CN107787332B - 多特异性抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明尤其提供在VH/VL结构域和/或CH1/CL结构域中包含一个或多个突变的多特异性抗原结合蛋白或其抗原结合片段，包含该多特异性抗原结合蛋白或其抗原结合片段的药物组合物，编码/表达该多特异性抗原结合蛋白或其抗原结合片段的分离的核酸、载体和宿主细胞，制备多特异性抗原结合蛋白的方法，用于评价多特异性抗原结合蛋白的计算机可读介质及文库。

Description

多特异性抗原结合蛋白
相关申请的交叉参考
本申请要求2015年4月24日提交的美国临时申请号62/152,735、2015年12月7日提交的美国临时申请号62/264,291和2016年3月18日提交的美国临时申请号62/310,555的优先权，所有临时申请在此以其整体引入作为参考。
序列表
本申请包含序列表，该序列表以ASCII格式电子提交，在此以其整体引入作为参考。于2016年4月22日创建的该ASCII拷贝命名为P05841WO_PCTSequenceListing.txt，大小为131,134字节。
背景技术
开发双特异性抗体作为治疗剂用于人类疾病具有巨大的临床潜能。但是，以IgG型式产生双特异性抗体极具挑战，因为抗体重链已进化为以相对混杂的方式结合抗体轻链。由于这种混杂配对，同时表达例如两种抗体重链和两种抗体轻链天然导致重链同二聚化和重链/轻链配对的错乱(scrambling)。
避免重链同二聚化问题的一种方法称为“杵入臼(knobs-into-holes)”，旨在通过在CH3结构域中引入突变来修饰接触界面，迫使两种不同抗体重链配对。在一条重链上，用具有短侧链的氨基酸取代原氨基酸来产生“臼”。相反，在另一CH3结构域中引入具有大侧链的氨基酸来产生“杵”。通过共表达这两种重链(和两条相同的轻链，其必须适于两种重链)，观察到高产率异二聚体形成(“杵-臼”)对同二聚体形成(“臼-臼”或“杵-杵”)(Ridgway,J.B.,Protein Eng.9(1996)617-621；及WO 96/027011)。
由于抗体Fab内的复杂多结构域异二聚相互作用，最小化重链/轻链错乱变得更困难。旨在解决重链/轻链错乱的双特异性抗体型式包括：DVD-Ig(双可变结构域Ig)(NatureBiotechnology 25,1290-1297(2007))；Cross-over Ig(Schaefer W等(2011)PNAS 108(27):11187-11192)；Two-in-One Ig(Science 2009,323,1610)；
Figure BDA0001520322730000021
抗体(PNAS 92(15):7021-7025；1995)；及Lewis等(2014)“Generation of bispecific IgG antibodiesby structure-based design of an orthogonal Fab interface.”Nat Biotechnol 32,191-8；Liu等(2015)“A Novel Antibody Engineering Strategy for Making MonovalentBispecific Heterodimeric IgG Antibodies by Electrostatic Steering Mechanism.”J Biol Chem.，2015年1月12日在线公布,doi:10.1074/jbc.M114.620260；Mazor等2015.“Improving target cell specificity using a novel monovalent bispecific IgGdesign.”Mabs.,2015年1月26日在线公布,,doi:10.1080/19420862.2015.1007816；WO2014/081955、WO 2014/082179和WO 2014/150973中所述的策略。
仍然存在减少错配重链/轻链副产物和提高双特异抗性抗体产率的需要。
发明概述
如下文更详细地描述，与序列中不含修饰的多特异性抗原结合蛋白相比，修饰为包含这类不对称突变的多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)尤其以改善的正确重链/轻链配对和/或改善的多特异性抗原结合蛋白产率在单细胞中产生。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白在VH/VL和/或CH1/CL区中包含修饰以便于正确的重链/轻链配对。在某些其他实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白进一步在Fc区中包含修饰以便于多特异性抗原结合蛋白的两条臂的异二聚化。
本文提供多特异性抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含：a)结合第一抗原的第一重链/轻链对，其包含第一重链多肽(H1)和第一轻链多肽(L1)，和b)结合第二抗原的第二重链/轻链对，其包含第二重链多肽(H2)和第二轻链多肽(L2)，其中H1和H2都包含重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域(CH1)，L1和L2都包含轻链可变结构域(VH)和轻链恒定结构域(CL)；其中H1的CH1结构域在S183(EU编号)处包含氨基酸取代，其中L1的CL结构域在V133(EU编号)处包含氨基酸取代。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，L1是κ链。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，L2是κ链。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，L1和L2都为κ链。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该S183取代选自S183A、S183T、S183V、S183Y、S183F、S183H、S183N、S183D、S183E、S183R和S183K，该V133取代选自V133E、V133S、V133L、V133W、V133K、V133R和V133D。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，用带正电荷残基取代H1的CH1结构域上的EU位置S183处的氨基酸，用带负电荷残基取代L1的CL结构域上的V133处的氨基酸。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，用带负电荷残基取代H1的CH1结构域上的EU位置S183处的氨基酸，用带正电荷残基取代L1的CL结构域上的V133处的氨基酸。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该带正电荷残基选自R和K。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该带负电荷残基选自D和E。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，H1的CH1结构域在S183(EU编号)处包含氨基酸取代，L1的CL结构域在V133(EU编号)处包含氨基酸取代。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含S183D突变，L1的CL结构域包含V133K突变；H1的CH1结构域包含S183E突变，L1的CL结构域包含V133K突变；H1的CH1结构域包含S183A突变，L1的CL结构域包含V133E突变；H1的CH1结构域包含S183A突变，L1的CL结构域包含V133S突变；H1的CH1结构域包含S183A突变，L1的CL结构域包含V133L突变；H1的CH1结构域包含S183A突变，L1的CL结构域包含V133W突变；H1的CH1结构域包含S183A突变，L1的CL结构域包含V133K突变；H1的CH1结构域包含S183A突变，L1的CL结构域包含V133R突变；H1的CH1结构域包含S183A突变，L1的CL结构域包含V133D突变；H1的CH1结构域包含S183T突变，L1的CL结构域包含V133E突变；H1的CH1结构域包含S183T突变，L1的CL结构域包含V133S突变；H1的CH1结构域包含S183T突变，L1的CL结构域包含V133L突变；H1的CH1结构域包含S183T突变，L1的CL结构域包含V133W突变；H1的CH1结构域包含S183T突变，L1的CL结构域包含V133K突变；H1的CH1结构域包含S183T突变，L1的CL结构域包含V133R突变；H1的CH1结构域包含S183T突变，L1的CL结构域包含V133D突变；H1的CH1结构域包含S183V突变，L1的CL结构域包含V133E突变；H1的CH1结构域包含S183V突变，L1的CL结构域包含V133S突变；H1的CH1结构域包含S183V突变，L1的CL结构域包含V133L突变；H1的CH1结构域包含S183V突变，L1的CL结构域包含V133W突变；H1的CH1结构域包含S183V突变，L1的CL结构域包含V133K突变；H1的CH1结构域包含S183V突变，L1的CL结构域包含V133R突变；H1的CH1结构域包含S183V突变，L1的CL结构域包含V133D突变；H1的CH1结构域包含S183Y突变，L1的CL结构域包含V133E突变；H1的CH1结构域包含S183Y突变，L1的CL结构域包含V133S突变；H1的CH1结构域包含S183Y突变，L1的CL结构域包含V133L突变；H1的CH1结构域包含S183Y突变，L1的CL结构域包含V133W突变；H1的CH1结构域包含S183Y突变，L1的CL结构域包含V133K突变；H1的CH1结构域包含S183Y突变，L1的CL结构域包含V133R突变；H1的CH1结构域包含S183Y突变，L1的CL结构域包含V133D突变；H1的CH1结构域包含S183F突变，L1的CL结构域包含V133E突变；H1的CH1结构域包含S183F突变，L1的CL结构域包含V133S突变；H1的CH1结构域包含S183F突变，L1的CL结构域包含V133L突变；H1的CH1结构域包含S183F突变，L1的CL结构域包含V133W突变；H1的CH1结构域包含S183F突变，L1的CL结构域包含V133K突变；H1的CH1结构域包含S183F突变，L1的CL结构域包含V133R突变；H1的CH1结构域包含S183F突变，L1的CL结构域包含V133D突变；H1的CH1结构域包含S183H突变，L1的CL结构域包含V133S突变；H1的CH1结构域包含S183H突变，L1的CL结构域包含V133L突变；H1的CH1结构域包含S183H突变，L1的CL结构域包含V133W突变；H1的CH1结构域包含S183N突变，L1的CL结构域包含V133L突变；或H1的CH1结构域包含S183E突变，L1的CL结构域包含V133L突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含S183D突变，L1的CL结构域包含V133K突变；H1的CH1结构域包含S183E突变，L1的CL结构域包含V133K突变；H1的CH1结构域包含S183T突变，L1的CL结构域包含V133K突变；或H1的CH1结构域包含S183V突变，L1的CL结构域包含V133E突变。
在某些实施方案中，H1的CH1结构域包含S183K突变，L1的CL结构域包含V133E突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含S183D突变，L1的CL结构域包含V133K突变；H1的CH1结构域包含S183E突变，L1的CL结构域包含V133K突变；H1的CH1结构域包含S183T突变，L1的CL结构域包含V133K突变；或H1的CH1结构域包含S183V突变，L1的CL结构域包含V133E突变。在某些实施方案中，H1的CH1结构域包含S183K突变，L1的CL结构域包含V133E突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H2的CH1结构域和/或L2的CL结构域不包含氨基酸取代。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H2的CH1结构域在S183处不包含取代，L2的CL结构域在V133处不包含取代。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1和/或H2的VH结构域在Q39位(Kabat编号)包含氨基酸取代，L1和/或L2的VL结构域在Q38位(Kabat编号)包含氨基酸取代。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，用带正电荷残基取代VH结构域中Q39位的氨基酸，用带负电荷残基取代VL结构域中Q38位的氨基酸。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，用带负电荷残基取代VH结构域中Q39位的氨基酸，用带正电荷残基取代VL结构域中Q38位的氨基酸。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该带正电荷残基选自R和K。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该带负电荷残基选自D和E。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，用带负电荷残基取代H1的CH1结构域上的EU位置S183处的氨基酸，用带正电荷残基取代VH结构域中Q39处的氨基酸，用带正电荷残基取代L1的CL结构域上的V133处的氨基酸，用带负电荷残基取代VL结构域中Q38处的氨基酸(Kabat编号)。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，用带正电荷残基取代H1的CH1结构域上的EU位置S183处的氨基酸，用带负电荷残基取代VH结构域中Q39处的氨基酸，用带负电荷残基取代L1的CL结构域上的V133处的氨基酸，用带正电荷残基取代VL结构域中Q38处的氨基酸(Kabat编号)。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，用带正电荷残基取代H1的CH1结构域上的EU位置S183处的氨基酸，用带负电荷残基取代VH结构域中Q39处的氨基酸，用带负电荷残基取代L1的CL结构域上的V133处的氨基酸，用带正电荷残基取代L1的VL结构域中Q38处的氨基酸(Kabat编号)。在其他实施方案中，用带负电荷残基取代H2的CH1结构域上的EU位置S183处的氨基酸，用带正电荷残基取代H2的VH结构域中Q39处的氨基酸，用带正电荷残基取代L2的CL结构域上的V133处的氨基酸，用带负电荷残基取代VL结构域中Q38处的氨基酸(Kabat编号)。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39E取代突变，L1的VL结构域包含Q38K取代突变，H2的VH结构域包含Q39K取代突变。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39E取代突变，L1的VL结构域包含Q38K取代突变，H2的VH结构域包含Q39K取代突变，L2的VL结构域包含Q38E取代突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39K取代突变，L1的VL结构域包含Q38E取代突变，H2的VH结构域包含Q39E取代突变(均为Kabat编号)。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39K取代突变，H2的VH结构域包含Q39E取代突变，L2的VL结构域包含Q38K取代突变(均为Kabat编号)。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39K取代突变，L1的VL结构域包含Q38E取代突变，H2的VH结构域包含Q39E取代突变，L2的VL结构域包含Q38K取代突变(均为Kabat编号)。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，两个取代氨基酸之间的相互作用是通过氢键。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，两个取代氨基酸之间的相互作用是通过静电相互作用。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39K取代突变，H1的CH1结构域包含S183E取代突变，L1的VL结构域包含Q38E取代突变，L1的CL结构域包含V133K突变，H2的VH结构域包含Q39E取代突变，L2的VL结构域包含Q38K取代突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39K取代突变，H1的CH1结构域包含S183T取代突变，L1的VL结构域包含Q38E取代突变，L1的CL结构域包含V133K突变，H2的VH结构域包含Q39E取代突变，L2的VL结构域包含Q38K取代突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39K取代突变，H1的CH1结构域包含S183Y取代突变，L1的VL结构域包含Q38E取代突变，L1的CL结构域包含V133K突变，H2的VH结构域包含Q39E取代突变，L2的VL结构域包含Q38K取代突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39K取代突变，H1的CH1结构域包含S183F取代突变，L1的VL结构域包含Q38E取代突变，L1的CL结构域包含V133K突变，H2的VH结构域包含Q39E取代突变，L2的VL结构域包含Q38K取代突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39E取代突变，H1的CH1结构域包含S183E取代突变，L1的VL结构域包含Q38K取代突变，L1的CL结构域包含V133K突变，H2的VH结构域包含Q39K取代突变，L2的VL结构域包含Q38E取代突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39K取代突变，L1的VL结构域包含Q38E取代突变，H2的VH结构域包含Q39E取代突变，H2的CH1结构域包含S183E取代突变，L2的VL结构域包含Q38K取代突变，L1的CL结构域包含V133K突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39E取代突变，H1的CH1结构域包含S183K取代突变，L1的VL结构域包含Q38K取代突变，L1的CL结构域包含V133E取代突变，H2的VH结构域包含Q39K取代突变，H2的CH1结构域包含S183E取代突变，L2的VL结构域包含Q38E取代突变，L2的CL结构域包含V133K突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39E取代突变，H1的CH1结构域包含S183E取代突变，L1的VL结构域包含Q38K取代突变，L1的CL结构域包含V133K取代突变，H2的VH结构域包含Q39K取代突变，H2的CH1结构域包含S183K取代突变，L2的VL结构域包含Q38E取代突变，L2的CL结构域包含V133E突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39E取代突变，H1的CH1结构域包含S183E取代突变，L1的VL结构域包含Q38K取代突变，L1的CL结构域包含V133K取代突变，H2的VH结构域包含Q39K取代突变，H2的CH1结构域包含S183K取代突变，L2的VL结构域包含Q38E取代突变，L2的CL结构域包含V133E突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39K取代突变，H1的CH1结构域包含S183E取代突变，L1的VL结构域包含Q38K取代突变，L1的CL结构域包含V133E取代突变，H2的VH结构域包含Q39E取代突变，H2的CH1结构域包含S183E取代突变，L2的VL结构域包含Q38K取代突变，L2的CL结构域包含V133K突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39K取代突变，H1的CH1结构域包含S183E取代突变，L1的VL结构域包含Q38E取代突变，L1的CL结构域包含V133K取代突变，H2的VH结构域包含Q39E取代突变，H2的CH1结构域包含S183K取代突变，L2的VL结构域包含Q38K取代突变，L2的CL结构域包含V133E突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39K取代突变，H1的CH1结构域包含S183K取代突变，L1的VL结构域包含Q38E取代突变，L1的CL结构域包含V133E取代突变，H2的VH结构域包含Q39E取代突变，H2的CH1结构域包含S183E取代突变，L2的VL结构域包含Q38K取代突变，L2的CL结构域包含V133K突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1和/或H2都包含含有CH2和CH3结构域的Fc区。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的Fc区和/或H2的Fc区是人IgG1 Fc、人IgG2 Fc或人IgG4 Fc。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的Fc区和/或H2的Fc区是人小鼠IgG1Fc、小鼠IgG2Fc或小鼠IgG4 Fc。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH3结构域和H2的CH3结构域两者在界面相遇，CH3结构域都包含这样的氨基酸取代，使得与H1相比，H1的Fc区优先与H2的Fc区配对。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，CH3结构域中的氨基酸取代产生更大的静电互补性(electrostaticcomplementarity)。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，CH3结构域中的氨基酸取代产生更大的空间互补性。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，改变H1的CH3结构域，使得在CH3/CH3界面内，用一个或多个具有较大侧链体积的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基，从而在与H2的CH3结构域相互作用的H1的CH3结构域表面产生凸起，改变H2的CH3结构域，使得在CH3/CH3界面内，用具有较小侧链体积的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基，从而在与H1的CH3结构域相互作用的H2的CH3结构域表面产生凹陷。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，改变H2的CH3结构域，使得在CH3/CH3界面内，用一个或多个具有较大侧链体积的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基，从而在与H1的CH3结构域相互作用的H2的CH3结构域表面产生凸起，改变H1的CH3结构域，使得在CH3/CH3界面内，用具有较小侧链体积的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基，从而在与H2的CH3结构域相互作用的H1的CH3结构域表面产生凹陷。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该凸起是杵突变。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，产生杵的改变是T366W(EU编号)。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该凹陷是臼突变(EU编号)。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，产生臼的改变是T366S、L368A和Y407V中的至少一个。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该杵包含T366W(EU编号)。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该臼突变包含T366S、L368A和Y407V中的至少一个、至少两个或全部三个。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，进一步改变H1的CH1结构域，使得在CH1/CL界面内，用同等数目的具有较大侧链体积的氨基酸残基取代两个或多个氨基酸残基，从而在与L1的CL结构域相互作用的H1的CH1结构域表面产生凸起，进一步改变L1的CL结构域，使得在CH1/CL界面内，用同等数目的具有较小侧链体积的氨基酸残基取代两个或多个氨基酸残基，从而在与H1的CH1结构域相互作用的L1的CL结构域表面产生凹陷。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，进一步改变CL结构域，使得在CH1/CL界面内，用同等数目的具有较大侧链体积的氨基酸残基取代两个或多个氨基酸残基，从而在与H1的CH1结构域相互作用的CL结构域表面产生凸起，进一步改变H1的CH1结构域，使得在CH1/CL界面内，用同等数目的具有较小侧链体积的氨基酸残基取代两个或多个氨基酸残基，从而在与CL结构域相互作用的H1的CH1结构域表面产生凹陷。
本文还提供多特异性抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含：a)包含第一重链多肽(H1)和第一轻链多肽(L1)的第一重链/轻链对，和b)包含第二重链多肽(H2)和第二轻链多肽(L2)的第二重链/轻链对，H1和H2都包含重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域(CH1)，L1和L2都包含轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)；H1的CH1在F170(EU编号)处包含氨基酸取代，L1的CL结构域在S176(EU编号)处包含氨基酸取代。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，L1是κ链。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，L2是κ链。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，L1和L2都为κ链。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域进一步在选自A141、S181、S183和V185(EU编号)的位置处包含一个或多个氨基酸取代。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，L1的CL结构域进一步在选自F116、S131、V133、L135、S162、S174和T178(EU编号)的位置处包含一个或多个氨基酸取代。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该氨基酸取代产生空间互补性。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，CH1的选自A141、F170、S181、S183和V185(EU编号)的位置处的一个或多个氨基酸取代和/或CL的选自F116、S131、V133、L135、S162、S174、S176和T178(EU编号)的位置处的一个或多个氨基酸取代不是用带电荷氨基酸残基取代。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含选自F170S和F170A的氨基酸取代，L1的CL结构域包含氨基酸取代S176F。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含F170S突变，L1的CL结构域包含S176突变；或H1的CH1结构域包含F170A突变，L1的CL结构域包含S176F突变。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含F170S突变，L1的CL结构域包含S176F突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183V和V185A突变，L1的CL结构域包含F116A、V133I、L135V、S162M、S174A、S176F和T178V突变；H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变，L1的CL结构域包含F116A、S131D、L135V、S162A、S174A、S176F和T178I突变；H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变；或H1的CH1结构域包含A141I、F170A、S181M、S183V和V185A突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S162M、S174A、S176F和T178V突变。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变，H2的CH1结构域在S183(EU编号)处包含氨基酸取代突变，L2的CL结构域包含氨基酸取代突变V133K(EU编号)。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变，H2的CH1结构域在S183(EU编号)处包含氨基酸取代突变，L2的CL结构域包含氨基酸取代突变V133(EU编号)。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，用带正电荷氨基酸取代H2的CH1结构域中位置S183处的氨基酸，用带负电荷氨基酸取代L2的CL结构域中位置V133处的氨基酸。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，用带负电荷氨基酸取代H2的CH1结构域中位置S183处的氨基酸，用带正电荷氨基酸取代L2的CL结构域中位置V133处的氨基酸。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，H1的VH结构域包含Q39E突变(Kabat编号)，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，L1的VL结构域包含Q38K突变(Kabat编号)，H2的VH结构域包含Q39K突变(Kabat编号)，L2的VL结构域包含Q38E突变(Kabat编号)。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，L1的CL包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，H2的CH1结构域包含S183E突变(EU编号)，L2的CL结构域包含V133K突变(EU编号)。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，H1的VH结构域包含Q39E突变(Kabat编号)，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，L1的VL结构域包含Q38K突变(Kabat编号)，H2的CH1结构域包含S183E突变(EU编号)，H2的VH结构域包含Q39K突变(Kabat编号)，L2的CL结构域包含V133K突变(EU编号)，L2的VL结构域包含Q38E突变(Kabat编号)。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，H1的VH结构域包含Q39K突变(Kabat编号)，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变，L1的VL结构域包含Q38E突变(Kabat编号)，H2的VH结构域包含Q39E突变(Kabat编号)，L2的VL结构域包含Q38K突变(Kabat编号)。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变，H2的CH1结构域包含S183K突变(EU编号)，L2的CL结构域包含V133K突变(EU编号)。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，H1的VH结构域包含Q39K突变(Kabat编号)，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变，L1的VL结构域包含Q38E突变(Kabat编号)，H2的CH1结构域包含S183E突变(EU编号)，H2的VH结构域包含Q39E突变(Kabat编号)，L2的CL结构域包含V133K突变(EU编号)，L2的VL结构域包含Q38K突变(Kabat编号)。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含F170S、S181M、S183A和V185A突变，L1的CL结构域包含L135V、S174A、S176F和T178V突变；H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S183A和V185A突变，L1的CL结构域包含F116A、S174A、S176F和T178V突变；H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M和V185A突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S176F和T178V突变；H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M和S183A突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变；H1的CH1结构域包含F170S、S183A和V185A突变，L1的CL结构域包含F116A、S176F和T178V突变；H1的CH1结构域包含F170S、S181M和V185A突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V和S176F突变；H1的CH1结构域包含F170S、S181M和S183A突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V和S176F突变；H1的CH1结构域包含A141I、F170S和V185A突变，L1的CL结构域包含F116A和S176F突变；H1的CH1结构域包含A141I、F170S和S183A突变，L1的CL结构域包含F116A和S176F突变；H1的CH1结构域包含A141I、F170S和S181M突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变；H1的CH1结构域包含F170S和V185A突变，L1的CL结构域包含F116A和S176F突变；H1的CH1结构域包含A141I和F170S突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变；H1的CH1结构域包含A141I和F170S突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S176F和T178V突变；H1的CH1结构域包含A141I和F170S突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变；H1的CH1结构域包含A141I和F170S突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V和S176F突变；H1的CH1结构域包含A141I和F170S突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V和S176F突变；H1的CH1结构域包含F170S突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变；H1的CH1结构域包含F170S突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S176F和T178V突变；H1的CH1结构域包含F170S突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变；H1的CH1结构域包含F170S突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V和S176F突变；或H1的CH1结构域包含F170S突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V和S176F突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M和S183A突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A和S176F突变；H1的CH1结构域包含F170S、S181M和S183A突变，L1的CL结构域包含F116A和S176F突变；H1的CH1结构域包含A141I和F170S突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A和S176F突变；H1的CH1结构域包含A141I和F170S突变，L1的CL结构域包含F116A和S176F突变；H1的CH1结构域包含F170S突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A和S176F突变；或H1的CH1结构域包含F170S突变，L1的CL结构域包含F116A和S176F突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含A141I、F170S和S181M突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含A141I和F170S突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含F170S突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含A141I和F170S突变，L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A和S176F突变。
本文提供抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含：a)包含第一重链序列(H1)和第一轻链序列(L1)的第一重链/轻链对，和b)包含第二重链序列(H2)和第二轻链序列(L2)的第二重链/轻链对，H1和H2都包含重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域(CH1)，L1和L2都包含轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)；H1的CH1结构域在L128和V185(EU编号)处包含氨基酸取代，C1的CL结构域在F118和L135(EU编号)处包含氨基酸取代。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，L1是κ链。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，L2是κ链。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，L1和L2都为κ链。
本文还提供抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含：a)包含第一重链序列(H1)和第一轻链序列(L1)的第一重链/轻链对，和b)包含第二重链序列(H2)和第二轻链序列(L2)的第二重链/轻链对，H1和H2都包含重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域(CH1)，L1和L2都包含轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)；H1的CH1结构域在L128(EU编号)处包含氨基酸取代，C1的CL结构域在F118和L135(EU编号)处包含氨基酸取代。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，L1是κ链。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，L2是κ链。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，L1和L2都为κ链。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域进一步在V185(EU编号)处包含氨基酸取代。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域进一步在选自A141、F170、S181和S183(EU编号)的位置处包含一个或多个氨基酸取代。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，L1的CL结构域进一步在选自S131、V133、S162、T164、S176和T178(EU编号)的位置处包含一个或多个氨基酸取代。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该氨基酸取代产生更大的空间互补性。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域在选自A141、F170、S181和S183的位置处包含氨基酸取代，CL结构域在选自S131、V133、S162、T164、S176和T178的位置处包含氨基酸取代。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，CH1的选自L128、A141、F170、S181、S183、V185(EU编号)的位置处的一个或多个氨基酸取代和/或CL的选自F118、S131、V133、L135、S162、T164、S176和T178(EU编号)的位置处的一个或多个氨基酸取代不是用带电荷氨基酸残基取代。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含L128F、A141M、F170M、S181I和S183A突变，CL结构域包含F118V、S131T、V133A、L135Y、S162A、T164S、S176M和T178L突变；H1的CH1结构域包含L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A突变，CL结构域包含F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L突变；H1的CH1结构域包含L128F、A141T、F170M、S181T、S183A和V185L突变，CL结构域包含F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、T164S、S176T和T178L突变；或H1的CH1结构域包含L128F、A141M、F170M、S181T和S183A突变，CL结构域包含F118V、S131T、V133A、L135F、S162M、T164S、S176M和T178L突变。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH1结构域包含L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A突变，CL结构域包含F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H2的CH1结构域包含S183E突变，L2的CL结构域包含V133K突变。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39E突变，L1的VL结构域包含Q38K突变，H2的VH结构域包含Q39K突变，L2的VL结构域包含Q38E突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H2的CH1结构域包含S183K突变，L2的CL结构域包含V133E突变。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Q39K突变，L1的VL结构域包含Q38E突变，H2的VH结构域包含Q39E突变，L2的VL结构域包含Q38K突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H2的CH1结构域在EU位置S183处包含氨基酸取代，L2的CL结构域在EU位置V133处包含氨基酸取代。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H2的CH1结构域上EU位置S183处的氨基酸取代和L2的CL结构域上EU位置V133处的氨基酸取代之间的相互作用是通过静电相互作用。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，用带正电荷残基取代H2的CH1结构域上EU位置S183处的氨基酸，用带负电荷残基取代L2的CL结构域上EU位置V133处的氨基酸。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，用带负电荷残基取代H2的CH1结构域上EU位置S183处的氨基酸，用带正电荷残基取代L2的CL结构域上EU位置V133处的氨基酸。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H2的CH1结构域在选自EU位置S183A、S183T、S183V、S183Y、S183F、S183H、S183N、S183D、S183E、S183R和S183K的位置处包含氨基酸取代，L2的CL结构域在选自EU位置V133E、V133S、V133L、V133W、V133K、V133R和V133D的位置处包含氨基酸取代。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H2的CH1结构域包含EU位置S183D突变，L2的CL结构域包含EU位置V133K突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183E突变，L2的CL结构域包含EU位置V133K突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183A突变，L2的CL结构域包含EU位置V133E突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183A突变，L2的CL结构域包含EU位置V133S突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183A突变，L2的CL结构域包含EU位置V133L突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183A突变，L2的CL结构域包含EU位置V133W突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183A突变，L2的CL结构域包含EU位置V133K突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183A突变，L2的CL结构域包含EU位置V133R突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183A突变，L2的CL结构域包含EU位置V133D突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183T突变，L2的CL结构域包含EU位置V133E突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183T突变，L2的CL结构域包含EU位置V133S突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183T突变，L2的CL结构域包含EU位置V133L突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183T突变，L2的CL结构域包含EU位置V133W突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183T突变，L2的CL结构域包含EU位置V133K突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183T突变，L2的CL结构域包含EU位置V133R突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183T突变，L2的CL结构域包含EU位置V133D突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183V突变，L2的CL结构域包含EU位置V133E突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183V突变，L2的CL结构域包含EU位置V133S突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183V突变，L2的CL结构域包含EU位置V133L突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183V突变，L2的CL结构域包含EU位置V133W突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183V突变，L2的CL结构域包含EU位置V133K突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183V突变，L2的CL结构域包含EU位置V133R突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183V突变，L2的CL结构域包含EU位置V133D突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183Y突变，L2的CL结构域包含EU位置V133E突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183Y突变，L2的CL结构域包含EU位置V133S突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183Y突变，L2的CL结构域包含EU位置V133L突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183Y突变，L2的CL结构域包含EU位置V133W突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183Y突变，L2的CL结构域包含EU位置V133K突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183Y突变，L2的CL结构域包含EU位置V133R突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183Y突变，L2的CL结构域包含EU位置V133D突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183F突变，L2的CL结构域包含EU位置V133E突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183F突变，L2的CL结构域包含EU位置V133S突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183F突变，L2的CL结构域包含EU位置V133L突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183F突变，L2的CL结构域包含EU位置V133W突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183F突变，L2的CL结构域包含EU位置V133K突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183F突变，L2的CL结构域包含EU位置V133R突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183F突变，L2的CL结构域包含EU位置V133D突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183H突变，L2的CL结构域包含EU位置V133S突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183H突变，L2的CL结构域包含EU位置V133L突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183H突变，L2的CL结构域包含EU位置V133W突变；H2的CH1结构域包含EU位置S183N突变，L2的CL结构域包含EU位置V133L突变；或H2的CH1结构域包含EU位置S183E突变，L2的CL结构域包含EU位置V133L突变。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H2的CH1结构域包含EU位置S183D取代，L2的CL结构域包含EU位置V133K取代。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H2的CH1结构域和L2的VL结构域不包含氨基酸取代。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域在Kabat位置Q39处包含氨基酸取代，V1的VL结构域在Kabat位置Q38处包含氨基酸取代。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，用带正电荷残基取代H1的VH结构域上Kabat位置Q39处的氨基酸，用带负电荷残基取代L1的VL结构域上Kabat位置Q38处的氨基酸。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，用带负电荷残基取代H1的VH结构域上Kabat位置Q39处的氨基酸，用带正电荷残基取代L1的VL结构域上Kabat位置Q38处的氨基酸。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该带正电荷残基选自R和K。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该带负电荷残基选自D和E。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Kabat位置Q39E取代突变，L1的VL结构域包含Kabat位置Q38K取代，H2的VH结构域包含Kabat位置Q39K取代突变，L2的VL结构域包含Kabat位置Q38E取代突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Kabat位置Q39E取代突变，L1的VL结构域包含Kabat位置Q38K取代。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Kabat位置Q39E取代突变，L1的VL结构域包含Kabat位置Q38K取代，H2的VH结构域包含Kabat位置Q39K取代突变。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Kabat位置Q39E取代突变，L1的VL结构域包含Kabat位置Q38K取代，H2的VH结构域包含Kabat位置Q39K取代突变，L2的VL结构域包含Kabat位置Q38E取代突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Kabat位置Q39K取代突变，L1的VL结构域包含Kabat位置Q38E取代。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Kabat位置Q39K取代突变，L1的VL结构域包含Kabat位置Q38E取代，H2的VH结构域包含Kabat位置Q39E取代突变。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的VH结构域包含Kabat位置Q39K取代突变，L1的VL结构域包含Kabat位置Q38E取代，H2的VH结构域包含Kabat位置Q39E取代突变，L2的VL结构域包含Kabat位置Q38K取代突变。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，与L2相比，H1优先与L1配对，与L1相比，H2优先与L2配对。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1包含含有CH2和CH3结构域的Fc区。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的Fc区和/或H2的Fc区是IgG1、IgG2或IgG4 Fc。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的Fc区和/或H2的Fc区是小鼠IgG1 Fc、小鼠IgG2 Fc或小鼠IgG4 Fc。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，H1的CH3结构域和H2的CH3结构域两者在界面相遇，CH3结构域都包含这样的氨基酸取代，使得与H1相比，H1的Fc区优先与H2的Fc区配对。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，CH3结构域中的氨基酸取代产生更大的静电互补性。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，CH3结构域中的氨基酸取代产生更大的空间互补性。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，改变H1的CH3结构域，使得在CH3/CH3界面内，用一个或多个具有较大侧链体积的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基，从而在与H2的CH3结构域相互作用的H1的CH3结构域表面产生凸起；改变H2的CH3结构域，使得在CH3/CH3界面内，用具有较小侧链体积的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基，从而在与H1的CH3结构域相互作用的H2的CH3结构域表面产生凹陷。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，改变H2的CH3结构域，使得在CH3/CH3界面内，用一个或多个具有较大侧链体积的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基，从而在与H1的CH3结构域相互作用的H2的CH3结构域表面产生凸起；改变H1的CH3结构域，使得在CH3/CH3界面内，用具有较小侧链体积的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基，从而在与H2的CH3结构域相互作用的H1的CH3结构域表面产生凹陷。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该凸起是杵突变。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，产生杵的改变是T366W。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该凹陷是臼。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，产生臼的改变是T366S、L368A和Y407V中的至少一个。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该杵包含T366W。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该臼突变包含T366S、L368A和Y407V中的至少一个、至少两个或全部三个。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，与L2相比，H1优先与L1配对，其中与L1相比，H2优先与L2配对。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，第一抗原和第二抗原相同。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，第一重链/轻链对和第二重链/轻链对分别结合同一抗原上的不同表位。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，第一抗原和第二抗原不同。
本文还提供药物组合物，其包含以上实施方案中任意个的多特异性抗原结合蛋白，及可药用载体。本文还提供在个体中治疗疾病的方法，其包括对该个体施用有效量的根据(或适用于)以上实施方案中任意个的药物组合物。
提供分离的核酸，其编码以上实施方案中任意个的多特异性抗原结合蛋白的至少一条多肽序列。还提供载体，其包含根据(或适用于)以上实施方案中任意个的核酸。还提供分离的宿主细胞，其包含根据(或适用于)以上实施方案中任意个的核酸，或根据(或适用于)以上实施方案中任意个的载体。
在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该宿主细胞是原核宿主细胞，大肠杆菌(E.coli)细胞，真核宿主细胞，酵母细胞，哺乳动物细胞，或CHO细胞。
本文提供产生根据(或适用于)以上实施方案中任意个的多特异性抗原结合蛋白的方法，其包括：(a)获得H1、H2、L1和L2多肽；(b)使与L2相比，H1优先与L1配对，与L1相比，H2优先与L2配对，以形成多特异性抗原结合蛋白。
还提供产生根据(或适用于)以上实施方案中任意个的多特异性抗原结合蛋白的方法，其包括：(a)将一组编码H1、L1、H2和L2的多核苷酸引入宿主细胞；和(b)培养该宿主细胞以产生该多特异性抗原结合蛋白。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，将该组编码H1、L1、H2和L2的多核苷酸引入同一宿主细胞。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，将该组编码H1、L1、H2和L2的多核苷酸引入细胞系。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该细胞系是稳定表达H1、L1、H2和L2的稳定细胞系。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该细胞系是稳定表达多特异性抗原结合蛋白的稳定细胞系。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，将该组编码H1、L1、H2和L2的多核苷酸按预先确定的比例引入宿主细胞。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该方法进一步包括确定引入宿主细胞的多核苷酸的最佳比例。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白以60％或更高的相对产率的产生。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白以至少约70％、至少约71％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约99％、或超过约99％的相对产率的产生。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白以至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约99％、或超过约99％的相对产率的产生。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白以至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约99％、或超过约99％的相对产率的产生。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白以至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约99％、或超过约99％的相对产率的产生。
