TW202334245A - 與ｃｄ３及ｐｌａｐ結合之抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明一般涉及與 CD3 及 PLAP 結合之抗體，其例如用於活化 T 細胞。另外，本發明涉及編碼此類抗體之多核苷酸，及包含此類多核苷酸之載體及宿主細胞。本發明進一步涉及產生該等抗體之方法，及使用該等抗體治療疾病之方法。
Description
本發明一般涉及與 CD3 及 PLAP 結合之抗體，其例如用於活化 T 細胞。另外，本發明涉及編碼此抗體之多核苷酸，以及包含此多核苷酸之載體及宿主細胞。本發明進一步涉及產生該抗體之方法，以及使用該抗體治療疾病之方法。
CD3 (分化簇3) 是由四個次單元、CD3γ 鏈、CD3δ 鏈及兩條 CD3ɛ 鏈組成之蛋白質複合體。CD3 與 T 細胞受體及 ζ 鏈締合，於 T 淋巴細胞中產生活化信號。
CD3 作為藥物標靶已得到探索。靶向 CD3 之單株抗體已被用為自體免疫疾病 (如第 I 型糖尿病) 的免疫抑制劑療法，或用於治療移植排斥反應。1985 年，CD3 抗體莫羅單抗-CD3 (OKT3) 成為第一種獲批用於人體臨床的單株抗體。
CD3 抗體的最新應用為雙特異性抗體的形式，一方面結合 CD3，另一方面結合標靶細胞抗原，諸如 PLAP。PLAP (胎盤鹼性磷酸酶) 為藉由多醣磷脂肌醇錨定至細胞膜之二聚酶，在胎盤中高度表現，但在健康組織中僅限於缺失表現。PLAP 異位表現被發現與卵巢癌、睾丸癌、肺癌及胃腸道癌相關 (Fishman 及 Singer，Cancer Res 36 (1976) 4256-4261)，使其成為使用 CD3 雙特異性抗體的靶向腫瘤的免疫療法之目標靶點。PLAP 的結合物描述於例如 WO 2019/240934 中。
此類抗體與其兩個標靶的同時結合將迫使標靶細胞與 T 細胞之間暫時相互作用，從而導致任何細胞毒性 T 細胞之活化及隨後標靶細胞之裂解。例如在 WO 2021/154534 中描述了與 CD3 及 PLAP 結合之雙特異性抗體。
出於治療目的，抗體必須滿足的一個重要要求係在活體外 (用於藥物儲存) 及活體內 (投予患者後) 具有足夠高之穩定性。
修飾 (如天冬醯胺脫醯胺) 為重組抗體之典型降解途徑，可能影響活體外穩定性及活體內生物學功能。
鑒於抗體，特別是雙特異性抗體，對於活化 T 細胞的巨大治療潜力，需要具有優化特性之 CD3 抗體，包括多特異性抗體。
本發明提供抗體，具體而言多特異性 (例如雙特異性) 抗體，其與 CD3 結合且耐受藉由例如天冬醯胺脫醯胺作用之降解，且因此正如治療目的所需的一般特別穩定。該抗體亦具有良好的熱穩定性及結合親和性。本文提供之 (多特異性) 抗體進一步將良好的效力及可生產性與低毒性及有利的藥物動力學特性相結合。
如本文所示，本發明所提供之與 CD3 結合的抗體 (包括多特異性抗體) 在 pH 7.4、37℃ 下放置 2 週後與 CD3 之結合活性相對於在 pH 6、-80℃ 下放置 2 週後之結合活性保留約 90% 以上，如表面電漿共振 (SPR) 所測定。如本文進一步所示，本發明所提供之與 CD3 結合的抗體 (包括多特異性抗體) 具有藉由動態光散射 (DLS) 測定的高於 55℃之聚集溫度及藉由 SPR 測定的與人及食蟹獼猴 CD3 單價結合的介於皮莫耳範圍內之 KD 值。
在一個方面中，本發明提供了一種與 CD3 及胎盤鹼性磷酸酶 (PLAP) 結合之抗體，其中該抗體包含 (a) 與 CD3 結合之第一抗原結合域，其包含：重鏈可變區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 3 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 6 之 HCDR 3；及輕鏈可變區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；及 (b) 與 PLAP 結合之第二抗原結合域及視情況之第三抗原結合域。在一個方面，第一抗原結合域之 VH 包含與 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，及/或第一抗原結合域之 VL 包含與 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。
在又一方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之抗體，其中該抗體包含 (a) 與 CD3 結合之第一抗原結合域，其包含 SEQ ID NO: 9 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 13 之 VL 序列；及 (b) 與 PLAP 結合之第二抗原結合域及視情況之第三抗原結合域。
在一個方面中，第二抗原結合域及/或在存在時之第三抗原結合域為 Fab 分子。
在一個方面中，抗體包含 Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成。
在一個方面中，第一抗原結合域為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈及Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1，特定而言可變域 VL 及 VH 彼此替換。
在一個方面中，第二抗原結合域及在存在時之第三抗原結合域為習用 Fab 分子。
在一個方面中，第二抗原結合域及在存在時之第三抗原結合域為 Fab 分子，其中，在恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在一個方面中，第一抗原結合域與第二抗原結合域彼此融合，視情況經由肽連接子彼此融合。
在一個方面中，第一抗原結合域與第二抗原結合域各自為 Fab 分子，且 (i) 第二抗原結合域在 Fab 重鏈的 C 端與第一抗原結合域的 Fab 重鏈的 N 端融合，或 (ii) 第一抗原結合域在 Fab 重鏈的 C 端與第二抗原結合域的 Fab 重鏈的 N 端融合。
在一個方面中，第一抗原結合域、第二抗原結合域及在存在時之第三抗原結合域各自為 Fab 分子，且抗體包含由第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域；且其中，(i) 第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端處與第一抗原結合域之 Fab 重鏈之 N 端融合，且第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端處與 Fc 域之第一次單元之 N 端融合，或 (ii) 第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端處與第二抗原結合域之 Fab 重鏈之 N 端融合，且第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端處與 Fc 域之第一次單元之 N 端融合；且第三抗原結合域在存在時在 Fab 重鏈之 C 端處與 Fc 域之第二次單元之 N 端融合。
在一個方面中，Fc 域為 IgG Fc 域，特定而言 IgG
1Fc 域。在一個方面中，Fc 域為人 Fc 域。在一個方面中，Fc 包含促進 Fc 域之第一次單元與第二次單元之締合之修飾。在一個方面中，Fc 域包含降低與 Fc 受體之結合及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代。
在一個方面中，第二抗原結合域及在存在時之第三抗原結合域包含：VH，其包含 (i) SEQ ID NO: 28 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 29 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 30 之 HCDR 3，(ii) SEQ ID NO: 32 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 33 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 34 之 HCDR 3，(iii) SEQ ID NO: 36 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 37 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 38 之 HCDR 3，(iv) SEQ ID NO: 40 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 41 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 42 之 HCDR 3；或 (v) SEQ ID NO: 44 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 45 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 46 之 HCDR 3；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 48 之 LCDR 1、SEQ ID NO: 49 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 50 之 LCDR 3。在一個方面中，第二抗原結合域及在存在時之第三抗原結合域包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。
在一特定方面中，第二抗原結合域及在存在時之第三抗原結合域包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 36 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 37 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 38 之 HCDR 3；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 48 之 LCDR 1、SEQ ID NO: 49 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 50 之 LCDR 3。在一個方面中，第二抗原結合域及在存在時之第三抗原結合域包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。
在又一方面中，第二抗原結合域及在存在時之第三抗原結合域包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 44 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 45 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 46 之 HCDR 3；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 48 之 LCDR 1、SEQ ID NO: 49 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 50 之 LCDR 3。在一個方面中，第二抗原結合域及在存在時之第三抗原結合域包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。
根據本發明之又一方面，提供一種編碼本發明之抗體的經分離之多核苷酸，以及包含本發明之經分離之多核苷酸的宿主細胞。
在另一方面中，提供一種產生與 CD3 及 PLAP 結合之抗體之方法，其包含如下步驟：(a) 在適於表現該抗體之條件下培養本發明之宿主細胞，及視情況 (b) 回收該抗體。本發明亦涵蓋一種與 CD3 及 PLAP 結合之抗體，其藉由本發明之方法產生。
本發明進一步提供一種包含本發明之抗體及藥學上可接受之載體的藥學組成物。
本發明亦涵蓋使用本發明之抗體及藥學組成物之方法。在一個方面中，本發明提供一種根據本發明用為藥劑之抗體或醫藥組成物。在一個方面中，提供一種根據本發明用於治療疾病之抗體或藥學組成物。亦提供根據本發明之抗體或醫藥組成物在用於製造藥劑中之用途，及根據本發明之抗體或醫藥組成物在用於製造供治療疾病之藥劑中之用途。本發明亦提供一種治療個體之疾病之方法，其包含向所述個體施用有效量的根據本發明之抗體或藥學組成物。在某些方面中，疾病為癌症。在其他方面，該疾病為自體免疫疾病。
I.
定義
定義除非在下文中另外定義，否則本文所用的術語為本技術領域中的一般使用。
如本文中所使用的關於抗原結合域等的術語「第一」、「第二」或「第三」，係用於方便區分每一類型之部分何時存在多於一個。除非明確說明，否則使用此等術語並非旨在賦予部分特定之順序或方向。
術語「抗 CD3 抗體」及「結合至 CD3 之抗體」是指能夠以足夠親和力結合 CD3，從而使得該抗體可用作靶向 CD3 之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個方面中，抗 CD3 抗體與無關、非 CD3 蛋白質結合之程度低於該抗體與 CD3 結合約 10%，其藉由例如表面電漿共振 (SPR) 所量測。在某些方面，與 CD3 結合之抗體之解離常數 (K
D) ≤ 1 μM、≤ 500 nM、≤ 200 nM 或 ≤ 100 nM。當抗體的 K
D為 1 μM 或更少時 (例如，藉由 SPR 所量測)，稱該抗體與 CD3「特異性結合」。在某些方面中，抗 CD3 抗體結合至 CD3 之表位，其在不同物種之 CD3 是保守性。
類似地，術語「抗 PLAP 抗體」及「與 PLAP 結合之抗體」是指能夠以足夠親和力結合 PLAP，從而使得該抗體可用作靶向 PLAP 之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個方面中，抗 PLAP 抗體與無關、非 PLAP 蛋白質結合之程度低於該抗體與 PLAP 結合約 10%，其藉由例如表面電漿共振 (SPR) 所量測。在某些方面中，與 PLAP 結合之抗體之解離常數 (K
D) ≤ 1 μM、≤ 500 nM、≤ 200 nM 或 ≤ 100 nM。當抗體具有 1 μM 或更少的 K
D時 (例如，藉由 SPR 所量測)，稱該抗體與 PLAP「特異性結合」。在某些方面中，抗 PLAP 抗體結合至 PLAP 之表位，其在來自不同物種之 PLAP 之間是保守性的。
本文中的術語「抗體」為在最寬廣意義上使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 (例如雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其等展示出所需抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')
2、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子 (例如 scFv 及 scFab)、單域抗體及由抗體片段所形成之多特異性抗體。關於某些抗體片段的綜述，參見 Hollinger 及 Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構實質上類似的結構之抗體。
如本文中所使用的術語「單株抗體 (monoclonal antibody)」，係指獲自實質上同源抗體群體之抗體，即群體中包含的個別抗體係相同的及/或結合相同抗原決定基，但不包括 (例如) 含有天然生成之突變或產生於單株抗體製劑生產過程中的可能的變異體抗體，此等變異體通常係以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (抗原決定基) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，單株抗體可藉由多種技術來製造，包括但不限於融合瘤方法、重組 DNA 方法、噬菌體展示方法、及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法，本文描述此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。
「經分離之」抗體是從其自然環境之組分中分離出來的抗體。在一些方面中，將抗體純化至大於 95% 或 99% 純度，如藉由例如電泳 (例如 SDS-PAGE、等電聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如離子交換或反相 HPLC、親和層析法、粒徑篩析層析法) 方法所測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如 Flatman 等人，
J. Chromatogr. B848:79-87 (2007)。在某些方面中，本發明所提供的抗體是經分離之抗體。
術語「嵌合」抗體是指其中重鏈及/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
「人源化 (humanized)」抗體係指包含來自非人 CDR 之胺基酸殘基及來自人 FR 之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些方面中，人源化抗體將包含實質上所有至少一個 (且通常兩個) 變異域，其中所有或實質上所有 CDR 對應於非人抗體之其等，且所有或實質上所有 FR 對應於人抗體之其等。此等可變域在本文中稱為「人源化可變區 (humanized variable region)」。人源化抗體視情況可包含衍生自人抗體之抗體恆定區之至少一部分。在一些方面中，人源化抗體中的一些 FR 殘基經來自非人抗體 (例如衍生 CDR 殘基之抗體) 之對應殘基取代，以例如恢復或改善抗體特異性或親和力。抗體 (例如非人抗體) 之「人源化形式 (humanized form)」係指已經歷人源化之抗體。
「人抗體 (human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人或人體細胞產生或自利用人抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人抗體編碼序列之非人來源衍生之抗體之胺基酸序列。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。在某些方面中，人抗體係衍生自非人轉殖基因哺乳動物，例如小鼠、大鼠或兔。在某些方面中，人抗體衍生自融合瘤細胞株。從人抗體庫分離的抗體或抗體片段在本文中亦被視作人抗體或人抗體片段。
術語「抗原結合域」係指抗體之部分，其包含結合至抗原之部分或全部且與其互補之區域。抗原結合域可由例如一個或多個抗體可變域 (亦稱為抗體可變區) 提供。在較佳方面中，抗原結合域包含抗體輕鏈變異域 (VL) 及抗體重鏈變異域 (VH)。
術語「可變區 (variable region)」或「可變域 (variable domain)」係指參與抗體與抗原結合之抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之變異域通常具有類似的結構，其中每個域均包含四個保守性框架區 (FR) 及互補決定區 (CDR)。參見，例如，Kindt 等人，
Kuby Immunology，第 6
版，W.H. Freeman & Co.，第 91 頁 (2007)。單個 VH 或 VL 域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，可以使用 VH 或 VL 域從結合抗原的抗體中分離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補 VL 或 VH 域的文庫。參見，例如，Portolano 等人
， J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson 等人，
Nature352:624-628 (1991)。如在本文中結合可變區序列所使用的「Kabat 編號」，係指 Kabat 等人，
Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版 Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda, MD (1991) 描述的編號系統。
如本文中所使用的重鏈及輕鏈之所有恆定區及域之胺基酸位置，係根據描述於 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991) 的 Kabat 編號系統 (在本文中稱為「根據 Kabat 編號」或「Kabat 編號」) 編號。具體而言，Kabat 編號系統 (參見 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991) 的第 647-660 頁) 用於 κ 及 λ 同型之輕鏈恆定域 CL 及 Kabat 及 EU 索引編號系統 (參見第 661-723 頁) 用於重鏈恆定域 (CH1、鉸鏈、CH2 及 CH3)，在此情況中，其於本文中藉由參考「根據 Kabat EU 指數編號」或「Kabat EU 指數編號」進一步闡明。
如本文所用，術語「高度可變區」或「HVR」係指抗體可變域中序列高變並決定抗原結合特異性的各個區域，例如「互補決定區」(「CDR」)。一般而言，抗體包含六個 CDR；三個在 VH 中 (HCDR1、HCDR2、HCDR3)，且三個在 VL 中 (LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在本文中，例示性 CDR 包括：
(a) 高度可變環存在於胺基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、及 96-101 (H3) 處 (Chothia 及 Lesk，
J. Mol. Biol.196:901-917 (1987))；
(b) CDR 存在於胺基酸殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、及 95-102 (H3) 處 (Kabat 等人
， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版 Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda, MD (1991))；以及
(c) 抗原接觸存在於胺基酸殘基 27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、及 93-101 (H3) 處 (MacCallum 等人
J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996))。
除非另有說明，否則
CDR 根據 Kabat 等人在上述文獻中所述之方法來確定。本領域之技術人員將理解，亦可根據在上述文獻
Chothia、在上述文獻 McCallum 中所述之方法或任何其他科學上接受之命名系統來確定 CDR 命名。
「框架」或「FR」係指互補決定區 (CDR) 之外的變異域殘基。可變域之 FR 通常由四個 FR 域組成：FR1、FR2、FR3、及 FR4。因此，HVR 及 FR 序列通常以如下順序出現在 VH (或 VL) 中：FR1-HCDR1(LCDR1)-FR2-HCDR2(LCDR2)-FR3-HCDR3(LCDR3)-FR4。
除非另有說明，否則可變域中之 CDR 殘基及其他殘基 (例如 FR 殘基) 在本文中係根據 Kabat 等人
( 同前述 ) 編號。
就本文目的而言，「接受者人骨架 (acceptor human framework)」為包含衍生自人免疫球蛋白骨架或人共通骨架的輕鏈可變域 (VL) 骨架或重鏈可變域 (VH) 骨架的胺基酸序列的骨架，如下定義。「衍生自 (derived from)」人免疫球蛋白骨架或人共通骨架的受體人骨架可包含與此等為相同的胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列的變更。在一些方面中，胺基酸變化的數目是 10 或更少、9 或更少、8 或更少、7 或更少、6 或更少、5 或更少、4 或更少、3 或更少或 2 或更少。在一些方面中，VL 受體人框架與 VL 人免疫球蛋白框架序列或人共同框架序列的序列相同。
「人共通骨架」是代表一系列人免疫球蛋白 VL 或 VH 骨架序列中最常見的胺基酸殘基的骨架。通常，人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列的選擇來自可變域序列的次群組。通常，序列的亞組是如 Kabat 等人在
Sequences of Proteins of Immunological Interest(第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD (1991)，第 1-3 卷) 中所述之亞組
。
在本文中術語「免疫球蛋白分子」係指具有天然存在之抗體之結構之蛋白質。例如，IgG 類的免疫球蛋白為約 150,000 道耳頓、由二條輕鏈及二條重鏈經二硫鍵鍵合所構成之異四聚體糖蛋白。從 N 端至 C 端，每條重鏈具有可變域 (VH)，亦稱為重鏈可變域或重鏈可變區，接著係三個恆定域 (CH1、CH2 及 CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，從 N 端至 C 端，每條輕鏈具有可變域 (VL)，亦稱為輕鏈可變域或輕鏈可變區，接著為輕鏈恆定 (CL) 域，亦稱為輕鏈恆定區。免疫球蛋白之重鏈可被歸類為五種類型中的一種，稱為 α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG) 或μ (IgM)，其中一些可進一步分為亞型，例如γ
1(IgG
1)、γ
2(IgG
2)、γ
3(IgG
3)、γ
4(IgG
4)、α
1(IgA
1) 及 α
2(IgA
2)。基於其恆定域之胺基酸序列，免疫球蛋白之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。免疫球蛋白基本上由經由免疫球蛋白鉸鏈區連接的二個 Fab 分子及一個 Fc 域組成。
抗體或免疫球蛋白之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG、及 IgM，且彼等中的幾種可進一步分為次類 (同型 (isotype))，例如 IgG
1、IgG
2、IgG
3、IgG
4、IgA
1、及 IgA
2。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。
「Fab 分子」係指由重鏈 (「Fab 重鏈」)之 VH 及 CH1 域及免疫球蛋白之輕鏈 (「Fab 輕鏈」)之 VL 及 CL 域組成之蛋白質。
「交換型 (crossover)」Fab 分子 (亦稱為「Crossfab」)意指 Fab 分子，其中，Fab 重鏈及輕鏈之變異域或恆定域被交換 (即彼此替換)，即，交換型 Fab 分子包含由輕鏈變異域 VL 及重鏈恆定域 1 CH1 組成之胜肽鏈 (VL-CH1，在 N 端至 C 端方向中)、及由重鏈變異域 VH 及輕鏈恆定域 CL 組成之胜肽鏈 (VH-CL，在 N 端至 C 端方向中)。為清楚起見，在 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之變異域被交換之交換型 Fab 分子中，包含重鏈恆定域 1 CH1 之肽鏈在本文中稱為 (交換型) Fab 分子之「重鏈」。相反地，在 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之恆定域被交換之交換型 Fab 分子中，包含重鏈變異域 VH 之肽鏈在本文中稱為 (交換型) Fab 分子之「重鏈」。
與此相反，「習知」 Fab 分子意指其自然形式 (即包含由重鏈變異域及恆定域組成之重鏈 (VH-CH1，在 N 端至 C 端方向中) 及由輕鏈變異域及恆定域組成之輕鏈 (VL-CL，在 N 端至 C 端方向中))之 Fab 分子。
本文中的術語「Fc 域」或「Fc 區域」，用於定義包含至少一部分恆定區的免疫球蛋白重鏈的 C 端區域。該術語包括天然序列 Fc 區域及變異 Fc 區域。在一個方面中，人 IgG 重鏈 Fc 區域從 Cys226 或 Pro230 延伸至重鏈的羧基端。但是，由宿主細胞產生的抗體可能經歷重鏈 C 端的一個或多個，特定而言一個或兩個胺基酸之翻譯後切割。因此，由宿主細胞透過表現編碼全長重鏈的特定核酸分子而產生的抗體可包括全長重鏈，或者可包括全長重鏈的切割變體。重鏈的最後兩個 C 端胺基酸為甘胺酸 (G446) 及離胺酸 (K447，根據 Kabat EU 索引編號)。因此，可以存在或可以不存在 Fc 區域之 C 端離胺酸 (Lys447) 或 C 端甘胺酸 (Gly446) 及離胺酸 (Lys447)。除非另有說明，否則包括 Fc 區 (或本文定義的 Fc 域的次單元) 之重鏈之胺基酸序列在本文中表示不含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽。在一個方面中，包含在根據本發明之抗體中的包括本文所述之 Fc 區 (次單元) 的重鏈包含額外的 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 和 K447，根據 Kabat EU 指數編號)。在一個方面中，包含在根據本發明之抗體中的包括本文所述之 Fc 區 (次單元) 的重鏈包含額外的 C 端甘胺酸殘基 (G446，根據 Kabat EU 指數編號)。除非本文另有說明，否則 Fc 區或恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統 (亦稱為 EU 指數) 進行，如 Kabat 等人
， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 所述 (另見上文)。如本文中所使用的 Fc 域之「次單元」，係指形成二聚體 Fc 域之兩個多肽之一，即包含能夠穩定自締合之免疫球蛋白重鏈之 C 端恆定區之多肽。例如，IgG Fc 域之次單元包含 IgG CH2 及 IgG CH3 恆定域。
「融合」意指組分 (例如 Fab 分子及 Fc 域次單元) 經肽鍵直接或經由一或多個肽連接子連接。
術語「多特異性」意指抗體能夠與至少二個不同的抗原決定位特異性結合。多特異性抗體可以是例如雙特異性抗體。通常，雙特異性抗體包含二個抗原結合位點，各個抗原結合位點對不同抗原決定位具有特異性。在某些方面中，多特異性 (例如雙特異性) 抗體能夠同時結合二個抗原決定位，特定而言在二種不同細胞上表現之二個抗原決定位。
如本文中所使用的術語「價數 (valent)」，表示抗原結合分子中存在指定數量之抗原結合位點。因此，術語「單價結合抗原 (monovalent binding to an antigen)」表示抗原結合分子中存在對抗原具有特異性之一個 (且不超過一個) 抗原結合位點。
「抗原結合位點 (antigen binding site)」係指提供與抗原相互作用的抗原結合分子之位點，即一個或多個胺基酸殘基。例如，抗體之抗原結合位點包含來自互補決定區 (CDR) 之胺基酸殘基。未處理之 (native) 免疫球蛋白分子通常具有二個抗原結合位點，Fab 分子通常具有單個抗原結合位點。
如本文中所使用，術語「抗原決定位 (antigenic determinant)」或「抗原決定基 (epitope)」係指與抗原結合域結合之多肽大分子上的形成抗原結合域-抗原複合體之位點 (例如，胺基酸之連續延伸或由非連續胺基酸之不同區域構成的構象構型)。例如，可用之抗原決定位可存在於腫瘤細胞之表面上、受病毒感染之細胞之表面上、其他患病細胞之表面上、免疫細胞的表面上，不存在於血清中，及/或存在於細胞外基質 (ECM) 中。在一較佳方面中，該抗原為人蛋白質。
除非另有說明，否則「CD3」係指源自任何脊椎動物的任何天然 CD3，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如人)、非人靈長類動物 (例如食蟹獼猴) 及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。術語涵蓋「全長」未經加工的 CD3 以及在細胞中加工所產生的任何形式之 CD3。該術語亦涵蓋天然生成之 CD3 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。在一個方面中，CD3 是人 CD3，特定而言人 CD3 的 ε 次單元 (CD3ε)。人 CD3ε 之胺基酸序列示於 SEQ ID NO: 63 (無信號肽) 中。另見 UniProt (www.uniprot.org) 登錄號 P07766 (版本 209)，或 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000724.1。在另一方面中，CD3 是食蟹獼猴 (cynomolgus/Macaca fascicularis) CD3，特定而言食蟹獼猴 CD3ɛ。食蟹獼猴 CD3ε 之胺基酸序列示於 SEQ ID NO: 64 (無信號肽) 中。另見 NCBI GenBank 號 BAB71849.1。在某些方面中，本發明之抗體結合至 CD3 之抗原決定基，該 CD3 之抗原決定基在來自不同物種的 CD3 抗原中，特定而言在人和食蟹獼猴 CD3 中是保守的。在較佳方面中，抗體結合至人 CD3。
如本文中所使用，「標靶細胞抗原」是指在標靶細胞 (例如癌症細胞) 表面上提呈之抗原決定子。較佳地，標靶細胞抗原不是 CD3，且/或與 CD3 在不同之細胞上表現。根據本發明，標靶細胞抗原為 PLAP，特定而言為人 PLAP。
「PLAP」代表胎盤鹼性磷酸酶 (酶素委員會 (EC) 編號 3.1.3.1)。人 PLAP 為藉由
ALPP基因編碼之 535 個胺基酸醣基化蛋白質 (因此有時被稱為「ALPP」)。存在四種不同的人鹼性磷酸酶：(1) 胎盤 ALP (PLAP，
ALPP基因) 及 (2) 生殖細胞 ALP (類 PLAP，
ALPG基因)，它們具有 98% 的同源性；以及 (3) 腸道型 ALP (
ALPI基因) 及 (4) 非特異性組織 ALP 或肝/骨/腎 ALP (
ALPL基因)，它們分別與 PLAP 具有 88% 及 56% 的同源性 (Moss, Clinical Chemistry 38 (1992) 2486-2492; Harris, Clin Chim Acta 186 (1990) 133-150)。如本文所用，「PLAP」係指源自任何脊椎動物的任何天然 PLAP，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如人)、非人靈長類動物 (例如食蟹獼猴) 及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」、未處理之 PLAP 以及在細胞處理中得到的任何形式的 PLAP。該術語亦涵蓋天然生成之 PLAP 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。在一個方面中，PLAP 為人 PLAP。參見人蛋白 UniProt (www.uniprot.org) 登錄號 P05187 (條目版本 224)。人 PLAP 之胺基酸序列示於 SEQ ID NO: 73 (無訊息肽) 中。食蟹獼猴 PLAP 之胺基酸序列示於 SEQ ID NO: 74 (包括訊息肽) 中。在某些方面中，本發明之抗體結合至 PLAP 之抗原決定基，該 PLAP 之抗原決定基在來自不同物種的 PLAP 抗原中，特定而言在人和食蟹獼猴 PLAP 中是保守的。在較佳的方面中，抗體結合至人 PLAP。
「親和力」係指分子 (例如抗體) 之單一結合位點與其結合搭配物 (例如抗原) 之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和性」係指反映結合對成員 (例如抗體及抗原) 之間 1:1 交互作用的內在結合親和性。分子 X 對於其配偶體 Y 之親和力通常可藉由解離常數 (K
D) 來表示。可藉由此項技術中已知的既定方法測定親和力，包括彼等本文所述之方法。用於測定親和力之較佳方法為表面電漿共振 (SPR)。
術語「親和力成熟」之抗體是指在一或多個互補決定區 (CDR) 中具有一或多種變化之抗體，與不具有此等變化之親本抗體相比，此類變化引起該抗體對抗原之親和力的改善。
「減少結合」，例如減少結合 Fc 受體，係指 (例如) 藉由 SPR 測得各自相互作用之親和力降低。為清楚起見，該術語亦包括將親和力降低至零 (或低於分析方法的檢測限度)，即相互作用完全廢除。相反，「增加結合」係指各自相互作用之結合親和性增加。
如本文中所使用的「T 細胞活化」，係指 T 淋巴細胞 (特定而言細胞毒性 T 淋巴細胞) 之一或多種細胞反應，選自：增殖、分化、細胞激素分泌、細胞毒性效應子分子釋放、細胞毒性活性及活化標誌物之表現。測定 T 細胞活化之適宜分析係本技術中已知的並在本文中描述。
「促進 Fc 域之第一次單元及第二次單元之締合之修飾」係對胜肽主鏈的操作或對 Fc 域次單元之轉譯後修飾，其減少或阻止包含 Fc 域次單元之多肽與相同多肽之締合形成同源二聚體。本文所用之促進締合之修飾，較佳包括對期望締合之兩個 Fc 域次單元 (即 Fc 域之第一次單元及第二次單元) 中的每一個所進行之單獨修飾，其中，該修飾彼此互補，以便促進兩個 Fc 域次單元之締合。例如，促進締合之修飾可改變一個或兩個 Fc 域次單元之結構或電荷，以分別使其在空間或靜電上有利。因此，(雜)二聚化發生在包含第一 Fc 域次單元之多肽與包含第二 Fc 域次單元之多肽之間，其就融合到每個次單元 (例如，抗原結合域) 的其他組分而言可能有所不同。在一些方面中，促進 Fc 域之第一次單元與第二次單元之締合之修飾包含 Fc 域中的胺基酸突變，具體而言胺基酸取代。在一較佳方面中，促進 Fc 域之第一次單元與第二次單元之締合之修飾包含 Fc 域之二個次單元的每一個中之單獨的胺基酸突變，具體而言胺基酸取代。
術語「效應子功能」，係指歸因於抗體的 Fc 區域的那些生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應子功能的實例包括：C1q 結合及補體依賴性細胞毒性 (CDC)、Fc 受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 (ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP)、細胞激素分泌、抗原呈遞細胞攝取之免疫複合物介導抗原、細胞表面受體 (例如 B 細胞受體) 降調及 B 細胞活化。
「活化 Fc 受體」為在抗體之 Fc 域參與之後引起刺激受體攜帶細胞執行效應子功能的傳訊事件的 Fc 受體。人活化 Fc 受體包括 FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32) 和 FcαRI (CD89)。
抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC) 為一種免疫機制，其導致免疫效應子細胞裂解抗體包被的標靶細胞。標靶細胞為抗體或其衍生物包含 Fc 區域的細胞，其通常透過作為 N 端的蛋白質部分與 Fc 區域特異性結合。如本文中所使用的術語「減少 ADCC」，係指透過上文定義的 ADCC 機制在給定時間內以標靶細胞周圍之培養基中給定濃度的抗體在給定時間內裂解的標靶細胞數量的減少，及/或透過 ADCC 機制在給定時間內實現給定數量的標靶細胞之裂解所需的標靶細胞周圍之培養基中抗體濃度的增加。ADCC 的減少相對於使用相同標準生產、純化、配製和儲存方法 (本技術領域具有通常知識者已知的方法) 由相同類型的宿主細胞所生產的相同抗體 (但尚未工程化) 所介導的 ADCC。例如，由 Fc 域中包含減少 ADCC 的胺基酸取代的抗體所介導的 ADCC 的減少為相對於在 Fc 域中不含此胺基酸取代的相同抗體所介導的 ADCC。用於測量 ADCC 的合適的測定法為本技術領域中熟知的 (參見例如 PCT 公開號 WO 2006/082515 或 PCT 公開號 WO 2012/130831)。
如本文中所使用的術語「工程改造 (engineer、engineered、engineering)」，被認為包括對胜肽主鏈的任何操作或天然存在的或重組的多肽或其片段的轉譯後修飾。工程改造包括修改胺基酸序列、醣基化模式、或單個胺基酸的側鏈基團，以及這些方法的組合。
如本文所用的術語「胺基酸突變」，意指涵蓋胺基酸取代、缺失、插入和修飾。可實施取代、缺失、插入和修飾之任意組合以得到最終構建體，前提條件為最終構建體具有所需之特徵，例如，與 Fc 受體之結合減少或與另一種肽之締合增加。胺基酸序列缺失和插入包括胺基酸之胺基及/或羧基末端之缺失和插入。較佳胺基酸突變為胺基酸取代。為改變例如 Fc 區域之結合特徵，特別優選非保守胺基酸取代，即將一個胺基酸取代為具有不同結構及/或化學性質之另一個胺基酸。胺基酸取代包括用二十種標準胺基酸之非天然存在之胺基酸或天然存在之胺基酸衍生物 (例如，4-羥基脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥基離胺酸) 取代。可使用本領域中熟知的遺傳或化學方法產生胺基酸突變。遺傳方法可包括定點誘變、PCR、基因合成等。預期透過遺傳工程以外之方法諸如化學修飾改變胺基酸之側鏈基團的方法也可能有用。本文可使用各種名稱指示同一胺基酸突變。例如，Fc 域位置 329 處之脯胺酸取代為甘胺酸，可表示為 329G、G329、G
329、P329G 或 Pro329Gly。
相對於參比多肽序列所述之「百分比 (%) 胺基酸序列同一性」，是指候選序列中胺基酸殘基與參比多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守取代作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸百分比序列同一性之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公開可用的電腦軟體，諸如 BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign (DNASTAR) 軟體或 FASTA 程式包。本領域之技術人員可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需之任何算法。可替代地，可使用序列比較計算機程式 ALIGN-2 生成同一性百分比值。ALIGN-2 序列比較計算機程式由建南德克公司開發，並且其源代碼已與用戶文檔一起歸檔在位於美國華盛頓特區 20559 的美國著作權局，其已經注冊 (美國版權註冊號 TXU510087) 並在 WO 2001/007611 中有所描述。
除非另有說明，否則出於本文之目的，使用 FASTA 封裝 36.3.8c 版本或更高版本的 ggsearch 程式與 BLOSUM50 比較矩陣來生成胺基酸序列同一性 % 值。FASTA 程式封裝由以下作者開發：W. R. Pearson 及 D. J. Lipman (「Improved Tools for Biological Sequence Analysis」, PNAS 85 (1988) 2444-2448)，W. R. Pearson (「Effective protein sequence comparison」 Meth. Enzymol. 266 (1996) 227- 258)，及 Pearson 等人(Genomics 46 (1997) 24-36) 且可自 www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml 或 www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta 公開獲取。可替代地，可使用透過 fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi 存取的公用伺服器，使用 ggsearch (global protein:protein) 程式和預設選項 (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup = 2) 比較序列，以確保執行全局而不是局部比對。胺基酸同一性百分比提供於輸出比對標題中。
術語「多核苷酸」或「核酸分子」包括任何包含核苷酸聚合物的化合物及/或物質。每個核苷酸由鹼基具體而言嘌呤或嘧啶鹼基 (即，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U))、糖 (即，去氧核糖或核糖) 及磷酸基團構成。通常，核酸分子通過鹼基序列進行描述，其中該鹼基代表核酸分子的一級結構 (線性結構)。鹼基序列通常由 5’ 至 3’ 表示。在本文中，術語核酸分子包括：去氧核糖核酸 (DNA)，其包括例如互補 DNA (cDNA) 和基因組 DNA；核糖核酸 (RNA)，特定而言信使 RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 的合成形式；以及包含兩個或更多個這些分子的混合聚合物。核酸分子可以是線性或環狀的。另外，術語核酸分子包括有義股和反義股，以及單股和雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可包含天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸的例子包括帶有衍生醣、磷酸鹽連接或化學修飾殘基的經修飾之核苷酸鹼基。核酸分子還包括適於在體外及/或體內例如在宿主或患者體內直接表現本發明之抗體的載體的
