CN106573986A - 多特异性抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多特异性抗体、其生产方法、含有所述抗体的药物组合物及其用途。
Description
技术领域
本发明涉及新的多特异性抗体、生产其的方法、包含所述抗体的药物组合物以及其用途。
背景技术
改造的蛋白质，如能够结合两种或多种抗原的双或多特异性抗体为本领域所知。可以使用细胞融合、化学缀合或重组DNA技术产生此类多特异性结合蛋白质。
最近几年，已经开发了多种多样的重组多特异性抗体形式，例如通过融合例如IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(参见例如Coloma,M.J.,等人,NatureBiotech.15(1997)159-163；WO 2001/077342；和Morrison,S.L.,Nature Biotech.25(2007)1233-1234。
还开发了若干其它新的形式，其中不再保留抗体核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)，如二抗体、三抗体或四抗体、微抗体(minibody)和若干单链形式(scFv、Bis-scFv)，其能够结合两个或者多个抗原(Holliger,P.,等人,Nature Biotech.23(2005)1126-1136；Fischer,N.,和Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14；Shen,J.,等人,J.Immunol.Methods 318(2007)65-74；Wu,C.,等人,Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。
所有这些形式都使用接头来将抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)与其它结合蛋白质(例如scFv)融合或者融合例如两个Fab片段或scFv(Fischer,N.,和Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14)。尽管接头对改造双特异性抗体具有优势是显而易见的，但是它们还可能在治疗背景中引起问题。事实上，这些外来肽可能引发针对接头本身或蛋白质与接头之间的连接的免疫应答。此外，这些肽的柔性性质使得它们更易于被蛋白水解切割，可能导致差的抗体稳定性、聚集和增加的免疫原性。此外，可能希望通过维持与天然发生的抗体的高度相似性来保留通过Fc部分介导的效应子功能，如例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
因此，理想的是，目标应该是开发这样的双特异性抗体，其与天然发生的抗体(像IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)在整体结构上非常相似，与人序列具有最小的偏差。
在一种方法中，使用四价体瘤(quadroma)技术(参见Milstein，C.和Cuello，AC，Nature 305(1983)537-540)基于两种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合生产与天然抗体非常相似的双特异性抗体，所述两种不同杂交瘤细胞系表达具有双特异性抗体的所需特异性的鼠单克隆抗体的。由于在所得杂合-杂交瘤(或四价体瘤)细胞系内两条不同抗体重链和轻链的随机配对，产生多达十种不同的抗体种类，其中只有一种是所需的功能性双特异性抗体。由于错配的副产物的存在和显着降低的产率，需要复杂的纯化步骤(参见例如Morrison，S.L.，Nature Biotech.25(2007)1233-1234)。通常，如果使用重组表达技术，则仍存在错配的副产物的相同问题。
一种避免错配副产物的问题的方法被称为“杵臼(knob-into-hole)技术”，旨在通过将突变引入CH3结构域以修饰接触界面来强制两条不同抗体重链的配对。在一条链上，大体积(bulky)氨基酸被具有短侧链的氨基酸替换以产生“臼”。相反，具有大侧链的氨基酸被引入另一CH3结构域，以产生“杵”。通过共表达这两条重链(和两条相同的轻链，其必须适合于两条重链)，观察到相对于同源二聚体形成(“臼-臼”或“杵-杵”)高产率的异源二聚体形成(“杵-臼”)(Ridgway，J.B.等人，Protein Eng.9(1996)617-621；和WO 96/027011)。通过使用噬菌体展示方法和引入二硫键来稳定异源二聚体，可以通过重塑两个CH3结构域的相互作用表面来进一步增加异源二聚体的百分比(Merchant，A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell，S.，等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)。用于杵臼技术的新方法在例如在EP 1 870459A1中描述了。虽然这种形式显得非常有吸引力，但目前没有描述向临床进展的数据。该策略的一个重要限制是两个亲本抗体的轻链必须是相同的，以防止错配和形成非活性分子。因此，该技术不适合作为从针对第一和第二抗原的两种抗体开始容易地开发针对三种或四种抗原的重组、三或四特异性抗体的基础，因为首先必须优化这些抗体的重链和/或相同的轻链，然后必须加入针对第三和第四抗原的进一步的抗原结合肽。
WO 2006/093794涉及异源二聚体蛋白结合组合物。WO 99/37791描述了多用途抗体衍生物。Morrison，S.L.等人，J.Immunol.160(1998)2802-2808涉及可变区结构域交换对IgG功能性质的影响。
WO 2013/02362涉及异源二聚化的多肽。WO 2013/12733涉及包含异源二聚体Fc区的多肽。WO 2012/131555涉及改造的异源二聚体免疫球蛋白。EP 2647707涉及改造的异源二聚体免疫球蛋白。
WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254和Schaefer，W.等人，PNAS，108(2011)11187-1191涉及具有结构域交叉的二价双特异性IgG抗体。
在WO 2009/080251和Schaefer，W.等人，PNAS，108(2011)11187-1191中描述的在一个结合臂中具有VL-VH/CL-CH1置换(CrossMabFab)的多特异性抗体明确地减少由特异性结合第一抗原的第一抗体的轻链与特异性结合第二抗原的第二抗体的错误重链的错配导致的副产物形成(与没有这种结构域交换的方法相比时)。然而，其制剂不是完全不含副产物。副产物谱取决于在一个结合臂中具有VL-VH/CL-CH1置换的多特异性抗体的结构。主要的副产物是非功能性的轻链二聚体(也参见Schaefer，W.等人，PNAS，108(2011)11187-1191；增刊的图S1G中)和非功能性重链二聚体(也参见Schaefer，W.等人PNAS，108(2011)11187-1191；增刊的图S1F中)。
因此，仍然需要进一步减少不需要的副产物的方法，以改善例如多特异性抗体的产率。
发明内容
本发明涉及多特异性抗体，其包含源自特异性结合第一抗原的第一抗体的第一轻链和第一重链；和源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中在第二轻链中可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换和恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和在第二重链中可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换和恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
-其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代；或
-其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代。
本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，
-其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；或
-其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代。
本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和其中在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选实施方案中E)；和其中在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被K或R取代，在一个实施方案中被K取代)。
本发明的另一方面是用于制备根据本发明的多特异性抗体的方法，包括以下步骤：
-用包含核酸的载体转化宿主细胞，所述核酸编码
a)根据本发明的多特异性抗体所定义的第一轻链，其源自特异性结合第一抗原的第一抗体；
b)根据本发明的多特异性抗体所定义的第一重链，其源自特异性结合第一抗原的第一抗体；
c)根据本发明的多特异性抗体所定义的第二轻链，其源自特异性结合第二抗原的第二抗体；和
d)根据本发明的多特异性抗体所定义的第二重链，其源自特异性结合第二抗原的第二抗体，
-在允许所述多特异性抗体合成的条件下培养所述宿主细胞；和
-从所述宿主细胞培养物中回收所述多特异性抗体。
本发明的另一方面是编码根据本发明的多特异性抗体的核酸。
本发明的另一方面是包含根据本发明的核酸的载体，其中所述载体能够在宿主细胞中表达所述核酸。
本发明的另一方面是包含根据本发明的载体的宿主细胞。
本发明的另一方面是包含与至少一种可药用载体组合的根据本发明的多特异性抗体的药物组合物。
本发明的另一方面是包含与细胞毒性剂偶联的根据本发明的多特异性抗体的免疫缀合物。
本发明的另一方面是根据本发明的多特异性抗体在制备药物组合物中的用途。
本发明的另一方面是根据本发明的多特异性抗体，用作药物。
本发明的另一方面是包含与至少一种可药用载体组合的根据本发明的多特异性抗体的药物组合物，用作药物。
本发明的另一方面是根据本发明的多特异性抗体在制备药物中的用途。
本发明的另一方面是通过向需要这种治疗的患者施用根据本发明的多特异性抗体来治疗患有疾病的患者的方法。
根据本发明，由于在CH1和CL结构域中的特定位置上引入带相反电荷的氨基酸，可以减少多特异性抗体生产期间不希望的副产物的形成。由此，可以提高期望的多特异性抗体的产率。
附图说明
图1：根据本发明的多特异性抗体的一些实例，其在一个抗体结合臂中具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)和在一个CH1/CL结构域界面中具有特定的氨基酸取代：
图1a：在一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换和另一(“未交叉”)抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的特异性突变。
图1b：在一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换和相同(“交叉”)抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的特异性突变。
图1c：在一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换，在相同(“交叉”)抗体结合臂中具有特异性突变，以及在另一(“未交叉”)抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的另外的特异性突变。
图1d：在一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换和在相同(“交叉”)抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的特异性突变，与另一(“未交叉”)抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的另外的特异性突变。
图1e：一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换和另一(“未交叉”)抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的特异性突变，以及两抗体结合臂的VH/VL界面中的另外的特异性突变。
图1f：一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换和相同(“交叉”)抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的特异性突变，以及两抗体结合臂的VH/VL界面中的另外的特异性突变。
图1g：一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换与相同(“交叉”)抗体结合臂中的特异性突变，以及另一(“未交叉”)抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的另外的特异性突变和两抗体结合臂的VH/VL界面中的进一步的特异性突变。
图1h：一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换与相同(“交叉”)抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的特异性突变，与另一(“未交叉”)抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的另外的特异性突变和两抗体结合臂的VH/VL界面中的进一步的特异性突变。
图1i：一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换和另一(“未交叉”)抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的特异性突变，以及CH3/CH3结构域界面的修饰以强化重链异源二聚化(例如杵入臼技术或替换的异源二聚化技术，如，例如用其各自的相反电荷取代带电荷的氨基酸)。
图1j：一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换和相同(“交叉”)抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的特异性突变，以及CH3/CH3结构域界面的修饰以强化重链异源二聚化(如，例如杵入臼技术或替换的异源二聚化技术，如，例如用其各自的相反电荷取代带电荷的氨基酸)。
图1k：一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换和两抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的特异性突变(“未交叉”结合臂上的双突变)，以及CH3/CH3结构域界面的修饰以强化重链异源二聚化(如，例如杵入臼技术或替换的异源二聚化技术，如，例如用其各自的相反电荷取代带电荷的氨基酸)。
图1l：一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换和两抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的特异性突变(“交叉”结合臂上的双突变)，以及CH3/CH3结构域界面的修饰以强化重链异源二聚化(如，例如杵入臼技术或替换的异源二聚化技术，如，例如用其各自的相反电荷取代带电荷的氨基酸)。
图1m：一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换和另一(“未交叉”)抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的特异性突变和两抗体结合臂的VH/VL界面中的另外的特异性突变，以及CH3/CH3结构域界面的修饰以强化重链异源二聚化(如，例如杵入臼技术或替换的异源二聚化技术，如，例如用其各自的相反电荷取代带电荷的氨基酸)。
图1n：一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换和相同(“交叉”)抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的特异性突变和两抗体结合臂的VH/VL界面中的另外的特异性突变，以及CH3/CH3结构域界面的修饰以强化重链异源二聚化(如，例如杵入臼技术或替换的异源二聚化技术，如，例如用其各自的相反电荷取代带电荷的氨基酸)。
图1o：一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换和两抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的特异性突变(“未交叉”结合臂上的双突变)和两抗体结合臂的VH/VL界面中的另外的特异性突变，以及CH3/CH3结构域界面的修饰以强化重链异源二聚化(如，例如杵入臼技术或替换的异源二聚化技术，如，例如用其各自的相反电荷取代带电荷的氨基酸)。
图1p：一个抗体结合臂中的VL-VH/CL-CH1结构域交换和两抗体结合臂的CH1/CL结构域界面中的特异性突变(“交叉”结合臂上的双突变)和两抗体结合臂的VH/VL界面中另外的特异性突变，以及CH3/CH3结构域界面的修饰以强化重链异源二聚化(如，例如杵入臼技术或替换的异源二聚化技术，如，例如用其各自的相反电荷取代带电荷的氨基酸)。
图2：多特异性抗体和该多特异性抗体的副产物的实例，多特异性抗体的一个抗体结合臂中具有VL-VH/CL-CH1结构域交换和在一个CH1/CL结构域界面上没有特异性氨基酸取代。上部：多特异性抗体，在仅包含第一和第二抗体的Fab片段(Fab-CrossFab(Fab))的一个抗体结合臂中具有VL-VH/CL-CH1结构域交换，主要副产物，在第一抗体的轻链(LC：VL-CL)和第二抗体的修饰轻链(LC＊：VH-CH1)之间形成的二聚体。下部：多特异性抗体，在另外包含Fc片段的一个抗体结合臂中具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)，主要副产物，在第一抗体的重链(HC：VH-CH1-CH2-CH3)和第二抗体的修饰的重链(HC＊：VL-CL-CH2-CH3)之间形成的非功能性重链二聚体。
图3：CH1和CL结构域中氨基酸取代的位置
图3A：CH1结构域中的野生型(wt)氨基酸序列(显示四种IgG同种型)，其中突出氨基酸位置147和213(根据Kabat编号)。
图3B：κ和λ同种型的CL结构域中的野生型(wt)氨基酸序列，其中下划线和突出氨基酸位置123和124(根据Kabat的EU索引编号)。
图4：在抗Ang2-VEGF双特异性抗体中通过带电荷的氨基酸取代减少副产物。
图4A：双特异性抗体的序列(SEQ ID NO)，其结果显示于图4B中。
图4B：通过使用根据本发明的具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)的抗Ang2-VEGF双特异性抗体的实例，通过根据本发明的在CH1/CL界面中带电荷的氨基酸取代，减少副产物(非功能性重链二聚体)。
图5：在抗-Tweak-IL17双特异性抗体中通过带电荷的氨基酸取代减少副产物。
图5A：双特异性抗体的序列(SEQ ID NO)，其结果显示于图5B中。
图5B：通过使用根据本发明的具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)的抗Tweak-IL17双特异性抗体的实例，通过根据本发明的在CH1/CL界面中单带电荷的氨基酸取代，减少副产物(非功能性重链二聚体)。
图6：在抗Her1Her3-cMet三特异性抗体中通过带电荷的氨基酸取代减少副产物。
图6A：双特异性抗体的序列(SEQ ID NO)，其结果显示于图6B中。
图6B：使用根据本发明的具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossDAF-Fab)的抗Her1Her3-cMet三特异性抗体的实例，在CH1/CL界面中根据本发明的带单电荷的氨基酸取代减少副产物。
图7：在抗Ang2-VEGF双特异性抗体中通过带电荷的氨基酸取代减少副产物。
图7A：双特异性抗体“Ang2VEGF 044”的序列(SEQ ID NO)，其结果显示于图7B中。
图7B：使用根据本发明的具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)的抗Ang2-VEGF双特异性抗体的实例，通过根据本发明的在CH1/CL界面(根据图4A的氨基酸序列)中带电荷氨基酸取代和在VL/VH界面中的另外的带电荷的氨基酸取代减少副产物。
发明的详细描述
I)定义
除非上下文另有明确说明，否则术语“一(a)”、“一(an)”和“该”通常包括复数指代。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示所需的抗原结合活性。
“多特异性抗体”结合两个或多个不同的表位(例如，两个，三个，四个或更多个不同的表位)。表位可以在相同或不同的抗原上。多特异性抗体的实例是结合两个不同表位的“双特异性抗体”。
当抗体具有多于一种特异性时，所识别的表位可以与单一抗原或与多于一种抗原相关。
本文所用的术语“价”表示在抗体分子中存在特定数量的结合位点。例如天然抗体具有两个结合位点，是二价的。因此，术语“三价”表示在抗体分子中存在三个结合位点。
“抗体特异性”是指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。天然抗体，例如，是单特异性的。本文所用的术语“单特异性抗体”表示具有一个或多个结合位点的抗体，其中每个结合位点结合相同抗原的相同表位。
表位是由抗体结合的抗原的区域。术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、聚糖侧链、磷酰基或磺酰基，在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。在某些实施方案中，当抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，称该抗体特异性结合抗原。
如本文所用，术语“结合”和“特异性结合”是指在体外测定中，优选在使用纯化的野生型抗原的等离子体共振测定法(BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，Sweden)中抗体与抗原表位的结合。
抗体与抗原的结合亲和力由术语ka(从抗体/抗原复合体的抗体的结合速率常数)、kD(解离常数)和KD(kD/ka)定义。在一个实施方案中，结合或其特异性结合是指10-8mol/l或更低的结合亲和力(KD)，在一个实施方案中为10-8M至10-13mol/l的结合亲和力(KD)。因此，根据本发明的多特异性抗体特异性结合其特异的每种抗原，其中结合亲和力(KD)为10- 8mol/l或更低，例如结合亲和力(KD)为10-8至10-13mol/l。在一个实施方案中结合亲和力(KD)为10-9至10-13mol/l。
可以通过BIAcore测定法(GE-Healthcare Uppsala，Sweden)研究抗体与FcγRIII的结合。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合体的抗体的结合速率常数)、kD(解离常数)和KD(kD/ka)定义。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一氨基酸组分的抗体分子的制剂。
术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同的来源或物种。
术语“人源化抗体”是指其中框架或CDR已被修饰以包含与亲本免疫球蛋白相比具有不同特异性的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个优选的实施方案中，将鼠CDR接枝到人抗体的构架区中以制备“人源化抗体”。参见例如Riechmann，L.等人，Nature 332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.等人，Nature 314(1985)268-270。本发明包含的其它形式的人源化抗体是其中恒定区已经从原始抗体的恒定区另外修饰或改变以产生根据本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的那些特性。
本文所用的术语“人抗体”意在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体在现有技术中是公知的(van Dijk，M.A.和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。还可以在转基因动物(例如小鼠)中产生人抗体，所述转基因动物在免疫后能够在不产生内源免疫球蛋白的情况下产生完整的人抗体谱(repertoire)或选择的人抗体。在这种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击后产生人抗体(参见例如Jakobovits，A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.等人，Nature 362(1993)255-258；Bruggemann，M.等人，Year Immunol.7(1993)33-40)。人抗体也可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom,H.R.,和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks,J.D.等人,J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；和Boerner,P.等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。如对于根据本发明的嵌合和人源化抗体已经提到的，本文所用的术语“人抗体”还包括这样的抗体，其在恒定区中被修饰以产生根据本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或FcR结合的特性，例如通过“类型转换”即Fc部分的改变或突变(例如从IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4的突变)。
本文所用的术语“重组人抗体”意在包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如从宿主细胞如NS0或CHO细胞或从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体、或使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。根据本发明的重组人抗体已经经过体内体细胞超突变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其虽然源自人种系VH和VL序列并与之相关，但并不能天然存在于体内的人抗体种系谱中。
如本文所用的术语“结合位点”或“抗原结合位点”是指配体(例如抗原或其抗原片段)实际结合的抗体分子的区域，其源自抗体。抗原结合位点包括抗体重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)、或VH/VL对。
特异性结合所需抗原的抗原结合位点可以源自a)与抗原特异性结合的已知抗体，或b)通过尤其是使用抗原蛋白或核酸或其片段或通过噬菌体展示的从头免疫方法获得的新抗体或抗体片段。
根据本发明的抗体的抗原结合位点可以包含六个互补决定区(CDR)，其在不同程度上对结合位点对抗原的亲和力有贡献。有三个重链可变结构域CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。通过与编辑的氨基酸序列数据库进行比较来确定CDR和框架区(FR)的范围，在所述编辑的氨基酸序列数据库中已根据序列之间的变异性定义了那些区域。本发明范围内还包括由较少的CDR组成的功能性抗原结合位点(即，其中结合特异性由三个、四个或五个CDR决定)。例如，比6个CDR的完整组少(的组)可能对结合是足够的。在一些情况下，VH或VL结构域将是足够的。
基于其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以归属于两种不同类型之一，称为κ(κ)和λ(λ)。野生型轻链通常含有两个免疫球蛋白结构域，通常对结合抗原重要的一个可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。
