JP7247101B2 - Steap-1に結合する抗体 - Google Patents
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Description
アスパラギン脱アミド、アスパルテート異性化、スクシンイミド形成、及びトリプトファン酸化のような修飾は、組み換え抗体に関する典型的な分解であり、in vitroでの安定性及びin vivoでの生体機能の両方に影響しうる。
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当技術分野で一般に使用されるように使用される。
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及び誘導体、例えば、その断片である。
本明細書において、Fab分子などに関して使用される用語「第1」、「第2」又は「第3」は、各種の部分が複数存在するときに区別を簡便にするために使用される。このような用語の使用は、明瞭に述べているのでない限り、二重特異性抗原結合分子の特定の順序又は方向を付与することを意図しているのではない。
「Fab分子」は、免疫グロブリンの、重鎖(「Fab重鎖」)のVH及びCH1ドメインと、軽鎖(「Fab軽鎖」)のVL及びCLドメインとからなるタンパク質を指す。
(a)アミノ酸残基26~32(L1)、50~52(L2)、91~96(L3)、26~32(H1)、53~55(H2)、及び96~101(H3)に生じる超可変ループ(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b)アミノ酸残基24~34(L1)、50~56(L2)、89~97(L3)、31~35b(H1)、50~65(H2)、及び95~102(H3)に生じるCDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c)アミノ酸残基27c~36(L1)、46~55(L2)、89~96(L3)、30~35b(H1)、47~58(H2)、及び93-101(H3)に生じる抗原コンタクト(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));及び
(d)HVRアミノ酸残基46~56(L2)、47~56(L2)、48~56(L2)、49~56(L2)、26~35(H1)、26~35b(H1)、49~65(H2)、93~102(H3)、及び94~102(H3)を含む、(a)、(b)、及び/又は(c)の組み合わせ
を含む。
本発明は、STEAP-1、特にヒトSTEAP-1に結合し、例えばスクシンイミド形成による分解に抵抗性であり、したがって治療目的に必要であるように特に安定な抗体及び二重特異性抗原結合分子を提供する。加えて、この分子は、治療的用途にとって好ましい、例えば有効性及び/又は安全性、並びに生産性に関する他の特性も有する。
したがって、第1の態様では、本発明はSTEAP-1に結合する抗体を提供し、この抗体は、質量分析により決定して、pH7.4、37℃で4週間後に約5%未満のスクシンイミド分解を示す、及び/又はpH6.0、40℃で4週間後に約10%未満のスクシンイミド分解を示す。一実施態様において、抗体は、質量分析により決定して、pH7.4、37℃で4週間後に約3%未満のスクシンイミド分解、特に約1%未満のスクシンイミド分解を示す。一実施態様において、抗体は、質量分析により決定して、pH6.0、40℃で4週間後に約7.5%未満のスクシンイミド分解、特に約5%未満のスクシンイミド分解を示す。
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を上昇又は低下させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一又は複数 グリコシル化部位が作成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に達成される。
特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオMab」を作製することが望ましい。特定の実施態様では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位に生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー-薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用される。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第7521541号、同第830930号、同第7855275号、同第9000130号、又は同第2016040856号に記載のように生成されうる。
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定しないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか)及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン(prolypropylene)オキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール並びにこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有しうる。ポリマーはいずれかの分子量のものであってよく、分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に付着するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが付着する場合、それらは同じ分子でも異なる分子でもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、その抗体誘導体が限定条件の下での治療に使用されるかどうかを含めた(但し、これらに限定されない)考慮事項に基づいて決定することができる。
本発明はまた、細胞傷害性剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素(例えば、タンパク毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素的に活性の毒素、若しくはその断片)、又は放射性同位体といった一又は複数の治療剤にコンジュゲート(化学的に結合)した、本明細書に記載される抗STEAP-1抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位、即ち異なる抗原上の異なるエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、多重特異性抗体は、三つ以上の結合特異性を有する。特定の実施態様では、結合特異性の一つはSTEAP-1に対するものであり、他の(二つ以上の)特異性は、他のいずれかの抗原に対するものである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、STEAP-1の二つ(以上)の異なるエピトープに結合することができる。多重特異性(例えば二重特異性)抗体はまた、STEAP-1を発現する細胞に対して細胞傷害性剤又は細胞を局在化させるために用いてもよい。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
本発明は、二重特異性抗原結合分子、即ち二つの異なる抗原決定基(第1及び第2の抗原)に特異的に結合することのできる少なくとも二つの抗原結合部分を含む抗原結合分子も提供する。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、STEAP-1(第1の抗原)に結合する少なくとも一の抗原結合部分、特にFab分子を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、STEAP-1に結合する二の抗原結合部分、特にFab分子を含む。このような特定の一実施態様では、これら抗原結合部分の各々は、同じ抗原決定基に結合する。さらに詳細な実施態様では、これら抗原結合部分のすべては同一であり、即ちそれらは、本明細書に記載されるようにCH1及びCLドメイン内に同じアミノ酸置換を含む(もしあれば)同じアミノ酸配列を含む。一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、STEAP-1に結合する二を超えない抗原結合部分、特にFab分子を含む。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、第2の抗原(STEAP-1とは異なる)に結合する少なくとも一つの抗原結合部分、特にFab分子を含む。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、その中に含まれるFab分子に、特にそれらの結合アームの一つ(又は三つ以上の抗原結合Fab分子を含む分子の場合、二つ以上)にVH/VL交換を有するFabベースの二重/多重特異性抗原結合分子の生成において生じうる、マッチしない重鎖との軽鎖の誤対合(Bence-Jones型副生成物)を減少させるうえで有効なアミノ酸置換を含むことができる(PCT出願番号PCT/EP2015/150447、特にその実施例も参照されたい。この特許文献を、参照によりその全体を本明細書に包含する)。望ましくない副産物、特にそれらの結合アームの一つにVH/VLドメイン交換を有する二重特異性抗原結合分子に起こるBence Jones型副生成物と比較した場合の所望の二重特異性抗原結合分子の比率は、CH1及びCLドメイン中の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することに(本明細書では時に「荷電修飾」という)より改善することができる。
i)第1の抗原結合部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、正の電荷を有するアミノ酸によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つ第1の抗原結合部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、負の電荷を有するアミノ酸によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)か;又は
