어 있다. 이원 복합체의 나머지 다른 성분인 B는 스페이서 기를 통한 재조합 공학 또는 화학적 접합에 의하여 B라고 칭해지는 B의 전구체와 AD 서열을 연결시켜 생성되어, 이하 b라고 칭해지는 B/AD의 구조가 생성된다. a 2 에 함유된 이량체 구조는 b에 함유된 AD 서열과 결합하는 도킹 사이트를 만들어 낸다는 사실로 인하여 a 2 와 b가 용이하게 화합하게 하여 a 2 b로 구성된 이원 복합체를 형성한다. 다양한 실시예들에서, 이러한 결합 사건은 후속 반응으로 더 안정화되어 예를 들어, 이황화물 다리들(disulfide bridges)을 통하여 최초 결합 상호작용들이 반응성 티올기들을 사이트-특이적으로 결찰시키는 것처럼 흔히 효율적으로 발생하는 조립체(assembly)의 두 가지 성분들을 공유적으로 고정시킨다.
DDD와 AD 서열들 양쪽 내의 전략적 위치들에 시스테인 잔기들을 배치함으로써(DDD2 및 AD2에 대하여 도시된 바와 같음), a2 및 b 사이의 결합 상호작용이 이황화물 다리들을 통하여 공유적으로 이루어져, 생체 내 응용들을 더 개연성 있게 만드는 안정적으로 묶여진 구조를 형성할 수 있다. 안정적으로 묶여진 구조는 A와 B 두 개의 전구체들의 전체 작용기 특성들도 유지한다. 본 발명자들은 이러한 독특한 특성들이 조합된 종래 기술 이중특이성 조성물을 알고 있지 않다. 상기 개시된 설계는 선택된 두 개의 전구체들 각각이 DDD 또는 AD중 어느 하나에 연결되고 이후 조합될 수 있는 것처럼, 자연적으로 모듈형식이다. 두 개의 전구체들은 또한 동일(A = B)하거나 상이(A ≠ B)할 수 있다. A = B인 경우, 그 결과로 나온 a 2 b 복합체는 이하 a 3 로 칭해지는 3 개의 소단위체들의 안정적으로 묶여진 조립체로 구성되어 있다. 전구체들로 적합한 물질들은 단백질들, 펩티드들, 펩티드 모방체들, 폴리뉴클레오티드들, RNAi, 올리고당류, 천연 또는 합성 고분자 물질들, 나노파티클들, 퀀텀 닷들(quantum dots) 및 유기 또는 무기 화합물들을 포함한다. 잠재적인 전구체들의 다른 비-한정적 예들은 하기 표 6 내지 10에 수록되어 있다.
구성 소단위체들의 해리를 방지하기 위하여 이황화물 다리들을 사용하는 것에 더하여, 안정적으로 묶여진 구조의 전체 안정도를 향상하는 다른 방법들이 실시될 수 있다. 예를 들어, 상용가능하거나 연구에 이용되는 다양한 가교제들 또는 방법들이 그러한 목적들을 위하여 선택될 수 있다. 잠재적으로 유용한 작용제는 구성 소단위체들을 교차 결합시켜 안정한 접합체들을 형성하는 비-공유적으로 화합된 다합체 단백질들의 구조들을 조사하는 데 광범위하게 사용되는 글루타알데히드이다(Silva, et al. Food Technol Biotechnol. 2004; 42:51-56). 단백질 소단위체들의 산화적 교차 결합을 포함하는 두 가지 화학적 방법들도 중요하다. 그 한가지는 헥사히스티딘-표적된(hexahistidine-tagged) 단백질들(Fancy, et al. Chem Biol. 1996; 3:551-559) 또는 N-말단 글리신-글리신-히스티딘-표적된 단백질들(Brown, et al. Biochemistry. 1998; 37:4397-4406) 중 어느 하나를 채용하는 근접 라벨링 기법이다(proximity labeling technique). 이러한 꼬리표들은 Ni(II)를 단단히 결합시키고, 과산(peracid)으로 산화되는 경우에, 단백질-단백질 교차 결합을 포함하여, 다양한 산화 반응들을 매개할 수 있는 Ni(III) 종이 생성된다. PICUP(비변형 단백질들의 광-유도(photo-induced) 교차 결합)로 칭해지는 다른 기법은 [Ru(II)(bipy)3]2+, 과황산 암모늄 및 가시광선을 이용하여 단백질-단백질 교차 결합을 유도한다(Fancy and Kodadek. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96:6020-6024). 그러나, 하기에 서술되는 바와 같이, 화학적으로 교차 결합하는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 다른 매크로분자 종들에 대한 수많은 방법들이 업계에 알려져 있으며 그러한 임의의 알려진 방법이 이용되어 이원 a 2 b 복합체를 공유적으로 안정화시킬 수 있다.
더 바람직한 실시예들에서, 하기 예 23 내지 35에 상세히 개시된 단일특이성 또는 이중특이성 중 어느 하나인 육량 복합체들이 형성될 수 있다. 예를 들어, 도 10, 도 11 및 도 13에 개시된 그러한 복합체들은 IgG 모이어티들의 C- 또는 N-터미널 말단들의 각각에 하나의 AD2를 부착시킨 후, 이후 DDD2-접합된 Fab 단편들 또는 다른 DDD2-접합된 항체들 또는 항체 단편들에 접합하여 육량 복합체를 형성할 수 있도록 함으로써 형성될 수 있다. 예 23 내지 35에 서술된 바와 같이, 그러한 단일특이성 또는 이중특이성 육량 복합체들은 양친 항체들 또는 단편들과 비교하여 더 높은 결합 친화도와 증가된 효능을 보인다. 그러나, 당업자는 상기 예들이 한정적이지 않으며 다양한 항원-결합 또는 다른 작용성 모이어티들이 표 6 내지 10에서 부분적으로 서술되어 있는 개시된 육량 구조들로 포함될 수 있다는 것을 알 것이다.
당업자는 상술한 사항이 IgG 또는 Fab 단편들을 언급하는 곳에서, 하기에서 상세히 토의되는 다른 유형의 항체들, 항체 단편들 또는 비-항체 단백질들이 대체될 수 있음을 알 것이다. 안정적으로 묶여진 구조들은 항원-결합 성분들 및/또는 작동체 성분들(effector components)의 다양한 조합들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 활성화된 혈소판과 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)와 반응하는 이중특이성 항체는 혈소판 응집을 억제함으로써 혈전 형성 더 방지할 뿐만 아니라 내생성 tPA를 혈소판 표면에 첨가하여 기존의 혈전을 용해시킬 수 있다(Neblock et al., Bioconjugate Chem. 1991, 3:126-31). 독소(리보뉴클레아제와 같은)에 연결된 인터널라이징 종양 화합된 항원(CD74와 같은)에 대항하여 다가의 항체 결합 성분을 포함하는 안정적으로 묶여진 구조는 표적 종양 세포를 파괴하는 독소의 선택적 전달에 중요할 수 있다. IL-4R을 위한 수용체의 용해성 성분(sIL-4R)과 IL-13을 위한 수용체의 용해성 성분(sIL-13R)을 포함하는 안정적으로 묶여진 구조는 천식이나 알레르기를 치료하는 잠재적인 치료제일 수 있다. 항-GPIIb/IIIa Fab 단편들로 구성된 육량체의 단일특이성 안정적으로 묶여진 구조는 높은 결합 화합력으로 인하여 일가(ReoPro, Centocor) 또는 이가 유사체들보다 혈전 형성 방지에 더 효과적이어야 한다. TNFα-R의 용해성 성분의 다중 복제물을 포함하는 안정적으로 묶여진 구조는 류마티스성 관절염과 몇몇 다른 자가면역성 질병들(AID)의 치료에서 Enbrel(Amgen)보다 TNF를 저지시키는 데 더 효과적이어야 한다.
청구된 방법들과 조성물들은 안정적으로 묶여진 구조에 연결된 하나 이상의 작동체들 또는 담체들로 구성된 접합체들도 포함한다. 상기 작동체들 또는 담체들은 하기에 더 기술되는 바와 같이, 예를 들어, 질병-관련된 표적에 대한 제 1 특이성 및 작동체 및/또는 작동체(들)에 연결된 합텐(hapten)에 대한 제 2 특이성으로 화학적 교차 또는 이중특이성 또는 다중 특이성 안정적으로 묶여진 구조에 결합함으로써 안정적으로 묶여진 구조에 비-공유적 또는 공유적으로 연결될 수 있다. 의도된 응용들에 따라, 작동체는 진단제, 치료제, 화학 치료제(chemotherapeutic agent), 방사성동위원소, 영상 제제(imgaing agent), 항혈관형성제, 시토카인, 케모카인(chemokine), 성장 인자, 약물, 전구약물, 효소, 결합 분자, 세포 표면 수용체를 위한 리간드, 킬레이트제, 면역조절물질(immunomodulator), 올리고뉴클레오티드, 호르몬, 광검출성 표지(photodetectable label), 염료, 펩티드, 독소, 조형제(contrast agent), 상자성 표지(paramagnetic label), 초음파 표지(ultrasound label), 프로-아팝토틱제(pro-apoptotic agent), 리포솜, 나노파티클 또는 그 조합으로부터 선택될 수 있다. 또한, 접합체는 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 작동체 또는 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 담체를 함유할 수 있다. 작동체들과 담체들은 동일한 접합체 내에 존재할 수도 있다. 작동체가 킬레이트제일 경우, 그 결과적인 접합체는 방사성 또는 비-방사성일 수 있는 금속과 통상적으로 더 복합된다. 담체들을 함유하는 접합체들은 의도된 응용들을 위하여 진단 또는 치료 기능의 약제들과 더 포함되기도 한다.
몇몇 실시예들에서, 작동체들 또는 담체들은 예를 들어, 하기에 서술된 사전-표적 전략들에서 안정적으로 묶여진 구조 이후에 피검자에게 투여될 수 있다. 안정적으로 묶여진 구조는 상기 피검자에게 우선 투여되어 예를 들어, 종양과 같은 병든 조직 내에 모이게 된다. 작동체들 또는 담체들이 이후에 첨가되어 상기 모여있는 안정적으로 묶여진 구조와 결합하게 된다. 작동체 또는 담체가 방사성 핵종과 같은 독성 모이어티에 접합되는 곳에, 이러한 사전표적 방법은 피검자의 독성에의 전신성 노출을 감소시켜, 표적된 조직에 독성 제제의 비례적으로 더 많은 전달을 가능하게 한다. 선택적으로, 표적가능한 구조체의 투여 이전에 비-국소적인 안정적으로 묶여진 구조들을 순환으로부터 제거하기 위하여 제거제(clearing agent)가 투여될 수 있다. 이러한 방법들은 업계에 알려져 있으며 U.S. Pat. No. 4,624,846 및 Sharkey et al., Int. J. Cancer 51:266(1992)에 상세히 기술되어 있다. 대표적인 표적가능한 구조체는 X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2의 구조를 가질 수 있으며, 상기 화합물은 X 또는 Y에서 굳은 산 양이온 킬레이트제(hard acid cation chelator) 및 나머지 X 또는 Y에서 무른 산(soft acid) 양이온 킬레이트제를포함할 수 있으며, 상기 화합물은 적어도 하나의 진단 또는 치료 양이온 및/또는 하나 이상의 킬레이트화되거나 화학적으로 결합된 치료제들, 진단제들 또는 효소들을 더 포함한다. 상기 진단제는 예를 들어, Gd(III), Eu(III), Dy(III), Pr(III), Pa(IV), Mn(II), Cr(III), Co(III), Fe(III), Cu(II), Ni(II), Ti(III), V(IV) 이온들이나 라디칼일 수 있다. 제 2 대표적인 구조체는 X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2의 공식일 수 있으며, 상기 화합물은 X 또는 Y에서 굳은 산 양이온 킬레이트제 또는 무른 산 양이온 킬레이트제를 포함한다, 그리고 나머지 X 또는 Y에서 아무것도 포함하지 않는다; 그리고 상기 화합물은 적어도 하나의 진단 또는 치료 양이온, 및/또는 하나 이상의 킬레이트되거나 화학적으로 결합된 치료제들, 진단제들 또는 효소들을 더 포함한다. 그러한 실시예들에서, A 소단위체는 예를 들어, 종양 관련 항원들에 대한 결합 사이트들을 함유할 수 있는 반면에, B 소단위체는 작동체 또는 담체 또는 작동체 또는 담체에 접합된 합텐에 대한 결합 사이트를 함유할 수 있다.
그 접합체들을 포함하여, 본 발명의 안정적으로 묶여진 구조들은 광범위한 치료 및 진단 응용들에 사용되기에 적합하다. 예를 들어, 항체 결합 구역들에 기초한 육가 구조체들은 나출된 항체(naked antibody)를 이용하는 치료요법과 동일한 방식으로 그러한 구조체가 다른 기능성 작용제(functional agent)에 접합되지 않는 치료요법에 이용될 수 있다. 또한, 이러한 안정적으로 묶여진 구조들은 진단 또는 치료 응용을 할 수 있도록 하나 이상의 기능성 작용제들로 유도될 수 있다. 기존의 접합 화학을 이용하여 다른 작용제가 안정적으로 묶여진 구조들에 공유적으로 연결될 수 있다.
안정적으로 묶여진 구조들의 사용 방법들은 질병 또는 다른 의료 질환의 검출, 진단 및/또는 치료를 포함할 수 있다. 그러한 질환들은 암, 심혈관 질병, 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 중풍, 신경변병적 질환, 알츠하이머 병, 대사성 질환, 이상증식, 당뇨병성 망막증, 황반변성, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 천식, 부종, 폐 고혈압, 건선, 각막 이식 거부반응, 혈관신생성 녹내장, 오슬러-웨버 증후근(Osler-Webber Syndrome), 심근 혈관형성(myocardial angiogenesis), 플라크 혈관신생(plaque neovascularization), 재발협착증, 혈관 손상 이후의 신내막 형성, 모세혈관확장증, 혈우병성 관절(hemophiliac joints), 혈관 섬유종, 만성 염증과 관련된 섬유증, 폐 섬유화증, 아밀로이드증, 장기 이식 거부반응, 심부 정맥 혈전증 또는 상처 과립화(wound granulation)을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
특정한 실시예들에서, 개신된 방법들 및 조성물들은 급성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 만성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 피부근육염, 시데남무도병(Sydenham's chorea), 중증근무력증, 전신 홍반 루프스, 루프스신염, 류마티스열, 다선성 증후근(polyglandular syndromes), 수포성 유천포창, 소아 당뇨병, 헤노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura), 후기-연쇄상구균신장염(post-streptococcalnephritis), 결절 홍반(erythema nodosurn), 다카야스 동맥염(Takayasu's arteritis), 애디슨병, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 사르코이드증, 궤양성 대장염, 다형 홍반, IgA 신장병증, 결절성 다발성 동맥염, 강직성 척추염, 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome), 폐색성 혈전맥관염(thromboangitisubiterans), 쇠그랜 증후근(Sjogren's syndrome), 원발성 담즙성 간경변증, 하시모토 갑상선종(Hashimoto's thyroiditis), 갑상선중독증, 피부경화증, 만성 활동성 간염, 다발성근육염/피부근육염, 다연골염, 심상성천포창, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 막성 신장병증, 근위축성 측삭 경화증, 척수로, 거대 세포 동맥염/다발성 근육통, 악성 빈혈, 급성 전진성 사구체신염(rapidly progressive glomerulonephritis), 건선 또는 섬유성 폐포염과 같은 자가면역성 질병의 치료에 유용할 수 있다.
다양한 실시예들은 염증성 및 면역-이상조절성 질환들(immune-dysregulatory diseses), 감염성 질병들, 병리학적 혈관형성(pathologic angiogenesis) 또는 암을 치료하는 방법들에 관한 것일 수 있다. 본 응용에서 안정적으로 묶여진 구조들은 (A) 선천 면역 체계의 전구염증 작동체들(proinflammatory effectors of the innate immune system), (B) 응고 인자들, (C) 보체 인자들 및 보체 조절 단백질들 및 (D) 다음 표적(latter target)이 (A), (B) 또는 (C)가 아닌 염증성 또는 면역-이상조절성 장애 또는 병리학적 혈관형성 또는 암과 특이적으로 관련된 표적들로 구성된 군으로부터 선택된 두 개의 상이한 표적들과 결합한다. 표적들 중 적어도 하나는 (A), (B) 또는 (C)이다. 적당한 표적들의 조합들은 "면역치료요법 및 염증성 및 면역-이상조절성 질환, 감염성 질병, 병리학적 혈관형성 및 암)이라는 제목의 2005년 12월 8일에 출원된 미국특허출원 제11/296,432호에 기술되어 있으며, 그 내용들이 여기에 그대로 참고로 포함되어 있다. 결합 분자들이 결합하는 선천성 면역 체계의 전구염증 작동체는 전구염증 작동체 시토카인, 전구염증 작동체 케모카인 또는 전구염증 작동체 수용체(proinflammatory effector receptor)일 수 있다. 적당한 전구염증 작동체 시토카인들은 MIF, HMGB-1(높은 이동성 군 박스 단백질 1), TNF-α, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15 및 IL-18을 포함한다. 전구염증 작동체 케모카인들의 예들은 CCL19, CCL21, IL-8, MCP-1, RANTES, MIP-1A, MIP-1B, ENA-78, MCP-1, IP10, GROB 및 에오탁신(Eotaxin)을 포함한다. 전구염증 작동체 수용체들은 IL-4R(인터류킨-4 수용체), IL-6R(인터류킨-6 수용체), IL-13R(인터류킨-13 수용체), IL-15R(인터류킨-15 수용체) 및 IL-18R(인터류킨-18 수용체)를 포함한다.
결합 분자는 적어도 하나의 응고 인자, 특히 조직 인자(TF) 또는 트롬빈과 특이적으로 반응할 수도 있다. 다른 실시예들에서, 결합 분자는 적어도 하나의 보체 인자 또는 보체 조절 단백질과 특이적으로 반응한다. 바람직한 실시예들에서, 보체 인자는 C3, C5, C3a, C3b 및 C5a로 구성된 군으로부터 선택된다. 결합 분자가 보체 조절 단백질과 특이적으로 반응하는 경우, 보체 조절 단백질은 바람직하게는 CD46, CD55, CD59 및 mCRP로 구성된 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시예들에서, 안정적으로 묶여진 구조들은 암의 치료에 유용할 수 있다. 임의의 유형의 종양과 임의의 유형의 종양 항원이 표적될 수 있다고 기대된다. 표적될 수 있는 대표적인 유형의 종양들은 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담도암, 유방암, 경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결직장암, 자궁내막암, 식도, 위, 두경부암, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 폐암, 갑상선 수질암, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신암, 난소암, 췌장암, 신경아교종, 간암, 전립선암 및 방광암을 포함한다.
표적될 수 있는 종양-관련된 항원들은 탄산 무수화효소 IX, A3, A33 항체에 특이적인 항원, BrE3-항원, CD1, CD1a, CD3, CD5, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD45, CD74, CD79a, CD80, HLA-DR, NCA95, NCA90, HCG 및 그 소단위체들, CEA(CEACAM-5), CEACAM-6, CSAp, EGFR, EGP-1, EGP-2, Ep-CAM, Ba 733, HER2/neu, 저산소증 유도 인자(HIF), KC4-항원, KS-1-항원, KS1-4, Le-Y, 대식세포 저해 인자(MIF), MAGE, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, PAM-4-항원, PSA, PSMA, RS5, S100, TAG-72, p53, 테나신(tenascin), IL-6, IL-8, 인슐린 성장 인자-1(IGF-1), Tn 항원, 톰슨-프리덴라이히 항원들(Thomson-Friedenreich antigens), 종양 괴사 항원들, VEGF, 태반 성장 인자(PIGF), 17-1A-항원, 혈관형성 표지(예컨대, ED-B 피브로넥틴), 암유전자 표지, 암유전자 생성물 및 다른 종양-관련된 항원들을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 종양 관련된 항원들에 관한 최근의 보고들은 Mizukami et al., (2005, Nature Med. 11:992-97); Hatfield et al., (2005, Curr . Cancer Drug Targets 5:229-48); Vallbohmer et al. (2005, J. Clin . Oncol . 23:3536-44); 및 Ren et al. (2005, Ann . Surg . 242:55-63)을 포함하며, 각각은 여기에 참고로 포함되어 있다. 특히 바람직한 실시예들은 CD20 또는 CD22를 위한 결합 사이트들이 있는 육가의 단일특이성 구조체들에 관한 것일 수 있다. 다른 바람직한 실시예들은 CD20 또는 CD22를 위한 결합 사이트들이 있는 육가의 이특이성 구조체에 관한 것일 수 있다.
다른 실시예들은 제 2 전구체의 결합 사이트가 림프구 항원과 결합하고, 제 1 전구체의 결합 사이트가 동일하거나 상이한 림프구 항원과 결합하는 안정적으로 묶여진 구조의 하나 이상의 투여량들을 피검자에게 투여하여 피검자의 림프종, 백혈병 또는 자가면역 질환을 치료하는 방법들에 관한 것일 수 있다. 결합 사이트 또는 사이트들은 별개의 에피토프 또는 CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CDl9, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD74, CD80, CD126, CD138, CD154, B7, MUCl, Ia, Ii, HM1.24, HLA-DR, 테나신, VEGF, PlGF, ED-B 피브로넥틴, 암유전자, 암유전자 생성물, NCA 66a-d, 괴사 항원들, IL-2, TlOl, TAG, IL-6, MIF, TRAIL-Rl (DR4) 및 TRAIL-R2 (DR5)로 구성된 군으로부터 선택된 항원의 에피토프들을 결합할 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어, 투여당 20 내지 1500 밀리그램 단백질, 투여당 20 내지 500 밀리그램 단백질, 투여당 20 내지 100 밀리그램 단백질 또는 투여당 20 내지 1500 밀리그램 단백질의 투여량으로 장관외적으로 투여될 수 있다.
다른 실시예들에서, 안정적으로 묶여진 구조들은 박테리아, 바이러스들 또는 균류와 같은 병원체들의 감염을 치료하는 데 유용할 수 있다. 처치될 수 있는 대표적인 균류는 소포자균(Microsporum ), 백선균( Trichophyton ), 표피사상균( Epidermophyton ), 스포르트릭스 쉔키( Sporothrix schenckii ), 크립토코크스 네오포르만스(Cyptococctis neoformans ), 콕시디오이데스 이미티스( Coccidioides immitis), 히스토플라스마 캡슐라툼( Histoplasma capsulatum ), 블라스토마이세스 데르마티티디스( Blastomyces dermatitidis ) 또는 칸디다 알비칸스( Candida albicans)를 포함한다. 대표적인 바이러스들은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 광견병 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인간 파필로마 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 센다이 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 레오 바이러스, 폴리오 바이러스, 인간 혈청 파르보-유사 바이러스, 유인원 바이러스40, 호흡기 합포체 바이러스, 쥐 유방 종양 바이러스, 수두-대상포상진 바이러스, 뎅기 바이러스, 풍진 바이러스, 홍역 바이러스, 아데노바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스들, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스, 쥐 백혈병 바이러스, 볼거리 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 신드비스 바이러스(Sindbis virus), 림프구성 맥락 수막염 바이러스 또는 청설 바이러스를 포함한다. 대표적인 박테리아는 탄저균(Bacillus anthracis ), 스트렙토코커스 아갈락티에( Streptococcus agalactiae ), 레지오넬라 뉴모필리아( Legionella pneumophilia), 스트렙토코쿠스 파이오제니스( Streptococcus pyogenes ), 대장균( Escherichia coli ), 임질균( Neisseria gonorrhoeae ), 수막구균(Neisseria meningitidis), 뉴모코쿠스균( Pneumococcus spp .), 헤모필루스 인플루엔자균 B(Hemophilis influenzae B), 매독균(Treponema pallidum ), 라임병 스피로헤타균들( Lyme disease spirochetes ), 슈도모나스 애루지노사( Pseudomonas aeruginosa ), 나병균(Mycobacterium leprae ), 우유산균( Brucella abortus ), 결핵균( Mycobacterium tuberculosis ) 또는 마이코플라스마(Mycoplasma )를 포함한다.
다양한 실시예들에서 비록 한정적이지는 않다 하더라도, 안정적으로 묶여진 구조들로 포함된 전구체들은 세균성 독소, 식물 독소, 리신(ricin), 아브린(abrin), 리보뉴클레아제(RNA분해효소), DNA분해효소 I, 포도상구균 장독소-A, 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질, 젤로닌(gelonin), 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소, 슈도모나스 내독소, 란피르나제(Rap), Rap(N69Q), PE38, dgA, DT390, PLC, tPA, 사이토킨, 성장 인자, 용해성 수용체 성분, 계면활성제 단백질 D, IL-4, sIL-4R, sIL-13R, VEGF121, TPO, EPO(적혈구생성소), 혈전-용해제, 효소, 형광 단백질, sTNFα-R, 아비머(avimer), scFv, dsFv 또는 나노체(nanobody)와 같은 하나 이상의 단백질들을 포함할 수 있다.
다른 실시예들에서, 항-혈관형성제는 전구체의 일부 또는 전부를 형성할 수 있거나 안정적으로 묶여진 구조에 부착될 수 있다. 유용한 대표적인 항-혈관형성제들은 안지오스타틴(angiostatin), 바큘로스타틴(baculostatin), 칸스타틴(canstatin), 마스핀(maspin), 항-VEGF 항체들 또는 펩티드들, 항-태반 성장 인자 항체들 또는 펩티드들, 항-Flk-1 항체들, 항-Flt-1 항체들 또는 펩티드들, 라미닌 펩티드들, 피브로넥틴 펩티드들, 플라스미노겐 활성제 억제제들, 조직 금속단백분해효소 억제제들, 인터페론들, 인터류킨 12, IP-10, Gro-β, 트롬보스폰딘(thrombospondin), 2-메톡시에스트라디올(2- methoxyoestradiol), 프롤리페린-관련 단백질(proliferin-related protein), 카복시아미도트리아졸(carboxiamidotriazole), CM101, 마리마스탯(Marimastat), 다황화펜토산(pentosan polysulphate), 리노미드(Linomide), 탈리도마이드(thalidomide), 펜톡시필린(pentoxifylline), 제니스테인(genistein), TNP-470, 엔도스타틴(endostatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 아쿠틴(accutin), 안지오스타틴, 시도포비르(cidofovir), 빈크리스틴(vincristine), 블레오마이신(bleomycin), AGM-1470, 혈소판 인자 4 또는 미노사이클린을 포함한다.
또 다른 실시예들에서, 아플리딘(aplidin), 아자리빈(azaribine), 아나스트로졸(anastrozole), 아자시티딘(azacytidine), 블레오마이신, 보르테조미브(Bortezomib), 브리오스타틴-1(bryostatin-1), 부설판(busulfan), 칼리키마이신(calicheamycin), 캄프토테신(camptothecin), 10-하이드록시캄프토테신(10-hydroxycamptothecin), 카르무스틴(carmustine), 셀레브렉스(celebrex), 클로람부실(chlorambucil), 시스플라틴(cisplatin), 이리노테칸(irinotecan (CPT-I l)), SN-38, 카르보플라틴(carboplatin), 클라드리빈(cladribine), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 시타라빈(cytarabine), 다카르바진(dacarbazine), 도세탁셀(docetaxel), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노마이신 글루쿠로나이드(daunomycin glucuronide), 다우노루비신(daunorubicin), 덱사메타존(dexamethasone), 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol), 독소루비신(doxorubicin), 2-파이롤리노독소루비신(2-pyrrolinodoxorubicine (2P-DOX)), 사이아노-모르폴리노 독소루비신(cyano-morpholino doxorubicin), 독소루비신 글루코나이드, 에피루비신 글루코나이드(epirubicin glucuronide), 에티닐 에스트라다이올(ethinyl estradiol), 에스트라무스틴(estramustine), 에토포사이드(etoposide), 에토포사이드 글루코나이드, 에토포사이드 인산(etoposide phosphate), 플록수리딘(floxuridine (FUdR)), 3',5'-O-디올레오일-FudR(3',5'-0-dioleoyl-FudR (FUdR-dO)), 플루다라빈(fludarabine), 플루타마이드(flutamide), 플루오르우라실(fluorouracil), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 젬시타빈(gemcitabine), 하이드록시프로게스테론 카프로에이트(hydroxyprogesterone caproate), 하이드록시요소(hydroxyurea), 이다루비신(idarubicin), 이포스파마이드(ifosfamide), L-아스파라기나제(L-asparaginase), 류코보린(leucovorin), 로무스틴(lomustine), 메클로르에타민(mechlorethamine), 아세트산 메드록시프로게스테론(medroprogesterone acetate), 아세트산 메게스트롤(megestrol acetate), 멜팔란(melphalan), 메르캅토푸린(mercaptopurine), 6-메르캅토푸린, 메토트랙세이트(methotrexate), 미토산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 마이토마이신(mitomycin),마이토테인(mitotane), 페닐 부티레이트(phenyl butyrate), 프레드니손(prednisone), 프로카르바진(procarbazine), 파클리탁셀(paclitaxel), 펜토스타틴(pentostatin), PSI-341, 세무스틴 스트렙토조신(semustine streptozocin), 타목시펜(tamoxifen), 탁산(taxanes), 택솔(taxol), 프로피온산 테스토스테론(testosterone propionate), 탈리도마이드(thalidomide), 타이오구아닌(thioguanine), 타이오테파(thiotepa), 테니포사이드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 우라실 머스타드(uracil mustard), 벨케이드(velcade), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 빈크리스틴(vincristine), 리신, 아브린, 리보뉴클레아제, 온코나제(onconase), rapLRl, DNA분해효소 I, 포도상구균 장독소-A, 미국자리공 항바이러스 단백질, 젤로닌, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소, 슈도모나스 내독소, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 간섭 RNA, 또는 그것의 조합과 같은 하나 이상의 치료제들이 안정적으로 묶여진 구조에 접합되거나 포함될 수 있다.
다양한 실시예들은 병든 세포들의 세포자살을 유도하는 데 유용한 안정적으로 묶여진 구조들과 그 사용 방법들에 관한 것일 수 있다. 자세한 사항들은 U.S. Patent Application Publication No. 20050079184에서 볼 수 있으며, 그것의 전체 내용은 여기에 참고로 포함되어 있다. 그러한 구조들은 CD2, CD3, CD8, CDlO, CD21, CD23, CD24, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD48, CD52, CD55, CD59, CD70, CD74, CD80, CD86, CD138, CD147, HLA-DR, CEA, CSAp, CA-125, TAG-72, EFGR, HER2, HER3, HER4, IGF-IR, c-Met, PDGFR, MUCl, MUC2, MUC3, MUC4, TNFRl, TNFR2, NGFR, Fas (CD95), DR3, DR4, DR5, DR6, VEGF, PIGF, ED-B 피브로넥틴, 테나신, PSMA, PSA, 탄산 무수화효소 IX 및 IL-6로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 대한 결합 친화도를 지닌 전구체들을 포함할 수 있다. 더 특정한 실시예들에서, 세포자살을 유도하는 데 유용한 안정적으로 묶여진 구조는 단일클론성 항체들, Fab 단편들, 키메라, 인간화된 또는 인간 항체들 또는 단편들을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예들에서, 안정적으로 묶여진 구조는 항-CD74 X 항-CD20, 항-CD74 X 항-CD22, 항-CD22 X 항-CD20, 항-CD20 X 항-HLA-DR, 항-CD 19 X 항-CD20, 항-CD20 X 항-CD80, 항-CD2 X 항-CD25, 항-CD8 X 항-CD25, 항-CD2 X 항-CD147, 항-CEACAM5 X 항-CD3, 항-CEACAM6 X 항-CD3, 항-EGFR X 항-CD3, 항-HER2/neu X 항-CD3, 항- CD20 X 항-CD3, 항-CD74 X 항-CD3 및 항-CCD22 X 항-CD3의 조합들을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시예들에서, 안정적으로 묶여진 구조는 단일특이성 또는 다중특이성 항-CD20, 항-CD22, 항-HLA-DR 및/또는 항-CD74일 수 있다. 당업자는 다가의 안정적으로 묶여진 구조가 예를 들어, CD20 또는 CD22 항원들의 상이한 에피토프들과 결합하는 다중 항원-결합 모이어티들을 포함할 수 있거나 또한 동일한 에피토프에 모두 결합하는 단일 항원-결합 모이어티의 다중 카피들을 포함할 수 있다는 것을 알 것이다. 더 바람직한 실시예들에서, 키메라, 인간화된 또는 인간 항체들 또는 항체 단편들은 LL2(항-CD22), LL1(항-CD74), L243(항-HLA-DR) 및 A20(항-CD20)의 가변 구역들로부터 유래될 수 있다.
도 1은 두 개의 대표적인 DDD 서열들을 도시한다. DDD1의 밑줄친 서열(서열 번호: 1)은 인간 PKA의 RIIα에서 발견되는 최초 44 개의 아미노-말단 잔기들에 해당한다. DDD2(서열 번호: 2)는 N-말단에서 2 개의 아미노산 잔기들에서 DDD1과 상이하다.
도 2는 두 개의 대표적인 AD 서열들을 도시한다. AD1의 밑줄친 서열(서열 번호: 3)은 0.4 nM의 Kd로 보고된 최적화된 RII-선택적인 펩티드인 AKAP-is에 해당한 다. AD2도 도시되어 있다(서열 번호: 4).
도 3은 N-DDD2-Fab-hMN-14의 개략도(A) 및 DDD2-매개 이량체화에 의하여 형성된 추정적인 a 2 구조(B)를 도시한다.
도 4는 N-DDD2-VH-hMN-14-pdHL2 플라스미드 발현 벡터의 설계를 도시한다.
도 5는 C-DDD2-Fab-hMN-14의 개략도(A) 및 DDD2-매개 이량체화에 의하여 형성된 추정적인 a 2 구조(B)를 도시한다.
도 6은 C-DDD2-VH-hMN-14-pdHL2 플라스미드 발현 벡터의 설계를 도시한다.
도 7은 (A) 환원 조건하에서 N-DDD2-Fab-hMN-14와 h679-Fab-AD2를 혼합시에 형성된 비공유 a 2 b 복합체 및 (B) 이황화물 다리들에 의하여 형성된 공유 TF1 구조의 개략적인 묘사를 도시한다.
도 8은 TF2의 개략도를 도시한다.
도 9는 C-H-AD2-IgG의 스케치이다. (A) 중 사슬-AD2와 경 사슬에 대한 cDNA/폴리펩티드 서열들의 배열. (B) C-H-AD2-IgG의 개략적인 묘사. 도 10은 C-H-AD2-IgG 및 Fab-DD2 분자들의 조합으로 생성하는 단일특이성 HIDS(육가(hexavalent) IgG-계 DNL 구조)의 개략적인 묘사이다. 도 11은 C-H-AD2-IgG 및 Fab-DDD2 분자들의 조합으로 생성하는 이중특이성 HIDS의 개략적인 묘사이다. 도 12는 N-K-AD2-IgG의 스케치이다. (A) 중 사슬과 AD2-경 사슬에 대한 cDNA/폴리펩티드 서열들의 배열. (B) N-K-AD2-IgG의 개략적인 묘사. 도 13은 N-K-AD2-IgG 및 Fab-DDD2 분자들의 조합으로 생성하는 이중특이성 HIDS의 개략적인 묘사이다. 도 14는 (A) Fc-AD2- pdHL2 셔틀 벡터, (B) IgG-pdHL2 포유류 발현 벡터 및 (C) C-H-AD2-IgG-pdHL2 포유류 발현 벡터의 스케치들을 도시한다. 도 15는 단백질 A-정제된 C-H-AD2-hLL2-IgG의 SE-HPLC 분석을 도시한다. 단량체 및 이량체 형태들을 나타내는 피크들이 표시되어 있다. 도 16은 환원 및 비-환원 조건하에서 단백질 A-정제된 C-H-AD2-hLL2-IgG의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 중 사슬-AD2, 중 사슬 및 카파(kappa) 경 사슬을 나타내는 밴드들은 환원 레인(reduced lanes)로 표시되어 있다. C-H-AD2-hLL2-IgG 및 공유 이량체를 나타내는 밴드들은 비-환원 레인으로 표시되어 있다. 분자량 표지들의 위치들이 표시되어 있다. 도 17은 단백질 A-정제된 N-K-AD2-hLL2-IgG의 SE-HPLC 분석을 도시한다. (A) 단량체, 이량체 및 삼량체 형태들을 나타내는 피크들이 화살표로 표시되어 있다. (B) 이량체 및 삼량체 형태들이 단량체 형태로 변환된 것을 보여주는 글루타티온으로 환원시킨 이후의 분석. 도 18은 약한 환원에 의하여 N-K-AD2-hLL2-IgG의 (A) 이량체 및 (B) 삼량체 형태들이 (C) 단량체 형태로 변환된 가정된 구조들의 스케치들을 도시한다. 도 19는 단백질 A-정제된 Hex-hA20의 SE-HPLC 분석을 도시한다. 도 20은 6 개의 C-H-AD2-hLL2-IgG-계 HIDS의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. (A) 비-환원 조건하의 SDS-PAGE. (B) 환원 조건하의 SDS-PAGE. 중 사슬-AD2, Fd-DDD2 및 카파 경 사슬을 나타내는 밴드들은 화살표로 표시되어 있다. 분자량 표지들의 위치들이 표시되어 있다. 도 21은 단백질 A-정제된 Hex-hLL2의 SE-HPLC 분석을 도시한다. 도 22는 (A) DN1 및 (B) DNL1C의 SE-HPLC 분석을 도시한다. 도 23은 DNL2의 SE-HPLC 분석을 도시한다. 도 24는 환원 및 비-환원 조건하에서의 DNL3 및 K-Hex-hA20의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 중 사슬, AD2-카파 사슬, Fd-DDD2 및 카파 경 사슬을 나타내는 밴드들은 환원 레인들에 도시되어 있다. 분자량 표지들의 위치들이 표시되어 있다. 도 25는 DNL3의 SE-HPLC 분석을 도시한다. 도 26은 DNL1, DNL2 Hex-hA20 및 Hex-hLL2와 양친 IgG들과의 상대적인 hA20/hLL2 결합 친화력들을 비교하는 2 개의 경쟁적 ELISA 실험들의 결과들을 도시한다. 마이크로타이터 플레이트들이 5 ㎍/㎖의 농도로 hA20 또는 hLL2로 코팅되었다. HIDS의 희석 계열들은 일정한 농도(2 nM)로 유지되는 hA20 또는 hLL2 IgG에 특이적인 항-Ids로 혼합되었다. 과산화효소-접합된-염소(peroxidase-conjugated-Goat) 항-생쥐 IgG 및 OPD 기질 용액을 사용하여 코팅된 웰들에 항-Ids의 결합 레벨이 검출되었다. 그 결과들은 % 저해(코팅된 웰들에 결합하는 항-Id의) 대 HIDS의 농도로 플롯팅 되었다. EC50(50 % 저해로 결과되는 유효 농도) 수치들은 Prsm 소프트웨어를 사용하여 유도되었다. (A) hA20-코팅된 웰들에서의 W12(hA20 생쥐 항-Id) 또는 (B) hLL2-코팅된 웰들에서의 WN(hLL2 생쥐 항-Id)와 결합 경쟁을 하도록 HIDS가 사용되었다. 도 27은 DNL2 및 DNL3의 상대적인 hA20/hLL2 결합 친화력들을 비교하는 2 개의 경쟁적 ELISA 실험들의 결과들을 도시한다. 실험들은 도 26에 기술된 바와 같이 실행되었다. (A) hA20-코팅된 웰들에서의 W12(hA20 생쥐 항-Id) 또는 (B) hLL2-코팅된 웰들에서의 WN(hLL2 생쥐 항-Id)와 결합 경쟁을 하도록 DNL2, DNL3 및 양친 IgG들이 사용되었다. 도 28은 DNL1, DNL2, Hex-hA20 또는 리툭시맵(rituximab)으로 다우디 림프종 세포들(Daudi lymphoma cells)을 처리한 이후에 세포 계수 분석들의 결과를 도시한다. 조직 배양 플라스크들이 HIDS 또는 리툭시맵 중 어느 하나로 농 도들을 달리하여 보충된 RPMI 1640 매질에서 1 x 105 Daudi 세포들/㎖로 접종되었다. 생존 세포들은 구아바(Guava) PCA를 사용하여 매일 계수되었다. (A) 10 nM 농도로 처리한 이후에 성장 곡선들의 비교. (B) 선택된 농도들에서의 성장 곡선들의 비교. 도 29는 다양한 HIDS로 다이디 세포들의 처리에 대한 투여량-반응 실험의 결과들을 도시한다. 세포들이 RPMI 1640 매질로 5,000 세포들/웰의 농도에서 96-웰 플레이트들 내에서 플레이트 되었다. 2 x 10-8에서 6.4 x 10-12의 농도로 5-배 계열 희석들이 세 벌씩 실시되었다. 플레이트들이 4일 동안 배양되었으며, 이후 MTS 시약이 첨가되어 상기 배양은 490 ㎚에서 플레이트들을 판독하기 전에 추가로 4 시간 더 계속되었다. 결과들은 몰 농도의 로그값 대 미처리 웰들에 대한 OD490의 퍼센트로 주어져 있다. 각각의 투여량-반응 곡선에 대하여 EC40(40 % 성장 저해로 결과되는 유효 농도) 수치들이 측정되었다. 도 30은 인간 버킷(Burkitt) 림프종(다우디)를 가지고 있는 쥐들이 DNL2 또는 Hex-hA20으로 처리된 생체 내 치료 실험의 결과들을 도시한다. 쥐들(4/그룹)은 1.5 x 107 다우디 세포들(0일(0 day))로 정맥 내 접종되었다. 1, 4 및 7일에 7 마리의 쥐들에게 DNL2 또는 Hex-hA20의 4 ㎍ 또는 20 ㎍중 어느 하나를 복강내로(i.p.) 투여하였다. 쥐들이 뒷다리 마비를 보이거나 체중이 20 % 초과하여 감소하는 경우에 이들을 죽였다. 그 결과는 시간(일) 대 % 생존으로 플롯팅되었다. 중간 생존(median survival)과 장기 생존자들이 도시되어 있다. 도 31은 hA20 IgG 대조와 비교하여 이중특이성 HID(DNL2-hA20 IgG에 묶여진 4 개의 hLL2 Fab 단편들) 및 단일특이성 HID(Hex-hA20)로 처리된 다우디 세포들, 라지 세포들(Raji cells) 및 라모스 세포들(Ramos cells)에 대한 MTS 증식 측정을 이용하여 발생된 상대적인 투여량-반응 곡선들을 도시한다. 다우디 세포들(상부 패널)에서, hA20 IgG보다 DNL2는 > 100-배를 초과하는 강력한 항증식(antiproliferative) 활성을 보였으며 Hex-hA20은 > 10,000 배를 초과하는 강력한 항증식 활성을 보였다. Raji 세포들(중간 패널)에서, hA20 IgG와 비교하여 Hex-hA20은 강력한 항증식 활성을 보인 반면에, DNL2는 최소한도의 활성만 보였다. 라모스 세포들(하부 패널)에서, hA20 IgG와 비교하여, DNL들과 Hex-hA20 양쪽 모두가 강력한 항증식 활성을 보였다. 도 32는 hA20 IgG, DNL2 및 Hex-hA20의 항증식 활성에 미치는 교차 결합의 영향들을 도시한다. 도면에서 도시된 바와 같이, 교차 결합은 hA20 IgG의 항증식 활성을 강력하게 하지만, DNL2 또는 Hex-hA20의 활성이 향상되지는 않았다. 도 33은 이중특이성 ELISA 검사를 이용하여 측정된 바와 같이 인간 혈청 내에서의 DNL1 및 DNL2의 안정도를 도시한다. 단백질 구조들은 37 ℃와 5 % CO2에서 5일 동안 신선한 인간 혼주 혈청들에서 10 ㎍/㎖로 배양되었다. 0일 표본들에 대하여, 혈청 내에 희석된 이후에 즉시 분취량들이 액체 질소 내에서 동결되었다. ELISA 플레이트들은 hA20 IgG에 대한 항-Id로 코팅되었으며, 이중특이성 결합은 hLL2 IgG에 대한 항-Id로 검출되었다. DNL1과 DNL2 양쪽 모두가 혈청 내에서 상당히 안정적이었으며 완전한 이중특이성 결합 활성을 유지하였다. 도 34는 DNL1, DNL2, Hex-hA20, hLL2, hA20-IgG 및 hA20-IgG-AD2에 의한 보체-의존성 세포독성(CDC) 또는 그 부족을 도시한다. 놀랍게도, hA20 IgG와 hA20-IgG-AD2가 생체 내 검사에서 다우디 세포들에 미치는 강력한 CDC 활성을 보여주었지만, 6가 DNL 구조들 중 어느 것도 본 검사에서 CDC 활성을 보여주지 않았다. DNL2 및 Hex-ha20 양쪽 모두는 hA20 IgG와 유사한 CDC 활성을 보였던 hA20-IgG-AD2를 포함한다. 도 35는 신선하게 분리된 말초 혈액 단핵 세포들로 검사된 hA20 IgG, 리툭시맵 및 hLL2 IgG와 비교하여 DNL1의 항체-의존성 세포 독성(ADCC)을 도시한다. 리툭시맵과 hA20 IgG 양쪽 모두는 강력한 ADCC 활성을 가지는 반면에, DNL1은 어떠한 검출가능한 ADCC를 보여주지 않았다.
특허, 특허 출원, 논문, 서적 및 협정들을 포함하지만 여기에 한정되지 않는 본 출원에 인용된 모든 문서들 또는 문서들의 일부는 여기에 명시적으로 그대로 참고로 포함된다.
몇몇 실시예들에서, a 2 b의 형식인 신규한 안정적으로 묶여진 구조들 및 이러한 복합체들을 제조하는 방법들이 제공된다. 일반적으로, 이원 복합체들은 B 또는 b라고 불리는 제 2 구조가 사이트-특이적으로 결합하는 A 또는 a 2 로 불리는 비공유적으로 연결된 동형이량체 구조로 구성되어 있다. 그 결과로 생긴 a 2 b 구조는 A와 B 사이에 비-공유적 또는 바람직하게는 공유적 상호작용(예컨대 이황화물 결합들)에 의하여 안정화될 수 있다. A는 두 개의 동일한 소단위체들로부터 형성되며, 각각의 소단위체는 바람직한 실시예들에서 cAMP-의존성 단백질 키나아제(PKA)로부터 유래된 이량체화 및 도킹 구역(DDD)으로 불리는 펩티드 서열에 연결된 전구체로 구성되 어 있다. 소단위체 내에 함유된 DDD 구역은 동시에 화합하여 안정한 동형이량체를 형성하며, 이러한 화합은 예를 들어, 다양한 A-키나아제 고정 단백질들(AKAPs) 내에서 발견되고 B 내에 함유되어 있는 고정 구역(AD)이라 불리는 펩티드 서열에 대한 높은 친화도 결합 사이트를 차례로 생성한다. 따라서, B는 AD에 연결된 전구체로 구성되어 있다.
이원 복합체의 조립은 AD 펩티드와 (DDD)2 결합 사이트와의 상호작용을 통하여 용이하게 발생한다. DDD 펩티드는 그러한 유도체화 반응이 이량체화 하는 것뿐만 아니라 AD 펩티드를 결합하는 그 능력을 간섭하지 않으면 본질적으로 임의의 폴리펩티드 서열로 삽입되거나 임의의 전구체에 묶여질 수 있다. 유사하게도, AD 펩티드는 그러한 유도체화 반응이 동형이량체 DDD 결합 사이트와의 결합을 방해한다면 본질적으로 임의의 폴리펩티드 서열로 삽입되거나 임의의 전구체로 묶여질 수 있다. 이러한 모듈 형식 접근법은 고도로 다목적이며 이를 이용하여 본질적으로 임의의 A와 임의의 B를 조합하여 A의 전구체로부터 유래한 두 개의 소단위체들(a 2 )과 B의 전구체로부터 유래한 하나의 소단위체(b)를 함유하는 이원 조립체를 형성할 수 있다. A와 B 양쪽 모두의 전구체들이 항원 결합 사이트를 생성하는 제 2 항체 구역과 화합할 수 있는 항체 구역을 함유하는 곳에(예를 들어, Fab 또는 scFv), 그로 인해 생성된 a 2 b 복합체는 이중특이성이며 3가이다. 몇몇 실시예들에서, 이원 복합체는 예를 들어, 화학적 접합을 통하여 리간드들이나 약물들과 같은 작동체들에, 덱스트란이나 나노파티클들과 같은 담체들에 또는 작동체들 및 담체들 양쪽 모두에 연결되어 그러한 변형에 의하여 허용될 수 있는 추가적인 응용들을 가능하게 한다. 바람직한 실시예들에서, 본 주제에 대한 변경사항들이 이용되어 동형육량체들 또는 이형육량체들 중 어느 하나인 육량 복합체들을 제제할 수 있다.
이원 복합체의 안정도가 C-말단으로 융합된 AD1 구조체(예 3에 기술된 h679-Fab-AD1)에서 C- 또는 N-말단으로 융합된 DDD1 구조체(C-DDD1-Fab-hMN-14 또는 N-DDD1-Fab-hMN-14 양쪽 모두가 예 4에 기술되어 있음) 사이에 형성된 두 개의 원형 a2b 구조들에 대하여 8 nM보다 더 강력하지 않은 것으로 평형 크기-배제 HPLC 분석에 의하여 추정된 B 내에 함유된 AD에 대해 A 내에 함유된 DDD의 결합 친화도에 주로 의존하므로, a 2 b 복합체 내에 함유된 공유적으로 결합하는 A와 B는 개별적인 소단위체들의 바람직하지 않은 화합을 방지하여 생체 내 응용들을 용이하게 한다. 이원 복합체를 안정화시키기 위하여, 시스테인 잔기들이 전략적 위치들에서 DDD 및 AD 서열들 양쪽 모두로 도입되어 DDD 및 AD 사이의 이황화물 결합들의 형성을 가능하게 한다. 다른 방법들 또는 전략들이 적용되어 a2 및 b의 교차결합을 통하여 안정화된 복합체의 형성을 가능할 수 있게 한다. 예를 들어, 성분 소단위체들은 글루타알데히드 또는 PICUP 방법을 이용하여 효율이 더 낮은 특이도가 낮은 방식으로 서로서로 공유적으로 연결될 수 있다. 공유적 교차 결합의 다른 알려진 방법들도 이용될 수 있다.
정의
여기에 사용된 "하나" 또는 "하나의"는 하나 이상의 특성항목(item)을 의미 할 수 있다.
여기에 사용된 "및" 및 "또는"이라는 용어들은 결합적 또는 분리적인 것을 의미하는 데 사용될 수 있다. 즉, 두 용어 모두가 달리 언급되지 않는다면 "및/또는"과 동등한 것으로 이해되어야 한다.
