ES2829829T3

ES2829829T3 - Moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T contra FolR1 y CD3

Info

Publication number: ES2829829T3
Application number: ES15797970T
Authority: ES
Inventors: Marina Bacac; Peter Bruenker; Anne Freimoser-Grundschober; Ralf Hosse; Christian Klein; Ekkehard Moessner; Pablo Umana; Tina Weinzierl
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-11-20
Filing date: 2015-11-17
Publication date: 2021-06-02
Anticipated expiration: 2035-11-17
Also published as: TWI756164B; HUE051715T2; JP2021058189A; UA122676C2; MX2017006571A; EA201791121A1; SG11201702976TA; BR112017007086A2; JP2017536121A; CR20170203A; DK3221356T3; KR102648966B1; AU2015348595A1; AR102732A1; ZA201701843B; IL251292A0; JP7146395B2; RS61010B1; CN107074955B; PT3221356T

Abstract

Una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende (i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica a CD3, y que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34; (ii) un segundo resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1); en el que el resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR1 comprende: a) la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 16, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 17, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 18, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 33 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 34; b) la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 8, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 56, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 57, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 59, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 60 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 65; o c) la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 16, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 275, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 315, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 33 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 34

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T contra FolRI y CD3

Listado de secuencias

La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia en ASCII, creada el 9 de noviembre de 2015, se denomina 32186_SL.txt.txt y tiene un tamaño de 445.570 bytes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T, en particular a anticuerpos biespecíficos dirigidos a CD3 y al receptor de folato 1 (FolR1). Además, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican dichas moléculas de unión a antígeno biespecíficas, y vectores y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos. La invención se refiere además a procedimientos para producir las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención, y a procedimientos de uso de estas moléculas de unión a antígeno biespecíficas en el tratamiento de enfermedad.

Antecedentes

La destrucción selectiva de una célula individual o un tipo de célula específico a menudo es deseable en una variedad de situaciones clínicas. Por ejemplo, un objetivo principal del tratamiento del cáncer es destruir específicamente las células tumorales, dejando las células y tejidos sanos intactos y sin daños.

Una forma atractiva de lograr esto es induciendo una respuesta inmunitaria contra el tumor, para hacer que las células efectoras inmunitarias tales como los linfocitos citolíticos naturales (NK) o los linfocitos T citotóxicos (CTL) ataquen y destruyan las células tumorales. Los CTL constituyen las células efectoras más potentes del sistema inmunitario; sin embargo, no se pueden activar por el mecanismo efector mediado por el dominio Fc de anticuerpos terapéuticos convencionales.

A este respecto, los anticuerpos biespecíficos diseñados para unirse con un "brazo" a un antígeno de superficie en células diana, y con el segundo "brazo" a un componente invariante activador del complejo receptor de linfocitos T (TCR), se han vuelto de interés en los últimos años. La unión simultánea de un anticuerpo de este tipo a ambas de sus dianas forzará una interacción temporal entre la célula diana y el linfocito T, provocando la activación de cualquier linfocito T citotóxico y la posterior lisis de la célula diana. Por tanto, la respuesta inmunitaria se redirige a las células diana y es independiente de la presentación de antígenos peptídicos por la célula diana o la especificidad del linfocito T como sería pertinente para la activación normal restringida a MHC de CTL. En este contexto, es crucial que los CTL solo se activen cuando una célula diana les presente el anticuerpo biespecífico, es decir, se imite la sinapsis inmunológica. Son en particular deseables anticuerpos biespecíficos que no requieren preacondicionamiento o coestimulación de linfocitos para provocar lisis eficaz de células diana.

FolR1 se expresa en células tumorales epiteliales de diversos orígenes, por ejemplo, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer renal, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio. Se han descrito varios enfoques para actuar sobre FolR1 con anticuerpos terapéuticos, tales como farletuzumab, conjugados anticuerpo-fármaco o tratamiento adoptivo con linfocitos T para la formación de imágenes de tumores (Kandalaft et al., J Transl Med. 2012 Ago 3;10:157. doi: 10.1186/1479-5876-10-157; van Dam et al., Nat Med. 2011 Sept 18;17(10):1315-9. doi: 10.1038/nm.2472; Clifton et al., Hum Vaccin. 2011 Feb;7(2): 183-90. Publicación electrónica: 1 de febrero de 2011; Kelemen et al., Int J Cancer. 15 de julio de 2006; 119(2):243-50; Vaitilingam et al., J Nucl Med. 2012 Jul;53(7); Teng et al., 2012 Ago;9(8):901-8. doi: 10.1517/17425247.2012.694863. Publicación electrónica: 5 de junio de 2012. Se han realizado algunas tentativas de actuar sobre tumores que expresan el receptor de folato con construcciones dirigidas al receptor de folato y CD3 (Kranz et al., Proc Natl Acad Sci USA. 26 de septiembre de 1995; 92(20): 9057-9061; Roy et al., Adv Drug Deliv Rev. 2004 Abr 29;56(8): 1219-31; Huiting Cui et al., Biol Chem. 2012 Ago 17; 287(34): 28206-28214; Lamers et al., Int. J. Cancer.

60(4):450 (1995); Thompson et al., MAbs. 2009 Jul-Ago;1(4):348-56. Publicación electrónica: 19 de julio de 2009; Mezzanzanca et al., Int. J. Cancer, 41, 609-615 (1988). El documento WO2014151910 describe anticuerpos biespecíficos heteroméricos. El documento WO2015048272 describe anticuerpos biespecíficos diméricos. Sin embargo, los enfoques adoptados hasta ahora tienen muchos inconvenientes. Las moléculas utilizadas hasta ahora no se podían producir de manera fácil y fiable, ya que requieren entrecruzamiento químico. De forma similar, no se pueden producir a gran escala moléculas híbridas como proteínas humanas y requieren el uso de proteínas de rata, murinas u otras que son altamente inmunogénicas cuando se administran a humanos y, por tanto, de valor terapéutico limitado. Además, muchas de las moléculas existentes conservaron la unión a FcyR. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de novedosos anticuerpos biespecíficos mejorados para la inmunoterapia dirigida mediada por linfocitos T. La presente invención proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas diseñadas para la activación de linfocitos T seleccionados, en particular, moléculas de unión a antígeno biespecíficas adecuadas como agentes terapéuticos eficaces y seguros que se pueden producir y dosificar fácilmente.

Sumario de la invención

La materia objeto de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas. En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende

(i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica a CD3, y que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34; y

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1);

en el que el resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR1 comprende:

a) la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 16, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 17, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 18, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, la CDR2 de la cadena ligera de SeQ ID NO: 33 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 34;

b) la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 8, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 56, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 57, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 59, la CDR2 de la cadena ligera de S^eQ ID NO: 60 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 65; o

c) la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 16, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 275, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 315, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 33 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 34.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende un primer resto de unión a antígeno que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende adicionalmente (iii) un tercer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR1. En un modo de realización, el segundo y tercer resto de unión a antígeno que se pueden unir de forma específica a FolR1 comprenden secuencias idénticas de región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada y de CDR de la cadena ligera. En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno es idéntico al segundo resto de unión a antígeno.

En un modo de realización de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de los modos de realización anteriores, al menos uno del segundo y tercer resto de unión a antígeno es una molécula Fab. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de los modos de realización anteriores comprende adicionalmente un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable. En algunos modos de realización, el primer resto de unión a antígeno y el segundo resto de unión a antígeno se conectan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. En algunos modos de realización, un tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, opcionalmente por medio de un conector peptídico.

En un modo de realización de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de los modos de realización anteriores, el resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1) comprende al menos una secuencia de aminoácidos de región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1) comprende al menos una secuencia de aminoácidos de región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolRI) comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64.

En otro aspecto, el resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1) comprende al menos una secuencia de aminoácidos de región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 50 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54. En un aspecto, el resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR1 comprende (a) una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada 1 de región determinante de la complementariedad (CDR-H1) de SEQ ID NO: 8; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR-H2 de SEQ ID NO: 9; (c) una secuencia de aminoácidos de CDR-H3 de SEQ ID NO: 50; (d) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera 1 de región determinante de la complementariedad (CDR-L1) de SEQ ID NO: 52; (e) una secuencia de aminoácidos de CDR-L2 de SEQ ID NO: 53 y (f) una secuencia de aminoácidos de cDr-L3 de SEQ ID NO: 54. En un aspecto, el resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR1 comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.

En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1) comprende al menos una secuencia de aminoácidos de región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 275 y SEQ iD NO: 315 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR1 comprende (a) una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada 1 de región determinante de la complementariedad (CDR-H1) de SEQ ID NO: 16; (b) una secuencia de aminoácidos de ^{CDR-H2 de SEQ ID}nO: 275; (c) una secuencia de aminoácidos de CDR-H3 de SEQ ID NO: 315; (d) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera 1 de región determinante de la complementariedad (CDR-L1) de SEQ ID NO: 32; (e) una secuencia de aminoácidos de CDR-L2 de SEQ ID NO: 33 y (f) una secuencia de aminoácidos de CDR-L3 de SEQ ID NO: 34. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR1 comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 274 y un dominio variable de la cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de los modos de realización anteriores se une a un FolR1 humano. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de los modos de realización anteriores se une a un FolR1 humano y un FolR1 de macaco cangrejero. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de los modos de realización anteriores se une a un FolR1 humano, un FolR1 de macaco cangrejero y un FolR1 murino. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de los modos de realización anteriores se une a un FolR1 humano, un FolR1 de macaco cangrejero y no a un FolR1 murino.

En un modo de realización de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones variables o constantes de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores comprende no más de un resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a CD3. En un modo de realización de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, el primer y el segundo resto de unión a antígeno y el dominio Fc forman parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de inmunoglobulina de la clase IgG, específicamente un dominio Fc de IgG1 o de IgG4. En un modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc humano.

En un modo de realización de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores, el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que se puede colocar en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro de la que se puede colocar la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad. En un modo de realización, el dominio Fc comprende al menos una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc y/o la función efectora, respecto a un dominio Fc de IgG1 natural. En un modo de realización, cada subunidad del dominio Fc comprende tres sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc activador y/o la función efectora en la que dichas sustituciones aminoacídicas son L234A, L235A y P329G (numeración de Kabat). En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de F^cy. En un modo de realización, la función efectora es citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

En un modo de realización de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la proliferación de un linfocito T humano CD3+ in vitro. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica humana de una célula tumoral humana que expresa FolR1 in vitro. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por linfocitos T de una célula tumoral humana que expresa FolR1 in vitro. En un modo de realización, el linfocito T es un linfocito T CD8+. En un modo de realización, la célula tumoral humana que expresa FolR1 es una célula Hela, Skov-3, HT-29 o HRCEpiC. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por linfocitos T de la célula tumoral humana que expresa FolR1 in vitro con una CE50 de entre aproximadamente 36 pM y aproximadamente 39573 pM después de 24 horas. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por linfocitos T de la célula tumoral que expresa FolR1 in vitro con una CE50 de aproximadamente 36 pM después de 24 horas. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por linfocitos T de la célula tumoral que expresa FolR1 in vitro con una CE50 de aproximadamente 178,4 pM después de 24 horas. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por linfocitos T de la célula tumoral que expresa FolR1 in vitro con una CE50 de aproximadamente 134,5 pM o mayor después de 48 horas.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores induce la regulación por incremento de la expresión en la superficie celular de al menos uno de CD25 y CD69 en el linfocito T, medida por citometría de flujo. En un modo de realización, el linfocito T es un linfocito T CD4+ o un linfocito T CD8+. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores se une a FolR1 humano con una K^daparente de aproximadamente 5,36 pM a aproximadamente 4 nM. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 humano y de macaco cangrejero con una K^daparente de aproximadamente 4 nM. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 murino con una K^daparente de aproximadamente 1,5 nM. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 humano con una K^dde unión monovalente de al menos aproximadamente 1000 nM.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores es específica para FolR1 y no se une a FolR2 o FolR3. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores tiene una afinidad (unión monovalente) de 1 pM o mayor. En un modo de realización, la afinidad es de aproximadamente 1,4 pM por FolR1 humano. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores tiene una avidez (unión bivalente) de aproximadamente 1-100 nM o menor. En un modo de realización, la avidez es de aproximadamente 10 nM o menor. En un modo de realización, la avidez es 10 nM.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores se une a FolR1 que se expresa en una célula tumoral humana. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores se une a un epítopo conformacional de FolR1 humano. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores no se une al receptor de folato 2 (FolR2) humano ni al receptor de folato 3 (FolR3) humano. En un modo de realización de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores, el resto de unión a antígeno se une a un polipéptido de FolR1 que comprende los aminoácidos 25 a 234 de FolR1 humano (SEQ ID NO: 227). En un modo de realización de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores, el resto de unión a antígeno FolR1 se une a un polipéptido de FolR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 227, 230 y 231, y en la que el resto de unión a antígeno FolR1 no se une a un polipéptido de FolR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 228 y 229.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un primer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a CD3, y un segundo resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1), en el que la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une al mismo epítopo de FolR1 humano que un primer anticuerpo de referencia que comprende un dominio de la cadena pesada variable (VH) de SEQ iD NO: 274 y un dominio de la cadena ligera variable (VL) de SEQ ID NO: 31; y en el que la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une al mismo epítopo de CD3 humano que un segundo anticuerpo de referencia que comprende un dominio de la cadena pesada variable (VH) de SEQ ID NO: 36 y un dominio de la cadena ligera variable (VL) de SEQ ID NO: 31.

En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a FolR1 humano con un anticuerpo que comprende un dominio de la cadena pesada variable (VH) de SEQ ID NO: 274 y un dominio de la cadena ligera variable de SEQ ID NO: 31, en el que la competición por la unión se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial.

En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, en la que la molécula de unión a antígeno comprende una primera, segunda, tercera, cuarta y quinta cadena polipeptídica que forman un primer, un segundo y un tercer resto de unión a antígeno, en la que el primer resto de unión a antígeno se puede unir a CD3 y el segundo y tercer resto de unión a antígeno se pueden unir al receptor de folato 1 (FolR1), en el que a) la primera y la segunda cadena polipeptídica comprenden, en dirección desde el extremo amino (N) al extremo carboxilo (C), VLD1 y CLD1; b) la tercera cadena polipeptídica comprende, en dirección desde el extremo N al extremo C, VLD2 y CH1D2; c) la cuarta cadena polipeptídica comprende, en dirección desde el extremo N al extremo C, VHD1, CH1D1, CH2D1 y CH3D1; d) la quinta cadena polipeptídica comprende VHD1, CH1D1, VHD2, CLD2, CH2D2 y CH3D2; en la que VLD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera, VLD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera, CLD1 es un primer dominio constante de la cadena ligera, CLD2 es un segundo dominio constante de la cadena ligera, VHD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada, VHD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada, CH1D1 es un primer dominio constante de la cadena pesada 1, CH1D2 es un segundo dominio constante de la cadena pesada 1, CH2D1 es un primer dominio constante de la cadena pesada 2, CH2D2 es un segundo dominio constante de la cadena pesada 2, CH3D1 es un primer dominio constante de la cadena pesada 3 y CH3D2 es un segundo dominio constante de la cadena pesada 3.

En un modo de realización de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, (i) la tercera cadena polipeptídica y VHD2 y CLD2 de la quinta cadena polipeptídica forman el primer resto de unión a antígeno que se puede unir a CD3; (ii) la primera cadena polipeptídica y VHD1 y CH1D1 de la cuarta cadena polipeptídica forman el segundo resto de unión que se puede unir a FolR1; y (iii) la segunda cadena polipeptídica y VHD1 y CH1D1 de la quinta cadena polipeptídica forman el tercer resto de unión que se puede unir a FolR1. En un modo de realización, CH2D1, CH3D1, CH2D2 y CH3D2 forman un dominio Fc de una inmunoglobulina de clase IgG. En un modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc humano. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización, CH3D2 comprende un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral mayor, que se puede colocar en una cavidad dentro de CH3D1. En un modo de realización, el dominio Fc comprende al menos una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc y/o la función efectora, respecto a un dominio Fc de IgG1 natural. En un modo de realización, cada subunidad del dominio Fc comprende tres sustituciones aminoacídicas que reducen al menos uno de la unión a un receptor de Fc activador y la función efectora en la que dichas sustituciones aminoacídicas son L234A, L235A y P329G de acuerdo con la numeración de Kabat. En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En uno de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la proliferación de un linfocito T humano CD3+ in vitro. En uno de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica humana de una célula tumoral humana que expresa FolR1 in vitro. En uno de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por linfocitos T de una célula tumoral humana que expresa FolR1 in vitro. En un modo de realización de este tipo, la célula tumoral humana que expresa FolR1 es una célula Hela, Skov-3, HT-29 o HRCEpiC. En uno de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por linfocitos T de la célula tumoral que expresa FolR1 in vitro con una CE50 de entre aproximadamente 36 pM y aproximadamente 39573 pM después de 24 horas. En uno de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por linfocitos T de la célula tumoral que expresa FolR1 in vitro con una CE50 de aproximadamente 36 pM después de 24 horas. En uno de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por linfocitos T de la célula tumoral que expresa FolR1 in vitro con una CE50 de aproximadamente 178,4 pM después de 24 horas. En uno de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por linfocitos T de la célula tumoral que expresa FolR1 in vitro con una CE50 de aproximadamente 134,5 pM o mayor después de 48 horas. En uno de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la regulación por incremento de la expresión en la superficie celular de al menos uno de CD25 y CD69 en el linfocito T, medida por citometría de flujo. En uno de dichos modos de realización, el linfocito T es un linfocito T CD4+ o un linfocito T CD8+. En uno de los modos de realización anteriores, en el que la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 humano con una K^daparente de aproximadamente 5,36 pM a aproximadamente 4 nM. En uno de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 humano y de macaco cangrejero con una K^daparente de aproximadamente 4 nM. En uno de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 murino con una K^daparente de aproximadamente 1,5 nM. En uno de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 humano con una K^dde unión monovalente de al menos aproximadamente 1000 nM. En uno de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 que se expresa en una célula tumoral humana. En uno de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a un epítopo conformacional de FolR1 humano. En uno de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T no se une al receptor de folato 2 (FolR2) humano ni al receptor de folato 3 (FolR3) humano. En uno de los modos de realización anteriores, el resto de unión a antígeno se une a un polipéptido de FolR1 que comprende los aminoácidos 25 a 234 de FolR1 humano (SEQ ID NO: 227). En uno de los modos de realización anteriores, el resto de unión a antígeno FolR1 se une a un polipéptido de FolR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 227, 230 y 231, y en el que el resto de unión a antígeno FolR1 no se une a un polipéptido de FolR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 228 y 229. En uno de los modos de realización anteriores, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T es una molécula humanizada o quimérica. En uno de los modos de realización anteriores, VHD2 y CH1D1 se unen a través de un conector peptídico.

En uno de los aspectos anteriores de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, la primera y la segunda cadena polipeptídica comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 230. En uno de los modos de realización anteriores de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86. En uno de los aspectos anteriores de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, la cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 309. En uno de los aspectos anteriores de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, la quinta cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 308. En uno de los aspectos anteriores de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, la primera y segunda cadena polipeptídica comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 230; la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; la cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 309; y la quinta cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 308.

En un aspecto, la descripción proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 308. En un aspecto, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T del modo de realización anterior comprende además la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 230 y de SEQ ID NO: 86.

En un aspecto, la descripción proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 308. En un aspecto, el aspecto proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 309.

En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 276. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T del modo de realización anterior comprende además la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 277 y de SEQ ID NO: 35.

En un aspecto, la descripción proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 277. En un aspecto, la descripción proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 276.

En un aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de uno cualquiera de los modos de realización de la invención.

En un aspecto, la descripción proporciona un polipéptido aislado codificado por el polinucleótido del modo de realización anterior. En otro aspecto, la invención proporciona un vector, en particular un vector de expresión, que comprende el polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de uno cualquiera de los modos de realización de la invención. En otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped que comprende un polinucleótido o vector de cualquiera de los modos de realización de la invención.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento de producción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que se puede unir de forma específica a CD3 y a un antígeno de una célula diana, que comprende las etapas de a) cultivar la célula huésped de los modos de realización anteriores en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T y b) recuperar la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T.

En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T producida por el procedimiento del modo de realización anterior.

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de uno cualquiera de los modos de realización anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la invención proporciona la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de uno cualquiera de los modos de realización anteriores o la composición farmacéutica de cualquiera de los modos de realización anteriores para su uso como medicamento.

En un aspecto, la invención proporciona la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de uno cualquiera de los modos de realización anteriores o la composición farmacéutica de uno cualquiera de los modos de realización anteriores para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesite. En algunos modos de realización, la enfermedad es cáncer. En un aspecto, la invención proporciona un uso de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de uno cualquiera de los modos de realización anteriores para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de uno cualquiera de los modos de realización anteriores en una forma farmacéuticamente aceptable. En algunos modos de realización, dicha enfermedad es cáncer.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para inducir la lisis de una célula diana, que comprende poner en contacto una célula diana con la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de uno cualquiera de los modos de realización anteriores en presencia de un linfocito T.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-I ilustran configuraciones ejemplares de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T (TCB) de la invención. Todas las construcciones, excepto el formato kappa-lambda en (Fig. 1I) tienen mutaciones P329G LALA y comprenden fragmentos Fc de botón en ojal con modificaciones de botón en ojal. (Fig. 1A) Ilustración de la 'TCB anti-FolR1 2+1, invertida (cadena ligera común)". La molécula de unión a FolR1 se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón. Estas construcciones no se cruzan y tienen tres veces la misma cadena ligera VLCL. (Fig. 1B) Ilustración de la "TCB anti-FolR1 1+1, cabeza a cola (cadena ligera común)". Estas construcciones no se cruzan y tienen dos veces la misma cadena ligera VLCL. (Fig. 1C) Ilustración de la "TCB anti-FolR1 1+1, clásica (cadena ligera común)". Estas construcciones no se cruzan y tienen dos veces la misma cadena ligera VLCL. (Fig. 1D) Ilustración de la "TCB anti-FolR1 2+1, clásica (cadena ligera común)". La molécula de unión a CD3 se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón. Estas construcciones no se cruzan y tienen tres veces la misma cadena ligera VLCL. (Fig. 1E) Ilustración de la "TCB anti-FolR1 2+1 crossfab, clásica". Estas construcciones comprenden una cadena C^k-VH para la molécula de unión a CD3 en lugar de la cadena CH1-VH convencional. La molécula de unión a CD3 se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón. (Fig. 1F) Ilustración de la "TCB anti-FolR1 2+1 crossfab, invertida". Estas construcciones comprenden una cadena C^k-VH para la molécula de unión a CD3 en lugar de la cadena CH1-VH convencional. La molécula de unión a FolR1 se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón. (Fig. 1G) Ilustración de la "TCB anti-FolR1 1 1 crossfab, cabeza a cola". Estas construcciones comprenden una cadena C^k-VH para la molécula de unión a CD3 en lugar de la cadena CH1-VH convencional. (Fig. 1H) Ilustración de la "TCB anti-FolR1 1 1 crossfab, clásica". Estas construcciones comprenden una cadena C^k-VH para la molécula de unión a CD3 en lugar de la cadena CH1-VH convencional. La figura 1I ilustra el formato de anticuerpo CD3/FolR1 kappa-lambda. Estas construcciones comprenden una cadena ligera común cruzada VLCH1 y una cadena VHCL cruzada específica para CD3 y una cadena VHCL cruzada específica para FolR1.

Las figuras 2A-C representan gráficos que resumen la unión de moléculas de unión IgG anti-FolR1 en células HeLa. La unión de las moléculas de unión a FolR1 generadas recientemente a FolR1 expresado en células HeLa se determinó por citometría de flujo. Los anticuerpos unidos se detectaron con un anticuerpo contra anticuerpo humano secundario marcado con fluorescencia.

Las figuras 3A-B representan gráficos que resumen la especificidad de moléculas de unión a FolR1 por FolR1. La unión de las IgG anti-FolR1 a las células HEK transfectadas de forma transitoria con FolR1 o FolR2 se analizó por citometría de flujo para identificar clones que se unen específicamente a FolR1 y no a FolR2. Los anticuerpos se detectaron con un anticuerpo contra anticuerpo humano secundario marcado con fluorescencia.

Las figuras 4A-B representan gráficos que resumen la reactividad cruzada de moléculas de unión a FolRI contra cyFolR1. La reactividad cruzada de los anticuerpos anti-FolR1 contra FolR1 de macaco se examinó en células HEK transfectadas de forma transitoria con cyFolR1 por citometría de flujo. Los anticuerpos se detectaron con un anticuerpo contra anticuerpo humano secundario marcado con fluorescencia.

La figura 5 representa un gráfico que ilustra la internalización de las TCB anti-FolR1 después de la unión. La internalización de las cuatro TCB anti-FolR1 después de la unión a FolR1 se sometió a prueba en células HeLa. Las TCB anti-FolR1 que quedaban en la superficie se detectaron con un anticuerpo contra anticuerpo humano secundario marcado con fluorescencia después de los tiempos de incubación indicados a 37 °C. Se calculó el porcentaje de internalización.

Las figuras 6A-E representan gráficos que resumen la unión de IgG anti-FolR1 a células con diferentes niveles de expresión de FolR1. La unión de las IgG 9D11, 16D5 y Mov19 a células tumorales con diferentes niveles de expresión de FolR1 se analizó por citometría de flujo. La IgG DP47 se incluyó como control de isotipo y MKN-45 se incluyó como línea celular negativa para FolR1. Los anticuerpos se detectaron con un anticuerpo contra anticuerpo humano secundario marcado con fluorescencia.

Las figuras 7A-L representan gráficos que resumen la destrucción mediada por linfocitos T de células HT-29 y SKOV3. Se usaron TCB anti-FolR1 para someter a prueba la destrucción mediada por linfocitos T de células tumorales HT-29 y SKOV3 y la regulación por incremento del marcador de activación en linfocitos T tras la destrucción. (Figs. 7A-D) La destrucción mediada por linfocitos T de células HT-29 y SKOV3 en presencia de TCB 9D11 anti-FolR1 y TcB 16D5 anti-FolR1 se midió por liberación de LDH después de 24 h y 48 h. La TCB DP47 se incluyó como control negativo. Después de 48 h de incubación, la regulación por incremento de los marcadores de activación CD25 y CD69 en linfocitos T CD8 y linfocitos T CD4 tras la destrucción de células tumorales SKOV3 (Fig. 7E-H) o HT-29 (Fig. 7I-L) se evaluó por citometría de flujo.

La figura 8 representa un gráfico que muestra la ausencia de unión de anticuerpos anti-FolR1 a eritrocitos. Los eritrocitos se seleccionaron como población con expresión de CD235a y la unión de IgG 9D11, IgG 16D5, IgG Mov19 e IgG DP47 a esta población se determinó por citometría de flujo. Los anticuerpos se detectaron con un anticuerpo contra anticuerpo humano secundario marcado con fluorescencia.

Las figuras 9A-D representan gráficos que resumen la regulación por incremento del marcador de activación en sangre completa. La regulación por incremento de los marcadores de activación CD25 y CD69 de linfocitos T CD4 y linfocitos T CD824 h después de la adición de TCB 9D11 anti-FolR1, TCB 16D5 anti-FolR1, TCB Mov19 anti-FolR1 y TCB DP47 se analizó por citometría de flujo.

Figura 10 Unión de variantes aglucosiladas de TCB 9D11 a células HeLa. La unión de variantes aglucosiladas de TCB 9D11 anti-FolR1 a células HeLa se comparó con la unión de la TCB 9D11 original a células HeLa. Los anticuerpos se detectaron con un anticuerpo contra anticuerpo humano secundario marcado con fluorescencia y la unión se determinó por citometría de flujo.

Las figuras 11A-F representan gráficos que resumen la destrucción mediada por linfocitos T con variantes aglucosiladas de TCB 9D11 anti-FolR1 de células tumorales. Se usaron variantes aglucosiladas de TCB 9D11 anti-FolR1 para someter a prueba la destrucción mediada por linfocitos T de células tumorales (Fig. 11A-D) ^SKOV3,mKN-45 (como control negativo de FolR1) y (Fig. 11E-F) HT-29 en comparación con la destrucción con la TCB 9D11 anti-FolR1 original. Como valor de lectura se usó la liberación de LDH después de 24 h y 48 h. Las figuras 12A-X representan gráficos que resumen la destrucción mediada por linfocitos T de células epiteliales primarias. Se usaron células epiteliales primarias con niveles muy bajos de FolR1 para someter a prueba la destrucción mediada por linfocitos T con TcB 16D5 anti-FolR1 y tCb 9D11 anti-FolR1, TCB DP47 se incluyó como control negativo y las células HT29 se incluyeron como control positivo. (Figs. 12A-H) La liberación de LDH en células del epitelio pigmentario de la retina humano (HRP), de la corteza renal humana (HRC), bronquiales humanas (HB) y HT29 se determinó después de 24 h y 48 h. La regulación por incremento de los marcadores de activación CD25 y CD69 en linfocitos T CD4 y linfocitos T CD8 tras la destrucción de (Figs. 12I-L) HRP, (Figs. 12M-P) HRC, (Figs. 12Q-T) HB y (Figs. 12U-X) HT29 se determinó después de 48 h por citometría de flujo.

Las figuras 13A-C muestran una comparación de diferentes formatos de TCB con 16D5. Se compararon cuatro formatos de TCB diferentes que contienen la molécula de unión a FolR1 16D5 en cuanto a la unión a células HeLa en la Fig. 13A, la destrucción mediada por linfocitos T de células SKOV3 después de 24 h y 48 h en la Fig. 14B y la regulación por incremento de los marcadores de activación CD25 y CD69 en linfocitos T CD4 y linfocitos T CD848 h después de la destrucción en la Fig. 14C.

Las figuras 14A-C representan una comparación de diferentes formatos de TCB con 9D11. Se compararon tres formatos de TCB diferentes que contienen la molécula de unión a FolR1 9D11 en cuanto a A) la unión a células HeLa, B), la destrucción mediada por linfocitos T de células SKOV3 después de 24 h y 48 h y C) la regulación por incremento de los marcadores de activación CD25 y CD69 en linfocitos T CD4 y linfocitos T CD8 48 h después de la destrucción.

La figura 15 representa un perfil FC de TCB anti-FolR1 en ratones NOG para tres dosis diferentes.

La figura 16 ilustra un protocolo experimental para el estudio de eficacia con TCB anti-FolR1.

Las figuras 17A-B representan curvas de crecimiento tumoral. (Fig. 17A) Valores medios y EEM de los volúmenes tumorales en los diferentes grupos de tratamiento. (Fig. 17B) Crecimiento tumoral de ratones individuales en todos los grupos de tratamiento. ICT (inhibición del crecimiento tumoral) proporciona el porcentaje del volumen tumoral medio en comparación con el grupo de vehículo.

La figura 18 muestra los pesos de los tumores al finalizar el estudio.

Las figuras 19A-B muestran el análisis por FACS de linfocitos T infiltrantes de tumor el día 32 del estudio. (Fig. 19A) Se tiñeron suspensiones de células individuales tumorales con anticuerpo anti-CD3/CD4/CD8 humano y se analizaron por citometría de flujo. (Fig. 19B) Valores medios y EEM de recuentos de linfocitos T por mg de tejido tumoral en diferentes grupos de tratamiento.

Las figuras 20A-B muestran el análisis por FACS de la activación/desgranulación de linfocitos T y la secreción de citocinas el día 32 del estudio. Los linfocitos T infiltrantes de tumor CD4+ (Fig. 20A) y CD8+ (Fig. 20B) se tiñeron para citocinas, marcadores de activación y desgranulación. Se muestran los valores medios y el EEM de los recuentos de linfocitos T por mg de tejido tumoral en diferentes grupos de tratamiento.

Las figuras 21A-B muestran el porcentaje de lisis tumoral. Las células SKOV3 se incubaron con PBMC en presencia de TCB DP47 o TCB anti-FolR1 kappa lambda. Después de 24 h (Fig. 21A) y 48 h (Fig. 21B), se determinó la destrucción de células tumorales midiendo la liberación de LDH.

Las figuras 22A-D muestran la regulación por incremento de CD25 y CD69 en linfocitos T CD4. Las células SKOV3 se incubaron con PBMC en presencia de TCB DP47 o TCB anti-FolR1 kappa lambda. Después de 48 h, se midió la regulación por incremento de CD25 y CD69 en linfocitos T CD4 (Fig. 22A-B) y linfocitos T CD8 (Fig. 22C-D) por citometría de flujo.

Las figuras 23A-B muestran el porcentaje de lisis tumoral. Destrucción por linfocitos T de células SKov-3 (expresión media de FolR1) inducida por TCB 36F2, TCB Mov19 y TCB 21a5 después de 24 h (Fig. 23A) y 48 h (Fig. 23B) de incubación (E:T = 10:1, PBMC efectores humanos).

Las figuras 24A-C muestran la destrucción por linfocitos T inducida por TCB 36F2, TCB 16D5, TCB 16D5 clásicas, TCB 16D5 1 1 y TCB 16D5 HT de células tumorales humanas HeLa (expresión alta de FolR1) (Fig. 24A), Skov-3 (expresión media de FolR1) (Fig. 24B) y HT-29 (expresión baja de FolR1) (Fig. 24C) (E:T = 10:1, PBMC efectores humanos, tiempo de incubación 24 h). La TCB DP47 se incluyó como control sin propiedades de unión.

Las figuras 25A-C muestran la regulación por incremento de CD25 y CD69 en linfocitos T humanos CD8+ (Fig. 25A, B) y CD4+ (Fig. 25C) después de la destrucción mediada por linfocitos T de células HeLa (expresión alta de FolR1) (Fig. 25A), células SKov-3 (expresión media de FolR1) (Fig. 25B) y células HT-29 (expresión baja de ^{FolR1) (Fig. 25C) (E:T = 10:1, 48 h de incubación) inducida por}TcB 36F2, TCB 16D5 y TCB DP47 (control sin propiedades de unión).

Las figuras 26A-F muestran la destrucción por linfocitos T inducida por TCB 36F2, TCB 16D5 y TCB DP47 de células epiteliales de corteza renal humanas (Fig. 26A, B), células del epitelio pigmentario de la retina humanas (Fig. 26C, D) y células HT-29 (Fig. 26E, F) después de 24 h (Fig. 26A, C, E) y 48 h (Fig. 26B, D, F) de incubación (E:T = 10:1, PBMC efectores humanos).

La figura 27 representa una tabla que resume la cuantificación de los sitios de unión a FolR1 en diversas líneas celulares normales y cancerosas.

Las figuras 28A-B muestran la unión de TCB 16D5 y sus correspondientes variantes de desamidación de CD3 TCB 16D5 N100A y TCB 16D5 S100aA y de TCB 9D11 y sus variantes de desamidación TCB 9D11 N100A y TCB 9D11 S100aA a CD3 humano expresado en células Jurkat.

Las figuras 29A-B muestran la destrucción por linfocitos T de células tumorales humanas SKov-3 (expresión media de FolR1) inducida por TCB 16D5 y sus correspondientes variantes de desamidación de CD3 TCB 16D5 N100A y TCB 16D5 S100aA (Fig. 29A) y por TCB 9D11 y sus variantes de desamidación TCB 9D11 N100A y TCB 9D11 S100aA (Fig. 29B) (E:T = 10:1, PBMC efectores humanos, tiempo de incubación 24 h). La TCB DP47 se incluyó como control sin propiedades de unión.

Las figuras 30A-B muestran la destrucción por linfocitos T de células tumorales humanas HT-29 (expresión baja de FolR1) inducida por TCB 16D5 y sus correspondientes variantes de desamidación de CD3 TCB 16D5 N100A y TCB 16D5 S100aA (Fig. 30A) y por TCB 9D11 y sus variantes de desamidación TCB 9D11 N100A y TCB 9D11 S100aA (Fig. 30B) (E:T = 10:1, ^pB^mC efectores humanos, tiempo de incubación 24 h). La TCB DP47 se incluyó como control sin propiedades de unión.

Las figuras 31A-C muestran la intensidad media de fluorescencia y la lisis de células tumorales.

Las figuras 32A-E muestran la unión de TCB 36F2, TCB 16D5 y las variantes HC/LC de 16D5 a FolR1 humano expresado en células Hela.

La figura 33 muestra la unión de TCB 36F2, TCB 16D5 y las dos variantes de 16D5 de afinidad reducida TCB 16D5 W96Y/D52E y TCB 16D5 G49S/S93A a FolR1 humano en células Hela.

Las figuras 34A-E muestran la unión de TCB 36F2, TCB 16D5 y las variantes HC/LC de 16D5 a FolR1 humano expresado en células HT-29.

Las figuras 35A-D muestran la unión de las moléculas de unión a FolR1 intermedias (TCB 6E10, TCB 14B1 y TCB 9C7), TCB 16D5 y TCB 36F2 a células HEK293T que expresan FolR1 o FolR2 humano o de ratón.

Las figuras 36A-F muestran la destrucción por linfocitos T de células tumorales humanas Hela (expresión alta de FolR1), SKov-3 (expresión media de FolR1) y HT-29 (expresión baja de FolR1) inducida por moléculas de unión a FolR1 intermedias (TCB 6E10, TCB 14B1 y TCB 9C7), TCB 16D5 y TCB 36F2 después de 24 h (A-C) y 48 h (D-F) de incubación. Se utilizaron PBMC humanos como células efectoras (E:T = 10:1).

Las figuras 37A-F muestran la destrucción por linfocitos T de células tumorales humanas Hela (expresión alta de FolR1), SKov-3 (expresión media de FolR1) y HT-29 (expresión baja de FolR1) inducida por variantes de 16D5 con afinidad reducida (TCB 16D5-G49S/S93A, TCB 16D5-G49S/K53A, TCB 16D5 W96Y, TCB 16D5 W96Y/D52E), TCB 16D5 y TCB 36F2 después de 24 h (Fig. 38A-C) y 48 h (Fig. 38D-F) de incubación. Se utilizaron PBMC humanos como células efectoras (E:T = 10:1).

La figura 38A-F muestra la destrucción por linfocitos T de células humanas primarias de epitelio pigmentario de la retina y epitelio de la corteza renal inducida por variantes de 16D5 con afinidad reducida (TCB 16D5-G49S/S93A, TCB 16D5 W96Y/D52E), TCB 16D5, TCB 36F2 y la molécula de unión a FolR1 intermedia TCB 14B1 evaluada después de 24 h (Fig. 39A-C) y 48 h (Fig. 39D-F) de incubación (E:T = 10:1, PBMC efectores humanos). Se incluyeron células HT-29 (expresión baja de FolR1) como línea celular de control y TCB DP47 sirvió como control sin propiedades de unión.

Las figuras 39A-B muestran la FC de dosis únicas de construcciones de TCB anti-FolR1 en ratones NOG hembra.

Las figuras 40A-G muestran la eficacia in vivo de las construcciones de TCB anti-FolR1 (16D5, 16D5 G49S/S93A y 16D5 W96Y/D52E) después de la transferencia de PBMC humanos en ratones NOG portadores de Hela.

La figura 41 muestra que Farletuzumab (verde oscuro, segundo desde la parte superior) y Mov19 (gris, parte superior) se pueden unir a huFolR1 capturado en 16D5, lo que demuestra que las moléculas de unión de la serie 16D5 reconocen un epítopo distinto del que reconocen Farletuzumab o Mov19.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Los términos se usan en el presente documento como se usan en general en la técnica, a menos que se defina de otro modo a continuación.

Como se usa en el presente documento, el término "molécula de unión a antígeno" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. Ejemplos de moléculas de unión a antígeno son inmunoglobulinas y derivados, por ejemplo, fragmentos, de las mismas.

El término "biespecífica" quiere decir que la molécula de unión a antígeno se puede unir específicamente a al menos dos determinantes antigénicos distintos. Típicamente, una molécula de unión a antígeno biespecífica comprende al menos dos sitios de unión a antígeno, cada uno de los cuales es específico para un determinante antigénico diferente. En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica se puede unir simultáneamente a dos determinantes antigénicos, en particular dos determinantes antigénicos expresados en dos células distintas.

El término "valente" como se usa en el presente documento indica la presencia de un número especificado de sitios de unión a antígeno en una molécula de unión a antígeno. Como tal, el término "unión monovalente a un antígeno" indica la presencia de un (y no más de un) sitio de unión a antígeno específico para el antígeno en la molécula de unión a antígeno.