ii)b)による第2の抗原結合部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、正の電荷を有するアミノ酸によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2の抗原結合部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、負の電荷を有するアミノ酸によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
i)第1の抗原結合部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つ第1の抗原結合部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け);又は
ii)第2の抗原結合部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つ第2の抗原結合部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合部分であって、第1の抗原がSTEAP-1であり、第1の抗原結合部分が、配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、及び配列番号4、配列番号5及び配列番号6からなる群より選択されるHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号7の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号8のLCDR2及び配列番号9のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含むFab分子である、第1の抗原結合部分、並びに
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合部分であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって置き換えられている第2の抗原結合部分
を含み;
第1の抗原結合部分の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)により置換されており(Kabatによる番号付け)(特定の一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)により置換されており(Kabatによる番号付け)(特定の一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、第1の抗原結合部分の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
本発明による二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な構成で互いに融合することができる。例示的構成を図1に示す。
a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合部分であって、第1の抗原がSTEAP-1であり、第1の抗原結合部分が、配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、及び配列番号4、配列番号5及び配列番号6からなる群より選択されるHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号7の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号8のLCDR2及び配列番号9のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含むFab分子である、第1の抗原結合部分、
b)T細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンである第2の抗原に結合する、第2の抗原結合部分であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが、又は定常ドメインCLとCH1が互いによって置き換えられているFab分子である、第2の抗原結合部分;
c)第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン;
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
(i)a)による第1の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合している。
a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合部分であって、第1の抗原がSTEAP-1であり、第1の抗原結合部分が、配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、及び配列番号4、配列番号5及び配列番号6からなる群より選択されるHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号7の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号8のLCDR2及び配列番号9のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含むFab分子である、第1の抗原結合部分、
b)T細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンである第2の抗原に結合する、第2の抗原結合部分であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが、又は定常ドメインCLとCH1が互いによって置き換えられているFab分子である、第2の抗原結合部分;
c)第1の抗原に結合する、第1の抗原結合部分と同一である第3の抗原結合部分;並びに
d)第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
(i)a)による第1の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2の抗原結合部分及びc)による第3の抗原結合部分の各々が、Fab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1の抗原結合部分及びc)による第3の抗原結合部分の各々が、Fab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合している。
a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合部分であって、第1の抗原がSTEAP-1であり、第1の抗原結合部分が、配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、及び配列番号4、配列番号5及び配列番号6からなる群より選択されるHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号7の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号8のLCDR2及び配列番号9のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含むFab分子である、第1の抗原結合部分、
b)T細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンである第2の抗原に結合する、第2の抗原結合部分であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが、又は定常ドメインCLとCH1が互いによって置き換えられているFab分子である、第2の抗原結合部分;
c)第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン;
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
(i)a)による第1の抗原結合部分及びb)による第2の抗原結合部分の各々が、Fab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合している。
a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合部分であって、第1の抗原がSTEAP-1であり、第1の抗原結合部分が、配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、及び配列番号4、配列番号5及び配列番号6からなる群より選択されるHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号7の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号8のLCDR2及び配列番号9のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含むFab分子である、第1の抗原結合部分、
b)T細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンである第2の抗原に結合する、第2の抗原結合部分であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって置き換えられているFab分子である、第2の抗原結合部分;
c)第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン;
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
a)による第1の抗原結合部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸がリジン(K)又はアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)(最も詳細にはアルギニン(R)によって)、且つa)による第1の抗原結合部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
