CN110845618A - 双特异性t细胞活化抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及用于T细胞活化和再指向特定靶细胞的新的双特异性抗原结合分子。此外，本发明涉及编码这类双特异性抗原结合分子的多核苷酸以及包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于产生本发明的双特异性抗原结合分子的方法，以及涉及在治疗疾病时使用这些双特异性抗原结合分子的方法。

Description

双特异性T细胞活化抗原结合分子
本申请是中国专利申请201480010296.3的分案申请，原申请的申请日是2014年 2月21日，发明名称是“双特异性T细胞活化抗原结合分子”。
发明领域
本发明总体上涉及用于活化T细胞的双特异性抗原结合分子。此外，本发明涉及编码这类双特异性抗原结合分子的多核苷酸以及包含这类多核苷酸的载体和宿主细 胞。本发明还涉及用于产生本发明双特异性抗原结合分子的方法，以及在治疗疾病时 使用这些双特异性抗原结合分子的方法。
背景
在多种临床环境下经常需要选择性破坏单个细胞或特定细胞类型。例如，癌疗法的主要目的是特异性摧毁肿瘤细胞，同时留下健康的细胞和完整不受损害的组织。
实现这个目的的一种有吸引力方式是诱导针对肿瘤的免疫反应，使得免疫效应细胞如天然杀伤(NK)细胞或细胞毒T淋巴细胞(CTL)攻击并摧毁肿瘤细胞。CTL构成 免疫系统的最强有力效应细胞，然而它们不能由常规治疗性抗体Fc结构域介导的效 应细胞机制活化。
在这个方面，近年来如下双特异性抗体日益引起兴趣，其设计成以一条“臂”结合靶细胞表面上的抗原，并且以第二“臂”结合T细胞受体(TCR)复合物的活化性不变组 分。这种抗体与其两种靶的同时结合将迫使靶细胞和T细胞之间短暂相互作用，造成 任何细胞毒T细胞的活化和靶细胞的后续裂解。因此，免疫反应再指向靶细胞并且不 依赖于靶细胞呈递肽抗原或T细胞特异性，其中所述靶细胞呈递肽抗原或T细胞特 异性与通常的MHC限制型CTL活化相关。在这种情况下关键是当靶细胞向CTL呈 递双特异性抗体时，仅活化CTL，即模拟了免疫突触。特别想要的是：不需要淋巴细 胞预先调节或共刺激以激发靶细胞的高效溶解的双特异性抗体。
已经开发了几种双特异性抗体样式并且研究了它们对T细胞介导的免疫疗法的适用性。这些抗体样式当中，已经非常充分地表征了所谓的BiTE(双特异性T细胞衔 接体(bispecific T cell engager))分子并且它们已经在临床环境下显示某种前景(综述见Nagorsen和
Figure BDA0002213187780000021
Exp Cell Res 317,1255-1260(2011))。BiTE是其中两个scFv分 子通过柔性接头融合的串联scFv分子。正在评价T细胞衔接作用的其他双特异性样 式包括双体抗体(diabody)(Holliger等人,Prot Eng 9,299-305(1996))及它们的衍生物， 如串联双体抗体(Kipriyanov等人,J Mol Biol 293,41-66(1999))。更近的发展是所谓的 DART(双亲和力再指向)分子，其是基于双体抗体样式，但是以起到额外稳定作用的 C末端二硫键为特征(Moore等人,Blood 117,4542-51(2011))。所谓的三体瘤，其是完 整杂合小鼠/大鼠IgG分子并且目前还在临床试验中评价，代表一种较大尺寸的样式 (综述见Seimetz等人Cancer Treat Rev 36,458-467(2010))。
正在开发的多种样式显示归属于免疫疗法中T细胞再指向和活化的巨大潜力。然而，产生适用于此的双特异性抗体的任务无论如何并非不重要，其涉及不得不解决的 与抗体效力、毒性、适用性和可生产性相关的众多挑战。
小构建体如，例如BiTE分子－尽管能够有效地交联效应细胞和靶细胞－具有非常短的血清半寿期，需要将它们通过连续输注施用至患者。在另一方面，类IgG样式 －尽管具有半寿期长的巨大益处－遭遇与IgG分子固有的天然效应子功能相关的毒 性。对于成功的治疗性开发而言，它们的免疫原性潜力构成IgG样双特异性抗体、尤 其非人类样式的另一个不利特征。最后，在总体开发双特异性抗体时的一个巨大挑战 是产生以临床上够用的量和纯度产生双特异性抗体构建体，原因在于共表达时，不同 特异性的抗体重链和轻链错误配对，这降低了正确装配的构建体的产率并产生可能与 所需双特异性抗体难以分离的众多无功能的副产物。
鉴于与目前可用于T细胞介导的免疫疗法的双特异性抗体相关的难题和缺点，仍需要这类分子的新颖改进样式。本发明提供设计用于T细胞活化和再指向的双特异性 抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子组合了良好有效性和可生产性及低毒性和 有利药代动力学特性。特别地，提供了新双特异性抗原结合分子，它们包含具有至少 一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。也提供了包含单结构域可变重链的新双特异性抗原 结合分子。这些新分子具有优点：它们可以以较少的副产物产生，原因是在分别包含 锚蛋白基序或单结构域可变重链的结合物和包含抗体重链和轻链的结合物之间不存 在错误配对。
还提供了新的双特异性抗原结合分子，所述分子包含借助静电转向效应促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰。由此促进Fc结构域的正确链缔合并且在产生 这些分子期间更少的不利副产物出现。
发明简述
在一个方面本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分和能够与靶细胞抗原特异性结合的第 二抗原结合部分，其中所述的一个抗原结合部分是Fab分子或交换Fab分子，其中 Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中另一个抗原结合部分包含单结构 域抗原结合分子。
在一个实施方案中，所述单结构域抗原结合分子是单结构域可变重链。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分包含交换Fab分 子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换，和能够与靶细胞抗原特异性 结合的第二抗原结合部分，其中所述第二抗原结合部分由单结构域可变重链组成。
在一个方面本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分和能够与靶细胞抗原特异性结合的第 二抗原结合部分，其中所述的一个抗原结合部分是Fab分子或交换Fab分子，其中 Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中另一个抗原结合部分是包含至少 一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。
在这样的一个实施方案中，能够与T细胞活化抗原特异性结合的所述第一抗原结合部分是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中 第二抗原结合部分是包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。
在这样的一个实施方案中，所述第二抗原部分包含一种包含两个、三个、四个或五个锚蛋白重复基序的结合蛋白。
在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子额外地包含含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域。
在一个具体实施方案中，不多于一个能够与T细胞活化抗原特异性结合的抗原结合部分存在于T细胞活化性双特异性抗原结合分子中(即T细胞活化性双特异性抗原 结合分子提供与T细胞活化抗原单价结合)。在具体的实施方案中，第一抗原结合部 分是交换Fab分子。
在一个实施方案中，第一和第二抗原结合部分彼此融合，任选地通过肽接头彼此融合。
在一个实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部 分的Fab重链的N末端融合。
在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子额外地包含能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分。
在这样的一个实施方案中，能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分是单结构域可变重链。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含
a)含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，
b)第一抗原结合部分，其包含其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的交换Fab分子，其中所述交换Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一 的N末端融合；
c)第二抗原结合部分，其包含单结构域可变重链，其中所述单结构域可变重链与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，和
d)第三抗原结合部分，其包含单结构域可变重链，其中所述单结构域可变重链与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。
在这样的一个实施方案中，能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分是包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。
在这样的一个实施方案中，能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分是一种包含两个、三个、四个或五个锚蛋白重复基序的结合蛋白。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含
a)含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，
b)第一抗原结合部分，其包含其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的交换Fab分子，其中所述交换Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一 的N末端融合；
c)第二抗原结合部分，其包含含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白，其中所述含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白与Fc结构域的亚基之一的N末端融合， 和
d)第三抗原结合部分，其包含含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白，其中含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融 合。
在一个实施方案中，所述第一抗原结合部分与T细胞活化抗原结合并且所述第二和第三抗原结合部分与相同的靶细胞抗原结合。
在一个具体实施方案中，Fc结构域是IgG Fc结构域。在一个具体实施方案中， Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个具体实施方案中，Fc结构域是IgG4 Fc结构域。 在具体的实施方案中，Fc结构域是人Fc结构域。
在具体的实施方案中，Fc结构域包含促进第一和第二Fc结构域亚基缔合的修饰。在一个这样的特定实施方案中，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残 基由具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3结构域内部产生 可安置在第二亚基的CH3结构域内部腔中的突出部分，并且在Fc结构域的第二亚基 的CH3结构域中的氨基酸残基由具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二 亚基的CH3结构域内部产生腔，在所述腔内部可安置第一亚基的CH3结构域内部的 突出部分。
在一个具体实施方案中，与天然IgG1 Fc结构域相比，Fc结构域显示降低的与 Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在某些实施方案中，与非工程化的Fc 结构域相比，Fc结构域经工程化以具有对Fc受体降低的结合亲和力和/或降低的效应 子功能。在一个实施方案中，Fc结构域包含降低与Fc受体结合和/或效应子功能的一 个或多个氨基酸置换。在一个实施方案中，Fc结构域中减少与Fc受体结合和/或效应 子功能的一种或多种氨基酸置换在选自L234、L235和P329的一个或多个位置处。 在具体的实施方案中，Fc结构域的每个亚基包含减少与Fc受体结合和/或效应子功能 的三个氨基酸置换，其中所述氨基酸置换是L234A、L235A和P329G。在这样的一 个实施方案中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，尤其人IgG1 Fc结构域。在其他实施方 案中，Fc结构域的每个亚基包含减少与Fc受体结合和/或效应子功能的两个氨基酸置 换，其中所述氨基酸置换是L235E和P329G。在这样的一个实施方案中，Fc结构域 是IgG4 Fc结构域，尤其人IgG4 Fc结构域。在这样的一个实施方案中，Fc结构域是 IgG4 Fc结构域，尤其人IgG4 Fc结构域，并且包含氨基酸置换L235E和S228P(SPLE)。
在一个实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，Fc受体是人Fc 受体。在一个实施方案中，Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体实施方案中，Fc受 体是人FcγRIIa、FcγRI和/或FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应子功能是抗体依赖 的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在一个方面本发明提供T细胞活化性双特异性抗原结合分子，所述分子包含第一和第二抗原结合部分，所述抗原结合部分之一是能够与T细胞活化抗原特异性结合的 Fab分子并且另一个抗原结合部分是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子；其中 第一抗原结合部分是(a)其中Fab轻链和Fab重链由肽接头连接的单链Fab分子或(b) 其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的交换Fab分子；并包含含有能够 稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，其中已经修饰所述第一亚基和所述第二亚 基以包含静电上有利于异二聚体形成的一个或多个带电荷的氨基酸。
在一个实施方案中，所述第一亚基包含氨基酸突变E356K、E357K和D399K并 且所述第二亚基包含氨基酸突变K370E、K409E和K439E。
在一个实施方案中，所述第一亚基包含氨基酸突变K392D、K409D并且所述第 二亚基包含氨基酸突变E356K、D399K(DDKK)。
在一个具体实施方案中，不多于一个能够与T细胞活化抗原特异性结合的抗原结合部分存在于T细胞活化性双特异性抗原结合分子中(即T细胞活化性双特异性抗原 结合分子提供与T细胞活化抗原单价结合)。在具体的实施方案中，第一抗原结合部 分是交换Fab分子。在甚至更具体的实施方案中，第一抗原结合部分是其中Fab轻 链和Fab重链的恒定区交换的交换Fab分子。
在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的第一和第二抗原结合部分彼此融合，任选地通过肽接头彼此融合。在这样的一个实施方案中，第二抗原结 合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在另一 个这样的实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分 的Fab重链的N末端融合。在又一个这样的实施方案中，第二抗原结合部分在Fab 轻链的C末端与第一抗原结合部分的Fab轻链的N末端融合。在这样的实施方案中， 其中第一抗原结合部分是交换Fab分子并且其中(i)第二抗原结合部分在Fab重链的C 末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合或(ii)第一抗原结合部分在Fab重 链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，第一抗原结合部分的Fab 轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链额外地可以彼此融合、任选地通过肽接头彼此融 合。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在另一个实施方案 中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端 融合。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合。
在某些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含第三抗原结合部分，所述第三抗原结合部分是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子。在这样的一个实 施方案中，第三抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的 N末端融合。在一个具体实施方案中，T细胞活化抗原结合分子的第二和第三抗原结 合部分各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，并且第一抗 原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在 另一个具体实施方案中，T细胞活化抗原结合分子的第一和第三抗原结合部分各自在 Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，并且第二抗原结合部分在 Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。T细胞活化性双 特异性抗原结合分子的组分可以直接融合或通过合适的肽接头融合。在一个实施方案 中，第二和第三抗原结合部分和Fc结构域是免疫球蛋白分子的部分。在一个具体实 施方案中，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更具体的实施方案中， 免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG4亚类 免疫球蛋白。
在一个具体实施方案中，Fc结构域是IgG Fc结构域。在一个具体实施方案中， Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个具体实施方案中，Fc结构域是IgG4 Fc结构域。 在具体的实施方案中，Fc结构域是人Fc结构域。
在一个具体实施方案中，与天然IgG1 Fc结构域相比，Fc结构域显示降低的与 Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在某些实施方案中，与非工程化的Fc 结构域相比，Fc结构域经工程化以具有对Fc受体降低的结合亲和力和/或降低的效应 子功能。在一个实施方案中，Fc结构域包含降低与Fc受体结合和/或效应子功能的一 个或多个氨基酸置换。在一个实施方案中，Fc结构域中减少与Fc受体结合和/或效应 子功能的一种或多种氨基酸置换在选自L234、L235和P329的一个或多个位置处。 在具体的实施方案中，Fc结构域的每个亚基包含减少与Fc受体结合和/或效应子功能 的三个氨基酸置换，其中所述氨基酸置换是L234A、L235A和P329G。在这样的一 个实施方案中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，尤其人IgG1 Fc结构域。在其他实施方 案中，Fc结构域的每个亚基包含减少与Fc受体结合和/或效应子功能的两个氨基酸置 换，其中所述氨基酸置换是L235E和P329G。在这样的一个实施方案中，Fc结构域 是IgG4 Fc结构域，尤其人IgG4 Fc结构域。在这样的一个实施方案中，Fc结构域是 IgG4 Fc结构域，尤其人IgG4 Fc结构域，并且包含氨基酸置换L235E和S228P(SPLE)。
在一个实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，Fc受体是人Fc 受体。在一个实施方案中，Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体实施方案中，Fc受 体是人FcγRIIa、FcγRI和/或FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应子功能是抗体依赖 的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在一个具体实施方案中，双特异性抗原结合分子能够与之结合的T细胞活化抗原是CD3。在其他实施方案中，双特异性抗原结合分子能够与之结合的靶细胞抗原是肿 瘤细胞抗原。在一个实施方案中，靶细胞抗原选自：黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚 糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、 CD19、CD20和CD33。
根据本发明的另一个方面，提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段。本发明还涵盖由本发明多核 苷酸编码的多肽。本发明还提供包含本发明的分离多核苷酸的表达载体，和包含本发 明的分离多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞， 尤其哺乳动物细胞。
在另一个方面，提供一种产生本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，所述方法包括步骤a)在适于表达T细胞活化性双特异性抗原结合分子的条件下培 养本发明的宿主细胞和b)回收T细胞活化性双特异性抗原结合分子。本发明还涵盖通 过本发明方法产生的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。
本发明还提供一种包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子和可药用载体的药物组合物。
本发明还涵盖了使用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子和药物组合物的方法。在一个方面，本发明提供本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或 药物组合物用作药物。在一个方面提供本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子 或药物组合物根据用于治疗有需求的个体中的疾病。在一个具体实施方案中，该疾病 是癌症。
还提供本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子用于制造治疗有需求的个体中疾病的药物的用途；并提供了治疗个体疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用 治疗有效量的组合物，所述组合物包含可药用形式的本发明T细胞活化性双特异性抗 原结合分子。在一个具体实施方案中，该疾病是癌症。在以上实施方案的任一者中， 个体优选地是哺乳动物，尤其是人。
本发明也提供一种用于诱导靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的方法，所述方法包括使靶细胞与本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子在T细胞、尤其细胞毒T 细胞存在下接触。
附图简述
图1：本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的(TCB)的示例性构型。 (A)“1+1 IgG scFab，单臂”，和(B)“1+1 IgG scFab，单臂倒置”分子的图示。在“1+1 IgG scFab，单臂”分子中，靶向T细胞的Fab的轻链通过接头与重链融合，而“1+1 IgG scFab，单臂倒置”分子在靶向肿瘤的Fab中具有接头。(C)“2+1 IgG scFab”分子的图 示。(D)“1+1 IgGscFab”分子的图示。(E)“1+1 IgG Crossfab”分子的图示。(F)“2+1 IgG Crossfab”分子的图示。(G)具有Crossfab和Fab组分备选顺序(“倒置”)的“2+1 IgG Crossfab”分子的图示。(H)“1+1 IgG Crossfab轻链(LC)融合分子的图示。(I)“1+1 CrossMab”分子的图示。(J)“2+1 IgG Crossfab，连接的轻链”分子的图示。(K)“1+1 IgG Crossfab，连接的轻链”分子的图示。(L)“2+1 IgG Crossfab、倒置、连接的轻链”分子 的图示。(M)“1+1 IgG Crossfab、倒置、连接的轻链”分子的图示。黑点：Fc结构域 中促进异二聚化的任选修饰。
图2：非还原(A)和还原(B)的“1+1 IgG scFab，单臂”(抗MCSP/抗huCD3)(参见 SEQID NO:1、3、5)及非还原(C)和还原(D)的“1+1 IgG scFab，单臂倒置”(抗MCSP/ 抗huCD3)(参见SEQ ID NO:7、9、11)的SDS PAGE(4-12％Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。
图3：“1+1 IgG scFab，单臂”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:1、3、5) (A)和“1+1 IgG scFab，单臂倒置”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:7、9、11) (B)的分析性大小排阻色谱(Superdex 200 10/300GL GE Healthcare；2mM MOPS pH 7.3，150mM NaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。
图4：非还原(A)和还原(B)的“1+1 IgG scFab，单臂”(抗EGFR/抗huCD3)(参见 SEQID NO:43、45、57)及非还原(C)和还原(D)的“1+1 IgG scFab，单臂倒置”(抗 EGFR/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:11、49、51)的SDS PAGE(4-12％Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。
图5：“1+1 IgG scFab，单臂”(抗EGFR/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:43、45、 47)(A)和“1+1 IgG scFab，单臂倒置”(抗EGFR/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:11、49、 51)(B)的分析性大小排阻色谱(Superdex 200 10/300GL GE Healthcare；2mM MOPS pH 7.3，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。
图6：(A、B)非还原(A)和还原(B)的“1+1 IgG scFab，单臂倒置”(抗FAP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:11、51、55)的SDS PAGE(4-12％Bis/Tris，NuPage Invitrogen， 考马斯染色)。(C)“1+1 IgG scFab，单臂倒置”(抗FAP/抗huCD3)的分析性大小排阻 色谱(Superdex200 10/300GL GE Healthcare；2mM MOPS pH 7.3，150mM NaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。
图7：(A)非还原(泳道2)和还原(泳道3)的“2+1 IgG scFab，P329G LALA”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:5、21、23)；(B)非还原(泳道2)和还原(泳道3) 的“2+1 IgGscFab，LALA”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:5、17、19)；(C) 非还原(泳道2)和还原(泳道3)的“2+1 IgG scFab，wt”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:5、13、15)；及(D)非还原(泳道2)和还原(泳道3)的“2+1 IgG scFab，P329G LALA N297D”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:5、25、27)的SDS PAGE(4-12％ Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。
图8：(A)“2+1 IgG scFab，P329G LALA”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO: 5、21、23)；(B)“2+1 IgG scFab，LALA”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:5、 17、19)；(C)“2+1 IgG scFab，wt”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:5、13、 15)；和(D)“2+1 IgG scFab，P329G LALA N297D”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:5、25、27)的分析性大小排阻色谱(Superdex 200 10/300GL GE Healthcare；2mM MOPS pH 7.3，150mM NaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。
图9：(A、B)非还原(A)和还原(B)的“2+1 IgG scFab，P329G LALA”(抗EGFR/ 抗huCD3)(参见SEQ ID NO:45、47、53)的SDS PAGE(4-12％Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。(C)“2+1 IgG scFab，P329G LALA”(抗EGFR/抗huCD3) 的分析性大小排阻色谱(Superdex 200 10/300GL GE Healthcare；2mM MOPS pH 7.3，150mM NaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。
图10：(A、B)非还原(A)和还原(B)的“2+1 IgG scFab，P329G LALA”(抗FAP/ 抗huCD3)(参见SEQ ID NO:57、59、61)的SDS PAGE(4-12％Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。(C)“2+1 IgG scFab，P329G LALA”(抗FAP/抗huCD3)的 分析性大小排阻色谱(Superdex 200 10/300GL GE Healthcare；2mM MOPS pH 7.3， 150mM NaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。
图11：(A、B)非还原(A)和还原(B)的“1+1 IgG Crossfab，Fc(扣)P329G LALA/ Fc(结)wt”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:5、29、31、33)的SDS PAGE(4-12％ Tris-乙酸盐(A)或4-12％Bis/Tris(B)，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。(C)“1+1 IgG Crossfab，Fc(扣)P329G LALA/Fc(结)wt”(抗MCSP/抗huCD3)的分析性大小排阻色 谱(Superdex 20010/300GL GE Healthcare；2mM MOPS pH 7.3，150mM NaCl， 0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。
图12：(A、B)非还原(A)和还原(B)的“2+1 IgG Crossfab”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:3、5、29、33)的SDS PAGE(4-12％Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考 马斯染色)。(C)“2+1 IgG Crossfab”(抗MCSP/抗huCD3)的分析性大小排阻色谱 (Superdex 20010/300GL GE Healthcare；2mM MOPS pH 7.3，150mM NaCl，0.02％ (w/v)NaCl；注入50μg样品)。
图13：(A、B)非还原(A)和还原(B)的“2+1 IgG Crossfab”(抗MCSP/抗cyCD3)(参见SEQ ID NO:3、5、35、37)的SDS PAGE(4-12％Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考 马斯染色)。(C)“2+1 IgG Crossfab”(抗MCSP/抗cyCD3)的分析性大小排阻色谱 (Superdex 20010/300GL GE Healthcare；2mM MOPS pH 7.3，150mM NaCl，0.02％ (w/v)NaCl；注入50μg样品)。
图14：(A、B)非还原(A)和还原(B)的“2+1 IgG Crossfab，倒置”(抗CEA/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:33、63、65、67)的SDS PAGE(4-12％Bis/Tris，NuPage Invitrogen， 考马斯染色)。(C)“2+1 IgG Crossfab，倒置”(抗CEA/抗huCD3)的分析性大小排阻色 谱(Superdex 200 10/300GL GE Healthcare；2mM MOPS pH 7.3，150mM NaCl， 0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。
图15：(A)“(scFv)2-Fc”和“(dsscFv)2-Fc”(抗MCSP(LC007)/抗huCD3(V9))的热 稳定性。动态光散射，按0.05℃/分钟以25-75℃的温变率所测量。黑色曲线： “(scFv)2-Fc”；灰色曲线：“(dsscFv)2-Fc”。(B)“2+1 IgG scFab”(参见SEQ ID NO:5、 21、23)和“2+1 IgGCrossfab”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:3、5、29、33) 的热稳定性。动态光散射，按0.05℃/分钟以25-75℃的温变率所测量。黑色曲线：“2+1 IgG scFab”；灰色曲线：“2+1 IgGCrossfab”。
图16：用于(A)测定多种Fc突变体与人FcγRIIIa的相互作用和(B)T细胞双特异性构建体与肿瘤靶和人CD3γ(G4S)5CD3ε–AcTev–Fc(结)–Avi/Fc(扣)的同时结合的Biacore测定法设置。
图17：T细胞双特异性构建体与人MCSP的D3结构域和人 CD3γ(G4S)5CD3ε–AcTev–Fc(结)–Avi/Fc(扣)的同时结合。(A)“2+1 IgG Crossfab”(参 见SEQ ID NO:3、5、29、33)，(B)“2+1 IgG scFab”(参见SEQ ID NO:5、21、23)。
图18：T细胞双特异性构建体与人EGFR和人 CD3γ(G4S)5CD3ε–AcTev–Fc(结)–Avi/Fc(扣)的同时结合。(A)“2+1 IgG scFab”(参见 SEQ ID NO:45、47、53)，(B)“1+1 IgGscFab，单臂”(参见SEQ ID NO:43、45、47)， (C)“1+1 IgG scFab，单臂倒置”(参见SEQ IDNO:11、49、51)，和(D)“1+1 IgG scFab” (参见SEQ ID NO:47、53、213)。
图19：通过FACS测量的“(scFv)2”分子(50nM)与Jurkat细胞上表达的CD3(A) 或与Colo-38细胞上的MCSP(B)结合。与未处理的细胞和仅用第二抗体染色的细胞相 比，绘制平均荧光强度。
图20：通过FACS测量的“2+1 IgG scFab，LALA”(参见SEQ ID NO:5、17、 19)构建体(50nM)与Jurkat细胞上表达的CD3(A)或与Colo-38细胞上的MCSP(B)结 合。与用参比抗CD3IgG(如所示)处理的细胞、未处理的细胞和仅用第二抗体染色的 细胞相比，绘制平均荧光强度。
图21：“1+1 IgG scFab，单臂”(参见SEQ ID NO:1、3、5)和“1+1 IgG scFab， 单臂倒置”(参见SEQ ID NO:7、9、11)构建体(50nM)与Jurkat细胞上表达的CD3(A) 或与Colo-38细胞上的MCSP(B)结合。与用参比抗CD3或抗MCSP IgG(如所示)处 理的细胞、未处理的细胞和仅用第二抗体染色的细胞相比，绘制平均荧光强度。
图22：“2+1 IgG scFab，LALA”(参见SEQ ID NO:5、17、19)双特异性构建体 和相应的抗MCSP IgG与Colo-38细胞上的MCSP的剂量依赖性结合，如通过FACS 所测量。
图23：与1nM的“2+1 IgG scFab，LALA”(参见SEQ ID NO:5、17、19)或 “(scFv)2”CD3-MCSP双特异性构建体在Colo-38肿瘤靶细胞存在或不存在下温育后， 人T细胞上不同活化标志物的表面表达水平，如所示(PBMC对肿瘤细胞的E:T比率 ＝10:1)。描述了分别15小时或24小时温育后CD8+T细胞上早期活化标志物CD69(A) 或晚期活化标志物CD25(B)的表达水平。
图24：与1nM的“2+1 IgG scFab，LALA”(参见SEQ ID NO:5、17、19)或 “(scFv)2”CD3-MCSP双特异性构建体在Colo-38肿瘤靶细胞存在或不存在下温育后， 人T细胞上晚期活化标志物CD25的表面表达水平，如所示(E:T比率＝5:1)。描述 了5天温育后CD8+T细胞(A)上或CD4+T细胞(B)上晚期活化标志物CD25的表达水 平。
图25：在表达人MCSP的MV-3肿瘤靶细胞(E:T比率＝3:1)存在或不存在下与 所示浓度的“2+1 IgG Crossfab”双特异性构建体(靶向食蟹猴CD3和人MCSP；参见 SEQ ID NO:3、5、35、37)温育43小时后，晚期活化标志物CD25在来自两只不同 动物(cyno Nestor，cynoNobu)的食蟹猴CD8+T细胞上的表面表达水平。作为对照， 使用参比IgG(抗食蟹猴CD3 IgG，抗人MCSP IgG)或非生理刺激物PHA-M。
图26：在U87MG肿瘤细胞(E:T比率＝5:1)存在下被“2+1 IgG scFab， LALA”CD3-MCSP双特异性构建体(参见SEQ ID NO:5、17、19)活化18.5小时的人 泛T细胞分泌的IFN-γ水平。作为对照，施用相应的抗CD3 IgG和抗MCSP IgG。
图27：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养并由不同浓度的“2+1 IgG scFab”(参见SEQ ID NO:5、21、23)、“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、29、33) 和“(scFv)2”双特异性分子和相应IgG活化20小时情况下对MDA-MB-435肿瘤细胞的 杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。
图28：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养并由不同浓度的双特异性构建体和 相应IgG活化20小时情况下对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放 所测量)。比较了差异在于其Fc结构域(具有野生型Fc结构域(参见SEQ ID NO:5、 13、15)，或经突变以取消(NK)效应细胞功能的Fc结构域：P329G LALA(参见SEQ ID NO:5、21、23)、P329G LALAN297D(参见SEQ ID NO:5、25、27))的“2+1 IgG scFab” 构建体和“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、29、33)构建体。
图29：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养情况下对Colo-38肿瘤细胞的杀伤 作用(如通过LDH释放所测量)，所述人泛T细胞用CD3-MCSP双特异性“2+1 IgG scFab，LALA”(参见SEQ ID NO:5、17、19)构建体、“(scFv)2”分子或相应的IgG处 理18.5小时。
图30：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养情况下对Colo-38肿瘤细胞的杀伤 作用(如通过LDH释放所测量)，所述人泛T细胞用CD3-MCSP双特异性“2+1 IgG scFab，LALA”(参见SEQ ID NO:5、17、19)构建体、“(scFv)2”分子或相应的IgG处 理18小时。
图31：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养并由不同浓度的CD3-MCSP双特异 性“2+1 IgG scFab，LALA”(参见SEQ ID NO:5、17、19)构建体、“(scFv)2”分子或相 应IgG活化23.5小时情况下对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放 所测量)。
图32：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养并由不同浓度的CD3-MCSP双特异 性“1+1 IgG scFab，单臂”(参见SEQ ID NO:1、3、5)、“1+1 IgG scFab，单臂倒置”(参 见SEQ IDNO:7、9、11)或“(scFv)2”构建体或相应IgG活化19小时情况下，对Colo-38 肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。
图33：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养情况下对Colo-38肿瘤细胞的杀伤 作用(如通过LDH释放所测量)，所述人泛T细胞用“1+1 IgG scFab”CD3-MCSP双特 异性构建体(参见SEQ ID NO:5、21、213)或“(scFv)2”分子处理20小时。
图34：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养并由不同浓度的双特异性构建体和 相应IgG活化21小时情况下对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放 所测量)。比较了CD3-MCSP双特异性“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、 29、33)和“1+1 IgGCrossfab”(参见SEQ ID NO:5、29、31、33)构建体、“(scFv)2” 分子和相应的IgG。
图35：通过用135ng/ml或1.35ng/ml“2+1 IgG Crossfab”CD3-MCSP双特异性 构建体(参见SEQ ID NO:3、5、29、33)活化人T细胞(E:T比率＝25:1)所诱导的对 不同靶细胞(MCSP阳性Colo-38肿瘤靶细胞、衍生自骨髓或脂肪组织的间充质干细 胞，或来自胎盘的周细胞；如所示)的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。
图36：与人PBMC和不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1 IgG scFab， LALA”(参见SEQ ID NO:5、17、19)和“(scFv)2”)或糖工程化抗MCSP IgG(GlycoMab) 共培养时，21小时温育过夜后测量的对Colo-38肿瘤靶细胞的杀伤作用(如通过LDH 释放所测量)。效应细胞对靶细胞比率设置在25:1(A)，或如所述变动(B)。PBMC从新 鲜血液(A)或从暗黄覆盖层(B)分离。
图37：靶向食蟹猴CD3和人MCSP的“2+1 IgG Crossfab”构建体，(参见SEQ ID NO:3、5、35、37)的时间依赖性细胞毒效应。描述了与原代食蟹猴PBMC(E:T比率 ＝3:1)共培养24小时或43小时时来自表达人MCSP的MV-3细胞的乳酸脱氢酶释放 量。作为对照，使用相同体积摩尔浓度的参比IgGs(抗cynoCD3 IgG和抗人MCSP IgG)。PHA-M充当T细胞活化(非生理性)的对照。
图38：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养情况下，对huMCSP阳性MV-3黑 素瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人PBMC用不同的 CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、29、33) 和“(scFv)2”)处理约26小时。
图39：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养情况下，对EGFR阳性LS-174T肿 瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人泛T细胞用不同的CD3-EGFR 双特异性构建体(“2+1 IgG scFab”(参见SEQ ID NO:45、47、53)、“1+1 IgG scFab”(参 见SEQ ID NO:47、53、213)和“(scFv)2”)或参比IgG处理18小时。
图40：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养情况下，对EGFR阳性LS-174T肿 瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人泛T细胞用不同的CD3-EGFR 双特异性构建体(“1+1 IgG scFab，单臂”(参见SEQ ID NO:43、45、47)、“1+1 IgG scFab，单臂倒置”(参见SEQ ID NO:11、49、51)、“1+1 IgG scFab”(参见SEQ ID NO: 47、53、213)和“(scFv)2”)或参比IgG处理21小时。
图41：与人泛T细胞(A)或人幼稚T细胞(B)共培养情况下，对EGFR阳性LS-174T 肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人泛T细胞或人幼稚T细胞 用不同的CD3-EGFR双特异性构建体(“1+1 IgG scFab，单臂”(参见SEQ ID NO:43、 45、47)、“1+1 IgGscFab，单臂倒置”(参见SEQ ID NO:11、49、51)和“(scFv)2”)或 参比IgG处理16小时。效应细胞对靶细胞比率是5:1。
图42：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养情况下，对FAP阳性GM05389成 纤维细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人泛T细胞用不同的 CD3-FAP双特异性构建体(“1+1 IgG scFab，单臂倒置”(参见SEQ ID NO:11、51、 55)、“1+1 IgG scFab”(参见SEQID NO:57、61、213)、“2+1 IgG scFab”(参见SEQ ID NO:57、59、61)和“(scFv)2”)处理约18小时。
图43：CD8+T细胞中CD107a/b表达水平以及穿孔素水平的流式细胞分析，其中 所述CD8+T细胞已经用不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1 IgG scFab，LALA” (参见SEQID NO:5、17、19)和“(scFv)2”)或相应的对照IgG在靶细胞存在(A)或不存 在(B)下处理6小时。将人泛T细胞与9.43nM的不同分子在Colo-38肿瘤靶细胞存 在或不存在下按效应细胞对靶细胞比率5:1温育。在第1小时温育后添加莫能菌素以 通过防止蛋白质运输而增加胞内蛋白水平。如所述，对全部CD107a/b阳性细胞、穿 孔素阳性细胞或双阳性细胞设门。
图44：与1nM不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1 IgG scFab，LALA”(参 见SEQID NO:5、17、19)或“(scFv)2”)或相应对照IgG在Colo-38肿瘤靶细胞存在或 不存在下按效应细胞对靶细胞比率5:1温育时，CD8+(A)或CD4+(B)人T细胞的相对 增殖。CFSE标记的人泛T细胞通过FACS表征。通过围绕非增殖性细胞设门并且相 对作为参考的实测总细胞数目而利用这种设门情况下的细胞数目，确定相对增殖水 平。
图45：用1nM不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1 IgG scFab，LALA”(参 见SEQID NO:5、17、19)或“(scFv)2”)或相应的对照IgG在Colo-38肿瘤细胞存在(A) 或不存在下(B)处理24小时后，人PBMC的上清液中测量的不同细胞因子水平。效应 细胞对靶细胞比率是10:1。
图46：用1nM不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1 IgG scFab”、“2+1 IgGCrossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、29、33)或“(scFv)2”)或相应的对照IgG在Colo-38 肿瘤细胞存在(A、B)或不存在(C、D)下处理24小时后，全血的上清液中测量的不同 细胞因子水平。在双特异性构建体当中存在不同的“2+1 IgG scFab”构建体，所述构建 体具有野生型Fc结构域(参见SEQ ID NO:5、13、15)或经突变以取消(NK)效应细胞 功能的Fc结构域(LALA(参见SEQ ID NO:5、17、19)、P329G LALA(参见SEQ ID NO:5、2、23)和P329G LALA N297D(参见SEQ ID NO:5、25、27))。
图47：CE-SDS分析。作为2+1 IgG Crossfab，连接的轻链(参见SEQ ID NO:3、 5、29、179)的SDS PAGE显示的电泳图。(泳道1：还原，泳道2：非还原)。
图48：2+1 IgG Crossfab，连接的轻链(参见SEQ ID NO:3、5、29、179)(终产 物)的分析性大小排阻色谱。注入20μg样品。
图49：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养情况下，对MCSP阳性MV-3肿瘤 细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人PBMC用不同的CD3-MCSP 双特异性构建体(“2+1IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、29、33)和“2+1 IgG Crossfab，连接的LC”(参见SEQID NO:3、5、29、179))处理约44小时。从健康志 愿者的新鲜血液分离人PBMC。
图50：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养情况下，对MCSP阳性Colo-38肿瘤 细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人PBMC用不同的CD3-MCSP 双特异性构建体(“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、29、33)和“2+1 IgG Crossfab，连接的LC”(参见SEQID NO:3、5、29、179))处理约22小时。从健康志 愿者的新鲜血液分离人PBMC。
图51：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养情况下，对MCSP阳性Colo-38肿瘤 细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人PBMC用不同的CD3-MCSP 双特异性构建体(“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、29、33)和“2+1 IgG Crossfab，连接的LC”(参见SEQID NO:3、5、29、179))处理约22小时。从健康志 愿者的新鲜血液分离人PBMC。
图52：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养情况下，对MCSP阳性WM266-4 细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人PBMC用不同的CD3-MCSP 双特异性构建体(“2+1IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、29、33)和“2+1 IgG Crossfab，连接的LC”(参见SEQID NO:3、5、29、179))处理约22小时。从健康志 愿者的新鲜血液分离人PBMC。
图53：与10nM、80pM或3pM不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、29、33)和“2+1 IgG Crossfab，连接的LC”(参见 SEQ ID NO:3、5、29、179))在表达人MCSP的Colo-38肿瘤靶细胞存在或不存在下 (E:T比率＝10:1)温育22小时后，人CD8+T细胞上的早期活化标志物CD69(A)和晚 期活化标志物CD25(B)的表面表达水平。
图54：CE-SDS分析。(A)作为1+1 IgG Crossfab；VL/VH交换(LC007/V9)(参见 SEQID NO:5、29、33、181)的SDS-PAGE显示的电泳图：a)非还原，b)还原。(B) 作为1+1CrossMab；CL/CH1交换(LC007/V9)(参见SEQ ID NO:5、23、183、185) 的SDS-PAGE显示的电泳图：a)还原，b)非还原。(C)作为2+1 IgG Crossfab，倒置； CL/CH1交换(LC007/V9)(参见SEQ ID NO:5、23、183、187)：a)还原，b)非还原的 SDS-PAGE显示的电泳图。(D)作为2+1 IgG Crossfab；VL/VH交换(M4-3 ML2/V9)(参 见SEQ ID NO:33、189、191、193)的SDS-PAGE显示的电泳图：a)还原，b)非还原。 (E)作为2+1 IgG Crossfab；CL/CH1交换(M4-3 ML2/V9)(参见SEQ IDNO:183、189、 193、195)的SDS-PAGE显示的电泳图：a)还原，b)非还原。(F)作为2+1 IgGCrossfab， 倒置；CL/CH1交换(CH1A1A/V9)(参见SEQ ID NO:65、67、183、197)的SDS-PAGE显示的电泳图：a)还原，b)非还原。(G)作为2+1 IgG Crossfab；CL/CH1交换(M4-3 ML2/H2C)(参见SEQ ID NO:189、193、199、201)的SDS-PAGE显示的电泳图：a) 还原，b)非还原。(H)作为2+1 IgG Crossfab，倒置；CL/CH1交换(431/26/V9)(参见 SEQ ID NO:183、203、205、207)的SDS-PAGE显示的电泳图：a)还原，b)非还原。 (I)作为“2+1 IgG Crossfab轻链融合物”(CH1A1A/V9)(参见SEQ ID NO:183、209、 211、213)的SDS-PAGE显示的电泳图：a)还原，b)非还原。(J)“2+1 IgG Crossfab”(抗 MCSP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:5、23、215、217)的SDSPAGE(4-12％Bis/Tris， NuPage Invitrogen，考马斯染色)，非还原(左)和还原(右)。(K)作为“2+1 IgG Crossfab， 倒置”(抗MCSP/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:5、23、215、219)的SDS-PAGE显示 的电泳图：a)还原，b)非还原。(L)“1+1 IgG Crossfab”(抗CD33/抗huCD3)(参见SEQ ID NO:33、213、221、223)的SDS PAGE(4-12％Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马 斯染色)，非还原(左)和还原(右)。(M)“2+1 IgG Crossfab”(抗CD33/抗huCD3)(参见 SEQ IDNO:33、221、223、225)的SDS PAGE(4-12％Bis/Tris，NuPage Invitrogen， 考马斯染色)，非还原(左)和还原(右)。(N)“2+1 IgG Crossfab”(抗CD20/抗huCD3)(参 见SEQ ID NO:33、227、229、231)的非还原SDS PAGE(4-12％Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。
图55：双特异性构建体(CEA/CD3“2+1 IgG Crossfab，倒置(VL/VH)”(参见SEQ IDNO:33、63、65、67)和“2+1 IgG Crossfab，倒置(CL/CH1)
2(参见SEQ ID NO:65、67、183、197))与Jurkat细胞表达的人CD3的结合(A) 或与LS-174T细胞表达的人CEA的结合(B)，如通过FACS所确定。作为对照，也评 估参比IgG的等价最大浓度和因标记第二抗体(山羊抗人FITC缀合的亲和纯F(ab’)2片段，Fcγ片段特异性，Jackson Immuno Research Lab#109-096-098)所致的背景染色。
图56：双特异性构建体(MCSP/CD3“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、 29、33)和“2+1 IgG Crossfab，倒置”(参见SEQ ID NO:5、23、183、187))与Jurkat 细胞表达的人CD3的结合(A)或与WM266-4肿瘤细胞表达的人MCSP的结合(B)，如 通过FACS所确定。
图57：“1+1 IgG Crossfab轻链融合物”(参见SEQ ID NO:183、209、211、213) 与Jurkat细胞表达的人CD3的结合(A)或与LS-174T细胞表达的人CEA的结合(B)， 如通过FACS所确定。
图58：“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:5、23、215、217)和“2+1 IgGCrossfab，倒置”(参见SEQ ID NO:5、23、215、219)构建体与Jurkat细胞表达的人 CD3的结合(A)或WM266-4肿瘤细胞表达的人MCSP的结合(B)，如通过FACS所确 定。
图59：与所示浓度的CD3/MCSP“1+1CrossMab”(参见SEQ ID NO:5、23、183、 185)，“1+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:5、29、33、181)和“2+1 IgG Crossfab”(参 见SEQ IDNO:3、5、29、33)构建体温育24小时后，人CD4+或CD8+T细胞上早期 活化标志物CD69(A)或晚期活化标志物CD25(B)的表面表达水平。如所示，该测定法 在MV-3靶细胞存在或不存在下进行。
图60：在huMCSP阳性MV-3肿瘤细胞存在或不存在时与食蟹猴PBMC(E:T比 率＝3:1，归一化为CD3+数目)共培养情况下，来自两不同食蟹猴(A和B)的CD4+或 CD8+T细胞上早期活化标志物CD25的表面表达水平，其中所述的食蟹猴PBMC用 “2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:5、23、215、217)和“2+1 IgG Crossfab，倒置” (参见SEQ ID NO:5、23、215、219)处理约41小时。
图61：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养并且相对于“2+1 IgG Crossfab，倒置(CL/CH1)”(参见SEQ ID NO:65、67、183、197)构建体，由不同浓度的“2+1 IgG Crossfab，倒置(VL/VH)”(参见SEQ ID NO:33、63、65、67)活化28小时情况下， 对肿瘤细胞MKN-45(A)或LS-174T(B)的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。
图62：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养并且相对于“2+1 IgG Crossfab (CL/CH1)”(参见SEQ ID NO:183、189、193、195)构建体，由不同浓度的“2+1 IgG Crossfab(VL/VH)”(参见SEQ ID NO:33、189、191、193)活化26小时情况下，对肿 瘤细胞WM266-4的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。
图63：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养并且相对于“2+1 IgG Crossfab (CL/CH1)”(参见SEQ ID NO:183、189、193、195)构建体，由不同浓度的“2+1 IgG Crossfab(VH/VL)”(参见SEQ ID NO:33、189、191、193)活化27小时情况下，对肿 瘤细胞MV-3的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。
图64：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养并且由不同浓度的“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、29、33)、“1+1CrossMab”(参见SEQ ID NO:5、 23、183、185)，和“1+1IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:5、29、33、181)活化21小 时情况下，对人MCSP阳性WM266-4(A)或MV-3(B)肿瘤细胞的杀伤作用(如通过 LDH释放所测量)，如所示。
图65：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养并且由不同浓度的“1+1 IgG CrossfabLC融合物”(参见SEQ ID NO:183、209、211、213)活化28小时情况下，对肿瘤细 胞MKN-45(A)或LS-174T(B)的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。
图66：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养并且相对于非靶向的参比“2+1 IgGCrossfab”，由不同浓度的“1+1 IgG Crossfab LC融合物”(参见SEQ ID NO:183、209、 211、213)活化24小时情况下，对MC38-huCEA肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH 释放所测量)。
图67：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养情况下，对人MCSP阳性MV-3(A) 或WM266-4(B)肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)，所述的人PBMC用 “2+1 IgG Crossfab(V9)”(参见SEQ ID NO:3、5、29、33)和“2+1 IgG Crossfab，倒 置(V9)”(参见SEQ ID NO:5、23、183、187)、“2+1 IgG Crossfab(抗CD3)”(参见SEQ ID NO:5、23、215、217)和“2+1 IgGCrossfab，倒置(抗CD3)”(参见SEQ ID NO:5、 23、215、219)构建体处理。
图68：MCSP TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置)分子的示意图。
图69：MCSP TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置，SEQ ID NO:278、319、 320、321)的CE-SDS分析。作为MCSP TCB的SDS-PAGE显示的电泳图：A)非还 原，B)还原。
图70：MCSP TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置，SEQ ID NO:278、319、 320、321)的分析性大小排阻色谱，色谱图A280(TSKgel G3000 SW XL[Tosoh]；25mM K2HPO4，125mM NaCl，200mM L-精氨酸单盐酸盐，0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7； 注入20μg样品。
图71：CEA TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置)分子的示意图。
图72：CEA TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置，SEQ ID NO:288、322、 323、324))分子的CE-SDS分析。作为CEA TCB的SDS-PAGE显示的电泳图：A) 非还原，B)还原。
图73：CEA TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置，SEQ ID NO:288、322、 323、324))分子的分析性大小排阻色谱，色谱图A280(TSKgel G3000 SW XL[Tosoh]； 25mMK2HPO4，125mM NaCl，200mM L-精氨酸单盐酸盐，0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7；注入20μg样品。
图74：MCSP TCB(SEQ ID NO:278、319、320、321)与A375细胞(MCSP+)(A) 和Jurkat(CD3+细胞)(B)的结合。“非靶向的TCB”：接合CD3但是不接合第二抗原 的双特异性抗体。
图75：对A375(高MCSP)(A)、MV-3(中等MCSP)(B)、HCT-116(低MCSP)(C) 和LS180(MCSP阴性)(D)靶细胞，由MCSP TCB抗体(SEQ ID NO:278、319、320、 321)诱导的T细胞杀伤作用(E:T＝10:1，效应细胞人PBMC，温育时间24小时)。“非 靶向的TCB”：接合CD3但是不接合第二抗原的双特异性抗体。
图76：在MCSP TCB抗体(SEQ ID NO:278、319、320、321)诱导T细胞介导 杀伤MV3黑素瘤细胞(E:T＝10:1，24小时温育)后，人CD8+(A、B)和CD4+(C、D)T 细胞上的CD25和CD69上调。“非靶向的TCB”：接合CD3但是不接合第二抗原的 双特异性抗体。
图77：在MCSP TCB抗体(SEQ ID NO:278、319、320、321)诱导T细胞介导 杀伤MV3黑素瘤细胞(E:T＝10:1，24小时温育)后，人PBMC分泌IL-2(A)、IFN-γ(B)、 TNFα(C)、IL-4(D)、IL-10(E)和粒酶B(F)。“非靶向的TCB”：接合CD3但是不接合 第二抗原的双特异性抗体。
图78：CEA TCB(SEQ ID NO:288、322、323、324)与LS180(中等CEA肿瘤细 胞)(A)和Jurkat(CD3+细胞)(B)的结合。
图79：对MKN45(高CEA)(A)、LS180(中等CEA)(B)、HT-29(低CEA)(C)，由 CEA TCB(SEQ ID NO:288、322、323、324)诱导的T细胞杀伤作用(E:T＝10:1，效 应细胞人PBMC，温育时间24小时)。“非靶向的TCB”：接合CD3但是不接合第二 抗原的双特异性抗体。
图80：在CEA TCB(SEQ ID NO:288、322、323、324)诱导T细胞介导杀伤LS180 结肠腺癌细胞(E:T＝10:1，24小时温育)后，人CD8+(A、B)和CD4+(C、D)T细胞上 的CD25和CD69上调。“非靶向的TCB”：接合CD3但是不接合第二抗原的双特异 性抗体。
图81：在CEA TCB(SEQ ID NO:288、322、323、324)诱导T细胞介导杀伤LS180 结肠腺癌细胞(E:T＝10:1、24小时温育)后，IFN-γ(A)、TNFα(B)、粒酶B(C)、IL-4(D)、 IL-10(E)的分泌。“非靶向的TCB”：接合CD3但是不接合第二抗原的双特异性抗体。
图82：含有DP47 GS作为非结合性抗体并含有人源化CH2527作为抗CD3抗体 的DP47 GS TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置＝“非靶向的TCB”，SEQ ID NO:325、326、327、328)的CE-SDS分析。作为DP47 GS TCB的SDS-PAGE显示 的电泳图：A)非还原，B)还原。
图83：含有DP47 GS作为非结合性抗体并含有人源化CH2527作为CD3抗体的 DP47GS TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置“非靶向的TCB”，SEQ ID NO: 325、326、327、328)的分析性大小排阻色谱，色谱图A280(TSKgel G3000 SW XL [Tosoh]；25mM K2HPO4，125mM NaCl，200mM L-精氨酸单盐酸盐， 0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7；注入20μg样品。
图84：与未成熟的亲本克隆(M4-3 ML2)相比，亲和力成熟的抗MCSP克隆的比 对结果。
图85：aVH TCB分子的图示。
图86：CE-SDS分析。作为aVH TCB(SEQ ID NO:369、370、371)的SDS-PAGE 显示的电泳图：A)非还原，B)还原。
图87：aVH TCB(SEQ ID NO:369、370、371)与MV-3细胞(MCSP+)(A)和 Jurkat(CD3+细胞)(B)的结合。
图88：在温育后24小时(A)和48小时(B)检测到的对MV-3黑素瘤细胞由aVH TCB抗体(SEQ ID NO:369、370、371)诱导的T细胞杀伤作用(E:T＝10:1，效应细胞 人PBMC)。
图89：Darpin TCB分子的图示。
图90：CE-SDS分析。作为DarpinTCB(SEQ ID NO:376、377、378)的SDS-PAGE 显示的电泳图：A)非还原，B)还原。
图91：Darpin TCB与KPL-4细胞(Her2+)(A)和Jurkat(CD3+细胞)(B)的结合。
图92：在温育后24小时(A)和48小时(B)检测到的对KPL-4细胞由Darpin TCB 抗体(SEQ ID NO:376、377、378)诱导的T细胞杀伤作用(E:T＝10:1，效应细胞人 PBMC)。
图93：hIgG1 DDKK TCB分子的图示。
图94：CE-SDS分析。作为hIgG1 DDKK TCB(SEQ ID NO:372、373、374、375) 的SDS-PAGE显示的电泳图：A)非还原，B)还原。
图95：hIgG1 DDKK TCB(SEQ ID NO:372、373、374、375)与MV-3黑素瘤细 胞(MCSP+)(A)和Jurkat(CD3+细胞)(B)的结合。
图96：在温育后24小时(A)和48小时(B)检测到的对MV-3(中等MCSP)由hIgG1 DDKKTCB抗体(SEQ ID NO:372、373、374、375)诱导的T细胞杀伤作用(E:T＝10:1， 效应细胞人PBMC)。
发明详述
定义
除非下文中另外定义，否则术语如本领域通常所用那样在本文使用。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广意义上指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的例子是免疫球蛋白和其衍生物，例如其片段。
术语“双特异性”意指抗原结合分子能够与至少两个不同的抗原决定簇特异性结合。一般地，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，每个抗原结合位点对不 同的抗原决定簇特异。在某些实施方案中，双特异性抗原结合分子是能够同时结合两 个抗原决定簇，尤其两个不同细胞上表达的两个抗原决定簇。
如本文所用的术语“价”指抗原结合分子中存在特定数目的抗原结合位点。因而，术语“与一种抗原单价结合”指抗原结合分子中存在一个(和不多于一个)对该抗原特异 的抗原结合位点。
“抗原结合位点”涉及一个抗原结合分子中提供与抗原相互作用的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补决定区(CDR)的氨基酸残 基。一个天然免疫球蛋白分子一般具有两个抗原结合位点，一个Fab分子一般具有单 个抗原结合位点。
如本文所用，术语“抗原结合部分”指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个实施方案中，抗原结合部分能够将与之连接的实体(例如第二抗原结合部分)引向靶 部位，例如引向携带抗原决定簇的特定类型肿瘤细胞或肿瘤基质。在另一个实施方案 中，抗原结合部分能够经靶抗原(例如T细胞受体复合物抗原)激活信号传导。抗原结 合部分包含抗体及其片段，以及如本文进一步限定的结合蛋白和支架。特定抗原结合 部分包含抗体的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含抗体重链可变区和抗体轻 链可变区。其他抗原结合部分包含一种结合蛋白，所述结合蛋白包含至少一个锚蛋白 重复基序和单结构域抗原结合(SDAB)分子。
在某些实施方案中，抗原结合部分可以包含如本文进一步限定和本领域已知的抗体恒定区。可用重链恒定区包括以下五个同种型的任一种：α、δ、ε、γ或μ。有用的 轻链恒定区包括以下两个同种型的任一种：κ和λ。
如本文所用，术语“抗原决定簇”同义于“抗原”和“表位”并且指多肽大分子上与抗原结合部分结合，形成抗体抗原结合部分-抗原复合物的位点(例如一段连续氨基酸或 由不同区域的不连续氨基酸构成的构象构型)。有用的抗原决定簇可以存在于例如肿 瘤细胞表面上、病毒感染细胞表面上、其他患病的细胞表面上、免疫细胞表面上找到、 游离于血清中，和/或在存在于胞外基质(ECM)中。除非另外说明，否则本文中称作抗 原的蛋白质(例如MCSP、FAP、CEA、EGFR、CD33、CD3)可以是来自任何脊椎动 物来源(包括哺乳动物如灵长类(例如人类)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任何天然形 式的蛋白质。在一个具体实施方案中，抗原是人蛋白质。在提到本文中具体蛋白质的 情况下，本术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质以及因细胞中加工产生的任何形式的蛋 白质。本术语还涵盖天然存在的蛋白质，例如，剪接变体或等位变体。可用作抗原的 示例性人蛋白质包括但不限于：黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，也称作 硫酸软骨素蛋白聚糖4(UniProt编号Q6UVK1(第70版)，NCBI RefSeq no. NP_001888.2)；成纤维细胞活化蛋白(FAP)，也称作Seprase(UniProt编号Q12884，Q86Z29、Q99998、NCBI登录号NP_004451)；癌胚抗原(CEA)，也称作癌胚抗原相 关的细胞黏附分子5(UniProt编号P06731(第119版)，NCBI RefSeq no.NP_004354.2)； CD33，也称作gp67或Siglec-3(UniProt编号P20138，NCBI登录号NP_001076087， NP_001171079)；表皮生长因子受体(EGFR)，也称作ErbB-1或Her1(UniProt编号 P0053，NCBI登录号NP_958439，NP_958440)，和CD3，尤其CD3ε亚基(参见UniProt 编号P07766(第130版)，NCBINCBIRefSeq no.NP_000724.1，人序列SEQ ID NO: 265；或UniProt编号Q95LI5(第49版)，NCBIGenBank no.BAB71849.1，食蟹猴 [Macaca fascicularis]序列SEQ ID NO:266)。在某些实施方案中，本发明的T细胞活 化性双特异性抗原结合分子与来自不同物种的T细胞活化抗原或靶抗原之间保守的T 细胞活化抗原表位或靶细胞抗原表位结合。
如本文所用，术语“特异性结合”意指结合作用对抗原具有选择性并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合部分与特定抗原决定簇结合的能力可以通过 酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术，例如表面等离子体共 振(SPR)技术(在BIAcore仪上分析)(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000))和常规 结合测定法(Heeley，Endocr Res 28,217-229(2002))测量。在一个实施方案中，抗原 结合部分与不相关蛋白质结合的程度小于抗原结合部分与抗原结合的程度约10％，如 通过SPR测量。在某些实施方案中，与抗原结合的抗原结合部分或包含该抗原结合 部分的抗原结合分子具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM 或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如，从10-9M至10-13M) 的解离常数(KD)。
“亲和力”指分子(例如，受体)的单一结合位点及其结合配偶体(例如，配体)之间非共价相互作用的强度总和。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映 结合对子的成员(例如，抗原结合部分和抗原，或受体和其配体)之间1:1相互作用的 固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力可以通常由解离常数(KD)代表，解 离常数是解离速率常数和缔合速率常数(分别是koff和kon)的比例。因此，等同亲和力 可以包含不同的速率常数，只要速率常数的比例保持相同即可。亲和力可以由本领域 已知的既定方法测量，包括本文所述的那些方法。用于测量亲和力的具体方法是表面 等离子体共振法(SPR)。
“减少的结合作用”，例如减少的Fc受体结合作用，指相应相互作用的亲和力下降，如通过例如SPR测量。为清晰起见，该术语还包括亲和力减少到零(或低于分析 方法的检测限)，即相互作用完全消除。相反，“增加的结合作用”指相应相互作用的 结合亲和力增加。
如本文所用，“T细胞活化抗原”指在T淋巴细胞、特别地细胞毒T淋巴细胞的表 面上表达的抗原决定簇，其中与抗原结合分子相互作用时，所述抗原决定簇能够诱导 T细胞活化。具体而言，抗原结合分子与T细胞活化抗原相互作用可以通过触发T细 胞受体复合物的信号传导级联，诱导T细胞活化。在一个具体实施方案中，T细胞活 化抗原是CD3。
如本文所用，“T细胞活化”指T淋巴细胞、特别地细胞毒T淋巴细胞的一种或多 种细胞反应，所述细胞反应选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒效应分子释放、 细胞毒活性和活化标志物表达。活化T细胞的本发明双特异性抗原结合分子能够诱导 T细胞活化。测量T细胞活化的合适测定法是本领域已知和本文所述的。
如本文所用，“靶细胞抗原”指呈递在靶细胞(例如肿瘤中的细胞，如癌细胞或肿瘤基质的细胞)表面上的抗原决定簇。
如本文所用，当存在多于一个每种类型的部分时，相对于抗原结合部分等而言，使用术语“第一”和“第二”便利区分。使用这些术语不意在赋予T细胞活化性双特异性 抗原结合分子的特定顺序或方向，除非明确地如此陈述。
“Fab分子”指由免疫球蛋白重链(“Fab重链”)的VH结构域和CH1结构域及其轻 链(“Fab轻链”)的VL结构域和CL结构域的组成的蛋白质。
“融合”意指各组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)直接或通过一个或多个肽接头由肽键连接。
“交换Fab分子(也称作“Crossfab”)意指一种Fab分子，其中Fab重链和轻链的 可变区或恒定区交换，即交换Fab分子包含由轻链可变区和重链恒定区组成的肽链， 和由重链可变区和轻链恒定区组成的肽链。为了清晰，在其中Fab轻链和Fab重链 的可变区交换的交换Fab分子中，包含重链恒定区的肽链在本文中称作交换Fab分 子的“重链”。相反，在其中Fab轻链和Fab重链的恒定区交换的交换Fab分子中， 包含重链可变区的肽链在本文中称作交换Fab分子的“重链”。
术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是由二硫键结合的两条轻链和两条重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖 蛋白。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重链域或重链可 变域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，也称作重链恒定区。类似地，从 N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链域或轻链可变域，随后 一个恒定轻链(CL)结构域，也称作轻链恒定区。免疫球蛋白的重链可以归属5个类之 一，称作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某个类可以划分成亚类， 例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻 链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类之一，称作κ和λ。免疫球蛋 白基本上由借助免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、 F(ab')2、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)和单结构域抗体。关于某些 抗体片段的综述，参见Hudson等人,Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综 述，参见例如Plückthun,引自The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113 卷,Rosenburg和Moore编著,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)；还 参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含救援受体(salvage receptor)结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')2片段的讨论，见美 国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述两个抗原结 合位点可以是双价或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson 等人,Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体还在Hudson等人,Nat Med 9,129-134(2003) 中描述。单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变域或全部或一部分轻链可 变域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc., Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。可以通过多种技术产生抗体片段， 所述多种技术包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体以及由重组宿主细胞产生(例如， 大肠杆菌或噬菌体)，如本文所述。
术语“抗原结合结构域”指抗体的部分，所述部分包含与部分或完整抗原特异性结合并且与之互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也 称作抗体可变区)提供。特别地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重 链可变区(VH)。
术语“包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白”指如通过引用纳入本文的WO2002/020565和WO 2012069655所述的结合蛋白。这些结合蛋白也称作“DARPins”(设 计的锚蛋白重复序列蛋白的首字母缩略词)并且是以遗传方式工程化的抗体模拟蛋白 质，其通常显示高度特异性和高亲和力靶蛋白结合作用。它们衍生自天然锚蛋白并由 至少一个重复基序组成。Zahnd,C.等人,J.Mol.Biol.(2007)369,1015-1028中描述了 靶向HER2的包含至少一个锚蛋白重复基序的示例性结合蛋白。本发明中还包含其他 结合蛋白如基于纤连蛋白III型结构域的Adenctin、基于脂笼蛋白的抗运载蛋白 (Anticalin)、基于遍在蛋白的Affilins、基于转铁蛋白的Transbody、基于蛋白A结构 域的亲和体、基于四连接素结构域的TrimerX、基于Cys丰富结构域的MicroProtein、 基于FynSH3结构域的Fynomer、基于EGFRA结构域的高亲和性多聚体(Avimers)、 基于centyrin的Centyrin、基于Kuniz结构域的kalibitor和具有随机化结合区和抗 体样行为的其他支架蛋白。
术语“单结构域抗原结合分子”指由单个单体状抗体可变结构域组成的抗体片段，如(通过引用的方式完整并入本文的)EP 0656946中所述。如同完整抗体，它能够选择 性地与特定抗原结合。分子量仅为12–15kDa，单结构域抗体比两条蛋白质重链和两 条轻链组成的常见抗体(150–160kDa)的小得多，并且甚至小于Fab片段(约50kDa， 一条轻链和半条重链)和单链可变片段(约25kDa，两个可变结构域，一个来自轻链和 一个来自重链)。尤其，单结构域抗原结合分子是由一个可变结构域(VH)组成的单结 构域可变重链，也称作自动可变重链(aVH)抗体。这些肽对抗原具有与完整抗体相似 的亲和力，但是更耐热并且对去垢剂和高浓度脲更稳定。比较低的分子质量导致组织 中的通透性更好，并且导致短血浆半寿期，原因是它们以肾方式消除。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合至抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构 域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见，例如，Kindt等人,Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH结构域或 VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文中使用的，术语“超变区”或“HVR”指抗体可变结构域中序列高度变化和/或形成结构定义的环(“超变环”)的每个区域。通常，天然4链抗体包含六个HVR； VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/ 或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或参与抗原识 别。除了VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVRs) 也称作“互补决定区”(CDR)，并且在谈及可变区的形成抗原结合区的部分时，这些术 语在本文中可互换地使用。这种特定区域已经由Kabat等人,美国卫生和公众服务部 (U.S.Dept.of Health and Human Services)，Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)描述并且由Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述，其中所 述定义包括彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，谈及抗体或其变体的CDR 的任一个定义的应用意在处于如本文中定义和使用的术语范围内。作为比较，下文在 表A中描述了构成如上文所引用每篇参考文献所定义的CDR的适宜氨基酸残基。构 成特定CDR的确切残基数数目将根据该CDR的序列和尺寸变动。根据抗体的可变 区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基构成特定CDR。
表A.CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM<sup>2</sup>
V<sub>H</sub> CDR1 31-35 26-32 26-35
V<sub>H</sub> CDR2 50-65 52-58 50-58
V<sub>H</sub> CDR3 95-102 95-102 95-102
V<sub>L</sub> CDR1 24-34 26-32 24-34
V<sub>L</sub> CDR2 50-56 50-52 50-56
V<sub>L</sub> CDR3 89-97 91-96 89-97
1根据Kabat等人(见下文)所述的编号惯例对表A中全部CDR定义编号
2如表A中使用的具有小写体“b”的“AbM”指如Oxford Molecular“AbM”抗体建 模软件所定义的CDR。
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列编号体系。本领域普通技术人员可以毫无疑义地将这种Kabat编号体系应用至任何可变区序列，不依赖于除序列本 身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”指Kabat等人,美国卫生和公众 服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，"Sequences of Proteins ofImmunological Interest(目的免疫蛋白质的序列)"(1983)所述的编号体系。除非另外说明，否则根据Kabat编号体系提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号。
没有根据Kabat编号法系统对序列表的多肽序列编号。然而，将序列表的序列的编号转化成Kabat编号完全处于本领域普通技术人员的能力范围内。
“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR 通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR 序列通常按以下序列出现在VH(或VL)中： FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗体或免疫球蛋白的“类别”指其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个大类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划 分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类别抗体 或免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该定义包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区 的界限可能略微变动，但是通常将人IgG重链Fc区定义为从Cys226或从Pro230延 伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非 本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat等人, Sequences of Proteins ofImmunological Interes,第5版,Public Health Service, National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系，也称作EU 索引。如本文所用，Fc结构域的“亚基”指形成二聚体Fc结构域的两个多肽之一，即 包含免疫球蛋白重链C末端恒定区的能够稳定自我缔合的多肽。例如，IgG Fc结构 域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。
“促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰”是对肽主链的操作或对Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成 同型二聚体。如本文所用的促进缔合的修饰特别包括对需要缔合的两个Fc结构域亚 基(即Fc结构域的第一和第二亚基)各自所做的独立修饰，其中所述修饰彼此互补，从 而促进两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可以改变一个或两个Fc结 构域亚基的结构或电荷，从而使得它们的缔合分别在空间上或静电上有利。因此，(异) 二聚化在包含第一Fc结构域亚基的多肽和包含第二Fc结构域亚基的多肽之间发生， 这可能在与每种亚基融合的其他组分(例如抗原结合部分)并非相同的含义上是不同 的。在一些实施方案中，促进缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨 基酸置换。在一个具体实施方案中，促进缔合的修饰包含在Fc结构域的两个亚基的 各自亚基中的独立氨基酸突变，特别地是氨基酸置换。在一个实施方案中，促进Fc 结构域的第一和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如，如PCT 公开WO 2009/089004中所述。通常，这种方法涉及将两个Fc结构域亚基的界面处 的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而同型二聚体形成在静电上 变得不利，而异二聚化在静电上有利。
术语“效应子功能”指随抗体同种型变动的归因于抗体Fc区的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作 用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细 胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B 细胞受体)和B细胞活化。
如本文所用，术语“工程、工程化的、工程化”视为包含对肽主链的任何操作或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括修饰氨基酸序列、糖基 化模式或个别氨基酸的侧链基团，以及这些方案的组合。
如本文所用的术语“氨基酸突变”意在涵盖氨基酸置换、缺失、插入和修饰。可以作出置换、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体拥有 所需的特征，例如，与Fc受体结合减少或与另一种肽的缔合增加。氨基酸序列缺失 和插入包括氨基端和/或羧基端缺失及插入氨基酸。特定的氨基酸突变是氨基酸置换。 出于改变例如Fc区结合特征的目的，特别优选非保守氨基酸置换，即将一个氨基酸 替换为另一个具有不同结构特性和/或化学特性的氨基酸。氨基酸置换包括由非天然存 在的氨基酸替换或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域熟知的遗传方 法或化学方法产生氨基酸突变。遗传方法可以包括位点定向诱变、PCR、基因合成等。 构思了也可以使用通过除基因工程之外的方法(如化学修饰法)改变氨基酸侧链基团的 方法。多种名称可以在本文中用来指示相同的氨基酸突变。例如，从Fc结构域第329 位置处的脯氨酸置换成甘氨酸可以显示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
如本文所用，术语“多肽”指由酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”指具有两个或更多个氨基酸的任何链，并且不指特定长度的产物。 因此，“多肽”定义内部包含肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用来指 具有两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语，并且可以使用术语“多肽”替代这些术 语的任一个或与之互换使用。术语“多肽”还意在指表达后修饰该多肽的产物、所述表 达后修饰包括而不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护基团/封闭 基团衍生化、蛋白酶剪切、或由非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以衍生自天然生物 来源或通过重组技术产生，但是不必然地从所指定的核酸序列翻译而来。它可以按任 何方式产生，包括通过化学合成产生。本发明多肽可以具有约3个或更多个、5个或 更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更 多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个、或2,000 个或更多个氨基酸的大小。多肽可以具有确定的三维结构，不过它们并不必然地具有 这种结构。将具有确定三维结构的多肽称作折叠的，并且将不具备确定三维结构，但 是反而可以采取众多不同构象的多肽称作解折叠的。
“分离的”多肽或变体或其衍生物意指不处于其天然环境的多肽。不要求特定水平的纯化。例如，分离的多肽可以从其天生或天然环境取出。出于本发明的目的，将宿 主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质视为分离的，已经通过任何合适技术分离、 分级或部分或基本上纯化的天然或重组多肽也是如此。
相对于参考多肽序列，将“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同 一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百 分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式 实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现 正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用 序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算 机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559 的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从 Genentech,Inc.,South San Francisco,加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇 编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作系统(包括数字式UNIX V4.0D)上使用。 全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。在使用ALIGN-2比较氨基酸序 列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B 或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序 列B或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序 列A)的氨基酸序列同一性％：
100乘以分数X/Y
在X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配 的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸 序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将 不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全 部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒衍生 的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰 胺键，如肽核酸(PNA)中存在的那样。术语“核酸分子”指多核苷酸中存在的任一个或 多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已经从其天然环境取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，出于本发明目的，将载体中所含的编码多肽的重组多核苷酸视为分离的。 分离的多核苷酸的其他例子包括在异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或溶液中(部 分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括含于细胞内的多核苷酸分子，所 述细胞通常含有该多核苷酸分子，但是该多核苷酸分子存在于染色体外或与其天然染 色体位置不同的染色体位置处。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转 录物，以及正链和负链形式，和双链形式。本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合 成产生的这类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包含调节元件如启动子、核 糖体结合位点或转录终止子。
就核酸或多核苷酸具有与本发明的参考核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列而言，它意指除了该多核苷酸序列可以包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸 至多5个点突变之外，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列同一。换而言之，为了获 得具有与参考核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸，可以将参考序列中 至多5％的核苷酸缺失或用另一个核苷酸置换，或可以将参考序列中多个核苷酸直至 5％的总核苷酸插入参考序列中。参考序列的这些改变可以在参考核苷酸序列的5’或 3’端位置出现或在这些末端位置之间任何位置出现，个别地间插在参考序列中的残基 之间或间插在参考序列内部的一个或多个连续群组中。实际来看，可以常规地使用已 知的计算机程序，如上文对多肽讨论的那种(例如ALIGN-2)，确定任何特定多核苷酸 序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或 99％同一。
如本文中所用，术语“表达盒”指重组或合成地产生的多核苷酸，其具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的指定核酸元件。重组表达盒可以并入质粒、染色体、线 粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段。一般而言，表达载体的重组表达盒部分包 括待转录的核酸序列和启动子，连同其他序列。在某些实施方案中，本发明的表达盒 包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”同义于“表达构建体”并且指用来在靶细胞中引入与之有效结合的特定基因并指导其表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制型核酸结 构的载体以及并入已经将该载体引入其中的宿主细胞的基因组内的载体。本发明的表 达载体包含表达盒。表达载体允许转录大量的稳定mRNA。一旦表达载体处靶细胞内 部，通过细胞转录和/或翻译装置产生基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施 方案中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的双特异性抗原 结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”， 其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含 量含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文包括具有与最初转化细 胞中所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代。宿主细胞是可以用来产生本发 明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞、例如 培养的哺乳动物细胞、如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓 瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、 昆虫细胞和植物细胞，此处仅提到数种，其还包括含于转基因动物、转基因植物或培 养的植物组织或动物组织内部的细胞。
“活化性Fc受体”是这样的Fc受体，其中由抗体Fc结构域接合后，所述Fc受体 激发了刺激携带受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。人活化性Fc受体包括 FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致抗体包覆的靶细胞被免疫效应细胞裂解的免疫机制。靶细胞是(通常借助相对于Fc区为N末端的蛋白质部分)与包含 Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞。如本文所用，术语“减低的ADCC”定义 为在包围靶细胞的介质中在给定的抗体浓度，给定时间内借助以上定义的ADCC机 制溶解的靶细胞的数目减少和/或在包围靶细胞的介质中在给定时间内借助ADCC机 制实现给定数目的靶细胞裂解所需要的抗体浓度增加。ADCC减低是相对于相同抗体 所介导的ADCC而言，其中使用相同的标准产生、纯化、配制和储存方法(它们是本 领域技术人员已知的)，所述的相同抗体由相同类型宿主细胞产生，但是尚未工程化。 例如，在其Fc结构域中包含减低ADCC的氨基酸置换的抗体所介导的ADCC的减低 是相对于Fc结构域中无这个氨基酸置换的相同抗体所介导的ADCC而言。测量 ADCC的合适测定法是本领域熟知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT 专利申请号PCT/EP2012/055393)。
药剂的“有效量”指在对其施用该药物的细胞或组织中产生生理变化所需的量。
药剂(例如，药物组合物)的“治疗有效量”指有效实现所需治疗性或预防性结果的量、以实现前述结果的剂量和持续实现前述结果所需要的时间段。药剂的治疗有效量 例如消除、减少、延迟、最小化或防止疾病的不良作用。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、 绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠 和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒 的额外组分。
“可药用载体”指药物组合物中除有效成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，名词“治疗”(和其语法变型如动词“治疗”或分词“治疗”)指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入，并且可以旨在预防或在临床病理 学过程期间实施。想要的治疗效果包括，但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、 减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和 疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异 性抗原结合分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“包装插页”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包括的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途 之警告的信息。
实施方案的详述
T细胞活化性双特异性抗原结合分子样式
大多数抗体由两条重链和两条轻链组成。两条链对通常呈扁平或凹陷的抗原结合位点均有贡献。除这些常规抗体之外，羊驼、其他驼类(camelid)和鲨鱼还产生仅由重 链组成的抗体。这些异常重链抗体的抗原结合位点仅由称作VH(自动可变重链)或单 结构域可变重链的单结构域形成。单结构域可变重链作为重组蛋白容易地产生。单结 构域可变重链的其他有利特征包括它们的尺寸小、溶解度高、热稳定性、再折叠能力 和组织渗透作用良好。单结构域抗体例如在Wesolowski等人,Med Microbiol Immunol(2009)198:157–174中描述。产生单结构域可变重链抗体的方法例如在通过 引用方式完整并入本文的WO2012152823和WO 2012056000中描述。
这些单结构域可变重链抗体缺少轻链并且还可能缺少CH1结构域。因此，单结 构域可变重链抗体的抗原结合位点仅由单结构域形成。
单结构域抗原结合(SDAB)分子包括其互补决定区是单结构域多肽组成部分的分子。例子包括但不限于重链可变结构域、天然缺少轻链的结合分子、纳米体、衍生自 常规4链抗体的单结构域、除衍生自抗体的那些之外的工程化结构域和单结构域支架。 SDAB分子可以是现有技术的任何分子，或将来的任何单结构域分子。SDAB分子可 以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、羊驼、鱼类、鲨鱼、山羊、兔和 牛。这个术语还包括来自骆驼和鲨鱼之外的物种中的天然存在的单结构域抗体分子。
在一个方面，SDAB分子可以衍生自鱼类中存在的免疫球蛋白的可变区，例如， 从鲨鱼血清中存在的称作新抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型衍生的那种可变区。 产生从NAR可变区衍生的单结构域分子(“IgNAR”)的方法在WO 03/014161和 Streltsov(2005)Protein Sci.14:2901-2909中描述。
根据另一个方面，SDAB分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，称作缺少轻 链的重链。这类单结构域分子例如在WO 9404678和Hamers-Casterman,C.等人, (1993)Nature 363:446-448中公开。出于清晰的目的，从天然缺少轻链的重链分子衍 生的这种可变结构域在本文中称作VHH或纳米体(TM)，以将它与四链免疫球蛋白的 常规VH区分。这种VHH分子可以衍生自骆驼属(Camelidae)物种，例如骆驼、羊驼、 单峰驼、驼羊和原驼。除骆驼属之外的其他物种可以产生天然缺少轻链的重链分子； 这类VHH处于本发明的范围内。
SDAB分子已经由例如通过引用方式完整并入本文的EP 0656946描述。
SDAB分子可以是重组的、经CDR移植、人源化、骆驼化、去免疫化和/或在体 外生成(例如，通过噬菌体展示法选择)。单结构域抗体可以通过用所需的抗原免疫单 峰驼、骆驼、羊驼、羊驼或鲨鱼并随后分离编码重链抗体的mRNA来获得。通过逆 转录和聚合酶链反应，产生含有数百万个克隆的单结构域抗体基因文库。筛选技术如 噬菌体展示法和核糖体展示法帮助鉴定结合抗原的克隆。一种不同方法使用来自先前 尚未免疫过的动物的基因文库。这类初始文库通常仅含有对所需抗原具有低亲和力的 抗体，这需要利用借助随机诱变的亲和力成熟过程作为额外步骤。当已经鉴定到鉴定 到最有力的克隆时，将它们的DNA序列优化，例如以改善它们对酶的稳定性。另一 个目标是人源化以防止人类有机体对抗体的免疫反应。因为驼类VHH和人VH片段 之间的同源性，所以人源化不带来问题。最终步骤是在大肠杆菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或其他合适生物中翻译优化的单结构域抗体。备选地，单 结构域抗体可以从具有4条链的常见鼠IgG或人IgG产生。过程是相似的，包括来 自免疫供体或初始供体的基因文库和用于鉴定最特异性抗原的展示技术。
在一个实施方案中，提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分和能够与靶细胞抗原特异性结合 的第二抗原结合部分，其中所述的一个抗原结合部分是交换Fab分子，其中Fab轻 链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中另一个抗原结合部分由单结构域抗原 结合分子组成。
在某些实施方案中，单结构域抗原结合分子是人单结构域结合分子(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
在一个实施方案中，提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分和能够与靶细胞抗原特异性结合 的第二抗原结合部分，其中所述抗原结合部分是Fab分子或交换Fab分子，其中Fab 轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中另一个抗原结合部分由单结构域可 变重链组成。
在另一个实施方案中，提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分是Fab分子或交换Fab分子，其 中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中能够与靶细胞抗原特异性结 合的第二抗原结合部分由单结构域可变重链组成。
本发明的双特异性抗体可以包含一个或多个互换Fab片段。交换Fab片段是其 中重链和轻链的可变区或恒定区交换的Fab片段。已经例如在WO 2009080252、WO2009080253、WO 2009080251、WO 2009080254、WO 2010/136172、WO 2010/145792 和EP专利申请号11178371.8中描述了包含交换Fab片段的双特异性抗体样式，所述 文献通过引用方式并入本文。
在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含含有单结构域抗原结合分子的结合蛋白并且包含不多于一个能够与T细胞活化抗原特异性结合的 抗原结合部分。
在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含一个包含单结构域抗原结合分子的抗原结合部分，所述抗原结合部分与另一个抗原结合部分融合， 所述另一个抗原结合部分包含Fab分子或交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链 的可变区或恒定区交换。任选地，抗原结合部分通过肽接头彼此融合。
在一个实施方案中，所述单结构域抗原结合分子与交换Fab分子的重链的N末 端融合。
在一个实施方案中，所述单结构域抗原结合分子与交换Fab分子的轻链的N末 端融合。
在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子额外地包含能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分。
在一个实施方案中，所述能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分是单结构域抗原结合分子。在一个实施方案中，所述能够与靶细胞抗原特异性结合的第三 抗原结合部分是如上文定义的单结构域可变重链。