DNA 和 RNA 分子。此等 DNA (例如，cDNA) 或 RNA (例如，mRNA) 載體可以是未修飾的或經過修飾的。例如，mRNA 可經過化學修飾以增強 RNA 載體之穩定性及/或編碼分子之表達，從而將 mRNA 注入個體
體內以產生抗體 (參見例如 Stadler 等人 (2017) Nature Medicine 23:815-817 或 EP 2 101 823 B1)。
「經分離之」核酸分子係指已經與其天然環境的組分分離的核酸分子。經分離之核酸分子包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
「編碼抗體之經分離之多核苷酸 (或核酸)」係指編碼抗體重鏈和輕鏈 (或其片段) 之一個或多個多核苷酸分子，包括在單個載體或單獨載體中之此等多核苷酸分子，以及存在於宿主細胞中的一個或多個位置處之此等多核苷酸分子。
如本文所用，術語「載體」係指一種核酸分子，其能夠傳送與其連接之另一種核酸。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。某些載體能夠指導與其可操作地連接的核酸的表現。這些載體在本文中稱為「表現載體」。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」和「宿主細胞培養物」可互換使用，係指已向其中引入外源性核酸的細胞，包括此等細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉化子」和「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文中包括具有與原始轉化細胞中篩選或選擇的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的突變子代細胞。宿主細胞為可用於產生本發明之抗體的任何類型的細胞系統。宿主細胞包括培養的細胞，例如培養的哺乳動物細胞，諸如 HEK 細胞、CHO 細胞、BHK 細胞、NS0
細胞、SP2/0 細胞、YO 骨髓瘤細胞、P3X63 小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6 細胞或雜交瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和植物細胞等，還包括轉基因動物、轉基因植物或培養的植物或動物組織內的細胞。在一個方面中，本發明之宿主細胞是真核細胞，特定而言哺乳動物細胞。在一個方面中，宿主細胞不是人體內的細胞。
術語「藥學組成物」或「藥學調配物」係指以下製劑，其形式為允許其中所含之活性成分的生物活性有效，並且其不含對將投予組成物之受試者具有不可接受之毒性的其他組分。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥組成物或調配物中除對個體無毒之活性成分以外的成分。醫藥上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文中所使用的「治療」(及其語法變異體，諸如「治療過程」或「治療中」)，係指試圖改變受治療個體之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、緩解或改善預後。在一些方面中，本發明之抗體用於延遲疾病之發展或減慢疾病之進展。
「受試者」或「個體」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒類動物 (例如小鼠及大鼠)。在某些方面中，受試者或個體為人類。
藥劑例如醫藥組成物的「治療有效量」係指在所需之給藥劑量和時間段內有效實現所需的治療或預防效果的量。
術語「藥品仿單」用於指涉通常包含在治療性產品的商業包裝中的說明，該說明包含有關使用此等治療性產品的適應症、用法、劑量、給藥途徑、組合療法、禁忌症及/或警告等資訊。
II. 組成物及方法
本發明提供結合 CD3 及 PLAP 之抗體。抗體顯示出優異的穩定性，且結合了其他用於治療應用例如關於功效及安全性、藥物動力學以及可生產性的有利特性。本發明之抗體例如可用於治療疾病，諸如癌症或自體免疫疾病。
A. 抗 CD3/PLAP 抗體
在一個方面中，本發明提供與 CD3 及 PLAP 結合之抗體。在一個方面中，提供了與 CD3 及 PLAP 結合之經分離之抗體。在一個方面中，本發明提供與 CD3 及 PLAP 特異性結合之抗體。在某些方面中，抗 CD3/PLAP 抗體在 pH 7.4、37°C 2 週後保留超過約 90% 的 CD3 結合活性，其相對於藉由表面電漿共振 (SPR) 所測量之在 pH 6、-80°C 2 週後之結合活性。
在一個方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之抗體，其中該抗體包含 (a) 第一抗原結合域，其包含：與 CD3 結合之重鏈可變區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 3 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 6 之 HCDR 3；及輕鏈可變區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3。
在一個方面中，抗體為人源化抗體。在一個方面，第一抗原結合域為人源化抗原結合域 (即人源化抗體之抗原結合域)。在一個方面，第一抗原結合域之 VH 及/或 VL 為人源化可變區。
在一個方面，第一抗原結合域之 VH 及/或 VL 包含受體人骨架，例如人免疫球蛋白骨架或人共通骨架。
在一個方面，第一抗原結合域之 VH 包含 SEQ ID NO: 9 之重鏈可變區之一個或多個重鏈骨架序列 (即 FR1、FR2、FR3 及/或 FR4 序列)。在一個方面，第一抗原結合域之 VH 包含與 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在一個方面，第一抗原結合域之 VH 包含與 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列至少約 95% 相同之胺基酸序列。在一個方面，第一抗原結合域之 VH 包含與 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列至少約 98% 相同之胺基酸序列。在某些方面中，具有至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性的 VH 序列包含相對於參比序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗體保留與 CD3 結合之能力。在某些方面中，在 SEQ ID NO: 9 的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。在一個方面，第一抗原結合域之 VH 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列。視情況，第一抗原結合域之 VH 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列，其包含該序列之轉譯後修飾。
在一個方面，第一抗原結合域之 VL 包含 SEQ ID NO: 13 之輕鏈可變區之一個或多個輕鏈骨架序列 (即 FR1、FR2、FR3 及/或 FR4 序列)。在一個方面，第一抗原結合域之 VL 包含與 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在一個方面，第一抗原結合域之 VL 包含與 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列至少約 95% 相同之胺基酸序列。在一個方面，第一抗原結合域之 VL 包含與 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列至少約 98% 相同之胺基酸序列。在某些方面中，具有至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性的 VL 序列包含相對於參比序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗體保留與 CD3 結合之能力。在某些方面中，在 SEQ ID NO: 13 的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。在一個方面，第一抗原結合域之 VL 包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列。視情況，第一抗原結合域之 VL 包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列，其包含該序列之轉譯後修飾。
在一個方面，第一抗原結合域之 VH 包含與 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列，且第一抗原結合域之 VL 包含與 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在一個方面，第一抗原結合域之 VH 域包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列且第一抗原結合域之 VL 域包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列。
在又一方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之抗體，其中該抗體包含與 CD3 結合之第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列，及 VL，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列。
在又一方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之抗體，其中該抗體包含與 CD3 結合之第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含 SEQ ID NO: 9 之 VH 序列，及 SEQ ID NO: 13 之 VL 序列。
在另一方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之抗體，其中該抗體包含與 CD3 結合之第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 9 之 VH 之重鏈 CDR 序列，及 VL，其包含 SEQ ID NO: 13 之 VL 之輕鏈 CDR 序列。
在另一方面中，第一抗原結合域包含 SEQ ID NO: 9 之 VH 之 HCDR1、HCDR2 及 HCDR3 胺基酸序列及 SEQ ID NO: 13 之 VL 之 LCDR1、LCDR2 及 LCDR3 胺基酸序列。
在一個方面，第一抗原結合域之 VH 包含 SEQ ID NO: 9 之 VH 之重鏈 CDR 序列，及與 SEQ ID NO: 9 之 VH 之骨架序列具有至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的骨架。在一個方面，第一抗原結合域之 VH 包含 SEQ ID NO: 9 之 VH 之重鏈 CDR 序列，及與 SEQ ID NO: 9 之 VH 之骨架序列具有至少 95% 序列同一性的骨架。在另一方面，第一抗原結合域之 VH 包含 SEQ ID NO: 9 之 VH 之重鏈 CDR 序列，及與 SEQ ID NO: 9 之 VH 之骨架序列具有至少 98% 序列同一性的骨架。
在一個方面，第一抗原結合域之 VL 包含 SEQ ID NO: 13 之 VL 之輕鏈 CDR 序列，及與 SEQ ID NO: 13 之 VL 之骨架序列具有至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的骨架。在一個方面，第一抗原結合域之 VL 包含 SEQ ID NO: 13 之 VL 之輕鏈 CDR 序列，及與 SEQ ID NO: 13 之 VL 之骨架序列具有至少 95% 序列同一性的骨架。在另一方面，第一抗原結合域之 VL 包含 SEQ ID NO: 13 之 VL 之輕鏈 CDR 序列，及與 SEQ ID NO: 13 之 VL 之骨架序列具有至少 98% 序列同一性的骨架。
在一個方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之抗體，其中該抗體包含與 CD3 結合之第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含如上文所提供之任何方面之 VH 序列及如上文所提供之任何方面之 VL 序列。
在一個方面中，抗體包含人恆定區。在一個方面中，抗體為包含人恆定區的免疫球蛋白分子，特定而言包含人 CH1、CH2、CH3 及/或 CL 域的 IgG 類免疫球蛋白分子。人恆定域的示例性序列在 SEQ ID NO 70 和 71 (分別為人 κ 和 λ CL 域) 以及 SEQ ID NO: 72 (人 IgG
1重鏈恆定域 CH1-CH2-CH3) 中給出。在一個方面中，抗體包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含與 SEQ ID NO: 70 或 SEQ ID NO: 71 之胺基酸序列，特定而言 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。在一個方面中，抗體包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含與 SEQ ID NO: 72 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。特定而言，如本文所述，重鏈恆定區可在 Fc 域中包含胺基酸突變。
在一個方面中，第一抗原結合域包含人恆定區。在一個方面中，第一抗原結合部分為 Fab 分子，該 Fab 分子包含人恆定區，特定而言人 CH1 及/或 CL 域。在一個方面中，第一抗原結合域包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含與 SEQ ID NO: 70 或 SEQ ID NO: 71 之胺基酸序列，特定而言 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。特定而言，輕鏈恆定區可包含如本文在「電荷修飾」下所述之胺基酸突變，及/或可在交換型 Fab 分子中包含一個或多個 (特別是兩個) N 端胺基酸之缺失或取代。在一些方面中，第一抗原結合域包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含與包含在 SEQ ID NO: 72 之胺基酸序列中之 CH1 域序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。特定而言，重鏈恆定區 (具體而言 CH1 域) 可包含如本文在「電荷修飾」下所述之胺基酸突變。
在一個方面中，抗體為單株抗體。
在一個方面中，抗體為 IgG 抗體，特定而言 IgG
1抗體。在一個方面中，抗體為全長抗體。
在另一方面中，抗體為選自 Fv 分子、scFv 分子、Fab 分子和 F(ab')
2分子之群組的抗體片段；特定而言 Fab 分子的抗體片段。在另一個方面中，抗體片段為雙鏈抗體、三鏈抗體或四鏈抗體。
在一個方面中，第一抗原結合域為 Fab 分子。在一較佳的方面中，第一抗原結合域為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈和 Fab 重鏈之可變域 VL 和 VH 或恆定域 CL 和 CH1，特定而言可變域 VL 和 VH 彼此替換 (即，第一抗原結合域為交換型 Fab 分子)。
在另一方面中，根據以上方面中之任一者所述之抗體可單獨或組合地合併任何特徵，如以下章節 II.A. 1.-8. 中所述。
在一較佳方面，抗體包含 Fc 域，特定而言 IgG Fc 域，更特別地是 IgG
1Fc 域。在一個方面中，Fc 域為人 Fc 域。在一個方面中，Fc 域為人 IgG
1Fc 域。Fc 域由第一和第二次單元組成，且可單獨或組合地結合下文中關於 Fc 域變體所描述的任何特徵 (章節 II.A. 8.)。
根據本發明，抗體包含與 PLAP 結合之第二抗原結合域及視情況的第三抗原結合域 (即抗體為多特異性抗體，如下文進一步描述的 (章節 II.A. 7.)。
1. 抗體片段
在某些方面中，本文提供之抗體為抗體片段。
在一個方面中，抗體片段為 Fab、Fab’、Fab’-SH 或 F(ab’)
2分子，特定而言如本文中所描述的 Fab 分子。「Fab’ 分子」與 Fab 分子的區別在於在 CH1 域之羧基端增加了殘基，其包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab’-SH 是 Fab’ 分子，其中恆定域的半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基團。胃蛋白酶處理產生一個 F(ab')
2分子，該分子具有兩個抗原結合位點 (兩個 Fab 分子) 和一部分 Fc 區。
在另一個方面中，抗體片段為雙鏈抗體、三鏈抗體或四鏈抗體。雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點 (其可係二價或雙特異性的) 之抗體片段。參見例如 EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。Hudson 等人 (Nat. Med. 9:129-134，(2003)) 中亦描述了三功能抗體及四功能抗體。
在又一方面中，抗體片段為單鏈 Fab 分子。「單鏈 Fab 分子」或「scFab」由抗體重鏈變異域 (VH)、抗體重鏈恆定域 1 (CH1)、抗體輕鏈變異域 (VL)、抗體輕鏈恆定域 (CL) 及連接子組成，其中所述抗體域及所述連接子在 N 端至 C 端方向具有以下序列之一：a) VH-CH1-連接子-VL-CL、b) VL-CL-連接子-VH-CH1、c) VH-CL-連接子-VL-CH1 或 d) VL-CH1-連接子-VH-CL。特定而言，所述連接子為至少 30 個胺基酸且較佳地 32 至 50 個胺基酸組成之多肽。所述單鏈 Fab 分子通過 CL 域與 CH1 域之間的天然二硫鍵達到穩定。此外，這些單鏈 Fab 分子可通過插入半胱胺酸殘基產生鏈間二硫鍵而得到進一步穩定 (例如，根據 Kabat 編號，在變異重鏈之位置 44 和變異輕鏈之位置 100 處插入)。
在另一方面中，抗體片段為單鏈變異片段 (scFv)。「單鏈變異片段」 或 「scFv」 為抗體之重鏈 (VH) 和輕鏈 (VL) 的可變域之融合蛋白，其通過連接子連接。特定而言，連接子為 10 至 25 個胺基酸組成之短多肽，並且通常富含甘胺酸以提高柔韌性，並含有絲胺酸或蘇胺酸以提高溶解度，並且可將
VH 之 N 端與 VL 的之 C 端連接，反之亦然。儘管去除了恆定區並引入了連接子，但是該蛋白仍保留了原始抗體的特異性。關於 scFv 片段的綜述，參見例如 Plückthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113卷，Rosenburg 及 Moore 編，Springer-Verlag，New York，第 269 頁至第 315 頁 (1994)；亦可參見 WO 93/16185；及美國專利第 5,571,894 號及第 5,587,458 號。
在另一方面中，抗體片段為單域抗體。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或部分或抗體之輕鏈可變域之全部或部分之抗體片段。在某些方面中，單域抗體為人單域抗體 (Domantis, Inc.，Waltham, MA；參見例如美國第 6,248,516 B1 號專利)。
抗體片段可藉由各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞 (例如
大腸桿菌) 之重組產生。
2. 人源化抗體
在某些方面中，本文提供之抗體為人源化抗體。通常，非人抗體為人源化抗體以降低對人的免疫原性，同時保留親代非人抗體之特異性及親和力。通常，人源化抗體包含一個或多個可變域，其中 CDR (或其部分) 來源於非人抗體，並且 FR (或其部分) 來源於人抗體序列。人源化抗體視情況將包含人恆定區之至少一部分。在一些方面中，人源化抗體中的一些 FR 殘基經來自非人抗體 (例如衍生 CDR 殘基之抗體) 之對應殘基取代，以例如恢復或改善抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其製備方法綜述於例如 Almagro 和 Fransson，
Front. Biosci.13:1619-1633 (2008) 中，並且進一步描述於例如：Riechmann 等人
， Nature332:323-329 (1988)；Queen 等人，
Proc. Nat ’ l Acad. Sci. USA86:10029-10033 (1989)；US 專利號
5,821,337、7,527,791、6,982,321 和 7,087,409；Kashmiri 等人，
Methods36:25-34 (2005) (具體描述了決定區 (SDR) 接枝)；Padlan，
Mol. Immunol.28:489-498 (1991) (描述了「表面重塑」)；Dall’Acqua 等人，
Methods36:43-60 (2005) (描述了「FR 改組」)；Osbourn 等人，
Methods36:61-68 (2005)；及 Klimka 等人，
Br. J. Cancer，83:252-260 (2000) (描述了 FR 改組的「導向選擇」法)。
可以用於人源化的人框架區域包括但不限於：使用「最佳匹配」方法選擇的框架區域 (參見例如 Sims 等人，
J. Immunol.151:2296 (1993))；來源於輕鏈或重鏈可變區的特定亞組的人抗體的共有序列的框架區域 (參見例如：Carter 等人，
Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89:4285 (1992)；及 Presta 等人，
J. Immunol.，151:2623 (1993))；人成熟的 (體細胞突變) 框架區域或人種系框架區域 (參見例如 Almagro 和 Fransson，
Front. Biosci.13:1619-1633 (2008))；以及來源於篩選 FR 文庫的框架區域 (參見例如：Baca 等人，
J. Biol. Chem.272:10678-10684 (1997)；及 Rosok 等人，
J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996))。
3. 醣基化變異體
在某些方面中，改變本文提供的抗體以增加或減少抗體發生醣基化之程度。抗體中添加或缺失醣基化位點可透過改變胺基酸序列以使得產生或去除一個或多個醣基化位點而方便地實現。
當抗體包含 Fc 區域時，可改變與其相連的寡醣。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支的雙觸角寡醣，該寡醣通常藉由 N-鍵聯附接至 Fc 區之 CH2 域的 Asn297。例如參見 Wright 等人，
TIBTECH15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡醣胺 (GlcNAc)、半乳糖及唾液酸以及在雙觸角寡醣結構之「莖」中附接至 GlcNAc 的岩藻醣。在一些方面中，可對本發明之抗體中的寡醣進行修飾，以產生具有某些改善之特性的抗體變異體。
在一個方面中，提供了具有非岩藻醣基化寡醣的抗體變異體，即缺少 (直接或間接地) 連接至 Fc 區域的岩藻醣的寡醣結構。此等非岩藻醣基化寡醣 (也稱為「去岩藻醣基化」寡醣) 特定而言在雙天線型寡醣結構的莖中缺少與第一 GlcNAc 連接之岩藻醣殘基的 N-連接寡醣。在一個方面中，提供了與天然或親本抗體相比在 Fc 區域中具有增加比例的非岩藻醣基化寡醣的抗體變異體。例如，非岩藻醣基化寡醣的比例可以為至少約 20%、至少約 40%、至少約 60%、至少約 80% 或甚至約 100% (即不存在岩藻醣基化寡醣)。非岩藻醣基化寡醣之百分比是缺少岩藻糖殘基之寡醣相對於連接至 Asn 297 (例如復合物、雜合和高甘露糖結構) 的所有寡醣的總和之 (平均) 量，該百分比透過 MALDI-TOF 質譜法測得，例如 WO 2006/082515 中所述。Asn297 係指位於 Fc 區域位置 297 附近之天冬醯胺酸殘基 (Fc 區域殘基的 EU 編號)；但是，Asn297 也可以位於位置 297 上游或下游大約 ±3 個胺基酸處，即由於抗體之微小序列變化而在位置 294 和 300 之間。此等在 Fc 區域中具有增加的比例的非岩藻醣基化寡醣的抗體可具有改善的 FcγRIIIa 受體結合及/或改善的效應子功能，特定而言改善的 ADCC 功能。參見例如 US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能夠產生具有減少的岩藻醣基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻醣基化之 Lec13 CHO 細胞 (Ripka 等人，
Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986)；US 2003/0157108；及 WO 2004/056312，尤其是在實例 11 中)；和敲除細胞株，諸如敲除 α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因
FUT8的 CHO 細胞 (參見例如 Yamane-Ohnuki 等人
Biotech. Bioeng.87:614-622 (2004)；Kanda, Y. 等人
, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及 WO 2003/085107)；或 GDP-岩藻糖合成或轉運蛋白活性降低或消失的細胞 (參見例如 US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在另一個方面中，抗體變異體被提供有二等分之寡醣，例如，其中連接至抗體之 Fc 區域的雙天線型寡醣被 GlcNAc 平分。此等抗體變異體可具有如上文所述之減少的岩藻醣基化及/或改善的 ADCC 功能。此等抗體變異體之實例描述於例如：Umana 等人，Nat Biotechnol 17，176-180 (1999)；Ferrara 等人，Biotechn Bioeng 93，851-861 (2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO 2003/011878。
亦提供了在寡醣上具有至少一個連接至 Fc 區域之半乳糖殘基的抗體變異體。此等抗體變體可具有改善的 CDC 功能。此等抗體變異體描述於例如 WO 1997/30087、WO 1998/58964 及 WO 1999/22764 中。
4. 半胱胺酸工程化抗體變異體
在某些方面中，可能希望創建半胱胺酸工程化抗體，例如 THIOMAB
TM抗體，其中抗體之一個或多個殘基被半胱胺酸殘基取代。在較佳方面中，經取代殘基出現在抗體之可進入的位點。透過用半胱胺酸取代那些殘基，反應性硫醇基團由此被定位在抗體之可進入的位點，並可用於使抗體與其他部分 (例如藥物部分或連接子-藥物部分) 結合，以形成免疫結合物，如本文進一步所述。半胱胺酸工程化抗體可按照例如美國專利號 7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130 或 WO 2016040856 所屬的方法產生。
5. 抗體衍生物
在某些方面中，可進一步修飾本文所提供之抗體，以使其包含本技術領域中已知且容易獲得的附加的非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三㗁𠮿、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸 (均聚物或隨機共聚物) 以及葡聚醣或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇 (例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可聚支鏈或無支鏈。連接至抗體的聚合物之數量可以變化，並且如果連接的聚合物超過一種，則它們可以為相同或不同之分子。通常，用於衍生化的聚合物之數量及/或類型可基於以下考慮因素來確定，此等考慮因素包括但不限於待改善之抗體的特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療中等。
6. 免疫結合物
本發明亦提供了包含如本文之抗 CD3/PLAP 抗體的免疫結合物，其結合 (化學鍵合) 至一種或多種治療劑，諸如細胞毒性劑、化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素 (例如來源於細菌、真菌、植物或動物之蛋白毒素、酶活性毒素或其片段) 或放射性同位素。
在一個方面中，免疫結合物為抗體-藥物結合物 (ADC)，其中抗體與上述一種或多種治療劑綴合。通常使用連接子將抗體連接至一種或多種治療劑。ADC 技術概述 (包括治療劑、藥物和連接子之實例) 載於
Pharmacol Review68:3-19 (2016) 中。
在另一方面中，免疫複合體包含綴合至酶活性毒素或其片段的本發明之抗體，該酶活性毒素或其片段包括但不限於白喉 A 鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素 A 鏈 (來源於銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白 A 鏈、相思子毒素 A 鏈、莫迪素 A 鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陸蛋白 (PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜抑制因子、薑黃素、巴豆毒素、肥皂草抑製劑、白樹毒素、米托菌素、局限曲菌素、酚黴素、伊諾黴素和單端孢黴烯族毒素。
在另一方面中，免疫複合體包含綴合至放射性原子以形成放射性複合體的本發明之抗體。在另一個實施例中，多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括 At
211、I
131、I
125、Y
90、Re
186、Re
188、Sm
153、Bi
212、P
32、Pb
212和 Lu 的放射性同位素。當放射性共軛物用於檢測時，它可能包含用於閃爍顯像研究之放射性原子，例如 Tc
99m或 I
123，或用於核磁共振 (NMR) 成像 (也稱為磁共振成像，MRI) 之自旋標記物，諸如 I
123、I
131、In
111、F
19、C
13、N
15、O
17、釓、錳或鐵。
抗體和細胞毒性劑之結合物可使用多種雙功能蛋白偶合劑進行製備，該雙功能蛋白偶合劑例如，N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基雙硫代)丙酸酯 (SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯 (SMCC)、亞胺基硫烷 (IT)、亞胺基酸酯的雙功能衍生物 (例如，己二酸二甲酯鹽酸鹽，HCl)、活性酯 (例如，雙琥珀醯亞胺辛二酸)、醛 (例如，戊二醛)、雙疊氮化合物 (例如，雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物 (例如，雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯 (例如，甲苯 2,6-二異氰酸酯) 和雙活性氟化合物 (例如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按照 Vitetta 等人 (
Science238:1098 (1987)) 所述的方法進行製備。用於將放射性核苷酸結合至抗體的一種例示性螯合劑為碳-14 標記的 1-異硫氰酸芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)。參見 WO 94/11026。連接子可以為促進細胞中細胞毒性藥物釋放的「可切割連接子」。例如，可使用酸不穩定之連接子、對肽酶敏感之連接子、光不穩定之連接基、二甲基連接子或含二硫鍵之連接子 (Chari 等人，
Cancer Res.52:127-131 (1992)；美國第 5,208,020 號專利)。
本文之免疫複合體或 ADC 明確考慮但不限於此等用交聯劑製得之複合體，該交聯劑包括但不限於可商購獲得 (例如從 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL., U.S.A) 商購獲得) 之 BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC 和磺基-SMPB 以及 SVSB (琥珀酰亞胺基-(4-乙烯碸)苯甲酸酯)。
7. 多特異性抗體
本文提供之抗體為多特異性抗體，特定而言雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同抗原決定位 (例如兩種不同蛋白質，或同一蛋白質上的兩個不同抗原決定基) 具有結合特異性的單株抗體。在某些方面中，多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。根據本發明，結合特異性之一為對 CD3 之結合特異性，而其他特異性則為針對 PLAP。
多特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。用於製備多特異性抗體之技術包括但不限於重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對 (參見 Milstein 和 Cuello，
Nature305: 537 (1983)) 和「杵臼」(knob-in-hole) 工程 (參見例如美國專利號 5,731,168，及 Atwell 等人 J. Mol. Biol. 270:26 (1997))。多特異性抗體也可透過以下方法進行製備：用於製備抗體 Fc-異二聚體分子的工程改造靜電轉向效應 (參見例如 WO 2009/089004)；交聯兩個或更多個抗體或片段 (參見例如美國專利號 4,676,980；及 Brennan 等人
， Science，229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體 (參見例如 Kostelny
等人，
J. Immunol.，148(5):1547-1553 (1992)；及 WO 2011/034605)；使用常用輕鏈技術規避輕鏈錯配問題 (參見例如 WO 98/50431)；使用「雙抗體」技術製備雙特異性抗體片段 (參見例如，Hollinger 等人
， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))；以及使用單鏈 Fv (sFv) 二聚體 (參見例如 Gruber 等人
， J. Immunol.,
152:5368 (1994))；以及按照例如 Tutt 等人
J. Immunol.147: 60 (1991) 所述的製備三特異性抗體。
本文還包括具有三個或更多個抗原結合位點之工程化抗體，包括例如「章魚抗體」(Octopus antibodies) 或 DVD-Ig (參見例如 WO 2001/77342 及 WO 2008/024715)。具有三個或更多個抗原結合位點之多特異性抗體的其他實例可參見 WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792 及 WO 2013/026831 中。多特異性抗體或其抗原結合片段也包括「雙重作用 FAb」或「DAF」，其包含與 CD3 以及另一種不同抗原或 CD3 的兩個不同抗原決定基結合之抗原結合位點 (參見例如 US 2008/0069820 及 WO 2015/095539)。
多特異性抗體也可以不對稱形式提供，其中域在一個或多個具有相同抗原特異性之結合臂中交叉 (所謂的「CrossMab」技術)，即透過交換 VH/VL 域 (參見例如 WO 2009/080252 及 WO 2015/150447)、CH1/CL 域 (參見例如 WO 2009/080253) 或完整的 Fab 臂 (參見例如 WO 2009/080251、WO 2016/016299，另見 Schaefer 等人，PNAS，108 (2011) 1187-1191，及 Klein 等人，MAbs 8 (2016) 1010-20) 實現。還可透過將帶電荷或不帶電荷之胺基酸突變引入域界面引導正確 Fab 配對，從而設計不對稱之 Fab 臂。參見例如 WO 2016/172485。
用於多特異性抗體之各種其他分子形式為本技術領域中已知的並且包括在本文中 (參見例如 Spiess 等人，Mol Immunol 67 (2015) 95-106)。
特定類型之多特異性抗體為雙特異性抗體，該雙特異性抗體被設計為同時結合至標靶細胞 (例如，癌症細胞) 上之表面抗原及 T 細胞受體 (TCR) 之活化不變組分 (例如 CD3) 複合體，用於重定向 T 細胞以毒殺標靶細胞。因此，本文中提供之抗體為多特異性抗體，特定而言為雙特異性抗體，其中結合特異性之一針對 CD3，且其他結合特異性則針對 PLAP，其作為標靶細胞抗原。
可用於此目的之雙特異性抗體形式包括但不限於所謂「BiTE」(bispecific T cell engager) 分子，其中，兩個 scFv 分子透過柔性連接子融合 (參見例如 WO 2004/106381、WO 2005/061547、WO 2007/042261 及 WO 2008/119567；Nagorsen 和 Bäuerle，Exp Cell Res 317，1255-1260 (2011))；雙抗體 (Holliger 等人，Prot Eng 9，299-305 (1996)) 及其衍生物，諸如串聯雙抗體 (“TandAb”；Kipriyanov 等人，J Mol Biol 293，41-56 (1999))；「DART」(雙親和性重定位) 分子，其基於雙抗體形式，但具有 C 端二硫鍵以供進一步穩定 (Johnson 等人，J Mol Biol 399，436-449 (2010))，以及所謂 triomab，它們為完整的小鼠/大鼠 IgG 雜合分子 (參見 Seimetz 等人的綜述：Cancer Treat Rev 36，458-467 (2010))。本文所包括之特定 T 細胞雙特異性抗體形式描述於：WO 2013/026833；WO 2013/026839；WO 2016/020309；及 Bacac 等人 Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498。
下面描述本發明之抗體的較佳方面。
在一個方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之抗體，其包含與 CD3 結合之第一抗原結合域，如本文所述，且包含與 PLAP 結合之第二抗原結合域及視情況的第三抗原結合域。
根據本發明之較佳方面，包含在抗體中之抗原結合域為 Fab 分子 (即，由重鏈和輕鏈組成的抗原結合域，其中每一個均包含變異域和恆定域)。在一個方面中，第二抗原結合域及/或在存在時之第三抗原結合域為 Fab 分子。在一個方面中，所述 Fab 分子為人 Fab 分子。在一較佳的方面中，該 Fab 分子為人源化 Fab 分子。在又一方面中，所述 Fab 分子包含人重鏈恆定域及人輕鏈恆定域。
較佳地，抗原結合域中之至少一個為交換型 Fab 分子。此等修飾減少了來自不同 Fab 分子之重鏈及輕鏈的錯配，從而提高重組生產本發明之 (多特異性) 抗體的產率和純度。在用於本發明之 (多特異性) 抗體的較佳交換型 Fab 分子中，交換了 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈 (分別為 VL 和 VH) 的變異域。然而，即使采用此域交換，由於錯配之重鏈與輕鏈之間的所謂 Bence Jones 型相互作用，(多特異性) 抗體的製備也可能包含某些副產物 (參見 Schaefer 等人，PNAS，108 (2011) 11187-11191)。為進一步減少來自不同 Fab 分子之重鏈及輕鏈的錯配，從而提高所需之 (多特異性) 抗體的純度及產率，可在與 CD3 結合之 Fab 分子或與 PLAP 結合之 Fab 分子的 CH1 及 CL 域中特定之胺基酸位置引入帶有相反電荷之胺基酸，如本文中進一步所述。在包含在 (多特異性) 抗體中的習用 Fab 分子 (諸如例如
圖 1 的 A 至 C、
G 至 J中所示的) 中或在包含在 (多特異性) 抗體中的 VH/VL 交換型 Fab 分子 (諸如例如
圖 1 的 D 至 F、
K 至 N中所示的) 中 (但不是兩者兼有) 進行電荷修飾。在較佳方面中，在包含在 (多特異性) 抗體中的習用 Fab 分子中進行電荷修飾 (在較佳方面中，其與 PLAP 結合)。
在根據本發明之一較佳方面中，(多特異性) 抗體能夠同時結合至 CD3 及 PLAP。在一個方面中，(多特異性) 抗體能夠藉由同時與 CD3 及 PLAP 結合而交聯 T 細胞及標靶細胞。在一個甚至更佳的方面中，此等同時結合導致標靶細胞、特定而言表現 PLAP-G 之腫瘤細胞裂解。在一個方面中，此等同時結合導致 T 細胞活化。在其他方面中，此等同時結合導致 T 淋巴細胞、特定而言細胞毒性 T 淋巴細胞之細胞回應，該細胞回應選自：增殖、分化、細胞因子分泌、細胞毒性效應子分子釋放、細胞毒性活性及活化標記物之表現。在一個方面中，(多特異性) 抗體與 CD3 結合而不同時與 PLAP 結合不會導致 T 細胞活化。
在一個方面中，(多特異性) 抗體能夠將 T 細胞之細胞毒性活性重定向至標靶細胞。在一較佳方面中，所述重定向不依賴於標靶細胞之 MHC 介導的肽抗原呈遞及/或 T 細胞之特異性。
較佳地，根據本發明之任何方面的 T 細胞為細胞毒性 T 細胞。在一些方面中，T 細胞為 CD4
+或 CD8
+T 細胞，特定而言 CD8
+T 細胞。
a) 第一抗原結合域
本發明之 (多特異性) 抗體包含與 CD3 結合的至少一個抗原結合域 (第一抗原結合域)。在較佳的方面中，CD3 是人 CD3 (SEQ ID NO: 63) 或食蟹獼猴 CD3 (SEQ ID NO: 64)，最特定而言人 CD3。在一個方面中，第一抗原結合域對人及食蟹獼猴 CD3 具有交叉反應 (即與之特異性結合)。在一些方面中，CD3 為 CD3 之 ε 次單元 (CD3 ε)。
在一較佳的方面中，(多特異性) 抗體包含不超過一個與 CD3 結合之抗原結合域。在一個方面中，(多特異性) 抗體提供與 CD3 之單價結合。
在一個方面中，與 CD3 結合之抗原結合域為選自 Fv 分子、scFv 分子、Fab 分子和 F(ab')
2分子之群組的抗體片段。在一較佳的方面中，與 CD3 結合之抗原結合域為 Fab 分子。
在較佳的方面中，與 CD3 結合之抗原結合域為本文所述之交換型 Fab 分子，即其中 Fab 重鏈和輕鏈之可變域 VH 和 VL 或恆定域 CH1 和 CL 彼此交換/替換的 Fab 分子。在此等方面中，與 PLAP 結合之抗原結合域較佳為習用 Fab 分子。在其中存在多於一個與 (多特異性) 抗體中包含之 PLAP 結合之抗原結合域、特定而言 Fab 分子之方面中，與 CD3 結合之抗原結合域較佳為交換型 Fab 分子，且與 PLAP 結合之抗原結合域為習用 Fab 分子。
在替代方面中，與 CD3 結合之抗原結合域為習用 Fab 分子。在此等方面中，與 PLAP 結合之抗原結合域為本文之交換型 Fab 分子，即其中 Fab 重鏈及輕鏈之可變域 VH 及 VL 或恆定域 CH1 及 CL 彼此交換/替換之 Fab 分子。在其中存在多於一個與 (多特異性) 抗體中包含之 CD3 結合之抗原結合域，特定而言 Fab 分子之方面中，與 PLAP 結合之抗原結合域較佳為交換型 Fab 分子，且與 CD3 結合之抗原結合域為習用 Fab 分子。
在較佳的方面中，第一抗原結合域為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1，特定而言可變域 VL 及 VH 彼此替換 (即根據此類方面，第一抗原結合域為交換型 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域或恆定域發生交換)。在一個此類方面中，第二抗原結合域 (及第三抗原結合域，如果有的話) 為習用 Fab 分子。
在一個方面中，不超過一個與 CD3 結合之抗原結合域存在於 (多特異性) 抗體中 (即抗體提供與 CD3 之單價結合)。
b) 第二抗原結合域 ( 及第三抗原結合域 )
本發明之 (多特異性) 抗體包含與 PLAP 結合之至少一個抗原結合域 (第二抗原結合域及視情況的第三抗原結合域)，特定而言為 Fab 分子。第二抗原結合域能夠將 (多特異性) 抗體導向標靶位點，例如導向表現 PLAP 的特定類型之細胞。
在一個方面中，與 PLAP 結合之抗原結合域為選自以下項所組成之群組的抗體片段：Fv 分子、scFv 分子、Fab 分子及 F(ab')
2分子。在一較佳方面中，與 PLAP 結合之抗原結合域為 Fab 分子。