Un "sitio de unión a antígeno" se refiere al sitio, es decir, uno o más residuos de aminoácidos, de una molécula de unión a antígeno que proporciona interacción con el antígeno. Por ejemplo, el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo comprende residuos de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Una molécula de inmunoglobulina natural típicamente tiene dos sitios de unión a antígeno, una molécula Fab típicamente tiene un único sitio de unión a antígeno.

Como se usa en el presente documento, el término "resto de unión a antígeno" se refiere a una molécula polipeptídica que se une específicamente a un determinante antigénico. En un modo de realización, un resto de unión a antígeno puede dirigir la entidad a la que se une (por ejemplo, un segundo resto de unión a antígeno) a un sitio diana, por ejemplo, a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porta el determinante antigénico. En otro modo de realización, un resto de unión a antígeno puede activar la señalización a través de su antígeno diana, por ejemplo, un antígeno del complejo receptor de linfocitos T. Los restos de unión a antígeno incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, como se define adicionalmente en el presente documento. Los restos de unión a antígeno particulares incluyen un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende una región variable de la cadena pesada del anticuerpo y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo. En determinados modos de realización, los restos de unión a antígeno pueden comprender regiones constantes de anticuerpo, como se define adicionalmente en el presente documento y es conocido en la técnica. Las regiones constantes de la cadena pesada útiles incluyen cualquiera de los cinco isotipos: a, 6, £, ^yo p. Las regiones constantes de la cadena ligera útiles incluyen cualquiera de los dos isotipos: ^ky A.

Como se usa en el presente documento, el término "determinante antigénico" es sinónimo de "antígeno" y "epítopo" y se refiere a un sitio (por ejemplo, un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional constituida por diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une un resto de unión a antígeno, formando un complejo resto de unión a antígenoantígeno. Se pueden encontrar determinantes antigénicos útiles, por ejemplo, en las superficies de células tumorales, en las superficies de células infectadas por virus, en las superficies de otras células afectadas, en la superficie de células inmunitarias, libres en suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (ECM). Las proteínas denominadas antígenos en el presente documento, por ejemplo FolR1 y CD3, pueden ser cualquier forma natural de las proteínas de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. En un modo de realización particular, el antígeno es una proteína humana. Cuando se hace referencia a una proteína específica en el presente documento, el término engloba la proteína no procesada "de longitud completa", así como cualquier forma de la proteína que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de la proteína, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. Las proteínas humanas ejemplares útiles como antígenos incluyen, pero no se limitan a: FolR1 (receptor de folato alfa (FRA); proteína de unión a folato (FBP); FolR1 humano UniProt n.°: P15328; FolR1 murino UniProt n.°: P35846; FolR1 de macaco cangrejero UniProt n.°: G7PR14) y CD3, en particular la subunidad épsilon de CD3 (véase UniProt n.° P07766 (versión 130), NCBI RefSeq n.° NPJD00724.1, SeQ ID NO: 150 para la secuencia humana; o UniProt n.° Q95LI5 (versión 49), NCBI GenBank n.° BAB71849.1, para la secuencia de macaco cangrejero [Macaca fascicularis]). La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención se une a un epítopo de CD3 o un antígeno de célula diana que se conserva entre el CD3 o el antígeno diana de diferentes especies. En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención se une a CD3 y FolR1, pero no se une a FolR2 (receptor de folato beta FRB; o FolR2 humano UniProt n.°: P14207) o FolR3 (receptor de folato gamma; FolR3 humano UniProt n.°: P41439).

Por "unión específica" se quiere decir que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de las interacciones no deseadas o no específicas. La capacidad de un resto de unión a antígeno para unirse a un determinante antigénico específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, la técnica de resonancia de plasmón superficial (SPR) (analizada en un instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). En un modo de realización, el grado de unión de un resto de unión a antígeno a una proteína no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 % de la unión del resto de unión a antígeno al antígeno medida, por ejemplo, mediante SPR. En determinados modos de realización, un resto de unión a antígeno que se une al antígeno, o una molécula de unión a antígeno que comprende ese resto de unión a antígeno, tiene una constante de disociación (K^d) de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menos, por ejemplo, de 10'8 M a 10 13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10'13 M).

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un receptor) y su compañero de unión (por ejemplo, un ligando). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, un resto de unión a antígeno y un antígeno, o un receptor y su ligando). La afinidad de una molécula X por su compañera Y se puede representar en general por la constante de disociación (KD), que es la proporción de las constantes de velocidad de disociación y asociación (kdis y kas, respectivamente). Por tanto, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de velocidad, siempre que la proporción de las constantes de velocidad permanezca igual. La afinidad se puede medir por procedimientos bien establecidos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Un procedimiento particular para medir la afinidad es la resonancia de plasmón superficial (SPR).

"Unión reducida", por ejemplo, unión reducida a un receptor de Fc, se refiere a una disminución en la afinidad para la interacción respectiva, como se mide, por ejemplo, por SPR. Para mayor claridad, el término incluye también la reducción de la afinidad hasta cero (o por debajo del límite de detección del procedimiento analítico), es decir, la supresión completa de la interacción. A la inversa, "unión incrementada" se refiere a un incremento en la afinidad de unión para la interacción respectiva.

"Activación de linfocitos T" como se usa en el presente documento se refiere a una o más respuestas celulares de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, seleccionadas de: proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica y expresión de marcadores de activación. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención pueden inducir la activación de linfocitos T. Los ensayos adecuados para medir la activación de linfocitos T son conocidos en la técnica descrita en el presente documento.

Un "antígeno de célula diana" como se usa en el presente documento se refiere a un determinante antigénico presentado en la superficie de una célula diana, por ejemplo, una célula en un tumor tal como una célula cancerosa o una célula del estroma tumoral. En particular, "antígeno de célula diana" se refiere al receptor de folato 1.

Como se usa en el presente documento, los términos "primero" y "segundo" con respecto a los restos de unión a antígeno, etc., se usan por conveniencia para distinguir cuando hay más de uno de cada tipo de resto. El uso de estos términos no pretende conferir una orientación u orden específico de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T a menos que así se establezca explícitamente.

Una "molécula Fab" se refiere a una proteína que consiste en el dominio VH y CH1 de la cadena pesada (la "cadena pesada de Fab") y el dominio VL y CL de la cadena ligera (la "cadena ligera de Fab") de una inmunoglobulina.

El término "moléculas Fab que tienen cadenas ligeras VLCL idénticas", como se usa en el mismo, se refiere a moléculas de unión que comparten una cadena ligera, pero que aún tienen especificidades independientes, por ejemplo, que se pueden unir a CD3 o FolR1. En algunos modos de realización, las moléculas biespecíficas activadoras de los linfocitos T comprenden al menos dos moléculas Fab que tienen cadenas ligeras VLCL idénticas. Las cadenas pesadas correspondientes se remodelan y confieren unión específica al antígeno biespecífico activador de linfocitos T CD3 y al antígeno de célula diana FolR1, respectivamente.

Por "fusionado" se quiere decir que los componentes (por ejemplo, una molécula Fab y una subunidad de dominio Fc) se unen por enlaces peptídicos, directamente o bien por medio de uno o más conectores peptídicos. Como se usa en el presente documento, el término "monocatenaria" se refiere a una molécula que comprende monómeros de aminoácidos unidos linealmente por enlaces peptídicos. En determinados modos de realización, uno de los restos de unión a antígeno es una molécula Fab monocatenaria, es decir, una molécula Fab en la que la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab están conectadas por un conector peptídico para formar una única cadena peptídica. En dicho modo de realización particular, el extremo C de la cadena ligera de Fab se conecta al extremo N de la cadena pesada de Fab en la molécula Fab monocatenaria.

Por una molécula Fab "de entrecruzamiento" (también denominada "Crossfab") se quiere decir una molécula Fab en la que las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian, es decir, la molécula Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera y la región constante de la cadena pesada, y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada y la región constante de la cadena ligera. Para mayor claridad, en una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones variables de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian, la cadena peptídica que comprende la región constante de la cadena pesada se denomina en el presente documento "cadena pesada" de la molécula Fab de entrecruzamiento. A la inversa, en una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones constantes de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian, la cadena peptídica que comprende la región variable de la cadena pesada se denomina en el presente documento "cadena pesada" de la molécula Fab de entrecruzamiento. Un anticuerpo que comprende una o más CrossFab se denomina en el presente documento "CrossMab".

Al contrario que esto, por una molécula Fab "convencional" se quiere decir una molécula Fab en su formato natural, es decir, que comprende una cadena pesada compuesta por las regiones variable y constante de la cadena pesada (VH-CH1), y una cadena ligera compuesta por las regiones variable y constante de la cadena ligera (VL-CL). El término "molécula de inmunoglobulina" se refiere a una proteína que tiene la estructura de un anticuerpo natural. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la clase IgG son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguido de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamados región constante de la cadena pesada. De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguido de un dominio ligero constante (CL), también llamado región constante de la cadena ligera. La cadena pesada de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de cinco tipos, llamados a (IgA), 6 (IgD), £ (IgE), ^y(IgG) o p (IgM), algunos de los cuales se pueden dividir además en subtipos, por ejemplo, ^y1 (IgG1), Y2 (IgG2), Y3 (IgG3), Y4 (IgG4), a1 (IgA1) y a2 (IgA2). La cadena ligera de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), basados en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante. Una inmunoglobulina consiste esencialmente en dos moléculas Fab y un dominio Fc, unidos por medio de la región bisagra de inmunoglobulina.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenarias (por ejemplo, scFv) y anticuerpos de dominio único. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994); véase también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para obtener un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopos de unión al receptor de rescate y que tienen una semivida in vivo incrementada, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1). Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

El término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria de parte o la totalidad de un antígeno. Se puede proporcionar un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, por uno o más dominios variables de anticuerpo (también llamados regiones variables de anticuerpo). En particular, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH).

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen, en general, estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un único dominio VH o Vl puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son de secuencia hipervariable y/o forman bucles definidos estructuralmente ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos tetracatenarios naturales comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden en general residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), siendo las últimas las de variabilidad de secuencia más alta y/o estando implicadas en el reconocimiento antigénico. Con la excepción de la CDR1 en VH, las CDR comprenden en general los residuos de aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), y estos términos se usan en el presente documento de manera intercambiable en referencia a porciones de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) y Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987) han descrito esta región en particular, donde las definiciones incluyen residuos de aminoácidos superpuestos o subconjuntos de los mismos cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo esté dentro del alcance del término como se define y se usa en el presente documento. Los residuos de aminoácidos apropiados que engloban las CDR, como se define en cada una de las referencias citadas anteriormente, se exponen a continuación en la tabla A como comparación. Los números de residuos exactos que engloba una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria los residuos que comprende una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

TABLA A. Definiciones de CDR1

1 La numeración de todas las definiciones de CDR en la tabla A está de acuerdo con las convenciones de numeración expuestas por Kabat et al. (véase a continuación).

2 "AbM" con una "b" minúscula como se usa en la tabla A se refiere a las CDR definidas por el programa informático de modelado de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular.

Kabat et al. también definieron un sistema de numeración para secuencias de región variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de región variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en el presente documento, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique de otro modo, las referencias a la numeración de posiciones de residuos de aminoácidos específicas en una región variable de anticuerpo están de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

Las secuencias polipeptídicas del listado de secuencias no se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, está dentro de las capacidades del experto en la técnica convertir la numeración de las secuencias del listado de secuencias a la numeración de Kabat.

La "región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

La "clase" de un anticuerpo o inmunoglobulina se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 6, £, ^yy H, respectivamente.

El término "dominio Fc" o "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente como que se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxiterminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar o no estar presente. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos de aminoácidos en la región Fc o región constante está de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD, 1991. Una "subunidad" de un dominio Fc, como se usa en el presente documento, se refiere a uno de los dos polipéptidos que forman el dominio Fc dimérico, es decir, un polipéptido que comprende regiones constantes C terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina, que se pueden autoasociar de manera estable. Por ejemplo, una subunidad de un dominio Fc de IgG comprende un dominio constante CH2 de IgG y uno CH3 de IgG.

Una "modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc" es una manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de una subunidad del dominio Fc que reduce o evita la asociación de un polipéptido que comprende la subunidad del dominio Fc con un polipéptido idéntico para formar un homodímero. Una modificación que promueve la asociación, como se usa en el presente documento, en particular incluye modificaciones independientes realizadas en cada una de las dos subunidades del dominio Fc que se desean asociar (es decir, la primera y la segunda subunidad del dominio Fc), en la que las modificaciones son complementarias entre sí para promover la asociación de las dos subunidades del dominio Fc. Por ejemplo, una modificación que promueve la asociación puede alterar la estructura o carga de una o ambas subunidades del dominio Fc para hacer que su asociación sea estérica o electrostáticamente favorable, respectivamente. Por tanto, se produce (hetero)dimerización entre un polipéptido que comprende la primera subunidad del dominio Fc y un polipéptido que comprende la segunda subunidad del dominio Fc, que podrían no ser idénticas en el sentido de que otros componentes fusionados a cada una de las subunidades (por ejemplo, restos de unión a antígeno) no son iguales. En algunos modos de realización, la modificación que promueve la asociación comprende una mutación aminoacídica en el dominio Fc, específicamente una sustitución aminoacídica. En un modo de realización particular, la modificación que promueve la asociación comprende una mutación aminoacídica independiente, específicamente una sustitución aminoacídica, en cada una de las dos subunidades del dominio Fc.

El término "funciones efectoras" se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión a receptor de Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, captación de antígenos mediada por complejo inmunitario por células presentadoras de antígenos, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.

Como se usa en el presente documento, se considera que los términos "genomanipular, genomanipulado, genomanipulación" incluyen cualquier manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La genomanipulación incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos, del patrón de glucosilación o del grupo de cadena lateral de aminoácidos individuales, así como combinaciones de estos enfoques.

El término "mutación aminoacídica", como se usa en el presente documento, pretende englobar sustituciones, deleciones, inserciones y modificaciones aminoacídicas. Cualquier combinación de sustitución, deleción, inserción y modificación se puede realizar para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión reducida a un receptor de Fc o asociación incrementada con otro péptido. Las deleciones e inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen deleciones e inserciones de aminoácidos amino y/o carboxiterminales. Mutaciones aminoacídicas particulares son sustituciones aminoacídicas. Con el propósito de alterar, por ejemplo, las características de unión de una región Fc, son en particular preferentes las sustituciones aminoacídicas no conservadoras, es decir, el reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas diferentes. Las sustituciones aminoacídicas incluyen el reemplazo por aminoácidos no naturales o por derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándar (por ejemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metilhistidina, ornitina, homoserina, 5-hidroxilisina). Se pueden generar mutaciones aminoacídicas usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis dirigida al sitio, PCR, síntesis génica y similares. Se contempla que también pueden ser útiles procedimientos de alteración del grupo de cadena lateral de un aminoácido por procedimientos distintos de genomanipulación, tales como modificación química. Se pueden usar diversas designaciones en el presente documento para indicar la misma mutación aminoacídica. Por ejemplo, se puede indicar una sustitución de prolina en la posición 329 del dominio Fc a glicina como 329G, G329, G329, P329G o Pro329Gly.

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por tanto, péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" se puede usar en lugar de, o de manera intercambiable con, cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende referirse a los productos de modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, incluyendo sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos no naturales. Un polipéptido se puede derivar de una fuente biológica natural o producir por tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Se puede generar de cualquier manera, incluyendo por síntesis química. Un polipéptido de la invención puede ser de un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, o 2000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no tienen necesariamente dicha estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, se denominan desplegados.

Por un polipéptido "aislado" o una variante o derivado del mismo se entiende un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel particular de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado se puede retirar de su entorno natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de manera recombinante expresados en células huésped se consideran aislados para el propósito de la invención, ya que son polipéptidos naturales o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente por cualquier técnica adecuada.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin tener en consideración ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde se ha registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. El programa ALIGN-2 establece todos los parámetros de comparación de secuencias y no varían. En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada (que, de forma alternativa, se puede parafrasear como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos de aminoácidos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos de B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.

El término "polinucleótido" se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ARN derivado de virus o ADN de plásmido (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en los ácidos peptidonucleicos (APN)). El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquiera de uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.

Por molécula de ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN que se ha retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterógenas o polinucleótidos (parcial o sustancialmente) purificados en solución. Un polinucleótido aislado incluye una molécula polinucleotídica contenida en células que normalmente contienen la molécula polinucleotídica, pero la molécula polinucleotídica está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de la presente invención, así como formas de hebras positivas y negativas y formas bicatenarias. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma o un finalizador de la transcripción.

Por un ácido nucleico o polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, un 95 % "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos de la secuencia de referencia se pueden delecionar o sustituir por otro nucleótido, o un número de nucleótidos de hasta un 5 % de los nucleótidos totales de la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los residuos de la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como cuestión práctica, si cualquier secuencia polinucleotídica particular es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de la presente invención, se puede determinar convencionalmente usando programas informáticos conocidos, tales como los analizados anteriormente para polipéptidos (por ejemplo, ALIGN-2).

El término "casete de expresión" se refiere a un polinucleótido generado de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana. El casete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir y un promotor. En determinados modos de realización, el casete de expresión de la invención comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de las mismas.

El término "vector' o "vector de expresión" es sinónimo de "construcción de expresión" y se refiere a una molécula de ADN que se usa para introducir y dirigir la expresión de un gen específico al que se asocia de forma funcional en una célula diana. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. El vector de expresión de la presente invención comprende un casete de expresión. Los vectores de expresión permiten la transcripción de grandes cantidades de ARNm estable. Una vez que el vector de expresión está dentro de la célula diana, la molécula de ácido ribonucleico o proteína que está codificada por el gen se produce por el mecanismo de transcripción y/o traducción celular. En un modo de realización, el vector de expresión de la invención comprende un casete de expresión que comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de las mismas.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pasos. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento. Una célula huésped es cualquier tipo de sistema celular que se puede usar para generar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención. Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado.

Un "receptor de Fc activador" es un receptor de Fc que, después del acoplamiento por un dominio Fc de un anticuerpo, provoca acontecimientos de señalización que estimulan a la célula portadora del receptor para que realice funciones efectoras. Los receptores de Fc activadores humanos incluyen FcYRIIIa (CD16a), F^cyRI (CD64), FcYRIIa (CD32) y FcaRI (CD89).

La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo inmunitario que da lugar a la lisis de células diana recubiertas de anticuerpo por células efectoras inmunitarias. Las células diana son células a las que se unen específicamente anticuerpos o derivados de los mismos que comprenden una región Fc, en general por medio de la parte proteica que es N terminal a la región Fc. Como se usa en el presente documento, el término "ADCC reducida" se define como una reducción en el número de células diana que se lisan en un tiempo dado, a una concentración de anticuerpo dada en el medio circundante a las células diana, por el mecanismo de ADCC definido anteriormente, y/o bien un incremento en la concentración de anticuerpo en el medio circundante a las células diana, requerido para lograr la lisis de un número dado de células diana en un tiempo dado, por el mecanismo de ADCC. La reducción en la ADCC es relativa a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células huésped, usando los mismos procedimientos de producción, purificación, formulación y almacenamiento estándar (que son conocidos por los expertos en la técnica), pero que no se ha genomanipulado. Por ejemplo, la reducción en ADCC mediada por un anticuerpo que comprende en su dominio Fc una sustitución aminoacídica que reduce la ADCC es relativa a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo sin esta sustitución aminoacídica en el dominio Fc. Los ensayos adecuados para medir la ADCC son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, publicación PCT n.° WO 2006/082515 o publicación PCT n.° WO 2012/130831).

Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a la cantidad que es necesaria para dar como resultado un cambio fisiológico en la célula o tejido al que se administra.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, por ejemplo, elimina, disminuye, retrasa, minimiza o previene efectos adversos de una enfermedad.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En particular, el individuo o sujeto es un humano.

El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una composición farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizador o conservante.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural de una enfermedad en el individuo que se está tratando, y se puede realizar para profilaxis o bien durante la evolución de la enfermedad clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

El término "antagonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquee, inhiba o neutralice parcial o completamente una actividad biológica de un polipéptido natural descrito en el presente documento. De forma similar, el término "agonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que induce una actividad biológica de un polipéptido natural descrito en el presente documento. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen específicamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpos agonistas o antagonistas, que incluyen fragmentos de anticuerpo genomanipulados, fragmentos o variantes de secuencia de aminoácidos de polipéptidos naturales, péptidos, oligonucleótidos antisentido, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Los procedimientos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido pueden comprender poner en contacto un polipéptido con una molécula candidata a agonista o antagonista y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas al polipéptido.

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.

Descripción detallada de los modos de realización

La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención es biespecífica, es decir, comprende al menos dos restos de unión a antígeno que se pueden unir de forma específica a dos determinantes antigénicos distintos, es decir a CD3 y a FolR1. De acuerdo con la invención, los restos de unión a antígeno son moléculas Fab (es decir, dominios de unión a antígeno compuestos por una cadena pesada y una ligera, comprendiendo cada una una región variable y una constante). En un modo de realización, dichas moléculas Fab son humanas. En otro modo de realización, dichas moléculas Fab son humanizadas. Aún en otro modo de realización, dichas moléculas Fab comprenden regiones constantes de la cadena pesada y ligera humanas.

La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención se puede unir simultáneamente al antígeno de la célula diana FolR1 y CD3. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T puede entrecruzar un linfocito T y una célula diana que expresa FolR1 mediante unión simultánea al antígeno de la célula diana FolR1 y a c D3. En un modo de realización incluso más particular, dicha unión simultánea da como resultado la lisis de la célula diana que expresa FolR1, en particular una célula tumoral que expresa FolR1. En un modo de realización, dicha unión simultánea da como resultado la activación del linfocito T. En otros modos de realización, dicha unión simultánea da como resultado una respuesta celular de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, seleccionada del grupo de: proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica y expresión de marcadores de activación. En un modo de realización, la unión de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T a CD3 sin unión simultánea al antígeno de la célula diana FolR1 no da como resultado la activación del linfocito T.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T puede redireccionar la actividad citotóxica de un linfocito T hacia una célula diana que expresa FolR1. En un modo de realización particular, dicho redireccionamiento es independiente de la presentación de antígenos peptídicos mediada por MHC por la célula diana y/o la especificidad del linfocito T.

En particular, un linfocito T de acuerdo con algunos de los modos de realización de la invención es un linfocito T citotóxico. En algunos modos de realización, el linfocito T es un linfocito T CD4+ o CD8+, en particular un linfocito T CD8+.

La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención comprende al menos un resto de unión a antígeno que se puede unir a CD3 (también denominado en el presente documento "resto de unión al antígeno CD3" o "primer resto de unión a antígeno"). En un modo de realización particular, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende no más de un resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a CD3. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T proporciona unión monovalente a CD3. En un modo de realización particular, el CD3 es CD3 humano o CD3 de macaco cangrejero, lo más en particular CD3 humano. En un modo de realización particular, el resto de unión al antígeno CD3 reacciona de forma cruzada con (es decir, se une específicamente a) CD3 humano y de macaco cangrejero. En algunos modos de realización, el primer resto de unión a antígeno se puede unir de forma específica a la subunidad épsilon de CD3 (véase UniProt n.° P07766 (versión 130), NCBI RefSeq n.° NP_000724.1, SEQ ID NO: 150 para la secuencia humana; UniProt n.° Q95LI5 (versión 49), NCBI GenBank n.° BAB71849.1, para la secuencia de macaco cangrejero [Macaca fascicularis]). En un modo de realización, el resto de unión al antígeno CD3 comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 37, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 39, la CDR1 de la cadena ligera de s Eq ID NO: 32, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 33 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 34.

En un modo de realización, el resto de unión al antígeno CD3 comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de: SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de: SEQ ID NO: 31.

En un modo de realización, el resto de unión al antígeno CD3 comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 36 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 31.

La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención comprende al menos un resto de unión a antígeno que se puede unir al antígeno de la célula diana FolR1 (también denominado en el presente documento "resto de unión a FolR1" o "segundo" o "tercer" resto de unión a antígeno). En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que se puede unir al antígeno de la célula diana FolR1 no se une a FolR2 o FolR3. En un modo de realización particular, el resto de unión al antígeno FolR1 reacciona de forma cruzada con (es decir, se une específicamente a) FolR1 humano y de macaco cangrejero. En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende dos restos de unión a antígeno que se pueden unir al antígeno de célula diana FolR1. En un modo de realización particular de este tipo, cada uno de estos restos de unión a antígeno se une específicamente al mismo determinante antigénico. En un modo de realización aún más particular, todos estos restos de unión a antígeno son idénticos. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende no más de dos restos de unión a antígeno que se pueden unir a FolR1.

El resto de unión a FolRI es en general una molécula Fab que se une específicamente a FolRI y puede dirigir la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T a la que está unida a un sitio diana, por ejemplo, a un tipo específico de célula tumoral que expresa FolR1.

En un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende

(i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica a CD3, y que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 32, SEQ ID nO: 33, SEQ ID NO: 34; y

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1).

En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica a CD3 comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T adicionalmente comprende

(iii) un tercer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica a FolR1.

En un modo de realización de este tipo, el segundo y tercer resto de unión a antígeno que se pueden unir de forma específica a FolR1 comprenden secuencias idénticas de región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada y CDR de la cadena ligera. En un modo de realización de este tipo, el tercer resto de unión a antígeno es idéntico al segundo resto de unión a antígeno.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores comprende adicionalmente un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.

En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno y el segundo resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc.

En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, opcionalmente por medio de un conector peptídico.

En otro modo de realización particular, no más de un resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a CD3 está presente en la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T (es decir, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T proporciona unión monovalente a CD3).

Molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T con una cadena ligera común Los autores de la presente invención generaron un anticuerpo biespecífico en el que los restos de unión comparten una cadena ligera común que conserva la especificidad y eficacia del anticuerpo monoespecífico original para CD3 y se puede unir a un segundo antígeno (por ejemplo, FolR1) usando la misma cadena ligera. La generación de una molécula biespecífica con una cadena ligera común que conserva las propiedades de unión del anticuerpo original no es sencilla, ya que las CDR comunes de la cadena ligera híbrida tienen que lograr la especificidad de unión para ambas dianas. En un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno, uno de los cuales es una molécula Fab que se puede unir de forma específica a CD3 y el otro de los cuales es una molécula Fab que se puede unir de forma específica a FolR1, en la que la primera y la segunda molécula Fab tienen cadenas ligeras VLCL idénticas. En un modo de realización, dicha cadena ligera (VLCL) idéntica comprende las CDR de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34. En un modo de realización, dicha cadena ligera (VLCL) idéntica comprende SEQ ID NO: 35.

En un modo de realización, la presente invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende

(i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica a CD3, y que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1), y que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, SEQ ID nO: 17 y SEQ ID NO: 18 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

En un modo de realización de este tipo, el resto de unión al antígeno CD3 comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 37, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 39, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 33 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 34 y el resto de unión al antígeno FolR1 comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 16, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 17, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 18, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 33 y CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 34.

(i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica a CD3 que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1) que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1), y que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 275 y SEQ ID NO: 315 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

(i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica a CD3, y que comprende las secuencias de aminoácidos de región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 y las secuencias de aminoácidos de CDR de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1) y que comprende las secuencias de aminoácidos de región determinante de la complementariedad (C^dR) de la cadena pesada de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 275 y SEQ ID NO: 315 y las secuencias de aminoácidos de CDR de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34. En un modo de realización, la presente invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende

(i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica a CD3 que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31;

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolRI) que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 274 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para FolR1 comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 15 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 31, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 36, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 15 y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 31.

(iii) un tercer resto de unión a antígeno (que es una molécula Fab) que se puede unir de forma específica a FolR1.

Por tanto, en un modo de realización, la presente invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende

(iii) un tercer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1), y que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, SEQ ID nO: 17 y SEQ ID NO: 18 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

(iii) un tercer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1) que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

Por tanto, en un modo de realización, la invención se refiere a moléculas biespecíficas en las que al menos dos restos de unión tienen cadenas ligeras idénticas y cadenas pesadas remodeladas correspondientes que confieren la unión específica al antígeno activador de linfocitos CD3 y al antígeno de célula diana FolR1, respectivamente. El uso de este llamado principio de "cadena ligera común", es decir, la combinación de dos moléculas de unión que comparten una cadena ligera, pero que todavía tienen especificidades independientes, evita el emparejamiento erróneo de las cadenas ligeras. Por tanto, existen menos productos secundarios durante la producción, lo que facilita la preparación homogénea de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T.

Los componentes de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se pueden fusionar entre sí en una variedad de configuraciones. Configuraciones ejemplares se muestran en las Figuras 1A-I y se describen con más detalle a continuación.

En algunos modos de realización, dicha molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende además un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable. A continuación se describen modos de realización ejemplares de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc.

Molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T con un fragmento Fab de entrecruzamiento

Los autores de la presente invención generaron un segundo formato de anticuerpo biespecífico en el que uno de los restos de unión es un fragmento Fab de entrecruzamiento. En un aspecto de la invención se proporciona un anticuerpo biespecífico monovalente, en el que uno de los fragmentos Fab de una molécula de IgG se reemplaza por un fragmento Fab de entrecruzamiento. Los fragmentos Fab de entrecruzamiento son fragmentos Fab en los que se intercambian las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera. Se han descrito formatos de anticuerpos biespecíficos que comprenden fragmentos Fab de entrecruzamiento, por ejemplo, en los documentos WO2009080252, WO2009080253, WO2009080251, WO2009080254, WO2010/136172, WO2010/145792 y WO2013/026831. En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones variables o constantes de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian. Dicha modificación evita el emparejamiento incorrecto de las cadenas pesada y ligera de diferentes moléculas Fab, mejorando de este modo el rendimiento y la pureza de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención en la producción recombinante. En una molécula Fab de entrecruzamiento particular útil para la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención, las regiones variables de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian. En otra molécula Fab de entrecruzamiento útil para la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención, las regiones constantes de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende (i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab de entrecruzamiento que se puede unir de forma específica a CD3 que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 37, SEQ ID ⁿO: 38 y SEQ ID NO: 39 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34; (ii) un segundo resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1) que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 59, SEQ ID ⁿO: 60, SEQ ID NO: 65.

En un modo de realización de este tipo, el resto de unión al antígeno CD3 comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 37, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 39, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 33 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 34 y el resto de unión al antígeno FolR1 comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 8, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 56, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 57, la CDR1 de la cadena ligera de S^eQ ID NO: 59, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 60 y CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 65.

En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab convencional. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende (i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab de entrecruzamiento que se puede unir de forma específica a CD3 que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1) que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64.

En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab convencional. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para FolR1 comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 55 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 64, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 36, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 31, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 55 y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID nO: 64.

(iii) un tercer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR1.

En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno es una molécula Fab convencional. En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende (i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab de entrecruzamiento que se puede unir de forma específica a CD3 que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34; (ii) un segundo resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1) que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 59, SEQ ID nO: 60, SEQ ID NO: 65.

(iii) un tercer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1) que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID N^o: 56 y SEQ ID NO: 57 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 59, SEQ ID nO: 60, SEQ ID NO: 65.

En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno y el tercer resto de unión a antígeno son ambos una molécula Fab convencional.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende (i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab de entrecruzamiento que se puede unir de forma específica a CD3 que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

(iii) un tercer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica al receptor de folato 1 (FolR1) que comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64.

En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno es una molécula Fab convencional. En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento.

Por tanto, en un modo de realización, la invención se refiere a moléculas biespecíficas en las que dos restos de unión confieren unión específica a FolR1 y un resto de unión confiere especificidad para el antígeno activador de linfocitos T CD3. Una de las cadenas pesadas se modifica para asegurar el emparejamiento apropiado de las cadenas pesada y ligera, eliminando por tanto la necesidad de un enfoque de cadena ligera común. La presencia de dos sitios de unión a FolR1 permite un acoplamiento apropiado con el antígeno diana FolR1 y la activación de los linfocitos T.

Formatos de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T

Como se representa anteriormente y en las figuras 1A-I, en un modo de realización las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T comprenden al menos dos fragmentos Fab que tienen cadenas ligeras (VLCL) idénticas y que tienen cadenas pesadas (VHCL) diferentes que confieren las especificidades para dos antígenos diferentes, es decir, un fragmento Fab se puede unir de forma específica a un antígeno activador de linfocitos T CD3 y el otro fragmento Fab se puede unir de forma específica al antígeno de célula diana FolR1.

En otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende al menos dos restos de unión a antígeno (moléculas Fab), uno de los cuales es una molécula Fab de entrecruzamiento y uno de los cuales es una molécula Fab convencional. En un modo de realización de este tipo, el primer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a CD3 es una molécula Fab de entrecruzamiento y el segundo resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR es una molécula de Fab convencional.

Estos componentes de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se pueden fusionar entre sí en una variedad de configuraciones. Configuraciones ejemplares se representan en las figuras 1A-I.

En algunos modos de realización, el primer y segundo resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno, un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad y, opcionalmente, uno o más conectores peptídicos, en la que el primer y el segundo resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización de este tipo, el primer y el segundo resto de unión a antígeno son ambos fragmentos Fab y tienen cadenas ligeras (VLCL) idénticas. En otro modo de realización de este tipo, el primer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a CD3 es una molécula Fab de entrecruzamiento y el segundo resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR es una molécula de Fab convencional.

En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno, el dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad y, opcionalmente, uno o más conectores peptídicos, en la que el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno, y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización de este tipo, el primer y el segundo resto de unión a antígeno son ambos fragmentos Fab y tienen cadenas ligeras (VLCL) idénticas. En otro modo de realización de este tipo, el primer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a CD3 es una molécula Fab de entrecruzamiento y el segundo resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR es una molécula de Fab convencional. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

En otros modos de realización, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización particular de este tipo, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno, el dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad y, opcionalmente, uno o más conectores peptídicos, en la que el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización de este tipo, el primer y el segundo resto de unión a antígeno son ambos fragmentos Fab y tienen cadenas ligeras (VLCL) idénticas. En otro modo de realización de este tipo, el primer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a CD3 es una molécula Fab de entrecruzamiento y el segundo resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR es una molécula de Fab convencional. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

Los restos de unión a antígeno se pueden fusionar al dominio Fc o entre sí directamente o a través de un conector peptídico, que comprende uno o más aminoácidos, típicamente aproximadamente 2-20 aminoácidos. Los conectores peptídicos son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento. Los conectores peptídicos no inmunogénicos adecuados incluyen, por ejemplo, los conectores peptídicos (G4S)n (SEQ ID NO: 300), (SG4)n (SEQ ID NO: 301), (G4S)n (SEQ ID NO: 300) o G4(SG4)n (SEQ ID NO: 302), siendo "n", en general, un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4. Un conector peptídico adecuado en particular para fusionar las cadenas ligeras de Fab del primer y el segundo resto de unión a antígeno entre sí es (G4S)2 (SEQ ID NO: 303). Un conector peptídico ejemplar adecuado para conectar las cadenas pesadas de Fab del primer y el segundo resto de unión a antígeno es EPKSC(D)-(G4S)2 (SEQ ID NO: 304 y 305). Adicionalmente, los conectores pueden comprender (una porción de) una región bisagra de inmunoglobulina. En particular, cuando un resto de unión a antígeno se fusiona al extremo N de una subunidad del dominio Fc, se puede fusionar por medio de una región bisagra de inmunoglobulina o una porción de la misma, con o sin un conector peptídico adicional.

Los autores de la presente invención han descubierto que la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dos restos de unión específicos para el antígeno de la célula diana FolR tiene características superiores en comparación con la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende solo un resto de unión específico para el antígeno de célula diana FolR.

En consecuencia, en determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención comprende además un tercer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica a FolR. En un modo de realización de este tipo, el segundo y tercer resto de unión a antígeno que se pueden unir de forma específica a FolR1 comprenden secuencias idénticas de región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada y CDR de la cadena ligera. En un modo de realización de este tipo, el tercer resto de unión a antígeno es idéntico al segundo resto de unión a antígeno (es decir, comprenden las mismas secuencias de aminoácidos).

En un modo de realización, el primer y el segundo resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc, y el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer, un segundo y un tercer resto de unión a antígeno, un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad y, opcionalmente, uno o más conectores peptídicos, en la que el primer y el segundo resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc y el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización de este tipo, el primer, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno son fragmentos Fab convencionales y tienen cadenas ligeras (VLCL) idénticas. En otro modo de realización de este tipo, el primer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a CD3 es una molécula Fab de entrecruzamiento y el segundo y tercer resto de unión a antígeno que se pueden unir de forma específica a FolR son una molécula de Fab convencional. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del tercer resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

En consecuencia, en determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención comprende cinco cadenas polipeptídicas que forman un primer, un segundo y un tercer resto de unión a antígeno en la que el primer resto de unión a antígeno se puede unir a CD3 y el segundo y el tercer resto de unión a antígeno se pueden unir cada uno al receptor de folato 1 (FolR1). La primera y la segunda cadena polipeptídica comprenden, en dirección desde el extremo amino (N) hacia el extremo carboxilo (C), un primer dominio variable de la cadena ligera (VLD1) y un primer dominio constante de la cadena ligera (CLD1). La tercera cadena polipeptídica comprende, en dirección desde el extremo N hacia el extremo C, un segundo dominio variable de la cadena ligera (VLD2) y un segundo dominio constante de la cadena pesada 1 (CH1D2). La cuarta cadena polipeptídica comprende, en dirección desde el extremo N hacia el extremo C, un primer dominio variable de la cadena pesada (VHD1), un primer dominio constante de la cadena pesada 1 (CH1D1), un primer dominio constante de la cadena pesada 2 (CH2D1) y un primer dominio constante de la cadena pesada 3 (CH3D1). La quinta cadena polipeptídica comprende VHD1, CH1D1, un segundo dominio variable de la cadena pesada (VHD2), un segundo dominio constante de la cadena ligera (CLD2), un segundo dominio constante de la cadena pesada 2 (CH2D2) y un segundo dominio constante de la cadena pesada 3 (CH3D2). La tercera cadena polipeptídica y VHD2 y CLD2 de la quinta cadena polipeptídica forman el primer resto de unión a antígeno que se puede unir a CD3. La segunda cadena polipeptídica y VHD1 y CH1D1 de la quinta cadena polipeptídica forman el tercer resto de unión que se puede unir a FolR1. La primera cadena polipeptídica y Vh D1 y CH1D1 de la cuarta cadena polipeptídica forman el segundo resto de unión que se puede unir a FolR1.

En otro modo de realización, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer, un segundo y un tercer resto de unión a antígeno, un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad y, opcionalmente, uno o más conectores peptídicos, en la que el segundo y el tercer resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del tercer resto de unión a antígeno. En un modo de realización de este tipo, el primer, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno son fragmentos Fab convencionales y tienen cadenas ligeras (VLCL) idénticas. En otro modo de realización de este tipo, el primer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a CD3 es una molécula Fab de entrecruzamiento y el segundo y tercer resto de unión a antígeno que se pueden unir de forma específica a FolR son una molécula de Fab convencional. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

Los restos de unión a antígeno se pueden fusionar al dominio Fc directamente o a través de un conector peptídico. En un modo de realización particular, los restos de unión a antígeno se fusionan cada uno al dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgG1 humana.

En un modo de realización, el primer y el segundo resto de unión a antígeno y el dominio Fc forman parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización particular, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG. En un modo de realización incluso más particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG1. En otro modo de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG4. En otro modo de realización particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana. En otros modos de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica o una inmunoglobulina humanizada.

En un modo de realización particular, dicha molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, el primer y el segundo resto de unión a antígeno y el dominio Fc forman parte de una molécula de inmunoglobulina, y el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, en la que el primer, segundo y tercer resto de unión a antígeno son fragmentos Fab convencionales y tienen cadenas ligeras (VLCL) idénticas, en el que el primer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a CD3 comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34; y el segundo y el tercer resto de unión a antígeno que se pueden unir de forma específica a FolR1 comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID nO: 18 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34.

