CN107074955B - 针对FolR1和CD3的T细胞活化性双特异性抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及用于T细胞活化和对特定靶细胞重定向的新颖双特异性抗原结合分子。另外，本发明涉及编码此类双特异性抗原结合分子的多核苷酸，和包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的方法，及在疾病的治疗中使用这些双特异性抗原结合分子的方法。

Description

针对FolR1和CD3的T细胞活化性双特异性抗原结合分子
序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交且据此通过援引完整收录。2015年11月9日创建的所述ASCII拷贝，名称为32186_SL.txt且大小为445，570字节。
发明领域
本发明一般涉及用于活化T细胞的双特异性抗原结合分子，特别是靶向CD3和叶酸受体1(FolR1)的双特异性抗体。另外，本发明涉及编码此类双特异性抗原结合分子的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的方法，以及在疾病的治疗中使用这些双特异性抗原结合分子的方法。
发明背景
在多种临床背景中常常期望选择性破坏个别细胞或特定细胞类型。例如，特异性破坏肿瘤细胞而使健康细胞和组织保持完整且不受损是癌症疗法的首要目的。
实现这点的一种有吸引力的方式是通过诱导针对肿瘤的免疫应答，使得免疫效应细胞诸如天然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)攻击并破坏肿瘤细胞。CTL构成免疫系统最有力的效应细胞，然而它们不能通过由常规治疗性抗体的Fc域介导的效应器机制来激活。
在此点上，最近数年对双特异性抗体变得感兴趣，其设计为用一个“臂”结合靶细胞上的表面抗原，而用第二个“臂”结合T细胞受体(TCR)复合物的活化性的，不变的构件。此类抗体对其两种靶物的同时结合会迫使靶细胞和T细胞之间的暂时相互作用，引起任何细胞毒性T细胞活化和随后的靶细胞裂解。因此，免疫应答重定向于靶细胞，而且不依赖于靶细胞的肽抗原呈递或T细胞的特异性，其对于CTL的正常MHC限制性活化会是相关的。在此背景中，至关重要的是CTL仅在靶细胞向其呈递双特异性抗体时活化，即模拟免疫突触。特别期望的是不需要淋巴细胞预条件化或共刺激来引发靶细胞有效裂解的双特异性抗体。
FolR1表达在多种起源的上皮肿瘤细胞上，例如卵巢癌，肺癌，乳腺癌，肾癌，结直肠癌，子宫内膜癌。已经描述了以治疗性抗体，诸如farletuzumab，抗体-药物缀合物，或过继性T细胞疗法靶向FolR1来对肿瘤成像的数种办法(Kandalaft et al.，J TranslMed.2012 Aug 3；10:157.doi:10.1186/1479-5876-10-157；van Dam et al.，NatMed.2011 Sep18；17(10):1315-9.doi:10.1038/nm.2472；Cliftonet al.，HumVaccin.2011Feb；7(2):183-90.Epub 2011 Feb 1；Kelemen et al.，Int J Cancer.2006Jul15；119(2):243-50；Vaitilingam et al.，J Nucl Med.2012 Jul；53(7)；Teng et al.,2012Aug；9(8):901-8.doi:10.1517/17425247.2012.694863.Epub 2012Jun 5)。已经进行了一些尝试以靶向叶酸受体和CD3的构建物来靶向叶酸受体阳性肿瘤(Kranz et al.,ProcNatl Acad Sci U S A.Sep 26,1995；92(20):9057-9061；Roy et al.,Adv Drug DelivRev.2004Apr 29；56(8):1219-31；Huiting Cui et al Biol Chem.Aug 17,2012；287(34):28206-28214；Lamers et al.,Int.J.Cancer.60(4):450(1995)；Thompson et al.,MAbs.2009Jul-Aug；1(4):348-56.Epub 2009Jul 19；Mezzanzanca et al.,Int.J.Cancer,41,609-615(1988))。然而，至今采取的办法具有许多缺点。迄今使用的分子不能容易且可靠地生产，因为它们需要化学交联。类似地，杂合分子不能作为人蛋白质以大规模生产，而且需要使用在施用于人时具有高度免疫原性且因而具有有限治疗价值的大鼠，小鼠或其它蛋白质。而且，许多现有分子保留FcgR结合。
如此，仍然存在对用于靶向性T细胞介导的免疫疗法的新颖的改进的双特异性抗体的需要。本发明提供设计用于靶向性T细胞活化的双特异性抗原结合分子，特别是能容易地生产和剂量给药的适合作为有效且安全的治疗剂的双特异性抗原结合分子。
发明概述
一方面，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的Fab分子，且包含至少一个选自由SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39组成的组的重链互补决定区(CDR)氨基酸序列和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34的组的轻链CDR；和
(ii)能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的第二抗原结合模块。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含如下的第一抗原结合模块，其包含：包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子另外包含(iii)能够特异性结合FolR1的第三抗原结合模块。在一个实施方案中，该能够特异性结合FolR1的第二和第三抗原结合模块包含相同的重链互补决定区(CDR)和轻链CDR序列。在一个实施方案中，该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同。
在上述实施方案的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，该第二和第三抗原结合模块中至少一项是Fab分子。在一个实施方案中，上述实施方案的T细胞活化性双特异性抗原结合分子另外包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。在一些实施方案中，该第一抗原结合模块和该第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端连接至该Fc域的第一或第二亚基的N端。在一些实施方案中，第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端，任选经由肽接头。
在上述实施方案的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，该能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的抗原结合模块包含至少一个选自由SEQ ID NO:16，SEQID NO:17和SEQ ID NO:18组成的组的重链互补决定区(CDR)氨基酸序列和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34的组的轻链CDR。在一个实施方案中，该能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的抗原结合模块包含：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。在一个实施方案中，该能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的抗原结合模块包含至少一个选自由SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57组成的组的重链互补决定区(CDR)氨基酸序列和至少一个选自SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:65的组的轻链CDR。在一个实施方案中，该能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的抗原结合模块包含：包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的可变轻链。
在另一个实施方案中，该能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的抗原结合模块包含至少一个选自由SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:50组成的组的重链互补决定区(CDR)氨基酸序列和至少一个选自SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:54的组的轻链CDR。在一个实施方案中，该能够特异性结合FolR1的抗原结合模块包含(a)SEQ ID NO:8的互补决定区重链1(CDR-H1)氨基酸序列；(b)SEQ ID NO:9的CDR-H2氨基酸序列；(c)SEQ IDNO:50的CDR-H3氨基酸序列；(d)SEQ ID NO:52的互补决定区轻链1(CDR-L1)氨基酸序列；(e)SEQ ID NO:53的CDR-L2氨基酸序列，和(f)SEQ ID NO:54的CDR-L3氨基酸序列。在一个实施方案中，该能够特异性结合FolR1的抗原结合模块包含：包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的可变轻链。
在另一个实施方案中，该能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的抗原结合模块包含至少一个选自由SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:275和SEQ ID NO:315组成的组的重链互补决定区(CDR)氨基酸序列和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34的组的轻链CDR。在一个实施方案中，该能够特异性结合FolR1的抗原结合模块包含(a)SEQ ID NO:16的互补决定区重链1(CDR-H1)氨基酸序列；(b)SEQ ID NO:275的CDR-H2氨基酸序列；(c)SEQID NO:315的CDR-H3氨基酸序列；(d)SEQ ID NO:32的互补决定区轻链1(CDR-L1)氨基酸序列；(e)SEQ ID NO:33的CDR-L2氨基酸序列，和(f)SEQ ID NO:34的CDR-L3氨基酸序列。在一个实施方案中，该能够特异性结合FolR1的抗原结合模块包含：包含SEQ ID NO:274的氨基酸序列的可变重链域(VH)和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链域(VL)。
在一个实施方案中，上述实施方案的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合人FolR1。在一个实施方案中，上述实施方案的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合人FolR1和食蟹猴FolR1。在一个实施方案中，上述实施方案的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合人FolR1，食蟹猴FolR1和鼠FolR1。在一个实施方案中，上述实施方案的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合人FolR1，食蟹猴FolR1且不结合鼠FolR1。
在上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，该第一抗原结合模块是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定区任一是交换的。在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不超过一个能够特异性结合CD3的抗原结合模块。在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，该第一和该第二抗原结合模块和该Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个实施方案中，该Fc域为IgG类免疫球蛋白，具体是IgG1或IgG4，Fc域。在一个实施方案中，该Fc域为人Fc域。
在上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，该Fc域包含促进该Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。在一个实施方案中，在该Fc域的第一亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3域内生成隆起，该隆起可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中，且在该Fc域的第二亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3域内生成空腔，该空腔内可安置第一亚基的CH3域内的隆起。在一个实施方案中，该Fc域包含至少一处与天然IgG1 Fc域相比降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代。在一个实施方案中，该Fc域的每个亚基包含三处降低对活化性Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G(Kabat编号方式)。在一个实施方案中，该Fc受体为Fcγ受体。在一个实施方案中，该效应器功能为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外诱导人CD3阳性T细胞的增殖。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外诱导人外周血单个核细胞介导的对FolR1表达性人肿瘤细胞的杀伤。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外诱导T细胞介导的对FolR1表达性人肿瘤细胞的杀伤。在一个实施方案中，该T细胞为CD8阳性T细胞。在一个实施方案中，该FolR1表达性人肿瘤细胞为Hela，Skov-3，HT-29，或HRCEpiC细胞。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在24小时之后以介于约36pM和约39573pM之间的EC50诱导T细胞介导的对FolR1表达性人肿瘤细胞的杀伤。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在24小时之后以约36pM的EC50诱导T细胞介导的对FolR1表达性肿瘤细胞的杀伤。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在24小时之后以约178.4pM的EC50诱导T细胞介导的对FolR1表达性肿瘤细胞的杀伤。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在48小时之后以约134.5pM或更大的EC50诱导T细胞介导的对FolR1表达性肿瘤细胞的杀伤。
在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子诱导T细胞上CD25和CD69中至少一项的细胞表面表达的上调，如通过流式细胞术测量的。在一个实施方案中，该T细胞为CD4阳性T细胞或CD8阳性T细胞。在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以约5.36pM至约4nM的表观KD结合人FolR1。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以约4nM的表观KD结合人和食蟹猴FolR1。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以约1.5nM的表观KD结合鼠FolR1。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以至少约1000nM的单价结合KD结合人FolR1。
在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子是对FolR1特异性的且不结合FolR2或FolR3。在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子具有1μM或更大的亲和力(单价结合)。在一个实施方案中，该亲和力对人FolR1为1.4μM左右。在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子具有约1-100nM或更低的亲合力(二价结合)。在一个实施方案中，该亲合力为约10nM或更小。在一个实施方案中，该亲合力为10nM。
在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合人肿瘤细胞上表达的FolR1。在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合人FolR1上的构象表位。在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子不结合人叶酸受体2(FolR2)或人叶酸受体3(FolR3)。在上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，该抗原结合模块结合包含人FolR1(SEQ ID NO:227)的氨基酸25至234的FolR1多肽。在上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，该FolR1抗原结合模块结合包含SEQ ID NO:227，230和231的氨基酸序列的FolR1多肽，且其中该FolR1抗原结合模块不结合包含SEQ ID NO:228和229的氨基酸序列的FolR多肽。
另一方面，本发明提供一种双特异性抗体，其包含a)与包含SEQ ID NO:49的可变重链域(VH)和SEQ ID NO:51的可变轻链域的参照抗体竞争结合人FolR1的第一抗原结合位点；和b)与包含SEQ ID NO:36的可变重链域(VH)和SEQ ID NO:31的可变轻链域的参照抗体竞争结合人CD3的第二抗原结合位点，其中结合竞争是使用表面等离振子共振测定法测量的。
另一方面，本发明提供一种双特异性抗体，其包含a)与包含SEQ ID NO:274的可变重链域(VH)和SEQ ID NO:31的可变轻链域的参照抗体竞争结合人FolR1的第一抗原结合位点；和b)与包含SEQ ID NO:36的可变重链域(VH)和SEQ ID NO:31的可变轻链域的参照抗体竞争结合人CD3的第二抗原结合位点，其中结合竞争是使用表面等离振子共振测定法测量的。
另一方面，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够特异性结合CD3的第一抗原结合模块和能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的第二抗原结合模块，其中该T细胞活化性双特异性抗原结合分子与包含SEQ ID NO:49的可变重链域(VH)和SEQ ID NO:51的可变轻链域的第一参照抗体结合人FolR1上的相同表位；且其中该T细胞活化性双特异性抗原结合分子与包含SEQ ID NO:36的可变重链域(VH)和SEQ ID NO:31的可变轻链域的第二参照抗体结合人CD3上的相同表位。
另一方面，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含能够特异性结合CD3的第一抗原结合模块和能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的第二抗原结合模块，其中该T细胞活化性双特异性抗原结合分子与包含SEQ ID NO:274的可变重链域(VH)和SEQ ID NO:31的可变轻链域(VL)的第一参照抗体结合人FolR1上的相同表位；且其中该T细胞活化性双特异性抗原结合分子与包含SEQ ID NO:36的可变重链域(VH)和SEQ ID NO:31的可变轻链域(VL)的第二参照抗体结合人CD3上的相同表位。
另一方面，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段，其与包含SEQ ID NO:274的可变重链域(VH)和SEQ ID NO:31的可变轻链域的抗体竞争结合人FolR1，其中结合竞争是使用表面等离振子共振测定法测量的。
一方面，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含形成第一，第二和第三抗原结合模块的第一，第二，第三，第四和第五多肽链，其中该第一抗原结合模块能够结合CD3且该第二和该第三抗原结合模块各自能够结合叶酸受体1(FolR1)，其中a)该第一和该第二多肽链以氨基(N)端至羧基(C)端方向包含VLD1和CLD1；b)该第三多肽链以N端至C端方向包含VLD2和CH1D2；c)该第四多肽链以N端至C端方向包含VHD1，CH1D1，CH2D1和CH3D1；d)该第五多肽链包含VHD1，CH1D1，VHD2，CLD2，CH2D2和CH3D2；其中VLD1为第一轻链可变域，VLD2为第二轻链可变域，CLD1为第一轻链恒定域，CLD2为第二轻链恒定域，VHD1为第一重链可变域，VHD2为第二重链可变域，CH1D1为第一重链恒定域1，CH1D2为第二重链恒定域1，CH2D1为第一重链恒定域2，CH2D2为第二重链恒定域2，CH3D1为第一重链恒定域3，且CH3D2为第二重链恒定域3。
在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，(i)该第三多肽链和该第五多肽链的VHD2和CLD2形成该能够结合CD3的第一抗原结合模块；(ii)该第一多肽链和该第四多肽链的VHD1和CH1D1形成该能够结合FolR1的第二结合模块；且(iii)该第二多肽链和该第五多肽链的VHD1和CH1D1形成该能够结合FolR1的第三结合模块。在一个实施方案中，CH2D1，CH3D1，CH2D2和CH3D2形成IgG类免疫球蛋白的Fc域。在一个实施方案中，该Fc域为人Fc域。在一个实施方案中，该Fc域包含促进该Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。在一个实施方案中，CH3D2包含具有更大侧链体积的氨基酸残基，其可安置于CH3D1内的空腔中。在一个实施方案中，该Fc域包含至少一处与天然IgG1 Fc域相比降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代。在一个实施方案中，该Fc域的每个亚基包含三处降低对活化性Fc受体的结合和效应器功能中至少一项的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为依照Kabat编号方式的L234A，L235A和P329G。在一个实施方案中，该Fc受体为Fcγ受体。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外诱导人CD3阳性T细胞的增殖。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外诱导人外周血单个核细胞介导的对FolR1表达性人肿瘤细胞的杀伤。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外诱导T细胞介导的对FolR1表达性人肿瘤细胞的杀伤。在一个此类实施方案中，该FolR1表达性人肿瘤细胞为Hela，Skov-3，HT-29，或HRCEpiC细胞。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在24小时之后以介于约36pM和约39573pM之间的EC50诱导T细胞介导的对FolR1表达性肿瘤细胞的杀伤。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在24小时之后以约36pM的EC50诱导T细胞介导的对FolR1表达性肿瘤细胞的杀伤。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在24小时之后以约178.4pM的EC50诱导T细胞介导的对FolR1表达性肿瘤细胞的杀伤。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在48小时之后以约134.5pM或更大的EC50诱导T细胞介导的对FolR1表达性肿瘤细胞的杀伤。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子诱导T细胞上CD25和CD69中至少一项的细胞表面表达的上调，如通过流式细胞术测量的。在一个此类实施方案中，该T细胞为CD4阳性T细胞或CD8阳性T细胞。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以约5.36pM至约4nM的表观KD结合人FolR1。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以约4nM的表观KD结合人和食蟹猴FolR1。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以约1.5nM的表观KD的结合鼠FolR1。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以至少约1000nM的单价结合KD结合人FolR1。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合人肿瘤细胞上表达的FolR1。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合人FolR1上的构象表位。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子不结合人叶酸受体2(FolR2)或人叶酸受体3(FolR3)。在一个上述实施方案中，该抗原结合模块结合包含人FolR1(SEQ ID NO:227)的氨基酸25至234的FolR1多肽。在一个上述实施方案中，该FolR1抗原结合模块结合包含SEQ ID NO:227，230和231的氨基酸序列的FolR1多肽，且其中该FolR1抗原结合模块不结合包含SEQ ID NO:228和229的氨基酸序列的FolR多肽。在一个上述实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子为人源化或嵌合分子。在一个上述实施方案中，VHD2和CH1D1是经由肽接头连接的。
在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个上述实施方案中，该第一和第二多肽链包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列。在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个上述实施方案中，该第三多肽链包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个上述实施方案中，该第四多肽链包含SEQ ID NO:309的氨基酸序列。在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个上述实施方案中，该第五多肽链包含SEQ ID NO:308的氨基酸序列。在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个上述实施方案中，该第一和第二多肽链包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列；该第三多肽链包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；该第四多肽链包含SEQ ID NO:309的氨基酸序列；且该第五多肽链包含SEQ ID NO:308的氨基酸序列。
一方面，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含SEQ ID NO:308的氨基酸序列。在一个实施方案中，上述实施方案的T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
一方面，本发明提供一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO:308的氨基酸序列。一方面，本发明提供一种分离的多肽，包含SEQ ID NO:309的氨基酸序列。
一方面，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列。在一个实施方案中，上述实施方案的T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含SEQ ID NO:277和SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
一方面，本发明提供一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列。一方面，本发明提供一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列。
一方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码本文中公开的实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的其编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:169的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:246的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:247的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:97的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:198的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:287的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:288的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:289的核苷酸序列。
一方面，本发明提供一种分离的多肽，其由上述实施方案的多核苷酸编码。另一方面，本发明提供一种载体，特别是表达载体，其包含编码本文中公开的实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸。另一方面，本发明提供宿主细胞，其包含本文中公开的任一实施方案的多核苷酸或载体。
一方面，本发明提供一种生成能够特异性结合CD3和靶细胞抗原的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，其包括下述步骤：a)在适合于表达该T细胞活化性双特异性抗原结合分子的条件下培养上述实施方案的宿主细胞，并b)回收该T细胞活化性双特异性抗原结合分子。
一方面，本发明提供T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其是通过上述实施方案的方法生成的。
一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子和药学可接受载剂。一方面，本发明提供上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或上述实施方案中任一项的药物组合物，其用作药物。
一方面，本发明提供上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或上述实施方案中任一项的药物组合物，其用于治疗有所需要的个体中的疾病。在一些实施方案中，该疾病为癌症。一方面，本发明提供上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子制造用于治疗有所需要的个体中的疾病的药物的用途。
一方面，本发明提供一种治疗个体中的疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的包含药学可接受形式的上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组合物。在一些实施方案中，所述疾病为癌症。
一方面，本发明提供一种用于诱导靶细胞裂解的方法，其包括在T细胞存在下使靶细胞与上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子接触。
一方面，本发明提供如说明书所述的发明。
附图简述
图1A-I图示本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(TCB)的例示性构造。除(图1I)中的κ-λ型式以外的所有构建物均具有P329G LALA突变且包含具有节入穴修饰的节入穴Fc片段。(图1A)“FolR1 TCB 2+1倒转的(共同轻链)”的图示。FolR1结合物在Fab重链的C端融合至包含节修饰的Fc域的第一亚基的N端。这些构建物不是交叉的且具有三份相同的VLCL轻链。(图1B)“FolR1 TCB 1+1头至尾(共同轻链)”的图示。这些构建物不是交叉的且具有两份相同的VLCL轻链。(图1C)“FolR1 TCB 1+1经典的(共同轻链)”的图示。这些构建物不是交叉的且具有两份相同的VLCL轻链。(图1D)“FolR1 TCB 2+1经典的(共同轻链)”的图示。CD3结合物在Fab重链的C端融合至包含节修饰的Fc域的第一亚基的N端。这些构建物不是交叉的且具有三份相同的VLCL轻链。(图1E)“FolR1 TCB 2+1crossfab经典的”的图示。这些构建物对于CD3结合物包含Ck-VH链代替常规的CH1-VH链。CD3结合物在Fab重链的C端融合至包含节修饰的Fc域的第一亚基的N端。(图1F)“FolR1 TCB 2+1crossfab倒转的”的图示。这些构建物对于CD3结合物包含Ck-VH链代替常规的CH1-VH链。FolR1结合物在Fab重链的C端融合至包含节修饰的Fc域的第一亚基的N端。(图1G)“FolR1 TCB 1+1crossfab头至尾”的图示。这些构建物对于CD3结合物包含Ck-VH链代替常规的CH1-VH链。(图1H)“FolR1 TCB 1+1crossfab经典的”的图示。这些构建物对于CD3结合物包含Ck-VH链代替常规的CH1-VH链。图1I图示CD3/FolR1κ-λ抗体型式。这些构建物包含交叉的共同轻链VLCH1和一个对CD3特异性的交叉的VHCL链和一个对FolR1特异性的交叉的VHCL链。
图2A-C描绘汇总FoLR1 IgG结合物对HeLa细胞的结合的图。通过流式细胞术测定新生成的FolR1结合物对HeLa细胞上表达的FolR1的结合。用荧光标记的抗人二抗检测结合的抗体。
图3A-B描绘汇总FolR1结合物对FolR1的特异性的图。通过流式细胞术分析FolR1IgG对用FolR1或FolR2任一瞬时转染的HEK细胞的结合以鉴定特异性结合FolR1且不结合FolR2的克隆。用荧光标记的抗人二抗检测抗体。
图4A-B描绘汇总FolR1结合物对cyFoLR1的交叉反应性的图。通过流式细胞术在用cyFolR1瞬时转染的HEK细胞上解析FolR1抗体对食蟹猴FolR1的交叉反应性。用荧光标记的抗人二抗检测抗体。
图5描绘图示结合后FolR1 TCB的内在化的图。在HeLa细胞上测试结合FolR1后四种FolR1 TCB的内在化。在于37℃温育指定时间点之后用荧光标记的抗人二抗检测表面上的剩余FolR1 TCB。计算内在化的百分比。
图6A-E描绘汇总FolR1 IgG对具有不同FolR1表达水平的细胞的结合的图。通过流式细胞术分析9D11，16D5和Mov19 IgG对具有不同FolR1表达水平的肿瘤细胞的结合。包括DP47 IgG作为同种型对照，且包括MKN-45作为FolR1阴性细胞系。用荧光标记的抗人二抗检测抗体。
图7A-L描绘汇总T细胞介导的对HT-29和SKOV3细胞的杀伤的图。使用FolR1 TCB来测试T细胞介导的对HT-29和SKOV3肿瘤细胞的杀伤和杀伤后T细胞上激活标志物的上调。(图7A-D)在24小时和48小时之后通过LDH释放测量在9D11 FolR1 TCB和16D5 FolR1 TCB存在下T细胞介导的对HT-29和SKOV3细胞的杀伤。包括DP47 TCB作为阴性对照。在48小时温育之后通过流式细胞术评估SKOV3(图7E-H)或HT-29(图7I-L)肿瘤细胞杀伤后CD8 T细胞和CD4 T细胞上激活标志物CD25和CD69的上调。
图8描绘显示对红细胞的抗FolR1结合的缺失的图。红细胞作为CD235a阳性群体设定门，并通过流式细胞术测定9D11 IgG，16D5 IgG，Mov19 IgG和DP47 IgG对这个群体的结合。用荧光标记的抗人二抗检测抗体。
图9A-D描绘汇总全血中的激活标志物上调的图。通过流式细胞术分析在添加9D11FolR1 TCB，16D5 FolR1 TCB，Mov19 FolR1 TCB和DP47 TCB之后24小时CD4 T细胞和CD8 T细胞的CD25和CD69激活标志物上调。
图10描绘9D11 TCB a-glyco变体对HeLa细胞的结合。将9D11 FolR1 TCB a-glyco变体对Hela细胞的结合与HeLa细胞上原始9D11 TCB的结合比较。用荧光标记的抗人二抗检测抗体，并通过流式细胞术测定结合。
图11A-F描绘汇总T细胞介导的9D11 FolR1 TCB a-glyco变体对肿瘤细胞的杀伤的图。使用9D11 FolR1 TCB a-glyco变体来测试T细胞介导的对(图11A-D)SKOV3，MKN-45(作为FolR1阴性对照)和(图11E-F)HT-29肿瘤细胞的杀伤，与原始9D11 FolR1 TCB的杀伤比较。使用24小时和48小时之后的LDH释放作为读出。
图12A-X描绘汇总T细胞介导的对原代上皮细胞的杀伤的图。使用具有很低水平的FolR1的原代上皮细胞来测试T细胞介导的16D5 FolR1 TCB和9D11 FolR1 TCB的杀伤，包括DP47 TCB作为阴性对照，包括HT29细胞作为阳性对照。(图12A-H)在24小时和48小时之后测定人视网膜色素(HRP)，人肾皮质(HRC)，人支气管(HB)和HT29细胞的LDH释放。在(图12I-L)HRP，(图12M-P)HRC，(图12Q-T)HB和(图12U-X)HT29的杀伤之后在48小时之后通过流式细胞术测定CD4 T细胞和CD8 T细胞上的CD25和CD69激活标志物上调。
图13A-C显示不同TCB型式与16D5的比较。对四种不同的含有FolR1结合物16D5的TCB型式比较(图13A)对HeLa细胞的结合，(图13B)在24小时和48小时之后T细胞介导的对SKOV3细胞的杀伤和(图13C)在杀伤之后48小时CD4 T细胞和CD8 T细胞上的CD25和CD69激活标志物上调。
图14A-C描绘不同TCB型式与9D11的比较。对三种不同的含有FolR1结合物9D11的TCB型式比较A)对HeLa细胞的结合，B)在24小时和48小时之后T细胞介导的对SKOV3细胞的杀伤和C)在杀伤之后48小时CD4 T细胞和CD8 T细胞上的CD25和CD69激活标志物上调。
图15描绘三种不同剂量的FolR1 TCB在NOG小鼠中的PK概况。
图16图示用于FolR1 TCB的功效研究的一种实验方案。
图17A-B描绘肿瘤生长曲线。(图17A)不同处理组中肿瘤体积的均值和SEM。(图17B)所有处理组中单只小鼠的肿瘤生长。TGI(肿瘤生长抑制)给出均值肿瘤体积与媒介组相比的百分比。
图18显示研究终止时的肿瘤重量。
图19A-B显示研究第32天时肿瘤浸润性T细胞的FACS分析。(图19A)将肿瘤单细胞悬浮液用抗人CD3/CD4/CD8染色并通过流式细胞术进行分析。(图19B)不同处理组中每mg肿瘤组织的T细胞计数的均值和SEM。
图20A-B显示研究第32天时T细胞激活/脱粒和细胞因子分泌的FACS分析。将CD4+(图20A)和CD8+(图20B)肿瘤浸润性T细胞对细胞因子，激活和脱粒标志物染色。展示的是不同处理组中每mg肿瘤组织的T细胞计数的均值和SEM。
图21A-B显示百分比肿瘤裂解。在κλFoLR1 TCB或DP47 TCB任一存在下将SKOV3细胞与PBMC一起温育。在24小时(图21A)和48小时(图21B)之后通过测量LDH释放来测定对肿瘤细胞的杀伤。
图22A-D显示CD4 T细胞上的CD25和CD69上调。在κλFoLR1 TCB或DP47 TCB任一存在下将SKOV3细胞与PBMC一起温育。在48小时之后通过流式细胞术测量CD4 T细胞(图22A-B)和CD8 T细胞(图22C-D)上的CD25和CD69上调。
图23A-B显示百分比肿瘤裂解。温育24小时(图23A)和48小时(图23B)之后由36F2TCB，Mov19 TCB和21A5 TCB诱导的对SKov-3细胞(中等FolR1)的T细胞杀伤(E:T＝10:1，效应人PBMC)。
图24A-C显示由36F2 TCB，16D5 TCB，16D5 TCB经典的，16D5 TCB 1+1和16D5 TCBHT诱导的对Hela(高FolR1)(图24A)，Skov-3(中等FolR1)(图24B)和HT-29(低FolR1)(图24C)人肿瘤细胞的T细胞杀伤(E:T＝10:1，效应人PBMC，温育时间24小时)。包括DP47 TCB作为非结合对照。
图25A-C显示在由36F2 TCB，16D5 TCB和DP47 TCB(非结合对照)诱导的T细胞介导的对Hela细胞(高FolR1)(图25A)，SKov-3细胞(中等FolR1)(图25B)和HT-29细胞(低FolR1)(图25C)的杀伤之后，人CD8+(图25A，B)和CD4+(图25C)上CD25和CD69的上调，T细胞(E:T＝10:1，48小时温育)。
图26A-F显示在温育24小时(图26A，C，E)和48小时(图26B，D，F)之后由36F2 TCB，16D5 TCB和DP47 TCB诱导的对人肾皮质上皮细胞(图26A，B)，人视网膜色素上皮细胞(图26C，D)和HT-29细胞(图26E，F)细胞的T细胞杀伤(E:T＝10:1，效应人PBMC)。
图27描绘汇总多种正常和癌细胞系上FolR1结合位点的量化的表。
图28A-B显示16D5 TCB及其相应的CD3脱酰胺变体16D5 TCB N100A和16D5 TCBS100aA和9D11 TCB及其脱酰胺变体9D11 TCB N100A和9D11TCB S100aA对Jurkat细胞上表达的人CD3的结合。
图29A-B显示由16D5 TCB及其相应的CD3脱酰胺变体16D5 TCB N100A和16D5 TCBS100aA (图29A)和9D11 TCB及其脱酰胺变体9D11 TCB N100A和9D11 TCB S100aA (图29B)诱导的对SKov-3(中等FolR1)人肿瘤细胞的T细胞杀伤(E:T＝10:1，效应人PBMC，温育时间24小时)。包括DP47 TCB作为非结合对照。
图30A-B显示由16D5 TCB及其相应的CD3脱酰胺变体16D5 TCB N100A和16D5 TCBS100aA (图30A)和9D11 TCB及其脱酰胺变体9D11 TCB N100A和9D11 TCB S100aA(图30B)诱导的对HT-29(低FolR1)人肿瘤细胞的T细胞杀伤(E:T＝10:1，效应人PBMC，温育时间24小时)。包括DP47 TCB作为非结合对照。
图31A-C显示均值荧光强度和肿瘤细胞裂解。
图32A-E显示36F2 TCB，16D5 TCB和16D5 HC/LC变体对Hela细胞上表达的人FolR1的结合。
图33显示36F2 TCB，16D5 TCB和两种16D5亲和力降低变体16D5W96Y/D52E TCB和16D5 G49S/S93A TCB对Hela细胞上的人FolR1的结合。
图34A-E显示36F2 TCB，16D5 TCB和16D5 HC/LC变体对HT-29细胞上表达的人FolR1的结合。
图35A-D显示中间体FolR1结合物(6E10 TCB，14B1 TCB和9C7 TCB)，16D5 TCB和36F2 TCB对表达人或小鼠FolR1或FolR2任一的HEK293T细胞的结合。
图36A-F显示在温育24小时(A-C)和48小时(D-F)之后由中间体FolR1结合物(6E10TCB，14B1 TCB和9C7 TCB)，16D5 TCB和36F2 TCB诱导的对Hela(高FolR1表达)，SKov-3(中等FolR1表达)和HT-29(低FolR1表达)人肿瘤细胞的T细胞杀伤。使用人PBMC作为效应细胞(E:T＝10:1)。
图37A-F显示在温育24小时(图37A-C)和48小时(图37D-F)之后由亲和力降低的16D5变体(16D5-G49S/S93A TCB，16D5-G49S/K53A TCB，16D5W96Y TCB，16D5 W96Y/D52ETCB)，16D5 TCB和36F2 TCB诱导的对Hela(高FolR1表达)，SKov-3(中等FolR1表达)和HT-29(低FolR1表达)人肿瘤细胞的T细胞杀伤。使用人PBMC作为效应细胞(E:T＝10:1)。
图38A-F显示在温育24小时(图38A-C)和48小时(图38D-F)之后评估的由亲和力降低的16D5变体(16D5-G49S/S93A TCB，16D5 W96Y/D52E TCB)，16D5 TCB，36F2 TCB和中间体FolR1结合物14B1 TCB诱导的对来自视网膜色素上皮和肾皮质上皮的原代人细胞的T细胞杀伤(E:T＝10:1，效应人PBMC)。包括HT-29细胞(低FolR1表达)作为对照细胞系，而DP47TCB充当非结合对照。
图39A-B显示FolR1 TCB构建物在雌性NOG小鼠中的单剂PK。
图40A-G显示携带Hela的NOG小鼠中在人PBMC转移之后FolR1 TCB构建物(16D5，16D5 G49S/S93A和16D5 W96Y/D52E)的体内功效。
图41显示Farletuzumab(深绿色，自顶部起第二个)和Mov19(灰色，顶部)能够结合16D5捕捉的huFolR1，证明16D5系列结合物识别与Farletuzumab或Mov19任一识别的表位不同的表位。
发明详述
定义
除非在下文另外定义，术语在本文中如本领域中一般使用的那样使用。
如本文中使用的，术语“抗原结合分子”在其最广义上指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是免疫球蛋白及其衍生物，例如片段。
术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同的抗原性决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含至少两种抗原结合位点，其中每种特异于不同的抗原性决定簇。在某些实施方案中，所述双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇，特别是在两种不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。
如本文中使用的，术语“价”指抗原结合分子中规定数目的抗原结合位点的存在。因而，术语“对抗原的单价结合”指抗原结合分子中一个(且不超过一个)特异于抗原的抗原结合位点的存在。
“抗原结合位点”指抗原结合分子上提供与抗原相互作用的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补性决定区(CDR)的氨基酸残基。天然的免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，Fab分子通常具有单个抗原结合位点。
如本文中使用的，术语“抗原结合模块”指特异性结合抗原性决定簇的多肽分子。在一个实施方案中，抗原结合模块能够将与其附接的实体(例如第二抗原结合模块)引导至靶部位，例如至特定类型的肿瘤细胞或携有抗原性决定簇的肿瘤基质。在另一个实施方案中，抗原结合模块能够经由其靶抗原例如T细胞受体复合物抗原来激活信号传导。抗原结合模块包括如本文中另外定义的抗体及其片段。具体的抗原结合模块包括抗体的抗原结合域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方案中，抗原结合模块可以包含抗体恒定区，如本文中另外定义和本领域中已知的。可用的重链恒定区包括以下5种同种型中的任何一种：α，δ，ε，γ或μ。可用的轻链恒定区包括以下2种同种型中的任何一种：κ和λ。
如本文中使用的，术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且指多肽大分子上与抗原结合模块结合，从而形成抗原结合模块-抗原复合物的位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区构成的构象性构造)。可用的抗原性决定簇可以在例如肿瘤细胞表面上，病毒感染的细胞的表面上，其它患病细胞的表面上，免疫细胞的表面上，游离在血液血清中和/或在胞外基质(ECM)中找到。除非另外指示，本文中称为抗原的蛋白质(例如FolR1和CD3)可以是来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然形式蛋白质。在一个具体的实施方案中，抗原是人蛋白。在对本文中的特定蛋白质进行提述的情况下，该术语涵盖“全长”，未加工的蛋白质以及起因于细胞中加工的蛋白质的任何形式。该术语还涵盖蛋白质的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。可用作抗原的例示性人蛋白包括但不限于：FolR1(叶酸受体α(FRA)；叶酸结合蛋白(FBP)；人FolR1 UniProt no.:P15328；鼠FolR1 UniProt no.:P35846；食蟹猴FolR1UniProt no.:G7PR14)，和CD3，特别是CD3的ε亚基(对于人序列，参见UniProt no.P07766(版本130)，NCBI RefSeq no.NP_000724.1，SEQ ID NO:150；或对于食蟹猴[Macacafascicularis]序列，参见UniProt no.Q95LI5(版本49)，NCBI GenBank no.BAB71849.1)。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合在来自不同物种的CD3或靶抗原间保守的CD3或靶细胞抗原的表位。在某些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合CD3和FolR1，但是不结合FolR2(叶酸受体β；FRB；人FolR2 UniProt no.:P14207)或FolR3(叶酸受体γ；人FolR3 UniProt no.:P41439)。
“特异性结合”意指结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。抗原结合模块结合特定抗原性决定簇的能力能经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术，例如表面等离振子共振技术(在BIAcore仪上分析)(Liljeblad等,Glyco J 17,323-329(2000))，以及传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施方案中，抗原结合模块对无关蛋白的结合程度是该抗原结合模块对抗原结合的小于约10％，如例如通过SPR测量的。在某些实施方案中，结合抗原的抗原结合模块，或包含该抗原结合模块的抗原结合分子具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。
“亲和力”指分子(例如受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗原结合模块和抗原，或受体及其配体)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以以解离常数(KD)来表述，其为解离与结合速率常数(分别为K解离和K结合)的比率。如此，相等的亲和力可能包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的确立方法来测量，包括本文中描述的那些方法。用于测量亲和力的一种具体方法是表面等离振子共振(SPR)。
“降低的结合”，例如降低的对Fc受体的结合，指相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为了清楚，该术语还包括亲和力降低至0(或低于分析方法的检测限)，即完全消除相互作用。相反，“升高的结合”指相应相互作用的结合亲和力升高。
如本文中使用的，“T细胞活化”指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答，其选自：增殖，分化，细胞因子分泌，细胞毒性效应分子释放，细胞毒性活性和活化标志物的表达。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够诱导T细胞活化。合适的测量T细胞活化的测定法是本文中所述技术领域中已知的。
如本文中使用的，“靶细胞抗原”指靶细胞表面上呈现的抗原性决定簇，所述靶细胞例如肿瘤中的细胞如癌细胞或肿瘤基质的细胞。特别地，“靶细胞抗原”指叶酸受体1。
如本文中使用的，术语“第一”和“第二”就抗原结合模块等而言为了在有超过一个每类模块时便于区分而使用。除非明确如此陈述，这些术语的使用不意图赋予T细胞活化性双特异性抗原结合分子的特定次序或取向。
“Fab分子”指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL域组成的蛋白质。
如本文中使用的，术语“具有相同VLCL轻链的Fab分子”指共享轻链但仍具有分开的特异性，例如能结合CD3或FolR1的结合物。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性分子包含至少两个具有相同VLCL轻链的Fab分子。重建相应的重链并赋予分别针对T细胞活化性双特异性抗原CD3和靶细胞抗原FolR1的特异性结合。
“融合”意指构件(例如Fab分子和Fc域亚基)直接地或经由一种或多种肽接头通过肽键连接。
如本文中使用的，术语“单链”指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在某些实施方案中，抗原结合模块之一是单链Fab分子，即其中通过肽接头连接Fab轻链和Fab重链以形成单一肽链的Fab分子。在一个具体的此类实施方案中，在单链Fab分子中Fab轻链的C端连接于Fab重链的N端。
“交换”Fab分子(亦称为“Crossfab”)意指其中交换Fab重链和轻链的可变区或恒定区的Fab分子，即交换Fab分子包含由轻链可变区和重链恒定区构成的肽链，和由重链可变区和轻链恒定区构成的肽链。为了清楚，在其中交换Fab轻链和Fab重链的可变区的交换Fab分子中，包含重链恒定区的肽链在本文中称为交换Fab分子的“重链”。相反，在其中交换Fab轻链和Fab重链的恒定区的交换Fab分子中，包含重链可变区的肽链在本文中称为交换Fab分子的“重链”。包含一个或多个CrossFab的抗体在本文中称为“CrossMab”。
与之相反，“常规”Fab分子意指处于它的天然型式的Fab分子，即包含由重链可变和恒定区构成的重链(VH-CH1)，和由轻链可变和恒定区构成的轻链(VL-CL)。
术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重域或重链可变域，接着是3个恒定域(CH1，CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻域或轻链可变域，接着是恒定轻(CL)域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入称为α(IgA)，δ(IgD)，ε(IgE)，γ(IgG)或μ(IgM)的5类之一，其中一些可以进一步分成亚类，例如γ1(IgG1)，γ2(IgG2)，γ3(IgG3)，γ4(IgG4)，α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以归入称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc域组成。
术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指完整抗体外的分子，其包含完整抗体中结合与完整抗体结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，双抗体，线性抗体，单链抗体分子(例如scFv)，和单域抗体。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等,NatMed 9,129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见例如Plückthun,于The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；亦参见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的论述，参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger等,Proc Natl Acad Sci USA90,6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat Med 9,129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域，或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis，Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516 B1)。可以通过各种技术来制备抗体片段，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中描述的。
术语“抗原结合域”指包含特异性结合部分或整个抗原且与其互补的区域的抗体部分。抗原结合域可由例如一个或多个抗体可变域(也称为抗体可变区)提供。具体地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。参见例如Kindt等,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freemanand Co.,第91页(2007)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。
如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中序列中高度可变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。通常，天然的四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1，H2，H3)，三个在VL中(L1，L2，L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自互补性决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。除了VH中CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为“互补性决定区”(CDR)，并且在述及形成抗原结合区的可变区部分时，这些术语在本文中可交换使用。此特定区域已由Kabat等,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1983)及由Chothia等,J Mol Biol 196:901-917(1987)描述，其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一种定义来指抗体或其变体的CDR意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每篇参考文献定义的CDR的适宜的氨基酸残基在下表A中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基数将随着CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基构成特定CDR。
表A：CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM2
VH CDR1 31-35 26-32 26-35
VH CDR2 50-65 52-58 50-58
VH CDR3 95-102 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32 24-34
VL CDR2 50-56 50-52 50-56
VL CDR3 89-97 91-96 89-97
1表A中所有CDR定义的编号方式依照由Kabat等提出的编号惯例(见下文)。
2如表A中使用的具有小写字母“b”的“AbM”指由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等还定义针对可变区序列的编号系统，其可应用于任何抗体。本领域的普通技术人员可以明确地将此“Kabat编号”系统归入任何可变区序列，不依赖于序列本身外的任何实验数据。如本文中使用的，“Kabat编号方式”指由Kabat等,U.S.Dept.of Health andHuman Services,“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)提出的编号系统。除非另外说明，提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号方式依照Kabat编号系统。
序列表的多肽序列并不依照Kabat编号系统编号。然而，本领域中普通技术人员完全能将序列表的序列编号方式转变成Kabat编号方式。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。可变域的FR一般由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因而，HVR和FR序列一般以下列顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗体或免疫球蛋白的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5种主要的类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中数种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称为α，δ，ε，γ和μ。
本文中术语“Fc域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，可以存在或不存在Fc区的C端赖氨酸(Lys447)。除非本文中另外指定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，也称为EU索引，如记载于Kabat等,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991的。如本文中使用的，Fc域的“亚基”指形成二聚体Fc域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的多肽。例如，IgG Fc域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定域。
“促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰”是降低或防止包含Fc域亚基的多肽与相同多肽联合以形成同二聚体的肽主链操作或Fc域亚基的翻译后修饰。如本文中使用的，具体地，促进联合的修饰包括对期望联合的两个Fc域亚基(即Fc域的第一和第二亚基)中的每一个进行的分开的修饰，其中所述修饰彼此互补，从而促进两个Fc域亚基的联合。例如，促进联合的修饰可以改变一种或两种Fc域亚基的结构或电荷，从而在立体或静电上分别促进它们的联合。如此，异二聚化在包含第一Fc域亚基的多肽和包含第二Fc域亚基的多肽之间发生，其在融合至每个亚基的别的构件(例如抗原结合模块)不同这一意义上讲可能是不相同的。在一些实施方案中，促进联合的修饰包含在Fc域中的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。在一个具体的实施方案中，促进联合的修饰包含Fc域的两个亚基的每一个中分开的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。
术语“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)，Fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，细胞因子分泌，免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞活化。
如本文中使用的，术语“工程化”视为包括对肽主链的任何操作或对天然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列，糖基化模式或各氨基酸侧链基团的修饰，以及这些办法的组合。
如本文中使用的，术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸替代，缺失，插入和修饰。可以进行取代，缺失，插入和修饰的任意组合来实现最终构建体，只要最终构建体拥有期望的特性，例如降低的对Fc受体的结合，或与另一种肽的增加的联合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸插入。具体的氨基酸突变是氨基酸替代。为了改变例如Fc区的结合特征，特别优选非保守性的氨基酸替代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸替代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸，3-甲基组氨酸，鸟氨酸，高丝氨酸，5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变，PCR，基因合成等。通过与遗传工程化不同的方法如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也可能可用。本文中可使用各种名称来指示同一氨基酸突变。例如，从Fc域第329位脯氨酸到甘氨酸的取代可指示为329G，G329，G329，P329G或Pro329Gly。
如本文中使用的，术语“多肽”指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”指具有两个或更多个氨基酸的任何链，并且不指特定长度的产物。如此，肽，二肽，三肽，寡肽，“蛋白质”，“氨基酸链”或任何其它用于指具有两个或更多个氨基酸的链的术语均包括在“多肽”的定义中，而且术语“多肽”可以代替这些术语中任一个或与其交换使用。术语“多肽”还意图指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，酰化，通过已知的保护性/封闭性基团衍生化，蛋白水解切割，或通过非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可以自天然的生物学来源衍生或通过重组技术生成，但不必从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式来生成，包括通过化学合成。本发明的多肽大小可以是约3个以上，5个以上，10个以上，20个以上，25个以上，50个以上，75个以上，100个以上，200个以上，500个以上，1,000个以上，或2,000个以上的氨基酸。多肽可以具有限定的三维结构，尽管它们不必具有此类结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠的，而不具有限定的三维结构而可以采用大量不同构象的多肽被称为未折叠的。
“分离的”多肽或其变体或衍生物意图为不处于其天然环境中的多肽。不需要特定水平的纯化。例如，分离的多肽可以是从其天然或自然环境中取出。就本发明目的而言，在宿主细胞中表达的重组生成的多肽和蛋白质被视为分离的，已通过任何合适的技术分开，分级，或部分或基本上纯化的天然的或重组的多肽也是如此。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为测定百分比氨基酸序列同一性目的比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数，包括在比较序列的全长里获得最大比对需要的任何算法。然而，就本文中目的而言，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创作，并且源代码已与用户文档一起提交到美国版权局(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.，20559，其在美国版权注册No.TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，South San Francisco，California公开获得，或可从源代码汇编。ALIGN-2程序应当汇编用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且不改变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定的氨基酸序列A对/与/相对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或其可以用短语表示为对/与/相对给定的氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y的100倍
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在所述程序对A和B的比对中评为相同匹配的氨基酸残基数，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。会领会的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另外明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值如在上一段中描述的那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)，病毒衍生的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如酰胺键，如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸分子”指任何一种或多种存在于多核苷酸中的核酸区段，例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已从其天然环境取出的核酸分子，DNA或RNA。例如，就本发明目的而言，包含在载体中的编码多肽的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中保持的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括在普遍含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子，但该多核苷酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录本，以及正链和负链形式，和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成生成的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以为或可以包括调节元件如启动子，核糖体结合位点或转录终止子。
与本发明的参照核苷酸序列具有至少例如95％“相同的”核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，只不过按照参照核苷酸序列的每100个核苷酸，该多核苷酸序列可以包含多达5处点突变。换言之，为了获得与参照核苷酸序列具有至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，可以删除或用另一种核苷酸取代参照序列中高达5％的核苷酸，或者可以将参照序列中占总核苷酸的高达5％的数目的核苷酸插入到参照序列中。参照序列的这些变更可以发生在参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任何地方，个别分散在参照序列中的残基中或分散在参照序列内的一或多个连续组中。作为一个实际问题，可以使用已知的计算机程序，如上文针对多肽论述的程序(例如ALIGN-2)来常规确定任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列为至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同。
术语“表达盒”指重组或合成生成的，具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的指定核酸元件的多核苷酸。可以将重组表达盒掺入质粒，染色体，线粒体DNA，质体DNA，病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包含要转录的核酸序列和启动子等。在某些实施方案中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”同义，并指用于在靶细胞中导入与其可操作联合的特定基因及指导表达的DNA分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入到已经接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达盒允许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体在靶细胞内，就通过细胞转录和/或翻译装置生成基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中，本发明的表达载体包含表达盒，其包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是能用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞如CHO细胞，BHK细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6细胞或杂交瘤细胞，酵母细胞，昆虫细胞和植物细胞等，而且还包括在转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。
“激活Fc受体”是一种在抗体的Fc域衔接后，引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。人激活Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)，FcγRI(CD64)，FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是一种导致通过免疫效应器细胞对抗体包被的靶细胞裂解的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体或其衍生物一般经由Fc区的N端的蛋白质部分特异性结合的细胞。如本文中使用的，术语“降低的ADCC”定义为通过上文定义的ADCC机制，以靶细胞周围介质中给定浓度的抗体，在给定的时间内裂解的靶细胞数目的降低，和/或通过ADCC机制，实现给定时间内给定数目的靶细胞裂解需要的靶细胞周围介质中抗体浓度的增加。ADCC的降低相对于使用相同的标准生产，纯化，配制和贮存方法(其是本领域技术人员已知的)，由同一类型的宿主细胞生成但尚未工程化改造的相同抗体介导的ADCC。例如，由在其Fc域包含降低ADCC的氨基酸替代的抗体所介导的ADCC中的降低，是相对于由在Fc域中无此氨基酸替代的相同抗体介导的ADCC而言。测量ADCC的合适测定法是本领域中公知的(参见例如PCT公开文本no.WO 2006/082515或PCT公开文本no.WO 2012/130831)。
药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化必需的量。
药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指有效实现期望的治疗或预防结果的量(以必要的剂量且持续必要的时间)。治疗有效量的药剂例如消除，降低，延迟，最小化或预防疾病的不良作用。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛，绵羊，猫，犬和马)，灵长类(例如人和非人灵长类如猴)，家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，所述个体或受试者是人。
术语“药物组合物”指其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受配制剂施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂或防腐剂。
如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，缓解症状，降低疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减缓疾病进展率，改善或减轻疾病状态，及消退或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。
术语“拮抗剂”以最广义使用，包括部分或完全阻断，抑制，或中和本文中所公开的天然多肽的生物学活性的任何分子。类似的，术语“激动剂”以最广义使用，包括诱导本文中所公开的天然多肽的生物学活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子明确包括激动性或拮抗性抗体或抗体片段，包括工程化抗体片段，天然多肽的片段或氨基酸序列变体，肽，反义寡核苷酸，有机小分子等。用于鉴定多肽的激动剂或拮抗剂的方法可包括使多肽接触候选激动剂或拮抗剂分子并测量通常与所述多肽有关的一种或多种生物学活性的可检测变化。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业化包装中通常含有的说明书，其含有关于适应症，使用，剂量，施用，组合疗法，禁忌症的信息和/或关于使用此类治疗产品的警告。
据此通过援引完整收录本文中公开的所有参考文献，出版物，专利和专利申请。
实施方案的详细描述
本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子是双特异性的，即它包含能够特异性结合两种不同抗原决定簇，即CD3和FolR1的至少两种抗原结合模块。依照本发明，该抗原结合模块是Fab分子(即由各自包含一个可变区和一个恒定区的一条重链和一条轻链构成的抗原结合域)。在一个实施方案中，所述Fab分子是人的。在另一个实施方案中，所述Fab分子是人源化的。在还有另一个实施方案中，所述Fab分子包含人重和轻链恒定区。
本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够同时结合该靶细胞抗原FolR1和CD3。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够通过同时结合靶细胞抗原FolR1和CD3而交联T细胞和FolR1表达性靶细胞。在一个甚至更加特定的实施方案中，此类同时结合导致FolR1表达性靶细胞，特别是FolR1表达性肿瘤细胞裂解。在一个实施方案中，此类同时结合导致T细胞激活。在其它实施方案中，此类同时结合导致T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的选自下组的细胞应答：增殖，分化，细胞因子分泌，细胞毒性效应分子释放，细胞毒性活性，和激活标志物表达。在一个实施方案中，在没有同时结合靶细胞抗原FolR1的情况下该T细胞活化性双特异性抗原结合分子对CD3的结合不导致T细胞激活。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够将T细胞的细胞毒性活性重定向至FolR1表达性靶细胞。在一个特定的实施方案中，所述重定向不依赖于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。
特别是，依照本发明的一些实施方案的T细胞为细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，该T细胞为CD4+或CD8+T细胞，特别是CD8+T细胞。
本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个能够结合CD3的抗原结合模块(在本文中也称作“CD3抗原结合模块”或“第一抗原结合模块”)。在一个特定的实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不超过一个能够特异性结合CD3的抗原结合模块。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子提供对CD3的单价结合。在一个特定的实施方案中，CD3为人CD3或食蟹猴CD3，最特别为人CD3。在一个特定的实施方案中，该CD3抗原结合模块是对人和食蟹猴CD3交叉反应性的(即特异性结合)。在一些实施方案中，该第一抗原结合模块能够特异性结合CD3的ε亚基(参见UniProt no.P07766(版本130)，NCBI RefSeq no.NP_000724.1，SEQ ID NO:150，人序列；UniProt no.Q95LI5(版本49)，NCBI GenBank no.BAB71849.1，食蟹猴[Macaca fascicularis]序列)。
在一些实施方案中，该CD3抗原结合模块包含至少一个选自由SEQ ID NO:37，SEQID NO:38和SEQ ID NO:39组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34的组的轻链CDR。
