CN114828965A - 与hla-a2/mage-a4结合的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明大体上涉及与HLA‑A2/MAGE‑A4结合的抗体，包括例如用于活化T细胞的多特异性抗体。此外，本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生所述抗体的方法，以及涉及在疾病的治疗中使用所述抗体的方法。

Description

与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体
技术领域
本发明大体上涉及与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体，包括例如用于活化T细胞的多特异性抗体。此外，本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生该抗体的方法，以及涉及在疾病的治疗中使用该抗体的方法。
背景技术
MAGE-A4(黑素瘤相关抗原4)是癌症睾丸抗原(CTA)MAGE家族的成员。MAGE-A蛋白家族涵盖12个高度同源的基因，这些基因聚集在Xq26-28处，并且由保守结构域(MAGE同源结构域，MHD)的存在来表征。尽管在20多年前就已发现MAGE蛋白，但对于其生物学功能仍然知之甚少。根据其表达模式，MAGE家族可分为I型和II型两个亚家族，其中MAGE-A组属于I型亚家族，其表达仅限于生殖细胞系和癌细胞。许多报道表明，I型MAGE的过表达与癌症恶性、肿瘤生长和患者预后不良之间存在相关性。细胞内蛋白质诸如MAGE-A4可以在蛋白酶体中降解，加工并通过主要组织相容性复合物(MHC)I作为T细胞表位呈递在细胞表面。因此，MAGE-A4衍生肽诸如MAGE-A4 p230-239(GVYDGREHTV)在HLA-A2环境中呈递在细胞表面，并可以触发T细胞识别。
鉴于其表达模式，MAGE-A4可能是癌症疗法的有希望的靶标。迄今为止，利用MAGE-A4作为癌症(免疫)疗法靶标的方法主要集中于开发靶向HLA-A2/MAGE-A4的T细胞受体(TCR)及其在基因工程化的T细胞(WO 2017/174824)或融合分子(WO 2017/175006)中的用途。还产生了针对HLA-A2/MAGE-A4复合物的TCR样抗体，包括其双特异性衍生物(另外靶向CD3)(WO 2016/199141)。
与靶细胞上的表面抗原和活化性T细胞抗原(诸如T细胞上的CD3)结合的双特异性抗体(在本文中也称为T细胞双特异性抗体或“TCB”)对于治疗各种癌症具有很好的前景。这种抗体与其两个靶标的同时结合将迫使靶细胞和T细胞之间发生暂时的相互作用，导致T细胞受体交联，并随后活化任何细胞毒性T细胞，随后裂解靶细胞。鉴于它们在靶细胞杀伤方面的效力，靶标的选择和靶向抗体的特异性对于T细胞双特异性抗体避免中靶和脱靶毒性至关重要。细胞内蛋白诸如MAGE-A4是有吸引力的靶标，但只有与主要组织相容性复合物(MHC)结合的T细胞受体(TCR)样抗体可接近，这些主要组织相容性复合物(MHC)将源自细胞内蛋白的肽抗原呈递到细胞表面。TCR样抗体的固有问题是可能与MHC分子本身或呈递除所需肽以外的肽的MHC分子发生交叉反应，这可能会损害器官或组织的选择性。
发明内容
本发明提供了新型抗体，包括多特异性(例如双特异性)抗体，其与HLA-A2/MAGE-A4结合并且对于治疗目的具有特别有利的特性。特别地，(多特异性)抗体以良好的亲和力和显著的特异性与HLA-A2/MAGE-A4结合，并结合良好的功效和可生产性以及低毒性和良好的药代动力学特性。
在一个方面，本发明提供了一种与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体，其中抗体包含第一抗原结合结构域，第一抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:25的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:28的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:1的HCDR 1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:4的LCDR 1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR3；
(iii)VH，其包含SEQ ID NO:41的HCDR 1、SEQ ID NO:42的HCDR 2和SEQ ID NO:43的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:44的LCDR 1、SEQ ID NO:45的LCDR 2和SEQ ID NO:46的LCDR 3；
(iv)VH，其包含SEQ ID NO:9的HCDR 1、SEQ ID NO:10的HCDR 2和SEQ ID NO:11的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:12的LCDR 1、SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3；
(v)VH，其包含SEQ ID NO:17的HCDR 1、SEQ ID NO:18的HCDR 2和SEQ ID NO:19的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:20的LCDR 1、SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3；或
(vi)VH，其包含SEQ ID NO:33的HCDR 1、SEQ ID NO:34的HCDR 2和SEQ ID NO:35的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:36的LCDR 1、SEQ ID NO:37的LCDR 2和SEQ ID NO:38的LCDR 3。
在一个方面，第一抗原结合结构域包含
(i)VH，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
(ii)VH，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
(iii)VH，其包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
(iv)VH，其包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
(v)VH，其包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或
(vi)VH，其包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体，其中抗体包含第一抗原结合结构域，第一抗原结合结构域包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQID NO:8的氨基酸序列；
(iii)VH，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
(iv)VH，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(v)VH，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；或
(vi)VH，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一个方面，抗体是多特异性抗体，特别是双特异性抗体。
在一个方面，抗体包含与第二抗原结合的第二抗原结合结构域。
在一个方面，第二抗原为活化性T细胞抗原，特别是CD3，最特别是CD3ε。
在一个方面，第二抗原结合结构域包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:59的HCDR 1、SEQ ID NO:60的HCDR 2和SEQ ID NO:61的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:62的LCDR 1、SEQ ID NO:63的LCDR 2和SEQ ID NO:64的LCDR 3；或
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:51的HCDR 1、SEQ ID NO:52的HCDR 2和SEQ ID NO:53的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:54的LCDR 1、SEQ ID NO:55的LCDR 2和SEQ ID NO:56的LCDR 3。
在一个方面，第二抗原结合结构域包含
(i)VH，其包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或
(ii)VH，其包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，第二抗原结合结构域包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
在一个方面，抗体包含第三抗原结合结构域。在一个方面，第三抗原结构域与HLA-A2/MAGE-A4结合。第三抗原结合结构域可以单独或组合并入本文描述的与第一抗原结合结构域相关的任何特征。在一个方面，第三抗原结构域与第一抗原结合结构域相同。
在一个方面，第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域(如果存在的话)和/或第三抗原结合结构域(如果存在的话)是Fab分子。
在一个方面，第二抗原结合结构域为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是可变结构域VL和VH彼此替换。
在一个方面，第一抗原结合结构域以及在存在时的第三抗原结合结构域为常规Fab分子。
在一个方面，第一抗原结合结构域以及在存在时的第三抗原结合结构域为Fab分子，其中在恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)；而在恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)，并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域彼此融合，任选地经由肽接头融合。
在一个方面，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自是Fab分子并且(i)第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合，或者(ii)第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合。
在一个方面，抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。
在一个方面，第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域以及在存在时的第三抗原结合结构域各自为Fab分子，并且抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；并且(i)第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合，并且第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基的N末端融合，或者(ii)第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合，并且第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基的N末端融合；并且第三抗原结合结构域在存在时在Fab重链的C末端与Fc结构域的第二亚基的N末端融合。
在一个方面，Fc结构域是IgG，特别是IgG1 Fc结构域。在一个方面，Fc结构域是人Fc结构域。在一个方面，Fc包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基进行缔合的修饰。在一个方面，Fc结构域包含降低与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或更多个氨基酸取代。
根据本发明的另一个方面，提供了编码本发明的抗体的分离的多核苷酸和包含本发明的分离的多核苷酸的宿主细胞。
在另一方面，提供了产生与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：(a)在适合表达该抗体的条件下培养本发明的宿主细胞，以及任选地(b)回收该抗体。本发明还涵盖通过本发明的方法产生的与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体。
本发明进一步提供了包含本发明的抗体和药用载体的药物组合物。
本发明还涵盖使用本发明的抗体和药物组合物的方法。在一个方面，本发明提供了用作药物的根据本发明的抗体或药物组合物。在一个方面，提供了根据本发明的用于治疗疾病的抗体或药物组合物。在一个具体方面，疾病为癌症。
还提供了根据本发明的抗体或药物组合物在制造药物中的用途，根据本发明的抗体或药物组合物在制造用于治疗疾病、特别是癌症的药物中的用途。本发明还提供了一种治疗个体中的疾病的方法，包括向所述个体施用有效量的根据本发明的抗体或药物组合物。在一个具体方面，疾病为癌症。
附图说明
图1.本发明的双特异性抗原结合分子的示例性构型。(A，D)“1+1CrossMab”分子示意图。(B，E)“2+1IgG Crossfab”分子示意图，其中Crossfab和Fab组分的顺序交替(“倒置”)。(C，F)“2+1IgG Crossfab”分子示意图。(G，K)“1+1IgG Crossfab”分子示意图，其中Crossfab和Fab组分的顺序交替(“倒置”)。(H，L)“1+1IgG Crossfab”分子示意图。(I，M)具有两个CrossFab的“2+1IgG Crossfab”分子的示意图。(J，N)具有两个CrossFab的“2+1IgGCrossfab”分子的示意图，其中Crossfab和Fab组分的顺序交替(“倒置”)。(O，S)“Fab-Crossfab”分子示意图。(P，T)“Crossfab-Fab”分子示意图。(Q，U)“(Fab)2-Crossfab”分子示意图。(R，V)“Crossfab-(Fab)2”分子示意图。(W，Y)“Fab-(Crossfab)2”分子示意图。(X，Z)“(Crossfab)2-Fab”分子示意图。黑点：Fc结构域中促进异源二聚化的任选修饰。++、--：任选引入CH1和CL结构域中的具有相反电荷的氨基酸。Crossfab分子被描述为包含VH区和VL区的交换，但是可以-在其中在CH1和CL结构域中不引入电荷修饰的方面中-可替代地包含CH1和CL结构域的交换。
图2.实例中制备的T细胞双特异性(TCB)抗体分子的图示。所有测试的TCB抗体分子均以带有电荷修饰的“2+1IgG CrossFab，倒置”产生(在CD3结合剂中的VH/VL交换，在MAGE-A4结合剂中的电荷修饰，EE＝147E、213E；RK＝123R、124K)。
图3.T细胞介导的T2细胞裂解，T2细胞用MAGE-A4 p230-239肽(GVYDGREHTV)(A)或无关肽(NY-ESO1 p157-165:(SLLMWITQC))(B)脉冲，用不同MAGE-A4 CD3 TCB分子诱导(E:T＝10:1，人PBMC效应细胞)。所描绘的是三个平行，带有SD。
图4.不同MAGE-A4 CD3 TCB分子与Jurkat-NFAT报告细胞和T2细胞(用MAGE-A4p230-239肽(GVYDGREHTV)(A)或无关肽(NY-ESO1 p157-165:(SLLMWITQC))(B)脉冲)上的人CD3同时结合时的Jurkat活化(如通过发光测定的)。所描绘的是三个平行，带有SD。
图5.不同适应症的HLA-A2+/MAGE-A4+肿瘤细胞系与由不同MAGE-A4 CD3 TCB分子诱导的HLA-A2+/MAGE-A4-MDA-MB-231细胞(E:T＝10:1，人PBMC效应细胞)的T细胞介导的裂解。(A)分子A，(B)分子D，(C)分子E，(D)分子B，(E)分子C，(F)分子F。所描绘的是三个平行，带有SD。
图6.不同适应症的HLA-A2+/MAGE-A4-肿瘤细胞系与由不同MAGE-A4 CD3 TCB分子诱导的HLA-A2+/MAGE-A4+NCI-H1755细胞(E:T＝10:1，人PBMC效应细胞)的T细胞介导的裂解。(A)分子A，(B)分子C，(C)分子E，(D)分子B，(E)分子D，(F)分子F。所描绘的是三个平行，带有SD。
图7.通过丙氨酸扫描鉴定MAGE-A4 CD3 TCB的MAGE-A4肽的结合残基。(A)不同MAGE-A4 CD3 TCB分子与Jurkat-NFAT报告细胞和T2细胞(用不同的ALA扫描肽脉冲)上的人CD3同时结合时的Jurkat活化确定的EC50值。小图(B)描绘了不同突变ALA扫描肽的EC50的x倍变化。关键接触残余物以粗体标记。
图8.不同MAGE-A4 CD3 TCB分子与Jurkat-NFAT报告细胞和T2细胞(用MAGE-A4p230-239肽(GVYDGREHTV)或所示33个预测的脱靶肽之一脉冲)上的人CD3同时结合时的Jurkat活化(如通过发光测定的)。所绘制的是MAGE-A4诱导信号与POTP诱导信号的百分比((CPS[POTP]–CPS[未脉冲的细胞])/(CPS[MAGE-A4]–CPS[未脉冲的细胞])*100)。比率>2％的脱靶肽被认为是相关的，并以灰色突出显示。
图9.通过Jurkat活化测定对509个预测的脱靶肽进行评估的分子D的已鉴定脱靶肽的总结。所描绘的是MAGE-A4诱导信号与POTP诱导信号的百分比((CPS[POTP]–CPS[未脉冲的细胞])/(CPS[MAGE-A4]–CPS[未脉冲的细胞])*100)。所描绘的是在所进行的2种测定之一中显示信号>2％的所有脱靶肽。
图10.在Jurkat活化测定中验证分子D的已识别脱靶肽。所描绘的是分子D与Jurkat-NFAT报告细胞和T2细胞(用感兴趣的脱靶肽脉冲)上的人CD3同时结合时测量的发光。
图11.通过Jurkat活化测定对509个预测的脱靶肽进行评估的分子G的已鉴定脱靶肽的总结。所描绘的是MAGE-A4诱导信号与POTP诱导信号的百分比((CPS[POTP]–CPS[未脉冲的细胞])/(CPS[MAGE-A4]–CPS[未脉冲的细胞])*100)。所描绘的是显示信号>2％的所有脱靶肽。
图12.不同MAGE-A4 IgG分子的PGLALA修饰的Fc结构域与Jurkat-NFAT报告细胞(基因工程化以表达直接针对IgG分子的Fc部分中的PGLALA突变的TCR)和T2细胞(用MAGE-A4 p230-239肽(GVYDGREHTV)(A)或MAGE-A4-/HLA-A2+MDA-MB231细胞(B)脉冲的)同时结合时的PGLALA-CAR-J活化。所描绘的是三个平行，带有SD。
图13.由含有不同MAGE-A4和CD3结合剂组合的不同MAGE-A4CD3 TCB分子诱导的不同适应症的各种HLA-A2+/MAGE-A4+肿瘤细胞系的T细胞介导的裂解(E:T＝10:1，人PBMC效应细胞)。所描绘的是三个平行，带有SD。(A)UMUC-3细胞，(B)A375细胞，(C)NCI-H2023。
图14.由MAGE-A4 CD3 TCB分子R(E:T＝10:1，人PBMC效应细胞)诱导的A375细胞、工程化以过表达HLA-A2的A375细胞和具有MAGE-A4敲除的A375细胞的T细胞介导的裂解。
图15.由MAGE-A4 CD3 TCB分子R(E:T＝10:1，人PBMC效应细胞)诱导的A375细胞、工程化以过表达HLA-A2的A375细胞和具有MAGE-A4敲除(ko)的A375细胞的T细胞介导的裂解时的细胞因子释放。
图16.在用MAGE-A4 CD3 TCB分子R(E:T＝5:1，人PBMC效应细胞)处理后，实时评估不同HLA-A2+/MAGE-A4+肿瘤细胞系的生长。(A)NCI-H1755；(B)UMUC-3；(C)A375；(D)ScaBer；(E)NCI-H1703；(F)NCI-H2023。
图17.如实例13所述，在人源化小鼠的IM-9异种移植物中MAGE-A4CD3 TCB分子R的研究设计和剂量发现功效研究的分组。
图18.如实例13所述，在人源化小鼠的IM-9异种移植物MAGE-A4CD3 TCB分子R的剂量发现功效研究中所有组的肿瘤生长动力学。(A)平均值+/-SEM；(B-E)每只小鼠的个体肿瘤生长。
图19.如实例13所述，在人源化小鼠的IM-9异种移植物中MAGE-A4CD3 TCB分子R的剂量发现功效研究中的肿瘤中T细胞浸润(B)。
具体实施方式
I.定义
除非在下文中另外定义，否则本文使用的术语通常如本领域中所使用的。
如本文所用，关于抗原结合结构域等的术语“第一”、“第二”或“第三”在每种类型的部分多于一种时用于方便区分。除非明确说明，否则这些术语的使用并非旨在赋予部分的特定次序或取向。然而，一般而言，与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗原结合结构域在本文中称为“第一抗原结合结构域”(并且在存在与HLA-A2/MAGE-A4结合的另外的抗原结合结构域的情况下，称为“第三抗原结合结构域”)，且与第二抗原结合的抗原结合结构域在本文中称为“第二抗原结合结构域”。
术语“抗HLA-A2/MAGE-A4抗体”和“与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力与HLA-A2/MAGE-A4结合，使得所述抗体可用作靶向HLA-A2/MAGE-A4的诊断和/或治疗剂。在一个方面，例如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，抗HLA-A2/MAGE-A4抗体与不相关的、非HLA-A2/MAGE-A4蛋白的结合程度小于抗体与HLA-A2/MAGE-A4结合的约10％。在某些方面，与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体具有≤1μM、≤500nM、≤200nM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(KD)。
“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。本文描述了用于确定本发明抗体特异性的合适测定，例如下文实例9中所述。在一个方面，抗体与无关蛋白质的结合程度为所述抗体与抗原结合的小于约10％，如例如通过SPR所测量的。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，其包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv和scFab)；单结构域抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，请参见Hollinger和Hudson,NatureBiotechnology 23:1126-1136(2005)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换使用以指代具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可能的变异抗体外，该群体中包括的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，所述可能的变异抗体例如含有天然存在的突变或是在单克隆抗体制备物的生产过程中产生的，此类变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“分离的”抗体为已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些方面，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度，纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法)方法测定。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。在一些方面，本发明提供的抗体是分离的抗体。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些方面，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR对应于非人抗体的CDR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。此类可变结构域在本文中称为“人源化可变区”。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。在一些方面，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。在某些方面，人抗体来源于非人转基因哺乳动物，例如小鼠、大鼠或兔。在某些方面，人抗体来源于杂交瘤细胞系。在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段也被认为是人抗体或人抗体片段。
术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分，该部分包含与抗原的部分或全部结合并互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。在优选的方面，抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和互补决定区(CDR)。参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman&Co，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。如本文所用，与可变区序列有关的“Kabat编号”是指由Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)提出的编号系统。
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和恒定结构域的氨基酸位置根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统进行编号，并且在本文中被称为“根据Kabat编号”或“Kabat编号”。具体地讲，将Kabat编号系统(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第647页至第660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且将Kabat EU索引编号系统(参见第661页至第723页)用于重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)，这在本文中通过在此种情况下称为“根据Kabat EU索引编号”或“Kabat EU索引编号”来进一步阐明。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并且确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。一般来讲，抗体包含六个CDR；三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，并且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处发生的高可变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))处发生的CDR；以及
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处发生的抗原接触(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另有说明，否则CDR根据Kabat等人所述的方法(同上)确定。本领域技术人员将理解，也可以根据Chothia(同上)、McCallum(同上)所述的方法或任何其他在科学上接受的命名系统来确定CDR名称。
“框架”或“FR”是指除互补决定区(CDR)之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常在VH(或VL)中以如下次序出现：FR1-HCDR1(LCDR1)-FR2-HCDR2(LCDR2)-FR3-HCDR3(LCDR3)-FR4。
除非另外指明，否则可变结构域中的CDR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，出处同上编号。
出于本文目的的“受体人框架”是这样的框架，其包含来源于如下所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与所述人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列，或者其可以包含氨基酸序列变化。在一些方面，氨基酸变化的数量为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少或2个或更少。在一些方面，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述的亚组。
本文中的术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变结构域(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变区)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N-末端到C-末端，每条轻链具有可变结构域(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变区)，接着是一个恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可配属为以下五种类型中的一种：称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而被配属为以下两种类型中的一种：称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。免疫球蛋白实质上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
抗体或免疫球蛋白的“类”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，以及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“Fab分子”是指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1结构域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL结构域组成的蛋白质。
所谓“交叉”Fab分子(也称为“Crossfab”)，意指以下Fab分子：其中Fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域发生交换(即互相替换)，即交叉Fab分子包含由轻链可变结构域VL和重链恒定结构域1CH1组成的肽链(VL-CH1，在N端至C端方向)，以及由重链可变结构域VH和轻链恒定结构域CL组成的肽链(VH-CL，在N端至C端方向)。为清楚起见，在其中Fab轻链的可变结构域和Fab重链的可变结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链恒定结构域1CH1的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。相反地，在其中Fab轻链的恒定结构域和Fab重链的恒定结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链可变结构域VH的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。
与之相比，所谓“常规”Fab分子，意指处于其天然形式的Fab分子，即，包含由重链可变结构域和恒定结构域组成的重链(VH-CH1，在N端至C端方向)，以及由轻链可变结构域和恒定结构域组成的轻链(VL-CL，在N端至C端方向)。
本文的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个方面，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链的C末端的一个或多个，特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可以包括全长重链，或者所述抗体可以包括全长重链的切割变体。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据Kabat EU索引)的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。如果没有另外指明，则包含Fc区(或如本文所定义的Fc结构域的亚基)的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有C末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在一个方面，包括如本文所指定的Fc区(亚基)的重链包含在根据本发明的抗体中，该重链包含另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在一个方面，包括如本文所指定的Fc区(亚基)的重链包含在根据本发明的抗体中，所述重链包含另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)来编号的，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991(还可参见上文)中所述。如本文所用的Fc结构域的“亚基”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽，该多肽能够稳定自缔合。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。
所谓“融合”，意指组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)直接地或经由一个或更多个肽连接基通过肽键链接。
术语“多特异性”意指该抗体能够特异性地结合至少两种不同的抗原决定簇。多特异性抗体可以是例如双特异性抗体。典型地，双特异性抗体包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每一个对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些方面，该多特异性(例如双特异性)抗体能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种不同细胞上表达的两种抗原决定簇。
如本文所用的术语“价”表示在抗原结合分子中存在指定数目的抗原结合位点。因此，术语“与抗原单价结合”表示在抗原结合分子中存在对抗原具有特异性的一个(并且不超过一个)抗原结合位点。
“抗原结合位点”是指提供与抗原的相互作用的抗原结合分子的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)的氨基酸残基。天然免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，Fab分子通常具有单个抗原结合位点。
如本文所用，术语“抗原决定簇”或“抗原”是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合结构域与所述位点结合，从而形成抗原结合结构域-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。在一个优选方面，抗原是人类蛋白质。
如本文所用，“活化性T细胞抗原”是指在T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞表面表达的抗原决定簇，其在与抗原结合分子相互作用时能够诱导T细胞活化。具体而言，抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联来诱导T细胞活化。在特定方面，活化性T细胞抗原是CD3，特别是CD3的ε亚基。
除非另外指明，否则“CD3”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工CD3，以及由细胞中的加工所产生的任何形式的CD3。该术语还涵盖CD3的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个方面，CD3是人CD3，特别是人CD3的ε亚基(CD3ε)。人CD3ε的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:76中(无信号肽)。还参见UniProt(www.uniprot.org)登录号P07766(版本189)，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1。在另一方面，CD3是食蟹猴(Macacafascicularis)CD3，特别是食蟹猴CD3ε。食蟹猴CD3ε的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:77中(无信号肽)。还参见NCBI GenBank no.BAB71849.1。在某些方面，本发明的抗体与在来自不同物种的CD3抗原中保守的CD3(特别是人和食蟹猴CD3)的表位结合。在优选的方面，抗体与人CD3结合。
如本文所用的“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，该靶细胞为例如肿瘤中的细胞(诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)(在此情况下，“肿瘤细胞抗原”)。根据本发明，靶细胞抗原是HLA-A2/MAGE-A4，特别是HLA-A2/MAGE-A4 p230-239。
“MAGE-A4”代表“黑素瘤相关抗原4”，其为癌症睾丸抗原(CTA)MAGE家族的成员。MAGE-A蛋白家族涵盖12个高度同源的基因，这些基因聚集在Xq26-28处，并且由保守结构域(MAGE同源结构域，MHD)的存在来表征。人MAGE-A4描述于UniProt(www.uniprot.org)登录号P43358(条目版本163)中，且人MAGE-A4的氨基酸序列也示于本文的SEQ ID NO:74中。除非另外指明，如本文所用的“MAGE-A4”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然MAGE-A4，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工MAGE-A4，以及通过细胞中加工产生的任何形式的MAGE-A4。该术语还涵盖MAGE-A4的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个方面，MAGE-A4是人MAGE-A4，特别是SEQ ID NO:74的蛋白质。
“MAGE-A4 p230-239”或“p230-239肽”意指具有氨基酸序列GVYDGREHTV(SEQ ID NO:73；SEQ ID NO:74的MAGE-A4蛋白的第230-239位)的MAGE-A4衍生肽。
“HLA-A2”、“HLA-A*02”、“HLA-A02”或“HLA-A*2”(可互换使用)是指HLA-A血清型组中的人白细胞抗原血清型。HLA-A2蛋白(由各自的HLA基因编码)构成各自的I类MHC(主要组织相容性复合物)蛋白的α链，其进一步包含β2微球蛋白亚基。具体的HLA-A2蛋白是HLA-A201(也称为HLA-A0201、HLA-A02.01或HLA-A*02:01)。在具体方面，本文所述的HLA-A2蛋白是HLA-A201。
“HLA-A2/MAGE-A4”是指HLA-A2分子和MAGE-A4衍生肽(本文也称为“MAGE-A4肽”)，具体是p230-239肽(“HLA-A2/MAGE-A4p230-239”)的复合物。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的完善确立的方法测量，包括本文所述的那些方法。用于测量亲和力的优选方法是表面等离子体共振(SPR)。
“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个互补决定区(CDR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致了抗体对抗原的亲和力的改善。
“降低的结合”(例如降低的与Fc受体的结合)是指对相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为清楚起见，该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即完全消除相互作用。相反地，“增加的结合”是指对相应相互作用的结合亲和力增加。
如本文所用，“T细胞激活”是指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞响应，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和激活标志物的表达。测量T细胞激活的合适测定是本领域已知的并在本文中描述的。
“促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰”是对肽骨架的操纵或Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成同源二聚体。如本文所用，“促进缔合的修饰”优选地包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一者进行的单独修饰，其中所述修饰彼此互补以促进这两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可以改变Fc结构域亚基中的一者或两者的结构或电荷，以便分别使它们的缔合在空间上或静电上有利。因此，(异源)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，就融合至每个亚基的另外组分(例如抗原结合结构域)而言则可能是不同的。在一些方面，促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，具体是氨基酸取代。在一个优选的方面，促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰在Fc结构域的两个亚基中的每个亚基中包含单独的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。
“活化性Fc受体”是这样的Fc受体：其在被抗体的Fc结构域接合后引发刺激携带该受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。人活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是与包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞，该特异性结合通常是通过Fc区的N末端的蛋白质部分。如本文所用，术语“降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量减少，和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度增加。ADCC降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的)，由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如，由在Fc结构域中包含降低ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的降低是相对于由在Fc结构域中没有该氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC。用于测量ADCC的合适测定法是本领域中熟知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT公开号WO 2012/130831)。
如本文所用，术语“工程化、工程化的、工程改造”被认为包括对肽骨架的任何操纵，或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程改造包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。
如本文所用的术语“氨基酸突变”表示涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如减少的与Fc受体的结合，或增加的与另一肽的缔合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和插入。优选的氨基酸突变是氨基酸取代。出于改变例如Fc区域的结合特征的目的，非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸，是特别优选的。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)进行替代。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法来产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。设想通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。本文可使用各种名称来指示相同的氨基酸突变。例如，将Fc结构域的329位处的脯氨酸取代为甘氨酸可以表示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列相同的百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并且引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列相同的百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列相同的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列相同的百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。可替代地，可使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成相同的百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.CopyrightOffice,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册，并且如WO2001/007611所述。
除非另外指明，否则出于本文的目的，用BLOSUM50比较矩阵，使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序产生氨基酸序列相同的％值。FASTA程序包由以下文献创作：W.R.Pearson和D.J.Lipman,“Improved Tools for Biological SequenceAnalysis”,PNAS 85(1988):2444-2448；W.R.Pearson“Effective protein sequencecomparison”Meth.Enzymol.266(1996):227-258；以及Pearson等人，(Genomics 46(1997)24-36)并且可从www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta公开获得。可替代地，可以使用可在fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)来确保执行全局而非局部比对。在输出的比对标头(alignment header)中给出氨基酸相同的百分比。
术语“多核苷酸”或“核酸分子”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基组成，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见例如Stadler等人，(2017)Nature Medicine 23:815-817，或EP 2 101823B1)。
“分离的”核酸分子是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸分子包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“编码抗体的分离的多核苷酸(或核酸)”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个多核苷酸分子，包括在单一载体或不同的载体中的此类多核苷酸分子，以及存在于宿主细胞中一个或多个位置的此类多核苷酸分子。
如本文所用的术语“载体”是指能够载运与其相连的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可用于产生本发明的抗体的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物的培养细胞，诸如仅举几个示例HEK细胞、CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个方面，本发明的宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞。在一个方面，宿主细胞不是人体内的细胞。
术语“药物组合物”或“药物制剂”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
“药用载体”是指药物组合物或配制物中除有效成分之外的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或在临床病理学过程中执行的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些方面，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些方面，个体或受试者是人。