在本发明一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域。在一个实施方案中，所述Fc结构域是 IgG、尤其IgG1或IgG4的Fc结构域。在具体实施方案中，Fc结构域还可以包含促进 Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰，如下文概述。在其他的具体实施方案中， Fc结构域包含降低与Fc受体结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸置换，如下文 概述。
在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含
a)含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，
b)第一抗原结合部分，其包含其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的Fab分子或交换Fab分子，其中所述Fab分子或交换Fab分子在Fab重链的C末端 与Fc结构域的亚基之一的N末端融合；
c)第二抗原结合部分，其包含单结构域可变重链，其中所述单结构域可变重链与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，和
d)第三抗原结合部分，其包含单结构域可变重链，其中所述单结构域可变重链与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。
在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含
a)含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，
b)能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分，其包含其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的Fab分子或交换Fab分子，其中所述Fab分子 或交换Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合；
c)能够与靶细胞抗原特异性结合的第二抗原结合部分，其包含单结构域可变重链， 其中所述单结构域可变重链与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，和
d)能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分，其包含单结构域可变重链，其中单结构域可变重链与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。
在一个实施方案中，所述第二和第三抗原结合部分与相同的靶细胞抗原结合。
在一个实施方案中，所述第一和/或第二抗原结合部分借助铰链区直接连接至Fc结构域。在另一个实施方案中，所述第一和/或第二抗原结合部分通过肽接头与Fc结 构域连接。
根据任一个以上实施方案，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分(例如抗原结合部分，Fc结构域)可以直接融合或通过本文中描述或本领域已知的多种接头、尤 其包含一个或多个氨基酸、一般约2-20个氨基酸的肽接头融合。合适地，无免疫原 性肽接头例如包括(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头，其中n通常是在1和 10之间、一般在2和4之间的数字。
在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含一个或多个与SEQ ID NO:369、370和371至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性 抗原结合分子包含SEQID NO:369、370和371。
除抗体之外，还存在可以用来特异性结合靶分子的其他结合蛋白或结合结构域(例如Binz,H.K.,Amstutz,P.和Pluckthun,A.,Nat.Biotechnol.23,1257-1268,2005)。 这样一个新类别的结合蛋白或结合结构域以设计的重复序列蛋白或设计的重复结构 域为基础(WO 2002/020565；Binz,H.K.,Amstutz,P.,Kohl,A.,Stumpp,M.T.,Briand, C,Forrer,P.,Grutter,M.G.和Pluckthun,A.,Nat.Biotechnol.22,575-582,2004； Stumpp,M.T.,Binz,H.K和Amstutz,P.,Drug Discov.Today 13,695-701,2008)。
已经在1987年通过酿酒酵母、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和秀丽隐杆线 虫(Caenorhabditis elegans)中这样四种蛋白质之间的序列比较鉴定到锚蛋白重复序列 蛋白。Breeden和Nasmyth报道了swi6p、cdcl0p、notch和lin-12的序列中一种大约 33个残基重复单元的多个副本(Breeden和Nasmyth，1987)。后续在锚蛋白中发现这 个重复单元的24个副本蛋白质导致将这种重复单元命名为锚蛋白重复序列(Lux等人, 1990)。后来，已经在不同生物和病毒的数百种蛋白质中鉴定到这种重复单元(Bork, 1993；SMART数据库,Schultz等人,2000)。这些蛋白质位于胞核、细胞质或胞外空 间。这与如下事实一致：这些蛋白质锚蛋白重复结构域与二硫键无关并且因此与环境 的氧化状态无关。每种蛋白质的重复单元数目从两个变动到多于20个(SMART数据 库，Schultz等人,2000)。似乎要求最低的重复单元数目以形成稳定的折叠结构域 (Zhang和Peng，2000)。在另一方面，还存在一个折叠结构域中具有最多六个重复单 元的某种证据(Michaely和Bennet,1993)。
WO 2002/020565描述了怎样可以构建庞大的锚蛋白重复序列蛋白文库和它们的一般应用。这些设计的重复结构域利用重复序列蛋白的模块性质并拥有N末端和C 末端封端模块以通过屏蔽该结构域的疏水核心，防止设计的重复结构域聚集(Forrer, P.,Stumpp,M.T.,Binz,H.K.和Pluckthun,A.,FEBS letters 539,2-6,2003)。WO 2012069655描述了通过改善设计的锚蛋白重复结构域的C末端或N末端封端模块或 C末端或N末端封端重复序列，优化重复序列蛋白。
本发明中还包含其他结合蛋白如基于纤连蛋白III型结构域的Adenctin、基于脂笼蛋白的抗运载蛋白(Anticalin)、基于遍在蛋白的Affilins、基于转铁蛋白的Transbody、基于蛋白A结构域的亲和体、基于四连接素结构域的TrimerX、基于 Cys丰富结构域的MicroProtein、基于FynSH3结构域的Fynomer、基于EGFR A结 构域的高亲和性多聚体(Avimers)、基于centyrin的Centyrin、基于Kuniz结构域的 kalibitor和具有随机化结合区和抗体样行为的其他支架蛋白。
在本发明的一个实施方案中，提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分和能够与靶细胞抗原特 异性结合的第二抗原结合部分，其中所述的一个抗原结合部分是Fab分子或交换Fab 分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中另一个抗原结合部 分是包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。
在一个优选的实施方案中，所述其他抗原结合部分是包含两个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在另一个实施方案中，所述其他抗原结合部分是包含三个、四个或五个锚 蛋白重复基序的结合蛋白。
在本发明的一个实施方案中，提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分和能够与靶细胞抗原特 异性结合的第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分是Fab分子或交换Fab 分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中第二抗原结合部分 是包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。
在一个优选的实施方案中，所述第二抗原结合部分是包含两个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在另一个实施方案中，所述第二抗原结合部分是包含三个、四个或五个锚 蛋白重复基序的结合蛋白。
优选地所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含含有至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白，其中所述重复结构域包含锚蛋白重复共有序列 DxxGxTPLHLAaxxGpxpaVpxLLpxGADVNAx，其中“x”指任何氨基酸，""指任何氨 基酸或缺失，“a”指具有非极性侧链的氨基酸，并且“p”指具有极性侧链的残基。在一 个实施方案中，所述重复结构域包含锚蛋白重复序列共有序列 DxxGxTPLHLAxxxGxxxVVxLLLxxGADVNAx，在此“x”指任何氨基酸。在一个实施 方案中，所述重复结构域包含锚蛋白重复序列基序 D11G1TPLHLAA11GHLEIVEVLLK2GADVNA1，其中1表示选自以下的氨基酸残 基：A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；其中2表示 选自以下的氨基酸残基：H、N和Y。
本发明的双特异性抗体包含一个或多个互换Fab片段。交换Fab片段是其中重 链和轻链的可变区或恒定区交换的Fab片段。已经例如在WO 2009080252、WO 2009080253、WO2009080251、WO 2009080254、WO 2010/136172、WO 2010/145792 和EP专利申请号11178371.8中描述了包含交换Fab片段的双特异性抗体样式，所述 文献通过引用方式并入本文。
在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含含有至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白，并且包含不多于一个能够与T细胞活化抗原特异性结 合的抗原结合部分。
在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含一个包含至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白，所述结合蛋白包含与另一个抗原结合部分融合， 所述另一个抗原结合部分包含Fab分子或交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链 的可变区或恒定区交换。任选地，抗原结合部分通过肽接头彼此融合。
在一个实施方案中，所述包含至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白与交换Fab分子的重链的N末端融合。
在一个实施方案中，所述包含至少一个锚蛋白重复结构域的结合蛋白与交换Fab分子的轻链的N末端融合。
在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子额外地包含能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分。
在一个实施方案中，能够与靶细胞抗原特异性结合的所述第三抗原结合部分是包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在一个实施方案中，能够与靶细胞抗原特异 性结合的所述第三抗原结合部分是一种如上文定义的包含至少一个锚蛋白重复基序 的结合蛋白。在一个实施方案中，所述能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合 部分是包含两个、三个、四个或五个锚蛋白重复基序的结合蛋白。
在本发明一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域。在一个实施方案中，所述Fc结构域是 IgG、尤其IgG1或IgG4的Fc结构域。在具体实施方案中，Fc结构域还可以包含促进 Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰，如下文概述。在其他的具体实施方案中， Fc结构域包含降低与Fc受体结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸置换，如下文 概述。
在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含
a)含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，
b)第一抗原结合部分，其包含其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的Fab分子或交换Fab分子，其中所述Fab分子或交换Fab分子在Fab重链的C末端 与Fc结构域的亚基之一的N末端融合；
c)第二抗原结合部分，其包含含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白，其中所述含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白与Fc结构域的亚基之一的N末端融合， 和
d)第三抗原结合部分，其包含含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白，其中含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融 合。
在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含
a)含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，
b)能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分，其包含其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的Fab分子或交换Fab分子，其中所述Fab分子 或交换Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合；
c)能够与靶细胞抗原特异性结合的第二抗原结合部分，其包含其包含含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白，其中所述含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白与 Fc结构域的亚基之一的N末端融合，和
d)能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分，其包含含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白，其中含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白与第一抗原结 合部分的Fab重链的N末端融合。
在一个实施方案中，所述第二和第三抗原结合部分与相同的靶细胞抗原结合。
在一个实施方案中，所述第一和/或第二抗原结合部分借助铰链区直接连接至Fc结构域。在另一个实施方案中，所述第一和/或第二抗原结合部分通过肽接头与Fc结 构域连接。
根据任一个以上实施方案，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分(例如抗原结合部分，Fc结构域)可以直接融合或通过本文中描述或本领域已知的多种接头、尤 其包含一个或多个氨基酸、一般约2-20个氨基酸的肽接头融合。合适地，无免疫原 性肽接头例如包括(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头，其中n通常是在1和 10之间、一般在2和4之间的数字。
Fc结构域
在本发明的一些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含Fc 结构域。T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc结构域由一对包含免疫球蛋白分 子重链结构域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域二聚体，其 每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定 缔合。在一个实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不多于 一个Fc结构域。
在本发明的一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc结构域 是IgG Fc结构域。在一个具体实施方案中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个 实施方案中，Fc结构域是IgG4 Fc结构域。在一个更具体的实施方案中，Fc结构域是 在位置S228(Kabat编号)包含氨基酸置换、尤其包含氨基酸置换S228P的IgG4 Fc结 构域。这个氨基酸置换减少IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人,Drug Metabolism andDisposition 38,84-91(2010))。在又一个具体实施方案中，Fc结构域 是人的。人IgG1 Fc区的示例性序列在SEQ ID NO:149中给出。
促进异二聚化的Fc结构域修饰
本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不同的抗原结合部分，并且在一个实施方案中与Fc结构域的两个亚基的一者或另一者融合，因此Fc结构域的两个 亚基一般包含于两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和后续二聚化导致两 种多肽的几种可能组合。为了改善重组生产中T细胞活化性双特异性抗原结合分子的 产率和纯度，在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多 肽缔合的修饰因此是有利的。
因此，在具体的实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的 Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个 亚基之间蛋白质-蛋白质相互作用最广泛的位点处于Fc结构域的CH3结构域中。因 此，在一个实施方案中，所述修饰处于Fc结构域的CH3结构域中。
在一个具体实施方案中，所述修饰是所谓的“结入扣(knob-into-hole)”修饰，包括 在Fc结构域的两个亚基的一者中的“结修饰”和在Fc结构域的两个亚基的另一者中的“扣修饰”。
结入扣技术例如在US5,731,168；US7,695,936；Ridgway等人,Prot Eng 9,617-621 (1996)和Carter，J Immunol Meth 248,7-15(2001)中描述。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突出部分(“结”)并在第二多肽的界面中引入相应腔(“扣”)，从而可 以将突出部分安置在腔中，从而促进异二聚体形成并阻碍同型二聚体形成。通过将源 自第一多肽界面小氨基酸侧链替换为较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)，构建突出部分。 通过将大氨基酸侧链替换为较小侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)，在第二多肽的界面中 产生与突出部分具有相同或相似尺寸的互补“腔”。
因此，在一个具体实施方案中，在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc结 构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基由具有更大侧链体积的氨基酸残基替 换，由此在第一亚基的CH3结构域内部产生可安置在第二亚基的CH3结构域内部腔 中的突出部分，并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基由具有更 小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3结构域内部产生腔，在所述 腔内部可安置第一亚基的CH3结构域内部的突出部分。
可以通过改变编码多肽的核酸产生突出部分和腔，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成产生。
在一个具体实施方案中，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中位置366处的 苏氨酸残基由色氨酸残基替换(T366W)，并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域 中位置407处的酪氨酸残基由缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施方案中，在Fc结 构域的第二亚基中位置366处的苏氨酸残基额外地由丝氨酸残基替换(T366S)并且位 置368处的亮氨酸残基由丙氨酸残基替换(L368A)。
在又一个实施方案中，在Fc结构域的第一亚基中位置354处的丝氨酸残基额外 地由半胱氨酸残基替换(S354C)并且在Fc结构域的第二亚基中位置349处的酪氨酸残 基额外地由半胱氨酸残基替换(Y349C)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在Fc结构域 的两个亚基之间形成二硫键，进一步稳定二聚体(Carter，J Immunol Methods 248, 7-15(2001))。
在一个具体实施方案中，能够与T细胞活化抗原结合的抗原结合部分融合(任选地通过能够与靶细胞抗原结合的抗原结合部分)至(包含“结”修饰的)Fc结构域的第一 亚基。不希望受理论约束，能够与T细胞活化抗原结合的抗原结合部分与含有结的 Fc结构域亚基的融合物将(进一步)使包含两个能够与T细胞活化抗原结合的抗原结合 部分的抗原结合分子的产生最小化(两个含有结的多肽的立体位阻)。
在一个实施方案中，促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰包含介导静电转向效应的修饰，例如，如PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，这种方法涉及 将两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基， 从而同型二聚体形成在静电上变得不利，而异二聚化在静电上有利。
在一个方面，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含第一和第二抗原结合部分，所述抗原结合部分之一是能够与T细胞活化抗原特异性结合的 Fab分子并且另一个抗原结合部分是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子；
其中第一抗原结合部分是
(a)其中Fab轻链和Fab重链由肽接头连接的单链Fab分子，或
(b)其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的交换Fab分子，
和含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，
其中已经修饰所述第一亚基和所述第二亚基以包含静电上有利于异二聚体形成的一个或多个带电荷的氨基酸。
在一个实施方案中，所述第一亚基包含氨基酸突变E356K、E357K和D399K和 所述第二亚基包含氨基酸突变K370E、K409E和K439E。
在另一个实施方案中，所述第一亚基包含氨基酸突变K392D、K409D并且所述 第二亚基包含氨基酸突变E356K、D399K(DDKK)。
T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分可以按多种构型彼此融合。图1中描述了示例性构型。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一 或第二亚基的N末端融合。
在一个这样的特定实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二 抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个这样的具体实施方案中，T细胞活化 性双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合部分、包含第一和第二亚基的 Fc结构域和任选地一个或多个肽接头组成，其中第一抗原结合部分在Fab重链的C 末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且第二抗原结合部分在Fab 重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个甚至更具体的实 施方案中，第一抗原结合部分是单链Fab分子。备选地，在一个具体实施方案中，第 一抗原结合部分是交换Fab分子。任选地，如果第一抗原结合部分是交换Fab分子， 则第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链可以额外地彼此融 合。
在一个这样的备选实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结 构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个这样的具体实施方案中，T细胞活化性 双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合部分、包含第一和第二亚基的 Fc结构域和任选地一个或多个肽接头组成，其中第一和第二抗原结合部分各自在Fab 重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合。在一个甚至更具体的实施方案 中，第一抗原结合部分是单链Fab分子。备选地，在一个具体实施方案中，第一抗原 结合部分是交换Fab分子。
在又一个这样的实施方案中，第二抗原结合部分在Fab轻链的C末端与第一抗 原结合部分的Fab轻链的N末端融合。在一个这样的具体实施方案中，T细胞活化性 双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合部分、包含第一和第二亚基的 Fc结构域和任选地一个或多个肽接头组成，其中第一抗原结合部分在Fab轻链的N 末端与第二抗原结合部分的Fab轻链的C末端融合，并且第二抗原结合部分在Fab 重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个甚至更具体的实 施方案中，第一抗原结合部分是交换Fab分子。
在其他实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一 或第二亚基的N末端融合。
在一个这样的特定实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一 抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个这样的具体实施方案中，T细胞活化 性双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合部分、包含第一和第二亚基的 Fc结构域和任选地一个或多个肽接头组成，其中第二抗原结合部分在Fab重链的C 末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且第一抗原结合部分在Fab 重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个甚至更具体的实 施方案中，第一抗原结合部分是交换Fab分子。任选地，第一抗原结合部分的Fab 轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链可以额外地彼此融合。
特别地，在这些实施方案中，第一抗原结合部分能够与T细胞活化抗原特异性结合。在其他实施方案中，第一抗原结合部分能够与靶细胞抗原特异性结合。
抗原结合部分可以与Fc结构域融合或彼此直接融合或通过包含一个或多个氨基酸、一般约2-20个氨基酸的肽接头融合。肽接头是本领域已知的并且在本文中描述。 合适地，无免疫原性肽接头例如包括(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头，“n” 通常是在1和10之间、一般在2和4之间的数字。使第一和第二抗原结合部分的Fab 轻链彼此融合的特别合适的肽接头是(G4S)2。适于连接第一和第二抗原结合部分的 Fab重链的示例性肽接头是EPKSC(D)-(G4S)2(SEQ ID NO:150和151)。另外，接头 可以包含(一部分的)免疫球蛋白铰链区。特别地，当抗原结合部分与Fc结构域亚基的 N末端融合时，它可以在具有或没有额外的肽接头的情况下通过免疫球蛋白铰链区或 其部分融合。
具有能够与靶细胞抗原特异性结合的单个抗原结合部分的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(例如如图1A、1B、1D、1E、1H、1I、1K或1M中所显示)是有用的， 尤其在预期靶细胞抗原于高亲和力抗原结合部分结合之后内化的情况下。在这种情况 下，多于一个对靶细胞抗原特异的抗原结合部分的存在可以增强靶细胞抗原的内化， 因而减少其可获得性。
然而，在许多其他情况下，有利的是具有包含两个或更多个对靶细胞抗原特异的抗原结合部分的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(参见图1C、1F、1G、1J或1L 中显示的例子)，例如以优化靶向靶位点或以允许靶细胞抗原交联。
因此，在某些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含第三抗原结合部分，所述第三抗原结合部分是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分 子。在一个实施方案中，第三抗原结合部分能够特异性结合与第一或第二抗原结合部 分相同的靶细胞抗原。在一个具体实施方案中，第一抗原结合部分能够与T细胞活化 抗原特异性结合，并且第二和第三抗原结合部分能够与靶细胞抗原特异性结合。
在一个实施方案中，第三抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一 或第二亚基的N末端融合。在一个具体实施方案中，第二和第三抗原结合部分各自在 Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，并且第一抗原结合部分在 Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在这样的一个实 施方案中，第一抗原结合部分是单链Fab分子。在一个这样的特定实施方案中，第一 抗原结合部分是交换Fab分子。任选地，如果第一抗原结合部分是交换Fab分子， 则第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链可以额外地彼此融 合。
第二和第三抗原结合部分可以直接或通过肽接头与Fc结构域融合。在一个具体实施方案中，第二和第三抗原结合部分各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。 在一个具体实施方案中，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区。在一个实施方案中， 第二和第三抗原结合部分和Fc结构域是免疫球蛋白分子的部分。在一个具体实施方 案中，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更具体的实施方案中，免疫 球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG4亚类免疫 球蛋白。在又一个具体实施方案中，免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其他实施方案中， 免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个实施方案中，T细胞活化 性双特异性抗原结合分子基本上由能够与靶细胞抗原特异性结合的免疫球蛋白分子 和能够与T细胞活化抗原特异性结合的抗原结合部分组成，其中抗原结合部分是单链 Fab分子或交换Fab分子，其任选地通过肽接头融合至免疫球蛋白重链之一的N末端。
在一个备选实施方案中，第一和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与 Fc结构域的亚基之一的N末端融合，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与 第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个这样的具体实施方案中，T细胞 活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一、第二和第三抗原结合部分、包含第一和 第二亚基的Fc结构域和任选地一个或多个肽接头组成，其中第二抗原结合部分在Fab 重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，和第一抗原结合部分 在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基的N末端融合，和其中第三抗原结合部 分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第二亚基的N末端融合。在一个这样的特定实 施方案中，第一抗原结合部分是交换Fab分子。任选地，第一抗原结合部分的Fab 轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链可以额外地彼此融合。
在本发明的一些T细胞活化性双特异性抗原结合分子中，第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链彼此融合、任选地通过接头肽彼此融合。取 决于第一和第二抗原结合部分的构型，第一抗原结合部分的Fab轻链可以在其C末 端处与第二抗原结合部分的Fab轻链的N末端融合，或第二抗原结合部分的Fab轻 链可以在其C末端与第一抗原结合部分的Fab轻链的N末端融合。第一和第二抗原 结合部分的Fab轻链的融合进一步减少不配对的Fab重链和轻链错误配对，并且还 减少为表达本发明的一些T细胞活化性双特异性抗原结合分子所需要的质粒的数目。
在某些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第一Fab轻链与肽接头共享羧基端肽键，所述肽接头转而与第一Fab重链共享羧基 端肽键，所述第一Fab重链转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VL-CL-接头 -VH-CH1-CH2-CH2(-CH4))，并包含这样的多肽，其中第二Fab重链与Fc结构域亚 基共享羧基端肽键(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中，T细胞活化性双 特异性抗原结合分子还包含第二Fab轻链多肽(VL-CL)。在某些实施方案中，多肽是 共价连接的，例如，通过二硫键共价连接。
在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第一Fab轻链与肽接头共享羧基端肽键，所述肽接头转而与第一Fab重链共享羧基 端肽键，所述第一Fab重链转而与第二Fab重链共享羧基端肽键，所述第二Fab重 链转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VL-CL-接头 -VH-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在这些实施方案之一中，这种T细胞活化性 双特异性抗原结合分子还包含第二Fab轻链多肽(VL-CL)。根据这些实施方案，T细 胞活化性双特异性抗原结合分子还可以包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))， 或(ii)多肽，其中第三Fab重链与Fc结构域亚基(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))和第三 Fab轻链多肽(VL-CL)共享羧基端肽键。在某些实施方案中，多肽是共价连接的，例如，通过二硫键共价连接。
在某些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第一Fab轻链可变区与第一Fab重链恒定区共享羧基端肽键(即交换Fab重链，其中 重链可变区由轻链可变区替换)，所述第一Fab重链恒定区转而与Fc结构域亚基共享 羧基端肽键(VL-CH1-CH2-CH2(-CH4))，并包含这样的多肽，其中第二Fab重链与 Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中，T 细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，其中Fab重链可变区与Fab 轻链恒定区(VH-CL)和Fab轻链多肽(VL-CL)共享羧基端肽键。在某些实施方案中， 多肽是共价连接的，例如，通过二硫键共价连接。
在备选的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第一Fab重链可变区与第一Fab轻链恒定区共享羧基端肽键(即交换Fab重链，其 中重链恒定区由轻链恒定区替换)，所述第一Fab轻链恒定区转而与Fc结构域亚基共 享羧基端肽键(VH-CL-CH2-CH2(-CH4))，并包含这样的多肽，其中第二Fab重链与 Fc结构域亚基共享羧基端肽键(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中，T 细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，其中Fab轻链可变区与Fab 重链恒定区(VL-CH1)和Fab轻链多肽(VL-CL)共享羧基端肽键。在某些实施方案中， 多肽是共价连接的，例如，通过二硫键共价连接。
在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第一Fab轻链可变区与第一Fab重链恒定区共享羧基端肽键(即交换Fab重链，其中 重链可变区由轻链可变区替换)，所述第一Fab重链恒定区转而与第二Fab重链共享 羧基端肽键，所述第二Fab重链转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键 (VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在其他实施方案中，T细胞活化性双特异性抗 原结合分子包含这样的多肽，其中第一Fab重链可变区与第一Fab轻链恒定区共享 羧基端肽键(即交换Fab重链，其中重链恒定区由轻链恒定区替换)，所述第一Fab轻 链恒定区转而与第二Fab重链共享羧基端肽键，所述第二Fab重链转而与Fc结构域 亚基共享羧基端肽键(VH-CL-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在另外的实施方案中，T 细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第二Fab重链与第一Fab 轻链可变区共享羧基端肽键，所述第一Fab轻链可变区转而与第一Fab重链恒定区 共享羧基端肽键(即交换Fab重链，其中重链可变区由轻链可变区替换)，所述第一Fab重链恒定区转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键 (VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在其他实施方案中，T细胞活化性双特异性抗 原结合分子包含这样的多肽，其中第二Fab重链与第一Fab重链可变区共享羧基端 肽键，所述第一Fab重链可变区转而与第一Fab轻链恒定区共享羧基端肽键(即交换 Fab重链，其中重链恒定区由轻链恒定区替换)，所述第一Fab轻链恒定区转而与Fc 结构域亚基共享羧基端肽键(VH-CH1-VH-CL-CH2-CH3(-CH4))。
在这些实施方案的一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含交换Fab轻链多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定区(VH-CL)和Fab轻链多 肽(VL-CL)共享羧基端肽键。在这些实施方案的其他实施方案中，T细胞活化性双特 异性抗原结合分子还包含交换Fab轻链多肽，其中Fab轻链可变区与Fab重链恒定 区(VL-CH1)和Fab轻链多肽(VL-CL)共享羧基端肽键。在这些实施方案的仍然其他实 施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，其中Fab轻链可 变区与Fab重链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab重链恒定区转而与Fab轻链多肽 共享羧基端肽键(VL-CH1-VL-CL)；包含这样的多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻 链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab轻链恒定区转而与Fab轻链多肽共享羧基端肽 键(VH-CL-VL-CL)；包含这样的多肽，其中Fab轻链多肽与Fab轻链可变区共享羧 基端肽键，所述Fab轻链可变区转而与Fab重链恒定区共享羧基端肽键(VL-CL-VL-CH1)；或包含这样的多肽，其中Fab轻链多肽与Fab重链可变区共享羧 基端肽键，所述Fab重链可变区转而与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键 (VL-CL-VH-CL)。
根据这些实施方案，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还可以包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)多肽，其中第三Fab重链与Fc结构域亚基 (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))和第三Fab轻链多肽(VL-CL)共享羧基端肽键。在某些实 施方案中，多肽是共价连接的，例如，通过二硫键共价连接。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第二Fab轻链与第一Fab轻链可变区共享羧基端肽键，所述第一Fab轻链可变区转 而与第一Fab重链恒定区共享羧基端肽键(即交换Fab轻链，其中轻链恒定区由重链 恒定区替换)(VL-CL-VL-CH1)；包含这样的多肽，其中第二Fab重链与Fc结构域亚 基共享羧基端肽键(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))；和包含这样的多肽，其中第一Fab 重链可变区与第一Fab轻链恒定区共享羧基端肽键(VH-CL)。在另一个实施方案中， T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，其中第二Fab轻链与第一Fab 重链可变区共享羧基端肽键，所述第一Fab重链可变区转而与第一Fab轻链恒定区 共享羧基端肽键(即交换Fab轻链，其中轻链可变区由重链可变区替 换)(VL-CL-VH-CL)；包含这样的多肽，其中第二Fab重链与Fc结构域亚基共享羧 基端肽键(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))；和包含这样的多肽，其中第一Fab轻链可变区与第一Fab重链恒定区共享羧基端肽键(VL-CH1)。根据这些实施方案，T细胞活化 性双特异性抗原结合分子还可以包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii) 多肽，其中第三Fab重链与Fc结构域亚基(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))和第三Fab轻 链多肽(VL-CL)共享羧基端肽键。在某些实施方案中，多肽是共价连接的，例如，通 过二硫键共价连接。
根据任一个以上实施方案，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分(例如抗原结合部分，Fc结构域)可以直接融合或通过本文中描述或本领域已知的多种接头、尤 其包含一个或多个氨基酸、一般约2-20个氨基酸的肽接头融合。合适地，无免疫原 性肽接头例如包括(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头，其中n通常是在1和 10之间、一般在2和4之间的数字。
在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含一个或多个与SEQ ID NO:372、373、374和375至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述T细胞活化性双 特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:372、373、374和375。
减少Fc受体结合作用和/或效应子功能的Fc结构域修饰
Fc结构域向T细胞活化性双特异性抗原结合分子赋予有利的药代动力学特性， 包括有助于靶组织中良好蓄积的长血清半寿期和有利的组织-血液分布比例。然而， 同时它可以导致将T细胞活化性双特异性抗原结合分子不需要地靶向表达Fc受体的 细胞，而不是优选的携带抗原的细胞。另外，Fc受体信号传导途径的共活化可以导致 细胞因子释放，连同抗原结合分子的T细胞活化特性和长半寿期，这导致全身性施用 时细胞因子受体的过度激活和严重副作用。活化除T细胞之外(携带Fc受体的)免疫 细胞可以甚至降低T细胞活化性双特异性抗原结合分子的效力，原因在于T细胞可 能被例如NK细胞潜在破坏。
因此，在具体的实施方案中，与天然IgG1 Fc结构域相比，本发明的T细胞活化 性双特异性抗原结合分子的Fc结构域显示降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低 的效应子功能。在这样的一个实施方案中，与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc 结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)相比，Fc结构域(或包含所述Fc结构 域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)显示小于50％、优选地小于20％、更优选 地小于10％和最优选地小于5％的对Fc受体的结合亲和力，和/或与天然IgG1 Fc结 构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)相比，小于50％、优选地小于20％、更优选地小于10％和最优选地小于5％的效应子功能。在一 个实施方案中，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合 分子)基本上不与Fc受体结合和/或不诱导效应子功能。在一个具体实施方案中，Fc 受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，Fc 受体是活化性Fc受体。在一个具体实施方案中，Fc受体是人活化性Fcγ受体，更具 体地人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地人FcγRIIIa。在一个实施方案中，效 应子功能是选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的一种或多种。在一个具体实施方案中，效应子功能是ADCC。在一个实施方案中，与天然IgG1 Fc结构域相比， Fc结构域显示出与新生Fc受体(FcRn)基本上相似的结合亲和力。当Fc结构域(或包 含所述Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)显示出大于约70％、特别地 大于约80％、更特别地大于约90％的天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域 的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力时，实现与FcRn基本 相似的结合。
在某些实施方案中，与非工程化的Fc结构域相比，Fc结构域经工程化以具有对 Fc受体降低的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在具体的实施方案中，T细胞活 化性双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含一个或多个氨基酸突变，所述氨基酸突 变减少Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。一般地，相同的一个或 多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基的每一者中。在一个实施方案中，氨基 酸突变减少Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，氨基酸突变减少 Fc结构域对Fc受体的结合亲和力至少2倍、至少5倍或至少10倍。在其中存在多 于一个减少Fc结构域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基 酸突变的组合可以减少Fc结构域对Fc受体的结合亲和力至少10倍、至少20倍或甚 至至少50倍。在一个实施方案中，与包含非工程化Fc结构域的T细胞活化性双特异 性抗原结合分子相比，包含工程化Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子 显示出小于20％、特别地小于10％、更具体地小于5％对Fc受体的结合亲和力。在 一个具体实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中，Fc受体是人Fc受体。 在一些实施方案中，Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体实施方案中，Fc受体是人 活化性Fcγ受体，更具体地人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地人FcγRIIIa。 优选地，对这些受体中每种的结合作用减低。在一些实施方案中，对补体组分的结合 亲和力、尤其对C1q的结合亲和力也减低。在一个实施方案中，对新生Fc受体(FcRn) 的结合亲和力不减低。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的T细胞活化性双特异性 抗原结合分子)显示出大于约70％的非工程化形式的Fc结构域(或包含所述非工程化 形式的Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力时， 实现与FcRn的基本上相似结合，即保留Fc结构域对所述受体的结合亲和力。本发 明的Fc结构域或包含所述Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以显示 出大于约80％和甚至大于约90％的这种亲和力。在某些实施方案中，与非工程化的 Fc结构域相比，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc结构域经工程化以具有减 少的效应子功能。减少的效应子功能可以包括，但不限于以下一种或多种：补体依赖 细胞毒性(CDC)减少、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)减少、抗体依赖的细 胞吞噬作用(ADCP)减少、细胞因子分泌减少、抗原呈递细胞的免疫复合物介导的抗 原摄取减少、与NK细胞结合减少、与巨噬细胞结合减少、与单核细胞结合减少、与 多形核细胞结合减少、信号传导诱导的直接凋亡减少、靶结合型抗体的交联减少、树 突细胞成熟减少、或T细胞引发作用减少。在一个实施方案中，减少的效应子功能是 选自以下的一种或多种：CDC减少、ADCC减少、ADCP减少、和细胞因子分泌减 少。在一个具体实施方案中，减少的效应子功能是减少的ADCC。在一个实施方案中， 减低的ADCC小于20％的由非工程化的Fc结构域(或包含非工程化Fc结构域的T细 胞活化性双特异性抗原结合分子)诱导的ADCC。
在一个实施方案中，减少Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的 氨基酸突变是氨基酸置换。在一个实施方案中，Fc结构域包含在选自E233、L234、 L235、N297、P331和P329位置处的氨基酸置换。在一个更具体的实施方案中，Fc 结构域包含在选自L234、L235和P329位置处的氨基酸置换。在一些实施方案中， Fc结构域包含氨基酸置换L234A和L235A。在这样的一个实施方案中，Fc结构域是 IgG1 Fc结构域，尤其人IgG1 Fc结构域。在一个实施方案中，Fc结构域包含在位置 P329处的氨基酸置换。在一个更具体的实施方案中，氨基酸置换是P329A或P329G， 特别地是P329G。在一个实施方案中，Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸置换和 在选自E233、L234、L235、N297和P331的位置处的进一步的氨基酸置换。在一个 更具体的实施方案中，进一步的氨基酸置换是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、 N297D或P331S。在具体的实施方案中，Fc结构域包含在位置P329、L234和L235 处的氨基酸置换。在更具体的实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A 和P329G(“P329G LALA”)。在这样的一个实施方案中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域， 尤其人IgG1Fc结构域。氨基酸置换的“P329G LALA”组合几乎完全消除人IgG1 Fc 结构域的Fcγ受体结合作用，如通过引用方式完整并入本文的PCT专利申请号 PCT/EP 2012/055393中所述。PCT/EP 2012/055393还描述了制备这类突变Fc结构域 的方法和用于确定其特性如Fc受体结合作用或效应子功能的方法。
与IgG1抗体相比，IgG4抗体显示减低的Fc受体结合亲和力和降低的效应子功能。因此，在一些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc结构 域是IgG4 Fc结构域，特别地人IgG4 Fc结构域。在一个实施方案中，IgG4 Fc结构域 包含在位置S228处的氨基酸置换，尤其氨基酸置换S228P。为了进一步减低其Fc受 体结合亲和力和/或其效应子功能，在一个实施方案中，IgG4 Fc结构域包含在位置 L235处的氨基酸置换，特别是氨基酸置换L235E。在另一个实施方案中，IgG4 Fc结 构域包含在位置P329处的氨基酸置换，特别是氨基酸置换P329G。在一个具体实施 方案中，IgG4 Fc结构域包含在位置S228、L235和P329处的氨基酸置换，特别是氨 基酸置换S228P、L235E和P329G。这类IgG4 Fc结构域突变体和它们的Fcγ受体结 合特性在通过引用方式完整并入本文的PCT专利申请号PCT/EP 2012/055393中描 述。
在一个具体实施方案中，与天然IgG1 Fc结构域相比，显示对Fc受体减少的结 合亲和力和/或减少的效应子功能的Fc结构域是包含氨基酸置换L234A、L235A和任 选地P329G的人IgG1 Fc结构域，或包含氨基酸置换S228P、L235E和任选地P329G 的人IgG4 Fc结构域。
在某些实施方案中，已经消除Fc结构域的N-糖基化。在这样的一个实施方案中，Fc结构域包含在位置N297处的氨基酸突变，特别是将天冬酰胺更换为丙氨酸(N297A) 或天冬氨酸(N297D)的氨基酸置换。
除上文和PCT专利申请号PCT/EP 2012/055393中所述的Fc结构域之外，Fc受 体结合作用和/或效应子功能减低的Fc结构域还包括置换Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个残基的那些Fc结构域(美国专利号6,737,056)。 这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处 具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体 (美国专利号7,332,581)。
可以使用本领域熟知的遗传方法或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰，制备突变Fc结构域。遗传方法可以包括DNA编码序列的位点特异性诱变、PCR、 基因合成等。可以例如通过测序，验证正确的核苷酸变化。
可以使用标准仪器如BIAcore仪器(GE Healthcare)和如可以通过重组表达获得的Fc受体，例如通过ELISA或通过表面等离子体共振法(SPR)容易地确定与Fc受体 的结合作用。本文描述了一种这样的合适结合测定法。备选地，可以使用已知表达特 定Fc受体的细胞系，如表达FcγIIIa受体的人NK细胞，评价Fc结构域或活化细胞 的包含Fc结构域的双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。
可以通过本领域已知的方法测量Fc结构域或包含Fc结构域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的效应子功能。本文描述了测量ADCC的合适测定法。评估目的 分子的ADCC活性的体外测定法的其他例子在美国专利号5,500,362；Hellstrom等人, Proc NatlAcad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人,Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166, 1351-1361(1987)中描述。备选地，可以使用非放射性分析方法(见例如用于流式细胞 术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和 CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。用于此类测定法的 效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可 以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes等人,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656 (1998)公开中的那种动物模型中，评估目的分子的ADCC活性。
在一些实施方案中，Fc结构域对补体组分、尤其对C1q的结合作用减少。因此， 在Fc结构域经工程化以具有减少的效应子功能的一些实施方案中，所述减少的效应 子功能包括减少的CDC。可以实施C1q结合测定法以确定T细胞活化性双特异性抗 原结合分子是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879 和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC 测定法(参见，例如，Gazzano-Santoro等人,J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg 等人,Blood 101,1045-1052(2003)；和Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。
抗原结合部分
本发明的抗原结合分子是双特异的，即它包含能够与两个不同抗原决定簇特异性结合的至少两个抗原结合部分。根据本发明，抗原结合部分是Fab分子(即由各自包 含可变区和恒定区的重链和轻链组成的抗原结合结构域)、单结构域抗原结合(SDAB) 分子或蛋白质支架，如包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白(例如Darpin)。在一 个实施方案中，所述Fab分子或单结构域抗原结合(SDAB)分子是人的。在另一个实 施方案中，所述Fab分子或单结构域抗原结合(SDAB)分子是人源化的。在又一个实 施方案中，所述Fab分子包含人重链恒定区和轻链恒定区。
至少一个抗原结合部分是单链Fab分子或交换Fab分子。这类修饰防止来自不 同Fab分子的重链和轻链错误配对，因而改善重组产生时本发明的T细胞活化性双 特异性抗原结合分子的产率和纯度。在可用于本发明T细胞活化性双特异性抗原结合 分子的特定单链Fab分子中，Fab轻链的C末端通过肽接头与Fab重链的N末端连 接。肽接头允许Fab重链和轻链排列以形成有功能的抗原结合部分。适于连接Fab 重链和轻链的肽接头例如包括(G4S)6-GG(SEQ ID NO:152)或 (SG3)2-(SEG3)4-(SG3)-SG(SEQ ID NO:153)。在可用于本发明T细胞活化性双特异性 抗原结合分子的具体交换Fab分子中，Fab轻链和Fab重链的恒定区交换。在可用于 本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子的另一个交换Fab分子中，Fab轻链可变 区和Fab重链可变区交换。
在本发明的一个具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子是能够与靶细胞抗原(尤其肿瘤细胞抗原)和T细胞活化抗原同时结合。在一个实施方案中，T 细胞活化性双特异性抗原结合分子能够通过与靶细胞抗原和T细胞活化抗原同时结 合，交联T细胞和靶细胞。在一个甚至更具体的实施方案中，这类同时结合导致靶细 胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解。在一个实施方案中，这类同时结合导致T细胞活化。在 其他实施方案中，这类同时结合导致T淋巴细胞、特别地细胞毒T淋巴细胞的细胞 反应，所述细胞反应选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒效应分子释放、细胞 毒活性和活化标志物表达。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子 与T细胞活化抗原在不与靶细胞抗原同时结合的情况下的结合不导致T细胞活化。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够使T细胞的细胞毒活性再指向靶细胞。在一个具体实施方案中，所述再指向与MHC介导的靶细胞呈递 肽抗原和/或T细胞的特异性无关。
特别地，根据本发明任何实施方案的T细胞是细胞毒T细胞。在一些实施方案 中，T细胞是CD4+或CD8+T细胞，特别地CD8+T细胞。
T细胞活化抗原结合部分
本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个能够与T细胞活化 抗原结合的抗原结合部分(在本文中也称作“T细胞活化抗原结合部分”)。在一个具体 实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不多于一个能够与T细胞活化 抗原特异性结合的抗原结合部分。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结 合分子提供与T细胞活化抗原的单价结合作用。T细胞活化抗原结合部分可以是常规 的Fab分子或修饰的Fab分子，即单链或交换Fab分子，或单结构域抗原结合(SDAB) 分子，或包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。在其中存在包含于T细胞活化性 双特异性抗原结合分子中的多于一个能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合部分 的实施方案中，能够与T细胞活化抗原特异性结合的抗原结合部分优选地是修饰Fab 分子。
在一个具体实施方案中，T细胞活化抗原是CD3，特别是人CD3(SEQ ID NO:265) 或食蟹猴CD3(SEQ ID NO:266)，最特别地是人CD3。在一个具体实施方案中，T细 胞活化抗原结合部分对人CD3和食蟹猴CD3交叉反应(即与之特异性结合)。在一些 实施方案中，T细胞活化抗原是CD3的ε亚基。
在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分可以与单克隆抗体H2C(在PCT公 开号WO 2008/119567中描述)竞争结合CD3的表位。在另一个实施方案中，T细胞 活化抗原结合部分可以与单克隆抗体V9(在Rodrigues等人,Int J Cancer Suppl 7, 45-50(1992)和美国专利号6,054,297中描述)竞争结合CD3的表位。在又一个实施方 案中，T细胞活化抗原结合部分可以与单克隆抗体FN18(在Nooij等人,Eur J Immunol 19,981-984(1986)中描述)竞争结合CD3的表位。在一个具体实施方案中，T细胞活 化抗原结合部分可以与单克隆抗体SP34(在Pessano等人,EMBO J 4,337-340(1985) 中描述)竞争结合CD3的表位。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分结合与 单克隆抗体SP34相同的CD3表位。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包 含SEQ ID NO:163的重链CDR1、SEQ ID NO:165的重链CDR2、SEQ ID NO:167 的重链CDR3、SEQ ID NO:171的轻链CDR1、SEQ ID NO:173的轻链CDR2和SEQ ID NO:175的轻链CDR3。在又一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含与SEQID NO:169至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一 的重链可变区序列和与SEQ ID NO:177至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。
在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含SEQ ID NO:249的重链 CDR1、SEQ ID NO:251的重链CDR2、SEQ ID NO:253的重链CDR3、SEQ ID NO: 257的轻链CDR1、SEQID NO:259的轻链CDR2和SEQ ID NO:261的轻链CDR3。 在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分可以与下述抗原结合部分竞争结合CD3 的表位，所述抗原结合部分包含SEQ IDNO:249的重链CDR1、SEQ ID NO:251的 重链CDR2、SEQ ID NO:253的重链CDR3、SEQ ID NO:257的轻链CDR1、SEQ ID NO:259的轻链CDR2和SEQ ID NO:261的轻链CDR3。在一个实施方案中，T细 胞活化抗原结合部分结合与下述抗原结合部分相同的CD3表位，所述抗原结合部分包含SEQ ID NO:249的重链CDR1、SEQ ID NO:251的重链CDR2、SEQ ID NO:253 的重链CDR3、SEQ ID NO:257的轻链CDR1、SEQ ID NO:259的轻链CDR2和SEQ ID NO:261的轻链CDR3。在又一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含与SEQ ID NO:255至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一 的重链可变区序列和与SEQ ID NO:263至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案 中，T细胞活化抗原结合部分可以与下述抗原结合部分竞争结合CD3的表位，所述 抗原结合部分包含SEQ ID NO:255的重链可变区序列和SEQ ID NO:263的轻链可 变区序列。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分结合与下述抗原结合部分相 同的CD3表位，所述抗原结合部分包含SEQ ID NO:255的重链可变区序列和SEQ IDNO:263的轻链可变区序列。在另一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含SEQ ID NO:255的重链可变区序列的人源化形式和SEQ ID NO:263的轻链可变区序列的 人源化形式。在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含SEQ ID NO:249的 重链CDR1、SEQ ID NO:251的重链CDR2、SEQ ID NO:253的重链CDR3、SEQ ID NO:257的轻链CDR1、SEQ ID NO:259的轻链CDR2和SEQ ID NO:261的轻链 CDR3，以及人重链和轻链的可变区构架序列。
在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含选自SEQ ID NO:270、SEQ IDNO:271和SEQ ID NO:272的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自SEQ ID NO: 274、SEQ IDNO:275、SEQ ID NO:276的至少一个轻链CDR。
在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含选自SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:298和SEQ ID NO:299的氨基酸序 列，所述可变轻链包含选自SEQ ID NO:273和SEQ ID NO:297的氨基酸序列。
在一个实施方案中，T细胞活化抗原结合部分包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，所述可变轻链包含SEQ ID NO:273的 氨基酸序列。
靶细胞抗原结合部分
本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个能够与靶细胞抗原结合的抗原结合部分(在本文中也称作“靶细胞抗原结合部分”)。在某些实施方案中， T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含两个能够与靶细胞抗原结合的抗原结合部 分。在一个这样的特定实施方案中，这些抗原结合部分各自与相同的抗原决定簇特异 性结合。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不多于两个能 够与靶细胞抗原结合的抗原结合部分。
靶细胞抗原结合部分可以是常规的Fab分子或修饰的Fab分子，即单链或交换 Fab分子，或单结构域抗原结合(SDAB)分子，或包含至少一个锚蛋白重复基序的结合 蛋白。靶细胞抗原结合部分与特定抗原决定簇结合并且能够使T细胞活化性双特异性 抗原结合分子指向靶部位，例如指向携带该抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞。
在某些实施方案中，使靶细胞抗原结合部分指向与病理状况相关的抗原，如肿瘤细胞上或病毒感染的细胞上呈递的抗原。合适的抗原是细胞表面抗原，例如，但是不 限于细胞表面受体。在具体的实施方案中，抗原是人抗原。在一个具体实施方案中， 靶细胞抗原选自成纤维细胞活化蛋白(FAP)、黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20和CD33。
在具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含对黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)特异的至少一个抗原结合部分。在一个实施方案中，T 细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个、一般两个或更多个可以与单克隆抗 体LC007(参见SEQ ID NO:75和83，和欧洲专利申请号EP11178393.2，其通过引用 方式完整并入本文)竞争结合MCSP表位的抗原结合部分。在一个实施方案中，对 MCSP特异的抗原结合部分包含SEQ ID NO:69的重链CDR1、SEQ ID NO:71的重 链CDR2、SEQ ID NO:73的重链CDR3、SEQID NO:77的轻链CDR1、SEQ ID NO: 79的轻链CDR2和SEQ ID NO:81的轻链CDR3。在又一个实施方案中，对MCSP 特异的抗原结合部分包含与SEQ ID NO:75至少约80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:83至少约80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其 保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少 一个、一般两个或更多个可以与单克隆抗体M4-3 ML2(参见SEQ ID NO:239和247， 和欧洲专利申请号EP11178393.2，其通过引用方式完整并入本文)竞争结合MCSP表 位的抗原结合部分。在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分结合与单克 隆抗体M4-3 ML2相同的MCSP表位。在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结 合部分包含SEQ ID NO:233的重链CDR1、SEQ IDNO:235的重链CDR2、SEQ ID NO:237的重链CDR3、SEQ ID NO:241的轻链CDR1、SEQ ID NO:243的轻链CDR2 和SEQ ID NO:245的轻链CDR3。在又一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合 部分包含与SEQ ID NO:239至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％、尤其约98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:247 至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％、尤其约98％、 99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，对 MCSP特异的抗原结合部分包含单克隆抗体M4-3 ML2的亲和力成熟形式的重链可 变区序列和轻链可变区序列。在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包 含具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个、尤其两个、三个、四个或五个 氨基酸置换的SEQ ID NO:239的重链可变区序列；和具有一个、两个、三个、四个、 五个、六个或七个、尤其两个、三个、四个或五个氨基酸置换的SEQ IDNO:247的 轻链可变区序列。可变区序列内部的任何氨基酸残基，包括CDR区内部的氨基酸残 基，可以被不同氨基酸置换，条件是与MCSP、特别人MCSP的结合作用保留。优 选的变体是对MCSP的结合亲和力至少等于(或强于)包含未置换的可变区序列的抗原 结合部分的结合亲和力的那些变体。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:1的 多肽序列、SEQ ID NO:3的多肽序列和SEQ ID NO:5的多肽序列，或其保留功能的 变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:7 的多肽序列、SEQID NO:9的多肽序列和SEQ ID NO:11的多肽序列，或其保留功 能的变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:13的多肽序列、SEQ ID NO:15的多肽序列和SEQ ID NO:5的多肽序列，或其 保留功能的变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含 SEQ ID NO:17的多肽序列、SEQ ID NO:19的多肽序列和SEQ ID NO:5的多肽序 列，或其保留功能的变体。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分 子包含SEQ ID NO:21的多肽序列、SEQ ID NO:23的多肽序列和SEQ IDNO:5的 多肽序列，或其保留功能的变体。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:25的多肽序列、SEQ ID NO:27的多肽序列和SEQ ID NO: 5的多肽序列，或其保留功能的变体。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性 抗原结合分子包含SEQ ID NO:29的多肽序列、SEQ ID NO:31的多肽序列、SEQ ID NO:33的多肽序列和SEQID NO:5的多肽序列，或其保留功能的变体。在另一个实 施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:29的多肽序列、SEQ ID NO:3的多肽序列、SEQ ID NO:33的多肽序列和SEQ ID NO:5的多肽序列，或 其保留功能的变体。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含 SEQ ID NO:35的多肽序列、SEQ ID NO:3的多肽序列、SEQID NO:37的多肽序列 和SEQ ID NO:5的多肽序列，或其保留功能的变体。在另一个实施方案中，T细胞 活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:39的多肽序列、SEQ ID NO:3的多 肽序列、SEQ ID NO:41的多肽序列和SEQ ID NO:5的多肽序列，或其保留功能的 变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:29 的多肽序列、SEQ ID NO:3的多肽序列、SEQ ID NO:5的多肽序列和SEQ ID NO: 179的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性 抗原结合分子包含SEQ IDNO:5的多肽序列、SEQ ID NO:29的多肽序列、SEQ ID NO:33的多肽序列和SEQ ID NO:181的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实 施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:5的多肽序列、SEQ ID NO:23的多肽序列、SEQ ID NO:183的多肽序列和SEQID NO:185的多肽序列， 或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含 SEQ ID NO:5的多肽序列、SEQ ID NO:23的多肽序列、SEQ ID NO:183的多肽序 列和SEQ ID NO:187的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细 胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:33的多肽序列、SEQ ID NO:189 的多肽序列、SEQ ID NO:191的多肽序列和SEQ ID NO:193的多肽序列，或其保留 功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:183的多肽序列、SEQID NO:189的多肽序列、SEQ ID NO:193的多肽序列和 SEQ ID NO:195的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活 化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:189的多肽序列、SEQ ID NO:193的多 肽序列、SEQ ID NO:199的多肽序列和SEQ ID NO:201的多肽序列，或其保留功能 的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:5 的多肽序列、SEQ ID NO:23的多肽序列、SEQ ID NO:215的多肽序列和SEQ ID NO: 217的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性 抗原结合分子包含SEQ ID NO:5的多肽序列、SEQ ID NO:23的多肽序列、SEQ ID NO:215的多肽序列和SEQ ID NO:219的多肽序列，或其保留功能的变体。
在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含选自SEQ ID NO:280、 SEQID NO:281、SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:303、SEQ ID NO: 304和SEQ IDNO:306的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自SEQ ID NO:284、 SEQ ID NO:285、SEQ IDNO:286、SEQ ID NO:310、SEQ ID NO:311、SEQ ID NO: 314、SEQ ID NO:315和SEQ ID NO:316的至少一个轻链CDR。
在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含选自SEQ ID NO:280、 SEQID NO:281和SEQ ID NO:282的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自SEQ ID NO:284、SEQID NO:285和SEQ ID NO:286的至少一个轻链CDR。
在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含SEQ ID NO:280的重链CDR1、SEQ ID NO:281的重链CDR2、SEQ ID NO:282的重链CDR3、SEQ ID NO: 284的轻链CDR1、SEQ ID NO:285的轻链CDR2和SEQ ID NO:286的轻链CDR3。
在又一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含可变重链和可变轻链， 所述变重链包含选自SEQ ID NO:279、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:305和SEQID NO:307的氨基酸序列，所述可变轻链包含选自SEQ ID NO:283、 SEQ ID NO:309、SEQ IDNO:312、SEQ ID NO:313和SEQ ID NO:317的氨基酸 序列。
在一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含可变重链和可变轻链， 所述可变重链包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，所述可变轻链包含SEQ ID NO: 283的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，对MCSP特异的抗原结合部分包含与SEQ ID NO:279 至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO: 283至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保 留功能的变体。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQ ID NO:278相同至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的多肽序列、与SEQ ID NO:319 至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列、与SEQ ID NO:320 至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列和与SEQ ID NO:321 至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQ ID NO:369至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列、与SEQ ID NO:370 至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列和与SEQ ID NO:371 至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQ ID NO:372同至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的多肽序列、与SEQ ID NO:373 至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列、与SEQ ID NO:374 至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列和与SEQ ID NO:375 至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列。
在一个具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由下述多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列编码与选自SEQ ID NO:70、SEQ ID NO: 72、SEQID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:242、SEQ IDNO:244、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:248、 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、 SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、 SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、 SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO:188、SEQID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、 SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:329至388的序列至少约80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％同一。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含对表皮生长因子受体(EGFR)特异的至少一个抗原结合部分。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特 异性抗原结合分子包含至少一个、一般两个或更多个可以与单克隆抗体GA201竞争 结合EGFR表位的抗原结合部分。参见通过引用方式完整并入本文的PCT公开WO 2006/082515。在一个实施方案中，对EGFR特异的抗原结合部分包含SEQ ID NO:85 的重链CDR1、SEQ ID NO:87的重链CDR2、SEQ ID NO:89的重链CDR3、SEQ ID NO:93的轻链CDR1、SEQ ID NO:95的轻链CDR2和SEQ ID NO:97的轻链CDR3。 在又一个实施方案中，对EGFR特异的抗原结合部分包含与SEQID NO:91至少约 80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列 和与SEQ ID NO:99至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或 100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。
在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:43 的多肽序列、SEQ ID NO:45的多肽序列和SEQ ID NO:47的多肽序列，或其保留功 能的变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:49的多肽序列、SEQ ID NO:51的多肽序列和SEQ ID NO:11的多肽序列，或 其保留功能的变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含 SEQ ID NO:53的多肽序列、SEQ IDNO:45的多肽序列和SEQ ID NO:47的多肽序 列，或其保留功能的变体。
在一个具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、 SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54和SEQID NO:12的序列至少约80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含对成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异的至少一个抗原结合部分。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特 异性抗原结合分子包含至少一个、一般两个或更多个可以与单克隆抗体3F2竞争结合 FAP表位的抗原结合部分。参见通过引用方式完整并入本文的PCT公开WO 2012/020006。在一个实施方案中，对FAP特异的抗原结合部分包含SEQ ID NO:101 的重链CDR1、SEQ ID NO:103的重链CDR2、SEQ ID NO:105的重链CDR3、SEQ ID NO:109的轻链CDR1、SEQ ID NO:111的轻链CDR2和SEQ ID NO:113的轻 链CDR3。在又一个实施方案中，对FAP特异的抗原结合部分包含与SEQ ID NO:107 至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变 区序列和与SEQ ID NO:115至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。
在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:55 的多肽序列、SEQ ID NO:51的多肽序列和SEQ ID NO:11的多肽序列，或其保留功 能的变体。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:57的多肽序列、SEQ ID NO:59的多肽序列和SEQ ID NO:61的多肽序列，或 其保留功能的变体。
在一个具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、 SEQ IDNO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:52和SEQ IDNO:12的序列至少约80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％同一。
在具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含对癌胚抗原(CEA)特异的至少一个抗原结合部分。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合 分子包含至少一个、一般两个或更多个可以与单克隆抗体BW431/26竞争(在欧洲专利 号EP160,897和Bosslet等人,Int J Cancer 36,75-84(1985)中描述)结合CEA表位的抗 原结合部分。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个、 一般两个或更多个可以与单克隆抗体CH1A1A(参见SEQ ID NO:123和131)竞争结合 CEA表位的抗原结合部分。参见通过引用方式完整并入本文的PCT专利公开号WO 2011/023787。在一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分结合与单克隆抗体 CH1A1A相同的CEA表位。在一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分包含 SEQ ID NO:117的重链CDR1、SEQ ID NO:119的重链CDR2、SEQ ID NO:121的 重链CDR3、SEQ ID NO:125的轻链CDR1、SEQ ID NO:127的轻链CDR2和SEQ ID NO:129的轻链CDR3。在又一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分包含 与SEQ ID NO:123至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％、 尤其约98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:131至少约80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％、尤其约98％、99％或100％ 同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，对CEA特异的 抗原结合部分包含单克隆抗体CH1A1A的亲和力成熟形式的重链可变区序列和轻链 可变区序列。在一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分包含具有一个、两个、 三个、四个、五个、六个或七个、尤其两个、三个、四个或五个氨基酸置换的SEQ ID NO:123的重链可变区序列；和具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个、 尤其两个、三个、四个或五个氨基酸置换的SEQ ID NO:131的轻链可变区序列。可 变区序列内部的任何氨基酸残基，包括CDR区内部的氨基酸残基，可以被不同氨基 酸置换，条件是与CEA、特别人CEA的结合作用保留。优选的变体是对CEA的结 合亲和力至少等于(或强于)包含未置换的可变区序列的抗原结合部分的结合亲和力的 那些变体。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:63的 多肽序列、SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ ID NO:67的多肽序列和SEQ ID NO:33 的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原 结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ ID NO:67的多肽序列、SEQ ID NO: 183的多肽序列和SEQID NO:197的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施 方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:183的多肽序列、SEQ ID NO:203的多肽序列、SEQ ID NO:205的多肽序列和SEQ ID NO:207的多肽序列， 或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含 SEQ ID NO:183的多肽序列、SEQ ID NO:209的多肽序列、SEQ ID NO:211的多肽 序列和SEQ ID NO:213的多肽序列，或其保留功能的变体。
在一个具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、 SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:184、SEQ IDNO:198、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、 SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212和SEQ ID NO:214的序列至 少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。
在一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分包含选自SEQ ID NO:290、SEQ IDNO:291和SEQ ID NO:292的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自SEQ ID NO: 294、SEQ IDNO:295和SEQ ID NO:296的至少一个轻链CDR。
在一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分包含SEQ ID NO:290的重链 CDR1、SEQ ID NO:291的重链CDR2、SEQ ID NO:292的重链CDR3、SEQ ID NO: 294的轻链CDR1、SEQID NO:295的轻链CDR2和SEQ ID NO:296的轻链CDR3。
在一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分包含可变重链和可变轻链，所 述可变重链包含SEQ ID NO:289的氨基酸序列，所述可变轻链包含SEQ ID NO:293 的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合部分包含与SEQ ID NO:289至少 约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:293 至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功 能的变体。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQ ID NO:288同至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的多肽序列、与SEQ ID NO:322 至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列、与SEQ ID NO:323 至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列和与SEQ ID NO:324 至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含对CD33特异的至 少一个抗原结合部分。在一个实施方案中，对CD33特异的抗原结合部分包含SEQ ID NO:133的重链CDR1、SEQ ID NO:135的重链CDR2、SEQ ID NO:137的重链 CDR3、SEQ ID NO:141的轻链CDR1、SEQ ID NO:143的轻链CDR2和SEQ ID NO: 145的轻链CDR3。在又一个实施方案中，对CD33特异的抗原结合部分包含与SEQ ID NO:139至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一 的重链可变区序列和与SEQ ID NO:147至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。
在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:33的 多肽序列、SEQ ID NO:213的多肽序列、SEQ ID NO:221的多肽序列和SEQ ID NO: 223的多肽序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性 抗原结合分子包含SEQ ID NO:33的多肽序列、SEQ ID NO:221的多肽序列、SEQ ID NO:223的多肽序列和SEQID NO:225的多肽序列，或其保留功能的变体。
在一个具体实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、 SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO: 224和SEQ ID NO:226的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。
多核苷酸
本发明还提供编码如本文所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离多核苷酸。
本发明的多核苷酸包括这些多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、 48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、 86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、 118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、 148、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、 192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、 222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、 252、254、256、258、260、262、264、329、330、331、332、333、334、335、336、 337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、 352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、373、374、 375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387和388中所 述的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一， 包括其功能性片段或变体。
编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸可以作为编码完整T细胞活化性双特异性抗原结合分子的单一多核苷酸表达或作为共表达的多个(例如， 两个或更多个)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经例如二硫键或 其他手段结合以形成有功能的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。例如，抗原结合 部分的轻链部分可以由来自T细胞活化性双特异性抗原结合分子的下述部分的分别 的多核苷酸编码，所述部分包含抗原结合部分的重链部分、Fc结构域亚基和任选地另 一个抗原结合部分(的一部分)。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽结合以形成抗原 结合部分。在另一个例子中，包含两个Fc结构域亚基之一和任选地一个或多个抗原 结合部分(的一部分)的T细胞活化性双特异性抗原结合分子部分可以由这样的分离多 核苷酸编码，所述分离的多核苷酸来自包含两个Fc结构域亚基中另一者和任选地抗 原结合部分(的一部分)的T细胞活化性双特异性抗原结合分子部分。当共表达时，Fc 结构域亚基缔和以形成Fc结构域。
在某些实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的片段，其包含第一和第二抗原结合部分和由两个亚基组成的Fc结构域，其中 第一抗原结合部分是单链Fab分子。在一个实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码 第一抗原结合部分和Fc结构域的亚基。在一个更具体的实施方案中，分离的多核苷 酸编码其中单链Fab分子与Fc结构域亚基共享羧基端肽键的多肽。在另一个实施方 案中，本发明的分离多核苷酸编码第二抗原结合部分的重链和Fc结构域的亚基。在 一个更具体的实施方案中，分离的多核苷酸编码其中Fab重链与Fc结构域亚基共享 羧基末端肽键的多肽。在又一个实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码第一抗原结 合部分、第二抗原结合部分的重链和Fc结构域的亚基。在一个更具体的实施方案中， 分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中单链Fab分子与Fab重链共享羧基端肽键， 所述Fab重链转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键。
在某些实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的片段，其包含第一和第二抗原结合部分和由两个亚基组成的Fc结构域，其中 第一抗原结合部分是交换Fab分子。在一个实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码 第一抗原结合部分的重链和Fc结构域的亚基。在一个更具体的实施方案中，分离的 多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab轻链可变区与Fab重链恒定区共享羧基端肽键， 所述Fab重链恒定区转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方 案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定区共 享羧基端肽键，所述Fab轻链恒定区转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键。在另一 个实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码第二抗原结合部分的重链和Fc结构域的 亚基。在一个更具体的实施方案中，分离的多核苷酸编码其中Fab重链与Fc结构域 亚基共享羧基末端肽键的多肽。在又一个实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码第 一抗原结合部分的重链、第二抗原结合部分的重链和Fc结构域的亚基。在一个更具 体的实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab轻链可变区与Fab重 链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab重链恒定区转而与Fab重链共享羧基端肽键，所述Fab重链转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键。在另一个具体实施方案中，分 离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定区共享羧基端 肽键，所述Fab轻链恒定区转而与Fab重链共享羧基端肽键，所述Fab重链转而与 Fc结构域亚基共享羧基端肽键。在又一个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码这样 的多肽，其中Fab重链与Fab轻链可变区共享羧基端肽键，所述Fab轻链可变区转 而与Fab重链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab重链恒定区转而与Fc结构域亚基共 享羧基端肽键。在又一个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中 Fab重链与Fab重链可变区共享羧基端肽键，所述Fab重链可变区转而与Fab轻链 恒定区共享羧基端肽键，所述Fab轻链恒定区转而与Fc结构域亚基共享羧基端肽键。
在其他实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码第三抗原结合部分的重链和Fc结构域的亚基。在一个更具体的实施方案中，分离的多核苷酸编码其中Fab重链与 Fc结构域亚基共享羧基末端肽键的多肽。
在其他实施方案中，本发明的分离多核苷酸编码抗原结合部分的轻链。在一些实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽,其中Fab轻链可变区与Fab重链恒定区 共享羧基端肽键。在其他实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab重 链可变区与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键。在另外的实施方案中，本发明的分离多 核苷酸编码第一抗原结合部分的轻链和第二抗原结合部分的轻链。在一个更具体的实 施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定 区共享羧基端肽键，所述Fab轻链恒定区转而与Fab轻链共享羧基端肽键。在另一 个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab轻链与Fab重链可 变区共享羧基端肽键，所述Fab重链可变区转而与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键。 在又一个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab轻链可变区与 Fab重链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab重链恒定区转而与Fab轻链共享羧基端肽 键。在又一个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码这样的多肽，其中Fab轻链与 Fab轻链可变区共享羧基端肽键，所述Fab轻链可变区转而与Fab重链恒定区共享羧 基端肽键。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含这样的序列，所述序列 编码如SEQ ID NO:75、83、91、99、107、115、123、131、139、147、169、177、239、247、255和263中所显示的可变区序列。在另一个实施方案中，本发明涉及一 种编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多 核苷酸包含了编码如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、 63、65、67、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、267、 268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、 283、284,285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、 298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、 313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327 和328中所示多肽序列的序列。在另一个实施方案中，本发明还涉及一种编码本发明 的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷 酸包含与SEQID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、 70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、 106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、164、166、168、170、172、174、176、178、 180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、 210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、 240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、329、330、 331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、 361、362、363、364、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、 384、385、386、387或388中所示核苷酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％或99％同一的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及一种编码本发明的 T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸 包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、 34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、 108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、 138、140、142、144、146、148、164、166、168、170、172、174、176、178、180、 182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、 212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、 242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、329、330、331、 332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、 347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、 362、363、364、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、 385、386、387或388中所示的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及一种编 码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所 述多核苷酸包含这样的序列，所述序列编码与SEQ ID NO:75、83、91、99、107、 115、123、131、139、147、169、177、239、247、255或263中的氨基酸序列至少约 80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的可变区序列。在另一个实 施方案中，本发明涉及一种编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离 的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码多肽序列的序列，所述多肽序列与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、 39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、179、181、183、 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、 215、217、219、221、223、225、227、229、231、267、268、269、270、271、272、 273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284,285、286、287、 288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、 303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、 318、319、320、321、322、323、324、325、326、327或328中的氨基酸序列至少 80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。本发明涵盖一种编码本发 明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核 苷酸包含这样的序列，所述序列编码具有保守氨基酸置换的SEQ ID NO:75、83、91、 99、107、115、123、131、139、147、169、177、239、247、255或263的可变区序 列。本发明还涵盖一种编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的 分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含这样的序列，所述序列编码具有保守氨基酸 置换的SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、 179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、 209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、267、268、269、 270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284,285、 286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、 301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、 316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327或328的多肽序列。
