CN114641270A - 防止水性蛋白质溶液中可见颗粒的形成 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种防止在水性蛋白质制剂中形成可见颗粒的方法，以及利用所述方法得到的组合物和药物产品。

Description

防止水性蛋白质溶液中可见颗粒的形成
本发明涉及水性蛋白质组合物领域，特别是药物抗体制剂，其可稳定地阻止形成包含游离脂肪酸的可见颗粒。
背景技术
表面活性剂是蛋白质制剂中的关键赋形剂，因为它们保护不稳定的蛋白质免受可能导致蛋白质聚集的界面应力的影响。蛋白质例如单克隆抗体(mAb)是经胃肠外施用的，这限制了表面活性剂的选择，包括最常用的表面活性剂之一聚山梨醇酯20(PS20)，还有聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188和Kolliphor/
Figure BDA0003631846670000011
HS 15(12-羟基硬脂酸的聚氧乙烯酯)。1PS20可能在产品的保质期内通过氧化降解或通过酶解、水解来降解。特别是，后者产生游离脂肪酸(FFA)作为降解产物，这些游离脂肪酸可以在溶液中沉淀并且随后形成亚可见和可见颗粒。2在生物药物制剂中常见的条件下，FFA甚至可以在低于其溶解度极限(依赖于温度)而沉淀，但即使对于表征良好的降解曲线，对颗粒沉淀的时间点知之甚少。这表明成核因子的参与。
因此，需要提供有效的溶液来防止在水性蛋白质溶液中形成可见颗粒，尤其是进行长期存放时。本发明通过初级包装材料的选择和处理，为低于其溶解度极限下形成FFA颗粒提供了缓解方案，从而减少了作为成核因子的玻璃可浸出物的量。
以前的文献证实单个小瓶批次的玻璃表面具有异质性，这可能转化为存放时玻璃浸出的差异。3对于本发明，研究了作为FFA颗粒形成的成核因子的玻璃可浸出物。
附图说明
图1：通过FTIR鉴定作为游离脂肪酸(FFA)的可见颗粒，其是在将肉豆蔻酸掺加至玻璃可浸出物溶液中后进行的，该溶液是从装有20mM甘氨酸溶液(pH10)的三次最终灭菌后的膨胀(Expansion)51小瓶中产生的。仅突出显示一小部分FFA颗粒。
图2：通过SEM-EDX鉴定在金滤光片上具有铝(其在黑圆圈中不太突出显示)和镁(虚线圆圈)的代表性FFA颗粒。该颗粒的化学组分汇总于下表中。在将玻璃可浸出物(从含甘氨酸溶液Exp33小瓶产生)掺加至含有降解的PS20/游离脂肪酸的混合物的老化蛋白溶液(22M 5℃)中后，鉴定颗粒。
图3：提出了对于肉豆蔻酸和铝示例性示出的依赖于成核因子的FFA颗粒形成的机理。
图4：依赖于存放时间和小瓶样式的由三种不同的安慰剂溶液产生的来自Exp51小瓶的历史实时玻璃可浸出物数据，证明了保质期结束时可浸出物的浓度。
图5：依赖于存放时间和温度的mAb1和mAb2的PS 20浓度。
图6：依赖于存放时间和温度的mAb1和mAb2的肉豆蔻酸(A)和月桂酸(B)浓度。可见颗粒的存在如第一个图中的灰色虚线框所示。用于掺入实验(spiking experiment)的样品如虚黑框所示。
具体实施方式
由于表面活性剂降解，尤其是PS20和/或PS80降解而形成由FFA组成的可见颗粒代表了生物制药行业的主要挑战，因为对胃肠外表面活性剂而言选择有限。通过各种方式减少PS20降解及FFA等降解产物很关键，因为FFA可以在没有特定的成核因子的条件下在超过其溶解度极限而沉淀。然而，低于其溶解度极限时，成核因子可诱导FFA沉淀并限制产物的保质期。
表面活性剂是蛋白质制剂中的必要组分，可防止界面应力和随后的蛋白质聚集。当前全行业面临的挑战之一是胃肠外表面活性剂的酶降解，诸如聚山梨醇酯20(PS20)，这可能导致在含例如市售水性抗体制剂等制剂的市售蛋白质的保质期内形成可见颗粒的游离脂肪酸(FFA)的形成。虽然可以可靠地定量FFA的浓度，但玻璃小瓶中所存放溶液中的颗粒形成的时间点仍然无法预测。因此，本发明人研究了无机离子(例如玻璃可浸出物)，例如作为成核因子对FFA颗粒形成的影响。
下表A汇总了依赖于存放的溶液、玻璃材料的制备(例如，终端灭菌)、溶液存放时间和温度的不同初级包装材料的最相关玻璃可浸出物的浓度，清楚地突出了与无涂层玻璃小瓶(Exp33/
Figure BDA0003631846670000031
和Exp51/
Figure BDA0003631846670000032
小瓶)相比，表面改性玻璃小瓶的可浸出物的减少。表面改性小瓶中有硅化小瓶、
Figure BDA0003631846670000033
小瓶(Si-O-C-H层，https：//www.schott.com/d/pharma ceutical_packaging/7f629b7e-e978-4417-a15e-8621f969d225/1.4/schott-datasheet-schott-toplyo-english-14062017.pdf)，和Type I
Figure BDA0003631846670000034
小瓶(共价结合的SiO2层，https：//www.schott.com/d/pharmaceutical_packaging/ff592e9e-4a7f-495f-9952-965c4d7b1ed8/1.4/schott-datasheet-schott-type-i-plus-english-14062017.pdf)。
表A：玻璃可浸出物的浓度依赖于存放温度、时间和玻璃制备的在装有不同溶液的不同玻璃类型中的铝、硼、硅和钠。将浓度与溶液的玻璃可浸出物的初始浓度及其定量限(LOQ)进行比较。将浓度与溶液的玻璃可浸出物的初始浓度及其定量限(LOQ)进行比较。
TS＝terminal sterilized(终端灭菌)，n.m.＝not measured(未测量)
Figure BDA0003631846670000035
Figure BDA0003631846670000041
Figure BDA0003631846670000051
根据本发明，现已通过FTIR鉴定发现FFA颗粒是用无机离子/组分沉淀的结果，例如玻璃可浸出物，例如铝，正如通过SEM-EDX进一步表征化学组成所阐明的那样。这表明无机元素参与这些颗粒的形成。二氧化硅、三氧化硼和三氧化铝是用于胃肠外产品的I型硼硅酸盐玻璃的典型玻璃网络形成剂。在玻璃制造过程中添加不同的玻璃网络改性剂，如碱金属氧化物(例如钠、钾)和碱土金属氧化物(例如钙和镁)，以降低玻璃的熔融温度。不拘泥于理论，可以得出结论：根据玻璃类型、制剂和存放条件，从玻璃小瓶浸出的无机元素可作为FFA颗粒形成的成核种子。在本研究中，月桂酸和肉豆蔻酸被用作酶促PS20降解的主要降解产物4，并且该研究针对不同的玻璃可浸出物及其混合物，以验证低于其溶解度极限的游离脂肪酸在它们存在下沉淀的假设。