存在几种不同类型的“重链”，其定义抗体的类型或同种型。野生型重链含有一系列免疫球蛋白结构域，通常具有对结合抗原重要的一个可变结构域(VH)和几个恒定结构域(CH1，CH2，CH3等)。
术语“Fc结构域”在本文中用于定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C末端区。例如在天然抗体中，Fc结构域由两个相同的蛋白片段组成，其源自IgG、IgA和IgD同种型中抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域；IgM和IgE Fc结构域在每条多肽链中含有三条重链恒定结构域(CH结构域2-4)。本文使用的“无Fc结构域”是指本发明的双特异性抗体不包含CH2、CH3和CH 4结构域；即恒定重链仅由一个或多个CH1结构域组成。
如本文所用的“可变结构域”或“可变区”是指直接参与抗体与抗原结合的轻链和重链对的每一个。轻链的可变结构域缩写为“VL”，重链的可变结构域缩写为“VH”。人轻链和重链的可变结构域具有相同的一般结构。每个可变结构域包含四个框架(FR)区，其序列是广泛保守的。FR通过三个“高变区”(或“互补决定区”，CDR)连接。每条链上的CDR由这样的框架氨基酸分开。因此，抗体的轻链和重链从N末端至C末端方向包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。FR采用β片层构象，CDR可以形成连接β片层结构的环。每条链中的CDR通过FR保持在其三维结构中，并与来自另一条链的CDR一起形成“抗原结合位点”。特别地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大的区域。CDR和FR区根据Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991)的标准定义来确定。
本申请中使用的术语“恒定结构域”或“恒定区”是指除可变区之外的抗体结构域的总和。恒定区不直接参与抗原的结合，但表现出各种效应子功能。
取决于其重链恒定区的氨基酸序列，抗体分为以下类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可进一步分为亚类，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类型抗体的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。可在所有五种抗体类型中发现的轻链恒定区(CL)称为κ(kappa)和λ(lambda)。如本文所用的“恒定结构域”来自人源，其来自IgG1、IgG2，IgG3或IgG4亚型的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区。这种恒定结构域和区在本领域的状态中是公知的，例如描述于Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)。
本文使用的术语“三级结构”是指根据本发明的抗体的几何形状。三级结构包括包含抗体结构域的多肽链主链，而氨基酸侧链以多种方式相互作用和键合。
本文所用的术语“氨基酸”是指具有位于羧基的α位的氨基部分的有机分子。氨基酸的实例包括：精氨酸，甘氨酸，鸟氨酸，赖氨酸，组氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，蛋氨酸，丝氨酸，脯氨酸。所使用的氨基酸任选在每种情况下为L-型。术语“带正电荷”或“带负电荷”的氨基酸是指在pH 7.4下的氨基酸侧链电荷。氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性：Asp，Glu；
(4)碱性：His，Lys，Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。
表-具有特定性质的氨基酸
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号，在本文中称为“根据Kabat等人编号”。特别地，对于κ和λ同种型的可变结构域和轻链恒定结构域CL，使用Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的Kabat编号系统(参见第647-660页)，和在本文中称为“根据Kabat编号”，尽管如此，对于恒定重链结构域(CH1，铰链，CH2和CH3)使用Kabat EU索引编号系统(参见第661-723页)，和在本文中称为“根据Kabat的EU索引编号”。
通过将适当的核苷酸变化引入抗体DNA或通过核苷酸合成来制备多特异性抗体的多肽链内的氨基酸取代(或突变)。然而，这样的修饰可以仅在非常有限的范围内进行，例如，如上所述。例如，修饰不改变上述抗体特征如IgG同种型和抗原结合，但可以进一步改善重组生产的产率、蛋白质稳定性或便于纯化。在某些实施方案中，提供了具有一个或多个保守氨基酸取代的抗体变体。
根据本发明的抗体通过重组方法产生。重组生产抗体的方法在本领域的状态中是广泛公知的，包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达，以及随后的抗体分离并通常纯化至可药用纯度。为了在宿主细胞中表达上述抗体，通过标准方法将编码各(修饰的)轻链和重链的核酸插入表达载体中。在合适的原核或真核宿主细胞，如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达，并从细胞中(裂解后的上清液或细胞)回收抗体。用于重组生产抗体的一般方法是本领域的状态中公知的，并且描述于例如Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.等人,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880的综述文章中。
如本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其类似物。核苷酸序列可以被非核苷酸成分中断。多核苷酸可以包含合成后进行的修饰，如与标记物的缀合。其它类型的修饰包括，例如“帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，例如具有不带电荷的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)和具有带电荷的键的那些(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有侧基(pendant moieties)的那些，如，例如，蛋白质(核酸酶，毒素，抗体，信号肽，聚-L-赖氨酸等)、具有嵌入剂的那些(例如吖啶，补骨脂素等)、含有螯合剂的那些(例如金属，放射性金属，硼，氧化金属等)、含有烷基化剂的那些、具有修饰的键的那些(例如，α异头核酸等)、以及多核苷酸的未修饰形式。此外，通常存在于糖中的任何羟基可以被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团替换，被标准保护基团保护或被活化以制备与另外的核苷酸另外的键，或者可以与固体或半固体载体缀合。5'和3'末端OH可以被磷酸化或用胺或1至20个碳原子的有机封端基团部分取代。其它羟基也可衍生为标准保护基团。多核苷酸还可以包含本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基-、2'-氟-或2'-叠氮-核糖、糖环类似物、α-端基异构糖、差向异构糖如阿拉伯糖，木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和碱性核苷类似物如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯键可以被替换的连接基团替换。这些替换的连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH 2(“甲缩醛(formacetal)”)替换，其中每个R或R'独立地为H或任选地含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基的取代或未取代的烷基(1-20C)。不是多核苷酸中的所有键都需要相同。前面的描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
“分离的”核酸是指已经从其天然环境的成分中分离的核酸分子。分离的核酸包括包含于通常含有核酸分子的细胞中的核酸分子，但是核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置。
如本文所使用的，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入其已被导入的宿主细胞的基因组中的载体。该术语包括主要用于将DNA或RNA插入细胞(例如，染色体整合)的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体复制、以及用于转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供多于一种所述功能的载体。
“表达载体”是能够指导其可操作地连接的核酸表达的载体。当将表达载体引入合适的宿主细胞中时，其可以被转录并翻译成多肽。当在根据本发明的方法中转化宿主细胞时，使用“表达载体”；从而与如本文所述的宿主细胞转化有关的术语“载体”意指“表达载体”。“表达系统”通常是指包含表达载体的合适的宿主细胞，其可以起到产生所需表达产物的作用。
如本文所用，“表达”是指核酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA(也称为转录物)随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽统称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，那么在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。
本文使用的术语“转化”是指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果使用无强大细胞壁屏障的细胞作为宿主细胞，那么通过Graham和Van der Eh，Virology 52(1978)546ff所述的磷酸钙沉淀法进行转染。然而，也可以使用其它方法将DNA引入细胞，如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或含有实质细胞壁结构的细胞，例如，一种转染方法是使用氯化钙的钙处理，如Cohen，F.N.等人，PNAS 69(1972)7110等所述。
本申请中使用的术语“宿主细胞”是指可以被改造以产生根据本发明的抗体的任何种类的细胞系统。
如本文所使用的，表达“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这样的命名包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞及其来源的培养物，而不考虑传代的次数。还应理解，由于有意的或无意的突变，所有后代在DNA含量上可能不完全相同。包括具有与在原始转化细胞中筛选的功能或生物活性相同的功能或生物活性的变体后代。在意图使用不同的名称时，从上下文中将是清楚的。
NS0细胞中的表达描述于，例如Barnes,L.M.等人,Cytotechnology32(2000)109-123；Barnes,L.M.等人,Biotech.Bioeng.73(2001)261-270。瞬时表达描述于，例如Durocher,Y.,等人,Nucl.Acids.Res.30(2002)E9。可变结构域的克隆描述于，例如Orlandi,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Norderhaug,L.等人,J.Immunol.Methods204(1997)77-87。优选的瞬时表达系统(HEK 293)描述于Schlaeger,E.-J.,和Christensen,K.,Cytotechnology 30(1999)71-83和by Schlaeger,E.-J.,J.Immunol.Methods 194(1996)191-199。
由宿主细胞产生的抗体可以经过从重链C末端翻译后切割一个或多个，特别是一个或两个氨基酸。因此，通过表达编码全长重链的特定核酸分子由宿主细胞产生的抗体可以包括全长重链，或者其可以包括全长重链的切割变体(本文中也称为切割的变体重链)。这可能是这样的情况，其中重链的最后两个C末端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据Kabat的EU索引编号)。
因此，如果没有另外指出，在本文中表示的包括CH3结构域的重链氨基酸序列不含C-末端甘氨酸-赖氨酸二肽。
本发明的组合物，如本文所述的药物组合物，包含本发明的抗体群。抗体群可以包含具有全长重链的抗体和具有切割的变体重链的抗体。在一个实施方案中，抗体群由具有全长重链的抗体和具有切割的变体重链的抗体的混合物组成，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体具有切割的变体重链。
通过标准技术进行抗体的纯化(从宿主细胞培养物中回收抗体)以消除细胞成分或其它污染物，例如，其它细胞核酸或蛋白质，所述标准技术包括碱性/SDS处理、CsCl带化、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其它方法。参见Ausubel,F.等人编辑.CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,NewYork(1987)。已经建立不同的方法并广泛用于蛋白质纯化，如使用微生物蛋白质的亲和色谱法(例如蛋白A或蛋白G亲和色谱法)，离子交换色谱法(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)，亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其它SH配体)，疏水相互作用或芳族吸附色谱发法(例如用苯基琼脂糖，氮杂亲树脂或间氨基苯基硼酸)，金属螯合物亲和色谱例法(如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)，尺寸排阻色谱法和电泳方法(如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，MA，Appl.Biochem.Biotech.74(1998)102)。
术语“药物组合物”是指制剂，其以使得其中包含的活性成分的生物活性是有效的形式存在，并且不含有对将施用该组合物的受试者有不可接受的毒性的额外组分。本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。如本领域技术人员将理解的，施用的途径和/或模式将根据所需的结果而变化。为了通过某些施用途径施用根据本发明的抗体，可能需要用防止抗体失活的材料包被抗体或防止抗体失活的材料与抗体共同施用。例如，抗体可以在合适的载体例如脂质体或稀释剂中施用给受试者。可药用稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。
“可药用载体”是指药物制剂中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一个优选的实施方案中，载体适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。
根据本发明的药物组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过上文的灭菌步骤和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯，三氯氯丁醇，苯酚，山梨酸等)来确保防止微生物的存在。还可能需要在组合物中包含等渗剂，如糖，氯化钠等。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来实现。
本文所用的短语“肠胃外的施用”和“肠胃外施用”是指肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内，肌内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，心脏内，皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，被膜下，蛛网膜下，脊柱内，硬膜外和胸骨内注射和输注。
无论选择的施用途径如何，本发明的化合物(可以以合适的水合形式使用)和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方法配制成可药用剂型。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得活性成分的量有效实现针对特定患者、组合物和施用方式的所需治疗反应，而对患者无毒。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所使用的本发明具体组合物的活性、施用途径、施用时间、所使用的具体化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所使用的具体组合物组合使用的其它药物，化合物和/或物质、所治疗患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况和先前的病史以及医学领域中熟知的类似因素。
组合物必须是无菌和一定程度上的流体，使得组合物可通过注射器递送。除了水之外，在一个实施方案中，载体是等渗缓冲盐溶液。
例如可以通过使用包衣例如卵磷脂、在分散体的情况下通过保持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨醇，和氯化钠。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如At211,I131,I125,Y90,Re186,Re188,Sm153,Bi212,P32,Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤，阿霉素，长春花生物碱(长春新碱，长春碱，依托泊苷)，多柔比星，美法仑，丝裂霉素C，苯丁酸氮芥，柔红霉素或其它嵌入剂)生长抑制剂；酶及其片段如核酸分解酶；抗生素；毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
本文所用的术语“癌症”是指增殖性疾病，如淋巴瘤，淋巴细胞白血病，肺癌，非小细胞肺癌(NSCL)，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头部或颈部癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌(stomach cancer)，胃癌(gastriccancer)，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，食管癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆管癌，中枢神经系统(CNS)的肿瘤，脊柱轴肿瘤，脑干神经胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，神经鞘瘤，室管膜瘤，成神经管细胞瘤，脑膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括任何上述癌症的难治性类型(refractory versions)，或一种或多种上述癌症的组合。
如本文所用的“人VEGF”是指人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)，其描述于例如Leung,D.W.等人,Science 246(1989)1306-9；Keck,P.J.等人,Science 246(1989)1309-12和Connolly,D.T.等人,J.Biol.Chem.264(1989)20017-24。VEGF参与与肿瘤和眼内疾患相关的正常和异常血管生成和新生血管形成的调节(Ferrara,N.,等人,Endocr.Rev.18(1997)4-25；Berkman,R.A.,等人,J.Clin.Invest.91(1993)153-159；Brown,L.F.,等人,Human Pathol.26(1995)86-91；Brown,L.F.,等人,Cancer Res.53(1993)4727-4735；Mattern,J.,等人,Brit.J.Cancer.73(1996)931-934；和Dvorak,H.,等人,Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039)。VEGF是已经从几个来源分离的同源二聚体糖蛋白。VEGF对内皮细胞显示高度特异的促有丝分裂活性。
本文所用的人“ANG-2”是指人血管生成素-2(ANG-2)(或者缩写为ANGPT2或ANG2)，其描述在Maisonpierre,P.C.等人,Science 277(1997)55-60和Cheung,A.H.等人,Genomics 48(1998)389-91。血管生成素-1和-2作为Ties的配体被发现，Ties是在血管内皮中选择性表达的酪氨酸激酶家族(Yancopoulos，G.D.等人，Nature 407(2000)242-48)。现在有四个血管生成素家族的明确的成员。血管生成素-3和-4(Ang-3和Ang-4)可以代表小鼠和人中相同基因座的广泛偏离的对应物(Kim，I.等人，FEBS Let，443(1999)353-56；Kim，I.等人，J Biol Chem 274(1999)26523-28)。
人TWEAK(UniProtKB O43508，TNF相关的弱细胞凋亡诱导剂)是细胞表面相关的II型跨膜蛋白。TWEAK描述于Chicheportiche,Y.等人,J.Biol.Chem.272(1997)32401-32410；Marsters,S.A.等人,Curr.Biol.8(1998)525-528；Lynch,C.N.等人,J.Biol.Chem.274(1999)8455-8459。TWEAK的活性形式是可溶性同源三聚体。人和鼠TWEAK在受体结合结构域中显示93％的序列同一性。TWEAK受体Fn14(成纤维细胞生长因子诱导型14kDa蛋白)是129aa的I型跨膜蛋白，其由配体结合结构域中的一个单一的富含半胱氨酸的结构域组成。TWEAK的信号传导通过NF-KB通路活化发生。TWEAK mRNA在多种组织中表达，并且存在于大多数主要器官如心脏，脑，骨骼肌和胰腺，与免疫系统相关的组织如脾、淋巴结和胸腺中。已经在心脏，脑，肺，胎盘，血管EC和平滑肌细胞中检测到Fn14mRNA。TWEAK敲除小鼠(TWEAK-null)和Fn14敲除小鼠(Fnl4-null)是活的、健康和可生育的，并且具有更多的自然杀伤细胞，显示增强的先天炎症反应。TWEAK参与细胞凋亡、增殖、血管生成、缺血半影区、脑水肿、多发性硬化。
人IL-17(也称为IL17-A；CTLA-8，Swiss Prot Q16552，IL17)是由例如参与多发性硬化的发病机理中的记忆T细胞(称为Th17)的亚组产生的促炎细胞因子。IL-17A在诱导其它炎性细胞因子，趋化因子和粘附分子中起作用。用IL-17A中和抗体治疗动物降低了自身免疫性脑脊髓炎的疾病发病率和严重性(Komiyama，Y.等人，J.Immunol.177(2006)566-573)。IL-17A在MS患者的脑脊液中过表达(Hellings,P.W.等人,Am.J.Resp.CellMol.Biol.28(2003)42-50；Matusevicius,D.等人,Multiple Sclerosis 5(1999)101-104；WO 2005/051422)。此外，IL-17A中和抗体降低胶原蛋白诱导的关节炎的小鼠类风湿性关节炎模型的严重性和发病率，并且可以在来自RA患者的发炎关节的滑液中检测到高水平的IL-17A(Ziolkowska,M.等人,J.Immunol.164(2000)2832-2838；Kotake,S.等人,J.Clin.Invest.103(1999)1345-1352；Hellings,P.W.等人,Am.J.Resp.Cell Mol.Biol.28(2003)42-50)。
II)本发明实施方案的详细描述
在一个结合臂中具有VL-VH/CL-CH1置换(CrossMabFab)的多特异性抗体详细描述于WO 2009/080251和Schaefer，W.等人，PNAS，108(2011)11187-1191(其作为参考文献并入本文)。使用这些抗体，(与没有这种结构域交换的方法比较时)可以显着降低由特异性结合第一抗原的第一抗体的轻链与特异性结合第二抗原的第二抗体的错误的重链的错配导致的副产物形成。但是，其制剂并不是完全没有副产物。副产物谱取决于在一个结合臂中具有VL-VH/CL-CH1置换的多特异性抗体的结构。对于仅包含Fab片段的多特异性抗体(Fab-CrossFab，例如如WO 2013/026835中所述的)，主要副产物是非功能性轻链二聚体(也参见Schaefer，W.等人，PNAS，108(2011)11187-1191；在增刊的图S1G中)。对于包括至少两种不同抗体的各Fc区的多特异性抗体，主要副产物是非功能性重链二聚体(也参见Schaefer，W.等人，PNAS，108(2011)11187-1191；在增刊的图S1F中)。
本发明提供了一种进一步减少形成不想要的副产物以改善产率的方法，其通过分别用带相反电荷的氨基酸取代CH1和CL结构域中的特定氨基酸。通过另外取代多特异性抗体的VH和VL结构域中的特定氨基酸，可以实现多特异性抗体产率的进一步改善和副产物形成的减少。
因此，本发明涉及一种多特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合第一抗原的第一抗体的第一轻链和第一重链；和
b)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换和恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，和恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代；或者
ii)其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代。
根据本发明的概念，根据本发明的抗体仅包含如上下文中i)和ii)所示的修饰之一。因此，根据本发明的多特异性抗体包含
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代；
或者
ii)其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代，
条件是所述多特异性抗体不同时包含在i)和ii)中提及的修饰。
在一个实施方案中，本发明涉及多特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合第一抗原的第一抗体的第一轻链和第一重链；和
b)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换和恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代。
在一个实施方案中，本发明涉及多特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合第一抗原的第一抗体的第一轻链和第一重链；和
b)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换，和恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，和恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，带负电荷的氨基酸选自E和D。在本发明的一个实施方案中，带负电荷的氨基酸是E。
在本发明的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K、R和H。在本发明的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K和R。在本发明的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸是K。
本发明还涉及多特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合第一抗原的第一抗体的第一轻链和第一重链；和