在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施方案中，本发明的多 核苷酸是RNA，例如，处于信使RNA(mRNA)形式。本发明的RNA可以是单链的或 双链的。
重组方法
本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。为了重组生产，将编码T细胞活化性双特异性 抗原结合分子(片段)的一个或多个多核苷酸(例如，如上文所述)分离并插入一个或多 个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。使用常规方法，可以轻易地分离这 种多核苷酸并将其测序。在一个实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸 的载体，优选地表达载体。本领域技术人员熟知的方法可以用来构建表达载体，所述 表达载体含有T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列，连同适宜的转 录/翻译控制信号。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/遗传重组。 参见，例如在Maniatis等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y(1989)中描述的技 术。表达载体可以是质粒、病毒的部分，或可以是核酸片段。表达载体包括将编码T 细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸(即编码区)以与启动子和/或其他 转录或翻译控制元件有效连接的方式克隆的表达盒。如本文所用，“编码区”是由翻译 成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不 翻译成氨基酸，但是如果存在的话，可以将它视为编码区的部分，但是任何侧翼序列， 例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等，均不是编 码区的部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中，例如存在于单 一载体上或存在于分立的多核苷酸构建体中，例如存在于分立(不同)的载体上。另外， 任何载体可以含有单个编码区，或可以包含两个或更多个编码区，例如，本发明的载 体可以编码一种或多种多肽，所述多肽借助蛋白酶剪切作用以翻译后方式或以共翻译 方式分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码 区，所述异源编码区与编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的多核 苷酸或变体或其衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于专用元件或基序，如分泌信号肽或异源功能性结构域。有效连接是以下情况，此时基因产物(例如多肽)的 编码区与一种或多种调节序列以如此方式连接，从而将基因产物的表达置于调节序列 的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA转录并且 如果两个DNA片段之间连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或 不干扰DNA模板被转录的能力，则这两个DNA片段(如多肽编码区和与之连接的启 动子)是“有效连接”的。因而，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，则该启 动子区与该核酸有效连接。启动子可以是指导DNA仅在预定细胞中大量转录的细胞 特异性启动子。其除启动子之外的他转录控制元件，例如增强子、操纵基因、阻遏蛋 白和转录终止信号，可以与多核苷酸有效连接以指导细胞特异转录。本文中公开了合 适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括 但不限于，在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，例如，但不限于，来自巨细胞 病毒(例如立即早期启动子，连同内含子-A一起)、猴病毒40(例如早期启动子)和逆转 录病毒(如，例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括源自脊 椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔α-珠蛋白的那些，以及能够控 制真核细胞中基因表达的其他序列。额外的合适转录控制区包括组织特异性启动子和 增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是 本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子和源自病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称作CITE序 列)。表达盒也可以包括其他特征如复制起点，和/或染色体整合元件如逆转录病毒长 末端重复序列(LTR)或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的额外编码区连接，所述分泌肽或信号肽指导由本发明多核苷酸编码的多肽分泌。例如，如果需要分泌T 细胞活化性双特异性抗原结合分子，则可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明 的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的核酸上游。根据信号假设，由哺乳 动物细胞分泌的蛋白质具有一旦已经启动正在增长的蛋白质链跨糙面内质网输出则 从成熟蛋白切下的信号肽或分泌前导序列。本领域普通技术人员知晓由脊椎动物细胞 分泌的多肽通常具有与多肽N末端融合的信号肽，所述信号肽从翻译的多肽被切下以 产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋 白重链或轻链的信号肽，或该序列的功能衍生物，所述功能衍生物保留指导与该序列 有效连接的多肽分泌的能力。备选地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。 例如，野生型前导序列可以用人组织纤维蛋白溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸 糖苷酶的前导序列替换。SEQ ID NO:154-162中给出分泌信号肽的示例性氨基酸序列 和多核苷酸序列。
可以在编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸的内部或末端处包含编码短蛋白质序列的DNA，所述短蛋白质序列可以用来促进稍后的纯化(例如 组氨酸标签)或辅助标记T细胞活化性双特异性抗原结合分子。
在又一个实施方案中，提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供了包含一种或多种本发明载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以 分别相对于多核苷酸和载体，单独或以组合方式合并本文中所述的任一特征。在一个 这样的实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已经用所述载体转化或转染)，所述载体 包含编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(部分)的多核苷酸。如本文所 用，术语“宿主细胞”指可以工程化以产生本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子 或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持T细胞活化性双特异性抗原结合分 子表达的宿主细胞是本领域熟知的。根据需要，这类细胞可以用特定表达载体转染或 转导，并且可以培育大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵器以获得足够量的T细 胞活化性双特异性抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，如 大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，可以 在细菌中产生多肽，特别是当不需要糖基化时可以在细菌中产生多肽。在表达后，可 以将多肽从细菌细胞糊状物分离于可溶性级分中并且可以进一步纯化多肽。除原核生 物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码多肽的载体的合适克隆宿主或表达宿 主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人 类糖基化模式的多肽。见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)和Li等人,Nat Biotech 24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还源自多细胞生物 (无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴 定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞 的许多杆状病毒毒株。也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如美国专利号 5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗 体的PLANTIBODIESTM技术)。也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如Graham等人,J Gen Virol36,59(1977)中所述那样)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠支持细胞(TM4细胞如在 例如Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述那样)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴 肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞 (BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562)、 TRI细胞(如在例如Mather等人,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982中所述那样))、 MRC5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人,Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和 骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适于产生蛋白质的某些哺乳动物宿 主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu，Methodsin Molecular Biology，第248 卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞 包括培养的细胞，例如，培养的哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植 物细胞，此处仅提到数种，其还包括含于转基因动物、转基因植物或培养的植物组织 或动物组织内部的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选地是哺乳动 物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。
本领域已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。表达包含抗原结合结构域的重链或轻链的多肽(如抗体)的细胞可以如此工程化，从而还表达抗体的其他链，从而 表达产物是具有重链和轻链的抗体。
在一个实施方案中，提供了产生本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，其中所述方法包括在适于表达T细胞活化性双特异性抗原结合分子的条件下培养 如本文中提供的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码T细胞活化性双特异性抗原结合分 子的多核苷酸，并且从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收T细胞活化性双特异性抗原 结合分子。
T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分以遗传方式彼此融合。可以如此设计T细胞活化性双特异性抗原结合分子，从而其组分彼此直接融合或通过接头序列间接 融合。接头的组成和长度可以根据本领域熟知的方法确定并且可以就功效进行测试。 T细胞活化性双特异性抗原结合分子的不同组分之间接头序列的例子存在于本文提供 的序列中。如果需要，也可以包括额外的序列以并入切割位点以便分隔融合物的各种 组分，例如内肽酶识别序列。
在某些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个或多个抗原结合部分至少包含能够结合抗原决定簇的抗体可变区。可变区可以形成天然或非天然存在 的抗体及其片段的部分，并且可变区可以衍生自天然或非天然存在的抗体及其片段。 产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(见例如Harlow和Lane， "Antibodies,alaboratory manual",Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存 在的抗体可以使用固相肽合成法构建，可以重组产生(例如，如美国专利号4,186,567 中所述)，或可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库获得(见例如授予 McCafferty的美国专利号5,969,108)。
任何动物种类的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可以用于本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子中。可用于本发明中的非限制性抗体、抗体片段、 抗原结合结构域或可变区可以是鼠源、灵长类源或人源的。如果T细胞活化性双特异 性抗原结合分子意欲用于人类，则可以使用嵌合形式的抗体，其中该抗体的恒定区来 自人类。也可以根据本领域熟知的方法制备人源化或完全人形式的抗体(见例如授予Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，所述方法包括但不 限于(a)在保留或不保留关键构架残基(例如对保留良好抗原结合亲和力或抗体功能重 要的那些残基)的情况下，将非人类(例如，供体抗体)CDR移植到人类(例如受体抗体) 构架和恒定区上，(b)仅将非人类特异性决定区(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作 用至关重要的残基)移植到人构架和恒定区上，或(c)移植整个非人类可变结构域，但 是通过更换表面残基用人样部分“掩蔽”它们。人源化抗体和制造它们的方法例如在 Almagro和Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)中综述，并且例如还在 Riechmann等人,Nature 332,323-329(1988)；Queen等人,Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Jones 等人,Nature 321,522-525(1986)；Morrison等人,Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855 (1984)；Morrison和Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人,Science 239, 1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人, Methods 36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR移植)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498 (1991)(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,Methods 36,43-60(2005)(描述“FR改 组”)；和Osbourn等人,Methods 36,61-68(2005)和Klimka等人,Br JCancer 83, 252-260(2000)(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中描述。人抗体和人可变区可以 使用本领域已知的多种技术产生。人抗体总体上在van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008) 中描述。人可变区可以形成通过杂交瘤方法产生的人单克隆抗体的部分，并且人可变 区可以衍生自所述人单克隆抗体(见例如Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications(单克隆抗体生产技术及应用)，第51-63页(MarcelDekker,Inc.,New York,1987))。人抗体和人可变区也可以通过施用免疫原至转基因动 物制备，其中所述转基因动物已经被修饰以应答于抗原攻击而产生完整人抗体或具有 人可变区的完整抗体(见例如Lonberg，Nat Biotech 23,1117-1125(2005)。也可以通过 分离从人衍生的噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体和人可 变区(见例如，Hoogenboom等人,引自Methods in Molecular Biology 178，1-37(O' Brien等人编著,Human Press,Totowa,NJ,2001)；和McCafferty等人,Nature 348, 552-554；Clackson等人,Nature 352,624-628(1991))。噬菌体一般将抗体片段展示为 单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。
在某些实施方案中，根据例如在美国专利申请公开号2004/0132066中公开的方法，将用于本发明中的抗原结合部分工程化以具有增强的结合亲和力，所述文献的完 整内容因而通过引用的方式并入。可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术 人员熟悉的其他技术，例如表面等离子体共振技术(在BIACORE T100系统上分 析)(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000))和传统结合测定法(Heeley，Endocr Res 28,217-229(2002))，测量本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子与特定抗原决 定簇结合的能力。竞争测定法可以用来鉴定与参考抗体竞争结合至特定抗原的抗体、 抗体片段、抗原结合结构域或可变结构域，例如，与V9抗体竞争结合至CD3的抗体。 在某些实施方案中，这种竞争性抗体与参考抗体结合的相同表位(例如线性表位或构 象表位)结合。用于定位与抗体结合的表位的详细示例性方法在Morris(1996) “Epitope Mapping Protocols(表位定位法)”,引自Methods in Molecular Biology第66 卷(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。在示例性竞争测定法中，将固定的抗原(例如 CD3)在溶液中温育，所述溶液包含与该抗原结合的第一标记抗体(例如V9抗体)和正 在测试与第一抗体竞争结合至该抗原的能力的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于 杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的抗原在包含第一标记抗体但是不包含第二未标 记抗体的溶液中温育。在允许第一抗体与该抗原结合的条件下温育后，移除过多的未 结合的抗体，并且测量与固定抗原结合的标记物的量。如果与固定抗原结合的标记物 的量在测试样品中相对于对照样品实质降低，则这表示第二抗体正在与第一抗体竞争 结合至该抗原。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratory Manual第14 章(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。
如本文所述那样制备的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以通过现有已知的技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。 用来纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸多因素，如净电荷、疏水性、亲水性 等并且将是本领域技术人员显而易见的。对于亲和层析纯化，可以使用与T细胞活化 性双特异性抗原结合分子结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于T细胞活化性 双特异性抗原结合分子的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基 本上如实施例中所述，依次的蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析可以用来分离T 细胞活化性双特异性抗原结合分子。T细胞活化性双特异性抗原结合分子的纯度可以 由多种熟知分析方法的任一种方法确定，所述熟知分析方法包括凝胶电泳、高压液相 色谱等。例如，显示如中所述那样表达的重链融合蛋白是完整的并且正确装配，如还 原性SDS-PAGE所展示(参见例如图2)。在大约相对分子量25,000、相对分子量50,000 和相对分子量75,000处分离出三个条带，所述相对分子量对应于T细胞活化性双特 异性抗原结合分子的轻链，重链和重链/轻链融合蛋白的预测分子量。
测定法
可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定、筛选或表征本文提供的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的物理/化学特性和/或生物学活性。
亲和力测定法
可以根据实施例中所述的方法，通过表面等离子体共振(SPR)，使用标准仪器如BIAcore仪(GE Healthcare)确定T细胞活化性双特异性抗原结合分子对Fc受体或靶 抗原的亲和力，并且例如可以通过重组表达获得受体或靶蛋白。备选地，T细胞活化 性双特异性抗原结合分子对不同受体或靶抗原的结合作用可以使用表达特定受体或 靶抗原的细胞系，例如通过流式细胞术(FACS)评价。在下文及在下文实施例中描述用 于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。
根据一个实施方案，使用T100仪(GE Healthcare)在25℃通过表面等离子体共振法测量KD。
为了分析Fc部分和Fc受体之间的相互作用，加His标签的重组Fc受体由CM5 芯片上固定的抗五His抗体(Qiagen)捕获并且使用特异性构建体作为分析物。简而言 之，根据供应商说明书，用盐酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟 基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GE Healthcare)。将 抗五His抗体用10mM乙酸钠，pH 5.0稀释至40μg/ml，随后以5μl/min的流速上 样以实现所偶联蛋白的大约6500个响应单位(RU)。在配体上样后，注入1M乙醇胺 以封闭未反应的基团。随后，在4或10nM捕获Fc受体60秒。对于动力学测量，将 双特异性构建体的4倍连续稀释物(范围在500nM和4000nM之间)在HBS-EP(GE Healthcare，10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20， pH 7.4)中于25℃按30μl/min流速上样120秒。
为了确定对靶抗原的亲和力，如对抗五His抗体所述那样，通过活化的CM5传 感芯片表面上固定的抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare)捕获双特异性构建体。偶联 的蛋白质的最终量是大约12000RU。在300nM捕获双特异性构建体90秒。使靶抗 原以250nM至1000nM的浓度范围通过流动小室持续180秒，流速30μl/分钟。监 测解离过程180秒。
通过扣除在参比流动小室上获得的响应，修正本体折射率差异。通过Langmuir 结合等温线的非线性曲线拟合，将稳态响应用来导出解离常数KD。使用简单一对一 Langmuir结合模型(
Figure BDA0002213187780000861
T100评价软件1.1.1版)，通过同时拟合缔合和解离 传感图(sensorgram)，计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算 为koff/kon比。参见，例如，Chen等人,J Mol Biol 293,865-881(1999)。
活性测定法
可以通过如实施例中所述的多种测定法测量本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的生物活性。生物活性可以例如包括诱导T细胞增殖、诱导中T细胞的 信号传导、诱导的T细胞中的活化标志物表达、诱导T细胞分泌细胞因子、诱导靶 细胞(如肿瘤细胞)溶解和诱导肿瘤消退和/或改善存活。
组合物、制剂和施用途径
在又一个方面，本发明提供了包含本文提供的任何T细胞活化性双特异性抗原结合分子的药物组合物，例如，用于下述任一种治疗方法中。在一个实施方案中，药物 组合物包含本文提供的任何T细胞活化性双特异性抗原结合分子和可药用载体。在另 一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的任何T细胞活化性双特异性抗原结合分 子和至少一种额外治疗药，例如，如下文描述。
进一步提供一种产生处于适于体内施用形式的本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，所述方法包括(a)获得本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合 分子，和(b)将T细胞活化性双特异性抗原结合分子与至少一种药学可接受载体配制， 因而配制了用于体内施用的T细胞活化性双特异性抗原结合分子制剂。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的溶解或分散于可药用载体中的一种或多种T细胞活化性双特异性抗原结合分子。短语“可药用或药理学可接受的”指在使用的 剂量和浓度通常对接受者无毒，即施用至动物(如果适宜，例如人)时不产生不良、变 应性或其他不利反应的分子实体和组合物。根据本公开，制备含有至少一种T细胞活 化性双特异性抗原结合分子并任选地含有额外有效成分的药物组合物将是本领域技 术人员已知的，如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Printing Company,1990所例举，所述文献通过引用方式并入本文。另外，对于动物(例如，人 类)施用，应当理解制品应当满足如FDA生物学标准办公室或其他国家的相应权力机 关所要求的无菌性、致热原性、总体安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或 水溶液剂。如本文所用，“可药用载体”包括任何和全部溶剂、缓冲剂、分散介质、包 衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌药、抗真菌药)、等渗剂、吸收延迟 剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、 赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、这类相似材料及其组合，这是本 领域普通技术人员已知的(见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版, Mack Printing Company,1990,第1289-1329页，所述文献通过引用方式并入本文)。 除了任何常规载体与有效成分不相容的情况下之外，构思了所述载体在治疗组合物或 药物组合物中的用途。
该组合物可以包含不同类型的载体，这取决于它是否将以固态、液态或气溶胶形式施用及作为注射剂对这类施用途径而言它是否需要是无菌的。可以将本发明的T细 胞活化性双特异性抗原结合分子(和任何其它的治疗药)按静脉内、真皮内、动脉内、 腹腔内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、脾内、肾内、胸膜内、气管内、鼻内、 玻璃体内、阴道内地、直肠内、瘤内、肌内、腹腔内、皮下、结膜下的、囊内、粘膜、 心包内、脐内、眼球内、口服、局部、局部方式、通过吸入(例如气溶胶吸入)、注射、 输注、连续输注、直接局限化灌流浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在膏料中、在 脂质组合物(例如脂质体)中或通过其他方法或前述方法的任何组合施用，这是本领域 普通技术人员已知的(参见，例如Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版， Mack Printing Company，1990，通过引用方式并入本文)。肠胃外施用，尤其静脉内 注射，最常使用于施用多肽分子，如本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。
肠胃外组合物包括设计成通过注射例如皮下、真皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用的那些组合物。对于注射剂，可以将本发明的T细胞活 化性双特异性抗原结合分子在水溶液中、优选地在生理相容性缓冲液如Hank溶液、Ringer溶液或生理盐水中配制。所述溶液可以含有配制剂如助悬剂、增溶剂、稳定剂 和/或分散剂。备选地，T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以处于使用前与合适溶 媒(例如，无菌无热原水)粉末构成的形式。通过以下方式制备无菌可注射溶液剂：将 本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子按要求的量，根据需要连同下文列举的 多种其他成分一起并入适宜的溶剂中。可以例如通过借助无菌滤膜过滤轻易地实现无 菌性。通常，通过将多种消毒的有效成分并入无菌溶媒中来制备分散体，所述无菌溶 媒含有基础分散介质和/或其他成分。在用于现场制备无菌可注射溶液剂、混悬剂或乳 剂的无菌粉末情况下，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，所述技术产生来 自事先无菌过滤的液体介质中的有效成分和任何额外所需成分的粉末。如果需要，应 当合适地缓冲液体介质并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂在注射之前等 渗。组合物必须在制造和储存条件下是稳定的；因此，受到保护免遭免微生物如细菌 和真菌的污染作用。可以理解应当使内毒素污染保持在最小，处于安全水平，例如， 小于0.5ng/mg蛋白质。合适的可药用载体包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸 和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基 氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊 金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个 残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯 烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二 糖和其他糖包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻 糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和/或非离 子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。水性注射混悬剂可以含有增加混悬剂黏度的化合物， 如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖等。任选地，混悬剂也可以含有合适的稳定剂或 增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液剂的物质。另外，活性化合物的混悬 剂可以制备为适宜的油性注射混悬剂。合适的亲脂溶剂或运载体包括脂肪油如芝麻 油，或合成性脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。
有效成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或乳浊液中。这类技 术在Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版,Mack Printing Company,1990) 中公开。可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有多肽的固态疏水 性聚合物的半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。在具 体的实施方案中，可以通过在可注射组合物中使用延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝、 明胶或其组合，引起组合物的吸收延长。
除前面所述的组合物之外，也可以将T细胞活化性双特异性抗原结合分子配制为贮库配制品。这种长效制剂可以通过(例如皮下或肌内)植入或通过肌内注射施用。因 此，例如，可以将T细胞活化性双特异性抗原结合分子用合适的聚合材料或疏水材料 (例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制，或者配制为微溶性衍生物，例如 微溶性盐。
包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的药物组合物可以按本领域已知的任何方式制造，例如，通过常规混合、溶解、乳化、囊化、包埋或冻干法制造。 可以使用一种或多种促进蛋白质加工成可以按药学方式使用的制品的生理可接受载 体、稀释剂、赋形剂或辅助剂以常规方式配制药物组合物。合适的制剂取决于所选的 施用途径。
可以将T细胞活化性双特异性抗原结合分子以游离酸或碱、中性盐或盐形式配制到组合物中。可药用盐是基本上保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些盐包括酸加成 盐，例如，与蛋白质组合物的游离氨基形成的或与无机酸例如氢氯酸或磷酸或这类有 机酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸酸形成的那些盐。与游离羧基形成的盐也可以源 自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁或这类有机碱 如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。药用盐倾向于在含水溶剂和不为相应游离碱 形式的其他质子溶剂中溶解性更高。
治疗方法和组合物
本文提供的任何T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以用于治疗方法中。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以用作免疫治疗剂，例如用于治疗癌症。
为了用于治疗方法中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子将以符合良好医学实践的方式配制、投予和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体 病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、 施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。
在一个方面，提供用作药物的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在其他方面，提供用于治疗疾病的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在某 些实施方案中，提供用于治疗方法中的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分 子。在一个实施方案中，本发明提供如本文所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分 子用于治疗有需求的个体中的疾病。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗患有疾 病的个体的方法中的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，所述方法包括向该个体施 用治疗有效量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，待治疗疾 病是增殖性病症。在一个具体实施方案中，疾病是癌症。在某些实施方案中，该方法 还包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗药，例如，如果待治疗疾病是癌 症，施用抗癌药。在其他实施方案中，本发明提供如本文所述的T细胞活化性双特异 性抗原结合分子用于诱导靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解。在某些实施方案中，本发 明提供T细胞活化性双特异性抗原结合分子用于诱导个体中的靶细胞裂解、尤其肿瘤 细胞裂解的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的T细胞活化性双特异性抗原结 合分子以诱导靶细胞裂解。根据以上任一个实施方案的“个体”是哺乳动物，优选地是 人类。
在又一个方面，本发明提供本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗有需求的个体中的疾病。 在又一个实施方案中，该药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向患有该疾病的 个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗疾病是增殖性病症。在一个 具体实施方案中，疾病是癌症。在一个实施方案中，该方法还包括向个体施用治疗有 效量的至少一种额外的治疗药，例如，如果待治疗疾病是癌症，则施用抗癌药。在又 一个实施方案中，药物用于诱导靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解。在仍然又一个实施 方案中，该药物用于诱导个体中靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的方法中，所述方法 包括向该个体施用有效量的药物以诱导靶细胞裂解。根据以上实施方案中任一个实施 方案的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
在又一个方面，本发明提供一种用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有这种疾病的个体施用治疗有效量的本发明的T细胞活化性双特异性抗 原结合分子。在一个实施方案中，将组合物施用至所述个体，所述组合物包含可药用 形式的本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，待治疗疾病 是增殖性病症。在一个具体实施方案中，疾病是癌症。在某些实施方案中，该方法还 包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗药，例如，如果待治疗疾病是癌症， 施用抗癌药。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选地 是人。
在又一个方面，本发明提供一种用于诱导靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的方法。在一个实施方案中，该方法包括使靶细胞与与本发明的T细胞活化性双特异性抗原结 合分子在T细胞、特别是细胞毒T细胞存在下接触。在又一个方面，提供一种用于 诱导个体中靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的方法。在这样的一个实施方案中，该方 法包括向该个体施用有效量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞裂 解。在一个实施方案中，“个体”是人。
在某些实施方案中，待治疗疾病是增殖性病症，特别是癌症。癌症的非限制性例子包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、 子宫内膜癌、食管癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、 鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。可以使用本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子治疗 的其他细胞增殖病症包括但不限于位于以下部位的肿瘤：腹部、骨、乳腺、消化系统、 肝、胰、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、 眼部、头部和颈部、(中枢和外周)神经系统、淋巴系统、盆腔、皮肤、软组织、脾、 胸部和泌尿生殖系统。还包括癌前病状或损害和癌症转移灶。在某些实施方案中，癌 症选自肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。技术人员轻易 地认识到，在许多情况下T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以不提供治愈，而仅 可以提供部分益处。在一些实施方案中，具有某些益处的生理变化也视为治疗性有益 的。因此，在一些实施方案中，将提供生理变化的T细胞活化性双特异性抗原结合分 子的量视为“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体一般是哺乳动物、更具体地是人。
在一些实施方案中，将有效量的本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子施用至细胞。在其他实施方案中，将治疗有效量的本发明T细胞活化性双特异性抗原结合 分子施用至个体以治疗疾病。
对于预防或治疗疾病，本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗药组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用 途径、患者体重、T细胞活化性双特异性抗原结合分子的类型、疾病的严重程度和过 程、T细胞活化性双特异性抗原结合分子是否出于预防或治疗目的施用、之前或同时 实施的治疗性介入、患者的临床史和对T细胞活化性双特异性抗原结合分子的反应以 及主治医师的决定。在任何情况下，负责施用的执业者将决定用于单个受试者的组合 物中的有效成分浓度及适宜剂量。本文中构思了多种给药方案，包括但不限于单次或 在多个时间点多次施用、快速浓注施用和脉冲输注。
将T细胞活化性双特异性抗原结合分子适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)T 细胞活化性双特异性抗原结合分子可以是向患者施用的初始候选剂量，无论是否例如 通过一个或多个单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见 的每日剂量可以是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内 重复施用，取决于病状，治疗通常将持续直至对疾病症状的所需抑制作用出现。T细 胞活化性双特异性抗原结合分子的一个示例性剂量处于约0.005mg/kg至约10mg/kg 范围内。在其他非限制性例子中，剂量还可以包含每次施用约1微克/kg体重、约5 微克/kg体重、约10微克/kg体重、约50微克/kg体重、约100微克/kg体重、约200 微克/kg体重、约350微克/kg体重、约500微克/kg体重、约1毫克/kg体重、约5 毫克/kg体重、约10毫克/kg体重、约50毫克/kg体重、约100毫克/kg体重、约200 毫克/kg体重、约350毫克/kg体重、约500毫克/kg体重至约1000mg/kg体重或更多， 以及使用可来自于其中的任何范围。在从本文所列数值可获得的范围的非限制性例子 中，基于上文描述的数值，可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5微克 /kg体重至约500毫克/kg体重等的范围。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0 mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg的一种或多种剂量(或其任意组合)。这类剂量可以间歇 地施用，例如，每周或每3周(例如，由此患者接受从约2个至约20个或例如约6 个剂量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)。可以施用较高的初始负荷剂量，随 后是一个或多个较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容 易地监测这种疗法的进程。
本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子通常将按有效实现预期目的量使用。为了用来治疗或预防疾病状态，以治疗有效量施用或施加本发明的T细胞活化性 双特异性抗原结合分子或其药物组合物。确定治疗有效量完全处于本领域技术人员的 能力范围内，尤其是根据本文所提供的详细公开内容。
对于全身性施用，可以从体外测定法初步估计治疗有效剂量，如细胞培养测定法。可以在动物模型中配制某个剂量以实现包括IC50的循环浓度范围，如细胞培养物中所 测定。这种信息可以用来更精确地确定用于人类中的剂量。
也可以使用本领域熟知的技术，从体内数据(如动物模型)估计初始剂量。本领域普通技术人员可以基于动物数据轻易地优化对人类施用。
可以逐一调整剂量数量和间隔时间以提供足以维持治疗效果的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的血浆水平。注射施用的患者常规剂量是约0.1至50mg/kg/日， 一般约0.5至1mg/kg/日。治疗有效的血浆水平可以通过每日施用多个剂量实现。可 以测量血浆中的水平，例如，通过HPLC测量。
在局部施用或选择性摄入的情况下，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的有效局部浓度可以与血浆浓度不相关。本领域技术人员将能够在无需过多实验的情况下优 化治疗有效的局部剂量。
本文所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的治疗有效剂量通常将在不造成明显毒性的情况下提供治疗益处。可以通过标准药学流程在细胞培养物或实验动物 中确定T细胞活化性双特异性抗原结合分子的毒性和治疗功效。细胞培养测定法和动 物研究可以用来测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体中治疗有效的剂 量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，它可以表述为LD50/ED50比。优 选显示出巨大治疗指数的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中， 本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子显示出高治疗指数。可以在配制适用于 人类中的剂量范围时使用从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据。该剂量优选 地位于毒性低或无毒性情况下包括ED50的一系列循环浓度范围内。剂量可以在这个 范围内部变动，这取决于多种因素，例如，所用的剂型、所用的施用途径、受试者状 况等。确切配方、施用途径和剂量可以由各位医师根据患者的疾病选择(参见，例如Fingl等人,1975,引自：The Pharmacological Basisof Therapeutics,第1章,第1页， 所述文献通过引用方式完整并入本文)。
用本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子治疗的患者的主治医生将知道如何和何时因所致毒性、器官功能障碍等而终止、暂停或调节施用。反过来，如果临床 反应不充分(不包括毒性)，主治医师也会知道将治疗调整到更高的水平。治疗目的病 状时所施用剂量的大小将随待治疗病状的严重性、随施用途径等变动。病状的严重性 可以例如部分地通过标准预后评价方法进行评价。另外，剂量和或许给药频率也将根 据各位患者的年龄、体重和反应而变动。
其他药剂和治疗
本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以在疗法中与一种或多种其它药剂组合施用。例如，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以与至少一种 额外的治疗剂共施用。术语“治疗药”涵盖为了治疗需要这种治疗的个体中的症状或疾 病所施用的任何药剂。这类额外治疗药可以包括适用于正在治疗的特定适应症的任何 有效成分，优选地具有互补活性的彼此无不利影响的那些治疗药。在某些实施方案中， 额外的治疗药是免疫调节剂、细胞抑制剂、细胞黏附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡 激活物、或增加细胞对凋亡诱导物的敏感性的药物。在一个具体实施方案中，额外治 疗药是抗癌药，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷 基化剂、激素治疗药、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡激活物或抗血管生成 剂。
此类其他药剂适当地以有效用于预期目的的量存在。这类其他药物的有效量取决于所用T细胞活化性双特异性抗原结合分子的量、疾病类型或疗法和上文讨论的其他 因素。T细胞活化性双特异性抗原结合分子通常以与如本文所述相同的剂量并且采用 与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验 地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。
上文所示的这类联合疗法涵盖联合施用(其中在相同或独立的组合物中包含两种或更多种治疗药)，和独立施用，在这种情况下，本发明T细胞活化性双特异性抗原 结合分子的施用可以在施用额外的治疗药和/或辅药之前、同时和/或之后进行。本发 明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子也可以与放射疗法组合使用。
制造物
在本发明的另一个方面，提供制造物，所述制造物含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造物包括容器和在该容器上或与之结合的标签或包装 插页。合适的容器包括例如瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。可以从多种材料 如玻璃或塑料形成容器。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防 和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或 是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。在组合物中的至少一种活性物质是本 发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。标签或包装插页说明该组合物用于治疗 选择的病状。而且，制造物可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物 包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子；和(b)其中含有组合物的第二容 器，其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或治疗剂。在本发明的这个实施方案中，制 造物还可以包含指示组合物可以用来治疗特定病状的包装插页。备选地或额外地，该 制造物可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、 磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢 迎的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
实施例
以下是本发明方法和组合物的例子。应当理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。
一般方法
重组DNA技术
如Sambrook等人,Molecular cloning:A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述的标准方法用来操作 DNA。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.等人,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH出版编号91-3242中给出。
DNA测序
通过双链测序法测定DNA序列。
基因合成
在需要的情况下，使用适宜的模板通过PCR产生目的基因区段，或由Geneart AG(雷根斯堡，德国)从合成性寡核苷酸和PCR产物，通过自动化基因合成法合成目的基 因区段。在精确基因序列不可获得的情况下，基于来自最接近同源物的序列设计寡核 苷酸引物并且通过RT-PCR从源自适宜组织的RNA分离基因。将旁侧分布有单一限 制性核酸内切酶切割位点的基因区段克隆至标准克隆/测序载体中。从转化的细菌纯化 出质粒DNA并且通过紫外光谱法测定浓度。通过DNA测序证实亚克隆基因片段的 DNA序列。基因区段设计成具有合适的限制性位点以允许亚克隆至相应的表达载体 中。全部构建体均设计成具有编码前导肽的5'末端DNA序列，所述前导肽在真核细 胞中引导蛋白质分泌。SEQ ID NO:154-162分别给出示例性前导肽和编码它们的多核 苷酸序列。
从PBMC分离原代人泛T细胞
通过Histopaque密度离心从富集的淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)制备外周血单个 核细胞(PBMC)，所述淋巴细胞制备物从本地血库或从健康人类供体的新鲜血液获得。简而言之，将血液用无菌PBS稀释并小心地敷设在Histopaque梯度(Sigma，H8889) 上。在室温以450x g离心30分钟(制动关闭)后，弃去PBMC之上含有中间层的血浆 部分。将PBMC转移至新的50ml Falcon管并将该管用PBS填充至总体积50ml。 将混合物在室温以400x g离心10分钟(制动开启)。将上清液弃去并且将PBMC沉淀 物用无菌PBS洗涤2次(在4℃以350x g持续10分钟的离心步骤)。自动计数所得的 PBMC群(ViCell)并在培养箱中于37℃，5％CO2贮存在含有10％FCS和1％L-丙氨 酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中直至开始分析。
使用泛T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec#130-091-156)，根据制造商的说明书 从PBMC富集T细胞。简而言之，将细胞沉淀物按每1千万个细胞稀释于40μl冷缓 冲液(无菌过滤的含有0.5％BSA，2mM EDTA的PBS)中并且在4℃按每1千万个 细胞与10μl生物素-抗体混合物温育10分钟。按每1千万个细胞添加30μl冷缓冲液 和20μl抗生物素磁珠，并且将混合物4℃温育另外15分钟。通过添加10-20x当前 体积并接着在300x g实施离心步骤10分钟，洗涤细胞。将至多1亿个细胞重悬于500 μl缓冲液中。根据制造商的说明书，使用LS柱(Miltenyi Biotec#130-042-401)磁性分 离未标记的人泛T细胞。将所得到的T细胞群体自动计数(ViCell)并在37℃，5％CO2贮藏在培养箱中的AIM-V培养基内直至开始分析(不超过24小时)。
从PBMC分离原代人幼稚T细胞
通过Histopaque密度离心从富集的淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)制备外周血单个 核细胞(PBMC)，所述淋巴细胞制备物从本地血库或从健康人类供体的新鲜血液获得。根据制造商的说明书，使用来自Miltenyi Biotec(#130-093-244)的幼稚CD8+T细胞分 离试剂盒从PBMC富集T细胞，但是跳过最后的CD8+T细胞分离步骤(也参见分离 原代人泛T细胞的描述)。
从脾细胞分离鼠泛T细胞
从C57BL/6小鼠分离脾脏，转移至含有MACS缓冲液(PBS+0.5％BSA+2mM EDTA)的GentleMACS C-管(Miltenyi Biotech#130-093-237)中并且根据制造商的说 明书用GentleMACS分离器解离以获得单细胞悬液。使细胞悬液通过预分离滤器以移 除剩余的未解离的组织块。在4℃以400x g离心4分钟后，添加ACK裂解缓冲液 以裂解红细胞(在室温温育5分钟)。将剩余的细胞用MACS缓冲液洗涤2次，计数并 用于鼠泛T细胞的分离。使用来自Miltenyi Biotec的泛T细胞分离试剂盒 (#130-090-861)，按照制造商的说明书进行负向(磁性)选择。将所得到的T细胞群体自 动计数(ViCell)并立即用于其他测定法。
从肝素化血液分离原代食蟹猴PBMC
如下从来自健康食蟹猴供体的新鲜血液，通过密度离心法制备外周血单个核细胞(PBMC)：将肝素化血1:3用无菌PBS稀释，并将Lymphoprep介质(Axon Lab #1114545)用无菌PBS稀释至90％。将两体积稀释的血液铺在一体积稀释的密度梯度 上，并且通过在室温不制动情况下以520x g离心30分钟，分离PBMC级分。将PBMC 带转移至一个新50ml Falcon管并通过在4℃以400x g离心10分钟，用无菌PBS 洗涤。进行一次低速离心以移除血小板(以150x g离心15分钟，4℃)，并且将所得到 的PBMC群体自动计数(ViCell)并立即用于其他测定法。
靶细胞
为了评定靶向MCSP的双特异性抗原结合分子，使用以下肿瘤细胞系：衍生自 恶性黑素瘤转移部位并表达高水平人MCSP的人黑素瘤细胞系WM266-4(ATCC#CRL-1676)，和表达中等水平人MCSP的人黑素瘤细胞系MV-3(来 自拉德堡大学奈梅亨医学中心的慷慨馈赠)。
为了评定靶向CEA的双特异性抗原结合分子，使用以下肿瘤细胞系：表达极高 水平人CEA的人胃癌细胞系MKN45(DSMZ#ACC409)；表达中等水平至低水平人 CEA的人类女性高加索人种结肠腺癌细胞系LS-174T(ECACC#87060401)；表达(很) 低水平人CEA的人上皮样胰腺癌细胞系Panc-1(ATCC#CRL-1469)；和经自主工程化 以稳定表达人CEA的鼠结肠癌细胞系MC38-huCEA。
此外，人T细胞白血病细胞系Jurkat(ATCC#TIB-152)用来评估不同双特异性构 建体与细胞上人CD3的结合。
实施例1
双特异性抗原结合分子的制备、纯化和表征
将所产生的重链和轻链可变区序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启动子驱动并 且合成性polyA信号序列位于在CDS的3'末端。此外，每个载体含有EBV OriP序 列。
通过用哺乳动物表达载体共转染HEK293 EBNA细胞，产生该分子。使用磷酸钙 方法转染指数生长的HEK293 EBNA细胞。备选地，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染以悬 浮方式生长的HEK293 EBNA细胞。为了制备“1+1 IgG scFab，单臂/单臂倒置”构建 体，将细胞用相应的表达载体按1:1:1比率(“载体重链”:“载体轻链”:“载体重链 -scFab”)转染。为了制备“2+1IgG scFab”构建体，将细胞用相应的表达载体按1:2:1 比率(“载体重链”:“载体轻链”:“载体重链-scFab”)转染。为了制备“1+1 IgG Crossfab”构建体，将细胞用相应的表达载体按1:1:1:1比率(“载体第二重链”:“载体 第一轻链”:“载体轻链Crossfab”:“载体第一重链-重链Crossfab”)转染。为了制备 “2+1 IgG Crossfab”构建体，将细胞用相应的表达载体按1:2:1:1比率(“载体第二重 链”:“载体轻链”:“载体第一重链-重链Crossfab”:“载体轻链Crossfab”)转染。为了 制备“2+1 IgG Crossfab，连接的轻链”构建体，将细胞用相应的表达载体按1:1:1:1比 率(“载体重链”:“载体轻链”:“载体重链(CrossFab-Fab-Fc)”:“载体连接的轻链”)转 染。为了制备“1+1CrossMab”构建体，将细胞用相应的表达载体按1:1:1:1比率(“载 体第一重链”:“载体第二重链”:“载体第一轻链”:“载体第二轻链”)转染。为了制备 “1+1 IgG Crossfab轻链融合”构建体，将细胞用相应的表达载体按1:1:1:1比率(“载体第一重链”:“载体第二重链”:“载体轻链Crossfab”:“载体第二轻链”)转染。
对于使用磷酸钙法转染，在T型瓶中使用补充有10％(v/v)FCS的DMEM培养 基，将细胞培育为贴壁单层培养物，并且在细胞达到50和80％汇合度时转染细胞。 对于T150瓶的转染，将1500万个细胞在转染之前24小时接种于补充有FCS(终浓度 10％v/v)的25ml DMEM培养基中，并且将细胞在37℃置于具有5％CO2气氛的培 养箱中过夜。对于每个待转染的T150瓶，通过混合按相应比例划分的94μg总质粒 载体DNA、至终体积469μl的水和469μl 1MCaCl2溶液，制备DNA、CaCl2和水的 溶液。向这种溶液添加938μl 50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM pH 7.05的 Na2HPO4溶液，立即混合10秒并在室温静置20秒。将该悬液用补充有2％(v/v)FCS 的10ml DMEM稀释并添加至T150替代现存培养基。随后，添加额外的13ml转染 培养基。将细胞在37℃，5％CO2温育约17至20小时，随后将培养基替换为25ml DMEM，10％FCS。交换培养基后大约7日，通过以210x g离心15分钟收获条件 培养基，无菌过滤(0.22μm滤器)，补充叠氮钠至终浓度0.01％(w/v)，并在4℃保存。
对于使用聚乙烯亚胺的转染，在无血清CD CHO培养基中以悬浮方式培育 HEK293EBNA细胞。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个 HEK293 EBNA细胞。为了转染，将细胞以210x g离心5分钟，并且将上清液更换 为预温的20ml CD CHO培养基。将表达载体混于20ml CD CHO培养基中至最终量 200μg DNA。在添加540μl PEI后，将混合物涡旋混合15秒并随后在室温温育10 分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％ CO2气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，添加160ml F17培养基并且将细胞 培育24小时。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed 1(Lonza)。在培养 7日后，通过以210x g离心15分钟，收集上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm 滤器)，补充叠氮钠至终浓度0.01％w/v，并在4℃保存。
通过蛋白A亲和层析，随后大小排阻色谱步骤，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。
为了亲和层析，将上清液加载于用25ml 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH 7.5 或40ml 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5平衡的HiTrap蛋 白A HP柱(CV＝5ml，GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积20mM磷酸钠， 20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠pH 7.5洗涤，随后一个使用6个柱体积10mM磷酸 钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠pH 5.45的额外洗涤步骤，移除未结合的蛋白质。 随后，将柱用20ml 10mM MES，100mM氯化钠，pH 5.0洗涤，并且将靶蛋白以六 柱体积20mM柠檬酸钠，100mM氯化钠，100mM甘氨酸，pH3.0洗脱。备选地， 以20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 2.5 的梯度使用多于20个柱体积来洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8中 和蛋白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用25mM磷酸钾、125mM氯化钠、 100mM pH 6.7甘氨酸溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。为了 纯化1+1 IgG Crossfab，将柱用20mM组氨酸，140mM pH 6.0氯化钠溶液平衡。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定 纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。根据制造商的说明书(4-12％Tris-乙酸盐凝胶或 4-12％Bis-Tris)，使用
Figure BDA0002213187780001001
预制凝胶系统(Invitrogen，美国)，通过在还原剂(5 mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在下的SDS-PAGE并用考马斯(来自Invitrogen的 SimpleBlueTMSafeStain)染色，分析双特异性构建体的纯度和分子量。备选地，根据 制造商的说明书，使用Caliper LabChip GXII(Caliper Lifescience)，通过CE-SDS分 析法在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。
在25℃使用Superdex 200 10/300GL分析性大小排阻层析柱(GE Healthcare)在2mM MOPS，150mM NaCl，0.02％(w/v)NaN3，pH 7.3运行缓冲液中分析蛋白质样 品的聚集物含量。备选地，在25℃使用TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱 (Tosoh)在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v) NaN3，pH 6.7运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。
图2-14显示SDS PAGE和分析性大小排阻色谱的结果并且表2A显示不同双特 异性构建体的制备物的产率、蛋白A层析后的聚集物含量和最终单体含量。
图47显示CE-SDS分析抗CD3/抗MCSP双特异性“2+1 IgG Crossfab，连接的 轻链”构建体(参见SEQ ID NO:3、5、29和179)的结果。2μg样品用于分析。图48 显示终产物的分析性大小排阻色谱结果(注入20μg样品)。
图54显示CE-SDS和SDS PAGE分析各种构建体的结果，并且表2A显示不同 双特异性构建体的制备物的产率、蛋白A层析后的聚集物含量和最终单体含量。
表2A.产率、蛋白A层析后的聚集物含量和最终单体含量。
Figure BDA0002213187780001011
Figure BDA0002213187780001021
Figure BDA0002213187780001031
Figure BDA0002213187780001041
作为对照，以现有技术的串联scFv样式(“(scFv)2”)以及通过串联scFv与Fc结构域融合，生成双特异性抗原结合分子(“(scFv)2-Fc”)。按照与如上文对本发明双特异性 抗原结合分子所述的类似方式，将这些分子在HEK293-EBNA细胞中产生并且通过蛋 白A亲和层析、随后大小排阻层析步骤纯化。由于高的聚集物形成，一些样品不得不 通过将来自HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)的洗脱和浓缩样品施加至用20 mM组氨酸，140mM氯化钠，pH 6.7平衡的Superdex 10/300GL柱(GE Healthcare) 来进一步纯化，以获得具有高单体含量的蛋白质。随后，如上文所述确定蛋白质浓度、 纯度和分子量和聚集物含量。
表2B中显示了对照分子的产率、第一纯化步骤后的聚集物含量和最终单体含量。比较第一纯化步骤(蛋白A)后的聚集物的含量显示与“(scFv)2-Fc”和二硫键稳定化“(dsscFv)2-Fc”分子相比，IgG Crossfab和IgG scFab构建体的稳定性优越。
表2B.产率、蛋白A层析后的聚集物含量和最终单体含量。
Figure BDA0002213187780001042
通过动态光散射法(DLS)监测该蛋白质的热稳定性。将蛋白质浓度为1mg/ml的 30μg已过滤蛋白质样品一式两份施加至Dynapro平板读数仪(Wyatt TechnologyCorporation；美国)。温度以0.05℃/分钟从25℃递增至75℃，采集半径和总散射强 度。在图15和表2C中显示结果。对于“(scFv)2-Fc”(抗MCSP/抗huCD3)分子，在49℃ 和68℃观察到两个聚集点。“(dsscFv)2-Fc”构建体因引入的二硫键而具有增加的聚集 温度(57℃)(图15A，表2C)。“2+1 IgG scFab”和“2+1 IgG Crossfab”构建体均在高于 60℃的温度聚集，从而与“(scFv)2-Fc”和“(dsscFv)2-Fc”样式相比，显示它们的优越热 稳定性(图15B，表2C)。
表2C.通过动态光散射法确定热稳定性。
构建体 T<sub>agg</sub>[℃]
2+1 IgG scFab(LC007/V9) 68
2+1 IgG Crossfab(LC007/V9) 65
Fc-(scFv)<sub>2</sub>(LC007/V9) 49/68
Fc-(dsscFv)<sub>2</sub>(LC007/V9) 57
实施例2
Fc受体和靶抗原结合的表面等离子体共振分析
方法
在25℃在Biacore T100上进行全部表面等离子体共振(SPR)实验，以HBS-EP 作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活 性剂P20，Biacore，Freiburg/德国)。
不同Fc变体的FcR结合作用的分析
图16A中显示测定法设置。为了分析不同Fc变体与人FcγRIIIa-V158和鼠 FcγRIV的相互作用，使用标准胺偶联试剂盒(Biacore，Freiburg/德国)，在pH 5.0在 CM5芯片上直接偶联约6,500个共振单位(RU)的抗五His抗体(Qiagen)。 HuFcγRIIIa-V158-K6H6和muFcγRIV-aviHis-生物素分别以4nM和10nM捕获60 秒。
使具有不同Fc突变的构建体以1000nM浓度，以30μl/分钟流速通过流动小室 120秒。监测解离过程220秒。通过扣除在参比流动小室中获得的响应，修正本体折 射率差异。此处，使Fc变体在下述表面上流过，所述表面具有固定化抗五His抗体， 但是已经在其上注射HBS-EP而非HuFcγRIIIa-V158-K6H6或muFcγRIV-aviHis-生 物素。使用500–4000nM的浓度范围，确定野生型Fc对人FcγRIIIa-V158和鼠FcγRIV 的亲和力。
通过Langmuir结合等温线的非线性曲线拟合，将稳态响应用来导出解离常数 KD。使用Biacore T100评价软件(vAA，Biacore AB，Uppsala/瑞典)推算动力学常数， 以通过数值积分拟合1:1Langmuir结合作用的速率方程。
结果
通过表面等离子体共振法监测Fc变体与人FcγRIIIa和鼠FcγRIV的相互作用。对于全部所分析的Fc突变体，与具有野生型(wt)Fc结构域的构建体相比，与捕获的 huFcγRIIIa-V158-K6H6和muFcγRIV-aviHis-生物素的结合显著减少。
与人Fcγ-受体结合最少的Fc突变体是P329G L234A L235A(LALA)和P329G LALAN297D。LALA突变单独不足以消除与huFcγRIIIa-V158-K6H6的结合作用。 仅携带LALA突变的Fc变体对人FcγRIIIa具有2.100nM残余结合亲和力，而wt Fc 以600nM亲和力结合人FcγRIIIa受体(表3)。使用单一浓度，两种KD值均通过1:1 结合模型导出。
仅能分析wt Fc对人FcγRIIIa-V158和鼠FcγRIV的亲和力。表3中列出KD值。 对于分析的全部Fc突变体，与鼠FcγRIV的结合作用几乎完全消除。
表3.Fc变体对人FcγRIIIa-V158和鼠FcγRIV的亲和力
Figure BDA0002213187780001061
Figure BDA0002213187780001071
*使用一种浓度(1000nM)测定
与肿瘤抗原和CD3同时结合作用的分析
使用标准偶联方法，通过在传感芯片SA上直接偶联1650个共振单位(RU)的 MCSP生物素酰化D3结构域，分析T细胞双特异性构建体与肿瘤抗原和人CD3ε的 同时结合。使用标准氨基偶联法固定人EGFR。在pH 5.5在CM5传感芯片上固定8000 RU。图16B中显示测定法设置。
在200nM捕获不同的T细胞双特异性构建体60秒。人 CD3γ(G4S)5CD3ε–AcTev–Fc(结)–Avi/Fc(扣)随后以2000nM的浓度和40μl/分钟的流 速通过60秒。通过扣减参比流动小室上获得的响应修正本体折射率差异，其中在所 述参比流动小室中重组CD3ε在具有MCSP或EGFR的固定化D3结构域的表面上没 有捕获的T细胞双特异性构建体的情况下流过。
结果
通过表面等离子体共振法分析与肿瘤抗原和人CD3ε的同时结合作用(图17，图18)。全部构建体均能够同时结合肿瘤抗原和CD3。对于大部分构建体，注射人CD3ε 后的结合水平(RU)高于仅注射构建体后实现的结合水平，这反映肿瘤抗原和人CD3ε 均与构建体结合。
实施例3
双特异性构建体与细胞上各靶抗原的结合
通过FACS测定不同双特异性构建体与Jurkat细胞(ATCC#TIB-152)上CD3和 靶细胞上相应肿瘤抗原的结合。简而言之，将细胞收获、计数并检验存活力。将0.15–0.2 百万个细胞/孔(含有0.1％BSA的PBS中；90μl)铺种在圆底96孔板中并且在4℃与 所示浓度的双特异性构建体和相应IgG对照(10μl)温育30分钟。为了更好地比较， 将全部构建体和IgG对照针对相同的体积摩尔浓度归一化。在温育后，将细胞离心(5 分钟，350x g)，用150μl含有0.1％BSA的PBS洗涤，重悬并在4℃与12μl/孔的 FITC缀合或PE缀合的第二抗体进一步温育30分钟。使用FACS CantoII检测结合 的构建体(Software FACS Diva)。使用FITC缀合的抗His抗体(Lucerna,#RHIS-45F-Z) 检测“(scFv)2”分子。对于全部其他分子，使用FITC缀合或PE缀合的亲和纯F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcγ特异性片段(分别是Jackson ImmunoResearch Lab#109-096-098/工作液1:20，或#109-116-170/工作液1:80)。通过添加120μl/孔含有 0.1％BSA的PBS并以350x g离心5分钟，洗涤细胞。用150μl/孔含有0.1％BSA 的PBS进行第二个洗涤步骤。除非另外说明，否则将细胞在4℃在暗处用100μl/孔 固定缓冲液(BD#554655)固定15分钟，以400x g离心6分钟并且保存在200μl/孔含 有0.1％BSA的PBS中直至用FACS CantoII测量样品。使用GraphPad Prism软件 计算EC50值。
在第一个实验中，通过流式细胞术分析靶向人MCSP和人CD3的不同双特异性 构建体与Jurkat、人T细胞、白血病细胞上表达的人CD3的结合或与Colo-38人黑 素瘤细胞上人MCSP的结合。
在图19-21中显示结果，所述结果显示与双特异性分子、对照IgG、仅第二抗体 温育或保持未处理的细胞的平均荧光强度。
如图19中所示，对于“(scFv)2”分子的两种抗原结合部分即CD3(图19A)和 MCSP(图19B)，与对照样品相比观察到清晰的结合信号。
“2+1 IgG scFab”分子(SEQ ID NO:5、17、19)显示与Colo-38细胞上的huMCSP 良好结合(图20A)。CD3部分比参比抗人CD3 IgG略微更好地结合CD3(图20B)。
如图21A中所示，两种“1+1”构建体均对细胞上的人CD3显示可比较的结合信号。参比抗人CD3 IgG产生略微较弱的信号。此外，测试的两个构建体(“1+1 IgG scFab， 单臂”(SEQ ID NO:1、3、5)和“1+1 IgG scFab，单臂倒置”(SEQ ID NO:7、9、11)) 均显示与细胞上人MCSP的可比较结合(图21B)。用参比抗人MCSP IgG获得的结合 信号略微地较弱。
在另一个实验中，通过流式细胞术分析纯化的“2+1 IgG scFab”双特异性构建体(SEQ ID NO:5、17、19)和相应的抗人MCSP IgG与Colo-38人黑素瘤细胞上人MCSP 的剂量依赖性结合，以确定双特异性构建体是否通过其一条或两条“臂”与MCSP结 合。如图22中所示，“2+1 IgG scFab”构建体显示与MCSP IgG相同的结合模式。
在又一个实验中，评估了在Crossfab片段中具有VL/VH(参见SEQ ID NO:33、 63、65、67)或CL/CH1交换(参见SEQ ID NO:66、67、183、197)的CD3/CEA“2+1 IgG Crossfab，倒置”双特异性构建体与Jurkat细胞表达的人CD3的结合或与LS-174T 细胞表达的人CEA的结合。作为对照，也评估相应IgG的等价最大浓度和因标记第 二抗体(山羊抗人FITC缀合的亲和纯F(ab’)2片段，Fcγ片段特异的，Jackson Immuno Research Lab#109-096-098)所致的背景染色。如图55中所示，两种构建体均显示与 人CEA以及与细胞上人CD3的良好结合。“2+1 IgG Crossfab，倒置(VL/VH)”和“2+1 IgG Crossfab，倒置(CL/CH1)”构建体的计算EC50值分别是4.6nM和3.9nM(CD3)， 及9.3nM和6.7nM(CEA)。
在另一个实验中，评估了CD3/MCSP“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、 5、29、33)和“2+1 IgG Crossfab，倒置”(参见SEQ ID NO:5、23、183、187)构建体 与Jurkat细胞表达的人CD3的结合或与WM266-4细胞表达的人MCSP的结合。图 56显示，尽管两种构建体与细胞上的MCSP的结合作用可比地良好，但是与另一个 构建体相比，“倒置”构建体与CD3的结合作用减少。“2+1 IgG Crossfab，倒置”和“2+1 IgG Crossfab”构建体的计算EC50值分别是6.1nM和1.66nM(CD3)，及0.57nM和 0.95nM(MCSP)。
在又一个实验中，测定“1+1 IgG Crossfab轻链(LC)融合”构建体(SEQ ID NO:183、209、211、213)与Jurkat细胞表达的人CD3和与LS-174T细胞表达的人CEA 的结合。作为对照，也评估相应的抗CD3和抗CEA IgG的等价最大浓度和因标记第 二抗体(山羊抗人FITC缀合的亲和纯F(ab’)2片段，Fcγ片段特异的，Jackson Immuno Research Lab#109-096-098)所致的背景染色。如图57中所示，“1+1 IgG Crossfab LC 融合物”与CEA的结合似乎大大减少，而与CD3的结合至少与参考IgG可比较。
在最终实验中，测定“2+1 IgG Crossfab”(SEQ ID NO:5、23、215、217)和“2+1 IgGCrossfab，倒置”(SEQ ID NO:5、23、215、219)构建体与Jurkat细胞表达的人CD3 的结合以及与WM266-4肿瘤细胞表达的人MCSP的结合。如图58中所示，与另一 个构建体相比，“2+1IgG Crossfab，倒置”与人CD3的结合减少，但是与人MCSP 的结合可比地良好。“2+1 IgGCrossfab”和“2+1 IgG Crossfab，倒置”构建体的计算 EC50值分别是10.3nM和32.0nM(CD3)，以及3.1nM和3.4nM(MCSP)。
实施例4
当双特异性构建体结合时原代人T细胞上表面活化标志物的FACS分析
通过流式细胞术对纯化的靶向huMCSP-huCD3的双特异性“2+1 IgG scFab”(SEQID NO:5、17、19)和“(scFv)2”分子测试它们在表达人MCSP的肿瘤细胞存在下 上调CD8+T细胞上早期表面活化标志物CD69或晚期活化标志物CD25的潜力。
简而言之，将MCSP阳性Colo-38细胞用细胞解离缓冲液收获，计数并检查存活 力。将细胞在AIM-V培养基中调节至0.3x 106个(活)细胞/ml，将100μl这种细胞悬 液/孔吸至圆底96孔板中(如所示)。将50μl(稀释的)双特异性构建体添加至含有细胞 的孔以获得终浓度1nM。从健康供体的新鲜血液分离人PBMC效应细胞并在AIM-V 培养基中调节至6x 106个(活)细胞/ml。将50μl这种细胞悬液添加测试平板的每个孔 (见上文)以获得最终E:T比率10:1。为了分析所述双特异性构建体是否能够仅在表达 肿瘤抗原huMCSP的靶细胞存在情况下活化T细胞，纳入这样的孔，所述孔含有1nM 相应的双特异性分子以及PBMC，但是不含靶细胞。
在37℃，5％CO2温育15小时(CD69)或24小时(CD25)后，将细胞离心(5分钟， 350xg)并用150μl/孔含有0.1％BSA的PBS洗涤两次。根据供应商的建议，在4℃ 对CD8(小鼠IgG1，κ；克隆HIT8a；BD#555635)、CD69(小鼠IgG1；克隆L78；BD #340560)和CD25(小鼠IgG1，K；克隆M-A251；BD#555434)进行表面染色30分钟。 将细胞用150μl/孔含有0.1％BSA的PBS洗涤两次并在4℃使用100μl/孔固定缓冲 液(BD#554655)固定15分钟。在离心后，使样品重悬于200μl/孔含有0.1％BSA的 PBS中并使用FACS CantoII仪(Software FACS Diva)分析。
图23描述了分别温育15小时或24小时后CD8+T细胞上早期活化标志物CD69(A) 或晚期活化标志物CD25(B)的表达水平。两种构建体均仅在靶细胞存在下诱导两种活 化标志物的上调。在这个测定法中，“(scFv)2”分子似乎比“2+1 IgG scFab”构建体略微 地更有活性。
通过流式细胞术对纯化的靶向huMCSP-huCD3的双特异性“2+1 IgG scFab”和“(scFv)2”分子进一步测试它们在表达人MCSP的肿瘤细胞存在下上调CD8+T细胞或 CD4+T细胞上晚期活化标志物CD25的潜力。实验性的程序如上文所述，按E:T比率 5:1使用人泛T效应细胞和五日温育时间。
图24显示两种构建体均仅在靶细胞存在下诱导CD8+(A)T细胞以及CD4+(B)T 细胞上的CD25上调。在这个测定法中，与“(scFv)2”分子相比，“2+1 IgG scFab”构建 体似乎更少地诱导CD25上调。从总体上看，CD25的上调在CD8+上比CD4+T细胞 上更明显。
在另一个实验中，在肿瘤靶细胞存在下对靶向食蟹猴CD3和人MCSP的纯化 “2+1IgG Crossfab”(SEQ ID NO:3、5、35、37)分析其上调CD8+T细胞上表面活化 标志物CD25的潜力。简而言之，将表达人MCSP的MV-3肿瘤靶细胞用细胞解离缓 冲液收获、洗涤和重悬在含有2％FCS和1％GlutaMax的DMEM中。在圆底96孔 平板中每孔铺种30 000个细胞并且以所示的浓度添加相应的抗体稀释物(图25)。将双 特异性构建体和不同的IgG对照调节至相同的体积摩尔浓度。添加从两只健康动物的 血液分离的食蟹猴PBMC效应细胞以获得最终E:T比率3:1。在37℃，5％CO2温 育43小时后，将细胞以350x g离心5分钟并用含有0.1％BSA的PBS洗涤2次。根 据供应商的建议对CD8(Miltenyi Biotech#130-080-601)和CD25(BD#557138)进行表 面染色。将细胞用150μl/孔含有0.1％BSA的PBS洗涤两次并在4℃使用100μl/孔 固定缓冲液(BD#554655)固定15分钟。在离心后，使样品重悬于200μl/孔含有0.1％BSA的PBS中并使用FACS CantoII仪(Software FACS Diva)分析。
如图25中所示，双特异性构建体仅在靶细胞存在下才诱导CD8+T细胞上CD25 的浓度依赖性上调。抗食蟹猴CD3 IgG(克隆FN-18)还能够在不交联的情况下诱导 CD8+T细胞上CD25的上调(参见用食蟹猴Nestor获得的数据)。采用最大浓度的双特 异性构建体(在靶细胞不存在情况下)时，不存在食蟹猴T细胞的过度活化。
在另一个实验中，将CD3-MCSP“2+1 IgG Crossfab，连接的轻链”(参见SEQ ID NO:3、5、29、179)与CD3-MCSP“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、29、 33)比较其在肿瘤靶细胞存在下上调CD8+T细胞上早期活化标志物CD69或晚期活化 标志物CD25的潜力。将原代人PBMC(如上文所述分离)在MCSP阳性Colo38靶细 胞存在或不存在下与所示浓度的双特异性构建体温育至少22小时。简而言之，平底 96孔板每孔铺种三十万个原代人PBMC，所述孔含有MCSP阳性靶细胞(或培养基)。 效应细胞对靶细胞(E:T)的最终比率是10:1。将细胞在37℃，5％CO2与所示浓度的 双特异性构建体和对照温育所示的温育时间。将效应细胞对CD8和CD69或CD25 染色并通过FACS CantoII分析。
图53显示这个实验的结果。两种2+1 IgG Crossfab分子(具有或没有连接的轻链)之间不存在检测到的CD69上调(A)或CD25上调(B)的显著差异。
在又一个实验中，将CD3/MCSP“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、 29、33)和“1+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:5、29、33、181)构建体与“1+1 CrossMab”构建体(参见SEQ ID NO:5、23、183、185)比较其在肿瘤靶细胞存在下上 调CD4+或CD8+T细胞上CD69或CD25的潜力。该测定法在表达人MCSP的MV-3 肿瘤细胞存在下或不存在下如上文所述进行，温育时间24小时。
如图59中所示，“1+1 IgG Crossfab”和“2+1 IgG Crossfab”构建体比“1+1CrossMab”分子诱导更明显的活化标志物上调
在最终实验中，对CD3/MCSP“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:5、23、215、217)和“2+1 IgG Crossfab，倒置”(参见SEQ ID NO:5、23、215、219)构建体评估其 在肿瘤靶细胞存在下上调来自两只不同食蟹猴的CD4+或CD8+T细胞上的CD25的潜 力。该测定法在表达人MCSP的MV-3肿瘤细胞存在下或不存在下如上文所述进行， E:T比率为3:1并且温育时间约41小时。
如图60中所示，两种构建体均能够以浓度依赖性方式上调CD4+细胞和CD8+T 细胞上的CD25，两种样式之间物显著差异。无抗体和无靶细胞的对照样品给出了与 有抗体但无靶的样品可比较的信号(未显示)。
实施例5
用CD3双特异性构建体活化人泛T细胞后干扰素-γ的分泌
通过测量人干扰素(IFN)-γ向上清液的释放量，分析靶向人MCSP和人CD3的纯 化的“2+1 IgG scFab”(SEQ ID NO:5、17、19)分析在人MCSP阳性U-87MG细胞存 在下诱导T细胞活化的潜力。作为对照，使用调节至相同体积摩尔浓度的抗人MCSP IgG和抗人CD3 IgG。简而言之，将表达huMCSP的U-87MG胶质母细胞瘤星形细 胞瘤靶细胞(ECACC89081402)用细胞解离缓冲液收获，洗涤并重悬于AIM-V培养基 (Invitrogen#12055-091)中。在圆底96孔平板中每孔铺种20 000个细胞并且添加相应 的抗体稀释物以获得终浓度1nM。添加从暗黄覆盖层分离的人泛T效应细胞以获得 最终E:T比率5:1。在37℃，5％CO2温育18.5小时后，将测试平板以350x g离心5 分钟并将上清液转移至新的96孔板。根据制造商的说明书，通过ELISA测量上清液 中的人IFN-γ水平(来自Becton Dickinson的BD OptEIA人IFN-γELISA试剂盒II， #550612)。
如图26中所示，参比IgG显示没有至微弱的IFN-γ分泌诱导作用，而“2+1 IgGscFab”构建体能够活化人T细胞以分泌IFN-γ。
实施例6
由靶向T细胞上CD3和肿瘤细胞上MCSP或EGFR的交联双特异性构建体介导 的再指向的T细胞细胞毒性(LDH释放测定法)
在第一系列实验中，分析靶向CD3和MCSP的双特异性构建体在通过抗原结合 部分与细胞上其相应靶抗原结合而交联构建体时其在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导 凋亡的潜力(图27-38)。
在一个实验中，将纯化的靶向人CD3和人MCSP的“2+1 IgG scFab”(SEQ ID NO: 5、21、23)和“2+1 IgG Crossfab”(SEQ ID NO:3、5、29、33)构建体和相应的“(scFv)2” 分子比较。简而言之，将表达huMCSP的MDA-MB-435人黑素瘤靶细胞用细胞解离 缓冲液收获，洗涤并重悬于AIM-V培养基(Invitrogen#12055-091)中。在圆底96孔 平板中每孔铺种30 000个细胞并且以所示的浓度添加相应的构建体稀释物。将全部构 建体和相应的对照IgG调节至相同的体积摩尔浓度。添加人泛T效应细胞以获得最 终E:T比率5:1。作为活化人泛T细胞的阳性对照，使用1μg/ml PHA-M(Sigma #L8902；从菜豆(Phaseolus vulgaris)分离的同工凝集素的混合物)。为了归一化，通过 将靶细胞与终浓度1％的Triton-X-100温育确定靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂 解(＝0％)是指与效应细胞共温育，但不与任何构建体或抗体共温育的靶细胞。在37℃， 5％CO2温育20小时过夜后，用LDH检测试剂盒(Roche AppliedScience，#11 644 793 001)，根据制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的LDH释放。
如图27中所示，两种“2+1”构建体均在靶细胞中诱导与“(scFv)2”分子可比较的凋亡。
另外，比较了纯化的在其Fc结构域中不同的“2+1 IgG Crossfab”(SEQ ID NO:3、5、29、33)和“2+1 IgG scFab”构建体以及“(scFv)2”分子。Fc结构域中的不同突变 (L234A+L235A(LALA)、P329G和/或N297D，如所示)减少或消除由含有野生型(wt)Fc 结构域的构建体诱导的(NK)效应细胞功能。实验方法如上文所述。
图28显示全部构建体均在靶细胞中诱导与“(scFv)2”分子可比较的凋亡。
图29显示了比较纯化的“2+1 IgG scFab”(SEQ ID NO:5、17、19)和“(scFv)2”分子在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导凋亡的潜力的结果。实验方法如上文所述，以E:T 比率5:1使用表达huMCSP的Colo-38人黑素瘤靶细胞和18.5小时温育过夜。如本 图中所示，“2+1IgG scFab”构建体显示与“(scFv)2”分子可比较的细胞毒活性。
类似地，图30显示以E:T比率5:1使用表达huMCSP的Colo-38人黑素瘤靶细 胞并使用18小时温育时间，比较纯化的“2+1 IgG scFab”构建体(SEQ ID NO:5、17、 19)和“(scFv)2”分子的结果。如本图中所示，“2+1 IgG scFab”构建体显示与(scFv)2分 子可比较的细胞毒活性。
图31显示以E:T比率5:1使用表达huMCSP的MDA-MB-435人黑素瘤靶细胞 并使用23.5小时过夜温育，比较纯化的“2+1 IgG scFab”构建体(SEQ ID NO:5、17、 19)和“(scFv)2”分子的结果。如本图中所示，该构建体在靶细胞中与“(scFv)2”分子可比 较地诱导凋亡。“2+1 IgG scFab”构建体在最高浓度显示降低的效力。
另外，分析对两种靶，即人CD3和人MCSP，为单价的不同双特异性构建体以 及相应的“(scFv)2”分子诱导T细胞介导凋亡的潜力。图32显示以E:T比率5:1使用 表达huMCSP的Colo-38人黑素瘤靶细胞并使用温育时间19小时，“1+1 IgG scFab， 单臂”(SEQ ID NO:1、3、5)和“1+1 IgG scFab，单臂倒置”(SEQ ID NO:7、9、11) 构建体的结果。如本图中所示，两种“1+1”构建体的活性在这个测定法中均低于 “(scFv)2”分子，“1+1 IgG scFab，单臂”分子优于“1+1 IgG scFab，单臂倒置”分子。
图33显示以E:T比率5:1使用表达huMCSP的Colo-38人黑素瘤靶细胞并使用 温育时间20小时，“1+1 IgG scFab”构建体(SEQ ID NO:5、21、213)的结果。如本图 中所示，“1+1IgG scFab”构建体的细胞毒性低于“(scFv)2”分子。
在又一个实验中，对纯化的“2+1 IgG Crossfab”(SEQ ID NO:3、5、29、33)、“1+1IgG Crossfab”(SEQ ID NO:5、29、31、33)和“(scFv)2”分子分析它们在细胞上结合两 种靶抗原CD3和MCSP而交联构建体时在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导的凋亡的潜 力。使用表达huMCSP的MDA-MB-435人黑素瘤细胞作为靶细胞，E:T比率是5:1， 并且温育时间是20小时。图34中显示结果。“2+1 IgG Crossfab”构建体在靶细胞中 与“(scFv)2”分子可比较地诱导凋亡。单价和双价“IgG Crossfab”样式的比较清楚显示 双价样式有力得多。
在又一个实验中，分析纯化的“2+1 IgG Crossfab”(SEQ ID NO:3、5、29、33) 构建体在不同(肿瘤)靶细胞中诱导T细胞介导凋亡的潜力。简而言之，如所示，将 MCSP阳性Colo-38肿瘤靶细胞、(衍生自骨髓，Lonza#PT-2501或脂肪组织， Invitrogen#R7788-115)的间充质干细胞或周细胞(来自胎盘；PromoCell#C-12980)用 细胞解离缓冲液收获，洗涤并重悬于AIM-V培养基中(Invitrogen#12055-091)。在圆 底96孔平板中每孔铺种30 000个细胞并且以所示的浓度添加相应的抗体稀释物。添 加从健康供体的新鲜血液分离的人PBMC效应细胞以获得最终E:T比率25:1。在 37℃，5％CO2温育4小时后，用LDH检测试剂盒(Roche Applied Science，#11 644 793 001)，根据制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的LDH释放。
如图35中所示，仅用Colo-38细胞可观察到明显的T细胞介导的细胞毒性。这 个结果与Colo-38细胞表达显著水平的MCSP相符，间充质干细胞和周细胞仅非常微 弱地表达MCSP。
还将纯化的“2+1 IgG scFab”(SEQ ID NO:5、17、19)构建体和“(scFv)2”分子与其Fc结构域中岩藻糖化的N-聚糖比例降低的糖工程化抗人MCSP IgG抗体(MCSP GlycoMab)比较。对于这个实验，以固定的E:T比率25:1(图36A)或以20:1至1:10 的不同E:T比率(图36B)使用表达huMCSP的Colo-38人黑素瘤靶细胞和人PBMC 效应细胞。以图36A中所示的浓度或以固定浓度1667pM(图36B)使用不同分子。在 21小时温育后进行读数。如图36A和36B中所示，两种双特异性构建体均显示比 MSCP GlycoMab更高的效力。
在另一个实验中，分析纯化的靶向食蟹猴CD3和人MCSP的“2+1 IgG Crossfab”(SEQ ID NO:3、5、35、37)。简而言之，将表达人MCSP的MV-3肿瘤靶 细胞用细胞解离缓冲液收获、洗涤和重悬在含有2％FCS和1％GlutaMax的DMEM 中。在圆底96孔平板中每孔铺种30000个细胞并且以所示的浓度添加构建体或参比 IgG的相应稀释物。将双特异性构建体和不同的IgG对照调节至相同的体积摩尔浓度。 添加从健康食蟹猴的血液分离的食蟹猴PBMC效应细胞以获得最终E:T比率3:1。 在37℃，5％CO2温育24小时或43小时后，用LDH检测试剂盒(Roche Applied Science，#11 644 793 001)，根据制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的 LDH释放。
如图37中所示，双特异性构建体诱导来自靶细胞的浓度依赖性LDH酶释放。43 小时后的效应强于24小时后的效应。抗食蟹猴CD3 IgG(克隆FN-18)还能够在不交 联情况下诱导靶细胞的LDH释放。
图38显示使用表达MCSP的人黑素瘤细胞系(MV-3)作为靶细胞和并使用人 PBMC作为效应细胞，E:T比率10:1和温育时间26小时情况下，比较纯化的“2+1 IgG Crossfab”(SEQID NO:3、5、29、33)和“(scFv)2“构建体的结果。如本图中所示，就 EC50而言，“2+1 IgGCrossfab”构建体比“(scFv)2“分子更有力。
在第二系列实验中，分析靶向CD3和EGFR的双特异性构建体在通过抗原结合 部分与细胞上其相应靶抗原结合而交联构建体时其在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导 凋亡的潜力(图39-41)。
在一个实验中，将纯化的靶向CD3和EGFR的纯化的“2+1 IgG scFab”(SEQ ID NO:45、47、53)和“1+1 IgG scFab”(SEQ ID NO:47、53、213)构建体和相应的“(scFv)2” 分子比较。简而言之，将表达人EGFR的LS-174T肿瘤靶细胞用胰蛋白酶收获，洗 涤并重悬于AIM-V培养基(Invitrogen#12055-091)中。在圆底96孔平板中每孔铺种 30 000个细胞并且以所示的浓度添加相应的抗体稀释物。将全部构建体和对照调节至 相同的体积摩尔浓度。添加人泛T效应细胞以获得最终E:T比率5:1。作为活化人泛 T细胞的阳性对照，使用1μg/mlPHA-M(Sigma#L8902)。为了归一化，通过将靶细 胞与终浓度1％的Triton-X-100温育确定靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％) 是指与效应细胞共温育，但不与任何构建体或抗体共温育的靶细胞。在37℃，5％CO2温育18小时过夜后，用LDH检测试剂盒(RocheApplied Science，#11 644 793 001)， 根据制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的LDH释放。
如图39中所示，“2+1 IgG scFab”构建体显示与“(scFv)2”分子可比较的细胞毒活性，“1+1 IgG scFab”构建体活性较小。
在另一个实验中，比较了纯化的“1+1 IgG scFab，单臂”(SEQ ID NO:43、45、 47)、“1+1 IgG scFab，单臂倒置”(SEQ ID NO:11、49、51)、“1+1 IgG scFab”(SEQ ID NO:47、53、213)和“(scFv)2”分子。实验条件如上文所述，除了温育时间为21小 时之外。
如图40中所示，“1+1 IgG scFab”构建体在这个测定法中显示比“(scFv)2”分子略微较低的细胞毒活性。两种“1+1 IgG scFab，单臂(倒置)”构建体比“(scFv)2”分子明显 活性更小。
在又一个实验中，比较了纯化的“1+1 IgG scFab，单臂”(SEQ ID NO:43、45、 47)和“1+1 IgG scFab，单臂倒置”(SEQ ID NO:11、49、51)构建体和“(scFv)2”分子。 在这个实验中的温育时间是16小时，并且图41中描述结果。与人泛T细胞温育时， 两种“1+1 IgGscFab，单臂(倒置)”构建体比“(scFv)2”分子活性更小，但是显示使乳酸 脱氢酶从靶细胞以浓度依赖性方式释放(图41A)。当LS-174T肿瘤细胞与从PBMC分 离的幼稚T细胞T细胞共培养时，这些构建体仅具有基础活性–它们当中最有活性的 是“(scFv)2”分子(图41B)。
在又一个实验中，对靶向CD3和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的纯化“1+1 IgGscFab，单臂倒置”(SEQ ID NO:11、51、55)、“1+1 IgG scFab”(57、61、213)，和“2+1 IgGscFab”(57、59、61)和相应的“(scFv)2”分子分析当通过两种靶向部分与表达人FAP 的成纤维细胞GM05389细胞上其相应靶抗原结合使构建体交联时它们在所述细胞中 诱导T细胞介导凋亡的潜力。简而言之，将人GM05389靶细胞用胰蛋白酶在前一日 收获，洗涤并重悬在AIM-V培养基中(Invitrogen#12055-091)。将30,000个细胞/孔 铺种在圆底96孔板中并在37℃，5％CO2温育过夜以允许细胞恢复并贴壁。次日， 将细胞离心，抛弃上清液并且添加新鲜培养基，以及以所示的浓度添加构建体或参比 IgG的相应稀释物。将全部构建体和对照调节至相同的体积摩尔浓度。添加人泛T效 应细胞以获得最终E:T比率5:1。作为活化人泛T细胞的阳性对照，使用5μg/ml PHA-M(Sigma#L8902)。为了归一化，通过将靶细胞与终浓度1％的Triton-X-100 温育确定靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共温育，但不 与任何构建体或抗体共温育的靶细胞。在37℃，5％CO2额外温育18小时过夜后， 用LDH检测试剂盒(Roche Applied Science，#11 644 793 001)，根据制造商的说明书 测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的LDH释放。
如图42中所示，就EC50值而言，“2+1 IgG scFab”构建体显示与“(scFv)2”分子可比较的细胞毒活性。“1+1 IgG scFab，单臂倒置”构建体比这个测定法中测试的其他构 建体活性更小。
在另一组实验中，将CD3/MCSP“2+1 IgG Crossfab，连接的轻链”(参见SEQ ID NO:3、5、29、179)与CD3/MCSP“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、29、33)比较。简而言之，将靶细胞(人Colo-38、人MV-3或WM266-4黑素瘤细胞)在分析 当日用细胞解离缓冲液(或在开始分析之前一天用胰蛋白酶)收获，洗涤并重悬于适宜 的细胞培养基(RPMI1640，包含2％FCS和1％Glutamax)中。在平底96孔板中每孔 铺种20 000-30 000个细胞并且如所示添加相应的抗体稀释物(一式三份)。添加PBMC 作为效应细胞以获得最终效应子对靶细胞(E:T)比率10:1。将全部构建体和对照调节 至相同的体积摩尔浓度，温育时间是22小时。如上文所述检测乳酸脱氢酶释放和归 一化。
图49至图52显示用MV-3黑素瘤细胞(图49)、Colo-38细胞(图50和51)或 WM266-4细胞(图52)进行的四个测定法的结果。如图49中所示，在以MV-3细胞作 为靶细胞的测定法中，与没有连接的轻链的构建体相比，具有连接的轻链的构建体效 力更小。如图50和图51中所示，在以高度表达MCSP的Colo-38细胞作为靶细胞的 测定法中，与没有连接的轻链的构建体相比，具有连接的轻链的构建体效力更强。最 后，如图52中所显示，当使用高度表达MCSP的WM266-4细胞作为靶细胞时，在 两种构建体之间不存在显著差异。
在另一个实验中，比较了两种靶向CEA的“2+1 IgG Crossfab，倒置”构建体，其中，在Crossfab片段中，V区(VL/VH，参见SEQ ID NO:33、63、65、67)或C区 (CL/CH1，参见SEQID NO:65、67、183、197)交换。该测定法如上文所述进行，使 用人PBMC作为效应细胞以及表达人CEA的靶细胞。将靶细胞(MKN-45或LS-174T 肿瘤细胞)用胰蛋白酶-EDTA(LuBiosciences#25300-096)收获，洗涤并重悬在包含1％ Glutamax(LuBiosciences#35050087)和2％FCS的RPMI1640(Invitrogen#42404042) 中。在圆底96孔平板中每孔铺种30 000个细胞并且以所示的浓度添加双特异性构建 体。将全部构建体和对照调节至相同的体积摩尔浓度。添加人PBMC效应细胞以获 得最终E:T比率10:1，温育时间是28小时。使用GraphPad Prism 5软件计算EC50值。
如图61中所示，具有CL/CH1交换的构建体在两个靶细胞系上均比具有VL/VH 交换的构建体显示略微更好的活性。对于CL/CH1-交换构建体和VL/VH-交换构建体， 在MKN-45细胞上的计算EC50值分别是115pM和243pM，并且在LS-174T细胞上 的计算EC50值分别是673pM和955pM。
类似地，比较了两种靶向MCSP的“2+1 IgG Crossfab”构建体，其中，在Crossfab片段中，V区(VL/VH，参见SEQ ID NO:33、189、191、193)或C区(CL/CH1，参 见SEQ ID NO:183、189、193、195)交换。该测定法如上文所述进行，使用人PBMC 作为效应细胞以及表达人MCSP的靶细胞。将靶细胞(WM266-4)用细胞解离缓冲液 (LuBiosciences#13151014)收获，洗涤并重悬在包含1％Glutamax(LuBiosciences #35050087)和2％FCS的RPMI1640(Invitrogen#42404042)中。在圆底96孔平板中每 孔铺种30 000个细胞并且以所示的浓度添加构建体。将全部构建体和对照调节至相同 的体积摩尔浓度。添加人PBMC效应细胞以获得最终E:T比率10:1，温育时间是26 小时。使用GraphPad Prism 5软件计算EC50值。
如图62中所示，两个构建体显示可比较的活性，具有CL/CH1交换的构建体具 有略微较低的EC50值(与VL/VH-交换构建体的16.8pM相比，CL/CH1-交换构建体 的EC50值为12.9pM)。
图63显示用表达人MCSP的MV-3靶细胞进行的相似测定法的结果。再次，两 个构建体显示可比较的活性，具有CL/CH1交换的构建体具有略微较低的EC50值(与 VL/VH-交换构建体的大约82.2pM相比，CL/CH1-交换构建体的EC50值为大约11.7 pM)。不能计算精确EC50值，因为杀伤曲线在化合物的高浓度没有抵达平顶(plateau)。
在又一个实验中，将CD3/MCSP“2+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:3、5、 29、33)和“1+1 IgG Crossfab”(参见SEQ ID NO:5、29、33、181)构建体与 CD3/MCSP“1+1CrossMab”(参见SEQ ID NO:5、23、183、185)比较。测定法如上 文所述进行，使用人PBMC作为效应细胞并使用WM266-4或MV-3靶细胞(E:T比 率＝10:1)和温育时间21小时。
如图64中所示，“2+1 IgG Crossfab”构建体是在这个测定法中最强力的分子，随后是“1+1 IgG Crossfab”和“1+1CrossMab”。与高度表达MCSP的WM266-4细胞相 比，采用表达中等水平MCSP的MV-3细胞时，这种排序甚至更明显。对于“2+1 IgG Crossfab”、“1+1 IgGCrossfab”和“1+1CrossMab”，在MV-3细胞上的计算EC50值 分别是9.2、40.9和88.4pM，在WM266-4细胞上的计算EC50值分别是33.1、28.4 和53.9pM。
在又一个实验中，以E:T比率10:1使用MKN-45或LS-174T肿瘤靶细胞和人PBMC效应细胞并使用28小时温育时间，测试了不同浓度的“1+1 IgG Crossfab LC 融合”构建体(SEQID NO:183、209、211、213)。如图65中所示，“1+1 IgG Crossfab LC融合”构建体在MKN-45靶细胞中诱导凋亡，计算的EC50为213pM，而采用 LS-174T细胞时，计算的EC50为1.56nM，这显示不同肿瘤抗原表达水平在某个时间 段内部对双特异性构建体效力的影响。
在又一个实验中，将“1+1 IgG Crossfab LC融合”构建体(SEQ ID NO:183、209、211、213)与非靶向的“2+1 IgG Crossfab”分子比较。使用MC38-huCEA肿瘤细胞和 人PBMC(E:T比率＝10:1)和24小时温育时间。如图66中所示，“1+1 IgG Crossfab LC融合”构建体以浓度依赖性方式诱导靶细胞凋亡，计算的EC50为大约3.2nM。与 之相反，非靶向的“2+1IgG Crossfab”仅在最高浓度显示抗原非依赖性T细胞介导的 靶细胞杀伤作用。
在最后的实验中，使用人MCSP阳性MV-3或WM266-4肿瘤细胞和人PBMC (E:T比率＝10:1)和约24小时温育时间，比较“2+1 IgG Crossfab(V9)”(SEQ ID NO: 3、5、29、33)、“2+1IgG Crossfab，倒置(V9)”(SEQ ID NO:5、23、183、187)、“2+1 IgG Crossfab(抗CD3)”(SEQID NO:5、23、215、217)、“2+1 IgG Crossfab，倒置(抗 CD3)”(SEQ ID NO:5、23、215、219)。如图67中所示，对两种CD3结合物而言，“2+1 IgG Crossfab，倒置”构建体的T细胞介导的杀伤作用似乎略微强于或至少等于“2+1 IgG Crossfabt”构建体诱导的杀伤作用。计算的EC50值如下：
Figure BDA0002213187780001201
实施例7
CD107a/b测定法
通过流式细胞术测试纯化的“2+1 IgG scFab”构建体(SEQ ID NO:5、17、19)和“(scFv)2”分子(二者均靶向人MCSP和人CD3)在表达人MCSP的肿瘤细胞存在或不 存在下上调CD107a和胞内穿孔素水平的潜力。
简而言之，在第1日，将30,000个Colo-38肿瘤靶细胞/孔是铺种在圆底96孔板 中并在37℃，5％CO2温育过夜，以使其贴壁。原代人泛T细胞在第1日或第2日从 暗黄覆盖层分离，如所述那样。
在第2日，添加0.15百万个效应细胞/孔以获得最终E:T比率5:1。添加FITC缀 合的CD107a/b抗体，以及不同的双特异性构建体和对照。将不同的双特异性分子和 抗体调节至相同的摩尔数以获得终浓度9.43nM。在37℃，5％CO2温育1小时的步 骤之后，添加莫能菌素以抑制分泌，并中和内体和溶酶体内部的pH。在5小时额外 温育时间后，将细胞在4℃针对表面CD8表达染色30分钟。将细胞用染色缓冲液(PBS /0.1％BSA)洗涤，固定并使用BDCytofix/Cytoperm Plus试剂盒与BD Golgi Stop(BD Biosciences#554715)透化20分钟。将细胞使用1x BD Perm/洗涤缓冲液洗涤2次，并 且在4℃对穿孔素进行胞内染色30分钟。用1x BD Perm/洗涤缓冲液进行最终洗涤 步骤后，将细胞重悬于PBS/0.1％BSA中并在FACSCantoII上分析(全部抗体均购 自BD Biosciences或BioLegend)。
如所示(图43)，对全部CD107a/b阳性细胞、穿孔素阳性细胞或双阳性细胞设门。“2+1 IgG scFab”构建体仅在靶细胞存在下能够活化T细胞并上调CD107a/b和胞内穿 孔素水平(图43A)，而“(scFv)2”分子还在靶细胞不存在的情况下显示活化T细胞的(弱) 诱导作用(图43B)。与“(scFv)2”分子或其他双特异性构建体相比，双价参比抗CD3 IgG 产生较低水平的活化。
实施例8
增殖测定法
通过流式细胞术测试纯化的“2+1 IgG scFab”(SEQ ID NO:5、17、19)和“(scFv)2”分子(二者均靶向人CD3和人MCSP)在表达人MCSP的肿瘤细胞存在或不存在下诱 导CD8+或CD4+T细胞增殖的潜力。
简而言之，将新鲜分离的人泛T细胞在温PBS中调节至1百万个细胞/ml并在室 温用1μM CFSE染色10分钟。通过添加含有10％FCS和1％GlutaMax的RPMI1640 培养基，使染液体积加倍。在室温温育另外20分钟后，将细胞用预温的培养基洗涤3 次移除剩余的CFSE。将MCSP阳性Colo-38细胞用细胞解离缓冲液收获，计数并检 查活力。将细胞在AIM-V培养基中调节至0.2x 106个(活)细胞/ml，将100μl这种细 胞悬液/孔吸至圆底96孔板中(如所示)。将50μl(稀释的)双特异性构建体添加至含有 细胞的孔以获得终浓度1nM。将CFSE染色的人泛T效应细胞在AIM-V培养基中调 节至2x 106个(活)细胞/ml。将50μl这种细胞悬液添加测试平板的每个孔(见上文)以 获得最终E:T比率5:1。为了分析所述双特异性构建体是否能够仅在表达肿瘤抗原 huMCSP的靶细胞存在情况下活化T细胞，纳入这样的孔，所述孔含有1nM相应的 双特异性分子以及PBMC，但是不含靶细胞。在37℃，5％CO2温育五日后，将细胞离心(5分钟，350x g)并用150μl/孔包含0.1％BSA的PBS洗涤两次。根据供应商的 建议，在4℃对CD8(小鼠IgG1，κ；克隆HIT8a；BD#555635)、CD4(小鼠IgG1， κ；克隆RPA-T4；BD#560649)或CD25(小鼠IgG1，K；克隆M-A251；BD#555434) 进行表面染色30分钟。将细胞用150μl/孔含有0.1％BSA的PBS洗涤两次，重悬于 200μl/孔含有0.1％BSA的PBS中，并使用FACS CantoII仪(Software FACS Diva) 分析。通过围绕非增殖性细胞设门并且相对作为参考的实测总细胞数目而利用这种设 门情况的细胞数目，确定相对增殖水平。
图44显示全部构建体均仅在靶细胞存在下诱导CD8+T细胞(A)或CD4+T细胞(B) 增殖，与“(scFv)2”分子可比。从总体上看，在这个测定法中，活化的CD8+T细胞增 殖多于活化的CD4+T细胞。
实施例9
细胞因子释放测定法
分析纯化的“2+1 IgG scFab”构建体(SEQ ID NO:5、17、19)和“(scFv)2”分子(二者 均靶向人MCSP和人CD3)在肿瘤靶细胞存在或不存在下诱导T细胞介导的细胞因子 从头分泌的能力。
