JP2023531625A - ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、概して、例えばＴ細胞を活性化するための、ＣＤ３及び葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に結合する二重特異性抗体に関する。さらに、本発明は、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、抗体を産生する方法、及び疾患の治療においてそれらを使用する方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、概して、例えばＴ細胞を活性化するための、ＣＤ３及び葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に結合する二重特異性抗体に関する。さらに、本発明は、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、抗体を産生する方法、及び疾患の治療においてそれらを使用する方法に関する。
個々の細胞又は特定の細胞タイプの選択的破壊は、多くの場合、様々な臨床環境で望ましいものである。たとえば、がん治療の主な目標は、腫瘍細胞を特異的に破壊する一方で、健康な細胞や組織を無傷で無傷のままにすることである。
これを達成するための魅力的な方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘導し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞や細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクタ細胞に腫瘍細胞を攻撃させて破壊させることである。ＣＴＬは免疫系の最も強力なエフェクタ細胞を構成するが、従来の治療用抗体のＦｃドメインによって媒介されるエフェクタ機序によって活性化することはできない。
この点に関して、一方の「アーム」で標的細胞の表面抗原に結合し、第２の「アーム」でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化不変成分に結合するように設計された二重特異性抗体が、近年注目されている。このような抗体が両方の標的に同時に結合すると、標的細胞とＴ細胞の間に一時的な相互作用が生じ、細胞傷害性Ｔ細胞が活性化され、その後標的細胞が溶解する。したがって、免疫応答は標的細胞に向け直され、標的細胞によるペプチド抗原の提示や、ＣＴＬの通常のＭＨＣ制限活性化に関連するＴ細胞の特異性とは無関係である。この文脈では、標的細胞がそれらに二重特異性抗体を提示している場合、すなわち免疫学的シナプスが模倣されている場合にのみ、ＣＴＬが活性化されることが重要である。標的細胞の効率的な溶解を誘発するために、リンパ球の必須条件化又は共刺激を必要としない二重特異性抗体が特に望ましい。
ＣＤ３は、創薬標的として広く研究されている。ＣＤ３を標的とするモノクローナル抗体は、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患や移植片拒絶反応の治療における免疫抑制療法として使用されてきた。ＣＤ３抗体ｍｕｒｏｍｏｎａｂ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）は、１９８５年にヒトでの臨床使用が承認された最初のモノクローナル抗体であった。
ＣＤ３抗体の最近の応用は、一方でＣＤ３に結合し、他方で腫瘍細胞抗原に結合する二重特異性抗体の形をとっている。このような抗体が両方の標的に同時に結合すると、標的細胞とＴ細胞の間に一時的な相互作用が生じ、細胞傷害性Ｔ細胞が活性化され、その後標的細胞が溶解する。
ＦＯＬＲ１は、例えば、卵巣がん、肺がん、乳がん、腎臓がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんなどの様々な起源の上皮性腫瘍細胞で発現している。ファルレツズマブ、抗体薬物複合体、又は腫瘍の画像化のための養子Ｔ細胞療法などの治療用抗体でＦＯＬＲ１を標的とするいくつかのアプローチが記載されている（Ｋａｎｄａｌａｆｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１２ Ａｕｇ ３；１０：１５７． ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７９－５８７６－１０－１５７；ｖａｎ Ｄａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２０１１ Ｓｅｐ １８；１７（１０）：１３１５－９． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｍ．２４７２；Ｃｌｉｆｔｏｎｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ． ２０１１ Ｆｅｂ；７（２）：１８３－９０． Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｆｅｂ １；Ｋｅｌｅｍｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２００６ Ｊｕｌ １５；１１９（２）：２４３－５０； Ｖａｉｔｉｌｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ． ２０１２ Ｊｕｌ；５３（７）；Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２ Ａｕｇ；９（８）：９０１－８． ｄｏｉ：１０．１５１７／１７４２５２４７．２０１２．６９４８６３． Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｊｕｎ ５。葉酸受容体及びＣＤ３を標的とする構築物を用いて、葉酸受容体陽性腫瘍を標的とするいくつかの試みがなされてきた（Ｋｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． Ｓｅｐ ２６， １９９５；９２（２０）：９０５７-９０６１；Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ． ２００４ Ａｐｒ ２９；５６（８）：１２１９－３１；Ｈｕｉｔｉｎｇ Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． Ａｕｇ １７， ２０１２；２８７（３４）：２８２０６-２８２１４；Ｌａｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． ６０（４）：４５０ （１９９５）； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＭＡｂｓ． ２００９ Ｊｕｌ－Ａｕｇ；１（４）：３４８－５６． Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊｕｌ １９；Ｍｅｚｚａｎｚａｎｃａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ４１， ６０９-６１５（１９８８）。しかし、これまでのアプローチには多くの欠点がある。これまでに使用された分子は、化学架橋を必要とするため、容易且つ確実に生成できなかった。同様に、ハイブリッド分子は、ヒトタンパク質のように大規模に生産することはできず、ヒトに投与した場合に免疫原性が高く、したがって治療的価値が限られているラット、マウス、又は他のタンパク質を使用する必要がある。さらに、既存の分子の多くはＦｃｇＲ結合を保持していた。
最近では、ＷＯ２０１６／０７９０７６に、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１を標的とするＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が記載されている。
治療目的のために、抗体が満たさなければならない重要な要件は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（薬物の保存用）とｉｎ ｖｉｖｏ（患者への投与後）の両方で十分な安定性である。
アスパラギンの脱アミド化などの修飾は、組換え抗体の典型的な分解であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏの安定性とｉｎ ｖｉｖｏの生物学的機能の両方に影響を与える可能性がある。
抗体、特にＴ細胞の活性化に対する二重特異性抗体の途方もない治療の可能性を考えると、最適化された特性を持つ二重特異性ＣＤ３／ＦｏｌＲ１抗体が必要である。
本発明は、ＣＤ３に結合し、例えばアスパラギン脱アミド化による分解に耐性があり、したがって治療目的に必要とされる場合に特に安定な、多重特異性（例えば二重特異性）抗体を含む抗体を提供する。提供される（多重特異性）抗体は、優れた有効性と生産性を低毒性と好ましい薬物動態特性とさらに兼ね備えている。
ここに示されているように、多重特異性抗体を含む、本発明によって提供されるＣＤ３に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定されるように、ｐＨ６、－８０℃で２週間後の結合活性と比較して、ｐＨ７．４、３７℃で２週間後にＣＤ３に対する約９０％以上の結合活性を保持する。
特定の態様では、本発明は、ＣＤ３及び葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に結合し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される際に、ｐＨ６、－８０℃で２週間後の結合活性に対して、ｐＨ７．４、３７℃で２週間後にＣＤ３に対する約９０％を超える結合活性を保持する二重特異性抗体を提供する。
一態様では、ＣＤ３及び葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に結合する二重特異性抗体が提供され、二重特異性抗体は、
（ｉ）配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号５のＨＣＤＲ３含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＣＤ３に特異的に結合できる第１の抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）ＦｏｌＲ１に特異的に結合できる第２の抗原結合ドメインと
を含む。
一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む及び／又はＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体が提供される。
一態様では、二重特異性抗体はＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合し、二重特異性抗体は、
（ｉ）配列番号７のＶＨ配列及び配列番号１１のＶＬ配列を含む、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）ＦｏｌＲ１に特異的に結合できる第２の抗原結合ドメインと
を含む。
一態様では、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。
一態様では、二重特異性抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。
一態様では、二重特異性抗体は、ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第３の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、第２及び／又は存在する場合に第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。
一態様では、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１、特に可変ドメインＶＬとＶＨは互いに置換される。
一態様では、第２及び、存在する場合に第３の抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
一態様では、第２及び、存在する場合に第３の抗原結合ドメインはＦａｂ分子であり、定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジンＫ）、アルギニンＲ）はヒスチジンＨ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立して置換され、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立して置換され、且つ、定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）によって独立して置換され、２１３位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）に置換されている、請求項６から９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
一態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインは、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合される。
一態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されるか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。
一態様では、第１、第２、及び存在する場合に第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、二重特異性抗体が、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されるか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、且つ、第３の抗原結合ドメインが、存在する場合、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合される。
一態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ、特にＩｇＧ１、Ｆｃドメインである。
一態様では、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。
一態様では、Ｆｃは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。
一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクタ機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。
一態様では、第２及び存在する場合に第３の抗原結合ドメインが、配列番号１２４のＨＣＤＲ１、配列番号１２５のＨＣＤＲ２、及び配列番号１２６のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号８のＬＣＤＲ１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。
一態様では、提供されるのは、本明細書の上記の二重特異性抗体であり、第２、及び存在する場合に抗原結合ドメインが、配列番号１２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
一態様では、本発明の二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
一態様では、単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。
一態様では、（ａ）二重特異性抗体の発現に適した条件下で請求項２１に記載の宿主細胞を培養することと、任意選択的に（ｂ）二重特異性抗体を回収することとを含む、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を産生する方法が提供される。
一態様では、提供されるのは、本明細書の上記の方法によって産生される、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体である。
一態様では、本発明の二重特異性抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が提供される。
一態様では、医薬として使用するための本発明の二重特異性抗体又は本発明の薬学的組成物が提供される。
一態様では、がんの治療に使用するための本発明の二重特異性抗体又は本発明の薬学的組成物が提供される。
一態様では、薬剤の製造における本発明の二重特異性抗体又本発明の薬学的組成物の使用が提供される。
一態様では、がんの治療のための医薬品の製造における本発明の二重特異性抗体又は本発明の薬学的組成物の使用が提供される。
一態様では、本発明の二重特異性抗体又は本発明の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体の疾患を治療する方法が提供される。
一態様では、疾患はがんである。
本発明の（多重特異性）抗体の例示的な構成。（Ａ、Ｄ）「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図。（Ｂ、Ｅ）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分とＦａｂ成分の順序が異なる（「反転」）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｃ、Ｆ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。 本発明の（多重特異性）抗体の例示的な構成。（Ｇ、Ｋ）ＣｒｏｓｓｆａｂとＦａｂ成分の順序が交互になった「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図（「反転」）。（Ｈ、Ｌ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｉ、Ｍ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂによる「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｊ、Ｎ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂとＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分の交互の順序（「反転」）を含む「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。 本発明の（多重特異性）抗体の例示的な構成。（Ｏ、Ｓ）「Ｆａｂ－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｐ、Ｔ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－Ｆａｂ」分子の図。（Ｑ、Ｕ）「（Ｆａｂ）２－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｒ、Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－（Ｆａｂ）２」分子の図。 本発明の（多重特異性）抗体の例示的な構成。（Ｗ、Ｙ）「Ｆａｂ－（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子の図。（Ｘ、Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２－Ｆａｂ」分子の図。黒丸：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの任意選択の修飾。＋＋、－－：任意選択的にＣＨ１及びＣＬドメインに導入された逆電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ及びＶＬ領域の交換を含むように描かれているが、ＣＨ１及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない態様では、代わりにＣＨ１及びＣＬドメインの交換を含む場合がある。 ４０℃、ｐＨ６で１４日後、又は３７℃、ｐＨ７．４で１４日後に、ストレスのない状態でＳＰＲによって測定された、オリジナル及び最適化されたＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＣＤ３ｏｐｔの組換えＣＤ３に対する相対的な結合活性（ＩｇＧフォーマット）。 フローサイトメトリー（ＩｇＧフォーマット）で測定されたオリジナル及び最適化されたＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＣＤ３ｏｐｔのＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞への結合。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に結合した抗体は、蛍光標識された抗ヒトＦｃ特異的二次抗体で検出された。 実施例３で使用したＣＤ３活性化アッセイの模式図。 オリジナル及び最適化されたＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＣＤ３ｏｐｔ（ＩｇＧ フォーマット）によるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞を、ＣＤ３ｏｒｉｇ又はＣＤ３ｏｐｔ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡ、あるいはネガティブコントロールとしてＣＤ３ｏｐｔ ＩｇＧ ｗｔの存在下で、抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ（ＣＨＯ－ＰＧＬＡＬＡ）細胞と共培養した。ＣＤ３活性化は、２４時間後に発光を測定することによって定量化された。 実施例で調製したＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）分子の模式図。試験したすべてのＴＣＢ抗体分子は、電荷修飾（ＣＤ３バインダのＶＨ／ＶＬ交換、ターゲット抗原バインダの電荷修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）を伴う「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転」として生成された。 ４０℃、ｐＨ６で１４日後、又は３７℃、ｐＨ７．４で１４日後に、ストレスのない状態でＳＰＲによって測定された、オリジナル又は最適化されたＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ又はＣＤ３ｏｐｔを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢの組換えＣＤ３に対する相対的な結合活性。 ４０℃、ｐＨ６で１４日後、又は３７℃、ｐＨ７．４で１４日後に、ストレスのない状態でＳＰＲによって測定された、オリジナル又は最適化されたＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ又はＣＤ３ｏｐｔ、あるいは対応するＴＹＲＰ１ ＩｇＧを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢの組換えＴＹＲＰ１に対する相対的な結合活性。 フローサイトメトリーで測定されたオリジナル及び最適化されたＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ又はＣＤ３ｏｐｔを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢのＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞への結合。ＴＣＢに結合した抗体は、蛍光標識された抗ヒトＦｃ特異的二次抗体で検出された。 オリジナル又は最適化されたＣＤ３バインダを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによる Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞は、ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇ又はＴＹＲＰ１ ＴＣＢ Ｄ３ｏｐｔの存在下でメラノーマ細胞株Ｍ１５０５４３と共培養された。ＴＣＢの存在下でのＣＤ３活性化は、２４時間後に発光を測定することによって定量化された。 図１１のＡとＢは、オリジナル又は最適化されたＣＤ３バインダを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによる腫瘍細胞の殺傷及びＴ細胞の活性化。３人の異なる健康なドナー（Ａ－Ｆ：ドナー１、Ｇ－Ｌ：ドナー２、Ｍ－Ｒ：ドナー３）からのＰＢＭＣによるＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔでの処理によるメラノーマ細胞株Ｍ１５０５４３の死滅は、２４時間後（Ａ、Ｇ、Ｍ）及び４８時間後（Ｂ、Ｈ、Ｎ）のＬＤＨ放出によって決定された。並行して、ＣＤ８（Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ）及びＣＤ４に対するＣＤ２５（Ｃ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｏ、Ｑ）及びＣＤ６９（Ｄ、Ｆ、Ｊ、Ｌ、Ｐ、Ｒ）の上方制御（Ｃ、Ｄ、Ｉ、Ｊ、Ｏ、Ｐ）ＰＢＭＣ内のＴ細胞は、４８時間後のＴ細胞活性化のマーカーとしてフローサイトメトリーによって測定された。 図１１のＣ～Ｆは、オリジナル又は最適化されたＣＤ３バインダを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによる腫瘍細胞の殺傷及びＴ細胞の活性化。３人の異なる健康なドナー（Ａ－Ｆ：ドナー１、Ｇ－Ｌ：ドナー２、Ｍ－Ｒ：ドナー３）からのＰＢＭＣによるＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔでの処理によるメラノーマ細胞株Ｍ１５０５４３の死滅は、２４時間後（Ａ、Ｇ、Ｍ）及び４８時間後（Ｂ、Ｈ、Ｎ）のＬＤＨ放出によって決定された。並行して、ＣＤ８（Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ）及びＣＤ４に対するＣＤ２５（Ｃ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｏ、Ｑ）及びＣＤ６９（Ｄ、Ｆ、Ｊ、Ｌ、Ｐ、Ｒ）の上方制御（Ｃ、Ｄ、Ｉ、Ｊ、Ｏ、Ｐ）ＰＢＭＣ内のＴ細胞は、４８時間後のＴ細胞活性化のマーカーとしてフローサイトメトリーによって測定された。 図１１のＧとＨは、オリジナル又は最適化されたＣＤ３バインダを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによる腫瘍細胞の殺傷及びＴ細胞の活性化。３人の異なる健康なドナー（Ａ－Ｆ：ドナー１、Ｇ－Ｌ：ドナー２、Ｍ－Ｒ：ドナー３）からのＰＢＭＣによるＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔでの処理によるメラノーマ細胞株Ｍ１５０５４３の死滅は、２４時間後（Ａ、Ｇ、Ｍ）及び４８時間後（Ｂ、Ｈ、Ｎ）のＬＤＨ放出によって決定された。並行して、ＣＤ８（Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ）及びＣＤ４に対するＣＤ２５（Ｃ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｏ、Ｑ）及びＣＤ６９（Ｄ、Ｆ、Ｊ、Ｌ、Ｐ、Ｒ）の上方制御（Ｃ、Ｄ、Ｉ、Ｊ、Ｏ、Ｐ）ＰＢＭＣ内のＴ細胞は、４８時間後のＴ細胞活性化のマーカーとしてフローサイトメトリーによって測定された。 図１１のＩ～Ｌは、オリジナル又は最適化されたＣＤ３バインダを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによる腫瘍細胞の殺傷及びＴ細胞の活性化。３人の異なる健康なドナー（Ａ－Ｆ：ドナー１、Ｇ－Ｌ：ドナー２、Ｍ－Ｒ：ドナー３）からのＰＢＭＣによるＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔでの処理によるメラノーマ細胞株Ｍ１５０５４３の死滅は、２４時間後（Ａ、Ｇ、Ｍ）及び４８時間後（Ｂ、Ｈ、Ｎ）のＬＤＨ放出によって決定された。並行して、ＣＤ８（Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ）及びＣＤ４に対するＣＤ２５（Ｃ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｏ、Ｑ）及びＣＤ６９（Ｄ、Ｆ、Ｊ、Ｌ、Ｐ、Ｒ）の上方制御（Ｃ、Ｄ、Ｉ、Ｊ、Ｏ、Ｐ）ＰＢＭＣ内のＴ細胞は、４８時間後のＴ細胞活性化のマーカーとしてフローサイトメトリーによって測定された。 図１１のＩ～Ｌは、オリジナル又は最適化されたＣＤ３バインダを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによる腫瘍細胞の殺傷及びＴ細胞の活性化。３人の異なる健康なドナー（Ａ－Ｆ：ドナー１、Ｇ－Ｌ：ドナー２、Ｍ－Ｒ：ドナー３）からのＰＢＭＣによるＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔでの処理によるメラノーマ細胞株Ｍ１５０５４３の死滅は、２４時間後（Ａ、Ｇ、Ｍ）及び４８時間後（Ｂ、Ｈ、Ｎ）のＬＤＨ放出によって決定された。並行して、ＣＤ８（Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ）及びＣＤ４に対するＣＤ２５（Ｃ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｏ、Ｑ）及びＣＤ６９（Ｄ、Ｆ、Ｊ、Ｌ、Ｐ、Ｒ）の上方制御（Ｃ、Ｄ、Ｉ、Ｊ、Ｏ、Ｐ）ＰＢＭＣ内のＴ細胞は、４８時間後のＴ細胞活性化のマーカーとしてフローサイトメトリーによって測定された。 図１１のＯ～Ｒは、オリジナル又は最適化されたＣＤ３バインダを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによる腫瘍細胞の殺傷及びＴ細胞の活性化。３人の異なる健康なドナー（Ａ－Ｆ：ドナー１、Ｇ－Ｌ：ドナー２、Ｍ－Ｒ：ドナー３）からのＰＢＭＣによるＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔでの処理によるメラノーマ細胞株Ｍ１５０５４３の死滅は、２４時間後（Ａ、Ｇ、Ｍ）及び４８時間後（Ｂ、Ｈ、Ｎ）のＬＤＨ放出によって決定された。並行して、ＣＤ８（Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ）及びＣＤ４に対するＣＤ２５（Ｃ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｏ、Ｑ）及びＣＤ６９（Ｄ、Ｆ、Ｊ、Ｌ、Ｐ、Ｒ）の上方制御（Ｃ、Ｄ、Ｉ、Ｊ、Ｏ、Ｐ）ＰＢＭＣ内のＴ細胞は、４８時間後のＴ細胞活性化のマーカーとしてフローサイトメトリーによって測定された。 図１２のＡとＢは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡの特異的結合。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡ抗体のＥＧＦＲｖＩＩＩへの特異的結合（ＥＧＦＲｗｔとの交差反応性なし）を、ＣＨＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ａ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＤＫ－ＭＧ（Ｂ）でフローサイトメトリーによって試験した。セツキシマブは、ＥＧＦＲｗｔ発現の陽性対照として含まれていた。 図１２のＣは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡの特異的結合。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡ抗体のＥＧＦＲｖＩＩＩへの特異的結合（ＥＧＦＲｗｔとの交差反応性なし）をＥＧＦＲｗｔ発現ＭＫＮ－４５（Ｃ）でフローサイトメトリーによって試験した。セツキシマブは、ＥＧＦＲｗｔ発現の陽性対照として含まれていた。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡによるＣＡＲ Ｊの活性化。抗ＰＧＬＡＬＡ ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞を、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＤＫ－ＭＧ細胞及びＥＧＦＲｖＩＩＩ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡ抗体又は陰性対照としてのＤＰ４７ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡと共培養した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞の活性化は、２２時間後に発光を測定することによって定量化された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡ及び対応するＴＣＢのＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合。ＣＨＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ａ）及びＭＫＮ－４５（Ｂ）細胞に対するＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡとしてのＥＧＦＲｖＩＩＩバインダの特異的結合及びＴＣＢに変換された結合を、フローサイトメトリーで測定した。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴの活性化。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＤＫ－ＭＧ細胞の存在下でのＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢとのＣＤ３結合のマーカーとして決定された。ＤＰ４７ ＴＣＢは陰性対照として含まれていた。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる腫瘍細胞の活性化。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる特異的な腫瘍細胞溶解の誘発は、新たに単離されたＰＢＭＣと、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＤＫ－ＭＧ細胞（Ａ、Ｂ）又はＥＧＦＲｗｔ陽性ＭＫＮ－４５細胞（Ｃ、Ｄ）のいずれかとの、２４時間（Ａ、Ｃ）又は４８時間（Ｂ、Ｄ）の共培養時に決定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＴ細胞の活性化。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＴ細胞活性化の誘発は、新たに単離されたＰＢＭＣ及びＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＤＫ－ＭＧ細胞（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）又はＥＧＦＲｗｔ陽性ＭＫＮ－４５細胞（Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）のいずれかとの共培時に、ＣＤ４Ｔ細胞（Ａ～Ｄ）又はＣＤ８Ｔ細胞（Ｅ～Ｈ）上の活性化マーカーＣＤ２５（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）又はＣＤ６９（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）を使用して決定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＴ細胞の活性化。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＴ細胞活性化の誘発は、新たに単離されたＰＢＭＣ及びＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＤＫ－ＭＧ細胞（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）又はＥＧＦＲｗｔ陽性ＭＫＮ－４５細胞（Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）のいずれかとの共培時に、ＣＤ４Ｔ細胞（Ａ～Ｄ）又はＣＤ８Ｔ細胞（Ｅ～Ｈ）上の活性化マーカーＣＤ２５（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）又はＣＤ６９（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）を使用して決定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるシトカイン放出。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＩＦＮ（Ａ、Ｄ）、ＴＮＦ（Ｂ、Ｅ）、及びグランザイムＢ（Ｃ、Ｆ）の放出の誘発は、新たに単離されたＰＢＭＣと、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＤＫ－ＭＧ細胞（Ａ－Ｃ）又はＥＧＦＲｗｔ陽性ＭＫＮ－４５細胞（Ｄ－Ｆ）のいずれかとの共培養時に決定された。 親和性成熟したＥＧＦＲｖＩＩＩ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡの特異的結合。親和性成熟したＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のＥＧＦＲｖＩＩＩへの特異的結合を、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞（Ａ）及びＥＧＦＲｗｔ陽性細胞株ＭＫＮ－４５（Ｂ）で、親ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合剤と比較した。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴの活性化。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴの活性化は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＤＫ－ＭＧ細胞（Ａ）の存在下で、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢとのＣＤ３結合のマーカーとして決定された。ＤＰ４７ ＴＣＢは陰性対照として含まれていた。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴの活性化。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴの活性化は、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞（Ｂ）の存在下で、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢとのＣＤ３結合のマーカーとして決定された。ＤＰ４７ ＴＣＢは陰性対照として含まれていた。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴの活性化。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴの活性化は、ＭＫＮ－４５細胞（Ｃ）の存在下で、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢとのＣＤ３結合のマーカーとして決定された。ＤＰ４７ ＴＣＢは陰性対照として含まれていた。 ４０℃、ｐＨ６で１４日後、又は３７℃、ｐＨ７．４で１４日後に、ストレスのない状態でＳＰＲによって測定された、オリジナル又は最適化されたＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ又はＣＤ３ｏｐｔを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの組換えＣＤ３に対する相対的な結合活性。 ４０℃、ｐＨ６で１４日後、又は３７℃、ｐＨ７．４で１４日後に、ストレスのない状態でＳＰＲによって測定された、オリジナル又は最適化されたＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ又はＣＤ３ｏｐｔを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの組換えＣＤ３に対する相対的な結合活性。 フローサイトメトリーで測定されたオリジナル及び最適化されたＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ又はＣＤ３ｏｐｔを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢのＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞への結合。ＴＣＢに結合した抗体は、蛍光標識された抗ヒトＦｃ特異的二次抗体で検出された。 フローサイトメトリーで測定した、Ｐ０６３．０５６又は Ｐ０５６．０２１ ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢのＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞への結合。Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞に結合したＴＣＢは、蛍光標識された抗ヒトＦｃ特異的二次抗体で検出された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる腫瘍細胞の溶解とＴ細胞の活性化。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる特定の腫瘍細胞溶解（Ａ、Ｂ）及びＴ細胞活性化（Ｃ、Ｄ）の誘導は、新たに単離されたＰＢＭＣと、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞との２４時間（Ａ、Ｃ）又は４８間（Ｂ、Ｄ）の共培養時に決定され。ＤＰ４７ ＴＣＢは陰性対照として含まれていた。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる腫瘍細胞の溶解とＴ細胞の活性化。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる特定の腫瘍細胞溶解（Ａ、Ｂ）及びＴ細胞活性化（Ｃ、Ｄ）の誘導は、新たに単離されたＰＢＭＣと、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞との２４時間（Ａ、Ｃ）又は４８間（Ｂ、Ｄ）の共培養時に決定され。ＤＰ４７ ＴＣＢは陰性対照として含まれていた。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ２＋１フォーマットと１＋１フォーマットを比較したＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴの活性化。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の存在下で、２＋１反転フォーマット及び１＋１ヘッドテイルフォーマットでのＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢとのＣＤ３結合のマーカーとして決定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ ２＋１フォーマットと１＋１フォーマットを比較した腫瘍細胞の溶解とＴ細胞の活性化。２＋１反転フォーマット及び１＋１頭尾フォーマットＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる特異的な腫瘍細胞溶解（Ａ、Ｂ）及びＴ細胞活性化（Ｃ、Ｄ）の誘発は、新たに単離したＰＢＭＣと、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞との、２４時間（Ａ、Ｃ）又は４８時間（Ｂ、Ｄ）の共培養時に決定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ ２＋１フォーマットと１＋１フォーマットを比較した腫瘍細胞の溶解とＴ細胞の活性化。２＋１反転フォーマット及び１＋１頭尾フォーマットＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる特異的な腫瘍細胞溶解（Ａ、Ｂ）及びＴ細胞活性化（Ｃ、Ｄ）の誘発は、新たに単離したＰＢＭＣと、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞との、２４時間（Ａ、Ｃ）又は４８時間（Ｂ、Ｄ）の共培養時に決定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＴ細胞の活性化と増殖。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＴ細胞増殖（Ａ、Ｃ）及びＣＤ４ Ｔ細胞（Ａ、Ｂ）及びＣＤ８ Ｔ細胞（Ｃ、Ｄ）のＴ細胞活性化の誘発は、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩと健康なドナーから分離されたＰＢＭＣの共培養時に決定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＴ細胞の活性化と増殖。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＴ細胞増殖（Ａ、Ｃ）及びＣＤ４ Ｔ細胞（Ａ、Ｂ）及びＣＤ８ Ｔ細胞（Ｃ、Ｄ）のＴ細胞活性化の誘発は、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩと健康なドナーから分離されたＰＢＭＣの共培養時に決定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる腫瘍細胞の溶解、Ｔ細胞の活性化、及びサイトカインの放出。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる腫瘍細胞の溶解（Ａ、Ｂ）、Ｔ細胞の活性化（Ｃ、Ｄ）、及びＩＦＮとＴＮＦの放出（Ｅ、Ｆ）の誘発は、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞とＰＢＭＣとの共培養時に決定される。腫瘍細胞溶解は、治療の２４時間後及び４８時間後に測定し、Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出は、４８時間後に決定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる腫瘍細胞の溶解、Ｔ細胞の活性化、及びサイトカインの放出。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる腫瘍細胞の溶解（Ａ、Ｂ）、Ｔ細胞の活性化（Ｃ、Ｄ）、及びＩＦＮとＴＮＦの放出（Ｅ、Ｆ）の誘発は、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞とＰＢＭＣとの共培養時に決定される。腫瘍細胞溶解は、治療の２４時間後及び４８時間後に測定し、Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出は、４８時間後に決定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる腫瘍細胞の溶解、Ｔ細胞の活性化、及びサイトカインの放出。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる腫瘍細胞の溶解（Ａ、Ｂ）、Ｔ細胞の活性化（Ｃ、Ｄ）、及びＩＦＮとＴＮＦの放出（Ｅ、Ｆ）の誘発は、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞とＰＢＭＣとの共培養時に決定される。腫瘍細胞溶解は、治療の２４時間後及び４８時間後に測定し、Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出は、４８時間後に決定された。 ＴＹＲＰ－１ ＴＣＢによる腫瘍細胞の溶解、Ｔ細胞の活性化、及びサイトカインの放出。ＴＹＲＰ－１ ＴＣＢによる腫瘍細胞の溶解（Ａ、Ｂ）、Ｔ細胞の活性化（Ｃ、Ｄ）、及びＩＦＮγとＴＮＦαの放出（Ｅ、Ｆ）の誘発は、患者由来メラノーマ細胞株Ｍ１５０５４３とＰＢＭＣとの共培養時に決定された。腫瘍細胞溶解は、治療の２４時間後及び４８時間後に測定し、Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出は、４８時間後に決定された。 ＴＹＲＰ－１ ＴＣＢによる腫瘍細胞の溶解、Ｔ細胞の活性化、及びサイトカインの放出。ＴＹＲＰ－１ ＴＣＢによる腫瘍細胞の溶解（Ａ、Ｂ）、Ｔ細胞の活性化（Ｃ、Ｄ）、及びＩＦＮγとＴＮＦαの放出（Ｅ、Ｆ）の誘発は、患者由来メラノーマ細胞株Ｍ１５０５４３とＰＢＭＣとの共培養時に決定された。腫瘍細胞溶解は、治療の２４時間後及び４８時間後に測定し、Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出は、４８時間後に決定された。 ＴＹＲＰ－１ ＴＣＢによる腫瘍細胞の溶解、Ｔ細胞の活性化、及びサイトカインの放出。ＴＹＲＰ－１ ＴＣＢによる腫瘍細胞の溶解（Ａ、Ｂ）、Ｔ細胞の活性化（Ｃ、Ｄ）、及びＩＦＮγとＴＮＦαの放出（Ｅ、Ｆ）の誘発は、患者由来メラノーマ細胞株Ｍ１５０５４３とＰＢＭＣとの共培養時に決定された。腫瘍細胞溶解は、治療の２４時間後及び４８時間後に測定し、Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出は、４８時間後に決定された。 ＴＹＲＰ－１ ＴＣＢのｉｎ ｖｉｖｏ有効性。ＩＧＲ－１ヒト黒色腫細胞株をヒト化ＮＳＧマウスに皮下注射して、黒色腫皮下異種移植モデルにおける腫瘍増殖阻害を研究した。ビヒクル群と比較して、ＴＹＲＰ－１ ＴＣＢ群において有意な腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）が観察された（６８％ＴＧＩ、ｐ＝０．００５８＊）。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢのｉｎ ｖｉｖｏ有効性。Ｕ８７－ｈｕＥＧＦＲｖＩＩＩヒト膠芽腫細胞株をヒト化ＮＳＧマウスに皮下注射して、膠芽腫皮下異種移植モデルにおける腫瘍増殖阻害を研究した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ群では有意な腫瘍制御が観察され、すべてのマウスが完全寛解を達成した。 ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ分子のフォーマット。Ａは、内部のＦＯＬＲ１ ＦａｂのＶＨに（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して融合したＣＤ３Ｆａｂを有する古典的な２＋１ＴＣＢ分子。ノブ・イントゥー・ホール技術によるヘテロ二量体化、ＦｃのＰＧＬＡＬＡ変異。Ｂは、Ｆｃノブ鎖の内部にＣＤ３ｏｐｔＦａｂを有する反転２＋１ ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ。３Ｃは、（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して内部ＦＯＬＲ１ ＦａｂのＶＨに融合したＣＤ３ｏｐｔＦａｂを含む、古典的な１＋１頭尾ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ分子。ノブ・イントゥー・ホール技術によるヘテロ二量体化、ＦｃのＰＧＬＡＬＡ変異。Ｄは、Ｆｃノブ鎖の内側にＣＤ３ｏｐｔＦａｂを有する反転１＋１頭尾ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ。Ｅは、１＋１ ＩｇＧ様ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ分子で、Ｆｃノブ鎖にＣＤ３ｏｐｔＦａｂ、Ｆｃホール鎖にＦＯＬＲ１ Ｆａｂがある。Ｆａｂノブ・イントゥー・ホール技術によるヘテロ二量体化、ＦｃのＰＧＬＡＬＡ変異。 ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ分子のフォーマット。Ａは、内部のＦＯＬＲ１ ＦａｂのＶＨに（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して融合したＣＤ３Ｆａｂを有する古典的な２＋１ＴＣＢ分子。ノブ・イントゥー・ホール技術によるヘテロ二量体化、ＦｃのＰＧＬＡＬＡ変異。Ｂは、Ｆｃノブ鎖の内部にＣＤ３ｏｐｔＦａｂを有する反転２＋１ ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ。３Ｃは、（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して内部ＦＯＬＲ１ ＦａｂのＶＨに融合したＣＤ３ｏｐｔＦａｂを含む、古典的な１＋１頭尾ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ分子。ノブ・イントゥー・ホール技術によるヘテロ二量体化、ＦｃのＰＧＬＡＬＡ変異。Ｄは、Ｆｃノブ鎖の内側にＣＤ３ｏｐｔＦａｂを有する反転１＋１頭尾ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ。Ｅは、１＋１ ＩｇＧ様ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ分子で、Ｆｃノブ鎖にＣＤ３ｏｐｔＦａｂ、Ｆｃホール鎖にＦＯＬＲ１ Ｆａｂがある。Ｆａｂノブ・イントゥー・ホール技術によるヘテロ二量体化、ＦｃのＰＧＬＡＬＡ変異。 ＦｏｌＲ１ ＴＣＢ分子のフォーマット。Ａは、内部のＦＯＬＲ１ ＦａｂのＶＨに（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して融合したＣＤ３Ｆａｂを有する古典的な２＋１ＴＣＢ分子。ノブ・イントゥー・ホール技術によるヘテロ二量体化、ＦｃのＰＧＬＡＬＡ変異。Ｂは、Ｆｃノブ鎖の内部にＣＤ３ｏｐｔＦａｂを有する反転２＋１ ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ。３Ｃは、（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して内部ＦＯＬＲ１ ＦａｂのＶＨに融合したＣＤ３ｏｐｔＦａｂを含む、古典的な１＋１頭尾ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ分子。ノブ・イントゥー・ホール技術によるヘテロ二量体化、ＦｃのＰＧＬＡＬＡ変異。Ｄは、Ｆｃノブ鎖の内側にＣＤ３ｏｐｔＦａｂを有する反転１＋１頭尾ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ。Ｅは、１＋１ ＩｇＧ様ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ分子で、Ｆｃノブ鎖にＣＤ３ｏｐｔＦａｂ、Ｆｃホール鎖にＦＯＬＲ１ Ｆａｂがある。Ｆａｂノブ・イントゥー・ホール技術によるヘテロ二量体化、ＦｃのＰＧＬＡＬＡ変異。 ＦＯＬＲ１－ＴＣＢ（ＣＤ３ｏｐｔ）を介したＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴの活性化。ＣＤ３ｏｐｔを使用したＦＯＬＲ１－ＴＣＢによって媒介されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴの活性化が示されている。ＦＯＬＲ１－ＴＣＢ をｈｕＦＯＬＲ１コーティングビーズ及びＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴエフェクタ細胞と３７℃で５．５時間インキュベートした。点線は、ＴＣＢを含まないＪｕｒｋａｔ細胞を含むビーズを表す。各点は、技術的なトリプリケートの平均を表す。標準偏差はエラーバー（ｎ＝１）で示される。 ＦＯＬＲ１（ｐｒｏ－）ＴＣＢ（ＣＤ３ｏｐｔ）による腫瘍細胞の溶解とＴ細胞の活性化。ヒトＰＢＭＣ（エフェクタ細胞）及びＦＯＬＲ１陽性標的細胞（Ｏｖｃａｒ－３）とＦＯＬＲ１ ＴＣＢを２４時間後に共培養した後、用量依存的な腫瘍細胞の溶解とＴ細胞の活性化を分析した。２４時間及び４８時間後（Ａ）の腫瘍細胞溶解の誘発。Ｔ細胞の活性化は、ＦＡＣＳによるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のＣＤ６９の定量化により、４８時間の処理後に測定された。ＣＤ６９陽性ＣＤ４Ｔ細胞（Ｃ）とＣＤ８Ｔ細胞（Ｄ）は上のパネルに示されている。下のパネルでは、ＣＤ６９の中央値｛ＰＥ｝をＣＤ４（Ｅ）及びＣＤ８（Ｆ）陽性Ｔ細胞についてプロットした。各点は、技術的なトリプリケートの平均を表す。標準偏差はエラーバーで示される。 ＦＯＬＲ１（ｐｒｏ－）ＴＣＢ（ＣＤ３ｏｐｔ）による腫瘍細胞の溶解とＴ細胞の活性化。ヒトＰＢＭＣ（エフェクタ細胞）及びＦＯＬＲ１陽性標的細胞（Ｏｖｃａｒ－３）とＦＯＬＲ１ ＴＣＢを２４時間後に共培養した後、用量依存的な腫瘍細胞の溶解とＴ細胞の活性化を分析した。２４時間及び４８時間後（Ａ）の腫瘍細胞溶解の誘発。Ｔ細胞の活性化は、ＦＡＣＳによるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のＣＤ６９の定量化により、４８時間の処理後に測定された。ＣＤ６９陽性ＣＤ４Ｔ細胞（Ｃ）とＣＤ８Ｔ細胞（Ｄ）は上のパネルに示されている。下のパネルでは、ＣＤ６９の中央値｛ＰＥ｝をＣＤ４（Ｅ）及びＣＤ８（Ｆ）陽性Ｔ細胞についてプロットした。各点は、技術的なトリプリケートの平均を表す。標準偏差はエラーバーで示される。 ＦＯＬＲ１（ｐｒｏ－）ＴＣＢ（ＣＤ３ｏｐｔ）による腫瘍細胞の溶解とＴ細胞の活性化。ヒトＰＢＭＣ（エフェクタ細胞）及びＦＯＬＲ１陽性標的細胞（Ｏｖｃａｒ－３）とＦＯＬＲ１ ＴＣＢを２４時間後に共培養した後、用量依存的な腫瘍細胞の溶解とＴ細胞の活性化を分析した。２４時間及び４８時間後（Ａ）の腫瘍細胞溶解の誘発。Ｔ細胞の活性化は、ＦＡＣＳによるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のＣＤ６９の定量化により、４８時間の処理後に測定された。ＣＤ６９陽性ＣＤ４Ｔ細胞（Ｃ）とＣＤ８Ｔ細胞（Ｄ）は上のパネルに示されている。下のパネルでは、ＣＤ６９の中央値｛ＰＥ｝をＣＤ４（Ｅ）及びＣＤ８（Ｆ）陽性Ｔ細胞についてプロットした。各点は、技術的なトリプリケートの平均を表す。標準偏差はエラーバーで示される。