还提供产生多特异性抗原结合蛋白的方法，其包括培养根据(或适用于)以上实施方案中任意个的宿主细胞，并产生该多特异性抗原结合蛋白。在根据(或适用于)以上实施方案中任意个的一些实施方案中，该方法进一步包括回收该多特异性抗原结合蛋白。还提供通过根据(或适用于)以上实施方案中任意个的方法产生的多特异性抗原结合蛋白。
本文提供文库，其包含编码根据(或适用于)以上实施方案中任意个的多种多特异性抗原结合蛋白的多种多核苷酸。还提供筛选结合第一抗原和第二抗原的多特异性抗原结合蛋白的方法，其包括：(a)从根据(或适用于)以上实施方案中任意个的文库获得多种多特异性抗原结合蛋白；(b)测定该多种多特异性抗原结合蛋白与第一抗原和第二抗原的结合；和(c)鉴定结合第一抗原和第二抗原的多特异性抗原结合蛋白。
还提供用于评价多特异性抗原结合蛋白的计算机可读介质，该多特异性抗原结合蛋白包含：1)包含第一重链序列(H1)和第一轻链序列(L1)的结合第一抗原的第一重链/轻链对，和2)包含第二重链序列(H2)和第二轻链序列(L2)的结合第二抗原的第二重链/轻链对，其中H1和H2都包含重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域(CH1)，L1和L2都包含轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)；该计算机可读介质包含：a)包含代表H1、L1、H2和L2中的氨基酸取代的数据的数据集，其中H1的CH1结构域中的至少一个氨基酸取代包含EU位置F170或L128和V185处的氨基酸取代，其中CL结构域在EU位置S176或F118和L135处包含氨基酸取代；和/或包含代表H1、L1、H2和L2中的氨基酸取代的数据的数据集，其中H1的CH1结构域中的至少一个氨基酸取代包含EU位置S183处的氨基酸取代，其中C1在EU位置V133处包含氨基酸取代；和(b)用于确定与L2相比，H1优先与L1配对；和/或与L1相比，H2优先与L2配对的可能性的计算机可执行代码。
还提供用于评价多特异性抗原结合蛋白的计算机可读介质，该多特异性抗原结合蛋白包含：1)包含第一重链序列(H1)和第一轻链序列(L1)的结合第一抗原的第一重链/轻链对，和2)包含第二重链序列(H2)和第二轻链序列(L2)的结合第二抗原的第二重链/轻链对，其中H1和H2都包含重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域(CH1)，L1和L2都包含轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)；该计算机可读介质包含：a)包含代表H1、L1、H2和L2中的氨基酸取代的数据的数据集，其中H1的CH1结构域中的至少一个氨基酸取代包含EU位置F170或L128处的氨基酸取代，其中CL结构域在EU位置S176或F118和L135处包含氨基酸取代；和/或包含代表H1、L1、H2和L2中的氨基酸取代的数据的数据集，其中H1的CH1结构域中的至少一个氨基酸取代包含EU位置S183处的氨基酸取代，其中C1在EU位置V133处包含氨基酸取代；和(b)用于确定与L2相比，H1优先与L1配对；和/或与L1相比，H2优先与L2配对的可能性的计算机可执行代码。在某些实施方案中，包含代表H1、L1、H2和L2中的氨基酸取代的数据的数据集中，H1的CH1结构域中的至少一个氨基酸取代包含EU位置F170或L128和V185处的氨基酸取代。
附图简述
图1(图A和图1B)显示来自包含在位置L128、G143、L145、S183或V185处具有取代突变的重链和在F118、V133或L135处具有取代的轻链的抗体的1ml 293T培养物的蛋白A回收。
图2提供哺乳动物培养物表达测定的结果，进行该测定来鉴定在与具有F118、V133或L135取代突变的CL共表达时恢复抗体表达的CH1中的氨基酸突变。
图3提供轻链恒定区(CL)和重链CH1结构域界面内部的示意图。
图4提供哺乳动物培养物表达测定的结果，进行该测定来分析表达具有V133X/S183X取代突变的轻链/重链对的培养物中的抗体表达。
图5显示在VH Q39或VL Q38或二者中具有氨基酸取代的多种突变体抗体与抗原IL-13结合的FACS分析的结果。
图6是进行来鉴定有利于VH/VL配对的Q39X-VH/Q38X-VL突变体对的附加FACS分析的结果。
图7显示进行来鉴定有利于VH/VL配对的Q39X-VH/Q38X-VL突变体对的哺乳动物培养物表达测定的结果。
图8显示通过Orbitrap质谱分析从哺乳动物共表达的抗体测量的具有正确重链-轻链配对的双特异性抗体变体的％存在的示例性结果。测试的突变显示在X轴上。各组突变中的四个字母分别指Q39XHC1/Q38XLC1杵/Q39XHC2/Q38XLC2臼处的氨基酸取代。
图9A显示进行来评估4D5/UCHT1双特异性抗体中的重链/轻链配对的QTOF测定的结果。图9B显示进行来评估4D5/UCHT1双特异性抗体中的重链/轻链配对的QTOF测定的结果，该双特异性抗体经修饰，使得4D5臂包含具有Q38K突变的VL和具有Q39E突变的VH，UCHT1臂包含具有Q38E突变的VL和具有Q39K突变的VH(“EKKE”)。
图10A显示图10B的放大图。图10B显示进行来评估双特异性4D5/UCHT1抗体中的重链/轻链配对的高分辨质谱分析的结果，其中UCHT1臂修饰为包含VL-Q38E、CL-V133K、VH-Q39K和CH-1-S183E突变，其中4D5/UCHT1抗体的4D5臂修饰为包含VL-Q38K和VH-Q39E突变。图10C显示图10D的放大图。图10D显示进行来评估双特异性4D5/UCHT1抗体中的重链/轻链配对的高分辨质谱分析的结果，其中UCHT1臂修饰为包含CL-V133K和CH-1-S183E突变。图10E显示进行来评估WT双特异性4D5/UCHT1抗体中的重链/轻链配对的高分辨质谱分析的结果。
图11A显示野生型4D5 Fab和修饰为具有VL-Q38K、CL-V133E、VH-Q39E和CH1-S183K突变的4D5 Fab的重叠晶体结构。图11B显示经修饰的4D5 Fab中由VL-Q38K和VH-Q39E形成的键(例如盐桥和氢键)。图11C显示经修饰的4D5 Fab中由CL-V133E和CH1-S183K形成的键(例如盐桥和氢键)。
图12A显示野生型4D5 Fab和修饰为具有VL-Q38E、CL-V133K、VH-Q39K和CH1-S183E突变的4D5 Fab的重叠晶体结构。图12B显示经修饰的4D5 Fab中由VL-Q38E和VH-Q39K形成的键。图12C显示经修饰的4D5 Fab中由CL-V133K和CH1-S183E形成的键。
图13A显示用于产生突变体CH1/CL对的一种设计方法(即“方法A”)。图13B显示用于针对4D5/UCHT1双特异性抗体(抗HER2/抗CD3)产生突变体CH1/CL对的第二种设计方法(即“方法B”)。
图14显示用于测定来自单细胞共表达的双特异性IgG含量的夹心ELISA实验的示意图。
图15显示对JS20、JS78、YS18和YT65变体进行的夹心ELISA的结果。
图16A提供JS20(SEQ ID NO:49)、JS78(SEQ ID NO:50)、JT20(SEQ ID NO:51)、JT25(SEQ ID NO:52)、YS08(SEQ ID NO:28)、YS18(SEQ ID NO:29)、YT65(SEQ ID NO:29)和YT34变体(SEQ ID NO:44)的重链的部分的氨基酸序列。图16A还提供4D5野生型重链“4D5wt-Hc”的部分的氨基酸序列(SEQ ID NO:67)。图16B提供JS20(SEQ ID NO:69)、JS78(SEQ ID NO:70)、JT20(SEQ ID NO:71)、JT25(SEQ ID NO:72)、YS08(SEQ ID NO:73)、YS18(SEQ ID NO:74)、YT65(SEQ ID NO:75)和YT34变体(SEQ ID NO:76)的轻链的部分的氨基酸序列。图16B还提供4D5WT轻链“4D5wt-Lc”的部分的氨基酸序列(SEQ ID NO:68)。
图17A显示对野生型4D5/UCHT1共表达双特异性抗体进行的质谱分析的结果。图17B显示对包含4D5臂上的YT65 CH1/CL突变和VH-Q39E和VL-Q38K突变及UCHT1臂上的VL-Q38E和VH-Q39K突变的4D5/UCHT1共表达抗体进行的质谱分析的结果。
图18A显示对野生型4D5/UCHT1双特异性抗体进行的质谱分析的结果。图18B显示对包含4D5臂上的YT65 CH1/CL突变和VH-Q39E和VL-Q38K突变及UCHT1臂上的VL-Q38E和VH-Q39K突变的4D5/UCHT1抗体进行的质谱分析的结果。
图19A提供YT65(SEQ ID NO:78)、YT65.1(SEQ ID NO:79)、YT65.2(SEQ ID NO:80)、YT65.3(SEQ ID NO:81)、YT65.4(SEQ ID NO:82)、YT65.5(SEQ ID NO:83)、YT65.6(SEQID NO:84)、YT65.7(SEQ ID NO:85)、YT65.8(SEQ ID NO:86)、YT65.9(SEQ ID NO:87)、YT65.10(SEQ ID NO:88)、YT65.11(SEQ ID NO:89)、YT65.12(SEQ ID NO:90)和YT65.13变体(SEQ ID NO:91)的重链的部分的氨基酸序列。图19B将4D5wt重链序列“4D5wt-Hc”公开为SEQ ID NO:77。图19B提供YT65(SEQ ID NO:93)、YT65.1(SEQ ID NO:94)、YT65.2(SEQ IDNO:95)、YT65.3(SEQ ID NO:96)、YT65.4(SEQ ID NO:97)、YT65.5(SEQ ID NO:98)、YT65.6(SEQ ID NO:99)和YT65.7变体(SEQ ID NO:100)的轻链的部分的氨基酸序列。图19B将4D5wt轻链序列“4D5wt-Lc”公开为SEQ ID NO:92。
图20A显示对包含4D5臂上的YT65 CH1/CL突变和VH-Q39E和VL-Q38K突变及UCHT1臂上的VH-Q39K和VL-Q38E突变的4D5/UCHT1抗体进行的pH中性天然质谱分析的结果。图20B显示进行来确认用于获得图20A中数据的分析的检测灵敏度的实验的结果。
图21显示进行来评估YT65、EKKE及YT65和EKKE二者对抗IL4/IL13、抗EGFR/MET、抗VEGFA/ANG2、抗VEGFA/VEGFC和抗HER2/CD3(即4D5/UCHT1)双特异性抗体中重链/轻链配对的影响的高分辨质谱分析实验的定量结果。
图22A显示修饰为具有VL-Q38K、VH-Q39E和YT65突变的4D5 Fab的晶体结构。图22B显示野生型4D5 Fab的CH1结构域和修饰为具有YT65突变的4D5 Fab的CH1结构域的重叠晶体结构。
图23显示抗HER2/CD3+EKKE+V133K/S183E臼、抗HER2/CD3+EKKE+YT65杵和未经修饰的抗HER2/CD3在体外T细胞介导的B细胞细胞毒性测定中的生物学活性。
图24显示(i)抗HER2、(ii)抗gD/CD3、(iii)抗HER2/CD3、(iv)抗HER2/CD3+EKKE+YT65杵和(iv)抗HER2/CD3+EKKE+V133E/S183K杵+V133K/S183E臼在C.B-17 SCID小鼠中5mg/kg静脉内施用抗体后的多种时间点的平均血清水平。
发明详述
除非文中另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。Singleton等,Dictionary of Microbiology andMolecular Biology,第2版,John Wiley and Sons,New York(1994)和Hale&Marham,TheHarper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY(1991)为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般字典。虽然类似或等同于本文中所述的那些的任何方法和材料都可以用于实施或测试本发明，但描述优选的方法和材料。数字范围包含定义该范围的数字。除非另有说明，分别按5’至3’方向从左至右书写核酸；按氨基至羧基方向从左至右书写氨基酸序列。对于本领域的定义和术语，从业者尤其可参考Sambrook等,1989和Ausubel FM等,1993。应理解，本发明不限于所述的具体方法、流程和试剂，因为这些可以变动。
数字范围包含定义该范围的数字。
除非另有说明，分别按5’至3’方向从左至右书写核酸；按氨基至羧基方向从左至右书写氨基酸序列。
本文提供的标题不是对可参考说明书整体而得到的多种方面或实施方案的限制。因此，下文即将定义的术语通过参考说明书整体而得到更充分的定义。
定义
本文的术语“多特异性抗原结合蛋白”以最广泛的含义使用，指能够结合两种或多种抗原的结合蛋白。在某些方面，多特异性结合蛋白指双特异性抗体，例如人双特异性抗体、人源化双特异性抗体、嵌和双特异性抗体或小鼠双特异性抗体。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)结合两种不同抗原。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)结合一种抗原上的不同表位。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，指包含两条重链和两条轻链的任何免疫球蛋白(Ig)分子，及其任何片段、突变体、变体或衍生物，只要它们显示希望得到的生物活性(例如表位结合活性)。抗体的实例包括本文所述的单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段。抗体可以是小鼠、嵌和、人、人源化和/或亲和力成熟的抗体。
作为参考系，本文所用的抗体将指免疫球蛋白G(IgG)的结构。但是，本领域技术人员将理解/认可，任何免疫球蛋白种类的抗体都可以用于本文所述的本发明的方法。为了清晰，IgG分子包含一对重链(HC)和一对轻链(LC)。每条LC具有一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)，而每条HC具有一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。CH1和CH2通过铰链区连接。此结构为本领域公知。
简言之，基本的4链抗体单位是由两条轻(L)链和两条重(H)链组成的异源四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本的异源四聚体单位连同称为J链的附加多肽组成，因此包含10个抗原结合部位，而分泌性IgA抗体可以多聚化形成包含2-5个基本4链单位连同J链的多价集聚)。在IgG的情况下，4链单位通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而取决于H链同种型，两条H链通过一个或多个二硫键相互连接。每条H和L链还具有规则间隔开的链内二硫键。每条H链在N端具有可变结构域(VH)，对于α和γ链中的每一种，后面是三个恒定结构域(CH)，对于μ和ε同种型，后面是四个CH结构域。每条L链在N端具有可变结构域(VL)，后面是其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，而CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。认为特定的氨基酸残基形成轻链和重链可变结构域之间的界面。VH和VL配对在一起形成单个抗原结合部位。对于不同种类抗体的结构和性质，参见例如Basic andClinical Immunology,第8版,Daniel P.Stites,Abba I.Ter和Tristram G.Parslow(编辑),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994,第71页和第6章。
根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任意脊椎动物物种的L链分配至两个明显不同的类型之一，称为κ和λ。取决于其重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分配至不同的种类或同种型。存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其分别具有称为α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能相对小的差异，将γ和α种类进一步划分为亚类，例如，人类表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“VL”结构域包含免疫球蛋白轻链的氨基端可变结构域。
术语“VH结构域”包含免疫球蛋白重链的氨基端可变结构域。
术语“CL结构域”包含例如从约Kabat位置107A延伸至216(EU位置108-214(κ))的免疫球蛋白轻链恒定区结构域。下文提供κC结构域的Eu/Kabat转换表。CL结构域邻近VL结构域，包含免疫球蛋白轻链的羧基端。下文SEQ ID NO:30中显示人κ轻链CL结构域的示例性氨基酸序列，包括由于基因剪接而存在于成熟CL结构域中的N端R残基。
表A
Figure BDA0001520322730000341
Figure BDA0001520322730000351
Figure BDA0001520322730000361
本文所用的术语人IgG的“CH1结构域”包含例如在Kabat编号系统中从约114位延伸至223位(EU位置118-215)的免疫球蛋白重链第一(最靠近氨基端)恒定区结构域。CH1结构域邻近VH结构域，处于免疫球蛋白重链分子铰链区氨基端，不形成免疫球蛋白重链Fc区的部分，能够与免疫球蛋白轻链恒定结构域(即“CL”)二聚化。
下文提供IgG1重链(SEQ ID NO:65)的EU/Kabat转化表。示例性CH1序列显示在SEQID NO:53中、铰链序列显示在SEQ ID NO:129中、CH2序列显示在SEQ ID NO:130中、CH3序列显示在SEQ ID NO:131中。
Figure BDA0001520322730000371
Figure BDA0001520322730000381
Figure BDA0001520322730000391
Figure BDA0001520322730000392
Figure BDA0001520322730000401
Figure BDA0001520322730000411
本文所用的术语“互补性”指例如本文所述多特异性抗原结合蛋白的重链CH1和轻链CL的界面处影响重链/轻链配对的相互作用的组合。“空间互补性”或“构象互补性”指例如重链CH1结构域和轻链CL结构域的相互作用表面处的三维结构的相容性。“静电互补性”指在例如重链CH1结构域和轻链CL结构域和/或重链VH结构域和轻链VL结构域的相互作用表面处放置带负电荷和/或正电荷原子的相容性。
术语人IgG Fc区的“CH2结构域”通常包含根据EU编号系统的IgG的约残基231至约340。CH2结构域的独特性在于它不与另一结构域紧密配对。相反，两条N连接分枝糖链插入在完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，糖类可以提供结构域-结构域配对的替代，帮助稳定CH2结构域。Burton,Mol.lmmunol.22:161-206(1985)。
术语“CH3结构域”包含Fc区中位于CH2结构域C端的残基(即按照EU编号系统从IgG的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447)。
本文所用的术语“Fc区”一般指包含免疫球蛋白重链的C端多肽序列的二聚体复合物，其中C端多肽序列是可通过木瓜蛋白酶消化完整抗体而获得的多肽序列。Fc区可以包括天然或变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc序列的边界可以不同，但人IgG重链Fc序列包含从约Cys226位或从约Pro230位至Fc序列羧基端。除非文中另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号按照Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号系统，也称为EU指数。免疫球蛋白Fc序列通常包含CH2结构域和CH3结构域两个恒定区，可选地包含CH4结构域。本文中的“Fc多肽”指构成Fc区的多肽之一，例如单体Fc。Fc多肽可以获自任何适宜的免疫球蛋白，如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，IgA、IgE、IgD或IgM。Fc多肽可以获自小鼠，例如小鼠IgG2a。Fc区包含通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列决定；此区域也是见于某些类型细胞上的Fc受体(FcR)识别的部分。在一些实施方案中，Fc多肽包含部分或全部野生型铰链序列(通常在其N端)。在一些实施方案中，Fc多肽不包含功能性或野生型铰链序列。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合、CDC、Fc受体结合、ADCC、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。这类效应子功能一般需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，且可以用例如本文定义中公开的多种测定来评估。
“天然序列Fc区”包含与见于自然界中的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；天然序列人IgG4 Fc区；及其天然存在的变体。天然序列Fc区还包括天然序列小鼠IgG2a。
“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰(优选一个或多个氨基酸取代)而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代，例如从约一个至约十个氨基酸取代，优选从约一个至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区将优选与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，最优选与之具有至少约90％同源性，更优选与之具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源性。
本文所用的“Fc成分”指Fc区的铰链区、CH2结构域或CH3结构域。
在某些实施方案中，Fc区包含优选源自野生型人IgG Fc区的IgG Fc区。在某些实施方案中，Fc区源自“野生型”小鼠IgG，如小鼠IgG2a。“野生型”人IgG Fc或“野生型”小鼠IgG Fc分别指天然存在于人群或小鼠群体内的氨基酸序列。当然，正如Fc序列在个体间可略微不同，可以对野生型序列进行一个或多个改变，且仍在本发明的范围之内。例如，Fc区可以包含改变，如糖基化位点中的突变，或包含非天然氨基酸。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的涉及该抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如Kindt等Kuby Immunology,第61版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域筛选互补VL或VH结构域的文库来分离结合特定抗原的抗体。参见例如Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。
本文所用的短语“抗原结合臂”、“靶分子结合臂”、“靶标结合臂”及其变形指本文提供的多特异性抗原结合蛋白的具有特异性结合目的靶标能力的组成部分。通常和优选地，抗原结合臂是免疫球蛋白多肽序列(例如免疫球蛋白轻链和重链的CDR和/或可变结构域序列)的复合物。
“靶标”或“靶分子”指多特异性抗原结合蛋白的结合臂所识别的部分。例如，如果多特异性抗原结合蛋白是抗体，则靶标取决于背景可以是单个分子上或不同分子上的表位、或病原体或肿瘤细胞。类似地，如果多特异性抗原结合蛋白是受体-Fc融合蛋白，则靶标可以是该受体的关连(cognate)结合配偶体。本领域技术人员将理解，靶标由靶标结合臂的结合特异性决定，不同靶标结合臂可识别不同靶标。靶标优选以高于1μM Kd的亲和力(根据Scatchard分析)结合本文提供的多特异性抗原结合蛋白。靶分子的实例包括但不限于血清可溶性蛋白和/或其受体，如细胞因子和/或细胞因子受体，黏附素，生长因子和/或其受体，激素，病毒颗粒(例如RSV F蛋白、CMV、Staph A、流感病毒、丙型肝炎病毒)，微生物(例如细菌细胞蛋白、真菌细胞)，黏附素，CD蛋白及其受体。
本文所用的术语“界面”指源自第一抗体结构域中的一个或多个氨基酸与第二抗体结构域的一个或多个氨基酸的相互作用的结合表面。示例性界面包括例如CH1/CL、VH/VL和CH3/CH3。在一些实施方案中，界面包括例如形成界面的氨基酸之间的氢键、静电相互作用或盐桥。
“完整”或“全长”抗体的一个实例是包含抗原结合臂以及CL和至少一个重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。
本文所用的术语“偶联”指将第一和第二重链多肽(即H1和H2)相互连接(例如形成共价键)所必需的步骤。这类步骤包括还原、复性和/或氧化第一和第二重链多肽(即H1和H2)中的半胱氨酸残基以形成链间二硫键。偶联可以通过化学交联或使用氧化还原系统来达到。参见例如Humphreys等,J.lmmunol.Methods(1998)217:1-10和Zhu等,Cancer Lett.,(1994)86:127-134。
“单特异性”抗原结合蛋白指抗原结合蛋白(如抗体)仅结合一个表位的能力。“双特异性”抗原结合蛋白指抗原结合蛋白结合两个不同表位的能力。“多特异性”抗原结合蛋白指抗原结合蛋白结合一个以上表位的能力。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白(如多特异性抗体)涵盖双特异性抗原结合蛋白或双特异性抗体。对于本文提供的双特异性和多特异性抗原结合蛋白，表位可以在同一抗原上，或者每个表位可以在不同的抗原上。因此，在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)结合两种不同抗原。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)结合一种抗原上的不同表位。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白以约≤1μM、约≤100nM、约≤10nM、约≤1nM、约≤0.1nM、约≤0.01nM或约≤0.001nM(例如约10-8M或更小，例如从约10-8M至约10-13M，例如从约10-9M至约10-13M)的解离常数(Kd)结合各表位。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体(Db)；串联双抗体(taDb)；线性抗体(例如美国专利号5,641,870；Zapata等,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体；单可变结构域抗体；微抗体；单链抗体分子；形成自抗体片段的多特异性抗体(例如，包括但不限于Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3和(scFV)4-Fc)。
本文提供的抗体可以是“嵌合”抗体，其中部分重链和/或轻链与源自特定物种或隶属于特定抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与源自另一物种或隶属于另一抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，以及这类抗体的片段，只要它们显示希望得到的生物活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文中的目的嵌合抗体包括含有源自非人灵长类(例如旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列的灵长类源化抗体。
非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式是含有源自非人抗体的最少序列的嵌合抗体。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中用来自非人物种(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的具有希望得到的抗体特异性、亲和力和能力的高变区(供体抗体)的残基取代来自受体的高变区的残基。在一些情况下，用对应的非人残基取代人免疫球蛋白的构架区(FR)残基。此外，人源化抗体可以包含不见于受体抗体中或供体抗体中的残基。进行这些修饰来进一步改良抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，且全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还将可选地包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节参见Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
本文中所用的“复合物”或“复合的”指通过并非肽键的键和/或力(例如范德瓦尔斯力、疏水力、亲水力)彼此相互作用的两个或多个分子的结合。在一个实施方案中，该复合物是异源多聚体。应理解，本文中所用的术语“蛋白质复合物”或“多肽复合物”包括具有缀合至该蛋白质复合物中的蛋白质的非蛋白质实体(例如，包括但不限于化学分子，如毒素或检测剂)的复合物。
本文提供的“结合目的抗原”的多特异性抗原结合蛋白是这样的抗原结合蛋白，其以足够的亲和力结合抗原(例如蛋白质)，使得该多特异性抗原结合蛋白作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向蛋白质或表达该蛋白质的细胞或组织，而不与其他蛋白质显著相互作用。在这类实施方案中，通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)或ELISA测定，该抗原结合蛋白与“非靶标”蛋白结合的程度将小于该抗体与它的具体靶蛋白的结合的约10％。就多特异性抗原结合蛋白与靶分子的结合而言，术语“特异性结合具体多肽或具体多肽靶标上的表位”或“与具体多肽或具体多肽靶标上的表位特异性结合”或“对具体多肽或具体多肽靶标上的表位特异”意指在测量上不同于非特异性相互作用(例如非特异性相互作用可以是与牛血清白蛋白或酪蛋白的结合)的结合。特异性结合可以例如通过与对照分子的结合相比，测定分子的结合来测量。例如，特异性结合可以通过与类似于靶标的对照分子(例如过量的未标记靶标)的竞争来测定。在这种情况下，如果过量的未标记靶标竞争性抑制标记靶标与探针的结合，则指示特异性结合。本文所用的术语“特异性结合具体多肽或具体多肽靶标上的表位”或“与具体多肽或具体多肽靶标上的表位特异性结合”或“对具体多肽或具体多肽靶标上的表位特异”可以显示为例如对靶标具有至少约200nM、备选地至少约150nM、备选地至少约100nM、备选地至少约60nM、备选地至少约50nM、备选地至少约40nM、备选地至少约30nM、备选地至少约20nM、备选地至少约10nM、备选地至少约8nM、备选地至少约6nM、备选地至少约4nM、备选地至少约2nM、备选地至少约1nM的Kd或更高亲和力的分子。在一个实施方案中，术语“特异性结合”指这样的结合，其中多特异性抗原结合蛋白与具体多肽或具体多肽上的表位结合，而与任何其他多肽或多肽表位无实质性结合。
“结合亲和力”一般指分子(例如抗体或多特异性抗原结合蛋白)的单个结合部位与它的结合配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，本文所用的“结合亲和力”指内在结合亲和力，其反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用。分子X对它的配偶体Y的亲和力一般可通过解离常数(Kd)来表示。例如，Kd可以是约200nM或更小、约150nM或更小、约100nM或更小、约60nM或更小、约50nM或更小、约40nM或更小、约30nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约8nM或更小、约6nM或更小、约4nM或更小、约2nM或更小、或约1nM或更小。亲和力可以通过本领域公知的方法来测量，包括本文中描述的那些。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原并倾向于容易解离，而高亲和力抗体一般更快地结合抗原并倾向于保持更长久的结合。多种测量结合亲和力的方法为本领域已知，其中的任一种都可以用于本发明的目的。
在一个实施方案中，用按～10个响应单位(RU)固定靶标(例如抗原)的CM5芯片，在25℃使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，通过使用表面等离振子共振测定来测量本“Kd”或“Kd值”。简言之，按照厂家的说明用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感芯片(CM5,BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释为5μg/ml(～0.2μM)，然后按5μl/分钟的流速注入，以达到约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺来封闭未反应的基团。对于动力学测量，按约25μl/分钟的流速在25℃注入Fab在含0.05％Tween 20的PBS(PBST)中的两倍系列稀释(例如0.78nM至500nM)。通过同时拟合结合和解离传感图来用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore Evaluation Softwareversion 3.2)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为比值koff/kon。参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果以上表面等离振子共振测定的结合速率超过106M-1S-1，则可以通过使用荧光淬灭技术来测定该结合速率，如在分光光度计，如配有停流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色杯的8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中测量，荧光淬灭技术在25℃测量浓度递增的抗原存在下，含20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的PBS pH 7.2的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm；16nm带通)的增加或减少。
就本文提供的多特异性抗原结合蛋白，如抗体(例如双特异性抗体)、片段或其衍生物而言，除非另有说明，“具有生物活性”和“生物活性”和“生物特征”意指具有与生物分子结合的能力。
在用于描述多种异源多聚体多肽时，“分离的”指已从表达它的细胞或细胞培养物分开和/或回收的异源多聚体。它的天然环境的污染成分是将干扰该异源多聚体的诊断或治疗用途的物质，且可以包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将纯化该异源多聚体至：(1)通过Lowry法测定蛋白质大于95wt％，且最优选超过99wt％；(2)足以通过使用旋杯式测序仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)考马斯蓝染色或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE显示同质。但是，通常将通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。
本文提供的多特异性抗原结合蛋白通常纯化至基本同质。短语“基本上同质的”、“基本上同质的形式”和“基本同质”用来指示产物基本上不含源自不希望的多肽组合(例如同源多聚体)的副产物。
用纯度表示的话，基本同质意指副产物的量不超过10wt％、9wt％、8wt％、7wt％、6wt％、4wt％、3wt％、2wt％或1wt％，或少于1wt％。在一个实施方案中，该副产物低于5％。
“生物分子”指核酸、蛋白质、糖类、脂质及其组合。在一个实施方案中，该生物分子存在于自然界中。
抗体“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性、Fc受体结合、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞激活。
“依赖抗体的细胞毒性”或“ADCC”指这样的细胞毒性形式，其中分泌的Ig结合至存在于某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上，使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合具有抗原的靶细胞，随后用细胞毒剂杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，且绝对为这种杀伤所需。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的Fc表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464页上的表3中。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如描述于美国专利号5,500,362或5,821,337中的体外ADCC测定。用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或此外，可以在体内，例如在诸如公开于Clynes等,PNAS USA 95:652-656(1998)中的动物模型的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有主要在其胞质结构域中不同的相似氨基酸序列。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述M.Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR综述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；及de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。本文的术语“FcR”涵盖了其他FcR，包括有待在将来鉴定的那些。该术语还包括负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。优选地，该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。可以从天然来源例如从血液分离效应细胞。
“依赖补体的细胞毒性”或“CDC”指在补体存在下裂解靶细胞。经典补体途径的激活由补体系统第一成分(C1q)与结合于其关连抗原的(适当亚类的)抗体的结合起始。为了评估补体激活，可以进行例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述的CDC测定。
术语“治疗有效量”指在个体中治疗疾病或障碍的抗体(包括多特异性抗体)、其抗原结合抗体片段、或其衍生物的量。在肿瘤(例如癌性肿瘤)的情况下，抗体或抗体片段(例如多特异性抗体或抗体片段)的治疗有效量可以减少癌细胞的数目、减小原发性肿瘤大小、抑制(即在某种程度上减慢和优选阻止)癌细胞浸润入外周器官、抑制(即在某种程度上减慢和优选阻止)肿瘤转移、在某种程度上抑制肿瘤生长、和/或在某种程度上减轻与障碍相关的一种或多种症状。在抗体或其抗体片段、或其衍生物可以阻止生长和/或杀死现有癌细胞的程度上，它可以是细胞抑制剂和/或细胞毒剂。对于癌症治疗，可以例如通过评估存活期、疾病进展时间(TTP)、应答率(RR)、应答持续时间和/或生活质量来测量体内功效。
“减少或抑制”指引起优选20％或更大、更优选50％或更大、最优选75％、85％、90％、95％或更大的总体减少的能力。减少或抑制可以指所治疗的障碍的症状、转移的存在或大小、原发性肿瘤的大小、或血管发生障碍中血管的大小或数目。
术语“癌症”和“癌性的”指或描述哺乳动物中通常表征为细胞生长/增殖失调的生理病症。此定义包括良性和恶性癌症。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。这类癌症更具体的实例包括但不限于鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾癌(例如肾细胞癌)、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、及多种类型的头颈癌。“早期癌症”指非浸润性或转移性且分类为0、I或II期癌症的癌症。术语“癌前的”指通常先于癌症或发展为癌症的病症或生长。“非转移的”指良性或保留在原发部位而未渗透进入淋巴管或血管系统或渗透至原发部位之外的组织的癌症。通常，非转移性癌症是任意癌症，其是0、I或II期癌症，偶尔是III期癌症。
本文的“自身免疫病”是源自并针对个体自身组织的疾病或障碍，或其共分离或表现或从其衍生的病症。自身免疫病或障碍的实例包括但不限于类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血(例如免疫性全血细胞减少、阵发性睡眠性血红蛋白尿症)、自身免疫性血小板减少症(例如特发性血小板减少性紫癜、免疫介导血小板减少症)、甲状腺炎(例如突眼性甲状腺肿、桥本甲状腺炎、青少年淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病、中枢和外周神经系统脱髓鞘疾病(例如多发性硬化、特发性脱髓鞘性多神经病或Guillain-Barré综合征)、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、大疱性皮肤病、多形性红斑、接触性皮炎和自身免疫性慢性活动性肝炎。
本文所用的术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂，例如氨甲喋呤、阿霉素、长春花生物碱(长春花新碱(vincristine)、长春灭瘟碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其他嵌入剂；酶及其片段，如核溶解酶；抗生素；毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及本文公开的多种抗肿瘤剂、抗癌剂和化疗剂。本文描述其他细胞毒剂。杀肿瘤剂引起肿瘤细胞破坏。
本文所用的“可药用的”或“药理学相容的”指并非在生物学上或在其他方面不希望的物质，例如该物质可以掺入对患者施用的药物组合物而不引起任何显著的不希望的生物效应或以有害方式与它所包含在其中的组合物的任意其他成分相互作用。可药用载体或赋形剂优选符合毒理学和制造测试所要求的标准和/或包括在美国食品与药品管理局编制的非活性成分指南中。
本文所用的“抗癌治疗”指在个体中减少或抑制癌症的治疗。抗癌治疗的实例包括细胞毒性放疗，以及对个体施用治疗有效量的细胞毒剂、化疗剂、生长抑制剂、癌症疫苗、血管发生抑制剂、前体药物、细胞因子、细胞因子拮抗剂、糖皮质激素、免疫抑制剂、镇吐药、抗体或抗体片段或止痛药。
本申请中所用的术语“前体药物”指药物活性物质的前体或衍生形式，与亲本药物相比，其对肿瘤细胞的细胞毒性较低，且能够通过酶激活或转化为更具活性的亲本形式。参见例如Wilman,“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”Biochemical SocietyTransactions,14,375-382页,第615次Meeting Belfast(1986)；和Stella等,“Prodrugs:AChemical Approach to Targeted Drug Delivery,”Directed Drug Delivery,Borchardt等,(编辑),247-267页,Humana Press(1985)。前体药物包括但不限于：包含磷酸的前体药物、包含硫代磷酸的前体药物、包含硫酸的前体药物、包含肽的前体药物、D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化的前体药物、包含β-内酰胺的前体药物、包含可选地取代的苯氧乙酰胺的前体药物或包含可选地取代的苯乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶及可以转化为更具活性的细胞毒性游离药物的其他5-氟尿嘧啶前体药物。可以衍生为用于本发明的前体药物形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于上文所述的那些化疗剂。
“个体”是脊椎动物，如哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于农场动物(如牛)、运动动物、宠物(如猫、狗和马)、灵长类、小鼠和大鼠。
除文中另有说明外，术语“第一”多肽(如重链(H1)或轻链(L1))和“第二”多肽(如重链(H2)或轻链(L2))及其变形仅是通用标识符，不认为标识本文提供的多特异性抗原结合蛋白的具体或特定的多肽或成分。
除非另有说明，实施例中提到的市售试剂按厂家说明书使用。以下实施例和说明书通篇中按ATCC检索号标识的那些细胞的来源是American Type Culture Collection,Manassas,VA。除非另有说明，本发明使用重组DNA技术标准方法，如上文及以下教科书中所述的那些：Sambrook等,上文；Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience,NY,1989)；Innis等,PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,Inc.,NY,1990)；Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,1988)；Gait,Oligonucleotide Synthesis(IRL Press,Oxford,1984)；Freshney,Animal Cell Culture,1987；Coligan等,Current Protocols in Immunology,1991。
本文提到“约”某个值或参数指本技术领域技术人员易于指导的该值的通常误差范围。本文提到“约”某个值或参数包括(和描述)了指向该值或参数本身的方面。例如，提到“约X”的描述包括“X”的描述。
应理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含”方面和实施方案、“由方面和实施方案组成”和“基本由方面和实施方案组成”。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，在此以其整体引入作为参考。
包含突变体或修饰重链/轻链对的多特异性抗原结合蛋白
本申请基于CH1/CL界面和/或VH/VL界面中改善重链/轻链配对选择性的新突变的鉴定。
本文提供的多特异性抗原结合蛋白在重链和轻链多肽的可变和/或恒定结构域内的具体残基处包含氨基酸修饰。如本领域普通技术人员将理解，可以利用多种编号惯例来命名IgG可变区序列内的具体氨基酸残基。常用的编号惯例包括Kabat和EU指数编号(参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。其他用于可变结构域的包括修正或交替编号系统的惯例包括Chothia(Chothia C,Lesk AM(1987),J Mal Biol196:901-917；Chothia等(1989),Nature 342:877-883)、IMGT(Lefranc等(2003),Dev CompImmunol 27:55-77)及AHo(Honegger A,Plückthun A(2001)J Mol Biol 309:657-670)。这些参考文献提供了免疫球蛋白可变区的氨基酸序列编号方案，其定义了抗体序列的可变区氨基酸残基的位置。
除非文中另有明确说明，实施例和权利要求中出现的所有对免疫球蛋白重链可变区(即VH)氨基酸残基(即编号)的引用都基于Kabat编号系统，所有对VL残基的引用也如此。实施例和权利要求中出现的所有对免疫球蛋白重链恒定区CH1残基(即编号)的引用都基于EU系统，所有对CL残基的引用也如此。通过对根据Kabat或EU指数编号的残基编号的了解，普通技术人员可以按照任何常用的编号惯例来鉴定本文所述的氨基酸序列修饰。
虽然本文的实施例和权利要求利用Kabat或EU指数来鉴定具体氨基酸残基，但应理解，序列表(在此以其整体引入)中出现的SEQ ID提供给定多肽内氨基酸的连续编号，因此不符合Kabat或EU指数提供的相应氨基酸编号。例如，SEQ ID NO:53的丝氨酸残基编号66在EU编号系统下对应于CH1的S183。
虽然本文中提供的项目、组成或元件(如“多特异性抗原结合蛋白”)以单数形式描述或声明，但除非明确陈述限于单数，考虑复数形式也在其范围之内。
如下文更详细地描述，本文提供经修饰的多特异性抗原结合蛋白，与具有不含修饰的序列的多特异性抗原结合蛋白相比，其可以以改善的重链/轻链配对和/或改善的产率在单细胞中产生。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白在VH/VL和/或CH1/CL区中包含一个或多个修饰，以便于正确重链/轻链配对(即第一重链H1(或其片段)与第一轻链L1配对形成能够结合第一表位的第一重链/轻链对(即H1/L1)，第二重链H2(或其片段)与第二轻链L2配对形成能够结合第二(即不同)表位的第二重链/轻链对(即H2/L2))。对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，术语“H1”和“H2”是随意命名，任意以上实施方案中的“H1”和“H2”可以颠倒。也就是说，上文描述为处于H1的CH1结构域和L1的CL结构域中的任意突变可以备选地处于H2的CH1结构域和L2的CL结构域中。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白进一步在Fc区中包含一个或多个修饰，以便于多特异性抗原结合蛋白的两条臂的异源二聚化。
策略#1
在一方面，惊奇地发现，对重链CH1结构域中S183位(EU编号)的单个氨基酸修饰和对轻链CL结构域中V133位(EU位)的单个氨基酸修饰证明经修饰的重链和经修饰的轻链之间优先配对，例如经修饰的重链和未修饰的轻链或例如未修饰的重链和经修饰的轻链之间配对减少。这些残基通过表达数据选择，并通过对重链CH1结构域和轻链CL结构域的结构和功能的了解和研究确认。参见图1-3、11C和12C。
因此，在某些实施方案中，提供多特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)能够结合第一抗原的第一重链/轻链对，该第一重链/轻链对包含第一重链多肽(H1)和第一轻链多肽(L1)；和(b)能够结合第二抗原的第二重链/轻链对，该第二重链/轻链对包含第二重链多肽(H2)和第二轻链多肽(L2)；其中H1和H2都包含重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域(CH1)，L1和L2都包含轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)；其中H1的CH1结构域在S183位(EU编号)包含氨基酸取代，其中CL结构域在V133位(EU编号)包含氨基酸取代突变。在某些实施方案中，H1的CH1结构域包含(如基本包含)S183位(EU编号)的氨基酸取代，其中CL结构域包含(如基本包含)V133位(EU编号)的氨基酸取代突变。在某些实施方案中，第一抗原和第二抗原相同。在某些实施方案中，第一重链/轻链对和第二重链/轻链对分别结合同一抗原上的不同表位。在某些实施方案中，第一抗原和第二抗原不同。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白是结合两种不同抗原的双特异性抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是拮抗或激动抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是一种或两种抗原的拮抗剂；而在其他实施方案中，双特异性抗体是一种或两种抗原的激动剂。还考虑本文提供的多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)的抗原结合片段。
在某些实施方案中，用带正电荷氨基酸残基取代多特异性抗原结合蛋白H1的CH1结构域上的S183位(EU编号)氨基酸，用带负电荷残基取代多特异性抗原结合蛋白CL结构域上的V133位(EU编号)氨基酸。在某些实施方案中，用带负电荷氨基酸残基取代H1的CH1结构域上的S183位(EU编号)氨基酸，用带正电荷残基取代CL结构域上的V133位(EU编号)氨基酸。在某些实施方案中，该带正电荷残基选自R或K。在某些实施方案中，该带负电荷残基选自D和E。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的CH1结构域包含选自S183A、S183T、S183V、S183Y、S183F、S183H、S183N、S183D、S183E、S183R和S183K(EU编号)的氨基酸取代，其中CL结构域包含选自V133E、V133S、V133L、V133W、V133K、V133R和V133D(EU编号)的氨基酸取代。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的CH1结构域包含(如基本包含)选自S183A、S183T、S183V、S183Y、S183F、S183H、S183N、S183D、S183E、S183R和S183K(EU编号)的氨基酸取代，其中CL结构域包含(如基本包含)选自V133E、V133S、V133L、V133W、V133K、V133R和V133D(EU编号)的氨基酸取代。
对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，术语“H1”和“H2”是随意命名，任意以上实施方案中的“H1”和“H2”可以颠倒。也就是说，上文描述为处于H1的CH1结构域和L1的CL结构域中的任意突变可以备选地处于H2的CH1结构域和L2的CL结构域中。
因此，考虑H1的CH1结构域上的S183位(EU编号)和L1的CL结构域上的V133位(EU编号)的取代突变的所有可能的配对组合。在某些实施方案中，考虑H1的CH1结构域上的S183位(EU编号)和L1的CL结构域上的V133位(EU编号)的取代突变的具体组合。这类组合包括但不限于下文表1中提供的那些：
表1
Figure BDA0001520322730000571
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有S183D或S183E突变(EU编号)的H1的CH1结构域和含有V133K突变(EU编号)的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含H1的CH1结构域和L1的CL结构域，其中CH1结构域包含S183D或S183E突变(EU编号)，L1的CL结构域包含V133K突变(EU编号)。
下文提供两个示例性IgG1 CH1结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:109)、示例性IgG2 CH1结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:109)、示例性IgG2 CH1结构域序列(SEQ ID NO:110)、示例性IgG3 CH1结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:111)、示例性IgG4 CH1结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:112)、示例性λCL结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:113)和示例性κCL结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:54)：
Figure BDA0001520322730000581
TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC(SEQ ID NO:54,不含SEQ IDNO:30中所示成熟CL结构域的N端R残基,其由于基因剪接而产生)
下文提供全长4D5 IgG1重链(SEQ ID NO:55)和轻链(SEQ ID NO:56)的氨基酸序列：
4D5 HC(人IgG1)：
Figure BDA0001520322730000591
4D5 LC(人κ)：
Figure BDA0001520322730000592
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含κ轻链。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:1中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:2中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:3中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:4中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:5中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:6中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:7中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。
下文表2A中提供SEQ ID NO:1-7的氨基酸序列。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有这些序列的任一个中所示的CL结构域的第一轻链多肽L1。SEQ ID NO:54中所示CL结构域对应于SEQ ID NO:1-7的氨基酸11-116。因此，L1可以包含含有SEQ IDNO:1-7的任一个中所示的氨基酸11-116的CL结构域。
表2A
Figure BDA0001520322730000601
κ轻链CL结构域中的氨基酸位置133(EU编号)对应于SEQ ID NO:1-7中的氨基酸位置35。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含λ轻链。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:114中所示氨基酸序列的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:115中所示氨基酸序列的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:116中所示氨基酸序列的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQID NO:117中所示氨基酸序列的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:118中所示氨基酸序列的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:119中所示氨基酸序列的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:120中所示氨基酸序列的L1的CL结构域。
下文表2B提供SEQ ID NO:114-120的氨基酸序列：
表2B
Figure BDA0001520322730000611
κ轻链CL结构域中的氨基酸位置133(EU编号)对应于λ轻链CL结构域中的氨基酸位置133(EU编号)，其对应于SEQ ID NO:114-120中的氨基酸位置27。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含IgG1重链、IgG2重链、IgG3重链或IgG4重链。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ IDNO:9中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:14中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:15中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:101中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:102中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:121中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:122中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:123中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:124中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:125中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:126中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。
下文表3中提供SEQ ID NO:8-16、101-102和121-126的氨基酸序列：
表3
Figure BDA0001520322730000621
Figure BDA0001520322730000631
IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的CH1结构域中的氨基酸位置183对应于SEQ ID NO:8-16、101-102和121-126中的氨基酸位置64。
考虑SEQ ID NO:1-7或SEQ ID NO:1-7的氨基酸11-116和114-120与SEQ ID NO:8-15、101-102和121-126的所有可能的配对组合。在某些实施方案中，考虑SEQ ID NO:1-7或SEQ ID NO:1-7的氨基酸11-116和114-120与SEQ ID NO:8-15及101和102的具体组合。这类组合包括但不限于下文表4中提供的那些(除非另有说明，HC是IgG1 HC)：
表4
Figure BDA0001520322730000632
Figure BDA0001520322730000641
Figure BDA0001520322730000651
*或对应序列的氨基酸11-116
表4中各对中的第一个SEQ ID NO指CH1结构域序列，表4中各对中的第二个SEQ IDNO指CL结构域序列。
对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，术语“H1”和“H2”是随意命名，任意以上实施方案中的“H1”和“H2”可以颠倒。也就是说，上文描述为处于H1的CH1结构域和L1的CL结构域中的任意突变可以备选地处于H2的CH1结构域和L2的CL结构域中。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含CH1/CL突变，并证明与不含突变的多特异性抗原结合蛋白或不含突变的各亲本单特异性抗原结合蛋白相当或更优的正确蛋白质折叠和/或表达水平。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域和L2的CL结构域不包含氨基酸取代。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域在S183(EU编号)处不包含取代，且该多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域在V133(EU编号)处不包含取代。
在某些实施方案中，衍生本文提供的多特异性抗原结合蛋白的H1的亲本H1未对衍生本文提供的多特异性抗原结合蛋白的L1的亲本L1显示显著偏好。在某些实施方案中，衍生本文提供的多特异性抗原结合蛋白的H1的亲本H1对衍生本文提供的多特异性抗原结合蛋白的L1的亲本L1显示偏好。
对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，术语“H1”和“H2”是随意命名，任意以上实施方案中的“H1”和“H2”可以颠倒。也就是说，上文描述为处于H1的CH1结构域和L1的CL结构域中的任意突变可以备选地处于H2的CH1结构域和L2的CL结构域中。
策略#2
使用通过计算机引导和人引导设计辅助的第二策略，申请人重新设计了重链CH1结构域和轻链CL结构域的相互作用表面，以产生彼此在空间上相容(如在构象上相容)的CH1/CL突变体对。CH1/CL突变体对中经修饰的CH1结构域与野生型CL空间相容性(如构象相容性)较差，证明与野生型CL配对减少。相应地，各CH1/CL突变体对中经修饰的CL结构域与野生型CH1空间相容性(如构象相容性)较差，证明与野生型CH1配对减少。惊奇地发现，在CH1结构域和CL结构域的界面处包含修饰的Fab的Tm与在CH1/CL结构域中不含相应突变的Fab的Tm相同或基本相同。