在一个实施方案中，该CD3抗原结合模块包含SEQ ID NO:37的重链CDR1，SEQ IDNO:38的重链CDR2，SEQ ID NO:39的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2，和SEQ ID NO:34的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该CD3抗原结合模块包含：包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，该CD3抗原结合模块包含与SEQ ID NO:36至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:31至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列。
本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个能够结合靶细胞抗原FolR1的抗原结合模块(在本文中也称作“FolR1结合模块”或“第二”或“第三”抗原结合模块)。在一个实施方案中，该能够结合靶细胞抗原FolR1的抗原结合模块不结合FolR2或FolR3。在一个特定的实施方案中，该FolR1抗原结合模块是对人和食蟹猴FolR1交叉反应性的(即特异性结合)。在某些实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含两个能够结合靶细胞抗原FolR1的抗原结合模块。在一个特定的此类实施方案中，这些抗原结合模块中的每个特异结合相同抗原决定簇。在一个甚至更加特定的实施方案中，所有这些抗原结合模块是相同的。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不超过两个能够结合FolR1的抗原结合模块。
该FolR1结合模块通常是特异结合FolR1且能够将T细胞活化性双特异性抗原结合分子定向至它所连接的靶位点，例如表达FolR1的特定类型的肿瘤细胞的Fab分子。
一方面，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的Fab分子，且包含至少一个选自由SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34的组的轻链CDR；和
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子。
在一个实施方案中，该为能够特异性结合CD3的Fab分子的第一抗原结合模块包含：包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子另外包含
(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块为能够特异性结合FolR1的Fab分子。
在一个此类实施方案中，该第二和第三能够特异性结合FolR1的抗原结合模块包含相同的重链互补决定区(CDR)和轻链CDR序列。在一个此类实施方案中，该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同。
在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子另外包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
在一个实施方案中，该第一抗原结合模块和该第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N端。
在一个实施方案中，该第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端，任选经由肽接头。
在又一个特定的实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子中存在不超过一个能够特异性结合CD3的抗原结合模块(即该T细胞活化性双特异性抗原结合分子提供对CD3的单价结合)。
具有共同轻链的T细胞活化性双特异性抗原结合分子
本发明的发明人生成了一种双特异性抗体，其中结合模块共享共同轻链，其保留针对CD3的亲本单特异性抗体的特异性和功效且能使用相同轻链结合第二抗原(例如FolR1)。保留亲本抗体的结合特性的具有共同轻链的双特异性分子的生成不是直截了当的，因为杂合轻链的共同CDR不得不实现针对两种靶的结合特异性。一方面，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含第一和第二抗原结合模块，其中之一为能够特异性结合CD3的Fab分子且其中另一为能够特异性结合FolR1的Fab分子，其中该第一和该第二Fab分子具有相同VLCL轻链。在一个实施方案中，所述相同轻链(VLCL)包含SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的轻链CDR。在一个实施方案中，所述相同轻链(VLCL)包含SEQ ID NO:35。
在一个实施方案中，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的Fab分子，且包含至少一个选自由SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34的组的轻链CDR；
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，且包含至少一个选自由SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ IDNO:34的组的轻链CDR。
在一个此类实施方案中，该CD3抗原结合模块包含SEQ ID NO:37的重链CDR1，SEQID NO:38的重链CDR2，SEQ ID NO:39的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2，和SEQ ID NO:34的轻链CDR3，且该FolR1抗原结合模块包含SEQ ID NO:16的重链CDR1，SEQ ID NO:17的重链CDR2，SEQ ID NO:18的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2，和SEQ ID NO:34的轻链CDR3。
在一个实施方案中，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的Fab分子，且包含至少一个选自由SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34的组的轻链CDR；
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，其包含至少一个选自由SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:275和SEQ ID NO:315组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQID NO:34的组的轻链CDR。
在一个实施方案中，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的Fab分子，且包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的重链互补决定区(CDR)氨基酸序列，和SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的轻链CDR氨基酸序列；
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，且包含SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:275和SEQ ID NO:315的重链互补决定区(CDR)氨基酸序列，和SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，和SEQ ID NO:34的轻链CDR氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链；
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:274的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。
在又一个实施方案中，对FolR1特异性的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:15至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:31至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变体。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQ ID NO:36至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与SEQ ID NO:15至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，和与SEQ ID NO:31至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子另外包含
(iii)能够特异性结合FolR1的第三抗原结合模块(其为Fab分子)。
在一个此类实施方案中，该能够特异性结合FolR1的第二和第三抗原结合模块包含相同的重链互补决定区(CDR)和轻链CDR序列。在一个此类实施方案中，该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同。
因而，在一个实施方案中，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的Fab分子，且包含至少一个选自由SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34的组的轻链CDR；
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，且包含至少一个选自由SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ IDNO:34的组的轻链CDR。
(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，且包含至少一个选自由SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ IDNO:34的组的轻链CDR。
在一个此类实施方案中，该CD3抗原结合模块包含SEQ ID NO:37的重链CDR1，SEQID NO:38的重链CDR2，SEQ ID NO:39的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2，和SEQ ID NO:34的轻链CDR3，且该FolR1抗原结合模块包含SEQ ID NO:16的重链CDR1，SEQ ID NO:17的重链CDR2，SEQ ID NO:18的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2，和SEQ ID NO:34的轻链CDR3。
在一个实施方案中，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。
(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。
如此，在一个实施方案中，本发明涉及双特异性分子，其中至少两个结合模块具有相同轻链和相应的分别赋予针对T细胞活化性抗原CD3和靶细胞抗原FolR1的特异性结合的重建的重链。这种所谓的‘共同轻链’原理，即组合共享一种轻链但是仍然具有分开的特异性的两种结合物的使用阻止轻链错配。如此，生产期间的副产物更少，推动T细胞活化性双特异性抗原结合分子的同质制备。
T细胞活化性双特异性抗原结合分子的各构件可以以多种构造彼此融合。例示性的构造描绘于图1A-I中且在下文中进一步描述。
在一些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。下文描述包含Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的例示性实施方案。
具有交换Fab片段的T细胞活化性双特异性抗原结合分子
本发明的发明人生成了第二种双特异性抗体型式，其中结合模块之一为交换Fab片段。在本发明的一个方面中，提供单价双特异性抗体，其中IgG分子的Fab片段之一用交换Fab片段替换。交换Fab片段是如下的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。包含交换Fab片段的双特异性抗体型式已有记载，例如WO2009080252，WO2009080253，WO2009080251，WO2009080254，WO2010/136172，WO2010/145792和WO2013/026831。在一个特定的实施方案中，第一抗原结合模块为交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定区任一是交换的。此类修饰阻止来自不同Fab分子的重和轻链的错配，由此改进重组生产中本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的产量和纯度。在一种特定的对本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子有用的交换Fab分子中，Fab轻链和Fab重链的可变区是交换的。在另一种对本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子有用的交换Fab分子中，Fab轻链和Fab重链的恒定区是交换的。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的交换Fab分子，包含至少一个选自由SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34的组的轻链CDR；
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)，包含至少一个选自由SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:65的组的轻链CDR。
在一个此类实施方案中，该CD3抗原结合模块包含SEQ ID NO:37的重链CDR1，SEQID NO:38的重链CDR2，SEQ ID NO:39的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2，和SEQ ID NO:34的轻链CDR3，且该FolR1抗原结合模块包含SEQ ID NO:8的重链CDR1，SEQ ID NO:56的重链CDR2，SEQ ID NO:57的重链CDR3，SEQ ID NO:59的轻链CDR1，SEQ ID NO:60的轻链CDR2，和SEQ ID NO:65的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该第二抗原结合模块为常规Fab分子。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的交换Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，该第二抗原结合模块为常规Fab分子。
在又一个实施方案中，对FolR1特异性的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:55至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:64至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变体。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQ ID NO:36至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与SEQ ID NO:31至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与SEQ ID NO:55至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，和与SEQ ID NO:64至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子另外包含
(iii)能够特异性结合FolR1的第三抗原结合模块。
在一个实施方案中，该第三抗原结合模块为常规Fab分子。在一个实施方案中，该第三抗原结合模块为交换Fab分子。
在一个此类实施方案中，该能够特异性结合FolR1的第二和第三抗原结合模块包含相同的重链互补决定区(CDR)和轻链CDR序列。在一个此类实施方案中，该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的交换Fab分子，包含至少一个选自由SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34的组的轻链CDR；
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)，包含至少一个选自由SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:65的组的轻链CDR。
(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块够特异性结合叶酸受体1(FolR1)，包含至少一个选自由SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:65的组的轻链CDR。
在一个此类实施方案中，该CD3抗原结合模块包含SEQ ID NO:37的重链CDR1，SEQID NO:38的重链CDR2，SEQ ID NO:39的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2，和SEQ ID NO:34的轻链CDR3，且该FolR1抗原结合模块包含SEQ ID NO:8的重链CDR1，SEQ ID NO:56的重链CDR2，SEQ ID NO:57的重链CDR3，SEQ ID NO:59的轻链CDR1，SEQ ID NO:60的轻链CDR2，和SEQ ID NO:65的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该第二抗原结合模块和该第三抗原结合模块均为常规Fab分子。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的交换Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的可变轻链。
(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，该第二抗原结合模块和该第三抗原结合模块均为常规Fab分子。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的交换Fab分子，包含至少一个选自由SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34的组的轻链CDR；
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)，包含至少一个选自由SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:50组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:54的组的轻链CDR。
在一个此类实施方案中，该CD3抗原结合模块包含SEQ ID NO:37的重链CDR1，SEQID NO:38的重链CDR2，SEQ ID NO:39的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2，和SEQ ID NO:34的轻链CDR3，且该FolR1抗原结合模块包含SEQ ID NO:8的重链CDR1，SEQ ID NO:9的重链CDR2，SEQ ID NO:50的重链CDR3，SEQ ID NO:52的轻链CDR1，SEQ ID NO:53的轻链CDR2，和SEQ ID NO:54的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该第二抗原结合模块为常规Fab分子。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块为交换Fab分子。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的交换Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，该第二抗原结合模块为常规Fab分子。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块为交换Fab分子。
在又一个实施方案中，对FolR1特异性的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:49至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:51至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变体。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQ ID NO:36至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与SEQ ID NO:31至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，与SEQ ID NO:49至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列，和与SEQ ID NO:51至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的多肽序列。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子另外包含
(iii)能够特异性结合FolR1的第三抗原结合模块。
在一个实施方案中，该第三抗原结合模块为常规Fab分子。在一个实施方案中，该第二抗原结合模块为交换Fab分子。
在一个此类实施方案中，该能够特异性结合FolR1的第二和第三抗原结合模块包含相同的重链互补决定区(CDR)和轻链CDR序列。在一个此类实施方案中，该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的交换Fab分子，包含至少一个选自由SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34的组的轻链CDR；
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)，包含至少一个选自由SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:49组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:54的组的轻链CDR。
(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)，包含至少一个选自由SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:50组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:54的组的轻链CDR。
在一个此类实施方案中，该CD3抗原结合模块包含SEQ ID NO:37的重链CDR1，SEQID NO:38的重链CDR2，SEQ ID NO:39的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2，和SEQ ID NO:34的轻链CDR3，且该FolR1抗原结合模块包含SEQ ID NO:8的重链CDR1，SEQ ID NO:9的重链CDR2，SEQ ID NO:50的重链CDR3，SEQ ID NO:52的轻链CDR1，SEQ ID NO:53的轻链CDR2，和SEQ ID NO:54的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该第二抗原结合模块和该第三抗原结合模块均为常规Fab分子。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的交换Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链。
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的可变轻链。
(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块为能够特异性结合叶酸受体1(FolR1)的Fab分子，包含：包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的可变轻链。
在一个实施方案中，该第二抗原结合模块和该第三抗原结合模块均为常规Fab分子。
如此，在一个实施方案中，本发明涉及双特异性分子，其中两个结合模块赋予针对FolR1的特异性结合且一个结合模块赋予针对T细胞活化性抗原CD3的特异性。修饰重链之一以确保重和轻链的正确配对，如此消除对共同轻链办法的需要。两个FolR1结合位点的存在使得能够实现适宜的靶抗原FolR1接合和T细胞激活。
T细胞活化性双特异性抗原结合分子的各构件可以以多种构造彼此融合。例示性的构造描绘于图1A-I中且在下文中进一步描述。
在一些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。下文描述包含Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的例示性实施方案。
T细胞活化性双特异性抗原结合分子型式
如上文和图1A-I中描绘的，在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含具有相同轻链(VLCL)且具有赋予针对两种不同抗原的特异性的不同重链(VHCL)的至少两个Fab片段，即一个Fab片段能够特异性结合T细胞活化性抗原CD3且另一个Fab片段能够特异性结合该靶细胞抗原FolR1。
在另一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少两个抗原结合模块(Fab分子)，其中之一为交换Fab分子且其中另一为常规Fab分子。在一个此类实施方案中，该能够特异性结合CD3的第一抗原结合模块为交换Fab分子且该能够特异性结合FolR的第二抗原结合模块为常规Fab分子。
T细胞活化性双特异性抗原结合分子的这些构件可以以多种构造彼此融合。例示性的构造描绘于图1A-I中。
在一些实施方案中，该第一和第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个具体的此类实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的Fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中该第一和第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个此类实施方案中，该第一和第二抗原结合模块均为Fab片段且具有相同轻链(VLCL)。在另一个此类实施方案中，该能够特异性结合CD3的第一抗原结合模块为交换Fab分子且该能够特异性结合FolR的第二抗原结合模块为常规Fab分子。
在一个实施方案中，该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N端且该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个具体的此类实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合模块，由第一和第二亚基的构成的Fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合模块的Fab重链的N端，且该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个此类实施方案中，该第一和第二抗原结合模块均为Fab片段且具有相同轻链(VLCL)。在另一个此类实施方案中，该能够特异性结合CD3的第一抗原结合模块为交换Fab分子和该能够特异性结合FolR的第二抗原结合模块为常规Fab分子。任选地，该第一抗原结合模块的Fab轻链和该第二抗原结合模块的Fab轻链可以另外彼此融合。
在其它实施方案中，该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个特定的此类实施方案中，该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个具体的此类实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的Fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端，且该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个此类实施方案中，该第一和第二抗原结合模块均为Fab片段且具有相同轻链(VLCL)。在另一个此类实施方案中，该能够特异性结合CD3的第一抗原结合模块为交换Fab分子且该能够特异性结合FolR的第二抗原结合模块为常规Fab分子。任选地，该第一抗原结合模块的Fab轻链和该第二抗原结合模块的Fab轻链可以另外彼此融合。
抗原结合模块可以直接地或经由肽接头融合至Fc域或彼此融合，所述肽接头包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸。肽接头是本领域中已知且本文中记载的。合适的，非免疫原性的肽接头包括例如(G4S)n(SEQ ID NO:300)，(SG4)n(SEQ ID NO:301)，(G4S)n(SEQ ID NO:300)或G4(SG4)n(SEQ ID NO:302)肽接头。“n”一般是介于1和10之间，通常介于2和4之间的数目。一种特别适合于将第一和第二抗原结合模块的Fab轻链彼此融合的肽接头是(G4S)2(SEQ ID NO:303)。一种适合于连接第一和第二抗原结合模块的Fab重链的例示性肽接头是EPKSC(D)-(G4S)2(SEQ ID NO 304和305)。另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，当抗原结合模块融合至Fc域亚基的N端时，其可以在有或无另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其部分融合。
本发明的发明人已经发现，包含两个对靶细胞抗原FolR特异性的结合模块的T细胞活化性双特异性抗原结合分子具有与只包含一个对靶细胞抗原FolR特异性的结合模块的T细胞活化性双特异性抗原结合分子相比卓越的特征。
因而，在某些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块为能够特异性结合FolR的Fab分子。在一个此类实施方案中，该能够特异性结合FolR1的第二和第三抗原结合模块包含相同的重链互补决定区(CDR)和轻链CDR序列。在一个此类实施方案中，该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同(即它们包含相同的氨基酸序列)。
在一个实施方案中，该第一和第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N端且该第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个具体的此类实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一，第二和第三抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的Fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中该第一和第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端且该第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个此类实施方案中，该第一，第二和第三抗原结合模块为常规Fab片段且具有相同轻链(VLCL)。在另一个此类实施方案中，该能够特异性结合CD3的第一抗原结合模块为交换Fab分子且该能够特异性结合FolR的第二和第三抗原结合模块为常规Fab分子。任选地，该第一抗原结合模块的Fab轻链和该第三抗原结合模块的Fab轻链可以另外彼此融合。
因而，在某些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含形成第一，第二和第三抗原结合模块的五条多肽链，其中该第一抗原结合模块能够结合CD3且该第二和第三抗原结合模块各自能够结合叶酸受体1(FolR1)。该第一和第二多肽链以氨基(N)端至羧基(C)端方向包含第一轻链可变域(VLD1)和第一轻链恒定域(CLD1)。该第三多肽链以N端至C端方向包含第二轻链可变域(VLD2)和第二重链恒定域1(CH1D2)。该第四多肽链以N端至C端方向包含第一重链可变域(VHD1)，第一重链恒定域1(CH1D1)，第一重链恒定域2(CH2D1)和第一重链恒定域3(CH3D1)。该第五多肽链包含VHD1，CH1D1，第二重链可变域(VHD2)，第二轻链恒定域(CLD2)，第二重链恒定域2(CH2D2)和第二重链恒定域3(CH3D2)。该第三多肽链和该第五多肽链的VHD2和CLD2形成该能够结合CD3的第一抗原结合模块。该第二多肽链和该第五多肽链的VHD1和CH1D1形成该能够结合FolR1的第三结合模块。该第一多肽链和该第四多肽链的VHD1和CH1D1形成该能够结合FolR1的第二结合模块。
在另一个实施方案中，该第二和第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N端，且该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个具体的此类实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由第一，第二和第三抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的Fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中该第二和第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端且该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第三抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个此类实施方案中，该第一，第二和第三抗原结合模块为常规Fab片段且具有相同轻链(VLCL)。在另一个此类实施方案中，该能够特异性结合CD3的第一抗原结合模块为交换Fab分子且该能够特异性结合FolR的第二和第三抗原结合模块为常规Fab分子。任选地，该第一抗原结合模块的Fab轻链和该第二抗原结合模块的Fab轻链可以另外彼此融合。
抗原结合模块可以直接地或经由肽接头融合至Fc域。在一个特定的实施方案中，抗原结合模块各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体的实施方案中，该免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区。
在一个实施方案中，该第一和第二抗原结合模块和该Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个特定的实施方案中，该免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，该免疫球蛋白为IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，该免疫球蛋白为IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个特定的实施方案中，该免疫球蛋白为人免疫球蛋白。在其它实施方案中，该免疫球蛋白为嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。
在一个特定的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子，该第一和第二抗原结合模块和该Fc域是免疫球蛋白分子的部分，且该第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端，其中该第一，第二和第三抗原结合模块为常规Fab片段且具有相同轻链(VLCL)，其中该能够特异性结合CD3的第一抗原结合模块包含至少一个选自由SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的组的轻链CDR；且该能够特异性结合FolR1的第二和第三抗原结合模块包含至少一个选自由SEQ ID NO:16，SEQID NO:17和SEQ ID NO:18组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的组的轻链CDR。
在一个特定的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子，该第一和第二抗原结合模块和该Fc域是免疫球蛋白分子的部分，且该第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端，其中该第一，第二和第三抗原结合模块为常规Fab片段且具有相同轻链(VLCL)，其中该能够特异性结合CD3的第一抗原结合模块包含：包含SEQ ID NO:36的序列的可变重链，包含SEQ ID NO:31的序列的可变轻链；且该能够特异性结合FolR1的第二和第三抗原结合模块包含：包含SEQ ID NO:15的序列的可变重链，包含SEQ ID NO:31的序列的可变轻链。
在一个特定的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子，该第一和第二抗原结合模块和该Fc域是免疫球蛋白分子的部分，且该第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端且该能够特异性结合CD3的第一抗原结合模块为交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定区任一是交换的，包含至少一个选自由SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的组的轻链CDR；且该能够特异性结合FolR1的第二和第三抗原结合模块包含至少一个选自由SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57组成的组的重链互补决定区(CDR)和至少一个选自SEQ ID NO:59，SEQ IDNO:60和SEQ ID NO:65的组的轻链CDR。
在一个特定的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子，该第一和该第二抗原结合模块和该Fc域是免疫球蛋白分子的部分，且该第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端且该能够特异性结合CD3的第一抗原结合模块为交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定区任一是交换的，其中该能够特异性结合CD3的第一抗原结合模块包含：包含SEQ ID NO:36的序列的可变重链，包含SEQID NO:31的序列的可变轻链；且该能够特异性结合FolR1的第二和第三抗原结合模块包含：包含SEQ ID NO:55的序列的可变重链，包含SEQ ID NO:65的序列的可变轻链。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子对于每种抗原是单价的。在一个特定的实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子能结合人CD3和人叶酸受体α(FolR1)且是在没有采用异二聚化办法，诸如例如节入穴技术的情况下生成的。例如，该分子可以通过采用共同轻链文库和CrossMab技术来生成。在一个特定的实施方案中，CD3结合物的可变区融合至标准人IgG1抗体的CH1域以形成VLVH交叉分子(融合至Fc)，这对于两种特异性是共同的。为了生成交叉的对应物(VHCL)，CD3特异性可变重链域融合至恒定人λ轻链，而人FolR1特异性可变重链域(例如自共同轻链文库分离的)融合至恒定人κ轻链。所得具有正确配对链的期望分子包含κ和λ轻链或其片段二者。因此，这种期望的双特异性分子种类能凭借以任一顺序选择κ和λ轻链的顺序纯化步骤自错配或同二聚体种类纯化。在一个特定的实施方案中，期望的双特异性抗体的纯化采用后续的纯化步骤，凭借KappaSelect和LambdaFabSelect柱(GE Healthcare)，去除不期望的同二聚体抗体。
Fc域
T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域由一对包含免疫球蛋白分子重链域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体，其每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定域。Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。在一个实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不超过一个Fc域。
在依照本发明的一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域是IgG Fc域。在一个具体的实施方案中，Fc域是IgG1 Fc域。在另一个实施方案中，Fc域是IgG4Fc域。在一个更加具体的实施方案中，Fc域是包含位置S228(Kabat编号方式)处的氨基酸替代，特别是氨基酸替代S228P的IgG4 Fc域。此氨基酸替代降低IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等,Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在又一个具体的实施方案中，Fc域是人的。人IgG1 Fc区的一种例示性序列在SEQ ID NO:245中给出。
促进异二聚化的Fc域修饰
依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不同的抗原结合模块，其融合至Fc域的两个亚基之一个或另一个，如此Fc域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后二聚化导致两种多肽的数种可能组合。为了改进重组生产中T细胞活化性双特异性抗原结合分子的产率和纯度，如此在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域中引入促进期望多肽联合的修饰会是有利的。
因而，在具体的实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人IgG Fc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此，在一个实施方案中，所述修饰在Fc域的CH3域中。
在一个特定的实施方案中，所述修饰是所谓的“节-入-穴”修饰，其包含在Fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和在Fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。
节-入-穴技术记载于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等,Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248，7-15(2001)。一般地，该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”)，使得隆起可以置于空腔中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽的界面中创建具有与隆起相同或相似大小的互补性空腔，其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换进行。
因而，在一个具体的实施方案中，在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域的第一亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3域内生成隆起，其可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中，而且在Fc域的第二亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3域内生成空腔，其中可安置第一亚基的CH3域内的隆起。
可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来生成隆起和空腔。
在一个特定的实施方案中，在Fc域第一亚基的CH3域中，第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W)，而在Fc域第二亚基的CH3域中，第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施方案中，在Fc域第二亚基中，另外，第366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)。
在还有又一个实施方案中，在Fc域的第一亚基中，另外，第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)，而在Fc域的第二亚基中，另外，第349位的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在Fc域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定了二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个具体的实施方案中，将能够结合CD3的抗原结合模块融合(任选地经由能够结合靶细胞抗原上的FolR1的抗原结合模块)至Fc域的第一亚基(其包含“节”修饰)。不希望受理论束缚，能够结合CD3的抗原结合模块与Fc域的含节的亚基的融合会(进一步)使包含两个能够结合CD3的抗原结合模块的抗原结合分子的生成最小化(两条含节的多肽的空间碰撞)。
在一个备选的实施方案中，促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰包含介导静电操纵效应(electrostatic steering effect)的修饰，例如如记载于PCT公开文本WO 2009/089004的。一般地，此方法涉及将在两个Fc域亚基界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而在静电上不利于同二聚体形成而在静电上有利于异二聚化。
消除Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰
Fc域赋予T细胞活化性双特异性抗原结合分子以有利的药动学特性，包括长血清半衰期，其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。然而，同时它可能导致不想要的T细胞活化性双特异性抗原结合分子对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。此外，Fc受体信号传导途径的共激活可能导致细胞因子释放，其与抗原结合分子的T细胞活化特性和长半衰期组合，在系统性施用后引起细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。(携带Fc受体的)免疫细胞而非T细胞的活化甚至可能降低T细胞活化性双特异性抗原结合分子的功效，原因是例如通过NK细胞对T细胞的潜在破坏。
因而，在具体的实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域展现出与天然IgG1 Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个此类实施方案中，Fc域(或包含所述Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)展现出与天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)相比少于50％，优选少于20％，更优选少于10％且最优选少于5％的对Fc受体的结合亲和力，和/或与天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)相比少于50％，优选少于20％，更优选少于10％且最优选少于5％的效应器功能。在一个实施方案中，Fc域(或包含所述Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)没有实质性结合Fc受体和/或诱导效应器功能。在一个具体的实施方案中，所述Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中，所述Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa，FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应器功能是选自下组的一项或多项：CDC，ADCC，ADCP，和细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中，所述效应器功能是ADCC。在一个实施方案中，所述Fc域展现出与天然IgG1 Fc域相比基本相似的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc域(或包含所述Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)展现出超过约70％，特别是超过约80％，更特别是超过约90％的天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力时，实现基本相似的对FcRn的结合。
在某些实施方案中，Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常，Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个实施方案中，所述氨基酸突变降低Fc域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，所述氨基酸突变将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍，至少5倍，或至少10倍。在有超过一处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍，至少20倍，或甚至至少50倍。在一个实施方案中，包含工程化Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子展现出与包含非工程化Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子相比少于20％，特别是少于10％，更特别是少于5％的对Fc受体的结合亲和力。在一个具体的实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中，所述Fc受体是人Fc受体。在一些实施方案中，Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中，Fc受体是活化性人Fcγ受体，更特别是人FcγRIIIa，FcγRI或FcγRIIa，最特别是人FcγRIIIa。优选地，对这些受体的每一种的结合是降低的。在一些实施方案中，对补体成分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当Fc域(或包含所述Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)展现出非工程化形式的Fc域(或包含所述非工程化形式的Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的超过约70％时，实现基本相似的对FcRn的结合，即保留该Fc域对所述受体的结合亲和力。Fc域或包含所述Fc域的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以展现出超过约80％和甚至超过约90％的此类亲和力。在某些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的效应器功能。所述降低的效应器功能可包括但不限于下列一项或多项：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)，降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，降低的细胞因子分泌，降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，降低的对NK细胞的结合，降低的对巨噬细胞的结合，降低的对单核细胞的结合，降低的对多形核细胞的结合，降低的诱导凋亡的直接信号传导，降低的靶物结合的抗体的交联，降低的树突细胞成熟，或降低的T细胞引发。在一个实施方案中，所述降低的效应器功能是选自下组的一项或多项：降低的CDC，降低的ADCC，降低的ADCP，和降低的细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中，所述降低的效应器功能是降低的ADCC。在一个实施方案中，所述降低的ADCC小于20％的由非工程化Fc域(或包含非工程化Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)诱导的ADCC。
在一个实施方案中，所述降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变是氨基酸替代。在一个实施方案中，Fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代：E233，L234，L235，N297，P331和P329。在一个更特定的实施方案中，Fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代：L234，L235和P329。在一些实施方案中，Fc域包含氨基酸替代L234A和L235A。在一个此类实施方案中，Fc域是IgG1 Fc域，特别是人IgG1 Fc域。在一个实施方案中，Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代。在一个更加特定的实施方案中，氨基酸替代是P329A或P329G，特别是P329G。在一个实施方案中，Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代和又一处在选自以下位置处的氨基酸替代：E233，L234，L235，N297和P331。在一个更加特定的实施方案中，所述又一处氨基酸替代是E233P，L234A，L235A，L235E，N297A，N297D或P331S。在具体的实施方案中，所述Fc域包含在位置P329，L234和L235处的氨基酸替代。在更具体的实施方案中，所述Fc域包含氨基酸突变L234A，L235A和P329G(“P329G LALA”)。在一个此类实施方案中，Fc域是IgG1 Fc域，特别是人IgG1 Fc域。氨基酸替代组合“P329G LALA”几乎完全消除了人IgG1 Fc域的Fcγ受体结合，如记载于PCT公开文本no.WO 2012/130831，其通过提述完整并入本文。WO 2012/130831还描述了制备此类突变体Fc域的方法和用于测定其特性(诸如Fc受体结合或效应器功能)的方法。
IgG4抗体展现出与IgG1抗体相比降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因此，在一些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域是IgG4 Fc域，特别是人IgG4 Fc域。在一个实施方案中，所述IgG4 Fc域包含在位置S228处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应器功能，在一个实施方案中，所述IgG4 Fc域包含在位置L235处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代L235E。在另一个实施方案中，所述IgG4 Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代P329G。在一个具体的实施方案中，所述IgG4 Fc域包含在位置S228，L235和P329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P，L235E和P329G。此类IgG4 Fc域突变体及其Fcγ受体结合特性记载于PCT公开文本no.WO 2012/130831，其通过提述完整并入本文。
在一个具体的实施方案中，展现出与天然IgG1 Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能的Fc域是包含氨基酸替代L234A，L235A和任选地P329G的人IgG1 Fc域，或包含氨基酸替代S228P，L235E和任选地P329G的人IgG4 Fc域。
在某些实施方案中，已消除Fc域的N-糖基化。在一个此类实施方案中，所述Fc域包含在位置N297处的氨基酸突变，特别是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替换天冬酰胺的氨基酸替代。
在上文和PCT公开文本no.WO 2012/130831中描述的Fc域以外，具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有Fc域残基238，265，269，270，297，327和329中一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括具有在氨基酸位置265，269，270，297和327的两个或更多个处的替代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其具有残基265和297到丙氨酸的替代(美国专利No.7,332,581)。
可以使用本领域中公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除，替代，插入或修饰来制备突变体Fc域。遗传方法可以包括编码DNA序列的位点特异性诱变，PCR，基因合成等。正确的核苷酸变化可以通过例如测序来验证。
可以容易地测定对Fc受体的结合，例如通过ELISA或通过使用标准仪器诸如BIAcore仪(GE Healthcare)的表面等离振子共振(SPR)进行，并且Fc受体诸如可通过重组表达获得。本文中描述了一种合适的此类结合测定法。或者，可使用已知表达特定Fc受体的细胞系，如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来估测Fc域或包含Fc域的细胞活化性双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。
可通过本领域中已知的方法来测量Fc域或包含Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的效应器功能。本文中描述了用于测量ADCC的一种合适的测定法。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其它例子记载于美国专利No.5,500,362；Hellstrom等，ProcNatl Acad Sci USA 83，7059-7063(1986)和Hellstrom等，Proc Natl Acad Sci USA 82，1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann等，J Exp Med 166，1351-1361(1987)。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)；和CytoTox
Figure GDA0002732657150000521
非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)的。
在一些实施方案中，Fc域对补体成分(特别是对C1q)的结合是降低的。因而，在其中Fc域工程化为具有降低的效应器功能的一些实施方案中，所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可实施C1q结合测定法来测定T细胞活化性双特异性抗原结合分子是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro等，J ImmunolMethods 202，163(1996)；Cragg等，Blood 101，1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103，2738-2743(2004))。
T细胞活化性双特异性抗原结合分子的生物学特性和功能特征
本领域技术人员会领会在癌性和非癌性健康细胞之间选择性区分的分子的有利效率。实现这一目标的一种方式是通过适宜靶物选择。可以采用在肿瘤细胞上排他表达的标志物将效应分子或细胞选择性靶向肿瘤细胞，同时不伤害不表达此类标志物的正常细胞。然而，在一些情况中，所谓的肿瘤细胞标志物也在正常组织中表达，虽然处于较低的水平。正常组织中的这种表达唤起毒性的可能性。如此，本领域需要能更加选择性地靶向肿瘤细胞的分子。本文中描述的发明提供选择性靶向FolR1阳性肿瘤细胞且不靶向以低水平表达或根本不表达FolR1的正常非癌性细胞的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少两个，优选两个具有相对低亲和力的FolR1结合模块，这赋予容许在高和低FolR1表达性细胞之间区分的亲合效应。因为肿瘤细胞以高或中等水平表达FolR1，所以这个本发明的实施方案选择性结合肿瘤细胞和/或诱导对肿瘤细胞的杀伤，且对以低水平表达或根本不表达FolR1的正常非癌性细胞不然。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子处于2+1倒转的型式。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子诱导T细胞介导的对FolR1阳性肿瘤细胞不对非肿瘤细胞的杀伤且包含：包含SEQ ID NO:37的重链CDR1，SEQ ID NO:38的重链CDR2，SEQ ID NO:39的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2，和SEQ IDNO:34的轻链CDR3的CD3抗原结合模块和各自包含SEQ ID NO:8的重链CDR1，SEQ ID NO:9的重链CDR2，SEQ ID NO:50的重链CDR3，SEQ ID NO:52的轻链CDR1，SEQ ID NO:53的轻链CDR2，和SEQ ID NO:54的轻链CDR3的两个FolR1抗原结合模块。
在一个具体的实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子不诱导对在它的表面上具有少于约1000个拷贝的FolR1的正常细胞的杀伤。
在上述有利特征以外，本发明的一个实施方案不要求化学交联或杂合办法来生成。因而，在一个实施方案中，本发明提供能够在CHO细胞中生成的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含人源化和人多肽。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子不引起FcgR交联。在一个此类实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够在CHO细胞中生成且包含：包含SEQ ID NO:37的重链CDR1，SEQ ID NO:38的重链CDR2，SEQ ID NO:39的重链CDR3，SEQ IDNO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2，和SEQ ID NO:34的轻链CDR3的CD3抗原结合模块和各自包含SEQ ID NO:8的重链CDR1，SEQ ID NO:9的重链CDR2，SEQ ID NO:50的重链CDR3，SEQ ID NO:52的轻链CDR1，SEQ ID NO:53的轻链CDR2，和SEQ ID NO:54的轻链CDR3的两个FolR1抗原结合模块。
如上文记录的，本文中涵盖的一些实施方案包括具有两个赋予针对FolR1的特异性结合的结合模块和一个赋予针对T细胞活化性抗原CD3的特异性的结合模块的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中每个个体FolR1结合模块以低亲和力接合抗原。因为该分子包含两个赋予针对FolR1的结合的抗原结合模块，所以该分子的总体亲合力仍然提供有效的对FolR1表达性靶细胞的结合和T细胞的激活以诱导T细胞效应器功能。考虑到虽然FolR1在肿瘤细胞上以各种水平表达，但是它在某些正常细胞中也以很低水平(例如细胞表面上少于约1000个拷贝)表达，本领域技术人员会容易地认识到此类分子用作治疗剂的有利效率。此类分子选择性靶向肿瘤细胞，胜过正常细胞。如此，与以高亲和力结合FolR1以诱导效应器功能的分子相比，此类分子可以以显著更少的关于源自FolR1阳性正常细胞的毒性的担忧施用于有所需要的个体。在一个优选的实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子具有毫摩尔范围中的对huFolR1的单价结合亲和力和纳摩尔范围中的对huFolR1的亲合力。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以约10nM至约40nM的表观KD结合人FolR1。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以约10nM的表观KD结合人FolR1。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子分别以约10nM和约30nM的表观KD结合人和食蟹猴FolR1。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以至少约1000nM的单价结合KD结合人FolR1。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以约1400nM的单价结合KD结合人FolR1。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以约1400nM的单价结合KD结合人FolR1且以约5600nM的单价结合KD结合食蟹猴FolR1。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以约10nM的表观KD和约1400nM的单价结合KD结合人FolR1。
在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以约5.36pM至约4nM的表观KD结合人FolR1。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以约4nM的表观KD结合人和食蟹猴FolR1。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以约1.5nM的表观KD结合鼠FolR1。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以至少约1000nM的单价结合KD结合人FolR1。在一个具体的实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以约4nM的表观KD结合人和食蟹猴FolR1，以约1.5nM的表观KD结合鼠FolR1，且包含：包含SEQ ID NO:37的重链CDR1，SEQ ID NO:38的重链CDR2，SEQ ID NO:39的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2，和SEQ ID NO:34的轻链CDR3的CD3抗原结合模块和各自包含SEQ ID NO:8的重链CDR1，SEQ ID NO:9的重链CDR2，SEQ ID NO:50的重链CDR3，SEQ ID NO:52的轻链CDR1，SEQ ID NO:53的轻链CDR2，和SEQ IDNO:54的轻链CDR3的两个FolR1抗原结合模块。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子以至少约1000nM的单价结合KD结合人FolR1且包含：包含SEQ ID NO:37的重链CDR1，SEQ ID NO:38的重链CDR2，SEQ ID NO:39的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2，和SEQ ID NO:34的轻链CDR3的CD3抗原结合模块和各自包含SEQID NO:8的重链CDR1，SEQ ID NO:9的重链CDR2，SEQ ID NO:50的重链CDR3，SEQ ID NO:52的轻链CDR1，SEQ ID NO:53的轻链CDR2，和SEQ ID NO:54的轻链CDR3的两个FolR1抗原结合模块。
如上文描述的，本文中涵盖的T细胞活化性双特异性抗原结合分子能诱导T细胞效应器功能，例如细胞表面标志物表达，细胞因子生成，T细胞介导的杀伤。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外诱导T细胞介导的对FolR1表达性靶细胞，诸如人肿瘤细胞的杀伤。在一个实施方案中，该T细胞为CD8阳性T细胞。FolR1表达性人肿瘤细胞的例子包括但不限于Hela，Skov-3，HT-29，和HRCEpiC细胞。可用于体外测试的其它FolR1阳性人癌细胞熟练技术人员容易获得的。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在24小时之后以介于约36pM和约39573pM之间的EC50诱导T细胞介导的对FolR1表达性人肿瘤细胞的杀伤。具体涵盖T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在24小时之后以约36pM的EC50诱导T细胞介导的对FolR1表达性肿瘤细胞的杀伤。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在24小时之后以约178.4pM的EC50诱导T细胞介导的对FolR1表达性肿瘤细胞的杀伤。在一个实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子在体外在48小时之后以约134.5pM或更大的EC50诱导T细胞介导的对FolR1表达性肿瘤细胞的杀伤。可以通过本领域知道的方法，例如通过本文中通过实施例公开的方法来测量EC50。
在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子诱导T细胞上CD25和CD69中至少一项的细胞表面表达的上调，如通过流式细胞术测量的。在一个实施方案中，该T细胞为CD4阳性T细胞或CD8阳性T细胞。
在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合人肿瘤细胞上表达的FolR1。在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合人FolR1上的构象表位。在一个实施方案中，上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子不结合人叶酸受体2(FolR2)或人叶酸受体3(FolR3)。在上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，该抗原结合模块结合包含人FolR1(SEQ ID NO:227)的氨基酸25至234的FolR1多肽。在上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，该FolR1抗原结合模块结合包含SEQ ID NO:227的氨基酸序列的FolR1多肽，包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列的FolR1多肽和包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列的FolR1多肽，且其中该FolR1抗原结合模块不结合包含SEQ ID NO:228或229的氨基酸序列的FolR多肽。在一个具体的实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含如下的FolR1抗原结合模块，该FolR1抗原结合模块结合包含SEQ ID NO:227，230和231的氨基酸序列的FolR1多肽，且不结合包含SEQ ID NO:228或229的氨基酸序列的FolR多肽，且包含如下的CD3抗原结合模块，该CD3抗原结合模块包含SEQ ID NO:37的重链CDR1，SEQ ID NO:38的重链CDR2，SEQ ID NO:39的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2，和SEQ ID NO:34的轻链CDR3和两个如下的FolR1抗原结合模块，该FolR1抗原结合模块各自包含SEQ ID NO:8的重链CDR1，SEQ ID NO:9的重链CDR2，SEQ ID NO:50的重链CDR3，SEQ ID NO:52的轻链CDR1，SEQ ID NO:53的轻链CDR2，和SEQ ID NO:54的轻链CDR3。
在上述实施方案中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，该FolR1抗原结合模块结合包含SEQ ID NO:227的氨基酸序列的FolR1多肽和包含SEQID NO:231的氨基酸序列的FolR1多肽，且其中该FolR1抗原结合模块不结合包含SEQ IDNO:228，229或230的氨基酸序列的FolR多肽。在一个具体的实施方案中，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含如下的FolR1抗原结合模块，该FolR1抗原结合模块结合包含SEQID NO:227的氨基酸序列的FolR1多肽和包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列的FolR1多肽，且其中该FolR1抗原结合模块不结合包含SEQ ID NO:228，229或230的氨基酸序列的FolR多肽，且包含如下的CD3抗原结合模块，该CD3抗原结合模块包含SEQ ID NO:37的重链CDR1，SEQ ID NO:38的重链CDR2，SEQ ID NO:39的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ IDNO:33的轻链CDR2，和SEQ ID NO:34的轻链CDR3和两个如下的FolR1抗原结合模块，该FolR1抗原结合模块各自包含SEQ ID NO:16的重链CDR1，SEQ ID NO:275的重链CDR2，SEQ ID NO:315的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2，和SEQ ID NO:34的轻链CDR3。
就FolR1而言，本文中涵盖的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可具有激动，拮抗或中性效果。激动效果的例子包括在通过FolR1结合模块与靶细胞上的FolR1受体接合后诱导或增强经由FolR1的信号传导。拮抗活性的例子包括在通过FolR1结合模块与靶细胞上的FolR1受体接合后消除或降低经由FolR1的信号传导。这可以例如通过阻断或降低叶酸与FolR1之间的相互作用而发生。具体涵盖具有更低亲和力，同时保留上文所述生物学特性的本文中公开的实施方案的序列变体。
免疫缀合物
本发明还关于包含与细胞毒剂诸如化疗剂，生长抑制剂，毒素(例如细菌，真菌，植物，或动物起源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(即放射缀合物)缀合的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的免疫缀合物。
多核苷酸
本发明还提供分离的多核苷酸，其编码如本文中描述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段。
本发明的多核苷酸包括那些与SEQ ID NO:151-226所列序列，包括其功能性片段或变体至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的。
可以将编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸以编码完整T细胞活化性双特异性抗原结合分子的单一多核苷酸表达，或以共表达的多种(例如两种或更多种)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性T细胞活化性双特异性抗原结合分子。例如，抗原结合模块的轻链部分可以与T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含抗原结合模块重链部分，Fc域亚基和任选地(部分的)另一个抗原结合模块的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽会与轻链多肽联合以形成抗原结合模块。在另一个例子中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含两个Fc域亚基之一和任选地(部分的)一个或多个抗原结合模块的部分可以与T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含两个Fc域亚基中另一个和任选地(部分的)抗原结合模块的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，Fc域亚基会联合以形成Fc域。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸编码整个依照本文所述发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在其它实施方案中，所述分离的多核苷酸编码依照本文所述发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含的多肽。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQ ID NO 151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223中所示可变区序列的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQ ID NO 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111,112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244中所示多肽序列的序列。在另一个实施方案中，本发明又涉及编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO 97，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，12，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，246，247中所示核苷酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO 97，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，12，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，246，247中所示核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO 1，2，3，4，5，6，7，11,13，15，19，21，12，25，27，29，31，36，41，45，49，51，55，58，62，64，66，68，70，72，74，76，78，82，113，114，115，116，117，118，119，12，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135中的氨基酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的可变区序列的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码包含与SEQ ID NO 8，9，50，37，38，和39中的氨基酸序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的一种或多种序列的多肽的序列。本发明涵盖编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码带保守氨基酸替代的SEQ ID NO 151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223的可变区序列的序列。本发明还涵盖编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码带保守氨基酸替代的SEQ ID NO1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，1，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138和227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244的多肽序列的序列。