药剂(例如药物组合物)的“有效量”是指能够以必需的剂量在必需的时段内有效地实现期望的治疗或预防结果的量。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
II.组合物和方法
本发明提供了与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体，包括与HLA-A2/MAGE-A4和第二抗原结合的多特异性抗体。这些(多特异性)抗体显示出良好的亲和力和显著的特异性，并结合其他有利于治疗应用的特性，例如关于功效和安全性、药代动力学以及可生产性。本发明的抗体可用于例如治疗疾病，诸如癌症。
A.抗HLA-A2/MAGE-A4抗体
在一个方面，本发明提供了与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体。在一个方面，提供了与HLA-A2/MAGE-A4结合的分离的肽。在一个方面，本发明提供了于HLA-A2/MAGE-A4特异性结合的抗体。
在一个方面，本发明提供了一种与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体，其中抗体包含第一抗原结合结构域，第一抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:25的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:28的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:1的HCDR 1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:4的LCDR 1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR3；
(iii)VH，其包含SEQ ID NO:41的HCDR 1、SEQ ID NO:42的HCDR 2和SEQ ID NO:43的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:44的LCDR 1、SEQ ID NO:45的LCDR 2和SEQ ID NO:46的LCDR 3；
(iv)VH，其包含SEQ ID NO:9的HCDR 1、SEQ ID NO:10的HCDR 2和SEQ ID NO:11的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:12的LCDR 1、SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3；
(v)VH，其包含SEQ ID NO:17的HCDR 1、SEQ ID NO:18的HCDR 2和SEQ ID NO:19的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:20的LCDR 1、SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3；或
(vi)VH，其包含SEQ ID NO:33的HCDR 1、SEQ ID NO:34的HCDR 2和SEQ ID NO:35的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:36的LCDR 1、SEQ ID NO:37的LCDR 2和SEQ ID NO:38的LCDR 3。
在一个方面，本发明提供了与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体，其中抗体包含第一抗原结合结构域，第一抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:25的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:26的HCDR 2、以及SEQ ID NO:27的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:28的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:29的LCDR2和SEQ ID NO:30的LCDR 3。
在一个方面，抗体为人源化抗体。在一个方面，抗原结合结构域是人源化抗原结合结构域(即人源化抗体的抗原结合结构域)。在一个方面，VH和/或VL是人源化可变区。
在一个方面，VH和/或VL包含受体人框架，诸如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个方面，抗体为人抗体。在一个方面，抗原结合结构域是人抗原结合结构域(即人抗体的抗原结合结构域)。在一个方面，VH和/或VL是人可变区。
在一个方面，VH包含选自由以下项组成的组的重链可变区序列的一个或多个重链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQID NO:31、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:47，特别是SEQ ID NO:31的重链可变区序列。在一个方面，VH包含与选自由以下项组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:39和SEQ ID NO:47，特别是SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一个方面，VH包含与选自由以下项组成的组的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:47，特别是SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一个方面，VH包含与选自由以下项组成的组的氨基酸序列至少约98％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:47，特别是SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在某些方面，至少具有95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗体保留了与HLA-A2/MAGE-A4结合的能力。在某些方面，在SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:47的氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个方面，VH包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:47，特别是SEQ ID NO:31的氨基酸序列。任选地，VH包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:39和SEQ IDNO:47，特别是SEQ ID NO:31的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个方面，VL包含选自由以下项组成的组的轻链可变区序列的一个或多个轻链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24、SEQID NO:32、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:48，特别是SEQ ID NO:32的轻链可变区序列。在一个方面，VL包含与选自由以下项组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:40和SEQ ID NO:48，特别是SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一个方面，VL包含与选自由以下项组成的组的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:48，特别是SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一个方面，VL包含与选自由以下项组成的组的氨基酸序列至少约98％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:48，特别是SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在某些方面，至少具有95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗体保留了与HLA-A2/MAGE-A4结合的能力。在某些方面，在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:48的氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个方面，VL包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:48，特别是SEQ ID NO:32的氨基酸序列。任选地，VL包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40和SEQ IDNO:48，特别是SEQ ID NO:32的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个方面，第一抗原结合结构域包含
(i)VH，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(ii)VH，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(iii)VH，其包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(iv)VH，其包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(v)VH，其包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；或
(vi)VH，其包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一个方面，第一抗原结合结构域包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；
(iii)VH，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
(iv)VH，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(v)VH，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；或
(vi)VH，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一个方面，第一抗原结合结构域包含VH和VL，所述VH包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；所述VL包含与SEQ IDNO:32的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，第一抗原结合结构域包含VH和VL，所述VH包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，所述VL包含SEQID NO:32的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体，其中抗体包含第一抗原结合结构域，第一抗原结合结构域包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；
(iii)VH，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
(iv)VH，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(v)VH，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；或
(vi)VH，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体，其中抗体包含第一抗原结合结构域，第一抗原结合结构域包含VH和VL，VH包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体，其中所述抗体包含第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含
(i)包含SEQ ID NO:31的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQ ID NO:32的VL的轻链CDR序列的VL；
(ii)包含SEQ ID NO:7的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQ ID NO:8的VL的轻链CDR序列的VL；
(iii)包含SEQ ID NO:47的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQ ID NO:48的VL的轻链CDR序列的VL；
(iv)包含SEQ ID NO:15的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQ ID NO:16的VL的轻链CDR序列的VL；
(v)包含SEQ ID NO:23的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQ ID NO:24的VL的轻链CDR序列的VL；或
(vi)包含SEQ ID NO:39的VH的重链CDR序列的VH和包含SEQ ID NO:40的VL的轻链CDR序列的VL。
在一个方面，本发明提供了与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体，其中抗体包含第一抗原结合结构域，第一抗原结合结构域包含VH和Vl，VH包含SEQ ID NO:31的VH的重链CDR序列，VL包含SEQ ID NO:32的VL的轻链CDR序列。
在另一方面，第一抗原结合结构域包含
(i)SEQ ID NO:31的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及SEQ ID NO:32的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:7的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及SEQ ID NO:8的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列；
(iii)SEQ ID NO:47的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及SEQ ID NO:48的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列；
(iv)SEQ ID NO:15的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及SEQ ID NO:16的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列；
(v)SEQ ID NO:23的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及SEQ ID NO:24的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列；或
(vi)SEQ ID NO:39的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及SEQ ID NO:40的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个方面，第一抗原结合结构域包含SEQ ID NO:31的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:32的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个方面，第一抗原结合结构域包含
(i)VH和/或VL，所述VH包含SEQ ID NO:31的VH的重链CDR序列，以及与SEQ ID NO:31的VH的框架序列至少95％、96％、97％、98％或99％，特别是至少95％或至少98％序列相同的框架；所述VL包含SEQ ID NO:32的VL的轻链CDR序列，以及与SEQ ID NO:32的VL的框架序列至少95％、96％、97％、98％或99％，特别是至少95％或至少98％序列相同的框架；
(i)VH和/或VL，所述VH包含SEQ ID NO:7的VH的重链CDR序列，以及与SEQ ID NO:7的VH的框架序列至少95％、96％、97％、98％或99％，特别是至少95％或至少98％序列相同的框架；所述VL包含SEQ ID NO:8的VL的轻链CDR序列，以及与SEQ ID NO:8的VL的框架序列至少95％、96％、97％、98％或99％，特别是至少95％或至少98％序列相同的框架；
(i)VH和/或VL，所述VH包含SEQ ID NO:47的VH的重链CDR序列，以及与SEQ ID NO:47的VH的框架序列至少95％、96％、97％、98％或99％，特别是至少95％或至少98％序列相同的框架；所述VL包含SEQ ID NO:48的VL的轻链CDR序列，以及与SEQ ID NO:48的VL的框架序列至少95％、96％、97％、98％或99％，特别是至少95％或至少98％序列相同的框架；
(i)VH和/或VL，所述VH包含SEQ ID NO:15的VH的重链CDR序列，以及与SEQ ID NO:15的VH的框架序列至少95％、96％、97％、98％或99％，特别是至少95％或至少98％序列相同的框架；所述VL包含SEQ ID NO:16的VL的轻链CDR序列，以及与SEQ ID NO:16的VL的框架序列至少95％、96％、97％、98％或99％，特别是至少95％或至少98％序列相同的框架；
(i)VH和/或VL，所述VH包含SEQ ID NO:23的VH的重链CDR序列，以及与SEQ ID NO:23的VH的框架序列至少95％、96％、97％、98％或99％，特别是至少95％或至少98％序列相同的框架；所述VL包含SEQ ID NO:24的VL的轻链CDR序列，以及与SEQ ID NO:24的VL的框架序列至少95％、96％、97％、98％或99％，特别是至少95％或至少98％序列相同的框架；或
(i)VH和/或VL，所述VH包含SEQ ID NO:39的VH的重链CDR序列，以及与SEQ ID NO:39的VH的框架序列至少95％、96％、97％、98％或99％，特别是至少95％或至少98％序列相同的框架；所述VL包含SEQ ID NO:40的VL的轻链CDR序列，以及与SEQ ID NO:40的VL的框架序列至少95％、96％、97％、98％或99％，特别是至少95％或至少98％序列相同的框架。
在一个方面，VH包含SEQ ID NO:31的VH的重链CDR序列，和框架，所述框架与SEQID NO:31的VH的框架序列至少有95％、96％、97％、98％或99％的序列相同。在一个方面，VH包含SEQ ID NO:31的VH的重链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ ID NO:31的VH的框架序列至少有95％的序列相同。在另一方面，VH包含SEQ ID NO:31的VH的重链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ ID NO:31的VH的框架序列至少有98％的序列相同。
在一个方面，VL包含SEQ ID NO:32的VL的轻链CDR和框架，所述框架与SEQ ID NO:32的VL的框架序列至少有95％、96％、97％、98％或99％的序列相同。在一个方面，VL包含SEQ ID NO:32的VL的轻链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ ID NO:32的VL的框架序列至少有95％的序列相同。在另一方面，VL包含SEQ ID NO:32的VL的轻链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ ID NO:32的VL的框架序列至少有98％的序列相同。
在一个方面，本发明提供了与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体，其中抗体包含第一抗原结合结构域，第一抗原结合结构域包含VH序列和VL序列，VH序列如在上文提供的方面中任一项所述，VL序列如在上文提供的方面中任一项所述。
在一个方面，抗体包含人恒定区。在一个方面，抗体是包含人恒定区的免疫球蛋白分子，特别是包含人CH1、CH2、CH3和/或CL结构域的IgG类免疫球蛋白分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80(分别为人κ和λCL结构域)和SEQ ID NO:81(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一个方面，抗体包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含的氨基酸序列，与SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:79的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一个方面，所述抗体包含重链恒定区，所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:81的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，重链恒定区可包含如本文所述的Fc结构域中的氨基酸突变。
在一个方面，第一抗原结合结构域包含人恒定区。在一个方面，第一抗原结合部分是包含人恒定区，特别是人CH1和/或CL结构域的Fab分子。在一个方面，第一抗原结合结构域包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含的氨基酸序列，与SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:79的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。具体地，轻链恒定区可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变和/或如果在交叉Fab分子中则可以包含对一个或多个(特别是两个)N末端氨基酸的缺失或取代。在一些方面，第一抗原结合结构域包含重链恒定区，该重链恒定区包含与包含在SEQ IDNO:81的氨基酸序列中的CH1结构域序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。具体地，重链恒定区(特别是CH1结构域)可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变。
在一个方面，抗体为单克隆抗体。
在一个方面，抗体是IgG，特别是IgG1抗体。在一个方面，抗体是全长抗体。
在另一个方面，抗体是选自Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab’)2分子的抗体片段；特别是Fab分子。在另一方面，抗体片段是双体抗体、三体抗体或四体抗体。
在一个方面，第一抗原结合结构域是Fab分子。在优选的方面，第一抗原结合结构域是常规Fab分子。在替代方面，第一抗原结合结构域是Fab分子，其中所述Fab轻链和所述Fab重链的所述可变结构域VL和VH彼此替换或所述恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是所述可变结构域VL和VH彼此替换(即第一抗原结合结构域是交叉Fab分子)。
在另一方面，根据上述方面中任一项所述的抗体可单独或组合地合并如下第II部分A.1.-10所述的特征。
在优选的方面，抗体包含Fc结构域，特别是IgG Fc结构域，更特别是IgG1 Fc结构域。在一个方面，Fc结构域是人Fc结构域。在一个方面，所述Fc结构域是IgG1 Fc结构域。Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成，并且可以单独或组合地并入如下文关于Fc结构域变体(第II.节A.10.)中所述的任何特征。
在另一个优选的方面，抗体包含与第二抗原结合的第二抗原结合结构域(即，抗体是多特异性抗体，如下文进一步描述的(第II节A.9.)中所述的任何特征。
1.抗体片段
在某些方面，本文提供的抗体是抗体片段。
在一个方面，抗体片段是Fab’、Fab’-SH或F(ab’)2分子，特别是如本文所述的Fab分子。“Fab’分子”与Fab分子的不同之处在于Fab’片段在CH1结构域的羧基末端添加了残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是Fab’分子，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')2分子，该分子具有两个抗原结合位点(两个Fab分子)和Fc区的一部分。
在另一方面，抗体片段是双体抗体、三体抗体或四体抗体。“双体抗体”是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。Hudson等人在《自然医学》(Nat.Med.)9:129-134(2003)中还描述了三体抗体和四体抗体。
在另一个方面，抗体片段是单链Fab分子。“单链Fab分子”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和连接基组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述连接基在N端至C端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-连接基-VL-CL、b)VL-CL-连接基-VH-CH1、c)VH-CL-连接基-VL-CH1，或d)VL-CH1-连接基-VH-CL。特别地，所述连接基是至少30个氨基酸，优选地在32个与50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab分子经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab分子可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。
在另一方面，抗体片段是单链可变片段(scFv)。“单链可变片段”或“scFv”是抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的融合蛋白，是通过连接基连接的。特别地，连接基是10个至约25个氨基酸的短多肽，并且通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可以将VH的N-末端与VL的C-末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并且引入了连接基，但该蛋白质仍保留了原始抗体的特异性。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun在The harmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)中所述；还可参见WO 93/16185；以及美国专利5,571,894和5,587,458。
在另一方面，抗体片段是单结构域抗体。“单结构域抗体”是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者抗体的全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些方面，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌)重组产生，如本文所述。
2.人源化抗体
在某些方面，本文提供的抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些方面，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25--34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。
可用于人源化的人架构区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的架构区(参见例如Sims等人，J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定子组的人抗体的共有序列的架构区(参见，例如，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人，J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)架构区或人类种系架构区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的架构区(参见，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
3.人抗体
在某些方面，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk and van de Winkel,Curr Opin Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol.20:450-459(2008)中。
可以通过以下方式来制备人抗体：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座，或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。另参见，例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述
Figure BDA0003698550180000381
技术的美国专利号5,770,429；描述K-M
Figure BDA0003698550180000382
技术的美国专利号7,041,870，以及描述
Figure BDA0003698550180000383
技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900。可以进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人，J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562(2006)中所述。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
人抗体还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的可变结构域序列产生。然后可以将此类可变结构域序列与预期的人恒定结构域结合。从抗体文库中选择人抗体的技术描述如下。
4.源自文库的抗体
在某些方面，本文提供的抗体衍生自文库。可以通过筛选组合文库中具有一个或多个所需活性的抗体来分离本发明的抗体。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner等人，Nature Reviews 16:498-508(2016)中。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有所需结合特征的抗体。此类方法综述于例如Frenzel等人，mAbs8:1177-1194(2016)；Bazan等人，Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828(2012)和Zhao等人，Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289(2016)中，以及Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编辑，Human Press,Totowa,NJ2001)中和Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编辑，Human Press,Totowa,NJ,2003)中。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的所有组成成分通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以从所述噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体，如在Winter等人，Annual Review of Immunology 12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。可替代地，可以克隆初始库(例如，来自人)以为多种非自身抗原和自身抗原提供单一的抗体来源，而无需任何免疫，如由Griffiths等人在EMBO Journal 12:725-734(1993)中所描述的。此外，还通过以下方式来合成天然文库：克隆来自干细胞的未重排的V基因区段；以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并完成体外重排，如由Hoogenboom和Winter在Journal ofMolecular Biology 227:381-388(1992)中所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373；7,985,840；7,785,903和8,679,490以及美国专利公开号2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764和2007/0292936。
本领域已知用于筛选具有一种或多种所需活性的抗体的组合文库的方法的其他实例包括核糖体和mRNA展示，以及对细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞进行抗体展示和选择的方法。用于酵母表面展示的方法综述于例如Scholler等人，Methods inMolecular Biology 503:135-56(2012)和Cherf等人，Methods in Molecular biology1319:155-175(2015)以及Zhao等人，Methods in Molecular Biology 889:73-84(2012)中。用于核糖体展示的方法描述于例如He等人，Nucleic Acids Research 25:5132-5134(1997)和Hanes等人，PNAS 94:4937-4942(1997)中。
在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段被认为是人抗体或人抗体片段。
5.糖基化变体
在某些方面，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。糖基化位点向抗体的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
当抗体包含Fc区时，与其相连的寡糖可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具有支链的双触角寡糖，所述双触角寡糖通常通过N-键结连接于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接于双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些方面中，可对本发明的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
一方面，提供了具有非岩藻糖基化的寡糖的抗体变体，即缺少(直接或间接地)连接在Fc区的岩藻糖的寡糖结构。这样的非岩藻糖基化的寡糖(也称为“去岩藻糖基化”的寡糖)特别是N-连接的寡糖，其缺少在双触角寡糖结构的茎中连接第一GlcNAc的岩藻糖残基。一方面，提供了与天然或亲本抗体相比在Fc区中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体变体。例如，非岩藻糖基化寡糖的比例可以为至少约20％、至少约40％、至少约60％、至少约80％或甚至约100％(即不存在岩藻糖基化寡糖)。非岩藻糖基化寡糖的百分比，如例如WO2006/082515中所述，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，是缺少岩藻糖残基的寡糖的(平均)量相对于与Asn 297连接的所有寡糖(例如复杂、杂合和高甘露糖结构)之和。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可以位于297位上游或下游大约±3个氨基酸，即在294位和300位之间。在Fc区中具有非岩藻糖基化寡糖比例增加的此类抗体可具有改善的FcγRIIIa受体结合和/或改善的效应子功能，特别是改善的ADCC功能。参见，例如，US2003/0157108；US 2004/0093621。
能够产生岩藻糖基化减少的抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，尤其是在实例11中)，以及敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人.Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO 2003/085107)，或具有降低或取消的GDP-岩藻糖合成或转运蛋白活性的细胞(参见，例如，US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在另一方面，抗体变体提供了二等分的寡糖，例如，其中连接至抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。如上所述，这样的抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如Umana等人,Nat Biotechnol 17,176-180(1999)；Ferrara等人,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540,WO 2003/011878。
还提供了在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。这样的抗体变体描述于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764。
6.经半胱氨酸工程改造的抗体变体
在某些方面，可能需要产生半胱氨酸工程化改造的抗体，例如THIOMABTM抗体，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在优选的方面，取代的残基存在于抗体的可接近位点。如本文进一步描述的，通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性硫醇基团定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或连接基-药物部分)缀合，以产生免疫缀合物。半胱氨酸工程化改造的抗体可以如例如在美国专利号7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130或WO 2016040856中所述产生。
7.抗体衍生物
在某些方面，可进一步修饰本文提供的抗体以使其含有本领域已知且易于获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接至抗体的聚合物的数目可变，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素测定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
8.免疫缀合物
本发明还提供了免疫缀合物，其包含本文的抗HLA-A2/MAGE-A4抗体，该抗体缀合(化学键合)至一种或多种治疗剂，诸如细胞毒性剂、化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。
一方面，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至上述一种或多种治疗剂。通常使用连接基将抗体连接至一种或多种治疗剂。Pharmacol Review 68:3-19(2016)中列出了ADC技术的概述，其包括治疗剂、药物和连接基的实例。
在另一方面，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的本发明的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-sarcin、油桐蛋白、石竹素蛋白(dianthin protein)、美洲商陆蛋白(Phytolaca americana protein)(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂(momordica charantia inhibitor)、麻疯树毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草抑制剂(sapaonaria officinalis inhibitor)、明胶、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。
在另一方面，免疫缀合物包括与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的本发明的抗体。多种放射性同位素可用于制备放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可能包含用于闪烁显像研究的放射性原子，例如，Tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记物，例如I123、I131、In111、F19、C13、N15、O17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备抗体和细胞毒剂的缀合物。例如，可以如Vitetta等人，Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至抗体。参见WO 94/11026。连接基可以为促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割连接基”。例如，可以使用对酸不稳定的连接基、肽酶敏感的连接基、对光不稳定的连接基、二甲基连接基或含二硫键的连接基(Chari等人，Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于市售的(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
9.多特异性抗体
在某些方面，本文提供的抗体是多特异性抗体，特别是双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同的抗原决定簇(例如，两种不同的蛋白质，或同一蛋白质上的两种不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些方面，多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。在某些方面，结合特异性中的一种是针对HLA-A2/MAGE-A4的，并且另一种特异性是针对任何其他抗原的。在某些方面，多特异性抗体可结合HLA-A2/MAGE-A4的两个(或更多个)不同的表位。多特异性(例如，双特异性)抗体还可用于将细胞毒性剂或细胞定位到表达HLA-A2/MAGE-A4的细胞。可以将多特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983))及“杵臼结构”工程化(参见例如，美国专利5,731,168，以及Atwell等人，J.Mol.Biol.270:26(1997))。多特异性抗体还可以通过以下方式来制备：工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电操纵效应(参见例如，WO 2009/089004)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如，美国专利号4,676,980，以及Brennan等人，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用用于避免轻链错配问题的常用轻链技术(参见例如，WO 98/50431)；使用用于制备双特异性抗体片段的“双体抗体”技术(参见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化抗体，包括例如“章鱼抗体”或者DVD-Ig(参见例如，WO 2001/77342和WO 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其他示例可以在WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2013/026831中找到。多特异性抗体或其抗原结合片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含与CD3以及另一种不同抗原结合或与CD3的两个不同表位结合的抗原结合位点(参见例如，US 2008/0069820和WO 2015/095539)。
多特异性抗体也可以以不对称形式提供，其中在具有相同抗原特异性(所谓的“CrossMab”技术)的一个或多个结合臂中有结构域交叉，即通过交换VH/VL结构域(参见例如，WO 2009/080252和WO 2015/150447)、CH1/CL结构域(参见例如，WO 2009/080253)或完整的Fab臂(参见例如，WO 2009/080251、WO 2016/016299，还参见Schaefer等人，PNAS,108(2011)1187-1191，以及Klein等人，MAbs 8(2016)1010-20)。还可以通过将荷电或非荷电的氨基酸突变引入结构域界面以指导正确的Fab配对，以对不对称Fab臂进行工程化。参见例如WO 2016/172485。
多特异性抗体的各种其他分子形式是在本领域中已知的并且包括在本文中(参见例如Spiess等人，Mol Immunol 67(2015)95-106)。
本文还包括的一种特定类型的多特异性抗体是这样的双特异性抗体，该双特异性抗体设计用于同时结合靶细胞(例如，肿瘤细胞)上的表面抗原和T细胞受体(TCR)复合物的活化不变组分(诸如CD3)，以用于再靶向T细胞以杀伤靶细胞。因此，在优选的方面，本文提供的抗体是多特异性抗体，特别是双特异性抗体，其中结合特异性之一针对HLA-A2/MAGE-A4而另一个针对活化性T细胞抗原，特别是CD3。
可用于此目的的双特异性抗体形式的示例包括但不限于所谓的“BiTE”(双特异性T细胞接合子)分子，其中两个scFv分子通过柔性接头融合(参见例如，WO 2004/106381、WO2005/061547、WO 2007/042261以及WO 2008/119567；Nagorsen和
Figure BDA0003698550180000451
Exp Cell Res317,1255-1260(2011))；双体抗体(Holliger等人，Prot Eng 9,299-305(1996))及其衍生物，诸如串联双体抗体(“TandAb”；Kipriyanov等人，J Mol Biol 293,41--56(1999))；“DART”(双重亲和力再靶向)分子，其基于双体抗体形式但特征是具有用于实现额外稳定化的C-末端二硫桥(Johnson等人，J Mol Biol 399,436-449(2010))，以及所谓的三功能抗体(triomab)，其是全杂交小鼠/大鼠IgG分子(综述于Seimetz等人，Cancer Treat Rev 36,458-467(2010)中)。本文所包含的特定的T细胞双特异性抗体形式描述于以下文献中：WO2013/026833；WO 2013/026839；WO 2016/020309；Bacac等人，Oncoimmunology 5(8)(2016)e1203498。
本发明的多特异性抗体的优选的方面描述如下。
在一个方面，本发明提供了与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体，其包含如本文所述的与HLA-A2/MAGE-A4结合的第一抗原结合结构域，并且包含与第二抗原结合的第二抗原结合结构域(以及任选地与HLA-A2/MAGE-A4结合的第三抗原结合结构域)。
根据本发明的优选的方面，包含在抗体中的抗原结合结构域是Fab分子(即由重链和轻链组成的抗原结合结构域，每个抗原结合结构域包含可变结构域和恒定结构域)。在一个方面，所述第一抗原结合结构域、所述第二抗原结合结构域和/或在存在时的第三抗原结合结构域是Fab分子。在一个方面，所述Fab分子是人。在另一方面，所述Fab分子是人源化的。在另一方面，所述Fab分子包含人重链和轻链恒定结构域。
优选地，所述抗原结合结构域中的至少一个抗原结合结构域是交叉Fab分子。这种修饰减少了来自不同Fab分子的重链和轻链的错配，从而提高了重组生产中本发明的(多特异性)抗体的产率和纯度。在可用于包含在本发明的(多特异性)抗体的优选的交叉Fab分子中，Fab轻链和Fab重链的可变结构域(分别为VL和VH)交换。然而，即使进行该结构域交换，由于错配的重链与轻链之间的所谓Bence Jones型相互作用，(多特异性)抗体的制备可能包含某些副产物(参见Schaefer等人，PNAS,108(2011)11187-11191)。为了进一步减少来自不同Fab分子的重链和轻链的错配并且由此提高所需(多特异性)抗体的纯度和产率，可以在与第一抗原(HLA-A2/MAGE-A4)结合的Fab分子或与第二抗原(例如CD3)结合的Fab分子中的任一者的CH1和CL结构域的特定氨基酸位置处引入带相反电荷的荷电氨基酸，如本文进一步描述的。在包含在(多特异性)抗体中的常规Fab分子中(诸如例如在图1A-C、G-J中所示)或在包含在(多特异性)抗体中的VH/VL交叉Fab分子中(诸如例如在图1D-F、K-N中所示)(而不是在两者中)进行荷电改性。在优选的方面，在包含在(多特异性)抗体中的常规Fab分子(其在优选的方面与第一抗原即HLA-A2/MAGE-A4结合)中进行荷电改性。
