CN115916825A - 与cd3和cd19结合的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明一般地涉及与CD3和CD19结合的、例如用于活化T细胞的抗体。此外，本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生所述抗体的方法，以及涉及将所述抗体用于治疗疾病的方法。

Description

与CD3和CD19结合的抗体
技术领域
本发明一般地涉及与CD3和CD19结合的、例如用于活化T细胞的抗体。此外，本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生所述抗体的方法，以及涉及将所述抗体用于治疗疾病的方法。
背景技术
CD3(分化簇3)是由四个亚基组成的蛋白质复合物，即CD3γ链、CD3δ链和两个CD3ε链。CD3与T细胞受体和ζ链结合，在T淋巴细胞中产生激活信号。
CD3作为药物靶点已被广泛探索。以CD3为靶向的单克隆抗体已被用于自身免疫性疾病(如I型糖尿病)或移植排斥处理的免疫抑制剂治疗。1985年，CD3抗体莫罗单抗CD3(muromonab-CD3,OKT3)成为第一个获准用于人体临床的单克隆抗体。
CD3抗体的最新应用为双特异性抗体的形式，一方面与CD3结合，另一方面与诸如CD19的靶细胞抗原结合。这种抗体与其两个靶标的同时结合将使靶细胞和T细胞之间产生一种暂时的相互作用，导致活化任何细胞毒性T细胞，随后裂解靶细胞。与CD3和CD19结合的双特异性抗体描述于例如WO 2017/055314中。
为了实现治疗的目的，抗体必须满足的一个重要条件是在体外(用于药物的储存)和体内(在患者给药以后)均具有足够的稳定性。
结构修饰，如天冬酰胺脱酰胺化是重组抗体的典型降解反应，可以作用于体外稳定性和体内生物学功能。
鉴于抗体、特别是用于活化T细胞的双特异性抗体的巨大治疗潜力，需要具有优化特性的CD3抗体，包括多特异性抗体。
发明内容
本发明提供了抗体，包括多特异性(例如双特异性)抗体，其与CD3结合并且对由例如天冬酰胺脱酰胺引起的降解具有抗性，因此如治疗目的所需尤其稳定。所提供的(多特异性)抗体进一步结合了良好的功效和可生产性以及低毒性和有利的药代动力学特性。
如本文所示，本发明提供的与CD3结合的抗体(包括多特异性抗体)在pH 7.4、37℃2周后保留超过约90％的CD3结合活性，其相对于如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的在pH 6、-80℃2周后的结合活性。
在一个方面，本发明提供了与CD3和CD19结合的抗体，其中抗体包含(a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含SEQID NO:2的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:3的HCDR 2和SEQ ID NO:5的HCDR 3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:8的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:9的LCDR 2和SEQ IDNO:10的LCDR 3；以及(b)与CD19结合的第二抗原结合结构域和任选的第三抗原结合结构域。在一个方面，第一抗原结合结构域的VH包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和/或第一抗原结合结构域的VL包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供与CD3和CD19结合的抗体，其中抗体包含(a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:11的VL序列；以及(b)与CD19结合的第二抗原结合结构域和任选的第三抗原结合结构域。
在一个方面，所述第一抗原结合结构域、所述第二抗原结合结构域和/或在存在时的第三抗原结合结构域是Fab分子。
在一个方面，抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。
在一个方面，第一抗原结合结构域为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是可变结构域VL和VH彼此替换。
在一个方面，第二抗原结合结构域和在存在时的第三抗原结合结构域为常规Fab分子。
在一个方面，第二抗原结合结构域和在存在时的第三抗原结合结构域为Fab分子，其中在恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)；并且在恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)，并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域彼此融合，任选地经由肽接头融合。
在一个方面，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自为Fab分子并且(i)第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合，或者(ii)第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合。
在一个方面，第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域以及在存在时的第三抗原结合结构域各自为Fab分子，并且抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；并且其中(i)第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合，并且第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基的N末端融合，或者(ii)第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合，并且第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基的N末端融合；并且第三抗原结合结构域在存在时在Fab重链的C末端与Fc结构域的第二亚基的N末端融合。
在一个方面，Fc结构域是IgG，特别是IgG1 Fc结构域。在一个方面，Fc结构域是人Fc结构域。在一个方面，Fc包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基进行缔合的修饰。在一个方面，Fc结构域包含降低与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或更多个氨基酸取代。
在一个方面，第二抗原结合结构域和在存在时的第三抗原结合结构域包含(i)VH，其包含SEQ ID NO:15的HCDR 1、SEQ ID NO:16的HCDR 2和SEQ ID NO:17的HCDR 3；以及VL，其包含SEQ ID NO:19的LCDR 1、SEQ ID NO:20的LCDR 2和SEQ ID NO:21的LCDR 3；或(ii)VH，其包含SEQ ID NO:28的HCDR 1、SEQ ID NO:29的HCDR 2和SEQ ID NO:30的HCDR 3；以及VL，其包含SEQ ID NO:32的LCDR 1、SEQ ID NO:33的LCDR 2和SEQ ID NO:34的LCDR 3。在一个方面，第二抗原结合结构域和在存在时的第三抗原结合结构域包含(i)VH，其包含与SEQID NO:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(ii)VH，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
根据本发明的另一个方面，提供了编码本发明的抗体的分离的多核苷酸和包含本发明的分离的多核苷酸的宿主细胞。
在另一方面，提供了产生与CD3和CD19结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：(a)在适合表达该抗体的条件下培养本发明的宿主细胞，以及任选地(b)回收该抗体。本发明还涵盖通过本发明的方法产生的与CD3和CD19结合的抗体。
本发明进一步提供了包含本发明的抗体和药用载体的药物组合物。
本发明还涵盖使用本发明的抗体和药物组合物的方法。在一个方面，本发明提供了用作药物的根据本发明的抗体或药物组合物。在一个方面，提供了根据本发明的用于治疗疾病的抗体或药物组合物。还提供了根据本发明的抗体或药物组合物在制造药物中的用途，以及根据本发明的抗体或药物组合物在制造用于治疗疾病的药物中的用途。本发明还提供了一种治疗个体中的疾病的方法，包括向所述个体施用有效量的根据本发明的抗体或药物组合物。在某些方面，该疾病为癌症。在其他方面，该疾病为自身免疫性疾病。
附图说明
图1本发明的(多特异性)抗体的示例性构型。(A，D)“1+1 CrossMab”分子示意图。(B，E)“2+1 IgG Crossfab”分子示意图，其中Crossfab和Fab组分的顺序交替(“倒置”)。(C，F)“2+1 IgG Crossfab”分子示意图。(G，K)“1+1 IgG Crossfab”分子示意图，其中Crossfab和Fab组分的顺序交替(“倒置”)。(H，L)“1+1 IgG Crossfab”分子示意图。(I，M)具有两个CrossFab的“2+1 IgG Crossfab”分子的示意图。(J，N)具有两个CrossFab的“2+1 IgGCrossfab”分子的示意图，其中Crossfab和Fab组分的顺序交替(“倒置”)。(O，S)“Fab-Crossfab”分子示意图。(P，T)“Crossfab-Fab”分子示意图。(Q，U)“(Fab)2-Crossfab”分子示意图。(R，V)“Crossfab-(Fab)2”分子示意图。(W，Y)“Fab-(Crossfab)2”分子示意图。(X，Z)“(Crossfab)2-Fab”分子示意图。黑点：Fc结构域中促进异源二聚化的任选修饰。++、--：任选地引入CH1和CL结构域中的具有相反电荷的氨基酸。Crossfab分子被描述为包含VH区和VL区的交换，但是可以-在其中在CH1和CL结构域中不引入电荷修饰的方面中-可替代地包含CH1和CL结构域的交换。
图2原始和优化的CD3结合剂(CD3原始和CD3优化)与重组CD3的相对结合活性，其是通过SPR在非受应激条件下、在40℃pH 6下14天后或在37℃pH 7.4下14天后所测量(IgG形式)。
图3通过流式细胞术所测量的原始和优化的CD3结合剂(CD3原始和CD3优化)与JurkatNFAT细胞的结合(IgG形式)。用荧光标记的抗人Fc特异性二级抗体检测与Jurkat NFAT细胞结合的抗体。
图4实例3中使用的CD3活化测定的示意图。
图5用原始和优化的CD3结合剂(CD3原始和CD3优化)活化Jurkat NFAT(IgG形式)。在作为阴性对照的CD3原始或CD3优化IgG PGLALA或CD3优化IgG wt的存在下，将Jurkat NFAT报告细胞与表达抗PGLALA的CHO(CHO-PGLALA)细胞共同孵育。通过测量24小时后的发光对CD3活化进行定量。
图6(A)用于实例中的T细胞双特异性(TCB)抗体分子的示意图。所有测试的TCB抗体分子均作为带有电荷修饰的“2+1 IgG CrossFab，倒置”产生(在CD3结合剂中的VH/VL交换，在靶抗原结合剂中的电荷修饰，EE＝147E、213E；RK＝123R、124K)。(B至E)用于组装TCB的成分：在CH1和CL中具有电荷修饰的抗TYRP1 Fab分子的轻链(B)、抗CD3交叉Fab分子的轻链(C)、在Fc区中具有杵和PG LALA突变的重链(D)、在Fc区中具有臼和PG LALA突变的重链(E)。
图7如通过流式细胞术所测量的CD19-TCB抗体与表达CD3的Jurkat细胞(A)以及与表达CD19的Z-138(B)和Nalm-6(C)细胞的结合。
图8由CD19-TCB抗体诱导的CD19+靶细胞的靶标特异性杀伤。(A)Z-138靶细胞，(B)Nalm-6靶细胞。
图9杀伤Z-138靶细胞后由CD19-TCB抗体诱导的T细胞活化。(A)CD4 T细胞上的CD25表达，(B)CD4 T细胞上的CD69表达，(C)CD4 T细胞上的CD107表达，(D)CD8 T细胞上的CD25表达，(E)CD8 T细胞上的CD69表达，(F)CD8 T细胞上的CD107表达。
图10杀伤Nalm-6靶细胞后由CD19-TCB抗体诱导的T细胞活化。(A)CD4 T细胞上的CD25表达，(B)CD4 T细胞上的CD69表达，(C)CD4 T细胞上的CD107表达，(D)CD8 T细胞上的CD25表达，(E)CD8 T细胞上的CD69表达，(F)CD8 T细胞上的CD107表达。
图11实例10的体内研究设计。
图12在实例10的研究中，用不同剂量的CD19-TCB或CD20-TCB处理后的体重变化。每组n＝3只小鼠。平均值+/-SEM。
图13在实例10的研究中，在具有或不具有obinituzumab(Gazyva(R)预处理(GPT))的情况下，用CD19-TCB或CD20-TCB处理后4小时时的血清中的细胞因子释放。(A)MIP-1β，(B)IL-6，(C)IFN-γ，(D)IL-5，(E)GM-CSF，(F)TNF-α，(G)IL-2，(H)IL-1β，(I)IL-13，(J)MCP1，(K)IL-8，(L)IL-10，(M)G-CSF，(N)IL-12p70，(O)IL-17。每个图中的条从左到右为：CD19-TCB 0.5mg/kg，CD19-TCB 0.15mg/kg，CD19-TCB 0.05mg/kg，GPT+CD19-TCB 0.5mg/kg，CD20-TCB 0.15mg/kg，GPT+CD20-TCB 0.15mg/kg。平均值+SEM。
图14在实例10的研究中，在具有或不具有obinituzumab(
Figure BDA0004001003030000071
)预处理(GPT)的情况下，CD19-TCB或CD20-TCB处理后4小时、24小时及72小时时血液中的B细胞计数。平均值+SEM。
图15治疗计划和实验设置。人源化NSG小鼠经皮下植入淋巴瘤患者来源的异种移植物(PDX)(500万个细胞)。根据卡尺测量计算肿瘤体积。当肿瘤体积达到200mm3时，基于肿瘤大小将小鼠随机分为8组。然后每周向小鼠注射(i.v.)媒介物或0.5mg/kg CD19-TCB。
图16CD19-TCB治疗对肿瘤生长的影响。如图15中所描述，对于B组中的n＝7只小鼠和A组中的n＝8只小鼠，根据卡尺测量每周两次(体积<1000mm3)或三次(体积≥1000mm3)计算肿瘤体积。通过Mann-Whitney检验，平均值+SD，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001。箭头表示用CD19-TCB或媒介物进行的4次治疗中的每一次。
具体实施方式
I.定义
除非在下文中另外定义，否则本文使用的术语通常如本领域中所使用的。
如本文所用，关于抗原结合结构域等的术语“第一”、“第二”或“第三”在每种类型的部分多于一种时用于方便区分。除非明确说明，否则这些术语的使用并非旨在赋予部分的特定次序或取向。
术语“抗CD3抗体”和“结合CD3的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合CD3，使得所述抗体可用作靶向CD3的诊断和/或治疗剂。在一个方面，例如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，抗CD3抗体与不相关的、非CD3蛋白的结合程度小于抗体与CD3结合的约10％。在某些方面，与CD3结合的抗体具有≤1μM、≤500nM、≤200nM、或≤100nM的解离常数(KD)。如例如通过SPR测量，当抗体的KD为1μM或更小时，则称该抗体与CD3“特异性结合”。在某些方面，抗CD3抗体与CD3的表位结合，所述表位在来自不同物种的CD3中是保守的。
类似地，术语“抗CD19抗体”和“与CD19结合的抗体”是指此类抗体，其能够以足够的亲和力结合CD19，使得该抗体可用作靶向CD19的诊断和/或治疗剂。在一个方面，例如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，抗CD19抗体与不相关的、非CD19蛋白的结合程度小于抗体与CD19结合的约10％。在某些方面，与CD19结合的抗体具有≤1μM、≤500nM、≤200nM、或≤100nM的解离常数(KD)。如例如通过SPR测量，当抗体的KD为1μM或更小时，则称该抗体与CD19“特异性结合”。在某些方面，抗CD19抗体与CD19的表位结合，所述表位在来自不同物种的CD19中是保守的。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，其包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv和scFab)；单结构域抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，请参见Hollinger和Hudson,NatureBiotechnology 23:1126-1136(2005)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换使用以指代具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可能的变异抗体外，该群体中包括的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，所述可能的变异抗体例如含有天然存在的突变或是在单克隆抗体制备物的生产过程中产生的，此类变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“分离的”抗体为已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些方面，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度，纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法)方法测定。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。在一些方面，本发明提供的抗体是分离的抗体。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在该抗体中重链及/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链及/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些方面，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR对应于非人抗体的CDR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。此类可变结构域在本文中称为“人源化可变区”。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。在一些方面，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体全套库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。在某些方面，人抗体来源于非人转基因哺乳动物，例如小鼠、大鼠或兔。在某些方面，人抗体来源于杂交瘤细胞系。在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段也被认为是人抗体或人抗体片段。
术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分，该部分包含与抗原的部分或全部结合并互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。在优选的方面，抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和互补决定区(CDR)。参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman&Co，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。如本文所用，与可变区序列有关的“Kabat编号”是指由Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)提出的编号系统。
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和恒定结构域的氨基酸位置根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统进行编号，并且在本文中被称为“根据Kabat编号”或“Kabat编号”。具体地讲，将Kabat编号系统(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第647页至第660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且将Kabat EU索引编号系统(参见第661页至第723页)用于重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)，这在本文中通过在此种情况下称为“根据Kabat EU索引编号”或“Kabat EU索引编号”来进一步阐明。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并且确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。一般来讲，抗体包含六个CDR；三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，并且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)出现在以下氨基酸残基处的高可变环：26至32(L1)、50至52(L2)、91至96(L3)、26至32(H1)、53至55(H2)和96至101(H3)(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)出现在以下氨基酸残基处的CDR：24至34(L1)、50至56(L2)、89至97(L3)、31至35b(H1)、50至65(H2)和95至102(H3)(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))；以及
(c)出现在以下氨基酸残基处的抗原接触点：27c至36(L1)、46至55(L2)、89至96(L3)、30至35b(H1)、47至58(H2)，以及93至101(H3)(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另外指明，否则CDR根据出处同上的Kabat等人所述的方法确定。本领域的技术人员将理解，CDR名称也可以根据出处同上的Chothia所述的方法、出处同上的McCallum所述的方法或者任何其他在科学上接受的命名系统来确定。
“框架”或“FR”是指除互补决定区(CDR)之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常在VH(或VL)中以如下次序出现：FR1-HCDR1(LCDR1)-FR2-HCDR2(LCDR2)-FR3-HCDR3(LCDR3)-FR4。
除非另外指明，否则可变结构域中的CDR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，出处同上编号。
出于本文目的的“受体人框架”是这样的框架，其包含来源于如下所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与所述人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列，或者其可以包含氨基酸序列变化。在一些方面，氨基酸变化的数量为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少或2个或更少。在一些方面，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述的亚组。
本文中的术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。从N端到C端，每条重链具有可变结构域(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变区)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N端到C端，每条轻链具有可变结构域(VL)(也称为轻链可变结构域或轻链可变区)，接着是一个恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归类为以下五种类型之一：α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可以进一步分为多个亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而归类为以下两种类型之一：κ和λ。免疫球蛋白实质上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
抗体或免疫球蛋白的“类”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“Fab分子”是指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1结构域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL结构域组成的蛋白质。
所谓“交叉”Fab分子(也称为“Crossfab”)，意指以下Fab分子：其中Fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域发生交换(即互相替换)，即交叉Fab分子包含由轻链可变结构域VL和重链恒定结构域1 CH1组成的肽链(VL-CH1，在N端至C端方向)，以及由重链可变结构域VH和轻链恒定结构域CL组成的肽链(VH-CL，在N端至C端方向)。为清楚起见，在其中Fab轻链的可变结构域和Fab重链的可变结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链恒定结构域1 CH1的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。相反地，在其中Fab轻链的恒定结构域和Fab重链的恒定结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链可变结构域VH的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。
与之相比，所谓“常规”Fab分子，意指处于其天然形式的Fab分子，即，包含由重链可变结构域和恒定结构域组成的重链(VH-CH1，在N端至C端方向)，以及由轻链可变结构域和恒定结构域组成的轻链(VL-CL，在N端至C端方向)。
本文的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区，该C端区含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个方面，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链C端的一个或更多个(特别是一个或两个)氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可以包括全长重链，或者该抗体可以包括全长重链的切割变体。这可能是重链的最后两个C端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据Kabat EU索引编号)时的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。如果没有另外指明，则包含Fc区(或如本文所定义的Fc结构域的亚基)的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有C末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在一个方面，包括如本文所指定的Fc区(亚基)的重链包含在根据本发明的抗体中，该重链包含另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在一个方面，包括如本文所指定的Fc区(亚基)的重链包含在根据本发明的抗体中，所述重链包含另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)来编号的，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991(还可参见上文)中所述。如本文所用，Fc结构域的“亚基”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种，即包含免疫球蛋白重链的C端恒定区的多肽，该多肽能够稳定自缔合。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgGCH2恒定结构域和IgG CH3恒定结构域。
所谓“融合”，意指组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)直接地或经由一个或更多个肽接头通过肽键链接。
术语“多特异性”意指该抗体能够特异性地结合至少两种不同的抗原决定簇。多特异性抗体可以是例如双特异性抗体。典型地，双特异性抗体包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每一个对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些方面，该多特异性(例如双特异性)抗体能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种不同细胞上表达的两种抗原决定簇。
如本文所用的术语“价”表示在抗原结合分子中存在指定数目的抗原结合位点。因此，术语“与抗原单价结合”表示在抗原结合分子中存在对抗原具有特异性的一个(并且不超过一个)抗原结合位点。
“抗原结合位点”是指提供与抗原的相互作用的抗原结合分子的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)的氨基酸残基。天然免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，Fab分子通常具有单个抗原结合位点。
如本文所用，术语“抗原决定簇”或“抗原”是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合结构域与所述位点结合，从而形成抗原结合结构域-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。在一个优选方面，抗原是人类蛋白质。
除非另外指明，否则“CD3”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工CD3，以及由细胞中的加工所产生的任何形式的CD3。该术语还涵盖CD3的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个方面，CD3是人CD3，特别是人CD3的ε亚基(CD3ε)。人CD3ε的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:45中(无信号肽)。还参见UniProt(www.uniprot.org)登录号P07766(版本209)，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1。在另一方面，CD3是食蟹猴(Macacafascicularis)CD3，特别是食蟹猴CD3ε。食蟹猴CD3ε的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:46中(无信号肽)。还参见NCBI GenBank no.BAB71849.1。在某些方面，本发明的抗体与在来自不同物种的CD3抗原中保守的CD3(特别是人和食蟹猴CD3)的表位结合。在优选的方面，抗体与人CD3结合。
如本文所用，“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞，例如B细胞表面上的抗原决定簇。优选地，靶细胞抗原不是CD3，和/或在与CD3不同的细胞上表达。根据本发明，靶细胞抗原是CD19，特别是人CD19。
除非另外指明，否则“CD19”代表分化簇19(也称为B淋巴细胞抗原CD19或B淋巴细胞表面抗原B4)并且是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD19，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工CD19，以及由细胞中的加工所产生的任何形式的CD19。该术语还涵盖CD19的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个方面，CD19是人CD19。参见人蛋白质UniProt(www.uniprot.org)登录号P15391(版本211)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_001761.3。在某些方面，本发明的抗体与在来自不同物种的CD19抗原中保守的CD19(特别是人和食蟹猴CD19)的表位结合。在优选的方面，抗体与人CD19结合。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的完善确立的方法测量，包括本文所述的那些方法。用于测量亲和力的优选方法是表面等离子体共振(SPR)。
“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个互补决定区(CDR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致了抗体对抗原的亲和力的改善。
“降低的结合”(例如降低的与Fc受体的结合)是指对相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为清楚起见，该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即完全消除相互作用。相反地，“增加的结合”是指对相应相互作用的结合亲和力增加。
如本文所用，“T细胞激活”是指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞响应，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和激活标志物的表达。测量T细胞激活的合适测定是本领域已知的并在本文中描述的。
