CN114174338A - 与gprc5d结合的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明大体上涉及与GPRC5D结合的抗体，包括例如用于活化T细胞的双特异性抗原结合分子。此外，本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生所述抗体的方法，以及涉及将所述抗体用于治疗疾病的方法。

Description

与GPRC5D结合的抗体
技术领域
本发明大体涉及与GPRC5D结合的抗体，包括具有糖工程化Fc部分的IgG分子以介导有效的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)/抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。此外，本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生所述抗体的方法，以及涉及将所述抗体用于治疗疾病的方法。
背景技术
自身免疫性疾病的特征在于自身抗体，其由浆细胞分泌。自身抗体提供诊断和预后标准，在疾病发病机制中发挥必要作用，并作为疾病活动的替代标志物(Martin和Chan,Immunity,2004,20(5))。因此，有效消耗自身反应性浆细胞可能是治愈这些疾病的关键。
GPRC5D(G蛋白偶联受体，C类第5组成员D)是多发性骨髓瘤浆细胞表达的特异性表面蛋白，也可能是自身免疫浆细胞上的相关靶标。据报道，GPRC5D与多发性骨髓瘤患者的预后和肿瘤负荷相关(Atamaniuk,J.,et al.,Overexpression of G protein-coupledreceptor 5D in the bone marrow is associated with poor prognosis in patientswith multiple myeloma.Eur J Clin Invest,2012.42(9):p.953-60；和Cohen,Y.,etal.,GPRC5D is a promising marker for monitoring the tumor load and to targetmultiple myeloma cells.Hematology,2013.18(6):p.348-51)。
GPRC5D是一种孤儿受体，在人类和人类癌症中没有已知的配体或功能。GPRC5D编码基因位于染色体12p13.3上，包含三个外显子，跨度约9.6kb(Brauner-Osborne,H.,etal.,Cloning and characterization of a human orphan family C G-protein coupledreceptor GPRC5D.Biochim Biophys Acta,2001.1518(3):p.237-48)。大的第一个外显子编码七跨膜结构域。然而，GPRC5D的生物学在很大程度上是未知的。已经表明GPRC5D参与动物毛囊中角蛋白的形成(Gao,Y.,et al.,Comparative Transcriptome Analysis ofFetal Skin Reveals Key Genes Related to Hair Follicle Morphogenesis inCashmere Goats.PLoS One,2016.11(3):p.e0151118；和Inoue,S.,T.Nambu,andT.Shimomura,The RAIG family member,GPRC5D,is associated with hard-keratinizedstructures.J Invest Dermatol,2004.122(3):p.565-73)。WO 2018/017786A2公开了GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段。
需要额外的药物来治疗癌症，特别是多发性骨髓瘤和自身免疫性疾病。为此目的特别有用的药物包括结合GPRC5D的抗体。本发明提供了新型抗体，其特异性结合人GPRC5D，并且能够在自身免疫性疾病的背景下诱导对GPRC5D阳性(血浆或B)细胞的ADCC/ADCP介导的消耗，并且能够在癌症的背景下诱导对表达GPRC5D的恶性多发性骨髓瘤浆细胞的ADCC/ADCP介导的消耗。
发明内容
本发明人开发了一种具有出人意料的改进特性的新型抗体，可与GPRC5D结合。此外，发明人已经开发了与GPRC5D结合的糖工程化抗体。
在第一方面，本发明提供了一种与GPRC5D结合的抗体，其中该抗体包括(i)重链可变结构域(VH)，其包括(a)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1、(b)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3，以及轻链可变结构域(VL)，其包括(d)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1、(e)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2，和(f)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3；或者(ii)重链可变结构域(VH)，其包括(a)含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H1、(b)含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变结构域(VL)，其包括(d)含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L1、(e)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2，和(f)含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个实施例中，该抗体包括(i)重链可变结构域(VH)，其包括(a)含有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的CDR-H1、