"이량체화 및 도킹 구역(DDD)"은 DDD 서열을 함유하는 두 개의 동형단량체들의 자발적인 이량체 형성을 가능하게 하는 펩티드 서열을 뜻한다. 그 결과로 생성되는 동형이량체는 고정 구역에 대한 DDD 서열 내의 도킹 사이트를 함유한다. 비록 대표적인 DDD 서열들이 cAMP-의존성 단백질 키나아제로부터 구해질 수 있다하더라도, 다른 알려진 DDD 서열들이 이용될 수 있다.
"고정 구역(AD)"은 이량체화된 DDD 서열에 대한 결합 친화도를 지닌 펩티드 서열이다. 비록 대표적인 AD 서열들이 A-키나아제 고정 단백질들(AKAPs) 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다 하더라도, 다른 알려진 AD 서열들이 이용될 수 있다.
"전구체"라는 용어는 이로부터 더 안정되고, 결정적이거나 최종 생성물이 형성되는 그러한 물질의 평이한 보통의 의미에 따라서 사용된다.
여기에 사용된 "결합 분자", "결합 모이어티" 또는 "표적 분자"는 표적 분자, 세포, 복합체 및/또는 조직과 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자이다. 결합 분자는 항체 또는 단편, 그 유사체 또는 모방체, 아비머, 앱타머(aptamer) 또는 표적 펩티드를 포함할 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다.
여기에 기술된 "항체"는 전장(즉, 자연발생이거나 정규의 면역글로불린 유전자 단편 재조합(recombinatorial) 공정에 의하여 형성된) 면역글로불린 분자(예컨 대, IgG 항체) 또는 항체 단편과 같은 면역학적으로 활성인(즉, 특이적으로 결합하는) 면역글로불린 분자의 일부 또는 유사체를 뜻한다.
"항체 단편"은 F(ab)2, F(ab')2, Fab, Fv, sFv 등과 같은 항체 일부이다. 구조에 상관없이, 항체 단편은 손상되지 않은 항체에 의하여 인식되는 동일한 항원과 결합한다. "항체 단편"이라는 용어는 또한 특이성 항원과 결합하여 복합체를 형성시켜 항체처럼 작용하는 임의의 합성 또는 유전적으로 조작된 단백질을 포함한다. 예를 들어, 항체 단편들은 중 사슬 및 경 사슬들의 가변 영역들, 경 및 중 가변 영역들이 펩티드 링커("scFv 단백질들")에 의하여 연결되는 재조합 단일 사슬 폴리펩티드 분자들 및 초가변 영역(hypervariable region)을 모방하는 아미노산 잔기들로 구성된 최소 인식 단위들(CDR)로 구성된 "Fv" 단편들과 같은 가변 영역들로 구성된 분리된 단편들을 포함한다.
"작동체"는 정해진 결과를 발생시키는 원자, 분자 또는 화합물이다. 작동체는 치료제 및/또는 진단제를 포함할 수 있다.
"치료제"는 질병의 치료에 유용한 원자, 분자 또는 화합물이다. 치료제들의 예들은 항체들, 항체 단편들, 약물들, 독소들, 효소들, 뉴클레아제들, 호르몬들, 면역조절물질들, 안티센스 올리고뉴클레오티드들, 소간섭 RNA(siRNA), 킬레이트제들, 붕소 화합물들, 감응제들, 염료들 및 방사성동위원소들을 포함한다. 다른 대표적인 치료제들 및 사용 방법들은 U.S. Patent Publication Nos. 20050002945, 20040018557, 20030148409 및 20050014207에 기술되어 있으며, 각각은 여기에 참고 로 포함되어 있다.
"진단제"는 질병을 진단하는 데 유용한 원자, 분자 또는 화합물이다. 유용한 진단제들은 방사성동위원소들, 염료들(비오틴-스트렙타비딘 복합체에서와 같은), 조형제, 형광 화합물들 또는 분자들 및 자기 공명 영상(MRI)을 위한 증진제들(예컨대, 상자성 이온들)을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
"면역 접합체"는 결합 분자(예컨대, 항체 성분)와 원자, 분자 또는 고등 구조(예컨대, 담체, 치료제 또는 진단제)와의 접합체이다.
"나출된 항체"는 임의의 다른 작용제와 접합되지 않은 항체이다.
"담체"는 치료제 또는 진단제와 화합할 수 있는 원자, 분자 또는 고등 구조로서 그러한 작용제가 표적 세포에 전달되는 것을 용이하게 하는 원자, 분자 또는 고등 구조이다. 담체들은 지질들(예컨대, 고등 구조들을 형성할 수 있는 양친매성 지질들), 다당류(덱스트란 같은) 또는 미셀들, 리포솜들 또는 나노파티클들과 같은 다른 고등 구조들을 포함할 수 있다.
여기에 사용된 "항체 융합 단백질"이라는 용어는 동일하거나 상이한 특이성들을 지닌 두 개 이상의 동일하거나 상이한 scFv 또는 항체 단편들이 연결된 재조합으로 생성된 항원-결합 분자이다. 융합 단백질의 결합가(valency)는 융합 단백질이 단일 항원이나 에피토프에 얼마나 많은 결합 팔들(arms) 또는 사이트들를 가지는지를, 즉, 1가, 2가, 3가 또는 다가를 나타낸다. 항체 융합 단백질의 다가성(multivalency)은 본 단백질이 항원에 결합하는 다중 상호작용들을 이용하여, 항원에 결합하는 화합력을 증가시킬 수 있다는 것을 의미한다. 특이성은 항체 융합 단백질이 얼마나 많은 항원들이나 에피토프들과 결합할 수 있는지; 즉, 단일특이성, 이중특이성, 삼중특이성, 다중특이성을 표시한다. 이러한 정의들을 사용하여, 자연 항체, 예컨대, IgG는 2 개의 결합 팔들을 가지기 때문에 2가이지만, 하나의 에피토프와 결합하기 때문에 단일특이적이다.단일특이성, 다가 융합 단백질들은 에피토프에 대하여 하나 이상의 결합 사이트를 가지지만, 예를 들어 동일한 항원과 반응하는 두 개의 결합 사이트를 지닌 다이어바디와 같은 하나의 그러한 에피토프와만 결합한다. 융합 단백질은 단일한 항체 성분, 상이한 항체 성분들의 다가 또는 다중특이성 조합 또는 동일한 항체 성분의 다중 카피들을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 또한 항체 또는 항체 단편 및 치료제를 포함할 수 있다. 그러한 융합 단백질들에 적당한 치료제들의 예들은 면역조절물질들("항체-면역조절물질 융합 단백질") 및 독소들("항체-독소 융합 단백질")을 포함한다. 바람직한 독소는 리보뉴클레아제(RNA분해효소), 바람직하게는 재조합 RNA분해효소를 포함한다.
항체 또는 면역접합체 제제 또는 여기에 기술된 조성물은 투여량이 생리학적으로 중요하다면 "치료상 유효량"으로 투여된다고 한다. 작용제는 그 존재로 인하여 수용자 포유류(recipient)의 생리에 검출가능한 변화가 발생한다면 생리학적으로 중요하다. 특정한 실시예들에서, 항체 제제는 그 존재로 인하여 항종양 반응을 불러 일으키거나 자가면역 질병 상태의 징후들 및 증세들을 완화시킨다면 생리학적으로 중요하다. 생리학적으로 중요한 영향은 표적 세포의 성장 저해 또는 사망으로 이어지는 수용자 포유류에서의 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 환기(evocation)일 수도 있다. "치료상 유효량"은 피검자에서 가장 바람직한 영향을 생성해 내는 작용제의 양으로 한정되지 않지만, 피검자, 세포, 조직 또는 기관에 미치는 작용제의 임의의 알려진 가능한 영향들을 일으키는 양을 뜻할 수 있다.
모듈형 소단위체들(Modular Subunits)의 안정적으로 묶여진 조립체를 발생시키는 방법들
개시된 방법들 및 조성물들은 모듈형 소단위체들의 안정적으로 묶여진 조립체를 발생시키는 기반 기술을 제공한다. 일 실시예는 바람직하게는 분리되어 생성되는 A와 B라는 두 개의 정의된 성분들로부터 형성된 안정적으로 묶여진 이원 복합체에 관한 것이다. 그러나, 다른 실시예들에서, A와 B 양쪽 모두는 예를 들어, A와 B 양쪽을 코딩하는 벡터로 단일 세포 계통을 형질감염시키거나 A와 B를 따로 엔코딩하는 두 개의 상이한 벡터들과 함께 생성될 수 있다. A와 B가 양쪽 모두 Fab 단편들인 곳에서는 분리 생성(separate production)이 바람직하며, 그렇지 않은 곳에서는 공동 생성(co-production)은 경 사슬 뒤섞임으로 인하여 불균질 생성물들이 생성될 것이다.
몇몇 실시예들에서, 두 개의 동일한 소단위체들(a 2 )로 구성된 A는 하나의 소단위체(b)로 구성된 B와 조합되어 a 2 b 구성의 조립체를 형성한다. A와 B의 화합은 각각 A와 B로 조립된 DDD 및 AD 서열들 사이의 강력한 결합 상호작용으로 인하여 사이트-특이적이며 자발적이다. A와 B 양쪽 모두는 임의의 실체(entity)일 수 있으며 DDD가 연결된 A의 전구체는 AD가 연결된 B의 전구체와 상이한 형태이거나 동일할 수 있다. 후자의 경우에는, a 3 로 불리는 그 결과로 생긴 a 2 b 복합체는 세 개의 소단위체들로 구성되어 있으며, 각각은 동일한 전구체를 함유하지만 DDD와 AD 양쪽 모두에 연결되어 있다.
청구된 방법들과 조성물들의 모듈형 성격은 임의의 A와 임의의 B와의 조합을 가능하게 한다. A와 B에 부착될 수 있거나 포함될 수 있는 전구체들은 DDD의 AD로의 이량체화 또는 DDD의 AD로의 결합을 간섭하지 않는 한, 그 유형들에는 본질적으로 제한은 없다. 재조합 조작으로 구성되는 경우에, A와 B는 상이한 숙주 세포 내에서 독립적으로 생성, 정제 및 저장될 수 있다(또는 상술한 바와 같이 동일한 숙주 세포 내에서 달리 생성된다). 그러나, 조립되기 이전에 A와 B의 정제에 대한 요구는 절대적으로 요구되지는 않는다. A와 B를 함유하는 세포 추출물들이나 배지는 이원 복합체의 형성을 달성하는 적절한 조건하에서 직접 혼합될 수 있으며, 이후 산화시에 이황화물 결합에 의하여 안정될 수 있으며, 이후 정제될 수 있다. 몇몇 응용들에서, 정제 이후에 A와 조합하기 전에 작동체들 또는 담체들로 B를 접합하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 정제 이후에 B와 조합하기 전에 작동체들 도는 담체들로 A를 접합하는 것이 바람직할 수 있다. 조합하기 전에 작동체들 또는 담체들로 A와 B 양쪽 모두를 변형시키는 것도 바람직할 수 있다. 또한, a 2 b 복합체를 작동체들 또는 담체들로 접합하는 것은 몇몇 응용들에서 바람직할 수도 있다. A와 B가 동일한 숙주 세포 내에서 생성되는 곳에서는, 이들이 a 2 b 복합체로 자발적으로 조립될 수 있다.
바람직한 실시예들은 자연적으로 발생하는 구역들을 고정하는 cAMP-의존성 단백질 키나아제(PKA) 조절 소단위체들과 A-키나아제 고정 단백질들(AKAP) 사이의 특이적 단백질/단백질 상호작용들을 이용한다. PKA는 1968년에 처음으로 보고되었다(See Walsh et al ., J Biol . Chem. 243:3763-65(1968)). 조절(R) 소단위 이량체에 의하여 비활성 형태로 유지되어 있는 두 개의 촉매 소단위체들로 구성된 완전효소의 구조는 1970 년대 중반에 밝혀졌다(See Corbin et al ., J. Biol . Chem. 248:1813-21(1973)). 두 가지 유형의 R 소단위체들(RI 및 RII)이 발견되며 각각은 α와 β 동등형들을 가진다. R 소단위체들은 안정된 이량체들로서만 분리되었으며 이량체화 구역은 최초 44 개의 아미노-말단 잔기들로 구성되어 있는 것을 보였다(See Hausken et al., J. Biol. Chem. 271:29016-22(1996)). 광역 스펙트럼 세린/트레오닌 키나아제인 PKA의 신호전달의 특이성은 A-키나아제 고정 단백질들(AKAPs)이라고 불리는 도킹 단백질들을 통한 완전효소의 구획화를 통하여 달성된다(Scott et al ., J. Biol . Chem. 265:21561-66)(1990)).
미세관-관련 단백질-2(microtubule-associated protein-2)인 최초 AKAP는 1984 년에 특성화되었다(Lohmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA. 81:6723-27(1984)). 지금까지, 50 개를 초과하는 구조적으로 다양한 AKAP들은 효모에서 인간에 이르는 종들에서 확인되었다(See Wong et al ., Nat Rev Mol Cell Biol. 12:959-70(2004)). AKAP들의 PKA 고정 구역은 14 내지 18 개의 잔기들의 양친매성 나선이다(See Carr et al . J. Biol . Chem. 266:14188-92(1991)). PKA 고정 구역의 아미노산 서열들은 AKAP들 사이에서 상당히 다양하며 RII 이량체들에 대한 결합 친화도들은 2 내지 90 nM에 이르는 반면에 RI 이량체들에 대한 결합 친화도는 약 100 배 정도 약하다(See Alto et al . Proc . Natl . Acad . Sci USA. 100:4445-50(2003)). 고정 구역은 RII의 최초 아미노 말단 23 개의 잔기들에 의하여 형성된 RII 이량체들 상의 소수성 표면과 결합한다(Colledge et al ., Trends Cell Biol.. 6:21-21(1999)). 따라서, RII 이량체화 구역 및 AKAP 결합 구역은 양쪽 모두 동일한 44 아미노산 서열 내에 위치한다. 또한, AKAP들은 단량체들이 아닌 RII 이량체들에만 결합할 것이다. 이러한 상호작용의 구조적 모델은 도 7에 도시되어 있다.
DDD 및 AD 서열들의 상호작용을 통하여 형성된 비-공유 복합체들은 생체 내 응용들이 가능하도록 공유적으로 안정화될 수 있다. 이는 시스테인 잔기들이 전략적인 위치들(DDD2와 AD2에서 보여진 위치들과 같은)에서의 DDD 및 AD 서열들 양쪽 모두로의 도입을 통하여 달성되어 이황화물 결합들의 형성을 용이하게 한다. 또한, 공유 교차 결합의 다른 알려진 유형들이 채용될 수 있다.
이원 복합체들의 두 개의 성분들(A 및 B)이 재조합 조작에 의하여 생성되는 경우에, 이들은 동일한 숙주 세포 내에서 또는 더 바람직하게는 두 개의 분리된 숙주 세포 계통들에서 합성될 수 있다. A의 합성을 지시하는 발현 벡터는 RIα, RIβ, RIIα, RIIβ의 최초 30 개 이상의 아미노산들 또는 임의의 자연 또는 합성 기능적 유사체로 구성될 수 있는 DDD1 또는 DDD2와 같은 PKA R-소단위체의 DDD를 엔코딩하는 서열로 융합되는 중요한 폴리펩티드의 DNA 서열들(A)을 포함할 것이다. DDD는 직접적으로 또는 바람직하게는 아미노산 잔기들의 적절한 길이와 조성물을 함유하는 스페이서로 A의 아미노산-말단이나 카르복실 말단으로 결합될 수 있다. 또한, DDD는 DDD의 결합 활성과 폴리펩티드 융합 파트너의 원하는 활성이 감소되지 않는다면 융합 단백질 내에서 내면적으로 위치될 수 있다. 합성이 되는 때에, A/DDD 융합 단백질은 DDD1이 있는 안정한 동형이량체를 배타적으로 또는 DDD2가 있는 안정한 동형사량체를 현저하게 형성할 것이다. 안정한 동형육량체들 또는 이형육량체들을 형성하는 방법들은 하기 예들에서 논의된다.
A 또는 바람직하게는 독립적인 것의 합성을 지시하는 동일한 벡터 내에 있을 수 있는 B의 합성을 지시하는 제 2 발현 카세트는 임의의 AKAP 단백질로부터 유래될 수 있는 AD1 또는 AD2와 같은 고정 구역(AD)을 엔코딩하는 서열에 융합되는 중요한 폴리펩티드의 DNA 서열들 또는 여기에 참고로 포함된 US 2003/0232420A1에 개시된 자연 또는 합성 유사체를 포함할 것이다. AD는 직접적으로 바람직하게는 아미노산 잔기들의 적절한 길이와 조성물을 함유하는 스페이서로 B의 아미노산-말단이나 카르복실 말단으로 결합될 수 있다. 이황화 환원제가 존재시에 B/AD2 융합 단백질(b)과 A/DDD2 융합 단백질(현저하게는 a4)을 혼합하면 디메틸 술폭사이드(DMSO)와 같은 적당한 산화제의 첨가에 의하여 촉진되는 이황화 결합들의 형성으로 이후 안정화되는 a 2 b로 구성된 이원 복합체가 생성된다.
소단위체들의 모듈화 성격은 임의의 DDD2-폴리펩티드 이량체와 임의의 AD2-폴리펩티드와의 조합을 가능하게 한다. 다양한 모듈화 소단위체들의 스톡들은 정제된 생성물 또는 정제되지 않은 세포 배양 상청액들 중 어느 하나로 개별적으로 유지될 수 있으며 원하는 경우에는 다양한 a 2 b 구조들을 얻기 위하여 이후에 조합될 수 있다.
다른 실시예는 약물들 또는 킬레이트제들과 같은 작동체들 또는 덱스트란 또는 나노파티클들과 같은 담체들은 그 정제 이후에 A 또는 B를 대상으로 적절한 접합 화학을 이용하여 결합될 수 있다는 것이다. 또한, 그 형성과 정제 이후에 상기 구조에 그러한 변형들이 가해질 수 있거나 혼합되기 전에 A와 B 양쪽 모두에 그러한 변형이 가해질 수 있다.
재조합 항체 결합 구역들로부터 유래된 모듈형 소단위체들의 안정적으로 묶여진 조립체
개시된 방법들 및 조성물들은 단일특이성 또는 이중특이성일 수 있는 재조합 항체-계 다가 결합 구조들을 제공하는 데 유용하다. 예를 들어, DDD2 서열은 단일 사슬 Fv에 융합되어 단일특이성 결합 구조들을 얻을 수 있다. 더 일반적으로, DDD 서열은 상보적인 항체 가변 구역과 화합할 수 있는 항체 가변 구역으로 융합되어 항원-결합 사이트를 형성할 수 있다. 예를 들어, DDD1 또는 DDD2 서열은 VH 구역 및 CH1 구역(Fd/DDD)를 함유하는 항체 서열에 융합될 수 있거나 또한 VL 구역 및 CL 구역(L/DDD)에 융합될 수 있다. Fd/DDD 또는 L/DDD는 이후에 상보적 L 또는 Fd와 각각 화합하여 Fab/DDD를 형성할 수 있고, 더 화합하여 Fab/DDD1의 이량체 또는 Fab/DDD2의 사량체/이량체를 형성할 수 있다.
비슷한 방법으로, AD2와 같은 AD 서열은 단일 사슬 Fv 또는 더 일반적으로는 동족(cognate) Fd 사슬로 짝지워지는 경우에 Fab/AD2를 형성하는 VL 구역과 CL 구역을 함유하는 항체 서열에 융합될 수 있다. Fab/DDD2의 사량체/이량체를 Fab/AD2 와 혼합시킨 후 환원 및 산화하면 단일특이성 또는 이중특이성일 수 있는 3가 결합 구조의 안정적으로 묶여진 조립체가 생성한다.
결합 구조 중 VH 및 VL 영역들은 "인간화된" 단일클론성 항체 또는 인간 항체로부터 유래될 수 있다. 또한, VH 및/또는 VL 영역들은 조합 면역글로불린 라이브러리로부터 분리된 인간 항체 단편들로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, Barbas et al., METHODS: A companion to Methods in Enzymology 2: 119(1991) 및 Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12:433(1994)를 참조. 인간 면역글로불린 파지 라이브러리를 생성하는 데 유용한 클로닝 및 발현 벡터들은 예를 들어, STRATAGENE Cloning Systems(La Jolla, Calif.)로부터 얻을 수 있다.
인간 항체 VH 또는 VL 서열은 쥐에서 생성된 인간 단일클론성 항체로부터 유래될 수 있다. 그러한 항체들은 항원 면역투여(challenge)에 반응하여 특이적인 인간 항체들을 생성하도록 "조작된" 형질전환 쥐들로부터 구해진다. 이러한 기법에서, 인간 중 사슬 및 경 사슬 유전자좌들(loci)의 구성요소들은 내생성 중 사슬 및 경 사슬 유전자좌들의 표적된 분열들을 함유하는 배아 줄기 세포 계통들로부터 유래된 쥐들의 계통들로 도입된다. 형질전환 쥐들은 인간 항원들에 특이적인 인간 항체들을 합성할 수 있으며, 상기 쥐들은 인간 항체-분비 혼성세포들을 생성하기 위하여 이용될 수 있다. 형질전환 쥐들로부터 인간 항체들을 구하는 방법들은 Green et al., Nature Genet. 7:13(1994), Lonberg et al., Nature 368:856(1994) 및 Taylor et al., Int. Immun. 6:579(1994)에서 기술되어 있다.
항체 단편들을 함유하는 재조합 융합 단백질들의 생성을 위한 일반적인 방법들
특이적인 에피토프들을 인식하는 항체 단편들을 엔코딩하는 핵산 서열들은 업계에 잘 알려진 기법들에 의하여 구해질 수 있다. 예를 들어, 원하는 특이성의 혼성세포 분비 항체들은 예를 들어, PCR 또는 기존의 cDNA 클로닝 기법들에 의한 알려진 기법들을 이용하여 제제될 수 있는 항체-엔코딩(antibody-encoding) DNA를 얻는데 사용될 수 있다. 또한, Fab 발현 라이브러리들(libraries) 또는 항체 파지 디스플레이 라이브러리들은 원하는 특이성을 가진 항체 단편들을 스크리닝하기 위하여 구성될 수 있다.
이후 항체 단편을 엔코딩하는 핵산은 직접적으로 또는 펩티드 스페이서를 엔코딩하는 서열을 통하여 DDD 또는 AD 중 어느 하나를 엔코딩하는 핵산에 결찰될 수 있다. 이러한 유형의 융합 단백질들을 엔코딩하는 핵산 서열들을 생성하는 방법들은 업계에 잘 알려져 있으며 예들에서 더 제공된다.
다른 실시예에서, 다른 아미노산 잔기들은 정확한 융합 사이트가 DDD 또는 AD가 N- 또는 C-말단(또는 내부 위치에서)에 부착되는 여부에 의존하는 곳인, A/DDD 또는 B/AD로 구성된 모듈형 소단위체의 N- 또는 C-터미널 중 어느 하나에 첨가될 수 있다. 다른 아미노산 잔기들은 펩티드 태그, 신호 펩티드, 시토카인, 효소(예를 들어, 전구-약물 활성 효소), 호르몬, 독소, 펩티드 약물, 막-상호작용 펩티드 또는 다른 기능성 단백질들을 포함할 수 있다.
원하는 숙주 세포 내에서 재조합 단백질들을 생성하는 방법들은 업계에 잘 알려져 있다. 정제를 촉진시키기 위하여, 안정적으로 묶여진 구조들은 FLAG 서열 또는 폴리-HIS 서열과 같은 적당한 펩티드 태그들을 함유하여 적절한 친화도 칼럼으로 그들의 정제를 촉진시킬 수 있다.
안정적으로 묶여진 구조들의 성분 소단위체들을 발현시키는 데 적당한 대표적인 발현 시스템은 메토트렉세이트 처리에 의한 선택과 증폭을 가능하게 하는 증폭가능한 쥐 dhfr 유전자를 가진 pdHL2 벡터이다. Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191(1989) 참조. pdHL2 벡터는 두 개의 금속티오닌 프로모터들과 IgH 증진제들에 의하여 따로 조절되는 두 개의 유전자들의 독립적인 발현을 제공한다.
안정적으로 묶여진 구조들의 성분 소단위체들의 발현을 위한 적당한 숙주 세포들 또는 세포 계통들은 당업자에게 알려져 있다. 인간 숙주 세포의 사용으로 임의의 발현된 분자들이 인간 당부가 패턴들로 변형될 수 있게 된다. 그러나, 인간 숙주 세포가 개시된 방법들에 필수적이라거나 바람직하다는 지적은 어디에도 없다.
Sp2/0과 같은 쥐 골수종 세포 계통은 안정적으로 묶여진 구조들의 성분 소단위체를 엔코딩하는 직선화된 pdHL2 벡터로 전기천공법에 의하여 형질감염될 수 있다. 0.05 내지 0.1 μM 메토트렉세이트를 함유하는 배지로 세포들을 배양하여 형질감염한 후 48 시간에 선택(selection)이 개시될 수 있다. 이후 선택된 클론들은 메토트렉세이트 농도를 최대 5 μM까지 단계적으로 증가시켜 증폭될 수 있다.
안정적으로 묶여진 구조들의 접합체들
다른 모이어티들이 상술한 안정적으로 묶여진 구조들에 접합될 수 있다. 예를 들어, 약물들, 독소들, 방사성 화합물들, 효소들, 호르몬들, 세포독성 단백질들, 킬레이트들, 시토카인들 및 다른 기능성 작용제들이 안정적으로 묶여진 구조들의 하나 이상의 소단위체들에 접합될 수 있다. 접합은 예를 들어 곁사슬들에 아민, 카르복실, 티올 또는 히드록실 기들을 함유하는 아미노산 잔기들에 공유 부착들을 통하여 될 수 있다. 예를 들어, 디이소사이아네이트들(diisocyanates), 디이소티오사이아네이트들, 비스(히드록시숙신이미드) 에스테르들(bis(hydroxysuccinimide) esters), 카보다이이미드들(carbodiimides), 말레이미드-히드록시숙신이미드 에스테르들(maleimide-hydroxysuccinimide esters), 글루타알데히드 등과 같은 기존의 다양한 링커들이 이러한 목적에 사용될 수 있다. 작용제들을 안정적으로 묶여진 구조들에 바람직하게 접합시키면 변형되지 않은 구조들 내에 함유된 각각의 소단위체의 활성에 상당한 영향을 주지는 않는다. 접합은 모듈형 소단위체들에 분리되어 실행될 수 있으며 이후 소단위체들은 안정적으로 묶여진 구조체로 조립되도록 하게 되거나 또한 접합은 안정적으로 묶여진 구조체의 형성에완전히 형성된 안정적으로 묶여진 구조체 또는 임의의 중간체를 사용하여 실행될 수 있다. 또한, 세포독성 또는 다른 작용제들이 우선 중합체 담체와 결합될 수 있으며 이후에 안정적으로 묶여진 구조와 접합된다. 이 방법에 대하여, 여기에 참고로 포함된 Ryser et al, Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 75:3867-3870, 1978; U.S. 4,699,784 및 U.S. 4,046,722을 참조.
여기에 기술된 접합체들은 업계에 알려진 다양한 방법들에 의하여 제제될 수 있다. 예를 들어, 안정적으로 묶여진 구조는 131I로 방사능 표지되고 지질로 접합될 수 있어, 그 결과로 생성된 접합체는 리포솜을 형성할 수 있다. 상기 리포솜은 하 나 이상의 치료제들(예컨대, FUdR-dO와 같은 약물) 또는 진단제들을 포함할 수 있다. 또한, 담체 이외에 안정적으로 묶여진 구조가 131I(예컨대, 티로신 잔기에서) 및 약물(라이신 잔기의 엡실론 아미노 기에서)과 접합될 수 있으며, 담체는 다른 치료제 또는 진단제를 포함할 수 있다. 치료 및 진단제들은 안정적으로 묶여진 구조들의 하나 이상의 소단위체와 공유적으로 화합될 수 있다.
리포솜들과 미셀들의 형성은 업계에 알려져 있다. 예컨대, Wrobel and Collins, Biochimxca et Biophysica Acta (1995), 1235: 296-304; Lundberg et al., J. Pharm. Pharmacol. (1999), 51:1099-1105; Lundberg et al., Int. J. Pharm. (2000), 205:101-108; Lundberg, J. Pharm. Sci. (1994), 83:72-75; Xu et al., Molec. Cancer Ther. (2002), 1:337- 346; Torchilin et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., U.S.A. (2003), 100:6039-6044; U.S. 5,565,215; U.S. 6,379,698; 및 U.S. 2003/0082154 참조.
약물 전달 또는 영상화에 유용한 중합체들, 실리카 또는 금속들로부터 형성된 나노파티클들 또는 나노캡슐들도 기술되어 있다. 예컨대, West et al., Applications of Nanotechnology to Biotechnology (2000), 11:215-217; U.S. 5,620,708; U.S. 5,702,727; 및 U.S. 6,530,944 참조. 치료 또는 진단제들을 위한 표적된 담체를 형성하기 위하여 항체들 또는 결합 분자들을 리포솜들에 접합시키는 것이 기술되어 있다. 예컨대, Bendas, Biodrugs(2001), 15:215-224; Xu et al., Mol. Cancer Ther(2002), 1:337-346; Torchilin et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A(2003), 100:6039-6044; Bally, et al., J. Liposome Res.(1998), 8:299-335; Lundberg, Int. J. Pharm.(1994), 109:73-81; Lundberg, J. Pharm. Pharmacol.(1997), 49:16-21; Lundberg, Anti-cancer Drug Design(1998), 13: 453-461 참조. 또한 U.S. 6,306,393; U.S. Serial No. 10/350,096; U.S. Serial No. 09/590,284, 및 1999년 6월 9일에 출원된 미국 특허출원 제60/138,284호 참조. 이 모든 참고문헌들은 여기에 참고로 포함되어 있다.
광범위한 진단 및 치료제들이 안정적으로 묶여진 구조들의 접합체들을 형성하는 데 유리하게 사용될 수 있거나 안정적으로 묶여진 구조들에 대한 인식 사이트와 결합하는 합텐들에 연결될 수 있다. 진단제들은 방사성동위원소들, MRI에의 사용을 위한 증진제들 또는 초음파 영상화를 위한 조형제들 및 형광 화합물들을 포함할 수 있다. 단백질들 또는 펩티드들에 부착되는 방법으로서, 적절한 많은 조영제들(imaging agents)이 업계에 알려져 있다(예컨대, 여기에 참고로 양쪽 모두가 ㅍ포함되어 있는 US. patents 5,021,236 및 4,472,509 참조). 몇몇 부착 방법들은 예를 들어, 단백질 또는 펩티드에 부착된 DTPA와 같은 유기 킬레이트제를 채용하는 금속 킬레이트 착물의 사용에 관한 것이다(U.S. Patent 4,472,509).
안정적으로 묶여진 구조를 방사성 금속들 또는 상자성 이온들로 채우기 위하여, 방사성 금속들 또는 상자성 이온들을 결합시키는 킬레이트 기의 다중 카피들이 부착되어 있는 담체와 우선 반응시키는 것이 필요할 수 있다. 그러한 담체는 폴리라이신, 다당류, 또는 예컨대 이러한 목적으로 유용하다고 알려진 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 포르피린들, 폴리아민들, 왕관형 에테르들(crown ethers), 비스-티오세미카르바존들(bis-thiosemicarbazones), 폴리옥심들(polyoximes) 등과 같은 결합된 킬레이트 기들일 수 있는 펜단트 기들(pendant groups)을 가지는 유도화되거나 유도화될 수 있는 중합체 물질일 수 있다. 킬레이트들을 함유하는 담체들은 응집 및 면역반응성의 손실을 최소화하는 방식으로 표준적인 화학들을 이용하는 안정적으로 묶여진 구조에 결합될 수 있다.
그러한 접합체들을 제제하는 데 응용될 수 있는 다른 보기 드문 방법들 및 시약들이 여기에 그대로 참고로 포함된 U.S. 4,824,659에 개시되어 있다. 특히 유용한 금속-킬레이트 조합들은 60 내지 4,000 keV의 총 에너지 범위의 진단 동위원소들로 사용되는 2-벤질-DTPA 및 그것의 모노에틸 및 사이클로헥실 유사체들을 포함한다. 몇몇 유용한 진단 핵종은 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu5, 67Ga, 68Ga, 86Y, 89Zr, 94Tc, 94 mTc, 99 mTc 또는 111In를 포함할 수 있다. 망간, 철 및 가돌리늄과 같은 비-방상성 금속들로 착화된 동일한 킬레이트들은 여기에 기술된 안정적으로 묶여진 구조들 및 담체들과 함께 사용되는 경우, MRI에 유용하다. NOTA, DOTA 및 TETA와 같은 장세대형(macrocyclic) 킬레이트들은 다양한 금속들 및 방사성금속들과 함께 특히 갈륨, 이트륨 및 구리 방사성 핵종들과 함께 유용하다. 그러한 금속-킬레이트 착물들은 중요한 금속에 반지 크기(ring size)를 재단하여 매우 안정될 수 있다. 233Ra를 복합화하는 장대세형 폴리에테르들과 같은 다른 고리형 킬레이트들이 사용될 수 있다.
치료제들은 예를 들어, 빈카 알칼로이드들, 안트라사이클린들(anthracyclines), 에피도필로톡신들(epidophyllotoxins), 탁산들, 항대사물질들, 알킬화제들, 항생제들, Cox-2 억제제들, 항유사분열제들, 항혈관형성 및 프로아포토틱제들(proapoptotic agents), 특히 독소루비신, 메토트렉세이트, 택솔, CPT-11, 캄프토테신들(camptothecans) 및 이것과 다른 클래스들의 항암제들로부터 온 다른 것들 등과 같은 화학적 치료 약물들을 포함한다. 다른 암 화학치료요법 약물들은 질소 겨자들, 알킬 술폰산염들, 나이트로소우레아들, 트라이아진들, 엽산 유사체들, 피리미딘 유사체들, 퓨린 유사체들, 백금 배위 착물들, 호르몬들 등을 포함한다. 적당한 화학적 치료제들은 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995) 및 GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)뿐만 아니라 이러한 간행물들의 개정판들에 기술되어 있다. 실험 약물들과 같은 다른 적당한 화학적 치료제들은 업계에 알려져 있으며, 업계에 알려진 방법들을 이용하여 여기에 기술된 안정적으로 묶여진 구조들에 접합될 수 있다.
다른 클래스의 치료제들은 α-입자들을 방출하는 방사성핵종들(212Pb, 212Bi, 213Bi, 211At, 223Ra, 225Ac와 같은), β-입자들을 방출하는 방사성핵종들( 32P, 33P, 47Sc, 67Cu, 67Ga, 89Sr, 90Y, 111Ag, 125I, 131I, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 166Dy, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re), 또는 오제(Auger) 전자들을 방출하는 방사성핵종들(111In, 125I, 67Ga, 191Os, 193 mPt, 195 mPt, 195 mHg)로 구성되어 있다. 안정적으로 묶여진 구조들은 진단제들에 대하여 기술된 방법들을 이용하여 하나 이상의 상기 방사성핵종들로 라벨링될 수 있다.
검출가능한 표지(예컨대, 형광 분자)를 함유하는 적당한 펩티드 또는 세포독성제(예컨대, 방사성요오드)는 안정적으로 묶여진 구조들과 공유적, 비공유적이거나 또는 화합될 수 있다. 예를 들어, 치료상 유용한 접합체는 감응제 또는 염료를 안정적으로 묶여진 구조들로 포함시켜 구해질 수 있다. 형광색소와 같은 형광 조성물들 및 다른 색원체들 또는 가시 광선에 민감한 포르피린들과 같은 염료들이 사용되어 적당한 빛을 병변(lesion)으로 향하게 하여 병변들을 검출하고 치료한다. 요법상으로, 이것은 광방사, 광선요법 또는 광역학적 요법이라는 용어로 쓰인다. Jori et al. (eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain (1986), 22:430 참조. 또한, 단일클론성 항체들은 광선요법을 달성하기 위하여 광활성된 염료들로 결합된다. Mew et al., J. Immunol.(1983),130:1473; idem., Cancer Res.(1985), 45:4380; Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1986), 83:8744; idem., Photochem. Photobiol.(1987), 46:83; Hasan et al., Prog. CHn. Biol. Res.(1989), 288:471; Tatsuta et al., Lasers Surg. Med.(1989), 9:422; Pelegrin et al., Cancer(1991), 67:2529 참조. 내시경검사 또는 복강경검사 응용들이 또한 고찰된다. 검출 및 요법의 내시경검사 방법들은 여기에 그대로 참고로 포함된 U.S. 4,932,412; U.S. 5,525,338; U.S. 5,716,595; U.S. 5,736,119; U.S. 5,922,302; U.S. 6,096,289; 및 U.S. 6,387,350에 기술되어 있다.
몇몇 실시예들에서, 여기에 기술된 신규한 구조체들 및 방법들은 치료적 간섭을 위한 RNAi의 표적된 전달에 유용하다. 전달 운반체는 그 전구체로서 인간 프로타아민(~50 개의 아미노산 잔기들의 펩티드)에 융합되는 내부화(internalizing) 항체 결합 구역을 지닌 안정적으로 묶여진 구조일 수 있다. 유용한 a 2 구조체의 예는 4 개의 활성 Fab 단편들로서, 그 각각이 RNAi와 결합하기 위하여 인간 프로타민을 지니는 단편들을 제공하는 VH-Ch1-hP1-DDD2/VL-CL 또는 VH-CH1-hP2-DDD2/VL-CL일 것이다. 다가의 복합체는 표적 세포들에의 그 결합과 표적 세포들에의 수용체-매개 내부화를 촉진시킬 것이며, 그 세포에는 비공유적으로 결합된 RNAi가 엔도솜들 내에서 해리되며 세포질로 방출된다. 어떠한 산화환원 화학도 관련되지 않으므로, hP1 또는 hP2 내에서의 세 개의 분자내 이황화 결합들의 존재는 문제를 제기하지 않는다. RNAi의 전달에 더하여, 이러한 구조체들은 치료 유전자 또는 DNA 백신들의 표적된 전달에도 유용할 수 있다. 유용한 다른 분야는 기능 면에서 RNAi의 단백질 유사체인 항체들을 생성시키기 위한 기술을 적용하는 것이다.
치료제들
약학적 조성물들
몇몇 실시예들에서, 안정적으로 묶여진 구조 및/또는 하나 이상의 치료제들은 암에 걸린 피검자와 같은 피검자에게 투여될 수 있다. 그러한 작용제들은 약학 적 조성물들의 형태로 투여될 수 있다. 일반적으로, 이는 인간 또는 동물들에 유해할 수 있는 불순물들이 근본적으로 제거된 조성물들의 제제를 수반할 것이다. 당업자는 약학적 조성물이 예를 들어 경구적으로나 정맥 내와 같이 장관외적인 것을 포함하여 다양한 경로들에 의하여 피검자에게 투여될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 치료제의 유효량은 피검자에게 투여되어야 한다. "유효량"은 원하는 효과를 일으키는 작용제의 양이다. 유효량은 예를 들어, 작용제의 효능 및 의도된 효과에 의존할 것이다. 예를 들어, 더 적은 양의 항혈관형성제는 고형 종양을 감소시키거나 제거시기키 위하여 또는 그 전이를 방지하거나 감소시키기 위하여 암 치료요법에 필요한 양과 비교하여, 황반 변성 또는 자궁내막증과 같은 과형성 질환의 치료에 필요할 수 있다. 특이적인 목적을 위한 특정 작용제의 유효량은 당업자에게 잘 알려진 방법들을 이용하여 결정될 수 있다.
화학 치료제들
몇몇 실시예들에서, 화학 치료제들이 투여될 수 있다. 유용한 항암 화학 치료제들은 5-플루오로우라실, 블레오마이신, 부설판, 캄프토테신들, 카르보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴(CDDP), 사이클로포스파마이드, 닥티노마이신, 다우노루비신, 에스트로겐 수용체 결합제들, 에토포사이드(VP16), 파네실-단백질 전달효소 억제제들, 젬시타빈, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 멜팔란, 메토트랙세이트, 마이토마이신, 나벨바인(navelbine), 니트로스우레아(nitrosurea), 플리코마이신(plicomycin), 프로카르바진, 랄로시페인(raloxifene), 타목시펜, 택솔, 테마졸로마이드(temazolomide) (DTIC의 수용성 형태), 트랜스플라티눔(transplatinum), 빈블라스틴 및 메토트랙세이트, 빈크리스틴 또는 상기의 임의의 유사체 또는 유도체 변이체를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 감염성 유기체에 대항하는 유용한 화학 치료제들은 아시클로버(acyclovir), 알벤다졸(albendazole), 아만타딘(amantadine), 아미카신(amikacin), 아목시실린(amoxicillin), 암포테리신(amphotericin) B, 앰피실린(ampicillin), 아즈트레오남(aztreonam), 아지스로마이신(azithromycin), 바시트라신(bacitracin), 박트림(bactrim), 바트라펜(Batrafen®), 비포졸(bifonazole), 카르베니실린(carbenicillin), 카스포푼진(caspofungin), 세파클로르(cefaclor), 세파졸린(cefazolin), 세팔로스포린들(cephalosporins), 세페핌(cefepime), 세프트리악존(ceftriaxone), 세포탁심(cefotaxime), 클로람페니콜(chloramphenicol), 시도포비르(cidofovir), 시프로(Cipro®), 클라리트로마이신(clarithromycin), 클라불란산(clavulanic acid), 클로트리마졸(clotrimazole), 클로사실린(cloxacillin), 독시사이클린(doxycycline), 에코나졸(econazole), 에리트로사이클린(erythrocycline), 에리트로마이신(erythromycin), 플라질(flagyl), 플루코나졸(fluconazole), 플루시토신(flucytosine), 포스카네트(foscarnet), 풀라졸리돈(furazolidone), 간시클로버(ganciclovir), 젠타마이신(gentamycin), 이미페넴(imipenem), 이소니아지드(isoniazid), 이트라코나졸(itraconazole), 카나마이신(kanamycin), 케토코나졸(ketoconazole), 린코마이신(lincomycin), 리네졸리드(linezolid), 메로페넴(meropenem), 미코나졸(miconazole), 미노사이클린(minocycline), 나프티핀(naftifine), 날리딕산(nalidixic acid), 네오마이신(neomycin), 네틸미 신(netilmicin), 니트로푸란토인(nitrofurantoin), 니스타틴(nystatin), 오셀타미비어(oseltamivir), 옥사실린(oxacillin), 파로모마이신(paromomycin), 페니실린, 펜타미딘(pentamidine), 피페라실린-타조박탐(piperacillin-tazobactam), 리파부틴(rifabutin), 리팜핀(rifampin), 리만타딘(rimantadine), 스트렙토마이신, 설파메톡사졸(sulfamethoxazole), 설파살라진(sulfasalazine), 테트라사이클린(tetracycline), 티코나졸(tioconazole), 토브라마이신(tobramycin), 톨시클레이트(tolciclate), 톨나프테이트(tolnaftate), 트리메토프림 설파메톡사졸(trimethoprim sulfamethoxazole), 발라시클로버(valacyclovir), 반코마이신(vancomycin), 자나미르(zanamir) 및 지트로마이신(zithromycin)을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
화학 치료제들 및 투여 방법들, 투여량들 등은 당업자에게 잘 알려져 있다(여기 해당 부분들에서 참고로 포함된 the "Physicians Desk Reference", Goodman & Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics" 및 "Remington's Pharmaceutical Sciences" 참조). 투여량에서의 일부 변경사항은 필연적으로 치료되는 피검자의 조건에 따라 발생할 것이다. 투여를 담당하는 관계자는 좌우간 개별 대상자에 대한 적절한 투여량을 결정할 것이다.
호르몬들
코르티코스테로이드(corticosteroid) 호르몬들은 다른 화학 치료제들의 유효성을 상승시킬 수 있으며, 이후 이들은 병용 치료에 자주 사용된다. 프레드니손 및 덱사메타손은 코르티코스테로이드 호르몬들의 예들이다. 하이드록시프로게스테론 카프론산염(hydroxyprogesterone capronate), 메드록시프로게스테론 아세트산염 및 아세트산 메제스트롤(megestrol acetate)과 같은 프로제스틴들은 자궁내막 및 유방의 암들에 사용되어 왔다. 디에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올과 같은 에스트로겐들은 전립선암과 같은 암들에 사용되어 왔다. 타목시펜과 같은 항에스트로겐들은 유방암과 같은 암들에 사용되어 왔다. 테스토스테론 프로피오네이트 및 플루옥시메스테론과 같은 안드로겐들은 유방암의 치료에도 사용되어 왔다.
혈관형성 억제제들
몇몇 실시예들에서, 안지오스타틴, 바쿨로스타틴, 칸스타틴, 마스핀, 항-VEGF 항체들, 항-PIGF 펩티드들 및 항체들 항-혈관 성장 인자 항체들, 항-Flk-1 항체들, 항-Flt-1 항체들 및 펩티드들, 라미닌 펩티드들, 피브로넥틴 펩티드들, 플라스미노겐 활성 억제제들, 조직 금속단백분해효소 억제제들, 인터페론들, 인터류킨-12, IP-10, Gro-β, 트롬보스폰딘, 2-메톡시에스트라디올, 프로리페린-관련 단백질(proliferin-related protein), 카르복시아미도트리아졸, CM101, 마리마스탯, 펜토산 폴리술페이트(pentosan polysulphate), 안지오포이에틴(angiopoietin)-2, 인터페론-알파, 허비마이신(herbimycin) A, PNU145156E, 16K 프로락틴 단편, 리노미드, 탈리도마이드, 펜톡시필린, 제니스테인, TNP-470, 엔도스타틴, 파클리탁셀, 아쿠틴, 안지오스타틴, 시도포비르, 빈크리스틴, 블레오마이신, AGM-1470, 혈소판 인자 4 또는 미노사이클린은 유용할 수 있다.
면역조절물질들
여기에 사용된 "면역조절물질"이라는 용어는 시토카인들, 줄기 세포 성장 인 자들, 인터류킨들, 집락 자극 인자들(colony-stimulating factors), 인터페론들(예컨대, 인터페론-α, -β 및 -γ) 및 "S1 인자"라 지명된 줄기 세포 성장 인자와 같은 림프독소들 및 조혈 인자들을 포함한다. 적당한 면역조절 모이어티들의 예들은 IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, 인터페론-감마, TNF-알파 등을 포함한다.
"시토카인"이라는 용어는 세포간 매개체들로서 다른 세포 상에 작용하는 일 세포 개체군에 의하여 방출된 단백질들 또는 펩티드들에 대한 일반명이다. 여기에 광범위하게 사용된 시토카인들의 예들은 림포카인들(lymphokines), 모노카인들(monokines), 성장 인자들 및 기존의 폴리펩티드 호르몬들을 포함한다. 상기 시토카인들 사이에 인간 성장 호르몬, N-메티오닐(N-methionyl) 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬들; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 레락신(relaxin); 프로레락신; 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체형성 호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬들; 간 성장 인자; 프로스타글란딘, 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반성 락토겐, OB 단백질; 종양 괴사 인자-α 및 - β; 물러리안(mullerian)-억제 물질; 쥐 생식샘자극호르몬-관련 펩티드; 억제호르몬(inhibin); 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 혈소판형성소 (TPO); NGF-B와 같은 신경 성장 인자들; 혈소판-성장 인자; TGF-α 및 TGF-β와 같은 변이 성장 인자들(TGFs); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 적혈구생성소(EPO); 골유도 인자들(osteoinductive factors); 인터페론-α, -β, 및 -γ와 같은 인터페론들; 대식세포-CSF(M-CSF)와 같은 집락 자극 인자들(CSFs); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); IL-I, IL-lα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- 8, IL-9, IL-IO5 IL-Il, IL-12와 같은 인터류킨들(ILs); IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, 키트-리간드 또는 FLT-3, 안지오스타틴, 트롬보스폰딘, 엔도스타틴, 종양 괴사 인자 및 LT가 포함된다. 여기에 사용된 시토카인이라는 용어는 자연발생원 또는 자연 서열 시토카인들의 재조합 세포 배양 및 생물학적 활성 동등체들을 포함한다.
케모카인들은 일반적으로 케모카인 발현의 사이트에 면역 작동 세포들을 보충하는 화학주성인자들(chemoattractants)로 작용한다. 케모카인들은 RANTES, MCAF, MIP1-알파, MIP1-베타 및 IP-10을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 당업자는 몇몇 시토카인들이 화학주성인자 효과를 가지고 있는 것으로도 알려져 있으며 케모카인들이라는 용어하에 또한 분류될 수 있다는 것을 알 것이다. 유사하게도, 면역조절물질 및 시토카인은 그 각각의 요소들에서 중첩된다.
방사성동위원소 요법 및 방사성면역요법
몇몇 실시예들에서, 펩티드들 및/또는 단백질들은 방사성핵종 요법 또는 방사성면역요법 방법들에서 유용할 수 있다(예컨대, 여기에 참고로 포함된 Govindan et al., 2005, Technology in Cancer Research & Treatment, 4:375-91 ; Sharkey and Goldenberg, 2005, J. Nucl. Med. 46:115S-127S; Goldenberg et al. ( J Clin Oncol 2006; 24:823-834), "Antibody Pre-targeting Advances Cancer Radioimmunodetection and Radioimmunotherapy," 참조). 특이적인 실시예들에서, 안정적으로 묶여진 구조들은 유용한 방사성동위원소로 직접 표적되고 피검자에게 투여될 수 있다. 다른 실시예들에서, 방사성동위원소(들)은 병든 조직 내의 향상된 발현의 사이트에 국소화하는 이중특이성 안정적으로 묶여진 구조의 투여 이후에 방사성라벨링되고 주사되는 합텐 펩티드 또는 리간드를 사용하여 상술한 사전-표적 방법들로 투여될 수 있다.
병든 조직을 치료하는 유용한 방사성 동위원소들은 111In, 177Lu, 212Bi, 213Bi, 211At, 62Cu, 67Cu, 90Y, 125I, 131I, 32P, 33P, 47Sc, 111Ag, 67Ga, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 59Fe, 75Se, 77As, 89Sr, 99Mo, 105Rh, 109Pd, 143Pr, 149Pm, 169Er, 194Ir, 198Au, 199Au 및 211Pb를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 치료성 방사성핵종은(therapeutic radionuclide) 오제 방출체(Auger emitter)에 대하여 20 내지 200 keV 범위, 바람직하게는 60 내지 200 keV 범위, 베타 이미터에 대하여 100 내지 2,500 keV 및 알파 이미터에 대하여 4,000 내지 6,000 keV 범위의 붕괴 에너지를 가진다. 유용한 베타-입자 방출 핵종들의 최대 붕괴 에너지들은 바람직하게는 20 내지 5,000 keV, 더 바람직하게는 100 내지 4,000 keV 및 가장 바람직하게는 500 내지 2,500 keV이다. 오제-방출 입자들로 실질적으로 붕괴하는 방사성핵종들도 바람직하다. 그러한 방사성핵종들은 Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213 및 Fm- 255를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 유용한 알파-입자-방출 방사성핵종들의 붕괴 에너지들은 바람직하게는 2,000 내지 10,000 keV, 더 바람직하게는 3,000 내 지 8,000 keV 및 가장 바람직하게는 4,000 내지 7,000 keV이다.