简而言之，从暗黄覆盖层分离人PBMC并将0.3百万个细胞/孔铺种至圆底96孔 板中。添加表达人MCSP的Colo-38肿瘤靶细胞以获得最终E:T比率10:1。以1nM 终浓度添加双特异性构建体和IgG对照并将细胞在37℃，5％CO2温育24小时。次 日，将细胞以350x g离心5分钟并将上清液转移至新的深孔96孔板用于后续分析。 根据制造商的FACS CantoII说明书，使用人Th1/Th2细胞因子试剂盒II(BD#551809) 进行CBA分析。
图45显示上清液中测量到的不同细胞因子水平。在靶细胞存在下，T细胞活化 时分泌的主要细胞因子是IFN-γ。“(scFv)2”分子比“2+1 IgG scFab”构建体诱导略微更 高水平的IFN-γ。人TNF可能存在相同的倾向性，但是与IFN-γ相比，这种细胞因子 的总体水平低得多。在靶细胞存在(或不存在)下活化T细胞时，不存在Th2细胞因子 (IL-10和IL-4)的显著分泌。在不存在Colo-38靶细胞的情况下，仅观察到非常弱的 TNF分泌诱导作用，所述TNF分泌诱导作用在“(scFv)2”分子处理的样品中最高。
在第二实验中，分析了以下纯化的靶向人MCSP和人CD3的双特异性构建体： “2+1IgG Crossfab”构建体(SEQ ID NO:3、5、29、33)、“(scFv)2”分子，以及包含野 生型或突变(LALA、P329G和/或N297D，如所示)Fc结构域的不同“2+1 IgG scFab” 分子。简而言之，深孔96孔板的每个孔铺种280μl来自健康供体的全血。添加30 000 个表达人MCSP的Colo-38肿瘤靶细胞以及以1nM终浓度添加不同的双特异性构建 体和IgG对照。将细胞在37℃，5％CO2温育24小时并随后以350x g离心5分钟。 将上清液转移至新的深孔96孔板用于后续分析。根据制造商的FACS CantoII说明书， 使用以下CBA Flex Set的组合进行CBA分析：人粒酶B(BD#560304)、人IFN-γFlex Set(BD#558269)、人TNF Flex Set(BD#558273)、人IL-10FlexSet(BD#558274)、 人IL-6Flex Set(BD#558276)、人IL-4Flex Set(BD#558272)、人IL-2Flex Set(BD #558270)。
图46显示上清液中测量到的不同细胞因子水平。在Colo-38肿瘤细胞存在下分 泌的主要细胞因子是IL-6，随后是IFN-γ。此外，粒酶B的水平也在靶细胞存在下活 化T细胞时强烈地增加。从总体上看，“(scFv)2”分子在靶细胞存在下诱导较高水平的 细胞因子分泌(图46，A和B)。在靶细胞存在(或不存在)下活化T细胞时，不存在Th2 细胞因子(IL-10和IL-4)的显著分泌。
在这个测定法中，存在不同“2+1IgG scFab”构建体诱导的IFN-γ微弱分泌，甚至在靶细胞不存在的情况下也是如此(图46，C和D)。在这些条件下，不能在具有野生 型或突变Fc结构域的“2+1 IgG scFab”构建体之间观察到显著差异。
实施例10
抗MCSP抗体M4-3/ML2的亲和力成熟
通过寡核苷酸定向诱变流程实施亲和力成熟。对于这种方法，将重链变体M4-3 和轻链变体ML2克隆至噬菌粒载体中，与Hoogenboom所述(Hoogenboom等人, Nucleic AcidsRes.1991,19,4133–4137)相似。通过以下方式确定待随机化的残基：首 先通过经典同源性建模产生这种抗体的3D模型并且随后确定重链和轻链的互补决定 区(CDR)的溶剂可及性残基。从Ella-biotech(Munich，德国)购买如表4中所示的基 于三核苷酸合成的带有随机化的寡核苷酸。通过经典的PCR生成三个独立子文库， 并且它们在CDR-H1和CDR-H2中或在CDR-L1和CDR-L2中含有随机化，CDR-L3 以独立方法随机化。将这些文库的DNA片段通过限制性消化和连接克隆至噬菌粒中 并随后电穿孔至TG1细菌中。
文库选择
将如此产生的抗体变体以单价形式从丝状噬菌体粒子中展示为与每个粒子内部包装的M13的基因III产物的融合物。随后筛选噬菌体展示变体的生物活性(这里： 结合亲和力)并且具有一种或多种改善活性的候选物用于进一步开发。用于制备噬菌 体展示文库的方法可以在Lee等人,J.Mol.Biol.(2004)340,1073–1093)中找到。
根据以下程序在溶液中用全部亲和力成熟文库实施选择：1.每个亲和力成熟文库的约1012个噬菌粒粒子在总体积1ml中与100nM生物素酰化hu-MCSP(D3结构 域)-avi-his(SEQ ID NO:390)结合0.5小时，2.通过添加5.4×107个链霉亲和素包被的 磁珠维持10分钟，捕获生物素酰化的hu-MCSP(D3结构域)-avi-his和特异性结合的 噬菌体粒子，3.使用5-10x 1ml PBS/Tween20和5-10x 1ml PBS洗涤所述珠，4.通 过添加1ml 100mM TEA(三乙胺)持续10分钟洗脱噬菌体粒子并通过添加500ul 1M Tris/HCl pH 7.4中和，以及5.再次感染指数生长的大肠杆菌TG1细菌，用辅助噬菌 体VCSM13感染并随后PEG/NaCl沉淀待用于后续选择轮次中的噬菌粒粒子。使用 恒定或递减(从10-7M至2x10-9M)抗原浓度，实施3-5轮选择。在第2轮中，使用中性 抗生物素蛋白平板而非是链霉亲和素珠，捕获抗原:噬菌体复合物。通过ELISA如下 鉴定特异性结合物：将100ul 10nM生物素酰化的hu-MCSP(D3结构域)-avi-his/孔包 被在中性抗生物素蛋白平板上。添加含有Fab的细菌上清液，并且通过使用抗 Flag/HRP第二抗体借助它们的Flag-标签，检出结合Fab。ELISA阳性克隆按96孔 样式用细菌表达为可溶性Fab片段，并且通过SPR分析，使用ProteOn XPR36 (BioRad)，对上清液进行动力学筛选实验。鉴定到表达具有最高亲和力常数的Fab的 克隆并且将相应的噬菌粒测序。
表4(排除的总是Cys和Met。在寡核苷酸是反向引物的那些情况下首先排除Lys)
Figure BDA0002213187780001251
图84显示与未成熟的亲本克隆(M4-3 ML2)相比，亲和力成熟的抗MCSP克隆的 比对结果。仅在CDR1和CDR2中进行重链随机化。在CDR1和CDR2中进行轻链 随机化，并且在CDR3中独立地进行轻链随机化。
在选择期间，在构架中出现一些突变，如克隆G3中的F71Y或克隆E10中的 Y87H。
人IgG1的产生和纯化
将亲和力成熟变体的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV 启动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成性polyA信号序列。此外，每个载体含有 EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺，用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生 该分子。将细胞用相应的表达载体按1:1比例转染。为了转染，在CD CHO培养基中 以无血清悬浮方式培育HEK293 EBNA细胞。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之 前24小时接种四亿个HEK293 EBNA细胞。为了转染，将细胞通过210x g离心5 分钟，用预温的20ml CD CHO培养基替换上清液。将表达载体混于20ml CD CHO 培养基中至最终量200μg DNA。在添加540μlPEI后，将溶液涡旋混合15秒并随后 在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在 37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，添加160ml F17 培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed1。 在7日后，通过以210x g离心15分钟，收集培养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤 (0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠氮钠并在4℃保持。
通过使用蛋白A的亲和层析，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。将上清液加载于用40ml 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5平衡的HiTrap 蛋白A HP柱(CV＝5mL，GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷 酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5洗涤移除未结合的蛋白质。经过20 个柱体积从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯 化钠，pH 2.5的梯度期间洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8中和蛋 白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用pH 6.0，20mM组氨酸，140mM氯 化钠溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定 纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。通过CE-SDS分析在还原剂存在和不存在下分析分子 的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper lifescience)。2ug样品用于分析。在25℃使用TSKgel G3000 SW XL分析性大小排 阻柱(Tosoh)在25mMK2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸单盐酸盐、0.02％ (w/v)NaN3，pH 6.7运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。
表5:产生和纯化亲和力成熟的抗MCSP IgG
Figure BDA0002213187780001271
亲和力确定
ProteOn分析
在25℃使用ProteOn XPR36仪(BioRad)，通过表面等离子体共振测量KD，其 中抗人F(ab’)2片段特异性捕获抗体(Jackson ImmunoResearch#109-005-006)通过胺 偶联法固定在CM5芯片上并且随后从细菌上清液或从纯化的Fab制备物捕获Fab。 简而言之，根据供应商说明书，用盐酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC) 和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GE Healthcare)。用10mM乙酸钠，pH5.0稀释抗人F(ab’)2片段特异性捕获抗体为50 μg/ml，之后以流速10μl/分钟注射以实现大约至多10000个响应单位(RU)的偶联捕获 抗体。在注射捕获抗体后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量， 来自细菌上清液的Fab或纯化的Fab以流速10μl/分钟注射300秒并且300秒解离用 于捕获基线稳定。捕获水平处于100–500RU范围内。在后续步骤中，将人MCSP(D3 结构域)-avi-his分析物在25℃以流速50μl/分钟作为单一浓度或(取决于范围在100 nM和250pM之间的克隆亲和力)作为稀释于HBS-EP+(GE Healthcare，10mMHEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)中的浓度系 列注射。通过以90ul/分钟注射甘氨酸pH 1.5持续30秒，随后以相同流速注入NaOH 持续20秒，使传感器的表面再生。使用简单一对一Langmuir结合模型(ProteOn XPR36评价软件或Scrubber软件(BioLogic))，通过同时拟合缔合和解离传感图 (sensorgram)，计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为 koff/kon比。该数据用来确定亲和力成熟变体相对于亲本抗体的比较结合亲和力。表 6a显示从这些测定法产生的数据。
对于轻链，选择G3、E10、C5，并且对于重链，选择D6、A7、B7、B8、C1， 转化成为人IgG1样式。由于轻链的CDR1和CDR2独立于CDR3随机化，所以将获 得的CDR在IgG转化期间组合。
在IgG样式下，重新测量针对人MCSP抗原(SEQ ID NO:390)的亲和力，另外 还测量针对食蟹猴同源物(SEQ ID NO:389)的亲和力。使用正如对Fab片段(仅从哺 乳动物生产纯化的IgG)所述的方法。
表6a：MCSP亲和力成熟的克隆：Proteon数据
Figure BDA0002213187780001281
Figure BDA0002213187780001291
使用Biacore T200通过表面等离子体共振法(SPR)确定亲和力
在25℃在Biacore T200上进行表面等离子体共振(SPR)实验以确定亲和力成熟的IgG的亲和力和亲合力，以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15 M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/德国)。
为了分析针对人MCSP D3和食蟹猴MCSP D3的不同抗MCSP IgG相互作用的 亲合力，在pH 5.0使用标准胺偶联试剂盒(Biacore，Freiburg/德国)在CM5芯片上直 接偶联约9,500个共振单位(RU)的抗五His抗体(Qiagen)。在30nM以10μl/分钟分 别捕获抗原60秒。使IgG以0.0064-100nM的浓度，30μl/分钟流速经280秒流过流 动小室。监测解离180秒。通过扣除在参比流动小室上获得的响应，修正本体折射率 差异。这里，使IgG在下述表面上流过，所述表面具有固定的抗五His抗体，但是在 其上面已经注射HBS-EP而非人MCSP D3或食蟹猴MCSP D3。
为了测量亲和力，在具有固定的抗人Fc的CM5传感器芯片表面上捕获IgG。通 过使用标准胺偶联试剂盒(Biacore，Freiburg/德国)在pH 5.0直接固定约9,500个共振 单位(RU)，将捕获IgG与传感器芯片表面偶联。在10nM以30μl/分钟捕获IgG 25 秒。使人MCSP D3和食蟹猴MCSP D3以2-500nM的浓度，30μl/分钟流速经120 秒流过流动小室。监测解离60秒。分别监测166nM和500nM浓度的缔合和解离1200 秒和600秒。通过扣除在参比流动小室上获得的响应，修正本体折射率差异。这里， 使抗原在下述表面上流过，所述表面具有固定的抗人Fc抗体，但是在其上面已经注 射HBS-EP而非抗MCSP IgG。
使用Biacore T200评价软件(vAA，Biacore AB，Uppsala/瑞典)推算动力学常数，以通过数值积分拟合1:1Langmuir结合作用的速率方程。
使用Biacore T200，通过表面等离子体共振测量证实对人MCSP D3和食蟹猴 MCSPD3的亲和力更高。此外，亲合力量值显示二价结合作用增加多达3倍(表6b)。
表6b.针对人MCSP-D3和食蟹猴MCSP D3的抗MCSP IgG的亲和力和亲合力。
Figure BDA0002213187780001301
实施例11
制备含有M4-3(C1)/ML2(G3)的MCSP TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒 置)作为抗MCSP抗体和制备人源化CH2527作为抗CD3抗体
将所产生的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启动子 驱动并且在CDS的3'末端携带合成性polyA信号序列。此外，每个载体含有EBV OriP 序列。
通过使用聚乙烯亚胺，用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生 该分子。将细胞用相应的表达载体按1:2:1:1比率(“载体重链Fc(扣)”:“载体轻链”: “载体轻链Crossfab”:“载体重链Fc(结)-FabCrossfab”)转染。
为了转染，在CD CHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293 EBNA细胞。 为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293 EBNA细胞。为 了转染，将细胞通过210x g离心5分钟，上清液由预温的20ml CD CHO培养基替 换。将表达载体混于20ml CDCHO培养基中至最终量200μg DNA。在添加540μl PEI 后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶 液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。 在温育时间后，添加160ml F17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加 1mM丙戊酸并且添加7％Feed 1。在7日后，通过以210x g离心15分钟，收集培 养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠 氮钠并在4℃保持。
通过使用蛋白A的亲和层析，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。将上清液加载于用40ml 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5平衡的HiTrap 蛋白A HP柱(CV＝5mL，GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷 酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5洗涤移除未结合的蛋白质。在经过20 个柱体积从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯 化钠，pH 2.5的梯度期间洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8中和蛋 白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用pH 6.0，20mM组氨酸，140mM氯 化钠溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定 纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。
通过CE-SDS分析在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper lifescience)。2μg样品用于分析。
在25℃使用TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mM K2HPO4、125mMNaCl、200mM L-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7 运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。
表7a：MCSP TCB产生和纯化的总结
Figure BDA0002213187780001321
图68显示MCSP TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置)分子的示意图。
图69和表7b显示MCSP TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置)分子(SEQ ID NO:278、319、320和321)的CE-SDS分析。
表7b：MCSP TCB的CE-SDS分析
峰 kDa 相应的链
MCSP TCB非还原(A) 1 206.47
MCSP TCB还原(B) 1 29.15 轻链ML2(C1)
2 37.39 轻链huCH2527
3 66.07 Fc(扣)
4 94.52 Fc(结)
图70显示MCSP TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置)分子(SEQ ID NO: 78、319、320和321)的分析性大小排阻色谱。
实施例12
制备含有CH1A1A 98/99 2F1的CEA TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置) 作为抗CEA抗体和制备人源化CH2527作为抗CD3抗体
将所产生的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启动子 驱动并且在CDS的3'末端携带合成性polyA信号序列。此外，每个载体含有EBV OriP 序列。
通过使用聚乙烯亚胺，用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生 该分子。将细胞用相应的表达载体按1:2:1:1比率(“载体重链Fc(扣)”:“载体轻链”: “载体轻链Crossfab”:“载体重链Fc(结)-FabCrossfab”)转染。
为了转染，在CD CHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293 EBNA细胞。 为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293 EBNA细胞。为 了转染，将细胞通过210x g离心5分钟，上清液由预温的20ml CD CHO培养基替 换。将表达载体混于20ml CDCHO培养基中至最终量200μg DNA。在添加540μl PEI 后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶 液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。 在温育时间后，添加160ml F17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加 1mM丙戊酸并且添加7％Feed 1。在7日后，通过以210x g离心15分钟，收集培 养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠 氮钠并在4℃保持。
通过使用蛋白A的亲和层析，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。将上清液加载于用40ml 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5平衡的HiTrap 蛋白A HP柱(CV＝5mL，GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷 酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5洗涤移除未结合的蛋白质。在经过20 个柱体积从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯 化钠，pH 2.5的梯度期间洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH 8中和蛋 白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用pH 6.0，20mM组氨酸，140mM氯 化钠溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定 纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。
通过CE-SDS分析在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper lifescience)。2μg样品用于分析。
在25℃使用TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mM K2HPO4、125mMNaCl、200mM L-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7 运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。
表8:CEA TCB的产生和纯化总结
图71显示CEA TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置)分子的示意图。
图72和表9显示CEA TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置)分子(SEQ ID NO:288、322、323和324)的CE-SDS分析。
表9:CEA TCB的CE-SDS分析
Figure BDA0002213187780001341
图73显示CEA TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置)分子(SEQ ID NO: 288、322、323和324)的分析性大小排阻色谱。
实施例13
GA903 TCB与表达MCSP的细胞和表达CD3的细胞的结合
在表达MCSP的人恶性黑素瘤细胞系(A375)和表达CD3的永生化T淋巴细胞系(Jurkat)上测试GA903 TCB的结合作用。简而言之，将细胞收获、计数、检验存活 力并以2x106个细胞/ml重悬在FACS缓冲液(100μl PBS，0.1％BSA)中。将100μl 细胞悬液(含有0.2x106个细胞)在4℃在圆底96孔板中与渐增浓度的MCSP TCB(2.6 pM-200nM)温育30分钟，用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次，在4℃与PE缀合的亲和 纯F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcg片段特异的第二抗体(Jackson Immuno Research Lab PE#109-116-170)再温育另外30分钟，用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次并且使用FACS CantoII(Software FACS Diva)，通过对DAPI阴性活细胞设门立即由FACS分析。使 用GraphPad Prism 5，获得结合曲线(图74A，与A375细胞结合，EC50＝3381pM； 图74B，与Jurkat细胞结合)。
实施例14
MCSP TCB抗体诱导的T细胞杀伤作用
使用一组表达不同水平MCSP的肿瘤细胞系，评估MCSP TCB抗体介导的T细 胞杀伤作用(A375＝MCSP高，MV-3＝MSCP中等，HCT-116＝MCSP低，LS180＝ MCSP阴性)。简而言之，将靶细用胰蛋白酶/EDTA收获，洗涤并使用平底96孔板以25,000个细胞/孔的密度铺种。任由细胞贴壁过夜。通过Histopaque密度离心从健康 人类供体获得的富集的淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)，制备外周血单个核细胞 (PBMC)。将新鲜血液用无菌PBS稀释并铺在Histopaque梯度(Sigma，#H8889)上。 在离心后(450x g，30分钟，室温)，弃去含有PBMC的中间层上方的血浆并将PBMC 转移入新的falcon管，所述管随后用50ml PBS填充。将混合物离心(400x g，10分 钟，室温)，弃去上清液并将PBMC沉淀物用无菌PBS洗涤两次(离心步骤350x g， 10分钟)。自动计数所得的PBMC群(ViCell)并在细胞培养箱中于37℃，5％CO2贮存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培 养基中，直至进一步使用(不超过24小时)。对于杀伤测定法，将抗体以所示的浓度添 加(范围1pM–10nM一式三份)。以最终E:T比率10:1向靶细胞添加PBMC。在37℃， 5％CO2温育24小时后，通过借助凋亡/坏死细胞对释放入细胞上清液的乳酸脱氢酶 定量(乳酸脱氢酶检测试剂盒，Roche Applied Science，#11,644,793,001)，评估靶细胞 杀伤作用。通过靶细胞与1％Triton X-100温育，实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。 最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共温育、不与双特异性构建体共温育的靶细胞。结果 显示MCSP TCB诱导强烈和靶特异地杀伤MCSP+靶细胞系，而不杀伤MCSP-细胞 系，图75A-D。表10中给出与杀伤测定法相关的、使用GraphPad Prism 5计算的 EC50值。
表10.MCSP TCB抗体诱导的T细胞介导杀伤表达MCSP的肿瘤细胞的EC50值 (pM)。
细胞系 MCSP受体拷贝数 EC<sub>50</sub>(pM)
A375 387 058 12.3
MV-3 260 000 9.4
HCT-116 36770 3.7
LS180 阴性 n.d.
实施例15
在MCSP TCB抗体诱导的T细胞杀伤表达MCSP的肿瘤细胞后CD8+和CD4+ 效应细胞上的CD25和CD69上调
使用抗体识别T细胞活化标志物CD25(晚期活化标志物)和CD69(早期活化标志物)，通过FACS分析评估在MCSP TCB抗体介导的T细胞杀伤表达MCSP的MV-3 肿瘤细胞后CD8+和CD4+T细胞的活化。抗体和杀伤测定法条件基本上如上文所述(实 施例14)，使用相同的抗体浓度范围(1pM–10nM一式三份)，E:T比率10:1和温育 时间24小时。
在温育后，将PBMC转移至圆底96孔板、以350x g离心5分钟并用含有0.1％ BSA的PBS洗涤2次。根据供应商的说明进行CD8(FITC抗人CD8，BD#555634)、 CD4(PECy7抗人CD4，BD#557852)、CD69(PE抗人CD69 Biolegend#310906)和 CD25(APC抗人CD25，BD#555434)的表面染色。将细胞用150μl/孔含有0.1％BSA 的PBS洗涤两次并在4℃使用100μl/孔固定缓冲液(BD#554655)固定15分钟。在离 心后，将样品重悬于200μl/孔含有DAPI的PBS 0.1％BSA中以排除死细胞用于FACS 测量。在BD FACS Fortessa分析样品。结果显示MCSP TCB在杀伤后诱导CD8+T 细胞(图76A、B)和CD4+T细胞(图76C、D)上活化标志物(CD25、CD69)的强烈和靶 特异性上调。
实施例16
在MCSP TCB抗体诱导的T细胞杀伤表达MCSP的肿瘤细胞后人效应细胞的细 胞因子分泌
通过FACS分析杀伤测定法后的细胞上清液，评估在MCSP TCB抗体诱导的T 细胞杀伤表达MCSP的MV-3肿瘤细胞后人PBMC的细胞因子分泌。
使用相同抗体并且杀伤测定法基本上如上文所述那样进行(实施例14和15)，使用E:T比率10:1和温育时间24小时。
在温育时间结束时，将平板以350x g离心5分钟，将上清液转移至新的96孔板 中并贮存在-20℃直至后续分析。使用BD CBA人可溶性蛋白Flex Set，根据制造商 的说明书在FACS CantoII上检测分泌至细胞上清液中的粒酶B、TNFα、IFN-γ、IL-2、 IL-4和IL-10。使用以下试剂盒：BD CBA人粒酶B BD CBA人粒酶B Flex Set#BD 560304；BD CBA人TNFFlex Set#BD 558273；BD CBA人IFN-γFlex Set#BD 558269；BD CBA人IL-2Flex Set#BD558270；BD CBA人IL-4Flex Set#BD 558272； BD CBA人IL-10Flex Set#BD 558274。
结果显示当杀伤时，MCSP TCB诱导IL-2、IFN-γ、TNFα、粒酶B和IL-10分 泌(但不诱导IL-4分泌)，图77A-F。
这些例子表明MCSP CD3双特异性抗体
·显示与MCSP+A375细胞良好结合
·诱导对MCSP+靶细胞系的强烈和靶特异性杀伤，并且不杀伤MCSP-细胞系
·在杀伤后诱导CD8+和CD4+T细胞上的活化标志物(CD25，CD69)的强烈和靶 特异性上调
·当杀伤时诱导IL-2、IFN-g、TNF-α、GrB和IL-10(但不诱导IL-4)分泌
实施例17
CEA TCB与表达CEA的和表达CD3的细胞的结合
在表达CEA的结肠腺癌细胞(LS180)和表达CD3的永生化T淋巴细胞系(Jurkat) 上测试CEA TCB的结合作用。简而言之，将细胞收获、计数、检验存活力并以2x106个细胞/ml重悬在FACS缓冲液(100μl PBS，0.1％BSA)中。将100μl细胞悬液(含有 0.2x106个细胞)在4℃在圆底96孔板中与渐增浓度的CEA TCB(3pM-200nM)温育 30分钟，用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次，在4℃与PE缀合的亲和纯F(ab’)2片段山 羊抗人IgG Fcg片段特异的第二抗体(Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170)再温育另外30分钟，用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次并且使用FACS CantoII(Software FACS Diva)，通过对DAPI阴性活细胞设门立即由FACS分析。使 用GraphPad Prism 5，获得结合曲线(图78A，与LS180细胞结合；图78B，与Jurkat 细胞结合)。
实施例18
CEA TCB抗体诱导的T细胞杀伤作用
在MKN45(高CEA)、LS180(中等CEA)和HT-29(低CEA)人肿瘤细胞上评估CEA TCB抗体诱导的T细胞杀伤作用。使用人PBMC作为效应细胞并且与双特异性抗体 温育24小时时检测杀伤作用。简而言之，将靶细用胰蛋白酶/EDTA收获，洗涤并使 用平底96孔板以25,000个细胞/孔的密度铺种。任由细胞贴壁过夜。通过Histopaque 密度离心从健康人类供体获得的富集的淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)，制备外周血单 个核细胞(PBMC)。将新鲜血液用无菌PBS稀释并铺在Histopaque梯度(Sigma， #H8889)上。在离心后(450x g，30分钟，室温)，弃去含有PBMC的中间层上方的血 浆并将PBMC转移入新的falcon管，所述管随后用50mlPBS填充。将混合物离心(400 x g，10分钟，室温)，弃去上清液并将PBMC沉淀物用无菌PBS洗涤两次(离心步骤 350x g，10分钟)。自动计数所得的PBMC群(ViCell)并在细胞培养箱中于37℃，5％ CO2贮存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中，直至进一步使用(不超过24小时)。对于杀伤测定法，将抗体以 所示的浓度添加(范围0.2pM–20nM一式三份)。以最终E:T比率10:1向靶细胞添 加PBMC。在37℃，5％CO2温育24小时和48小时后，通过借助凋亡/坏死细胞对 释放入细胞上清液的乳酸脱氢酶定量(乳酸脱氢酶检测试剂盒，Roche Applied Science，#11,644,793,001)，评估靶细胞杀伤作用。通过靶细胞与1％Triton X-100温 育，实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共温育、不与 双特异性构建体共温育的靶细胞。结果显示CEATCB诱导对CEA+靶细胞系的强烈 和靶特异性杀伤，图79A-C。表11中给出与杀伤测定法相关的、使用GraphPad Prism 5计算的EC50值。
表11.CEA TCB抗体诱导的T细胞介导杀伤表达CEA的肿瘤细胞的EC50值 (pM)。
细胞系 CEA受体拷贝数 EC<sub>50</sub>[pM]24小时
MKN45 280 000 95
LS180 92 000 560
HT-29 3000 n.d
实施例19
在CEA TCB抗体诱导的T细胞杀伤表达CEA的肿瘤细胞后CD8+和CD4+效应 细胞上的CD25和CD69上调
使用抗体识别T细胞活化标志物CD25(晚期活化标志物)和CD69(早期活化标志物)，通过FACS分析评估在CEA TCB抗体介导的T细胞杀伤表达CEA的LS180 肿瘤细胞后CD8+和CD4+T细胞的活化。抗体和杀伤测定法条件基本上如上文所述(实 施例18)，使用相同的抗体浓度范围(0.2pM–20nM一式三份)，E:T比率10:1和温 育时间24小时。
在温育后，将PBMC转移至圆底96孔板、以350x g离心5分钟并用含有0.1％BSA的PBS洗涤2次。根据供应商的说明进行CD8(FITC抗人CD8，BD#555634)、 CD4(PECy7抗人CD4，BD#557852)、CD69(PE抗人CD69 Biolegend#310906)和 CD25(APC抗人CD25，BD#555434)的表面染色。将细胞用150μl/孔含有0.1％BSA 的PBS洗涤两次并在4℃使用100μl/孔固定缓冲液(BD#554655)固定15分钟。在离 心后，将样品重悬于200μl/孔含有DAPI的PBS 0.1％BSA中以排除死细胞用于FACS 测量。在BD FACS Fortessa分析样品。结果显示CEA TCB在杀伤后诱导CD8+T细 胞(图80A、B)和CD4+T细胞(图80C、D)上活化标志物(CD25、CD69)的强烈和靶特 异性上调。
实施例20
在CEA TCB诱导的T细胞杀伤表达CEA的肿瘤细胞后人效应细胞的细胞因子 分泌
通过FACS分析杀伤测定法后的细胞上清液，评估在CEA TCB诱导的T细胞杀 伤表达CEA的LS180肿瘤细胞后人PBMC的细胞因子分泌。
使用相同抗体并且杀伤测定法基本上如上文所述那样进行(实施例18和19)，使用E:T比率10:1和温育时间24小时。
在温育时间结束时，将平板以350x g离心5分钟，将上清液转移至新的96孔板 中并贮存在-20℃直至后续分析。使用BD CBA人可溶性蛋白Flex Set，根据制造商 的说明书在FACS CantoII上检测分泌至细胞上清液中的粒酶B、TNFα、IFN-γ、IL-4 和IL-10。使用以下试剂盒：BD CBA人粒酶B BD CBA人粒酶B Flex Set#BD 560304； BD CBA人TNF FlexSet#BD 558273；BD CBA人IFN-γFlex Set#BD 558269；BD CBA人IL-4Flex Set#BD558272；BD CBA人IL-10Flex Set#BD 558274。
结果显示当杀伤时，CEA TCB诱导IFN-γ、TNFα、粒酶B、IL-4和IL-10分泌， 图81A-E。
这些例子显示CEA CD3双特异性抗体
·显示与CEA+细胞良好结合
·诱导对CEA+靶细胞系的强烈和靶特异性杀伤。
·在杀伤后诱导CD8+和CD4+T细胞上的活化标志物(CD25，CD69)的强烈和靶 特异性上调
·当杀伤时诱导IL-2、IFN-g、TNF-α、GrB和IL-10(但不诱导IL-4)分泌
实施例21
制备含有DP47 GS的DP47 GS TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置＝“非 靶向的TCB”)作为非结合性抗体和制备人源化CH2527作为抗CD3抗体
使用“非靶向的TCB”作为以上实验中的对照。双特异性抗体接合CD3e，但是不 与任何其他抗原结合并且因此不能使T细胞与任何靶细胞交联(并随后不能诱导任何 杀伤作用)。因此使用它作为本测定法中的阴性对照以监测任何非特异性T细胞活化。
已经将所产生的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启 动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成性polyA信号序列。此外，每个载体含有EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺，用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生 该分子。将细胞用相应的表达载体按1:2:1:1比率(“载体重链Fc(扣)”:“载体轻链”: “载体轻链Crossfab”:“载体重链Fc(结)-FabCrossfab”)转染。
为了转染，在CD CHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293 EBNA细胞。 为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293 EBNA细胞。为 了转染，将细胞通过210x g离心5分钟，上清液由预温的20ml CD CHO培养基替 换。将表达载体混于20ml CDCHO培养基中至最终量200μg DNA。在添加540μl PEI 后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶 液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。 在温育时间后，添加160ml F17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加 1mM丙戊酸并且添加7％Feed 1。在7日后，通过以210x g离心15分钟，收集培 养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠 氮钠并在4℃保持。
通过使用蛋白A的亲和层析，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。将上清液加载于用40ml 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5平衡的HiTrap 蛋白A HP柱(CV＝5mL，GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷 酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5洗涤移除未结合的蛋白质。在经过20 个柱体积从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯 化钠，pH 2.5的梯度期间洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH 8中和蛋 白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用pH 6.0，20mM组氨酸，140mM氯 化钠溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定 纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。
通过CE-SDS分析在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper lifescience)。2ug样品用于分析。
在25℃使用TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mM K2HPO4、125mMNaCl、200mM L-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7 运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。
表12:DP47 GS TCB的产生和纯化总结
Figure BDA0002213187780001411
图82和表13显示作为非结合性抗体的含有DP47 GS的DP47 GS TCB(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒置)和作为抗CD3抗体的人源化CH2527的CE-SDS分 析(SEQ IDNO:325、326、327和328)。
表13:DP47 GS TCB的CE-SDS分析
峰 kDa 相应的链
DP47 GS TCB非还原(A) 1 165.22 2条轻链丢失的分子
2 181.35 1条轻链丢失的分子
3 190.58 无N联糖基化的正确分子
4 198.98 正确的分子
DP47GS TCB还原(B) 1 27.86 轻链DP47 GS
2 35.74 轻链huCH2527
3 63.57 Fc(扣)
4 93.02 Fc(结)
图83显示作为非结合性抗体的含有DP47 GS的DP47 GS TCB(2+1 Crossfab-IgGP329G LALA倒置)和作为抗CD3抗体的人源化CH2527的分析性大小 排阻色谱。(SEQ ID NO:325、326、327和328)。
实施例22：AVH TCB的制备
已经将所产生的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启 动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成性polyA信号序列。此外，每个载体含有EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺，用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生 该分子。将细胞用相应的表达载体按1:1:1比率(“载体重链AVH-Fc(扣)”:“载体轻链 抗CD3”:“载体重链AVH-Fab(抗CD3)-Fc(结)”)转染。
为了转染，在CD CHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293 EBNA细胞。 为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293 EBNA细胞。为 了转染，将细胞通过210x g离心5分钟，上清液由预温的20ml CD CHO培养基替 换。将表达载体混于20ml CDCHO培养基中至最终量200μg DNA。在添加540μl PEI 后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶 液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。 在温育时间后，添加160ml F17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加 1mM丙戊酸并且添加7％Feed 1。在7日后，通过以210x g离心15分钟，收集培 养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠 氮钠并在4℃保持。
通过使用蛋白A的亲和层析，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。将上清液加载于用40ml 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5平衡的HiTrap 蛋白A HP柱(CV＝5mL，GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷 酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5洗涤移除未结合的蛋白质。在经过20 个柱体积从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯 化钠，pH 2.5的梯度期间洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH 8中和蛋 白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用pH 6.0，20mM组氨酸，140mM氯 化钠溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定 纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。
通过CE-SDS分析在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper lifescience)。2μg样品用于分析。
在25℃使用TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mM K2HPO4、125mMNaCl、200mM L-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7 运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。
表14:aVH TCB的产生和纯化总结
Figure BDA0002213187780001431
图85显示aVH TCB分子的示意图。
图86和表15显示含有Crossfab片段的aVH TCB分子(2+1Crossfab-IgG P329GLALA)(SEQ ID NO:369、370和371)的CE-SDS分析，所述Crossfab片段具有一个 CD3结合部分和两个结合MCSP的aVH部分。
表15：aVH TCB的CE-SDS分析
峰 kDa 相应的链
aVH TCB非还原(A) 1 58.4
2 145.6 正确的分子
3 206.19 Fc(结)-同型二聚体
4 249
aVH TCB还原(B) 1 27.5 轻链huCH2527)
2 34.5 aVH-Fc(扣)
3 91.3 aVH-Fab-Fc(结)
实施例23：aVH TCB与表达MCSP的细胞和表达CD3的细胞的结合
在表达MCSP的人黑素瘤细胞系(MV-3)和表达CD3的永生化T淋巴细胞系(Jurkat)上测试aVH TCB的结合作用。简而言之，将细胞收获、计数、检验存活力 并以2x106个细胞/ml重悬在FACS缓冲液(100μl PBS，0.1％BSA)中。将100μl细胞 悬液(含有0.2x106个细胞)在4℃在圆底96孔板中与渐增浓度的aVH TCB(2pM-170 nM)温育30分钟，用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次，在4℃与PE缀合的亲和纯F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcg片段特异的第二抗体(Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170)再温育另外30分钟，用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次并且使用FACS CantoII(Software FACS Diva)，立即由FACS分析。使用GraphPad Prism 5，获得 结合曲线(图87A，与MV3细胞结合；图87B，与Jurkat细胞结合)。
实施例24：aVH TCB抗体诱导的T细胞杀伤作用
在温育24小时和48小时使用表达MCSP的人黑素瘤肿瘤细胞(MV-3)和人PBMC 评估aVH TCB抗体介导的T细胞杀伤作用。简而言之，将靶细用胰蛋白酶/EDTA收 获，洗涤并使用平底96孔板以25,000个细胞/孔的密度铺种。任由细胞贴壁过夜。通 过Histopaque密度离心从健康人类供体获得的富集的淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)， 制备外周血单个核细胞(PBMC)。将新鲜血液用无菌PBS稀释并铺在Histopaque梯度 (Sigma，#H8889)上。在离心后(450x g，30分钟，室温)，弃去含有PBMC的中间层 上方的血浆并将PBMC转移入新的falcon管，所述管随后用50ml PBS填充。将混 合物离心(400x g，10分钟，室温)，弃去上清液并将PBMC沉淀物用无菌PBS洗涤 两次(离心步骤350x g，10分钟)。自动计数所得的PBMC群(ViCell)并在细胞培养箱 中于37℃，5％CO2贮存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom， K0302)的RPMI1640培养基中，直至进一步使用(不超过24小时)。对于杀伤测定法， 将抗体以所示的浓度添加(范围110pM–80nM一式三份)。以最终E:T比率10:1向 靶细胞添加PBMC。在37℃，5％CO2温育24小时和48小时后，通过借助凋亡/坏 死细胞对释放入细胞上清液的乳酸脱氢酶定量(乳酸脱氢酶检测试剂盒，Roche Applied Science，#11,644,793,001)，评估靶细胞杀伤作用。通过靶细胞与1％Triton X-100温育，实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共温 育、不与双特异性构建体共温育的靶细胞。结果显示aVH TCB诱导对MCSP+靶细 胞系的强烈和靶特异性杀伤，图88A、B。表16中给出与杀伤测定法相关的、使用 GraphPad Prism 5计算的EC50值。
表16.aVH TCB抗体诱导的T细胞介导杀伤表达MCSP的肿瘤细胞(MV-3)的 EC50值(pM)。
细胞系 EC<sub>50</sub>[pM]24小时 EC<sub>50</sub>[pM]48小时
MV-3 9119.5 8967
附图简述
图87：aVH TCB与MV-3细胞(MCSP+)(A)和Jurkat(CD3+细胞)(B)的结合。
图88：在温育后24小时(A)和48小时(B)检测到的对MV-3黑素瘤细胞由aVH TCB抗体诱导的T细胞杀伤作用(E:T＝10:1，效应细胞人PBMC)。
实施例25：锚蛋白重复序列蛋白(DARPIN)-TCB的制备
已经将所产生的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启 动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成性polyA信号序列。此外，每个载体含有EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺，用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生 该分子。将细胞用相应的表达载体按1:1:1比率(“载体重链DARPIN-Fc(扣)”:“载体 轻链抗CD3”:“载体重链DARPIN-Fab(抗CD3)-Fc(结)”)转染。
为了转染，在CD CHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293 EBNA细胞。 为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293 EBNA细胞。为 了转染，将细胞通过210x g离心5分钟，上清液由预温的20ml CD CHO培养基替 换。将表达载体混于20ml CDCHO培养基中至最终量200μg DNA。在添加540μl PEI 后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶 液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。 在温育时间后，添加160ml F17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加 1mM丙戊酸并且添加7％Feed 1。在7日后，通过以210x g离心15分钟，收集培 养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠 氮钠并在4℃保持。
通过使用蛋白A的亲和层析，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。将上清液加载于用40ml 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5平衡的HiTrap 蛋白A HP柱(CV＝5mL，GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷 酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5洗涤移除未结合的蛋白质。在经过20 个柱体积从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯 化钠，pH 2.5的梯度期间洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8中和蛋 白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用pH 6.0，20mM组氨酸，140mM氯 化钠溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定 纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。
通过CE-SDS分析在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper lifescience)。2μg样品用于分析。
在25℃使用TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mM K2HPO4、125mMNaCl、200mM L-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7 运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。
图89显示Darpin-TCB分子的示意图。
表17：DARPIN-TCB的产生和纯化总结
图90和表18显示含有Crossfab片段的DARPIN-TCB分子(2+1Crossfab-IgG P329GLALA)(SEQ ID NO:376、377和378)的CE-SDS分析，所述Crossfab片段具 有一个CD3结合部分和两个结合HER2的Darpin部分。
表18：Darpin TCB的CE-SDS分析
峰 kDa 相应的链
DARPIN TCB非还原(A) 1 107.5 轻链丢失的正确分子
2 140.38 正确的分子
DARPIN TCB还原(B) 1 34 轻链huCH2527)
2 49.5 Darpin-Fc(扣)
3 76.6 Darpin-Fab-Fc(结)
实施例26：Darpin TCB与表达Her2的和表达CD3的细胞的结合
在表达Her2的人黑素瘤细胞系(KPL-4)和表达CD3的永生化T淋巴细胞系(Jurkat)上测试Darpin TCB的结合作用。简而言之，将细胞收获、计数、检验存活 力并以2x106个细胞/ml重悬在FACS缓冲液(100μl PBS，0.1％BSA)中。将100μl 细胞悬液(含有0.2x106个细胞)在4℃在圆底96孔板中与渐增浓度的Darpin TCB(3 pM-200nM)温育30分钟，用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次，在4℃与PE缀合的亲和 纯F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcg片段特异的第二抗体(Jackson Immuno Research Lab PE#109-116-170)再温育另外30分钟，用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次并且使用FACS CantoII(Software FACS Diva)，立即由FACS分析。使用GraphPad Prism 5，获得 结合曲线(图91A，与KPL-4细胞结合；图91B，与Jurkat细胞结合)。
实施例27：Darpin TCB抗体诱导的T细胞杀伤作用
在温育24小时和48小时使用表达Her2的人黑素瘤肿瘤细胞(KPL4)和人PBMC 评估Darpin TCB抗体介导的T细胞杀伤作用。简而言之，将靶细用胰蛋白酶/EDTA 收获，洗涤并使用平底96孔板以25,000个细胞/孔的密度铺种。任由细胞贴壁过夜。 通过Histopaque密度离心从健康人类供体获得的富集的淋巴细胞制备物(暗黄覆盖 层)，制备外周血单个核细胞(PBMC)。将新鲜血液用无菌PBS稀释并铺在Histopaque 梯度(Sigma，#H8889)上。在离心后(450x g，30分钟，室温)，弃去含有PBMC的中 间层上方的血浆并将PBMC转移入新的falcon管，所述管随后用50ml PBS填充。 将混合物离心(400x g，10分钟，室温)，弃去上清液并将PBMC沉淀物用无菌PBS 洗涤两次(离心步骤350x g，10分钟)。自动计数所得的PBMC群(ViCell)并在细胞培 养箱中于37℃，5％CO2贮存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 (Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中，直至进一步使用(不超过24小时)。对于 杀伤测定法，将抗体以所示的浓度添加(范围2pM–20nM一式三份)。以最终E:T 比率10:1向靶细胞添加PBMC。在37℃，5％CO2温育24小时和48小时后，通过 借助凋亡/坏死细胞对释放入细胞上清液的乳酸脱氢酶定量(乳酸脱氢酶检测试剂盒， Roche Applied Science，#11,644,793,001)，评估靶细胞杀伤作用。通过靶细胞与1％ Triton X-100温育，实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细 胞共温育、不与双特异性构建体共温育的靶细胞。结果显示Darpin TCB诱导对Her2+ 靶细胞系的强烈和靶特异性杀伤，图92A、B。表19中给出与杀伤测定法相关的、 使用GraphPad Prism 5计算的EC50值。
表19.Darpin TCB抗体诱导的T细胞介导对表达Her2的肿瘤细胞(KPL-4)的杀 伤作用的EC50值(pM)。
细胞系 EC<sub>50</sub>[pM]24小时 EC<sub>50</sub>[pM]48小时
KPL-4 376.5 234.6
实施例28：hIgG1 DDKK TCB的制备
已经将所产生的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启 动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成性polyA信号序列。此外，每个载体含有EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺，用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生 该分子。将细胞用相应的表达载体按1:1:2:1比率(“载体重链Fc(KK)”:“载体轻链 Crossfab”:“载体轻链”:“载体重链Fc(KK)FabCrossfab”)转染。
为了转染，在CD CHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293 EBNA细胞。 为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293 EBNA细胞。为 了转染，将细胞通过210x g离心5分钟，上清液由预温的20ml CD CHO培养基替 换。将表达载体混于20ml CDCHO培养基中至最终量200μg DNA。在添加540μl PEI 后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶 液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。 在温育时间后，添加160ml F17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加 1mM丙戊酸并且添加7％Feed 1。在7日后，通过以210x g离心15分钟，收集培 养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠 氮钠并在4℃保持。
通过使用蛋白A的亲和层析，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。将上清液加载于用40ml 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5平衡的HiTrap 蛋白A HP柱(CV＝5mL，GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷 酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5洗涤移除未结合的蛋白质。在经过20 个柱体积从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯 化钠，pH 2.5的梯度期间洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8中和蛋 白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用pH 6.0，20mM组氨酸，140mM氯 化钠溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定 纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。
通过CE-SDS分析在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper lifescience)。2μg样品用于分析。
在25℃使用TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mM K2HPO4、125mMNaCl、200mM L-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7 运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。
携带具有DDKK突变的Fc的人IgG1可以用来产生T细胞双特异性异二聚体分 子。第一纯化步骤后，主要群体是含有Fc(KK)的同型二聚体分子。可以主要通过大 小排阻层析移除这种LMW不纯物并且可以富集正确的异二聚体。
表20：hIgG1 DDKK TCB的产生和纯化总结
Figure BDA0002213187780001491
图93显示hIgG1 DDKK-TCB分子的示意图。
图94和表21显示含有Crossfab片段的hIgG1 DDKK-TCB分子(2+1 Crossfab-IgGP329G LALA)(SEQ ID NO:372、373、374和375)的CE-SDS分析，所 述Crossfab片段具有一个CD3结合部分和两个MCSP结合部分。
表21:hIgG1 DDKK TCB的CE-SDS分析
Figure BDA0002213187780001492
Figure BDA0002213187780001501
实施例29：hIgG1 DDKK TCB与表达MCSP的和表达CD3的细胞的结合
在表达MCSP的人黑素瘤细胞系(MV-3)和表达CD3的永生化T淋巴细胞系 (Jurkat)上测试hIgG1 DDKK TCB的结合作用。简而言之，将细胞收获、计数、检验 存活力并以2x106个细胞/ml重悬在FACS缓冲液(100μl PBS，0.1％BSA)中。将100 μl细胞悬液(含有0.2x106个细胞)在4℃在圆底96孔板中与渐增浓度的hIgG1 DDKK TCB(2pM-170nM)温育30分钟，用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次，在4℃与PE缀 合的亲和纯F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcg片段特异的第二抗体(Jackson Immuno Research Lab PE#109-116-170)再温育另外30分钟，用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次并 且使用FACS CantoII(Software FACS Diva)，立即由FACS分析。使用GraphPad Prism 5，获得结合曲线(图95A，与MV-3细胞结合，EC50＝12803pM；图95B，与Jurkat细胞结合)。
实施例30：hIgG1 DDKK TCB抗体诱导的T细胞杀伤作用
在温育24小时和48小时使用表达MCSP的人黑素瘤肿瘤细胞(MV-3)和人PBMC 评估hIgG1 DDKK TCB抗体介导的T细胞杀伤作用。简而言之，将靶细用胰蛋白酶 /EDTA收获，洗涤并使用平底96孔板以25,000个细胞/孔的密度铺种。任由细胞贴壁 过夜。通过Histopaque密度离心从健康人类供体获得的富集的淋巴细胞制备物(暗黄 覆盖层)，制备外周血单个核细胞(PBMC)。将新鲜血液用无菌PBS稀释并铺在 Histopaque梯度(Sigma，#H8889)上。在离心后(450x g，30分钟，室温)，弃去含有 PBMC的中间层上方的血浆并将PBMC转移入新的falcon管，所述管随后用50ml PBS填充。将混合物离心(400x g，10分钟，室温)，弃去上清液并将PBMC沉淀物 用无菌PBS洗涤两次(离心步骤350x g，10分钟)。自动计数所得的PBMC群(ViCell) 并在细胞培养箱中于37℃，5％CO2贮存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰 胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中，直至进一步使用(不超过24小时)。对 于杀伤测定法，将抗体以所示的浓度添加(范围0.02pM–20nM一式三份)。以最终 E:T比率10:1向靶细胞添加PBMC。在37℃，5％CO2温育24小时和48小时后， 通过借助凋亡/坏死细胞对释放入细胞上清液的乳酸脱氢酶定量(乳酸脱氢酶检测试剂 盒，Roche AppliedScience，#11,644,793,001)，评估靶细胞杀伤作用。通过靶细胞与 1％Triton X-100温育，实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应 细胞共温育、不与双特异性构建体共温育的靶细胞。结果显示hIgG1 DDKK TCB诱 导对MCSP+靶细胞系的强烈和靶特异性杀伤，图96A、B。表22中给出与杀伤测定 法相关的、使用GraphPad Prism 5计算的EC50值。
表22.hIgG1 DDKK TCB抗体诱导的T细胞介导杀伤表达MCSP的肿瘤细胞 (MV-3)的EC50值(pM)。
细胞系 EC<sub>50</sub>[pM]24小时 EC<sub>50</sub>[pM]48小时
MV-3 20.6 7
在所附序列表中提供SEQ ID NO:1-266。
序列
Figure BDA0002213187780001511
Figure BDA0002213187780001531
Figure BDA0002213187780001551
Figure BDA0002213187780001552
Figure BDA0002213187780001561
Figure BDA0002213187780001571
Figure BDA0002213187780001581
Figure BDA0002213187780001591
Figure BDA0002213187780001601
Figure BDA0002213187780001602
Figure BDA0002213187780001611
Figure BDA0002213187780001621
Figure BDA0002213187780001632
Figure BDA0002213187780001641
Figure BDA0002213187780001651
Figure BDA0002213187780001661
Figure BDA0002213187780001671
Figure BDA0002213187780001672
Figure BDA0002213187780001681
Figure BDA0002213187780001691
Figure BDA0002213187780001692
Figure BDA0002213187780001701
Figure BDA0002213187780001702
Figure BDA0002213187780001711
Figure BDA0002213187780001721
Figure BDA0002213187780001731
DNA序列
Figure BDA0002213187780001732
Figure BDA0002213187780001741
Figure BDA0002213187780001751
Figure BDA0002213187780001761
Figure BDA0002213187780001771
Figure BDA0002213187780001781
Figure BDA0002213187780001791
Figure BDA0002213187780001801
Figure BDA0002213187780001811
Figure BDA0002213187780001821
Figure BDA0002213187780001822
Figure BDA0002213187780001831
Figure BDA0002213187780001841
Figure BDA0002213187780001851
Figure BDA0002213187780001861
Figure BDA0002213187780001871
Figure BDA0002213187780001881
Figure BDA0002213187780001891
Figure BDA0002213187780001901
Figure BDA0002213187780001911
Figure BDA0002213187780001921
Figure BDA0002213187780001931
Figure BDA0002213187780001942
Figure BDA0002213187780001951
Figure BDA0002213187780001991
Figure BDA0002213187780001992
Figure BDA0002213187780002011
Figure BDA0002213187780002031
Figure BDA0002213187780002032
Figure BDA0002213187780002041
Figure BDA0002213187780002051
Figure BDA0002213187780002071
虽然已经出于清晰理解的目的，以说明和举例方式某种程度地详细描述了前述发明，但是这些说明和例子不应当解释为限制本发明的范围。本文中援引的全部专利和 科学文献的公开内容通过引用方式明确地完整并入。
序列表
<110> 罗切格利卡特公司
<120> 双特异性T细胞活化抗原结合分子
<130> 31457
<160> 390
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 700
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 (scFab)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
260 265 270
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
275 280 285
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly
290 295 300
Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val
305 310 315 320
Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
325 330 335
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp
340 345 350
Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
370 375 380
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
405 410 415
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
420 425 430
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
435 440 445
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
450 455 460
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
465 470 475 480
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
485 490 495
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
500 505 510
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
515 520 525
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
530 535 540
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
545 550 555 560
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
565 570 575
Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
580 585 590
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg
595 600 605
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly
610 615 620
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
625 630 635 640
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
645 650 655
Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
660 665 670
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
675 680 685
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695 700
<210> 2
<211> 2103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 (scFab)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 2
gacatccaga tgacccagag cccctctagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca ggacatcaga aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac acctctagac tggaaagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggcaacacac tcccctggac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc agcgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gaaagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600
ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gcagcggcgg aggctctgga 660
ggcggctctg aaggcggagg aagtgagggc ggaggctcag aaggcggcgg aagcgaaggt 720
ggcggctctg gcggcggatc cggcgaggtg cagctggtcg agtccggcgg aggcctggtg 780
cagcctggcg gcagcctgag actgagctgc gccgccagcg gctacagctt caccggctac 840
accatgaact gggtccggca ggctcctggc aagggcctcg aatgggtggc cctgatcaac 900
ccctacaagg gcgtgagcac ctacaaccag aagttcaagg accggttcac catcagcgtg 960
gacaagagca agaacaccgc ctatctgcag atgaacagcc tgcgggccga ggacaccgcc 1020
gtgtactact gcgccagaag cggctactac ggcgacagcg actggtactt cgacgtgtgg 1080
ggccagggca cactggtcac cgtgtccagc gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc 1140
ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 1200
gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg 1260
cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc 1320
gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc 1380
aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca 1440
ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 1500
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 1560
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1620
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1680
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1740
ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1800
gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc 1860
gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1920
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg 1980
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 2040
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 2100
tga 2103
<210> 3
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 (VH-CH1)-Fc(结) P329G LALA
<400> 3
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180 185 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu
340 345 350
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 4
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 (VH-CH1)-Fc(结) P329G LALA
<400> 4
gaggtccagc tgcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60
acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120
tttccaggaa acaagctgga atggatgggc tacataacct acgacggtag caataactac 180
aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240
ctgaagttga attctgtgac tactgaggac acagctacat attactgtgc ggactttgac 300
tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc 360
ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 420
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gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac 840
aatgccaaga ccaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 900
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 960
aaagccctcg gcgcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1020
ccacaggtgt acaccctgcc cccatgccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1080
tggtgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1140
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1200
ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1260
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1320
ggtaaataa 1329
<210> 5
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 (VL-CL)
<400> 5
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
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115 120 125
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165 170 175
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180 185 190
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210
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 (VL-CL)
<400> 6
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gatggaactg ttaaactcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg agtcccatca 180
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ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 (scFab)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 7
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
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210 215 220
Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
245 250 255
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val
260 265 270
Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln
275 280 285
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340 345 350
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
355 360 365
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
370 375 380
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
385 390 395 400
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
405 410 415
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
420 425 430
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
435 440 445
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gln Asp Lys Thr
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485 490 495
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515 520 525
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
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545 550 555 560
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
565 570 575
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
580 585 590
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
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660 665 670
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
675 680 685
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695 700
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<211> 2115
<212> DNA
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<220>
<223> LC007 (scFab)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 8
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tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa ggtggagccc 1380
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tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1800
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agcctctcgt gcgcagtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1920
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1980
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tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 2100
tctccgggta aatga 2115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 (VH-CH1) -Fc(结) LALA
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1 5 10 15
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Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
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115 120 125
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130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
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Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gln Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
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370 375 380
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> V9 (VH-CH1) -Fc(结) LALA
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<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 (VL-CL)
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 12
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 (VL-CL)
<400> 12
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
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gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggcaacacac tgccctggac cttcggccag 300
ggcacaaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645
<210> 13
<211> 926
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 (scFab)-LC007 (VH-CH1)-Fc(结) wt
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
260 265 270
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
275 280 285
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly
290 295 300
Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val
305 310 315 320
Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
325 330 335
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp
340 345 350
Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
370 375 380
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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580 585 590
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
595 600 605
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
610 615 620
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
625 630 635 640
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
645 650 655
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
660 665 670
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
675 680 685
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
690 695 700
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
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Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
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Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
755 760 765
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
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Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
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Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
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Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
370 375 380
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
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885 890 895
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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<212> DNA
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<223> LC007 (VH-CH1)-Fc(扣) LALA
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580 585 590
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
595 600 605
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
610 615 620
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
625 630 635 640
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
645 650 655
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
660 665 670
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
675 680 685
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
690 695 700
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
705 710 715 720
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
725 730 735
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
740 745 750
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
755 760 765
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
770 775 780
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
785 790 795 800
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
805 810 815
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
820 825 830
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
835 840 845
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
850 855 860
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
865 870 875 880
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
885 890 895
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
900 905 910
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
915 920 925
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<211> 2781
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 (scFab)-LC007 (VH-CH1)-Fc(结) P329G LALA N297D
<400> 26
gacatccaga tgacccagag cccctctagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca ggacatcaga aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac acctctagac tggaaagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggcaacacac tcccctggac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc agcgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gaaagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600
ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gcagcggcgg aggctctgga 660
ggcggctctg aaggcggagg aagtgagggc ggaggctcag aaggcggcgg aagcgaaggt 720
ggcggctctg gcggcggatc cggcgaggtg cagctggtcg agtccggcgg aggcctggtg 780
cagcctggcg gcagcctgag actgagctgc gccgccagcg gctacagctt caccggctac 840
accatgaact gggtccggca ggctcctggc aagggcctcg aatgggtggc cctgatcaac 900
ccctacaagg gcgtgagcac ctacaaccag aagttcaagg accggttcac catcagcgtg 960
gacaagagca agaacaccgc ctatctgcag atgaacagcc tgcgggccga ggacaccgcc 1020
gtgtactact gcgccagaag cggctactac ggcgacagcg actggtactt cgacgtgtgg 1080
ggccagggca cactggtcac cgtgtccagc gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc 1140
ctggccccca gcagcaagag caccagcggc ggcacagccg ccctcggctg cctggtcaag 1200
gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg 1260
cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc ggcctgtaca gcctgtccag cgtggtcacc 1320
gtgccctcca gcagcctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 1380
aataccaagg tggacaagaa ggtggagccc aagagctgcg acggcggtgg tggctccgga 1440
ggcggtggat ctgaagtgca gctgcaggaa agcggccctg gcctggtcaa gcccagccag 1500
agcctgagcc tgacctgtag cgtgaccggc tactccatca cctccggcta ctactggaat 1560
tggattcggc agttccccgg caacaagctg gaatggatgg gctacatcac ctacgacggc 1620
agcaacaact acaaccccag cctgaagaac cggatcagca tcacccggga caccagcaag 1680
aaccagttct tcctgaagtt gaattctgtg actactgagg acacagctac atattactgt 1740
gcggactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcagc tagcaccaag 1800
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 1860
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 1920
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 1980
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 2040
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 2100
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagctg cagggggacc gtcagtcttc 2160
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 2220
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 2280
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacgacag cacgtaccgt 2340
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 2400
aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 2460
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatgcc gggatgagct gaccaagaac 2520
caggtcagcc tgtggtgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 2580
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 2640
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 2700
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 2760
tccctgtctc cgggtaaatg a 2781
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180 185 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
340 345 350
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
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<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> LC007 (VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA N297D
<400> 28
gaggtccagc tgcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60
acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120
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aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240
ctgaagttga attctgtgac tactgaggac acagctacat attactgtgc ggactttgac 300
tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc 360
ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 420
gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 480
ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 540
gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 600
cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 660
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aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 780
gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 840
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacgacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 900
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 960
aaagccctcg gcgcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1020
ccacaggtgt gcaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctc 1080
tcgtgcgcag tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1140
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1200
ctcgtgagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1260
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1320
ggtaaatga 1329
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<211> 664
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 (VL-CH1)-LC007 (VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
210 215 220
Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr
245 250 255
Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly
260 265 270
Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
275 280 285
Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys
290 295 300
Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Asp
305 310 315 320
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
340 345 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355 360 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370 375 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385 390 395 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
405 410 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
420 425 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
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Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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565 570 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
580 585 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
595 600 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
610 615 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
625 630 635 640
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