En un modo de realización particular, dicha molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, el primer y el segundo resto de unión a antígeno y el dominio Fc forman parte de una molécula de inmunoglobulina, y el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, en la que el primer, segundo y tercer resto de unión a antígeno son fragmentos Fab convencionales y tienen cadenas ligeras (VLCL) idénticas, en el que el primer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a CD3 comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 36, una cadena ligera variable que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 31; y el segundo y el tercer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR1 comprenden una cadena pesada variable que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 15, una cadena ligera variable que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 31.

En un modo de realización particular, dicha molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, el primer y el segundo resto de unión a antígeno y el dominio Fc forman parte de una molécula de inmunoglobulina, y el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno y el primer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a CD3 es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones variable o constante de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian, que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 37, SEQ iD NO: 38 y SEQ ID NO: 39 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 32, SEQ ID nO: 33 y SEQ ID nO: 34; y el segundo y el tercer resto de unión a antígeno que se pueden unir de forma específica a FolR1 comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 65.

En un modo de realización particular, dicha molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, el primer y el segundo resto de unión a antígeno y el dominio Fc forman parte de una molécula de inmunoglobulina, y el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno y el primer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a CD3 es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones variable o constante de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian, en la que el primer resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a CD3 comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 36, una cadena ligera variable que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 31; y el segundo y el tercer resto de unión a antígeno que se pueden unir de forma específica a FolR1 comprenden una cadena pesada variable que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 55, una cadena ligera variable que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 65.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T es monovalente para cada antígeno. En un modo de realización particular, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se puede unir a CD3 humano y al receptor de folato humano alfa (FolR1) y se preparó sin emplear un enfoque de heterodimerización, tal como, por ejemplo, tecnología de botón en ojal. Por ejemplo, la molécula se puede producir empleando una colección de cadenas ligeras comunes y tecnología CrossMab. En un modo de realización particular, la región variable de la molécula de unión a CD3 se fusiona al dominio CH1 de un anticuerpo IgG1 humano estándar para formar la molécula entrecruzada VLVH (fusionada a Fc) que es común para ambas especificidades. Para generar los equivalentes entrecruzados (VHCL), se fusiona un dominio de la cadena pesada variable específico para CD3 a una cadena ligera A humana constante, mientras que un dominio de la cadena pesada variable específico para FolR1 humano (por ejemplo, aislado de la colección de cadenas ligeras comunes) se fusiona con una cadena ligera ^khumana constante. La molécula deseada resultante con cadenas correctamente emparejadas comprende ambas cadenas ligeras kappa y lambda o fragmentos de las mismas. En consecuencia, esta especie de molécula biespecífica deseada se puede purificar de las especies homodiméricas o mal emparejadas mediante etapas de purificación secuenciales que seleccionan la cadena ligera kappa y lambda, en cualquier secuencia. En un modo de realización particular, la purificación del anticuerpo biespecífico deseado emplea etapas de purificación posteriores con las columnas KappaSelect y LambdaFabSelect (GE Healthcare) para eliminar los anticuerpos homodiméricos no deseados. Dominio Fc

El dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste en un par de cadenas polipeptídicas que comprenden dominios de la cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina. Por ejemplo, el dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina G (IgG) es un dímero, del que cada unidad comprende los dominios constantes de la cadena pesada de IgG CH2 y CH3. Las dos subunidades del dominio Fc se pueden asociar de manera estable entre sí. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención comprende no más de un dominio Fc.

En un modo de realización de acuerdo con la invención, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T es un dominio Fc de IgG. En un modo de realización particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. En otro modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En un modo de realización más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende una sustitución aminoacídica en la posición S228 (numeración de Kabat), en particular la sustitución aminoacídica S228P. Esta sustitución aminoacídica reduce el intercambio in vivo en el brazo Fab de los anticuerpos IgG4 (véase Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). En otro modo de realización particular, el dominio Fc es humano. Una secuencia ejemplar de una región Fc de IgG1 humana se da en SEQ ID NO: 245. Modificaciones en el dominio Fc que promueven la heterodimerización

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de acuerdo con la invención comprenden diferentes restos de unión a antígeno, fusionados a una o a la otra de las dos subunidades del dominio Fc, por tanto, las dos subunidades del dominio Fc están comprendidas típicamente en dos cadenas polipeptídicas no idénticas. La coexpresión recombinante de estos polipéptidos y la posterior dimerización dan lugar a varias combinaciones posibles de los dos polipéptidos. Para mejorar el rendimiento y la pureza de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T en producción recombinante, será ventajoso, por tanto, introducir en el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T una modificación que promueva la asociación de los polipéptidos deseados.

En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de acuerdo con la invención comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. El sitio de interacción proteína-proteína más extensa entre las dos subunidades de un dominio Fc de IgG humana está en el dominio c H3 del dominio Fc. Por tanto, en un modo de realización, dicha modificación está en el dominio CH3 del dominio Fc.

En un modo de realización específico, dicha modificación es una modificación llamada "botón en ojal", que comprende una modificación de "botón" en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de "ojal" en la otra de las dos subunidades del dominio Fc.

La tecnología de botón en ojal se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.731.168; US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una cavidad correspondiente ("ojal") en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).

En consecuencia, en un modo de realización particular, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que se puede colocar en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro de la que se puede colocar la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad. La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica.

En un modo de realización específico, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza el residuo de treonina en la posición 366 por un residuo de triptófano (T366W), y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza el residuo de tirosina en la posición 407 por un residuo de valina (Y407V). En un modo de realización, en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente se reemplaza el residuo de treonina en la posición 366 por un residuo de serina (T366S) y se reemplaza el residuo de leucina en la posición 368 por un residuo de alanina (L368A).

Aún en otro modo de realización, en la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza adicionalmente el residuo de serina en la posición 354 por un residuo de cisteína (S354C), y en la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 por un residuo de cisteína (Y349C). La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades del dominio Fc, estabilizando por tanto adicionalmente el dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

En un modo de realización particular, el resto de unión a antígeno que se puede unir a CD3 se fusiona (opcionalmente a través del resto de unión a antígeno que se puede unir a FolR1 en un antígeno de célula diana) a la primera subunidad del dominio Fc (que comprende la modificación "botón"). Sin quedar vinculado a ninguna teoría, la fusión del resto de unión a antígeno que se puede unir a CD3 a la subunidad que contiene un botón del dominio Fc minimizará (además) la generación de moléculas de unión a antígeno que comprenden dos restos de unión a antígeno que se pueden unir a CD3 (impedimento estérico de dos polipéptidos que contienen botones). En un modo de realización alternativo, una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc comprende una modificación que media en los efectos de conducción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT w O 2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos en la interfase de las dos subunidades del dominio Fc por residuos de aminoácidos cargados de modo que la formación de homodímeros se vuelve electrostáticamente desfavorable, pero la heterodimerización es electrostáticamente favorable.

Modificaciones en el dominio Fc que suprimen la unión al receptor de Fc y/o la función efectora

El dominio Fc confiere a la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T propiedades farmacocinéticas favorables, incluyendo una semivida en suero larga que contribuye a una buena acumulación en el tejido diana y una proporción de distribución tejido-sangre favorable. Al mismo tiempo, sin embargo, puede dar lugar a la dirección indeseable de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T hacia células que expresan receptores de Fc en lugar de a las células portadoras de antígenos preferentes. Además, la coactivación de las rutas de señalización del receptor de Fc puede dar lugar a la liberación de citocinas lo que, en combinación con las propiedades activadoras de linfocitos T y la semivida larga de la molécula de unión a antígeno, da como resultado una activación excesiva de receptores de citocinas y efectos secundarios graves tras la administración sistémica. La activación de células inmunitarias (portadoras del receptor de Fc) distintas de linfocitos T incluso puede reducir la eficacia de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T debido a la destrucción potencial de linfocitos T, por ejemplo, por linfocitos NK.

En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de acuerdo con la invención presenta una afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con el dominio Fc de IgG1 natural. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) presenta menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc de IgG1 natural), y/o menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la función efectora en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc de IgG1 natural). En un modo de realización, el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) no se une sustancialmente a un receptor de Fc y/o induce función efectora. En un modo de realización particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor de Fc es un receptor de F^cyhumano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. En un modo de realización, la función efectora es una o más seleccionada del grupo de CDC, ADCC, ADCP y secreción de citocinas. En un modo de realización particular, la función efectora es ADCC. En un modo de realización, el dominio Fc presenta una afinidad de unión sustancialmente similar al receptor de Fc neonatal (FcRn) en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn cuando el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 %, en particular más de aproximadamente un 80 %, más en particular más de aproximadamente un 90 % de la afinidad de unión de un dominio Fc de IgG1 natural (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc de IgG1 natural) por FcRn.

En determinados modos de realización, el dominio Fc se genomanipula para que tenga afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En modos de realización particulares, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o función efectora. Típicamente, en cada una de las dos subunidades del dominio Fc está presente la misma mutación o mutaciones aminoacídicas. En un modo de realización, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc. En un modo de realización, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc en al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces. En modos de realización donde existe más de una mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por el receptor de Fc, la combinación de estas mutaciones aminoacídicas puede reducir la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc en al menos 10 veces, al menos 20 veces o incluso al menos 50 veces. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc genomanipulado presenta menos de un 20 %, en particular menos de un 10 %, más en particular menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc en comparación con una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización particular, el receptor de Fc es un receptor de F^cy. En algunos modos de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En algunos modos de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. Preferentemente, se reduce la unión a cada uno de estos receptores. En algunos modos de realización también se reduce la afinidad de unión por un componente del complemento, específicamente la afinidad de unión por C1q. En un modo de realización, no se reduce la afinidad de unión por el receptor de Fc neonatal (FcRn). La unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la conservación de la afinidad de unión del dominio Fc por dicho receptor, se logra cuando el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de unión de una forma no genomanipulada del dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dicha forma no genomanipulada del dominio Fc) por FcRn. El dominio Fc, o las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención que comprenden dicho dominio Fc, pueden presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad. En determinados modos de realización, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se genomanipula para que tenga función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. La función efectora reducida puede incluir, pero no se limita a, una o más de las siguientes: citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) reducida, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) reducida, secreción de citocinas reducida, captación de antígenos mediada por inmunocomplejos por células presentadoras de antígenos reducida, unión a linfocitos NK reducida, unión a macrófagos reducida, unión a monocitos reducida, unión a células polimorfonucleares reducida, señalización directa que induce apoptosis reducida, entrecruzamiento de anticuerpos unidos a diana reducido, maduración de células dendríticas reducida o activación de linfocitos T reducida. En un modo de realización, la función efectora reducida es una o más seleccionadas del grupo de CDC reducida, ADCC reducida, ADCP reducida y secreción de citocinas reducida. En un modo de realización particular, la función efectora reducida es ADCC reducida. En un modo de realización, la ADCC reducida es menor de un 20 % de la ADCC inducida por un dominio Fc no genomanipulado (o una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc no genomanipulado).

En un modo de realización, la mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o función efectora es una sustitución aminoacídica. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de E233, L234, L235, N297, P331 y P329. En un modo de realización más específico, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de L234, L235 y P329. En algunos modos de realización, el dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A y L235A. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329. En un modo de realización más específico, la sustitución aminoacídica es P329A o P329G, en particular, P329G. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329 y una sustitución aminoacídica adicional en una posición seleccionada de E233, L234, L235, N297 y P331. En un modo de realización más específico, la sustitución aminoacídica adicional es E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En modos de realización particulares, el dominio Fc comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones P329, L234 y L235. En modos de realización más particulares, el dominio Fc comprende las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G ("P329G LALA"). En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. La combinación "P329G LALA" de sustituciones aminoacídicas suprime casi completamente la unión de un dominio Fc de IgG1 humana a un receptor de Fcy, como se describe en la publicación PCT n.° WO 2012/130831. El documento WO 2012/130831 también describe procedimientos de preparación de dichos dominios Fc mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades tales como unión al receptor de Fc o funciones efectoras.

Los anticuerpos IgG4 presentan una afinidad de unión reducida por receptores de Fc y funciones efectoras reducidas en comparación con anticuerpos IgG1. Por tanto, en algunos modos de realización, el dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención es un dominio Fc de IgG4, en particular un dominio Fc de IgG4 humana. En un modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones aminoacídicas en la posición S228, específicamente la sustitución aminoacídica S228P. Para reducir más su afinidad de unión por un receptor de Fc y/o su función efectora, en un modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución aminoacídica en la posición L235, específicamente la sustitución aminoacídica L235E. En otro modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329, específicamente la sustitución aminoacídica P329G. En un modo de realización particular, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones S228, L235 y P329, específicamente las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y P329G. Dichos mutantes de dominio Fc de IgG4 y sus propiedades de unión al receptor de Fcy se describen en la publicación PCT n.° WO 2012/130831.

En un modo de realización particular, el dominio Fc que presenta afinidad de unión por un receptor de Fc reducida y/o una función efectora reducida en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural es un dominio Fc de IgG1 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y opcionalmente P329G, o un dominio Fc de IgG4 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y opcionalmente P329G.

En determinados modos de realización se ha eliminado la N-glucosilación del dominio Fc. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc comprende una mutación aminoacídica en la posición N297, en particular, una sustitución aminoacídica que reemplaza asparagina por alanina (N297A) o ácido aspártico (N297D).

Además de los dominios Fc descritos anteriormente en el presente documento y en la publicación PCT n.° WO 2012/130831, los dominios Fc con unión a receptor de Fc y/o función efectora reducidas también incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 del dominio Fc (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

Se pueden preparar dominios Fc mutantes por deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios de nucleótidos correctos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación.

La unión a receptores de Fc se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores de Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. Un ensayo de unión de este tipo adecuado se describe en el presente documento. De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de dominios Fc o moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos que comprenden un dominio Fc por los receptores de Fc usando líneas celulares conocidas por expresar receptores de Fc particulares, tales como linfocitos NK humanos que expresan el receptor de FcYlIIa.

La función efectora de un dominio Fc, o una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc, se puede medir por procedimientos conocidos en la técnica. Un ensayo adecuado para medir la ADCC se describe en el presente documento. Otros ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. u U. n.° 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

En algunos modos de realización, se reduce la unión del dominio Fc a un componente del complemento, específicamente a C1q. En consecuencia, en algunos modos de realización en los que se genomanipula el dominio Fc para que tenga una función efectora reducida, dicha función efectora reducida incluye una CDC reducida. Se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para determinar si la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se puede unir a C1q y, por tanto, tener actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELlSA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); y Cragg y Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

Propiedades biológicas y características funcionales de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T

Un experto en la técnica puede apreciar la eficacia ventajosa de una molécula que distingue selectivamente entre células cancerosas y células sanas no cancerosas. Una forma de lograr este objetivo es mediante selección de dianas adecuadas. Se pueden emplear marcadores expresados exclusivamente en células tumorales para dirigir selectivamente moléculas o células efectoras a células tumorales, evitando al mismo tiempo las células normales que no expresan dicho marcador. Sin embargo, en algunos casos, los denominados marcadores de células tumorales también se expresan en tejido normal, aunque a niveles menores. Esta expresión en tejido normal plantea la posibilidad de toxicidad. Por tanto, existía una necesidad en la técnica de moléculas que se pudieran dirigir de forma más selectiva a células tumorales. La invención descrita en el presente documento proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T que se dirigen selectivamente a células tumorales que expresan FolR1 y no a células normales no cancerosas que expresan FolR1 a niveles bajos o no lo expresan en absoluto. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende al menos dos, preferentemente dos, restos de unión a FolR1 de afinidad relativamente baja que confieren un efecto de avidez que permite la diferenciación entre células con expresión de FolR1 alta y baja. Debido a que las células tumorales expresan FolR1 a niveles altos o intermedios, este modo de realización de la invención se une selectivamente a y/o induce la destrucción de células tumorales y no de células normales no cancerosas que expresan FolR1 a niveles bajos o no lo hacen en absoluto. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T está en el formato 2+1 invertido.

En un modo de realización específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T no induce la destrucción de células normales que tienen menos de aproximadamente 1000 copias de FolR1 en su superficie.

Además de las características ventajosas anteriores, un modo de realización de la invención no requiere que se produzca entrecruzamiento químico o un enfoque híbrido. En consecuencia, en un modo de realización, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que se puede producir en células CHO. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende polipéptidos humanizados y humanos. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T no causa entrecruzamiento de FcyR.

Como se indica anteriormente, algunos modos de realización contemplados en el presente documento incluyen moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T que tienen dos restos de unión que confieren unión específica a FolR1 y un resto de unión que confiere especificidad para el antígeno activador de linfocitos T CD3, en la que cada resto de unión a FolR1 individual se acopla al antígeno con baja afinidad. Dado que la molécula comprende dos restos de unión a antígeno que confieren unión a FolR1, la avidez global de la molécula, no obstante, proporciona una unión eficaz a células diana que expresan FolR1 y una activación eficaz de linfocitos T para inducir la función efectora de los linfocitos T. Teniendo en cuenta que, aunque FolR1 se expresa a niveles diversos en células tumorales, también se expresa a niveles muy bajos (por ejemplo, menos de aproximadamente 1000 copias en la superficie celular) en determinadas células normales, un experto en la técnica puede reconocer fácilmente la eficacia ventajosa de dicha molécula para su uso como agente terapéutico. Dicha molécula se dirige selectivamente más a células tumorales que a células normales. Por tanto, dicha molécula se puede administrar a un individuo que necesite la misma con una preocupación significativamente menor por la toxicidad resultante de células normales que expresan FolR1 en comparación con las moléculas que se unen a FolR1 con alta afinidad para inducir la función efectora. En un modo de realización preferente, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T tienen una afinidad de unión monovalente por huFolR1 en el intervalo micromolar y una avidez por huFolR1 en el intervalo nanomolar.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 humano con una K^daparente de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 40 nM. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 humano con una Kd aparente de aproximadamente 10 nM. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 humano y de macaco cangrejero con una K ^d aparente de aproximadamente 10 nM y aproximadamente 30 nM, respectivamente. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 humano con una K^dde unión monovalente de al menos aproximadamente 1000 nM. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 humano con una Kd de unión monovalente de aproximadamente 1400 nM. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 humano con una Kd de unión monovalente de aproximadamente 1400 nM y a FolR1 de macaco cangrejero con una K^dde unión monovalente de aproximadamente 5600 nM. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 humano con una Kd aparente de aproximadamente 10 nM y con una Kd de unión monovalente de aproximadamente 1400 nM.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 humano con una Kd aparente de aproximadamente 5,36 pM a aproximadamente 4 nM. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 humano y de macaco cangrejero con una Kd aparente de aproximadamente 4 nM. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 murino con una K^daparente de aproximadamente 1,5 nM. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se une a FolR1 humano con una K^dde unión monovalente de al menos aproximadamente 1000 nM.

Como se describe anteriormente, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T contempladas en el presente documento pueden inducir función efectora de los linfocitos T, por ejemplo, expresión de marcadores de superficie celular, producción de citocinas, destrucción mediada por linfocitos T. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por linfocitos T de la célula diana que expresa FolR1, tal como una célula tumoral humana, in vitro. En un modo de realización, el linfocito T es un linfocito T CD8+. Los ejemplos de células tumorales humanas que expresan FolR1 incluyen, pero no se limitan a, células Hela, Skov-3, HT-29 y HRCEpiC. Otras células cancerosas humanas que expresan FolR1 que se pueden usar para pruebas in vitro están fácilmente disponibles para el experto en la materia. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por linfocitos T de la célula tumoral humana que expresa FolR1 in vitro con una CE50 de entre aproximadamente 36 pM y aproximadamente 39573 pM después de 24 horas. Se contemplan específicamente moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T que inducen la destrucción mediada por linfocitos T de la célula tumoral que expresa FolR1 in vitro con una CE50 de aproximadamente 36 pM después de 24 horas. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por linfocitos T de la célula tumoral que expresa FolR1 in vitro con una CE50 de aproximadamente 178,4 pM después de 24 horas. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T induce la destrucción mediada por linfocitos T de la célula tumoral que expresa FolR1 in vitro con una CE50 de aproximadamente 134,5 pM o mayor después de 48 horas. La CE50 se puede medir mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante procedimientos descritos en el presente documento por los ejemplos.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores induce la regulación por incremento de la expresión en la superficie celular de al menos uno de CD25 y CD69 en el linfocito T, medida por citometría de flujo. En un modo de realización, el linfocito T es un linfocito T CD4+ o un linfocito T CD8+.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores se une a FolR1 que se expresa en una célula tumoral humana. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores se une a un epítopo conformacional de FolR1 humano. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores no se une al receptor de folato 2 (FolR2) humano ni al receptor de folato 3 (FolR3) humano. En un modo de realización de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores, el resto de unión a antígeno se une a un polipéptido de FolR1 que comprende los aminoácidos 25 a 234 de FolR1 humano (SEQ ID NO: 227). En un modo de realización de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores, el resto de unión al antígeno FolR1 se une a un polipéptido de FolR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 227, a un polipéptido de FolR1 que comprende la secuencia de aminoácidos. de SEQ ID NO: 230 y a un polipéptido de FolR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 231, y en la que el resto de unión al antígeno FolR1 no se une a un polipéptido de FolR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 228 o 229. En un modo de realización específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende un resto de unión al antígeno FolR1 que se une a un polipéptido de FolR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 227, 230 y 231, y en la que el resto de unión al antígeno FolR1 no se une a un polipéptido de FolR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 228 o 229, y comprende un resto de unión al antígeno CD3 que comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 37, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 39, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 33 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 34 y dos restos de unión al antígeno FolR1 que cada uno comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 8, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 9, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 50, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 52, la CDR2 de la cadena ligera de s Eq ID NO: 53 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 54.

En un modo de realización de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de los modos de realización anteriores, el resto de unión al antígeno FolR1 se une a un polipéptido de FolR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 227 y a un polipéptido de FolR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 231, y en la que el resto de unión al antígeno FolR1 no se une a un polipéptido de FolR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 228, 229 o 230. En un modo de realización específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende un resto de unión al antígeno FolR1 que se une a un polipéptido de FolR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 227 y a un polipéptido de FolR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 231, y en la que el resto de unión al antígeno FolR1 no se une a un polipéptido de FolR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 228, 229 o 230, y comprende un resto de unión al antígeno CD3 que comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 37, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 39, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 33 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 34 y dos restos de unión al antígeno FolR1 que cada uno comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 16, la CDR2 de la cadena pesada de ^sE^qID NO: 275, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 315, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 33 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 34.

Con respecto al FolR1, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T contempladas en el presente documento pueden tener un efecto agonista, antagonista o neutro. Los ejemplos de efecto agonista incluyen inducción o potenciación de la señalización a través de FolR1 tras el acoplamiento del resto de unión a FolR1 con el receptor FolR1 en la célula diana. Los ejemplos de actividad antagonista incluyen anulación o reducción de la señalización a través de FolR1 tras el acoplamiento del resto de unión a FolR1 con el receptor FolR1 en la célula diana. Esto se puede producir, por ejemplo, al bloquear o reducir la interacción entre folato y FolR1. Se contemplan específicamente variantes de secuencia de los modos de realización descritos en el presente documento que tienen menor afinidad al tiempo que conservan las propiedades biológicas descritas anteriormente.

Inmunoconjugados

La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T conjugada con un agente citotóxico, tal como un agente quimioterápico, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina activa enzimáticamente de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

Polinucleótidos

La descripción proporciona además polinucleótidos aislados que codifican una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T como se describe en el presente documento o un fragmento de la misma.

Los polinucleótidos incluyen aquellos que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %,

97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 151-226, incluyendo los fragmentos funcionales o variantes de los mismos.

Los polinucleótidos que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la

invención se pueden expresar como un único polinucleótido que codifica toda la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T o como múltiples (por ejemplo, dos o más) polinucleótidos que se coexpresan. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se coexpresan se pueden asociar a través de,

por ejemplo, enlaces disulfuro u otros medios para formar una molécula de unión a antígeno biespecífica

activadora de linfocitos T funcional. Por ejemplo, la porción de la cadena ligera de un resto de unión a antígeno

se puede codificar por un polinucleótido separado de la porción de la molécula de unión a antígeno biespecífica

activadora de linfocitos T que comprende la porción de la cadena pesada del resto de unión a antígeno, una

subunidad del dominio Fc y opcionalmente (parte de) otro resto de unión a antígeno. Cuando se coexpresen, los polipéptidos de la cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de la cadena ligera para formar el resto de

unión a antígeno. En otro ejemplo, la porción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de

linfocitos T que comprende una de las dos subunidades del dominio Fc y opcionalmente (parte de) uno o más

restos de unión a antígeno se podría codificar por un polinucleótido separado de la porción de la molécula de

unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende la otra de las dos subunidades del

dominio Fc y opcionalmente (parte de) un resto de unión a antígeno. Cuando se coexpresen, las subunidades

del dominio Fc se asociarán para formar el dominio Fc.

En algunos aspectos, el polinucleótido aislado codifica toda la molécula de unión a antígeno biespecífica

activadora de linfocitos T de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento. En otros

aspectos, el polinucleótido aislado codifica polipéptidos comprendidos en la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento.

En otros aspectos, la descripción proporciona un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a

antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de región variable como se muestra en

SEQ ID NO: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170,

171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 y 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214,

215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223.

antígeno biespecífica activadora de linfocitos T o fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende

una secuencia que codifica una secuencia de polipéptido como se muestra en ^sE^qID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,

40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,

70, 1, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,

100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121,

122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 227, 228, 229, 230, 231,

232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244. En otros aspectos, la descripción proporciona

un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de

la invención o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 97, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164,

165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 189, 190,

191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 12,

213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 246, 247. En otro aspecto, la descripción proporciona un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de

linfocitos T de la invención o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de

ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 97, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163,

164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 12, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 246, 247. En otro aspecto, la descripción proporciona un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica

activadora de linfocitos T de la invención o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una

secuencia que codifica una secuencia de región variable que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %,

97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 13, 15, 19,

21, 12, 25, 27, 29, 31, 36, 41, 45, 49, 51, 55, 58, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 82, 113, 114, 115, 116, 117,

118, 119, 12, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135. En otro aspecto, la descripción proporciona un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica

activadora de linfocitos T o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que

codifica un polipéptido que comprende una o más secuencias que son al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %,

96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 9, 50, 37, 38 y 39. La

descripción proporciona un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica

secuencia que codifica la secuencia de la región variable de SEQ ID NO: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158,

159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177,

181, 182 y 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 con

sustituciones aminoacídicas conservadoras. La descripción también proporciona un polinucleótido aislado que

codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención o fragmento de

la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica las secuencias de polipéptido de

SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,

30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,

60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 1, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,

90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,112, 113, 114,

115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133,

137, 138 y 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, sustituciones aminoacídicas conservadoras.

En determinados modos de realización, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En otros modos de

realización, un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero

(ARNm). El ARN de la presente invención puede ser monocatenario o bicatenario.

Procedimientos recombinantes

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención se pueden obtener,

por ejemplo, por síntesis de péptidos en estado sólido (por ejemplo, síntesis en fase sólida de Merrifield) o

producción recombinante. Para la producción recombinante, uno o más polinucleótidos que codifican la molécula

(fragmento) de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, por ejemplo, como se describe

anteriormente, se aíslan o insertan en uno o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula

huésped. Dicho polinucleótido se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales.

En un modo de realización se proporciona un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende

uno o más de los polinucleótidos de la invención. Se pueden usar procedimientos que son bien conocidos por los

expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de una

molécula (fragmento) de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T junto con señales de control de

la transcripción/traducción apropiadas. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro,

técnicas sintéticas y recombinación in vivo/recombinación genética. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas

en Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.

(1989) y Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates

and Wiley Interscience, N.Y (1989). El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus, o puede ser un

fragmento de ácido nucleico. El vector de expresión incluye un casete de expresión en el que el polinucleótido

que codifica la molécula (fragmento) de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T (es decir, la

región codificante) se clona en asociación funcional con un promotor y/u otros elementos de control de la

transcripción o traducción. Como se usa en el presente documento, una "región codificante" es una porción de

ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG,

TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región codificante, si

está presente; sin embargo, cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo promotores, sitios de unión a

ribosoma, finalizadores de la transcripción, intrones, regiones no traducidas 5' y 3' y similares, no forma parte de

una región codificante. Dos o más regiones codificantes pueden estar presentes en una única construcción de

polinucleótidos, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones de polinucleótidos separadas, por ejemplo,

en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante, o

puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un vector de la presente invención puede

codificar uno o más polipéptidos, que se separan de forma postraduccional o cotraduccional en las proteínas

finales por medio de escisión proteolítica. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención

puede codificar regiones codificantes heterógenas, fusionadas o bien no fusionadas a un polinucleótido que

codifica la molécula (fragmento) de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención, o

variante o derivado de la misma. Las regiones codificantes heterógenas incluyen, sin limitación, elementos o

motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterógeno. Una asociación

funcional es cuando una región codificante de un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con

una o más secuencias reguladoras de tal forma que sitúa la expresión del producto génico bajo la influencia o

control de la(s) secuencia(s) reguladora(s). Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de

polipéptido y un promotor asociado con la misma) se "asocian de forma funcional" si la inducción de la función

promotora da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto génico deseado y si la

naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias

reguladoras de la expresión de dirigir la expresión del producto génico ni interfiere con la capacidad del molde de

ADN de transcribirse. Por tanto, una región promotora se asociaría de forma funcional con un ácido nucleico que

codifica un polipéptido si el promotor puede efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede

ser un promotor específico de célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, se pueden asociar de forma funcional con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de célula. En el presente documento se describen promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción. Los expertos en la técnica conocen una variedad de regiones de control de la transcripción. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción, que funcionan en células de vertebrado, tales como, pero sin limitarse a, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (por ejemplo, el promotor temprano inmediato, conjuntamente con intrón-A), virus de simio 40 (por ejemplo, el promotor temprano) y retrovirus (tales como, por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovina y a-globina de conejo, así como otras secuencias que pueden controlar la expresión génica en células eucariotas. Regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido, así como promotores inducibles (por ejemplo, promotores inducibles por tetraciclinas). De forma similar, los expertos en la técnica conocen una variedad de elementos de control de la traducción. Estos incluyen, pero no se limitan a, sitios de unión a ribosoma, codones de iniciación y terminación de la traducción y elementos derivados de sistemas víricos (en particular un sitio de entrada a ribosoma interno o IRES, también denominado secuencia CITE). El casete de expresión también puede incluir otros rasgos característicos tales como un origen de replicación y/o elementos de integración cromosómica tales como repeticiones terminales largas (LTR) retrovíricas o repeticiones terminales invertidas (ITR) víricas adenoasociadas (AAV).

Se pueden asociar regiones codificantes de polinucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, si se desea la secreción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, se puede disponer el ADN que codifica una secuencia señal en dirección 5' del ácido nucleico que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención o un fragmento de la misma. De acuerdo con la hipótesis de señal, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen un péptido señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la técnica saben que los polipéptidos secretados por células de vertebrado en general tienen un péptido señal fusionado al extremo N del polipéptido, que se escinde del polipéptido traducido para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En determinados modos de realización se usa el péptido señal natural, por ejemplo, un péptido señal de la cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que conserva la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que está funcionalmente asociado con él. De forma alternativa, se puede usar un péptido señal de mamífero heterógeno o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder natural se puede sustituir por la secuencia líder del activador de plasminógeno tisular (TPA) humano o p-glucuronidasa de ratón.

El ADN que codifica una secuencia proteica corta que se podría usar para facilitar la posterior purificación (por ejemplo, una marca de histidina) o ayudar a marcar la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se puede incluir dentro de o en los extremos del polinucleótido que codifica la molécula (fragmento) de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T.

En otro modo de realización se proporciona una célula huésped que comprende uno o más polinucleótidos de la invención. En determinados modos de realización se proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores de la invención. Los polinucleótidos y vectores pueden incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en el presente documento en relación con polinucleótidos y vectores, respectivamente. En un modo de realización de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado o transfectado con) un vector que comprende un polinucleótido que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención. Como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier tipo de sistema celular que se puede genomanipular para generar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención o fragmentos de las mismas. Las células huésped adecuadas para replicación y para sustentar la expresión de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T son bien conocidas en la técnica. Dichas células se pueden transfectar o traducir según sea apropiado con el vector de expresión particular y se pueden cultivar grandes cantidades de células que contienen vectores para sembrar fermentadores a gran escala para obtener cantidades suficientes de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para aplicaciones clínicas. Las células huésped adecuadas incluyen microorganismos procariotas, tales como E. coli, o diversas células eucariotas, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto o similares. Por ejemplo, se pueden producir polipéptidos en bacterias, en particular cuando no se necesita glucosilación. Después de la expresión, se puede aislar el polipéptido a partir de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente. Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con rutas de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un polipéptido con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véase Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), y Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos (glucosilados) también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus, que se pueden usar junto con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas). También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que están adaptadas para el cultivo en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293T como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células de riñón de cría de hámster (BHK), células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de riñón de mono (CV1), células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA), células de riñón canino (MDCK), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A), células de pulmón humano (W138), células de hígado humano (Hep G2), células de tumor mamario de ratón (MMT 060562), células TRI (como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC-5 y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO-DHFR' (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como YO, Ns 0, P3X63 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de proteínas, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp.

255-268 (2003). Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, células de levadura, células de insecto, células bacterianas y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado. En un modo de realización, la célula huésped es una célula eucariota, preferentemente una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón embrionario humano (HEK) o una célula linfoide (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20).

Son conocidas en la técnica las tecnologías estándar para expresar genes exógenos en estos sistemas. Las células que expresan un polipéptido que comprende la cadena pesada o bien la ligera de un dominio de unión a antígeno tal como un anticuerpo se pueden genomanipular para que expresen también la otra de las cadenas de anticuerpo de modo que el producto expresado sea un anticuerpo que tiene tanto una cadena pesada como una ligera.

En un modo de realización se proporciona un procedimiento de producción de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de acuerdo con la invención, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, como se proporciona en el presente documento, en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, y recuperar la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la célula huésped (o medio de cultivo de célula huésped).

Los componentes de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se fusionan genéticamente entre sí. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se puede diseñar de modo que sus componentes se fusionen directamente entre sí o indirectamente a través de una secuencia conectora. La composición y longitud del conector se pueden determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica y se pueden someter a prueba para determinar su eficacia. Ejemplos de secuencias conectoras entre diferentes componentes de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T se encuentran en las secuencias proporcionadas en el presente documento. También se pueden incluir secuencias adicionales para incorporar un sitio de escisión para separar los componentes individuales de la fusión si se desea, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de endopeptidasas.

En determinados modos de realización, el uno o más restos de unión a antígeno de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T comprenden al menos una región variable de anticuerpo que se puede unir a un determinante antigénico. Las regiones variables pueden formar parte y derivarse de anticuerpos naturales o no naturales y fragmentos de los mismos. Los procedimientos para producir anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Los anticuerpos no naturales se pueden construir usando síntesis de péptidos en fase sólida, se pueden producir de forma recombinante (por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.186.567) o se pueden obtener, por ejemplo, cribando colecciones combinatorias que comprendan cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.969.108, McCafferty).

Se puede usar cualquier especie de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o región variable animal en las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención.

Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, dominios de unión a antígeno o regiones variables no limitantes útiles en la presente invención pueden ser de origen murino, primate o humano. Si la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T está destinada al uso en humanos, se puede usar una forma quimérica de anticuerpo en la que las regiones constantes del anticuerpo son de un humano. También se puede preparar una forma humanizada o totalmente humana del anticuerpo de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.565.332 concedida a Winter). La humanización se puede lograr mediante diversos procedimientos incluyendo, pero sin limitarse a, (a) injertar las CDR no humanas (por ejemplo, anticuerpo donante) en regiones estructurales y constantes humanas (por ejemplo, anticuerpo receptor) con o sin conservación de residuos de la región estructural críticos (por ejemplo, los que son importantes para conservar buenas funciones de afinidad de unión a antígeno o de anticuerpo), (b) injertar solo las regiones determinantes de la especificidad (SDR o a-CDR; los residuos críticos para la interacción anticuerpo-antígeno) no humanas en regiones estructurales y constantes humanas, o (c) trasplantar todos los dominios variables no humanos completos, pero "enmascararlos" con una sección similar a humana mediante el reemplazo de residuos superficiales. Los anticuerpos humanizados y procedimientos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); las patentes de EE. UU. n.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169 217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (que describen un injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (que describe el "rebamizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (que describe el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) y Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (que describe el enfoque de "selección guiada" al reordenamiento de FR). Se pueden producir anticuerpos humanos y regiones variables humanas usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk y van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) y Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Las regiones variables humanas pueden formar parte de y derivarse de anticuerpos monoclonales humanos preparados por el procedimiento de hibridoma (véase, por ejemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)). También se pueden preparar anticuerpos humanos y regiones variables humanas administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para que produzca anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica (véase, por ejemplo, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)). También se pueden generar anticuerpos humanos y regiones variables humanas aislando secuencias de regiones variables de clones de Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de humano (véase, por ejemplo, Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); y McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab.

En determinados modos de realización, los restos de unión a antígeno útiles en la presente invención se genomanipulan para que tengan una afinidad de unión potenciada de acuerdo con, por ejemplo, los procedimientos descritos en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0132066. La capacidad de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención de unirse a un determinante antigénico específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas conocidas por un experto en la técnica, por ejemplo, técnica de resonancia de plasmón superficial (analizada en un sistema BIACORE T100) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o dominio variable que compite con un anticuerpo de referencia por la unión a un antígeno particular, por ejemplo, un anticuerpo que compite con el anticuerpo V9 por la unión a CD3. En determinados modos de realización, dicho anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o uno conformacional) al que se une el anticuerpo de referencia. Se proporcionan procedimientos ejemplares detallados para mapear un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol.

66 (Humana Press, Totowa, NJ). En un ensayo de competencia ejemplar se incuba el antígeno inmovilizado (por ejemplo, CD3) en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une al antígeno (por ejemplo, anticuerpo V9, descrito en el documento US 6.054.297) y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por la unión al antígeno. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba el antígeno inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado, pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo al antígeno, se retira el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de prueba con relación a la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión al antígeno. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T preparadas como se describe en el presente documento se pueden purificar por técnicas conocidas en la técnica tales como cromatografía de líquidos de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño y similares. Las condiciones reales usadas para purificar una proteína particular dependerán, en parte, de factores tales como carga neta, hidrofobia, hidrofilia, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica. Para la purificación por cromatografía de afinidad se puede usar un anticuerpo, ligando, receptor o antígeno al que se une la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T. Por ejemplo, para la purificación por cromatografía de afinidad de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención, se puede usar una matriz con proteína A o proteína G. Se pueden usar la cromatografía de afinidad con proteína A o G y la cromatografía de exclusión por tamaño secuenciales para aislar una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T esencialmente como se describe en los ejemplos. Se puede determinar la pureza de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T por cualquiera de una variedad de procedimientos analíticos bien conocidos, incluyendo electroforesis en gel, cromatografía de líquidos de alta presión y similares. Por ejemplo, se demostró que las proteínas de fusión de la cadena pesada expresadas como se describe en los ejemplos estaban intactas y apropiadamente ensambladas como se demostró por SDS-PAGE en condiciones reductoras (véase por ejemplo, la figura 2). Se resolvieron tres bandas a aproximadamente Mr 25.000, Mr 50.000 y Mr 75.000, correspondientes a los pesos moleculares previstos de la cadena ligera, la cadena pesada y la proteína de fusión cadena pesada/cadena ligera de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T.

Ensayos

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T proporcionadas en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.

Ensayos de afinidad

La afinidad de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T por un receptor de Fc o un antígeno diana se puede determinar de acuerdo con los procedimientos expuestos en los ejemplos por resonancia de plasmón superficial (SPR), usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores o proteínas diana tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. De forma alternativa, la unión de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T para diferentes receptores o antígenos diana se puede evaluar usando líneas celulares que expresan el receptor o antígeno diana particular, por ejemplo, por citometría de flujo (FACS). Un modo de realización ilustrativo y ejemplar específico para medir la afinidad de unión se describe en lo que sigue y en los ejemplos a continuación.

De acuerdo con un modo de realización, se mide la KD mediante resonancia de plasmón superficial usando una máquina BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C.