Ｉ．定義
以下で別段の定義がない限り、本明細書では、当技術分野で一般的に使用される用語を使用する。
本明細書で使用される場合、抗原結合ドメインなどに関して「第１」、「第２」又は「第３」という語は、各タイプの部分が２つ以上ある場合に区別するのに便利なように使用される。これらの用語の使用は、明示的に述べられていない限り、部分の特定の順序又は向きを付与することを意図していない。
「抗ＣＤ３抗体」及び「ＣＤ３に結合する抗体」という用語は、抗体がＣＤ３を標的とする診断薬及び／又は治療薬として有用であるように、十分な親和性でＣＤ３に結合することができる抗体を指す。一態様では、抗ＣＤ３抗体の無関係の非ＣＤ３タンパク質への結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される場合、抗体のＣＤ３への結合の約１０％未満である。特定の局面において、ＣＤ３に結合する抗体は、≦１μＭ、≦５００ｎＭ、≦２００ｎＭ、又は≦１００ｎＭの解離定数（ＫＤ）を有する。抗体は、例えばＳＰＲによって測定して、抗体が１μＭ以下のＫＤを有する場合、ＣＤ３に「特異的に結合する」と言われる。特定の態様では、抗ＣＤ３抗体は、異なる種からのＣＤ３間で保存されているＣＤ３のエピトープに結合する。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
「抗体断片」とは、無傷の抗体が結合する抗原に結合する無傷の抗体の一部を含む、無傷の抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ又ｓｃＦａｂなど）、単一ドメイン抗体、及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。特定の抗体断片の概説については、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。
「全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、ネイティブ抗体構造と実質的に類似した構造を有する抗体を指す。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、可能なバリアント抗体を除いて、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合し、例えば、自然に発生する突然変異を含むか、又はモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、そのような変異体は一般に微量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾子「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特徴を示し、特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができ、そのような方法及びモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）、又はクロマトグラフィ（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ）によって決定されるように、９５％又は９９％を超える純度まで精製される。抗体純度の評価方法のレビューについては、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。いくつかの態様では、本発明によって提供される抗体は、単離された抗体である。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＣＤＲのすべて又は実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する。そのような可変ドメインは、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ばれる。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。いくつかの態様では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞によって産生されるか、あるいはヒト抗体レパートリー又は他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。特定の態様では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、例えばマウス、ラット、又はウサギに由来する。特定の態様では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株に由来する。ヒト抗体ライブラリから単離された抗体又は抗体断片も、本明細書ではヒト抗体又はヒト抗体断片と見なされる。
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全部に結合し、それに相補的である領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。好ましい態様では、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に同様の構造を持ち、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６ｔｈ ｅｄ．， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， ｐａｇｅ ９１ （２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインで、抗原結合特異性を付与するのに十分な場合がある。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からＶＨ又はＶＬドメインを使用して単離し、それぞれ相補的なＶＬ又はＶＨドメインのライブラリをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：８８０－８８７ （１９９３）； Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８ （１９９１）を参照されたい。可変領域配列に関連して本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ（１９９１）によって規定されている番号付けシステムを指す。
本明細書で使用されるように、重鎖及び軽鎖のすべての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ（１９９１）に記載されており、本明細書では、「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ばれる。具体的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（ｐａｇｅｓ ６４７－６６０ ｏｆ Ｋａｂａｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ（１９９１）を参照）は、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１－７２３ページを参照）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用され、この場合、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステム」又は「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け」参照することにより、本明細書でさらに明確にされる。
本明細書で使用される「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が高頻度可変性のであり、抗原結合特異性を決定する抗体可変ドメインの各領域、例えば「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）を指す。一般に、抗体は６つのＣＤＲ；ＶＨに３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、ＶＬに３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む。本明細書における例示的なＣＤＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、及び９６－１０１（Ｈ３）で発生する超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）で発生するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ（１９９１））；及び
（ａ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）、及び９３－１０１（Ｈ３）で発生する抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２：７３２－７４５（１９９６））
を含む。
特に明記しない限り、ＣＤＲは前出のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従って決定される。当業者は、ＣＤＲ指定が前出のＣｈｏｔｈｉａ、前出のＭｃＣａｌｌｕｍ、又は任意の他の科学的に認められた命名法に従っても決定できることを理解するであろう。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、通常、次の４つのＦＲドメイン；ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４
で構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、概して、ＶＨ（又はＶＬ）で次の順序で表示される。ＦＲ１－ＨＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）－ＦＲ２－ＨＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）－ＦＲ３－ＨＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）－ＦＲ４。
特に明記しない限り、可変ドメイン内のＣＤＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、前出のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従って番号付けされる。
本明細書における目的のための「受容体ヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」受容体ヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、又はアミノ酸配列変化を含んでもよい。いくつかの態様では、アミノ酸変化の数は、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、又は２個以下である。いくつかの態様では、ＶＬ受容体ヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループ由来のものである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２， Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１）， ｖｏｌｓ． １－３におけるようなものである。
本明細書における「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖から構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は可変重ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプのいずれかに割り当てられ、そのうちのいくつかは、サブタイプ、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）にさらに分けられる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。免疫グロブリンは基本的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して連結された２つのＦａｂ分子と１つのＦｃドメインから構成される。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭがあり、そしてこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分類できる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメイン（「Ｆａｂ重鎖」）及び軽鎖のＶＬ及びＣＬドメイン（「Ｆａｂ軽鎖」）からなるタンパク質を指す。
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも呼ばれる）とは、Ｆａｂ分子を意味し、Ｆａｂの重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換される（つまり、互いに置換される）、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＶＬ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向）から構成されるペプチド鎖、及び重鎖可変ドメインＶＨと軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向）から構成されるペプチド鎖を含む。明確にするために、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されるクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ＣＨ１を含むペプチド鎖は、本明細書において（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されるクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖は、本明細書において（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。
それとは対照的に、「従来の」Ｆａｂ分子とは、天然の形式のＦａｂ分子を意味する、すなわち、重鎖の可変ドメインと定常ドメイン（ＶＨ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向）から構成される重鎖、及び軽鎖の可変ドメインと定常ドメイン（ＶＬ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向）から構成される軽鎖を含む。
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも２つの結合部分が、それぞれの抗原（例えば、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１）への特異的結合を付与する同一の軽鎖及び対応する改造された重鎖を有する二重特異性分子に関する。このいわゆる「共通の軽鎖」の原則、つまり、１つの軽鎖を共有するが個別の特異性を持つ２つ以上のバインダを組み合わせることで、軽鎖のミスペアリングが防止される。したがって、生産中の副産物が少なくなり、二重特異性分子の均一な調製が容易になる。
本明細書における「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語には、ネイティブ配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域が含まれる。一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかし、宿主細胞によって産生された抗体は、重鎖のＣ末端から１つ又は複数、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後切断を受ける可能性がある。したがって、全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって宿主細胞によって産生される抗体は、全長重鎖か、又は全長重鎖の切断されたバリアントを含み得る。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしなくてもよい。Ｆｃ領域（又は本明細書で定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、他に示されない限り、本明細書ではＣ末端グリシン－リジンジペプチドなしで示される。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書で特定されるＦｃ領域（サブユニット）を含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書で特定されるＦｃ領域（サブユニット）を含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書で特に明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， １９９１（上記も参照）で説明されているようなＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書で使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち安定した自己会合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「融合」とは、構成要素（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）がペプチド結合によって、直接又は１つ又は複数のペプチドリンカーを介して連結されることを意味する。
「多重特異性」という用語は、抗体が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合できることを意味する。多重特異性抗体は、例えば、二重特異性抗体であり得る。典型的には、二重特異性抗体は２つの抗原結合部位を含み、その各々は異なる抗原決定基に特異的である。特定の態様では、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体は、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞で発現される２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
本明細書で使用される「価」という用語は、抗原結合分子内に指定された数の抗原結合部位が存在することを意味する。したがって、「抗原への一価結合」という用語は、抗原結合分子中の抗原に特異的な１つ（及び１つより多くない）の抗原結合部位の存在を意味する。
「抗原結合部位」とは、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、すなわち１つ又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は典型的には２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は典型的に単一の抗原結合部位を有する。
本明細書で使用されるように、「抗原決定基」又は「抗原」という用語は、抗原結合ドメインが結合するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続ストレッチ又は非連続アミノ酸の異なる領域から構成される立体構造の構成）を指し、抗原結合ドメイン－抗原複合体を形成する。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、腫瘍細胞の表面上に、他の病気の細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中に遊離に及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に見ることができる。好ましい態様では、抗原はヒトタンパク質である。
「ＣＤ３」とは、特に断りのない限り、霊長類（例えば、ｌヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、げっ歯類（例えば、マウスとラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物由来のネイティブＣＤ３を指す。この用語は、「完全長」の未処理のＣＤ３だけでなく、細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のＣＤ３も含む。該用語は、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体など、ＣＤ３の天然に存在する変異体も包含する。一態様では、ＣＤ３はヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列を配列番号１１２（シグナルペプチドを除く）に示す。（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｐ０７７６６（バージョン１８９）、又は
ＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００７２４．１も参照されたい。別の態様では、ＣＤ３はカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εである。カニクイザルＣＤ３εのアミノ酸配列を配列番号１１３（シグナルペプチドを除く）に示す。ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ． ＢＡＢ７１８４９．１も参照されたい。特定の態様では、本発明の抗体は、異なる種、特にヒト及びカニクイザルＣＤ３由来のＣＤ３抗原の間で保存されているＣＤ３のエピトープに結合する。好ましい態様では、抗体はヒトＣＤ３に結合する。
本明細書で使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞の表面に提示される抗原決定基、例えば、がん細胞又は腫瘍間質の細胞などの腫瘍中の細胞（その場合、「腫瘍細胞抗原」）を指す。好ましくは、標的細胞抗原はＣＤ３ではなく、及び／又はＣＤ３とは異なる細胞で発現される。一態様では、標的細胞抗原はＴＹＲＰ－１、特にヒトＴＹＲＰ－１である。別の態様では、標的細胞抗原はＥＧＦＲｖＩＩＩ、特にヒトＥＧＦＲｖＩＩＩである。好ましい実施形態では、標的抗原は葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）である。
「ＦｏｌＲ１」は葉酸受容体１（同義語には、葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）が含まれるが、これらに限定されない）は、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）を表し、ＭＯｖ１８、Ｐ１５３２８、ＦＲＡ１、ＦＲＡＩ）は、葉酸及び還元葉酸誘導体の細胞内部への更新を媒介するタンパク質受容体である。ヒトＦｏｌＲ１の配列は、配列番号１３７に示されている。ＵｎｉＰｒｏｔエントリ番号Ｐ１５３２８も参照されたい。ここで用いられる「ＦｏｌＲ１」とは、特に断りのない限り、霊長類（例えば、ｌヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、げっ歯類（例えば、マウスとラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物由来のネイティブＦｏｌＲ１を指す。この用語は、「完全長」の未処理のＦｏｌＲ１だけでなく、細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のＦｏｌＲ１も含む。該用語は、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体など、ＦｏｌＲ１の天然に存在する変異体も包含する。一態様では、ＦｏｌＲ１はヒトＦｏｌＲ１である。
「ＴＹＲＰ１」又は「ＴＹＲＰ－１」は、メラニン合成に関与する酵素であるチロシン関連タンパク質１を表す。ｇｐ７５とも呼ばれるＴＹＲＰ１の成熟型は、７５ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質である。ヒトＴＹＲＰ１の配列は、配列番号１１４（シグナルペプチドなし）に示される。ＵｎｉＰｒｏｔエントリバングＰ１７６４３（バージョン１８５）も参照されたい。ここで用いられる「ＴＹＲＰ１」とは、特に断りのない限り、霊長類（例えば、ｌヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、げっ歯類（例えば、マウスとラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物由来のネイティブＴＹＲＰ１を指す。この用語は、「完全長」の未処理のＴＹＲＰ１だけでなく、細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のＴＹＲＰ１も含む。該用語は、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体など、ＴＹＲＰ１の天然に存在する変異体も包含する。一態様では、ＴＹＲＰ１はヒトＴＹＲＰ１である。
「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」は、ＥＧＦＲの変異体である上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩを表し、エクソン２～７のインフレーム欠失によって形成され、接合部にグリシン置換を伴う２６７個のアミノ酸の欠失をもたらす。ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩの配列は、配列番号１１５（シグナルペプチドなし）に示される。ヒトＥＧＦＲの配列は、配列番号１１６（シグナルペプチドなし）に示される。ＵｎｉＰｒｏｔエントリバングＰ００５３３（バージョン２５８）も参照されたい。ここで用いられる「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」とは、特に断りのない限り、霊長類（例えば、ｌヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、げっ歯類（例えば、マウスとラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物由来のネイティブＥＧＦＲｖＩＩＩを指す。この用語は、「完全長」のプロセッシングされていないＥＧＦＲｖＩＩＩ（しかし、野生型ＥＧＦＲではない）、並びに細胞内でのプロセシングから生じるＥＧＦＲｖＩＩＩの任意の形態（例えば、シグナルペプチドを含まないＥＧＦＲｖＩＩＩ）を含む。一態様では、ＥＧＦＲｖＩＩＩはヒトＥＧＦＲｖＩＩＩである。
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（ＫＤ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載のものを含む、当技術分野で知られている十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「親和性成熟」抗体は、そのような変化を持たない親抗体と比較して、１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）に１つ又は複数の変化を有する抗体を指し、そのような変化は、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。
「結合の減少」、例えばＦｃ受容体への結合の減少は、例えばＳＰＲによって測定される、それぞれの相互作用に対する親和性の減少を指す。明確にするために、この用語には、アフィニティをゼロ（又は分析方法の検出限界未満）に減少させること、つまり相互作用を完全になくすことも含まれる。逆に、「結合の増加」とは、それぞれの相互作用に対する結合親和性の増加を指す。
本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化」は、以下から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の１つ又は複数の細胞応答を指す：増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクタ分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、当技術分野で知られており、本明細書に記載されている。
「Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾」は、ペプチド骨格の操作、又はＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの会合を低減又は防止するＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である同一のポリペプチドとホモ二量体を形成する。本明細書で使用される修飾促進会合は、好ましくは、会合することが望まれる２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）のそれぞれに対して行われた別個の修飾を含み、その際、修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように互いに相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させて、それらの会合をそれぞれ立体的又は静電的に有利にすることができる。したがって、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、これは、サブユニットのそれぞれに融合されたさらなる構成要素（例えば、抗原結合ドメイン）が同じではないという意味で、同一ではない可能性がある。いくつかの態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインにおけるアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。好ましい態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれにおける別個のアミノ酸突然変異、特にアミノ酸置換を含む。
「エフェクタ機能」という用語は、抗体のアイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクタ機能の例は、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体を介した抗原の取り込み、細胞表面受容体（Ｂ細胞受容体など）の下方制御、及びＢ細胞の活性化
を含む。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる関与に続いて、受容体保有細胞を刺激してエフェクタ機能を実行させるシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクタ細胞による抗体でコーティングされた標的細胞の溶解につながる免疫メカニズムである。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が、一般にＦｃ領域のＮ末端にあるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書で使用されるように、「減少したＡＤＣＣ」という用語は、上記で定義されたＡＤＣＣのメカニズムによって、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の所定の濃度で、所定の時間内に溶解される標的細胞の数の減少、及び／又はＡＤＣＣのメカニズムによって、所定の時間内に所定の数の標的細胞の溶解を達成するために必要とされる、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の濃度の増加のいずれかによって定義される。ＡＤＣＣの減少は、同じ標準的な産生、精製、調合及び保存方法（当業者に知られている）を使用して、同じタイプの宿主細胞によって産生された同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較されるが、それは、操作されていない。例えば、ＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換をそのＦｃドメインに含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下は、Ｆｃドメインにおいてこのアミノ酸置換を伴わない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当技術分野で周知である（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０８２５１５又はＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１を参照）。
本明細書で使用される用語「操作された、操作された、操作された」は、ペプチド主鎖の任意の操作、あるいは天然又は組換えポリペプチド又はその断片の翻訳後修飾を含むと考えられる。操作には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、及びこれらのアプローチの組み合わせが含まれる。
本明細書で使用される「アミノ酸変異」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。最終構築物が所望の特徴、例えば、Ｆｃ受容体への結合の減少、又は別のペプチドとの会合の増加を有することを条件として、置換、欠失、挿入、及び修飾の任意の組み合わせを最終構築物に到達させるために行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ酸のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失及び挿入が含まれる。好ましいアミノ酸突然変異はアミノ酸置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特性を変更する目的で、非保存的アミノ酸置換、すなわち、あるアミノ酸を異なる構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置換することが特に好ましい。アミノ酸置換には、天然に存在しないアミノ酸による、又は２０の標準アミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体による置換が含まれる。アミノ酸変異は、当技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を使用して生成することができる。遺伝的方法には、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などが含まれ得る。化学修飾などの遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を修飾する方法も又有用であり得ることが企図される。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために様々な呼称が使用され得る。例えば、Ｆｃドメインの３２９位のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示すことができる。
基準ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大のパーセント配列同一性を達成した後、配列同一性の一部として保存的置換を考慮せずに、基準ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。あるいはまた、パーセントの同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成することができる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．によって作成され、ソースコードがユーザドキュメントと共に米国著作権局（ワシントンＤ．Ｃ．， ２０５５９）に提出されて、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されており、ＷＯ２００１／００７６１１に記載されている。
特に明記しない限り、本明細書の目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃ以降のｇｇｓｅａｒｃｈプログラムをＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスと共に使用して生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ． Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ（「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、ＰＮＡＳ ８５（１９８８）２４４４－２４４８）、Ｗ． Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ（「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ． ２６６ （１９９６）２２７－２５８）及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ． ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６（１９９７）２４－３６）によって著され、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ ｏｒ ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａから公に入手可能である。あるいはまた、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公開サーバは、ローカルではなくグローバルなアライメントが確実に実行されるように、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラムとデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を使用して、配列の比較に使用できる。アミノ酸同一性パーセントは、出力アラインメントヘッダに表示される。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基、具体的にはプリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成されている。多くの場合、核酸分子は塩基の配列によって記述され、それによって前記塩基は核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、通常、５’から３’に表される。本明細書では、核酸分子という用語は、例えば相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は線状又は環状であってよい。さらに、核酸分子という用語は、センス及びアンチセンス鎖の両方、並びに一本鎖及び二本鎖形態を含む。さらに、本明細書に記載の核酸分子は、天然又は非天然のヌクレオチドを含むことができる。天然に存在しないヌクレオチドの例には、誘導体化された糖又はリン酸骨格結合又は化学的に修飾された残基を有する修飾ヌクレオチド塩基が含まれる。核酸分子はまた、例えば宿主又は患者において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで本発明の抗体を直接発現させるためのベクターとして適したＤＮＡ及びＲＮＡ分子を包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていないか又は修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡを対象に注射してｉｎ ｖｉｖｏで抗体を生成できるように、ｍＲＮＡを化学的に修飾して、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコード化された分子の発現を増強することができる（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３：８１５－８１７、又はＥＰ ２ １０１ ８２３ Ｂ１を参照されたい。）。
「単離された」核酸分子は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸分子には、通常は核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は染色体外又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド（又は核酸）」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はそのフラグメント）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内におけるようなポリヌクレオチド分子、及び宿主細胞内の１つ又は複数の位置に存在するようなポリヌクレオチド分子を含む。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、結合している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。該用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、継代数に関係なく、一次形質転換細胞及びそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではない可能性があるが、突然変異を含む可能性がある。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異子孫が本明細書に含まれる。宿主細胞は、本発明の抗体を生成するために使用できる任意の種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えば、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞などの哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞を含み、ほんの数例を挙げると、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内に含まれる細胞も含まれる。一態様では、本発明の宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。一態様では、宿主細胞はヒト体内の細胞ではない。
「薬学的組成物」又は「医薬製剤」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性を有効にするような形態であり、組成物が投与される被験体に対して容認できないほど有毒である追加の成分を含まない製剤を指す。
「薬学的に許容される担体」とは、対象に対して非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物又は製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、ビヒクル、安定剤、又は保存剤が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などのその文法的変形）は、治療される個体の疾患の自然な経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理学の過程で実行できる。療の望ましい効果には、これらに限定されないが、疾患の発生又は再発の防止、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせるため、あるいは疾患の進行を遅らせるために使用される。
「個体」又は「被験者」は哺乳類である。哺乳類には、これらに限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特定の態様では、個体又は対象はヒトである。
薬剤、例えば、薬学的組成物の「有効量」は、所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び期間で有効な量を指す。
「添付文書」という用語は、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む、治療用製品の市販のパッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
ＩＩ．組成物及び方法
本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供する。抗体は、例えば、有効性と安全性、薬物動態、及び生産性に関して、治療への応用に有利な他の特性と相まって、優れた安定性を示す。本発明の抗体は、例えばがんなどの疾患の治療に有用である。
Ａ．二重特異性抗ＣＤ３抗ＦｏｌＲ１抗体
一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供する。一態様では、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する単離された二重特異性抗体が提供される。一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。特定の態様では、二重特異性抗ＣＤ３抗ＦｏｌＲ１抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される、ｐＨ６、－８０℃で２週間後の結合活性に対して、ｐＨ７．４、３７℃で２週間後、ＣＤ３に対する約９０％を超える結合活性を保持している。
一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供し、抗体は、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、抗体はヒト化抗体である。一態様では、抗原結合ドメインはヒト化抗原結合ドメイン（すなわち、ヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様では、ＶＨ及び／又はＶＬはヒト化可変領域である。
一態様では、ＶＨ及び／又はＶＬは、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号７の重鎖可変領域配列の１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗体はＣＤ３に結合する能力を保持する。特定の態様では、配列番号７のアミノ酸配列において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）で起こる。一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＶＨは配列番号７のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、ＶＬは、配列番号１１の軽鎖可変領域配列の１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗体はＣＤ３に結合する能力を保持する。特定の態様では、配列番号１１のアミノ酸配列において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）で起こる。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＶＬは配列番号１１のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む及び／又はＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ３に結合する抗体を提供し、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む第１の抗原結合ドメインを含む。
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供し、抗体は、配列番号７のＶＨ配列と、配列番号１１のＶＬ配列とを含む第１の抗原結合ドメインを含む。
別の態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供し、抗体は、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬとを含む第１の抗原結合ドメインを含む。