用下文所述设计策略鉴定的突变可以独立于或附加至上文讨论的S183/V133突变(即策略#1)使用。
在第一种方法(即“方法A”)中，向轻链CL结构域引入一个或多个氨基酸取代突变，以在与CH1结构域相互作用的CL结构域表面产生“杵”(或凸起)。相应地，向重链CH1结构域引入一个或多个氨基酸取代突变，以在与CL结构域相互作用的CH1结构域表面产生“臼”(或凹陷)。参见例如图11A。在某些实施方案中，包含经修饰的CH1/CL序列的多特异性抗原结合蛋白导致在CH1结构域和CL结构域中具有氨基酸取代突变的重链和轻链的优先配对。在某些实施方案中，与不含相应CH1/CL突变的多特异性抗原结合蛋白相比，包含经修饰的CH1/CL序列的多特异性抗原结合蛋白证明蛋白表达水平提高。在某些实施方案中，所取代的一个或多个氨基酸不是用一个或多个带电荷残基替换。
在第二种方法(即“方法B”)中，向轻链CL结构域引入两个或多个氨基酸取代突变，以在与CH1结构域相互作用的CL结构域表面产生“杵”(或凸起)和“臼”(或凹陷)。相应地，向重链CH1结构域引入两个或多个突变，以在与CL结构域相互作用的CH1结构域表面产生“臼”和“杵”。参见例如图11B。在某些实施方案中，包含经修饰的CH1/CL序列的多特异性抗原结合蛋白显示在CH1结构域和CL结构域中具有氨基酸取代突变的重链和轻链的优先配对。在某些实施方案中，与不含相应CH1/CL突变的多特异性抗原结合蛋白相比，包含经修饰的CH1/CL序列的多特异性抗原结合蛋白显示蛋白表达水平提高。在某些实施方案中，所取代的一个或多个氨基酸不是用一个或多个带电荷残基替换。
包含经修饰的H1的CH1结构域和经修饰的L1的CL结构域的多特异性抗原结合蛋白显示改善的稳定性和就重链/轻链配对而言改善的特异性。本文提供多特异性抗原结合蛋白，其包含：a)能够结合第一抗原的第一重链/轻链对，该第一重链/轻链对包含第一重链多肽(H1)和第一轻链多肽(L1)；和b)能够结合第二抗原的第二重链/轻链对，该第二重链/轻链对包含第二重链多肽(H2)和第二轻链多肽(L2)；其中H1和H2都包含重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域(CH1)，L1和L2都包含轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)；其中H1的CH1结构域在F170位(EU编号)包含氨基酸取代，其中CL结构域在S176位(EU编号)包含氨基酸取代。在某些实施方案中，第一抗原和第二抗原相同。在某些实施方案中，第一重链/轻链对和第二重链/轻链对分别结合同一抗原上的不同表位。在某些实施方案中，第一抗原和第二抗原不同。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域进一步包含选自A141、S181、S183和V185(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域进一步包含选自F116、S131、V133、L135、S162、S174和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域进一步包含选自F116、V133、L135、S162、S174和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域进一步包含选自F116、S131、L135、S162、S174和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域进一步包含选自F116、L135、S174和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域进一步包含选自F116、L135、S162、S174和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生空间互补性。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。在某些实施方案中，所取代的一个或多个氨基酸不是用一个或多个带电荷残基替换。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)选自A141和F170(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含选自F116、L135、S176和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生空间互补性。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)选自F170、S181和S183(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含选自F116和S176(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生空间互补性。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)氨基酸取代F170(EU编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含选自F116、L135、S174、S176和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生空间互补性。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)选自F170、S183和V185(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含选自F116、S176和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生空间互补性。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)选自F170、S181和V185(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含选自F116、L135和S176(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生空间互补性。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)选自A141和F170(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含选自F116、L135、S174、S176和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生空间互补性。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)选自A141、F170和S181(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含选自F116、L135、S174、S176和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生空间互补性。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)选自F170、S181、S183和V185(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含选自L135、S174、S176和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生空间互补性。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)选自A141、F170、S183和V185(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含选自F116、S174、S176和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生空间互补性。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)选自A141、F170、S181和V185(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含选自F116、L135、S176和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生空间互补性。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)选自A141、F170、S181和S183(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含选自F116、L135、S174和S176(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生空间互补性。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)氨基酸取代F170(EU编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含选自F116、L135、S176和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生空间互补性。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)选自A141、F170和V185(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含选自F116和S176(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)选自A141、F170和S183(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含选自F116和S176(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)选自F170和V185(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含选自F116和S176(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生构象互补性。
在某些实施方案中，改变多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域和L1的CL结构域，使得在CH1/CL界面内，用同等数目的氨基酸残基(一些或全都具有更大的侧链体积)替换CH1结构域的一个或多个氨基酸残基，从而在CH1结构域表面产生凸起，用同等数目的氨基酸残基(一些或全都具有更小的侧链体积)替换CL结构域的一个或多个氨基酸残基，从而在CL结构域表面产生凹陷。在某些实施方案中，CH1结构域和CL结构域上的修饰在CH1/CL界面处提供空间互补性。在一些实施方案中，CH1结构域和CL结构域上的修饰在CH1/CL界面处提供构象互补性。
在某些实施方案中，改变多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域和L1的CL结构域，使得在CH1/CL界面内，用同等数目的氨基酸残基(一些或全都具有更大的侧链体积)替换CL结构域的一个或多个氨基酸残基，从而在CL结构域表面产生凸起，用同等数目的氨基酸残基(一些或全都具有更小的侧链体积)替换CH1结构域的一个或多个氨基酸残基，从而在CH1结构域表面产生凹陷。在某些实施方案中，CL结构域的一个或多个取代氨基酸残基包含S176。在某些实施方案中，CH1结构域的一个或多个取代氨基酸残基包含F170。在某些实施方案中，CH1结构域和CL结构域上的修饰在界面处提供空间互补性。在一些实施方案中，CH1结构域和CL结构域上的修饰在界面处提供构象互补性。
在某些实施方案中，H1的CH1结构域包含选自F170S和F170A(EU编号)的氨基酸取代，其中L1的CL结构域包含选自S176F(EU编号)的氨基酸取代。
在某些实施方案中，H1的CH1结构域包含F170S突变(EU编号)，L1的CL结构域包含S176F突变(EU编号)。在某些实施方案中，H1的CH1结构域包含F170A突变(EU编号)，L1的CL结构域包含S176F突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S、S181M、S183V和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、V133I、L135V、S162M、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、S131D、L135V、S162A、S174A、S176F和T178I突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含由A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成(如基本由其组成)的H1的CH1结构域，及由F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)组成(如基本由其组成)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170A、S181M、S183V和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、L135V、S162M、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S、S183A和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S、S181M和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、L135V、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S、S181M和S183A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、L135V、S174A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S、S183A和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S、S181M和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、L135V和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S、S181M和S183A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S和S183A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S和S181M突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I和F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I和F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、L135V、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I和F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、L135V、S174A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I和F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I和F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、L135V和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I和F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、L135V、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、L135V、S174A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A、L135V和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F116A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自A141I、F170S、S181M、S183V和V185A突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个氨基酸突变的H1的CH1结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个氨基酸突变的H1的CH1结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含由选自A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个氨基酸突变组成的H1的CH1结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自A141I、F170A、S181M、S183V和V185A突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个氨基酸突变的H1的CH1结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自F116A、V133I、L135V、S162M、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个、不超过六个或不超过七个氨基酸突变的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自F116A、S131D、L135V、S162A、S174A、S176F和T178I突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个、不超过六个或不超过七个氨基酸突变的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个氨基酸突变的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个氨基酸突变的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自F116A、L135V、S162M、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个或不超过六个氨基酸突变的L1的CL结构域。
考虑上述CH1结构域和L1结构域的所有可能的配对组合。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含κ轻链。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:17-27的任一个中所示CL结构域的第一轻链多肽L1。SEQ ID NO:54中所示CL结构域对应于SEQ ID NO:17-27的氨基酸11-116。因此，L1可以包含含有SEQ ID NO:17-27的任一个中所示的氨基酸11-116的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:17中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:18中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:19中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:19中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列或SEQ IDNO:20中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:21中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ IDNO:22中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:22中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:23中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:23中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:24中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:24中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:25中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:25中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:26中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:26中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:27中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:27中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含λ轻链。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:127中所示氨基酸序列的L1的CL结构域。
下文表5中提供SEQ ID NO:17-27和127的氨基酸序列(除非另有说明，LC是κLC)：
表5
Figure BDA0001520322730000791
CL中的氨基酸位置116、118、131、133、135、162、164、174、176和178(EU编号)分别对应于SEQ ID NO:17-27中的氨基酸位置18、20、33、35、37、64、66、76、78和80。κ链CL结构域中的氨基酸位置116、118、131、133、135、162、164、174、176和178(EU编号)对应于λ轻链CL结构域中的氨基酸位置116、118、131、133、135、162、164、174、176和178(Kabat编号)。λ轻链CL结构域中的氨基酸位置116、118、131、133、135、162、164、174、176和178(Kabat编号)分别对应于SEQ ID NO:127中的氨基酸位置10、12、25、27、29、56、59、67,69和71。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:29中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:31中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:32中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:33中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:34中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:35中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ IDNO:36中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:37中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:38中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:39中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:40中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:41中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:42中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:44中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:103中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:104中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:105中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。
下文表6中提供SEQ ID NO:28-44的氨基酸序列(除非另有说明，HC是IgG1同种型)：
表6
Figure BDA0001520322730000811
Figure BDA0001520322730000821
CH1中的氨基酸位置141、170、181、183和185(EU编号)分别对应于SEQ ID NO:28-44和103-105的氨基酸位置22、51、62、64和66。
考虑上述SEQ ID NO:17-27或SEQ ID NO:17-27的氨基酸11-116和127与SEQ IDNO:28-44和103-105的所有可能的配对组合。在某些实施方案中，考虑SEQ ID NO:17-27或SEQ ID NO:17-27的氨基酸11-116和127与SEQ ID NO:28-44和103-105的具体组合。这类组合包括但不限于下文表7中提供的那些：
表7
Figure BDA0001520322730000822
Figure BDA0001520322730000831
*或相应序列的氨基酸11-116
表7中各对中的第一个SEQ ID NO指CH1结构域序列，表7中各对中的第二个SEQ IDNO指CL结构域序列。
在相关方面，提供多特异性抗原结合蛋白，其包含：a)能够结合第一抗原的第一重链/轻链对，该第一重链/轻链对包含第一重链序列(H1)和第一轻链序列(L1)；和b)第二重链/轻链对，其包含第二重链序列(H2)和第二轻链序列(L2)；其中H1和H2都包含重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域(CH1)，L1和L2都包含轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)；其中改变多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域和L1的CL结构域，使得在CH1/CL界面内，用同等数目的氨基酸残基(一些具有更大的侧链体积，一些具有更小的侧链体积)替换CH1结构域的一个或多个氨基酸残基，从而在CH1结构域表面产生凸起和凹陷，用同等数目的氨基酸残基(一些具有更小的侧链体积，一些具有更大的侧链体积)替换CL结构域的一个或多个氨基酸残基，从而在CL结构域表面产生凹陷和凸起。在某些实施方案中，CH1结构域和CL结构域上的修饰在界面处提供空间互补性(如构象互补性)。
在某些实施方案中，H1的CH1结构域在L128位包含氨基酸取代，其中L1的CL结构域在F118和L135位(EU编号)包含氨基酸取代。在某些实施方案中，第一抗原和第二抗原相同。在某些实施方案中，第一重链/轻链对和第二重链/轻链对分别结合同一抗原上的不同表位。在某些实施方案中，第一抗原和第二抗原不同。在某些实施方案中，H1的CH1结构域在L128和V185位(EU编号)包含氨基酸取代，其中L1的CL结构域在F118和L135位(EU编号)包含氨基酸取代。在某些实施方案中，第一抗原和第二抗原相同。在某些实施方案中，第一重链/轻链对和第二重链/轻链对分别结合同一抗原上的不同表位。在某些实施方案中，第一抗原和第二抗原不同。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域进一步包含选自A141、F170、S181和S183(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域进一步包含选自S131、V133、S162、S176和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生与野生型序列的空间互补性相当或大于野生型序列的空间互补性的空间互补性(如构象互补性)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域进一步包含选自S131、V133、S162、T164、S176和T178(全为EU编号)的一个或多个氨基酸取代。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)选自F128、A141、F170、S181和S183(EU编号)的一个或多个氨基酸取代的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成或基本由其组成)选自V118、S131、V133、S135、S162、T164、S176和T178(EU编号)的一个或多个氨基酸取代的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生与野生型序列的空间互补性相当或大于野生型序列的空间互补性的空间互补性(如构象互补性)。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)选自F128、A141、F170、S181、S183和V185(EU编号)的一个或多个氨基酸取代的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成或基本由其组成)选自V118、S131、V133、S135、S162、T164、S176和T178(EU编号)的一个或多个氨基酸取代的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生与野生型序列的空间互补性相当或大于野生型序列的空间互补性的空间互补性(如构象互补性)。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)选自F128、A141、F170、S181、S183和V185(EU编号)的一个或多个氨基酸取代的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成或基本由其组成)选自V118、S131、V133、S135、S162、S176和T178(EU编号)的一个或多个氨基酸取代的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该氨基酸取代产生与野生型序列的空间互补性相当或大于野生型序列的空间互补性的空间互补性(如构象互补性)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)L128F、A141M、F170M、S181I和S183A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F118V、S131T、V133A、L135Y、S162A、T164S、S176M和T178L突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)L128F、A141T、F170M、S181T、S183A和V185L突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、T164S、S176T和T178L突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)L128F、A141M、F170M、S181T和S183A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，及含有(包括由其组成或基本由其组成)F118V、S131T、V133A、L135F、S162M、T164S、S176M和T178L突变(EU编号)的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自L128F、A141M、F170M、S181I和S183A突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个氨基酸突变的H1的CH1结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个或不超过六个氨基酸突变的H1的CH1结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自L128F、A141T、F170M、S181T、S183A和V185L突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个或不超过六个氨基酸突变的H1的CH1结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自L128F、A141M、F170M、S181T和S183A突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个氨基酸突变的H1的CH1结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自F118V、S131T、V133A、L135Y、S162A、T164S、S176M和T178L突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个、不超过六个、不超过七个或不超过八个氨基酸突变的H1的CH1结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个、不超过六个或不超过七个氨基酸突变的H1的CH1结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、T164S、S176T和T178L突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个、不超过六个、不超过七个或不超过八个氨基酸突变的H1的CH1结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有选自F118V、S131T、V133A、L135F、S162M、T164S、S176M和T178L突变(EU编号)的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个、不超过六个、不超过七个或不超过八个氨基酸突变的H1的CH1结构域。
考虑上述CH1和L1结构域的所有可能的配对组合。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含κ轻链。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:45-48的任一个中所示CL结构域的第一轻链多肽L1。SEQ ID NO:54中所示CL结构域对应于SEQ ID NO:45-48的氨基酸11-116。因此，L1可以包含含有SEQ ID NO:45-48的任一个中所示的氨基酸11-116的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:45中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:45中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:46中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:46中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:47中所示氨基酸序列或SEQ ID NO:47中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:48中所示氨基酸序列或SEQ IDNO:48中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含λ轻链。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:128中所示氨基酸序列的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:49中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:50中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:51中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:52中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:106中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:107中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:108中所示氨基酸序列的H1的CH1结构域。下文表8中提供SEQ ID NO:45-52和106-108的氨基酸序列(除非另有说明，LC是κLC；除非另有说明，HC是IgG1同种型)。
表8
Figure BDA0001520322730000881
CL中的氨基酸位置116、118、131、133、135、162、164、174、176和178(EU编号)分别对应于SEQ ID NO:45-48中的氨基酸位置18、20、33、35、37、64、66、76、78和80。κ链CL结构域中的氨基酸位置116、118、131、133、135、162、164、174、176和178(EU编号)对应于λ轻链CL结构域中的氨基酸位置116、118、131、133、135、162、164、174、176和178(Kabat编号)。λ轻链CL结构域中的氨基酸位置116、118、131、133、135、162、164、174、176和178(Kabat编号)分别对应于SEQ ID NO:128中的氨基酸位置10、12、25、27、29、56、59、67、69和71。
CH1中的氨基酸位置128、141、170、181、183和185(EU编号)分别对应于SEQ ID NO:49-52和106-108的氨基酸位置9、22、51、62、64和66。
考虑SEQ ID NO:45-48或SEQ ID NO:45-48的氨基酸11-116和SEQ ID NO:49-52的所有可能的配对组合。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:45-48的任一个中所示CL结构域的第一轻链多肽L1。SEQ ID NO:54中所示CL结构域对应于SEQ ID NO:45-48的氨基酸11-116。因此，L1可以包含含有SEQ ID NO:45-48的任一个中所示的氨基酸11-116的CL结构域。在某些实施方案中，考虑SEQ ID NO:45-48或SEQ ID NO:45-48的氨基酸11-116和128与SEQ ID NO:49-52和106-108的具体组合。这类组合包括但不限于：SEQ ID NO:49/SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:45的氨基酸11-116；SEQ ID NO:50/SEQID NO:46或SEQ ID NO:46的氨基酸11-116；SEQ ID NO:106/SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:46的氨基酸11-116；SEQ ID NO:107/SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:46的氨基酸11-116；SEQ IDNO:108/SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:46的氨基酸11-116；SEQ IS NO:51/SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:47的氨基酸11-116；SEQ ID NO:50/SEQ ID NO:128；SEQ ID NO:106/SEQ IDNO:128；SEQ ID NO:107/SEQ ID NO:128；SEQ ID NO:108/SEQ ID NO:128；及SEQ ID NO:52/SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:48的氨基酸11-116。
对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，术语“H1”和“H2”是随意命名，任意以上实施方案中的“H1”和“H2”可以颠倒。也就是说，上文描述为处于H1的CH1结构域和L1的CL结构域中的任意突变可以备选地处于H2的CH1结构域和L2的CL结构域中。
如上文所指出，通过策略2#鉴定的CH1/CL界面中的突变可以独立于或附加至通过策略#1鉴定的CH1/CL界面中的突变使用。
因此，例如，本文提供多特异性抗原结合蛋白，其包含含有A141I、F170S、S181M、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F116A、L135V、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有S183E取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有V133K取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。此外，在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有A141I、F170S、S181M、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F116A、L135V、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有S183E取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有V133K取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。此外，在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有A141I、F170S、S181M、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F116A、L135V、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有S183E取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有V133K取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。此外，在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有(或由其组成或基本由其组成)氨基酸序列SEQ ID NO:29的H1的CH1结构域，含有(或由其组成或基本由其组成)SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:19中所示序列中的氨基酸11-116的L1的CL结构域，含有(或由其组成或基本由其组成)氨基酸序列SEQ ID NO:15的H2的CH1结构域，及含有(或由其组成或基本由其组成)SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5中所示序列中的氨基酸11-116的L2的CL结构域。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有A141I、F170S、S181M、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F116A、L135V、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有S183E取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有V133E取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有A141I、F170S、S181M、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F116A、L135V、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，由S183K取代突变(EU编号)组成的H2的CH1结构域，及由V133E取代突变(EU编号)组成的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含由A141I、F170S、S181M、S183A和V185A取代突变(EU编号)组成的H1的CH1结构域，由F116A、L135V、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)组成的L1的CL结构域，由S183K取代突变(EU编号)组成的H2的CH1结构域，及由V133E取代突变(EU编号)组成的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有A141I、F170S、S181M、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F116A、L135V、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有L128F、A141M、F170M、S181I和S183A取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有F118V、S131T、V133A、L135Y、S162A、T164S、S176M和S178L取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有A141I、F170S、S181M、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F116A、L135V、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有L128F、A141T、F170M、S181T、S183A和V185L取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、T164S、S176T和T178L取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有A141I、F170S、S181M、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F116A、L135V、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有L128F、A141M、F170M、S181T和S183A取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有F118V、S131T、V133A、L135F、S162M、T164S、S176M和T178L取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有A141I、F170S、S181M、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F116A、L135V、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有A141I、F170S、S181M、S183V和V185A取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有F116A、V133I、L135V、S162M、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有A141I、F170S、S181M、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F116A、L135V、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有A141I、F170S、S181M、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有F116A、S131D、L135V、S162A、S174A、S176F和T178I取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有A141I、F170S、S181M、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F116A、L135V、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有A141I、F170A、S181M、S183V和V185A取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有F116A、L135V、S162M、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有S183E取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有V133K取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有S183K取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有V133E取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有L128F、A141M、F170M、S181I和S183A取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有F118V、S131T、V133A、L135Y、S162A、T164S、S176M和S178L取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有A141I、F170S、S181M、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有F116A、L135V、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有L128F、A141T、F170M、S181T、S183A和V185L取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、T164S、S176T和T178L取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有L128F、A141M、F170M、S181T和S183A取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有F118V、S131T、V133A、L135F、S162M、T164S、S176M和T178L取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有A141I、F170S、S181M、S183V和V185A取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有F116A、V133I、L135V、S162M、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，术语“H1”和“H2”是随意命名，任意以上实施方案中的“H1”和“H2”可以颠倒。也就是说，上文描述为处于H1的CH1结构域和/或VH结构域及L1的CL结构域和/或VL结构域中的任意突变可以备选地处于H2的CH1结构域和/或VH结构域及L2的CL结构域和/或VL结构域中。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有A141I、F170S、S181M、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有F116A、S131D、L135V、S162A、S174A、S176F和T178I取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白包含含有L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A取代突变(EU编号)的H1的CH1结构域，含有F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L取代突变(EU编号)的L1的CL结构域，含有A141I、F170A、S181M、S183V和V185A取代突变(EU编号)的H2的CH1结构域，及含有F116A、L135V、S162M、S174A、S176F和T178V取代突变(EU编号)的L2的CL结构域。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)。
对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，术语“H1”和“H2”是随意命名，任意以上实施方案中的“H1”和“H2”可以颠倒。也就是说，上文描述为处于H1的CH1结构域和/或VH结构域及L1的CL结构域和/或VL结构域中的任意突变可以备选地处于H2的CH1结构域和/或VH结构域及L2的CL结构域和/或VL结构域中。
在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白包含含有不超过1个氨基酸取代、不超过2个氨基酸取代、不超过3个氨基酸取代、不超过5个氨基酸取代、或不超过6个氨基酸取代、不超过7个氨基酸取代、不超过8个氨基酸取代、不超过9个氨基酸取代、不超过10个氨基酸取代、不超过11个氨基酸取代、或不超过12个氨基酸取代的H1的CH1结构域。
在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白包含含有不超过1个氨基酸取代、不超过2个氨基酸取代、不超过3个氨基酸取代、不超过5个氨基酸取代、或不超过6个氨基酸取代、不超过7个氨基酸取代、不超过8个氨基酸取代、或不超过9个氨基酸取代、不超过10个氨基酸取代、不超过11个氨基酸取代、或不超过12个氨基酸取代的L1的CL结构域。
在某些实施方案中，H1的CH1结构域与人种系或同种异型重链CH1结构域具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性。下文提供人IgG1 CH1结构域(即SEQ ID NO:57)和人IgG4S228P CH1结构域(即SEQ ID NO:58)的氨基酸序列。
Figure BDA0001520322730001021
在一些实施方案中，LC1是κ轻链。在一些实施方案中，LC1的CL结构域与人种系或同种异型κ轻链CL结构域具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性。下文提供人κ轻链恒定结构域的氨基酸序列(即SEQ ID NO:59)。
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC(SEQ ID NO.59)
在一些实施方案中，LC1是λ轻链。在一些实施方案中，LC1的CL结构域与人种系或同种异型λCL结构域具有至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性。下文提供人λ轻链恒定结构域的氨基酸序列(即SEQ ID NO:113)。
Figure BDA0001520322730001031
在某些实施方案中，衍生本文提供的多特异性抗原结合蛋白的H1的亲本H1未对衍生本文提供的多特异性抗原结合蛋白的L1的亲本L1显示显著偏好。在某些实施方案中，衍生本文提供的多特异性抗原结合蛋白的H1的亲本H1对衍生本文提供的多特异性抗原结合蛋白的L1的亲本L1显示偏好。
对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，术语“H1”和“H2”是随意命名，任意以上实施方案中的“H1”和“H2”可以颠倒。也就是说，上文描述为处于H1的CH1结构域和/或VH结构域及L1的CL结构域和/或VL结构域中的任意突变可以备选地处于H2的CH1结构域和/或VH结构域及L2的CL结构域和/或VL结构域中。
VH和VL结构域修饰
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白或其抗原结合片段在一个或多个VH和VL结构域中包含氨基酸修饰，即独立于本文所述CH1结构域和CL结构域中的修饰。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白还在一个或多个VH和VL结构域中包含氨基酸修饰，即与通过策略#1鉴定的CH1/CL界面中的突变和/或通过策略#1鉴定的CH1/CL界面中的突变组合。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域在Q39位(Kabat编号)包含氨基酸取代，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域在Q38位(Kabat编号)包含氨基酸取代。在某些实施方案中，用带正电荷残基替换H1的VH结构域中的Q39位(Kabat编号)氨基酸，用带负电荷残基替换L1的VL结构域中的Q38位(Kabat编号)氨基酸。在某些实施方案中，用带负电荷残基替换H1的VH结构域中的Q39位(Kabat编号)氨基酸，其中用带正电荷残基替换L1的VL结构域中的Q38位(Kabat编号)氨基酸。在某些实施方案中，该带正电荷残基选自R、H和K。在某些实施方案中，该带负电荷残基选自D和E。
此外或备选地，在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域在Q39位(Kabat编号)包含氨基酸取代，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域在Q38位(Kabat编号)包含氨基酸取代。在某些实施方案中，用带正电荷残基替换H2的VH结构域中的Q39位(Kabat编号)氨基酸，用带负电荷残基替换L2的VL结构域中的Q38位(Kabat编号)氨基酸。在某些实施方案中，用带负电荷残基替换H2的VH结构域中的Q39位(Kabat编号)氨基酸，其中用带正电荷残基替换L2的VL结构域中的Q38位(Kabat编号)氨基酸。在某些实施方案中，该带正电荷残基选自R、H和K。在某些实施方案中，该带负电荷残基选自D和E。
在某些实施方案中，考虑H1的VH结构域上Q39位(Kabat编号)和L1的VL结构域上Q38位(Kabat编号)和/或H2的VH结构域上Q39位(Kabat编号)和L2的VL结构域上Q38位(Kabat编号)的取代突变的具体组合。这类组合包括但不限于下文表9A和9B中所示的那些：
表9A
Q39D/Q38E Q39R/Q38D
Q39E/Q38K Q39K/Q38D
Q39D/Q38R Q39R/Q38R
Q39E/Q38R Q39K/Q38E
Q39D/Q38H Q39H/Q38D
Q39E/Q38H Q39H/Q38E
表9A中各对中的第一个突变指VH结构域序列中的修饰，表9A中各对中的第二个突变指VL结构域序列中的修饰。
表9B
Figure BDA0001520322730001051
表9B中的四字母突变指Q39XVH1/Q38XVL1/Q39XVH2/Q38XVL2处的氨基酸取代，其中“VH1”指H1的VH结构域，“VL”指L1的VL结构域，“VH2”指H2的VH结构域，“VL2”指L2的VL结构域。对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，术语“H1”/“L1”和“H2”/“L2”是随意命名，任意以上实施方案中的“H1”和“L1”可以分别颠倒为“H2”和“L2”。也就是说，上文描述为处于H1的VH结构域和L1的VL结构域中的任意突变可以备选地处于H2的VH结构域和L2的VL结构域中。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域在Q39E位(Kabat编号)包含氨基酸取代，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域在Q38K位(Kabat编号)包含氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域在Q39K位(Kabat编号)包含氨基酸取代，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域在Q38E位(Kabat编号)包含氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域在Q39K位(Kabat编号)包含氨基酸取代，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域在Q38E位(Kabat编号)包含氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域在Q39E位(Kabat编号)包含氨基酸取代，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域在Q38K位(Kabat编号)包含氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域在Q39E位(Kabat编号)包含氨基酸取代，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域在Q38K位(Kabat编号)包含氨基酸取代，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域在Q39K位(Kabat编号)包含氨基酸取代，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域在Q38E位(Kabat编号)包含氨基酸取代。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域在Q39K位(Kabat编号)包含氨基酸取代，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域在Q38E位(Kabat编号)包含氨基酸取代，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域在Q39E位(Kabat编号)包含氨基酸取代，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域在Q38K位(Kabat编号)包含氨基酸取代。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39R取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38R取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39H取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38H取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39H取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38H取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39D取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38H取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39H取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38D取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38H取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39H取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)。