ここで、
(i)a)による第1の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合している。
a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合部分であって、第1の抗原がSTEAP-1であり、第1の抗原結合部分が、配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、及び配列番号4、配列番号5及び配列番号6からなる群より選択されるHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号7の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号8のLCDR2及び配列番号9のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含むFab分子である、第1の抗原結合部分、
b)T細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンである第2の抗原に結合する、第2の抗原結合部分であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって置き換えられているFab分子である、第2の抗原結合部分;
c)第1の抗原に結合する、第1の抗原結合部分と同一である第3の抗原結合部分;並びに
d)第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン;
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
a)による第1の抗原結合部分及びc)による第3の抗原結合部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸がリジン(K)又はアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)(最も詳細にはアルギニン(R)によって)、且つa)による第1の抗原結合部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
ここで、
(i)a)による第1の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2の抗原結合部分及びc)による第3の抗原結合部分の各々が、Fab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1の抗原結合部分及びc)による第3の抗原結合部分の各々が、Fab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合している。
a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合部分であって、第1の抗原がSTEAP-1であり、第1の抗原結合部分が、配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、及び配列番号4、配列番号5及び配列番号6からなる群より選択されるHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号7の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号8のLCDR2及び配列番号9のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含むFab分子である、第1の抗原結合部分、
b)T細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンである第2の抗原に結合する、第2の抗原結合部分であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって置き換えられているFab分子である、第2の抗原結合部分;
c)第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン;
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
a)による第1の抗原結合部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸がリジン(K)又はアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)(最も詳細にはアルギニン(R)によって)、且つa)による第1の抗原結合部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
(i)a)による第1の抗原結合部分及びb)による第2の抗原結合部分の各々が、Fab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合している。
a)STEAP-1である第1の抗原に結合する、第1及び第3の抗原結合部分であって;第1及び第2の抗原結合部分の各々が配列番号13のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む(従来の)Fab分子である、第1及び第3の抗原結合部分;
b)CD3である第2の抗原に結合する第2の抗原結合部分であって、配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって置き換えられているFab分子である第2の抗原結合部分;
c)第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン;
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
a)による第1及び第3の抗原結合部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸がリジン(K)又はアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)(最も詳細にはアルギニン(R)によって)、且つa)による第1及び第3の抗原結合部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
さらに、
a)による第1の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2の抗原結合部分及びa)による第3の抗原結合部分の各々が、Fab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインを含む。二重特異性抗原結合分子に関連して本明細書に記載されるFcドメインの特徴は、本発明の抗体に含まれるFcドメインに等しく当てはまる。
本発明による二重特異性抗原結合分子は複数の異なる抗原結合部分を含み、これらはFcドメインの二つのサブユニットの一方又は他方に融合することができ、したがってFcドメインの二つのサブユニットは通常、二つの非同一なポリペプチド鎖に含まれている。これらポリペプチドの組み換え同時発現とそれに続く二量体化は、二つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組み換え生成における二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、二重特異性抗原結合分子のFcドメインに所望のポリペプチドの会合を促す修飾を導入することが有利であろう。
ヘテロダイマー化を実施するために、FcドメインのCH3ドメインにおける修飾のための複数の手法が存在し、それらについては例えば国際公開第96/27011号、国際公開第98/050431号、EP1870459、国際公開第2007/110205号、国際公開第2007/147901号、国際公開第2009/089004号、国際公開第2010/129304号、国際公開第2011/90754号、国際公開第2011/143545号、国際公開第2012058768号、国際公開第2013157954号、国際公開第2013096291号に詳細な記載がある。典型的には、そのような手法のすべてにおいて、Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメイン及びFcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインは共に、各CH3ドメイン(又はそれを含む重鎖)がそれ自体ともはやホモダイマー化することがなく、相補的に改変された他のCH3ドメインとヘテロダイマー化するように、(よって第1と第2のCH3ドメインがヘテロダイマー化し、二つの第1のCH3ドメイン又は二つの第2のCH3ドメインの間にホモダイマーが形成されないように)共に相補的に改変される。重鎖ヘテロダイマー化の改善のためのこれら異なる手法は、重鎖/軽鎖誤対合及びBence Jones型副生成物を低減する二重特異性抗原結合分子における重鎖-軽鎖修飾(例えば、一の結合アームにおけるVHとVLの交換/置き換え、及びCH1/CL接触面における、反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入)と組み合わせた異なる代替法として考慮される。
Fcドメインは、二重特異性抗原結合分子(又は抗体)に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織-血液分布比が含まれる。しかしながら、同時に、Fcドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Fc受容体を発現する細胞への二重特異性抗原結合分子(又は抗体)の望ましくないターゲティングの原因となることがある。さらには、Fc受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出の原因となりえ、サイトカイン放出は、T細胞活性化特性(例えば、第2の抗原結合部分がT細胞活性化抗原に結合する二重特異性抗原結合分子の実施態様において)、及び二重特異性抗原結合分子の長い半減期と組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化を招き、全身投与されると重い副作用性を引き起こす。T細胞以外の(Fc受容体保有)免疫細胞の活性化は、例えばNK細胞によるT細胞の破壊の可能性により、二重特異性抗原結合分子(特に第2の抗原結合部分がT細胞活性化抗原に結合する二重特異性抗原結合分子)の有効性をさらに低下させることすらある。