さらなる態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号７のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号１１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＨは、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、ＶＬは、配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１１のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１１のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＬは、配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１１のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供し、抗体は、上に提供された態様のいずれかにおけるようなＶＨ配列、及び上に提供された態様のいずれかにおけるようなＶＬ配列を含む第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、二重特異性抗体はヒト定常領域を含む。一態様では、二重特異性抗体は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリン分子、特にヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含むＩｇＧクラス免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号１２０及び１２１（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）及び配列番号１２２（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に示されている。一態様では、二重特異性抗体は、配列番号１２０又は配列番号１２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、特に配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。一態様では、二重特異性抗体は、配列番号１２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域は、本明細書に記載のＦｃドメインにアミノ酸変異を含み得る。
一態様では、第１の抗原結合ドメインはヒト定常領域を含む。一態様では、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。一態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２０又は配列番号１２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、特に配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書で「電荷修飾」の下に記載されるアミノ酸変異を含んでもよく、及び／又はｃｒｏｓｓｏｖｅｒ Ｆａｂ分子の場合、１つ又は複数（特に２つ）のＮ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでもよい。いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２２のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」の下に記載されるアミノ酸変異を含み得る。
一態様では、二重特異性抗体はモノクローナル抗体である。
一態様では、二重特異性抗体はＩｇＧ、特にＩｇＧ１抗体である。一態様では、二重特異性抗体は全長抗体である。
別の態様では、第１及び／又は第２及び／又はさらなる抗原結合ドメインは、Ｆｖ分子、（ａ）ｓｃＦｖ分子、（ａ）Ｆａｂ分子、及び（ａ）Ｆ（ａｂ’）２分子；特に（ａ）Ｆａｂ分子の群から選択される抗体断片である。別の態様では、抗体断片は、（ａ）二重特異性抗体、（ａ）三重特異性抗体、又は（ａ）四重特異性抗体である。
一態様では、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。好ましい態様では、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１、特に可変ドメインＶＬとＶＨは互いに置換される（第１の抗原結合ドメインはクロスオーバーＦａｂ分子である）。
さらなる態様では、上記の態様のいずれかによる抗体は、以下のセクションＩＩ．Ａ．１－８に記載したように、特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
好ましい態様では、抗体は、Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ Ｆｃドメイン、より具体的にはＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。一態様ではＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。一態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。Ｆｃドメインは、第１及び第２のサブユニットから構成され、Ｆｃドメイン変異体に関して以下に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる（セクションＩＩ．Ａ．８．）。
別の好ましい態様では、抗体は、第２の抗原に結合する第２及び任意選択的に第３の抗原結合ドメインを含む（すなわち、抗体は、本明細書の以下でさらに説明するように、多重特異性抗体である（セクションＩＩ．Ａ．７．）。）。
１．抗体断片
特定の態様では、本明細書において提供される抗原結合ドメインは、抗体フラグメントである。
一態様では、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、又はＦ（ａｂ’）２分子、特に本明細書に記載のＦａｂ分子である。「Ｆａｂ’分子」は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での残基の付加によってＦａｂ分子とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’分子である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ分子）とＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２分子が得られる。
別の態様において、抗体断片は、二重特異性抗体、三重特異性抗体又は四重特異性抗体である。「二重特異性抗体」は、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２９－１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。三重特異性抗体及び四重特異性抗体もまた、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２９－１３４（２００３）に記載されている。
さらなる態様では、抗体断片は単鎖Ｆａｂ分子である。「単鎖Ｆａｂ分子」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に以下の順序のうちの１つを有する：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬ。特に、前記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２～５０個のアミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ分子は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。さらに、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入による鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化される可能性がある（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）。
別の態様では、抗体断片は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。「単鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの融合タンパク質であり、リンカーによって連結されている。特に、リンカーは１０～２５個のアミノ酸の短いポリペプチドであり、通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解性のためにセリン又はトレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続することも、その逆も可能である。このタンパク質は、定常領域の除去とリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ断片のレビューについては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ， ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）， ｐｐ． ２６９－３１５（１９９４）；及びＷＯ９３／１６１８５；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照されたい。
別の態様では、抗体断片は単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」は、抗体の重鎖可変ドメインの全部又は一部、あるいは軽鎖可変ドメインの全部又は一部を含む抗体断片である。特定の態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ， Ｉｎｃ．， Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照されたい。）。
抗体断片は、本明細書に記載のように、無傷の抗体のタンパク質分解消化、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌）による組換え産生を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができる。
２．ヒト化抗体
特定の態様では、本明細書において提供される抗体（例えば二重特異性抗体）はヒト化抗体である。通常、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその部分）がヒト抗体配列に由来する１つ又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。いくつかの態様では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
ヒト化抗体とその作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ， Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ． １３：１６１９－１６３３（２００８）でレビューされており、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号、及び第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域の説明（ＳＤＲ）グラフト化）；Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：４８９－４９８（１９９１）（「ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ」を説明している）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフル」を説明している）；及びＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフルへの「ガイド付き選択」アプローチを説明している。）。
ヒト化に使用できるヒトフレームワーク領域には、以下が含まれるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：２２９６（１９９３）参照。）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：４２８５（１９９２）参照；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１：２６２３（１９９３））；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ， Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ． １３：１６１９－１６３３（２００８）参照。）；及びＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）参照。）。
３．グリコシル化バリアント
特定の態様で、本明細書において提供される抗体（例えば、二重特異性抗体）は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるために変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作成又は除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって簡便に達成することができる。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合するオリゴ糖は変更され得る。哺乳動物細胞によって産生されるネイティブ抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって一般に結合された分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ． ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸などの様々な炭水化物、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」中のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含み得る。いくつかの態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために行われ得る。
一態様では、非フコシル化オリゴ糖、すなわちＦｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠くオリゴ糖構造を有する抗体変異体が提供される。そのような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は、特にＮ結合オリゴ糖であり、これは、二分岐オリゴ糖構造のステムの最初のＧｌｃＮＡｃに結合したフコース残基を欠いている。一態様では、天然抗体又は親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加した抗体変異体が提供される。例えば、非フコシル化オリゴ糖の比率は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は約１００％（すなわち、フコシル化オリゴ糖は存在しない）でさえあり得る。非フコシル化オリゴ糖の割合は、例えばＷＯ２００６／０８２５１５に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法によって測定された場合の、Ａｓｎ ２９７に結合したすべてのオリゴ糖の合計に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である（例えば、複合構造、ハイブリッド構造、及び高マンノース構造。）。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）の約２９７位に位置するアスパラギン残基を指す；が、Ａｓｎ２９７は、抗体のわずかな配列の違いにより、２９７位の約±３アミノ酸上流又は下流、すなわち２９４と３００の間に位置することもある。Ｆｃ領域において非フコシル化オリゴ糖の割合が増加したそのような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合及び／又は改善されたエフェクタ機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＵＳ２００４／００９３６２１を参照されたい。
フコシル化が減少した抗体を産生できる細胞株の例には、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２４９：５３３－５４５（１９８６）；ＵＳ２００３／０１５７１０８；及びＷＯ ２００４／０５６３１２， ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ａｔ Ｅｘａｍｐｌｅ １１）、及びα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８７：６１４－６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照されたい）、又はｃＧＤＰ－フコース合成又はトランスポータータンパク質の活性が低下又は消失した細胞が含まれる（例えば、ＵＳ２００４２５９１５０、ＵＳ２００５０３１６１３、ＵＳ２００４１３２１４０、ＵＳ２００４１１０２８２を参照されたい。）。
さらなる局面において、抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖と共に提供される。そのような抗体変異体は、上記のように、フコシル化の減少及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有する可能性がある。そのような抗体バリアントの例は、例えば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７， １７６－１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３， ８５１－８６１ （２００６）；ＷＯ９９／５４３４２；ＷＯ２００４／０６５５４０、ＷＯ２００３／０１１８７８に記載されている。
Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中の少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体バリアントは、ＣＤＣ機能が改善されている可能性がある。そのような抗体バリアントは、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７；ＷＯ１９９８／５８９６４；及びＷＯ１９９９／２２７６４に記載されている。
４．システイン改変抗体バリアント
特定の態様では、システイン操作抗体、例えば、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されているＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を作製することが望ましい場合がある。好ましい態様では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。本明細書でさらに説明するように、これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置され、抗体を薬物部分又はリンカー－薬物部分などの他の部分に結合させて、免疫複合体を作製するために使用することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、第８，３０，９３０号、第７，８５５，２７５号、第９，０００，１３０号、又はＷＯ２０１６０４０８５６に記載されている。
５．抗体誘導体
特定の態様では、本明細書で提供される抗体（例えば、二重特異性抗体）は、当技術分野で知られており、容易に入手できる追加の非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（グリセロールなど）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性により、製造に利点がある場合がある。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても分岐していなくてもよい。抗体に結合するポリマーの数は様々であり、複数のポリマーが結合している場合、それらは同じ分子又は異なる分子である可能性がある。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下での治療に使用されるかどうかなどを含む考慮事項に基づいて決定できるが、これらに限定されない。
６．免疫複合体
本発明はまた、細胞毒性剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位体などの１つ又は複数の治療薬に複合化（化学結合）された本明細書の抗ＣＤ３／抗ＦｏｌＲ１抗体を含む免疫複合体を提供する。
一態様では、免疫複合体は、抗体が上記の治療薬の１つ又は複数に結合している抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）である。抗体は、典型的には、リンカーを使用して１つ又は複数の治療薬に結合される。治療薬、薬物、リンカーの例を含むＡＤＣ技術の概要は、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ６８：３－１９（２０１６）に記載されている。
別の態様では、免疫複合体は、酵素的に活性な毒素又はその断片に結合した本発明の抗体を含み、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－サルシン、アリューライト・フォーディタンパク質、ダイアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含むが、これらに限定されない。
別の態様では、免疫複合体は、放射性原子に結合して放射性複合体を形成する本発明の抗体を含む。放射性結合体の生成には、様々な放射性同位元素が利用できる。例は、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。放射性複合体を検出に使用する場合、シンチグラフィ研究用の放射性原子、例えば、Ｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、あるいは核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング用のスピン標識（Ｉ１２３、Ｉ１３１、Ｉｎ１１１、Ｆ１９、Ｃ１３、Ｎ１５、Ｏ１７、ガドリニウム、マンガン、又は鉄など（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとも呼ばれる）を含むことができる。
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビスジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、ビス活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製できる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドの結合のためのキレート剤の例である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内での細胞毒性薬の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：１２７－１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
本明細書における免疫複合体又はＡＤＣは、架橋剤試薬で調製されたそのような複合体を明確に意図しているが、これらに限定されず、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、スルホ－ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含み、これらは市場（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ．， Ｕ．Ｓ．Ａ）から入手可能であるがこれらに限定されない。
７．多重特異性抗体
本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、特に二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原決定基（例えば、２つの異なるタンパク質、又は同じタンパク質上の２つの異なるエピトープ）に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、多重特異性抗体は、３つ以上の結合特異性を有する。特定の態様では、結合特異性の一方はＣＤ３に対するものであり、他方の特異性はＦｏｌＲ１に対するものである。特定の態様では、多重特異性抗体は、ＣＤ３の２つ（又はそれ以上）の異なるエピトープに結合し得る。多重特異性（例えば、二重特異性）抗体もまた、細胞障害剤又は細胞をＣＤ３を発現する細胞に局在化するために使用され得る。多重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多特異性抗体を作製する技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現が含まれるが、これらに限定されない（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）を参照）及び「ノブインホール」エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２７０：２６（１９９７）を参照）。多重特異性抗体は、抗体のＦｃヘテロ二量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（例えば、ＷＯ ２００９／０８９００４を参照）；２つ以上の抗体又はフラグメントを架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：８１（１９８５）を参照）；二重特異性抗体を産生するためのロイシンジッパーすること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）及びＷＯ２０１１／０３４６０５を参照）；軽鎖ミスペアリングの問題を回避するための一般的な軽鎖技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）；及びＴｕｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０（１９９１）における単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用することによっても作製することができる。
例えば「オクトパス抗体」又はＤＶＤ－Ｉｇを含む、３つ以上の抗原結合部位を有する操作された抗体も本明細書に含まれる（例えば、ＷＯ２００１／７７３４２及びＷＯ２００８／０２４７１５を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、ＷＯ２０１０／１１５５８９、ＷＯ２０１０／１１２１９３、ＷＯ２０１０／１３６１７２、ＷＯ２０１０／１４５７９２、及びＷＯ２０１３／０２６８３１に見出すことができる。多重特異性抗体又はその抗原結合断片はまた、ＣＤ３及び別の異なる抗原、又はＣＤ３の２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０及びＷＯ２０１５／０９５５３９）。
多重特異性抗体は、同じ抗原特異性の１つ又は複数の結合アームにドメインが交差する非対称形で（いわゆる「ＣｒｏｓｓＭａｂ」技術）、すなわち、ＶＨ／ＶＬドメインを交換することによって（例えば、ＷＯ２００９／０８０２５２及びＷＯ２０１５／１５０４４７を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば、ＷＯ２００９／０８０２５３を参照）又は完全なＦａｂアーム（例えば、ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２０１６／０１６２９９を参照。Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， １０８（２０１１）１１８７－１１９１、及びＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０も参照）で提供することもできる。非対称Ｆａｂアームは、ドメインインターフェースに荷電又は非荷電アミノ酸変異を導入して正しいＦａｂペアリングを指示することによって操作することもできる。例えば、ＷＯ２０１６／１７２４８５を参照。
異なる特異性の結合アームが共通の軽鎖を共有する多重特異性抗体も提供される。本発明の発明者等は、結合部分が、ＣＤ３に対する親の単一特異性抗体の特異性及び有効性を保持し、同じ軽鎖を使用して第２の抗原（例えば、ＦｏｌＲ１）に結合できる共通の軽鎖を共有する二重特異性抗体を生成した。親抗体の結合特性を保持する共通の軽鎖を有する二重特異性分子の生成は、ハイブリッド軽鎖の共通のＣＤＲが両方のターゲットに対する結合特異性を実現する必要があるため、簡単ではない。一態様では、本発明は、第１及び第２の抗原結合部分を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供し、その一方はＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子であり、他方はＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子であり、第１及び第２のＦａｂ分子が同一のＶＬＣＬ軽鎖を有する。一実施形態では、前記同一の軽鎖（ＶＬＣＬ）は、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲを含む。一実施形態では、前記同一軽鎖（ＶＬＣＬ）は、配列番号１２９を含む。
多重特異性抗体の様々なさらなる分子形式が当技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６を参照）。
本明細書にも含まれる特定のタイプの多重特異性抗体は、ＦｏｌＲ１などの表面抗原に、標的細胞上、例えば、腫瘍細胞、及び標的細胞を殺すためにＴ細胞を再標的化するための、ＣＤ３などのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化、不変成分に同時に結合するように設計された二重特異性抗体である。したがって、好ましい態様では、本明細書において提供される抗体は、結合特異性の一方がＣＤ３に対するものであり、他方がＦｏｌＲ１に対するものである多重特異性抗体、特に二重特異性抗体である。
この目的に有用であり得る二重特異性抗体フォーマットの例には、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ）分子が含まれるが、これらに限定されず、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合されている（例えば、ＷＯ２００４／１０６３８１、ＷＯ２００５／０６１５４７、ＷＯ２００７／０４２２６１、及びＷＯ２００８／１１９５６７、Ｎａｇｏｒｓｅｎ及びＢａｕｅｒｌｅ、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７、１２５５－１２６０（２０１１））；二重特異性抗体（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９， ２９９－３０５（１９９６））及びタンデム型二重特異性抗体などのその誘導体（「ＴａｎｄＡｂ」；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３， ４１－５６（１９９９））；二重特異性抗体フォーマットに基づくが、追加の安定化のためにＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（ｄｕａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９９， ４３６－４４９（２０１０））、及びいわゆる全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であるトリオマブ（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ３６， ４５８－４６７（２０１０）でレビュー）。本明細書に含まれる特定のＴ細胞二重特異性抗体フォーマットは、ＷＯ２０１３／０２６８３３、ＷＯ２０１３／０２６８３９、ＷＯ２０１６／０２０３０９；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。
本発明の多重特異性抗体の好ましい態様を以下に記載する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載のように、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含み、ＦｏｌＲ１に結合する第２及び任意選択的に第３の抗原結合ドメインを含む、ＣＤ３に結合する抗体を提供する。
本発明の好ましい態様によれば、抗体に含まれる抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子（すなわち、重鎖及び軽鎖から構成され、それぞれ可変ドメイン及び定常ドメインを含む抗原結合ドメイン）である。一態様では、第１、第２及び／又は存在する場合に第３の抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。一態様では、前記Ｆａｂ分子はヒトのものである。好ましい態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。さらに別の態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
本発明による好ましい態様では、（多重特異性）抗体は、第１の抗原（すなわちＣＤ３）及び第２の抗原（すなわちＦｏｌＲ１）に同時に結合することができる。一態様では、（多重特異性）抗体は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１への同時結合によってＴ細胞及び標的細胞を架橋することができる。さらにより好ましい態様では、そのような同時結合は、標的細胞、特に標的細胞抗原（すなわち、ＦｏｌＲ１）発現腫瘍細胞の溶解をもたらす。一態様では、そのような同時結合はＴ細胞の活性化をもたらす。他の態様では、そのような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクタ分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現の群から選択されるＴリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答をもたらす。一態様では、ＦｏｌＲ１への同時結合なしの（多重特異性）抗体のＣＤ３への結合は、Ｔ細胞の活性化をもたらさない。
一態様では、（多重特異性）抗体は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を標的細胞に再指向することができる。好ましい態様では、前記再指向は、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原提示及び／又はＴ細胞の特異性とは無関係である。
好ましくは、本発明の態様のいずれかによるＴ細胞は細胞障害性Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞、特にＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
ａ）第１の抗原結合ドメイン
本発明の（多重特異性）抗体は、ＣＤ３に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン（第１の抗原結合ドメイン）を含む。好ましい態様において、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３（配列番号１１２）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号１１３）、最も特にヒトＣＤ３である。一態様では、第１の抗原結合ドメインは、ヒト及びカニクイザルＣＤ３に対して交差反応性である（すなわち、特異的に結合する）。いくつかの態様では、ＣＤ３はＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３イプシロン）である。
好ましい態様では、（二重特異性）抗体は、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインを１つ以下含む。一態様では、（二重特異性）抗体は、ＣＤ３への一価結合を提供する。
一態様では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。好ましい態様では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。
ｂ）第２（及び第３）の抗原結合ドメイン
特定の態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、第２の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子を含む。第２の抗原は、好ましくはＣＤ３ではない、すなわちＣＤ３とは異なる。一態様では、第２の抗原は、ＣＤ３とは異なる細胞で発現される（例えば、Ｔ細胞以外の細胞で発現される）抗原である。一態様では、第２の抗原は標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原である。好ましい実施形態では、第２の抗原はＦｏｌＲ１である。第２の抗原結合ドメインは、（多重特異性）抗体を標的部位、例えば第２の抗原を発現する特定のタイプの腫瘍細胞に指向させることができる。
一態様では、第２の抗原（すなわちＦｏｌＲ１）に結合する抗原結合ドメインは、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。好ましい態様では、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。
特定の態様では、（多重特異性）抗体は、第２の抗原に結合する２つの抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子を含む。好ましいそのような態様では、これらの抗原結合ドメインのそれぞれが同じ抗原決定基に結合する。さらにより好ましい態様では、これらの抗原結合ドメインのすべてが同一である、すなわち、それらは同じ分子形式（例えば、従来のＦａｂ分子）を有し、本明細書に記載されているのと同じアミノ酸置換をＣＨ１及びＣＬドメインに含む同じアミノ酸配列を含む（存在する場合）。一態様では、（多重特異性）抗体は、第２の抗原に結合する２つ以下の抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子を含む。
一態様では、第２（及び、存在する場合は第３）の抗原結合ドメインは、ヒト定常領域を含む。一態様では、第２（及び存在する場合は第３）抗原結合ドメインは、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号１２０及び１２１（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）及び配列番号１２２（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に示されている。一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１２０又は配列番号１２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、特に配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書で「電荷修飾」の下に記載されるアミノ酸変異を含んでもよく、及び／又はｃｒｏｓｓｏｖｅｒ Ｆａｂ分子の場合、１つ又は複数（特に２つ）のＮ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでもよい。いくつかの態様では、第（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１２２のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」の下に記載されるアミノ酸変異を含み得る。
ＴＹＲＰ－１
本開示のいくつかの態様において、第２の抗原は、ＴＹＲＰ－１、特にヒトＴＹＲＰ－１（配列番号：１１４）である。
一態様では、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１６のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７のＨＣＤＲ３含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１９の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２０のＬＣＤＲ２及び配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一態様では、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、ヒト化抗体（由来）である。一態様では、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、ヒト化抗原結合ドメイン（すなわち、ヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様では、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト化可変領域である。
一態様では、第２（存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、受容体ヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８の１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）から構成される。一態様では、ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗体はＴＹＲＰ－１に結合する能力を保持する。特定の態様では、配列番号１８のアミノ酸配列において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）で起こる。一態様では、ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＶＨは配列番号１８のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２の１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）から構成される。一態様では、ＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗体はＴＹＲＰ－１に結合する能力を保持する。特定の態様では、配列番号２２のアミノ酸配列において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）で起こる。一態様では、ＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＶＬは配列番号２２のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは配列番号１８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１８の配列を含むＶＨと、配列番号２２の配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１８のＶＨ配列と、配列番号２２のＶＬ配列とを含む。
別の態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号２２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号２２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインＶＨは、配列番号１８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１８のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＶＨは、配列番号１８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１８のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＨは、配列番号１８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１８のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインＶＬは、配列番号２２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号２２のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＶＬは、配列番号２２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号２２のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＬは、配列番号２２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号２２のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ
本開示のいくつかの態様において、第２の抗原は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、特にヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号：１１５）である。
一態様では、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号８５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８６のＨＣＤＲ２、及び配列番号８７のＨＣＤＲ３含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８９の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９０のＬＣＤＲ２及び配列番号９１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一態様では、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、ヒト化抗体（由来）である。一態様では、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、ヒト化抗原結合ドメイン（すなわち、ヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様では、第２（及び、存在する場合は第３）抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト化可変領域である。
一態様では、第２（存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、受容体ヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号８８の１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）から構成される。一態様では、ＶＨは、配列番号８８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号８８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号８８のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、それを含む抗体は、配列はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する能力を保持している。特定の態様では、配列番号８８のアミノ酸配列において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）で起こる。一態様では、ＶＨは、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＶＨは配列番号８８のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号９２の１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）から構成される。一態様では、ＶＬは、配列番号９２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号９２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号９２のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、それを含む抗体は、配列はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する能力を保持している。特定の態様では、配列番号９２のアミノ酸配列において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）で起こる。一態様では、ＶＬは、配列番号９２のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＶＬは配列番号９２のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号８８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号９２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは配列番号８８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号９２のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号８８の配列を含むＶＨと、配列番号９２の配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号８８のＶＨ配列と、配列番号９２のＶＬ配列とを含む。
別の態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号８８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号９２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号８８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号９２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインＶＨは、配列番号８８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号８８のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＶＨは、配列番号８８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号８８のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＨは、配列番号８８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号８８のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインＶＬは、配列番号９２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号９２のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＶＬは、配列番号９２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号９２のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＬは、配列番号９２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号９２のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
別の態様では、第２（及び存在する場合は第３）の抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに関して上記のセクションで提供される態様のいずれかにおけるＶＨ配列、及び該セクションで提供される態様のいずれかにおけるＶＬ配列を含むが、配列番号８５（ＨＣＤＲ１）、８６（ＨＣＤＲ２）、８７（ＨＣＤＲ３）、８８（ＶＨ）、８９（ＬＣＤＲ１）、９０（ＬＣＤＲ２）、９１（ＬＣＤＲ３）及び９２（ＶＬ）の代わりに、次の配列（行の順序）に基づく：
Figure 2023531625000001
ＦｏｌＲ１
本開示のいくつかの態様において、第２の抗原は、ＦｏｌＲ１、特にヒトＦｏｌＲ１（配列番号：１３７）である。
一態様では、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１２４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１２５のＨＣＤＲ２、及び配列番号１２６のＨＣＤＲ３含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一態様では、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、ヒト化抗体（由来）である。一態様では、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、ヒト化抗原結合ドメイン（すなわち、ヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様では、第２（及び、存在する場合は第３）抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト化可変領域である。