b)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换和恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，和恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代；或者
ii)其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代。
在一个实施方案中，本发明涉及多特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合第一抗原的第一抗体的第一轻链和第一重链；和
b)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换和恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，和恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代。
在一个实施方案中，本发明涉及多特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合第一抗原的第一抗体的第一轻链和第一重链；和
b)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换和恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，和恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代。
在本发明的一个实施方案中，在恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E替换。
在本发明的一个实施方案中，在恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代，和在恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代，和在恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代，和在第一重链的恒定结构域CH1，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代，和在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代，和在第二轻链的恒定结构域CH1，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代，和在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代。
本文使用的“抗体轻链”是在从N末端至C末端方向包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)的多肽，缩写为VL-CL。如本文所用的“抗体重链”是在从N末端至C末端方向包含抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定重链结构域1(CH1)的多肽。在本发明的一个优选实施方案中，抗体的重链在从N末端至C末端方向包含抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)、抗体重链恒定结构域2(CH2)和抗体重链恒定结构域3(CH3)，缩写为VH-CH1-CH2-CH3。
因此，在根据本发明的多特异性抗体中，在源自所述第一抗体的所述第一轻链中，轻链结构域的顺序排列(CL-VL)保持不变。在源自所述第一抗体的所述第一重链中，重链结构域的顺序排列(CH1-CL或CH3-CH2-CH1-CL)保持不变。因为源自所述第一抗体的Fab区不包括结构域交叉，所以该区域在本文中也称为根据本发明的多特异性抗体的“非交叉Fab区”。
在本发明的一个实施方案中，多特异性抗体包含第一轻链和第一重链，所述第一轻链在N末端至C末端方向包含VL和CL结构域的顺序排列(即从N末端至C末端方向的VL-CL)，和所述第一重链在N末端至C末端方向包含VH和CH1结构域的顺序排列(即从N末端至C末端方向的VH-CH1)，其中第一轻链和第一重链源自特异性结合第一抗原的第一抗体。
在本发明的一个实施方案中，多特异性抗体包含第一轻链和第一重链，所述第一轻链在N末端至C末端方向包含VL和CL结构域的顺序排列(即从N末端至C末端方向的VL-CL)，和所述第一重链在N末端至C末端方向包含VH、CH1、CH2和CH3结构域的顺序排列(即从N末端至C末端方向的VH-CH1-CH2-CH3)，其中第一轻链和第一重链源自特异性结合第一抗原的第一抗体。
相反，在所述第二轻链(本文也称为“修饰的第二轻链”或“LC＊”)中，原始可变结构域VL被(原始)第二重链的可变结构域VH替换，和原始恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换。因此，修饰的第二轻链由源自所述第二抗体的第二重链的CH1和VH结构域构成。因此，所述修饰的第二轻链的轻链结构域的顺序排列是VH-CH1(在N末端至C末端方向)。
另外，在所述第二重链(本文中也称为“修饰的第二重链”或“HC＊”)中，原始可变结构域VH被(原始)第二轻链的可变结构域VL替换，和原始恒定结构域CH1被(原始)第二轻链的恒定结构域CL替换。因此，修饰的第二重链至少包含源自所述第二抗体的第二轻链的CL和VL结构域的顺序排列。因此，所述修饰的第二重链的重链结构域的顺序排列至少为VL-CL(在N末端至C末端方向)。
总之，在源自所述第二抗体的所述第二重链和所述第二轻链中，可变结构域VL和VH彼此替换，和恒定结构域CL和CH1彼此替换。因为源自所述第二抗体的Fab区包括如上所述的结构域交叉，该区域在本文中也称为根据本发明的多特异性抗体的“交叉Fab区”。因此，根据本发明的多特异性抗体包括至少一个非交叉Fab区和至少一个交叉Fab区。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体的修饰的重链由第二轻链的VL和CL结构域的顺序排列(N末端至C末端方向)组成(然而，在所述VL和CL结构域中如本发明所述的特定的氨基酸取代是可能的)。因此，在该实施方案中，多特异性抗体包含至少两个Fab片段，其包含源自所述第一抗体的第一Fab片段(非交叉Fab片段)和源自所述第二抗体的第二Fab片段(交叉Fab片段)，其中根据该实施方案的多特异性抗体不包含所述第一和所述第二抗体的各自的Fc结构域(因此，多特异性抗体缺乏Fc结构域)。在一个实施方案中，多特异性抗体包含2至5个Fab片段。在多特异性抗体的一个实施方案中，Fab片段通过肽接头彼此连接。本文所用的术语“肽接头”是指具有氨基酸序列的肽，其优选是合成来源的。在一个实施方案中，使用肽接头将Fab片段之一连接到另一Fab片段的C末端或N末端，以形成根据本发明的多特异性抗体。在一个优选的实施方案中，所述肽接头是具有长度为至少5个氨基酸的氨基酸序列的肽，在一个实施方案中具有5至100个氨基酸的长度，在另一个实施方案中为10至50个氨基酸的长度。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，和(x＝3，n＝3,4,5或6，和m＝0,1,2或3)或(x＝4，n＝2,3,4或5，和m＝0,1,2或3)，在一个实施方案中x＝4和n＝2或3，在另一个实施方案中x＝4和n＝2。在一个实施方案中，所述肽接头是(G4S)2。肽接头用于连接第一和第二Fab片段。在一个实施方案中，第一Fab片段连接到第二Fab片段的C或N末端。图2(上图)描述了该实施方案的多特异性抗体的示例性方案，其中缺少Fc结构域。根据图2(上图)的多特异性抗体在本文中也称为“Fab-CrossFab”。此形式的多特异性抗体先前已描述于WO 2013/026835中。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体的修饰的重链包含源自特异性结合所述第二抗原的所述第二抗体的VL，CL，CH2和CH3结构域的顺序排列(在N末端至C末端方向)。因此，在该实施方案中，多特异性抗体包含所述第一和第二抗体的各自的Fc区。本发明的该实施方案的多特异性抗体的示例性方案描述于图2(下图)中。根据图2(下图)的多特异性抗体在本文中也称为“CrossMAb-Fab”。
在本发明的一个实施方案中，多特异性抗体包含源自特异性结合所述第一抗原和第三抗原的第一抗体的第一轻链和第一重链。该实施方案包括所谓的双作用Fab中的可变轻链结构域和可变重链结构域，如前所述(WO 2013/174873)。
在本发明的一个实施方案中，多特异性抗体缺少Fc结构域并且包含
a)第一轻链和第一重链，所述第一轻链在N末端至C末端方向上包含VL和CL结构域的顺序排列(即从N末端至C末端方向的VL-CL)和所述第一重链在N末端至C末端方向包含VH和CH1结构域的顺序排列(即，从N末端至C末端方向的VH-CH1)，其中第一轻链和第一重链源自特异性结合第一抗原的第一抗体；和
b)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换和恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，和恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代；或者
ii)其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，多特异性抗体缺少Fc结构域并且包含
a)第一轻链和第一重链，所述第一轻链在N末端至C末端方向包含VL和CL结构域的顺序排列(即从N末端至C末端方向的VL-CL)，和所述第一重链在N末端至C末端方向包含VH和CH1结构域的顺序排列(即，从N末端至C末端方向的VH-CH1)，其中第一轻链和第一重链源自特异性结合第一抗原的第一抗体；和
b)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换和恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，和恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，多特异性抗体缺少Fc结构域并且包含
a)第一轻链和第一重链，所述第一轻链在N末端至C末端方向包含VL和CL结构域的顺序排列(即从N末端至C末端方向的VL-CL)，和所述第一重链在N末端至C末端方向包含VH和CH1结构域的顺序排列(即，从N末端至C末端方向的VH-CH1)，其中第一轻链和第一重链源自特异性结合第一抗原的第一抗体；和
b)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换和恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，和恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，多特异性抗体包含
a)第一轻链和第一重链，所述第一轻链在N末端至C末端方向上包含VL和CL结构域的顺序排列(即从N末端至C末端方向的VL-CL)和所述第一重链在N末端至C末端方向包含VH,CH1,CH2和CH3结构域的顺序排列(即，从N末端至C末端方向的VH-CH1-CH2-CH3)，其中第一轻链和第一重链源自特异性结合第一抗原的第一抗体；和
b)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换和恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，和恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代；或者
ii)其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，多特异性抗体包含
a)第一轻链和第一重链，所述第一轻链在N末端至C末端方向上包含VL和CL结构域的顺序排列(即从N末端至C末端方向的VL-CL)和所述第一重链在N末端至C末端方向包含VH,CH1,CH2和CH3结构域的顺序排列(即，从N末端至C末端方向的VH-CH1-CH2-CH3)，其中第一轻链和第一重链源自特异性结合第一抗原的第一抗体；和
b)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换和恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，和恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，多特异性抗体包含
a)第一轻链和第一重链，所述第一轻链在N末端至C末端方向上包含VL和CL结构域的顺序排列(即从N末端至C末端方向的VL-CL)和所述第一重链在N末端至C末端方向包含VH,CH1,CH2和CH3结构域的顺序排列(即，从N末端至C末端方向的VH-CH1-CH2-CH3)，其中第一轻链和第一重链源自特异性结合第一抗原的第一抗体；和
b)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换和恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，和恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代。
本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中除了上述修饰之外，在各自的其它CL结构域(即第二重链或第一轻链)中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被带负电荷的氨基酸取代。在位置124处引入的负电荷支持CL结构域与相应的CH1结构域配对(两个结构域都源自第一或第二抗体)。这是由于在CL结构域中的位置124(根据Kabat编号)上引入的带负电荷的氨基酸在多特异性抗体的三级结构中面对相应的CH1结构域上位置124处的带正电荷的氨基酸K。结果，通过引入第二带负电荷的氨基酸，增强了由CL结构域中位置123的谷氨酸(E)残基(根据Kabat编号)引起的在该环境中最初存在的负电荷，从而改善了CL和CH1配对。通过根据本实施方案的氨基酸取代，可以进一步改善多特异性抗体的产率，以及进一步削弱副产物的形成。
本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代，和其中在第二重链的恒定结构域CL，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被带负电荷的氨基酸取代；或者
ii)其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代，和其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被带负电荷的氨基酸取代。
本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E或D的氨基酸取代；或者
ii)其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E或D的氨基酸取代。
本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代，和其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被带负电荷的氨基酸取代。
本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代，和其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E或D的氨基酸取代，在一个优选的实施方案中被E取代。
本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E或D的氨基酸取代，在一个优选的实施方案中被E取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代；和在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代；和在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代，在一个优选的实施方案中被E取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代；和在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代，在一个优选的实施方案中被E取代。
本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代，和其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被带负电荷的氨基酸取代。
本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被带正电荷的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代，和其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E或D的氨基酸取代，在一个优选的实施方案中被E取代。
本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E或D的氨基酸取代，在一个优选的实施方案中被E取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代；和在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代；和在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代，在一个优选的实施方案中被E取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代；和在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代，在一个优选的实施方案中被E取代。
本发明的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和其中在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和其中在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代。
在本发明的一个实施方案中
-在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代；或者
-在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代；和
在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中
-在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代；或者
-在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代；和
在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中
-在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代；或者
-在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代；和
在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代。
在本发明的一个实施方案中
-在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；或者
-在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和
在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中
-在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；或者
-在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和
在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中
-在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；或者
-在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；和
在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K和R的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中
-在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，和在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；或者
-在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，和在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和
在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，和在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，和在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中
-在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，和在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；或者
-在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，和在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；和
在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，和在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被E代替；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，和在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中
-在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，和在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；或者
-在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，和在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；和
在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代。
在本发明的一个实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，和在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代。
在本发明的一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，和在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；和在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代；在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被E取代；和在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被K取代。
在根据本发明的多特异性抗体包含Fc区和/或[包含结构域VH-CH1-CH2-CH3的第一重链和包含结构域VL-CL-CH2-CH3的修饰的第二重链]的情况下，本发明的另一方面是提供一种方法，以改善所需多特异性抗体与不需要的副产物的比例(其可以例如通过将第一重链与另一条第一重链错配形成，或通过第二重链与另一条第二重链错配形成)。根据本发明，这可以另外通过分别在第一重链和第二重链的CH3结构域中的氨基酸取代来支持。通过将在以下段落中进一步详细描述的这些方法，改善了第一重链和修饰的第二重链的异源二聚化。
因此，本发明的一个实施方案是根据本发明的多特异性抗体，其包含第一重链和第二重链，所述第一重链包含源自所述第一抗体的CH3结构域，所述第二重链包含源自所述第二抗体的CH3结构域，其中两个CH3结构域通过各自的氨基酸取代以互补方式改造，以支持第一重链和修饰的第二重链的异源二聚化。
几种用于CH3修饰以支持异源二聚化的方法描述在，例如，WO 96/27011,WO 98/050431,EP 1870459,WO 2007/110205,WO 2007/147901,WO 2009/089004,WO 2010/129304,WO 2011/90754,WO 2011/143545,WO 2012/058768,WO 2013/157954,WO 2013/096291,其通过引用并入本文。通常，在本领域已知的方法中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域均以互补方式被改造，使得包含一个改造的CH3结构域的重链不能再与相同结构的另一条重链同源二聚化(例如CH3-改造的第一重链不能再与另一条CH3-改造的第一重链同源二聚化；以及CH3改造的第二重链不能再与另一条CH3改造的第二重链同源二聚化)。因此，包含一个改造的CH3结构域的重链被迫与包含以互补方式改造的CH3结构域的另一条重链异源二聚化。对于本发明的该实施方案，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域通过氨基酸取代以互补方式改造，使得第一重链和第二重链被强制异源二聚化，而第一重链和第二重链不能再同源二聚化(例如出于立体原因)。
本文中引用和包括的本领域已知的支持重链异源二聚化的不同方法被考虑作为根据本发明的多特异性抗体中使用的不同替换物，所述根据本发明的多特异性抗体包含源自特异性结合第一抗原的第一抗体的“非交叉Fab区”和源自特异性结合第二抗原的第二抗体的“交叉Fab区”，其与上文针对本发明所述的特定氨基酸取代组合。
在根据本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，其包含第一重链和第二重链，所述第一重链包含源自所述第一抗体的CH3结构域和所述第二重链包含源自所述第二抗体的CH3结构域，所述第一和第二重链的CD3结构域由所谓的“杵入臼”技术改造，其提供一些实施例详细描述在例如WO 96/027011,Ridgway,J.B.等人,Protein Eng.9(1996)617-621；Merchant,A.M.等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681和WO 98/050431中,其通过引用并入本文。在“杵入臼”技术中，在抗体三级结构中、在第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域之间形成的界面内，每个CH3结构域上的特定氨基酸被改造以分别在一条重链的CH3结构域中产生突起(“杵”)，在另一条重链的CH3结构域中产生凹穴(“臼”)。在多特异性抗体的三级结构中，一条重链的CH3结构域中引入的突起可定位在另一条重链的CH3结构域中引入的凹穴中。重链中的每条可以在其CH3结构域中包含“杵”，而另一条重链在其CH3结构域中包含“臼”。
因此，一个实施方案涉及根据本发明的多特异性抗体，其中在抗体的三级结构中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域形成位于各抗体CH3结构域之间的界面，其中第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域的相应的氨基酸序列各自包含位于抗体三级结构中的所述界面内的一组氨基酸，