根据本发明，出人意料地发现无机盐，尤其是NaAlO2和CaCl2，在肉豆蔻酸或月桂酸存在下引发低于其溶解度极限的可见颗粒的形成。这些盐模拟通常用于胃肠外产品的I型硼硅酸盐玻璃中的可浸出物。特别是出人意料地，通过高压灭菌循环得到的混合物中的相关玻璃可浸出物，在具有不同制剂的不同玻璃类型中和在代表性可浸出物浓度下，蛋白质药物产品在5℃其2年至3年的保质期内，证实了月桂酸/肉豆蔻酸的颗粒形成是市售胃肠外抗体制剂中聚山梨醇酯(如PS20)的主要降解产物。Exp33小瓶和Exp51小瓶中不同制剂的颗粒是被鉴定为具有玻璃可浸出物(诸如铝或硅)的FFA盐。此外，本发明特别地证实FFA颗粒的形成依赖于相关铝浓度。在根据本发明的一个实施方案中，所述铝浓度均在ppb范围内。目前的发现在两个案例研究中得到验证，单克隆抗体(mAb)制剂在推荐的存放温度(22M，5℃)下老化，显示酶促PS20降解曲线导致不同FFA的混合物。在这些中，掺加玻璃可浸出物混合物导致立即形成可见颗粒，被鉴定为玻璃可浸出物诸如铝、硅、镁、钾、钠、钙和游离脂肪酸的复合物。基于目前的结果，在蛋白质制剂中，颗粒的形成将在实时条件下长期存放时得到验证。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种稳定的水性组合物，其包含蛋白质和药用赋形剂，所述药用赋形剂例如为缓冲液、包括抗氧化剂在内的稳定剂以及表面活性剂，其中所述组合物进一步包含混合物，其为从包装材料诸如玻璃小瓶中扩散出的一种或多种无机离子与由所述表面活性剂降解而产生的不形成可见颗粒的物质的混合物。在一个方面，所述无机离子选自铝、硼、硅、钙、镁、钾和钠。在另一个方面，对于每种离子和未表面改性的小瓶(称为Exp33和exp51小瓶)的每种小瓶类型，所述无机离子的浓度分别是表A中所公开浓度以下的任何浓度(6M，40℃)。在又一个方面，特别是对于不同小瓶形式的Exp51小瓶，所述无机离子的浓度为如在图4中公开的每种离子相应浓度以下的任何浓度。
在另一个实施方案中，提供了如上定义的组合物，其中所述组合物的pH在5至7的范围内。在一个方面，pH在6左右。
在另一个实施方案中，本发明提供如上文所定义的组合物，其中蛋白质为抗体。在一个方面，抗体为单克隆抗体。在另一个方面，抗体是人或人源化单克隆、单特异性或双特异性抗体。
在一个方面，本发明提供如上文所定义的组合物，进一步包含一种或几种类型的由存在于所述组合物中的表面活性剂降解产生的物质(降解产物)。在一个方面，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯(PS)。在另一方面，所述表面活性剂选自PS20或PS80。在另一方面，所述降解产物是不同链长和饱和度的不同脂肪酸和剩余的PS20残基的混合物，该剩余的PS20残基由具有不同极性头部基团、不同脂肪酸尾部和不同酯化度的聚合酯组成。在一个方面，所述降解产物是如本文所定义的游离脂肪酸。在一个方面，由聚山梨醇酯降解产生的所述物质为游离脂肪酸，其浓度高但不高于它们各自的溶解度水平。在另一方面，所述游离脂肪酸选择如USP中PS20中所定义的。在另一方面，所述游离脂肪酸选自月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸/油酸、癸酸和硬脂酸。在另一方面，所述游离脂肪酸选自月桂酸和/或肉豆蔻酸，室温下在水中的月桂酸的溶解度水平为15μg/ml，肉豆蔻酸的溶解度水平为7μg/ml。
在一个实施方案中，本发明提供如上文所定义的组合物，其中浓度为0.03μg/ml以下的铝和/或0.05μg/ml以下的硼和/或0.5μg/ml以下的硅。
在另一个实施方案中，本发明提供如上文所定义的组合物，其中稳定剂选自由糖、糖醇、糖衍生物或氨基酸组成的组。在一个方面，稳定剂是(1)蔗糖、海藻糖、环糊精、山梨醇、甘露醇、甘氨酸、或/和(2)蛋氨酸、和/或(3)精氨酸、或赖氨酸。在又一个方面，所述稳定剂的浓度分别是(1)500mM以下或(2)5-25mM，或/和(3)350mM以下。
在另一个实施方案中，本发明提供如上文所定义的组合物，其中缓冲液选自由以下项组成的组：醋酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、精氨酸、组氨酸、磷酸盐、Tris、甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸缓冲液体系。在一个方面，缓冲液由游离组氨酸碱基和组氨酸-HCl或醋酸盐或琥珀酸盐和/或天冬氨酸组成。而且，在该实施方案中，所述缓冲液的组氨酸浓度为5-50mM。
在另一个实施方案中，本发明提供如上文所定义的组合物，其中表面活性剂选自由非离子表面活性剂组成的组。在一个方面，表面活性剂是聚山梨醇酯(PS)。在另一方面，表面活性剂是PS20或PS80或聚乙二醇15羟基硬脂酸。在又一个方面，所述表面活性剂的浓度为0.01％-1％(w/v)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上文所定义的组合物，其中药用赋形剂为：在20mM pH 5.5HisHCl缓冲液中的1000U/mL透明质酸酶、105mM海藻糖、100mM蔗糖、10mM蛋氨酸和0.04％(w/v)聚山梨醇酯20。
在另一个实施方案中，本发明提供如上文所定义的组合物，其特征在于它保持不含可见颗粒。在一个方面，所述可见颗粒由本文所定义的游离脂肪酸和无机离子组成。在一个方面，所述可见颗粒由本文定义的游离脂肪酸和无机离子组成。
在另一个实施方案中，本发明提供如上文所定义的组合物，其中所述组合物在其授权的保质期结束之前保持不含所述可见颗粒。在另一个方面，所述组合物保持不含所述可见颗粒长达5年、或长达3年、或长达24个月、或长达18个月、或长达12个月。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于得到如本文所定义的组合物的方法，其中所述方法包括选择初级包装材料，所述初级包装材料防止如本文所定义的一种或多种无机离子浸出到所述组合物中。在一个方面，所述方法防止浸出所述一种或多种无机离子高于表A(6M，40℃，非表面改性小瓶)和/或图4中示出的相应浓度。在另一个实施方案中，本方法防止浸出高至0.03μg/ml的铝和/或高至0.05μg/ml的硼和/或高至0.5μg/ml的硅。
在一个实施方案中，本发明提供用于得到本文所定义的组合物的方法，其中所述初级包装材料选自：
ο具有内表面涂层的玻璃小瓶
ο具有共价改性表面的玻璃小瓶
ο纯SiO2(＞99％)制的玻璃小瓶
ο经如下所述洗涤和灭菌的玻璃小瓶
ο聚合物小瓶
ο具有内表面涂层或表面改性的聚合物小瓶
在另一个实施方案中，本发明提供用于得到本文定义组合物的方法，其中所述初级包装材料选自：
ο硅化小瓶，
ο
Figure BDA0003631846670000081
小瓶，
οType I
Figure BDA0003631846670000082
小瓶.