예를 들어, 61.5 시간의 반감기 및 베타 입자들과 감마선들의 풍부한 공급으로 인하여 방사성면역요법에 대한 더 유망한 방사성동위원소들 중 하나로 여겨지는 67Cu는 킬레이트제인 p-브로모아세트아미도-벤질-테트라에틸아민테트라아세트산(TETA)을 사용하여 단백질 또는 펩티드에 접합될 수 있다. 또한, 강력한 베타 입자를 방출하는 90Y는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)를 사용하여 펩티드, 항체, 융합 단백질 또는 그 단편에 접합될 수 있다.
다른 잠재적인 방사성동위원소들은 11C, 13N, 15O, 75Br, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113 mIn, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 121 mTe, 122 mTe, 125 mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 197Pt, 109Pd, 105Rh, 142Pr, 143Pr5 161Tb, 166Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201Tl, 225Ac, 76Br, 169Yb 등을 포함한다.
다른 실시예에서, 방사선 민감제(radiosensitizer)가 사용될 수 있다. 방사선 민감제를 첨가하면 효능이 증가할 수 있다. 방사성 증감제들은 여기에 그대로 참고로 포함된 D. M. Goldenberg (ed.), CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, CRC Press(1995)에 기술되어 있다.
열 중성자 활성화 요법에 대한 붕소 가수-적재된(addend-loaded) 담체를 가진 안정적으로 묶여진 구조는 몇몇 방식들에서 정상적으로 효과가 있을 것이다. 그 러나, 중성자 조사(neutron irradiation)가 실행되기 전에 비-표적된 면역접합체가 사라질(clear) 때까지 기다리는 것이 유리할 것이다. 면역접합체의 제거는 리간드에 접합하는 항체를 사용하여 가속될 수 있다. 예를 들어, 카아보란들(carboranes)과 같은 보론 가수들은 항체들에 부착될 수 있다. 카아보란들은 업계에 잘 알려진 펜단드 곁사슬들 상에 카르복실 기능들로 제제될 수 있다. 아미노덱스트란과 같은 담체에 카아보란들의 부착은 카아보란들의 카르복실 기들의 활성화 및 담체 상의 아민들과의 축합에 의하여 달성될 수 있다. 접합체의 투여 이후에, 붕소 가수는 열중성자 조사에 의하여 활성화되며 알파-방출에 의하여 붕괴하는 방사능 원자들로 변환되어 고도로 독성인 단기 효과들을 생성한다.
키트들
다양한 실시예들은 환자의 병든 조직을 치료하거나 진단하는 데 적당한 성분들을 함유하는 키트들에 관한 것일 수 있다. 대표적인 키트들은 적어도 하나의 안정적으로 묶여진 구조를 함유할 수 있다. 만약 투여용 성분들을 함유하는 조성물이 구강 전달에 의한 것과 같은 소화관을 통한 전달에 제제되지 않으면, 몇몇 다른 경로를 통하여 키트 성분들을 전달할 수 있는 장치가 포함될 수 있다. 비경구 전달과 같은 응용들을 위한 장치의 일 유형은 피검자의 신체로 조성물을 주사하는 데 사용되는 주사기이다. 흡입 장치들도 사용될 수 있다.
키트 성분들이 함께 포장되거나 둘 이상의 용기들로 분리될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 용기들은 재구성(reconstitution)에 적당한 조성물의 멸균 동결건조 제제들을 함유하는 바이알들일 수 있다. 키트는 다른 시약들의 재구성 및/ 또는 희석에 적당한 하나 이상의 완충제들도 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 용기들은 파우치, 트래이, 박스, 튜브 등을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 키트 성분들은 포장될 수 있으며 용기들 내에서 멸균상태로 유지될 수 있다. 포함될 수 있는 다른 성분은 키트를 사용하는 사람에게 주어지는 지시사항이다.
제제 및 투여
접합체들을 포함하는 안정적으로 묶여진 구조들은 하나 이상의 약학적으로 적당한 부형제들, 하나 이상의 부가 성분들 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물들을 얻기 위하여 더 제제될 수 있다. 이는 활성 성분들(즉, 안정적으로 묶여진 구조들 또는 접합체들)이 하나 이상의 약학적으로 적당한 부형제들로 혼합되어 조합되는 약학적으로 유용한 투여량들을 제제하는 알려진 방법들에 의하여 달성될 수 있다. 멸균 인산염-완충 식염수는 약학적으로 적당한 부형제의 한 예이다. 다른 적당한 부형제들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예컨대, Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition (Lea & Febiger 1990)과 Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990) 및 이들의 수정판들을 참조.
여기에 기술된 조성물들 바람직한 투여 경로는 장관외적 주사이다. 장관외적 투여에서, 조성물들은 약학적으로 수용가능한 부형제와 함께 용액, 현탁액 또는 유탁액과 같은 단위 투여 주사 형태로 제제될 것이다. 그러한 부형제들은 본래 비독성이며 비치료성이다. 그러한 부형제들의 예들은 식염구, 링거액, 포도당 용액 및 행크 용액이다. 고정유들 및 올레인산 에틸과 같은 비수용성 부형제들도 사용될 수 있다. 바람직한 부형제는 식염수 녹은 5 % 포도당이다. 부형제는 완충제들 및 보존제들을 포함하는 등장성과 화학적 안정성을 향상시키는 물질들과 같은 첨가제들을 소량 함유할 수 있다. 경구 투여를 포함하여 다른 투여 방법들도 고려된다.
안정적으로 묶여진 구조들을 포함하는 제제된 조성물들은 예를 들어, 볼루스 주사(bolus injection) 또는 지속 주입을 통하여 정맥 투여에 이용될 수 있다. 주사용 조성물들은 첨가된 보존제와 함께 예컨대, 앰퓰 또는 다중-투여 용기들과 같은 단위 투여 형태로 제출될 수 있다. 조성물들은 또한 현탁액들, 유성 또는 수용성 운반체의 용액들 또는 유탁액들과 같은 형태들도 취할 수 있으며, 현탁, 안정화 및/또는 분산제들과 같은 조제제들(formulatory agents)을 함유할 수 있다. 또한, 조성물들은 사용전에 예컨대, 멸균 무파이로겐 수(pyrogen-free water)와 같은 적당한 운반체로 재구성을 위한 분말 형태일 수 있다.
조성물들은 용액으로 투여될 수 있다. 용액의 pH는 pH 5 내지 9.5, 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.5의 범위에 있어야 한다. 그것의 제제는 인산염, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄-HCL 또는 시트르산염 등과 같은 적당한 약학적으로 수용가능한 완충제를 가지는 용액 내이어야 한다. 완충제 농도들은 1 내지 100 mM의 범위에 있어야 한다. 제제된 용액은 50 내지 150 mM 농도의 염화 나트륨 또는 염화 칼륨과 같은 염도 포함할 수 있다. 글리세롤, 알부민, 글로불린, 세제, 젤라틴, 프로타민 또는 프로타민의 염과 같은 안정화제의 유효량도 포함될 수 있다. 제제된 조성물의 전신성 투여는 항체의 인간화된 형태가 안정적으로 묶여진 구조들에 대한 주형(template)으로 사용된다면 매 2일 내지 3일 또는 일주일에 1회씩 통상적으로 이 루어진다. 또한, 매일 투여는 유용하다. 주로 투여는 근육내 주사 또는 혈관내 주입에 의한 것이다.
조성물들은 포유류에게 피하적으로 또는 다른 장관외적 투여들에 의하여 투여될 수 있다. 또한, 투여는 지속 주입에 의하거나 단일 또는 다중 볼루스들에 의할 수 있다. 항체들 또는 면역접합체들에 유용한 방법들은 여기에 기술된 조성물들에 적용될 수 있다. 일반적으로, 인간에 대한 투여된 면역접합체, 융합 단백질 또는 나출된 항체의 투여량은 환자의 연령, 체중, 신장, 성별, 전체적 의료 조건 및 과거 의료 이력과 같은 인자들에 따라 변할 것이다. 통상적으로, 비록 상황에 따라 규정량보다 적거나 많은 투여량도 투여될 수 있다고 하더라도, 약 1 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏ 범위의 활성 성분 투여량으로 피검자에게 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 투여량은 예를 들어, 4 내지 10 주 동안 주당 1 회, 바람직하게는 8 주 동안 주당 1 회, 더 바람직하게는 4 주 동안 주당 1 회 반복될 수 있다. 몇 달 동안 격주(every other week)와 같이 투여 회수가 줄어들 수도 있다. 투여량은 투여량과 일정을 적절히 조절하여 다양한 장관외적 경로들을 통하여 주어질 수 있다. 다양한 대표적인 실시예들에서, 투여량들은 항체, 항체 단편 또는 융합 단백질 투여에 대하여 알려진 100 내지 500 ㎎, 200 내지 1000 ㎎, 500 내지 2000 ㎎, 100 내지 250 ㎎, 250 내지 500 ㎎, 500 내지 1000 ㎎ 또는 다른 범위들에 이를 수 있다.
면역접합체들 또는 항체들의 작용의 지속시간을 조절하기 위해 채용되는 약학적 방법들은 여기에 기술된 제제된 조성물들에 적용될 수 있다. 서방형(control release) 제제들은 예를 들어, 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)의 매트릭스들 및 스테아르산 이량체와 세박산의 폴리안하이드라이 공중합체의 매트릭스들과 같은 면역접합체 또는 나출된 항체를 복합시키거나 흡수하는 생체적합성 중합체들의 사용을 통하여 달성될 수 있다. Sherwood et al., Bio/Technology(1992), 10:1446 참조. 그러한 매트릭스로부터 면역접합체 또는 항체의 방출 속도는 면역접합체 또는 항체의 분자량, 면역접합체의 양, 매트릭스 내의 항체 및 분산된 입자들의 크기에 의존한다. Saltzman et al., Biophys. J(1989), 55:163; Sherwood et al., supra 참조. 다른 고체 투여 형태들은 Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition (Lea & Febiger 1990)과 Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990) 및 그들의 수정판들에 기술되어 있다.
요법의 목적들을 위하여, 조성물은 치료상 유효량으로 포유류에 투여된다. 여기에 기술된 치료 및 진단 방법들에 대한 적당한 피검자는 비록 포유류, 고양이, 개, 말, 돼지, 염소, 소, 알파카, 라마 또는 양과 같은 인간이 아닌 동물 피검자도 고려되지만 주로 인간이다.
여기에 기술된 안정적으로 묶여진 구조들은 그대로 참고로 포함된 "B-세포들을 표적하는 항체들을 사용하는 자가면역 질환들의 면역요법("Immunotherapy of Autoimmune Disorders using Antibodies that Target B-Cells")"라는 제목의 2000 년 6 월 9 일에 제출된 계류중인 미국 특허출원 제 09/590,284호에 기술된 자가면역 질환들을 치료하는 방법에 특히 유용하다. 그러한 결합 구조들을 함유하는 조성물들은 바람직하게는 20 내지 5000 ㎎의 투여량으로 정맥내 또는 근육내로 투여된 다. 투여는 비강내 또는 다른 비장관외적 경로들에 의하여도 투여될 수 있다. 조성물들은 혈액을 포함하여 몇몇 조질들에 위치되어 있는 미세구들, 리포솜들 또는 미세입자 전달 시스템들을 통하여 투여될 수도 있다.
조성물들은 폐들에 국소화된 전달을 달성하기 위하여 에어로졸에 의하여 투여될 수 있다. 수용성 에어로졸 또는 비수용성(예컨대, 플루오르화탄소 추진제) 현탁액이 사용될 수 있다. 바람직하게는 음파 분무기들이 에어로졸들의 제제에 사용되어 조성물들 내의 안정적으로 묶여진 구조가 분해되고 활성 손실이 일어날 수 있는 전단응력에 노출되는 것을 최소화시킨다.
일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 체중, 신장, 성별, 전체적 의료 조건 및 과거 의료 이력과 같은 인자들에 따라 변할 것이다. 바람직하게는, 안정적으로 묶여진 구조의 포화 투여량이 환자에게 투여된다.
통상적으로, 비록 상황에 따라 규정량보다 적거나 많은 투여량도 투여될 수 있다고 하더라도, 안정적으로 묶여진 구조의 약 50 ㎎/㎏ 내지 500 ㎎/㎏ 범위인 투여량을 피검자에게 제공하는 것이 바람직하다. 투여량들의 예들은 투여당 20 내지 1500 밀리그람의 단백질, 투여당 20 내지 500 밀리그람의 단백질, 투여당 20 내지 100 밀리그람의 단백질, 투여당 20 내지 1000 밀리그람의 단백질, 투여당 100 내지 1500 밀리그람의 단백질을 포함한다. 조성물이 방사성핵종을 포함하는 실시예들에서, 투여량은 밀리퀴리(millicurie)로 측정될 수 있다. 90Y의 경우에, 투여량은 15 내지 40 mCi, 10 내지 30 mCi, 20 내지30 mCi 또는 10 내지 20 mCi 사이일 수 있다.
방사성핵종에 연결된 안정적으로 묶여진 구조는 미생물 요법에 특히 효과적이다. 안정적으로 묶여진 구조가 피검자의 하나 이상의 감염된 사이트들에 국소화되었다고 결정된 이후에, 70 ㎏의 환자 체중에 각각 기초하여 일반적으로 131I에 대하여 투여당 20 mCi 내지 150 mCi, 90Y에 대하여 5 mCi 내지 30 mCi 또는 186Re의 투여당 5 mCi 내지 20 mCi에 이르는 표지된 조성물의 더 높은 투여량들이 주사된다. 주사는 정맥 내, 동맥 내, 림프관 내, 척수강 내 또는 강 내(즉, 장관외적)일 수 있으며 반복될 수 있다. 몇몇 요법들은 다중적, 분할 투여량들을 투여하여, 보통의 조직들의 방사에서 비례 증가를 주로 일으키지 않으면서 더 많은 미생물 독성 투여량을 제공하는 것이 유리할 수 있다.
안정적으로 묶여진 구조들에 화학적으로 연결되지 않은 화학 치료제들, 항미생물제들, 시토카인들, 과립구-집락 자극 인자(G-CSF), 과립성 대식세포-집락 자극 인자(GM-CSF), 적혈구생성소, 혈소판형성소 등은 조성물의 투여 전, 투여 도중 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 또한, 그러한 작용제들은 안정적으로 묶여진 구조들에 부착될 수 있다.
a 2 b 형식인 안정적으로 묶여진 구조들은 작용제들을 사전표적하는 것으로 특히 적당하다. 대표적인 구조는 표적 조직 또는 세포에 이가로 결합하는 a 2 로서 두 개의 scFv 또는 Fab 소단위체들 및 합텐과 결합하는 b로서 하나의 scFv 또는 Fab 소단위체로 구성될 것이다. 그러한 이중특이성 삼가 구조는 우선 피검자에게 투여 되고, 선택적으로는 제거제의 투여가 뒤따르고, 합텐은 진단용 검출가능한 표지와 같은 기능성 작용제 또는 치료제에 결합되는 작용제의 투여가 뒤따른다. 치료 방법들을 위함. 당업자는 이중특이성 항체들을 사용하는 다른 알려진 방법들은 안정적으로 묶여진 구조들을 사용하여 실시될 수도 있다는 것을 알 것이다. 이러한 진단 및 치료 방법들은 항체-계 작용제들이 진단 또는 요법에 사용되는 본질적으로 모든 상황에 적용될 수 있다. 하기에서 논의되는 바와 같이, 이중특이성 육가의 안정적으로 묶여진 구조들은 이중특이성 삼가의 구조들로서 동일한 목적들을 위하여 이용될 수도 있다.
치료 및 진단을 위한 사용: 사전표적과 관련하지 않은 응용들
그 접합체들을 포함하여, 안정적으로 묶여진 구조들은 항체들 또는 면역접합체들을 이용하며 사전표적을 필요로 하지 않는 광범위한 치료 및 진단 응용들에 이용되기에 적당하다. 예를 들어, 3가 구조들은 "나출된" 구조체로서, 즉 그러한 구조는 나출된 항체를 사용하는 요법으로서 동일한 방식으로 다른 기능성 제제에 접합되지 않는 실시예에서 치료요법용으로 사용될 수 있다. 또한, 안정적으로 묶여진 구조들은 하나 이상의 기능성 제제들로 유도화될 수 있어서 진단 또는 치료 응용들을 가능하게 한다. 다른 작용제는 상술한 안정적으로 묶여진 구조들에 공유적으로 연결될 수 있다.
안정적으로 묶여진 구조들에 연결되는 방사성 및 비-방사성 진단제들의 사용도 고려된다. 적당한 비-방사성 진단제들은 자기 공명 영상(MRI), 컴퓨터 단층 촬영법(CT) 또는 초음파에 사용되는 것들이다. MRI 작용제들은 예를 들어, 2-벤질- DTPA 및 그것의 모노메틸 및 사이클로헥실 유사체들과 같은 적당한 킬레이트들과 복합되는 망간, 철 및 가돌리늄과 같은 비-방사성 금속들을 포함한다. 그대로 참고로 포함된 2001년 10월 10일에 출원된 미국 출원 제09/921,290호를 참조.
안정적으로 묶여진 구조들은 진단 연상에 유용한 방사성동위원소로 라벨링될 수 있다. 적당한 방사성동위원소들은 60 내지 4,000 KeV의 에너지 범위에 있는 방사성동위원소들을 또는 더 특이적으로는 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 89Zr 94 mTc, 94Tc, 99 mTc, 45Ti, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 154-158Gd, 177Lu, 32P, 188Re 등 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 예컨대, "Labeling Targeting Agents with Gallium-68"의 제목인 U.S. Patent Application - 발명자 G.L.Griffiths 및 WJ. McBride, 및 그대로 참고로 포함된 영상 목적을 위한 18F, 68Ga, 94mTc 등과 같은 포지트론 방출제들을 개시하는 U.S. Provisional Application No. 60/342,104을 참조. 검출은 예를 들어, 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영법(SPECT) 또는 포지트론 방출 단층촬영법(PET)에 의하여 달성될 수 있다. 상기 응용은 잠재성 종양들을 확인하는 외과수술중의 진단을 위한 것일 수도 있다.
다른 실시예에서 안정적으로 묶여진 구조들은 β-방출체들(32P, 33P, 47Sc, 67Cu, 67Ga, 89Sr, 90Y, 111Ag, 125I, 131I, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 166Dy, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re와 같은), 오제 전자 방출제들(111In, 125I, 67Ga, 191Os, 193 mPt, 195 mPt, 19SmHg와 같은), α-방출제들(212Pb, 212Bi, 213Bi, 211At, 223Ra, 225Ac와 같은) 또는 그 조합을 포함하는 종양성 또는 급속히 분열하는 다른 세포들을 죽이는데 유용한 하나 이상의 동위원소들로 라벨링될 수 있다.
안정적으로 묶여진 구조들은 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디늄(III), 사마륨(III), 이터븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(holmium) 및 에르븀(III)으로 구성된 군으로부터 선택된 금속들의 착물들을 포함할 수 있는 하나 이상의 영상 증진제들에 연결시켜 MRI용으로 사용될 수 있다. 유사하게는, 안정적으로 묶여진 구조들은 시판중인 하나 이상의 영상 증진제들에 연결시켜 초음파 영상용으로 사용될 수 있다. U.S. Patent No. 6,331,175는 MRI 기법 및 MRI 증진제에 접합된 항체들의 제제를 기술하고 그대로 참고로 포함되어 있다.
독소와 같은 기능성 단백질은 다양한 방식으로 안정적으로 묶여진 구조들로서 제시될 수 있다. 예를 들어, 기능성 단백질은 DDD2 또는 AD2 중 어느 하나에 융합하여, 이후 예를 들어, Fab/AD2 또는 Fab/DDD2로 각각 구성된 표적 실체오 결합되는 이원 복합체의 성분에 대한 전구체로서 작용할 수 있다. 또한, 기능성 단백질은 표적 구조에 융합되어 A에 대한 전구체로서 작용할 수 있으며, 그 결과로 생긴 A는 적당한 B와 선택적으로 쌍을 이룬다. 이런 점에서 사용될 수 있는 독소들은 리신, 아브린, 리보뉴클레아제(RNA분해효소), DNA분해효소 I, 포도상구균 장독소-A, 미국자리공 항바이러스 단백질, 젤로닌, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소 및 슈도모나스 내독소를 포함한다(예컨대, Pastan. et al., Cell (1986), 47:641, and Goldenberg, CA - A Cancer Journal for Clinicians (1994), 44:43 참조). 여기에 사용에 적합한 다른 독소들은 당업자에게 알려져 있으며 그대로 참고로 포함된 U.S. 6,077,499에 기술되어 있다. 중요한 다른 기능성 단백질들은 다양한 시토카인들, 혈전-용해제들, 효소들 및 형광 단백질들을 포함한다.
상술한 "나출된" 안정적으로 묶여진 결합 구조를 피검자에게 투여하여 피검자의 종양 질환을 치료하는 방법도 제공되어, 항원 결합 사이트들의 적어도 하나는 탄산 무수화효소 IX, 알파-태아단백질, A3, A33 항체에 특이적인 항원, Ba 733, BrE3-항원, CAl 25, 암배아성 항원(CEACAM5), CEACAM6, CDl, CDIa, CD3, CD5, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD38, CD45, CD74, CD79a, CD80, CDl38, 결장-특이적 항원-p(CSAp), EGFR, EGP-I, EGP-2, FIt-I, Flt-3, 폴산염 수용체(folate receptor), HER2/neu, HLA-DR, 인간 융모성 성선자극호르몬, Ia, IL-2, IL-6, IL-8, 인슐린-유사 성장 인자, KC4-항원, KS-1, KS1-4, Le(y), 대식세포-억제 인자(MIF), MAGE, MUCl, MUC2, MUC3, MUC4, NCA66, NCA95, NCA90, 괴사 항원들, p53에 의하여 결합된 항원, PAM-4 항체, 태반 성장 인자, 전립선 산성 포스파타제(prostatic acid phosphatase), PSA, PSMA, RS5, SlOO, TlOl, TAC, TAG-72, Tn 항원, 톰슨-프리덴라이히(Thomson-Friedenreich) 항원들, 종양 괴사 항원들, 테나신, TRAIL 수용체들, ED-B 피브로넥틴, VEGF, 17-1A-항원, 혈관형성 표지, 암유전자 표지 또는 암유전자 생성물로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 결합한다. TRAIL-R1 및 TRAIL-R2와 같은 TRAIL 수용체들에 대항하는 항체들은 업계 에 잘 알려져 있다(예컨대, Georgakis et al., Br. J. Haematol. 2005, 130:501-510; Mori et al., FEBS Lett. 2005, 579:5379-84 참조). 그러한 항체들 또는 단편들은 단독으로 또는 암 치료를 위한 항-TAA 항체들과 병용적으로 사용될 수 있다.
종양 질환은 암종들, 육종들, 신경아교종들, 림프종들, 백혈병들 및 흑색종들로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 표적될 수 있는 종양들의 대표적인 유형들은 급성 림프구성 백혈병, 담도암, 유방암, 경부암, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결직장암, 자궁내막암, 식도, 위, 두경부암, 호지킨 림프종, 폐암, 갑상선 수질암, 비-호지킨 림프종, 림프종, 난소암, 췌장암, 신경아교종, 간암, 전립선암 및 방광암을 포함한다.
상술한 안정적으로 묶여진 구조와 약학적으로 수용가능한 담체를 함유하는 치료 조성물의 하나 이상의 투여량들을 피검자에게 투여하여 피검자의 B-세포 악성종양 또는 B-세포 면역 또는 자가면역 질환을 치료하는 방법도 제공되며, 각각의 항원 결합 사이트는 CD19, CD20, CD22 또는 IL-17의 상이한 에피토프를 결합한다. 치료 조성물은 투여당 20 내지 1500 밀리그람 단백질 또는 투여당 20 내지 500 밀리그람 단백질 또는 투여당 20 내지 100 밀리그람 단백질의 투여량으로 장관외적으로 투여될 수 있다. 피검자는 투여당 20 내지 100 밀리그람 단백질의 반복된 비장관외적 투여량 또는 투여당 20 내지 1500 밀리그람 단백질의 반복된 비장관외적 투여량을 받을 수 있다. 이러한 방법들에서, 결합 구조의 하분수(sub-fraction)는 32P, 33P, 47Sc, 67Cu, 67Ga, 90Y, 111Ag, 111In, 125I, 1311, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166 Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 211At, 223Ra 및 225Ac 또는 그 조합과 같은 방사성 동위원소로 라벨링될 수 있다.
안정적으로 묶여진 구조를 함유하는 진단 조성물을 피검자에게 투여하여 피검자의 B-세포 악성종양 또는 B-세포 면역 또는 자가면역 질환을 검출하거나 진단하는 방법도 제공되며, 각각의 항원 결합 사이트는 CD19, CD20, CD22 또는 IL-17의 상이한 에피토프, 약학적으로 수용가능한 담체 및 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 89Zr 94 mTc, 94Tc, 99 mTc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 154-158Gd, 177Lu, 32P, 45Ti 및 188Re 또는 그 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 방사성핵종을 결합한다. 상기 응용은 잠재성 종양들을 확인하는 외과수술중의 진단을 위한 것일 수도 있다.
안정적으로 묶여진 구조를 함유하는 진단 조성물을 피검자에게 투여하여 피검자의 B-세포 악성종양 또는 B-세포 면역 또는 자가면역 질환을 검출하거나 진단하는 방법도 제공되며, 각각의 항원 결합 사이트는 CD19, CD20, CD22 또는 IL-17의 상이한 에피토프, 약학적으로 수용가능한 담체 및 자기 공명 영상(MRI)에 사용되는 하나 이상의 영상 증진제들을 결합한다. 영상 증진제는 상술한 것들로부터 선택될 수 있다.
검출가능한 표지 또는 진단제가 부착되고 하나 이상의 항원 결합 사이트들이 질병 또는 질환의 표지 물질에 특이적인 안정적으로 묶여진 구조를 질병이나 질환을 앓고 있는 피검자에게 투여하여 비-종양성 질병 또는 질환을 진단하고/하거나 치료하는 방법도 제공된다. 질병 또는 질환은 소포자균, 백선균, 표피사상균, 스포르트릭스 쉔키, 크립토코크스 네오포르만스, 콕시디오이데스 이미티스, 히스토플라스마 캡슐라툼, 블라스토마이세스 데르마티티디스 및 칸디다 알비칸스, 또는 a virus, such as 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 광견병 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인간 파필로마 바이러스, B형 간염 바이러스, 센다이 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 레오 바이러스, 폴리오 바이러스, 인간 혈청 파르보-유사 바이러스, 유인원 바이러스40, 호흡기 합포체 바이러스, 쥐 유방 종양 바이러스, 수두-대상포상진 바이러스, 뎅기 바이러스, 풍진 바이러스, 홍역 바이러스, 아데노바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스들, 엡스타인-바르 바이러스, 쥐 백혈병 바이러스, 볼거리 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 신드비스 바이러스, 림프구성 맥락 수막염 바이러스 및 청설 바이러스와 같은 바이러스 , 대표적인 바이러스들은 (HIV), , , 풍진 바이러스, 홍역 바이러스, 아데노바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스들, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스, 쥐 백혈병 바이러스, 볼거리 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 신드비스 바이러스(Sindbis virus), 림프구성 맥락 수막염 바이러스 또는 청설 바이러스를 포함한다. 질병 또는 질환은 탄저균, 스트렙토코커스 아갈락티에, 레지오넬라 뉴모필리아, 스트렙토코쿠스 파이오제니스, 대장균, 임질균, 수막구균, 뉴모코쿠스균, 헤모필루스 인플루엔자균 B, 매독균, 라임병 스피로헤타균들, 슈도모나스 애루지노사, 나병균, 우유산균, 결핵균 또는 마이코플라스마와 같은 박테리아에 의하여 유발될 수 있다.
질병 또는 질환은 급성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 만성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 피부근육염, 시데남무도병, 중증근무력증, 전신 홍반 루프스, 루프스신염, 류마티스열, 다선성 증후근, 수포성 유천포창, 소아 당뇨병, 헤노흐-쇤라인 자반증, 후기-연쇄상구균신장염, 결절 홍반, 다카야스 동맥염, 애디슨병, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 사르코이드증, 궤양성 대장염, 다형 홍반, IgA 신장병증, 결절성 다발성 동맥염, 강직성 척추염, 굿파스튜어 증후군, 폐색성 혈전맥관염, 쇠그랜 증후근, 원발성 담즙성 간경변증, 하시모토 갑상선종, 갑상선중독증, 피부경화증, 만성 활동성 간염, 다발성근육염/피부근육염, 다연골염, 심상성천포창, 베게너 육아종증, 막성 신장병증, 근위축성 측삭 경화증, 척수로, 거대 세포 동맥염/다발성 근육통, 악성 빈혈, 급성 전진성 사구체신염, 건선 및 섬유성 폐포염과 같은 자가면역성 질병일 수 있다.
질병 또는 질환은 심근 경색, 허혈성 심장병 또는 경동맥죽상경화반들(atherosclerotic plaques) 또는 이식 거부반응 또는 알츠하이머 병일 수 있거나 아토피성 조직에 의하여 유발될 수 있다. 질병 또는 질환은 염증이 발생하는 사이트에서 활성화된 과립구들, 단핵구들, 림프계 세포들 또는 대식세포들의 누적에 의하여 유발된 염증일 수 있으며 상기 염증은 감염원에 의하여 유발된다.
또한, 특정 수용체를 발현하거나 수용체를 과잉발현하는 세포들은 A 또는 B 성분이 수용체를 가지는 세포(들)에 안정적으로 묶여진 구조의 결합을 지시하는 수용체에 대한 리간드를 함유하는 안정적으로 묶여진 구조를 사용하여 표적될 수 있다. 치료 또는 진단제들은 상기 구조의 소단위체들 중 하나 이상에 융합되거나 접 합되어 진단 및 치료 방법들을 가능하게 한다.
치료 및 진단을 위한 사용: 사전표적과 관계된 응용들
사전표적은 원래 항체들을 직접 표적하는 느린 혈액 제거를 해결하도록 개발된 다단계 과정으로서, 정상 세포들, 특히 골수에 바람직하지 않은 독성에 기여한다. 사전표적으로, 방사성핵종 또는 다른 치료제가 혈액으로부터 몇 분 이내에 제거되는 작은 화합물로 부착된다. 항원을 표적하는 것에 더하여 작은 방사성라벨링된 화합물을 인식할 수 있는 사전표적 작용제가 우선 투여되고, 방사성라벨링된 화합물은 사전표적 작용제가 혈액으로부터 충분히 제거되는 이후에 투여된다.
사전표적 방법들이 개발되어 검출 또는 치료제들의 표적:배경 비율들을 증가시킨다. 사전-표적 및 바이오틴/아비딘 접근법들의 예들은 예를 들어, 여기에 모두 참고로 포함된 Goodwin et al., U.S. Pat. No. 4,863,713; Goodwin et al., J. Nucl. Med. 29:226, 1988; Hnatowich et al., J. Nucl. Med. 28:1294, 1987; Oehr et al., J. Nucl. Med. 29:728, 1988; Klibanov et al., J. Nucl. Med. 29:1951 , 1988; Sinitsyn et al., J. Nucl. Med. 30:66, 1989; Kalofonos et al., J. Nucl. Med. 31 :1791, 1990; Schechter et al., Int. J. Cancer 48:167, 1991; Paganelli et al., Cancer Res. 51:5960, 1991; Paganelli et al., Nucl. Med. Commun. 12:211, 1991; U.S. Pat. No. 5,256,395; Stickney et al., Cancer Res. 51:6650, 1991; Yuan et al., Cancer Res. 51 :3119, 1991; U.S. Pat. No. 6,077,499; U.S. Ser. No. 09/597,580; U.S. Ser. No. 10/361,026; U.S. Ser. No. 09/337,756; U.S. Ser. No. 09/823,746; U.S. Ser. No. 10/116,116; U.S. Ser. No. 09/382,186; U.S. Ser. No. 10/150,654; U.S. Pat. No. 6,090,381; U.S. Pat. No. 6,472,511; U.S. Ser. No. 10/114,315; U.S. Provisional Application No. 60/386,411; U.S. Provisional Application No. 60/345,641; U.S. Provisional Application No. 60/3328,835; U.S. Provisional Application No. 60/426,379; U.S. Ser. No. 09/823,746; U.S. Ser. No. 09/337,756; U.S. Provisional Application No. 60/342,103; 및 U.S. Patent No. 6,962,702에 기술되어 있다.
특이적인 비-한정적 예에서, 안정적으로 묶여진 구조에 기초한 사전표적 작용제는 CEA에 특이적인 두 개의 동일한 종양 항원 결합 사이트들과 합텐인 히스타민-숙시닐-글리신(HSG)에 특이적인 제 3의 결합 사이트를 함유한다. 다른 실시예들에서, 상이한 종양-관련 항원은 동일하거나 상이한 합텐으로 표적될 수 있다.
사전표적 응용들에 대하여, 표적가능한 작용제는 리포솜 지질막의 외부 표면에 공유적으로 부착된 2가의 HSG-펩티드가 있는 리포솜일 수 있다. 리포솜은 대비를 위하여 가스 충진될 수 있거나 치료 또는 진단제로 충진될 수 있다.
피검자의 질병 또는 질환을 치료하거나 진단하는 사전표적 방법은 (1) 제 1 항원 결합 사이트들이 표지 물질 또는 질환에 특이적인 표지 물질들로 향하고 제 2 항원 결합 사이트들이 2가 합텐을 함유하는 표적가능한 구조체로 향하는 상술한 이중특이성 3가 또는 6가 결합 구조를 피검자에게 투여하고; (2) 선택적으로 제거 조성물(clearing composition)을 투여하고, 상기 조성물이 결합 구조를 순환으로부터 제거시키고; 그리고 (3) 표적가능한 구조체는 하나 이상의 킬레이트 되거나 화학적으로 결합된 치료 또는 진단제들을 더 함유하는 2가 합텐을 함유하는 표적 가능한 구조체를 피검자에게 투여함으로써 제공된다. 상기 질병 또는 질환은 상술한 것일 수 있다.
(1) 상술한 바와 같이 전구약물을 활성화시킬 수 있는 공유적으로 부착된 효소를 함유하는 결합 구조를 종양 질환을 지닌 환자에게 투여하고, (2) 선택적으로 제거 조성물을 피검자에게 투여하고 상기 조성물이 상기 구조를 순환으로부터 제거하게 하고, 그리고 (3) 상기 전구약물을 상기 환자에게 투여함으로써 항체 의존성 효소 전구약물 치료요법(ADEPT)의 방법도 제공된다.
다른 사용들
일반적으로, 안정적으로 묶여진 구조들은 암들 또는 비-암 질병들을 치료하는 데 효능을 보인 항체-계 작용제들을 대체할 수 있다. 방사성동위원소들, 약물들 및 독소들이 암 세포들에 의하여 생성되거나 암 세포들과 화합된 표지들에 특이적으로 결합하는 항체들 또는 항체 단편들에 접합될 수 있다는 것이 잘 알려져 있으며 그러한 항체 접합체들은 방사성동위원소들, 약물들 또는 독소들을 표적하여 그 치료 효능을 증진시키고 부작용들을 최소화시키는 데 사용될 수 있는 것이 잘 알려져 있다. 이러한 작용제들 및 방법들의 예들은 Wawrzynczak and Thorpe(Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer, L. M. Franks and N. M. Teich, eds, Chapter 18, pp. 378-410, Oxford University Press. Oxford, 1986), Immunoconjugates, Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer (C. W. Vogel, ed., 3-300, Oxford University Press, N.Y., 1987), 및 Dillman, R. O. (CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology 1 :357, CRC Press, Inc., 1984)에서 검토된다. Pastan et al., Cell (1986), 47:641; Vitetta et al., Science (1987), 238:1098-1104; 및 Brady et al., Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys. (1987), 13:1535-1544도 참조.
몇몇 실시예들에서, 다가의 안정적으로 묶여진 구조들은 예를 들어, 각각이 여기에 참고로 포함된 U.S. Pat. Nos. 6,126,916; 6,077,499; 6,010,680; 5,776,095; 5,776,094; 5,776,093; 5,772,981; 5,753,206; 5,746,996; 5,697,902; 5,328,679; 5,128,119; 5,101,827; 및 4,735,210에 기술된 방법들을 이용하여 정상적인 또는 병든 조직 및 기관들을 치료하고/하거나 영상화하는 데 유용할 수 있다. 다른 방법들은 1999년 6월 22일에 출원된 미국 출원번호 제09/337,756호 및 2001년 4월 3일에 출원된 미국 출원번호 제09/823,746호에 기술되어 있다. 그러한 영상화는 Goldenberg et al, "Antibody Pretargeting Advances Cancer Radioimmunodetection and Radiotherapy," (press, J. Clin. Oncol.)에 기술된 안정적으로 묶여진 구조를 직접 라벨링하거나 사전표적된 영상 방법에 의하여 실행될 수 있다. 각각이 여기에 참고로 포함된 미국 특허공개 제20050002945호, 제 20040018557호, 제20030148409호 및 제20050014207호도 참조.
암에 대한 면역접합체들의 사용하는 다른 예들과 요법의 다른 형태들은 특히, 하기의 미국 특허들: 4,331,647, 4,348,376, 4,361,544, 4,468,457, 4,444,744, 4,460,459, 4,460,561 4,624,846, 4,818,709, 4,046,722, 4,671,958, 4,046,784, 5,332,567, 5,443,953, 5,541,297, 5,601,825, 5,635,603, 5,637,288, 5,677,427, 5,686,578, 5,698,178, 5,789,554, 5,922,302, 6,187,287 및 6,319,500 에 기술되어 있다. 이러한 방법들은 조작된 항체들 및 당해 안정적으로 묶여진 구조들로 기존의 방법들의 항체들을 치환시켜 여기에 기술된 방법들에 적용될 수도 있다.
몇몇 실시예들에서, 여기에 개시되고 청구된 안정적으로 묶여진 구조들은 방사성핵종 또는 방사성면역요법 방법들에 유용할 수 있다(예컨대, 각각이 여기에 참고로 포함된 Govindan et al., 2005, Technology in Cancer Research & Treatment, 4:375-91; Sharkey and Goldenberg, 2005, J. Nucl. Med. 46:115S-127S; Goldenberg et al. (in press, J. Clin. Oncol.), "Antibody Pretargeting Advances Cancer Radioimmunodetection and Radioimmunotherapy" 참조).
다른 실시예에서, 방사선 민감제가 노출되거나 접합된 안정적으로 묶여진 구조, 항체 또는 항체 단편과 병용되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 방사선 민감제는 방사선라벨링된 안정적으로 묶여진 구조와 병용하여 사용될 수 있다. 방사선 민감제를 첨가하면 방사선라벨링된 안정적으로 묶여진 구조 단독으로 처리하는 것과 비교하여 효능이 증가할 수 있다. 방사성 민감제들은 여기에 그대로 참고로 포함된 D. M. Goldenberg (ed.), CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, CRC Press (1995)에 기술되어 있다.
청구된 방법들 중 임의의 것에 사용되는 안정적으로 묶여진 구조들은 항미생물제들과 화합되거나 병용적으로 투여될 수 있다.
청구된 방법들 중 임의의 것에 사용되는 안정적으로 묶여진 구조들은 시토카인들 및 면역조절물질들과 화합되거나 병용적으로 투여될 수 있다. 이러한 시토카 인들 및 면역조절물질들은 적어도 알파, 베타 및 감마의 인터페론들 및 집락 자극 인자들을 포함한다.
개시된 방법들은 안정적으로 묶여진 구조들을 사용하여 환자의 면역 반응을 자극하는 데 유용할 수도 있다. 일 실시예에서, 안정적으로 묶여진 구조는 항-유전형 항체의 항원 결합 사이트(ABS)를 포함할 수 있다. 그러한 안정적으로 묶여진 구조는 신체의 면역 반응을 증진시키는 종양-관련 항원의 에피토프를 모방할 수 있다.
안정적으로 묶여진 구조는 항체들을 현재 채용하는 수많은 면역학적 절차들에 사용될 수 있다. 이러한 절차들은 면역 시스템을 부양시키는 항-유전형 항체들과 에피토프 접합된 항체들의 사용을 포함한다. U.S. Patents 5,798,100; 6,090,381; 및 6,132,718을 참조. 항-유전형 항체들은 암들과 감염성 질병들에 대항하는 백신들로서도 채용될 수 있다. 또한, 다중특이성 삼량체 또는 육량체 결합 구조는 다중약물 트랜스포터 단백질들을 결합하고 세포들과 병원체들 내에서 다중약물 내성 표현형을 극복할 수 있다. 이러한 방법들에서의 항체들은 여기에 개시된 안정적으로 묶여진 구조에 의하여 대체될 수 있다.
다양한 실시예들은 자가면역 질환의 증세를 치료하는 방법들에 관한 것이다. 상기 방법에서, 안정적으로 묶여진 구조는 투여되기 전에 약학적으로 수용가능한 담체와 혼합될 수 있는 자가면역 질환을 지닌 환자에게 투여된다. 본 방법의 안정적으로 묶여진 구조는 B-세포 또는 T-세포 항원 에피토프에 결합 특이성을 지닌 적어도 하나의 ABS를 함유하여야 한다. B 세포 항원은 CD22일 수 있으며 에피토프는 CD22의 에피토프 A, 에피토프 B, 에피토프 C, 에피토프 D 및 에피토프 E와 기타 다른 것들일 수 있다. B 세포-관련 항원은 CD19, CD20, HLA-DR 및 CD74와 같은 다른 세포 항원일 수도 있다. T-세포 항원들은 CD25를 포함할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 자가면역 질병을 치료하는 유용한 안정적으로 묶여진 구조들은 IL-17과 결합하도록 선택될 수 있다.
ABS는 인간하위 영장류(subhuman primate), 쥐 단일클론성 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 인간 기원의 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, ABS는 인간화된 LL2(항-CD22), 인간화된 LL1(항-CD74) 또는 인간화된 A20(항-CD20) 단일클론성 항체 기원일 수 있다.
투여는 투여당 20 내지 2000 ㎎의 투여량들로 장관외성일 수 있다. 투여는 증세가 어느 정도 감소될 때까지 반복될 수 있다.
청구된 방법들에 의하여 치료될 수 있는 환자들은 인간을 포함한 임의의 동물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 동물은 인간, 영장류, 말, 개 및 고야이와 같은 포유류이다.
안정적으로 묶여진 구조들은 전신성 화학요법에 대하여 내성이 있거나 무반응적인(refractory) 질병들의 치료에 사용될 수 있다. 이것들은 다양한 바이러스성, 진균성, 박테리아성 및 원충감염뿐만 아니라 특정한 기생충성 감염들을 포함한다. 바이러스성 감염들은 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 및 사이토메갈로바이러스, 광견병 바이러스(랍도바이러스), 파필로마 바이러스 및 파포바바이러스에 의하여 유발된 감염들을 포함하며, 이 모든 것은 전신 성 항생/세포독소제들로 치료하기 어렵다. 다가의 결합 구조들을 사용하면 표적 바이러스들에 대한 더 높은 친화력을 제공하여 상당히 높은 치료 지수로 나타날 수 있다. 방사성동위원소들로 라벨링된 안정적으로 묶여진 구조들의 접합체들(및 열중성자로 활성가능한 붕소 가수들을 포함)을 사용하는 표적된 방사성면역요법은 항바이러스 치료요법에 새로운 접근법을 제공한다.
본 발명에 기술된 방법들에 의하여 치료될 수 있는 원생동물들은 예컨대, 변형체(특히 말라리아 기생충인 열대열 말라리아(P. falciparum)), 톡소플라즈마 곤디이(톡소플라즈마증 감염원), 리슈만편모충(리슈마니아증의 감염원) 및 에스케리치아 히스톨리티카(Escherichia histolytica)를 포함한다. 다양한 단계들에서 말라리아를 검출하고 치료는 안정적으로 묶여진 구조들을 사용하여 상당히 증진될 수 있다. 포자소체 항원들과 결합하는 단일클론성 항체들(mAbs)은 알려져 있다. 그러나, 포자소체 항원들은 혈액 단계(blood stage) 기생충들에 의하여 공유되지 않기 때문에, 표적용 포자소체 항원들에 대항하는 그러한 mABs의 사용은 주사한 직후 및 숙주의 간세포들 내에서 발달되기 전에 포자소체들이 순환에서 존재하지 않는 상대적으로 짧은 시간의 기간에 한정된다. 따라서, 다중 특이성을 지닌 하나 이상의 안정적으로 묶여진 구조로 달성될 수 있는 원생동물(열대열 말라리아 같은)의 하나 이상의 기생충 단계를 표적할 수 있는 mAbs의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 접합체들을 사용하면 예컨대 99 mTc 또는 치료요법, 예컨대, 211At 또는 항말라리아 약물, 예컨대, 피리메타민으로 영상에 다른 장점을 제공할 수 있다.
톡소플라즈마증은 전신성 화학요법에도 내성이 있다. 톡소플라즈마 곤디이 와 특이적으로 결합하는 mAbs 또는 자연 숙주 항체들은 톡소플라즈마증에 대한 면역 반응에 역할을 할 수 있지만, 말라리아 기생충들의 경우에, 적절하게 표적된 안정적으로 묶여진 구조들은 치료제들의 전달에 효과적인 운반체들일 수 있다.
광범위 연충 감염인 주혈협충증은 몇몇 우렁패들에 의하여 옮겨지는 자유-유영 세르카리아에의하여 촉발된다. 말라리아의 경우에, 감염 과정에 관련된 상이한 단계의 세르카리아가 있다. 세르카리아의 복수의 단계들과 결합하고, 선택적으로는 그것들의 하나 이상의 복수의 에피토프들과 결합하는 안정적으로 묶여진 구조들 및 바람직하게는 다중특이성 복합체(polyspecific composite)의 형태인 안정적으로 묶여진 구조들은 효과적인 표적화 및 치료 효능의 증가를 위하여 영상 또는 요법제에 접합될 수 있다.
샤가스병(Chaga's disease)의 병원체인 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)의 하나 이상의 형태들과 결합하는 안정적으로 묶여진 구조들은 이러한 미생물 감염의 검출 및 치료를 위하여 제조되고 사용될 수 있다. 상기 트리파노소마의 분화 단계들 상에 세포-표면 당단백질 또는 다른 표면 항원들과 반응하는 안정적으로 묶여진 구조들은 영상 및 치료제들을 신체 내의 기생충 침투(parasitic infiltration)의 사이트들로 지시하는 데 적당하다.
적당한 약물들에 의한 치료를 위하여 아주 까다로운 다른 감염성 유기체는 나병균(나병 미코박테리아)이다. 나병 미코박테리아의 표면상에 복수개의 에피토프들과 특이적으로 결합하는 안정적으로 묶여진 구조들은 상기 나병균에 대하여 영상 제들 및/도는 항생/세포독성제들을 표적시키기 위하여 제조될 수 있으며 단독으로 또는 병용하여 사용될 수 있다.
예컨대, 분성충증 및 선모충증과 같은 그자체로 화학 치료제들에 대하여 상대적으로 무반응적인 기생성 연충 감염들은 안정적으로 묶여진 구조들에 대하여 적당한 표적들이다. 그들의 진단과 치료는 기생충들 상의 하나 또는 바람직하게는, 복수개의 에피토프들과 특이적으로 결합하는 적절한 안정적으로 묶여진 구조들 또는 접합체들에 의하여 달성될 수 있다.
항체들은 이용가능하거나 인간에서의 대부분의 감염들의 원인이 되는 미생물 및 기생충들의 대부분과 특이적으로 결합하도록 용이하게 재배될 수 있다. 수많은 항체들이 시험관 내 진단 목적들을 위하여 이전에 사용되었으며 감염 사이트들에 진단 및 치료제들을 표적하는 항체 접합체들의 성분들로서 안정적으로 묶여진 구조들로 포함될 수 있다. 미생물 병원체들 및 인간들과 포유류의 무척추 기생충들은 그것의 다양한 단계들에서 발현되는 항원들의 다양성을 가지는 복합생활환들(complex life cycles)을 지닌 유기체들이다. 그러므로, 상이한 형태들 상에 항원 결정인자들을 인식하는 안정적으로 묶여진 구조들이 적절한 치료 종류(therapeutic modality)에 연결된 혼합물 또는 다중특이성 접합체들로서 제조되고 병용적으로 사용된다. 예컨대, 핵종들 및/또는 MRI 증진제들과 같은 조영제들의 부착에 의하여 감염 사이트들을 검출하기 위하여 안정적으로 묶여진 구조들을 포함하는 시약들을 사용하는 것에 동일한 원리가 적용된다.
다른 실시예들은 안정적으로 묶여진 구조가 표적된 조직을 특이적으로 결합 하는 적어도 하나의 항원 결합 사이트 및 표적가능한 구조체를 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 다른 항원 결합 사이트를 포함하고; 그리고 상기 적어도 하나의 항원 결합 사이트가 표적 세포들, 조직들 또는 병원체 상의 또는 그것에 의하여 생성되거나 그것과 화합된 분자 상의 상보적인 결합 모이어티와 결합할 수 있는 안정적으로 묶여진 구조 및 표적가능한 구조체의 유효량을 투여하여 병든 조직들을 외과수술중에 확인하는 방법들에 관한 것이다.
또 다른 실시예들은 안정적으로 묶여진 구조의 유효량을 투여하고 표적가능한 구조체를 투여하여 피검자의 병든 조직들을 내시경검사 확인 방법들에 관한 것이다. 안정적으로 묶여진 구조는 표적된 조직을 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 사이트 및 표적가능한 구조체를 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 사이트를 포함한다; 그리고 상기 적어도 하나의 항원 결합 사이트는 표적 세포들, 조직들 또는 병원체 상의 또는 그것에 의하여 생성되거나 그것과 화합된 분자 상의 상보적인 결합 모이어티와의 특이적인 결합을 보여준다.