(b)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3，以及轻链可变结构域(VL)，其包括(d)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1、(e)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2，和(f)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3；或者(ii)重链可变结构域(VH)，其包括(a)含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H1、(b)含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变结构域(VL)，其包括(d)含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L1、(e)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2，和(f)含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个实施例中，抗体是结合GPRC5D的抗体片段。
在另一个实施例中，该抗体进一步包含(i)SEQ ID NO:13的重链可变结构域框架序列和/或SEQ ID NO 14的轻链可变结构域框架序列；或(ii)SEQ ID NO:15的重链可变结构域框架序列和/或SEQ ID NO 16的轻链可变结构域框架序列。
在另一个实施例中，抗体包括选自由以下项组成的组的序列：(a)与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；(c)如(a)中定义的VH序列和如(b)中定义的VL序列。
在另一个实施例中，抗体包括选自由以下项组成的组的序列：(a)与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；(c)如(a)中定义的VH序列和如(b)中定义的VL序列。
在另一个实施例中，抗体包括SEQ ID NO:13的VH序列和SEQ ID NO:14的VL序列；或包括SEQ ID NO:15的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列。
在另一方面，本发明提供一种特异性与GPRC5D结合的抗体，其包括SEQ ID NO:13的VH序列和SEQ ID NO:14的VL序列；或包括SEQ ID NO:15的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列。
在另一个实施例中，抗体是IgG抗体。在另一个实施例中，抗体是IgG1抗体。在另一个实施例中，抗体是全长抗体。在另一个实施例中，抗体是多特异性抗体。
在另一个实施例中，抗体包括SEQ ID NO:98的轻链和SEQ ID NO:99的重链；或包括SEQ ID NO：100的轻链和SEQ ID NO：101的重链。
在又一方面，本发明提供了包含本文公开的抗体和细胞毒剂的免疫缀合物。
在又一方面，本发明提供一种或多种编码本文公开的抗体或免疫缀合物的分离的核酸。在又一方面，本发明提供一种包含本文所述一种或多种核酸的宿主细胞。在另一方面，本发明提供一种产生与GPRC5D结合的抗体或免疫缀合物的方法，其包括在适合表达抗体的条件下培养本文所述的宿主细胞。在另一个实施例中，该方法进一步包括从所述宿主细胞回收所述抗体或免疫缀合物。
在另一方面，本发明提供了通过本文公开的方法产生的抗体或免疫缀合物。
在另一方面，本发明提供了一种包含本发明的抗体和药用载体的药物组合物。
在另一个实施例中，药物组合物进一步包括额外的治疗剂。在另一方面，本发明提供了用作药物的如本文所述的抗体或药物组合物。在另一方面，本发明提供了用于治疗疾病的如本文所述的抗体或药物组合物。该疾病可以是癌症。该癌症可以是多发性骨髓瘤。该疾病可以是自身免疫性疾病。该自身免疫性疾病可以是系统性红斑狼疮和/或类风湿性关节炎等自身免疫性疾病；和其他。
在又一方面，本发明提供如本文所述的抗体或免疫缀合物或药物组合物在制备用于治疗疾病，特别是癌症或自身免疫性疾病的药物中的用途。该癌症可以是多发性骨髓瘤。该自身免疫性疾病可以是系统性红斑狼疮和/或类风湿性关节炎；或其他。
在另一方面，本发明提供如本文所述的抗体或免疫缀合物或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于诱导对GPRC5D阳性细胞的ADCC/ADCP介导的消耗。
一方面，本发明提供了一种治疗患有癌症或自身免疫性疾病的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的本发明所述的抗体或免疫缀合物或药物组合物。
在另一方面，本发明提供了在个体中对GPRC5D阳性细胞的ADCC/ADCP介导的消耗的方法，包括向个体施用有效量的如本文所述的抗体或免疫缀合物或药物组合物以诱导对GPRC5D阳性细胞的ADCC/ADCP介导的消耗。
在上述方面中的任何方面和实施例中，个体优选是哺乳动物，特别是人。
附图说明
图1A-Z.本发明的双特异性抗原结合分子的示例性构型。(图1A、图2D)“1+1CrossMab”分子示意图。(图1B，图1E)“2+1IgG Crossfab”分子示意图，其中Crossfab和Fab组分的顺序交替(“倒置”)。(图1C、图1F)“2+1IgG Crossfab”分子示意图。(图1G，图1K)“1+1IgG Crossfab”分子示意图，其中Crossfab和Fab组分的顺序交替(“倒置”)。(图1H、图1L)“1+1IgG Crossfab”分子示意图。(图1I，图1M)具有两个CrossFab的“2+1IgG Crossfab”分子的示意图。(图1J、图1N)具有两个CrossFab的“2+1IgG Crossfab”分子的示意图，其中Crossfab和Fab组分的顺序交替(“倒置”)。(图1O、图1S)“Fab-Crossfab”分子示意图。(图1P，图1T)“Crossfab-Fab”分子示意图。(图1Q、图1U)“(Fab)2-Crossfab”分子示意图。(图1R，图1V)“Crossfab-(Fab)2”分子示意图。(图1W，图1Y)“Fab-(Crossfab)2”分子示意图。(图1X，图1Z)“(Crossfab)2-Fab”分子示意图。黑点：Fc结构域中促进异源二聚化的任选修饰。++、--：任选引入CH1和CL结构域中的具有相反电荷的氨基酸。Crossfab分子被描述为包含VH区和VL区的交换，但是可以-特别是在其中在CH1和CL结构域中不引入电荷修饰的实施例中-可替代地包含CH1和CL结构域的交换。