在某些方面中，(多特異性) 抗體包含兩個與 PLAP 結合之抗原結合域，特定而言 Fab 分子。在一較佳方面，所有這些抗原結合域都是相同的，即它們具有相同的分子形式 (例如習用或交換型 Fab 分子)，並且包含相同的胺基酸序列，其包含與本文中所述相同的在 CH1 及 CL 域中之胺基酸取代 (如果有的話)。在一個方面中，(多特異性) 抗體包含不超過兩個與 PLAP 結合之抗原結合域，特定而言 Fab 分子。
在較佳方面中，與 PLAP 結合之抗原結合域為習用 Fab 分子。在此等方面中，與 CD3 結合之抗原結合域為本文所述之交換型 Fab 分子，即其中 Fab 重鏈和輕鏈之可變域 VH 和 VL 或恆定域 CH1 和 CL 彼此交換/替換的 Fab 分子。
在替代方面中，與 PLAP 結合之抗原結合域為本文之交換型 Fab 分子，即其中 Fab 重鏈及輕鏈之可變域 VH 及 VL 或恆定域 CH1 及 CL 彼此交換/替換的 Fab 分子。在此等方面中，與 CD3 結合之抗原結合域為習用 Fab 分子。
在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 包含人恆定區。在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 為 Fab 分子，該 Fab 分子包含人恆定區，特定而言人 CH1 及/或 CL 域。人恆定域的示例性序列在 SEQ ID NO 70 和 71 (分別為人 κ 和 λ CL 域) 以及 SEQ ID NO: 72 (人 IgG
1重鏈恆定域 CH1-CH2-CH3) 中給出。在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含與 SEQ ID NO: 70 或 SEQ ID NO: 71 之胺基酸序列，特定而言 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。特定而言，輕鏈恆定區可包含如本文在「電荷修飾」下所述之胺基酸突變，及/或可在交換型 Fab 分子中包含一個或多個 (特別是兩個) N 端胺基酸之缺失或取代。在一些方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含與包含在 SEQ ID NO: 72 之胺基酸序列中的 CH1 域序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。特定而言，重鏈恆定區 (具體而言 CH1 域) 可包含如本文在「電荷修飾」下所述之胺基酸突變。
在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 包含：重鏈可變域 VH，該重鏈可變域包含 (i) SEQ ID NO: 28 之重鏈互補決定區 HCDR 1、SEQ ID NO: 29 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 30 之 HCDR 3，(ii) SEQ ID NO: 32 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 33 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 34 之 HCDR 3，(iii) SEQ ID NO: 36 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 37 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 38 之 HCDR 3，(iv) SEQ ID NO: 40 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 41 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 42 之 HCDR 3；或 (v) SEQ ID NO: 44 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 45 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 46 之 HCDR 3；及輕鏈可變域 VL，該輕鏈可變域包含 SEQ ID NO: 48 之 LCDR 1、SEQ ID NO: 49 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 50 之輕鏈互補決定區 LCDR 3。
在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 為 (來源於) 人源化抗體。在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 為人源化抗原結合域 (即人源化抗體之抗原結合域)。在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VH 及/或 VL 為人源化可變區。
在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VH 及/或 VL 包含受體人骨架，例如人免疫球蛋白骨架或人共通骨架。
在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VH 包含 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之一個或多個重鏈骨架序列 (即 FR1、FR2、FR3 及/或 FR4 序列)。在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VH 包含與 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VH 包含與 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列至少約 95% 相同之胺基酸序列。在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VH 包含與 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列至少約 98% 相同之胺基酸序列。在某些方面中，具有至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性的 VH 序列包含相對於參比序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗體保留與 PLAP 結合之能力。在某些方面中，在 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列中，總共有 1 至 10 個胺基酸被取代，插入及/或缺失。在某些方面中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VH 包含 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列。視情況，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VH 包含 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列，其包含該序列之轉譯後修飾。
在一個方面，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VL 包含 SEQ ID NO: 51 之一個或多個輕鏈骨架序列 (即 FR1、FR2、FR3 及/或 FR4 序列)。在一個方面，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VL 包含與 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在一個方面，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VL 包含與 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列至少約 95% 相同之胺基酸序列。在一個方面，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VL 包含與 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列至少約 98% 相同之胺基酸序列。在某些方面中，具有至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性的 VL 序列包含相對於參比序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗體保留與 PLAP 結合之能力。在某些方面中，在 SEQ ID NO: 51 的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。在一個方面，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VL 包含 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列。視情況，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VL 包含 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列，其包含該序列之轉譯後修飾。
在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VH 包含與 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列，且第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VL 包含與 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VH 包含 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列，且第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VL 包含 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列。
在再一方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列。
在再一方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 包含 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之 VH 序列；及 SEQ ID NO: 51 之 VL 序列。
在另一方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 包含：VH，其包含 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之 VH 之重鏈 CDR 序列；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 51 之 VL 之輕鏈 CDR 序列。
在再一方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 包含 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之 VH 之 HCDR1、HCDR2 及 HCDR3 胺基酸序列；及 SEQ ID NO: 51 之 VL 之 LCDR1、LCDR2 及 LCDR3 胺基酸序列。
在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VH 包含 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之 VH 之重鏈 CDR 序列；及分別與 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之 VH 之骨架序列具有至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性之骨架。在一個方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VH 包含 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之 VH 之重鏈 CDR 序列；及分別與 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之 VH 之骨架序列具有至少 95% 序列同一性之骨架。在另一方面中，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VH 包含 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之 VH 之重鏈 CDR 序列；及分別與 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之 VH 之骨架序列具有至少 98% 序列同一性之骨架。
在一個方面，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VL 包含 SEQ ID NO: 51 之 VL 之輕鏈 CDR 序列，及與 SEQ ID NO: 51 之 VL 之骨架序列具有至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的骨架。在一個方面，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VL 包含 SEQ ID NO: 51 之 VL 之輕鏈 CDR 序列，及與 SEQ ID NO: 51 之 VL 之骨架序列具有至少 95% 序列同一性的骨架。在另一方面，第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之 VL 包含 SEQ ID NO: 51 之 VL 之輕鏈 CDR 序列，及與 SEQ ID NO: 51 之 VL 之骨架序列具有至少 98% 序列同一性的骨架。
c) 電荷修飾
本發明之 (多特異性) 抗體可在其中所包含之 Fab 分子中包含胺基酸取代，其特別有效地減少輕鏈與不匹配重鏈之錯配 (Bence-Jones 型副產物)，該錯配可能發生在基於 Fab 之多特異性抗體的製備中，其中在其結合臂之一個 (或多個，如果分子包含兩個以上之抗原結合 Fab 分子) 中發生 VH/VL 交換 (另見 PCT 公開號 WO 2015/150447，特定而言其中的實例，其全部內容以引用方式併入本文)。所需的 (多特異性) 抗體與不希望的副產物，特定而言在其結合臂之一中具有 VH/VL 域交換之多特異性抗體中發生的 Bence Jones 型副產物之比率可透過在 CH1 和 CL 域中之特定胺基酸位置引入帶有相反電荷之胺基酸來改善 (有時在本文中稱為「電荷修飾」)。
因此，在一些方面，其中，(多特異性) 抗體之第一抗原結合域及第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 均為 Fab 分子，且在抗原結合域之一 (特定而言第一抗原結合域) 中，Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 彼此替換，
i) 在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被帶正電荷之胺基酸 (根據 Kabat 編號) 取代，且其中在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸或位置 213 的胺基酸被帶負電荷之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；或
ii) 在第一抗原結合域之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸經帶正電荷之胺基酸 (根據 Kabat 編號) 取代，且其中，在第一抗原結合域之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸或位置 213 處之胺基酸經帶負電荷之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
(多特異性) 抗體不包含 i) 及 ii) 下所提及的修飾。具有 VH/VL 交換之抗原結合域之恆定域 CL 和 CH1 未彼此取代 (即保留未交換狀態)。
在一個更具體之方面中，
i) 在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸或位置 213 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；或
ii) 在第二抗原結合域之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第二抗原結合域之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸或位置 213 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 指數編號) 取代。
在一個此類方面中，在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸或位置 213 的胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在又一方面，在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在一較佳方面中，在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 指數編號) 取代，且位置 213 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 指數編號) 取代。
在一更佳方面，在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在一個甚至更佳方面，在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在較佳方面，如果根據上述方面之胺基酸取代發生在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CL 及恆定域 CH1 中，則第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CL 為 κ 同型。
可替代地，根據上述方面之胺基酸取代可發生在第一抗原結合域之恆定域 CL 及恆定域 CH1 中，而不是第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CL 及恆定域 CH1 中。在較佳的此等方面中，第一抗原結合域之恆定域 CL 為 κ 同型。
因此，在一個方面中，在第一抗原結合域之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第一抗原結合域之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸或位置 213 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 指數編號) 取代。
在又一方面中，在第一抗原結合域之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第一抗原結合域之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 指數編號) 取代。
在又一方面中，在第一抗原結合域之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第一抗原結合域之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 指數編號) 取代，且位置 213 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 指數編號) 取代。
在一個方面中，在第一抗原結合域之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸經離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 處之胺基酸經離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第一抗原結合域之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸經麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 處之胺基酸經麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在另一方面中，在第一抗原結合域之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸經離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 處之胺基酸經精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第一抗原結合域之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸經麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 處之胺基酸經麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在一較佳方面中，本發明之 (多特異性) 抗體包含
(a) 與 CD3 結合之第一抗原結合部分，其中第一抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 彼此替換，且包含重鏈可變區 (VH)，該 VH 包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 3 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 6 之 HCDR 3，及輕鏈可變區 (VL)，該 VL 包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；以及
(b) 結合 PLAP 之第二抗原結合域及視情況之第三抗原結合域；
其中，在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代 (在一較佳方面中，經離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 取代)，且位置 123 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代 (在一較佳方面中，經離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 取代)，並且在第二抗原結合域 (及在存在時之第三抗原結合域) 之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 指數編號) 取代，且位置 213 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 指數編號) 取代。
d) 多特異性抗體格式
根據本發明之 (多特異性) 抗體可具有各種構型。例示性構型如
圖 1所示。
在較佳方面中，包含在 (多特異性) 抗體中的抗原結合域為 Fab 分子。在此等方面中，第一抗原結合域、第二抗原結合域、第三抗原結合域等在本文中可分別稱為第一 Fab 分子、第二 Fab 分子、第三 Fab 分子等。
在一個方面中，(多特異性) 抗體之第一抗原結合域與第二抗原結合域彼此融合，視情況經由肽連接子彼此融合。在較佳方面中，第一抗原結合域及第二抗原結合域各自為 Fab 分子。在一個此類方面中，第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合域的 Fab 重鏈之 N 端融合。在另一此類方面中，第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與第一抗原結合域的 Fab 重鏈之 N 端融合。另外，在其中，(i) 第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合域的 Fab 重鏈之 N 端融合，或 (ii) 第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與第一抗原結合域的 Fab 重鏈之 N 端融合的方面中，第一抗原結合域的 Fab 輕鏈與第二抗原結合域的 Fab 輕鏈可彼此融合，視情況可經由肽連接子融合。
可使用能夠與第二抗原例如標靶細胞抗原 (諸如 PLAP) 特異性結合之具有單個抗原結合域 (諸如 Fab 分子) 的 (多特異性) 抗體 (例如，如
圖 1 的 A 、 D 、 G 、 H 、 K 、 L所示)，特定而言在高親和力抗原結合域結合後預期第二抗原發生內在化的情況下。在此等情況下，針對第二抗原的多於一種抗原結合域的存在可增強第二抗原之內在化，從而降低其可用性。
然而，在其他情況下，具有包含兩個或更多個對第二抗原具有特異性之抗原結合域 (諸如 Fab 分子) 之 (多特異性) 抗體例如標靶細胞 (諸如 PLAP) (如
圖 1B 、圖 1C 、圖 1E 、圖 1F 、圖 1I 、圖 1J 、圖 1M或
圖 1N所示之實例) 將是有利的，例如有利於優化對標靶位點的靶向或使標靶細胞抗原交聯。
因此，在較佳方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體包含第三抗原結合域。
在一個方面中，第三抗原結合域與 PLAP 結合。在一個方面中，第三抗原結合域為 Fab 分子。
在一個方面中，第三抗原域與第二抗原結合域相同。
在一些方面中，第三抗原結合域及第二抗原結合域各自為 Fab 分子，並且第三抗原結合域與第二抗原結合域相同。因此，在這些方面中，第二抗原結合域及第三抗原結合域包含相同的重鏈和輕鏈胺基酸序列，並且具有相同排列的域 (即習用或交換型)。此外，在這些方面中，第三抗原結合域包含與第二抗原結合域相同之胺基酸取代 (如果有的話)。例如，本文描述為「電荷修飾」之胺基酸取代將在第二抗原結合域及第三抗原結合域中之每個的恆定域 CL 和恆定域 CH1 中進行。可替代地，該等胺基酸取代可在第一抗原結合域 (其在較佳的方面中亦為 Fab 分子) 之恆定域 CL 及恆定域 CH1 中進行，但是不在第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域 CL 及恆定域 CH1 中進行。
與第二抗原結合域類似，第三抗原結合域較佳為習用 Fab 分子。但是，也可以設想其中，第二抗原結合域及第三抗原結合域為交換型 Fab 分子 (且第一抗原結合域為習用 Fab 分子) 的方面。因此，在較佳的方面中，第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為習用 Fab 分子，且第一抗原結合域為本文所述之交換型 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈及輕鏈之可變域 VH 及 VL 或恆定域 CL 及 CH1 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其他方面中，第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為交換型 Fab 分子，且第一抗原結合域為習用 Fab 分子。
如果存在第三抗原結合域，在一較佳方面，第一抗原域與 CD3 結合，且第二抗原結合域及第三抗原結合域與 PLAP 結合。
在較佳方面中，本發明之 (多特異性) 抗體包含 Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成。Fc 域之第一次單元及第二次單元能夠穩定締合。
根據本發明之 (多特異性) 抗體可具有不同的構型，即第一抗原結合域、第二抗原結合域 (及視情況存在之第三抗原結合域) 可彼此融合並以不同方式與 Fc 域融合。這些成分可直接彼此融合或優選地通過一個或多個合適的胜肽連接子融合。在 Fab 分子與 Fc 域的次單元之 N 端融合的情況下，其通常透過免疫球蛋白鉸鏈區融合。
在一些方面中，第一抗原結合域及第二抗原結合域各自為 Fab 分子，並且第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元或第二次單元之 N 端融合。在此等方面中，第二抗原結合域可在 Fab 重鏈之 C 端與第一抗原結合域的 Fab 重鏈之 N 端或 Fc 域的次單元中另一個之 N 端融合。在較佳的此等方面中，第二抗原結合域為習用 Fab 分子，且第一抗原結合域為本文所述之交換型 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈及輕鏈之可變域 VH 及 VL 或恆定域 CL 及 CH1 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其他此等方面中，第二抗原結合域為交換型 Fab 分子，且第一抗原結合域為習用 Fab 分子。
在一個方面中，第一抗原結合域及第二抗原結合域各自為 Fab 分子，第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元或第二次單元之 N 端融合，並且第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與第一抗原結合域的 Fab 重鏈之 N 端融合。在一具體方面中，(多特異性) 抗體基本上由第一 Fab 分子及第二 Fab 分子組成，Fc 域由第一次單元及第二次單元以及視情況存在的一個或多個肽連接子構成，其中，第二 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第一 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元或第二次單元之 N 端融合。
圖 1G及
圖 1K中示意性地描繪了此類構型 (在這些實例中，第一抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子)。另外，視情況，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈和第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可彼此融合。
在另一方面中，第一抗原結合域及第二抗原結合域各自為 Fab 分子，並且第一抗原結合域及第二抗原結合域各自在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。在一具體方面中，(多特異性) 抗體基本上由第一 Fab 分子及第二 Fab 分子組成，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元以及視情況由一個或多個肽連接子構成，其中，第一 Fab 分子及第二 Fab 分子各自在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。圖
1A及圖
1D中示意性地描繪了此類構型 (在此等實例中，第一抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子並且第二抗原結合域為習用 Fab 分子)。第一 Fab 分子及第二 Fab 分子可直接或透過胜肽連接子與 Fc 域融合。在一較佳方面中，第一 Fab 分子及第二 Fab 分子各自透過免疫球蛋白鉸鏈區與 Fc 域融合。在一具體方面中，免疫球蛋白鉸鏈區為人 IgG
1鉸鏈區，特定而言，其中 Fc 域為 IgG
1Fc 域。
在一些方面中，第一抗原結合域及第二抗原結合域各自為 Fab 分子，並且第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元或第二次單元之 N 端融合。在此等方面中，第一抗原結合域可在 Fab 重鏈之 C 端與第一抗原結合域的 Fab 重鏈之 N 端或 (如上文所述) Fc 域的次單元中另一個之 N 端融合。在較佳的此等方面中，該第二抗原結合域為習用 Fab 分子，且第一抗原結合域為本文所述之交換型 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈及輕鏈之可變域 VH 及 VL 或恆定域 CL 及 CH1 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其他此等方面中，該第二抗原結合域為交換型 Fab 分子，且第一抗原結合域為習用 Fab 分子。
在一個方面中，第一抗原結合域及第二抗原結合域各自為 Fab 分子，第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元或第二次單元之 N 端融合，並且第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合域的 Fab 重鏈之 N 端融合。在一具體方面中，(多特異性) 抗體基本上由第一 Fab 分子及第二 Fab 分子組成，Fc 域由第一次單元及第二次單元以及視情況存在的一個或多個肽連接子構成，其中，第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第二 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元或第二次單元之 N 端融合。
圖 1H及
圖 1L中示意性地描繪了此類構型 (在此等實例中，第一抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子且第二抗原結合域為習用 Fab 分子)。另外，視情況，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈和第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可彼此融合。
在一些方面中，第三抗原結合域，特定而言第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元或第二次單元之 N 端融合。在較佳的此等方面中，該第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為習用 Fab 分子，且第一抗原結合域為本文所述之交換型 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈及輕鏈之可變域 VH 及 VL 或恆定域 CL 及 CH1 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其他此等方面中，該第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為交換型 Fab 分子，且第一抗原結合域為習用 Fab 分子。
在一較佳此等方面中，第一抗原結合域及第三抗原結合域各自在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，並且第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與第一 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合。在一個具體方面中，(多特異性) 抗體基本上由第一 Fab 分子、第二 Fab 分子及第三 Fab 分子組成，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元以及視情況存在的一個或多個肽連接子構成，其中，第二 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第一 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元之 N 端融合，且其中，第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第二次單元之 N 端融合。
圖 1B及
圖 1E(在這些實例中，第一抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子，且第二抗原結合域及第三抗原結合域為習用 Fab 分子) 以及
圖 1J及
圖 1N(在這些實例中，第一抗原結合域為習用 Fab 分子，且第二抗原結合域及第三抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子) 中示意性描繪了此類構型。第一 Fab 分子及第三 Fab 分子可直接或透過胜肽連接子與 Fc 域融合。在一較佳方面中，第一 Fab 分子及第三 Fab 分子各自透過免疫球蛋白鉸鏈區與 Fc 域融合。在一具體方面中，免疫球蛋白鉸鏈區為人 IgG
1鉸鏈區，特定而言，其中 Fc 域為 IgG
1Fc 域。另外，視情況，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈和第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可彼此融合。
在另一此等方面中，第二抗原結合域及第三抗原結合域各自在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，並且第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合域的 Fab 重鏈之 N 端融合。在一個具體方面中，(多特異性) 抗體基本上由第一 Fab 分子、第二 Fab 分子及第三 Fab 分子組成，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元以及視情況存在的一個或多個肽連接子構成，其中，第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第二 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元之 N 端融合，且其中，第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第二次單元之 N 端融合。
圖 1C及
圖 1F(在這些實例中，第一抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子，並且第二抗原結合域及第三抗原結合域為習用 Fab 分子) 以及
圖 1I及
圖 1M(在這些實例中，第一抗原結合域為習用 Fab 分子，並且第二抗原結合域及第三抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子) 中示意性描繪了此類構型。第二 Fab 分子及第三 Fab 分子可直接或透過胜肽連接子與 Fc 域融合。在一較佳的方面中，第二 Fab 分子及第三 Fab 分子各自透過免疫球蛋白鉸鏈區與 Fc 域融合。在一具體方面中，免疫球蛋白鉸鏈區為人 IgG
1鉸鏈區，特定而言，其中 Fc 域為 IgG
1Fc 域。另外，視情況，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈和第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可彼此融合。
在其中，Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端透過免疫球蛋白鉸鏈區與 Fc 域的次單元中的每個之 N 端融合的 (多特異性) 抗體之構型中，兩個 Fab 分子、鉸鏈區和 Fc 域基本上形成免疫球蛋白分子。在一較佳的方面中，免疫球蛋白分子為 IgG 類免疫球蛋白。在一個甚至更佳的方面中，免疫球蛋白為 IgG
1亞類免疫球蛋白。在另一方面中，免疫球蛋白為 IgG
4亞類免疫球蛋白。在又一較佳的方面中，免疫球蛋白為人免疫球蛋白。在其他方面中，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一個方面中，免疫球蛋白包含人恆定區，特定而言人 Fc 區。
在本發明之一些 (多特異性) 抗體中，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈彼此融合，視情況經由肽連接子融合。根據第一 Fab 分子及第二 Fab 分子的構型不同，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可在其 C 端與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈之 N 端融合，或第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可在其 C 端與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈之 N 端融合。第一 Fab 分子與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈的融合進一步減少了 Fab 重鏈與輕鏈之錯配，並且還減少了表現本發明的一些 (多特異性) 抗體所需的質體數量。
抗原結合域可直接與 Fc 域融合或彼此融合，或者透過肽連接子與 Fc 融合或彼此融合，該肽連接子包含一個或多個胺基酸，通常約 2-20 個胺基酸。胜肽連接子為本領域中所公知的並且如本文所述。合適的非免疫肽連接子包括例如 (G
4S)
n、(SG
4)
n、(G
4S)
n、G
4(SG
4)
n或 (G
4S)
nG
5肽連接子。「N」通常為 1 至 10 的整數，特別為 2 至 4。在一個方面中，該肽連接子的長度為至少 5 個胺基酸；在一個方面中，長度為 5 至 100 個胺基酸；在又一個方面中，長度為 10 至 50 個胺基酸。在一個方面中，該肽連接子為 (GxS)
n或 (GxS)
nG
m，其中 G = 甘胺酸，S = 絲胺酸，且 (x=3，n=3、4、5 或 6，且 m=0、1、2 或 3) 或 (x=4，n=1、2、3、4 或 5，且 m=0、1、2、3、4 或 5)；在一個方面中，x=4 且 n=2 或 3；在另一方面中，x=4 且 n=2；在又一方面中，x=4，n=1，且 m=5.在一個方面中，該肽連接子為 (G
4S)
2。在另一方面中，該肽連接子為 G
4SG
5。一種用於使第一 Fab 分子及第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈彼此融合的特別合適的胜肽連接子為 (G
4S)
2。一種適用於連接第一 Fab 片段及第二 Fab 片段之 Fab 重鏈的示例性胜肽連接子包含序列 (D)-(G
4S)
2(SEQ ID NO 66 及 67)。另一合適的此類連接子包含序列 (D)-G
4SG
5(SEQ ID NO: 68 及 SEQ ID NO: 69)。在一特定方面中，連接子包含 SEQ ID NO:67 之序列。另外，連接子可包含免疫球蛋白鉸鏈區 (的一部分)。特定而言，在其中 Fab 分子與 Fc 域次單元之 N 端融合的情況下，可透過包含附加的胜肽連接子或不含附加的胜肽連接子的免疫球蛋白鉸鏈區或其一部分融合。
在某些方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第一 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VL
(1)-CH1
(1)-CH2-CH3(-CH4))；及多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 重鏈與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH
(2)-CH1
(2)-CH2-CH3(-CH4))。在一些方面中，該 (多特異性) 抗體一步包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VH
(1)-CL
(1))，並且與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(2)-CL
(2))。在某些方面中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在某些方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第一 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH
(1)-CL
(1)-CH2-CH3(-CH4))；及多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 重鏈與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH
(2)-CH1