οPur
Figure BDA0003631846670000083
小瓶，
οCrystal
Figure BDA0003631846670000084
小瓶，
οSiO2材料scienceSM小瓶，
ο经如下所述洗涤和灭菌的
Figure BDA0003631846670000091
小瓶，和/或
ο经如下所述洗涤和灭菌的
Figure BDA0003631846670000092
小瓶。
在另一个实施方案中，本发明提供用于得到本文所定义的组合物的方法，进一步包括在使用初级包装材料之前的a)初级包装材料的洗涤/干燥和/或b)初级包装材料的去热原的步骤，例如在填充水性蛋白质组合物之前。在一个方面，洗涤在水温高于50℃下进行，接着通过干燥步骤使残存水<50μl。在一个方面，去热原在低于或等于400℃的温度下进行。在另一个方面，去热原在温度180℃至340℃之间进行，并且在灭菌通道中的停留时间限于8h。
在另一个实施方案中，本发明提供用于得到本文所定义的组合物的方法，其中所述方法提供所述组合物的稳定性以防可见颗粒的形成。在一个方面，所述可见颗粒由本文所定义的一种或多种降解产物和一种或多种无机离子组成。在另一个方面，所述可见颗粒由一种或多种如本文所定义的游离脂肪酸和一种或多种如本文所定义的无机离子组成。在又一个方面，根据本发明的方法提供了一种组合物，例如市售药物抗体组合物，该组合物在其许可的保质期到期之前保持不含可见颗粒。在另一个方面，本方法提供一种组合物，该组合物保持不含所述可见颗粒长达5年、或长达3年、或长达24个月、或长达18个月、或长达12个月。
在另一个实施方案中，本发明提供一种药物剂型，药物剂型包含如本文所定义的组合物，例如在容器中的水性抗体组合物，其中在所述药物剂型许可的保质期内，该组合物中的一种或多种无机离子的浓度基本保持恒定。在一个方面，当与在存放开始时(例如在2周后或立即将所述组合物填充到所述容器或包装材料中)在相同容器中含有相同组合物的药物剂型中测得的相同离子的浓度相比时，一种或多种无机离子的所述浓度在存放长达5年、或3年、或24个月、或18个月、或12个月中基本保持恒定。在一个方面，容器是本文所定义的玻璃小瓶或初级包装材料。在一个方面，无机离子选自铝、硼、硅、钙、镁、钾和钠。
在另一个实施方案中，本发明提供如上文所定义的药物剂型，例如在容器中的水性抗体制剂，其中所述剂型中的一种或多种无机离子的浓度增加保持低于表A(非表面改性小瓶，6M，40℃)和/或图4中示出的每种离子和每种小瓶类型的相应浓度。在另一方面，与小瓶类型无关，在存放长达5年、或3年、或24个月、或18个月、或12个月后铝的浓度保持低于0.03μg/ml和/或硼的浓度保持低于0.05μg/ml和/或硅的浓度保持低于0.5μg/ml，当与在存放开始时在相同容器中含有相同组合物的药物剂型中测得的相同离子的浓度相比时，例如在2周后或立即将所述组合物填充到所述容器或包装材料中。在一个方面，无机离子选自铝、硼、硅、钙、镁、钾和钠。在一个方面，容器是如本文所定义的玻璃小瓶或初级包装材料。
在另一个实施方案中，本发明提供如上文所定义的“初级包装材料”的用途，其用于存放水性抗体制剂。在另一个实施方案中，本发明提供如本文所定义的所述“初级包装材料”的用途，其用于在存放水性抗体制剂期间减少或避免可见颗粒的形成，例如包含FFA的颗粒。在一个实施方案中，所述初级包装材料是如本文所定义的聚合物小瓶。在另一个实施方案中，所述初级包装材料是如本文所定义的表面改性玻璃小瓶。在又一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，所述存放的特征在于至少在相应抗体产品的许可的保质期内所述抗体制剂保持不含可见颗粒。在另一个实施方案中，所述存放的特征在于在存放长达5年、或3年、或24个月、或18个月、或12个月中所述抗体制剂保持不含可见颗粒。
术语“赋形剂”是指药物组合物或制剂中除活性成分之外的成分，其对受试者是无毒的。赋形剂包括但不限于缓冲液、稳定剂(包括抗氧化剂)、表面活性剂或防腐剂。
术语“无机离子”是无机化学领域的技术人员所熟知的。本文所用的无机离子是铝、硼、硅、钠，镁、钾和钙。优选的无机离子是铝、钙和镁。根据本发明，所述无机离子可以以浓度高至0.03μg/ml的铝和/或高至高至0.05μg/ml的硼和/或高至高至0.5μg/ml的硅。
术语“缓冲液”是有机化学或药物科学领域的技术人员所熟知的，例如药物制剂开发。本文所用的缓冲液是醋酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、精氨酸、组氨酸、磷酸盐、Tris、甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸缓冲液体系。而且，在该实施方案中，所述缓冲液的组氨酸浓度为5-50mM。优选的缓冲液为游离组氨酸碱基和组氨酸-HCl或醋酸盐或琥珀酸盐和/或天冬氨酸。而且，在该实施方案中，所述缓冲液的组氨酸浓度为5-50mM。
术语“表面活性剂”是有机化学领域的技术人员所熟知的。本文所用的表面活性剂是非离子表面活性剂。优选的表面活性剂是聚山梨醇酯，尤其是PS20或PS80。根据本发明，所述表面活性剂能够以浓度0.01％-1％(w/v)存在。
术语“稳定剂”是有机化学或药物科学领域的技术人员所熟知的，例如药物制剂开发。根据本发明，稳定剂选自由糖、糖醇、糖衍生物或氨基酸组成的组。在一个方面，稳定剂是(1)蔗糖、海藻糖、环糊精、山梨醇、甘露醇、甘氨酸、或/和(2)蛋氨酸、和/或(3)精氨酸、或赖氨酸。在又一个方面，所述稳定剂的浓度分别是(1)500mM以下或(2)5-25mM，或/和(3)350mM以下
本文所用的术语“由聚山梨醇酯降解产生的物质”或“降解产物”是本领域技术人员已知的由聚山梨醇酯降解产生的任何物质。在一个方面，所述物质为游离脂肪酸。术语“脂肪酸”(或“FA”)是有机化学领域普通技术人员所熟知的。在一个方面，脂肪酸是任何具有脂肪链的甲酸，该脂肪族链是饱和或不饱和的、直链或支链的，并且包含4至28、或8至24、或10至22、或12至20个碳原子。在一个方面，所述游离脂肪酸选择如USP中PS20中所定义的。在一个方面，所述游离脂肪酸选自月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸/油酸、癸酸和硬脂酸。在另一方面，所述游离脂肪酸选自月桂酸和/或肉豆蔻酸。根据本发明，所述由聚山梨醇酯降解产生的物质可以以达到他们在室温下水中相应溶解度水平的浓度存在。在另一个方面，这样的物质以达到但不包括它们在室温下水中的溶解度水平的任何浓度存在。术语“室温”具有其通常含义。在一个方面，室温是指20至28摄氏度，优选22至26摄氏度。
本文所用的术语“包装材料”或“初级包装材料”是指与产品接触的材料。在一个实施方案中术语“初级包装材料”是指：
·具有内表面涂层的玻璃小瓶，
·具有共价改性表面的玻璃小瓶，
·纯SiO2(＞99％)制的玻璃小瓶，
·经如下所述洗涤和灭菌的玻璃小瓶，
·聚合物小瓶，
·具有内表面涂层或表面改性的聚合物小瓶，
在一个实施方案中术语“初级包装材料”是指：
·硅化小瓶，
·
Figure BDA0003631846670000121
小瓶，
·Type I
Figure BDA0003631846670000122
小瓶，
·Pur
Figure BDA0003631846670000123
小瓶，
·Crystal
Figure BDA0003631846670000124
小瓶，
·SiO2材料sciencesM小瓶，
·经如下所述洗涤和灭菌的
Figure BDA0003631846670000125
小瓶，和/或
·经如下所述洗涤和灭菌的
Figure BDA0003631846670000126
小瓶
在某些实施方案中，包装材料是在接收所述稳定的水性蛋白质组合物之前被洗涤和/或去热原。所述包装材料的洗涤可以通过本领域技术人员已知的任何方式进行。优选地，所述洗涤在水温高于50℃下进行使用，接着通过干燥步骤使残存水<50uL。所述包装材料的去热原可以通过本领域技术人员已知的任何方式进行。优选地，所述去热原在温度低于或等于400℃下进行使用。更优选地，所述去热原在温度180℃至340℃之间进行，并且在灭菌通道中的停留时间限于8h。
本文所用的术语“蛋白质”是指任何治疗相关的多肽。在一个实施方案中，术语蛋白质是指抗体。在另一个实施方案中，术语蛋白质是指免疫缀合物。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体类别或结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。在一个实施方案中，任何这些抗体是人的或人源化的。在一个方面，抗体选自以下：阿仑单抗(alemtuzumab)
Figure BDA0003631846670000127
阿特珠单抗(atezolizumab)
Figure BDA0003631846670000128
贝伐单抗(bevacizumab)
Figure BDA0003631846670000129
西妥昔单抗(cetuximab)
Figure BDA00036318466700001210
帕尼单抗(panitumumab)
Figure BDA00036318466700001211
帕妥珠单抗(pertuzumab)(
Figure BDA00036318466700001212
2C4)、曲妥珠单抗(trastuzumab)
Figure BDA00036318466700001213
托西莫单抗(tositumomab)
Figure BDA00036318466700001214
阿昔单抗(abciximab)
Figure BDA00036318466700001215
阿达木单抗(adalimumab)
Figure BDA00036318466700001216
阿泊珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、托珠单抗(atlizumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)
Figure BDA0003631846670000131
巴维妥昔单抗(bavituximab)、贝利木单抗(belimumab)
Figure BDA0003631846670000132
briankinumab、卡那单抗(canakinumab)
Figure BDA0003631846670000133
西利珠单抗(cedelizumab)、培戈-赛妥珠单抗(certolizumab pegol)
Figure BDA0003631846670000134
cidfusituzumab、cidtuzumab、西妥木单抗(cixutumumab)、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、克瑞组单抗(crenezumab)、达利珠单抗(daclizumab)