在根据本发明的一个优选的方面，(多特异性)抗体能够同时与第一抗原(即HLA-A2/MAGE-A4)和第二抗原(例如活化性T细胞抗原，诸如CD3)结合。在一个方面，(多特异性)抗体能够通过同时与第二抗原(例如活化性T细胞抗原，诸如CD3)和HLA-A2/MAGE-A4结合来交联T细胞和靶细胞。在甚至更优选的方面，这种同时结合导致靶细胞，特别是表达靶细胞抗原(即HLA-A2/MAGE-A4)的肿瘤细胞的裂解。在一个方面，这种同时结合导致T细胞的活化。在其它方面，这种同时结合导致T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的细胞应答，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。在一个方面，(多特异性)抗体与第二抗原(例如活化性T细胞抗原，诸如CD3)的结合而同时不与靶细胞抗原(即HLA-A2/MAGE-A4)结合不会导致T细胞活化。
在一个方面，(多特异性)抗体能够将T细胞的细胞毒活性重新导向靶细胞。在优选的方面，所述重新导向不依赖于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。
优选地，根据本发明任何方面的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些方面，T细胞是CD4+或CD8+T细胞，特别是CD8+T细胞。
a)第一(和第三)抗原结合结构域
本发明的(多特异性)抗体包含至少一个与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗原结合结构域(第一抗原结合结构域)。在优选的方面，HLA-A2/MAGE-A4是人HLA-A2/MAGE-A4。在特定方面，HLA-A2/MAGE-A4是HLA-A2/MAGE-A4 p230-239。
第一抗原结合结构域能够将(多特异性)抗体引导至靶位点，例如引导至表达HLA-A2/MAGE-A4的特定类型的肿瘤细胞。
在优选的方面，(多特异性)抗体包含与HLA-A2/MAGE-A4结合的两个抗原结合结构域。在一个方面，(多特异性)抗体提供了与HLA-A2/MAGE-A4的二价结合。
在一个方面，与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗原结合结构域是选自下组的抗体片段：Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab’)2分子。在优选的方面，与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗原结合结构域是Fab分子。
在某些方面，(多特异性)抗体包含与HLA-A2/MAGE-A4结合的两个抗原结合结构域，特别是Fab分子。在特定方面，优选地所有这些抗原结合结构域都是相同的，即它们具有相同的分子形式(例如常规的或交叉的Fab分子)并且包含相同的氨基酸序列(在CH1和CL结构域中包括相同氨基酸取代，如本文所述(如果有的话))。在一个方面，(多特异性)抗体包含不超过两个与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗原结合结构域，特别是Fab分子。
在优选的方面，与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗原结合结构域是常规Fab分子。在此类方面，与第二抗原结合的抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，其中在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。
在替代方面，与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，其中在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。在此类方面，与第二抗原结合的抗原结合结构域是常规Fab分子。
在一个方面，所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)包含人恒定区。在一个方面，所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)是包含人恒定区，特别是人CH1和/或CL结构域的Fab分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQ IDNO:79和SEQ ID NO:80(分别为人κ和λCL结构域)和SEQ ID NO:81(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一个方面，所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含与SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:79的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。具体地，轻链恒定区可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变和/或如果在交叉Fab分子中则可以包含对一个或多个(特别是两个)N末端氨基酸的缺失或取代。在一些方面，所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)包含重链恒定区，该重链恒定区包含与包含在SEQ ID NO:81的氨基酸序列中的CH1结构域序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。具体地，重链恒定区(特别是CH1结构域)可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变。
b)第二抗原结合结构域
在某些方面，本发明的(多特异性)抗体包含与第二抗原结合的至少一个抗原结合结构域，特别是Fab分子。第二抗原优选地不是HLA-A2/MAGE-A4，即不同于HLA-A2/MAGE-A4。在一个方面，第二抗原是在与HLA-A2/MAGE-A4不同的细胞上表达的抗原(例如在除靶细胞诸如肿瘤细胞之外的细胞上表达)。在一个方面，第二抗原是T细胞抗原，特别是活化性T细胞抗原。在具体的方面，第二抗原是CD3。在优选的方面，CD3是人CD3(SEQ ID NO:76)或食蟹猴CD3(SEQ ID NO:77)，最特别是人CD3。在一个方面，第二抗原结合结构域与人和食蟹猴CD3交叉反应(即特异性结合)。在一些方面，CD3是CD3的ε亚基(CD3ε)。
在一个优选的方面，(多特异性)抗体包含不超过一个与第二抗原(例如活化性T细胞抗原，诸如CD3)结合的抗原结合结构域。在一个方面，(多特异性)抗体提供了与第二抗原(例如活化性T细胞抗原，诸如CD3)的单价结合。
在一个方面，与第二抗原结合的抗原结合结构域是选自下组的抗体片段：Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab’)2分子。在优选的方面，与第二抗原结合的抗原结合结构域是Fab分子。
在优选的方面，与第二抗原(例如活化性T细胞抗原，诸如CD3)结合的抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，其中在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。在此类方面，与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗原结合结构域优选地是常规Fab分子。在(多特异性)抗体中存在多于一个结合HLA-A2/MAGE-A4的抗原结合结构域，特别是Fab分子的方面，结合第二抗原的抗原结合结构域优选是交叉Fab分子，并且结合HLA-A2/MAGE-A4的抗原结合结构域是常规的Fab分子。
在替代方面，与第二抗原(例如活化性T细胞抗原，诸如CD3)结合的抗原结合结构域是常规Fab分子。在此类方面，与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，其中在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL彼此交换/替换或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。在(多特异性)抗体中存在多于一个结合第二抗原的抗原结合结构域，特别是Fab分子的方面，结合HLA-A2/MAGE-A4的抗原结合结构域优选是交叉Fab分子，并且结合第二抗原的抗原结合结构域是常规的Fab分子。
在优选的方面，第二抗原结合结构域是Fab分子，其中所述Fab轻链和所述Fab重链的所述可变结构域VL和VH彼此替换或所述恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是所述可变结构域VL和VH彼此替换(即，根据此类方面，第二抗原结合结构域是交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定域被交换)。在一个这样的方面，第一(和第三，如果有的话)抗原结合结构域是常规的Fab分子。
在优选的方面，第二抗原是CD3，如上所述。
在一个方面，第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:59的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:60的HCDR 2、以及SEQ ID NO:61的HCDR 3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:62的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:63的LCDR 2和SEQ ID NO:64的LCDR 3；或
(ii)VH和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:51的HCDR 1、SEQ ID NO:52的HCDR 2、以及SEQ ID NO:53的HCDR 3，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:54的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:55的LCDR 2和SEQ ID NO:56的LCDR 3。
在一个方面，第二抗原结合结构域是(来源于)人源化抗体。在一个方面，第二抗原结合结构域是人源化抗原结合结构域(即人源化抗体的抗原结合结构域)。在一个方面，第二抗原结合结构域的VH和/或VL是人源化可变区。
在一个方面，第二抗原结合结构域的VH和/或VL包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些方面，第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:59的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:60的HCDR 2、以及SEQ ID NO:61的HCDR 3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:62的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:63的LCDR 2和SEQ ID NO:64的LCDR 3。
在一个方面，第二抗原结合结构域的VH包含SEQ ID NO:65的一个或多个重链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面，VH包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，VH包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少约有95％相同的氨基酸序列。在一个方面，VH包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少约有98％相同的氨基酸序列。在某些方面，至少具有95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗体保留了与第二抗原(例如活化的T细胞抗原，诸如CD3)结合的能力。在某些方面，在SEQ ID NO:65的氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个方面，VH包含SEQ IDNO:65的氨基酸序列。任选地，VH包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个方面，第二抗原结合结构域的VL包含SEQ ID NO:66的一个或多个轻链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面，VL包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，VL包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少约有95％相同的氨基酸序列。在一个方面，VL包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少约有98％相同的氨基酸序列。在某些方面，至少具有95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗体保留了与第二抗原(例如活化的T细胞抗原，诸如CD3)结合的能力。在某些方面，在SEQ ID NO:66的氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个方面，所述VL包含SEQID NO:66的氨基酸序列。任选地，所述VL包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个方面，第二抗原结合结构域的VH包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，并且第二抗原结合结构域的VL包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，所述VH包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。
在另一方面，第二抗原结合结构域包含VH和VL，所述VH包含SEQ ID NO:65的序列，所述VL包含SEQ ID NO:66的序列。
在另一个方面，第二抗原结合结构域包含SEQ ID NO:65的VH序列和SEQ ID NO:66的VL序列。
在另一方面，第二抗原结合结构域包含VH和VL，所述VH包含SEQ ID NO:65的VH的重链CDR序列，所述VL包含SEQ ID NO:66的VL的轻链CDR序列。
在另一个方面，第二抗原结合结构域包含SEQ ID NO:65的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:66的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个方面，第二抗原结合结构域的VH包含SEQ ID NO:65的VH的重链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ ID NO:65的VH的框架序列至少有95％、96％、97％、98％或99％的序列相同。在一个方面，VH包含SEQ ID NO:65的VH的重链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ IDNO:65的VH的框架序列至少有95％的序列相同。在另一方面，VH包含SEQ ID NO:65的VH的重链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ ID NO:65的VH的框架序列至少有98％的序列相同。
在一个方面，第二抗原结合结构域的VL包含SEQ ID NO:66的VL的轻链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ ID NO:66的VL的框架序列至少有95％、96％、97％、98％或99％的序列相同。在一个方面，VL包含SEQ ID NO:66的VL的轻链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ IDNO:66的VL的框架序列至少有95％的序列相同。在另一方面，VL包含SEQ ID NO:66的VL的轻链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ ID NO:66的VL的框架序列至少有98％的序列相同。
在一些方面，第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:51的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:52的HCDR 2、以及SEQ ID NO:53的HCDR 3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:54的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:55的LCDR 2和SEQ ID NO:56的LCDR 3。
在一个方面，第二抗原结合结构域的VH包含SEQ ID NO:57的一个或多个重链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面，VH包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，VH包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少约有95％相同的氨基酸序列。在一个方面，VH包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少约有98％相同的氨基酸序列。在某些方面，至少具有95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗体保留了与第二抗原(例如活化的T细胞抗原，诸如CD3)结合的能力。在某些方面，在SEQ ID NO:57的氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个方面，VH包含SEQ IDNO:57的氨基酸序列。任选地，VH包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个方面，第二抗原结合结构域的VL包含SEQ ID NO:58的一个或多个轻链框架序列(即FR1、FR2、FR3和/或FR4序列)。在一个方面，VL包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，VL包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少约有95％相同的氨基酸序列。在一个方面，VL包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少约有98％相同的氨基酸序列。在某些方面，至少具有95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗体保留了与第二抗原(例如活化的T细胞抗原，诸如CD3)结合的能力。在某些方面，在SEQ ID NO:58的氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在一个方面，所述VL包含SEQID NO:58的氨基酸序列。任选地，所述VL包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个方面，第二抗原结合结构域的VH包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，并且第二抗原结合结构域的VL包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个方面，所述VH包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
在另一方面，第二抗原结合结构域包含VH和VL，所述VH包含SEQ ID NO:57的序列，所述VL包含SEQ ID NO:58的序列。
在另一个方面，第二抗原结合结构域包含SEQ ID NO:57的VH序列和SEQ ID NO:58的VL序列。
在另一方面，第二抗原结合结构域包含VH和VL，所述VH包含SEQ ID NO:57的VH的重链CDR序列，所述VL包含SEQ ID NO:58的VL的轻链CDR序列。
在另一个方面，第二抗原结合结构域包含SEQ ID NO:57的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:58的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个方面，第二抗原结合结构域的VH包含SEQ ID NO:57的VH的重链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ ID NO:57的VH的框架序列至少有95％、96％、97％、98％或99％的序列相同。在一个方面，VH包含SEQ ID NO:57的VH的重链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ IDNO:57的VH的框架序列至少有95％的序列相同。在另一方面，VH包含SEQ ID NO:57的VH的重链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ ID NO:57的VH的框架序列至少有98％的序列相同。
在一个方面，第二抗原结合结构域的VL包含SEQ ID NO:58的VL的轻链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ ID NO:58的VL的框架序列至少有95％、96％、97％、98％或99％的序列相同。在一个方面，VL包含SEQ ID NO:58的VL的轻链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ IDNO:58的VL的框架序列至少有95％的序列相同。在另一方面，VL包含SEQ ID NO:58的VL的轻链CDR序列，和框架，所述框架与SEQ ID NO:58的VL的框架序列至少有98％的序列相同。
c)荷电改性
本发明的(多特异性)抗体可以在其中所包含的Fab分子中包含氨基酸取代，所述氨基酸取代特别有效地减少轻链与不匹配重链的错配(Bence-Jones型副产物)，所述错配可以发生在基于Fab的多特异性抗体的产生中，所述双/多特异性抗原结合分子在其结合臂中的一个(或在分子包含多于两个抗原结合Fab分子的情况下为多个)结合臂中具有VH/VL交换(同样参见PCT公开号WO 2015/150447，特别是其中的实例，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文)。所需的(多特异性)抗体与不期望的副产物，特别是在(多特异性)抗体的结合臂中的一个结合臂中具有VH/VL结构域交换的多特异性抗体中出现的Bence Jones型副产物的比率，可以通过在CH1和CL结构域中的特定氨基酸位置处引入带相反电荷的荷电氨基酸(有时在本文中称为“荷电改性”)来提高。
因此，在一些方面，在其中所述(多特异性)抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)都是Fab分子的一些方面，并且在所述抗原结合结构域之一(特别是第二抗原结合结构域)中，Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH互相替换，
i)在所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号)，并且其中在所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸或第213位的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)；或
ii)在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号)，并且其中在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸或第213位的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。
所述(多特异性)抗体不包含在i)和ii)中提及的两种修饰。具有VH/VL交换的抗原结合结构域的恒定结构域CL和CH1不互相替换(即保持未交换)。
在一个更具体的方面，
i)在所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且在所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸或第213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)；或
ii)在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸或第213位的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个这样的方面，在所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸或第213位的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在另一方面，在所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在优选的方面，在所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且在所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
在更优选的方面，在所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据KabatEU索引编号)并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在甚至更优选的方面，在所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在优选的方面，如果根据上述方面的氨基酸取代在所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行，则所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL是κ同种型。
可替代地，根据上述方面的氨基酸取代可以在第二抗原结合结构域的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行，而不是在第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行。在优选的此类方面，第二抗原结合结构域的恒定结构域CL为κ同种型的。
因此，在一个方面，在第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸或第213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个方面，在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在又一个方面，在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)并且第213位的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，在第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在另一方面，在第二抗原结合结构域的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个优选的方面，本发明的(多特异性)抗体包含
(A)与HLA-A2/MAGE-A4结合的第一和任选的第三抗原结合结构域；
其中所述第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)是常规Fab分子，且所述常规Fab分子包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；
(iii)VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；
(iv)VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；
(v)VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；
(vi)VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；以及
其中在第一抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个优选的方面，由赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个优选的方面，由赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)；并且在第二抗原结合结构域(和存在时的第三抗原结合结构域)的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据KabatEU索引编号)；
以及
(B)结合第二抗原(优选CD3)的第二抗原结合结构域，其中第二抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换。
d)多特异性抗体形式
根据本发明的(多特异性)抗体可以具有多种构型。示例性配置在图1中描述。
在优选的方面，(多特异性)抗体中包含的抗原结合结构域是Fab分子。在此类方面，第一、第二、第三抗原结合结构域等在本文中可分别称为第一、第二、第三Fab分子等。
在一个方面，(多特异性)抗体的所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域彼此融合，任选地经由肽接头融合。在优选的方面，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自是Fab分子。在一个这样的方面，第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端。在另一这样的方面，第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端。在其中(i)第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端或(ii)第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端的方面，另外地第一抗原结合结构域的Fab轻链和第二抗原结合结构域的Fab轻链可以任选地通过肽接头彼此融合。
具有能够特异性结合HLA-A2/MAGE-A4(例如如图1A、D、G、H、K、L中所示)的单个抗原结合结构域的(多特异性)抗体(诸如Fab分子)是有用，特别是在结合高亲和力抗原结合结构域后预期抗原内化的情况下。在这种情况下，存在一个以上对HLA-A2/MAGE-A4特异的抗原结合结构域可能会增强抗原的内化，从而降低其可用性。
然而，在其他情况下，具有包含两个或更多个对HLA-A2/MAGE-A4的抗原结合结构域的(多特异性)抗体(诸如Fab分子)将是有利的(参见图1B、1C、1E、1F、1I、1J、1M或1N所示实例)，例如优化对靶位点的靶向或允许靶细胞抗原的交联。
因此，在优选的方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含第三抗原结合结构域。
在一个方面，第三抗原结合结构域与HLA-A2/MAGE-A4结合。在一个方面，第三抗原结合结构域是Fab分子。
在一个方面，第三抗原结构域与第一抗原结合结构域相同。
在一些方面，第三和第一抗原结合结构域各自是Fab分子并且第三抗原结合结构域与第一抗原结合结构域相同。因此，在这些方面，第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域包含相同的重链和轻链氨基酸序列并且具有相同的结构域排列(即常规或交叉)。此外，在这些方面，第三抗原结合结构域包含与第一抗原结合结构域相同的氨基酸取代(如果有的话)。例如，本文描述为“电荷修饰”的氨基酸取代将在第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行。可替代地，所述氨基酸取代可在第二抗原结合结构域(其在优选的方面也是Fab分子)的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行，但不在第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行。
与第一抗原结合结构域一样，第三抗原结合结构域优选是常规的Fab分子。然而，其中第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域是交叉Fab分子(并且第二抗原结合结构域是常规Fab分子)的方面也被考虑。因此，在优选的方面，第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子，并且第二抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，其中在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他方面，第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是交叉Fab分子并且第二抗原结合结构域是常规Fab分子。
如果存在第三抗原结合结构域，在优选的方面，第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域与HLA-A2/MAGE-A4结合，并且第二抗原结构域与第二抗原(例如活化性T细胞抗原，诸如CD3)结合。
在优选的方面，本发明的(多特异性)抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。Fc结构域的第一亚基和第二亚基能够稳定缔合。
根据本发明的(多特异性)抗体可以具有不同的构型，即第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域(以及任选地第三抗原结合结构域)可以以不同方式彼此融合和与Fc结构域融合。组分可以直接彼此融合，或优选地通过一种或多种合适的肽连接基融合。当Fab分子与Fc结构域的亚基的N末端融合时，该融合通常是经由免疫球蛋白铰链区。
在一些方面，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自是Fab分子，并且第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在此类方面，第一抗原结合结构域可以在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端或融合至Fc结构域的另一个亚基的N末端。在优选的此类方面，所述第一抗原结合结构域是常规Fab分子，并且第二抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，其中在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他此类方面，第一抗原结合结构域是交叉Fab分子，并且第二抗原结合结构域是常规Fab分子。
在一个方面，第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自是Fab分子，第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端，并且第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端。在具体的方面，(多特异性)抗体基本上由第一和第二Fab分子、第一和第二亚基构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子融合在Fab重链的C末端融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域第一或第二亚基的N末端。这种构型在图1G和1K中示意性地描绘(在这些实例中第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子)。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在另一方面，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自是Fab分子，并且第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的亚基中的一者的N末端。在具体的方面，(多特异性)抗体基本上由第一Fab分子和第二Fab分子、由第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域，以及任选地一个或多个肽接头组成，其中该第一Fab分子和该第二Fab分子各自在Fab重链的C末端处与Fc结构域的亚基中的亚基中的一者的N末端融合。这种构型在图1A和1D中示意性地描绘(在这些实例中，第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子并且第一抗原结合结构域是常规Fab分子)。第一Fab分子和第二Fab分子可以直接或通过肽连接基与Fc结构域融合。在优选的方面，所述第一Fab分子和所述第二Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在具体的方面，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在Fc结构域是IgG1 Fc结构域的情况下。
在一些方面，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自是Fab分子，并且第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在此类方面，第二抗原结合结构域可以在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端或(如上所述)融合至Fc结构域的另一个亚基的N末端。在优选的此类方面，所述第一抗原结合结构域是常规Fab分子，并且第二抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，其中在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他此类方面，所述第一抗原结合结构域是交叉Fab分子，并且第二抗原结合结构域是常规Fab分子。
在一个方面，第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自是Fab分子，第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端，第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端。在具体的方面，(多特异性)抗体基本上由第一和第二Fab分子、第一和第二亚基构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第二Fab分子融合在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且第一Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域第一或第二亚基的N末端。这种构型在图1H和1L中示意性地描绘(在这些实例中，第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子并且第一抗原结合结构域是常规Fab分子)。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在一些方面，第三抗原结合结构域，特别是第三Fab分子，在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。在优选的此类方面，所述第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子，并且第二抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，其中在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他此类方面，所述第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是交叉Fab分子并且第二抗原结合结构域是常规Fab分子。
在优选的这样的方面，第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的亚基中的一者的N末端，并且第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端。在具体的方面，(多特异性)抗体基本上由第一、第二和第三Fab分子、第一和第二亚基构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第一亚基，并且其中第三Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第二亚基的N末端。这种构型示意性地描述于图1B和1E(在这些实例中，第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子，第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域是常规Fab分子)，和图1J和1N(在这些实例中，第二抗原结合结构域是常规Fab分子，第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子)。第二和第三Fab分子可以直接或通过肽连接基融合至Fc结构域。在优选的方面，所述第二Fab分子和所述第三Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在具体的方面，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在Fc结构域是IgG1 Fc结构域的情况下。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在另一这样的方面，第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的亚基中的一者的N末端，并且第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端。在具体的方面，(多特异性)抗体基本上由第一、第二和第三Fab分子、第一和第二亚基构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且第一Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第一亚基，并且其中第三Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第二亚基的N末端。这种构型示意性地描述于图1C和1F(在这些实例中，第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子，第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域是常规Fab分子)，和图1I和1M(在这些实例中，第二抗原结合结构域是常规Fab分子，第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子)。第一和第三Fab分子可以直接或通过肽连接基融合至Fc结构域。在优选的方面，所述第一Fab分子和所述第三Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在具体的方面，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在Fc结构域是IgG1 Fc结构域的情况下。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在(多特异性)抗体的构型中，其中Fab分子在Fab重链的C末端处通过免疫球蛋白铰链区融合至Fc结构域的亚基中的每个的N末端，所述两个Fab分子、铰链区和Fc结构域基本上形成了免疫球蛋白分子。在优选的方面，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在甚至更优选的方面，免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一方面，免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在另一个优选的方面，免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其他方面，免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个方面，免疫球蛋白包含人恒定区，特别是人Fc区。
在本发明的一些(多特异性)抗体中，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合，任选地通过肽接头融合。根据第一和第二Fab分子的构型，第一Fab分子的Fab轻链可以在其C末端融合至第二个Fab分子的Fab轻链的N末端，或第二Fab分子的Fab轻链可以在其C末端融合至第一Fab分子的Fab轻链的N末端。第一和第二Fab分子的Fab轻链的融合进一步减少了未匹配Fab重链和轻链的错配，并且还减少了表达本发明的一些(多特异性)抗体所需的质粒数量。
抗原结合结构域可以直接或通过肽接连接基与Fc结构域融合，该肽连接基包含一个或多个氨基酸，通常为约2-20个氨基酸。肽连接基是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性肽连接基包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽连接基。“n”通常为1至10的整数，通常为2至4。在一个方面，所述肽接头的长度为至少5个氨基酸，在一个方面，长度为5至100个氨基酸，在另一个方面为10至50个氨基酸。在一个方面，所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且(x＝3、n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4、n＝2、3、4或5并且m＝0、1、2或3)，在一个方面，x＝4并且n＝2或3，在另一方面，x＝4并且n＝2。在一个方面，所述肽接头是(G4S)2。用于使第一Fab分子和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合的特别合适的肽连接基是(G4S)2。适于连接第一Fab片段和第二Fab片段的Fab重链的一种示例性肽连接基包含序列(D)-(G4S)2(SEQ ID NO 82和83)。另一种合适的此类连接基包含序列(G4S)4。另外，连接基可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，在Fab分子与Fc结构域亚基的N末端融合的情况下，可以在具有或没有另外的肽连接基的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，所述Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))，以及这样的多肽，在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在某些方面，多肽例如通过二硫键共价连接。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，所述Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4))，以及这样的多肽，在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在某些方面，多肽例如通过二硫键共价连接。
在一些方面，(多特异性)抗体包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，所述Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，所述第一Fab分子的Fab重链继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其他方面，(多特异性)抗体包含这样的多肽，在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，所述Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在一些这些的方面，(多特异性)抗体进一步包含第二Fab分子的交叉Fab轻链多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在其他这样的方面，(多特异性)抗体进一步包含一种多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VL(1)-CL(1))，或其中第一Fab分子的Fab轻链多肽与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))，视情况而定。根据这些方面的(多特异性)抗体可进一步包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中第三Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，和第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些方面，多肽例如通过二硫键共价连接。