다른 유용한 검출 방법은 예를 들어, Given Imaging(Norcross GA)로부터 상용으로 구입가능한 유형의 먹는 캡슐 카메라/검출기(ingested capsule camera/detector)를 사용하여 무선 캡슐 내시경검사이다. 몇몇 실시예들은 안정적으로 묶여진 구조의 유효량을 투여하고 표적가능한 구조체를 투여하여 피검자에게 병든 조직들의 내시경검사 확인 방법들에 관한 것이다. 본 실시예에서, 안정적으로 묶여진 구조는 표적된 조직을 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 사이트 및 표적가능한 구조체를 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 사이트 를 포함하며; 그리고 상기 적어도 하나의 항원 결합 사이트는 표적 세포들, 조직들 또는 병원체 상의 또는 그것에 의하여 생성되거나 그것과 화합된 분자 상의 상보적인 결합 모이어티와의 특이적인 결합을 보여준다.
다른 실시예들은 안정적으로 표적된 구조의 유효량과 표적가능한 구조체를 투여하여 피검자의 병든 조직들의 혈관 내 확인 방법들에 관한 것이다. 안정적으로 묶여진 구조는 표적 세포들, 조직들 또는 병원체 상의 또는 그것에 의하여 생성되거나 그것과 화합된 분자 상의 상보적인 결합 모이어티와 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 사이트(ABS) 및 표적가능한 구조체를 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 ABS를 포함한다. 표적 조직은 갑상선, 간, 심장, 난소, 흉선, 부갑상선, 자궁내막, 골수, 림프절들 또는 비장과 같은 정상적인 조직일 수 있다.
몇몇 실시예들은 청구된 방법들을 실시하는 키트들에 관한 것이다. 키트는 표적가능한 구조체를 포함할 수 있다. 표적가능한 구조체는 상기 표적가능한 구조체들에 적당한 것으로 기술된 임의의 작용제들에 의하여 라벨링될 수 있다. 또한, 표적가능한 구조체는 라벨링되지 않을 수 있지만 키트는 표적가능한 구조체를 라벨링하는 표지 시약들(labeling reagents)을 포함할 수 있다. 표지 시약들은 포함된다면, 표지 및 가교제를 함유할 수 있다. 키트는 표적가능한 구조체에 특이적인 적어도 하나의 ABS 및 표적가능한 조직에 특이적인 적어도 하나의 ABS를 포함하는 안정적으로 묶여진 구조를 포함할 수도 있다. 키트는 안정적으로 묶여진 구조를 순환으로부터 제거하는 제거 조성물을 선택적으로 함유할 수 있다.
안정적으로 묶여진 구조들에 대한 표적들
안정적으로 묶여진 구조들에 대한 표적들에 대한 다른 개시물은 2004년 12월 9일에 출원된 Goldenberg 등의 가출원인 미국 특허출원 제60/634,076호(발명의 명칭: "Methods and Compositions for Immunotherapy and Detection of Inflammatory and Immune-dysregulatory Disease, Infectious Disease, Pathologic Angiogenesis and Cancer")에 개시되어 있으며, 그 전체 내용은 여기에 참고로 포함되어 있다.
몇몇 실시예들에서, 여기에 청구된 안정적으로 묶여진 구조들은 두 개의 상이한 표적들과 특이적으로 반응한다. 상이한 표적들은 고유의 면역 시스템의 전구염증 작동체들, 응고 인자들, 보체 인자들 및 상보적인 조절 단백질, 염증 또는 면역 이상조절 질환, 감염성 병원체 또는 병리학적 혈관형성 또는 암과 특이적으로 관련된 표적들을 포함할 수 있지만 여기에 한정되지 않으며, 표적의 이러한 후자의 클래스는 면역 시스템 또는 응고 인자의 전구염증 작동체는 아니다. 따라서, 몇몇 실시예들에서 안정적으로 묶여진 구조는 병든 세포, 병리학적 혈관형성 또는 암 또는 감염성 질병과 관련된 적어도 하나의 결합 특이성 및 B-세포들, T-세포들, 호중구들, 단핵구들 및 대식세포들 및 수지상 세포들 또는 트롬빈 또는 조직 인자와 같은 응고 조절물질들 또는 IL-1, IL-6, IL-10, HMGB-1 및 MIF와 같은 전구염증 시토카인들을 함유한다.
안정적으로 묶여진 구조는 나출될 수 있지만, 방사성핵종, 붕소 화합물, 면역조절물질, 펩티드, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 올리고뉴클레오티드들, 효소 억제제, 감응 치료제(photoactive therapeutic agent), 세포독성제, 혈관형성 억제제 및 그 조합을 포함하여, 진단 조영제(예컨대, 동위원소, 방사선학적인 조형제) 에 또는 치료제에 접합될 수도 있다. 안정적으로 묶여진 구조를 표적에 결합시키면 하양조절하거나 그렇지 않으면 면역 세포 기능에 영향을 줄 수 있지만, 안정적으로 묶여진 구조는 면역 세포 기능에 직접적으로 영향을 주지 않는 다른 표적들에 결합할 수도 있다. 예를 들어, CD66 또는 CEACAM6(예컨대, NCA90 또는 NCA95) 항-과립구 항체는 감염된 조직들 내에서 과립구들을 표적하는 데 사용될 수 있으며, CEACAM6을 발현하는 암들을 표적하는 데 사용될 수도 있다.
일 실시예에서, 치료제는 올리고뉴클레이드이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이중 가닥 간섭 RNA(RNAi) 분자일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 bcl-2 또는 p53같은 암유전자에 대항할 수 있다. bcl-2 발현을 억제하는 안티센스 분자는 U.S. Pat. No. 5,734,033에 기술되어 있다. 그것은 안정적으로 묶여진 구조에 접합되거나 안정적으로 묶여진 구조의 치료제 부분을 형성할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 안정적으로 묶여진 구조와 동시적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
다른 실시예에서, 치료제는 붕소 가수이며, 치료는 치료제의 국소화 이후에 열 또는 고열중성자들로 조사를 포함한다. 치료제는 특히 색소원 또는 염료인 감응 치료제일 수도 있다.
바람직한 일 실시예에서, 치료제는 약물이나 독소인 세포독성제이다. 또한 바람직하게는 상기 약물은 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체들, 알킬 설폰산염들, 나이트로소우레아들, 젬시타빈, 트라이아진들, 엽산 유사체들, 안트라사이클린들, 탁산들, COX-2 억제제들, 피리미딘 유사체들, 퓨린 유사체들, 항생제들, 효소들, 효소 억제제들, 에피포도필로톡신들, 백금 배위 착물들, 빈카 알카로이드들, 대체된 우레아들, 메틸 하이드라진 유도체들, 부신피질 억제제들, 호르몬 길항제들, 엔도스타틴, 택솔들, SN38, 캄프토테신들, 독소루비신들 및 그 유사체들, 항대사물질들, 알킬화제들, 항유사분열제들, 항혈관형성제들, 세포자살제들(apoptotoic agents), 메토트렉세이트, CPT-11 및 그 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 다른 실시예에서, 치료제는 동물, 식물 및 미생물 원천을 포함하는 군으로부터 선택된 원천으로부터 유래한 독소이다. 바람직한 독소들은 리신, 아브린, 알파 독소, 사포린, 리보뉴클레아제(RNA분해효소), DNA분해효소 I, 포도상구균 장독소-A, 미국자리공 항바이러스 단백질, 젤로닌, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소 및 슈도모나스 내독소들을 포함한다.
치료제는 시토카인과 같은 면역조절물질, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소, 조혈 인자, 집락 자극 인자(CSF), 인터페론(IFN), 줄기 세포 성장 인자, 적혈구생성소, 혈소판형성소 및 그 조합일 수 있다. 상기 림프독소는 종양 괴사 인자(TNF)이다. 상기 조혈 인자는 인터류킨(IL)일 수 있으며, 상기 집락 자극 인자는 과립구-집락 자극 인자(G-CSF) 또는 과립구 대식세포-집락 자극 인자(GM-CSF)이며, 상기 인터페론은 인터페론-α, β 또는 γ일 수 있으며, 상기 줄기 세포 성장 인자는 S1 인자일 수 있다. 또한, 상기 면역조절물질은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-18, IL-21, 인터페론-γ, TNF-α 또는 그 조합을 포함할 수 있다.
바람직한 치료 핵종들은 80 내지 500 keV의 keV 범위의 베타, 알파 및 오제 방출체를 포함한다. 대표적인 치료 방사성핵종들은 32P, 33P, 47Sc, 125I, 131I, 86Y, 90Y, 186Re, 188Re, 189Re, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 111In, 111Ag, 142Pr, .153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 177Lu, 198Au, 211At, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 223Ra 및 225Ac 및 그 조합들을 포함한다. 대표적인 감응 치료제들은 색소원들 및 염료들을 포함하는 군으로부터 선택된다.
치료제는 말산 탈수소효소, 포도상구균 뉴클레아제, 델타-V-스테로이드 이성질화효소, 효모 알코올 탈수소효소, α-글리세로포스페이트 디하이드로게나제, 삼탄당인산 이성질화효소, 고추냉이 과산화효소, 알칼라인 포스파타제, 아스파라기나제, 포도당 산화효소, β-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 요소분해효소, 카탈라제, 포도당-6-인산 탈수소효소, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린에스테라아제를 포함하는 군으로부터 선택된 효소이다.
치료제 펩티드들의 다양한 예들은 업계에 알려져 있고 그러한 임의의 알려진 작용제는 사용될 수 있다. 대표적인 치료 펩티드들은 호르몬들, 성장 인자들, 시토카인들, 케모카인들, 결합 펩티드들, 차단 펩티드들, 독소들, 혈관형성 인자들, 항-혈관형성 인자들, 항생제들, 항암 펩티드들, 항-바이러스성 펩티드들, 약학적 펩티드들, 효소들, 길항물질들, 길항제들, 적혈구생성소와 같은 조혈제들 및 수많은 다른 임상적으로 유용한 화합물들을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
안정적으로 묶여진 구조는 적어도 하나의 전구염증 작동체 시토카인, 전구염증 작동체 케모카인 또는 전구염증 작동체 수용체에 특이적으로 결합할 수 있다. 안정적으로 묶여진 구조가 결합하는 전구염증 작동체 시토카인들은 MIF, HMGB-1, TNF-α(종양 괴사 인자 알파), IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17 및 IL-18을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 전구염증 작동체 케모카인들은 CCL19, CCL21, IL-8, MCP-I(단핵구 화학주성 단백질 1), RANTES, MIP-IA (대식세포 염증 단백질 IA), MIP- IB (대식세포 염증 단백질 IB), ENA-78 (상피 호중구 활성 펩티드 78), IP-10, GROB (GRO 베타) 및 에오탁신을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 전구염증 작동체 수용체들은 IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R 및 IL-18을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 안정적으로 묶여진 구조는 조직 인자 또는 트롬빈과 같은 적어도 하나의 응고 인자와 특이적으로 반응할 수도 있다. 림포카인들/시토카인들은 면역 세포들 상의 그 수용체들과 반응하여 활성화를 이루며, 항체들은 리포카인/시토카인을 중화시킴으로써 활성화를 차단할 수 있다. 또한, 항체들은 림포카인/시토카인 수용체들과 반응하여 활성화를 차단할 수 있다.
안정적으로 묶여진 구조가 특이적으로 결합하는 상이한 표적들은 동일하거나 상이한 클래스들의 작동체들 및 응고 인자들로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, 안정적으로 묶여진 구조가 특이적으로 결합하는 두 개 이상의 상이한 표적들은 동일한 종류의 작동체들 또는 두개 이상의 상이한 전구염증 작동체 시토카인들, 두 개 이상의 상이한 전구염증 작동체 케모카인들, 두 개 이상의 상이한 전구염증 작동체 수용체들 또는 두 개 이상의 응고 인자들과 같은 응고 인자들로부터 선택될 수 있다. 또한, 두 개 이상의 상이한 표적들은 상이한 클래스의 작동체들 및 응고 인자들로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나의 표적은 고유의 면역 시스템의 전 구염증 작동체일 수 있으며 하나의 작용제는 응고 인자일 수 있다. 또는 안정적으로 묶여진 구조는 적어도 하나의 전구염증 작동체 시토카인 및 적어도 하나의 전구염증 작동체 케모카인, 적어도 하나의 전구염증 작동체 시토카인 및 적어도 하나의 전구염증 작동체 수용체 또는 적어도 하나의 전구염증 작동체 케모카인 및 적어도 하나의 전구염증 작동체 수용체와 같은 두 개의 상이한 종류의 전구염증 작동체들과 특이적으로 반응할 수 있다. 안정적으로 묶여진 구조는 특이적으로 반응하는 두 개의 상이한 표적들은 고유 면역 시스템의 동일한 전구염증 작동체의 하나 이상의 에피토프 또는 동일한 응고 인자의 하나 이상의 에피토프인 경우일 수도 있다.
따라서, "두 개의 상이한 표적들"은 두 개의 상이한 항원들 또는 동일한 항원의 두 개의 상이한 에피토프들을 뜻할 수 있다. 다중 항체들은 동일한 항원에 대항하여 사용되어, 원자가를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 특히, 패혈증, 몇몇 암들 및 경동맥죽상경화반들의 치료를 위하여, MIF 또는 HMGB-1을 표적하는 경우에, 표적들의 두 개의 동일한 에피토프들에 결합하는 두 개의 항체들은 CD74와 같은 HLF 클래스 II 불변 사슬 항원과 같은 상이한 항원에 대해 한 개 이상의 결합 팔들을 가지는 다른 항체를 지닌 안정적으로 묶여진 구조로 포함될 수 있다. 항체들은 예컨대, MIF 및 CD74에 대한 항체들; HMGB-1 및 CD74에 대한 항체들과 같은 두 개의 상이한 항원들과 결합하도록 선택될 수 있다.
전구염증 작동체 수용체가 표적되는 경우에, 바람직한 일 실시예에서 실질적인 표적은 전구염증 작동체 수용체의 세포외 구역일 수 있다. 다른 실시예에서, 안정적으로 묶여진 구조는 전구염증 작동체 수용체와 반응하는 적어도 하나의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 상기 전구염증 작동체 수용체에 대한 천연 길항체 또는 수용체와 특이적으로 상호작용하는 본 길항제의 단편 또는 돌연변이체일 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 천연 길항제는 천연 IL-1 수용체 길항제 또는 본 길항제의 단편 또는 돌연변이체일 수 있다.
일 실시예에서, 표적은 후천성 면역 시스템(adaptive immune system)의 항원 또는 수용체일 수 있다. 다른 실시예들에서, 안정적으로 묶여진 구조의 표적은 과립구들, 단핵구들, 대식세포들, 수지상 세포들 및 NK-세포들과 같은 고유의 면역 시스템의 세포들 상에 발생할 수 있다. 다른 표적들은 혈소판들 및 내피 세포들을 포함한다. 표적들의 또 다른 군은 C5a, LPS, IFNγ 및 B7으로 구성된 군이다. 적당한 표적들의 다른 군은 CD2, CD3, CD4, CD14, CD18, CD11a, CD20, CD22, CD23, CD25, CD29, CD38, CD40L, CD52, CD64, CD83, CD147 및 CDl54를 포함한다. CD들은 면역 세포 반응을 방지하도록 차단될 수 있는 면역 세포들 상의 표적들이다. CD83은 활성화된 수지상 세포들의 표지로서 특히 유용하다(Cao et al ., Biochem J., Aug. 23, 2004 (Epub ahead of print); Zinser et al ., J. Exp Med. 200(3):345-51 (2004)).
MIF, HMGB-1, TNF-α, 보체 인자들 및 보체 조절 단백질들 및 응고 인자들과 같은 몇몇 표적들은 특히 중요하다. MIF는 고유의 면역 시스템의 중요한 시토카인이며 염증 반응들의 대조에서 중요한 역할을 한다. 원천적으로 대식세포들의 무작위 이주(random migration)를 억제했던 T 림프구-유도된 인자로서 기술된 대식세포 이주 억제 인자(MIF)로 알려진 단백질은 거의 30년 동안 정체 모를 시토카인이었 다. 근년에, 뇌하수체 전엽 산물로서 MIF를 발견하고 생동성 재조합 MIF 단백질의 클로닝 및 발현은 생체 내에서의 그 중요한 생물학적 역할을 정의하게 되었다. MIF는 당질코르티코이드들(glucocorticoids)에 의하여 자극되는 대식세포들 및 T 림프구들으로부터 방출되는 독특한 성질을 가진다. 일단 방출되면, MIF는 시험관 내의 LPS-자극된 단핵구들에 의한 TNF-α, IL-1 베타, IL-6 및 IL-8 생성에 미치는 당질코르티코이드들의 억제적 영향들을 극복하고 생체 내의 치명적인 내독소혈증에 대항하는 스테로이드들의 보호하는 영향들을 멈추게 한다. MIF는 IL-2 및 IFN-감마 생성을 회복시켜 시험관 내의 T-세포 증식의 당질코르티코이드 억제를 길항하기도 한다. MIF는 당질코르티코이드들의 억제 영향들을 대항하여 역-조절(counter-regulate)할 수 있는 것으로 확인되는 제 1 매개체이므로 염증 및 면역의 숙주 대조에 중요한 역할을 한다. MIF는 암, 병리적 혈관형성 및 패혈증 또는 패혈 쇼크를 치료하는 데 특히 유용하다.
DNA 결합 핵 및 세포질 단백질인 HMGB-1은 IL-1β, TNF 또는 LPS에 의하여 활성화되는 단핵구들 및 대식세포들에 의하여 방출되는 전구염증 시토카인이다. 그것의 B 박스 구역을 통하여, 그것은 DC들의 표현형 성장(phenotypic maturation)을 유도한다. 그것은 또한 IL-1 알파, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α 및 RANTES의 전구 염증 시토카인들의 분비 증가를 유발하기도 한다. 괴사 세포들에 의하여 방출되는 HMGB-1은 DC들에 의하여 감지되는 경우에 면역 반응을 유도하고/하거나 증진시키는 조직 또는 세포 손상의 신호일 수 있다. Palumbo et al.은 HMBG1이 메조혈관세포 이주 및 증식을 유도한다고 보고한다(J Cell Biol, 164:441-449(2004)).
HMGB-1은 TNF 및 IL-1베타와 관련한 상당히 지연된 반응과정을 보이는 내독소-유도된 치사율의 말기 매개체(late mdiator)이다. TNF 및 IL-1베타와 같은 특이적인 초기 염증 매개체들을 표적하는 실험적인 치료제들은 단독으로는 임상에서 효능이 있는 것으로 증명되지 않았지만, 안정적으로 묶여진 구조들은 초기 및 말기 염증 매개체들을 표적함으로써 반응을 개선시킬 수 있다.
HMBG-1을 표적하는 안정적으로 묶여진 구조들은 관절염, 특히 콜라겐-유도 관절염을 치료하는 데 유용하다. HMBG-1을 포함하는 안정적으로 묶여진 구조들은 패혈증 및/또는 패혈 쇼크를 치료하는 데 또한 유용하다. Yang et al., PNAS USA 101:296-301(2004); Kokkola et al., Arthritis Rheum, 48:2052-8 (2003); Czura et al., J Infect Dis, 187 Suppl 2:S391-6(2003); Treutiger et al., J Intern Med, 254:375-85 (2003).
TNF-α는 전신성 염증 및 급성 단계 반응에 관련된 중요한 시토카인이다. TNF-α는 자극된 단핵구들, 섬유아세포들 및 내피 세포들에 의하여 방출된다. 대식세포들, T-세포들 및 B-림프구들, 과립구들, 평활근 세포들, 호산구들, 연골세포들, 조골세포들, 비만 세포들, 신경교세포들 및 케라틴세포들은 또한 자극 이후에 TNF-α를 생성한다. 그 방출은 예컨대, 감염에 의한 손상을 입은 동안에 인터류킨-1 및 세균 내독소와 같은 몇 가지 다른 매개체들에 의하여 자극된다. TNF-α는 일반적으로 인터류킨-1 및 인터류킨-6과 함께 다양한 기관계들 상에 수많은 작용들을 가진다. TNF-α의 작용들 중 하나는 식욕 억제이다: 따라서 악액질(cachexia)를 치료하는 안정적으로 묶여진 구조들은 바람직하게는 TNF-α를 표적한다. 또한 간의 급성 단계 반응을 자극하기도 하여, C-반응성 단백질 및 수많은 다른 매개체들의 증가로 이어진다. 패혈증 또는 패혈 쇼크를 치료하는 경우에 유용한 표적이기도 하다.
보체 시스템은 세포 수용체들에 의하여 종종 활성화되는 혈청 당단백질들의 단백질 가수분해 분할을 포함하는 복합 연쇄반응(complex cascade)이다. "보체 연쇄반응"은 구성적이며 비특이성이지만 기능하기 위해서는 활성화되어야만 한다. 보체 활성화는 효소 및 생화학적 반응들의 일방향 서열(unidirectional sequence)로 결과된다. 이러한 연쇄반응에서, 특이적인 보체 단백질인 C5는 백혈구 세포들을 공동으로 활성화시키는 두 개의 고도로 활성인 염증성 부산물들인 C5a 및 C5b를 형성한다. 이는 악성 시토카인들(injurious cytokines), 염증성 효소들 및 세포 부착 분자들을 포함하여, 수많은 다른 염증성 부산물들을 차례로 환기시킨다(evoke). 동시에, 이러한 부산물들은 수많은 염증성 질병들에서 보는 조직의 파괴로 이어질 수 있다. 이러한 연쇄반응은 궁극적으로 염증 반응, 포식세포 화학주성(phagocyte chemotaxis) 및 옵소닌화의 유도 및 세포 용해를 일으킨다.
보체 시스템은 고전 경로 및 대체 경로의 두 개의 상이한 경로들을 통하여 활성화될 수 있다. 대부분의 보체 성분들은 번호가 매겨지지만(예컨대, C1, C2, C3 등) 몇몇은 "인자들"이라고 칭해진다. 몇몇 보체들은 효소적으로 분할되어 그 기능을 활성화한다. 다른 것들은 단순히 조합하여 활성인 복합체들을 형성한다. 고전 경로의 활성 성분들은 C1q, C1r, C1s, C2a, C2b, C3a, C3b, C4a 및 C4b를 포함한다. 대체 경로의 활성 성분들은 C3a, C3b, 인자 B, 인자 Ba, 인자 Bb, 인자 D 및 프로페르딘을 포함한다. 각각의 경로의 최종 단계는 동일하며 막 공격 복합체로의 성분 조립(componet assembly)을 포함한다. 막 공격 복합체의 활성 성분들은 C5a, C5b, C6, C7, C8 및 C9n을 포함한다.
상기 보체 시스템의 이러한 성분들 중 임의의 것이 안정적으로 묶여진 구조에 의하여 표적될 수 있는 반면에, 몇몇 보체 성분들이 바람직하다. C3a, C4a 및 C5a는 항체들 및 보체 등을 공격하는 히스타민 및 세로토닌과 같은 화학주성 인자들을 포식 세포들로 하여금 방출하도록 한다. 이것들은 바람직한 표적들의 일 군을 형성한다. 바람직한 표적들의 다른 군은 외부 세포들의 식균작용을 증진시키는 C3b, C4b 및 C5b를 포함한다. 표적들의 다른 바람직한 군은 이러한 두 개 군들에 대한 선행 성분들(predecessor components)인 즉, C3, C4 및 C5이다. C5b, C6, C7, C8 및 C9은 외부 세포들(막 공격 복합체)의 용해를 유도하며 표적들의 또 다른 바람직한 군을 형성한다.
C3a와 같은 보체 C5a는 아나필라톡신이다. 이는 염증을 매개하여 항균 단백질분해효소들(proteases) 및 산소 라디칼들의 호중구성 방출(neutrophilic release)의 도입에 대한 화학주성 유인물질이다. 그러므로, C5a 및 그 선행자인 C5는 특히 바람직한 표적들이다. C5 표적함으로써, C5a가 영향받을 뿐만 아니라, 막 공격 복합체의 조립을 개시하는 C5b도 영향을 받는다. 따라서, C5는 다른 바람직한 표적이다. 고전 및 대체 보체 경로 양쪽 모두가 C3b에 의존하듯이, C3b 및 그 선행자인 C3도 바람직한 표적들이다. 세 단백질들이 이러한 인자, C1 억제제, 단백질 H 및 인자 I의 레벨들에 영향을 주며, 이들은 본 발명에 따른 바람직한 표적들이기도 하다. CD46, CD55 및 CD59와 같은 보체 조절 단백질들은 안정적으로 묶여진 구조들이 결합하는 표적들일 수 있다.
응고 인자들도 바람직한 표적들로서, 특히, 조직 인자(TF) 및 트롬빈이다. TF는 조직 트롬보플라스틴, CD142, 응고 인자 III 또는 인자 III로도 알려져 있다. TF는 내재성 막 수용체 당단백질이며 시토카인 수용체 상과(superfamily)의 요소이다. TF의 리간드 결합 세포외 구역은 2-형 시토카인 수용체들의 요소로서 TF의 분류와 일치하는 특징들을 지닌 두 개의 구조 분자들로 구성되어 있다. TF는 혈액 응고 단백질분해효소 연쇄반응에 관련되어 있으며, TF의 세포외 구역과 순환하는 혈액 응고 인자들, 세린 단백질분해효소들 인자 VII 또는 인자 VIIa 사이의 높은 친화도 복합체들을 형성하여 외재성 및 내재성 양쪽 모두의 혈액 응고 연쇄반응들을 개시한다. 이후에 이것들은 효소적으로 활성인 복합체들이 인자 IX 및 인자 X를 활성화시켜 트롬빈 발생 및 혈전 형성으로 이어진다.
TF는 단핵구들, 대식세포들 및 혈관 내막 세포들을 포함하는 다양한 세포 유형들에 의하여 발현되며, IL-1, TNF-α 또는 박테리아성 지질다당류에 의하여 유도된다. 단백질 키나아제 C는 내피 세포 TF 발현의 시토카인 활성화에 관련되어 있다. 내독소 및 시토카인들에 의한 TF의 도입은 그램-음성 패혈증이 있는 환자들에서 보여지는 범발성 혈관내 응고의 시작에 대한 중요한 메카니즘이다. TF도 염증, 암, 두뇌 기능, 면역 반응 및 종양-관련 혈관형성을 포함하여 다양한 비-지혈성 기능들에 관련되어 있는 듯하기도 하다. 따라서, TF를 표적하는 안정적으로 묶여진 구조들은 응고 장애들의 치료에 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 패혈증, 암, 병리학 적 혈관형성 및 다른 면역과 염증 이상조절 질병들의 치료에 유용하다. 응고 경로 및 시토카인 네트워크 사이의 복합 상호작용은 다양한 세포들에서의 TF 발현에 영향을 주는 몇몇 시토카인들의 능력 및 수용체와 결합하는 리간드의 영향들에 의하여 암시된다. 리간드 결합(인자 VIIa)은 세포내 칼슘 신호를 부여하는 것으로 보고되었으며, 이는 TF가 진정한 수용체라는 것을 나타낸다.
트롬빈은 응고 인자 II(프로트롬빈)의 활성화된 형태이다; 피브리노겐을 피브린으로 변환시킨다. 트롬빈은 대식세포들에 대한 강력한 화학주성물질(chemotaxin)이며, 그리고 시토카인들 및 아라키돈산 대사물질들을 변경시킬 수 있다. 이는 패혈증과 동반되는 응고병증들에서 특히 중요하다. 수많은 연구들이 패혈증 환자들에서의 응고 시스템의 활성화 또는 이후 동물 모델들에서의 LPS 투여를 상세히 기록하였다. 30 년 넘게 연구를 했음에도, LPS-유도 간 독성의 메커니즘은 그 이해가 불충분한 상태로 남아있다. 이제 그들이 세포 및 체액성 매개체들 사이의 상호작용들의 복합적이고 순차적인 서열과 관련되어 있다는 것이 드러났다. 동일한 시기에, 그램-음성 전신성 패혈증 및 그 후유증은 중요한 관심사가 되었으며, LPS에 대항하여 지시된 단일클론성 항체들 또는 다양한 염증 매개체들을 사용하는 시도들은 치료적인 실패만 양산하였다. 트롬빈과 적어도 하나의 다른 표적 양쪽 모두를 표적하는 안정적으로 묶여진 구조들은 패혈증 치료에서의 임상적 실패들을 다룬다.
다른 실시예들에서, 안정적으로 묶여진 구조들은 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 CD40, CD54, CD80 또는 CD86과 같은 보조 분자와 결합한다. 안정적으로 묶 여진 구조는 T-세포 활성화 시토카인 또는 NF-κB와 같은 시토카인 매개체와 결합할 수도 있다.
몇몇 실시예들에서, 두 개의 상이한 표적들 중 하나는 암 세포 수용체 또는 암-관련 항원일 수 있으며, 특히 B-세포 혈근(lineage) 항원들(CD19, CD20, CD21, CD22, CD23 등), VEGFR, EGFR, 암배아성 항원(CEA), 태반 성장 인자(PlGF), 테나신, HER-2/neu, EGP-I, EGP-2, CD25, CD30, CD33, CD38, CD40, CD45, CD52, CD74, CD80, CD138, NCA66, CEACAM6(암배아성 항원-관련 세포 부착 분자 6), MUCl, MUC2, MUC3, MUC4, MUC16, IL-6, α-태아단백질(AFP), A3, CAl 25, 결장-특이적 항원-p (CSAp), 폴산염 수용체(folate receptor), HLA-DR, 인간 융모성 성선자극호르몬(HCG), Ia, EL-2, 인슐린-유사 성장 인자(ILGF) 및 ILGF 수용체, KS-I, Le(y), MAGE, 괴사 항원들, PAM-4, 전립선 산성 포스파타제(PAP), PrI, 전립선 특이 항원(PSA), 전립선 특이 세포막 항원(PSMA), SlOO, TlOl, TAC, TAG72, TRAIL 수용체들 및 탄산 무수화효소 IX로 구성된 군으로부터 선택된다.
패혈증 및 면역이상조절 및 다른 면역 질환들과 관련된 표적들은 MIF, IL-1, IL-6, IL-8, CD74, CD83 및 C5aR을 포함한다. C5aR에 대항하는 항체들과 억제제들은 패혈증을 지닌 설취류들의 생존율을 향상시키고(Huber-Lang et al., FASEB J 2002; 16:1567-1574; Riedemann et al., J Clin Invest 2002; 110:101-108) 원숭이들에서 패혈 쇼크 및 성인 호흡 곤란 증후근을 개선시키는(Hangen et ah, J Surg Res 1989; 46:195-199; Stevens et al., J Clin Invest 1986; 77:1812-1816) 것으로 발견되었다. 따라서, 패혈증에 대하여, 두 개의 상이한 표적들 중 하나는 바람 직하게는 LPS/C5a와 같은 감염과 관련된 표적이다. 다른 바람직한 표적들은 HMGB-1, TF, CD14, VEGF 및 IL-6을 포함하며, 그 각각은 패균혈증(septicemia) 또는 패혈 쇼크와 관련된 것이다. 바람직한 안정적으로 묶여진 구조들은 HMGB-1, MIF/TF와 같은 TF 및 MIF 그리고 HMGB-1/TF로부터 두 개 이상의 표적들을 표적하는 구조들이다.
또 다른 실시예들에서, 두 개의 상이한 표적들 중 하나는 MIF와 같은 이식 대 숙주 질병 또는 이식 거부반응과 관련된 표적일 수 있다(Lo et al , Bone Marrow Transplant, 30(6):375-80 (2002)). 두 개의 상이한 표적들 중 하나는 IL-8과 같은 급성 호흡 곤란 증후근(Bouros et al ., PMC Pulm Med, 4(1):6(2004)), MIF와 같은 죽상동맥경화증 또는 재발협착증(Chen et al ., Arterioscler Thromb Vase Biol, 24(4):709-14 (2004)), IL-18과 같은 천식(Hata et al ., Int Immunol, Oct. 11, 2004 Epub 출판을 앞둠), TNF-α와 같은 육아종성 질병(Ulbricht et al ., Arthritis Rheum, 50(8):2717-8(2004)), 카바밀화된 EPO(적혈구생성소)(Leist et ah, Science 305(5681): 164-5 (2004)) 또는 IL-6 및 TNF-α와 같은 악액질과 관련된 것일 수도 있다.
다른 표적들은 C5a, LPS, IFN-감마, B7; CD2, CD4, CD14, CDl 8, CDl Ia, CDl Ib, CDl Ic, CD14, CD18, CD27, CD29, CD38, CD40L, CD52, CD64, CD83, CD147, CD 154를 포함한다. LPS를 포함하여 몇몇 미생물 항원들에 의한 단핵 세포들의 활성화는 CD18, CD11b 또는 CD11c에 대한 항체들에 의하여 어느 정도 억제될 수 있으며, 따라서 β2-인테그린들을 포함한다(Cuzzola et ah, J Immunol 2000; 164:5871- 5876; Medvedev et ah, J Immunol 1998; 160: 4535-4542). CD83은 현저하게는 대동맥 궁 및 대동맥 그 자체의 두개외 가지들(extracranial branches)인 중간 및 대형 동맥들에 영향을 주는 전신성 혈관염인 거대 세포 동맥염(GCA)에 역할을 하는 것으로 알려졌으며, 혈관 협착증과 후속 조직 허혈 및 실명, 중풍 및 대동맥 궁 증후근의 심각한 합병증들을 일으킨다(Weyand and Goronzy, N EnglJ Med 2003; 349:160-169; Hunder and Valente, In: Inflammatory Diseases of Blood Vessels. G. S. Hoffman and CM. Weyand, eds, Marcel Defcker, New York, 2002; 255-265). CD83에 대한 항체들은 인간 GCA의 SCID 쥐 모델에서 동맥염을 없애는 것으로 알려졌으며(Ma-Krupa et al ., J Exp Med 2004; 199:173-183), 이는 본 사안을 연구한 연구자들에게 활성화 되는 경우에 CD83을 발현시키는 수지상 세포들은 GCA에서 중요한 항원-처리 세포들이라는 것을 암시한다. 본 연구들에서, 연구자들은 쥐 항-CD83 Mab(Research Diagnostics로 부터 구한 IgG1 클론 HB15e)를 사용하였다. TNF 패밀리의 요소인 CD154는 CD4-양성 T-림프구들의 의 표면 상에 발현되며, CD154에 대한 인간화된 단일클론성 항체는 활동성 전신성 홍반성 난창(SLE)가 있는 환자들에 상당한 임상적 이득을 드러내었다고 보고되었다(Grammar et al., J Clin Invest 2003; 112:1506-1520). 이는 또한 본 항체가 다른 자가면역 질병들에 유용할 수 있다는 것을 암시한다(Kelsoe, J Clin Invest 2003; 112:1480-1482). 진실로, 본 항체는 무반응성 면역 혈소판감소성 자반증이 있는 환자들에서 효과가 있는 것으로도 보고되었다(Kuwana et al ., Blood 2004; 103:1229-1236).
류마티스성 관절염에서, 재조합 인터류킨-1 수용체 길항체인 IL-1Ra 또는 아 나킨라(anakinra)(Kineret
Figure 112008051206938-pct00001
)는 활성을 보였다(Cohen et ai, Ann Rheum Dis 2004; 63:1062-8; Cohen, Rheum Dis Clin North Am 2004; 30:365-80). 지금까지 메토트렉세이트로 부수적인 치료를 요하였던 이러한 환자들의 치료에서 개선된 사항은 아나킨라를 하나 이상의 항-전구염증 작동체 시토카인들 또는 항-전구염증 작동체 케모카인들(상기 수록됨)과 조합하는 것이다. 류마티스성 관절염에 대한 항체 요법의 검토에서, Taylor(Curr Opin Pharmacol 2003; 3:323-328)는 TNF에 더하여, IL-1, IL-6, IL-8, IL-15, IL-17 및 IL-18과 같은 시토카인들에 대한 다른 항체들이 유용하다는 것을 암시한다.
몇몇 더 바람직한 표적 조합들은 하기를 포함한다. 이것은 바람직한 조합들의 예들을 나열한 것이지만, 모든 것을 다 망라한 것이라는 의미는 아니다.
제 1 표적 제 2 표적
MIF 제 2 전구염증 작동체 시토카인, 특히 HMGB-1, TNF-α, IL-1 또는 IL-6
MIF 전구염증 작동체 케모카인, 특히 MCP-1, RANTES, MIP-1A 또는 MIP-1B
MIF 전구염증 작동체 수용체, 특히 IL-6R, IL-13R 및 IL-15R
MIF 응고 인자, 특히 TF 또는 트롬빈
MIF 보체 인자, 특히 C3, C5, C3a 또는 C5a
MIF 보체 조절 단백질, 특히 CD46, CD55, CD59 및 mCRP
MIF 암 관련 항원 또는 수용체
HMGB-1 제2 전구염증 작동체 시토카인, 특히 MIF, TNF-α, IL-1 또는 IL-6
HMGB-1 전구염증 작동체 케모카인, 특히 MCP-1, RANTES, MIP-1A 또는 MIP-1B
HMGB-1 전구염증 작동체 수용체 특히 MCP-1, RANTES, MIP-1A 또는 MIP-1B
HMGB-1 응고 인자, 특히 TF 또는 트롬빈
HMGB-1 보체 인자, 특히 C3, C5, C3a 또는 C5a
HMGB-1 보체 조절 단백질, 특히 CD46, CD55, CD59 및 mCRP
HMGB-1 암 관련 항원 또는 수용체
TNF-α 제 2 전구염증 작동체 시토카인, 특히 MIF, HMGB-1, TNF-α, IL-1 또는 IL-6
TNF-α 전구염증 작동체 케모카인, 특히 MCP-1, RANTES, MIP-1A 또는 MIP-1B
TNF-α 전구염증 작동체 수용체, 특히 IL-6R, IL-13R 및 IL-15R
TNF-α 응고 인자, 특히 TF 또는 트롬빈
TNF-α 보체 인자, 특히 C3, C5, C3a 또는 C5a
TNF-α 보체 조절 단백질, 특히 CD46, CD55, CD59 및 mCRP
TNF-α 암 관련 항원 또는 수용체
LPS 전구염증 작동체 시토카인, 특히 MIF, HMGB-1, TNF-α, IL-1 또는 IL-6
LPS 전구염증 수용체 케모카인, 특히 MCP-1, RANTES, MIP-1A 또는 MIP-1B
LPS 전구염증 작동체 수용체, 특히 IL-6R, IL-13R 및 IL-15R
LPS 응고 인자, 특히 TF 또는 트롬빈
LPS 보체 인자, 특히 C3, C5, C3a 또는 C5a
LPS 보체 조절 단백질, 특히 CD46, CD55, CD59 및 mCRP
TF 또는 트롬빈 전구염증 작동체 시토카인, 특히 MIF, HMGB-1, TNF-α, IL-1 또는 IL-6
TF 또는 트롬빈 전구염증 작동체 케모카인, 특히 MCP-1, RANTES, MIP-1A 또는 MIP-1B
TF 또는 트롬빈 전구염증 작동체 수용체, 특히 IL-6R, IL-13R 및 IL-15R
TF 또는 트롬빈 보체 인자, 특히 C3, C5, C3a 또는 C5a
TF 또는 트롬빈 보체 조절 단백질, 특히 CD46, CD55, CD59 및 mCRP
TF 또는 트롬빈 암 관련 항원 또는 수용체
안정적으로 묶여진 구조는 적어도 두 개의 분리된 항체들 및/또는 수용체들 또는 상이한 표적들과 결합하는 그들의 리간드들을 함유하는 혼합물일 수 있다. 바람직한 일 실시예에서 상기 표적들은 고유의 면역 시스템, 응고 인자들, 보체 인자들 및 보체 조절 단백질들의 전구염증 작동체들 및 염증성 또는 면역-이상조절 질환, 병리학적 혈관형성 또는 암 또는 감염성 질병과 특이적으로 관련된 표적들로 구성된 군으로부터 선택된다.
안정적으로 묶여진 구조는 LPS, IL-1, IL-10, IL-6, MIF, HMGBl, TNF, IFN, 조직 인자, 트롬빈, CD14, CD27, 및 CD 134를 위하여 수용체 또는 그 표적 분자와 결합할 수 있다. 이러한 것들 중 많은 것은 수용체들 및 혈액에서 용해가능한 형태들로서 존재한다. 안정적으로 묶여진 구조에 의한 결합은 혈액으로부터 급속한 제거가 일어나게 되며, 이후 세포, 특히 리소좀들에 의한 수송 및 분해를 위하여 대식세포와 같은 다른 세포에 안정적으로 묶여진 구조의 제 2 성분에 의한 표적하기가 일어난다. 이는 제 2 표적 성분이 대식세포들 및 수지상 세포들에 의하여 발현되는 CD74와 같은 내부화 항원에 대항하는 경우에 특히 유효하다. 이는 Hansen, U.S. patent 6,458,933의 개시물과 일치하지만, 면역-이상조절 질병들에 대한 염증성 시토카인들 및 다른 면역 조절 물질들 및 수용체들 및 이러한 암들의 면역요법에 대한 암 항원들에 집중되어 있다.
바람직하게는 암의 치료를 위한 안정적으로 묶여진 구조는 CD55 및 상기 암 항원들 중 임의의 것에 대한 항체들, CD46 및 상기 암 항원들 중 임의의 것에 대한 항체들, CD59 및 상기 암 항원들 중 임의의 것에 대한 항체들, MIF 및 상기 암 항원들 중 임의의 것에 대한 항체들, NF-κB 및 상기 암 항원들 중 임의의 것에 대한 항체들 및 IL-6 및 IL-6 이외의 상기 암 항원들 중 임의의 것에 대한 항체들을 포함한다.
안정적으로 묶여진 구조는 하나 이상의 2차 치료제들과 병용하여 사용될 수 있다. 이러한 2 차 치료제는 고유한 면역 시스템의 성분에 영향을 주는 것일 수 있다. 또한, 후천성 면역 시스템의 성분에 영향을 줄 수 있다. 2차 치료제는 응고, 암 또는 자가면역 질병에 영향을 주는 세포독성 약물과 같은 성분일 수 있다.
진단 또는 치료제와 함께 안정적으로 묶여진 구조는 바람직하게는 생리학적 pH 및 농도에서의 인산염-완충 식염수(PBS)인 약학적으로 수용가능한 주사 운반체에서 인간 또는 포유류 치료 및 진단 사용을 위한 키트로서 제공될 수 있다. 제제는 특히 인간에의 사용을 의도한다면 멸균되어야 할 것이다. 그러한 키트들의 선택적인 성분들은 안정화제들, 완충제들, 표지 시약들, 방사성동위원소들, 상자성 화합물들, 제거 향상을 위한 제 2 항체 및 기존의 주사기들, 칼럼들, 바이알들 등을 포함한다.
파지 표시( Phage Display )
몇몇 다른 실시예들에서, DDD 및/또는 AD 구역들의 구성을 위한 결합 펩티드들은 업계에 잘 알려진 파지 표시 방법들에 의하여 결정될 수 있다. 예를 들어, DDD 구역들과 결합하고 따라서 자연발생적 AD 서열들로 교체될 수 있는 펩티드들은 DDD 이량체에 대항하는 파지 표시 패닝(panning) 및 높은 결합 친화도를 지닌 파지를 선택함으로써 확인될 수 있다. 특정 표적 분자들에 선택적이거나 특이적인 결합 펩티드들의 다른 유형들은 선택된 표적에 대항하여 파지 표시 패닝에 의하여 검출될 수 있다.
파지 표시의 다양한 방법들 및 펩티드들의 다양한 집락들을 생성하는 기법들은 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 그 각각이 여기에 참고로 포함되어 있는 U.S. Pat. Nos. 5,223,409; 5,622,699 및 6,068,829는 파지 표시를 제조하기 위한 방법들을 개시한다. 파지 표시 기법은 작은 펩티드들이 그 표면 상에서 발현될 수 있도록 박테리오파지의 유전적 조작을 포함한다(Smith and Scott, 1985, Science 228:1315-1317; Smith and Scott, 1993, Meth. Enzymol. 21:228-257).
지난 십년간에 파지-표시 펩티드 라이브러리들의 구성 및 펩티드 리간드들을 분리하는 데 상기 라이브러리들이 사용되는 스크리닝 방법들의 개발에서 상당한 진전이 있었다. 예를 들어, 펩티드 라이브러리들을 사용하면 세포 부착을 매개하는 염증 반응들 또는 인테그린들에 관련된 항체들과 같은 수많은 단백질들 내에서 상호작용하는 사이트들 및 수용체-리간드 결합 모티프들을 특성화하는 것을 가능하게 한다. 본 방법은 또한 펩티도모방체 약물들(peptidomimetic drugs) 또는 조영제들의 개발로 이어지는 역할을 할 수 있는 신규한 펩티드 리간드들을 확인하는 데 이용되어 왔다(Arap et al., 1989a, Science 279:377-380). 펩티드들 이외에, 단일-사슬 항체들과 같은 더 큰 단백질 구역들은 파지 입자들의 표면상에 표시될 수도 있다(Arap et al., 1989a).
주어진 표적 분자에 대하여 선택적인 표적 아미노산 서열들을 패닝에 의하여 분리될 수 있다(Pasqualini and Ruoslahti, 1996, Nature 380:364-366; Pasqualini, 1999, The Quart. J. Nucl. Med. 43:159-162). 정리하자면, 추정적인 표적 펩티드들을 함유하는 파지의 라이브러리가 투여되며 결합된 파지를 함유하는 표본들이 채집된다. 표적 분자들은 예를 들어, 96-웰 플레이트 내에서 마이크로타이터 웰들의 바닥에 달라붙을 수 있다. 표적과 결합하는 파지는 용리될 수 있으며 이후 이들을 숙주 박테리아 내에서 성장시켜 증폭될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 파지는 패닝의 라운드들 사이에 숙주 박테리아 내에서 증식될 수 있다. 파지에 의하여 용해된다라기 보다는, 그 대신에 박테리아는 특정 한 인서트를 표시하는 파지의 다중 카피들을 분비할 수 있다. 원한다면, 증폭된 파지는 표적 분자에 다시 노출되고 다른 패닝의 라운드들을 위하여 채집될 수 있다. 다중 라운드들의 패닝은 선택적이거나 특이적인 결합제들의 집락이 구해질 때가지 실시될 수 있다. 펩티드들의 아미노산 서열은 파지 게놈 내에서의 표적 펩티드 인서트에 해당하는 DNA를 서열화시켜 결정될 수 있다. 이후 확인된 표적 펩티드는 표준 단백질 화학 기법들에 의하여 합성 펩티드로서 생성될 수 있다(Arap et al., 1998a, Smith et al., 1985).
앱타머들
몇몇 실시예들에서, 구성 형성을 위한 전구체는 앱타머를 포함할 수 있다. 앱타머들을 구성하고 앱타머들의 결합 특징들을 결정하는 방법들은 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 그러한 기법들은 각각이 여기에 참고로 포함된 U.S. Patent Nos. 5,582,981, 5,595,877 및 5,637,459에 기술되어 있다.
앱타머들은 합성, 재조합 및 정제 방법들을 포함하여 임의의 알려진 방법에 의하여 제제될 수 있으며, 단독으로 또는 동일한 표적에 특이적인 다른 리간드들과 병용하여 사용될 수 있다. 일반적으로, 최소 약 3 개의 핵종들, 바람직하게는 적어도 5 개의 핵종들이 특이적인 결합을 이루는 데 필요하다. 비록 10, 20, 30 또는 40 개의 핵종들의 앱타머들이 바람직할 수 있다고 하더라도, 10 개의 미만의 염기들로 된 서열들의 앱타머들은 있을 수 있다.
앱타머들은 결합 특이성을 부여하는 서열을 함유할 필요가 있지만, 측부 영역들(flanking regions)로 연장되고 그렇지 않으면 유도화될 수 있다. 바람직한 실 시예들에서, 앱타머들의 결합 서열들은 프라이머-결합 서열들에 의하여 측면에 있을 수 있어, PCR 또는 다른 증폭 기법들에 의하여 앱타머들의 증폭을 용이하게 한다. 다른 실시예에서, 측부 서열은 기질에 앱타머의 고정화를 증진시키기 위하여 모이어티를 편향적으로 인식하거나 결합하는 특이적인 서열을 포함할 수 있다.
앱타머들은 분리, 서열화 및/또는 기존의 DNA 또는 RNA 분자들로서 증폭되거나 합성될 수 있다. 또한, 중요한 앱타머들은 변형된 올리고머들을 포함할 수 있다. 통상적으로 앱타머들 내에 존재하는 히드록실 군들 중 임의의 것은 포스폰산염 기들, 인산염 기들에 의하여 교체되고, 표준적인 보호기에 의하여 보호되거나 활성화되어 다른 뉴클레오티드들에 추가적인 결합들(linkages)을 제제하거나 고체 지지체들에 접합될 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 결합들은 R이 H 또는 알킬(1 내지 20 C) 및 R'이 알킬(1 내지 20 C)인 P(O)S, P(O)NR2, P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CNR2로 대체되는 P(O)O와 같은 다른 연결기들에 의하여 대체될 수 있다; 또한, 이러한 기는 O 또는 S를 통하여 인접한 뉴클레오티드들에 부착될 수 있다. 올리고머에 있는 결합들이 모두 동일할 필요가 있는 것은 아니다.
관심의 대상이 되는 특정한 표적들과 결합하는 앱타머들을 제제하고 스크리닝하는 방법들은 예를 들어, 각각이 참고로 포함되어 있는 미국 특허 제5,475,096호 및 제5,270,163호에 잘 알려져 있다. 상기 기법은 일반적으로 후보 앱타머들의 혼합물로부터 선택과 결합의 단계식 반복, 결합된 앱타머들을 결합하지 않은 앱타머들과의 분리 및 증폭에 관한 것이다. 최고의 친화도 앱타머들에 해당하는 몇 안 되는 서열들(가능하다면 앱타머 일 분자)이 혼합물 내에 존재하기 때문에, 혼합물 내에서 앱타머들이 상당량(약 5 내지 50 %) 존재하도록 분할 기준을 설정하는 것이 일반적으로 바람직하다. 각각의 사이클은 표적에 대한 고도의 친화도를 지닌 앱타머들을 농축(enrichment)하게 된다. 3 내지 6 회 사이의 선택 및 증폭 사이클들로 반복하면 표적에의 높은 친화도와 특이성으로 결합하는 앱타머들을 발생시킬 수 있다.