Figure BDA0003631846670000135
达洛珠单抗(dalotuzumab)、地诺单抗(denosumab)
Figure BDA0003631846670000136
依库珠单抗(eculizumab)
Figure BDA0003631846670000137
依法利珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、艾米希组单抗(emicizumab)
Figure BDA0003631846670000138
泛维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、戈利木单抗(golimumab)
Figure BDA0003631846670000139
伊匹单抗(ipilimumab)、伊马曲单抗(imgatuzumab)、英夫利昔单抗(infliximab)
Figure BDA00036318466700001310
拉贝妥珠单抗(labetuzumab)、来瑞组单抗(lebrikizumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、卢卡木单抗(lucatumumab)、培戈-鲁利珠单抗(lulizumab pegol)、鲁妥珠单抗(1umretuzumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、纳武单抗(mogamulizumab)、莫维组单抗(motavizumab)、motovizumab、muronomab、那他珠单抗(natalizumab)
Figure BDA00036318466700001311
耐昔妥珠单抗(necitumumab)
Figure BDA00036318466700001312
尼妥珠单抗(nimotuzumab)
Figure BDA00036318466700001313
nolovizumab、numavizumab、奥洛组单抗(olokizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)
Figure BDA00036318466700001317
奥那妥组单抗(onartuzumab)(也称为MetMAb)、帕利珠单抗(palivizumab)
Figure BDA00036318466700001314
帕考珠单抗(pascolizumab)、pecfusituzumab、pectuzumab、帕博利珠单抗(pembrolizumab)
Figure BDA00036318466700001315
培克珠单抗(pexelizumab)、普立昔单抗(priliximab)、ralivizumab、兰尼单抗(ranibizumab)
Figure BDA00036318466700001316
reslivizumab、瑞替珠单抗(reslizumab)、resyvizumab、罗妥木单抗(robatumumab)、隆利组单抗(rontalizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、西鲁库单抗(sarilumab)、苏金单抗(secukinumab)、瑟瑞妥单抗(seribantumab)、西法木单抗(sifalimumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、司妥昔单抗(siltuximab)
Figure BDA0003631846670000141
西利珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、他度组单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、替非组单抗(tefibazumab)、托西珠单抗(tocilizumab)
Figure BDA0003631846670000142
托利珠单抗(toralizumab)、tucusituzumab、umavizumab、乌珠单抗(urtoxazumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)
Figure BDA0003631846670000143
维多珠单抗(vedolizumab)
Figure BDA0003631846670000144
维西珠单抗(visilizumab)、扎木单抗(zanolimumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv和scFab)；单结构域抗体(dAb)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，请参见Holliger和Hudson，NatureBiotechnology 23：1126-1136(2005)。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在某些方面，抗体为IgG1同种型。在某些方面，抗体为IgG1同型，其具有P329G、L234A和L235A突变以降低Fc区效应子功能。在其他方面，抗体为IgG2同种型。在某些方面，抗体为IgG4同种型，其在铰链区包含S228P突变以改善IgG4抗体的稳定性。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为a、d、e、g和m。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，所述两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些方面，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR对应于非人抗体的CDR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；以及
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))。
除非另有说明，否则CDR根据Kabat等人所述的方法(同上)确定。本领域的技术人员将理解，也可以根据Chothia(同上)、McCallum(同上)所述的方法或任何其他在科学上接受的命名系统来确定CDR名称。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些方面，个体或受试者是人。
“经分离的”抗体为已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些方面，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)方法测定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
术语“药物组合物”或“药物制剂”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
“药用载体”是指药物组合物或制剂中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒。药用载体包括但不限于本文所定义的赋形剂。
嵌合抗体和人源化抗体
在某些方面，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于，例如，美国专利号4,816,567和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(诸如猴)的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体为其中类别或亚类已经与亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些方面，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些方面，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法，例如在Almagro and Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如：Riechmann等人，
Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’1Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(记载了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(记载了“表面重塑”)；Dall’Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(记载了“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(记载了FR改组的“引导选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等人J.Immunol.151：2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；以及Presta等人J.Immunol.，151：2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro and Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)和Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
B.人抗体
在某些方面，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk and van de Winkel，Curr Opin Pharmacol.5：368-74(2001)和Lonberg，Curr Opin Immunol.20：450-459(2008)中。
可以通过以下方式来制备人抗体：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座，或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物得到人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.