(2)-CH2-CH3(-CH4))。在一些方面中，(多特異性) 抗體進一步包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VL
(1)-CH1
(1))，且與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(2)-CL
(2))。在某些方面中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在一些方面中，(多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即，第一 Fab 分子包含交換型 Fab 重鏈，其中，重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VL
(1)-CH1
(1)-VH
(2)-CH1
(2)-CH2-CH3(-CH4))。在其他方面中，(多特異性) 抗體包含如下多肽：其中第二 Fab 分子之 Fab 重鏈與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共用羧基端肽鍵 (即第一 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，該第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區繼而與 Fc 域次單元共用羧基端肽鍵 (VH
(2)-CH1
(2)-VL
(1)-CH1
(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些該等方面中，(多特異性) 抗體進一步包含：第一 Fab 分子之交叉型 Fab 輕鏈多肽，其中第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵 (VH
(1)-CL
(1))，且與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共用羧基端肽鍵 (VL
(2)-CL
(2))。在其他該等方面中，(多特異性) 抗體進一步包含：多肽，其中第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵，該第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區繼而與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共用羧基端肽鍵 (VH
(1)-CL
(1)-VL
(2)-CL
(2))；或多肽，其中第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區繼而與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵 (VL
(2)-CL
(2)-VH
(1)-CL
(1)) (在適當情況下)。根據這些方面之(多特異性) 抗體可進一步包含 (i) Fc 域次單元多肽 (CH2-CH3(-CH4))，或 (ii) 多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 重鏈與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH
(3)-CH1
(3)-CH2-CH3(-CH4))，且與第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(3)-CL
(3))。在某些方面中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在一些方面中，(多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即，第一 Fab 分子包含交換型 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH
(1)-CL
(1)-VH
(2)-CH1
(2)-CH2-CH3(-CH4))。在其他方面中，(多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 重鏈與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區共享羧基端肽鍵，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即，第一 Fab 分子包含交換型 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH
(2)-CH1
(2)-VH
(1)-CL
(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些該等方面中，(多特異性) 抗體進一步包含：第一 Fab 分子之交叉型 Fab 輕鏈多肽，其中第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共用羧基端肽鍵 (VL
(1)-CH1
(1))，且與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共用羧基端肽鍵 (VL
(2)-CL
(2))。在其他該等方面中，(多特異性) 抗體進一步包含：多肽，其中第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共用羧基端肽鍵，該第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區繼而與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共用羧基端肽鍵 (VL
(1)-CH1
(1)-VL
(2)-CL
(2))；或多肽，其中第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區繼而與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵 (VL
(2)-CL
(2)-VH
(1)-CL
(1)) (在適當情況下)。根據這些方面之(多特異性) 抗體可進一步包含 (i) Fc 域次單元多肽 (CH2-CH3(-CH4))，或 (ii) 多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 重鏈與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH
(3)-CH1
(3)-CH2-CH3(-CH4))，且與第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(3)-CL
(3))。在某些方面中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在某些方面中，(多特異性) 抗體不包含 Fc 域。在較佳的此等方面中，該第二抗原結合域及 (如果存在) 第三抗原結合域各自為習用 Fab 分子，且第一抗原結合域為本文所述之交換型 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈及輕鏈之可變域 VH 及 VL 或恆定域 CL 及 CH1 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其他此等方面中，該第二抗原結合域及 (如果存在) 第三抗原結合域各自為交換型 Fab 分子，且第一抗原結合域為習用 Fab 分子。
在一個此等方面中，(多特異性) 抗體基本上由第一抗原結合域及第二抗原結合域組成，並且視情況包含一個或多個肽連接子，其中，第一抗原結合域及第二抗原結合域均為 Fab 分子，並且第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與第一抗原結合域的 Fab 重鏈之 N 端融合。
圖 1O及
圖 1S中示意性描繪了此類構型 (在這些實例中，第一抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子且第二抗原結合域為習用 Fab 分子)。
在另一個此類方面中，(多特異性) 抗體基本上由第一抗原結合域及第二抗原結合域組成，並且視情況包含一個或多個肽連接子，其中，第一抗原結合域及第二抗原結合域均為 Fab 分子，並且第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合域的 Fab 重鏈之 N 端融合。
圖 1P及
圖 1T中示意性地描繪了此類構型 (在此等實例中，第一抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子且第二抗原結合域為習用 Fab 分子)。
在一些方面中，第二 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第一 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，且 (多特異性) 抗體進一步包含第三抗原結合域，特定而言第三 Fab 分子，其中，該第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合。在某些此等方面中，(多特異性) 抗體基本上由第一 Fab 分子、第二 Fab 分子及第三 Fab 分子組成，並且視情況包含一個或多個肽連接子，其中，第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合。
圖 1Q及
圖 1U(在這些實例中，第一抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子，且第二抗原結合域及第三抗原結合域為習用 Fab 分子) 或
圖 1X及
圖 1Z(在這些實例中，第一抗原結合域為習用 Fab 分子，且第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為 VH/VL 交換型 Fab 分子) 中示意性描繪了此類構型。
在一些方面中，第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且 (多特異性) 抗體進一步包含第三抗原結合域，特定而言第三 Fab 分子，其中，該第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 N 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 C 端融合。在某些此等方面中，(多特異性) 抗體基本上由第一 Fab 分子、第二 Fab 分子及第三 Fab 分子組成，並且視情況包含一個或多個肽連接子，其中，第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 N 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 C 端融合。
圖 1R及
圖 1V(在這些實例中，第一抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子，且第二抗原結合域及第三抗原結合域為習用 Fab 分子) 或
圖 1W及
圖 1Y(在這些實例中，第一抗原結合域為習用 Fab 分子，且第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為 VH/VL 交換型 Fab 分子) 中示意性描繪了此類構型。
在某些方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 重鏈與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區共享羧基端肽鍵，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第一 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈可變區被輕鏈可變區替換) (VH
(2)-CH1
(2)-VL
(1)-CH1
(1))。在一些方面中，該 (多特異性) 抗體一步包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VH
(1)-CL
(1))，並且與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(2)-CL
(2))。
在某些方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第一 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵 (VL
(1)-CH1
(1)-VH
(2)-CH1
(2))。在一些方面中，該 (多特異性) 抗體一步包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VH
(1)-CL
(1))，並且與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(2)-CL
(2))。
在某些方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 重鏈與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區共享羧基端肽鍵，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第一 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換) (VH
(2)-CH1
(2)-VH
(1)-CL
(1))。在一些方面中，(多特異性) 抗體進一步包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VL
(1)-CH1
(1))，且與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(2)-CL
(2))。
在某些方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第一 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵 (VH
(1)-CL
(1)-VH
(2)-CH1
(2))。在一些方面中，(多特異性) 抗體進一步包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VL
(1)-CH1
(1))，且與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(2)-CL
(2))。
在某些方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 重鏈與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區共享羧基端肽鍵，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第一 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈可變區被輕鏈可變區替換) (VH
(3)-CH1
(3)-VH
(2)-CH1
(2)-VL
(1)-CH1
(1))。在一些方面中，該 (多特異性) 抗體一步包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VH
(1)-CL
(1))，並且與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(2)-CL
(2))。在一些方面中，(多特異性) 抗體進一步包含第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽 (VL
(3)-CL
(3))。
在某些方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 重鏈與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區共享羧基端肽鍵，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第一 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換) (VH
(3)-CH1
(3)-VH
(2)-CH1
(2)-VH
(1)-CL
(1))。在一些方面中，(多特異性) 抗體進一步包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VL
(1)-CH1
(1))，且與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(2)-CL
(2))。在一些方面中，(多特異性) 抗體進一步包含第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽 (VL
(3)-CL
(3))。
在某些方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第一 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵，其繼而與第三 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵 (VL
(1)-CH1
(1)-VH
(2)-CH1
(2)-VH
(3)-CH1
(3))。在一些方面中，該 (多特異性) 抗體一步包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VH
(1)-CL
(1))，並且與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(2)-CL
(2))。在一些方面中，(多特異性) 抗體進一步包含第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽 (VL
(3)-CL
(3))。
在某些方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第一 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵，其繼而與第三 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵 (VH
(1)-CL
(1)-VH
(2)-CH1
(2)-VH
(3)-CH1
(3))。在一些方面中，(多特異性) 抗體進一步包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VL
(1)-CH1
(1))，且與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(2)-CL
(2))。在一些方面中，(多特異性) 抗體進一步包含第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽 (VL
(3)-CL
(3))。
在某些方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區共享羧基端肽鍵，其繼而與第三 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第三 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈可變區被輕鏈可變區替換) (VH
(1)-CH1
(1)-VL
(2)-CH1
(2)-VL
(3)-CH1
(3))。在一些方面中，該 (多特異性) 抗體一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VH
(2)-CL
(2))，並且與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(1)-CL
(1))。在一些方面中，(多特異性) 抗體進一步包含多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VH
(3)-CL
(3))。
在某些方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第一 Fab 分子之 Fab 重鏈與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第三 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區共享羧基端肽鍵，其繼而與第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第三 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換) (VH
(1)-CH1
(1)-VH
(2)-CL
(2)-VH
(3)-CL
(3))。在一些方面中，該 (多特異性) 抗體一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VL
(2)-CH1
(2))，並且與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(1)-CL
(1))。在一些方面中，(多特異性) 抗體進一步包含多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第三 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VL
(3)-CH1
(3))。
在某些方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第三 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第三 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵 (VL
(3)-CH1
(3)-VL
(2)-CH1
(2)-VH
(1)-CH1
(1))。在一些方面中，該 (多特異性) 抗體一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VH
(2)-CL
(2))，並且與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(1)-CL
(1))。在一些方面中，(多特異性) 抗體進一步包含多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VH
(3)-CL
(3))。
在某些方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體包含：多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第三 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (即第二 Fab 分子包含交叉型 Fab 重鏈，其中，重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵 (VH
(3)-CL
(3)-VH
(2)-CL
(2)-VH
(1)-CH1
(1))。在一些方面中，該 (多特異性) 抗體一步包含：多肽，其中，第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VL
(2)-CH1
(2))，並且與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL
(1)-CL
(1))。在一些方面中，(多特異性) 抗體進一步包含多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第三 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VL
(3)-CH1
(3))。
在一個方面中，本發明提供一種 (多特異性) 抗體，其包含
a) 與 CD3 結合之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1 彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 3 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 6 之 HCDR 3，及輕鏈可變區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；
b) 與 PLAP 結合之第二抗原結合域，其中，該第二抗原結合域為 (習用) Fab 分子；
c) Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成；
其中
(i) 根據 a) 之第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與根據 b) 之第二抗原結合域的 Fab 重鏈的 N 端融合，且根據 b) 之第二抗原結合域在 Fab 重鏈的 C 端與根據 c) 之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，或
(ii) 根據 b) 之第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與根據 a) 之第一抗原結合域的 Fab 重鏈的 N 端融合，且根據 a) 之第一抗原結合域在 Fab 重鏈的 C 端與根據 c) 之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一較佳方面中，本發明提供一種 (多特異性) 抗體，其包含
a) 與 CD3 結合之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1 彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 3 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 6 之 HCDR 3，及輕鏈可變區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；
b) 與 PLAP 結合之第二抗原結合域及第三抗原結合域，其中該第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為 (習用) Fab 分子；及
c) Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成；
其中
(i) 根據 a) 之第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與根據 b) 之第二抗原結合域的 Fab 重鏈的 N 端融合，且根據 b) 之第二抗原結合域及根據 b) 之第三抗原結合域各自在 Fab 重鏈的 C 端與根據 c) 之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，或
(ii) 根據 b) 之第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與根據 a) 之第一抗原結合域的 Fab 重鏈的 N 端融合，且根據 a) 之第一抗原結合域與根據 b) 之第三抗原結合域各自在 Fab 重鏈的 C 端與根據 c) 之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一方面中，本發明提供一種 (多特異性) 抗體，其包含
a) 與 CD3 結合之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1 彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 3 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 6 之 HCDR 3，及輕鏈可變區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；
b) 與 PLAP 結合之第二抗原結合域，其中，該第二抗原結合域為 (習用) Fab 分子；
c) Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成；
其中
(i) 根據 a) 之第一抗原結合域與根據 b) 之第二抗原結合域各自在 Fab 重鏈之 C 端與根據 c) 之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在根據本發明之 (多特異性) 抗體的所有不同構型中，本文所述之胺基酸取代 (「電荷修飾」) (如果存在) 可在第二抗原結合域及 (如果存在) 第三抗原結合域/Fab 分子的 CH1 和 CL 域中，或在第一抗原結合域/Fab 分子的 CH1 和 CL 域中。較佳地，它們在第二抗原結合域及 (如果存在) 第三抗原結合域/Fab 分子之 CH1 和 CL 域中。根據本發明之概念，如果本文所述之胺基酸取代在第二抗原結合域 (及 (如果存在) 第三抗原結合域) /Fab 分子中進行，則第一抗原結合域/Fab 分子中不存在此類胺基酸取代。相反，如果本文所述之胺基酸取代在第一抗原結合域/Fab 分子中進行，則第二抗原結合域 (及 (如果存在) 第三抗原結合域) /Fab 分子中不存在此類胺基酸取代。胺基酸取代較佳在包含 Fab 分子的 (多特異性) 抗體中進行，在該 Fab 分子中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之變異域 VL 和 VH1 彼此取代。
在根據本發明之 (多特異性) 抗體的較佳的方面中，特定而言其中，如本文所述之胺基酸取代在第二抗原結合域 (及 (如果存在) 第三抗原結合域) /Fab 分子中進行的情況下，第二 Fab 分子 (及 (如果存在) 第三 Fab 分子) 之恆定域 CL 為 κ 同型。在根據本發明之 (多特異性) 抗體的其他方面中，特定而言其中，如本文所述之胺基酸取代在第一抗原結合域/Fab 分子中進行的情況下，第一抗原結合域/Fab 分子之恆定域 CL 為 κ 同型。在一些方面中，第二抗原結合域 (及 (如果存在) 第三抗原結合域) /Fab 分子之恆定域 CL 及第一抗原結合域/Fab 分子之恆定域 CL 為 κ 同型。
在一個方面中，本發明提供一種 (多特異性) 抗體，其包含
a) 與 CD3 結合之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 3 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 6 之 HCDR 3，及輕鏈可變區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；
b) 與 PLAP 結合之第二抗原結合域，其中，該第二抗原結合域為 (習用) Fab 分子；
c) Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成；
其中在 b) 下所述之第二抗原結合域之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) (最佳地被精胺酸 (R)) 取代，並且其中在 b) 下所述之第二抗原結合域之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且
其中
(i) 根據 a) 之第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與根據 b) 之第二抗原結合域的 Fab 重鏈的 N 端融合，且根據 b) 之第二抗原結合域在 Fab 重鏈的 C 端與根據 c) 之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，或
(ii) 根據 b) 之第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與根據 a) 之第一抗原結合域的 Fab 重鏈的 N 端融合，且根據 a) 之第一抗原結合域在 Fab 重鏈的 C 端與根據 c) 之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在一較佳方面中，本發明提供一種 (多特異性) 抗體，其包含
a) 與 CD3 結合之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 3 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 6 之 HCDR 3，及輕鏈可變區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；
b) 與 PLAP 結合之第二抗原結合域及第三抗原結合域，其中該第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為 (習用) Fab 分子；及
c) Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成；
其中在 b) 下所述之第二抗原結合域及 b) 下所述之第三抗原結合域之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) (最佳地被精胺酸 (R)) 取代，並且其中在 b) 下所述之第二抗原結合域及 b) 下所述之第三抗原結合域之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且
其中
(i) 根據 a) 之第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與根據 b) 之第二抗原結合域的 Fab 重鏈的 N 端融合，且根據 b) 之第二抗原結合域及根據 b) 之第三抗原結合域各自在 Fab 重鏈的 C 端與根據 c) 之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，或
(ii) 根據 b) 之第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與根據 a) 之第一抗原結合域的 Fab 重鏈的 N 端融合，且根據 a) 之第一抗原結合域與根據 b) 之第三抗原結合域各自在 Fab 重鏈的 C 端與根據 c) 之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在另一方面中，本發明提供一種 (多特異性) 抗體，其包含
a) 與 CD3 結合之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 3 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 6 之 HCDR 3，及輕鏈可變區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；
b) 與 PLAP 結合之第二抗原結合域，其中，該第二抗原結合域為 (習用) Fab 分子；
c) Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成；
其中在 b) 下所述之第二抗原結合域之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) (最佳地被精胺酸 (R)) 取代，並且其中在 b) 下所述之第二抗原結合域之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；且
其中，在 a) 下所述之第一抗原結合域與在 b) 下所述之第二抗原結合域各自在 Fab 重鏈之 C 端與在 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
根據上述任一方面，(多特異性) 抗體的組分 (例如 Fab 分子、Fc 域) 可直接融合或透過各種連接子融合，特定而言透過本文所述或本領域中所公知的包含一個或多個胺基酸 (通常約 2-20 個胺基酸) 的肽連接子進行融合。合適的非免疫性胜肽連接子包括例如 (G
4S)
n、(SG
4)
n、(G
4S)
n、G
4(SG
4)
n或 (G
4S)
nG
5肽連接子，其中，n 通常為 1 至 10 的整數，特別為 2 至 4。
在一較佳方面中，本發明提供一種 (多特異性) 抗體，其包含
a) 結合 CD3 之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 3 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 6 之 HCDR 3，及輕鏈可變區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；
b) 與 PLAP 結合之第二抗原結合域及第三抗原結合域，其中，該第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為 (習用) Fab 分子，且包含：重鏈可變區 (VH)，該重鏈可變區包含 (i) SEQ ID NO: 28 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 29 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 30 之 HCDR 3，(ii) SEQ ID NO: 32 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 33 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 34 之 HCDR 3，(iii) SEQ ID NO: 36 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 37 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 38 之 HCDR 3，(iv) SEQ ID NO: 40 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 41 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 42 之 HCDR 3,或 (v) SEQ ID NO: 44 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 45 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 46 之 HCDR 3，及輕鏈可變區 (VL)，該輕鏈可變區包含 SEQ ID NO: 48 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 49 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 50 之 LCDR 3；
c) Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成；
其中
在 b) 下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) (最佳地被精胺酸 (R)) 取代，並且其中在 b) 下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；
並且其中另外
在 b) 下之第二抗原結合域在 Fab 重鏈的 C 端與在 a) 下之第一抗原結合域在 Fab 重鏈的 N 端融合，並且在 a) 下之第一抗原結合域及在 b) 下之第三抗原結合域各自在 Fab 重鏈的 C 端與在 c) 下之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在又一較佳方面中，本發明提供一種 (多特異性) 抗體，其包含
a) 與 CD3 結合之第一抗原結合域，其中該第一抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 彼此替換，並且該第一抗原結合域包含：重鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 13 之的胺基酸序列；
b) 與 PLAP 結合之第二抗原結合域及第三抗原結合域，其中第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為 (習用) Fab 分子，且包含：重鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列；
c) Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成；
其中
在 b) 下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) (最佳地被精胺酸 (R)) 取代，並且其中在 b) 下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；
並且其中另外
在 b) 下之第二抗原結合域在 Fab 重鏈的 C 端與在 a) 下之第一抗原結合域在 Fab 重鏈的 N 端融合，並且在 a) 下之第一抗原結合域及在 b) 下之第三抗原結合域各自在 Fab 重鏈的 C 端與在 c) 下之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在又一較佳方面中，本發明提供一種 (多特異性) 抗體，其包含
a) 結合 CD3 之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (VH)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 3 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 6 之 HCDR 3，及輕鏈可變區 (VL)，其包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；
b) 與 PLAP 結合之第二抗原結合域及第三抗原結合域，其中，該第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為 (習用) Fab 分子，且包含：重鏈可變區 (VH)，該重鏈可變區包含 (i) SEQ ID NO: 28 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 29 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 30 之 HCDR 3，(ii) SEQ ID NO: 32 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 33 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 34 之 HCDR 3，(iii) SEQ ID NO: 36 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 37 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 38 之 HCDR 3，(iv) SEQ ID NO: 40 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 41 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 42 之 HCDR 3,或 (v) SEQ ID NO: 44 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 45 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 46 之 HCDR 3，及輕鏈可變區 (VL)，該輕鏈可變區包含 SEQ ID NO: 48 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 49 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 50 之 LCDR 3；
c) Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成；
其中
在 b) 下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) (最佳地被精胺酸 (R)) 取代，並且其中在 b) 下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；
並且其中另外