Para analizar la interacción entre la porción Fc y los receptores de Fc, se captura el receptor de Fc recombinante con marca de His con un anticuerpo anti-Penta His ("Penta His" descrito como SEQ ID NO: 306) (Qiagen) inmovilizado en chips CM5 y se usan las construcciones biespecíficas como analitos. En resumen, se activan chips de biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, G^eHealthcare) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el anticuerpo anti-Penta-His ("Penta-His" descrito como SEQ ID NO: 306) con acetato de sodio 10 mM, pH 5,0, a 40 pg/ml antes de la inyección a un caudal de 5 pl/min para lograr aproximadamente 6500 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del ligando, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Posteriormente, se captura el receptor de Fc durante 60 s a 4 o 10 nM. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie 1:4 de la construcción biespecífica (intervalo entre 500 nM y 4000 nM) en HBS-Ep (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4) a 25 °C a un caudal de 30 pl/min durante 120 s.

Para determinar la afinidad por el antígeno diana, se capturan las construcciones biespecíficas con un anticuerpo específico anti-Fab humano (GE Healthcare) que se inmoviliza en una superficie de chip sensor CM5 activado como se describe para el anticuerpo anti-Penta-His ("Penta-His" descrito como SEQ ID NO: 306). La cantidad final de proteína acoplada es de aproximadamente 12000 UR. Se capturan las construcciones biespecíficas durante 90 s a 300 nM. Se pasan los antígenos diana a través de las cubetas de lectura durante 180 s a un intervalo de concentración de 250 a 1000 nM con un caudal de 30 pl/min. Se monitoriza la disociación durante 180 s.

Se corrigen las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia. Se usó la respuesta en situación de equilibrio para derivar la constante de disociación K^dpor ajuste no lineal de la curva de la isoterma de unión de Langmuir. Se calculan las velocidades de asociación (kas) y velocidades de disociación (kdis) usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo (programa informático de evaluación BIACORE ® T100 versión 1.1.1) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (K^d) se calcula como la proporción k^{d is}/k^{a s}. Véase, por ejemplo, Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).

Ensayos de actividad

Se puede medir la actividad biológica de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención por diversos ensayos como se describe en los ejemplos. Las actividades biológicas pueden incluir, por ejemplo, la inducción de proliferación de linfocitos T, la inducción de señalización en linfocitos T, la inducción de expresión de marcadores de activación en linfocitos T, la inducción de secreción de citocinas por linfocitos T, la inducción de lisis de células diana tales como células tumorales y la inducción de regresión tumoral y/o la mejora de la supervivencia.

Composiciones, formulaciones y vías de administración

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos a continuación. En un modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

Se proporciona además un procedimiento de producción de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención en una forma adecuada para su administración in vivo, comprendiendo el procedimiento (a) obtener una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de acuerdo con la invención, y (b) formular la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, con lo que se formula una preparación de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para su administración in vivo.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T disueltas o dispersadas en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son, en general, atóxicas para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, es decir, que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción indeseable cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un humano, según sea apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T y opcionalmente un ingrediente activo adicional será conocida por los expertos en la técnica en vista de la presente descripción, como se ejemplifica en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990. Además, para administración a animales (por ejemplo, humanos), se entenderá que las preparaciones deben cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza que exige la Oficina de Normalización Biológica de la FDA o las autoridades correspondientes en otros países. Las composiciones preferentes son formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos los disolventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, conservantes, antioxidantes, proteínas, fármacos, estabilizantes de fármacos, polímeros, geles, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, tintes, tales como materiales y combinaciones de los mismos, como conocerá un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier vehículo convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.

La composición puede comprender diferentes tipos de vehículos dependiendo de si se va a administrar en forma sólida, líquida o aerosol, y si es necesario que sea estéril para dichas vías de administración como inyección. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la presente invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se pueden administrar por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intraesplénica, intrarrenal, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, por inhalación (por ejemplo, inhalación de aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada, bañando células diana directamente, a través de un catéter, a través de un lavado, en cremas, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), o por otro procedimiento o cualquier combinación de lo anterior como conocería un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. Mack Printing Company, 1990). La administración parenteral, en particular inyección intravenosa, se usa más comúnmente para administrar moléculas polipeptídicas tales como las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención.

Las composiciones parenterales incluyen aquellas diseñadas para administración por inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. Para inyección, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De forma alternativa, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril apirógena, antes de su uso. Se preparan soluciones inyectables estériles incorporando las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados a continuación, según se requiera. Se puede conseguir fácilmente la esterilidad, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferentes son técnicas de secado al vacío o liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de un medio líquido previamente filtrado estéril del mismo. Se debe tamponar adecuadamente el medio líquido si es necesario y hacer isotónico el diluyente líquido en primer lugar antes de la inyección con solución salina o glucosada suficiente. La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe preservar de la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que se debe mantener al mínimo la contaminación por endotoxinas hasta un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (p Eg ). Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener compuestos que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, dextrano o similares. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones inyectables oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleatos de etilo o triglicéridos, o liposomas.

Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (18.a ed. Mack Printing Company, 1990). Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. En determinados modos de realización, se puede conseguir una absorción prolongada de una composición inyectable mediante el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.

Además de las composiciones descritas previamente, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T también se pueden formular como preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T se pueden formular con materiales hidrófobos o poliméricos adecuados (por ejemplo, como emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención se pueden fabricar por medio de procedimientos de mezclado, disolución, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización convencionales. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o coadyuvantes fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de las proteínas en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T se pueden formular en una composición en forma de ácido o base libre, neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que conservan sustancialmente la actividad biológica del ácido o base libre. Estas incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteínica, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las correspondientes formas de base libre.

Procedimientos y composiciones terapéuticas

Se puede usar cualquiera de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T proporcionadas en el presente documento en procedimientos terapéuticos. Se pueden usar moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención como agentes inmunoterápicos, por ejemplo, en el tratamiento de cánceres.

Para su uso en procedimientos terapéuticos, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención se formularían, dosificarían y administrarían de una manera consecuente con una buena práctica médica. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por los médicos.

En un aspecto, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En determinados modos de realización se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento. En un modo de realización, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesita el mismo. En determinados modos de realización, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otros modos de realización, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T como se describe en el presente documento para su uso en la inducción de lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral. En determinados modos de realización, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para su uso en un procedimiento de inducción de lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral, en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para inducir la lisis de una célula diana. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un mamífero, preferentemente un humano.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención en la fabricación o preparación de un medicamento. En un modo de realización, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesita el mismo. En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar a un individuo que tiene la enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En un modo de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otro modo de realización, el medicamento es para inducir la lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral. Todavía en otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de inducción de lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral, en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para inducir la lisis de una célula diana. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un mamífero, preferentemente un humano.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad. En un modo de realización, el procedimiento comprende administrar a un individuo que tiene dicha enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención. En un modo de realización se administra una composición a dicho individuo, que comprende la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención en una forma farmacéuticamente aceptable. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un mamífero, preferentemente un humano.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para inducir la lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral. En un modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto una célula diana con una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención en presencia de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico. En otro aspecto se proporciona un procedimiento para inducir la lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral, en un individuo. En un modo de realización este tipo, el procedimiento comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para inducir la lisis de una célula diana. En un modo de realización, un "individuo" es un humano.

En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo, en particular cáncer. Los ejemplos no limitantes de cánceres incluyen cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, neoplasia hemática, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de huesos y cáncer de riñón. Otros trastornos de proliferación celular que se pueden tratar usando una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, neoplasias localizadas en el(los)/la(s): abdomen, hueso, mama, aparato digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroidea, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroidea), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, aparato genital femenino, piel, tejidos blandos, bazo, región torácica y sistema urogenital. También se incluyen afecciones o lesiones precancerosas y metástasis de cáncer. En determinados modos de realización, el cáncer se elige del grupo que consiste en cáncer de células renales, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer cerebral, cáncer de cabeza y cuello. Un experto en la técnica reconoce fácilmente que en muchos casos la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T puede que no proporcione una cura, sino que solo proporciona un beneficio parcial. En algunos modos de realización, un cambio fisiológico que tiene algún beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Por tanto, en algunos modos de realización, una cantidad de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que proporciona un cambio fisiológico se considera una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz". El sujeto, paciente o individuo que necesita tratamiento es típicamente un mamífero, más específicamente un humano.

En algunos modos de realización, una cantidad eficaz de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención se administra a una célula. En otros modos de realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención se administra a un individuo para el tratamiento de enfermedad.

Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención (cuando se usa sola o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, la vía de administración, el peso corporal del paciente, el tipo de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, la gravedad y evolución de la enfermedad, si la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, intervenciones terapéuticas previas o coincidentes, la anamnesis y respuesta del paciente a la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, y el criterio del médico especialista. El profesional responsable de su administración determinará, en cualquier caso, la concentración del/de los ingrediente(s) activo(s) en una composición y la(s) dosis apropiada(s) para el sujeto individual. En el presente documento se contemplan diversas pautas de dosificación que incluyen, pero sin limitarse a, administraciones únicas o múltiples durante diversos momentos, administración con inyección intravenosa rápida e infusión intermitente.

La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se administra de forma adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T puede ser una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua.

Una dosificación diaria típica puede variar desde aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, en general, se prolongaría el tratamiento hasta que se produjera una supresión

deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosificación ejemplar de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T estaría en el intervalo de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 microgramo/kg de peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg de peso

corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg de

peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg de peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg de peso

corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 50 miligramos/kg de peso

corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg de pe corporal, aproximadamente 350 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg de pe corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo

derivable de los mismos. En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de los números enumerados en el

presente documento, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 5 microgramos/kg de peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, etc., en base a los números descritos anteriormente. Por

tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg

o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente,

por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte o, por ejemplo, aproximadamente seis dosis de la molécula de

unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T). Se puede administrar una dosis inicial mayor de carga,

seguida de una o más dosis menores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. La

progresión de este tratamiento se supervisa fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención se usarán en general

en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. Para su uso para tratar o prevenir un estado de enfermedad, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención, o composiciones farmacéuticas de las mismas, se administran o se aplican en una cantidad terapéuticamente

eficaz. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está claramente dentro de las capacidades de

los expertos en la técnica, en especial en vista de la descripción detallada proporcionada en el presente documento.

Para la administración sistémica, se puede estimar inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de

ensayos in vitro, tales como ensayos de cultivo celular. A continuación se puede formular una dosis en modelos

animales para lograr un intervalo de concentración en circulación que incluye la CI50 determinada en cultivo

celular. Se puede usar dicha información para determinar con más exactitud dosis útiles en humanos.

También se pueden estimar dosificaciones iniciales a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales,

usando técnicas que se conocen bien en la técnica. Un experto en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a humanos en base a los datos en animales.

La cantidad e intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar concentraciones plasmáticas de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T que sean suficientes

para mantener un efecto terapéutico. Las dosificaciones habituales en pacientes para administración por

inyección varían de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg/día, típicamente de aproximadamente 0,5 a 1 mg/kg/día.

Se pueden lograr concentraciones plasmáticas terapéuticamente eficaces administrando múltiples dosis cada

día. Las concentraciones en plasma se pueden medir, por ejemplo, por HPLC.

En los casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz de las moléculas de

unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Un experto en la técnica podrá optimizar dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación excesiva.

Una dosis terapéuticamente eficaz de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T

descritas en el presente documento proporcionará en general beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad y la eficacia terapéutica de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de

linfocitos T se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivo celular o animales de experimentación. Se pueden usar ensayos de cultivo celular y estudios en animales para determinar la DL50 (la

dosis letal para un 50 % de una población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en un 50 % de una población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, que se puede

expresar como la proporción DL50/DE50. Son preferentes las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T que presentan índices terapéuticos grandes. En un modo de realización, la molécula

de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de acuerdo con la presente invención presenta un

índice terapéutico alto. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificaciones adecuadas para su uso en humanos. Preferentemente, la dosificación se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo, la forma de dosificación empleada, la vía de administración utilizada, la afección del sujeto y similares. La formulación exacta, vía de administración y dosificación las puede elegir el médico individual en vista de la afección del paciente (véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Cap. 1, p. 1).

El médico especialista para pacientes tratados con moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención sabrá cómo y cuándo finalizar, interrumpir o ajustar la administración debido a la toxicidad, a disfunción orgánica y similares. A la inversa, el médico especialista también sabrá ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no fuera adecuada (descartando la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el abordaje del trastorno de interés variará con la gravedad de la afección que se va a tratar, con la vía de administración y similares. La gravedad de la afección, por ejemplo, se puede evaluar, en parte, por procedimientos de evaluación de pronóstico estándar. Además, la dosis y quizás la frecuencia de las dosis también variarán de acuerdo con la edad, el peso corporal y la respuesta del paciente individual.

Otros agentes y tratamientos

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes en el tratamiento. Por ejemplo, una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. El término "agente terapéutico" engloba cualquier agente administrado para tratar un síntoma o enfermedad en un individuo que necesita dicho tratamiento. Dicho agente terapéutico adicional puede comprender cualquier ingrediente activo adecuado para la indicación particular que se está tratando, preferentemente los que tienen actividades complementarias que no se ven afectadas de manera adversa entre sí. En determinados modos de realización, un agente terapéutico adicional es un agente inmunomodulador, un agente citostático, un inhibidor de la adhesión celular, un agente citotóxico, un activador de la apoptosis celular o un agente que incrementa la sensibilidad de las células a los inductores apoptóticos. En un modo de realización particular, el agente terapéutico adicional es un agente antineoplásico, por ejemplo, un alterador de los microtúbulos, un antimetabolito, un inhibidor de topoisomerasas, un intercalador de ADN, un agente alquilante, un tratamiento hormonal, un inhibidor de cinasas, un antagonista de receptores, un activador de la apoptosis de células tumorales o un agente antiangiogénico.

Dichos otros agentes están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T usada, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores analizados anteriormente. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T se usan en general en las mismas dosificaciones y con vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empírica/clínicamente como apropiada.

Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde dos o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma composición o en composiciones separadas), y la administración separada, en cuyo caso se puede producir la administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención antes de, simultáneamente a y/o después de la administración del adyuvante y/o agente terapéutico adicional. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención también se pueden usar en combinación con radioterapia.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende a) un primer sitio de unión a antígeno que comprende un dominio de la cadena pesada variable (VH) de SEQ ID NO: 274 y un dominio de la cadena ligera variable de SEQ ID NO: 31; y b) un segundo sitio de unión a antígeno que comprende un dominio de la cadena pesada variable (VH) de SEQ ID NO: 36 y un dominio de la cadena ligera variable de SEQ ID NO: 31 para su uso en combinación con un anticuerpo contra PD-L1 o FAP-4-1BBL. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende además un tercer sitio de unión a antígeno que comprende un dominio de la cadena pesada variable (VH) de SEQ ID NO: 274 y un dominio de la cadena ligera variable de SEQ ID NO: 31.

Artículos de fabricación

En otro aspecto de la invención se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o terapéutico de otro modo. El artículo de fabricación en este modo de realización de la invención puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Ejemplos

Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden poner en práctica otros modos de realización diversos, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Procedimientos generales

Técnicas de ADN recombinante

Se usaron procedimientos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. La información general con respecto a las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulinas humanas se da en: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., publicación NIH n.° 91-3242.

Secuenciación de ADN

Las secuencias de ADN se determinaron mediante secuenciación estándar de doble hebra en Synergene (Schlieren).

Síntesis génica

Se generaron segmentos de genes deseados, cuando se requirió, por PCR usando moldes apropiados o bien se sintetizaron por Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR por síntesis génica automatizada. En casos donde no estaba disponible ninguna secuencia génica exacta, se diseñaron cebadores oligonucleotídicos en base a las secuencias de los homólogos más cercanos y se aislaron los genes por RT-PCR del ARN procedente del tejido apropiado. Se clonaron segmentos génicos flanqueados por sitios de escisión de endonucleasas de restricción singulares en vectores de clonación/secuenciación estándar. Se purificó el ADN plasmídico de bacterias transformadas y se determinó la concentración por espectroscopia UV. Se confirmó la secuencia de ADN de los fragmentos génicos subclonados por secuenciación de ADN. Se diseñaron segmentos génicos con sitios de restricción adecuados para permitir la subclonación en los respectivos vectores de expresión. Se diseñaron todas las construcciones con una secuencia de ADN del extremo 5' que codifica un péptido líder que dirige las proteínas para su secreción en células eucariotas.

Aislamiento de linfocitos pan T primarios humanos de PBMC

Se prepararon leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación por densidad en Histopaque a partir de preparaciones enriquecidas de linfocitos (capas leucocíticas) obtenidas de bancos de sangre locales o de sangre fresca de donantes humanos sanos. En resumen, la sangre se diluyó con PBS estéril y se colocó cuidadosamente en una capa sobre un gradiente de Histopaque (Sigma, H8889). Después de la centrifugación durante 30 minutos a 450 x g a temperatura ambiente (freno desconectado), se desechó parte del plasma que se encontraba por encima de la interfase que contenía los PBMC. Los PBMC se transfirieron a nuevos tubos Falcon de 50 ml y los tubos se rellenaron con PBS hasta un volumen total de 50 ml. La mezcla se centrifugó a temperatura ambiente durante 10 minutos a 400 x g (freno activado). El sobrenadante se desechó y el sedimento de PBMC se lavó dos veces con PBS estéril (etapas de centrifugación a 4 °C durante 10 minutos a 350 x g). La población de PBMC resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en un medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 % y L-alanil-L-glutamina al 1 % (Biochrom, K0302) a 37 °C, 5 % de CO2 en la incubadora hasta el inicio del ensayo.

El enriquecimiento de linfocitos T a partir de PBMC se realizó usando el kit II de aislamiento de linfocitos pan T (Miltenyi Biotec n.° 130-091-156), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, los sedimentos celulares se diluyeron en 40 pl de tampón frío por 10 millones de células (PBS con BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM, filtrado estéril) y se incubaron con 10 pl de cóctel de biotina-anticuerpo por 10 millones de células durante 10 min a 4 °C. Se añadieron 30 pl de tampón frío y 20 pl de microesferas magnéticas anti-biotina por 10 millones de células, y la mezcla se incubó durante otros 15 min a 4 °C. Las células se lavaron añadiendo 10-20x el volumen en ese momento y una etapa de centrifugación posterior a 300 x g durante 10 min. Se resuspendieron hasta 100 millones de células en 500 pl de tampón. La separación magnética de linfocitos pan T humanos no marcados se realizó usando columnas ^lS (Miltenyi Biotec n.° 130-042-401) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La población de linfocitos T resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en un medio AIM-V a 37 °C, 5 % de CO2 en la incubadora hasta el inicio del ensayo (no más de 24 h).

Aislamiento de linfocitos T indiferenciados primarios humanos de PBMC

Se prepararon leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación por densidad en Histopaque a partir de preparaciones enriquecidas de linfocitos (capas leucocíticas) obtenidas de bancos de sangre locales o de sangre fresca de donantes humanos sanos. El enriquecimiento de linfocitos T a partir de PBMC se realizó utilizando el kit de aislamiento de linfocitos T indiferenciados CD8+ de Miltenyi Biotec (n.° 130-093-244), de acuerdo con las instrucciones del fabricante pero omitiendo la última etapa de aislamiento de los linfocitos T CD8+ (véase también la descripción para el aislamiento de linfocitos pan T humanos primarios).

Aislamiento de linfocitos pan T murinos de esplenocitos

Se aislaron bazos de ratones C57BL/6, se transfirieron a un tubo en C GentleMACS (Miltenyi Biotech n.° 130 093-237) que contenía tampón MACS (PBS BSA al 0,5 % EDTA 2 mM) y se disociaron con el disociador GentleMACS para obtener suspensiones de células disociadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La suspensión celular se pasó a través de un filtro de separación previa para eliminar las partículas de tejido no disociadas restantes. Después de la centrifugación a 400 x g durante 4 min a 4 °C, se añadió tampón de lisis ACK para lisar los glóbulos rojos (incubación durante 5 min a temperatura ambiente). Las células restantes se lavaron con tampón MACS dos veces, se contaron y se usaron para el aislamiento de linfocitos pan T murinos. Se realizó selección (magnética) negativa usando el kit de aislamiento de linfocitos pan T de Miltenyi Biotec (n.° 130-090-861), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La población de linfocitos T resultante se contó automáticamente (ViCell) y se usó inmediatamente para ensayos adicionales.

Aislamiento de PBMC primarios de macaco cangrejero de sangre heparinizada

Se prepararon leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación por densidad a partir de sangre fresca de donantes macacos cangrejeros sanos, como sigue: Se diluyó sangre heparinizada 1:3 con PBS estéril, y se diluyó medio Lymphoprep (Axon Lab n.° 1114545) al 90 % con PBS estéril. Dos volúmenes de la sangre diluida se colocaron en una capa sobre un volumen del gradiente de densidad diluido y la fracción de PBMC se separó mediante centrifugación durante 30 min a 520 x g, sin freno, a temperatura ambiente. La banda de PBMC se transfirió a un tubo Falcon nuevo de 50 ml y se lavó con PBS estéril por centrifugación durante 10 min a 400 x g a 4 °C. Se realizó una centrifugación a baja velocidad para eliminar las plaquetas (15 min a 150 x g, 4 °C), y la población de PBMC resultante se contó automáticamente (ViCell) y se usó inmediatamente para ensayos adicionales.

Ejemplo 1

Purificación de fusiones biotiniladas de Fc con receptor de folato

Para generar nuevos anticuerpos contra FolR1 humano, se generaron los siguientes antígenos y herramientas de cribado como proteínas de fusión de Fc monovalentes (el dominio extracelular (ECD) del antígeno unido a la región bisagra de la molécula de Fc-botón que se coexpresa con una molécula de Fc-ojal). Los genes antigénicos se sintetizaron (Geneart, Regensburg, Alemania) en base a secuencias obtenidas de GenBank o SwissProt y se insertaron en vectores de expresión para generar proteínas de fusión con Fc-botón con una marca de avidina C terminal para biotinilación in vivo o in vitro. La biotinilación in vivo se logró mediante la coexpresión del gen birA bacteriano que codifica una biotina ligasa bacteriana durante la producción. La expresión de todos los genes se realizó bajo el control de un promotor MPSV quimérico en un plásmido que contiene un elemento oriP para el mantenimiento estable de los plásmidos en líneas celulares que contienen EBNA.

Para la preparación de las moléculas de fusión Fc/antígeno monoméricas biotiniladas, se cotransfectaron células HEK293 EBNA en suspensión en crecimiento exponencial con tres vectores que codifican los dos componentes de la proteína de fusión (cadenas botón en ojal), así como BirA, una enzima necesaria para la reacción de biotinilación. Los vectores correspondientes se utilizaron en una proporción 9,5: 9,5: 1 ("ECD del antígeno-Fc botón-marca de avidina" : "Fc ojal" : "BirA").

Para la producción de proteínas en matraces de agitación de 500 ml, se sembraron 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se centrifugaron durante 5 minutos a 210 x g y el sobrenadante se reemplazó por medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión se resuspendieron en 20 ml de medio CD ^cH^oque contenía 200 |jg de ADN del vector. Después de la adición de 540 j l de polietilenimina (PEI), la solución se mezcló durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclaron con la solución de ADN/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 ml y se incubaron durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 ml de medio F17 y las células se cultivaron durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadió ácido valproico 1 mM y Feed 1 (Lonza) al 7 % al cultivo. El medio de producción también se complementó con biotina 100 jM. Después de cultivar durante 7 días, se recogió el sobrenadante de las células mediante sedimentación por centrifugado durante 15 min a 210 x g. La solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 |jm), se complementó con acida sódica hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo a 4 °C.

Las proteínas secretadas se purificaron de los sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad usando proteína A, seguida de una cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, se cargó el sobrenadante en una columna HiTrap Protein A HP (VC = 5 ml, GE Healthcare) equilibrada con 40 ml de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5. Se retiró la proteína no unida lavando con al menos 10 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5. La proteína unida se eluyó usando un gradiente de pH lineal creado en 20 volúmenes de columna de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM, pH 3,0. A continuación, se lavó la columna con 10 volúmenes de columna de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM, pH 3,0.

El pH de las fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/10 (v/v) de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0. Se concentró la proteína y se filtró antes de cargarla en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,0.

Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de la fusión FolR1-Fc se analizaron mediante electroforesis capilar-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor siguiendo las instrucciones del fabricante (instrumento Caliper LabChipGx, Perkin Elmer). Se analizó el contenido de agregado de las muestras usando una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) en K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7 a 25 °C.

Las proteínas de fusión antígeno-Fc purificadas se analizaron mediante ensayos de resonancia de plasmón superficial usando anticuerpos disponibles comercialmente para confirmar la conformación correcta y natural de los antígenos (no se muestran datos).

Tabla 1: Antígenos producidos para aislamiento, selección y contraselección de anticuerpos anti-FolR1 humano

Tabla 2: Resumen del rendimiento y contenido final de monómero de las fusiones FolR-Fc.

Ejemplo 2

Generación de la cadena ligera común con especificidad para CD3e

Las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T descritas en el presente documento comprenden al menos un resto de unión a CD3. Este resto se puede generar inmunizando animales de laboratorio, cribando una colección de fagos o usando anticuerpos anti-CD3 conocidos. La cadena ligera común con especificidad para CD3s se generó humanizando la cadena ligera de un anticuerpo murino anti-CD3s original (CH2527). Para la humanización de un anticuerpo de origen no humano, se deben trasplantar los residuos de las CDR del anticuerpo no humano (donante) a la región estructural de un anticuerpo humano (aceptador). En general, las secuencias de la región estructural aceptadora se seleccionan alineando la secuencia del donante con una colección de secuencias aceptadoras potenciales y eligiendo una que tenga una homología razonable con el donante o que muestre aminoácidos similares en algunas posiciones críticas para la estructura y la actividad. En el presente caso, la búsqueda de la región estructural aceptadora de anticuerpo se realizó alineando la secuencia del dominio VL de ratón del anticuerpo original con una colección de secuencias de la línea germinal humana y eligiendo la secuencia humana que mostró una identidad de secuencia alta. Sorprendentemente, se encontró una buena coincidencia en términos de homología de secuencia de la región estructural en una cadena ligera humana bastante poco frecuente perteneciente a la familia 7 de dominios V del tipo lambda, más precisamente, hVL_7_46 (nomenclatura IMGT, n.° acceso GenBank Z73674). Esta cadena ligera humana poco frecuente se eligió posteriormente como región estructural aceptadora para la humanización de la cadena ligera de CH2527. Las tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del dominio variable de la cadena ligera de ratón se injertaron en esta región estructural aceptadora. Dado que la región estructural 4 no forma parte de la región variable del gen V de la línea germinal, la alineación para esta región (elemento J) se realizó individualmente. Por tanto, se eligió la secuencia IGLJ3-02 para la humanización de esta cadena ligera. Se generaron trece variantes humanizadas (CH2527-VL7_46-1 a VL7_46-10, VL7_46-12 a VL7_46-14). Estas variantes difieren en los residuos de la región estructural (y combinaciones de los mismos) que se retromutaron a la secuencia del dominio V murino o en los residuos CDR (definición de Kabat) que se podían mantener idénticos a la secuencia de la línea germinal humana. Los siguientes residuos de región estructural fuera de las CDR se retromutaron a los residuos murinos en la variante del dominio VL humanizado final VL7_46-13 (residuos murinos enumerados): V36, E38, F44, G46, G49 y G57, respectivamente. El elemento J humano IGLJ3-02 era 100 % idéntico al elemento J del anticuerpo murino original.

Ejemplo 3

Evaluación por SPR de variantes humanizadas con especificidad para CD3e

Las variantes de VL humanizadas se evaluaron como quimera en un formato clásico 2+1 (figura 1D), es decir, los dominios V de la cadena ligera humanizada se emparejaron con dominios V de la cadena pesada murina. La evaluación por SPR se realizó en un instrumento ProteOn XPR36 (Bio-Rad). Más precisamente, las variantes se capturaron directamente del sobrenadante de cultivo en un chip sensor GLM derivatizado anti-Fab (anticuerpo caprino anti-IgG humana, específico del fragmento F(ab')2, Jackson ImmunoResearch) en orientación vertical.

Los siguientes analitos posteriormente se inyectaron horizontalmente como concentraciones únicas para evaluar la unión a CD3s humano y de macaco cangrejero: huCD3s(-1-26)-Fc(botón)-avi (ID807) 3 pM y cyCD3s-(-1-26)-Fc(botón)-avi-Fc(ojal) (lD873) 2,5 pM, respectivamente. Las respuestas de unión se compararon cualitativamente con la unión de la construcción de control murina y se calificaron con (unión observada comparable), /-(unión observada reducida) y -(ninguna unión observada). El anticuerpo de captura se regeneró después de cada ciclo de captura de ligando y unión de analito y la construcción murina se reinyectó al final del estudio para confirmar la actividad de la superficie de captura. Los resultados se resumen en la tabla 3.

Tabla 3: Evaluación cualitativa de unión basada en SPR para las variantes de la cadena ligera humanizada combinadas con la cadena pesada murina de CH2527. Solo la variante de la cadena ligera humanizada que se eligió finalmente, CH2527-VL7_46-13, resaltada en negrita, presentó una unión comparable a CD3s humano y de macaco cangrejero.

Ejemplo 4

Propiedades de la cadena ligera común humanizada con especificidad para CD3e

La variante del dominio V de la cadena ligera que se eligió como la molécula inicial humanizada es VL7_46-13. Se determinó el grado de humanidad, es decir, la homología de secuencia del dominio V humanizado con la secuencia del dominio V de la línea germinal humana. Para VL7_46-13, la identidad de secuencia global con el homólogo de la línea germinal humana más cercano es de un 65 % antes de la humanización y de un 80 % después de ella. Omitiendo las regiones CDR, la identidad de secuencia es de un 92 % con respecto al homólogo de la línea germinal humana más cercano. Como se puede ver en la tabla 3, VL7_46-13 es la única variante de VL humanizada de un panel de 13 variantes que mostró una unión comparable al anticuerpo murino original y también conservó su reactividad cruzada con el CD3s de macaco cangrejero. Este resultado indica que no era trivial humanizar el dominio VL murino sin perder afinidad de unión por CD3s, lo que requería varias retromutaciones a los residuos de la región estructural murina (en particular G46) mientras se conservaba G24 en CDR1. Además, este resultado muestra que el dominio VL desempeña un papel fundamental en el reconocimiento de la diana. Es importante destacar que el dominio VL humanizado VL7_46-13 basado en una línea germinal humana poco frecuente perteneciente a la familia 7 de dominios V de tipo lambda y que conserva la afinidad y especificidad para CD3s, también es adecuado para su uso como una cadena ligera común en colecciones de anticuerpos de presentación en fagos del formato Fab y permite la selección exitosa de especificidades novedosas, lo que facilita enormemente la generación y producción de moléculas biespecíficas que se unen a CD3s y, por ejemplo, a una diana tumoral y que comparten la misma cadena ligera "común".

Ejemplo 5

Generación de una colección de anticuerpos de presentación en fagos usando una cadena ligera común de la línea germinal humana derivada de HVK1-39

Varios enfoques para generar anticuerpos biespecíficos que se asemejan a la IgG humana de longitud completa utilizan modificaciones en la región Fc que inducen la heterodimerización de dos cadenas pesadas distintas. Dichos ejemplos incluyen tecnologías de botón en ojal (Merchant et al., Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81), SEED (Davis et al., Protein Eng Des Sel. 2010 Abr; 23(4): 195-202) y conducción electrostática (Gunasekaran et al., J Biol Chem. 2010 Jun 18;285(25): 19637-46). Aunque estos enfoques permiten la heterodimerización eficaz de dos cadenas pesadas distintas, el emparejamiento apropiado de cadenas ligeras y pesadas relacionadas sigue siendo un problema. El uso de una cadena ligera (LC) común puede resolver este problema (Merchant et al., Nat Biotech 16, 677-681 (1998)).

Aquí se describe la generación de una colección de anticuerpos para la presentación en un fago M13. Esencialmente, se diseñó una colección de múltiples regiones estructurales para la cadena pesada con una cadena ligera constante (o "común"). Esta colección está diseñada para generar anticuerpos multiespecíficos sin necesidad de usar tecnologías sofisticadas para evitar el emparejamiento erróneo de la cadena ligera.

El uso de una cadena ligera común permite facilitar la producción de estas moléculas, ya que ya no se produce un emparejamiento erróneo y se facilita el aislamiento de un anticuerpo biespecífico altamente puro. En comparación con otros formatos, el uso de fragmentos Fab como componentes básicos a diferencia de, por ejemplo, el uso de fragmentos scFv da como resultado una mayor estabilidad térmica y la ausencia de agregación de scFv y de formación de scFv intermolecular.

Generación de la colección

A continuación se describe la generación de una colección de anticuerpos para la presentación en el fago M13. Esencialmente, se diseñó una colección de múltiples regiones estructurales para la cadena pesada con una cadena ligera constante (o "común").

Se usaron estas cadenas pesadas en la colección (números de acceso GenBank entre paréntesis):

IGHV1-46*01 (X92343) (SEQ ID NO: 104),

IGHV1-69*06 (L22583) (SEQ ID NO: 105),

IGHV3-15*01 (X92216) (SEQ ID NO: 106),

IGHV3-23*01 (M99660) (SEQ ID NO: 107),

IGHV4-59*01 (AB019438) (SEQ ID NO: 108),

IGHV5-51*01 (M99686), (SEQ ID NO: 109)

Todas las cadenas pesadas usan IGHJ2 como elemento J, excepto IGHV1-69*06 que usa la secuencia IGHJ6. El diseño de la aleatorización incluyó la CDR-H1, CDR-H2 y c Dr-H3. Para CDR-H1 y CDR-H2 se eligió una estrategia de aleatorización "suave", y los oligonucleótidos de aleatorización fueron tales que el codón para el aminoácido de la secuencia de la línea germinal estaba presente al 50 %. Todos los demás aminoácidos, excepto la cisteína, sumaban el 50 % restante. En CDR-H3, donde no hay aminoácidos en la línea germinal debido a la presencia del elemento D genético, se diseñaron oligonucleótidos que permiten el uso de insertos aleatorizados entre el elemento V y el elemento J de 4 a 9 aminoácidos de longitud. Los oligonucleótidos contenidos en su parte aleatorizada, por ejemplo, los tres aminoácidos G/Y/S, están presentes al 15 % cada uno, mientras que los aminoácidos A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E están presentes al 4,6 % cada uno.

Procedimientos ejemplares para la generación de colecciones de anticuerpos se describen en Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-413; Lee et al., J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093.

La cadena ligera se deriva de la secuencia humana hVK1-39, y se usa de forma no modificada y no aleatorizada. Esto garantizará que se pueda usar la misma cadena ligera para otros proyectos sin modificaciones adicionales.

Selección de la colección ejemplar:

Las selecciones con todas las colecciones de maduración de la afinidad se llevan a cabo en solución de acuerdo con el siguiente procedimiento usando un dominio extracelular monomérico y biotinilado de un antígeno X diana.

1. 10A12 partículas de fagómidos de cada colección se unen a antígeno soluble biotinilado 100 nM durante 0,5 h en un volumen total de 1 ml. 2. El antígeno biotinilado se captura y las partículas de fagos unidas específicamente se aíslan mediante la adición de ~5 x 10A7 microesferas magnéticas recubiertas con estreptavidina durante 10 min. 3. Las microesferas se lavan usando 5-10 x 1 ml de PBS/Tween20 y 5-10 x 1 ml de PBS. 4. La elución de las partículas de fagos se realiza por adición de 1 ml de TEA (trietilamina) 100 mM durante 10 min y neutralización mediante adición de 500 pl de Tris/HCl 1 M, pH 7,4 y 5. En rondas de selección subsiguientes se aplica la reinfección de las bacterias E. coli TG1 en crecimiento exponencial, la infección con el fago auxiliar VCSM13 y la posterior precipitación con PEG/NaCl de partículas de fagómidos. Las selecciones se llevan a cabo en 3-5 rondas usando concentraciones de antígeno constantes o decrecientes (de 10A-7 M a 2 x 10A-9 M). En la ronda 2, la captura de los complejos antígeno-fago se realizó usando placas de neutravidina en lugar de microesferas de estreptavidina. Todas las reacciones de unión se complementan con seroalbúmina bovina 100 nM o con leche desnatada en polvo para competir por los clones no deseados que surgen de la simple unión adhesiva de los anticuerpos al soporte plástico.

Las selecciones se llevan a cabo en tres o cuatro rondas usando concentraciones decrecientes del antígeno comenzando a partir de 100 nM y bajando hasta 5 nM en la ronda de selección final. Las moléculas de unión específica se definen como señales aprox. 5 veces mayores que el fondo y se identifican mediante ELISA. Las moléculas de unión específica se identifican mediante ELISA como sigue: Se recubren 100 |jl de antígeno biotinilado 10 nM por pocillo en placas de neutravidina. Se añaden sobrenadantes bacterianos que contienen Fab y se detectan los Fab de unión por medio de sus marcas Flag usando un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP. Los clones positivos en ELISA se expresan en bacterias como fragmentos Fab solubles en formato de 96 pocillos y los sobrenadantes se someten a un experimento de cribado cinético mediante análisis SPR usando ProteOn XPR36 (BioRad). Se identifican los clones que expresan Fab con las constantes de afinidad más altas y se secuencian los fagómidos correspondientes. Para una caracterización adicional, las secuencias de Fab se amplifican mediante PCR a partir del fagómido y se clonan por medio de sitios de restricción apropiados en vectores de expresión de IgG1 humana para la producción en mamíferos.

Generación de una colección de anticuerpos de presentación en fagos usando una cadena ligera común específica para CD3e humanizada

Aquí se describe la generación de una colección de anticuerpos para la presentación en el fago M13. Esencialmente, se diseñó una colección de múltiples regiones estructurales para la cadena pesada con una cadena ligera constante (o "común"). Esta colección se diseñó para la generación de anticuerpos biespecíficos de linfocitos T inactivos que contienen Fc, pero que se unen a FcyR, del isotipo IgG1 P329G lAlA o IgG4 SPLE PG en los que uno o dos Fab reconocen un antígeno de superficie tumoral expresado en una célula tumoral mientras que el brazo Fab restante del anticuerpo reconoce CD3s en un linfocito T.

Generación de la colección

A continuación se describe la generación de una colección de anticuerpos para la presentación en el fago M13. Esencialmente, se diseñó una colección de múltiples regiones estructurales para la cadena pesada con una cadena ligera constante (o "común"). Esta colección está diseñada únicamente para la generación de anticuerpos biespecíficos de linfocitos T inactivos que contienen Fc, pero que se unen a FcyR, del isotipo IgG1 P329G LALA o IgG4 SPLE PG.

La diversidad se introdujo mediante aleatorización de oligonucleótidos solo en la CDR3 de las diferentes cadenas pesadas. Los procedimientos para la generación de colecciones de anticuerpos son bien conocidos en la técnica y se describen en Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-413; o en: Lee et al., J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093.