在某些实施方案中，所述多核苷酸或核酸是DNA。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
可以获得本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，例如通过固相肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生成进行。对于重组生成，分离一种或多种编码所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸(例如如上文描述的)，并将其插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程容易分离并测序此类多核苷酸。在一个实施方案中，提供包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体(优选为表达载体)。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列以及适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如记载于Maniatis等,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associatesand Wiley Interscience,N.Y(1989)的技术。表达载体可以是质粒，病毒的一部分或可以是核酸片段。表达载体包含表达盒，其中在与启动子和/或其它转录或翻译控制元件的可操作联合中克隆编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸(即编码区)。如本文中使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。尽管“终止密码子”(TAG，TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但可将其视为编码区的一部分(若存在的话)，但任何侧翼序列例如启动子，核糖体结合位点，转录终止子，内含子，5’和3’非翻译区等，不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中(例如单一载体上)，或存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译分开成最终蛋白质。另外，本发明的载体，多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其与编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于特殊化的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能域。当基因产物例如多肽的编码区与一种或多种调节序列以某种方式联合从而使得该基因产物的表达置于该调节序列的影响或控制下时，即为可操作联合。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mRNA的转录并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导该基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(如多肽编码区和与其联合的启动子)为“可操作联合的”。如此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么该启动子区将是与该核酸可操作联合。所述启动子可以是细胞特异性启动子，其仅在预先确定的细胞中指导DNA的实质性转录。除启动子以外，其它转录控制元件例如增强子，操纵基因，阻遏物和转录终止信号能与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子，以及内含子-A)，猿病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因如肌动蛋白，热休克蛋白，牛生长激素和家兔
Figure GDA0002732657150000621
球蛋白衍生的，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点，翻译起始和终止密码子以及自病毒系统衍生的元件(具体地，内部核糖体进入位点或IRES，也称作CITE序列)。表达盒还可以包含其它特征，如复制起点和/或染色体整合元件，如逆转录病毒长末端重复(LTR)或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外的编码区联合，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果期望分泌所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子，那么可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的核酸上游。依照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦启动将生长的蛋白质链跨越粗面内质网输出，就将该信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽N端的信号肽，其从所翻译的多肽切去以生成分泌性或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以将野生型前导序列用人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。
可以将编码能用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记T细胞活化性双特异性抗原结合分子的短蛋白序列的DNA纳入T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)编码多核苷酸内或其末端。
在一个别的实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独地或组合地掺入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已用该载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子(的部分)的多核苷酸。如本文中使用的，术语“宿主细胞”指任何能工程化以生成本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的细胞系统种类。适用于复制并支持T细胞活化性双特异性抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适当时，可用特定的表达载体转染或转导此类细胞，并且可以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，昆虫细胞等。例如，可以在细菌中生成多肽，尤其在不需要糖基化时。在表达后，可以将多肽在可溶性级分中从细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合编码多肽的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化模式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)，和Li等,Nat Biotech 24,210-215(2006)。适用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177，6,040,498,6,420,548，7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适应于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如记载于Graham等,J Gen Virol 36,59(1977))，幼仓鼠肾细胞(BHK)，小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如记载于Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)的)，猴肾细胞(CV1)，非洲绿猴肾细胞(VERO-76)，人宫颈癌细胞(HELA)，犬肾细胞(MDCK)，牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)，人肺细胞(W138)，人肝细胞(Hep G2)，小鼠乳房肿瘤细胞(MMT 060562)，TRI细胞(如例如记载于Mather等,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)的)，MRC 5细胞和FS4细胞。其它可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等,Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO，NS0，P3X63和Sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞，酵母细胞，昆虫细胞，细菌细胞和植物细胞等，但还包括在转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选为哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0，NS0，Sp20细胞)。
本领域中已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。可以将表达包含抗原结合域如抗体的重链或轻链的多肽的细胞工程化改造为使得还表达另一抗体链，从而使得表达的产物是具有重链和轻链两者的抗体。
在一个实施方案中，提供了生成依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，其中所述方法包括在适合于所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子表达的条件下培养包含编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸的宿主细胞(如本文中提供的)，并从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子。
所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的各构件彼此遗传融合。T细胞活化性双特异性抗原结合分子可设计为使其构件直接彼此融合或经由接头序列间接融合。可依照本领域中公知的方法测定接头的组成和长度，并可以测试功效。T细胞活化性双特异性抗原结合分子不同构件之间的接头序列的例子见于本文中提供的序列。还包含另外的序列以纳入切割位点来分开融合的各个构件(若期望的话)，例如内肽酶识别序列。
在某些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个或多个抗原结合模块至少包含能结合抗原性决定簇的抗体可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分和自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域中公知的(参见例如Harlow和Lane,“Antibodies,a laboratory manual”,Cold Spring HarborLaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成构建生成，可以重组生成(例如如记载于美国专利No.4,186,567的)或可通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合库获得(参见例如McCafferty的美国专利No.5,969,108)。
可以将抗体，抗体片段，抗原结合域或可变区的任何动物种类用于本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。可用于本发明的非限制性抗体，抗体片段，抗原结合域或可变区可以是鼠，灵长类或人起源的。如果T细胞活化性双特异性抗原结合分子意图供人使用，那么可以使用嵌合形式的抗体，其中抗体的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化或全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上，保留或不保留关键的框架残基(例如那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上，或(c)移植完整的非人可变域，但通过替换表面残基用人样部分来“掩饰(cloak)”它们。人源化的抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)，并且还记载于例如Riechmann等，Nature 332,323-329(1988)；Queen等,Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337，7,527,791，6,982,321和7,087,409；Jones等，Nature321，522-525(1986)；Morrison等，Proc Natl Acad Sci 81，6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv Immunol 44，65-92(1988)；Verhoeyen等，Science239，1534-1536(1988)；Padlan，Molec Immun 31(3)，169-217(1994)；Kashmiri等，Methods 36，25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan，Mol Immunol28，489-498(1991)(描述“表面重建”)；Dall’Acqua等，Methods 36，43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等，Methods 36，61-68(2005)以及Klimka等，Br J Cancer 83，252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”办法)。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体和人可变区。人抗体一般记载于van Dijk和van deWinkel，Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)以及Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)。人可变区能形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分和自其衍生(参见例如Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体和人可变区，所述转基因动物已经过修饰以应答抗原激发而生成完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见例如Lonberg,Nat Biotech 23，1117-1125(2005)。还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示库的Fv克隆可变区序列来生成人抗体和人可变区(参见例如Hoogenboom等，于Methods in Molecular Biology 178，1-37(O’Brien等编，HumanPress，Totowa，NJ，2001)；和McCafferty等，Nature 348，552-554；Clackson等，Nature352，624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。
在某些实施方案中，将可用于本发明的抗原结合模块工程化改造为具有增强的结合亲和力，其依照例如公开于美国专利申请公开文本No.2004/0132066的方法进行，其完整内容通过提述据此并入。可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术来测量本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合特定抗原性决定簇的能力，所述其它技术例如表面等离振子共振技术(在BIACORE T100系统上分析)(Liljeblad等，Glyco J 17，323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley，Endocr Res 28，217-229(2002))。可以使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争对特定抗原的结合的抗体，抗体片段，抗原结合域或可变域，例如与V9抗体竞争对CD3的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合由参照抗体结合的相同表位(例如线性或构象性表位)。用于定位抗体结合的表位的详细的例示性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols，”于Methodsin Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。在一种例示性竞争测定法中，将固定化的抗原(例如CD3)在溶液中温育，所述溶液包含结合该抗原的第一标记抗体(例如V9抗体，记载于US 6,054,297)和测试其与第一抗体竞争对抗原的结合的能力的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含第一标记抗体但没有第二未标记抗体。在允许第一抗体结合抗原的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果与固定化抗原联合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质性降低，那么这指示第二抗体在与第一抗体竞争对抗原的结合。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A LaboratoryManual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，所述技术如高效液相层析，离子交换层析，凝胶电泳，亲和层析，大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于因素，如净电荷，疏水性，亲水性等，而且对于本领域中的技术人员将是明显的。对于亲和层析纯化，能使用T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合的抗体，配体，受体或抗原。例如，对于本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以使用连续的蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析来分离T细胞活化性双特异性抗原结合分子，基本如实施例中描述的。可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定T细胞活化性双特异性抗原结合分子的纯度，包括凝胶电泳，高压液相层析等。例如，如实施例中所描述的那样表达的重链融合蛋白显示为完整且正确装配的，如通过还原性SDS-PAGE证明的(见例如图2)。在约Mr 25,000,Mr 50,000和Mr 75,000处解析出三条条带，其对应于预测的T细胞活化性双特异性抗原结合分子轻链，重链和重链/轻链融合蛋白的分子量。
测定法
通过本领域中已知的各种测定法，可以鉴定，筛选或表征本文中提供的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的物理/化学特性和/或生物学活性。
亲和力测定法
可以依照实施例中提出的方法使用标准的仪器如BIAcore仪(GE Healthcare)通过表面等离振子共振(SPR)测定T细胞活化性双特异性抗原结合分子对Fc受体或靶抗原的亲和力，而且可以诸如通过重组表达获得受体或靶蛋白。或者，可以例如通过流式细胞术(FACS)，使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估T细胞活化性双特异性抗原结合分子对不同受体或靶抗原的结合。一个用于测量结合亲和力的特定的说明性和例示性实施方案记载于下文和下文实施例。
依照一个实施方案，通过表面等离振子共振使用
Figure GDA0002732657150000671
T100仪(GEHealthcare)于25℃测量KD。
为了分析Fc部分与Fc受体之间的相互作用，通过固定化于CM5芯片上的抗5xHis抗体(“5xHis”作为SEQ ID NO:306公开)(Qiagen)来捕捉带His标签的重组Fc受体并将双特异性构建体用作分析物。简言之，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GE Healthcare)依照供应商说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗5xHis抗体(“5xHis”作为SEQ ID NO:306公开)用10mM醋酸钠pH5.0稀释至40μg/ml，接着以5μl/分钟的流速注射以实现约6500响应单位(RU)的偶联蛋白。在注射配体后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。然后，在4或10nM捕捉Fc受体60秒。对于动力学测量，将双特异性构建体的4倍连续稀释液(范围为约500nM至4000nM)在HBS-EP(GEHealthcare,10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％表面活性剂P20,pH 7.4)中于25℃以约30μl/分钟的流速注射120秒。
为了测定对靶抗原的亲和力，通过固定化于活化CM5传感器芯片表面上的抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare)来捕捉双特异性构建体，如对于抗5xHis抗体(“5xHis”作为SEQ ID NO:306公开)所描述的。偶联蛋白质的最终量为约12000RU。双特异性构建体在300nM捕捉90秒。使靶抗原在从250至1000nM的浓度范围以30μl/min的流速通过流动池达180秒。监测解离达180秒。
通过扣除在参照流动池上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractiveindex)差异。使用稳定态响应通过Langmuir结合等温线的非线性曲线拟合来导出解离常数KD。使用简单的1对1Langmuir结合模型(BIACORE
Figure GDA0002732657150000681
T100评估软件版本1.1.1)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(k结合)和解离速率(k解离)。平衡解离常数(KD)计算为比率k解离/k结合。参见例如Chen等,J Mol Biol 293,865-881(1999)。
活性测定法
可以通过各种测定法来测量本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的生物学活性，如实施例中描述的。生物学活性可例如包括诱导T细胞的增殖，诱导T细胞中的信号传导，诱导T细胞中活化标志物的表达，诱导通过T细胞的细胞因子分泌，诱导靶细胞如肿瘤细胞的裂解，和诱导肿瘤消退和/或改善存活。
组合物，配制剂和施用路径
在一个别的方面，本发明提供包含本文中提供的任一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子的药物组合物，例如用于以下任一种治疗方法。在一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子以及药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子以及至少一种另外的治疗剂，例如如下文描述的。
还提供以适于体内施用的形式生成本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，所述方法包括(a)获得依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，并(b)将所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子与至少一种药学可接受载体配制在一起，由此配制成用于体内施用的T细胞活化性双特异性抗原结合分子制剂。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的在药学可接受载体中溶解或分散的一种或多种T细胞活化性双特异性抗原结合分子。短语“药学或药理学可接受的”指在所采用的剂量和浓度一般对接受者无毒性，即在适当时对动物如例如人施用时不产生不利，变应性或其它不当反应的分子实体和组合物。根据本公开，制备含有至少一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子以及任选地另外的活性成分的药物组合物将是本领域技术人员已知的，如由Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990例示的，其通过提述并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，会理解制剂应当满足FDA生物标准部门(FDA Office of Biological Standards)或其它国家的相应机构要求的无菌性，热原性(pyrogenicity)，一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干配制剂或水性溶液。如本文中使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有的溶剂，缓冲剂，分散介质，涂料材料，表面活性剂，抗氧化剂，防腐剂(例如抗细菌剂，抗真菌剂)，等张剂，吸收延缓剂，盐，防腐剂，抗氧化剂，蛋白质，药物，药物稳定剂，聚合物，凝胶，粘合剂，赋形剂，崩解剂(disintegrationagent)，润滑剂，甜味剂，芳香剂，染料，此类类似的材料及其组合，如本领域普通技术人员将已知的(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack PrintingCompany,1990,pp.1289-1329，通过提述并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，涵盖其在治疗或药物组合物中的使用。
所述组合物可以包含不同类型的载体，这取决于其要以固体，液体还是气雾剂形式施用，以及其对于此类施用路径如注射是否需要是无菌的。可以静脉内，皮内，动脉内，腹膜内，损伤内，颅内，关节内，前列腺内，脾内，肾内，胸膜内，气管内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，肿瘤内，肌内，腹膜内，皮下，结膜下，囊泡内，粘膜，心包内，脐内，眼内，口服，表面(topically)，局部(locally)，通过吸入(例如气雾剂吸入)，注射，输注，连续输注，直接浸洗靶细胞的局部灌注，经由导管，经由灌洗，以乳剂，以液体组合物(例如脂质体)，或通过其它方法或前述项的任意组合施用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(以及任何另外的治疗剂)，如本领域中普通技术人员会知晓的(参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990，通过提述并入本文)。胃肠外施用，特别是静脉内注射，最常用于施用多肽分子如本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。
胃肠外组合物包括那些设计用于通过注射施用，例如皮下，皮内，损伤内，静脉内，动脉内，肌内，鞘内或腹膜内注射施用的组合物。对于注射，可以将本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子在水性溶液，优选地在生理学相容的缓冲液中配制，所述生理学相容的缓冲液如汉克(Hanks)氏溶液，林格(Ringer)氏溶液或生理学盐水缓冲液。溶液可以含有配制剂如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。或者，T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以为粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水构成。根据需要，通过将本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以需要的量掺入到具有下文列举的各种其它成分的合适溶剂中来制备无菌可注射溶液。可以容易地实现无菌，例如通过过滤流过无菌过滤膜进行。一般地，通过将各种无菌活性成分掺入到无菌媒介物中来制备分散剂，所述无菌媒介物含有基础分散介质和/或其它成分。在制备无菌可注射溶液，悬液或乳剂的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，其将活性成分以及任何另外的期望成分的粉末从其先前无菌过滤的液体介质产生。液体介质在必要时应当是适当缓冲的，并且在用充足的盐水或葡萄糖注射前首先使液体稀释液等张。组合物在制备和贮存条件下必须是稳定的，并且针对微生物如细菌和真菌的污染作用提供保护。会领会的是，应当将内毒素污染最少保持于安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学可接受载体包括但不限于：缓冲剂如磷酸，柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵(hexamethonium chloride)；氯化苯甲烃铵(benzalkonium chloride)；氯化苄乙铵(benzethoniumchloride)；酚，丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清清蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬液可以含有提高悬液粘度的化合物，如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇，葡聚糖等。任选地，悬液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。另外，可以将活性化合物的悬液制备为合适的油性注射悬液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油或合成的脂肪酸酯，如乙基cleats或甘油三酯或脂质体。
可以将活性成分在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合作用制备的微囊剂，例如羟甲基纤维素或明胶微囊剂和聚-(甲基丙烯酸酯)微囊剂中，在胶体药物投递系统(例如脂质体，清蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液(macroemulsion)中包载。此类技术披露于Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Ed.Mack PrintingCompany,1990)。可以制备持续释放的制剂。合适的持续释放制剂的例子包括含多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品例如膜或微囊剂的形式。在具体的实施方案中，可以通过在组合物中使用吸收延迟剂如例如单硬脂酸铝，明胶或其组合，来产生可注射组合物的延长吸收。
在先前描述的组合物外，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还可以配制为贮存(depot)制剂。可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用此类长效配制剂。如此，例如所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以用合适的聚合或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶性衍生物，例如微溶性盐。
可以通过常规的混合，溶解，乳化，包囊，包载或冻干过程来制备包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的药物组合物。可以以常规方式配制药物组合物，其使用一种或多种有助于将蛋白质加工成可药学使用的制剂的生理学可接受载体，稀释剂，赋形剂或辅助剂。合适的配制剂依赖于选择的施用路径。
可以将T细胞活化性双特异性抗原结合分子以游离酸或碱，中性或盐形式配制成组合物。药学可接受盐是基本保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐(acidaddition salt)，例如与蛋白质性组合物的游离氨基基团形成的那些，或与无机酸(如例如氢氯酸或磷酸)或与有机酸如乙酸，草酸，酒石酸或扁桃酸形成的。与游离羧基基团形成的盐还可以自无机碱如例如氢氧化钠，钾，铵，钙或铁；或有机碱如异丙胺，三甲胺，组氨酸或普鲁卡因(procaine)衍生。药用盐倾向于比相应的游离碱形式更可溶于水性溶剂和其它质子溶剂中。
治疗方法和组合物
可以将本文中提供的任一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子用在治疗方法中。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可用作免疫治疗剂，例如在癌症的治疗中。
对于在治疗方法中的使用，将以与优良医学实践一致的方式配制，给药和施用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在此背景中考虑的因素包括治疗的特定病症，治疗的特定哺乳动物，个体患者的临床状况，病症的起因，药剂的投递部位，施用方法，施用时间安排以及医学从业人员已知的其它因素。
在一个方面，提供用作药物的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在别的方面，提供用于治疗疾病的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，本发明提供如本文中描述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，用于治疗有此需要的个体中的疾病。在某些实施方案中，本发明提供T细胞活化性双特异性抗原结合分子，用于治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括对所述个体施用治疗有效量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。在别的实施方案中，本发明提供如本文中描述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。在某些实施方案中，本发明提供T细胞活化性双特异性抗原结合分子，用于在个体中诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法，该方法包括对该个体施用有效量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞的裂解。依照上文任何实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。
在一个别的方面，本发明提供本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗有此需要的个体中的疾病。在一个别的实施方案中，所述药物用于治疗疾病的方法，该方法包括对患疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在一个实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。在一个别的实施方案中，所述药物用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。仍在别的实施方案中，所述药物用于在个体中诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法，所述方法包括对该个体施用有效量的药物以诱导靶细胞的裂解。依照上文任何实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。
在一个别的方面，本发明提供用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对患有此类疾病的个体施用治疗有效量的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，对所述个体施用组合物，其包含药学可接受的形式的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。依照上文任何实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。
在一个别的方面，本发明提供一种用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在存在T细胞，特别是细胞毒性T细胞的情况下使靶细胞与本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子接触。在一个别的方面，提供一种用于在个体中诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个此类实施方案中，所述方法包括对个体施用有效量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞裂解。在一个实施方案中，“个体”是人。
在某些实施方案中，所述待治疗的疾病是增殖性病症，特别是癌症。癌症的非限制性例子包括膀胱癌，脑癌，头和颈癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，子宫癌，宫颈癌，子宫内膜癌，食道癌，结肠癌，结肠直肠癌，直肠癌，胃癌，前列腺癌，血液癌，皮肤癌，鳞状细胞癌，骨癌和肾癌。其它可使用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子治疗的细胞增殖病症包括但不限于位于下列各项中的新生物：腹部，骨，乳房，消化系统，肝，胰，腹膜，内分泌腺(肾上腺，副甲状腺，垂体，睾丸，卵巢，胸腺，甲状腺)，眼，头和颈，神经系统(中枢和外周)，淋巴系统，骨盆，皮肤，软组织，脾，胸区，和泌尿生殖系统。还包括癌症前期状况或损伤以及癌症转移。在某些实施方案中，癌症选自下组：肾细胞癌，皮肤癌，肺癌，结肠直肠癌，乳腺癌，脑癌，头和颈癌。熟练技术人员容易地认可在许多情况下，T细胞活化性双特异性抗原结合分子可能不提供治愈而仅可以提供部分益处。在一些实施方案中，具有一些益处的生理学变化也被视为治疗有益的。如此，在一些实施方案中，提供生理学变化的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的量被视为“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者，患者或个体通常为哺乳动物，更特定地为人。
在一些实施方案中，对细胞施用有效量的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在其它实施方案中，对个体施用治疗有效量的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以治疗疾病。
为了预防或治疗疾病，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的合适剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型，施用路径，患者的体重，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的类型，疾病的严重程度和进程，施用T细胞活化性双特异性抗原结合分子是为了预防还是治疗目的，先前或同时的治疗干预，患者的临床史和对T细胞活化性双特异性抗原结合分子的响应，以及主治医师的判断。负责施用的从业人员将在任何事件中确定组合物中活性成分的浓度和用于个体受试者的合适剂量。本文中涵盖各种给药方案，包括但不限于在各个时间点的单次或多次施用，推注施用，和脉冲输注。
所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子适宜地在一次或一系列治疗里对患者施用。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以是用于对患者施用的起始候选剂量，不管是例如通过一次或多次分开的施用，还是通过连续输注进行。根据上文提及的因素，一种典型的每日剂量的范围可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在数天或更长里的重复施用，根据状况，治疗一般将持续直至发生对疾病症状的期望的抑制。T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一种例示性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其它非限制性例子中，剂量还可包括每次施用从约1微克/kg体重，约5微克/kg体重，约10微克/kg体重，约50微克/kg体重，约100微克/kg体重，约200微克/kg体重，约350微克/kg体重，约500微克/kg体重，约1毫克/kg体重，约5毫克/kg体重，约10毫克/kg体重，约50毫克/kg体重，约100毫克/kg体重，约200毫克/kg体重，约350毫克/kg体重，约500毫克/kg体重，至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可导出的任何范围。在从本文列出的数量可导出的范围的非限制性例子中，基于上文描述的数目，可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重的范围，约5微克/kg体重至约500毫克/kg体重的范围等。如此，可以对患者施用一剂或多剂的约0.5mg/kg，2.0mg/kg，5.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。可以间歇地施用此类剂量，例如每周或每3周(例如使得患者接受约2至约20，或例如约6剂的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)。可以施用起始较高的加载剂量，继之以一剂或多剂较低剂量。然而，可以使用其它剂量方案。通过常规技术和测定法容易监测该疗法的进行。
本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子一般将以对于实现意图的目的有效的量使用。对于治疗或预防疾病状况的用途，以治疗有效量施用或应用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，或其药物组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力以内，尤其根据本文中提供的详细公开内容。
对于系统性施用，能从体外测定法如细胞培养测定法初步估算出治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包含如在细胞培养中测定的IC50的循环浓度范围。可以将此类信息用于更准确地确定人中的可用剂量。
使用本领域中公知的技术，还能从体内数据例如动物模型估算出初始剂量。本领域中的普通技术人员能容易地基于动物数据优化对人的施用。
可以分别调整剂量量和时间间隔以提供足以维持治疗效果的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的血浆水平。通过注射施用的可用患者剂量的范围为从约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。可以通过每日施用多剂实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC测量血浆中的水平。
在局部施用或选择性摄取的情况中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员会能够在无需过度实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文中描述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的治疗有效剂量一般将提供治疗益处，而不导致实质性毒性。可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学规程来测定T细胞活化性双特异性抗原结合分子的毒性和治疗功效。可以使用细胞培养测定法和动物研究来测定LD50(对50％的群体致命的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率为治疗指数，其可以表达为LD50/ED50比。优选展现出较大治疗指数的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子展现出高治疗指数。可以将从细胞培养测定法和动物研究获得的数据用来制定适用于人的剂量范围。优选地，剂量处于具有很小或无毒性的循环浓度(包含ED50)的范围内。剂量在此范围内可以随多种因素，例如采用的剂量形式，利用的施用路径，受试者的状况等而变化。鉴于患者的状况，各个内科医生可以选择确切的配制剂，施用路径和剂量(参见例如Fingl等,1975，于：The Pharmacological Basis ofTherapeutics,Ch.1,p.1,通过提述完整并入本文)。
用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子治疗的患者的主治内科医生将知晓如何及何时终止，中断或调整施用(由于毒性，器官功能障碍等)。相反，如果临床应答不适当(排除毒性)，主治内科医生还将知晓如何将治疗调整至更高水平。在感兴趣的病症的管理中的施用剂量的量级将随待治疗的状况的严重程度，施用路径等而变化。可以例如部分地通过标准的预后评估方法来评估状况的严重程度。另外，剂量以及可能的给药频率也将随个体患者的年龄，体重和应答而变化。
其它药剂和治疗
本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以与一种或多种其它药剂在疗法中组合施用。例如，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以与至少一种另外的治疗剂共施用。术语“治疗剂”涵盖施用以治疗需要此类治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。此类另外的治疗剂可以包含任何适用于所治疗的特定适应征的任何活性成分，优选地具有不会彼此不利影响的互补活性的那些活性成分。在某些实施方案中，另外的治疗剂是免疫调控剂，细胞抑制剂，细胞粘着的抑制剂，细胞毒剂，细胞凋亡的激活剂，或提高细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂。在一个具体的实施方案中，另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏物，抗代谢物，拓扑异构酶抑制剂，DNA嵌入剂，烷化剂，激素疗法，激酶抑制剂，受体拮抗剂，肿瘤细胞凋亡的激活剂，或抗血管生成剂。
此类其它药剂以对意图目的有效的量适宜地组合存在。此类其它药剂的有效量取决于使用的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的量，病症或治疗的类型以及上文所述其它因素。所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子一般以与本文中描述的相同的剂量和施用路径，或以本文中描述的剂量的约1至99％，或通过凭经验/临床上确定为合适的任何剂量和任何路径使用。
上文记载的此类组合疗法涵盖组合施用(其中在同一组合物或分别的组合物中包含两种或更多种治疗剂)和分开施用，在该情况中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的施用可以在施用另外的治疗剂和/或辅助剂之前，同时和/或之后发生。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子还可以与放射疗法组合使用。
另一方面，本发明提供一种双特异性抗体，其包含a)包含SEQ ID NO:274的可变重链域(VH)和SEQ ID NO:31的可变轻链域的第一抗原结合位点；和b)包含SEQ ID NO:36的可变重链域(VH)和SEQ ID NO:31的可变轻链域的第二抗原结合位点，其用于与针对PD-L1或FAP-4-1BBL的抗体组合。在一个实施方案中，该双特异性抗体进一步包含：包含SEQ ID NO:274的可变重链域(VH)和SEQ ID NO:31的可变轻链域的第三抗原结合位点。
制品
在本发明的另一个方面，提供含有可用于治疗，预防和/或诊断上文描述的病症的材料的制品。所述制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，IV溶液袋等。所述容器可从多种材料如玻璃或塑料形成。所述容器容纳组合物，其自身或与其它组合物组合对于治疗，预防和/或诊断状况是有效的，并且可以具有无菌的存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中至少一种活性成分是本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的状况。此外，所述制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性或其它方面治疗剂。本发明的这一实施方案中的制品还可以包含包装插页，其指示该组合物可用于治疗特定状况。或者/另外，所述制品还可以包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针，和注射器。
实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实践各种其他实施方案。
通用方法
重组DNA技术
使用标准方法操作DNA，如Sambrook et al.,Molecular cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中描述的。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息参见：Kabat,E.A.et al.，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th ed.,NIH Publication No 91-3242。
DNA测序
在Synergene(Schlieren)通过标准双链测序来测定DNA序列。
基因合成
在需要的情况下，期望的基因区段使用适宜的模板通过PCR来生成或由GeneartAG(Regensburg,Germany)通过自动化基因合成从合成的寡核苷酸和PCR产物合成。在确切基因序列不可得的情况下，基于来自最近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并通过RT-PCR从源自适宜组织的RNA分离基因。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆入标准的克隆/测序载体。从经转化的细菌纯化质粒DNA，并通过UV分光术测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。基因区段设计为具有合适的限制性位点以允许亚克隆入相应的表达载体。所有构建体均设计为具有编码前导肽的5’端DNA序列，该前导肽在真核细胞中将蛋白质靶向分泌。
从PBMC分离原代人泛T细胞
通过Histopaque密度离心从富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)制备外周血单个核细胞(PBMC)，所述制备物自当地血库或来自健康人供体的新鲜血液获得。简言之，将血液用无菌PBS稀释并小心在Histopaque梯度(Sigma,H8889)上铺层。于室温以450xg离心30分钟后(开启制动器)，丢弃含PBMC界面上方的血浆部分。将PBMC转移至新的50ml Falcon管并将管用PBS补充至总体积50ml。将混合物于室温以400xg离心10分钟(关闭制动器)。丢弃上清液并将PBMC团粒用无菌PBS清洗两次(离心步骤为4℃，350xg，10分钟)。将所得PBMC群自动计数(ViCell)并在温箱中在37℃，5％CO2在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom,K0302)的RPMI1640培养基中贮存直至测定开始。
使用泛T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec#130-091-156)依照制造商的说明书实施从PBMC富集T细胞。简言之，将细胞团粒以每1千万个细胞40μl冷缓冲液(含0.5％BSA，2mM EDTA的PBS，无菌过滤)稀释并与每1千万个细胞10μl生物素-抗体混合物一起于4℃温育10分钟。每1千万个细胞添加30μl冷缓冲液和20μl抗生物素磁珠，并将混合物于4℃再温育15分钟。通过添加10-20倍当前体积的缓冲液和300xg，10分钟的随后离心步骤来清洗细胞。将高达1亿个细胞重悬浮于500μl缓冲液。使用LS柱(Miltenyi Biotec#130-042-401)依照制造商的说明书实施未标记人泛T细胞的磁性分离。将所得T细胞群自动计数(ViCell)并在温箱中在37℃，5％CO2在AIM-V培养基中贮存直至测定开始(不超过24小时)。
从PBMC分离原代人幼稚T细胞
通过Histopaque密度离心从富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)制备外周血单个核细胞(PBMC)，所述制备物(血沉棕黄层)自当地血库或来自健康人供体的新鲜血液获得。使用幼稚CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec#130-093-244)依照制造商的说明书实施从PBMC富集T细胞，但是跳过最后一个CD8+T细胞分离步骤(亦见关于分离原代人泛T细胞的描述)。
从脾细胞分离鼠泛T细胞
从C57BL/6小鼠分离脾，转移到装有MACS缓冲液(PBS+0.5％BSA+2mM EDTA)的GentleMACS C管(Miltenyi Biotech#130-093-237)中，并依照制造商的说明书用GentleMACS解离器解离以获得单细胞悬浮液。使细胞悬浮液通过预分离滤器以除去剩余的未解离组织颗粒。于4℃以400xg离心4分钟后，添加ACK裂解缓冲液以裂解红血球(于室温温育5分钟)。将剩余细胞用MACS缓冲液清洗两次，计数并用于分离鼠泛T细胞。使用泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec#130-090-861)依照制造商的说明书实施负(磁性)选择。将所得T细胞群自动计数(ViCell)并立即用于进一步测定。
从肝素化血液分离原代食蟹猴PBMC
如下通过密度离心从来自健康食蟹猴供体的新鲜血液制备外周血单个核细胞(PBMC)：将肝素化血液用无菌PBS以1:3稀释，并将Lymphoprep介质(Axon Lab#1114545)用无菌PBS稀释至90％。将2份体积的稀释血液在1份体积的稀释密度梯度上铺层，并通过于室温以520xg离心30分钟(无制动)来分离PBMC级分。将PBMC带转移入新的50ml Falcon管并通过于4℃以400xg离心10分钟用无菌PBS清洗。实施一次低速离心以除去血小板(150xg，15分钟，4℃)，将所得PBMC群自动计数(ViCell)并立即用于进一步测定。
实施例1
生物素化叶酸受体-Fc融合物的纯化
为了生成针对人FolR1的新抗体，作为单价Fc融合蛋白(抗原的胞外域连接至Fc-节的铰链区，它与与Fc-穴分子共表达)生成下述抗原和筛选工具。基于自GenBank或SwissProt获得的序列合成(Geneart，Regensburg，Germany)抗原基因，并插入表达载体以生成具有Fc-节(其具有C端Avi标签，供体内或体外生物素化用)的融合蛋白。通过生成期间编码细菌生物素连接酶的细菌birA基因的共表达来实现体内生物素化。所有基因的表达在含有oriP元件(其用于质粒在含有EBNA的细胞系中的稳定维持)的质粒上的嵌合MPSV启动子控制下。
为了制备生物素化单体抗原/Fc融合分子，用编码融合蛋白的两种成分(节和穴链)以及BirA(生物素化反应必需的一种酶)的三种载体共转染指数式生长中的悬浮HEK293EBNA细胞。以9.5:9.5:1比率(“抗原ECD-Fc节-avi标签”:“Fc穴”:“BirA”)使用相应的载体。
对于500ml摇瓶中的蛋白质生成，在转染之前24小时接种400x106个HEK293 EBNA细胞。对于转染，将细胞以210g离心5分钟，并用预温热的CD CHO培养基替换上清液。在20mL含有200μg载体DNA的CD CHO培养基中重悬浮表达载体。在添加540μL聚乙烯亚胺(PEI)之后，将溶液混合15秒并于室温温育10分钟。之后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500mL摇瓶并在具有5％CO2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育后，添加160mL F17培养基并将细胞培养24小时。转染后1天，对培养物添加1mM丙戊酸和7％补料1(Lonza)。还对生产培养基补充100μM生物素。培养7天后，通过将细胞以210g旋转沉降15分钟来收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，补充叠氮化钠至终浓度0.01％(w/v)，并保存于4℃。
通过使用蛋白A的亲和层析，接着是大小排阻层析自细胞培养物上清液纯化所分泌的蛋白质。对于亲和层析，将上清液加载到用40mL 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH 7.5平衡的HiTrap蛋白A HP柱(CV＝5mL，GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH 7.5清洗来去除未结合的蛋白质。使用在20个柱体积的20mM柠檬酸钠，100mM氯化钠，100mM甘氨酸，pH 3.0上创建的线性pH梯度洗脱结合的蛋白质。然后用10个柱体积的20mM柠檬酸钠，100mM氯化钠，100mM甘氨酸，pH 3.0清洗柱。
通过添加1/10(v/v)的0.5M磷酸钠，pH 8.0来调节收集的级分的pH。将蛋白质浓缩并过滤，之后加载到用20mM组氨酸，140mM氯化钠，pH 6.0平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
通过测量280nm处的光密度(OD)，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来测定蛋白质浓度。通过在还原剂存在和缺失下的SDS毛细管电泳遵循制造商的说明书(instrument Caliper LabChipGX，Perkin Elmer)分析FolR1-Fc融合物的纯度和分子量。于25℃使用在25mM K2HPO4，125mM NaCl，200mM L-精氨酸单氢氯化物，0.02％(w/v)NaN3，pH6.7运行缓冲液中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)分析样品的聚集体含量。
通过表面等离振子共振测定法分析经过纯化的抗原-Fc融合蛋白，使用商品化抗体来确认抗原的正确和天然构象(数据未显示)。
表1：为分离，选择和反选择人FolR1抗体生成的抗原
Figure GDA0002732657150000811
Figure GDA0002732657150000821
表2：FolR-Fc融合物的产率和最终单体含量的汇总。
抗原 单体[％](SEC) 产率
huFolR1 100 30mg/L
cyFolR1 100 32mg/L
muFolR1 100 31mg/L
huFolR2 100 16mg/L
huFolR3 95 38mg/L
实施例2
具有CD3ε特异性的共同轻链的生成
本文中描述的T细胞活化性双特异性分子包含至少一个CD3结合模块。这个模块可以通过免疫接种实验室动物，筛选噬菌体文库或使用已知的抗CD3抗体来生成。具有CD3ε特异性的共同轻链是通过人源化鼠亲本抗CD3ε抗体(CH2527)的轻链而生成的。为了人源化非人起源的抗体，不得不将来自非人抗体(供体)的CDR残基移植到人(受体)抗体的框架上。一般而言，通过将供体序列与潜在受体序列集合比对并选择与供体具有任何合理同源性或在对于结构和活性至关重要的一些位置显示相似氨基酸的来选择受体框架序列。在本案中，抗体受体框架搜索是通过将亲本抗体的小鼠VL域序列与人种系序列集合比对并选择显示高序列同一性的人序列来实施的。令人惊讶的是，在相当不频繁的属于λ型的V域家族7，更加准确的说，hVL_7_46(IMGT命名法，GenBank登录号Z73674)的人轻链中找到了就框架序列同源性而言较好的匹配。随后选择这种不频繁的人轻链作为受体框架，用于人源化CH2527的轻链。将小鼠轻链可变域的三个互补决定区(CDR)嫁接到这种受体框架上。既然框架4区不是种系V基因的可变区的一部分，那么个别进行这个区(J元件)的比对。因而，选择IGLJ3-02序列用于人源化这种轻链。
生成了13种人源化变体(CH2527-VL7_46-1至VL7_46-10，VL7_46-12至VL7_46-14)。它们的差异在于回复突变成鼠V域序列的框架残基(及其组合)或能保持与人种系序列相同的CDR残基(Kabat定义)。CDR以外的下述框架残基在最终的人源化VL域变体VL7_46-13中分别回复突变成鼠残基(列出了鼠残基)：V36，E38，F44，G46，G49，和G57。人J元件IGLJ3-02与鼠亲本抗体的J元件100％相同。
实施例3
具有CD3ε特异性的人源化变体的SPR评估
作为2+1经典型式的嵌合物(图1D)评估人源化VL变体，即人源化轻链V域与鼠重链V域配对。在ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad)上进行SPR评估。更加准确的说，以垂直取向在抗Fab衍生物GLM传感器芯片(山羊抗人IgG，F(ab’)2片段特异性，Jackson ImmunoResearch)上直接自培养物上清液捕捉变体。随后作为单一浓度水平注射下述分析物以分别评估对人和食蟹猴CD3ε的结合：3μM hu CD3ε(-1-26)-Fc(节)-avi(ID807)和2.5μM cy CD3ε-(-1-26)-Fc(节)-Avi-Fc(穴)(ID873)。将结合响应与鼠对照构建体的结合定性比较，并评级为+(观察到相当的结合)，+/-(观察到降低的结合)和–(没有观察到结合)。在配体捕捉和分析物结合的每个循环之后再生捕捉抗体，并在研究结束时再注射鼠构建体以确认捕捉表面的活性。结果汇总于表3。
Figure GDA0002732657150000831
Figure GDA0002732657150000841
表3：与CH2527的鼠重链组合的人源化轻链变体的基于SPR的定性结合评估。只有最终选择的人源化轻链变体CH2527-VL7_46-13(以粗体字母突显)展现相当的对人和食蟹猴CD3ε的结合。
实施例4
具有CD3ε特异性的人源化共同轻链的特性
为人源化先导分子选择的轻链V域变体为VL7_46-13。测定人性的程度，即人源化V域与人种系V域序列的序列同源性。对于VL7_46-13，与最接近的人种系同系物的总体序列同一性在人源化之前为65％且在人源化之后为80％。忽略CDR区，与最接近的人种系同系物的序列同一性为92％。自表3可知，VL7_46-13是一组13种变体中唯一显示与亲本鼠抗体相当的结合且还保留它的对食蟹猴CD3ε的交叉反应性的人源化VL变体。这一结果指示人源化鼠VL域而不丧失对CD3ε的结合亲和力并非微不足道，这要求几处回复突变成鼠框架残基(特别是G46)同时保留CDR1中的G24。另外，这一结果显示VL域发挥在靶物识别中关键作用。重要的是，基于属于λ型的V域家族7的一种不频繁的人种系且保留对CD3ε的亲和力和特异性的人源化VL域VL7_46-13也适合在Fab型式的噬菌体展示抗体文库中用作共同轻链且使得能够成功选择新颖特异性，大大推动结合CD3ε和例如肿瘤靶物且共享相同‘共同’轻链的双特异性分子的生成和生产。
实施例5
使用自HVK1-39衍生的人种系共同轻链的噬菌体展示抗体文库的生成
生成类似全长人IgG的双特异性抗体的数种办法利用Fc区中诱导两条不同重链异二聚化的修饰。此类例子包括节-入-穴(Merchant et al.,Nat Biotechnol.1998Jul；16(7):677-81)，SEED(Davis et al.,Protein Eng Des Sel.2010Apr；23(4):195-202)和静电操纵技术(Gunasekaran et al.,J Biol Chem.2010Jun 18；285(25):19637-46)。虽然这些办法能够实现两条不同重链的有效异二聚化，但是关联轻和重链的恰当配对仍然是个问题。使用共同轻链(LC)能解决这个问题(Merchant,et al.Nat Biotech 16,677-681(1998))。
在此，我们描述用于在M13噬菌体上展示的抗体文库的生成。本质上，我们设计了重链与一种恒定(或“共同”)轻链的一种多框架文库。此文库设计用于生成多特异性抗体而不需要复杂的技术来避免轻链错配。
通过使用共同轻链能方便这些分子的生成，因为不再发生错配，而且方便高度纯的双特异性抗体的分离。与其它型式相比，使用Fab片段作为构建块与例如使用scFv片段相比导致更高的热稳定性且没有scFv聚集和分子间scFv形成。
文库生成
下面描述用于在M13噬菌体上展示的一种抗体文库的生成。本质上，我们设计了重链与一种恒定(或“共同”)轻链的一种多框架文库。
我们在文库中使用这些重链(括号中为GenBank登录号)：
IGHV1-46*01(X92343)(SEQ ID NO:104)，
IGHV1-69*06(L22583)(SEQ ID NO:105)，
IGHV3-15*01(X92216)(SEQ ID NO:106)，
IGHV3-23*01(M99660)(SEQ ID NO:107)，
IGHV4-59*01(AB019438)(SEQ ID NO:108)
IGHV5-51*01(M99686)(SEQ ID NO:109)。
所有重链使用IGHJ2作为J元件，IGHV1-69*06除外，它使用IGHJ6序列。随机化的设计包括CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3。对于CDR-H1和CDR-H2，选择“软”随机化策略，而且随机化寡核苷酸使得种系序列的氨基酸的密码子以50％存在。除半胱氨酸以外的所有其它氨基酸合起来成为剩余50％。在CDR-H3中，其中因遗传D元件的存在而不存在种系氨基酸，寡核苷酸设计成容许在V元件和J元件之间使用长度为4至9个氨基酸的随机化插入物。那些寡核苷酸在它们的随机化部分中含有例如各自以15％存在的三种氨基酸G/Y/S，各自以4.6％存在的氨基酸A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E。
用于生成抗体文库的例示性方法描述于Hoogenboom et al.,Nucleic AcidsRes.1991,19,4133-413；Lee et al.,J.Mol.Biol.(2004)340,1073-1093。
轻链是自人序列hVK1-39衍生的，而且以未修饰且未随机化的样式使用。这会确保相同的轻链能在没有另外的修饰的情况下用于其它计划。
例示性文库选择：
依照下述规程在溶液中使用靶抗原X的单体和生物素化胞外域进行对所有亲和力成熟文库的选择。
1.在1ml的总体积中将每种文库的1012个噬菌粒颗粒结合至100nM生物素化可溶性抗原达0.5小时。2.捕捉生物素化抗原，并通过添加约5x107个链霉亲合素包被的磁珠达10分钟来分离特异性结合的噬菌体颗粒。3.使用5-10x 1ml PBS/Tween 20和5-10x 1ml PBS清洗珠。4.通过添加1ml 100mM TEA(三乙胺)达10分钟来进行噬菌体颗粒的洗脱，并通过添加500μl 1M Tris/HCl pH 7.4来中和。5.再感染指数式生长中的大肠杆菌TG1细菌，用辅助噬菌体VCSM13感染，随后PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒，在后续轮选择中应用。3-5轮使用恒定的或递减的(自10-7M至2x10-9M)抗原浓度任一进行选择。在第2轮中，使用中性亲合素板代替链霉亲合素珠来实施抗原/噬菌体复合物的捕捉。对所有结合反应补充100nM牛血清清蛋白或脱脂奶粉任一以竞争仅仅因抗体对塑料支持物的粘性结合而产生的不想要的克隆。
3或4轮使用递减的抗原浓度进行选择，抗原始于100nM并在最后一轮选择中降至5nM。特异性结合物定义为信号比背景高约5倍，而且通过ELISA来鉴定。如下通过ELISA鉴定特异性结合物：在中性亲合素板上包被每孔100μl 10nM生物素化抗原。添加含有Fab的细菌上清液，并使用抗Flag/HRP二抗经由它们的Flag标签检测结合性Fab。以96孔型式作为可溶性Fab片段在细菌中表达ELISA阳性克隆，并使用ProteOn XPR36(BioRad)通过SPR分析对上清液进行动力学筛选实验。鉴定表达具有最高亲和常数的Fab的克隆，并对相应的噬菌粒测序。为了进一步表征，经由PCR自噬菌粒扩增Fab序列，并经由适宜的限制性位点克隆入人IgG1表达载体，用于哺乳动物生成。
使用人源化CD3ε特异性共同轻链的噬菌体展示抗体文库的生成
在此，我们描述用于在M13噬菌体上展示的抗体文库的生成。本质上，我们设计了重链与一种恒定(或“共同”)轻链的一种多框架文库。此文库设计用于生成IgG1 P329GLALA或IgG4 SPLE PG同种型的含有Fc但FcgR结合无活性的T细胞双特异性抗体，其中一个或两个Fab识别肿瘤细胞上表达的肿瘤表面抗原，而抗体的剩余Fab臂识别T细胞上的CD3e。
文库生成
下面描述用于在M13噬菌体上展示的一种抗体文库的生成。本质上，我们设计了重链与一种恒定(或“共同”)轻链的一种多框架文库。这个文库设计用于唯独生成IgG1 P329GLALA或IgG4 SPLE PG同种型的含有Fc但FcgR结合无活性的T细胞双特异性抗体。
经由随机化寡核苷酸仅仅在不同重链的CDR3中引入多样性。用于生成抗体文库的方法是本领域公知的，而且描述于Hoogenboom et al.,Nucleic Acids Res.1991,19,4133-413；或Lee et al.,J.Mol.Biol.(2004)340,1073-1093。
我们在文库中使用这些重链：
IGHV1-46*01(X92343)(SEQ ID NO:104)，
IGHV1-69*06(L22583)(SEQ ID NO:105)，
IGHV3-15*01(X92216)(SEQ ID NO:106)，
IGHV3-23*01(M99660)(SEQ ID NO:107)，
IGHV4-59*01(AB019438)(SEQ ID NO:108)，
IGHV5-51*01(M99686)(SEQ ID NO:109)。
我们在文库中使用自人源化人和食蟹猴CD3ε特异性抗体CH2527衍生的轻链：(VL7_46-13；SEQ ID NO:112)。这种轻链没有随机化，在没有任何进一步修饰的情况下使用，以确保与不同双特异性结合物的相容性。
所有重链使用IGHJ2作为J元件，IGHV1-69*06除外，它使用IGHJ6序列。随机化的设计仅聚焦于CDR-H3，而且PCR寡核苷酸设计成容许介于V元件和J元件之间使用长度为4至9氨基酸的随机化插入物。
实施例6
自针对FolR1的共同轻链文库(包含具有CD3ε特异性的轻链)选择抗体片段
通过针对不同物种(人，食蟹猴和鼠)的FolR1的噬菌体展示选择获得了抗体16A3，15A1，18D3，19E5，19A4，15H7，15B6，16D5，15E12，21D1，16F12，21A5，21G8，19H3，20G6，和20H7，它们包含具有CD3ε特异性的共同轻链VL7_46-13。克隆16A3，15A1，18D3，19E5，19A4，15H7，15B6，21D1，16F12，19H3，20G6，和20H7选自共同轻链与基于人种系VH1_46的重链全集配对的子文库。在这个子文库中，VH1_46的CDR已经基于6种不同CDR3长度而随机化。克隆16D5，15E12，21A5，和21G8选自共同轻链与基于人种系VH3_15的重链全集配对的子文库。在这个子文库中，VH3_15的CDR3已经基于6种不同CDR3长度而随机化。为了获得物种交叉反应性(或鼠FolR1反应性)抗体，在3轮生物淘选中以不同方式变更(或保持恒定)不同物种的FolR1：16A3和15A1(人-食蟹猴-人FolR1)；18D3(食蟹猴-人-鼠FolR1)；19E5和19A4(3轮针对鼠FolR1)；15H7，15B6，16D5，15E12，21D1，16F12，21A5，21G8(人-食蟹猴-人FolR1)；19H3，20G6，和20H7(3轮针对鼠FolR1)。
作为N端单体Fc融合物在HEK EBNA细胞中瞬时表达作为抗原用于噬菌体展示选择以及基于ELISA和SPR的筛选的人，鼠和食蟹猴FolR1，并经由共表达BirA生物素连接酶在位于携带受体链的Fc部分(Fc节链)C端的avi标签识别序列处进行体内位点特异性生物素化。为了评估针对FolR1的特异性，以相同方式生成了两种相关受体，即人FolR2和FolR3。
依照下述样式在溶液中实施多轮选择(生物淘选)：
1.在用10μg/ml无关人IgG包被的Maxisorp板上预清洁约1012个噬菌粒颗粒以消减文库中识别抗原的Fc部分的抗体。
2.在1ml总体积中在100nM无关非生物素化Fc节入穴构建体存在下将非Fc结合性噬菌粒颗粒与100nM生物素化人，食蟹猴，或鼠FolR1一起温育0.5小时以进一步消减Fc结合物。
3.通过转移至中性亲合素预包被的微量滴定板的4个孔达10分钟来捕捉生物素化FolR1和附着的特异结合噬菌体(在第1和3轮中)。
4.使用5x PBS/Tween 20和5x PBS清洗相应的孔。
5.通过对每个孔添加250μl 100mM TEA(三乙胺)达10分钟来洗脱噬菌体颗粒，并通过将500μl 1M Tris/HCl pH 7.4添加至来自4个孔的合并洗出液来中和。
6.通过在中性亲合素预包被的微量滴定板上与100nM生物素捕捉的FolR2或FolR3一起温育来后清洁经过中和的洗出液以最终去除Fc结合物和非特异性结合物。
7.用洗脱的噬菌体颗粒的上清液再感染对数期大肠杆菌TG1细胞，用辅助噬菌体VCSM13感染，在摇床上于30℃温育过夜，随后PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒，要用于下一轮选择。
3轮使用恒定抗原浓度100nM进行选择。在第2轮，为了避免富集针对中性亲合素的结合物，通过添加5.4x 107个链霉亲合素包被的磁珠来实施抗原:噬菌体复合物的捕捉。如下通过ELISA鉴定特异性结合物：分别在中性亲合素板和Maxisorp板上包被100μl 25nM生物素化人，食蟹猴，或鼠FolR1和10μg/ml人IgG。添加含有Fab的细菌上清液，并使用抗Flag/HRP二抗经由它们的Flag标签检查结合性Fab。在人FolR1上展现信号且在人IgG上呈阴性的克隆通过初选用于进一步分析，并且还以相似方式针对其余两个物种的FolR1进行测试。它们以0.5升培养体积在细菌中表达，亲和纯化，并使用BioRad的ProteOn XPR36生物传感器通过SPR分析进一步表征。
于25℃使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)通过表面等离振子共振(SPR)测量选定克隆的亲和力(KD)，通过中性亲合素捕捉在NLC芯片上固定化生物素化人，食蟹猴，和鼠FolR1以及人FolR2和FolR3(阴性对照)。抗原(配体)的固定化：将重组抗原用PBST(10mM磷酸盐，150mM氯化钠pH 7.4，0.005％Tween 20)稀释至10μg/ml，然后以垂直取向以30μl/min注射。分析物的注射：对于‘一击动力学’测量，将注射方向变成水平取向，沿着分开的通道1-5同时注射经过纯化的Fab(不同浓度范围)的两倍稀释系列，结合时间200秒，解离时间600秒。沿着第六通道注射缓冲液(PBST)以提供“在线”空白作为参照。使用ProteOnManager v3.1软件中的简单一对一Langmuir结合模型通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。作为比koff/kon计算平衡解离常数(KD)。表4列出了对FolR1特异性的选定克隆的平衡解离常数(KD)。
表4：通过噬菌体展示自包含VL7_46-13(一种对CD3ε特异性的人源化轻链)的共同轻链子文库选择的抗FolR1抗体(Fab型式)的平衡解离常数(KD)。KD以nM计。
Figure GDA0002732657150000891
Figure GDA0002732657150000901
实施例7
自通用多框架文库选择针对FolR1的抗体片段
基于通用多框架子文库通过针对不同物种(人，食蟹猴和鼠)的FolR1的噬菌体展示选择获得了抗体11F8，36F2，9D11，5D9，6B6，和14E4。在这些多框架子文库中，具有随机化CDR3(3种不同长度)的不同VL域与具有随机化CDR3(6种不同长度)的不同VH域配对。选定克隆是如下VL/VH配对：11F8(Vk_1_5/VH_1_69)，36F2(Vk_3_20/VH_1_46)，9D11(Vk2D_28/VH1_46)，5D9(Vk3_20/VH1_46)，6B6(Vk3_20/VH1_46)，和14E4(Vk3_20/VH3_23)。为了获得物种交叉反应性(或鼠FolR1反应性)抗体，在3或4轮生物淘选中以不同方式变更(或保持恒定)不同物种的FolR1：11F8(食蟹猴-鼠-人FolR1)；36F2(人-鼠-食蟹猴-鼠FolR1)；9D11(食蟹猴-人-食蟹猴FolR1)；5D9(人-食蟹猴-人FolR1)；6B6(人-食蟹猴-人FolR1)和14E4(3轮针对鼠FolR1)。
作为N端单体Fc融合物在HEK EBNA细胞中瞬时表达作为抗原用于噬菌体展示选择以及基于ELISA和SPR的筛选的人，鼠和食蟹猴FolR1，并经由共表达BirA生物素连接酶在位于携带受体链的Fc部分(Fc节链)C端的avi标签识别序列处进行体内位点特异性生物素化。为了评估针对FolR1的特异性，以相同方式生成了两种相关受体，即人FolR2和FolR3。
依照下述样式在溶液中实施多轮选择(生物淘选)：
1.在用10μg/ml无关人IgG包被的Maxisorp板上预清洁约1012个噬菌粒颗粒以消减文库中识别抗原的Fc部分的抗体。
2.在1ml总体积中在100nM无关非生物素化Fc节入穴构建体存在下将非Fc结合性噬菌粒颗粒与100nM生物素化人，食蟹猴，或鼠FolR1一起温育0.5小时以进一步消减Fc结合物。
3.通过转移至中性亲合素预包被的微量滴定板的4个孔达10分钟来捕捉生物素化FolR1和附着的特异结合噬菌体(在第1和3轮中)。
4.使用5x PBS/Tween20和5x PBS清洗相应的孔。
5.通过对每个孔添加250μl 100mM TEA(三乙胺)达10分钟来洗脱噬菌体颗粒，并通过将500μl 1M Tris/HCl pH 7.4添加至来自4个孔的合并洗出液来中和。
6.通过在中性亲合素预包被的微量滴定板上与100nM生物素捕捉的FolR2或FolR3一起温育来后清洁经过中和的洗出液以最终去除Fc结合物和非特异性结合物。
7.用洗脱的噬菌体颗粒的上清液再感染对数期大肠杆菌TG1细胞，用辅助噬菌体VCSM13感染，在摇床上于30℃温育过夜，随后PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒，要用于下一轮选择。
3轮使用恒定抗原浓度100nM进行选择。在第2和4轮，为了避免富集针对中性亲合素的结合物，通过添加5.4x 107个链霉亲合素包被的磁珠来实施抗原:噬菌体复合物的捕捉。如下通过ELISA鉴定特异性结合物：分别在中性亲合素板和Maxisorp板上包被100μl25nM生物素化人，食蟹猴，或鼠FolR1和10μg/ml人IgG。添加含有Fab的细菌上清液，并使用抗Flag/HRP二抗经由它们的Flag标签检查结合性Fab。在人FolR1上展现信号且在人IgG上呈阴性的克隆通过初选用于进一步分析，并且还以相似方式针对其余两个物种的FolR1进行测试。它们以0.5升培养体积在细菌中表达，亲和纯化，并使用BioRad的ProteOn XPR36生物传感器通过SPR分析进一步表征。
于25℃使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)通过表面等离振子共振(SPR)测量选定克隆的亲和力(KD)，通过中性亲合素捕捉在NLC芯片上固定化生物素化人，食蟹猴，和鼠FolR1以及人FolR2和FolR3(阴性对照)。抗原(配体)的固定化：将重组抗原用PBST(10mM磷酸盐，150mM氯化钠pH 7.4，0.005％Tween 20)稀释至10μg/ml，然后以垂直取向以30μl/min注射。分析物的注射：对于‘一击动力学’测量，将注射方向变成水平取向，沿着分开的通道1-5同时注射经过纯化的Fab(不同浓度范围)的两倍稀释系列，结合时间150或200秒，解离时间200或600秒。沿着第六通道注射缓冲液(PBST)以提供“在线”空白作为参照。使用ProteOn Manager v3.1软件中的简单一对一Langmuir结合模型通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。作为比koff/kon计算平衡解离常数(KD)。表5列出了对FolR1特异性的选定克隆的平衡解离常数(KD)。
表5：通过噬菌体展示自通用多框架子文库选择的抗FolR1抗体(Fab型式)的平衡解离常数(KD)。KD以nM计。
Figure GDA0002732657150000921
实施例8
IgG和T细胞双特异性型式的新颖FolR1结合物的生成和纯化