在一些方面，(多特异性)抗体包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，所述Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，所述第一Fab分子的Fab重链继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其他方面，(多特异性)抗体包含这样的多肽，在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，所述Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4))。在一些这些的方面，(多特异性)抗体进一步包含第二Fab分子的交叉Fab轻链多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在其他这样的方面，(多特异性)抗体进一步包含一种多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1))，或其中第一Fab分子的Fab轻链多肽与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))，视情况而定。根据这些方面的(多特异性)抗体可进一步包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中第三Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，和第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些方面，多肽例如通过二硫键共价连接。
在某些方面，(多特异性)抗体不包含Fc结构域。在优选的此类方面，所述第一抗原结合结构域和(如果存在的话)第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子，并且第二抗原结合结构域是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，其中在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他此类方面，所述第一抗原结合结构域和(如果存在的话)第三抗原结合结构域各自是交叉Fab分子并且第二抗原结合结构域是常规Fab分子。
在一个这样的方面，(多特异性)抗体基本上由第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域都是Fab分子，并且第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端。这种构型在图1O和1S中示意性地描绘(在这些实例中，第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子并且第一抗原结合结构域是常规Fab分子)。
在另一这样的方面，(多特异性)抗体基本上由第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域都是Fab分子，并且第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端。这种构型在图1P和1T中示意性地描绘(在这些实例中，第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子并且第一抗原结合结构域是常规Fab分子)。
在一些方面，第一Fab分子在Fab重链的C末端融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且(多特异性)抗体进一步包含第三抗原结合结构域，特别是第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端。在某些此类方面，(多特异性)抗体基本上由第一、第二和第三Fab分子以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第三Fab分子在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端。这种构型示意性地描述于图1Q和1U(在这些实例中，第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子，第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子)，或者图1X和1Z(在这些实例中，第二抗原结合结构域是常规Fab分子，第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是VH/VL交叉Fab分子)。
在一些方面，第二Fab分子在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且(多特异性)抗体进一步包含第三抗原结合结构域，特别是第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的N末端融合至第一Fab分子的Fab重链的C末端。在某些此类方面，(多特异性)抗体基本上由第一、第二和第三Fab分子以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且第三Fab分子在Fab重链的N末端融合至第一Fab分子的Fab重链的C末端。这种构型示意性地描述于图1R和1V(在这些实例中，第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子，第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是常规Fab分子)，或者图1I和1Y(在这些实例中，第二抗原结合结构域是常规Fab分子，第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自是VH/VL交叉Fab分子)。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，所述Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)(VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，所述第二Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在所述多肽中，第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，所述第一Fab分子的Fab重链继而与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在所述多肽中，第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，所述第一Fab分子的Fab重链继而与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，所述第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，所述第一Fab分子的Fab重链继而与第三Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，所述第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，所述第一Fab分子的Fab重链继而与第三Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些方面，根据本发明的多特异性)抗体包含这样的多肽，其中在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，所述第一Fab分子的Fab轻链可变区继而与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，所述第一Fab分子的Fab重链恒定区继而与第三Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，所述第三Fab分子的Fab轻链可变区继而与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-VL(3)-CH1(3))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))并且与第而Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含这样的多肽，其中在所述多肽中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，而所述第一Fab分子的Fab重链可变区继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，所述第一Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第三Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，所述第三Fab分子的Fab重链可变区继而与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-VH(3)-CL(3))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))并且与第而Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含这样的多肽，其中在所述多肽中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，其中在所述多肽中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，所述第三Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，所述第一Fab分子的Fab轻链可变区继而与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，所述第一Fab分子的Fab重链恒定继而与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3)-VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))并且与第而Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含这样的多肽，其中在所述多肽中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3))。
在某些方面，根据本发明的(多特异性)抗体包含这样的多肽，其中在所述多肽中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，所述第三Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，所述第一Fab分子的Fab重链可变区继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，所述第一Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3)-VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2))。在一些方面中，(多特异性)抗体还包含这样的多肽，其中在所述多肽中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))并且与第而Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在一些方面，(多特异性)抗体进一步包含这样的多肽，其中在所述多肽中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3))。
在一个方面，本发明提供了一种(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
(A)与HLA-A2/MAGE-A4结合的第一抗原结合结构域，其中该第一抗原结合结构域是(常规)Fab分子，且所述(常规)Fab分子包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:1的HCDR 1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:4的LCDR 1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR3；
(iii)VH，其包含SEQ ID NO:41的HCDR 1、SEQ ID NO:42的HCDR 2和SEQ ID NO:43的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:44的LCDR 1、SEQ ID NO:45的LCDR 2和SEQ ID NO:46的LCDR 3；
(iv)VH，其包含SEQ ID NO:9的HCDR 1、SEQ ID NO:10的HCDR 2和SEQ ID NO:11的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:12的LCDR 1、SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3；
(v)VH，其包含SEQ ID NO:17的HCDR 1、SEQ ID NO:18的HCDR 2和SEQ ID NO:19的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:20的LCDR 1、SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3；或
(vi)VH，其包含SEQ ID NO:33的HCDR 1、SEQ ID NO:34的HCDR 2和SEQ ID NO:35的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:36的LCDR 1、SEQ ID NO:37的LCDR 2和SEQ ID NO:38的LCDR 3；
(特别是VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3)；
(B)结合第二抗原的第二抗原结合结构域，特别是活化性T细胞抗原，更特别是CD3，其中第二抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；
(C)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中
(i)依据(A)的第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据(B)的第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据(B)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据(C)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端，或
(ii)依据(B)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据(A)的第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据(A)的第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据(C)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在优选的方面，本发明提供了(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
(A)与HLA-A2/MAGE-A4结合的第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域和第三抗原结合域中的每一者是(常规)Fab分子并且包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:1的HCDR 1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:4的LCDR 1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR3；
(iii)VH，其包含SEQ ID NO:41的HCDR 1、SEQ ID NO:42的HCDR 2和SEQ ID NO:43的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:44的LCDR 1、SEQ ID NO:45的LCDR 2和SEQ ID NO:46的LCDR 3；
(iv)VH，其包含SEQ ID NO:9的HCDR 1、SEQ ID NO:10的HCDR 2和SEQ ID NO:11的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:12的LCDR 1、SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3；
(v)VH，其包含SEQ ID NO:17的HCDR 1、SEQ ID NO:18的HCDR 2和SEQ ID NO:19的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:20的LCDR 1、SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3；或
(vi)VH，其包含SEQ ID NO:33的HCDR 1、SEQ ID NO:34的HCDR 2和SEQ ID NO:35的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:36的LCDR 1、SEQ ID NO:37的LCDR 2和SEQ ID NO:38的LCDR 3；
(特别是VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3)；
(B)结合第二抗原的第二抗原结合结构域，特别是活化性T细胞抗原，更特别是CD3，其中第二抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；以及
(C)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中
(i)依据(A)的第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据(B)的第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据(B)的第二抗原结合结构域和依据(A)的第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据(C)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端，或
(ii)依据(B)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据(A)的第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据(A)的第一抗原结合结构域和依据(A)的第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据(C)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在另一方面，本发明提供了(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
(A)与HLA-A2/MAGE-A4结合的第一抗原结合结构域，其中该第一抗原结合结构域是(常规)Fab分子，且所述(常规)Fab分子包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:1的HCDR 1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:4的LCDR 1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR3；
(iii)VH，其包含SEQ ID NO:41的HCDR 1、SEQ ID NO:42的HCDR 2和SEQ ID NO:43的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:44的LCDR 1、SEQ ID NO:45的LCDR 2和SEQ ID NO:46的LCDR 3；
(iv)VH，其包含SEQ ID NO:9的HCDR 1、SEQ ID NO:10的HCDR 2和SEQ ID NO:11的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:12的LCDR 1、SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3；
(v)VH，其包含SEQ ID NO:17的HCDR 1、SEQ ID NO:18的HCDR 2和SEQ ID NO:19的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:20的LCDR 1、SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3；或
(vi)VH，其包含SEQ ID NO:33的HCDR 1、SEQ ID NO:34的HCDR 2和SEQ ID NO:35的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:36的LCDR 1、SEQ ID NO:37的LCDR 2和SEQ ID NO:38的LCDR 3；
(特别是VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3)；
(B)结合第二抗原的第二抗原结合结构域，特别是活化性T细胞抗原，更特别是CD3，其中第二抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；以及
(C)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中
(i)依据(A)的第一抗原结合结构域和依据(B)的第二抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据(C)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在根据本发明的(多特异性)抗体的所有不同构型中，本文所述的氨基酸取代(“荷电改性”)(如果存在的话)可以在第一抗原结合结构域和(如果存在的话)第三抗原结合结构域/Fab分子的CH1和CL结构域中，或者在第二抗原结合结构域/Fab分子的CH1和CL结构域中。优选地，它们在第一抗原结合结构域和(如果存在的话)第三抗原结合结构域/Fab分子的CH1和CL结构域中。根据本发明的概念，如果在第一抗原结合结构域(和如果存在的第三抗原结合结构域)/Fab分子中进行如本文所述的氨基酸取代，则在第二抗原结合结构域/Fab分子中不进行此类氨基酸取代。相反地，如果在第二抗原结合结构域/Fab分子中进行如本文所述的氨基酸取代，则在第一抗原结合结构域(和如果存在的第三抗原结合结构域)/Fab分子中不进行此类氨基酸取代。氨基酸取代优选地在包含这样的Fab分子的(多特异性)抗体中进行，其中在所述Fab分子中，Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH1彼此替换。
在根据本发明的(多特异性)抗体的优选的方面，特别地其中如本文所述的氨基酸取代是在第一(和如果存在的第三)抗原结合结构域/Fab分子中进行的，并且第一(和如果存在的第三)Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型的。在根据本发明的(多特异性)抗体的其他方面，特别地其中如本文所述的氨基酸取代是在第二抗原结合结构域/Fab分子中进行的，并且第二抗原结合结构域/Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型的。在一些方面，第一(和如果存在的第三)抗原结合结构域/Fab分子的恒定结构域CL和第二抗原结合结构域/Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型的。
在一个方面，本发明提供了一种(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
(A)与HLA-A2/MAGE-A4结合的第一抗原结合结构域，其中该第一抗原结合结构域是(常规)Fab分子，且所述(常规)Fab分子包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:1的HCDR 1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:4的LCDR 1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR3；
(iii)VH，其包含SEQ ID NO:41的HCDR 1、SEQ ID NO:42的HCDR 2和SEQ ID NO:43的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:44的LCDR 1、SEQ ID NO:45的LCDR 2和SEQ ID NO:46的LCDR 3；
(iv)VH，其包含SEQ ID NO:9的HCDR 1、SEQ ID NO:10的HCDR 2和SEQ ID NO:11的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:12的LCDR 1、SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3；
(v)VH，其包含SEQ ID NO:17的HCDR 1、SEQ ID NO:18的HCDR 2和SEQ ID NO:19的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:20的LCDR 1、SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3；或
(vi)VH，其包含SEQ ID NO:33的HCDR 1、SEQ ID NO:34的HCDR 2和SEQ ID NO:35的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:36的LCDR 1、SEQ ID NO:37的LCDR 2和SEQ ID NO:38的LCDR 3；
(特别是VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3)；
(B)结合第二抗原(特别是活化性T细胞抗原，更特别是CD3)的第二抗原结合结构域，其中第二抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；以及
(C)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中依据(A)的第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最优选地被精氨酸(R)取代)；并且其中依据(A)的第二抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)；并且
其中
(i)依据(A)的第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据(B)的第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据(B)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据(C)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端，或
(ii)依据(B)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据(A)的第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据(A)的第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据(C)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在优选的方面，本发明提供了(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
(A)与HLA-A2/MAGE-A4结合的第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域和第三抗原结合域中的每一者是(常规)Fab分子并且包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:1的HCDR 1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:4的LCDR 1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR3；
(iii)VH，其包含SEQ ID NO:41的HCDR 1、SEQ ID NO:42的HCDR 2和SEQ ID NO:43的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:44的LCDR 1、SEQ ID NO:45的LCDR 2和SEQ ID NO:46的LCDR 3；
(iv)VH，其包含SEQ ID NO:9的HCDR 1、SEQ ID NO:10的HCDR 2和SEQ ID NO:11的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:12的LCDR 1、SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3；
(v)VH，其包含SEQ ID NO:17的HCDR 1、SEQ ID NO:18的HCDR 2和SEQ ID NO:19的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:20的LCDR 1、SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3；或
(vi)VH，其包含SEQ ID NO:33的HCDR 1、SEQ ID NO:34的HCDR 2和SEQ ID NO:35的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:36的LCDR 1、SEQ ID NO:37的LCDR 2和SEQ ID NO:38的LCDR 3；
(特别是VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3)；
(B)结合第二抗原(特别是活化性T细胞抗原，更特别是CD3)的第二抗原结合结构域，其中第二抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；以及
(C)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中在依据(A)的第一抗原结合结构域和依据(A)的第三抗原结合结构域的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最优选地被精氨酸(R)取代)，并且其中在依据(A)的第一抗原结合结构域和依据(A)的第三抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中
(i)依据(A)的第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据(B)的第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据(B)的第二抗原结合结构域和依据(A)的第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据(C)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端，或
(ii)依据(B)的第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据(A)的第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据(A)的第一抗原结合结构域和依据(A)的第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据(C)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在另一方面，本发明提供了(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
(A)与HLA-A2/MAGE-A4结合的第一抗原结合结构域，其中该第一抗原结合结构域是(常规)Fab分子，且所述(常规)Fab分子包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:1的HCDR 1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:4的LCDR 1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR3；
(iii)VH，其包含SEQ ID NO:41的HCDR 1、SEQ ID NO:42的HCDR 2和SEQ ID NO:43的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:44的LCDR 1、SEQ ID NO:45的LCDR 2和SEQ IDNO:46的LCDR 3；
(iv)VH，其包含SEQ ID NO:9的HCDR 1、SEQ ID NO:10的HCDR 2和SEQ ID NO:11的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:12的LCDR 1、SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3；
(v)VH，其包含SEQ ID NO:17的HCDR 1、SEQ ID NO:18的HCDR 2和SEQ ID NO:19的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:20的LCDR 1、SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3；或
(vi)VH，其包含SEQ ID NO:33的HCDR 1、SEQ ID NO:34的HCDR 2和SEQ ID NO:35的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:36的LCDR 1、SEQ ID NO:37的LCDR 2和SEQ ID NO:38的LCDR 3；
(特别是VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3)；
(B)结合第二抗原(特别是活化性T细胞抗原，更特别是CD3)的第二抗原结合结构域，其中第二抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；以及
(C)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中依据(A)的第一抗原结合结构域的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最优选地被精氨酸(R)取代)，并且其中依据(A)的第一抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中依据(A)的第一抗原结合结构域和依据(B)的第二抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据(C)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
根据上述任一方面，(多特异性)抗体的组分(例如Fab分子、Fc结构域)可以直接融合或通过各种接头，特别是包含一个或多个氨基酸、通常约2-20个氨基酸的肽接头融合，这些接头在本文中描述或在本领域中是已知的。合适的非免疫原性肽连接基包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽连接基，其中“n”通常是1至10的整数，通常是2至4。
此外，根据上述方面中任一项，第二抗原结合结构域可以包含(i)VH，其包含SEQID NO:59的HCDR 1、SEQ ID NO:60的HCDR 2和SEQ ID NO:61的HCDR 3；和VL，其包含SEQ IDNO:62的LCDR 1、SEQ ID NO:63的LCDR 2和SEQ ID NO:64的LCDR 3，或(ii)VH，其包含SEQID NO:51的HCDR 1、SEQ ID NO:52的HCDR 2和SEQ ID NO:53的HCDR 3；和VL，其包含SEQ IDNO:54的LCDR 1、SEQ ID NO:55的LCDR 2和SEQ ID NO:56的LCDR 3(特别是VH，其包含SEQID NO:59的HCDR 1、SEQ ID NO:60的HCDR 2和SEQ ID NO:61的HCDR 3；和VL，其包含SEQ IDNO:62的LCDR 1、SEQ ID NO:63的LCDR 2和SEQ ID NO:64的LCDR 3)；和/或(i)VH，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，或(ii)VH，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列(特别是VH，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列)。
在优选的方面，本发明提供了(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
(A)与HLA-A2/MAGE-A4结合的第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域和第三抗原结合域中的每一者是(常规)Fab分子并且包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:1的HCDR 1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:4的LCDR 1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR3；
(iii)VH，其包含SEQ ID NO:41的HCDR 1、SEQ ID NO:42的HCDR 2和SEQ ID NO:43的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:44的LCDR 1、SEQ ID NO:45的LCDR 2和SEQ ID NO:46的LCDR 3；
(iv)VH，其包含SEQ ID NO:9的HCDR 1、SEQ ID NO:10的HCDR 2和SEQ ID NO:11的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:12的LCDR 1、SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3；
(v)VH，其包含SEQ ID NO:17的HCDR 1、SEQ ID NO:18的HCDR 2和SEQ ID NO:19的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:20的LCDR 1、SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3；或
(vi)VH，其包含SEQ ID NO:33的HCDR 1、SEQ ID NO:34的HCDR 2和SEQ ID NO:35的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:36的LCDR 1、SEQ ID NO:37的LCDR 2和SEQ ID NO:38的LCDR 3；
(特别是VH，其包含SEQ ID NO:25的HCDR 1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:28的LCDR 1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3)；
(B)结合第二抗原(特别是活化性T细胞抗原，更特别是CD3)的第二抗原结合结构域，其中第二抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换并且包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:59的HCDR 1、SEQ ID NO:60的HCDR 2和SEQ ID NO:61的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:62的LCDR 1、SEQ ID NO:63的LCDR 2和SEQ ID NO:64的LCDR 3；或
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:51的HCDR 1、SEQ ID NO:52的HCDR 2和SEQ ID NO:53的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:54的LCDR 1、SEQ ID NO:55的LCDR 2和SEQ ID NO:56的LCDR 3；
(特别是VH，其包含SEQ ID NO:59的HCDR 1、SEQ ID NO:60的HCDR 2和SEQ ID NO:61的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:62的LCDR 1、SEQ ID NO:63的LCDR 2和SEQ ID NO:64的LCDR 3)；以及
(C)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中
在根据(A)的第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最优选地被精氨酸(R)取代)，并且其中根据(A)的第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；
并且其中进一步地
依据(A)的第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据(B)的第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据(B)的第二抗原结合结构域和依据(A)的第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据(C)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在另一优选的方面，本发明提供了(多特异性)抗体，所述(多特异性)抗体包含
(A)与HLA-A2/MAGE-A4结合的第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域和第三抗原结合域中的每一者是(常规)Fab分子并且包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(i)VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；
(i)VH，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
(i)VH，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(i)VH，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
(i)VH，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；
(特别是VH，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列)；
(B)结合第二抗原(特别是活化性T细胞抗原，更特别是CD3)的第二抗原结合结构域，其中第二抗原结合结构域是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换并且包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；或
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
(特别是VH，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列)；和
(C)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中
在根据(A)的第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最优选地被精氨酸(R)取代)，并且其中根据(A)的第一抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；
并且其中进一步地
依据(A)的第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端融合至依据(B)的第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端，并且依据(B)的第二抗原结合结构域和依据(A)的第三抗原结合结构域各自在Fab重链的C末端融合至依据(C)的Fc结构域的亚基中的一者的N末端。
在根据本发明的这些方面的一个方面，在所述Fc结构域的所述第一亚基中，366位的苏氨酸残基被替换为色氨酸残基(T366W)；而在所述Fc结构域的所述第二亚基中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替换，并且任选地，366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替换并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替换(根据Kabat EU索引编号)。
在根据本发明的这些方面的另一个方面，在所述Fc结构域的第一亚基中，另外地，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换)，并且在所述Fc结构域的第二亚基中，另外地，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。
在根据本发明的这些方面的又另一个方面，在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中，234位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替换(L234A)，235位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替换(L235A)，并且329位的脯氨酸残基被用甘氨酸残基替换(P329G)(根据KabatEU索引编号)。
在根据本发明的这些方面的又另一个方面，Fc结构域是人IgG1 Fc结构域。
在具体的方面，(多特异性)抗体包含含有与SEQ ID NO:68所示氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:69所示氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:70所示氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)，以及含有与SEQ ID NO:72所示氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。在另一具体的方面，(多特异性)抗体包含含有如SEQ ID NO:68氨基酸序列的多肽、含有如SEQ ID NO:69氨基酸序列的多肽、含有如SEQ ID NO:70氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)和含有如SEQ ID NO:72氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供了与HLA-A2/MAGE-A4和CD3结合的(多特异性)抗体，所述抗体包含含有与SEQ ID NO:68的序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:69的序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:70的序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)，和含有与SEQ ID NO:72的序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。在一个方面，本发明提供了与HLA-A2/MAGE-A4和CD3结合的(多特异性)抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的多肽、含有SEQID NO:69的氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)和含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的多肽。