一態様では、第２（存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、受容体ヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１２３の１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）から構成される。一態様では、ＶＨは、配列番号１２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号１２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号１２３のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗体はＦｏｌＲ１に結合する能力を保持する。特定の態様では、配列番号１２３のアミノ酸配列において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）で起こる。一態様では、ＶＨは、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＶＨは配列番号１２３のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１１の１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）から構成される。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗体はＦｏｌＲ１に結合する能力を保持する。特定の態様では、配列番号１１のアミノ酸配列において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）で起こる。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＶＬは配列番号１１のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは配列番号１２３のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１２３の配列を含むＶＨと、配列番号１１の配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１２３のＶＨ配列と、配列番号１１のＶＬ配列とを含む。
別の態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１２３のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１２３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号１１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインＶＨは、配列番号１２３のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１２３のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＶＨは、配列番号１２３のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１２３のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＨは、配列番号１２３のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１２３のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインＶＬは、配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１１のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１１のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＶＬは、配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１１のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、第２（及び、存在する場合は第３）抗原結合ドメインは、上記のこのセクションで提供される態様のいずれかにおけるＶＨ配列、及び上記のこの節で提供される態様のいずれかにおけるＶＬ配列を含む。
抗ＴＹＲＰ－１及び抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体
本開示はまた、ＴＹＲＰ－１に関して上記のこのセクションで提供される態様のいずれかにおけるようなＶＨ配列、及びＴＹＲＰ－１に関して上記のこのセクションで提供される態様のいずれかにおけるようなＶＬ配列を含む、ＴＹＲＰ－１に結合する抗体を提供する（例えば、配列番号１５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１６のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１９の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２０のＬＣＤＲ２及び配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、ＴＹＲＰ－１に結合する抗体；又は配列番号１８の配列を含むＶＨと、配列番号２２の配列を含むＶＬとを含む、ＴＹＲＰ－１に結合する抗体）。
本開示はまた、ＥＧＦＲｖＩＩＩに関して上記のこのセクションで提供される態様のいずれかにおけるようなＶＨ配列、及びＥＧＦＲｖＩＩＩに関して上記のこのセクションで提供される態様のいずれかにおけるようなＶＬ配列を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する抗体を提供する（例えば、配列番号８５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８６のＨＣＤＲ２、及び配列番号８７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８９の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９０のＬＣＤＲ２及び配列番号９１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する抗体；又は配列番号８８の配列を含むＶＨと、配列番号９２の配列を含むＶＬとを含む、ＴＹＲＰ－１に結合する抗体）。
抗ＦｏｌＲ１抗体
本発明はまた、ＦｏｌＲ１に関して上記のこのセクションで提供される態様のいずれかにおけるようなＶＨ配列、及びＦｏｌＲ１に関して上記のこのセクションで提供される態様のいずれかにおけるようなＶＬ配列を含む、ＦｏｌＲ１に結合する抗体を提供する（例えば、配列番号１２４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１２５のＨＣＤＲ２、及び配列番号１２６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、ＦｏｌＲ１に結合する抗体；又は配列番号１２３の配列を含むＶＨと、配列番号１１の配列を含むＶＬとを含む、ＦｏｌＲ１に結合する抗体）。
本発明のさらなる態様では、上記の態様のいずれかによるＦｏｌＲ１に結合する抗体は、ＣＤ３に結合する抗体に関して記載した特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる（結合配列など、抗ＣＤ３抗体に明確に特異的でない限り）。
ｃ）電荷の変更
本発明の（二重特異性）抗体は、そこに含まれるＦａｂ分子にアミノ酸置換を含んでもよく、軽鎖と一致しない重鎖とのミスペアリング（ベンス・ジョーンズ型副産物）を減少させるのに特に有効であり、これは、結合アームの１つ（２つ以上の抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合は２つ以上）でＶＨ／ＶＬ交換を伴うＦａｂベースの多重特異性抗体の産生で発生する可能性がある（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／１５０４４７も参照されたい。特にその中の例は、その全体が本明細書に特にその中の例は、その全体が参照により本明細書に援用される）。望ましくない副産物と比較した望ましい（二重特異性）抗体の比率、特に、結合アームの１つでＶＨ／ＶＬドメイン交換を伴う多重特異性抗体で発生するベンスジョーンズ型の副産物は、ＣＨ１及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に反対の電荷を持つ荷電アミノ酸を導入することで改善できる（本明細書では「電荷修飾」と呼ばれることもある）。
したがって、いくつかの態様では、（二重特異性）抗体の第１及び第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインが両方ともＦａｂ分子であり、抗原結合ドメインの１つ（特に第１の抗原結合ドメイン）において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置換され、
ｉ）第２（及び、存在する場合に第３）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、第２（及び、存在する場合に第３）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸によって置換される（Ｋａｂａｔ Ｅｕインデックスによる番号付け）か；あるいは
ｉｉ）第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換され、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は負に荷電したアミノ酸に置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
（二重特異性）抗体は、ｉ）及びｉｉ）で言及された修飾の両方を含まない。ＶＨ／ＶＬ交換を有する抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置換されない（すなわち、未交換のままである）。
より具体的な態様では、
ｉ）第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔｔによる番号付け）によって独立して置換され、且つ第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている；あるいは
ｉｉ）第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔｔによる番号付け）によって置換されており、且つ、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔｔ ＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
一態様では、第２（及び、存在する場合は第３）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（番号付けＫａｂａｔによる）、及び第２（存在する場合は第３）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸によって独立して置換されている酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらなる態様では、第２（存在する場合は第３）抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔｔによる番号付け）によって置換されており、且つ、第２（存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔｔ ＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
好ましい態様では、第２（存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって独立して置換されており、且つ、第２（存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔｔ ＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、且つ、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔｔ ＥＵインデックスによる番号付け）によって独立して置換されている。
より好ましい態様では、第２（存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）で置換されており、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）に置換されており（ナンバリングはＫａｂａｔによる）、且つ、第２（存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）に置換され、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらにより好ましい態様では、第２（存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）で置換され、１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ第２（存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）に置換され、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
好ましい態様では、上記の局面によるアミノ酸置換が定常ドメインＣＬ及び第２（存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１で行われる場合、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。
あるいはまた、上記の態様よるアミノ酸置換は、定常ドメインＣＬ及び第２（存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１に代えて、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１においてなされ得る。好ましいそのような態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプのものである。
したがって、一態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって独立して置換され、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１は、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）に置換されている（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる）。
さらなる態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、且つ、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されている。
さらに別の態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって置換されており、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって独立して置換されており、且つ、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔｔ ＥＵインデックスによる番号付け）によって置換されており、且つ、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔｔ ＥＵインデックスによる番号付け）によって独立して置換されている。
一態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）で置換されており、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）に置換されており（ナンバリングはＫａｂａｔによる）、且つ、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）に置換され、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
別の態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）で置換され、１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）に置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）に置換され、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
好ましい態様では、本発明の（二重特異性）抗体は、
（ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換され、且つ、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）標的抗原に結合する第２及び場合により第３の抗原結合ドメインであって；
第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して（好ましい態様では、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立して）（Ｋａｂａｔｔによる番号付け）置換されており、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して（好ましい態様では、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって独立して）（Ｋａｂａｔｔによる番号付け）置換されており、第２（存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されており（Ｋａｂａｔｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
ｄ）多重特異性抗体フォーマット
本発明による（二重特異性及び／又は多重特異性）抗体は、様々な構成を有することができる。例示的な構成が図１に示されている。
好ましい態様では、（多重特異性）抗体に含まれる抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。そのような態様では、第１、第２、第３などの抗原結合ドメインは、本明細書ではそれぞれ第１、第２、第３などのＦａｂ分子と呼ぶことができる。
一態様では、（二重特異性）抗体の第１及び第２の抗原結合ドメインは、場合によりペプチドリンカーを介して互いに融合される。好ましい態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子である。一態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。別のそのような態様では、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。（ｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されるか、あるいは（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される態様では、追加的に、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合ドメインのＦａｂ軽鎖は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合され得る。
単一の抗原結合ドメイン（Ｆａｂ分子など）を有する（二重特異性）抗体は、第２の抗原、例えば、ＦｏｌＲ１などの標的細胞抗原に特異的に結合することができる（例えば、図１のＡ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ）は、特に高親和性抗原結合ドメインの結合後に第２の抗原の内在化が予想される場合に有用である。そのような場合、第２の抗原に特異的な２つ以上の抗原結合ドメインの存在は、第２の抗原のインターナリゼーションを増強し、それによってその利用可能性を低下させる可能性がある。
しかしながら、他の場合には、第２の抗原、例えば標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合ドメイン（Ｆａｂ分子など）を含む（二重特異性）抗体を有することが有利であり（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｍ、１Ｎ、３３Ａ、３３Ｂに示される例を参照）、例えば、標的部位への標的化を最適化したり、標的細胞抗原の架橋を可能にしたりする。
したがって、好ましい態様では、本発明による（多重特異性、例えば、二重特異性）抗体は、第３の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、第３の抗原結合ドメインは、第２の抗原、例えば、ＦｏｌＲ１などの標的細胞抗原に結合する。一態様では、第３の抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。
一態様では、第３の抗原ドメインは第２の抗原結合ドメインと同一である。
いくつかの態様では、第３及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、第３の抗原結合ドメインは第２の抗原結合ドメインと同一である。したがって、これらの態様では、第２及び第３の抗原結合ドメインは、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、ドメインの同じ配置（すなわち、従来型又はクロスオーバー）を有する。さらに、これらの態様では、第３の抗原結合ドメインは、もしあれば、第２の抗原結合ドメインと同じアミノ酸置換を含む。例えば、「電荷修飾」として本明細書に記載されるアミノ酸置換は、第２の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインのそれぞれの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われる。あるいはまた、前記アミノ酸置換は、定常ドメインＣＬ及び第１の抗原結合ドメイン（好ましい態様ではこれもＦａｂ分子である）の定常ドメインＣＨ１で行うことができるが、第２の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１には含まれない。
第２の抗原結合ドメインと同様に、第３の抗原結合ドメインは、好ましくは従来のＦａｂ分子である。すべてのＦａｂ分子が共通の軽鎖を共有していてもよい。しかしながら、第２及び第３の抗原結合ドメインがクロスオーバーＦａｂ分子である（及び第１の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である）態様も企図される。したがって、いくつかの態様では、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、交換／互いに置換されているＦａｂ分子である。他の態様では、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
第３の抗原結合ドメインが存在する場合、好ましい態様では、第１の抗原ドメインはＣＤ３に結合し、第２及び第３の抗原結合ドメインは第２の抗原、特にＦｏｌＲ１などの標的細胞抗原に結合する。
上記及び図３３Ａ～図３３Ｅに示すように、一実施形態では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、２つの異なる抗原に対する特異性を付与する、同一の軽鎖（ＶＬＣＬ）及び異なる重鎖（ＶＨＣＬ）を有する少なくとも２つのＦａｂ断片を含む、すなわち、一方のＦａｂ断片はＴ細胞活性化抗原ＣＤ３に特異的に結合することができ、他方のＦａｂ断片は標的細胞抗原ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる。
好ましい態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットは、安定した会合が可能である。
本発明による（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、異なる構成を有することができる。すなわち、第１、第２（及び場合により第３）抗原結合ドメインは、互いに及びＦｃドメインに異なる方法で融合することができる。構成要素は、互いに直接、又は好ましくは、１つ又は複数の適切なペプチドリンカーを介して融合され得る。Ｆａｂ分子の融合がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端にある場合、典型的には免疫グロブリンヒンジ領域を介する。
いくつかの態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合される。そのような態様では、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に、又はＦｃドメインのサブユニットの他の１つのＮ末端に融合され得る。好ましいそのような態様では、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに交換／置換されているＦａｂ分子である。他のそのような態様では、第２の抗原結合ドメインはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
一態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。特定の態様では、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、本質的に第１及び第２のＦａｂ分子からなり、Ｆｃドメインは、第１及び第２のサブユニット、及び任意で１つ又は複数のペプチドリンカーから構成され、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合される。そのような構成は、図１Ｇ及び１Ｋに概略的に示されている（これらの例における第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合され得る。
別の態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、第１及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合される。特定の態様では、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、本質的に第１及び第２のＦａｂ分子からなり、Ｆｃドメインは、第１及び第２のサブユニット、及び任意に１つ又は複数のペプチドリンカーから構成され、第１及び第２のＦａｂ分子はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合される。そのような構成は、図１Ａ及び図１Ｄ（これらの例では、第１の抗原結合ドメインがＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である）及び図３３Ｅ（この例では、第１及び第２の抗原結合ドメインの軽鎖は同一である）に概略的に示されている。第１及び第２のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合され得る。好ましい態様では、第１及び第２のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合される。特定の態様では、免疫グロブリンヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１Ｆｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
いくつかの態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合される。そのような態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に、又は（上述のように）Ｆｃドメインのサブユニットの他の１つのＮ末端に融合され得る。好ましいそのような態様では、前記第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、交換／互いに置換されているＦａｂ分子である。他のそのような態様では、前記第２の抗原結合ドメインはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
一態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合され、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。特定の態様では、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、本質的に第１及び第２のＦａｂ分子からなり、Ｆｃドメインは、第１及び第２のサブユニット、及び任意で１つ又は複数のペプチドリンカーから構成され、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合される。そのような構成は、図１Ｈ及び図１Ｌ（これらの例では、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）及び図３３Ｃ及び図Ｄ（これらの例では第一及び第二の抗原結合ドメインの軽鎖は同一である）に概略的に示されている。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合され得る。
好ましいそのような態様では、第１及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。特定の態様では、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、本質的に第１、第２及び第３のＦａｂ分子からなり、Ｆｃドメインは、第１及び第２のサブユニット、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーから構成され、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合される。
第１及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合され得る。好ましい態様では、第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合される。特定の態様では、免疫グロブリンヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１Ｆｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合され得る。
別のそのような態様では、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合され、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。特定の態様では、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、本質的に第１、第２及び第３のＦａｂ分子からなり、Ｆｃドメインは、第１及び第２のサブユニット、及び任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーから構成され、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合される。第２及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合され得る。好ましい態様では、第２及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合される。特定の態様では、免疫グロブリンヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１Ｆｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、さらに互いに融合され得る。
Ｆａｂ分子がＦａｂ重鎖のＣ末端で免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインの各サブユニットのＮ末端に融合される（多重特異性）抗体の構成において、２つのＦａｂ分子は、ヒンジ領域とＦｃドメインは、本質的に免疫グロブリン分子を形成する。好ましい態様では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。さらにより好ましい態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。さらに好ましい態様では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。他の態様では、免疫グロブリンはキメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一態様では、免疫グロブリンはヒト定常領域、特にヒトＦｃ領域を含む。
本発明の（多重特異性）抗体のいくつかにおいて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合される。第１及び第２のＦａｂ分子の構成に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合され得るか、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合され得る。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合は、一致しないＦａｂ重鎖及び軽鎖のミスペアリングをさらに低減し、また、本発明の（多重特異性）抗体のいくつかの発現に必要なプラスミドの数を減少させる。
抗原結合ドメインは、Ｆｃドメインに、又は互いに直接、又はペプチドリンカーを介して融合され得、１つ又は複数のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含む。ペプチドリンカーは当技術分野で知られており、本明細書に記載されている。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は一般に１～１０の整数であり、典型的には２～４である。一態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５個のアミノ酸長、一態様では５～１００個のアミノ酸長、さらなる態様では１０～５０個のアミノ酸長を有する。一態様では、前記ペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍである（式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３）、あるいは（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５及びｍ＝０、１、２又は３）であり、一態様ではｘ＝４、及びｎ＝２又は３、さらなる態様ではｘ＝４、及びｎ＝２である。）。一態様では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合させるのに特に適したペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂフラグメントのＦａｂ重鎖を接続するのに適した例示的なペプチドリンカーは、配列（Ｄ）－（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１１８及び１１９）を含む。別の適切なそのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。さらに、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含み得る。特にＦａｂ分子がＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合される場合、追加のペプチドリンカーの有無にかかわらず、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して融合され得る。
いくつかの態様では、二重特異性抗原結合分子は、共通の軽鎖を含む。一態様では、本発明は、第１及び第２の抗原結合部分を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、その一方はＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子であり、他方はＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子であり、第１及び第２のＦａｂ分子が同一のＶＬＣＬ軽鎖を有する。一実施形態では、前記同一の軽鎖（ＶＬＣＬ）は、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲを含む。一実施形態では、前記同一軽鎖（ＶＬＣＬ）は、配列番号１３３を含む。
一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供するものであって、該Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）第１の抗原結合部分であって、ＣＤ３に特異的に結合できるＦａｂ分子であり、配列番号２、配列番号３及び配列番号５からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む、第１の抗原結合部分；（ｉｉ）第２の抗原結合部分であって、配列番号１２４、配列番号１２５及び配列番号１２６からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む、第２の抗原結合部分を含む。
そのような一実施形態では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１を含み、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３、ＦｏｌＲ１抗原結合部分５は、配列番号１２４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１２６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、本発明は、（ｉ）第１の抗原結合部分であって、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含むＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分と、（ｉｉ）第２の抗原結合部分であって、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分とを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
一実施形態では、本発明は、（ｉ）第１の抗原結合部分であって、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含むＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、（ｉｉ）第２の抗原結合部分であって、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分とを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
一実施形態では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、（ｉｉｉ）ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第３の抗原結合部分（Ｆａｂ分子である）をさらに含む。
そのような一実施形態では、ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第２及び第３の抗原結合部分は、同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。そのような一実施形態では、第３の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分と同一である。
したがって、一実施形態では、本発明は、以下を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
（ｉ）第１の抗原結合部分であって、ＣＤ３に特異的に結合できるＦａｂ分子であり、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、第１の抗原結合部分；と
（ｉｉ）第２の抗原結合部分であって、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合できるＦａｂ分子であり、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、第２の抗原結合部分と；
（ｉｉｉ）第３の抗原結合部分であって、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合できるＦａｂ分子であり、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び配列番号３２、配列番号５、３３、配列番号３４の群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む、第３の抗原結合部分。
そのような一実施形態では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１を含み、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３、ＦｏｌＲ１抗原結合部分は、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一実施形態では、本発明は、以下を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
（ｉ）第１の抗原結合部分であって、配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）第２の抗原結合部分であって、配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分と
（ｉｉｉ）第３の抗原結合部分であって、配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第３の抗原結合部分。
したがって、一実施形態では、本発明は、少なくとも２つの結合部分が、Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ３及び標的細胞抗原ＦｏｌＲ１にそれぞれ特異的結合を付与する同一の軽鎖及び対応する修飾された重鎖を有する二重特異性分子に関する。このいわゆる「共通の軽鎖」の原則、つまり、１つの軽鎖を共有するが個別の特異性を持つ２つのバインダを組み合わせることで、軽鎖のミスペアリングが防止される。したがって、生産中の副産物が少なくなり、二重特異性抗原結合分子を活性化するＴ細胞の均質な調製が容易になる。
いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定した会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。以下に、Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の例示的な実施形態を記載する。
一態様では、本発明は、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体であって、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号５のＨＣＤＲ３と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）第２の抗原結合ドメインであって、第２の抗原、特に標的細胞抗原、より具体的にはＦｏｌＲ１に結合し、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；
を含む抗体を提供し、
（ｉ）ａ）の下の最初の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端で、ｂ）の下の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の下の第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｃ）の下のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されているか、あるいは
（ｉｉ）ｂ）の下の第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ａ）の下の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ａ）の下の第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｃ）の下のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されている。
好ましい局面において、本発明は、（多重特異性）抗体であって、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号５のＨＣＤＲ３と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２および配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原、特に標的細胞抗原、より具体的にはＦｏｌＲ１に結合し、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むそれぞれがＦａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；
を含む抗体を提供し、
（ｉ）ａ）の下の最初の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端で、ｂ）の下の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の下の第２の抗原結合ドメイン及びｂ）の下の第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｃ）の下のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端にそれぞれ融合しているか、あるいは、
（ｉｉ）ｂ）の下の第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ａ）の下の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ａ）の下の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の下の第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｃ）の下のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端にそれぞれ融合されている。
別の態様では、本発明は、（多重特異性）抗体であって、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号５のＨＣＤＲ３と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）第２の抗原結合ドメインであって、第２の抗原、特に標的細胞抗原、より具体的にはＦｏｌＲ１に結合し、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと；
を含む抗体を提供し、
（ｉ）ａ）の下の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の下の第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）の下のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端にそれぞれ融合している。
上記の態様のいずれかによれば、（多重特異性、例えば、二重特異性）抗体（例えば、Ｆａｂ分子、Ｆｃドメイン）の構成要素は、直接又は様々なリンカー、特に１個又は複数個のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合することができ、これらは、本明細書に記載されているか、又は当技術分野で知られている。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、ｎは一般に１～１０、典型的には２～４の整数である。
好ましい局面において、本発明は、（二重特異性）抗体であって、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインはＦａｂであり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１を含む重鎖可変領域ＶＨ）、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む第１の抗原結合ドメインと；
ｂ）ＦｏｌＲ１に結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれＦａｂ分子であり、配列番号１２４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１２５のＨＣＤＲ２、及び配列番号１２６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む第２及び第３の抗原結合ドメインと；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン；と
を含む抗体を提供し、
第１の抗原結合ドメイン及び第２と第３の抗原結合ドメインは、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
本発明のこれらの態様による一態様では、Ｆｃドメインの最初のサブユニットでは、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基（Ｔ３６６Ｗ）に置き換えられ、Ｆｃドメインの２番目のサブユニットでは、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置換され（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的に３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基はアラニン残基（Ｌ３６８Ａ）で置換される（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本発明のこれらの態様によるさらなる態様では、Ｆｃドメインの最初のサブユニットでは、さらに３５４位のセリン残基がシステイン残基に置換されている（Ｓ３５４Ｃ）、３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基に置換されている（Ｅ３５６Ｃ）（特に、３５４位のセリン残基がシステイン残基に置換されている）、及びＦｃドメインの第２のサブユニットでは、さらに３４９位のチロシン残基がシステイン残基（Ｙ３４９Ｃ）に置換される（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本発明のこれらの態様によるさらに別の態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２サブユニットのそれぞれにおいて、２３４位のロイシン残基がアラニン残基に置換され（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基がアラニン残基（Ｌ２３５Ａ）に置換され、３２９位のプロリン残基はグリシン残基（Ｐ３２９Ｇ）で置換される（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本発明のこれらの態様によるさらに別の態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインである。
好ましい具体的な態様では、二重特異性抗体は、配列番号１２７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）を含む。さらなる好ましい具体的態様において、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、配列番号１２７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）を含む。
好ましい一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供し、該抗体は、配列番号１２７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号１２８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）を含む。好ましい一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供し、該抗体は、配列番号１２７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）。
具体的な態様では、二重特異性抗体は、配列番号１３０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）を含む。さらなる具体的態様において、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）を含む。