Biotech.23：1117-1125(2005)。也参见，例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述
Figure BDA0003631846670000171
技术的美国专利号5,770,429；描述K-M
Figure BDA0003631846670000172
技术的美国专利号7,041,870，以及描述
Figure BDA0003631846670000173
技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900。可以进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；以及Boerner等人，J.Immunol.，147：86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)中所述。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)和Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3)：185-91(2005)中。
人抗体还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的可变结构域序列产生。然后可以将此类可变结构域序列与预期的人恒定结构域结合。从抗体文库中选择人抗体的技术描述如下。
C.抗体衍生物
在某些方面，本文提供的抗体可以被进一步修饰以包含本领域已知且容易得到的另外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氯基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接至抗体的聚合物的数目可变，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素测定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
D.免疫缀合物
本发明还提供了包含本文抗体的免疫缀合物，该抗体与一种或多种治疗剂如细胞毒剂、化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素缀合(化学结合)。
一方面，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至上述一种或多种治疗剂。通常使用连接基将抗体连接至一种或多种治疗剂。Pharmacol Review 68：3-19(2016)中列出了ADC技术的概述，其包括治疗剂、药物和连接基的实例。
在另一个方面，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的本文所述的抗体，该酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白质A链、相思豆毒蛋白质A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹黄素蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、姜黄素、巴豆素、肥皂草抑制剂、明胶、米托菌素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。
在另一个方面，免疫缀合物包括与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于制备放射性缀合物。例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可能包含用于闪烁显像研究的放射性原子，例如，tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)制备抗体和细胞毒剂的缀合物。例如，可以如Vitetta等人，《科学》(Science)238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至抗体。参见WO 94/11026。连接基可以为促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割连接基”。例如，可以使用对酸不稳定的连接基、肽酶敏感的连接基、对光不稳定的连接基、二甲基连接基或含二硫键的连接基(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于市售的(例如，来自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
E.多特异性抗体
在某些方面，本文提供的抗体是多特异性抗体，特别是双特异性抗体。“多特异性抗体”是对至少两个不同位点(即，不同抗原上的不同表位或相同抗原上的不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些方面，多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。可以将多特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983))及“杵臼结构”工程化(参见例如，美国专利5,731,168，以及Atwell等人，J.Mol.Biol.270：26(1997))。多特异性抗体还可以通过以下方式来制备：工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电操纵效应(参见例如，WO 2009/089004)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如，美国专利4,676,980，以及Brennan等人，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用用于避免轻链错配问题的常用轻链技术(参见例如，WO 98/50431)；使用用于制备双特异性抗体片段的“双体抗体”技术(参见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，J.Immunol.，152：5368(1994))；以及如Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化抗体，包括例如“章鱼抗体”或者DVD-Ig(参见例如，WO 2001/77342和WO 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其他示例可以在WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2013/026831中找到。双特异性抗体或其抗原结合片段还包括“双作用FAb”或“DAF”，其包含结合两种不同抗原或相同抗原的两种不同表位的抗原结合位点(参见例如US 2008/0069820和WO 2015/095539)。
多特异性抗体也可以以不对称形式提供，其中在具有相同抗原特异性的一个或多个结合臂中有结构域互换，即通过交换VH/VL结构域(参见例如，WO 2009/080252和WO2015/150447)、CH1/CL结构域(参见例如，WO 2009/080253)或完整的Fab臂(参见例如，WO2009/080251、WO 2016/016299，还参见Schaefer等人，PNAS，108(2011)1187-1191，以及Klein等人，MAbs 8(2016)1010-20)。在一方面，多特异性抗体包含交叉Fab片段。术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换型Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交叉Fab片段包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区1(CH1)组成的多肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。还可以通过将荷电或非荷电的氨基酸突变引入结构域界面以指导正确的Fab配对，以对不对称Fab臂进行工程化。参见例如WO 2016/172485。