在另一具体的方面，(多特异性)抗体包含：含有与SEQ ID NO:67氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:69氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:70氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)，以及含有与SEQ ID NO:71氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。在另一具体的方面，(多特异性)抗体包含含有如SEQ ID NO:67氨基酸序列的多肽、含有如SEQ ID NO:69氨基酸序列的多肽、含有如SEQ ID NO:70氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)和含有如SEQ ID NO:71氨基酸序列的多肽。
在一个方面，本发明提供了与HLA-A2/MAGE-A4和CD3结合的(多特异性)抗体，所述抗体包含含有与SEQ ID NO:67的序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:69的序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:70的序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)，和含有与SEQ ID NO:71的序列至少有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。在一个方面，本发明提供了与HLA-A2/MAGE-A4和CD3结合的(多特异性)抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的多肽、含有SEQID NO:69的氨基酸序列的多肽、含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的多肽(特别是两个多肽)和含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的多肽。
10.Fc结构域变体
在优选的方面，本发明的(多特异性)抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。
(多特异性)抗体的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。在一个方面，本发明的(多特异性)抗体包含不超过一个Fc结构域。
在一个方面，(多特异性)抗体的Fc结构域是IgG Fc结构域。在一个优选的方面，所述Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个方面，所述Fc结构域是IgG4 Fc结构域。在一个更具体的方面，所述Fc结构域是在位置S228(Kabat EU索引编号)处包含氨基酸取代(特别是氨基酸取代S228P)的IgG4 Fc结构域。该氨基酸取代减少了IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在另一个优选的方面，所述Fc结构域是人Fc结构域。在甚至更优选的方面，Fc结构域是人IgG1 Fc结构域。人IgG1 Fc区的示例性序列以SEQ ID NO:78给出。
a)促进异源二聚化的Fc结构域修饰
根据本发明的(多特异性)抗体包含可以与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合结构域，因此所述Fc结构域的两个亚基通常包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高(多特异性)抗体的产率和纯度，因此将有利的是在(多特异性)抗体子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰。
因此，在优选的方面，根据本发明的(多特异性)抗体的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个方面，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。
存在几种对Fc结构域的CH3结构域进行修饰以实施异二聚化的方法，这些方法例如在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO2013157954、WO 2013096291中详细描述。通常，在所有此类方法中，Fc结构域的第一亚基的CH3结构域和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域都以互补的方式工程化，使得每个CH3结构域(或包含其的重链)可以不再与其自身同源二聚化，而是被迫与互补工程化的其他CH3结构域异源二聚化(使得第一和第二CH3结构域异源二聚化并且在两个第一或两个第二CH3结构域之间不形成同源二聚体)。这些用于实现改善的重链异源二聚化的不同方法被认为是与(多特异性)抗体中的重-轻链修饰(例如在一个结合臂中进行VH和VL交换/替换并且在CH1/CL界面中引入带有相反电荷的荷电氨基酸的取代)组合的不同替换方案，所述不同替换方案减少重链/轻链错配和Bence Jones型副产物。
在一个具体方面，所述促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰是所谓的“杵臼结构”修饰，其包括Fc结构域的两个亚基中的一个亚基中的“杵”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中的“臼”修饰。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9,617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得所述突起可以定位在所述空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一个优选的方面，在(多特异性)抗体的Fc结构域的所述第一亚基的所述CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在所述第一亚基的所述CH3结构域内产生突起，所述突起可定位在所述第二亚基的所述CH3结构域内的空腔中，并且在所述Fc结构域的所述第二亚基的所述CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在所述第二亚基的所述CH3结构域内产生空腔，所述第一亚基的所述CH3结构域内的所述突起可定位在所述空腔内。
优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组。
优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。
突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。
在一个具体方面，在Fc结构域的第一亚基(“杵”亚基)(的CH3结构域)中，366位的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替换，并且在Fc结构域的第二亚基(“臼”亚基)(的CH3结构域)中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替换。在一个方面，在Fc结构域的第二亚基中，另外地366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替换，并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替换(根据Kabat EU索引编号)。
在又另一个方面，在Fc结构域的第一亚基中，另外地，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换)，并且在所述Fc结构域的第二亚基中，另外地，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定所述二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个优选方面，所述Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且所述Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在一个优选的方面，优选与活化性T细胞抗原(例如CD3)结合的第二抗原结合结构域与(任选地经由与HLA-A2/MAGE-A4结合的第一抗原结合结构域和/或肽接头)Fc结构域的第一亚基(包含“杵”修饰)融合。不希望受理论束缚，与第二抗原(例如CD3)结合的抗原结合结构域与Fc结构域的含有杵的亚基的融合将(进一步)最小化包含两个与第二抗原结合的抗原结合结构域的抗体的产生(两个含有杵的多肽的空间位阻)。
用于实施异源二聚化的其他CH3修饰技术被设想为根据本发明的替代方案，并且描述于例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO2013/157954、WO 2013/096291中。
在一个方面，可替代地使用EP 1870459中描述的异源二聚化方法。该方法基于在Fc结构域的两个亚基之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨基酸位置处引入带有相反电荷的荷电氨基酸。本发明的(多特异性)抗体的一个特定方面是氨基酸突变R409D；在(Fc结构域的)两个CH3结构域中的一个CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的CH3结构域中的另一个CH3结构域中的E357K(编号根据Kabat EU索引)。
在另一方面，本发明的(多特异性)抗体包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366S、L368A、Y407V，以及另外地氨基酸突变R409D；在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(编号根据Kabat EU索引)。
在另一方面，本发明的(多特异性)抗体包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366S、L368A、Y407V，或者所述(多特异性)抗体包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366S、L368A、Y407V，以及另外地氨基酸突变R409D；在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(所有根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，可替代地使用WO 2013/157953中描述的异源二聚化方法。在一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366K，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变L351D(编号根据Kabat EU索引)。在另一个方面，第一CH3结构域包含另外的氨基酸突变L351K。在另一个方面，第二CH3结构域还包含选自由Y349E、Y349D和L368E(特别是L368E)组成的组的氨基酸突变(编号根据Kabat EU索引)。
在一个方面，可替代地使用WO 2012/058768中描述的异源二聚化方法。在一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一个方面，第二CH3结构域包含在T411、D399、S400、F405、N390或K392位的进一步氨基酸突变，例如选自由以下项组成的组：a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W，b)D399R、D399W、D399Y或D399K，c)S400E、S400D、S400R或S400K，d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W，e)N390R、N390K或N390D，f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E(编号根据Kabat EU索引)。在另一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366V、K409F。在另一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一个方面，第二CH3结构域还包含氨基酸突变K392E、T411E、D399R和S400R(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，可替代地使用WO 2011/143545中描述的异源二聚化方法，例如在选自由368和409组成的组的位置处进行氨基酸修饰(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，可替代地使用WO 2011/090762中描述的异源二聚化方法，该异源二聚化方法也使用上述杵臼结构技术。在一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366W，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407A。在一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366Y，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407T(编号根据Kabat EU索引)。
在一个方面，(多特异性)抗体或其Fc结构域为IgG2亚类，并且可替代地使用在WO2010/129304中描述的异源二聚化方法。
在一个替代方面，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。在一个这样的方面，第一CH3结构域包含用带负电荷的氨基酸对K392或N392进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，特别是K392D或N392D)，并且第二CH3结构域包含用带正电荷的氨基酸对D399、E356、D356或E357进行的氨基酸取代(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R)，特别是D399K、E356K、D356K或E357K，更特别是D399K和E356K)。在另一个方面，第一CH3结构域还包含用带负电荷的氨基酸对K409或R409进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，特别是K409D或R409D)。在另一个方面，第一CH3结构域进一步或可替代地包含用带负电荷的氨基酸对K439和/或K370进行的氨基酸取代，(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))(所有根据Kabat EU索引编号)。
在又另一个方面，可替代地使用WO 2007/147901中描述的异源二聚化方法。在一个方面，第一CH3结构域包含氨基酸突变K253E、D282K和K322D，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变D239K、E240K和K292D(根据Kabat EU索引编号)。
在又一方面，可替代地使用WO 2007/110205中描述的异源二聚化方法。
在一个方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代K392D和K409D，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代D356K和D399K(根据Kabat EU索引编号)。
b)减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
Fc结构域赋予(多特异性)抗体有利的药代动力学性质，包括有助于在靶组织中良好积累的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，同时，其可能导致(多特异性)抗体不期望地靶向至表达Fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。此外，Fc受体信号传导通路的共活化可导致细胞因子释放，所述细胞因子释放与T细胞活化特性和(多特异性)抗体的长半衰期组合，在全身施用后导致对细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。由于对T细胞的潜在破坏(例如被NK细胞)，T细胞以外的(带有Fc受体的)免疫细胞的活化甚至可能降低(多特异性)抗体的功效。
因此，在优选的方面，与天然IgG1 Fc结构域相比，根据本发明的(多特异性)抗体的Fc结构域表现出降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个这样的方面，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的(多特异性)抗体)表现出与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的(多特异性)抗体)相比小于50％，特别是小于20％，更特别是小于10％并且最特别是小于5％的结合亲和力，和/或与天然IgG1 Fc结构域结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的(多特异性)抗体)相比小于50％，特别是小于20％，更特别是小于10％并且最特别是小于5％的效应子功能。在一个方面，Fc结构域结构域(或包含所述Fc结构域的(多特异性)抗体)基本上不结合Fc受体和/或诱导效应子功能。在一个优选的方面，Fc受体是Fcγ受体。在一个方面，所述Fc受体是人Fc受体。在一个方面，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体方面，所述Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面，效应子功能是选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的组的一种或多种效应子功能。在一个优选的方面，效应子功能是ADCC。在一个方面，与天然IgG1 Fc结构域结构域相比，Fc结构域结构域对新生Fc受体(FcRn)表现出基本相似的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的(多特异性)抗体)表现出天然IgG1Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的(多特异性)抗体)对FcRn的结合亲和力的大于约70％，特别地大于约80％，更特别地大于约90％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合。
在某些方面，Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在优选的方面，(多特异性)抗体的Fc结构域包含降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。在一个方面，氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个方面，氨基酸突变将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在存在多于一个降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的方面，这些氨基酸突变的组合可以将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍，或甚至至少50倍。在一个方面，与包含非工程化的Fc结构域的(多特异性)抗体相比，包含工程化的Fc结构域的(多特异性)抗体表现出对Fc受体的结合亲和力的小于20％，特别地小于10％，更特别地小于5％。在一个优选的方面，Fc受体是Fcγ受体。在一些方面，Fc受体是人Fc受体。在一些方面，Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体方面，Fc受体是活化人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中的每一个的结合降低。在一些方面，对互补组分的结合亲和力，对C1q的特异性结合亲和力也降低。在一个方面，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力不降低。当所述Fc结构域(或包含所述Fc结构域的(多特异性)抗体)表现出非工程化形式的所述Fc结构域(或包含非工程化形式的所述Fc结构域的(多特异性)抗体)对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合，即保持了Fc结构域对所述受体的结合亲和力。Fc结构域或包含所述Fc结构域的本发明的(多特异性)抗体可表现出这种亲和力的大于约80％，以及甚至大于约90％。在某些方面，(多特异性)抗体的Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可包括但不限于以下项中的一种或多种：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导的细胞凋亡、减少的靶结合抗体的交联、减少的树突细胞成熟，或减少的T细胞致敏。在一个方面，降低的效应子功能是选自降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和减少的细胞因子分泌的组的一种或多种降低的效应子功能。在一个优选的方面，降低的效应子功能是降低的ADCC。在一个方面，降低的ADCC小于由非工程化的Fc结构域(或包含所述非工程化的Fc结构域的(多特异性)抗体)诱导的ADCC的20％。
在一个方面，降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸突变是氨基酸取代。在一个方面，所述Fc结构域在选自包括E233、L234、L235、N297、P331和P329(根据Kabat EU索引编号)的组的位置处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面，所述Fc结构域在选自包括L234、L235和P329(根据Kabat EU索引编号)的组的位置处包含氨基酸取代。在一些方面，所述Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。在一个这样的方面，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。在一个方面，所述Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面，氨基酸取代是P329A或P329G，特别是P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个方面，Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代，并且在选自E233、L234、L235、N297和P331(根据Kabat EU索引编号)的位置处包含另外的氨基酸取代。在一个更具体的方面，所述另外的氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在优选的方面，Fc结构域在位置P329、L234和L235(根据Kabat EU索引编号)处包含氨基酸取代。在更优选的方面，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”、“PGLALA”或“LALAPG”)。具体地讲，在优选的方面，Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)，即在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中，位置234处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L234A)，位置235处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L235A)，并且位置329处的脯氨酸残基被甘氨酸残基替换(P329G)(根据Kabat EU索引编号)。
在一个这样的方面，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体(以及补体)结合，如在PCT公开号WO 2012/130831中所述，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。WO2012/130831还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和确定其性质(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。
与IgG1抗体相比，IgG4抗体表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。因此，在一些方面，本发明的(多特异性)抗体的Fc结构域是IgG4 Fc结构域，特别地是人IgG4 Fc结构域。在一个方面，IgG4 Fc结构域包含在S228位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代S228P(根据Kabat EU索引编号)。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应子功能，在一个方面，IgG4 Fc结构域包含L235位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代L235E(根据Kabat EU索引编号)。在另一方面，IgG4Fc结构域包含P329位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个优选的方面，IgG4 Fc结构域包含S228、L235和P329位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代S228P、L235E和P329G(根据Kabat EU索引编号)。这种IgG4 Fc结构域突变体以及它们的Fcγ受体结合性质描述于PCT公开号WO 2012/130831中，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。
在一个优选的方面，与天然IgG1 Fc结构域相比表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的Fc结构域是包含氨基酸取代L234A、L235A和任选地P329G的人IgG1 Fc结构域，或者是包含氨基酸取代S228P、L235E和任选地P329G的人IgG4 Fc结构域(根据Kabat EU索引编号)。
在某些方面，已消除了Fc结构域的N糖基化。在一个这样的方面，Fc结构域包含N297位的氨基酸突变，特别地是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替换天冬酰胺的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。
除了上文和PCT公开号WO 2012/130831中所述的Fc结构域外，具有减少的Fc受体结合和/或降低的效应子功能的Fc结构域还包括具有对Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些Fc结构域(美国专利号6,737,056)(根据Kabat的EU索引编号)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸中两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
可以使用本领域熟知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。可替代地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(例如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)，来评估Fc结构域或包含Fc结构域的(多特异性)抗体对Fc受体的结合亲和力。
Fc结构域或包含Fc结构域的(多特异性)抗体的效应子功能可通过本领域已知的方法测量。用于评定感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)中。可替代地，可以使用非放射性测定(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0003698550180001031
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应物细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。另选地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的ADCC活性。
在一些方面，Fc结构域与补体组分，特别是C1q的结合减少。因此，在一些方面，其中Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定Fc结构域或包含Fc结构域的(多特异性)抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J ImmunolMethods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。
FcRn结合和体内清除/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929)。
B.多核苷酸
本发明进一步提供了编码本发明的抗体的分离的多核苷酸。所述分离的多核苷酸可以是单个多核苷酸或多个多核苷酸。
编码本发明的(多特异性)抗体的多核苷酸可以表达为编码完整抗体的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如，两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他方式缔合以形成功能性抗体。例如，抗体的轻链部分可以由与包含抗体的重链的抗体的部分分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成抗体。在另一个实例中，包含两个Fc结构域亚基中的亚基中的一者和任选地一个或多个Fab分子的一部分的抗体可以由与包含所述两个Fc结构域亚基中的另一个亚基和任选地Fab分子的一部分的抗体分开的多核苷酸编码。当共表达时，Fc结构域亚基将缔合以形成Fc结构域。
在一些方面，分离的多核苷酸编码如本文所述的根据本发明的完整抗体分子。在其他方面，分离的多核苷酸编码包含在如本文所述的根据本发明的抗体中的多肽。
在某些方面，多核苷酸或核酸是DNA。在其他方面，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
C.重组方法
本发明的抗体可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。对于重组生产，将例如如上所述的编码抗体的一种或多种多核苷酸分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在一个方面，提供了包含本发明的多核苷酸(即单个多核苷酸或多个多核苷酸)的载体，特别是表达载体。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有抗体的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如以下文献所述的技术：Maniatis等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y(1989)。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码抗体的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，该异源编码区与编码本发明的抗体的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的键结性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，所述附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌抗体，可以将编码信号序列的DNA置于本发明的抗体或其片段的核酸的上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与所述多肽的N末端融合的信号肽，所述信号肽被从翻译的多肽上切割下来以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。在某些方面，使用天然信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留引导与其可操作地缔合的多肽的分泌的能力的该序列的功能性衍生物。另选地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。
编码短蛋白质序列(其可用于促进后续纯化(例如组氨酸标签)或帮助标记抗体)的DNA可包含在抗体(片段)编码多核苷酸的内部或末端。
在另一个方面，提供了包含本发明的多核苷酸(即单个多核苷酸或多个多核苷酸)的宿主细胞。在某些方面，提供了包含本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个这样的方面，宿主细胞包含一种或多种载体(例如已经用一种或多种载体转化或转染)，该一种或多种载体包含编码本发明的抗体的(一部分)的一种或多种多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的抗体或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持抗体表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的抗体用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，例如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)和Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J Gen Virol36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，ProcNatl Acad Sci USA 77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methodsin Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个方面，宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个方面，宿主细胞不是人体内的细胞。
用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。可以对表达包含抗原结合结构域例如抗体的重链或轻链的多肽的细胞进行工程化，以便也表达另一条抗体链，使得表达的产物为具有重链和轻链的抗体。
在一个方面，提供了产生根据本发明的抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含编码如本文所提供的抗体的多核苷酸的宿主细胞，以及任选地从该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
本发明的(多特异性)抗体的组分可以彼此遗传融合。(多特异性)抗体可以被设计成使得其组分直接或通过接头序列彼此间接融合。连接基的组成和长度可以根据本领域熟知的方法测定，并且可以测试连接基的功效。本文提供了(多特异性)抗体的不同组分之间的接头序列的实例。如果需要的话，还可包括另外的序列(例如内肽酶识别序列)以掺入切割位点来分离融合的各个组分。
如本文所述制备的抗体可通过本领域已知的技术纯化，所述技术为诸如高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、亲和色谱、尺寸排阻色谱等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱纯化，可以使用与抗体结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明的抗体的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离抗体。抗体的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任何一种来确定，所述各种熟知的分析方法包括凝胶电泳、高压液相色谱等。
D.测定
可通过本技术领域中已知的各种测定，对本文所提供的抗体的物理/化学特性和/或生物活性来进行鉴别、筛选或表征。
1.结合测定
抗体对靶抗原或Fc受体的结合(亲和力)可以例如使用标准仪器例如BIAcore仪器(GE Healthcare)以及诸如可通过重组表达获得的受体或靶抗原，通过表面等离子体共振(SPR)来确定。可替代地，可以使用表达特定受体或靶抗原的细胞系，例如通过流式细胞术(FACS)评估抗体与不同受体或靶抗原的结合。下文描述了用于测量与HLA-A2/MAGE-A4的结合活性的特定说明性和示例性方面。
在一个方面，本发明的(多特异性)抗体对HLA-A2/MAGE-A4的结合亲和力通过SPR如下确定：
SPR在Biacore T200仪器(GE Healthcare)上在25℃使用HBS-EP+(10mM HEPES、150mM NaCl pH 7.4、0.005％表面活性剂P20(GE Healthcare，#BR-1006-69))作为运行缓冲液进行。抗人Fc特异性抗体(GE Healthcare，#BR-1008-39)通过胺偶联直接固定在CM5芯片(GE Healthcare)上。HLA-A2/MAGE-A4抗体在2.5nM下被捕获60秒。将HLA-A2/MAGE-A4p230-239复合物在HBS-EP(6.17至1500nM)中的三倍稀释系列以30μl/min的速度通过配体240秒以记录缔合阶段。监测解离阶段持续240s，并通过从样品溶液切换到HBS-EP+来触发。每次循环后，使用3M MgCl2以10μl/min的速度注射30秒，使芯片表面再生。通过减去在含有抗人Fc抗体但没有在其上捕获HLA-A2/MAGE-A4抗体的参考流动池上获得的响应来校正本体折射率差异。亲和常数是通过使用BIAeval软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合由动力学速率常数得出的。
2.活性测定
本发明的(多特异性)抗体的生物活性可以通过如实例中所述的各种测定来测量。生物活性可以例如包括T细胞增殖的诱导、T细胞中信号传导的诱导、T细胞中活化标志物表达的诱导、T细胞细胞因子分泌的诱导、靶细胞(例如肿瘤细胞)裂解的诱导，以及肿瘤消退的诱导和/或提高生存。
E.组合物、配方和施用途径
在另一个方面，本发明提供了包含本文提供的任一种抗体的药物组合物，其例如用于以下任一种治疗方法中。在一个方面，药物组合物包含根据本发明的抗体，以及药用载体。在另一方面，药物组合物包含根据本发明的抗体以及如下文所述的至少一种附加治疗剂。
还提供了一种以适于体内施用的形式产生本发明的抗体的方法，该方法包括(a)获得根据本发明的抗体，以及(b)用至少一种药用载体配制该抗体，由此配制抗体制剂以用于体内施用。
本发明的药物组合物包含溶解或分散在药用载体中的有效量的抗体。术语“药学上可接受的”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。根据本公开内容，含有抗体和任选地另外的活性成分的药物组合物的制备将对本领域技术人员而言是已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990例示的，该文献以引用方式并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应理解制备物应满足FDA生物标准办公室或其他国家/地区相应当局所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所使用的，“药用载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲液、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料，类似物质以及它们的组合，如本领域普通技术人员应已知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990，第1289-1329页，该文献通过引用并入本文)。除了任何常规载体与活性成分不相容的情况之外，所述载体在药物组合物中的用途是可预期的。
本发明的抗体(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。投配可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。
肠胃外组合物包括设计用于注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)的那些组合物。对于注射，本发明的抗体可以在水溶液中配制，特别是在生理上相容的缓冲液(例如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液)中配制。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，抗体可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)构建。通过根据需要将本发明的抗体以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，所述真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白的安全水平保持最低。合适的药用载体包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定方面，可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。
除了先前描述的组合物之外，抗体还可以配制成贮库制剂。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，抗体可以用合适的聚合或疏水材料配制(例如作为可接受油中的乳液)或用离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如配制为微溶盐。
包含本发明的抗体的药物组合物可借助于常规混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干的手段制备。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。适当的配方取决于所选择的施用途径。
抗体可以配制成游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药用盐是基本上保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
F.治疗方法和组合物
本文提供的任何抗体可用于治疗方法。本发明的抗体可用作免疫治疗剂，例如用于治疗癌症。
为了用于治疗方法中，本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
在一个方面，将本发明的抗体提供为用作药物。在另外的方面，将本发明的抗体提供为用于治疗疾病。在某些方面，提供了用于治疗方法的本发明的抗体。在一个方面，本发明提供了本发明的抗体以用于治疗有需要的个体的疾病。在某些方面，本发明提供了抗体以用于治疗患有疾病的个体的方法中，该方法包括向所述个体施用有效量的所述抗体。在某些方面，待治疗的疾病是增殖性疾患。在优选的方面，疾病为癌症。在某些方面，如果待治疗的疾病是癌症，则所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂。在另外的方面，本发明提供了用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解的本发明的抗体。在某些方面，本发明提供了用于在个体中诱导靶细胞、特别是肿瘤细胞的裂解的方法中使用的本发明的抗体，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗体以诱导靶细胞的裂解。根据上述方面中的任一方面的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
在另一个方面，本发明提供了本发明的抗体在制造或制备药物中的用途。在一个方面，所述药物用于治疗有此需要的个体的疾病。在另一个方面，所述药物用于治疗疾病的方法，所述方法包括向患有疾病的个体施用有效量的药物。在某些方面，待治疗的疾病是增殖性疾患。在优选的方面，疾病为癌症。在一个方面，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在另一个方面，所述药物用于诱导靶细胞、特别是肿瘤细胞的裂解。在又另一个方面，所述药物用于在个体中诱导靶细胞、特别是肿瘤细胞的裂解的方法中，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物以诱导靶细胞的裂解。根据上述方面中的任一方面的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
在另一方面，本发明提供了治疗疾病的方法。在一个方面，所述方法包括向患有这种疾病的个体施用有效量的本发明的抗体。在一个方面，向所述个体施用组合物，所述组合物包含药学上可接受形式的本发明的抗体。在某些方面，待治疗的疾病是增殖性疾患。在优选的方面，疾病为癌症。在某些方面，如果待治疗的疾病是癌症，则所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂。根据上述方面中的任一方面的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
在另一方面，本发明提供了一种用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解的方法。在一个方面，所述方法包括在存在T细胞、特别是细胞毒性T细胞的情况下，使靶细胞与本发明的抗体接触。在另一方面，提供了一种在个体中诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个这样的方面，所述方法包括向个体施用有效量的本发明的抗体以诱导靶细胞的裂解。在一个方面，“个体”是人。
在某些方面中，待治疗的疾病是增殖性疾患，特别是癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌，以及肾癌。可以使用本发明的抗体治疗的其他细胞增殖疾患包括但不限于位于以下部位中的肿瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经系统(中枢和外周神经系统)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部，以及泌尿生殖系统。还包括癌前病症或病变和癌转移。在某些方面，癌症是表达HLA-A2/MAGE-A4的癌症。在某些方面，癌症是选自由以下项组成的组的癌症：肺癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、皮肤癌、胃癌和卵巢癌。技术人员容易认识到，在许多情况下，抗体可能不提供治愈，而可能仅提供部分益处。在一些方面，具有某些益处的生理变化也被视为具有治疗益处。因此，在一些方面，提供生理变化的抗体的量被认为是“有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是哺乳动物，更特别地是人。
在一些方面，将有效量的本发明的抗体施用于个体以治疗疾病。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、施用途径、患者的体重、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、抗体是施用用于预防目的还是治疗目的、既往或同时进行的治疗干预、患者的临床病史和对抗体的反应，以及主治医师的判断。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
抗体适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。抗体的一种示例性剂量的范围为约0.005mg/kg至约10mg/kg。在其他非限制性实例中，剂量还可包括每次施用约1ug/kg体重、约5ug/kg体重、约10ug/kg体重、约50ug/kg体重、约100ug/kg体重、约200ug/kg体重、约350ug/kg体重、约500ug/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重，至约1000mg/kg体重或更多，以及从其中推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的非限制性实例中，约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5ug/kg体重至约500mg/kg体重等的范围可以基于上述数值施用。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约两次至约二十次，或例如约六次剂量的抗体)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
本发明的抗体将通常以有效实现预期目的的量使用。为用于治疗或预防病症，将本发明的抗体或其药物组合物以有效量施用或施加。
对于全身施用，有效剂量可以最初根据体外测定(诸如细胞培养物测定)来进行估计。可以随后在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC50循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。