对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，术语“H1”/“L1”和“H2”/“L2”是随意命名，任意以上实施方案中的“H1”和“L1”可以分别颠倒为“H2”和“L2”。也就是说，上文描述为处于H1的VH结构域和L1的VL结构域中的任意突变可以备选地处于H2的VH结构域和L2的VL结构域中。
如本文中其他地方所指出，在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白在一个或多个VH和VL结构域中包含氨基酸修饰，即如上文所述的氨基酸修饰，与通过策略#1鉴定的CH1/CL界面中的突变和/或通过策略#2鉴定的CH1/CL界面中的突变组合。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183E取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含(如由其组成或基本由其组成)V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183E取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含(如由其组成或基本由其组成)V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183E取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含(如由其组成或基本由其组成)V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183E取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含(如由其组成或基本由其组成)V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183E取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含(如由其组成或基本由其组成)V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183K取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含(如由其组成或基本由其组成)V133E取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183E取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含(如由其组成或基本由其组成)V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183E取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含(如由其组成或基本由其组成)V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183F取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含(如由其组成或基本由其组成)V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183E取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183F取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含(如由其组成或基本由其组成)V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183T取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含(如由其组成或基本由其组成)V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183E取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183T取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含(如由其组成或基本由其组成)V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183Y取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含(如由其组成或基本由其组成)V133K取代突变(EU编号)。
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在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含(如由其组成或基本由其组成)V133E取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含(如由其组成或基本由其组成)S183E取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含(如由其组成或基本由其组成)V133K取代突变(EU编号)。
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在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含S183T取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含V133K取代突变(EU编号)。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含S183K取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含V133T取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域由A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域由F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域由A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域由F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含S183E取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域由S183E取代突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域由V133K取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域由A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域由F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域由S183E取代突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域由V133K取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含S183E取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含S183E取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域由S183E取代突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域由V133K取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域由A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域由F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域由S183E取代突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域由V133K取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含S183E取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域由S183E取代突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域由V133K取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域由A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域由F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域由S183E取代突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域由V133K取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含S183K取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含V133E取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域由S183K取代突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域由V133E取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域由A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域由F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域由S183K取代突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域由V133E取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含S183K取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含V133E取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域由S183K取代突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域由V133E取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域由A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域由F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域由S183K取代突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域由V133E取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域包含S183K取代突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域包含V133E取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域由S183K取代突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域由V133E取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1的VH结构域包含Q39K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L1的VL结构域包含Q38E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域由A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L1的CL结构域由F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的H2的VH结构域包含Q39E取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的H2的CH1结构域由S183K取代突变(EU编号)组成，多特异性抗原结合蛋白的L2的VL结构域包含Q38K取代突变(Kabat编号)，多特异性抗原结合蛋白的L2的CL结构域由V133E取代突变(EU编号)组成。
还考虑通过策略#2鉴定的CH1/CL界面中的突变、通过策略#1鉴定的CH1/CL界面中的突变及VH和VL结构域中的突变的其他组合，即不限于上文所述的那些。
对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，术语“H1”和“H2”是随意命名，任意以上实施方案中的“H1”和“H2”可以颠倒。也就是说，上文描述为处于H1的CH1结构域和/或VH结构域及L1的CL结构域和/或VL结构域中的任意突变可以备选地处于H2的CH1结构域和/或VH结构域及L2的CL结构域和/或VL结构域中。
Fc突变
在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白的H1和H2都包含含有CH2和CH3结构域的Fc区。在某些实施方案中，H1的Fc区和/或H2的Fc区是IgG1、IgG2或IgG4 Fc。在某些实施方案中，H1的CH3结构域和H2的CH3结构域两者在界面相遇，CH3结构域都包含这样的氨基酸取代，使得与H1相比，H1的Fc区优先与H2的Fc区配对。在某些实施方案中，CH3结构域中的氨基酸取代产生比CH3结构域中不含取代的野生型更大的静电互补性。测量蛋白质/蛋白质界面处的静电互补性的方法为本领域已知，并描述于例如McCoy等(1997)J Mol Biol 268,570–584；Lee等,(2001)Protein Sci.10,362-377；和Chau等(1994)J Comp Mol Des8,51325中。在某些实施方案中，CH3结构域中的氨基酸取代产生比CH3结构域中不含取代的野生型更大的空间互补性。测量蛋白质/蛋白质界面处的静电互补性的方法为本领域已知，并描述于例如Lawrence等(1993)J Mol Biol 234,946–950；Walls等(1992)J Mol Biol228,277-297；和Schueler-Furman等(2005)Proteins 60,187-194中。
在某些实施方案中，改变H1和H2(例如本文所述实施方案中任意个的H1和H2)的CH3结构域，使得在CH3/CH3界面内，用一个或多个具有更大侧链体积的氨基酸残基替换H1的CH3结构域中的一个或多个氨基酸残基，从而在H1的CH3结构域表面产生凸起(或杵)，修饰H2的CH3结构域中与H1的CH3结构域相互作用的一个或多个、优选两个或三个氨基酸残基，用具有小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在与H1的CH3结构域相互作用的H2的CH3结构域表面产生凹陷(或臼)。在某些实施方案中，改变H1和H2(例如本文所述实施方案中任意个的H1和H2)的CH3结构域，使得在界面内，用等同数目的具有更大侧链体积的氨基酸残基替换H2的CH3结构域中的一个或两个氨基酸残基，从而在H2的CH3结构域的界面内产生可放置在H1的CH3结构域表面内的凹陷(或臼)的凸起(或杵)，改变H1的CH3结构域，使得在遇见H2的CH3结构域界面的H2的CH3结构域表面内，用等同数目的具有更小侧链体积的氨基酸残基替换两个或三个氨基酸残基，从而在与H1的CH3结构域界面内产生可以放置H2的CH3结构域界面内的凸起的凹陷。在某些实施方案中，具有更大侧链体积的输入残基是苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、精氨酸(R)或色氨酸(W)。在某些实施方案中，该凸起或杵突变包含用色氨酸替换366位苏氨酸，氨基酸编号按照Kabat等(Sequences of proteins ofimmunological interest,第5版,第1卷(1991；NIH,Bethesda,MD)中的688-696页)的EU编号方案。在某些实施方案中，具有更小侧链体积的输入残基是丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)或苏氨酸(T)。在某些实施方案中，原残基是苏氨酸。在某些实施方案中，原残基是亮氨酸。在某些实施方案中，原残基是酪氨酸。在某些实施方案中，输入残基不是半胱氨酸(C)。在一个实施方案中，输入残基是丙氨酸(A)。可以通过替换CH3结构域的一个或多个原残基来产生凹陷。例如，在一个实施方案中，含有凹陷的CH3结构域包含替换选自苏氨酸、亮氨酸和酪氨酸的两个或多个原氨基酸。在某些实施方案中，含有凹陷的CH3结构域包含选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸的两个或多个输入残基。在某些实施方案中，杵突变修饰是T366W，臼突变修饰是T366S、L368A和Y407V中的至少一个或至少两个。在某些实施方案中，杵突变修饰是T366W，臼突变修饰是T366S、L368A和Y407V。参见例如US 5,731,168、US5,807,706、US 7,183,076，每个专利在此以其整体引入作为参考。
可转移性
虽然相对于EU编号系统描述了以上H1的CH1结构域和L1的CL结构域的具体氨基酸修饰，但考虑这些氨基酸修饰可转移至其他免疫球蛋白重链和轻链，鉴于以下产生一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链之一的优先配对的相似模式。
免疫球蛋白重链和轻链间界面中的CH1/CL界面残基相对保守(Padlan等,1986,Mol.Immunol.23(9):951-960)。此序列保守(进化限制的结果)提高了在轻链和重链的组合配对期间形成具有功能活性的抗体结合结构域的可能性。由于此序列保守，上文指出的驱动优先配对的序列修饰可转移至其他重链和轻链对，因为此区域在抗体间显示高度序列保守。
在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgG1/κ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgG2/κ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgG3/κ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgG4/κ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgA1/κ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgA2/κ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgD/κ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgE/κ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgG/κ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgM/κ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。
在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgG1/λ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgG2/λ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgG3/λ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgG4/λ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgA1/λ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgA2/λ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgD/λ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgE/λ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgG/λ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgM/λ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至具有接近于种系的构架的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。在某些实施方案中，本文所述氨基酸修饰可转移至具有典型CL和CH1结构域的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。
在某些实施方案中，向小鼠抗体的免疫球蛋白重链和轻链引入本文所述氨基酸修饰。在某些实施方案中，向基于小鼠IgG2a/λ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链引入本文所述氨基酸修饰。在某些实施方案中，向基于小鼠IgG2a/κ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链引入本文所述氨基酸修饰。
下文SEQ ID NO:60中显示小鼠IgG2a恒定区的氨基酸序列：
Figure BDA0001520322730001371
下文SEQ ID NO:61中显示小鼠 轻链的氨基酸序列：
Figure BDA0001520322730001372
下文SEQ ID NO:62中显示小鼠
Figure BDA0001520322730001376
轻链的氨基酸序列：
Figure BDA0001520322730001373
下文SEQ ID NO:63中显示小鼠 轻链的氨基酸序列：
Figure BDA0001520322730001374
下文SEQ ID NO:64中显示小鼠 轻链的氨基酸序列：
Figure BDA0001520322730001375
在某些实施方案中，可转移(如转移至任意上述免疫球蛋白重链和轻链)的氨基酸修饰包含以下取代突变组合：H1的VH结构域上的Q39位(Kabat编号)；L1的VL结构域上的Q38位；H2的VH结构域上的Q39位(Kabat编号)；H2的CH1结构域上的S183位(EU编号)；L2的VL结构域上的Q38位(Kabat编号)；和L2的CL结构域上的V133位(EU编号)。
在某些实施方案中，可转移(如转移至任意上述免疫球蛋白重链和轻链)的氨基酸修饰包含以下取代突变组合：H1的VH结构域上的Q39位(Kabat编号)；H1的CH1结构域上的S183位(EU编号)；L1的VL结构域上的Q38位；L1的CL结构域上的V133位(EU编号)；H2的VH结构域上的Q39位(Kabat编号)；H2的CH1结构域上的S183位(EU编号)；L2的VL结构域上的Q38位(Kabat编号)；和L2的CL结构域上的V133位(EU编号)。
在某些实施方案中，可转移(如转移至任意上述免疫球蛋白重链和轻链)的氨基酸修饰包含(如由其组成或基本由其组成)以下取代突变组合：H1的VH结构域上的Q39E位(Kabat编号)；L1的VL结构域上的Q38K位；H2的VH结构域上的Q39K位(Kabat编号)；H2的CH1结构域上的S183K位(EU编号)；L1的VL结构域上的Q38E位(Kabat编号)；和L2的CL结构域上的V133E(EU编号)。
在某些实施方案中，可转移(如转移至任意上述免疫球蛋白重链和轻链)的氨基酸修饰包含(如由其组成或基本由其组成)以下取代突变组合：H1的VH结构域上的Q39K位(Kabat编号)；L1的VL结构域上的Q38E位；H2的VH结构域上的Q39E位(Kabat编号)；H2的CH1结构域上的S183K位(EU编号)；L1的VL结构域上的Q38K位(Kabat编号)；和L2的CL结构域上的V133E(EU编号)。
在某些实施方案中，可转移(如转移至任意上述免疫球蛋白重链和轻链)的氨基酸修饰包含(如由其组成或基本由其组成)以下取代突变组合：H1的VH结构域上的Q39E位(Kabat编号)；L1的VL结构域上的Q38K位；H2的VH结构域上的Q39K位(Kabat编号)；H2的CH1结构域上的S183E位(EU编号)；L1的VL结构域上的Q38E位(Kabat编号)；和L2的CL结构域上的V133K(EU编号)。
在某些实施方案中，可转移(如转移至任意上述免疫球蛋白重链和轻链)的氨基酸修饰包含(如由其组成或基本由其组成)以下取代突变组合：H1的VH结构域上的Q39K位(Kabat编号)；L1的VL结构域上的Q38E位；H2的VH结构域上的Q39E位(Kabat编号)；H2的CH1结构域上的S183E位(EU编号)；L1的VL结构域上的Q38K位(Kabat编号)；和L2的CL结构域上的V133K(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含：H1的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；L1的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)；H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)；L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；H2的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；L2的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰：包含H1的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；包含L1的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)；有H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成；由L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)组成；包含H2的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；包含L2的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含：H1的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；L1的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)；H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)；L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；H2的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；L2的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰：包含H1的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；包含L1的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)；由H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成；由L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)组成；包含H2的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；包含L2的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含：H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)；L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；H2的CH1结构域中的S183E取代突变(EU编号)；L2的CL结构域中的V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰：包含H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)；包含L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；由H2的CH1结构域中的S183E取代突变(EU编号)组成；由L2的CL结构域中的V133K取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰由以下组成：H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)；L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；H2的CH1结构域中的S183E取代突变(EU编号)；L2的CL结构域中的V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含：H1的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；L1的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)；H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)；H1CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；H2的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；H2的CH1结构域中的S183E取代突变(EU编号)；L2的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)；L2的CL结构域中的V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰：包含H1的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；包含L1的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)；包含H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)；包含H1CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；包含H2的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；由H2的CH1结构域中的S183E取代突变(EU编号)组成；包含L2的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)；由L2的CL结构域中的V133K取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰：包含H1的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；包含L1的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)；由H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成；由H1CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)组成；包含H2的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；由H2的CH1结构域中的S183E取代突变(EU编号)组成；包含L2的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)；由L2的CL结构域中的V133K取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含：H1的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；L1的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)；H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)；L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；H2的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；H2的CH1结构域中的S183E取代突变(EU编号)；L2的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)；L2的CL中的V133K取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰：包含H1的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；包含L1的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)；包含H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)；包含L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；包含H2的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；由H2的CH1结构域中的S183E取代突变(EU编号)组成；包含L2的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)；由L2的CL中的V133K取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰：包含H1的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；包含L1的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)；由H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成；由L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)组成；包含H2的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；由H2的CH1结构域中的S183E取代突变(EU编号)组成；包含L2的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)；由L2的CL中的V133K取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含：H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)；L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；H2的CH1结构域中的S183K取代突变(EU编号)；L2的CL结构域中的V133E取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰：包含H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)；包含L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；由H2的CH1结构域中的S183K取代突变(EU编号)组成；由L2的CL结构域中的V133E取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰：由H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成；L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；由H2的CH1结构域中的S183K取代突变(EU编号)组成；由L2的CL结构域中的V133E取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含：H1的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；L1的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)；H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)；L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；H2的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；H2的CH1结构域中的S183K取代突变(EU编号)；L2的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)；L2的CL结构域中的V133E取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰：包含H1的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；包含L1的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)；包含H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)；包含L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；包含H2的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；由H2的CH1结构域中的S183K取代突变(EU编号)组成；包含L2的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)；由L2的CL结构域中的V133E取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰：包含H1的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；包含L1的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)；由H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成；由L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)组成；包含H2的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；由H2的CH1结构域中的S183K取代突变(EU编号)组成；包含L2的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)；由L2的CL结构域中的V133E取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含：H1的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；L1的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)；H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)；L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；H2的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；H2的CH1结构域中的S183K取代突变(EU编号)；L2的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)；L2的CL结构域中的V133E取代突变(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰：包含H1的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；包含L1的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)；包含H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)；包含L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)；包含H2的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；由H2的CH1结构域中的S183K取代突变(EU编号)组成；包含L2的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)；由L2的CL结构域中的V133E取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰：包含H1的VH结构域中的Q39K取代突变(Kabat编号)；包含L1的VL结构域中的Q38E取代突变(Kabat编号)；由H1的CH1结构域中的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)组成；由L1的CL结构域中的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)组成；包含H2的VH结构域中的Q39E取代突变(Kabat编号)；由H2的CH1结构域中的S183K取代突变(EU编号)组成；包含L2的VL结构域中的Q38K取代突变(Kabat编号)；由L2的CL结构域中的V133E取代突变(EU编号)组成。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含(如由其组成或基本由其组成)以下取代突变组合：H1的CH1结构域上的L128F、A141M、F170M、S181I和S183A突变(EU编号)及L1的CL结构域上的F118V、S131T、V133A、L135Y、S162A、T164S、S176M和T178L突变(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含(如由其组成或基本由其组成)以下取代突变组合：H1的CH1结构域上的L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A突变(EU编号)及L1的CL结构域上的F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L突变(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含(如由其组成或基本由其组成)以下取代突变组合：H1的CH1结构域上的L128F、A141T、F170M、S181T、S183A和V185L突变(EU编号)及L1的CL结构域上的F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、T164S、S176T和T178L突变(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含(如由其组成或基本由其组成)以下取代突变组合：H1的CH1结构域上的L128F、A141M、F170M、S181T和S183A突变(EU编号)及L1的CL结构域上的F118V、S131T、V133A、L135F、S162M、T164S、S176M和T178L突变(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含(如由其组成或基本由其组成)以下取代突变组合：H1的CH1结构域上的A141I、F170S、S181M、S183V和V185A突变(EU编号)及L1的CL结构域上的F116A、V133I、L135V、S162M、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含(如由其组成或基本由其组成)以下取代突变组合：H1的CH1结构域上的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)及L1的CL结构域上的F116A、S131D、L135V、S162A、S174A、S176F和T178I突变(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含以下取代突变组合：H1的CH1结构域上的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)及L1的CL结构域上的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰由以下取代突变组合组成：H1的CH1结构域上的A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)及L1的CL结构域上的F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)。
在某些实施方案中，向不同IgG分子(如向任意上述免疫球蛋白重链和轻链)引入的氨基酸修饰包含(如由其组成或基本由其组成)以下取代突变组合：H1的CH1结构域上的A141I、F170A、S181M、S183V和V185A突变(EU编号)及L1的CL结构域上的F116A、L135V、S162M、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)。
还考虑通过策略#2鉴定的CH1/CL界面中的突变、通过策略#1鉴定的CH1/CL界面中的突变及VH和VL结构域中的突变的其他组合，即不限于上文所述的那些。这类组合包括但不限于下文所述的那些：
对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，术语“H1”和“H2”是随意命名，任意以上实施方案中的“H1”和“H2”可以颠倒。也就是说，上文描述为处于H1的CH1结构域和/或VH结构域及L1的CL结构域和/或VL结构域中的任意突变可以备选地处于H2的CH1结构域和/或VH结构域及L2的CL结构域和/或VL结构域中。
特性
优先配对/优先组装
“优先配对”描述在第一和第二多肽之间发生配对的同一时间存在一种或多种附加的不同多肽时，第一多肽(如H1)与第二多肽(如L1)的配对模式。在H1与至少L1和L2共表达时，如果H1-L1重链-轻链配对的量大于H1-L2配对的量，则例如本文提供的多特异性抗原结合蛋白的H1和L1之间发生优先配对。同样，在H2与至少L1和L2共表达时，如果H2-L2重链-轻链配对的量大于H2-L1配对的量，则例如本文提供的多特异性抗原结合蛋白的H2和L2之间发生优先配对。在某些实施方案中，优先配对产生自VH/VL结构域和/或CH1/CL结构域的氨基酸修饰。
在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白的H1优先与L1配对。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白的H2优先与L2配对。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白的H1优先与L1配对，且本文的多特异性抗原结合蛋白的H2优先与L2配对。在某些实施方案中，在本文所述多特异性抗原结合蛋白的H1与H2、L1和L2共表达时，包含希望得到的配对(例如H1-L1和H2-L2)的多特异性抗原结合蛋白以至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约71％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或超过约99％(包括这些值之间的任意范围)的相对产率产生。包含希望得到的配对(例如H1-L1和H2-L2)的多特异性抗原结合蛋白的相对产率可以用例如实施例中所述的质谱分析来测定。
在某些实施方案中，所表达的本文提供的多特异性抗原结合蛋白的多肽以改善的特异性组装，以减少错配重链和轻链的产生。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域在产生期间与L1的CL结构域组装。
评估优先配对/优先组装的方法
多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域与L1的CL结构域的优先配对和/或优先组装可以用本领域普通技术人员公知的多种方法中的任一种来测定。例如，可以通过轻链竞争测定(LCCA)来测定多特异性抗原结合蛋白中H1的CH1结构域与L1的CL结构域的优先配对程度。2013年10月3日提交的国际专利申请PCT/US2013/063306描述了LCCA的多种实施方案，在此为了所有目的以其整体引入作为参考。该方法允许定量分析共表达的蛋白质混合物内重链与具体轻链的配对，在共表达重链和轻链时可以用来确定一条具体的免疫球蛋白重链是否选择性地与两条免疫球蛋白轻链中的任一条结合。该方法简述如下：按这样的比例在细胞中共表达至少一条重链和两条不同的轻链，使得重链是限制性配对反应物；可选地将所分泌的蛋白质与细胞分开；将结合于重链的免疫球蛋白轻链多肽与其余分泌蛋白质分开，以产生分离的重链配对级分；检测分离的重链级分中每种不同轻链的量；分析分离的重链级分中每种不同轻链的相对量，以确定至少一条重链与轻链之一选择性配对的能力。
在某些实施方案中，通过质谱分析(如液相层析-质谱分析(LC-MS)天然质谱分析、酸性质谱分析等)测定多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域与L1的CL结构域的优先配对。用其分子量的差异来鉴定每个不同的种类，用质谱分析来定量包括各轻链的相对异源二聚体群体。
在某些实施方案中，通过测定本文提供的多特异性抗原结合蛋白的重链/轻链配对的热稳定性来测定多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域与L1的CL结构域的优先配对。多特异性抗原结合蛋白中重链/轻链对的热稳定性可以按照本领域已知的方法测定。多特异性抗原结合蛋白中重链/轻链对的熔解温度指示其热稳定性。重链/轻链对的熔点可以用诸如差示扫描量热法的技术测量(Chen等(2003)Pharm Res 20:1952-60；Ghirlando等(1999)Immunol Lett 68:47-52)。备选地，重链/轻链对的热稳定性可以用圆二色谱测量(Murray等(2002)J.Chromatogr Sci 40:343-9)。
在某些实施方案中，通过重链/轻链配对对其各自靶标的结合亲和力来测定多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域与L1的CL结构域的优先配对。相互作用的结合速率和解离速率可以按照本领域公知的方法通过竞争结合测定来测定。在某些实施方案中，该竞争结合测定是放射免疫测定，其包括在量递增的未标记靶标存在下用本文提供的多特异性抗原结合蛋白孵育标记靶标(例如3H或125I)，并检测结合于标记靶标的多特异性抗原结合蛋白。在某些实施方案中，可以从Scatchard分析的饱和数据测定多特异性抗原结合蛋白对靶标的亲和力和结合解离速率。
在某些实施方案中，通过测量动力学参数(如KD、koff、kon、Rmax)来测定多特异性抗原结合蛋白的H1的CH1结构域与L1的CL结构域的优先配对。在某些实施方案中，本领域已知的基于表面等离振子共振(SPR)的测定(例如BIAcore动力学分析)来测定动力学参数。基于SPR的技术的综述参见Mullet等,2000,Methods 22:77-91；Dong等,2002,Review inMol.Biotech.,82:303-23；Fivash等,1998,Current Opinion in Biotechnology 9:97-101；Rich等,2000,Current Opinion In Biotechnology11:54-61。此外，考虑描述于美国专利号6,373,577、6,289,286、5,322,798、5,341,215、6,268,125中的任意用于测量蛋白质-蛋白质相互作用的SPR仪器和基于SPR的方法。
在某些实施方案中，按照本领域公知的方法用荧光激活细胞分选(FACS)来测量多特异性抗原结合蛋白对其一种或多种靶标的亲和力。测定H1的CH1结构域与L1的CL结构域的优先配对的其他方法描述于例如WO 2014/081955、WO 2014/082179和WO 2014/150973中，在此为了所有目的以其整体引入作为参考。
稳定性
在某些实施方案中，H1的CH1结构域上存在的一个或多个氨基酸取代和L1的CL上存在的一个或多个氨基酸取代突变不降低本文提供的多特异性抗原结合蛋白的稳定性。在某些实施方案中，H1的CH1结构域上存在的一个或多个氨基酸取代、L1的CL上存在的一个或多个氨基酸取代突变、H1的VH上Q39位(Kabat编号)的氨基酸取代突变和L1的VL的Q38位(Kabat编号)的氨基酸取代突变不降低本文提供的多特异性抗原结合蛋白的稳定性。在某些实施方案中，H1的CH1结构域上存在的一个或多个氨基酸取代、L1的CL上存在的一个或多个氨基酸取代突变、H1的VH上Q39位(Kabat编号)的氨基酸取代突变、L1的VL的Q38位(Kabat编号)的氨基酸取代突变、H2的VH结构域VH上Q39位(Kabat编号)的氨基酸取代突变、L2的VL的Q38位(Kabat编号)的氨基酸取代突变不降低本文提供的多特异性抗原结合蛋白的稳定性。
在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白的稳定性是不含氨基酸取代突变的多特异性抗原结合蛋白的稳定性的至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或超过约99％。
多特异性抗原结合蛋白的稳定性可以用本领域普通技术人员已知的用于评估蛋白质稳定性的多种技术中的任一种来测定。例如，圆二色谱(CD)是广泛使用的测量圆偏振光的吸收的光谱技术。由于诸如α螺旋和β片层的结构是手性的，圆偏振光的吸收可作为蛋白质整体的折叠程度的标志。此技术已用于通过测量此吸收的变化作为温度的函数来测量蛋白质的平衡解折叠。转换中点(此时天然状态和变性状态的浓度比为1)的温度称为蛋白质的熔解温度(Tm)。关于CD的其他细节描述于例如Kelly等(2000)Curr Prot and PeptideSci 1,349-384；Correa等(2009)African J Biochem Res 3,164-173；及Greenfield(2006)Nat Protoc.1,2527-2535中。
在某些实施方案中，本文所述多特异性抗原结合蛋白(例如包含本文所述CH1/CL修饰和/或VH/VL修饰)具有比在CH1/CL和/或VH/VL结构域中不包含氨基酸取代突变的野生型多特异性抗原结合蛋白的Tm低不超过约10℃、不超过约9.5℃、不超过约9℃、不超过约8.5℃、不超过约8℃、不超过约7.5℃、不超过约7.0℃、不超过约6.5℃、不超过约6.0℃、不超过约5.5℃、不超过约5.0℃、不超过约4.5℃、不超过约4℃、不超过约3.5℃、不超过约3℃、不超过约2.5℃、不超过约2℃、不超过约1.5℃、不超过约1℃、不超过约0.5℃或不到约0.5℃的熔解温度。在某些实施方案中，本文所述多特异性抗原结合蛋白(例如包含本文所述CH1/CL修饰和/或VH/VL修饰)的Fab具有比在CH1/CL和/或VH/VL结构域中不包含氨基酸取代突变的多特异性抗原结合蛋白的野生型亲本抗体的Fab的Tm低不超过约10℃、不超过约9.5℃、不超过约9℃、不超过约8.5℃、不超过约8℃、不超过约7.5℃、不超过约7.0℃、不超过约6.5℃、不超过约6.0℃、不超过约5.5℃、不超过约5.0℃、不超过约4.5℃、不超过约4℃、不超过约3.5℃、不超过约3℃、不超过约2.5℃、不超过约2℃、不超过约1.5℃、不超过约1℃、不超过约0.5℃或不到约0.5℃的熔解温度。
备选地，可以用例如差示扫描量热法(DSC)测定多特异性抗原结合蛋白的稳定性，该方法测量控制蛋白质中非共价键形成的热力学参数。关于DSC的其他细节描述于例如Ionescu等(2008)J Pharm Sci 97,1414–1426中。还可以用例如差示扫描荧光测定(DSF或热迁移测定)来测定多特异性抗原结合蛋白的稳定性，该方法测量靶蛋白的热稳定性及蛋白质与例如配体或第二蛋白质结合时蛋白质熔解温度的变化。关于DSF的其他细节描述于例如Niesen等(2007)Nat Protoc 2,2212–2221中。
结合亲和力
在某些实施方案中，H1的CH1结构域上存在的一个或多个氨基酸取代和L1的CL上存在的一个或多个氨基酸取代突变不降低本文提供的多特异性抗原结合蛋白与抗原的结合亲和力。在某些实施方案中，H1的CH1结构域上存在的一个或多个氨基酸取代、L1的CL上存在的一个或多个氨基酸取代突变、H1的VH上Q39位(Kabat编号)的氨基酸取代突变和L1的VL的Q38位(Kabat编号)的氨基酸取代突变不降低本文提供的多特异性抗原结合蛋白与抗原的结合亲和力。在某些实施方案中，H1的CH1结构域上存在的一个或多个氨基酸取代、L1的CL上存在的一个或多个氨基酸取代突变、H1的VH上Q39位(Kabat编号)的氨基酸取代突变、L1的VL的Q38位(Kabat编号)的氨基酸取代突变、H2的VH结构域VH上Q39位(Kabat编号)的氨基酸取代突变、L2的VL的Q38位(Kabat编号)的氨基酸取代突变不降低本文提供的多特异性抗原结合蛋白与抗原的结合亲和力。
测量结合亲和力的方法
如本文中其他地方所指出，可以通过测量多种结合动力学参数(包括Kd、kon和/或koff)中的任一个来评估本文提供的多特异性抗原结合蛋白的抗原结合。用按100个响应单位(RU)固定靶标(例如抗原)的CM5芯片，在25℃使用BIAcoreTM-T100或BIAcoreTM-T200(GEHealthcare,Piscataway,NJ)，通过使用表面等离振子共振测定来测量本Kd。简言之，按照厂家的说明用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感芯片(CM5,BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释为5μg/ml(～0.2μM)，然后按5μl/分钟的流速注入，以达到约100个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺来封闭未反应的基团。对于动力学测量，按约25μl/分钟的流速在25℃注入Fab在含0.05％Tween 20的PBS(PBST)中的两倍系列稀释(例如0.78nM至500nM)。通过同时拟合结合和解离传感图来用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore Evaluation Software)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为比值koff/kon。参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果以上表面等离振子共振测定的结合速率超过106M-1S-1，则可以通过使用荧光淬灭技术来测定该结合速率，如在分光光度计，如配有停流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色杯的8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中测量，荧光淬灭技术在25℃测量浓度递增的抗原存在下，含20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的PBS pH 7.2的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm；16nm带通)的增加或减少。
在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白的Kd是在CH1/CL界面处不包含突变的野生型结合蛋白的Kd的至少不小于约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％或超过约50％。
免疫原性
在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白在人中无免疫原性或基本无免疫原性。在某些实施方案中，CH1区的修饰(如一个或多个氨基酸取代)在人中无免疫原性或基本无免疫原性。在某些实施方案中，CL区的修饰(如一个或多个氨基酸取代)在人中无免疫原性或基本无免疫原性。在某些实施方案中，CH1区的修饰(如一个或多个氨基酸取代)不产生人T细胞表位。在某些实施方案中，CL区的修饰(如一个或多个氨基酸取代)不产生人T细胞表位。本文提供的多特异性抗原结合蛋白的免疫原性可以用本领域普通技术人员公知的方法评价。在某些实施方案中，通过ELISA评估本文提供的多特异性抗原结合蛋白的免疫原性(参见例如Yin等(2015)Cell Immunol.295,118-126)。还参见例如Hartmann等(2001)Clin Cancer Res.7,1873-1881。
药代动力学特性