아비머들
몇몇 실시예들에서, 여기에 기술된 전구체들, 성분들 및/또는 착물들은 하나 이상의 아비머 서열들을 포함할 수 있다. 아비머들은 다양한 표적 분자들에 대하여 그 친화도들과 특이성들에서 항체들과 다소간 유사한 결합 단백질들의 클래스이다. 그들은 시험관 내 엑손 뒤섞기(exon shuffling) 및 파지 표시에 의하여 인간 세포외 수용체 구역들로부터 개발되었다(Silverman et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23:1493-94; Silverman et al., 2006, Nat. Biotechnol. 24:220). 그 결과로 나온 다중구역 단백질들은 단일-에피토프 결합 단백질들과 비교하여 개선된 친화도(몇몇 경우들에는 나노분자급 이하) 및 특이성을 보일 수 있는 다중 독립 결합 구역들을 포함할 수 있다(Id.). 다양한 실시예들에서, 아비머들은 예를 들어, 청구된 방법들 및 조성물들에 사용되는 AD 및/또는 DDD 서열들에 부착될 수 있다. 구성 방법들 및 아비머들의 사용에 관한 추가 사항들이 예를 들어, 그 각각의 예(Examples) 부분이 여기에 참고로 포함되어 있는 U.S. Patent Application Publication Nos. 20040175756, 20050048512, 20050053973, 20050089932 및 20050221384에 개시되어 있다.
단백질들 및 펩티드들
다양한 폴리펩티드들 또는 단백질들이 청구된 방법들과 조성물들의 범위 내에서 사용될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 단백질들은 항원-결합 사이트를 함유하는 항체들 또는 항체들의 단편들을 포함할 수 있다. 다른 실시예들에서, 단백질 또는 펩티드는 효소, 호르몬, 시토카인, 결합 단백질 또는 독소와 같은 작동체 분자일 수 있다.
여기에 사용된 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 일반적으로 유전자로부터 번역되어 최대 전장 서열로는 약 200 개를 초과하는 아미노산들의 단백질; 약 100 개를 초과하는 아미노산들의 폴리펩티드; 및/또는 약 3 개 내지 약 100 개의 아미노산들의 펩티드를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 편의상, "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"라는 용어들은 여기에 서로 바꾸어 사용된다. 따라서, "단백질 또는 펩티드"라는 용어는 자연발생적 단백질들에서 발견되는 20 개의 흔한 아미노산들 중 적어도 하나 또는 적어도 하나의 변형되거나 비정상적인 아미노산을 포함하는 아미노산 서열들을 포함한다.
여기에 사용된 "아미노산 잔기"는 업계에 알려진 임의의 자연발생적 아미노산, 임의의 아미노산 유도체 또는 임의의 아미노산 모방체를 뜻한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 단백질 또는 펩티드의 잔기들은 아미노산 잔기들의 서열을 가로막는 임의의 비아미노산이 존재하지 않는 순차적인 것이다. 다른 실시예들에서, 상기 서열은 하나 이상의 비아미노산 모이어티들을 포함할 수 있다. 특정한 실시예들에서, 단백질 또는 펩티드의 잔기들의 서열은 하나 이상의 비아미노산 모이어티들에 의하여 가로막혀질 수 있다.
따라서, "단백질 또는 펩티드"라는 용어는 자연발생적 단백질들에서 발견되는 20 개의 흔한 아미노산들 중 적어도 하나 또는 2-아미노아디핀산(Aminoadipic acid), 3-아미노아디핀산, β-알라닌, β-아미노-프로핀산, 2-아미노부틸산(Aminobutyric acid), 4-아미노부틸산, 피페리딘산, 6-아미노카프론산(Aminocaproic acid), 2-아미노카프론산, 2-아미노이소부틸산(Aminoisobutyric acid), 3-아미노이소부틸산, 2-아미노피멜산(Aminopimelic acid), 2,4-디아미노부틸산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로핀산, N-에틸아스파라긴(Ethylasparagine), 히드록시리신(Hydroxylysine), 알로(allo)-히드록시리신, 3-히드록시프롤린(Hydroxyproline), 4-히드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸글리신, 사르코신, N-메틸이소류신, 6-N-메틸리신, N-메틸발린, 노르발린 노르류신 및 오르니틴을 포함하는 아미노산 서열들을 포함한다. 또한, 단백질들 또는 펩티드들은 자연발생적 L-아미노산들에 더하거나 그 대신에 하나 이상의 D-아미노산들을 포함할 수 있다. D-아미노산들을 포함하는 펩티드들을 생성하는 방법들은 예를 들어, 2004년 6월 14일에 출원된 McBride 등의 미국 특허출원공개 제 20050025709호에 개시되어 있다.
단백질들, 폴리펩티드들 또는 펩티드들의 발현을 포함하여 단백질들 또는 펩티드들은 표준적인 분자 생물학적 기법들, 자연적인 원천으로부터 단백질들 또는 펩티드들의 분리 또는 단백질들 또는 펩티드들의 화학 합성을 통하여 당업자에게 알려진 임의의 기법에 의하여 제작될 수 있다. 뉴클레오티드 및 단백질, 다양한 유전자들에 해당하는 폴리펩티드 및 펩티드 서열들은 이전에 개시되었으며 당업자에게 알려진 컴퓨터화된 데이터베이스들에서 발견될 수 있다. 그러한 데이터베이스 중에 하나는 National Center for Biotechnology Information's Genbank and GenPept databases이다. 알려진 유전자들에 대한 코딩 영역들은 여기에 개시되거나 당업자에게 알려져 있는 기법들을 이용하여 증폭될 수 있고/있거나 발현될 수 있다. 또한, 단백질들, 폴리펩티드들 및 펩티드들의 다양한 상업적 제제들은 당업자에게 알려져 있다.
펩티드 모방체들
폴리펩티드들의 제제를 위한 다른 실시예는 펩티드 모방체들을 사용하는 것이다. 모방체들은 단백질 2차 구조의 요소들을 모방하는 펩티드-함유 분자들이다. 예를 들어, 여기에 참고로 포함된 Johnson et al, "Peptide Turn Mimetics" in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al, Eds., Chapman and Hall, New York (1993) 참조. 펩티드 모방체들의 사용에 대한 이론적 근거는 단백질들의 펩티드 골격이 주로 항체 및 항원의 분자적 상호작용들과 같은 분자적 상호작용들을 용이하게 하기 위하여 아미노산 곁사슬들을 방향짓도록 존재한다는 것이다. 펩티드 모방체는 천연 분자와 유사한 분자 상호작용들을 허용하도록 기대된다. 이러한 원리들은 여기에 개시된 펩티드들을 결합하는 수많은 자연적인 특성들을 지니지만, 위장 또는 창자를 따라 증가된 흡수 및/또는 개선된 안정도 또는 생체 내 활성과 같은 변경되거나 개선된 특징들을 지닌 제 2 발생 분자들을 조작하는 데 이용될 수 있 다.
융합 단백질들
다양한 실시예들은 융합 단백질들에 관한 것일 수 있다. 이러한 분자들은 일반적으로 N- 또는 C-말단에서 제 2 폴리펩티드 또는 단백질의 전부 또는 일 부분에 연결된 펩티드의 전부 또는 실질적인 부분을 일반적으로 가지고 있다. 예를 들어, 융합들은 다른 종들로부터 온 선도 서열을 채용하여 이종 숙주 내에서 단백질의 재조합 발현을 가능하게 할 수 있다. 다른 유용한 융합은 항체 에피토프와 같은 면역학적으로 활성인 구역의 첨가를 포함한다. 융합의 또 다른 유용한 형태는 FLAG 에피토프와 같이 정제를 위한 유용한 모이어티의 부착을 포함할 수 있다(Prickett et al., 1989, Biotechniques 7:580-589; Castrucci et al., 1992, J Virol 66:4647-4653). 융합 단백질들의 다른 사용은 예를 들어, 제 1 단량체에 부착된 DDD 서열 및 제 2 단량체에 부착된 AD 서열을 제공하기 위하여 여기에 청구된 묶여진 복합체들의 성분들의 구정에 관한 것이다.
융합 단백질들을 발생시키는 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러한 단백질들은 예를 들어, 하기의 예들에서 예시되어 있는 바와 같이 이작용기성 가교제들을 사용한 화학적 부착에 의하거나, 완전한 융합 단백질의 새로운 합성에 의하거나 제 2 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 제 1 단백질 또는 펩티드를 엔코딩하는 DNA 서열의 부착에 의하고, 이후 손상되지 않은 융합 단백질의 발현에 의하여 생성될 수 있다.
합성 펩티드들
단백질들 또는 펩티드들은 기존의 기법들에 따라 전체적으로 또는 부분적으로, 용액으로 또는 고체 지지체 상에 합성될 수 있다. 다양한 자가면역 합성기들은 상용 구입가능하며 알려진 프로토콜들에 따라서 사용될 수 있다. 예를 들어, Stewart and Young, (1984, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed.5 Pierce Chemical Co.); Tarn et al, (1983, J. Am. Ghent. Soc, 105:6442); Merrifield, (1986, Science, 232: 341-347); 및 Barany and Merrifield (1979, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds., Academic Press, New York, pp. 1-284) 참조. 주로 약 6 개 내지 약 35에서 50 개의 아미노산들로부터 짧은 펩티드 서열들은 그러한 방법들에 의하여 용이하게 합성될 수 있다. 또한, 중요한 펩티드를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열은 발현 벡터로 삽입되고, 적절한 숙주 세포로 변형되거나 형질감염되고 발현에 적당한 조건 하에서 배양되는 재조합 DNA 기술이 채용될 수 있다.
펩티드 투여
청구된 방법들 및/또는 조성물들의 다양한 실시예들은 피검자에게 투여되는 하나 이상의 펩티드 계 안정적으로 묶여진 구조들에 관한 것일 수 있다. 투여는 구강, 비강, 볼(buccal), 흡입, 직장, 질, 국소, 정위의(orthotopic), 피내, 피하, 근육내, 복강내, 동맥내, 척수강내 또는 정맥내 주입을 포함하지만 여기에 한정되지 않는 업계에 알려진 임의의 경로에 의하여 발생할 수 있다.
피검자에게 구강으로 투여되는 변형되지 않는 펩티드들은 소화관 내에서 분해될 수 있으며 서열 및 구조에 의존하면 장 내피(intestinal lining)를 횡단하는 흡수가 불충분함을 보일 수 있다. 그러나, 펩티드들을 내생성 단백질분해효소들에 의하여 분해에 감수성을 덜 가지게 하거나 소화관을 통하여 더 흡수가 되게 하도록 펩티드들을 화학적으로 변형하는 방법들이 잘 알려져 있다(예를 들어, Blondelle et al., 1995, Biophys. J. 69:604-11; Ecker and Crooke, 1995, Biotechnology 13:351-69; Goodman and Ro, 1995, BURGER'S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY, VOL. I, ed. Wollf, John Wiley & Sons; Goodman and Shao, 1996, Pure & Appl. Chem. 68:1303-08 참조). D-아미노산들을 함유하는 펩티드들과 같은 펩티드 유사체들; 펩티드의 구조를 모방하는 유기 분자들로 구성된 펩티도모방체들; 또는 비닐로거스 펩토이드들(vinylogous peptoids)과 같은 펩토이드들의 라이브러리들을 제제하는 방법들도 기술되어 있으며 피검자에게 경구 투여에 적당한 펩티드계 안정적으로 묶여진 구조들을 구성하는 데 이용될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 표준적인 펩티드 결합 연결은 CH2-NH, CH2-S, CH2-CH2, CH=CH, CO-CH2, CHOH-CH2 등과 같은 하나 이상의 다른 연결기들에 의하여 대체될 수 있다. 펩티드 모방체들을 제제하는 방법들은 잘 알려져 있다(예를 들어, Hruby, 1982, Life Sci 31 : 189-99; Holladay et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24:4401-04; Jennings- White et al., 1982, Tetrahedron Lett. 23:2533; Almquiest et al., 1980, J. Med. Chem. 23:1392-98; Hudson et al., 1979, Int. J. Pept. Res. 14:177-185; Spatola et al., 1986, Life Sci 38:1243-49; 각각이 여기에 참고로 포함된 U.S. Patent Nos. 5,169,862; 5,539,085; 5,576,423, 5,051,448, 5,559,103). 펩티드 모방체들은 그들의 펩티드 유사체들과 비교하여 생체 내에서 증가된 안정도 및/또는 생체 내 흡수를 보여줄 수 있다.
또한, 펩티드들은 엑소펩티다제(exopeptidase) 활성을 방지하기 위하여 N-말단 및/또는 C-말단 캡핑(capping)을 사용한 구강 전달에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들어, C-말단은 아미드 펩티드들을 사용하여 캡핑될 수 있으며 N-말단은 펩티드의 아세틸화에 의하여 캡핑될 수 있다. 펩티드들은 예를 들어, 사이클릭 아미드들, 이황화물들, 에테르들, 황화물들 등의 형성에 의하여 엑소펩티다제들을 차단하도록 사이클릭화될 수도 있다.
펩티드 안정화는 특히, 엔도펩티다제들이 작용하는 것으로 알려진 위치들에서 자연발생적 L-아미노산들에 대한 D-아미노산들의 대체에 의하여 발생할 수도 있다. 엔도펩티다제 결합 및 분열 서열들은 업계에 알려져 있으며 D-아미노산들을 포함하는 펩티드들을 제작하고 사용하는 방법들이 기술되어 있다(예컨대, 여기에 참고로 포함된 2004년 6월 14일에 출원된 McBride 등의 미국 특허출원공개 제20050025709호). 몇몇 실시예들에서, 펩티드들 및/또는 단백질들은 단백질가수분해효소(proteinase)- 및/또는 펩티드분해효소-억제제들과의 공동 제형(co-formulation)에 의하여 구강으로 투여될 수 있다.
치료 펩티드들의 구강 전달에 대한 다른 방법들은 Mehta("Oral delivery and recombinant production of peptide hormones," June 2004, BioPharm International)에 개시되어 있다. 펩티드들은 장내 단백질분해 활성을 조절하고 장벽을 가로질러 펩티드 수송을 증진시키는 부형제들과 함께 장-코팅된(enteric-coated) 고체 투여 형태로 투여된다. 이러한 기법을 이용한 손상되지 않은 펩티드 들의 상대적인 생체이용도는 투여된 투여량의 1 % 내지 10 %에 이르렀다. 인슐린은 콜산 나트륨 및 단백질분해효소 억제제와 함께 장-코팅된 마이크로캡슐들을 사용하여 개들에게 성공적으로 투여되었다(Ziv et al., 1994, J. Bone Miner. Res. 18(Suppl. 2):792-94). 펩티드들의 구강 투여는 침투 촉진제(permeation enhancer)로서 아실카르니틴(acylcarnitine) 및 장 코팅을 사용하여 실행되었다(Eudragit L30D-55, Rohm Pharma Polymers, see Mehta, 2004). 구강으로 투여되는 펩티드들에 사용되는 부형제들은 일반적으로 장-코팅된 캡슐 또는 정제 내에서 패키지될 수 있는 펩티드의 용해도 또는 흡수를 증진시키기 위하여 계면활성제들(detergents) 또는 다른 작용제들과 함께 장 단백질분해효소들/펩티드분해효소들의 하나 이상의 억제제들을 포함한다(Mehta, 2004). 유기산들은 캡슐이 장 내에서 용해되면 장을 산성화시키고 장내 단백질분해효소 활성을 억제하기 위하여 캡슐 내에 포함될 수 있다(Mehta, 2004). 펩티드들의 구강 전달을 위한 다른 대안은 흡수 및 효소 분해에 대한 내성을 증가시키는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-계 양친매성 올리고머들에 접합을 포함한다(Soltero and Ekwuribe, 2001, Pharm . Technol. 6:110).
또 다른 실시예들에서, 펩티드들은 IgG1의 Fc 영역과 같은 몇몇 단백질들에 대한 접합에 의하여 구강 또는 흡입 투여를 위하여 변형될 수 있다(Examples 3-7 참조). 펩티드-Fc 접합체들의 제제 및 사용 방법들은 예를 들어, 각각이 여기에 참고로 포함된 Low et al.(2005, Hum. Reprod. 20:1805-13) 및 Dumont et al.(2005, J. Aerosol, Med. 18:294-303)에 개시되어 있다. Low et al.(2005)는 CHO 세포들 내에서의 재조합 발현을 이용하여, 단일 사슬 또는 육량체 형태로 IgG1의 Fc 영역 들에 FSH의 알파 및 베타 소단위체들의 접합을 개시한다. 상기 Fc 접합된 펩티드들은 신생아기의(neonatal) Fc 수용체 매개 수송 시스템에 의하여 폐 또는 장의 상피 세포를 통하여 흡수된다. 상기 Fc 접합된 펩티드들은 천연 펩티드들과 비교하여 안정도 및 생체 내 흡수가 증가된 것을 보였다. 육량체 접합체는 단일 사슬 형태보다 더 활성이 있었다는 것도 관찰되었다.
가교제들
몇몇 실시예들에서, 단백질들, 펩티드들 또는 다른 거대 분자들은 동형이작용기성, 이형-이작용기성 및/또는 광활성화가능한(photoactivatable) 가교 시약들과 같은 업계에 알려진 다양한 가교 시약들을 사용하여 공유적으로 교차결합될 수 있다. 그러한 시약들의 비한정적인 예들은 비스이미데이트들(bisimidates),; 1,5-디플루오로-2,4-(디나이트로벤젠); 수베르산의 N-히드록시숙신이미드 에스테르; 디숙신이미딜 타르타레이트(disuccinimidyl tartarate); 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(dimethyl-3,3'-dithiobispropionimidate); N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피온산염(N-succinimidyl-3(2-pyridyldithio)propionate); 4-(브로모아미노에틸)-2-니트로페닐아지드(4-(bromoaminoethyl)-2-nitrophenylazide); 및 4-아지도글리옥살(4-azidoglyoxal)을 포함한다. 대표적인 일 실시예에서, DCCD 또는 EDC와 같은 카보다이이미드(carbodiimide) 가교제가 사용되어 산성 잔기들을 아미노 또는 다른 기들과 교차결합시킬 수 있다. 그러한 시약들은 변형되어 형광 표지들과 같은 다양한 유형들의 표지들을 부착할 수 있다.
이작용기성 가교 시약들은 다양한 목적을 위하여 광범위하게 사용된다. 두 개의 동일한 작용기들을 지니는 동형이작용기성 시약들은 동일한 그리고 상이한 거대분자들 또는 거대분자의 소단위체들 사이에서의 교차결합을 유도하고, 폴리펩티드 리간드들을 그 특이적인 결합 사이트들과 연결시키는 데 효율이 높은 것으로 증명되었다. 이형이작용기성 시약들은 두 개의 상이한 작용기들을 함유한다. 두 개의 상이한 작용기들의 차등 반응성들(differential reactivities)을 이용하여, 교차결합이 선택적으로나 순차적으로 양쪽 모두로 조절될 수 있다. 이작용기성 가교 시약들은 예컨대, 아미노, 설프히드릴(sulfhydryl), 구아니디노, 인돌, 카복실 특이성 기들과 같은 그들의 작용기들의 특이성에 따라 분류될 수 있다. 물론, 자유 아미노기들로 지시된 시약들은 상용 이용가능성, 합성의 용이성 및 시약들이 응용될 수 있는 온화한 반응 조건들로 인하여 특히 많이 이용된다. 대부분의 이형이작용기성 가교 시약들은 제 1 아민-반응성 기(reactive group) 및 티올-반응성 기를 함유한다.
다른 예에서, 이형이작용성 가교 시약들과 상기 가교 시약들의 사용 방법들이 기술되어 있다(U.S. Patent 5,889,155). 가교 시약들은 친핵성 히드라지드 잔기를 친전자성 말레이미드 잔기와 조합하여 일 예에서 알데히드들을 자유 티올들과 결합하게 한다. 가교 시약은 변형되어 다양한 작용기들을 교차시킬 수 있다.
항체들
다양한 실시예들은 표적에 대한 항체들에 관한 것일 수 있다. "항체"라는 용어는 항원 결합 영역을 가진 임의의 항체-유사 분자를 뜻하는 것으로 여기에 사용되었으며, Fab', Fab, F(ab'), 단일 구역 항체들(DABs), Fv, scFv(단일 사슬 Fv) 등과 같은 항체 단편들을 포함한다. 다양한 항체-계 구조체들 및 단편들을 제제하고 사용하는 기법들이 업계에 잘 알려져 있다(예컨대, Harlowe and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 참조). 유용한 항체들은 또한 알려진 다양한 원천들로부터 상업적으로 구입가능할 수 있다. 예를 들어, 다양한 항체 분비 혼성세포 계통들은 American Type Culture Collection(ATTC, Manassas, VA)로부터 구입할 수 있다.
항체 단편들의 생성
청구된 방법들 및/또는 조성물들의 몇몇 실시예들은 항체 단편들에 관한 것일 수 있다. 그러한 항체 단편들은 기존의 방법들에 의하여 항체들 전체를 펩신 또는 파파인이 소화시켜 얻어질 수 있다. 예를 들어, 항체 단편들은 F(ab')2 단편들을 제공하는 펩신으로 항체들의 효소적 분열에 의하여 생성될 수 있다. 이러한 단편은 티올 환원제를 사용하여 더 분열되고, 선택적으로는 이후에 이황화물 결합들의 분열로부터 생성하는 설프히드릴기들에 대한 차단기에 의하여 Fab' 일가 단편들을 생성한다. 또한, 파파인 n을 사용한 효소적 분열은 두 개의 일가 Fab 단편들과 한 개의 Fc 단편을 생성한다. 항체 단편들을 생성하는 대표적인 방법들은 U.S. Pat. No. 4,036,945; U.S. Pat. No. 4,331,647; Nisonoff et al., 1960, Arch. Biochem. Biophys., 89:230; Porter, 1959, Biochem. J., 73:119; Edelman et al., 1967, METHODS IN ENZYMOLOGY, page 422 (Academic Press) 및 Coligan et al. (eds.), 1991, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, (John Wiley & Sons)에 개시되어 있다. 단편들이 손상되지 않은 항체에 의하여 인식되는 항원과 결합하는 한, 일가 경-중 사슬 단편들을 생성하기 위하여 중 사슬들을 분리시키고, 단편들을 더 분열시키거나 다른 효소적, 화학적 또는 유전적 기법들과 같은 항체들을 분열시키는 다른 방법들도 이용될 수 있다. 예를 들어, Fv 단편들은 VH 및 VL 사슬들의 화합을 포함한다. 이러한 화합은 Inbar et al., 1972, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 69:2659에 기술된 바와 같이 비공유적일 수 있다. 또한, 가변 사슬들은 분자간 이황화물 결합 또는 글루타알데히드와 같은 화학물질들에 의하여 교차결합될 수 있다. Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech, 12:437 참조.
바람직하게는, Fv 단편들은 펩티드 링커에 의하여 연결되는 VH 및 VL 사슬들을 포함한다. 이러한 단일-사슬 항원 결합 단백질들(sFv)은 올리고뉴클레오티드 링커 서열에 의하여 연결되는 VH 및 VL 구역들을 엔코딩하는 DNA 서열들을 포함하는 구조 유전자를 구성하여 제제된다. 상기 구조 유전자는 대장균과 같은 숙주 세포들에로 순차적으로 도입되는 발현 벡터로 삽입된다. 재조합 숙주 세포들은 두 개의 V 구역들을 잇는 링커 펩티드로 단일 폴리펩티드 사슬을 합성한다. sFv들을 생성하는 방법들은 업계에 잘 알려져 있다. Whitlow et al., 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97; Bird et al., 1988, Science, 242:423; U.S. Pat. No. 4,946,778; Pack et al., 1993, Bio/Technology, 11:1271 및 Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech., 12:437 참조.
항체 단편의 다른 형태는 단일 상보성-결정 영역(complementarity-determining region: CDR)을 코딩하는 펩티드이다. CDR 펩티드들("최소 인식 단위 들")은 중요한 항체의 CDR을 엔코딩하는 유전자들을 구성하여 구해질 수 있다. 그러한 유전자들은 예를 들어, 항체-생성 세포들의 RNA로부터 가변 영역을 합성하는 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 제제된다. Larrick et al., 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106; Ritter et al. (eds.), 1995, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, pages 166-179 (Cambridge University Press); Birch et al., (eds.), 1995, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, pages 137-185 (Wiley-Liss, Inc.) 참조.
키메라 항체는 인간 항체의 가변 영역들이 예를 들어, 상보성-결정 영역들(CDRs)를 포함하여, 쥐 항체의 가변 영역들로 대체된다. 키메라 항체들은 피검자에게 투여되는 경우에 감소된 면역원성 및 증가된 안정도를 보인다. 키메라 항체들을 구성하는 방법들은 업계에 잘 알려져 있다(예컨대, Leung et al., 1994, Hybridoma 13:469).
키메라 단일클론성 항체는 쥐 면역글로불린의 중 및 경 가변 사슬들로부터 유래된 쥐 CDR들을 인간 항체의 해당 가변 구역들로 전달시켜 인간화될 수 있다. 키메라 단일클론성 항체 내에서 쥐 프레임워크 영역들(FR)은 인간 FR 서열들로 대체되기도 한다. 인간화된 단일클론의 안정도 및 항원 특이성을 보존하기 위하여, 하나 이상의 인간 FR 잔기들이 쥐의 대응 잔기들에 의하여 대체될 수 있다. 인간화된 단일클론성 항체들은 피검자들의 치료를 위하여 사용될 수 있다. 표적에 대한 인간화된 항체들의 친화도는 CDR 서열들의 선택된 변형에 의하여 증가될 수도 있 다(WO0029584A1). 인간화된 단일클론성 항체들의 생성을 위한 기법들은 업계에 잘 알려져 있다(예컨대, JoJones et al., 1986, Nature, 321 :522; Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534; Carter et al., 1992, Proc. Natl Acad. Sci. USA5 89:4285; Sandhu, Crit. Rev. Biotech., 1992, 12:437; Tempest et al., 1991, Biotechnology 9:266; Singer et al., J. Immunol., 1993, 150:2844 참조).
다른 실시예들은 인간이 아닌 영장류 항체들에 관한 것일 수 있다. 비비 원숭이들에게서 치료상 유용한 항체들을 성장시키는 일반적인 기법들은 예를 들어, Goldenberg et al., WO 91/11465 (1991), and in Losman et al., Int. J. Cancer 46: 310 (1990)에서 발견될 수 있다.
인간 항체들
병용적 접근법들 또는 인간 면역글로불린 유전자좌들로 변형된 형질변환 동물들을 이용한 완전한 인간 항체들을 생성하는 방법들이 업계에 알려져 있다(예컨대, 각각이 여기에 참고로 포함된 Mancini et al., 2004, New Microbiol. 27:315-28; Conrad and Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8:117-26; Brekke 및 Loset, 2003, Curr. Opin. Phamacol. 3 :544-50 참조). 그러한 완전한 인간 항체들은 키메라 또는 인간화된 항체들보다 훨씬 적은 부작용들을 보이고 본질적으로 내생성 인간 항체들로서 생체 내에서 기능하도록 예상된다. 몇몇 실시예들에서, 청구된 방법들 및 절차들은 그러한 기법들에 의하여 생성된 인간 항체들을 이용할 수 있다.
일 대안(alternative)에서, 파지 표시 기법이 이용되어 인간 항체들을 발생시킬 수 있다(예컨대, 여기에 참고로 포함된 Dantas-Barbosa et al., 2005, Genet. MoI. Res. 4:126-40). 인간 항체들은 정상적인 인간들 또는 암과 같은 특정한 질병 상태를 보이는 인간들로부터 발생될 수 있다(Dantas-Barbosa et al., 2005). 병든 개인으로부터 인간 항체들을 구성하는 장점은 순환하는 항체 레퍼토리는 질병-관련 항원들에 대항하는 항체들로 향하여 편향될 수 있다.
본 방법의 하나의 비한정적인 예에서, Dantas-Barbosa et al.(2005)는 골육종 환자들로부터 유래된 인간 Fab 항체 단편들의 파지 표시 라이브러리를 구성하였다. 일반적으로, 총 RNA는 순환하는 혈액 림프구들(Id .)로부터 구해진다. 재조합 Fab는 μ, γ 및 κ 사슬 항체 레퍼토리들로부터 클로닝되며 파지 표시 라이브러리(Id .)로 삽입된다. RNA들은 cDNA들로 변환되며 중 및 경 사슬 면역글로불린 서열들에 대항하는 특이적인 프라이머들을 사용하는 Fab cDNA 라이브러리들을 제작하는 데 사용된다(여기에 참고로 포함된 Marks et al., 1991 , J. MoI. Biol. 222:581 -97). 라이브러리 구성은 Andris-Widhopf et al.(여기에 참고로 포함된 2000, In: Phage Display Laboratory Manual, Barbas et al. (eds), 1st edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY pp. 9.1 to 9.22)에 따라 실행되었다. 최종 Fab 단편들이 제한 효소들로 소화되며 박테리오파지 게놈으로 삽입되어 파지 표시 라이브러리를 제작한다. 그러한 라이브러리들은 업계에 알려진 표준 파지 표시 방법들에 의하여 스크리닝될 수 있다. 당업자는 본 기법이 단지 대표적인 것이며 파지 표시에 의한 인간 항체들 또는 항체 단편들을 제작하고 스크리 닝하는 임의의 알려진 방법이 이용될 수 있다는 것을 알 것이다.
다른 대안에서, 인간 항체들을 생성하도록 유전적으로 조작된 형질전환 동물들은 표준 면역화 프로토콜들을 이용하여 모든 면역원성 표적에 대항하는 항체들을 발생시키는 데 사용될 수 있다. 그러한 시스템의 비한정적 예는 Abgenix(Fremont, Ca) 사의 XenoMouse
Figure 112008051206938-pct00002
(예컨대, 여기에 참고로 포함된 Green et al., 1999, J. Immunol. Methods 231:11- 23)이다. XenoMouse
Figure 112008051206938-pct00003
및 유사 동물들에서, 쥐 항체 유전자들은 비활성화되며 기능적인 인간 항체 유전자들에 의하여 대체되는 반면에, 쥐 면역 시스템의 나머지는 손상을 입지 않은 채 남아있다.
XenoMouse
Figure 112008051206938-pct00004
는 대부분의 가변 영역 서열들을 포함하여, 인간 IgH 및 Ig카파 유전자좌들의 부분들을 보조 유전자들(accessory genes) 및 조절 서열들을 따라 함유하였던 배선-형성된(germline-configured) YACs(효모 인공 염색체들)로 형질변환되었다. 인간 가변 영역 레퍼토리는 알려진 기법들에 의하여 혼성세포들로 처리될 수 있는 항체 생성 B 세포들을 발생시키는 데 사용될 수 있다. 표적 항원으로 면역화된 XenoMouse
Figure 112008051206938-pct00005
는 상술한 표준 기법들에 의하여 수거되고/되거나 생성될 수 있는 정상적인 면역 반응에 의한 인간 항체들을 생성할 것이다. 다양한 계통들의 XenoMouse
Figure 112008051206938-pct00006
가 이용가능하며, 그 각각은 상이한 클래스의 항체를 생성할 수 있다. 그러한 인간 항체들은 화학적 교차결합 또는 다른 알려진 방법들에 의하여 다른 분자들에 결합될 수 있다. 형질전환으로 생성된 인간 항체들은 치료적인 잠재력을 가지는 것을 보이면서, 정상적인 인간 항체들의 약동학적 특성들을 유지한다(Green et al., 1999). 당업자는 청구된 조성물들 및 방법들이 XenoMouse
Figure 112008051206938-pct00007
시스템의 사용에 한정되지 않지만, 인간 항체들을 생성하도록 유전적으로 조작되는 임의의 형질전환 동물을 이용할 수 있다.
질병 조직 검출, 진단 및 영상화 방법들
단백질-계 시험관 내 진단
본 발명은 질병-관련 항원들의 존재에 대한 시험관 내 및/또는 생체 내 생물학적 표본들을 스크리닝하기 위하여 안정적으로 묶여진 구조들의 사용을 고찰한다. 대표적인 면역검사들에서, 항체, 융합 단백질 또는 그 단편을 포함하는 안정적으로 묶여진 구조는 액체상(liquid phase)으로 이용되거나 하기에서 토론되는 바와 같이 고체상 담체에 결합될 수 있다. 바람직한 실시예들, 특히 생체 내 투여에 관련된 실시예들에서, 항체 또는 그 단편은 인간화된다. 항체 또는 그 단편은 완전히 인간으로부터 유래한 것도 바람직하다. 융합 단백질이 인간화되거나 완전히 인간으로부터 온 항체를 포함하는 것은 훨씬 더 바람직하다. 당업자는 특정한 유전자의 발현 레벨들을 결정하는 데 광범위한 기법들이 알려져 있으며, 면역검사, RT-PCR, mRNA 정제 및/또는 cDNA 제제와 같은 그러한 임의의 알려진 방법과 이후에 유전자 발현 검사 칩으로의 혼성화를 이용하여 개별 피검자들 및/또는 조직들 내에서의 발현 레벨들을 결정할 수 있다. 유용한 대표적인 시험관 내 검사들은 RIA, ELISA, 샌드위치 ELISA, 웨스턴 블롯, 슬롯 블롯(slot blot) 등을 포함한다. 그러한 기법들이 손상되지 않은 항체들을 사용하여 개발되었지만, 항체들, 항체 단편들 또는 다른 결합 모이어티들을 포함하는 안정적으로 묶여진 구조들이 사용될 수 있다.
항체들, 융합 단백질들, 항체 단편들 및/또는 다른 결합 모이어티들을 포함하는 안정적으로 묶여진 구조들도 조직학적 시편(histological specimen)로부터 제제되는 조직 절편들 내의 표적 항원의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다. 그러한 제자리 검출(in situ detection)은 항원의 존재를 결정하고 검사된 조직 내에서 항원의 분포를 결정하는 데 이용될 수 있다. 제자리 검출은 검출가능하게-표지된 구조를 동결되거나 파라핀-포매(paraffin-embedded) 조직 절편들에 적용시켜 달성될 수 있다. 제자리 검출의 일반적인 기법들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application," in MAMMALIAN DEVELOPMENT: A PRACTICAL APPROACH 113-38 Monk (ed.) (IRL Press 1987) 및 Coligan at pages 5.8.1-5.8.8 참조.
안정적으로 묶여진 구조들은 예를 들어, 방사성동위원소, 효소, 형광 표지, 염료, 색소원, 화학발광 표지(chemiluminescent label), 생물발광 표지 또는 상자성 표지와 같은 임의의 적절한 표지 모이어티로 검출가능하게 라벨링될 수 있다.
표지 모이어티는 감마-카운터 또는 베타-신틸레이션 카운터(beta-scintillation counter)의 사용과 같은 수단에 의하거나 방사선자동사진법에 의하여 검출된다. 바람직한 일 실시예에서, 진단 접합체는 감마-, 베타- 또는 양전자-방출 동위원소이다. 표지 모이어티는 소정의 조건들 하에서 신호를 발생시킬 분자를 뜻한다. 표지 모이어티들의 예들은 방사성동위원소들, 효소들, 형광 표지들, 화학발광 표지들, 생물발광 표지들 및 상자성 표지들을 포함한다. 표지 모이어티들을 안정적으로 묶여진 구조들로의 결합은 업계에 알려진 표준 기법들을 이용하여 달성 될 수 있다. 이러한 측면에서 통상적인 방법은 Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70: 1 (1976), Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81 : 1 (1977), Shih et al., Int'l J. Cancer 46: 1101 (1990)에 기술되어 있다.
핵산 계 시험관 내 진단
안정적으로 묶여진 구조들은 몇몇 실시예들에서, 핵산 모이어티들을 포함할 수 있다. 특정한 실시예들에서, 핵산들은 특히 핵산 증폭 방법들을 이용하여 결합 레벨들을 결정하기 위하여 분석될 수 있다. 증폭의 다양한 형태들이 업계에 잘 알려져 있으며 그러한 임의의 알려진 방법이 이용될 수 있다. 일반적으로, 증폭은 증폭되는 표적 핵산 서열과 선택적으로 또는 특이적으로 혼성하는 하나 이상의 프라이머들의 사용과 관련되어 있다.
여기에 정의된 프라이머라는 용어는 주형-의존성 과정에서 신생 핵산의 합성을 촉진(prime)시킬 수 있는 임의의 핵산을 포함하는 것을 의도한다. 증폭 프라이머들의 선택과 설계를 위한 컴퓨터화된 프로그램들은 당업자에게 잘 알려진 상업적 및/또는 공중 소스들로부터 구할 수 있다. 수많은 주형 의존성 공정들이 주어진 표본 내에 존재하는 표지 서열들을 증폭하는 데 이용될 수 있다. 가장-잘 알려진 증폭 방법들 중 하나는 U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202 및 4,800,159에 상세히 기술되어 있는 중합효소 연쇄 반응(PCR이라고 칭함)이다. 그러나, 다른 증폭 방법들이 알려져 있으며 사용될 수 있다.
생체 내 진단
표지된 펩티드들 또는 MAb들로 진단 영상화의 방법들은 잘 알려져 있다. 예 를 들어, 면역섬광조영술(immunoscintigraphy)의 기법에서, 리간드들 또는 항체들은 감마-방출 방사성동위원소로 라벨링되며 환자에게로 도입된다. 감마 카메라는 감마-방출 방사성동위원소들의 위치와 분포를 검출하는 데 사용된다. 예를 들어, Srivastava (ed.), RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY (Plenum Press 1988), Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition, Gennaro et al. (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990) 및 Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49, Pezzuto et al. (eds.) (Chapman & Hall 1993) 참조. 18F, 68Ga, 64Cu 및 124I과 같은 511 keV의 에너지를 지닌 양전자-방출 방사성핵종들(PET 동위원소들)의 사용도 바람직하다. 그러한 영상화는 안정적으로 묶여진 구조를 직접 라벨링하거나 Goldenberg et al, "Antibody Pre-targeting Advances Cancer Radioimmunodetection and Radioimmunotherapy," ( J Clin Oncol 2006;24:823-834)에 기술된 사전표적된 영상화 방법에 의하여 실행될 수 있다. 또한 각각이 여기에 참고로 포함된 U.S. Patent Publication Nos. 20050002945, 20040018557, 20030148409 및 20050014207 참조.
환자에게 전달되는 방사선량은 검출과 정확한 측정을 가능하게 할 최소 반감기, 신체 내에서의 최소 잔류 및 동위원소의 최소량을 최고로 조합하기 위한 동위원소의 선택을 통하여 가능한 한 낮은 레벨로 유지된다. 진단 영상에 적절한 방사성동위원소들의 예들은 99 mTc 및 111In을 포함한다.
안정적으로 묶여진 구조들 또는 그들과 결합하는 합텐들 또는 담체들은 생체 내 진단의 목적들을 위하여 상자성 이온들과 다양한 방사선 조형제들로 라벨링될 수도 있다. 상자성 공명 영상에 특히 유용한 조형제들은 가돌리늄, 망간, 디스프로슘, 란탄 또는 철 이온들을 포함한다. 다른 작용제들은 크롬, 구리, 코발트, 니켈, 레늄, 유로퓸, 테르븀, 홀뮴(holmium) 또는 네오디뮴(neodymium)을 포함한다. 리간드들, 항체들 및 그 단편들도 초음파 조형/증진제들에 접합될 수 있다. 예를 들어, 초음파 조형제는 인간화된 IgG 또는 그 단편을 포함하는 리포솜이다. 초음파 조형제는 공기 충진된 리포솜이면 또한 바람직하다.
조영제들 및 방사선동위원소들
수많은 적절한 조영제들이 업계에 알려져 있으며, 단백질들 또는 펩티드들에 그것들을 부착시키는 방법들이 알려져 있다(예컨대, 양쪽 모두 여기에 참고로 포함된 U.S. patents 5,021,236 및 4,472,509 참조). 몇몇 부착 방법들은 예를 들어, 단백질 또는 펩티드에 부착된 DTPA와 같은 유기 킬레이트제를 채용하는 금속 킬레이트 착물의 사용에 관한 것이다(U.S. Patent 4,472,509). 단백질들 또는 펩티드들은 글루타알데히드 또는 과옥소산염과 같은 커플링제(coupling agent)의 존재하에 효소와 반응될 수도 있다. 플루오레세인 표지들(fluorescein markers)이 있는 접합체들은 이러한 커플링제들이 존재하거나 이소티오사이아네이트와의 반응에 의하여 제제된다.
조영제들로 잠재적으로 유용한 상자성 이온들의 비한정적 예들은 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디늄(III), 사 마륨(III), 이터븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(holmium) 및 에르븀(III)을 포함하며, 이중 가돌리늄이 특히 바람직하다. X-선 영상화와 같은 다른 문맥들의 유용한 이온들은 란탄(III), 금(III), 납(II) 및 특히 비스무스(III)를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
조영제들 또는 치료제들로서 잠재적으로 유용한 방사선동위원소들은 아스타틴211, 탄소14, 크롬51, 염소36, 코발트57, 코발트58, 구리62, 구리64, 유로퓸152, 불소18, 갈륨6 7, 갈륨68, 수소3, 요오드123, 요오드124, 요오드125, 요오드131, 인듐111, 철52, 철59, 루테튬177, 인32, 인33, 레늄186, 레늄188, 스칸듐47, 셀레늄75, 은111, 황35, 테크네튬94 m, 테크네튬99 m, 이트륨86과 이트륨90 및 지르코늄89를 포함한다. 요오드125는 종종 몇몇 실시예들에서 사용에 바람직하며, 테크네늄99 m 및 인듐111도 그들의 낮은 에너지와 긴-범위 검출에의 접합성으로 인하여 종종 바람직하다.
방사선 라벨링된 단백질들 또는 펩티드들은 업계에 잘 알려진 방법들에 따라 생성될 수 있다. 예를 들어, 요오드화 나트륨 또는 요오드화 칼륨 및 차아염소산 나트륨과 같은 화학적 산화제 또는 락토과산화효소와 같은 효소 산화제와 접촉시켜 요오드화될 수 있다. 단백질들 또는 펩티드들은 예를 들어, 과테크네산염(pertechnate)을 주석 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스(Sephadex) 칼럼 상으로 킬레이트시키고 펩티드를 본 칼럼에 도포하거나 예컨대, 관테크네산염, 염화 주석과 같은 환원제, 프탈산 나트륨-칼륨 용액과 같은 완충 용 액 및 펩티드를 배양시키는 것과 같은 직접 라벨링 기법들에 의한 리간드 교환 공정에 의하여 테크네튬-99m으로 라벨링될 수 있다. 펩티드들에 대한 금속 이온들로서 존재하는 방사선동위원소들을 결합하는 데 종종 사용되는 매개 작용기들(intermediary functional groups)은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), DOTA, NOTA, 포르피린 킬레이트들 및 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA)를 포함한다. 로다민(rhodamine), 플루오레세인 이소티오사이아네이트 및 레노그라핀(renographin)을 포함하는 형광 표지들도 사용을 위하여 고찰된다.
몇몇 실시예들에서, 단백질들 또는 펩티드들은 염료착색 기질(chromogenic substrate)와 접촉시에 색깔을 띤 생성물을 발생시킬 2차 결합 리간드 또는 효소(효소 태그(tag))에 연결될 수 있다. 적당한 효소들의 예들은 요소분해효소, 알칼리성 포스파타제, (고추냉이) 수소 과산화효소(hydrogen peroxidase) 및 포도당 산화효소를 포함한다. 바람직한 2차 결합 리간드들은 바이오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘 화합물들이다. 그러한 표지들의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 각각이 여기에 참고로 포함된 U.S. Patents 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 및 4,366,241에 기술되어 있다. 이러한 형광 표지들은 시험관 내 사용들에 바람직하지만, 또한 생체 내 응용들, 특히 내시경검사 또는 혈관내 검출 절차들에 유용할 수 있다.
다른 실시예들에서, 리간드들, 항체들 또는 다른 단백질들 또는 펩티드들은 형광 표지로 꼬리를 달수 있다. 광검출성 표지들의 비한정적 예들은 Alexa 350, Alexa 430, AMCA, 아미노아크리딘, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 5-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시 플루오레세인, 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인, 5-카르복시로다민, 6-카르복시로다민, 6-카르복시테트라메틸 아미노, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), Cy2, Cy3, Cy5,6-FAM, 단실 클로리드(dansyl chloride), 플루오레세인, HEX, 6-JOE, NBD (7-니트로벤즈-2-옥사-l,3-디아졸), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛(cresyl fast violet), 크레실 블루 바이올렛(cresyl blue violet), 밝은 크레실 블루(brilliant cresyl blue), 파라-아미노벤조산, 에리트로신(erythrosine), 프탈로사이아닌들(phthalocyanines), 아조메틴들(azomethines), 사이아닌들, 크산틴들(xanthines), 숙시닐플루오레세인들(succinylfluoresceins), 희토류 금속 주머니형 화합물들, 유로퓸 트리스비피리딘 디아민(trisbipyridine diamine), 유로퓸 주머니형 화합물 또는 킬레이트(eropium cryptate or chelate), 디아민, 디시아닌들(dicyanins), 라 졸라 블루 염료(La Jolla blue dye), 알로피코시아닌(allopycocyanin), 알로코시아닌(allococyanin) B, 피코시아닌 C, 피코시아닌 R, 티아민, 피코에리트로시아닌(phycoerythrocyanin), 피코에리트린(phycoerythrin) R, REG5 로다민 그린, 로다민 이소티오시아네이트(rhodamine isothiocyanate), 로다민 레드(Rhodamine Red), ROX, TAMRA, TET, TRIT (테트라메틸 로다민 이소티올), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), 에단들(Edans) 및 텍사스 레드(Texas Red)를 포함한다. 이들과 다른 형광 표지들은 Molecular Probes(Eugene, OR) 및 EMD Biosciences(San Diego, CA)와 같은 상업적인 소스들로부터 구해질 수 있다.
유용한 화학발광 라벨링 화합물들은 루미놀(lumonol), 이소루미놀, 방향족 아크리디늄 에스테르(aromatic acridinium ester), 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살산염 에스테르(oxalate ester) 또는 루시페린, 루시페라제 및 에쿼린과 같은 생물발광 화합물을 포함한다. 진단 접합체들은 예를 들어, 외과수술중의, 내시경검사의 또는 혈관내 종양 또는 질병 진단에 사용될 수 있다.
다양한 실시예들에서, 유용한 표지들은 금속 나노파티클들을 포함할 수 있다. 나노파티클들을 제제하는 방법들은 알려져 있다(예컨대, U.S. Patent Nos. 6,054,495; 6,127,120; 6,149,868; Lee and Meisel, Jl Phys. Chem. 86:3391-3395, 1982 참조). 나노파티클들은 상업적 소스들(예컨대, Nanoprobes Inc., yaphank, NY; Polysciences, Inc., Warrington, PA)로부터 구해질 수도 있다. Nanoprobes, Inc.(Yaphank, NY)의 Nanogold
Figure 112008051206938-pct00008
나노파티클들과 같은 변형된 나노파티클들은 상용 구입가능하다. 단백질들 또는 펩티드들에의 접합에 유용한 작용기화 나노파티클들은 상업적으로 구입될 수 있다.
예
하기의 예들은 청구된 발명을 예시하기 위하여 제공되는 것이지, 한정하기 위하여 제공되지는 않는다.
3 개의 Fab - 소단위체들로 구성된 비공유성 a 2 b 복합체들을 발생시키는 방법들
예 1. 모듈형 Fab 소단위체들의 생성을 위한 일반적인 전략
Fab 모듈들은 DDD 또는 AD 서열 중 어느 하나를 함유하는 융합 단백질들로서 생성될 수 있다. 독립적인 형질전환 세포 계통들은 각각의 Fab 융합 단백질에 대하여 개발된다. 일단 생성되면, 상기 모듈들은 원한다면 정제되거나 세포 배양 상청액 내에서 유지될 수 있다. 생성한 이후, 임의의 (Fab-DDD)2 모듈은 임의의 Fab-AD 모듈과 함께 조합되어 이중특이성 3가 Fab(bsTF)를 발생시킬 수 있다.
플라스미드 벡터 pdHL2는 수많은 항체들 및 항체계 구조체들을 생성하는 데 사용되어왔다. Gillies et al., J Immunol Methods (1989), 125:191-202; Losman et al., Cancer (Phila) (1997), 80:2660-6 참조. 디-시스트로닉(di-cistronic) 포유류 발현 벡터는 IgG의 중 및 경 사슬들의 합성을 지시한다. 벡터 서열들은 가변 구역(VH 및 VL) 서열들 내에 존재하는 약간의 차이들이 있으면서, 많은 상이한 IgG-pdHL2 구조체들에 대하여 대부분 동일하다. 당업자에게 알려진 분자 생물학 도구들을 이용하여, 이러한 IgG 발현 벡터들은 Fab-DDD 또는 Fab-AD 발현 벡터들로 변환될 수 있다. Fab-DDD 발현 벡터들을 발생시키기 위하여, 중 사슬의 CH2 및 CH3 구역들인 경첩(hinge)에 대한 코딩 서열들이 14 개 잔기 Gly-Ser 링커와 인간 RIIα의 최초 44 개 잔기들(DDD1으로 칭해짐, 도 1)인 경첩의 최초 4 개 잔기들을 엔코딩하는 서열로 대체된다. Fab-AD 발현 벡터들을 발생시키기 위하여, IgG의 CH2 및 CH3 구역들인 경첩에 대한 서열들은 15 개 잔기 Gly-Ser 링커와 생물정보학(bioinformatics) 및 펩티드 배열 기술을 이용하여 발생되며 매우 높은 친화 도(0.4 nM)를 지닌 RIIα 이량체들을 결합하는 것으로 보이는 AKAP-IS라는 이름의 17 개 잔기 합성 AD(AD1이라고 칭해짐, 도 2)인 경첩의 최초 4 개 잔기들을 엔코딩하는 서열로 대체된다. Alto, et al. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A(2003), 100:4445-50 참조.
두 개의 셔틀 벡터들은 IgG-pdHL2 벡터들을 하기에 기술되는 바와 같이 Fab-DDD1 또는 Fab-AD1 발현 벡터들 중 어느 하나로의 변환을 용이하게 하도록 설계되었다.
CH1 의 제제
CH1 구역은 주형으로서 pdHL2 플라스미드 벡터를 사용하는 PCR에 의하여 증폭되었다. 좌측 PCR 프라이머는 CH1 구역의 상부(5')와 CH1 코딩 서열의 5'인 SacII 제한 효소 사이트로 구성된다. 우측 프라이머는 경첩의 최초 4 개 잔기들을 코딩하는 서열로 구성되며 이후 Bam HI 제한 사이트를 포함하는 최종 두 개의 코돈들(GS)로 GGGGS를 거치게 된다.
CH1 좌측 프라이머의 5'
5'GAACCTCGCGGACAGTTAAG-3' (서열 번호:5)
CH1+G 4 S - Bam 우측( Right )
5'GGATCCTCCGCCGCCGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGG-3' (서열 번호:6)
410 bp PCR 앰플라이머(amplimer)는 pGemT PCR 클로닝 벡터(Promega, Inc.)로 클로닝되었으며 클론들은 T7(5') 배향성의 인서트들에 대하여 스크리닝되었다.