本発明はさらに、本明細書に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を提供する。いくつかの実施態様において、前記断片は抗原結合断片である。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成(例えばメリフィールド固体相合成)又は組み換え生成によって得ることができる。組み換え生成のために、例えば上述したように、抗体又は二重特異性抗原結合分子(断片)をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び/又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法を使用して、適切な転写/翻訳制御シグナルとともに、抗体又は二重特異性抗原結合分子(断片)のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、in vitroでの組み換えDNA技術、合成技術及びin vivoでの組み換え/遺伝子組み換えを含む。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989);及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、抗体又は二重特異性抗原結合分子(断片)をコードするポリヌクレオチド(即ち、コード化領域)が、プロモーター及び/又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合するようにクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」(TAG、TGA、又はTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード化領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’非翻訳領域などはコード化領域の一部ではない。二以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中、例えば別の(異なる)ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード化領域を含んでいてもよいし、二以上のコード化領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子(断片)、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合した又は融合していない異種コード化領域をコードしうる。異種コード化領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード化領域が、一又は複数の調節配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、同調節配列と結合するときである。(ポリペプチドコード化領域及びそれに結合するプロモーターのような)二つのDNA断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、及び二つのDNA断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力を妨げないか又は転写されるべきDNA鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるといえる。プロモーターは所定の細胞においてのみDNAの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント(例えばイントロン-Aと連動した即初期プロモーター)、サルウイルス40(例えば初期プロモーター)、及びレトロウイルス(例えばラウス肉腫ウイルスなど)が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ-βグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター(例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン)を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来の要素(特に、配列内リボソーム進入部位、又はCITE配列とも呼ばれるIRES)が含まれる。発現カセットは、例えば、複製起点、及び/又はレトロウイルスの長い末端反復配列(LTR)又はアデノ随伴ウイルス(AAV)の末端反転型配列(ITR)などの染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子が、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、その物理的/化学的性質及び/又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特徴づけされる。
Fc受容体又は標的抗原に対する抗体又は二重特異性抗原結合分子の親和性は、例えば、BIAcore機器(GE Healthcare)などの標準器具と、組み換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて表面プラズモン共鳴(SPR)により決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対する抗体又は二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー(FACS)により、評価することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明的且つ例示的な一実施態様は、以下で説明される。
本発明の二重特異性抗原結合分子(又は抗体)の生物活性は、実施例に記載される様々なアッセイにより測定することができる。生物活性には、例えば、T細胞の増殖の誘導、T細胞中のシグナル伝達の誘導、T細胞中の活性マーカーの発現の誘導、T細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍後退の誘導及び/又は生存率の改善が含まれる。
さらなる態様において、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の他の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかと、少なくとも一の追加的治療剤を、例えば後述するように含む。
本明細書において提供されるいずれの抗体又は二重特異性抗原結合分子も、治療法に使用することができる。本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、例えばがんの治療において、免疫療法薬剤として使用されてもよい。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、療法において、一又は複数の他の薬剤との組み合わせで投与されうる。例えば、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、少なくとも一の追加的治療剤と共投与される。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与されるあらゆる薬剤を包含する。このような追加的な治療剤は、治療される特定の兆候に適したあらゆる活性成分、好ましくは、互いに打ち消し合うことのない相補的活性を有する活性成分を含む。特定の実施態様では、追加的治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。特定の実施態様では、追加的治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊因子、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、DNAインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。
このような他の薬剤は、意図した目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される抗体又は二重特異性抗原結合分子の量、障害又は治療の種類、及び上述した他の要因によって決まる。抗体又は二重特異性抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路において、又は本明細書に記載された投与量の1%~99%で、又は経験的に/臨床的に妥当であると決定された任意の投与量で任意の経路により使用される。
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び/又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、状態の治療、予防、及び/又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる(例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一の活性な薬剤は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示している。さらに、製造品は、(a)本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む組成物を中に含む第一の容器;及び(b)さらなる細胞傷害性又はその他の治療剤を含む組成物を中に含む第2の容器を含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでいてもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む第二(又は第三)の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的に及びユーザーの立場から望まれる他の材料をさらに含んでもよい。