图2.通过RNAseq分析浆细胞和B细胞上肿瘤靶标的基因表达。
图3.本发明的5E11-双特异性抗原结合分子的示例性构型。黑点：Fc结构域中促进异源二聚化的任选修饰。++、--：任选引入CH1和CL结构域中的具有相反电荷的氨基酸。
图4A-C.双特异性抗原结合分子5F11-TCB(图4A)和5E11-TCB(图4B)和对照抗体ET150-5-TCB(图4C)与表达GPRC5D的多发性骨髓瘤细胞系AMO-1、L636、NCI-H929、RPMI-8226、OPM-2和对照细胞WSU-DLCL2的结合分析。
图5A-E.分析对多发性骨髓瘤细胞系AMO-1(图5A)、NCI-H929(图5B)、RPMI-8226(图5C)和L363(图5D)的GPRC5D-TCB介导的T细胞细胞毒性。对照细胞系是WSU-DL CL2(图5E)。测试分子:5E11-TCB、5F11-TCB。对照分子：DP47-TCB(无靶标)和ET150-5-TCB。
图6.分析与多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929和阴性对照细胞系WSU-DLCL2的GPRC5D-TCB活化的T细胞接合上调CD25和CD69。
图7A-J.T细胞活化，如在AMO-1(图7A)、NCI-H929(图7B)、RPMI-8226(图7C)、L363(图7D)和WSU-DLCL2(图7E)存在下，用渐增浓度的GPRC5D-TCB或阴性对照DP47-TCB孵育T细胞后，通过CD8+T细胞上CD25的上调确定的；和如或者在AMO-1(图7F)、NCI-H929(图7G)、RPMI-8226(图7H)、L363(图7I)和WSU-DLCL2(图7J)存在下，用渐增浓度的GPRC5D-TCB或阴性对照DP47-TCB孵育T细胞后通过CD8+T细胞上CD69的上调确定的。
图8A-B.通过荧光共聚焦显微镜观察抗体定位和内化(图8A)以及分析膜与细胞质的信号强度(图8B)。
图9.使用表达人GPRC5D(克隆12)或食蟹猴GPRC5D(克隆13)、鼠GPRC5D(克隆4)或人GPRC5A(克隆30)的稳定转染的CHO克隆，通过ELISA评估不同抗GPRC5D抗体与人、食蟹猴和鼠GPRC5D的结合。
图10A-G.在20小时的共孵育期间(E:T＝10:1，人泛T细胞)，由不同的GPRC5D或BCMA靶向T细胞双特异性分子诱导的各种多发性骨髓瘤(MM)细胞系的T细胞介导裂解。所描绘的是SD的重复。
图11A-F.在同种异体泛人类T细胞和来自健康供体的未加工骨髓细胞共孵育约20小时期间(E:T＝10:1，人类泛T细胞)，由不同的GPRC5D或BCMA靶向T细胞双特异性分子诱导的T细胞活化(图11A中的5E11-TCB；图11B中的5F11-TCB；图11C中的10B10-TCB；图11D中的BCMA-TCB；图11E中的B72-TCB；图11F中的DP47-TCB)。描绘的是来自一位代表性供体的FACS点图，显示CD4 T细胞(上排)或CD8 T细胞(下排)上活化标志物CD69的上调，分别作为所有CD4 T细胞和CD8 T细胞中的阳性细胞百分比。
图12A-B.在同种异体泛人类T细胞和来自健康供体的未加工骨髓细胞共孵育约20小时期间(E:T＝10:1，人类泛T细胞)，由不同的GPRC5D或BCMA靶向T细胞双特异性分子诱导的T细胞活化。描绘的是所有四位评估供体的总结，显示在选定的50nM TCB(图12A)或5nM(图12B)固定剂量下，CD8 T细胞上的活化标志物CD69上调。
图13A-D.由不同GPRC5D靶向T细胞双特异性分子(图13A中的5F11-TCB；图13B中的BCMA-TCB；图13C中的B72-TCB；图13D中的媒介物)诱导的体内功效，如移植NCI-H929肿瘤细胞的人源化NSG小鼠模型中随时间的肿瘤生长动力学所示。绘制的是蜘蛛图，每条线代表一只小鼠。
图14A-D.由不同GPRC5D靶向T细胞双特异性分子(图14A中的5F11-TCB；图14B中的5E11-TCB；图14C中的B72-TCB；图14D中的媒介物)诱导的体内功效，如移植OPM-2肿瘤细胞的人源化NSG小鼠模型中随时间的肿瘤生长动力学所示。绘制的是蜘蛛图，每条线代表一只小鼠。
图15A-B.PGLALA-CAR-J在大约16小时的孵育后活化，由发光确定。后者在GPRC5DIgG(图15A中的5F11-IgG；图15B中的5E11-IgG)与表达GPRC5D的多发性骨髓瘤细胞系L-363结合并且同时地PGLALA修饰的Fc结构域与Jurkat-NFAT报告细胞(它们经过基因工程工程化以表达针对这些IgG分子Fc部分中PGLALA突变的TCR)结合时被诱导。所描绘的是SD的重复。
图16.不同GPRC5D IgG分子与NCI-H929肿瘤细胞上表达的人GPRC5D的结合。描绘的是来自SD技术三次重复的相对中位荧光值(MFI)。结合的EC50值通过Graph Pad Prism计算并包含在表14中。
图17A-B.如果肿瘤细胞发生ADCC介导的裂解(图17A：AMO-1细胞，图17B:NCI-H929细胞)是在指定的糖基工程化GPRC5D靶向IgG与PBMC效应子和肿瘤靶细胞以25:1的效应子与靶细胞比率共孵育4小时后确定的。描绘的是肿瘤细胞裂解的百分比，基于检测从坏死或凋亡细胞释放到上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)。显示的是SD技术三次重复。
具体实施方式
定义
除非在下文中另外定义，否则本文使用的术语通常如本领域中所使用的。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广泛意义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例是免疫球蛋白及其衍生物，例如其片段。