初始剂量也可以使用本领域公知的技术，根据体内数据(例如动物模型)来估计。
可以单独地调整剂量的量和间隔，以提供足以维持治疗效果的抗体的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量的范围是约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。通过每天施用多个剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC来测量血浆中的水平。
有效剂量的本发明的抗体通常将在不会引起显著毒性的情况下提供治疗益处。抗体的毒性和治疗功效可通过标准药学方法在细胞培养或实验动物中测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，所述治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的抗体是优选的。在一个方面，根据本发明的抗体表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化，所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个别医生根据患者的病症来选择(参见例如Fingl等人，1975，在：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1页中，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。
用本发明的抗体治疗的患者的主治医师将知道如何以及何时由于毒性、器官功能障碍等终止、中断或调整施用。相反地，如果临床应答不充分(排除毒性)，则主治医师也会知道将治疗调节到更高水平。在目标疾患的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。
本发明的抗体可以与治疗中的一种或多种其他药剂组合施用。例如，本发明的抗体可与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括被施用以治疗需要这种治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体疾病的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些方面，另外的治疗剂是免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡活化剂，或增加细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂。在优选的方面，另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂，或抗血管生成剂。
此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用抗体的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。抗体通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以经验地/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
上述此类组合疗法包括联合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或不同的组合物中)和单独施用，在单独施用的情况下，本发明的抗体的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。本发明的抗体也可以与放射疗法组合使用。
G.制品
在本发明的另一方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。该制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。所述容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合能够有效地用于治疗、预防和/或诊断病症，并且所述容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是具有能够被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，所述制品可包括(a)第一容器，其中所述第一容器中含有包含本发明的抗体的组合物；以及(b)第二容器，所述第二容器中含有包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂组合物。本发明该方面中的制品还可包含包装插页，所述包装插页指示所述组合物可用于治疗特定病症。可替代地或另外地，所述制品还可包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包括药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品还可以包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
H.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些方面，本文提供的抗体中的任一种可用于检测生物样品中其靶标(例如HLA-A2/MAGE-A4)的存在。如本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些方面，生物样品包括细胞或组织，例如前列腺组织。
在一个方面，提供了用于诊断或检测的方法的根据本发明的抗体。在另一方面，提供了检测生物样品中HLA-A2/MAGE-A4的存在的方法。在某些方面，所述方法包括在允许抗体与HLA-A2/MAGE-A4结合的条件下使生物样品与本发明的抗体接触，并且检测抗体和HLA-A2/MAGE-A4之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一个方面，本发明的抗体用于选择适合用与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体治疗的受试者，例如，其中HLA-A2/MAGE-A4是用于选择患者的生物标志物。
可以使用本发明的抗体诊断的示例性病症包括癌症，特别是皮肤癌或脑癌。
在某些方面，提供了根据本发明的抗体，其中所述抗体被标记。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(诸如荧光标记、发色标记、电子致密标记、化学发光标记，以及放射性标记)，以及间接(例如通过酶促反应或分子相互作用)检测的部分(诸如酶或配体)。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I；荧光团，诸如稀土螯合物或荧光素(fluorescein)及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮；萤光素酶(luciferase)，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)；萤光素(luciferin)；2,3-二氢二氮杂萘二酮(2,3-dihydrophthalazinedione)；辣根过氧化物酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，诸如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶；与采用过氧化氢来氧化染料前体的酶(诸如HRP、乳过氧化物酶，或微过氧化物酶)偶联；生物素/抗生物素蛋白；纺丝标记；噬菌体标记；稳定自由基等。
序列
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Figure BDA0003698550180001371
IV.实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他方面。
实例1.HLA-A2/MAGE-A4结合剂的产生
抗HLA-A2/MAGE-A4 Fab的选择和筛选
抗HLA-A2/MAGE-A4 Fab通过噬菌体展示从合成Fab文库中选择，该文库由衍生自不同V结构域家族的VL和VH配对组成。这些文库完全基于人类框架，在VL和VH结构域的CDR1、CDR2和CDR3中具有序列多样性。
根据以下方案在溶液中进行选择轮次(生物淘选)：1.在包被有500nM无关生物素化HLA-A2/WT1RMF复合物(WTRMF肽参见SEQ ID NO:84)的中性抗生物素蛋白包被的96孔板上预清除每个文库约1012个噬菌粒颗粒，2.孵育非HLA-A2/WT1RMF结合噬菌粒颗粒与100nM生物素化HLA-A2/MAGEA4p230-239复合物(总体积800μl)0.5小时，3.捕获生物素化HLA-A2/MAGE-A4p230-239并通过在摇床上添加80μl链霉抗生物素蛋白包被的磁性颗粒20分钟特异性结合噬菌体，4.使用磁性颗粒分离器用1ml PBS/Tween 20洗涤各个磁性颗粒5-10次并用1ml PBS洗涤5-10次，5.通过添加1ml 100mM三乙胺(TEA)5-10分钟洗脱噬菌体颗粒，并通过添加1/2体积的1M Tris/HCl pH 7.4进行中和，6.用洗脱噬菌体颗粒重新感染对数期大肠杆菌TG1细胞，在37℃摇床上孵育0.5小时，用辅助噬菌体VCSM13感染，在30℃的摇床上孵育过夜，随后PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒，用于下一轮选择。
进行3到4轮选择，分别使用100nM、50nM、50nM和10nm的递减抗原浓度。
HLA-A2/MAGE-A4结合测定：用于表征通过噬菌体展示获得的Fab的夹心ELISA
单个克隆以96孔格式细菌表达为1ml培养物，并通过ELISA对上清液(具有可溶性Fab形式的结合剂，标记有FLAG或T7序列)进行筛选。特定结合剂被定义为具有高于HLA-A2/MAGEp230-239的5x背景的信号和低于HLA-A2/WT1RMF(不相关的HLA-A2/肽复合物)的3x背景的信号。更准确地说，在37℃，用10nM HLA-A2/MAGEp230-239或50nM HLA-A2/WT1RMF包被的中性抗生物素蛋白96孔条板(Thermo Fisher)30分钟，然后在室温用2％(w/v)牛奶磷酸盐缓冲盐水(MPBS)(200μl/孔)封闭板1-2小时。将板用PBS洗涤3次，然后添加含有Fab的细菌上清液，将板在室温孵育1小时。用PBS再洗涤3步后，添加抗FLAG-HRP二抗(1:4000)或抗T7-HRP二抗(1:10000)，并将板在室温孵育1小时。将板用PBS洗涤3次并通过添加100μl/孔BM Blue POD(Roche)显色。通过添加50μl/孔1M H2SO4终止酶促反应。在450nm处读取OD(在900nm处读取参考)，用于最终读取OD450-900。使ELISA阳性克隆进行下述动力学筛选实验。
HLA-A2/MAGE-A4结合测定：用于动力学表征的表面等离子共振(SPR)通过噬菌体 展示获得的Fab
通过使用ProteOn XPR36生物传感器(BioRad)对含有Fab的细菌培养上清液进行表面等离子共振筛选来鉴定特定的结合剂。简而言之，在用洗脱的噬菌体颗粒感染对数期大肠杆菌TG1细胞后，将单菌落形成单位(cfu)铺板并挑取用于在96-深孔板中接种1ml表达培养物。
所有实验均在25℃使用PBST作为运行缓冲液(10mM PBS，pH 7.4和0.005％(v/v)Tween 20)进行。使用ProteOn XPR36生物传感器配备GLM传感器芯片和偶联试剂(10mM乙酸钠，pH 4.5，磺基-N-羟基琥珀酰亚胺[磺基-NHS]、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐[EDC]和乙醇胺)(均为BioRad)。
在GLM芯片上以30μl/min的速度进行固定。pAb(山羊)抗人IgG、F(ab)2特异性抗体(Jackson ImmunoResearch)使用标准胺偶联程序在垂直方向上偶联：所有六个配体通道均用EDC(200mM)和磺基-NHS(50mM)的混合物活化5分钟。表面活化后，立即将pAb(山羊)抗人IgG、F(ab)2特异性抗体(50μg/ml，10mM乙酸钠，pH 5)注入所有六个通道5分钟。最后，通过5分钟注射1M乙醇胺-HCl(pH 8.5)阻断通道。所有通道的最终固定水平相似，范围从10000到11500RU。将从大肠杆菌上清液中捕获的Fab抗体通过沿单独水平通道中的五个同时注射(30μl/min)5分钟，并产生200至900RU的范围的水平，具体取决于上清液中Fab的浓度。将条件培养基沿第六个通道注射，以提供“在线”空白供双重参考目的。将HLA-A2/MAGEp230-239或HLA-A2/WT1RMF(100、50、25、12.5、6.25、0nM、50μl/min)的稀释系列通过沿垂直通道注射2分钟进行一次性动力学测量。监测解离3分钟。在ProteOn Manager v.2.1中分析动力学数据。反应点数据的处理涉及使用在线缓冲空白应用点间参考和双重参考步骤(Myszka,J MolRecognit(1999)12,279-284)。将来自重复单次注射的过程数据拟合简单的1:1Langmuir粘合模型，没有质量传递(O'Shannessy等人，Anal Biochem(1993)212,457-468)。
对于48孔格式的HEK产生上清液中的IgG测量，将从HEK293上清液中捕获的IgG变体通过沿单独完整水平通道中的五个同时注射(30μl/min)5分钟，产生200至400RU的范围的水平。将条件培养基沿第六个通道注射，以提供“在线”空白供双重参考目的。将HLA-A2/MAGEp230-239或HLA-A2/WT1RMF(100、50、25、12.5、6.25、0nM、50μl/min)的稀释系列通过沿垂直通道注射3分钟进行一次性动力学测量。监测解离5分钟。如上所述分析动力学数据。
基于结合谱和测量的与抗原结合的特异性，结合剂被列入候选名单并在功能测定中进行测量。
所有选择的结合剂(007A09、007D10、057B04、057D03、032G09、034F05)的序列在本文包括的序列表中提供并总结在下表1中。
表1.所选HLA-A2/MAGE-A4结合剂的氨基酸序列。
Figure BDA0003698550180001401
实例2.HLA-A2/MAGE-A4 IgG和HLA-A2/MAGE-A4 CD3 T细胞双特异性(TCB)抗体的制备
CD3双特异性抗体在本文中也称为“T细胞双特异性抗体”、“TCB抗体”或“TCB”。本实例中制备的双特异性抗体的示意图于图2中给出。
作为CD3结合剂，使用抗体CH2527或抗体V9。这些结合物的序列在本文包括的序列表中提供并且总结在下表2中。
表2.CD3结合剂的氨基酸序列。
Figure BDA0003698550180001402
TCB抗体的示例性序列在SEQ ID NO 67、69、70和71(分子D)和SEQ ID NO 68、69、70和72(分子R)中给出。使用相应HLA-A2/MAGE-A4结合剂的VH和VL序列以类似方式构建其他TCB抗体。
作为对照，制备了WO 2016/199141中描述的基于结合剂“C106B9”的HLA-A2/MAGE-A4 IgG抗体和TCB抗体。该结合剂的VH和VL区序列分别显示在SEQ ID NO 49和50中。
下表3显示了产生的IgG和TCB抗体分子，以及这些分子在本文中使用的命名法。
表3.产生的IgG和TCB抗体分子的概述及其在本文中使用的命名法。
Figure BDA0003698550180001411
一般方法和工具
重组DNA技术使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook,J.等人，Molecularcloning:A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold springHarbor,New York,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下参考文献中给出：Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH PublicationNo 91-3242。
DNA测序通过双链测序确定DNA序列。
基因合成在需要时，通过使用适当模板进行PCR生成所需的基因区段，或在Geneart AG(Regensburg,Germany)处通过自动化基因合成从合成寡核苷酸和PCR产物合成所需的基因区段。将侧接有单个限制性内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化出质粒DNA，并通过紫外光谱法确定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有合适限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计有5’端DNA序列，该序列编码前导肽，该前导肽靶向真核细胞分泌的蛋白。
IgG和TCB抗体的产生
使用常规克隆技术将编码HLA-A2/MAGE-A4结合剂(以及，适用情况下，CD3结合剂)的可变重链和轻链区的DNA序列克隆到哺乳动物表达载体中。
通过瞬时转染HEK293 EBNA细胞或CHO EBNA细胞，形成IgG和TCB抗体。对细胞进行离心，然后用经过预热的CD CHO培养基(Thermo Fisher，#10743029)代替原培养基。将表达载体在CD CHO培养基中混合，添加聚乙烯亚胺(PEI；Polysciences，#23966-1)，并将溶液涡旋混合，并且在室温孵育10分钟。然后，将细胞(2mio/ml)与载体/PEI溶液混合，将其转移至烧瓶中，并且置于振荡培养箱中，在5％CO2的气氛下于37℃孵育3小时。孵育后，加入含有补充剂(占总体积的80％)的Excell培养基(W.Zhou和A.Kantardjieff，Mammalian CellCultures for Biologics Manufacturing，DOI：10.1007/978-3-642-54050-9；2014)。转染后1天，加入补充剂(饲料，占总体积的12％)。7天后，通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用如下所示的标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
替代地，本文所述的IgG和TCB抗体由Evitria(Schlieren,Switzerland)使用其专有的载体系统通过常规的(基于非PCR)克隆技术并且使用悬浮液适应的CHO K1细胞(最初接收自ATCC，并且适于在Evitria的悬浮液培养物中进行无血清生长)制备。在生产过程中，Evitria使用了其专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
IgG和TCB抗体的纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白。简言之，利用蛋白A亲和色谱法(平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH 7.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH3.0)从细胞培养上清液中纯化含Fc的蛋白质。在pH 3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(Millipore
Figure BDA0003698550180001421
ULTRA-15，#UFC903096)浓缩蛋白质，并且通过尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。
IgG和TCB抗体的分析
通过测量280nm处的吸光度来测定纯化的蛋白质的浓度，其中根据Pace等人(Protein Science,1995,4,2411-1423)所述的方法，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII或LabChip GX Touch(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。使用在运行缓冲液(200mMKH2PO4，250mM KCl pH 6.2，0.02％NaN3)中平衡的分析尺寸排阻柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000,Tosoh Bioscience)在25℃通过HPLC色谱进行聚集含量的确定。
所有分子的最终质量都非常好，在CE-SDS上的几乎100％的单体含量和100％的纯度。
实施例3.HLA-A2/MAGE-A4抗体的亲和力分析
为了测定HLA-A2/MAGE-A4抗体对HLA-A2/MAGE-A4p230-239的亲和力，在BiacoreT200上以HBS-EP+作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20(GE Healthcare，#BR-1006-69))在25℃进行表面等离子体共振(SPR)实验。抗人Fc特异性抗体(GE Healthcare，#BR-1008-39)通过胺偶联直接固定在CM5芯片(GE Healthcare)上。HLA-A2/MAGE-A4抗体在2.5nM下被捕获60秒。将HLA-A2/MAGE-A4p230-239复合物在HBS-EP(6.17至1500nM)中的三倍稀释系列以30μl/min的速度通过配体240秒以记录缔合阶段。监测解离阶段持续240s，并通过从样品溶液切换到HBS-EP+来触发。每次循环后，使用3MMgCl2以10μl/min的速度注射30秒，使芯片表面再生。通过减去在含有抗人Fc抗体但没有在其上捕获HLA-A2/MAGE-A4抗体的参考流动池上获得的响应来校正本体折射率差异。亲和常数是通过使用BIAeval软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合由动力学速率常数得出的。以独立稀释系列的三个平行进行测量。
对于所有测试的分子(分子H、I、J、K、L和M(所有IgG抗体)和分子R(TCB抗体))，1:1Langmuir结合的动力学常数总结在表4中。
所有测试的HLA-A2/MAGE-A4抗体以两位数的纳摩尔(单价)亲和力与HLA-A2/MAGE-A4p230-239结合，并在从IgG转换为双特异性形式时保持相同的亲和力(如分子K和R所示)。
表4.由SPR确定的选择的HLA-A2/MAGE-A4 IgG和HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体对HLA-A2/MAGE-A4p230-239的亲和力数据汇总。
Figure BDA0003698550180001441
实例4.HLA-A2/MAGE-A4 CD3 T细胞双特异性(TCB)抗体诱导的T细胞介导的肽脉冲的T2细胞裂解
在肽脉冲的T2细胞上评估了由不同HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体介导的T细胞杀伤。人PBMC用作效应子，在与双特异性抗体孵育24小时时检测到杀伤作用。
收获T2细胞、洗涤并用0.8μM的MAGE-A4 p230-239肽(GVYDGREHTV，SEQ ID NO:73)或不相关的肽(NY-ESO1 p157-165:SLLMWITQC,SEQ ID NO:85)在37℃脉冲2小时。在PBS中进行一个洗涤步骤后，使用平底96孔板以30 000个细胞/孔的密度接种肽脉冲靶细胞。
通过对从健康人类供体获得的肝素化血液的富集的淋巴细胞制剂进行Histopaque密度离心制备外周血单核细胞(PBMC)。用无菌PBS稀释新鲜血液，并在Histopaque梯度(Sigma,#H8889)上分层。离心分离(450x g，30分钟，室温)后，丢弃含PBMC间期以上的血浆，并将PBMC转移到新的falcon管中，随后用50ml PBS填充。将混合物离心分离(400x g，10分钟，室温)，弃去上清液，并且用无菌PBS洗涤PBMC沉淀球粒两次(离心分离步骤350x g，10分钟)。产生的PBMC群被自动计数(ViCell)并储存在37℃、5％CO2的细胞培养箱中的含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom,#K0302)的RPMI1640培养基中，直至进一步使用(不超过24小时)。
对于杀伤测定，以指定的浓度添加抗体(三个平行的范围为0.02pM–50nM)。将PBMC添加到靶细胞中以获得10:1的最终E:T比率。在37℃、5％CO2下孵育24小时后，通过定量凋亡/坏死细胞释放到细胞上清液中的LDH(LDH检测试剂盒，Roche Applied Science，#11644 793001)来评估靶细胞杀伤。通过用1％Triton X-100孵育靶细胞来实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与效应细胞共孵育的靶细胞，而没有双特异性构建体。
如图3所示，所有评估的HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体在孵育24小时后诱导MAGE-A4肽脉冲的T2细胞的杀伤。HLA-A2/MAGE-A4 CD3TCB抗体排名如下：分子D>分子A＝分子F>分子E≥分子C＝分子B。
使用GraphPadPrism6计算肿瘤细胞裂解的相应EC50值，并在表5中给出。
表5.由指定的HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体诱导的T细胞介导的MAGE-A4肽脉冲的T2细胞裂解的EC50值(pM)。
TCB抗体 EC50[pM]24h
分子A 1.2
分子B 72.8
分子C 120.9
分子D 0.2
分子E 32.7
分子F 1.5
实施例5.肽脉冲的T2细胞上的HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体诱导的Jurkat细胞活化(Jurkat-NFAT活化测定)
使用T2细胞(用MAGE-A4 p230-239肽(GVYDGREHTV)或无关肽(NY-ESO1 p157-165:(SLLMWITQC)脉冲)和Jurkat-NFAT报告细胞(一种带有NFAT启动子的表达CD3的人急性淋巴性白血病报告细胞系，GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega#CS176501)共培养评估HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体在同时结合细胞上的CD3和HLA-A2/MAGE-A4肽MHC(pMHC)复合物时诱导CD3介导的Jurkat-NFAT效应细胞活化的能力。当TCB抗体同时与MAGE-A4肽脉冲的T2细胞和CD3抗原(在Jurkat-NFAT报告细胞上表达)上的HLA-A2/MAGE-A4结合时，NFAT启动子被活化并导致活性萤火虫荧光素酶的表达。发光信号的强度(在添加荧光素酶底物后获得)与CD3活化和信号传导的强度成正比。
对于该测定，收获T2细胞、洗涤并用0.8μM的(MAGE-A4 p230-239肽(GVYDGREHTV))或不相关的肽(NY-ESO1 p157-165:(SLLMWITQC))脉冲。以8000个细胞/孔接种在平底白壁384孔板(Falcon，#353963)中，并添加稀释的抗体或培养基(范围为0.1pM–100nM)。
随后，收获Jurkat-NFAT报告细胞并使用ViCell评估活力。将细胞重新悬浮在细胞培养基中并添加到肿瘤细胞中以获得2.5:1的最终E:T，如所示，最终体积为30μl/孔。将细胞在湿润培养箱中于37℃孵育6小时。在孵育时间结束时，将10μl/孔的ONE-Glo溶液(Promega；每孔1:4ONE-Glo和测定培养基体积)添加到孔中，并在室温避光孵育10分钟。使用WALLAC Victor3 ELISA检测仪(PerkinElmer2030)检测发光，检测时间为1秒/孔。
如图4所示，所有评估的HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体经由CD3诱导T细胞交联，并随后在与用MAGE-A4肽脉冲的T2细胞一起孵育时诱导T细胞活化。考虑到EC50以及诱导的总体活化水平两者，HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体的排名如下：分子D>分子A＝分子F>分子C>分子E>分子B。
使用GraphPadPrism6计算Jurkat活化的相应EC50值，并在表6中给出。
表6.HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体介导的Jurkat-NFAT报告细胞活化的EC50值(pM)，孵育6小时后通过发光测量。
TCB抗体 EC50[pM]
分子A 30.3
分子B n.c.(8309)
分子C 975.6
分子D 15.7
分子E 876.6
分子F 41.6
n.c.：曲线拟合不允许正确计算EC50
实施例6.HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体诱导的一组表达HLA-A2+MAGE-A4的肿瘤细胞系的T细胞介导的裂解
在一组表达HLA-A2+MAGE-A4肿瘤细胞系(NCI-H1755、NCI-H2023、IM-9、U266B1、A-375、UMUC-3、C-33A)中评估不同HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体介导的T细胞杀伤。包括HLA-A2+MAGE-A4-阴性细胞系MDA-MB-231作为阴性对照。如实例4中所述进行测定。
对于杀伤测定，以指定的浓度添加抗体(三个平行的范围为0.02pM–50nM)。
24小时后的结果(图5)显示所有HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体都能够诱导表达HLA-A2+MAGE-A4的肿瘤细胞系的杀伤。不同的TCB抗体和不同的肿瘤细胞系之间的杀伤程度不同。NCI-H1755和IM-9细胞杀伤最佳。HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体分子A、D和F是测试的6种TCB抗体中最有效的。
使用GraphPadPrism6计算肿瘤细胞裂解的相应EC50值，并在表7中给出。
表7.由指定的HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体诱导的T细胞介导的各种HLA-A2+MAGE-A4+肿瘤细胞系裂解的EC50值(pM)。
Figure BDA0003698550180001471
实施例7.HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体诱导的一组HLA-A2+MAGE-A4-阴性肿瘤细胞系的T细胞介导的肿瘤裂解
在一组HLA-A2+MAGE-A4-阴性肿瘤细胞系(MDA-MA-231、SKM-1、SW-480、Colo-205、HCT-116、SW-620、Saos-2、L363)中评估不同HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体介导的T细胞杀伤。包括HLA-A2+MAGE-A4-阳性细胞系NCI-H1755作为阳性对照。如实例4中所述进行测定。
对于杀伤测定，以指定的浓度添加抗体(三个平行的范围为0.02pM–50nM)。
24小时后的结果(图6)显示没有一种HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体诱导HLA-A2+MAGE-A4阴性肿瘤细胞的杀伤。与单独的HLA-A2相比，所有测试的TCB都显示出选择性，并且在没有MAGE-A4表达的情况下不会诱导靶细胞杀伤。
实施例8.通过丙氨酸扫描测定确定选择的HLA-A2/MAGE-A4 CD3TCB的结合残基
为了通过我们的TCB抗体表征MAGE-A4肽的潜在结合基序，我们使用源自天然序列的肽通过用丙氨酸单独替换每个氨基酸来建立丙氨酸扫描测定，并测量用这些肽脉冲的T2细胞的NFAT报告信号。
对于该测定，收获T2细胞、洗涤并用0.8μM的MAGE-A4 p230-239肽(GVYDGREHTV)或丙氨酸替代肽脉冲。以20 000个细胞/孔接种在平底白壁96孔板(Greiner Bio-One，#655098)中，并添加稀释的抗体或培养基(用于对照)。随后，收获Jurkat-NFAT报告细胞并使用ViCell评估活力。将细胞重新悬浮在细胞培养基中并添加到肿瘤细胞中以获得5:1的最终E:T，如所示，最终体积为100μl/孔。将细胞在湿润培养箱中于37℃孵育6小时。在孵育时间结束时，将100μl/孔的ONE-Glo溶液(Promega；每孔1:1ONE-Glo和测定培养基体积)添加到孔中，并在室温避光孵育10分钟。使用WALLAC Victor3 ELISA检测仪(PerkinElmer2030)检测发光，检测时间为5秒/孔。
使用GraphPadPrism6计算NFAT报告信号的EC50值，并在图7A中给出。此外，计算了EC50相对于天然肽EC50的倍数变化，且≥5的倍数变化被认为是显著的(图7B)。
丙氨酸扫描结果显示TCB抗体对MAGE-A4肽的不同结合基序。
实施例9.肽脉冲的T2细胞上不同MAGE-A4 CD3 TCB抗体的预测脱靶肽(POTP)评估(Jurkat-NFAT活化测定)
使用T2细胞(用MAGE-A4 p230-239肽(GVYDGREHTV)或33种预测的脱靶肽之一(图8)脉冲)和Jurkat-NFAT报告细胞(一种带有NFAT启动子的表达CD3的人急性淋巴性白血病报告细胞系，GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega#CS176501)共培养评估HLA-A2/MAGE-A4CD3 TCB抗体在同时结合细胞上的CD3和HLA-A2/MAGE-A4肽MHC(pMHC)复合物时诱导CD3介导的Jurkat-NFAT细胞活化的能力。当TCB抗体同时与MAGE-A4肽脉冲的T2细胞和CD3抗原(在Jurkat-NFAT报告细胞上表达)上的HLA-A2/MAGE-A4复合物结合时，NFAT启动子被活化并导致活性萤火虫荧光素酶的表达。发光信号的强度(在添加荧光素酶底物后获得)与CD3活化和信号传导的强度成正比。
对于该测定，收获T2细胞、洗涤并使用96孔板用10μM MAGE-A4p230-239肽(GVYDGREHTV)或POTP在37℃脉冲2h(以1mio细胞/ml)。洗涤脉冲的T2细胞并以0.4mio细胞/ml的浓度转移至96深孔板中，板中含有2％FCS、1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，#K0302)和1％青霉素-链霉素(Sigma，#P4333)(自动化培养基)的RPMI1640培养基中。
随后，收获Jurkat-NFAT报告细胞并使用ViCell评估活力。将细胞以1mio/ml的浓度重新悬浮在自动化培养基中，以在最终测定板中获得2.5:1的E:T比率。
HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体在自动化培养基中稀释以获得10nM的最终测定浓度，并在4℃储存直至使用。
使用TECAN EVO 200平台以自动化方式运行以下步骤：
将肽脉冲的T2细胞、Jurkat-NFAT报告细胞和MAGE-A4 CD3 TCB抗体添加到平底白壁384孔板(Falcon,#353963)，并在湿润培养箱中于37℃孵育16h。在孵育时间结束时，添加20μl/孔的ONE-Glo溶液(Promega；用测定培养基按1:2稀释)，并将混合物在室温避光孵育10分钟。使用Tecan Spark检测仪检测发光，检测时间为0.5秒/孔。
将得到的Jurkat-NFAT报告细胞活化信号测量为量化的相对光单位，以每秒计数(CPS信号)。POTP信号与MAGE-A4诱导信号的百分比计算如下：(CPS[POTP]–CPS[未脉冲的细胞])/(CPS[MAGE-A4]–CPS[未脉冲的细胞])*100。与用MAGE-A4肽脉冲的T2细胞诱导的100％相比，诱导高于2％的信号的POTP被定义为相关并考虑进一步评估。
如图8所示，除分子C外，所有评估的HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体均在与Jurkat-NFAT报告细胞上的CD3和用所示POTP脉冲的T2细胞上的pMHC同时结合时诱导T细胞活化。分子C仅在用MAGE-A4肽脉冲的T2细胞存在时才诱导Jurkat-NFAT报告细胞活化，但在用任何指定的POTP脉冲的T2细胞存在时不诱导，这显示出高水平的特异性。然而，先前的肿瘤细胞裂解实验仅显示出相当差的体外抗肿瘤功效(参见图5)。
因此，选择分子D进行进一步评估，基于其相对于安全性谱的有利的效力(参见图5)，显示仅在存在用肽脉冲的T2细胞存在时Jurkat活化，在高风险器官(诸如肺和心)上没有广泛表达。
接下来，将POTP组扩展到503个肽(SEQ ID NO 86-589)，并且在如上所述脉冲的T2细胞存在下在类似的Jurkat-NFAT报告细胞测定中评估分子D。图9将得到的Jurkat-NFAT报告细胞活化信号总结为POTP信号与MAGE-A4诱导信号的百分比，其中POTP诱导高于2％的信号。
在Jurkat NFAT测定中使用用相应肽脉冲的T2证明了诱导信号高于2％的POTP。如实例4中所述进行测定。大多数先前鉴定的肽可以被证明为脱靶(图10)。然而，在MAGE-A4靶肽和测试的POTP之间有一个明确的治疗窗口。使用GraphPadPrism6计算HLA-A2/MAGE-A4CD3 TCB抗体介导的Jurkat-NFAT报告细胞活化的相应EC50值，并在表8中给出。
表8.HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体介导的Jurkat-NFAT报告细胞活化的EC50值(nM)，通过发光测量。
Figure BDA0003698550180001501
Figure BDA0003698550180001511
MAGE-A8衍生肽仅显示10倍的治疗窗口，这可以通过MAGE-A8衍生肽(GLYDGREHSV)和MAGE-A4靶肽(GVYDGREHTV)的强同源性来解释。然而，没有一个确定的POTP在高风险器官中广泛表达。这清楚地表明了分子D保持良好的安全性。
使用与上述类似的测定设置来分析分子G的特异性。在Jurkat-NFAT报告细胞测定中评估了503个POTP的扩展组，其中存在用10μM的MAGE-A4 p230-239肽(GVYDGREHTV)脉冲的T2细胞或指定的POTP。图11描绘了POTP信号与MAGE-A4诱导信号的百分比，与用MAGE-A4肽脉冲的T2细胞诱导的100％相比，POTP诱导高于2％的信号。一些经过验证的POTP(TPC、RBBP5和RENT1)显示出相当广泛的表达谱，表明需要进行更深入的风险评估来判断潜在的相关安全风险。因此可以预期，与包含在分子G中包括的HLA-A2/MAGE-A4结合剂的类似分子相比，包含在分子D中的HLA-A2/MAGE-A4结合剂的分子将具有更好的治疗窗/安全性谱。
实施例10.肽脉冲的T2细胞上的HLA-A2/MAGE-A4 IgG诱导的Jurkat细胞活化(PGLALA-CAR-J活化测定)
如下所述评估IgG形式的HLA-A2/MAGE-A4结合剂活化PGLALA-CAR-J效应细胞的能力。将T2细胞用MAGE-A4 p230-239肽(GVYDGREHTV)脉冲，并与抗PGLALA-CAR-J效应细胞(表达直接针对IgG分子的Fc部分中的PGLALA(P329G L234A L235A(EU编号))突变的嵌合抗原受体(CAR)并含有NFAT启动子的Jurkat-NFAT人急性淋巴性白血病报告细胞系)共培养，参见PCT公开号WO 2019/122046(通过引用以其全文并入本文)。当IgG分子同时与MAGE-A4肽脉冲的T2细胞和PGLALA-CAR-J细胞上的HLA-A2/MAGE-A4结合时，NFAT启动子被活化并导致活性萤火虫荧光素酶的表达。
对于该测定，收获T2细胞、洗涤并用10μM的MAGE-A4 p230-239肽(GVYDGREHTV)脉冲。同时，收获HLA-A2+/MAGE-A4-MDA-MB-231细胞并接种。以8000个细胞/孔接种在平底白壁384孔板(Falcon，#353963)中，并添加稀释的抗体或培养基(范围为0.01pM–10nM)。
随后，收获PGLALA-CAR-J报告细胞并使用ViCell评估活力。将细胞重新悬浮在细胞培养基中并添加到肿瘤细胞中以获得2.5:1的最终E:T，如所示，最终体积为30μl/孔。将细胞在湿润培养箱中于37℃孵育16小时。在孵育时间结束时，将10μl/孔的ONE-Glo溶液(Promega；每孔1:4ONE-Glo和测定培养基体积)添加到孔中，并在室温避光孵育10分钟。使用Tecan Spark检测仪检测发光，检测时间为0.5秒/孔。
如图12所示，所有评估的HLA-A2/MAGE-A4 IgG在同时与PGLALA-CAR-J和用MAGE-A4肽脉冲的T2细胞结合时诱导CAR-J活化。在MAGE-A4阴性MDA-MB231细胞上没有观察到CAR-J活化，表明在没有MAGE-A4肽的情况下，测试的IgG对HLA-A2没有交叉反应性。就效力而言，由EC50值(表9)以及信号的最大幅度确定，分子H和分子K是测试IgG中最有效的。
表9.在MAGE-A4肽脉冲的T2细胞存在下，由所示IgG诱导的PGLALA-CAR-J细胞活化的EC50值(pM)。
Figure BDA0003698550180001521
实施例11.HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体诱导的一组HLA-A2+MAGE-A4+肿瘤细胞系的T细胞介导的肿瘤裂解
在一组HLA-A2+MAGE-A4+肿瘤细胞系(UM-UC3、A375、NCI-H2013)中评估含有不同HLA-A2/MAGE-A4结合剂和不同CD3结合剂的HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体介导的T细胞杀伤。如实例4中所述进行测定。
对于杀伤测定，以指定的浓度添加抗体(三个平行的范围为1pM–50nM)。
48小时后的结果(图13)表明，在含有不同HLA-A2/MAGE-A4结合剂(分子D相对于G和分子R相对于U)的两种TCB抗体之间，TCB诱导的靶细胞裂解没有差异。
与含有CH2527(分子D和G)的TCB相比，含有V9作为CD3结合剂的两种TCB抗体(分子R和U)中的靶细胞裂解增加。
使用GraphPadPrism6计算肿瘤细胞裂解的相应EC50值，并在表10中给出。
表10.由指定的HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体诱导的T细胞介导的各种HLA-A2+MAGE-A4+肿瘤细胞系裂解的EC50值(nM)。
Figure BDA0003698550180001531
实例12.HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体(分子R)在表达HLA-A2+MAGE-A4的A375细胞、工程化以过表达HLA-A2的A375细胞以及具有MAGE-A4敲除的A375细胞上诱导的T细胞介导的肿瘤裂解和细胞因子释放
在表达不同水平HLA-A2/MAGE-A4肽MHC(pMHC)复合物的A375细胞(A375细胞、基因工程化(使用慢病毒)以过表达HLA-A2的A375细胞以及具有MAGE-A4敲除的A375细胞(经由CRISPR-Cas9生成)上评估分子R的T细胞杀伤。
经由不同A375细胞的MHC相关肽蛋白质组学(MAPPS)检测到的MAGE-A4/HLA-A2pMHC拷贝数显示在表11中。
表11.经由MHC相关肽蛋白质组学(MAPPS)检测到的MAGE-A4/HLA-A2 pMHC拷贝数。
Figure BDA0003698550180001532
如实例4中所述进行测定。对于杀伤测定，以指定的浓度添加分子R(三个平行的范围为1pM–50nM)。
24小时后的结果(图14)表明，分子R能够诱导A375细胞的杀伤，但对具有HLA-A2过表达的A375细胞的杀伤程度要强得多。具有MAGE-A4敲除的A375细胞没有被杀伤，因为它们由于缺乏MAGE-A4表达而没有呈现靶标pMHC复合物。
使用GraphPadPrism6计算肿瘤细胞裂解的相应EC50值，并在表12中给出。
表12.由分子R诱导的T细胞介导的A375和过表达HLA-A2的A375裂解的EC50值(pM)。
Figure BDA0003698550180001541
24和48小时后，收集上清液用于随后经由Luminex测定(Human CustomProcartaPlex 7-plex；Thermo Fisher Scientific；#PPX-07-MXFVK4Y)分析细胞因子TNFα和IFNγ。根据制造说明书执行测定。
图15描绘了与1.4nM分子R一起孵育24小时后的IFNγ释放和48小时后的TNFα释放。在A375 HLA-A2过表达细胞上，分子R介导的杀伤后两种细胞因子的释放都强烈增加，这表明IFNγ和TNFα的释放与MAGE-A4/HLA-A2 pMHC复合物表达水平相关。在A375 MAGE-A4敲除细胞上未观察到细胞因子释放。
实施例13.用HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体(分子R)治疗时的肿瘤细胞生长
I为了监测用不同浓度的分子R处理后的肿瘤细胞生长，将不同HLA-A2+/MAGE-A4+细胞系(A375、NCI-H1755、ScaBer、UM-UC3、NCI-H2023、NCI-H1703)用Essen CellPlayerNucLight Red Lentivirus(Essenbioscience,#4476；EF1α,puromycin)转导以稳定表达限制在细胞核内的NucLight Red荧光蛋白。随着时间的推移，每孔的定量允许这种对肿瘤细胞裂解或增殖的实时评估。
如实例4所述，从健康志愿者的血液中分离出效应细胞(PBMC)。
使用细胞解离缓冲液(Invitrogen,#13151-014)收获HLA-A2+/MAGE-A4+NucLight红细胞(A375,NCI-H1755,ScaBer,UM-UC3,NCI-H2023,NCI-H1703)并以15×103个细胞/孔(A375,UM-UC3,NCI-H2023,NCI-H1703)、5×103个细胞/孔(ScaBer)或25×103个细胞/孔(NCI-H1755)的密度在细胞培养基中在无菌96孔平底粘附组织培养板(TPP,#92096)中铺板在37℃和5％CO2的培养箱中过夜。以指定的浓度添加分子R(三个平行的范围为1pM–50nM)。将PBMC作为效应细胞以5:1的E:T比率添加到每个孔中。
在37℃和5％CO2条件下，使用
Figure BDA0003698550180001551
Zoom System(Essenbioscience，HD相位对比，红色荧光，10x物镜)以3小时的间隔通过荧光显微镜高含量影像监测板长达96小时。使用IncucyteZoom软件对健康肿瘤细胞的数量(计数(每张图像))进行定量，以监测肿瘤细胞的生长。将各个时间点和条件的值相对于使用的TCB浓度作图，以分析对T细胞溶细胞潜能的影响。
图16显示分子R可以抑制HLA-A2+/MAGE-A4+肿瘤细胞系的肿瘤生长。肿瘤生长抑制程度以及有效浓度在不同细胞系之间存在差异，这可以通过不同的HLA-A2/MAGE-A4 pMHC复合物表达水平以及癌细胞系的不同来源来解释。
实施例14.在人源化小鼠的IM-9异种移植物中使用HLA-A2/MAGE-A4 CD3 TCB抗体(分子R)进行剂量发现功效研究
本实例描述的功效研究旨在了解在完全人源化的NSG小鼠中，分子R在肿瘤消退和Immuno-PD方面的形式剂量依赖性疗效。
人IM-9细胞(人多发性骨髓瘤)最初获自DMSZ，并且扩增后保藏在Roche Glycart内部细胞库。将细胞在RPMI 1640+10％FCS+1％Glutamax+10mM HEPES+1mM丙酮酸钠中于37℃在5％CO2的水饱和气氛中培养。体外传代12用于皮下注射，存活率为98％。
将混合有50微升Matrigel的50微升肿瘤细胞悬液用22G至30G针头皮下注射到麻醉小鼠的侧面。
根据规定指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，将实验开始时为4-5周龄的雌性NSG小鼠(Jackson实验室)维持在不含特定病原体的条件下，日循环为12h光照/12h黑暗。实验研究方案经过地方政府的审查和批准(P 2011/128)。到达之后，将动物维持一周以适应新环境并进行观察。定期进行连续健康状态监测。
对雌性NSG小鼠i.p.注射15mg/kg的白消安，接着在一天后i.v.注射从脐带血中分离的1×105个人造血干细胞。在干细胞注射后第14-16周，对小鼠进行舌下放血并且通过流式细胞术针对成功的人源化对血液进行分析。将有效移植的小鼠根据它们的人T细胞频率随机化为不同的处理组。当时，小鼠如上所述注射肿瘤细胞，当肿瘤大小达到约200mm3时，每周用不同剂量的分子或媒介物处理一次(第7天)(图17)。静脉注射应用，注射体积为200μl。使用卡尺每周测量肿瘤生长两次，并按下式计算肿瘤体积：
Tv：(W2/2)×L(W：宽度，L：长度)
在研究的第15天，每组处死四只观测小鼠，取出肿瘤，称重，用PFA固定过夜并包埋在石蜡中进行组织学评估。肿瘤载玻片用抗小鼠CD3抗体染色，以评估所有组中的肿瘤内T细胞频率。在研究第28天，研究终止。
图18显示了所有组中的肿瘤生长动力学(平均值，+/-SEM)以及每只小鼠的个体肿瘤生长。分子R作为单一药剂的所有剂量均诱导肿瘤生长抑制。测试的最低剂量(0.1mg/kg)显示出更不均匀的抑制，因为两只小鼠从低剂量治疗中逃脱。对观测动物肿瘤中人T细胞浸润的分析(图19)揭示了与媒介物相比，所有组中肿瘤中T细胞频率的良好增加，然而，剂量之间没有观察到差异。
***
尽管为了清楚理解的目的既往已经通过说明和实例相当详细地描述了发明，但是所述说明和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容的全部内容以引用方式明确地并入。
序列表
<110> 豪夫迈•罗氏有限公司
<120> 与HLA-A2/MAGE-A4 结合的抗体
<130> P35782
<150> EP 19217463.9
<151> 2019-12-18
<160> 589
<170> PatentIn 3.5 版
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Gly
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 35
Ser Ser Tyr Glu Ala Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 36
Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 37
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 38