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗STEAP-1抗体のいずれもが、生物学的試料中のSTEAP-1の存在を検出するために有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。特定の実施態様では、生物学的サンプルは細胞又は組織、例えば前立腺組織を含む。
コンストラクト及びツールの生成
組み換えDNA技術
標準的な方法を使用して、Sambrook, J. et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにDNAを操作した。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている:Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。
所望の遺伝子セグメントは、必要に応じて、適切なテンプレートを用いてPCRによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びPCR生成物からGeneart AG(Regensburg、Germany)で合成した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング/シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドDNAを精製し、UV分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。すべてのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする5’末端DNA配列を含むように設計された。
DNA配列は、二本鎖配列決定により決定された。
種々のSTEAP1特異性T細胞二重特異性(TCB)抗体変異体の生成のために、バンドルツズマブの可変ドメインを使用した。それぞれの発現プラスミドの生成のために、バンドルツズマブの可変領域配列(配列番号10及び14)又はその変異体を使用し、各レシピエント哺乳動物の発現ベクターに事前挿入されるそれぞれの定常領域を用いてインフレームでサブクローニングした。その結果得られる分子の模式図が図2に示される。
以下の分子が調製された。これらの模式図を図2に示す:
A.分子A:2+1 IgG CrossFab「反転型」(CD3バインダーC末端からSTEAP1バインダーへ)、電荷修飾あり(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、STEAP1バインダーにおける電化修飾)(配列番号26、27、34及び35)
B.分子B:2+1 IgG CrossFab「反転型」(CD3バインダーC末端からSTEAP1バインダーへ)、電荷修飾あり(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、STEAP1バインダーにおける電荷修飾;両方のSTEAP1結合部分におけるD100aE変異)(配列番号28、29、34及び35)
C.分子C:2+1 IgG CrossFab「反転型」(CD3バインダーC末端からSTEAP1バインダーへ)、電荷修飾あり(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、STEAP1バインダーにおける電荷修飾;両方のSTEAP1結合部分におけるD100bE変異)(配列番号30、31、34及び35)
D.分子D:2+1 IgG CrossFab「反転型」(CD3バインダーC末端からSTEAP1バインダーへ)、電荷修飾あり(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、STEAP1バインダーにおける電荷修飾;両方のSTEAP1結合部分におけるD100aE/D100bE変異)(配列番号32、33、34及び35)
すべてのコンストラクトの生成のために、懸濁液中において増殖するHEK293-EBNA細胞を、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミンを用いて、それぞれの発現ベクターと共に共トランスフェクトした。したがって、すべての「2+1 IgG CrossFab」コンストラクトの生成のために、対応する発現ベクターを、1:2:1:1の比(「ベクター重鎖(VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3)」:「ベクター軽鎖(VL-CL)」:「ベクター重鎖(VH-CH1-CH2-CH3)」:「ベクター軽鎖(VH-CL)」で共トランスフェクトした。
HEK293 EBNA細胞を、6mMのL-グルタミン及び250mg/lのG418を含む無血清Excell培地において懸濁培養した。600mlのチューブスピンフラスコ(最大作業体積400mL)内での生成のために、6億個のHEK293 EBNA細胞をトランスフェクションの24時間前に播種した。トランスフェクションの前に、細胞を210×gにより5分間遠心分離し、予め温めた20mlのCD CHO培地により上清を置き換えた。発現ベクターを、DNAの量が最終的に400μgになるまで20mlのCD CHO培地中で混合した。1080μlのPEI溶液(2.7μg/ml)を加えた後、培地を15秒間ボルテックスし、その後室温で10分間インキュベートした。その後細胞を、DNA/PEI溶液と混合し、600mlのチューブスピンフラスコに移し、加湿した5%CO2雰囲気のインキュベーター内において37℃で3時間インキュベートした。このインキュベーション工程の後、6mMのL-グルタミン、5g/LのPepsoy、及び1.0mMのVPAを含む360mlのExcell培地を加え、細胞を24時間培養した。トランスフェクションの一日後、7%のFeed 7を加える。7日間の培養後、上清を収集して20~30分間3600×gで遠心分離(Sigma 8K遠心分離)することによって精製し、溶液を滅菌濾過し(0.22μmのフィルター)、アジ化ナトリウムを最終濃度0.01% w/vになるまで加え、4℃に保持した。
すべての分子を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより、続いてサイズ排除クロマトグラフィー工程により、細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、25mlの20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム(pH7.5)により平衡化したHiTrap ProteinA HPカラム(CV=5mL、GE Healthcare)に充填した。結合していないタンパク質を、少なくとも10カラム容積の20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム(pH7.5)で洗浄することにより除去した。標的タンパク質を、6カラム容積の20mMクエン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム、100mMグリシン(pH3.0)に溶出した。タンパク質溶液を、1/10容積の0.5 M リン酸ナトリウム(pH8.0)を加えることにより中和させた。ProteinAクロマトグラフィー後のインプロセス分析のために、単一の画分中の分子の純度及び分子量を、還元剤の非存在下においてSDS-PAGEにより分析し、Coomassie(InstantBlueTM、Expedeon)で染色した。NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(4~12%のBis-Tris、,Invitrogen,USA)を、製造者の指示に従って使用した。標的タンパク質の選択された画分を、濃縮し、濾過した後、20mMのヒスチジン、140mMの塩化ナトリウム(pH6.0)、0.01%のTween20で平衡化したHiLoad Superdex 200カラム(GE Healthcare)に充填した。
精製されタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いる280nmにおける光学濃度(OD)により決定した。加えて、すべての分子の同一性を確認するために、それら分子の質量分析を実施した。
完全長ヒトSTEAP1をコードする遺伝子を、哺乳動物の発現ベクター中にクローニングした。製造者のプロトコールに従って(Invitrogen、#15338100)Lipofectamine LTX Reagentを用いて、プラスミドをCHO-K1(ATCC CRL-9618)細胞中にトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされたSTEAP1陽性CHO細胞を、10%のウシ胎児血清(Gibco、#16140063)及び1%のGlutaMAX Supplement(Gibco;#31331-028)を補ったDMEM/F-12培地(Gibco、#11320033)中に維持した。トランスフェクションの二日後、ピューロマイシン(Invivogen;#ant-pr-1)を6μg/mLに加え、細胞を複数継代にわたって培養した。最初の選択後、最も高いSTEAP1の細胞表面発現を有する細胞を、BD FACSAria IIセルソーター(BD Biosciences)によりソートし、培養して安定な細胞クローンを確立した。発現レベル及び安定性は、4週間の期間にわたって二次抗体としてバンドルツズマブ及びPerCPコンジュゲートFcガンマ特異性ヤギ抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch、#109-126-097)を用いたFACS解析により確認された。
バンドルツズマブベースの配列変異体の生成及び特徴づけ
バンドルツズマブの配列分析