在某些实施方案中，与不包含这类氨基酸取代的多特异性抗原结合蛋白相比，H1的CH1结构域上存在的一个或多个氨基酸取代和L1的CL上存在的一个或多个氨基酸取代突变不显著影响本文提供的多特异性抗原结合蛋白的药代动力学特性。在某些实施方案中，与不包含这类氨基酸取代的多特异性抗原结合蛋白相比，H1的CH1结构域上存在的一个或多个氨基酸取代、L1的CL上存在的一个或多个氨基酸取代突变、H1的VH上Q39位(Kabat编号)的氨基酸取代突变和L1的VL的Q38位(Kabat编号)的氨基酸取代突变不显著影响本文提供的多特异性抗原结合蛋白的药代动力学特性。在某些实施方案中，与不包含这类氨基酸取代的多特异性抗原结合蛋白相比，H1的CH1结构域上存在的一个或多个氨基酸取代、L1的CL上存在的一个或多个氨基酸取代突变、H1的VH上Q39位(Kabat编号)的氨基酸取代突变、L1的VL的Q38位(Kabat编号)的氨基酸取代突变、H2的VH结构域VH上Q39位(Kabat编号)的氨基酸取代突变、L2的VL的Q38位(Kabat编号)的氨基酸取代突变不显著影响本文提供的多特异性抗原结合蛋白的药代动力学特性。这类药代动力学特性包括例如Cmax、AUC、CL(即药物清除率)、t1/2,β、V1和Vss。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白的Cmax是在H1的CH1、H1的VH、L1的CL、L1的VL、H2的CH1、H2的VH、L2的CL和/或L2的VL中不包含氨基酸取代的多特异性抗原结合蛋白的50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％或160％(包括这些值之间的任意范围)中的约任一个。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白的AUC是在H1的CH1、H1的VH、L1的CL、L1的VL、H2的CH1、H2的VH、L2的CL和/或L2的VL中不包含氨基酸取代的多特异性抗原结合蛋白的50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％或160％(包括这些值之间的任意范围)中的约任一个。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白的CL(即药物清除率)是在H1的CH1、H1的VH、L1的CL、L1的VL、H2的CH1、H2的VH、L2的CL和/或L2的VL中不包含氨基酸取代的多特异性抗原结合蛋白的50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％或160％(包括这些值之间的任意范围)中的约任一个。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白的t1/2,β是在H1的CH1、H1的VH、L1的CL、L1的VL、H2的CH1、H2的VH、L2的CL和/或L2的VL中不包含氨基酸取代的多特异性抗原结合蛋白的50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％或160％(包括这些值之间的任意范围)中的约任一个。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白的V1是在H1的CH1、H1的VH、L1的CL、L1的VL、H2的CH1、H2的VH、L2的CL和/或L2的VL中不包含氨基酸取代的多特异性抗原结合蛋白的50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％或160％(包括这些值之间的任意范围)中的约任一个。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白的Vss是在H1的CH1、H1的VH、L1的CL、L1的VL、H2的CH1、H2的VH、L2的CL和/或L2的VL中不包含氨基酸取代的多特异性抗原结合蛋白的50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％或160％(包括这些值之间的任意范围)中的约任一个。
多特异性抗体型式
本文提供的多特异性抗原结合蛋白可以以本领域已知的多种双特异性或多特异性抗体型式中的任一种使用。本领域中已发展了许多型式来研究具有多重结合特异性的分子所提供的治疗机会。已描述了几种制备双特异性抗体的方法，其中特异性抗体轻链或片段与特异性抗体重链或片段配对。
例如国际专利申请号PCT/EP2011/056388(WO 2011/131746)描述了用于产生异源二聚体蛋白质的体外方法，其中在两种单特异性起始蛋白质的CH3区中引入不对称突变，以在还原条件下孵育时驱动两种单特异性IgG4或IgG4样抗体间的定向“Fab臂”或“半分子”交换。
Schaefer等(Roche Diagnostics GmbH)描述了将源自两种现有抗体的两条重链和两条轻链组装为人二价双特异性IgG抗体而不使用人工接头的方法(PNAS(2011)108(27):11187-11192和US 2009/0232811)。该方法涉及在一半双特异性抗体的抗原结合片段(Fab)内交换一个或多个重链和轻链结构域(CrossMab)。基于使得能够异源二聚化重链的杵入臼技术，通过在一半双特异性抗体的抗原结合片段(Fab)内交换重链和轻链结构域来达到轻链和它的关连重链的正确结合。此“交换”保留抗原结合亲和力，但使两条臂如此不同，以致不再发生轻链错配。参见WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253和WO2009/080254，各专利在此以其整体引入作为参考。
杵入臼是抗体CH3结构域异源二聚化技术。之前，杵入臼技术已用于产生具有单条共同轻链(LC)的人全长双特异性抗体(Merchant等“An efficient route to humanbispecific IgG.”Nat Biotechnol.1998；16:677–81；Jackman等“Development of a two-part strategy to identify a therapeutic human bispecific antibody thatinhibits IgE receptor signaling.”J Biol Chem.2010；285:20850–9)。还参见WO1996027011，在此为了所有目的以其整体引入作为参考。
Strop等(Rinat-Pfizer Inc.)描述了通过分别表达和纯化两种目的抗体，然后在指定的氧化还原条件下将它们混合在一起来产生稳定的双特异性抗体的方法(J.Mol.Biol.(2012)420:204-19)。
可将与同二聚体相比强烈优先形成异二聚体的其他异二聚化结构域掺入本多特异性抗原结合蛋白。说明性实例包括但不限于例如WO2007147901(
Figure BDA0001520322730001561
等–NovoNordisk：描述离子相互作用)、WO 2009089004(Kannan等–Amgen：描述静电转向效应)、WO2010/034605(Christensen等-Genentech：描述卷曲螺旋)。还参见例如描述亮氨酸拉链的Pack,P.&Plueckthun,A.,Biochemistry 31,1579-1584(1992)或描述螺旋-转角-螺旋基序的Pack等,Bio/Technology 11,1271-1277(1993)。短语“异源多聚化结构域”和“异源二聚化结构域”在本文中可互换使用。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白包含一个或多个异源二聚化结构域。
Zhu等(Genentech)在由完全缺乏恒定结构域的变体结构域抗体片段组成的双抗体构建体的VL/VH界面中改造引入突变，产生了异源二聚体双抗体(Protein Science(1997)6:781-788)。类似地，Igawa等(Chugai)也在单链双抗体的VL/VH界面中改造引入突变来促进选择性表达，并抑制双抗体的构象异构化(Protein Engineering,Design&Selection(2010)23:667-677)。
美国专利公开号2009/0182127(Novo Nordisk,Inc.)描述了通过修饰Fc界面处和轻链-重链对的CH1:CL界面处降低一对的轻链与另一对的重链相互作用的能力的氨基酸残基来产生双特异性抗体。
另一种用于双特异性T细胞衔接(BiTE)分子的型式(参见例如Wolf等(2005)DrugDiscovery Today 10:1237-1244))基于单链可变片段(scFv)模块。scFv由通过柔性接头融合抗体轻链和重链可变区组成，该柔性接头通常可以正确折叠，使得轻链和重链可变区可以结合关连抗原。BiTE在单条链上串联具有不同特异性的两个scFv。此构型阻止了具有相同重链可变区的两个拷贝的分子的产生。此外，将接头构型设计为确保各轻链和重链的正确配对。
Klein等,(2012)mAbs 4:6,653-663和Spiess等(2015)“Alternative molecularformats and therapeutic applications for bispecific antibodies.”Mol.Immunol.2015年1月27日在线发表；doi:10.1016/j.molimm.2015.01.003中提供了多种双特异性和多特异性抗体型式的综述。
本文所述多特异性抗原结合蛋白可以掺入上述型式中的任一种。在某些实施方案中，可以将本文所述CH1/CL和VH/VL突变与CrossMab技术组合，以进一步确保正确重链/轻链配对。
多核苷酸、载体和宿主细胞
多核苷酸
本文提供编码本文所述重链和/或轻链恒定结构域和/或可变结构域的核酸。在某些实施方案中，本文提供的分离的核酸编码本文所述多特异性抗原结合蛋白的至少一条多肽序列。在某些实施方案中，本文提供的分离的核酸编码本文所述多特异性抗原结合蛋白的至少两个多肽序列。在某些实施方案中，本文提供的分离的核酸编码本文所述多特异性抗原结合蛋白的至少三个多肽序列。在某些实施方案中，本文提供的分离的核酸编码本文所述多特异性抗原结合蛋白的至少四个多肽序列。在某些实施方案中，本文提供的分离的核酸编码本文所述多特异性抗原结合蛋白的四个以上多肽序列。
本文提供的核酸分子包括单链和双链两种形式的DNA和RNA，以及对应的互补序列。DNA包括例如cDNA、基因组DNA、化学合成DNA、PCR扩增DNA及其组合。本文提供的核酸分子包括全长基因或cDNA分子，以及其片段的组合。在某些实施方案中，本文提供的核酸源自人来源。在某些实施方案中，本文提供的核酸源自小鼠来源。
如本文中其他地方所指出，在核酸分离自天然存在的来源的情况下，“分离的”核酸是已从存在于从其分离该核酸的生物的基因组中的邻近基因序列分开的核酸。在从模板酶促合成或化学合成的核酸(例如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸)的情况下，应理解，产生自这类方法的核酸是分离的核酸。分离的核酸分子指处于分离片段的形式或作为更大的核酸构建体的成分的核酸分子。
在某些实施方案中，核酸基本不含污染性内源物质。核酸分子优选源自分离了至少一次的DNA或RNA，该DNA或RNA处于基本纯的形式和使得能够通过标准生物化学方法(如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)中所述的那些)鉴定、操作和回收其组成核酸序列的量或浓度。这类序列优选以未被通常存在于真核基因中的内部非翻译序列或内含子中断的可读框的形式提供和/或构建。非翻译DNA的序列可以存在于可读框的5’或3’，其中非翻译DNA序列不干扰编码区的操作或表达。
通常通过编码多肽的DNA中的核苷酸的位点特异性诱变、使用盒或PCR诱变或本领域公知的其他技术来制备核酸变体，以产生编码变体的DNA，然后在本文所述细胞培养物中表达重组DNA。但是，可以通过用已建立的技术体外合成来制备具有至多约100-150个残基的包含变体CDR的抗体或其抗原结合片段。变体通常显示与天然存在的类似物相同的定性生物活性，例如与抗原结合，但也可以选择具有修饰特征的变体。
如本领域技术人员所理解，由于遗传密码的简并性，可以产生极大数目的核酸，这些核酸全都编码本文所述多聚体抗原结合蛋白的CDR和重链和轻链或其他成分。因此，鉴定出具体氨基酸序列后，本领域技术人员可以通过以不改变所编码的多聚体抗原结合蛋白的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制备任意数目的不同核酸。
载体
提供包含本文所述的至少一种多核苷酸的质粒、表达载体、转录或表达盒形式的表达系统和构建体。在某些实施方案中，本文提供的质粒、表达载体、转录或表达盒包含编码本文提供的多特异性抗原结合蛋白的至少一种多肽(例如第一重链、第一轻链、第二重链或第二轻链)的多核苷酸。在某些实施方案中，本文提供的质粒、表达载体、转录或表达盒包含编码本文提供的多特异性抗原结合蛋白的至少两种多肽(例如第一重链和第一轻链，或第二重链和第二轻链)的多核苷酸。在某些实施方案中，本文提供的质粒、表达载体、转录或表达盒包含编码本文提供的多特异性抗原结合蛋白的至少四种多肽(例如第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链)的多核苷酸。
通常，用于宿主细胞中的表达载体将包含用于质粒维持及用于克隆和表达外源核苷酸序列的序列。在某些实施方案中，这类统称为“侧翼序列”的序列通常将包括一种或多种以下核苷酸序列中：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、包含供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号、用于插入编码所要表达的多肽的核酸的多聚接头区和选择标记元件。下文讨论这些序列中的每一个。
可选地，载体可以包含“标签”编码序列，即通常定位在多肽编码序列的5’或3’端的寡核苷酸分子；编码存在于市售抗体的多聚组氨酸(如六组氨酸(SEQ ID NO:66))或另一“标签”如FLAG、HA(流感病毒血凝素)或Myc的寡核苷酸序列。此标签通常在表达多肽时与多肽融合，可作为用于亲和纯化或检测来自宿主细胞的多肽的手段。亲和纯化可以例如用抗该标签的抗体作为亲和基质通过柱层析达到。可选地，该标签随后可以通过多种手段如使用某些用于切割的肽酶从纯化的多肽去除。
侧翼序列可以是同源的(即来自于宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源的(即来自宿主物种或菌株以外的物种)、杂合的(即来自一个以上来源的侧翼序列的组合)、合成的或天然的。因此，侧翼序列的来源可以是任何原核或真核生物，任何脊椎动物或无脊椎动物生物，或任何职务，只要侧翼序列在宿主细胞机器(machinery)中具有功能，且可以被宿主细胞机器激活。
用于本文提供的载体中的侧翼序列可以通过本领域公知的几种方法中的任一种获得。通常，用于本文的侧翼序列此前已通过作图和/或通过限制性内切酶消化鉴定，因此可用适当的限制性内切酶从恰当的组织来源分离。在一些情况下，侧翼序列的全核苷酸序列可以是已知的。在此，侧翼序列可以用本文所述的用于核酸合成或克隆的方法合成。
无论已知全部还是仅部分侧翼序列，它都可以用聚合酶链反应(PCR)和/或通过用适宜的探针，如来自同一物种或另一物种的寡核苷酸和/或侧翼序列筛选基因组文库获得。在侧翼序列未知时，可以从可包含例如编码序列或甚至另外一个或多个基因的更大段的DNA分离包含侧翼序列的DNA片段。可以通过限制性内切酶消化产生正确的DNA片段，然后用琼脂糖凝胶纯化、
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柱层析(Chatsworth,CA)或技术人员已知的其他方法分离，来达到分离。达到此目的的适宜酶的选择对本领域普通技术人员而言显而易见。
复制起点通常是可购得的那些原核表达载体的部分，起点辅助载体在宿主细胞中扩增。如果所选择的载体不包含复制起点，则可以根据已知序列化学合成，并连接入载体。例如，来自质粒pBR322(New England Biolabs,Beverly,MA)的复制起点适合用于大多数革兰氏阴性菌，多种病毒起点(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、水疱性口炎病毒(VSV)或乳头瘤病毒如HPV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，复制起点成分不为哺乳动物表达载体所需(例如，常使用SV40起点，仅仅它也包含病毒早期启动子)。
转录终止序列通常定位在多肽编码区的3’端，用于终止转录。通常，原核细胞中的转录终止序列是富含G-C片段后随多聚T序列。虽然该序列易于从文库克隆或甚至可作为载体的部分购得，但它也可以用诸如本文中所述的那些核酸合成方法容易地合成。
选择标记基因编码培养在选择培养基中的宿主细胞存活和生长所必需的蛋白质。典型的选择标记基因编码这样的蛋白质，该蛋白质：(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如用于原核宿主细胞的氨苄青霉素、四环素或卡那霉素)的抗性；(b)弥补细胞的营养缺陷；或(c)提供不能从复合或限定培养基获得的关键营养物。具体的选择标记有卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。有利地，新霉素抗性基因也可以用于原核和真核宿主细胞二者中的选择。
其他选择基因可以用于扩增将要表达的基因。扩增是这样的过程，其中产生对生长或细胞存活至关重要的蛋白质的基因在连续代次的重组细胞的染色体内串联重复。适合用于哺乳动物细胞的选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子胸苷激酶基因。将哺乳动物细胞转化体置于选择压力下，其中只有转化体借助存在于载体中的选择基因唯一地适应存活。通过在其中培养基中的选择剂浓度连续提高的条件下培养转化的细胞来施加选择压力，从而导致选择基因和编码另一基因(如抗体轻链或重链)的DNA二者的扩增。因此，从扩增的DNA合成的多肽量增加。
核糖体结合位点通常是mRNA的翻译起始所必需的，且表征为Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。该元件通常定位在启动子的3’和所要表达的多肽的编码序列的5’。在某些实施方案中，可以将一个或多个编码区与内部核糖体结合位点(IRES)有效连接，使得从单个RNA转录物翻译两个可读框。
在一些情况下，如希望在真核宿主细胞表达系统中得到糖基化的情况下，可以操作多种前序列或原序列来改善糖基化或产率。例如，可以改变具体信号肽的肽酶切割位点，或加入原序列，这也可以影响糖基化。最终蛋白产物可以在-1位(相对于成熟蛋白质的第一个氨基酸)具有一个或多个伴随表达的附加氨基酸，其可以未全部去除。例如，最终蛋白产物可以具有一个或多个附着于氨基端的见于肽酶切割位点中的残基。备选地，如果酶在成熟多肽内的这种区域切割，则一些酶切割位点的使用可以产生希望得到的多肽的略微截短的形式。
本文提供的表达载体和克隆载体通常包含宿主生物可识别且与编码多肽的分子有效连接的启动子。启动子是定位于结构基因的起始密码子上游(即5’)的非转录序列(通常在约100至1000bp内)，其控制结构基因的转录。常将启动子分入两个种类之一：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子响应培养条件中的某种变化(如营养物的存在或缺乏或温度变化)而从其控制下的DNA起始提高的转录水平。另一方面，组成型启动子一致地转录与之有效连接的基因，即对基因表达控制很小或无控制。多种潜在宿主细胞识别的大量启动子是公知的。通过限制酶消化从源DNA去除启动子并将所希望的启动子序列插入载体，将适宜的启动子有效连接至编码例如重链或轻链的DNA。
适合用于酵母宿主的启动子也为本领域公知。将酵母增强子有利地与酵母启动子一起使用。适合用于哺乳动物宿主细胞的启动子众所周知，包括但不限于获自病毒(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头状病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒和最优选猿猴病毒40(SV40))的基因组的那些。其他适宜的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。
可能有兴趣的其他启动子包括但不限于：SV40早期启动子(Benoist和Chambon,1981,Nature 290:304-310)；CMV启动子(Thomsen等,1984,Proc.Natl.Acad.U.S.A.81:659-663)；包含在劳氏肉瘤病毒3’长末端重复中的启动子(Yamamoto等,1980,Cell 22:787-797)；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1444-1445)；来自金属硫蛋白基因的启动子和调节序列(Prinster等,1982,Nature 296:39-42)；及原核启动子，如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)。还感兴趣的是以下显示组织特异性并已用于转基因动物的动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等,1984,Cell 38:639-646；Omitz等,1986,Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.50:399-409；MacDonald,1987,Hepatology7:425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan,1985,Nature 315:115-122)；在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等,1984,Cell 38:647-658；Adames等,1985,Nature318:533-538；Alexander等,1987,Mol.Cell.Biol.7:1436-1444)；在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴样细胞和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等,1986,Cell45:485-495)；在肝中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等,1987,Genes and Devel.1:268-276)；在肝中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等,1985,Mol.Cell.Biol.5:1639-1648；Hammer等,1987,Science 253:53-58)；在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等,1987,Genes and Devel.1:161-171)；在髓样细胞中有活性的β-球蛋白基因控制区(Mogram等,1985,Nature 315:338-340；Kollias等,1986,Cell 46:89-94)；在脑中的少突细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等,1987,Cell 48:703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani,1985,Nature 314:283-286)；即在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等,1986,Science234:1372-1378)。
可将增强子序列插入载体，以增加高等真核生物对编码本文提供的轻链或重链的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，长度通常为约10-300bp，作用于启动子来增加转录。增强子相对具有取向和位置独立性，在转录单位5’和3’的位置都有发现。已知几种可从哺乳动物基因获得的增强子序列(例如，球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。但是，通常使用来自病毒的增强子。本领域已知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子是用于激活真核启动子的示例性增强元件。虽然增强子可以在载体中位于编码序列的5’或3’，但通常定位在启动子的5’部位。可以将编码适当的天然或异源信号序列(前导序列或信号肽)的序列掺入表达载体，以促进多特异性抗原结合蛋白的胞外分泌。信号肽或前导序列的选择取决于在其中产生多特异性抗原结合蛋白的宿主细胞的类型，异源信号序列可以取代天然信号序列。在哺乳动物宿主细胞中具有功能的信号肽的实例包括以下：美国专利号4,965,195中所述的白介素-7(IL-7)信号序列；Cosman等,1984,Nature 312:768中所述的白介素-2受体信号序列；欧洲专利号0367566中所述的白介素-4受体信号肽；美国专利号4,968,607中所述的I型白介素-I受体信号肽；欧洲专利号0460846中所述的II型白介素-I受体信号肽。
载体可以包含一个或多个在载体整合入宿主细胞基因组时便于表达的元件。实例包括EASE元件(Aldrich等2003Biotechnol Prog.19:1433-38)和基质附着区(MAR)。MAR介导染色质的结构组织，可将整合的载体与“位置”效应隔绝。因此，MAR在用载体来产生稳定转化体时尤其有用。许多天然和合成的含有MAR的核酸为本领域已知，例如美国专利号6,239,328；7,326,567；6,177,612；6,388,066；6,245,974；7,259,010；6,037,525；7,422,874；7,129,062。
本文提供的表达载体可以从起始载体如市售载体构建。这类载体可以包含或不包含全部希望得到的侧翼序列。在本文所述的一个或多个侧翼序列并非已经存在于载体中时，可以单独获得它们，并连接入载体。用于获得各侧翼序列的方法为本领域技术人员公知。
构建载体并将编码轻链、重链或轻链和重链序列的核酸分子插入载体的正确位点之后，可以将完成的载体插入适宜的宿主细胞进行扩增和/或多肽表达。可以通过公知的方法来将表达载体转化入所选择的宿主细胞，该方法包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体转染、DEAE-葡聚糖介导转染、或其他已知的技术。所选择的方法将部分是所使用的宿主细胞的类型的函数。这些方法及其他适宜的方法为技术人员公知，并显示在例如Sambrook等,2001,上文中。在某些实施方案中，将能够表达第一重链、第一轻链、第二重链和第一轻链的一个或多个载体引入宿主细胞。
宿主细胞
此外，提供包含上述表达系统或构建体的宿主细胞。在某些实施方案中，从单个宿主细胞表达多特异性抗原结合蛋白。在适当条件下培养时，宿主细胞合成多特异性抗原结合蛋白，随后可以从培养基(如果宿主细胞将它分泌入培养基)或直接从产生它的宿主细胞(如果不分泌)收集多特异性抗原结合蛋白。适当宿主细胞的选择将取决于多种因素，如所希望得到的表达水平、希望得到或活性所必需的多肽修饰(如糖基化或磷酸化)及折叠为生物活性分子的容易程度。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。
可作为宿主用于表达的哺乳动物细胞系为本领域公知，包括但不限于可从美国典型培养物保藏所(ATCC)获得的永生化细胞系，用本领域已知的表达系统的任何细胞系都可以用于制备本文提供的重组多肽。通常，用包含编码希望得到的多特异性抗原结合蛋白的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。可以利用的宿主细胞包括原核生物、酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或阳性生物，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。高等真核细胞包括昆虫细胞和已建立的哺乳动物来源的细胞系。适宜的哺乳动物宿主细胞系的实例包括：COS-7猴肾细胞系(ATCC CRL 1651)(Gluzman等,1981,Cell 23:175)、L细胞、293细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物如Veggie CHO和在无血清培养基中生长的相关细胞系(Rasmussen等,1998,Cytotechnology 28:31)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL10)细胞系、源自McMahan et al.,1991,EMBO J.10:2821所述非洲绿猴肾细胞系CVI(ATCC CCL 70)的CVI/EBNA细胞系、人胚肾细胞如293、293EBNA或MSR 293、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其他转化灵长类细胞系、正常二倍体细胞、源自原代组织体外培养的细胞株、原代外植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。可选地，希望在多种信号转导或报告测定中使用多肽时，可以用例如哺乳动物细胞系如HepG2/3B、KB、NIH 3T3或S49来表达多肽。备选地，可能在低等真核生物如酵母中或在原核生物如细菌中产生多肽。适宜的宿主包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)菌株、假丝酵母属(Candida)菌株、毕赤酵母属(Pichia)菌株、或能够表达异源多肽的任意酵母菌株。适宜的细菌菌株包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、或能够表达异源多肽的任意细菌菌株。
在某些实施方案中，提供表达本文所述多特异性抗原结合蛋白的细胞系。在某些实施方案中，该细胞系是原核细胞系。在某些实施方案中，该细胞系是大肠杆菌细胞系。在某些实施方案中，在同一原核细胞中共表达HC1、LC1、HC2和LC2。在某些实施方案中，在同一大肠杆菌细胞中共表达HC1、LC1、HC2和LC2。在某些实施方案中，在同一真核细胞中共表达HC1、LC1、HC2和LC2。在某些实施方案中，该细胞系是真核细胞系。在某些实施方案中，该细胞系是稳定细胞系。在某些实施方案中，该稳定细胞系是哺乳动物细胞系。在某些实施方案中，该稳定细胞系是CHO细胞系。在某些实施方案中，该稳定细胞系表达的至少约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的多特异性抗原结合蛋白是正确组装的(即其中LC1与HC1配对，其中LC2与HC2配对)。稳定细胞系可通过本领域已知的方法获得。在某些实施方案中，通过将编码HC1、LC1、HC2和LC2的一个或多个多核苷酸随机或靶向整合入宿主细胞基因组来产生稳定细胞系。
如果在酵母或细菌中产生多特异性抗原结合蛋白，则可以希望例如通过磷酸化或糖基化适当的位点来修饰其中产生的产物，以获得功能性产物。这类共价附着可以用已知的化学或酶促方法达到。还可以通过使本文提供的分离的核酸在一个或多个昆虫表达载体中与适宜的控制序列有效连接并利用昆虫表达系统来产生多肽。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式从例如Invitrogen,San Diego,Calif.,U.S.A.(the MaxBac kit)购得，这类方法为本领域公知，如描述于Summers和Smith,TexasAgricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)及Luckow和Summers,Bio/Technology 6:47(1988)中。还可以使用源自本文公开的核酸构建体的RNA，利用无细胞翻译系统来产生多肽，如抗体或片段。Pouwels等(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,New York,1985)描述了适合用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体。包含优选与至少一个表达控制序列有效连接的本文提供的分离的核酸的宿主细胞是“重组宿主细胞”。
在某些实施方案中，可通过测定哪些细胞系具有高表达水平且组成性产生具有希望得到的结合特性的多特异性抗原结合蛋白来选择细胞系。在另一实施方案中，可以选择来自本身不产生抗体但具有产生和分泌异源多特异性抗原结合蛋白能力的B细胞系的细胞系。
多特异性抗原结合蛋白的产生和纯化
培养宿主细胞
在某些实施方案中，提供产生本文所述多特异性抗原结合蛋白的方法，其包括：(a)将一组编码H1、H2、L1和L2的多核苷酸引入宿主细胞；和(b)培养宿主细胞以产生多特异性抗原结合蛋白。在某些实施方案中，按预先确定的比例(例如摩尔比或重量比)将编码L1和L2的多核苷酸引入宿主细胞。在某些实施方案中，将编码L1和L2的多核苷酸引入宿主细胞，使得L1:L2的比值(例如摩尔比或重量比)为约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1.5:1、约2:1、约2.5:1、约3:1、约3.5:1、约4:1、约4.5:1、约5:1或约5.5:1，包括这些值之间的任意范围。在某些实施方案中，该比值为摩尔比。在某些实施方案中，该比值为重量比。在某些实施方案中，按预先确定的比例(例如摩尔比或重量比)将编码H1和H2的多核苷酸引入宿主细胞。在某些实施方案中，将编码H1和H2的多核苷酸引入宿主细胞，使得H1:H2的比值(例如摩尔比或重量比)为约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:5.5、约1.5:1、约2:1、约2.5:1、约3:1、约3.5:1、约4:1、约4.5:1、约5:1或约5.5:1，包括这些值之间的任意范围。在某些实施方案中，该比值为摩尔比。在某些实施方案中，该比值为重量比。在某些实施方案中，按预先确定的比例(例如摩尔比或重量比)将编码H1、H2、L1和L2的多核苷酸引入宿主细胞。在某些实施方案中，将编码H1、H2、L1和L2的多核苷酸引入宿主细胞，使得H1+H2:L1+L2的比值(例如摩尔比或重量比)为约5:1、约5:2、约5:3、约5:4、约1:1、约4:5、约3:5、约2:5或约1:5，包括这些值之间的任意范围。在某些实施方案中，将编码LC1、LC2、HC1和HC2的多核苷酸引入宿主细胞，使得LC1:LC2:HC1:HC2的比值(例如摩尔比或重量比)为约1:1:1:1、约2.8:1:1:1、约1.4:1:1:1、约1:1.4:1:1、约1:2.8:1:1、约1:1:2.8:1、约1:1:1.4:1、约1:1:1:2.8或约1:1:1:1.4，包括这些值之间的任意范围。在某些实施方案中，该比值为摩尔比。在某些实施方案中，该比值为重量比。
在某些实施方案中，产生多特异性抗原结合蛋白的方法进一步包括确定引入细胞的多核苷酸的最佳比例。在某些实施方案中，用质谱分析来测定多特异性抗原结合蛋白产率(如双特异性抗体产率)，调整最佳链比例以最大化多特异性抗原结合蛋白产率(如双特异性抗体产率)。在某些实施方案中，用双抗原ELISA来测定多特异性抗原结合蛋白产率(如双特异性抗体产率)，调整最佳链比例以最大化产率。在某些实施方案中，产生多特异性抗原结合蛋白的方法进一步包括从细胞培养物收获或回收多特异性抗原结合蛋白。在某些实施方案中，产生多特异性抗原结合蛋白的方法进一步包括纯化所收获或回收多特异性抗原结合蛋白。
用于产生希望得到的本文提供的多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)的宿主细胞可以培养在多种培养基中。市售培养基如Ham’s F10(Sigma)、Minimal EssentialMedium((MEM),Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium((DMEM),Sigma)适合用于培养宿主细胞。此外，可以用Ham等,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980),美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；美国专利Re.30,985中所述的任意培养基作为宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一种可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常按微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等同的能源。还可以按本领域技术人员已知的适当浓度包含任意其他必需的补充物。培养条件(如温度、pH等)是之前选择用于表达的宿主细胞的那些，且对普通技术人员而言将是显而易见的。
收获或回收和纯化多特异性抗原结合蛋白
在相关方面，提供产生本文所述多特异性抗原结合蛋白的方法，其包括在允许表达多特异性抗原结合蛋白的条件下培养上述宿主细胞和回收(如收获)多特异性抗原结合蛋白。在某些实施方案中，该方法进一步包括纯化所回收的多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)，以获得基本同质的制备物例如用于其他测定和用途。
本文提供的多特异性抗原结合蛋白可以在胞内产生，或者直接分泌进入培养基。如果多特异性抗原结合蛋白在胞内产生，作为第一步，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。在多特异性抗原结合蛋白分泌进入培养基时，通常首先用市售蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这类表达系统的上清。可以在任意前述步骤中包含蛋白酶抑制剂(如PMSF)来抑制蛋白酶解，且可以包含抗生素来防止外来污染物的生长。
可以利用本领域已知的标准蛋白质纯化方法来获得来自细胞的多特异性抗原结合蛋白的基本同质的制备物。以下方法是适宜的纯化方法的示例：免疫亲和柱或离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上或阳离子交换树脂如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
此外或备选地，可以用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析纯化所制备的多特异性抗原结合蛋白，亲和层析是优选的纯化技术。
在某些方面，将源自上述细胞培养基的制备物上样至蛋白A固定的固相，以允许目的多特异性抗原结合蛋白与蛋白A特异性结合。然后洗涤固相，以去除非特异性结合于固相的污染物。通过洗脱入含有离液剂或温和去垢剂的溶液来从固相回收多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)。示例性离液剂和温和去垢剂包括但不限于盐酸胍、尿素、高氯酸锂、精氨酸、组氨酸、SDS(十二烷基硫酸钠)、Tween、Triton和NP-40，它们全都是市售的。
蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于存在于多特异性抗原结合蛋白中的任意免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型及用于人γ3(Guss等,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体所附着的基质最常见的是琼脂糖，但其他基质也可用。与用琼脂糖可以达到的流速和处理时间相比，机械稳定的基质(如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)允许更快的流速和更短的处理时间。在多特异性抗原结合蛋白包含CH3结构域时，用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)进行纯化。取决于要回收的多特异性抗原结合蛋白，用于蛋白质纯化的其他技术也可用，如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
任何一个或多个初步纯化步骤之后，可以使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行，对包含目的多特异性抗原结合蛋白和污染物的混合物进行低pH疏水作用层析。多特异性抗原结合蛋白的产生可以备选地或附加地(对于任意前述具体方法)包括透析包含多肽混合物的溶液。
多特异性抗原结合蛋白文库
本文提供包含本文所述的多种多特异性抗原结合蛋白的文库。在某些实施方案中，该文库是多核苷酸文库(如多个本文所述的任意多核苷酸)。在某些实施方案中，该文库是多肽文库(如多种本文所述的任意多肽)。在某些实施方案中，本文提供的多肽文库是多肽展示文库。可以筛选这类多肽展示文库，以选择和/或设计具有多种用途(包括但不限于治疗、预防、兽医、诊断、试剂或材料应用)所希望得到的特性的结合蛋白。
在某些实施方案中，提供包含至少2、3、4、5、10、30、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500、10000、25000、50000、75000、100000、250000、500000、750000、1000000、2500000、5000000、7500000、10000000或超过10000000种不同多特异性抗原结合蛋白的文库，该多特异性抗原结合蛋白都包含H1的CH1结构域上的S183位(EU编号)的氨基酸取代和L1的CL结构域上的V133位(EU编号)的氨基酸取代。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S、S181M、S183V和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、V133I、L135V、S162M、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、S131D、L135V、S162A、S174A、S176F和T178I突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170A、S181M、S183V和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、L135V、S162M、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)L128F、A141M、F170M、S181I和S183A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F118V、S131T、V133A、L135Y、S162A、T164S、S176M和T178L突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)L128F、A141M、F170Y、S181I、S183A和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、S176A和T178L突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)L128F、A141T、F170M、S181T、S183A和V185L突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F118V、S131T、V133A、L135F、S162A、T164S、S176T和T178L突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)L128F、A141M、F170M、S181T和S183A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F118V、S131T、V133A、L135F、S162M、T164S、S176M和T178L突变(EU编号)的L1的CL结构域。
此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S、S181M、S183A和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S、S183A和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S、S181M和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、L135V、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S、S181M和S183A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、L135V、S174A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S、S183A和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S、S181M和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、L135V和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S、S181M和S183A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S和S183A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I、F170S和S181M突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S和V185A突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I和F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、L135V、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、L135V、S174A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、L135V和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。
此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I和F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、L135V、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I和F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、L135V、S174A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I和F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、S176F和T178V突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I和F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A、L135V和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含含有(包括由其组成和基本由其组成)A141I和F170S突变(EU编号)的H1的CH1结构域及含有(包括由其组成和基本由其组成)F116A和S176F突变(EU编号)的L1的CL结构域。
此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含H1的VH结构域Q39位(Kabat编号)的氨基酸取代突变和L1的VL结构域Q38位(Kabat编号)的氨基酸取代突变。此外或备选地，文库中的多特异性抗原结合蛋白包含H2的VH结构域Q39位(Kabat编号)的氨基酸取代突变和L2的VL结构域Q38位(Kabat编号)的氨基酸取代突变。
在某些实施方案中，提供包含至少2、3、4、5、10、30、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500、10000、25000、50000、75000、100000、250000、500000、750000、1000000、2500000、5000000、7500000、10000000或超过10000000种在其互补决定区(CDRS)中具有独特序列的本文提供的多特异性抗原结合蛋白的文库，包括这些值之间的任意范围。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白文库具有约2、约5、约10、约50、约100、约250、约500、约750、约103、约104、约105、约106、约107、约108、约109、约1010、约1011、约1012、约1013、约1014或超过约1014(如约1015或约1016)的序列多样性，包括这些值之间的任意范围。
在某些实施方案中，通过基因工程产生多特异性抗原结合蛋白文库。之前已描述了用于诱变和随后的文库构建的多种方法(连同用于筛选或选择的适当方法)。这类诱变方法包括但不限于例如易错PCR、环改组、或寡核苷酸定向诱变、随机核苷酸插入或重组之前的其他方法。关于这些方法的其他细节描述于例如Abou-Nadle等(2010)BioengineeredBugs 1,337-340；Firth等(2005)Bioinformatics 21,3314-3315；Cirino等(2003)MethodsMol Biol 231,3-9；Pirakitikulr(2010)Protein Sci 19,2336-2346；Steffens等(2007)J.Biomol Tech 18,147-149中。因此，在某些实施方案中，提供通过基因工程技术产生的多特异性抗原结合蛋白文库。
在某些实施方案中，通过体外翻译产生多特异性抗原结合蛋白文库。简言之，体外翻译需要将一个或多个蛋白质编码序列克隆入含有启动子的载体，通过用RNA聚合酶转录所克隆的一个或多个序列产生mRNA，通过例如用无细胞提取物体外翻译此mRNA来合成蛋白质。可以简单地通过改变所克隆的蛋白质编码序列来产生希望得到的突变体蛋白质。许多mRNA可以在麦胚提取物中或兔网织红细胞裂解物中有效地翻译。关于体外翻译的其他细节描述于例如Hope等(1985)Cell 43,177-188；Hope等(1986)Cell 46,885-894；Hope等(1987)EMBO J.6,2781-2784；Hope等(1988)Nature 333,635-640；和Melton等(1984)Nucl.Acids Res.12,7057-7070中。
因此，提供编码本文所述多肽展示文库的多种核酸分子。本文还提供与多种核酸分子有效连接的表达载体。
在某些实施方案中，通过化学合成产生多特异性抗原结合蛋白文库。固相和液相肽合成的方法为本领域公知，并详细描述于例如Methods of Molecular Biology,35,Peptide Synthesis Protocols,(M.W.Pennington和B.M.Dunn编辑),Springer,1994；Welsch等(2010)Curr Opin Chem Biol14,1-15；Methods of Enzymology,289,SolidPhase Peptide Synthesis,(G.B.Fields编辑),Academic Press,1997；ChemicalApproaches to the Synthesis of Peptides and Proteins,(P.Lloyd-Williams,F.Albericio和E.Giralt编辑),CRC Press,1997；Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,A Practical Approach,(W.C.Chan,P.D.White编辑),Oxford University Press,2000；Solid Phase Synthesis,A Practical Guide,(S.F.Kates,F Albericio编辑),MarcelDekker,2000；P.Seneci,Solid-Phase Synthesis and Combinatorial Technologies,John Wiley&Sons,2000；Synthesis of Peptides and Peptidomimetics(M.Goodman,Editor-in-chief,A.Felix,L.Moroder,C.Tmiolo编辑),Thieme,2002；N.L.Benoiton,Chemistry of Peptide Synthesis,CRC Press,2005；Methods in Molecular Biology,298,Peptide Synthesis and Applications,(J.Howl编辑)Humana Press,2005；及AminoAcids,Peptides and Proteins in Organic Chemistry,3卷,Building Blocks,Catalysts and Coupling Chemistry,(A.B.Hughs编辑)Wiley-VCH,2011中。因此，在某些实施方案中，提供通过化学合成技术产生的多特异性抗原结合蛋白文库。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白文库包含展示文库。在某些实施方案中，该展示文库是噬菌体展示文库、噬菌粒展示文库、病毒展示文库、细菌展示文库、酵母展示文库、gt11文库、CIS展示文库、体外分格化文库或核糖体展示文库。制备和筛选这类展示文库的方法为本领域技术人员公知，并描述于例如Molek等(2011)Molecules 16,857-887；Boder等,(1997)Nat Biotechnol 15,553-557；Scott等(1990)Science 249,386-390；Brisette等(2007)Methods Mol Biol 383,203-213；Kenrick等(2010)Protein Eng DesSel 23,9-17；Freudl等(1986)J Mol Biol188,491-494；Getz等(2012)Methods Enzymol503,75-97；Smith等(2014)Curr Drug Discov Technol 11,48-55；Hanes等(1997)ProcNatl Acad Sci USA 94,4937-4942；Lipovsek等,(2004)J Imm Methods 290,51-67；Ullman等(2011)Brief.Funct.Genomics,10,125–134；Odegrip等(2004)Proc Natl AcadSci USA 101,2806-2810；及Miller等(2006)Nat Methods 3,561-570中。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白文库包含例如通过Szostak等的US6258558、US 6261804、US 5643768和US 5658754中所述的技术产生的RNA-蛋白质融合文库。在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白文库包含例如US 6416950中所述的DNA-蛋白质文库。
多特异性抗原结合蛋白文库的定向进化
可以筛选本文提供的多特异性抗原结合蛋白来鉴定例如对两种或多种目的靶配体具有改善的结合亲和力的多价抗原结合蛋白。因此，本文提供获得特异性结合至少两种目的靶配体(例如本文中其他地方描述的两种或多种目的靶配体)的多特异性抗原结合蛋白的方法。
在某些实施方案中，该方法包括：a)使第一靶配体与多特异性抗原结合蛋白文库(如本文所述文库)在允许形成多特异性抗原结合蛋白:第一靶配体复合物的条件下接触；b)检测多特异性抗原结合蛋白:第一靶配体复合物；和c)从该复合物获得特异性结合第一靶配体的多特异性抗原结合蛋白。
此外或备选地，在某些实施方案中，该方法包括：a)使第二靶配体与多特异性抗原结合蛋白文库(如本文所述文库)在允许形成多特异性抗原结合蛋白:第二靶配体复合物的条件下接触；b)检测多特异性抗原结合蛋白:第二靶配体复合物；和c)从该复合物获得特异性结合第二靶配体的多特异性抗原结合蛋白。
在某些实施方案中，提供包含本文提供的多特异性抗原结合蛋白和第一靶配体的复合物(即多特异性抗原结合蛋白:靶配体的复合物)。在某些实施方案中，提供包含本文提供的多特异性抗原结合蛋白和第二靶配体的复合物。在某些实施方案中，提供包含本文提供的多特异性抗原结合蛋白、第一靶配体和第二靶配体的复合物。在某些实施方案中，提供能够结合两种或多种靶配体的多特异性抗原结合蛋白。在某些实施方案中，该方法进一步包括d)测定特异性结合两种或多种靶配体的多特异性抗原结合蛋白的核酸序列。
在某些实施方案中，对特异性结合两种或多种靶配体的多特异性抗原结合蛋白进行亲和力成熟。在此方法中，对多特异性抗原结合蛋白进行选择对第一靶标和/或第二靶标的亲和力提高的方案(参见Wu等(1998)Proc Natl Acad Sci USA.95,6037-42)。在某些实施方案中，在从文库筛选鉴定出来之后进一步随机化特异性结合第一靶配体的多特异性抗原结合蛋白。例如，在某些实施方案中，获得特异性结合第一靶配体的多特异性抗原结合蛋白的方法进一步包括：(e)随机化从之前鉴定的多特异性抗原结合蛋白:第一靶配体复合物获得的多特异性抗原结合蛋白的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3，以产生其他多特异性抗原结合蛋白；(f)使第一靶配体与进一步随机化的多特异性抗原结合蛋白接触；(g)检测进一步随机化的多特异性抗原结合蛋白:第一靶配体复合物的形成；和(h)从该复合物获得进一步随机化的特异性结合第一靶配体的多特异性抗原结合蛋白。此外或备选地，在某些实施方案中，用第二靶配体重复步骤(e)-(h)。
在某些实施方案中，该方法进一步包括(i)测定特异性结合第一(和/或第二)靶配体的多特异性抗原结合蛋白的核酸序列。
在某些实施方案中，进一步随机化的多特异性抗原结合蛋白包含至少一个或至少两个之前在第一文库中未随机化的随机化的CDR。可以进行多轮随机化、筛选和选择，直至获得对第一和/或第二靶配体具有足够亲和力的n种多特异性抗原结合蛋白。因此，在某些实施方案中，重复步骤(e)-(h)或步骤(e)-(i)一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或超过十次，以鉴定特异性结合第一靶配体的多特异性抗原结合蛋白。此外或备选地，在某些实施方案中，重复步骤(e)-(h)或步骤(e)-(i)一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或超过十次，以鉴定特异性结合第二靶配体的多特异性抗原结合蛋白。
在某些实施方案中，进行了至少两轮、三轮、四轮、五轮、六轮、七轮、八轮、九轮、十轮或超过十轮随机化、筛选和选择的多特异性抗原结合蛋白以至少与进行了一轮随机化、筛选和选择的多特异性抗原结合蛋白的亲和力一样高的亲和力结合靶配体。在某些实施方案中，进行了至少两轮、三轮、四轮、五轮、六轮、七轮、八轮、九轮、十轮或超过十轮随机化、筛选和选择的多特异性抗原结合蛋白以高于进行了一轮随机化、筛选和选择的多特异性抗原结合蛋白的亲和力的亲和力结合第一靶配体。此外或备选地，在某些实施方案中，进行了至少两轮、三轮、四轮、五轮、六轮、七轮、八轮、九轮、十轮或超过十轮随机化、筛选和选择的多特异性抗原结合蛋白以高于进行了一轮随机化、筛选和选择的多特异性抗原结合蛋白的亲和力的亲和力结合第二靶配体。
对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，可以重复上述方法来鉴定特异性结合三种目的靶配体、四种目的靶配体、五种目的靶配体、或超过五种目的靶配体的多特异性抗原结合蛋白。
可以通过本领域已知的任何技术筛选本文提供的多特异性抗原结合蛋白文库来演化新的或改善的特异性结合靶配体的结合蛋白。在某些实施方案中，将靶配体固定在固体支持物(如柱树脂或微量滴定板孔)上，使靶配体与候选多特异性抗原结合蛋白的文库(如本文所述的任意文库)接触。选择技术可以是例如噬菌体展示(Smith(1985)Science228,1315-1317)、mRNA展示(Wilson等(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:3750-3755)、细菌展示(Georgiou等(1997)Nat Biotechnol 15:29-34.)、酵母展示(Boder和Wittrup(1997)Nat.Biotechnol.15:553-5577)或核糖体展示(Hanes和Plückthun(1997)Proc NatlAcad Sci U S A 94:4937–4942及WO2008/068637)。
在某些实施方案中，该多特异性抗原结合蛋白文库是噬菌体展示文库。在某些实施方案中，提供展示本文所述多特异性抗原结合蛋白的噬菌体颗粒。在某些实施方案中，提供展示能够结合靶配体的本文所述多特异性抗原结合蛋白的噬菌体颗粒。
噬菌体展示是通过其来将多种多特异性抗原结合蛋白变体作为与外壳蛋白的融合蛋白展示在细菌噬菌体颗粒表面的技术(Smith,G.P.(1985)Science,228:1315-7；Scott,J.K.和Smith,G.P.(1990)Science 249:386；Sergeeva,A.等(2006)Adv.DrugDeliv.Rev.58:1622-54)。噬菌体展示的用途在于这样的事实，可以针对以高亲和力结合靶分子的那些序列快速和有效地分选选择性随机化蛋白质(或随机克隆的cDNA)变体的大文库。
肽(Cwirla,S.E.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378)或蛋白质(Lowman,H.B.等(1991)Biochemistry,30:10832；Clackson,T.等(1991)Nature,352:624；Marks,J.D.等(1991),J.Mol.Biol.,222:581；Kang,A.S.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363)文库在噬菌体上的展示已用于针对具有特异性结合特性的多肽或寡肽筛选数百万种多肽或寡肽(Smith,G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.,2:668；Wu等(1998)Proc NatlAcad Sci USA.May 95,6037-42)。多价噬菌体展示方法已用于通过与丝状噬菌体的基因III或基因VIII融合来展示小的随机肽和小蛋白质。(Wells和Lowman,Curr.Opin.Struct.Biol.,3:355-362(1992)及本文引用的参考文献)。在单价噬菌体展示中，将蛋白质或肽与基因III或其部分融合，在野生型基因III蛋白质存在下低水平表达，使得噬菌体颗粒展示融合蛋白的一个拷贝或没有一个拷贝。亲和力效应相对于多价噬菌体降低，使得分选基于内在配体亲和力，使用噬菌粒载体，其简化了DNA操作。(Lowman和Wells,Methods:A companion to Methods in Enzymology,3:205-0216(1991))。
分选多特异性抗原结合蛋白的噬菌体文库需要构建和繁殖大量变体、使用靶配体的用于亲和纯化的方法及评价结合富集结果的手段(参见例如US 5223409、US 5403484、US5571689和US 5663143)。
大多数噬菌体展示方法使用丝状噬菌体(如M13噬菌体)。还已知λ形噬菌体展示系统(参见WO1995/34683、US 5627024)、T4噬菌体展示系统(Ren等(1998)Gene 215:439；Zhu等(1998)Cancer Research,58:3209-3214；Jiang等,(1997)Infection&Immunity,65:4770-4777；Ren等(1997)Gene,195:303-311；Ren(1996)Protein Sci.,5:1833；Efimov等.(1995)Virus Genes,10:173)和T7噬菌体展示系统(Smith和Scott(1993)Methods inEnzymology,217:228-257；US.5766905)。
现已发展了基本噬菌体展示概念的许多其他改进和变化。这些改进增强了展示系统针对与所选择的靶分子的结合筛选肽文库和展示具有针对希望得到的特性筛选这些蛋白质的潜能的功能性蛋白质的能力。已发展了用于噬菌体展示反应的组合反应装置(WO1998/14277)，噬菌体展示文库已用于分析和控制双分子相互作用(WO 1998/20169；WO1998/20159)和受限螺旋肽的特性(WO 1998/20036)。WO 1997/35196描述了分离亲和配体的方法，其中使噬菌体展示文库与其中配体将结合靶分子的一种溶液和其中亲和配体将不结合靶分子的第二溶液接触，已选择性分离结合配体。WO 1997/46251描述了用亲和纯化抗体生物淘选随机噬菌体展示文库、然后分离结合噬菌体、然后用微量滴定板孔进行微量淘选过程来分离高亲和力结合噬菌体的方法。这种方法可以应用于本文公开的多特异性抗原结合蛋白。还已报道了金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A作为亲和标签的用途(Li等(1998)Mol Biotech.9:187)。WO 1997/47314描述了底物扣除文库在用组合文库(其可以是噬菌体展示文库)区分酶特异性中的用途。选择特异性结合蛋白的其他方法描述于US 5498538、US 5432018和WO 1998/15833中。产生肽文库并筛选这些文库的方法还公开于US 5723286、US 5432018、US 5580717、US 5427908、US 5498530、US 5770434、US5734018、US 5698426、US 5763192和US 5723323中。
抗原/靶分子
本文提供的多特异性抗原结合蛋白可以靶向的分子的实例包括但不限于可溶性血清蛋白质及其受体和其他膜结合蛋白质(例如黏附素)。在另一实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白能够结合选自以下的一种、两种或多种细胞因子、细胞因子相关蛋白质和细胞因子受体：8MPI、8MP2、8MP38(GDFIO)、8MP4、8MP6、8MP8、CSFI(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(αFGF)、FGF2(βFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFN81、IFNG、IFNWI、FEL1、FEL1(EPSELON)、FEL1(ZETA)、IL 1A、IL 1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL1 0、IL 11、IL 12A、IL 12B、IL 13、IL 14、IL 15、IL 16、IL 17、IL 17B、IL 18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBb3、LTA(TNF-β)、LTB、TNF(TNF-α)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、HGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL 11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦蛋白)、PTN和THPO.