“促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰”是对肽骨架的操纵或Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成同源二聚体。如本文所用，“促进缔合的修饰”优选地包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一者进行的单独修饰，其中所述修饰彼此互补以促进这两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可以改变所述Fc结构域亚基中的一者或两者的结构或电荷，以便分别使它们的缔合在空间上或静电上有利。因此，(异源)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，就融合至每个亚基的另外组分(例如抗原结合结构域)而言则可能是不同的。在一些方面，促进Fc域的第一亚基与第二亚基的缔合的修饰包含Fc结构域中的氨基酸突变，具体是氨基酸取代。在一个优选的方面，所述促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰在Fc结构域的两个亚基中的每个亚基中包含单独的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。
“活化性Fc受体”是这样的Fc受体：其在被抗体的Fc结构域接合后引发刺激携带该受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。人活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是与包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞，该特异性结合通常是通过Fc区的N末端的蛋白质部分。如本文所用，术语“降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量减少，和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度增加。ADCC降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的)，由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如，由在Fc结构域中包含降低ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的降低是相对于由在Fc结构域中没有该氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC。用于测量ADCC的合适测定法是本领域中熟知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT公开号WO 2012/130831)。
如本文所用，术语“工程化、工程化的、工程改造”被认为包括对肽骨架的任何操纵，或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程改造包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。
如本文所用的术语“氨基酸突变”表示涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体，前提条件是所述最终构建体具有所需特征，例如减少的与Fc受体的结合，或增加的于另一种肽的缔合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和插入。优选的氨基酸突变是氨基酸取代。出于改变例如Fc区的结合特征的目的，非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸，是特别优选的。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)进行替代。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法来产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。设想通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。本文可使用各种名称来指示相同的氨基酸突变。例如，将Fc结构域的329位处的脯氨酸取代为甘氨酸可以表示为329G、G329、G329、P329G、或Pro329Gly。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并且引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。可替代地，可以使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成同一性百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册，并且在WO 2001/007611中有所描述。
除非另外指明，否则出于本文的目的，用BLOSUM50比较矩阵，使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序产生氨基酸序列同一性％值。FASTA程序包由以下文献创作：W.R.Pearson和D.J.Lipman,“Improved Tools for Biological SequenceAnalysis”,PNAS 85(1988):2444-2448；W.R.Pearson“Effective protein sequencecomparison”Meth.Enzymol.266(1996):227-258；以及Pearson等人，(Genomics 46(1997)24-36)并且可从www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta公开获得。可替代地，可以使用可在fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)来确保执行全局而非局部比对。在输出比对标头中给出氨基酸同一性百分比。
术语“多核苷酸”或“核酸分子”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由以下构成：碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))；糖(即脱氧核糖或核糖)；和磷酸酯基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见例如Stadler等人，(2017)Nature Medicine 23:815-817，或EP 2 101 823 B1)。
“分离的”核酸分子是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸分子包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“编码抗体的分离的多核苷酸(或核酸)”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个多核苷酸分子，包括在单一载体或不同的载体中的此类多核苷酸分子，以及存在于宿主细胞中一个或多个位置的此类多核苷酸分子。
如本文所用的术语“载体”是指能够载运与其相连的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可用于产生本发明的抗体的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物的培养细胞，诸如仅举几个示例HEK细胞、CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个方面，本发明的宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞。在一个方面，宿主细胞不是人体内的细胞。
术语“药物组合物”或“药物制剂”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
“药用载体”是指药物组合物或配制物中除有效成分之外的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
如本文所用，“治疗”(及其语法变体)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或可以在临床病理学过程中执行的临床干预措施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些方面，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些方面，个体或受试者是人。
药剂(例如药物组合物)的“有效量”是指能够以必需的剂量在必需的时段内有效地实现期望的治疗或预防结果的量。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
II.组合物和方法
本发明提供了与CD3和CD19结合的抗体。这些抗体显示出优异的稳定性，并结合其他有利于治疗应用的特性，例如关于功效和安全性、药代动力学以及可生产性。本发明的抗体可用于例如治疗疾病，诸如癌症或自身免疫性疾病。
A.抗CD3/CD19抗体
在一个方面，本发明提供了与CD3和CD19结合的抗体。在一个方面，提供了与CD3和CD19结合的分离的抗体。在一个方面，本发明提供了与CD3和CD19特异性结合的抗体。在某些方面，抗CD3/CD19抗体在pH 7.4、37℃2周后保留超过约90％的CD3结合活性，其相对于如通过表面等离子体共振(SPR)所测定的在pH 6、-80℃2周后的结合活性。
在一个方面，本发明提供了与CD3和CD19结合的抗体，其中抗体包含(a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含SEQID NO:2的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:3的HCDR 2和SEQ ID NO:5的HCDR 3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:8的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:9的LCDR 2和SEQ IDNO:10的LCDR 3。
在一个方面，抗体为人源化抗体。在一个方面，第一抗原结合结构域是人源化抗原结合结构域(即人源化抗体的抗原结合结构域)。在一个方面，第一抗原结合结构域的VH和/或VL是人源化可变区。
在一个方面，第一抗原结合结构域的VH和/或VL包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个方面，第一抗原结合结构域的VH包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列的一个或多个重链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面，第一抗原结合结构域的VH包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，第一抗原结合结构域的VH包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。在一个方面，第一抗原结合结构域的VH包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约98％相同的氨基酸序列。在某些方面，至少具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗体保留了与CD3结合的能力。在某些方面，在SEQ ID NO:7的氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个方面，第一抗原结合结构域的VH包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。任选地，第一抗原结合结构域的VH包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个方面，第一抗原结合结构域的VL包含SEQ ID NO:11的轻链可变区序列的一个或多个轻链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面，第一抗原结合结构域的VL包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，第一抗原结合结构域的VL包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。在一个方面，第一抗原结合结构域的VL包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少约98％相同的氨基酸序列。在某些方面，至少具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗体保留了与CD3结合的能力。在某些方面，在SEQ ID NO:11的氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个方面，第一抗原结合结构域的VL包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。任选地，第一抗原结合结构域的VL包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个方面，第一抗原结合结构域的VH包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，并且第一抗原结合结构域的VL包含与SEQID NO:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，第一抗原结合结构域的VH包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列并且第一抗原结合结构域的VL包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了与CD3和CD19结合的抗体，其中抗体包含与CD3结合的第一抗原结合结构域，其包含VH和VL，该VH包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，该VL包含SEQID NO:11的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了与CD3和CD19结合的抗体，其中抗体包含与CD3结合的第一抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:11的VL序列。
在另一个方面，本发明提供了与CD3和CD19结合的抗体，其中抗体包含与CD3结合的第一抗原结合结构域，其包含VH和VL，该VH包含SEQ ID NO:7的VH重链CDR序列，该VL包含SEQ ID NO:11的VL轻链CDR序列。
在另一个方面，第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:11的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个方面，第一抗原结合结构域的VH包含SEQ ID NO:7的VH重链CDR序列；和框架，该框架与SEQ ID NO:7的VH框架序列至少有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，第一抗原结合结构域的VH包含SEQ ID NO:7的VH重链CDR序列；和框架，该框架与SEQ ID NO:7的VH框架序列至少有95％的序列同一性。在另一个方面，第一抗原结合结构域的VH包含SEQ ID NO:7的VH重链CDR序列；和框架，该框架与SEQ ID NO:7的VH框架序列至少有98％的序列同一性。
在一个方面，第一抗原结合结构域的VL包含SEQ ID NO:11的VL轻链CDR序列；和框架，该框架与SEQ ID NO:11的VL框架序列至少有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，第一抗原结合结构域的VL包含SEQ ID NO:11的VL轻链CDR序列；和框架，该框架与SEQ ID NO:11的VL框架序列至少有95％的序列同一性。在另一个方面，第一抗原结合结构域的VL包含SEQ ID NO:11的VL轻链CDR序列；和框架，该框架与SEQ ID NO:11的VL框架序列至少有98％的序列同一性。
在一个方面，本发明提供了与CD3和CD19结合的抗体，其中抗体包含与CD3结合的第一抗原结合结构域，其包含VH序列和VL序列，VH序列如在上文提供的方面中任一项所述，VL序列如在上文提供的方面中任一项所述。
在一个方面，抗体包含人恒定区。在一个方面，抗体是包含人恒定区的免疫球蛋白分子，特别是包含人CH1、CH2、CH3和/或CL结构域的IgG类免疫球蛋白分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53(分别为人κ和λCL结构域)和SEQ ID NO:54(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一个方面，所述抗体包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含与SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个方面，所述抗体包含重链恒定区，所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。具体地，重链恒定区可包含如本文所述的Fc结构域中的氨基酸突变。
在一个方面，第一抗原结合结构域包含人恒定区。在一个方面，第一抗原结合部分是包含人恒定区，特别是人CH1和/或CL结构域的Fab分子。在一个方面，第一抗原结合结构域包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含的氨基酸序列，与SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。具体地，轻链恒定区可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变和/或如果在交叉Fab分子中则可以包含对一个或多个(特别是两个)N末端氨基酸的缺失或取代。在一个方面，第一抗原结合结构域包含重链恒定区，该重链恒定区包含的氨基酸序列，与包含在SEQ ID NO:54所示氨基酸序列中的CH1结构域序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。具体地，重链恒定区(特别是CH1结构域)可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变。
在一个方面，抗体为单克隆抗体。
在一个方面，抗体是IgG，特别是IgG1抗体。在一个方面，抗体是全长抗体。
在另一个方面，抗体是选自Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab’)2分子的抗体片段；特别是Fab分子。在另一方面，抗体片段是双体抗体、三体抗体或四体抗体。
在一个方面，第一抗原结合结构域是Fab分子。在一个优选的方面，第一抗原结合结构域是Fab分子，其中所述Fab轻链和所述Fab重链的所述可变结构域VL和VH彼此替换或所述恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是所述可变结构域VL和VH彼此替换(即第一抗原结合结构域是交叉Fab分子)。
在另一方面，根据上述方面中任一项所述的抗体可单独或组合地合并如下第II部分A.1.-8所述的特征。
在一个优选的方面，抗体包含Fc结构域，特别是IgG Fc结构域，更特别是IgG1 Fc结构域。在一个方面，Fc结构域是人Fc结构域。在一个方面，所述Fc结构域是IgG1 Fc结构域。Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成，并且可以单独或组合地并入如下文关于Fc结构域变体(第II.节A.8.)中所述的任何特征。
根据本发明，该抗体包含与CD19结合的第二抗原结合结构域和任选的第三抗原结合结构域(即该抗体是多特异性抗体，如下文进一步描述的(章节II.A.7.)中所述的任何特征。
1.抗体片段
在某些方面，本文提供的抗体是抗体片段。
在一个方面，抗体片段是Fab’、Fab’-SH或F(ab’)2分子，特别是如本文所述的Fab分子。“Fab’分子”与Fab分子的不同之处在于Fab’片段在CH1结构域的羧基末端添加了残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是Fab’分子，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')2分子，该分子具有两个抗原结合位点(两个Fab分子)和Fc区的一部分。
在另一方面，抗体片段是双体抗体、三体抗体或四体抗体。“双体抗体”是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体也在Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中进行了描述。
在另一个方面，抗体片段是单链Fab分子。“单链Fab分子”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N端至C端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL、b)VL-CL-接头-VH-CH1、c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL。特别地，所述接头是至少30个氨基酸，优选地在32个与50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab分子经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab分子可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。
在另一方面，抗体片段是单链可变片段(scFv)。“单链可变片段”或“scFv”是抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的融合蛋白，是通过接头连接的。特别地，接头是10个至约25个氨基酸的短多肽，并且通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可以将VH的N-末端与VL的C-末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并且引入了接头，但该蛋白质仍保留了原始抗体的特异性。关于scFv片段的综述，参见例如Pl ü ckthun，载于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑(Springer-Verlag,New York)，第269至第315页(1994)；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。
在另一方面，抗体片段是单结构域抗体。“单结构域抗体”是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者抗体的全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些方面，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌)重组产生，如本文所述。
2.人源化抗体
在某些方面，本文提供的抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些方面，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall’Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。
可用于人源化的人架构区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的架构区(参见例如Sims等人，J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定子组的人抗体的共有序列的架构区(参见，例如，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人，J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)架构区或人类种系架构区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的架构区(参见，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
3.糖基化变体
在某些方面，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。糖基化位点向抗体的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
当抗体包含Fc区时，与其相连的寡糖可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的、双触角寡糖，该双触角寡糖通常通过N-键结连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些方面中，可对本发明的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
一方面，提供了具有非岩藻糖基化的寡糖的抗体变体，即缺少(直接或间接地)连接在Fc区的岩藻糖的寡糖结构。这样的非岩藻糖基化的寡糖(也称为“去岩藻糖基化”的寡糖)特别是N-连接的寡糖，其缺少在双触角寡糖结构的茎中连接第一GlcNAc的岩藻糖残基。一方面，提供了与天然或亲本抗体相比在Fc区中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体变体。例如，非岩藻糖基化寡糖的比例可以为至少约20％、至少约40％、至少约60％、至少约80％或甚至约100％(即不存在岩藻糖基化寡糖)。非岩藻糖基化寡糖的百分比，如例如WO2006/082515中所述，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，是缺少岩藻糖残基的寡糖的(平均)量相对于与Asn 297连接的所有寡糖(例如复杂、杂合和高甘露糖结构)之和。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可以位于297位上游或下游大约±3个氨基酸，即在294位和300位之间。在Fc区中具有非岩藻糖基化寡糖比例增加的此类抗体可具有改善的FcγRIIIa受体结合和/或改善的效应子功能，特别是改善的ADCC功能。参见例如US 2003/0157108和US 2004/0093621。
能够产生岩藻糖基化减少的抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，尤其是在实例11中)，以及敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人.Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)，或具有降低或取消的GDP-岩藻糖合成或转运蛋白活性的细胞(参见，例如，US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在另一方面，抗体变体提供了二等分的寡糖，例如，其中连接至抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。如上所述，这样的抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如Umana等人,Nat Biotechnol 17,176-180(1999)；Ferrara等人,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540,WO 2003/011878。
还提供了在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087、WO 1998/58964和WO 1999/22764中。
4.半胱氨酸工程抗体变体
在某些方面，可能需要产生半胱氨酸工程化改造的抗体，例如THIOMABTM抗体，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在优选的方面，取代的残基存在于抗体的可接近位点。如本文进一步描述的，通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性硫醇基团定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)缀合，以产生免疫缀合物。半胱氨酸工程化改造的抗体可以如例如在美国专利号7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130或WO 2016040856中所述产生。
5.抗体衍生物
在某些方面，可进一步修饰本文提供的抗体以使其含有本领域已知且易于获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接至抗体的聚合物的数目可变，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素测定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
6.免疫缀合物
本发明还提供了免疫缀合物，其包含本文的抗CD3/CD19抗体，该抗体缀合(化学键合)至一种或多种治疗剂，诸如细胞毒性剂、化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。
一方面，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至上述一种或多种治疗剂。通常使用接头将抗体连接至一种或多种治疗剂。Pharmacol Review 68:3-19(2016)中列出了ADC技术的概述，其包括治疗剂、药物和接头的实例。
在另一方面，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的本发明的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-sarcin、油桐蛋白、石竹素蛋白(dianthin protein)、美洲商陆蛋白(Phytolaca americana protein)(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂(momordica charantia inhibitor)、麻疯树毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草抑制剂(sapaonaria officinalis inhibitor)、明胶、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。
在另一方面，免疫缀合物包括与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的本发明的抗体。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可能包含用于闪烁显像研究的放射性原子，例如，Tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记物，例如I123、I131、In111、F19、C13、N15、O17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备抗体和细胞毒剂的缀合物。例如，可以如Vitetta等人，Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至抗体。参见WO 94/11026。接头可以为促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割接头”。例如，可以使用对酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、对光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等人，Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于市售的(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
7.多特异性抗体
本文提供的抗体是多特异性抗体，特别是双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同的抗原决定簇(例如，两种不同的蛋白质，或同一蛋白质上的两种不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些方面，多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。根据本发明，结合特异性中的一种是针对CD3的，并且另一种特异性是针对CD19的。
可以将多特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983))及“杵臼结构”工程化(参见例如，美国专利5,731,168，以及Atwell等人，J.Mol.Biol.270:26(1997))。多特异性抗体还可以通过以下方式来制备：工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电操纵效应(参见例如，WO 2009/089004)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如，美国专利号4,676,980，以及Brennan等人，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用用于避免轻链错配问题的常用轻链技术(参见例如，WO 98/50431)；使用用于制备双特异性抗体片段的“双体抗体”技术(参见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化抗体，包括例如“章鱼抗体”或者DVD-Ig(参见例如，WO 2001/77342和WO 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其他示例可以在WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2013/026831中找到。多特异性抗体或其抗原结合片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含与CD3以及另一种不同抗原结合或与CD3的两个不同表位结合的抗原结合位点(参见例如，US 2008/0069820和WO 2015/095539)。