在 b) 下之第二抗原結合域在 Fab 重鏈的 C 端與在 a) 下之第一抗原結合域在 Fab 重鏈的 N 端融合，並且在 a) 下之第一抗原結合域及在 b) 下之第三抗原結合域各自在 Fab 重鏈的 C 端與在 c) 下之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在再一較佳方面，本發明提供一種 (多特異性) 抗體，其包含
a) 與 CD3 結合之第一抗原結合域，其中該第一抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 彼此替換，並且該第一抗原結合域包含：重鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 13 之的胺基酸序列；
b) 與 PLAP 結合之第二抗原結合域及第三抗原結合域，其中第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為 (習用) Fab 分子，且包含：重鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列；
c) Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成；
其中
在 b) 下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) (最佳地被精胺酸 (R)) 取代，並且其中在 b) 下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；
並且其中另外
在 b) 下之第二抗原結合域在 Fab 重鏈的 C 端與在 a) 下之第一抗原結合域在 Fab 重鏈的 N 端融合，並且在 a) 下之第一抗原結合域及在 b) 下之第三抗原結合域各自在 Fab 重鏈的 C 端與在 c) 下之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在根據本發明這些方面的一個方面中，在 Fc 域之第一次單元中，位置 366 的蘇胺酸殘基被色胺酸殘基取代 (T366W)，並且在 Fc 域之第二次單元中，位置 407 的酪胺酸殘基被纈胺酸殘基取代 (Y407V)，並且視情況，位置 366 的蘇胺酸殘基被絲胺酸殘基取代 (T366S)，並且位置 368 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L368A) (根據 Kabat EU 指數編號)。
在根據本發明這些方面的另一方面中，在 Fc 域之第一次單元中，位置 354 的絲胺酸殘基又被胱胺酸殘基取代 (S354C) 或位置 356 的麩胺酸殘基被胱胺酸殘基取代 (E356C) (特定而言位置 354 的絲胺酸殘基被胱胺酸殘基取代)，並且在 Fc 域之第二次單元中，位置 349 的酪胺酸殘基又被胱胺酸殘基取代 (Y349C) (根據 Kabat EU 指數編號)。
在根據本發明這些方面的又一方面中，在 Fc 域之第一次單元及第二次單元中的每個中，位置 234 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L234A)，位置 235 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L235A)，並且位置 329 的脯胺酸殘基被甘胺酸殘基取代 (P329G) (根據 Kabat EU 指數編號)。
在根據本發明這些方面的又一方面中，Fc 域為人 IgG
1Fc 域。
在一具體方面中，(多特異性) 抗體包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含與 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在另一具體方面中，(多特異性) 抗體包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列。
在一個方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之 (多特異性) 抗體，其包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含與 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在一個方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之 (多特異性) 抗體，其包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列。
在另一具體方面中，(多特異性) 抗體包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含與 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在另一具體方面中，(多特異性) 抗體包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列。
在一個方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之 (多特異性) 抗體，其包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含與 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在一個方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之 (多特異性) 抗體，其包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列。
在一特定具體方面中，(多特異性) 抗體包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 56 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含與 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在另一具體方面中，(多特異性) 抗體包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 56 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列。
在一個方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之 (多特異性) 抗體，其包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 56 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含與 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在一個方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之 (多特異性) 抗體，其包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 56 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列。
在另一具體方面中，(多特異性) 抗體包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含與 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在另一具體方面中，(多特異性) 抗體包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列。
在一個方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之 (多特異性) 抗體，其包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含與 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在一個方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之 (多特異性) 抗體，其包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列。
在另一具體方面中，(多特異性) 抗體包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含與 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在另一具體方面中，(多特異性) 抗體包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列。
在一個方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之 (多特異性) 抗體，其包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含與 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。在一個方面中，本發明提供一種與 CD3 及 PLAP 結合之 (多特異性) 抗體，其包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列；及多肽 (特定而言兩個多肽)，該多肽包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列。
8. Fc 域變體
在較佳方面中，本發明之 (多特異性) 抗體包含 Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成。
(多特異性) 抗體之 Fc 域由包含免疫球蛋白分子之重鏈域的一對多肽鏈組成。例如，免疫球蛋白 G (IgG) 分子之 Fc 域為二聚體，其每個次單元包含 CH2 及 CH3 IgG 重鏈恆定域。Fc 域之兩個次單元能夠彼此穩定締合。在一個方面中，本發明之 (多特異性) 抗體包含不超過一個 Fc 域。
在一個方面中，(多特異性) 抗體之 Fc 域為 IgG Fc 域。在一較佳方面中，Fc 域為 IgG
1Fc 域。在另一方面中，Fc 域為 IgG
4Fc 域。在一個更具體之方面中，Fc 域為 IgG
4Fc 域，其包含在位置 S228 (根據 Kabat EU 指數編號) 的胺基酸取代，特定而言胺基酸取代 S228P。該胺基酸取代減少體內
IgG
4抗體之 Fab 臂交換 (參見 Stubenrauch 等人，Drug Metabolism and Disposition 38，84-91 (2010))。在另一個較佳方面中，Fc 域為人 Fc 域。在一個甚至更佳的方面中，Fc 域為人 IgG
1Fc 域。人 IgG
1Fc 區域的一個示例性序列在 SEQ ID NO: 65 中給出。
a) 促進異源性二聚化的 Fc 域修飾
根據本發明之 (多特異性) 抗體包含不同的抗原結合域，其可與 Fc 域之兩個次單元中的一個或另一個融合，因此 Fc 域之兩個次單元通常包含在兩個不同的多肽鏈中。這些多肽的重組共表達及隨後的二聚化導致兩種多肽具有若干可能的組合。為改善重組生產中 (多特異性) 抗體之產率和純度，在 (多特異性) 抗體之 Fc 域中引入促進所需之多肽締合之修飾將為有利的。
因此，在較佳方面中，根據本發明之 (多特異性) 抗體的 Fc 域包含促進 Fc 域之第一次單元及第二次單元之締合之修飾。人 IgG Fc 域之兩個次單元之間最廣泛的蛋白質-蛋白質相互作用位點在 Fc 域之 CH3 域中。因此，於一個方面中，該修飾在 Fc 域之 CH3 域中進行。
存在多種對 Fc 域之 CH3 域進行修飾以便增強異源二聚化之方法，這些方法很好地描述於例如 WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291 中。通常，在所有此等方法中，Fc 域之第一次單元的 CH3 域及 Fc 域之第二次單元的 CH3 域均以互補的方式進行工程改造，以使每個 CH3 域 (或包含 CH3 域的重鏈) 不再能夠與自身發生同源二聚化，而是被迫與經互補工程改造之其他 CH3 域進行異源二聚化 (使得第一 CH3 域及第二 CH3 域異源二聚化，並且在兩個第一 CH3 域或兩個第二 CH3 域之間不形成同源二聚體)。這些用於改善重鏈異源二聚化之不同方法被視為與 (多特異性) 抗體中重鏈-輕鏈修飾 (例如，一個結合臂中之 VH 和 VL 交換/替換，以及在 CH1/CL 界面中引入帶有相反電荷的胺基酸的取代基) 結合之不同選擇，其減少了重鏈/輕鏈錯配及 Bence Jones 型副產物。
在一個具體方面中，所述促進 Fc 域之第一次單元及第二次單元之締合之修飾為所謂的「杵臼 (knob-into-hole)」修飾，其包括在 Fc 域之兩個次單元中的一個的「杵」修飾及 Fc 域之兩個次單元中的另一個的「臼」修飾。
「杵臼」技術描述於例如：US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway 等人，Prot Eng 9，617-621 (1996)；及 Carter，J Immunol Meth 248，7-15 (2001)。通常，該方法包括在第一多肽之界面處引入一個突起 (「杵」)，並且在第二多肽之界面中引入一個對應的空腔 (「臼」)，以使該突起可定位於空腔中，從而促進異源二聚體形成並阻礙同源二聚體形成。透過用較大側鏈 (例如酪胺酸或色胺酸) 替換第一多肽界面上之較小的胺基酸側鏈來構建突起。透過將較大胺基酸側鏈替換為較小的胺基酸側鏈 (例如丙胺酸或蘇胺酸)，在第二多肽之界面中形成與突起具有相同或相近大小的互補空腔。
因此，在一較佳方面中，在 (多特異性) 抗體之 Fc 域的第一次單元的 CH3 域中，胺基酸殘基被具有較大側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在第一次單元之 CH3 域內產生突起，該突起可定位在第二次單元之 CH3 域内的空腔中，並且在 Fc 域的第二次單元的 CH3 域中，胺基酸殘基被具有較小側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在第二次單元之 CH3 域內產生空腔，第二次單元之 CH3 域内的突起為可定位在該空腔內。
較佳地，該具有較大側鏈體積的胺基酸殘基選自精胺酸 (R)、苯丙胺酸 (F)、酪胺酸 (Y) 和色胺酸 (W)。
較佳地，該具有較小側鏈體積的胺基酸殘基選自丙胺酸 (A)、絲胺酸 (S)、蘇胺酸 (T) 和纈胺酸 (V)。
可透過改變編碼多肽的核酸 (例如透過針對特定位點之突變或透過胜肽合成) 來製備突起和空腔。
在一個具體方面中，在 Fc 域之第一次單元 (「杵」次單元) (之 CH3 域) 中，位置 366 的蘇胺酸殘基被色胺酸殘基取代 (T366W)，並且在 Fc 域之第二次單元 (「臼」次單元) (之 CH3 域) 中，位置 407 的酪胺酸殘基被纈胺酸殘基取代 (Y407V)。在一個方面中，在 Fc 域之第二次單元中，位置 366 的蘇胺酸殘基又被絲胺酸殘基取代 (T366S)，並且位置 368 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L368A) (根據 Kabat EU 指數編號)。
在又一方面中，在 Fc 域之第一次單元中，位置 354 的絲胺酸殘基又被胱胺酸殘基取代 (S354C) 或位置 356 的麩胺酸殘基被胱胺酸殘基取代 (E356C) (特定而言位置 354 的絲胺酸殘基被胱胺酸殘基取代)，並且在 Fc 域之第二次單元中，位置 349 的酪胺酸殘基又被胱胺酸殘基取代 (Y349C) (根據 Kabat EU 指數編號)。引入這兩個半胱胺酸殘基導致在 Fc 域之兩個次單元之間形成二硫鍵，從而進一步穩定二聚體 (Carter，J Immunol Methods 248，7-15 (2001))。
在一較佳方面中，Fc 域之第一次單元包含胺基酸取代 S354C 和 T366W，並且 Fc 域之第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S、L368A 和 Y407V (根據 Kabat EU 指數編號)。
在一較佳方面中，與 CD3 結合之抗原結合域與 Fc 域之第一次單元 (包含「杵」修飾) 融合 (視情況，經由與 PLAP 結合之第二抗原結合域融合，及/或經由肽連接子融合)。不希望被理論束縛，與 CD3 結合之抗原結合域與 Fc 域之含杵次單元的融合將 (進一步) 最大限度減少包含兩個與 CD3 結合之抗原結合域之抗體的產生 (兩個含杵多肽之空間碰撞)。
可以設想將用於實施異源二聚化的 CH3 修飾的其他技術作為本發明之替代方案，並且該等技術闡述於例如 WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291 中。
在一個方面中，可替代地使用 EP 1870459 中所述之異源二聚化方法。該方法基於在 Fc 域之兩個次單元之間的 CH3/CH3 域界面的特定胺基酸位置引入帶有相反電荷的胺基酸。本發明之 (多特異性) 抗體的一個特定方面為 (Fc 域之) 兩個 CH3 域之一中的胺基酸突變 R409D 和 K370E；及 Fc 域的 CH3 域之另一個中的胺基酸突變 D399K 和 E357K (根據 Kabat EU 指數編號)。
在另一方面中，本發明之 (多特異性) 抗體包含 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 T366W 和 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 T366S、L368A、Y407V，以及 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 R409D、K370E 和 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 D399K、E357K (根據 Kabat EU 指數編號)。
在另一方面中，本發明之 (多特異性) 抗體包含 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 S354C、T366W 和 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 Y349C、T366S、L368A、Y407V，或者所述 (多特異性) 抗體包含 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 Y349C、T366W 和 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 S354C、T366S、L368A、Y407V，以及 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 R409D、K370E 和 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 D399K、E357K (全部根據 Kabat EU 指數編號)。
在一個方面中，可替代地使用 WO 2013/157953 中所述之異源二聚化方法。在一個方面中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 T366K，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 L351D (根據 Kabat EU 指數編號)。在另一個方面中，第一 CH3 域進一步包含胺基酸突變 L351K。在另一個方面中，第二 CH3 域進一步包含選自 Y349E、Y349D 和 L368E (特定而言 L368E) (根據 Kabat EU 指數編號) 的胺基酸突變。
在一個方面中，可替代地使用 WO 2012/058768 中所述之異源二聚化方法。在一個方面中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 L351Y、Y407A，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 T366A、K409F。在另一個方面中，第二 CH3 域進一步包含位置 T411、D399、S400、F405、N390 或 K392 的胺基酸突變，所述位置選自例如：a) T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E 或 T411W；b) D399R、D399W、D399Y 或 D399K；c) S400E、S400D、S400R 或 S400K；d) F405I、F405M、F405T、F405S、F405V 或 F405W；e) N390R、N390K 或 N390D；f) K392V、K392M、K392R、K392L、K392F 或 K392E (根據 Kabat EU 指數編號)。在另一個方面中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 L351Y、Y407A，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 T366V、K409F。在另一個方面中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 Y407A，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 T366A、K409F。在另一個方面中，第二 CH3 域進一步包含胺基酸突變 K392E、T411E、D399R 和 S400R (根據 Kabat EU 指數編號)。
在一個方面中，可替代地使用 WO 2011/143545 中所述之異源二聚化方法，例如，在選自 368 和 409 (根據 Kabat EU 指數編號) 的位置處進行胺基酸修飾。
在一個方面中，可替代地使用 WO 2011/090762 中所述之異源二聚化方法，該方法同樣使用上述之「杵臼」技術。在一個方面中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 T366W，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 Y407A。在一個方面中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 T366Y，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 Y407T (根據 Kabat EU 指數編號)。
在一個方面中，(多特異性) 抗體或其 Fc 域屬於 IgG
2亞類，並且另選地使用 WO 2010/129304 中所述之異源二聚化方法。
於一替代方面中，促進 Fc 域之第一次單元及第二次單元的締合的修飾包括介導靜電轉向作用的修飾，例如 PCT 公開 WO 2009/089004 中所述。通常，此方法涉及用帶電荷的胺基酸殘基取代兩個 Fc 域次單元界面上的一個或多個胺基酸殘基，從而使同源二聚體形成在靜電上不利，但異源二聚化在靜電上有利。在一個此類方面中，第一 CH3 域包含帶負電荷之胺基酸 (例如麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D)，特定而言 K392D 或 N392D) 對 K392 和 N392 之胺基酸取代，並且第二 CH3 域包含帶正電荷之胺基酸 (例如離胺酸 (K) 或精胺酸 (R)，特定而言 D399K、E356K、D356K 或 E357K 且更特定而言 D399K 和 E356K) 對 D399、E356、D356 或 E357 之胺基酸取代。在另一個方面中，第一 CH3 域進一步包含帶負電荷之胺基酸 (例如麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D)，特定而言 K409D 或 R409D) 對 K409 或 R409 之胺基酸取代。在另一個方面中，第一 CH3 域進一步或可替代地包含帶負電荷之胺基酸 (例如麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D)) 對 K439 及/或 K370 之胺基酸取代 (全部根據 Kabat EU 指數編號)。
在又一方面中，可替代地使用 WO 2007/147901 中所述之異源二聚化方法。在一個方面中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 K253E、D282K 和 K322D，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 D239K、E240K 和 K292D (根據 Kabat EU 指數編號)。
在另一個方面中，可替代地使用 WO 2007/110205 中所述之異源二聚化方法。
在一個方面中，Fc 域之第一次單元包含胺基酸取代 K392D 和 K409D，並且 Fc 域之第二次單元包含胺基酸取代 D356K 和 D399K (根據 Kabat EU 指數編號)。
b) 減少 Fc 受體結合及 / 或效應子功能之 Fc 域修飾
Fc 域賦予 (多特異性) 抗體有利的藥物動力學特性，包括較長之血清半衰期，其有助於在標靶組織中獲得良好的累積比和有利的組織-血液分配比。但是，與此同時，這可能導致不希望地將 (多特異性) 抗體靶向表現 Fc 受體之細胞，而不是靶向較佳的攜帶抗原的細胞。此外，Fc 受體信號傳導途徑的共激活可能導致細胞因子釋放，這在與 T 細胞活化特性和 (多特異性) 抗體的長半衰期相結合的情況下，導致在全身施用後細胞因子受體的過度活化和嚴重的副作用。由於 T 細胞的潛在破壞 (例如透過 NK 細胞) ，因此除 T 細胞外的 (攜帶 Fc 受體的) 免疫細胞的活化甚至可能降低 (多特異性) 抗體的功效。
因此，在較佳方面中，與天然 IgG
1Fc 域相比，根據本發明的 (多特異性) 抗體之 Fc 域表現出對 Fc 受體的降低的結合親和性及/或降低的效應子功能。在一個此類方面中，該 Fc 域 (或包含所述 Fc 域的 (多特異性) 抗體) 與天然 IgG
1Fc 域 (或包含天然 IgG
1Fc 域的 (多特異性) 抗體) 相比，表現出小於 50%，特定而言小於 20%，更特定而言小於 10% 且最特定而言小於 5% 的對 Fc 受體的結合親和性，及/或與天然 IgG
1Fc 域域 (或包含天然 IgG
1Fc 域的 (多特異性) 抗體) 相比，表現出小於 50%，特定而言小於 20%，更特定而言小於 10% 且最特定而言小於 5% 的效應子功能。在一個方面中，Fc 域域 (或包含所述 Fc 域的 (多特異性) 抗體) 基本上不與 Fc 受體結合及/或誘導效應子功能。在一較佳方面中，Fc 受體為 Fcγ 受體。在一個方面中，Fc 受體為人 Fc 受體。在一個方面中，Fc 受體為活化 Fc 受體。在一個具體方面中，Fc 受體為活化人 Fcγ 受體，更具體而言人 FcγRIIIa、FcγRI 或 FcγRIIa，最具體而言 FcγRIIIa。在一個方面中，效應子功能為選自 CDC、ADCC、ADCP 和細胞因子分泌之群組中的一種或多種。在一較佳方面中，效應子功能為 ADCC。在一個方面中，與天然 IgG
1Fc 域域相比，Fc 域域對新生 Fc 受體 (FcRn) 表現出基本類似的結合親和性。當 Fc 域 (或包含所述 Fc 域的 (多特異性) 抗體) 表現出大於約 70%、特定而言大於約 80%、更特定而言大於約 90% 的天然 IgG
1Fc 域 (或包含 IgG
1Fc 域的 (多特異性) 抗體) 對 FcRn 的結合親和性時，實現了與 FcRn 的基本上類似的結合。
在某些方面中，與非工程改造的 Fc 域相比，工程改造的 Fc 域對 Fc 受體具有降低的結合親和性及/或降低的效應子功能。在較佳方面中，(多特異性) 抗體之 Fc 域包含一個或多個胺基酸突變，其降低 Fc 域對 Fc 受體的結合親和性及/或效應子功能。通常，在 Fc 域之兩個次單元中的每個中都存在相同的一個或多個胺基酸突變。在一個方面中，胺基酸突變降低了 Fc 域與 Fc 受體的結合親和性。在一個方面中，胺基酸突變將 Fc 域與 Fc 受體的結合親和性降低至少 2 倍、至少 5 倍或至少 10 倍。在其中存在多於一個降低胺基酸對 Fc 受體的結合親和性的胺基酸突變的方面中，這些胺基酸突變的組合可使 Fc 域對 Fc 受體的結合親和性降低至少 10 倍、至少 20 倍或甚至至少 50 倍。在一個方面中，與包含非工程改造的 Fc 域之 (多特異性) 抗體相比，包含工程改造的 Fc 域之 (多特異性) 抗體表現出小於 20%、特定而言小於 10%、更特定而言小於 5% 的與 Fc 受體的結合親和性。在一較佳方面中，Fc 受體為 Fcγ 受體。在一些方面，Fc 受體為人 Fc 受體。在一些方面，Fc 受體為活化 Fc 受體。在一個具體方面中，Fc 受體為活化人 Fcγ 受體，更具體而言人 FcγRIIIa、FcγRI 或 FcγRIIa，最具體而言人 FcγRIIIa。較佳地，減少與這些受體中的每個之結合。在一些方面中，也降低了與補體組分的結合親和性，具體而言與 C1q 的結合親和性。在一個方面中，不降低與新生 Fc 受體 (FcRn) 之結合親和性。當 Fc 域 (或包含所述 Fc 域的 (多特異性) 抗體) 表現出大於約 70% 的非工程改造形式的 Fc 域 (或包含所述非工程改造形式的 Fc 域的 (多特異性) 抗體) 對 FcRn 之結合親和性時，實現了與 FcRn 基本上類似的結合，即 Fc 域對所述受體的結合親和性得以保持。Fc 域或包含所述 Fc 域的本發明之 (多特異性) 抗體可表現出大於約 80% 及甚至大於約 90% 的此等親和性。在某些方面中，與非工程改造的 Fc 域相比，(多特異性) 抗體之 Fc 域經工程改造以具有降低的效應子功能。降低的效應子功能可包括但不限於以下一種或多種：降低補體依賴性細胞毒性 (CDC)、降低抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)、降低抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP)、減少細胞激素分泌、減少抗原呈遞細胞的免疫複合體介導的抗原攝取、減少與 NK 細胞的結合、減少與巨噬細胞的結合、減少與單核細胞的結合、減少與多形核細胞的結合、減少直接傳訊誘導的細胞凋亡、減少標靶結合抗體的交聯、降低樹突狀細胞成熟度或減少 T 細胞引發。在一個方面中，降低的效應子功能選自降低的 CDC、降低的 ADCC、降低的 ADCP 和減少的細胞因子分泌之群組中的一種或多種。在一較佳方面中，降低的效應子功能為降低的 ADCC。在一個方面中，降低的 ADCC 小於非工程改造的 Fc 域 (或包含非工程改造的 Fc 域之 (多特異性) 抗體) 誘導的 ADCC 的 20%。
在一個方面中，降低 Fc 域與 Fc 受體的結合親和性及/或效應子功能的胺基酸突變為胺基酸取代。在一個方面中，Fc 域包含在選自 E233、L234、L235、N297、P331 和 P329 (根據 Kabat EU 指數編號) 的位置的胺基酸取代。在一個更具體之方面中，Fc 域包含在選自 L234、L235 和 P329 (根據 Kabat EU 指數編號) 的位置的胺基酸取代。在一些方面，Fc 域包含 L234A 和 L235A (根據 Kabat EU 索引編號) 的胺基酸取代。在一個此類方面中，Fc 域為 IgG
1Fc 域，特定而言人 IgG
1Fc 域。在一個方面中，Fc 域包含在位置 P329 的胺基酸取代。在一個更具體之方面中，胺基酸取代為 P329A 或 P329G，特定而言 P329G (根據 Kabat EU 指數編號)。在一個方面中，Fc 域包含在位置 P329 的胺基酸取代，以及在選自 E233、L234、L235、N297 和 P331 (根據 Kabat EU 指數編號) 的位置的另一個胺基酸取代。在一個更具體之方面中，該另一個胺基酸取代為 E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D 或 P331S。在較佳方面中，Fc 域包含在位置 P329、L234 和 L235 (根據 Kabat EU 指數編號) 的胺基酸取代。在更佳的方面中，Fc 域包含胺基酸突變 L234A、L235A 和 P329G (「P329G LALA」、「PGLALA」 或 「LALAPG」)。具體而言，在較佳方面，Fc 域之每個次單元包含胺基酸取代 L234A、L235A 和 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)，即在 Fc 域之第一次單元及第二次單元中的每個中，位置 234 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L234A)，位置 235 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L235A)，並且位置 329 的脯胺酸殘基被甘胺酸殘基取代 (P329G) (根據 Kabat EU 索引編號)。
在一個此類方面中，Fc 域為 IgG
1Fc 域，特定而言人 IgG
1Fc 域。胺基酸取代的「P329G LALA」組合幾乎完全消除了人 IgG
1Fc 域的 Fcγ 受體 (以及補體) 結合，如 PCT 公開號 WO 2012/130831 所述，其全文以引用方式併入本文。WO 2012/130831 還描述了用於製備此等突變 Fc 域的方法及確定其性質 (例如 Fc 受體結合或效應子功能) 的方法。
IgG
4抗體與 IgG
1抗體相比，表現出與 Fc 受體的降低的結合親和性和降低的效應子功能。因此，在一些方面中，本發明之 (多特異性) 抗體的 Fc 域為 IgG
4Fc 域，特定而言人 IgG
4Fc 域。在一個方面中，IgG
4Fc 域包含在位置 S228 的胺基酸取代，具體而言胺基酸取代 S228P (根據 Kabat EU 指數編號)。為進一步降低其與 Fc 受體的結合親和性及/或其效應子功能，在一個方面中，IgG
4Fc 域包含在位置 L235 的胺基酸取代，具體而言胺基酸取代 L235E (根據 Kabat EU 指數編號)。在另一個方面中，IgG
4Fc 域包含在位置 P329 的胺基酸取代，具體而言胺基酸取代 P329G (根據 Kabat EU 指數編號)。在一較佳方面中，IgG
4Fc 域包含在位置 S228、L235 和 P329 的胺基酸取代，具體而言胺基酸取代 S228P、L235E 和 P329G (根據 Kabat EU 指數編號)。此等 IgG
4Fc 域變異體及其 Fcγ 受體結合性質描述於 PCT 公開號 WO 2012/130831中，其全文以引用方式併入本文。
在一較佳方面中，與天然 IgG
1Fc 域相比，表現出降低的對 Fc 受體的結合親和性及/或降低的效應子功能的 Fc 域為包含胺基酸取代 L234A、L235A 及視情況存在的 P329G 的人 IgG
1Fc 域或包含胺基酸取代 S228P、L235E 及視情況存在的 P329G (根據 Kabat EU 指數編號) 的人 IgG
4Fc 域。
在某些方面中，已消除 Fc 域的 N-糖基化。在一個此類方面中，Fc 域包含在位置 N297 的胺基酸突變，特定而言天冬醯胺酸被丙胺酸取代 (N297A) 或被天冬胺酸取代 (N297D) 之胺基酸取代 (根據 Kabat EU 指數編號)。
除上文及 PCT 公開號 WO 2012/130831 中所述的 Fc 域以外，具有降低的 Fc 受體結合及/或效應子功能的 Fc 域也包括被 Fc 域殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 中的一個或多個取代的那些 (美國專利號 6,737,056) (根據 Kabat EU 索引編號)。此等 Fc 突變體包括具有在胺基酸位置 265、269、270、297 及 327 中的兩者或更多者處的取代之 Fc 突變體，包括所謂的「DANA」Fc 突變體，其中殘基 265 及 297 被丙胺酸取代 (美國專利號 7,332,581)。
可使用此領域中所公知遺傳或化學方法，透過胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備變異體 Fc 域。遺傳方法可包括編碼 DNA 序列的位點特異性誘變、PCR、基因合成等。可透過例如測序來驗證核苷酸變化是否正確。
與 Fc 受體之結合可易於透過 ELISA 確定，或透過表面電漿共振 (SPR) 使用標準儀器例如 BIAcore 儀器 (GE Healthcare) 進行確定，並且 Fc 受體可透過例如重組表現來獲得。可替代地，Fc 域或包含 Fc 域的 (多特異性) 抗體對 Fc 受體之結合親和性可使用已知表現特定 Fc 受體的細胞株 (例如表現 FcγIIIa 受體的人 NK 細胞) 進行評估。
Fc 域或包含 Fc 域的 (多特異性) 抗體的效應子功能可透過此領域中所公知的方法進行測定。用於評估目標分子之
ADCC 活性的體外分析方法的實例描述於例如：美國專利號 5,500,362；Hellstrom 等人，Proc Natl Acad Sci USA 83，7059-7063 (1986)；及 Hellstrom 等人，Proc Natl Acad Sci USA 82，1499-1502 (1985)；美國專利號 5,821,337；Bruggemann 等人，J Exp Med 166，1351-1361 (1987)。可替代地，可采用非放射性分析 (參見例如：用於流式細胞術的 ACTI™ 非放射性細胞毒性分析 (CellTechnology，Inc. Mountain View，CA)；及 CytoTox 96
®非放射性細胞毒性測定 (Promega，Madison，WI))。用於此等分析的有用的效應子細胞包括周邊血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。可替代地或另外地，可在例如 Clynes 等人在 Proc Natl Acad Sci USA 95，652-656
(1998) 中公開的動物模型中在體內評估目標分子之 ADCC 活性。
在一些方面中，減少 Fc 域與補體組分之結合，具體而言減少與 C1q 之結合。因此，在一些方面中，其中，Fc 域工程改造為具有降低的效應子功能，該降低的效應子功能包括降低的 CDC。可實施 C1q 結合分析以確定 Fc 域或包含 Fc 域的 (多特異性) 抗體能否結合 C1q 並因此具有 CDC 活性。參見例如 WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 結合 ELISA。為評估補體活化，可實施 CDC 測定 (參見例如：Gazzano-Santoro 等人，J Immunol Methods 202，163 (1996)；Cragg 等人，Blood 101，1045-1052 (2003)；及 Cragg 和 Glennie，Blood 103，2738-2743 (2004))。
FcRn
結合和體內清除率/半衰期測定也可使用此領域中所公知的方法進行 (參見例如 Petkova, S.B. 等人，
Int ’ l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929)。
B. 多核苷酸
本發明進一步提供一種編碼本發明抗體的經分離之多核苷酸。所述經分離之多核苷酸可以是單個多核苷酸或複數個多核苷酸。
編碼本發明之 (多特異性) 抗體的多核苷酸可表現為編碼整個抗體的單個多核苷酸或表現為共表現的多個 (例如兩個或更多個) 多核苷酸。共表現的由多核苷酸編碼的多肽可透過例如二硫鍵或其他方式締合以形成功能性抗體。例如，抗體的輕鏈部分可以由與包含抗體重鏈的抗體部分分開的多核苷酸進行編碼。當共表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽締合以形成抗體。在另一個實例中，包含兩個 Fc 域次單元之一和視情況存在的一個或多個 Fab 分子 (的一部分) 的抗體的部分可由與包含兩個 Fc 域次單元之另一個和視情況存在的 Fab 分子 (的一部分) 的抗體的部分分開的多核苷酸進行編碼。當共表現時，Fc 域次單元將締合以形成 Fc 域。
在一些方面中，經分離之多核苷酸編碼根據本發明的整個抗體分子，如本文所述。在其他方面中，經分離之多核苷酸編碼根據本發明之抗體中包含的多肽，如本文所述。
於某些方面中，多核苷酸或核酸為 DNA。在其他方面中，本發明之多核苷酸為 RNA，例如，呈信使 RNA (mRNA) 的形式。本發明之 RNA 可以為單鏈或雙鏈 RNA。
C. 重組方法
可透過固態肽合成 (例如 Merrifield 固相合成) 或重組生產獲得本發明之抗體。在重組生產時，將例如如上所述之編碼抗體之一個或多個多核苷酸分離並插入一個或多個載體中，以在宿主細胞中進一步克隆及/或表達。此等多核苷酸可易於使用習知方法進行分離和定序。在一個方面中，提供了一種包含本發明之多核苷酸 (即單個多核苷酸或複數個多核苷酸) 的載體，特定而言表現載體。可使用本領域的技術人員所公知的方法來構建包含抗體的編碼序列以及適當的轉錄/轉譯控制信號的表現載體。這些方法包括體外重組
DNA 技術、合成技術及體內重組/基因重組。參見例如以下文獻中所述之技術：Maniatis 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)；及 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y (1989)。表現載體可以為質體、病毒的一部分，也可以為核酸片段。表現載體包括表達盒，其中將編碼抗體 (即編碼區) 的多核苷酸與啟動子及/或其他轉錄或轉翻控制元件可操縱地締合以進行克隆。如本文所用的「編碼區」，為由轉譯成胺基酸的密碼子組成的核酸的一部分。儘管 「終止密碼子」 (TAG、TGA 或 TAA) 不轉譯成胺基酸，但可以將其視為編碼區的一部分 (如果存在)，但是任何側翼序列 (例如啟動子、核醣體結合位點、轉錄終止子、內含子、5’ 和 3’ 非轉譯區等) 不屬於編碼區的一部分。兩個或更多個編碼區可存在於單個多核苷酸構建體中，例如，存在於單個載體上，或存在於單獨的多核苷酸構建體中，例如，存在於單獨的 (不同的) 載體上。此外，任何載體可包含單個編碼區，或可包含兩個或更多個編碼區，例如，本發明之載體可編碼一個或多個多肽，該多肽經由蛋白水解後轉譯或共轉譯分離成最終蛋白。另外，本發明之載體、多核苷酸或核酸可編碼異源編碼區，其與編碼本發明之抗體的多核苷酸或其變體或衍生物融合或不融合。異源編碼區包括但不限於專門的元件或模體 (諸如分泌訊息肽) 或異源性功能域。可操作的締合是指基因產物的編碼區 (例如，多肽) 與一個或多個調控序列締合，從而使基因產物的表現處於調控序列的影響或控制之下。如果啟動子功能的誘導導致編碼所需基因產物的 mRNA 轉錄，並且兩個 DNA 片段之間的連接子性質不干擾表現調控序列指導基因產物表現的能力，也不干擾 DNA 模板被轉錄的能力，則兩個 DNA 片段 (例如多肽編碼區以及與之相締合的啟動子) 「可操縱地締合」。因此，如果啟動子能夠影響核酸的轉錄，則該啟動子區將與編碼多肽的核酸可操縱地締合。啟動子可以為細胞特異性啟動子，其僅指導預定細胞中 DNA 的大量轉錄。除啟動子外，其他轉錄控制元件，例如增強子、操縱子、抑制子和轉錄終止信號，可與多核苷酸可操縱地締合以指導細胞特異性轉錄。本文公開了合適的啟動子及其他轉錄控制區。各種轉錄控制區為本領域的技術人員所公知的。此等區域包括 (但不限於) 在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，例如 (但不限於) 啟動子及增強子區段，其來自巨細胞病毒 (例如即刻早期啟動子，連同內含子 A)、猿猴病毒 40 (例如早期啟動子) 及反轉錄病毒 (例如勞斯肉瘤病毒 (Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因的那些，例如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素和兔 β-珠蛋白以及能夠控制真核細胞中基因表達的其他序列。其他合適的轉錄控制區包括組織特異性啟動子和增強子以及誘導型啟動子 (例如四環素誘導的啟動子)。類似地，各種轉譯控制元件為本領域的普通技術人員所公知的。其中包括但不限於核醣體結合位點、轉譯起始和終止密碼子以及來源於病毒體系的元件 (特定而言內部核醣體進入位點或 IRES，也稱為 CITE 序列)。表現卡匣還可包含其他特徵，例如複製起點及/或染色體整合元件，例如反轉錄病毒長末端重複序列 (LTR) 或腺相關病毒 (AAV) 反向末端重複序列 (ITR)。
本發明之多核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌或訊息肽的其他編碼區締合，該分泌或訊息肽指導由本發明之多核苷酸編碼的多肽的分泌。例如，如果需要分泌抗體，則可將編碼信號序列的 DNA 置於編碼本發明之抗體或其片段的核酸的上游。根據訊息假說，哺乳動物細胞所分泌之蛋白質具有訊息肽或分泌前導序列，其在增長的蛋白質鏈透過粗內質網輸出時從成熟蛋白質上裂解下來。本領域的普通技術人員將認識到，脊椎動物細胞所分泌之多肽通常具有與多肽之 N 端融合的信號肽，其從轉譯後的多肽上裂解下來以產生分泌或「成熟」形式的多肽。在某些方面中，使用天然信號肽
，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽或該序列的功能性衍生物，該功能性衍生物保留指導與之可操縱地締合的分泌的能力。可替代地，可使用異源性哺乳動物訊息肽或其功能性衍生物。例如，野生型前導序列可被人組織胞漿素原活化物 (TPA) 或小鼠 β-葡萄醣醛酸苷酶的前導序列取代。