アスパラギン脱アミド、アスパルテート異性化、スクシンイミド形成、及びトリプトファン酸化のような修飾は、組み換え抗体に関する典型的な分解であり、in vitroでの安定性及びin vivoでの生体機能の両方に影響しうる。アスパルテート異性化、アスパラギン脱アミド又はスクシンイミド形成を生じやすい潜在的なアミノ酸配列パターンの存在をスクリーニングするために、バンドルツズマブCDR配列(Kabatによる配列番号1、2、3、7、8及び9)の計算解析を実施した。さらに、CDR領域を、酸化する可能性を有するトリプトファンの存在について分析した。図3に示すように、バンドルツズマブ配列の解析により、重鎖及び軽鎖両方の可変ドメインのCDR領域内の潜在的ホットスポットが明らかになった。
最小のイソ-アスパルテート及びスクシンイミド形成と、最適な安定性とを有する抗STEAP1抗体を調製するために、修飾されたHCDR3配列を有するバンドルツズマブ配列の複数の変異体を生成した。特に、100a位及び100b位(Kabat番号付け)におけるアスパルテート残基を、個別に又は組み合わせてグルタメートにより置き換え(配列番号4、5及び6)、その結果得られたプラスミド(配列番号28、29、34及び35(変異D100aE、分子B);配列番号30、31、34及び35(変異D100bE、分子C);配列番号32-35(変異D100aE/D100bE、分子D))は、それぞれのTCB抗体分子の発現のために生成された。
導入された変異により、HCDR3に予測されるホットスポットが消滅し、安定性が上昇し、抗STEAP1抗体の結合力価の欠失が防止されることを確認するために、すべてのコンストラクト(分子A-D)を二つのアリコートに分割し、それぞれ20mMのHis/HisCl、140mMのNaCl(pH6.0)又はPBS(pH7.4)に再バファリングし、40℃(His/NaCl)又は37℃(PBS)でインキュベートした。加えて、コントロール試料を-80℃で貯蔵した。pH7.4でのインキュベーションは、血漿中の状況への分子の曝露を反映したものであり、in vivoでの分子の安定性についての結論を導くことができる。対照的に、低減したpH(ここではpH6)を有するバッファー製剤は、抗体ベースのコンストラクトの長期貯蔵により適しており、このような条件下でのストレス試験は、分子の貯蔵寿命を予測する。
28日間のインキュベーション期間の後、STEAP1結合部分の結合力価(相対活性濃度)について試料を分析及び比較した。この分析は、質量分析及び細胞ベースのELISAにより間接的に実施された。
バンドルツズマブ及びその変異体のCDR内部における予測位置でのストレス誘導性のタンパク質分解を同定するために、分子A-Dの質量分析を実施した。80μgの参照試料及びストレスタンパク質試料を、124.5μlの100mM Tris、5.6M塩酸グアニジニウム、10mM TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(Pierce Protein Biology Products)(pH6.0)中で、37℃で1時間にわたり変性させ、還元した。バッファーを、0.5mLのZeba Spin Desalting Columns中に、20mM ヒスチジン クロリド、0.5mM TCEP(pH6.0)(Pierce Protein Biology Products)に交換した。タンパク質試料は、最終容積140μLにおいてタンパク質1μgにつき0.05μgのトリプシン(Promega)を加えた後、一晩37℃で消化させた。7μLの10%ギ酸(FA)溶液を加えることにより消化を止めた。
消化させた試料は使用まで-80℃で貯蔵した。nanoAcquity UPLC(Waters)及びOrbitrap Fusion質量分析計(Thermo Fisher Scientific)を用いたUHPLC-MS/MSにより分析を実施した。約2.4μgの消化した融合タンパク質を5μLで注入した。クロマトグラフ分離法を、流速60μL/分を用いるAcquity BEH300C18カラム(1×150mm、1.7μm、300Å(Waters))において逆相により実施した。移動相A及びBは、UPLCグレードの水及びアセトニトリル中にそれぞれ0.1%(v/v)のギ酸を含んでいた。50℃のカラム温度を使用し、90分間に1%から40%の移動相Bの勾配を適用した。Orbitrap Fusionを、データ依存モードで使用した。Essential MSの設定は:イオン化(スプレー電圧:3.6kV、イオン輸送管:250℃、ベーパライザー:100℃)、フルMS(AGC:2×105、分解能:12×104、m/zレンジ:300-2000、最大注入時間:100ms);MS/MS(AGC:1×104、最大注入時間:100ms、単離幅:2Da).正規化された衝突エネルギーは35%に設定された。
分子A-Dの予測されるホットスポット(N53(HCDR2)、N97(HCDR3)、D100a(HCDR3)及びW50(LCDR2)(Kabat番号付け))の脱アミド化、異性化及び酸化のレベルを定量化するためにペプチドマッピングを適用した。
HCDR3領域を担持するペプチドにおいて、いずれの条件においても、分子A-Dのいずれにおいても、N97位における脱アミドもスクシンイミド形成も検出されなかった(データは示さない)。しかしながら、pH6でのストレス曝露により、やはり予測されるホットスポットアスパルテート100aを担持する同じHCDR3ペプチドに異なるレベルのアスパルテート分解がもたらされた。四つの試験された分子それぞれのトリプシンペプチドには、40℃のHis/NaCl(pH6.0)中で4週間後に、異なるレベルのスクシンイミド及びイソアスパルテート形成が検出された(表1)。pH6.0でのストレス曝露の後、最も高い合計レベルは分子Aに検出された。分子BにおけるD100a→E100aの変異導入と、分子CにおけるD100b→E100bの変異導入は、スクシンイミドレベルを有意に低下させる。しかしながら、両変異の組み合わせ(D100aE/D100bE)(分子D)は、スクシンイミドレベルを3%へと強力に低下させ、これはこのような長期間のストレス曝露については無視できる量である。さらに、分子Dにイソアスパルテートは検出されなかった。この結果は、分子A中の両方のアスパルテート(D100a及びD100b)と分子C又はB中のアスパルテート(D100a又はD100b)のいずれか一つとが、ストレス後に見られるスクシンイミドとイソアスパルテートの合計レベルに寄与していることを示している。加えて、pH7.4でのストレス曝露後に、分子DのHCDR3にタンパク質分解はまったく検出されず、この新規に設計された配列変異体の一体性が確認された。
pH7.4又は6.0で1-4週間のストレスによって生じる結合力価の低下を定量化するために、ヒトSTEAP1を安定に発現するCHO-K1細胞を用いる細胞ベースのELISAを採用した。この細胞ベースのELISAのために、96ウェルプレートの各ウェルに10000個の細胞を播種し、18時間37℃、5%CO2でインキュベートした。上清を、自動洗浄器(BIOTEK)を用いて除去し、増殖培地中の抗体コンストラクトの100μlの希釈系列(10pM-30nM)を各ウェルに加えた。4℃でのインキュベーションの1時間後、ウェルを空にし、PBS中0.05%のグルタルアルデヒド100μlを10分間RTで加えた。PBS/0.025%Tween20(PBST)での4回の洗浄後、ブロッキングバッファー(Roche)中において1:20000に希釈した100μlの抗ヒト-IgG-HRP(Jackson)を加え、プレートを1時間室温(RT)でインキュベートした。ウェルを、PBSTで6回洗浄し、1ウェルあたり100μlのTMBを用いてシグナルを生成し、50μlの1M HClを用いて10分後に反応を止め、450nmでの吸光度を測定した。データ(表4)は、ストレス試料の結合EC50を未処理の試料の同値で除したものに100を乗じた「%結合」で表している。
試験したすべてのTCB抗体が、分子あたり二つのSTEAP1結合部分を含むとして、STEAP1に対する一価の結合の親和性が40-60nMの範囲であるとことを考慮すると、二つの機能的STEAP1結合部分を有する分子のみがこのELISAにおいて検出されうると考えられる。対照的に、一つの機能的STEAP1結合部分のみを有する分子は、このプロトコールに記載される洗浄工程の間に洗い流されるはずである。したがって、スクシンイミドレベルが上昇した分子に関する結合損失の累積率は、HCDR3において検出されたタンパク質分解より高い(分子A-C)。
生化学的及び生物物理学的特性を特徴づけて比較するために、新規の抗STEAP-1抗体配列変異体を有するすべてのTCB(分子B-D)を分析し、バンドルツズマブ配列を担持するTCB抗体(分子A)と比較した。この結果を表5にまとめる。
見掛け上の疎水性を、25mMのNa-ホスフェート、1.5Mの硫酸アンモニウム(pH7.0)で平衡化したHIC-Ether-5PW(Tosoh)カラムに20μgの試料を注入することにより決定した。0から100%の直線勾配のバッファーB(25mMのNa-ホスフェート、pH7.0)を用いて60分以内に溶出を実施した。保持時間を、既知の疎水性を有するタンパク質標準と比較した。
20mMのヒスチジン/ヒスチジンクロリド、140mMのNaCl(pH6.0)中、1mg/mLの濃度で試料を調製し、0.4μmフィルターを通じた遠心分離により、光学384ウェルプレートに移し、パラフィン油でカバーした。試料を0.05℃/分の速度で25℃から80℃に加熱する間に、流体力学半径を、DynaPro Plate Reader(Wyatt)で動的光散乱により繰り返し測定する。
FcRnが発現し、精製され、記載されるようにビオチン化された(Schlothauer et al., MAbs (2013) 5(4), 576-86)。カップリングのために、調製された受容体をストレプトアビジン-セファロース(GE Healthcare)に加えた。その結果得られたFcRn-セファロースマトリックスを、カラムのハウジングに詰めた。カラムを20mMの2-(N-モルホリン)-エタンスルホン酸(MES)、140mMのNaCl(pH5.5)(溶出剤A)で0.5ml/分の流速で平衡化した。30μgの抗体試料を、溶出剤Aと1:1の容積比で希釈し、FcRnカラムに適用した。カラムを5カラム容積の溶出剤Aで洗浄し、続いて35カラム容積中20から100%の直線勾配の20mMのTris/HCl、140mMのNaCl(pH8.8)(溶出剤B)で溶出した。分析を、25℃のカラムオーブンで実施した。溶出プロファイルを、280nmでの吸光度を連続測定することにより監視した。保持時間を、既知の親和性を有するタンパク質標準と比較した。