为了鉴定能够对选定靶细胞的诱导T细胞依赖性杀伤的FolR1结合物，将自共同轻链文库或Fab文库分离的抗体转变成相应的人IgG1型式。简言之，使用Fab克隆作为模板，通过标准PCR反应扩增来自噬菌体展示的独特FolR1结合物的可变重和可变轻链。纯化PCR产物，并插入(或是通过基于限制性内切核酸酶和连接酶的克隆，或是通过使用来自Invitrogen的Infusion试剂盒进行的‘重组工程’)合适的表达载体，其中它们融合至适宜的人恒定重或人恒定轻链。这些载体中的表达盒由嵌合MPSV启动子和合成多腺苷酸化位点组成。另外，质粒含有来自EB病毒的oriP区，用于在包含EBV核抗原(EBNA)的HEK293细胞中稳定维持质粒。在PEI介导的转染之后，抗体在HEK293 EBNA细胞中瞬时生成，并如描述的那样通过标准蛋白A亲和层析，接着是大小排阻层析来纯化：
瞬时转染和生成
如下文所述对于所需载体使用PEI介导的转染规程在HEK293 EBNA细胞中瞬时生成本文中使用的所有(双特异性)抗体(如果不是自商业来源获得的话)。在CD CHO培养基中悬浮无血清培养HEK293 EBNA细胞。对于500ml摇瓶中的生成，在转染之前24小时接种400x106个HEK293 EBNA细胞(对于备选规模，相应调节所有量)。为了转染，将细胞以210x g离心5分钟，用预温热的20ml CD CHO培养基替换上清液。在20ml CD CHO培养基中混合表达载体至最终量200μg DNA。在添加540μl PEI溶液之后，漩涡震荡15秒，随后于室温温育10分钟。之后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml烧瓶，并在具有5％CO2气氛的温箱中于37℃温育3小时。在温育时间之后，添加160ml F17培养基，并将细胞培养24小时。转染后1天，添加1mM丙戊酸并添加7％补料1。7天后，收集培养上清液，用于通过以210x g离心15分钟来纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，以终浓度0.01％w/v添加叠氮化钠，并保存于4℃。在生成之后，收获上清液，将含有抗体的上清液过滤通过0.22μm无菌滤器，并保存于4℃直至纯化。
抗体纯化
使用标准规程以两个步骤纯化所有分子，诸如蛋白A亲和纯化
Figure GDA0002732657150000931
Explorer)和大小排阻层析。将自瞬时生成获得的上清液调节至pH 8.0(使用2M TRIS pH 8.0)，并应用于用8个柱体积(cv)的缓冲液A(20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH 7.5)平衡的HiTrap PA FF(GE Healthcare，柱体积(cv)＝5ml)。在用10cv的缓冲液A清洗之后，使用12cv上变成缓冲液B(20mM柠檬酸钠pH 3，100mM NaCl，100mM甘氨酸)的pH梯度洗脱蛋白质。合并含有感兴趣蛋白质的级分，并温和地将溶液的pH调节至pH 6.0(使用0.5M Na2HPO4 pH 8.0)。使用超浓缩器(Vivaspin 15R 30.000MWCO HY，Sartorius)将样品浓缩至2ml，随后应用于用20mM组氨酸，pH 6.0，140mM NaCl，0.01％Tween-20平衡的HiLoadTM 16/60SuperdexTM 200制备级(GE Healthcare)。通过分析性大小排阻层析分析洗脱级分的聚集体含量。因此，于25℃将30μl每份级分应用于在25mM K2HPO4，125mM NaCl，200mM L-精氨酸单氢氯化物，0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7运行缓冲液中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)。合并含有少于2％寡聚物的级分，并使用超浓缩器(Vivaspin 15R 30.000MWCO HY，Sartorius)浓缩至1-1.5mg/ml的终浓度。通过测量280nm处的光密度(OD)，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来测定蛋白质浓度。通过在还原剂存在和缺失下的SDS毛细管电泳遵循制造商的说明书(instrument Caliper LabChipGX，Perkin Elmer)分析构建体的纯度和分子量。在液氮中冷冻经过纯化的蛋白质，并保存于-80℃。
基于体外表征结果，将选定的结合物转变成T细胞双特异性型式。在这些分子中，以2:1次序排列FolR1:CD3结合模块，其中FolR1 Fab位于N端。对于自标准Fab文库分离的克隆，作为CrossFab生成CD3结合部分(CH1Cκ交叉)，而对于来自共同轻链文库的克隆，交叉不是必需的。与IgG类似地生成和纯化这些双特异性分子。
表6：分别为IgG和TCB型式的新颖FolR1结合物的产量和单体含量。
Figure GDA0002732657150000941
CLC：共同轻链
实施例9
2+1和1+1T细胞双特异性型式
对一种共同轻链结合物(16D5)制备了四种不同T细胞双特异性型式并对一种来自Fab文库的结合物(9D11)生成了三种型式以比较它们的体外杀伤特性。
标准型式为早已描述的2+1倒转型式(以2:1次序排列FolR1:CD3结合模块，其中FolR1 Fab位于N端)。在2+1经典型式中，以2:1次序排列FolR1:CD3结合模块，其中CD3 Fab位于N端。还制备了两种单价型式。1+1头至尾具有分子的同一臂上以1:1次序排列的FolR1:CD3结合模块，其中FolR1 Fab位于N端。在1+1经典型式中，FolR1:CD3结合模块出现一次，每种在分子的一个臂上。对于自标准Fab文库分离的9D11克隆，作为CrossFab(CH1Cκ交叉)生成CD3结合部分，而对于来自共同轻链文库的16D5，交叉不是必需的。与标准的倒转的T细胞双特异性型式类似地生成并纯化这些双特异性分子。
表7：不同T细胞双特异性型式的产量和最终单体含量的汇总。
构建体 单体[％](SEC) 产量
16D5 FolR1 TCB 2+1(倒转的) 96％ 5.4mg/L
16D5 FolR1 TCB 2+1(经典的) 90％ 4.6mg/L
16D5 FolR1 TCB 1+1(头至尾) 100％ 5.4mg/L
16D5 FolR1 TCB 1+1(经典的) 100％ 0.7mg/L
9D11 FolR1 TCB 2+1(倒转的) 100％ 2.6mg/L
9D11 FolR1 TCB 1+1(头至尾) 100％ 6.1mg/L
9D11 FolR1 TCB 1+1(经典的) 96％ 1.3mg/L
Mov19 FolR1 TCB 2+1(倒转的) 98％ 3mg/L
Mov19 FolR1 TCB 1+1(头至尾) 100％ 5.2mg/L
实施例10
通过表面等离振子共振对FolR1结合物的生化表征
通过表面等离振子共振(SPR)评估作为IgG或T细胞双特异性型式的FolR1结合物对不同重组叶酸受体(人FolR1，2和3，鼠FolR1和食蟹猴FolR1；均作为Fc融合物)的结合。于25℃在Biacore T200上实施所有SPR实验，以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)。
单次注射
首先通过单次注射分析抗FolR1 IgG(表1)以表征它们的交叉反应性(对人，鼠和食蟹猴FolR1)和特异性(对人FolR1，人FolR2，人FolR3)。使用标准偶联指令(Biacore，Freiburg/Germany)直接在SA芯片上偶联人，食蟹猴和鼠叶酸受体1(FolR1-Fc)或人叶酸受体2和3(FolR2-Fc，FolR3-Fc)的重组生物素化单体Fc融合物。固定化水平为约300-400RU。以500nM的浓度注射IgG达60秒。因缺乏特异性而排除结合huFolR2和huFolR3的IgG。大多数结合物只在人和食蟹猴FolR1之间是交叉反应性的，另外的对鼠FolR1的交叉反应性大多数时间伴有特异性丧失。
表8：25种新的叶酸受体1结合物(作为IgG)以及两种对照IgG(Mov19和Farletuzumab)的交叉反应性和特异性。+表示结合，-表示无结合，+/-表示弱结合。
Figure GDA0002732657150000961
Figure GDA0002732657150000971
对叶酸受体1的亲合力
如下文所述测定抗FolR1 IgG或T细胞双特异性和重组叶酸受体之间的相互作用的亲合力(表9)。
使用标准偶联指令(Biacore，GE Healthcare)直接在SA芯片上偶联人，食蟹猴和鼠叶酸受体1的重组生物素化单体Fc融合物(FolR1-Fc)。固定化水平为约300-400RU。抗FolR1 IgG或T细胞双特异性以2.1至500nM的浓度范围以30μL/min的流速通过流动室达180秒。监测解离达600秒。通过扣除在用重组生物素化IL2受体Fc融合物固定化的参照流动室上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractive index)差异。为了分析19H3 IgG和鼠叶酸受体1的相互作用，在HBS-EP运行缓冲液中以2.3μM的浓度添加叶酸(Sigma F7876)。自IgG或T细胞双特异性的二价结合产生的结合曲线近似1:1Langmuir结合，并用该模型拟合(这是不正确的，但是给出亲合力的概念)。使用Bia评估软件(GE Healthcare)自拟合的速率常数推导相互作用的表观亲合常数。
表9：选定FolR1结合物作为IgG或作为T细胞双特异性(TCB)对人和食蟹猴FolR1的二价结合(亲合力及表观KD)。
Figure GDA0002732657150000972
Figure GDA0002732657150000981
1.对叶酸受体1的亲和力
如下文所述测定抗FolR1 IgG或T细胞双特异性和重组叶酸受体之间的相互作用的亲和力(表10)。
为了亲和力测量，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)于pH 5.0在CM5芯片上实施6000-7000个共振单位(RU)左右的抗人Fab特异性抗体(Fab捕捉试剂盒，GEHealthcare)的直接偶联。以20nM及流速10μl/min捕捉抗FolR1IgG或T细胞双特异性达20或40秒，留下参照流动室没有捕捉。使人或食蟹猴叶酸受体1Fc融合物的稀释系列(6.17至500nM或12.35至3000nM)以30μl/min通过所有流动室达120或240秒以记录结合期。解离期监测240秒并通过自样品溶液转换至HBS-EP来触发。在每一个循环之后使用两次注射60秒10mM甘氨酸-HCl pH 2.1或pH 1.5来再生芯片表面。通过扣除在参照流动室1上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractive index)差异。通过使用Bia评估软件(GEHealthcare)拟合至1:1Langmuir结合自速率常数推导相互作用的亲和力常数。
表10：选定FolR1结合物作为IgG或作为T细胞双特异性(TCB)对人和食蟹猴FolR1的单价结合(亲和力)。
Figure GDA0002732657150000982
2.对CD3的亲和力
如下文所述测定抗FolR1 T细胞双特异性和重组人CD3εδ-Fc之间的相互作用的亲和力(表11)。
为了亲和力测量，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)于pH 5.0在CM5芯片上实施9000个共振单位(RU)左右的抗人Fab特异性抗体(Fab捕捉试剂盒，GE Healthcare)的直接偶联。以20nM及流速10μl/min捕捉抗FolR1 T细胞双特异性达40秒，留下参照流动室没有捕捉。使人CD3εδ-Fc融合物的稀释系列(6.17至500nM)以30μl/min通过所有流动室达240秒以记录结合期。解离期监测240秒并通过自样品溶液转换至HBS-EP来触发。在每一个循环之后使用两次注射60秒10mM甘氨酸-HCl pH 2.1来再生芯片表面。通过扣除在参照流动室1上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractive index)差异。通过使用Bia评估软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合自速率常数推导相互作用的亲和常数。
表11：选定FolR1 T细胞双特异性(TCB)对人CD3-Fc的单价结合(亲和力)。
配体 分析物 ka(1/Ms) kd(1/s) K<sub>D</sub>(M)
16D5 TCB huCD3 4.25E+04 3.46E-03 8.14E-08
21A5 TCB huCD3 3.72E+04 3.29E-03 8.8E-08
CD3结合部分对于所有构建体是相同的，而且亲和力对于所测量的T细胞双特异性是相似的(KD范围在60和90nM之间)。
实施例11
T细胞双特异性对叶酸受体1和CD3的同时结合
如下文所述通过表面等离振子共振测定抗FolR1 T细胞双特异性对重组叶酸受体1和重组人CD3εδ-Fc的同时结合。使用标准偶联指令(Biacore，Freiburg/Germany)直接在SA芯片上偶联人，食蟹猴和鼠叶酸受体1的重组生物素化单体Fc融合物(FolR1-Fc)。固定化水平为约300-400RU。穿过流动室以流速30μL/min注射500nM抗FolR1 T细胞双特异性达60秒，接着注射500nM hu CD3εδ-Fc达60秒。通过扣除在用重组生物素化IL2受体Fc融合物固定化的参照流动室上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractive index)差异。所测试的四种T细胞双特异性(16D5 TCB，21A5 TCB，51C7 TCB和45D2 TCB)能够同时结合叶酸受体1和人CD3，正如预期的。
实施例12
表位分仓(binning)
为了表位分仓，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)于pH 5.0在CM5芯片上直接固定化抗FolR1 IgG或T细胞双特异性，最终响应为700RU左右。然后对500nM huFolR1-Fc捕捉60秒，接着对500nM不同结合物捕捉30秒。用两次注射10mM甘氨酸pH 2各30秒来再生表面。评估不同结合物是否能结合固定化结合物上捕捉的huFolR1(表12)。
表12：选定FolR1结合物作为IgG或作为T细胞双特异性(TCB)在人FolR1上的表位表征。+表示结合，-表示无结合，+/-表示弱结合
Figure GDA0002732657150001001
基于这些结果和另外的固定化huFolR1上同时结合的数据，将结合物分成三个组。不清楚9D11是否具有不同的表位，因为它置换所有其它结合物。16D5和21A5看来在同一组中，而Mov19，Farletuzumab(Coney et al.,Cancer Res.1991Nov 15；51(22):6125-32；Kalli et al.,Curr Opin Investig Drugs.2007Dec；8(12):1067-73)和36F2在另一组中(表13)。然而，36F2结合与Mov 19和Farletuzumab不同的表位，因为它结合人，食蟹猴和鼠FolR1。
表13：选定FolR1结合物作为IgG或作为T细胞双特异性(TCB)在人FolR1上的表位分组
表位1 表位2 表位3
16D5 9D11 Mov19
21A5 Farletuzumab
36F2
实施例13
结合物的选择
通过表面等离振子共振(SPR)和通过在细胞上进行的体外测定法筛选IgG型式的FolR1结合物以选择最佳候选者。
通过SPR分析抗FolR1 IgG以表征它们的交叉反应性(对人，鼠和食蟹猴FolR1)和特异性(对人FolR1，人FolR2，人FolR3)。对人FolR2和3的非特异性结合视为排除因素。在细胞上确认对人FolR1的结合和特异性。一些结合物没有在表达FolR1的细胞上结合，尽管它们在SPR中识别重组人FolR1。测定聚集温度，但是不是排除因素，因为选定结合物都是稳定的。在一项多重反应性ELISA中测试选定结合物以检查非特异性结合，这导致排除四种结合物。这一过程导致最初选择三种结合物：36F2(Fab文库)，9D11(Fab文库)和16D5(共同轻链)。36F2自huFolR1迅速解离，因此最初不是偏爱的。
实施例14
新生成的FolR1结合物对人FolR1阳性肿瘤细胞的特异性结合
使用Fab文库或共同轻链文库(其使用CD3轻链)任一经由噬菌体展示生成了新的FolR1结合物。将所鉴定的结合物转变成人IgG1型式，并分析对FolR1高表达性HeLa细胞的结合。作为参照分子，包括人FolR1结合物Mov19。在这项测定法中测试的大多数结合物显示中等至较好的对FolR1的结合，其中一些克隆与Mov19同等好地结合(见图2)。排除克隆16A3，18D3，15H7，15B6，21D1，14E4和16F12，因为不能通过流式细胞术确认对细胞上的FolR1的结合。在下一个步骤中，通过排除对密切相关人FolR2的结合来对选定克隆测试对人FolR1的特异性。用人FolR1或人FolR2任一瞬时转染HEK细胞以分析特异性。自Fab文库衍生的克隆36F2和9D11和自CLC文库衍生的克隆16D5和21A5特异性结合人FolR1且不结合人FolR2(见图3A-B)。所有其它测试的克隆显示至少一些对人FolR2的结合(见图3A-B)。因此，自进一步表征排除这些克隆。平行地，通过实施用食蟹猴FolR1瞬时转染的HEK细胞结合研究来分析FolR1克隆对食蟹猴FolR1的交叉反应性。所有测试的克隆均能够结合食蟹猴FolR1，而且四种选定人FolR1特异性克隆36F2，9D11，16D5和21A5同等好地结合人和食蟹猴FolR1(图4)。随后，将三种人FolR1特异性食蟹猴交叉反应性结合物转变成TCB型式并测试对T细胞杀伤和T细胞激活的诱导。这些克隆是来自Fab文库的9D11和来自CLC文库的16D5和21A5。作为参照分子，在所有研究中包括Mov19 FolR1 TCB。然后使用这些FolR1 TCB来比较结合HeLa细胞上的FolR1后对内在化的诱导。所有三种测试的克隆均在结合FolR1后内在化，与Mov19 FoLR1 TCB在结合后的内在化相当(图5)。21A5 FolR1 TCB因多重反应性的迹象而中止。
实施例15
由FolR1 TCB抗体诱导的对FolR1表达性肿瘤靶细胞的T细胞介导的杀伤
使用FolR1 TCB来测定T细胞介导的对表达FoLR1的肿瘤细胞的杀伤。通过Qifikit分析使用一组潜在靶细胞系来测定FoLR1结合位点。
所使用的该组肿瘤细胞含有FolR1高，中等和低表达性肿瘤细胞和一组FolR1阴性细胞系。
表14：肿瘤细胞上的FolR1结合位点
细胞系 起源 FolR1结合位点
Hela 宫颈腺癌 2’240’716
Skov3 卵巢腺癌 91’510
OVCAR5 卵巢腺癌 22’077
HT29 结直肠腺癌 10’135
MKN45 胃腺癌 54
测定了三种不同FoLR1 TCB(含有9D11，16D5和Mov19结合物)对这组肿瘤细胞系的结合，显示FoLR1 TCB特异性结合FolR1表达性肿瘤细胞且不结合FolR1阴性肿瘤细胞系。结合的构建体的量与FolR1表达水平成比例，而且构建体对可检测的FolR1低细胞系HT-29仍然有较好的结合。另外，阴性对照DP47 TCB对任何使用的细胞系没有结合(图6A-E)。
进一步使用中等表达细胞系SKOV3和低表达细胞系HT-29来测试T细胞介导的杀伤和T细胞激活，其中使用16D5 TCB和9D11 TCB；包括DP47 TCB作为阴性对照。两种细胞系均在早就很低水平的16D5 TCB和9D11 TCB存在下被杀死，而且两种TCB之间活性没有差异，尽管9D11 TCB比16D5 TCB更强地结合FolR1。SKOV3细胞的总体杀伤与HT-29相比要高，HT-29反映比SKOV3细胞上更高表达水平的FolR1(图7A-D)。与此一致，检测到CD4+T细胞和CD8+T细胞上激活标志物CD25和CD69的强上调。T细胞的激活在SKOV3细胞和HT-29细胞存在下非常相似。阴性对照DP47 TCB在所使用浓度没有诱导任何杀伤，而且T细胞上的CD25和CD69没有显著上调。
表15：SKOV3细胞的肿瘤细胞杀伤和T细胞激活的EC50值
Figure GDA0002732657150001021
Figure GDA0002732657150001031
表16：HT-29细胞的肿瘤细胞杀伤和T细胞激活的EC50值
Figure GDA0002732657150001032
实施例16
全血中对红细胞的结合和T细胞激活
为了证明在FolR1表达性肿瘤细胞缺失下没有自发激活，我们测试了是否有FolR1克隆对可能潜在表达FolR1的红细胞的结合。我们未能观察到9D11IgG，16D5 IgG和Mov19IgG对红细胞的任何特异性结合，正如包括在内的阴性对照DP47 IgG(图8)。
为了排除任何别的FolR1 TCB对血细胞的非特异性结合或经由FolR1TCB的非特异性激活，将9D11 TCB，16D5 TCB和Mov19 TCB添加入全血，并通过流式细胞术分析CD4+T细胞和CD8+T细胞上CD25和CD69的上调。包括DP47 TCB作为阴性对照。通过分析CD4+T细胞和CD8+T细胞上CD25和CD69的上调未能对任何测试的构建体观察到T细胞的激活(图9)。
实施例17
去除9D11轻链中的N-糖基化位点
在分析不同FolR1结合物以鉴定潜在的序列热点期间，在克隆9D11的CDR L3的末端鉴定出一个推定的N-糖基化位点。通常，N-糖基化的共有基序定义为N-X-S/T-X(其中X不是P)。CDR L3的序列(MQASIMNRT)(SEQ ID NO:61)完美匹配这种共有基序，具有序列N-R-T。既然糖基化在不同生产批次间可能不是完全可再现的，那么这可能对FolR1结合有影响，如果CDR L3中的糖基化对抗原结合有贡献的话。为了评估这个N-糖基化位点是否对FolR1结合是重要的，或者能在不损害结合的情况下替换，生成9D11轻链的不同变体，其中通过位点特异性诱变调换N-糖基化位点。
1.瞬时转染和生成
如下文所述对于所需载体使用PEI介导的转染规程在HEK293 EBNA细胞中瞬时生成四种T细胞双特异性。在CD CHO培养基中悬浮无血清培养HEK293 EBNA细胞。对于500ml摇瓶中的生成，在转染之前24小时接种400x106个HEK293 EBNA细胞(对于备选规模，相应调节所有量)。为了转染，将细胞以210x g离心5分钟，用预温热的20ml CD CHO培养基替换上清液。在20ml CD CHO培养基中混合表达载体至最终量200μg DNA。在添加540μl PEI溶液之后，漩涡震荡15秒，随后于室温温育10分钟。之后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml烧瓶，并在具有5％CO2气氛的温箱中于37℃温育3小时。在温育时间之后，添加160ml F17培养基，并将细胞培养24小时。转染后1天，添加1mM丙戊酸并添加7％补料1。7天后，收集培养上清液，用于通过以210x g离心15分钟来纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，以终浓度0.01％w/v添加叠氮化钠，并保存于4℃。在生成之后，收获上清液，将含有抗体的上清液过滤通过0.22μm无菌滤器，并保存于4℃直至纯化。
2.抗体纯化
使用标准规程以两个步骤纯化所有分子，诸如蛋白A亲和纯化
Figure GDA0002732657150001041
Explorer)和大小排阻层析。将自瞬时生成获得的上清液调节至pH 8.0(使用2M TRIS pH 8.0)，并应用于用8个柱体积(cv)的缓冲液A(20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M NaCl，0.01％Tween-20，pH 7.5)平衡的HiTrap PA HP(GE Healthcare，柱体积(cv)＝5ml)。在用10cv的缓冲液A清洗之后，使用20cv上变成缓冲液B(20mM柠檬酸钠pH 2.5，0.5M NaCl，0.01％Tween-20)的pH梯度洗脱蛋白质。合并含有感兴趣蛋白质的级分，并温和地将溶液的pH调节至pH 6.0(使用2M Tris pH 8.0)。使用超浓缩器(Vivaspin 15R 30.000MWCO HY，Sartorius)将样品浓缩至1ml，随后应用于用20mM组氨酸，pH6.0，140mM NaCl，0.01％Tween-20平衡的SuperdexTM200 10/300GL(GE Healthcare)。通过分析性大小排阻层析分析洗脱级分的聚集体含量。因此，于25℃将30μl每份级分应用于在25mM K2HPO4，125mM NaCl，200mM L-精氨酸单氢氯化物，0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7运行缓冲液中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)。合并含有少于2％寡聚物的级分，并使用超浓缩器(Vivaspin 15R 30.000MWCOHY，Sartorius)浓缩至1-1.5mg/ml的终浓度。通过测量280nm处的光密度(OD)，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来测定蛋白质浓度。通过在还原剂存在和缺失下的SDS毛细管电泳遵循制造商的说明书(instrument Caliper LabChipGX，Perkin Elmer)分析构建体的纯度和分子量。在液氮中冷冻经过纯化的蛋白质，并保存于-80℃。
3.聚集温度
通过0.1℃/min的25°至80°的梯度加热在Optim1000(Avacta，PALL Corporation)上测试四种构建体的稳定性。记录聚集开始时的温度。
表34：2+1倒转的T细胞双特异性型式的9D11结合物的四种N-糖基化位点敲除突变体的产量，单体含量和聚集温度。所有四种突变体的性能与野生型9D11结合物相似。
克隆 突变 产量[mg/L] 单体[％] 聚集温度
9D11 T102N 1.34 97 56°
9D11 T102A 1.29 100 56°
9D11 N100Q 2.5 100 56°
9D11 N100S 2.05 100 56°
9D11 - 2.6 100 57°
生成了下述变体：N100S(N95S)，N100Q(N95Q)，T102A(T97A)和T102N(T97N)(括号中指示Kabat编号方式)，并转变成T细胞双特异性型式。在HEK293 EBNA细胞中瞬时生成和纯化之后，对不同变体分析靶物结合和细胞杀伤活性，与原始9D11克隆比较。
表17：用于去除9D11的CDR L3中的N-糖基化位点的引物(序列见下文)
# 氨基酸调换 诱变引物
1 N95S GAB-7735
2 N95Q GAB-7734
3 T97A GAB7736
4 T97N GAB-7737
实施例18
9D11无糖基化变体的结合和T细胞介导的杀伤
由于CDR中的糖基化位点，生成四种不同9D11变体，它们具有去除糖基化位点的突变(实施例17)。对这四种变体测试对HeLa细胞上的FolR1的结合(图10)和对SKOV3和HT-29的肿瘤细胞杀伤诱导，与原始9D11比较(图11A-B，E-F)。无一变体显示结合或肿瘤细胞杀伤诱导的差异。平行地，分析了对FolR1阴性细胞系MKN-45的非特异性杀伤(图11C-D)。同样，未能在变体和原始结合物之间观察到差异。无一构建体对FoLR1阴性肿瘤细胞诱导非特异性杀伤。
实施例19
原代上皮细胞上的FolR1表达
FolR1在原代上皮细胞上以低水平表达。在这里我们想要测试这些水平是否足以在FolR1 TCB存在下诱导T细胞介导的杀伤。为了测试这一点，我们使用原代人支气管上皮细胞，原代人脉络丛上皮细胞，原代人肾皮质上皮细胞和原代人视网膜色素上皮细胞。作为阳性对照，包括FolR1阳性SKOV3细胞或HT-29细胞任一。首先，我们验证所使用的原代细胞上的FolR1表达并测定这些细胞上FolR1结合位点的量。与肿瘤细胞上的表达水平相比，支气管上皮细胞，肾皮质上皮细胞和视网膜色素上皮细胞表达很低但显著水平的FolR1。脉络丛上皮细胞没有表达显著水平的FolR1。
表18：原代上皮细胞上的FolR1结合位点
细胞系 结合位点
支气管上皮 492
脉络丛上皮 104
肾皮质上皮 312
视网膜色素上皮 822
Skov3 69’890
使用在表面上展现FolR1表达的原代上皮细胞来解决这些细胞是否能在FoLR1TCB存在下被T细胞杀死的问题。未能检测到显著水平的杀伤，但是检测到在视网膜色素上皮细胞，支气管上皮细胞和肾皮质细胞存在下对T细胞激活的诱导，导致CD25和CD69上调。对视网膜色素上皮细胞看到最强激活，导致CD4+T细胞和CD8+T细胞上CD25和CD69二者的上调。在支气管上皮细胞存在下诱导更低的T细胞激活，伴随CD4+T细胞和CD8+T细胞上CD69的上调，但是只有CD4+T细胞上很低的CD25上调，但CD8+T细胞上没有。在肾上皮细胞存在下获得最低的T细胞激活，伴随CD4+T细胞和CD8+T细胞上没有CD25上调，而且只有CD8+T细胞上CD69上调(图12A-X)。
实施例20
含有16D5或9D11结合物任一的不同TCB型式的比较
为了测定TCB 2+1倒转型式是否是最有活性的具有选定FolR1结合物的型式，生成含有16D5或9D11任一的不同型式，并在靶细胞结合，T细胞介导的杀伤和T细胞激活方面进行比较。16D5结合物以TCB 2+1倒转的(图1A)，TCB 2+1经典的(图1D)，TCB 1+1经典的(图1C)和TCB 1+1头至尾(图1B)型式测试；9D11结合物以TCB 2+1倒转的(图1A)，TCB 1+1经典的(图1C)和TCB1+1头至尾(图1B)型式测试。
对所有构建体测试对HeLa细胞上的FolR1的结合。由于亲合力，二价结合FolR1的分子与单价构建体相比有更强的结合。二价与单价构建体之间的差异对于16D5更加突出。原因可能是由于16D5更低的亲和力，这种结合物的亲合效应更强。在两种1+1TCB之间在结合方面没有显著差异，但是两种2+1构建体之间有差异。倒转的2+1构建体比经典的2+1构建体更强地结合FolR1。这指示在经典的2+1构建体中对FoLR1的结合受到CD3 Fab的存在影响，而在倒转的构建体中结合受到的影响更小。
通过测试这些构建体的T细胞介导的杀伤，我们能显示与2+1经典的TCB相比，2+1倒转的TCB的更强结合转化成更强的肿瘤细胞杀伤和T细胞激活。16D5 FolR1 TCB 2+1经典比相应的1+1头至尾构建体只是略微更有活性。1+1头至尾构建体比1+1经典构建体显著更有活性。这没有反映在结合中看到的情形，而且可能是由于头至尾构建体有更好的交联。总体肿瘤细胞杀伤和T细胞激活对所有测试的构建体是相当的，所看到的效力差异是仅就EC50值而言的差异。一般而言，能得出结论，不依赖于所使用的结合物，FolR1 TCB 2+1倒转的是优选的型式，用来诱导T细胞介导的肿瘤细胞杀伤和T细胞激活(见图13A-C和图14A-C)。
表19：不同TCB型式的靶细胞结合和T细胞介导的杀伤的EC50值
Figure GDA0002732657150001071
Figure GDA0002732657150001081
表20：在SKOV3细胞存在下不同TCB型式的T细胞激活的EC50值
Figure GDA0002732657150001082
实施例21
肿瘤细胞系和原代细胞
HeLa细胞(CCL-2)自ATCC获得并在含10％FCS和2mM谷氨酰胺的DMEM中培养，SKOV3(HTB-77)自ATCC获得并在含10％FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI中培养，OVCAR5自NCI或并在含10％FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI中培养，HT-29(ACC-299)自DSMZ获得并在含10％FCS和2mM谷氨酰胺的McCoy’s 5A培养基中培养，MKN-45(ACC-409)自DSMZ获得并在含10％FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI中培养。
自ScienCell Research Laboratories获得所有测试的原代上皮细胞。在支气管上皮细胞培养基(BEpiCM，产品目录号3211，ScienCell)中培养人支气管上皮细胞(HBEpiC，产品目录号3210)。在结肠上皮细胞培养基(CoEpiCM，产品目录号2951，ScienCell)中培养人结肠上皮细胞(HCoEpiC，产品目录号2950)。在上皮细胞培养基(EpiCM，产品目录号4101，ScienCell)中培养人视网膜色素上皮细胞(HRPEpiC，产品目录号6540)。在上皮细胞培养基(EpiCM，产品目录号4101，ScienCell)中培养人肾皮质上皮细胞(HRCEpiC，产品目录号4110)。在上皮细胞培养基(EpiCM，产品目录号4101，ScienCell)中培养人脉络丛上皮细胞(HCPEpiC，产品目录号1310)。
实施例22
通过流式细胞术测定的靶物结合
将所指示的靶细胞用细胞解离缓冲液收获，用PBS清洗，并在FACS缓冲液中重悬浮。在96孔圆底板中实施抗体染色。因此，每个孔接种200’000个细胞。将板以400g离心4分钟，并去除上清液。在FACS缓冲液中稀释测试抗体，并于4℃将20μl抗体溶液添加至细胞达30分钟。为了去除未结合的抗体，将细胞用FACS缓冲液清洗两次，之后添加经过稀释的二抗(FITC缀合的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG，Fcg片段，Jackson ImmunoResearch#109-096-098或PE缀合的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcg片段特异性，JacksonImmunoResearch#109-116-170)。于4℃温育30分钟之后，洗掉未结合的二抗。在测量之前，在200μl FACS缓冲液中重悬浮细胞，并使用BD Canto II或BD Fortessa通过流式细胞术进行分析。
实施例23
内在化
收获细胞并测定存活力。以2x106个细胞/ml在新鲜的冷的培养基中重悬浮细胞，并为每种抗体将细胞悬浮液转移至15ml falcon管。以20μg/ml的终浓度将应当测试内在化的抗体添加至细胞。将管在冷室中在摇床上温育45分钟。在温育之后，将细胞用冷的PBS清洗三次以去除未结合的抗体。在时间点零点将0.2x106个细胞/孔转移至FACS板。在温热的培养基中重悬浮经过标记的细胞并于37℃温育。在指示的时间点，在冷的PBS中转移0.2x106个细胞/孔，清洗，在FACS板上涂板。为了检测保持在表面上的构建体，用PE标记的抗人Fc二抗对细胞染色。因此，每个孔添加20μl经过稀释的抗体，并将板于4℃温育30分钟。然后将细胞清洗两次以去除未结合的抗体，然后用1％PFA固定以阻止任何进一步内在化。使用BD FACS CantoII测量荧光。
实施例24
Figure GDA0002732657150001091
分析
Figure GDA0002732657150001092
含有一系列珠，直径10μm且包被有不同但准确限定数量的小鼠单抗分子(高亲和力抗人CD5，克隆CRIS-1，同种型IgG2a)。珠模拟具有不同抗原密度的细胞，已经用小鼠单克隆一抗，同种型IgG标记。简言之，用针对感兴趣抗原的小鼠单克隆一抗标记细胞。在另一个测试孔中，用无关小鼠单克隆抗体(同种型对照)标记细胞。然后，试剂盒中包括用荧光素缀合的抗小鼠二抗标记的细胞，建立珠和校准珠。用于标记细胞的一抗必须以饱和浓度使用。一抗可以是任何小鼠IgG同种型。在这些条件下，所结合的一抗分子的数目对应于细胞表面上存在的抗原位点的数目。二抗也以饱和浓度使用。因而，荧光与细胞上和珠上结合的一抗分子的数目有关。
实施例25
T细胞介导的肿瘤细胞杀伤和T细胞激活
用胰蛋白酶/EDTA收获靶细胞，计数，并检查存活力。以300’000个细胞/ml的终浓度将细胞在它们各自的培养基中重悬浮。然后将100μl靶细胞悬浮液转移入96平底板的每个孔。将板在温箱中于37℃温育过夜以容许细胞粘附至板。次日，自来自健康供体的全血分离PBMC。用PBS 2:1稀释血液，覆盖在Leucosep管中的15ml Histopaque-1077(#10771，Sigma-Aldrich)上，并以450g无中断离心30分钟。在离心之后，用10ml移液器收集含有细胞的带，并转移入50ml管。用PBS装满管直至50ml，并离心(400g，10分钟，室温)。去除上清液，并在PBS中重悬浮团粒。在离心(300g，10分钟，室温)之后，丢弃上清液，合并2个管，并重复清洗步骤(这次离心350xg，10分钟，室温)。之后，重悬浮细胞，并在50ml PBS中合并团粒，用于细胞计数。在计数之后，将细胞离心(350g，10分钟，室温)，并以6x106个细胞/孔在含2％FCS和2nM谷氨酰胺的RPMI中重悬浮。自涂板的靶细胞去除培养基，并添加在含2％FCS和2nM谷氨酰胺的RPMI中稀释的测试抗体。将300’000个细胞的效应细胞溶液转移至每个孔，导致10:1的E:T比。为了测定最大释放，用Triton X-100裂解靶细胞。在24小时和48小时之后使用细胞毒性检测试剂盒(#1644793，Roche Applied Science)测定LDH释放。通过流式细胞术测量肿瘤细胞杀伤之后T细胞上的激活标志物上调。简言之，收获PBMC，转移入96孔圆底板，并用在FACS缓冲液中稀释的CD4 PE-Cy7(#3557852，BD Bioscience)，CD8 FITC(#555634，BD Bioscience)，CD25 APC(#555434，BD Bioscience)，CD69 PE(#310906，BioLegend)抗体染色。于4℃温育30分钟之后，将细胞用FACS缓冲液清洗两次。在使用BDCanto II测量荧光之前，在200μl FACS缓冲液中重悬浮细胞。
实施例26
全血中的T细胞激活
将280μl新鲜血液添加入96孔锥形深孔板。然后将20μl经过稀释的TCB添加至血液，并通过摇动板来充分混合。在温箱中于37℃温育24小时之后，混合血液并将35μl转移至96孔圆底板。然后添加20μl由CD4 PE-Cy7(#3557852，BD Bioscience)，CD8 FITC(#555634，BD Bioscience)，CD25 APC(#555434，BD Bioscience)，CD69 PE(#310906，BioLegend)和CD45 V500(#560777，BD Horizon)组成的抗体染色混合液，并于室温在黑暗中温育15分钟。在测量之前，将200μl新鲜制备的BD FACS裂解溶液(#349202，BD FCAS)添加至血液。于室温温育15分钟之后，用BD Fortessa测量细胞。
实施例27
人源化FolR1 TCB(克隆16D5)在免疫缺陷NOD/Shi-scid/IL-2Rγ缺无(NOG)小鼠中的SDPK(单剂药动学)研究
依照承诺的指导方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小时光亮/12小时黑暗的日周期在无特定病原体的条件下维持实验开始时6-7周龄的雌性NOD/Shi-scid/IL-2Rγ缺无(NOG)小鼠(购自Taconic，Denmark)。实验研究方案得到地方政府的审查和批准(P 2011/128)。在到达之后，将动物维持一周以适应新环境和进行观察。规则地进行连续健康监测。
对小鼠静脉内注射10/1/0.1μg/小鼠FolR1 TCB，而每个组和时间点对3只小鼠采血。对所有小鼠注射总体积200μl的适宜溶液。为了获得正确量的FolR1 TCB/200μl，在必要时用PBS稀释储备溶液。在疗法注射5分钟，1小时，3小时，8小时，24小时，48小时，72小时，96小时和168小时之后收集血清样品。
图15显示16D5 FolR1 TCB在NOG小鼠中显示典型的且与剂量成比例的IgG样PK特性，具有较慢的清除。
表21：实验条件。
Figure GDA0002732657150001111
Figure GDA0002732657150001121
实施例28
携带Skov3的NOG小鼠中人PBMC转移之后FolR1 TCB(克隆16D5)的体内功效
在皮下注射入PBMC植入NOG小鼠的人卵巢癌细胞系Skov3中测试FolR1 TCB。
Skov3卵巢癌细胞是自ATCC(HTB-77)获得的。在5％CO2的水饱和气氛中于37℃在含有10％FCS(Gibco)的RPMI中培养肿瘤细胞系。使用第35代进行移植，存活力>95％。将5x106个细胞/动物在总共100μl RPMI细胞培养基(Gibco)中皮下注射入动物的右体侧。
依照承诺的指导方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小时光亮/12小时黑暗的日周期在无特定病原体的条件下维持实验开始时6-7周龄的雌性NOD/Shi-scid/IL-2Rγ缺无(NOG)小鼠(购自Taconic，Denmark)。实验研究方案得到地方政府(P 2011/128)的审查和批准。在到达之后，将动物维持一周以适应新环境和进行观察。规则地进行连续健康监测。
依照方案(图16)，在研究第0天对小鼠皮下注射5x106个Skov3。在研究第21天，经由Ficoll方法分离健康供体的人PBMC，并将10x106个细胞腹膜内注射入携带肿瘤的小鼠。2天后，将小鼠随机化并平等地分配至5个处理组(n＝12)，接着是持续三周一周一次静脉内注射10/1/0.1μg/小鼠FolR1 TCB或10μg/小鼠DP47对照TCB任一。对所有小鼠静脉内注射200μl适宜的溶液。对媒介组中的小鼠注射PBS。为了获得正确量的TCB/200μl，在必要时用PBS稀释储备溶液。一周一次使用测径器测量肿瘤生长(图17)，并如下计算肿瘤体积：
Tv:(W2/2)x L (W：宽度，L：长度)
一周一次注射FolR1 TCB导致剂量依赖性抗肿瘤效果。10μg/小鼠和1μg/小鼠的剂量诱导肿瘤收缩，而0.1μg/小鼠的剂量诱导肿瘤停滞(图17，表22)。与非靶向性对照DP47TCB相比，最大肿瘤收缩是以10μg/小鼠的剂量实现的。
表22：体内功效。
Figure GDA0002732657150001122
Figure GDA0002732657150001131
对于PD读出，在研究第32天处死每个处理组的3只小鼠，取出肿瘤，并经由胶原酶V，Dispase II和DNA酶的酶促消化来制备单细胞悬浮液，用于后续的FACS分析(图19和20)。单细胞或是直接用于针对胞外抗原和激活标志物的染色，或是在普通培养基中在蛋白质转运抑制剂莫能霉素(Monensin)存在下使用5ng/ml PMA和500ng/ml伊屋诺霉素(Ionomycin)再刺激5小时。在再刺激之后，将细胞针对表面抗原染色，接着是固定和透化步骤。然后将固定样品针对TNF-α，IFN-γ，IL-10和IL-2细胞内染色，并通过流式细胞术进行分析。使用相同规程进行细胞脱粒，但是在再刺激时段期间添加抗CD107a抗体，并将经过固定的样品针对细胞内穿孔素和粒酶-B内容物染色。FACS分析揭示与媒介和非靶向性对照TCB相比用FolR1 TCB处理后肿瘤组织中统计学更大数目的浸润性CD4+和CD8+T细胞。而且，在FolR1TCB处理的肿瘤中检测到更大数目的TNF-α，IFN-γ和IL-2生成性以及穿孔素+/粒酶B+CD4+和CD8+T细胞。用FolR1 TCB处理的肿瘤浸润性T细胞还显示与对照组相比更高的脱粒速率。
在第38天研究结束，处死所有动物；取出肿瘤并称重(图18)。与对照组相比，用10和1μg/小鼠FolR1 TCB处理的肿瘤的重量显示统计学显著的差异。
表23：实验条件。
Figure GDA0002732657150001132
Figure GDA0002732657150001141
实施例29
双特异性FolR1/CD3-κ-λ抗体的生成
为了在不使用任何异二聚化办法(例如节入穴技术)的情况下生成同时能结合人CD3和人叶酸受体α(FolR1)的双特异性抗体(对于每种抗原是单价的)，应用共同轻链文库与所谓的CrossMab技术的组合：将人源化CD3结合物的可变区(CH2527_VL7_46/13)融合至标准人IgG1抗体的CH1域以形成VLVH交叉分子(融合至Fc)，它对于两种特异性是共同的。为了生成交叉的相对部分(VHCL)，将CD3特异性可变重链域(CH2527_VH_23/12)融合至恒定人λ轻链，而将对人FolR1特异性的可变重链域(克隆16D5，自共同轻链文库分离)融合至恒定人κ轻链。这使得能够通过应用后续κSelect和λFabSelect柱(GE Healthcare)纯化步骤以去除不想要的同二聚体抗体来纯化期望的双特异性抗体。
如Sambrook,J.et al.,Molecular cloning:A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中描述的，使用标准重组DNA技术生成所有抗体表达载体。依照制造商的推荐使用分子生物学试剂。基因或基因片段或是通过聚合酶链式反应(PCR)扩增或是在Geneart AG(Regensburg，Germany)通过自动化基因合成自合成寡核苷酸生成。通过DNA测序(Synergene GmbH，Switzerland)确认PCR扩增的或亚克隆的DNA片段。将质粒DNA转化入合适的大肠杆菌宿主菌株，并在其中扩增，用于使用标准Maxiprep试剂盒(Qiagen)制备转染级质粒DNA。为了生成双特异性分子，使用标准的基于聚乙烯亚胺(PEI)的方法用编码相应基因的质粒转染HEK293EBNA细胞。所使用的三种表达载体的质粒比为1:1:1。将转染细胞培养7天，之后收获上清液用于纯化。如下生成并纯化双特异性FolR1/CD3-κ-λ抗体。
1.瞬时转染和生成
如下文所述对于所需载体使用PEI介导的转染规程在HEK293 EBNA细胞中瞬时生成κ-λ双特异性抗体。在CD CHO培养基中悬浮无血清培养HEK293 EBNA细胞。对于500ml摇瓶中的生成，在转染之前24小时接种400x106个HEK293 EBNA细胞(对于备选规模，相应调节所有量)。为了转染，将细胞以210x g离心5分钟，用预温热的20ml CD CHO培养基替换上清液。在20ml CD CHO培养基中混合表达载体至最终量200μg DNA。在添加540μl PEI溶液之后，漩涡震荡15秒，随后于室温温育10分钟。之后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml烧瓶，并在具有5％CO2气氛的温箱中于37℃温育3小时。在温育时间之后，添加160ml F17培养基，并将细胞培养24小时。转染后1天，添加1mM丙戊酸并添加7％补料1。7天后，收集培养上清液，用于通过以210x g离心15分钟来纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，以终浓度0.01％w/v添加叠氮化钠，并保存于4℃。
2.纯化
以三个步骤纯化κ-λ双特异性抗体，使用对κ轻链特异性的亲和步骤，接着是对λ轻链的特异性亲和步骤，最后是用于去除聚集体的大小排阻层析步骤。将自瞬时生成获得的上清液调节至pH 8.0(使用2M TRIS pH 8.0)，并应用于用5个柱体积(cv)的缓冲液A(50mMTris，100mM甘氨酸，150mM NaCl，pH 8.0)平衡的Capture Selectκ亲和基质，或HiTrapκSelect，GE Healthcare，柱体积(cv)＝1ml。在用15cv的缓冲液A清洗之后，使用25cv上变成缓冲液B(50mM Tris，100mM甘氨酸，150mM NaCl，pH 2.0)的pH梯度洗脱蛋白质。合并含有感兴趣蛋白质的级分，并将溶液的pH调节至pH 8.0(使用2M Tris pH 8.0)。将中和后的合并级分应用于用5个柱体积(cv)的缓冲液A(50mM Tris，100mM甘氨酸，150mM NaCl，pH 8.0)平衡的Capture Selectλ亲和基质(现在是：HiTrapλFabSelect，GE Healthcare，柱体积(cv)＝1ml)。在用15cv的缓冲液A清洗之后，使用25cv上变成缓冲液B(50mM Tris，100mM甘氨酸，150mM NaCl，pH 2.0)的pH梯度洗脱蛋白质。合并含有感兴趣蛋白质的级分，并将溶液的pH调节至pH 8.0(使用2M Tris pH 8.0)。使用超浓缩器(Vivaspin 15R 30.000MWCO HY，Sartorius)浓缩溶液，随后应用于用20mM组氨酸，pH 6.0，140mM NaCl，0.01％Tween-20平衡的SuperdexTM 20010/300GL(GE Healthcare)。再次使用超浓缩器(Vivaspin 15R30.000MWCO HY，Sartorius)浓缩大小排阻之后的合并级分。
通过测量280nm处的光密度(OD)，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来测定蛋白质浓度。通过在还原剂存在和缺失下的SDS毛细管电泳遵循制造商的说明书(instrument Caliper LabChipGX，Perkin Elmer)分析构建体的纯度和分子量。只有少量的蛋白质能以0.17mg/L的最终产量纯化。
实施例30
双特异性FolR1/CD3-κ-λ抗体的T细胞介导的杀伤
在新鲜分离的PBMC存在下在SKOV3细胞上测试κλFolR1 TCB的活性。作为阴性对照，包括DP47 TCB。在24小时和48小时之后通过LDH释放测定T细胞介导的SKOV3细胞杀伤。在48小时之后，收获T细胞，并通过流式细胞术测量CD4 T细胞和CD8 T细胞上的CD69和CD25上调。
κλFolR1构建体以浓度依赖性方式诱导SKOV3细胞杀伤，在CD4 T细胞上和在CD8 T细胞上均伴有CD69和CD25上调。
在κλFolR1 TCB或DP47 TCB任一存在下将SKOV3细胞与PBMC一起温育。在24小时和48小时之后通过测量LDH释放来测定肿瘤细胞杀伤(图21)。在κλFolR1 TCB或DP47 TCB任一存在下将SKOV3细胞与PBMC一起温育。在48小时之后通过流式细胞术测量CD4 T细胞和CD8T细胞上的CD25和CD69上调(图22)。
实施例31
通过表面等离振子共振对16D5和36F2 FolR1结合物的生化表征
通过表面等离振子共振(SPR)评估不同单价或二价T细胞双特异性型式的抗FolR116D5和作为IgG或作为T细胞双特异性的抗FolR1 36F2对重组人，食蟹猴和鼠叶酸受体1(均作为Fc融合物)的结合。于25℃在Biacore T200上实施所有SPR实验，以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20，Biacore，GEHealthcare)。
1.所测试的分子
用于亲和力和亲合力测定的分子描述于表24。
表24：SPR分析中使用的6种构建体的名称和描述
Figure GDA0002732657150001161
Figure GDA0002732657150001171
2.对叶酸受体1的亲合力
如下文所述测定抗FolR1 IgG或T细胞双特异性和重组叶酸受体之间的相互作用的亲合力(表25)。
使用标准偶联指令(Biacore，GE Healthcare)直接在SA芯片上偶联人，食蟹猴和鼠叶酸受体1的重组生物素化单体Fc融合物(FolR1-Fc)。固定化水平为约300-400RU。抗FolR1 IgG或T细胞双特异性以3.7至900nM的浓度范围以30μL/min的流速通过流动室达180秒。监测解离达240或600秒。在每一个循环之后使用两次注射30秒10mM甘氨酸-HCl pH 2来再生芯片表面。通过扣除在用重组生物素化鼠CD134 Fc融合物固定化的参照流动室上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractive index)差异。自IgG或T细胞双特异性的二价结合产生的结合曲线近似1:1Langmuir结合(尽管它是1:2结合)，并用该模型拟合以得到代表二价结合的亲合力的表观KD。使用Bia评估软件(GE Healthcare)自拟合的速率常数推导相互作用的表观亲合常数。对于1+1T细胞双特异性型式，相互作用真的是1:1，而且KD代表亲和力，因为这种构建体中只有一个FolR1结合物。
表25：抗FolR1 16D5和36F2作为IgG或作为T细胞双特异性(TCB)对人，食蟹猴和鼠FolR1的二价结合(亲合力及表观KD)。
Figure GDA0002732657150001172
Figure GDA0002732657150001181
3.对叶酸受体1的亲和力
如下文所述测定抗FolR1 IgG或T细胞双特异性和重组叶酸受体之间的相互作用的亲和力(表26)。
为了亲和力测量，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)于pH 5.0在CM5芯片上实施12000个共振单位(RU)左右的抗人Fab特异性抗体(Fab捕捉试剂盒，GE Healthcare)的直接偶联。以20nM及流速10μl/min捕捉抗FolR1IgG或T细胞双特异性达40秒，留下参照流动室没有捕捉。使人，食蟹猴或鼠叶酸受体1Fc融合物的稀释系列(12.3至3000nM)以30μl/min通过所有流动室达240秒以记录结合期。解离期监测300秒并通过自样品溶液转换至HBS-EP来触发。在每一个循环之后使用两次注射60秒10mM甘氨酸-HCl pH 1.5来再生芯片表面。通过扣除在参照流动室1上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractive index)差异。通过使用Bia评估软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合自速率常数推导相互作用的亲和常数。
表26：抗FolR1 16D5和36F2作为IgG或作为T细胞双特异性(TCB)对人，食蟹猴和鼠FolR1的单价结合(亲和力)。
Figure GDA0002732657150001182
Figure GDA0002732657150001191
36F2 TCB对人和食蟹猴FolR1-Fc的亲和力(单价结合)是相似的，而且均为1000nM左右，而对鼠FolR1-Fc的亲和力略微更好，而且为300nM左右。36F2可以在鼠和灵长类动物模型中使用，不需要替代品。
36F2 TCB对人FolR1的亲合力(表观KD)比16D5 TCB对人FolR1的亲和力低30倍左右。在二价型式中，36F2 TCB在低纳摩尔范围中，而16D5 TCB在低皮摩尔范围中(差异1000倍)。
FolR1在肿瘤细胞上表达，在一系列上皮恶性肿瘤中以间歇和高水平在癌细胞的表面上过表达，包括卵巢，乳腺，肾，结直肠，肺和其它实体癌，而且还在正常组织中在一个有限子集的极化上皮细胞的顶部表面上表达。这些非肿瘤性，正常细胞只以低水平表达FolR1，而且包括例如肺泡表面上的支气管上皮细胞，肾小管细胞的肾皮质管腔边界，视网膜色素上皮(基底外侧膜)和脉络丛。
16D5 TCB结合表达少量FolR1的正常组织细胞，这导致它们的T细胞介导的杀伤。这可能至少部分说明了以10μg/kg在食蟹猴中观察到的有限的耐受。发明人想要确定降低T细胞双特异性分子的亲和力是否能提高高和低靶物密度组织之间的区分，并由此利用二价结合和亲合力实现更低的毒性。正常情况下不选择低亲和力结合物作为合适的候选者用于进一步分析，因为低亲和力常常与低效力和功效有关。不过，以数种型式开发了低亲和力FolR1结合物36F2，并表征它的生物学特性。对于以二价T细胞双特异性型式使用的36F2，亲合效应(单价和二价结合之间的差异)为250倍左右(1000nM对4nM)。在低靶物密度，亲和力限定相互作用并以1000nM导致TCB的低效力。然而，在高靶物密度，分子的亲合力开始活动并以4nM导致TCB的高活性(见实施例32)。
在一种备选办法中，发明人生成了单价型式的16D5和二价型式的16D5的低亲和力变体(亲和力为约10-40nM)。以单价型式(1+1)使用的16D5结合物具有约50nM的亲和力。利用亲合效应能更好地实现高和低靶物密度组织之间的区分。
实施例32
由36F2 TCB，Mov19 TCB和21A5 TCB诱导的对SKov-3细胞的T细胞杀伤
在SKov-3细胞(中等FolR1)上评估由36F2 TCB，Mov19 TCB和21A5 TCB介导的T细胞杀伤。使用人PBMC作为效应物，并在与双特异性抗体一起温育24小时和48小时时检测杀伤。简言之，用胰蛋白酶/EDTA收获靶细胞，清洗，并以25 000个细胞/孔的密度铺于平底96孔板中。让细胞贴壁过夜。通过将自健康人供体获得的富集淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)进行Histopaque密度离心来制备外周血单个核细胞(PBMC)。用无菌PBS稀释新鲜血液并在Histopaque梯度(Sigma,#H8889)上铺层。离心(450xg，30分钟，室温)后，丢弃含PBMC的界面上方的血浆并将PBMC转移至新的falcon管，随后装满50ml PBS。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液，用无菌PBS清洗PBMC团粒两次(离心步骤350xg，10分钟)。对所得PBMC群进行自动计数(ViCell)并在含10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom,K0302)的RPMI1640培养基中在细胞温箱(37℃,5％CO2)中保存直至进一步使用(不超过24小时)。对于杀伤测定法，以标示浓度添加抗体(范围0.005pM-5nM，一式三份)。以最终E:T比率10:1将PBMC添加至靶细胞。于37℃,5％CO2温育24小时和48小时后通过对由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液中的LDH进行定量(LDH检测试剂盒，Roche Applied Science，#11 644793 001)来评估靶细胞杀伤。对靶细胞的最大裂解(＝100％)通过将靶细胞与1％TritonX-100一起温育来实现。最小裂解(＝0％)指在没有双特异性构建体的情况下与效应细胞一起共温育的靶细胞。
结果显示由36F2诱导的杀伤与Mov19 TCB和21A5 TCB相比强烈降低(图23A-B)。使用GraphPadPrism6计算的、与杀伤测定法有关的EC50值汇总于表27。
表27：由36F2 TCB，Mov19 TCB和21A5 TCB诱导的T细胞介导的对FolR1表达性SKov-3细胞的杀伤的EC50值(pM)。
Figure GDA0002732657150001201
*曲线没有达到饱和，值是假设的
实施例33
由不同单价和二价T细胞双特异性型式的36F2 TCB和16D5 TCB诱导的T细胞杀伤
评估由36F2 TCB，16D5 TCB，16D5 TCB经典的，16D5 TCB 1+1和16D5TCB HT抗体介导的对Hela(高FolR1，约2x106个拷贝，表14，图27)，Skov-3(中等FolR1，约70000-90000个拷贝，表14，图27)和HT-29(低FolR1，约10000个，表14，图27)人肿瘤细胞的T细胞杀伤。包括DP47 TCB抗体作为阴性对照。使用人PBMC作为效应器，并在与双特异性抗体一起温育24小时时检测杀伤。简言之，用胰蛋白酶/EDTA收获靶细胞，清洗，并以25 000细胞/孔的密度铺于平底96孔板中。让细胞贴壁过夜。通过将自健康人供体获得的富集淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)进行Histopaque密度离心来制备外周血单个核细胞(PBMC)。用无菌PBS稀释新鲜血液并在Histopaque梯度(Sigma，#H8889)上铺层。离心(450xg，30分钟，室温)后，丢弃含PBMC的界面上方的血浆并将PBMC转移至新的falcon管，随后装满50ml PBS。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液，用无菌PBS清洗PBMC团粒两次(离心步骤350xg，10分钟)。对所得PBMC群进行自动计数(ViCell)并在含10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom,K0302)的RPMI1640培养基中在细胞温箱(37℃,5％CO2)中保存直至进一步使用(不超过24小时)。对于杀伤测定法，以标示浓度添加抗体(范围0.01pM-100nM，一式三份)。以最终E:T比率10:1将PBMC添加至靶细胞。于37℃,5％CO2温育24小时后通过对由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液中的LDH进行定量(LDH检测试剂盒,Roche Applied Science,#11644 793 001)来评估靶细胞杀伤。对靶细胞的最大裂解(＝100％)通过将靶细胞与1％Triton X-100一起温育来实现。最小裂解(＝0％)指在没有双特异性构建体的情况下与效应细胞一起共温育的靶细胞。
结果显示由36F2 TCB诱导的对所有三种FolR1+靶细胞系的靶物特异性杀伤与由16D5 TCB诱导的杀伤相比弱得多(图24A-C，表29)。由单价16D5TCB(16D5 HT和16D5 1+1)诱导的靶物特异性杀伤与二价16D5 TCB(16D5TCB和16D5 TCB经典的)相比要差。使用GraphPadPrism6计算的与杀伤测定法有关的EC50值汇总于表28。重要的是，这些数据显示使用二价2+1TCB型式的36F2 FolR1结合物与16D5 FolR1 TCB相比扩宽了治疗窗(图24A-C)。虽然16D5和36F2 FolR1 TCB之间的效力降低对于Hela细胞(高FolR1表达，见表28：16D5TCB＝0.8对36F2 TCB＝36.0)为大约45倍，对于Skov3细胞(中等FolR1表达，见表28：16D5TCB＝0.6对36F2 TCB＝178.4)为大约297-倍，但是这种降低对于具有低FolR1表达的HT29为几乎7000倍(见表28：16D5 TCB＝5.7对36F2 TCB＝39573)。如此，36F2 FolR1 TCB在高和低表达细胞之间有区别，这对于降低毒性有特殊的重要性，因为一些正常，非肿瘤组织的细胞表达很低水平的FolR1(大约少于1000个拷贝/细胞)。与这项观察结果一致，下文实施例35中讨论的结果显示36F2 TCB没有对原代细胞诱导T细胞杀伤(图26A-D)，而对于16D5 TCB能在温育48小时之后在HRCEpiC和HRPEpiC细胞上观察到一些杀伤(图26B和C)。36F2 TCB的这项重要特征容许为FolR1阳性肿瘤的治疗进行剂量给药，使得它对具有高或中等FolR1表达的肿瘤组织介导有力的杀伤，但是对具有低(部分极化的)表达的正常组织不然。值得注意的是，这项特征看来是由二价2+1倒转型式的36F2 TCB的亲合力介导的，因为在使用携带相同低亲和力36F2结合物的1+1单价型式时没有观察到它。
换言之，二价2+1型式的36F2 TCB包含亲和力相对较低的FolR1结合模块，但是它拥有亲合效应，容许在高和低FolR1表达性细胞之间区分。因为肿瘤细胞以高或中等水平表达FolR1，所以这种TCB选择性结合肿瘤细胞且不结合以低水平或根本不表达FolR1的正常的，非癌性细胞。
在上述有利特征以外，二价2+1倒转型式的36F2 TCB还具有它不需要化学交联或其它杂合办法的优点。这使得它适合于制造用于治疗患者，例如具有FolR1阳性癌性肿瘤的患者的药物。二价2+1倒转型式的36F2 TCB可使用标准CHO工艺来生产，具有低聚集体。而且，二价2+1型式的36F2 TCB包含人和人源化序列，这使得它优于采用当施用于人时高度免疫原性的大鼠和鼠多肽的分子。另外，改造二价2+1型式的36F2 TCB以消除FcgR结合，而且因此不引起FcgR交联和融合反应，进一步增强它在施用于患者时的安全性。
正如上文所述结果证明的，它的头至尾几何学使得二价2+1倒转型式的36F2 TCB成为高度有力诱导绝对靶细胞杀伤的分子。它的二价性增强亲合力和效力，而且还容许高和低表达细胞之间的区分。因其亲合效应所致它对高或中等靶物表达性细胞的偏爱降低源自T细胞介导的对以低水平表达FolR1的正常细胞的杀伤的毒性。
二价2+1型式的36F2 TCB和本文中公开的其它实施方案的另一项优点在于它们的临床开发不需要使用替代分子，因为它们结合人，食蟹猴和鼠FolR1。照此，本文中公开的分子与先前描述的针对FolR1的抗体(它们并非识别来自所有三个物种的FolR1)识别不同的表位。
表28：在温育24小时之后由不同单价和二价T细胞双特异性型式的36F2 TCB和16D5 TCB诱导的T细胞介导的对FolR1表达性肿瘤细胞的杀伤的EC50值(pM)。
抗体 Hela(FolR1高) Skov-3(FolR1中等) HT-29(FolR1低)
16D5 TCB 0.8 0.6 5.7
16D5 TCB经典的 4.6 2.0 13.0
16D5 TCB HT 11.6 12.3 15.1
16D5 TCB 1+1 23.8 48.9 883.8*
36F2 TCB 36.0 178.4 39573.0*
*曲线没有达到饱和，只有假设值
表29显示16D5 TCB和36F2 TCB对所测试的不同细胞系的EC50值的比较。自所获得的EC50值计算Δ(16D5 TCB的EC50减去36F2 TCB的EC50)和x倍差异(16D5 TCB的EC50除以36F2 TCB的EC50)。
表29：16D5 TCB和36F2 TCB的EC50值的比较。
抗体 Hela(FolR1高) Skov-3(FolR1中等) HT-29(FolR1低)
16D5 TCB 0.82 0.63 5.73
36F2 TCB 35.99 178.40 39573.00*
Δ 35.17 177.77 39567.27
x倍 43.83 284.61 6906.58
*曲线没有达到饱和，只有假设值
计算EC50值清楚地显示靶细胞上的FolR1表达越低，36F2 TCB和16D5TCB之间的差异变得越大。
对16D5 TCB和两种单价16D5 TCB(16D5 TCB HT和16D5 1+1)进行与关于16D5 TCB和36F2 TCB的EC50值的比较进行的计算相同的计算。表30和31显示16D5 TCB与16D5 TCBHT(表30)和16D5 TCB与16D5 TCB 1+1(表31)的EC50值的比较以及相应的Δ(16D5 TCB的EC50减去16D5 TCB HT/1+1的EC50)和x倍差异(16D5 TCB的EC50除以16D5 TCB HT/1+1的EC50)。
表30：16D5 TCB(2+1倒转的)和16D5 TCB HT的EC50值的比较。
Figure GDA0002732657150001231
Figure GDA0002732657150001241
表31：16D5 TCB和16D5 TCB 1+1的EC50值的比较。
抗体 Hela(FolR1高) Skov-3(FolR1中等) HT-29(FolR1低)
16D5 TCB 0.82 0.63 5.73
16D5 TCB 1+1 23.84 48.86 883.78*
Δ 23.02 48.24 878.05
x倍 29.03 77.95 154.24
*曲线没有达到饱和，只有假设值
16D5 TCB和36F2 TCB的EC50值的比较(表29)显示靶细胞上的FolR1表达越低，EC50值中的差异变得越大。16D5 TCB和单价16D5 TCB的比较(表29和表30)中看不到这种影响。对于16D5 TCB 1+1(表31)，随着FolR1表达降低，16D5 TCB和16D5 TCB 1+1的EC50之间的差异也有轻微增大，但是迄今为止不如16D5 TCB与36F2 TCB的比较中能看到的来得突出。
实施例34
在由36F2 TCB和16D5 TCB抗体诱导的对FolR1表达性肿瘤细胞的T细胞杀伤之后CD8+和CD4+效应细胞上的CD25和CD69上调
使用识别T细胞激活标志物CD25(晚期激活标志物)和CD69(早期激活标志物)的抗体通过FACS分析评估在由36F2 TCB和16D5 TCB介导的对FolR1表达性Hela，SKov-3和HT-29肿瘤细胞的T细胞杀伤之后CD8+和CD4+T细胞的激活。包括DP47 TCB作为非结合对照。抗体和杀伤测定法条件本质上如上文描述的(实施例32)，使用相同的抗体浓度范围(0.01pM-100nM，一式三份)，E:T比10:1和温育时间48小时。
在温育之后，将PBMC转移至圆底96孔板，以400x g离心4分钟，并用含有0.1％BSA的PBS清洗两次。依照制造商的说明书实施针对CD8(PE-抗人CD8，BD#555635)，CD4(亮紫421TM-抗人CD4，Biolegend#300532)，CD69(FITC-抗人CD69，BD#555530)和CD25(APC-抗人CD25 BD#555434)的表面染色。将细胞用150μl/孔含有0.1％BSA的PBS清洗两次。在离心之后，在200μl/孔PBS 0.1％中重悬浮样品，用于FACS测量。在BD FACS Canto II上分析样品。
36F2 TCB诱导Hela(图25A)和SKov-3(图25B)细胞杀伤之后CD8+和CD4+T细胞上的靶物特异性的激活标志物(CD25，CD69)上调。与16D5 TCB相比，CD8+和CD4+T细胞上由36F2诱导的CD25和CD69上调弱得多。
在HT-29(低FolR1)上只在最高浓度的36F2 TCB时能看到激活标志物的上调。相反，对于16D5 TCB，在低得多的抗体浓度早就能看到CD25和CD69的上调(图25C)。
正如在肿瘤裂解实验中看到的，对杀伤之后T细胞(CD4+和CD8+)上的激活标志物(CD25和CD69)的分析清楚地显示靶细胞上的FolR1表达水平越低，16D5 TCB和36F2 TCB之间的差异变得越大。
实施例35
由36F2 TCB和16D5 TCB诱导的对原代细胞的T细胞杀伤
在原代细胞(人肾皮质上皮细胞(HRCEpiC)(ScienCell Research Laboratories；产品目录号4110)和人视网膜色素上皮细胞(HRPEpiC)(ScienCell ResearchLaboratories；产品目录号6540))上评估由36F2 TCB和16D5 TCB介导的T细胞杀伤。包括HT-29细胞(低FolR1)作为对照细胞系。DP47 TCB充当非结合对照。使用人PBMC作为效应器，并在与双特异性抗体一起温育24小时和48小时时检测杀伤。简言之，用胰蛋白酶/EDTA收获靶细胞，清洗，并以25 000细胞/孔的密度铺于平底96孔板中。让细胞贴壁过夜。通过将自健康人供体获得的富集淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)进行Histopaque密度离心来制备外周血单个核细胞(PBMC)。用无菌PBS稀释新鲜血液并在Histopaque梯度(Sigma,#H8889)上铺层。离心(450xg，30分钟，室温)后，丢弃含PBMC的界面上方的血浆并将PBMC转移至新的falcon管，随后装满50ml PBS。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液，用无菌PBS清洗PBMC团粒两次(离心步骤350xg，10分钟)。对所得PBMC群进行自动计数(ViCell)并在含10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom,K0302)的RPMI1640培养基中在细胞温箱(37℃，5％CO2)中保存直至进一步使用(不超过24小时)。对于杀伤测定法，以标示浓度添加抗体(范围0.01pM-10nM，一式三份)。以最终E:T比率10:1将PBMC添加至靶细胞。于37℃,5％CO2温育24小时和48小时后通过对由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液中的LDH进行定量(LDH检测试剂盒,Roche Applied Science,#11 644 793 001)来评估靶细胞杀伤。对靶细胞的最大裂解(＝100％)通过将靶细胞与1％Triton X-100一起温育来实现。最小裂解(＝0％)指在没有双特异性构建体的情况下与效应细胞一起共温育的靶细胞。
结果显示36F2 TCB没有诱导原代细胞的T细胞杀伤(图26A-D)，而对于16D5 TCB，能在温育48小时之后在HRCEpiC和HRPEpiC细胞上观察到一些杀伤(图26B和D)。正如上文描述的，在16D5 TCB和36F2 TCB之间观察到HT-29细胞的T细胞杀伤的强差异(图26E，F)。
实施例36
DP47 GS TCB的制备
(2+1Crossfab-IgG P329G LALA倒转的＝“非靶向TCB”)
“非靶向TCB”在以上实验中用作对照。双特异性抗体针对CD3e但不结合任何其它抗原，并因此不能将T细胞与任何靶细胞交联(且随后不能诱导任何杀伤)。因此将其用作测定法中的阴性对照以监测任何非特异性T细胞活化。如WO2014/131712中所述制备此非靶向TCB。简言之，将重和轻链DNA序列的可变区亚克隆入各自接受者哺乳动物表达载体，与预插入的恒定重链或恒定轻链同框。抗体表达由MPSV启动子驱动且在CDS的3’端携带合成的polyA信号序列。此外，每种载体包含EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染HEK293 EBNA细胞生成该分子。用相应表达载体以1:2:1:1的比率(“载体重链Fc(穴)”:“载体轻链”:“载体轻链Crossfab”:“载体重链Fc(节)-FabCrossfab”)转染细胞。
为了转染，在CD CHO培养基中无血清悬浮培养HEK293 EBNA细胞。为了500ml摇瓶中的生产，在转染前24小时接种4亿个HEK293 EBNA细胞。为了转染，将细胞以210xg离心5分钟，用预温热的20ml CD CHO培养基置换上清液。在20ml CD CHO培养基中混合表达载体至最终200μg DNA的量。添加540μl PEI溶液后，将混合物涡旋15秒，随后于室温温育10分钟。之后将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在5％CO2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育时间后添加160ml F17培养基并将细胞培养24小时。转染后1天添加1mM丙戊酸和7％给料1。培养7天后通过以210xg离心15分钟收集上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)并以终浓度0.01％w/v添加叠氮化钠，保存于4℃。
通过蛋白A亲和层析自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。将上清液加载到用40ml 20mM磷酸钠,20mM柠檬酸钠,0.5M氯化钠,pH 7.5平衡的HiTrap蛋白A HP柱(CV＝5mL,GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷酸钠,20mM柠檬酸钠,0.5M氯化钠,pH7.5清洗去除未结合的蛋白质。靶蛋白在20个柱体积上从20mM柠檬酸钠,0.5M氯化钠,pH7.5至20mM柠檬酸钠,0.5M氯化钠,pH2.5的梯度期间洗脱。通过添加1/10的0.5M磷酸钠,pH8中和蛋白质溶液。浓缩并过滤靶蛋白，之后加载到用pH 6.0的20mM组氨酸,140mM氯化钠溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
通过测量280nm的光密度(OD)使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数确定经过纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。
通过还原剂存在和缺失下的CE-SDS分析来分析分子的纯度和分子量。依照制造商的说明书使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper Lifescience)。使用2μg样品进行分析。
使用TSKgel G3000 SW XL分析型大小排阻柱(Tosoh)在25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM L-精氨酸单氢氯化物,0.02％(w/v)NaN3,pH 6.7运行缓冲液中于25℃分析抗体样品的聚集体含量。
表32：DP47 GS TCB的产生和纯化汇总。
Figure GDA0002732657150001271
表33：DP47 GS TCB的CE-SDS分析。
峰 kDa 相应的链
DP47 GS TCB非还原(A) 1 165.22 具有2条丢失轻链的分子
2 181.35 具有1条丢失轻链的分子
3 190.58 无N-连接糖基化的正确分子
4 198.98 正确分子
DP47GS TCB还原(B) 1 27.86 轻链DP47 GS
2 35.74 轻链huCH2527
3 63.57 Fc(穴)
4 93.02 Fc(节)
实施例37
16D5 TCB和9D11 TCB和它们的相应CD3脱酰胺变体N100A和S100aA对CD3表达性Jurkat细胞的结合
在CD3表达性永生化T淋巴细胞系(Jurkat)上评估16D5 TCB和相应的CD3脱酰胺变体16D5 TCB N100A和16D5 TCB S100aA和9D11 TCB和脱酰胺变体9D11 TCB N100A和9D11TCB S100aA对人CD3的结合。简言之，收获细胞，计数，检查存活力，并以2x106个细胞/ml在FACS缓冲液(100μl PBS 0.1％BSA)中重悬浮。将100μl细胞悬浮液(含有0.2x106个细胞)与不同浓度的双特异性抗体(686pM-500nM)一起在圆底96孔板中于4℃温育30分钟。在两个冷的PBS 0.1％BSA清洗步骤之后，将样品与PE缀合的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgGFcg片段特异性二抗(Jackson Immuno Research Lab PE#109-116-170)一起于4℃再温育另30分钟。在用冷的PBS 0.1％BSA清洗样品两次之后，立即使用FACS CantoII(SoftwareFACS Diva)通过FACS分析它们。使用GraphPadPrism6获得结合曲线(图28A-B)。
结果显示脱酰胺变体N100A和S100aA的与亲本抗体16D5 TCB(图28A)和9D11 TCB(图28B)相比降低的对CD3的结合。
实施例38
由16D5 TCB和9D11 TCB及其CD3脱酰胺变体N100A和S100aA诱导的对SKov-3和HT-29细胞的T细胞杀伤
在SKov-3(中等FolR1)和HT-29(低FolR1)细胞上评估由16D5 TCB及相应的CD3脱酰胺变体16D5 TCB N100A和16D5 TCB S100aA和9D11 TCB及脱酰胺变体9D11 TCB N100A和9D11 TCB S100aA介导的T细胞杀伤。使用人PBMC作为效应器，并在与双特异性抗体一起温育24小时时检测杀伤。简言之，用胰蛋白酶/EDTA收获靶细胞，清洗，并以25,000个细胞/孔的密度铺于平底96孔板中。让细胞贴壁过夜。通过将自健康人供体获得的富集淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)进行Histopaque密度离心来制备外周血单个核细胞(PBMC)。用无菌PBS稀释新鲜血液并在Histopaque梯度(Sigma,#H8889)上铺层。离心(450xg，30分钟，室温)后，丢弃含PBMC的界面上方的血浆并将PBMC转移至新的falcon管，随后装满50ml PBS。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液，用无菌PBS清洗PBMC团粒两次(离心步骤350xg，10分钟)。对所得PBMC群进行自动计数(ViCell)并在含10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom,K0302)的RPMI1640培养基中在细胞温箱(37℃,5％CO2)中保存直至进一步使用(不超过24小时)。对于杀伤测定法，以标示浓度添加抗体(范围0.01pM至10nM，一式三份)。以最终E:T比率10:1将PBMC添加至靶细胞。于37℃,5％CO2温育24小时后通过对由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液中的LDH进行定量(LDH检测试剂盒,Roche Applied Science,#11644 793 001)来评估靶细胞杀伤。对靶细胞的最大裂解(＝100％)通过将靶细胞与1％Triton X-100一起温育来实现。最小裂解(＝0％)指在没有双特异性构建体的情况下与效应细胞一起共温育的靶细胞。
结果显示对于SKov-3细胞，由CD3脱酰胺变体16D5 TCB N100A和16D5S100aA诱导的杀伤与由16D5 TCB诱导的杀伤相当(图29A)。9D11 TCB及其变体9D11 TCB N100A和9D11TCB S100aA也是如此(图29B)。对于FolR1低表达性HT-29细胞，S100aA变体显示受损的杀伤效率，16D5 TCB(图30A)以及9D11 TCB(图30B)均如此。使用GraphPadPrism6计算的、与杀伤测定法有关的EC50值见表35。
表35：由16D5 TCB和9D11 TCB及其脱酰胺变体N100A和A100aA诱导的对FolR1表达性SKov-3和HT-29细胞的T细胞介导杀伤的EC50值(pM)。
Figure GDA0002732657150001291
*未测定
实施例39
通过表面等离振子共振对去除脱酰胺位点的两种CD3结合物变体(N100A和S100aA)作为TCB的生化表征
通过表面等离振子共振(SPR)评估两种具有CD3结合物变体(N100A或S100aA)的16D5 TCB对人重组CD3(CD3ε-CD3δ异二聚体，作为Fc融合物)的结合。于25℃在BiacoreT200上实施所有SPR实验，以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)。
对CD3ed-Fc的亲和力
如下文所述测定抗FolR1 T细胞双特异性和重组CD3 ε-δ异二聚体之间的相互作用的亲和力(表36)。
为了亲和力测量，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)于pH 5.0在CM5芯片上实施6000个共振单位(RU)左右的抗人Fab特异性抗体(Fab捕捉试剂盒，GE Healthcare)的直接偶联。以200nM及流速20μl/min捕捉抗FolR1 T细胞双特异性达60秒，留下参照流动室没有捕捉。使人和食蟹猴叶酸受体1 Fc融合物的稀释系列(4.1至3000nM)以30μl/min通过所有流动室达240秒以记录结合期。解离期监测240秒并通过自样品溶液转换至HBS-EP来触发。在每一个循环之后使用两次注射60秒10mM甘氨酸-HCl pH 1.5来再生芯片表面。通过扣除在参照流动室1上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractive index)差异。通过使用Bia评估软件(GE Healthcare)拟合至1:1 Langmuir结合速率常数推导相互作用的亲和力常数。
表36：两种16D5 CD3脱酰胺变体作为TCB对人CD3ed-Fc的单价结合(亲和力)。
配体 分析物 ka(1/Ms) kd(1/s) KD
16D5 TCB N100A huCD3 1.23E+04 4.67E-03 380nM
16D5 TCB S100aA huCD3 1.21E+04 5.49E-03 460nM
16D5 TCB huCD3 2.03E+04 4.41E-03 220nM
两种CD3脱酰胺变体具有与野生型CD3结合物(CH2527)相比略微降低的亲和力，但是差异不严重。
实施例40
16D5 T细胞双特异性抗体的具有去除CD3结合物中的脱酰胺位点的突变的两种变体的生成和纯化：16D5 TCB N100A，16D5 TCB S100aA
瞬时转染和生成
如下文所述对于所需载体使用PEI介导的转染规程在HEK293 EBNA细胞中瞬时生成两种脱酰胺变体16D5 TCB。在CD CHO培养基中悬浮无血清培养HEK293 EBNA细胞。对于500ml摇瓶中的生成，在转染之前24小时接种400x106个HEK293 EBNA细胞(对于备选规模，相应调节所有量)。为了转染，将细胞以210x g离心5分钟，用预温热的20ml CD CHO培养基替换上清液。在20ml CD CHO培养基中混合表达载体至最终量200μg DNA。在添加540μl PEI溶液之后，漩涡震荡15秒，随后于室温温育10分钟。之后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶，并在具有5％CO2气氛的温箱中于37℃温育3小时。在温育时间之后，添加160ml F17培养基，并将细胞培养24小时。转染后1天，添加1mM丙戊酸并添加7％补料1。7天后，收集培养上清液，用于通过以210x g离心15分钟来纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，以终浓度0.01％w/v添加叠氮化钠，并保存于4℃。在生成之后，收获上清液，过滤通过0.22μm无菌滤器，并保存于4℃直至纯化。