編碼可用於促進以後的純化 (例如組胺酸標籤) 或輔助標記抗體的短蛋白質序列的 DNA 可包括在編碼多核苷酸的抗體 (片段) 的內部或末端。
在另一個方面中，提供了一種包含本發明之多核苷酸 (即單個多核苷酸或複數個多核苷酸) 的宿主細胞。在某些方面中，提供了包含本發明之載體的宿主細胞。多核苷酸和載體可分別單獨或組合結合本文中相對於多核苷酸和載體所述的任何特徵。在一個此類方面中，宿主細胞包含一個或多個載體 (例如已被其轉化或轉染)，該載體包含個或多個編碼本發明之抗體 (的一部分) 的多核苷酸。如本文所用的術語「宿主細胞」，係指可被工程改造以產生本發明之抗體或其片段的任何類型的細胞體系。適於複製並支持抗體之表現的宿主細胞為此領域中所公知。可在適當情況下用特定的表現載體轉染或轉導此等細胞，並且可生長大量包含載體的細胞以接種大規模發酵劑，獲得足夠量的抗體以用於臨床應用。合適的宿主細胞包括原核微生物
(諸如大腸桿菌) 或各種真核細胞 (諸如中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)、昆蟲細胞等)。例如，多肽可能在細菌中產生，特定而言在無需醣基化的情況下。在表現後，多肽可與細菌細胞糊中的可溶性部分分離，並可經過進一步純化。除原核生物以外，真核微生物 (如絲狀真菌或酵母菌) 也為合適的多肽編碼載體的選殖或表現宿主，包括其醣基化途徑已被「人源化」的真菌和酵母菌株，從而導致具有部分或完全人醣基化模式的多肽的產生。參見：Gerngross，Nat Biotech 22，1409-1414 (2004)；及 Li 等人，Nat Biotech 24，210-215 (2006)。用於表現 (醣基化) 多肽的合適的宿主細胞也來源於多細胞生物 (無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出許多桿狀病毒毒株，其可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地貪夜蛾 (
Spodoptera frugiperda) 細胞。植物細胞培養物亦可以用作宿主。參見例如，美國專利號 5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978 及 6,417,429 (描述在基因轉殖植物中生產抗體的 PLANTIBODIES
TM技術)。脊椎動物細胞也可用作宿主。例如，可使用適於在懸液中生長的哺乳動物細胞株。可用的哺乳動物宿主細胞株的其他實例包括：由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 系；人胚胎腎系 (如 Graham 等人，J Gen Virol 36，59 (1977) 中所述之 293 或 293T 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (如 Mather，Biol Reprod 23，243-251 (1980) 中所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如 Mather 等人，Annals N.Y.Acad Sci 383，44-68 (1982) 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 dhfr
-CHO 細胞 (Urlaub 等人，Proc Natl Acad Sci USA 77，4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，例如 YO、NS0、P3X63 和 Sp2/0。有關某些適用於蛋白質生產的哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如：Yazaki 和 Wu，Methods in Molecular Biology，Vol. 248 (B.K.C. Lo 主編，Humana Press，Totowa, NJ)，pp. 255-268 (2003)。宿主細胞包括培養的細胞，例如哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞和植物細胞等，還包括轉基因動物、轉基因植物或培養的植物或動物組織內的細胞。在一個方面中，宿主細胞為真核細胞，特定而言哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞、人胚腎 (HEK) 細胞或淋巴樣細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。在一個方面中，宿主細胞不是人體內的細胞。
標準技術為此領域中所公知，可在這些系統中表現外源基因。可對表現包含抗原結合域 (例如抗體) 的重鏈或輕鏈的多肽的細胞進行工程改造，使其也表現其他抗體鏈，從而使表現的產物為兼有重鏈和輕鏈的抗體。
在一個方面，提供了一種生產根據本發明之抗體的方法，其中該方法包括在適合於抗體表現的條件下培養包含如本文所述之編碼抗體的多核苷酸的宿主細胞，並視情況從宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 中回收該抗體。
本發明之 (多特異性) 抗體的組分可彼此基因融合。(多特異性) 抗體可設計為使其組分直接彼此融合或透過連接子序列間接融合。可根據此領域中所公知的方法確定連接子的組成和長度，並可以對其效力進行測試。本文提供了介於 (多特異性) 抗體的不同組分之間的連接子序列之實例。如果需要，還可以包括附加的序列以併入切割位點，以分離融合體的各種組分，例如內肽酶識別序列。
按照本文所述之方法製備的抗體可透過本領域中已知的技術進行純化，諸如高效能液相層析法、離子交換層析法、凝膠電泳、親和層析法、粒徑篩析層析法等。用於純化特定蛋白質之實際條件將部分取決於淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且對本領域的技術人員而言為顯而易見的。對於親和層析法純化，可使用抗體、配體、受體或抗原以結合抗體。例如，對於本發明之抗體的親和層析法純化，可使用具有蛋白質 A 或蛋白質 G 的基體。可使用順序 Protein A 或 G 親和層析法和粒徑篩析層析法分離基本上如實例中所述之抗體。抗體的純度可透過多種熟知的分析方法 (包括凝膠電泳法、高壓液相層析法等) 中的任一種進行測定。
D. 分析
可用此領域中所公知的各種分析法對本文所提供之抗體的物理/化學性質及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。
1. 結合分析
抗體與 Fc 受體或靶標抗原之結合 (親和性) 可藉由表面電漿共振 (SPR)，使用諸如 BIAcore 儀器 (GE Healthcare) 之標準儀器和受體或標靶蛋白質 (諸如可藉由重組表現獲得的那些) 進行測定。可替代地，可使用表現特定受體或靶標抗原的細胞株 (例如通過流式細胞術 (FACS)) 評估抗體與不同受體或靶標抗原的結合。下面描述了用於量測對 CD3 之結合活性的具體的說明性和例示性方面。
在一個方面中，與 CD3 之結合活性藉由 SPR 進行測定，如下所述：
SPR 在Biacore T200 儀器 (GE Healthcare)上進行。抗 Fab 捕獲抗體 (GE Healthcare, #28958325) 使用標準胺偶合化學以 4000 – 6000 個共振單位 (RU) 之表面密度固定在 Series S Sensor Chip CM5 (GE Healthcare) 上。使用 HBS-P+ (10 mM HEPES，150 mM NaCl pH 7.4，0.05% 界面活性劑 P20) 作為運行及稀釋緩衝液。濃度為 2 µg/ml (在 20 mM His、140 mM NaCl、pH 6.0 中) 之 CD3 抗體以 5 μl/分 之流速注射約 60 秒。所用 CD3 抗原為 CD3 δ 及 CD3 ε 胞外域之異二聚體，該等胞外域與具有杵-臼修飾及 C 端 Avi-標籤的人 Fc 域 (參見 SEQ ID NO: 24 及 25) 融合。將濃度為 10 μg/ml 之 CD3 抗原注射 120 秒，且以 5 μl/分 之流速監測解離約 120 秒。藉由連續兩次注射 pH 2.1 的 10 mM 甘胺酸，每次注射約 60 秒，使晶片表面再生。藉由扣除空白注射且藉由扣除自空白對照流通池獲得之反應，校正本體折射率差。為了評估，在注射結束後 5 秒進行結合反應。為了使結合訊號標準化，將 CD3 結合除以抗 Fab 反應 (在固定化抗 Fab 抗體上捕獲 CD3 抗體後獲得之訊號 (RU))。特定處理後 CD3 對抗體之結合活性，相對於不同處理後 CD3 對抗體之結合活性 (亦稱為相對活性濃度(RAC)) 係藉由參考特定處理後的抗體樣品之結合活性至不同處理後的相應抗體樣品之結合活性來計算。
2. 活性測定
本發明之 (多特異性) 抗體的生物活性可藉由如實例中所述的各種分析法來量測。生物活性可例如包括誘導 T 細胞的增殖、誘導 T 細胞中的信號傳導、誘導 T 細胞中活化標志物的表現、誘導 T 細胞分泌細胞介素、誘導標靶細胞 (諸如癌症細胞) 裂解及誘導腫瘤消退及/或改善存活率。
E. 組成物、配方和給藥途徑
在又一方面中，本發明提供了包含本文所提供之任何抗體的藥學組成物，例如用於以下任何治療方法。在一個方面中，藥學組成物包含根據本發明之抗體和藥學上可接受之載劑。在另一方面中，藥學組成物包含根據本發明之抗體及至少一種例如如下文所述的額外治療劑。
還提供了一種以適合於體內給藥的形式產生本發明之抗體的方法，該方法包括
(a)
獲得根據本發明之抗體，及 (b) 與至少一種藥學上可接受之載劑一起配製抗體，從而配製用於體內給藥之抗體的製劑。
本發明之藥學組成物包含有效量的溶於或分散於藥學上可接受之載劑中之抗體。短語「藥學上可接受」係指在採用的劑量和濃度下通常對受體無毒的分子實體和組成物，即在給予動物 (例如人) 時不產生不利的、過敏或其他不良反應 (在適當情況下)。根據本揭露，本領域技術人員將認識到包含抗體及視情況存在的額外活性成分的藥學組成物的製備方法，如 Remington's Pharmaceutical Sciences 第 18 版 (Mack Printing Company，1990) 所例示，該文獻以引用方式併入本文中。此外，對於動物 (例如，人) 給藥，應當理解，製劑應符合 FDA 生物製品標準辦公室或其他國家/地區的有關部門所要求的無菌性、熱原性、一般安全性和純度標準。優選的組成物為凍乾製劑或水溶液。如本文所使用的「藥學上可接受之載劑」，包括任何及所有溶劑、緩衝液、分散介質、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑 (例如抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、抗氧化劑、蛋白質、藥物、藥物穩定劑、聚合物、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料，諸如本技術領域具有通常知識者已知的材料及其組合 (參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第
18 版，Mack Printing Company，1990，pp. 1289-1329，該文獻以引用方式併入本文)。除非任何習知載劑與活性成分不相容，否則考慮其在藥學組成物中的用途。
本發明之抗體 (及任何其他治療劑) 可透過任何合適的方式給藥，包括腸胃外、肺內和鼻內給藥，並且如果需要局部治療，則可以採用病灶內給藥。腸胃道外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。給藥可透過任何合適的途徑進行，例如透過注射，例如靜脈內或皮下注射，部分取決於短暫投予還是長期投予。
腸胃外組成物包括那些設計用於注射投予的組成物，例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹腔內注射。對於注射，可在水溶液中 (特定而言在生理相容性緩衝液中，諸如 Hanks 溶液、Ringer 溶液或生理鹽水緩衝液) 配製本發明之抗體。該溶液可包含配製劑，例如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。可替代地，抗體可以呈粉末形式，以便在使用前與合適的載劑 (例如無菌無熱原水) 一起配製。藉由將所需量的本發明之抗體併入適當的溶劑以及所需的以下枚舉之多種其他成分中來製備無菌注射溶液。無菌性可易於例如藉由無菌濾膜過濾來實現。通常，藉由將各種滅菌後的活性成分併入含有基本分散介質及/或其他成分的無菌載劑中來製備分散液。對於用於製備無菌注射液、混懸劑或乳劑的無菌粉末，優選的製備方法是真空乾燥或冷凍乾燥技術，該技術可從先前過濾後的無菌液體介質中得到活性成分與任何其他所需成分的粉末。如有必要，應適當緩衝液體介質，並且在注射足夠的鹽水或葡萄糖之前先使液體稀釋劑等滲。組成物必須在製造和儲存條件下保持穩定，並且必須能夠抵抗諸如細菌和真菌等微生物的污染作用。應當理解，內毒素污染應最小限度地保持在安全濃度，例如，小於 0.5 ng/mg 蛋白質。合適的藥學上可接受之載劑包括但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑 (例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨；芐索銨氯化物；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量 (小於約 10 個殘基) 多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑 (例如 EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物 (例如鋅蛋白錯合物)；及/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇 (PEG)。水性注射懸液可包含提高混懸劑黏度的化合物，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、右旋葡萄聚糖等。視情況，懸液還可包含合適的穩定劑或提高化合物溶解度的試劑，以製備高濃度溶液。另外，可將活性化合物的懸液製備為合適的油性注射懸液。合適的親脂性溶劑或載劑包括脂肪油 (例如芝麻油) 或合成脂肪酸酯 (例如油酸乙酯或甘油三酯) 或脂質體。
活性成分可以包載在例如透過凝聚技術或透過介面聚合製備的微囊 (例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、膠體藥物遞送系統 (例如脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米顆粒和奈米囊 (nanocapsule)) 中或粗滴乳狀液中。此等技術公開於 Remington’s Pharmaceutical Sciences (第 18 版，Mack Printing Company，1990) 中。可以製備緩釋製劑。緩釋製劑的適宜的實例包括含有多肽的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質是成形物品的形式，例如膜或微囊。在特定方面中，可以藉由在組成物中使用延遲吸收的物質 (例如單硬脂酸鋁、明膠或其組合) 來產生可注射組成物的延長吸收。
除先前描述的組成物外，抗體還可以配製為儲存製劑。此等長效製劑可以透過植入 (例如皮下或肌內) 或透過肌內注射投予。因此，例如，抗體可以用適宜的聚合物質或疏水物質 (例如作為可用油中的乳狀液) 或離子交換樹脂配製，或配製為微溶的衍生物，例如配製為微溶的鹽類。
包含本發明之抗體的藥學組成物可以利用習用的混合、溶解、乳化、包膜、誘捕或凍乾方法來製備。可使用一種或多種有助於將蛋白質加工成可藥用製劑的生理上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑以習用方式配製藥學組成物。適宜的製劑視所選的給藥途徑而定。
抗體可以以游離酸或鹼、中性或鹽形式配製成組成物。藥學上可接受之鹽為基本上保持游離酸或鹼的生物活性的鹽類。這些包括酸加成鹽，例如與蛋白質組成物的游離氨基形成的那些，或與無機酸 (例如，鹽酸或磷酸) 或有機酸 (諸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸) 形成的那些。與游離羧基形成的鹽類還可以衍生自：無機鹼，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因。藥用鹽趨向於比對應的游離鹼形式更易溶於水性溶劑和其他質子性溶劑。
F. 治療方法和組成物
本文提供之任何抗體均可用於治療方法中。本發明之抗體可以用為免疫治療劑，例如用於癌症或自體免疫疾病的治療中。
為了在治療方法中使用，本發明之抗體將以符合良好醫療實踐的方式予以配製、給藥和施用。在此情況中考量的因素包括待治療的特定疾病、待治療的特定哺乳動物、個別患者的臨床狀況、疾病原因、遞送藥劑的部位、投予方法、投予日程及醫療從業人員已知的其他因素。
在一個方面中，提供了用作藥劑的本發明之抗體。在另一方面中，提供了用於治療疾病的本發明之抗體。在某些方面中，提供了用於治療方法中的本發明之抗體。在一個方面中，本發明提供了一種用於治療有需要的個體之疾病的本發明之抗體。在某些方面中，本發明提供了一種用於治療患有癌症之個體的方法中的抗體，該方法包含向該個體施用有效量之抗體。在某些方面，該疾病為增生性疾病。在某些方面中，該疾病為癌症，特定而言表現 PLAP 之癌症。在一具體方面中，該癌症為卵巢癌、肺癌或胃腸道癌 (例如胃癌、結腸癌、胰臟癌或食道癌)。在另一具體方面中，該癌症為選自由以下項所組成群組的癌症：卵巢癌、肺癌、胃癌、大腸直腸癌、胰臟癌及食管癌。在某些方面，該方法進一步包含向該受試者投予有效量之至少一種另外的治療劑，例如抗癌劑 (如果該待治療的疾病為癌症) 或免疫抑制劑 (如果該待治療的疾病為自體免疫疾病)。在另一方面中，本發明提供了一種用於誘導標靶細胞，特定而言癌症細胞裂解的抗體。在某些方面中，本發明提供了一種用於誘導個體中之標靶細胞、特定而言癌症細胞裂解之方法中的本發明之抗體，該方法包含對個體投予有效量之抗體以誘導標靶細胞裂解。根據上述任一方面中之「受試者」為哺乳動物，較佳地為人。
在另一方面中，本發明提供了本發明之抗體在用於製造或製備藥劑中之用途。在一個方面中，藥劑用於治療有需要之受試者的疾病。在另一方面中，藥劑用於治療疾病的方法中，該方法包含向患有疾病的個體施用治療有效量之藥劑。在某些方面，該疾病為增生性疾病。在某些方面中，該疾病為癌症，特定而言表現 PLAP 之癌症。在一具體方面中，該癌症為卵巢癌、肺癌或胃腸道癌 (例如胃癌、結腸癌、胰臟癌或食道癌)。在另一具體方面中，該癌症為選自由以下項所組成群組的癌症：卵巢癌、肺癌、胃癌、大腸直腸癌、胰臟癌及食管癌。在一個方面，該方法進一步包含向該受試者投予有效量之至少一種另外的治療劑，例如抗癌劑 (如果待治療的疾病為癌症) 或免疫抑制劑 (如果該待治療的疾病為自體免疫疾病)。在再一方面中，藥劑用於誘導標靶細胞、特定而言癌症細胞裂解。在又一方面中，藥劑用於誘導個體中之標靶細胞、特定而言癌症細胞裂解之方法中，該方法包含對個體投予有效量之藥劑以誘導標靶細胞裂解。根據上述任一方面之「個體」可為哺乳動物，較佳地為人。
本發明之另一方面提供了一種治療疾病的方法。在一個方面中，該方法包括向患有此類疾病的個體施用治療有效量的本發明之抗體。在一個方面中，向該受試者投予包含本發明之抗體的呈醫藥上可接受之形式的組成物。在某些方面，該疾病為增生性疾病。在某些方面中，該疾病為癌症，特定而言表現 PLAP 之癌症。在一具體方面中，該癌症為卵巢癌、肺癌或胃腸道癌 (例如胃癌、結腸癌、胰臟癌或食道癌)。在另一具體方面中，該癌症為選自由以下項所組成群組的癌症：卵巢癌、肺癌、胃癌、大腸直腸癌、胰臟癌及食管癌。在某些方面，該方法進一步包含向該受試者投予有效量之至少一種另外的治療劑，例如抗癌劑 (如果該待治療的疾病為癌症) 或免疫抑制劑 (如果該待治療的疾病為自體免疫疾病)。根據上述任一方面之「個體」可為哺乳動物，較佳地為人。
本發明之另一方面中提供了一種誘導標靶細胞，特定而言表現 PLAP 之細胞裂解之方法。在一個方面中，該方法包含在 T 細胞、特定而言細胞毒性 T 細胞的存在下，使標靶細胞與本發明之抗體接觸。在再一方面中，提供了一種誘導個體中之標靶細胞、特定而言表現 PLAP 之細胞裂解之方法。在一個此類方面中，該方法包括對個體施用有效量的本發明之抗體以誘導標靶細胞裂解。在一個方面中，「個體」為人。
熟練的技術人員容易地認識到，在許多情況下，該抗體可能無法提供治愈，而只能提供部分益處。在一些方面中，還認為具有某種益處的生理變化在治療上有益。因此，在一些方面中，提供生理變化的抗體量被認為是「有效量」。需要治療的受試者、患者或個體通常為哺乳動物，更具體而言人。
在一些方面中，對個體施用有效量的本發明之抗體以治療疾病。
對於疾病的預防或治療，本發明之抗體的適當劑量 (單獨使用或與一種或多種其他治療劑組合使用) 將取決於待治療的疾病的類型、給藥途徑、患者體重、抗體類型、疾病的嚴重度和病程、為了預防或是治療的目的施用該抗體、之前的或同時進行的治療干預、患者的臨床病史和對該抗體的反應以及主治醫師的判斷。在任何情況下，負責給藥的從業者將確定組成物中一種或多種活性成分的濃度以及單個受試者的合適劑量。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次投予、快速注射投予和脈衝輸注。
在一次或一系列的治療中適宜地對患者投予抗體。根據疾病的類型和嚴重程度不同，約 1 µg/kg 至 15 mg/kg (例如 0.1 mg/kg – 10 mg/kg) 的抗體可為例如透過一次或多次分開的施用或透過連續輸注來對患者施用的初始候選劑量。根據上述因素，一種典型的日劑量可在約 1 µg/kg 至 100 mg/kg 或更多的範圍內。對於在幾天或更長時間內重複給藥，視病症而定，治療通常將持續直至出現所需的疾病症狀抑制。抗體的一種例示性劑量將在從 0.005 mg/kg 至約 10 mg/kg 的範圍內。在其他非限制性實例中，劑量還可以包含每次施用從約 1 μg/kg體重、約 5 μg/kg體重、約 10 μg/kg體重、約 50 μg/kg體重、約 100 μg/kg體重、約 200 μg/kg體重、約 350 μg/kg體重、約 500 μg/kg體重、約 1 mg/kg體重、約 5 mg/kg體重、約 10 mg/kg體重、約 50 mg/kg體重、約 100 mg/kg體重、約 200 mg/kg體重、約 350 mg/kg體重、約 500 mg/kg體重至約 1000 mg/kg體重或更多及可從其衍生的任意範圍。在從本文中所列的數字衍生的範圍的非限制性實例中，可基於上述數字施用約 5 mg/kg體重至約 100 mg/kg體重、約 5 μg/kg體重至約 500 mg/kg體重範圍內的劑量。因此，可以對患者施用約 0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg 或 10 mg/kg 中的一種或多種劑量 (或其任意組合)。此等劑量可以間歇施用，例如每週或每三週施用 (例如，使得患者接受約 2 種至約 20 種或例如約 6 種劑量的抗體)。可以施用初始較高的負荷劑量，然後施用一種或多種較低的劑量。但是，可以使用其他劑量方案。藉由習用技術和測定很容易監測此治療的進展。
本發明之抗體通常將以能夠達到預期目的量使用。為用於治療或預防疾病病症，以有效量施用或應用本發明之抗體或其藥學組成物。
對於全身投予
，最初可以從諸如細胞培養物測定的
體外測定估計有效劑量。然後可以在動物模型中製定劑量，以達到包括細胞培養物中確定的 IC
50在內的循環濃度範圍。此等資訊可用於更準確地確定對人體有用的劑量。
也可以使用本技術領域中熟知的技術，根據
體內資料 (
例如動物模型)
估計初始劑量。
可以單獨調節劑量和間隔來提供足以維持治療效果的抗體的血漿濃度。透過注射投予的常見患者劑量在約 0.1-50 mg/kg/天的範圍內，典型範圍為 0.5-1 mg/kg/天。可以透過每天投予多種劑量來達到治療有效的血漿含量。血漿中含量可以例如透過 HPLC 來測量。
有效劑量的本發明抗體通常將提供治療益處而不會引起實質性毒性。可透過標準藥學方法在細胞培養物或實驗動物中測定抗體的毒性和治療有效性。可以用細胞培養物測定和動物研究來測定 LD
50(致死群體的 50% 的劑量) 和 ED
50(在群體的 50% 中治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數，其可以表示為比值 LD
50/ED
50。表現出大治療指數的抗體是較佳的。在一個方面中，根據本發明之抗體表現出高治療指數。從細胞培養測定法和動物研究中得到的數據可用於配製適用於人類的一系列劑量。劑量較佳地在包括很小毒性或無毒性的 ED
50的循環濃度範圍內。劑量可根據多種因素 (例如所採用的劑型、所利用的給藥途徑、受試者的狀況等) 在此範圍內變化。精確的製劑、給藥途徑和劑量可以由個別醫師基於患者的病症來選擇 (參見例如 Fingl 等人，1975，在：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第 1 章第 1 頁，該文獻全文以引用方式併入本文)。
用本發明之抗體治療的患者的主治醫師將指導如何及何時由於毒性、器官功能障礙等而終止、中斷或調整施用。相反，主治醫師還將知道在臨床反應不充分 (排除毒性) 時如何將治療調整至更高的水平。在目標疾病的治療中，給藥劑量的大小將隨待治療疾病的嚴重程度、給藥途徑等而變化。病症的嚴重程度可部分地透過例如標準預後評價法來評價。此外，劑量以及可能的給藥頻率也將根據個體患者的年齡、體重和反應而變化。
本發明之抗體可以在治療中與一種或多種其他藥物聯合施用。例如，本發明之抗體可以與至少一種其他治療劑聯合施用。術語「治療劑」涵蓋為治療需要此等治療的個體中的症狀或疾病而施用的任何藥劑。此等另外的治療劑可包含適合於所治療的特定疾病的任何活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。在某些方面中，該另外的治療劑為免疫調節劑、細胞生長抑製劑、細胞黏附抑製劑、細胞毒性劑、細胞凋亡啟動劑或增加細胞對凋亡誘導劑敏感性的藥劑。在某些方面，該另外的治療劑為抗癌症劑，例如微管破壞劑、抗代謝藥、拓撲異構酶抑制劑、DNA 嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡啟動劑或抗血管新生劑。在其他方面中，該另外的治療劑為免疫抑制劑。在具體方面，另外的治療劑為選自下組之一者或多者：皮質類固醇、羥氯喹、黴酚酸酯、黴酚酸、胺甲喋呤、硫唑嘌呤、環磷醯胺、鈣調神經磷酸酶抑制劑、貝立單抗 (belimumab)、利妥昔單抗 (rituximab) 及奧比妥珠單抗 (obinutuzumab)。
此等其他藥物適宜地以對預期目的有效的量組合存在。此等其他藥劑的有效量取決於所使用的抗體量、病症或治療的類型以及上文討論的其他因素。該等抗體通常以與本文中所述相同的劑量和給藥途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任意劑量和透過任意途徑使用。
上面提到的此等聯合療法涵蓋聯合施用 (其中兩種或多種治療劑包含在同一或單獨的組成物中)，以及單獨施用，在這種情況下，本發明之抗體的施用可在施用附加的治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後發生。本發明之抗體還可以與放射療法聯合使用。
G. 製成品
本發明的另一方面中提供包含能夠有效治療、預防及/或診斷上述疾病材料的製成品。製成品包括容器及容器上或與容器相關的標籤或包裝說明書。合適的容器包括例如，瓶、小瓶、注射器、IV 溶液袋等。該等容器可以由多種材料例如，玻璃或塑膠形成。該容器可容納組成物，該組成物本身或與有效治療、預防及/或診斷疾病的另一組成物結合使用，並可具有無菌入口 (例如，容器可為具有可透過皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈內溶液袋或小管)。組成物中的至少一種活性劑為本發明之抗體。標籤或藥品仿單指示該組成物用於治療所選擇的疾病。此外，該製品可以包括 (a) 其中包含有組成物的第一容器，其中，該組成物包含本發明之抗體；及 (b) 其中包含有組成物的第二容器，其中，組成物包含其他細胞毒性或其他治療劑。本發明之此方面中的製成品可以進一步包含指示組成物可以用於治療具體疾病的藥品仿單。可替代地或另外地，製成品可以進一步包含第二 (或第三) 容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝劑，例如抑菌注射用水 (BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、Ringer 溶液和葡萄糖溶液。從商業和使用者的角度來看，它可以進一步包含其他材料，其中包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。
H. 用於診斷和偵測之方法及組成物
在某些方面中，本文提供的任何抗體均可用於檢測生物樣品中是否存在其標靶 (例如 CD3 或 PLAP)。如本文所用的術語「偵測」，涵蓋定量或定性偵測。在某些方面中，生物樣品包含細胞或組織，諸如前列腺組織。
在一個方面中，提供了一種用於診斷或檢測方法中的根據本發明之抗體。在再一方面中，提供了一種檢測生物樣品中是否存在 CD3 或 PLAP 之方法。在某些方面中，該方法包含：在允許抗體與 CD3 或 PLAP 結合的條件下，使生物樣品與本發明之抗體接觸，及檢測抗體與 CD3 或 PLAP 之間是否形成複合體。此等方法可為體外或體內方法
。在一個方面中，使用本發明之抗體來選擇適合使用與 CD3 及/或 PLAP 結合之抗體進行治療的個體，例如其中 CD3 及/或 PLAP 為用於選擇患者的生物標記物。
可使用本發明之抗體診斷的例示性疾病包括癌症，具體而言表現 PLAP 之癌症。
在某些方面中，提供了根據本發明的抗體，其中，該抗體被標記。標記包括但不限於直接檢測的標記或部分 (例如螢光、髮色、電子緻密、化學發光和放射性標記)，以及間接檢測 (例如，透過酶促反應或分子相互作用) 的部分，例如酶或配體。例示性標記包括但不限於：放射性同位素
32P、
14C、
125I、
3H 及
131I；螢光團，例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；玫瑰紅及其衍生物；丹磺醯基；繖形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶 (美國專利號 4,737,456)；螢光素；2,3-二氫鄰苯二甲二酮；辣根過氧化物酶 (HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖 6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與採用過氧化氫氧化染料前體 (例如 HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶) 的酶結合使用；生物素/抗生物素蛋白；旋轉標記；噬菌體標記；穩定自由基等。
III. 序列
IV. 實例
| 胺基酸序列 | SEQ ID NO | |
| CD3 原始HCDR1 | TYAMN | 1 |
| P035.093 / CD3 優化HCDR1 | SYAMN | 2 |
| P035.093 / CD3 原始/ CD3 優化HCDR2 | RIRSKYNNYATYYADSVKG | 3 |
| CD3 原始HCDR3 | HGNFGNSYVSWFAY | 4 |
| CD3 優化HCDR3 | HTTFPSSYVSYYGY | 5 |
| P035.093 HCDR3 | ASNFPASYVSYFAY | 6 |
| CD3 原始VH | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS | 7 |
| CD3 優化VH | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGTLVTVSS | 8 |
| P035.093 VH | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRASNFPASYVSYFAYWGQGTLVTVSS | 9 |
| P035.093 / CD3 原始/ CD3 優化LCDR1 | GSSTGAVTTSNYAN | 10 |
| P035.093 / CD3 原始/ CD3 優化LCDR2 | GTNKRAP | 11 |
| P035.093 / CD3 原始/ CD3 優化LCDR3 | ALWYSNLWV | 12 |
| P035.093 / CD3 原始/ CD3 優化VL | QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL | 13 |
| TYRP-1 VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYFLHWVRQAPGQGLEWMGWINPDNGNTVYAQKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRRDYTYEKAALDYWGQGTLVTVSS | 14 |
| TYRP-1 VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIYNYLAWYQQKPGKVPKLLIYDAKTLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHFWSLPFTFGQGTKLEIK | 15 |
| P035.093 VH-CL | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRASNFPASYVSYFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 16 |
| CD3 原始VH-CL | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 17 |
| CD3 優化VH-CL | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 18 |
| TYRP-1 VH-CH1(EE) – P035.093/CD3 原始/CD3 優化VL-CH1 – Fc (杵，PGLALA) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYFLHWVRQAPGQGLEWMGWINPDNGNTVYAQKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRRDYTYEKAALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 19 |
| TYRP-1 VH-CH1(EE) –Fc (臼，PGLALA) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYFLHWVRQAPGQGLEWMGWINPDNGNTVYAQKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRRDYTYEKAALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 20 |
| TYRP-1 VL-CL(RK) | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIYNYLAWYQQKPGKVPKLLIYDAKTLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHFWSLPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 21 |
| P035.093/CD3 優化VL-CH1 – Fc (杵，PGLALA | QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 22 |
| Fc (臼，PGLALA) | DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 23 |
| 人 CD3 ε 莖（stalk） – Fc（杵）– Avi | QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVSENCVDEQLYFQGGSPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFEAQKIEWHE | 24 |
| 人 CD3δ 莖 – Fc（臼）– Avi | FKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCRSEQLYFQGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFEAQKIEWHE | 25 |
| 食蟹獼猴 CD3 ε 莖 – Fc（杵）– Avi | QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILTCSQHLGSEAQWQHNGKNKEDSGDRLFLPEFSEMEQSGYYVCYPRGSNPEDASHHLYLKARVSENCVDEQLYFQGGSPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFEAQKIEWHE | 26 |
| 食蟹獼猴 CD3δ 莖 – Fc（臼）– Avi | FKIPVEELEDRVFVKCNTSVTWVEGTVGTLLTNNTRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESAVQVHYRMSQNCVDEQLYFQGGSPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFEAQKIEWHE | 27 |
| H1 HCDR1 | GFSLTSYGVS | 28 |
| H1 HCDR2 | VIWEDGSTNYHSALIS | 29 |
| H1 HCDR3 | PHYGSSYVGAMEY | 30 |
| H1 VH | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWEDGSTNYHSALISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSS | 31 |
| H2 HCDR1 | GFSLTSYGVS | 32 |
| H2 HCDR2 | VIWEDGSTNYHSALIS | 33 |
| H2 HCDR3 | PHYGSSYVGAMEY | 34 |
| H2 VH | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVSWIRQPAGKGLEWIGVIWEDGSTNYHSALISRVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSS | 35 |
| H3 HCDR1 | GFSLTSYGVS | 36 |
| H3 HCDR2 | VIWEDGSTNYNPSLKS | 37 |
| H3 HCDR3 | PHYGSSYVGAMEY | 38 |
| H3 VH | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWEDGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSS | 39 |
| H4 HCDR1 | GGSITSYGVS | 40 |
| H4 HCDR2 | VIWEDGSTNYHSALIS | 41 |
| H4 HCDR3 | PHYGSSYVGAMEY | 42 |
| H4 VH | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWEDGSTNYHSALISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSS | 43 |
| H5 HCDR1 | GGSVTSYGVS | 44 |
| H5 HCDR2 | VIWEDGSTNYHSALIS | 45 |
| H5 HCDR3 | PHYGSSYVGAMEY | 46 |
| H5 VH | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVTSYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWEDGSTNYHSALISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSS | 47 |
| H1-H5 LCDR1 | RASENIYSYVA | 48 |
| H1-H5 LCDR2 | NAKSLAS | 49 |
| H1-H5 LCDR3 | QHHYVSPWT | 50 |
| H1-H5 VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYVAWYQQKPGKAPKLLIYNAKSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYVSPWTFGGGTKLEIK | 51 |
| PLAP (H1) VH-CH1(EE) – P035.093/CD3 原始/CD3 優化VL-CH1 – Fc (杵，PGLALA) | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWEDGSTNYHSALISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 52 |
| PLAP (H1) VH-CH1(EE) –Fc (臼，PGLALA) | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWEDGSTNYHSALISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 53 |
| PLAP (H2) VH-CH1(EE) – P035.093/CD3 原始/CD3 優化VL-CH1 – Fc (杵，PGLALA) | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVSWIRQPAGKGLEWIGVIWEDGSTNYHSALISRVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 54 |
| PLAP (H2) VH-CH1(EE) –Fc (臼，PGLALA) | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVSWIRQPAGKGLEWIGVIWEDGSTNYHSALISRVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 55 |
| PLAP (H3) VH-CH1(EE) – P035.093/CD3 原始/CD3 優化VL-CH1 – Fc (杵，PGLALA) | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWEDGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 56 |
| PLAP (H3) VH-CH1(EE) –Fc (臼，PGLALA) | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWEDGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 57 |
| PLAP (H4) VH-CH1(EE) – P035.093/CD3 原始/CD3 優化VL-CH1 – Fc (杵，PGLALA) | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWEDGSTNYHSALISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 58 |
| PLAP (H4) VH-CH1(EE) –Fc (臼，PGLALA) | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWEDGSTNYHSALISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 59 |
| PLAP (H5) VH-CH1(EE) – P035.093/CD3 原始/CD3 優化VL-CH1 – Fc (杵，PGLALA) | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVTSYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWEDGSTNYHSALISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 60 |
| PLAP (H5) VH-CH1(EE) –Fc (臼，PGLALA) | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVTSYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWEDGSTNYHSALISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 61 |