多特异性抗体也可以以不对称形式提供，其中在具有相同抗原特异性(所谓的“CrossMab”技术)的一个或多个结合臂中有结构域交叉，即通过交换VH/VL结构域(参见例如，WO 2009/080252和WO 2015/150447)、CH1/CL结构域(参见例如，WO 2009/080253)或完整的Fab臂(参见例如，WO 2009/080251、WO 2016/016299，还参见Schaefer等人，PNAS,108(2011)1187-1191，以及Klein等人，MAbs 8(2016)1010-20)。还可以通过将荷电或非荷电的氨基酸突变引入结构域界面以指导正确的Fab配对，以对不对称Fab臂进行工程化。参见例如WO 2016/172485。
多特异性抗体的各种其他分子形式是在本领域中已知的并且包括在本文中(参见例如Spiess等人，Mol Immunol 67(2015)95-106)。
一种特定类型的多特异性抗体是此类双特异性抗体，该双特异性抗体经设计用于同时结合靶细胞(例如，B细胞)上的表面抗原和T细胞受体(TCR)复合物的活化不变组分(诸如CD3)，以用于再靶向T细胞以杀伤靶细胞。因此，本文提供的抗体是多特异性抗体，特别是双特异性抗体，其中结合特异性中的一种针对CD3而另一种针对作为靶细胞抗原的CD19。
可用于此目的双特异性抗体形式的实例包括但不限于：所谓“BiTE”(双特异性T细胞募召剂)分子，其中两个scFv分子通过柔性接头融合(参见例如WO 2004/106381；WO2005/061547；WO 2007/042261；WO 2008/119567；Nagorsen和
Figure BDA0004001003030000331
Exp Cell Res317，1255-1260(2011))；双体抗体(Holliger等人，Prot Eng 9，299-305(1996))及其衍生物，诸如串联双体抗体(“TandAb”；Kipriyanov等人，J Mol Biol 293，41-56(1999))；“DART”(双亲和性重新靶向)分子，其基于双体抗体形式，但具有C末端二硫键以实现额外的稳定化(Johnson等人，J Mol Biol 399，436-449(2010))；以及所谓的三功能抗体，其为完整的杂交小鼠/大鼠IgG分子(如Seimetz等人所综述：Cancer Treat Rev 36，458-467(2010))。本文所包含的特定的T细胞双特异性抗体形式描述于以下文献中：WO 2013/026833；WO 2013/026839；WO 2016/020309；Bacac等人，Oncoimmunology 5(8)(2016)e1203498。
本发明的抗体的优选方面描述如下。
在一个方面，本发明提供一种与CD3和CD19结合的抗体，其包含与CD3结合的第一抗原结合结构域，如本文所述，并且包含与CD19结合的第二抗原结合结构域和任选的第三抗原结合结构域。
根据本发明的优选的方面，包含在抗体中的抗原结合结构域是Fab分子(即由重链和轻链组成的抗原结合结构域，每个抗原结合结构域包含可变结构域和恒定结构域)。在一个方面，所述第一抗原结合结构域、所述第二抗原结合结构域和/或在存在时的第三抗原结合结构域是Fab分子。在一个方面，所述Fab分子是人。在优选的方面，所述Fab分子是人源化的。在另一方面，所述Fab分子包含人重链和轻链恒定结构域。
优选地，所述抗原结合结构域中的至少一个抗原结合结构域是交叉Fab分子。这种修饰减少了来自不同Fab分子的重链和轻链的错配，从而提高了重组生产中本发明的(多特异性)抗体的产率和纯度。在可用于包含在本发明的(多特异性)抗体的优选的交叉Fab分子中，Fab轻链和Fab重链的可变结构域(分别为VL和VH)交换。然而，即使进行该结构域交换，由于错配的重链与轻链之间的所谓Bence Jones型相互作用，(多特异性)抗体的制备可能包含某些副产物(参见Schaefer等人，PNAS,108(2011)11187-11191)。为进一步减少来自不同Fab分子的重链和轻链的错配并由此提高所需的(多特异性)抗体的纯度和产率，可以在与CD3结合的Fab分子或与CD19结合的Fab分子的CH1和CL结构域中的特定氨基酸位置处引入带有相反电荷的荷电氨基酸，如本文中进一步所述。在包含在(多特异性)抗体中的常规Fab分子中(诸如例如在图1A-C、G-J中所示)或在包含在(多特异性)抗体中的VH/VL交叉Fab分子中(诸如例如在图1D-F、K-N中所示)(而不是在两者中)进行荷电改性。在优选的方面，在包含在(多特异性)抗体中的常规Fab分子(其在优选的方面与CD19结合)中进行荷电改性。
在根据本发明的优选方面，(多特异性)抗体能够同时与CD3和CD19结合。在一个方面，(多特异性)抗体能够通过同时与CD3和CD19结合来交联T细胞和靶细胞。在一甚至更优选的方面，这种同时结合导致靶细胞，特别是表达CD19的靶细胞(诸如B细胞)的裂解。在一个方面，这种同时结合导致T细胞的活化。在其它方面，这种同时结合导致T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的细胞应答，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。在一个方面，(多特异性)抗体与CD3结合而不同时与CD19结合不会导致T细胞活化。
在一个方面，(多特异性)抗体能够将T细胞的细胞毒活性重新导向靶细胞。在优选的方面，所述重新导向不依赖于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。
优选地，根据本发明任何方面的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些方面，T细胞是CD4+或CD8+T细胞，特别是CD8+T细胞。
a)第一抗原结合结构域
本发明的(多特异性)抗体包含至少一个与CD3结合的抗原结合结构域(第一抗原结合结构域)。在优选的方面，CD3是人CD3(SEQ ID NO:45)或食蟹猴CD3(SEQ ID NO:46)，最特别是人CD3。在一个方面，第一抗原结合结构域与人和食蟹猴CD3交叉反应(即特异性结合)。在一些方面，CD3是CD3的ε亚基(CD3ε)。
在一个优选的方面，(多特异性)抗体包含不超过一个与CD3结合的抗原结合结构域。在一个方面，(多特异性)抗体提供了与CD3的单价结合。
在一个方面，与CD3结合的抗原结合结构域是选自下组的抗体片段：Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab’)2分子。在一个优选的方面，与CD3结合的抗原结合结构域是Fab分子。
在优选的方面，与CD3结合的抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在该Fab分子中，Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。在此类方面，与CD19结合的抗原结合结构域优选地是常规Fab分子。在(多特异性)抗体中存在超过一个与CD19结合的抗原结合结构域，特别是Fab分子的方面，与CD3结合的抗原结合结构域优选是交叉Fab分子，并且与CD19结合的抗原结合结构域是常规Fab分子。
在替代方面，与CD3结合的抗原结合结构域是常规Fab分子。在此类方面，与CD19结合的抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在该Fab分子中，Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。在(多特异性)抗体中存在超过一个与CD3结合的抗原结合结构域，特别是Fab分子的方面，与CD19结合的抗原结合结构域优选是交叉Fab分子，并且与CD3结合的抗原结合结构域是常规Fab分子。
在优选的方面，第一抗原结合结构域是Fab分子，其中所述Fab轻链和所述Fab重链的所述可变结构域VL和VH彼此替换或所述恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是所述可变结构域VL和VH彼此替换(即，根据此类方面，第一抗原结合结构域是交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定域被交换)。在一个这样的方面，第二(和第三，如果有的话)抗原结合结构域是常规Fab分子。
在一个方面，(多特异性)抗体中存在不超过一个与CD3结合的抗原结合结构域(即抗体提供与CD3的单价结合)。
b)第二(和第三)抗原结合结构域
本发明的(多特异性)抗体包含与CD19结合的至少一个抗原结合结构域(第二抗原结合结构域和任选的第三抗原结合结构域)，特别是Fab分子。第二抗原结合结构域能够将(多特异性)抗体引导至靶位点，例如引导至表达CD19的特定类型的细胞。
在一个方面，与CD19结合的抗原结合结构域是选自下组的抗体片段：Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab’)2分子。在一个优选的方面，与CD19结合的抗原结合结构域是Fab分子。
在某些方面，(多特异性)抗体包含与CD19结合的两个抗原结合结构域，特别是Fab分子。在优选的方面，所有这些抗原结合结构域都是相同的，即它们具有相同的分子形式(例如常规或交叉Fab分子)并且包含相同的氨基酸序列(在CH1和CL结构域中包括相同的氨基酸取代，如本文所述(如果有的话))。在一个方面，(多特异性)抗体包含不超过两个与CD19结合的抗原结合结构域，特别是Fab分子。
在优选的方面，与CD19结合的抗原结合结构域是常规Fab分子。在此类方面，与CD3结合的抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。
在替代方面，与CD19结合的抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在该Fab分子中，Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。在此类方面，与CD3结合的抗原结合结构域是常规Fab分子。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)包含人恒定区。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)是包含人恒定区，特别是人CH1和/或CL结构域的Fab分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53(分别为人κ和λCL结构域)和SEQ ID NO:54(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)包含轻链恒定区，其包含与SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53的氨基酸序列，特别是SEQ IDNO:52的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。具体地，轻链恒定区可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变和/或如果在交叉Fab分子中则可以包含对一个或多个(特别是两个)N末端氨基酸的缺失或取代。在一些方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)包含重链恒定区，其包含与包含在SEQ ID NO:54的氨基酸序列中包含的CH1结构域序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。具体地，重链恒定区(特别是CH1结构域)可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含SEQ ID NO:15的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:16的HCDR 2和SEQ ID NO:17的HCDR 3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:19的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:20的LCDR 2和SEQ ID NO:21的LCDR 3。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)是(来源于)人源化抗体。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)是人源化抗原结合结构域(即人源化抗体的抗原结合结构域)。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH和/或VL是人源化可变区。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH和/或VL包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含SEQ ID NO:18的一个或多个重链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少约98％相同的氨基酸序列。在某些方面，至少具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗体保留了与CD19结合的能力。在某些方面，在SEQ ID NO:18的氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。任选地，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含SEQ ID NO:22的一个或多个轻链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少约98％相同的氨基酸序列。在某些方面，至少具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗体保留了与CD19结合的能力。在某些方面，在SEQ ID NO:22的氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。任选地，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，并且第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在另一方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)包含VH和VL，该VH包含SEQ ID NO:18的序列，该VL包含SEQ ID NO:22的序列。
在另一方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)包含SEQID NO:18的VH序列和SEQ ID NO:22的VL序列。
在另一方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)包含VH和VL，该VH包含SEQ ID NO:18的VH重链CDR序列，该VL包含SEQ ID NO:22的VL轻链CDR序列。
在另一方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)包含SEQID NO:18的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:22的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含SEQ ID NO:18的VH重链CDR序列，和框架，该框架与SEQ ID NO:18的VH框架序列至少有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含SEQ ID NO:18的VH重链CDR序列，和框架，该框架与SEQID NO:18的VH框架序列至少有95％的序列同一性。在另一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含SEQ ID NO:18的VH重链CDR序列，和框架，该框架与SEQ ID NO:18的VH框架序列至少有98％的序列同一性。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含SEQ ID NO:22的VL轻链CDR序列，和框架，该框架与SEQ ID NO:22的VL框架序列至少有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含SEQ ID NO:22的VL轻链CDR序列，和框架，该框架与SEQID NO:22的VL框架序列至少有95％的序列同一性。在另一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含SEQ ID NO:22的VL轻链CDR序列，和框架，该框架与SEQ ID NO:22的VL框架序列至少有98％的序列同一性。
在另一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含SEQ ID NO:28的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:29的HCDR 2和SEQ ID NO:30的HCDR 3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:32的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:33的LCDR 2和SEQ ID NO:34的LCDR 3。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)是(来源于)人源化抗体。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)是人源化抗原结合结构域(即人源化抗体的抗原结合结构域)。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH和/或VL是人源化可变区。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH和/或VL包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含SEQ ID NO:31的一个或多个重链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约98％相同的氨基酸序列。在某些方面，至少具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗体保留了与CD19结合的能力。在某些方面，在SEQ ID NO:31的氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。任选地，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含SEQ ID NO:35的一个或多个轻链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约98％相同的氨基酸序列。在某些方面，至少具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗体保留了与CD19结合的能力。在某些方面，在SEQ ID NO:35的氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。任选地，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，并且第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，并且第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在另一方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)包含VH和VL，该VH包含SEQ ID NO:31的序列，该VL包含SEQ ID NO:35的序列。
在另一方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)包含SEQID NO:31的VH序列和SEQ ID NO:35的VL序列。
在另一方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)包含VH和VL，该VH包含SEQ ID NO:31的VH重链CDR序列，该VL包含SEQ ID NO:35的VL轻链CDR序列。
在另一方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)包含SEQID NO:31的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:35的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含SEQ ID NO:31的VH重链CDR序列，和框架，该框架与SEQ ID NO:31的VH框架序列至少有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含SEQ ID NO:31的VH重链CDR序列，和框架，该框架与SEQID NO:31的VH框架序列至少有95％的序列同一性。在另一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VH包含SEQ ID NO:31的VH重链CDR序列，和框架，该框架与SEQ ID NO:31的VH框架序列至少有98％的序列同一性。
在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含SEQ ID NO:35的VL轻链CDR序列，和框架，该框架与SEQ ID NO:35的VL框架序列至少有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含SEQ ID NO:35的VL轻链CDR序列，和框架，该框架与SEQID NO:35的VL框架序列至少有95％的序列同一性。在另一个方面，第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的VL包含SEQ ID NO:35的VL轻链CDR序列，和框架，该框架与SEQ ID NO:35的VL框架序列至少有98％的序列同一性。
c)荷电改性
本发明的(多特异性)抗体可以在其中所包含的Fab分子中包含氨基酸取代，所述氨基酸取代特别有效地减少轻链与不匹配重链的错配(Bence-Jones型副产物)，所述错配可以发生在基于Fab的多特异性抗体的产生中，所述双/多特异性抗原结合分子在其结合臂中的一个(或在分子包含多于两个抗原结合Fab分子的情况下为多个)结合臂中具有VH/VL交换(同样参见PCT公开号WO 2015/150447，特别是其中的实例，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文)。所需的(多特异性)抗体与不期望的副产物，特别是在(多特异性)抗体的结合臂中的一个结合臂中具有VH/VL结构域交换的多特异性抗体中出现的Bence Jones型副产物的比率，可以通过在CH1和CL结构域中的特定氨基酸位置处引入带相反电荷的荷电氨基酸(有时在本文中称为“荷电改性”)来提高。
因此，在一些方面，在其中(多特异性)抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)都是Fab分子的一些方面，并且在抗原结合结构域中的一者(特别是第一抗原结合结构域)中，Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH互相替换，
i)在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号)，并且其中在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸或第213位的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)；或
ii)在第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号)，并且其中在第一抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸被带负电的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。
所述(多特异性)抗体不包含在i)和ii)中提及的两种修饰。具有VH/VL交换的抗原结合结构域的恒定结构域CL和CH1不互相替换(即保持未交换)。
在一个更具体的方面，
i)在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸或第213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)；或
ii)在第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且在第一抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个此类方面，在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸或第213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
在另一方面，在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
在优选的方面，在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
在更优选的方面，在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在甚至更优选的方面，在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在优选的方面，如果根据上述方面的氨基酸取代在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行，则第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL是κ同种型。
可替代地，根据上述方面的氨基酸取代可以在第一抗原结合结构域的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行，而不是在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行。在优选的此类方面，第一抗原结合结构域的恒定结构域CL为κ同种型的。
因此，在一个方面，在第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且在第一抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个方面，在所述第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第一抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在又一方面，在第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且在第一抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，在第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，并且在第一抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在另一方面，在第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且在第一抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个优选的方面，本发明的(多特异性)抗体包含
(a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VH和VL彼此替换，并且包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含SEQ ID NO:2的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:3的HCDR 2和SEQ ID NO:5的HCDR 3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:8的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ IDNO:9的LCDR 2和SEQ ID NO:10的LCDR 3；以及
(b)与CD19结合的第二抗原结合结构域和任选的第三抗原结合结构域；
其中在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个优选的方面，由赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个优选的方面，由赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)；并且在第二抗原结合结构域(和在存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
d)多特异性抗体形式
根据本发明的(多特异性)抗体可以具有多种构型。示例性配置在图1中描述。
在优选的方面，(多特异性)抗体中包含的抗原结合结构域是Fab分子。在此类方面，第一、第二、第三抗原结合结构域等在本文中可分别称为第一、第二、第三Fab分子等。
在一个方面，(多特异性)抗体的所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域彼此融合，任选地经由肽接头融合。在优选的方面，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自是Fab分子。在一个这样的方面，第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端。在另一这样的方面，第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端。在其中(i)第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端或(ii)第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端的方面，另外地第一抗原结合结构域的Fab轻链和第二抗原结合结构域的Fab轻链可以任选地通过肽接头彼此融合。
具有能够与第二抗原例如靶细胞抗原诸如CD19特异性结合的单个抗原结合结构域的(多特异性)抗体(诸如Fab分子)(例如如图1A、D、G、H、K、L中所示)是有用的，特别是在结合高亲和力抗原结合结构域后预期第二抗原内化的情况下。在这种情况下，存在超过一个对第二抗原特异的抗原结合结构域可能会增强第二抗原的内化，从而降低其可用性。
然而，在其他情况下，具有包含两个或更多个对第二抗原例如靶细胞抗原诸如CD19特异的抗原结合结构域的(多特异性)抗体(诸如Fab分子)将是有利的(参见图1B、1C、1E、1F、1I、1J、1M或1N所示的实例)，例如优化对靶位点的靶向或允许靶细胞抗原的交联。
因此，在优选的方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含第三抗原结合结构域。
在一个方面，第三抗原结合结构域与CD19结合。在一个方面，第三抗原结合结构域是Fab分子。
在一个方面，第三抗原结构域与第二抗原结合结构域相同。
在一些方面，第三和第二抗原结合结构域各自是Fab分子并且第三抗原结合结构域与第二抗原结合结构域相同。因此，在这些方面，第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域包含相同的重链和轻链氨基酸序列并且具有相同的结构域排列(即常规或交叉)。此外，在这些方面，第三抗原结合结构域包含与第二抗原结合结构域相同的氨基酸取代(如果有的话)。例如，本文描述为“电荷修饰”的氨基酸取代将在第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行。可替代地，所述氨基酸取代可在第一抗原结合结构域(其在优选的方面也是Fab分子)的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行，但不在第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行。
与第二抗原结合结构域一样，第三抗原结合结构域优选是常规Fab分子。然而，其中第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域是交叉Fab分子(并且第一抗原结合结构域是常规Fab分子)的方面也被考虑。因此，在优选的方面，第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子，并且第一抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在该Fab分子中，Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他方面，第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是交叉Fab分子并且第一抗原结合结构域是常规Fab分子。
如果存在第三抗原结合结构域，则在优选的方面，第一抗原结构域与CD3结合，并且第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域与CD19结合。
在优选的方面，本发明的(多特异性)抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。Fc结构域的第一亚基和第二亚基能够稳定缔合。
根据本发明的(多特异性)抗体可以具有不同的构型，即第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域(以及任选地第三抗原结合结构域)可以以不同方式彼此融合和与Fc结构域融合。组分可以直接彼此融合，或优选地经由一种或多种合适的肽接头融合。当Fab分子与Fc结构域的亚基的N末端融合时，该融合通常是经由免疫球蛋白铰链区。
在一些方面，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自是Fab分子，并且第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在此类方面，第二抗原结合结构域可以在Fab重链的C末端处融合至第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端或融合至Fc结构域的另一个亚基的N末端。在优选的此类方面，第二抗原结合结构域是常规Fab分子，并且第一抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在该Fab分子中，Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他此类方面，第二抗原结合结构域是交叉Fab分子，并且第一抗原结合结构域是常规Fab分子。