645 650 655
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660
<210> 30
<211> 1995
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 (VL-CH1)-LC007 (VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 30
gatatccaga tgacccagag ccccagctct ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca ggacatcaga aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
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<212> PRT
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys Ser Gly
225
<210> 32
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc(结) wt
<400> 32
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
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ctctccctgt ctccgggtaa atccggatga 690
<210> 33
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 (VH-CL)
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro
115 120 125
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
130 135 140
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
145 150 155 160
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
165 170 175
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
195 200 205
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
210 215 220
Asn Arg Gly Glu Cys
225
<210> 34
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 (VH-CL)
<400> 34
gaggtgcagc tggtcgagag cggaggcggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcggcta cagcttcacc ggctacacca tgaactgggt ccggcaggca 120
cctggcaagg gactggaatg ggtggccctg atcaacccct acaagggcgt gagcacctac 180
aaccagaagt tcaaggaccg gttcaccatc agcgtggaca agagcaagaa caccgcctat 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaagcggc 300
tactacggcg acagcgactg gtacttcgac gtgtggggcc agggcaccct cgtgaccgtg 360
tctagcgcta gcgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 420
aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 480
gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag 540
caggacagca aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac 600
tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc 660
acaaagagct tcaacagggg agagtgttga 690
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FN18 (VL-CH1)-LC007 (VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 35
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
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Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Asn Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val
225 230 235 240
Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser
245 250 255
Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn
260 265 270
Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr
275 280 285
Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys
290 295 300
Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala
305 310 315 320
Thr Tyr Tyr Cys Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
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Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
340 345 350
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
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Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
370 375 380
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
385 390 395 400
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
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Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
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Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
450 455 460
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
465 470 475 480
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
485 490 495
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
500 505 510
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
565 570 575
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
580 585 590
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Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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<211> 2013
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FN18 (VL-CH1)-LC007 (VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 36
gacatcgtga tgagccagag ccccagcagc ctggccgtgt ccgtgggcga gaaagtgacc 60
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tggtatcagc agaagcccgg ccagtccccc aagctgctga tcaactgggc cagcacccgc 180
gagagcggcg tgcccgatag attcacaggc agcggcagcc ggaccgactt caccctgacc 240
atcagcagcg tgaaggccga ggatctggcc gtgtacttct gccagcagtt ctacagctac 300
ccccccacct tcggcggagg cacgaagctg gaaatcaaga gcagcgcttc caccaaaggc 360
ccttccgtgt ttcctctggc tcctagctcc aagtccacct ctggaggcac cgctgctctc 420
ggatgcctcg tgaaggatta ttttcctgag cctgtgacag tgtcctggaa tagcggagca 480
ctgacctctg gagtgcatac tttccccgct gtgctgcagt cctctggact gtacagcctg 540
agcagcgtgg tgacagtgcc cagcagcagc ctgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aaccacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaggtgg aacccaagtc ttgtggcgga 660
ggcggatccg gcggaggggg atctgaggtg cagctgcagg aaagcggccc tggcctggtg 720
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tactactgga actggatcag acagttcccc ggcaacaagc tggaatggat gggctacatc 840
acctacgacg gcagcaacaa ctacaacccc agcctgaaga acagaatcag catcacccgg 900
gacaccagca agaaccagtt cttcctgaag ctgaacagcg tgaccaccga ggacaccgcc 960
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gcctctacca agggccccag cgtgttcccc ctggcaccca gcagcaagag cacatctggc 1080
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cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 2013
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<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FN18 (VH-CL)
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Glu Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Thr Ile His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile
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Gly Tyr Phe Asn Pro Ser Ser Glu Ser Thr Glu Tyr Asn Arg Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Thr Ile Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Arg Lys Gly Glu Lys Leu Leu Gly Asn Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala
115 120 125
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
130 135 140
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
145 150 155 160
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
165 170 175
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
195 200 205
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
210 215 220
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 38
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FN18 (VH-CL)
<400> 38
caggtgcagc tgcagcagag cgaggccgag ctggctagac ctggagccag cgtgaagatg 60
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gagaagctgc tgggcaacag atactggtac ttcgacgtgt ggggagccgg caccagcgtg 360
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 2C11 (VL-CH1)-LC007 (VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Asn Lys Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Ser Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
210 215 220
Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr
245 250 255
Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly
260 265 270
Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
275 280 285
Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys
290 295 300
Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Asp
305 310 315 320
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
340 345 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355 360 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
370 375 380
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
385 390 395 400
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
405 410 415
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
420 425 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515 520 525
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595 600 605
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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660
<210> 40
<211> 1995
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C11 (VL-CH1)-LC007 (VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 40
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgcctgcca gcctgggcga cagagtgacc 60
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gaggacatcg gcagctacta ctgccagcag tactacaact acccctggac cttcggccct 300
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Lys
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35 40 45
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100 105 110
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115 120 125
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145 150 155 160
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
165 170 175
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
180 185 190
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
195 200 205
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 42
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 2C11 (VH-CL)
<400> 42
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ccggcaagag cctgaagctg 60
agctgcgagg ccagcggctt caccttcagc ggctacggca tgcactgggt gagacaggcc 120
cctggcagag gactggaaag cgtggcctac atcaccagca gcagcatcaa cattaagtac 180
gccgacgccg tgaagggccg gttcaccgtg tccagggata acgccaagaa cctgctgttc 240
ctgcagatga acatcctgaa gtccgaggac accgctatgt attactgcgc cagattcgac 300
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gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 420
gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 480
aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 540
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<210> 43
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<212> PRT
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<220>
<223> V9 (scFab)-Fc(结) P329G LALA
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1 5 10 15
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
260 265 270
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
275 280 285
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly
290 295 300
Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val
305 310 315 320
Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
325 330 335
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp
340 345 350
Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
370 375 380
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
405 410 415
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
420 425 430
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
435 440 445
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
450 455 460
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
465 470 475 480
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
485 490 495
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
500 505 510
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
515 520 525
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
530 535 540
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
545 550 555 560
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
565 570 575
Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
580 585 590
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg
595 600 605
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
610 615 620
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
625 630 635 640
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
645 650 655
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
660 665 670
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
675 680 685
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695 700
<210> 44
<211> 2103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 (scFab)-Fc(结) P329G LALA
<400> 44
gacatccaga tgacccagag cccctctagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca ggacatcaga aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac acctctagac tggaaagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggcaacacac tcccctggac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc agcgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gaaagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600
ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gcagcggcgg aggctctgga 660
ggcggctctg aaggcggagg aagtgagggc ggaggctcag aaggcggcgg aagcgaaggt 720
ggcggctctg gcggcggatc cggcgaggtg cagctggtcg agtccggcgg aggcctggtg 780
cagcctggcg gcagcctgag actgagctgc gccgccagcg gctacagctt caccggctac 840
accatgaact gggtccggca ggctcctggc aagggcctcg aatgggtggc cctgatcaac 900
ccctacaagg gcgtgagcac ctacaaccag aagttcaagg accggttcac catcagcgtg 960
gacaagagca agaacaccgc ctatctgcag atgaacagcc tgcgggccga ggacaccgcc 1020
gtgtactact gcgccagaag cggctactac ggcgacagcg actggtactt cgacgtgtgg 1080
ggccagggca cactggtcac cgtgtccagc gctagcacca agggccctag cgtgttccct 1140
ctggccccta gcagcaagag cacaagtgga ggaacagccg ccctgggctg cctggtcaag 1200
gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc tggaattctg gcgccctgac aagcggcgtg 1260
cacacatttc cagccgtgct gcagagcagc ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgacc 1320
gtgccctcta gctctctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 1380
aacaccaaag tggacaagaa ggtggaaccc aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc 1440
ccttgccctg cccctgaagc tgctggtggc ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc 1500
aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc gaagtgacct gcgtggtggt cgatgtgtcc 1560
cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaatgcc 1620
aagaccaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1680
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1740
ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1800
gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgtggtgc 1860
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agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 2040
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 2100
taa 2103
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<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 (VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
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Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 (VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 46
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
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gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagactatcc 300
ccaggcggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
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ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
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cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1353
<210> 47
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 (VL-CL)
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 48
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 (VL-CL)
<400> 48
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
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accaagctcg agatcaagcg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360
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<210> 49
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 (scFab)-Fc(结) P329G LALA
<400> 49
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
245 250 255
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
260 265 270
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro
275 280 285
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr
290 295 300
Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp
305 310 315 320
Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
325 330 335
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr
340 345 350
Val Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
355 360 365
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
370 375 380
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
385 390 395 400
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
405 410 415
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
420 425 430
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
435 440 445
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
450 455 460
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
465 470 475 480
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
485 490 495
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
500 505 510
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
515 520 525
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
530 535 540
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
545 550 555 560
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
565 570 575
Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
580 585 590
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu
595 600 605
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
610 615 620
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
625 630 635 640
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
645 650 655
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
660 665 670
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
675 680 685
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695
<210> 50
<211> 2094
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 (scFab)-Fc(结) P329G LALA
<400> 50
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gggcattaac aattacttaa attggtacca gcagaagcca 120
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aggttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag cataatagtt ttcccacgtt tggccagggc 300
accaagctcg agatcaagcg tacggtggcc gctcccagcg tgttcatctt cccccccagc 360
gacgagcagc tgaaatctgg caccgccagc gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 420
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ggctctggcg gcggatccgg ccaggtgcag ctggtgcagt ctggggctga ggtgaagaag 780
cctgggtcct cggtgaaggt ctcctgcaag gcctctggtt tcacattcac tgactacaag 840
atacactggg tgcgacaggc ccctggacaa gggctcgagt ggatgggata tttcaaccct 900
aacagcggtt atagtaccta cgcacagaag ttccagggca gggtcaccat taccgcggac 960
aaatccacga gcacagccta catggagctg agcagcctga gatctgagga cacggccgtg 1020
tattactgtg cgagactatc cccaggcggt tactatgtta tggatgcctg gggccaaggg 1080
accaccgtga ccgtctcctc agctagcacc aagggcccta gcgtgttccc tctggcccct 1140
agcagcaaga gcacaagtgg aggaacagcc gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 1200
cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaattct ggcgccctga caagcggcgt gcacacattt 1260
ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac tctctgagca gcgtcgtgac cgtgccctct 1320
agctctctgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaacc acaagcccag caacaccaaa 1380
gtggacaaga aggtggaacc caagagctgc gacaagaccc acacctgtcc cccttgccct 1440
gcccctgaag ctgctggtgg cccttccgtg ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc 1500
ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc tgcgtggtgg tcgatgtgtc ccacgaggac 1560
cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaatgc caagaccaag 1620
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1680
caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc 1740
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1800
ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa 1860
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1920
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1980
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 2040
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa ataa 2094
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> V9 (VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
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210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
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ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaagcggc 300
tactacggcg acagcgactg gtacttcgac gtgtggggcc agggcaccct cgtgaccgtg 360
tctagcgcta gcaccaaggg cccctccgtg ttccccctgg cccccagcag caagagcacc 420
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acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
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atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt gcaccctgcc cccatcccgg 1080
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tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 1359
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<213> 人工序列
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
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Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
260 265 270
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
275 280 285
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly
290 295 300
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Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
325 330 335
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp
340 345 350
Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
370 375 380
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
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Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
435 440 445
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Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
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Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
545 550 555 560
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
565 570 575
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp
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Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
595 600 605
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
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Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
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Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
660 665 670
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
675 680 685
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Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
740 745 750
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
755 760 765
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Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
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Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
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gacatccaga tgacccagag cccctctagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
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gtgccctcca gcagcctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 1380
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gtgaccgtgt cctggaacag cggagccctg acctccggcg tgcacacctt ccccgccgtg 1980
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ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 2100
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<223> 3F2 (scFab)-Fc(结) P329G LALA
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
260 265 270
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
275 280 285
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser
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Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
305 310 315 320
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
325 330 335
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn
340 345 350
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
355 360 365
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
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Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
385 390 395 400
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
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Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
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Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
435 440 445
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
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Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
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Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
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Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
530 535 540
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
545 550 555 560
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
565 570 575
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
580 585 590
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
595 600 605
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Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
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660 665 670
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
675 680 685
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690
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<211> 2085
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 (scFab)-Fc(结) P329G LALA
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gagatcgtgc tgacacagag ccccggaacc ctgtctctga gccctggcga aagagccacc 60
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tattattgcg ccaagggatg gttcggcggc ttcaactatt ggggccaggg aaccctggtc 1080
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ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcggcgc ccccatcgag 1740
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1800
tgccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat 1860
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1920
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1980
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 2040
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aataa 2085
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 57
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
260 265 270
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
275 280 285
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly
290 295 300
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305 310 315 320
Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
325 330 335
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp
340 345 350
Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
370 375 380
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
405 410 415
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
420 425 430
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
485 490 495
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500 505 510
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530 535 540
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
545 550 555 560
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565 570 575
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
645 650 655
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
660 665 670
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
675 680 685
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
725 730 735
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Pro Gly Lys
930
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ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac acctctagac tggaaagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggcaacacac tcccctggac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc agcgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
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ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gcagcggcgg aggctctgga 660
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accatgaact gggtccggca ggctcctggc aagggcctcg aatgggtggc cctgatcaac 900
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gacaagagca agaacaccgc ctatctgcag atgaacagcc tgcgggccga ggacaccgcc 1020
gtgtactact gcgccagaag cggctactac ggcgacagcg actggtactt cgacgtgtgg 1080
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gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg 1260
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cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 2160
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 2220
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 2280
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tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atgccgggat 2520
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acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 2796
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 (VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 59
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
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Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<220>
<223> 3F2 (VL-CL)
<400> 61
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
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Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
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Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 (VL-CL)
<400> 62
gagatcgtgc tgacccagtc tcccggcacc ctgagcctga gccctggcga gagagccacc 60
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<211> 673
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<223> CH1A1A (VH-CH1)- V9 (VL-CH1)-Fc(结) P329G LALA
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
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Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
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Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
225 230 235 240
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
245 250 255
Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
260 265 270
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu
275 280 285
Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
290 295 300
Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
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Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
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Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
340 345 350
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
355 360 365
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
385 390 395 400
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
405 410 415
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
420 425 430
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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645 650 655
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
660 665 670
Lys
<210> 64
<211> 2022
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A (VH-CH1)- V9 (VL-CH1)-Fc(结) P329G LALA
<400> 64
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gagttcggca tgaactgggt ccgacaggcc 120
cctggacagg gcctggaatg gatgggctgg atcaacacca agaccggcga ggccacctac 180
gtggaagagt tcaagggcag agtgaccttc accaccgaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagatgggac 300
ttcgcctact atgtggaagc catggactac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtct 360
agtgctagca caaagggccc cagcgtgttc cctctggccc ctagcagcaa gagcacatct 420
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact ttcccgagcc cgtgacagtg 480
tcctggaact ctggcgccct gacaagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 540
agcggcctgt actctctgag cagcgtggtc accgtgccta gctctagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 660
cccaagagct gcggcggagg cggatccgga ggcggaggat ctgatatcca gatgacccag 720
agccccagca gcctgtctgc cagcgtgggc gacagagtga ccattacctg cagagccagc 780
caggacatca gaaactacct gaactggtat cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagctg 840
ctgatctact acaccagcag actggaatcc ggcgtgccca gcagattttc cggcagcggc 900
tctggcaccg actacaccct gacaatcagc agcctgcagc ccgaggactt cgccacctac 960
tactgccagc agggcaacac cctgccctgg acatttggac agggcacaaa ggtggaaatc 1020
aagagcagcg cctccaccaa gggcccttcc gtgtttccac tggcccccag ctctaagagc 1080
accagcggag gaacagctgc tctgggatgt ctcgtgaagg attacttccc cgaacctgtg 1140
accgtcagct ggaacagcgg cgctctgaca tctggggtgc acacattccc cgctgtcctg 1200
cagtcctccg gcctgtacag tctgtccagc gtcgtgacag tgcctagcag ctccctggga 1260
acacagacat atatctgtaa tgtcaatcac aagccctcta ataccaaggt cgacaaaaaa 1320
gtcgagccca agtcctgcga caagacccac acctgtcccc cttgtcctgc ccctgaagct 1380
gctggcggcc cttctgtgtt cctgttcccc ccaaagccca aggacaccct gatgatcagc 1440
cggacccccg aagtgacctg cgtggtggtg gatgtgtccc acgaggaccc tgaagtgaag 1500
ttcaattggt acgtggacgg cgtggaagtg cacaacgcca agacaaagcc gcgggaggag 1560
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1620
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcggcgcccc catcgagaaa 1680
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatgc 1740
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc 1800
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1860
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1920
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1980
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 2022
<210> 65
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A (VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 66
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A (VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 66
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggagctag tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gagttcggca tgaactgggt ccgacaggct 120
ccaggccagg gcctcgaatg gatgggctgg atcaacacca agaccggcga ggccacctac 180
gtggaagagt tcaagggcag agtgaccttc accacggaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagatgggac 300
ttcgcctatt acgtggaagc catggactac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtct 360
agcgctagca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggcacag ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaaca gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagt 540
tctggcctgt atagcctgag cagcgtggtc accgtgcctt ctagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctctcg tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1356
<210> 67
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A (VL-CL)
<400> 67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 68
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A (VL-CL)
<400> 68
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtgc ggctgtgggt acgtatgttg cgtggtatca gcagaaacca 120
gggaaagcac ctaagctcct gatctattcg gcatcctacc gcaaaagggg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagatttcg caacttacta ctgtcaccaa tattacacct atcctctatt cacgtttggc 300
cagggcacca agctcgagat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 648
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 HCDR1
<400> 69
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn
1 5 10
<210> 70
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 HCDR1
<400> 70
ggctactcca tcaccagtgg ttattactgg aac 33
<210> 71
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 HCDR2
<400> 71
Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
<210> 72
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 HCDR2
<400> 72
tacataacct acgacggtag caataactac aacccatctc tcaaaaat 48
<210> 73
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 HCDR3
<400> 73
Phe Asp Tyr
1
<210> 74
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 HCDR3
<400> 74
tttgactac 9
<210> 75
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 VH
<400> 75
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 76
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 VH
<400> 76
gaggtccagc tgcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60
acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120
tttccaggaa acaagctgga atggatgggc tacataacct acgacggtag caataactac 180
aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240
ctgaagttga attctgtgac tactgaggac acagctacat attactgtgc ggactttgac 300
tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 336
<210> 77
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 LCDR1
<400> 77
Ser Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 78
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 LCDR1
<400> 78
agtgcaagtc agggcattag aaattattta aac 33
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 LCDR2
<400> 79
Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 LCDR2
<400> 80
tacacatcaa gtttacactc a 21
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 LCDR3
<400> 81
Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 82
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 LCDR3
<400> 82
cagcagtata gtaagcttcc ttggacg 27
<210> 83
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 VL
<400> 83
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 84
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007 VL
<400> 84
gatattgtgc tcacacagtc tccatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gtgcaagtca gggcattaga aattatttaa actggtatca gcagagacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240
gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccttggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 85
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 HCDR1
<400> 85
Asp Tyr Lys Ile His
1 5
<210> 86
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 HCDR1
<400> 86
gactacaaga tacac 15
<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 HCDR2
<400> 87
Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 88
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 HCDR2
<400> 88
tatttcaacc ctaacagcgg ttatagtacc tacgcacaga agttccaggg c 51
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 HCDR3
<400> 89
Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala
1 5 10
<210> 90
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 HCDR3
<400> 90
ctatccccag gcggttacta tgttatggat gcc 33
<210> 91
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 VH
<400> 91
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 92
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 VH
<400> 92
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctctggttt cacattcact gactacaaga tacactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggatat ttcaacccta acagcggtta tagtacctac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagactatcc 300
ccaggcggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360
<210> 93
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 LCDR1
<400> 93
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 94
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 LCDR1
<400> 94
cgggcaagtc agggcattaa caattactta aat 33
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 LCDR2
<400> 95
Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr
1 5
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 LCDR2
<400> 96
aataccaaca acttgcagac a 21
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 LCDR3
<400> 97
Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr
1 5
<210> 98
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 LCDR3
<400> 98
ttgcagcata atagttttcc cacg 24
<210> 99
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 VL
<400> 99
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 100
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GA201 VL
<400> 100
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60
atcacctgcc gggcaagtca gggcattaac aattacttaa attggtacca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctataat accaacaact tgcagacagg cgtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag cataatagtt ttcccacgtt tggccagggc 300
accaagctcg agatcaag 318
<210> 101
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 HCDR1
<400> 101
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 102
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 HCDR1
<400> 102
agctacgcca tgagc 15
<210> 103
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 HCDR2
<400> 103
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 104
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 HCDR2
<400> 104
gccatctccg gcagcggagg cagcacctac tacgccgaca gcgtgaag 48
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 HCDR3
<400> 105
Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Phe Gly
1 5
<210> 106
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 HCDR3
<400> 106
tattgcgcca agggatggtt cggc 24
<210> 107
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 VH
<400> 107
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 108
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 VH
<400> 108
gaggtgcagc tgctggaatc tggaggcggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgacaggct 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atctccggca gcggaggcag cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agcagagaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggat accgccgtgt attattgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggccaggga accctggtga cagtgtccag c 351
<210> 109
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 LCDR1
<400> 109
Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu
1 5 10
<210> 110
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 LCDR1
<400> 110
agagccagcc agagcgtgac cagcagctac ctg 33
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 LCDR2
<400> 111
Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala
1 5
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 LCDR2
<400> 112
aacgtgggca gcagacgggc c 21
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 LCDR3
<400> 113
Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro
1 5
<210> 114
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 LCDR3
<400> 114
tgccagcagg gcatcatgct gcccccc 27
<210> 115
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 VL
<400> 115
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 116
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3F2 VL
<400> 116
gagatcgtgc tgacccagtc tcccggcacc ctgagcctga gccctggcga gagagccacc 60
ctgagctgca gagccagcca gagcgtgacc agcagctacc tggcctggta tcagcagaag 120
cccggccagg cccccagact gctgatcaac gtgggcagca gacgggccac cggcatcccc 180
gatagattca gcggcagcgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatcag ccggctggaa 240
cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagggcatca tgctgccccc caccttcggc 300
cagggcacca aggtggaaat caag 324
<210> 117
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A HCDR1
<400> 117
Glu Phe Gly Met Asn
1 5
<210> 118
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A HCDR1
<400> 118
gagttcggca tgaac 15
<210> 119
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A HCDR2
<400> 119
Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 120
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A HCDR2
<400> 120
tggatcaaca ccaagaccgg cgaggccacc tacgtggaag agttcaaggg c 51
<210> 121
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A HCDR3
<400> 121
Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 122
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A HCDR3
<400> 122
tgggacttcg cctattacgt ggaagccatg gactac 36
<210> 123
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A VH
<400> 123
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 124
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A VH
<400> 124
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggagctag tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gagttcggca tgaactgggt ccgacaggct 120
ccaggccagg gcctcgaatg gatgggctgg atcaacacca agaccggcga ggccacctac 180
gtggaagagt tcaagggcag agtgaccttc accacggaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagatgggac 300
ttcgcctatt acgtggaagc catggactac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtct 360
agc 363
<210> 125
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A LCDR1
<400> 125
Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 126
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A LCDR1
<400> 126
aaggccagtg cggctgtggg tacgtatgtt gcg 33
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A LCDR2
<400> 127
Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg
1 5
<210> 128
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A LCDR2
<400> 128
tcggcatcct accgcaaaag g 21
<210> 129
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A LCDR3
<400> 129
His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr
1 5 10
<210> 130
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A LCDR3
<400> 130
caccaatatt acacctatcc tctattcacg 30
<210> 131
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A VL
<400> 131
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 132
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A VL
<400> 132
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtgc ggctgtgggt acgtatgttg cgtggtatca gcagaaacca 120
gggaaagcac ctaagctcct gatctattcg gcatcctacc gcaaaagggg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagatttcg caacttacta ctgtcaccaa tattacacct atcctctatt cacgtttggc 300
cagggcacca agctcgagat caag 324
<210> 133
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 HCDR1
<400> 133
Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser Asn Ile His
1 5 10
<210> 134
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 HCDR1
<400> 134
ggctacacca tcaccgacag caacatccac 30
<210> 135
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 HCDR2
<400> 135
Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln
1 5 10
<210> 136
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 HCDR2
<400> 136
tacatctacc cctacaacgg cggcaccgac tacaaccag 39
<210> 137
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 HCDR3
<400> 137
Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr
1 5
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 HCDR3
<400> 138
ggcaacccct ggctggccta t 21
<210> 139
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 VH
<400> 139
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 140
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 VH
<400> 140
gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ccggcagcag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccatcacc gacagcaaca tccactgggt ccgacaggcc 120
cctgggcaga gcctggaatg gatcggctac atctacccct acaacggcgg caccgactac 180
aaccagaagt tcaagaaccg ggccaccctg accgtggaca accccaccaa caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccttct actactgcgt gaacggcaac 300
ccctggctgg cctattgggg ccagggaacc ctggtcaccg tgtctagc 348
<210> 141
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 LCDR1
<400> 141
Arg Ala Ser Glu Ser Leu Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe Leu Thr
1 5 10 15
<210> 142
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 LCDR1
<400> 142
cgggccagcg agagcctgga caactacggc atccggtttc tgacc 45
<210> 143
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 LCDR2
<400> 143
Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser
1 5
<210> 144
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 LCDR2
<400> 144
gccgccagca accagggcag c 21
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 LCDR3
<400> 145
Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Ser
1 5
<210> 146
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 LCDR3
<400> 146
cagcagacca aagaggtgcc ctggtcc 27
<210> 147
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 VL
<400> 147
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Met Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys
100 105 110
<210> 148
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33 VL
<400> 148
gacatccagc tgacccagag ccccagcacc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcga gagcctggac aactacggca tccggtttct gacctggttc 120
cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagctg ctgatgtacg ccgccagcaa ccagggcagc 180
ggcgtgccaa gcagattcag cggcagcggc tccggcaccg agttcaccct gaccatcagc 240
agcctgcagc ccgacgactt cgccacctac tactgccagc agaccaaaga ggtgccctgg 300
tccttcggcc agggcaccaa ggtggaagtg aag 333
<210> 149
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 149
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 150
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 150
Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 151
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 151
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 152
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 152
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 153
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 153
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly
<210> 154
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导序列1
<400> 154
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 155
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导序列1
<400> 155
atggactgga cctggagaat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc 57
<210> 156
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导序列1
<400> 156
atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc 57
<210> 157
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导序列2
<400> 157
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys
20
<210> 158
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导序列2
<400> 158
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg ggcctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc 60
aggtgt 66
<210> 159
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导序列3
<400> 159
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 160
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导序列3
<400> 160
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcc 57
<210> 161
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导序列3
<400> 161
atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggctaccg ccactggagt gcattcc 57
<210> 162
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导序列3
<400> 162
atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtcgccacag ccaccggcgt gcactct 57
<210> 163
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 HCDR1
<400> 163
Gly Tyr Thr Met Asn
1 5
<210> 164
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 HCDR1
<400> 164
ggctacacca tgaac 15
<210> 165
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 HCDR2
<400> 165
Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 166
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 HCDR2
<400> 166
ctgatcaacc cctacaaggg cgtgagcacc tacaaccaga agttcaagga c 51
<210> 167
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 HCDR3
<400> 167
Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 168
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 HCDR3
<400> 168
agcggctact acggcgacag cgactggtac ttcgacgtg 39
<210> 169
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 VH
<400> 169
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 170
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 VH
<400> 170
gaggtgcagc tggtcgagtc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcggcta cagcttcacc ggctacacca tgaactgggt ccggcaggct 120
cctggcaagg gcctcgaatg ggtggccctg atcaacccct acaagggcgt gagcacctac 180
aaccagaagt tcaaggaccg gttcaccatc agcgtggaca agagcaagaa caccgcctat 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaagcggc 300
tactacggcg acagcgactg gtacttcgac gtgtggggcc agggcacact ggtcaccgtg 360
tccagc 366
<210> 171
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 LCDR1
<400> 171
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 172
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 LCDR1
<400> 172
cgggccagcc aggacatcag aaactacctg aac 33
<210> 173
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 LCDR2
<400> 173
Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser
1 5
<210> 174
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 LCDR2
<400> 174
tacacctcta gactggaaag c 21
<210> 175
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 LCDR3
<400> 175
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 176
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 LCDR3
<400> 176
cagcagggca acacactccc ctggacc 27
<210> 177
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 VL
<400> 177
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 178
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9 VL
<400> 178
gacatccaga tgacccagag cccctctagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca ggacatcaga aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac acctctagac tggaaagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggcaacacac tcccctggac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321
<210> 179
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VH-CL)-LC007(VL-CL)
<400> 179
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro
115 120 125
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
130 135 140
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
145 150 155 160
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
165 170 175
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
195 200 205
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
210 215 220
Asn Arg Gly Glu Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
245 250 255
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
260 265 270
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
275 280 285
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
290 295 300
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
305 310 315 320
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp
325 330 335
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
340 345 350
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
355 360 365
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
370 375 380
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
385 390 395 400
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
405 410 415
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
420 425 430
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
435 440 445