多特异性抗体的各种其他分子形式是在本领域中已知的并且包括在本文中(参见例如Spiess等人，Mol Immunol 67(2015)95-106)。
F.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如，如在US 4,816,567中所述。对于这些方法，提供了编码抗体的一种或多种分离的核酸。
在天然抗体或天然抗体片段的情况下，需要两种核酸，一种用于轻链或其片段，一种用于重链或其片段。此类核酸编码构成抗体的VL的氨基酸序列和/或构成抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。这些核酸可以在相同的表达载体上或不同的表达载体上。
在具有异源二聚重链的某些双特异性抗体的情况下，需要四种核酸，一种用于第一轻链，一种用于包含第一异单体(heteromonomeric)Fc区多肽的第一重链，一种用于第二轻链，并且一种用于包含第二异单体Fc区多肽的第二重链。四种核酸可包含在一种或多种核酸分子或表达载体中。此类核酸编码构成抗体的第一VL的氨基酸序列和/或构成抗体的包含第一异单体Fc区的第一VH的氨基酸序列和/或构成抗体的第二VL的氨基酸序列和/或构成抗体的包含第二异单体Fc区的第二VH的氨基酸序列(例如抗体的第一轻链和/或第二轻链和/或第一重链和/或第二重链)。这些核酸可以在相同的表达载体上或在不同的表达载体上，通常这些核酸位于两个或三个表达载体上，即一个载体可以包含这些核酸中的多于一种。这些双特异性抗体的示例是CrossMab(参见例如Schaefer，W.等人，PNAS，108(2011)11187-1191)。例如，该异单体重链中的一条包含所谓的“杵突变(knob mutation)”(T366W，以及任选地S354C或Y349C中的一者)，并且该异单体重链中的另一条包含所谓的“臼突变(hole mutation)”(T366S、L368A和Y407V，以及任选地Y349C或S354C)(参见例如Carter，P.等人，Immunotechnol。2(1996)73)，根据EU索引编号。
对于抗体重组生产，将编码抗体的核酸(例如，如上所述)分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，或通过重组方法产生或通过化学合成获得此类核酸。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523，(还参见Charlton，K.A.，在：Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo，B.K.C.(ed.)，HumanaPress，Totowa，NJ(2003)，第245-254页中，描述的抗体片段在大肠杆菌中的表达。)抗体可在表达后在可溶性级分中从细菌细胞糊中分离，并且可以进一步纯化。
除了原核生物外，诸如丝状真菌或酵母等真核微生物也是用于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，该真核微生物包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gemgross，T.U.，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；以及Li，H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(如在例如Graham，F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的293或293T细胞)；小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(例如在Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞(如例如在Mather，J.P.等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述)；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo，B.K.C.(编辑)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，第255-268页。
现在将通过以下非限制性实用示例来进一步说明本发明。
实例
材料和方法
FFA溶液(储存溶液)
如Doshi等人之前所描述的那样6在0.02％PS20(Croda，Edison，NJ，USA)中以(1)5mg/mL和(2)12.5mg/mL(月桂酸，Sigma-Aldrich/Merck，Darmstadt，DE)或(1)1.5mg/mL和(2)5mg/mL(肉豆蔻酸，Sigma-Aldrich/Merck，Darmstadt，DE)的限定浓度制备水性储存溶液。该程序经调整，在1∶10稀释之前使用0.22μm PVDF Steriflip过滤器(MerckMillipore，Darmstadt，DE)对FFA/PS20储存溶液进行无菌过滤，随后不使用磁力搅拌器而使用Heidolph Rotamax 120轨道式摇床(Schwabach，DE)以100rpm在25℃均质化1小时。在1∶500稀释之后，溶液在2℃至8℃过夜均质化之前在25℃均质化1小时。将12-40μL储存溶液用于掺入实验(spiking experiment)，产生(1)10μg/mL和(2)25μg/mL(月桂酸)或(1)3μg/mL和(2)10μg/mL(肉豆蔻酸)的最终FFA浓度。用储存溶液1稀释产生低于其溶解度极限的FFA浓度，而储存溶液2用作通过可见颗粒的形成来证实的阳性对照。通过LC-MS样品(根据Honemann等人7)验证选择FFA浓度。
无机盐溶液
以1mg/mL制备不同盐的水性储存溶液，以终浓度250mg/mL至1g/mL用于掺入实验。选择NaCl、NaAlO2、NaBO2、B2O3和CaCl2(Sigma-Aldrich/Merck，Darmstadt，DE)，因为它们的溶解产物(离子)代表来自I型硼硅酸盐玻璃的典型玻璃可浸出物。使用HCl将NaAlO2和NaBO2储存溶液的pH调节至pH 6，随后使用0.22μm PVDF Sterivex过滤器(Merck Millipore，Darmstadt，DE)进行过滤，并通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)确定真实的元素浓度。元素浓度分别是0.048μg/mL铝、295μg/mL钠、78μg/mL硼和168μg/mL。FFA的掺入实验重复进行二次。
玻璃可浸出物溶液
玻璃可浸出物的代表性混合物通过代表加速老化条件的三个高压灭菌循环(121℃，20min)从三种不同类型的玻璃小瓶，例如6mL形式的Exp 33和Exp51(Schott AG，M üllheim，DE和Schott North America Inc.，NY，USA)获得。小瓶装有6mL的注射用水(WFI)、20mM甘氨酸溶液pH 10或典型安慰剂溶液，用于由20mM组氨酸/组氨酸-HCl缓冲液pH6.0、10mM蛋氨酸、240mM蔗糖(Ferro Pfanstiehl，Waukegan，IL，USA)和0.02％PS20组成的蛋白质制剂。甘氨酸溶液的pH在高压灭菌之后用HCl调节至pH 6.0，并通过0.22μm PVDFSterivex过滤器(Merck Millipore，Darmstadt，DE)进行过滤。如Ditter等人所描述的那样8，可浸出物浓度通过ICP-MS(表1)进行验证。FFA的掺入实验重复进行三次。
表1：掺加溶液中所选择的玻璃可浸出物浓度。
Figure BDA0003631846670000251
mAB制剂
mAb1(IgG1，Mw＝145.5kDa，帕妥珠单抗)和mAb2(IgG1，Mw＝148kDa，曲妥珠单抗)从F.Hoffmann-La Roche获得，并与20mM pH 5.5HisHCl缓冲液中的1000U/mL透明质酸酶、105mM海藻糖、100mM蔗糖、10mM蛋氨酸和0.04％聚山梨醇酯20一起配制。相应的安慰剂是不含蛋白质的相同制剂。制剂在5℃和25℃下储存24个月。掺入实验使用无机盐溶液(CaCl2和NaAlO2以10+1稀释)或以10+1或100+1稀释来自储存溶液的玻璃可浸出物重复进行三次，包括各自的安慰剂对照。