-其中从位于一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，至少一个氨基酸残基被具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基取代，从而在所述界面内产生突起，其中所述突起位于一条重链的CH3结构域中，和其中所述突起可定位在位于所述界面内的另一条重链的CH3结构域中的凹穴内；和
-其中从位于另一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，至少一个氨基酸残基被具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基取代，从而在界面内产生凹穴，其中凹穴位于另一条重链的CH3结构域中，和其中位于一条重链的CH3结构域中的界面内的突起可定位在所述凹穴中。根据该实施方案的多特异性抗体在本文中也称为“CH3(KiH)改造的多特异性抗体”(其中缩写“KiH”代替“杵入臼”技术)。
根据涉及CH3(KiH)改造的多特异性抗体的本发明的该实施方案，CH3(KiH)改造的多特异性抗体的特征以及所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的各种实施方案在以下进一步地详细描述，其可以与上述多特异性抗体的任一实施方案组合。
在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，所述具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基选自R，F，Y和W。
在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，所述具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基选自A，S，T和V。
在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，所述具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基选自R，F，Y和W；并且所述具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基选自A，S，T和V。
在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被W取代；和在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被S替换，位置368的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被A取代，和位置407的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被V取代。
在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被W取代，位置409的氨基酸R(根据Kabat的EU索引编号)被D取代，位置370的氨基酸K(根据Kabat的EU索引编号)被E取代；和在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被S替换，位置368的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被A取代，位置407的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被V取代，位置399的氨基酸D(根据Kabat的EU索引编号)被K取代，位置357的氨基酸E(根据Kabat的EU索引编号)被K取代。
除了通过“杵入臼”技术改造第一和第二重链的CH3结构域之外，引入二硫键桥还进一步稳定异源二聚体(Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35；Merchant,A.M.等人,Nature Biotech.16(1998)677-681)。通过额外引入二硫键桥进一步提高了根据本发明的多特异性抗体的产率。
因此，在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，从位于一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，第一氨基酸被半胱氨酸取代；并且从位于另一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，第二氨基酸被半胱氨酸取代，其中第二氨基酸面向界面内的第一氨基酸；使得可以通过引入的半胱氨酸残基形成一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域之间的二硫键桥。
在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，所述具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基选自R，F，Y和W；并且从位于一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，第一氨基酸被半胱氨酸取代；并且从位于另一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，第二氨基酸被半胱氨酸取代，其中第二氨基酸面向界面内的第一氨基酸；使得可以通过引入的半胱氨酸残基形成一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域之间的二硫键桥。
在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，所述具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基选自A，S，T和V；并且从位于一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，第一氨基酸被半胱氨酸取代；并且从位于另一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸，第二氨基酸被半胱氨酸取代，其中第二氨基酸面向界面内的第一氨基酸；使得可以通过引入的半胱氨酸残基形成一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域之间的二硫键桥。
在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，所述具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基选自R，F，Y和W；所述具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基选自A，S，T和V；并且从位于一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，第一氨基酸被半胱氨酸取代；并且从位于另一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸，第二氨基酸被半胱氨酸取代，其中第二氨基酸面向界面内的第一氨基酸；使得可以通过引入的半胱氨酸残基形成一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域之间的二硫键桥。
在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，所述具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基选自R，F，Y和W；和在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置356的氨基酸E(根据Kabat的EU索引编号)或位置354的氨基酸S(根据Kabat的EU索引编号)被C取代，和在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置349的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被C取代。
在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，所述具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基选自A，S，T和V；和在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置356的氨基酸E(根据Kabat的EU索引编号)或位置354的氨基酸S(根据Kabat的EU索引编号)被C取代，和在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置349的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被C替换。
在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，所述具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基选自R，F，Y和W；并且所述具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基选自A，S，T和V；和在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置356的氨基酸E(根据Kabat的EU索引编号)或位置354的氨基酸S(根据Kabat的EU索引编号)被C取代，和在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置349的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被C取代。
在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被W取代，并且位置356的氨基酸E(根据Kabat的EU索引编号)或位置354的氨基酸S(根据Kabat的EU索引编号)被C取代；和在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被S取代，位置368的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被A取代，位置407的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被V取代，位置349的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被C取代。
在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被W取代，位置349的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被C取代；和在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被S取代，位置368的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被A取代，位置407的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被V取代，和位置356的氨基酸E(根据Kabat的EU索引编号)或位置354的氨基酸S(根据Kabat的EU索引编号)被C取代。
在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被W取代，位置409的氨基酸R(根据Kabat的EU索引编号)被D取代，位置370的氨基酸K(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，位置356的氨基酸E(根据Kabat的EU索引编号)或位置354的氨基酸S(根据Kabat的EU索引编号)被C取代；和在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被S取代，位置368的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被A取代，位置407的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被V取代，位置399的氨基酸D(根据Kabat的EU索引编号)为被K取代，位置357的氨基酸E(根据Kabat的EU索引编号)被K取代，和位置349的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被C取代。
在根据本发明的所述CH3(KiH)改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被W取代，位置409的氨基酸R(根据Kabat的EU索引编号)被D取代，位置370的氨基酸K(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，位置349的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被C取代；和在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被S取代，位置368的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被A取代，位置407的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被V取代，位置399的氨基酸D(根据Kabat的EU索引编号)被K取代，位置357的氨基酸E(根据Kabat的EU索引编号)被K取代，和位置356的氨基酸E(根据Kabat的EU索引编号)或位置354的氨基酸S(根据Kabat的EU索引编号)被C取代。
除了“杵入臼”技术，用于修饰多特异性抗体的重链的CH3结构域以强化异源二聚化的其它技术是本领域已知的。这些技术，特别是在WO 96/27011,WO 98/050431,EP1870459,WO 2007/110205,WO 2007/147901,WO 2009/089004,WO 2010/129304,WO 2011/90754,WO 2011/143545,WO 2012/058768,WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述的那些在本文中被视为与根据本发明的多特异性抗体组合的“杵入臼”技术的替换。
在根据本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，EP 1870459中描述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。该方法基于在第一和第二重链二者之间的CH3/CH3-结构域-界面中的特定氨基酸位置引入带相反电荷的带电荷氨基酸。
因此，本实施方案涉及根据本发明的多特异性抗体，其中在抗体的三级结构中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域形成位于各抗体CH3之间的界面，其中第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域的相应的氨基酸序列各自包含位于抗体三级结构中的所述界面内的一组氨基酸，其中从位于一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸，第一氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，和从位于另一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，第二氨基酸被带负电荷的氨基酸取代。根据本实施方案的多特异性抗体在本文中也称为“CH3(+/-)-改造的多特异性抗体”(其中缩写“+/-”代表在各自的CH3结构域中引入的带相反电荷的氨基酸)。
在根据本发明的所述CH3(+/-)-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K、R和H；和带负电荷的氨基酸选自E或D。
在根据本发明的所述CH3(+/-)-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K和R；和带负电荷的氨基酸选自E或D。
在根据本发明的所述CH3(+/-)-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸是K；和带负电荷的氨基酸是E。
在根据本发明的所述CH3(+/-)-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置409的氨基酸R(根据Kabat的EU索引编号)被D取代，位置370的氨基酸K(根据Kabat的EU索引编号)被E取代；和在另一条重链的CH3结构域中，位置399的氨基酸D(根据Kabat的EU索引编号)被K取代，位置357的氨基酸E(根据Kabat的EU索引编号)被K取代。
在根据本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，在WO2013/157953中描述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。在根据本发明的所述CH3-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被K取代；和在另一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被D取代。在根据本发明的所述CH3-改造的多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被K取代，和位置351的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被K取代；和在另一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被D取代。
在根据本发明的所述CH3-改造的多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被K取代，位置351的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被K取代；和在另一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被D取代。另外，以下取代中的至少一个包含在另一条重链的CH3结构域中：位置349的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，位置349的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被D取代，位置368的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被E取代。在一个实施方案中，位置368的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被E取代。
在根据本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，WO2012/058768中描述的方法用于支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。在根据本发明的所述CH3-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被Y取代，位置407的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被A取代；和在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被A取代，位置409的氨基酸K(根据Kabat的EU索引编号)被F取代。在另一个实施方案中，除了上述取代之外，在另一条重链的CH3结构域中，位置411(原始T)、399(原始D)、400(原始S)、405(原始F)、390(原始N)和392(原始K)的氨基酸中的至少一个被取代。优选的取代是：
-用选自N，R，Q，K，D，E和W的氨基酸取代位置411的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)；
-用选自R，W，Y和K的氨基酸取代位置399的氨基酸D(根据Kabat的EU索引编号)；
-用选自E，D，R和K的氨基酸取代位置400的氨基酸S(根据Kabat的EU索引编号)；
-用选自I，M，T，S，V和W的氨基酸取代位置405的氨基酸F(根据Kabat的EU索引编号)；
-用选自R，K和D的氨基酸取代位置390的氨基酸N(根据Kabat的EU索引编号)；和
-用选自V，M，R，L，F和E的氨基酸取代位置392的氨基酸K(根据Kabat的EU索引编号)。
在根据本发明的所述CH3-改造的多特异性抗体的另一个实施方案中(根据WO2012/058768改造)，在一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被Y取代和位置407的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被A取代；和在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被V取代，位置409的氨基酸K(根据Kabat的EU索引编号)被F取代。在根据本发明的所述CH3-改造的多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置407的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被A取代；和在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被A取代，位置409的氨基酸K(根据Kabat的EU索引编号)被F取代。在所述最后一个上述实施方案中，在所述另一条重链的CH3结构域中，位置392的氨基酸K(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，位置411的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，位置399的氨基酸D(根据Kabat的EU索引编号)被R取代，位置400的氨基酸S(根据Kabat的EU索引编号)被R取代。
在根据本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO 2011/143545中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。在根据本发明的所述CH3-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在两条重链的CH3结构域中的氨基酸修饰引入在位置368和/或409。
在根据本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO 2011/090762中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。WO 2011/090762涉及根据“杵入臼”技术的氨基酸修饰。在根据本发明的所述CH3(KiH)-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被W取代；和在另一重链的CH3结构域中，位置407的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被A取代。在根据本发明的所述CH3(KiH)-改造的多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被Y取代；在另一条重链的CH3结构域中，位置407的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被T取代。
在根据本发明的多特异性抗体的一个实施方案中(其是IgG2同种型)，使用WO2011/090762中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。
在根据本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO 2009/089004中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。在根据本发明的所述CH3-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置392的氨基酸K或N(根据Kabat的EU索引编号)被带负电荷的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E或D取代，在一个优选实施方案中被D取代)；和在另一条重链的CH3结构域中，位置399的氨基酸D、位置356的氨基酸E或D、或位置357的氨基酸E(根据Kabat的EU索引编号)被带正电荷的氨基取代(在一个优选的实施方案中被K或R取代，在一个优选的实施方案中被K取代，在一个优选的实施方案中，位置399或356的氨基酸被K取代)。在一个另外的实施方案中，除了上述取代之外，在一条重链的CH3结构域中，位置409的氨基酸K或R(根据Kabat的EU索引编号)被带负电荷的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E或D取代，在一个优选的实施方案中被D取代)。在一个甚至进一步的实施方案中，除了上述取代之外或作为上述取代的替换，在一条重链的CH3结构域中，位置439的氨基酸K和/或位置370的氨基酸K(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E或D取代，在一个优选的实施方案中被D取代)。
在根据本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO 2007/147901中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。在根据本发明的所述CH3-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置253的氨基酸K(根据Kabat的EU索引编号)被E取代，位置282的氨基酸D(根据Kabat的EU索引编号)被K取代，和位置322的氨基酸K(根据Kabat的EU索引编号)被D取代；和在另一条重链的CH3结构域中，位置239的氨基酸D(根据Kabat的EU索引编号)被K取代，位置240的氨基酸E(根据Kabat的EU索引编号)被K取代和位置292的氨基酸K(根据Kabat的EU索引编号)被D取代。
在根据本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO 2007/110205中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。
在本发明的一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。在本发明的一个优选实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。
在本发明的一个实施方案中，抗体是二价或三价抗体。在本发明的一个实施方案中，抗体是二价抗体。
在本发明的一个实施方案中，多特异性抗体包含一种或多种免疫球蛋白类型的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白类型包括IgG，IgM，IgA，IgD和IgE同种型，以及在IgG和IgA的情况下的其亚型。