在一个方面，第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自是Fab分子，第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端，第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端。在具体的方面，(多特异性)抗体基本上由第一和第二Fab分子、第一和第二亚基构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第二Fab分子融合在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且第一Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域第一或第二亚基的N末端。这种构型在图1G和1K中示意性地描绘(在这些实例中第一抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子)。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在另一方面，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自是Fab分子，并且第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的亚基中的一者的N末端。在具体的方面，(多特异性)抗体基本上由第一Fab分子和第二Fab分子、由第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域，以及任选地一个或多个肽接头组成，其中该第一Fab分子和该第二Fab分子各自在Fab重链的C末端处与Fc结构域的亚基中的亚基中的一者的N末端融合。这种构型在图1A和1D中示意性地描绘(在这些实例中，第一抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子并且第二抗原结合结构域是常规Fab分子)。第一Fab分子和第二Fab分子可以直接或通过肽接头与Fc结构域融合。在优选的方面，所述第一Fab分子和所述第二Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在具体的方面，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在Fc结构域是IgG1 Fc结构域的情况下。
在一些方面，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自是Fab分子，并且第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在此类方面，第一抗原结合结构域可以在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端或(如上所述)融合至Fc结构域的另一个亚基的N末端。在优选的此类方面，所述第二抗原结合结构域是常规Fab分子，并且第一抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在该Fab分子中，Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他此类方面，所述第二抗原结合结构域是交叉Fab分子，并且第一抗原结合结构域是常规Fab分子。
在一个方面，第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自是Fab分子，第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端，并且第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端。在具体的方面，(多特异性)抗体基本上由第一和第二Fab分子、第一和第二亚基构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子融合在Fab重链的C末端融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域第一或第二亚基的N末端。这种构型在图1H和1L中示意性地描绘(在这些实例中，第一抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子并且第二抗原结合结构域是常规Fab分子)。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在一些方面，第三抗原结合结构域，特别是第三Fab分子，在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。在优选的此类方面，所述第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子，并且第一抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在该Fab分子中，Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他此类方面，所述第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是交叉Fab分子并且第一抗原结合结构域是常规Fab分子。
在优选的此类方面，第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的亚基中的一者的N末端，并且第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端。在具体的方面，(多特异性)抗体基本上由第一、第二和第三Fab分子、第一和第二亚基构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且第一Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第一亚基，并且其中第三Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第二亚基的N末端。这种构型示意性地描述于图1B和1E(在这些实例中，第一抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子，并且第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域是常规Fab分子)，和图1J和1N(在这些实例中，第一抗原结合结构域是常规Fab分子，并且第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子)。第一和第三Fab分子可以直接或通过肽接头融合至Fc结构域。在优选的方面，所述第一Fab分子和所述第三Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在具体的方面，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在Fc结构域是IgG1 Fc结构域的情况下。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在另一个这样的方面，第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的亚基中的一者的N末端，并且第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端。在具体的方面，(多特异性)抗体基本上由第一、第二和第三Fab分子、第一和第二亚基构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第一亚基，并且其中第三Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第二亚基的N末端。这种构型示意性地描述于图1C和1F(在这些实例中，第一抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子，并且第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域是常规Fab分子)，和图1I和1M(在这些实例中，第一抗原结合结构域是常规Fab分子，并且第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子)。第二和第三Fab分子可以直接或通过肽接头融合至Fc结构域。在优选的方面，第二Fab分子和第三Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在具体的方面，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在Fc结构域是IgG1 Fc结构域的情况下。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在(多特异性)抗体的构型中，其中Fab分子在Fab重链的C末端处通过免疫球蛋白铰链区融合至Fc结构域的亚基中的每个的N末端，所述两个Fab分子、铰链区和Fc结构域基本上形成了免疫球蛋白分子。在一个优选的方面，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在甚至更优选的方面，免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一方面，免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在另一个优选的方面，免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其他方面，免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个方面，免疫球蛋白包含人恒定区，特别是人Fc区。
在本发明的一些(多特异性)抗体中，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合，任选地通过肽接头融合。根据第一和第二Fab分子的构型，第一Fab分子的Fab轻链可以在其C末端融合至第二个Fab分子的Fab轻链的N末端，或第二Fab分子的Fab轻链可以在其C末端融合至第一Fab分子的Fab轻链的N末端。第一和第二Fab分子的Fab轻链的融合进一步减少了未匹配Fab重链和轻链的错配，并且还减少了表达本发明的一些(多特异性)抗体所需的质粒数量。
抗原结合结构域可以直接或通过肽接接头与Fc结构域融合，该肽接头包含一个或多个氨基酸，通常为约2-20个氨基酸。肽接头是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n、G4(SG4)n或(G4S)nG5肽接头。“n”通常为1至10的整数，通常为2至4。在一个方面，所述肽接头的长度为至少5个氨基酸，在一个方面，长度为5至100个氨基酸，在另一个方面为10至50个氨基酸。在一个方面，所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且(x＝3，n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝1、2、3、4或5并且m＝0、1、2、3、4或5)，在一个方面，x＝4并且n＝2或3，在另一方面，x＝4并且n＝2，在又另一个方面，x＝4，n＝1并且m＝5。在一个方面，所述肽接头是(G4S)2。在另一个方面，所述肽接头是G4SG5。用于使第一Fab分子和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合的特别合适的肽接头是(G4S)2。适于连接第一Fab片段和第二Fab片段的Fab重链的一种示例性肽接头包含序列(D)-(G4S)2(SEQ ID NO 48和49)。另一个特别合适的此类接头包含序列(D)-G4SG5(SEQ ID NO 50和51)。另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，在Fab分子与Fc结构域亚基的N末端融合的情况下，可以在具有或没有另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))，以及这样的多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))并且与第而Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在某些方面，多肽例如通过二硫键共价连接。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，Fab轻链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4))，以及这样的多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))并且与第而Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在某些方面，多肽例如通过二硫键共价连接。
在一些方面，(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该Fab重链恒定区继而与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab重链继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在其他方面，(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab轻链可变区继而与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该第一Fab分子的Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在这些方面的一些，(多特异性)抗体进一步包含第一Fab分子的交叉Fab轻链多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))并且与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在这些方面的其他，(多特异性)抗体进一步包含这样的多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1)-VL(2)-CL(2))，或这样的多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab轻链多肽与第一Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab重链可变区继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2)-VH(1)-CL(1))，视情况而定。根据这些方面的(多特异性)抗体可进一步包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中第三Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，和第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些方面，多肽例如通过二硫键共价连接。
在一些方面，(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该第一Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab重链继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在其他方面，(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab重链可变区继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该第一Fab分子的Fab轻链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4))。在这些方面的一些，(多特异性)抗体进一步包含第一Fab分子的交叉Fab轻链多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))并且与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在这些方面的其他，(多特异性)抗体进一步包含这样的多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab重链恒定区继而与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1)-VL(2)-CL(2))，或这样的多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab轻链多肽与第一Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab重链可变区继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2)-VH(1)-CL(1))，视情况而定。根据这些方面的(多特异性)抗体可进一步包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中第三Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，和第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些方面，多肽例如通过二硫键共价连接。
在某些方面，(多特异性)抗体不包含Fc结构域。在优选的此类方面，所述第二抗原结合结构域和在存在时的第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子，并且第一抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在该Fab分子中，Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他此类方面，所述第二抗原结合结构域和在存在时的第三抗原结合结构域各自是交叉Fab分子并且第一抗原结合结构域是常规Fab分子。
在一个此类方面，(多特异性)抗体基本上由第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域都是Fab分子，并且第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端。这种构型在图1O和1S中示意性地描绘(在这些实例中，第一抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子并且第二抗原结合结构域是常规Fab分子)。
在另一个此类方面，(多特异性)抗体基本上由第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域都是Fab分子，并且第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端。这种构型在图1P和1T中示意性地描绘(在这些实例中，第一抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子并且第二抗原结合结构域是常规Fab分子)。
在一些方面，第二Fab分子在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且(多特异性)抗体进一步包含第三抗原结合结构域，特别是第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的C末端融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端。在某些此类方面，(多特异性)抗体基本上由第一、第二和第三Fab分子以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且第三Fab分子在Fab重链的C末端融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端。这种构型示意性地描述于图1Q和1U(在这些实例中，第一抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子，并且第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子)，或者图1X和1Z(在这些实例中，第一抗原结合结构域是常规Fab分子，并且第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是VH/VL交叉Fab分子)。
在一些方面，第一Fab分子在Fab重链的C末端融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且(多特异性)抗体进一步包含第三抗原结合结构域，特别是第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的N末端融合至第二Fab分子的Fab重链的C末端。在某些此类方面，(多特异性)抗体基本上由第一、第二和第三Fab分子以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第三Fab分子在Fab重链的N末端融合至第二Fab分子的Fab重链的C末端。这种构型示意性地描述于图1R和1V(在这些实例中，第一抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子，并且第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子)，或者图1W和1Y(在这些实例中，第一抗原结合结构域是常规Fab分子，并且第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是VH/VL交叉Fab分子)。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab轻链可变区继而与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))并且与第而Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该第一Fab分子的Fab重链恒定区继而与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))并且与第而Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab重链可变继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))并且与第而Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该第一Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))并且与第而Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第三Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab重链继而与第一Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab轻链可变区继而与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(3)-CH1(3)-VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))并且与第而Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第三Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab重链继而与第一Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第一Fab分子的Fab重链可变区继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)(VH(3)-CH1(3)-VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))并且与第而Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该第一Fab分子的Fab重链恒定区继而与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab重链继而与第三Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)-VH(3)-CH1(3))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))并且与第而Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该第一Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab重链继而与第三Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2)-VH(3)-CH1(3))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))并且与第而Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第三Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，该第三Fab分子的Fab轻链可变区继而与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-VL(3)-CH1(3))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含这样的多肽，其中在所述多肽中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第三Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第三Fab分子的Fab重链可变区继而与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)(VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-VH(3)-CL(3))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含这样的多肽，其中在所述多肽中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该第三Fab分子的Fab重链恒定区继而与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3)-VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含这样的多肽，其中在所述多肽中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在该多肽中，第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该第三Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3)-VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含这样的多肽，其中在所述多肽中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3))。
在一个方面，本发明提供了一种(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VH和VL彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，并且包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:3的HCDR 2、以及SEQ ID NO:5的HCDR 3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:9的LCDR 2和SEQ ID NO:10的LCDR 3；
b)与CD19结合的第二抗原结合结构域，其中该第二抗原结合结构域是(常规)Fab分子；
c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；
其中
(i)依据a)的第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在优选的方面，本发明提供了(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VH和VL彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，并且包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:3的HCDR 2、以及SEQ ID NO:5的HCDR 3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:9的LCDR 2和SEQ ID NO:10的LCDR 3；
b)与CD19结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，其中第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是(常规)Fab分子；以及
c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；
其中
(i)依据a)的第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合结构域和依据b)的第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合结构域和依据b)的第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在另一方面，本发明提供了(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VH和VL彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，并且包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:3的HCDR 2、以及SEQ ID NO:5的HCDR 3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:9的LCDR 2和SEQ ID NO:10的LCDR 3；
b)与CD19结合的第二抗原结合结构域，其中该第二抗原结合结构域是(常规)Fab分子；
c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；
其中
(i)依据a)的第一抗原结合结构域和依据b)的第二抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在根据本发明的(多特异性)抗体的所有不同构型中，本文所述的氨基酸取代(“荷电改性”)(如果存在的话)可以在第二抗原结合结构域和(如果存在的话)第三抗原结合结构域/Fab分子的CH1和CL结构域中，或者在第一抗原结合结构域/Fab分子的CH1和CL结构域中。优选地，它们在第二抗原结合结构域和(如果存在的话)第三抗原结合结构域/Fab分子的CH1和CL结构域中。根据本发明的概念，如果在第二抗原结合结构域(和如果存在的第三抗原结合结构域)/Fab分子中进行如本文所述的氨基酸取代，则在第一抗原结合结构域/Fab分子中不进行此类氨基酸取代。相反地，如果在第一抗原结合结构域/Fab分子中进行如本文所述的氨基酸取代，则在第二抗原结合结构域(和如果存在的第三抗原结合结构域)/Fab分子中不进行此类氨基酸取代。氨基酸取代优选地在包含这样的Fab分子的(多特异性)抗体中进行，在所述Fab分子中，Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH1彼此替换。
在根据本发明的(多特异性)抗体的优选的方面，特别地其中如本文所述的氨基酸取代是在第二抗原结合结构域(和如果存在的第三抗原结合结构域)/Fab分子中进行的，第二Fab分子(和如果存在的第三Fab分子)的恒定结构域CL为κ同种型的。在根据本发明的(多特异性)抗体的其他方面，特别地其中如本文所述的氨基酸取代是在第一抗原结合结构域/Fab分子中进行的，并且第一抗原结合结构域/Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型的。在一些方面，第二抗原结合结构域(和如果存在的第三抗原结合结构域)/Fab分子的恒定结构域CL和第一抗原结合结构域/Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型的。
在一个方面，本发明提供了一种(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VH和VL彼此替换，并且包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:3的HCDR 2、以及SEQ ID NO:5的HCDR 3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:9的LCDR 2和SEQ ID NO:10的LCDR 3；
b)与CD19结合的第二抗原结合结构域，其中该第二抗原结合结构域是(常规)Fab分子；
c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；
其中在b)中的第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最优选地被精氨酸(R)取代)；并且其中在b)中的第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在优选的方面，本发明提供了(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VH和VL彼此替换，并且包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:3的HCDR 2、以及SEQ ID NO:5的HCDR 3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:9的LCDR 2和SEQ ID NO:10的LCDR 3；