Se usaron estas cadenas pesadas en la colección:

IGHV1-46*01 (X92343) (SEQ ID NO: 104),

IGHV1-69*06 (L22583) (SEQ ID NO: 105),

IGHV3-15*01 (X92216) (SEQ ID NO: 106),

IGHV3-23*01 (M99660) (SEQ ID NO: 107),

IGHV4-59*01 (AB019438) (SEQ ID NO: 108),

IGHV5-51*01 (M99686) (SEQ ID NO: 109)

Se usó la cadena ligera derivada del anticuerpo humanizado CH2527 específico para CD3s de macaco cangrejero y humano en la colección: (VL7_46-13; SEQ ID NO:112). Esta cadena ligera no se aleatorizó y se usó sin modificaciones adicionales para garantizar la compatibilidad con diferentes moléculas de unión biespecíficas. Todas las cadenas pesadas usan IGHJ2 como elemento J, excepto IGHV1-69*06 que usa la secuencia IGHJ6. El diseño de la aleatorización se centró solo en la CDR-H3, y se diseñaron oligonucleótidos de PCR que permiten el uso de insertos aleatorios entre el elemento V y el elemento J de 4 a 9 aminoácidos de longitud. Ejemplo 6

Selección de fragmentos de anticuerpo de colecciones de cadenas ligeras comunes (que comprenden cadenas ligeras con especificidad para CD3e) contra FolRI

Los anticuerpos 16A3, 15A1, 18D3, 19E5, 19A4, 15H7, 15B6, 16D5, 15E12, 21D1, 16F12, 21A5, 21G8, 19H3, 20G6 y 20H7 que comprenden la cadena ligera común VL7_46-13 con especificidad para CD3s se obtuvieron mediante selecciones de presentación en fagos contra diferentes especies (humana, de macaco cangrejero y murina) de FolRI. Los clones 16A3, 15A1, 18D3, 19E5, 19A4, 15H7, 15B6, 21D1, 16F12, 19H3, 20G6 y 20H7 se seleccionaron de una subcolección en la que la cadena ligera común estaba emparejada con un repertorio de cadenas pesadas basado en la línea germinal humana VH1_46. En esta subcolección, la CDR3 de VH1_46 se había aleatorizado en base a 6 longitudes diferentes de CDR3. Los clones 16D5, 15E12, 21A5 y 21G8 se seleccionaron de una subcolección en la que la cadena ligera común estaba emparejada con un repertorio de cadenas pesadas basado en la línea germinal humana VH3_15. En esta subcolección, la CDR3 de VH3_15 se había aleatorizado en base a 6 longitudes diferentes de CDR3. Para obtener anticuerpos con reactividad cruzada para distintas especies (o reactivos para FolR1 murino), las diferentes especies de FolR1 se alternaron (o se mantuvieron constantes) de diferentes maneras en 3 rondas de bioselección (biopanning): 16A3 y 15A1 (FolR1 humano - de macaco cangrejero - humano); 18D3 (FolR1 de macaco cangrejero - humano - murino); 19E5 y 19A4 (3 rondas contra FolR1 murino); 15H7, 15B6, 16D5, 15E12, 21D1, 16F12, 21A5, 21G8 (FolR1 humano - de macaco cangrejero - humano); 19H3, 20G6 y 20H7 (3 rondas contra FolR1 murino).

Los FolR1 humano, murino y de macaco cangrejero como antígenos para las selecciones de presentación en fagos, así como los cribados basados en ELISA y SPR, se expresaron de forma transitoria como fusión de Fc monomérico N terminal en células HEK EBNA y se biotinilaron de forma específica de sitio in vivo por medio de la coexpresión de la biotina ligasa BirA en la secuencia de reconocimiento de la marca de avidina localizada en el extremo C de la porción de Fc que porta la cadena receptora (cadena de botón de Fc). Para evaluar la especificidad para FolR1, se generaron dos receptores relacionados, FolR2 y FolR3 humanos de la misma manera.

Se realizaron rondas de selección (biopanning) en solución de acuerdo con el siguiente patrón:

1. Eliminación previa de ~1012 partículas de fagómidos en placas Maxisorp recubiertas con 10 pg/ml de una IgG humana no relacionada para agotar las colecciones de anticuerpos que reconocen la porción Fc del antígeno.

2. Incubación de las partículas de fagómidos que no se unen a Fc con FolR1 biotinilado humano, de macaco cangrejero o murino 100 nM durante 0,5 h en presencia de una construcción de Fc de botón en ojal no biotinilada no relacionada 100 nM para una disminución adicional de las moléculas de unión a Fc en un volumen total de 1 ml.

3. Captura del FolR1 biotinilado y del fago específicamente unido mediante transferencia a 4 pocillos de una placa de microvaloración prerrecubierta con neutravidina durante 10 min (en las rondas 1 y 3).

4. Lavado de los pocillos respectivos con 5 x PBS/Tween20 y 5 x PBS.

5. Elución de las partículas de fagos por adición de 250 pl de TEA (trietilamina) 100 mM por pocillo durante 10 min y neutralización por adición de 500 pl de Tris/HCl 1 M pH 7,4 a los eluidos agrupados de 4 pocillos. 6. Eliminación posterior de los eluidos neutralizados por incubación en una placa de microvaloración prerrecubierta con neutravidina con FolR2 o FolR3 capturado con biotina 100 nM para la eliminación final de las moléculas de unión a Fc y de unión inespecífica.

7. Reinfección de células de E. coli TG1 en fase logarítmica con el sobrenadante de partículas de fagos eluidas, infección con el fago auxiliar VCSM13, incubación en un agitador a 30 °C durante la noche y posterior precipitación con PEG/NaCl de partículas de fagómidos que se van a usar en la siguiente ronda de selección. Las selecciones se llevaron a cabo en 3 rondas usando concentraciones de antígenos constantes de 100 nM. En la ronda 2, para evitar el enriquecimiento de moléculas de unión a neutravidina, se realizó la captura de complejos antígeno:fago por adición de 5,4 x 107 microesferas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Las moléculas de unión específica se identificaron mediante ELISA como sigue: Se recubrieron 100 pl de FolR1 biotinilado humano, de macaco cangrejero o murino 25 nM y 10 pg/ml de IgG humana sobre placas de neutravidina y placas Maxisorp, respectivamente. Se añadieron sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y se detectaron los Fab de unión por medio de sus marcas Flag usando un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP. Los clones que presentan señales en FolR1 humano y son negativos en IgG humana se incluyeron en la preselección para realizar análisis adicionales y también se sometieron a prueba de manera similar contra las dos especies restantes de FolR1. Se expresaron en bacterias en un volumen de cultivo de 0,5 litros, se purificaron por afinidad y se caracterizaron adicionalmente por análisis por SPR usando el biosensor ProteOn XPR36 de BioRad.

Las afinidades (K^d) de los clones seleccionados se midieron por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un instrumento ProteOn XPR36 (Biorad) a 25 °C con FolR1 biotinilado humano, de macaco cangrejero y murino, así como FolR2 y FolR3 humanos (controles negativos) inmovilizados en chips NLC por captura con neutravidina. Inmovilización de antígenos (ligando): los antígenos recombinantes se diluyeron con PBST (fosfato 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,4, Tween 20 al 0,005 %) a 10 pg/ml y, a continuación, se inyectaron a 30 pl/minuto en orientación vertical. Inyección de analitos: para las mediciones de cinética con dosis única, se cambió la dirección de inyección a la orientación horizontal, se inyectaron simultáneamente series de dilución 1:2 de Fab purificado (intervalos de concentración variables) a lo largo de los canales 1-5 separados, con tiempos de asociación de 200 s y tiempos de disociación de 600 s. Se inyectó el tampón (PBST) a lo largo del sexto canal para proporcionar un blanco "en línea" como referencia. Se calcularon las constantes de velocidad de asociación (kas) y las constantes de velocidad de disociación (kdis) usando un modelo de Langmuir sencillo de unión uno a uno en el programa informático ProteOn Manager v3.1 ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calculó la constante de disociación en equilibrio (KD) como la proporción kdis/kas. La tabla 4 enumera las constantes de disociación en equilibrio (KD) de los clones seleccionados específicos para FolR1.

Tabla 4: Constantes de disociación en equilibrio (KD) para anticuerpos anti-FolR1 (formato Fab) seleccionados por presentación en fagos de subcolecciones de cadenas ligeras comunes que comprenden VL7_46-13, una cadena ligera humanizada específica para CD3s. K^den nM.

Ejemplo 7

Selección de fragmentos de anticuerpo de colecciones genéricas de múltiples regiones estructurales contra FolR1

Los anticuerpos 11F8, 36F2, 9D11, 5D9, 6B6 y 14E4 se obtuvieron mediante selecciones de presentación en fagos basadas en subcolecciones genéricas de múltiples regiones estructurales contra diferentes especies (humana, de macaco cangrejero y murina) de FolR1. En estas subcolecciones de múltiples regiones estructurales, diferentes dominios VL con CDR3 aleatorizada (3 longitudes diferentes) se emparejan con diferentes dominios VH con CDR3 aleatorizada (6 longitudes diferentes). Los clones seleccionados son de los siguientes emparejamientos VL/VH: 11F8 (Vk_1_5/VH_1_69), 36F2 (Vk_3_20/VH_1_46), 9D11 (Vk2D_28/VH1_46), 5D9 (Vk3_20/VH1_46), 6B6 (Vk3_20/VH1_46) y 14E4 (Vk3_20/VH3_23). Para obtener anticuerpos con reactividad cruzada entre especies (o reactivos contra FolR1 murino), las diferentes especies de FolR1 se alternaron (o se mantuvieron constantes) de diferentes maneras en 3 o 4 rondas de bioselección (biopanning): 11F8 (FolR1 de macaco cangrejero - murino - humano); 36F2 (FolR1 humano - murino - de macaco cangrejero - murino); 9D11 (FolR1 de macaco cangrejero - humano - macaco cangrejero); 5D9 (FolR1 humano - de macaco cangrejero - humano); 6B6 (FolR1 humano - de macaco cangrejero - humano) y 14E4 (3 rondas contra FolR1 murino).

2. Incubación de las partículas de fagómidos que no se unen a Fc con FolRI biotinilado humano, de macaco cangrejero o murino 100 nM durante 0,5 h en presencia de una construcción de Fc de botón en ojal no biotinilada no relacionada 100 nM para una disminución adicional de las moléculas de unión a Fc en un volumen total de 1 ml.

4. Lavado de los pocillos respectivos con 5 x PBS/Tween20 y 5 x PBS.

7. Reinfección de células de E. coli TG1 en fase logarítmica con el sobrenadante de partículas de fagos eluidas, infección con el fago auxiliar VCSM13, incubación en un agitador a 30 °C durante la noche y posterior precipitación con PEG/NaCl de partículas de fagómidos que se van a usar en la siguiente ronda de selección. Las selecciones se llevaron a cabo en 3 rondas usando concentraciones de antígenos constantes de 100 nM. En las rondas 2 y 4, para evitar el enriquecimiento de moléculas de unión a neutravidina, se realizó la captura de complejos antígeno:fago por adición de 5,4 x 107 microesferas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Las moléculas de unión específica se identificaron mediante ELISA como sigue: Se recubrieron 100 pl de FolR1 biotinilado humano, de macaco cangrejero o murino 25 nM y 10 pg/ml de IgG humana sobre placas de neutravidina y placas Maxisorp, respectivamente. Se añadieron sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y se detectaron los Fab de unión por medio de sus marcas Flag usando un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP. Los clones que presentan señales en FolR1 humano y son negativos en IgG humana se incluyeron en la preselección para realizar análisis adicionales y también se sometieron a prueba de manera similar contra las dos especies restantes de FolR1. Se expresaron en bacterias en un volumen de cultivo de 0,5 litros, se purificaron por afinidad y se caracterizaron adicionalmente por análisis por SPR usando el biosensor ProteOn XPR36 de BioRad.

Las afinidades (K^d) de los clones seleccionados se midieron por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un instrumento ProteOn XPR36 (Biorad) a 25 °C con FolR1 biotinilado humano, de macaco cangrejero y murino, así como FolR2 y FolR3 humanos (controles negativos) inmovilizados en chips NLC por captura con neutravidina. Inmovilización de antígenos (ligando): los antígenos recombinantes se diluyeron con PBST (fosfato 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,4, Tween 20 al 0,005 %) a 10 pg/ml y, a continuación, se inyectaron a 30 pl/minuto en orientación vertical. Inyección de analitos: para las mediciones de cinética con dosis única, se cambió la dirección de inyección a la orientación horizontal, se inyectaron simultáneamente series de dilución 1:2 de Fab purificado (intervalos de concentración variables) a lo largo de los canales 1-5 separados, con tiempos de asociación de 150 o 200 s y tiempos de disociación de 200 o 600 s, respectivamente. Se inyectó el tampón (PBST) a lo largo del sexto canal para proporcionar un blanco "en línea" como referencia. Se calcularon las constantes de velocidad de asociación (k^{a s}) y las constantes de velocidad de disociación (k^{d is}) usando un modelo de Langmuir sencillo de unión uno a uno en el programa informático ProteOn Manager v3.1 ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calculó la constante de disociación en equilibrio (K^d) como la proporción k^{d is}/k^{a s}. La tabla 5 enumera las constantes de disociación en equilibrio (K^d) de los clones seleccionados específicos para FolR1.

Tabla 5: Constantes de disociación en equilibrio (K^d) para anticuerpos anti-FolR1 (formato Fab) seleccionados por presentación en fagos de subcolecciones genéricas de múltiples regiones estructurales. K^den nM.

Ejemplo 8

Producción y purificación de moléculas de unión a FolRI novedosas en formatos biespecíficos de linfocitos T e IgG

Para identificar las moléculas de unión a FolRI que pueden inducir la destrucción dependiente de linfocitos T de las células diana seleccionadas, los anticuerpos aislados de una colección de Fab o cadenas ligeras comunes se convirtieron al formato IgG1 humano correspondiente. En resumen, se amplificaron las cadenas pesada variable y ligera variable de moléculas de unión a FolR1 únicas de la presentación en fagos mediante reacciones de PCR estándar usando los clones de Fab como molde. Los productos de PCR se purificaron e insertaron (mediante clonación basada en endonucleasas de restricción y ligasas o bien mediante "recombinación" usando el kit InFusion de Invitrogen) en vectores de expresión adecuados en los que se fusionan a la cadena pesada constante humana o cadena ligera constante humana apropiada. Los casetes de expresión en estos vectores consisten en un promotor MPSV quimérico y un sitio de poliadenilación sintético. Además, los plásmidos contienen la región oriP del virus de Epstein-Barr para el mantenimiento estable de los plásmidos en células HEK293 que albergan el antígeno nuclear de EBV (EBNA). Después de la transfección mediada por PEI, los anticuerpos se produjeron de forma transitoria en células HEK293 EBNA y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A estándar seguida de cromatografía de exclusión por tamaño como se describe:

Transfección y producción transitorias

Todos los anticuerpos (biespecíficos) (si no se obtuvieron a partir de una fuente comercial) usados en el presente documento se produjeron de forma transitoria en células HEK293 EBNA usando un procedimiento de transfección mediada por PEI para los vectores requeridos como se describe a continuación. Las células HEK293 EBNA se cultivan en suspensión sin suero en medio de cultivo CD CHO. Para la producción en un matraz de agitación de 500 ml, se siembran 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección (para escalas alternativas, todas las cantidades se ajustaron en consecuencia). Para la transfección, las células se centrifugan durante 5 min a 210 x g, el sobrenadante se reemplaza por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Se mezclan vectores de expresión en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 pg de ADN. Después de la adición de 540 pl, la solución de PEI se mezcla con una agitadora vorticial durante 15 s y posteriormente se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclan con la solución de ADN/PEI, se transfieren a un matraz de agitación de 500 ml y se incuban durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añaden 160 ml de medio F17 y las células se cultivan durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añade ácido valproico 1 mM y Feed 1 al 7 %. Después de un cultivo de 7 días, se recoge el sobrenadante para la purificación mediante centrifugación durante 15 min a 210 x g, la solución se filtra en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm) y se añade acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantiene a 4 °C. Después de la producción, se obtuvieron los sobrenadantes y se filtraron los sobrenadantes que contenían anticuerpos a través de filtros estériles de 0,22 pm y se almacenaron a 4 °C hasta su purificación.

Purificación de anticuerpos

Todas las moléculas se purificaron en dos etapas usando procedimientos estándar, tales como cromatografía de afinidad con proteína A (Ákta Explorer) y cromatografía de exclusión por tamaño. El sobrenadante obtenido de la producción transitoria se ajustó a pH 8,0 (usando TRIS 2 M, pH 8,0) y se aplicó a una columna HiTrap PA FF (GE Healthcare, volumen de columna (VC) = 5 ml) equilibrada con 8 volúmenes de columna (VC) de tampón A (fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5). Después de lavar con 10 VC de tampón A, la proteína se eluyó usando un gradiente de pH para tampón B (citrato de sodio 20 mM, pH 3, NaCl 100 mM, glicina 100 mM) en 12 VC. Las fracciones que contenían la proteína de interés se combinaron y el pH de la solución se ajustó suavemente a pH 6,0 (usando Na2HPO40,5 M, pH 8,0).

Las muestras se concentraron a 2 ml usando ultraconcentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius) y posteriormente se aplicaron a una columna de calidad preparativa HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, pH 6,0, NaCl 140 mM, Tween-20 al 0,01 %. El contenido agregado de las fracciones eluidas se analizó por cromatografía analítica de exclusión por tamaño. Por lo tanto, se aplicaron 30 pl de cada fracción a una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en K2HPO4 25 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7, a 25 °C. Se combinaron las fracciones que contenían menos de un 2 % de oligómeros y se concentraron a una concentración final de 1-1,5 mg/ml usando ultraconcentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius). Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de las construcciones se analizaron mediante electroforesis capilar-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor siguiendo las instrucciones del fabricante (instrumento Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Las proteínas purificadas se congelaron en N2 líquido y se almacenaron a -80 °C.

Basándose en los resultados de la caracterización in vitro, las moléculas de unión seleccionadas se convirtieron a un formato biespecífico de linfocitos T. En estas moléculas, los restos de unión a FolR1:CD3 están dispuestos en un orden 2:1 con los Fab de FolR1 localizados en el extremo N. Para los clones aislados de la colección de Fab estándar, la parte de unión a CD3 se generó como un CrossFab (entrecruzamiento de CHICx), mientras que para los clones de la colección de cadenas ligeras comunes no fue necesario ningún entrecruzamiento. Estas moléculas biespecíficas se produjeron y purificaron de forma análoga a las IgG.

Tabla 6: Rendimiento y contenido de monómero de moléculas de unión a FolR1 novedosas en formato IgG y TCB, respectivamente.

CLC: Cadena ligera común

Ejemplo 9

Formatos biespecíficos de linfocitos T 2+1 y 1+1

Se prepararon cuatro formatos biespecíficos de linfocitos T diferentes para una molécula de unión de la colección de cadenas ligeras comunes (16D5) y tres formatos para una molécula de unión de la colección de Fab (9D11) para comparar sus propiedades de destrucción in vitro.

El formato estándar es el formato invertido 2+1 como ya se describió (restos de unión a FolR1:CD3 dispuestos en un orden 2:1 con los Fab de FolR1 localizados en el extremo N). En el formato clásico 2+1, los restos de unión a FolR1:CD3 están dispuestos en un orden 2:1 con el Fab de CD3 localizado en el extremo N. También se prepararon dos formatos monovalentes. El formato 1 1 cabeza a cola tiene los restos de unión a FolR1:CD3 dispuestos en un orden 1:1 en el mismo brazo de la molécula con el Fab de FolR1 localizado en el extremo N. En el formato 1 1 clásico, los restos de unión a FolR1:CD3 están presentes una vez, cada uno en un brazo de la molécula. Para el clon 9D11 aislado de la colección de Fab estándar, la parte de unión a CD3 se generó como un CrossFab (entrecruzamiento de CHICx), mientras que para el clon 16D5 de la colección de cadenas ligeras comunes no fue necesario ningún entrecruzamiento. Estas moléculas biespecíficas se produjeron y purificaron de forma análoga al formato biespecífico de linfocitos T invertido estándar.

Tabla 7: Resumen del rendimiento y contenido final de monómero de los diferentes formatos biespecíficos de linfocitos T.

Ejemplo 10

Caracterización bioquímica de moléculas de unión a FolRI por resonancia de plasmón superficial La unión de las moléculas de unión a FolRI como IgG o en el formato biespecífico de linfocitos T a diferentes receptores de folato recombinantes (FolR1, 2 y 3 humano, FolR1 murino y FolR1 de macaco cangrejero; todos como fusiones Fc) se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Todos los experimentos de SPR se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo/Alemania).

Inyecciones únicas

Primero, las IgG anti-FolR1 se analizaron mediante inyecciones únicas (tabla 1) para caracterizar su reactividad cruzada (con FolR1 humano, murino y de macaco cangrejero) y especificidad (para FolR1 humano, FolR2 humano, FolR3 humano). Las fusiones con Fc monomérico biotinilado recombinante de los receptores de folato 1 humano, de macaco cangrejero y murino (FolR1-Fc) o los receptores de folato 2 y 3 humano (FolR2-Fc, FolR3-Fc) se acoplaron directamente en un chip SA usando las instrucciones de acoplamiento estándar (Biacore, Friburgo/Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 300-400 UR. Las IgG se inyectaron durante 60 segundos a una concentración de 500 nM. Las IgG que se unieron a huFolR2 y huFolR3 se rechazaron por falta de especificidad. La mayoría de las moléculas de unión solo tienen reactividad cruzada entre FolR1 humano y de macaco cangrejero, mientras que la reactividad cruzada adicional para FolR1 murino estuvo la mayor parte del tiempo vinculada a la pérdida de especificidad.

Tabla 8: Reactividad cruzada y especificidad de 25 nuevas moléculas de unión al receptor de folato 1 (como IgG), así como de dos IgG de control (Mov19 y Farletuzumab). significa unión,-significa que no se une, /-significa unión débil.

Avidez por el receptor de folato 1

La avidez de la interacción entre las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 y los receptores de folato recombinantes se determinó como se describe a continuación (tabla 9).

Las fusiones con Fc monomérico biotinilado recombinante del receptor de folato 1 humano, de macaco cangrejero y murino (FolR1-Fc) se acoplaron directamente en un chip SA usando las instrucciones de acoplamiento estándar (Biacore, Friburgo/Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 300 400 UR. Las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 se pasaron a un intervalo de concentración de 2,1 a 500 nM con un caudal de 30 pl/minuto a través de las cubetas de lectura durante 180 segundos. Se supervisó la disociación durante 600 segundos. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia inmovilizada con fusión de Fc del receptor de IL2 biotinilado recombinante. Para el análisis de la interacción de IgG 19H3 y el receptor de folato 1 murino, se añadió folato (Sigma F7876) en el tampón de migración HBS-EP a una concentración de 2,3 pM. Las curvas de unión resultantes de la unión bivalente de las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T se aproximaron a una unión de Langmuir 1:1 y se ajustaron a ese modelo (que no es correcto, pero da una idea de la avidez). Las constantes de avidez aparente para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad del ajuste utilizando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare). Tabla 9: Unión bivalente (avidez con K^daparente) de moléculas de unión a FolR1 seleccionadas como IgG o como moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) en FolR1 humano y de macaco cangrejero.

1. Afinidad por el receptor de folato 1

La afinidad de la interacción entre las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 y los receptores de folato recombinantes se determinó como se describe a continuación (tabla 10).

Para la medición de afinidad, se realizó el acoplamiento directo de alrededor de 6000-7000 unidades de resonancia (UR) del anticuerpo específico anti-Fab humano (kit de captura de Fab, GE Healthcare) en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (GE Healthcare). Se capturaron las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 a 20 nM con un caudal de 10 pl/min durante 20 o 40 segundos, la cubeta de lectura de referencia se dejó sin captura. Se pasaron series de dilución (6,17 a 500 nM o 12,35 a 3000 nM) de fusión de Fc con el receptor de folato 1 humano o de macaco cangrejero en todas las cubetas de lectura a 30 pl/min durante 120 o 240 segundos para registrar la fase de asociación. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 240 s y se activó cambiando de la solución de muestra a HBS-EP. La superficie del chip se regeneró después de cada ciclo usando una inyección doble de 60 s de glicina-HCl 10 mM, pH 2,1 o pH 1,5. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia 1. Las constantes de afinidad para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad ajustando a una unión de Langmuir 1:1 usando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabla 10: Unión monovalente (afinidad) de moléculas de unión a FolR1 seleccionadas como IgG o como moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) en FolR1 humano y de macaco cangrejero.

2. Afinidad por CD3

La afinidad de la interacción entre las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FoIRI y CD3só-Fc humano recombinante se determinó como se describe a continuación (tabla 11).

Para la medición de la afinidad, se realizó el acoplamiento directo de alrededor de 9000 unidades de resonancia (UR) del anticuerpo específico anti-Fab humano (kit de captura de Fab, GE Healthcare) en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (GE Healthcare). Se capturaron las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 a 20 nM con un caudal de 10 pl/min durante 40 segundos, la cubeta de lectura de referencia se dejó sin captura. Se pasaron series de dilución (6,17 a 500 nM) de la fusión CD3só humano-Fc en todas las cubetas de lectura a 30 pl/min durante 240 segundos para registrar la fase de asociación. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 240 s y se activó cambiando de la solución de muestra a HBS-EP. La superficie del chip se regeneró después de cada ciclo usando una inyección doble de 60 s de glicina-HCl 10 mM, pH 2,1. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia 1. Las constantes de afinidad para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad ajustando a una unión de Langmuir 1:1 usando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabla 11: Unión monovalente (afinidad) de moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) anti-FolR1 seleccionadas en CD3-Fc humano.

La parte de unión a CD3 es idéntica para todas las construcciones y la afinidad es similar para las moléculas biespecíficas de linfocitos T medidas (intervalo de K^dentre 60 y 90 nM).

Ejemplo 11

Moléculas biespecíficas de linfocitos T de unión simultánea al receptor de folato 1 y a CD3

La unión simultánea de las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 al receptor de folato 1 recombinante y a CD3só-Fc humano recombinante se determinó mediante resonancia de plasmón superficial como se describe a continuación. Las fusiones con Fc monomérico biotinilado recombinante del receptor de folato 1 humano, de macaco cangrejero y murino (FolR1-Fc) se acoplaron directamente en un chip SA usando las instrucciones de acoplamiento estándar (Biacore, Friburgo/Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 300-400 UR. Las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 se inyectaron durante 60 s a 500 nM con un caudal de 30 pl/minutos a través de las cubetas de lectura, seguido de una inyección de huCDsó-Fc durante 60 s a 500 nM. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia inmovilizada con fusión de Fc del receptor de IL2 biotinilado recombinante. Las cuatro moléculas biespecíficas de linfocitos T sometidas a prueba (TCB 16D5, TCB 21A5, TCB 51C7 y TCB 45D2) se pudieron unir simultáneamente al receptor de folato 1 y a CD3 humano como se esperaba.

Ejemplo 12

Agrupación de epítopos

Para la agrupación de epítopos, las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 se inmovilizaron directamente en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (GE Healthcare), con una respuesta final de alrededor de 700 UR. A continuación, se capturó huFolR1-Fc 500 nM durante 60 s, seguido de 500 nM de las diferentes moléculas de unión durante 30 s. La superficie se regeneró con dos inyecciones de glicina 10 mM a pH 2 durante 30 s cada una. Se evalúa si las diferentes moléculas de unión se pueden unir a huFolR1 capturado en moléculas de unión inmovilizadas (tabla 12).

Tabla 12: Caracterización de epítopos de moléculas de unión a FolR1 seleccionadas como IgG o como moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) en FolR1 humano. significa unión,-significa que no se une, /-significa unión débil

En base a estos resultados y a datos adicionales con unión simultánea a huFoIRI inmovilizado, las moléculas de unión se separaron en tres grupos. No está claro si 9D11 tiene un epítopo separado, ya que desplaza a todas las demás moléculas de unión. 16D5 y 21A5 parecen estar en el mismo grupo y Mov19, Farletuzumab (Coney et al., Cancer Res. 1991 Nov 15;51(22):6125-32; Kalli et al., Curr Opin Investig Drugs. 2007 Dic; 8(12): 1067-73) y 36F2 en otro (tabla 13). Sin embargo, 36F2 se une a un epítopo diferente que Mov19 y Farletuzumab, ya que se une a FolR1 humano, de macaco cangrejero y murino.

Tabla 13: Agrupación de epítopos de moléculas de unión a FolR1 seleccionadas como IgG o como moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) en FolR1 humano

Ejemplo 13

Selección de moléculas de unión

Las moléculas de unión a FolR1 en los formatos de IgG se cribaron mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) y mediante ensayo in vitro en células para seleccionar los mejores candidatos.

Las IgG anti-FolR1 se analizaron mediante SPR para caracterizar su reactividad cruzada (con FolR1 humano, murino y de macaco cangrejero) y especificidad (para FolR1 humano, FolR2 humano, FolR3 humano). La unión inespecífica a FolR2 y 3 humanos se consideró un factor de exclusión. La unión y la especificidad para FolR1 humano se confirmó en las células. Algunas moléculas de unión no se unieron a las células que expresaban FolR1, aunque reconocieron el FolR1 humano recombinante en SPR. Se determinó la temperatura de agregación, pero no fue un factor de exclusión, ya que las moléculas de unión seleccionadas eran todas estables. Las moléculas de unión seleccionadas se sometieron a prueba en un ELISA de polirreactividad para verificar la unión inespecífica, lo que dio lugar a la exclusión de cuatro moléculas de unión. Este procedimiento dio como resultado una selección inicial de tres moléculas de unión: 36F2 (colección de Fab), 9D11 (colección de Fab) y 16D5 (cadena ligera común). 36F2 se disoció rápidamente de huFolR1 y, por lo tanto, inicialmente no se escogió.

Ejemplo 14

Unión específica de moléculas de unión a FolRI recientemente generadas a células tumorales que expresan FolR1 humano

Se generaron nuevas moléculas de unión a FolR1 por medio de presentación en fagos usando una colección de Fab o una colección de cadenas ligeras comunes usando la cadena ligera de CD3. Las moléculas de unión identificadas se convirtieron a un formato de IgG1 humana y se abordó la unión a células HeLa de alta expresión de FolR1. Como molécula de referencia se incluyó la molécula de unión a FolR1 humano Mov19. La mayoría de las moléculas de unión sometidas a prueba en este ensayo mostraron una unión a FolR1 de intermedia a buena con algunos clones uniéndose igual de bien que Mov19 (véase la figura 2). Los clones 16A3, 18D3, 15H7, 15B6, 21D1, 14E4 y 16F12 se excluyeron porque la unión a FolR1 en las células no se pudo confirmar por citometría de flujo. En una siguiente etapa, se sometió a prueba la especificidad de los clones seleccionados para FolR1 humano excluyendo la unión al FolR2 humano estrechamente relacionado. Las células HEK se transfectaron de forma transitoria con FolR1 humano o FolR2 humano para abordar la especificidad. Los clones 36F2 y 9D11 derivados de la colección de Fab y los clones 16D5 y 21A5 derivados de la colección de CLC se unieron específicamente a FolR1 humano y no a FolR2 humano (véanse las figuras 3A-B). Todos los demás clones sometidos a prueba mostraron al menos algo de unión a FolR2 humano (véanse las figuras 3A-B). Por lo tanto, estos clones se excluyeron de la caracterización adicional. En paralelo, la reactividad cruzada de los clones de FolR1 con FolR1 de macaco cangrejero se abordó realizando estudios de unión a células HEK transfectadas de forma transitoria con FolR1 de macaco cangrejero. Todos los clones sometidos a prueba se pudieron unir a FolR1 de macaco cangrejero y los cuatro clones específicos seleccionados de FolR1 humano 36F2, 9D11, 16D5 y 21A5 se unieron comparativamente bien a FolR1 humano y de macaco cangrejero (figura 4). Posteriormente, tres moléculas de unión de reactividad cruzada con macaco cangrejero específicas de FolR1 humano se convirtieron al formato de TCB y se sometieron a prueba para determinar la inducción de la destrucción por linfocitos T y la activación de linfocitos T. Estos clones fueron 9D11 de la colección de Fab y 16D5 y 21A5 de la colección de CLC. Como molécula de referencia se incluyó TCB Mov19 anti-FolR1 en todos los estudios. Estos TCB anti-FolR1 se usaron a continuación para comparar la inducción de internalización después de unirse a FolR1 en células HeLa. Los tres clones sometidos a prueba se internalizan tras la unión a FolR1 de manera comparable a la internalización tras la unión de TCB Mov19 anti-FolR1 (figura 5). TCB 21A5 anti-FolR1 se suspendió debido a signos de polirreactividad.

Ejemplo 15

Destrucción mediada por linfocitos T de células diana tumorales que expresan FolRI inducida por anticuerpos TCB anti-FolR1

Las TCB anti-FolR1 se usaron para determinar la destrucción mediada por linfocitos T de células tumorales que expresan FolR1. Se usó un panel de potenciales líneas celulares diana para determinar los sitios de unión a FolR1 mediante análisis por Qifikit.

El panel de células tumorales usado contiene células tumorales con expresión alta, intermedia y baja de FolR1 y una línea celular negativa para FolR1.

Tabla 14: Sitios de unión a FolR1 en células tumorales

Se determinó la unión de las tres TCB anti-FolR1 diferentes (que contienen las moléculas de unión 9D11, 16D5 y Mov19) a este panel de líneas celulares tumorales, lo que demuestra que las TCB anti-FolR1 se unen específicamente a las células tumorales que expresan FolR1 y no a una línea celular tumoral negativa para FolR1. La cantidad de construcción unida es proporcional al nivel de expresión de FolR1 y todavía existe una buena unión de las construcciones a la línea celular de baja expresión de FolR1 HT-29 detectable. Además, no existe unión del control negativo TCB DP47 a ninguna de las líneas celulares usadas (figuras 6A-E).

La línea celular de expresión intermedia SKOV3 y la línea celular de expresión baja HT-29 se usaron adicionalmente para someter a prueba la destrucción mediada por linfocitos T y la activación de linfocitos T usando TCB 16D5 y TCB 9D11; TCB DP47 se incluyó como control negativo. Ambas líneas celulares se destruyeron ya en presencia de niveles muy bajos de TCB 16D5 y TCB 9D11 y no existió diferencia en la actividad entre ambas TCB, aunque TCB 9D11 se une más fuertemente a FolR1 que TCB 16D5. La destrucción global de células SKOV3 fue mayor en comparación con HT-29, que refleja los niveles de expresión más altos de FolR1 en células SKOV3 (figuras 7A-D). En línea con esto, se detectó una fuerte regulación por incremento del marcador de activación CD25 y CD69 en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. La activación de los linfocitos T fue muy similar en presencia de células SKOV3 y células HT-29. El control negativo TCB DP47 no induce ninguna destrucción a las concentraciones usadas y no existió una regulación por incremento significativa de CD25 y CD69 en los linfocitos T.

Tabla 15: Valores de CE50 de destrucción de células tumorales y activación de linfocitos T con células SKOV3

Tabla 16: Valores de CE50 de destrucción de células tumorales y activación de linfocitos T con células HT-29

Ejemplo 16

Unión a eritrocitos y activación de linfocitos T en sangre completa

Para demostrar que no existe activación espontánea en ausencia de células tumorales que expresan FolRI, se analizó si existe unión de los clones de FolR1 a eritrocitos que potencialmente podrían expresar FolR1. No pudimos observar ninguna unión específica de IgG 9D11, IgG 16D5 e IgG Mov19 a los eritrocitos, incluyendo IgG DP47 de control negativo (figura 8).

Para excluir cualquier unión inespecífica adicional a los glóbulos sanguíneos o la activación inespecífica por medio de TCB anti-FolR1, se añadieron TCB 9D11, TCB 16D5 y TCB Mov19 a la sangre completa y se analizó la regulación por incremento de CD25 y CD69 en los linfocitos T CD4+ y los linfocitos T CD8+ por citometría de flujo. La TCB DP47 se incluyó como control negativo. No se pudo observar activación de los linfocitos T con ninguna de las construcciones sometidas a prueba al analizar la regulación por incremento de CD25 y CD69 en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ (figura 9).

Ejemplo 17

Eliminación del sitio de N-glucosilación en la cadena ligera de 9D11

Durante el análisis de las diferentes moléculas de unión a FolR1 para identificar posibles puntos calientes de secuencia, se identificó un supuesto sitio de N-glucosilación al final de la CDR L3 del clon 9D11. Normalmente, el motivo consenso para la N-glucosilación se define como N-X-S/T-X (donde X no es P). La secuencia de CDR L3 (MQASIMNRT) (SEQ ID NO: 61) coincide perfectamente con este motivo consenso que tiene la secuencia N-R-T. Dado que la glucosilación podría no ser completamente reproducible entre diferentes lotes de producción, esto podría tener un impacto en la unión a FolR1, si la glucosilación en CDR L3 contribuye a la unión al antígeno. Para evaluar si este sitio de N-glucosilación es importante para la unión a FolR1, o si se podría reemplazar sin afectar a la unión, se generaron diferentes variantes de la cadena ligera de 9D11 en las que el sitio de N-glucosilación se intercambió por mutagénesis específica de sitio.

1. Transfección y producción transitorias

Las cuatro moléculas biespecíficas de linfocitos T se produjeron de forma transitoria en células HEK293 EBNA usando un procedimiento de transfección mediado por PEI para los vectores requeridos como se describe a continuación. Las células HEK293 EBNA se cultivaron en suspensión sin suero en medio de cultivo CD CHO. Para la producción en un matraz de agitación de 500 ml, se sembraron 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección (para escalas alternativas, todas las cantidades se ajustaron en consecuencia). Para la transfección, las células se centrifugaron durante 5 min a 210 x g y el sobrenadante se reemplazó por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión se mezclaron en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 pg de ADN. Después de la adición de 540 pl, la solución de PEI se mezcló con una agitadora vorticial durante 15 s y posteriormente se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclaron con la solución de ADN/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 ml y se incubaron durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añadieron 160 ml de medio F17 y las células se cultivaron durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadió ácido valproico 1 mM y Feed 1 al 7 %. Después de un cultivo de 7 días, se recogió el sobrenadante para la purificación mediante centrifugación durante 15 min a 210 x g, la solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm) y se añadió acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo a 4 °C. Después de la producción, se obtuvieron los sobrenadantes y se filtraron los sobrenadantes que contenían anticuerpos a través de filtros estériles de 0,22 pm y se almacenaron a 4 °C hasta su purificación.

2. Purificación de anticuerpos

Todas las moléculas se purificaron en dos etapas usando procedimientos estándar, tales como cromatografía de afinidad con proteína A (Ákta Explorer) y cromatografía de exclusión por tamaño. El sobrenadante obtenido de la producción transitoria se ajustó a pH 8,0 (usando TRIS 2 M, pH 8,0) y se aplicó a una columna HiTrap PA HP (GE Healthcare, volumen de columna (VC) = 5 ml) equilibrada con 8 volúmenes de columna (VC) de tampón A (fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M, Tween-20 al 0,01 %, pH 7,5). Después de lavar con 10 VC de tampón A, la proteína se eluyó usando un gradiente de pH para tampón B (citrato de sodio 20 mM, pH 2,5, NaCl 0,5 M, Tween-20 al 0,01 %) en 20 VC. Las fracciones que contenían la proteína de interés se combinaron y el pH de la solución se ajustó suavemente a pH 6,0 (usando Tris 2 M, pH 8,0). Las muestras se concentraron a 1 ml usando ultraconcentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius) y posteriormente se aplicaron a una columna Superdex™ 200 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, pH 6,0, NaCI 140 mM, Tween-20 al 0,01 %. El contenido agregado de las fracciones eluidas se analizó por cromatografía analítica de exclusión por tamaño. Por lo tanto, se aplicaron 30 pl de cada fracción a una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7, a 25 °C. Se combinaron las fracciones que contenían menos de un 2 % de oligómeros y se concentraron a una concentración final de 1-1,5 mg/ml usando ultraconcentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius). Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de las construcciones se analizaron mediante electroforesis capilar-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor siguiendo las instrucciones del fabricante (instrumento Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Las proteínas purificadas se congelaron en N2 líquido y se almacenaron a -80 °C.

3. Temperatura de agregación

La estabilidad de las cuatro construcciones se sometió a prueba en un Optim 1000 (Avacta, PALL Corporation) mediante un gradiente de calentamiento de 25 °C a 80 °C a 0,1 °C/min. Se registra la temperatura al inicio de la agregación.

Tabla 34: Rendimiento, contenido de monómero y temperatura de agregación de cuatro mutantes inactivados en el sitio de N-glucosilación de la molécula de unión 9D11 en el formato biespecífico de linfocitos T 2+1 invertido. Los cuatro mutantes se comportaron de manera similar a la molécula de unión 9D11 natural

Se generaron las siguientes variantes: N100S (N95S); N100Q (N95Q), T102A (T97A) y T102N (T97N) (la numeración de Kabat se indica entre paréntesis) y se convirtieron al formato biespecífico de linfocitos T. Después de la producción transitoria en células HEK293 EBNA y la purificación, se analizaron las diferentes variantes para determinar la actividad de unión a la diana y destrucción celular en comparación con el clon 9D11 original.