在本发明的一个实施方案中，多特异性抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构。在本发明的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG1亚类，或具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类。在本发明的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG2亚类。在本发明的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG3亚类。在本发明的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG4亚类，或具有额外突变S228P的人IgG4亚类。在本发明的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG1或人IgG4亚类。在本发明的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变L234A和L235A(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG1亚类。在本发明的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变L234A，L235A和P329G(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG1亚类。在本发明的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变S228P和L235E(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG4亚类。在本发明的另一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变S228P，L235E和P329G(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG4亚类。
在一个实施方案中，如本文所述包含重链(包含CH3结构域)的抗体包含另外的C-末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，如本文所述包含重链(包含CH3结构域)的抗体包含另外的C-末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。
通过重组方法制备多特异性抗体。因此，本发明还涉及用于制备根据本发明的多特异性抗体的方法，包括以下步骤：
-用包含核酸的载体转化宿主细胞，所述核酸编码
a)如对根据本发明的多特异性抗体所定义的第一轻链，其源自特异性结合第一抗原的第一抗体；
b)如对根据本发明的多特异性抗体所定义的第一重链，其源自特异性结合第一抗原的第一抗体；
c)如对根据本发明的多特异性抗体所定义的第二轻链，其源自特异性结合第二抗原的第二抗体；和
d)如对根据本发明的多特异性抗体所定义的第二重链，其源自特异性结合第二抗原的第二抗体，
-在允许所述多特异性抗体合成的条件下培养所述宿主细胞；和
-从所述宿主细胞培养物中回收所述多特异性抗体。
在根据本发明的方法的一个实施方案中，用包含核酸的载体转化宿主细胞，所述核酸编码
a)源自特异性结合第一抗原的第一抗体的第一轻链，其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被K或R取代，在一个优选的实施方案中被K取代)；
b)源自特异性结合第一抗原的第一抗体的第一重链，其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)；
c)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换，并且恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和
d)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二重链，其中在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，并且恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换。
在根据本发明的方法的一个实施方案中，用包含核酸的载体转化宿主细胞，所述核酸编码
a)源自特异性结合第一抗原的第一抗体的第一轻链；
b)源自特异性结合第一抗原的第一抗体的第一重链；
c)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换，并且恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换，
和其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被K或R取代，在一个优选实施方案中被K取代)；和
d)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二重链，其中在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，并且恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换，
和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
本发明的另一个目的是通过根据本发明的方法产生的多特异性抗体。
本发明的另一个目的是宿主细胞，其包含
a)载体，其包含编码如权利要求1至9之一所定义的第一轻链的核酸，所述第一轻链源自特异性结合第一抗原的第一抗体；
b)载体，其包含编码如权利要求1至9之一所定义的第一重链的核酸，所述第一重链源自特异性结合第一抗原的第一抗体；
c)载体，其包含编码如权利要求1至9之一所定义的第二轻链的核酸，所述第二轻链源自特异性结合第二抗原的第二抗体；和
d)载体，其包含编码如权利要求1至9之一所定义的第二重链的核酸，所述第二重链源自特异性结合第二抗原的第二抗体。
本发明的另一个目的是编码根据本发明的多特异性抗体的核酸。
在一个实施方案中，核酸编码如对根据本发明的多特异性抗体所定义的第一轻链。在一个实施方案中，核酸编码如对根据本发明的多特异性抗体所定义的第一轻链，其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个实施方案中选自K和R，在一个实施方案中，氨基酸是K)。在一个实施方案中，核酸编码如对根据本发明的多特异性抗体所定义的第一轻链，其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个实施方案中，氨基酸是E)。
在一个实施方案中，核酸编码如对根据本发明的多特异性抗体所定义的第一重链。在一个实施方案中，核酸编码如对根据本发明的多特异性抗体所定义的第一重链，其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个实施方案中，氨基酸是E)。
在一个实施方案中，核酸编码如对根据本发明的多特异性抗体所定义的修饰的第二轻链。在一个实施方案中，核酸编码如对根据本发明的多特异性抗体所定义的修饰的第二轻链，其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个实施方案中，氨基酸是E)。在一个另外的实施方案中，核酸编码如对根据本发明的多特异性抗体所定义的修饰的第二轻链，其中在可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中为E)。
在一个实施方案中，核酸编码如对根据本发明的多特异性抗体所定义的修饰的第二重链。在一个实施方案中，核酸编码如对根据本发明的多特异性抗体所定义的修饰的第二重链，其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个实施方案中选自K和R，在一个实施方案中氨基酸是K)。在一个另外的实施方案中，核酸编码如对根据本发明的多特异性抗体所定义的修饰的第二重链，其中在恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个实施方案中，氨基酸是E)。在一个另外的实施方案中，核酸编码如对根据本发明的多特异性抗体所定义的修饰的第二重链，其中在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被K或R取代，在一个优选的实施方案中被K取代)。在一个另外的实施方案中，核酸编码如对根据本发明的多特异性抗体所定义的修饰的第二重链，其中在恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和其中在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
在一个实施方案中，根据本发明的核酸是分离的核酸。
本发明的另一个目的是包含根据本发明的核酸的表达载体，其中所述载体能够在宿主细胞中表达所述核酸。
本发明的另一个目的是包含根据本发明的核酸的宿主细胞。本发明的另一个目的是包含根据本发明的表达载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是HEK293细胞或CHO细胞。
本发明的另一个目的是产生抗体的方法，包括培养本发明的所述宿主细胞以产生抗体。在所述方法的一个实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞中回收抗体。
本发明的另一个目的是包含根据本发明的多特异性抗体的药物组合物。本发明的一个方面是药物组合物，其包含与至少一种可药用载体组合的根据本发明的多特异性抗体。
在一个实施方案中，包含本发明抗体群的组合物(在一个优选实施方案中为药物组合物)包含抗体，所述抗体包含重链，其包含本文所述的CH3结构域和另外的C-末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，包含本发明抗体群的组合物包含抗体，所述抗体包含重链，其包含本文所述的CH3结构域和另外的C-末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施方案中，这样的组合物包含抗体群，所述抗体群由以下抗体组成：包含重链的抗体，所述重链包含本文所述的CH3结构域；包含重链的抗体，所述重链包含本文所述的CH3结构域和另外的C-末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)；和包含重链的抗体，所述重链包含本文所述的CH3结构域和另外的C-末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。
本发明的另一个目的是包含与细胞毒性剂偶联的根据本发明的多特异性抗体的免疫缀合物。
本发明的另一个目的是根据本发明的多特异性抗体在制备药物组合物中的用途。本发明的另一个目的是制备包含根据本发明的多特异性抗体的药物组合物的方法，所述方法包括配制根据本发明的多特异性抗体与至少一种可药用载体的组合。
本发明的另一个目的是根据本发明的多特异性抗体用作药物。本发明的另一个目的是根据本发明的多特异性抗体用于治疗癌症。本发明的另一个目的是根据本发明的多特异性抗体用于治疗炎性疾病，自身免疫性疾病，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，肌肉疾病(例如肌营养不良)，多发性硬化，慢性肾脏疾病，骨疾病(例如，多发性骨髓瘤中的骨变性)，系统性红斑狼疮，狼疮性肾炎和/或血管损伤。
本发明的另一个目的是包含根据本发明的多特异性抗体组合至少一种可药用载体的药物组合物，用作药物。本发明的另一个目的是包含根据本发明的多特异性抗体组合至少一种可药用载体的药物组合物，用于治疗癌症。本发明的另一个目的是包含根据本发明的多特异性抗体组合至少一种可药用载体的药物组合物，用于治疗炎性疾病，自身免疫性疾病，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，肌肉疾病(例如肌营养不良)，多发性硬化，慢性肾脏疾病，骨疾病(例如，多发性骨髓瘤中的骨变性)，系统性红斑狼疮，狼疮性肾炎和/或血管损伤。
本发明的另一个目的是包含偶联至细胞毒性剂的根据本发明的多特异性抗体的免疫缀合物用作药物。本发明的另一个目的是包含偶联至细胞毒性剂的根据本发明的多特异性抗体的免疫缀合物用于治疗癌症。本发明的另一个目的是包含偶联至细胞毒性剂的根据本发明的多特异性抗体的免疫缀合物用于治疗炎性疾病，自身免疫性疾病，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，肌肉疾病(例如肌营养不良)，多发性硬化，慢性肾脏疾病，骨疾病(例如，多发性骨髓瘤中的骨变性)，系统性红斑狼疮，狼疮性肾炎和/或血管损伤。
本发明的另一个目的是根据本发明的多特异性抗体在制备药物中的用途。本发明的另一个目的是根据本发明的多特异性抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。本发明的另一个目的是根据本发明的多特异性抗体在制备用于炎性疾病，自身免疫性疾病，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，肌肉疾病(例如肌营养不良)，多发性硬化，慢性肾脏疾病，骨疾病(例如，多发性骨髓瘤中的骨变性)，系统性红斑狼疮，狼疮性肾炎和/或血管损伤的药物中的用途。
本发明的另一个目的是通过向需要这种治疗的患者施用根据本发明的多特异性抗体来治疗患有疾病的患者的方法。本发明的另一个目的是通过向需要这种治疗的患者施用根据本发明的多特异性抗体来治疗患有癌症的患者的方法。本发明的另一个目的是通过向需要这种治疗的患者施用根据本发明的多特异性抗体来治疗患有至少一种下列疾病的患者的方法，所述疾病包括炎性疾病，自身免疫性疾病，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，肌肉疾病(例如肌营养不良)，多发性硬化，慢性肾脏疾病，骨疾病(例如，多发性骨髓瘤中的骨变性)，系统性红斑狼疮，狼疮性肾炎和血管损伤。
I)本发明的具体实施方案
在下面列出本发明的具体实施方案。
1.一种多特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合第一抗原的第一抗体的第一轻链和第一重链；和
b)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换和恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，和恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代；或者
ii)其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代。
2.根据实施方案1的多特异性抗体，其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个更优选的实施方案中被K取代)，和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
3.根据实施方案1的多特异性抗体，其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选的实施方案中被K取代)，和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
4.根据实施方案1的多特异性抗体，其中
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E取代)；或者
ii)其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
5.根据实施方案2的多特异性抗体，其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E取代)。
6.根据实施方案3的多特异性抗体，其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
7.根据前述实施方案中任一个的多特异性抗体，
iii)其中在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和
其中在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E取代)；和
iv)其中在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E取代)；和其中在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被K或R取代，在一个实施方案中被K取代)。
8.根据前述实施方案中任一个的多特异性抗体，其中第一轻链的恒定结构域CL和第二重链的恒定结构域CL是κ同种型。
9.根据实施方案1至7中任一个的多特异性抗体，其中第一轻链的恒定结构域CL是κ同种型，和第二重链的恒定结构域CL是λ同种型。
10.根据实施方案1至7中任一个的多特异性抗体，其中第一轻链的恒定结构域CL是λ同种型，和第二重链的恒定结构域CL是κ同种型。
11.根据实施方案1至7中任一个的多特异性抗体，其中第一轻链的恒定结构域CL和第二重链的恒定结构域CL是λ同种型。
12.根据实施方案1至9中任一个的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体在第一轻链中包含κ同种型的恒定结构域CL，其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置123的氨基酸E(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)和位置124的氨基酸E(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被K或R取代；在一个另外的优选的实施方案中被K取代)。
13.根据实施方案1至8和10中任一个的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体在第二重链中包含κ同种型的恒定结构域CL，其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置123的氨基酸E(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被K或R取代；在一个另外的优选的实施方案中被K取代)和位置124的氨基酸E(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被K或R取代；在一个另外的优选的实施方案中被K取代)。
14.根据实施方案1至7、10和11中任一个的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体在第一轻链中包含λ同种型的恒定结构域CL，其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置123的氨基酸E(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选的实施方案中被K取代)和位置124的氨基酸Q(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)。
15.根据实施方案1至7、9和11中任一个的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体在第二重链中包含λ同种型的恒定结构域CL，其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置123的氨基酸E(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选的实施方案中被K取代)和位置124的氨基酸Q(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)。
16.根据前述实施方案中任一个的多特异性抗体，其中在抗体的三级结构中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域形成位于各抗体CH3结构域之间的界面，其中第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域的相应的氨基酸序列各自包含位于抗体三级结构中的所述界面内的一组氨基酸，
-其中从位于一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中,至少一个氨基酸残基被具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基取代，从而产生位于所述界面内的突起，其中所述突起位于所述一条重链的CH3结构域中，和其中所述突起可定位在位于所述界面内另一条重链的CH3结构域中的凹穴中；和
-其中从位于另一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，至少一个氨基酸残基被具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基取代，由此在所述界面内产生凹穴，其中所述凹穴位于所述另一条重链的CH3结构域中，和其中位于一条重链的CH3结构域中的界面内的突起可定位在所述凹穴中。
17.根据实施方案16的多特异性抗体，其中所述具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基选自R，F，Y和W；和/或其中所述具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基选自A，S，T和V。
18.根据实施方案16或17中任一个的多特异性抗体，其中在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被W取代；和在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被S取代，位置368的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被A取代和位置407的氨基酸Y被V取代(根据Kabat的EU索引编号)。
19.根据实施方案16至18中任一个的多特异性抗体，其中在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被W取代，位置409的氨基酸R(根据Kabat的EU索引编号)被D取代，和位置370的氨基酸K(根据Kabat的EU索引编号)被E取代；和在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T(根据Kabat的EU索引编号)被S取代，位置368的氨基酸L(根据Kabat的EU索引编号)被A取代和位置407的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被V取代，位置399的氨基酸D(根据Kabat的EU索引编号)被K取代，位置357的氨基酸E(根据Kabat的EU索引编号)被K取代。
20.根据实施方案16至19中任一个的多特异性抗体，其中从位于一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，第一氨基酸被半胱氨酸取代；和从位于另一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸，第二氨基酸被半胱氨酸取代，其中第二氨基酸面向界面内的第一氨基酸；使得可以通过引入的半胱氨酸残基形成一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域之间的二硫键桥。
21.根据实施方案20的多特异性抗体，其中在一条重链的CH3结构域中，位置356的氨基酸E(根据Kabat的EU索引编号)或位置354的氨基酸S(根据Kabat的EU索引编号)被C取代，和在另一条重链的CH3结构域中，位置349的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被C取代。
22.根据实施方案20的多特异性抗体，其中在一条重链的CH3结构域中，位置349的氨基酸Y(根据Kabat的EU索引编号)被C取代；和在另一条重链的CH3结构域中，位置354的氨基酸S(根据Kabat的EU索引编号)被C取代。
23.根据前述实施方案中任一个的多特异性抗体，其中所述抗体是双特异性、三特异性或四特异性的。
24.根据前述实施方案中任一个的多特异性抗体，其中所述抗体是双特异性或三特异性的。
25.根据前述实施方案中任一个的多特异性抗体，其中所述抗体是双特异性的。
26.根据前述实施方案中任一个的多特异性抗体，其中所述抗体是二价或三价的。
27.根据前述实施方案中任一个的多特异性抗体，其中所述抗体是二价的。
28.根据前述实施方案中任一个的多特异性抗体，其中所述抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构。
29.根据前述实施方案中任一个的多特异性抗体，其中所述抗体是人IgG1或人IgG4亚类。
30.根据前述实施方案中任一个的多特异性抗体，其中所述抗体是具有突变L234A和L235A(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG1亚类。
31.根据前述实施方案中任一个的多特异性抗体，其中所述抗体是具有突变S228P和L235E(根据Kabat的EU索引编号)的人IgG4亚类。
32.根据实施方案30或31的多特异性抗体，其中所述抗体还包含P329G突变(根据Kabat的EU索引编号)。
33.根据实施方案1至15、23至27中任一个的多特异性抗体，其中所述抗体缺乏Fc结构域。
34.根据前述实施方案中任一个的多特异性抗体，其特异性结合人血管生成素-2和人VEGF，其中
a)所述抗体包含根据SEQ ID NO：32(<VH Ang2>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ ID NO：33(<VL Ang2>)的可变轻链结构域(VL)；和
b)所述抗体包含根据SEQ ID NO：31(VH VEGF)的可变重链结构域(VH)和根据SEQID NO：30(VL VEGF)的可变轻链结构域(VL)。
35.根据前述实施方案中任一个的多特异性抗体，其特异性结合人血管生成素-2和人VEGF，其中
a)第一抗体包含根据SEQ ID NO：32(<VH Ang2>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ ID NO：33(<VL Ang2>)的可变轻链结构域(VL)；和
b)第二抗体包含根据SEQ ID NO：31((<VH VEGF>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ ID NO：30(<VL VEGF>)的可变轻链结构域(VL)。
36.一种特异性结合人血管生成素-2和人VEGF的双特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合人血管生成素-2的第一抗体的第一轻链和第一重链，在一个优选实施方案中其包含根据SEQ ID NO：32的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：33的可变轻链结构域；和
b)源自特异性结合人VEGF的第二抗体的第二轻链和第二重链，在一个优选实施方案中其包含根据SEQ ID NO：31的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：30的可变轻链结构域，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换，并且恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和
在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，并且恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中，彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)；或者
ii)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
37.一种特异性结合人血管生成素-2和人VEGF的双特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合人血管生成素-2的第一抗体的第一轻链和第一重链，在一个优选的实施方案中其包含根据SEQ ID NO：32的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：33的可变轻链结构域；和