分析表征
如Ditter等人之前所述的那样9通过在Seidenader V 90-T仪器(SeidenaderMaschinenbau GmbH，Markt Schwaben，DE)上进行目视检查并根据Ph.Eur 2.9.2010使用黑/白面板来分析样品，在E/P box中分类为很多颗粒(＞7)、少量颗粒(4-7)或实际上不含颗粒(0-4)，并通过Seidenader分类为很多颗粒(＞10)、少量颗粒(6-10)、基本上不含颗粒(1-5)或不含颗粒(0)。
如以前Ditter等人所述的那样9，亚可见颗粒(SVP)根据Ph.Eur 2.9.1911通过光阻法确定，使用具有HRLD-150传感器(Skan AG，Allschwill，CH)的HIAC/ROYCO 9703液体注射器采样器(Liquid Syringe Sampler)3000 A。
浊度如Ph.Eur 2.2.1中所概述的那样12进行确定，在比率模式下使用Hach 2100AN浊度计(Hach Company，Loveland，Co)。
使用NicoletTM iNTM10红外显微镜(Thermo Fisher Scientific)通过傅里叶变换红外光谱法(FTTIR)与参考光谱进行比较，进一步鉴定颗粒＞20μm。在层流空气流下通过镀金聚碳酸酯过滤器(孔径0.8μm，直径13mm，Sterlitech)过滤样品。过滤器调节包括几滴乙醇，接着是1mL无颗粒水。过滤样品后，使用约1mL冷却无颗粒水作为在分析前的最终洗涤步骤。
使用来自LOT Quantum Design GmbH的Phenom XL仪器并通过与能量分散X射线光谱法fSEM-EDX)相关的扫描电子显微镜来验证所选颗粒的化学组分。
验证了所有溶液的pH。掺加后立即目视检查样品，并定期检查至7天。仅在第1天通过HIAC、浊度、FTIR、SEM-EDX进行进一步表征。当平衡至室温(4h)时，分析所有样品。
使用蒸发光散射检测并通过混合模式HPLC来确定mAb样品的聚山梨醇酯含量。
实施方案1人工玻璃可浸出物(盐)导致FFA颗粒形成
制备不同的无机盐溶液，即CaCl2、NaAlO2、NaBO2、B2O3和NaCl，模拟人工玻璃可浸出物。肉豆蔻酸和月桂酸作为来自水解PS20降解的主要降解产物，以低于其溶解度极限的浓度进行添加，并分析样品的可见颗粒、SVP、和浊度。将样品与相关对照进行比较，并将pH校正为pH 6。
根据盐浓度，观察到肉豆蔻酸和月桂酸与NaAlO2掺加后立即形成可见颗粒。对于所有测试的盐浓度，在用具有CaCl2的肉豆蔻酸掺加后尤其直接立即看到颗粒形成。颗粒形成的增加通常与脂肪酸溶液的孵育时间增加以及NaAlO2和CaCl2浓度的增加有关。取决于检查的时间点，如表1所汇总的那样，颗粒甚至在E/P box中可见，特别是对于在钙存在下的肉豆蔻酸。颗粒随后通过FTIR被鉴定为FFA颗粒(数据未显示)。对于NaBO2和B2O3溶液，取决于盐浓度随时间的变化，肉豆蔻酸和月桂酸在Seidenader中获得可见颗粒，但与CaCl2和NaAlO2相比程度要小得多。当添加氯化钠至1mg/mL的盐浓度时，没有观察到颗粒形成。
掺入实验证实在盐的存在下在可见范围内形成FFA颗粒的可行性，这些盐模拟了硼硅酸盐玻璃的相关玻璃可浸出物，该硼硅酸盐玻璃通常用作胃肠外产品的初级包装。发现颗粒形成高度依赖于离子/盐的类型和浓度，如Ca2+或Al3+，以及孵育时间。除了充分的对照之外，样品的检查和平衡的时间点/溶液的温度对于这些实验也是至关重要的：FFA溶解度高度依赖于温度，在更低的温度下检测到更多的颗粒，例如，平衡至室温的时间为1h对4h。FFA的溶解度极限也严重依赖于pH。因此，实验在pH 6下进行。然而，NaAlO2和NaBO2最初在溶液中形成氢氧化物(约pH 10)。所以，需要调节掺加溶液的pH，随后通过ICP-MS检查剩余的离子浓度(过滤后)。在方法部分中概述了掺加溶液中存在的确切离子浓度。特别是对于铝，浓度用于与从Expansion 51小瓶获得的相关安慰剂制剂的实时数据相当的相关可浸出物浓度中，如图4中汇总的那样。
表2：在不同盐浓度下将低于溶解度极限的(A)肉豆蔻酸和(B)月桂酸掺加到不同无机盐溶液(CaCl2和NaAlO3)中后的可见颗粒。提供来自两次重复实验的数据，该数据根据阴性对照(不含盐)和阳性对照(FFA大于溶解度极限)进行了验证。颗粒在E/P box中分类为很多颗粒(＞7，xxx)、少量颗粒(4-7，xx)或实际上不含颗粒(0-4，/)，以及通过Seidenader分类为很多颗粒(＞10，xxx)、少量颗粒(6-10，xx)、基本上不含颗粒(1-5，x)或不含颗粒(0，/)。d＝检查日。d0＝刚掺加后。*pH调节和过滤前的标称盐浓度。
(A)肉豆蔻酸
Figure BDA0003631846670000271
Figure BDA0003631846670000281
(B)月桂酸
Figure BDA0003631846670000282
实施方案2：“真实”玻璃可浸出物(混合物)导致FFA颗粒形成
玻璃可浸出物由不同类型的玻璃小瓶产生，例如，Exp33和Exp51小瓶，具有不同的基质溶液，包括WFI、调节至pH 6的甘氨酸溶液和代表mAb制剂的安慰剂溶液。玻璃可浸出物的浓度提供于表1中。将低于其溶解度极限的确定量肉豆蔻酸和月桂酸添加到玻璃可浸出物溶液/混合物中并进行分析。Seidenader中的可见颗粒汇总于表3中，并与各种对照相比对所有样品进行了检测。颗粒形成依赖于玻璃可浸出物溶液和依赖于孵育时间。在检查时间点(d1)没有确定SVP和浊度的明显趋势，然而数据表明如果还没有形成可见颗粒，则SVP会增加。表3提供了来自Exp51小瓶/甘氨酸溶液的玻璃可浸出物溶液中肉豆蔻酸的颗粒形成对孵育时间的依赖性的例子。该例子突出了颗粒形成的动力学，在刚掺加后没有颗粒，在孵育第5天和第7天多于10个颗粒。对于所选择的样品，通过FTIR进一步表征和鉴定颗粒，确认游离脂肪酸的存在。对于用WTI产生的玻璃可浸出物溶液，FFA没有通过FTIR证实，这与这些样品在d1的FTIR分析的时间点和颗粒形成开始较晚有关。没有通过FTIR进一步分析安慰剂样品，因为发现阳性对照是阴性的，归因于存在另外的0.02％PS20，可能溶解FFA种子。通过SEM-EDX表征颗粒证实了在FFA颗粒表面上存在玻璃可浸出物，如铝或硅。图1显示了FTIR分析后金滤光片的典型图片，突出显示了一些不同尺寸的FFA颗粒和具有代表性的FFA光谱。掺入研究强调“真实”玻璃可浸出物的混合物导致可见范围内的FFA沉淀和颗粒形成，这依赖于玻璃可浸出物的混合物和数量以及孵育时间。
表3：可见颗粒(Seidenader)和通过FTIR和SEM-EDX对所选择样品的颗粒鉴定(d1)。在不同的玻璃小瓶中将低于其溶解度极限的月桂酸和肉豆蔻酸掺加到由3次高压灭菌循环产生的不同的含玻璃可滤出物的溶液中后，报告可见颗粒。在最长7天的孵育时间内按从最少到最多颗粒形成(+，++，+++)的相对排名报告重复三次的结果。示例性示出了在Exp51/甘氨酸基质中肉豆蔻酸的颗粒形成对孵育时间的依赖性。n.t.＝未测试
Figure BDA0003631846670000291
Figure BDA0003631846670000301
实施方案3：在老化基质中在玻璃可浸出物的存在下FFA颗粒形成的验证(案例研究)
通过添加不同浓度的“真实”玻璃可浸出物，进一步研究了蛋白质基质中的FFA颗粒在老化的mAb1和mAb2溶液(22M，5℃)中的沉淀。在该实验中，FFA的存在是PS20在药物产品保质期内形成降解的结果。Mab1和mAb2在相同的基质中配制，但mAb(CDR)的类型不同。源自不同的原料药过程和纯化过程，发现PS20降解率不同(图5)以及作为随后结果的FFA的类型和浓度也不同(图6)。有趣的是，mAb2在25℃下存放12M后显示出表征为FFA和铝的可见颗粒，而mAb1则没有。在25℃下存放12M后，在加上在5℃下存放10M后，两种制剂都显示出可见颗粒，其被鉴定为FFA和不同玻璃可浸出物的复合物。