纯化
使用标准规程以两个步骤纯化两种脱酰胺变体16D5 TCB，诸如蛋白亲和纯化
Figure GDA0002732657150001311
Explorer)和大小排阻层析。将自瞬时生成获得的上清液调节至pH 8.0(使用2MTRIS pH 8.0)，并应用于用8个柱体积(cv)的缓冲液A(20mM磷酸钠pH 7.5，20mM柠檬酸钠)平衡的MabSelect SuRe(GE Healthcare，柱体积(cv)＝2ml)。在用10cv的缓冲液A清洗之后，使用20cv上变成缓冲液B(20mM柠檬酸钠pH 3.0，100mM NaCl，100mM甘氨酸)的pH梯度洗脱蛋白质。合并含有感兴趣蛋白质的级分，并温和地将溶液的pH调节至pH 6.0(使用0.5MNa2HPO4 pH 8.0)。使用超浓缩器(Amicon Ultra-15，30.000MWCO，Millipore)将样品浓缩至1ml，随后应用于用20mM组氨酸，pH 6.0，140mM NaCl平衡的HiLoadTM 16/60SuperdexTM 200制备级(GE Healthcare)。通过分析性大小排阻层析分析洗脱级分的聚集体含量。因此，于25℃将30μl每份级分应用于在25mM K2HPO4，125mM NaCl，200mM L-精氨酸单氢氯化物，0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7运行缓冲液中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)。合并含有少于2％寡聚物的级分。通过测量280nm处的光密度(OD)，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来测定蛋白质浓度。通过在还原剂存在和缺失下的SDS毛细管电泳(CE-SDS)遵循制造商的说明书(instrument Caliper LabChipGX，Perkin Elmer)分析构建体的纯度和分子量。在液氮中冷冻经过纯化的蛋白质，并保存于-80℃。
表36：T细胞双特异性型式的两种16D5脱酰胺变体的产量，单体含量和纯度，通过CE-SDS。
名称 CD3结合物中的突变 产量[mg/L] 单体[％] CE-SDS纯度[％]
16D5 TCB N100A 9 100 89
16D5 TCB S100aA 23 100 83
16D5 TCB 野生型 9 100 93
两种TCB均以较好的质量生成，与具有野生型CD3结合物的构建体相似。
实施例41
去除CDR中的热点的两种16D5结合物变体(D52dE和D52dQ)作为IgG的生成和纯化
瞬时转染和生成
如下文所述对于所需载体使用PEI介导的转染规程在HEK293 EBNA细胞中瞬时生成两种IgG。在CD CHO培养基中悬浮无血清培养HEK293 EBNA细胞。对于500ml摇瓶中的生成，在转染之前24小时接种400x106个HEK293EBNA细胞(对于备选规模，相应调节所有)。为了转染，将细胞以210x g离心5分钟，用预温热的20ml CD CHO培养基替换上清液。在20mlCD CHO培养基中混合表达载体至最终量200μg DNA。在添加540μl PEI溶液之后，漩涡震荡15秒，随后于室温温育10分钟。之后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶，并在具有5％CO2气氛的温箱中于37℃温育3小时。在温育时间之后，添加160ml F17培养基，并将细胞培养24小时。转染后1天，添加1mM丙戊酸并添加7％补料1。7天后，收集培养上清液，用于通过以210x g离心15分钟来纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，以终浓度0.01％w/v添加叠氮化钠，并保存于4℃。在生成之后，收获上清液，将含有抗体的上清液过滤通过0.22μm无菌滤器，并保存于4℃直至纯化。
抗体纯化
使用标准规程以两个步骤纯化两种IgG，诸如蛋白A亲和纯化
Figure GDA0002732657150001321
Explorer)和大小排阻层析。将自瞬时生成获得的上清液调节至pH 8.0(使用2M TRIS pH 8.0)，并应用于用8个柱体积(cv)的缓冲液A(20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH 7.5)平衡的POROS单抗捕捉A(Applied Biosystems，柱体积(cv)＝1ml)。在用10cv的缓冲液A清洗之后，使用5cv上变成缓冲液B(20mM柠檬酸钠pH 3.0，100mM NaCl，100mM甘氨酸)的pH阶梯洗脱蛋白质。将含有感兴趣蛋白质的5ml保存在
Figure GDA0002732657150001322
Explorer上的回路中，随后应用于用20mM组氨酸，pH 6.0，140mM NaCl(不使用TWEEN)平衡的HiLoad16/60SuperdexTM 200(GE Healthcare)。合并含有IgG的级分，并使用超浓缩器(Amicon Ultra-15，30.000MWCO，Millipore)浓缩。通过分析性大小排阻层析分析最终合并液的聚集体含量。因此，于25℃将30μl应用于在25mM K2HPO4，125mM NaCl，200mM L-精氨酸单氢氯化物，0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7运行缓冲液中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)。通过测量280nm处的光密度(OD)，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来测定蛋白质浓度。通过在还原剂存在和缺失下的SDS毛细管电泳(CE-SDS)遵循制造商的说明书(instrument Caliper LabChipGX，PerkinElmer)分析构建体的纯度和分子量。将经过纯化的蛋白质保存于4℃。
表37：两种16D5 IgG热点变体的产量，单体含量和纯度，通过CE-SDS。
克隆 突变HC/LC 产量[mg/L] 单体[％] CE-SDS纯度[％]
16D5 D52dE 24 100 96
16D5 D52dQ 20 100 96
两种IgG均较好地且以较好的质量生成。
实施例42
通过表面等离振子共振对两种去除CDR中的热点的16D5结合物变体(D52dE和D52dQ)作为IgG的生化表征
通过表面等离振子共振(SPR)评估两种16D5结合物变体(D52dE和D52dQ)作为IgG对人和食蟹猴重组叶酸受体1(均作为Fc融合物)的结合。于25℃在Biacore T200上实施所有SPR实验，以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)。
1.对叶酸受体1的亲合力
如下文所述测定抗FolR1 IgG或T细胞双特异性和重组叶酸受体之间的相互作用的亲合力(表38)。
使用标准偶联指令(Biacore，Freiburg/Germany)直接在SA芯片上偶联人，食蟹猴和鼠叶酸受体1的重组生物素化单体Fc融合物(FolR1-Fc)。固定化水平为约160。使抗FolR1IgG或T细胞双特异性以3.7至900nM的浓度范围以30μL/min的流速通过流动室达180秒。监测解离达600秒。通过扣除在用重组生物素化鼠IL2受体Fc融合物固定化的参照流动室上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractive index)差异。自IgG或T细胞双特异性的二价结合产生的结合曲线近似1:1Langmuir结合(尽管它是1:2结合)，并用该模型拟合以得到代表二价结合的亲合力的表观KD。使用Bia评估软件(GE Healthcare)自拟合的速率常数推导相互作用的表观亲合常数。
表38：两种16D5热点变体作为IgG对人，鼠和食蟹猴FolR1的二价结合(亲合力及表观KD)(对muFolR1没有结合，正如预期的)。
Figure GDA0002732657150001341
2.对叶酸受体1的亲和力
如下文所述测定抗FolR1 IgG或T细胞双特异性和重组叶酸受体之间的相互作用的亲和力(表39)。
为了亲和力测量，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)于pH 5.0在CM5芯片上实施10000个共振单位(RU)左右的抗人Fab特异性抗体(Fab捕捉试剂盒，GE Healthcare)的直接偶联。以20nM及流速10μl/min捕捉抗FolR1IgG或T细胞双特异性达40秒，留下参照流动室没有捕捉。使人和食蟹猴叶酸受体1Fc融合物的稀释系列(12.35至3000nM)以30μl/min通过所有流动室达240秒以记录结合期。解离期监测300秒并通过自样品溶液转换至HBS-EP来触发。在每一个循环之后使用两次注射60秒10mM甘氨酸-HCl pH 1.5来再生芯片表面。通过扣除在参照流动室1上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractive index)差异。通过使用Bia评估软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合自速率常数推导相互作用的亲和常数。
表39：两种16D5热点变体作为IgG对人和食蟹猴FolR1的单价结合(亲和力)。
Figure GDA0002732657150001342
两种16D5热点变体具有与野生型16D5结合物相似的亲合力(二价结合)。D52dQ变体的亲合力略微降低，而且这种差异在亲和力(单价结合)中甚至更加明显。
实施例43
16D5结合物的具有重和轻链中降低对FolR1的亲和力的突变的12种变体作为IgG的生成和纯化
瞬时转染和生成
如下文所述对于所需载体使用PEI介导的转染规程在HEK293 EBNA细胞中瞬时生成12种IgG。在CD CHO培养基中悬浮无血清培养HEK293 EBNA细胞。对于500ml摇瓶中的生成，在转染之前24小时接种400x106个HEK293EBNA细胞(对于备选规模，相应调节所有量)。为了转染，将细胞以210x g离心5分钟，用预温热的20ml CD CHO培养基替换上清液。在20mlCD CHO培养基中混合表达载体至最终量200μg DNA。在添加540μl PEI溶液之后，漩涡震荡15秒，随后于室温温育10分钟。之后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶，并在具有5％CO2气氛的温箱中于37℃温育3小时。在温育时间之后，添加160ml F17培养基，并将细胞培养24小时。转染后1天，添加1mM丙戊酸并添加7％补料1。7天后，收集培养上清液，用于通过以210x g离心15分钟来纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，以终浓度0.01％w/v添加叠氮化钠，并保存于4℃。在生成之后，收获上清液，将含有抗体的上清液过滤通过0.22μm无菌滤器并保存于4℃直至纯化。
抗体纯化
使用标准规程以两个步骤纯化所有分子，诸如蛋白A亲和纯化
Figure GDA0002732657150001351
Explorer)和大小排阻层析。将自瞬时生成获得的上清液调节至pH 8.0(使用2M TRIS pH 8.0)，并应用于用8个柱体积(cv)的缓冲液A(20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH 7.5)平衡的POROS单抗捕捉A(Applied Biosystems，柱体积(cv)＝1ml)。在用10cv的缓冲液A清洗之后，使用5cv上变成缓冲液B(20mM柠檬酸钠pH 3.0，100mM NaCl，100mM甘氨酸)的pH梯度洗脱蛋白质。将含有感兴趣蛋白质的5ml保存在
Figure GDA0002732657150001352
Explorer上的回路中，随后应用于用20mM组氨酸，pH 6.0，140mM NaCl，0.01％Tween-20平衡的HiLoad16/60SuperdexTM 200(GE Healthcare)。合并含有IgG的级分，并使用超浓缩器(Amicon Ultra-15，30.000MWCO，Millipore)浓缩。通过分析性大小排阻层析分析最终合并液的聚集体含量。因此，于25℃将30μl每份级分应用于在25mM K2HPO4，125mM NaCl，200mM L-精氨酸单氢氯化物，0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7运行缓冲液中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)。通过测量280nm处的光密度(OD)，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来测定蛋白质浓度。通过在还原剂存在和缺失下的SDS毛细管电泳(CE-SDS)遵循制造商的说明书(instrument Caliper LabChipGX，Perkin Elmer)分析构建体的纯度和分子量。将经过纯化的蛋白质保存于4℃。
表40：12种16D5 IgG变体的产量，单体含量和纯度，通过CE-SDS
克隆 突变HC/LC 产量[mg/L] 单体[％] CE-SDS纯度[％]
16D5 W98Y/wt 32 100 100
16D5 W98Y/K53A 24 100 100
16D5 S35H/wt 21 100 100
16D5 S35H/K53A 18 100 100
16D5 S35H/S93A 18 100 100
16D5 W96Y/wt 40 100 100
16D5 W96Y/K53A 21 100 100
16D5 W96Y/S93A 25 98 100
16D5 R50S/K53A 10 98 100
16D5 R50S/S93A 7 100 100
16D5 G49S/K53A 42 100 100
16D5 G49S/S93A 45 100 100
所有12种IgG均较好地且以较好的质量生成。
实施例44
通过表面等离振子共振对16D5重和轻链组合变体作为IgG的生化表征
通过表面等离振子共振(SPR)评估FolR1 16D5重和轻链组合变体结合物作为IgG对不同重组叶酸受体(人，鼠和食蟹猴FolR1；均作为Fc融合物)的结合。于25℃在BiacoreT200上实施所有SPR实验，以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)。
对叶酸受体1的亲合力
如下文所述测定抗FolR1 IgG或T细胞双特异性和重组叶酸受体之间的相互作用的亲合力(表41)。
使用标准偶联指令(Biacore，Freiburg/Germany)直接在SA芯片上偶联人，食蟹猴和鼠叶酸受体1的重组生物素化单体Fc融合物(FolR1-Fc)。固定化水平为约300。使抗FolR1IgG或T细胞双特异性以11.1至900nM的浓度范围以30μL/min的流速通过流动室达180秒。监测解离达240或600秒。通过扣除在用重组生物素化鼠IL2受体Fc融合物固定化的参照流动室上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractive index)差异。自IgG或T细胞双特异性的二价结合产生的结合曲线近似1:1Langmuir结合(尽管它是1:2结合)，并用该模型拟合以得到代表二价结合的亲合力的表观KD。使用Bia评估软件(GE Healthcare)自拟合的速率常数推导相互作用的表观亲合常数。对于结合和解离期太快以至于不能通过1:1Langmuir结合模型来拟合的低亲和力动力学，使用Bia评估软件(GE Healthcare)应用稳态分析模型。稳态分析给出平衡时结合反应的KD。
表41：12种16D5变体结合物作为IgG对人，鼠和食蟹猴FolR1的二价结合(亲合力及表观KD)。
Figure GDA0002732657150001371
Figure GDA0002732657150001381
对叶酸受体1的亲和力
如下文所述测定抗FolR1 IgG或T细胞双特异性和重组叶酸受体之间的相互作用的亲和力(表42)。
为了亲和力测量，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)于pH 5.0在CM5芯片上实施10000个共振单位(RU)左右的抗人Fab特异性抗体(Fab捕捉试剂盒，GE Healthcare)的直接偶联。以200nM及流速10μl/min捕捉抗FolR1IgG或T细胞双特异性达40秒，留下参照流动室没有捕捉。使人叶酸受体1Fc融合物的稀释系列(12.35至3000nM)以30μl/min通过所有流动室达240秒以记录结合期。解离期监测300秒并通过自样品溶液转换至HBS-EP来触发。在每一个循环之后使用两次注射60秒10mM甘氨酸-HCl pH 1.5来再生芯片表面。通过扣除在参照流动室1上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractive index)差异。通过使用Bia评估软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合自速率常数推导相互作用的亲和力常数。
表42：12种16D5变体FolR1结合物作为IgG对人，食蟹猴和鼠FolR1的单价结合(亲和力)。
Figure GDA0002732657150001382
Figure GDA0002732657150001391
通过表面等离振子共振分析16D5 FolR1结合物的12种“亲和力降低的”变体，与16D5野生型结合物和36F2结合物比较。目的是找到一种具有与36F2相当的亲和力和亲合力的16D5变体。在测量单价结合(亲和力)时，有亲和力比36F2高的变体和亲和力比36F2低的变体。然而，在二价结合(亲合力)方面，所有变体具有比36F2高的表观KD值。这主要是由于36F2的结合速率(ka)较快，这导致36F2的表观KD较小。36F2二价结合时较大的亲合效应看来是这种结合物独特的。如上所述，36F2是能鉴定到的唯一人，鼠和食蟹猴交叉反应性结合物。
实施例45
16D5 HC/LC变体对人Hela细胞上表达的FolR1的结合
在Hela细胞上评估36F2 TCB，16D5 TCB和16D5的多种HC/LC变体对人FolR1的结合。简言之，收获细胞，计数，检查存活力，并以2x106个细胞/ml在FACS缓冲液(100μl PBS0.1％BSA)中重悬浮。将100μl细胞悬浮液(含有0.2x106个细胞)与不同浓度的双特异性抗体(229pM-500nM)一起在圆底96孔板中于4℃温育30分钟。在两个冷的PBS 0.1％BSA清洗步骤之后，将样品与PE缀合的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcg片段特异性二抗(Jackson Immuno Research Lab PE#109-116-170)一起于4℃再温育另30分钟。在用冷的PBS 0.1％BSA清洗样品两次之后，将它们用1％PFA固定过夜。之后，将样品离心，在PBS0.1％BSA中重悬浮，并使用FACS CantoII(Software FACS Diva)通过FACS分析。使用GraphPadPrism6获得结合曲线(图32A-E)。结合FolR2的36F2 TCB没有在小鼠中得到较好耐受，而且没有展现期望的功效。
实施例46
16D5 T细胞双特异性的具有降低对人和食蟹猴FolR1的亲和力的突变的四种变体的生成和纯化：16D5 TCB G49S/S93A，G49S/K53A，W96Y，W96Y/D52E
瞬时转染和生成
如下文所述对于所需载体使用PEI介导的转染规程在HEK293 EBNA细胞中瞬时生成16D5 TCB的具有降低的对FolR1的亲和力的另外四种变体。为了转染，在含有6mM L-谷氨酰胺和250mg/l G418培养基的Excell培养基中悬浮无血清培养HEK293 EBNA细胞。对于600ml tubespin烧瓶(最大工作体积400mL)中的生成，在转染之前24小时接种600x106个HEK293 EBNA细胞。为了转染，将细胞以210x g离心5分钟，用预温热的20ml CD CHO培养基替换上清液。在20ml CD CHO培养基中混合表达载体至最终量400μg DNA。在添加1080μlPEI溶液(2.7μg/ml)之后，漩涡震荡15秒，随后于室温温育10分钟。之后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至600ml tubespin烧瓶，并在具有5％CO2气氛的温箱中于37℃温育3小时。在温育时间之后，添加360ml Excell+6mM L-谷氨酰胺+5g/L Pepsoy+1.0mM VPA培养基，并将细胞培养24小时。转染后1天，添加7％补料7。7天后，收集培养上清液，用于通过以3600xg离心(Sigma 8K离心机)20-30分钟来纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，以终浓度0.01％w/v添加叠氮化钠，并保存于4℃。
纯化
使用标准规程以两个步骤纯化降低的亲和力变体16D5 TCB，诸如蛋白A亲和纯化
Figure GDA0002732657150001401
Explorer)和大小排阻层析。将自瞬时生成获得的上清液调节至pH 8.0(使用2MTRIS pH 8.0)，并应用于用8个柱体积(cv)的缓冲液A(20mM磷酸钠pH 7.5，20mM柠檬酸钠)平衡的HiTrap蛋白A(GE Healthcare，柱体积(cv)＝5ml)。在用10cv的缓冲液A清洗之后，使用20cv上变成缓冲液B(20mM柠檬酸钠pH 3.0，100mM NaCl，100mM甘氨酸)的pH梯度洗脱蛋白质。合并含有感兴趣蛋白质的级分，并温和地将溶液的pH调节至pH 6.0(使用0.5MNa2HPO4 pH 8.0)。使用超浓缩器(Amicon Ultra-15，30.000MWCO，Millipore)将样品浓缩至1ml，随后应用于用20mM组氨酸，pH 6.0，140mM NaCl，0.01％Tween 20平衡的HiLoadTM 16/60SuperdexTM 200制备级(GE Healthcare)。通过分析性大小排阻层析分析洗脱级分的聚集体含量。因此，于25℃将30μl每份级分应用于在25mM K2HPO4，125mM NaCl，200mM L-精氨酸单氢氯化物，0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7运行缓冲液中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)。合并含有少于2％寡聚物的级分。通过测量280nm处的光密度(OD)，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来测定蛋白质浓度。通过在还原剂存在和缺失下的SDS毛细管电泳(CE-SDS)遵循制造商的说明书(instrument Caliper LabChipGX，PerkinElmer)分析构建体的纯度和分子量。在液氮中冷冻经过纯化的蛋白质，并保存于-80℃。
表43：T细胞双特异性型式的降低的亲和力16D5变体的产量，单体含量和纯度，通过CE-SDS。
名称 降低亲和力的突变 产量[mg/L] 单体[％] CE-SDS纯度[％]
16D5 TCB G49S S93A 10.3 100 88
16D5 TCB G49S K53A 22.3 98.5 96
16D5 TCB W96Y 15.2 98.7 92.5
16D5 TCB W96Y D52E 9.9 99.3 92.9
16D5 TCB 野生型 5.4 96 91.6
所有具有降低的亲和力的变体能以较好的质量生成。
实施例47
36F2 TCB，16D5 TCB和两种16D5亲和力降低的变体16D5 W96Y/D52E TCB和16D5G49S/S93A TCB对人Hela细胞上表达的FolR1的结合
在Hela细胞上评估36F2 TCB，16D5 TCB和两种16D5亲和力降低的变体16D5 W96Y/D52E TCB和16D5 G49S/S93A TCB对人FolR1的结合。简言之，收获细胞，计数，检查存活力，并以2x106个细胞/ml在FACS缓冲液(100μl PBS0.1％BSA)中重悬浮。将100μl细胞悬浮液(含有0.2x106个细胞)与不同浓度的双特异性抗体(30pM-500nM)一起在圆底96孔板中于4℃温育30分钟。在两个冷的PBS 0.1％BSA清洗步骤之后，将样品与FITC缀合的AffiniPureF(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcg片段特异性二抗(Jackson Immuno Research Lab PE#109-096-098)一起于4℃再温育另30分钟。在用冷的PBS 0.1％BSA清洗样品两次之后，将样品离心，在PBS 0.1％BSA中重悬浮，并使用FACS CantoII(Software FACS Diva)通过FACS分析。使用GraphPadPrism6获得结合曲线(图33)。
实施例48
三种对人和食蟹猴FolR1具有中等亲和力的T细胞双特异性的生成和纯化：14B1，6E10，2C7
瞬时转染和生成
如下文所述对于所需载体使用PEI介导的转染规程在HEK293 EBNA细胞中瞬时生成中等亲和力TCB。为了转染，在含有6mM L-谷氨酰胺和250mg/l G418培养基的Excell培养基中悬浮无血清培养HEK293 EBNA细胞。对于600ml tubespin烧瓶(最大工作体积400mL)中的生成，在转染之前24小时接种600x106个HEK293 EBNA细胞。为了转染，将细胞以210x g离心5分钟，用预温热的20ml CD CHO培养基替换上清液。在20ml CD CHO培养基中混合表达载体至最终量400μg DNA。在添加1080μl PEI溶液(2.7μg/ml)之后，漩涡震荡15秒，随后于室温温育10分钟。之后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至600ml tubespin烧瓶，并在具有5％CO2气氛的温箱中于37℃温育3小时。在温育时间之后，添加360ml Excell+6mM L-谷氨酰胺+5g/L Pepsoy+1.0mM VPA培养基，并将细胞培养24小时。转染后1天，添加7％补料7。7天后，收集培养上清液，用于通过以3600x g离心(Sigma 8K离心机)20-30分钟来纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，以终浓度0.01％w/v添加叠氮化钠，并保存于4℃。
纯化
使用标准规程以两个步骤纯化中等亲和力TCB，诸如蛋白A亲和纯化
Figure GDA0002732657150001421
Explorer)和大小排阻层析。将自瞬时生成获得的上清液调节至pH 8.0(使用2M TRIS pH8.0)，并应用于用8个柱体积(cv)的缓冲液A(20mM磷酸钠pH 7.5，20mM柠檬酸钠)平衡的HiTrap蛋白A(GE Healthcare，柱体积(cv)＝5ml)。在用10cv的缓冲液A清洗之后，使用20cv上变成缓冲液B(20mM柠檬酸钠pH 3.0，100mM NaCl，100mM甘氨酸)的pH梯度洗脱蛋白质。合并含有感兴趣蛋白质的级分，并温和地将溶液的pH调节至pH 6.0(使用0.5M Na2HPO4 pH8.0)。使用超浓缩器(Amicon Ultra-15，30.000MWCO，Millipore)将样品浓缩至1ml，随后应用于用20mM组氨酸，pH 6.0，140mM NaCl，0.01％Tween 20平衡的HiLoadTM 16/60SuperdexTM 200制备级(GE Healthcare)。通过分析性大小排阻层析分析洗脱级分的聚集体含量。因此，于25℃将30μl每份级分应用于在25mM K2HPO4，125mM NaCl，200mM L-精氨酸单氢氯化物，0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7运行缓冲液中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)。合并含有少于2％寡聚物的级分。通过测量280nm处的光密度(OD)，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来测定蛋白质浓度。通过在还原剂存在和缺失下的SDS毛细管电泳(CE-SDS)遵循制造商的说明书(instrument Caliper LabChipGX，PerkinElmer)分析构建体的纯度和分子量。在液氮中冷冻经过纯化的蛋白质，并保存于-80℃。
表44：中等亲和力TCB的产量，单体含量和纯度，通过CE-SDS。
名称 产量[mg/L] 单体[％] CE-SDS纯度[％]
6E10 TCB 2.3 93 95
14B1 TCB 1.8 94 70
9C7 TCB 3.4 98 99
能生成所有中等亲和力T细胞双特异性。产量不高。9C7的质量较好，而14B1和6E10的质量可接受。
实施例49
16D5 HC/LC变体对人HT-29细胞上表达的FolR1的结合
在HT-29细胞上评估36F2 TCB，16D5 TCB和16D5的多种HC/LC变体(图34A-E)对人FolR1的结合。简言之，收获细胞，计数，检查存活力，并以2x106个细胞/ml在FACS缓冲液(100μl PBS 0.1％BSA)中重悬浮。将100μl细胞悬浮液(含有0.2x106个细胞)与不同浓度的双特异性抗体(229pM-500nM)一起在圆底96孔板中于4℃温育30分钟。在两个冷的PBS0.1％BSA清洗步骤之后，将样品与PE缀合的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcg片段特异性二抗(Jackson Immuno Research Lab PE#109-116-170)一起于4℃再温育另30分钟。在用冷的PBS 0.1％BSA清洗样品两次之后，将它们用1％PFA固定过夜。之后，将样品离心，在PBS 0.1％BSA中重悬浮，并使用FACS CantoII(Software FACS Diva)通过FACS分析。使用GraphPadPrism6获得结合曲线(图34A-E)。
实施例50
中等FolR1结合物对人和小鼠FolR1和FolR2的结合
在FACS结合测定法中在经过转染的HEK293T细胞上评估中等FolR1结合物(6E10TCB，14B1 TCB和9C7 TCB)，以及16D5 TCB和36F2 TCB对人和小鼠FolR1和FolR2的交叉反应性。
简言之，收获细胞，计数，检查存活力，并以2x106个细胞/ml在FACS缓冲液(100μlPBS 0.1％BSA)中重悬浮。将100μl细胞悬浮液(含有0.2x106个细胞)与100nM双特异性抗体一起在圆底96孔板中于4℃温育30分钟。在两个冷的PBS 0.1％BSA清洗步骤之后，将样品与荧光素(FITC)AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性二抗(JacksonImmuno Research Lab PE#109-096-098)一起于4℃再温育另30分钟。在用冷的PBS 0.1％BSA清洗样品两次之后，将它们用1％PFA固定过夜。之后，将样品离心，在PBS 0.1％BSA中重悬浮，并使用FACS CantoII(Software FACS Diva)通过FACS分析。使用GraphPadPrism6获得图(图35A-D)。
结果显示36F2 TCB和14B1 TCB对小鼠FolR1和人和小鼠FolR2有交叉反应性。对于6E10 TCB，能观察到对人FolR2的弱结合。16D5 TCB和9C7 TCB对人FolR1特异性，而且显示对小鼠FolR1或人和小鼠FolR2没有交叉反应性。
实施例51
通过表面等离振子共振对T细胞双特异性型式的16D5降低的亲和力变体和另外的中等亲和力结合物的生化表征
通过表面等离振子共振(SPR)评估二价T细胞双特异性型式的抗FolR116D5降低的亲和力变体和另外的中等亲和力结合物对重组人，食蟹猴和鼠叶酸受体1(均作为Fc融合物)的结合。于25℃在Biacore T200上实施所有SPR实验，以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01MHEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20，Biacore，GE Healthcare)。表45中描述用于亲和力和亲合力测定的分子。
表45：SPR分析中使用的9种构建体的名称，描述和图参照。
Figure GDA0002732657150001441
Figure GDA0002732657150001451
单次注射
首先通过单次注射分析抗FolR1 TCB(表46)以表征它们的交叉反应性(对人，鼠和食蟹猴FolR1)和特异性(对人FolR1，人FolR2，人FolR3)。使用标准偶联指令(Biacore，Freiburg/Germany)直接在SA芯片上偶联人，食蟹猴和鼠叶酸受体1(FolR1-Fc)或人叶酸受体2和3(FolR2-Fc，FolR3-Fc)的重组生物素化单体Fc融合物。固定化水平为约300-400RU。以500nM的浓度注射TCB达60秒。
表46：7种叶酸受体1T细胞双特异性的交叉反应性和特异性。+表示结合，-表示无结合，+/-表示弱结合。
Figure GDA0002732657150001452
对叶酸受体1的亲合力
如下文所述测定抗FolR1 T细胞双特异性和重组叶酸受体之间的相互作用的亲合力(表47)。
使用标准偶联指令(Biacore，GE Healthcare)直接在SA芯片上偶联人，食蟹猴和鼠叶酸受体1的重组生物素化单体Fc融合物(FolR1-Fc)。固定化水平为约200-300RU。使抗FolR1 T细胞双特异性以11.1至900nM(对于16D5降低的亲和力变体)或0.2至500nM(对于另外的中等亲和力结合物和36F2)的浓度范围以30μL/min的流速通过流动室达180秒。监测解离达240或600秒。在每个循环之后使用两次注射10mM甘氨酸-HCl pH 1.5达30秒来再生芯片表面。通过扣除在用重组生物素化鼠IL2R Fc融合物(无关Fc融合的受体)固定化的参照流动室上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractive index)差异。自T细胞双特异性的二价结合产生的结合曲线近似1:1Langmuir结合(尽管它是1:2结合)，并用该模型拟合以得到代表二价结合的亲合力的表观KD。使用Bia评估软件(GE Healthcare)自拟合的速率常数推导相互作用的表观亲合常数。
表47：抗FolR1 T细胞双特异性(TCB)的人，食蟹猴和鼠FolR1的二价结合(亲合力及表观KD)。
Figure GDA0002732657150001461
3.对叶酸受体1的亲和力
如下文所述测定抗FolR1 T细胞双特异性和重组叶酸受体之间的相互作用的亲和力(表48)。
为了亲和力测量，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)于pH 5.0在CM5芯片上实施12000个共振单位(RU)左右的抗人Fab特异性抗体(Fab捕捉试剂盒，GE Healthcare)的直接偶联。以20nM及流速10μl/min捕捉抗FolR1 T细胞双特异性达40秒，留下参照流动室没有捕捉。使人，食蟹猴或鼠叶酸受体1Fc融合物的稀释系列(12.3至3000nM)以30μl/min通过所有流动室达240秒以记录结合期。解离期监测300秒并通过自样品溶液转换至HBS-EP来触发。在每一个循环之后使用两次注射60秒10mM甘氨酸-HCl pH 2.1来再生芯片表面。通过扣除在参照流动室1上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractive index)差异。通过使用Bia评估软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合自速率常数推导相互作用的亲和常数。对于结合和解离期太快以至于不能通过1:1Langmuir结合模型来拟合的低亲和力动力学，使用Bia评估软件(GE Healthcare)应用稳态分析模型。稳态分析给出平衡时结合反应的KD。
表48：抗FolR1 T细胞双特异性(TCB)对人，食蟹猴和鼠FolR1的单价结合(亲和力)。
Figure GDA0002732657150001471
Figure GDA0002732657150001481
引入16D5结合物的突变降低它对人和食蟹猴FolR1的亲和力，如通过表面等离振子共振测定的。亲和力降低的排序为16D5 WT(57nM)>W96Y(低6.5倍)>G49S/S93A(低14.5倍)>W96Y/D52E(低24.5倍)>G49S/K53A(低30倍)。在亲合力值中可见相同的排序，然而倍数差异更小，16D5 WT(3nM)>W96Y，G49S/S93A，W96Y/D52E(低3倍)>G49S/K53A(低13倍)。
中等亲和力结合物具有下述亲和力排序：16D5(57nM)>14B1(低8.5倍)>9C7(低15倍)>6E10(低21倍)>36F2(低24.5倍)。然而，这些差异在亲合力测量中消失：14B1，9C7，6E10(1nM)>16D5(3nM)>36F2(7nM)。
16D5 W96Y/D52E TCB解决了对先前的候选物观察到的问题。16D5W96Y/D52E TCB基于共同轻链16D5结合物且相对于亲本16D5结合物具有重链上的两处点突变。W96Y突变与亲本结合物相比降低结合物对FolR1的亲和力，而D52E突变去除脱酰胺位点且也有助于降低亲和力。16D5W96Y/D52E TCB结合人和食蟹猴FolR1，但不结合鼠FolR1。它对FolR1特异性且不结合重组人FolR2或人FolR3。16D5 W96Y/D52E对于人FolR1的亲和力(单价结合)为1.4μM左右(比亲本16D5结合物低24.5倍)，而且亲合力(二价结合)为10nM左右(比亲本16D5结合物低3倍)。
实施例52
由中等FolR1 TCB诱导的对Hela，SKov-3和HT-29细胞的T细胞杀伤
在Hela(高FolR1)，SKov-3(中等FolR1)和HT-29(低FolR1)细胞上评估由中等FolR1结合物(6E10 TCB,14B1 TCB和9C7 TCB)介导的T细胞杀伤。包括16D5 TCB和36F2 TCB作为基准。使用人PBMC作为效应器，并在与双特异性抗体一起温育24小时和48小时时检测杀伤。简言之，用胰蛋白酶/EDTA收获靶细胞，清洗，并以密度25,000个细胞/孔铺于平底96孔板中。让细胞贴壁过夜。通过将自健康人供体获得的富集淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)进行Histopaque密度离心来制备外周血单个核细胞(PBMC)。用无菌PBS稀释新鲜血液并在Histopaque梯度(Sigma,#H8889)上铺层。离心(450xg，30分钟，室温)后，丢弃含PBMC的界面上方的血浆并将PBMC转移至新的falcon管，随后装满50ml PBS。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液，用无菌PBS清洗PBMC团粒两次(离心步骤350xg，10分钟)。对所得PBMC群进行自动计数(ViCell)并在含10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom,K0302)的RPMI1640培养基中在细胞温箱(37℃,5％CO2)中保存直至进一步使用(不超过24小时)。对于杀伤测定法，以标示浓度添加抗体(范围0.01pM至10nM，一式三份)。以最终E:T比率10:1将PBMC添加至靶细胞。于37℃,5％CO2温育24小时和48小时后通过对由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液中的LDH进行定量(LDH检测试剂盒,Roche Applied Science,#11644 793 001)来评估靶细胞杀伤。对靶细胞的最大裂解(＝100％)通过将靶细胞与1％Triton X-100一起温育来实现。最小裂解(＝0％)指在没有双特异性构建体的情况下与效应细胞一起共温育的靶细胞。
结果显示由中等FolR1结合物(6E10 TCB，14B1 TCB和9C7 TCB)诱导的肿瘤裂解的范围在高亲和力16D5 TCB所获得的和低亲和力36F2 TCB所获得的之间(图36A-F)。在中等FolR1结合物之中，14B1 TCB显示最强的杀伤，如在温育48小时之后能看到的(图36D-F)。表49和表50中给出使用GraphPadPrism6计算的在温育24小时和48小时之后与杀伤测定法有关的EC50值。
表49：在温育24小时之后由中等FolR1 TCB诱导的T细胞介导的Hela，SKov-3和HT-29细胞杀伤的EC50值(pM)。
Figure GDA0002732657150001491
Figure GDA0002732657150001501
*未测定
表50：在温育48小时之后由中等FolR1 TCB诱导的T细胞介导的Hela，SKov-3和HT-29细胞杀伤的EC50值(pM)。
Figure GDA0002732657150001502
*未测定
实施例53
由亲和力降低的16D5变体诱导的对Hela，SKov-3和HT-29细胞的T细胞杀伤
在Hela(高FolR1)，SKov-3(中等FolR1)和HT-29(低FolR1)细胞上评估由亲和力降低的16D5变体(16D5-G49S/S93A TCB，16D5-G49S/K53A TCB，16D5 W96Y TCB，16D5 W96Y/D52E TCB)介导的T细胞杀伤。包括16D5 TCB和36F2 TCB作为基准。如上文(实施例52)所述实施测定法。
结果显示由亲和力降低的16D5变体(16D5-G49S/S93A TCB，16D5-G49S/K53A TCB，16D5 W96Y TCB，16D5 W96Y/D52E TCB)诱导的肿瘤裂解的范围介于高亲和力16D5 TCB所获得的和低亲和力36F2 TCB所获得的之间。表51和表52中给出使用GraphPadPrism6计算的在温育24小时和48小时之后与杀伤测定法有关的EC50值(图37A-F)。
表51：在温育24小时之后由16D5 TCB及其亲和力降低的变体诱导的T细胞介导的FolR1表达性Hela，SKov-3和HT-29细胞杀伤的EC50值(pM)。
Figure GDA0002732657150001511
*未测定
表52：在温育48小时之后由16D5 TCB及其亲和力降低的变体诱导的T细胞介导的FolR1表达性Hela，SKov-3和HT-29细胞杀伤的EC50值(pM)。
Figure GDA0002732657150001512
*未测定
如此，正如上文就36F2 FolR1 TCB描述的，16D5 W96Y/D52E TCB在高和低表达细胞之间有区别，这对于降低毒性有特殊的重要性，因为一些正常，非肿瘤组织的细胞表达很低水平的FolR1(大约少于1000个拷贝/细胞)。与这项观察结果一致，下文实施例54中讨论的结果显示16D5 W96Y/D52E TCB诱导与亲本16D5 TCB相比水平低得多的T细胞介导的对原代细胞的杀伤(图38A-F)。照此，16D5 W96Y/D52E TCB介导有力的对具有高或中等FolR1表达的肿瘤组织的杀伤，但是对具有低表达的正常组织不然。二价2+1型式的16D5 W96Y/D52ETCB包含具有相对低亲和力的FolR1结合模块，但是它拥有亲合效应，这容许高和低FolR1表达性细胞之间的分化。因为肿瘤细胞以高或中等水平表达FolR1，所以这种TCB选择性结合肿瘤细胞且不结合以低水平或根本不表达FolR1的正常，非癌细胞。作为胜过上文所述36F2FolR1TCB的另一项优点，16D5 W96Y/D52E TCB特异性结合FolR1且不结合FolR2或FolR3，进一步增强它对于体内治疗的安全性。
在上述有利特征以外，二价2+1倒转型式的16D5 W96Y/D52E TCB还具有它不需要化学交联或其它杂合办法的优点。这使得它适合于制造用于治疗患者，例如具有FolR1阳性癌性肿瘤的患者的药物。二价2+1倒转型式的16D5W96Y/D52E TCB可使用标准CHO工艺来生产，具有低聚集体。而且，二价2+1型式的16D5 W96Y/D52E TCB包含人和人源化序列，这使得它优于采用当施用于人时高度免疫原性的大鼠和鼠多肽的分子。另外，改造二价2+1型式的16D5 W96Y/D52E TCB以消除FcgR结合，而且因此不引起FcgR交联和融合反应，进一步增强它在施用于患者时的安全性。
正如上文所述结果证明的，它的头至尾几何学使得二价2+1倒转型式的16D5W96Y/D52E TCB成为高度有力诱导绝对靶细胞杀伤的分子。它的二价性增强亲合力和效力，而且还容许高和低表达细胞之间的区分。因其亲合效应所致它对高或中等靶物表达性细胞的偏爱降低源自T细胞介导的对以低水平表达FolR1的正常细胞的杀伤的毒性。
二价2+1型式的16D5 W96Y/D52E TCB和本文中公开的其它实施方案的另一项优点在于它们的临床开发不需要使用替代分子，因为它们结合人和食蟹猴FolR1。照此，本文中公开的分子与先前描述的针对FolR1的抗体(它们并非识别来自这两个物种的FolR1)识别不同的表位(还可见图41)。
实施例54
由亲和力降低的16D5变体和中等FolR1 TCB诱导的对原代细胞的T细胞杀伤
在原代细胞(人肾皮质上皮细胞(HRCEpiC)(ScienCell Research Laboratories；产品目录号4110)和人视网膜色素上皮细胞(HRPEpiC)(ScienCell ResearchLaboratories；产品目录号6540))上评估由亲和力降低的16D5变体(16D5-G49S/S93A TCB，16D5 W96Y/D52E TCB)和中等FolR1结合物14B1 TCB介导的T细胞杀伤。包括HT-29细胞(低FolR1)作为对照细胞系。包括16D5 TCB和36F2 TCB作为基准，而DP47 TCB充当非结合对照。
如实施例52中所述实施测定法，抗体的浓度范围为0.1pM–100nM(一式三份)。
当使用人原代细胞作为靶时，总体裂解因这些细胞上FolR1的更低的表达速率而低得多(图38A-F)。对于高亲和力FolR1结合16D5 TCB，在所使用的两种原代细胞类型上均能观察到T细胞介导的裂解。正如先前当使用肿瘤细胞系作为靶时所观察到的，由中等FolR1结合物14B1 TCB和亲和力降低的16D5变体(16D5-G49S/S93A TCB，16D5 W96Y/D52ETCB)诱导的裂解的范围介于高亲和力16D5 TCB所获得的和低亲和力36F2 TCB所获得的之间。以低水平表达FolR1的细胞的显著降低的裂解与较低的脱靶活性一致，如此，预期亲和力降低的16D5变体16D5-G49S/S93A TCB和16D5 W96Y/D52E TCB在体内耐受较好。
实施例55
FolR1 TCB构建体在雌性NOG小鼠中的单剂PK
依照承诺的指导方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小时光亮/12小时黑暗的日周期在无特定病原体的条件下维持实验开始时平均8-10周龄的雌性NOD/Shi-scid/IL-2Rγ缺无(NOG)小鼠(购自Taconic，SOPF facility)。实验研究方案得到地方政府的审查和批准(ZH193/2014)。在到达之后，将动物维持一周以适应新环境和进行观察。规则地进行连续健康监测。
实施单剂药动学研究(SDPK)以评价FolR1 TCB构建体(36F2，16D5，16D5G49S/S93A和16D5 W96Y/D52E)的暴露。对NOG小鼠施用静脉内推注施用0.5mg/kg，并在选定时间点采集血液样品用于药动学评价。通过ELISA分析小鼠血清样品。逐步将生物素化a-huCD3-CDR(mAb<ID-mAb<CD3>>M-4.25.93-IgG-Bi)，测试样品，Digoxygenin标记的a-huFc抗体(mAb<H-FC pan>M-R10Z8E9-IgG-Dig)和抗Digoxygenin检测抗体(POD)逐步添加至96孔链霉亲合素包被的微量滴定板，并在每一个步骤之后于室温温育1小时。在每个步骤之后将板清洗3次以去除未结合的物质。最后，通过添加ABTS底物溶液以形成有色反应产物来显现过氧化物酶结合的复合物。于405nm(参照波长490nm)以光度学测定的反应产物强度与血清样品中的分析物浓度成比例。构建体的标准曲线的校正范围为0.078至5ng/ml，其中1.5ng/ml是定量下限(LLOQ)。
SDPK研究揭示16D5，16D5 W96Y/D52E和16D5 G49S/S93A构建体的IgG样PK概况(图39A-B)。因此，为功效研究选择一周一次日程安排(图40B)。36F2的半衰期与其它克隆相比更短。36F2是所测试的4种分子中唯一对小鼠FolR1交叉反应性的，这可能解释了此分子更短的半衰期并指示TMDD(靶物介导的药物配置)。
实施例56
携带Hela的NOG小鼠中人PBMC转移之后FolR1 TCB构建体(16D5，16D5G49S/S93A和16D5 W96Y/D52E)的体内功效
在皮下注射入PBMC植入NOG小鼠的FolR1表达性人宫颈癌细胞系Hela中测试FolR1TCB构建体。
Hela细胞最初是自ATCC(CCL2)获得的，并在扩充之后保藏于Roche-Glycart内部细胞库。在5％CO2的水饱和气氛中于37℃在含有10％FCS(Gibco)的RPMI中例行培养肿瘤细胞系。使用第13代进行移植，存活力>95％。将1x106个细胞/动物在总共100μl RPMI细胞培养基(Gibco)中皮下注射入动物的右体侧。
依照承诺的指导方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小时光亮/12小时黑暗的日周期在无特定病原体的条件下维持60只实验开始时8-10周龄的雌性NOG小鼠(购自Taconic，Denmark)。实验研究方案得到地方政府(ZH193/2014)的审查和批准。在到达之后，将动物维持一周以适应新环境和进行观察。规则地进行连续健康监测。
依照研究方案(图40B)，在研究第0天对小鼠皮下注射1x106个Hela细胞。在研究第30天，当肿瘤达到大约150mm3的尺寸时，经由Ficoll方法分离健康供体的人PBMC，并将10x106个细胞静脉内注射入携带肿瘤的小鼠。2天后(第32天)，将小鼠随机化并平等地分配至6个处理组(n＝10)，接着是静脉内注射16D5(0.5mg/kg)，16D5 G49S/S93A(2.5或0.5mg/kg)和16D5 W96Y/D52E(2.5或0.5mg/kg)任一。一周一次对所有处理组注射总共三周。对小鼠静脉内注射200μl适宜的溶液。对媒介组中的小鼠注射PBS。为了获得正确量的TCB/200μl，在必要时用PBS稀释储备溶液。一周一次使用测径器测量肿瘤生长(图40C-E)，并如下计算肿瘤体积：
Tv:(W2/2)x L (W：宽度，L：长度)
一周一次注射FolR1 TCB构建体导致显著的肿瘤消退(图40C-E)。16D5(0.5mg/kg)和16D5 W96Y/D52E16D5(0.5mg/kg)的功效相当，而16D5G49S/S93A(0.5mg/kg)显示略微更低的效力。更高剂量2.5mg/kg 16D5W96Y/D52E16D5和16D5 G49S/S93A没有显示与0.5mg/kg剂量相比升高的功效。对于PD读出，在研究第52天处死小鼠，取出肿瘤，称重，并经由胶原酶V，Dispase II和DNA酶的酶促消化来制备单细胞悬浮液，用于后续的FACS分析。所有处理组的外植肿瘤在研究结束时显示与媒介对照肿瘤相比显著更低的肿瘤重量(图40F)。将来自肿瘤的单细胞悬浮液针对huCD45和huCD3染色，DAPI用于死细胞排除，并在BD Fortessa处分析。FACS分析揭示用16D5以及16D5 W96Y/D52E16D5处理后肿瘤组织中与媒介对照肿瘤相比统计学上更高数目的浸润CD3阳性人T细胞(图40C)。
实施例57
食蟹猴中的毒性研究
实施药动学(PK)，药效学(PD)和耐受性研究以调查单剂静脉内亲和力降低的16D5变体TCB(例如16D5-G49S/S93A TCB，16D5 W96Y/D52E TCB)在食蟹猴中的耐受性，PK和PD效果。在这项研究中，未实验食蟹猴(1只雄性和1只雌性猴/组)遵循一项剂量放大方案接受单剂静脉内亲和力降低的16D5变体TCB，包括16D5 W96Y/D52E TCB。例示性剂量水平包括0.003，0.03，和0.09mg/kg。评估标准毒性参数(临床体征，体重，血液学和临床化学)和血液中T细胞数目和激活状态的动力学和细胞因子释放的动力学。还对于28天的时段采集血液样品用于PK，用于亲和力降低的16D5变体TCB(包括16D5W96Y/D52E TCB)和抗药物抗体的测量。
例示性实施方案的氨基酸序列
1)在共同轻链型式中有用的FolR结合物，可变重链
Figure GDA0002732657150001551
Figure GDA0002732657150001561
Figure GDA0002732657150001571
2)CD3结合物，共同轻链(CLC)
Figure GDA0002732657150001572
3)CD3结合物，重链
Figure GDA0002732657150001573
4)对于crossfab型式有用的FolR结合物
Figure GDA0002732657150001574
Figure GDA0002732657150001581
Figure GDA0002732657150001591
5)在crossfab型式中有用的CD3结合物
Figure GDA0002732657150001601
6)CD3-FolR双特异性抗体2+1倒转的crossmab型式的例示性氨基酸序列
Figure GDA0002732657150001602
Figure GDA0002732657150001611
Figure GDA0002732657150001621
7)具有共同轻链的CD3-FolR双特异性抗体的例示性氨基酸序列
Figure GDA0002732657150001622
Figure GDA0002732657150001631
Figure GDA0002732657150001641
Figure GDA0002732657150001651
8)具有降低的亲和力的例示性16D5变体
a.具有降低的亲和力的例示性轻链变体
Figure GDA0002732657150001652
b.具有降低的亲和力的例示性重链变体
Figure GDA0002732657150001653
Figure GDA0002732657150001661
9)自噬菌体展示文库生成的另外的例示性实施方案(CDR标有下划线)
Figure GDA0002732657150001662
Figure GDA0002732657150001671
Figure GDA0002732657150001681
10)9D11糖位点变体：例示性实施方案的可变轻链(CDR标有下划线)
Figure GDA0002732657150001682
Figure GDA0002732657150001691
11)脱氨变体
Figure GDA0002732657150001692
Figure GDA0002732657150001701
Figure GDA0002732657150001711
12)例示性实施方案的基于Mov19的TCB(CDR标有下划线)
Figure GDA0002732657150001712
Figure GDA0002732657150001721
13)具有中等亲和力结合物的另外的FolR1 TCB(依照Kabat的CDR标有下划线)：
Figure GDA0002732657150001722
Figure GDA0002732657150001731
Figure GDA0002732657150001741
14)抗原序列
Figure GDA0002732657150001742
Figure GDA0002732657150001751
Figure GDA0002732657150001761
15)例示性实施方案的核苷酸序列
Figure GDA0002732657150001762
Figure GDA0002732657150001771
Figure GDA0002732657150001781
Figure GDA0002732657150001791
Figure GDA0002732657150001801
Figure GDA0002732657150001811
Figure GDA0002732657150001821
Figure GDA0002732657150001831
Figure GDA0002732657150001841
Figure GDA0002732657150001851
Figure GDA0002732657150001861
Figure GDA0002732657150001871
Figure GDA0002732657150001881
Figure GDA0002732657150001891
Figure GDA0002732657150001901
Figure GDA0002732657150001911
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Figure GDA0002732657150001931
Figure GDA0002732657150001932
Figure GDA0002732657150001933
Figure GDA0002732657150001941
Figure GDA0002732657150001942
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Figure GDA0002732657150001962
Figure GDA0002732657150001971
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Figure GDA0002732657150001982
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Figure GDA0002732657150002011
Figure GDA0002732657150002021
Figure GDA0002732657150002031
Figure GDA0002732657150002041
Figure GDA0002732657150002042
Figure GDA0002732657150002051
Figure GDA0002732657150002061
Figure GDA0002732657150002071
Figure GDA0002732657150002081
Figure GDA0002732657150002091
Figure GDA0002732657150002101
***
尽管为了理解清楚的目的已经通过例示和实施例较为详细地描述了前述发明，但是该描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提述明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. HOFFMANN-LA ROCHE AG）
<120> 针对FolR1和CD3的T细胞活化性双特异性抗原结合分子
<130> 32186
<140>
<141>
<150> EP14194147.6
<151> 2014-11-20
<160> 316
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 24
Pro Trp Glu Trp Ala Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 25
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Ser Arg Trp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 26
Thr Gly Trp Ser Arg Trp Gly Tyr Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 27
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Trp Ile Arg Tyr Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 28
Gly Glu Trp Ile Arg Tyr Tyr His Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Trp Tyr Arg Trp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 30
Val Gly Trp Tyr Arg Trp Gly Tyr Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 31
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 32
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 33
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 34
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 35
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 35
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 36
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 36
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 37
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 38
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 38
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 39
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 39
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 40
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 40
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys
225
<210> 41
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Val Phe Tyr Arg Ala Trp Tyr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 42
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 43
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 44
Ala Val Phe Tyr Arg Ala Trp Tyr Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Ser Pro Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 46
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 47
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 48
Gln Gln Tyr Thr Ser Pro Pro Pro Thr
1 5
<210> 49
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr His Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Phe Phe Thr Gly Phe His Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 50
Ser Phe Phe Thr Gly Phe His Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 51
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 51
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Asn Glu His
85 90 95
Tyr Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 52
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 53
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 54
Gln Gln Tyr Thr Asn Glu His Tyr Tyr Thr
1 5 10
<210> 55
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Phe Ala Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 56
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 57
Gly Asp Phe Ala Trp Leu Asp Tyr
1 5
<210> 58
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 58
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Ser Ile Met Asn Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 59
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 59
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 60
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 61
Met Gln Ala Ser Ile Met Asn Arg Thr
1 5
<210> 62
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 62
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Ser Ile Met Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 63
Met Gln Ala Ser Ile Met Ser Arg Thr
1 5
<210> 64
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 64
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Ser Ile Met Gln Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 65
Met Gln Ala Ser Ile Met Gln Arg Thr
1 5
<210> 66
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 66
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Ser Ile Met Asn Arg Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<221> 来源
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Met Gln Ala Ser Ile Met Asn Arg Ala
1 5
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<400> 68
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Ser Ile Met Asn Arg Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<220>
<221> 来源
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Met Gln Ala Ser Ile Met Asn Arg Asn
1 5
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Ile Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asn Trp Ser Pro
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<220>
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Tyr Val Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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Thr Val Ser Ser
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Ser Tyr Val Asp Met Asp Tyr
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<220>
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Ile Trp Ser Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<220>
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Gln Gln Asp Ile Trp Ser Pro Thr
1 5
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<220>
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<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 78
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Asp Ser Ser Tyr Val Glu Trp Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<220>
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Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
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<220>
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<400> 80
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<220>
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<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 81
Asp Ser Ser Tyr Val Glu Trp Tyr Ala Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 108
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 82
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Pro Thr Ser Ser Pro
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Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<220>
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Gln Gln Pro Thr Ser Ser Pro Ile Thr
1 5
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<220>
<221> 来源
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<400> 84
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 85
<211> 103
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 85
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<400> 86
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
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Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
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Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
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Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
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Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
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Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
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Val Glu Pro Lys Ser Cys
210
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 87
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
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Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
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Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
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Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 88
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 88
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
1 5 10 15
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
20 25 30
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
35 40 45
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
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Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
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Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
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Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 89
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
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Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
275 280 285
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
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Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
305 310 315 320
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
325 330 335
Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
405 410 415
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
420 425 430
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
435 440 445
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
450 455 460
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
465 470 475 480
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
485 490 495
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
500 505 510
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
515 520 525
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
530 535 540
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
580 585 590
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Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
610 615 620
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
660 665 670
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680 685
Lys
<210> 90
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 90
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 91
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 91
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
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Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
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165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
225 230 235 240
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
245 250 255
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp
260 265 270
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
275 280 285
Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro
290 295 300
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu
305 310 315 320
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
325 330 335
Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
370 375 380
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
385 390 395 400
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
405 410 415
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
420 425 430