b)源自特异性结合人VEGF的第二抗体的第二轻链和第二重链，在一个优选的实施方案中其包含根据SEQ ID NO：31的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：30的可变轻链结构域，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换，并且恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和
在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，并且恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中，彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
38.一种特异性结合人血管生成素-2和人VEGF的双特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合人血管生成素-2的第一抗体的第一轻链和第一重链，在一个优选实施方案中其包含根据SEQ ID NO：32的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：33的可变轻链结构域；和
b)源自特异性结合人VEGF的第二抗体的第二轻链和第二重链，在一个优选实施方案中其包含根据SEQ ID NO：31的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：30的可变轻链结构域，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换，并且恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和
在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，并且恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中，彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
39.根据实施方案36的特异性结合人血管生成素-2和人VEGF的双特异性抗体，
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中，彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，和其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E取代)；或者
ii)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，和其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
40.根据实施方案37的特异性结合人血管生成素-2和人VEGF的双特异性抗体，
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中，彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，和其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
41.根据实施方案38的特异性结合人血管生成素-2和人VEGF的双特异性抗体，
ii)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，和其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
42.根据实施方案36至41中任一个的特异性结合人血管生成素-2和人VEGF的双特异性抗体，
-其中在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E取代)；和
-其中在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E取代)；和其中在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被K或R取代，在一个实施方案中被K取代)。
43.根据实施方案1至33中任一个的多特异性抗体，其特异性结合人TWEAK和人IL17，其中
a)所述抗体包含根据SEQ ID NO：36(<VH IL17>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ ID NO：37(<VL IL17>)的可变轻链结构域(VL)和
b)所述抗体包含根据SEQ ID NO：35(<VH TWEAK>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ ID NO：34(<VL TWEAK>)的可变轻链结构域(VL)。
44.根据实施方案1至33或43中任一个的多特异性抗体，其特异性结合人TWEAK和人IL17，其中
a)第一抗体包含根据SEQ ID NO：36(<VH IL17>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ ID NO：37(<VL IL17>)的可变轻链结构域(VL)；和
b)第二抗体包含根据SEQ ID NO：35(<VH TWEAK>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ ID NO：34(<VL TWEAK>)的可变轻链结构域(VL)。
45.特异性结合人TWEAK和人IL17的双特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合人IL17的第一抗体的第一轻链和第一重链，在一个优选的实施方案中其包含根据SEQ ID NO：35的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：34的可变轻链结构域；和
b)源自特异性结合人TWEAK的第二抗体的第二轻链和第二重链，在一个优选实施方案中其包含根据SEQ ID NO：36的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：37的可变轻链结构域，
其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换，并且恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和
在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，并且恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中，彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)；或者
ii)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
46.特异性结合人TWEAK和人IL17的双特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合人IL17的第一抗体的第一轻链和第一重链，在一个优选的实施方案中其包含根据SEQ ID NO：35的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：34的可变轻链结构域；和
b)源自特异性结合人TWEAK的第二抗体的第二轻链和第二重链，在一个优选实施方案中其包含根据SEQ ID NO：36的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：37的可变轻链结构域，
其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换，并且恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和
在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，并且恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中，彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
47.特异性结合人TWEAK和人IL17的双特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合人IL17的第一抗体的第一轻链和第一重链，在一个优选的实施方案中其包含根据SEQ ID NO：35的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：34的可变轻链结构域；和
b)源自特异性结合人TWEAK的第二抗体的第二轻链和第二重链，在一个优选实施方案中其包含根据SEQ ID NO：36的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：37的可变轻链结构域，
其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换，并且恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和
在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，并且恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中，彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
48.根据实施方案45的特异性结合人TWEAK和人IL17的双特异性抗体，
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中，彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，和其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E取代)；或者
ii)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，和其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
49.根据实施方案46的特异性结合人TWEAK和人IL17的双特异性抗体，
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中，彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，和其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
50.根据实施方案47的特异性结合人TWEAK和人IL17的双特异性抗体，
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中，彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，和其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
51.根据实施方案45至50中任一个的特异性结合人TWEAK和人IL17的双特异性抗体，
-其中在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；和其中在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E取代)；和
-其中在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E取代)；和
其中在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被K或R取代，在一个实施方案中被K取代)。
52.根据实施方案1至33中任一个的多特异性抗体，其特异性结合人Her1、人Her3和人cMet，其中
a)所述抗体包含根据SEQ ID NO：40(<VH Her1Her3>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ ID NO：41(<VL Her1Her3>)的可变轻链结构域(VL)；和
b)所述抗体包含根据SEQ ID NO：39(<VH cMet>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ ID NO：38(<VL cMet>)的可变轻链结构域(VL)。
53.根据实施方案1至33或52中任一个的多特异性抗体，其特异性结合人Her1、人Her3和人cMet，其中
a)第一抗体包含根据SEQ ID NO：40(<VH Her1Her3>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ ID NO：41(<VL Her1Her3>)的可变轻链结构域(VL)；和
b)第二抗体包含根据SEQ ID NO：39(<VH cMet>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ ID NO：38(<VL cMet>)的可变轻链结构域(VL)。
54.特异性结合人Her1、人Her3和人cMet的三特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合人Her1和人Her3的第一抗体的第一轻链和第一重链，在一个优选的实施方案中其包含根据SEQ ID NO：40的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：41的可变轻链结构域；和
b)源自特异性结合人cMet的第二抗体的第二轻链和第二重链，在一个优选实施方案中其包含根据SEQ ID NO：39的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：38的可变轻链结构域，
其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换，并且恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和
在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，并且恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中，彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；并且其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)；或者
ii)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；并且其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
55.特异性结合人Her1、人Her3和人cMet的三特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合人Her1和人Her3的第一抗体的第一轻链和第一重链，在一个优选的实施方案中其包含根据SEQ ID NO：40的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：41的可变轻链结构域；和
b)源自特异性结合人cMet的第二抗体的第二轻链和第二重链，在一个优选实施方案中其包含根据SEQ ID NO：39的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：38的可变轻链结构域，
其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换，并且恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和
在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，并且恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；并且其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
56.特异性结合人Her1、人Her3和人cMet的三特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合人Her1和人Her3的第一抗体的第一轻链和第一重链，在一个优选的实施方案中其包含根据SEQ ID NO：40的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：41的可变轻链结构域；和
b)源自特异性结合人cMet的第二抗体的第二轻链和第二重链，在一个优选实施方案中其包含根据SEQ ID NO：39的可变重链结构域和根据SEQ ID NO：38的可变轻链结构域，
其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换，并且恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和
在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，并且恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；并且其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
57.根据实施方案54的特异性结合人Her1、人Her3和人cMet的三特异性抗体，
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；并且其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，并且其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E取代)；或者
ii)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；并且其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，并且其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
58.根据实施方案55的特异性结合人Her1、人Her3和人cMet的三特异性抗体，
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；并且其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，并且其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
59.根据实施方案56的特异性结合人Her1、人Her3和人cMet的三特异性抗体，
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；并且其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，并且其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
60.根据实施方案54或59中任一个的特异性结合人Her1、人Her3和人cMet的三特异性抗体，
-其中在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；并且其中在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E取代)；和
-其中在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E取代)；和
其中在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被K或R替换，在一个实施方案中被K取代)。
61.根据前述实施方案中任一个的抗体，用作药物。
62.根据实施方案1至60中任一个的抗体，用于治疗癌症。
63.根据实施方案1至60中任一个的抗体，用于治疗炎性疾病，自身免疫性疾病，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，肌肉疾病(例如肌营养不良)，多发性硬化，慢性肾脏疾病，骨疾病(例如，多发性骨髓瘤中的骨变性)，系统性红斑狼疮，狼疮性肾炎和/或血管损伤。
64.实施方案1至60中任一个的抗体在制备药物中的用途，在一个优选实施方案中用于治疗癌症或治疗炎性疾病，自身免疫性疾病，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，肌肉疾病(例如肌营养不良)，多发性硬化，慢性肾脏疾病，骨疾病(例如，多发性骨髓瘤中的骨变性)，系统性红斑狼疮，狼疮性肾炎和/或血管损伤。
65.一种用于制备根据实施方案1至60中任一个的多特异性抗体的方法，包括以下步骤：
-用包含核酸的载体转化宿主细胞，所述核酸编码
a)如实施方案1至60之一所定义的第一轻链，其源自特异性结合第一抗原的第一抗体；
b)如实施方案1至60之一中所定义的第一重链，其源自特异性结合第一抗原的第一抗体；
c)如实施方案1至60之一所定义的第二轻链，其源自特异性结合第二抗原的第二抗体；和
d)如实施方案1至60之一所定义的第二重链，其源自特异性结合第二抗原的第二抗体，
-在允许所述多特异性抗体合成的条件下培养所述宿主细胞；和
-从所述宿主细胞培养物中回收所述多特异性抗体。
66.在多特异性抗体制备期间减少副产物形成的方法，在根据前述实施方案中任一个的一个优选实施方案中，包括以下步骤：
-用包含核酸的载体转化宿主细胞，所述核酸编码
a)源自特异性结合第一抗原的第一抗体的第一轻链和第一重链；和
b)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换和恒定结构域CL被第二重链的恒定域CH1替换；并且在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，并且恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；
其中为了减少所述多特异性抗体的副产物的形成：
i)在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；并且在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代；或者
ii)在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；并且在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代；
-在允许所述多特异性抗体合成的条件下培养所述宿主细胞；和
-从所述宿主细胞培养物中回收所述多特异性抗体。
67.根据实施方案66的方法，其中为了减少多特异性抗体的副产物的形成：
i)在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；并且在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代。
68.根据实施方案66的方法，其中为了减少多特异性抗体的副产物的形成：
i)在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；并且在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代。
69.根据实施方案66的方法，其中为了减少多特异性抗体的副产物的形成
i)在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；并且在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，并且在第二重链的恒定域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E取代)；或者
ii)在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；并且在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，并且在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
70.根据实施方案67的方法，其中为了减少多特异性抗体的副产物的形成
i)在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；并且在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，并且在第二重链的恒定域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
71.根据实施方案68的方法，其中为了减少多特异性抗体的副产物的形成
i)在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在一个另外的优选实施方案中被K取代)；并且在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)，并且在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)。
72.根据实施方案66至71中任一个的方法，其中为了减少多特异性抗体的副产物的形成，包括以下的氨基酸取代
-在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中彼此独立地被K或R取代；在另一个优选的实施方案中被K取代)；并且在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被E取代)；和
-其中在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；(在一个优选实施方案中E)和
其中在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被K或R取代，在一个实施方案中被K取代)。
73.通过根据实施方案65的方法产生的多特异性抗体。
74.一种核酸，其编码以下氨基酸序列
a)如实施方案1至60之一所定义的第一轻链，
b)如实施方案1至60之一所定义的第二轻链，
c)如实施方案1至60之一所定义的第一重链；或者
d)如实施方案1至60之一所定义的第二重链。
75.一种载体，其包含根据实施方案74的核酸，其中所述载体能够在宿主细胞中表达所述核酸。
76.一种表达载体，其包含根据实施方案74的核酸，其中所述载体能够在宿主细胞中表达所述核酸。
77.一种宿主细胞，其包含根据实施方案74的核酸。
78.一种宿主细胞，其包含根据实施方案75的载体或根据实施方案76的表达载体。
79.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至60中任一个的多特异性抗体组合至少一种可药用载体。
80.根据实施方案79的药物组合物，用作药物。
81.根据实施方案79的药物组合物，用于治疗癌症。
82.根据实施方案79的药物组合物，用于治疗炎性疾病，自身免疫性疾病，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，肌肉疾病(例如肌营养不良)，多发性硬化，慢性肾脏疾病，骨疾病(例如，多发性骨髓瘤中的骨变性)，系统性红斑狼疮，狼疮性肾炎和/或血管损伤。
83.一种免疫缀合物，其包含与细胞毒性剂偶联的实施方案1至60之一的抗体。
84.根据实施方案83的免疫缀合物，用作药物。
85.根据实施方案83的免疫偶联物，用于治疗癌症，或用于炎性疾病，自身免疫性疾病，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，肌肉疾病(例如肌营养不良)，多发性硬化，慢性肾脏疾病，骨疾病(例如，多发性骨髓瘤中的骨变性)，系统性红斑狼疮，狼疮性肾炎和/或血管损伤。
氨基酸序列的描述
SEQ ID NO:1重链(HC)<VEGF>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换的野生型(wt)