Asn Ser Arg Gln Ser Ser Tyr Tyr His His Ile Val
1 5 10
<210> 39
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 39
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Tyr Glu Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 40
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Gln Ser Ser Tyr Tyr His
85 90 95
His Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 41
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 42
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 43
Val Ser Tyr Glu Ser Phe Asp Tyr
1 5
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 44
Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 46
Asn Ser Arg Met Ser Ser Arg Tyr His His Asp Val
1 5 10
<210> 47
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 47
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Glu Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 48
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Ser Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Met Ser Ser Arg Tyr His
85 90 95
His Asp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 49
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 49
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Glu Val Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala His Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Asn Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 50
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val Asp Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Phe Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 51
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 52
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 52
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 53
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 54
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 54
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 55
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 56
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 57
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 57
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 58
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 58
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 59
Gly Tyr Thr Met Asn
1 5
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 60
Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 61
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 61
Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 62
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 63
Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 64
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 65
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 66
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 66
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 67
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 67
Ala Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Tyr Phe Ser Phe Lys Ala Met
20 25 30
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Ser
35 40 45
Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Asp Asn Val Leu Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
85 90 95
Asp Val Gly Phe Phe Asp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val
225 230 235 240
Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala
245 250 255
Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln
260 265 270
Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr
275 280 285
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr
290 295 300
Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu
305 310 315 320
Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
325 330 335
Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
340 345 350
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
355 360 365
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
370 375 380
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
405 410 415
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
420 425 430
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
435 440 445
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
450 455 460
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
465 470 475 480
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
485 490 495
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
500 505 510
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
515 520 525
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
530 535 540
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
545 550 555 560
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys
565 570 575
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
580 585 590
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
595 600 605
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
610 615 620
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
625 630 635 640
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
645 650 655
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
660 665
<210> 68
<211> 665
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 68
Ala Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Tyr Phe Ser Phe Lys Ala Met
20 25 30
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Ser
35 40 45
Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Asp Asn Val Leu Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
85 90 95
Asp Val Gly Phe Phe Asp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
225 230 235 240
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
245 250 255
Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
260 265 270
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
275 280 285
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser
290 295 300
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn
305 310 315 320
Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
325 330 335
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
340 345 350
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
355 360 365
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
370 375 380
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
405 410 415
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
420 425 430
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
435 440 445
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
450 455 460
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
465 470 475 480
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
485 490 495
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
500 505 510
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
515 520 525
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
530 535 540
Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
545 550 555 560
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp
565 570 575
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
580 585 590
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
595 600 605
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
610 615 620
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
625 630 635 640
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
645 650 655
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
660 665
<210> 69
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 69
Ala Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Tyr Phe Ser Phe Lys Ala Met
20 25 30
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Ser
35 40 45
Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Asp Asn Val Leu Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
85 90 95
Asp Val Gly Phe Phe Asp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg
340 345 350
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440
<210> 70
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 70
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Asp Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 71
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 71
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 72
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro
115 120 125
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
130 135 140
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
145 150 155 160
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
165 170 175
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
195 200 205
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
210 215 220
Asn Arg Gly Glu Cys
225
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 73
Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val
1 5 10
<210> 74
<211> 317
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 74
Met Ser Ser Glu Gln Lys Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Val
1 5 10 15
Glu Ala Gln Glu Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Thr
20 25 30
Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Pro Leu Val Pro
35 40 45
Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Ala Gly Pro Pro Gln
50 55 60
Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Leu Pro Thr Thr Ile Ser Phe Thr Cys
65 70 75 80
Trp Arg Gln Pro Asn Glu Gly Ser Ser Ser Gln Glu Glu Glu Gly Pro
85 90 95
Ser Thr Ser Pro Asp Ala Glu Ser Leu Phe Arg Glu Ala Leu Ser Asn
100 105 110
Lys Val Asp Glu Leu Ala His Phe Leu Leu Arg Lys Tyr Arg Ala Lys
115 120 125
Glu Leu Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Glu Arg Val Ile Lys Asn Tyr
130 135 140
Lys Arg Cys Phe Pro Val Ile Phe Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu Lys
145 150 155 160
Met Ile Phe Gly Ile Asp Val Lys Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr
165 170 175
Tyr Thr Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly
180 185 190
Asn Asn Gln Ile Phe Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Gly
195 200 205
Thr Ile Ala Met Glu Gly Asp Ser Ala Ser Glu Glu Glu Ile Trp Glu
210 215 220
Glu Leu Gly Val Met Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val Tyr
225 230 235 240
Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gln Asp Trp Val Gln Glu Asn Tyr
245 250 255
Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asn Pro Ala Arg Tyr Glu Phe
260 265 270
Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu
275 280 285
Glu His Val Val Arg Val Asn Ala Arg Val Arg Ile Ala Tyr Pro Ser
290 295 300
Leu Arg Glu Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Glu Gly Val
305 310 315
<210> 75
<211> 275
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 75
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr
50 55 60
Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr
65 70 75 80
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln
85 90 95
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu
115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys
130 135 140
His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His
180 185 190
Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp Glu
275
<210> 76
<211> 186
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 76
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro
20 25 30
Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp
35 40 45
Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys
50 55 60
Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg
65 70 75 80
Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg
85 90 95
Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met Ser Val Ala Thr Ile
100 105 110
Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr
115 120 125
Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly
130 135 140
Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro
145 150 155 160
Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp
165 170 175
Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
180 185
<210> 77
<211> 177
<212> PRT
<213> 食蟹猕猴
<400> 77
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu
20 25 30
Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys Asn Lys Glu Asp Ser
35 40 45
Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly
50 55 60
Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His
65 70 75 80
His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp
85 90 95
Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Leu
100 105 110
Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys
115 120 125
Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly
130 135 140
Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro
145 150 155 160
Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg
165 170 175
Ile
<210> 78
<211> 225
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 78
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 79
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 79
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 80
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 80
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 81
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 81
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 82
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 83
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 84
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 85
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 86
Gly Leu Tyr Glu Gly Arg Ile Lys Gln Leu
1 5 10
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 87
Gly Met Ile Glu Ser Arg Asp Val Met Leu
1 5 10
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 88
Gly Leu Tyr Asp Gly Pro Val His Glu Val
1 5 10
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 89
Gly Met Tyr Asp Gly Pro Val Tyr Glu Val
1 5 10
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 90
Gly Leu Tyr Asp Gly Pro Val Cys Glu Val
1 5 10
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 91
Gly Leu Phe Asp Gly Pro Lys Pro Thr Val
1 5 10
<210> 92
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 92
Gly Leu Val Asp Gly Arg Tyr Ser Pro Val
1 5 10
<210> 93
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 93
Gly Leu Phe Asp Ala Arg Thr Ser Leu Val
1 5 10
<210> 94
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 94
Gly Met Tyr Asp Gly Pro Val Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 95
Gly Met Val Asp Ala Arg Ser Ile Pro Val
1 5 10
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 96
Gly Ile Ile Glu Ala Arg Phe Val Tyr Val
1 5 10
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 97
Gly Leu Trp Asp Ser Arg Met Glu Gly Leu
1 5 10
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 98
Gly Leu Ala Glu Gly Pro Trp Pro Ala Ala
1 5 10
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 99
Gly Met Phe Glu Ser Arg Trp Leu Asn Ile
1 5 10
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 100
Gly Thr Met Asp Gly Arg Ile Leu Gln Val
1 5 10
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 101
Gly Val Tyr Gln Gly Arg Val Ser Ala Val
1 5 10
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 102
Gly Val Tyr Ala Gly Arg Pro Leu Ser Val
1 5 10
<210> 103
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 103
Gly Val Ile Asp Gly His Ile Tyr Ala Val
1 5 10
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 104
Gly Leu Tyr Asp Gly Met Glu His Leu Ile
1 5 10
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 105
Gly Val Tyr Asp Gly Glu Glu His Ser Val
1 5 10
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 106
Gly Ile Tyr Asp Gly Ile Leu His Ser Ile
1 5 10
<210> 107
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 107
Gly Val Tyr Asp Val Arg Gln Ala Tyr Val
1 5 10
<210> 108
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 108
Gly Thr Ile Asp Gly Leu Glu Pro Gly Leu
1 5 10
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 109
Gly Leu Phe Glu Gly Asp Glu Tyr Ala Thr
1 5 10
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 110
Gly Leu Leu Glu Gly Arg Glu Gly Ala Leu
1 5 10
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 111
Gly Leu Ala Asp Gly Val Glu Asp Leu Leu
1 5 10
<210> 112
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 112
Gly Leu Phe Asp Gly Ala Glu Val Val Leu
1 5 10
<210> 113
<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Leu Tyr Glu Gly Leu Asp Trp Leu Ala
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Ile Val Glu Gly Leu Met Thr Thr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ala Leu Ala Glu Gly Leu Asp Ile Lys Leu
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Leu Asn Asp Gly Gln Trp His Glu Val
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Gly Leu Cys Asp Ile Ser Glu Gly Thr Val
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Gly Val Ala Asp Gly Val Ile Lys Ser Val
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Gly Val Ile Asn Gly Arg Lys Phe Gly Val
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Gly Val Tyr Asp Ser Ser Gly Ile Arg Val
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Gly Val Tyr Arg Ile Ile Leu His Arg Val
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Gly Val Gly Asp Met Val Met Ala Thr Val
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Gly Val Lys Asp Pro Asn Leu Trp Thr Val
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Gly Glu Tyr Asp Phe Arg Tyr Ile Phe Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 162
Gly Val Tyr Trp Ala Thr Gly Cys Thr Val
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<400> 163
Gly Val Leu Gly Gly Arg Val Cys Pro Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 164
Gly Thr Tyr Gln Gly Leu Thr Ala Thr Val
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Gly Leu Gly Leu Gly Arg Glu Val Gly Val
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Gly Val Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Val
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Arg Leu Lys Asp Gly Glu Glu Thr Thr Val
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Arg Val Tyr Glu Val Arg Glu Thr Ala Val
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<400> 170
Ser Val Ile Asp Gly Asp Glu Ala Gln Val
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<400> 171
Gly Ala Tyr Tyr Glu Pro Glu Gln Thr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 172
His Phe Tyr Asp Gly Ser Glu Ile Val Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 173
Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Glu Asp Thr Val
1 5 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 174
Val Tyr Ile Asp Pro Arg Glu His Tyr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 175
Gly Leu Gln Asp Gly Phe Gln Ile Thr Val
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Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 177
Gly Leu Ile Asp Gly Ala Glu Ser Tyr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 178
Gly Leu Tyr Gln Gly Tyr Gly Ser Thr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Met Glu Asp Ser Arg Phe Gln Asn Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Gln Phe Glu Gly Arg Ala Val Ala Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Phe Phe Asp Ala Arg Ala Leu Ala Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 184
Gly Phe Tyr Glu Ser Arg Gly Phe Cys Val
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Gly Leu Thr Asp Ser Arg Ala Leu Pro Leu
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Leu Ala Glu Gly Arg Phe Pro Pro Thr
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 187
Gly Thr Val Asp Ala Pro Asn Phe Ile Val
1 5 10
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 188
Gly Ala Phe Glu Gly Pro Arg Cys Glu Val
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 189
Gly Val Ala Glu Ser Pro Leu Pro Ala Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 190
Gly Ala Trp Glu Ala Pro Trp Cys Thr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Leu Ile Glu Ala Pro Glu His Ala Ala
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Leu Thr Asp Gly Pro Ala Arg Leu Leu
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Gly Leu Ala Asp Ser Arg Asp Ile Ser Leu
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 194
Gly Leu Ile Glu Gly Arg Ser Tyr Ile Phe
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Leu Phe Glu Gly Arg Ser Tyr Ile Phe
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<211> 10
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Gly Leu Ala Asp Gly Pro Pro Ser Ser Leu
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Leu Val Asp Ser Arg Leu Ala Leu Thr
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 198
Gly Met Glu Asp Ser Pro Asp Leu Leu Ala
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 199
Gly Leu Trp Asp Ser Pro Arg Ser His Ala
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Ile Ala Asp Ala Pro Leu Ser Pro Leu
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Leu Val Glu Ser Arg Tyr Trp Ser Ala
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Leu Glu Asp Ala Pro Pro Val Glu Leu
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 203
Gly Leu Glu Glu Gly Pro Ala Pro Val Leu
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 204
Gly Ser Tyr Glu Ala Pro Leu Pro Pro Gly
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 205
Gly Leu Trp Glu Ala Arg Arg Glu Ala Leu
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 206
Gly Leu Ala Glu Gly Pro Leu Cys Leu Asp
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 207
Gly Thr Cys Glu Ala Pro Val Ala Val Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 208
Gly Leu Glu Asp Ala Pro Gly Cys Phe Leu
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 209
Gly Leu Trp Glu Ala Arg Pro Arg Val Leu
1 5 10
<210> 210
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 210
Gly Leu Val Glu Ala Arg Asn Phe Pro Ala
1 5 10
<210> 211
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 211
Gly Leu Glu Glu Ser Pro Pro Asn Glu Leu
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 212
Gly Met Lys Glu Ser Pro Val Ile Pro Leu
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 213
Gly Leu Trp Glu Ala Pro Arg Gln Gly Gly
1 5 10
<210> 214
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 214
Gly Val Ser Asp Gly Arg Trp His Ser Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 215
Arg Val Tyr Asp Gly Arg Glu Ile Leu Thr
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 216
Gly Val Leu Asp Gly Arg Phe His Tyr Gly
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 217
Ala Val Leu Asp Gly Arg Glu Leu Arg Val
1 5 10
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 218
Gln Val Ile Asp Gly Arg Asn Val Thr Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 219
Arg Ser Phe Asp Gly Arg Glu Leu Leu Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 220
Ala Leu Leu Asp Gly Arg Asp Cys Thr Val
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ala Val Ser Asp Gly Arg His Met Phe Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Pro Leu Arg Asp Gly Arg Val Phe Thr Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Arg Leu Asp Asp Gly Arg Trp His Gln Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 224