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
435 440 445
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
450 455 460
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
465 470 475 480
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
485 490 495
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
500 505 510
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
515 520 525
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
530 535 540
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
545 550 555 560
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
565 570 575
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
580 585 590
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
595 600 605
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
610 615 620
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
625 630 635 640
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
645 650 655
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
660 665 670
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680 685
Lys
<210> 92
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 92
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 93
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 93
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 94
<211> 690
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 94
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Phe Ala Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
245 250 255
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
260 265 270
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn
275 280 285
Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
290 295 300
Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
305 310 315 320
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly
325 330 335
Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
340 345 350
Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
355 360 365
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
370 375 380
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
385 390 395 400
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
405 410 415
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
420 425 430
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
435 440 445
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp
450 455 460
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
465 470 475 480
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
485 490 495
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
500 505 510
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
515 520 525
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
530 535 540
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
545 550 555 560
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
565 570 575
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
580 585 590
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
595 600 605
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
610 615 620
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
625 630 635 640
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
645 650 655
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
660 665 670
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
675 680 685
Gly Lys
690
<210> 95
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 95
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Phe Ala Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 96
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 96
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Ser Ile Met Asn Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 97
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的
polynucleotide"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (603)..(603)
<223> a, c, t, g, 未知 或 其它
<400> 97
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatacca acgaacatta ttatacgttc 300
ggccagggga ccaaagtgga aatcaaacgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 360
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600
canggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 648
<210> 98
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 98
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
225 230 235 240
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
245 250 255
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260 265 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
275 280 285
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
290 295 300
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
305 310 315 320
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
325 330 335
Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
340 345 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp
355 360 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
370 375 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385 390 395 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405 410 415
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
420 425 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435 440 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 99
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 99
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
275 280 285
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
290 295 300
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
305 310 315 320
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
325 330 335
Asn Phe Gly Ala Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
370 375 380
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
385 390 395 400
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
405 410 415
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
420 425 430
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
435 440 445
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
450 455 460
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
465 470 475 480
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
485 490 495
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
500 505 510
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
515 520 525
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
530 535 540
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
545 550 555 560
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
565 570 575
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
580 585 590
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
595 600 605
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
610 615 620
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
625 630 635 640
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
645 650 655
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
660 665 670
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680 685
Lys
<210> 100
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
275 280 285
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
290 295 300
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
305 310 315 320
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
325 330 335
Asn Phe Gly Asn Ala Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
370 375 380
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
405 410 415
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
420 425 430
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
450 455 460
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
465 470 475 480
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
485 490 495
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
500 505 510
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
515 520 525
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
530 535 540
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
545 550 555 560
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
565 570 575
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
580 585 590
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
595 600 605
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
610 615 620
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
625 630 635 640
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
645 650 655
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
660 665 670
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680 685
Lys
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<212> PRT
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 101
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Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
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Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
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Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
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Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
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Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
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Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
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Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
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Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
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Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
130 135 140
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
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Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
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Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
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Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
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Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
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Gly Glu Cys
225
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 103
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Pro
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Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
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Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
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Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
165 170 175
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
195 200 205
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
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Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<400> 104
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<213> 人工序列
<220>
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
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Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Thr Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 118
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 107
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 108
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
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Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
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Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 110
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 110
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
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Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<210> 111
<211> 107
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 111
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
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Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
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Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 114
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 115
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 116
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 117
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 118
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Tyr Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 119
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Tyr Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 120
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<220>
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
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<220>
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
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<220>
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
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100 105 110
Arg Thr
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<220>
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<400> 124
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Ala Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Gly Ser Ser Ser
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 126
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 127
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
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100 105 110
Lys Arg Thr
115
<210> 128
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 128
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 129
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
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65 70 75 80
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Trp His Ser Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 130
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115
<210> 131
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 131
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
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Leu Gln Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr
<210> 132
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 132
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Ile Met Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 133
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
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100 105 110
<210> 134
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 134
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 135
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 136
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
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Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
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50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His
65 70 75 80
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100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
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130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
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210 215 220
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
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275 280 285
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
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340 345 350
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<210> 137
<211> 691
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 137
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Asn Phe
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Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala
245 250 255
Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
260 265 270
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn
275 280 285
Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile
290 295 300
Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu
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Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe
325 330 335
Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
340 345 350
Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
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Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
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675 680 685
Pro Gly Lys
690
<210> 138
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 138
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Gln Arg Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Thr
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 139
<211> 257
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 139
Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val
1 5 10 15
Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu
20 25 30
Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly
35 40 45
Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala
50 55 60
Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr
65 70 75 80
Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys
85 90 95
Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn
100 105 110
Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg
115 120 125
Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu
130 135 140
Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp
145 150 155 160
Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln
165 170 175
Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile
180 185 190
Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg
195 200 205
Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu
210 215 220
Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala
225 230 235 240
Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu
245 250 255
Ser
<210> 140
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 140
Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala
1 5 10 15
Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln
20 25 30
Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln
35 40 45
Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His
50 55 60
Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr
65 70 75 80
Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val
85 90 95
Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys
100 105 110
Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys
115 120 125
Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys
130 135 140
Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr
145 150 155 160
Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser
165 170 175
Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro
180 185 190
Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala
195 200 205
Met Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile
450 455 460
Glu Trp His Glu
465
<210> 141
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 141
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 142
<211> 255
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 142
Met Ala His Leu Met Thr Val Gln Leu Leu Leu Leu Val Met Trp Met
1 5 10 15
Ala Glu Cys Ala Gln Ser Arg Ala Thr Arg Ala Arg Thr Glu Leu Leu
20 25 30
Asn Val Cys Met Asp Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu
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Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Thr Met Thr Ser Glu Cys Lys Arg
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Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu
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Asp Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Gln Gln Trp Trp Glu Asp Cys
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Ser Ser Gly His Asn Glu Cys Pro Val Gly Ala Ser Cys His Pro Phe
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195 200 205
Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala
210 215 220
Arg Phe Tyr Ala Glu Ala Met Ser Gly Ala Gly Leu His Gly Thr Trp
225 230 235 240
Pro Leu Leu Cys Ser Leu Ser Leu Val Leu Leu Trp Val Ile Ser
245 250 255
<210> 143
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 143
Thr Arg Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asp Ala Lys His
1 5 10 15
His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Asn Leu His Asp Gln Cys Ser
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Pro Trp Lys Thr Asn Ser Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala
35 40 45
His Lys Asp Ile Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln
85 90 95
Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu Asp Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp
100 105 110
Cys Gln Gln Trp Trp Glu Asp Cys Gln Ser Ser Phe Thr Cys Lys Ser
115 120 125
Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Ser Ser Gly His Asn Glu Cys Pro
130 135 140
Val Gly Ala Ser Cys His Pro Phe Thr Phe Tyr Phe Pro Thr Ser Ala
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Ala Leu Cys Glu Glu Ile Trp Ser His Ser Tyr Lys Leu Ser Asn Tyr
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Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln
180 185 190
Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Glu Ala Met Val
195 200 205
Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp
450 455 460
His Glu
465
<210> 144
<211> 257
<212> PRT
<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）
<400> 144
Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val
1 5 10 15
Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Thr Ala Arg Ala Arg Thr Glu
20 25 30
Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly
35 40 45
Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Lys Lys Asn Ala
50 55 60
Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr
65 70 75 80
Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys
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Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn
100 105 110
Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg
115 120 125
Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu
130 135 140
Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp
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Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Pro Val Gly Ala Ala Cys Gln
165 170 175
Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile
180 185 190
Trp Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg
195 200 205
Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu
210 215 220
Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala
225 230 235 240
Ala Trp Pro Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Thr Leu Leu Trp Leu Leu
245 250 255
Ser
<210> 145
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 145
Arg Thr Ala Arg Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala
1 5 10 15
Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln
20 25 30
Cys Arg Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln
35 40 45
Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His
50 55 60
Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr
65 70 75 80
Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val
85 90 95
Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys
100 105 110
Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys
115 120 125
Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys
130 135 140
Cys Pro Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr
145 150 155 160
Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Ser
165 170 175
Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro
180 185 190
Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala
195 200 205
Met Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile
450 455 460
Glu Trp His Glu
465
<210> 146
<211> 255
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 146
Met Val Trp Lys Trp Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Val Cys Val Ala
1 5 10 15
Thr Met Cys Ser Ala Gln Asp Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met
20 25 30
Asp Ala Lys His His Lys Thr Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His
35 40 45
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Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Val
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Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala
210 215 220
Ala Ala Met His Val Asn Ala Gly Glu Met Leu His Gly Thr Gly Gly
225 230 235 240
Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Gln Leu Trp Leu Leu Gly
245 250 255
<210> 147
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 147
Thr Met Cys Ser Ala Gln Asp Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met
1 5 10 15
Asp Ala Lys His His Lys Thr Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His
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Asp Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr
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Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp
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Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln
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Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln
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Gln Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Phe Leu Asp Val Pro Leu
100 105 110
Cys Lys Glu Asp Cys Gln Arg Trp Trp Glu Asp Cys His Thr Ser His
115 120 125
Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Val
130 135 140
Asn Lys Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Arg Thr Phe Glu Ser Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Tyr Lys
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Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe
180 185 190
Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala
195 200 205
Ala Ala Met His Val Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser
210 215 220
Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
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Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu
450 455 460
Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
465 470
<210> 148
<211> 243
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 148
Met Ala Trp Gln Met Met Gln Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val Thr Ala
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Ala Gly Ser Ala Gln Pro Arg Ser Ala Arg Ala Arg Thr Asp Leu Leu
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Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Thr Gln Pro Ser Pro Glu
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165 170 175
Glu Ser Tyr Phe Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser
180 185 190
His Ser Phe Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile
195 200 205
Gln Met Trp Phe Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala
210 215 220
Lys Phe Tyr Ala Ala Ala Met Asn Ala Gly Ala Pro Ser Arg Gly Ile
225 230 235 240
Ile Asp Ser
<210> 149
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 149
Ser Ala Arg Ala Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys
1 5 10 15
His His Lys Thr Gln Pro Ser Pro Glu Asp Glu Leu Tyr Gly Gln Cys
20 25 30
Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr Ser Gln Glu
35 40 45
Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp Asp His Cys
50 55 60
Gly Lys Met Glu Pro Thr Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Ser Cys
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Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu
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Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys
115 120 125
Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Ile Asn Glu Cys
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Pro Ala Gly Ala Leu Cys Ser Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Pro Thr Pro
145 150 155 160
Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Phe Lys Val Ser Asn
165 170 175
Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Ser Ala
180 185 190
Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Lys Phe Tyr Ala Ala Ala Met
195 200 205
Asn Ala Gly Ala Pro Ser Arg Gly Ile Ile Asp Ser Val Asp Glu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr
225 230 235 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
245 250 255
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
260 265 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
275 280 285
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
290 295 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
305 310 315 320
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
325 330 335
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
340 345 350
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
355 360 365
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
370 375 380
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
385 390 395 400
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
405 410 415
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
420 425 430
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
435 440 445
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly
450 455 460
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
465 470 475
<210> 150
<211> 207
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 150
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 151
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 151
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
tacgctggtg ttactccgtt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 152
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 152
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
tacatcggtg ttgttacttt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 153
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 153
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
tacactggtg gttcttctgc tttcgactat tggggtcaag gcaccctcgt aacggtttct 360
tct 363
<210> 154
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (47)..(47)
<223> a, c, t, g, 未知 或 其它
<400> 154
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgnttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgaa 300
tggcgtcgtt acacttcttt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 155
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 155
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtggt 300
tggatccgtt gggaacattt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 156
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 156
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
tacctgttct ctacttcttt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 157
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 157
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgag gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
tacatcggta tcgttccgtt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 158
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 158
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
<210> 159
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (53)..(53)
<223> a, c, t, g, 未知 或 其它
<400> 159
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc ccngcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaacc gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttactt cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
<210> 160
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 160
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
tacgttggtg tttctccgtt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 161
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (47)..(47)
<223> a, c, t, g, 未知 或 其它
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (177)..(177)
<223> a, c, t, g, 未知 或 其它
<400> 161
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgnttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcntac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaacttc 300
actgttctgc gtgttccgtt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 162
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 162
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat gggcttggtt cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
<210> 163
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 163
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaacc gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccttgggaat gggcttactt cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
<210> 164
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 164
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcactggt 300
tggtctcgtt ggggttacat ggactattgg ggccaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 165
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 165
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgaa 300
tggatccgtt actaccattt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 166
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 166
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcgttggt 300
tggtaccgtt ggggttacat ggactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 167
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 167
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtaaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagctgtt 300
ttctaccgtg cttggtactc tttcgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tca 363
<210> 168
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 168
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataccagcc caccaccaac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 169
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 169
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccatgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctctttc 300
ttcactggtt tccatctgga ctattggggt caaggcaccc tcgtaacggt ttcttct 357
<210> 170
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 170
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatacca acgaacatta ttatacgttc 300
ggccagggga ccaaagtgga aatcaaa 327
<210> 171
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 171
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggccc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
ttcgcttggc tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc t 351
<210> 172
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 172
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgaac 300
cggacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336
<210> 173
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 173
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgagc 300
cggacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336
<210> 174
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 174
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgcag 300
cggacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336
<210> 175
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 175
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgaac 300
cgggcttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336
<210> 176
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 176
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgaac 300
cggaattttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 177
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctcttac 300
atcgacatgg actattgggg tcaaggcacc ctcgtaacgg tttcttct 348
<210> 178
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 178
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caggataact ggagcccaac gttcggccag 300
gggaccaaag tggaaatcaa a 321
<210> 179
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 179
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctcttac 300
gttgacatgg actattgggg tcaaggcacc ctcgtaacgg tttcttct 348
<210> 180
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 180
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctacc tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caggatattt ggagcccaac gttcggccag 300
gggaccaaag tggaaatcaa a 321
<210> 181
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 181
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagactct 300
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agt 363
<210> 182
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 182
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gactccactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagccaacca gcagcccaat tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 183
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 183
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt caagcgctag taccaagggc cccagcgtgt tccccctggc acccagcagc 420
aagagcacat ctggcggaac agccgctctg ggctgtctgg tgaaagacta cttccccgag 480
cccgtgaccg tgtcttggaa ctctggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac ctttccagcc 540
gtgctgcaga gcagcggcct gtactccctg tcctccgtgg tcaccgtgcc ctctagctcc 600
ctgggaacac agacatatat ctgtaatgtc aatcacaagc cttccaacac caaagtcgat 660
aagaaagtcg agcccaagag ctgc 684
<210> 184
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 184
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt caagcgctag tgtggccgct ccctccgtgt ttatctttcc cccatccgat 420
gaacagctga aaagcggcac cgcctccgtc gtgtgtctgc tgaacaattt ttaccctagg 480
gaagctaaag tgcagtggaa agtggataac gcactgcagt ccggcaactc ccaggaatct 540
gtgacagaac aggactccaa ggacagcacc tactccctgt cctccaccct gacactgtct 600
aaggctgatt atgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 660
tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgt 696
<210> 185
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的引物"
<400> 185