实验前将产品表征为不含可见颗粒(在5℃下储存22M)。对于这两种制剂，在已经与50μL或500μL不同的玻璃可浸出物混合物一起孵育后，在Seideander检测机中观察到可见颗粒的形成(表4)。将结果与各种对照组(如初始时间点)进行比较，并与掺加的安慰剂溶液进行比较，后者仍然没有可见颗粒。通过高分辨率SEM-EDX，选定的颗粒进一步被鉴定为与无机离子混合物结合的FFA颗粒(FTIR)。图2显示了FFA颗粒的代表性SEM图像，突出显示了铝和镁的存在。总结了化学组分，表明存在各种玻璃可浸出物。这表明FFA在作为成核因子的掺加的玻璃可浸出物的存在下沉淀。基于这些发现，但不拘泥于理论，颗粒形成的可能机制如图3所示。FFA在生物制药的相关pH值下以质子化和去质子化形式处于平衡状态。以铝为例，三电荷铝离子可能与去质子化的FFA反应并形成高度不溶的铝-脂肪酸-三甲酸盐，其将作为成核种子。FFA的疏水链可以通过疏水相互作用进一步相互作用，促进种子生长。如图3所示，所提出的机理显示了在铝存在下肉豆蔻酸的机理。最后，颗粒可能因疏水性增加而沉淀。
表4：可见颗粒(Seidenader)。在掺加不同的混合物和玻璃可浸出物量后，老化的mAb1和mAb2制剂(22M，5℃)与安慰剂的比较。d＝检查日
Figure BDA0003631846670000311
实施方案4：洗涤和灭菌程序对因聚山梨醇酯降解导致的颗粒成核的影响
玻璃小瓶的制备
20cc构造的Expansion 51玻璃小瓶
Figure BDA0003631846670000312
购自Schott North America Inc.(NY，USA)。该小瓶符合欧洲药典(Ph.Eur.)规定的I型玻璃。如下所述洗涤和去热原后，小瓶装有12.2mL安慰剂缓冲液(20mM His/His-HCl，240mM蔗糖，10mM蛋氨酸，pH 5.5)其包含(1.)没有更进一步的赋形剂(阴性对照，NC)，(2.)0.4mg/mL聚山梨醇酯20(PS20)或(3.)0.4mg/mL PS20，另外掺加AlCl3至最终的Al3+浓度为约250ppb(阳性对照，PC)。在此之前，0.4mg/mL PS20用C.Antarctica耦合磁珠降解了约10％，如前所述13。小瓶在5℃、25℃/60％RH和40℃/70％RH下直立储存。
洗涤和去热原
使用FAW1020洗瓶机(Bausch&Stroebel，德国)在70℃下用注射用水(WFI)(水和气压1bar，最终气压2.5bar)洗涤小瓶。随后，将小瓶置于不锈钢箱中并在层流空气流下干燥96h。
根据表5中指定的最佳或最差灭菌条件进一步处理小瓶。所有小瓶的去热原均在DHT2550隧道灭菌烘箱(Bausch&Stroebel，德国)中进行。工艺条件在存在残余水分、加热区温度、灭菌温度、隧道停留时间和传送带速度方面不同。在去热原之前，根据最差情况条件处理的小瓶装有281μL的WFI，以模拟残余水分的存在。此外，在小瓶进入灭菌区后，传送带停止，以延长在隧道中的停留时间。经计算，在最佳情况条件下(总共134.5min)，加热，灭菌和冷却区的时间分别为41min，43.5min和50min，而在最差情况条件下(总共966.5min)分别为3min，16h和3.5min。
表5.去热原工艺参数
Figure BDA0003631846670000321
*体积归一化为2cc小瓶的表面积，默认为80μL的残留水分。归一化的体积＝表面积*F；具有F＝80μL/表面积的2cc小瓶
目视检查
根据Ph.Eur 2.9.20和Seidenader V90-T仪器(Seidenader Maschinenbau GmbH，Markt Schwaben，德国)使用黑/白面板通过目视检查来鉴别颗粒。后者在本研究中被称为增强目视检查。为了增强目视检查，从后面以及底部和顶部照射样品。旋转容器并且通过2倍放大镜检查。对于这两种仪器，在使容器平衡到室温3h后检查样品。报告的颗粒数量为5个小瓶的平均值。
结果：
在25℃和40℃下开始存放2个月，通过增强目视检查进行分析，观察到最差情况下灭菌样品的颗粒形成(表6A)。对于最佳情况的样品，在从40℃开始3个月后有颗粒形成，但程度较小。考虑到颗粒形成是一个随机事件，E/P box(表6B)分析的趋势遵循来自更敏感的增强目视检查的结果。3个月后，在40℃最差情况下的灭菌小瓶开始有颗粒形成。一般来说，在5℃存放长达3个月的情况下，没有观察到有颗粒形成，没有目视检查方法和样品测试。对于所有温度和分析的时间点，使用两种目视检查方法已经确认了阴性对照不存在颗粒，并且已经确认了阳性对照存在颗粒。
因此可以得出结论，洗涤和灭菌程序对因聚山梨醇酯降解导致的颗粒成核有重大影响。
表6：目视检查结果汇总。
Figure BDA0003631846670000331
Figure BDA0003631846670000341
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Claims (15)

1.一种稳定的水性组合物，其包含蛋白质和药用赋形剂，所述药用赋形剂例如为缓冲液、包括抗氧化剂在内的稳定剂以及表面活性剂，其中所述组合物进一步包含混合物，其为从包装材料诸如玻璃小瓶中扩散出的一种或多种无机离子与由所述表面活性剂降解而产生的不形成可见颗粒的物质的混合物。
2.根据权利要求2所述的组合物，其中所述无机离子选自铝、硼、硅、钙、镁、钾和钠。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其中所述组合物的pH在5至7的范围内，优选在6左右。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述蛋白质为抗体，优选单克隆抗体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其包含浓度高至0.03μg/ml的铝和/或浓度高至0.05μg/ml的硼和/或浓度高至0.5μg/ml的硅。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂选自由糖、糖醇、糖衍生物或氨基酸组成的组。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述缓冲液选自由以下项组成的组：醋酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、精氨酸、组氨酸、磷酸盐、Tris、甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸缓冲液体系。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂选自由非离子表面活性剂，优选聚山梨醇酯组成的组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中由所述表面活性剂降解产生的物质为游离脂肪酸，其低于它们在室温下水中的溶解度水平。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述药用赋形剂为：在20mM pH5.5 HisHCl缓冲液中的1000U/mL透明质酸酶、105mM海藻糖、100mM蔗糖、10mM蛋氨酸和0.04％聚山梨醇酯20。
11.一种用于得到根据权利要求1至10中任一项所述的组合物的方法，其中所述方法包括选择初级包装材料，所述初级包装材料防止一种或多种如权利要求1中所定义的无机离子浸出到所述组合物中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述初级包装材料为玻璃或聚合物小瓶。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其进一步包括在使用所述初级包装材料之前的a)所述初级包装材料的洗涤和/或b)所述初级包装材料的去热原的步骤。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述方法提供所述组合物的稳定性以防可见颗粒的形成。
15.一种药物剂型，其在容器中包含根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中在所述组合物中，一种或多种选自铝、硼、硅、钙、镁、钾和钠的无机离子的浓度在其许可的保质期内基本保持恒定。
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