( G 4 S ) 2 DDD1 의 구성
지정된 (G4S)2DDD1인 올리고뉴클레오티드의 듀플렉스는 BamHI 제한 사이트를 포함하는 최초 두 개의 코돈들로서 링커 펩티드의 11 개 잔기들이 선행하는 DDD1의 아미노산 서열을 코딩하도록 Sigma Genosys(Haverhill, UK)에서 합성시켰다. 종결 코돈 및 EagI 제한 사이트가 3' 말단에 부착된다(appended). 엔코딩된 폴리펩티드 서열은 하기에 나타나 있다.
GSGGGGSGGGGSHIOIPPGLTELLOGYTVEVLROOPPDLVEFAVEYFTRLREARA (서열 번호:7)
3' 말단들 상에 30 개의 염기쌍들이 중첩하는 RIIA1-44 상부(top) 및 RIIA1-44 바닥(bottom)으로 지정된 두 개의 올리고뉴클레오티드들은 174 bp DDD1 서열의 중심 154 개 염기쌍들을 포함하도록 합성되고(Sigma Genosys) 조합된다. 올리고뉴클레오티드들은 복원(annealed)되고 Taq 중합효소로 프라이머 연장 반응을 받게 된다.
RIIA1 -44 상부
5'GTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCAGGGCTACACGGTGGAGGTGCTGCGACAG-3' (서열 번호:8)
RIIA1-44 바닥
5'GCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTGAAGTACTCCACTGCGAATTCGACGAGGTCAGGCGGCTGCTGTCGCAGCACCTCCACCGTGTAGCCCTG-3' (서열 번호:9)
프라이머 연장 이후에, 듀플렉스는 하기의 프라이머들을 사용하여 PCR에 의 하여 증폭되었다:
G4S Bam -좌측( Left )
5'-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3' (서열 번호: 10)
1-44 상부 Eag 우측
5'-CGGCCGTCAAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCG-3' (서열 번호:11)
본 앰플라이머는 pGemT로 클로닝되었으며 T7(5') 배향성의 인서트들에 대하여 스크리닝되었다.
( G 4 S ) 2 - AD1 의 구성
(G4S)2-AD1으로 지정된 듀플렉스 올리고뉴클레오티드는 BamHI 제한 사이트를 포함하는 최초 2 개 코돈들이 있는 링커 펩티드의 11 개 잔기들이 선행하는 AD1의 아미노산 서열을 코딩하기 위하여 합성되었다(Sigma Genosys). 종결 코돈과 EagI 제한 사이트는 3 말단에 부착된다. 엔코딩된 폴리펩티드 서열은 하기에 나타나 있다.
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA (서열 번호: 12)
AKAP-IS 상부와 AKAP-IS 바닥으로 지정된 두 개의 상보적인 겹치는 올리고뉴클레오티드들이 합성되었다.
AKAP - IS 상부
5'GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCTGACGGCCG-3' (서열 번호:13)
AKAP - IS 바닥
5'CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCTGCCACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCGGATCC-3' (서열 번호:14)
듀플렉스는 하기의 프라이머들을 사용하는 PCR에 의하여 증폭되었다:
G4S Bam -좌측
5'-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3' (서열 번호: 15)
AKAP - IS 종결 Eag 우측
5'-CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATG-3' (서열 번호: 16)
본 앰플라이머는 pGemT 벡터로 pGemT로 클로닝되었으며 T7(5') 배향성의 인서트들에 대하여 스크리닝되었다.
DDD1 을 CH1 으로 결찰하기
DDD1 서열을 엔코딩하는 190 bp 단편은 BamHI 및 NotI 제한 효소들을 사용하여 pGemT로부터 절단되었으며 이후 CH1-pGemT의 동일한 사이트들 속으로 결찰되어 셔틀 벡터 CH1-DDD1-pGemT를 발생시켰다.
AD1 을 CH1 으로 결찰하기
AD1 서열을 함유하는 110 bp 단편은 BamHI 및 NotI를 사용하여 pGemT로부터 절단되었으며 이후 CH1-pGemT의 동일한 사이트들 속으로 결찰되어 셔틀 벡터 CH1-AD1-pGemT를 발생시켰다.
CH1 - DDD1 또는 CH1 - AD1 을 pdHL2 -계 벡터들 속으로 클로닝하기
이러한 모듈형 설계를 이용하여 CH1-DDD1 또는 CH1-AD1 중 어느 하나가 pdHL2 벡터 내의 임의의 IgG 구조체 속으로 포함될 수 있다. 전체 중 사슬 상수 구 역은 pdHL2로부터 SacII/EagI 제한 단편(CH1-CH3)을 제거하고 각각의 pGemT 셔틀 벡터로부터 삭제된 CH1-DDD1 또는 CH1-AD2의 SacII/EagI 단편으로 그것을 대체하여 상기 구조체들 중 하나로 대체된다.
N-터미널 DDD 구역들
DDD 또는 AD의 위치는 CH1의 카르복실 터미널 말단으로 한정되지 않는다. DDD1 서열이 VH 구역의 아미노 터미널 말단에 부착되어 있었던 구조체가 조작되었다.
예 2: 발현 벡터들
h679 - Fd - Ad1 - pdHL2 의 구성
h679-Fd-AD1-pdHL2는 14 개의 아미노산 잔기들로 구성된 유연한 Gly/Ser 펩티드 스페이서를 통하여 Fd의 CH1 구역의 카르복실 터미널 말단에 결합된 AD1을 지닌 h679 Fab의 생성을 위한 발현 벡터이다. h679의 가변 구역들을 함유하는 pdHL2-계 벡터는 SacII 및 EagI를 이용하여 CH1-AD1-SV3 셔틀 벡터로부터 절단된 CH1-AD1 단편들로 SacII/EagI 단편을 교체하여 h679-Fd-AD1-pdHL2로 변환되었다.
C- DDD1 - Fd - hMN -14- pdHL2 의 구성
C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2는 DDD1이 유연한 펩티드 서열을 통하여 CH1의 카르복실 터미널에서 hMN-14 Fab에 연결되는 융합 단백질 C-DDD1-Fab-hMN-14의 두 개의 카피들을 포함하는 안정된 이량체의 생성을 위한 발현 벡터이다. hMN-14 IgG를 생성하는 데 사용된 플라스미드 벡터 hMN14(I)-pdHL2는 CH1-CH3 구역들을 제거하기 위하여 SacII 및 EagI 제한 효소들로 소화시키고 SacII 및 EagI를 사용하여 CH1- DDD1-SV3 셔틀 벡터로부터 절단된 CH1-DDD1을 삽입시켜 C-DDD1-Fd-hMN-14pdHL2로 변환되었다.
N- DDD1 - Fd - hMN -14- pdHL2 의 구성
N-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2는 DDD1이 유연한 펩티드 스페이서를 통하여 VH의 아미노 터미널에서 hMN-14와 연결되는 융합 단백질 N-DDD1-Fab-hMN-14의 두 개의 카피들을 포함하는 안정된 이량체의 생성을 위한 발현 벡터이다.
상기 발현 벡터는 하기와 같이 조작되었다. 상기 DDD1 구역은 하기에 보이는 두 개의 프라이머들을 사용하여 PCR에 의하여 증폭되었다.
DDD1 Nco 좌측
5' CCATGGGCAGCCACATCCAGATCCCGCC-3' (서열 번호:17)
DDDl - G4S Bam 우측
5'GGATCCGCCACCTCCAGATCCTCCGCCGCCAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGG TG-3' (서열 번호: 18)
PCR의 결과로서, NcoI 제한 사이트 및 BamHI 제한 효소를 함유하는 링커 (G4S)2의 부분에 대한 코딩 서열은 각각 5' 및 3' 말단들에 부착되었다. 170 bp PCR 앰플라이머는 pGemT 벡터 속으로 클로닝되었으며 클론들은 T7(5') 배향성의 인서트들에 대하여 스크리닝되었다. 194 bp 인서트는 NcoI 및 SalI 제한 효소들을 사용하여 pGemT로부터 절단되었으며 매개 벡터 DDD1-SV3를 발생시키기 위하여 상기와 동일한 효소들로 소화시켜 제제된 SV3 셔틀 벡터 속으로 클로닝되었다.
hMN-14 Fd 서열은 하기에 보이는 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 사용한 PCR에 의하여 증폭되었다.
hMN -14 VH 좌측 G4S Bam
5'-GGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGAGGTCCAACTGGTGGAGAGCGG-3' (서열 번호: 19)
CHl -C 종결 Eag
5'-CGGCCGTCAGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTC-3' (서열 번호:20)
PCR의 결과로서, BamHI 제한 사이트 및 링커(G4S)의 부분에 대한 코딩 서열이 앰플라이머의 5' 말단에 부착되었다. 종결 코돈 및 EagI 제한 사이트는 3' 말단에 부착되었다. 1043 bp 앰플라이머는 pGemT 속으로 클로닝되었다. hMN-14-Fd 인서트가 BamHI 및 EagI 제한 효소들을 사용하여 pGemT로부터 절단되었으며 이후 구조체 N-DDD1-hMN-14d-SV3를 발생시키기 위하여 상기와 동일한 효소들로 소화시켜 제제되었다.
N-DDD1-hMN-14Fd 서열은 XhoI 및 EagI 제한 효소들을 사용하여 절달되었으며 1.28 kb 인서트 단편은 상기와 동일한 효소들을 사용하여 C-hMN-14-pdHL2를 소화시켜 제제된 벡터 단편으로 결찰되었다. 최종 발현 벡터는 N-DDD1-Fd-hMN-14-pDHL2이다.
예 3. h679 - Fab - AD1 의 생성 및 정제
h679-Fab-AD1-phHL2 벡터는 SalI 제한 효소를 사용한 소화에 의하여 직선화되고 전기천공법에 의하여 Sp/EEE 골수 세포들 속으로 형질감염되었다. 디-시스트로닉 발현 벡터는 조합하여 h679 Fab-AD1을 형성하는 h679 카파 경 사슬 및 h679 Fd-AD1 양쪽 모두의 합성과 분비를 지시한다. 전기천공을 한 이후에, 세포들은 96- 웰 조직 배양 플레이트들 내에서 플레이트되고 트랜스펙탄트(transfectant) 클론들이 0.05 μM 메토트렉세이트(MTX)를 사용하여 선택되었다. 클론들은 BSA-IMP-260(HSG) 접합체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트들을 사용한 ELISA 및 HRP-접합된 염소 항-인간 Fab로 검출하여 단백질 발현 여부에 대하여 스크리닝되었다. HSG(IMP-239) 센서칩을 사용한 BIAcore 분석이 이용되어 희석된 매체 표본들의 주사를 통하여 구해진 최초 기울기를 측정하여 생산성을 측정하였다. 최고로 생성하는 클론은 약 30 ㎎/L의 최초 생산성을 가졌다. 총 230 ㎎의 h679-Fab-AD1이 단일-단계 IMP-291 친화성 크로마토그래피에 의하여 4.5 리터의 회전병 배양(roller bottle)으로부터 정제되었다. 배양 배지는 IMP-291-아피젤 칼럼(affigel column)으로 옮겨 넣기 전에 한외여과(ultrafiltration)에 의하여 약 10-배 농축되었다. 상기 칼럼은 PBS로 바닥선까지 세척되었으며 h679-Fab-AD1은 1 M 이미다졸, 1mM EDTA, 0.1 M NaAc, pH 4.5로 용리되었다. 상기 용출물을 SE-HPLC 분석하면 50 kDa 단백질과 일치하는 체류 시간(9.63 분)을 지닌 단일한 급격한 피크를 보였다(미도시). h679-AD1의 폴리펩티드 구성성분들을 나타내는 두 개의 밴드들만이 SDS-PAGE 분석을 감소시키면 명료하였다(미도시).
예4. N- DDD1 - Fab - hMN -14 및 C- DDD1 - Fab - hMN -14의 생성 및 정제
C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2 및 N-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2 벡터들은 전기천공법에 의하여 Sp2/0-유도된 골수 세포들 속으로 형질감염되었다. C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2는 조합하여 C-DDD1-hMN-14 Fab를 형성하는 hMN 카파 경 사슬 및 hMN-14 Fd-DDD1 양쪽 모두의 합성과 분비를 지시하는 디-시스트로닉 발현 벡터이다. N-DDD1-hMN- 14-pdHL2는 조합하여 N-DDD1-Fab-hMN-14를 형성하는 hMN-14 카파 경 사슬 및 N-DDD1-Fd-hMN-14 양쪽 모두의 합성과 분비를 지시하는 디-시스트로닉 발현 벡터이다. 각각의 융합 단백질은 DDD1 구역의 상호작용을 통하여 안정된 동형이량체를 형성한다.
전기천공을 실시한 이후에, 세포들이 96-웰 조직 배양 플레이트들 내에서 플레이트 되었으며 트랜스펙탄트 클론들은 0.05 μM 메토트렉세이트(MTX)를 사용하여 선택되었다. 클론들은 WI2(hMN-14에 대한 생쥐 항-id 단일클론성 항체)로 코팅된 마이크로타이터 플레이트들을 사용한 ELISA 및 HRP-접합된 염소 항-인간 Fab를 사용한 검출에 의하여 단백질 발현여부에 대하여 스크리닝 되었다. 최고로 생성하는 C-DDD1-Fab-hMN14 Fab 및 N-DDD1-Fab-hMN14 Fab 클론들의 최초 생산성은 각각 60 ㎎/L 및 6 ㎎/L이었다.
AD1 - 아피젤을 이용한 N- DDD1 - hMN -14 및 C- DDD1 - hMN -14의 친화성 정제
DDD/AD 상호작용을 이용하여 DDD1-함유 구조체들을 친화성 정제하였다. AD1-C는 설프히드릴 기를 클로로아세틱 무수물(chloroacetic anhydride)과 반응시킨 이후에 아피젤에 펩티드를 결합시키는 데 사용되는 AD1 서열과 카르복실 터미널 시스테인 잔기로 구성되는 합성된 펩티드이다. DDD-함유 a2 구조들은 중성 pH에서 AD1-C-아피젤 수지와 특이적으로 결합하고 낮은 pH(예컨대, pH 2.5)에서 용리될 수 있다.
총 81 ㎎의 C-DDD1-hMN-14 가 단일-단계 AD1-C 친화성 크로마토그래피에 의 하여 1.2 리터의 회전병 배양으로부터 정제되었다. 배양 배지는 AD1-C-아피젤 칼럼 상으로 옮겨 넣기 전에 한외여과에 의하여 약 10-배 농축되었다. 상기 칼럼은 PBS로 바닥선까지 세척되었으며 C-DDD1-Fab-hMN-14는 0.1 M 글리신, pH 2.5로 용리되었다. 상기 용출물을 SE-HPLC 분석하면 107 kDa 단백질과 일치하는 체류 시간(8.7 분)을 지닌 단일한 단백질 피크를 보였다(미도시). 순도는 SDS-PAGE를 감소시켜서 확인되었으며, 이는 C-DDD1-Fab-hMN-14의 두 개의 폴리펩티드 구성성분들에서 예상되는 분자 크기의 밴드들 두 개만 보여주고 있다(미도시).
총 10 ㎎의 N-DDD1-hMN-14가 상술한 단일-단계 AD1-C 친화성 크로마토그래피에 의하여 1.2 리터의 회전병 배양으로부터 정제되었다. 상기 용출물을 SE-HPLC 분석하면 C-DDD1-Fab-hMN-14와 유사한 체류 시간(8.77 분)을 지니고 107 kDa 단백질과 일치하는 단일한 단백질 피크를 보였다(미도시). SDS-PAGE는 N-DDD1-Fab-hMN-14의 폴리펩티드 구성성분들이라고 여겨지는 두 개의 밴드들만 보였다(미도시).
C-DDD1-Fab-hMN-14의 결합 활성은 시험체(test article)가 다양한 양의 WI2와 혼합되는 표본들을 SE-HPLC 분석하여 측정되었다. 0.75:1의 몰비로 WI2 Fab와 C-DDD1-Fab-hMN-14를 혼합하여 제제된 표본은 세 개의 피크들을 보였는데, 이는 결합되지 않은 C-DDD1-Fab-hMN14(8.71 분), 하나의 WI2 Fab에 결합된 C-DDD1-Fab-hMN-14(7.95 분) 및 두 개의 WI2 Fab들에 결합된 C-DDD1-Fab-hMN14에 해당한다(미도시). 4의 몰비로 WI2 Fab와 C-DDD1-Fab-hMN-14를 함유하는 표본이 분석되는 경우에, 7.36 분에서의 단일한 피크만이 관찰되었다(미도시). 이러한 결과들은 hMN14-Fab-DDD1이 이량체이며 두 개의 활성 결합 사이트들을 가진다는 것을 보여준다. 본 실험이 N-DDD1-Fab-hMN-14로 반복되는 경우에 아주 유사한 결과들이 구해졌다.
경쟁적인 ELISA는 C-DDD1-Fab-hMN-14 및 N-DDD1-Fab-hMN-14 양쪽 모두가 hMN-14 IgG와 유사하고 일가 hMN-14 Fab보다 더 상당히 강력한 화합력을 지닌 CEA와 결합한다는 것을 보였다(미도시). ELISA 플레이트들은 hMN-14가 특이적인 CEA의 에피토프(A3B3)를 함유하는 융합 단백질로 코팅되었다.
예 5. a 2 b 복합체들의 형성
a 2 b 복합체의 형성에 대한 증거는 동일한 몰량의 C-DDD1-Fab-hMN-14(a 2 ) 및 h679-Fab-AD1(b)을 함유하는 혼합물을 SE-HPLC 분석하여 우선 제공되었다. 그런 표본이 분석되는 경우에, h679-Fab-AD1(9.55 분) 또는 C-DDD1-Fab-hMN-14(8.73 분) 중 어느 하나보다 더 큰 신규한 단백질의 형성과 일치하는 8.40 분의 체류 시간을 지니는 단일한 피크가 관찰되었다(미도시). hMN-14 F(ab')2이 h679-Fab-AD1과 혼합되거나 C-DDD1-Fab-hMN-14가 679-Fab-NEM과 혼합되는 경우에, 업필드 쉬프트(upfield shift)는 관찰되지 않았는데, 이는 상호작용이 DDD1 및 AD1 구역들을 통하여 특이적으로 매개된다는 것을 보여주고 있다. h679-Fab-AD1 및 N-DDD1-Fab-hMN-14를 사용하여 아주 유사한 결과들이 구해졌다(미도시).
DD1 및 AD1 융합 단백질들 사이에 특이적인 상호작용을 더 실증하고 특징화시키기 위하여 BIAcore가 사용되었다. 실험들은 h679-Fab-AD1 또는 679-Fab-NEM 중 어느 하나를 고밀도의 HSG-결합(IMP239) 센서칩의 표면과 결합시키게 하고, C-DDD1-Fab-hMN-14 또는 hMN-14 F(ab')2를 후속적으로 주사하였다. 예상한 바와 같이, h679-Fab-AD1 및 C-DDD1-Fab-hMN-14를 조합만 해도 후자가 주사되는 경우에 반응 단위들에서 더 증가되었다(미도시). N-DDD1-Fab-hMN-14 및 h679-Fab-AD1을 사용한 유사한 결과들이 구해졌다(미도시).
각각의 융합 단백질들 내에 존재하는 AD1 및 DDD1 사이의 특이적인 상호작용의 결합 친화도를 측정하기 위하여 평형 SE-HPLC 실험들이 실행되었다. h679-Fab-AD1을 C-DDD1-Fab-hMN-14, N-DDD1-hMN-14 및 재조합 인간 RIIα의 상업적 표본과 결합에 대한 해리 상수들(Kd)은 각각 15 nM, 8 nM 및 30 nM인 것으로 나타났다.
기타 관련 방법들
예6. Di - AD1 의 발생
본 예에서, 하기의 아미노산 서열을 가지는 작은 폴리펩티드(AD1-C)가 합성되었다.
NH2-KQIEYLAKQIVDNAIOOAKGC-COOHΥ (서열 번호:37)
AD1-C에서, AD1 아미노산 서열(밑줄)은 N-터미널에서 라이신 잔기 및 카르복실 터미널에서 KGC 트리펩티드에 의하여 측면에 있게 된다(flank). 두 개의 라이신(K) 잔기들이 도입되어 용해도를 증가시키고 글리신(G) 잔기가 C-터미널 시스테인 앞에 삽입되어 더 유연해진다. DMSO로 처리하면, AD1-C는 Di-AD1으로 지정된 이량체로 산화되며, 이는 RP-HPLC에 의하여 정제되었다. Di-AD1의 개략적인 구조가 하기에 나타나있다(= 이황화물 다리를 나타냄).
NH2-KQIEYLAKOIVDNAIQOAKGC=CGKAQQIANDVIOKALYEIQK-NH2 (서열 번호:21)
더 변형되기 위하여 사용될 수 있는 Di-AD1 또는 Ad1-C 내에 존재하는 수많은 작용기들이 있다. 예를 들어, Di-AD1 및 AD1-C에 각각 함유되어 있는 8 개 및 4 개의 제 1 아미노산들은 약물들, 독소들, 단백질들 또는 다른 작동체들을 결합하는 데 사용될 수 있다. 또한, Di-AD1 및 AD1-C는 방사성요오드화를 위하여 사용될 수 있는 2 개 및 1 개의 티로신 잔기들을 각각 가진다. 최종적으로, AD1-C는 작동체들을 결합하거나 작동체들을 함유하는 Di-AD1 유사체를 형성하도록 사용될 수도 있는 자유 시스테인 잔기를 함유한다.
예 7. 신규한 사전표적 접근법
본 발명의 방법은 신규한 사전표적 방법론들에 적합하다. 하기는 합텐-결합 항체에 대한 필요없이 친화도 증진 시스템(affinity enhancement system)을 이용하는 사전표적 시스템(Le Doussal et al., J Nucl Med (1989), 30:1358-66)의 예를 제공한다. 예 4에 기술된 바와 같이 생산되는 C-DDD1-Fab-hMN-14 또는 N-Fab-DDD2-hMN-14의 이량체는 종양을 사전표적하기 위하여 사용될 수 있다. 107 kDa 단백질이 우선 환자들에게 정맥으로 투여되며 혈액 및 정상 조직들로부터 제거되는 동안에 종양들 상에 CEA를 결합하도록 한다. 이후에, 치료제(예를 들어, 90Y) 또는 진단 방사성동위원소(예를 들어, 111In)를 가지는 Di-AD1의 DOTA 접합체와 같은 이가 펩티드는 정맥으로 투여된다. 혈액 및 정상 조직들로부터 급속히 제거되는 동안에, 작은 펩티드(~ 5000 Da)는 종양으로 국소화하는데, 이는 이미 상기 종양에 의하여 보유되는 C-DDD1-Fab-hMN-14와 특이적으로 상호작용하는 것으로 기대되는 두 개의 AD 서열들을 함유하기 때문이다.
C-DDD1-Fab-hMN-14를 Di-AD1과 시험관 내에서의 교차결합은 SE-HPLC에 의하여 예시되었다. C-DDD1-Fab-hMN-14가 Di-AD1과 혼합되는 경우에, 단백질 피크는 8.67 분에서 7.95 분으로 이동하였는데, 이는 가교 구조의 형성을 나타내고 있다(미도시). hMN-14 F(ab')2가 Di-AD1과 혼합되는 경우에 그러한 이동이 관찰되지 않았는데, 이는 상기 가교가 DDD1 및 AD1 사이의 상호작용에 의하여 매개되는 것을 나타내고 있다. 피크 이동이 사실상 C-DDD1-Fab-hMN-14의 특이적인 가교 때문이었다는 것을 확인하기 위하여, 복합체는 DTT로 환원되어 Di-AD1의 이황화물 다리를 분열시켰는데, 이로 인하여 상기 피크를 8.67 분으로 다시 이동시켰다(미도시).
예 8. DDD 또는 AD 융합 단백질들의 친화성 정제
보편적인 친화성 정제 시스템들은 낮은 친화도 도킹(affinity docking)을 가진 DDD 또는 AD 단백질들의 생성에 의하여 개발될 수 있다. RIα 이량체들에 의하여 형성된 DDD는 RIIα와 비교하여 500-배 낮은 친화도(225 nM)을 지닌 AKAP-IS(AD1)과 결합한다. 따라서, 최초 44 개의 아미노산 잔기들로부터 형성된 RIα 이량체들은 생성되고 수지(resin)에 결합되어 임의의 AD1-함유 융합 단백질의 정제를 위한 인력 친화성 매트릭스를 제작할 수 있다.
수많은 낮은 친화도(0.1 μM) AKAP 고정 구역들이 자연적으로 존재한다. 필요하다면, 고도로 단정할 수 있는(highly predicable) 아미노산 치환들이 도입되어 결합 친화도를 더 낮출 수 있다. 낮은 친화성 AD는 합성으로 또는 생물학적으로 생 성되고 임의의 DDD1 융합 단백질의 친화성 정제에 사용되는 수지에 결합될 수 있다.
안정적으로 묶여진 구조들의 발생과 관련된 방법들
예 9. 3 개의 Fab 단편들로 구성된 이황화물 안정화된 구조들을 생성하는 벡터들
N- DDD2 - Fd - hMN -14- pdHL2
N-DDD2-hMN-14-pdHL2는 Fd의 아미노 터미널에 부착된 DDD2의 이량체화 및 도킹 구역 서열을 가지는 N-DDD2-Fab-hMN-14의 생성을 위한 발현 벡터이다(도 4). DDD2는 15 아미노산 잔기 Gly/Ser 펩티드 링커를 통하여 VH 구역에 결합된다. DDD2는 DDD1의 서열들과 동일한 이량체화 및 도킹 서열들을 선행하는 시스테인 잔기를 가진다. 분비되는 융합 단백질은 DDD2 구역들의 비공유 상호작용에 의하여 함께 묶여진 hMN-14 Fab의 동일한 두 개 카피들로 구성되어 있다(도 3).
발현 벡터는 하기와 같이 조작되었다. DDD2의 1 내지 13 잔기들을 포함하는 두 개의 오버래핑 상보적인 올리고뉴클레오티드들(DDD2 상부 및 DDD2 바닥)은 합성되었다. 상기 올리고뉴클레오티드는 복원되고 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK)로 인산화되어, 각각 NcoI와 PstI의 제한 효소들로 소화된 DNA로의 결찰에 적합한 5' 및 3' 말단들 상에 오버행들이 있게 된다.
DDD2 상부
5'CATGTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3' (서열 번호:22)
DDD2 바닥
5'GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCA-3' (서열 번호:23)
듀플렉스 DNA는 매개 구조체 DDD2-hMN14 Fd-SV3를 발생시키기 위하여 NcoI 및 PstI를 사용하여 소화시켜 제제된 DDD1-hMN14 Fd-SV3 벡터 단편으로 결찰되었다. DDD2-hMN14 Fd에 대한 코딩 서열을 함유했던 1.28 kb 인서트 단편은 XhoI 및 EagI 제한 효소들을 사용하여 상기 매개 구조체로부터 절단되며 상기와 동일한 효소들로 소화시켜 제제된 hMN14-pdHL2 벡터 DNA로 결찰되었다. 최종 발현 벡터는 N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2이다(도 4).
C- DDD2 - Fd - hMN -14- pdHL2
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2는 14 아미노산 잔기 Gly/Ser 펩티드 링커를 통하여 Fd의 카르복실 터미널에 부착되는 DDD2의 이량체화 및 도킹 구역 서열을 소유하는 C-DDD2-Fab-hMN-14를 생성하기 위한 발현 벡터이다(도 5A). 분비된 융합 단백질은 DDD2 구역들의 비공유 상호작용에 의하여 함께 묶여진 hMN-14 Fab의 동일한 두 개의 카피들로 구성되어 있다.
발현 벡터는 하기와 같이 조작되었다. 링커 펩티드의 부분에 대한 코딩 서열(GGGGSGGGCG, SEQ ID NO:38)과 DDD2의 1 내지 13 잔기들을 포함하는 두 개의 오버래핑 상보적인 올리고뉴클레오티드들은 합성되었다. 상기 올리고뉴클레오티드들은 복원되고 T4 PNK로 인산화되어, 제한 효소들 BamHI 및 PstI 각각으로 소화된 DNA와의 결찰과 융합하는 5' 및 3' 말단들 상에 오버행들이 있게 된다.
G4S - DDD2 상부
5'GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA- 3' (서열 번호:24)
G4S - DDD2 바닥
5'GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCAACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3' (서열 번호:25)
상기 듀플렉스 DNA는 셔틀 벡터 CH1-DDD2-pGemT를 발생시키기 위하여, BamHI 및 PstI로 소화시켜 제제된 셔틀 벡터 CH1-DDD1-pGemT로 결찰되었다. 507 bp 단편은 SacII 및 EagI를 사용하여 CH1-DDD2-pGemT로부터 절단되고 SacII 및 EagI로 소화시켜 제제된 IgG 발현 벡터 hMN14(I)-pdHL2로 결찰되었다. 최종 발현 구조체는 C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2이다(도 6).
h679 - Fd - AD2 - pdHL2
h679-Fab-AD2는 B로서 N-DDD2-Fab-hMN-14 또는 C-DDD2-Fab-hMN-14와 짝짓도록 설계되었다. h679-Fd-AD2-pdHL2는 14 아미노산 잔기 Gly/Ser 펩티드 링커를 통하여 CH1 구역의 카르복실 터미널 말단에 부착되는 AD2의 고정 구역 서열을 소유하는 h679-Fab-AD2의 생성을 위한 발현 벡터이다. AD2는 하나의 선행하는 잔기 및 AD1의 고정 구역 서열 이후에 다른 잔기를 가진다.
발현 벡터는 하기와 같이 조작되었다. AD2에 대한 코딩 서열 및 링커 서열의 부분을 포함하는 두 개의 오버래핑 상보적인 올리고뉴클레오티드들(AD2 상부 및 AD2 바닥)은 합성되었다. 상기 올리고뉴클레오티드들은 복원되고 T4 PNK로 인산화되어, 제한 효소들 BamHI 및 PstI 각각으로 소화된 DNA와의 결찰과 융합하는 5' 및 3' 말단들 상에 오버행들이 있게 된다.
AD2 상부
5'GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGATGTGGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCGGCTGCTGAA-3' (서열 번호:26)
AD2 바닥
5TTCAGCAGCCGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCCACATCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3'(서열 번호:27)
상기 듀플렉스 DNA는 셔틀 벡터 CH1-AD2-pGemT를 발생시키기 위하여 BamHI 및 SpeI로 소화시켜 제제된 셔틀 벡터 CH1-AD1-pGemT 속으로 결찰되었다. CH1 및 AD2 코딩 서열들을 함유하는 429 염기쌍 단편은 SacII 및 Eagl 제한 효소들을 사용하여 셔틀 벡터로부터 절단되며 상기와 동일한 효소들로 소화시켜 제제된 h679-pdHL2 벡터 속으로 결찰되었다. 최종 발현 벡터는 h679-Fd-AD2-pdHL2이다.
예 10. h679 - Fab - AD2 의 생성
h679-Fd-AD2-pdHL2 벡터는 전기천공법에 의하여 Sp/EEE 골수 세포들 속으로 형질감염되었다. 디-시스트로닉 발현 벡터는 조합하여 h679-Fab-AD2를 형성하는 h679 카파 경 사슬 및 h679 Fd-AD2 양쪽 모두의 합성과 분비를 지시한다. AD의 어는 쪽 말단 상의 시스테인 잔기들은 두 개의 잠재적으로 반응성인 설프히드릴 기들을 제공한다. 전기천공을 한 이후에, 상기 세포들은 96-웰 조직 배양 플레이트들 내에서 플레이트 되었으며 트랜스펙턴트 클론들은 0.05 μM 메토트렉세이트(MTX)로 선택되었다. 클론들은 BSA-IMP-260(HSG) 접합체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트들을 사용하는 ELISA 및 염소 항-인간 Fab-HRP를 사용한 검출에 의하여 단백질 발 현에 대하여 스크리닝되었다. HSG(IMP-239) 센서칩을 사용하는 BIAcore 분석은 희석된 매질 표본들의 주사로부터 얻어진 초기 기울기를 측정하여 생산성을 측정하도록 이용되었다. 최고의 생성하는 클론은 약 50 ㎎/L의 초기 생산성을 가졌다. 총 160 ㎎의 h679-Fab-AD2는 단일-단계 IMP-291 친화성 크로마토그래피에 의하여 2.9 리터의 회전병 배양으로부터 정제되었다. 배양 배지는 IMP-291-아피젤 칼럼 상으로 옮겨 넣기 전에 한외여과에 의하여 약 10-배 농축되었다. 상기 칼럼은 BS로 바닥선까지 세척되었으며 h679-AD2는 1 M 이미다졸, 1 mM EDTA, 0.1 M NaAc, pH 4.5로 용리되었다. SE-HPLC 분석은 50 kDa 단백질과 일치하는 체류 시간(~10 분)을 지닌 단일한 뚜렷한 피크를 보였다(미도시). 본 물질은 hMN-14-Fab-DDD1과 혼합되는 경우에, 1/3 정도만 이원 복합체라고 여겨지는 새로운 피크의 SE-HPLC 자취(trace)에서 관찰로 뚜렷해지는 반응성이었다(미도시). 그러나, h679-Fab-AD2를 TCEP로 환원시키면 100 % 활성이 되었다(미도시). 이는 (1) 분자내 이황화물 결합은 AD2의 두 개의 시스테인 잔기들 사이에서 형성하여, DDD와의 화합을 방지할 뿐만 아니라, 설프히드릴 기들을 다른 물질들과 반응하지 못하도록 보호하며; 그리고 (2) 분자내 이황화물 다리는 환원에 의하여 끊어져 두 개의 자유 설프히드릴 기들을 지닌 DDD-반응성 고정 구역이 생성될 수 있다는 것을 암시한다.
예 11. N- DDD2 - Fab - hMN -14의 a2 구조로서의 생성
N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2 벡터는 전기천공법에 의한 Sp/EEE 골수 세포들로 형질감염되었다. 디-시스트로닉 발현 벡터는 조합하여 N-DDD2-hMN14 Fab를 형성하는 hMN-14 카파 경 사슬 및 N-DDD2-hMN-14 Fd의 양쪽 모두의 합성과 분비를 지시한다. A2 구조는 DDD2를 통한 이량체화에 의하여 형성하는 것으로 예상되어, 각각의 DDD2 내에서의 시스테인 잔기에 의하여 제공되는 두 개의 잠재적으로 반응성인 설프히드릴 기들이 생성한다. 전기천공을 한 이후에, 상기 세포들은 96-웰 조직 배양 플레이트들 내에서 플레이트 되었으며 트랜스펙턴트 클론들은 0.05 μM 메토트렉세이트(MTX)로 선택되었다.
클론들은 WI2(hMN-14 항-Id)로 코팅된 마이크로타이터 플레이트들을 사용하는 ELISA 및 염소 항-인간 Fab-HRP를 사용한 검출에 의하여 단백질 발현에 대하여 스크리닝되었다. 최고의 생성하는 클론들은 약 10 ㎎/L의 초기 생산성을 가졌다. 총 16 ㎎의 N-DDD2-hMN-14는 단백질 L 친화성 크로마토그래피에 의하여 1.8 리터의 회전병 배양으로부터 정제되었다. 배양 배지는 단백질 L 친화성 크로마토그래피 칼럼 상으로 옮겨 넣기 전에 한외여과에 의하여 약 10-배 농축되었다. 상기 칼럼은 PBS로 바닥선까지 세척되었으며 N-DDD2-hMN14는 1 mM EDTA, 0.1 M NaAc, pH 2.5로 용리되었다. SE-HPLC 분석은 4 개의 단백질 피크들을 보였으며(미도시), 그 중 2 개는 N-DDD2-Fab-hMN-14의 a 4 (7.9 분) 및 a 2 (8.8 분)로 이후에 확인되었으며, 나머지 두 개는 카파 사슬의 이량체 및 단량체였다. 본 혼합물은 TCEP과 같은 티올-환원제가 첨가되어 a 4 형태의 대부분이 a 2 형태로 변환되지 않는다면, h679-Fab-AD1을 지닌 결합 활성을 거의 보이지 않았다(미도시). 이러한 데이터는 (1) a4는 DDD2 내에 존재하는 시스테인들을 통한 두 개의 a2 구조들의 연결을 통하여 형성되어, AD와의 화합을 방지할 뿐만 아니라, 설프히드릴 기들을 다른 물질들과 반응하지 못하 도록 보호하며; 그리고 (2) 분자내 이황화물 다리는 환원에 의하여 끊어져 두 개의 자유 설프히드릴 기들을 함유하는 AD-반응성 DDD 이량체들이 있는 a 2 구조들을 생성할 수 있다는 것을 암시한다. 이러한 부산물(a 4 )은 네 개의 활성 Fab 소단위체들로 구성되어 있다는 것을 유의하라. 환원 이후에 높은 TCEP 농도들 및 오랜 반응 시간들을 지닌 총 N-DDD2-Fab-hMN-14 중 약 15 %는 A4 형태로 존재한다(미도시). 이는 구역 스와핑(swapping)과 같은 다른 메커니즘들이 이황화물 가교짓기(disulfide bridging)에 더하여 a 4 형태의 형성에 기여할 수 있다는 것을 암시한다.
예 12. C- DDD2 - Fab - hMN -14의 생성
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2 벡터는 전기천공법에 의하여 Sp/EEE 골수 세포들 속으로 형질감염되었다. 디-시스트로닉 발현 벡터는 조합하여 C-DDD2-hMN14를 형성하는 hMN-14 카파 경 사슬 및 C-DDD2-Fd-hMN-14의 양쪽 모두의 합성과 분비를 지시한다. N-DDD2-Fab-hMN-14와 같이, a 2 구조는 DDD2를 통한 이량체화에 의하여 형성하는 것으로 예상되어, 각각의 DDD2 내에서의 시스테인 잔기에 의하여 제공되는 두 개의 잠재적으로 반응성인 설프히드릴 기들이 생성한다. 전기천공을 한 이후에, 상기 세포들은 96-웰 조직 배양 플레이트들 내에서 플레이트 되었으며 트랜스펙턴트 클론들은 0.05 μM 메토트렉세이트(MTX)로 선택되었다.
클론들은 WI2(hMN-14 항-Id)로 코팅된 마이크로타이터 플레이트들을 사용하는 ELISA 및 염소 항-인간 Fab-HRP를 사용한 검출에 의하여 단백질 발현에 대하여 스크리닝되었다. 최고의 생성하는 클론들은 약 100 ㎎/L의 초기 생산성을 가지는데, 이는 N-DDD2-Fab-hMN-14의 생산성에 비하여 10 배 더 높은 것이었다. 총 200 ㎎의 C-DDD2-hMN-14는 예 3에 기술된 바와 같이 단백질 L 친화성 크로마토그래피에 의하여 1.8 리터의 회전병 배양으로부터 정제되었다. 단백질 L-정제된 C-DDD2-Fab-hMN-14의 SE-HPLC 프로파일(미도시)은 N-DDD2-Fab-hMN-14의 SE-HPLC 프로파일과 유사하였다. 4 개의 단백질 피크들 중 2 개는 C-DDD2-Fab-hMN-14의 a 4 (8.40 분) 및 a 2 (9.26 분)로 확인되었으며, 나머지 두 개는 카파 사슬의 이량체 및 단량체를 나타낸다. 본 혼합물은 TCEP과 같은 티올-환원제가 첨가되어 a 4 형태의 대부분이 이후에 h679-AD1에 격렬하게(avidly) 연결되는 a 2 형태로 변환되지 않는다면, h679-AD1을 지닌 결합 활성을 거의 보이지 않았다. 이러한 데이터는 C-DDD2-Fab-hMN-14가 N-DDD2-hMN-14의 기능적 등가물이라는 것을 암시한다.
예 13. TF1 의 발생
h679-Fab-AD2는 B 성분으로서 조합되는 경우에 이황화물 결합들(도 7B)을 통하여 공유적으로 결합하도록 더 유도될 수 있는 a 2 b 구조(도 7A)를 형성하도록 용이하게 화합하는 aN-DDD2-hMN-Fab-14 또는 C-DDD2-hMN-14과 같은 a 2 성분과 짝짓도록 설계되었다. N-DDD2- 및 AD2- 구조체들의 특징화는 상기 구조체들 각각의 환원이 전체 DDD/AD 상호작용을 달성하는 데 필요하였으므로, 환원 단계가 공정에 포함되었다. 최초에, 부동화된(immobilized) TCEP가 환원제로서 사용되어 환원제의 제거 에 소요되는 시간을 절약하였다. 상온에서 1 시간 동안 환원을 한 이후에, TCEP-아가로스는 원심분리에 의하여 제거되었으며 DMSO가 반응 용액에 첨가되어 10 %의 최종 농도가 되었다. 이하 TF1으로 칭해지는 공유적으로 연결된 a 2 b 복합체의 최초 증거는 BIAcore 분석에 의하여 실증되었다.
부동화된 TCEP를 사용한 소규모 반응들에서 타당성이 입증된 이후에, TF1의 대규모 제제는 하기와 같이 실행되었다. N-DDD2-Fab-hMN-14(단백질 L-정제된) 및 h679-Fab-AD2(IMP-291-정제된)가 1 mM EDTA, PBS, pH7.4로 대략적인 화학양론적 농도들에서 우선 혼합되었다. TCEP를 첨가하기 전에, SE-HPLC는 a 2 b 형성의 어떠한 증거도 보이지 않았다(미도시). 그 대신, a 4 (7.97 분; 200 kDa), a 2 (8.91 분; 100 kDa) 및 B(10.01 분; 50 kDa)를 나타내는 피크들이 있었다. 5 mM TCEP를 첨가하면 급속하게 a2b 복합체가 형성되었는데, 이는 150 kDa 단백질과 일치하는 8.43 분에서의 새로운 피크에 의하여 실증되었다(미도시). h679-Fab-AD2라고 여겨지는 피크가 여전히 눈에 띄지만 a 2 또는 a 4 중 어느 하나에 해당하는 어떠한 뚜렷한 피크도 관찰되지 않았으므로 본 실험에서는 과량의 B가 있었다(미도시). 1 시간 동안 환원시킨 이후에, TCEP는 PBS의 몇몇 변화들에 대항하는 하룻밤 동안의 투석에 의하여 제거되었다. 그 결과로 나온 용액은 10 % DMSO와 접촉시켜 상온에서 하룻밤 동안 두었다.
SE-HPLC에 의하여 분석되는 경우에, a 2 b를 나타나는 피크는 0.1 분 내지 8.31 분으로의 지체 시간이 약간 감소되면 피크가 더 날카로워 지는 듯 하였는데, 이는 우리가 이전에 한 발견들에 근거한다면, 결합 친화도에서 증가한 것을 나타낸다. 복합체는 IMP-291 친화성 크로마토그래피에 의하여 더 정제되어 카파 사슬 오염물질들을 제거하였다. 예상한 바와 같이 여분의 h679-AD2는 공동으로 정제되고 이후 예비 SE-HPLC에 의하여 제거되었다(미도시).
TF1은 고도로 안정된 복합체이다. TF1이 HSG(IMP-239) 센서칩에의 결합여부에 대하여 시험되는 경우에, 표본 주사의 말미에 관찰된 반응의 뚜렷한 감소는 없었다. 이와는 대조적으로, C-DDD1-Fab-hMN-14 및 h679-Fab-AD1 양쪽 모두의 등몰 혼합물을 함유하는 용액이 유사한 조건하에서 시험되는 경우에, 반응 단위체들에서의 관찰된 증가는 표본 주사 도중 및 주사 직후에 검출가능한 방울이 동반하게 되었는데, 이는 초기에 형성된 a 2 b 구조가 불안정하였다는 것을 나타낸다. 또한, 후속적으로 WI2를 주사하면 TF1에 대한 반응 단위체들에서 실질적인 증가를 주었던 반면에, C-DDD1/AD1 혼합물에 대하여는 어떠한 뚜렷한 증가도 없었다.
WI2를 센서칩 상에 부동화된 TF1과 결합시켜 발생하는 반응 단위체들의 추가적인 증가는 두 개의 완전한 작용성 결합 사이트들에 해당하며, 그 각각은 N-DDD2-Fab-hMN-14의 하나의 소단위체가 기여한 것이다. 이는 TF1이 WI2의 두 개의 Fab 단편들을 결합하는 능력으로 확인되었다. 정확히 TF1으로 산환 및 환원된 h679-AD2 및 N-DDD1-hMN-14를 함유하는 혼합물이 BIAcore에 의하여 분석되었던 경우에, WI2의 추가적인 결합은 거의 없었는데(미도시), 이는 TF1과 같은 이황화물-안정화된 a2b 복합체는 DDD2 및 AD2의 상호작용을 통하여 형성할 수 있을 뿐이라는 것을 나타낸다.
상기 공정에 두 가지 개선사항들이 실시되어 시간과 공정의 효율을 감소시켰다. 우선, a 4 / a 2 의 혼합물로서 존재하는 약간의 몰 과량 N-DDD2-Fab-hMN-14를 사용하여 h679-Fab-AD2와 반응시키면 자유 h679-Fab-AD2는 전혀 남지않았으며 h679-Fab-AD2에 묶여있지 않은 임의의 a 4 / a 2 구조들 뿐만 아니라 경 사슬들도 IMP-291 친화성 크로마토그래피에 의하여 제거될 것이다. 그 다음으로, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 환원시킨 이후에 TCEP를 제거하는 수단으로서 투석 또는 정용여과(diafiltration)를 대체하는데, 이는 공정 시간을 줄여줄 뿐만 아니라 잠재적 바이러스 제거 공정을 부가할 것이다. N-DDD2-Fab-hMN-14 및 679-Fab-AD2는 혼합되고 1 시간 동안 상온에서 5 mM TCEP로 환원되었다. 상기 용액은 075 M 황산 암모늄과 접촉되었고 이후 부틸 FF HIC 칼럼 상으로 옮겨졌다. 상기 칼럼은 0.75 M 황산 암모늄, 5 mM EDTA, PBS로 세척되어 TCEP를 제거하였다. 환원된 단백질들은 PBS를 사용하여 HIC 칼럼으로부터 용리되었으며 10 % DMSO와 접촉되었다. 하룻밤 동안 상온에서 배양한 이후에, 고도로 정제된 TF1이 IMP-291 친화성 크로마토그래피에 의하여 분리되었다(미도시). 젤 여과와 같은 정제 단계들이 따로 요구되지 않았다.
예 14. TF2 의 발생
TF1이 성공적으로 생성된 이후에, TF2(도 8)로 지정된 유사체는 또한 C-DDD2-Fab-hMN-14를 h679-Fab-AD2와 반응시켜 구해졌다. TF2는 TF1에 비하여 2 가지 잠재적인 장점들을 가지고 있다. 첫째로, C-DDD2-Fab-hMN-14는 N-DDD2-Fab-hMN-14보다 10-배 높은 레벨로 생산된다. 둘째로, C-터미널 DDD 구역들을 지닌 융합 단백질들은 N-터미널 DDD 구역들을 지닌 융합 단백질들보다 눈에 띄게 더 강력한 CEA-결합 화합력를 보인다. 이는 N-DDD 변이체들의 결합이 입체 간섭으로 인하여 감소될 수 있는 구역들의 배열에 기인한 듯하다.
TF2의 시험생산 배치(pilot batch)는 하기와 같이 >90 % 수율로 발생되었다. 단백질 L-정제된 C-DDD2-Fab-hMN-14(200 ㎎)은 h679-Fab-AD2(60 ㎎)와 1.4:1의 몰비로 혼합되었다. 총 단백질 농도는 1 mM EDTA를 함유하는 PBS에서 1.5 ㎎/㎖였다. TCEP 환원, HIC 크로마토그래피, DMSO 산화 및 IMP-291 친화성 크로마토그래피를 포함하는 후속 단계들은 TF1에 대하여 기술된 것과 동일하였다. TCEP를 첨가하기 전에, SE-HPLC는 a 2 b 형성의 어떠한 증거도 보이지 않았다(미도시). 그 대신에 a 4 (8.40 분; 215 kDa), a 2 (9.32 분; 107 kDa) 및 b(10.33 분; 50 kDa)에 해당하는 피크들이 있었다. 5 mM TCEP를 첨가하면 이원 구조에 대하여 예상되는 157 kDa 단백질과 일치하는 8.77 분(미도시)에서 새로운 피크로 실증되듯이 a 2 b 복합체의 형성이 급속하게 생성하였다. TF2는 IMP-291 친화성 크로마토그래피에 의하여 거의 균질성을 가질 때까지 정제되었다(미도시). IMP-291 비결합율(unbound fraction)을 SE-HPLC 분석하면 생성물로부터 a 4 , a 2 및 자유 카파 사슬들이 제거되는 것을 보여준다.
비환원 SDS-PAGE 분석으로 IgG의 상대적 이동도(mobility)에 가까운 상대적 이동도를 지닌 대형 공유 구조로서 존재한다는 것을 보여주었다. 추가로 밴드들이 있는 것은 이황화물 형성은 실험 조건 하에서 불완전하다는 것을 암시한다. SDS-PAGE를 환원시키면 비환원 젤에서 뚜렷한 임의의 추가적인 밴드들이 생성물-관련되어 있으며(미도시), TF2의 구성성분 폴리펩티드들을 나타내는 밴드들만이 명백하다는 것을 보여준다. 그러나, 네 개 폴리펩티드들 각각의 상대적 이동도들이 너무 밀접하게 가까워서 분리하지 못한다. MALDI-TOF 질량 분석법(미도시)은 TF2의 계산된 질량(157,319 Da)의 99.5 % 이내에 있는 156,434의 단일 피크를 드러내 보였다.
TF2의 작용기성은 TF1에 기술된 바와 같이 BIACORE에 의하여 결정되었다. TF2, C-DDD1-hMN-14 + h679-AD1(비공유 a 2 b 복합체의 대조 표본으로 사용됨) 또는 C-DDD2-hMN-14 + h679-AD2(비환원된 a 2 및 b 성분들의 대조 표본으로 사용됨)는 1 ㎍/㎖(총 단백질)로 희석되었으며 HSG로 부동화된 센서칩 상을 거치게 된다. TF2에 대한 반응은 두 개의 대조 표본들의 반응에 비해 약 2-배 정도였는데, 이는 대조 표본들에서의 h679-Fab-AD 성분이 센서칩과 결합하고 센서칩 상에 존재할 것이라는 것을 나타내고 있다. 후속적인 WI2 IgG 주사들은 TF2 만이 추가 신호 반응에서 나타나는 바와 같이 h679-Fab-AD와 밀접하게 관련되어 있다는 것을 보여주었다. 센서칩 상에 부동화된 TF2에 WI2를 결합시켜 생성한 반응 단위체들의 추가적 증가는 두 개의 완전히 기능적인 결합 사이트들에 해당하며, 그 각각은 C-DDD2-Fab-hMN-14의 하나의 소단위체에 의하여 기인한 것이다. 이는 WI2의 두 개 Fab 단편들을 결합하는 TF2의 능력에 의하여 확인되었다(미도시).