| PLAP (H1-H5) VL-CL(RK) | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYVAWYQQKPGKAPKLLIYNAKSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYVSPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 62 |
| 人 CD3 | QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI | 63 |
| 食蟹獼猴 CD3 | QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILTCSQHLGSEAQWQHNGKNKEDSGDRLFLPEFSEMEQSGYYVCYPRGSNPEDASHHLYLKARVCENCMEMDVMAVATIVIVDICITLGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQQDLYSGLNQRRI | 64 |
| hIgG 1Fc 區 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 65 |
| 連接子 | GGGGSGGGGS | 66 |
| 連接子 | DGGGGSGGGGS | 67 |
| 連接子 | GGGGSGGGGG | 68 |
| 連接子 | DGGGGSGGGGG | 69 |
| 人 κ CL 域 | RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 70 |
| 人 λ CL 域 | QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS | 71 |
| 人 IgG 1重鏈恒定區 (CH1-CH2-CH3) | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 72 |
| 人 PLAP | IIPVEEENPDFWNREAAEALGAAKKLQPAQTAAKNLIIFLGDGMGVSTVTAARILKGQKKDKLGPEIPLAMDRFPYVALSKTYNVDKHVPDSGATATAYLCGVKGNFQTIGLSAAARFNQCNTTRGNEVISVMNRAKKAGKSVGVVTTTRVQHASPAGTYAHTVNRNWYSDADVPASARQEGCQDIATQLISNMDIDVILGGGRKYMFRMGTPDPEYPDDYSQGGTRLDGKNLVQEWLAKRQGARYVWNRTELMQASLDPSVTHLMGLFEPGDMKYEIHRDSTLDPSLMEMTEAALRLLSRNPRGFFLFVEGGRIDHGHHESRAYRALTETIMFDDAIERAGQLTSEEDTLSLVTADHSHVFSFGGYPLRGSSIFGLAPGKARDRKAYTVLLYGNGPGYVLKDGARPDVTESESGSPEYRQQSAVPLDEETHAGEDVAVFARGPQAHLVHGVQEQTFIAHVMAFAACLEPYTACDLAPPAGTTDAAHPGRSVVPALLPLLAGTLLLLETATAP | 73 |
| 食蟹獼猴 PLAP | MRGPWVLLLLLGLRLQLSLGIIPVEEENPDFWNRQAAEALGAAKKLQPIQTAAKNLIIFLGDGMGVSTVTAARILKGQKEDKLGPETPLAMDHFPYVALSKTYSVDKHVPDSAATATAYLCGVKGNFQTIGLSAAARYNQCNTTRGNEVVSVMNRAKKAGKSVGVVTTTRVQHASPAGTYAHTVNRNWYSDANMPGSARREGCKDIATQLISNMDIDVILGGGRKYMFRMGAPDPEYPHDYSQDGTRMDGKNLVQEWLAKHQGARYVWNRTELMQASLDPSVTHLMGLFEPGDMKYEIHRDPTLDPSLMEMTEAALRLLSRNPRGFFLFVEGGRIDHGHHENRAYRALTEAVMFDDAIERGGQLTSEEDTLTLVTADHSHVFSFGAYPLRGSSIFGLAPGKAQDRKAYTALLYGNGPGYVLKDGARPDVTESESGSPEYRQQAAVPLDEE | 74 |
| PLAP (H3) VH-CH1(EE) – P035.093/CD3 原始/CD3 優化VL-CH1 – Fc (杵，PGLALA) | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWEDGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSGAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP | 75 |
以下為本發明之方法和組成物的實例。應當理解，鑒於上文給出的一般描述，可以實施各種其他方面。
實例 1 – 製備經優化之抗 CD3 ( 多特異性 ) 抗體
經優化之抗 CD3 抗體 「P035.093」 藉由噬菌體展示選擇活動，使用源自之前描述的文庫 (參見例如 WO 2014/131712，其藉由引用併入本文) CD3 結合物 (在本文中稱為「CD3
原始」且分別包含 SEQ ID NO: 7 及 SEQ ID NO: 13 的 VH 及 VL 序列) 產生。在該等文庫中，定位於重鏈之 CDR3 區內的位置 N97 和 N100（Kabat 編號）被緘默化或移除。使用抗 TYRP1 抗體作為示例性標靶細胞抗原結合部分 (SEQ ID NO: 14 及 SEQ ID NO: 15)，將 P035.093 轉化為 T 細胞雙特異性抗體 (TCB) 形式，如
圖 2A所示。還製備了包含 CD3
原始或先前進一步描述的 CD3 結合物 (「CD3
優化」，參見例如 WO 2020/127619) 作為 CD3 結合物的相應分子。
將重鏈和輕鏈 DNA 序列之可變區與預插入到各自之接納者哺乳動物表現載體中的恆定重鏈或恆定輕鏈按讀框進行次選殖，如
圖 2 B-E中所示。
經測試之抗 CD3 抗體的序列在
表 1所示的 SEQ ID NO 中給出。
表 1.本實例中使用經優化之 (P035.093) 和對照 (CD3
原始，CD3
優化) 抗 CD3 抗體的序列。
| 殖株 | HCDR1 | HCDR2 | HCDR3 | VH | LCDR1 | LCDR2 | LCDR3 | VL |
| P035.093 | 2 | 3 | 6 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| CD3 優化 | 2 | 3 | 5 | 8 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| CD3 原始 | 1 | 3 | 4 | 7 | 10 | 11 | 12 | 13 |
為了改善輕鏈與相應重鏈之正確配對，將突變引入 TYRP1 結合 Fab 分子之人 CL（E123R、Q124K）及人 CH1（K147E、K213E）中。
為了重鏈之正確配對（形成異二聚體分子），將杵臼突變引入抗體重鏈之恆定區（分別為 T366W/S354C 和 T366S/L368A/Y407V/Y349C）中。
此外，將 P329G、L234A 及 L235A 突變引入抗體重鏈的恆定區中，以廢止與 Fcγ 受體的結合。
所製備之 TCB 分子之完整序列見：SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20 及 SEQ ID NO: 21 (P035.093)；SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20 及 SEQ ID NO: 21 (CD3
優化)；SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20 及 SEQ ID NO: 21 (CD3
原始)。
TCB 由 Evitria（瑞士）使用其專有的載體系統與習知（基於非 PCR ）之選殖技術以及使用懸液適應的 CHO K1 細胞（最初從 ATCC 獲得，並於 Evitria 適應懸浮培養中的無血清生長）製備。對於生產，Evitria 使用其專有的無動物組分且無血清的培養基 (eviGrow 和 eviMake2) 及其專有的轉染試劑 (eviFect)。細胞用相應之表現載體以 1:1:2:1（「載體杵重鏈」：「載體臼重鏈」：「載體 TYRP-1 輕鏈」：「載體 CD3 輕鏈」）轉染。透過離心和隨後的過濾 (0.2 μm 過濾器) 收集上清液。
作為在 Evitria 製備的替代方案，在內部藉由 HEK293 EBNA 細胞之瞬時轉染製備 TCB 分子。將細胞離心，並且培養基用預熱的 CD CHO 培養基 (Thermo Fisher, #10743029) 代替。將表現載體混合在 CD CHO 培養基中，加入聚乙烯亞胺 (PEI; Polysciences Inc, #23966-1)，並且將溶液渦旋並在室溫下孵育 10 分鐘。然後，將細胞 (2 mio/ml) 與載體/PEI 溶液混合，轉移到燒瓶中，並在振盪培養箱中在 5% CO
2氣氛下於 37℃ 孵育 3 小時。孵育後，添加具有補充劑 (佔總體積的 80%) 的 Excell 培養基 (W. Zhou 和 A. Kantardjieff，Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, DOI: 10.1007/978-3-642-54050-9; 2014)。轉染後一天，加入補充劑 (進料，佔總體積的 12%)。藉由離心及隨後的過濾 (0.2 μm 過濾器) 在 7 天後收集細胞上清液。
透過標準方法從收穫的上清液中純化蛋白質。簡而言之，藉由蛋白 A-親和層析法從經過濾之細胞培養上清液中純化含 Fc 的蛋白質 (平衡緩衝液：20 mM 檸檬酸鈉、20 mM 磷酸鈉、pH 7.5；洗脫緩衝液：20 mM 檸檬酸鈉，pH 3.0) 。在 pH 3.0 下完成洗脫，然後立即中和樣品的 pH。通過離心 (Millipore Amicon® ULTRA-15, #UFC903096) 濃縮蛋白質，並通過粒徑篩析層析法在 20 mM 組胺酸，140 mM 氯化鈉，pH 6.0 中將聚集的蛋白質從單體蛋白質分離。
通過使用根據 Pace 等人，Protein Science, 1995, 4, 2411-1423 基於胺基酸序列計算的質量消光係數來量測在 280 nm 處的吸收來測定純化蛋白質之濃度。在還原劑存在和不存在下，使用 LabChipGXII (Perkin Elmer)，藉由 CE-SDS 分析蛋白質之純度和分子量。藉由 HPLC 層析法，於 25℃ 使用在運行緩衝液（分別為 25 mM K
2HPO
4、125 mM NaCl、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽，pH 6.7；或者 200 mM KH
2PO
4、250 mM KCl pH 6.2）中平衡的分析性粒徑篩析管柱（TSKgel G3000 SW XL 或 UP-SW3000）執行凝集體含量之測定。
表 2中給出了所製備之 TCB 分子的生物化學及生物物理學分析結果。
所有 TCB 分子皆可以高品質產生。
表 2.TCB 形式之抗 CD3 抗體的生物化學和生物物理學分析。
實例 2 – 測定經優化之抗 CD3 ( 多特異性 ) 抗體之熱穩定性
| 抗 CD3 抗體 | 產量 [mg/l] | 分析性粒徑篩析層析法 [%] | CE-SDS （主峰） [%] | ||
| HMW | 單體 | LMW | |||
| P035.093 | 26.8 | 0 | 100 | 0 | 100 |
| CD3 優化 | 17.2 | 0 | 100 | 0 | 100 |
| CD3 原始 | 18.7 | 0 | 100 | 0 | 100 |
實例 1 中所製備之抗 CD3 抗體 (TCB 形式) 的熱穩定性藉由動態光散射 (DLS) 進行監測，並藉由使用 Optim 2 儀器 (Avacta Analytical, UK) 應用溫度斜坡監測溫度依賴性內源蛋白質螢光來監測。
將 10 µg 蛋白質濃度為 1 mg/ml 的經過濾之蛋白質樣本以二重複加到 Optim 2 上。溫度以 0.1 ℃/min 從 25℃ 上升到 85℃，收集 350 nm/330 nm 之螢光強度比率以及 266 nm 之散射強度。
結果顯示於
表 3中。實例 1 中所產生之經之優化 CD3 結合物的聚集溫度 (T
聚集) 及觀察到的誘導解折疊轉變之溫度中點 (T
m) 高於之前描述的 CD3 結合物 CD3
原始及 CD3
優化。
表 3.藉由動態光散射以及溫度依賴性內在蛋白質螢光之變化量測 TCB 形式之抗 CD3 抗體的熱安定性。
實例 3 – 藉由表面電漿共振 (SPR) 對經優化之抗 CD3 ( 多特異性 ) 抗體進行功能表徵分析
| 抗 CD3 抗體 | T m[℃] | T agg[℃] |
| P035.093 | 58.5 | 57 |
| CD3 優化 | 53 | 51 |
| CD3 原始 | 57 | 54 |
在具有 HBS-EP 作為運行緩衝液（0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005% 界面活性劑 P20，Biacore，Freiburg/Germany）的 Biacore T200 上於 25°C 執行所有表面電漿共振 (SPR) 實驗。
對於親和力量測，將 TCB 分子捕獲在具有經固定化之抗 Fc(P329G) IgG（一種特異性地結合人 IgG
1Fc(P329G) 的抗體；「抗 PG 抗體」- 參見 WO 2017/072210，以引用方式併入本文）的 C1 感測器晶片 (GE Healthcare) 表面上。實驗設置如
圖 3中所示。使用標準胺偶合試劑盒 (GE Healthcare Life Sciences) 藉由直接固定約 400 個共振單位 (RU) 而將捕獲 IgG 偶合到感測器晶片表面。
為了分析與 CD3 的相互作用，以 10 μl/min 的流速在 25 nM 下捕獲 TCB 分子，持續 80 秒。令人和食蟹獼猴 CD3ɛ 莖-Fc (杵)-Avi/CD3δ 莖-Fc (臼) (CD3ɛ/δ, 參見 SEQ ID NO:24 及 SEQ ID NO:25 (人) 以及 SEQ ID NO:26 及 SEQ ID NO:27 (食蟹獼猴)) 以 0.122 nM 至 125 nM 之濃度以及 30 μl/分鐘之流速穿過流通池，持續 300 秒。監測解離 800 秒。
藉由減去在參照流通池上獲得之反應，以校正體折射率差。在這裡，抗原在具有經固定化之抗 PG 抗體的表面上流過，但在該表面上已經注入了 HBS-EP 而不是 TCB 分子。
使用 Biacore T200 評估軟體 (GE Healthcare Life Sciences) 推導出動力學常數，以藉由數值積分擬合 1:1 Langmuir 結合的速率方程式。該相互作用之半衰期 (t
1/2) 係使用公式 t
1/2= ln2/k
off計算。
表 4中列出了與之前描述的結合物 CD3
原始及 CD3
優化相比，經優化之抗 CD3 抗體結合的所有動力學參數。經優化之抗 CD3 抗體 P035.093 (TCB 形式) 與 CD3ɛ/δ 結合，K
D值在高 pM 範圍內；對於人 CD3ɛ/δ 及食蟹獼猴 CD3ɛ/δ，K
D值分別為 410 pM 及 210 pM。與 CD3
原始及 CD3
優化相比，，如在相同條件下藉由 SPR 所量測的，經優化之抗 CD3 抗體與人 CD3ɛ/δ 之結合的親和性提高了多達 10 倍。
抗 CD3 抗體 P035.093 與人 CD3ɛ/δ 單價結合之半衰期為 7.55 分鐘，比 CD3
原始及 CD3
優化之結合半衰期高多達 4 倍。
表 4.抗 CD3 抗體（TCB 形式）對人和食蟹獼猴 CD3ɛ/δ 的親和力。
實例 4 – 藉由表面電漿共振 (SPR) 對應力下之經優化之抗 CD3 ( 多特異性 ) 抗體進行表徵分析
| T = 25 ℃ 時的動力學值 | |||||
| 抗原 | 抗 CD3 抗體 | k on[1/Ms] | k off[1/s] | K D[M] | t 1/2[min] |
| 人 CD3 ɛ / δ | P035.093 | 3.75E+06 | 1.53E-03 | 4.10E-10 | 7.55 |
| CD3 優化 | 1.44E+06 | 6.21E-03 | 4.30E-09 | 1.86 | |
| CD3 原始 | 5.17E+05 | 3.38E-03 | 6.54E-09 | 3.42 | |
| 食蟹獼猴 CD3 ɛ / δ | P035.093 | 4.89E+06 | 1.04E-03 | 2.10E-10 | 11.1 |
| CD3 優化 | 2.67E+06 | 2.30E-03 | 8.60E-10 | 5.02 | |
| CD3 原始 | 1.14E+06 | 2.52E-03 | 2.21E-09 | 4.58 |
為評估脫醯胺位點去除之效果及其對抗體穩定性的影響，將抗 CD3 抗體 (TCB 形式) 在 37℃、pH 7.4 及 40℃、pH 6 下孵育 14 天，並藉由 SPR 進一步分析它們與人 CD3ɛ/δ 的結合能力。儲存在 -80℃ pH 6 的樣本用作參考。參考樣本和在 20 mM His、140 mM NaCl、pH 6.0 中於 40℃ 應激之樣本，以及於 37℃ 在 PBS pH 7.4 中應激之樣本，濃度皆為 1.0 mg/ml。在應激期（14 天）後，將 PBS 中之樣本透析回 20 mM His、140 mM NaCl、pH 6.0 以進行進一步分析。
在 Biacore T200 儀器 (GE Healthcare) 上於 25℃ 以 HBS-P+（10 mM HEPES，150 mM NaCl pH 7.4，0.05% 界面活性劑 P20）作為運行及稀釋緩衝液執行所有 SPR 實驗。將經生物素化之人 CD3ɛ/δ（參見實例 3，SEQ ID NO:24 和 SEQ ID NO:25）以及經生物素化之抗 huIgG（Capture Select，Thermo Scientific，#7103262100）固定在 S 系列感測器晶片 SA（GE Healthcare，#29104992）上，導致表面密度為至少 1000 個共振單位 (RU)。以 5 µl/min 的流速注入濃度為 2 µg/ml 的抗 CD3 抗體，持續 30 秒，並監測解離 120 秒。藉由注入 10 mM 甘胺酸 pH 1.5 60 秒來再生表面。藉由減去空白進樣並減去從空白對照流通池獲得之反應來校正體折射率差。為了評估，取注入結束後 5 秒的結合反應。為了標準化結合訊號，將 CD3 結合除以抗 huIgG 反應（在經固定化之抗 huIgG 抗體上捕獲 CD3 抗體後獲得的訊號 (RU)）。藉由將每個溫度應激樣本與相應的非應激樣本進行比較，計算相對結合活性。
如
表 5所示，與 CD3
原始相比，實例 1 中所製備之抗 CD3 抗體 (以及 CD3
優化) 在經過應力處理後表現出改善的與 CD3ɛ/δ 之結合。
表 5.在 pH 6/40℃ 或 pH 7.4/37℃ 下培養 2 週後，抗 CD3 抗體（TCB 形式）與人 CD3ɛ/δ 的結合活性。
實例 5 - 使用經優化之抗 CD3 ( 多特異性 ) 抗體對原發性黑色素瘤細胞進行腫瘤細胞毒殺
| 抗 CD3 抗體 | 結合活性 [%] | |
| 在 pH 6.0/40℃ 下 2 週 | 在 pH 7.4/37℃ 下 2 週 | |
| P035.093 | 97 | 95 |
| CD3 優化 | 97 | 92 |
| CD3 原始 | 95 | 65 |
在用新鮮分離的人 PBMC 腫瘤細胞毒殺檢定中測試 (TYRP1 靶向) TCB 形式的經優化之抗 CD3 抗體，將其與人黑色素細胞株 M150543 (原發性黑色素瘤細胞株，得自蘇黎世大學的皮膚細胞庫) 共孵育。腫瘤細胞裂解藉由在 24 小時和 48 小時後將由凋亡或壞死細胞釋放到細胞上清液中的 LDH 定量來測定。CD4 和 CD8 T 細胞之活化藉由在 48 小時後兩個細胞亞群上的 CD69 和 CD25 之正調控來分析。
簡言之，標靶細胞用胰蛋白酶/EDTA 收集，洗滌，且使用平底 96 孔盤以 30 000 個細胞/孔之密度平鋪。使細胞黏附隔夜。周邊血單核細胞 (PBMC) 藉由對自健康人供體獲得的新鮮血液進行 Histopaque 密度離心來製備。新鮮血液用無菌 PBS 稀釋並以 Histopaque 梯度 (Sigma, #H8889) 分層。在離心 (450 x g, 30 分鐘，室溫) 後，丟棄含有 PBMC 的中間相上方的血漿，並將 PBMC 轉移到新的離心管中，隨後用 50 ml PBS 填充。將混合物離心 (400 x g，10 分鐘，室溫)，丟棄上清液，并且用無菌 PBS 洗滌 PBMC 沉澱兩次 (離心步驟 350 x g，10 分鐘)。對所得的 PBMC 群體自動計數 (ViCell)，且在 37℃，5% CO2 下在細胞孵育箱中儲存在 RPMI1640 培養基中直至進一步使用 (不超過 24 小時)，該培養基含有 10% FCS 及 1% L-丙胺醯-L-麩醯胺 (Biochrom, K0302)。對於毒殺分析，以指定濃度添加抗體 (三重複)。將 PBMC 添加至標靶細胞中，以獲得 10:1 之最終效應子與目標 (E:T) 比。在 37℃，5% CO
2下孵育 24 小時後，通過定量由凋亡/壞死細胞釋放到細胞上清液中的 LDH (LDH 檢測套組，Roche Applied Science, #11 644 793 001) 來評估標靶細胞殺傷。通過將標靶細胞與 1% Triton X-100 一起孵育，實現標靶細胞的最大裂解 (= 100%)。最小裂解 (= 0%) 係指與沒有雙特異性構建體的效應子細胞共同培育的標靶細胞。
使用識別 T 細胞活化標記 CD25 (後期活化標記) 及 CD69 (早期活化標記) 的抗體藉由流式細胞術評估由 TCB 介導之 T 細胞毒殺標靶細胞後 CD8 及 CD4 T 細胞的活化。 48 小時孵育後，將 PBMC 轉移至圓底 96 孔盤，以 350 x g 離心 5 分鐘，且用 FACS 緩衝液洗滌兩次。CD4 APC (#300514, BioLegend)、CD8 FITC (#344704, BioLegend)、CD25 BV421 (#302630, BioLegend) 及 CD69 PE (#310906, BioLegend) 之表面染色根據供應商之指示進行。細胞用 150 μl/孔 FACS 緩衝液洗滌兩次，且使用 100 μl/孔固定緩衝液 (BD #554655) 在 4℃ 固定 15 分鐘。離心後，樣品重懸浮於 200 μl/孔 FACS 緩衝液中。以 BD FACS Fortessa 分析樣品。
與含有親代結合物 CD3
原始或結合物 CD3
優化的 TCB 相比，含有抗 CD3 抗體 P035.093 的 TCB 治療導致最高的腫瘤細胞毒殺及 T 細胞活化 (
圖 4)。
實例 6 – 製備單價 IgG 形式之經優化之抗 CD3 抗體
將經優化之抗 CD3 抗體殖株 P035.093 及 CD3
原始轉化為單價人 IgG
1形式，其在 CD3 結合部分上具有交叉之 VH 及 VL 域，如
圖 5A所示。
將重鏈和輕鏈 DNA 序列之可變區與預插入到各自之接納者哺乳動物表現載體中的恆定重鏈或恆定輕鏈按讀框進行次選殖，如
圖 5 B-D中所示。
為了重鏈之正確配對（形成異二聚體分子），將杵臼突變引入抗體重鏈之恆定區（分別為 T366W/S354C 和 T366S/L368A/Y407V/Y349C）中。
此外，將 P329G、L234A 及 L235A 突變引入抗體重鏈的恆定區中，以廢止與 Fcγ 受體的結合。
所製備之單價 IgG 分子之完整序列見：SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 22 及 SEQ ID NO: 23 (P035.093)；SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 22 及 SEQ ID NO: 23 (CD3
原始)；SEQ ID NO: 及 SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 22 及 SEQ ID NO: 23 (CD3
優化)。
如實例 1 中針對 TCB 分子所揭示者，單價 IgG 分子在 Evitria（瑞士）進行製備、純化及分析。對於細胞之轉染，以 1:1:1 的比率應用相應的表現載體（「載體杵重鏈」：「載體臼重鏈」：「載體輕鏈」）。
表 6中給出了所製備之單價 IgG 分子的生物化學及生物物理學分析結果。
兩種單價 IgG 分子均可以高質量產生。
表 6.單價 IgG 形式之抗 CD3 抗體的生化及生物物理分析。
實例 7 – 測定經優化之抗 CD3 抗體之熱穩定性
| 抗 CD3 抗體 | 產量 [mg/l] | 分析性粒徑篩析層析法 [%] | CE-SDS （主峰） [%] | ||
| HMW | 單體 | LMW | |||
| P035.093 | 2250 | 0 | 98.2 | 1.8 | 92.1 |
| CD3 原始 | 1447.5 | 0.9 | 99.1 | 0 | 90.5 |
單價 IgG 形式之抗 CD3 抗體 (在實例 6 中製備) 的熱穩定性藉由動態光散射 (DLS) 進行監測，並藉由監測溫度依賴性內源蛋白質螢光來監測 (如實例 2 中所述)。
結果顯示於
表 7中。單價 IgG 形式之經優化之 CD3 結合物的聚集溫度 (T
聚集) 及觀察到的誘導解折疊轉變之溫度中點 (T
m) 高於之前描述的 CD3 結合物 CD3
原始。
表 7.藉由動態光散射以及溫度依賴性內在蛋白質螢光之變化量測單價 IgG 形式之抗 CD3 抗體的熱安定性。
實例 8 – 藉由表面電漿共振 (SPR) 對經優化之抗 CD3 抗體進行功能表徵分析
| 抗 CD3 抗體 | T m[℃] | T agg[℃] |
| P035.093 | 58.0 | 55.5 |
| CD3 原始 | 55 | 53.0 |
SPR 實驗按實例 3 中所述進行，使用實例 6 中所製備之單價 IgG 分子。
為了分析與 CD3 的相互作用，以 5 μl/min 的流速在 50 nM 下捕獲 IgG 分子，持續 240 秒。令人和食蟹獼猴 CD3ɛ 莖-Fc（杵）-Avi/CD3δ 莖-Fc（臼）以 0.061 nM 至 250 nM 之濃度以及 30 μl/min 之流速穿過流通池，持續 300 秒。監測解離 800 秒。
表 8中列出了與之前描述的結合物 CD3
原始相比，經優化之抗 CD3 抗體 P035.093 結合的所有動力學參數。經優化之抗 CD3 抗體 (單價 IgG 形式) 與 CD3ɛ/δ 結合，K
D值在高 pM 範圍內；對於人 CD3ɛ/δ 及食蟹獼猴 CD3ɛ/δ，K
D值分別為 450 pM 及 220 pM。與 CD3
原始相比，如在相同條件下藉由 SPR 所量測的，經優化之抗 CD3 抗體與人 CD3ɛ/δ 之結合的親和性提高了多達 10 倍。
抗 CD3 抗體殖株 P033.078 單價結合人 CD3ɛ/δ 的半衰期為 8.69 分鐘，比 CD3
原始的結合半衰期高 2 倍以上。
表 8.抗 CD3 抗體 (單價 IgG 形式) 與人及食蟹獼猴 CD3ɛ/δ 的親和性。數據係獲自三重複量測。
實例 9 – 藉由表面電漿共振 (SPR) 對應力下之經優化之抗 CD3 抗體進行表徵分析
| T = 25 ℃ 時的動力學值 | |||||
| 抗原 | 抗 CD3 抗體 | k on[1/Ms] | k off[1/s] | K D[M] | t 1/2[min] |
| 人 CD3 ɛ / δ | P035.093 | 3.08 E+06 | 1.40 E-03 | 4.56 E-10 | 8.25 |
| CD3 原始 | 5.87 E+05 | 2.90 E-03 | 4.94 E-09 | 3.98 | |
| 食蟹獼猴 CD3 ɛ / δ | P035.093 | 4.38 E+06 | 9.81 E-04 | 2.24 E-10 | 11.78 |
| CD3 原始 | 1.20 E+06 | 2.45 E-03 | 2.03 E-09 | 4.72 |
實驗按實例 4 中所述進行，使用實例 6 中所製備之單價 IgG 分子。
如
表 9所示，與 CD3
原始相比，所有經優化之抗 CD3 抗體在經過應力處理後均表現出改善的與 CD3ɛ/δ 之結合。
表 9.在pH 6/40℃ 或 pH 7.4/37℃ 下孵育 2 週後，抗 CD3 抗體 (單價 IgG 形式) 與人 CD3ɛ/δ 的結合活性。
實例 10 – 將經優化之抗 CD3 抗體製備為抗 PLAP T 細胞雙特異性抗體 (PLAP TCB)
| 抗 CD3 抗體 | 結合活性 [%] | |
| 在 pH 6.0/40℃ 下 2 週 | 在 pH 7.4/37℃ 下 2 週 | |
| CD3 原始 | 97 | 60 |
| P035.093 | 100 | 93 |
使用 5 種不同的抗 PLAP 抗體，H1-H5 (ProMab Biotechnologies 提供)，將抗 CD3 抗體 P035.093 轉化為另外的 TCB 作為標靶細胞抗原結合部分 (SEQ ID NO 28-31, 48-51 (H1)、SEQ ID NO 32-35, 48-51 (H2)、SEQ ID NO 36-39, 48-51 (H3)、SEQ ID NO 40-43, 48-51 (H4)、SEQ ID NO 44-51 (H5))，其形式如實例 1 所述並如
圖 2A所示。
所製備之 TCB 分子之完整序列見：SEQ ID NO 16、52、53 及 62 (PLAP H1 CD3 P035.093)；SEQ ID NO 16、54、55 及 62 (PLAP H2 CD3 P035.093)；SEQ ID NO 16、56、57 及 62 (PLAP H3 CD3 P035.093)；SEQ ID NO 16、58、59 及 62 (PLAP H4 CD3 P035.093) 及 SEQ ID NO 16、60、61 及 62 (PLAP H5 CD3 P035.093)。
藉由瞬時轉染 HEK Expi293F 細胞來產生 TCB。細胞在 Expi293F™ 表現培養基中擴增 (Life Technologies™ Cat N° A1435101)，細胞密度為 2.5x10
6個細胞/ml，活力
＞95%。
將表現載體 (TwistBioscience, 1mg DNA/1L 細胞培養物) 在 Opti-MEM® (Gibco® Cat N° 31985070, 50mL/1L 細胞培養物) 中混合，添加 ExpiFectamine 293 (Life Technologies™ Cat N° A14524, 2.7mL/ 1L 細胞培養物)，並在室溫下孵育溶液 20 分鐘。將細胞培養物與載體/ExpiFectamine 293 溶液 (100mL/1L 細胞培養物) 混合，並在振盪孵育箱中在 8% CO
2氣氛下於 37°C 孵育 7 天。轉染後 18-23 小時，添加 ExpiFectamine 293 轉染增強子 1 (Life Technologies™ Cat N° A14524, 5mL/1L 細胞培養物) 及增強子 2 (Life Technologies™ Cat N° A14524, 50 mL/1L 細胞培養物)。7 天后，通過離心和隨後的過濾 (0.2 μm 過濾器) 收穫細胞上清液，並通過如下所示的標準方法從收穫的上清液中純化蛋白質。
參照標準方案從過濾的細胞培養上清液中純化蛋白質。簡而言之，藉由蛋白 A-親和層析法 (Atoll MabSelect SuRe，Ge Healthcare，平衡緩衝液：PBS，pH 7.4；洗脫緩衝液：100 mM 乙酸鈉，pH 3.0)。在 pH 3.0 下完成洗脫，然後立即中和樣品的 pH。透過離心將該蛋白質濃縮 (Millipore Amicon® ULTRA-15，Art.Nr.：UFC903096) 自細胞培養上清液中純化含 Fc 之蛋白質，並藉由粒徑篩析層析法 (HiLoad 26/60 Superdex 200 製備級，GE Healthcare) 在 20 mM 組胺酸，140 mM 氯化鈉，pH 6.0 中將聚集的蛋白質與單體蛋白質分離。另外地，藉由離子交換層析法 (Poros XS 柱，ThermoFischer，平衡緩衝液：40 mM 乙酸鈉，pH 5.5；洗脫緩衝液：1 M 乙酸鈉，pH 5.5)，用 PLAP (H1)、PLAP (H2) 及 PLAP (H5) TCB 進行純化，並將蛋白質分緩衝液-交換至 20 mM 組胺酸、140 mM 氯化鈉、pH 6.0。
藉由使用根據 Pace 等人，Protein Science 4 (1995) 2411-1423 基於胺基酸序列計算的質量消光係數來量測在 280 nm 處的吸收來測定純化蛋白質之濃度。在還原劑存在和不存在下，使用 LabChipGXII (Perkin Elmer)，藉由 CE-SDS 分析蛋白質之純度和分子量。藉由 HPLC 層析法，於 25℃ 使用平衡的分析性粒徑篩析層析法 (Biosuite 高解析度 SEC 柱，250Å，5µm，平衡於 200 mM KH
2PO
4，250 mM KCl pH 6.2) 執行凝集體含量之測定。
表 10.PLAP TCB 分子之生化及生物物理分析。
實例 11 – 藉由疏水性交互作用層析法 (HIC) 測定 PLAP TCB 分子之疏水性
| PLAP 抗體 | 分析性粒徑篩析層析法 單體含量 (%) | CE-SDS 主峰 (%) |
| H1 | 99 | 97 |
| H2 | 99 | 97 |
| H3 | 96 | 92 |
| H4 | 99 | 98 |
| H5 | 98 | 99 |
藉由使用疏水性交互作用層析法 (HIC) 測定 PLAP TCB 分子 (在實例 10 中製備) 之疏水性。為此，用 20 mM His、140 mM NaCl、pH 6.0 將樣品稀釋至 1mg/ml 的濃度。使用 40°C 下的 TSKgel Ether-5PW (Tosoh Bioscience，10 µm，7.5 x 75 mm) 柱，以流速 0.8 ml/分鐘及如下梯度：溶析液 B 0%/0-2 分鐘，13%/3-5 分鐘，100%/57-62 分鐘，0%/63-65 分鐘的流動相 A (25 mM NaH
2PO
4/Na
2HPO
4，1.5 M NH
4SO
4，pH 7) 及流動相 B (25 ml NaH
2PO
4/Na
2HPO
4，pH 7)，在 HPLC 系統 (Thermo Fisher，Ultimate 3000 Rs，11 µl 流通池，10°C 自動進樣器溫度) 上進行量測。每次注入的樣品量為 20 µg，樣品體積為 10 µl，檢測 214 nm、220 nm 及 280 nm 處的吸光度。為了測定分子之相對滯留時間，使用 HIC 標準混合物，其由具有不同滯留時間的 1:1 比率之兩個參考分子 (REF
低及 REF
高，20 mM His 中之 1 mg/ml，140 mM NaCl，pH 6，20 µg 量) 組成。分子之相對滯留時間 (RT) 被定義為：
相對 RT [分鐘] =
(主峰樣品 RT [分鐘] – REF
低RT [分鐘]) / (REF
高RT [分鐘] – REF
低RT [分鐘])
結果顯示於
表 11中。相對滯留時間小於 0.35 為具有可接受的疏水性之抗體樣蛋白的表徵。因此，PLAP H1 TCB、PLAP H3 TCB、PLAP H4 TCB 及 PLAP H5 TCB 的疏水性在可接受的範圍內，而發現 PLAP H2 TCB 超過疏水性標準。
表 11.藉由疏水性交互作用層析法測定 PLAP TCB 分子之相對滯留時間。
實施例 12 – 測定 PLAP TCB 分子之熱穩定性
| 分子 | 相對滯留時間 [ 分鐘 ] |
| PLAP H1 TCB | 0.27 |
| PLAP H2 TCB | 0.46 |
| PLAP H3 TCB | 0.19 |
| PLAP H4 TCB | 0.33 |
| PLAP H5 TCB | 0.31 |
藉由使用 UNCLE 儀器 (Unchained Labs, USA) 施加溫度梯度，藉由靜態光散射法 (SLS) 監測 PLAP TCB (在實例 10 中製備) 的熱穩定性。為了進行量測，將 10 µg 蛋白質濃度為 1 mg/ml 的每個樣品 (在 20 mM His、140 mM NaCl、pH 6.0 中) 一式兩份應用於 UNCLE。溫度以 0.1℃/分鐘 的速率從 30℃ 升至 90℃，並收集 266 nm 下的散射強度。
結果顯示於
表 12中。聚集溫度 (T
聚集) 高於 64°C 的蛋白質被視為是熱穩定的。因此，所有 PLAP TCB 分子均符合該標準。
表 12.藉由靜態光散射法量測的 PLAP TCB 分子的熱穩定性。
實施例 13 – 藉由粒徑篩析層析法 (SEC) 對應力下之 PLAP TCB 分子進行表徵分析
| 分子 | 聚集溫度 (T 聚集 ) [ ° C] |
| PLAP H1 TCB | 66.7 |
| PLAP H2 TCB | 65.3 |
| PLAP H3 TCB | 70.7 |
| PLAP H4 TCB | 68.2 |
| PLAP H5 TCB | 69.0 |
為了評估抗體的穩定性，將 PLAP TCB 分子 (在實例 10 中製備) 在 37℃、pH 7.4 及 40℃、pH 6 下孵育 14 天，並藉由粒徑篩析層析法 (SEC) 進一步分析，以測定單體、高分子物種 (例如聚集體、二聚體、雜質) 及低分子物種 (例如降解產物、雜質) 的相對含量。儲存在 -80℃ pH 6 的樣本用作參考。參考樣本和在 20 mM His、140 mM NaCl、pH 6.0 中於 40℃ 應激之樣本，以及於 37℃ 在 PBS pH 7.4 中應激之樣本，濃度皆為 1.0 mg/ml。在應激期（14 天）後，將 PBS 中之樣本透析回 20 mM His、140 mM NaCl、pH 6.0 以進行進一步分析。
為了分析，將五個 PLAP TCB 分子稀釋至 5mg/ml 濃度的流動相 (200 mM KH
2PO
4, 250 mM KCl pH 6.2)。使用 25°C 下的 TSKgel UP-SW3000 (Tosoh Bioscience，2 µm，4.6 x 300 mm) 柱，以 0.3 ml/min 的流速及 18 分鐘的等梯度梯度，在 UHPLC 系統 (Thermo Fisher，Ultimate 3000 RS，2.5 µl 流通池，10°C 自動進樣器溫度) 上進行量測。每次注入的樣品量為 50 µg，樣品體積為 10 µl，檢測 280 nm 處的吸光度。
結果顯示於
表 13中。所有五種 PLAP TCB 分子的單體含量均超過 95%，因此該等分子具有高純度。無應力樣品的主峰含量 (「無應力」) 與應力樣品主峰含量之間的差值 (40℃，20 mM His，pH 6.0，140 mM (「應力 A」) 中，兩周，或 37℃，1x PBS 中，兩周，pH 7.4「應力 B」) 被定義為「δ」值，並作為穩定性指標。該等 δ 值在 1.0–3.4% 的範圍內，這表明分子在兩種不同的應力條件下是穩定的。總之，經由 SEC 的分析證實了五種 PLAP TCB 的純度及穩定性。
表 13.SEC 分析結果。PLAP TCB 分子在無應力條件下 (-80℃，20 mM His ，pH 6.0，140 mM NaCl 中，兩周) 及兩種應力條件，應力 A (40℃，20 mM His，pH 6.0，140 mM NaCl 中，兩周) 及應力 B (37℃，1x PBS，pH 7.4中，兩周) 下的分析 SEC 資料。高分子量物質 (HMW)，低分子量物質 (LMW)。δ 值的計算：δ = Rel。面積 [%] (主峰，無應力) - Rel。面積 [%] (主峰，應力 A 或 B)。無應力樣品中的主峰含量小於應力樣品的，因此無法測定。
實例 14 – 藉由表面電漿共振 (SPR) 對應力下之 PLAP TCB 分子進行表徵分析
| 分子 | 條件 | HMWRel.面積 [%] | 主峰 ( 單體 )Rel.面積 [%] | LMWRel.面積 [%] | δRel.面積 [%] |
| PLAP H1 TCB | 無應力 | 0.4 | 99.5 | 0.1 | - |
| 應力 A | 0.8 | 98.2 | 1.0 | 1.3 | |
| 應力 B | 1.1 | 96.5 | 2.4 | 3.0 | |
| PLAP H2 TCB | 無應力 | 0.3 | 99.6 | 0.1 | - |
| 應力 A | 0.5 | 98.6 | 0.9 | 1.0 | |
| 應力 B | 1.2 | 96.2 | 2.6 | 3.4 | |
| PLAP H3 TCB | 無應力 | 0.7 | 99.2 | 0.1 | - |
| 應力 A | 0.8 | 97.7 | 1.5 | 1.5 | |
| 應力 B | 1.3 | 96.2 | 2.5 | 3.0 | |
| PLAP H4 TCB | 無應力 | 4.3 | 95.7 | 0.0 | - |
| 應力 A | 0.9 | 97.7 | 1.4 | -* | |
| 應力 B | 1.4 | 96.2 | 2.4 | -* | |
| PLAP H5 TCB | 無應力 | 0.9 | 99.1 | 0.0 | - |
| 應力 A | 1.0 | 98.1 | 0.9 | 1.1 | |
| 應力 B | 1.5 | 96.1 | 2.4 | 3.0 |
為了進一步評估 PLAP TCB 分子 (在實例 10 中製備) 的穩定性，如實例 13 中所述對樣品進行施壓，並藉由 SPR 進一步分析其與人 CD3ɛ/δ 的結合能力。
SPR 實驗採用 Biacore T200 儀器 (GE Healthcare)，於 25℃ 下以 HBS-P+ (10 mM HEPES，150 mM NaCl pH 7.4，0.05% 界面活性劑 P20) 作為運行及稀釋緩衝液進行。藉由胺偶和 (使用胺偶和試劑盒，Cytiva #BR100050) 在 CM5 晶片 (感測器晶片 CM5，Cytiva#29104988) 上以 ＞ 6000 RU 的密度固定抗 PG 抗體 (參見實例 3)。以 10 µl/min 的流速捕獲 HBS-P+ 中 TCB 分子樣品之 10 nM 溶液 30 秒。然後以 10 µl/min 的流速注入 300 nM 的人 CD3ɛ/δ 溶液 (參見實例 3，SEQ ID NOs 24 及 25) 150 秒締合時間及 120 秒解離時間。表面的再生隨後用 20 mM NaOH 溶液進行 35 秒的再生步驟。使用 Biacore T200 評估及 Excel 軟件分析資料。為了計算相對活性濃度 (RAC)，使用了結合報告點 (BRP) (BRP 為 SPR 中的標準讀出點，即抗原和抗體之間交互作用的最大響應 (組織/值))。
該結果證實了經優化之 CD3 結合物 P035.093 在 PLAP TCB 分子中的穩定性。
表 14.PLAP TCB 分子在無應力條件下 (-80℃，在 20 mM His 中，pH 6.0，140 mM NaCl 中，兩周) 及兩種應力條件，應力 A (40℃，20 mM His 中，pH 6.0，140 mM NaCl 中兩周) 及應力 B (37℃，1x PBS 中，pH 7.4，兩周) 下的 SPR 資料。
實例 15 – PLAP TCB 分子之功能活性
| 分子 | 條件 | RAC CD3 結合之 % |
| PLAP H1 TCB | 無應力 | 100 |
| 應力 A | 100 | |
| 應力 B | 98 | |
| PLAP H2 TCB | 無應力 | 100 |
| 應力 A | 100 | |
| 應力 B | 96 | |
| PLAP H3 TCB | 無應力 | 100 |
| 應力 A | 99 | |
| 應力 B | 97 | |
| PLAP H4 TCB | 無應力 | 100 |
| 應力 A | 100 | |
| 應力 B | 98 | |
| PLAP H5 TCB | 無應力 | 100 |
| 應力 A | 97 | |
| 應力 B | 99 |
在 Jurkat 報告細胞檢定中測試 PLAP TCB 分子 (在實例 10 中製備) 的功能活性。
CHO-K1 ALPP 、 ALPG 、 ALPL 或 ALPI 細胞株的產生
為了產生穩定表現 PLAP (ALPP)、ALPG (ALPPL2)、ALPL 或 ALPI 的 CHO-K1 細胞，轉位子載體系統被用於由兩個質體組成的轉染，該兩個質體共轉染：其中感興趣的基因兩側有兩個反向/直接重複 IR/DR 的轉位子載體及編碼睡美人轉位酶 SB100x 的載體。根據製造商的說明，使用 Lipofectamine 2000 (ThermoFisher，#11668-019) 用攜帶嘌呤黴素抗性基因的轉座子載體轉染 CHO-K1 細胞，該轉座子編碼人 PLAP (ALPP)、ALPPL2、ALPI 或 ALPL 以及小鼠 ALPI、ALPPL2 或食蟹獼猴 PLAP (ALPP)。在用嘌呤黴素 (Gibco，#A11138-03) 富集轉染細胞群體的抗生素選擇階段後，通過細胞分選來分離穩定表現人、食蟹獼猴或小鼠 ALPP 或同系物 CHO-K1 細胞。因此，用綿羊抗 ALPP/ALPI 抗體 (RnD Systems，#AF5905) 或小鼠抗 ALPL 抗體殖株 B4-78 (RnD Systems，#MAB1448) 染色嘌呤黴素選擇的細胞池，然後分別用與 R-PE 綴合的第二抗小鼠或抗綿羊抗體染色。在補充了 2mM L 麩醯胺 (PAN#P04-80100)、10%FCS (PAN#P30-2006) 及 10 µg/ml 嘌呤黴素 (Gibco#A11138-03) 的 DMEM F12 (PAN#P04-41450) 中擴增分選的細胞池，並將 5 x 10