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
450
<210> 180
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VH-CL)-LC007(VL-CL)
<400> 180
gaggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggcta cagcttcacc ggctacacca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtggccctg atcaacccct acaagggcgt gtccacctac 180
aaccagaagt tcaaggaccg gttcaccatc agcgtggaca agagcaagaa caccgcctac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaagcggc 300
tactacggcg acagcgactg gtacttcgac gtgtggggcc agggcacact cgtgaccgtg 360
tcaagcgcta gcgtggccgc tcccagcgtg ttcatcttcc cacctagcga cgagcagctg 420
aagtccggca cagcctctgt cgtgtgcctg ctgaacaact tctacccccg cgaggccaag 480
gtgcagtgga aggtggacaa tgccctgcag agcggcaaca gccaggaaag cgtgaccgag 540
caggacagca aggatagcac ctacagcctg agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac 600
tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgaa gtgacccacc agggcctgtc tagccccgtg 660
accaagagct tcaaccgggg cgagtgtgat ggcggaggcg gatccggggg aggcggctct 720
gatattgtgc tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcct ctctgggcga cagagtgacc 780
atcagctgta gcgcctctca gggcatccgg aactacctga actggtatca gcagcggccc 840
gacggcaccg tgaagctgct gatctactac accagctccc tgcactccgg cgtgcccagc 900
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac tactccctga ccatctccaa cctggaaccc 960
gaggatatcg ccacctacta ctgccagcag tactccaagc tgccctggac ctttggaggc 1020
ggcaccaagc tggaaatcaa gcgtacggtg gctgccccct ccgtgtttat ctttccccca 1080
tccgatgaac agctgaaaag cggcaccgcc agcgtcgtgt gtctgctgaa caatttttac 1140
cctagggaag ctaaagtgca gtggaaagtg gataacgcac tgcagtccgg caactcccag 1200
gaatctgtga cagaacagga ctctaaggac agcacatact ccctgtcctc caccctgaca 1260
ctgtctaagg ctgattatga gaaacacaaa gtgtatgctt gtgaagtgac acatcaggga 1320
ctgagcagcc ctgtgacaaa gtccttcaac agaggcgagt gc 1362
<210> 181
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc(结) P329G LALA
<400> 181
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 182
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc(结) P329G LALA
<400> 182
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 183
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)
<400> 183
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys
210
<210> 184
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)
<400> 184
gatattcaga tgacccagag ccccagctct ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca ggacatcaga aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac accagcagac tggaaagcgg cgtgccctcc 180
agattttccg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggatttcg ccacatatta ctgccagcag ggcaataccc tgccctggac cttcggacag 300
ggcacaaaag tggaaatcaa gagcagcgct tccaccaaag gcccttccgt gtttcctctg 360
gctcctagct ccaagtccac ctctggaggc accgctgctc tcggatgcct cgtgaaggat 420
tattttcctg agcctgtgac agtgtcctgg aatagcggag cactgacctc tggagtgcat 480
actttccccg ctgtgctgca gtcctctgga ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgacagtg 540
cccagcagca gcctgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac 600
accaaggtgg acaagaaggt ggaacccaag tcttgt 636
<210> 185
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VH-CL)-Fc(结) P329G LALA
<400> 185
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro
115 120 125
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
130 135 140
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
145 150 155 160
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
165 170 175
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
195 200 205
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
210 215 220
Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 186
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VH-CL)-Fc(结) P329G LALA
<400> 186
gaggtgcagc tggtcgagag cggaggcggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcggcta cagcttcacc ggctacacca tgaactgggt ccggcaggca 120
cctggcaagg gactggaatg ggtggccctg atcaacccct acaagggcgt gagcacctac 180
aaccagaagt tcaaggaccg gttcaccatc agcgtggaca agagcaagaa caccgcctat 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaagcggc 300
tactacggcg acagcgactg gtacttcgac gtgtggggcc agggcaccct cgtgaccgtg 360
tctagcgcta gcgtggccgc tccctccgtg tttatctttc ccccatccga tgaacagctg 420
aaaagcggca ccgcctccgt cgtgtgtctg ctgaacaatt tttaccctag ggaagctaaa 480
gtgcagtgga aagtggataa cgcactgcag tccggcaact cccaggaatc tgtgacagaa 540
caggactcca aggacagcac ctactccctg tcctccaccc tgacactgtc taaggctgat 600
tatgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc 660
acaaagagct tcaacagggg agagtgtgac aagacccaca cctgtccccc ttgtcctgcc 720
cctgaagctg ctggcggccc ttctgtgttc ctgttccccc caaagcccaa ggacaccctg 780
atgatcagcc ggacccccga agtgacctgc gtggtggtgg atgtgtccca cgaggaccct 840
gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gacaaagccg 900
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc 1020
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080
cccccatgcc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgtggtgcct ggtcaaaggc 1140
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1260
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1368
<210> 187
<211> 682
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007(VH-CH1)-V9(VH-CL)-Fc(结) P329G LALA
<400> 187
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180 185 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
225 230 235 240
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
245 250 255
Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
260 265 270
Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr
290 295 300
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
305 310 315 320
Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp
325 330 335
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala
340 345 350
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
355 360 365
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
370 375 380
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
385 390 395 400
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
405 410 415
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
420 425 430
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
435 440 445
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
450 455 460
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
465 470 475 480
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
485 490 495
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
500 505 510
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
565 570 575
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu
580 585 590
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595 600 605
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
645 650 655
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
660 665 670
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680
<210> 188
<211> 2046
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007(VH-CH1)- V9(VH-CL)-Fc(结) P329G LALA
<400> 188
gaggtgcagc tgcaggaatc tggccctggc ctggtcaagc caagccagag tctgagcctg 60
acctgcagcg tgaccggcta cagcattacc agcggctact actggaactg gattcggcag 120
ttccccggca ataagctgga atggatgggc tacatcacct acgacggcag caacaactac 180
aaccccagcc tgaagaaccg gatcagcatc acccgggaca ccagcaagaa ccagttcttc 240
ctgaagctga acagcgtgac caccgaggac accgccacat actattgcgc cgacttcgac 300
tactggggcc agggcaccac cctgaccgtg tccagcgcca gcacaaaggg ccctagcgtg 360
ttccctctgg cccccagcag caagagcaca agcggcggaa cagccgccct gggctgcctc 420
gtgaaggact acttccccga gcccgtgaca gtgtcttgga acagcggagc cctgacaagc 480
ggcgtgcaca ccttccctgc cgtgctgcag agcagcggcc tgtactccct gagcagcgtg 540
gtcaccgtgc ctagcagcag cctgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag 600
cccagcaaca ccaaagtgga caagaaggtg gagcccaaga gctgtgatgg cggaggaggg 660
tccggaggcg gaggatccga agtgcagctg gtggaatctg gcggaggcct ggtgcagcct 720
ggcggatctc tgagactgag ctgtgccgcc agcggctaca gcttcaccgg ctacaccatg 780
aactgggtgc gccaggcccc tggcaaggga ctggaatggg tggccctgat caacccctac 840
aagggcgtgt ccacatacaa ccagaagttc aaggaccggt tcaccatcag cgtggacaag 900
agcaagaaca ccgcctacct gcagatgaac agcctgcggg ccgaggacac cgccgtgtac 960
tattgtgcca gaagcggcta ctacggcgac agcgactggt acttcgacgt gtggggccag 1020
ggcacactcg tgaccgtgtc aagcgctagc gtggccgctc cctccgtgtt tatctttccc 1080
ccatccgatg aacagctgaa aagcggcacc gcctccgtcg tgtgtctgct gaacaatttt 1140
taccctaggg aagctaaagt gcagtggaaa gtggataacg cactgcagtc cggcaactcc 1200
caggaatctg tgacagaaca ggactccaag gacagcacct actccctgtc ctccaccctg 1260
acactgtcta aggctgatta tgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 1320
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgtgacaa gacccacacc 1380
tgtccccctt gtcctgcccc tgaagctgct ggcggccctt ctgtgttcct gttcccccca 1440
aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat 1500
gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac 1560
aacgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1620
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1680
aaagccctcg gcgcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1740
ccacaggtgt acaccctgcc cccatgccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1800
tggtgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1860
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1920
ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1980
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 2040
ggtaaa 2046
<210> 189
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2(VL-CL)
<400> 189
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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115 120 125
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210
<210> 190
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2(VL-CL)
<400> 190
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<210> 191
<211> 664
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)-M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(结) P329G LALA
<400> 191
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
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340 345 350
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
355 360 365
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
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His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
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420 425 430
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
435 440 445
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
450 455 460
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
465 470 475 480
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
485 490 495
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
500 505 510
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
515 520 525
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
530 535 540
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
565 570 575
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
580 585 590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
595 600 605
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
610 615 620
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
645 650 655
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660
<210> 192
<211> 1992
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)-M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(结) P329G LALA (DNA)
<400> 192
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 193
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180 185 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
340 345 350
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
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385 390 395 400
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 194
<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 194
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
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caccccggca agggcctgga atggatcggc tacatcacct acgacggcag caacaactac 180
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ctgaagctgt ccagcgtgac agccgccgac accgccgtgt actactgcgc cgacttcgac 300
tactggggcc agggcaccct ggtcaccgtg tccagcgcta gcaccaaggg cccctccgtg 360
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cccagcaaca ccaaggtgga caagaaggtg gagcccaaga gctgcgacaa aactcacaca 660
tgcccaccgt gcccagcacc tgaagctgca gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 720
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 780
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ggtaaa 1326
<210> 195
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VH-CL)-M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(结) P329G LALA
<400> 195
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro
115 120 125
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
130 135 140
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
145 150 155 160
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
165 170 175
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
195 200 205
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
210 215 220
Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
225 230 235 240
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr
245 250 255
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly Tyr
260 265 270
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
275 280 285
Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
290 295 300
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
305 310 315 320
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
325 330 335
Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
340 345 350
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355 360 365
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
370 375 380
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
385 390 395 400
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
405 410 415
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
420 425 430
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435 440 445
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
450 455 460
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
465 470 475 480
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
485 490 495
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
500 505 510
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
515 520 525
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580 585 590
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<210> 196
<211> 2043
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VH-CL)-M4-3 ML2(VH-CH1)-Fc(结) P329G LALA (DNA)
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ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaagcggc 300
tactacggcg acagcgactg gtacttcgac gtgtggggcc agggcaccct cgtgaccgtg 360
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aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 480
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caggacagca aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac 600
tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc 660
acaaagagct tcaacagggg agagtgtggc ggaggcggat ccggcggagg gggatctcag 720
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tgcaccgtgt ccggcggcag catcaccagc ggctactact ggaactggat tcggcagcac 840
cccggcaagg gcctggaatg gatcggctac atcacctacg acggcagcaa caactacaac 900
cccagcctga agtccagagt gaccatcagc cgggacacca gcaagaacca gttcagcctg 960
aagctgtcca gcgtgacagc cgccgacacc gccgtgtact actgcgccga cttcgactac 1020
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cccctggcac ccagcagcaa gagcacatct ggcggaacag ccgctctggg ctgtctggtg 1140
aaagactact tccccgagcc cgtgaccgtg tcttggaact ctggcgccct gaccagcggc 1200
gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc agcggcctgt actccctgtc ctccgtggtc 1260
accgtgccct ctagctccct gggaacacag acatatatct gtaatgtcaa tcacaagcct 1320
tccaacacca aagtcgataa gaaagtcgag cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc 1380
ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 1440
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 1500
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gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1620
accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1680
gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1740
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ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1920
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gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 2040
aaa 2043
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<211> 690
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A(VH-CH1)- V9(VH-CL)-Fc(结) P329G LALA
<400> 197
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
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Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
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100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
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Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg
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Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<400> 201
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195 200 205
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210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
245 250 255
Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr
260 265 270
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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
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tactacgccg acagcgtgaa ggaccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
gcctacctgc agatgaacaa cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacag ctacatcagc tactgggcct actggggaca gggcaccctg 360
gtgacagtgt ccagcgctag cgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 420
gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga 480
gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt 540
gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc 600
aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 660
tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgtggcg gaggcggatc cggcggaggg 720
ggatctcagg tgcagctgca ggaaagcggc cctggcctgg tcaagcccag ccagaccctg 780
agcctgacct gcaccgtgtc cggcggcagc atcaccagcg gctactactg gaactggatt 840
cggcagcacc ccggcaaggg cctggaatgg atcggctaca tcacctacga cggcagcaac 900
aactacaacc ccagcctgaa gtccagagtg accatcagcc gggacaccag caagaaccag 960
ttcagcctga agctgtccag cgtgacagcc gccgacaccg ccgtgtacta ctgcgccgac 1020
ttcgactact ggggccaggg caccctggtc accgtgtcca gcgctagcac caagggcccc 1080
agcgtgttcc ccctggcacc cagcagcaag agcacatctg gcggaacagc cgctctgggc 1140
tgtctggtga aagactactt ccccgagccc gtgaccgtgt cttggaactc tggcgccctg 1200
accagcggcg tgcacacctt tccagccgtg ctgcagagca gcggcctgta ctccctgtcc 1260
tccgtggtca ccgtgccctc tagctccctg ggaacacaga catatatctg taatgtcaat 1320
cacaagcctt ccaacaccaa agtcgataag aaagtcgagc ccaagagctg cgacaaaact 1380
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gctgcagggg gaccgtcagt cttcctcttc 1440
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 1500
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1560
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1620
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1680
tccaacaaag ccctcggcgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1740
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tgccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1800
agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1860
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1920
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1980
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 2040
tctccgggta aa 2052
<210> 203
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 431/26(VL-CL)
<400> 203
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Thr Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
100 105 110
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
115 120 125
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130 135 140
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
145 150 155 160
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
180 185 190
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
195 200 205
Arg Gly Glu Cys
210
<210> 204
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 431/26(VL-CL)
<400> 204
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta gcaccagcag cagcgtgtcc tacatgcact ggtatcagca gaagcccggc 120
aaggccccca agctgctgat ctacagcacc tccaatctgg ccagcggcgt gcccagcaga 180
ttttctggca gcggctccgg caccgacttc accttcacca tcagctccct gcagcccgag 240
gatatcgcca cctactactg ccaccagtgg tccagctacc ccacctttgg ccagggcacc 300
aaggtggaaa tcaagcgtac ggtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 360
gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga 420
gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt 480
gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc 540
aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 600
tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgt 636
<210> 205
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 431/26(VH-CH1)-V9(VH-CL)-Fc(结) P329G LALA
<400> 205
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Gln Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Tyr His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
245 250 255
Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln
260 265 270
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys
275 280 285
Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser
290 295 300
Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
305 310 315 320
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly
325 330 335
Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
340 345 350
Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
355 360 365
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
370 375 380
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
385 390 395 400
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
405 410 415
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
420 425 430
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
435 440 445
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys
450 455 460
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
465 470 475 480
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
485 490 495
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
500 505 510
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
515 520 525
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
530 535 540
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
545 550 555 560
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
565 570 575
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
580 585 590
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
595 600 605
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
610 615 620
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
625 630 635 640
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
645 650 655
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
660 665 670
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680 685
Lys
<210> 206
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 431/26(VH-CH1)-V9(VH-CL)-Fc(结) P329G LALA
<400> 206
caggtgcagc tgcaggaatc tggccctgga ctcgtgcggc ctagccagac actgagcctg 60
acctgtaccg tgtccggctt caccatcagc agcggctaca gctggcattg ggtgcgccag 120
ccacctggca gaggcctgga atggatcggc tacatccagt acagcggcat caccaactac 180
aaccccagcc tgaagtccag agtgaccatg ctggtggaca cctccaagaa ccagttcagc 240
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tacgactacc actggtactt cgacgtgtgg ggccagggct ctctcgtgac cgtgtcaagc 360
gctagcacaa agggccccag cgtgttccct ctggccccta gcagcaagag cacatctggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactactttc ccgagcccgt gacagtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtact ctctgagcag cgtggtcacc gtgcctagct ctagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
aagagctgcg gcggaggcgg atccggaggc ggaggatccg aagtgcagct ggtggaatct 720
ggcggaggcc tggtgcagcc tggcggatct ctgagactga gctgtgccgc cagcggctac 780
agcttcaccg gctacaccat gaactgggtg cgccaggccc ctggcaaggg actggaatgg 840
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ttcaccatca gcgtggacaa gagcaagaac accgcctacc tgcagatgaa cagcctgcgg 960
gccgaggaca ccgccgtgta ctattgtgcc agaagcggct actacggcga cagcgactgg 1020
tacttcgacg tgtggggcca gggcacactc gtgaccgtgt caagcgctag cgtggccgct 1080
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tactccctgt cctccaccct gacactgtct aaggctgatt atgagaaaca caaagtctac 1320
gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga 1380
gagtgtgaca agacccacac ctgtccccct tgtcctgccc ctgaagctgc tggcggccct 1440
tctgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgaa 1500
gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccac gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac 1560
gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067
<210> 207
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 431/26(VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 207
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Gln Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Tyr His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 208
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 431/26(VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 208
caggtgcagc tgcaggaatc tggccctgga ctcgtgcggc ctagccagac actgagcctg 60
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gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 540
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tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660
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ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 209
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A(VL-CL)-V9 (VH-CL)
<400> 209
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
225 230 235 240
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
245 250 255
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val
260 265 270
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro
275 280 285
Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr
290 295 300
Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
305 310 315 320
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr
325 330 335
Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
340 345 350
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
355 360 365
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
370 375 380
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
385 390 395 400
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
405 410 415
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
420 425 430
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
435 440 445
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
450 455 460
<210> 210
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A(VL-CL)-V9 (VH-CL)
<400> 210
gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggcctctgc cgccgtgggc acatacgtgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggaagagagg cgtgcccagc 180
agattttccg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccaccag tactacacct accccctgtt caccttcggc 300
cagggcacca agctcgagat caagcgtacg gtggccgctc ccagcgtgtt catcttccca 360
cctagcgacg agcagctgaa gtccggcaca gcctctgtcg tgtgcctgct gaacaacttc 420
tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaatg ccctgcagag cggcaacagc 480
caggaaagcg tgaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540
acactgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 600
ggcctgtcta gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg aatgtggcgg cggaggatcc 660
ggcggaggcg gctccggagg cggaggaagt ggcggagggg gatctgaagt gcagctggtg 720
gaatctggcg gaggcctggt gcagcctggc ggatctctga gactgagctg tgccgccagc 780
ggctacagct tcaccggcta caccatgaac tgggtgcgcc aggcccctgg caagggactg 840
gaatgggtgg ccctgatcaa cccctacaag ggcgtgtcca catacaacca gaagttcaag 900
gaccggttca ccatcagcgt ggacaagagc aagaacaccg cctacctgca gatgaacagc 960
ctgcgggccg aggacaccgc cgtgtactac tgtgccagaa gcggctacta cggcgacagc 1020
gactggtact tcgacgtgtg gggccaggga accctcgtga ccgtgtcaag cgctagcgtg 1080
gccgcaccct ctgtgtttat ctttccaccc tctgacgaac agctgaaaag cggcaccgcc 1140
agcgtcgtgt gtctgctgaa caatttttac cctagggaag ctaaagtgca gtggaaagtg 1200
gataacgcac tgcagtccgg caactcccag gaatctgtga cagaacagga ctccaaggac 1260
agcacatact ccctgtccag cacactgacc ctgtctaagg ccgattatga gaaacacaaa 1320
gtgtatgctt gtgaagtgac acatcaggga ctgagcagcc ctgtgacaaa gtccttcaac 1380
agaggcgagt gt 1392
<210> 211
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A(VH-CH1)-Fc(结) P329G LALA
<400> 211
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 212
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1A1A(VH-CH1)-Fc(结) P329G LALA
<400> 212
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggagctag tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gagttcggca tgaactgggt ccgacaggct 120
ccaggccagg gcctcgaatg gatgggctgg atcaacacca agaccggcga ggccacctac 180
gtggaagagt tcaagggcag agtgaccttc accacggaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagatgggac 300
ttcgcctatt acgtggaagc catggactac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtct 360
agcgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atgccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctgtgg tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 213
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc(扣) P329G LALA
<400> 213
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 214
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc(扣) P329G LALA
<400> 214
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 215
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH2527(VL-CH1)
<400> 215
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys
210
<210> 216
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH2527(VL-CH1)
<400> 216
caggccgtcg tgacccagga aagcgccctg acaacaagcc ctggcgagac agtgaccctg 60
acctgcagat ctagcacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120
aagcccgacc acctgttcac cggcctgatc ggcggcacca acaaaagggc tccaggcgtg 180
ccagccagat tcagcggcag cctgattggc gataaggccg ccctgaccat cactggcgcc 240
cagacagagg acgaggccat ctacttttgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtgctgagc agcgcttcca ccaaaggccc ttccgtgttt 360
cctctggctc ctagctccaa gtccacctct ggaggcaccg ctgctctcgg atgcctcgtg 420
aaggattatt ttcctgagcc tgtgacagtg tcctggaata gcggagcact gacctctgga 480
gtgcatactt tccccgctgt gctgcagtcc tctggactgt acagcctgag cagcgtggtg 540
acagtgccca gcagcagcct gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc 600
agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa cccaagtctt gt 642
<210> 217
<211> 684
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH2527(VH-CL)-LC007(VH-CH1)-Fc(结) P329G LALA
<400> 217
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
245 250 255
Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
260 265 270
Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu
275 280 285
Glu Trp Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro
290 295 300
Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
305 310 315 320
Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
325 330 335
Tyr Cys Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
340 345 350
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
355 360 365
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
370 375 380
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
385 390 395 400
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
405 410 415
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
420 425 430
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
435 440 445
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
450 455 460
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
465 470 475 480
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
485 490 495
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
500 505 510
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
515 520 525
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
530 535 540
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
545 550 555 560
Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
565 570 575
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg
580 585 590
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
595 600 605
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
610 615 620
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
625 630 635 640
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
645 650 655
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
660 665 670
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680
<210> 218
<211> 2052
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH2527(VH-CL)-LC007(VH-CH1)-Fc(结) P329G LALA
<400> 218
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctaagggctc tctgaagctg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcaac acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtggcccgg atcagaagca agtacaacaa ttacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa ggaccggttc accatcagcc gggacgacag ccagagcatc 240
ctgtacctgc agatgaacaa cctgaaaacc gaggacaccg ccatgtacta ctgcgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgacagtgt ctgctgctag cgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 420
gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga 480
gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt 540
gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc 600
aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 660
tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgtggcg gaggcggatc cggcggaggg 720
ggatctgagg tccagctgca ggagtcagga cctggcctcg tgaaaccttc tcagtctctg 780
tctctcacct gctctgtcac tggctactcc atcaccagtg gttattactg gaactggatt 840
cggcagtttc caggaaacaa gctggaatgg atgggctaca taacctacga cggtagcaat 900
aactacaacc catctctcaa aaatcgaatc tccattactc gtgacacatc taagaaccag 960
tttttcctga agttgaattc tgtgactact gaggacacag ctacatatta ctgtgcggac 1020
tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcca gcgctagcac caagggcccc 1080
agcgtgttcc ccctggcacc cagcagcaag agcacatctg gcggaacagc cgctctgggc 1140
tgtctggtga aagactactt ccccgagccc gtgaccgtgt cttggaactc tggcgccctg 1200
accagcggcg tgcacacctt tccagccgtg ctgcagagca gcggcctgta ctccctgtcc 1260
tccgtggtca ccgtgccctc tagctccctg ggaacacaga catatatctg taatgtcaat 1320
cacaagcctt ccaacaccaa agtcgataag aaagtcgagc ccaagagctg cgacaaaact 1380
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gctgcagggg gaccgtcagt cttcctcttc 1440
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 1500
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1560
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1620
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1680
tccaacaaag ccctcggcgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1740
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tgccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1800
agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1860
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1920
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1980
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 2040
tctccgggta aa 2052
<210> 219
<211> 685
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007(VH-CH1)-CH2527(VH-CL)-Fc(结) P329G LALA
<400> 219
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180 185 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
225 230 235 240
Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn
245 250 255
Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
260 265 270
Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr
275 280 285
Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln
290 295 300
Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala
305 310 315 320
Met Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser
325 330 335
Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala
340 345 350
Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
355 360 365
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
370 375 380
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
385 390 395 400
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
405 410 415
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
420 425 430
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
435 440 445
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
450 455 460
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
465 470 475 480
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
485 490 495
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
500 505 510
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
515 520 525
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
530 535 540
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
545 550 555 560
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
565 570 575
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys
580 585 590
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
595 600 605
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
610 615 620
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
625 630 635 640
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
645 650 655
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
660 665 670
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680 685
<210> 220
<211> 2055
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007(VH-CH1)-CH2527(VH-CL)-Fc(结) P329G LALA
<400> 220
gaggtgcagc tgcaggaatc tggccctggc ctggtcaagc caagccagag tctgagcctg 60
acctgcagcg tgaccggcta cagcattacc agcggctact actggaactg gattcggcag 120
ttccccggca ataagctgga atggatgggc tacatcacct acgacggcag caacaactac 180
aaccccagcc tgaagaaccg gatcagcatc acccgggaca ccagcaagaa ccagttcttc 240
ctgaagctga acagcgtgac caccgaggac accgccacat actattgcgc cgacttcgac 300
tactggggcc agggcaccac cctgaccgtg tccagcgcca gcacaaaggg ccctagcgtg 360
ttccctctgg cccccagcag caagagcaca agcggcggaa cagccgccct gggctgcctc 420
gtgaaggact acttccccga gcccgtgaca gtgtcttgga acagcggagc cctgacaagc 480
ggcgtgcaca ccttccctgc cgtgctgcag agcagcggcc tgtactccct gagcagcgtg 540
gtcaccgtgc ctagcagcag cctgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag 600
cccagcaaca ccaaagtgga caagaaggtg gagcccaaga gctgtgatgg cggaggaggg 660
tccggaggcg gaggatccga agtgcagctg gtggaaagcg gcggaggcct ggtgcagcct 720
aagggctctc tgaagctgag ctgtgccgcc agcggcttca ccttcaacac ctacgccatg 780
aactgggtgc gccaggcccc tggcaaaggc ctggaatggg tggcccggat cagaagcaag 840
tacaacaatt acgccaccta ctacgccgac agcgtgaagg accggttcac catcagccgg 900
gacgacagcc agagcatcct gtacctgcag atgaacaacc tgaaaaccga ggacaccgcc 960
atgtactact gcgtgcggca cggcaacttc ggcaacagct atgtgtcttg gtttgcctac 1020
tggggccagg gcaccctcgt gacagtgtct gctgctagcg tggccgctcc ctccgtgttt 1080
atctttcccc catccgatga acagctgaaa agcggcaccg cctccgtcgt gtgtctgctg 1140
aacaattttt accctaggga agctaaagtg cagtggaaag tggataacgc actgcagtcc 1200
ggcaactccc aggaatctgt gacagaacag gactccaagg acagcaccta ctccctgtcc 1260
tccaccctga cactgtctaa ggctgattat gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 1320
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgtgacaag 1380
acccacacct gtcccccttg tcctgcccct gaagctgctg gcggcccttc tgtgttcctg 1440
ttccccccaa agcccaagga caccctgatg atcagccgga cccccgaagt gacctgcgtg 1500
gtggtggatg tgtcccacga ggaccctgaa gtgaagttca attggtacgt ggacggcgtg 1560
gaagtgcaca acgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 1620
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1680
gtctccaaca aagccctcgg cgcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1740
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatgccggg atgagctgac caagaaccag 1800
gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1860
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1920
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1980
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 2040
ctgtctccgg gtaaa 2055
<210> 221
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33(VL-CL)
<400> 221
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 222
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33(VL-CL)
<400> 222
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
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ggcgtgccca gcagattcag cggctctggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240
agcctgcagc ccgacgactt cgccacctac tactgccagc agagcaaaga ggtgccctgg 300
accttcggcc agggcaccaa ggtggaaatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
<210> 223
<211> 668
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)-抗CD33(VH-CH1)-Fc(结) P329G LALA
<400> 223
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
210 215 220
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val
225 230 235 240
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met
245 250 255
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr
260 265 270
Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser
275 280 285
Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu
290 295 300
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
305 310 315 320
Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
325 330 335
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
340 345 350
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
355 360 365
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
370 375 380
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
405 410 415
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
420 425 430
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
435 440 445
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
450 455 460
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
465 470 475 480
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
485 490 495
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
500 505 510
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
515 520 525
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
530 535 540
Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
545 550 555 560
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg
565 570 575
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
580 585 590
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
595 600 605
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
610 615 620
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
625 630 635 640
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
645 650 655
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665
<210> 224
<211> 2004
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)-抗CD33(VH-CH1)-Fc(结) P329G LALA
<400> 224
gatatccaga tgacccagag ccccagctct ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca ggacatcaga aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac accagcagac tggaaagcgg cgtgccctcc 180
agattttccg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggatttcg ccacatatta ctgccagcag ggcaataccc tgccctggac cttcggacag 300
ggcacaaaag tggaaatcaa gagcagcgct tccaccaaag gcccttccgt gtttcctctg 360
gctcctagct ccaagtccac ctctggaggc accgctgctc tcggatgcct cgtgaaggat 420
tattttcctg agcctgtgac agtgtcctgg aatagcggag cactgacctc tggagtgcat 480
actttccccg ctgtgctgca gtcctctgga ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgacagtg 540
cccagcagca gcctgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac 600
accaaggtgg acaagaaggt ggaacccaag tcttgtggcg gaggcggatc cggcggaggc 660
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tactccctgt cctccgtggt caccgtgccc tctagctccc tgggaacaca gacatatatc 1260
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tgcgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagctgcagg gggaccgtca 1380
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 1440
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 1500
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 1560
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1620
aagtgcaagg tctccaacaa agccctcggc gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1680
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aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1800
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gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1980
agcctctccc tgtctccggg taaa 2004
<210> 225
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33(VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 225
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
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Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 226
<211> 1338
<212> DNA
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<220>
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<400> 226
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ccggcagcag cgtgaaggtg 60
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aaccagaagt tcaagagcaa ggccaccatc accgccgacg agagcaccaa caccgcctac 240
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cccgccatgg actactgggg ccagggcacc ctggtgacag tgtccagcgc tagcaccaag 360
ggcccctccg tgttccccct ggcccccagc agcaagagca ccagcggcgg cacagccgct 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaacagcgga 480
gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agagttctgg cctgtatagc 540
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ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
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<211> 219
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20(VL-CL)
<400> 227
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 228
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20(VL-CL)
<400> 228
gatatcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gcccgccagc 60
attagctgca ggtctagcaa gagcctcttg cacagcaatg gcatcactta tttgtattgg 120
tacctgcaaa agccagggca gtctccacag ctcctgattt atcaaatgtc caaccttgtc 180
tctggcgtcc ctgaccggtt ctccggatcc gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgcg ctcagaatct agaacttcct 300
tacaccttcg gcggagggac caaggtggag atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 229
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)-抗CD20(VH-CH1)-Fc(结) P329G LALA
<400> 229
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20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
210 215 220
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val
225 230 235 240
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Ile
245 250 255
Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg
260 265 270
Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly
275 280 285
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
290 295 300
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
305 310 315 320
Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
325 330 335
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
340 345 350
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
355 360 365
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
370 375 380
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
385 390 395 400
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
405 410 415
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
420 425 430
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
435 440 445
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
450 455 460
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
465 470 475 480
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
485 490 495
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
500 505 510
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
515 520 525
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
530 535 540
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
545 550 555 560
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
565 570 575
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
580 585 590
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
595 600 605
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
610 615 620
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
625 630 635 640
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
645 650 655
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 230
<211> 2013
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9(VL-CH1)-抗CD20(VH-CH1)-Fc(结) P329G LALA
<400> 230
gatatccaga tgacccagag ccccagctct ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca ggacatcaga aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac accagcagac tggaaagcgg cgtgccctcc 180
agattttccg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggatttcg ccacatatta ctgccagcag ggcaataccc tgccctggac cttcggacag 300
ggcacaaaag tggaaatcaa gagcagcgct tccaccaaag gcccttccgt gtttcctctg 360
gctcctagct ccaagtccac ctctggaggc accgctgctc tcggatgcct cgtgaaggat 420
tattttcctg agcctgtgac agtgtcctgg aatagcggag cactgacctc tggagtgcat 480
actttccccg ctgtgctgca gtcctctgga ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgacagtg 540
cccagcagca gcctgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac 600
accaaggtgg acaagaaggt ggaacccaag tcttgtggcg gaggcggatc cggcggaggg 660
ggatctcagg tgcaattggt gcagtctggc gctgaagtta agaagcctgg gagttcagtg 720
aaggtctcct gcaaggcttc cggatacgcc ttcagctatt cttggatcaa ttgggtgcgg 780
caggcgcctg gacaagggct cgagtggatg ggacggatct ttcccggcga tggggatact 840
gactacaatg ggaaattcaa gggcagagtc acaattaccg ccgacaaatc cactagcaca 900
gcctatatgg agctgagcag cctgagatct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcaaga 960
aatgtctttg atggttactg gcttgtttac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 1020
tcagctagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggcac ccagcagcaa gagcacatct 1080
ggcggaacag ccgctctggg ctgtctggtg aaagactact tccccgagcc cgtgaccgtg 1140
tcttggaact ctggcgccct gaccagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 1200
agcggcctgt actccctgtc ctccgtggtc accgtgccct ctagctccct gggaacacag 1260
acatatatct gtaatgtcaa tcacaagcct tccaacacca aagtcgataa gaaagtcgag 1320
cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 1380
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 1440
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 1500
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 1560
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1620
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1680
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atgccgggat 1740
gagctgacca agaaccaggt cagcctgtgg tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1800
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1860
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1920
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1980
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 2013
<210> 231
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20(VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 231
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 232
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20(VH-CH1)-Fc(扣) P329G LALA
<400> 232
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttccggata cgccttcagc tattcttgga tcaattgggt gcggcaggcg 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagct 360
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tgcaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080
accaagaacc aggtcagcct ctcgtgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200
gactccgacg gctccttctt cctcgtgagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347
<210> 233
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 HCDR1
<400> 233
Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn
1 5 10
<210> 234
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 HCDR1
<400> 234
ggcggcagca tcaccagcgg ctactactgg aac 33
<210> 235
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 HCDR2
<400> 235
Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 236
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 HCDR2
<400> 236
tacatcacct acgacggcag caacaactac aaccccagcc tgaagtcc 48
<210> 237
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 HCDR3
<400> 237
Phe Asp Tyr
1
<210> 238
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 HCDR3
<400> 238
ttcgactac 9
<210> 239
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 VH
<400> 239
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 240
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 VH
<400> 240
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgcaccg tgtccggcgg cagcatcacc agcggctact actggaactg gatccggcag 120
caccccggca agggcctgga atggatcggc tacatcacct acgacggcag caacaactac 180
aaccccagcc tgaagtccag agtgaccatc agccgggaca ccagcaagaa ccagttcagc 240
ctgaagctgt ccagcgtgac agccgccgac accgccgtgt actactgcgc cgacttcgac 300
tactggggcc agggcaccct ggtcaccgtg tccagc 336
<210> 241
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 LCDR1
<400> 241
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 242
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 LCDR1
<400> 242
cgggccagcc agggcatccg gaactacctg aac 33
<210> 243
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 LCDR2
<400> 243
Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 244
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 LCDR2
<400> 244
tacaccagca gcctgcacag c 21
<210> 245
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 LCDR3
<400> 245
Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 246
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 LCDR3
<400> 246
cagcagtaca gcaagctgcc ctggacc 27
<210> 247
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 VL
<400> 247
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 248
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3 ML2 VL
<400> 248