在另一实施方案中，靶分子是选自以下的趋化因子、趋化因子受体或趋化因子相关蛋白质：CCLI(1-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-Iα)、CCL4(MIP-Iβ)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(嗜伊红粒细胞趋化蛋白)、CCL 13(MCP-4)、CCL 15(MIP-Iδ)、CCL 16(HCC-4)、CCL 17(TARC)、CCL 18(PARC)、CCL 19(MDP-3b)、CCL20(MIP-3α)、CCL21(SLC/exodus-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜伊红粒细胞趋化蛋白-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜伊红粒细胞趋化蛋白-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCLI(GROI)、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL 10(IP 10)、CXCL 11(1-TAC)、CXCL 12(SDFI)、CXCL 13、CXCL 14、CXCL 16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL 1(SCYDI)、SCYEI、XCLI(淋巴细胞趋化因子)、XCL2(SCM-Iβ)、BLRI(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCRI(CKRI/HM145)、CCR2(mcp-IRB IRA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBII)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Rα)、IL8RB(IL8Rβ)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HDF1、HDF1α、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2和VHL.
在另一实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白能够结合选自以下的一种或多种靶标：ABCF1、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、ADORA2A、Aggrecan、AGR2、AICDA、AIF1、AIG1、AKAP1、AKAP2、AMH、AMHR2、ANGPTL、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、APC、APOC1、AR、AZGP1(锌-a-糖蛋白)、B7.1、B7.2、BAD、BAFF(BLys)、BAG1、BAI1、BCL2、BCL6、BDNF、BLNK、BLRI(MDR15)、BMP1、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、BPAG1(网蛋白)、BRCA1、C19orf10(IL27w)、C3、C4A、C5、C5R1、CANT1、CASP1、CASP4、CAV1、CCBP2(D6/JAB61)、CCL1(1-309)、CCL11(嗜伊红粒细胞趋化蛋白)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP1δ)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3β)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3α)、CCL21(MTP-2)、SLC、exodus-2、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜伊红粒细胞趋化蛋白-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜伊红粒细胞趋化蛋白-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CCL3(MTP-Iα)、CCL4(MDP-Iβ)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CCR1(CKRI/HM145)、CCR2(mcp-IRβ/RA)；CCR3(CKR/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKBR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、CD164、CD19、CD1C、CD20、CD200、CD22、CD24、CD28、CD3、CD37、CD38、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45RB、CD52、CD69、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CDS、CD80、CD81、CD83、CD86、CDH1(E-钙黏蛋白)、CDH10、CDH12、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH5、CDH7、CDH8、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、CDKN1A(p21/WAF1/Cip1)、CDKN1B(p27/Kip1)、CDKN1C、CDKN2A(P16INK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、CER1、CHGA、CHGB、几丁质酶、CHST10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、CLDN3、CLDN7(封闭蛋白-7)、CLN3、CLU(簇集蛋白)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CNR1、COL 18A1、COL1A1、COL4A3、COL6A1、CR2、CRP、CSFI(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA4、CTNNB1(b-联蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、CX3CL1(SCYDI)、CX3CR1(V28)、CXCL1(GRO1)、CXCL10(IP-10)、CXCL11(I-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR4、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYB5、CYC1、CYSLTR1、DAB2IP、DES、DKFZp451J0118、DNCLI、DPP4、E2F1、ECGF1、EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、EGFR、ELAC2、ENG、ENO1、ENO2、ENO3、EPHB4、EPO、ERBB2(Her-2)、EREG、ERK8、ESR1、ESR2、F3(TF)、FADD、FasL、FASN、FCER1A、FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(αFGF)、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF8、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FELl(EPSILON)、FILl(ZETA)、FLJ12584、FLJ25530、FLRTI(纤连蛋白)、FLT1、FOS、FOSL1(FRA-1)、FY(DARC)、GABRP(GABAa)、GAGEB1、GAGEC1、GALNAC4S-6ST、GATA3、GDF5、GFI1、GGT1、GM-CSF、GNASI、GNRHI、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR44、GPR81(FKSG80)、GRCCIO(C10)、GRP、GSN(Gelsolin)、GSTP1、HAVCR2、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、HGF、HIF1A、HOP1、组胺和组胺受体、HLA-A、HLA-DRA、HM74、HMOXI、HUMCYT2A、ICEBERG、ICOSL、1D2、IFN-a、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNγ、DFNW1、IGBP1、IGF1、IGF1R、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、IL-l、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL-12、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL14、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17B、IL17C、IL17R、IL18、IL18BP、IL18R1、IL18RAP、IL19、IL1A、IL1B、ILIF10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL1HY1、IL1R1、IL1R2、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RL1、IL1RL2,ILIRN、IL2、IL20、IL20RA、IL21R、IL22、IL22R、IL22RA2、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL30、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST(糖蛋白130)、EL7、EL7R、EL8、IL8RA、DL8RB、IL8RB、DL9、DL9R、DLK、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAK1、ERAK2、ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA6(a6整联蛋白)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(b4整联蛋白)、JAG1、JAK1、JAK3、JUN、K6HF、KAI1、KDR、KITLG、KLF5(GC Box BP)、KLF6、KLKIO、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KHTHB6(毛发特异性H型角蛋白)、LAMAS、LEP(瘦蛋白)、Lingo-p75、Lingo-Troy、LPS、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或OMgp、MAP2K7(c-Jun)、MDK、MIB1、midkine、MEF、MIP-2、MKI67、(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(金属硫蛋白-111)、MTSS1、MUC1(黏蛋白)、MYC、MY088、NCK2、神经蛋白聚糖、NFKB1、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-p75、NgR-Troy、NME1(NM23A)、NOX5、NPPB、NR0B1、NR0B2、NR1D1、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NR112、NR113、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、NRP1、NRP2、NT5E、NTN4、ODZI、OPRD1、P2RX7、PAP、PART1、PATE、PAWR、PCA3、PCNA、POGFA、POGFB、PECAM1、PF4(CXCL4)、PGF、PGR、磷酸酶蛋白聚糖、PIAS2、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG、PLXDC1、PPBP(CXCL7)、PPID、PRI、PRKCQ、PRKDI、PRL、PROC、PROK2、PSAP、PSCA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、RAC2(p21Rac2)、RARB、RGSI、RGS13、RGS3、RNF110(ZNF144)、ROBO2、S100A2、SCGB1D2(嗜脂素B)、SCGB2A1(乳球蛋白2)、SCGB2A2(乳球蛋白1)、SCYEI(内皮单核细胞活化细胞因子)、SDF2、SERPINA1、SERPINA3、SERP1NB5(乳腺丝抑蛋白)、SERPINE1(PAI-1)、SERPDMF1、SHBG、SLA2、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPPI、SPRR1B(Sprl)、ST6GAL1、STABI、STAT6、STEAP、STEAP2、TB4R2、TBX21、TCPIO、TOGFI、TEK、TGFA、TGFBI、TGFB1II、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBRI、TGFBR2、TGFBR3、THIL、THBSI(血小板反应蛋白-1)、THBS2、THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TMP3、组织因子、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TNF、TNF-a、TNFAEP2(B94)、TNFAIP3、TNFRSFIIA、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSF5、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSFS(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TOLLIP、Toll样受体、TOP2A(拓扑异构酶Ea)、TP53、TPM1、TPM2、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TREM1、TREM2、TRPC6、TSLP、TWEAK、VEGF、VEGFB、VEGFC、多功能蛋白聚糖、VHL C5、VLA-4、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、XCL2(SCM-1b)、XCRI(GPR5/CCXCRI)、YY1和ZFPM2。
本文提供的抗体的优选的靶分子包括CD蛋白质，如CD3、CD4、CDS、CD16、CD19、CD20、CD34、CD64、CD200；ErbB受体家族成员，如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞黏附分子，如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整联蛋白和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子，如VEGF-A、VEGF-C；组织因子(TF)；α干扰素(αIFN)；TNFα；白介素，如IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-S、IL-9、IL-13、IL17AF、IL-1S、IL-13Rα1、IL13Rα2、IL-4R、IL-5R、IL-9R、IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；RANKL；RANK；RSV F蛋白；蛋白C等。
在一个实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白结合低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-1或LRP-8或转铁蛋白受体及选自以下的至少一个靶标：1)β-分泌酶(BACE1或BACE2)；2)α-分泌酶；3)γ-分泌酶；4)τ-分泌酶；5)淀粉样蛋白前体(APP)；6)死亡受体6(DR6)；7)淀粉样β肽；8)α-突触核蛋白；9)Parkin；10)Huntingtin；11)p75NTR；和12)胱天蛋白酶-6。
在一个实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白结合选自以下的至少两种靶分子：IL-1α和IL-1β、IL-12和IL-1S；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-5和IL-4；IL-13和IL-1β；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MEF；IL-13和TGF-～；IL-13和LHR激动剂；IL-12和TWEAK、IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAMS、IL-13和PED2、IL17A和IL 17F、CD3和CD19、CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD3S和CD13S；CD3S和CD20；CD3S和CD40；CD40和CD20；CD-S和IL-6；CD20和BR3、TNFα和TGF-β、TNFα和IL-1β；TNFα和IL-2、TNFα和IL-3、TNFα和IL-4、TNFα和IL-5、TNFα和IL6、TNFα和IL8、TNFα和IL-9、TNFα和IL-10、TNFα和IL-11、TNFα和IL-12、TNFα和IL-13、TNFα和IL-14、TNFα和IL-15、TNFα和IL-16、TNFα和IL-17、TNFα和IL-18、TNFα和IL-19、TNFα和IL-20、TNFα和IL-23、TNFα和IFNα、TNFα和CD4、TNFα和VEGF、TNFα和MIF、TNFα和ICAM-1、TNFα和PGE4、TNFα和PEG2、TNFα和RANK配体、TNFα和Te38、TNFα和BAFF、TNFα和CD22、TNFα和CTLA-4、TNFα和GP130、TNF a和IL-12p40、VEGF和HER2、VEGF-A和HER2、VEGF-A和PDGF、HER1和HER2、VEGFA和ANG2、VEGF-A和VEGF-C、VEGF-C和VEGF-D、HER2和DR5、VEGF和IL-8、VEGF和MET、VEGFR和MET受体、EGFR和MET、VEGFR和EGFR、HER2和CD64、HER2和CD3、HER2和CD16、HER2和HER3；EGFR(HER1)和HER2、EGFR和HER3、EGFR和HER4、IL-14和IL-13、IL-13和CD40L、IL4和CD40L、TNFR1和IL-1R、TNFR1和IL-6R和TNFR1和IL-18R、EpCAM和CD3、MAPG和CD28、EGFR和CD64、CSPGs和RGM A；CTLA-4和BTN02；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；MAG和RGM A；NgR和RGMA；NogoA和RGM A；OMGp和RGM A；POL-l和CTLA-4；及RGM A和RGM B.
可以用可选地与其他分子缀合的可溶性抗原或其片段作为免疫原来产生抗体。对于跨膜分子，如受体，可以用这些的片段(例如受体的胞外域)作为免疫原。备选地，可以用表达该跨膜分子的细胞作为免疫原。这类细胞可以源自天然来源(例如癌细胞系)或可以是通过重组技术转化为表达该跨膜分子的细胞。用于制备抗体的其他抗原及其形式对本领域技术人员而言将显而易见。
活性测定
可以通过本领域已知的多种测定，针对其物理/化学特性和生物学功能表征本文提供的多特异性抗原结合蛋白。
纯化的多特异性抗原结合蛋白可以通过一系列测定进一步表征，包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)、质谱分析、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。
在某些实施方案中，针对其生物活性，分析本文提供的多特异性抗原结合蛋白。在一些实施方案中，针对其抗原结合活性，测试该多特异性抗原结合蛋白。本领域已知且在本文中可以使用的抗原结合测定非限制性地包括使用诸如Western印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定的技术的任何直接结合测定或竞争结合测定。下文实施例中提供示例性抗原结合测定。
在一个实施方案中，本文提供具有一些但不是全部效应子功能的改变的多特异性抗原结合蛋白，这使得其成为其中多特异性抗原结合蛋白的体内半衰期很重要但某些效应子功能(如补体和ADCC)不必要或有害的许多应用所希望得到的候选者。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白显示降低的FcγR结合活性。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白在Fc区中包含选自K322A、L234A和L235A(EU编号)的至少一个、至少两个或三个突变。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白是在Fc区中包含N297A取代突变的无糖基化多特异性抗原结合蛋白。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白是在Fc区中包含例如N297G取代突变的无糖基化多特异性抗原结合蛋白。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白在H1和H2的C端赖氨酸处包含缺失(ΔK447)。在某些实施方案中，测量所产生的多特异性抗原结合蛋白的Fc活性以确保仅保留希望得到的特性。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定来确认CDC和/或ADCC活性的降低/减损。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定来确保多特异性抗原结合蛋白缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定的实例描述于美国专利号5,500,362或5,821,337中。用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或此外，可以在体内，例如在诸如公开于Clynes等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中的动物模型的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定来确认多特异性抗原结合蛋白不能结合C1q，并因此缺乏CDC活性。为了评估补体活化，可以进行例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述的CDC测定。还可以用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定。
缀合蛋白质
本文还提供缀合蛋白质，如缀合多特异性抗原结合蛋白或免疫缀合物(例如“抗体-药物缀合物”或“ADC”)，其包含本文所述多特异性抗原结合蛋白中的任一种(例如按照本文所述方法产生的多特异性抗原结合蛋白)，其中轻链或重链的恒定区之一与化学分子(如染料或细胞毒剂，如化疗剂、药物、生长抑制剂)、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的具有酶活性的毒素，或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)缀合。具体而言，如本文所述，异源多聚化结构域的使用使得能够构建包含两条不同重链(HC1和HC2)以及两条不同轻链(LC1和LC2)的抗体。用本文所述方法构建的免疫缀合物可以包含与仅一条重链(HC1或HC2)或仅一条轻链(LC1或LC2)的恒定区缀合的细胞毒剂。此外，由于免疫缀合物可以具有仅附着于一条重链或轻链的细胞毒剂，相对于具有附着于重链和/或轻链的细胞毒剂的多特异性抗原结合蛋白的施用，对个体施用的细胞毒剂的量减少。减少对个体施用的细胞毒剂的量限制了与细胞毒剂相关的不良副作用。
多特异性抗原结合蛋白-药物缀合物在局部递送细胞毒剂或细胞抑制剂(即在癌症治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物(Syrigos和Epenetos,Anticancer Research 19:605-614(1999)；Niculescu-Duvaz和Springer,Adv.Drg.Del.Rev.26:151-172(1997)；美国专利号4,975,278))中的用途允许靶向递送药物部分至肿瘤，并在胞内累积，其中全身施用这些未缀合的药剂可导致对正常细胞以及试图消除的肿瘤细胞的不可接受的毒性水平(Baldwin等,Lancet(Mar.15,1986):603-605(1986)；Monoclonal Antibodies‘84:Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等(编辑),475-506页中的Thorpe,(1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”)。因此力求以最小的毒性达到最大的功效。已报道了多克隆抗体和单克隆抗体都可以用于这些策略(Rowland等,Cancer Immunol.Immunother.21:183-187(1986))。用于这些方法中的药物包括柔红霉素、阿霉素、氨甲喋呤和脱乙酰长春花碱(Rowland等,(1986)上文)。用于抗体-毒素缀合物中的毒素包括细菌毒素，如白喉毒素；植物毒素，如蓖麻毒蛋白；小分子毒素，如格尔德霉素(Mandler等,Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581(2000)；Mandler等,Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028(2000)；Mandler等,Bioconjugate Chem.13:786-791(2002))；美登木素生物碱(EP 1391213；Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996))；和棘孢霉素(Lode等,Cancer Res.58:2928(1998)；Hinman等,Cancer Res.53:3336-3342(1993))。毒素可以通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机制来发挥其细胞毒害和细胞抑制作用。在与大的抗体或蛋白受体配体缀合时，一些细胞毒性药物倾向于无活性或低活性。
本文(例如上文)描述了用于产生免疫缀合物的化疗剂。可以使用的具有酶活性的毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白II A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、香石竹毒蛋白蛋白质、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制剂、多花白树毒蛋白、米托洁林(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。参见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。可获得多种放射性核素用于放射性缀合抗体的产生。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。用多种双功能蛋白质偶联剂产生多特异性抗原结合蛋白和细胞毒剂的缀合物，如3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、亚胺基硫烷(IT)、亚胺酯的双功能衍生物(如己二酰亚氨酸二甲酯HCl)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮基衍生物(如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以按Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14标记的3-甲基二乙烯三胺五乙酸1-异硫氰基苄酯(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见例如WO 94/11026。
本文还考虑多特异性抗原结合蛋白和一种或多种小分子毒素(如棘孢霉素、美登木素生物碱、多拉司他汀(dolastatin)、aurostatin、单端孢霉烯和CC1065)及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的缀合物。
美登素和美登木素生物碱
在一些实施方案中，免疫缀合物包含与一个或多个美登木素生物碱分子缀合的本文提供的多特异性抗原结合蛋白(全长或片段)。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初分离自东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)(美国专利号3,896,111)。随后发现某些微生物也产生美登木素生物碱，如美登木醇和C-3美登木醇酯(美国专利号4,151,042)。例如美国专利号4,137,230、4,248,870、4,256,746、4,260,608、4,265,814、4,294,757、4,307,016、4,308,268、4,308,269、4,309,428、4,313,946、4,315,929、4,317,821、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,364,866、4,424,219、4,450,254、4,362,663和4,371,533中公开了合成的美登木醇及其衍生物和类似物。
美登木素生物碱药物部分是抗体药物缀合物中的吸引药物部分，因为它们：(i)相对易接近，以通过发酵或化学修饰、发酵产物的衍生来制备；(ii)顺从用适于通过非二硫键接头与抗体缀合的功能基团衍生；(iii)在血浆中稳定；和(iv)对多种肿瘤细胞系有效。
包含美登木素生物碱的免疫缀合物、其产生方法及其治疗用途公开于例如美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 81中，其公开内容在此明确引用作为参考。Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)描述了抗人结直肠癌的包含与单克隆抗体C242连接的命名为DM1的美登木素生物碱的免疫缀合物。发现该缀合物对培养的结肠癌细胞具有高毒性，且在体内肿瘤生长测定中显示抗肿瘤活性。Chari等,CancerResearch 52:127-131(1992)描述了这样的免疫缀合物，其中美登木素生物碱通过二硫键接头与结合人结肠癌细胞系上的抗原的鼠抗体A7缀合，或与结合HER-2/neu癌基因的另一鼠单克隆抗体TA.1缀合。在体外测试了TA.1-美登木素生物碱缀合物对人乳腺癌细胞系SK-BR-3的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3×105个HER-2表面抗原。该药物缀合物达到了与游离美登木素生物碱药物相似的细胞毒性程度，其可以通过增加每个抗体分子的美登木素生物碱分子数来提高。A7-美登木素生物碱缀合物在小鼠中显示低的全身细胞毒性。
通过将多特异性抗原结合蛋白与美登木素生物碱化学连接而不显著减少多特异性抗原结合蛋白或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备多特异性抗原结合蛋白-美登木素生物碱缀合物。参见例如美国专利号5,208,020(其公开内容在此明确引用作为参考)。虽然预期甚至毒素/抗体的一个分子也具有超过使用裸抗体的增强的细胞毒性，但每个抗体分子平均缀合3-4个美登木素生物碱分子显示了增强靶细胞的细胞毒性的功效，而不负面影响抗体的功能或可溶性。美登木素生物碱为本领域公知，且可以通过已知的技术合成或从天然来源分离。适宜的美登木素生物碱公开于例如美国专利号5,208,020中及上文提到的其他专利和非专利出版物中。优选的美登木素生物碱是美登木醇和在美登木醇的芳香环中修饰或在其他位置修饰的美登木醇类似物，如多种美登木醇酯。
存在本领域已知的用于产生多特异性抗原结合蛋白-美登木素生物碱缀合物的许多连接基团，包括例如公开于美国专利号5,208,020或EP专利0 425 235B1、Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992)和美国专利申请公开号2005/0169933中的那些，其公开内容在此明确引用作为参考。可以按照美国专利申请公开号2005/0169933所公开制备包含接头成分SMCC的抗体-美登木素生物碱缀合物。连接基团包括上述专利中公开的二硫基、硫醚基、酸敏感基团、光敏感基团、肽酶敏感基团或酯酶敏感基团，优选二硫基和硫醚基。本文描述和示例了其他连接基团。
可以用多种双功能蛋白质偶联剂产生多特异性抗原结合蛋白和美登木素生物碱的缀合物，如3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚胺基硫烷(IT)、亚胺酯的双功能衍生物(如己二酰亚氨酸二甲酯HCl)、活性酯(如如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮基衍生物(如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。尤其优选的偶联剂包括提供二硫键连接的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)(Carlsson等,Biochem.J.173:723-737(1978))和4-(2-吡啶硫)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(“SPP”)。
取决于连接类型，接头可以在多种位置附着于美登木素生物碱分子。例如，可以通过用常规偶联技术与羟基反应形成酯键。反应可以发生在具有羟基的C-3位、羟甲基修饰的C-14位、羟基修饰的C-15位和具有羟基的C-20位。在优选实施方案中，在美登木醇或美登木醇类似物的C-3位形成键。
Auristatin和多拉司他汀
在一些实施方案中，免疫缀合物包含与多拉司他汀或多拉司他汀肽类似物和衍生物auristatin缀合的本文提供的多特异性抗原结合蛋白(美国专利号5,635,483和5,780,588)。已显示多拉司他汀和auristatin干扰微管动力学、GTP合成及核分裂和细胞分裂(Woyke等,Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584(2001))，且具有抗肿瘤(美国专利号5,663,149)和抗真菌活性(Pettit等,Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965(1998))。多拉司他汀或auristatin药物部分可以通过肽药物部分的N(氨基)端或C(羧基)端附着于多特异性抗原结合蛋白(WO 02/088172)。
示例性auristatin实施方案包括公开于“Monomethylvaline Compounds Capableof Conjugation to Ligands,”美国申请公开号2005/0238649中的N端连接的单甲基auristatin药物部分DE和DF，该专利的公开内容在此明确引用作为参考。
通常，可以通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备肽基药物部分。可以例如按照肽化学领域公知的液相合成法(参见E.Schroder和K.Lubke,“ThePeptides,”第1卷,76-136页,1965,Academic Press)制备这类肽键。可以按照以下的方法制备auristatin/多拉司他汀药物部分：美国专利号5,635,483和5,780,588；Pettit等,J.Nat.Prod.44:482-485(1981)；Pettit等,Anti-Cancer Drug Design 13:47-66(1998)；Poncet,Curr.Pharm.Des.5:139-162(1999)；和Pettit,Fortschr.Chem.Org.Naturst.70:1-79(1997)。还参见Doronina,Nat.Biotechnol.21(7):778-784(2003)；和“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands,”美国申请公开号2005/0238649，在此以其整体引入作为参考(公开例如接头和制备与接头缀合的诸如MMAE和MMAF的单甲基缬氨酸化合物的方法)。
棘孢霉素
在其他实施方案中，免疫缀合物包含与一个或多个棘孢霉素分子缀合的本文提供的多特异性抗原结合蛋白。棘孢霉素家族的抗生素能够以低于皮摩尔的浓度产生双链DNA断裂。棘孢霉素家族缀合物的制备参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296(全都属于American CyanamidCompany)。可以使用的棘孢霉素结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman等,Cancer Research 53:3336-3342(1993)；Lode等,Cancer Research 58:2925-2928(1998)；和前述属于American Cyanamid的美国专利)。多特异性抗原结合蛋白可以缀合的另一抗肿瘤药物是QFA，其是抗叶酸剂。棘孢霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易跨过质膜。因此，细胞通过抗体介导的内化摄取这些药剂大幅增强了的它们的细胞毒效应。
其他细胞毒剂
可以与本文提供的多特异性抗原结合蛋白缀合的其他抗肿瘤剂包括BCNU、链脲菌素、长春花新碱和5-氟尿嘧啶，美国专利号5,053,394和5,770,710中所述的统称为LL-E33288复合体的活性剂家族，以及埃斯波霉素(esperamicin)(美国专利号5,877,296)。
可以使用的具有酶活性的毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、内毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白II A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白质、香石竹毒蛋白蛋白质、美洲商陆蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制剂、多花白树毒蛋白、米托洁林、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯(参见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232)。
还提供本文所述多特异性抗原结合蛋白和具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫缀合物。
为了选择性破坏肿瘤，多特异性抗原结合蛋白可以包含高放射性原子。可获得多种放射性同位素来产生放射性缀合抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁照相研究的放射性同位素，例如tc99m或I123，或者用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记物，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
放射性标记或其他标记可以按已知的方式掺入缀合物。例如，使用涉及例如氟-19取代氢的适宜氨基酸前体，可以生物合成或可以通过化学氨基酸合成来合成肽。可以通过肽中的半胱氨酸残基附着诸如tc99m或I123、Re186、Re188和In111的标记。可以通过赖氨酸残基附着钇-90。可以用IODOGEN法(Fraker等,Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57(1978))来掺入碘-123。“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”(Chatal,CRC Press1989)详细描述了其他方法。
可以用多种双功能蛋白质偶联剂产生多特异性抗原结合蛋白和细胞毒剂的缀合物，如3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚胺基硫烷(IT)、亚胺酯的双功能衍生物(如己二酰亚氨酸二甲酯HCl)、活性酯(如如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮基衍生物(如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以按照Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14标记的3-甲基二乙烯三胺五乙酸1-异硫氰基苄酯(MX-DTPA)是用于将放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂。参见例如WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可以使用酸敏感接头、肽酶敏感接头、光敏感接头、二甲基接头或包含二硫化物的接头(Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
这类化合物包括但不限于用交联剂制备的ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB；以及市售可得(例如从Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,美国)的SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸盐)。参见2003-2004应用手册和目录的467-498页。
缀合多特异性抗原结合蛋白的制备
在某些实施方案中，可选地通过接头将本文提供的多特异性抗原结合蛋白与一个或多个部分(例如药物部分)缀合，例如每个多特异性抗原结合蛋白约1至约20个部分。可以利用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂，通过几种途径制备缀合抗体，其包括：(1)多特异性抗原结合蛋白的亲核基团通过共价键与二价接头试剂反应，然后与目的部分反应；和(2)部分的亲核基团通过共价键与二价接头试剂反应，然后与多特异性抗原结合蛋白的亲核基团反应。本文描述了用于制备缀合抗体的其他方法。
接头试剂可以由一个或多个接头成分组成。示例性接头成分包括6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、4-(2-吡啶硫)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(“SPP”)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸N-琥珀酰亚胺酯(“SMCC”)和(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(“SIAB”)。其他接头成分为本领域已知，且本文描述了其中一些。还参见“Monomethylvaline Compounds Capable ofConjugation to Ligands,”美国申请公开号2005/0238649，其内容在此以其整体引入作为参考。
在一些实施方案中，接头可以包含氨基酸残基。示例性氨基酸接头成分包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸接头成分的氨基酸残基包括天然存在的那些，以及稀有氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。可以就它们对特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶)的酶切割的选择性来设计和优化氨基酸接头成分。
抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖氨酸；(iii)侧链巯基，例如半胱氨酸；和(iv)多特异性抗原结合蛋白糖基化时的糖羟基或氨基。胺基、巯基和羟基是亲核的，且能够与包括以下的接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应形成共价键：(i)活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤甲酸酯和酰基卤；(ii)烷基卤和苄基卤，如卤乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可以通过用诸如OTT(二硫苏糖醇)的还原剂处理来使抗体具有与接头试剂缀合的反应性。因此，每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性巯基亲核体。可以通过赖氨酸与2-亚胺基硫烷(Traut试剂)反应导致胺基转化为巯基来向抗体中引入附加的亲核基团。可以通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基来向多特异性抗原结合蛋白(或其片段)中引入反应性巯基(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸残基的突变体抗体)。
还可以通过修饰多特异性抗原结合蛋白引入亲电子部分来产生缀合多特异性抗原结合蛋白，该亲电子部分可以与接头试剂或药物或其他部分上的亲核取代基反应。可以例如用高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖来形成醛基或酮基，该醛基或酮基可以与接头试剂或药物或其他部分的胺基反应。产生的亚胺希夫碱基团可以形成稳定连接，或者可以例如通过氢硼化物试剂还原来形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化多特异性抗原结合蛋白的糖类部分与半乳糖(glactose)氧化酶或偏过碘酸钠的反应可以在蛋白质中产生羰基(醛和酮)，其可以与药物或其他部分上适当的基团反应(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一实施方案中，包含N端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可以与偏过碘酸钠反应，导致在第一氨基酸处产生醛(Geoghegan和Stroh,BioconjugateChem.3:138-146(1992)；美国专利号5,362,852)。这种醛可以与药物部分或接头亲核体反应。
同样，部分(如药物部分)上的亲核基团包括但不限于：能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应形成共价键的胺、巯基、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，该接头试剂包括：(1)活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤甲酸酯和酰基卤；(ii)烷基卤和苄基卤，如卤乙酰胺；和(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基。