gcaggcaagc attatgcagc ggacttttgg tcaagg 36
<210> 186
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的引物"
<400> 186
caggcaagca ttatgagccg gacttttggt caagg 35
<210> 187
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的引物"
<400> 187
cattatgaac cgggcttttg gtcaaggcac caaggtc 37
<210> 188
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的引物"
<400> 188
cattatgaac cggaattttg gtcaaggcac caaggtc 37
<210> 189
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 189
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcacaa agggccctag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagag cacaagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtct 480
tggaacagcg gagccctgac aagcggcgtg cacactttcc ctgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtact ccctgagcag cgtggtcacc gtgcctagca gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgtg atggcggagg agggtccgga ggcggaggat ccgaggtgca gctgctggaa 720
tctggcggcg gactggtgca gcctggcgga tctctgagac tgagctgtgc cgccagcggc 780
ttcaccttca gcacctacgc catgaactgg gtgcgccagg cccctggcaa aggcctggaa 840
tgggtgtccc ggatcagaag caagtacaac aactacgcca cctactacgc cgacagcgtg 900
aagggccggt tcaccatcag ccgggacgac agcaagaaca ccctgtacct gcagatgaac 960
agcctgcggg ccgaggacac cgccgtgtac tattgtgtgc ggcacggcaa cttcggcaac 1020
agctatgtgt cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcaagcgct 1080
agtaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcacccagca gcaagagcac atctggcgga 1140
acagccgctc tgggctgtct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcttgg 1200
aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 1260
ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320
atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1440
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1500
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1560
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067
<210> 190
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 190
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 540
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccgcttcacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 191
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 191
caggccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120
aagcccggcc aggccttcag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180
cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgcc 240
cagccagaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtcctaggt caacccaagg ctgcccccag cgtgaccctg 360
ttccccccca gcagcgagga actgcaggcc aacaaggcca ccctggtctg cctgatcagc 420
gacttctacc caggcgccgt gaccgtggcc tggaaggccg acagcagccc cgtgaaggcc 480
ggcgtggaga ccaccacccc cagcaagcag agcaacaaca agtacgccgc cagcagctac 540
ctgagcctga cccccgagca gtggaagagc cacaggtcct acagctgcca ggtgacccac 600
gagggcagca ccgtggagaa aaccgtggcc cccaccgagt gcagc 645
<210> 192
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 192
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt catctgctag cacaaagggc cctagcgtgt tccctctggc ccccagcagc 420
aagagcacaa gcggcggaac agccgccctg ggctgcctcg tgaaggacta cttccccgag 480
cccgtgacag tgtcttggaa cagcggagcc ctgacaagcg gcgtgcacac cttccctgcc 540
gtgctgcaga gcagcggcct gtactccctg agcagcgtgg tcaccgtgcc tagcagcagc 600
ctgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aaccacaagc ccagcaacac caaagtggac 660
aagaaggtgg agcccaagag ctgtgatggc ggaggagggt ccggaggcgg aggatccgag 720
gtgcaattgg ttgaatctgg tggtggtctg gtaaaaccgg gcggttccct gcgtctgagc 780
tgcgcggctt ccggattcac cttctccaac gcgtggatga gctgggttcg ccaggccccg 840
ggcaaaggcc tcgagtgggt tggtcgtatc aagtctaaaa ctgacggtgg caccacggat 900
tacgcggctc cagttaaagg tcgttttacc atttcccgcg acgatagcaa aaacactctg 960
tatctgcaga tgaactctct gaaaactgaa gacaccgcag tctactactg tactaccccg 1020
tgggaatggt cttggtacga ttattggggc cagggcacgc tggttacggt gtctagcgct 1080
agtaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcacccagca gcaagagcac atctggcgga 1140
acagccgctc tgggctgtct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcttgg 1200
aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 1260
ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320
atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1440
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1500
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1560
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067
<210> 193
<211> 1365
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 193
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt catctgctag caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 420
aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480
ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 540
gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 600
ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660
aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 720
gaagctgcag ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 780
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 840
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 900
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tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctcgg cgcccccatc 1020
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1080
ccatgccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc 1140
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1200
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gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1320
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<210> 194
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 194
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
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<210> 195
<211> 2070
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 195
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
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atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
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<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
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<220>
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<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 198
caggccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
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<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
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<210> 200
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 200
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<211> 2067
<212> DNA
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<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 201
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ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
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ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtct 480
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ggcctgtact ccctgagcag cgtggtcacc gtgcctagca gcagcctggg cacccagacc 600
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aagagctgtg atggcggagg agggtccgga ggcggaggat ccgaggtgca gctgctggaa 720
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agcctgcggg ccgaggacac cgccgtgtac tattgtgtgc ggcacggcaa cttcggcaac 1020
gcctatgtgt cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcaagcgct 1080
agtaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcacccagca gcaagagcac atctggcgga 1140
acagccgctc tgggctgtct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcttgg 1200
aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 1260
ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320
atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1440
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1500
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1560
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067
<210> 202
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 202
caggccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120
aagcccggcc aggccttcag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180
cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgcc 240
cagccagaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtgctgagc agcgctagca ccaagggccc atcggtcttc 360
cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 420
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 480
gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 540
accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 600
agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 660
ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 720
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 780
agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 840
gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 900
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tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140
ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200
tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1260
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1320
aaa 1323
<210> 203
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 203
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcgtgg ccgctccctc cgtgttcatc ttcccacctt ccgacgagca gctgaagtcc 420
ggcaccgctt ctgtcgtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag 480
tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc aacagccagg aatccgtgac cgagcaggac 540
tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag 600
aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc caccagggcc tgtctagccc cgtgaccaag 660
tctttcaacc ggggcgagtg c 681
<210> 204
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 204
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc acctacgcca tgaactgggt gcgacaggct 120
cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcccgg atcagatcca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg actccgtgaa gggccggttc accatctctc gggacgactc caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaactc cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaactc ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt catctgctag ccccaaggct gcccccagcg tgaccctgtt tccccccagc 420
agcgaggaac tgcaggccaa caaggccacc ctggtctgcc tgatcagcga cttctaccca 480
ggcgccgtga ccgtggcctg gaaggccgac agcagccccg tgaaggccgg cgtggagacc 540
accaccccca gcaagcagag caacaacaag tacgccgcca gcagctacct gagcctgacc 600
cccgagcagt ggaagagcca caggtcctac agctgccagg tgacccacga gggcagcacc 660
gtggagaaaa ccgtggcccc caccgagtgc agc 693
<210> 205
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 205
cagaccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcagcag 120
aagccaggcc aggctcccag aggactgatc ggcggcacca acgccagagc ccctggcacc 180
cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgtg 240
cagcctgaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtccta 327
<210> 206
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 206
cagaccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcagcag 120
aagccaggcc aggctcccag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180
cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgtg 240
cagcctgaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acgccaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtccta 327
<210> 207
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 207
gaggtgcaat tggtggaaag cggaggcggc ctcgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aacgcctgga tgcactgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gactcgagtg ggtgggacgg atcaagagca agaccgatgg cggcaccacc 180
gactatgccg cccctgtgaa gggccggttc accatcagca gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccacc 300
ccctgggagt ggtcttggta cgactattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcctct 360
gctagc 366
<210> 208
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 208
gaggtgcaat tggtggaaag cggaggcggc ctcgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aacgcctgga tgagctgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gactcgagtg ggtgtcccgg atcaagagca agaccgatgg cggcaccacc 180
gactatgccg cccctgtgaa gggccggttc accatcagca gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccacc 300
ccctgggagt ggtcttggta cgactattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcctct 360
gctagc 366
<210> 209
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 209
gaggtgcaat tggtggaaag cggaggcggc ctcgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aacgcctgga tgagctgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gactcgagtg ggtgggatct atcaagagca agaccgacgg cggcaccacc 180
gactatgccg cccctgtgaa gggccggttc accatcagca gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccacc 300
ccctgggagt ggtcttggta cgactattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcctct 360
gctagc 366
<210> 210
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 210
gaggtgcaat tggtggaaag cggaggcggc ctcgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aacgcctgga tgagctgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gactcgagtg ggtgggacgg atcaagagca agaccgatgg cggcaccacc 180
gactatgccg cccctgtgaa gggccggttc accatcagca gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccacc 300
ccctacgagt ggtcttggta cgactactgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcatct 360
gctagc 366
<210> 211
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 211
gaggtgcaat tggtggaaag cggaggcggc ctcgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aacgcctgga tgagctgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gactcgagtg ggtgggacgg atcaagagca agaccgatgg cggcaccacc 180
gactatgccg cccctgtgaa gggccggttc accatcagca gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccacc 300
ccctgggagt actcttggta cgactactgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcatct 360
gctagc 366
<210> 212
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 212
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
actatcgttg tttctccgtt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
gctagc 366
<210> 213
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 213
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
ttcatcggtt ctgttgctat ggactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
gctagc 366
<210> 214
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 214
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtctg 300
acttactcta tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagc 357
<210> 215
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 215
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcact gcagattcca 300
aacacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaacgta cg 342
<210> 216
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 216
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatacgct 300
tacgctctgg actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcgagtgc tagc 354
<210> 217
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 217
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagcatggca gcagcagcac gttcggccag 300
gggaccaaag tggaaatcaa acgtacg 327
<210> 218
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 218
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
ttctctgctg gtcgtctgat ggactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
gctagc 366
<210> 219
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 219
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcact gcagacccca 300
ccaattacct ttggtcaagg caccaaggtc gaaattaaac gtacg 345
<210> 220
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 220
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
tacaacgctt tcgactattg gggtcacggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagc 357
<210> 221
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 221
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcatg gcatagccca 300
acttttggtc aaggcaccaa ggtcgaaatt aaacgtacg 339
<210> 222
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 222
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgct 300
acttacacta tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagc 357
<210> 223
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 223
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcact gcagacccca 300
attacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaacgta cg 342
<210> 224
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 224
caggtgcagc tgcagcagtc tggcgccgag ctcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc ggctacttca tgaactgggt caagcagagc 120
cacggcaaga gcctggaatg gatcggcaga atccacccct acgacggcga caccttctac 180
aaccagaact tcaaggacaa ggccaccctg accgtggaca agagcagcaa caccgcccac 240
atggaactgc tgagcctgac cagcgaggac ttcgccgtgt actactgcac cagatacgac 300
ggcagccggg ccatggatta ttggggccag ggcaccaccg tgacagtgtc cagcgctagc 360
accaagggcc cctccgtgtt ccccctggcc cccagcagca agagcaccag cggcggcaca 420
gccgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 480
agcggagccc tgacctccgg cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag ttctggcctg 540
tatagcctga gcagcgtggt caccgtgcct tctagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaggtgga gcccaagagc 660
tgcgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagctgcagg gggaccgtca 720
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa agccctcggc gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtgc accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080
aagaaccagg tcagcctctc gtgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct cgtgagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320
agcctctccc tgtctccggg taaa 1344
<210> 225
<211> 2073
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 225
caggtgcagc tgcagcagtc tggcgccgag ctcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc ggctacttca tgaactgggt caagcagagc 120
cacggcaaga gcctggaatg gatcggcaga atccacccct acgacggcga caccttctac 180
aaccagaact tcaaggacaa ggccaccctg accgtggaca agagcagcaa caccgcccac 240
atggaactgc tgagcctgac cagcgaggac ttcgccgtgt actactgcac cagatacgac 300
ggcagccggg ccatggatta ttggggccag ggcaccaccg tgacagtgtc cagcgctagc 360
acaaagggcc ccagcgtgtt ccctctggcc cctagcagca agagcacatc tggcggaaca 420
gccgccctgg gctgcctcgt gaaggactac tttcccgagc ctgtgaccgt gtcctggaac 480
tctggcgccc tgacaagcgg cgtgcacacc tttccagccg tgctgcagag cagcggcctg 540
tactctctga gcagcgtggt caccgtgcct agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaagtggaca agaaggtgga gcccaagagc 660
tgtgatggcg gaggagggtc cggaggcgga ggatccgaag tgcagctggt ggaaagcggc 720
ggaggcctgg tgcagcctaa gggctctctg aagctgagct gtgccgccag cggcttcacc 780
ttcaacacct acgccatgaa ctgggtgcgc caggcccctg gcaaaggcct ggaatgggtg 840
gcccggatca gaagcaagta caacaattac gccacctact acgccgacag cgtgaaggac 900
cggttcacca tcagccggga cgacagccag agcatcctgt acctgcagat gaacaacctg 960
aaaaccgagg acaccgccat gtactactgc gtgcggcacg gcaacttcgg caacagctat 1020
gtgtcttggt ttgcctactg gggccagggc accctcgtga cagtgtctgc tgctagcgtg 1080
gccgctccct ccgtgtttat ctttccccca tccgatgaac agctgaaaag cggcaccgcc 1140
tccgtcgtgt gtctgctgaa caatttttac cctagggaag ctaaagtgca gtggaaagtg 1200
gataacgcac tgcagtccgg caactcccag gaatctgtga cagaacagga ctccaaggac 1260
agcacctact ccctgtcctc caccctgaca ctgtctaagg ctgattatga gaaacacaaa 1320
gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 1380
aggggagagt gtgacaagac ccacacctgt cccccttgtc ctgcccctga agctgctggc 1440
ggcccttctg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 1500
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 1560
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 1620
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1680
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1740
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atgccgggat 1800
gagctgacca agaaccaggt cagcctgtgg tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1860
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1920
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1980
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 2040
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 2073
<210> 226
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 226
gacatcgagc tgacccagag ccctgcctct ctggccgtgt ctctgggaca gagagccatc 60
atcagctgca aggccagcca gagcgtgtcc tttgccggca cctctctgat gcactggtat 120
caccagaagc ccggccagca gcccaagctg ctgatctaca gagccagcaa cctggaagcc 180
ggcgtgccca caagattttc cggcagcggc agcaagaccg acttcaccct gaacatccac 240
cccgtggaag aagaggacgc cgccacctac tactgccagc agagcagaga gtacccctac 300
accttcggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
<210> 227
<211> 209
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 227
Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala
1 5 10 15
Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln
20 25 30
Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln
35 40 45
Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His
50 55 60
Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr
65 70 75 80
Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val
85 90 95
Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys
100 105 110
Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys
115 120 125
Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys
130 135 140
Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr
145 150 155 160
Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser
165 170 175
Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro
180 185 190
Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala
195 200 205
Met
<210> 228
<211> 214
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 228
Thr Met Cys Ser Ala Gln Asp Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met
1 5 10 15
Asp Ala Lys His His Lys Thr Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His
20 25 30
Asp Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr
35 40 45
Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp
50 55 60
Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln
65 70 75 80
Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln
85 90 95
Gln Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Phe Leu Asp Val Pro Leu
100 105 110
Cys Lys Glu Asp Cys Gln Arg Trp Trp Glu Asp Cys His Thr Ser His
115 120 125
Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Val
130 135 140
Asn Lys Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Arg Thr Phe Glu Ser Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Tyr Lys
165 170 175
Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe
180 185 190
Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala
195 200 205
Ala Ala Met His Val Asn
210
<210> 229
<211> 220
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 229
Ser Ala Arg Ala Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys
1 5 10 15
His His Lys Thr Gln Pro Ser Pro Glu Asp Glu Leu Tyr Gly Gln Cys
20 25 30
Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr Ser Gln Glu
35 40 45
Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp Asp His Cys
50 55 60
Gly Lys Met Glu Pro Thr Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Ser Cys
65 70 75 80
Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Arg Gln Val Asn
85 90 95
Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu
100 105 110
Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys
115 120 125
Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Ile Asn Glu Cys
130 135 140
Pro Ala Gly Ala Leu Cys Ser Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Pro Thr Pro
145 150 155 160
Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Phe Lys Val Ser Asn
165 170 175
Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Ser Ala
180 185 190
Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Lys Phe Tyr Ala Ala Ala Met
195 200 205
Asn Ala Gly Ala Pro Ser Arg Gly Ile Ile Asp Ser
210 215 220
<210> 230
<211> 208
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 230
Thr Arg Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asp Ala Lys His
1 5 10 15
His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Asn Leu His Asp Gln Cys Ser
20 25 30
Pro Trp Lys Thr Asn Ser Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala
35 40 45
His Lys Asp Ile Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly
50 55 60
Thr Met Thr Ser Glu Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu
65 70 75 80
Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln
85 90 95
Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu Asp Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp
100 105 110
Cys Gln Gln Trp Trp Glu Asp Cys Gln Ser Ser Phe Thr Cys Lys Ser
115 120 125
Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Ser Ser Gly His Asn Glu Cys Pro
130 135 140
Val Gly Ala Ser Cys His Pro Phe Thr Phe Tyr Phe Pro Thr Ser Ala
145 150 155 160
Ala Leu Cys Glu Glu Ile Trp Ser His Ser Tyr Lys Leu Ser Asn Tyr
165 170 175
Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln
180 185 190
Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Glu Ala Met Ser
195 200 205
<210> 231
<211> 213
<212> PRT
<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）
<400> 231
Glu Ala Gln Thr Arg Thr Ala Arg Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val
1 5 10 15
Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys
20 25 30
Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr
35 40 45
Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe
50 55 60
Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe
65 70 75 80
Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp
85 90 95
Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val
100 105 110
Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr
115 120 125
Ser Tyr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly
130 135 140
Phe Asn Lys Cys Pro Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr
145 150 155 160
Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr Tyr Ser Tyr
165 170 175
Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp
180 185 190
Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr
195 200 205
Ala Ala Ala Met Ser
210
<210> 232
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 232
Pro Trp Glu Tyr Ser Trp Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 233
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 233
Asn Tyr Thr Ile Val Val Ser Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 234
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 234
Asn Tyr Phe Ile Gly Ser Val Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 235
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 235
Gly Leu Thr Tyr Ser Met Asp Tyr
1 5
<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 236
Met Gln Ala Leu Gln Ile Pro Asn Thr
1 5
<210> 237
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 237
Tyr Ala Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5
<210> 238
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 238
Gln Gln His Gly Ser Ser Ser Thr
1 5
<210> 239
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 239
Gly Asp Phe Ser Ala Gly Arg Leu Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 240
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 240
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 241
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 241
Gly Asp Tyr Asn Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 242
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 242
Met Gln Ala Trp His Ser Pro Thr
1 5
<210> 243
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 243
Gly Ala Thr Tyr Thr Met Asp Tyr
1 5
<210> 244
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 244
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Ile Thr
1 5
<210> 245
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 245
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 246
<211> 2076
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 246
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccatgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctctttc 300
ttcactggtt tccatctgga ctattggggt caaggcaccc tcgtaacggt ttcttctgct 360
agcacaaagg gccccagcgt gttccctctg gcccctagca gcaagagcac atctggcgga 420
acagccgccc tgggctgcct cgtgaaggac tactttcccg agcctgtgac cgtgtcctgg 480
aactctggcg ccctgacaag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 540
ctgtactctc tgagcagcgt ggtcaccgtg cctagcagca gcctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaagtgg acaagaaggt ggagcccaag 660
agctgtgatg gcggaggagg gtccggaggc ggaggatccg aggtgcagct gctggaatct 720
ggcggcggac tggtgcagcc tggcggatct ctgagactga gctgtgccgc cagcggcttc 780
accttcagca cctacgccat gaactgggtg cgccaggccc ctggcaaagg cctggaatgg 840
gtgtcccgga tcagaagcaa gtacaacaac tacgccacct actacgccga cagcgtgaag 900
ggccggttca ccatcagccg ggacgacagc aagaacaccc tgtacctgca gatgaacagc 960
ctgcgggccg aggacaccgc cgtgtactat tgtgtgcggc acggcaactt cggcaacagc 1020
tatgtgtctt ggtttgccta ctggggccag ggcaccctcg tgaccgtgtc aagcgctagt 1080
gtggccgctc cctccgtgtt tatctttccc ccatccgatg aacagctgaa aagcggcacc 1140
gcctccgtcg tgtgtctgct gaacaatttt taccctaggg aagctaaagt gcagtggaaa 1200
gtggataacg cactgcagtc cggcaactcc caggaatctg tgacagaaca ggactccaag 1260
gacagcacct actccctgtc ctccaccctg acactgtcta aggctgatta tgagaaacac 1320
aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc 1380
aacaggggag agtgtgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaagctgct 1440
ggcggccctt ctgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg 1500
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc 1560
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1620
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1680
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcg gcgcccccat cgagaaaacc 1740
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatgccgg 1800
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg tggtgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1860
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1920
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1980
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 2040
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 2076
<210> 247
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 247
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccatgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctctttc 300
ttcactggtt tccatctgga ctattggggt caaggcaccc tcgtaacggt ttcttctgct 360
agcaccaagg gcccctccgt gttccccctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 420
acagccgctc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg 480
aacagcggag ccctgacctc cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagttctggc 540
ctgtatagcc tgagcagcgt ggtcaccgtg ccttctagca gcctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 660
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tgcaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080
accaagaacc aggtcagcct ctcgtgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200
gactccgacg gctccttctt cctcgtgagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347
<210> 248
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 248
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Glu Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 249
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 249
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Gln Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 250
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 250
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Ala Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 251
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ala Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
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115 120 125
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 252
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
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Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
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Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680 685
Lys
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<212> PRT
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 253
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
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Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 254
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
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Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
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Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
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Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
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Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
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Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 255
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
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Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
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Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
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Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
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Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
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Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
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Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
515 520 525
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
530 535 540
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
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Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
660 665 670
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680 685
Lys
<210> 256
<211> 690
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 256
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Asp Phe Ala Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
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Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
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Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly
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Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
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Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn
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Gly Lys
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 257
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
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<220>
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<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 258
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<211> 214
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<213> 人工序列
<220>
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<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 259
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys
210
<210> 260
<211> 690
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 260
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Phe Ala Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
245 250 255
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
260 265 270
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn
275 280 285
Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
290 295 300
Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
305 310 315 320
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly
325 330 335
Asn Ala Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
340 345 350
Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
355 360 365
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
370 375 380
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
385 390 395 400
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
405 410 415
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
420 425 430
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
435 440 445
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp
450 455 460
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
465 470 475 480
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
485 490 495
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
500 505 510
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
515 520 525
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
530 535 540
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
545 550 555 560
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
565 570 575
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
580 585 590
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
595 600 605
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
610 615 620
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
625 630 635 640
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
645 650 655
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
660 665 670
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
675 680 685
Gly Lys
690
<210> 261
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 261
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgaggg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
<210> 262
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 262