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgcc gggccagcca gggcatccgg aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac accagcagcc tgcacagcgg cgtgcctagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccattagctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcaagc tgccctggac cttcggccag 300
ggaacaaagg tggagatcaa g 321
<210> 249
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 HCDR1
<400> 249
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 250
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 HCDR1
<400> 250
acctacgcca tgaac 15
<210> 251
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 HCDR2
<400> 251
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 252
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 HCDR2
<400> 252
cggatcagaa gcaagtacaa caattacgcc acctactacg ccgacagcgt gaaggac 57
<210> 253
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 HCDR3
<400> 253
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 254
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 HCDR3
<400> 254
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct ac 42
<210> 255
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH
<400> 255
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120 125
<210> 256
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VH
<400> 256
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctaagggctc tctgaagctg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcaac acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtggcccgg atcagaagca agtacaacaa ttacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa ggaccggttc accatcagcc gggacgacag ccagagcatc 240
ctgtacctgc agatgaacaa cctgaaaacc gaggacaccg ccatgtacta ctgcgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgacagtgt ctgct 375
<210> 257
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 LCDR1
<400> 257
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 258
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 LCDR1
<400> 258
agatctagca caggcgccgt gaccaccagc aactacgcca ac 42
<210> 259
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 LCDR2
<400> 259
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 260
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 LCDR2
<400> 260
ggcaccaaca aaagggctcc a 21
<210> 261
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 LCDR3
<400> 261
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 262
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 LCDR3
<400> 262
gccctgtggt acagcaacct gtgggtg 27
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<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL
<400> 263
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 264
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 VL
<400> 264
caggccgtcg tgacccagga aagcgccctg acaacaagcc ctggcgagac agtgaccctg 60
acctgcagat ctagcacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120
aagcccgacc acctgttcac cggcctgatc ggcggcacca acaaaagggc tccaggcgtg 180
ccagccagat tcagcggcag cctgattggc gataaggccg ccctgaccat cactggcgcc 240
cagacagagg acgaggccat ctacttttgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtgctg 327
<210> 265
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人
<400> 265
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 266
<211> 198
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 266
Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys
50 55 60
Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu
65 70 75 80
Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro
85 90 95
Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn
100 105 110
Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp
115 120 125
Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys
130 135 140
Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn
165 170 175
Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly
180 185 190
Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195
<210> 267
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链
"CD3 CH2527 (VH_3-23(12))"
<400> 267
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 268
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
"CD3 CH2527 (VL_7-46(13))"
<400> 268
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 269
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
"CD3 CH2527 (VH_3-23(12))"
<400> 269
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 270
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H1
"CD3 CH2527 (VH_3-23(12))"
<400> 270
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 271
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H2
"CD3 CH2527 (VH_3-23(12))"
<400> 271
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 272
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H3
"CD3 CH2527 (VH_3-23(12))"
<400> 272
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 273
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
"CD3 CH2527 (VL_7-46(13))"
<400> 273
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 274
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L1
"CD3 CH2527 (VL_7-46(13))"
<400> 274
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 275
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L2
"CD3 CH2527 (VL_7-46(13))"
<400> 275
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 276
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L3
"CD3 CH2527 (VL_7-46(13))"
<400> 276
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 277
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链
"MCSP M4-3 (C1)"
<400> 277
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180 185 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
340 345 350
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 278
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
"MCSP ML2 (G3) "
<400> 278
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 279
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
" MCSP M4-3 (C1)"
<400> 279
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 280
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H1
" MCSP M4-3 (C1)"
<400> 280
Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn
1 5
<210> 281
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H2
" MCSP M4-3 (C1)"
<400> 281
Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 282
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H3
" MCSP M4-3 (C1)"
<400> 282
Phe Asp Tyr
1
<210> 283
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
"MCSP ML2 (G3) "
<400> 283
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 284
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L1
"MCSP ML2 (G3) "
<400> 284
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 285
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L2
"MCSP ML2 (G3) "
<400> 285
Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 286
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L3
"MCSP ML2 (G3) "
<400> 286
Gln Gln Tyr Ser Ala Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 287
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链
"CEA CH1A1A 98-99"
<400> 287
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 288
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
"CEA 2F1"
<400> 288
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 289
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
"CEA CH1A1A 98-99"
<400> 289
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 290
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H1
"CEA CH1A1A 98-99"
<400> 290
Glu Phe Gly Met Asn
1 5
<210> 291
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H2
"CEA CH1A1A 98-99"
<400> 291
Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 292
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H3
"CEA CH1A1A 98-99"
<400> 292
Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 293
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
"CEA 2F1"
<400> 293
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 294
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L1
"CEA 2F1"
<400> 294
Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 295
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L2
"CEA 2F1"
<400> 295
Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg
1 5
<210> 296
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L3
"CEA 2F1"
<400> 296
His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr
1 5 10
<210> 297
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
"CD3 CH2527 (VL_7-43(11))"
<400> 297
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser
100 105 110
<210> 298
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
"CD3 CH2527 (VHcomboA49SV93A)"
<400> 298
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 299
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
"CD3 CH2527 (VHcomboA49SV93AR94K)"
<400> 299
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Lys His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 300
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
"MCSP M4-3 (D6)"
<400> 300
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Lys Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 301
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H2
" MCSP M4-3 (D6)"
<400> 301
Ile Thr Phe Asp Gly Lys Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 302
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
"MCSP M4-3 (A7)"
<400> 302
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Asp Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Arg Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 303
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H1
" MCSP M4-3 (A7)"
<400> 303
Asp Gly Tyr Tyr Trp Asn
1 5
<210> 304
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H2
" MCSP M4-3 (A7)"
<400> 304
Ile Thr Phe Asp Gly Arg Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 305
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
"MCSP M4-3 (B7)"
<400> 305
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Ile Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 306
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H2
" MCSP M4-3 (B7)"
<400> 306
Ile Thr Phe Asp Gly Ile Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 307
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
"MCSP M4-3 (B8)"
<400> 307
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Arg Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 308
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲本VH MCSP M4-3
<400> 308
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 309
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
"MCSP ML2 (E10) "
<400> 309
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Tyr Gly Ile Arg Gly Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 310
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L1
"MCSP ML2 (E10) "
<400> 310
Arg Ala Ser Tyr Gly Ile Arg Gly Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 311
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L3
"MCSP ML2 (E10) "
<400> 311
Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 312
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
"MCSP ML2 (E10-G3) "
<400> 312
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Tyr Gly Ile Arg Gly Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 313
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
"MCSP ML2 (C5) "
<400> 313
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Gly Ile Arg Glu Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Gly Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Glu Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 314
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L1
"MCSP ML2 (C5) "
<400> 314
Arg Ala Ser Arg Gly Ile Arg Glu Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 315
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L2
"MCSP ML2 (C5) "
<400> 315
Tyr Thr Gly Ser Leu His Ser
1 5
<210> 316
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> QQYSELPWT
<400> 316
Gln Gln Tyr Ser Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 317
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
"MCSP ML2 (C5-G3) "
<400> 317
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Gly Ile Arg Glu Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Gly Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 318
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲本VL MCSP ML2
<400> 318
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 319
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链人源化的
CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1)
<400> 319
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys
210
<210> 320
<211> 685
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MCSP M4-3 (C1) (VH-CH1) -人源化的CD3 CH2527 (Crossfab
VH-Ck)-Fc(结) P329GLALA
<400> 320
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180 185 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
225 230 235 240
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
245 250 255
Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
260 265 270
Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr
275 280 285
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys
290 295 300
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
305 310 315 320
Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser
325 330 335
Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
340 345 350
Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
355 360 365
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
370 375 380
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
385 390 395 400
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
405 410 415
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
420 425 430
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
435 440 445
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
450 455 460
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
465 470 475 480
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
485 490 495
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
500 505 510
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
515 520 525
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
530 535 540
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
545 550 555 560
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
565 570 575
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys
580 585 590
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
595 600 605
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
610 615 620
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
625 630 635 640
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
645 650 655
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
660 665 670
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680 685
<210> 321
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MCSP M4-3 (C1) (VH-CH1)-Fc(扣) P329GLALA
<400> 321
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180 185 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
340 345 350
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 322
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链人源化的CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1)
<400> 322
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
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115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
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165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
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195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys
210
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<213> 人工序列
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1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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260 265 270
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
325 330 335
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340 345 350
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
355 360 365
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370 375 380
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<210> 324
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aVH (MCSP) -Fc(扣) P329GLALA
<400> 324
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile Gly Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Thr Glu Leu Val
35 40 45
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Thr Ser Trp Gly Gly Trp Leu Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
210 215 220
Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
225 230 235 240
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
245 250 255
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
260 265 270
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
275 280 285
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
290 295 300
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305 310 315 320
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
325 330 335
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 325
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
"MCSP ML2 (G3) "
<400> 325
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 326
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链人源化的CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1)
<400> 326
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys
210
<210> 327
<211> 685
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MCSP M4-3(C1) -人源化的CD3 CH2527 (VH-CK)-Fc(DD) P329GLALA
<400> 327
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1 5 10 15
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Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
245 250 255
Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
260 265 270
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
435 440 445
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
450 455 460
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
465 470 475 480
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
485 490 495
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
500 505 510
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
515 520 525
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
530 535 540
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
545 550 555 560
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
565 570 575
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
580 585 590
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660 665 670
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675 680 685
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<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MCSP M4-3(C1) - Fc(KK) P329GLALA
<400> 328
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180 185 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
210 215 220
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225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu
340 345 350
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 329
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 人源化的
CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1)
<400> 329
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys
210
<210> 330
<211> 694
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA CH1A1A 98/99 -人源化的CD3 CH2527 (Crossfab VH-Ck)-Fc(结)
P329GLALA
<400> 330
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu
225 230 235 240
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
245 250 255
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val
260 265 270
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser
275 280 285
Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
290 295 300
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
305 310 315 320
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His
325 330 335
Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
340 345 350
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
355 360 365
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
370 375 380
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
385 390 395 400
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
405 410 415
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
420 425 430
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
435 440 445
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
450 455 460
Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
465 470 475 480
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
485 490 495
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
500 505 510
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
515 520 525
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
530 535 540
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
545 550 555 560
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
565 570 575
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
580 585 590
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
595 600 605
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
610 615 620
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
625 630 635 640
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
645 650 655
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
660 665 670
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
675 680 685
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690
<210> 331
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA CH1A1A 98/99 (VH-CH1)-Fc(扣) P329GLALA
<400> 331
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
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210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 332
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 DP47 GS
<400> 332
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1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
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50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链人源化的
CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1)
<400> 333
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1 5 10 15
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35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys
210
<210> 334
<211> 688
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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P329GLALA
<400> 334
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
225 230 235 240
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
245 250 255
Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
260 265 270
Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala
275 280 285
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
290 295 300
Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
305 310 315 320
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser
325 330 335
Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
340 345 350
Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
355 360 365
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
370 375 380
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
385 390 395 400
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
405 410 415
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
420 425 430
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
435 440 445
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450 455 460
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
465 470 475 480
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
485 490 495
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
500 505 510
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
515 520 525
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
530 535 540
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
545 550 555 560
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
565 570 575
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
580 585 590
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
595 600 605
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
610 615 620
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
625 630 635 640
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
645 650 655
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
660 665 670
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680 685
<210> 335
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 GS (VH-CH1)-Fc(扣) P329GLALA
<400> 335
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 336
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链人源化的CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1)
<400> 336
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys
210
<210> 337
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Darpin (HER2) -人源化的CD3 CH2527 (VH-CK)-Fc(结) P329GLALA
<400> 337
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Val
50 55 60
Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Gly Asn Gly
100 105 110
Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
130 135 140
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
145 150 155 160
Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala
180 185 190
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
195 200 205
Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
210 215 220
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser
225 230 235 240
Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
245 250 255
Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
260 265 270
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
275 280 285
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
290 295 300
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
305 310 315 320
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
325 330 335
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
340 345 350
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr
355 360 365
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
370 375 380
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
385 390 395 400
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
405 410 415
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
420 425 430
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
435 440 445
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
450 455 460
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
465 470 475 480
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
485 490 495
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
500 505 510
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
515 520 525
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
530 535 540
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
545 550 555 560
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
565 570 575
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580 585 590
<210> 338
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Darpin (HER2) -Fc(扣) P329GLALA
<400> 338
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Val
50 55 60
Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Gly Asn Gly
100 105 110
Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asp Lys Thr His Thr
115 120 125
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
130 135 140
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
145 150 155 160
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
165 170 175
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
180 185 190
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
195 200 205
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
210 215 220
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
225 230 235 240
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
245 250 255
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
260 265 270
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
275 280 285
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
290 295 300
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
305 310 315 320
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
325 330 335
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 339
<211> 643
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 339
Leu Ser Leu Glu Gly Ser Arg Thr Leu Thr Val Cys Pro Gly Ser Val
1 5 10 15
Gln Pro Leu Ser Ser Gln Thr Leu Arg Ala Ser Ser Ser Ala Gly Thr
20 25 30
Asp Pro Gln Leu Leu Leu Tyr Arg Val Val Arg Gly Pro Gln Leu Gly
35 40 45
Arg Leu Phe His Ala Gln Gln Asp Ser Thr Gly Glu Ala Leu Val Asn
50 55 60
Phe Thr Gln Ala Glu Val Tyr Ala Gly Asn Ile Leu Tyr Glu His Glu
65 70 75 80
Met Pro Thr Glu Pro Phe Trp Glu Ala His Asp Thr Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Leu Ser Ser Pro Pro Ala Arg Asp Val Ala Ala Thr Leu Ala Val Ala
100 105 110
Val Ser Phe Glu Ala Ala Cys Pro Gln Arg Pro Ser His Leu Trp Lys
115 120 125
Asn Lys Gly Leu Trp Val Pro Glu Gly Gln Arg Ala Lys Ile Thr Met
130 135 140
Ala Ala Leu Asp Ala Ser Asn Leu Leu Ala Ser Val Pro Ser Pro Gln
145 150 155 160
Arg Leu Glu His Asp Val Leu Phe Gln Val Thr Gln Phe Pro Ser Arg
165 170 175
Gly Gln Leu Leu Val Ser Glu Glu Pro Leu His Ala Gly Gln Pro His
180 185 190
Phe Leu Gln Ser Gln Leu Ala Ala Gly Gln Leu Val Tyr Ala His Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Thr Gln Gln Asp Gly Phe His Phe Arg Ala His Leu Gln
210 215 220
Gly Pro Ala Gly Ala Thr Val Ala Gly Pro Gln Thr Ser Glu Ala Phe
225 230 235 240
Ala Ile Thr Val Arg Asp Val Asn Glu Arg Pro Pro Gln Pro Gln Ala
245 250 255
Ser Val Pro Leu Arg Ile Thr Arg Gly Ser Arg Ala Pro Ile Ser Arg
260 265 270
Ala Gln Leu Ser Val Val Asp Pro Asp Ser Ala Pro Gly Glu Ile Glu
275 280 285
Tyr Glu Val Gln Arg Ala Pro His Asn Gly Phe Leu Ser Leu Val Gly
290 295 300
Gly Gly Pro Gly Pro Val Thr His Phe Thr Gln Ala Asp Val Asp Ser
305 310 315 320
Gly Arg Leu Ala Phe Val Ala Asn Gly Ser Ser Val Ala Gly Val Phe
325 330 335
Gln Leu Ser Met Ser Asp Gly Ala Ser Pro Pro Leu Pro Met Ser Leu
340 345 350
Ala Val Asp Ile Leu Pro Ser Ala Ile Glu Val Gln Leu Gln Ala Pro
355 360 365
Leu Glu Val Pro Gln Ala Leu Gly Arg Ser Ser Leu Ser Gln Gln Gln
370 375 380
Leu Arg Val Val Ser Asp Arg Glu Glu Pro Glu Ala Ala Tyr Arg Leu
385 390 395 400
Ile Gln Gly Pro Lys Tyr Gly His Leu Leu Val Gly Gly Arg Pro Ala
405 410 415
Ser Ala Phe Ser Gln Leu Gln Ile Asp Gln Gly Glu Val Val Phe Ala
420 425 430
Phe Thr Asn Phe Ser Ser Ser His Asp His Phe Arg Val Leu Ala Leu
435 440 445
Ala Arg Gly Val Asn Ala Ser Ala Val Val Asn Ile Thr Val Arg Ala
450 455 460
Leu Leu His Val Trp Ala Gly Gly Pro Trp Pro Gln Gly Ala Thr Leu
465 470 475 480
Arg Leu Asp Pro Thr Ile Leu Asp Ala Gly Glu Leu Ala Asn Arg Thr
485 490 495
Gly Ser Val Pro His Phe Arg Leu Leu Glu Gly Pro Arg His Gly Arg
500 505 510
Val Val Arg Val Pro Arg Ala Arg Thr Glu Pro Gly Gly Ser Gln Leu
515 520 525
Val Glu Gln Phe Thr Gln Gln Asp Leu Glu Asp Gly Arg Leu Gly Leu
530 535 540
Glu Val Gly Arg Pro Glu Gly Arg Ala Pro Ser Pro Thr Gly Asp Ser
545 550 555 560
Leu Thr Leu Glu Leu Trp Ala Gln Gly Val Pro Pro Ala Val Ala Ser
565 570 575
Leu Asp Phe Ala Thr Glu Pro Tyr Asn Ala Ala Arg Pro Tyr Ser Val
580 585 590
Ala Leu Leu Ser Val Pro Glu Ala Thr Arg Met Glu Ala Gly Lys Pro
595 600 605
Glu Ser Ser Thr Pro Thr Gly Glu Pro Gly Pro Met Ala Ser Ser Pro
610 615 620
Val Pro Ala Val Ala Lys Gly Gly Phe Leu Gly Phe Leu Glu Ala Asn
625 630 635 640
Met Phe Ser
<210> 340
<211> 643
<212> PRT
<213> 智人
<400> 340
Leu Ser Leu Lys Gly Ser Gln Thr Leu Thr Val Cys Pro Gly Ser Val
1 5 10 15
Gln Pro Leu Ser Ser Gln Thr Leu Arg Ala Ser Ser Ser Ala Gly Thr
20 25 30
Asp Pro Gln Leu Leu Leu Tyr Arg Val Val Arg Gly Pro Gln Leu Gly
35 40 45
Arg Leu Phe His Ala Gln Gln Asp Ser Thr Gly Glu Ala Leu Val Asn
50 55 60
Phe Thr Gln Ala Glu Val Tyr Ala Gly Asn Ile Leu Tyr Glu His Glu
65 70 75 80
Met Pro Pro Glu Pro Phe Trp Glu Ala His Asp Thr Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Leu Ser Ser Pro Pro Ala Arg Asp Val Ala Ala Thr Leu Ala Val Ala
100 105 110
Val Ser Phe Glu Ala Ala Cys Pro Gln His Pro Ser His Leu Trp Lys
115 120 125
Asn Lys Gly Leu Trp Val Pro Glu Gly Gln Arg Ala Arg Ile Thr Val
130 135 140
Ala Ala Leu Asp Ala Ser Asn Leu Leu Ala Ser Val Pro Ser Pro Gln
145 150 155 160
Arg Ser Glu His Asp Val Leu Phe Gln Val Thr Gln Phe Pro Ser Arg
165 170 175
Gly Gln Leu Leu Val Ser Glu Glu Pro Leu His Ala Gly Gln Pro His
180 185 190
Phe Leu Gln Ser Gln Leu Ala Ala Gly Gln Leu Val Tyr Ala His Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Thr Gln Gln Asp Gly Phe His Phe Arg Ala His Leu Gln
210 215 220
Gly Pro Ala Gly Ala Ser Val Ala Gly Pro Gln Thr Ser Glu Ala Phe
225 230 235 240
Ala Ile Thr Val Arg Asp Val Asn Glu Arg Pro Pro Gln Pro Gln Ala
245 250 255
Ser Val Pro Leu Arg Leu Thr Arg Gly Ser Arg Ala Pro Ile Ser Arg
260 265 270
Ala Gln Leu Ser Val Val Asp Pro Asp Ser Ala Pro Gly Glu Ile Glu
275 280 285
Tyr Glu Val Gln Arg Ala Pro His Asn Gly Phe Leu Ser Leu Val Gly
290 295 300
Gly Gly Leu Gly Pro Val Thr Arg Phe Thr Gln Ala Asp Val Asp Ser
305 310 315 320
Gly Arg Leu Ala Phe Val Ala Asn Gly Ser Ser Val Ala Gly Ile Phe
325 330 335
Gln Leu Ser Met Ser Asp Gly Ala Ser Pro Pro Leu Pro Met Ser Leu
340 345 350
Ala Val Asp Ile Leu Pro Ser Ala Ile Glu Val Gln Leu Arg Ala Pro
355 360 365
Leu Glu Val Pro Gln Ala Leu Gly Arg Ser Ser Leu Ser Gln Gln Gln
370 375 380
Leu Arg Val Val Ser Asp Arg Glu Glu Pro Glu Ala Ala Tyr Arg Leu
385 390 395 400
Ile Gln Gly Pro Gln Tyr Gly His Leu Leu Val Gly Gly Arg Pro Thr
405 410 415
Ser Ala Phe Ser Gln Phe Gln Ile Asp Gln Gly Glu Val Val Phe Ala
420 425 430
Phe Thr Asn Phe Ser Ser Ser His Asp His Phe Arg Val Leu Ala Leu
435 440 445
Ala Arg Gly Val Asn Ala Ser Ala Val Val Asn Val Thr Val Arg Ala
450 455 460
Leu Leu His Val Trp Ala Gly Gly Pro Trp Pro Gln Gly Ala Thr Leu
465 470 475 480
Arg Leu Asp Pro Thr Val Leu Asp Ala Gly Glu Leu Ala Asn Arg Thr
485 490 495
Gly Ser Val Pro Arg Phe Arg Leu Leu Glu Gly Pro Arg His Gly Arg
500 505 510
Val Val Arg Val Pro Arg Ala Arg Thr Glu Pro Gly Gly Ser Gln Leu
515 520 525
Val Glu Gln Phe Thr Gln Gln Asp Leu Glu Asp Gly Arg Leu Gly Leu
530 535 540
Glu Val Gly Arg Pro Glu Gly Arg Ala Pro Gly Pro Ala Gly Asp Ser
545 550 555 560
Leu Thr Leu Glu Leu Trp Ala Gln Gly Val Pro Pro Ala Val Ala Ser
565 570 575
Leu Asp Phe Ala Thr Glu Pro Tyr Asn Ala Ala Arg Pro Tyr Ser Val
580 585 590
Ala Leu Leu Ser Val Pro Glu Ala Ala Arg Thr Glu Ala Gly Lys Pro
595 600 605
Glu Ser Ser Thr Pro Thr Gly Glu Pro Gly Pro Met Ala Ser Ser Pro
610 615 620
Glu Pro Ala Val Ala Lys Gly Gly Phe Leu Ser Phe Leu Glu Ala Asn
625 630 635 640
Met Phe Ser
<210> 341
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链
"CD3 CH2527 (VH_3-23(12))"
<400> 341
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60
gtgcagctgc tggaatctgg cggcggactg gtgcagcctg gcggatctct gagactgagc 120
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcacc tacgccatga actgggtgcg ccaggcccct 180
ggcaaaggcc tggaatgggt gtcccggatc agaagcaagt acaacaacta cgccacctac 240
tacgccgaca gcgtgaaggg ccggttcacc atcagccggg acgacagcaa gaacaccctg 300
tacctgcaga tgaacagcct gcgggccgag gacaccgccg tgtactattg tgtgcggcac 360
ggcaacttcg gcaacagcta tgtgtcttgg tttgcctact ggggccaggg caccctcgtg 420
accgtgtcat ctgctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 480
agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 600
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 660
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720
aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 780
ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 840
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 900
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 960
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1020
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1080
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1140
tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1200
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1260
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1320
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1380
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga 1425
<210> 342
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
"CD3 CH2527 (VL_7-46(13))"
<400> 342
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattctcag 60
gccgtcgtga cccaggaacc cagcctgaca gtgtctcctg gcggcaccgt gaccctgaca 120
tgtggcagtt ctacaggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggaaaag 180
cccggccagg ccttcagagg actgatcggc ggcaccaaca agagagcccc tggcacccct 240
gccagattca gcggatctct gctgggagga aaggccgccc tgacactgtc tggcgcccag 300
ccagaagatg aggccgagta ctactgcgcc ctgtggtaca gcaacctgtg ggtgttcggc 360
ggaggcacca agctgacagt cctaggtcaa cccaaggctg cccccagcgt gaccctgttc 420
ccccccagca gcgaggaact gcaggccaac aaggccaccc tggtctgcct gatcagcgac 480
ttctacccag gcgccgtgac cgtggcctgg aaggccgaca gcagccccgt gaaggccggc 540
gtggagacca ccacccccag caagcagagc aacaacaagt acgccgccag cagctacctg 600
agcctgaccc ccgagcagtg gaagagccac aggtcctaca gctgccaggt gacccacgag 660
ggcagcaccg tggagaaaac cgtggccccc accgagtgca gctga 705
<210> 343
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
"CD3 CH2527 (VH_3-23(12))"
<400> 343
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60
gtgcagctgc tggaatctgg cggcggactg gtgcagcctg gcggatctct gagactgagc 120
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcacc tacgccatga actgggtgcg ccaggcccct 180
ggcaaaggcc tggaatgggt gtcccggatc agaagcaagt acaacaacta cgccacctac 240
tacgccgaca gcgtgaaggg ccggttcacc atcagccggg acgacagcaa gaacaccctg 300
tacctgcaga tgaacagcct gcgggccgag gacaccgccg tgtactattg tgtgcggcac 360
ggcaacttcg gcaacagcta tgtgtcttgg tttgcctact ggggccaggg caccctcgtg 420
accgtgtcat ct 432
<210> 344
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H1
"CD3 CH2527 (VH_3-23(12))"
<400> 344
acctacgcca tgaac 15
<210> 345
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H2
"CD3 CH2527 (VH_3-23(12))"
<400> 345
cggatcagaa gcaagtacaa caactacgcc acctactacg ccgacagcgt gaagggc 57
<210> 346
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H3
"CD3 CH2527 (VH_3-23(12))"
<400> 346
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct ac 42
<210> 347
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
"CD3 CH2527 (VL_7-46(13))"
<400> 347
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattctcag 60
gccgtcgtga cccaggaacc cagcctgaca gtgtctcctg gcggcaccgt gaccctgaca 120
tgtggcagtt ctacaggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggaaaag 180
cccggccagg ccttcagagg actgatcggc ggcaccaaca agagagcccc tggcacccct 240
gccagattca gcggatctct gctgggagga aaggccgccc tgacactgtc tggcgcccag 300
ccagaagatg aggccgagta ctactgcgcc ctgtggtaca gcaacctgtg ggtgttcggc 360
ggaggcacca agctgacagt ccta 384
<210> 348
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L1
"CD3 CH2527 (VL_7-46(13))"
<400> 348
ggcagttcta caggcgccgt gaccaccagc aactacgcca ac 42
<210> 349
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L2
"CD3 CH2527 (VL_7-46(13))"
<400> 349
ggcaccaaca agagagcccc t 21
<210> 350
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L3
"CD3 CH2527 (VL_7-46(13))"
<400> 350
gccctgtggt acagcaacct gtgggtg 27
<210> 351
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链
"MCSP M4-3 (C1)"
<400> 351
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcccag 60
gtgcaattgc aggaaagcgg ccctggcctg gtcaagccca gccagaccct gagcctgacc 120
tgcaccgtgt ccggcggcag catcaccagc ggctattatt ggaactggat tcggcagcac 180
cccggcaagg gcctggaatg gatcggctac atcactttcg acggctctaa caactacaac 240
cccagcctga agtccagagt gaccatcagc cgggacacca gcaagaacca gttcagcctg 300
aagctgtcca gcgtgacagc cgccgacacc gccgtgtact actgcgccga cttcgactac 360
tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc agcgctagca ccaagggccc atcggtcttc 420
cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 480
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 540
gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 600
accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 660
agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 720
ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 840
agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900
gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 960
accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020
gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1080
caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140
tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200
ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260
tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1380
aaatga 1386
<210> 352
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
"MCSP ML2 (G3) "
<400> 352
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgac 60
atccagatga cccagagccc cagcagcctg agcgccagcg tgggcgacag agtgaccatc 120
acctgccggg ccagccaggg catccggaac tacctgaact ggtatcagca gaagcccggc 180
aaggccccca agctgctgat ctactacacc agcagcctgc acagcggcgt gcctagccgg 240
tttagcggca gcggctccgg caccgactac accctgacca ttagctccct gcagcccgag 300
gacttcgcca cctactactg ccagcagtac tctgctctgc cgtggacctt cggccaggga 360
acaaaggtgg agatcaagcg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 702
<210> 353
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
" MCSP M4-3 (C1)"
<400> 353
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcccag 60
gtgcaattgc aggaaagcgg ccctggcctg gtcaagccca gccagaccct gagcctgacc 120
tgcaccgtgt ccggcggcag catcaccagc ggctattatt ggaactggat tcggcagcac 180
cccggcaagg gcctggaatg gatcggctac atcactttcg acggctctaa caactacaac 240
cccagcctga agtccagagt gaccatcagc cgggacacca gcaagaacca gttcagcctg 300
aagctgtcca gcgtgacagc cgccgacacc gccgtgtact actgcgccga cttcgactac 360
tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc agc 393
<210> 354
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H1
" MCSP M4-3 (C1)"
<400> 354
agcggctatt attggaac 18
<210> 355
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H2
" MCSP M4-3 (C1)"
<400> 355
tacatcactt tcgacggctc taacaactac aaccccagcc tgaagtcc 48
<210> 356
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H3
" MCSP M4-3 (C1)"
<400> 356
ttcgactac 9
<210> 357
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
"MCSP ML2 (G3) "
<400> 357
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgac 60
atccagatga cccagagccc cagcagcctg agcgccagcg tgggcgacag agtgaccatc 120
acctgccggg ccagccaggg catccggaac tacctgaact ggtatcagca gaagcccggc 180
aaggccccca agctgctgat ctactacacc agcagcctgc acagcggcgt gcctagccgg 240
tttagcggca gcggctccgg caccgactac accctgacca ttagctccct gcagcccgag 300
gacttcgcca cctactactg ccagcagtac tctgctctgc cgtggacctt cggccaggga 360
acaaaggtgg agatcaag 378
<210> 358
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L1
"MCSP ML2 (G3) "
<400> 358
cgggccagcc agggcatccg gaactacctg aac 33
<210> 359
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L2
"MCSP ML2 (G3) "
<400> 359
tacaccagca gcctgcacag cg 22
<210> 360
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L3
"MCSP ML2 (G3) "
<400> 360
cagcagtact ctgctctgcc gtggacc 27
<210> 361
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链
"CEA CH1A1A 98-99"
<400> 361
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gagctagtgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcca gcggctacac cttcaccgag ttcggcatga actgggtccg acaggctcca 180
ggccagggcc tcgaatggat gggctggatc aacaccaaga ccggcgaggc cacctacgtg 240
gaagagttca agggcagagt gaccttcacc acggacacca gcaccagcac cgcctacatg 300
gaactgcgga gcctgagaag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag atgggacttc 360
gcctattacg tggaagccat ggactactgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtctagc 420
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413
<210> 362
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
"CEA 2F1"
<400> 362
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg ggcctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc 60
aggtgtgata tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt gggagacaga 120
gtcaccatca cttgcaaggc cagtgcggct gtgggtacgt atgttgcgtg gtatcagcag 180
aaaccaggga aagcacctaa gctcctgatc tattcggcat cctaccgcaa aaggggagtc 240
ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 300
caacctgaag atttcgcaac ttactactgt caccaatatt acacctatcc tctattcacg 360
tttggccagg gcaccaagct cgagatcaag cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttag 714
<210> 363
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
"CEA CH1A1A 98-99"
<400> 363
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gagctagtgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcca gcggctacac cttcaccgag ttcggcatga actgggtccg acaggctcca 180
ggccagggcc tcgaatggat gggctggatc aacaccaaga ccggcgaggc cacctacgtg 240
gaagagttca agggcagagt gaccttcacc acggacacca gcaccagcac cgcctacatg 300
gaactgcgga gcctgagaag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag atgggacttc 360
gcctattacg tggaagccat ggactactgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtctagc 420
<210> 364
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H1
"CEA CH1A1A 98-99"
<400> 364
gagttcggca tgaac 15
<210> 365
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H2
"CEA CH1A1A 98-99"
<400> 365
tggatcaaca ccaagaccgg cgaggccacc tacgtggaag agttcaaggg c 51
<210> 366
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR H3
"CEA CH1A1A 98-99"
<400> 366
tgggacttcg cctattacgt ggaagccatg gactac 36
<210> 367
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
"CEA 2F1"
<400> 367
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtgc ggctgtgggt acgtatgttg cgtggtatca gcagaaacca 120
gggaaagcac ctaagctcct gatctattcg gcatcctacc gcaaaagggg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagatttcg caacttacta ctgtcaccaa tattacacct atcctctatt cacgtttggc 300
cagggcacca agctcgagat caag 324
<210> 368
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L1
"CEA 2F1"
<400> 368
aaggccagtg cggctgtggg tacgtatgtt gcg 33
<210> 369
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L2
"CEA 2F1"
<400> 369
tcggcatcct accgcaaaag g 21
<210> 370
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR L3
"CEA 2F1"
<400> 370
caccaatatt acacctatcc tctattcacg 30
<210> 371
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链人源化的
CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1)
<400> 371
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattctcag 60
gccgtcgtga cccaggaacc cagcctgaca gtgtctcctg gcggcaccgt gaccctgaca 120
tgtggcagtt ctacaggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggaaaag 180
cccggccagg ccttcagagg actgatcggc ggcaccaaca agagagcccc tggcacccct 240
gccagattca gcggatctct gctgggagga aaggccgccc tgacactgtc tggcgcccag 300
ccagaagatg aggccgagta ctactgcgcc ctgtggtaca gcaacctgtg ggtgttcggc 360
ggaggcacca agctgacagt gctgagcagc gcttccacca aaggcccttc cgtgtttcct 420
ctggctccta gctccaagtc cacctctgga ggcaccgctg ctctcggatg cctcgtgaag 480
gattattttc ctgagcctgt gacagtgtcc tggaatagcg gagcactgac ctctggagtg 540
catactttcc ccgctgtgct gcagtcctct ggactgtaca gcctgagcag cgtggtgaca 600
gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 660
aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc aagtcttgtt ga 702
<210> 372
<211> 2115
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCSP M4-3 (C1) (VH-CH1) -人源化的CD3 CH2527 (Crossfab
VH-Ck)-Fc(结) P329GLALA
<400> 372
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcccag 60
gtgcaattgc aggaaagcgg ccctggcctg gtcaagccca gccagaccct gagcctgacc 120
tgcaccgtgt ccggcggcag catcaccagc ggctattatt ggaactggat tcggcagcac 180
cccggcaagg gcctggaatg gatcggctac atcactttcg acggctctaa caactacaac 240
cccagcctga agtccagagt gaccatcagc cgggacacca gcaagaacca gttcagcctg 300
aagctgtcca gcgtgacagc cgccgacacc gccgtgtact actgcgccga cttcgactac 360
tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc agcgctagca caaagggccc cagcgtgttc 420
cctctggccc ctagcagcaa gagcacatct ggcggaacag ccgccctggg ctgcctcgtg 480
aaggactact ttcccgagcc tgtgaccgtg tcctggaact ctggcgccct gacaagcggc 540
gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc agcggcctgt actctctgag cagcgtggtc 600
accgtgccta gcagcagcct gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc 660
agcaacacca aagtggacaa gaaggtggag cccaagagct gtgatggcgg aggagggtcc 720
ggaggcggag gatccgaggt gcagctgctg gaatctggcg gcggactggt gcagcctggc 780
ggatctctga gactgagctg tgccgccagc ggcttcacct tcagcaccta cgccatgaac 840
tgggtgcgcc aggcccctgg caaaggcctg gaatgggtgt cccggatcag aagcaagtac 900
aacaactacg ccacctacta cgccgacagc gtgaagggcc ggttcaccat cagccgggac 960
gacagcaaga acaccctgta cctgcagatg aacagcctgc gggccgagga caccgccgtg 1020
tactattgtg tgcggcacgg caacttcggc aacagctatg tgtcttggtt tgcctactgg 1080
ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcaagc gctagcgtgg ccgctccctc cgtgtttatc 1140
tttcccccat ccgatgaaca gctgaaaagc ggcaccgcct ccgtcgtgtg tctgctgaac 1200
aatttttacc ctagggaagc taaagtgcag tggaaagtgg ataacgcact gcagtccggc 1260
aactcccagg aatctgtgac agaacaggac tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc 1320
accctgacac tgtctaaggc tgattatgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 1380
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg tgacaagacc 1440
cacacctgtc ccccttgtcc tgcccctgaa gctgctggcg gcccttctgt gttcctgttc 1500
cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc agccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg 1560
gtggatgtgt cccacgagga ccctgaagtg aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa 1620
gtgcacaacg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1680
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1740
tccaacaaag ccctcggcgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1800
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tgccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1860
agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1920
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1980
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 2040
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 2100
tctccgggta aatga 2115
<210> 373
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCSP M4-3 (C1) (VH-CH1)-Fc(扣) P329GLALA
<400> 373
atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggctaccg ccactggagt gcattcccag 60
gtgcaattgc aggaaagcgg ccctggcctg gtcaagccca gccagaccct gagcctgacc 120
tgcaccgtgt ccggcggcag catcaccagc ggctattatt ggaactggat tcggcagcac 180
cccggcaagg gcctggaatg gatcggctac atcactttcg acggctctaa caactacaac 240
cccagcctga agtccagagt gaccatcagc cgggacacca gcaagaacca gttcagcctg 300
aagctgtcca gcgtgacagc cgccgacacc gccgtgtact actgcgccga cttcgactac 360
tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc agcgctagca ccaagggccc ctccgtgttc 420
cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc ggcggcacag ccgctctggg ctgcctggtc 480
aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg tcctggaaca gcggagccct gacctccggc 540
gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagt tctggcctgt atagcctgag cagcgtggtc 600
accgtgcctt ctagcagcct gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc 660
agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc 720
ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 840
agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900
gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 960
accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020
gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1080
caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctctcg 1140
tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200
ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260
gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1380
aaatga 1386
<210> 374
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链人源化的CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1)
<400> 374
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattctcag 60
gccgtcgtga cccaggaacc cagcctgaca gtgtctcctg gcggcaccgt gaccctgaca 120
tgtggcagtt ctacaggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggaaaag 180
cccggccagg ccttcagagg actgatcggc ggcaccaaca agagagcccc tggcacccct 240
gccagattca gcggatctct gctgggagga aaggccgccc tgacactgtc tggcgcccag 300
ccagaagatg aggccgagta ctactgcgcc ctgtggtaca gcaacctgtg ggtgttcggc 360
ggaggcacca agctgacagt gctgagcagc gcttccacca aaggcccttc cgtgtttcct 420
ctggctccta gctccaagtc cacctctgga ggcaccgctg ctctcggatg cctcgtgaag 480
gattattttc ctgagcctgt gacagtgtcc tggaatagcg gagcactgac ctctggagtg 540
catactttcc ccgctgtgct gcagtcctct ggactgtaca gcctgagcag cgtggtgaca 600
gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 660
aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc aagtcttgtt ga 702
<210> 375
<211> 1827
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aVH (MCSP) -人源化的CD3 CH2527 (VH-CK)-Fc(结) P329GLALA
<400> 375
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgaa 60
gttcagctgg ttgaaagcgg tggtggtctg gttcagcctg gtggtagcct gcgtctgagc 120
tgtgcagcaa gcggttttaa tatcaaagat acctatattg gttgggttcg tcgtgcaccg 180
ggtaaaggta ccgaactggt tgcacgtatt tatccgacca atggttatac ccgttatgca 240
gatagcgtga aaggtcgttt taccattagc gcagatacca gcaaaaatac cgcatatctg 300
cagatgaata gcctgcgtgc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgcg tacttcttgg 360
ggtggttggc tgtctggtga ctactggggc caaggaaccc tggttactgt ctcgagtggc 420
ggaggagggt ccggaggcgg aggatccgag gtgcagctgc tggaatctgg cggcggactg 480
gtgcagcctg gcggatctct gagactgagc tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcacc 540
tacgccatga actgggtgcg ccaggcccct ggcaaaggcc tggaatgggt gtcccggatc 600
agaagcaagt acaacaacta cgccacctac tacgccgaca gcgtgaaggg ccggttcacc 660
atcagccggg acgacagcaa gaacaccctg tacctgcaga tgaacagcct gcgggccgag 720
gacaccgccg tgtactattg tgtgcggcac ggcaacttcg gcaacagcta tgtgtcttgg 780
tttgcctact ggggccaggg caccctcgtg accgtgtcaa gcgctagcgt ggccgctccc 840
tccgtgttta tctttccccc atccgatgaa cagctgaaaa gcggcaccgc ctccgtcgtg 900
tgtctgctga acaattttta ccctagggaa gctaaagtgc agtggaaagt ggataacgca 960
ctgcagtccg gcaactccca ggaatctgtg acagaacagg actccaagga cagcacctac 1020