TF2의 상대적 CEA-결합 화합력은 경쟁적 ELISA에 의하여 결정되었다. 플레이트들은 hMN-14에 의하여 인식되는 CEA의 A3B3 구역을 함유하는 융합 단백질로 코팅(0.5 ㎍/웰)되었다. TF1, TF2 및 hMN-14 IgG의 계열 희석은 4 벌씩 실시하였으며 HRP-접합된 hMN-14 IgG(1 nM)를 함유하는 웰들 내에서 배양되었다. 데이터는 TF2가 IgGdml 화합력과 적어도 동등하고 TF1보다 2-배 강력한 화합력을 지닌 CEA를 결합하는 것을 보인다(미도시). 이는 이전에 유사한 검사에서 C-DDD1-Fab-hMN-14가 N-DDD1-Fab-hMN-14보다 더 강하게 결합되어 있는 hMN-14 IgG보다 더 강력한 CDA-결합 화합력을 가지는 것을 보이기 때문에 놀라운 것은 아니다. 양친 IgG에 비하여 C-DDD-Fab-hMN-14의 월등히 개선된 화합력에 대한 가능한 설명은 C-DDD-Fab-hMN-14에서의 Gly/Ser 링커들이 IgG보다 더 유연한 분자들을 제공한다는 것이다. N-DDD 변이체들이 유연한 펩티드 링커들을 소유한다고 하더라도, CEA 결합 사이트들은 서로서로 밀접하게 위치되고 DDD 이량체에 인접하는데, 이는 화합력이 감소되었다는 것이다.
예 15. TF1 및 TF2 의 혈청 안정도
TF1 및 TF2는 혈액 및 조직들에서 광범위한 희석이 발생하는 생체 내에서 사용될 수 있는 안정적으로 묶여진 구조들이 되도록 설계되었다. 인간 혈청에서의 TF2의 안정도는 BIACORE를 이용하여 평가되었다. TF2는 4 명의 기증자들로부터 혼주된 신선한 인간 혈청 내에서 0.1 ㎎/㎖로 희석되었으며, 7일 동안 5 % CO2 하에서 37 ℃로 배양되었다. 매일 표본들은 1:25로 희석되었으며 이후 IMP-239 HSG 센서칩 을 사용한 BIACORE에 의하여 분석되었다. WI2 IgG의 주사를 사용하여 손상되지 않고 완전 활성인 TF2의 양을 정량화하였다. 혈청 표본들은 스탁으로부터 직접 희석된 대조 표본들과 비교되었다. TF2는 7 일이 지난 후 그 이중특이성 결합 활성의 98 %를 보유하면서 혈청에서 고도로 안정하다(미도시). 유사한 결과들이 인간 또는 쥐 혈청 내에서의 TF1에 대하여 구해졌다(미도시).
예 16. 종양을 가지고 있는 쥐들에서의 TF2 의 생물학적 분포( biodistribution )
생물학적 분포 연구들은 s.c. 인간 결직장 선암종 이종이식편들(LS 174T)을 가지고 있는 암 무흉선(athymic) 누드 쥐들 내에서의 TF2에 대하여 실시되었다. 충분한 세포들은 자라서 50 마리의 쥐 s.c.를 쥐 한 마리당 1x107 세포들로 주사할 때까지 조직 배양액에서 증식되었다. 1 주일 후에, 종양들은 측정되었고 쥐들은 시점당 5 마리의 쥐들의 군들로 지정되었다. 본 연구를 시작할 때에 평균 종양 크기는 0.141±0.044 ㎤였다. 모든 쥐들에게 125I-TF2 40 ㎍(250 pmoles, 2 μCi)이 주사되었다. 이후 이들을 죽여 주사후 0.5, 2, 4, 16, 24, 48 및 72 시간에 부검하였다. 총 35 마리의 쥐들이 본 연구에 사용되었다. 종양뿐만 아니라 다양한 조직들이 제거되었으며 γ-카운터 내에 두어, 각 시점에서 조직 내의 그램당 퍼센트-주사된 투여량(%/ID/g)을 측정하였다.
125I-TF2의 방사성요오드화로 1.48 mCi/㎎의 특이적 활성을 지닌 2.7 % 비결합 동위원소가 발생하였다. 이후 표지된 표본은 SE-HPLC만을 거쳤으며 이후 CEA의 20-배 몰 과량과 혼합하였다. 10.1 분의 체류 시간을 지닌 TF2의 약 83 %가 용리되 었다. 상기 표지된 TF2 내에서 9 %의 응집된 물질(RT=9.03 분) 및 8 % 저 분자량 물질(RT=14.37 분)이 있었다. CEA와 혼합되는 경우에, 표지된 TF2의 95 %가 고 분자량 종으로으로 이동하였다(RT=7.25 분). 이러한 결과들은 표지된 제제는 종양을 지니고 있는 쥐들에의 투여에 수용가능하다는 것을 나타내었다.
표 1은 종양들 및 다양한 조직들의 계산된 %ID/g 수치들을 제시한다. 피크 종양 섭취가 주사 후 4 시간이 되는 때에 발생하였다(10.3 ± 2.1 %ID/g). 주사 후 16 내지 24 시간 사이에, 종양 내에서의 TF2의 양은 상당한 차이는 없었는데(5.3 ± 1.1 %ID/g 및 5.37 ± 0.7 %), 이는 펩티드가 이러한 두 개의 시점들 사이에서 종양 표적하기에 영향을 주지 않고 혈액 수치들에 의존하여, 임의의 시간에 투여될 수 있다는 것을 나타내고 있다. 정상적인 조직들로부터 TF2의 섭취 및 제거는 TF1에 대하여 이전에 관찰되었던 것과 아주 유사하였다. TF1 및 TF2 양쪽 모두는 RES 시스템(비장 및 간)을 통한 제거를 선호하는 것 같았다.
종양을 가지고 있는 쥐들 내에서 TF2에 대한 혈액 PK도 측정되어 이상(biphasic) 제거를 보인 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 WinNonlin Nonlinear Estimation Program(v. 4.1)에서 제공된 2-구역 분석을 이용하여 분석되었으며 측정된 파라미터들은 표 2에 나타나있다.
예 17. 종양을 지닌 쥐들에서의 TF2 로 사전표적하기
사전표적 연구는 s.c. 인간 결직장 선암종 이종이식편들(LS 174T)을 가지고 있는 암 무흉선 누드 쥐들 내에서의 TF2를 사용하여 실시되었다. 충분한 세포들은 자라서 55 마리의 쥐 s.c.를 쥐 한 마리당 1x107 세포들로 주사할 때까지 조직 배양액에서 증식되었다. 1 주일 후에, 종양들은 측정되었고 쥐들은 시점당 5 마리의 쥐들의 군들로 지정되었다. 본 연구를 시작할 때에 평균 종양 크기는 0.105±0.068 ㎤였다. 20 마리의 쥐들에게 125I-TF2 80 ㎍(500 pmoles, 2 μCi)이 주사되었으며 16 시간 이후에 99 mTc-IMP-245(40 μCi, 92 ng, 50 pmoles)이 투여되었다. 또한, 24 시간 시점 군들의 3 마리의 쥐들은 주사 후 1, 4 및 24 시간에 γ-카메라 상에서 영상화되었다. 다른 3 마리의 쥐들이 대조로서 99 mTc-IMP-245(사전표적 없음)만 받았으며, 24 시간 영상화 기간 이후 부검되기 전에 주사 후 1, 4 및 24 시간에 영상화되었다. 종양뿐만 아니라 다양한 조직들이 제거되었으며 γ-카운터 내에 두어, 각 시점에서 조직 내의 %/ID/g을 측정하였다.
125I-TF2 및 125I-TF2로 사전표적된 99 mTc-IMP-245에 대하여 측정된 %ID/g 수치들이 표 3 및 4에 각각 요약되어 있다. TF2 레벨들은 펩티드의 주사 이후에 최초 4 시간(또는 TF2 투여 이후 20 시간)에 걸쳐서 상대적으로 변하지 않은 채로 남아 있었으며, 펩티드 주사 후 0.5 시간(TF2 투여 후 16.5 시간)에서 6.7 ± 1.6 %ID/g 내지 4 시간 시점(TF2 주사 후 20 시간)에서 6.5 ± 1.5 %ID/g에 이르렀다. TF2로 사전표적된 IMP-245의 종양 섭취 수치들(%ID/g)은 펩티드 주사 후 0.5, 1, 4 및 24 시간에 22 ± 3 %, 30 ± 14 %, 25 ± 4 % 및 16 ± 3 %였다.
정상적인 조직들로 환산하면, 지금까지 개발된 다른 사전표적 작용제들로 구 해진 결과들과 비교하여 TF2로 사전표적된 쥐들 내에서 시험된 각각의 시점에서 간, 폐들 및 혈액 내에서는 펩티드가 상당히 감소 되었다(Rossi, et al. Clin Cancer Res. 2005; 11(19 Suppl): 7122s-7129s). 이러한 데이터는 TF2가 이후에 투여되는 펩티드를 결합할 수 있는 임의의 잔류 단편들을 남겨 놓지 않으면서 정상적인 기관들을 통하여 효율적으로 제거되는 것을 나타내고 있다.
정상적인 조직들 내에서 더 낮은 레벨들과 결합되는 높은 종양 섭취는 뛰어난 종양:비종양(T/NT) 비율들을 생성시켜(표 5), di-HSG-계 작동체들을 CEA-생성 종양들로 국소화시키는 적당한 사전표적 작용제로서 TF2를 유효화시켰다.
예 18. 글루타티온 산화환원 시스템을 사용한 TF2 의 발생
상기 예 13 및 14에 개시된 방법들에 대한 대안적 실시예로서, TF1 또는 TF2와 같은 안정적으로 묶여진 구조는 안정적으로 묶여진 구조를 함께 연결하는 특이적인 이황화물 결합들을 형성하도록 글루타티온 산화환원 시스템을 사용하여 발생될 수 있다.
TF2를 발생시키는 간단하고도 효율적인 방법은 하기와 같이 실시되었다. 전체 공정은 상온에서 시행되었다. C-DDD2-Fab-hMN-14(단백질 L-정제된) 및 h679-Fab-AD2(IMP-291-정제된)는 1 mM EDTA, PBS, pH 7.4으로 대략적인 화학양론적 농도들에서 우선 혼합되었다. 환원된 글루타티온이 첨가되어 1 mM의 최종 농도가 되었다. 30 분 이후에, 산화된 글루타티온이 첨가되어 2 mM의 최종 농도가 되었다. BIACORE 분석을 하면 TF2 형성은 산화된 글루타티온의 첨가 이후 2 분에 50 % 완료되었으며 4 시간 이후에 100 % 완료되었다는 것을 보여주었다. TF2는 상기 예 14에 기술되어 있는 바와 같이 IMP-291 친화성 크로마토그래피에 의하여 거의 균질성을 가질 때까지 정제되었다.
예 19. 과립구 대식세포 집락 -자극 인자( GM - CSF )의 사이트-특이적 페질화( site -specific pegylation )
재조합 인간 GM-CSF(14 kDa)가 임상적으로 사용되어 다양한 혈액학적 질환들을 치료한다. 현재 GM-SCF 생성물들의 한계는 짧은 순환 반감기를 가지므로, 최적의 효과를 위해 매일 주사하여 환자들에게 투여되어야 한다. 단백질 치료제들의 순환 반감기들을 연장하기 위하여 이용되는 접근법은 단백질을 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 변형시켜 그 유효 크기를 증가시킨다. 그러나, PEG를 단백질들에 접합하는(페질화) 현재 알려진 모든 방법들이 최적인 것은 아니며, 사이트-특이적인 결합을 달성하기 위하여 중용한 단백질의 변형을 주로 요구한다(Doherty et al., Bioconjugate Chem. 2005, 16: 1291-1298). 그러한 변형들에서 조차도, 접합 수율들은 가변적이며 그로 인한 생성물들은 균일하지 않을 수 있다.
정량적 수율을 지닌 GM-CSF의 사이트 특이적 페질화는 하기에 요약된 본 발명(이하 Dock-and-Lock(DNL) 방법 또는 기술)을 이용하여 달성될 수 있다. DDD2 서열은 스페이서를 통하여 GM-CSF의 C-터미널로 융합되어 GM-SCF의 이량체를 생성하여, PEG-AD2를 얻기 위하여 접합된 AD2에 대한 도킹 사이트(docking site)를 만들어 낸다. 페질화된 GM-CSF의 형성은 TF2에 대하여 기술된 바와 같은 유사한 조건 하에서 GM-CSF-DDD2 및 PEG-AD2를 조합하여 이루어진다. 순환 반감기들을 연장하는 것에 더하여, 페질화된 생성물에서의 GM-CSF의 이량체 구조는 GM-CSF의 현재 단량 체 형태보다 더 강력하여야 한다는 것에 유의한다. 이러한 전략은 다른 시토카인들(재조합 인간 IL-2과 같은 시토카인), 효소들(재조합 인간 아르기나제 같은 효소) 또는 생물학적으로 활성인 펩티드들(혈소판형성소 수용체의 펩티드 길항물질과 같은 펩티드, Cwirta et al., Science 1997, 276: 1696-1699) 또는 치료 효능을 향상시키기 위하여 더 오랜 순환 반감기들에 대한 요구를 가지는 펩티드 유사체들에 적용될 수 있다.
예 20. DNL 기술에 의하여 가능한 신규한 면역약물들
중요한 세포독성 약물의 접합을 가능하게 할 B 성분으로서의 융합 단백질은 A 성분으로서 생성되는 표적 단백질에 결합되기 위하여 생성되고 사용될 수 있으며, 하기에 요약된 신규한 유형의 면역약물이 생성되게 된다. 우선, 양호하게 발현된 면역글로불린 인간 경 사슬은 그것의 C-터미널에서 AD2 서열에 융합되는 골격(scaffold) 또는 담체 단백질로서 선택된다. 경 사슬 이량체의 형성을 방지하기 위하여, 터미널 시스테인(Fd 사슬과 이황화물 결합을 형성)은 세린으로 대체된다. 또한, 적어도 하나의 N-글리코실화 사이트(트리펩티드 서열 N-X-T)는 경 사슬 속으로 조작되어 고수율의 재조합으로 생성되며, 균질화로 정제되며 예를 들어, 안트라사이클린을 아미노-덱스트란에 접합하기 위하여 Shih et al이 기술한 바와 같은 적절한 화학들을 통한 약물 접합을 위한 기질로서 사용될 수 있는 올리고당류의 첨가를 가능하게 한다(Cancer Res. 1991; 51:4192-4198). 그러한 약물 함유 B-성분들은 표적 및 내부화 기능들을 소유하는 결합 구조에 연결된 DDD2를 함유하는 다양한 A 성분들과 조합될 수 있다. 또한, AD2로 유도화된 약물-함유 아미노-덱스트란은 적 당한 A 성분과 조합되어 표적 특이적인 약물 요법을 가능하게 한다. 다른 양호하게 발현된 재조합 분자들은 약물 접합을 위한 골격 또는 담체 단배질들로서 선택될 수도 있다.
예 21. 병원체들을 죽이기 위하여 호중구들에 표적하기
인플루엔자 A 바이러스, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 대장균을 포함하는 다양한 병원체들에 의하여 유발되는 질병들을 치료하는 데 잠재적으로 유효한 광역 스펙트럼 항감염제가 재조합 인간 계면활성 단백질 단편 D(rfhSP-D) 및 항-CD89 항체의 Fb를 포함하는 화학적 접합체로서 최근에 보고되었다(Tacken et al., J. Immunol. 2004, 172: 4934-4940). DNL 기술은 하기와 같이 병원체들을 죽이기 위하여 호중구들에 표적할 안정적으로 묶여진 복합체들을 생성하는 데 이용될 수 있다. α-나선 코일형 코일 목 구역(α-helical coiled coil neck domain) 및 C-터미널 탄수화물 인식 구역들(CRDs)을 포함하는 hsP-D의 절단된 단편은 CRD들을 통하여 병원체에 다가적으로 결합하는 A 구조를 발생시키는 DDD2에 대한 N-터미널에서 융합된다. 호중구들 상에 FcR들에 대한 표적을 제공하기 위하여 A 구조는 항-CD89 Fab 및 AD2의 융합 단백질로 구성된 B 성분에 연결되어, hSP-D의 두 개 CRD들 및 항-CD89의 하나의 Fab로 구성된 안정한 복합체가 생성하게 된다. 유사한 항-감염제들은 hSP-D를 인간 계면활성제 단백질 A(hSP-A)로 CD3 및 CD64를 그와 같은 다른 항체들로 치환하여 제제될 수 있다.
예 22. PKA 및 AKAP 들로부터 유래되지 않은 단백질-단백질 상호작용 구역들을 사용하여 발생되는 다가의 다중특이성 구조들
두 가지 기본적인 전략들이 계획된다. 제 1 전략은 DDD 및 AD의 역할들을 대체하는 데 적당할 수 있는 다른 자연발생적 단백질-단백질 상호작용 구역들의 검색과 평가에 의존한다. 예를 들어, HNF-1α의 N-터미널 이량체화 구역은 DDD를 대체할 수 있으며 HFN-1에 대한 이량체화 보조인자(DcoH)는 AD를 대체할 수 있다. 제 2 전략은 하기에 요약되어 있다.
인간 p53은 불연속적인 기능 구역들로 구성된 모듈형 단백질이다. 사량체화 구역이라 칭하는 인간 p53(p53tet)의 C-터미널 잔기들 325 내지 355(계획 I)은 사실상 두 개의 이량체들 사이에 약한 친화도(Kd ~2 uM)를 지닌 이량체들의 이량체인 용액 내의 사량체를 동시에 형성한다. 그러나, 각각의 이량체 내에서의 두 개의 단량체들은 10-15 M보다 더 낮은 것으로 보고된 Kd로 강하게 화합된다(Brokx et al., J. Biol. Chem. 2003; 278: 2327-2332). 그러므로 p53tet를 함유하는 융합 단백질들은 PKA의 인간 RIIα의 DDD 서열을 함유하는 융합 단백질들로서, 아주 단단히 결합된 이량체들을 형성하는 것으로 기대된다. 제 2 구조를 p53tet의 이량체에 결찰시키기 위하여, 1 uM이하의 Kd를 가지고 15 내지 50 잔기들을 함유하는 p53tet에 대한 결합 서열들은 효모 2-잡종(yeast 2-hybrid system) 시스템 또는 적당한 파지 표시 라이브러리들을 사용하여 선택된다. 가장 높은 친화도(즉, Kd에 대한 가장 낮은 수치)를 지닌 펩티드는 필요하다면 시스테인과 유도화되며 p53tet의 이량체에 안정적으로 묶여질 수 있는 중요한 단백질에 융합된다.
계획 I
GEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQA (서열 번호:28)
육가의( hexavalent ) IgG -계 DNL 구조들( HIDS )의 생성 및 사용
예 23. 육량체 구조체들
a2b 복합체들의 형성을 위하여 상기에 기술된 DNL 기술이 적용되어 육가의 IgG-계 DNL 구조들(HIDS)를 발생시켰다. 재조합 융합 단백질들로서 생성되었던 모듈들의 두 유형들은 다양한 HIDS를 발생시키기 위하여 조합되었다. Fab-DDD2 모듈들은 Tri-Fab 구조들을 발생시키는데 사용하기 위해 기술되었다(Rossi et al . Proc Natl Acad Sd USA.2006; 103(18): 6841-6, 상기 예들 참조). 상기 Fab-DDD2 모듈들은 AD2-함유 모듈들과 결합하는 안정한 동형이량체들을 형성한다. HIDS를 발생시키기 위하여, 두 유형의 IgG-AD2 모듈들이 발생되어 Fab-DDD2 모듈들과 짝을 이룬다: C-H-AD2-IgG 및 N-L-AD2-IgG.
C-H-AD2-IgG 모듈들은 9 아미노산 잔기 펩티드 링커를 통하여 IgG의 중(H) 사슬의 카로복실 터미널(C)에 융합된 AD2 펩티드를 가진다(도 9A). 링커 펩티드(GSGGGGSGG, 서열 번호: 29) 이후에 AD2 펩티드(CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC, 서열 번호: 4)를 거치는 DNA 코딩 서열들은 표준 재조합 DNA 방법론들에 의하여 CH3(중 사슬 불변 구역 3A) 코딩 서열의 3' 말단에 결합되어, 인접한 공개된 해독 구조(reading frame)가 발생한다. 중 사슬-AD2 폴리펩티드는 경 사슬 폴리펩티드로 공동 발현되는 경우에, 2 개의 Fab-DDD2 이량체들을 결합할 수 있는 두 개의 AD2 펩티드들을 소유하는 IgG 분자가 형성된다(도 9B). C-H-AD2-IgG 모듈은 임의의 Fab-DDD2 모듈과 조합되어 Fc 단편 하나와 Fab 단편들 여섯 개로 구성된 광범위한 육가의 구조들을 발생시킬 수 있다. 상기 C-H-AD2-IgG 모듈 및 Fab-DDD2 모듈이 동일한 양친 모노클론성 항체(MAb)로부터 유래된다면, 그 결과로 생긴 HIDS는 동일한 항원에 대하여 6 개의 결합 팔들을 지닌 단일특이성이다. 그 대신 상기 모듈들이 두 개의 상이한 MAb들로부터 유래된다면, 그 결과로 생긴 HIDS는 C-H-AD2-IgG 모듈의 특이성에 대한 두 개의 결합 팔들과 Fab-DDD2 모듈의 특이성에 대한 4 개의 결합 팔들을 지닌 이중특이성이다.
N-L-AD2-IgG는 AD2 펩티드가 13 아미노산 잔기 펩티드 링커를 통하여 IgG의 경(L) 사슬의 아미노 터미널(N)로 융합되는 IgG-AD2 모듈의 다른 유형이다(도 12A). L 사슬은 카파(Κ) 또는 람다(λ) 중 어느 하나일 수 있으며, 또한 텍스트 또는 도면들에서 동일한 의미를 지닌 Κ로서 제시될 수 있다. AD2 펩티드(CGQIEYLAKQIVDN AIQQ AGC, 서열 번호:4) 이후에 링커 펩티드(GGGGSGGGSGGG, 서열 번호:30)를 거치는 DNA 코딩 서열들은 L 사슬(VL)의 가변 구역에 대한 코딩 서열의 5' 말단에 연결되어, 인접한 공개된 해독 구조가 발생한다. AD2-카파 사슬 폴리펩티드는 중 사슬 폴리펩티드로 공동 발현되는 경우에, 두 개의 Fab-DDD2 이량체들을 결합할 수 있는 두 개의 AD2 펩티드들(도 12B)을 가지는 IgG 분자가 형성된다. N-L-AD2-IgG 모듈은 임의의 Fab-DDD2 모듈과 조합되어, 도 13에 보는 바와 같이 정렬된 하나의 Fc 단편과 여섯 개의 Fab 단편들로 구성된 다양한 육가 구조들을 발생시킬 수 있다.
예 24. C-H- AD2 - IgG - pdHL2 발현 벡터들의 발생
pdHL2 포유류 발현 벡터는 많은 재조합 IgG들의 발현을 매개하는 데 사용되 었다. 플라스미드 셔틀은 임의의 IgG-pdHL2를 C-H-AD2-IgG-pdHL2로 변환을 용이하게 하기 위하여 생성되었다. Fc(CH2 및 CH3 구역들)에 대한 유전자는 pdHL2 벡터를 주형으로서 그리고 Fc BgIII 좌측 및 Fc Bam - EcoRI 우측 올리고뉴클레오티드들을 프라이머들로서 사용하여 증폭되었다.
Fc BgIII 좌측
5'-AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG-3' (서열 번호:31)
Fc Bam - EcoRI 우측
5'-GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3' (서열 번호:32)
앰플라이머는 pGemT PCR 클로닝 벡터 내에서 클로닝되었다. 셔틀 벡터 Fc-AD2-pdHL2(도 14A)를 발생시키기 위하여, Fc 인서트 단편은 XbaI 및 BamHI 제한 효소들을 사용하여 pGemT로부터 절단되며 XbaI 및 BamHI를 사용한 h679-Fab-AD2-pdHL2를 소화시켜 제제된 AD2-pdHL2과 결찰되었다.
임의의 IgG-pdHL2 발현 벡터(도 14B)를 C-H-AD2-IgG-pdHL2로 변환시키기 위하여, 861 bp BsrGI/NdeI 제한 단편은 전자로부터 절단되며 Fc-AD2-pdHL2 벡터로부터 절단된 BsrGI/NdeI 제한 단편으로 대체된다. BsrGI은 CH3 구역을 잘라내며 NdeI는 발현 카세트의 하류(downstream)(3')을 잘라낸다.
예 25. C-H- AD2 - hLL2 IgG 의 생성
에프라투주맵 또는 hLL2 IgG는 인간화된 항-인간 CD22 MAb이다. C-H-AD2-hLL2 IgG에 대한 발현 벡터는 예 24에 기술된 hLL2 IgG-pdHL2로부터 발생되었으며 전기천공법에 의한 Sp2/0 골수 세포들을 형질감염시키는 데 사용되었다. 형질감염 이후에, 상기 세포들은 96-웰 플레이트들 내에서 플레이트 되었으며 형질전환 클론들은 메토트렉세이트를 함유하는 배지 내에서 선택되었다. 클론들은 hLL2-특이성 항-유전형 MAb로 코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트들을 사용한 샌드위치 ELISA 및 과산화효소-접합된 항-인간 IgG를 사용한 검출에 의한 C-H-AD2-hLL2 IgG 생산성에 대하여 스크리닝되었다. 클론들은 단백질 생성을 위하여 회전병들로 전개되었으며 C-H-AD2-hLL2 IgG는 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 사용하는 단일 단계에서의 소모된 배양 배지로부터 정제되었다. SE-HPLC 분석으로 두 개의 단백질 피크들을 분해한다(도 15). 더 느리게 용리되는 피크의 체류 시간(8.63 분)은 hLL2 IgG와 유사하다. 더 빨리 용리되는 피크의 체류 시간(7.75 분)은 ~300 kDa 단백질과 일치한다. 이 피크는 C-H-AD2-hLL2-IgG의 이황화물 연결된 이량체들을 나타낸다고 나중에 알려졌다. 이러한 이량체는 DNL 반응이 일어나는 동안에 이량체 형태로 환원된다. SDS-PAGE 분석을 하면 정제된 C-H-AD2-hLL2-IgG는 상기 모듈의 단량체 및 이황화물-연결된 이량체 형태들로 구성되어 있다는 것을 보여주었다(도 16). 이러한 두 개 형태들을 나타내는 단백질 밴드들은 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의하여 명백한 반면에, 환원 조건들 하에서 모든 형태들은 구성성분 폴리펩티드들(중 사슬-AD2 및 카파 사슬)dmf 나타내는 두 개의 밴드들로 환원되었다. 다른 오염성 밴드들은 전혀 검출되지 않았다.
예 26. C-H- AD2 - hA20 IgG 의 생성
hA20 IgG는 인간화된 항-인간 CD20 MAb이다. C-H-AD2-hA20 IgG에 대한 발현 벡터는 예 24에 기술된 hA20 IgG-pdHL2로부터 발생되었으며, 전기천공법에 의한 Sp2/0 골수 세포들을 형질감염시키는 데 사용되었다. 형질감염 이후에, 상기 세포들은 96-웰 플레이트들 내에서 플레이트 되었으며 형질전환 클론들은 메토트렉세이트를 함유하는 배지 내에서 선택되었다. 클론들은 hA20-특이성 항-유전형 MAb로 코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트들을 사용한 샌드위치 ELISA 및 과산화효소-접합된 항-인간 IgG를 사용한 검출에 의한 C-H-AD2-hA20 IgG 생산성에 대하여 스크리닝되었다. 클론들은 단백질 생성을 위하여 회전병들로 전개되었으며 C-H-AD2-hA20 IgG는 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 사용하는 단일 단계에서의 소모된 배양 배지로부터 정제되었다. SE-HPLC 및 SDS-PAGE 분석들을 하면 예 25의 C-H-AD2-hLL2 IgG에서 구해졌던 것과 아주 유사한 결과들을 내어 놓았다.
예 27. N-L- AD2 - hA20 IgG 의 생성
경 사슬 선도 펩티드(leader peptide), AD2, 13-잔기 펩티드 링커 및 hA20 Vk의 최초 4 개 잔기들(모두 프레임 내에 있음)에 대한 코딩 서열을 포함하는 197 bp DNA 듀플렉스는 하기와 같이 발생되었다. 35 염기쌍들로 중첩하는 두 개의 100량체 합성 올리고뉴클레오티드들은 Taq 중합효소를 사용한 프라이머 연장에 의하여 완전한 듀플렉스로 제작되었다.
LP - AD2 - L13 상부
CATCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGACGGCTGTGGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATC (서열 번호:33)
LP - AD2 - L13 바닥
CCGCCAGACCCGCCACCTCCGGACCCTCCGCCGCCGCAGCCGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGC CAGGTACTCGATCTGGCCACAGC (서열 번호:34)
상기 서열은 XbaI 및 PvuII 제한 사이트들을 각각 5' 및 3' 말단들에 부착시키는 PCR에 의하여 증폭되었다. 앰플라이머는 pGemT 속으로 클로닝되었다.
LP -좌측 XbaI
TCTAGACACAGGACCTCATCATGGGATGGAGCTGTA (서열 번호:35)
L13 - VK 우측 PvuII
CAGCTGGATGTCACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCC (서열 번호:36)
197 bp XbaI/Pvull 단편은 pGemT로부터 절단되었으며 XbaI 및 PvuII로 섭취하여 제제된 hA20 VK 셔틀 벡터 h2B8-Vk-pBR2로 결찰되었다. 새로운 셔틀 벡터는 AD2-K-hA20-pBR2이다. 536 bp XbaI/Bam HI 제한 단편은 AD2-K-hA20-pBR2로부터 절단되었으며 발현 벡터 N-L-AD2-hA20-IgG-pdHL2를 발생시키는 XbaI 및 Bam HI로 소화시켜 제제된 hA20-IgG-pDHL2 벡터로 결찰되었다.
N-L-AD2-hA20-IgG-pdHL2는 전기천공법에 의하여 Sp2/0 골수 세포들을 형질감염하기 위하여 사용되었다. 형질감염 이후에, 세포들은 96-웰 플레이트들 내에서 플레이트되었으며 형질전환 클론들은 메토트렉세이트를 함유하는 배지 내에서 선택되었다. 클론들은 hA20-특이성 항-유전형 MAb로 코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트들을 사용하는 샌드위치 ELISA 및 과산화효소-접합된 항-인간 IgG를 사용한 검출에 의한 N-L-AD2-hA20 IgG 생산성에 대하여 스크리닝되었다. 클론들은 단백질 생성을 위하여 회전병들로 전개되었으며 N-L-AD2-hA20 IgG는 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 사용하는 단일 단계에서의 소모된 배양 배지로부터 정제되었다.
크기 배제 HPLC를 실시하면 상기 제제에서 N-L-AD2-hA20 IgG의 대부분은 IgG와 유사한 체류 시간을 지닌 단량체 형태라는 것을 보여주었다. 각각이 전체 단백질의 약 15 %를 차지하며 이황화물 연결된 이량체 및 삼량체 형태들을 나타내는 두 개의 다른 피크들도 관찰되었다(도 17A). DNL 반응에서 사용된 바와 같이, 상기 제제를 약간 환원시키면 이량체 및 삼량체 형태들이 단량체 형태로 변환한다(도 17B). 상기 세 개 형태들에 대한 추정적인 구조들을 스케치한 것들이 표 18에 제공된다.
예28. Hex - hA20 의 발생
DNL 방법은 C-H-AD2-hA20 IgG(예 26 참조)를 hA20-Fab-DDD2와 조합하여 Hex-hA20, 단일특이성 항-CD20 HIDS를 발생시키는 데 이용되었다. Hex-hA20 구조는 여섯 개의 항-CD20 Fab 단편들 및 한 개의 Fc 단편을 함유한다(도 10).
Hex-hA20은 4 개 단계들로 제작되었다.
단계 1, 조합: (hA20-Fab-DDD2)2의 210 % 몰 당량이 C-H-AD2-hA20 IgG와 혼합되었다. 이러한 몰비는 두 개의 Fab-DDD2 이량체들이 각각의 C-H-AD2-hA20 IgG 분자와 결합하고 전자(former)를 10 % 과량으로 추가로 투입하면 결합 반응이 완료되도록 해 주기 때문에 사용되었다. C-H-AD2-hA20 IgG 및 (hA20-Fab-DDD2)2의 분자량들은 각각 168 kDa 및 107 kDa이다. 일례로, 134 ㎎의 hA20-Fab-DDD2는 100 ㎎의 C-H-AD2-hA20 IgG와 혼합되어 전자의 210 % 몰 당량을 달성할 것이다. 상기 혼합물은 1 mM EDTA를 사용하연 인산염 완충 식염수, pH7.4(PBS) 내에서 통상적으로 제조된다.
단계 2, 약한 환원: 환원된 글루타티온(GSH)이 첨가되어 1 mM의 최종 농도가 되었으며 상기 용액은 1 내지 24 시간 동안 상온(16 내지 25 ℃)에 놓여진다.
단계 3, 약한 산화: 환원된 이후에, 산화된 글루타티온(GSSH)이 반응 혼합물에 직접 첨가되어 최종 농도가 2 mM이 되었으며 상기 용액은 1 내지 24 시간 동안 상온에 놓여졌다.
단계 4, DNL 생성물의 분리: 산화 이후에, 상기 반응 혼합물은 단백질-A 친화성 크로마토그래피 칼럼 상으로 직접 옮겨 넣었다. 상기 칼럼은 PBS로 세척되고 Hex-hA20은 0.1 M 글리신, pH로 용리되었다. 과량의 hA20-Fab-DDD2가 반응에 사용되었으므로, 미접합 C-H-AD2-hA20 IgG 또는 유일한 (hA20-Fab-DDD2)2 모이어티를 함유하는 불완전한 DNL 구조들은 존재하지 않았다. 상기 미접합된 과량의 hA20-Fab-DDD2는 친화성 수지와 결합하지 않는다; 그러므로, 단백질 A-정제된 물질은 원하는 생성물만 함유한다.
구성성분 폴리펩티드들의 추론된 아미노산 서열들로부터 계산된 분자량은 386 kDa이다. 크기 배제 HPLC 분석은 375 내지 400 kDa의 단백질 구조와 일치하는 체류 시간을 지닌 단일한 단백질 피크를 보였다(도 19). 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE 분석을 하면 대형 공유 구조를 나타내는 고분자량 밴드들의 클러스터를 보여준다(도 20A, 3 레인). 환원 조건 하에서의 SDS-PAGE(도 20B, 3 레인)는 하기 세 개의 예상되는 폴리펩티드 사슬들만 존재한다는 것을 보여준다: AD2-융합된 중 사슬(HC-AD2), DDD2-융합된 Fd 사슬(Fd-DDD2) 및 카파 사슬들.
예 29. Hex - hLL2 의 발생
C-H-AD2-hLL2 IgG(예 25 참조)와 hLL2-Fab-DDD2를 조합하여 단일특이성 항-CD22 HIDS(Hex-hLL2)를 발생시키기 위하여 DNL 방법이 이용되었다. DNL 반응은 예28의 Hex-hA20에 대하여 기술된 바와 같이 실행되었다.
구성성분 폴리펩티드들의 추론된 아미노산 서열들로부터 계산된 분자량은 386 kDa이다. 크기 배제 HPLC 분석은 375 내지 400 kDa의 단백질 구조와 일치하는 체류 시간을 지닌 단일한 단백질 피크를 보였다(도 21). 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE 분석을 하면 대형 공유 구조를 나타내는 고분자량 밴드들의 클러스터를 보여준다(도 20A, 4 레인). 환원 조건 하에서의 SDS-PAGE(도 20B, 4 레인)는 하기 세 개의 예상되는 폴리펩티드 사슬들만 존재한다는 것을 보여준다: HC-AD2, Fd-DDD2 및 카파 사슬.
예 30. DNL1 및 DNL1C 의 발생
DNL1을 얻기 위하여 hA20-Fab-DDD2 또는 DNL1C를 얻기 위하여 hMN-14-DDD2 중 어느 하나를 C-H-AD2-hLL2 IgG(예 25 참조)와 조합시켜 이중특이성 HIDS를 발생하도록 DNL 방법이 이용되었다. DNL1은 CD20에 대하여 네 개의 결합 팔들과 CD22에 대하여 두 개의 결합 팔들을 가진다. hMN-14는 암배아성 항원(CEA)에 대한 인간화된 MAb이기 때문에, DNL1C는 CEA에 대하여 네 개의 결합 팔들과 CD22에 대하여 두 개의 결합 팔들을 가진다. DNL 반응들은 예 28의 Hex-hA20에 대하여 기술된 바와 같이 실행되었다.
DNL1 및 DNL1C 양쪽 모두에 대하여, 구성성분 폴리펩티드들의 추론된 아미노 산 서열들로부터 계산된 분자량들은 ~386 kDa이다. 크기 배제 HPLC 분석은 각각의 구조(도 22A의 DNL1 및 도 22B의 DNL1C)에 대하여 375 내지 400 kDa의 단백질 구조와 일치하는 체류 시간을 지닌 단일한 단백질 피크를 보였다. 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE 분석을 하면 대형 공유 구조를 나타내는 고분자량 밴드들(도 20A, 1 및 5 레인)의 클러스터를 보여준다. 환원 조건 하에서의 SDS-PAGE(도 20B, 1 및 5 레인)는 하기 세 개의 예상되는 폴리펩티드들로만 구성되어 있는 것을 보여준다: HC-AD2, Fd-DDD2 및 카파 사슬.
예 31. DNL2 및 DNL2C 의 발생
DNL2를 얻기 위하여 hLL2-Fab-DDD2 또는 DNL2C를 얻기 위하여 hMN-14-DDD2 중 어느 하나를 C-H-AD2-hA20 IgG(예 26 참조)와 조합시켜 이중특이성 HIDS를 발생하도록 DNL 방법이 이용되었다. DNL2는 CD22에 대하여 네 개의 결합 팔들과 CD20에 대하여 두 개의 결합 팔들을 가진다. DNL 반응들은 예 28의 Hex-hA20에 대하여 기술된 바와 같이 실행되었다.
DNL2 및 DNL2C 양쪽 모두에 대하여, 구성성분 폴리펩티드들의 추론된 아미노산 서열들로부터 계산된 분자량들은 ~386 kDa이다. 크기 배제 HPLC 분석은 각각의 구조(도 23)에 대하여 375 내지 400 kDa의 단백질 구조와 일치하는 체류 시간을 지닌 단일한 단백질 피크를 보였다. 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE 분석을 하면 대형 공유 구조를 나타내는 고분자량 밴드들(도 20A, 2 및 6 레인)의 클러스터를 보여준다. 환원 조건 하에서의 SDS-PAGE(도 20B, 2 및 6 레인)는 하기 세 개의 예상되는 폴리펩티드들로만 구성되어 있는 것을 보여준다: HC-AD2, Fd-DDD2 및 카파 사슬.
예 32. K- Hex - hA20 의 발생
hA20-Fab-DDD2를 N-L-AD2-hA20 IgG(예 27 참조)와 조합시켜 단일특이성 항-CD20 HIDS를 발생하도록 DNL 방법이 이용되었다. DNL 반응은 예 28의 Hex-hA20에 대하여 기술된 바와 같이 실행되었다.
구성성분 폴리펩티드들의 추론된 아미노산 서열들로부터 계산된 분자량은 386 kDa이다. 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE 분석을 하면 대형 공유 구조를 나타내는 고분자량 밴드들(도 24, 2 및 3 레인)의 클러스터를 보여준다. 환원 조건 하에서의 SDS-PAGE(도 24, 2R 및 3R 레인)는 하기 네 개의 예상되는 폴리펩티드들로만 구성되어 있는 것을 보여준다: Fd-DDD2, H-사슬, 카파 사슬 및 AD2-카파.
예33. DNL3 의 발생
이중특이성 HIDS는 hLL2-Fab-DDD2를 N-L-AD2-hA20 IgG(예 27 참조)와 조합시켜 이중특이성 HIDS가 발생되었다. DNL 반응은 예 28의 Hex-hA20에 대하여 기술된 바와 같이 실행되었다.
구성성분 폴리펩티드들의 추론된 아미노산 서열들로부터 계산된 분자량은 386 kDa이다. 크기 배제 HPLC 분석은 375 내지 400 kDa의 단백질 구조와 일치하는 체류 시간을 지닌 단일한 단백질 피크를 보였다(도 25). 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE 분석을 하면 대형 공유 구조를 나타내는 고분자량 밴드들(도 24, 1 레인)의 클러스터를 보여준다. 환원 조건 하에서의 SDS-PAGE(도 24, 1 레인)는 하기 네 개의 예상되는 폴리펩티드들로만 구성되어 있는 것을 보여준다: Fd-DDD2, H-사슬, 카파 사슬 및 AD2-카파.
예 34. HIDS 의 시험관 내 특징화
도 26 및 27에 보여지는 바와 같이, 예 28 내지 33에서 기술된 바와 같이 발생된 HIDS는 그것들의 양친 Fab/IgG들의 결합 특성을 유지한다. 경쟁적 ELISA들은 hA20 성분들의 결합 활성을 평가하기 위하여 hA20(WR2)에 대한 쥐 항-유전형 MAb 또는 hLL2 성분들의 결합 활성을 평가하기 위하여 hLL2(WN)에 대한 쥐 항-유전형 MAb 중 어느 하나를 사용한 다양한 HIDS의 결합 화합력을 조사하기 위하여 이용되었다. hA20 결합을 평가하기 위하여, ELISA 플레이트들은 hA20 IgG로 코팅되었으며 HIDS는 WR2 결합을 위하여 부동화된 IgG와 경쟁하도록 하였다. hLL2 결합을 평가하기 위하여, 플레이트들은 hLL2 IgG로 코팅되었으며 HIDS는 WN 결합을 위하여 부동화된 IgG와 경쟁하도록 하였다. 부동화된 IgG에 결합된 항-Id의 상대량은 과산화효소-접합된 항-쥐 IgG를 사용하여 검출되었다.
상대적인 CD20 결합 화합력들이 도 26A에 도시되어 있다. 두 개의 CD20 결합기들을 가지는 DNL2는 두 개의 CD20-결합 팔들을 또한 가지는 hA20 IgG에 유사한 결합 화합력을 보였다. 네 개의 CD20-결합 기들을 가지는 DNL1은 DNL2 또는 hA20 IgG보다 더 강한(~4 배) 상대적 화합력을 가졌다. 여섯 개의 CD20-결합 기들을 가지는 Hex-hA20은 hA20 IgG보다 더욱 더 강한(~10 배) 상대적 화합력을 가졌다.
도 26B에 CD22 결합에 대한 유사한 연구 결과들이 도시되어 있다. 두 개의 CD20 결합 기들을 가지는 DNL1은 두 개의 CD22-결합 팔들을 또한 가지는 hLL2 IgG에 유사한 결합 화합력을 보였다. 네 개의 CD22-결합 기들을 가지는 DNL2는 DNL1 또는 hLL2 IgG보다 더 강한(>5 배) 상대적 화합력을 가졌다. 여섯 개의 CD20-결합 기들을 가지는 Hex-hA20은 hA20 IgG보다 더욱 더 강한(~10 배) 상대적 화합력을 가졌다.
DNL2 및 DNL3 양쪽 모두가 두 개의 hA20 Fab들 및 네 개의 hLL2 Fab들을 함유하고 있기 때문에, 이들은 동일한 항-id 항체에 결합에서 유사한 강도를 보여준다(도 27).
몇몇 HIDS는 림프종 세포 계통들 상에 강력한 항-증식 활성을 가진 것으로 보여졌다. DNL1, DNL2 및 Hex-hA20은 생체 내의 다우디 버킷(Daudi Burkitt) 림프종 세포들의 세포 성장을 억제하였다(도 28). 10 nM 농도들로 세포들을 처리하면 리투시맙과 비교하여 HIDS에 대하여 실질적으로 더 효과적이었다(도 28A). 세포 계측 검사를 이용하여, DNL1 및 DNL2의 역가는 리투시맙의 역가보다 100-배 더 높았다고 측정되는 반면에, Hex-hA20은 그보다 더 강력한 것을 보였다(도 28B). 이는 투여-반응 곡선들이 다양한 HIDS의 농도들로 처리된 다우디 세포들에 대하여 발생된 MTS 증식 검사로 확인되었다(도 29). 리투시맙과 비교하여, 이중특이성 HIDS(DNL1 및 DNL2) 및 Hex-hA20은 각각 >100-배 및 >10000-배 더 강력하였다.
예 35. HIDS 의 생체 내 항-종양 활성
HIDS는 쥐들에서의 인간 버킷 림프종 모델을 사용한 생체 내 치료 성능을 가지는 것으로 보였다(도 30). DNL2 및 Hex-hA20의 저 투여량(12 ㎍)은 종양을 가지고 있는 쥐들의 생존 시간들을 배가시켰다. 더 높은 투여량(60 ㎍)으로 처리하면 장기 생존자들을 생성하였다.
예 36. 림프종 세포 계통들 상에 미치는 HIDS 및 양친 IgG 의 비교 효과들
양친 IgG(hA20 IgG) 대 HIDS(DNL1, DNL2, Hex-hA20)에 대한 투여-반응 곡선들은 MTS 증식 검사를 이용하여, 세 개의 상이한 림프종 세포 계통들에 대하여 비교되었다(도 31). 다우디 림프종 세포들에서(도 31, 상부 패널), 이중특이성 구조들 DNL1(미도시) 및 DNL2는 양친 hA20 IgG보다 >100-배 더 강력한 항-증식 화합력을 보였으며 Hex-hA20은 양친 hA20 IgG보다 >10,000-배 더 강력한 역가 활성을 보였다. Hex-hLL2 및 대조 구조들(DNL1-C 및 DNL2-C)는 본 검사에서 항-증식 활성을 거의 가지지 않았다(미도시).
라지(Raji) 림프종 세포들에서(도 31, 중간 패널), Hex-hA20은 강력한 항-증식 활성을 보였지만, DNL2는 hA20 IgG와 비교하여 최소한의 활성만을 보였다. 라모스 림프종 세포들에서(도 31, 바닥 패널), DNL2 및 Hex-hA20은 hA20 IgG와 비교하여 강력한 항-증식 활성을 보였다. 이러한 결과들은 양친 IgG들에 비교하여 HIDS의 증가된 역가는 특정한 세포 계통들에 한정되지 않지만, 오히려 적절한 표적들을 보여주는 세포들에 대한 일반적인 현상이라는 것을 나타낸다.
예 37. HIDS 및 양친 IgG 들의 효능에 미치는 교차-결합의 효과들
항-CD20 단일클론성 항체들의 교차-결합은 시험관 내에서 그들의 효능을 증진시키는 것으로 보였다. 도 32는 MTS 분석을 이용하여, 양친 IgG 대 HIDS의 상대적 효능들에 미치는 교차-결합의 효과들을 도시한다. 도 32에 보이는 바와 같이, 본 효과는 교차결합되지 않은 hA20 IgG와 비교하여, 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 가교제로 교차-결합된 hA20 IgG로 처리된 다우디 림프종 세포들 내에서 재현되었다. 그러나, 가교제가 존재하에서 DNL2 또는 Hex-hA20에서는 어떠한 항-증식 활성 이 증가하는 것도 관찰되지 않았다. 하기에 토의되는 바와 같이, HIDS의 Fc 부분은 네 개의 추가적인 Fab 기들이 그 카르복실 터미널에 묶여지는 경우에 접근이 불가해진다는 것이다.
예 38. 혈청 내에서의 안정도
도 33은 이중특이성 ELISA 검사를 이용하여 결정된 바와 같이, 인간 혈청 내에서의 DNL1 및 DNL2의 안정도를 도시한다. 단백질 구조들은 37 ℃ 및 5 % CO2에서 5일 동안 신선한 혼주된 인간 혈청들 내에서 10 ㎍/㎖로 배양되었다. 0일 표본들에 대하여, 혈청이 희석된 직후에 분취량들이 액체 질소에서 동결되었다. ELISA 플레이트들은 hA20 IgG에 대한 항-Id로 코팅되었으며 이중특이성 결합은 hLL2 IgG에 대한 항-Id로 검출되었다. DNL1 및 DNL2 양쪽 모두는 혈청 내에서 고도로 안정하였고 완전한 이중특이성 결합 활성을 유지하였다.
예 39. CDC 및 ADCC 활성
생체 내에서, 리투시맙 및 hA20과 같은 항-CD20 단일클론성 항체들은 종양 세포를 죽이기 위하여 보체-의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC) 및 신호 형질도입 유도된 성장 억제/세포자살을 이용할 수 있다. 육가의 DNL 구조들(DNL1, DNL2, Hex-hA20)은 시험관 내 검사에서 다우디 세포들을 사용한 CDC 활성에 대하여 시험되었다. 놀랍게도, CD20을 결합하는 육가의 구조들 중 어느것도 CDC 활성을 보여주지 않았다(도 34). 양친 hA20 IgG는 강력한 CDC 활성(도 34)을 보였던 반면에, 예상된 바와 같이 CD22에 대항하는 hLL2 항체는 어떠한 활성 도 보이지 않았다. DNL2 및 Hex-hA20의 효과가 부족한 것은 그들이 hA20 IgG에 대한 유사한 양성 CDC 활성을 보였던 hA20-IgG-Ad2를 포함하기 때문에 중요하였다.
DNL1은 갓 분리된 말초 혈액 단핵 세포들을 사용하여 ADCC 활성에 대하여 검사되었다(도 35). 리투시맙 및 hA20 IgG 양쪽 모두는 다우디 세포들 상에 강력한 활성을 보였던 반면에(도 35), DNL1은 검출가능한 ADCC 활성을 전혀 보이지 않았다.
이러한 데이터는 Fc 영역은 네 개의 추가적인 Fab 기들이 그것의 카르복실 터미널에 묶여지는 경우에 작동체 기능들(CDC 및 ADCC)에 대하여 접근이 불가능해 질 수 있다는 것을 암시한다. 그러므로, 육가의 DNL 구조들은 생체 내 항-종양 활성에 대하여 신호 형질도입 유도된 성장 억제/세포자살에만 의존하는 듯하다.