备选地，可以例如通过重组技术或肽合成来产生包含多特异性抗原结合蛋白和细胞毒剂的融合蛋白质。DNA的长度可以包含编码缀合物的两个部分的各区域，该区域相互邻近，或通过编码不破坏希望得到的缀合物特性的接头肽的区域分开。还在另一实施方案中，可以将多特异性抗原结合蛋白与“受体”(如链霉抗生物素蛋白)缀合用于肿瘤预寻靶，其中对个体施用多特异性抗原结合蛋白-受体缀合物，然后用清除剂从循环去除未结合的缀合物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如抗生物素蛋白)。
用途
本文提供的本方法可在工业上应用于产生多特异性抗原结合蛋白。本文所述多特异性抗原结合蛋白可用于例如体外、离体和体内治疗方法。本文提供基于使用一种或多种这些分子的多种方法。在某些病理条件下，有必要和/或希望利用多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)。本文提供多特异性抗原结合蛋白，其可用于多种目的，例如作为治疗剂、预防剂和诊断剂。例如，提供治疗疾病的方法，该方法包括需要治疗的个体施用本文提供的多特异性抗原结合蛋白，由此治疗疾病。本文所述的任何多特异性抗原结合蛋白都可以用于本文所述的治疗(或预防或诊断)方法。
例如，本文提供的多特异性抗原结合蛋白的一个有价值的益处是它们对其抗原的亲和力增强。除在结合单元(即Fab)上对抗原基础具有内在高亲和力外，由于它们对靶标的二价结合，正常IgG抗体也利用对增加其与抗原的结合有效的亲和力。
在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白结合两个或多个抗原分子上的表位。在某些实施方案中，多特异性抗原结合蛋白结合同一抗原分子上的两个或多个表位。抗同一抗原分子上的两个分开的表位的多特异性抗原结合蛋白可以不仅提供结合亲和力增强(由于二价结合)的益处，还可以获得与亲本抗体中的任一个相关的新特性。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗原结合蛋白可用于例如阻断受体-配体相互作用。
本文所述多特异性抗原结合蛋白还可用于用一个分子同时阻断两个靶标的信号传导途径的应用。
治疗用途
多特异性抗原结合蛋白(如本文所述抗体和抗体片段)可以用于治疗应用。在某些实施方案中，提供在个体中治疗疾病的方法，其包括对该个体施用有效量的本文所述多特异性抗原结合蛋白。在某些实施方案中，提供本文提供的多特异性抗原结合蛋白在制备用于治疗疾病的药物中的用途。在某些实施方案中，提供多特异性抗原结合蛋白用于在个体中治疗疾病。
例如，这类多特异性抗原结合蛋白可以用于治疗肿瘤，包括癌变前肿瘤、非转移性肿瘤、转移性肿瘤和癌性肿瘤(例如早期癌症)；用于治疗变应性或炎性障碍；或用于治疗自身免疫病；或用于治疗处于发展癌症(例如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肾细胞癌、胶质瘤或卵巢癌)、变应性或炎性障碍、或自身免疫病的风险的个体。
术语癌症涵盖一系列增生性障碍，其包括但不限于癌变前生长、良性肿瘤和恶性肿瘤。良性侵入或转移至远端部位。恶性肿瘤将侵入和损伤其周围的其他组织。它们还可以获得从它们起始的位置突破并扩散至身体其他部分(转移)的能力，通常通过血流或通过淋巴结定位的淋巴系统。原发性肿瘤按它们出现的组织类型分类；转移性肿瘤按衍生癌细胞的组织类型分类。随时间推移，恶性肿瘤的细胞变得更为异常，显得更不像正常细胞。肿瘤细胞形态的这种变化称为肿瘤分级，将肿瘤细胞描述为良好分化、中度分化、低分化或未分化。良好分化的细胞显得非常正常，类似于其来源的正常细胞。未分化的细胞是已变得如此异常，以致不再可能确定细胞来源的细胞。
肿瘤可以是实体瘤或非实体或软组织肿瘤。软组织肿瘤的实例包括白血病(慢性髓性白血病、急性髓细胞白血病、成年型急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、成熟B细胞急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、polymphocytic leukemia或多毛细胞白血病)或淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤或霍奇金病)。实体瘤包括除血液、骨髓或淋巴系统外的身体组织的任意癌症。实体瘤可进一步分为上皮细胞来源的实体瘤和非上皮细胞来源的实体瘤。上皮细胞实体瘤的实例包括胃肠道、结肠、乳腺、前列腺、肺、肾、肝、胰腺、卵巢、头和颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、下唇、鼻咽、皮肤、子宫、雄性生殖器、泌尿器官、膀胱和皮肤的肿瘤。非上皮细胞来源的实体瘤包括肉瘤、脑肿瘤和骨肿瘤。
上皮癌通常从良性肿瘤发展至侵袭前阶段(例如原位癌)、至恶性癌症(其已渗透基膜，侵入上皮下基质)。多特异性抗原结合蛋白复合物也可以用于这些治疗应用，结合HER2的抗体尤其可以用来治疗乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肾细胞癌、胶质瘤或卵巢癌。
作为接受本文提供的组合物的候选者的其他个体患有以下或处于发展以下的风险：维管组织的异常增生、红色痤疮、获得性免疫缺陷综合征、血管闭塞、特应性角膜炎、细菌性溃疡、Bechet病、血液肿瘤、颈动脉阻塞性疾病、脉络膜新生血管形成、慢性炎症、慢性视网膜脱离、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃体炎、contact lens overwear、角膜移植片排斥、角膜新生血管形成、角膜移植片新生血管形成、克罗恩氏病、视网膜静脉周围炎(Ealesdisease)、流行性角膜结膜炎、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、高粘滞综合征、Kaposi肉瘤、白血病、脂质变性、Lyme病、边缘性角膜溶解、蚕食性角膜溃疡、除麻风外的分枝杆菌感染、近视、眼部新生血管性疾病、optic pits、遗传性出血性毛细血管扩张症、骨关节炎、Paget病、睫状体扁平部炎、类天疱疮、phylectenulosis、多动脉炎、激光后并发症、原虫感染、弹性假黄色瘤、pterygium keratitis sicca、放射状角膜切开术、视网膜新生血管形成、早产儿视网膜病、晶状体后纤维增生症、肉样瘤、巩膜炎、镰状细胞贫血、Sogren综合征、实体瘤、Stargart病、Steven’s Johnson病、上缘角膜炎、梅毒、全身性红斑狼疮、Terrien边缘变性、弓形虫病、尤因肉瘤的肿瘤、神经母细胞瘤的肿瘤、骨肉瘤的肿瘤、视网膜母细胞瘤的肿瘤、横纹肌肉瘤的肿瘤、溃疡性结肠炎、视网膜静脉分枝阻塞、维生素A缺乏病、Wegener结节病、不希望的糖尿病相关血管发生、寄生虫病、异常伤口愈合、手术、损伤或创伤后肥大(例如急性肺损伤/ARDS)、毛发生长的抑制、排卵和黄体形成的抑制、植入抑制和子宫中胚胎发育的抑制。
可以用按照本文所述方法产生的多特异性抗原结合蛋白治疗的变应性或炎性障碍或自身免疫病或障碍包括但不限于：关节炎(类风湿性关节炎，如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎症性关节炎、变性关节炎、感染性关节炎、Lyme关节炎、增生性关节炎、银屑病关节炎、椎骨关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、arthritis chronica progrediente、变形性关节炎、慢性原发性多关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎)；炎性过度增殖性皮肤病；银屑病，如斑块状银屑病、点滴状银屑病、脓疱性银屑病和指甲银屑病；皮炎，包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎和特应性皮炎；X连锁高IgM综合征；荨麻疹，如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹；多肌炎/皮肌炎；青少年型皮肌炎；中毒性表皮坏死溶解症；硬皮病(包括全身性硬皮病)；硬化症，如全身性硬化病、多发性硬化症(MS)(如spina-optical MS、原发性进行性MS(PPMS)和复发-好转型MS(RRMS))、进行性全身性硬化症、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化和共济失调性硬化；炎性肠病(IBD)(例如克罗恩氏病、自身免疫介导的胃肠疾病、结肠炎(如溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，colitis ulcerosa)、微小性结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎)和自身免疫性炎性肠病)；坏疽性脓皮病；结节性红斑；原发性硬化性胆管炎；巩膜外层炎；呼吸窘迫综合征，包括成人型或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；脑膜炎；全部或部分血管膜的炎症；虹膜炎；脉络膜炎；自身免疫性血液障碍；类风湿性脊椎炎；突发性耳聋；IgE介导的疾病，如过敏症及变应性和特发性鼻炎；脑炎，如Rasmussen脑炎及边缘性脑炎和/或脑干脑炎；葡萄膜炎，如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎；伴随和不伴随肾病综合征的肾小球肾炎(GN)，如慢性或急性肾小球肾炎，如原发性GN、免疫性GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜性增生性GN(MPGN)(包括I型和II型)和急进性GN；变应性病症；变应性反应；湿疹，包括变应性或特应性湿疹；哮喘，如支气管哮喘(asthma bronchiale，bronchial asthma)和自身免疫性哮喘；涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病症；慢性肺炎性疾病；自身免疫性心肌炎；白细胞黏附性缺陷；全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus(SLE)或systemic lupus erythematodes)，如皮肤SLE、亚急性皮肤红斑狼疮、新生儿狼疮综合征(NLE)、播散性红斑狼疮、狼疮(包括肾炎、大脑炎、儿科、非肾、肾外、盘状、脱发)；幼年型(I型)糖尿病，包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)；成年型糖尿病(II型糖尿病)；自身免疫性糖尿病；特发性尿崩症；与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答；结核病；结节病；肉芽肿病，包括淋巴瘤样肉芽肿病、Wegener肉芽肿病；粒细胞缺乏症；血管病，包括血管炎(包括大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安)动脉炎)、中血管血管炎(包括Kawasaki病和结节性多动脉炎)、微小性多动脉炎、CNS血管炎、坏死性、皮肤性或过敏性血管炎、系统性坏死性血管炎和ANCA相关血管炎，如Churg-Strauss血管炎或综合征(CSS)、颞动脉炎；再生障碍性贫血、自身免疫性再生障碍性贫血、Coombs阳性贫血、Diamond Blackfan贫血、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血(pernicious anemia，anemiaperniciosa)、Addison病、纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA)、VIII因子缺乏、血友病A、自身免疫性中性白细胞减少、全血细胞减少、白细胞减少、涉及白细胞渗出的疾病；CNS炎性障碍；多器官损伤综合征，如败血症、创伤或出血继发的那些；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基膜病；抗磷脂抗体综合征；变应性神经炎；Bechet或Behcet病；Castleman综合征；Goodpasture综合征；Reynaud综合征；Sjogren综合征；Stevens-Johnson综合征；类天疱疮，如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮；天疱疮(包括寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、pemphigus mucus-membrane pemphigoid和红斑性天疱疮)；自身免疫性多内分泌病；Reiter病或综合征；免疫复合物性肾炎；抗体介导的肾炎；视神经脊髓炎；多神经病；慢性神经病，如IgM多神经病或IgM介导的神经病；血小板减少症(例如心肌梗塞患者所发展)，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自身免疫性或免疫介导性血小板减少症，如特发性血小板减少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP；睾丸和卵巢的自身免疫病，包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎；原发性甲状腺功能减退、甲状旁腺功能减退；自身免疫性内分泌疾病，包括甲状腺炎(如自身免疫性甲状腺炎、桥本病、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎)、自身免疫性甲状腺病、特发性甲状腺功能减退、Grave病；多腺体综合征，如自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)；瘤外综合征，包括神经系瘤外综合征，如Lambert-Eaton肌无力综合征或Eaton-Lambert综合征、僵人综合征(stiff-man syndrome或stiff-person syndrome)；脑脊髓炎，如变应性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis或encephalomyelitis allergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)；重症肌无力，如胸腺瘤相关重症肌无力、小脑变性、神经性肌强直、视性眼阵挛综合征或视性眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)；感觉神经病；多灶性运动神经病；Sheehan综合征；自身免疫性肝炎；慢性肝炎；狼疮样肝炎；巨细胞肝炎；慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎；淋巴性间质性肺炎；闭塞性细支气管炎(非移植)对NSIP；Guillain-Barre综合征；Berger病(IgA肾病)；特发性IgA肾病；线性IgA皮肤病；原发性胆汁性肝硬变；肺硬变；自身免疫性肠病综合征；乳糜泻；腹腔病；口炎性腹泻(麸质肠病)；顽固性腹泻；特发性腹泻；冷球蛋白血症；肌萎缩性侧索硬化症(ALS；Lou Gehrig病)；冠状动脉疾病；自身免疫性耳病，如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听力丧失；视性眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)；多软骨炎，如顽固性或复发性多软骨炎；肺泡蛋白沉着症；淀粉样变性；巩膜炎；非癌性淋巴细胞增多；原发性淋巴细胞增多，其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如良性单克隆丙种球蛋白病和意义未定性单克隆丙种球蛋白病(MGUS))；周围神经病；瘤外综合征；通道病，如癫痫、偏头痛、心律失常、肌肉障碍、聋、盲、周期性麻痹和CNS的通道病；孤独症；炎性肌病；局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)；内分泌性眼病；葡萄膜视网膜炎；脉络膜视网膜炎；自身免疫性肝障碍；纤维肌痛；多内分泌衰竭；Schmidt综合征；肾上腺炎；胃萎缩；早老性痴呆；脱髓鞘病，如自身免疫性脱髓鞘病；糖尿病性肾病；Dressier综合征；斑秃；CREST综合征(钙质沉着、雷诺现象、食道运动功能障碍、指端硬化和毛细血管扩张)；雄性和雌性自身免疫性不育；混合性结缔组织病；Chagas病；风湿热；习惯性流产；农民肺；多形性红斑；心脏切开术后综合征；Cushing综合征；养鸟者肺；变应性肉芽肿性血管炎；良性淋巴细胞性脉管炎；Alport综合征；肺泡炎，如变应性肺泡炎和致纤维性肺泡炎；间质性肺病；输血反应；麻风；疟疾；利什曼病；kypanosomiasis；血吸虫病；蛔虫病；曲霉病；Sampter综合征；Caplan综合征；登革热；心内膜炎；心内膜心肌纤维化；弥漫性肺间质纤维化；间质性肺纤维化；特发性肺纤维化；囊性纤维化；眼内炎；持久性隆起性红斑；胎儿有核红细胞增多症；嗜酸性筋膜炎；Shulman综合征；Felty综合征；flariasis；睫状体炎，如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎或Fuch睫状体炎；Henoch-Schonlein紫癜；人免疫缺陷病毒(HIV)感染；艾柯病毒感染；心肌病；阿尔茨海默病；细小病毒感染；风疹病毒感染；接种后综合征；先天性风疹感染；EB病毒感染；流行性腮腺炎；Evan综合征；自身免疫性生殖腺衰竭；Sydenham舞蹈病；链球菌感染后肾炎；thromboangitis ubiterans；甲状腺毒症；脊髓痨；脉络膜炎；巨细胞多肌痛；内分泌性眼病；慢性过敏性肺炎；干燥性角膜结膜炎；流行性角膜结膜炎；特发性肾炎综合征；微小病变性肾病；良性家族性和缺血-再灌注性损伤；视网膜自身免疫；关节炎症；支气管炎；慢性梗阻性气道疾病；硅肺病；口疮；口疮性口炎；动脉硬化性障碍；无精子发生；自身免疫性溶血；Boeck病；冷球蛋白血症；Dupuytren挛缩；晶状体过敏性眼内炎；过敏性肠炎；麻风结节性红斑；特发性面神经麻痹；慢性疲劳综合征；风湿性发热；Hamman-Rich病；感觉神经性听力丧失；hemoglobinuria paroxistica；性腺功能减退；区域性回肠炎；白细胞减少；传染性单核细胞增多症；贯性脊髓炎；原发性特发性黏液水肿；肾病；ophthalmia simpatica；肉芽肿性睾丸炎；胰腺炎；急性多神经根炎；坏疽性脓皮病；Quervain甲状腺炎；acquiredspenic atrophy；抗精子抗体引起的不育；非恶性胸腺瘤；白癜风；SCID和EB病毒相关疾病；获得性免疫缺陷综合征(AIDS)；寄生虫病，如利什曼原虫；中毒性休克综合征；食物中毒；涉及T细胞侵润的病症；白细胞粘附缺陷；与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答；涉及淋巴白细胞渗出的疾病；多器官损伤综合征；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基膜病；变应性神经炎；自身免疫性多内分泌病；卵巢炎；原发性黏液水肿；自身免疫性萎缩性胃炎；交感性眼炎；风湿性疾病；混合性结缔组织病；肾病综合征；胰岛炎；多内分泌腺衰竭；周围神经病；I型自身免疫性多腺体综合征；成人型特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)；全秃；扩张型心肌病；获得性大疱性表皮松解症(EBA)；血色素沉着病；心肌炎；肾病综合征；原发性硬化性胆管炎；化脓性或非化脓性鼻窦炎；急性或慢性鼻窦炎；筛窦、额窦、上颌窦或蝶窦炎；嗜酸性粒细胞相关障碍，如嗜酸粒细胞增多、肺嗜酸细胞增多性浸润、嗜酸细胞增多-肌痛综合征、Loffler综合征、慢性嗜酸细胞性肺炎、热带性肺嗜酸细胞浸润症；支气管肺曲霉病；曲霉肿或包含嗜酸性细胞的肉芽肿；过敏反应；血清阴性脊椎关节炎；多内分泌自身免疫病；硬化性胆管炎；巩膜、巩膜外层慢性黏膜皮肤念珠菌病；Bruton综合征；婴儿一过性低丙种球蛋白血症；Wiskott-Aidrich综合征；共济失调性毛细血管扩张症；与胶原性疾病、风湿病、神经病、缺血性再灌注障碍、血压应答减少、血管功能障碍、antgiectasis、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血和伴血管形成疾病相关的自身免疫性障碍；变应性过敏性障碍；肾小球肾炎；再灌注损伤；心肌或其他组织的再灌注损伤；具有基性岩性成分的皮肤病；急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性障碍；眼和眼眶炎性障碍；粒细胞输注相关综合征；细胞因子诱导的毒性作用；急性严重验证；慢性顽固性炎症；肾盂炎；肺硬变；糖尿病性视网膜病；糖尿病性大动脉障碍；动脉内增生；消化性溃疡；心瓣炎；子宫内膜异位症。
除治疗用途外，本文提供的多特异性抗原结合蛋白还可以用于其他目的，包括诊断方法，如用于本文所述疾病和病症的诊断方法。
剂量、制剂和持续时间
将以符合良好医疗实践的方式配制、制剂和施用本文提供的蛋白质。在此背景中考虑的因素包括所治疗的具体障碍、所治疗的具体哺乳动物、个体的临床病症、障碍的原因、活性剂的递送部位、施用方法、施用时间安排及医疗从业者已知的其他因素。待施用的蛋白质的“治疗有效量”将由这类考虑决定，且是预防、缓解或治疗特定障碍(例如癌症、变应性或炎性障碍或自身免疫性障碍)必需的最小量。蛋白质无需但可选地与目前用来预防或治疗该障碍的一种或多种活性剂配制在一起。这类其他活性剂的有效量取决于制剂中存在的蛋白质的量、障碍或治疗的类型及上文讨论的其他因素。这些通常以与此前所用的剂量和给药途径相同的剂量和给药途径使用，或者是此前所用剂量的约1％至99％。通常，癌症的缓解或治疗涉及与该癌症相关的一种或多种症状或医疗问题的减轻。药物的治疗有效量可以达到以下之一或以下的组合：减少癌细胞的数目(减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多)；减少或抑制肿瘤大小或肿瘤负荷；抑制(即以某种程度减少和/或阻止)癌细胞侵润进入外周器官；在腺瘤的情况下减少激素分泌；降低血管密度；抑制肿瘤转移；减少或抑制肿瘤生长；和/或以某种程度减轻与癌症相关的一种或多种症状。在一些实施方案中，用蛋白质来在个体中预防癌症或自身免疫性障碍的发生或复发。
在一个实施方案中，本文提供的组合物可以用来增加易感癌症或自身免疫性障碍或诊断为患有癌症或自身免疫障碍的人个体的存活时间。存活时间定义为从首次施用药物至死亡的时间。还可以通过治疗组对对照组的分层危害比(HR)来测量存活时间，HR表示个体在治疗期间死亡的风险。
在某些实施方案中，治疗在用多种抗癌疗法治疗的易感癌症或诊断为患有癌症的人个体组中显著提高应答率。应答率定义为应答治疗的治疗个体的百分比。一方面，与用手术、放疗或化疗单独治疗的组相比，包含使用本文提供的多特异性抗原结合蛋白和手术、放疗或一种或多种化疗剂的联合治疗显著提高了治疗个体组中的应答率，该提高具有小于0.05的卡方p值。美国专利申请公开号20050186208中描述了癌症治疗中的治疗功效的其他测量。
药物组合物和制剂
本文公开的多特异性抗原结合蛋白可以用适宜的载体或赋形剂配制，使得它们适合用于施用。通过将具有希望的纯度的本文公开的多特异性抗原结合蛋白与可选的可药用载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980))混合，以冻干制剂或水溶液的形式获得本文公开的多特异性抗原结合蛋白的适宜制剂。可药用载体、赋形剂或稳定剂在所利用的剂量和浓度下对受体无毒性，且包括缓冲剂，如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；氯苄烷铵；苄索氯铵；苯酚；丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。可适用于本文提供的多特异性抗原结合蛋白的示例性抗体制剂描述于W098/56418中，在此明确引入作为参考。适于皮下施用的冻干制剂描述于W097/04801中。这类冻干制剂可用适宜的稀释剂复溶至高蛋白浓度，复溶制剂可对本文中所要治疗的哺乳动物皮下施用。
本文的制剂还可以包含所治疗的具体适应症所必需的一种以上活性化合物，优选相互无不利影响的具有互补活性的那些。例如，可希望进一步提供抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒剂或化疗剂。这类分子以对预期目的有效的量适宜地组合存在。这类其他活性剂的有效量取决于存在于制剂中的多特异性抗原结合蛋白的量、疾病或障碍或治疗的类型、及上文讨论的其他因素。这些活性剂通常以与本文所述相同的剂量和给药途径使用，或者是此前所用剂量的1％至99％。活性成分可以包载在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如，分别为羟甲基纤维素微囊或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊(nanocapsule))中或粗滴乳状液中。这类技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。可以制备缓释制剂。缓释制剂的适宜实例包括含有拮抗剂的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形物品的形式，例如膜或微囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
可以用Lipofectin或脂质体来将本文公开的多特异性抗原结合蛋白或本文提供的组合物递送入细胞。
可选地，但优选地，制剂优选按大约生理浓度包含可药用盐，优选氯化钠。可选地，制剂可以包含可药用防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂浓度在从0.1％至2.0％的范围内，通常为v/v。适宜的防腐剂包括制药领域已知的那些。优选的防腐剂是苄醇、苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。优选地，制剂可以按0.005％至0.02％的浓度包含可药用表面活性剂。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适宜实例包括含有多特异性抗原结合蛋白的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形物品的形式，例如膜或微囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物使得能够在超过100天内释放分子，但某些水凝胶在更短时期内释放蛋白质。在装入胶囊的多特异性抗原结合蛋白长时间保持在体内时，它们可由于在37℃暴露于湿气而变性或聚集，导致生物学活性丧失和可能的免疫原性改变。取决于所涉及的机制，可以设计合理的策略来稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过硫-二硫键交换形成分子间S-S键，则可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制含水量、使用适当的添加剂和开发专用聚合物基质组合物来达到。
本文所述的蛋白质(例如本文提供的多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体))按已知方法对人个体施用，如作为推注或通过在一定时期内连续输注静脉内施用，通过肌内、腹腔内、脑脊液内、皮下、关节内、化膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。如果广泛的副作用或毒性与对该蛋白质所识别的靶分子的拮抗作用相关，则可以尤其希望进行局部施用。还可以将离体策略用于治疗性应用。离体策略涉及用编码本文提供的蛋白质的多核苷酸转染或转导从个体获得的细胞。然后将转染或转导的细胞回注至个体。细胞可以是多种类型中的任一种，其非限制性地包括造血细胞(例如骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞或肌细胞。
在一个实例中，在障碍或肿瘤的位置允许时，可以例如通过直接注射局部施用多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)，注射可以定期重复。蛋白质复合物还可以全身递送至个体或直接递送至肿瘤细胞，例如手术切除肿瘤后递送至肿瘤或瘤床，以阻止或减少局部复发或转移。
诊断和成像
本文提供的多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)可以用于用本领域技术人员已知的经典免疫组织化学方法测定生物样品中的蛋白质水平(例如参见Jalkanen等,J.Cell.Biol.101:976-985(1985)；Jalkanen等,J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987))。其他用于检测蛋白质基因表达的基于抗体的方法包括免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)可适用于本文提供的多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)。适宜的测定标记为本领域已知，包括酶标记，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn、113mIn、112In、111In)、锝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru；鲁米诺；荧光标记，如荧光素和罗丹明；及生物素。
本领域已知的技术可适用于本文提供的多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)。这类技术包括但不限于使用双功能缀合剂(参见例如美国专利号5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；和5,808,003)。还可以例如使用适用于本文提供的多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)的基于抗体的测定(还参见例如1990年6月12日授权的美国专利号4,933,294；1991年4月18日公开的W091/05264；1995年3月28日授权的美国专利5,401,638；及Sias等,J.Immunol.Methods 132:73-80(1990))，通过测量生物流体中的一种或多种脱落抗原来研究一种或多种目的抗原的过量表达。除上述测定外，熟练的从业者可用多种体内和离体测定。例如，可使哺乳动物体内的细胞暴露于可选地用可检测标记(例如放射性同位素)标记的本文提供的多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)，可以例如通过外部扫描放射性或通过分析从之前暴露于多特异性抗原结合蛋白的哺乳动物采集的样品(例如活检组织或其他生物样品)来评价多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)与一种或多种目的抗原的结合。
制成品
还提供包含本文所述的一种或多种多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)和用于治疗或诊断障碍(例如自身免疫病或癌症)的材料的制成品。在某些实施方案中，制成品包含容器及容器上或伴随容器的标签或包装说明书。适宜的容器包括例如瓶、小管、注射器等。容器可以形成自多种材料，如玻璃或塑料。容器容纳对治疗病症有效的组合物，且可以具有无菌接口(例如容器可以是具有可通过皮下注射针头穿孔的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂是本文提供的多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗特定病症。标签或包装说明书将进一步包含对个体施用多特异性抗原结合蛋白组合物的说明。还考虑包含本文所述组合治疗的制成品和试剂盒。
“包装说明书”指通常包含在治疗性产品的商业包装中的说明书，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症的信息和/或有关这类治疗性产品的用途的警告的信息。在某些实施方案中，包装说明书指示组合物用于治疗乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肾细胞癌、胶质瘤或卵巢癌。
此外，制成品可以进一步包含第二容器，该容器包含可药用缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户角度考虑的其他材料，包括其他缓冲液、稀释液、滤器、针头和注射器。
还提供用于多种目的的试剂盒，例如用于从细胞纯化或免疫沉淀两种或多种靶抗原。为了分离和纯化两种或多种靶抗原，试剂盒可以包含与小球(例如琼脂糖小球)偶联的多特异性抗原结合蛋白(例如EGFR/HER2抗体)。可以提供包含用于例如在ELISA或Western印迹中体外检测和定量抗原的多特异性抗原结合蛋白的试剂盒。与制成品一样，试剂盒包含容器即容器上或伴随容器的标签或包装说明书。容器容纳包含至少一种本文提供的多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)的组合物。可以包含含有例如稀释液和缓冲液或对照抗体的附加容器。标签或包装说明书可以提供组合物的描述，以及对预期的体外或诊断用途的说明。
计算机执行
本文提供用于评价多特异性抗原结合蛋白的计算机可读介质，该多特异性抗原结合蛋白包含：1)包含第一重链序列(H1)和第一轻链序列(L1)的结合第一抗原的第一重链/轻链对，和2)包含第二重链序列(H2)和第二轻链序列(L2)的结合第二抗原的第二重链/轻链对，其中H1和H2都包含重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域(CH1)，L1和L2都包含轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)。
在某些实施方案中，该计算机可读介质包含：包含代表H1、L1、H2和L2中的氨基酸取代的数据的数据集，其中H1的CH1结构域中的至少一个氨基酸取代包含参考SEQ ID NO:1的S183位的氨基酸取代，其中CL结构域在参考SEQ ID NO:2的V133位包含氨基酸取代。在某些实施方案中，该计算机可读介质包含：包含代表H1、L1、H2和L2中的氨基酸取代的数据的数据集，其中H1的CH1结构域中的至少一个氨基酸取代包含参考SEQ ID NO:1的F170或L128和V185位的氨基酸取代，其中CL结构域在参考SEQ ID NO:2的S176或F118和L135位包含氨基酸取代。在某些实施方案中，该计算机可读介质包含：包含代表H1、L1、H2和L2中的氨基酸取代的数据的数据集，其中H1的CH1结构域中的至少一个氨基酸取代包含参考SEQ ID NO:1的S182、F170或L128和V185位的氨基酸取代，其中CL结构域在参考SEQ ID NO:2的V13、S176或F118和L135位包含氨基酸取代。
在某些实施方案中，用于评价多特异性抗原结合蛋白的计算机可读介质包含用于确定与L2相比，H1优先与L1配对和/或与L1相比，H2优先与L2配对的可能性的计算机可执行代码。
在某些实施方案中，计算机包含至少一个与芯片组偶联的处理器。与芯片组偶联的还有内存、存储设备、键盘、图形适配器、定点设备和网络适配器。显示器与图形适配器偶联。在一个实施方案中，芯片组的功能性由内存控制器集线器和I/O控制器集线器提供。在另一实施方案中，内存直接偶联处理器而不是芯片组。
存储设备是能够保持数据的任何设备，如硬盘驱动器、只读光盘存储器(CD-ROM)、DVD或固态存储设备。内存保持处理器所使用的指令和数据。定点设备可以是鼠标、跟踪球或其他类型的定点设备，与键盘组合使用来将数据输入计算机系统。图形适配器在显示器上显示图像和其他信息。网络适配器将计算机系统与局域网或广域网偶联。
如本领域已知，计算机可以具有不同于之前所述的那些的组成部分和/或其他组成部分。此外，计算机可以缺少某些组成部分。此外，存储设备可以是本地存储设备和/或远离计算机(如包含在存储区域网络(SAN)内)。
如本领域已知，使计算机适于执行用于提供本文所述功能性的计算机程序模块。本文所用的术语“模块”指用于提供指定功能性的计算机程序逻辑。因此，模块可以在硬件、固件和/或软件中执行。在一个实施方案中，程序模块存储在存储设备中，载入内存，由处理器执行。
认为前面的书面描述足以使得本领域技术人员能够实施本发明。提供以下实施例仅为了说明的目的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。实际上，对本领域技术人员而言，除本文所显示和描述的那些之外的多种修改将从前面的描述变得显而易见，并落在所附权利要求的范围之内。
实施例
实施例1：用策略#1改造抗体重链/轻链对
Fab组装由VH/VL和CH1/CL结构域相互作用独立地驱动。CL去稳定化突变对抗原结合可以仅具有微小影响；CH1结构域和CL结构域间相互作用的破坏还可干扰哺乳动物细胞中的抗体折叠和分泌(数据未显示)。我们产生了一系列CH1/CL突变对，以指导特异和正确的HC和LC配对和最小化HC/LC错配。如下文进一步详述，检查了CH1/CL突变对指导正确配对的能力。
发现CL结构域中F118、V133或L135处的突变扰乱与CH1的组装(数据未显示)。为了鉴定CH1结构域中恢复与突变的CL结构域组装的氨基酸位置，用PyMol制备了抗体恒定结构域PDB ID 1CZ8。使用基于对重链CH1结构域和轻链CL结构域的结构和功能的详尽知识的人类引导设计，单独或组合测试了CH1结构域的位置L128、G143、L145、S183和V185处的取代。显示在位置S183处具有带电荷氨基酸取代突变的重链在带相反电荷的CL取代突变的背景下改善抗体表达(参见图1A和1B)。图1A和1B显示来自1ml 293T培养物的蛋白A回收(A280吸收单位)。因此，选择S183突变体进行进一步分析。
筛选突变体CH1结构域和突变体CL结构域，以初步鉴定恢复抗体表达的突变对。作为初步筛选，使用标准分子生物学技术，产生具有用带正电荷氨基酸(即K或R)取代其中的F118、V133或L135的CL的抗体轻链，产生具有用带负电荷氨基酸(即E或D)取代其中的S183的CH1的重链，并克隆入哺乳动物表达载体。按之前所述(参见例如Bos等(2014)“Development of a semi-automated high throughput transient transfectionsystem.”Journal of Biotechnology 180,10–16)，使用1mL HEK293T细胞瞬时转染培养物，按等浓度对编码具有S183E或S183D突变的重链CH1结构域和具有F118K、F118R、V133K、V133R、V135K或L135R取代突变的轻链CL结构域的质粒进行共转染。对CH1和CL突变体的每对组合重复此流程。
按照厂家流程通过MabSelectSure(GE Healthcare,USA)从哺乳动物培养物上清纯化人IgG1，通过所纯化的MabSelectSure洗脱物的OD280测量来计算抗体表达。如图2中所示，与V133K和野生型CH1配对相比，在V133K CL突变与S183D CH1突变或S183E CH1突变配对时，抗体表达得到改善。图2的y轴上显示从150μL体积的MabSelectSure纯化洗脱物获得的总抗体产率(μg)。
如图3中提供的X射线晶体结构中所示，轻链恒定结构域(CL)中的V133和重链CH1结构域中的S183位于IgG轻链CL和重链CH1结构域界面的内部。该结构在IgG4中类似。CH1的S183(EU编号，等同于Kabat编号下的S188)在人和小鼠种系间保守，V133存在于人和小鼠κ和λ轻链中。不受限于任何一种理论，V133处的带电荷氨基酸取代和S183处具有相反电荷的氨基酸取代可以产生不存在于未经修饰的CH1/CL界面中的与周围氨基酸残基(如CL结构域中的S176和S178)的新的稳定化相互作用。
进行了其他实验来鉴定显示良好抗体表达水平的其他特异性V133X/S183X突变体对。用上文所述的抗体表达测定鉴定了有利于CH1-CL配对的V133X/S183X突变体对。简言之，按上文所述产生具有CH1S183X取代突变(例如S183A、S183T、S183V、S183Y、S183F、S183H、S183N、S183D、S183E、S183R或S183K)的抗体重链和具有V133X取代突变(例如V133E、V133S、V133L、V133W、V133K、V133R或V133D)的轻链。按上文所述使用30mL HEK293T细胞瞬时转染培养物，按等浓度对表达具有以上突变CH1和CL突变中每一种的重链和轻链的质粒进行共转染。针对V133X/S183X突变体对的每种组合重复此流程。按上文所述测定总抗体产率(μg)。图4中提供各V133X/S183X突变体对的表达结果。简言之，图4显示来自各V133X/S183X突变体对的30ml 293T培养物的纯化蛋白质以毫克计的总产率。从纯化的MabSelectSure洗脱物的OD280测量结果计算抗体蛋白质水平。将证明良好的抗体表达水平的V133X/S183X突变体对(如V133K/S183T、V133K/S183V、V133K/S183Y和V133K/S183F)引入抗Her2/抗CD3双特异性抗体的一条臂。虽然V133K/S183E初步表达结果不高，但也在抗Her2/抗CD3双特异性抗体背景中测试了V133K/S183E。基于以下标准选择抗Her2(4D5)和抗CD3(UCHT1)抗体：a)重链和轻链二者都为抗原结合所需；b)组成抗体表达良好，不倾向于聚集；和c)亲本抗体显示对关连和非关连重链/轻链配对无显著偏好。“4D5”指Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,4285-9中所述的人源化4D5v8。“UCHT1”指Zhu和Carter(1995)J.Immunol.155,1903-10中所述的人源化UCHT1v9。
在此实验中，UCHT1重链在CH3结构域中包含臼突变(T366S、L368A、Y407V)，4D5重链在CH3结构域中包含杵突变(T366W)。表达、纯化了在UCHT1臂中具有V133K/S183E突变的4D5/UCHT1双特异性抗体，并通过四级杆飞行时间(QTOF)质谱分析来定量存在于纯化样品中的各抗体种类的相对丰度。野生型序列的正确重链/轻链配对+错乱重链/轻链配对(即HC1/LC2和HC2/LC1)的无偏、预期量为50％。如下文表14C的第一和第三行中所示，正确重链/轻链配对在UCHT1臂中具有V133K/S183E的4D5/UCHT1抗体变体中得到改善。
表达、纯化了在4D5臂或UCHT1臂中具有V133K/S183T、V133K/S183V、V133K/S183Y、V133K/S183E或V133K/S183F突变对的4D5/UCHT1抗体，并通过四级杆飞行时间(QTOF)质谱分析来定量存在于纯化样品中的各抗体种类的相对丰度。
表达、纯化和分析4D5/UCHT1抗体之前，使用之前所述的方法(参见例如Bos等(2014),上文)，用30ml HEK293T细胞瞬时转染培养物进行了轻链比例优化。编码两种抗体重链的质粒DNA的量在所有转染中保持恒定，而转染的轻链DNA的量在LC1(杵):LC2(臼)DNA比例的一个范围内变动。通过Orbitrap质谱分析瞬时转染培养物的产物，以鉴定轻链表达平衡最佳的条件，即产生最高百分比的正确组装双特异性抗体的条件。
开发了数学公式来根据来自高分辨质谱的三个峰的定量将轻链正确配对(即其中LC-1与HC-1配对、LC-2与HC-2配对的双特异性抗体)的BsIgG的量与2x LC错乱种类(即其中LC-2与HC-1配对、LC-1与HC-2配对的双特异性抗体)区别开。假定杵重链(HC杵)和臼重链(HC臼)的LC配对是完全独立的事件。正确配对的BsIgG的百分比％[BsIgG]可以计算为：
％[BsIgG]＝％[组合BsIgG&2x LC错乱]/2+SQRT((％[组合BsIgG&
2x LC错乱]/2)2-％[2x LC杵]*％[2x LC臼])
如果((％[组合BsIgG&2x LC错乱]/2)2-％[2x LC杵]*％[2x LC臼])为负数，则强制它为零；则：
％[BsIgG]＝％[组合BsIgG&2x错乱]/2
因此，2x LC错乱种类的百分比计算为：
％[2x LC错乱]＝％[组合BsIgG&2x LC错乱]-％[BsIgG]
为了实验确认此数学方法，通过质谱分析了两个纯化双特异性抗体样品。样品1中的组合BsIgG和2x LC错乱级分为51.3％，样品2中的组合BsIgG和2x LC错乱级分为70.6％。使用以上公式，确定了％[BsIgG]、％[2x LC杵]、％[2x LC臼]和％[2x LC错乱]的数值(参见表10)，还从其计算了各Fab种类的分数％[Fab杵]、％[Fab臼]、％[LC杵/HC臼]和％[LC臼/HC杵](参见表11)。两个样品在通过质谱分析前都用Lysyl内肽酶处理。然后将所测量的经消化的Fab种类的分数与那些计算的分数相比较。来自两个样品的密切匹配的测量百分比和计算百分比验证了我们的用于定量正确配对BsIgG种类的数学方法。
表10
Figure BDA0001520322730002191
表11
Figure BDA0001520322730002192
如表12中的示例性结果中所示，与不含V133X/S183X突变的野生型序列相比，％双特异性组装提高。与V133/S183突变体对存在于UCHT1臂中时相比，V133X/S183X突变体对存在于4D5臂中时，双特异性组装的百分比相当。这类结果表明，引入V133X/S183X突变体对的臂不显著影响正确的双特异性抗体组装。
表12
Figure BDA0001520322730002193
用不同的双特异性抗体重复了上述实验。使用不同双特异性抗体的结果也表明引入V133X/S183X突变体对的臂不显著影响双特异性抗体组装。还观察到，在亲本抗体已经显示强优先的重链/轻链配对的情况下，进一步的改善难以达到或检测到。
然后，我们检查了VH和VL非CDR区中的附加突变是否可进一步改善HC和LC配对。构架区中形成氢键的VL-Q38和VH-Q39在大多数种系中高度保守。将带电荷残基引入IL 13抗体的VL-Q38或VH-Q39或引入这两个位置。在抗IL 13抗体中通过细菌表面展示鉴定了有利于VH/VL配对的Q39X突变体、Q38X突变体或Q39X/Q38X突变体对。简言之，在去除卡那霉素抗性的大肠杆菌菌株33D3的Δlpp衍生物(参见例如Simmons等(2002)“Expression of full-length immunoglobulins in Escherichia coli:rapid and efficient production ofaglycosylated antibodies.”Journal of Immunological Methods.263,133–147)中表达突变抗体。单个构架变体作为过夜培养物培养于30℃，等体积组合，并按1:100稀释度接种50mL CRAP培养物。30℃培养24小时后，收获1OD整分试样，并通过离心(4分钟，6500rcf)沉淀。将细胞重悬在100μL含2％BSA和5mM EDTA的PBS中，4℃孵育30分钟。初步孵育后，加入SYTO 41或9核酸染料(Molecular Probes,USA)至最终稀释度为1:100，加入Alexa488或Alexa647标记抗原至终浓度为1-2μM。继续在4℃避光孵育1小时，其间加入MgCl2至10-20mM终浓度。通过用1mL PBS+20mM MgCl2洗涤3次去除未结合的蛋白质。将染色的细胞重悬在SOC培养基(New England Biolabs,USA)中至终浓度为1x107细胞/ml，用于用BectonDickenson FACS AriaII流式细胞仪分析。FACS门控策略包括SYTO染料阳性的细胞。用双联体辨别门控来去除双联体，最终门控设为测定结合抗原的单细胞的百分比。如图5中所示，在具有VL-Q38和VH-Q39取代二者的变体中，VL-Q38K/VH-Q39E突变体对给出最强的FACS信号，高于VL-Q38K/VH-Q39K突变体对(参见图6)。此外，在Q38K VL突变与Q39E VH突变配对时，抗体表达水平等于或好于野生型。参见图7。由于Q38K/Q39K表达弱于Q38K/WT对，这导致我们向两条臂都引入EKKE突变(其中四个字母分别指Q39XHC1/Q38XLC1杵/Q39XHC2/Q38XLC2臼处的氨基酸取代)，以为正确的LC/HC配对获得最佳驱动力。