SEQ ID NO:2轻链(LC)<VEGF>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换的野生型(wt)
SEQ ID NO:3重链(HC)<Ang-2>野生型(wt)
SEQ ID NO:4κ轻链(LC)<Ang-2>野生型(wt)
SEQ ID NO:5重链(HC)<Ang-2>，具有K213E和K147E取代
SEQ ID NO:6κ轻链(LC)<Ang-2>，具有E123K和Q124K取代
SEQ ID NO:7重链(HC)<VEGF>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换，具有Q124E取代
SEQ ID NO:8重链(HC)<VEGF>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换，具有Q124E和Q38E取代
SEQ ID NO:9轻链(LC)<VEGF>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换，具有Q39K取代
SEQ ID NO:10重链(HC)<Ang-2>，具有K213E、K147E和Q39E取代
SEQ ID NO:11κ轻链(LC)<Ang-2>，具有E123K、Q124K和Q38K取代
SEQ ID NO:12λ轻链(LC)<Ang-2>野生型(wt)
SEQ ID NO:13λ轻链(LC)<Ang-2>，具有E123K和E124K取代
SEQ ID NO:14重链(HC)<TWEAK>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换的野生型(wt)
SEQ ID NO:15轻链(LC)<TWEAK>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换的野生型(wt)
SEQ ID NO:16重链(HC)<IL17>野生型(wt)
SEQ ID NO:17κ轻链(LC)<IL17>野生型(wt)
SEQ ID NO:18重链(HC)<IL17>，具有K213E和K147E取代
SEQ ID NO:19κ轻链(LC)<IL17>，具有E123K和Q124K取代
SEQ ID NO:20重链(HC)<TWEAK>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换，具有Q124E取代
SEQ ID NO:21重链(HC)<cMet>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换的野生型(wt)
SEQ ID NO:22轻链(LC)<cMet>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换的野生型(wt)
SEQ ID NO:23重链(HC)<Her1Her3>野生型(wt)
SEQ ID NO:24κ轻链(LC)<Her1Her3>野生型(wt)
SEQ ID NO:25重链(HC)<cMet>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换，具有Q124E取代
SEQ ID NO:26重链(HC)<Her1Her3>，具有K213E和K147E取代
SEQ ID NO:27κ轻链(LC)<Her1Her3>E123K和Q124K取代
SEQ ID NO:28重链(HC)<Her1Her3>，具有K213D和K147E取代
SEQ ID NO:29κ轻链(LC)<Her1Her3>E123R和Q124K取代
SEQ ID NO:30可变重链结构域<VEGF>289
SEQ ID NO:31可变轻链结构域<VEGF>289
SEQ ID NO:32可变重链结构域<Ang-2>289
SEQ ID NO:33可变轻链结构域<Ang-2>289
SEQ ID NO:34可变重链结构域<TWEAK>
SEQ ID NO:35可变轻链结构域<TWEAK>
SEQ ID NO:36可变重链结构域<IL17>
SEQ ID NO:37可变轻链结构域<IL17>
SEQ ID NO:38可变重链结构域<cMet>
SEQ ID NO:39可变轻链结构域<cMet>
SEQ ID NO:40可变重链结构域<Her1Her3>
SEQ ID NO:41可变轻链结构域<Her1Her3>
SEQ ID NO:42重链(HC)<TWEAK>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换，具有Q38E和Q124E取代
SEQ ID NO:43轻链(LC)<TWEAK>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换，具有Q39K取代
SEQ ID NO:44重链(HC)<IL17>，具有K213E,K147E和Q39E取代
SEQ ID NO:45κ轻链(LC)<IL17>，具有E123K,Q124K和Q38K取代
SEQ ID NO:46重链(HC)<VEGF>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换，具有Q124E取代，具有野生型CH3
SEQ ID NO:47重链(HC)<Ang-2>，具有K231E，K147E取代，具有野生型CH3
SEQ ID NO:48重链(HC)<VEGF>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换，具有野生型CH3
SEQ ID NO:49重链(HC)<VEGF>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换，具有E123K、Q124K取代
SEQ ID NO:50轻链(LC)<VEGF>，具有VL-VH/CL-CH1结构域交换，具有K213E,K147E取代
SEQ ID NO:51κ轻链(LC)<Ang-2>，具有Q124E取代
实施例
提供以下实施例以帮助理解本发明，其真实范围在所附权利要求中阐述。应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对所阐述的步骤进行修改。
在以下部分中，如果没有另外说明，LC＊表示修饰的轻链<CH1-VH>，HC＊表示修饰的重链<CL-VL>或<CH3-CH2-CL-VL>。
材料和一般方法
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中给出。抗体链的氨基酸根据Kabat(Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))编号进行编号和参照。
重组DNA技术
使用标准方法操作DNA，如Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989所述。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。
基因合成
从化学合成制备的寡核苷酸制备所需的基因区段。通过退火和连接寡核苷酸(包括PCR扩增)组装侧翼有单一限制性内切核酸酶切割位点的600-1800bp长的基因区段，并随后通过指定的限制性位点，如KpnI/SacI或AscI/PacI克隆至基于pGA4克隆载体的pPCRScript(Stratagene)。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。根据在Geneart(Regensburg，Germany)中给出的说明排序基因合成片段。
DNA序列测定
通过在MediGenomix GmbH(Martinsried，Germany)或Sequiserve GmbH(Vaterstetten，Germany)上进行的双链测序来测定DNA序列。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)软件包版本10.2和Infomax的Vector NT1Advance suite版本8.0用于序列产生、定位、分析、注释和说明。
表达载体
为了表达所述抗体，使用基于具有或不具有CMV内含子A启动子的cDNA构造(organization)或基于具有CMV启动子的基因组构造的用于瞬时表达(例如在HEK293EBNA或HEK293-F中)细胞的表达质粒的变体。
除了抗体表达盒之外，载体包含：
-允许该质粒在大肠杆菌中复制的复制起点，和
-赋予大肠杆菌氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
抗体基因的转录单位由以下元件组成：
-在5'端的独特限制性位点，
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
-在cDNA构造的情况下随后是内含子A序列，
-人抗体基因的5'-非翻译区，
-免疫球蛋白重链信号序列，
-人抗体链(野生型或具有结构域交换)作为cDNA或作为基因组构造，具有免疫球蛋白外显子-内含子构造，
-具有聚腺苷酸化信号序列的3'非翻译区，和
-在3'端的独特限制性位点。
通过PCR和/或基因合成产生包含如下所述的抗体链的融合基因，并通过已知的重组方法和技术例如使用独特的限制性位点通过连接相应的核酸区段在各个载体中组装。通过DNA测序验证亚克隆的核酸序列。对于瞬时转染，通过从转化的大肠杆菌培养物的质粒制备来制备更大量的质粒(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)。
细胞培养技术
使用标准细胞培养技术，如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编著),John Wiley&Sons,Inc中所述。
通过在粘附生长的HEK293-EBNA中或在悬浮生长的HEK29-F细胞中瞬时共转染各表达质粒来表达多特异性抗体，如下所述。
HEK293-EBNA系统中的瞬时转染
通过在粘附生长的HEK293-EBNA细胞(表达EB病毒核抗原的人胚胎肾细胞系293；美国典型培养物保藏号ATCC#CRL-10852，Lot.959218)中瞬时共转染各表达质粒(例如编码重链和修饰的重链、以及相应的轻链和修饰的轻链)来表达多特异性抗体，所述细胞培养在补充有10％超低IgG FCS(胎牛血清，)、2mM L-谷氨酰胺和250μg/ml遗传霉素的DMEM(Dulbecco's modified Eagle's培养基，)中。使用FuGENETM 6转染试剂(Roche Molecular Biochemicals)转染，其中FuGENETM试剂(μl)与DNA(μg)的比例为4:1(范围为3:1至6:1)。使用等摩尔比的编码(修饰的和野生型)轻链和(修饰的和野生型)重链的质粒从各质粒表达蛋白质。细胞在第3天用L-谷氨酰胺ad 4mM，葡萄糖[Sigma]和NAA饲养。在转染后第5至11天通过离心收集含有多特异性抗体的细胞培养物上清液，并储存在-20℃。关于在例如HEK293细胞中重组表达人免疫球蛋白的一般信息在下列文献中给出Meissner,P.等人,Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203。
HEK293-F系统中的瞬时转染
使用HEK293-F系统(Invitrogen)根据制造商的说明书、通过用各质粒(例如编码重链和修饰的重链，以及相应的轻链和修饰的轻链)瞬时转染产生多特异性抗体。简言之，用四种表达质粒和293fectinTM或fectin(Invitrogen)的混合物转染在摇瓶中或搅拌发酵罐中、在无血清FreeStyleTM 293表达培养基(Invitrogen)中悬浮生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)。对于2L摇瓶(Corning)，将HEK293-F细胞以1.0E＊6细胞/mL的密度接种在600mL中，并在120rpm、8％CO2中孵育。第二天，细胞以约1.5E＊6细胞/mL的细胞密度，用约42mL的A)和B)的混合物转染：A)20mL Opti-MEM(Invitrogen)，具有等摩尔比的分别编码重链或修饰的重链和相应的轻链或修饰的轻链的600μg总质粒DNA(1μg/mL)，和B)20ml Opti-MEM+1.2mL 293fectin或fectin(2μl/mL)。根据葡萄糖消耗，在发酵过程中加入葡萄糖溶液。5-10天后收获含有分泌的抗体的上清液，从上清液中直接纯化抗体或冷冻保存上清液。
蛋白质测定
根据Pace,等人,Protein Science,1995,4,2411-1423通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数、通过测定280nm处的光密度(OD)测定纯化的抗体和衍生物的蛋白质浓度。
上清液中的抗体浓度测定
通过用蛋白A琼脂糖珠(Roche)的免疫沉淀来估计细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。60μL蛋白A琼脂糖珠在TBS-NP40(50mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，1％Nonidet-P40)中洗涤三次。随后，将1-15mL细胞培养上清液应用于在TBS-NP40中预平衡的蛋白A琼脂糖珠。在室温下孵育1小时后，将珠在Ultrafree-MC-过滤柱(Amicon)上用0.5mLTBS-NP40洗涤一次，用0.5mL 2x磷酸盐缓冲盐水(2xPBS，Roche)洗涤两次，并用0.5mL100mM柠檬酸钠pH5.0短暂洗涤4次。通过加入35μlLDS样品缓冲液(Invitrogen)洗脱结合的抗体。分别将一半样品与样品还原剂组合或保留未还原，并在70℃下加热10分钟。因此，将5-30μl应用于4-12％Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(具有用于非还原SDS-PAGE的MOPS缓冲液和具有抗氧化运行缓冲液添加剂用于还原SDS-PAGE的MES缓冲液(Invitrogen))并用考马斯蓝染色。
通过亲和HPLC色谱法定量测量细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。简言之，将含有结合蛋白A的抗体和衍生物的细胞培养物上清液施加到200mM KH2PO4、100mM柠檬酸钠，pH 7.4的Applied Biosystems Poros A/20柱上，并用200mM NaCl、100mM柠檬酸，pH2.5，在Agilent HPLC 1100系统上从基质洗脱。通过UV吸光度和峰面积的积分来定量洗脱的蛋白质。纯化的标准IgG1抗体作为标准。
或者，通过夹心-IgG-ELISA测量细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。简言之，用100μL/孔的生物素化抗人IgG捕获分子F(ab')2<h-Fcγ>BI(Dianova)以0.1μg/mL在室温下包被Strepta孔高结合链霉亲和素A-96孔微量滴定板(Roche)1小时或者在4℃过夜，随后用200μL/孔PBS、0.05％Tween(PBST，Sigma)洗涤三次。将100μL/孔含有PBS(Sigma)中系列稀释的相应抗体的细胞培养物上清液加入到孔中，并在室温下在微量滴定板振荡器上孵育1-2小时。用200μL/孔的PBST洗涤孔三次，并用100μl F(ab')2<hFcγ>POD(Dianova)以0.1μl/mL作为检测抗体在微量滴定板振荡器上持续1-2小时检测结合的抗体。未结合的检测抗体用200μL/孔PBST洗涤三次，并通过加入100μL ABTS/孔检测结合的检测抗体。在Tecan Fluor光谱仪上在405nm的测量波长下(参考波长492nm)进行吸光度的测定。
蛋白纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，将抗体施加于蛋白A Sepharose柱(GE healthcare)上并用PBS洗涤。在pH 2.8下实现抗体的洗脱，然后立即中和样品。通过尺寸排阻色谱法(Superdex 200，GE Healthcare)在PBS中或在20mM组氨酸、150mM NaCl pH 6.0中将聚集的蛋白从单体抗体分离。汇集单体抗体级分，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩(如果需要)，冷冻并储存在-20℃或-80℃。提供部分样品用于随后的蛋白质分析和分析表征，例如通过SDS-PAGE、尺寸排阻色谱法(SEC)或质谱法。
SDS-PAGE
根据制造商的说明书使用Pre-Cas凝胶系统(Invitrogen)。特别地，使用10％或4-12％Bis-TRIS Pre-Cast凝胶(pH 6.4)和MES(还原凝胶，具有抗氧化运行缓冲液添加剂)或MOPS(非还原凝胶)运行缓冲液。
CE-SDS
使用微流体Labchip技术(PerkinElmer，USA)通过CE-SDS分析纯度和抗体完整性。使用HT蛋白表达试剂试剂盒(HT Protein Express Reagent Kit)根据制造商的说明制备5μl蛋白质溶液用于CE-SDS分析，并使用HT蛋白表达芯片(HT Protein Express Chip)在LabChip GXII系统上分析。使用LabChip GX软件分析数据。
分析性尺寸排阻色谱法
通过HPLC色谱法进行尺寸排阻色谱法(SEC)，用于测定抗体的聚集和寡聚状态。简言之，将蛋白A纯化的抗体施加到Agilent HPLC1100系统的300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4，pH 7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱上，或Dionex HPLC-系统的2×PBS中的Superxex200柱(GE Healthcare)上。通过UV吸光度和峰面积的积分来定量洗脱的蛋白质。BioRad凝胶过滤标准151-1901作为标准。
质谱法
本节描述了具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)的多特异性抗体的表征，重点在于它们的正确装配。通过去糖基化的完整CrossMAb的电喷雾离子化质谱法(ESI-MS)和在去糖基化/限制性LysC消化的CrossMab的特殊情况下分析预期的一级结构。
在磷酸盐或Tris缓冲液中在37℃下用N-糖苷酶F将CrossMabFab去糖基化至多17小时，蛋白质浓度为1mg/ml。使用100μg去糖基化的CrossMabFab在Tris缓冲液pH8中分别进行室温下120小时和在37℃下40分钟的纤溶酶或限制性LysC(Roche)消化。在质谱法分析之前，样品通过HPLC在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上脱盐。在配备有TriVersaNanoMate源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(Bruker Daltonik)上通过ESI-MS测定总质量。
使用表面等离子体共振(SPR)(BIACORE)测定多特异性抗体与各抗原的结合和结合亲和力
根据以下步骤测定VEGF结合：
使用T200仪器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振研究所示抗体与人VEGFA-121的结合。通过使用由GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒，大约10000(RU)的抗His抗体(1μg/ml抗His抗体；订购代码：28995056；GE Healthcare Bio-SciencesAB，Sweden)偶联在系列S CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上，pH 5.0。在固定过程中使用HBS-N(10mM HEPES、150mM NaCl，pH 7.4，GE Healthcare)作为运行缓冲液。对于以下动力学表征，样品和运行缓冲液是pH 7.4的PBS-T(10mM磷酸盐缓冲盐水，包括0.05％Tween20)。流动池设置为25℃-，并且样品块设置为12℃-，并且在动力学表征之前用运行缓冲液引发两次。
通过以5μl/min的流速注射0.5μg/ml溶液30秒来捕获VEFGA-121-His。通过以30μl/min的流速、从1:3系列稀释中的1000nM开始注射溶液中不同浓度的所示抗体180秒来测量结合。监测解离相至多600秒，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液来触发。通过用甘氨酸pH1.5的溶液以30μl/min的流速洗涤60秒来再生表面。通过减去从抗His抗体表面获得的响应来校正体积折射率差异(Bulk refractive index differences)。也减去空白注射(＝双参考)。为了计算KD和其它动力学参数，使用Langmuir 1：1模型。
根据以下步骤测定Ang-2结合：
使用T200仪器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振研究所示抗体与人Ang-2-RBD-Fc的结合。通过使用由GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒，大约8000(RU)的山羊抗人F(ab’)2(10μg/ml抗人F(ab’)2；订购代码：28958325；GE Healthcare Bio-Sciences AB，Sweden)偶联在系列S CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上，pH 5.0。在固定过程中使用HBS-N(10mM HEPES、150mM NaCl，pH 7.4，GE Healthcare)作为运行缓冲液。对于以下动力学表征，样品和运行缓冲液是pH 7.4的PBS-T(10mM磷酸盐缓冲盐水，包括0.05％Tween20)。流动池设置为25℃-，并且样品块设置为12℃-，并且在动力学表征之前用运行缓冲液引发两次。
通过以5μl/min的流速注射5nM溶液25秒来捕获双特异性抗体。通过以30μl/min的流速、从1:3系列稀释中的100nM开始注射溶液中不同浓度的人Ang2-RBD-Fc 120秒来测量结合。监测解离相至多180秒，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液来触发。通过用甘氨酸pH2.1的溶液以30μl/min的流速洗涤60秒来再生表面。通过减去从山羊抗人F(ab’)2表面获得的响应来校正体积折射率差异。也减去空白注射(＝双参考)。为了计算表观KD，使用Langmuir 1：1模型。
根据以下步骤测定IL-17结合：
通过使用GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒，约6000共振单位(RU)的捕获系统(15μg/ml山羊抗人F(ab')2；订购代码：28958325；GE Healthcare Bio-Sciences AB，Schweden)偶联在CM5芯片上，pH5.0。样品和系统缓冲液是PBS-T(10mM磷酸盐缓冲盐水，包括0.05％Tween20)pH 7.4。通过以10μl/min的流速注射50nM溶液90秒来捕获双特异性抗体。通过以30μl/min的流速、从1:1系列稀释中的50nM开始注射溶液中不同浓度的人IL7持续3分钟来测量结合。监测解离相至多10分钟，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液来触发。通过用10mM甘氨酸pH2.1的溶液以30μl/min的流速洗涤60秒来再生表面。通过减去从山羊抗人F(ab’)2表面获得的响应来校正体积折射率差异。也减去空白注射(＝双参考)。为了计算表观KD和其它动力学参数，使用Langmuir 1：1模型。
根据以下步骤测定TWEAK结合：
由于TWEAK分析物与传感器表面的强烈非特异性结合，选择使用TWEAK作为配体的反向设置。使用GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒将约100RU的TWEAK固定在C1芯片表面上，pH5.0。样品和系统缓冲液是PBS-T(10mM磷酸盐缓冲盐水，包括0.05％Tween 20)pH7.4。通过以30μl/min的流速、从1:1系列稀释中的50nM开始注射溶液中不同浓度的双特异性抗体持续3分钟来测量结合。监测解离相至多10分钟，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液来触发。用3M MgCl2溶液以30μl/min的流速洗涤30秒三次来再生表面。通过减去从空白偶联表面获得的响应来校正体积折射率差异。也减去空白注射(＝双参考)。为了计算KD和其它动力学参数，使用Langmuir 1：1模型。
实施例1A
结合血管生成素-2(ANG2)和血管内皮生长因子(VEGF)的二价、双特异性抗体的产生和表达，其在一个结合臂中具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)并且在CH1/CL界面具有两个带电荷的氨基酸取代
在第一个实施例中，如一般方法部分中描述的通过经典分子生物学技术产生结合人血管生成素-2(ANG2)和人血管内皮生长因子(VEGF)的双特异性抗体，并如上所述在HEK293细胞中瞬时表达。
这些各双特异性抗体的一般方案在图1中给出。为了进行比较分析，制备了在CH1/CL界面中没有带电荷的氨基酸取代的野生型(wt)VL-VH/CL-CH1结构域交换抗体。使用含有编码如表1所示的氨基酸序列的核酸的表达质粒表达双特异性抗体。
表1：具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)的抗Ang2-VEGF双特异性抗体Ang2VEGF-0289、Ang2VEGF-280、Ang2VEGF-111、Ang2VEGF_290和Ang2VEGF_279的轻链(LC)和重链(HC)的氨基酸序列交换：野生型(wt)和具有带电荷氨基酸取代的不同组合
…Ang2VEGF_290和Ang2VEGF_279包括具有λ轻链的Ang2特异性抗体，而所有其它列出的抗-Ang2-VEGF双特异性抗体包括κ轻链
对于所有构建体，使用杵入臼异源二聚化技术，其中在第一CH3结构域中具有典型的杵(T366W)取代，并且在第二CH3结构域中具有相应的臼取代(T366S、L368A和Y407V)(以及两个额外引入的半胱氨酸残基S354C/Y349'C)(包含在上述各相应的重链(HC)序列中)。
实施例1B
结合ANG2和VEGF的二价、双特异性抗体的纯化和表征，其在一个结合臂中具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)并且在CH1/CL界面中具有两个带电荷的氨基酸取代
通过蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法的组合从上清液中纯化上文实施例1A中表达的双特异性抗体。所有双特异性抗体可以以良好的产率生产并且是稳定的。通过质谱法表征所获得产物的同一性并通过CE-SDS表征分析性质如纯度、单体含量和稳定性。
通过如一般方法部分中所述的去糖基化的完整CrossMAb和去糖基化/纤溶酶消化的或去糖基化/限制性LysC消化的CrossMAb的电喷雾离子化质谱法(ESI-MS)分析预期的一级结构。
结果示于表2a和图4中。
表2a：通过CH1/CL界面中的带电荷氨基酸取代，减少作为副产物的非功能性重链二聚体(HC)2形成
…Ang2VEGF_290和Ang2VEGF_279包括具有λ轻链的Ang2-特异性抗体，而所有其它列出的抗-Ang2-VEGF双特异性抗体包括κ轻链。...蛋白A色谱法后。
表2b总结了所述实验的重复：
表2b：通过CH1/CL界面中的带电荷氨基酸取代，减少作为副产物的非功能性重链二聚体(HC)2形成
…Ang2VEGF_290和Ang2VEGF_279包括具有λ轻链的Ang2特异性抗体，而所有其它列出的抗-Ang2-VEGF双特异性抗体包括κ轻链；＊蛋白A纯化后；#蛋白A和SEC纯化后。
表2a和b和图4中的结果显示，通过在“未交叉”侧的CH1结构域中(K213E，K147E)以及CL结构域中(E123K，Q124K)用相反电荷取代两个带电荷的氨基酸，如上文对本发明的进一步详细描述，与没有这种取代的野生型双特异性抗体相比，主要副产物(非功能性重链二聚体)的形成被大大降低。实验证明当在κ轻链(测试抗体Ang2VEGF-0289[wt]、Ang2VEGF-280、Ang2VEGF-111)以及在λ轻链(测试抗体Ang2VEGF_290[wt]和Ang2VEGF_279)中进行时，电荷取代减少副产物形成。
通过在“交叉”侧的CL结构域中引入额外的带电氨基酸，可进一步降低副产物的形成(测试抗体Ang2VEGF-0289[wt]、Ang2VEGF-280[在“交叉”侧没有额外的电荷)、Ang2VEGF-111[在交叉侧有额外的电荷])。
抗原结合：