b)与CD19结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，其中第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是(常规)Fab分子；以及
c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；
其中在依据b)的第二抗原结合结构域和依据b)的第三抗原结合结构域的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最优选地被精氨酸(R)取代)，并且其中在依据b)的第二抗原结合结构域和依据b)的第三抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合结构域和依据b)的第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合结构域和依据b)的第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在另一方面，本发明提供了(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VH和VL彼此替换，并且包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:3的HCDR 2、以及SEQ ID NO:5的HCDR 3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:9的LCDR 2和SEQ ID NO:10的LCDR 3；
b)与CD19结合的第二抗原结合结构域，其中该第二抗原结合结构域是(常规)Fab分子；
c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；
其中在b)中的第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最优选地被精氨酸(R)取代)；并且其中在b)中的第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)；并且
其中依据a)的第一抗原结合结构域和依据b)的第二抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
根据上述任一方面，(多特异性)抗体的组分(例如Fab分子、Fc结构域)可以直接融合或通过各种接头，特别是包含一个或多个氨基酸、通常约2-20个氨基酸的肽接头融合，这些接头在本文中描述或在本领域中是已知的。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n、G4(SG4)n或(G4S)nG5肽接头，其中n通常是1至10的整数，通常是2至4。
在优选的方面，本发明提供了(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换，并且包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含SEQ ID NO:2的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:3的HCDR 2和SEQ ID NO:5的HCDR 3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:8的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ IDNO:9的LCDR 2和SEQ ID NO:10的LCDR 3；
b)与CD19结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，其中第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是(常规)Fab分子并且包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含SEQ ID NO:15的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:16的HCDR2和SEQ ID NO:17的HCDR 3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:19的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:20的LCDR 2和SEQ ID NO:21的LCDR 3；
c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；
其中
在依据b)的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最优选地被精氨酸(R)取代)，并且其中依据b)的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)；
并且其中进一步地
依据b)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合结构域和依据b)的第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在另一优选的方面，本发明提供了(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其中该第一抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换，并且该第一抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链可变区；
b)与CD19结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，其中第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是(常规)Fab分子并且包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区；
c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；
其中
在依据b)的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最优选地被精氨酸(R)取代)，并且其中依据b)的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)；
并且其中进一步地
依据b)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合结构域和依据b)的第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在另一优选的方面，本发明提供了(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换，并且包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含SEQ ID NO:2的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:3的HCDR 2和SEQ ID NO:5的HCDR 3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:8的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ IDNO:9的LCDR 2和SEQ ID NO:10的LCDR 3；
b)与CD19结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，其中第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是(常规)Fab分子并且包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含SEQ ID NO:28的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:29的HCDR2和SEQ ID NO:30的HCDR 3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:32的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:33的LCDR 2和SEQ ID NO:34的LCDR 3；
c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；
其中
在依据b)的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最优选地被精氨酸(R)取代)，并且其中依据b)的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)；
并且其中进一步地
依据b)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合结构域和依据b)的第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在又另一优选的方面，本发明提供了(多特异性)抗体，其包含
a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其中该第一抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换，并且该第一抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链可变区；
b)与CD19结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，其中第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是(常规)Fab分子并且包含含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链可变区；
c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；
其中
在依据b)的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最优选地被精氨酸(R)取代)，并且其中依据b)的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)；
并且其中进一步地
依据b)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合结构域和依据b)的第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在根据本发明的这些方面的一个方面，在所述Fc结构域的所述第一亚基中，366位的苏氨酸残基被替换为色氨酸残基(T366W)；而在所述Fc结构域的所述第二亚基中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替换，并且任选地，366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替换并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替换(根据Kabat EU索引编号)。
在根据本发明的这些方面的另一个方面，在所述Fc结构域的第一亚基中，另外地，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换)，并且在所述Fc结构域的第二亚基中，另外地，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。
在根据本发明的这些方面的又另一个方面，在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中，234位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替换(L234A)，235位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替换(L235A)，并且329位的脯氨酸残基被用甘氨酸残基替换(P329G)(根据KabatEU索引编号)。
在根据本发明的这些方面的又另一个方面，Fc结构域是人IgG1 Fc结构域。
在优选的具体方面，(多特异性)抗体包含：含有与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:39(特别是SEQ ID NO:39)序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:24序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:25序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)以及含有与SEQ ID NO:27序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。在另一优选的具体方面，(多特异性)抗体包含含有SEQ ID NO:23或SEQ IDNO:39(特别是SEQ ID NO:39)氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:24氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:25氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)以及含有SEQ ID NO:27氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供了与CD3和CD19结合的(多特异性)抗体，该抗体包含含有与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:39(特别是SEQ ID NO:39)序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:24序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:25序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)以及含有与SEQ ID NO:27序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。在一个方面，本发明提供了与CD3和CD19结合的(多特异性)抗体，该抗体包含含有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:39(特别是SEQ IDNO:39)的氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)以及含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的多肽。
在优选的具体方面，(多特异性)抗体包含：含有与SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:40(特别是SEQ ID NO:36)序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:37序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:38序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)以及含有与SEQ ID NO:27序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。在另一优选的具体方面，(多特异性)抗体包含含有SEQ ID NO:36或SEQ IDNO:40(特别是SEQ ID NO:36)氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:37氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:38氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)和含有SEQ ID NO:27氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供了与CD3和CD19结合的(多特异性)抗体，该抗体包含含有与SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:40(特别是SEQ ID NO:36)的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:37的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:38的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)以及含有与SEQ ID NO:27的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。在一个方面，本发明提供了与CD3和CD19结合的(多特异性)抗体，该抗体包含含有SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:40(特别是SEQID NO:36)的氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)以及含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的多肽。
8.Fc结构域变体
在优选的方面，本发明的(多特异性)抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。
(多特异性)抗体的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。在一个方面，本发明的(多特异性)抗体包含不超过一个Fc结构域。
在一个方面，(多特异性)抗体的Fc结构域是IgG Fc结构域。在一个优选的方面，所述Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个方面，所述Fc结构域是IgG4 Fc结构域。在一个更具体的方面，所述Fc结构域是在位置S228(Kabat EU索引编号)处包含氨基酸取代(特别是氨基酸取代S228P)的IgG4 Fc结构域。该氨基酸取代减少了IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在另一个优选的方面，所述Fc结构域是人Fc结构域。在甚至更优选的方面，Fc结构域是人IgG1 Fc结构域。人IgG1 Fc区的示例性序列以SEQ ID NO:47给出。
a)促进异源二聚化的Fc结构域修饰
根据本发明的(多特异性)抗体包含可以与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合结构域，因此所述Fc结构域的两个亚基通常包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高(多特异性)抗体的产率和纯度，因此将有利的是在(多特异性)抗体子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰。
因此，在优选的方面，根据本发明的(多特异性)抗体的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个方面，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。
存在几种对Fc结构域的CH3结构域进行修饰以实施异二聚化的方法，这些方法例如在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO2013157954、WO 2013096291中详细描述。通常，在所有此类方法中，Fc结构域的第一亚基的CH3结构域和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域都以互补的方式工程化，使得每个CH3结构域(或包含其的重链)可以不再与其自身同源二聚化，而是被迫与互补工程化的其他CH3结构域异源二聚化(使得第一和第二CH3结构域异源二聚化并且在两个第一或两个第二CH3结构域之间不形成同源二聚体)。这些用于实现改善的重链异源二聚化的不同方法被认为是与(多特异性)抗体中的重-轻链修饰(例如在一个结合臂中进行VH和VL交换/替换并且在CH1/CL界面中引入带有相反电荷的荷电氨基酸的取代)组合的不同替换方案，所述不同替换方案减少重链/轻链错配和Bence Jones型副产物。
在一个具体方面，所述促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰是所谓的“杵臼结构”修饰，其包括所述Fc结构域的两个亚基中的一个亚基中的“杵”修饰和所述Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中的“臼”修饰。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。一般来讲，该方法涉及在第一多肽的界面处引入凸起(“杵”)并且在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得所述凸起可以定位在所述空腔中，以便促进异源二聚体的形成并且阻碍同源二聚体的形成。凸起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与凸起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一个优选的方面，在(多特异性)抗体的Fc结构域的所述第一亚基的所述CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在所述第一亚基的所述CH3结构域内产生突起，所述突起可定位在所述第二亚基的所述CH3结构域内的空腔中，并且在所述Fc结构域的所述第二亚基的所述CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在所述第二亚基的所述CH3结构域内产生空腔，所述第一亚基的所述CH3结构域内的所述突起可定位在所述空腔内。
优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组。
优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。
凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸(例如通过位点特异性诱变或通过肽合成)来制备。
在一个具体方面，在Fc结构域的第一亚基(“杵”亚基)(的CH3结构域)中，366位的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替换，并且在Fc结构域的第二亚基(“臼”亚基)(的CH3结构域)中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替换。在一个方面，在Fc结构域的第二亚基中，另外地366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替换，并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替换(根据Kabat EU索引编号)。
在又另一个方面，在所述Fc结构域的第一亚基中，另外地，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换)，并且在所述Fc结构域的第二亚基中，另外地，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定所述二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个优选方面，所述Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且所述Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在一个优选的方面，与CD3结合的抗原结合结构域与(任选地经由与CD19结合的第二抗原结合结构域和/或肽接头)Fc结构域的第一亚基(包含“杵”修饰)融合。不希望受理论束缚，与CD3结合的抗原结合结构域与Fc结构域的含有杵的亚基的融合将(进一步)最小化包含两个与CD3结合的抗原结合结构域的抗体的产生(两个含有杵的多肽的空间位阻)。
用于实施异源二聚化的其他CH3修饰技术被设想为根据本发明的替换方案，并且描述于例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO2013/157954、WO 2013/096291中。
在一个方面，可替代地使用EP 1870459中描述的异源二聚化方法。该方法基于在Fc结构域的两个亚基之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨基酸位置处引入带有相反电荷的荷电氨基酸。本发明的(多特异性)抗体的一个特定方面是氨基酸突变R409D；在(Fc结构域的)两个CH3结构域中的一个CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的CH3结构域中的另一个CH3结构域中的E357K(编号根据Kabat EU索引)。
在另一方面，本发明的(多特异性)抗体包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366S、L368A、Y407V，以及另外地氨基酸突变R409D；在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(编号根据Kabat EU索引)。
在另一方面，本发明的(多特异性)抗体包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366S、L368A、Y407V，或者所述(多特异性)抗体包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366S、L368A、Y407V，以及另外地氨基酸突变R409D；在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(所有根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，可替代地使用WO 2013/157953中描述的异源二聚化方法。在一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366K，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变L351D(编号根据Kabat EU索引)。在另一个方面，第一CH3结构域包含另外的氨基酸突变L351K。在另一个方面，第二CH3结构域还包含选自由Y349E、Y349D和L368E(特别是L368E)组成的组的氨基酸突变(编号根据Kabat EU索引)。
在一个方面，可替代地使用WO 2012/058768中描述的异源二聚化方法。在一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一个方面，第二CH3结构域包含在T411、D399、S400、F405、N390或K392位的进一步氨基酸突变，例如选自由以下项组成的组：a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W，b)D399R、D399W、D399Y或D399K，c)S400E、S400D、S400R或S400K，d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W，e)N390R、N390K或N390D，f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E(编号根据Kabat EU索引)。在另一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366V、K409F。在另一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一个方面，第二CH3结构域还包含氨基酸突变K392E、T411E、D399R和S400R(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，可替代地使用WO 2011/143545中描述的异源二聚化方法，例如在选自由368和409组成的组的位置处进行氨基酸修饰(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，可替代地使用WO 2011/090762中描述的异源二聚化方法，该异源二聚化方法也使用上述杵臼结构技术。在一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366W，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407A。在一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366Y，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407T(编号根据Kabat EU索引)。
在一个方面，(多特异性)抗体或其Fc结构域为IgG2亚类，并且可替代地使用在WO2010/129304中描述的异源二聚化方法。
在替代方面，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。在一个这样的方面，第一CH3结构域包含用带负电荷的氨基酸对K392或N392进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，特别是K392D或N392D)，并且第二CH3结构域包含用带正电荷的氨基酸对D399、E356、D356或E357进行的氨基酸取代(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R)，特别是D399K、E356K、D356K或E357K，更特别是D399K和E356K)。在另一个方面，第一CH3结构域还包含用带负电荷的氨基酸对K409或R409进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，特别是K409D或R409D)。在另一个方面，第一CH3结构域进一步或可替代地包含用带负电荷的氨基酸对K439和/或K370进行的氨基酸取代，(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))(所有根据Kabat EU索引编号)。
在又另一个方面，可替代地使用WO 2007/147901中描述的异源二聚化方法。在一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变K253E、D282K和K322D，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变D239K、E240K和K292D(根据Kabat EU索引编号)。
在又一方面，可替代地使用WO 2007/110205中描述的异源二聚化方法。
在一个方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代K392D和K409D，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代D356K和D399K(根据Kabat EU索引编号)。
b)减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
Fc结构域赋予(多特异性)抗体有利的药代动力学性质，包括有助于在靶组织中良好积累的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，同时，其可能导致(多特异性)抗体不期望地靶向至表达Fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。此外，Fc受体信号传导通路的共活化可导致细胞因子释放，所述细胞因子释放与T细胞活化特性和(多特异性)抗体的长半衰期组合，在全身施用后导致对细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。由于对T细胞的潜在破坏(例如被NK细胞)，T细胞以外的(带有Fc受体的)免疫细胞的活化甚至可能降低(多特异性)抗体的功效。
因此，在优选的方面，与天然IgG1 Fc结构域相比，根据本发明的(多特异性)抗体的Fc结构域表现出降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个这样的方面，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的(多特异性)抗体)表现出与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的(多特异性)抗体)相比小于50％，特别是小于20％，更特别是小于10％并且最特别是小于5％的结合亲和力，和/或与天然IgG1 Fc结构域结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的(多特异性)抗体)相比小于50％，特别是小于20％，更特别是小于10％并且最特别是小于5％的效应子功能。在一个方面，Fc结构域结构域(或包含所述Fc结构域的(多特异性)抗体)基本上不结合Fc受体和/或诱导效应子功能。在一个优选的方面，Fc受体是Fcγ受体。在一个方面，所述Fc受体是人Fc受体。在一个方面，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体方面，所述Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面，效应子功能是选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的组的一种或多种效应子功能。在一个优选的方面，效应子功能是ADCC。在一个方面，与天然IgG1 Fc结构域结构域相比，Fc结构域结构域对新生Fc受体(FcRn)表现出基本相似的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的(多特异性)抗体)表现出天然IgG1Fc结构域(或包含天然IgG1Fc结构域的(多特异性)抗体)对FcRn的结合亲和力的大于约70％，特别地大于约80％，更特别地大于约90％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合。