一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供し、該抗体は、配列番号１３０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号１２８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）を含む。一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供し、該抗体は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）を含む。
具体的な態様では、二重特異性抗体は、配列番号１３１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１３２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）を含む。さらなる具体的態様において、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）を含む。
一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供し、該抗体は、配列番号１３１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号１３２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）を含む。一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１－１に結合する二重特異性抗体を提供し、該抗体は、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）を含む。
具体的な態様では、二重特異性抗体は、配列番号１３３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１３４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）を含む。さらなる具体的態様において、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、配列番号１３３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）を含む。
一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供し、該抗体は、配列番号１３３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号１３４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）を含む。一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供し、該抗体は、配列番号１３３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に３つのポリペプチド）を含む。
具体的な態様では、二重特異性抗体は、配列番号１３５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１３６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）を含む。さらなる具体的態様において、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、配列番号１３５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）を含む。
一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供し、該抗体は、配列番号１３５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号１３６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）を含む。一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を提供し、該抗体は、配列番号１３５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）を含む。
ｅ）Ｆｃドメインバリアント
好ましい態様では、本発明の（多重特異性、例えば、二重特異性）抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。
（多重特異性、例えば二重特異性）抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定した結合が可能である。一態様では、本発明の（多重特異性、例えば、二重特異性）抗体は、１つ以下のＦｃドメインを含む。
一態様では、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体のＦｃドメインはＩｇＧ Ｆｃドメインである。好ましい態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１Ｆｃドメインである。別の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４Ｆｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のｉｎ ｖｉｖｏでのＦａｂアーム交換を減少させる（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８， ８４－９１（２０１０）を参照）。さらなる一態様では、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。より一層好ましい態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的な配列は、配列番号１１７で与えられる。
ｆ）ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの修飾
本発明による（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合され得る異なる抗原結合ドメインを含み、それ故、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、通常、２つの同一でないポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化により、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。したがって、組換え産生における（多重特異性、例えば二重特異性）抗体の収量及び純度を改善するために、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの結合を促進する修飾を導入することが有利である。
したがって、好ましい態様では、本発明による（多重特異性、例えば、二重特異性）抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２サブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のタンパク質間相互作用が最も広範囲に及ぶ部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、一態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
ヘテロ二量体化を強制するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインを修飾するためのいくつかのアプローチが存在し、例えば、ＷＯ ９６／２７０１１、ＷＯ ９８／０５０４３１、ＥＰ １８７０４５９、ＷＯ ２００７／１１０２０５、ＷＯ ２００７／１４７９０１、ＷＯ ２００９／０８９００４、ＷＯ ２０１０／１２９３０４、ＷＯ ２０１１／９０７５４、ＷＯ ２０１１／１４３５４５、ＷＯ ２０１２０５８７６８、ＷＯ ２０１３１５７９５４、ＷＯ ２０１３０９６２９１に、十分説明されている。典型的には、そのようなすべてのアプローチにおいて、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインとＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは両方とも相補的に設計され、それにより、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを構成する重鎖）は、それ自体でホモ二量体化できなくなるが、（第１及び第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量体化し、２つの第１又は２つの第２のＣＨ３ドメイン間にホモ二量体が形成されないように）相補的に操作された他のＣＨ３ドメインと強制的にヘテロ二量体化される。重鎖ヘテロ二量体化を改善するためのこれらの異なるアプローチは、重鎖／軽鎖のミスペアリングとベンス・ジョーンズ型の副産物を減させる（多重特異性、例えば、二重特異性）抗体において、重鎖－軽鎖修飾と組み合わせた異なる選択肢として企図される（例えば、１つの結合アームでのＶＨとＶＬの交換／置換、及びＣＨ１／ＣＬ界面での反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）。
特定の態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの結合を促進する前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」修飾、及びＦｃドメインの２つのサブユニットのもう１つに「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾である。
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、ＵＳ５，７３１，１６８；ＵＳ７，６９５，９３６；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９， ６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８， ７－１５（２００１）に記載されている。概して、該方法は、ヘテロ二量体の形成を促進し、ホモ二量体の形成を妨げるように、隆起を空洞内に配置することができるように、第１のポリペプチドの界面に隆起（「ノブ」）を導入し、第２のポリペプチドの界面に対応する空洞（「ホール」）を導入することを含む。隆起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることによって構築される。大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）で置換することにより、隆起と同一又は同様のサイズの代償空洞が第２のポリペプチドの界面に作られる。
したがって、好ましい態様では、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインは、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に配置可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に隆起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは、アミノ酸残基がより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中に第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が配置可能である。
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。
好ましくは、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
隆起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を修飾することによって、例えば部位特異的突然変異誘発によって、又はペプチド合成によって作製することができる。
特定の態様では、Ｆｃドメイン（のＣＨ３ドメイン）の第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）は、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基（Ｔ３６６Ｗ）に置換され、Ｆｃドメイン（のＣＨ３ドメイン）の第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）が、４０７位のチロシン残基がバリン残基（Ｙ４０７Ｖ）に置換される。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵによる番号付け）。
よりさらなる態様では、Ｆｃドメインの最初のサブユニットでは、さらに３５４位のセリン残基がシステイン残基に置換されている（Ｓ３５４Ｃ）、３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基に置換されている（Ｅ３５６Ｃ）（特に、３５４位のセリン残基がシステイン残基に置換されている）、及びＦｃドメインの第２のサブユニットでは、さらに３４９位のチロシン残基がシステイン残基（Ｙ３４９Ｃ）に置換される（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。これらの２つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、二量体がさらに安定化される（Ｃａｒｔｅｒ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８， ７－１５（２００１））。
好ましい態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
好ましい態様では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、（任意選択的に、第２の抗原（すなわち、ＦｏｌＲ１）に結合する第２の抗原結合ドメイン、及び／又はペプチドリンカーを介して）Ｆｃドメインの第１のサブユニットに（「ノブ」修飾を含む）に融合している。理論に縛られることを望むものではないが、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインをＦｃドメインのノブ含有サブユニットに融合させると、ＣＤ３に結合する２つの抗原結合ドメインを含む抗体の生成が（さらに）最小限に抑えられる（２つのノブ含有ポリペプチドの立体衝突）。
ヘテロ二量体化を実施するためのＣＨ３修飾の他の技術は、本発明による代替法として企図されており、例えば、ＷＯ ９６／２７０１１、ＷＯ ９８／０５０４３１、ＥＰ １８７０４５９、ＷＯ ２００７／１１０２０５、ＷＯ ２００７／１４７９０１、ＷＯ ２００９／０８９００４、ＷＯ ２０１０／１２９３０４、ＷＯ ２０１１／９０７５４、ＷＯ ２０１１／１４３５４５、ＷＯ ２０１２／０５８７６８、ＷＯ ２０１３／１５７９５４、ＷＯ ２０１３／０９６２９１に記載されている。
一態様では、ＥＰ １８７０４５９に記載されているヘテロ二量体化アプローチが代わりに使用される。このアプローチは、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することに基づいている。本発明の（多重特異性）抗体の特定の態様は、２つのＣＨ３ドメインの１つ（Ｆｃドメインの）アミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、並びにＦｃドメインのＣＨ３ドメインのもう１つ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）におけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋである。
別の態様では、本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１サブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗ、及びＦｃドメインの第２サブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、並びに、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）における、さらにアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインのＫ３７０Ｅ及びアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む。
別の態様では、本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１サブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＦｃドメインの第２サブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、あるいは前記（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１サブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２サブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、さらにＦｃドメインの最初のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（すべての番号付けはＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる）。
一態様では、ＷＯ２０１３／１５７９５３号に記載のヘテロ二量体化アプローチが代わりに使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインはさらなるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅ（特にＬ３６８Ｅ）から選択されるアミノ酸変異をさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、ＷＯ２０１２／０５８７６８に記載されているヘテロ二量体化アプローチが代わりに使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様において、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、又はＫ３９２にさらなるアミノ酸変異を含み、例えばａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、又はＫ３９２Ｅ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から選択される。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）をさらに含む。
一態様では、ＷＯ２０１１／１４３５４５に記載のヘテロ二量体化アプローチが、例えば、３６８及び４０９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）からなる群から選択される位置でのアミノ酸修飾とともに、代替的に使用される。
一態様では、上述のノブ・イン・トゥ・ホール技術も使用するＷＯ２０１１／０９０７６２に記載のヘテロ二量体化アプローチが代わりに使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体又はそのＦｃドメインはＩｇＧ２サブクラスのものであり、ＷＯ２０１０／１２９３０４に記載のヘテロ二量体化アプローチが代わりに使用される。
別の態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、例えばＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載されているように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法では、２つのＦｃドメインサブユニットの界面にある１つ又は複数のアミノ酸残基を帯電したアミノ酸残基で置換して、ホモ二量体形成が静電気的に不利になるが、ヘテロ二量体化が静電気的に有利になるようにする。そのような一態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、特にＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）によるＫ３９２又はＮ３９２のアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメインは、正荷電アミノ酸（例えば、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、特にＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、又はＥ３５７Ｋ、より具体的にはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）によるＤ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６、又はＥ３５７のアミノ酸置換を含む。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ４０９又はＲ４０９の負荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、特にＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）によるアミノ酸置換をさらに含む。さらなる態様では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ４３９及び／又はＫ３７０の負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））によるアミノ酸置換をさらに又は代わりに含む（すべての番号付けは、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる））。
さらなる態様では、ＷＯ２００７／１４７９０１に記載されているヘテロ二量体化アプローチが代わりに使用される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、及びＫ２９２Ｄ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
さらに別の態様では、ＷＯ２００７／１１０２０５に記載されているヘテロ二量体化アプローチを代わりに使用することができる。
一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはアミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットはアミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
ｇ）Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクタ機能を低下させるＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、（多重特異性）抗体に、標的組織における良好な蓄積及び好ましい組織血液分布比に寄与する長い血清半減期を含む、好ましい薬物動態特性を付与する。しかし同時に、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する（多重特異性、例えば二重特異性）抗体の望ましくない標的化につながる可能性がある。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の共活性化は、サイトカインの放出につながる可能性があり、Ｔ細胞活性化特性及び（多重特異性）抗体の長い半減期と組み合わせて、サイトカイン受容体の過剰な活性化と、全身投与による重篤な副作用を引き起こす結果となる。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体を有する）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の破壊の可能性により、（多重特異性）抗体の有効性を低下させることさえある。
したがって、好ましい態様では、本発明による（多重特異性、例えば二重特異性）抗体のＦｃドメインは、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクタ機能の低下を示す。そのような一態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）は、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性、例えば二重特異性）抗体）と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の５０％未満、特に２０％未満、より特に１０％未満、最も特に５％未満を示し、及び／又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインドメイン（又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性、例えば二重特異性）抗体）と比較して、エフェクタ機能の５０％未満、特に２０％未満、より特に１０％未満、最も特に５％未満を示す。一態様では、Ｆｃドメインドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性、例えば二重特異性）抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクタ機能を誘導しない。好ましい局面において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、エフェクタ機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ又は複数である。好ましい態様では、エフェクタ機能はＡＤＣＣである。一態様では、Ｆｃドメインドメインは、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性、例えば二重特異性）抗体）が、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性、例えば二重特異性）抗体）のＦｃＲｎへの結合親和性を、約７０％を超える、特に約８０％を超える、さらに特に約９０％を超える場合に達成される。
特定の態様では、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が低下し、及び／又はエフェクタ機能が低下するように操作される。好ましい態様では、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体及び／又はエフェクタ機能への結合親和性を低下させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに同じ１つ又は複数のアミノ酸変異が存在する。一態様では、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合親和性を低下させる。一態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍減少させる。ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合親和性を低下させる２つ以上のアミノ酸変異が存在する態様では、これらのアミノ酸変異の組み合わせは、ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合親和性を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又はさらに少なくとも５０倍にさえ低下させる可能性がある。一態様では、操作されたＦｃドメインを含む（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、修飾されていないＦｃドメインを含む（多重特異性、例えば二重特異性）抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満、特に１０％未満、より特に５％未満を示す。好ましい態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体のそれぞれへの結合が減少する。いくつかの態様では、補体成分への結合親和性、特にＣ１ｑへの結合親和性も低下する。一態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、Ｆｃドメインの前記受容体に対する結合親和性の維持は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性、例えば二重特異性）抗体）が、ＦｃＲｎに対する操作されていない形態のＦｃドメイン（又はＦｃドメインの前記非操作型を含む（多重特異性、例えば二重特異性）抗体）の結合親和性の約７０％を超える場合に達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の（多重特異性）抗体は、そのような親和性の約８０％を超え、さらには約９０％を超えてもよい。特定の態様では、（多重特異性、例えば二重特異性）抗体のＦｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、エフェクタ機能が低下するように操作される。低下したエフェクタ機能には、以下の１つ又は複数を含むことができるが、これらに限定されない：低下した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、低下した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、低下した抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、低下したサイトカイン分泌、低下した抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、低下したＮＫ細胞への結合、低下したマクロファージへの結合、低下した単球への結合、低下した多形核細胞への結合、低下したアポトーシスを誘導する直接シグナル伝達、低下した標的結合抗体の架橋、低下した樹状細胞成熟、又は低下したＴ細胞プライミング。一態様では、低下したエフェクタ機能は、低下したＣＤＣ、低下したＡＤＣＣ、低下したＡＤＣＰ、及び低下したサイトカイン分泌からなる群から選択される１つ又は複数である。好ましい態様では、低下したエフェクタ機能は低下したＡＤＣＣである。一態様では、低下したＡＤＣＣは、非修飾Ｆｃドメイン（又は非修飾Ｆｃドメインを含む（多重特異性、例えば二重特異性）抗体）によって誘導される２０％未満のＡＤＣＣである。
一態様では、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクタ機能を低下させるアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。いくつかの態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。そのような一態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。一態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。より具体的な態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。好ましい態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）にアミノ酸置換を含む。より好ましい態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。具体的には、好ましい態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、すなわち、Ｆｃドメインの第１サブユニットと第２サブユニットのそれぞれにおいて、２３４位のロイシン残基がアラニン残基に置換されており（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基がアラニン残基（Ｌ２３５Ａ）に置換され、及び３２９位のプロリン残基がグリシン残基（Ｐ３２９Ｇ）に置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
そのような一態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、その全体が参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載されているように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（及び補体）結合をほぼ完全に無効にする。ＷＯ２０１２／１３０８３１はまた、そのような突然変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクタ機能などのその特性を決定する方法を記載している。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクタ機能の低下を示す。したがって、いくつかの態様では、本発明の（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。Ｆｃ受容体に対するその結合親和性及び／又はそのエフェクタ機能をさらに低下させるために、一態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｌ２３５位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。別の態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。好ましい態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位、Ｌ２３５位及びＰ３２９位にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。そのようなＩｇＧ４ Ｆｃドメイン変異体及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
好ましい態様では、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクタ機能の低下を示すＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び任意にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインであるか、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である。
特定の態様では、ＦｃドメインのＮ－グリコシル化は排除されている。そのような一態様では、Ｆｃドメインは、Ｎ２９７位にアミノ酸変異、特にアスパラギンをアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）に置換するアミノ酸置換（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
上記及びＰＣＴ公開番号第ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載のＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクタ機能が低下したＦｃドメインには、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ又は複数が置換されたものも含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。そのようなＦｃ変異体には、２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、及び３２７位のアミノ酸の２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が含まれ、これには、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されたいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
突然変異Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝的又は化学的方法を使用して、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法には、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などが含まれ得る。正確なヌクレオチド変化は、例えばシーケンシングによって確認できる。
Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＥＬＩＳＡ、又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な装置、及び組換え発現によって得ることができるＦｃ受容体を使用して、容易に決定できる。あるいはまた、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体のＦｃ受容体に対する結合親和性は、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞など、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株を使用して評価することができる。
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む（多重特異性、例えば二重特異性）抗体のエフェクタ機能は、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３， ７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２， １４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６， １３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。あるいはまた、非放射性アッセイを使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））。このようなアッセイに有用なエフェクタ細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的に、あるいは追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５、６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価され得る。
いくつかの態様では、Ｆｃドメインの補体成分への結合、特にＣ１ｑへの結合が減少する。したがって、Ｆｃドメインが低下したエフェクタ機能を有するように操作されるいくつかの態様では、前記低下したエフェクタ機能は低減されたＣＤＣを含む。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む（多重特異性、例えば二重特異性）抗体がＣ１ｑに結合でき、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定することができる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２， １６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １０１， １０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ， Ｂｌｏｏｄ １０３， ２７３８－２７４３（２００４））。
ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定も、当技術分野で知られている方法を使用して行うことができる（Ｐｅｔｋｏｖａ， Ｓ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ’ｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；ＷＯ２０１３／１２０９２９を参照されたい。）。
Ｂ．ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。前記単離されたポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチドであり得る。
本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数（例えば、２つ以上）のポリヌクレオチドとして発現され得る。同時発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合して、機能的抗体を形成し得る。例えば、抗体の軽鎖部分は、抗体の重鎖を含む抗体の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して抗体を形成する。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットの１つと、任意選択的に１つ又は複数のＦａｂ分子（の一部）を含む抗体の部分は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方及び任意選択的にＦａｂ分子（の一部）を含む抗体の部分からの別個のポリヌクレオチドによってコード化できる。共発現すると、Ｆｃドメインサブユニットが会合してＦｃドメインを形成する。
いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明による抗体分子全体をコードする。他の態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明による抗体に含まれるポリペプチドをコードする。
特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
Ｃ．組換え法
本発明の抗体は、例えば、固体ペプチド合成（例えば、メリフィールド固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、例えば上記のように、抗体をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定することができる。一態様では、本発明のポリヌクレオチド（すなわち、単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド）を含むベクター、特に発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに抗体のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ（１９８９）で説明されている手法を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であり得るか、又は核酸フラグメントであり得る。発現ベクターは、抗体をコードするポリヌクレオチド（すなわちコード領域）がプロモーター及び／又は他の転写又は翻訳制御要素と作動可能に結合してクローニングされる発現カセットを含む。本明細書で使用される「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されたコドンからなる核酸の一部である。「ストップコドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合はコード領域の一部と見なすことができるが、プロモーター、リボソーム結合部位などの隣接配列転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などは、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域は、例えば単一のベクター上の単一のポリヌクレオチド構築物、又は例えば別個の（異なる）ベクター上の別個のポリヌクレオチド構築物中に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでもよく、例えば、本発明のベクターは、タンパク質分解切断を介して最終タンパク質に翻訳後又は翻訳と同時に分離される１つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合又は非融合の異種コード領域をコードし得る。異種コード領域には、分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインなどの特殊な要素又はモチーフが含まれるが、これらに限定されない。操作可能な結合は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響又は制御下に置くような方法で、１つ又は複数の調節配列と会合する場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに関連付けられたプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導により、目的の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡが転写される場合、及び２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨げないか、又はＤＮＡテンプレートの転写能力を妨げない場合、「機能的に関連付けられている」。したがって、プロモーターがポリペプチドをコードする核酸の転写を行うことができる場合、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と操作可能に関連している。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指令する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルをポリヌクレオチドと作動可能に結合させて、細胞特異的転写を指示することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域が本明細書に開示されている。様々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、脊椎動物細胞で機能する、サイトメガロウイルス（例えば、イントロンＡと組み合わせた前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例えば、初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルスなど）からのプロモーター及びエンハンサーセグメントのような転写制御領域が含まれるが、これらに限定されない。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβグロビンなどの脊椎動物遺伝子由来のもの、並びに真核細胞における遺伝子発現を制御できる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンによって誘導可能なプロモーター）が含まれる。同様に、様々な翻訳制御要素が当業者に知られている。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる内部リボソーム侵入部位又はＩＲＥＳ）が含まれるが、これらに限定されない。発現カセットはまた、複製起点、及び／又はレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）などの染色体組み込み要素などの他の特徴を含み得る。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と関連し得る。例えば、抗体の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の抗体又はその断片をコードする核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、粗い小胞体を横切る成長中のタンパク質鎖の輸送が開始されると、成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが一般にポリペプチドのＮ末端に融合された、これは、翻訳されたポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するシグナルペプチドを有することを承知している。特定の態様では、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド、又はそれに作動可能に関連するポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換され得る。
後の精製を容易にするために使用できる短いタンパク質配列をコードするＤＮＡ（例えば、ヒスチジンタグ）又は抗体の標識を補助するＤＮＡは、ポリヌクレオチドをコードする抗体（断片）内又はその末端に含まれ得る。
さらなる態様では、本発明のポリヌクレオチド（すなわち、単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド）を含む宿主細胞が提供される。特定の態様では、本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載されている特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。そのような一態様では、宿主細胞は、本発明の抗体（の一部）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む１つ又は複数のベクターを含む（例えば、形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、本発明の抗体又はその断片を生成するように操作できる任意の種類の細胞系を指す。抗体の複製及び支持発現に適した宿主細胞は、当技術分野で周知である。そのような細胞は、特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入され得、細胞を含む大量のベクターを増殖させて大規模発酵槽に播種し、臨床適用のために十分な量の抗体を得ることができる。適切な宿主細胞には、大腸菌などの原核微生物、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などの様々な真核細胞が含まれる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でない場合、細菌で産生され得る。発現後、ポリペプチドを細菌細胞ペーストから可溶性画分に単離し、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌や酵母などの真核微生物は、グリコシル化経路が「ヒト化」された菌類や酵母菌株を含む、ポリペプチドをコードするベクターの適切なクローニング又は発現宿主であり、その結果、部分的又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドが生成される。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２， １４０９－１４１４（２００４）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４， ２１０－２１５（２００６）を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と共に使用できる多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物も宿主として利用できる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、及び第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載）を参照されたい。脊椎動物細胞も宿主として使用できる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；ヒト胚性腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６， ５９（１９７７）に記載の２９３又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３， ２４３－２５１（１９８０）記載のＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３， ４４－６８（１９８２）に記載されるような）、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７， ４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３、Ｓｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳類宿主細胞株のレビューについては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ． Ｌｏ， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ）， ｐｐ． ２５５－２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞には、培養細胞、例えば哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が含まれるが、ほんの数例を挙げると、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内に含まれる細胞も含まれる。一態様では、宿主細胞は、真核細胞、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）などの哺乳動物細胞である。一態様では、宿主細胞はヒト体内の細胞ではない。