如一般方法部分中所述，通过测定多特异性抗体与其各自的靶抗原(即ANG2和VEGF)的结合。
作为比较实施例，平行测定特异性结合Ang2和VEGF参照抗体，其包含VH/VL结构域交换/置换但缺少带电荷的氨基酸取代(Ang2VEGF-0290抗体)。
用来自概述于表2b中的重复实验的纯化材料进行亲和力测定。
结果示于表2c和2d中。
表2c：所示抗体对VEGF的亲和力
| 样品 | KD(nM) |
| Ang2VEGF-0280 | 7 |
| Ang2VEGF-0290(wt) | 8 |
| Ang2VEGF-0279 | 6 |
表2d：所示抗体对Ang2的亲和力
测试的抗体特异性结合两个靶标，Ang2和VEGF，并且表现出纳摩尔范围内的抗原亲和力。
稳定性：
为了测定抗体构建体的稳定性，测定聚集开始的温度。使用来自表2b中概述的重复实验的纯化材料进行热稳定性测量。
结果示于表2e中。
表2e：所示抗体的聚集开始的温度(Tagg)
| 样品 | Tagg(℃) |
| Ang2VEGF-0280 | 61.0 |
| Ang2VEGF-0290(wt) | 62.0 |
| Ang2VEGF-0279 | 61.0 |
实施例1C
结合TNF-相关的细胞凋亡弱诱导剂(TWEAK)和白细胞介素-17(IL17)的二价、双特异性抗体的产生和表达，其在一个结合臂中具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)，并且在CH1/CL界面中具有两个带电荷的氨基酸取代
在第二个实施例中，如一般方法部分中所述的通过经典分子生物学技术产生结合人TNF相关的细胞凋亡弱诱导剂(TWEAK)和人白细胞介素-17(IL17)的双特异性抗体，并如以上所述在HEK293细胞中瞬时表达。
这些各双特异性抗体的一般方案在图1a中给出。为了进行比较分析，制备了在CH1/CL界面中没有带电荷的氨基酸取代的野生型(wt)VL-VH/CL-CH1结构域交换抗体。使用含有编码如表3所示的氨基酸序列的核酸的表达质粒表达双特异性抗体。
表3：具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)的抗-Tweak-IL17双特异性抗体TweakIL17_101、TweakIL17_102、TweakIL17_103的轻链(LC)和重链(HC)的氨基酸序列：野生型(wt)和具有带电荷氨基酸取代的不同组合
＊只可获得自重复实验的数据
对于所有构建体，使用杵入臼异源二聚化技术，其中在第一CH3结构域中具有典型的杵(T366W)取代，并且在第二CH3结构域中具有相应的臼取代(T366S、L368A和Y407V)(以及两个额外引入的半胱氨酸残基S354C/Y349′C)(包含在上述各相应的重链(HC)序列中)。
实施例1D
结合TWEAK和IL17的二价、双特异性抗体的纯化和表征，其在一个结合臂中具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)并且在CH1/CL界面中具有两个带电荷的氨基酸取代
通过蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法的组合从上清液中纯化上文实施例1C中表达的双特异性抗体。所有双特异性抗体可以以良好的产率生产并且是稳定的。通过质谱法表征所获得产物的同一性并通过CE-SDS表征分析的性质如纯度、单体含量和热稳定性。
通过如一般方法部分中所述的去糖基化的完整CrossMAb和在多种去糖基化/限制性LysC消化的CrossMAb的情况中的电喷雾离子化质谱法(ESI-MS)分析预期的一级结构。
结果示于表4a和图5中。
表4a：通过在CH1/CL界面中的带电荷氨基酸取代减少蛋白A色谱法后副产物的形成
来自重复示例实验的数据总结在表4b中。
表4b：通过在CH1/CL界面中的带电荷氨基酸取代减少蛋白A色谱法后副产物的形成
通过CE-SDS的所需分子的纯度(主峰含量)
表4c：通过在CH1/CL界面中带电荷的氨基酸取代，减少蛋白A和制备型尺寸排阻色谱法后副产物的形成
＊通过CE-SDS的纯度(主峰含量)
表4a，4b和4c以及图5中的结果显示，通过在“未交叉”侧的CH1结构域(K213E，K147E)中以及CL结构域(E123K，Q124K)中通过用相反电荷取代两个带电氨基酸，如以上对本发明的进一步详细描述，与没有这样的取代的野生型双特异性抗体相比，主要副产物(非功能性重链二聚体)的形成被大大降低。通过在“交叉”侧的CL结构域(κ链)中引入额外的带电荷氨基酸，可以进一步减少主要副产物(非功能性重链二聚体)的形成。剩余副产物，即非功能性重链二聚体，可以容易地通过尺寸排阻色谱法从所需分子中分离。
抗原结合：
如一般方法部分所述，使用T200仪器(GE Healthcare)在25℃下通过表面等离子体共振(SPR)测量多特异性抗体与其各自的靶抗原(即TWEAK和IL-17)的结合。
作为比较例，平行测定特异性结合TWEAK和IL-17的参照抗体(TweakIL17_101抗体)，其包含VH/VL结构域交换/置换但缺乏带电荷的氨基酸取代。
使用来自表4d和4e中概述的重复实验的纯化材料进行亲和力测量。
表4d：所示抗体对IL-17的亲和力
| 样品 | KD(nM) |
| TweakIL17_101(wt) | 0.1 |
| TweakIL17_102 | 0.1 |
| TweakIL17_103 | 0.1 |
| TweakIL17_128 | 0.1 |
表4e：所示抗体对于Tweak的亲和力
测试的抗体以与缺少氨基酸取代的相应抗体可比较的方式特异性结合两个靶标，TWEAK和IL-17。
实施例1E
结合Her1和Her3(以双重作用Fab[DAF]形式的组合)以及Met原癌基因(cMet)的三特异性抗体的产生和表达，其一个结合臂上具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossDAFFab)，并且在CH1/CL界面中具有带电荷的氨基酸取代
在第三个实施例中，如一般方法部分中所述通过经典分子生物学技术产生结合ErbB家族成员Her1和Her3以及Met原癌基因(cMet)的三特异性抗体，并如上所述在HEK293细胞中瞬时表达。在该构建体中，针对Her1和Her3的特异性以如WO2013/174873中公开的所谓双作用-Fab(DAF)的形式组合。
这些各多特异性抗体的一般方案在图1中给出。为了进行比较分析，制备了在CH1/CL界面中没有带电荷的氨基酸取代的野生型(wt)VL-VH/CL-CH1结构域交换的三特异性抗体。使用包含编码如表5所示的氨基酸序列的核酸的表达质粒表达多特异性抗体。
表5：具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossDAFFab)的抗-[Her1Her3]-cMet三特异性抗体MetHER1(3)DAF_0002、MetHER1(3)DAF_0001、MetHER1(3)DAF_0003的轻链(LC)和重链(HC)的氨基酸序列：野生型(wt)和带电荷氨基酸取代的不同组合
对于所有构建体，使用杵入臼异源二聚化技术，其中在第一CH3结构域中具有典型的杵(T366W)取代，并且在第二CH3结构域中具有相应的臼取代(T366S、L368A和Y407V)(以及两个额外引入的半胱氨酸残基S354C/Y349C)(包含在上述各相应的重链(HC)序列中)。
实施例1F
纯化和表征结合Her1Her3和cMet的三特异性抗体，其在一个结合臂上具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossDAFFab)并且在CH1/CL界面中具有带电荷的氨基酸取代
通过蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱的组合从上清液中纯化上文实施例1E中表达的多特异性抗体。所有多特异性抗体可以以良好产率产生并且是稳定的。通过质谱法表征所获得产物的同一性和通过SDS-PAGE表征分析的性质如纯度、单体含量和稳定性。
如在一般方法部分中所述，通过去糖基化的完整CrossDAF和在去糖基化/限制性LysC消化的CrossDAF的特殊情况下的电喷雾离子化质谱法(ESI-MS)分析预期的一级结构。
结果示于表6和图6中。
表6：通过CH1/CL界面中的带电荷的氨基酸取代减少作为副产物的非功能性重链二聚体(HC)2的形成
表6和图6中的结果显示，通过用在“未交叉”侧的CH1结构域(K213E或K213D、K147E)以及CL结构域(E123K或E123R、Q124K)中用相反电荷取代两个带电荷的氨基酸，如上面对本发明的进一步详细描述，以及在“交叉”侧的CL结构域中引入额外的带电荷的氨基酸，与没有这种取代的野生型三特异性抗体相比，主要副产物(非功能性重链二聚体)的形成大大降低了。
实施例2A
结合血管生成素-2(ANG2)和血管内皮生长因子(VEGF)的二价、双特异性抗体的产生和表达，其在一个结合臂中具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)、在CH1/CL界面中具有带电荷的氨基酸取代、并且在VH/VL界面中具有带电荷的氨基酸导入
如实施例1A所述产生结合人血管生成素-2(ANG2)和人血管内皮生长因子(VEGF)的双特异性抗体。使用包含编码如表7所示的氨基酸序列的核酸的表达质粒表达双特异性抗体。
表7：抗-Ang2-VEGF双特异性抗体Ang2VEGF-044的轻链(LC)和重链(HC)的氨基酸序列，其包括在两个VH/VL界面中引入的额外的带电荷的氨基酸
| 抗体 | VEGF_HC＊ | VEGF_LC＊ | Ang2_HC | Ang2_LC |
| Ang2VEGF_044 | SEQ ID NO:8 | SEQ ID NO:9 | SEQ ID NO:5 | SEQ ID NO:6 |
在该构建体中，使用杵入臼异源二聚化技术，其中在第一CH3结构域中具有典型的杵(T366W)取代，并且在第二CH3结构域中具有相应的臼取代(T366S、L368A和Y407V)(以及两个额外引入的半胱氨酸残基S354C/Y349’C)(包含在上述各相应的重链(HC)序列中)。
实施例2B：
纯化和表征结合ANG2和VEGF的二价、双特异性抗体，其在一个结合臂中具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)、在CH1/CL界面中具有两个带电荷的氨基酸取代，并且在VH/VL界面中具有带电荷的氨基酸导入
通过蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法的组合从上清液中纯化上文实施例1A(Ang2VEGF-0289[wt]、Ang2VEGF-280、Ang2VEGF-111)和实施例2A(Ang2VEGF_044)中表达的双特异性抗体。所有双特异性抗体可以以良好的产率产生并且是稳定的。通过质谱法表征所获得产物的同一性和通过SDS-PAGE表征分析的性质如纯度、单体含量和稳定性。
如在一般方法部分中描述的，通过去糖基化的完整CrossMAb和在去糖基化/限制性LysC消化的CrossMAb的特殊情况下的电喷雾离子化质谱法(ESI-MS)分析预期的一级结构。
结果示于表8和图7中。
表8：通过在CH1/CL界面中带电荷的氨基酸取代与在VH/VL界面中引入额外的带电荷的氨基酸，减少作为副产物的非功能性重链二聚体(HC)2的形成
＊...n.d.＝未测定
表8和图7中的结果显示，通过在“交叉”侧以及“未交叉”侧的VH结构域中引入带电荷的氨基酸和在VL结构域中带相反电荷的氨基酸，可以进一步降低副产物的形成(测试的抗体Ang2VEGF-0289[wt]，Ang2VEGF-111[无额外电荷的VH-VL结构域]，Ang2VEGF-044[具有额外电荷的VH-VL结构域]。
实施例3A
结合TWEAK和IL-17的二价、双特异性抗体的产生和表达，其在一个结合臂中具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)、在CH1/CL界面中具有带电荷的氨基酸取代、并且在VH/VL界面中具有带电荷的氨基酸导入
如实施例1C所述产生结合TWEAK和IL-17的双特异性抗体。使用包含编码如表9所示的氨基酸序列的核酸的表达质粒表达双特异性抗体。
表9：抗-TWEAK-IL17双特异性抗体TweakIL17_0128的轻链(LC)和重链(HC)的氨基酸序列，其包括在两个VH/VL界面中引入的带电荷的氨基酸
在该构建体中，使用杵入臼异源二聚化技术，其中在第一CH3结构域中具有典型的杵(T366W)取代，并且在第二CH3结构域中具有相应的臼取代(T366S、L368A和Y407V)(以及两个额外引入的半胱氨酸残基S354C/Y349C)(包含在上述各相应的重链(HC)序列中)。
实施例3B
纯化和表征结合TWEAK和IL-17的二价、双特异性抗体，其在一个结合臂中具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)、在CH1/CL界面中具有带电荷的氨基酸取代、并且在VH/VL界面中具有带电荷的氨基酸导入
通过蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法的组合从上清液中纯化上文实施例1C和实施例3A中表达的双特异性抗体。所有双特异性抗体可以以良好的产率产生并且是稳定的。结果示于表10中。
表10：蛋白A纯化后所需抗体的产率和分数
＊...在蛋白A纯化后通过分析性SEC分析的所需双特异性抗体的级分
为了测定抗体构建体的稳定性，测定聚集开始的温度。
结果示于表11中。
表11：所示抗体的聚集开始的温度(Tagg)
| 样品 | Tagg(℃) |
| TweakIL17_0101 | 54.8 |
| TweakIL17_0102 | 52.4 |
| TweakIL17_0103 | 53.0 |
| TweakIL17_0128 | 51.6 |
如实施例1D中所述测定抗体TweakIL17_0128的抗原结合：
KD(TWEAK)＝＜0.1nM
KD(IL-17)＝0.1nM
实施例4A
结合血管生成素-2(ANG2)和血管内皮生长因子(VEGF)的二价、双特异性抗体的产生和表达，其包含野生型CH3结构域、在一个结合臂中具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)、在CH1/CL界面中具有带电荷的氨基酸取代
为了测定重链异源二聚化策略对所示抗体的副产物谱的影响，生成缺少CH3修饰的抗体。
如实施例1A所述产生结合人血管生成素-2(ANG2)和人血管内皮生长因子(VEGF)的双特异性抗体。使用含有编码如表12所示的氨基酸序列的核酸的表达质粒表达双特异性抗体。
表12：所示的抗-Ang2-VEGF双特异性抗体的轻链(LC)和重链(HC)的氨基酸序列
| 抗体 | VEGF_HC＊ | VEGF_LC＊ | Ang2_HC | Ang2_LC |
| Ang2VEGF_467 | SEQ ID NO：46 | SEQ ID NO：2 | SEQ ID NO：47 | SEQ ID NO：6 |
| Ang2VEGF_468 | SEQ ID NO：48 | SEQ ID NO：2 | SEQ ID NO：47 | SEQ ID NO：6 |
在这些构建体中，使用野生型CH3结构域。
实施例4B
纯化和表征结合血管生成素-2(ANG2)和血管内皮生长因子(VEGF)的二价、双特异性抗体，其包含野生型CH3结构域、在一个结合臂中具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)、在CH1/CL界面中具有带电荷的氨基酸取代
通过蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法的组合从上清液中纯化上文实施例4A中表达的双特异性抗体。抗体可以以良好的产率产生并且是稳定的。通过CE-SDS分析重链二聚体副产物，表明在CH3/CH3界面内具有和不具有杵入臼修饰的构建体中形成可比较的重链二聚体的比例，表明在CH1/CL界面中引入带电荷的氨基酸对副产物形成的减少作用，这是由于轻链错配(即错误的轻链与错误的重链错配)不依赖于支持重链正确装配的突变的存在而发生(文中：使用在CH3/CH3界面内的杵入臼修饰抑制重链-重链错配，即两条相同重链的不期望的配对)。
表13a：蛋白A和SEC纯化后所示抗体的产率、HC二聚体和单体含量
...在CH3/CH3界面中包括杵入臼修饰的构建体
如所预期的，缺少CH3-修饰的构建体引起由重链-重链错配导致的副产物，如单特异性抗Ang2抗体和重链同源二聚体。在酶促去糖基化后在变性和非还原条件下通过MS定量构建体的副产物谱。测量Ang2或VEGF特异的单特异性抗体、重链同源二聚体和异源二聚体的相对含量以及所需双特异性全长抗体的含量。在蛋白A和SEC纯化后分析样品。
表13b：重链异源二聚化策略对本发明所示的双特异性抗体的副产物谱的影响
如上文材料和方法部分中所述通过测定抗原结合。
表14a：所示抗体对VEGF的亲和力
| 样品 | KD(nM) |
| Ang2VEGF_280 | 7 |
| Ang2VEGF_467 | 17 |
| Ang2VEGF_468 | 22 |
表14b:所示抗体对ANG2的亲和力
| 样品 | App.KD(nM) |
| Ang2VEGF_280 | 3 |
| Ang2VEGF_467 | 0.5 |
| Ang2VEGF_468 | 0.5 |
为了测定抗体构建体的热稳定性，测定聚集开始的温度。
结果示于表14c中。
表14c：所示抗体的聚集开始温度(Tagg)
实施例5A
结合血管生成素-2(ANG2)和血管内皮生长因子(VEGF)的二价、双特异性抗体的生成和表达，其具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)，并且在同一结合臂的CH1/CL界面中具有带电荷的氨基酸取代
如实施例1A所述产生结合人血管生成素-2(ANG2)和人血管内皮生长因子(VEGF)的双特异性抗体。使用含有编码如表15所示的氨基酸序列的核酸的表达质粒表达双特异性抗体。
表15：所示的抗-Ang2-VEGF双特异性抗体的轻链(LC)和重链(HC)的氨基酸序列
| 抗体 | VEGF_HC＊ | VEGF_LC＊ | Ang2_HC | Ang2_LC |
| Ang2VEGF_469 | SEQ ID NO:49 | SEQ ID NO:50 | SEQ ID NO:3 | SEQ ID NO:4 |
| Ang2VEGF_470 | SEQ ID NO:49 | SEQ ID NO:50 | SEQ ID NO:3 | SEQ ID NO:51 |
对于所有构建体，使用杵入臼异源二聚化技术，其中在第一CH3结构域中具有典型的杵(T366W)取代，并且在第二CH3结构域中具有相应的臼取代(T366S、L368A和Y407V)(以及两个额外引入的半胱氨酸残基S354C/Y349’C)(包含在上述各相应的重链(HC)序列中)。
实施例5B
纯化和表征结合血管生成素-2(ANG2)和血管内皮生长因子(VEGF)的二价、双特异性抗体，其具有VL-VH/CL-CH1结构域交换(CrossMAbFab)，并且在同一结合臂的CH1/CL界面中具有带电荷的氨基酸取代
通过蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法的组合从上清液中纯化上文实施例5A中表达的双特异性抗体。抗体可以以良好的产率产生并且是稳定的。
表16a：蛋白A和SEC纯化后所示抗体的产率和单体含量
表16b：蛋白A和SEC纯化后所示抗体的副产物
#...除了HC异源二聚体外，观察到约x％VEGF-HC同源二聚体。
如上所述通过测定抗原结合。
表17a：所示抗体对VEGF的亲和力
| 样品 | KD(nM) |
| Ang2VEGF_469 | 13 |
| Ang2VEGF_470 | 12 |
表17b：所示抗体对ANG2的亲和力
为了测定抗体构建体的稳定性，测定聚集开始的温度。
结果示于表17c中。
表17c：所示抗体聚集开始的温度(Tagg)
| 样品 | Tagg(℃) |
| Ang2VEGF_469 | 59 |
| Ang2VEGF_470 | 59 |
Claims (15)
1.一种多特异性抗体，其包含
a)源自特异性结合第一抗原的第一抗体的第一轻链和第一重链；和
b)源自特异性结合第二抗原的第二抗体的第二轻链和第二重链，其中，
在第二轻链中，可变结构域VL被第二重链的可变结构域VH替换，恒定结构域CL被第二重链的恒定结构域CH1替换；和
在第二重链中，可变结构域VH被第二轻链的可变结构域VL替换，恒定结构域CH1被第二轻链的恒定结构域CL替换；和
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代；或
ii)其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代。
2.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中
i)其中在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和
在第二重链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；或
ii)其中在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸(根据Kabat编号)彼此独立地被选自K、R和H的氨基酸取代；和其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸(根据Kabat的EU索引编号)彼此独立地被选自E或D的氨基酸取代，和
在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代。
3.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，
iii)其中在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代；和
其中在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D的氨基酸取代；和
iv)其中在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸(根据Kabat编号)被选自E和D(在一个优选的实施方案中被E取代)的氨基酸取代；和其中在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸(根据Kabat编号)被选自K、R和H的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被K或R取代，在一个实施方案中被K取代)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中
在抗体的三级结构中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域形成位于各抗体CH3结构域之间的界面，
其中第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域的相应的氨基酸序列各自包含位于抗体三级结构中的所述界面内的一组氨基酸，
其中从位于一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，至少一个氨基酸残基被具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基取代，
从而在所述界面内产生突起，其中所述突起位于一条重链的CH3结构域中，和其中所述突起可定位在位于所述界面内的另一条重链的CH3结构域中的凹穴内；和
其中从位于另一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，至少一个氨基酸残基被具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基取代，
从而在界面内产生凹穴，其中凹穴位于另一条重链的CH3结构域中，和其中位于一条重链的CH3结构域中的界面内的突起可定位在所述凹穴中。
5.根据权利要求4所述的多特异性抗体，其中
所述具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸残基选自R、F、Y和W；和
其中所述具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸残基选自A、S、T和V。
6.根据权利要求4或5所述的多特异性抗体，其中
从位于一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，第一氨基酸被半胱氨酸取代；和
从位于另一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，第二氨基酸被半胱氨酸取代，其中第二氨基酸在界面内面向第一氨基酸；
从而可以通过引入的半胱氨酸残基形成一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域之间的二硫键。
7.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其特异性结合人血管生成素-2和人VEGF，其中
a)所述抗体包含根据SEQ ID NO：32(<VH Ang2>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ IDNO：33(<VL Ang2>)的可变轻链结构域(VL)；和
b)所述抗体包含根据SEQ ID NO：31(VH VEGF)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ IDNO：30(VL VEGF)的可变轻链结构域(VL)。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的多特异性抗体，其特异性结合人TWEAK和人IL17，其中
a)所述抗体包含根据SEQ ID NO：36(<VH IL17>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ IDNO：37(<VL IL17>)的可变轻链结构域(VL)；和
b)所述抗体包含根据SEQ ID NO：35(<VH TWEAK>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQID NO：34(<VL TWEAK>)的可变轻链结构域(VL)。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的多特异性抗体，其特异性结合人Her1、人Her3和人cMet，其中
a)所述抗体包含根据SEQ ID NO：40(<VH Her1Her3>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ ID NO：41(<VL Her1Her3>)的可变轻链结构域(VL)；和
b)所述抗体包含根据SEQ ID NO：39(<VH cMet>)的可变重链结构域(VH)和根据SEQ IDNO：38(<VL cMet>)的可变轻链结构域(VL)。
10.一种用于制备根据权利要求1至9中任一项所述的多特异性抗体的方法，包括以下步骤：
-用包含核酸的载体转化宿主细胞，所述核酸编码
a)如权利要求1至9之一所定义的第一轻链，其源自特异性结合第一抗原的第一抗体；
b)如权利要求1至9之一所定义的第一重链，其源自特异性结合第一抗原的第一抗体；
c)如权利要求1至9之一所定义的第二轻链，其源自特异性结合第二抗原的第二抗体；和
d)如权利要求1至9之一所定义的第二重链，其源自特异性结合第二抗原的第二抗体，
-在允许所述多特异性抗体合成的条件下培养所述宿主细胞；和
-从所述宿主细胞培养物中回收所述多特异性抗体。
11.一种编码以下氨基酸序列的核酸
a)如权利要求1至9之一所定义的第一轻链，
b)如权利要求1至9之一所定义的第二轻链，
c)如权利要求1至9之一所定义的第一重链；或
d)如权利要求1至9中之一所定义的第二重链。
12.一种载体，其包含根据权利要求11所述的核酸，其中载体能够在宿主细胞中表达所述核酸。
13.一种宿主细胞，其包含
a)载体，其包含编码如权利要求1至9之一所定义的第一轻链的核酸，所述第一轻链源自特异性结合第一抗原的第一抗体；
b)载体，其包含编码如权利要求1至9之一所定义的第一重链的核酸，所述第一重链源自特异性结合第一抗原的第一抗体；
c)载体，其包含编码如权利要求1至9之一所定义的第二轻链的核酸，所述第二轻链源自特异性结合第二抗原的第二抗体；和
d)载体，其包含编码如权利要求1至9之一所定义的第二重链的核酸，所述第二重链源自特异性结合第二抗原的第二抗体。
14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的多特异性抗体组合至少一种可药用载体。
15.根据权利要求1至9中任一项所述的多特异性抗体，其用作药物。
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