在某些方面，Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在优选的方面，(多特异性)抗体的Fc结构域包含降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。在一个方面，氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个方面，氨基酸突变将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在存在多于一个降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的方面，这些氨基酸突变的组合可以将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍，或甚至至少50倍。在一个方面，与包含非工程化的Fc结构域的(多特异性)抗体相比，包含工程化的Fc结构域的(多特异性)抗体表现出对Fc受体的结合亲和力的小于20％，特别地小于10％，更特别地小于5％。在一个优选的方面，Fc受体是Fcγ受体。在一些方面，Fc受体是人Fc受体。在一些方面，Fc受体是活化性Fc受体。在具体方面，Fc受体为活化的人Fcγ受体，更具体地为人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地为人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中的每一个的结合降低。在一些方面，对互补组分的结合亲和力，对C1q的特异性结合亲和力也降低。在一个方面，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力不降低。当所述Fc结构域(或包含所述Fc结构域的(多特异性)抗体)表现出非工程化形式的所述Fc结构域(或包含非工程化形式的所述Fc结构域的(多特异性)抗体)对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合，即保持了Fc结构域对所述受体的结合亲和力。Fc结构域或包含所述Fc结构域的本发明的(多特异性)抗体可表现出这种亲和力的大于约80％，以及甚至大于约90％。在某些方面，(多特异性)抗体的Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可包括但不限于以下项中的一种或多种：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导的细胞凋亡、减少的靶结合抗体的交联、减少的树突细胞成熟，或减少的T细胞致敏。在一个方面，降低的效应子功能是选自降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和减少的细胞因子分泌的组的一种或多种降低的效应子功能。在一个优选的方面，降低的效应子功能是降低的ADCC。在一个方面，降低的ADCC小于由非工程化的Fc结构域(或包含所述非工程化的Fc结构域的(多特异性)抗体)诱导的ADCC的20％。
在一个方面，降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸突变是氨基酸取代。在一个方面，所述Fc结构域在选自包括E233、L234、L235、N297、P331和P329(根据Kabat EU索引编号)的组的位置处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面，所述Fc结构域在选自包括L234、L235和P329(根据Kabat EU索引编号)的组的位置处包含氨基酸取代。在一些方面，所述Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。在一个这样的方面，所述Fc结构域是IgG1Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。在一个方面，Fc结构域在第P329位处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面，所述氨基酸取代是P329A或P329G，特别是P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个方面，所述Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代，并且在选自E233、L234、L235、N297和P331(根据Kabat EU索引编号)的位置处包含另外的氨基酸取代。在一个更具体的方面，所述另外的氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在优选的方面，所述Fc结构域在位置P329、L234和L235(根据Kabat EU索引编号)处包含氨基酸取代。在更优选的方面，所述Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”、“PGLALA”或“LALAPG”)。具体地讲，在优选的方面，所述Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)，即在所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中，位置234处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L234A)，位置235处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L235A)，并且位置329处的脯氨酸残基被甘氨酸残基替换(P329G)(根据Kabat EU索引编号)。
在一个这样的方面，所述Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1Fc结构域。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体(以及补体)结合，如在PCT公开号WO 2012/130831中所述，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。WO2012/130831还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和确定其性质(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。
与IgG1抗体相比，IgG4抗体表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。因此，在一些方面，本发明的(多特异性)抗体的Fc结构域是IgG4 Fc结构域，特别地是人IgG4 Fc结构域。在一个方面，IgG4 Fc结构域包含在S228位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代S228P(根据Kabat EU索引编号)。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应子功能，在一个方面，IgG4 Fc结构域包含L235位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代L235E(根据Kabat EU索引编号)。在另一方面，IgG4Fc结构域包含P329位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个优选的方面，IgG4 Fc结构域包含S228、L235和P329位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代S228P、L235E和P329G(根据Kabat EU索引编号)。这种IgG4 Fc结构域突变体以及它们的Fcγ受体结合性质描述于PCT公开号WO 2012/130831中，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。
在一个优选的方面，与天然IgG1 Fc结构域相比表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的Fc结构域是包含氨基酸取代L234A、L235A和任选地P329G的人IgG1 Fc结构域，或者是包含氨基酸取代S228P、L235E和任选地P329G的人IgG4 Fc结构域(根据Kabat EU索引编号)。
在某些方面，已消除了Fc结构域的N糖基化。在一个这样的方面，Fc结构域包含N297位的氨基酸突变，特别地是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替换天冬酰胺的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。
除了上文和PCT公开号WO 2012/130831中所述的Fc结构域外，具有减少的Fc受体结合和/或降低的效应子功能的Fc结构域还包括具有对Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些Fc结构域(美国专利号6,737,056)(根据Kabat的EU索引编号)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸中两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
可以使用本领域熟知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。可替代地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(例如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)，来评估Fc结构域或包含Fc结构域的(多特异性)抗体对Fc受体的结合亲和力。
Fc结构域或包含Fc结构域的(多特异性)抗体的效应子功能可通过本领域已知的方法测量。用于评定目标分子的ADCC活性的体外测定的示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，ProcNatl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J ExpMed 166,1351-1361(1987)中。可替代地，可以使用非放射性测定(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0004001003030000841
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。另选地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的ADCC活性。
在一些方面，Fc结构域与补体组分，特别是C1q的结合减少。因此，在一些方面，其中Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定Fc结构域或包含所述Fc结构域的(多特异性)抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J ImmunolMethods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。
FcRn结合和体内清除/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929)。
B.多核苷酸
本发明进一步提供了编码本发明的抗体的分离的多核苷酸。所述分离的多核苷酸可以是单个多核苷酸或多个多核苷酸。
编码本发明的(多特异性)抗体的多核苷酸可以表达为编码完整抗体的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如，两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他方式缔合以形成功能性抗体。例如，抗体的轻链部分可以由与包含抗体的重链的抗体的部分分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成抗体。在另一个实例中，包含两个Fc结构域亚基中的一个亚基和任选地一个或多个Fab分子的一部分的抗体可以由与包含所述两个Fc结构域亚基中的另一个亚基和任选地Fab分子的一部分的抗体分开的多核苷酸编码。当共表达时，Fc结构域亚基将缔合以形成Fc结构域。
在一些方面，分离的多核苷酸编码如本文所述的根据本发明的完整抗体分子。在其他方面，分离的多核苷酸编码包含在如本文所述的根据本发明的抗体中的多肽。
在某些方面，多核苷酸或核酸是DNA。在其他方面，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
C.重组方法
本发明的抗体可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。对于重组生产，将例如如上所述的编码抗体的一种或多种多核苷酸分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在一个方面，提供了包含本发明的多核苷酸(即单个多核苷酸或多个多核苷酸)的载体，特别是表达载体。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有抗体的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如以下文献所述的技术：Maniatis等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y(1989)。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码抗体的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，该异源编码区与编码本发明的抗体的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，所述附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌抗体，可以将编码信号序列的DNA置于本发明的抗体或其片段的核酸的上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与所述多肽的N-末端融合的信号肽，所述信号肽被从翻译的多肽上切割下来以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。在某些方面，使用天然信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留引导与其可操作地缔合的多肽的分泌的能力的该序列的功能性衍生物。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。
编码短蛋白质序列(其可用于促进后续纯化(例如组氨酸标签)或帮助标记抗体)的DNA可包含在抗体(片段)编码多核苷酸的内部或末端。
在另一个方面，提供了包含本发明的多核苷酸(即单个多核苷酸或多个多核苷酸)的宿主细胞。在某些方面，提供了包含本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个这样的方面，宿主细胞包含一种或多种载体(例如已经用一种或多种载体转化或转染)，该一种或多种载体包含编码本发明的抗体的(一部分)的一种或多种多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的抗体或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持抗体表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的抗体用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，例如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)和Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J Gen Virol36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个方面，宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个方面，宿主细胞不是人体内的细胞。
用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。可以对表达包含抗原结合结构域的重链和轻链的多肽(例如抗体)的细胞进行工程化改造，以便也表达另一条抗体链，使得表达的产物为具有重链和轻链的抗体。
在一个方面，提供了产生根据本发明的抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含编码如本文所提供的抗体的多核苷酸的宿主细胞，以及任选地从该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
本发明的(多特异性)抗体的组分可以彼此遗传融合。(多特异性)抗体可以被设计成使得其组分直接或通过接头序列彼此间接融合。接头的组成和长度可以根据本领域熟知的方法测定，并且可以测试接头的功效。本文提供了(多特异性)抗体的不同组分之间的接头序列的实例。如果需要的话，还可包括另外的序列(例如内肽酶识别序列)以掺入切割位点来分离融合的各个组分。
如本文所述制备的抗体可通过本领域已知的技术纯化，所述技术为诸如高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、亲和色谱、尺寸排阻色谱等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱纯化，可以使用与抗体结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明的抗体的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离抗体。抗体的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任何一种来确定，所述各种熟知的分析方法包括凝胶电泳、高压液相色谱等。
D.测定
可通过本技术领域中已知的各种测定，对本文所提供的抗体的物理/化学特性和/或生物活性来进行鉴别、筛选或表征。
1.结合测定
抗体与Fc受体或靶抗原的结合(亲和力)可以例如使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)以及诸如可通过重组表达获得的受体或靶蛋白，通过表面等离子体共振(SPR)来确定。可替代地，可以使用表达特定受体或靶抗原的细胞系，例如通过流式细胞术(FACS)评估抗体与不同受体或靶抗原的结合。下文描述了用于测量与CD3的结合活性的特定说明性和示例性方面。
在一个方面，对CD3的结合活性由SPR确定如下：
SPR在Biacore T200仪器(GE Healthcare)上进行。使用标准的胺偶联化学以4000–6000个共振单位(RU)的表面密度将抗Fab捕获抗体(GE Healthcare,#28958325)固定在S系列传感器芯片CM5(GE Healthcare)上。使用HBS-P+(10mM HEPES，150mM NaCl pH7.4，0.05％表面活性剂P20)作为运行和稀释缓冲液。将浓度为2μg/ml(在20mM His，140mMNaCl，pH 6.0中)的CD3抗体以5μl/min的流速注射约60秒。所使用的CD3抗原是融合至具有杵臼修饰和C末端Avi-tag的人Fc域的CD3δ与CD3ε胞外结构域的异二聚体(参见SEQ ID NO41和42)。CD3抗原以10μg/ml的浓度注射120秒，并监测以5μl/min的流速进行解离约120秒。芯片表面通过两次连续注射10mM甘胺酸pH 2.1进行再生，每次注射约60秒。通过减去空白注射并通过减去从空白对照流通池获得的应答来校正本体折射率偏差。为了评估，在注射结束后5秒获取结合反应。为了将结合信号归一化，CD3结合除以抗Fab应答(在固定化的抗Fab抗体上捕获CD3抗体时获得的信号(RU))。相对于不同处理后抗体对CD3的结合活性(也称为相对活性浓度(RAC))，经过过特定处理后抗体对CD3的结合活性通过将某种处理后的抗体样品的结合活性与不同处理后的相应抗体样品的结合活性相比较来计算。
2.活性测定
本发明的(多特异性)抗体的生物活性可以通过如实例中所述的各种测定来测量。生物活性可以例如包括T细胞增殖的诱导、T细胞中信号传导的诱导、T细胞中活化标志物表达的诱导、通过T细胞对细胞因子分泌的诱导、靶细胞(诸如B细胞)裂解的诱导，以及肿瘤消退的诱导和/或生存率的提高。
E.组合物、配方和施用途径
在另一个方面，本发明提供了包含本文提供的任一种抗体的药物组合物，其例如用于以下任一种治疗方法中。在一个方面，药物组合物包含根据本发明的抗体，以及药用载体。在另一方面，药物组合物包含根据本发明的抗体以及如下文所述的至少一种附加治疗剂。
还提供了一种以适于体内施用的形式产生本发明的抗体的方法，该方法包括(a)获得根据本发明的抗体，以及(b)用至少一种药用载体配制该抗体，由此配制抗体制剂以用于体内施用。
本发明的药物组合物包含溶解或分散在药用载体中的有效量的抗体。术语“药用”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。根据本公开内容，含有抗体和任选地另外的活性成分的药物组合物的制备将对本领域技术人员而言是已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990例示的，该文献以引用方式并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应理解制备物应满足FDA生物标准办公室或其他国家/地区相应当局所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所使用的，“药用载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲液、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料，类似物质以及它们的组合，如本领域普通技术人员应已知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPrinting Company,1990，第1289-1329页，该文献通过引用并入本文)。除了任何常规载体与活性成分不相容的情况之外，所述载体在药物组合物中的用途是可预期的。
本发明的抗体(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。
肠胃外组合物包括设计用于注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)的那些组合物。对于注射，本发明的抗体可以在水溶液中配制，特别是在生理上相容的缓冲液(例如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液)中配制。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，抗体可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)构建。通过根据需要将本发明的抗体以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，所述真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白的安全水平保持最低。合适的药用载体包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定方面，可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。
除了先前描述的组合物之外，抗体还可以配制成贮库制剂。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，抗体可以用合适的聚合或疏水材料配制(例如作为可接受油中的乳液)或用离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如配制为微溶盐。
包含本发明的抗体的药物组合物可借助于常规混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干的手段制备。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。合适的制剂取决于所选择的施用途径。
抗体可以配制成游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药用盐是基本上保留游离酸或游离碱的生物活性的盐。这些药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
F.治疗方法和组合物
本文提供的任何抗体可用于治疗方法。本发明的抗体可用作免疫治疗剂，例如用于治疗癌症或自身免疫性疾病。
为了用于治疗方法中，本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
在一个方面，将本发明的抗体提供为用作药物。在另外的方面，将本发明的抗体提供为用于治疗疾病。在某些方面，提供了用于治疗方法的本发明的抗体。在一个方面，本发明提供了本发明的抗体以用于治疗有需要的个体的疾病。在某些方面，本发明提供了抗体以用于治疗患有疾病的个体的方法中，该方法包括向所述个体施用有效量的所述抗体。在某些方面，该疾病是增殖性疾患。在某些方面，该疾病是癌症，特别是表达CD19的癌症。在一个具体方面，该癌症是B细胞癌症。在一个方面，B细胞癌症是B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。在一个方面，B细胞癌症是非霍奇金淋巴瘤或急性淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病。在其他方面，该疾病为自身免疫性疾病。在一个具体方面，该疾病是狼疮，特别是系统性红斑狼疮(SLE)或狼疮肾炎(LN)。
在某些方面，如果待治疗的疾病是癌症，则方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂，或如果待治疗的疾病是自身免疫性疾病，则施用免疫抑制剂。在另外的方面，本发明提供了用于诱导靶细胞，特别是B细胞的裂解的本发明的抗体。在某些方面，本发明提供了用于在个体中诱导靶细胞、特别是B细胞的裂解的方法中使用的本发明的抗体，该方法包括向个体施用有效量的抗体以诱导靶细胞的裂解。根据任何上述方面的“个体”是哺乳动物，优选人。
在另一个方面，本发明提供了本发明的抗体在制造或制备药物中的用途。在一个方面，所述药物用于治疗有此需要的个体的疾病。在另一个方面，所述药物用于治疗疾病的方法，所述方法包括向患有疾病的个体施用有效量的药物。在某些方面，该疾病是增殖性疾患。在某些方面，该疾病是癌症，特别是表达CD19的癌症。在一个具体方面，该癌症是B细胞癌症。在一个方面，B细胞癌症是B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。在一个方面，B细胞癌症是非霍奇金淋巴瘤或急性淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病。在其他方面，该疾病为自身免疫性疾病。在一个具体方面，该疾病是狼疮，特别是系统性红斑狼疮(SLE)或狼疮肾炎(LN)。在一个方面，如果待治疗的疾病是癌症，则方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂，或如果待治疗的疾病是自身免疫性疾病，则施用免疫抑制剂。在另一个方面，该药物用于诱导靶细胞、特别是B细胞的裂解。在又另一个方面，该药物用于在个体中诱导靶细胞、特别是B细胞的裂解的方法中，该方法包括向个体施用有效量的药物以诱导靶细胞的裂解。根据上述方面中的任一方面的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
在另一个方面，本发明提供了治疗疾病的方法。在一个方面，所述方法包括向患有这种疾病的个体施用有效量的本发明的抗体。在一个方面，向所述个体施用组合物，所述组合物包含药学上可接受形式的本发明的抗体。在某些方面，该疾病是增殖性疾患。在某些方面，该疾病是癌症，特别是表达CD19的癌症。在一个具体方面，该癌症是B细胞癌症。在一个方面，B细胞癌症是B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。在一个方面，B细胞癌症是非霍奇金淋巴瘤或急性淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病。在其他方面，该疾病为自身免疫性疾病。在一个具体方面，该疾病是狼疮，特别是系统性红斑狼疮(SLE)或狼疮肾炎(LN)。在某些方面，如果待治疗的疾病是癌症，则方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂，或如果待治疗的疾病是自身免疫性疾病，则施用免疫抑制剂。根据上述方面中的任一方面的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
在另一方面，本发明提供了一种用于诱导靶细胞，特别是表达CD19的细胞诸如B细胞的裂解的方法。在一个方面，所述方法包括在存在T细胞、特别是细胞毒性T细胞的情况下，使靶细胞与本发明的抗体接触。在另一方面，提供了一种在个体中诱导靶细胞，特别是表达CD19的细胞诸如B细胞的裂解的方法。在一个这样的方面，所述方法包括向个体施用有效量的本发明的抗体以诱导靶细胞的裂解。在一个方面，“个体”是人。
技术人员容易认识到，在许多情况下，抗体可能不提供治愈，而可能仅提供部分益处。在一些方面，具有某些益处的生理变化也被视为具有治疗益处。因此，在一些方面，提供生理变化的抗体的量被认为是“有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是哺乳动物，更特别地是人。
在一些方面，将有效量的本发明的抗体施用于个体以治疗疾病。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、施用途径、患者的体重、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、抗体是施用用于预防目的还是治疗目的、既往或同时进行的治疗干预、患者的临床病史和对抗体的反应，以及主治医师的判断。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种给药时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用、以及脉冲输注。
抗体适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生期望的疾病症状抑制。抗体的一种示例性剂量的范围为约0.005mg/kg至约10mg/kg。在其他非限制性实例中，剂量还可包括每次施用约1微克/kg体重、约5微克/kg体重、约10微克/kg体重、约50微克/kg体重、约100微克/kg体重、约200微克/kg体重、约350微克/kg体重、约500微克/kg体重、约1毫克/kg体重、约5毫克/kg体重、约10毫克/kg体重、约50毫克/kg体重、约100毫克/kg体重、约200毫克/kg体重、约350毫克/kg体重、约500毫克/kg体重，至约1000mg/kg体重或更多，以及从其中推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的非限制性实例中，约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5微克/kg体重至约500毫克/kg体重等的范围可以基于上述数值施用。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约两次至约二十次，或例如约六次剂量的抗体)。可以施用初始较高的负荷剂量，之后施用一次或多次较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。这种疗法的进展易于通过常规的技术和测定法来监测。
本发明的抗体将通常以有效实现预期目的的量使用。为用于治疗或预防病症，将本发明的抗体或其药物组合物以有效量施用或施加。
对于全身施用，有效剂量可以最初根据体外测定(诸如细胞培养物测定)来进行估计。可以随后在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC50循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。
初始剂量也可以使用本领域公知的技术，根据体内数据(例如动物模型)来估计。
可以单独地调整剂量的量和间隔，以提供足以维持治疗效果的抗体的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量的范围是约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。通过每天施用多个剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC来测量血浆中的水平。
有效剂量的本发明的抗体通常将在不会引起显著毒性的情况下提供治疗益处。抗体的毒性和治疗功效可通过标准药学方法在细胞培养或实验动物中测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，所述治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的抗体是优选的。在一个方面，根据本发明的抗体表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化，所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个别医生根据患者的病症来选择(参见例如Fingl等人，1975，在：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1页中，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。
用本发明的抗体治疗的患者的主治医师将知道如何以及何时由于毒性、器官功能障碍等终止、中断或调整施用。相反地，如果临床应答不充分(排除毒性)，则主治医师也会知道将治疗调整到更高水平。在目标病症的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。