Tabla 17: Cebadores usados para la eliminación del sitio de N-glucosilación en CDR L3 de 9D11 (las secuencias se muestran a continuación)

Ejemplo 18

Unión y destrucción mediada por linfocitos T con variantes aglucosiladas de 9D11

Debido a un sitio de glucosilación en las CDR, se produjeron cuatro variantes de 9D11 diferentes con una mutación que elimina el sitio de glucosilación (ejemplo 17). Estas cuatro variantes se sometieron a prueba en comparación con el 9D11 original para determinar la unión a FolR1 en células HeLa (figura 10) y la inducción de la destrucción de células tumorales en SKOV3 y HT-29 (figuras 11A-B, E-F). Ninguna de las variantes mostró diferencias en cuanto a la unión o la inducción de la destrucción de células tumorales. En paralelo, se abordó la destrucción inespecífica de las líneas celulares MKN-45 negativas para FolR1 (figuras 11C-D). Además, no se pudieron observar diferencias entre las variantes y la molécula de unión original. Ninguna de las construcciones indujo destrucción inespecífica en las células tumorales que no expresan FolR1.

Ejemplo 19

Expresión de FolR1 en células epiteliales primarias

FolR1 se expresa a niveles bajos en células epiteliales primarias. Aquí se quería someter a prueba si estos niveles son suficientes para inducir la destrucción mediada por linfocitos T en presencia de las TCB anti-FolR1. Para ello, se usaron células epiteliales bronquiales humanas primarias, células epiteliales del plexo coroideo humanas primarias, células epiteliales de la corteza renal humanas primarias y células del epitelio pigmentario de la retina humanas primarias. Como control positivo se incluyeron células HT-29 o células SKOV3 que expresan FolR1. En primer lugar, verificamos la expresión de FolR1 en las células primarias usadas y determinamos la cantidad de sitios de unión a FolR1 en estas células. Las células epiteliales bronquiales, las células epiteliales de la corteza renal y las células del epitelio pigmentario de la retina expresan niveles muy bajos pero significativos de FolR1 en comparación con los niveles expresados en células tumorales. Las células epiteliales del plexo coroideo no expresan niveles significativos de FolR1.

Tabla 18: Sitios de unión a FolR1 en células epiteliales primarias

Las células epiteliales primarias que demostraron expresión de FolR1 en la superficie se usaron para abordar la cuestión de si los linfocitos T pueden destruir estas células en presencia de TCB anti-FolR1. No se pudieron medir niveles significativos de destrucción, pero se detectó inducción de la activación de los linfocitos T en presencia de células del epitelio pigmentario de la retina, células epiteliales bronquiales y células de la corteza renal, dando como resultado una regulación por incremento de CD25 y CD69. La activación más fuerte se observa con las células del epitelio pigmentario de la retina, dando como resultado una regulación por incremento de CD25 y CD69 tanto en linfocitos T CD4+ como en linfocitos T CD8+. En presencia de células epiteliales bronquiales se induce una menor activación de linfocitos T con regulación por incremento de CD69 en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+, pero con una regulación por incremento muy baja de CD25 solo en linfocitos T CD4+ pero no en linfocitos T CD8+. La activación más baja de linfocitos T se obtiene en presencia de células epiteliales renales, sin regulación por incremento de CD25 en linfocitos T CD4+ ni linfocitos T CD8+ y observando regulación por incremento de CD69 solo en linfocitos T CD8+ (figuras 12A-X).

Ejemplo 20

Comparación de diferentes formatos de TCB que contienen molécula de unión 16D5 o 9D11

Para determinar si el formato TCB2+1 invertido es el formato más activo con la molécula de unión a FolR1 seleccionada, se produjeron diferentes formatos que contenían 16D5 o 9D11 y se compararon en cuanto a la unión a células diana, la destrucción mediada por linfocitos T y la activación de linfocitos T. La molécula de unión 16D5 se sometió a prueba en los formatos TCB 2+1 invertido (Fig. 1A), TCB 2+1 clásico (Fig. 1D), TCB 1 1 clásico (Fig. 1C) y TCB 1 1 cabeza a cola (Fig. 1B); la molécula de unión 9D11 se sometió a prueba en los formatos TCB 2+1 invertido (Fig. 1A), TCB 1 1 clásico (Fig. 1C) y TCB 1+1 cabeza a cola (Fig. 1B).

Todas las construcciones se sometieron a prueba para determinar la unión a FolR1 en células HeLa. Las moléculas bivalentes para la unión a FolR1 se unen más fuertemente en comparación con las construcciones monovalentes debido a la avidez. La diferencia entre las construcciones bivalentes y las monovalentes es más pronunciada para 16D5. El motivo podría ser que, debido a la menor afinidad de 16D5, el efecto de avidez para esta molécula de unión es más fuerte. Entre las dos TCB 1 1 no existe una diferencia significativa en cuando a la unión, pero existe diferencia entre las dos construcciones 2+1. La construcción 2+1 invertida se une más fuertemente a FolR1 que la construcción 2+1 clásica. Esto indica que, en la construcción 2+1 clásica, la unión a FolR1 está influenciada por la presencia de Fab CD3, mientras que en la construcción invertida la unión está menos influenciada.

Al someter a prueba la destrucción mediada por linfocitos T con estas construcciones, se pudo demostrar que la unión más fuerte de la TCB 2+1 invertida se traduce en una destrucción de células tumorales más fuerte y una activación de linfocitos T más fuerte en comparación con la TCB 2+1 clásica. La construcción TCB 16D5 anti-FolR1 2+1 clásica es solo ligeramente más activa que la respectiva construcción 1+1 cabeza a cola. La construcción 1+1 cabeza a cola es significativamente más activa que la construcción 1+1 clásica. Esto no refleja la situación observada en la unión y se podría deber a un mejor entrecruzamiento con la construcción cabeza a cola. La destrucción global de las células tumorales y la activación de linfocitos T son comparables con todas las construcciones sometidas a prueba, observándose diferencias en la potencia solo en términos de valores de CE50. En general, se puede concluir que, independientemente de la molécula de unión usada, el formato TCB anti-FolR1 2+1 invertido es el formato preferente para inducir la destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T y la activación de linfocitos T (véanse las Fig. 13A-C y Fig.14A-C).

Tabla 19: Valores de CE50 de unión a células diana y destrucción mediada por linfocitos T con diferentes formatos de TCB

Tabla 20: Valores de CE50 de activación de linfocitos T en presencia de células SKOV3 con diferentes formatos de TCB

Ejemplo 21

Líneas celulares tumorales y células primarias

Se obtuvieron células HeLa (CCL-2) de ATCC y se cultivaron en DMEM con FCS al 10 % y glutamina 2 mM, se obtuvieron células SKOV3 (H^tB-77) de ATCC y se cultivaron en RPMI con FCS al 10 % y glutamina 2 mM, se obtuvieron células OVCAR5 de NCI y se cultivaron en RPMI con FCS al 10 % y glutamina 2 mM, se obtuvieron células HT-29 (ACC-299) de DSMZ y se cultivaron en medio McCoy 5A con FCS al 10 % y glutamina 2 mM, se obtuvieron células MKN-45 (ACC-409) de DSMZ y se cultivaron en RpMI con FCS al 10 % y glutamina 2 mM. Todas las células epiteliales primarias sometidas a prueba se obtuvieron de ScienCell Research Laboratories. Se cultivaron células de epitelio bronquial humano (HBEpiC, n.° cat. 3210) en medio para células epiteliales bronquiales (BEpiCM, n.° cat. 3211, ScienCell). Se cultivaron células epiteliales del colon humano (HCoEpiC, n.° cat. 2950) en medio para células epiteliales del colon (CoEpiCM, n.° cat. 2951, ScienCell). Se cultivaron células del epitelio pigmentario de la retina humanas (HRPEpiC, n.° cat. 6540) en medio de células epiteliales (EpiCM, n.° cat. 4101, ScienCell). Se cultivaron células epiteliales de la corteza renal humanas (HRCEpiC, n.° cat. 4110) en medio de células epiteliales (EpiCM, n.° cat. 4101, ScienCell). Se cultivaron células epiteliales del plexo coroideo humanas (HCpEpiC, n.° cat. 1310) en medio de células epiteliales (EpiCM, n.° cat. 4101, ScienCell). Ejemplo 22

Unión a células diana por citometría de flujo

Las células diana como se indica se recogieron con tampón de disociación celular, se lavaron con PBS y se resuspendieron en tampón FACS. La tinción con anticuerpos se realizó en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Por lo tanto, se sembraron 200.000 células por pocillo. La placa se centrifugó durante 4 min a 400 x g y se retiró el sobrenadante. Los anticuerpos de prueba se diluyeron en tampón FACS y se añadieron 20 pl de la solución de anticuerpo a las células durante 30 min a 4 °C. Para eliminar el anticuerpo no unido, las células se lavaron dos veces con tampón FACS antes de la adición del anticuerpo secundario diluido (anticuerpo caprino AffiniPure de fragmento F(ab')2 específico del fragmento F^cyanti-IgG humana conjugado con FITC, Jackson ImmunoResearch n.° 109-096-098 o anticuerpo caprino AffiniPure de fragmento F(ab')2 específico del fragmento Fcy anti-IgG humana conjugado con PE, Jackson ImmunoResearch n.° 109-116-170). Después de 30 min de incubación a 4 °C, el anticuerpo secundario no unido se eliminó por lavado. Antes de la medición, las células se resuspendieron en 200 pl de tampón FACS y se analizaron por citometría de flujo usando Canto II de BD o Fortessa de BD.

Ejemplo 23

Internalización

Se recogieron las células y se determinó la viabilidad. Las células se resuspendieron en medio frío reciente a 2 millones de células por ml y la suspensión celular se transfirió a un tubo Falcon de 15 ml para cada anticuerpo. Los anticuerpos que se debían someter a prueba para determinar la internalización se añadieron a las células a una concentración final de 20 pg por ml. Los tubos se incubaron durante 45 min en la cámara fría sobre un agitador. Después de la incubación, las células se lavaron tres veces con PBS frío para eliminar los anticuerpos no unidos. Se transfirieron 0,2 millones de células por pocillo a la placa FACS como punto temporal cero. Las células marcadas se resuspendieron en medio tibio y se incubaron a 37 °C. En los puntos temporales indicados, se transfirieron 0,2 millones de células por pocillo en PBS frío, se lavaron en la placa FACS. Para detectar las construcciones que permanecen en la superficie, las células se tiñeron con anticuerpo secundario anti-Fc humano marcado con PE. Por lo tanto, se añadieron 20 pl por pocillo del anticuerpo diluido y la placa se incubó durante 30 min a 4 °C. A continuación, las células se lavaron dos veces para eliminar los anticuerpos no unidos y se fijaron con PFA al 1 % para evitar cualquier internalización adicional. La fluorescencia se midió usando FACS Canto II de BD.

Ejemplo 24

Análisis por QIFIKIT®

QIFIKIT® contiene una serie de microesferas de 10 pm de diámetro y recubiertas con cantidades diferentes pero bien definidas de moléculas de Mab de ratón (anti-CD5 humano de alta afinidad, Clon CRIS-1, isotipo IgG2a). Las microesferas imitan células con diferentes densidades de antígeno que se han marcado con un Mab de ratón primario de isotipo IgG. En resumen, las células se marcaron con anticuerpo monoclonal primario de ratón dirigido contra el antígeno de interés. En un pocillo de prueba separado, las células se marcaron con anticuerpo monoclonal de ratón irrelevante (control de isotipo). A continuación, las células, las microesferas de configuración y las microesferas de calibración se marcaron con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con fluoresceína incluido en el kit. El anticuerpo primario usado para marcar las células se tiene que usar a concentración de saturación. El anticuerpo primario puede ser de cualquier isotipo de IgG de ratón. En estas condiciones, el número de moléculas de anticuerpo primario unidas corresponde al número de sitios antigénicos presentes en la superficie celular. El anticuerpo secundario también se usa a concentración de saturación. En consecuencia, la fluorescencia se correlaciona con el número de moléculas de anticuerpo primario unidas en las células y en las microesferas.

Ejemplo 25

Destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T y activación de linfocitos T

Las células diana se recogieron con tripsina/EDTA, se contaron y se verificó su viabilidad. Las células se resuspendieron en su medio respectivo a una concentración final de 300.000 células por ml. A continuación, se transfirieron 100 pl de la suspensión de células diana a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano. La placa se incubó durante la noche a 37 °C en la incubadora para permitir la adherencia de las células a la placa. Al día siguiente, se aislaron PBMC de sangre completa de donantes sanos. La sangre se diluyó 2:1 con PBS y se superpuso sobre 15 ml de Histopaque-1077 (n.° 10771, Sigma-Aldrich) en tubos Leucosep y se centrifugó durante 30 min a 450 x g sin interrupción. Después de la centrifugación, la banda que contenía las células se recogió con una pipeta de 10 ml y se transfirió a tubos de 50 ml. Los tubos se llenaron con PBS hasta 50 ml y se centrifugaron (400 x g, 10 min, temperatura ambiente). El sobrenadante se eliminó y el sedimento se resuspendió en PBS. Después de la centrifugación (300 x g, 10 min, temperatura ambiente), se descartaron los sobrenadantes, se combinaron 2 tubos y se repitió la etapa de lavado (esta vez con centrifugación a 350 x g, 10 min, temperatura ambiente). Posteriormente, las células se resuspendieron y los sedimentos se combinaron en 50 ml de PBS para el recuento celular. Después de contarlas, las células se centrifugaron (350 x g, 10 min, temperatura ambiente) y se resuspendieron a 6 millones de células por ml en RPMI con FCS al 2 % y glutamina 2 nM. Se retiró el medio de las células diana sembradas y se añadieron los anticuerpos de prueba diluidos en RPMI con FCS al 2 % y glutamina 2 nM. Se transfirieron 300.000 células de la solución de células efectoras a cada pocillo, dando como resultado una proporción E:T de 10:1. Para determinar la liberación máxima, las células diana se lisaron con Triton X-100. La liberación de LDH se determinó después de 24 h y 48 h usando el kit de detección de citotoxicidad (n.° 1644793, Roche Applied Science). La regulación por incremento del marcador de activación en los linfocitos T después de la destrucción de las células tumorales se midió por citometría de flujo. En resumen, se recogieron los PBMC, se transfirieron a una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se tiñeron con anticuerpos CD4 PE-Cy7 (n.° 3557852, BD Bioscience), CD8 FITC (n.° 555634, BD Bioscience), CD25 APC (n.° 555434, BD Bioscience), CD69 PE (n.° 310906, BioLegend) diluidos en tampón FACS. Después de 30 min de incubación a 4 °C, las células se lavaron dos veces con tampón FACS. Antes de medir la fluorescencia usando Canto II de BD, las células se resuspendieron en 200 pl de tampón FACS.

Ejemplo 26

Activación de linfocitos T en sangre completa

Se añadieron 280 pl de sangre fresca a una placa de pocillos profundos cónicos de 96 pocillos. A continuación, se añadieron a la sangre 20 pl de las TCB diluidas y se mezclaron bien agitando la placa. Después de 24 h de incubación a 37 °C en una incubadora, la sangre se mezcló y se transfirieron 35 pl a una placa de 96 pocillos de fondo redondo. A continuación, se añadieron 20 pl de la mezcla de tinción de anticuerpos que consistía en CD4 PE-Cy7 (n.° 3557852, BD Bioscience), CD8 FITC (n.° 555634, BD Bioscience), CD25 APC (n.° 555434, BD Bioscience), CD69 PE (n.° 310906, BioLegend) y c D45 V500 (n.° 560777, BD Horizon) y se incubaron durante 15 min en oscuridad a temperatura ambiente. Antes de la medición, se añadieron 200 pl de solución de lisis FACS de BD recién preparada (n.° 349202, BD FCAS) a la sangre. Después de 15 min de incubación a temperatura ambiente, las células se sometieron a medición con Fortessa de BD.

Ejemplo 27

Estudio de SDPK (farmacocinética de dosis única) de TCB anti-FolR1 humanizadas (clon 16D5) en ratones NOD/Shi-scid/IL-2RYnull (NOG) inmunodeficientes

Ratones NOD/Shi-scid/IL-2RYnuN (NOG) hembra de 6-7 semanas de edad al inicio del experimento (criados en Taconic, Dinamarca) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz y 12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas, Felasa, TierschG). Las autoridades gubernamentales locales revisaron y aprobaron el protocolo del estudio experimental (P 2011/128). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo de manera regular.

Los ratones recibieron una inyección i.v. con 10/1/0,1 pg de TCB anti-FolR1 por ratón, mientras que a 3 ratones por grupo y punto temporal se les extrajo una muestra de sangre. Todos los ratones recibieron una inyección i.v. con un volumen total de 200 pl de la solución apropiada. Para obtener la cantidad apropiada de TCB anti-FolR1 por 200 pl, las soluciones madre se diluyeron con PBS cuando fue necesario. Se recogieron muestras de suero 5 min, 1 h, 3 h, 8 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 168 h después de la inyección de tratamiento.

La figura 15 muestra que la TCB 16D5 anti-FolR1 muestra propiedades FC similares a IgG típicas y proporcionales a la dosis en ratones NOG con aclaramiento lento.

Tabla 21: Condiciones experimentales.

Ejemplo 28

Eficacia in vivo de TCB anti-FolR1 (clon 16D5) después de la transferencia de PBMC humanos en ratones NOG portadores de Skov3

La TCB anti-FolR1 se sometió a prueba en la línea celular de carcinoma de ovario humano Skov3, inyectada s.c. en ratones NOG con PBMC injertados.

Las células de carcinoma de ovario Skov3 se obtuvieron de ATCC (HTB-77). La línea celular tumoral se cultivó en RPMI que contenía FCS al 10 % (Gibco) a 37 °C en una atmósfera saturada en agua con CO2 al 5 %. Se usó el pase 35 para el trasplante, a una viabilidad >95 %. Se inyectaron s.c. 5 x 106 células por animal en el flanco derecho de los animales en un total de 100 pl de medio de cultivo celular RPMI (Gibco).

Ratones NOD/Shi-scid/IL-2RYnull (NOG) hembra de 6-7 semanas de edad al inicio del experimento (criados en Taconic, Dinamarca) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz y 12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas, Felasa, TierschG). Las autoridades gubernamentales locales revisaron y aprobaron el protocolo del estudio experimental (P 2011/128). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo de manera regular.

De acuerdo con el protocolo (figura 16), los ratones recibieron una inyección s.c. el día 0 de estudio con 5 x 106 células Skov3. El día 21 de estudio, PBMC humanos de un donante sano se aislaron mediante el procedimiento de Ficoll y se inyectaron 10 x 106 células i.p. en los ratones portadores de tumor. Dos días después, los ratones se aleatorizaron y se distribuyeron por igual en cinco grupos de tratamiento (n = 12), seguido de inyección i.v. con 10/1/0,1 pg de TCB anti-FolR1 por ratón o 10 pg de DP47 por ratón como TCB de control una vez por semana durante tres semanas. A todos los ratones se les inyectaron i.v. 200 |jl de la solución apropiada. Los ratones del grupo de vehículo recibieron una inyección con PBS. Para obtener la cantidad apropiada de TCB por 200 jl, las soluciones madre se diluyeron con PBS cuando fue necesario. El crecimiento del tumor se midió una vez por semana usando un calibre (figura 17) y el volumen del tumor se calculó como sigue:

Tv: (W2/2) x L (W: anchura, L: longitud)

La inyección semanal de TCB anti-FolR1 dio como resultado un efecto antitumoral dependiente de la dosis. Mientras que una dosis de 10 pg/ratón y 1 pg/ratón indujeron la reducción del volumen tumoral, 0,1 pg/ratón indujo una estasis tumoral (figura 17, tabla 22). La reducción máxima del volumen tumoral se logró a una dosis de 10 pg/ratón en comparación con una TCB DP47 de control no dirigida.

Tabla 22: Eficacia in vivo.

Para las lecturas de FD, se sacrificaron tres ratones por grupo de tratamiento el día 32 de estudio, se extirparon los tumores y se prepararon suspensiones de células individuales a través de una digestión enzimática con Colagenasa V, Dispasa II y DNasa para el posterior análisis por FACS (figuras 19 y 20). Las células individuales se usaron directamente para la tinción de antígenos extracelulares y marcadores de activación o se reestimularon usando 5 ng/ml de PMA y 500 ng/ml de ionomicina en presencia de un inhibidor del transporte de proteínas, monensina, durante 5 h en medio de cultivo normal. Después de la reestimulación, las células se tiñeron para determinar antígenos de superficie, seguido de una etapa de fijación y permeabilización. Las muestras fijadas se tiñeron intracelularmente para determinar TNF-a, IFN-y, IL-10 e IL-2 y se analizaron por citometría de flujo. Se usó el mismo procedimiento para la desgranulación de las células, pero se añadió un anticuerpo anti-CD107a durante el período de reestimulación y las muestras fijadas se tiñeron para determinar el contenido intracelular de perforina y granzima B. El análisis por FACS reveló un número estadísticamente mayor de linfocitos T CD4+ y CD8+ infiltrantes en el tejido tumoral tras el tratamiento con TCB anti-FolR1 en comparación con el vehículo y la TCB de control no dirigida. Además, se detectaron números mayores de linfocitos T CD4+ y CD8+ que producían TNF-a, IFN-y e IL-2, así como que expresaban perforina/granzima B en tumores tratados con TCB anti-FolR1. Los linfocitos T infiltrantes de tumor tratados con TCB anti-FolR1 también mostraron mayores tasas de desgranulación en comparación con los grupos de control.

Al finalizar el estudio el día 38, todos los animales fueron sacrificados; se extirparon los tumores y se pesaron (figura 18). El peso de los tumores tratados con 10 y 1 pg de TCB anti-FolR1 por ratón mostró una diferencia estadísticamente significativa en comparación con los grupos de control.

Tabla 23: Condiciones experimentales.

Ejemplo 29

Generación de un anticuerpo biespecífico anti-FolR1/CD3-kappa-lambda

Para generar un anticuerpo biespecífico (monovalente para cada antígeno) que se pueda unir simultáneamente a CD3 humano y al receptor de folato humano alfa (FolR1) sin usar ningún enfoque de heterodimerización (por ejemplo, tecnología de botón en ojal), se aplicó una combinación de una colección de cadenas ligeras comunes con la llamada tecnología CrossMab: la región variable de la molécula de unión a CD3 humanizada (CH2527_VL7_46/13) se fusionó con el dominio CH1 de un anticuerpo humano anti-IgG1 estándar para formar la molécula cruzada VLVH (fusionada con Fc) que es común para ambas especificidades. Para generar los equivalentes cruzados (VHCL), se fusionó un dominio de la cadena pesada variable específico para CD3 (CH2527_VH_23/12) a una cadena ligera A humana constante, mientras que un dominio de la cadena pesada variable específico para FolR1 humano (clon 16D5, aislado de la colección de cadenas ligeras comunes) se fusionó con una cadena ligera k humana constante. Esto permite la purificación del anticuerpo biespecífico deseado mediante la aplicación de etapas de purificación posteriores con las columnas KappaSelect y LambdaFabSelect (GE Healthcare) para eliminar los anticuerpos homodiméricos no deseados.

Todos los vectores de expresión de anticuerpos se generaron usando una tecnología de ADN recombinante estándar como se describe en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se usaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los genes o fragmentos de genes se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o bien se generaron a partir de oligonucleótidos sintéticos en Geneart AG (Regensburg, Alemania) mediante síntesis génica automatizada. Los fragmentos de ADN amplificados por PCR o subclonados se confirmaron mediante secuenciación del ADN (Synergene GmbH, Suiza). El ADN plasmídico se transformó y amplificó en cepas huésped de E. coli adecuadas para la preparación de ADN plasmídico de calidad para la transfección usando kits Maxiprep (Qiagen) estándar. Para la producción de las moléculas biespecíficas, se transfectaron células HEK293 EBNA con plásmidos que codificaban los genes respectivos usando un procedimiento estándar basado en polietilenimina (PEI). La proporción de plásmido usada de los tres vectores de expresión fue 1:1:1. Las células transfectadas se cultivaron durante 7 días antes de que se recogieran los sobrenadantes para su purificación. Los anticuerpos biespecíficos FolR1/CD3-kappa-lambda se produjeron y purificaron como sigue.

1. Transfección y producción transitorias

El anticuerpo biespecífico kappa-lambda se produjo de forma transitoria en células HEK293 EBNA usando un procedimiento de transfección mediado por PEI para los vectores requeridos como se describe a continuación. Las células HEK293 EBNA se cultivaron en suspensión sin suero en medio de cultivo CD CHO. Para la producción en un matraz de agitación de 500 ml, se sembraron 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección (para escalas alternativas, todas las cantidades se ajustaron en consecuencia). Para la transfección, las células se centrifugaron durante 5 min mediante 210 x g, el sobrenadante se reemplaza por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión se mezclaron en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 pg de ADN. Después de la adición de 540 pl, la solución de PEI se mezcla con una agitadora vorticial durante 15 s y posteriormente se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclaron con la solución de ADN/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 ml y se incubaron durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añadieron 160 ml de medio F17 y las células se cultivaron durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadió ácido valproico 1 mM y Feed 1 al 7 %. Después de un cultivo de 7 días, se recogió el sobrenadante para la purificación mediante centrifugación durante 15 min a 210 x g, la solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm) y se añadió acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo a 4 °C.

2. Purificación

El anticuerpo biespecífico kappa-lambda se purificó en tres etapas, usando una etapa de afinidad específica para las cadenas ligeras kappa, seguida de una etapa de afinidad específica para las cadenas ligeras lambda y finalmente una etapa de cromatografía de exclusión por tamaño para la eliminación de agregados. El sobrenadante obtenido de la producción transitoria se ajustó a pH 8,0 (usando TRIS 2 M, pH 8,0) y se aplicó a una matriz de afinidad Capture Select kappa, o HiTrap KappaSelect, GE Healthcare, volumen de columna (VC) = 1 ml, equilibrada con 5 volúmenes de columna (VC) de tampón A (Tris 50 mM, glicina 100 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0). Después de lavar con 15 VC de tampón A, la proteína se eluyó usando un gradiente de pH para tampón B (Tris 50 mM, glicina 100 mM, NaCl 150 mM, pH 2,0) en 25 VC. Las fracciones que contenían la proteína de interés se combinaron y el pH de la solución se ajustó a pH 8,0 (usando Tris 2 M, pH 8,0). Las fracciones combinadas neutralizadas se aplicaron a una matriz de afinidad lambda Capture Select (ahora: HiTrap LambdaFabSelect, GE Healthcare, volumen de columna (VC) = 1 ml) equilibrada con 5 volúmenes de columna (VC) de tampón A (Tris 50 mM, glicina 100 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0). Después de lavar con 15 VC de tampón A, la proteína se eluyó usando un gradiente de pH para tampón B (Tris 50 mM, glicina 100 mM, NaCl 150 mM, pH 2,0) en 25 VC. Las fracciones que contenían la proteína de interés se combinaron y el pH de la solución se ajustó a pH 8,0 (usando Tris 2 M, pH 8,0). Esta solución se concentró usando ultraconcentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius) y posteriormente se aplicaron a una columna Superdex™ 200 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, pH 6,0, NaCl 140 mM, Tween-20 al 0,01 %. Las fracciones combinadas después de la cromatografía de exclusión por tamaño se concentraron nuevamente usando ultraconcentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius).

Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de las construcciones se analizaron mediante electroforesis capilar-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor siguiendo las instrucciones del fabricante (instrumento Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Solo se pudieron purificar pequeñas cantidades de proteína con un rendimiento final de 0,17 mg/l.

Ejemplo 30

Destrucción mediada por linfocitos T con anticuerpo biespecífico anti-FolR1/CD3-kappa-lambda

La actividad de TCB anti-FolR1 kappa lambda se sometió a prueba en células SKOV3 en presencia de PBMC recién aislados. Como control negativo se incluyó TCB DP47. La destrucción mediada por linfocitos T de células SKOV3 se determinó después de 24 h y 48 h por liberación de LDH. Después de 48 h, se recogieron los linfocitos T y se midió la regulación por incremento de CD69 y CD25 en linfocitos T CD4 y linfocitos T CD8 por citometría de flujo.

La construcción FolR1 kappa lambda induce la destrucción de células SKOV3 de manera dependiente de la concentración, que va acompañada de una regulación por incremento de CD69 y CD25 tanto en linfocitos T CD4 como en linfocitos T CD8.

Las células SKOV3 se incubaron con PBMC en presencia de TCB DP47 o TCB anti-FolR1 kappa lambda. Después de 24 h y 48 h, la destrucción de las células tumorales se determinó midiendo la liberación de LDH (Fig. 21). Las células SKOV3 se incubaron con PBMC en presencia de TCB DP47 o TCB anti-FolR1 kappa lambda. Después de 48 h, se midió la regulación por incremento de CD25 y CD69 en linfocitos T CD4 y linfocitos T CD8 por citometría de flujo (Fig. 22).

Ejemplo 31

Caracterización bioquímica de moléculas de unión 16D5 y 36F2 anti-FolR1 por resonancia de plasmón superficial

La unión de 16D5 anti-FolR1 en diferentes formatos biespecíficos de linfocitos T monovalentes o bivalentes y de 36F2 anti-FolR1 como IgG o como linfocitos T biespecíficos para el receptor de folato 1 humano, de macaco cangrejero y murino recombinante (todos como fusiones de Fc) se evaluó por resonancia de plasmón superficial (SPR). Todos los experimentos de SPR se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, GE Healthcare).

1. Moléculas sometidas a prueba

Las moléculas usadas para la determinación de afinidad y avidez se describen en la tabla 24.

Tabla 24: Nombre y descripción de las 6 construcciones usadas en el análisis por SPR

2. Avidez por el receptor de folato 1

La avidez de la interacción entre las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 y los receptores de folato recombinantes se determinó como se describe a continuación (tabla 25).

Las fusiones con Fc monomérico biotinilado recombinante del receptor de folato 1 humano, de macaco cangrejero y murino (FolR1-Fc) se acoplaron directamente en un chip SA usando las instrucciones de acoplamiento estándar (Biacore, GE Healthcare). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 300 400 UR. Las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 se pasaron a un intervalo de concentración de 3,7 a 900 nM con un caudal de 30 pl/minuto a través de las cubetas de lectura durante 180 segundos. Se supervisó la disociación durante 240 o 600 segundos. La superficie del chip se regeneró después de cada ciclo usando una inyección doble de 30 s de glicina-HCl 10 mM, pH 2. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia inmovilizada con fusión Fc/CD134 murino biotinilado recombinante. Las curvas de unión resultantes de la unión bivalente de las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T se aproximaron a una unión de Langmuir 1:1 (aunque es una unión 1:2) y se ajustaron con ese modelo para obtener una K^daparente que representa la avidez de la unión bivalente. Las constantes de avidez aparente para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad del ajuste utilizando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare). Para el formato 1 1 de las moléculas biespecíficas de linfocitos T, la interacción es 1:1 real y la K^drepresenta la afinidad, ya que solo hay una molécula de unión a FolR1 en esta construcción.

Tabla 25: Unión bivalente (avidez con K^daparente) de 16D5 y 36F2 anti-FolR1 como IgG o como moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) en FolR1 humano, de macaco cangrejero y murino.

3. Afinidad por el receptor de folato 1

La afinidad de la interacción entre las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 y los receptores de folato recombinantes se determinó como se describe a continuación (tabla 26).

Para la medición de la afinidad, se realizó el acoplamiento directo de alrededor de 12.000 unidades de resonancia (UR) del anticuerpo específico anti-Fab humano (kit de captura de Fab, GE Healthcare) en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (GE Healthcare). Se capturaron las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 a 20 nM con un caudal de 10 pl/min durante 40 segundos, la cubeta de lectura de referencia se dejó sin captura. Se pasaron series de dilución (12,3 a 3000 nM) de fusión de Fc con el receptor de folato 1 humano, de macaco cangrejero y murino en todas las cubetas de lectura a 30 pl/min durante 240 segundos para registrar la fase de asociación. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 300 s y se activó cambiando de la solución de muestra a HBS-EP. La superficie del chip se regeneró después de cada ciclo usando una inyección doble de 60 s de glicina-HCl 10 mM, pH 1,5. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia 1. Las constantes de afinidad para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad ajustando a una unión de Langmuir 1:1 usando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabla 26: Unión monovalente (afinidad) de 16D5 y 36F2 anti-FolR1 como IgG o como moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) en FolR1 humano, de macaco cangrejero y murino.

La afinidad (unión monovalente) por Fc-FolR1 humano y de macaco de TCB 36F2 es similar y alrededor de 1000 nM para ambos, mientras que la afinidad por Fc-FolR1 murino es ligeramente mejor y de alrededor de 300 nM. La 36F2 se puede usar en modelos murinos y de primates, no existiendo necesidad de un sustituto. La avidez (K^daparente) de TCB 36F2 por FolR1 humano es aproximadamente 30 veces menor que la afinidad de la TCB 16D5 por FolR1 humano. En el formato bivalente, TCB 36F2 está en el intervalo nanomolar bajo, mientras que TCB 16D5 está en el intervalo picomolar bajo (diferencia de 1000 veces).

FolR1 se expresa en células tumorales sobreexpresadas, a niveles intermitentes y altos, en la superficie de las células cancerosas en un espectro de neoplasias malignas epiteliales, incluyendo los cánceres de ovario, mama, riñón, colorrectal, pulmón y otros cánceres sólidos, y también se expresa en la superficie apical de un subconjunto limitado de células epiteliales polarizadas en tejido normal. Estas células normales no tumorales expresan FolR1 solo a niveles bajos e incluyen, por ejemplo, células epiteliales bronquiolares en la superficie alveolar, borde luminal de la corteza renal de células tubulares, epitelio pigmentario de la retina (membrana basolateral) y plexo coroideo.

La TCB 16D5 se une a células de tejidos normales que expresan bajas cantidades de FolR1, lo que da como resultado su destrucción mediada por linfocitos T. Esto podría explicar, al menos en parte, la limitada tolerancia observada a 10 pg/kg en macacos cangrejeros. Los autores de la invención querían determinar si la disminución de la afinidad de la molécula biespecífica de linfocitos T podría incrementar la diferenciación entre los tejidos de alta y baja densidad de la diana y, de este modo, disminuir la toxicidad mediante el uso de la unión bivalente y la avidez. Las moléculas de unión de baja afinidad normalmente no se seleccionan como candidatos adecuados para un análisis posterior porque la baja afinidad se asocia a menudo con baja potencia y eficacia. No obstante, la molécula de unión a FolR1 de baja afinidad 36F2 se desarrolló en varios formatos y se caracterizó por sus propiedades biológicas. Para la 36F2 usada en el formato biespecífico bivalente de linfocitos T, el efecto de la avidez (diferencia entre la unión monovalente y bivalente) es de alrededor de 250 veces (1000 nM frente a 4 nM). A baja densidad de la diana, la afinidad definió la interacción y con 1000 nM dio lugar a una baja potencia de la TCB. Sin embargo, a alta densidad de la diana, la avidez de la molécula entra en juego y con 4 nM dio lugar a una alta actividad de la TCB (véase el ejemplo 32).

En un enfoque alternativo, los autores de la invención generaron formatos monovalentes de 16D5 y una variante de baja afinidad de 16D5 (afinidad de aproximadamente 10-40 nM) en un formato bivalente. La molécula de unión 16D5 usada en un formato monovalente (1+1) tiene una afinidad de aproximadamente 50 nM. La diferenciación entre tejidos de alta y baja densidad de la diana se puede lograr mejor aprovechando el efecto de avidez.

Ejemplo 32

Destrucción por linfocitos T de células SKov-3 inducida por TCB 36F2, TCB Mov19 y TCB 21A5

La destrucción por linfocitos T mediada por TCB 36F2, TCB Mov19 y TCB 21A5 se evaluó en células SKov-3 (expresión media de FolR1). Se usaron PBMC humanos como células efectoras y se detectó la destrucción tras 24 h y 48 h de incubación con los anticuerpos biespecíficos. En resumen, se recogieron células diana con tripsina/EDTA, se lavaron y se sembraron a una densidad de 25.000 células/pocillo usando placas de 96 pocillos de fondo plano. Se dejó que las células se adhirieran durante la noche. Los leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) se prepararon mediante centrifugación por densidad en Histopaque a partir de preparaciones enriquecidas de linfocitos (capas leucocíticas) obtenidas de donantes humanos sanos. Se diluyó la sangre recién obtenida con PBS estéril y se colocó en una capa sobre un gradiente de Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, temperatura ambiente), se desechó el plasma por encima de la interfase que contenía los PBMC y se transfirieron los PBMC a un nuevo tubo Falcon llenado posteriormente con 50 ml de PBS. Se centrifugó la mezcla (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se desechó el sobrenadante y se lavó el sedimento de PBMC dos veces con PBS estéril (etapas de centrifugación 350 x g, 10 minutos). La población de PBMC resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 % y L-alanil-L-glutamina al 1 % (Biochrom, K0302) a 37 °C, CO2 al 5 % en incubadora celular hasta su uso posterior (no más de 24 h). Para el ensayo de destrucción, se añadió el anticuerpo a las concentraciones indicadas (intervalo de 0,005 pM-5 nM por triplicado). Se añadieron PBMC a células diana a una proporción E:T final de 10:1. Se evaluó la destrucción de células tumorales después de 24 h y 48 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 % por cuantificación de LDH liberada en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11644793001). Se logró la lisis máxima de las células diana (= 100 %) por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 %. Lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin construcción biespecífica.

Los resultados muestran que la destrucción inducida por 36F2 se reduce fuertemente en comparación con TCB Mov19 y TCB 21A5 (figuras 23A-B). Los valores de CE50 relacionados con los ensayos de destrucción, calculados usando GraphPadPrism6 se resumen en la tabla 27.

Tabla 27: Valores de CE50 (pM) para la destrucción mediada por linfocitos T de células SKov-3 que expresan FolR1 inducida por TCB 36F2, TCB Mov19 y TCB 21A5.

*la curva no alcanzó la saturación, el valor es hipotético

Ejemplo 33

Destrucción por linfocitos T inducida por TCB 36F2 y TCB 16D5 en diferentes formatos biespecíficos de linfocitos T monovalentes y bivalentes

Se evaluó la destrucción por linfocitos T mediada por anticuerpos TCB 36F2, TCB 16D5, TCB 16D5 clásica, TCB 16D5 1 1 y TCB 16D5 Ht de células tumorales humanas HeLa (expresión alta de FolR1, aproximadamente 2 millones de

tumorales después de 24 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 % por cuantificación de LDH liberada en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11 644 793 001). Se logró la lisis máxima de las células diana (= 100 %) por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 %. Lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin construcción biespecífica.

Los resultados muestran que la destrucción específica de diana de las tres líneas celulares diana que expresan FoIR1 inducida por TCB 36F2 es mucho más débil en comparación con la destrucción inducida por TCB 16D5 (figuras 24A-C, tabla 29). La destrucción específica de diana inducida por las TCB 16D5 monovalentes (16D5 HT y 16D51 1) es peor en comparación con las TCB 16D5 bivalentes (^tC^b16D5 y TCB 16D5 clásica). Los valores de CE50 relacionados con los ensayos de destrucción, calculados usando GraphPadPrism6 se resumen en la tabla 28. Es importante destacar que estos datos muestran que el uso de la molécula de unión a FolR1 36F2 en el formato bivalente TCB 2+1 amplía la ventana terapéutica en comparación con la TCB 16D5 anti-FolR1 (Fig. 24A-C). Mientras que la reducción de potencia entre las TCB anti-FolR1 16D5 y 36F2 es de aproximadamente 45 veces para las células HeLa (expresión alta de FolR1, véase la tabla 28: TCB 16D5 de 0,8 frente a TCB 36F2 de 36,0) y de aproximadamente 297 veces para las células Skov3 (expresión media de FolR1, véase la tabla 28: TCB 16D5 de 0,6 frente a TCB 36F2 de 178,4), esta reducción es de casi 7000 veces para HT29 con baja expresión de FolR1 (véase la tabla 28: TCB 16D5 de 5,7 frente a TCB 36F2 de 39573). Por tanto, la TCB 36F2 anti-FolR1 diferencia entre las células de alta y baja expresión, lo que es de especial importancia para reducir la toxicidad, ya que las células de algunos tejidos normales no tumorales expresan niveles muy bajos de FolR1 (aproximadamente menos de 1000 copias por célula). De forma consecuente con esta observación, los resultados discutidos en el ejemplo 35 a continuación muestran que TCB 36F2 no induce la destrucción por linfocitos T de las células primarias (figuras 26A-D), mientras que se puede observar una cierta destrucción para TCB 16D5 en células HRCEpiC y HRPEpiC después de 48 h de incubación (figuras 26B y C). Esta importante característica de TCB 36F2 permite la dosificación para el tratamiento de tumores que expresan FolR1, de modo que media en la destrucción potente de los tejidos tumorales con expresión alta o media de FolR1, pero no de tejidos normales con expresión baja (parcialmente polarizada). De forma destacable, esta característica parece estar mediada por la avidez de TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 invertido, ya que no se observó al usar los formatos 1+1 monovalentes que llevan la misma molécula de unión 36F2 de baja afinidad.