これらの系で外来遺伝子を発現させるための標準的な技術は、当技術分野で知られている。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現産物が重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体であるように、他の抗体鎖も発現するように遺伝子操作され得る。
一態様では、本発明による抗体を産生する方法が提供され、方法は、抗体の発現に適した条件下で、本明細書で提供される抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び任意選択的に宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体の成分は、互いに遺伝的に融合され得る。（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、その成分が互いに直接又はリンカー配列を介して間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。（多重特異性）抗体の異なる成分間のリンカー配列の例をここで提供する。必要に応じて、融合の個々の構成要素を分離するための切断部位を組み込むために、追加の配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を含めることもできる。
本明細書に記載のように調製された抗体は、高速液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィなどの既知の技術によって精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、正味の電荷、疎水性、親水性などの要因に部分的に依存し、当業者には明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィ精製では、抗体が結合する抗体、リガンド、受容体、又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の抗体のアフィニティークロマトグラフィ精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続プロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィを使用して、本質的に実施例に記載されるように抗体を単離することができる。抗体の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。
Ｄ．アッセイ
本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られている様々なアッセイによって、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特性決定することができる。
１．結合アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対する抗体の結合（親和性）は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な機器、及び組換え発現によって得ることができるような受容体又は標的タンパク質を用いて決定できる。あるいはまた、異なる受容体又は標的抗原への抗体の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価することができる。ＣＤ３への結合活性を測定するための特定の例証的及び例示的な態様を以下に記載する。図示のアッセイは、ＣＤ３抗原の代わりにＦｏｌＲ１抗原を使用し、当業者が容易に認識できる微調整を行うことにより、ＦｏｌＲ１に対する結合活性を測定するように容易に適合させることができる。
一態様では、ＣＤ３への結合活性は、以下のようにＳＰＲによって決定される：
ＳＰＲは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実行される。抗－Ｆａｂ捕捉抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃２８９５８３２５）は、標準的なアミン結合化学を使用して、４０００～６０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度で、シリーズＳセンサチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化されている。実行及び希釈バッファとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）を使用する。２μｇ／ｍｌの濃度のＣＤ３抗体（２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中）を５μｌ／分の流量で約６０秒間注入する。使用されるＣＤ３抗原は、ノブインツーホール修飾及びＣ末端Ａｖｉタグを有するヒトＦｃドメインに融合されたＣＤ３デルタ及びＣＤ３イプシロンエクトドメインのヘテロ二量体である（配列番号２８及び２９を参照）。ＣＤ３抗原を１０μｇ／ｍｌの濃度で１２０秒間注入し、解離を５μｌ／分の流量で約１２０秒間モニターする。チップ表面は、１０ｍＭグリシン ｐＨ２．１をそれぞれ約６０秒間２回連続して注入することによって再生される。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、及びブランクコントロールフローセルから得られた応答を差し引くことによって補正される。評価のために、注入終了から５秒後に結合応答が取得される。結合シグナルを正規化するために、ＣＤ３結合を抗Ｆａｂ応答（固定化抗Ｆａｂ抗体上のＣＤ３抗体の捕捉時に得られるシグナル（ＲＵ））で割る。異なる処理後の抗体のＣＤ３に対する結合活性に対する、ある処理後の抗体のＣＤ３に対する結合活性（相対活性濃度（ＲＡＣ）ともいう）は、ある処理後の抗体サンプルの結合活性を、別の処理後の対応する抗体サンプルの結合活性に参照することによって計算される。
２．活性アッセイ
本発明の（多重特異性、例えば、二重特異性）抗体の生物学的活性は、実施例に記載の様々なアッセイによって測定することができる。生物活性は、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞におけるシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞における活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍退縮の誘導及び／又は生存率の改善を含む。
Ｅ．組成物、調合、及び投与経路
さらなる態様において、本発明は、例えば以下の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書で提供される（多重特異性、例えば二重特異性）抗体のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一態様では、薬学的組成物は、本発明による抗体及び薬学的に許容される担体を含む。別の態様では、薬学的組成物は、本発明による（多重特異性、例えば二重特異性）抗体及び少なくとも１つの追加の治療剤を、例えば以下に記載するように含む。
さらに提供されるのは、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適した形態で本発明の抗体を産生する方法であり、該方法は、（ａ）本発明による抗体を得ること、及び（ｂ）少なくとも１つの薬学的に許容される担体を用いて抗体を調合することを含み、これにより抗体の調製物がｉｎ ｖｉｖｏ投与用に調合される。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解又は分散された有効量の抗体を含む。「薬学的に許容される」という語句は、使用される投与量及び濃度で受容者に対して一般に非毒性である分子実体及び組成物を指す、すなわち、必要に応じて、例えばヒトなどの動物に投与した場合、有害反応、アレルギー反応、又はその他の有害な反応を引き起こさない。抗体及び任意に追加の活性成分を含む薬学的組成物の調製は、本開示に照らして、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０に例示されるように当業者に公知であり、参照により本明細書において援用される。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与については、製剤は、ＦＤＡ生物基準局又は他の国の対応する当局によって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度基準を満たすべきであることが理解される。好ましい組成物は、凍結乾燥調合物又は水溶液である。本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される担体」には、当業者に知られているように、ありとあらゆる溶媒、緩衝剤、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（抗菌剤、抗真菌剤など）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、ビヒクル、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、香味剤、染料などの材料及びそれらの組み合わせが含まれる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０， ｐｐ． １２８９－１３２９参照）。従来の担体が有効成分と不適合である場合を除いて、薬学的組成物におけるその使用が企図される。
本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療が望まれる場合には病巣内投与を含む任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投与は、投与が短時間か長期かに応じて、任意の適切な経路、例えば静脈内注射又は皮下注射などの注射によるものであり得る。
非経口組成物には、注射による投与、例えば、皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注射のために、本発明の抗体は、水溶液、特に、ハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液で調合され得る。溶液は、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤などの調合剤を含んでもよい。あるいはまた、抗体は、使用前に、適切なビヒクル、例えば発熱物質を含まない無菌水で構成するための粉末形態であってもよい。無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて、以下に列挙する様々な他の成分とともに、適切な溶媒中に必要な量の本発明の抗体を組み込むことによって調製される。無菌性は、例えば無菌ろ過膜による濾過によって容易に達成することができる。一般に、分散液は、様々な滅菌された有効成分を、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌の注射用溶液、懸濁液又は乳濁液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加えて、事前に無菌濾過されたその液体媒体から任意の追加の所望の成分をもたらす真空乾燥又は凍結乾燥技術である。必要に応じて液体培地を適切に緩衝し、十分な生理食塩水又はブドウ糖を注入する前に液体希釈剤をまず等張にする必要がある。組成物は、製造及び保管の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。エンドトキシンの混入は、安全なレベル、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に最小限に保たれるべきであることが理解されよう。適切な薬学的に許容される担体には、リン酸、クエン酸、その他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸とメチオニンを含む抗酸化物質；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマ－；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる化合物を含んでもよい。任意選択的に、懸濁液は、化合物の溶解度を高めて高濃度溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は試薬を含んでもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、又はエチルクリート又はトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
活性成分を、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルの、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合によって調整されたマイクロカプセル、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル）又はマクロエマルションに内包され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０）に開示されている。徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の態様では、注射用組成物の長期吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はそれらの組み合わせなどの吸収を遅延させる試薬を組成物に使用することによってもたらすことができる。
前述の組成物に加えて、抗体はデポー調整物として調合することもできる。そのような徐放性調製物は、移植（例えば、皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、抗体は、適切なポリマー材料又は疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として調合され得る。
本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体を含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、封入、捕捉又は凍結乾燥プロセスによって製造され得る。薬学的組成物は、薬学的に使用できる調製物へのタンパク質のプロセッシングを促進する、１つ又は複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、ビヒクル又は助剤を使用して、従来の方法で調合することができる。適切な製剤は、選択した投与経路に依存する。
抗体は、遊離酸又は遊離塩基、中性又は塩形態の組成物に調合され得る。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は塩基の生物学的活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、又は、例えば、塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、又はマンデル酸などの有機酸で形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基から；あるいは、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインなどの有機塩から誘導できる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
Ｆ．治療方法及び組成物
本明細書で提供される（多重特異性、例えば二重特異性）抗体のいずれも、治療方法で使用することができる。本発明の抗体は、例えば癌の治療において免疫療法剤として使用することができる。
治療法で使用するために、本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、良好な医療行為と一致する様式で処方され、投薬され、投与される。これに関連して考慮すべき要素には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に知られているその他の要因が含まれる。
一態様では、医薬として使用するための本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体が提供される。さらなる態様では、疾患の治療に使用するための本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体が提供される。特定の態様では、治療方法において使用するための本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体が提供される。一態様では、本発明は、それを必要とする個体における疾患の治療に使用するための本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、個体に有効量の抗体を投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法において使用するための（多重特異性、例えば、二重特異性）抗体を提供する。特定の態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。好ましい態様では、疾患はがんである。特定の態様では、方法は、治療される疾患ががんである場合、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば抗がん剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する際に使用するための本発明の抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、標的細胞の溶解を誘導するのに有効な量の抗体を個体に投与することを含む、個体において標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法で使用するための本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体を提供する。上記の態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明は、医薬品の製造又は調製における本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体の使用を提供する。一態様では、薬剤は、それを必要とする個体における疾患の治療のためのものである。さらなる態様において、薬剤は、疾患を有する個体に有効量の薬剤を投与することを含む、疾患を治療する方法において使用するためのものである。特定の態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。好ましい態様では、疾患はがんである。一態様では、方法は、治療される疾患ががんである場合、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば抗がん剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる態様では、薬剤は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。さらなる態様では、医薬は、標的細胞の溶解を誘導するのに有効な量の医薬を個体に投与することを含む、個体における標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法において使用するためのものである。上記の態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
さらなるでは、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、該方法は、そのような疾患を有する個体に有効量の本発明の抗体を投与することを含む。一態様では、本発明の抗体を薬学的に許容される形態で含む組成物が前記個体に投与される。特定の態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。好ましい態様では、疾患はがんである。特定の態様では、方法は、治療される疾患ががんである場合、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば抗がん剤を個体に投与することをさらに含む。上記の態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法を提供する。一態様では、この方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で標的細胞を本発明の抗体と接触させることを含む。さらなる態様では、個体において標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法が提供される。そのような一態様では、この方法は、標的細胞の溶解を誘導するために有効量の本発明の抗体を個体に投与することを含む。一態様では、「個体」はヒトである。
特定の態様では、治療される疾患は増殖性疾患、特にがんである。がんの非限定的な例は、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮がん、骨がん、及び腎臓がんを含む。本発明の抗体を使用して治療することができる他の細胞増殖障害は、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍を含むが、これらに限定されない。前がん状態又は前がん病変及びがん転移も含まれる。特定の態様では、がんは、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん及び前立腺がんからなる群から選択される。一態様では、特に抗体が第２の抗原としてＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体である場合、がんはＦｏｌＲ１を発現する（又は過剰発現する）がんである。一態様では、特に抗体が第２の抗原としてＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体である場合、がんは卵巣がん、肺がん、乳がん、又は腎がんである。当業者は、多くの場合、抗体が治癒をもたらさず、部分的な利益しかもたらさない可能性があることを容易に認識する。いくつかの態様では、何らかの利益を有する生理学的変化も、治療上有益であると考えられる。したがって、いくつかの態様では、生理学的変化をもたらす抗体の量は「有効量」とみなされる。治療を必要とする対象、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、より具体的にはヒトである。
いくつかの態様では、本発明の抗体の有効量が、疾患の治療のために個体に投与される。
病気の予防や治療のために、本発明の抗体の適切な投与量（単独で、あるいは１つ又は複数の他の追加の治療薬と組み合わせて使用する場合）は、治療する疾患の種類、投与経路、患者の体重、抗体の種類、疾患の重症度と経過、抗体が予防又は治療目的で投与されるかどうか、以前又は同時の治療的介入、患者の病歴及び抗体に対する反応、並びに主治医の裁量に依存することになる。いずれにせよ、投与を担当する開業医は、組成物中の有効成分の濃度及び個々の対象に対する適切な用量を決定する。本明細書では、様々な時点にわたる単回又は複数回の投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが企図される。
抗体は、一度に又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患の種類と重症度に応じて、例えば、１回又は複数回の別々の投与によるか、持続注入により、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者への投与の最初の候補投与量となり得る。上記の要因に応じて、典型的な１日あたりの投与量は、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である可能性がある。状態に応じて、数日間又はそれ以上にわたる反復投与の場合、治療は、一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで持続される。抗体の投与量の一例は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。他の非限定的な例において、用量はまた、投与当たり、約１マイクログラム／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重、約１０マイクログラム／ｋｇ体重、約５０マイクログラム／ｋｇ体重、約１００マイクログラム／ｋｇ体重、約２００マイクログラム／ｋｇ体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ体重、約５００マイクログラム／ｋｇ体重、約１ミリグラム／ｋｇ体重、約５ミリグラム／ｋｇ体重、約１０ミリグラム／ｋｇ体重、約５０ミリグラム／ｋｇ体重、約１００ミリグラム／ｋｇ体重、約２００ミリグラム／ｋｇ体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ体重、約５００ミリグラム／ｋｇ体重、約１０００ミリグラム／ｋｇ体重、又はより多く、及びそこから導き出される任意の範囲を含み得る。本明細書に列挙された数値から導出可能な範囲の非限定的な例では、約５ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重～約５００ミリグラム／ｋｇ体重の範囲、など、上記の数値に基づいて投与することができる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はそれらの任意の組み合わせ）の１つ又は複数の用量を患者に投与することができる。このような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間ごとに（例えば、患者が約２回から約２０回、又は例えば約６回の抗体投与を受けるように）投与することができる。最初に高負荷量を投与し、続いて１回又は複数回の低用量を投与することができる。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であり得る。この治療の進行状況は、従来の技術とアッセイによって簡単に監視できる。
本発明の抗体は、一般に、意図した目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するために使用するために、本発明の抗体又はその薬学的組成物は、有効量で投与又は適用される。
全身投与の場合、有効用量は、細胞培養アッセイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイから最初に推定できる。次いで、細胞培養で決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルで用量を処方することができる。このような情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定するために使用できる。
初期投与量は、当技術分野で周知の技術を使用して、動物モデルなどのｉｎ ｖｉｖｏデータから推定することもできる。
投与量及び投与間隔は、治療効果を維持するのに十分な抗体の血漿レベルを提供するために個別に調整することができる。注射による投与のための通常の患者投与量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療上有効な血漿レベルは、毎日複数の用量を投与することによって達成することができる。血漿中のレベルは、例えば、ＨＰＬＣによって測定することができる。
本発明の抗体の有効用量は、一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく、治療上の利益を提供する。抗体の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物研究を使用して、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定できる。毒性効果と治療効果の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す抗体が好ましい。一態様では、本発明による抗体は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用に適した用量範囲の処方に使用できる。投与量は、毒性がほとんど又は全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、様々な要因、例えば、使用される剤形、使用される投与経路、対象の状態などに応じて、この範囲内で変動し得る。正確な製剤、投与経路及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．， １９７５， ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｃｈ． １， ｐ． １を参照されたい。その全体は参照により本明細書で援用される）。
本発明の抗体で治療された患者の主治医は、毒性、器官機能不全などのために投与を終了、中断、又は調整する方法と時期を知っている。逆に、主治医は、臨床反応が適切でない場合（毒性を排除する場合）、治療をより高いレベルに調整することも知っている。関心のある障害の管理における投与用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変化する。状態の重症度は、例えば、標準的な予後評価方法によって部分的に評価することができる。さらに、投与量及びおそらく投与頻度も、個々の患者の年齢、体重、及び反応に応じて変化する。
本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体は、治療において１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与され得る。「治療薬」という用語は、治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。そのような追加の治療剤は、治療される特定の疾患に適した任意の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有する活性成分を含み得る。特定の態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞毒性剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増加させる薬剤である。好ましい態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。
このような他の薬剤は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用される抗体の量、障害又は治療の種類、及び上記で論じた他の要因に依存する。抗体は、一般に、本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載される用量の約１～９９％で、又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の用量及び任意の経路で使用される。
上記のそのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療薬が同じ又は別個の組成物に含まれる場合）、及び別個の投与を包含し、この場合、本発明の（多重特異性、例えば二重特異性）抗体の投与は、投与の前に行うことができる。追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与と同時に、及び／又はその後に投与する。本発明の抗体は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
Ｇ．製造品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製品が提供される。製造品は、容器と、容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、それ自体で、又は状態を治療、予防及び／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わされた組成物を保持し、無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は貫通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）皮下注射針による）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物を含む第１の容器と、（ｂ）組成物が入った第２の容器であって、組成物はさらなる細胞傷害剤又はその他の治療剤を含む。本発明のこの態様における製品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでもよい。代替的に、又は追加的に、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２（又は第３）の容器をさらに含んでもよい。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及び注射器を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
Ｈ．診断及び検出のための方法及び組成物
特定の態様では、本明細書で提供される抗体のいずれも、生物学的サンプル中のその標的（例えば、ＣＤ３、ＦｏｌＲ１）の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用される「検出する」という用語は、定量的又は定性的な検出を包含する。特定の局面において、生物学的サンプルは、前立腺組織などの細胞又は組織を含む。
一態様では、診断又は検出の方法で使用するための本発明による抗体が提供される。さらなる局面において、生体試料中のＣＤ３及びＦｏｌＲ１の存在を検出する方法が提供される。特定の態様では、この方法は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１への抗体の結合を許容する条件下で生体試料を本発明の抗体と接触させること、及び抗体とＣＤ３及びＦｏｌＲ１との間で複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。そのような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏの方法であり得る。一態様では、本発明の抗体を使用して、例えばＣＤ３及びＦｏｌＲ１が患者選択のためのバイオマーカーである場合、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する抗体による治療に適格な対象を選択する。
本発明の抗体を使用して診断され得る例示的な障害には、がん、特に皮膚がん又は脳がんが含まれる。
特定の態様では、抗体が標識されている、本発明による抗体が提供される。標識には、直接検出される標識又は部分（蛍光、発色団、高電子密度、化学発光、及び放射性標識など）、並びに間接的に検出される、例えば、酵素反応又は分子相互作用による酵素又はリガンドなどの部分が含まれるが、これらに限定されない。例示的な標識には、放射性同位元素３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体などのフルオロフォア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼやキサンチンオキシダーゼなどの複素環式オキシダーゼを、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定したフリーラジカルなどの色素前駆体を酸化するために過酸化水素を使用する酵素と結合したものなどが含まれるが、これらに限定されない。
ＩＩＩ．配列
Figure 2023531625000002
Figure 2023531625000003
Figure 2023531625000004
Figure 2023531625000005
Figure 2023531625000006
Figure 2023531625000007
Figure 2023531625000008
Figure 2023531625000009
Figure 2023531625000010
Figure 2023531625000011
Figure 2023531625000012
二重特異性ＣＤ３／ＦｏｌＲ１抗体配列：
ＩＶ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明が与えられると、様々な他の態様が実施され得ることが理解される。
実施例１－最適化されたＣＤ３バインダの生成
本明細書では「ＣＤ３ｏｒｉｇ」と呼ばれ、それぞれ配列番号６及び１１のＶＨ及びＶＬ配列を含む、以前に記載された（例えば、ＷＯ２０１４／１３１７１２を参照、参照により本明細書に援用される。）ＣＤ３バインダから出発して、我々は、重鎖ＣＤＲ３のＫａｂａｔ位置９７及び１００にある２つのアスパラギン脱アミド化配列モチーフを除去することにより、このバインダを結合する。
この目的のために、Ｋａｂａｔ位置９７と１００の両方のアスパラギンを除去し、親和性成熟プロセスを通じてＡｓｎ９７とＡｓｎ１００を置換することによって引き起こされる親和性の損失を補うために、さらにＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３をランダム化した重鎖のファージディスプレイに適した抗体ライブラリを作成した。
このライブラリをマイナーコートタンパク質ｐ３との融合を介して線状ファージに載せ（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２， ５８１－５９７）、組換えＣＤ３εとの結合について選択した。
１０個の候補クローンが最初のスクリーニングで同定され、ＳＰＲによって測定される組換え抗原に対する許容可能な結合をＦａｂフラグメント（大腸菌で生成）として示した。
しかしながら、これらのクローンの１つだけが、ＩｇＧフォーマットへの変換後にフローサイトメトリーで測定した場合、ＣＤ３発現細胞に対して許容できる結合活性を示した。
本明細書で「ＣＤ３ｏｐｔ」と呼ばれ、それぞれ配列番号７及び１１のＶＨ及びＶＬ配列を含む選択されたクローンをさらに評価し、以下に記載するように二重特異性フォーマットに変換した。
実施例２－最適化されたＣＤ３バインダのＣＤ３への結合
組換えＣＤ３への結合
組換えＣＤ３への結合は、最適化されたＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」及び元のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定され、両方とも、Ｆｃ領域におけるＰ３２９Ｇ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ（「ＰＧＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）突然変異を有するヒトＩｇＧ１フォーマットである（配列番号１２及び１４（ＣＤ３ｏｒｉｇ）並びに配列番号１３及び１４（ＣＤ３ｏｐｔ））。
脱アミド部位除去の効果と抗体の安定性への影響を評価するために、オリジナル及び最適化されたＣＤ３バインダの組換えＣＤ３への結合は、３７℃又は４０℃で１４日間の温度ストレス後に試験された。－８０℃で保存された試料を参照として使用した。参照試料及び４０℃でストレスをかけた試料は２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で、３７℃でストレスをかけた試料はＰＢＳ、ｐＨ７．４で、すべて１．２～１．３ｍｇ／ｍｌの濃度であった。ストレス期間（１４日間）の後、さらなる分析のために、ＰＢＳ中の試料を２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に透析した。
試料の相対活性濃度（ＲＡＣ）は、次のようにＳＰＲによって決定された。
ＳＰＲは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実行された。抗Ｆａｂ捕捉抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃２８９５８３２５）は、標準的なアミン結合化学を使用してシリーズＳセンサチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化され、４０００～６０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度が得られた。実行及び希釈バッファとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）を使用した。２μｇ／ｍｌの濃度のＣＤ３抗体を５μｌ／分の流量で６０秒間注入した。ＣＤ３抗原（下記参照）を１０μｇ／ｍｌの濃度で１２０秒間注入し、解離を５μｌ／分の流速で１２０秒間モニターした。チップ表面は、１０ｍＭ グリシン ｐＨ２．１を２回連続して６０秒間注入することによって再生された。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、及びブランクコントロールフローセルから得られた応答を差し引くことによって補正された。評価のために、注入終了から５秒後に結合応答が取得された。結合シグナルを正規化するために、ＣＤ３結合を抗Ｆａｂ応答（固定化抗Ｆａｂ抗体上のＣＤ３抗体の捕捉時に得られるシグナル（ＲＵ））で割った。相対活性濃度は、各温度ストレス試料を対応する非ストレス試料と参照することによって計算された。
使用されるＣＤ３抗原は、ノブインツーホール修飾及びＣ末端Ａｖｉタグを有するヒトＦｃドメインに融合されたＣＤ３デルタ及びＣＤ３イプシロンエクトドメインのヘテロ二量体であった（配列番号２８及び２９を参照）。
この実験の結果を図２に示す。図からわかるように、最適化されたＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔは、元のＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇと比較して、温度ストレス（３７℃、ｐＨ７．４で２週間）後にＣＤ３への結合が大幅に改善された。この結果は、脱アミド部位の除去が成功し、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期に関連する優れた安定性を備えた抗体、及び中性ｐＨでの抗体の製剤が得られたことを示している。
Ｊｕｒｋａｔ細胞のＣＤ３への結合
ヒトレポーターＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ上のＣＤ３への結合は、最適化されたＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」及び元のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」についてＦＡＣＳによって決定され、両方とも、Ｆｃ領域におけるＰ３２９Ｇ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ（「ＰＧＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）突然変異を有するヒトＩｇＧ１フォーマットである（配列番号１２及び１４（ＣＤ３ｏｒｉｇ）並びに配列番号１３及び１４（ＣＤ３ｏｐｔ））。
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ；Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）は、ヒトＣＤ３を発現するＮＦＡＴプロモーターを有するヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株である。細胞は、ＲＰＭＩ１６４０、２ｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウム中で０．１～０．５ｍｉｏ細胞／ｍｌで培養した。細胞を継代するたびに、ハイグロマイシンＢ１ｍｌ当たり２００μｇの最終濃度を加えた。
結合アッセイのために、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳバッファに再懸濁した。抗体染色は、９６ウェル丸底プレートで行った。したがって、１ウェルあたり１００，０００～２００，０００個の細胞を播種した。プレートを４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を除去した。試験抗体をＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、２０μｌの抗体溶液を４℃で３０分間細胞に添加した。未結合の抗体を除去するために、希釈した二次抗体を添加する前に、細胞をＦＡＣＳバッファで２回洗浄した（ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃｇ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ； Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９－１１６－１７０）。４℃で３０分間インキュベーションした後、未結合の二次抗体を洗い流した。測定前に、細胞を ２００μｌのＦＡＣＳバッファに再懸濁し、ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩデバイスを使用してフローサイトメトリーで分析した。
図３に示すように、最適化されたＣＤ３結合剤「ＣＤ３ｏｐｔ」と元のＣＤ３結合剤「ＣＤ３ｏｒｉｇ」は、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３に比較的良好に結合した。
実施例３－最適化されたＣＤ３バインダの機能活性
最適化されたＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」の機能活性をＪｕｒｋａｔレポーター細胞アッセイで試験し、元のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」の活性と比較した。ＩｇＧの機能活性を試験するために、抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ細胞を、増加する濃度のＣＤ３ｏｐｔヒトＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ又はＣＤ３ｏｒｉｇヒトＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡの存在下でＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞と共インキュベートした。Ｔ細胞架橋時のＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ レポーター細胞上のＣＤ３の活性化は、ルシフェラーゼの産生を誘導し、発光は活性化マーカーとして測定できる。ＣＤ３ｏｒｉｇヒトＩｇＧ１ ｗｔは、抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ細胞に結合できず、したがってＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞上で架橋できない陰性対照として含まれた。アッセイの模式図を図４に示す。
抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ細胞は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＧＬＡＬＡ）に特異的に結合する抗体をその表面に発現するように操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞である（参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７／０７２２１０を参照）。これらの細胞は、５％ＦＣＳ＋１％ＧｌｕＭａｘを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。ジャーカットＮＦＡＴレポーター細胞は、実施例２に記載されている通りである。
ＣＤ３ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡが、ＣＨＯで発現する抗ＰＧＬＡＬＡ及びＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞で発現するＣＤ３に同時に結合すると、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、活性なホタルルシフェラーゼが発現する。発光シグナルの強度（ルシフェラーゼ基質の添加により得られる）は、ＣＤ３の活性化とシグナル伝達の強度に比例する。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ レポーター細胞は懸濁液中で増殖し、ＲＰＭＩ１６４０、２ｇ／ｌ グルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウム０．１～０．５ｍｉｏ細胞／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンで培養された。アッセイのために、ＣＨＯ細胞を採取し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存率を測定した。３０，０００ターゲット細胞／ウェルを、１００μｌの培地と５０μｌ／ウェルの希釈抗体で、平底の白い壁の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ ＃６５５０９８）にプレーティングするか又は培地（対照用）をＣＨＯ細胞に添加した。その後、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存率を評価した。細胞を、ハイグロマイシンＢを含まない細胞培養培地に１．２ｍｉｏ細胞／ｍｌで再懸濁し、６０，０００細胞／ウェル（５０μｌ／ウェル）でＣＨＯ細胞に添加し、２：１の最終エフェクタ対標的（Ｅ：Ｔ）比とウェルあたり２００μｌの最終容量を得た。次に、４μｌのＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｅ１２９１）を各ウェルに加えた（最終容量の２％）。細胞を加湿インキュベーター内で３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、ＴＥＣＡＮ Ｓｐａｒｋ １０Ｍを使用して発光を検出した。
図５に示すように、最適化されたＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔは、架橋時にＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に対してＣＤ３ｏｒｉｇと同様の活性を示した。
実施例４－最適化されたＣＤ３バインダを含むＴ細胞二重特異性抗体の生成
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ
実施例１で同定された最適化されたＣＤ３バインダ（「ＣＤ３ｏｐｔ」、配列番号７（ＶＨ）及び１１（ＶＬ））を使用して、ＣＤ３及びＴＹＲＰ１を標的とするＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）（「ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ」）を生成した。
このＴＣＢに含まれるＴＹＲＰ１バインダは、ＴＹＲＰ１バインダ「ＴＡ９９」のヒト化によって生成され（重鎖と軽鎖については、それぞれＧｅｎＢａｎｋエントリーＡＸＱ５７８１１及びＡＸＱ５７８１３を参照）、それぞれ配列番号１８及び２２に示される重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む。
ＴＣＢ分子の模式図を図６に示し、その全配列を配列番号２３、２４、２５及び２７に示す。
元のＣＤ３結合配列を有する類似分子も調製した（配列番号２３、２４、２５及び２６）。
二重特異性分子は、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞の一過性トランスフェクションによって生成された。細胞を、対応する発現ベクターで１：２：１：１の比率でトランスフェクトした（「ベクター重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ－ＣＬ）」）細胞を遠心分離し、培地を予熱したＣＤＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃１０７４３０２９）に交換した。発現ベクターをＣＤ ＣＨＯ培地に混合し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃２３９６６－１）を加え、溶液をボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２ｍｉｏ／ｍｌ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合し、フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気の振とう培養器で３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、サプリメントを含むエクセル培地（総量の８０％）を加えた。トランスフェクションの１日後、サプリメント（飼料、総量の１２％）を追加した。遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）によって７日後に細胞上清を回収した。