本发明的抗体可以与治疗中的一种或多种其他药剂组合施用。例如，本发明的抗体可与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括被施用以治疗需要这种治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体疾病的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些方面，另外的治疗剂是免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡活化剂，或增加细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂。在某些方面，另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂或抗血管生成剂。在另一方面，另外的治疗剂为免疫抑制剂。在具体方面，另外的治疗剂是选自以下的组的一者或多者：皮质类固醇、羟氯喹、霉酚酸酯、霉酚酸、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、环磷酰胺、钙调磷酸酶抑制剂、贝利木单抗、利妥昔单抗和奥妥珠单抗。
此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用抗体的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。抗体通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以经验地/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
上述此类组合疗法包括联合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或不同的组合物中)和单独施用，在单独施用的情况下，本发明的抗体的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。本发明的抗体也可以与放射疗法组合使用。
G.制品
在本发明的另一个方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的物质。制品包括容器和在该容器上或与该容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋，等等。所述容器可以由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。所述容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合能够有效地用于治疗、预防和/或诊断病症，并且所述容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是具有能够被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，该制品可包括(a)第一容器，该第一容器中含有包含本发明的抗体的组合物；以及(b)第二容器，该第二容器中含有包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂组合物。本发明该方面中的制品还可包含包装插页，该包装插页指示该组合物可用于治疗特定病症。可替代地或另外地，该制品还可包括第二(或第三)容器，该第二(或第三)容器包括药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。所述药盒可以还包括从商业和用户的角度所需的其他物质，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
H.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些方面，本文提供的抗体中的任一种可用于检测生物样品中其靶标(例如CD3或CD19)的存在。如本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些方面，生物样品包括细胞或组织，例如前列腺组织。
在一个方面，提供了用于诊断或检测的方法的根据本发明的抗体。在另一方面，提供了检测生物样品中CD3或CD19的存在的方法。在某些方面，该方法包括在允许抗体与CD3或CD19结合的条件下使生物样品与本发明的抗体接触，并且检测抗体和CD3或CD19之间是否形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个方面，本发明的抗体用于选择适合用与CD3和/或CD19结合的抗体治疗的受试者，例如，其中CD3和/或CD19是用于选择患者的生物标志物。
可以使用本发明的抗体诊断的示例性病症包括癌症，特别是B细胞癌症。
在某些方面，提供了根据本发明的抗体，其中所述抗体被标记。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(诸如荧光标记、发色标记、电子致密标记、化学发光标记，以及放射性标记)，以及间接(例如通过酶促反应或分子相互作用)检测的部分(诸如酶或配体)。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I；荧光团，诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮；荧光素酶(luceriferase)，例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)；虫荧光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，诸如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶；与采用过氧化氢来氧化染料前体的酶(诸如HRP、乳过氧化物酶，或微过氧化物酶)偶联；生物素/抗生物素蛋白、纺丝标记、噬菌体标记、稳定自由基，等等。
III.序列
Figure BDA0004001003030001011
Figure BDA0004001003030001021
Figure BDA0004001003030001031
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Figure BDA0004001003030001051
Figure BDA0004001003030001061
Figure BDA0004001003030001071
IV.实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他方面。
实例1-优化的CD3结合剂的生成
从先前描述的(参见例如WO 2014/131712，该文献以引用方式并入本文中)CD3结合剂开始，其在本文中称为“CD3原始”，并分别包含SEQ ID NO 6和11的VH和VL序列，我们旨在通过移除重链CDR3的Kabat位置97和100处的两个天冬酰胺脱酰胺序列基序来优化这种结合剂的特性。
为此，我们生成了一个适用于噬菌体展示的重链抗体库，其中移除了Kabat位置97和100处的天冬酰胺，并且此外随机分配了CDR H1、H2和H3以补偿经由亲和力成熟过程替换Asn97和Asn100引起的亲和力损失。
此文库经由与次要外壳蛋白p3融合而置于丝状噬菌体上(Marks等人(1991)J MolBiol 222,581-597)，并被选择用于与重组CD3ε结合。
在初步筛选中鉴定出10个候选克隆，作为Fab片段(在大肠杆菌中产生)，如通过SPR测量显示其对重组抗原的可接受的结合。
然而，这些克隆中只有一个显示出在转化为IgG形式后通过流式细胞术测量到与表达CD3的细胞具有可接受的结合活性。
所选的克隆(本文中称为“CD3优化”且分别包含SEQ ID NO 7和11的VH和VL序列)经进一步评估并转化为如下所述的双特异性形式。
实例2-优化的CD3结合剂与CD3的结合
与重组CD3的结合
针对优化的CD3结合剂“CD3优化”和原始CD3结合剂“CD3原始”，通过表面等离子体共振(SPR)测定与重组CD3的结合，两者均呈人IgG1形式，在Fc区(SEQ ID NO 12和14(CD3原始)和SEQ ID NO 13和14(CD3优化))中具有P329G L234A L235A(“PGLALA”，EU编号)突变。
为了评估脱酰胺位点移除的效应和其对抗体稳定性的影响，在37℃或40℃温度应激14天后，检测了原始的和优化的CD3结合剂与重组CD3的结合。将储存在-80℃的样品用作参考。将参考样品和在40℃受应激的样品置于20mM His，140mM NaCl(pH 6.0)中，且将在37℃受应激的样品置于PBS(pH 7.4)中，浓度均为1.2-1.3mg/ml。在应激期(14天)后，将PBS中的样品透析回20mM His、140mM NaCl，pH 6.0以进行进一步分析。
样品的相对活性浓度(RAC)通过SPR测定如下。
在Biacore T200仪器(GE Healthcare)上进行SPR。使用标准的胺偶联化学将抗Fab捕获抗体(GE Healthcare,#28958325)固定在S系列传感器芯片CM5(GE Healthcare)上，得到4000–6000个共振单位(RU)的表面密度。使用HBS-P+(10mM HEPES，150mM NaCl pH7.4，0.05％表面活性剂P20)作为运行和稀释缓冲液。将浓度为2μg/ml的CD3抗体以5μl/min的流速注射60秒。CD3抗原(见下文)以10μg/ml的浓度注射120秒，并监测到以5μl/min的流速解离120秒。芯片表面通过两次连续注射10mM甘胺酸pH 2.1进行再生，每次注射60秒。通过减去空白注射并通过减去从空白对照流通池获得的应答来校正大折射率偏差。为了评估，在注射结束后5秒获取结合反应。为了将结合信号归一化，CD3结合除以抗Fab应答(在固定化的抗Fab抗体上捕获CD3抗体时获得的信号(RU))。通过将每个温度加压样品与相应的加压力样品进行比较来计算相对活性浓度。
所使用的抗原是融合至具有杵臼修饰和C末端Avi-tag的人Fc域的CD3δ与CD3ε胞外结构域的异二聚体(参见SEQ ID NO 41和42)。
这一实验的结果在图2中示出。可以看出，与原始CD3结合剂CD3原始相比，在温度应激(在37℃，pH 7.4 2周)后，优化的CD3结合剂CD3优化显示出与CD3的结合得到极大改进。这一结果表明，脱酰胺位点移除是成功的，并产生了一种具有优异稳定性特性(与体内半衰期有关)的抗体，以及抗体在中性pH的配方。
Jurkat细胞上与CD3的结合
针对优化的CD3结合剂“CD3优化”和原始CD3结合剂“CD3原始”，通过FACS测定与人报告T细胞系Jurkat NFAT上的CD3的结合，两者均呈人IgG1形式，在Fc区(SEQ ID NO 12和14(CD3原始)和SEQ ID NO 13和14(CD3优化))中具有P329G L234A L235A(“PGLALA”，EU编号)突变。
Jurkat-NFAT报告细胞(GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P；Promega#CS176501)是一种具有NFAT启动子的人急性淋巴细胞白血病报告细胞系，表达人CD3。将该等细胞在RPMI1640、2g/l葡萄糖、2g/l NaHCO3、10％ FCS、25mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、1xNEAA、1x丙酮酸钠中以0.1-0.5mio细胞/ml培养。每当细胞传代时，添加最终浓度为200μg/ml潮霉素B。
对于结合测定，收获Jurkat NFAT细胞，用PBS洗涤并重悬浮于FACS缓冲液中。在96孔圆底板中进行抗体染色。因此，每孔接种100’000至200’000个细胞。在400x g下将孔板离心4min，并且除去上清液。将测试抗体在FACS缓冲液中稀释，并在4℃将20μl的抗体溶液添加至细胞持续30min。为了移除未结合的抗体，在添加稀释的二级抗体(PE缀合的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcg片段特异性；Jackson ImmunoResearch#109-116-170)之前，用FACS缓冲液洗涤细胞两次。在4℃孵育30min后洗掉未结合的二级抗体。在测量之前，将细胞重悬浮于200μl FACS缓冲液中，然后使用BD Canto II装置通过流式细胞术进行分析。
如图3所示，优化的CD3结合剂“CD3优化”和原始CD3结合剂“CD3原始”与Jurkat细胞上的CD3结合得相当好。
实例3–优化的CD3结合剂的功能活性
在Jurkat报告细胞测定中测试优化的CD3结合剂“CD3优化”的功能活性并与原始CD3结合剂“CD3原始”的活性进行比较。为了测试IgG的功能活性，在存在CD3优化人IgG1 PGLALA或CD3原始人IgG1 PGLALA的浓度增加的情况下，将表达抗PGLALA的CHO细胞与Jurkat NFAT报告细胞共孵育。T细胞交联后CD3在Jurkat NFAT报告细胞上的活化诱导荧光素酶的产生，且发光可被测量为活化标志物。CD3原始人IgG1 wt作为阴性对照物包括在内，其无法与表达抗PGLALA的CHO细胞结合，且因此无法在Jurkat NFAT细胞上交联。该测定的示意图在图4中提供。
表达抗PGLALA的CHO细胞为CHO-K1细胞，其经工程化以在其表面上表达抗体，该抗体特异性结合人IgG1 Fc(PGLALA)(参见WO 2017/072210，该文献以引用方式并入本文中)。将这些细胞在含5％ FCS+1％GluMax的DMEM/F12培养基中进行培养。Jurkat NFAT报告细胞如实例2中所述。
在CD3 huIgG1 PGLALA与CHO上表达的抗PGLALA和Jurkat-NFAT报告细胞上表达的CD3同时结合后，NFAT启动子被活化并导致活性萤火虫荧光素酶的表达。发光信号的强度(在添加荧光素酶底物后获得)与CD3活化和信号传导的强度成正比。使Jurkat-NFAT报告细胞在悬浮液中生长，并且在RPMI1640、2g/l葡萄糖、2g/l NaHCO3、10％FCS、25mM HEPES、2mML-谷氨酰胺、1x NEAA、1x丙酮酸钠中以0.1-0.5mio细胞/ml、200μg/ml潮霉素培养。对于测定，收获CHO细胞并使用ViCell测定活力。在100μl培养基中，将30 000个靶细胞/孔接种于平底白壁96孔板(Greiner bio-one#655098)中，并添加50μl/孔的经稀释的抗体或培养基(用于对照)至CHO细胞。随后，收获Jurkat-NFAT报告细胞并使用ViCell评估活力。将细胞以1.2mio细胞/ml重悬浮于不含潮霉素B的细胞培养基中，并以60 000个细胞/孔(50μl/孔)添加至CHO细胞以得到2:1的最终效应物与靶标(E:T)比率和200μl/孔的最终体积。然后，将4μl的GloSensor(Promega#E1291)添加至每个孔(最终体积的2％)。将细胞在湿润培养箱中于37℃孵育24小时。在孵育时间结束时，使用TECAN Spark 10M检测发光。
如图5中所示，优化的CD3结合剂CD3优化在交联后在Jurkat NFAT细胞上具有与CD3原始类似的活性。
实例4-包含优化的CD3结合剂的T细胞双特异性抗体的产生
实例1中所鉴定的优化的CD3结合剂(“CD3优化”，SEQ ID NO 7(VH)和SEQ ID NO 11(VL))用于产生靶向CD3和CD19(“CD19-TCB”)的T细胞双特异性抗体(TCB)，使用抗CD19抗体2B11或018作为CD19结合部分(分别为SEQ ID NO 15-22或28-35)。
图6A中提供了TCB分子的示意图，并且其完整序列在SEQ ID NO 39、24、25和27(2B11)以及SEQ ID NO 36、37、38和27(018)中给出。
还制备了包含上述任一抗CD19抗体作为靶细胞抗原结合部分和CD3原始作为CD3结合剂的相应分子(SEQ ID NO 39、24、25和26(2B11)，以及SEQ ID NO 40、37、38和26(018))。
将重链和轻链DNA序列的可变区与预插入各自的受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链在框架中一起亚克隆，如图6B至6E所示。
为了改善轻链与相对应重链的正确配对，将突变引入CD19结合Fab分子的人CL(E123R，Q124K)和人CH1(K147E，K213E)中。
为了正确配对重链(形成异源二聚体分子)，在抗体重链的恒定区中引入了杵入臼突变(分别为T366W/S354C和T366S/L368A/Y407V/Y349C)。
此外，将P329G、L234A和L235A突变引入抗体重链的恒定区以消除与Fcγ受体的结合。
TCB由Evitria(Switzerland)使用其专有的载体系统通过常规的(基于非PCR)克隆技术并使用悬浮液适应的CHO K1细胞(最初接收自ATCC，并且适于在Evitria的悬浮液培养物中进行无血清生长)制备。在生产过程中，Evitria使用了其专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。用相对应的表达载体以1:1:2:1的比率(“载体杵重链”:“载体臼重链”：“载体CD3轻链”:“载体CD19轻链”)转染细胞。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收集上清液。
作为Evitria制备的替代方法，通过HEK293 EBNA细胞的瞬时转染内部制备TCB分子。对细胞进行离心，然后用经过预热的CD CHO培养基(Thermo Fisher，#10743029)代替原培养基。将表达载体在CD CHO培养基中混合，添加聚乙烯亚胺(PEI；Polysciences Inc,#23966-1)，将溶液涡旋混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，将细胞(2mio/ml)与载体/PEI溶液混合，将其转移至烧瓶中，并且置于振荡培养箱中，在5％ CO2的气氛下于37℃下孵育3小时。孵育后，加入含有补充剂(占总体积的80％)的Excell培养基(W.Zhou和A.Kantardjieff，Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing，DOI：10.1007/978-3-642-54050-9；2014)。转染后1天，加入补充剂(饲料，占总体积的12％)。7天后通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液。
通过标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。简言之，利用蛋白A亲和色谱法(平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH 7.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH 3.0)从细胞培养上清液中纯化含Fc的蛋白质。在pH 3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(Millipore
Figure BDA0004001003030001121
ULTRA-15，#UFC903096)浓缩蛋白质，并且通过尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。
通过测量280nm处的吸光度来测定纯化的蛋白质的浓度，其中根据Pace等人(Protein Science,1995,4,2411-1423)所述的方法，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。利用HPLC色谱法在25℃下测定聚集体含量，该系统使用分析型尺寸排阻色谱柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)，并且在运行缓冲液(分别为25mMK2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸盐酸盐(pH 6.7)或200mM KH2PO4、250mM KCl(pH6.2))中平衡。
表1给出所制备的TCB分子的生化和生物物理分析结果。
所有四种TCB分子都可以良好质量产生。
表1.CD19-TCB格式的抗CD3抗体CD3优化的生化分析和生物物理分析。通过分析尺寸排阻色谱法测定单体含量。通过非还原性CE-SDS测定纯度。
分子 单体[％] 纯度[％]
<![CDATA[CD19(018)CD3<sub>原始</sub>]]> 91 97
<![CDATA[CD19(2B11)CD3<sub>原始</sub>]]> 96 97
<![CDATA[CD19(2B11)CD3<sub>优化</sub>]]> 98 99
<![CDATA[CD19(018)CD3<sub>优化</sub>]]> 98 99
实例5–通过表面等离子体共振(SPR)优化的抗CD3(多特异性)抗体的功能表征
使用实例4中制备的CD19-TCB分子，在Biacore T200仪器上，在25℃进行SPR实验，其中HBS-EP+作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.005％表面活性剂P20(GE Healthcare,#BR-1006-69))。抗Fc(P329G)IgG(一种特异性结合人IgG1 Fc(P329G)的抗体；“抗PG抗体”-参见WO 2017/072210，通过引用并入本文中)通过胺偶联直接固定在C1芯片(GE Healthcare)上。在25nM处捕获不同的TCB分子。CD19抗原(人CD19胞外结构域(ECD)-Fc融合；参见SEQ ID NO43和44)或CD3抗原(CD3ε/δ–Fc融合；参见实例2，SEQ ID NO41和42)的三倍稀释系列(在HBS-EP中为0.14至100nM)以30μl/min流过配体240秒以记录缔合相。监测解离相1500秒(CD19抗原)或800秒(CD3抗原)，并通过从样品溶液切换到HBS-EP+来触发该解离相。在每一次循环后，使用两次10mM甘氨酸pH 2.1注入60秒，使芯片表面再生。通过减去在参比流通池(不具有捕获的TCB)上获得的应答来校正本体折射率差异。亲和常数是通过使用Biaeval软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合而由动力学速率常数得出的。用三个独立的稀释系列进行测量。
测定了四种经测试的TCB与重组人CD19(表2)和与重组人CD3(表3)的1:1Langmuir结合的动力学常数。
表2.与人CD19结合：动力学常数。同一运行中的独立稀释系列的平均值和标准偏差(括号内)。
Figure BDA0004001003030001141
表3.与人CD3结合：动力学常数。同一运行中的独立稀释系列的平均值和标准偏差(括号内)。
Figure BDA0004001003030001142
不同的结合剂在不同的TCB中显示出类似的亲和力。CD19结合剂2B11在对应的TCB中具有约0.4nM的KD。CD19结合剂018的亲和力略低，在对应的TCB中具有约1.1nM的KD。具有CD3结合剂CD3原始或CD3优化的TCB具有与KD为约3.4nM的CD3相当的亲和力。虽然CD19和CD3抗原相互作用的KD类似，但动力学不同。CD19的解离速度比CD3慢，但CD3的缔合速度比CD19快，从而导致类似的KD值。
实例6–具有优化的抗CD3抗体的CD19-TCB分子与表达人CD19和人CD3的细胞的结合
测试了实例4中制备的CD19-TCB分子与表达人CD19和CD3的靶细胞的结合。使用了两种具有不同CD19表达水平的表达CD19的细胞系。即，Nalm-6，一种具有高CD 19表达的急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞系；和具有平均表达水平的Z-138(套细胞淋巴瘤)。使用永生化T淋巴细胞系(Jurkat细胞系)评估CD3结合。简单说来，收获细胞，进行计数，检查其活力并以1x106个细胞/ml重悬浮于FACS缓冲液(PBS+2％ FCS+5mM EDTA+0.25％叠氮化钠)中。在CD19-TCB分子的浓度增加的情况下(在Jurkat细胞上为200nM–0.05nM；在Z-128和Nalm-6细胞上为200nM–0.0002nM)，将100μl细胞悬浮液(含0.1x106个细胞)于圆底96孔板中在4℃孵育30min，用冷FACS缓冲液洗涤两次，在4℃用PE-缀合的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcγ片段特异性二级抗体(Jackson Immuno Research Lab PE#109-116-170)进一步再孵育30min，用冷FACS缓冲液洗涤两次，并立即使用FACS CantoII(软件FlowJo10.5.3)通过FACS进行分析。使用GraphPad Prism 7计算结合曲线和与结合相关的EC50值。
结果示于图7以及表4和表5中。包含作为CD3结合剂的CD3优化的CD19-TCB分子显示与包含CD3结合剂CD3原始的分子相当(或略佳)的CD3结合(图7A和表4)。
CD19-TCB分子(包含作为CD19结合剂的2B11或018)显示与表达CD19的细胞相当的结合(表7B、C和表5)。对于Z-138细胞，由于结合曲线未达到饱和，因此无法计算EC50值。
表4.CD19-TCB与表达人CD3的Jurkat细胞结合的EC50值(nM)。
Figure BDA0004001003030001151
Figure BDA0004001003030001161
表5.CD19-TCB与表达人CD19的目标Nalm-6细胞结合的EC50值(nM)。
抗体 EC50[nM]
<![CDATA[CD19(2B11)CD3<sub>优化</sub>]]> 0.6
<![CDATA[CD19(018)CD3<sub>优化</sub>]]> 1
<![CDATA[CD19(2B11)CD3<sub>原始</sub>]]> 0.7
<![CDATA[CD19(018)CD3<sub>原始</sub>]]> 1.5
实例7–通过具有优化的抗CD3抗体的CD19-TCB分子诱导的肿瘤细胞裂解和T细胞活化
在Nalm-6细胞(ALL)和Z-138细胞(套细胞淋巴瘤)上评估了通过实例4中所制备的CD19-TCB分子介导的对表达CD19的肿瘤细胞的裂解和随后的T细胞活化。人PBMC用作效应子，并在与不同的TCB分子孵育20小时时检测到肿瘤裂解。
通过对从健康人类供体获得的富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层)进行Histopaque密度离心制备外周血单核细胞(PBMC)。用无菌PBS稀释新鲜血液，并在Histopaque梯度(Sigma,#H8889)上分层。离心分离(450x g，不间断，30分钟，室温)后，弃去含有PBMC的中间相以上的血浆，并将PBMC转移到新的falcon管中，随后用50ml PBS填充。将混合物离心分离(350x g，10分钟，室温)，弃去上清液，并将PBMC沉淀物在红细胞裂解液中在37℃孵育5分钟，随后用无菌PBS洗涤(以300x g离心，10分钟)。将所得PBMC群体重新悬浮在PBS中并自动计数(ViCell)。在含有10％ FCS和1％ GlutaMAX(Gibco)(含有10％ DMSO(Sigma,#D2650))的RPMI1640培养基(Gibco,#21870076)中冷冻50mio PBMC/冷冻管。在测定当天解冻PBMC并再次自动计数(ViCell)。将所需量用无菌PBS洗涤一次。根据制造商的说明，使用CD20微珠粒(Miltenyi,#130-091-104)进行B细胞耗尽。对B细胞耗尽的PBMC进行计数(ViCell)并在含有10％ FCS和1％ GlutaMAX的RPMI1640培养基中以5x106个细胞/ml重悬浮。
对于杀伤测定，将0.25mio B细胞耗尽的PBMC添加到U底96孔板中。简单说来，以50000个细胞/孔的密度收获、洗涤和接种靶细胞，使得最终效应物与靶标(E:T)的比为5:1。以指示浓度(0.02pM–1000pM范围，一式三份)添加TCB分子。在测定中已经将CD107a(LAMP-1)直接染色(PE抗人CD107a；Biolegend，#328608)。
在37℃、5％ CO2下孵育20小时后，通过定量凋亡/坏死细胞释放到细胞上清液中的LDH(LDH检测试剂盒，Roche Applied Science，#11 644793 001)来评估肿瘤细胞裂解。通过用1％ Triton X-100孵育靶细胞来实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共孵育的靶细胞，而没有双特异性构建体。
为了评估肿瘤细胞裂解时发生的T细胞活化，将PBMC以400x g离心4分钟，并用FACS缓冲液洗涤两次。简单说来，将细胞用PBS洗涤两次，然后进行活/死染色(Zombie AquaFixable Viability试剂盒；Biolegend，#423102，RT 20分钟)。先用PBS再通过FACS缓冲液反复洗涤后，根据供应商的指示对CD3(PE-Cy5抗人CD3；BD Pharmigen，#555341)、CD4(BV605抗人CD4；Biolegend，#317438)、CD8(BV711抗人CD8；Biolegend，#301044)、CD25(PE-Cy7抗人CD25；Biolegend，#302612)和CD69(BV421抗人CD69；Biolegend，#310930)进行表面染色。将细胞用150μl/孔FACS缓冲液洗涤两次，并用120μl/孔1x裂解液(BD Biosciences#349202)固定。在BD FACS Fortessa(软件FlowJo 10.5.3)上分析样品。
图8显示CD19-TCB分子诱导CD19+靶细胞的靶标特异性杀伤。四种不同的CD19-TCB分子在诱导表达CD19的肿瘤细胞裂解方面具有总体可比性。图9和图10显示，与含有CD3原始结合剂的分子相比，含有CD3优化结合剂的CD19-TCB在肿瘤杀伤后显示出略微优越的T细胞活化诱导(在杀伤Nalm-6或Z-138靶细胞后CD8和CD4 T细胞上的CD25、CD69和CD107表达)。没有观察到CD19结合剂2B11和018对T细胞活化的影响。
表6.在表达CD19的肿瘤靶细胞上评估CD19-TCB分子介导的肿瘤细胞裂解的EC50值(pM)。
EC50(pM) Nalm-6 Z-138
<![CDATA[CD19(2B11)CD3<sub>优化</sub>]]> 0.24 2.9
<![CDATA[CD19(018)CD3<sub>优化</sub>]]> 0.4 3
<![CDATA[CD19(2B11)CD3<sub>原始</sub>]]> 0.3 4.8
<![CDATA[CD19(018)CD3<sub>原始</sub>]]> 0.3 5.4
表7.使用Z-138作为靶细胞，由CD19-TCB分子介导的肿瘤细胞裂解后T细胞活化的EC50值(pM)。
Figure BDA0004001003030001181
表8.使用Nalm-6作为靶细胞，由CD19-TCB分子介导的肿瘤细胞裂解后T细胞活化的EC50值(pM)。
Figure BDA0004001003030001182
实例8–具有优化的抗CD3抗体的CD19-TCB分子的热稳定性测定
包含优化的抗CD3抗体CD3优化(和CD19结合剂2B11，参见实例4)的CD19-TCB分子的热稳定性通过静态光散射(SLS)进行监测，该静态光散射通过使用Uncle系统(UnchainedLabs,USA)施加温度斜坡进行。
将蛋白质浓度为1mg/ml的9μl过滤蛋白质样品施加至Uncle装置。温度以0.1℃/min从30℃升温至90℃，收集266nm处的散射强度。
结果示于表9中。
表9.如通过静态光散射测量的CD19-TCB分子的热稳定性。
抗CD3抗体 <![CDATA[T<sub>agg</sub>[℃]]]>
<![CDATA[CD3<sub>优化</sub>]]> 64.8
实例9–应激后通过表面等离子体共振(SPR)表征具有优化的抗CD3抗体的CD19-TCB分子
为了证实脱酰胺位点移除的效应和其对抗体稳定性的影响，将包含优化的抗CD3抗体CD3优化(和CD19结合剂2B11，参见实例4)的CD19-TCB分子在37℃、pH 7.4和40℃、pH 6孵育14天，并进一步通过SPR分析其与人CD3ε/δ的结合能力。使用储存在-80℃pH 6的样品作为参考。参考样品和在40℃在20mM His、140mM NaCl，pH 6.0中应激的样品，以及在37℃在PBS，pH 7.4中应激的样品，浓度均为1.0mg/ml。在应激期(14天)后，将PBS中的样品透析回20mM His、140mM NaCl，pH6.0以进行进一步分析。
所有SPR实验均在25℃使用HBS-P+(10mM HEPES、150mM NaCl pH 7.4、0.05％表面活性剂P20)作为运行和稀释缓冲液在Biacore T200仪器(GE Healthcare)上进行。将生物素化的人CD3ε/δ(参见实例2，SEQ ID NO 41和42)以及生物素化的抗huIgG(CaptureSelect,Thermo Scientific,#7103262100)固定在S系列传感器芯片SA(GE Healthcare,#29104992)上，使得表面密度为至少1000个共振单位(RU)。以5μl/min的流速注入2μg/ml浓度的TCB，持续30秒，并监测解离120秒。通过注入10mM甘氨酸pH 1.5，持续60秒，使表面再生。通过减去空白注入和减去从空白对照流通池获得的应答来校正本体折射率差异。为了评估，在注射结束后5秒采取结合应答。为了将结合信号归一化，CD3结合除以抗huIgG应答(在固定化的抗huIgG抗体上捕获TCB时获得的信号(RU))。通过将每个温度加压样品与相应的加压力样品进行比较来计算相对结合活性。
如表10所示，包含优化的抗CD3结合剂CD3优化的CD19-TCB与CD3ε/δ的结合基本上不受应激影响，与CD3结合剂的结果一致(实例2)。
表10.在pH 6/40℃或pH 7.4/37℃孵育2周后CD19-TCB分子与人CD3ε/δ的结合活性。
Figure BDA0004001003030001201
实例10–通过具有优化的抗CD3抗体的CD19-TCB分子诱导的体内B细胞耗尽和细胞因子释放
为了解CD19-TCB分子(包含优化的抗CD3抗体CD3优化和2B11CD19结合剂)的效力和安全性型态，进行了一项体内作用模式研究，评估人源化NSG小鼠的外周B细胞耗尽和细胞因子释放。
根据规定指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，将实验开始时为4-5周龄的雌性NSG小鼠(Jackson Laboratory)维持在不含特定病原体的条件下，日循环为12h光照/12h黑暗。实验研究方案经过地方政府的审查和批准(ZH223-17)。到达之后，将动物维持一周以适应新环境并进行观察。定期进行连续健康状态监测。
对雌性NSG小鼠i.p.注射15mg/kg的白消安，接着在一天后i.v.注射从脐带血中分离的1x105个人造血干细胞。在干细胞注射后第14-16周，对小鼠进行舌下放血并且通过流式细胞术针对成功的人源化对血液进行分析。将有效移植的小鼠根据它们的人T细胞频率随机分到不同的处理组。在随机分组后，将来自三个组的小鼠用奥妥珠单抗(
Figure BDA0004001003030001202
)(30mg/kg)预处理一次，作为防止细胞因子过度释放的措施。
在此预处理后7天，即第0天，使所有组均接受不同剂量的CD19-TCB；CD20-TCB(靶向CD20并包含CD3结合剂CD3原始的TCB)；或媒介物。注射了三种不同剂量(0.5、0.15和0.05mg/kg)的CD19-TCB。将具有和不具有
Figure BDA0004001003030001212
预处理的CD20-TCB(0.15mg/kg)用作比较剂。向所有小鼠静脉注射200μl适当的溶液。每组三只小鼠在治疗后(第0天)4小时、24小时和72小时时放血。
研究设计示于图11中，并且研究组汇总于表11中。
表11.研究组(每组动物数量＝3，治疗施用＝i.v.)