Dicho de otra manera, TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 comprende restos de unión a FolR1 de afinidad relativamente baja, pero posee un efecto de avidez que permite la diferenciación entre células que expresan niveles altos y bajos de FolR1. Debido a que las células tumorales expresan FolR1 a niveles altos o intermedios, esta TCB se une selectivamente a las células tumorales y a las células normales no cancerosas que expresan FolR1 a niveles bajos o no lo hacen en absoluto.

Además de las características ventajosas anteriores, la TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 invertido también tiene la ventaja de que no requiere entrecruzamiento químico u otro enfoque híbrido. Esto hace que sea adecuado para la fabricación de un medicamento para tratar a pacientes, por ejemplo, pacientes que tienen tumores cancerosos que expresan FolR1. La TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 invertido se puede producir usando procedimientos estándar con CHO con bajos niveles de agregados. Además, la TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 comprende secuencias humanas y humanizadas que hacen que sea superior a moléculas que emplean polipéptidos de rata y ratón que son altamente inmunogénicos cuando se administran a humanos. Además, la TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 se genomanipuló para eliminar la unión a FcyR y, como tal, no causa entrecruzamiento de F^cyR ni reacciones a la infusión, potenciando aún más su seguridad cuando se administra a pacientes.

Como lo demuestran los resultados descritos anteriormente, su geometría de cabeza a cola hace que la TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 invertido sea una molécula altamente potente que induce la destrucción absoluta de las células diana. Su bivalencia potencia la avidez y la potencia, pero también permite la diferenciación entre células con alta y baja expresión. Su preferencia por células diana con niveles altos o medios de expresión debido a su avidez reduce la toxicidad resultante de la destrucción mediada por linfocitos T de células normales que expresan FolR1 a niveles bajos.

Una ventaja adicional de la TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 y otros modos de realización descritos en el presente documento es que su desarrollo clínico no requiere el uso de moléculas sustitutas, ya que se unen a FolR1 humano, de macaco cangrejero y murino. Como tal, las moléculas descritas en el presente documento reconocen un epítopo diferente que los anticuerpos contra FolR1 descritos previamente que no reconocen FolR1 de ninguna de las tres especies.

Tabla 28: Valores de CE50 (pM) para destrucción mediada por linfocitos T de células tumorales que expresan FolR1 inducida por TCB 36F2 y TCB 16D5 en diferentes formatos biespecíficos de linfocitos T monovalentes y bivalentes después de 24 h de incubación.

*la curva no alcanzó la saturación, es solo un valor hipotético

La tabla 29 muestra una comparación de los valores de CE50 de TCB 16D5 y TCB 36F2 en las diferentes líneas celulares sometidas a prueba. A partir de los valores de CE50 obtenidos, se calculó el delta (CE50 de TCB 16D5 menos CE50 de TCB 36F2) y la diferencia en número de veces (CE50 de TCB 16D5 dividido por CE50 de TCB 36F2).

Tabla 29: Comparación de los valores de CE50 de TCB 16D5 y TCB 36F2.

*la curva no alcanzó la saturación, es solo un valor hipotético

Los valores de CE50 calculados muestran claramente que la diferencia entre TCB 36F2 y TCB 16D5 aumenta cuanto menor es la expresión de FolR1 en las células diana.

Los mismos cálculos que se hicieron para la comparación de los valores de CE50 de TCB 16D5 y TCB 36F2 se realizaron para TCB 16D5 y las dos T^cB 16D5 monovalentes (TCB 16D5 HT y 16D5 1 1). Las tablas 30 y 31 muestran las comparaciones de los valores de CE50 de TCB 16D5 frente a TCB 16D5 HT (tabla 30) y TCB 16D5 frente a TCB 16D5 1+1 (tabla 31), así como los deltas (CE50 de TCB 16D5 menos CE50 de TCB 16D5 HT/1 1) correspondientes y las diferencias en número de veces (CE50 de TCB 16D5 dividido por CE50 de TCB 16D5 HT/1 1).

Tabla 30: Comparación de los valores de CE50 de TCB 16D5 (2+1 invertido) y TCB 16D5 HT.

Tabla 31: Comparación de los valores de CE50 de TCB 16D5 y TCB 16D51 1.

*la curva no alcanzó la saturación, es solo un valor hipotético

La comparación de los valores de CE50 de TCB 16D5 y TCB 36F2 (tabla 29) muestra que la diferencia en los valores de CE50 aumenta cuanto menor es la expresión de FolR1 en las células diana. Este efecto no se puede ver en la comparación de TCB 16D5 y las TCB 16D5 monovalentes (tabla 29 y tabla 30). Para TCB 16D5 1+1 (tabla 31) también existe un ligero incremento en la diferencia entre la CE50 de TCB 16D5 y de TCB 16D5 1 1 con la disminución de la expresión de FolR1, pero no tan pronunciado como se puede observar en la comparación de TCB 16D5 frente a TCB 36F2.

Ejemplo 34

Regulación por incremento de CD25 y CD69 en células efectoras CD8+ y CD4+ después de la destrucción mediada por linfocitos T de células tumorales que expresan FolR1 inducida por el anticuerpo TCB 36F2 y TCB 16D5

La activación de linfocitos T CD8+ y CD4+ después de la destrucción mediada por linfocitos T de células tumorales HeLa, SKov-3 y HT-29 que expresan FolR1 mediada por TCB 36F2 y TCB 16D5 se evaluó mediante análisis por FACS usando anticuerpos que reconocen los marcadores de activación de linfocitos T CD25 (marcador de activación tardía) y CD69 (marcador de activación temprana). La TCB DP47 se incluyó como control sin propiedades de unión. El anticuerpo y las condiciones del ensayo de destrucción fueron esencialmente como se describe anteriormente (ejemplo 32), usando el mismo intervalo de concentraciones de anticuerpo (0,01 pM - 100 nM por triplicado), proporción E:T 10:1 y un tiempo de incubación de 48 h.

Después de la incubación, se transfirieron PBMC a una placa de 96 pocillos de fondo redondo, se centrifugaron a 400 x g durante 4 min y se lavaron dos veces con p Bs que contenía BSA al 0,1 %. Se realizó la tinción de superficie para CD8 (anticuerpo anti-CD8 humano con PE, BD n.° 555635), CD4 (anticuerpo anti-CD4 humano con Brilliant Violet 421 ™, Biolegend n.° 300532), CD69 (anticuerpo anti-CD69 humano con FlTC, BD n.° 555530) y CD25 (anticuerpo anti-CD25 humano con APC, BD n.° 555434) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se lavaron dos veces con 150 pl/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 %. Después de la centrifugación, las muestras se resuspendieron en 200 pl/pocillo de PBS con BSA al 0,1 % para la medición de FACS. Se analizaron las muestras en FACS Canto II de ^bD.

La TCB 36F2 indujo una regulación por incremento específica de diana de los marcadores de activación (CD25, CD69) en linfocitos T CD8+ y CD4+ después de destruir las células HeLa (figura 25A) y SKov-3 (figura 25^b). En comparación con TCB 16D5, la regulación por incremento de CD25 y CD69 en linfocitos T CD8+ y CD4+ inducida por 36F2 es mucho más débil.

En HT-29 (expresión baja de FolR1), solo se puede ver una regulación por incremento de los marcadores de activación a la concentración más alta de TCB 36F2. Por el contrario, con TCB 16D5, la regulación por incremento de CD25 y CD69 se puede observar ya a concentraciones de anticuerpos mucho menores (figura 25C).

Como se observa también en el experimento de lisis tumoral, el análisis de los marcadores de activación (CD25 y CD69) en linfocitos T (CD4+ y CD8+) después de la destrucción muestra claramente que la diferencia entre TCB 16D5 y TCB 36F2 se hace mayor cuanto menor es el nivel de expresión de FolR1 en las celdas diana. Ejemplo 35

Destrucción por linfocitos T de células primarias inducida por TCB 36F2 y TCB 16D5

La destrucción por linfocitos T mediada por TCB 36F2 y TCB 16D5 se evaluó en células primarias (células epiteliales de la corteza renal humanas (HRCEpiC) (ScienCell Research Laboratories; n.° cat. 4110) y células del epitelio pigmentario de la retina humanas (HRPEpiC) (ScienCell Research Laboratories; n.° cat. 6540)). Las células HT-29 (expresión baja de FolR1) se incluyeron como línea celular de control. TCB DP47 sirvió como control sin unión. Se usaron PBMC humanos como células efectoras y se detectó la destrucción tras 24 h y 48 h de incubación con los anticuerpos biespecíficos. En resumen, se recogieron células diana con tripsina/EDTA, se lavaron y se sembraron a una densidad de 25.000 células/pocillo usando placas de 96 pocillos de fondo plano. Se dejó que las células se adhirieran durante la noche. Los leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) se prepararon mediante centrifugación por densidad en Histopaque a partir de preparaciones enriquecidas de linfocitos (capas leucocíticas) obtenidas de donantes humanos sanos. Se diluyó la sangre recién obtenida con PBS estéril y se colocó en una capa sobre un gradiente de Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, temperatura ambiente), se desechó el plasma por encima de la interfase que contenía los PBMC y se transfirieron los PBMC a un nuevo tubo Falcon llenado posteriormente con 50 ml de PBS. Se centrifugó la mezcla (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se desechó el sobrenadante y se lavó el sedimento de PBMC dos veces con PBS estéril (etapas de centrifugación 350 x g, 10 minutos). La población de PBMC resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 % y L-alanil-L-glutamina al 1 % (Biochrom, K0302) a 37 °C, CO2 al 5 % en incubadora celular hasta su uso posterior (no más de 24 h). Para el ensayo de destrucción, se añadió el anticuerpo a las concentraciones indicadas (intervalo de 0,01 pM-10 nM por triplicado). Se añadieron PBMC a células diana a una proporción E:T final de 10:1. Se evaluó la destrucción de células tumorales después de 24 h y 48 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 % por cuantificación de LDH liberada en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11644793001). Se logró la lisis máxima de las células diana (= 100 %) por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 %. Lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin construcción biespecífica.

Los resultados muestran que TCB 36F2 no induce la destrucción por linfocitos T de las células primarias (figuras 26A-D), mientras que se puede observar una cierta destrucción para TCB 16D5 en células HRCEpiC y HRPEpiC después de 48 h de incubación (figuras 26B y D). Como se describe anteriormente, se observó una gran diferencia en la destrucción por linfocitos T de células HT-29 entre TCB 16D5 y TCB 36F2 (Fig. 26E, F).

Ejemplo 36

Preparación de TCB DP47 GS

(2+1 Crossfab-IgG P329G LALA invertido = "TCB no dirigida")

La "TCB no dirigida" se usó como control en los experimentos anteriores. El anticuerpo biespecífico se vincula a CD3s, pero no se une a ningún otro antígeno y, por lo tanto, no puede reticular los linfocitos T con ninguna célula diana (y posteriormente no puede inducir ninguna destrucción). Por lo tanto, se usó como control negativo en los ensayos para supervisar cualquier activación inespecífica de linfocitos T. Esta TCB no dirigida se preparó como se describe en el documento WO2014/131712. En resumen, se han subclonado las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera sin cambio del marco de lectura con la cadena pesada constante o bien la cadena ligera constante preinsertada en el respectivo vector de expresión de mamífero receptor. La expresión del anticuerpo estaba dirigida por un promotor MPSV y lleva una secuencia señal de poliA sintética en el extremo 3' de la CDS. Además, cada vector contiene una secuencia OriP de EBV.

Se produjo la molécula cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Se transfectaron las células con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:2:1:1 ("vector de la cadena pesada Fc(ojal)": "vector de la cadena ligera": "vector de la cadena ligera Crossfab": "vector de la cadena pesada Fc(botón)-FabCrossfab").

Para la transfección, se cultivaron células HEK293 EBNA en suspensión sin suero en medio de cultivo CD CHO. Para la producción en un matraz de agitación de 500 ml, se sembraron 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se centrifugaron durante 5 min mediante 210 x g, el sobrenadante se reemplaza por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión se mezclaron en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 pg de ADN. Después de la adición de 540 pl, la solución de PEI se mezcló con una agitadora vorticial durante 15 s y posteriormente se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclaron con la solución de ADN/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 ml y se incubaron durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añadieron 160 ml de medio F17 y las células se cultivaron durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadió ácido valproico 1 mM y Feed 1 al 7 %. Después de un cultivo de 7 días, se recogió el sobrenadante para la purificación mediante centrifugación durante 15 min a 210 x g, la solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm) y se añadió acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo en 4 °C.

La proteína secretada se purificó de los sobrenadantes del cultivo celular mediante cromatografía de afinidad usando proteína A. El sobrenadante se cargó en una columna HiTrap Protein A HP (VC = 5 ml, GE Healthcare) equilibrada con 40 ml de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,5. Se retiró la proteína no unida lavando con al menos 10 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,5. La proteína diana se eluyó usando un gradiente en 20 volúmenes de columna desde citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,5 hasta citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 2,5. Se neutralizó la solución de proteína añadiendo 1/10 de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8. Se concentró la proteína diana y se filtró antes de su carga en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, solución de cloruro de sodio 140 mM a pH 6,0.

Se determinó la concentración de proteína de las muestras de proteínas purificadas midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. Se analizaron la pureza y el peso molecular de las moléculas por análisis por CE-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor. Se usó el sistema Caliper LabChip GXII (Caliper lifescience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usan 2 pg de muestra para los análisis.

Se analizó el contenido en agregado de las muestras de anticuerpo usando una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) en K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7 a 25 °C.

Tabla 32: Resumen de producción y purificación de TCB DP47 GS.

Tabla 33: Análisis por CE-SDS de TCB DP47 GS.

Ejemplo 37

Unión de TCB 16D5 y TCB 9D11 y sus correspondientes variantes de desamidación de CD3 N100A y S100aA a células Jurkat que expresan CD3

La unión de TCB 16D5 y las variantes de desamidación de CD3 correspondientes TCB 16D5 N100A y TCB 16D5 S100aA y de TCB 9D11 y las variantes de desamidación TCB 9D11 N100A y TCB 9D11 S100aA a CD3 humano se evaluaron en una línea de linfocitos T inmortalizados que expresan ^cD3 (Jurkat). En resumen, las células se recogieron, se contaron, se comprobó su viabilidad y se resuspendieron a 2 x 106 células/ml en tampón FACS (100 pl de PBS, BSA al 0,1 %). Se incubaron 100 pl de suspensión celular (que contenía 0,2 x 106 células) en placas de 96 pocillos de fondo redondo durante 30 min a 4 °C con diferentes concentraciones de los anticuerpos biespecíficos (686 pM-500 nM). Después de dos etapas de lavado con PBS frío con BSA al 0,1 %, las muestras se volvieron a incubar durante otros 30 min a 4 °C con un anticuerpo secundario caprino AffiniPure de fragmento F(ab')2 específico del fragmento Fcy anti-IgG humana conjugado con PE (Jackson Immuno Research Lab PE n.° 109-116-170). Después de lavar las muestras dos veces con PBS frío con BSA al 0,1 %, se analizaron inmediatamente mediante FACS usando un FACS Canto II (programa informático FACS Diva). Se obtuvieron curvas de unión usando GraphPadPrism6 (Fig. 28A-B).

Los resultados muestran una unión a CD3 reducida de las variantes de desamidación N100A y S100aA en comparación con los anticuerpos originales TCB 16D5 (Fig. 28A) y TCB 9D11 (Fig. 28B).

Ejemplo 38

Destrucción por linfocitos T de células SKov-3 y HT-29 inducida por TCB 16D5 y TCB 9D11 y sus variantes de desamidación de CD3 N100A y S100aA

La destrucción por linfocitos T mediada por TCB 16D5 y las variantes de desamidación de CD3 correspondientes TCB 16D5 N100A y TCB 16D5 S100aA y de TCB 9D11 y las variantes de desamidación TCB 9D11 N100A y TCB 9D11 S100aA se evaluó en células SKov-3 (nivel medio de FolR1) y HT-29 (nivel bajo de FolR1). Se usaron PBMC humanos como células efectoras y se detectó la destrucción tras 24 h de incubación con los anticuerpos biespecíficos. En resumen, se recogieron células diana con tripsina/EDTA, se lavaron y se sembraron a una densidad de 25.000 células/pocillo usando placas de 96 pocillos de fondo plano. Se dejó que las células se adhirieran durante la noche. Los leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) se prepararon mediante centrifugación por densidad en Histopaque a partir de preparaciones enriquecidas de linfocitos (capas leucocíticas) obtenidas de donantes humanos sanos. Se diluyó la sangre recién obtenida con PBS estéril y se colocó en una capa sobre un gradiente de Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, temperatura ambiente), se desechó el plasma por encima de la interfase que contenía los PBMC y se transfirieron los PBMC a un nuevo tubo Falcon llenado posteriormente con 50 ml de PBS. Se centrifugó la mezcla (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se desechó el sobrenadante y se lavó el sedimento de PBMC dos veces con PBS estéril (etapas de centrifugación 350 x g, 10 minutos). La población de PBMC resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 % y L-alanil-L-glutamina al 1 % (Biochrom, K0302) a 37 °C, CO2 al 5 % en incubadora celular hasta su uso posterior (no más de 24 h). Para el ensayo de destrucción, se añadió el anticuerpo a las concentraciones indicadas (intervalo de 0,01 pM-10 nM por triplicado). Se añadieron PBMC a células diana a una proporción E:T final de 10:1. Se evaluó la destrucción de células tumorales después de 24 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 % por cuantificación de LDH liberada en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11 644 793 001). Se logró la lisis máxima de las células diana (= 100 %) por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 %. Lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin construcción biespecífica.

Los resultados muestran que, en las células SKov-3, la destrucción inducida por las variantes de desamidación de CD3 TCB 16D5 N100A y TCB 16D5 S100aA es comparable a la inducida por TCB 16D5 (Fig. 29A). Lo mismo sucede para TCB 9D11 y sus variantes TCB 9D11 N100A y TCB 9D11 S100aA (Fig. 29B). En las células HT-29 de baja expresión de FolR1, la variante S100aA muestra una eficacia de destrucción reducida, como es el caso para TCB 16D5 (Fig. 30A), así como para TCB 9D11 (Fig. 30B). Los valores de CE50 relacionados con los ensayos de destrucción, calculados usando GraphPadPrism6 se dan en la tabla 35.

Tabla 35: Valores de CE50 (pM) para destrucción mediada por linfocitos T de células SKov-3 y HT-29 que expresan FolR1 inducida por T^cB 16D5 y TCB 9D11 y sus variantes de desamidación N100A y A100aA.

*no determinado

Ejemplo 39

Caracterización bioquímica por resonancia de plasmón superficial como TCB de dos variantes de molécula de unión a CD3 (N100A y S100aA) para eliminar un sitio de desamidación

La unión de dos TCB 16D5 con variantes de unión a CD3 (N100A o S100aA) a CD3 recombinante humano (heterodímero CD3épsilon-CD3delta como fusión de Fc) se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Todos los experimentos de SPR se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo/Alemania).

Afinidad por CD3s5-Fc

La afinidad de la interacción entre las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 y el heterodímero CD3 épsilon-delta recombinante se determinó como se describe a continuación (tabla 36).

Para la medición de la afinidad, se realizó el acoplamiento directo de alrededor de 6000 unidades de resonancia (UR) del anticuerpo específico anti-Fab humano (kit de captura de Fab, GE Healthcare) en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (GE Healthcare). Se capturaron las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 a 200 nM con un caudal de 20 pl/min durante 60 segundos, la cubeta de lectura de referencia se dejó sin captura. Se pasaron series de dilución (4,1 a 3000 nM) de fusión de Fc con el receptor de folato 1 humano y de macaco cangrejero en todas las cubetas de lectura a 30 pl/min durante 240 segundos para registrar la fase de asociación. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 240 s y se activó cambiando de la solución de muestra a HBS-EP. La superficie del chip se regeneró después de cada ciclo usando una inyección doble de 60 s de glicina-HCl 10 mM, pH 1,5. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia 1. Las constantes de afinidad para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad ajustando a una unión de Langmuir 1:1 usando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabla 36: Unión monovalente (afinidad) de dos variantes de desamidación de CD3 16D5 como TCB en CD3s6 humano-Fc.

Las dos variantes de desamidación de CD3 tienen una afinidad ligeramente reducida en comparación con la molécula de unión a CD3 natural (CH2527), pero la diferencia no es grave.

Ejemplo 40

Producción y purificación de dos variantes de la molécula biespecífica de linfocitos T 16D5 con mutaciones para eliminar el sitio de desamidación en la molécula de unión a CD3: TCB 16D5 N100A, TCB 16D5 S100aA

Transfección y producción transitorias

Las dos variantes de desamidación de TCB 16D5 se produjeron de forma transitoria en células HEK293 EBNA usando un procedimiento de transfección mediado por PEI para los vectores requeridos como se describe a continuación. Las células HEK293 EBNA se cultivan en suspensión sin suero en medio de cultivo CD CHO. Para la producción en un matraz de agitación de 500 ml, se siembran 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección (para escalas alternativas, todas las cantidades se ajustaron en consecuencia). Para la transfección, las células se centrifugan durante 5 min a 210 x g, el sobrenadante se reemplaza por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Se mezclan vectores de expresión en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 pg de ADN. Después de la adición de 540 pl, la solución de PEI se mezcla con una agitadora vorticial durante 15 s y posteriormente se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclan con la solución de ADN/PEI, se transfieren a un matraz de agitación de 500 ml y se incuban durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añaden 160 ml de medio F17 y las células se cultivan durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añade ácido valproico 1 mM y Feed 1 al 7 %. Después de un cultivo de 7 días, se recoge el sobrenadante para la purificación mediante centrifugación durante 15 min a 210 x g, la solución se filtra en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm) y se añade acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantiene a 4 °C. Después de la producción, se obtuvo el sobrenadante, se filtró a través de filtros estériles de 0,22 pm y se almacenó a 4 °C hasta su purificación.

Purificación

Las dos variantes de desamidación de TCB 16D5 se purificaron en dos etapas usando procedimientos estándar, tales como cromatografía de afinidad con proteína A (Ákta Explorer) y cromatografía de exclusión por tamaño. El sobrenadante obtenido de la producción transitoria se ajustó a pH 8,0 (usando TRIS 2 M, pH 8,0) y se aplicó a una columna MabSelect SuRe (GE Healthcare, volumen de columna (VC) = 2 ml) equilibrada con 8 volúmenes de columna (VC) de tampón A (fosfato de sodio 20 mM pH 7,5, citrato de sodio 20 mM). Después de lavar con 10 VC de tampón A, la proteína se eluyó usando un gradiente de pH para tampón B (citrato de sodio 20 mM, pH 3,0, NaCl 100 mM, glicina 100 mM) en 20 VC. Las fracciones que contenían la proteína de interés se combinaron y el pH de la solución se ajustó suavemente a pH 6,0 (usando Na2HPO4 0,5 M, pH 8,0). Las muestras se concentraron a 1 ml usando ultraconcentradores (Amicon Ultra-15, 30.000 MWCO, Millipore) y posteriormente se aplicaron a una columna de calidad preparativa HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, pH 6,0, NaCl 140 mM. El contenido agregado de las fracciones eluidas se analizó por cromatografía analítica de exclusión por tamaño. Por lo tanto, se aplicaron 30 pl de cada fracción a una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7, a 25 °C. Se combinaron las fracciones que contenían menos de un 2 % de oligómeros. Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de las construcciones se analizaron mediante electroforesis capilar (CE-SDS) en presencia y ausencia de un agente reductor siguiendo las instrucciones del fabricante (instrumento Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Las proteínas purificadas se congelaron en N2 líquido y se almacenaron a -80 °C.

Tabla 36: Rendimiento, contenido de monómeros y pureza por CE-SDS de las dos variantes de desamidación de 16D5 en formato biespecífico de linfocitos T.

Ambas TCB se produjeron en buena calidad, similar a la construcción con la molécula de unión a CD3 natural.

Ejemplo 41

Producción y purificación de dos variantes de moléculas de unión 16D5 (D52dE y D52dQ) como IgG para eliminar un punto caliente en la CDR

Transfección y producción transitorias

Las dos IgG se produjeron de forma transitoria en células HEK293 EBNA usando un procedimiento de transfección mediado por PEI para los vectores requeridos como se describe a continuación. Las células HEK293 EBNA se cultivan en suspensión sin suero en medio de cultivo CD CHO. Para la producción en un matraz de agitación de 500 ml, se siembran 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección (para escalas alternativas, todas las cantidades se ajustaron en consecuencia). Para la transfección, las células se centrifugan durante 5 min a 210 x g, el sobrenadante se reemplaza por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Se mezclan vectores de expresión en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 pg de ADN. Después de la adición de 540 pl, la solución de PEI se mezcla con una agitadora vorticial durante 15 s y posteriormente se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclan con la solución de ADN/PEI, se transfieren a un matraz de agitación de 500 ml y se incuban durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añaden 160 ml de medio F17 y las células se cultivan durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añade ácido valproico 1 mM y Feed 1 al 7 %. Después de un cultivo de 7 días, se recoge el sobrenadante para la purificación mediante centrifugación durante 15 min a 210 x g, la solución se filtra en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm) y se añade acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantiene a 4 °C. Después de la producción, se obtuvieron los sobrenadantes y se filtraron los sobrenadantes que contenían anticuerpos a través de filtros estériles de 0,22 pm y se almacenaron a 4 °C hasta su purificación.

Purificación de anticuerpos

Las dos IgG se purificaron en dos etapas usando procedimientos estándar, tales como cromatografía de afinidad con proteína A (Ákta Explorer) y cromatografía de exclusión por tamaño. El sobrenadante obtenido de la producción transitoria se ajustó a pH 8,0 (usando TRIS 2 M, pH 8,0) y se aplicó a una columna POROS MabCapture A (Applied Biosystems, volumen de columna (VC) = 1 ml) equilibrada con 8 volúmenes de columna (VC) de tampón A (fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5). Después de lavar con 10 VC de tampón A, la proteína se eluyó usando una etapa de pH para tampón B (citrato de sodio 20 mM, pH 3,0, NaCl 100 mM, glicina 100 mM) en 5 VC. Los 5 ml que contenían la proteína de interés se almacenan en un bucle en el Ákta Explorer y posteriormente se aplican a una columna HiLoad 16/60 Superdex™ 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, pH 6,0, NaCl 140 mM (no se utilizó TWEEn). Las fracciones que contenían las IgG se combinaron y concentraron usando ultraconcentradores (Amicon Ultra-15, 30.000 MWCO, Millipore). El contenido agregado de las fracciones combinadas finales se analizó por cromatografía analítica de exclusión por tamaño. Por lo tanto, se aplicaron 30 pl a una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7, a 25 °C. Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado sobre la base de la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de las construcciones se analizaron mediante electroforesis capilar (CE-SDS) en presencia y ausencia de un agente reductor siguiendo las instrucciones del fabricante (instrumento Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Las proteínas purificadas se almacenaron a 4 °C.

Tabla 37: Rendimiento, contenido de monómeros y pureza por CE-SDS de dos variantes de puntos calientes de 16D5 como IgG.

Ambas IgG se produjeron bien y con buena calidad.

Ejemplo 42

Caracterización bioquímica por resonancia de plasmón superficial de dos variantes de moléculas de unión 16D5 (D52dE y D52dQ) como IgG para eliminar un punto caliente en la CDR

La unión de dos variantes de moléculas de unión 16D5 (D52dE y D52dQ) como IgG al receptor de folato 1 recombinante humano y de macaco cangrejero (ambos como fusiones de Fc) se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Todos los experimentos de SPR se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo/Alemania).

1. Avidez por el receptor de folato 1

La avidez de la interacción entre las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 y los receptores de folato recombinantes se determinó como se describe a continuación (tabla 38).

Las fusiones con Fc monomérico biotinilado recombinante del receptor de folato 1 humano, de macaco cangrejero y murino (FolR1-Fc) se acoplaron directamente en un chip SA usando las instrucciones de acoplamiento estándar (Biacore, Friburgo/Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 160. Las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 se pasaron a un intervalo de concentración de 3,7 a 900 nM con un caudal de 30 pl/minuto a través de las cubetas de lectura durante 180 segundos. Se supervisó la disociación durante 600 segundos. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia inmovilizada con fusión de Fc y el receptor de IL2 murino biotinilado recombinante. Las curvas de unión resultantes de la unión bivalente de las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T se aproximaron a una unión de Langmuir 1:1 (aunque es una unión 1:2) y se ajustaron con ese modelo para obtener una K^daparente que representa la avidez de la unión bivalente. Las constantes de avidez aparente para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad del ajuste utilizando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabla 38: Unión bivalente (avidez con K^daparente) de dos variantes de puntos calientes de 16D5 como IgG a FolR1 humano, murino y de macaco cangrejero (no se une a muFolR1 como se esperaba).

2. Afinidad por el receptor de folato 1

La afinidad de la interacción entre las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 y los receptores de folato recombinantes se determinó como se describe a continuación (tabla 39).

Para la medición de la afinidad, se realizó el acoplamiento directo de alrededor de 10000 unidades de resonancia (UR) del anticuerpo específico anti-Fab humano (kit de captura de Fab, GE Healthcare) en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (GE Healthcare). Se capturaron las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 a 20 nM con un caudal de 10 pl/min durante 40 segundos, la cubeta de lectura de referencia se dejó sin captura. Se pasaron series de dilución (12,35 a 3000 nM) de fusión de Fc con el receptor de folato 1 humano y de macaco cangrejero en todas las cubetas de lectura a 30 pl/min durante 240 segundos para registrar la fase de asociación. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 300 s y se activó cambiando de la solución de muestra a HBS-EP. La superficie del chip se regeneró después de cada ciclo usando una inyección doble de 60 s de glicina-HCl 10 mM, pH 1,5. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia 1. Las constantes de afinidad para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad ajustando a una unión de Langmuir 1:1 usando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabla 39: Unión monovalente (afinidad) de dos variantes de puntos calientes de 16D5 como IgG a FolR1 humano y de macaco cangrejero.

Ligando Analito ka (1/Ms) kd (1/s) K _d

Las dos variantes de puntos calientes de 16D5 tienen una avidez similar (unión bivalente) a la molécula de unión 16D5 natural. La avidez está ligeramente disminuida para la variante D52dQ y esta diferencia es aún más visible en la afinidad (unión monovalente).

Ejemplo 43

Producción y purificación como IgG de doce variantes de la molécula de unión 16D5 con mutaciones en la cadena pesada y ligera para reducir la afinidad por FolR1

Transfección y producción transitorias

Las doce IgG se produjeron de forma transitoria en células HEK293 EBNA usando un procedimiento de transfección mediado por PEI para los vectores requeridos como se describe a continuación. Las células HEK293 EBNA se cultivan en suspensión sin suero en medio de cultivo CD CHO. Para la producción en un matraz de agitación de 500 ml, se siembran 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección (para escalas alternativas, todas las cantidades se ajustaron en consecuencia). Para la transfección, las células se centrifugan durante 5 min a 210 x g, el sobrenadante se reemplaza por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Se mezclan vectores de expresión en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 pg de ADN. Después de la adición de 540 pl, la solución de PEI se mezcla con una agitadora vorticial durante 15 s y posteriormente se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclan con la solución de ADN/PEI, se transfieren a un matraz de agitación de 500 ml y se incuban durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añaden 160 ml de medio F17 y las células se cultivan durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añade ácido valproico 1 mM y Feed 1 al 7 %. Después de un cultivo de 7 días, se recoge el sobrenadante para la purificación mediante centrifugación durante 15 min a 210 x g, la solución se filtra en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm) y se añade acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantiene a 4 °C. Después de la producción, se obtuvieron los sobrenadantes y se filtraron los sobrenadantes que contenían anticuerpos a través de filtros estériles de 0,22 pm y se almacenaron a 4 °C hasta su purificación.

Purificación de anticuerpos

Todas las moléculas se purificaron en dos etapas usando procedimientos estándar, tales como cromatografía de afinidad con proteína A (Ákta Explorer) y cromatografía de exclusión por tamaño. El sobrenadante obtenido de la producción transitoria se ajustó a pH 8,0 (usando TRIS 2 M, pH 8,0) y se aplicó a una columna POROS MabCapture A (Applied Biosystems, volumen de columna (VC) = 1 ml) equilibrada con 8 volúmenes de columna (VC) de tampón A (fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5). Después de lavar con 10 VC de tampón A, la proteína se eluyó usando una etapa de pH para tampón B (citrato de sodio 20 mM, pH 3,0, NaCl 100 mM, glicina 100 mM) en 5 VC. Los 5 ml que contenían la proteína de interés se almacenan en un bucle en el Ákta Explorer y posteriormente se aplican a una columna HiLoad 16/60 Superdex™ 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, pH 6,0, NaCl 140 mM, Tween-20 al 0,01 %. Las fracciones que contenían las IgG se combinaron y concentraron usando ultraconcentradores (Amicon Ultra-15, 30.000 MWCO, Millipore). El contenido agregado de las fracciones combinadas finales se analizó por cromatografía analítica de exclusión por tamaño. Por lo tanto, se aplicaron 30 pl a una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7, a 25 °C. Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado sobre la base de la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de las construcciones se analizaron mediante electroforesis capilar (CE-SDS) en presencia y ausencia de un agente reductor siguiendo las instrucciones del fabricante (instrumento Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Las proteínas purificadas se almacenaron a 4 °C.

Tabla 40: Rendimiento, contenido de monómeros y pureza por CE-SDS de doce variantes de IgG 16D5

Las doce IgG se produjeron bien y con buena calidad.

Ejemplo 44

Caracterización bioquímica de variantes de combinación de cadena ligera y pesada de 16D5 como IgG por resonancia de plasmón superficial

La unión de las variantes de las de combinación de cadenas pesadas y ligeras de moléculas de unión a FolR1 16D5 como IgG a diferentes receptores de folato recombinantes (FolR1 humano, murino y de macaco cangrejero; todos como fusiones de Fc) se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Todos los experimentos de SPR se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo/Alemania).

Avidez por el receptor de folato 1

La avidez de la interacción entre las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 y los receptores de folato recombinantes se determinó como se describe a continuación (tabla 41).

Las fusiones con Fc monomérico biotinilado recombinante del receptor de folato 1 humano, de macaco cangrejero y murino (FolR1-Fc) se acoplaron directamente en un chip SA usando las instrucciones de acoplamiento estándar (Biacore, Friburgo/Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 300. Las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 se pasaron a un intervalo de concentración de 11,1 a 900 nM con un caudal de 30 pl/minuto a través de las cubetas de lectura durante 180 segundos. Se supervisó la disociación durante 240 o 600 segundos. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia inmovilizada con fusión de Fc y el receptor de IL2 murino biotinilado recombinante. Las curvas de unión resultantes de la unión bivalente de las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T se aproximaron a una unión de Langmuir 1:1 (aunque es una unión 1:2) y se ajustaron con ese modelo para obtener una K^daparente que representa la avidez de la unión bivalente. Las constantes de avidez aparente para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad del ajuste utilizando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare). Para cinéticas de baja afinidad con fases de asociación y disociación demasiado rápidas para ajustarse al modelo de unión de Langmuir 1:1, se aplicó el modelo de análisis de estado de equilibrio usando el software Bia Evaluation (GE Healthcare). El análisis de estado de equilibrio da la K^dde la reacción de unión en equilibrio.

Tabla 41: Unión bivalente (avidez con K^daparente) de doce variantes de la molécula de unión 16D5 como IgG a FolR1 humano, murino y de macaco cangrejero.

Afinidad por el receptor de folato 1

La afinidad de la interacción entre las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FoIRI y los receptores de folato recombinantes se determinó como se describe a continuación (tabla 42).

Para la medición de la afinidad, se realizó el acoplamiento directo de alrededor de 10000 unidades de resonancia (UR) del anticuerpo específico anti-Fab humano (kit de captura de Fab, GE Healthcare) en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (GE Healthcare). Se capturaron las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 a 200 nM con un caudal de 10 pl/min durante 40 segundos, la cubeta de lectura de referencia se dejó sin captura. Se pasaron series de dilución (12,35 a 3000 nM) de fusión de Fc con el receptor de folato 1 humano en todas las cubetas de lectura a 30 pl/min durante 240 segundos para registrar la fase de asociación. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 300 s y se activó cambiando de la solución de muestra a HBS-EP. La superficie del chip se regeneró después de cada ciclo usando una inyección doble de 60 s de glicina-HCl 10 mM, pH 1,5. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia 1. Las constantes de afinidad para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad ajustando a una unión de Langmuir 1:1 usando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabla 42: Unión monovalente (afinidad) de doce variantes de la molécula de unión a FolR1 16D5 como IgG a FolR1 humano, de macaco cangrejero y murino.

Se analizaron doce variantes de "afinidad reducida" de la molécula de unión a FolRI 16D5 mediante resonancia de plasmón superficial en comparación con la molécula de unión 16D5 natural y la molécula de unión 36F2. El objetivo era encontrar una variante de 16D5 con una afinidad y una avidez comparables a las de 36F2. Al medir la unión monovalente (afinidad), hubo variantes con una afinidad mayor y variantes con una afinidad menor que 36F2. Sin embargo, en la unión bivalente (avidez), todas las variantes tienen un valor de K^daparente mayor que 36F2. Esto se debe principalmente a la rápida velocidad de asociación (ka) de 36F2, que da como resultado una pequeña K^daparente para 36F2. El gran efecto de avidez cuando 36F2 se une de forma bivalente parece ser exclusivo de esta molécula de unión. Como se indica anteriormente, 36F2 fue la única molécula de unión de reactividad cruzada con receptor humano, murino y de macaco cangrejero que se pudo identificar.

Ejemplo 45

Unión de variantes de HC/LC de 16D5 a FolRI humano expresado en células Hela

Se evaluó la unión de TCB 36F2, TCB 16D5 y diversas variantes de HC/LC de 16D5 a FolR1 humano en células Hela. En resumen, las células se recogieron, se contaron, se comprobó su viabilidad y se resuspendieron a 2 x 106 células/ml en tampón FACS (100 pl de PBS, BSA al 0,1 %). Se incubaron 100 pl de suspensión celular (que contenía 0,2 x 106 células) en placas de 96 pocillos de fondo redondo durante 30 min a 4 °C con diferentes concentraciones de los anticuerpos biespecíficos (229 pM-500 nM). Después de dos etapas de lavado con PBS frío con BSA al 0,1 %, las muestras se volvieron a incubar durante otros 30 min a 4 °C con un anticuerpo secundario caprino AffiniPure de fragmento F(ab')2 específico del fragmento F^cyanti-IgG humana conjugado con PE (Jackson Immuno Research Lab PE n.° 109-116-170). Después de lavar las muestras dos veces con PBS frío con BSA al 0,1 %, se fijaron con PFA al 1 % durante la noche. Posteriormente, las muestras se centrifugaron, se resuspendieron en PBS con BSA al 0,1 % y se analizaron por FACS usando un FACS Canto II (programa informático FACS Diva). Se obtuvieron curvas de unión usando GraphPadPrism6 (Fig. 32A-E). El FolR2 unido a TCB 36F2 no fue bien tolerado en ratones y no demostró la eficacia deseada.