標準的な方法により、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡単に述べると、Ｆｃ含有タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：平衡バッファ：２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出バッファ：２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ グリシンｐＨ３．０）によって細胞培養上清から精製された。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いて直ちに試料のｐＨが中和された。タンパク質を遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（＃ＵＦＣ９０３０９６））により濃縮し、凝集タンパク質は、２０ｍＭ ヒスチジン、１４０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ６．０中のサイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって単量体タンパク質から分離された。
精製タンパク質の濃度は、Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４， ２４１１－２３に従って、アミノ酸配列に基づいて算出した質量消光係数を用いて２８０ｎｍの吸収を測定することにより決定した。タンパク質の純度と分子量は、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下と非存在下でＣＥ－ＳＤＳによって分析された（表１）。凝集体含有量の測定は、ランニングバッファ（２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ Ｌ－アルギニン一塩酸塩、ｐＨ６．７又は２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ６．２、それぞれ）（表２）。
表１．ＴＹＲＰ１ ＴＣＢのＣＥ－ＳＤＳ分析（非還元）。
Figure 2023531625000016
表２．ＴＹＲＰ１ ＴＣＢの生産と精製の概要。
Figure 2023531625000017
実施例５－最適化されたＣＤ３バインダを含むＴ細胞二重特異性抗体のＣＤ３及びＴＹＲＰ１への結合
組換えＣＤ３への結合
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢの組換えＣＤ３への結合は、最適化された（ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔ）又は元の（ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇ）ＣＤ３結合配列を有するＴＣＢを使用して、ＳＰＲによって評価された。
ＳＰＲ実験は、実行バッファとしてＨＢＳ－ＥＰを使用してＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で実行されました（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））。
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＧＬＡＬＡ）に特異的に結合する固定化抗体を用いてＣＭ５センサチップ表面に捕捉された（参照により本明細書で援用されるＷＯ２０１７／０７２２１０を参照）。標準的なアミン結合キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ｐＨ５．０で約８７００共鳴単位（ＲＵ）を直接固定することにより、捕捉抗体をセンサチップ表面に結合させた。ＴＣＢ分子は、１０μｌ／分の流量で５ｎＭ で３０秒間捕捉された。
ヒト及びカニクイザル抗原（下記参照）は、１２．３５～３０００ｎＭの濃度で、３０μｌ／分の流量でフローセルを２４０秒間通過させた。解離フェーズは２４０秒間監視され、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰに切り替えることによってトリガーされた。チップ表面は、１０ｍＭ グリシンｐＨ２．０を３０秒間１回注入することにより、サイクルごとに再生された。
使用した抗原は、ヒト又はカニクイザルのいずれかのＣＤ３デルタ及びＣＤ３イプシロンエクトドメインのヘテロ二量体で、ノブからホールへの修飾及びＣ末端Ａｖｉタグを使用してヒトＦｃドメインに融合されたもの（配列番号２８及び２９（ヒトＣＤ３）並びに配列番号３０を参照）及び３１（カニクイザルＣＤ３））であった。
バルク屈折率の差は、参照フローセル（ＴＣＢが捕捉されていない）で得られた応答を差し引くことによって補正された。親和定数は、ＢＩＡｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１：１ラングミュア結合にフィッティングすることにより速度定数から導出した。
ヒト及びカニクイザルＣＤ３への結合のＫＤ値は、ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔについて、それぞれ５０ｎＭ及び２０ｎＭと決定され、ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇのものと同様であった（それぞれ５０ｎＭ及び４０ｎＭ）。
これは、ストレスのない状態では、ＣＤ３ｏｐｔ又はＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含む両方のＴＣＢが、組換えＣＤ３に比較的よく結合したことを示している。
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢの組換えヒトＣＤ３への結合も、最適化された、又はオリジナルのＣＤ３結合配列を有するＴＣＢを使用して、３７℃又は４０℃で１４日間の温度ストレス後に評価された。ＩｇＧ分子の代わりにＴＣＢを使用して、上記の実施例２に記載のように実験を行った。
この実験の結果を図７に示す。
図７に見られるように、最適化されたＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔを含むＴＣＢは、元のＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇを含むＴＣＢと比較して、ストレス後（３７℃、ｐＨ７．４で２週間）にＣＤ３への結合が大幅に改善された。この結果は、最適化されたＣＤ３バインダ（実施例２を参照）の改善された特性がＴＣＢレベルで維持されていることを確認する。
組換えＴＹＲＰ１への結合
組換えＴＹＲＰ１への結合は、対応する抗体のプラスミン消化によって調製されたＴＹＲＰ１ Ｆａｂ断片を使用して、ＳＰＲによって評価された。
ＳＰＲ実験は、実行バッファとしてＨＢＳ－ＥＰを使用してＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で実行されました（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））。
ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＧＬＡＬＡ）に特異的に結合する抗体（ＷＯ２０１７／０７２２１０を参照、参照により本明細書に援用される）を、標準アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ｐＨ５．０でＣＭ５センサチップ上に直接カップリングした。抗原（以下を参照）は、流速１０ｌ／分で３０秒間捕捉された。ＴＹＲＰ１ Ｆａｂ断片の３倍希釈系列をフローセルに３０μｌ／分で１８０秒間通過させて会合相を記録した。解離フェーズは、１８０秒又は１２００秒監視され、サンプルソリューションからＨＢＳ－ＥＰに切り替えることによってトリガーされる。チップ表面は、１０ｍＭ グリシン ｐＨ２を３０μｌ／分で３０秒間１回注入することにより、サイクルごとに再生された。
使用した抗原は、ヒト、カニクイザル、又はマウスのＴＹＲＰ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と、ノブ・イントゥー・ホール（及びＰＧ ＬＡＬＡ）修飾及びＣ末端Ａｖｉタグ（配列番号配列番号３２及び３５（ヒトＴＹＲＰ１）、配列番号３３及び３５（カニクイザルＴＹＲＰ１）又は配列番号３４及び３５（マウスＴＹＲＰ１））。
参照フローセルで得られた応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した（抗原は捕捉されなかった）。親和定数（ＫＤ）は、ＢＩＡｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１：１ラングミュア結合にフィッティングすることにより速度定数から導出した。
ヒト、カニクイザル、及びマウスＴＹＲＰ１への結合のＫＤ値は、それぞれ１３０ｐＭ、１８０ｐＭ、及び５３０ｐＭと決定され、親ＴＡ９９抗体の値と同様であった（それぞれ、９０ｐＭ、１２０ｐＭ、及び３１０ｐＭ）。
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢの組換えＴＹＲＰ１への結合も、最適化された、又はオリジナルのＣＤ３結合配列を有するＴＣＢを使用して、３７℃又は４０℃で１４日間の温度ストレス後に評価された。
実験は、抗原として組換えＴＹＲＰ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用して、ＣＤ３への結合について上述したように行った。
この実験の結果を図８に示す。彼らは、両方のＴＣＢ（及び対応するＩｇＧフォーマットのＴＹＲＰ１バインダ）のヒトＴＹＲＰ１への結合が、ストレス条件の影響を受けないことを確認している。
Ｊｕｒｋａｔ細胞のＣＤ３への結合
ヒトレポーターＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ上のＣＤ３への結合は、実施例２で上述したように、最適化されたＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」又は元のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」を含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢについてＦＡＣＳによって決定された。
図９に示すように、最適化されたＣＤ３結合剤「ＣＤ３ｏｐｔ」を含むＴＣＢは、元のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」を含むＴＣＢと少なくとも同等に良好にジャーカット細胞上のＣＤ３に結合する。
実施例６－最適化されたＣＤ３バインダを含むＴ細胞二重特異性抗体の機能活性
ＣＤ３活性化
最適化されたＣＤ３結合剤ＣＤ３ｏｐｔ又は元のＣＤ３結合剤ＣＤ３ｏｒｉｇ（実施例４）のいずれかを含有するＴＹＲＰ１ ＴＣＢを、ＴＹＲＰ１陽性メラノーマ細胞Ｍ１５０５４３の存在下でＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイ（実施例３を参照）で試験した。（チューリッヒ大学の皮膚科細胞バンクから得られた原発性メラノーマ細胞株）。
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢがＴＹＲＰ１陽性標的細胞及びＣＤ３抗原（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞で発現）に同時に結合すると、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、活性なホタルルシフェラーゼが発現する。発光シグナルの強度（ルシフェラーゼ基質の添加により得られる）は、ＣＤ３の活性化とシグナル伝達の強度に比例する。アッセイは、抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ細胞の代わりにＭ１５０５４３を使用して、実施例３に記載のように行った。
ＩｇＧについて見られるように（実施例３）、ＣＤ３ｏｐｔ又はＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含有するＴＣＢは両方とも、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞に対して同様の機能的活性を有し、濃度依存的にＣＤ３活性化を誘導した（図１０）。
標的細胞死滅
次のステップでは、両方のＴＣＢ分子が、３人の異なるドナーから新たに単離されたヒトＰＢＭＣを用いた腫瘍細胞キリングアッセイで試験され、ヒト黒色腫細胞株Ｍ１５０５４３と共インキュベートされた。腫瘍細胞の溶解は、２４時間及び４８時間後のＬＤＨ放出によって決定された。ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の活性化は、４８時間後の両方の細胞サブセットでのＣＤ６９及びＣＤ２５の上方制御によって分析された。
簡単に言えば、標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを使用して３００００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を一晩接着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なヒトドナーから得られた新鮮な血液のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離によって調製された。新鮮な血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ ＃Ｈ８８８９）の上に重層した。遠心分離（４５０ｘｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣを含む間期の上の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを新しいＦａｌｃｏｎチューブに移し、続いて５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分、室温）、上清を捨て、ＰＢＭＣペレットを無菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心ステップ３５０×ｇ、１０分）。得られたＰＢＭＣ集団を自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、１０％ＦＣＳ及び１％Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＃Ｋ０３０２）で、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターで、さらに使用するまで保存した（２４時間以内）。キリングアッセイのために、抗体を指示された濃度で三重に添加した。ＰＢＭＣは、１０：１の最終エフェクタ対標的（Ｅ：Ｔ）比で標的細胞に添加された。標的細胞のキリングは、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした後、アポトーシス／ネクローシス細胞によって細胞上清に放出されたＬＤＨの定量化によって評価された（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＃１１ ６４４ ７９３ ００１）。標的細胞の最大の溶解（＝１００％）は、標的細胞を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とインキュベートすることによって達成された。最小限の溶解（＝０％）は、二重特異性構築物なしでエフェクタ細胞と共培養された標的細胞を指す。
ＴＣＢによって媒介される標的細胞のＴ細胞死滅によるＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（後期活性化マーカー）及びＣＤ６９（早期活性化マーカー）を認識する抗体を使用したフローサイトメトリーによって評価されました。４８時間のインキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０×ｇで５分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＣＤ４ ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３００５１４）、ＣＤ８ ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３４４７０４）、ＣＤ２５ ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３０２６３０）、及びＣＤ６９ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３１０９０６）の表面染色は、サプライヤーの指示に従って行った。細胞を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定バッファ（ＢＤ＃５５４６５５）を使用して４℃で１５分間固定した。遠心分離後、サンプルを２００μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファに再懸濁した。サンプルはＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析された。
３人のドナーすべてで、最適化されたＣＤ３バインダ又は元のＣＤ３バインダのいずれかを含む両方のＴＣＢが、同等の方法でＴ細胞活性化及び腫瘍細胞溶解を誘導した（図１１）。４８時間後の３人のドナーすべての腫瘍細胞溶解のＥＣ５０値を表３に要約する。
表３．４８時間でのＴＹＲＰ１ ＴＣＢによる腫瘍細胞死滅のＥＣ５０値の要約。
Figure 2023531625000018
実施例７－マウスにおけるＴ細胞二重特異性抗体を用いたＰＫ研究
異なるＣＤ３バインダ（ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＣＤ３ｏｐｔ）を使用したＴＹＲＰ１ ＴＣＢの薬物動態（ＰＫ）を、ヒトＦｃＲｎトランスジェニック（ｌｉｎｅ３２、ホモ接合）及びＦｃＲｎノックアウトマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ系統番号００３９８２及び０１４５６５）への１ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス投与後（ｎ＝３／系統／試験化合物）に研究した。ヒトＦｃＲｎトランスジェニック（ｔｇ）マウスから連続血液マイクロ試料を、最大６７２時間（投与後５分～６７２時間までマウス当たり９試料）、ＦｃＲｎノックアウト（ｋｏ）マウスでは最大９６時間（投与後５分～９６時間マウス当たり８試料）で採取した。血清を調製し、分析まで凍結保存した。マウス血清サンプルは、非ＧＬＰ条件下でｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ４１１（Ｒｏｃｈｅ）装置を使用して、ヒトＩｇ／Ｆａｂ ＣＨ１／カッパドメインに特異的な一般的なＥＣＬＩＡ法で分析された。薬物動態評価は、標準的な非コンパートメント分析を使用して実施された。
この調査の結果を表４に示す。これは、ＣＤＲの操作が、抗体クリアランスに影響を与えるであろう他の配列責任を生じさせなかったことを示している。ＣＤ３ｏｐｔは、血清半減期に関してＣＤ３ｏｒｉｇと同様に良好であり、ＣＤＲ安定性が増加するという追加の利点を有する。
表４．ｈｕＦｃＲｎ ｔｇマウス及びＦｃＲｎ ｋｏマウスにおけるクリアランスデータ（ｍｌ／日／ｋｇ；平均及び（ＣＶ））。
Figure 2023531625000019
実施例８－最適化されたＣＤ３バインダを含むさらなるＴ細胞二重特異性抗体の生成
実施例１で同定された最適化されたＣＤ３バインダ（「ＣＤ３ｏｐｔ」、配列番号７（ＶＨ）及び１１（ＶＬ））を使用して、ＣＤ３及びＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）（「ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ」）を生成した。
このＴＣＢ（Ｐ０６３．０５６）に含まれるＥＧＦＲｖＩＩＩバインダは、ファージディスプレイとそれに続く親和性成熟（下記参照）に由来し、それぞれ配列番号８８及び９２に示される重鎖及び軽鎖の可変領域配列を含む。
ＴＣＢ分子の模式図を図６に示し、その全配列を配列番号１０９、１１０、１１１及び２７に示す。
元のＣＤ３結合配列を有する類似分子も調製した（配列番号１０９、１１０、１１１及び２６）。
二重特異性分子は、実施例４で上述したように、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞の一過性トランスフェクションによって生成され、精製され、分析された。
さらに、ファージディスプレイに由来するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、以下に記載するように使用するために、類似の方法（ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞をＩｇＧ重鎖及び軽鎖の発現ベクターで１：１の比率でトランスフェクトする）でヒトＩｇＧ１フォーマットで産生された。
すべてのＩｇＧ及びＴＣＢコンストラクトは、サイズ排除クロマトグラフィで測定した９５％を超えるモノマー含有量で、同等の品質で精製された。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の選択
ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ファージディスプレイに由来し、親和性が成熟した。ＥＧＦＲｖＩＩＩに対して高親和性結合及び特異性を示す抗体（Ｐ０５６．０２１（配列番号４０および４４）、Ｐ０５６．０５２（配列番号４８および５２）、Ｐ０４７．０１９（配列番号５６および６０）、Ｐ０５７．０１２（配列番号６４および６８）、Ｐ０５７．０１１（配列番号７２及び７６）、Ｐ０５６．０２７（配列番号８０及び８４））特異性を確認し、野生型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｗｔ）に対する交差反応性を排除するために、選択した抗体をＥＧＦＲｗｔ陽性ヒト腫瘍細胞株ＭＫＮ－４５への結合について試験した（図１２）。セツキシマブは、ＥＧＦＲｗｔへの結合の陽性対照として含まれ、非標的ＤＰ４７ＩｇＧは陰性対照として含まれた。選択されたすべての抗体は、ＥＧＦＲｗｔとの交差反応性なしにＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し、さらなる特徴付けのために考慮された。
次のステップでは、これらのＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（Ｆｃ領域にＰ３２９Ｇ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ（「ＰＧＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）変異を有するヒトＩｇＧ１フォーマット）としての機能活性は、ルミネセンスを測定することにより、抗ＰＧＬＡＬＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（ＣＡＲ Ｊアッセイ、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８６０３８を参照、参照によりその全体が本明細書に援用される。）を発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞と共培養されたＤＫ－ＭＧ細胞で評価された。ＤＰ４７ ＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡは陰性対照として含まれていた。試験したすべてのＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ＣＡＲ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞の強力な活性化を誘導した（図１３）。最も弱い結合及び活性化を示したＰ０４７．０１９を除いて、すべての試験したＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を選択して、ＴＣＢ形式（ＣＤ３バインダとしてＣＤｏｒｉｇを使用）に変換した。
ＴＣＢ形式に変換された選択されたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のＣＨＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞への結合を、対応するＩｇＧの結合と比較して（図１４）、ＴＣＢフォーマットへの変換がＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の結合能力に影響を与えないことを確認した。試験されたＥＧＦＲｖＩＩＩクローンのほとんどは、ＴＣＢフォーマットへの変換時にＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する能力を保持しており；クローンＰ０５７．０１１のみが、対応するＩｇＧと比較して、ＴＣＢフォーマットのＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合がわずかに減少したことを示した（表５）。
表５．ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＩｇＧ及びＴＣＢのＣＨＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合（ＥＣ５０）。
Figure 2023531625000020
続いて、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの機能的活性を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＤＫ－ＭＧ細胞に対するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイで試験した（図１５）。試験したすべてのＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢはＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターセルアッセイで活性があり、Ｐ０５６．０２１が最も強力なものであり、Ｐ０５６．０２７、Ｐ０５６．０５２、及びＰ０５７．０１２が同様の活性を備えており、Ｐ０５７．０１１が最も活性が低かった。次に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢを、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢのＥＧＦＲｗｔに対する交差反応性を排除するために、ＤＫ－ＭＧ又はＭＫＮ－４５細胞のいずれかと共培養したＰＢＭＣを用いた腫瘍細胞溶解アッセイで試験した（図１６）。このアッセイでは、腫瘍細胞の溶解とは別に、Ｔ細胞の活性化（図１７）及びサイトカインの放出（図１８）を追加の読み取り値として測定した。以前のレポーター細胞アッセイで見られたように、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ Ｐ０５６．０２１はＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞に対して最も高い活性を示したが、ＥＧＦＲｗｔ陽性細胞に対してはまったく活性がなかった。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ Ｐ０５７．０１１は、ＥＧＦＲｗｔ細胞に対して非特異的な活性を示したため、除外された。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ Ｐ０５６．０２７、Ｐ０５６．０５２、及びＰ０５７．０１２は、同等の活性を示した。これらの結果に基づいて、ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダＰ０５６．０２１及びＰ０５７．０１２が、追加のラウンドの親和性成熟のために選択された。
Ｐ０５７．０１２からは良好なバインダを得ることができなかった（結果は示していない。）。ＳＰＲによって決定された、Ｐ０５６．０２１由来の選択されたＥＧＦＲｖＩＩＩバインダのＥＧＦＲｖＩＩＩに対する親和性と特異性を表６に示す。
表６。ＳＰＲによって決定された、選択されたＥＧＦＲｖＩＩＩバインダのＥＧＦＲｖＩＩＩに対する親和性と特異性。
Figure 2023531625000021
親和性成熟ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダ（Ｐ０６３．０５６（配列番号８８及び９２）、Ｐ０６４．０７８（配列番号９６及び１００）、Ｐ０６５．０３６（配列番号１０４及び１０８））もまた、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＭＫＮ－４５細胞上のＥＧＦＲｖＩＩＩへの特異的結合のための親バインダへの結合と比較された（図１９）。ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する親和性及び特異性に関して最良のＥＧＦＲｖＩＩＩバインダであるＰ０６３．０５６が、ＣＤ３バインダとしてＣＤ３ｏｒｉｇ又はＣＤ３ｏｐｔのいずれかを用いてＴＣＢフォーマットに変換するために選択された。
Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＤＫ－ＭＧ、及びＭＫＮ－４５細胞に対するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイで、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ Ｐ０６３．０５６（ＣＤ３ｏｐｔ又はＣＤ３ｏｒｉｇを含む）の機能活性を親ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ Ｐ０５６．０２１と比較した（図２０）。３つのＴＣＢはすべて、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞の存在下でのみ特定のＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化を誘導する。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ Ｐ０６３．０５６は、親のＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ Ｐ０５６．０２１よりもわずかに高い活性を示した。
方法
表面プラズモン共鳴
ＥＧＦＲｖＩＩＩに対するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の親和性は、２５℃でＨＢＳ－ＥＰをランニングバッファ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）としてＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００での表面プラズモン共鳴によって決定された。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＰＧＬＡＬＡ ＩｇＧは、ＣＭ５チップ上に固定化されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＧＬＡＬＡ）（参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７／０７２２１０を参照）に特異的に結合する抗体を用いて、２５ｎＭで３０秒間捕捉された。ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥＣＤ ａｖｉ ｈｉｓ抗原（以下、実施例９を参照）を、１２．４～１０００ｎＭの濃度で、３０μｌ／分の流量で、２００秒にわたってすべてのフローセルに通過させた。解離段階を３００秒間監視し、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰに切り替えることでトリガーしチップ表面は、１０ｍＭ グリシン、ｐＨ２．０を３０秒間２回注入することにより、サイクルごとに再生された。参照フローセルで得られた応答を差し引くことにより、全体の屈折率の差を補正した。親和定数は、ＢＩＡｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１：１ラングミュア結合にフィッティングすることにより速度定数から導出した。
特異性を決定するために、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＥＧＦＲｗｔ ＥＣＤ抗原を、１００ｎＭで４０秒間、ＣＭ５チップ上に固定化された抗ｈｉｓ（Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ）で捕捉した。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を５００ｎＭで６０秒間単回注射した後、１０ｍＭグリシンｐＨ２．０で６０秒間再生した。５０を超える応答ユニットがＥＧＦＲｖＩＩＩ結合で観察された。５応答単位（ＲＵ）を超える応答はＥＧＦＲｗｔ結合に対して陽性であると見なされ、ＩｇＧはＥＧＦＲｗｔに対して５ＲＵ未満の応答で特異的であると分類された。
細胞株
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ；Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）は、ヒトＣＤ３を発現するＮＦＡＴプロモーターを有するヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株である。細胞は、ＲＰＭＩ１６４０、２ｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、１×ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウム中で０．１～０．５ｍｉｏ細胞／ｍｌで培養した。細胞を継代するたびに、ハイグロマイシンＢ１ｍｌ当たり２００μｇの最終濃度を加えた。
ＰＧＬＡＬＡ ＣＡＲを含むＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞は社内で生成された。元の細胞株（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ；Ｓｉｇｎｏｓｉｓ）は、ヒトＣＤ３を介した活性化時にルシフェラーゼ発現を引き起こすＮＦＡＴプロモーターを有するヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株である。それらは、Ｐ２９３Ｇ ＬＡＬＡ変異を認識できるキメラ抗原受容体を発現するように設計された。培養すると、細胞は１０％ ＦＣＳと１％グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０の懸濁液で増殖し、１ｍｌあたり０．４～１．５ｍｉｏ細胞に維持される。
ＣＨＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞は社内で生成された。ＣＨＯ－Ｋ１細胞にＥＧＦＲｖＩＩＩを安定的に形質導入した。細胞は、５％ ＦＣＳ、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ、及び６ｇ／ｍｌピューロマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。
ＤＫ－ＭＧ（ＤＳＭＺ ＃ＡＣＣ ２７７）は、ヒト神経膠芽腫細胞株である。ＤＫ－ＭＧ細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現のセルソーティングによって濃縮された。細胞は、ＲＰＭＩ １８６０、１０％ ＦＣＳ、及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸで培養した。
Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１４）は、ＥＧＦＲｖＩＩＩで安定に形質導入されたヒト神経膠芽腫細胞株である。細胞は、ＤＭＥＭ、１０％ ＦＣＳ、及び１％ ＧｌｕｔａＭＡＸで培養した。
ＭＫＮ－４５（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４０９）は、高レベルのＥＧＦＲｗｔを発現するヒト胃腺がん細胞である。細胞は、２％ＦＣＳ及び１％ ＧｌｕｔａＭＡＸを含む高度なＲＰＭＩ１６４０で培養された。
フローサイトメトリーによる標的結合
結合実験に使用した細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳバッファに再懸濁した。抗体染色は、９６ウェル丸底プレートで行った。細胞を回収し、計数し、１ウェルあたり１００，０００～２００，０００個の細胞を播種した。プレートを４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を除去した。試験抗体をＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、２０μｌの抗体溶液を４℃で３０分間細胞に添加した。非結合抗体を除去するために、細胞をＦＡＣＳバッファで２回洗浄した後、希釈した二次抗体ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃｇ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９－１１６－１７０又は＃ １０９－１１６－０９８）。４℃で３０分間インキュベーションした後、未結合の二次抗体を洗い流した。測定前に、細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファに再懸濁し、ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ又はＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用してフローサイトメトリーで分析した。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＰＧＬＡＬＡ ＩｇＧを用いたＣＡＲ Ｊ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイ
Ｔ細胞活性化を誘導するＥＧＦＲｖＩＩＩ ＰＧＬＡＬＡ ＩｇＧの効力は、ＣＡＲ Ｊ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイを使用して評価した。アッセイの原理は、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴで操作されたエフェクタ細胞を、腫瘍抗原を発現するがん細胞と共培養することである。ＰＧＬＡＬＡ変異と標的抗原ＥＧＦＲｖＩＩＩを介してＩｇＧがＣＡＲに同時に結合した場合にのみ、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、Ｊｕｒｋａｔエフェクタ細胞でのルシフェラーゼ発現が増加する。適切な基質を添加すると、アクティブなホタルルシフェラーゼが発光し、ＣＡＲを介した活性化のシグナルとして測定できる。簡単に言えば、標的細胞を採取し、生存率を決定した。アッセイ開始の前日に、３０，０００個の標的細胞／ウェルを、平底の白い壁の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、＃６５５０９８）に１００μｌの培地で播種した。翌日、培地を除去し、２５μｌ／ウェルの希釈抗体又は培地（対照用）を標的細胞に添加した。その後、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存率を評価した。細胞を細胞培養培地に１．５ｍｉｏ細胞／ｍｌで再懸濁し、７５，０００細胞／ウェル（５０μｌ／ウェル）で腫瘍細胞に添加して、２．５：１の最終的なエフェクタ対標的（Ｅ：Ｔ）比と、ウェル当たり７５μｌの最終容量を得た。次いで、４μｌのＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ１２９１）を各ウェルに添加した（最終容積の２％）。細胞を加湿インキュベーター内で３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、プレートを室温に順応させた（約１５分）。次に、２５μｌ／ウェルのＯｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６１２０）を添加し、ＴＥＣＡＮ Ｓｐａｒｋを使用して発光を検出する前に、プレートを暗所で１５分間インキュベートした。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢを用いたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイ
ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞とＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を使用して、改善されたＣＤ３又は元のＣＤ３バインダのいずれかを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢがＴ細胞架橋を誘導し、その後Ｔ細胞活性化を誘導する能力を評価した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢがＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性標的細胞及びＣＤ３抗原（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞で発現）に同時に結合すると、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、活性なホタルルシフェラーゼが発現する。発光シグナルの強度（ルシフェラーゼ基質の添加により得られる）は、ＣＤ３の活性化とシグナル伝達の強度に比例する。アッセイのために、標的細胞を採取し、生存率を決定した。３０，０００ターゲット細胞／ウェルを、１００μｌの培地と５０μｌ／ウェルの希釈抗体で、平底の白い壁の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－、ｏｎｅ ＃６５５０９８）にプレーティングするか又は培地（対照用）を標的細胞に添加した。その後、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存率を評価した。細胞を、ハイグロマイシンＢを含まない細胞培養培地に１．２ｍｉｏ細胞／ｍｌで再懸濁し、６０，０００細胞／ウェル（５０μｌ／ウェル）で腫瘍細胞に添加し、２：１の最終エフェクタ対標的（Ｅ：Ｔ）比とウェルあたり２００μｌの最終容量を得た。次いで、４μｌのＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ１２９１）を各ウェルに添加した（最終容積の２％）。細胞を加湿インキュベーター内で３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、ＴＥＣＡＮ Ｓｐａｒｋを使用して発光を検出した。
Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞死滅
標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを使用して３０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を一晩接着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なヒトドナーから得られた新鮮な血液のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離によって調製された。新鮮な血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）に積層した。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、室温）後、ＰＢＭＣを含む中間層の上の血漿を捨て、ＰＢＭＣを新しいファルコンチューブに移し、続いて５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分、室温）、上清を捨て、ＰＢＭＣペレットを無菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心ステップ３５０×ｇ、１０分）。得られたＰＢＭＣ集団を自動的に計数し（ＶｉＣｅｌｌ）、１０％ＦＣＳ及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ２で細胞インキュベーター内でさらに使用するまで（２４時間以内）保存した。殺傷アッセイのために、抗体を指示された濃度で三重に添加した。ＰＢＭＣは、１０：１の最終エフェクタ対標的（Ｅ：Ｔ）比で標的細胞に添加された。標的細胞のキリングは、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした後、アポトーシス／ネクローシス細胞によって細胞上清に放出されたＬＤＨの定量化によって評価された（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）。標的細胞の最大の溶解（＝１００％）は、標的細胞を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とインキュベートすることによって達成された。最小限の溶解（＝０％）は、二重特異性構築物なしでエフェクタ細胞と共培養された標的細胞を指す。
ＴＣＢによって媒介される標的細胞のＴ細胞死滅によるＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（後期活性化マーカー）及びＣＤ６９（早期活性化マーカー）を認識する抗体を使用したフローサイトメトリーによって評価されました。４８時間のインキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０×ｇで５分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＣＤ４ ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３００５１４）、ＣＤ８ ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３４４７０４）、ＣＤ２５ ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３０２６３０）、及びＣＤ６９ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３１０９０６）の表面染色は、製造元の指示に従って行った。細胞を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定バッファ（ＢＤ、＃５５４６５５）を使用して４℃で１５分間固定した。遠心分離後、サンプルを２００μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファに再懸濁した。サンプルはＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析された。
上清中のサイトカイン分泌は、製造元の指示に従ってサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）を使用してフローサイトメトリーで測定したが、５０μｌのビーズとサンプルの代わりに２５μｌの上清とビーズのみを使用した。以下のＣＢＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。ＣＢＡヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）フレックスセット、ＣＢＡヒトグランザイムβレックスセット、及びＣＢＡヒトＴＮＦフレックスセット。ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ又はＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して試料を測定し、Ｄｉｖａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析を実施した。
実施例９－最適化されたＣＤ３バインダを含むＴ細胞二重特異性抗体のＣＤ３及びＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合
組換えＣＤ３への結合
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの組換えＣＤ３への結合は、上記の実施例５でＴＹＲＰ１ ＴＣＢについて記載したように、最適化された（ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔ）又は元の（ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇ）ＣＤ３結合配列を有するＴＣＢを使用して、ＳＰＲによって評価した。標準的なアミン結合キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ｐＨ５．０で約５２００共鳴単位（ＲＵ）を直接固定することにより、捕捉抗体をセンサチップ表面に結合させ、ＴＣＢ分子は、１０μｌ／分の流量で２０ｎＭで３０秒間捕捉された。
ヒト及びカニクイザルＣＤ３への結合のＫＤ値は、ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔについて、それぞれ３０ｎＭ及び２０ｎＭと決定され、ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇのものと同様であった（それぞれ４０ｎＭ及び３０ｎＭ）。
これは、ストレスのない状態では、ＣＤ３ｏｐｔ又はＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含む両方のＴＣＢが、組換えＣＤ３に比較的よく結合したことを示している。
組換えヒトＣＤ３へのＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの結合も、最適化された、又は元のＣＤ３結合配列を有するＴＣＢを使用して、３７℃又は４０℃で１４日間の温度ストレス後に評価された。ＩｇＧ分子の代わりにＴＣＢを使用して、上記の実施例２に記載のように実験を行った。
この実験の結果を図２１に示す。
図２１に見られるように、最適化されたＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔを含むＴＣＢは、元のＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇを含むＴＣＢと比較して、ストレス後（３７℃、ｐＨ７．４で２週間）にＣＤ３への結合が大幅に改善された。この結果は、再び、最適化されたＣＤ３バインダ（実施例２を参照）の改善された特性がＴＣＢレベルで維持されていることを確認する。
組換えＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの組換えＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合は、ＳＰＲによって評価された。
ＳＰＲ実験は、実行バッファとしてＨＢＳ－ＥＰを使用してＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で実行されました（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））。
抗Ｆｃ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、標準的なアミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ｐＨ５．０でＣＭ５センサチップに直接結合された。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ（５ｎＭ）を１０ｌ／分の流速で３０秒間捕捉した。結合相を記録するために、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原の３倍希釈系列を３０μｌ／分で２００秒間フローセルに通した。解離フェーズは、３００秒又は３００秒監視され、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰに切り替えることによってトリガーされる。チップ表面は、３Ｍ ＭｇＣＬ２を２０μｌ／分で３０秒間１回注入することにより、サイクルごとに再生された。
使用した抗原は、Ｃ末端のＡｖｉタグおよびＨｉｓタグに融合したヒトＥＧＦＲｖＩＩＩの細胞外ドメインを含む（ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥＣＤ ａｖｉ ｈｉｓ；配列番号３６）。
バルク屈折率の差は、参照フローセル（ＴＣＢが捕捉されていない）で得られた応答を差し引くことによって補正された。親和定数（ＫＤ）は、ＢＩＡｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１：１ラングミュア結合にフィッティングすることにより速度定数から導出した。見かけのアビディティＫＤ定数は、この２：１相互作用に対する１：１結合適合を使用して、速度定数を介して動力学的分析によって概算された。
ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合のＫＤ値（親和性）は、ＣＤ３ｏｐｔ又はＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの両方について６ｎＭと測定された。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの組換えＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合も、最適化された、又はオリジナルのＣＤ３結合配列を有するＴＣＢを使用して、３７℃又は４０℃で１４日間の温度ストレス後に評価された。実験は、抗原としてＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥＣＤ ａｖｉ ｈｉｓを使用して、上記の実施例５に記載のように行った（上記参照）。
この実験の結果を図２２に示す。彼らは、両方のＴＣＢのヒトＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合がストレス条件の影響を受けないことを確認している。
Ｊｕｒｋａｔ細胞のＣＤ３への結合
ヒトレポーターＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ上のＣＤ３への結合は、実施例２で上述したように、最適化されたＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」又は元のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」を含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢについてＦＡＣＳによって決定された。
図２３に示されるように、最適化されたＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」又は元のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」のいずれかを含むＴＣＢは、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３に比較的良好に結合した。
Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞上のＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合
ヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ上のＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合は、ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダＰ０６３．０５６をＣＤ３ｏｐｔ又はＣＤ３ｏｒｉｇ共に、あるいはＥＧＦＲｖＩＩＩクローンＰ０５６．０２１をＣＤ３ｏｒｉｇ共に含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢについてのＦＡＣＳによって決定された。ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダＰ０６３．０５６もＩｇＧフォーマットで含まれていた。
図２４に示されるように、３つのＴＣＢはすべて、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞上で発現されたＥＧＦＲｖＩＩＩに高い親和性で結合し、結合はＴＣＢ形式への変換によって損なわれない。
実施例１０－最適化されたＣＤ３バインダを含むＴ細胞二重特異性抗体の機能活性
ＣＤ３活性化
選択したＥＧＦＲｖＩＩＩバインダ（Ｐ０６３．０５６）と、最適化されたＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔ又は元のＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢは、実施例８で上述した通りに、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性神経膠芽腫細胞ＤＫ－ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ－ｈｕＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＥＧＦＲｗｔ陽性ＭＫＮ４５細胞の存在下でＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターセルアッセイで試験された。
ＩｇＧについて見られるように（実施例３）、ＣＤ３ｏｐｔ又はＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含有するＴＣＢは両方とも、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞に対して同様の機能的活性を有し、濃度依存的にＣＤ３活性化を誘導した（図２０）。
標的細胞死滅
選択したＥＧＦＲｖＩＩＩバインダ（Ｐ０６３．０５６）と、最適化されたＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔ又は元のＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢは、実施例８で上述した通りに、神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＰＢＭＣの存在下での腫瘍細胞死滅実験において、親ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダＰ０５６．０２１及びＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇ含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢと比較した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞で見られるように、ＣＤ３ｏｐｔ又はＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを有するＴＣＢの機能的活性は、ＣＤ６９上方制御によって測定される腫瘍細胞溶解の誘導及びＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の活性化に関して類似している（図２５）。
さらに、ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダＰ０６３．０５６及び最適化されたＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔを使用したＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの「２＋１フォーマット」での機能活性（図６に示すように）は、「１＋１ ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌフォーマット」で同じＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＣＤ３バインダを使用したＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢと比較された（図１Ｇに模式的に示されている）。これらの２つのＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢは、実施例８に記載されるように、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイ及び神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩを用いた腫瘍細胞死滅アッセイにおいて試験された。２＋１フォーマットのＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢは、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイ（図２６）及びＰＢＭＣを用いたキリングアッセイにおける腫瘍細胞死滅及びＴ細胞活性化の誘導において（図２７）測定されたＣＤ３活性化の両方において優れた機能活性を有していた。
実施例１１－最適化されたＣＤ３バインダを含むＴ細胞二重特異性抗体の機能特性評価
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＴ細胞の増殖と活性化
選択したＥＧＦＲバインダ（Ｐ０６３．０５６）と、最適化されたＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔ又は元のＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの機能活性を、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞に対するＴ細胞増殖アッセイにおいて、親ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合剤Ｐ０５６．０２１及びＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢと比較した（図２８）。３つのＴＣＢはすべて、ＣＤ４ Ｔ細胞とＣＤ８ Ｔ細胞の強力な増殖と活性化を誘導した。ＣＤ３ｏｐｔを含むＰ０６３．０５６ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢは、他の２つのＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢよりも高い活性を示した。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる腫瘍細胞溶解
次に、選択されたＥＧＦＲバインダ（Ｐ０６３．０５６）と最適化されたＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ、及び親ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダＰ０５６．０２１とＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢを、ＤＫ－ＭＧ細胞と共培養したＰＢＭＣを用いた腫瘍細胞溶解アッセイで試験した（図２９）。このアッセイでは、腫瘍細胞の溶解とは別に、Ｔ細胞の活性化とサイトカインの放出を追加の読み取り値として測定した。前に見たように、ＣＤ３ｏｐｔを含むＰ０６３．０５６ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢは、腫瘍細胞の溶解、Ｔ細胞の活性化、及びＩＦＮγとＴＮＦαの放出に関して、ＣＤ３ｏｒｉｇを含むＰ０５６．０２１ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢよりも高い活性を示した。
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢによるＴ細胞の活性化と腫瘍細胞の溶解
サイトカイン放出を誘導するＴＹＲＰ１ ＴＣＢの機能的特性は、健康なドナーから分離されたＰＢＭＣと初代メラノーマ細胞株Ｍ１５０５４３を共培養することによって試験された。ＴＹＲＰ１ ＴＣＢを介してＴ細胞によって媒介される腫瘍細胞溶解を、処置の２４時間後及び４８時間後に分析した（図３０）。上清中へのＩＦＮγ及びＮＦαの放出、並びにＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を、４８時間の処理後に分析した。ＴＹＲＰ１ ＴＣＢは、２４時間後にすでに強力な腫瘍細胞溶解を誘導することができた。これは、ＣＤ２５の上方制御、並びにＩＦＮγ及びＴＮＦαの有意な放出によって決定されるＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の強力な活性化を伴っていた。
方法
ＰＢＭＣの単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なヒトドナーから得られた新鮮な血液のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離によって調製された。新鮮な血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）に積層した。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、室温）後、ＰＢＭＣを含む中間層の上の血漿を捨て、ＰＢＭＣを新しいファルコンチューブに移し、続いて５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分、室温）、上清を捨て、ＰＢＭＣペレットを無菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心ステップ３５０×ｇ、１０分）。得られたＰＢＭＣ集団を自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、１０％ ＦＣＳ及び１％ ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＲＰＭＩ１６４０培地に３７℃、５％ ＣＯ２の細胞インキュベーターで、さらに使用するまで（２４時間以内）又は冷凍して保存し、さらに使用するまで液体窒素で貯蔵した。使用前日に、凍結したＰＢＭＣを解凍し、３７℃の培地で一晩培養した。
Ｔ細胞増殖
手短に言えば、標的細胞を採取し、計数し、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＰＢＳ中に１ｍｌ当たり５ｍｉｏ細胞で再懸濁した。細胞を細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃６５－０８４０－８５）で染色し、最終濃度は５μＭ、３７℃で１０分間染色した。染色反応を停止させるために、４容量の冷完全細胞培養培地を細胞懸濁液に加え、４℃で５分間インキュベートし、その後培地で３回洗浄した。標識された標的細胞を計数し、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ、及び１％ＧｌｕｔａＭａｘで１ｍｌ当たり０．１ｍｉｏ細胞に調整した。ウェル当たり１０，０００個の標的細胞を９６ウェルプレートに播種した。次いで、処置を指示された濃度で添加し、最後に健康なドナーから単離した１００，０００個のＰＢＭＣをウェルごとに添加した。細胞を３７℃で５日間インキュベートし、次に、ＰＢＭＣを回収し、ＣＤ３ ＢＵＶ３９５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃５６３５４８）、ＣＤ４ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３００５０８）、ＣＤ８ ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３４４７２２）、ＣＤ２５ ＰＥ／Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３０２６１２）で染色した。増殖は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定されたＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞におけるｅＦｌｕｏｒ ６７０色素の希釈と、ＣＤ２５上方制御の測定によるＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の活性化によって決定された。
Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞死滅
標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで回収し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを使用して３０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を一晩接着させた。キリングアッセイのために、抗体を指示された濃度で三重に添加した。ＰＢＭＣは、１０：１の最終エフェクタ対標的（Ｅ：Ｔ）比で標的細胞に添加された。標的細胞のキリングは、３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベーションした後、アポトーシス／ネクローシス細胞によって細胞上清に放出されたＬＤＨの定量化によって評価された（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）。標的細胞の最大の溶解（＝１００％）は、標的細胞を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とインキュベートすることによって達成された。最小限の溶解（＝０％）は、二重特異性構築物なしでエフェクタ細胞と共培養された標的細胞を指す。
Ｔ細胞活性化
ＴＣＢによって媒介される標的細胞のＴ細胞死滅によるＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（後期活性化マーカー）及びＣＤ６９（早期活性化マーカー）を認識する抗体を使用したフローサイトメトリーによって評価された。４８時間のインキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０×ｇで５分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＣＤ４ ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３００５１４）、ＣＤ８ ＦＩＴＣ（＃３４４７０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５ ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３０２６３０）、及びＣＤ６９ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３１０９０６）の表面染色は、製造元の指示に従って行った。細胞を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定バッファ（ＢＤ、＃５５４６５５）を使用して４℃で１５分間固定した。遠心分離後、サンプルを２００μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファに再懸濁した。サンプルはＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析された。
サイトカイン分泌
上清中のサイトカイン分泌は、製造元の指示に従ってサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）を使用してフローサイトメトリーで測定したが、５０μｌのビーズとサンプルの代わりに２５μｌの上清とビーズのみを使用した。以下のＣＢＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。ＣＢＡヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）フレックスセット及びＣＢＡヒトＴＮＦフレックスセット。ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ又はＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して試料を測定し、Ｄｉｖａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析を実施した。
実施例１３－最適化されたＣＤ３バインダを含むＴ細胞二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ（実施例１で同定された最適化されたＣＤ３バインダを含む）を、ヒト腫瘍細胞株の異種移植マウスモデルであるＩＧＲ－１メラノーマ異種移植モデルにおいて、その抗腫瘍効果について試験した。
ＩＧＲ－１細胞（ヒトメラノーマ）は、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞は、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気中、３７℃で培養された。継代６を移植に使用した。細胞生存率は９６．７％だった。動物１匹当たり２×１０６個の細胞を、１ｍｌのツベルクリン注射器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ）を使用して、１００μｌのＲＰＭＩ細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ）中のマウスの脇腹に皮下注射した。
完全にヒト化されたＮＳＧ雌マウス（Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ ＡＧ、スイス）は、コミットされたガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間の明／１２時間の暗の毎日のサイクルで、特定の病原体のない状態で維持された。実験的研究プロトコルは、現地政府によって審査及び承認された（ＺＨ２２３／２０１７）。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
研究０日目にマウスに２×１０６個のＩＧＲ－１細胞を皮下注射し、無作為化し、秤量した。腫瘍細胞注射（腫瘍体積＞２００ｍｍ３）の２０日後、マウスに１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）のＴＹＲＰ１ ＴＣＢを週２回、５週間静脈内注射した。すべてのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。ビヒクル群のマウスにはヒスチジン緩衝液を注射し、治療群にはＴＹＲＰ１ ＴＣＢ構築物を注射した。２００μｌ当たりの適切な量の抗体を得るために、必要に応じてストック溶液をヒスチジンバッファで希釈した。腫瘍サイズは、キャリパーを使用して週３回測定し、ＧｒａｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してｍｍ３＋／－ＳＥＭの体積としてプロットした。ＪＭＰ１２ソフトウェアを使用して統計分析を実行した。
図３１は、ＴＹＲＰ１ ＴＣＢが、ビヒクル群と比較して、腫瘍増殖阻害に関して有意な有効性を媒介したことを示している（６８％ＴＧＩ、ｐ＝０．００５８＊）。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ（実施例１で同定された最適化されたＣＤ３バインダを含む）は、同様に、ヒト腫瘍細胞株の異種移植マウスモデルであるＵ８７－ＥＧＦＲｖＩＩＩ神経膠芽腫異種移植モデルにおけるその抗腫瘍効果について試験された。
Ｕ８７細胞（ヒト神経膠芽腫）はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＵＳＡ）から最初に入手し、安定してトランスフェクトしてヒトＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を発現させた（Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ ＡＧ、スイス）。増殖後、細胞は Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに保管された。Ｕ８７－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞株は、１０％ ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）及び０．５μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞は、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気中、３７℃で培養された。継代８を移植に使用した。細胞生存率は９４．７％だった。動物１匹あたり５×１０５個の細胞を、１ｍｌのツベルクリン注射器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ）を使用して、１００μｌのＲＰＭＩ細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ）中のマウスの脇腹に皮下注射した。
完全にヒト化されたＮＳＧ雌マウス（Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ ＡＧ、スイス）は、コミットされたガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間の明／１２時間の暗の毎日のサイクルで、特定の病原体のない状態で維持された。実験的研究プロトコルは、現地政府によって審査及び承認された（ＺＨ２２３／２０１７）。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
研究０日目にマウスに５×１０５個のＵ８７－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を皮下注射し、無作為化して秤量した。腫瘍細胞注射（腫瘍体積＞２００ｍｍ３）の２週間後、マウスに１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）のＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢを週２回、３週間静脈内注射した。すべてのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。ビヒクル群のマウスにはヒスチジン緩衝液を注射し、治療群にはＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ構築物を注射した。２００μｌ当たりの適切な量の抗体を得るために、必要に応じてストック溶液をヒスチジンバッファで希釈した。腫瘍サイズは、キャリパーを使用して週３回測定し、ＧｒａｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してｍｍ３＋／－ＳＥＭの体積としてプロットした。
図３２は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢが腫瘍増殖制御に関して有意な有効性を媒介し、すべてのマウスが完全寛解を達成したことを示している。
実施例１４－マウスにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＰＫ研究
最適化されたＣＤ３バインダであるＣＤ３ｏｐｔを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの薬物動態（ＰＫ）を、ヒトＦｃＲｎトランスジェニック（ｌｉｎｅ３２、ホモ接合体）及びＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスへの１ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス投与後に研究した。ヒトＦｃＲｎトランスジェニック（ｔｇ）マウス及びＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスから６７２時間まで連続血液マイクロ試料を採取した（投与後５分～６７２時間、マウス当たり９試料）。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢで処理したマウス血清の試料を、非ＧＬＰ条件下で特異的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して分析した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの捕捉は、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート（ＳＡ－ＭＴＰ）上のビオチン化ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原（ｈｕＥＧＦＲｖＩＩＩ ｈｉｓビオチン）を使用して行った。結合したＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＧＬＡＬＡ）に対するジゴキシゲニン標識モノクローナル抗体（実施例３を参照）に続いて抗ジゴキシゲニン－ＰＯＤ二次検出抗体を添加して検出した。シグナルは、ペルオキシダーゼ基質（ＡＢＴＳ）の添加によって生成された。キャリブレーション範囲は２．３５ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌで、２．５ｎｇ／ｍｌが定量下限（ＬＬＯＱ）であった。
この調査の結果を表７に示す。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢのＰＫプロファイルは、試験した両方のマウス系統で予想される範囲内である。これは、ＣＤ３バインダのＣＤＲの操作が、抗体クリアランスに影響を与える他の配列責任を生じさせなかったことを示している。
表７．ｈｕＦｃＲｎ ｔｇマウス及びＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおけるクリアランスデータ（ｍｌ／日／ｋｇ；平均）。
Figure 2023531625000022
実施例１５－ＣＤ３バインダとしてＣＤ３ｏｐｔを使用したＦＯＬＲ１ ＴＣＢ：
ＣＤ３ｏｐｔをＣＤ３バインダとして使用したＦＯＬＲ１ ＴＣＢの変換と生成
ＣＤ３ｏｐｔ ＦＯＬＲ１ ＴＣＢ（「クラシック２＋１フォーマット」＝外側にＣＤ３ Ｆａｂ、Ｆｃノブ鎖の内側にＦＯＬＲ１ Ｆａｂ、図３３Ａ、配列番号１２７、１２８、１２９）の製造のために、ＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔの可変ドメインを適切な発現ベクターに挿入した。この分子は、Ｆｃエフェクタ機能を無効にするために、Ｆｃ領域（ＬＬ２３４／２３５ＡＡ及びＰ３２９Ｇ）に変異によるヒトＩｇＧ１骨格で構成されている。Ｔ細胞二重特異性分子は、ノブ・イントゥー・ホール技術（標的抗原に対する２つの結合部分とＣＤ３に対する１つの結合部分）に基づく独自の２＋１ヘテロ二量体形式で生成された。
ＣＤ３ｏｐｔをＣＤ３バインダとして使用したＦＯＬＲ１ ＴＣＢのトランスフェクションと発現
ＦＯＬＲ１ ＴＣＢの発現は、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｔｈｅｒｍｏ／Ｇｉｂｃｏ ＃Ａ２９１３３）の一過性トランスフェクションによって行った。ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞は、製造元の指示に従って事前培養した。トランスフェクションの日に、５００ｍｌの細胞に６×１０Ｅ６生細胞／ｍＬを無菌の使い捨てシェーカーフラスコに播種した。最適なトランスフェクションのために、培養液量１ｍＬ当たり１．０μｇのプラスミドＤＮＡと０．６４μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を使用した。
ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔを冷ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地で希釈し、ＤＮＡ を冷ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地で希釈して、室温で５分間インキュベートした。希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅｓ（商標）ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔを希釈したＤＮＡに加え、十分に混合し、室温でさらに５分間インキュベートした。続いて、複合混合物を細胞に添加し、オービタルシェーカープラットフォーム上で相対湿度≧８０％、ＣＯ２ ８％の３７℃のインキュベーターでインキュベートする。
製造元の推奨に従って、高力価プロトコルがタンパク質発現に使用された：トランスフェクション後１日目にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒとシングルフィードの追加；トランスフェクション後１日目に細胞を３２℃にシフト。トランスフェクション後８日目に、精製のために細胞上清を回収した。
ＦＯＬＲ１ ＴＣＢの精製
ＦＯＬＲ１ ＴＣＢは、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィ、続いてイオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィによって精製された。簡単に説明すると、上清を、１×ＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。５カラム容量の平衡化バッファでの洗浄ステップの後、ｐｒｏＴＣＢを１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ３．０を使用して溶出した。流量は５ｍｌ／分に設定した。プールした画分を水で希釈し（１：５ｖ／ｖ）、４０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ５．５で平衡化したＰＯＲＯＳ ＨＳ ５０カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に充填した。平衡緩衝液で洗浄した後、ＴＣＢを、４０ｍＭから１Ｍまでの酢酸ナトリウム勾配を２７カラム容積にわたって用いて溶出した。流量は７ｍｌ／分に設定した。収集した画分を分析用サイズ排除クロマトグラフィ（Ｗａｔｅｒｓ ＢｉｏＳｕｉｔｅ）で分析し、単量体種の含有量に従ってプールした。続いて、プールした画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して最終容積１５ｍｌまで濃縮した。濃縮プールを、カラム容積３２０ｍｌのＨｉＬｏａｄ ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。ランニングバッファは２０ｍＭヒスチジン－ＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．０で、流量は３ｍｌ／分に設定された。単量体種の含有量に従って画分をプールした。
表８：ｃｌ２２をＣＤ３バインダとしたＦＯＬＲ１ ＴＣＢの生産／精製結果
実施例１６－ＦＯＬＲ１－ＴＣＢ（ＣＤ３ｏｐｔ）によって媒介されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴの活性化
ＣＤ３ ｃｌｏｎｅ２２バインダを含むＦＯＬＲ１－ＴＣＢは、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターアッセイで最初に試験された。
ＦＯＬＲ１標的化Ｔ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）は、ｈｕＦＯＬＲ１コーティングビーズとＴ細胞上のＣＤ３ｅｐｓｉｌｏｎ（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ）に同時に結合し、それによってＴ細胞の活性化を誘導する。Ｔ細胞の活性化は、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴルシフェラーゼ細胞がＣＤ３ｅｐｓｉｌｏｎ（ＣＤ３ε）を介して活性化されるとルシフェラーゼを発現するため、発光として測定できる。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＮＦＡＴプロモーターを有し、ヒトＣＤ３εを発現するヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株である。ＴＣＢが腫瘍標的に結合し、ＣＤ３（架橋）がＣＤ３εに結合する場合、ルシフェラーゼ発現は、Ｏｎｅ－Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加後にルミネッセンスで測定することができる。
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴアッセイ培地：ＲＰＭＩ１６４０、２ｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウム Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ培養培地：ＲＰＭＩ １６４０、２ｇ／ｌ グルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウム；新たにハイグロマイシンＢ ２００μｇ／ｍｌを加えた。
６５μｌのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを１０ｍｌのＰＢＳで希釈した。ビーズを４００ｒｃｆで４分間遠心分離し、上清を除去した。次に、３０μｇのビオチン化ＦｏｌＲ１抗原を１．５ｍｌのＤＰＢＳに加え、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｂｅａｄｓに加えた。ビーズと抗原の混合物をゆっくりと回転させながら、４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、１０ｍｌのＤＰＢＳをビーズ－ａｇコンジュゲートに添加し、遠心分離し（４分間、４００ｒｃｆ）、上清を廃棄した。コンジュゲートを再び５ｍｌのＤＰＢＳで洗浄し、次いでペレットを６ｍｌのアッセイ培地に再懸濁した。エフェクタ細胞（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ）を採取し、計数し、生存率をチェックした。細胞を３５０ｒｃｆで４分間遠心分離した後、細胞を１２ｍｌのアッセイ培地に再懸濁した。エフェクタ細胞懸濁液にｃＡＭＰを添加した（最終容積２％）。
コーティングされたビーズ（１０μｌ／ウェル）とＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴエフェクタ細胞（２０μｌ／ウェルで２０，０００細胞／ウェル）をｃＡＭＰで混合し、３８４ウェルの白壁透明底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ）に加えた。ＦＯＬＲ１－ＴＣＢをｊｕｒｋａｔアッセイ培地で希釈してから、希釈列を調製し、ウェル当たり１０μｌを加えた。細胞をビーズ及びＴＣＢ／培地とともに加湿インキュベーターで３７℃で５．５時間インキュベートした後、検出時間として０．５秒／ウェルを使用してＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋで発光を読み取る前にインキュベーターから約１０分間取り出して室温に適応させた。
ＦＯＬＲ１－ＴＣＢは、架橋のためにｈｕＦＯＬＲ１でコーティングされたビーズを使用して、用量依存的なＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化を誘導した（図３４）。
実施例１７－ＦＯＬＲ１ ｐｒｏ－ＴＣＢ（ＣＤ３ｃｌｏｎｅ２２）によって媒介されるＴ細胞死滅
ＣＤ３ｏｐｔによるＦＯＬＲ１－ＴＣＢの効力を評価するために、ＦＯＬＲ１－ＴＣＢによって媒介される標的細胞の細胞毒性及びＴ細胞活性化を、ＦＯＬＲ１陽性Ｏｖｃａｒ－３細胞を使用して評価した。ヒトＰＢＭＣをエフェクタ細胞として使用し、分子及び細胞との４８時間のインキュベーション後にＴ細胞活性化マーカーを染色した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なヒトドナーから得られたバフィーコートから分離された。バフィーコートを無菌ＰＢＳで１：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）上に積層した。遠心分離（４５０×ｇ、３０分、休憩なし、室温）後、ＰＢＭＣを含む中間相を新しいファルコンチューブに移し、続いて５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を捨て、赤血球溶解のためにＰＢＭＣペレットを２ｍｌのＡＣＫ緩衝液に再懸濁した。３７℃で約２～３分間インキュベートした後、チューブを滅菌ＰＢＳで５０ｍｌまで満たし、３５０×ｇで１０分間遠心分離した。この洗浄ステップは、２％ ＦＣＳ、１ＸＧｌｕｔａＭａｘ及び１０％ ＤＭＳＯを含む高度なＲＰＭＩ１６４０培地にＰＢＭＣを再懸濁する前に１回繰り返した。ＰＢＭＣをＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ（ＢｉｏＣｉｓｉｏｎ）で－８０℃でゆっくりと凍結し、液体窒素に移した。アッセイ開始の１日前に、接着標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで回収し、計数し、生存率をチェックし、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％ ＦＣＳ、１ＸＧｌｕｔａＭａｘ）に再懸濁した。アッセイ開始の約２４時間前に、ＰＢＭＣをＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ、１ＸＧｌｕｔａＭａｘ）で解凍した。ＰＢＭＣを３５０ｇで７分間遠心分離し、新鮮な培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ、１ＸＧｌｕｔａＭａｘ）に再懸濁した。ＰＢＭＣは、アッセイに使用する前に最大２４時間保持された。アッセイ培地は、ＲＰＭＩ＋２％ ＦＣＳ＋１％ ＧｌｕｔａＭａｘであった。
標的細胞は、９６ウェル平底プレートを使用して、２０，０００細胞／ウェル（アッセイ培地中５０μｌ／ウェル中）の密度で播種した。細胞を３７℃の加湿インキュベーターで一晩インキュベートした。分子をアッセイ培地で希釈し、指示された濃度で三重に添加した。ＰＢＭＣＳを回収し、３５０ｇで７分間遠心分離した後、アッセイ培地に再懸濁した。プレートを３７℃で４８時間インキュベートする前に、１００μｌ／ウェル中の０．２ｍｉｏ ｈｕＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ １０：１、播種した標的細胞の数に基づく）を添加した。標的細胞のキリングは、３７℃、５％ ＣＯ２で４８時間インキュベーションした後、アポトーシス／ネクローシス細胞によって細胞上清に放出されたＬＤＨの定量化によって評価された（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）。標的細胞の最大の溶解（＝１００％）は、ＬＤＨ読み出し前に標的細胞を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と１時間インキュベートすることによって達成された。最小限の溶解（＝０％）は、ＴＣＢなしでエフェクタ細胞と共培養された標的細胞を指す。吸光度（Ａ４９２ｎｍ－Ａ６５０ｎｍ）を測定することにより、ＬＤＨ放出を測定した。
Ｔ細胞の活性化は、３７℃、５％ＣＯ２での４８時間のインキュベーション後に、ＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔ細胞上のＣＤ６９の定量化によって評価した。
プレートを４００×ｇで４分間遠心分離する前に、ＰＢＭＣを含むウェルにＤＰＢＳを添加した。上清を吸引し、細胞をＰＢＳで再度洗浄し、遠心分離し、上清を除去し、プレートを注意深くボルテックスすることにより細胞ペレットを再懸濁した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ ５μｌをＤＰＢＳで１：１０００に希釈した。５０μｌの希釈色素をＰＢＭＣを含むウェルに添加した。１滴の補正ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡｒｃＴＭ、反応性ビーズ）を加えて１つの空のウェルを用意し、未希釈のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ色素１μｌを加えた。プレートを４℃で３０分間インキュベートした。余分な色を取り除くために、細胞を２回洗浄した。１回目は１５０μｌのＰＢＳで、２回目は１５０μｌのＦＡＣＳバッファで洗浄した。プレートを４００×ｇで４分間遠心分離した。上清を除去し、注意深くボルテックスして細胞を再懸濁した。ネガティブビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡｒｃＴＭ、ネガティブビーズ）１滴を、ＬＩＶＥ染色ビーズを含む補正コントロールウェルに加えた。２５μｌの希釈したＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤ２５／ＣＤ６９抗体混合物（各色０．８μｌ／ウェル）、単一抗体（補正対照用；０．８μｌ ＡＢ＋２４μｌ ＦＡＣＳバッファ）又はＦＡＣＳバッファ（無染色対照用）は、ウェル内の再懸濁細胞に添加され、プレートは４℃で６０分間インキュベートされた。未結合の抗体を除去するために、細胞をウェル当たり１５０μｌのＦＡＣＳバッファで２回洗浄した。遠心分離後、上清を除去し、注意深くボルテックスすることにより細胞を再懸濁した。細胞は、翌週の分析のために一晩、１５０μｌのＦＡＣＳ＋１％ ＰＦＡ緩衝液中で固定された。翌日、細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＦＡＣＳ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて蛍光を測定した。
ｈｕＰＢＭＣ及びＦＯＬＲ１－ＴＣＢ（ＣＤ３ｏｐｔ）と共にインキュベートしたＯｖｃａｒ－３細胞について、用量依存的な標的細胞死滅を示すことができた（図３５Ａ）。点線は、標的細胞と共にインキュベートしたが、ＴＣＢなしでインキュベートしたｈｕＰＢＭＣを示している。標的細胞の細胞毒性は、ＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞についてＣＤ６９によって測定されるＴ細胞活性化と相関する（図３５Ｂ）。
前述の発明は、理解を明確にする目的で図解及び例としてある程度詳細に説明されたが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用されたすべての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明確に援用されている。

Claims (31)

  1. ＣＤ３及び葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に結合する二重特異性抗体であって、二重特異性抗体が、
    （ｉ）配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインと、
    （ｉｉ）ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインと
    を含む、二重特異性抗体。
  2. 第１の抗原結合ドメインのＶＨが、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、及び／又はＶＬが、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
  3. ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体であって、二重特異性抗体が、
    （ｉ）配列番号７のＶＨ配列及び配列番号１１のＶＬ配列を含む、ＣＤ３に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインと、
    （ｉｉ）ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインと
    を含む、二重特異性抗体。
  4. 第１の抗原結合ドメインがＦａｂ分子である、請求項１から３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  5. 第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  6. ＦｏｌＲ１に特異的に結合することができる第３の抗原結合ドメインを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  7. 第２及び／又は存在する場合に第３の抗原結合ドメインがＦａｂ分子である、請求項６に記載の二重特異性抗体。
  8. 第１の抗原結合ドメインがＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１、特に可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置換されている、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  9. 第２及び存在する場合に第３の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である、請求項６から８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  10. 第２及び存在する場合に第３の抗原結合ドメインがＦａｂ分子であり、定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジンＫ）、アルギニンＲ）又はヒスチジンＨ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立して置換され、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって独立して置換され、且つ、定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）によって独立して置換され、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）に独立して置換されている、請求項６から９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  11. 第１及び第２の抗原結合ドメインが、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している、請求項６から１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  12. 第１及び第２の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されるか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される、請求項６から１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  13. 第１、第２、及び存在する場合に第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、二重特異性抗体が、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されるか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、且つ、第３の抗原結合ドメインが、存在する場合、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合される、請求項６から１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  14. ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１、Ｆｃドメインである、請求項５から１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  15. ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、請求項５から１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  16. Ｆｃが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項５から１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  17. Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクタ機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項５から１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  18. 第２及び存在する場合に第３の抗原結合ドメインが、配列番号１２４のＨＣＤＲ１、配列番号１２５のＨＣＤＲ２、及び配列番号１２６のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号８のＬＣＤＲ１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む、請求項６から１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  19. 第２及び存在する場合に第３の抗原結合ドメインが、配列番号１２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１９又は２０に記載の二重特異性抗体。
  20. 請求項１から１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  21. 請求項２０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  22. （ａ）二重特異性抗体の発現に適した条件下で請求項２１に記載の宿主細胞を培養することと、任意選択的に（ｂ）二重特異性抗体を回収することとを含む、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体を産生する方法。
  23. 請求項２２に記載の方法によって産生される、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１に結合する二重特異性抗体。
  24. 請求項１から１９又は２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
  25. 医薬としての使用のための、請求項１から１９又は２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の薬学的組成物。
  26. がんの治療における使用のための、請求項１から１９又は２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の薬学的組成物。
  27. 請求項１から１９又は２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の薬学的組成物の、医薬の製造における使用。
  28. 請求項１から１９又は２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の薬学的組成物の、がんの治療のための医薬の製造における使用。
  29. 個体の疾患を治療する方法であって、請求項１から１９又は２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の薬学的組成物の有効量を前記個体に投与することを含む方法。
  30. 疾患ががんである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前述の発明。
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