6細胞等分試樣冷凍在 Cryopan (PAN#P07-92500) 中。產生的 CHO-K1 細胞株表現以下蛋白質：人 PLAP (ALPP) (UniProtKB 登錄號 P05187)、人 ALPLL2 (UniProtKB 登錄號 P10696)、人鹼性磷酸酶 (UniProtKB 登錄號 P05186)、人鹼性磷酸酶 (UniProtKB 登錄號 P09923)、小鼠鹼性磷酸酶 2 (UniProtKB 登錄號 P24823)、小鼠鹼性磷酸酶 (UniProtKB 登錄號 #P09242) 或食蟹獼猴 PLAP (鹼性磷酸酶) (SEQ ID NO:74)。
使用工程化 CHO 細胞作標靶細胞的 Jurkat NFAT 活化檢定
Jurkat NFAT 報導細胞株是一種表現 CD3 的人急性淋巴性白血病報導細胞株，具有 NFAT 啟動子（GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega #CS176501）。在 TCB 與腫瘤標靶細胞及 CD3 抗原 (在 Jurkat-NFAT 報告細胞上表現) 同時結合後，NFAT 啟動子經活化且導致活性螢火蟲螢光素酶的表現。冷光信號的強度 (藉由添加螢光素酶受質取得) 與 CD3 活化和信號傳導的強度成正比。
對於檢定，CHO 細胞之池已被工程化来表現如上所述之人 ALPP、ALPG、ALPI、ALPL、小鼠 ALPG、ALPI 及食蟹獼猴 ALPP。對 LoVo、CHO 池及親代 CHO 細胞進行計數，並使用 Countess 細胞計數器 (Invitrogen) 檢查活力。藉由以 350 x g 離心 5 分鐘收穫所需量的標靶細胞。將細胞重新懸浮在由 RPMI-1640 (Gibco) + 10% FBS (Sigma) + 1% Glutamax (Gibco) 組成的檢定培養基中，並將 0.03 x 10
6個細胞/孔接種在白色平底 96 孔板 (Greiner) 中。隨後，收穫 Jurkat NFAT 報告細胞，使用 Countess 細胞計數器 (Invitrogen) 進行計數及活力評估。細胞以 0.09 x 10
6個細胞/孔接種，以獲得 3:1 之最終效應子與目標 (E:T) 比。在檢定培養基中製備 TCB 系列稀釋液。將 TCB 滴定添加到 96 孔板中的各個孔。最終分析體積為 90 µl。
孵育 6 小時後，添加 90 µl ONE-Glo™ 加入螢光素酶檢定受質 (Promega #E6120)，並立即使用 Perkin Elmer EnVision® 2104 多模式讀板器進行讀出，測定相對冷光單位 (RLU)。
如
圖 6所示，含有經優化之抗 CD3 結合物 P035.093 之 PLAP TCB 在 Jurkat NFAT 報告細胞上具有類似的功能活性。測試的 TCB 以濃度依賴性方式誘導 CD3 活化，EC50 值列於
表 15中，而具有相同 CD3 結合物的非靶向對照 TCB (DP47) 不誘導 T 細胞活化。在人 ALPP 或 ALPG 工程化 CHO-K1 細胞存在，但人 ALPI、ALPL 或小鼠 ALPG、ALPI 不存在下的情況想，PLAP 結合物 H1 至 H5 均誘導 CD3 活化。在 LoVo 大腸直腸腺癌細胞株存在的情况下，該等 TCB 還誘導 Jurkat 報告物活化。
表 15.報告檢定中量測的 EC50 值。
| 分子 | 標靶細胞 | EC50 (pM) |
| PLAP H1 TCB | CHO-K1 人 ALPP | 37 |
| PLAP H2 TCB | CHO-K1 人 ALPP | 21 |
| PLAP H3 TCB | CHO-K1 人 ALPP | 35 |
| PLAP H4 TCB | CHO-K1 人 ALPP | 36 |
| PLAP H5 TCB | CHO-K1 人 ALPP | 36 |
| PLAP H1 TCB | CHO-K1 人 ALPG | 40 |
| PLAP H2 TCB | CHO-K1 人 ALPG | 22 |
| PLAP H3 TCB | CHO-K1 人 ALPG | 35 |
| PLAP H4 TCB | CHO-K1 人 ALPG | 34 |
| PLAP H5 TCB | CHO-K1 人 ALPG | 34 |
| PLAP H1 TCB | LoVo | 13 |
| PLAP H2 TCB | LoVo | 5 |
| PLAP H3 TCB | LoVo | 9 |
| PLAP H4 TCB | LoVo | 10 |
| PLAP H5 TCB | LoVo | 12 |
如
圖 7所示，當與表現人或食蟹獼猴 ALPP 的標靶細胞共孵育時，含有經優化之抗 CD3 結合物 P035.093 的 PLAP TCB 對 Jurkat NFAT 報告細胞具有類似的功能活性。TCB 以濃度依賴性方式誘導 CD3 活化，EC50 值列於
表 16中。在人及食蟹獼猴 ALPP 工程化 CHO-K1 細胞存在的情況下，PLAP 結合劑 H1、H3 及 H5 均誘導 CD3 活化，這證實了其對食蟹獼猴鹼性磷酸酶的交叉反應性。
表 16.報告檢定中量測的 EC50 值顯示食蟹獼猴交叉反應性。
實例 16 – PLAP TCB 分子誘導之腫瘤細胞毒殺
| 分子 | 標靶細胞 | EC50 (pM) |
| PLAP H1 TCB | CHO-K1 人 ALPP | 98 |
| PLAP H3 TCB | CHO-K1 人 ALPP | 98 |
| PLAP H5 TCB | CHO-K1 人 ALPP | 37 |
| PLAP H1 TCB | CHO-K1 食蟹獼猴 ALPP | 45 |
| PLAP H3 TCB | CHO-K1 食蟹獼猴 ALPP | 48 |
| PLAP H5 TCB | CHO-K1 食蟹獼猴 ALPP | 52 |
在用新鮮分離的人 PBMC 腫瘤細胞毒殺檢定中測試 PLAP TCB 分子 (在實例 10 中製備)，使其與人上皮細胞株 LoVo 共孵育。藉由在 48 小時及 72 小時後將由凋亡或壞死細胞釋放到細胞上清液中的不同細胞內蛋白酶活性的胞外活性定量來測定腫瘤細胞裂解。藉由流式細胞術分析 CD4 及 CD8 T 細胞的活化，以評估 72 小時後兩個亞群上活化標記物的上調。
使用胰蛋白酶 (Gibco) 分離標靶細胞 (LoVo)，用 PBS 洗滌一次，並以 0.3 mio 細胞/ml 的密度再懸浮在生長培養基 (RPMI 1640 (Gibco) 含有 10% FBS，1% GlutaMax (Gibco) 及 1% 丙酮酸鈉 (Sigma)) 中。將 100 μl 細胞懸液 (含 30 000 個細胞) 接種到 96 孔 U 型底板中。
從健康供體之血液中分離出 PBMC 並檢查活力。將抗體以所指示之濃度在分析培養基中稀釋，並將每孔 50 µl 添加到標靶細胞中。將分析培養基添加到對照孔中。將經分離之 PBMC 以 6 mio 細胞/ml 的密度重新懸浮，每孔添加 50 µl，導致 300 000 個細胞/孔 (E:T 10:1)。為了測定自發死亡細胞蛋白酶釋放，PBMC 及標靶細胞僅作為陰性對照共孵育。在標靶細胞不存在下，使用具有 PBMC 加上 TCB 的對照孔來測試 TCB 之特異性。
該分析在培養箱中於 37℃ 共培養總計 72 小時。檢定開始後進行 48 小時及 72 小時死細胞蛋白酶活性量測。為此，CytoTox Glo ™ 細胞毒性檢定 (Promega，#G9291) 在量測前調節至室溫。將每孔 30 µl 上清液轉移至 96 孔平底板進行分析。隨後向每孔中添加 30 µl 發光肽受質，並在室溫下孵育 15 分鐘後，使用 Perkin Elmer EnVision®2104 儀器量測發光。
然後收穫 PBMC，並藉由量測 CD25 及 CD69 正調控對活化進行分析。具體而言，將板以 600 x g 離心 3 分鐘，去除上清液，每孔用 150 l FACS 緩衝液洗滌細胞。將板再次以 600 x g 離心 3 分鐘並移除上清液。隨後，以每孔 50 l 的將含有 CD4 Alexa 700 (殖株 OKT4，BioLegend)、CD8 BV421 (殖株 RPA-T8，BioLegend)、CD25 PE (殖株 BC96，BioLegend) 及 CD69 FITC (殖株 FN50，BioLegend) 之抗體混合物添加細胞中。細胞在冰箱中培養 30 分鐘。然後將細胞用 FACS 緩衝液洗滌兩次，並再懸浮於每孔含 1% PFA 的 100 µl FACS 緩衝液中。量測前，將細胞洗滌並再懸浮於 150 µl FACS 緩衝液中。使用 BD Symphony A3 裝置執行分析。
用含有抗 CD3 抗體殖株 P035.093 的 PLAP TCB 處理導致了有效 LoVo 腫瘤細胞毒殺，該有效 LoVo 腫瘤細胞毒殺如
圖 8及顯示了兩個受試健康供體之一的代表性 EC50 值之
表 17所示。當 PBMC 在存在 LoVo 標靶細胞的情況下共孵育時，當用含有抗 CD3 抗體殖株 P035.093 的 TCB 處理時觀察到 T 細胞之活化。如
圖 9所示，在不存在腫瘤標靶細胞的情況下，所測試之 TCB 未誘導 CD8 及 CD4 T 細胞上顯著之 CD25 上調。該結果表明，所測試之 CD3 結合物依賴於交聯，例如經由與腫瘤細胞結合以誘導 T 細胞活化，且不能以單價形式誘導 T 細胞活化。與此一致，藉由 CD25 之流式細胞術分析，觀察到存在標靶細胞時 T 細胞上之活化標記物的表現增加 (
圖 9)。CD69 表現顯示出類似結果，儘管訊號弱得多，這可能是由於分析的時間點較晚，並且該標記物為早期活化標記物，其在稍後的時間點被下調 (資料未顯示)。
表 17.在 T 細胞介導的腫瘤細胞毒殺檢定中量測的 EC50 值。
實施例 17 – 進一步製備抗 PLAP T 細胞雙特異性抗體 (PLAP TCB)
| 分子 | 時間點 | 標靶細胞 | EC50 (pM) |
| PLAP H1 TCB | T48H | LoVo | 3.3 |
| PLAP H2 TCB | T48H | LoVo | 1.2 |
| PLAP H3 TCB | T48H | LoVo | 1.0 |
| PLAP H4 TCB | T48H | LoVo | 1.8 |
| PLAP H5 TCB | T48H | LoVo | 2.8 |
| PLAP H1 TCB | T72H | LoVo | 3.0 |
| PLAP H2 TCB | T72H | LoVo | 1.2 |
| PLAP H3 TCB | T72H | LoVo | 1.0 |
| PLAP H4 TCB | T72H | LoVo | 2.8 |
| PLAP H5 TCB | T72H | LoVo | 1.9 |
除了在實例 10 中製備的 PLAP TCB (包含抗 CD3 抗體 P035.093 及抗 PLAP 抗體 H1-H5) 之外，還使用 (i) 抗 PLAP 抗體 H3 (由 ProMab Biotechnologies 提供；SEQ ID NO 36-39、48-51) 及抗 CD3 抗體 P035.093、CD3
原始或 CD3
優化(參見上述
表 1實例 1 中之序列)，或 (ii) 抗 PLAP 抗體 H2 或 H4 (由 ProMab Biotechnologies 提供；分別為 SEQ ID NO 32-35、48-51 或 SEQ ID NO 40-43、48-51) 及抗 CD3 抗體 CD3
原始來製備其他 PLAP TCB。
所製備之 TCB 分子之完整序列見：SEQ ID NO 16、56、57 及 62 (PLAP H3 CD3
P035.093)；SEQ ID NO 17、56、57 及 62 (PLAP H3 CD3
原始)；SEQ ID NO 18、75、57 及 62 (PLAP H3 CD3
優化)；SEQ ID NO 17、54、55 及 62 (PLAP H2 CD3
原始)、及 SEQ ID NO 18、58、59 及 62 (PLAP H4 CD3
原始)，其形式如實例 1 所述並如
圖 2A所示。
由 Proteros Biostructures 使用源自 GeneArt (ThermoFisher Scientific) 的表現載體來製備 TCB。將 Expi293 細胞用質體以 1:1:2:1 之比例瞬時轉染 (「載體杵重鏈」:「載體臼重鏈」:「載體 PLAP 輕鏈」:「載體 CD3 輕鏈」)。藉由離心及隨後的過濾收集上清液。藉由親和層析法 (MabSelect SuRe.GE Healthcare，平衡緩衝液：PBS，pH 7.4；洗脫緩衝液：50mM 乙酸，pH 3.2)、離子交換層析法 (POROS XS，Applied Biosystems，平衡緩衝液：40 mM 乙酸鈉，pH 5.5；洗脫緩衝液：1M 乙酸鈉，pH 5.5)及粒徑篩析層析法 (HiLoad 26/60 Superdex 200 製備級，GE Healthcare，20 mM 組胺酸，140 mM 氯化鈉，pH 6.0) 自收穫的上清液中純化蛋白質。
藉由使用根據 Pace
等人，Protein Science, 4, 1995, 2411-1423 基於胺基酸序列計算的質量消光係數來量測在 280 nm 處的吸收來測定純化蛋白質之濃度。在還原劑存在和不存在下，使用 LabChipGXII (Perkin Elmer)，藉由 CE-SDS 分析蛋白質之純度和分子量。藉由 HPLC 層析法，於 25℃ 使用平衡的分析性粒徑篩析層析法 (Biosuite 高解析度 SEC 柱，250Å，5µm，平衡於 200 mM KH
2PO
4，250 mM KCl pH 7.0) 執行凝集體含量之測定。
表 18.PLAP TCB 分子之生化及生物物理分析。
實施例 18 - 測定 PLAP TCB 分子之熱穩定性
| 分子 | 分析性粒徑篩析 層析法 單體含量 (%) | CE-SDS 主峰 (%) |
| PLAP-H3-CD3 原始-TCB | 99 | 98 |
| PLAP-H3-CD3 優化-TCB | 99 | 99 |
| PLAP-H3-P035.093-TCB | 98 | 98 |
| PLAP-H2-CD3 原始-TCB | 99 | 99 |
| PLAP-H4-CD3 原始-TCB | 99 | 99 |
藉由使用 UNCLE 儀器 (Unchained Labs, USA) 施加溫度梯度，藉由靜態光散射法 (SLS) 監測實例 17 中產生的 PLAP TCB 的熱穩定性。為了進行量測，將 10 µg 蛋白質濃度為 1 mg/ml 的每個樣品 (在 20 mM His、140 mM NaCl、pH 6.0 中) 一式兩份應用於 UNCLE。溫度以 0.1℃/分鐘 的速率從 30℃ 升至 90℃，並收集 266 nm 下的散射強度。
結果顯示於
表 19中。聚集溫度 (T
聚集) 高於 64°C 的蛋白質被視為是熱穩定的。所有 PLAP TCB 分子均符合該標準。該 PLAP-H3-P035.093-TCB 構建體顯示出最高的熱穩定性。
表 19.藉由靜態光散射法 (SLS) 量測不同 PLAP TCB 的熱穩定性。
實例 19 - 藉由疏水性交互作用層析法 (HIC) 測定 PLAP TCB 分子之疏水性
| 分子 | 聚集溫度 [ ° C] |
| PLAP-H3-CD3 原始-TCB | 70.40 |
| PLAP-H3-CD3 優化-TCB | 69.60 |
| PLAP-H2-CD3 原始-TCB | 66.20 |
| PLAP-H4-CD3 原始-TCB | 69.00 |
| PLAP-H3-P035.093-TCB | 71.10 |
藉由使用疏水性交互作用層析法 (HIC) 測定實例 17 中製備的 PLAP TCB 分子之疏水性。為此，用 20 mM His、140 mM NaCl、pH 6.0 將樣品稀釋至 1mg/ml 的濃度。使用 40°C 下的 TSKgel Ether-5PW (Tosoh Bioscience, 7.5 x 75 mm) 柱、具有流速 0.8 ml/分鐘的流動相 A (25 mM NaH
2PO
4/Na
2HPO
4, 1.5 M NH
4SO
4, pH 7) 及具有流速 0.8 ml/分鐘的流動相 B (25 mM NaH
2PO
4/Na
2HPO
4, pH 7) 在 HPLC 系統 (Thermo Fisher) 上進行量測，並檢測 280 nm 處的吸光度。為了測定分子之相對滯留時間 (rel. RT)，使用 HIC 標準混合物，其由具有不同滯留時間的 1:1 比率之兩個參考分子 (REF
低及 REF
高) 組成。分子之相對滯留時間被定義為：
rel.RT [ 分鐘 ] = ( 主峰 ( 樣品 ) RT [ 分鐘 ]- REF 低 RT [ 分鐘 ]) / (REF 高 RT [ 分鐘 ]- REF 低 RT [ 分鐘 ])主峰 (樣品) RT: 被分析分子主峰的滯留時間，REF
低RT: 低滯留時間參考分子的滯留時間，REF
高RT: 高滯留時間參考分子的滯留時間。
結果顯示於
表 20中。相對滯留時間小於 0.35 分鐘是具有可接受的疏水性之抗體樣蛋白的表徵。因此，PLAP-H3-CD3
原始-TCB、PLAP-H4-CD3
原始-TCB 及 PLAP-H3-P035.093-TCB 的疏水性在可接受的範圍內，而 PLAP-H3-CD3
優化-TCB 及 PLAP-H2-CD3
原始-TCB 被發現超過疏水性標準。
表 20.藉由疏水性交互作用層析法測定不同 PLAP TCB 分子之相對滯留時間。
實施例 20 - 藉由粒徑篩析層析法 (SEC) 對應力下之 PLAP TCB 分子進行表徵分析
| 分子 | HIC rel. ret. 時間 [ 分鐘 ] |
| PLAP-H3-CD3 原始-TCB | 0.16 |
| PLAP-H3-CD3 優化-TCB | 0.43 |
| PLAP-H2-CD3 原始-TCB | 0.44 |
| PLAP-H4-CD3 原始-TCB | 0.30 |
| PLAP-H3-P035.093-TCB | 0.19 |
為了評估其穩定性，將實例 17 中產生的 PLAP TCB 分子在 37℃、pH 7.4 或 40℃、pH 6 下孵育 14 天，並藉由粒徑篩析層析法 (SEC) 進一步分析，以測定單體、高分子物種 (例如聚集體、二聚體、雜質) 及低分子物種 (例如降解產物、雜質) 的相對含量。以儲存於 -80℃ 及 pH 6 下的樣品用為參考。參考樣本和在 20 mM His、140 mM NaCl、pH 6.0 中於 40℃ 應激之樣本，以及於 37℃ 在 PBS pH 7.4 中應激之樣本，濃度皆為 10.0 mg/ml。在應激期（14 天）後，將 PBS 中之樣本透析回 20 mM His、140 mM NaCl、pH 6.0 以進行進一步分析。
為了分析，將五個 PLAP TCB 分子稀釋至 5 mg/ml 濃度的流動相 (200 mM KH
2PO
4，250 mM KCl pH 6.2)。使用 25°C 下的 TSKgel UP-SW3000 (Tosoh Bioscience，2 µm，4.6 x 300 mm) 柱，以 0.3 ml/min 的流速及 18 分鐘的等梯度梯度，在 UHPLC 系統 (Thermo Fisher) 上進行量測。每次注入的樣品量為 50 µg，檢測 280 nm 處的吸光度。
結果顯示於
表 21中。所有 PLAP TCB 分子的單體 (主峰) 含量均超過 95%，因此該等分子具有高純度。無應力樣品的主峰含量 (「無應力」) 與應力樣品主峰含量之間的差值 (40℃，20 mM His，pH 6.0，140 mM (「應力 A」) 中，兩周，或 37℃，1x PBS 中，兩周，pH 7.4「應力 B」) 被定義為「δ」值，並作為穩定性指標。該等 δ 值在 1.5–3.3% 的範圍內，這表明分子在兩種不同的應力條件下是穩定的。總之，經由 SEC 的分析證實了 PLAP TCB 的純度及穩定性。
表 21.不同 PLAP TCB 在無應力條件下 (-80℃，20 mM His ，pH 6.0，140 mM 中，兩周) 及兩種應力條件，應力 A (40℃，20 mM His，pH6.0，140 mM 中，兩周) 及應力 B (37℃，1x PBS，pH 7.4中，兩周) 下的 SEC 資料。高分子量物質 (HMW)，低分子量物質 (LMW)。δ 值的計算：δ = Rel。面積 [%] (主峰，無應力) - Rel。面積 [%] (主峰，應力 A 或 B)。
實例 21 - 藉由表面電漿共振 (SPR) 對應力下之 PLAP TCB 分子進行表徵分析 (RAC 檢定 )
| 分子 | 條件 | Rel. 面積 HMW [%] | Rel. 主峰面積 [%] | Rel. 面積 LMW [%] | Rel. 面積 δ [%] |
| PLAP-H3-CD3 原始-TCB | 無應力 | 0.40 | 99.00 | 0.60 | - |
| 應力 A | 0.50 | 97.50 | 2.00 | 1.50 | |
| 應力 B | 0.50 | 96.60 | 2.90 | 2.40 | |
| PLAP-H3-CD3 優化-TCB | 無應力 | 0.20 | 99.40 | 0.30 | - |
| 應力 A | 0.70 | 96.80 | 2.50 | 2.60 | |
| 應力 B | 0.60 | 96.10 | 3.30 | 3.30 | |
| PLAP-H2-CD3 原始-TCB | 無應力 | 0.60 | 98.90 | 0.50 | - |
| 應力 A | 1.00 | 96.80 | 2.20 | 2.10 | |
| 應力 B | 1.30 | 96.10 | 2.60 | 2.80 | |
| PLAP-H4-CD3 原始-TCB | 無應力 | 0.20 | 99.30 | 0.50 | - |
| 應力 A | 0.40 | 97.80 | 1.70 | 1.50 | |
| 應力 B | 0.40 | 96.70 | 2.80 | 2.60 | |
| PLAP-H3-P035.093-TCB | 無應力 | 0.20 | 98.00 | 1.80 | - |
| 應力 A | 0.20 | 96.20 | 3.50 | 1.80 | |
| 應力 B | 0.60 | 95.40 | 4.00 | 2.60 |
為了進一步評估 PLAP TCB 分子 (在實例 17 中製備) 的穩定性，如實例 20 中所述對樣品進行施壓，並藉由 SPR 進一步分析其與人 CD3ɛ/δ 的結合能力。
在 Biacore T200 儀器 (GE Healthcare) 上進行 SPR 實驗。對於該固定，HBS-N pH 7.4 用作運行緩衝液 (Cytiva#BR100670)。藉由胺偶和 (使用胺偶和試劑盒，Cytiva #BR100050) 在 CM3 晶片 (Cytiva #29104990) 上以 ＞ 6000 RU 的密度固定抗 PG 抗體 (參見實例 3)。將抗 PG 抗體儲備溶液在 pH 5.0 的 10 mM 乙酸鈉緩衝液 (Cytiva#BR100351) 中稀釋至 25 μg/mL 的濃度。固定後，在 25°C 下進行分析，並使用 PBS-P+ (Cytiva#28995084) 作為運行及稀釋緩衝液。以 5 µl/min 的流速捕獲 PBS-P+ 中 TCB 分子樣品之 5 nM 溶液 30 秒。然後以 8 µl/min 的流速注入 100 nM 的人 PLAP 溶液90 秒締合時間及 30 秒解離時間。此後，以 8 µl/min 的流速注入 200 nM 的人 CD3ɛ/δ 溶液 (參見實例 3，SEQ ID NOs 24 及 25) 90 秒締合時間及 30 秒解離時間。表面的再生隨後用 10 mM NaOH 溶液進行兩個 60 秒的再生步驟。使用 Biacore T200 評估及 Excel 軟件分析資料。使用結合報告點 (BRP) 計算相對活性濃度 (RAC)。為了計算 RAC，將靶標和抗體濃度參考未應力樣品 (-80°C) 作為 100% 比較。對於蛋白質濃度的標準化，參考抗 PG 抗體捕獲 (RAC 值)。
CD3 結合穩定性的結果如
表 22所示，PLAP 結合穩定性的結果如
表 23所示。包含 P035.093 CD3 結合物的 TCB 分子顯示出最高的結合穩定性，其次是包含 CD3 結合物 CD3
優化的分子。包含 CD3
原始的 TCB 分子顯示出最低的結合穩定性 (
表 22)。所有分子的 PLAP 結合穩定性在相同範圍內 (
表 23)。
表 22.經由 RAC 檢定的應力後 CD3 結合資料。PLAP TCB 分子在無應力條件下 (-80℃，20 mM His ，pH 6.0，140 mM 中，兩周) 及兩種應力條件，應力 A (40℃，20 mM His，pH6.0，140 mM 中，兩周) 及應力 B (37℃，1x PBS，pH 7.4中，兩周) 下的 RAC 資料。
表 23.經由 RAC 檢定的應力下之 PLAP 結合數據。PLAP TCB 分子在無應力條件下 (-80℃，20 mM His，pH 6.0，140 mM 中，兩周) 及兩種應力條件，應力 A (40℃，20 mM His，pH6.0，140 mM 中，兩周) 及應力 B (37℃，1x PBS，pH 7.4中，兩周) 下的 RAC 資料。
實例 22 - 單循環動力學檢定：藉由表面電漿共振 (SPR) 對 PLAP TCB 分子之結合動力學進行表徵分析
| 分子 | 條件 | RAC [%] |
| PLAP-H3-CD3 原始-TCB | 無應力 | 100 |
| 應力 A | 97 | |
| 應力 B | 82 | |
| PLAP-H3-CD3 優化-TCB | 無應力 | 100 |
| 應力 A | 98 | |
| 應力 B | 95 | |
| PLAP-H2-CD3 原始-TCB | 無應力 | 100 |
| 應力 A | 96 | |
| 應力 B | 81 | |
| PLAP-H4-CD3 原始-TCB | 無應力 | 100 |
| 應力 A | 97 | |
| 應力 B | 78 | |
| PLAP-H3-P035.093-TCB | 無應力 | 100 |
| 應力 A | 99 | |
| 應力 B | 98 |
| 分子 | 條件 | RAC [%] |
| PLAP-H3-CD3 原始-TCB | 無應力 | 100 |
| 應力 A | 99 | |
| 應力 B | 100 | |
| PLAP-H3-CD3 優化-TCB | 無應力 | 100 |
| 應力 A | 100 | |
| 應力 B | 101 | |
| PLAP-H2-CD3 原始-TCB | 無應力 | 100 |
| 應力 A | 100 | |
| 應力 B | 102 | |
| PLAP-H4-CD3 原始-TCB | 無應力 | 100 |
| 應力 A | 99 | |
| 應力 B | 103 | |
| PLAP-H3-P035.093-TCB | 無應力 | 100 |
| 應力 A | 100 | |
| 應力 B | 100 |
實例 17 中產生的 PLAP TCB 分子的結合動力學藉由單循環動力學 (SSK) 檢定來表徵。對於該檢定，再次使用 SPR Biacore T200。在 25°C 下進行固定，HBS-N pH 7.4 作為運行緩衝液 (Cytiva#BR100670)。藉由胺偶和 (使用胺偶和試劑盒，Cytiva #BR100050) 在 CM3 晶片 (Cytiva #29104990) 上以 ＞ 5000 RU 的密度固定抗 PG 抗體 (參見實例 3)。將抗 PG 抗體儲備溶液在 pH 5.0 的 10 mM 乙酸鈉緩衝液 (Cytiva#BR100351) 中稀釋至 25 μg/mL 的濃度。固定後，在 25°C 下進行分析，並將 PBS-P+ (Cytiva#28995084) 用作運行緩衝液及稀釋緩衝液。用 CM3 感測器晶片上的抗 PG 抗體捕獲 PBS-P+ 中 TCB 分子樣品之 3 nM 溶液。
樣品分析的量測週期由如
表 24及
表 25所示的三個不同的步驟組成。CD3 結合物的衍生的動力學速率常數及相應的親和力值 (平衡解離常數 KD) 總結在
表 26中，PLAP 結合物的總結在
表 27中。使用 Biacore T200 評估及 Excel 軟件分析資料。
CD3 結合物動力學的結果如
表 26所示，PLAP 結合物動力學結果如
表 27所示。與 CD3 結合物 CD3
優化及 CD3
原始相比，P035.093 CD3 結合物顯示出對 CD3 靶標的最高親和力 (見
表 26)，且與 PLAP 結合物 H2 及 H4 相比，PLAP H3 結合物顯示出對 PLAP 靶標的最高親和性 (見
表 27)。
表 24.樣品與人 CD3 結合的量測週期。
| 循環指令 | 注入溶液 | 締合時間 [s] | 解離時間 [s] | 流量 [µl/ 分鐘 ] | 流通池 |
| 捕獲 | TCB 樣品 | 30 | - | 5 | 2 |
| 樣品 | 人 CD3ɛ/δ | 180 | 1200 | 40 | 1,2 |
| 再生 | 10 mM NaOH (1:5 稀釋的 NaOH50 - Cytiva #BR100358) | 2x 60 | - | 30 | 1,2 |
在第三步期間，從五倍稀釋系列 (0.781 nM – 3.13 nM – 1.5 nM – 50.0 nM - 200 nM) 中依次注入一個濃度。亦用空白 (0 nM) 重複整個週期。
表 25.樣品與人 PLAP 結合的量測週期。
| 循環指令 | 注入溶液 | 締合時間 [s] | 解離時間 [s] | 流量 [µl/ 分鐘 ] | 流通池 |
| 捕獲 | TCB 樣品 | 30 | - | 5 | 2 |
| 樣品 | 人 PLAP | 180 | 1200 | 40 | 1,2 |
| 再生 | 10 mM NaOH (1:5 稀釋的 NaOH50 - Cytiva #BR100358) | 2x 60 | - | 30 | 1,2 |
在第三步期間，從五倍稀釋系列 (0.195 nM – 0.781 nM – 3.12 nM – 12.5 nM – 50.0 nM) 中依次注入一個濃度。亦用空白 (0 nM) 重複整個週期。
表 26.CD3 結合動力學。25°C 時人 CD3 交互作用的動力學速率常數及平衡解離常數。
表 27.PLAP 結合動力學。25°C 時人 PLAP 交互作用的動力學速率常數及平衡解離常數。
* * *
| 分子 | ka (1/Ms) | kd (1/s) | KD [nM] |
| PLAP-H3-CD3 原始-TCB | 2.67E+05 | 1.67E-03 | 6.3 |
| PLAP-H3-CD3 優化-TCB | 4.79E+06 | 1.36E-02 | 2.8 |
| PLAP-H2-CD3 原始-TCB | 2.69E+05 | 1.70E-03 | 6.3 |
| PLAP-H4-CD3 原始-TCB | 2.92E+05 | 1.67E-03 | 5.7 |
| PLAP-H3-P035.093-TCB | 2.09E+06 | 9.33E-04 | 0.5 |
| 構建體 | ka (1/Ms) | kd (1/s) | KD [pM] |
| PLAP-H3-CD3 原始-TCB | 4.32E+06 | 3.87E-05 | 9.0 |
| PLAP-H3-CD3 優化-TCB | 4.12E+06 | 3.99E-05 | 9.7 |
| PLAP-H2-CD3 原始-TCB | 2.46E+06 | 4.45E-05 | 18.1 |
| PLAP-H4-CD3 原始-TCB | 1.80E+06 | 8.91E-05 | 49.6 |
| PLAP-H3-P035.093-TCB | 4.33E+06 | 2.22E-05 | 5.1 |
儘管為了清楚理解起見，藉由圖示和實例的方式對上述發明進行了詳細描述，但是這些描述和實例不應被解釋為限製本發明的範圍。本文引用的所有專利和科學文獻的公開內容均以引用的方式明確納入其全部內容。
圖 1.本發明的（多特異性）抗體的例示性組態。(A、D)「1+1 CrossMab」分子之圖示。(B、E)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖示，具有 Crossfab 和 Fab 組成之順序替換 (「倒置 (inverted)」)。(C、F)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖示。(G、K)「1+1 IgG Crossfab」分子之圖示，具有 Crossfab 和 Fab 組成之順序替換 (「倒置」)。(H、L)「1+1 IgG Crossfab」分子之圖示。(I、M)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖示，具有二個 CrossFab。(J、N)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖示，具有二個 CrossFab 及 Crossfab 和 Fab 組成之順序替換 (「倒置」)。(O、S)「Fab-Crossfab」分子之圖示。(P、T)「Crossfab-Fab」分子之圖示。(Q、U)「(Fab)
2-Crossfab」分子之圖示。(R、V)「Crossfab-(Fab)
2」分子之圖示。(W、Y)「Fab-(Crossfab)
2」分子之圖示。(X、Z)「(Crossfab)
2-Fab」分子之圖示。黑點：Fc 域中的可選修飾，其促進異源二聚化 (heterodimerization)。++、--：在 CH1 和 CL 域中視情況引入相反電荷的胺基酸。Crossfab 分子描述為包含 VH 和 VL 區域的交換，但可以 (在其中 CH1 和 CL 域中沒有引入電荷修飾的方面中) 交替地包含 CH1 和 CL 域的交換。
圖 2.(A) 在實例中製備的 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體分子的示意圖。所有經測試之 TCB 抗體分子皆以「2+1 IgG CrossFab，倒置」的形式產生，具有電荷修飾（CD3 結合物中之 VH/VL 交換、標靶細胞抗原結合物中之電荷修飾，EE = 147E, 213E；RK = 123R, 124K）。(B 至 E) 用於組裝 TCB 的組分：在 CH1 和 CL 中進行電荷修飾的抗 TYRP1 Fab 分子的輕鏈 (B)、抗 CD3 交叉 Fab 分子的輕鏈 (C)、在 Fc 區具有杵和 PG LALA 突變的重鏈 (D)、在 Fc 區具有臼和 PG LALA 突變的重鏈 (E)。
圖 3.實例 3 中使用的表面電漿共振 (SPR) 設置的示意圖。與 C1 感測器晶片偶和的抗 PG 抗體。人和食蟹獼猴 CD3（與 Fc 區融合）通過表面以分析 TCB 中的抗 CD3 抗體與 CD3 的相互作用。
圖 4.用包含不同 CD3 結合物的 TCB 進行之腫瘤細胞毒殺及 T 細胞活化。用包含 P035.093、CD3
原始或 CD3
優化CD3 結合物的 TYRP1 TCB 治療後，藉由 24 h (A) 及 48 h (B)後 LDH 釋放測定健康供體的 PBMC 對黑色素瘤細胞株 M150543 的毒殺。同時，藉由流式細胞術量測 PBMC 內 CD8 及 CD4 T 細胞上 CD25 及 CD69 之上調，作為 48 小時後 T 細胞活化之標誌物。CD4 CD25 (C)、CD4 CD69 (D)、CD8 CD25 (E)、CD8 CD69 (F)。
圖 5.(A) 實例 6 中生成之單價 IgG 分子的示意圖。單價 IgG 分子作為人 IgG
1產生，在 CD3 結合物中具有 VH/VL 交換。(B 至 D) 用於組裝單價 IgG 的組分：抗 CD3 交叉 Fab 分子的輕鏈 (B)、在 Fc 區具有杵和 PG LALA 突變的重鏈 (C)、在 Fc 區具有臼和 PG LALA 突變的重鏈 (D)。
圖 6.在 Jurkat NFAT 報告檢定測試含有經優化之抗 CD3 結合物 P035.093 之 PLAP TCB，其中以工程化 CHO-K1 池作為標靶細胞。藉由測定處理後 6 小時後之發光來測定 Jurkat NFAT 報告細胞之活化。每組代表不同的靶標細胞株，如下所示：(A) 無標靶細胞、(B) CHO-K1 親代、(C) CHO-K1 人 ALPP、(D) CHO-K1 人 ALPG、(E) CHO-K1 人 ALPI、(F) CHO-K1 人 ALPL、(G) CHO-K1 小鼠 ALPG、(H) CHO-K1 小鼠 ALPI、(I) LoVo。
圖 7.在 Jurkat NFAT 報告檢定測試含有經優化之抗 CD3 結合物 P035.093 之 PLAP TCB，其中以工程化 CHO-K1 池作為標靶細胞。藉由測定處理後 6 小時後之發光來測定 Jurkat NFAT 報告細胞之活化。每組代表不同的靶標細胞株，如下所示：(A) CHO-K1 人 ALPP、(B) CHO-K1 食蟹獼猴 ALPP。
圖 8.當用 PLAP TCB 治療時，評估了來自健康供體的大腸直腸腺癌細胞株 LoVo 與 PBMC 之腫瘤細胞毒殺。在48 小時 (A, C) 及 72 小時 (B, D) 後，在標靶細胞不存在 (A, B) 或存在 (C, D) 的情况下，藉由使用 CytotoxGlo 試劑盒 (Promega) 定量細胞死亡來量測腫瘤細胞毒殺。
圖 9.在 LoVo 細胞株作為標靶細胞存在 (C, D) 或不存在 (A, B) 的情况下，分析 CD4 T 細胞 (A, C) 及 CD8 T 細胞 (B, D) 上 CD25 之上調，用於來自用 PLAP TCB 處理的健康供體之 PBMC。於 72 小時後，藉由流式細胞術進行分析。
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Claims (31)
- 一種與 CD3 及 PLAP 結合之抗體，其中該抗體包含 (a) 與 CD3 結合之第一抗原結合域，其包含：重鏈可變區 (VH)，該重鏈可變區包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 (HCDR) 1、SEQ ID NO: 3 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 6 之 HCDR 3；及輕鏈可變區 (VL)，該輕鏈可變區包含 SEQ ID NO: 10 之輕鏈互補決定區 (LCDR) 1、SEQ ID NO: 11 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 12 之 LCDR 3；及 (b) 與 PLAP 結合之第二抗原結合域及視情況之第三抗原結合域。
- 如請求項 1 之抗體，其中該第一抗原結合域之該 VH 包含與 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，且/或該第一抗原結合域之該 VL 包含與 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。
- 一種與 CD3 及 PLAP 結合之抗體，其中該抗體包含 (a) 與 CD3 結合之第一抗原結合域，其包含 SEQ ID NO: 9 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 13 之 VL 序列；及 (b) 與 PLAP 結合之第二抗原結合域及視情況之第三抗原結合域。
- 如請求項 1至3 中任一項之抗體，其中該第一抗原結合域、該第二抗原結合域及/或在存在時之該第三抗原結合域為 Fab 分子。
- 如請求項 1至4 中任一項之抗體，其包含由第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域。
- 如請求項 1至5 中任一項之抗體，其中該第一抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1，特定而言該等可變域 VL 及 VH 彼此替換。
- 如請求項 1至6 中任一項之抗體，其中該第二抗原結合域及在存在時之該第三抗原結合域為習用 Fab 分子。
- 如請求項 1至7 中任一項之抗體，其中該第二抗原結合域及在存在時之該第三抗原結合域為 Fab 分子，其中在該恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，且在該恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
- 如請求項 1至8 中任一項之抗體，其中該第一抗原結合域與該第二抗原結合域視情況經由肽連接子彼此融合。
- 如請求項 1至9 中任一項之抗體，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域各自為 Fab 分子，且 (i) 該第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與該第一抗原結合域之 Fab 重鏈之 N 端融合，或 (ii) 該第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與該第二抗原結合域之 Fab 重鏈之 N 端融合。
- 如請求項 1至10 中任一項之抗體，其中該第一抗原結合域、該第二抗原結合域及在存在時之該第三抗原結合域各自為 Fab 分子，且該抗體包含由第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域；且其中 (i) 該第二抗原結合域在該 Fab 重鏈之該 C 端與該第一抗原結合域之該 Fab 重鏈之該 N 端融合且該第一抗原結合域在該 Fab 重鏈之該 C 端與該 Fc 域之該第一次單元之 N 端融合，或 (ii) 該第一抗原結合域在該 Fab 重鏈之該 C 端與該第二抗原結合域之該 Fab 重鏈之該 N 端融合且該第二抗原結合域在該 Fab 重鏈之該 C 端與該 Fc 域之該第一次單元之該 N 端融合；且該第三抗原結合域在存在時在 Fab 重鏈之 C 端與該 Fc 域之該第二次單元之 N 端融合。
- 如請求項 5至11 中任一項之抗體，其中該 Fc 域為 IgG，特定而言 IgG 1Fc 域。
- 如請求項 5至12 中任一項之抗體，其中該 Fc 域為人 Fc 域。
- 如請求項 5至13 中任一項之抗體，其中該 Fc 包含促進該 Fc 域之該第一次單元與該第二次單元之締合之修飾。
- 如請求項 5至14 中任一項之抗體，其中該 Fc 域包含降低與 Fc 受體之結合及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代。
- 如請求項 1至15 中任一項之抗體，其中該第二抗原結合域及在存在時之第三抗原結合域包含：VH，其包含 (i) SEQ ID NO: 28 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 29 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 30 之 HCDR 3，(ii) SEQ ID NO: 32 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 33 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 34 之 HCDR 3，(iii) SEQ ID NO: 36 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 37 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 38 之 HCDR 3，(iv) SEQ ID NO: 40 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 41 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 42 之 HCDR 3；或 (v) SEQ ID NO: 44 之 HCDR 1、SEQ ID NO: 45 之 HCDR 2 及 SEQ ID NO: 46 之 HCDR 3；及 VL，其包含 SEQ ID NO: 48 之 LCDR 1、SEQ ID NO: 49 之 LCDR 2 及 SEQ ID NO: 50 之 LCDR 3。
- 如請求項 1至16 中任一項之抗體，其中該第二抗原結合域及在存在時之該第三抗原結合域包含：VH，其包含與 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；及/或 VL，其包含與 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。
- 一種經分離之多核苷酸，其編碼如請求項 1至17 中任一項之抗體。
- 一種宿主細胞，其包含如請求項 18 之經分離之多核苷酸。
- 一種產生與 CD3 及 PLAP 結合之抗體之方法，其包括以下步驟：(a) 在適於表現該抗體之條件下培養如請求項 19 之宿主細胞，及視情況 (b) 回收該抗體。
- 一種與 CD3 及 PLAP 結合之抗體，其藉由如請求項 20 之方法產生。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項 1至17 或 21 中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
- 如請求項 1至17 或 21 中任一項之抗體或如請求項 22 之醫藥組成物，其用作藥劑。
- 如請求項 1至17 或 21 中任一項之抗體或如請求項 22 之醫藥組成物，其用於治療疾病。
- 如請求項 24之抗體，其中該疾病為癌症或自體免疫疾病。
- 一種如請求項 1至17 或 21 中任一項之抗體或如請求項 22 之醫藥組成物在製造藥劑中之用途。
- 一種如請求項 1至17 或 21 中任一項之抗體或如請求項 22 之醫藥組成物在製造用於治療疾病之藥劑中之用途。
- 如請求項 27 之用途，其中該疾病為癌症或自體免疫疾病。
- 一種治療個體疾病之方法，其包括向該個體施用有效量之如請求項 1至17 或 21 中任一項之抗體或如請求項 22 之醫藥組成物。
- 如請求項 29 之方法，其中該疾病為癌症。
- 本發明如前文所述。
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