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactcaggg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
<210> 263
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 263
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcgccag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt caagc 375
<210> 264
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 264
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacgc ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt caagc 375
<210> 265
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 265
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcacaa agggccctag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagag cacaagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtct 480
tggaacagcg gagccctgac aagcggcgtg cacactttcc ctgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtact ccctgagcag cgtggtcacc gtgcctagca gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgtg atggcggagg agggtccgga ggcggaggat ccgaggtgca gctgctggaa 720
tctggcggcg gactggtgca gcctggcgga tctctgagac tgagctgtgc cgccagcggc 780
ttcaccttca gcacctacgc catgaactgg gtgcgccagg cccctggcaa aggcctggaa 840
tgggtgtccc ggatcagaag caagtacaac aactacgcca cctactacgc cgacagcgtg 900
aagggccggt tcaccatcag ccgggacgac agcaagaaca ccctgtacct gcagatgaac 960
agcctgcggg ccgaggacac cgccgtgtac tattgtgtgc ggcacggcaa cttcggcgcc 1020
agctatgtgt cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcaagcgct 1080
agtaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcacccagca gcaagagcac atctggcgga 1140
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aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 1260
ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320
atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1440
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1500
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1560
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067
<210> 266
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 266
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420
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ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 600
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gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
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cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccgcttcacg 1320
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<210> 267
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 267
caggccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120
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cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgcc 240
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ggcggaggca ccaagctgac agtcctaggt caacccaagg ctgcccccag cgtgaccctg 360
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ctgagcctga cccccgagca gtggaagagc cacaggtcct acagctgcca ggtgacccac 600
gagggcagca ccgtggagaa aaccgtggcc cccaccgagt gcagc 645
<210> 268
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 268
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcacaa agggccctag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagag cacaagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtct 480
tggaacagcg gagccctgac aagcggcgtg cacactttcc ctgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtact ccctgagcag cgtggtcacc gtgcctagca gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgtg atggcggagg agggtccgga ggcggaggat ccgaggtgca gctgctggaa 720
tctggcggcg gactggtgca gcctggcgga tctctgagac tgagctgtgc cgccagcggc 780
ttcaccttca gcacctacgc catgaactgg gtgcgccagg cccctggcaa aggcctggaa 840
tgggtgtccc ggatcagaag caagtacaac aactacgcca cctactacgc cgacagcgtg 900
aagggccggt tcaccatcag ccgggacgac agcaagaaca ccctgtacct gcagatgaac 960
agcctgcggg ccgaggacac cgccgtgtac tattgtgtgc ggcacggcaa cttcggcaac 1020
gcctatgtgt cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcaagcgct 1080
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agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1440
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1500
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1560
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067
<210> 269
<211> 2070
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 269
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ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggccc tacctcctac 180
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ttcgcttggc tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagcaca 360
aagggcccca gcgtgttccc tctggcccct agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420
gccctgggct gcctcgtgaa ggactacttt cccgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 480
ggcgccctga caagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540
tctctgagca gcgtggtcac cgtgcctagc agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaaa gtggacaaga aggtggagcc caagagctgt 660
gatggcggag gagggtccgg aggcggagga tccgaggtgc agctgctgga atctggcggc 720
ggactggtgc agcctggcgg atctctgaga ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc 780
agcacctacg ccatgaactg ggtgcgccag gcccctggca aaggcctgga atgggtgtcc 840
cggatcagaa gcaagtacaa caactacgcc acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg 900
ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg 960
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aacgcactgc agtccggcaa ctcccaggaa tctgtgacag aacaggactc caaggacagc 1260
acctactccc tgtcctccac cctgacactg tctaaggctg attatgagaa acacaaagtc 1320
tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 1380
ggagagtgtg acaagaccca cacctgtccc ccttgtcctg cccctgaagc tgctggcggc 1440
ccttctgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 1500
gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 1560
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 1620
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1680
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1740
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag 1800
ctgaccaaga accaggtcag cctgtggtgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1860
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1920
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1980
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 2040
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 2070
<210> 270
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 270
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggccc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
ttcgcttggc tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagcacc 360
aagggcccct ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc 420
gctctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
<210> 271
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 271
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgcag 300
cggacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 272
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 272
caggccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120
aagcccggcc aggccttcag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180
cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgcc 240
cagccagaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtgctgagc agcgcttcca ccaaaggccc ttccgtgttt 360
cctctggctc ctagctccaa gtccacctct ggaggcaccg ctgctctcgg atgcctcgtg 420
aaggattatt ttcctgagcc tgtgacagtg tcctggaata gcggagcact gacctctgga 480
gtgcatactt tccccgctgt gctgcagtcc tctggactgt acagcctgag cagcgtggtg 540
acagtgccca gcagcagcct gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc 600
agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa cccaagtctt gt 642
<210> 273
<211> 2070
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 273
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggccc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
ttcgcttggc tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagcaca 360
aagggcccca gcgtgttccc tctggcccct agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420
gccctgggct gcctcgtgaa ggactacttt cccgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 480
ggcgccctga caagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540
tctctgagca gcgtggtcac cgtgcctagc agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaaa gtggacaaga aggtggagcc caagagctgt 660
gatggcggag gagggtccgg aggcggagga tccgaggtgc agctgctgga atctggcggc 720
ggactggtgc agcctggcgg atctctgaga ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc 780
agcacctacg ccatgaactg ggtgcgccag gcccctggca aaggcctgga atgggtgtcc 840
cggatcagaa gcaagtacaa caactacgcc acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg 900
ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg 960
gccgaggaca ccgccgtgta ctattgtgtg cggcacggca acttcggcaa cgcctatgtg 1020
tcttggtttg cctactgggg ccagggcacc ctcgtgaccg tgtcaagcgc tagtgtggcc 1080
gctccctccg tgtttatctt tcccccatcc gatgaacagc tgaaaagcgg caccgcctcc 1140
gtcgtgtgtc tgctgaacaa tttttaccct agggaagcta aagtgcagtg gaaagtggat 1200
aacgcactgc agtccggcaa ctcccaggaa tctgtgacag aacaggactc caaggacagc 1260
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ggagagtgtg acaagaccca cacctgtccc ccttgtcctg cccctgaagc tgctggcggc 1440
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tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 1620
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gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1740
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag 1800
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gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1920
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1980
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 2040
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 2070
<210> 274
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 274
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Glu Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Tyr Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 275
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 275
Arg Ile Lys Ser Lys Thr Glu Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 276
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 276
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Glu Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Tyr Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
275 280 285
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
290 295 300
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
305 310 315 320
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
325 330 335
Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
370 375 380
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
385 390 395 400
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
405 410 415
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
420 425 430
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
435 440 445
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
450 455 460
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
465 470 475 480
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
485 490 495
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
500 505 510
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
515 520 525
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
530 535 540
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
545 550 555 560
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
565 570 575
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
580 585 590
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
595 600 605
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
610 615 620
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
625 630 635 640
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
645 650 655
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
660 665 670
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680 685
Lys
<210> 277
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 277
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Glu Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Tyr Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 278
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 278
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Arg Tyr Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 279
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 279
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Glu Ser Pro Pro Thr Gly
85 90 95
Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 280
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 280
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Arg Tyr Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu
225 230 235 240
Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly
245 250 255
Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln
260 265 270
Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys
275 280 285
Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly
290 295 300
Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu
305 310 315 320
Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly
325 330 335
Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
340 345 350
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
355 360 365
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
370 375 380
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
385 390 395 400
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
405 410 415
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
420 425 430
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
435 440 445
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
450 455 460
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
465 470 475 480
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
485 490 495
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
500 505 510
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
515 520 525
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
530 535 540
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
545 550 555 560
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
565 570 575
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
580 585 590
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
595 600 605
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
610 615 620
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
625 630 635 640
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
645 650 655
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
660 665 670
Gly Lys
<210> 281
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 281
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Arg Tyr Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 282
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 282
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Glu Ser Pro Pro Thr Gly
85 90 95
Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Lys Lys Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 283
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 283
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Trp Ser Tyr Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 284
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 284
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Arg Gln Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 285
<211> 673
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 285
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Trp Ser Tyr Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro
225 230 235 240
Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser
245 250 255
Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu
260 265 270
Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg
275 280 285
Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys
290 295 300
Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr
305 310 315 320
Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr
325 330 335
Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
340 345 350
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
355 360 365
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
370 375 380
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
385 390 395 400
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
405 410 415
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
420 425 430
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
435 440 445
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
450 455 460
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
465 470 475 480
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
485 490 495
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
500 505 510
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
515 520 525
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
530 535 540
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
545 550 555 560
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
565 570 575
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
580 585 590
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
595 600 605
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
610 615 620
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
625 630 635 640
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
645 650 655
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
660 665 670
Lys
<210> 286
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 286
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Trp Ser Tyr Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 287
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 287
gaggtgcaat tggtggaaag cggaggcggc ctcgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aacgcctgga tgagctgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gactcgagtg ggtgggacgg atcaagagca agaccgaggg cggcaccacc 180
gactatgccg cccctgtgaa gggccggttc accatcagca gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccacc 300
ccctacgagt ggtcttggta cgactactgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcatct 360
<210> 288
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 288
gaggtgcaat tggtggaaag cggaggcggc ctcgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aacgcctgga tgagctgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gactcgagtg ggtgggacgg atcaagagca agaccgaggg cggcaccacc 180
gactatgccg cccctgtgaa gggccggttc accatcagca gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccacc 300
ccctacgagt ggtcttggta cgactactgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcatct 360
gctagcacaa agggccctag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagag cacaagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtct 480
tggaacagcg gagccctgac aagcggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtact ccctgagcag cgtggtcacc gtgcctagca gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgtg atggcggagg agggtccgga ggcggaggat ccgaggtgca gctgctggaa 720
tctggcggcg gactggtgca gcctggcgga tctctgagac tgagctgtgc cgccagcggc 780
ttcaccttca gcacctacgc catgaactgg gtgcgccagg cccctggcaa aggcctggaa 840
tgggtgtccc ggatcagaag caagtacaac aactacgcca cctactacgc cgacagcgtg 900
aagggccggt tcaccatcag ccgggacgac agcaagaaca ccctgtacct gcagatgaac 960
agcctgcggg ccgaggacac cgccgtgtac tattgtgtgc ggcacggcaa cttcggcaac 1020
agctatgtgt cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcaagcgct 1080
agtaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcacccagca gcaagagcac atctggcgga 1140
acagccgctc tgggctgtct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcttgg 1200
aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 1260
ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320
atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1440
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1500
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1560
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067
<210> 289
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 289
gaggtgcaat tggtggaaag cggaggcggc ctcgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aacgcctgga tgagctgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gactcgagtg ggtgggacgg atcaagagca agaccgaggg cggcaccacc 180
gactatgccg cccctgtgaa gggccggttc accatcagca gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccacc 300
ccctacgagt ggtcttggta cgactactgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcatct 360
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 540
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccgcttcacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 290
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 290
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgtggtgac 300
taccgttacc gttacttcga ctactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt 357
<210> 291
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 291
tcttctgaac tgactcaaga tccagctgtt agcgtggctc tgggtcagac tgtacgtatc 60
acctgccaag gcgattctct gcgctcctac tacgcaagct ggtaccagca gaaaccgggt 120
caggccccag ttctggtgat ttacggcaaa aacaaccgtc cgtctgggat cccggaccgt 180
ttctccggca gctcttccgg taacacggcg agcctcacca tcactggcgc tcaagcagaa 240
gacgaggccg actattactg taactctcgg gaaagcccac caaccggcct ggttgtcttc 300
ggtggcggta ccaagctgac cgtccta 327
<210> 292
<211> 2022
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 292
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgtggtgac 300
taccgttacc gttacttcga ctactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagtgct 360
agcaccaagg gcccctccgt gtttcctctg gccccttcca gcaagtccac ctctggcgga 420
actgccgctc tgggctgcct ggtggaagat tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg 480
aattctggcg ctctgacctc cggcgtgcac acctttccag ctgtgctgca gtcctccggc 540
ctgtactccc tgtcctccgt cgtgacagtg ccctccagct ctctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gccctccaac accaaggtgg acgagaaggt ggaacccaag 660
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ccctccctga cagtgtctcc tggcggcacc gtgaccctga cctgtggatc ttctaccggc 780
gctgtgacca cctccaacta cgccaattgg gtgcaggaaa agcccggcca ggccttcaga 840
ggactgatcg gcggcaccaa caagagagcc cctggcaccc ctgccagatt ctccggttct 900
ctgctgggcg gcaaggctgc cctgactctg tctggtgctc agcctgagga cgaggccgag 960
tactactgcg ccctgtggta ctccaacctg tgggtgttcg gcggaggcac caagctgacc 1020
gtgctgtcca gcgcttccac caagggaccc agtgtgttcc ccctggcccc cagctccaag 1080
tctacatccg gtggcacagc tgccctggga tgtctcgtga aggactactt tcctgagcct 1140
gtgacagtgt cttggaacag cggagccctg accagcggag tgcacacatt ccctgcagtg 1200
ctgcagagca gcggcctgta tagcctgagc agcgtcgtga ccgtgccttc ctctagcctg 1260
ggaacacaga catatatctg taatgtgaat cataagccca gtaataccaa agtggataag 1320
aaagtggaac ctaagagctg cgataagacc cacacctgtc ccccctgccc tgctcctgaa 1380
gctgctggtg gccctagcgt gttcctgttc cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc 1440
tcccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg gtggatgtgt cccacgagga ccctgaagtg 1500
aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagagag 1560
gaacagtaca actccaccta ccgggtggtg tccgtgctga cagtgctgca ccaggactgg 1620
ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctgggcgc tcccatcgaa 1680
aagaccatct ccaaggccaa gggccagccc cgggaacccc aggtgtacac cctgccccca 1740
tgccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat 1800
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1860
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1920
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1980
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa 2022
<210> 293
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 293
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgtggtgac 300
taccgttacc gttacttcga ctactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagtgct 360
agcaccaagg gcccctccgt gttccccctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 420
acagccgctc tgggctgcct ggtcgaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg 480
aacagcggag ccctgacctc cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagttctggc 540
ctgtatagcc tgagcagcgt ggtcaccgtg ccttctagca gcctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acgagaaggt ggagcccaag 660
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tgcaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080
accaagaacc aggtcagcct ctcgtgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200
gactccgacg gctccttctt cctcgtgagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347
<210> 294
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 294
tcttctgaac tgactcaaga tccagctgtt agcgtggctc tgggtcagac tgtacgtatc 60
acctgccaag gcgattctct gcgctcctac tacgcaagct ggtaccagca gaaaccgggt 120
caggccccag ttctggtgat ttacggcaaa aacaaccgtc cgtctgggat cccggaccgt 180
ttctccggca gctcttccgg taacacggcg agcctcacca tcactggcgc tcaagcagaa 240
gacgaggccg actattactg taactctcgg gaaagcccac caaccggcct ggttgtcttc 300
ggtggcggta ccaagctgac cgtcctaggt caacccaagg ctgcccccag cgtgaccctg 360
ttccccccca gcagcaagaa actgcaggcc aacaaggcca ccctggtctg cctgatcagc 420
gacttctacc caggcgccgt gaccgtggcc tggaaggccg acagcagccc cgtgaaggcc 480
ggcgtggaga ccaccacccc cagcaagcag agcaacaaca agtacgccgc cagcagctac 540
ctgagcctga cccccgagca gtggaagagc cacaggtcct acagctgcca ggtgacccac 600
gagggcagca ccgtggagaa aaccgtggcc cccaccgagt gcagc 645
<210> 295
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 295
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
tggtcttact acatggacta ttggggtcaa ggcaccctcg taacggtttc ttct 354
<210> 296
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 296
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcacg gcagacccca 300
acttttggtc aaggcaccaa ggtcgaaatt aaa 333
<210> 297
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 297
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
tggtcttact acatggacta ttggggtcaa ggcaccctcg taacggtttc ttctgctagc 360
accaagggcc cctccgtgtt tcctctggcc ccttccagca agtccacctc tggcggaact 420
gccgctctgg gctgcctggt ggaagattac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaat 480
tctggcgctc tgacctccgg cgtgcacacc tttccagctg tgctgcagtc ctccggcctg 540
tactccctgt cctccgtcgt gacagtgccc tccagctctc tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga accacaagcc ctccaacacc aaggtggacg agaaggtgga acccaagtcc 660
tgcgacggtg gcggaggttc cggaggcgga ggatcccagg ctgtcgtgac ccaggaaccc 720
tccctgacag tgtctcctgg cggcaccgtg accctgacct gtggatcttc taccggcgct 780
gtgaccacct ccaactacgc caattgggtg caggaaaagc ccggccaggc cttcagagga 840
ctgatcggcg gcaccaacaa gagagcccct ggcacccctg ccagattctc cggttctctg 900
ctgggcggca aggctgccct gactctgtct ggtgctcagc ctgaggacga ggccgagtac 960
tactgcgccc tgtggtactc caacctgtgg gtgttcggcg gaggcaccaa gctgaccgtg 1020
ctgtccagcg cttccaccaa gggacccagt gtgttccccc tggcccccag ctccaagtct 1080
acatccggtg gcacagctgc cctgggatgt ctcgtgaagg actactttcc tgagcctgtg 1140
acagtgtctt ggaacagcgg agccctgacc agcggagtgc acacattccc tgcagtgctg 1200
cagagcagcg gcctgtatag cctgagcagc gtcgtgaccg tgccttcctc tagcctggga 1260
acacagacat atatctgtaa tgtgaatcat aagcccagta ataccaaagt ggataagaaa 1320
gtggaaccta agagctgcga taagacccac acctgtcccc cctgccctgc tcctgaagct 1380
gctggtggcc ctagcgtgtt cctgttcccc ccaaagccca aggacaccct gatgatctcc 1440
cggacccccg aagtgacctg cgtggtggtg gatgtgtccc acgaggaccc tgaagtgaag 1500
ttcaattggt acgtggacgg cgtggaagtg cacaacgcca agaccaagcc tagagaggaa 1560
cagtacaact ccacctaccg ggtggtgtcc gtgctgacag tgctgcacca ggactggctg 1620
aacggcaaag agtacaagtg caaggtgtcc aacaaggccc tgggcgctcc catcgaaaag 1680
accatctcca aggccaaggg ccagccccgg gaaccccagg tgtacaccct gcccccatgc 1740
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc 1800
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1860
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1920
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1980
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa 2019
<210> 298
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 298
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
tggtcttact acatggacta ttggggtcaa ggcaccctcg taacggtttc ttctgctagc 360
accaagggcc cctccgtgtt ccccctggcc cccagcagca agagcaccag cggcggcaca 420
gccgctctgg gctgcctggt cgaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 480
agcggagccc tgacctccgg cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag ttctggcctg 540
tatagcctga gcagcgtggt caccgtgcct tctagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggacg agaaggtgga gcccaagagc 660
tgcgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagctgcagg gggaccgtca 720
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa agccctcggc gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtgc accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080
aagaaccagg tcagcctctc gtgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct cgtgagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320
agcctctccc tgtctccggg taaa 1344
<210> 299
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 299
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcacg gcagacccca 300
acttttggtc aaggcaccaa ggtcgaaatt aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatcg gaagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
<210> 300
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> /注释="此序列可涵盖1-10个'Gly Gly Gly Gly Ser'重复单元, 其中有些位置可以缺失"
<220>
<221> 来源
<223> /注释="替代和优选实施方案的详细描述见提交的说明书"
<400> 300
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser
50
<210> 301
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> /注释="此序列可涵盖1-10个'Ser Gly Gly Gly Gly'重复单元, 其中有些位置可以缺失"
<220>
<221> 来源
<223> /注释="替代和优选实施方案的详细描述见提交的说明书"
<400> 301
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Gly Gly
50
<210> 302
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(54)
<223> /注释="此区域可涵盖1-10个'Ser Gly Gly Gly Gly'重复单元, 其中有些位置可以缺失"
<220>
<221> 来源
<223> /注释="替代和优选实施方案的详细描述见提交的说明书"
<400> 302
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50
<210> 303
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 303
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 304
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 304
Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 305
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 305
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 306
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的
Penta-His tag"
<400> 306
His His His His His
1 5
<210> 307
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 307
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
100
<210> 308
<211> 692
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 308
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr His Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Phe Phe Thr Gly Phe His Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
245 250 255
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln
260 265 270
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr
275 280 285
Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
290 295 300
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
305 310 315 320
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn
325 330 335
Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
340 345 350
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
355 360 365
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
370 375 380
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
385 390 395 400
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
405 410 415
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
420 425 430
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
435 440 445
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
450 455 460
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
465 470 475 480
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
485 490 495
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
500 505 510
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
515 520 525
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
530 535 540
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
545 550 555 560
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
565 570 575
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
580 585 590
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
595 600 605
Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
610 615 620
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
625 630 635 640
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
645 650 655
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
660 665 670
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
675 680 685
Ser Pro Gly Lys
690
<210> 309
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 309
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr His Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Phe Phe Thr Gly Phe His Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 310
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (201)..(201)
<223> 任何氨基酸
<400> 310
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Asn Glu His
85 90 95
Tyr Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Xaa Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 311
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 311
Gly Thr Asn Ala Arg Ala Pro
1 5
<210> 312
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 312
Ala Leu Trp Tyr Ala Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 313
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 313
Asn Ala Trp Met His
1 5
<210> 314
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 314
Ser Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 315
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 315
Pro Tyr Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 316
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 316
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Arg Gln Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (27)

1.一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含
(i)第一抗原结合模块，该第一抗原结合模块为能够特异性结合CD3的Fab分子，且包含SEQ ID NO: 37的重链CDR1，SEQ ID NO: 38的重链CDR2，SEQ ID NO: 39的重链CDR3，SEQID NO: 32的轻链CDR1，SEQ ID NO: 33的轻链CDR2，和SEQ ID NO: 34的轻链CDR3；
(ii)第二抗原结合模块，该第二抗原结合模块能够特异性结合叶酸受体1 (FolR1)，
其中该能够特异性结合FolR1的抗原结合模块包含：
a)SEQ ID NO: 16的重链CDR1，SEQ ID NO: 17的重链CDR2，SEQ ID NO: 18的重链CDR3，SEQ ID NO: 32的轻链CDR1，SEQ ID NO: 33的轻链CDR2，和SEQ ID NO: 34的轻链CDR3；
b)SEQ ID NO: 8的重链CDR1，SEQ ID NO: 56的重链CDR2，SEQ ID NO: 57的重链CDR3，SEQ ID NO: 59的轻链CDR1，SEQ ID NO: 60的轻链CDR2，和SEQ ID NO: 65的轻链CDR3；或
c)SEQ ID NO: 16的重链CDR1，SEQ ID NO: 275的重链CDR2，SEQ ID NO: 315的重链CDR3，SEQ ID NO: 32的轻链CDR1，SEQ ID NO: 33的轻链CDR2，和SEQ ID NO: 34的轻链CDR3。
2.权利要求1的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中该第一抗原结合模块包含：如SEQ ID NO: 36的氨基酸序列所示的可变重链和如SEQ ID NO: 31的氨基酸序列所示的可变轻链。
3.权利要求1的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其另外包含
(iii)第三抗原结合模块，该第三抗原结合模块能够特异性结合FolR1。
4.权利要求3的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中该第三抗原结合模块与该第二抗原结合模块相同。
5.权利要求3的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中该第二和第三抗原结合模块中至少一项是Fab分子。
6.权利要求1的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中该能够特异性结合叶酸受体1 (FolR1)的抗原结合模块包含：如SEQ ID NO: 15的氨基酸序列所示的可变重链和如SEQID NO: 31的氨基酸序列所示的可变轻链。
7.权利要求1的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中该能够特异性结合叶酸受体1 (FolR1)的抗原结合模块包含：如SEQ ID NO: 55的氨基酸序列所示的可变重链和如SEQID NO: 64的氨基酸序列所示的可变轻链。
8.权利要求1的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中该能够特异性结合FolR1的抗原结合模块包含：如SEQ ID NO: 274的氨基酸序列所示的可变重链和如SEQ ID NO: 31的氨基酸序列所示的可变轻链。
9.权利要求7的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中该第一抗原结合模块是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定区任一是交换的。
10.权利要求1至9任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其另外包含
(iv)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
11.权利要求10的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中该Fc域为IgG类免疫球蛋白Fc域。
12.权利要求11的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中该Fc域为IgG1或IgG4 Fc域。
13.权利要求10的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中该Fc域为人Fc域。
14.权利要求10的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中该Fc域包含促进该Fc域的第一亚基和第二亚基联合的修饰。
15.权利要求14的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中在该Fc域的第一亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3域内生成隆起，该隆起可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中，且在该Fc域的第二亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3域内生成空腔，该空腔内可安置第一亚基的CH3域内的隆起。
16.权利要求10的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中该Fc域包含至少一处与天然IgG1 Fc域相比降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代。
17.权利要求16的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中该Fc域的每个亚基包含三处降低对活化性Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为依照Kabat编号方式的L234A，L235A和P329G。
18.一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其由一条如SEQ ID NO: 276的氨基酸序列所示的多肽，一条如SEQ ID NO: 277的氨基酸序列所示的多肽和两条如SEQ ID NO: 35的氨基酸序列所示的多肽组成。
19.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至18中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。
20.一种载体，其包含权利要求19的多核苷酸。
21.权利要求20的载体，其为表达载体。
22.一种宿主细胞，其包含权利要求19的多核苷酸或权利要求20或21的载体。
23.一种生成能够特异性结合CD3和靶细胞抗原的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，其包括下述步骤：a) 在适合于表达该T细胞活化性双特异性抗原结合分子的条件下培养权利要求22的宿主细胞，并b) 回收该T细胞活化性双特异性抗原结合分子。
24.一种药物组合物，其包含权利要求1至18中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子和药学可接受载剂。
25.权利要求1至18中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或权利要求24的药物组合物，其用作药物。
26.权利要求1至18中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或权利要求24的药物组合物，其用于治疗有所需要的个体中的FolR1阳性癌症。
27.权利要求1至18中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子制造用于治疗有所需要的个体中的FolR1阳性癌症的药物的用途。
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