표 1. 하기 표 1은 LS 174T 종양을 가지고 있는 누드 쥐들에서의 125I- TF2 의 종양 섭취 및 조직 제거
% ID /g± SD
조직 0.5 시간 2 시간 4 시간 16 시간 24 시간 48 시간 72 시간
LS 174T 4.43±1.13 9.19±1.18 10.33±2.05 5.32±1.09 5.37±0.72 1.69±0.60 1.00±0.13
간 11.71±2.22 8.39±0.86 4.24±0.11 0.32±0.02 0.26±0.03 0.15±0.02 0.12±0.01
비장 22.04±6.02 24.87±8.22 15.39±1.35 0.73±0.14 0.45±0.06 0.25±0.08 0.21±0.03
신장 13.45±0.64 6.31±0.48 3.88±0.24 0.31±0.04 0.24±0.03 0.14±0.02 0.11±0.01
폐 9.02±1.38 4.99±0.62 3.91±0.08 0.33±0.06 0.23±0.04 0.09±0.00 0.06±0.01
혈액 36.17±3.49 15.51±2.43 9.06±0.93 0.68±0.07 0.43±0.05 0.16±0.04 0.11±0.03
위장 3.03±0.45 26.00±5.55 50.79±10.83 0.85±0.10 1.08±0.38 0.23±0.06 0.20±0.03
Sm . Int . 2.21±0.17 3.09±0.50 2.08±0.11 0.19±0.03 0.18±0.04 0.06±0.01 0.05±0.01
Lg . Int . 0.83±0.03 1.38±0.12 1.62±0.07 0.21±0.04 0.25±0.05 0.07±0.01 0.09±0.03
꼬리 3.83±0.16 3.64±0.95 2.79±0.38 0.19±0.02 0.18±0.05 0.09±0.02 0.06±0.01
종양 중량(g) 0.154±0.040 0.098±0.055 0.114±0.061 0.175±0.061 0.159±0.014 0.240±.150 0.468±0.220
표 2. LS 174T 종양을 가지고 있는 쥐들에서의 TF2 의 혈액 약동학
t1 /2α t1 /2β Cmax CL
(h) (h) (ng) (ng/h*ng)
0.58±0.08 3.47±0.36 31,186±995 0.51±0.02
표 3. LS 174T 종양을 가지고 있는 누드 쥐들에서의 TF2 의 종양 섭취 및 조직 제거
% ID /g± SD
시점- TF2 16.5 시간 17 시간 20 시간 40 시간
시점- IMP245 0.5 시간 1 시간 4 시간 24 시간
LS 174T 6.7±1.6 9.0±4.9 6.5±1.5 3.5±0.8
간 0.29±0.03 0.35±0.05 0.27±0.02 0.14±0.02
비장 0.49±0.12 0.53±0.10 0.46±0.08 0.22±0.06
신장 0.48±0.11 0.45±0.14 0.29±0.06 0.14±0.01
폐 0.31±0.04 0.37±0.09 0.24±0.06 0.12±0.03
혈액 0.53±0.05 0.61±0.16 0.44±0.11 0.20±0.04
위장 1.05±0.13 1.78±0.64 0.88±0.47 0.50±0.40
Sm . Int. 0.20±0.02 0.27±0.09 0.13±0.03 0.08±0.03
Lg . Int . 0.30±0.10 0.47±0.17 0.20±0.06 0.10±0.05
꼬리 0.41±0.13 0.26±0.06 0.22±0.15 0.09±0.01
종양 중량(g) 0.279±0.142 0.222±0.113 0.362±0.232 0.356±0.152
표 4. LS 174T 종양을 가지고 있는 누드 쥐들에서의 TF2 로 사전표적된 99 m Tc - IMP -245의 종양 섭취 및 조직 제거
% ID /g± SD
시점- TF2 16.5 시간 17 시간 20 시간 40 시간
시점- IMP245 0.5 시간 1 시간 4 시간 24 시간
LS 174T 21.8±3.0 30.1±13.7 25.0±3.7 16.3±2.9
간 0.64±0.07 0.41±0.06 0.23±0.06 0.14±0.02
비장 0.59±0.07 0.30±0.06 0.16±0.08 0.09±0.02
신장 8.7±1.4 5.0±0.4 2.4±0.4 1.2±0.2
폐 1.6±0.2 0.69±0.16 0.24±0.05 0.10±0.03
혈액 1.7±0.2 0.50±0.12 0.11±0.02 0.04±0.01
위장 0.37±0.09 0.87±1.28 0.09±0.08 0.16±0.09
Sm . Int. 0.79±0.04 1.08±0.22 0.25±12 0.15±0.06
Lg . Int . 0.30±0.09 0.13±0.03 1.9±2.0 0.40±0.28
꼬리 2.1±0.4 0.94±0.45 0.45±0.49 0.06±0.02
종양 중량(g) 0.279±0.142 0.222±0.113 0.362±0.232 0.356±0.152
표 5. TF2 를 사용한 사전표적된 99 m Tc -펩티드( IMP -245)에 대한 T/ NT 비율
시점- IMP245 0.5 시간 1 시간 4 시간 24 시간
간 34±4 83±10 116±32 115±21
비장 37±4 109±21 170±54 177±30
신장 3±0.4 7±2 11±2 14±3
폐 14±2 47±4 106±26 162±24
혈액 13±2 66±5 237±36 395±26
위장 63±25 169±116 456±271 135±91
Sm. Int. 28±3 35±5 114±47 125±46
Lg. Int. 75±17 241±31 22±14 57±34
꼬리 11±3 37±8 164±135 293±80
표 6. 항원-결합 소단위체들의 두 개 유형들로 구성된 복합체들의 예들
A의 표적 B의 표적 A B 적용
CEA HSG hMN-14 h679 pRAIT; 암 영상/요법
CEA In-DTPA hMN-14 h734 pRAIT; 암 영상/요법
ED-B 피브로넥틴 HSG L19 h679 pRAIT; 암 영상/요법
ED-B 피브로넥틴 In-DTPA L19 h734 pRAIT; 암 영상/요법
CD20 CD22 hA20 hLL2 림프종 및 자가면역 질병(AID) 요법들
CD22 CD20 hLL2 hA20 림프종/AID 요법들
CD19 CD20 림프종/AID 요법들
EGFR IGFR1 고형 종양 요법
VEGFR1/Flt-1 VEGFR2/KDR 차단 VEGF/PIGF 결합; 고형 종양 및 혈관형성 요법들
VEGFR3/Flt-4 VEGFR2/KDR 차단 혈관형성 및 고형 종양 요법들
CD19 CD3/TCR 림프종/AID 요법
CD19 CD16/FcγRIIIa 림프종/AID 요법
CD19 CD64/FcγRI 림프종/AID 요법
HER2/neu CD89/FcαRI 유방암 요법
HER2/neu CD16 유방암 요법
HER2/neu CD64 유방암 요법
HER2/neu CD3 유방암 요법
CD30 CD64 림프종 요법
CD33 CD64 급성 골수성 백혈병(AML) 요법
EGFR CD2 고형 종양 요법
EGFR CD64 고형 종양 요법
EGFR CD16 고형 종양 요법
EGFR CD89 고형 종양 요법
PfMSP-1 CD3 말라리아 요법
HN CD3 HN1,4c OKT3 종양 백신 증진제(enhancer)
HN CD28 HN1,4c 15E8 종양 백신 증진제
EpCAM/17-1A CD3 고형 종양 요법
IL-2R/Tac CD3 림프종/AID 요법들
CAI19-9 CD16 고형 종양 요법
MUC1 CD64 고형 종양 요법
HLA 클래스 II CD64 암 요법
GD2 CD64 신경아세포 요법
G250 CD89 신세포 암종 요법
TAG-72 CD89 고형 종양 요법
EpCAM 아데노바이러스 섬유 놉(fiber knob) 바이러스 벡터-고형 종양 요법을 재표적함
PSMA 전립선암 요법
CEA CEA-양성 암 요법
HMWMAA 흑색종 요법
G250 신세포 암종 요법
CD40 아데노바이러스 섬유 놉 면역 질병 및 암 요법들
M13 외피 단백질 알칼라인 포스파타제 바이러스 검출
GpIIb/IIIa tPA 혈전용해 증진
표 7. 일 유형의 항원-결합 소단위체 및 일 유형의 작동체 소단위체로 구성된 복합 체들의 예들
A의 표적 A B 적용
CD74 hLL1 Rap(N69Q) CD74+암/AID 요법들
CD22 hLL2 Rap(N69Q) 림프종 및 자가면역 질병(AID) 요법들
MUC1 hPAM4 Rap(N69Q) 췌장암 요법
EGP-1 hRS7 Rap(N69Q) 고형 암 요법
IGF1R hR1 Rap(N69Q) 고형 종양 요법
CD22 HLL2/RFB4 PE38 림프종 요법
CD30 PE38 림프종 요법
CD25/Tac PE38 림프종 요법
LeY
PE38 고형 종양 요법
메조텔린 PE38 고형 종양 요법
Erb-B2 PE38 유방암
EpCAM PE38 고형 종양 요법
CD25 dgA 림프종 요법
CD30 dgA 림프종 요법
CD19 dgA 림프종 요법
CD22 dgA 림프종 요법
CD3 DT390 이식편대 숙주 질병
CD25 PLC 림프종 요법
Gp240 겔로닌 흑색종 요법
X 항-X 스트랩타비딘 ELISA
X 항-X HRP ELISA
X 항-X AP ELISA
X 항-X GFP 보고자 단백질
GpIIb/IIIa 7E3 tPA 혈전용해 증진
X 항-X 시토카인 시토카인 재표적
X 항-X 성장 인자 성장 인자 재표적
X 항-X 용해성 수용체 성분 수용체 재표적
X 항-X 카복시펩티다제 G2(CPG2) 전구약물 요법
X 항-X 페니실린아미다제 전구약물 요법
X 항-X β-락타마제 전구약물 요법
X 항-X 시토신 디아미나제 전구약물 요법
X 항-X 니트로리덕타제 전구약물 요법
p97 L49 대장균 베타-갈라톡시다제 전구약물 요법
X 항-X 인간 카복시에스테라제 2 고형 암 요법
표 8. 두 개의 상이한 유형들의 작동체 소단위체들을 지닌 복합체들의 예들
A의 표적 B의 표적 A B 적용
IL-4R - IL-4 PE38 고형 종양 요법
- IL-4R PE38 IL-4 고형 종양 요법
IL-4 IL-13 sIL-4R sIL-13R 천식, 알레르기 요법
IL-13 IL-4 sIL-13R sIL-4R 천식, 알레르기 요법
VEGFR-2 - VEGF121 쉬가-유사 독소 암 요법
VEGFR-2 VEGF121 디프테리아 독소 암 요법
ED-B 피브로넥틴 ILGF-1 암 요법
표 9. 항원-결합 소단위체의 일 유형을 지닌 복합체들의 예들
A의 표적 A 적용
X 항-X X 표지를 가지는 질병을 치료 또는 검출함
CD14 항-CD14 셉틱 쇼크를 치료함
CD111/넥틴-1 항-CD111 헤르페스바이러스 감염을 치료함
폴산염 수용체 α 필로바이러스 감염을 치료함(예컨대, 에볼라 및 마르부르크 바이러스들)
Gp120 HIV-1/AIDS를 치료함
IL-6 골수, 관절염 및 다른 자가면역 질병을 치료함
IL-5 천식을 치료함
IL-8 일반 병원 감염을 치료함
CD154 루프스, 이식 거부반응, AID를 치료함
IgE 천식을 치료함
LFA-1 이식 거부반응을 치료함
β-트립타제 알레르기, 염증을 치료함
CD105/엔도글린 항-혈관형성
GpIIb/IIa 7E3 혈전용해
TNFα (휴미라(Humira)) AID 요법
TNFα (레미케이드) AID 요법
IgE (졸에어(Xolair)) 천식 요법
RSV F-단백질 시나기스(Synagis)) RSV 요법
CEA의 A1B1 hMN-15 고형 종양들의 부착/침습/전이를 억제함
CEA의 N 구역 hMN-15 고형 종양들의 부착/침습/전이를 억제함
표 10. 작동체 소단위체의 일 유형을 지닌 복합체들의 예들
A의 표적 A 적용
시토카인 수용체 시토카인 시토카인 기능을 증진함
성장 인자 수용체 성장 인자 성장 인자 기능을 증진함
막 결합 수용체 용해성 수용체 성분들 용해성 수용체 성분의 능력 및 화합력을 증진함
혈전 tPA tPA의 효능을 증진함
TPO 수용체 TPO 혈소판형성소의 효능을 증진함
EPO 수용체 EPO rHuEPO의 효능을 증진함
TNFα sTNFα-R Enbrel의 효능을 증진함
SEQUENCE LISTING <110> IBC Pharmaceuticals, Inc. Chang, Chien Hsing Goldenberg, David M. Rossi, Edmund A. <120> MULTIVALENT IMMUNOGLOBULIN-BASED BIOACTIVE ASSEMBLIES <130> 78256-345588 <140> PCT/US2006/046367 <141> 2006-12-05 <150> PCT/US2006/010762 <151> 2006-03-24 <150> US 60/751,196 <151> 2005-12-16 <150> US 60/782,332 <151> 2006-03-14 <150> US 60/864,530 <151> 2006-11-06 <150> PCT/US2006/012084 <151> 2006-03-29 <150> PCT/US2006/025499 <151> 2006-06-29 <150> US 11/389,358 <151> 2006-03-24 <150> US 11/391,584 <151> 2006-03-28 <150> US 11/478,021 <151> 2006-06-29 <160> 38 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr 1 5 10 15 Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala 20 25 30 Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala 35 40 <210> 2 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 2 Cys Gly His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly 1 5 10 15 Tyr Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe 20 25 30 Ala Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala 35 40 45 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 3 Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln 1 5 10 15 Ala <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Cys Gly Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile 1 5 10 15 Gln Gln Ala Gly Cys 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 5 gaacctcgcg gacagttaag 20 <210> 6 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 6 ggatcctccg ccgccgcagc tcttaggttt cttgtccacc ttggtgttgc tgg 53 <210> 7 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 7 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Ile Gln Ile 1 5 10 15 Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr Thr Val Glu Val Leu 20 25 30 Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala Val Glu Tyr Phe Thr 35 40 45 Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala 50 55 <210> 8 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 8 gtggcgggtc tggcggaggt ggcagccaca tccagatccc gccggggctc acggagctgc 60 tgcagggcta cacggtggag gtgctgcgac ag 92 <210> 9 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 9 gcgcgagctt ctctcaggcg ggtgaagtac tccactgcga attcgacgag gtcaggcggc 60 tgctgtcgca gcacctccac cgtgtagccc tg 92 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 10 ggatccggag gtggcgggtc tggcggaggt 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 11 cggccgtcaa gcgcgagctt ctctcaggcg 30 <210> 12 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 12 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Glu Tyr 1 5 10 15 Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln Ala 20 25 <210> 13 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 13 ggatccggag gtggcgggtc tggcggaggt ggcagccaga tcgagtacct ggccaagcag 60 atcgtggaca acgccatcca gcaggcctga cggccg 96 <210> 14 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 14 cggccgtcag gcctgctgga tggcgttgtc cacgatctgc ttggccaggt actcgatctg 60 gctgccacct ccgccagacc cgccacctcc ggatcc 96 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 15 ggatccggag gtggcgggtc tggcggaggt 30 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 16 cggccgtcag gcctgctgga tg 22 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 17 ccatgggcag ccacatccag atcccgcc 28 <210> 18 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 18 ggatccgcca cctccagatc ctccgccgcc agcgcgagct tctctcaggc gggtg 55 <210> 19 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 19 ggatccggcg gaggtggctc tgaggtccaa ctggtggaga gcgg 44 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 20 cggccgtcag cagctcttag gtttcttgtc 30 <210> 21 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 21 Lys Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln 1 5 10 15 Gln Ala Lys Gly Cys Cys Gly Lys Ala Gln Gln Ile Ala Asn Asp Val 20 25 30 Ile Gln Lys Ala Leu Tyr Glu Ile Gln Lys 35 40 <210> 22 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 22 catgtgcggc cacatccaga tcccgccggg gctcacggag ctgctgca 48 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 23 gcagctccgt gagccccggc gggatctgga tgtggccgca 40 <210> 24 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 24 gatccggagg tggcgggtct ggcggaggtt gcggccacat ccagatcccg ccggggctca 60 cggagctgct gca 73 <210> 25 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 25 gcagctccgt gagccccggc gggatctgga tgtggccgca acctccgcca gacccgccac 60 ctccg 65 <210> 26 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 26 gatccggagg tggcgggtct ggcggatgtg gccagatcga gtacctggcc aagcagatcg 60 tggacaacgc catccagcag gccggctgct gaa 93 <210> 27 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 27 ttcagcagcc ggcctgctgg atggcgttgt ccacgatctg cttggccagg tactcgatct 60 ggccacatcc gccagacccg ccacctccg 89 <210> 28 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 28 Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met 1 5 10 15 Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala 20 25 30 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptided <400> 29 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 31 agatctggcg cacctgaact cctg 24 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 32 gaattcggat cctttacccg gagacaggga gag 33 <210> 33 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 33 catcatggga tggagctgta tcatcctctt cttggtagca acagctacag gtgtccactc 60 cgacggctgt ggccagatcg agtacctggc caagcagatc 100 <210> 34 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 34 ccgccagacc cgccacctcc ggaccctccg ccgccgcagc cggcctgctg gatggcgttg 60 tccacgatct gcttggccag gtactcgatc tggccacagc 100 <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 35 tctagacaca ggacctcatc atgggatgga gctgta 36 <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 36 cagctggatg tcacctccgc cagacccgcc acctcc 36 <210> 37 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 37 Lys Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln 1 5 10 15 Gln Ala Lys Gly Cys 20 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 38 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Cys Gly 1 5 10

Claims (34)

  1. 두 개의 AD2(서열 번호: 4) 모이어티들에 부착된 IgG 항체, 및 DDD2(서열번호 : 2) 모이어티에 부착된 각 단편을 갖는 동일하거나 상이한 IgG의 네 개의 항체 단편을 포함하며; 상기 AD2 모이어티들은 상기 DDD2 모이어티들에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 육량체의(hexameric) 안정적으로 묶여진 구조물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 AD2 모이어티들은 이황화물 결합들(disulfide bonds)에 의하여 DDD2 모이어티들에 공유적으로 부착되는 것을 특징으로 하는 구조물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 구조는 6 개의 Fab 단편들 및 1 개의 Fc 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 구조물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 구조는 하나의 IgG 항체 및 4개의 Fv 항체 단편들을 포함하는 구조물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 단편들의 각각은 동일한 항원 에피토프와 결합하는 것을 특징으로 하는 구조물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 단편들 중 2 개는 제 1 항원 에피토프와 결합하며 상기 항체 단편들 중 4 개는 제 2 항원 에피토프와 결합하는 것을 특징으로 하는 구조물.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 단편은 인간, 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 구조물.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 단편들은 hMN-14, L19, hA20, hLL2, hL243, hCC49, 7E3, hLL1, hPAM4, hRS7, hR1, L49, 항-CD14, 항-CD111, 아달리무맵(Adalimumab), 인플리시맵(infliximab), 오말리주맵(omalizumab), 팔리비주맵(palivizumab) 및 hMN-15의 Fab 단편들로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 구조물.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 IgG 항체 또는 항체 단편들은, 탄산 무수화효소 IX(carbonic anhydrase IX), 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein), A3, A33 항체에 특이적인 항원, Ba 733, BrE3-항원, CA125, CDl, CD1a, CD3, CD5, CDl5, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD38, CD45, CD74, CD79a, CD80, CD138, 결장-특이적 항원-p(CSAp), CEA(CEACAM5), CEACAM6, CSAp, EGFR, EGP-1, EGP-2, Ep-CAM, FIt-1, Flt-3, 폴산염 수용체(folate receptor), HLA-DR, 인간 융모성 성선자극호르몬(HCG) 및 그 소단위체들, HER2/neu, 저산소증 유도 인자(HIF-I), Ia, IL-2, IL-6, IL-8, 인슐린 성장 인자-1(IGF-1), KC4-항원, KS-1-항원, KSl-4, Le-Y, 대식세포 억제 인자(MIF), MAGE, MUCl, MUC2, MUC3, MUC4, NCA66, NCA95, NCA90, PAM-4 항체에 특이적인 항원, 태반 성장 인자, p53, 전립선 산성 포스파타제(prostatic acid phosphatase), PSA, PSMA, RS5, SlOO, TAC, TAG-72, 테나신(tenascin), TRAIL 수용체들, Tn 항원, 톰슨-프리덴라이히(Thomson-Friedenreich) 항원들, 종양 괴사 항원들, VEGF, ED-B 피브로넥틴(fibronectin), 17-1A-항원, 혈관형성 표지(angiogenesis marker), 암유전자 표지(oncogene marker) 또는 암유전자 생성물로 구성된 군으로부터 선택된 항원과 결합하는 것을 특징으로 하는 구조물.
  10. 청구항 1에 있어서,
    공유 또는 비공유 결합 중 어느 하나에 의하여 상기 구조에 접합된 하나 이상의 작동체들(effectors) 또는 담체들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 구조물.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 작동체는 진단제, 치료제, 화학 치료제(chemotherapeutic agent), 방사성동위원소, 조영제(imaging agent), 항-혈관형성제, 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 약물, 전구약물, 효소, 결합 분자, 세포 표면 수용체에 대한 리간드, 킬레이트제(chelator), 면역조절물질, 올리고뉴클레오티드, 호르몬, 광검출성 표지(photodetectable label), 염료, 펩티드, 독소, 조형제(contrast agent), 상자성 표지(paramagnetic label), 초음파 표지(ultrasound label), 전-세포사멸의 제제(pro-apoptotic agent), 리포솜, 나노파티클 또는 그 조합인 것을 특징으로 하는 구조물.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 IgG 항체 및 항체 단편들은 표적 분자들, 복합체들(composites), 응집체들, 세포들, 항원들 또는 조직들에 대한 결합 친화도들을 가지는 것을 특징으로 하는 구조물.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 IgG 항체는 표적 분자, 복합체, 응집체, 세포, 항원 또는 조직에 대한 결합 친화도를 가지며, 적어도 하나의 항체 단편은 합텐(hapten)에 대한 결합 사이트를 가지는 것을 특징으로 하는 구조물.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 IgG 항체는 세포 표면 수용체, 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase), 고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase), β-갈라톡시다제, tpA, 스트렙토키나제(streptokinase), 히루딘, 유로키나제(urokinase), CAl9-9, CEA, CEACAM6, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD74, ED-B 피브로넥틴, EGFR, GD2, G250-항원, HER2/neu, hTR, HLA 클래스 II, HMW/MAA, HN/NDV, IGFlR, IL-2R/Tac, IL-17, MUCl, PSMA, M13 외피 단백질, GpIIb/IIIa, CD74, EGP-I, CD25/Tac, LeY, 메소테린(mesothelin), Erb-B2, Erb-B3, EpCAM, GP240, GPIIb/IIIa, p97, CD3, IL-4R, IL-4, IL-13, VEGFR-2, CD14, CD111/넥틴-1, 폴산염 수용체 α, gp120, IL-6, Il-5, IL-8, CD154, IgE, LFA-I, β-트립타제(tryptase), CD105/엔도글린(endoglin), TNFα, RSV F-단백질, CEA의 AlBl, CEA의 N 구역(domain), PfMSP-I, TAG-72, MUCl, MUC2, MUC3, MUC4, VEFGRl/Flt-1, VEGFR2/KDR 또는 VEGRF3/Flt-4에 대한 결합 친화도를 가지는 것을 특징으로 하는 구조물.
  15. 청구항 14에 있어서,
    적어도 하나의 항체 단편은 IL-17, 히스타민-숙시닐-글리신(HSG), 인듐-DTPA, CD22, CD20, EGFR, IGFlR, VEFGRl/Flt-1, VEGFR2/KDR, VEGRF3/Flt-4, CD3, CDl6, CD64, CD89, CD2, 아데노바이러스 섬유 놉(fiber knob), M13 외피 단백질, GpIIb/IIIa, 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase), 고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase), β-갈락토시다제, tpA, 스트렙토키나제, 히루딘 또는 유로키나제에 대한 결합 친화도를 가지는 것을 특징으로 하는 구조물.
  16. 청구항 13에 있어서,
    상기 IgG 항체는 CEA, ED-B 피브로넥틴, CD20, CD22, CDl9, EGFR, IGFlR, VEFGRl/Flt-1, VEGFR2/KDR, VEGRF3/Flt-4, HER2/neu, CD30, CD33, PfMSP-1, HN/NDV, EpCAM/17-lA, hTR, IL-2R/Tac, CAl9-9, MUCl, HLA 클래스 II, GD2, G250, TAG-72, PSMA, CEACAM6, HMWMAA, CD40, Ml3 외피 단백질 및 GPIIb/IIIa로 구성된 군으로부터 선택된 세포 표면 항원에 대한 결합 친화도를 가지는 것을 특징으로 하며, 적어도 하나의 항체 단편은 히스타민-숙시닐-글리신(HSG) 및 인듐-DTPA으로 구성된 군으로부터 선택된 합텐에 대한 결합 친화도 또는 CD22, CD20, EGFR, IGFlR, VEFGRl/FIt-1, VEGFR2/KDR, VEGRF3/Flt-4, CD3, CD16, CD64, CD89, CD2 및 아데노바이러스 섬유 놉으로 구성된 군으로부터 선택된 세포 표면 항원에 대한 결합 친화도를 가지는 것을 특징으로 하는 구조물.
  17. 청구항 1에 있어서,
    상기 IgG 항체는 M13 외피 단백질 및 GpIIb/IIIa로 구성된 군으로부터 선택된 세포 표면 항원에 대한 결합 친화도 또는 알칼리성 포스파타제, 고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다제, tpA, 스트렙토키나제, 히루딘 및 유로키나제로 구성된 군으로부터 선택된 생체분자에 대한 결합 친화도를 가지는 것을 특징으로 하며, 적어도 하나의 항체 단편은 Ml3 외피 단백질 및 GpIIb/IIIa로 구성된 군으로부터 선택된 세포 표면 항원에 대한 결합 친화도 또는 알칼리성 포스파타제, 고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다제, tpA, 스트렙토키나제, 히루딘 및 유로키나제로 구성된 군으로부터 선택된 생체분자에 대한 결합 친화도를 가지는 것을 특징으로 하는 구조물.
  18. 청구항 1에 있어서,
    상기 IgG 항체 및 항체 단편들은 CDl4, CD111/넥틴-1, 폴산염 수용체 α, gpl20, IL-6, IL-5, IL-8, CD154, IgE, LFA-1, β-트립타제, CD105/엔도글린, GpIIb/IIIa, TNFα, RSV F-단백질, CEA의 AlBl 및 CEA의 N-구역으로 구성된 군으로부터 선택된 항원과 동일한 항원과 결합하는 것을 특징으로 하는 구조물.
  19. 청구항 5에 있어서,
    상기 IgG 항체 및 항체 단편들은 CD20/CD22; CD20/CD74; CD20/HLA-DR; CD22/CD74; CD22/HLA-DR; CD74/HLA-DR; CD74/CEA 또는 HLA-DR/CEA의 항원 조합들과 결합하는 것을 특징으로 하는 구조물.
  20. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 따른 육량체의 안정적으로 묶여진 구조물을 포함하는 암, 자가면역 질병, 퇴행성신경 질환(neurodegerative disease), 알츠하이머병, 대사 질환(metabolic disease), 심혈관 질병(cardiovascular disease), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 기관 이식 거부반응, 진균, 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 의하여 유발되는 질환 또는 증상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병 또는 질환의 치료용 조성물.
  21. 삭제
  22. 청구항 20에 있어서,
    상기 질병 또는 질환은 암이며, 상기 IgG 항체 또는 상기 항체 단편들 중 적어도 하나는 탄산 무수화효소 IX, 알파-태아단백질, A3, A33 항체에 특이적인 항원, Ba 733, BrE3-항원, CA125, CDl, CD1a, CD3, CD5, CDl5, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD38, CD45, CD74, CD79a, CD80, CD138, 결장-특이적 항원-p(CSAp), CEA(CEACAM5), CEACAM6, EGFR, EGP-1, EGP-2, Ep-CAM, FIt-1, Flt-3, 폴산염 수용체, G250 항원, HLA-DR, 인간 융모성 성선자극호르몬(HCG) 및 그 소단위체들, HER2/neu, 저산소증 유도 인자(HIF-I), Ia, IL-2, IL-6, IL-8, 인슐린 성장 인자-1(IGF-1), KC4-항원, KS-1-항원, KSl-4, Le-Y, 대식세포 억제 인자(MIF), MAGE, MUCl, MUC2, MUC3, MUC4, NCA66, NCA95, NCA90, PAM-4 항체에 특이적인 항원, 태반 성장 인자, p53, 전립선 산성 포스파타제, PSA, PSMA, RS5, SlOO, TAC, TAG-72, 테나신, TRAIL 수용체들, Tn 항원, 톰슨-프리덴라이히 항원들, 종양 괴사 항원들, VEGF, ED-B 피브로넥틴, 17-1A-항원, 혈관형성 표지, 암유전자 표지 또는 암유전자 생성물로 구성된 군으로부터 선택된 종양-관련 항원에 대한 결합 친화도를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 청구항 22에 있어서,
    상기 항체 단편들 중 적어도 하나는 합텐에 대한 결합 친화도를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 합텐을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 청구항 26에 있어서,
    상기 합텐은 항-혈관형성제, 화학 치료제, 시토카인, 약물, 전구약물, 톡신, 효소, 올리고뉴클레오티드, 방사성동위원소, 면역조절물질, 항생제, 항-바이어스제, 항-진균제(anti-fungal agent), 호르몬, 결합 분자, 지질, 중합체, 미셀(micelle), 리포솜, 나노파티클 또는 그 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 작용제에 부착되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 삭제
  29. 청구항 20에 있어서,
    상기 질병 또는 질환은 자가면역 질병인 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 청구항 20에 있어서,
    상기 구조물은 IgG 항체와, 항-CD74 X 항-CD20, 항-CD74 X 항-CD22, 항-CD22 X 항-CD20, 항-CD20 X 항-HLA-DR, 항-CD19 X 항-CD20, 항-CD20 X 항-CD80, 항-CD2 X 항-CD25, 항-CD8 X 항-CD25, 항-CD2 X 항-CD147, 항-CEACAM5 X 항-CD3, 항- CEACAM6 X 항-CD3, 항-EGFR X 항-CD3, 항-HER2/neu X 항-CD3, 항-CD20 X 항-CD3, 항-CD74 X 항-CD3 및 항-CCD22 X 항-CD3으로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 삭제
  32. 청구항 22에 있어서,
    상기 암은 상피암, 간엽암(mesenchymal cancer), 혈액암(hematological cancer), 신경암(neural cancer), 암종(carcinoma), 흑색종(melanoma), 육종(sarcoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 백혈병, 림프종, 신경아교종(glioma) 및 골수종(myeloma)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 따른 육량체의 안정적으로 묶여진 구조물을 포함하는 암, 자가면역 질병, 퇴행성신경 질환, 알츠하이머병, 대사 질환, 심혈관 질병, 죽상동맥경화증, 기관 이식 거부반응, 진균, 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 의하여 유발되는 질환 또는 증상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병 또는 질환의 진단용 조성물.
  34. 삭제
KR1020087017349A 2005-12-16 2006-12-05 다가 면역글로불린-계 생동성 어셈블리들 KR101410521B1 (ko)

Applications Claiming Priority (19)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US75119605P 2005-12-16 2005-12-16
US60/751,196 2005-12-16
US78233206P 2006-03-14 2006-03-14
US60/782,332 2006-03-14
US11/389,358 2006-03-24
PCT/US2006/010762 WO2006107617A2 (en) 2005-04-06 2006-03-24 Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
US11/389,358 US7550143B2 (en) 2005-04-06 2006-03-24 Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
USPCT/US2006/010762 2006-03-24
US11/391,584 2006-03-28
US11/391,584 US7521056B2 (en) 2005-04-06 2006-03-28 Stably tethered structures of defined compositions with multiple functions or binding specificities
PCT/US2006/012084 WO2006107786A2 (en) 2005-04-06 2006-03-29 Improved stably tethered structures of defined compositions with multiple functions or binding specificities
USPCT/US2006/012084 2006-03-29
PCT/US2006/025499 WO2007046893A2 (en) 2005-10-19 2006-06-29 Methods for generating bioactive assemblies and uses thereof
USPCT/US2006/025499 2006-06-29
US11/478,021 US7534866B2 (en) 2005-10-19 2006-06-29 Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US11/478,021 2006-06-29
US86453006P 2006-11-06 2006-11-06
US60/864,530 2006-11-06
PCT/US2006/046367 WO2007075270A2 (en) 2005-12-16 2006-12-05 Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080097995A KR20080097995A (ko) 2008-11-06
KR101410521B1 true KR101410521B1 (ko) 2014-06-20

Family

ID=48922352

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087017349A KR101410521B1 (ko) 2005-12-16 2006-12-05 다가 면역글로불린-계 생동성 어셈블리들

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1959993B1 (ko)
JP (1) JP5090366B2 (ko)
KR (1) KR101410521B1 (ko)
CN (3) CN103242451B (ko)
AU (1) AU2006330051B2 (ko)
CA (1) CA2633486C (ko)
HK (1) HK1117761A1 (ko)
SG (1) SG153825A1 (ko)
WO (1) WO2007075270A2 (ko)

Families Citing this family (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7527787B2 (en) 2005-10-19 2009-05-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
US7666400B2 (en) * 2005-04-06 2010-02-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. PEGylation by the dock and lock (DNL) technique
US7550143B2 (en) 2005-04-06 2009-06-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
US7534866B2 (en) 2005-10-19 2009-05-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US7906118B2 (en) 2005-04-06 2011-03-15 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Modular method to prepare tetrameric cytokines with improved pharmacokinetics by the dock-and-lock (DNL) technology
US9481878B2 (en) 2004-02-13 2016-11-01 Immunomedics, Inc. Compositions and methods of use of immunotoxins comprising ranpirnase (Rap) show potent cytotoxic activity
US8491914B2 (en) 2004-02-13 2013-07-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) complexes for delivery of interference RNA
US8551480B2 (en) 2004-02-13 2013-10-08 Immunomedics, Inc. Compositions and methods of use of immunotoxins comprising ranpirnase (Rap) show potent cytotoxic activity
US8034352B2 (en) 2005-04-06 2011-10-11 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Tetrameric cytokines with improved biological activity
US8652484B2 (en) 2004-02-13 2014-02-18 Immunomedics, Inc. Delivery system for cytotoxic drugs by bispecific antibody pretargeting
US8562988B2 (en) 2005-10-19 2013-10-22 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Strategies for improved cancer vaccines
US8003111B2 (en) 2005-04-06 2011-08-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dimeric alpha interferon pegylated site-specifically shows enhanced and prolonged efficacy in vivo
US7878978B2 (en) 2004-03-18 2011-02-01 University Of Pittsburgh- Of The Commonwealth System Of Higher Education Use of relaxin to increase arterial compliance
US9623115B2 (en) 2005-04-06 2017-04-18 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-Lock (DNL) Complexes for Disease Therapy
US9931413B2 (en) 2005-04-06 2018-04-03 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Tetrameric cytokines with improved biological activity
US8349332B2 (en) 2005-04-06 2013-01-08 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multiple signaling pathways induced by hexavalent, monospecific and bispecific antibodies for enhanced toxicity to B-cell lymphomas and other diseases
US8481041B2 (en) 2005-04-06 2013-07-09 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) constructs for human immunodeficiency virus (HIV) therapy
US8067006B2 (en) 2005-04-06 2011-11-29 Immunomedics, Inc. Polymeric carriers of therapeutic agents and recognition moieties for antibody-based targeting of disease sites
EP1874824A4 (en) 2005-04-06 2009-12-30 Ibc Pharmaceuticals Inc METHODS OF GENERATING STABLE COMPOUND RELATED COMPLEXES OF HOMODIMERS, HOMOTRATEERS OR DIMER SIZES AND USES THEREOF
US8475794B2 (en) 2005-04-06 2013-07-02 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with anti-CD74 antibodies provides enhanced toxicity to malignancies, Autoimmune disease and other diseases
US8158129B2 (en) 2005-04-06 2012-04-17 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dimeric alpha interferon PEGylated site-specifically shows enhanced and prolonged efficacy in vivo
US9862770B2 (en) 2005-10-19 2018-01-09 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antibody complexes targeting IGF-1R show potent toxicity against solid tumors
US8883162B2 (en) 2005-10-19 2014-11-11 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antibody complexes targeting IGF-1R show potent toxicity against solid tumors
AU2006302848C1 (en) * 2005-10-19 2012-08-02 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US20100226884A1 (en) 2009-01-20 2010-09-09 Immunomedics, Inc. Novel Class of Monospecific and Bispecific Humanized Antibodies that Target the Insulin-like Growth Factor Type I Receptor (IGF-1R)
AU2009233925B2 (en) * 2006-12-05 2014-03-13 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Modular method to prepare tetrameric cytokines with improved pharmacokinetics by the dock-and-lock (DNL) technology
US8574577B2 (en) 2008-01-03 2013-11-05 The Scripps Research Institute VEGF antibodies comprising modular recognition domains
US8557242B2 (en) 2008-01-03 2013-10-15 The Scripps Research Institute ERBB2 antibodies comprising modular recognition domains
DK2769991T3 (en) 2008-01-03 2018-12-10 Scripps Research Inst ANTIBODY TARGETING WITH A MODULAR RECOGNITION AREA
US8557243B2 (en) 2008-01-03 2013-10-15 The Scripps Research Institute EFGR antibodies comprising modular recognition domains
US8454960B2 (en) 2008-01-03 2013-06-04 The Scripps Research Institute Multispecific antibody targeting and multivalency through modular recognition domains
US9272029B2 (en) 2009-03-26 2016-03-01 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Interferon lambada-antibody complexes
CN102186499B (zh) 2008-08-20 2015-05-20 Ibc医药公司 用于癌症治疗的对接和锁定(dnl)疫苗
WO2010028796A1 (en) * 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Trispecific hexavalent antibodies
US8535477B2 (en) 2009-02-21 2013-09-17 Sofradim Production Medical devices incorporating functional adhesives
US20120100538A1 (en) 2009-03-24 2012-04-26 Biocept, Inc. Devices and methods of cell capture and analysis
CA2756493C (en) 2009-03-24 2019-07-02 Biocept, Inc. Devices and methods of cell capture and analysis
CA2772572A1 (en) * 2009-08-31 2011-03-03 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Bispecific immunocytokine dock-and-lock (dnl) complexes and therapeutic use thereof
CA2770351C (en) * 2009-08-31 2019-04-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use of immunotoxins comprising ranpirnase (rap) show potent cytotoxic activity
WO2011056721A2 (en) * 2009-11-05 2011-05-12 Center For Molecular Medicine And Immunology Immunoconjugates comprising poxvirus-derived peptides and antibodies against antigen-presenting cells for subunit-based poxvirus vaccines
CA2781717C (en) * 2009-12-09 2017-09-12 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (dnl) complexes for delivery of interference rna
CA2782398C (en) 2009-12-09 2017-09-26 Immunomedics, Inc. Delivery system for cytotoxic drugs by bispecific antibody pretargeting
WO2011123428A1 (en) * 2010-04-01 2011-10-06 Immunomedics, Inc. Antibody-based depletion of antigen-presenting cells and dendritic cells
WO2012006147A1 (en) 2010-06-29 2012-01-12 Tyco Healthcare Group Lp Microwave-powered reactor and method for in situ forming implants
CA2804251A1 (en) 2010-07-01 2012-01-05 Sofradim Production Medical device with predefined activated cellular integration
US20120100166A1 (en) 2010-07-15 2012-04-26 Zyngenia, Inc. Ang-2 Binding Complexes and Uses Thereof
EP2605788B1 (en) * 2010-08-17 2018-10-10 IBC Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with anti-cd74 antibodies provides enhanced toxicity to malignancies, autoimmune disease and other diseases
US20120164137A1 (en) * 2010-10-20 2012-06-28 Morphotek, Inc. Anti-folate receptor alpha antibody glycoforms
CN103328001B (zh) * 2010-11-03 2017-02-15 Ibc药品公司 用于人免疫缺陷病毒(hiv)疗法的对接和锁定(dnl)构建体
JP6024025B2 (ja) * 2011-05-02 2016-11-09 イミューノメディクス、インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ， Ｉｎｃ． 少容量投与用のアロタイプ選択抗体の限外濾過濃縮
EP2714738B1 (en) 2011-05-24 2018-10-10 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
EP3892640A1 (en) * 2011-08-23 2021-10-13 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2013026837A1 (en) * 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
KR101681818B1 (ko) * 2011-08-23 2016-12-01 로슈 글리카트 아게 T 세포 활성화 항원 및 종양 항원에 대해 특이적인 이중특이적 항체 및 이의 사용 방법
LT2748202T (lt) * 2011-08-23 2018-09-25 Roche Glycart Ag Bispecifinės antigeną surišančios molekulės
AU2012320597C1 (en) 2011-10-07 2015-10-15 Baxalta GmbH oxMIF as a diagnostic marker
AU2013202693B2 (en) * 2012-04-16 2015-01-22 Baxalta GmbH Combination Therapy of Anti-MIF Antibodies and Chemotherapeutics
WO2013181087A2 (en) 2012-06-01 2013-12-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multimeric complexes with improved in vivo stability, pharmacokinetics and efficacy
KR102006997B1 (ko) * 2012-07-03 2019-08-02 한국생명공학연구원 ＩｇＧ Ｆｃ 위치선택적 결합 펩티드 및 이를 포함하는 하이브리드 분자
US9682143B2 (en) 2012-08-14 2017-06-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
US9382329B2 (en) 2012-08-14 2016-07-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells
US20150231241A1 (en) 2012-08-14 2015-08-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
CN104379169A (zh) * 2012-08-14 2015-02-25 Ibc药品公司 用于治疗疾病的t-细胞重定向双特异性抗体
CA2879768A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
FR3003172B1 (fr) * 2013-03-15 2017-12-08 Lab Francais Du Fractionnement Utilisation d'anticorps monoclonaux pour le traitement de l'inflammation et d'infections bacteriennes
CN110845618A (zh) 2013-02-26 2020-02-28 罗切格利卡特公司 双特异性t细胞活化抗原结合分子
RS59992B1 (sr) 2013-02-26 2020-04-30 Roche Glycart Ag Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije specifični za cd3 i cea
MX2015013163A (es) 2013-03-15 2016-04-04 Zyngenia Inc Complejos multiespecificos multivalente y monovalentes y sus usos.
US9775928B2 (en) 2013-06-18 2017-10-03 Covidien Lp Adhesive barbed filament
CA2924520C (en) 2013-11-01 2023-09-26 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antibodies that neutralize both tnf-alpha and il-6: novel therapeutic agent for autoimmune disease
KR20150080417A (ko) 2013-12-30 2015-07-09 경희대학교 산학협력단 링커를 통해 연결된 동일한 표적 물질에 결합하는 항체 및 앱타머를 포함하는 집게 분자 및 이의 용도
KR102355609B1 (ko) 2014-05-29 2022-01-27 마크로제닉스, 인크. 다중 암 항원에 특이적으로 결합하는 삼중-특이적 결합 분자 및 그것의 사용 방법
TWI693232B (zh) 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
AU2015299163B2 (en) 2014-08-04 2019-07-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific T cell activating antigen binding molecules
KR20170063755A (ko) 2014-09-26 2017-06-08 마크로제닉스, 인크. Cd19 및 cd3에 결합할 수 있는 이중-특이적 1가 디아바디, 및 그것의 사용
BR112017010324A2 (pt) 2014-11-20 2018-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag método para tratar ou retardar a progressão de um câncer em um indivíduo, moléculas, métodos para aumentar a função imune em um indivíduo e para selecionar um paciente para tratamento, kits, composição farmacêutica e usos de uma combinação de uma molécula
RU2696378C2 (ru) * 2015-01-16 2019-08-01 Академиа Синика Молекулярные конструкции с нацеливающими и эффекторными элементами
CN107250161A (zh) 2015-01-26 2017-10-13 宏观基因有限公司 包含dr5‑结合结构域的多价分子
CN104829730A (zh) * 2015-04-14 2015-08-12 苏静 一种能联合免疫细胞增强肿瘤杀伤能力的双特异性抗体及其制备方法和应用
CA2982376A1 (en) 2015-05-28 2016-12-01 Immunomedics, Inc. T20 constructs for anti-hiv (human immunodeficiency virus) therapy and/or vaccines
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
CA2987641A1 (en) * 2015-07-06 2017-01-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
EP3322716A2 (en) * 2015-07-15 2018-05-23 California Institute of Technology Il-17f-specific capture agents, compositions, and methods of using and making
CN116333138A (zh) 2015-07-30 2023-06-27 宏观基因有限公司 Pd-1结合分子和其使用方法
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
AU2016329111A1 (en) 2015-10-02 2018-02-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-CEAXCD3 T cell activating antigen binding molecules
EP3359192A4 (en) 2015-10-08 2019-05-01 MacroGenics, Inc. POLY THERAPY FOR THE TREATMENT OF CANCER
BR112018003984A2 (pt) 2015-12-09 2018-09-25 Hoffmann La Roche anticorpos
AU2016370376B2 (en) 2015-12-14 2023-12-14 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules having immunoreactivity with PD-1 and CTLA-4, and methods of use thereof
EP3400246B1 (en) 2016-01-08 2020-10-21 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies
UY37127A (es) 2016-02-17 2017-08-31 Macrogenics Inc Moléculas de unión a ror1, y métodos de uso de las mismas
RS64266B1 (sr) 2016-03-22 2023-07-31 Hoffmann La Roche Bispecifični molekul koji aktivira t ćeliju koji se aktivira proteazom
CR20180484A (es) 2016-04-15 2019-03-05 Macrogenics Inc Moléculas de unón b7-h3 novedosas, conjugados anticuerpos-fármaco de los mismos y métodos de uso de los mismos
WO2018060301A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against cd3
EP3558368A4 (en) 2016-12-23 2020-12-30 MacroGenics, Inc. ADAM9 BINDING MOLECULES AND THEIR METHODS FOR USE
EP3585431A4 (en) 2017-02-24 2020-12-16 MacroGenics, Inc. BISPECIFIC BINDING MOLECULES CAPABLE OF BINDING TO CD137 AND TUMOR ANTIGENS, AND THEIR USES
BR112019017869A2 (pt) * 2017-02-28 2020-05-12 Affimed Gmbh Combinação de um anticorpo anti-cd16a com uma citocina
GB201705686D0 (en) * 2017-04-07 2017-05-24 Centauri Therapeutics Ltd Novel compounds and therapeutic uses thereof
AR111651A1 (es) * 2017-04-28 2019-08-07 Novartis Ag Conjugados de anticuerpos que comprenden agonistas del receptor de tipo toll y terapias de combinación
AU2018298060B2 (en) 2017-07-03 2021-02-25 Torque Therapeutics, Inc. Immunostimulatory fusion molecules and uses thereof
SG11202005557TA (en) 2017-12-12 2020-07-29 Macrogenics Inc Bispecific cd 16-binding molecules and their use in the treatment of disease
US11866498B2 (en) 2018-02-08 2024-01-09 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
CA3089877A1 (en) 2018-02-15 2019-08-22 Macrogenics, Inc. Variant cd3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
EP4168447A1 (en) 2020-06-19 2023-04-26 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to cd3 and cd19
WO2022010798A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Kiromic BioPharma, Inc. Mesothelin isoform binding molecules and chimeric pd1 receptor molecules, cells containing the same and uses thereof
CN111848462B (zh) * 2020-08-14 2021-05-11 上海大学 一种芘磺酸盐衍生物及其制备方法和应用
CA3202233A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Kiromic BioPharma, Inc. Gamma-delta t cell manufacturing processes and chimeric pd1 receptor molecules
CN112553256B (zh) * 2021-02-20 2021-06-22 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 Il-2受体复合物及其制备方法与应用
CN113533272B (zh) * 2021-06-26 2024-01-09 浙江工商大学 一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6524854B1 (en) 2001-09-11 2003-02-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of PKA regulatory subunit RII alpha expression
US20040018587A1 (en) 1994-10-13 2004-01-29 Lee Makowski Nanostructures containing antibody assembly units
US20050003403A1 (en) 2003-04-22 2005-01-06 Rossi Edmund A. Polyvalent protein complex

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8501219A (nl) * 1985-04-29 1986-11-17 Stichting Vrienden Van De Stic Immunologisch complex, de bereiding en toepassing daarvan.
US20030198956A1 (en) * 2002-02-21 2003-10-23 Lee Makowski Staged assembly of nanostructures
US7060506B2 (en) * 2000-01-31 2006-06-13 Cyclacel, Ltd. Compositions and methods for monitoring the modification of modification dependent binding partner polypeptides
WO2003093296A2 (en) * 2002-05-03 2003-11-13 Sequenom, Inc. Kinase anchor protein muteins, peptides thereof, and related methods
AU2006232310B9 (en) * 2005-04-06 2011-07-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Improved stably tethered structures of defined compositions with multiple functions or binding specificities
EP1874824A4 (en) * 2005-04-06 2009-12-30 Ibc Pharmaceuticals Inc METHODS OF GENERATING STABLE COMPOUND RELATED COMPLEXES OF HOMODIMERS, HOMOTRATEERS OR DIMER SIZES AND USES THEREOF

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040018587A1 (en) 1994-10-13 2004-01-29 Lee Makowski Nanostructures containing antibody assembly units
US6524854B1 (en) 2001-09-11 2003-02-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of PKA regulatory subunit RII alpha expression
US20050003403A1 (en) 2003-04-22 2005-01-06 Rossi Edmund A. Polyvalent protein complex

Also Published As

Publication number Publication date
AU2006330051A1 (en) 2007-07-05
CA2633486C (en) 2015-02-03
EP1959993B1 (en) 2014-11-19
KR20080097995A (ko) 2008-11-06
JP5090366B2 (ja) 2012-12-05
WO2007075270A3 (en) 2008-03-06
HK1117761A1 (en) 2009-01-23
CN101374546A (zh) 2009-02-25
CN103242451B (zh) 2017-11-21
EP1959993A2 (en) 2008-08-27
CN101374546B (zh) 2016-03-23
AU2006330051B2 (en) 2011-08-18
JP2009519931A (ja) 2009-05-21
CN105709237A (zh) 2016-06-29
WO2007075270A2 (en) 2007-07-05
EP1959993A4 (en) 2010-06-30
SG153825A1 (en) 2009-07-29
CN103242451A (zh) 2013-08-14
CA2633486A1 (en) 2007-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101410521B1 (ko) 다가 면역글로불린-계 생동성 어셈블리들
US9540435B2 (en) Stably tethered structures of defined compositions with multiple functions or binding specificities
US8211440B2 (en) Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
EP1874358B1 (en) Improved stably tethered structures of defined compositions with multiple functions or binding specificities
US8932593B2 (en) Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
EP2674440B1 (en) Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170608

Year of fee payment: 4