然后，构建4D5/UCHT1双特异性抗体变体，以在两条重链和两条轻链中都包含Q39X/Q38X突变。表达、纯化修饰的双特异性抗体，并通过高分辨质谱分析。高分辨质谱在EMR Exactive Plus质谱仪上利用Orbitrap技术增强的检测能力。对于定量，用微量离心柱(Spin-6,Bio-Rad)或反相离线HPLC将PBS中的抗体产物缓冲液更换入0.1％三氟乙酸。得到的样品级分直接输注至质谱仪上。以调整模式(Tune mode)优化参数，以确保内电荷态部分的基线分辨。用Protein Deconvolution软件(Thermo,得分阈值50)去卷积质量包裹(massenvelope)。记录得到的去卷积峰的强度，并用来确定“正确”序列、错配、半抗体和同二聚体的％存在。图8中的示例性结果显示具有正确重链-轻链配对的“正确”双特异性抗体变体的％存在。所测试的突变体显示在X轴上。每组突变中的四个字母分别指Q39XHC1/Q38XLC1杵/Q39XHC2/Q38XLC2臼处的氨基酸取代。图8中所示的定量结果在下文表13中提供。在这些实验中，4D5抗体携带杵突变，UCHT1抗体携带臼突变。结果显示，除EKKE外，Q39/Q38处的其他突变也改善正确的重链/轻链配对。
表13
突变 组合BsIgG和LC错乱 2x杵LC 2x臼LC BsIgG LC错乱
EKKE 70.2％ 28.4％ 1.4％ 69.6％ 0.6％
ERKE 66.3％ 28.8％ 4.9％ 64.1％ 2.2％
DKKE 68.0％ 28.9％ 3.1％ 66.7％ 1.3％
DRKE 64.7％ 30.1％ 5.2％ 62.2％ 2.5％
EKRE 74.8％ 22.6％ 2.6％ 74.0％ 0.8％
ERRE 72.2％ 22.3％ 5.5％ 70.5％ 1.7％
DKRE 75.2％ 21.1％ 3.7％ 74.1％ 1.1％
DRRE 74.9％ 20.6％ 4.6％ 73.6％ 1.3％
EKKD 70.2％ 23.9％ 5.9％ 68.1％ 2.1％
ERKD 70.8％ 21.3％ 8.0％ 68.3％ 2.5％
DKKD 65.5％ 26.7％ 7.8％ 62.1％ 3.4％
DRKD 72.2％ 14.2％ 13.5％ 69.4％ 2.8％
EKRD 78.6％ 15.6％ 5.8％ 77.4％ 1.2％
ERRD 73.8％ 18.7％ 7.5％ 71.8％ 2.0％
DKRD 75.0％ 18.4％ 6.7％ 73.3％ 1.7％
DRRD 68.5％ 25.3％ 6.1％ 66.2％ 2.3％
KEEK 56.9％ 39.8％ 3.3％ 54.5％ 2.4％
KEER 64.4％ 31.2％ 4.4％ 62.2％ 2.2％
KEDK 57.8％ 36.4％ 5.7％ 54.0％ 3.8％
KEDR 64.4％ 29.3％ 6.3％ 61.4％ 3.0％
REEK 60.6％ 36.3％ 3.1％ 58.7％ 1.9％
REER 67.2％ 24.1％ 8.6％ 64.0％ 3.2％
REDK 58.6％ 36.8％ 4.5％ 55.6％ 3.0％
REDR 62.4％ 29.8％ 7.8％ 58.4％ 4.0％
KDEK 60.7％ 33.2％ 6.1％ 57.2％ 3.5％
KDER 64.6％ 24.5％ 10.9％ 60.2％ 4.4％
KDDK 61.4％ 30.0％ 8.6％ 56.9％ 4.5％
KDDR 66.5％ 23.9％ 9.6％ 62.8％ 3.7％
RDEK 61.3％ 33.6％ 5.1％ 58.4％ 2.9％
RDER 62.5％ 28.6％ 8.8％ 58.2％ 4.3％
RDDK 62.8％ 30.5％ 6.7％ 59.4％ 3.4％
RDDR 64.8％ 23.2％ 12.0％ 60.2％ 4.6％
将VL-Q38VH-Q39突变引入4D5/UCHT1双特异性抗体。这样修饰4D5/UCHT1双特异性抗体，使得4D5臂包含具有Q39E突变的VH和具有Q38K突变的VL，使得UCHT1臂包含具有Q39K突变的VH和具有Q38E突变的VL(即“EKKE”)。在此实验中，4D5抗体在CH3结构域中包含杵突变，UCHT1抗体在CH3结构域中包含臼突变。在图9中所示的QTOF分析中，与WT双特异性抗体(参见图9A)相比，修饰抗体(参见图9B)中重链-轻链错配显著减少。如下文在表15中提供的示例性结果中进一步显示，Q38/Q39突变改善单细胞中产生的％双特异性IgG。
进一步修饰已经包含VL-Q38E和VH-Q39K突变的双特异性4D5/UCHT1抗体的UCHT1臂，以包含CL-V133K和CH-1-S183E突变。修饰4D5/UCHT1抗体的4D5臂，以包含VL-Q38K和VH-Q39E突变。表达、纯化修饰的双特异性抗体，并通过高分辨质谱分析。高分辨质谱在EMRExactive Plus质谱仪上利用Orbitrap技术增强的检测能力。对于定量，用微量离心柱(Spin-6,Bio-Rad)或反相离线HPLC将PBS中的抗体产物缓冲液更换入0.1％三氟乙酸。得到的样品级分直接输注至质谱仪上。以调整模式优化参数，以确保内电荷态部分的基线分辨。用Protein Deconvolution软件(Thermo,得分阈值50)去卷积质量包裹。记录得到的去卷积峰的强度，并用来确定“正确”序列、错配、半抗体和同二聚体的示例性％存在。如图10A(其显示图10B的放大版)中所示，包含正确配对的重链/轻链臂的抗体种类是样品中的主要群体。(定量结果参见下文表14C的第四行)。用修饰为在UCHT1臂中包含CL-V133K和CH-1-S183E突变而不含EKKE突变的双特异性4D5/UCHT1进行了相同的实验。如图10C(其显示图10D的放大版)中所示，包含2条4D5轻链或2条UCHT1轻链的种类(即错配双特异性抗体)是样品中的主要群体。(定量结果参见下文表14C的第三行)。图10E提供未修饰的WT 4D5/UCHT1抗体的高分辨质谱结果，显示包含2条4D5轻链或2条UCHT1轻链的种类(即错配双特异性抗体)也是此样品中的主要群体。结果显示，双特异性抗体臼臂上的V133X/S183X突变减少重链/轻链错配，EKKE突变的加入进一步改善双特异性组装。
按上文所述产生、表达、纯化了其他双特异性抗体(包括在两条臂中都具有Q39X/Q38X和/或V133X/S183X突变的变体)，并通过高分辨质谱分析，以确定这类双特异性抗体是否显示提高的优先重链/轻链配对。下文表14A和14B中提供高分辨质谱分析的示例性结果：
表14A
Figure BDA0001520322730002231
表14B
Figure BDA0001520322730002232
将Q39X/Q38X引入多种双特异性抗体的杵和/或臼臂，和/或将V133X/S183X突变引入多种双特异性抗体的臼臂。四字母突变分别指Q39XHC1/Q38XLC1杵/Q39XHC2/Q38XLC2臼处的氨基酸取代。代表性结果显示，EKKE和V133X/S183X突变(表14C中用V133K/S183E示例)单独或组合通常在不同抗体中改善双特异性组装。在亲本抗体已经显示强优先重链/轻链配对的实例中，进一步的改善难以达到或检测到。还将V133X/S183X突变引入双特异性抗体的杵臂，并显示相当的结果。
表14C
Figure BDA0001520322730002241
#在抗VEGFA/ANG2样品中，正确组装的双特异性Ab、“2x臼LC”Ab和“2X杵”Ab的分子量非常相似。为了将“正确”群体与“2x臼LC”和“2X杵”群体区分开，提高了Orbitrap分辨率，因此略微降低了灵敏度。100％正确配对因此可能更接近>95％。
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进一步修饰包含Q39EHC1/Q38KLC1杵/Q39KHC2/Q38ELC2臼和V133K/S183E臼突变的抗HER2/CD3抗体，以包含V133E/S183K杵突变。按上文所述表达、纯化抗体，并通过高分辨质谱分析，以确定这类双特异性抗体是否显示提高的优先重链/轻链配对。下文表14D中提供高分辨质谱分析的示例性结果：
表14D
Figure BDA0001520322730002251
表14D中的示例性结果显示，V133E/S183K杵突变与EKKE和V133K/S183E臼突变组合使双特异性组装提高至几乎100％。
在体外细胞毒性测定中将具有EKKE和V133K/S183E臼突变的抗HER2/CD3抗体的活性与未修饰的抗HER2/CD3抗体的活性相比较。简言之，用淋巴细胞分离培养基(MPbiomedicals,Solon,OH)从健康志愿者的血液分离外周血单核细胞(PBMC)。用来自Miltenyi的CD8+Isolation Kit(#130-094-156)通过负选择从PBMC提取CD8+细胞。将1x104PBMC细胞接种在96孔板中，并孵育过夜。加入5x104CD8+ T细胞：(a)含具有EKKE和V133K/S183E臼突变的抗HER2/CD3抗体；(b)不含具有EKKE和V133K/S183E臼突变的抗HER2/CD3抗体；(c)含未修饰的抗HER2/CD3；和(d)不含未修饰的抗HER2/CD3。混合物于37℃孵育48小时。通过用PBS洗涤两次去除T细胞。用
Figure BDA0001520322730002252
Luminescent CellViability Assay(Promega,Madison,WI)测量PBMC的活率。如图23中所示，修饰和未修饰的抗HER2/CD3抗体的活性相当。
进行差示扫描荧光测定(DSF)来测定以下的熔解温度：(a)修饰为包含VL-Q38K和VH-Q39E突变的4D5 Fab；(b)修饰为包含VL-Q38E、CL-V133K、VH-Q39K和CH-1S183E突变的UCHT1 Fab；和(c)修饰为包含VL-Q38E、CL-V133K、VH-Q39K和CH-1S183T突变的UCHT1臂(参见例如Niesen等(2007)Nat Protoc 2,2212–2221)。用最终稀释度1:500的Sypro Orange染料母液(Molecular Probes,USA)在Biorad CFX96Real-Time System(Biorad,USA)中测定蛋白质稳定性。从20℃至100℃记录25μL含Fab样品的PBS的荧光(0.2℃增长量，每步保持10秒)。下文表15中所示的结果证明，本文所述引入可变区和/或恒定区的突变不大幅影响抗体的Tm。
表15
Figure BDA0001520322730002261
根据表15中所示的结果，所测试的变体的热稳定性似乎主要由HC的稳定性驱动。虽然稳定性可以是改善的双特异性配对的解释，但数据意外地显示，显示最佳双特异性配对的变体并非总是与最佳热稳定性相关，例如，与错配Fab相比，正确配对的Fab可以显示更低或相似的热稳定性。不受限于具体机制，备选地或此外，突变可以影响正确对的组装动力学，例如，正确对可以更快地组装，然后在重链和轻链之间形成二硫键。这得到了链比例优化进一步改善双特异性形成的观察结果的进一步支持。
将Q39EHC1/Q38KLC1杵/Q39KHC2/Q38ELC2臼和V133K/S183E臼突变引入人IgG1同种型、人IgG2同种型、人IgG4同种型和小鼠IgG2a同种型的双特异性抗4D5/UCHT1抗体。未观察到人IgG2同种型抗体在体外成功组装。下文表16中的示例性结果显示，在不同同种型的人双特异性抗体中以及在小鼠双特异性抗体中，轻链和重链可变结构域中的突变一般改善双特异性组装。
表16
Figure BDA0001520322730002271
*结果是用优化的LC1：LC2比例获得。
Figure BDA0001520322730002273
所有峰的未表征的与预期相差-110Da的质量差异。
#所有峰的未表征的与预期相差+160Da的质量差异。
测定修饰为包含VL-Q38K、CL-V133E、VH-Q39E和CH1-S183K突变的4D5 Fab的晶体结构至
Figure BDA0001520322730002272
分辨率。与野生型4D5 Fab相比，突变体的总体结构未显示显著差异，表明向全部4个结构域引入的电荷突变不扰乱结构完整性。参见图11A。但是，发现除突变残基VL-Q38K和VH-Q39E之间的盐桥外，VL-Q38K和VH-Q39E都与2个溶剂水分子形成额外的氢键。还发现VL-Q38K分别以氢键与VH-Y95和VL-K39相互作用。广泛的氢键网络稳定了突变的VL和VH之间的配对。参见图11B。在包含CL-V133E和CH1-S183K突变的恒定结构域中，除突变残基CL-V133E和CH1-S183K之间的盐桥外，V133E和CH1-S183K二者都3个溶剂水分子形成额外的氢键。CL-V133E和CH1-S183K还分别以氢键与VL-T178相互作用。非预期的广泛的氢键网络稳定了突变的CL和CH1之间的配对，便于产生正确配对的BsIgG。参见图11C。
测定修饰为包含VL-Q38E、CL-V133K、VH-Q39K和CH1-S183E突变的4D5 Fab的晶体结构至
Figure BDA0001520322730002281
分辨率。与野生型4D5 Fab相比，突变体的总体结构未显示显著差异，表明向全部4个结构域引入的电荷突变不扰乱结构完整性。参见图12A。发现VL-Q38E和VH-Q39K不形成氢键。但是，VL-Q38E与2个溶剂水分子形成氢键。参见图12B。在包含CL-V133K和CH1-S183E突变的恒定结构域中，除突变残基CL-V133K和CH1-S183E之间的盐桥外，CL-V133K和CH1-S183E二者都分别与2个溶剂水分子形成额外的氢键。CL-V133K还与CL-T178形成氢键，CH1-S183E与VL-T76形成氢键。非预期的广泛的氢键网络稳定了突变的CL和CH1之间的配对，其便于产生正确配对的BsIgG。参见图12C。
概括起来，我们发现，在与野生型重链配对时，CL的V133处的突变减少抗体组装。但是，在于VL的V133位的突变配对时，CH1的S183位的氨基酸取代恢复了抗体变体的组装。因此，在单个细胞中表达时，V133X/S183X突变对可以指导特异的LC和HC配对。在双特异性抗体的背景中，VH的Q39位和VL的Q38位的突变单独或与CH1/CL突变组合进一步改善LC和HC配对，从而相应地在单个细胞中表达两种半抗体时改善正确的双特异性形成。按经验确定的优化轻链比例进一步改善双特异性组装。在所测试的所有人和小鼠抗体中，VH的Q39位和VL的Q38位的突变单独或与CH1/CL突变组合进一步改善双特异性组装。非预期地，重链或轻链的可变区和恒定区中的突变单独或组合不大幅影响抗体的热稳定性。
实施例2：用策略#2改造抗体重链/轻链对
此外，用分子模拟程序ROSETTA(Leaver-Fay等(2011)“ROSETTA3:an object-oriented software suite for the simulation and design of macromolecules.”Methods Enzymol.487,545-74)通过计算重新设计了示例性双特异性抗体4D5的CH1-CL界面。ROSETTA程序处于积极开发中并不断更新。简言之，ROSETTA程序从为给定的设计方法指定的用户输入文库产生随机序列。进行了下文详述的两种设计方法：
在第一种设计方法(即方法A，参见图13A)中，将CL结构域的S176氨基酸残基限制为F、Y或W中的任一个；将CH1结构域的F170氨基酸残基限制为A、G、I、L、S、T或V中的任一个。为了保持但优化残基同一性，将CL结构域的F118氨基酸残基限制为F、Y或W中的任一个；将CH1结构域的F126氨基酸残基限制为F、Y或W中的任一个；将CH1的S183氨基酸残基限制为A、G、I、L、S、T或V中的任一个。将CL结构域的F116、V133、L135、S174氨基酸残基和CH1结构域的L128、G143、L145、S181氨基酸残基限制为非极性氨基酸。允许将诸如CL结构域的S131、S162、T164、T178和CH1结构域的A141、V185的其他残基重新设计为除半胱氨酸外的任意氨基酸。
在第二种设计方法(即方法B，参见图13B)中，将CL结构域的L135氨基酸残基和CH1结构域的L128氨基酸残基限制为F、Y或W中的任一个；将CL结构域的F118氨基酸残基和CH1结构域的L145氨基酸残基限制为A、I、L、S、T或V中的任一个。还将CH1结构域的S181氨基酸残基限制为A、I、L、S、T或V中的任一个。此外，将CL结构域的F116氨基酸残基限制为A、F、I、L、M、S、T、V或Y的任一个；将CL结构域的V133氨基酸残基限制为A、F、I、L、S、T、V、W或Y的任一个；将CH1结构域的V185氨基酸残基限制为非极性氨基酸。允许将CL结构域的S131、S162、T164、S176和T178氨基酸残基和CH1结构域的A141和F170氨基酸残基重新设计为除半胱氨酸外的任意氨基酸。
ROSETTA为所模拟的结构计算多重结合能得分，包括重新设计的CH1和重新设计的CL结构域(H’L’)、野生型CH1和重新设计的CL结构域(HL’)、以及重新设计的CH1和野生型CL结构域(H’L)。然后将对比得分计算为H’L’与HL’和H’L间更稳定的配对之间的能量差。然后使每个设计的序列经过确定的过滤，以弃除具有不利的结合能得分和对比得分的序列。
Score12和Talaris是ROSETTA所采用的两个评分函数。二者都用来分析上文所述的设计方法。对于score12，用1000个CPU核运行方法A和方法B 10周。如下文表17中所示，方法A返回36,831个总输出，包含275个独特序列；方法B返回3,464个总输出，包含184个独特序列。对于Talaris，用1000个CPU核运行两种设计方法5周。方法A返回33,286个总输出，包含110个独特序列；方法B返回1,253个总输出，包含47个独特序列。参加下文表17。选择182个序列进行基因合成和评价。
表17
Figure BDA0001520322730002301
*1000个CPU核
除根据其能量得分选择候选序列外，还产生了全部616个独特输出序列的系统树(phylogenetic tree)。认为系统树的每个分枝代表一类CH1/CL配对解决方案。由于计算程序对预测对比能不可能足够准确(正确配对对错配的选择性)，从每个系统树分枝选择至少一个序列使我们获得所有输出的良好采样。实际上，挑选了下文更详细描述的最终候选分子，如YT65和JS78，因为根据系统树分析，它们的序列与其他分子不同，尽管它们的对比能相对弱。
合成了所选择的用策略#2产生的4D5CL/CH1变体的输出序列。轻链变体作为KpnI/HindIII片段克隆入表达载体pRK5hu4D5-8L链(Carter等(1992)“Humanization of ananti-p185HER2antibody for human cancer therapy.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,4285-9)，重链变体作为ApaI/NdeI片段克隆入表达载体pRK5hu4D5-8H链。重链Fc区在糖基化位点携带突变(N297G)，用于哺乳动物细胞中的无糖基化IgG产生，在C端缺失赖氨酸(ΔK447)。这两个突变产生均一的IgG质量，便于进行基于质谱的定量而无需纯化后的酶处理。通过将各携带测试对的轻链或重链基因的4种质粒共转染入HEK293T细胞(1ml培养物，96孔深孔板)，来进行策略#2变体与配偶抗体UCHT1.v9的BsIgG的单细胞产生。在37℃剧烈震荡进行抗体表达7天。收集培养物上清，用300μl(50:50浆液)Mabselect Sure树脂(GEHealthcare)过夜孵育。然后将树脂转移至过滤板，用20倍树脂床体积洗涤。用50mM磷酸pH3.0洗脱结合的物质，用20x PBS pH11.0中和(1:20)。将IgG蛋白过滤(0.22μm)除菌。所测试的各策略#2变体的IgG产率与WT相当。
进行图14中所示的夹心ELISA测定来测定来自单细胞共表达的双特异性IgG含量。首先，作为针对策略#2变体基准(benchmark)的用于夹心ELISA中的双特异性IgG(BsIgG)标准包含人源化抗HER2(4D5)作为“杵”臂和抗CD3(UCHT1.v9)作为“臼”臂(Zhu等(1995)“Identification of heavy chain residues in a humanized anti-CD3antibodyimportant for efficient antigen binding and T cell activation.”J.Immunol.155,1903-10)。通过在HEK293T细胞中分别表达各臂，然后对它们进行体外复性来产生BsIgG标准(Schatz等(2013)“Knobs-into-holes antibody production in mammalian celllines reveals that asymmetric afucosylation is sufficient for full antibody-dependent cellular cytotoxicity.”MAbs 5,872–881)。如图14中所示，产生夹心ELISA信号需要双特异性抗体与两种抗原的结合。然后将ELISA信号强度针对BsIgG标准(体外组装)的强度检测，来测定混合物中的BsIgG含量。
简言之，用含1μg/ml HER2-ECD抗原的PBS包被ELISA平板(MaxiSorp,Nunc)，4℃放置过夜。然后用含1％BSA的PBST(1X PBS加0.05％Tween-20)封闭抗原包被的平板1小时。测试样品在分开的96孔板中稀释在相同的封闭缓冲液中，室温放置1小时。将封闭的样品转移(100μl/孔)至HER2包被(封闭)的平板，室温孵育2小时。PBST洗涤平板15次。然后按100μl/孔(含0.5μg/ml CD3-生物素的封闭缓冲液)加入第二抗原(CD3-生物素)，室温孵育2小时。PBST洗涤平板15次。按100μl/孔(0.1μg/ml)加入链霉抗生物素蛋白-HRP(Thermo Fisher,Rockford,IL)，室温孵育30分钟。PBST洗涤平板15次。按100μl/孔加入辣根过氧化物酶底物Sureblue Reserve TMB solution(KPL,Gaithersburg,MD)。通过加入等体积的1.0M磷酸(H3PO4)终止显色。然后在OD450读板。如图15中所示，在4D5臂中具有JS20、JS78、YS18和YT65突变的变体显示提高的优先重链/轻链配对，超出25％双特异性组装标准(其代表不受序列修饰影响的野生型序列的正确重链/轻链配对的无偏、预期量)。
按上文所述针对4D5.UCHT1双特异性抗体优化了轻链DNA比例和重链DNA比例。如下文表18中提供的示例性结果中所示，对于4D5.UCHT1抗体，轻链比例和重链比例的优化改善了双特异性抗体形成。下文所述的其他实验中使用LC杵:LC臼:HC杵:HC臼为1:1.4:1:1的DNA比例。
表18
DNA比例* 百分比2x LC<sub>杵</sub> 百分比2x LC错配 百分比2x LC<sub>臼</sub> 百分比2x正确BsIgG
2.8:1:1:1 74.3 24.3 1.4 18.5
1.4:1:1:1 52.3 40.4 7.3 25.2
1:1:1.4:1 27.1 49.4 23.5 29.8
1:2.8:1:1 9.8 41.2 49.0 28.0
*LC杵:LC臼:HC杵:HC臼
轻链比例优化和重链比例优化后表达和纯化了以下变体抗体：4D5.UCHT1.JS20、4D5.UCHT1.JS78、4D5.UCHT1.JT25、4D5.UCHT1.YS08、4D5.UCHT1.YS18和4D5.UCHT1.YT65，与4D5.UCHT1相比，全都在EKKE(4D5杵、Q39E/Q38K；UCHT1臼，Q39K/Q38E)背景中。JS78、JT25、YS08、YS18和YT65突变在各变体的4D5臂中。通过质谱定量由各变体产生的双特异性抗体的百分比，显示在下文表19中。
表19
Figure BDA0001520322730002331
图16A中显示S20、JS78、YS18和YT65重链的CH1结构域和CL结构域的部分序列，图16B中显示S20、JS78、YS18和YT65轻链的CH1结构域和CL结构域的部分序列。
通过高分辨质谱确认夹心ELISA的结果。高分辨质谱在EMR Exactive Plus质谱仪上利用Orbitrap技术增强的检测能力。对于定量，用微量离心柱(Spin-6,Bio-Rad)或反相离线HPLC将PBS中的抗体产物缓冲液更换入0.1％三氟乙酸。得到的样品级分直接输注至质谱仪上。以调整模式优化参数，以确保内电荷态部分的基线分辨。用ProteinDeconvolution软件(Thermo,得分阈值50)去卷积质量包裹。记录得到的去卷积峰的强度，并用来确定“正确”序列、错配、半抗体和同二聚体的％存在。参见图17和18中的示例性结果。图17A和18A显示对野生型4D5/UCHT1双特异性抗体进行的质谱分析的结果，图17B和18B显示对在4D5臂上包含YT65CH1/CL突变和VH-Q39E/VL-Q38K突变及在UCHT1臂上包含VH-Q39K/VL-Q38E突变(“EKKE”)的4D5/UCHT1抗体进行的质谱分析的结果。下文表20中定量这些示例性结果，VH/VL和CH1/CL突变单独或组合进一步改善4D5/UCHT1v.9双特异性中的正确重链/轻链配对。
表20
Figure BDA0001520322730002332
如图16A和16B中所示，YT65重链和轻链序列都包含5个氨基酸取代。进一步修饰YT65重链和轻链来在一个或多个位置处恢复野生型氨基酸，以测定驱动正确重链/轻链配对所需的最少突变数。图19A和19B中提供“回复突变”的YT65重链和轻链变体的氨基酸序列。对YT65回复突变变体也进行了高分辨质谱分析，以确定这类变体是否也显示提高的优先重链/轻链配对。如下文表21中提供的示例性结果中所示，测试的所有回复突变变体都在双特异性抗体背景中显示改善的LC和HC配对，因此在单细胞中表达两种半抗体时相应地改善双特异性形成。
表21
Figure BDA0001520322730002341
通过天然质谱进行了经修饰的双特异性样品在中性pH条件下的复杂性的定性分析。天然MS提供关于抗体多聚体和其他形式的聚集体(即半抗体-单体相互作用)的信息。用SEC HPLC或离心柱将样品缓冲液更换入10mM乙酸铵，并通过直接注入离子化进入EMR MS。以得分阈值10用Protein Deconvolution软件进行分析。如图20A中所示，4D5臂包含YT65CH1/CL突变及VL-Q38K和VH-Q39E突变且UCHT1臂上包含VL-Q38E和VH-Q39K突变的4D5/UCHT1抗体显示提高的正确重链/轻链配对。将UCHT1抗体掺入样品，以确定该测定的灵敏度和检测限，并辅助定量双特异性抗体、2x LC杵抗体和2X LC臼抗体种类。图20A显示，对2xLC杵抗体和2X LC臼抗体种类的定量限低于2.8％。
图20B确认用于获得图20A中数据的分析的检测灵敏度。在图20B中，按图20B左侧所示的递减比例，用包含两条HER2 LC的错配HER2/UCHT1(即HER2 LC/HER2HC/UCHT1HC/HER2 LC，左峰)和包含两条UCHT1 LC的错配HER2/UCHT1(即UCHT1 LC/HER2 HC/UCHT1HC/UCHT1 LC，右峰)掺入(spike)包含100％正确配对的HER2/UCHT1(即HER2 LC/HER2HC/UCHT1HC/UCHT1 LC，中间峰)的样品。图20B右侧所示的测量比值表明，样品中各种类的实际比值和测量比值之间差异非常小。
实施例3：抗体变体与野生型抗体的Tm和KD比较
进行了差示扫描量热法(DSC)来测定修饰为包含以下的4D5 Fab的熔解温度：(a)VH中的Q39E，和VL中的Q38K；(b)CH1中的S183K，和CL中的V133E；(c)VH中的Q39E、VL中的Q38K、CH1中的S183K，和CL中的V133E；(d)VH中的Q39K和VL中的Q38E；(e)CH1中的S183E，和CL中的V133K；(f)VH中的Q39K、VL中的Q38E、CH1中的S183E，和CL中的V133K；(g)CH1和CL中的YT65突变；或(h)VH中的Q39E，和VL中的Q38K，及CH1和CL中的YT65突变(参见Ionescu等(2008)J Pharm Sci 97,1414–1426)。平行进行了不含突变的4D5的DSC。下文表22-1中所示的示例性结果显示，本文所述可变区和/或恒定区中引入的突变不大幅影响抗体的Tm。
表22-1
Figure BDA0001520322730002351
进行了表面等离振子共振(SPR)分析来计算上文所述4D5变体对HER2的结合亲和力。下文表22-2中所示的结果显示，本文所述可变区和/或恒定区中引入的突变不大幅影响抗体的KD。
表22-2
Figure BDA0001520322730002361
实施例4：将VH/VL和CH1/CL突变应用于其他双特异性对
然后，分析了YT65、EKKE或YT65和EKKE突变对4D5/UCHT1以外的双特异性抗体中重链/轻链配对的影响。简言之，在以下双特异性抗体的每一种中引入YT65 CH1/CL突变、EKKEVH/VL突变，或YT65和EKKE二者：抗IL4/IL13、抗EGFR/MET、抗VEGFA/ANG2和抗VEGFA/VEGFC。将YT65 CH1/CL突变引入各双特异性抗体的杵臂。按上文所述通过高分辨质谱分析未修饰和修饰的双特异性抗体。如表23和图21中提供的示例性结果中所示，EKKE和YT.65突变单独或组合通常在不同抗体中改善双特异性组装。在亲本抗体已经显示强优先重链/轻链配对的实例中，进一步的改善难以达到或检测到。
表23
Figure BDA0001520322730002362
Figure BDA0001520322730002371
Figure BDA0001520322730002373
未修饰的双特异性抗体显示正确HC/LC配对
按上文所述在体外细胞毒性测定中将具有EKKE和YT65杵突变的抗HER2/CD3抗体的活性与未修饰的抗HER2/CD3抗体的活性相比较。如图23中所示，修饰和未修饰的抗HER2/CD3抗体的活性相当。
分析了YT65和EKKE突变对不同同种型的双特异性4D5/UCHT1抗体中重链/轻链配对的影响。将Q39EHC1/Q38KLC1杵/Q39KHC2/Q38ELC2臼和YT65杵突变引入人IgG1同种型、人IgG2同种型、人IgG4同种型和小鼠IgG2a同种型的双特异性抗4D5/UCHT1抗体。未观察到人IgG2同种型抗体在体外成功组装。下文表24中的示例性结果显示，在不同同种型的人双特异性抗体中，轻链和重链可变结构域中的突变显著改善双特异性组装。
表24
Figure BDA0001520322730002372
然后，构建了表达具有Q39EHC1/Q38KLC1杵/Q39KHC2/Q38ELC2臼和YT65杵突变的双特异性4D5/UCHT1抗体的稳定细胞系。通过电穿孔转染CHO细胞，在MSX(甲硫氨酸亚砜亚胺(sulfoximine))存在下选择转化体。几周后挑取分离株，并针对抗体滴度和正确组装的双特异性抗体的百分比进行筛选。利用14天补料分批方法评价排名靠前的克隆。收集、纯化双特异性抗体，通过上述高分辨质谱分析。如下文表25中提供的示例性结果中所示，从该细胞系表达的超过97％的双特异性抗体是正确组装的。发现表达具有Q39EHC1/Q38KLC1杵/Q39KHC2/Q38ELC2臼和YT65杵突变的4D5/UCHT1抗体的瞬时转染细胞系表达90％正确组装的双特异性抗体。这类结果显示，稳定细胞系表达的正确组装的双特异性抗体的百分比与瞬时转染细胞表达的百分比相当。构建了表达具有Q39EHC1/Q38KLC1杵/Q39KHC2/Q38ELC2臼和V133E/S183K杵/V133K/S183E臼突变的4D5/UCHT1双特异性抗体或抗IL13/IL4Q39EHC1/Q38KLC1杵/Q39KHC2/Q38ELC2V133K/S183E臼突变的稳定细胞系。示例性结果显示，从该细胞系表达的超过98％或91％的双特异性抗体是正确组装的(表25)。
表25
Figure BDA0001520322730002381
然后，分析了YT65、EKKE和V133K/S183E突变的组合对4D5/UCHT1中重链/轻链配对的影响。简言之，构建、产生、纯化杵臂(即4D5臂)上包含EKKE突变、YT65突变且臼臂(即UCHT1臂)上包含V133K/S183E突变的4D5/UCHT1双特异性抗体，并通过上述高分辨质谱分析。将4D5/UCHT1.YT65杵.V133K/S183E臼.EKKE的双特异性组装与4D5/UCHT1.V133K/S183E臼.EKKE的双特异性组装相比较。下文表26中的示例性结果显示，在具有V133K/S183E臼和EKKE突变的4D5/UCHT1双特异性抗体的杵臂中引入YT65突变使正确重链/轻链配对从约95％提高至100％。
表26
Figure BDA0001520322730002382
Figure BDA0001520322730002391
进行了其他实验来评估表26中所测试的突变向其他双特异性抗体的可转移性。下文表27中的示例性结果显示，在具有EKKE和YT65杵突变的五种不同双特异性抗体的臼臂中引入V133K/S183E突变使正确重链/轻链配对从约79-95％提高至95-100％。
表27
Figure BDA0001520322730002392
进行了其他实验来评估表26和27中所测试的突变向其他人IgG亚类的抗HER2/CD3(4D5/UCHT1)双特异性抗体的可转移性。下文表28中的示例性结果显示，在具有EKKE和YT65杵突变的三种不同人IgG亚型的臼臂中引入V133K/S183E突变使正确重链/轻链配对从约77-85％提高至98-100％。
表28
Figure BDA0001520322730002393
测定包含VL-Q38K、VH-Q39E和YT65突变的4D5 Fab的晶体结构至
Figure BDA0001520322730002394
分辨率。与野生型4D5 Fab相比，突变体的总体结构未显示显著差异，表明向CH1/CL界面引入的突变不扰乱结构完整性。参见图22A。CL-S176F突变和CH1-F170S突变显示良好的构象互补性，产生包装良好的CH1/CL界面。这与表22-1中所述的所观察到的含有YT65突变的4D5Fab的高热稳定性一致。
根据该结构，CL-S176F突变不利于突变体LC与野生型HC的配对，因为残基CL-S176F和野生型CH1-F170在构象上不相容。CH1-F170S突变不利于突变体HC与野生型LC的配对，因为这种配对将在疏水核心处产生能量上不稳定的空隙(vacancy)。参见图22B。因此，CL-S176F和CH1-F170S之间的选择性配对有助于提高正确配对的BsIgG产生的产率。
下文表29提供进行来评估EK杵、EK臼、KE杵、KE臼、EKKE、KEEK、S183E/V133K杵、S183/V133K臼、S183K/V133杵、S183K/V133E臼、YT65杵和YT65臼的不同组合向抗HER2/CD3 IgG1、抗IL4/IL13 IgG1、抗EGFR/MET IgG1、抗VEGFA/ANG2 IgG1、抗VEGFA/VEGFC IgG1、抗HER2/CD3IgG2、抗HER2/CD3 IgG4和抗HER2/CD3mIgG2a的可转移性的实验的结果。下文表29中的示例性结果显示，突变改善了正确重链/轻链配对。
表29
Figure BDA0001520322730002401
Figure BDA0001520322730002411
Figure BDA0001520322730002421
实施例5：单细胞产生的双特异性抗体的药代动力学研究
设计了其他研究来在C.B-17 SCID小鼠中将单细胞产生的包含EKKE、YT65和/或V133X/S183X(CL/CH1)突变的抗HER2/CD3杵入臼(KIH)双特异性抗体与(a)体外组装的在VH/VL和CH1/CL中不含突变的抗HER2/CD3杵入臼(KIH)双特异性抗体和(b)曲妥珠单抗(trastuzumab,即二价单特异性抗HER2)进行评价和比较。
将C.B-17 SCID小鼠(Charles River Laboratories,Hollister,CA)分为五组(n＝9)。第一组中的小鼠各给以单个5mg/kg静脉内(IV)剂量的体外组装抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体。第二组中的小鼠各给以单个5mg/kg静脉内(IV)剂量的体外组装抗gD/CD3杵入臼双特异性抗体。第三组中的小鼠各给以单个5mg/kg静脉内(IV)剂量的单细胞产生的含EKKE+YT65杵突变的抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体。第四组中的小鼠各给以单个5mg/kg静脉内(IV)剂量的单细胞产生的含EKKE+V133E/S183K杵+V133K/S183E臼突变的抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体。第五组中的小鼠各给以单个5mg/kg静脉内(IV)剂量的曲妥珠单抗(即抗HER2单特异性二价抗)。动物在研究启动时为6至8周龄，体重约16.6-21.4g。在多种时间点经股静脉采集血样直至第28天。通过ELISA测定血清中的总抗体浓度，用于PK评价。用具有IV推注输入模型(模型8)的两室模型(PhoenixTM
Figure BDA0001520322730002431
6.4版；PharsightCorporation；Mountain View,CA)估计PK参数。将标称样品采集时间和标称剂量浓度用于数据分析。所有PK分析均基于个体动物数据的首次合并(naive pool)。
用定量下限为0.08μg/mL的特异性ELISA(用HER2胞外域包被，用生物素化CD3检测，如图14中所示例)分析血清中(i)抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体、(ii)含EKKE+YT65杵突变的抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体和(iii)含EKKE+V133E/S183K杵+V133K/S183E臼突变的抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体的浓度。用一般ELISA测定血清中(iv)抗gD/CD3杵入臼双特异性抗体和(v)曲妥珠单抗的浓度。该测定用绵羊抗人IgG作为捕获试剂，缀合辣根过氧化物酶的山羊抗人IgG作为检测试剂，定量下限为0.03μg/mL。
所有抗体都显示IgG抗体典型的双相处理，开始时快速分布，然后缓慢消除(图24)。单细胞产生的含EKKE+YT65杵突变的抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体和含EKKE+V133E/S183K杵+V133K/S183E臼突变的抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体的药代动力学与常规体外组装的抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体相似(参见下文表30)。单细胞产生的含EKKE+YT65杵突变的抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体和含EKKE+V133E/S183K杵+V133K/S183E臼突变的抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体的药物清除率(CL)在7.14至8.08mL/天/kg范围内，t1/2,β在9.34至9.38天范围内。体外组装的抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体CL为8.23mL/天/kg，t1/2,β为11.4天。与体外组装的抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体相比，体外组装的抗gD/CD3杵入臼双特异性抗体似乎具有略慢的CL和更长的末端半衰期。在此实验中，与曲妥珠单抗相比，抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体、含EKKE+YT65杵的抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体和含EKKE+V133E/S183K杵+V133K/S183E臼的抗HER2/CD3杵入臼双特异性抗体具有快约2倍的清除率和短约2倍的半衰期。
表30：在C.B-17 SCID小鼠中5mg/kg IV施用后抗HER2/CD3、抗gD/CD3和赫赛汀(herceptin)的药代动力学参数估计
Figure BDA0001520322730002441
AUC＝血清浓度对时间曲线下面积；
CL＝清除率；
Cmax＝最大浓度；IV＝静脉内；
PK＝药代动力学；
t1/2,β＝β相半衰期；
V1＝中央区室分布容积；
Vss＝稳态分布容积。
提供前述实施例仅是为了说明的目的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。对本领域技术人员而言，除本文所显示和描述的那些之外的本发明的多种修改将从前面的描述变得显而易见，并落在所附权利要求的范围之内。
Figure IDA0001520322780000011
Figure IDA0001520322780000021
Figure IDA0001520322780000031
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Figure IDA0001520322780000051
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Claims (13)

1.多特异性抗原结合蛋白，其包含：a)结合第一抗原的第一重链/轻链对，其包含第一重链多肽(H1)和第一轻链多肽(L1)，和b)结合第二抗原的第二重链/轻链对，其包含第二重链多肽(H2)和第二轻链多肽(L2)，其中H1和H2都包含重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域(CH1)，L1和L2都包含轻链可变结构域(VH)和轻链恒定结构域(CL)；
其中：
(i)用带正电荷残基取代H1的CH1结构域上的EU编号S183处的氨基酸，用带负电荷残基取代H1的VH结构域上的Kabat编号Q39处的氨基酸，用带负电荷残基取代L1的CL结构域上的EU编号V133处的氨基酸，和用带正电荷残基取代L1的VL结构域上的Kabat编号Q38处的氨基酸；和
用带正电荷残基取代H2的VH结构域上的Kabat编号Q39处的氨基酸和用带负电荷残基取代L2的VL结构域上的Kabat编号Q38处的氨基酸；或
(ii)用带负电荷残基取代H1的CH1结构域上的EU编号S183处的氨基酸，用带正电荷残基取代H1的VH结构域上的Kabat编号Q39处的氨基酸，用带正电荷残基取代L1的CL结构域上的EU编号V133处的氨基酸，和用带负电荷残基取代L1的VL结构域上的Kabat编号Q38处的氨基酸；和
用带负电荷残基取代H2的VH结构域上的Kabat编号Q39处的氨基酸和用带正电荷残基取代L2的VL结构域上的Kabat编号Q38处的氨基酸；和
其中带正电荷残基选自R和K，且其中带负电荷残基选自D和E。
2.权利要求1所述的多特异性抗原结合蛋白，其中H1的CH1结构域在S183(EU编号)处包含氨基酸取代，其中L1的CL结构域在V133(EU编号)处包含氨基酸取代。
3.权利要求1所述的多特异性抗原结合蛋白，其中用带正电荷残基取代H1的CH1结构域上的EU编号S183处的氨基酸，用带负电荷残基取代H1的VH结构域上的Kabat编号Q39处的氨基酸，用带负电荷残基取代L1的CL结构域上的EU编号V133处的氨基酸，和用带正电荷残基取代L1的VL结构域上的Kabat编号Q38处的氨基酸；用带正电荷残基取代H2的VH结构域上的Kabat编号Q39处的氨基酸，和用带负电荷残基取代L2的VL结构域上的Kabat编号Q38处的氨基酸；和
其中用带负电荷的氨基酸残基取代H2的CH1结构域上的EU编号S183处的氨基酸，和用带正电荷的氨基酸残基取代L2的CL结构域上的EU编号V133处的氨基酸。
4.权利要求1所述的多特异性抗原结合蛋白，其中用带负电荷残基取代H1的CH1结构域上的EU编号S183处的氨基酸，用带正电荷残基取代H1的VH结构域上的Kabat编号Q39处的氨基酸，用带正电荷残基取代L1的CL结构域上的EU编号V133处的氨基酸，和用带负电荷残基取代L1的VL结构域上的Kabat编号Q38处的氨基酸；用带负电荷残基取代H2的VH结构域上的Kabat编号Q39处的氨基酸和用带正电荷残基取代L2的VL结构域上的Kabat编号Q38处的氨基酸；和
其中用带正电荷残基取代H2的CH1结构域上的EU编号S183处的氨基酸，和用带负电荷残基取代L2的CL结构域上的EU编号V133处的氨基酸。
5.权利要求1的多特异性抗原结合蛋白，其中用带负电荷残基取代H1的CH1结构域上的EU编号S183处的氨基酸，用带正电荷残基取代H1的VH结构域上的Kabat编号Q39处的氨基酸，用带正电荷残基取代L1的CL结构域上的EU编号V133处的氨基酸，用带负电荷残基取代L1的VL结构域上的Kabat编号Q38处的氨基酸，用带负电荷残基取代H2的VH结构域上的Kabat编号Q39处的氨基酸，和用带正电荷残基取代L2的VL结构域上的Kabat编号Q38处的氨基酸；和
其中H1的VH结构域包含Q39K突变，H1的CH1结构域包含S183E突变，L1的VL结构域包含Q38E突变，L1的CL结构域包含V133K突变，H2的VH结构域包含Q39E突变，和L2的VL结构域包含Q38K突变。
6.权利要求5的多特异性抗原结合蛋白，其中H2的CH1结构域包含S183K突变，和L2的CL结构域包含V133E突变。
7.权利要求5的多特异性抗原结合蛋白，其中H2的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变，和L2的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变。
8.权利要求1的多特异性抗原结合蛋白，其中用带正电荷残基取代H1的CH1结构域上的EU编号S183处的氨基酸，用带负电荷残基取代H1的VH结构域上的Kabat编号Q39处的氨基酸，用带负电荷残基取代L1的CL结构域上的EU编号V133处的氨基酸，用带正电荷残基取代L1的VL结构域上的Kabat编号Q38处的氨基酸，用带正电荷残基取代H2的VH结构域上的Kabat编号Q39处的氨基酸和用带负电荷残基取代L2的VL结构域上的Kabat编号Q38处的氨基酸；和
其中H1的VH结构域包含Q39E突变，H1的CH1结构域包含S183K突变，L1的VL结构域包含Q38K突变，L1的CL结构域包含V133E突变，H2的VH结构域包含Q39K突变，和L2的VL结构域包含Q38E突变。
9.权利要求8的多特异性抗原结合蛋白，其中H2的CH1结构域包含S183E突变，和L2的CL结构域包含V133K突变。
10.权利要求8的多特异性抗原结合蛋白，H2的CH1结构域包含A141I、F170S、S181M、S183A和V185A突变，和L2的CL结构域包含F116A、L135V、S174A、S176F和T178V突变。
11.权利要求1的多特异性抗原结合蛋白，其中H1和/或H2都包含含有CH2结构域和CH3结构域的Fc区，并且其中所述Fc区是人IgG1 Fc区、人IgG2 Fc区或人IgG4 Fc区。
12.权利要求1的多特异性抗原结合蛋白，其中H1和H2各自包含Fc区，所述Fc区包含CH2结构域和CH3结构域，且其中
(1)H1的CH3结构域包含T366W(EU编号)，和其中H2的CH3结构域包含T366S、L368A和Y407V取代(EU编号)；
(2)H2的CH3结构域包含T366W(EU编号)，和其中H1的CH3结构域包含T366S、L368A和Y407V取代(EU编号)。
13.药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白和可药用载体。
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Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface;Steven M Lewis,等;《Nature biotechnology》;20140126;第32卷;摘要，第191页最后5行、第192页左栏第一段-第193页右栏第4行，第194页-第197页左栏最后一段，图1、3-4，表1 *
双特异性抗体的结构设计及其装配工艺研究进展;黎晓维，等;《中国新药杂志》;20141119(第20期);第2430-2436页 *

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