Figure BDA0004001003030001211
在终止时(第3天)，处死小鼠，并收获脾脏、淋巴结(LN)和骨髓(BM)，称重，并且经由释放酶和DNA酶的酶消化制备单细胞悬液，以用于随后的FACS分析。对脾脏单细胞以及所有血样进行人CD45、CD19、CD20染色，并在BD Fortessa流式细胞仪上进行分析。另外，通过多重分析对三个放血时间点的血清进行细胞因子含量分析。
图12显示了处理组的体重变化(％)。与CD20-TCB处理相比，CD19-TCB分子诱导的体重下降较少。这种体重下降与所用的剂量无关。此外，经处理动物的血清中的细胞因子分析揭示，在用CD20-TCB分子处理后4小时时，细胞因子水平升高到峰值(其可以通过用
Figure BDA0004001003030001213
(GPT)预处理来降低)，而对于CD19-TCB分子，仅检测到低水平的细胞因子(图13)。
关于血液中B细胞耗尽动力学的免疫PD数据(图14)揭示，随着时间的推移通过CD19-TCB的CD19+CD20+B细胞的强烈耗尽(CD19+或CD20+细胞的平均计数/μl血液+/-SEM)，且显示有剂量依赖性。在用CD19-TCB与CD20-TCB同样有效的处理后72小时时，在分析的所有淋巴器官中也观察到这种B细胞耗尽效应(资料未示出)。
实例11–通过具有优化的抗CD3抗体的CD19-TCB分子在小鼠异种移植实验中的肿瘤生长控制
为了评估CD19-TCB分子(包含优化的抗CD3抗体CD3优化和2B11CD19结合剂)在体内的抗肿瘤功效，给人源化NSG小鼠植入来自R-CHOP治疗的复发患者的CD19+淋巴瘤患者来源的异种移植(PDX)细胞。当肿瘤体积达到200mm3时，基于肿瘤大小将小鼠随机分为8组。然后向其每周注射0.5mg/kg CD19-TCB或媒介物(i.v.)，如图15所示。为了评估CD19-TCB对肿瘤生长的影响，根据每周两次或三次的卡尺测量计算肿瘤体积。
因此，与媒介物处理相比，每周CD19-TCB处理可显著控制肿瘤生长(图16)。此数据表明每周给药0.5mg/kg CD19-TCB对携带淋巴瘤PDX的huNSG小鼠有效，并显示R-CHOP处理复发的淋巴瘤患者可受益于CD19-TCB处理。
***
尽管为了清楚理解的目的先前已通过举例说明和实施方案相当详细地描述了本发明，但是这些描述和实施方案不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均全文以引用方式明确地并入。
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1               5
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 3
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Gly
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 4
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1               5                   10
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 5
His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr Gly Tyr
1               5                   10
<210> 6
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 6
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
            100                 105                 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 7
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 7
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr
            100                 105                 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 8
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1               5                   10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 9
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1               5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 10
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1               5
<210> 11
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 11
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
            20                  25                  30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
        35                  40                  45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
                85                  90                  95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105
<210> 12
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 12
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
            100                 105                 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
        115                 120                 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
    130                 135                 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145                 150                 155                 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
                165                 170                 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
            180                 185                 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
        195                 200                 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
    210                 215                 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225                 230                 235                 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
                245                 250                 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
            260                 265                 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
        275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
    290                 295                 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305                 310                 315                 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
                325                 330                 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
            340                 345                 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
        355                 360                 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
    370                 375                 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
                405                 410                 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
            420                 425                 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
        435                 440                 445
Leu Ser Leu Ser Pro
    450
<210> 13
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 13
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr
            100                 105                 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
        115                 120                 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
    130                 135                 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145                 150                 155                 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
                165                 170                 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
            180                 185                 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
        195                 200                 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
    210                 215                 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225                 230                 235                 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
                245                 250                 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
            260                 265                 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
        275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
    290                 295                 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305                 310                 315                 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
                325                 330                 335
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
            340                 345                 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
        355                 360                 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
    370                 375                 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
                405                 410                 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
            420                 425                 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
        435                 440                 445
Leu Ser Leu Ser Pro
    450
<210> 14
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 14
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
            20                  25                  30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
        35                  40                  45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
                85                  90                  95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr Val
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
        115                 120                 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
    130                 135                 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
            180                 185                 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
        195                 200                 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 15
Asp Tyr Ile Met His
1               5
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 16
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 17
Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210> 18
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 19
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn
1               5                   10                  15
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 20
Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser
1               5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 21
Leu Gln Leu Leu Glu Asp Pro Tyr Thr
1               5
<210> 22
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
            20                  25                  30
Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
                85                  90                  95
Leu Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210> 23
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
        195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
    210                 215                 220
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gln Ala Val Val Thr
225                 230                 235                 240
Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr
                245                 250                 255
Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp
            260                 265                 270
Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr
        275                 280                 285
Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu
    290                 295                 300
Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu
305                 310                 315                 320
Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly
                325                 330                 335
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
            340                 345                 350
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
        355                 360                 365
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
    370                 375                 380
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
385                 390                 395                 400
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
                405                 410                 415
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
            420                 425                 430
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
        435                 440                 445
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
    450                 455                 460
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
465                 470                 475                 480
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
                485                 490                 495
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
            500                 505                 510
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
        515                 520                 525
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
    530                 535                 540
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
545                 550                 555                 560
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
                565                 570                 575
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
            580                 585                 590
Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
        595                 600                 605
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
    610                 615                 620
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
625                 630                 635                 640
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
                645                 650                 655
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
            660                 665                 670
Ser Pro
<210> 24
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
        195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
    210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
                245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
            260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
        275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
    290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
                325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
            340                 345                 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
        355                 360                 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
    370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
                405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
            420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
        435                 440                 445
Pro
<210> 25
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
            20                  25                  30
Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
                85                  90                  95
Leu Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg
        115                 120                 125
Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
            180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215
<210> 26
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
            100                 105                 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
        115                 120                 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145                 150                 155                 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
                165                 170                 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
            180                 185                 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
        195                 200                 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
    210                 215                 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230
<210> 27
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 27
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr
            100                 105                 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
        115                 120                 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145                 150                 155                 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
                165                 170                 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
            180                 185                 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
        195                 200                 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
    210                 215                 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 28
Asp Tyr Ile Met His
1               5
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 29
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 30
Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210> 31
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 32
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1               5                   10                  15
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 33
Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser
1               5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 34
Leu Gln Leu Thr His Val Pro Tyr Thr
1               5
<210> 35
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210> 36
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
        195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
    210                 215                 220
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gln Ala Val Val Thr
225                 230                 235                 240
Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr
                245                 250                 255
Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp
            260                 265                 270
Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr
        275                 280                 285
Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu
    290                 295                 300
Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu
305                 310                 315                 320
Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly
                325                 330                 335
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
            340                 345                 350
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
        355                 360                 365
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
    370                 375                 380
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
385                 390                 395                 400
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
                405                 410                 415
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
            420                 425                 430
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
        435                 440                 445
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
    450                 455                 460
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
465                 470                 475                 480
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
                485                 490                 495
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
            500                 505                 510
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
        515                 520                 525
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
    530                 535                 540
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
545                 550                 555                 560
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
                565                 570                 575
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
            580                 585                 590
Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
        595                 600                 605
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
    610                 615                 620
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
625                 630                 635                 640
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
                645                 650                 655
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
            660                 665                 670
Ser Pro
<210> 37
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
        195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
    210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
                245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
            260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
        275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
    290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
                325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
            340                 345                 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
        355                 360                 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
    370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
                405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
            420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
        435                 440                 445
Pro
<210> 38
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg
        115                 120                 125
Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
            180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215
<210> 39
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
        195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
    210                 215                 220
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr
225                 230                 235                 240
Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr
                245                 250                 255
Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp
            260                 265                 270
Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr
        275                 280                 285
Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu
    290                 295                 300
Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu
305                 310                 315                 320
Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly
                325                 330                 335
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
            340                 345                 350
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
        355                 360                 365
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
    370                 375                 380
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
385                 390                 395                 400
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
                405                 410                 415
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
            420                 425                 430
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
        435                 440                 445
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
    450                 455                 460
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
465                 470                 475                 480
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
                485                 490                 495
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
            500                 505                 510
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
        515                 520                 525
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
    530                 535                 540
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
545                 550                 555                 560
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
                565                 570                 575
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
            580                 585                 590
Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
        595                 600                 605
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
    610                 615                 620
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
625                 630                 635                 640
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
                645                 650                 655
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
            660                 665                 670
Ser Pro
<210> 40
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
        195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
    210                 215                 220
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr
225                 230                 235                 240
Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr
                245                 250                 255
Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp
            260                 265                 270
Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr
        275                 280                 285
Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu
    290                 295                 300
Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu
305                 310                 315                 320
Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly
                325                 330                 335
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
            340                 345                 350
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
        355                 360                 365
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
    370                 375                 380
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
385                 390                 395                 400
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
                405                 410                 415
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
            420                 425                 430
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
        435                 440                 445
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
    450                 455                 460
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
465                 470                 475                 480
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
                485                 490                 495
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
            500                 505                 510
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
        515                 520                 525
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
    530                 535                 540
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
545                 550                 555                 560
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
                565                 570                 575
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
            580                 585                 590
Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
        595                 600                 605
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
    610                 615                 620
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
625                 630                 635                 640
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
                645                 650                 655
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
            660                 665                 670
Ser Pro
<210> 41
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 41
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1               5                   10                  15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro
            20                  25                  30
Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp
        35                  40                  45
Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg
65                  70                  75                  80
Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg
                85                  90                  95
Val Ser Glu Asn Cys Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser
            100                 105                 110
Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
        115                 120                 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
    130                 135                 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145                 150                 155                 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                165                 170                 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
            180                 185                 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
        195                 200                 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
    210                 215                 220
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225                 230                 235                 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
                245                 250                 255
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
            260                 265                 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
        275                 280                 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
    290                 295                 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305                 310                 315                 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
                325                 330                 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu
            340                 345                 350
Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
        355                 360
<210> 42
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 42
Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys
1               5                   10                  15
Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser
            20                  25                  30
Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly
        35                  40                  45
Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr
    50                  55                  60
Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Arg Ser Glu Gln Leu Tyr Phe Gln
65                  70                  75                  80
Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                85                  90                  95
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            100                 105                 110
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        115                 120                 125
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    130                 135                 140
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                165                 170                 175
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            180                 185                 190
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        195                 200                 205
Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
225                 230                 235                 240
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                245                 250                 255
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
            260                 265                 270
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        275                 280                 285
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    290                 295                 300
Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
305                 310                 315                 320
Ile Glu Trp His Glu
                325
<210> 43
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 43
Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val
1               5                   10                  15
Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr
            20                  25                  30
Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe
    50                  55                  60
Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro
65                  70                  75                  80
Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val
                85                  90                  95
Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly
            100                 105                 110
Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro
        115                 120                 125
Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg
    130                 135                 140
Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser
145                 150                 155                 160
Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr
                165                 170                 175
Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro
            180                 185                 190
Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser
        195                 200                 205
Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu
    210                 215                 220
Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr
225                 230                 235                 240
Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr
                245                 250                 255
Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys
            260                 265                 270
Val Asp Ala Ser Gly Gly Ser Pro Thr Pro Pro Thr Pro Gly Gly Gly
        275                 280                 285
Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
    290                 295                 300
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
305                 310                 315                 320
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
                325                 330                 335
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
            340                 345                 350
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
        355                 360                 365
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
    370                 375                 380
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
385                 390                 395                 400
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
                405                 410                 415
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
            420                 425                 430
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
        435                 440                 445
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
    450                 455                 460
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
465                 470                 475                 480
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
                485                 490                 495
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
            500                 505                 510
Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln
        515                 520                 525
Lys Ile Glu Trp His Glu
    530
<210> 44
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 44
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
            20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
        35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
    50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
                85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
            100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
        115                 120                 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
    130                 135                 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
                165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
            180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
        195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
    210                 215                 220
Pro
225
<210> 45
<211> 186
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1               5                   10                  15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro
            20                  25                  30
Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp
        35                  40                  45
Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg
65                  70                  75                  80
Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg
                85                  90                  95
Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met Ser Val Ala Thr Ile
            100                 105                 110
Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr
        115                 120                 125
Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly
    130                 135                 140
Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro
145                 150                 155                 160
Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp
                165                 170                 175
Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
            180                 185
<210> 46
<211> 177
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 46
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln
1               5                   10                  15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu
            20                  25                  30
Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys Asn Lys Glu Asp Ser
        35                  40                  45
Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly
    50                  55                  60
Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His
65                  70                  75                  80
His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp
                85                  90                  95
Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Leu
            100                 105                 110
Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys
        115                 120                 125
Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly
    130                 135                 140
Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro
145                 150                 155                 160
Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg
                165                 170                 175
Ile
<210> 47
<211> 225
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
            20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
        35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
    50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
                85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
            100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
        115                 120                 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
    130                 135                 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
                165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
            180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
        195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
    210                 215                 220
Pro
225
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 48
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 49
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 50
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
1               5                   10
<210> 51
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 51
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
1               5                   10
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
        35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
    50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
                85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
            100                 105
<210> 53
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
        35                  40                  45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
    50                  55                  60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65                  70                  75                  80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
                85                  90                  95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
            100                 105
<210> 54
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                325

Claims (31)

1.一种与CD3和CD19结合的抗体，其中所述抗体包含
(a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:3的HCDR 2和SEQIDNO:5的HCDR 3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ IDNO:9的LCDR 2和SEQ ID NO:
10的LCDR 3；以及
(b)与CD19结合的第二抗原结合结构域和任选的第三抗原结合结构域。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述第一抗原结合结构域的所述VH包含与SEQ IDNO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，且/或所述第一抗原结合结构域的所述VL包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
3.一种与CD3和CD19结合的抗体，其中所述抗体包含
(a)与CD3结合的第一抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:7的VH序列和SEQ ID NO:11的VL序列；以及
(b)与CD19结合的第二抗原结合结构域和任选的第三抗原结合结构域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中所述第一抗原结合结构域、所述第二抗原结合结构域和/或在存在时的所述第三抗原结合结构域为Fab分子。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述第一抗原结合结构域为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是可变结构域VL和VH彼此替换。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中所述第二抗原结合结构域和在存在时的所述第三抗原结合结构域为常规Fab分子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中所述第二抗原结合结构域和在存在时的所述第三抗原结合结构域为Fab分子，其中在恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)；并且在恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)，并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域彼此融合，任选地经由肽接头融合。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自为Fab分子，并且(i)所述第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与所述第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合，或(ii)所述第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与所述第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体，其中所述第一抗原结合结构域、所述第二抗原结合结构域和在存在时的所述第三抗原结合结构域各自为Fab分子，并且所述抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；并且其中(i)所述第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与所述第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合，并且所述第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与所述Fc结构域的第一亚基的N末端融合，或(ii)所述第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与所述第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合，并且所述第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与所述Fc结构域的第一亚基的N末端融合；并且所述第三抗原结合结构域在存在时在Fab重链的C末端与所述Fc结构域的第二亚基的N末端融合。
12.根据权利要求5至11中任一项所述的抗体，其中所述Fc结构域为IgG Fc结构域，特别是IgG1 Fc结构域。
13.根据权利要求5至12中任一项所述的抗体，其中所述Fc结构域为人Fc结构域。
14.根据权利要求5至13中任一项所述的抗体，其中Fc包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基进行缔合的修饰。
15.根据权利要求5至14中任一项所述的抗体，其中所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体的结合和/或降低效应子功能。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体，其中所述第二抗原结合结构域和在存在时的所述第三抗原结合结构域包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:15的HCDR 1、SEQ ID NO:16的HCDR 2和SEQ ID NO:17的HCDR3；以及VL，其包含SEQID NO:19的LCDR 1、SEQ ID NO:20的LCDR 2和SEQ IDNO:21的LCDR 3；或
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:28的HCDR 1、SEQ ID NO:29的HCDR 2和SEQ ID NO:30的HCDR 3；以及VL，其包含SEQID NO:32的LCDR 1、SEQ ID NO:33的LCDR 2和SEQ IDNO:34的LCDR 3。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的抗体，其中所述第二抗原结合结构域和在存在时的所述第三抗原结合结构域包含
(i)VH，其包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或
(ii)VH，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
18.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至17中任一项所述的抗体。
19.一种宿主细胞，其包含根据权利要求18所述的分离的多核苷酸。
20.一种产生与CD3和CD19结合的抗体的方法，其包括以下步骤：(a)在适合表达所述抗体的条件下培养根据权利要求19所述的宿主细胞，以及任选地(b)回收所述抗体。
21.一种与CD3和CD19结合的抗体，其通过根据权利要求20所述的方法产生。
22.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至17或21中任一项所述的抗体以及药用载体。
23.根据权利要求1至17或21中任一项所述的抗体或根据权利要求22所述的药物组合物，其用作药物。
24.根据权利要求1至17或21中任一项所述的抗体或根据权利要求22所述的药物组合物，其在疾病的治疗中使用。
25.根据权利要求24所述使用的抗体，其中所述疾病为癌症或自身免疫性疾病。
26.根据权利要求1至17或21中任一项所述的抗体或根据权利要求22所述的药物组合物在制造药物中的用途。
27.根据权利要求1至17或21中任一项所述的抗体或根据权利要求22所述的药物组合物在制造用于治疗疾病的药物中的用途。
28.根据权利要求27所述的用途，其中所述疾病为癌症或自身免疫性疾病。
29.一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至17或21中任一项所述的抗体或根据权利要求22所述的药物组合物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述疾病为癌症或自身免疫性疾病。
31.如前所述的本发明。
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