Gly Val Met Leu Gly Ile Trp His Thr Val
1 5 10
<210> 225
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 225
Gly Val Tyr Ser Phe Arg Phe His Val Val
1 5 10
<210> 226
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Val Ser Asp Gly Gln Trp His Thr Val
1 5 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 227
Gly Leu Ser Asp Gly Gln Trp His Thr Val
1 5 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Val Ala Ala Gly Arg Phe His Thr Val
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Gly Val Ser Asp Gly Gln Leu Lys Thr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Val Ala Tyr Asp Gly Val Glu Ile Thr Val
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Arg Ser Phe Glu Gly Arg Glu Leu Leu Val
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Gly Met Phe Asp Gly Gly Glu Ser Ser Pro
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Gly Leu Glu Pro Gly Arg Asp Tyr Glu Val
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Gly Met Phe Asp Asn Arg Asp Val Ala Val
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Phe Ser Val Glu Gly Arg Glu Ile Pro Val
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Gly Thr Ile Asp Phe Arg Glu Phe Ile Ile
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Leu Val Asp Phe Arg Asp Val Ala Leu
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Gly Leu Thr Glu Leu Arg Glu Leu Ser Leu
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Gly Leu Ser Glu Gly Pro Glu Pro Ser Ile
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<400> 254
Cys Leu Ala Asp Gly Arg Glu Pro Gly Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Pro Met Ala Asp Gly Arg Glu Phe Asn Leu
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<400> 259
Ala Met Tyr Asp Ala Arg Glu Ala Ile Ile
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Gly Ser Phe Glu Gly Leu Glu Ser Leu Val
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Gly Leu Ala Asp Gly Ala Asp Leu Leu Gly
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Ile Leu Val Glu Gly Arg Glu Phe Pro Thr
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Gly Met Val Val Gly Arg Glu Leu Leu Ala
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Gly Ser Thr Asp Ile Pro Asp Trp Cys Val
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 269
Ala Val Phe Asp Ser Leu Glu Gly Phe Val
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ala Leu Ile Glu Val Pro Asp Gly Phe Thr
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ala Leu Tyr Asp His Leu Met Asp Phe Leu
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 272
Ala Met Val Asp Ala Leu Met Met Ala Tyr
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Ala Leu Val Glu Ser Pro Glu Ser Met Ile
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Ala Met Glu Asp Ala Leu Asp Glu Leu Ile
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Gly Met Thr Asp Ile Pro Asp Phe Leu Trp
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<211> 10
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Gly Leu Val Glu His Leu Glu Leu Leu Gln
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Ala Met Ala Asp Ile Leu Asp Ile Trp Ala
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Leu Ser
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<211> 10
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<400> 283
Ala Ile Thr Asp Gly Leu Glu Ile Val Val
1 5 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 284
Ala Gln Val Glu Ser Leu Glu Arg Glu Val
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 285
Ala Val His Asp Val Leu Asp Leu Tyr Leu
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 286
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 287
Ala Ala Phe Glu Ala Leu Met Asn Gly Val
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 288
Ala Ala Phe Glu Ala Leu Met Asp Gly Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 289
Gly Leu Val Glu Gly Leu Asp Tyr Gln Phe
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Leu Ala Asp Val Leu Glu Glu Pro Gly
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 291
Gly Leu Tyr Asp Gly Arg Glu His Ser Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 292
Gly Ile Thr Asp Ala Pro Ser Cys Ala Val
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 293
Gly Leu His Glu Ala Arg Leu Trp Cys Glu
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 294
Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 295
Gly Val Tyr Ala Gly Arg Glu His Phe Leu
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Ala Tyr Asp Gly Glu Glu His Leu Ile
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 297
Gly Leu Tyr Asp Gly Ile Glu His Phe Met
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 298
Gly Val Tyr Ala Gly Arg Glu His Phe Val
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 299
Gly Leu Val Cys Gly Pro Glu Pro Leu Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 300
Ser Leu Lys Glu Gly Arg Glu Ile Gly Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 301
Gly Leu Thr Asp Val Pro Glu Leu Gln Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 302
Gly Leu Thr Asp Asp Pro Glu Leu Gln Ile
1 5 10
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 303
Ala Leu Ala Asp Gly Leu Met Glu Leu Ser
1 5 10
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 304
Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 305
Ala Leu Val Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Ser Gly Asp Gly Arg Ile Val Ile Val
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<211> 10
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Asp Val Ile Asp Gly Ser Asp His Gly Val
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Gly Leu Tyr Asp Gly Pro Arg Phe Glu Ser
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Gly Met Phe Glu Gly Arg Leu Phe Phe Ser
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Gly Met Phe Glu Gly Arg Phe Phe Phe Ser
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Glu Tyr Leu Gly Thr Glu His Pro Val
1 5 10
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 313
Gly Thr Arg Asp Gly Ile Glu Phe Thr Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 314
Ile Met Lys Asp Gly Arg Glu Ile Val Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 315
Gly Val Tyr Leu Leu Arg Asp His Val Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 316
Gly Val Met Val Gly Arg Glu His Glu Ile
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 317
Ile Leu Phe Asp Gly Arg Asp Thr Gly Ala
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 318
Val Leu Phe Asp Gly Arg Asp Asn Gly Ala
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 319
Gly Ile Phe Asp Glu Arg Asp Tyr Gly Leu
1 5 10
<210> 320
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 320
Gly Leu Thr Asp Gly Glu Asp Pro Glu Val
1 5 10
<210> 321
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 321
Gly Ile Ala Asp Ile Arg Asp Lys Tyr Met
1 5 10
<210> 322
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 322
Gly Leu Ala Glu Val Leu Glu Ile Leu Ala
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 323
Ala Leu Val Glu Ser Leu Glu Leu Phe Ala
1 5 10
<210> 324
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 324
Ala Ser Phe Glu Ile Arg Asp Gln Tyr Ile
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 325
Ala Ile Ile Glu Ile Leu Met Ala Val Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Val Trp Glu Ala Arg Gly Tyr Gly Leu
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 327
Gly Met Ala Glu Ala Arg Val Leu Met Thr
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 328
Asn Leu Thr Asp Gly Arg Trp His Arg Val
1 5 10
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 329
Gly Met Tyr Lys Gly Arg Lys His Phe Ile
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Leu Tyr Asp Leu Arg Ala Lys Thr Ile
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 331
Gly Val Val Asp Gly Asn Val Ala Arg Val
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 332
Gly Val Tyr Trp Gly Pro Gly His Pro Leu
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<212> PRT
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Gly Leu Tyr Glu Glu Arg Ala His Val Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 334
Lys Ser Phe Asp Phe Arg Glu His Phe Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 335
Ala Glu Tyr Asp Glu Arg Glu Ile Ser Val
1 5 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 336
Ala Glu Tyr Asp Asp Arg Glu Ile Ser Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 337
Ser Leu Ala Asp Gly Arg Ile Val Thr Val
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Gly Leu Ala Glu Leu Arg Glu Leu Asp Leu
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Gly Val Gly Ala Gly Leu Ala Ala Thr Val
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Glu Leu Tyr Asp Leu Arg Gln His Phe Val
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Gly Leu Arg Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val
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Leu Val Leu Asp Gly Glu Glu Ile Pro Val
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Leu Val Tyr Asp Gly Asp Thr Val Ser Val
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Gly Leu Gln Asp Gln Gln Glu His Val Val
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Gly Leu Arg Pro Gly Val Glu Tyr Thr Val
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Gly Gln Tyr Gly Cys Gly Glu Met Thr Val
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Tyr Met Tyr Asp Ser Leu Glu His Thr Gly
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Leu Val Ser Asp Leu Arg Asn His Pro Val
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Leu Val Gln Asp Thr Arg Ile His Leu Val
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Tyr Val Phe Arg Gly Val Glu His Ala Val
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Ile Val Ile Thr Gly Phe Glu Val Thr Val
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 10
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Ala Val Asn Asp Gly Ser Trp His Ser Val
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Lys Val Ser Asp Gly His Phe His Thr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Val Phe Gly Phe Glu Glu Lys Thr Val
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Lys Val Phe Cys Gly His Glu His Thr Leu
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<400> 409
Lys Val Leu Ser Ser Arg Val His Thr Val
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<211> 10
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Leu Leu Ser Asp Gly Lys Trp His Thr Val
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Phe Val Tyr Asp Glu Pro Gly His Ala Val
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Val Gln Tyr Asp His Pro Asn His Thr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ser Val Leu Asp Gly Thr Leu Leu Thr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 414
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 415
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Thr Val Asn Asp Gly Gln Phe His Ser Val
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Val Leu Cys Ser Gly Arg Arg His Thr Val
1 5 10
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<210> 425
<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 425
Val Val Tyr Gly Ile Gly Glu Ser Thr Val
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 426
Ser Val Leu Ala Gly His Ser His Thr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 427
Ile Val Tyr Leu Gln Lys Glu His Pro Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Tyr Gln Tyr Tyr Gly Phe Ser His Thr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 429
Val Val Pro Asp Gly Glu Thr His Leu Val
1 5 10
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 430
Gly Val Met Cys Val Ile Glu Lys Thr Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 431
Ser Val Val Asp Tyr Val Glu Val Thr Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 432
Ala Val Tyr Asp Thr Leu Leu Asn Thr Val
1 5 10
<210> 433
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 433
Ser Val Ser Asp Asp Thr Glu His Leu Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 434
Cys Val His Ser Gly His Phe His Thr Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 435
Gly Leu Gly Gly Ala Arg Leu His Thr Val
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Thr Val Tyr Gln Gly Ile Lys His Ala Val
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Gly Leu Val Asp Ala Pro Glu Ala Ala Val
1 5 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Ile Tyr Asp Gly Glu Thr Leu Thr Val
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Leu Ala Met Gly Arg Met His Pro Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Tyr Met Asp Gly Arg Ala Leu Thr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ala Leu Ala Glu Gly Arg Glu Met Ser Leu
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Gly Leu Lys Asp Gly Phe Asp Trp Leu Leu
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Gly Leu Ile Gly Gly Arg Asp Asp Tyr Leu
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Arg Val Tyr Gly Gly Gly Ala Asn Thr Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 554
Asn Val Tyr Asp Ile Leu Glu Val Asp Val
1 5 10
<210> 555
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 555
Ala Val Ala Asp Tyr Arg Gly Leu Thr Val
1 5 10
<210> 556
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 556
Gly Val Met Asp Met Phe Pro His Thr Met
1 5 10
<210> 557
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 557
Gly Val Asn Asp Val Leu Glu Ala Leu Val
1 5 10
<210> 558
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 558
Val Val Ala Asp Tyr Arg Gly Leu Thr Val
1 5 10
<210> 559
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 559
Gly Val Phe Ser Thr Val Glu Gln Thr Val
1 5 10
<210> 560
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 560
Arg Val Leu Asp Gly Arg Val Ala Val Val
1 5 10
<210> 561
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 561
Lys Val Tyr Pro Met Arg Ser His Thr Val
1 5 10
<210> 562
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 562
Gly Val Leu Asp Val Gly Ser Asn Thr Val
1 5 10
<210> 563
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 563
Gly Val Tyr Gln Ser Leu His Thr Thr Val
1 5 10
<210> 564
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 564
Gly Ile Arg Asp Gly Val Val Ala Thr Val
1 5 10
<210> 565
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 565
Arg Thr Ser Asp Gly Val Glu His Pro Val
1 5 10
<210> 566
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 566
Met Val Ser Arg Gly Arg Val His Ala Val
1 5 10
<210> 567
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 567
Leu Val Ala Lys Gly Ile Glu Ala Thr Val
1 5 10
<210> 568
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 568
Lys Val Leu Asp Tyr Lys Glu His Thr Leu
1 5 10
<210> 569
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 569
Thr Val Leu Asp Gly Arg Gly Ala Pro Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 570
Thr Val Ile Asp Arg Arg Leu His Leu Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 571
Leu Val Leu Asp Gly Thr Glu Glu Ile Val
1 5 10
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 572
Ala Val Tyr Asn Gly Arg Gly Leu Pro Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 573
Thr Val Leu Asp Arg Arg Leu His Leu Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 574
Val Glu Leu Asp Gly Gln Thr His Thr Val
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 575
Phe Val Tyr His Val Gln Glu Arg Thr Val
1 5 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 576
Arg Arg Leu Asp Gly Arg Ala Ile Thr Val
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Leu Arg Leu Gly Arg Leu Lys Thr Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 578
Gly Glu Leu His Gly Cys Glu His Ser Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Val Tyr Asp Asp Gln Thr Val Asp Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 580
Gly Val Met Gly Gly Arg Asn Ser Glu Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 581
Leu Val Asp Asp Leu Ile Glu Lys Thr Val
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 582
Gly Glu Ile Asp Glu Asn Leu His Thr Val
1 5 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 583
Gly Val Trp Pro Arg Ala Glu Leu Thr Val
1 5 10
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 584
Arg Val Val Asp Gly Val Arg Leu Thr Val
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Lys Leu Ser Asp Gly Arg Arg His Asp Val
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Lys Val Phe Pro Thr Arg Ser His Thr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Phe Val Ala Gln Cys Arg Glu His Gly Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ser Ile Tyr Thr Pro Thr Glu His Thr Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 589
Gly Leu Tyr Asp Gly Arg Glu His Ser Val
1 5 10

Claims (37)

1.一种与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体，其中所述抗体包含第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:25的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:26的HCDR 2和SEQ ID NO:27的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:28的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:29的LCDR 2和SEQ ID NO:30的LCDR 3；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:1的HCDR 1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ ID NO:3的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:4的LCDR 1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3；
(iii)VH，其包含SEQ ID NO:41的HCDR 1、SEQ ID NO:42的HCDR 2和SEQ ID NO:43的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:44的LCDR 1、SEQ ID NO:45的LCDR 2和SEQ ID NO:46的LCDR 3；
(iv)VH，其包含SEQ ID NO:9的HCDR 1、SEQ ID NO:10的HCDR 2和SEQ ID NO:11的HCDR3；和VL，其包含SEQ ID NO:12的LCDR 1、SEQ ID NO:13的LCDR 2和SEQ ID NO:14的LCDR 3；
(v)VH，其包含SEQ ID NO:17的HCDR 1、SEQ ID NO:18的HCDR 2和SEQ ID NO:19的HCDR3；和VL，其包含SEQ ID NO:20的LCDR 1、SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3；或
(vi)VH，其包含SEQ ID NO:33的HCDR 1、SEQ ID NO:34的HCDR 2和SEQ ID NO:35的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:36的LCDR 1、SEQ ID NO:37的LCDR 2和SEQ ID NO:38的LCDR 3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述第一抗原结合结构域包含
(i)VH，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
(ii)VH，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
(iii)VH，其包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％的相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
(iv)VH，其包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
(v)VH，其包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或
(vi)VH，其包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
3.一种与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体，其中所述抗体包含第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；
(iii)VH，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
(iv)VH，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(v)VH，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；或
(vi)VH，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体为多特异性抗体，特别是双特异性抗体。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含与第二抗原结合的第二抗原结合结构域。
6.根据权利要求5所述的抗体，其中所述第二抗原为活化性T细胞抗原，特别是CD3，最特别是CD3ε。
7.根据权利要求5或6所述的抗体，其中所述第二抗原结合结构域包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:59的HCDR 1、SEQ ID NO:60的HCDR 2和SEQ ID NO:61的HCDR3；和VL，其包含SEQ ID NO:62的LCDR 1、SEQ ID NO:63的LCDR 2和SEQ ID NO:64的LCDR 3；或
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:51的HCDR 1、SEQ ID NO:52的HCDR 2和SEQ ID NO:53的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO:54的LCDR 1、SEQ ID NO:55的LCDR 2和SEQ ID NO:56的LCDR 3。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的抗体，其中所述第二抗原结合结构域包含
(i)VH，其包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或
(ii)VH，其包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和/或VL，其包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的抗体，其中所述第二抗原结合结构域包含
(i)VH，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；
(ii)VH，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；和/或VL，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第三抗原结合结构域。
11.根据权利要求10所述的抗体，其中第三抗原结构域与HLA-A2/MAGE-A4结合。
12.根据权利要求10或11所述的抗体，其中所述第三抗原结构域与所述第一抗原结合结构域相同。
13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述第一抗原结合结构域、所述第二抗原结合结构域和/或所述第三抗原结合结构域为Fab分子。
14.根据权利要求5至13中任一项所述的抗体，其中所述第二抗原结合结构域为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换或恒定结构域CL和CH1彼此替换，特别是所述可变结构域VL和VH彼此替换。
15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述第一抗原结合结构域以及在存在时的所述第三抗原结合结构域为常规Fab分子。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述第一抗原结合结构域以及在存在时的所述第三抗原结合结构域为Fab分子，其中在恒定结构域CL中，第124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且第123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)；并且在恒定结构域CH1中，第147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)，并且第213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
17.根据权利要求5至16中任一项所述的抗体，其中所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域彼此融合，任选地经由肽接头融合。
18.根据权利要求5至17中任一项所述的抗体，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自为Fab分子，并且(i)所述第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与所述第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合，或者(ii)所述第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与所述第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合。
19.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。
20.根据权利要求5至19中任一项所述的抗体，其中所述第一抗原结合结构域、所述第二抗原结合结构域以及在存在时的所述第三抗原结合结构域各自为Fab分子，并且所述抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；并且(i)所述第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与所述第二抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合，并且所述第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与所述Fc结构域的第一亚基的N末端融合，或者(ii)所述第二抗原结合结构域在Fab重链的C末端与所述第一抗原结合结构域的Fab重链的N末端融合，并且所述第一抗原结合结构域在Fab重链的C末端与所述Fc结构域的第一亚基的N末端融合；并且所述第三抗原结合结构域在存在时在Fab重链的C末端与所述Fc结构域的第二亚基的N末端融合。
21.根据权利要求19或20所述的抗体，其中所述Fc结构域为IgG Fc结构域，特别是IgG1Fc结构域。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的抗体，其中所述Fc结构域为人Fc结构域。
23.根据权利要求19至21中任一项所述的抗体，其中Fc包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基进行缔合的修饰。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的抗体，其中所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体的结合和/或降低效应子功能。
25.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至24中任一项所述的抗体。
26.一种宿主细胞，其包含根据权利要求25所述的分离的多核苷酸。
27.一种产生与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在适合表达所述抗体的条件下培养根据权利要求26所述的宿主细胞，以及任选地(b)回收所述抗体。
28.一种与HLA-A2/MAGE-A4结合的抗体，其通过根据权利要求27所述的方法产生。
29.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至24或权利要求28中任一项所述的抗体以及药用载体。
30.根据权利要求1至24或权利要求28中任一项所述的抗体或根据权利要求29所述的药物组合物，其用作药物。
31.根据权利要求1至24或权利要求28中任一项所述的抗体或根据权利要求29所述的药物组合物，其在疾病的治疗中使用。
32.根据权利要求31所述使用的抗体或药物组合物，其中所述疾病为癌症。
33.根据权利要求1至24或权利要求28中任一项所述的抗体或根据权利要求29所述的药物组合物在制造药物中的用途。
34.根据权利要求1至24或权利要求28中任一项所述的抗体或根据权利要求29所述的药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用于治疗疾病，特别是癌症。
35.一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至24或权利要求28中任一项所述的抗体或根据权利要求29所述的药物组合物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述疾病为癌症。
37.如前所述的本发明。
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