tccctgtcct ccaccctgac actgtctaag gctgattatg agaaacacaa agtctacgcc 1080
tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag 1140
tgtgacaaga cccacacctg tcccccttgt cctgcccctg aagctgctgg cggcccttct 1200
gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac accctgatga tcagccggac ccccgaagtg 1260
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 1320
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 1380
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1440
aagtgcaagg tctccaacaa agccctcggc gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1500
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catgccggga tgagctgacc 1560
aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1620
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1680
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1740
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1800
agcctctccc tgtctccggg taaatga 1827
<210> 376
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aVH (MCSP) -Fc(扣) P329GLALA
<400> 376
atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggctaccg ccactggagt gcattccgaa 60
gttcagctgg ttgaaagcgg tggtggtctg gttcagcctg gtggtagcct gcgtctgagc 120
tgtgcagcaa gcggttttaa tatcaaagat acctatattg gttgggttcg tcgtgcaccg 180
ggtaaaggta ccgaactggt tgcacgtatt tatccgacca atggttatac ccgttatgca 240
gatagcgtga aaggtcgttt taccattagc gcagatacca gcaaaaatac cgcatatctg 300
cagatgaata gcctgcgtgc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgcg tacttcttgg 360
ggtggttggc tgtctggtga ctactggggc caaggaaccc tggttactgt ctcgagtgac 420
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagctg cagggggacc gtcagtcttc 480
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 540
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 600
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 660
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 720
aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 780
cagccccgag aaccacaggt gtgcaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 840
caggtcagcc tctcgtgcgc agtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 900
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 960
ggctccttct tcctcgtgag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1020
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1080
tccctgtctc cgggtaaatg a 1101
<210> 377
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链
"MCSP ML2 (G3) "
<400> 377
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgac 60
atccagatga cccagagccc cagcagcctg agcgccagcg tgggcgacag agtgaccatc 120
acctgccggg ccagccaggg catccggaac tacctgaact ggtatcagca gaagcccggc 180
aaggccccca agctgctgat ctactacacc agcagcctgc acagcggcgt gcctagccgg 240
tttagcggca gcggctccgg caccgactac accctgacca ttagctccct gcagcccgag 300
gacttcgcca cctactactg ccagcagtac tctgctctgc cgtggacctt cggccaggga 360
acaaaggtgg agatcaagcg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 702
<210> 378
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链人源化的CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1)
<400> 378
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattctcag 60
gccgtcgtga cccaggaacc cagcctgaca gtgtctcctg gcggcaccgt gaccctgaca 120
tgtggcagtt ctacaggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggaaaag 180
cccggccagg ccttcagagg actgatcggc ggcaccaaca agagagcccc tggcacccct 240
gccagattca gcggatctct gctgggagga aaggccgccc tgacactgtc tggcgcccag 300
ccagaagatg aggccgagta ctactgcgcc ctgtggtaca gcaacctgtg ggtgttcggc 360
ggaggcacca agctgacagt gctgagcagc gcttccacca aaggcccttc cgtgtttcct 420
ctggctccta gctccaagtc cacctctgga ggcaccgctg ctctcggatg cctcgtgaag 480
gattattttc ctgagcctgt gacagtgtcc tggaatagcg gagcactgac ctctggagtg 540
catactttcc ccgctgtgct gcagtcctct ggactgtaca gcctgagcag cgtggtgaca 600
gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 660
aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc aagtcttgtt ga 702
<210> 379
<211> 2115
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCSP M4-3(C1) -人源化的CD3 CH2527 (VH-CK)-Fc(DD) P329GLALA
<400> 379
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcccag 60
gtgcaattgc aggaaagcgg ccctggcctg gtcaagccca gccagaccct gagcctgacc 120
tgcaccgtgt ccggcggcag catcaccagc ggctattatt ggaactggat tcggcagcac 180
cccggcaagg gcctggaatg gatcggctac atcactttcg acggctctaa caactacaac 240
cccagcctga agtccagagt gaccatcagc cgggacacca gcaagaacca gttcagcctg 300
aagctgtcca gcgtgacagc cgccgacacc gccgtgtact actgcgccga cttcgactac 360
tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc agcgctagca caaagggccc cagcgtgttc 420
cctctggccc ctagcagcaa gagcacatct ggcggaacag ccgccctggg ctgcctcgtg 480
aaggactact ttcccgagcc tgtgaccgtg tcctggaact ctggcgccct gacaagcggc 540
gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc agcggcctgt actctctgag cagcgtggtc 600
accgtgccta gcagcagcct gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc 660
agcaacacca aagtggacaa gaaggtggag cccaagagct gtgatggcgg aggagggtcc 720
ggaggcggag gatccgaggt gcagctgctg gaatctggcg gcggactggt gcagcctggc 780
ggatctctga gactgagctg tgccgccagc ggcttcacct tcagcaccta cgccatgaac 840
tgggtgcgcc aggcccctgg caaaggcctg gaatgggtgt cccggatcag aagcaagtac 900
aacaactacg ccacctacta cgccgacagc gtgaagggcc ggttcaccat cagccgggac 960
gacagcaaga acaccctgta cctgcagatg aacagcctgc gggccgagga caccgccgtg 1020
tactattgtg tgcggcacgg caacttcggc aacagctatg tgtcttggtt tgcctactgg 1080
ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcaagc gctagcgtgg ccgctccctc cgtgtttatc 1140
tttcccccat ccgatgaaca gctgaaaagc ggcaccgcct ccgtcgtgtg tctgctgaac 1200
aatttttacc ctagggaagc taaagtgcag tggaaagtgg ataacgcact gcagtccggc 1260
aactcccagg aatctgtgac agaacaggac tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc 1320
accctgacac tgtctaaggc tgattatgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 1380
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg tgacaagacc 1440
cacacctgtc ccccttgtcc tgcccctgaa gctgctggcg gcccttctgt gttcctgttc 1500
cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc agccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg 1560
gtggatgtgt cccacgagga ccctgaagtg aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa 1620
gtgcacaacg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1680
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1740
tccaacaaag ccctcggcgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1800
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1860
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1920
aatgggcagc cggagaacaa ctacgacacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1980
ttcttcctct acagcgacct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 2040
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 2100
tctccgggta aatga 2115
<210> 380
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCSP M4-3(C1) - Fc(KK) P329GLALA
<400> 380
atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggctaccg ccactggagt gcattcccag 60
gtgcagctgc aggaaagcgg ccctggcctg gtcaagccca gccagaccct gagcctgacc 120
tgcaccgtgt ccggcggcag catcaccagc ggctactact ggaactggat ccggcagcac 180
cccggcaagg gcctggaatg gatcggctac atcacctacg acggcagcaa caactacaac 240
cccagcctga agtccagagt gaccatcagc cgggacacca gcaagaacca gttcagcctg 300
aagctgtcca gcgtgacagc cgccgacacc gccgtgtact actgcgccga cttcgactac 360
tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc agcgctagca ccaagggccc atcggtcttc 420
cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 480
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 540
gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 600
accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 660
agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 720
ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 840
agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900
gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 960
accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020
gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1080
caggtgtaca ccctgccccc atcccggaaa gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140
tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200
ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctgaagt ccgacggctc cttcttcctc 1260
tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1380
aaatga 1386
<210> 381
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 人源化的
CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1)
<400> 381
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattctcag 60
gccgtcgtga cccaggaacc cagcctgaca gtgtctcctg gcggcaccgt gaccctgaca 120
tgtggcagtt ctacaggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggaaaag 180
cccggccagg ccttcagagg actgatcggc ggcaccaaca agagagcccc tggcacccct 240
gccagattca gcggatctct gctgggagga aaggccgccc tgacactgtc tggcgcccag 300
ccagaagatg aggccgagta ctactgcgcc ctgtggtaca gcaacctgtg ggtgttcggc 360
ggaggcacca agctgacagt gctgagcagc gcttccacca aaggcccttc cgtgtttcct 420
ctggctccta gctccaagtc cacctctgga ggcaccgctg ctctcggatg cctcgtgaag 480
gattattttc ctgagcctgt gacagtgtcc tggaatagcg gagcactgac ctctggagtg 540
catactttcc ccgctgtgct gcagtcctct ggactgtaca gcctgagcag cgtggtgaca 600
gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 660
aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc aagtcttgtt ga 702
<210> 382
<211> 2142
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA CH1A1A 98/99 -人源化的CD3 CH2527 (Crossfab VH-Ck)-Fc(结)
P329GLALA
<400> 382
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gcgccagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcca gcggctacac cttcaccgag ttcggcatga actgggtccg acaggcccct 180
ggacagggcc tggaatggat gggctggatc aacaccaaga ccggcgaggc cacctacgtg 240
gaagagttca agggcagagt gaccttcacc accgacacca gcaccagcac cgcctacatg 300
gaactgcgga gcctgagaag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag atgggacttc 360
gcctactatg tggaagccat ggactactgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtctagt 420
gctagcacaa agggccccag cgtgttccct ctggccccta gcagcaagag cacatctggc 480
ggaacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactactttc ccgagcccgt gacagtgtcc 540
tggaactctg gcgccctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagagcagc 600
ggcctgtact ctctgagcag cgtggtcacc gtgcctagct ctagcctggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 720
aagagctgcg atggcggagg cggctccgga ggcggaggat ccgaggtgca gctgctggaa 780
tctggcggcg gactggtgca gcctggcgga tctctgagac tgagctgtgc cgccagcggc 840
ttcaccttca gcacctacgc catgaactgg gtgcgccagg cccctggcaa aggcctggaa 900
tgggtgtccc ggatcagaag caagtacaac aactacgcca cctactacgc cgacagcgtg 960
aagggccggt tcaccatcag ccgggacgac agcaagaaca ccctgtacct gcagatgaac 1020
agcctgcggg ccgaggacac cgccgtgtac tattgtgtgc ggcacggcaa cttcggcaac 1080
agctatgtgt cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcaagcgct 1140
agcgtggccg ctccctccgt gtttatcttt cccccatccg atgaacagct gaaaagcggc 1200
accgcctccg tcgtgtgtct gctgaacaat ttttacccta gggaagctaa agtgcagtgg 1260
aaagtggata acgcactgca gtccggcaac tcccaggaat ctgtgacaga acaggactcc 1320
aaggacagca cctactccct gtcctccacc ctgacactgt ctaaggctga ttatgagaaa 1380
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 1440
ttcaacaggg gagagtgtga caagacccac acctgtcccc cttgtcctgc ccctgaagct 1500
gctggcggcc cttctgtgtt cctgttcccc ccaaagccca aggacaccct gatgatcagc 1560
cggacccccg aagtgacctg cgtggtggtg gatgtgtccc acgaggaccc tgaagtgaag 1620
ttcaattggt acgtggacgg cgtggaagtg cacaacgcca agacaaagcc gcgggaggag 1680
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1740
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcggcgcccc catcgagaaa 1800
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatgc 1860
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc 1920
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1980
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 2040
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 2100
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 2142
<210> 383
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA CH1A1A 98/99 (VH-CH1)-Fc(扣) P329GLALA
<400> 383
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gagctagtgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcca gcggctacac cttcaccgag ttcggcatga actgggtccg acaggctcca 180
ggccagggcc tcgaatggat gggctggatc aacaccaaga ccggcgaggc cacctacgtg 240
gaagagttca agggcagagt gaccttcacc acggacacca gcaccagcac cgcctacatg 300
gaactgcgga gcctgagaag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag atgggacttc 360
gcctattacg tggaagccat ggactactgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtctagc 420
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 480
ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 540
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 600
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 720
aagagctgcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140
ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413
<210> 384
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 DP47 GS
<400> 384
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgaa 60
atcgtgttaa cgcagtctcc aggcaccctg tctttgtctc caggggaaag agccaccctc 120
tcttgcaggg ccagtcagag tgttagcagc agctacttag cctggtacca gcagaaacct 180
ggccaggctc ccaggctcct catctatgga gcatccagca gggccactgg catcccagac 240
aggttcagtg gcagtggatc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 300
gaagattttg cagtgtatta ctgtcagcag tatggtagct caccgctgac gttcggccag 360
gggaccaaag tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705
<210> 385
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链人源化的
CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1)
<400> 385
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattctcag 60
gccgtcgtga cccaggaacc cagcctgaca gtgtctcctg gcggcaccgt gaccctgaca 120
tgtggcagtt ctacaggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggaaaag 180
cccggccagg ccttcagagg actgatcggc ggcaccaaca agagagcccc tggcacccct 240
gccagattca gcggatctct gctgggagga aaggccgccc tgacactgtc tggcgcccag 300
ccagaagatg aggccgagta ctactgcgcc ctgtggtaca gcaacctgtg ggtgttcggc 360
ggaggcacca agctgacagt gctgagcagc gcttccacca aaggcccttc cgtgtttcct 420
ctggctccta gctccaagtc cacctctgga ggcaccgctg ctctcggatg cctcgtgaag 480
gattattttc ctgagcctgt gacagtgtcc tggaatagcg gagcactgac ctctggagtg 540
catactttcc ccgctgtgct gcagtcctct ggactgtaca gcctgagcag cgtggtgaca 600
gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 660
aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc aagtcttgtt ga 702
<210> 386
<211> 2124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 GS (VH-CH1) -人源化的CD3 CH2527 (Crossfab VH-Ck)-Fc(结)
P329GLALA
<400> 386
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60
gtgcaattgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcct ccggattcac ctttagcagt tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180
gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 240
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa aggcagcgga 360
tttgactact ggggccaagg aaccctggtc accgtctcga gtgctagcac aaagggcccc 420
agcgtgttcc ctctggcccc tagcagcaag agcacatctg gcggaacagc cgccctgggc 480
tgcctcgtga aggactactt tcccgagcct gtgaccgtgt cctggaactc tggcgccctg 540
acaagcggcg tgcacacctt tccagccgtg ctgcagagca gcggcctgta ctctctgagc 600
agcgtggtca ccgtgcctag cagcagcctg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac 660
cacaagccca gcaacaccaa agtggacaag aaggtggagc ccaagagctg tgatggcgga 720
ggagggtccg gaggcggagg atccgaggtg cagctgctgg aatctggcgg cggactggtg 780
cagcctggcg gatctctgag actgagctgt gccgccagcg gcttcacctt cagcacctac 840
gccatgaact gggtgcgcca ggcccctggc aaaggcctgg aatgggtgtc ccggatcaga 900
agcaagtaca acaactacgc cacctactac gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc 960
agccgggacg acagcaagaa caccctgtac ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac 1020
accgccgtgt actattgtgt gcggcacggc aacttcggca acagctatgt gtcttggttt 1080
gcctactggg gccagggcac cctcgtgacc gtgtcaagcg ctagcgtggc cgctccctcc 1140
gtgtttatct ttcccccatc cgatgaacag ctgaaaagcg gcaccgcctc cgtcgtgtgt 1200
ctgctgaaca atttttaccc tagggaagct aaagtgcagt ggaaagtgga taacgcactg 1260
cagtccggca actcccagga atctgtgaca gaacaggact ccaaggacag cacctactcc 1320
ctgtcctcca ccctgacact gtctaaggct gattatgaga aacacaaagt ctacgcctgc 1380
gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 1440
gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccctgaag ctgctggcgg cccttctgtg 1500
ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 1560
tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac 1620
ggcgtggaag tgcacaacgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 1680
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1740
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1800
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag 1860
aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1920
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1980
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 2040
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 2100
ctctccctgt ctccgggtaa atga 2124
<210> 387
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 GS (VH-CH1)-Fc(扣) P329GLALA
<400> 387
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60
gtgcaattgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcct ccggattcac ctttagcagt tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180
gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 240
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa aggcagcgga 360
tttgactact ggggccaagg aaccctggtc accgtctcga gtgctagcac caagggcccc 420
tccgtgttcc ccctggcccc cagcagcaag agcaccagcg gcggcacagc cgctctgggc 480
tgcctggtca aggactactt ccccgagccc gtgaccgtgt cctggaacag cggagccctg 540
acctccggcg tgcacacctt ccccgccgtg ctgcagagtt ctggcctgta tagcctgagc 600
agcgtggtca ccgtgccttc tagcagcctg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac 660
cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaggtggagc ccaagagctg cgacaaaact 720
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gctgcagggg gaccgtcagt cttcctcttc 780
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 840
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 960
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020
tccaacaaag ccctcggcgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080
cgagaaccac aggtgtgcac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1140
agcctctcgt gcgcagtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260
ttcttcctcg tgagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380
tctccgggta aatga 1395
<210> 388
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链人源化的CD3 CH2527 (Crossfab, VL-CH1)
<400> 388
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattctcag 60
gccgtcgtga cccaggaacc cagcctgaca gtgtctcctg gcggcaccgt gaccctgaca 120
tgtggcagtt ctacaggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggaaaag 180
cccggccagg ccttcagagg actgatcggc ggcaccaaca agagagcccc tggcacccct 240
gccagattca gcggatctct gctgggagga aaggccgccc tgacactgtc tggcgcccag 300
ccagaagatg aggccgagta ctactgcgcc ctgtggtaca gcaacctgtg ggtgttcggc 360
ggaggcacca agctgacagt gctgagcagc gcttccacca aaggcccttc cgtgtttcct 420
ctggctccta gctccaagtc cacctctgga ggcaccgctg ctctcggatg cctcgtgaag 480
gattattttc ctgagcctgt gacagtgtcc tggaatagcg gagcactgac ctctggagtg 540
catactttcc ccgctgtgct gcagtcctct ggactgtaca gcctgagcag cgtggtgaca 600
gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 660
aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc aagtcttgtt ga 702
<210> 389
<211> 1836
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Darpin (HER2) -人源化的CD3 CH2527 (VH-CK)-Fc(结) P329GLALA
<400> 389
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgat 60
ctgggcaaga agctgctgga agccgccaga gccggccagg acgacgaagt gcggatcctg 120
atggccaacg gcgccgacgt gaacgccaag gacgagtacg gcctgacccc tctgtatctg 180
gccacagccc acggccacct ggaaatcgtg gaggtgctgc tgaagaacgg ggccgatgtg 240
aacgccgtgg acgccatcgg cttcacacct ctgcacctgg ccgccttcat cggccacctc 300
gagattgccg aggtcctgct gaaacatggc gctgacgtga acgctcagga caagttcggc 360
aagaccgcct tcgacatcag catcggcaac ggcaacgagg acctggccga gatcctgcag 420
aagctgggcg gaggagggtc cggaggcgga ggatccgagg tgcagctgct ggaatctggc 480
ggcggactgg tgcagcctgg cggatctctg agactgagct gtgccgccag cggcttcacc 540
ttcagcacct acgccatgaa ctgggtgcgc caggcccctg gcaaaggcct ggaatgggtg 600
tcccggatca gaagcaagta caacaactac gccacctact acgccgacag cgtgaagggc 660
cggttcacca tcagccggga cgacagcaag aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg 720
cgggccgagg acaccgccgt gtactattgt gtgcggcacg gcaacttcgg caacagctat 780
gtgtcttggt ttgcctactg gggccagggc accctcgtga ccgtgtcaag cgctagcgtg 840
gccgctccct ccgtgtttat ctttccccca tccgatgaac agctgaaaag cggcaccgcc 900
tccgtcgtgt gtctgctgaa caatttttac cctagggaag ctaaagtgca gtggaaagtg 960
gataacgcac tgcagtccgg caactcccag gaatctgtga cagaacagga ctccaaggac 1020
agcacctact ccctgtcctc caccctgaca ctgtctaagg ctgattatga gaaacacaaa 1080
gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 1140
aggggagagt gtgacaagac ccacacctgt cccccttgtc ctgcccctga agctgctggc 1200
ggcccttctg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 1260
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 1320
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 1380
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1440
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1500
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atgccgggat 1560
gagctgacca agaaccaggt cagcctgtgg tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1620
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1680
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1740
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1800
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1836
<210> 390
<211> 1110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Darpin (HER2) -Fc(扣) P329GLALA
<400> 390
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgat 60
ctgggcaaga agctgctgga agccgccaga gccggccagg acgacgaagt gcggatcctg 120
atggccaacg gcgccgacgt gaacgccaag gacgagtacg gcctgacccc tctgtatctg 180
gccacagccc acggccacct ggaaatcgtg gaggtgctgc tgaagaacgg ggccgatgtg 240
aacgccgtgg acgccatcgg cttcacacct ctgcacctgg ccgccttcat cggccacctc 300
gagattgccg aggtcctgct gaaacatggc gctgacgtga acgctcagga caagttcggc 360
aagaccgcct tcgacatcag catcggcaac ggcaacgagg acctggccga gatcctgcag 420
aagctggaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 480
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 540
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 600
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 660
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 720
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 780
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tgcaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 840
accaagaacc aggtcagcct ctcgtgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 900
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 960
gactccgacg gctccttctt cctcgtgagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1020
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1080
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1110

Claims (68)

1.T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分和能够与靶细胞抗原特异性结合的第二抗原结合部分，
其中所述的一个抗原结合部分是Fab分子或交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中另一个抗原结合部分包含单结构域抗原结合分子。
2.根据权利要求1所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述单结构域抗原结合分子是单结构域可变重链。
3.根据权利要求2所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中能够与靶细胞抗原特异性结合的第二抗原结合部分由单结构域可变重链组成。
4.T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分和能够与靶细胞抗原特异性结合的第二抗原结合部分，
其中所述的一个抗原结合部分是Fab分子或交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中另一个抗原结合部分是包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。
5.根据权利要求4所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中能够与T细胞活化抗原特异性结合的第一抗原结合部分是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换并且其中第二抗原结合部分是包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。
6.根据权利要求4或5所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第二抗原部分包含含有两个、三个、四个或五个锚蛋白重复基序的结合蛋白。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其还包含含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含不多于一个能够与T细胞活化抗原特异性结合的抗原结合部分。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第一和第二抗原结合部分彼此融合，任选地通过肽接头彼此融合。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分。
12.根据权利要求11所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第三抗原结合部分是单结构域抗原结合分子。
13.根据权利要求12所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中单结构域抗原结合分子是单结构域可变重链。
14.根据权利要求13所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含
a)含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，
b)第一抗原结合部分，其包含其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的交换Fab分子，其中所述交换Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合；
c)第二抗原结合部分，其包含单结构域可变重链，其中所述单结构域可变重链与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，和
d)第三抗原结合部分，其包含单结构域可变重链，其中所述单结构域可变重链与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。
15.根据权利要求11所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第三抗原结合部分是包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。
16.根据权利要求15所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第三抗原结合部分是包含两个、三个、四个或五个锚蛋白重复基序的结合蛋白。
17.根据权利要求15或16所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含
a)含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，
b)第一抗原结合部分，其包含其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的交换Fab分子，其中所述交换Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合；
c)第二抗原结合部分，其包含含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白，其中所述含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，和
d)第三抗原结合部分，其包含含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白，其中含有至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。
18.根据权利要求14或17所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合部分与T细胞活化抗原结合并且第二和第三抗原结合部分与相同的靶细胞抗原结合。
19.根据权利要求7至19中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中Fc结构域是IgG Fc结构域，特别地是IgG1或IgG4 Fc结构域。
20.根据权利要求19所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中Fc结构域是人Fc结构域。
21.根据权利要求7至20中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰。
22.根据权利要求21所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基由具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3结构域内部产生可安置在第二亚基的CH3结构域内部腔中的突出部分，并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基由具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3结构域内部产生腔，在所述腔内部可安置第一亚基的CH3结构域内部的突出部分。
23.根据权利要求7至22中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中与天然IgG1 Fc结构域相比，Fc结构域显示降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。
24.根据权利要求7至23中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中Fc结构域包含降低与Fc受体结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸置换。
25.根据权利要求24所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述一个或多个氨基酸置换位于选自L234、L235和P329的一个或多个位置。
26.根据权利要求25所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中Fc结构域的每个亚基包含降低与活化性Fc受体结合和/或效应子功能的三个氨基酸置换，其中所述氨基酸置换是L234A、L235A和P329G。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中Fc受体是Fcγ受体。
28.根据权利要求20至23中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中效应子功能是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
29.T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含第一和第二抗原结合部分，所述抗原结合部分之一是能够与T细胞活化抗原特异性结合的Fab分子并且另一个抗原结合部分是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子；
其中第一抗原结合部分是
(a)其中Fab轻链和Fab重链由肽接头连接的单链Fab分子，或
(b)其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换的交换Fab分子；并且其中Fc结构域包含
和含有能够稳定缔合的第一和第二亚基的Fc结构域，
其中已经修饰所述第一亚基和所述第二亚基以包含静电上有利于异二聚体形成的一个或多个带电荷的氨基酸。
30.根据权利要求29所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述第一亚基包含氨基酸突变E356K、E357K和D399K并且所述第二亚基包含氨基酸突变K370E、K409E和K439E。
31.根据权利要求29所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述第一亚基包含氨基酸突变K392D、K409D并且所述第二亚基包含氨基酸突变E356K、399K(DDKK)。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含不多于一个能够与T细胞活化抗原特异性结合的抗原结合部分。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第一和第二抗原结合部分彼此融合，任选地通过肽接头彼此融合。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。
35.根据权利要求29至33中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。
36.根据权利要求34或35所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合部分是交换Fab分子并且第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链彼此融合，任选地通过肽接头彼此融合。
37.根据权利要求29至33中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中T细胞活化性双特异性抗原结合分子的第二抗原结合部分在Fab轻链的C末端与第一抗原结合部分的Fab轻链的N末端融合。
38.根据权利要求29至33、35或37中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中T细胞活化性双特异性抗原结合分子的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。
39.根据权利要求29至34中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。
40.根据权利要求29至32所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第一和第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合。
41.根据权利要求29至40中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含第三抗原结合部分，所述第三抗原结合部分是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子。
42.根据权利要求41所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第三抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。
43.根据权利要求41或42所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第二和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。
44.根据权利要求41或42所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第一和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。
45.根据权利要求43所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中第二和第三抗原结合部分和Fc结构域是免疫球蛋白分子的部分，特别地是IgG类免疫球蛋白的部分。
46.根据权利要求29至45中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中Fc结构域是IgG Fc结构域，特别地是IgG1或IgG4 Fc结构域。
47.根据权利要求29至46所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中Fc结构域是人Fc结构域。
48.根据权利要求29至47中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中与天然IgG1 Fc结构域相比，Fc结构域显示降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。
49.根据权利要求29至49中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中Fc结构域包含降低与Fc受体结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸置换。
50.根据权利要求49所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述一个或多个氨基酸置换位于选自L234、L235和P329的一个或多个位置。
51.根据权利要求50所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中Fc结构域的每个亚基包含降低与活化性Fc受体结合和/或效应子功能的三个氨基酸置换，其中所述氨基酸置换是L234A、L235A和P329G。
52.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中T细胞活化抗原是CD3。
53.根据前述权利要求中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中靶细胞抗原选自：黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、CD19、CD20、CD33、癌胚抗原(CEA)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)。
54.分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至53中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段。
55.多肽，其由根据权利要求54所述的分离的多核苷酸编码。
56.载体，特别地是表达载体，其包含根据权利要求54所述的分离的多核苷酸。
57.宿主细胞，其包含根据权利要求54所述的分离的多核苷酸或根据权利要求56所述的表达载体。
58.产生根据权利要求1至53中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，其包括步骤a)在适于表达T细胞活化性双特异性抗原结合分子的条件下培养根据权利要求57所述的宿主细胞和b)回收T细胞活化性双特异性抗原结合分子。
59.T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其是通过根据权利要求58所述的方法产生的。
60.药物组合物，其包含根据权利要求1至53中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子和可药用载体。
61.根据权利要求1至53中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或根据权利要求60所述的药物组合物，用作药物。
62.根据权利要求1至53中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或根据权利要求60所述的药物组合物，用于治疗有需求的个体中的疾病。
63.根据权利要求62所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或药物组合物，其中疾病是癌症。
64.根据权利要求1至53中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的用途，用于制备治疗有需求的个体中疾病的药物。
65.治疗个体中疾病的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含可药用形式的根据权利要求1至53中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。
66.根据权利要求64所述的用途或根据权利要求65所述的方法，其中所述疾病是癌症。
67.用于诱导靶细胞裂解的方法，包括在T细胞存在下使靶细胞与根据权利要求1-53中任一项所述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子接触。
68.如本文所述的本发明。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021237717A1 (zh) * 2020-05-29 2021-12-02 武汉友芝友生物制药有限公司 抗cldn18.2和cd3的双特异性抗体
CN114317562A (zh) * 2022-02-22 2022-04-12 辽宁省农业科学院 普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白的编码基因PvEXO70及应用

Families Citing this family (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107586340B (zh) 2011-08-23 2022-01-21 罗切格利卡特公司 对t细胞活化性抗原和肿瘤抗原特异性的双特异性抗体及使用方法
EP3586874A1 (en) 2012-08-14 2020-01-01 IBC Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
US20150231241A1 (en) 2012-08-14 2015-08-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
US9682143B2 (en) 2012-08-14 2017-06-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
JP6444874B2 (ja) 2012-10-08 2018-12-26 ロシュ グリクアート アーゲー ２つのＦａｂフラグメントを含むＦｃ不含抗体および使用方法
RU2015140915A (ru) 2013-02-26 2017-04-03 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
WO2014131712A1 (en) 2013-02-26 2014-09-04 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
KR102236367B1 (ko) * 2013-07-26 2021-04-05 삼성전자주식회사 DARPin을 포함하는 이중 특이 키메라 단백질
GB201409558D0 (en) 2014-05-29 2014-07-16 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201412659D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
LT3177643T (lt) 2014-08-04 2019-08-12 F. Hoffmann-La Roche Ag T ląstelę aktyvinantį antigeną surišančios bispecifinės molekulės
EP3023437A1 (en) * 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
KR102648966B1 (ko) * 2014-11-20 2024-03-19 에프. 호프만-라 로슈 아게 Folr1 및 cd3에 대한 t 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자
WO2016079050A1 (en) 2014-11-20 2016-05-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules cd3 abd folate receptor 1 (folr1) and pd-1 axis binding antagonists
KR102663073B1 (ko) 2015-01-08 2024-05-07 젠맵 에이/에스 Cd3 및 cd20에 대항한 이중특이적 항체
PL3298033T5 (pl) 2015-05-18 2023-10-30 TCR2 Therapeutics Inc. Kompozycje i zastosowania medyczne do reprogramowania TCR z zastosowaniem białek fuzyjnych
CA2985718A1 (en) 2015-06-24 2016-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-transferrin receptor antibodies with tailored affinity
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201601075D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies molecules
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
AR106201A1 (es) * 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche Moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de células t
WO2017055385A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xgd2 bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2017055391A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules binding mesothelin and cd3
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
WO2017055392A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xcd44v6 bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP3356406A1 (en) 2015-10-02 2018-08-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific anti-human cd20/human transferrin receptor antibodies and methods of use
WO2017055318A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Cd33xcd3 bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP3356407B1 (en) * 2015-10-02 2021-11-03 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific anti-cd19xcd3 t cell activating antigen binding molecules
WO2017055393A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xtim-3 bispecific t cell activating antigen binding molecules
US20180282410A1 (en) * 2015-10-02 2018-10-04 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-cd3xrob04 bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN105296421B (zh) * 2015-11-24 2019-01-29 高岱清 一种双特异性抗体活化的t细胞及制备方法与应用
GB201521391D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521382D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521389D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201521383D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl And Ucb Celltech Method
GB201521393D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
WO2017097723A2 (en) 2015-12-09 2017-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment method
KR20180097615A (ko) 2016-01-08 2018-08-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-1 축 결합 길항물질 및 항-cea/항-cd3 이중특이성 항체를 사용하는 cea-양성 암의 치료 방법
DK3433280T5 (da) 2016-03-22 2024-09-16 F Hoffmann La Roche Ag Protease-aktiverede T-celle-bispecifikke molekyler
KR102098919B1 (ko) * 2016-07-19 2020-04-23 (주) 아이벤트러스 이중 특이성 단백질 및 이의 제조 방법
CN109715668A (zh) 2016-08-02 2019-05-03 T细胞受体治疗公司 用于使用融合蛋白进行tcr重编程的组合物和方法
CN107384932B (zh) 2016-08-31 2020-10-20 北京天广实生物技术股份有限公司 抗人cd20人源化单克隆抗体mil62、其制备方法及用途
US10882918B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific T cell activating antigen binding molecules
ES2875959T3 (es) 2016-10-07 2021-11-11 Tcr2 Therapeutics Inc Composiciones y métodos para reprogramación de receptores de linfocitos T mediante el uso de proteínas de fusión
US11851491B2 (en) 2016-11-22 2023-12-26 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
IL267113B2 (en) 2016-12-21 2024-09-01 Cephalon Llc Antibodies that bind specifically to human IL-15 and their uses
WO2018156106A1 (en) * 2017-02-22 2018-08-30 Ding Enyu An mrna cancer vaccine encoding human gm-csf fused to multiple tandem epitopes
WO2018178055A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
TWI800552B (zh) 2017-11-10 2023-05-01 新加坡科技研究局 介白素2受體β(IL2Rβ)/共同γ鏈抗體
WO2019122046A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Universal reporter cell assay for specificity test of novel antigen binding moieties
EP3502140A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
CN111836630A (zh) * 2018-01-05 2020-10-27 希望之城 多特异性配体结合物
CN111630063A (zh) * 2018-01-31 2020-09-04 豪夫迈·罗氏有限公司 稳定化的免疫球蛋白结构域
MX2020008289A (es) 2018-02-08 2020-09-25 Genentech Inc Moleculas biespecificas de union al antigeno y metodos de uso.
WO2019173832A2 (en) * 2018-03-09 2019-09-12 AskGene Pharma, Inc. Novel cytokine prodrugs
CN110305210B (zh) * 2018-03-27 2023-02-28 信达生物制药(苏州)有限公司 新型抗体分子、其制备方法及其用途
WO2019184909A1 (zh) * 2018-03-27 2019-10-03 信达生物制药(苏州)有限公司 新型抗体分子、其制备方法及其用途
WO2019185163A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Hummingbird Bioscience Holdings Pte. Ltd. Vista antigen-binding molecules
US20190300610A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Vista antigen-binding molecules
WO2019185164A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Hummingbird Bioscience Holdings Pte. Ltd. Her3 antigen-binding molecules
US20210163562A1 (en) * 2018-07-25 2021-06-03 AskGene Pharma, Inc. Novel IL-21 Prodrugs and Methods of Use Thereof
CN110964114B (zh) * 2018-09-29 2023-07-04 上海博槿生物科技有限公司 一种双靶点抗原结合分子
GB201817354D0 (en) 2018-10-25 2018-12-12 Hummingbird Bioscience Pte Ltd Engineered FC
WO2020095107A1 (en) * 2018-11-07 2020-05-14 Crispr Therapeutics Ag Anti-cd33 immune cell cancer therapy
WO2020094834A1 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Euchloe Bio Pte. Ltd. Il2rbeta/common gamma chain antibodies
WO2020094836A1 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Euchloe Bio Pte. Ltd. Il2rbeta/common gamma chain antibodies
SG11202102859TA (en) 2018-12-21 2021-04-29 Hoffmann La Roche Antibodies binding to cd3
SG11202109122SA (en) * 2019-02-21 2021-09-29 Marengo Therapeutics Inc Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
CN114531878A (zh) 2019-06-27 2022-05-24 豪夫迈·罗氏有限公司 新颖icos抗体及包含它们的肿瘤靶向抗原结合分子
KR20220028035A (ko) * 2019-07-31 2022-03-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 Gprc5d에 결합하는 항체
CN112390882A (zh) * 2019-08-19 2021-02-23 杨洋 靶向cd3和cd20的双特异性抗体及其应用
GB201913079D0 (en) 2019-09-11 2019-10-23 Hummingbird Bioscience Holdings Pte Ltd Treatment and prevention of cancer using her3 antigen-binding molecules
PE20221282A1 (es) 2019-12-18 2022-09-05 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a hla-a2/mage-a4
TWI811703B (zh) 2020-06-19 2023-08-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與ｃｄ３及ｃｄ１９結合之抗體
CA3188862A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 Carl Alexander Kamb Compositions and methods for treating mesothelin positive cancers
JP2023538115A (ja) 2020-08-20 2023-09-06 エー２ バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド Ｃｅａｃａｍ陽性がんを治療するための組成物及び方法
CN116507363A (zh) 2020-09-10 2023-07-28 健玛保 用于治疗滤泡性淋巴瘤的联合疗法中的针对cd3和cd20的双特异性抗体
CA3190349A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating chronic lymphocytic leukemia
EP4210743A1 (en) 2020-09-10 2023-07-19 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
BR112023004296A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar linfoma de célula b grande difusa em um indivíduo humano
US20240034812A1 (en) 2020-09-10 2024-02-01 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
WO2023031435A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Cancer Research Technology Limited Treatment and prevention of cancer using her3 antigen-binding molecules
TW202328196A (zh) 2021-09-16 2023-07-16 新加坡商蜂鳥生物科技私人有限公司 使用vista抗原結合分子的癌症之治療及預防
WO2023046979A1 (en) 2021-09-27 2023-03-30 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Treatment and prevention of cancer using vista antigen-binding molecules
WO2024062073A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Treatment and prevention of cancer using vista antigen-binding molecules
WO2024146955A1 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Twain Therapeutics Pte. Ltd. Antigen-binding molecules
WO2024146957A1 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Twain Therapeutics Pte. Ltd. Antigen-binding molecules

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101115773A (zh) * 2005-02-07 2008-01-30 格黎卡特生物技术股份公司 结合egfr的抗原结合分子，编码它的载体，及其应用
CN101896504A (zh) * 2007-12-21 2010-11-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 二价双特异性抗体
CN101903406A (zh) * 2007-12-21 2010-12-01 霍夫曼-拉罗奇有限公司 二价双特异性抗体
CN102272148A (zh) * 2008-11-03 2011-12-07 分子组合公司 抑制vegf-a受体相互作用的结合蛋白
US20120100180A1 (en) * 2009-03-05 2012-04-26 Institute Of Microbiology,Chinese Academy Of Sciences Methods for proliferation of antigen-specific t cells
WO2012069655A2 (en) * 2010-11-26 2012-05-31 Molecular Partners Ag Improved n-terminal capping modules for designed ankyrin repeat proteins

Family Cites Families (137)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1096187A (en) 1977-04-18 1981-02-24 Souhei Monden Ornament adapted to be fixed by permanent magnets
DE3416774A1 (de) 1984-05-07 1985-11-14 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Monoklonale antikoerper, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1991003493A1 (en) 1989-08-29 1991-03-21 The University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
ATE503496T1 (de) 1992-02-06 2011-04-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches bindeprotein für tumormarker
DK1589107T3 (da) 1992-08-21 2010-04-26 Univ Bruxelles Immonuglobuliner uden lette kæder
US5798100A (en) 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
AU6267896A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth oftumors
US7727761B2 (en) 1995-08-01 2010-06-01 Vegenics Limited Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof
IL132560A0 (en) 1997-05-02 2001-03-19 Genentech Inc A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
JP4460155B2 (ja) 1997-12-05 2010-05-12 ザ・スクリプス・リサーチ・インステイチユート マウス抗体のヒト化
DE69922159T2 (de) 1998-01-23 2005-12-01 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Mehrzweck-antikörperderivate
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
EP1272647B1 (en) * 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US6773883B2 (en) 2000-07-31 2004-08-10 The Brigham & Women's Hospital, Inc. Prognostic classification of endometrial cancer
WO2002020565A2 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
EP2277913A3 (en) 2001-08-10 2012-08-08 Aberdeen University Antigen binding domains from fish
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
CN102373214B (zh) 2003-11-05 2014-07-09 罗氏格黎卡特股份公司 具有增加的Fc受体结合亲和性和效应子功能的CD20抗体
US20050282233A1 (en) 2004-03-05 2005-12-22 Ludwig Institute For Cancer Research Multivalent antibody materials and methods for VEGF/PDGF family of growth factors
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
WO2005100402A1 (en) 2004-04-13 2005-10-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
TWI544076B (zh) 2005-03-31 2016-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of manufacturing a polypeptide that controls assembly
JP5129122B2 (ja) 2005-04-26 2013-01-23 トリオン ファーマ ゲーエムベーハー 癌治療のための抗体およびグルココルチコイドの組み合わせ
CN101228189A (zh) 2005-05-09 2008-07-23 格黎卡特生物技术股份公司 具有修饰的fc区域和改变的与fc受体的结合的抗原结合分子
CN103145838A (zh) * 2005-06-30 2013-06-12 Abbvie公司 Il-12/p40结合蛋白
TWI323734B (en) 2005-08-19 2010-04-21 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US8236308B2 (en) 2005-10-11 2012-08-07 Micromet Ag Composition comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
AU2006330051B2 (en) 2005-12-16 2011-08-18 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
PL1976880T3 (pl) 2005-12-21 2017-01-31 Amgen Research (Munich) Gmbh Kompozycje farmaceutyczne odporne na rozpuszczalny cea
CA2638794A1 (en) * 2006-02-15 2007-08-23 Imclone Systems Incorporated Functional antibodies
DK1999154T3 (da) 2006-03-24 2012-12-03 Merck Patent Gmbh Fremstillede heterodimere proteindomæner
CA3149553C (en) 2006-06-12 2023-11-21 Aptevo Research And Development Llc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
TR201816277T4 (tr) 2007-04-03 2018-11-21 Amgen Res Munich Gmbh Çapraz-tür-spesifik bağlama alanı.
RS58217B1 (sr) 2007-04-03 2019-03-29 Amgen Res Munich Gmbh Interspecijski specifičan vezujući domen
US20100183615A1 (en) 2007-04-03 2010-07-22 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
CA2694488A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
CA2697922A1 (en) 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
EP2195341B1 (en) * 2007-09-26 2017-03-22 UCB Biopharma SPRL Dual specificity antibody fusions
JP5490714B2 (ja) 2007-11-28 2014-05-14 メディミューン，エルエルシー タンパク質製剤
EA023031B1 (ru) 2007-11-30 2016-04-29 Глаксо Груп Лимитед Антиген-связывающая конструкция и ее применение
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8592562B2 (en) 2008-01-07 2013-11-26 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
EP2414391B1 (en) 2009-04-02 2018-11-28 Roche Glycart AG Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
PT2417156E (pt) 2009-04-07 2015-04-29 Roche Glycart Ag Anticorpos trivalentes, biespecíficos
BRPI1014449A2 (pt) * 2009-04-07 2017-06-27 Roche Glycart Ag anticorpos biespecíficos anti-erbb-2/ anti-c-met.
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
EP2435473B1 (en) * 2009-05-27 2013-10-02 F.Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
CA2770174A1 (en) 2009-08-31 2011-03-03 Roche Glycart Ag Affinity-matured humanized anti cea monoclonal antibodies
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
CA2774732A1 (en) * 2009-09-18 2011-03-24 Micromet Ag Dosage regimen for administering an epcamxcd3 bispecific antibody
GB201005063D0 (en) * 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
TW201120210A (en) * 2009-11-05 2011-06-16 Hoffmann La Roche Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates
BR112012016135A2 (pt) 2009-12-29 2017-03-07 Emergent Product Dev Seattle proteínas de ligação de heterodímero e seus usos
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
EP2569337A1 (en) 2010-05-14 2013-03-20 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
SG187746A1 (en) 2010-08-13 2013-03-28 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
EP2609111B1 (en) * 2010-08-24 2017-11-01 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized-fv fragment
DK2632946T3 (en) 2010-10-29 2018-03-12 Ablynx Nv PROCEDURE FOR MANUFACTURING VARIABLE IMMUNGLOBULIN SINGLE DOMAINS
EP2635607B1 (en) 2010-11-05 2019-09-04 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
JP2014500879A (ja) * 2010-11-16 2014-01-16 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｂｃｍａ発現に相関性を有する疾患を治療する因子及び方法
ES2693232T3 (es) * 2010-11-30 2018-12-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agente terapéutico que induce citotoxicidad
KR101852245B1 (ko) 2011-02-10 2018-04-25 로슈 글리카트 아게 돌연변이 인터루킨-2 폴리펩티드
CN103476795B (zh) 2011-03-29 2016-07-06 罗切格利卡特公司 抗体Fc变体
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
EP2707382B1 (en) 2011-05-09 2019-07-17 Ablynx NV Method for the production of immunoglobulin single variable domains
WO2012158818A2 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
SG195072A1 (en) 2011-05-21 2013-12-30 Macrogenics Inc Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3
CN107586340B (zh) 2011-08-23 2022-01-21 罗切格利卡特公司 对t细胞活化性抗原和肿瘤抗原特异性的双特异性抗体及使用方法
WO2013026831A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific antigen binding molecules
US20130078249A1 (en) * 2011-08-23 2013-03-28 Oliver Ast Bispecific t cell activating antigen binding molecules
US20130078250A1 (en) * 2011-08-23 2013-03-28 Oliver Ast Bispecific t cell activating antigen binding molecules
RU2617970C2 (ru) 2011-08-23 2017-04-28 Рош Гликарт Аг Антитела, не содержащие fc-фрагмента, включающие два fab-фрагмента, и способы их применения
EP2578230A1 (en) 2011-10-04 2013-04-10 Trion Pharma Gmbh Removal of Tumor Cells from Intraoperative Autologous Blood Salvage
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
WO2013096291A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
EA035344B1 (ru) 2012-04-20 2020-05-29 Мерюс Н.В. Способ получения двух антител из одной клетки-хозяина
WO2014022540A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
TR201816437T4 (tr) 2012-08-07 2018-11-21 Roche Glycart Ag Azalmış ve artmış efektör fonksiyonuna sahip olacak şekilde tasarlanmış iki antikor içeren bileşim.
EP3586874A1 (en) 2012-08-14 2020-01-01 IBC Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
JP6444874B2 (ja) 2012-10-08 2018-12-26 ロシュ グリクアート アーゲー ２つのＦａｂフラグメントを含むＦｃ不含抗体および使用方法
CN112079929A (zh) * 2012-11-21 2020-12-15 武汉友芝友生物制药有限公司 双特异性抗体
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
JP6618362B2 (ja) 2013-01-14 2019-12-11 ゼンコア インコーポレイテッド 新規異種二量体タンパク質
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
JO3529B1 (ar) 2013-02-08 2020-07-05 Amgen Res Munich Gmbh مضاد التصاق خلايا الدم البيض من أجل التخفيف من الاثار السلبية الممكنة الناتجة عن مجالات ارتباط cd3- المحدد
RU2015140915A (ru) 2013-02-26 2017-04-03 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
JP2016512421A (ja) 2013-02-26 2016-04-28 ロシュ グリクアート アーゲー 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子
WO2014131712A1 (en) 2013-02-26 2014-09-04 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP2970505A4 (en) 2013-03-14 2016-10-19 California Inst Biomedical Res SPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF
US10537638B2 (en) 2013-03-15 2020-01-21 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Low concentration antibody formulations
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CA2913069A1 (en) 2013-05-28 2014-12-04 Numab Ag Novel antibodies
JP6841656B2 (ja) 2013-12-17 2021-03-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｄ−１軸結合アンタゴニスト及びタキサンを使用する癌の治療方法
TWI747385B (zh) 2013-12-17 2021-11-21 美商建南德克公司 抗cd3抗體及使用方法
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
LT3177643T (lt) 2014-08-04 2019-08-12 F. Hoffmann-La Roche Ag T ląstelę aktyvinantį antigeną surišančios bispecifinės molekulės
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
ES2774380T3 (es) 2014-08-29 2020-07-20 Hoffmann La Roche Politerapia de inmunocitocinas de variante de IL-2 dirigida a tumor y anticuerpos frente a PD-L1 humano
WO2016036678A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Medimmune, Llc Formulations of bispecific antibodies
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
MX2017006626A (es) 2014-11-20 2017-08-21 Hoffmann La Roche Cadenas ligeras comunes y metodos de uso.
KR102648966B1 (ko) 2014-11-20 2024-03-19 에프. 호프만-라 로슈 아게 Folr1 및 cd3에 대한 t 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자
JP2018520642A (ja) 2015-05-01 2018-08-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド マスク抗ｃｄ３抗体及びその使用方法
CN107849132B (zh) 2015-06-16 2022-03-08 豪夫迈·罗氏有限公司 人源化的和亲和力成熟的针对FcRH5的抗体和使用方法
WO2017055391A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules binding mesothelin and cd3
WO2017055318A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Cd33xcd3 bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP3356407B1 (en) 2015-10-02 2021-11-03 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific anti-cd19xcd3 t cell activating antigen binding molecules
AR106201A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche Moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de células t
US20170096495A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2017097723A2 (en) 2015-12-09 2017-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment method

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101115773A (zh) * 2005-02-07 2008-01-30 格黎卡特生物技术股份公司 结合egfr的抗原结合分子，编码它的载体，及其应用
CN101896504A (zh) * 2007-12-21 2010-11-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 二价双特异性抗体
CN101903406A (zh) * 2007-12-21 2010-12-01 霍夫曼-拉罗奇有限公司 二价双特异性抗体
CN102272148A (zh) * 2008-11-03 2011-12-07 分子组合公司 抑制vegf-a受体相互作用的结合蛋白
US20120100180A1 (en) * 2009-03-05 2012-04-26 Institute Of Microbiology,Chinese Academy Of Sciences Methods for proliferation of antigen-specific t cells
WO2012069655A2 (en) * 2010-11-26 2012-05-31 Molecular Partners Ag Improved n-terminal capping modules for designed ankyrin repeat proteins

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DIANE SEIMETZ等: "Development and approval of the trifunctional antibody catumaxomab(anti-EpCAM anti-CD3 as a targeted cancer immunotherapy", 《CANCER TREATMENT REVIEWS》 *
WOLFGANG SCHAEFER等: "Immunoglobulin domain crossover as a generic approach for the production of bispecific IgG antibodies", 《PNAS》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021237717A1 (zh) * 2020-05-29 2021-12-02 武汉友芝友生物制药有限公司 抗cldn18.2和cd3的双特异性抗体
CN114317562A (zh) * 2022-02-22 2022-04-12 辽宁省农业科学院 普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白的编码基因PvEXO70及应用
CN114317562B (zh) * 2022-02-22 2023-06-13 辽宁省农业科学院 普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白的编码基因PvEXO70及应用

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