Ejemplo 46

Producción y purificación de cuatro variantes de la molécula biespecífica de linfocitos T16D5 con mutaciones para reducir la afinidad por FolR1 humano y de macaco cangrejero: TCB 16D5 G49S/S93A, G49S/K53A, W96Y, W96Y/D52E

Transfección y producción transitorias

Se produjeron transitoriamente cuatro variantes adicionales de TCB 16D5 que tenían afinidad reducida por FolR1 en células HEK293 EBNA usando un procedimiento de transfección mediado por PEI para los vectores requeridos como se describe a continuación. Para la transfección, se cultivan células HEK293 EBNA en suspensión libre de suero en medio de cultivo Excell que contiene L-glutamina 6 mM y 250 mg/l de medio de cultivo G418. Para la producción en matraz TubeSpin de 600 ml (volumen de trabajo máx. de 400 ml), se sembraron 600 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se centrifugan durante 5 min a 210 x g, el sobrenadante se reemplaza por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Se mezclan vectores de expresión en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 400 pg de ADN. Después de la adición de 1080 pl, la solución de PEI (2,7 pg/ml) se mezcla con una agitadora vorticial durante 15 s y posteriormente se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclan con la solución de ADN/PEI, se transfieren a un matraz TubeSpin de 600 ml y se incuban durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añaden 360 ml de Excell L-glutamina 6 mM 5 g/l de Pepsoy medio VPA 1,0 mM y se cultivan las células durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añade Feed 7 al 7 %. Después de un cultivo de 7 días, se recoge el sobrenadante para la purificación mediante centrifugación durante 20-30 min a 3600 x g (centrífuga Sigma 8K), la solución se filtra en condiciones estériles (filtro de 0,22 mm) y se añade acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantiene a 4 °C.

Purificación

Las variantes de afinidad reducida de TCB 16D5 se purificaron en dos etapas usando procedimientos estándar, tales como cromatografía de afinidad con proteína A (Ákta Explorer) y cromatografía de exclusión por tamaño. El sobrenadante obtenido de la producción transitoria se ajustó a pH 8,0 (usando TRIS 2 M, pH 8,0) y se aplicó a una columna HiTrap Protein A (GE Healthcare, volumen de columna (VC) = 5 ml) equilibrada con 8 volúmenes de columna (VC) de tampón A (fosfato de sodio 20 mM pH 7,5, citrato de sodio 20 mM). Después de lavar con 10 VC de tampón A, la proteína se eluyó usando un gradiente de pH para tampón B (citrato de sodio 20 mM, pH 3,0, NaCI 100 mM, glicina 100 mM) en 20 VC. Las fracciones que contenían la proteína de interés se combinaron y el pH de la solución se ajustó suavemente a pH 6,0 (usando Na2HPO4 0,5 M, pH 8,0). Las muestras se concentraron a 1 ml usando ultraconcentradores (Amicon Ultra-15, 30.000 MWCO, Millipore) y posteriormente se aplicaron a una columna de calidad preparativa HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, pH 6,0, NaCl 140 mM, Tween 20 al 0,01 %. El contenido agregado de las fracciones eluidas se analizó por cromatografía analítica de exclusión por tamaño. Por lo tanto, se aplicaron 30 pl de cada fracción a una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7, a 25 °C. Se combinaron las fracciones que contenían menos de un 2 % de oligómeros. Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de las construcciones se analizaron mediante electroforesis capilar (CE-SDS) en presencia y ausencia de un agente reductor siguiendo las instrucciones del fabricante (instrumento Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Las proteínas purificadas se congelaron en N2 líquido y se almacenaron a -80 °C.

Tabla 43: Rendimiento, contenido de monómeros y pureza por CE-SDS de las variantes de 16D5 de afinidad reducida en formato biespecífico de linfocitos T.

Todas las variantes de afinidad reducida se pudieron producir con buena calidad.

Ejemplo 47

Unión de TCB 36F2, TCB 16D5 y las dos variantes de 16D5 de afinidad reducida TCB 16D5 W96Y/D52E y TCB 16D5 G49S/S93A a FolR1 humano expresado en células Hela

La unión de TCB 36F2, TCB 16D5 y las dos variantes de 16D5 de afinidad reducida TCB 16D5 W96Y/D52E y TCB 16D5 G49S/S93A a FolR1 humano se evaluó en células Hela. En resumen, las células se recogieron, se contaron, se comprobó su viabilidad y se resuspendieron a 2 x 106 células/ml en tampón FACS (100 pl de PBS, BSA al 0,1 %). Se incubaron 100 pl de suspensión celular (que contenía 0,2 x 106 células) en placas de 96 pocillos de fondo redondo durante 30 min a 4 °C con diferentes concentraciones de los anticuerpos biespecíficos (30 pM-500 nM). Después de dos etapas de lavado con PBS frío con BSA al 0,1 %, las muestras se volvieron a incubar durante otros 30 min a 4 °C con un anticuerpo secundario caprino AffiniPure de fragmento F(ab')2 específico del fragmento F^cyanti-IgG humana conjugado con FITC (Jackson Immuno Research Lab PE n.° 109 096-098). Después de lavar las muestras dos veces con PBS frío con BSA al 0,1 %, las muestras se centrifugaron, se resuspendieron en PBS con BSA al 0,1 % y se analizaron inmediatamente mediante FACS usando un FACS Canto II (programa informático FACS Diva). Se obtuvieron curvas de unión usando GraphPadPrism6 (Fig. 33).

Ejemplo 48

Producción y purificación de tres moléculas biespecíficas de linfocitos T con afinidad intermedia por FolR1 humano y de macaco cangrejero: 14B1, 6E10, 2C7

Transfección y producción transitorias

Las TCB de afinidad intermedia se produjeron de forma transitoria en células HEK293 EBNA usando un procedimiento de transfección mediado por PEI para los vectores requeridos como se describe a continuación. Para la transfección, se cultivan células HEK293 EBNA en suspensión libre de suero en medio de cultivo Excell que contiene L-glutamina 6 mM y 250 mg/l de medio de cultivo G418. Para la producción en matraz TubeSpin de 600 ml (volumen de trabajo máx. de 400 ml), se sembraron 600 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se centrifugan durante 5 min a 210 x g, el sobrenadante se reemplaza por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Se mezclan vectores de expresión en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 400 pg de ADN. Después de la adición de 1080 pl, la solución de PEI (2,7 pg/ml) se mezcla con una agitadora vorticial durante 15 s y posteriormente se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclan con la solución de ADN/PEI, se transfieren a un matraz TubeSpin de 600 ml y se incuban durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añaden 360 ml de Excell L-glutamina 6 mM 5 g/l de Pepsoy medio VPA 1,0 mM y se cultivan las células durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añade Feed 7 al 7 %. Después de un cultivo de 7 días, se recoge el sobrenadante para la purificación mediante centrifugación durante 20-30 min a 3600 x g (centrífuga Sigma 8K), la solución se filtra en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm) y se añade acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantiene a 4 °C.

Purificación

Las TCB de afinidad intermedia se purificaron en dos etapas usando procedimientos estándar, tales como cromatografía de afinidad con proteína A (Ákta Explorer) y cromatografía de exclusión por tamaño. El sobrenadante obtenido de la producción transitoria se ajustó a pH 8,0 (usando TRIS 2 M, pH 8,0) y se aplicó a una columna HiTrap Protein A (GE Healthcare, volumen de columna (VC) = 5 ml) equilibrada con 8 volúmenes de columna (VC) de tampón A (fosfato de sodio 20 mM pH 7,5, citrato de sodio 20 mM). Después de lavar con 10 VC de tampón A, la proteína se eluyó usando un gradiente de pH para tampón B (citrato de sodio 20 mM, pH 3,0, NaCl 100 mM, glicina 100 mM) en 20 VC. Las fracciones que contenían la proteína de interés se combinaron y el pH de la solución se ajustó suavemente a pH 6,0 (usando Na2HPÜ4 0,5 M, pH 8,0). Las muestras se concentraron a 1 ml usando ultraconcentradores (Amicon Ultra-15, 30.000 MWCO, Millipore) y posteriormente se aplicaron a una columna de calidad preparativa HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, pH 6,0, NaCl 140 mM, Tween 20 al 0,01 %. El contenido agregado de las fracciones eluidas se analizó por cromatografía analítica de exclusión por tamaño. Por lo tanto, se aplicaron 30 pl de cada fracción a una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7, a 25 °C. Se combinaron las fracciones que contenían menos de un 2 % de oligómeros. Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de las construcciones se analizaron mediante electroforesis capilar (CE-SDS) en presencia y ausencia de un agente reductor siguiendo las instrucciones del fabricante (instrumento Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Las proteínas purificadas se congelaron en N2 líquido y se almacenaron a -80 °C.

Tabla 44: Rendimiento, contenido de monómeros y pureza por CE-SDS de las TCB de afinidad intermedia.

Se pudieron producir todas las moléculas biespecíficas de linfocitos T de afinidad intermedia. Los rendimientos no son elevados. La calidad de 9C7 es buena y la de 14B1 y 6E10 es aceptable.

Ejemplo 49

Unión de variantes de HC/LC de 16D5 a FolRI humano expresado en células HT-29

Se evaluó la unión de TCB 36F2, TCB 16D5 y diversas variantes de HC/LC de 16D5 (Figuras 34A-E) a FolR1 humano en células HT-29. En resumen, las células se recogieron, se contaron, se comprobó su viabilidad y se resuspendieron a 2 x 106 células/ml en tampón FACS (100 pl de PBS, BSA al 0,1 %). Se incubaron 100 pl de suspensión celular (que contenía 0,2 x 106 células) en placas de 96 pocillos de fondo redondo durante 30 min a 4 °C con diferentes concentraciones de los anticuerpos biespecíficos (229 pM-500 nM). Después de dos etapas de lavado con PBS frío con BSA al 0,1 %, las muestras se volvieron a incubar durante otros 30 min a 4 °C con un anticuerpo secundario caprino AffiniPure de fragmento F(ab')2 específico del fragmento Fcy anti-IgG humana conjugado con PE (Jackson Immuno Research Lab PE n.° 109-116-170). Después de lavar las muestras dos veces con PBS frío con BSA al 0,1 %, se fijaron con PFA al 1 % durante la noche. Posteriormente, las muestras se centrifugaron, se resuspendieron en PBS con BSA al 0,1 % y se analizaron por FACS usando un FACS Canto II (programa informático FACS Diva). Se obtuvieron curvas de unión usando GraphPadPrism6 (Figura 34A-E).

Ejemplo 50

Unión de moléculas de unión a FolR1 intermedia a FolR1 y FolR2 humanos y de ratón

Se evaluó la reactividad cruzada de las moléculas de unión a FolR1 intermedias (TCB 6E10, TCB 14B1 y TCB 9C7), así como TCB 16D5 y TCB 36F2 con FolR1 y FolR2 humano y de ratón en un ensayo de unión por FACS en células HEK293T transfectadas.

En resumen, las células se recogieron, se contaron, se comprobó su viabilidad y se resuspendieron a 2 x 106 células/ml en tampón FACS (100 pl de PBS, BSA al 0,1 %). Se incubaron 100 pl de suspensión celular (que contenía 0,2 x 106 células) en placas de 96 pocilios de fondo redondo durante 30 min a 4 °C con 100 nM de los anticuerpos biespecíficos. Después de dos etapas de lavado con PBS frío con BSA al 0,1 %, las muestras se volvieron a incubar durante otros 30 min a 4 °C con un anticuerpo secundario caprino AffiniPure de fragmento F(ab')2 específico del fragmento Fcy anti-IgG humana con fluoresceína (FITC) (Jackson Immuno Research Lab PE n.° 109-096-098). Después de lavar las muestras dos veces con PBS frío con BSA al 0,1 %, se fijaron con PFA al 1 % durante la noche. Posteriormente, las muestras se centrifugaron, se resuspendieron en PBS con BSA al 0,1 % y se analizaron por FACS usando un FACS Canto II (programa informático FACS Diva). Se obtuvieron gráficas usando GraphPadPrism6 (Fig. 35A-D).

Los resultados muestran que TCB 36F2 y TCB 14B1 presentan reactividad cruzada con FolR1 de ratón y FolR2 humano y de ratón. Para TCB 6E10 se puede observar una unión débil a FolR2 humano. TCB 16D5 y TCB 9C7 son específicos para FolR1 humano y no muestran reactividad cruzada con FolR1 de ratón o FolR2 humano o de ratón.

Ejemplo 51

Caracterización bioquímica por resonancia de plasmón superficial de variantes de 16D5 de afinidad reducida y moléculas de unión de afinidad intermedia adicionales en el formato biespecífico de linfocitos T

La unión de variantes de 16D5 anti-FolR1 de afinidad reducida y moléculas de unión de afinidad intermedia adicionales en el formato biespecíficos de linfocitos T bivalente al receptor de folato 1 humano, de macaco cangrejero y murino recombinante (todos como fusiones de Fc) se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Todos los experimentos de SPR se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, GE Healthcare). Las moléculas usadas para la determinación de afinidad y avidez se describen en la tabla 45. Tabla 45: Nombre, descripción y referencia de figura de las nueve construcciones utilizadas en el análisis por SPR.

Inyecciones únicas

Primero, las TCB anti-FolR1 se analizaron mediante inyecciones únicas (tabla 46) para caracterizar su reactividad cruzada (con FolR1 humano, murino y de macaco cangrejero) y especificidad (para FolR1 humano, FolR2 humano, FolR3 humano). Las fusiones con Fc monomérico biotinilado recombinante de los receptores de folato 1 humano, de macaco cangrejero y murino (FolR1-Fc) o los receptores de folato 2 y 3 humano (FolR2-Fc, FolR3-Fc) se acoplaron directamente en un chip SA usando las instrucciones de acoplamiento estándar (Biacore, Friburgo/Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 300-400 UR. Las TCB se inyectaron durante 60 segundos a una concentración de 500 nM.

Tabla 46: Reactividad cruzada y especificidad de 7 moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-receptor de folato 1. significa unión,-significa que no se une, /- significa unión débil.

Avidez por el receptor de folato 1

La avidez de la interacción entre las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FoIRI y los receptores de folato recombinantes se determinó como se describe a continuación (tabla 47).

Las fusiones con Fc monomérico biotinilado recombinante del receptor de folato 1 humano, de macaco cangrejero y murino (FolR1-Fc) se acoplaron directamente en un chip SA usando las instrucciones de acoplamiento estándar (Biacore, GE Healthcare). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 200 300 UR. Las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 se pasaron en un rango de concentración de 11,1 a 900 nM (para las variantes de 16D5 de afinidad reducida) o de 0,2 a 500 nM (para las moléculas de unión de afinidad intermedia adicionales y 36F2) con un flujo de 30 pl/minuto a través las cubetas de lectura durante 180 segundos. Se supervisó la disociación durante 240 o 600 segundos. La superficie del chip se regeneró después de cada ciclo usando una inyección doble de 30 s de glicina-HCl 10 mM, pH 1,5. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia inmovilizada con fusión Fc/IL2R murino biotinilado recombinante (receptor fusionado con Fc no relacionado). Las curvas de unión resultantes de la unión bivalente de las moléculas biespecíficas de linfocitos T se aproximaron a una unión de Langmuir 1:1 (aunque es una unión 1:2) y se ajustaron con ese modelo para obtener una K^daparente que representa la avidez de la unión bivalente. Las constantes de avidez aparente para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad del ajuste utilizando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabla 47: Unión bivalente (avidez con K^daparente) de moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) anti-FolR1 a FolR1 humano, de macaco cangrejero y murino.

3. Afinidad por el receptor de folato 1

La afinidad de la interacción entre las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 y los receptores de folato recombinantes se determinó como se describe a continuación (tabla 48).

Para la medición de la afinidad, se realizó el acoplamiento directo de alrededor de 12000 unidades de resonancia (UR) del anticuerpo específico anti-Fab humano (kit de captura de Fab, GE Healthcare) en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (GE Healthcare). Se capturaron las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 a 20 nM con un caudal de 10 pl/min durante 40 segundos, la cubeta de lectura de referencia se dejó sin captura. Se pasaron series de dilución (12,3 a 3000 nM) de fusión de Fc con el receptor de folato 1 humano, de macaco cangrejero y murino en todas las cubetas de lectura a 30 pl/min durante 240 segundos para registrar la fase de asociación. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 300 s y se activó cambiando de la solución de muestra a HBS-EP. La superficie del chip se regeneró después de cada ciclo usando una inyección doble de 60 s de glicina-HCl 10 mM, pH 2,1. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia 1. Las constantes de afinidad para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad ajustando a una unión de Langmuir 1:1 usando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare). Para cinéticas de baja afinidad con fases de asociación y disociación demasiado rápidas para ajustarse al modelo de unión de Langmuir 1:1, se aplicó el modelo de análisis de estado de equilibrio usando el software Bia Evaluation (GE Healthcare). El análisis de estado de equilibrio da la K^dde la reacción de unión en equilibrio.

Tabla 48: Unión monovalente (afinidad) de moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) anti-FolR1 a FolR1 humano, de macaco cangrejero y murino.

Las mutaciones introducidas en las moléculas de unión 16D5 reducen su afinidad por FolR1 humano y de macaco cangrejero según lo determinado por resonancia de plasmón superficial. La clasificación por afinidad decreciente es: 16D5 natural (57 nM) > W96Y (6,5 veces menor) > G49S/S93A (14,5 veces menor) > W96Y/D52E (24,5 veces menor) > G49S/K53A (30 veces menor). La misma clasificación se obtiene para los valores de avidez; sin embargo, las diferencias son menores: 16D5 natural (3 nM) > W96Y, G49S/S93A, W96Y/D52E (3 veces menor) > G49S/K53A (13 veces menor).

Las moléculas de unión de afinidad intermedia tienen la siguiente clasificación por afinidad: 16D5 (57 nM) > 14B1 (8,5 veces menor) > 9C7 (15 veces menor) > 6E10 (21 veces menor) > 36F2 (24,5 veces menor). Sin embargo, estas diferencias desaparecen en la medición de la avidez: 14B1, 9C7, 6E10 (1 nM) > 16D5 (3 nM) > 36F2 (7 nM).

TCB 16D5 W96Y/D52E resuelve los problemas observados con candidatos anteriores. TCB 16D5 W96Y/D52E se basa en la molécula de unión de la cadena ligera común de 16D5 y tiene dos mutaciones puntuales en la cadena pesada con respecto a la molécula de unión 16D5 original. La mutación W96Y reduce la afinidad de la molécula de unión a FolR1 en comparación con la molécula de unión original y la mutación D52E elimina un sitio de desamidación y también contribuye a la reducción de la afinidad. TCB 16D5 W96Y/D52E se une a FolR1 humano y de macaco cangrejero, pero no a FolR1 murino. Es específica para FolR1 y no se une al FolR2 humano recombinante ni al FolR3 humano. La afinidad (unión monovalente) de 16D5 W96Y/D52E es de aproximadamente 1,4 |^jM para FolR1 humano (24,5 veces menor que la de la molécula de unión 16D5 original) y la avidez (unión bivalente) es de aproximadamente 10 nM (3 veces menor que la de la molécula de unión 16D5 original).

Ejemplo 52

Destrucción por linfocitos T de células Hela, SKov-3 y HT-29 inducida por TCB anti-FoIRI intermedias Se evaluó la destrucción por linfocitos T mediada por moléculas de unión a FolR1 intermedias (TCB 6E10, TCB 14B1 y TCB 9C7) en células Hela (FolR1 alto), SKov-3 (FolR1 medio) y HT-29 (FolR1 bajo). TCB 16D5 y TCB 36F2 se incluyeron como referencias. Se usaron PBMC humanos como células efectoras y se detectó la destrucción tras 24 h y 48 h de incubación con los anticuerpos biespecíficos. En resumen, se recogieron células diana con tripsina/EDTA, se lavaron y se sembraron a una densidad de 25.000 células/pocillo usando placas de 96 pocillos de fondo plano. Se dejó que las células se adhirieran durante la noche. Los leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) se prepararon mediante centrifugación por densidad en Histopaque a partir de preparaciones enriquecidas de linfocitos (capas leucocíticas) obtenidas de donantes humanos sanos. Se diluyó la sangre recién obtenida con PBS estéril y se colocó en una capa sobre un gradiente de Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, temperatura ambiente), se desechó el plasma por encima de la interfase que contenía los PBMC y se transfirieron los PBMC a un nuevo tubo Falcon llenado posteriormente con 50 ml de PBS. Se centrifugó la mezcla (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se desechó el sobrenadante y se lavó el sedimento de PBMC dos veces con PBS estéril (etapas de centrifugación 350 x g, 10 minutos). La población de PBMC resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 % y L-alanil-L-glutamina al 1 % (Biochrom, K0302) a 37 °C, CO2 al 5 % en incubadora celular hasta su uso posterior (no más de 24 h). Para el ensayo de destrucción, se añadió el anticuerpo a las concentraciones indicadas (intervalo de 0,01 pM-10 nM por triplicado). Se añadieron PBMC a células diana a una proporción E:T final de 10:1. Se evaluó la destrucción de células tumorales después de 24 h y 48 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 % por cuantificación de LDH liberada en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11 644 793 001). Se logró la lisis máxima de las células diana (= 100 %) por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 %. Lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin construcción biespecífica.

Los resultados muestran que la lisis tumoral inducida por las moléculas de unión a FolR1 intermedias (TCB 6E10, TCB 14B1 y TCB 9C7) varía entre la obtenida para la TCB 16D5 de alta afinidad y la de TCB 36F2 de baja afinidad (Fig. 36A-F). Entre las moléculas de unión a FolR1 intermedias, TCB 14B1 muestra la destrucción más fuerte, como se puede observar después de 48 h de incubación (Fig. 36D-F). Los valores de CE50 relacionados con los ensayos de destrucción después de 24 h y 48 h de incubación, calculados utilizando GraphPadPrism6, se dan en la Tabla 49 y la Tabla 50.

Tabla 49: Valores de CE50 (pM) para la destrucción mediada por linfocitos T de células Hela, SKov-3 y HT-29 inducida por TCB anti-FolR1 intermedias después de 24 h de incubación.

* no determinado

Tabla 50: Valores de CE50 (pM) para la destrucción mediada por linfocitos T de células Hela, SKov-3 y HT-29 inducida por TCB anti-FolR1 intermedias después de 48 h de incubación.

* no determinado

Ejemplo 53

Destrucción por linfocitos T de células Hela, SKov-3 y HT-29 inducida por variantes de 16D5 de afinidad reducida

La destrucción por linfocitos T mediada por variantes de 16D5 de afinidad reducida (TCB 16D5-G49S/S93A, TCB 16D5-G49S/K53A, TCB 16D5 W96Y, TCB 16D5 W96Y/D52E) se evaluó en células Hela (FolR1 alto), SKov-3 (FolR1 medio) y HT-29 (FolR1 bajo). TCB 16D5 y TCB 36F2 se incluyeron como referencias. Se realizó el ensayo como se describe anteriormente (ejemplo 52).

Los resultados muestran que la lisis tumoral inducida por las variantes de 16D5 de afinidad reducida (TCB 16D5-G49S/S93A, TCB 16D5-G49S/K53A, TCB 16D5 W96Y, TCB 16D5 W96Y/D52E) varía entre la obtenida para la TCB 16D5 de alta afinidad y para la TCB 36F2 de baja afinidad. Los valores de CE50 relacionados con los ensayos de destrucción después de 24 h y 48 h de incubación, calculados utilizando GraphPadPrism6, se dan en la Tabla 51 y la Tabla 52 (figura 37A-F).

Tabla 51: Valores de CE50 (pM) para destrucción mediada por linfocitos T de células Hela, SKov-3 y HT-29 que expresan FolR1 inducida por TCB 16D5 y sus variantes de afinidad reducida después de 24 h de incubación.

* no determinado

Tabla 52: Valores de CE50 (pM) para destrucción mediada por linfocitos T de células Hela, SKov-3 y HT-29 que expresan FolR1 inducida por TCB 16D5 y sus variantes de afinidad reducida después de 48 h de incubación.

* no determinado

Por tanto, al igual que la TCB 36F2 ant¡-FolR1 descrita anteriormente, la TCB 16D5 W96Y/D52E diferencia entre las células de alta y baja expresión, lo que es de especial importancia para reducir la toxicidad, ya que las células de algunos tejidos normales no tumorales expresan niveles muy bajos de FolR1 (aproximadamente menos de 1000 copias por célula). De forma consecuente con esta observación, los resultados analizados en el ejemplo 54 a continuación muestran que TCB 16D5 W96Y/D52E induce niveles mucho menores de destrucción de células primarias mediada por linfocitos T (Fig. 38A-F) en comparación con la TCB 16D5 original. Como tal, TCB 16D5 W96Y/D52E media en la destrucción potente de tejidos tumorales con niveles de expresión de FolR1 altos o medios, pero no de tejidos normales con expresión baja. TCB 16D5 W96Y/D52E en el formato bivalente 2+1 comprende restos de unión a FolR1 de afinidad relativamente baja, pero posee un efecto de avidez que permite la diferenciación entre células que expresan niveles altos y bajos de FolR1. Debido a que las células tumorales expresan FolR1 a niveles altos o intermedios, esta TCB se une selectivamente a las células tumorales y a las células normales no cancerosas que expresan FolR1 a niveles bajos o no lo hacen en absoluto. Como ventaja adicional sobre la TCB 36F2 anti-FolR1 descrita anteriormente, la TCB 16D5 W96Y/D52E se une específicamente a FolR1 y no a FolR2 o FolR3, potenciando aún más su seguridad para el tratamiento in vivo. Además de las características ventajosas anteriores, la TCB 16D5 W96Y/D52E en el formato bivalente 2+1 invertido también tiene la ventaja de que no requiere entrecruzamiento químico u otro enfoque híbrido. Esto hace que sea adecuado para la fabricación de un medicamento para tratar a pacientes, por ejemplo, pacientes que tienen tumores cancerosos que expresan FolR1. La TCB 16D5 W96Y/D52E en el formato bivalente 2+1 invertido se puede producir usando procedimientos estándar con CHO con bajos niveles de agregados. Además, la TCB 16D5 W96Y/D52E en el formato bivalente 2+1 comprende secuencias humanas y humanizadas que hacen que sea superior a moléculas que emplean polipéptidos de rata y ratón que son altamente inmunogénicos cuando se administran a humanos. Además, la TCB 16D5 W96Y/D52E en el formato bivalente 2+1 se genomanipuló para eliminar la unión a FcyR y, como tal, no causa entrecruzamiento de FcyR ni reacciones a la infusión, potenciando aún más su seguridad cuando se administra a pacientes.

Como lo demuestran los resultados descritos anteriormente, su geometría de cabeza a cola hace que la TCB 16D5 W96Y/D52E en el formato bivalente 2+1 invertido sea una molécula altamente potente que induce la destrucción absoluta de las células diana. Su bivalencia potencia la avidez y la potencia, pero también permite la diferenciación entre células con alta y baja expresión. Su preferencia por células diana con niveles altos o medios de expresión debido a su avidez reduce la toxicidad resultante de la destrucción mediada por linfocitos T de células normales que expresan FolR1 a niveles bajos.

Una ventaja adicional de la TCB 16D5 W96Y/D52E en el formato bivalente 2+1 y otros modos de realización descritos en el presente documento es que su desarrollo clínico no requiere el uso de moléculas sustitutas, ya que se unen a FolR1 humano y de macaco cangrejero. Como tal, las moléculas descritas en el presente documento reconocen un epítopo diferente que los anticuerpos contra FolR1 descritos previamente que no reconocen FolR1 de ambas especies (véase también la fig. 41).

Ejemplo 54

Destrucción por linfocitos T de células primarias inducida por variantes de 16D5 de afinidad reducida y TCB anti-FolR1 intermedias

La destrucción por linfocitos T mediada por variantes de 16D5 de afinidad reducida (TCB 16D5-G49S/S93A, TCB 16D5 W96Y/D52E) y por la molécula de unión a FolR1 intermedia TCB 14B1 se evaluó en células primarias (células epiteliales de la corteza renal humanas (HRCEpiC) (ScienCell Research Laboratories; n.° cat. 4110) y células del epitelio pigmentario de la retina humanas (HRPEpiC) (ScienCell Research Laboratories; n.° cat.

6540)). Las células HT-29 (expresión baja de FolR1) se incluyeron como línea celular de control. TCB 16D5 y TCB 36F2 se incluyeron como referencias y TCB DP47 sirvió como control sin propiedades de unión.

El ensayo se realizó como se describe en el ejemplo 52, con un intervalo de concentración de los anticuerpos de 0,1 pM-100 nM (por triplicado).

Cuando se usan células primarias humanas como dianas, la lisis global es mucho menor debido a una menor tasa de expresión de FolR1 en estas células (Fig. 38A-F). Para la molécula de unión a FolR1 de alta afinidad TCB 16D5, se puede observar una lisis mediada por linfocitos T en los dos tipos de células primarias utilizados. Como se observó anteriormente cuando se usaron líneas celulares tumorales como dianas, la lisis inducida por la molécula de unión a FolR1 intermedia TCB 14B1 y las variantes de 16D5 de afinidad reducida (TCB 16D5-G49S/S93A, TCB 16D5 W96Y/D52E) varía entre la obtenida para la TCB 16D5 de afinidad alta y la de TCB 36F2 de afinidad baja. La lisis significativamente reducida de células que expresan FolR1 a niveles bajos es consecuente con una baja actividad colateral y, por tanto, se espera que las variantes de 16D5 de afinidad reducida TCB 16D5-G49S/S93A y TCB 16D5 W96Y/D52E sean bien toleradas in vivo.

Ejemplo 55

FC de dosis únicas de construcciones de TCB anti-FoIRI en ratones NOG hembra

Ratones NOD/Shi-scid/IL-2RYnull (NOG) hembra, de un promedio de 8-10 semanas de edad al inicio del experimento (adquiridos de Taconic, instalación de SOPF), se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz y 12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas, Felasa, TierschG). Las autoridades gubernamentales locales revisaron y aprobaron el protocolo del estudio experimental (ZH193/2014). Después de su llegada, los animales se mantuvieron durante una semana para que se acostumbraran a su nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo regularmente.

Se realizó un estudio farmacocinético de dosis única (SDPK) para evaluar la exposición de las construcciones TCB anti-FolR1 (36F2, 16D5, 16D5 G49S/S93A y 16D5 W96Y/D52E). Se administró una administración intravenosa rápida de 0,5 mg/kg a ratones NOG y se obtuvieron muestras de sangre en los puntos temporales seleccionados para la evaluación farmacocinética. Las muestras de suero de ratón se analizaron mediante ELISA. Se añadieron gradualmente anticuerpo anti-huCD3-CDR biotinilado (mAb<ID-mAb<CD3>>M-25.4.93-IgG-Bi), muestras de prueba, anticuerpo anti-huFc marcado con digoxigenina (mAb<H-FC pan>M-R10Z8E9-IgG-Dig) y anticuerpo de detección anti-digoxigenina (POD) a una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina de 96 pocillos y se incubaron después de cada paso durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se lava tres veces después de cada paso para eliminar las sustancias no unidas. Finalmente, el complejo unido a peroxidasa se visualiza añadiendo solución de sustrato ABTS para formar un producto de reacción con color. La intensidad del producto de reacción, que se determina fotométricamente a 405 nm (con longitud de onda de referencia a 490 nm), es proporcional a la concentración de analito en la muestra de suero. El intervalo de calibración de la curva estándar para las construcciones fue de 0,078 a 5 ng/ml, donde 1,5 ng/ml es el límite inferior de cuantificación (LLOQ).

El estudio de SDPK reveló un perfil FC similar a las IgG para las construcciones 16D5, 16D5 W96Y/D52E y 16D5 G49S/S93A (Fig. 39A-B). Por eso, se eligió una pauta de una vez por semana para el estudio de eficacia (Fig. 40B). La semivida de 36F2 es menor en comparación con la de los otros clones. 36F2 es la única de las cuatro moléculas sometidas a prueba que presenta reactividad cruzada con FolR1 de ratón, lo que podría explicar la semivida menor de esta molécula e indica una TMDD (disposición de fármaco mediada por diana). Ejemplo 56

Eficacia in vivo de las construcciones de TCB anti-FolR1 (16D5, 16D5 G49S/S93A y 16D5 W96Y/D52E) después de la transferencia de PBMC humanos en ratones NOG portadores de Hela

Las construcciones de TCB anti-FolR1 se sometieron a prueba en la línea celular de cáncer de cuello de útero humano Hela que expresa FolR1, inyectada s.c. en ratones NOG con PBMC injertados.

Las células Hela se obtuvieron originalmente de ATCC (CCL2) y después de la expansión se depositaron en el banco de células interno de Roche-Glycart. La línea celular tumoral se cultivó de forma rutinaria en RPMI que contenía FCS al 10 % (Gibco) a 37 °C en una atmósfera saturada en agua con CO2 al 5 %. Se usó el pase 13 para el trasplante, a una viabilidad >95 %. Se inyectaron s.c. 1 x 106 células por animal en el flanco derecho de los animales en un total de 100 pl de medio de cultivo celular RPMI (Gibco).

60 ratones NOG hembra de 8-10 semanas de edad al inicio del experimento (criados en Taconic, Dinamarca) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz y 12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas, Felasa, TierschG). Las autoridades gubernamentales locales revisaron y aprobaron el protocolo del estudio experimental (ZH193/2014). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo de manera regular.

De acuerdo con el protocolo del estudio (Fig. 40B), los ratones recibieron una inyección s.c. el día 0 de estudio con 1 x 106 células Hela. El día 30 del estudio, cuando el tumor alcanzó un tamaño de aprox. 150 mm3, PBMC humanos de un donante sano se aislaron mediante el procedimiento de Ficoll y se inyectaron 10 x 106 células i.v. en los ratones portadores de tumor. Dos días después (día 32), se aleatorizó a los ratones y se distribuyeron por igual en seis grupos de tratamiento (n = 10) seguido de inyección i.v. con 16D5 (0,5 mg/kg), 16D5 G49S/S93A (2,5 o 0,5 mg/kg) o 16D5 W96Y/D52E (2,5 o 0,5 mg/kg). Todos los grupos de tratamiento recibieron una inyección una vez a la semana durante tres semanas en total. Los ratones recibieron una inyección i.v. de 200 pl de la solución apropiada. Los ratones del grupo de vehículo recibieron una inyección con PBS. Para obtener la cantidad apropiada de TCB por 200 pl, las soluciones madre se diluyeron con PBS cuando fue necesario. El crecimiento del tumor se midió una vez por semana usando un calibre (figura 40C-E) y el volumen del tumor se calculó como sigue:

Tv: (W2/2) x L (W: anchura, L: longitud)

La inyección semanal de las construcciones de TCB anti-FolR1 dio como resultado una regresión tumoral significativa (Fig. 40C-E). La eficacia de 16D5 (0,5 mg/kg) y 16D5 W96Y/D52E16D5 (0,5 mg/kg) fue comparable, mientras que 16D5 G49S/S93A (0,5 mg/kg) mostró una potencia ligeramente menor. Las dosis más altas de 2,5 mg/kg de 16D5 W96Y/D52E16D5 y 16D5 G49S/S93A no mostraron una eficacia incrementada en comparación con las dosis de 0,5 mg/kg. Para las lecturas de FD, se sacrificaron los ratones el día 52 de estudio, se extirparon los tumores y se prepararon suspensiones de células individuales a través de una digestión enzimática con Colagenasa V, Dispasa II y DNasa para el posterior análisis por FACS. Los tumores explantados de todos los grupos de tratamiento mostraron un peso tumoral significativamente menor al terminar el estudio en comparación con los tumores de control con vehículo (Fig. 40F). Suspensiones de células individuales de los tumores se tiñeron para determinar huCD45 y huCD3 y DAPI para excluir las células muertas y se analizaron en el BD Fortessa. El análisis por FACS reveló un número estadísticamente mayor de linfocitos T humanos CD3+ infiltrados en el tejido tumoral tras el tratamiento con 16D5, así como con 16D5 W96Y/D52E16D5, en comparación con los tumores de control con vehículo (Fig. 40C).

Ejemplo 57

Estudio de toxicidad en macaco cangrejero

Se realiza un estudio farmacocinético (FC), farmacodinámico (FD) y de tolerabilidad para investigar la tolerabilidad, los efectos FC y FD de una única dosis intravenosa de variantes de TCB 16D5 de afinidad reducida (por ejemplo, 16D5-G49S/S93A TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB) en macacos cangrejeros. En este estudio, macacos cangrejeros no tratados previamente (1 macaco macho y 1 hembra/grupo) reciben una única dosis intravenosa de variantes de TCB 16D5 de afinidad reducida, que incluyen TCB 16D5 W96Y/D52E, siguiendo un protocolo de aumento de dosis. Los niveles de dosis ejemplares incluyen 0,003, 0,03 y 0,09 mg/kg. Se evalúan los parámetros de toxicidad estándar (signos clínicos, pesos corporales, hematología y bioquímica clínica) y la cinética del número de linfocitos T y el estado de activación en sangre y la cinética de liberación de citocinas. También se toman muestras de sangre para FC durante un período de 28 días para la medición de variantes de TCB 16D5 de afinidad reducida, que incluyen TCB 16D5 W96Y/D52E, y de anticuerpos anti-fármacos.

Secuencias de aminoácidos de modos de realización ejemplares

1) Moléculas de unión a FolR útiles en formato de la cadena ligera común, cadena pesada variable

2) molécula de unión a CD3, cadena ligera común (CLC)

3) molécula de unión a CD3, cadena pesada

4) moléculas de unión a FolR útiles para el formato crossfab

5) molécula de unión a CD3 útil para el formato crossfab

6) - Secuencias de aminoácidos ejemplares de anticuerpos biespecíficos anti-CD3-FolR en formato crossmab invertido 2+1

7) Secuencias de aminoácidos ejemplares de anticuerpos biespecíficos anti-CD3-FolR con cadena ligera común

8) Variantes de 16D5 con afinidad reducida ejemplares

a. Variantes de la cadena ligera con afinidad reducida ejemplares

b. Variantes de la cadena pesada con afinidad reducida ejemplares

Denomina Secuencia SEQ ID NO

9) Modos de realización ejemplares adicionales generados a partir de una colección de presentación en fagos (CDR subrayadas)

10) Variantes de sitios de glucosilación de 9D11: cadena ligera variable de modos de realización ejemplares (CDR subrayadas)

11) Variantes de desaminación

12) TCB basadas en Mov19 de modos de realización ejemplares (CDR subrayadas)

13) TCB anti-FolR1 adicionales con moléculas de unión de afinidad intermedia (CDR de acuerdo con Kabat, subrayadas):

14) Secuencias de antígenos

15) Secuencias de nucleótidos de modos de realización ejemplares

Aunque la invención precedente se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para los propósitos de claridad de comprensión, no se deben interpretar las descripciones y ejemplos como limitantes del alcance de la invención que está definido por las reivindicaciones adjuntas exclusivamente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende

(i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir de forma específica a CD3, y que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

2. La molécula de unión a antígeno activadora de linfocitos T de la reivindicación 1, en la que el primer resto de unión a antígeno comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

3. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la reivindicación 1 o 2, que comprende adicionalmente

4. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la reivindicación 3, en la que el tercer resto de unión a antígeno es idéntico al segundo resto de unión a antígeno.

5. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en la que al menos uno del segundo y el tercer resto de unión a antígeno es una molécula Fab.

6. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende adicionalmente

(iv) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.

7. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR1 comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

8. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR1 comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64.

9. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el resto de unión a antígeno que se puede unir de forma específica a FolR1 comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 274 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

10. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la reivindicación 8, en la que el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones variables o constantes de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian.

11. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en la que el dominio Fc es un dominio Fc de inmunoglobulina de clase IgG, específicamente de IgG1 o IgG4.

12. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en la que el dominio Fc es un dominio Fc humano.

13. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en la que el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc.

14. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la reivindicación 13, en la que, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que se puede colocar en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro de la que se puede colocar la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad.

15. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, en la que el dominio Fc comprende al menos una sustitución aminoacídica que reduce la unión a un receptor de Fc y/o la función efectora, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural.

16. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de acuerdo con la reivindicación 15, en la que cada subunidad del dominio Fc comprende tres sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc activador y/o la función efectora, en la que dichas sustituciones aminoacídicas son L234A, L235A y P329G (numeración de Kabat).

17. Una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 276 y que comprende además la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 277 y de SEQ ID NO: 35.

18. Un polinucleótido aislado que codifica la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

19. Un vector, en particular, un vector de expresión, que comprende el polinucleótido de la reivindicación 18.

20. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de la reivindicación 18 o el vector de la reivindicación 19.

21. Un procedimiento de producción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que se puede unir de forma específica a CD3 y a un antígeno de la célula diana, que comprende las etapas de a) cultivar la célula huésped de la reivindicación 20 en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T y b) recuperar la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T.

22. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o la composición farmacéutica de la reivindicación 22 para su uso como medicamento.

24. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o la composición farmacéutica de la reivindicación 22 para su uso en el tratamiento del cáncer.