ヘパリン親和性を、50mMのTris(pH7.4)で平衡化したTSKgel Heparin-5PW(Tosoh)カラムに30-50μgの試料を注入することにより決定した。0から100%の直線勾配のバッファーB(50mM Tris、1MのNaCl、pH7.4mM)を用いて37分以内に溶出を実施した。保持時間を、既知の親和性を有するタンパク質標準と比較した。
STEAP-1 TCB抗体変異体の機能的特徴づけ
STEAP-1 TCB抗体変異体によって誘導されるT細胞媒介性の腫瘍溶解
異なるSTEAP-1 TCB抗体変異体(分子A-D)によって媒介されるT細胞殺傷を、STEAP-1発現LnCAP細胞において評価した。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)をエフェクター細胞として使用し、前記殺傷を、二重特異性抗体と共に行ったインキュベーションの24時間目及び48時間目において検出した。付着した標的細胞を、トリプシン/EDTAを用いて収集し、洗浄し、平底96ウェルプレートを用いて30000細胞/ウェルの密度で播いた。細胞を一晩放置して付着させた。PBMCを、健常なヒトドナーから得られたヘパリン添加血液の濃縮リンパ球調製物のHistopaque密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌PBSで希釈し、Histopaqueグラジエント上に重ねた(Sigma、H8889)。遠心分離(450×g、30分、室温)後、PBMCを含有する界面相上の血漿を棄て、PBMCを新しいfalconチューブに移し、その後50mlのPBSを満たした。混合物を遠心分離(400×g、10分間、室温)し、上清を棄て、滅菌PBSを用いてPBMCペレットを二度洗浄した(遠心分離工程:350×g、10分間)。その結果得られたPBMCの集団を自動カウントし(ViCell)、細胞インキュベーター内において、37℃、5% CO2で10%のFCS及び1%のL-アラニル-L-グルタミン(Biochrom、K0302)を含有するRPMI1640培地中に、さらなる使用まで(24時間以内)保管した。
殺傷アッセイのために、抗体を、示された濃度(0.01pM~1nMの範囲で3通り)で加えた。PBMCを標的細胞に、最終的なE:T比が10:1となるように加えた。標的細胞の死滅を、37℃、5% CO2での24時間及び48時間のインキュベーションの後に、アポトーシス/壊死細胞による細胞上清中に放出されたLDHの定量化(LDH検出キット、Roche Applied Science、#11 644 793 001)により評価した。標的細胞の最大溶解(=100%)が、1% Triton X-100と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解(=0%)は、二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。24時間後(図4A)及び48時間後(図4B)の結果は、細胞媒介性の腫瘍溶解が、試験された分子によりT同様に誘導されること、及び分子B-DにおけるSTEAP-1バインダーの修飾が、分子の殺傷力価に悪影響を与えないことを示している。
細胞上のCD3及びヒトSTEAP-1に同時結合すると、CD3媒介性のエフェクター細胞活性化を誘導するSTEAP-1 TCB抗体変異体の能力を、腫瘍抗原陽性標的細胞(LnCAP、22RV1)とJurkat-NFATレポーター細胞(CD3発現ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株とNFATプロモーター;GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P、Promega #CS176501)の共培養を用いて評価した。STEAP-1抗原(標的細胞に発現)及びCD3抗原(Jurkat-NFATレポーター細胞に発現)にTCB分子が同時結合すると、NFATプロモーターが活性化し、活性ホタルルシフェラーゼの発現を導く。発光シグナルの強度(ルシフェラーゼ基質の付加時に得られる)は、CD3活性化及びシグナル伝達の強度に比例している。
アッセイのために、ヒト腫瘍細胞を回収し、ViCellを用いて生存率を決定した。20000個の細胞/ウェルを、平底白壁96ウェルプレート(#655098、Greiner Bio-One)に蒔き、希釈した抗体又は培地(コントロール用)を加えた(2.6pM-200nMの範囲)。
その後、Jurkat-NFATレポーター細胞を回収し、ViCellを用いて生存率を評価した。細胞を細胞培地に再懸濁し、腫瘍細胞に加え、最終的なエフェクター対標的(E:T)比を5:1とし、最終容積をウェルあたり100μlとした。細胞を、加湿したインキュベーター内で6時間37℃でインキュベートした。インキュベーション時間の最後に、100μl/ウェルのONE-Glo溶液(Promega;各ウェルのONE-Gloとアッセイ培地の比1:1)をウェルに加え、10分間室温で暗所でインキュベートした。WALLAC Victor3 ELISAリーダー(PerkinElmer2030)を用いて、発光を、検出時間5秒/ウェルで検出した。
図5に示すように、評価されたすべてのSTEAP-1 TCB抗体分子はCD3を介してT細胞架橋を誘導し、その後STEAP1発現LnCAP(図5A)及び22Rv1(図5B)細胞にT細胞活性化を誘導している。STEAP1陰性CHO-K1細胞(図5C)にT細胞活性化は観察できない。
STEAP-1 TCB抗体変異体(分子A-D)の結合を、STEAP-1発現CHO-hSTEAP1細胞(ヒトSTEAP-1を安定に発現するようにトランスフェクトされたハムスター卵巣由来の上皮細胞株)及びCD3発現Jurkat-NFAT レポーター細胞(Promega #CS176501)を用いて試験した。
簡潔には、Cell Dissociation Buffer(Gibco、#13151014)を用いて付着したCHO-hSTEAP1細胞を回収し、数え、生存率をチェックし、FACSバッファー(100μl PBS 0.1% BSA)中、2x106個の細胞/mlで再懸濁した。Jurkat懸濁細胞も回収し、数え、生存率をチェックした。100μlの細胞懸濁液(0.2x106個の細胞を含有)を、丸底96ウェルプレートにおいて30分間4℃で、漸増濃度のSTEAP-1 TCB抗体(31pM-1000nM)と共にインキュベートし、0.1%のBSAを含有する冷PBS(FACSバッファー)で二回洗浄し、4℃でさらに30分間、1:50に事前希釈したAlexa Fluor 647コンジュゲートAffiniPure F(ab’)2断片ヤギ-ヒトIgG Fcγ断片特異性二次抗体(Jackson Immuno Research Lab、Alexa Fluor 647 #109-606-008、FACSバッファー中で希釈)と共に再インキュベートし、冷PBS 0.1% BSAで二回洗浄した。
染色した細胞を、100μLの2%パラホルムアルデヒド含有FACSバッファー中に再懸濁し、4℃で30分間インキュベートして染色を固定した。最後に、細胞を4分間350×g及び4℃で遠心分離し、上清を棄て、細胞ペレットを200μlのFACSバッファーに再懸濁した。染色を、FACS Canto II(Software FACS Diva)を用いてFACSにより分析した。GraphPadPrism6を用いて結合曲線を得た(図6A、CHO-hSTEAP1細胞に対する結合;図6B、Jurkat細胞に対する結合)。
図6に示すように、評価されたすべてのSTEAP-1 TCB抗体分子は、ヒトSTEAP-1を発現するヒトCHO細胞(図6A)と、Jurkat NFAT細胞に発現されたヒトCD3(図6B)に対する濃度依存性の結合を示し、このことは、分子B-DにおけるSTEAP-1バインダーの修飾が、細胞上のSTEAP-1に対するそれらの結合に悪影響を与えないことを示唆するものである。
Claims (46)
- 配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、並びに配列番号4、配列番号5及び配列番号6からなる群より選択されるHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号7の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号8のLCDR2及び配列番号9のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む、STEAP-1に結合する抗体。
- VHが、配列番号11、配列番号12及び配列番号13からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含み、VLが、配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体。
- VHが、配列番号11、配列番号12及び配列番号13からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、VLが、配列番号14のアミノ酸配列を含む、請求項1又は2に記載の抗体。
- IgG抗体である、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記IgG抗体がIgG1抗体である、請求項4に記載の抗体。
- 完全長抗体である、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体。
- Fv分子、scFv分子、Fab分子、及びF(ab’)2分子からなる群より選択される抗体断片である、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体。
- 多重特異性抗体である、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体。
- (a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合部分であって、第1の抗原がSTEAP-1であり、第1の抗原結合部分が、配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、並びに配列番号4、配列番号5及び配列番号6からなる群より選択されるHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号7の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号8のLCDR2及び配列番号9のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む、第1の抗原結合部分、並びに
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合部分
を含む二重特異性抗原結合分子。 - 第1の抗原結合部分のVHが、配列番号11、配列番号12及び配列番号13からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含み、第1の抗原結合部分のVLが、配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第1の抗原結合部分のVHが、配列番号11、配列番号12及び配列番号13からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、第1の抗原結合部分のVLが、配列番号14のアミノ酸配列を含む、請求項10に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第2の抗原がCD3である、請求項9から11のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第2の抗原がCD3εである、請求項9から12のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第2の抗原結合部分が、配列番号15のHCDR1、配列番号16のHCDR2、及び配列番号17のHCDR3を含むVHと、配列番号18のLCDR1、配列番号19のLCDR2及び配列番号20のLCDR3を含むVLとを含む、請求項9から13のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第2の抗原結合部分のVHが、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含み、第2の抗原結合部分のVLが、配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第2の抗原結合部分のVHが、配列番号21のアミノ酸配列を含み、第2の抗原結合部分のVLが、配列番号22のアミノ酸配列を含む、請求項15に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び/又は第2の抗原結合部分がFab分子である、請求項9から16のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第2の抗原結合部分は、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが、又は定常ドメインCLとCH1が、互いによって置き換えられているFab分子である、請求項9から17のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって置き換えられている、請求項18に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第1の抗原結合部分が、定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立してリジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、独立してリジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)により置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)Fab分子である、請求項9から19のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2の抗原結合部分が、互いに融合している、請求項9から20のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2の抗原結合部分が、ペプチドリンカーを介して互いに融合している、請求項21に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2の抗原結合部分はそれぞれFab分子であり、(i)第2の抗原結合部分がFab重鎖のC末端において第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合しているか、又は(ii)第1の抗原結合部分がFab重鎖のC末端において第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合している、請求項9から22のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第1の抗原に特異的に結合する第3の抗原結合部分を含む、請求項9から23のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第3の抗原結合部分が第1の抗原結合部分と同一である、請求項24に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインを含む、請求項9から25のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第1の、第2の、及び存在する場合は第3の抗原結合部分はそれぞれFab分子であり;
(i)第2の抗原結合部分がFab重鎖のC末端において第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合し、且つ第1の抗原結合部分がFab重鎖のC末端においてFcドメインの第1のサブユニットのN末端に融合しているか、又は(ii)第1の抗原結合部分がFab重鎖のC末端において第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合し、且つ第2の抗原結合部分がFab重鎖のC末端においてFcドメインの第1のサブユニットのN末端に融合しており;
第3の抗原結合部分は、存在する場合は、Fab重鎖のC末端においてFcドメインの第2のサブユニットのN末端に融合している、
請求項26に記載の二重特異性抗原結合分子。 - FcドメインがIgGのFcドメインである、請求項26又は27に記載の二重特異性抗原結合分子。
- FcドメインがIgG1のFcドメインである、請求項28に記載の二重特異性抗原結合分子。
- FcドメインがヒトFcドメインである、請求項26から29のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメイン内のアミノ酸残基が、それよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより第1のサブユニットのCH3ドメイン内部に、第2のサブユニットのCH3ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメイン内のアミノ酸残基が、それよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第2のサブユニットのCH3ドメイン内部に、第1のサブユニットのCH3ドメイン内部の隆起を収容可能な空洞が生成される、請求項26から30のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインが、Fc受容体への結合を低減する及び/又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含んでいる、請求項26から31のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 請求項1から32のいずれか一項に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド。
- 請求項33に記載のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- ベクターが発現ベクターである、請求項34に記載のベクター。
- 請求項33に記載のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド又は請求項34又は35に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- STEAP-1に結合する抗体又は二重特異性抗原結合分子の生成方法であって、請求項36に記載の宿主細胞を、抗体又は二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程を含む、方法。
- 抗体又は二重特異性抗原結合分子を回収する工程をさらに含む、請求項37に記載の方法。
- 請求項37又は38に記載の方法によって生成される、STEAP-1に結合する抗体又は二重特異性抗原結合分子。
- 請求項1から32のいずれか一項又は請求項39に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項1から32のいずれか一項又は請求項39に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子、又は請求項40に記載の薬学的組成物。
- 疾患の治療における使用のための、請求項1から32のいずれか一項又は請求項39に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子、又は請求項40に記載の薬学的組成物。
- 疾患ががんである、請求項42に記載の、抗体、二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物。
- 疾患の治療のための医薬の製造における、請求項1から32のいずれか一項又は請求項39に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子の使用。
- 前記疾患ががんである、請求項44に記載の使用。
- がんを治療するための医薬であって、請求項1から32のいずれか一項又は請求項39に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子、又は請求項40に記載の薬学的組成物を含む、医薬。
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