术语“双特异性”是指抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同的抗原决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种独特细胞上表达的两种抗原决定簇。
如本文所用的术语“价”表示在抗原结合分子中存在指定数目的抗原结合位点。因此，术语“与抗原单价结合”表示在抗原结合分子中存在对抗原具有特异性的一个(并且不超过一个)抗原结合位点。
“抗原结合位点”是指提供与抗原的相互作用的抗原结合分子的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)的氨基酸残基。天然免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，Fab分子通常具有单个抗原结合位点。
如本文所用，术语“抗原结合部分”是指特异性地结合抗原决定簇的多肽分子。在一个实施例中，抗原结合部分能够将其所附接的实体(例如第二抗原结合部分)引导至靶位点，例如引导至携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞。在另一个实施例中，抗原结合部分能够通过其靶抗原(例如T细胞受体复合物抗原)活化信号传导。抗原结合部分包括如本文进一步定义的抗体及其片段。特定的抗原结合部分包括抗体的抗原结合结构域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施例中，抗原结合部分可包含如本文进一步定义且在本领域中已知的抗体恒定区。可用的重链恒定区包括以下五种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。可用的轻链恒定区包括以下两种同种型中的任一种：κ和λ。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与所述位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，否则作为本文所述抗原的蛋白质(例如GPRC5D,CD3)是指来自任何脊椎动物来源的任何天然蛋白质形式，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在一个具体实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体。可用作抗原的示例性人类蛋白质是CD3，特别是CD3的ε亚基(参见UniProt编号P07766(版本185)，NCBI RefSeq编号NP_000724.1，SEQ ID NO：40用于人类序列；或UniProt编号Q95LI5(版本69)，NCBI GenBank编号BAB71849.1，SEQ ID NO：41用于食蟹猴[Macaca fascicularis]序列)或GPRC5D(参见UniProt编号Q9NZD1(版本115)，NCBI RefSeq编号NP_061124.1，SEQ ID NO:45用于人类序列)。在某些实施例中，本发明的抗体或双特异性抗原结合分子与在来自不同物种的CD3或GPRC5D抗原中保守的CD3或GPRC5D表位结合。在特定实施例中，本发明的抗体或双特异性抗原结合分子与人GPRC5D结合。
“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合部分与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术(例如在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，抗原结合部分与不相关蛋白质的结合程度小于该抗原结合部分与抗原的结合程度的约10％，如例如通过SPR所测得的。在某些实施例中，与抗原结合的抗原结合部分或包含该抗原结合部分的抗原结合分子的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
“亲和力”是指分子(例如，受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，配体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，该固有结合亲和力反映了结合对的成员(例如，抗原结合部分与抗原，或者受体与其配体)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示，所述解离常数是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的完善确立的方法测量，包括本文所述的那些方法。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
“降低的结合”(例如降低的与Fc受体的结合)是指对相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为清楚起见，该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即完全消除相互作用。相反地，“增加的结合”是指对相应相互作用的结合亲和力增加。
如本文所用，“活化性T细胞抗原”是指在T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞表面表达的抗原决定簇，其在与抗原结合分子相互作用时能够诱导T细胞活化。具体而言，抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联来诱导T细胞活化。在一特定实施例中，活化性T细胞抗原是CD3，特别是CD3的ε亚基(参见UniProt编号P07766(版本144)、NCBI RefSeq编号NP_000724.1、SEQ ID NO:40用于人类序列；或UniProt编号Q95LI5(版本49)，NCBI GenBank编号BAB71849.1，SEQ ID NO：41用于食蟹猴[Macaca fascicularis]序列)。
如本文所用，“T细胞激活”是指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞响应，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和激活标志物的表达。测量T细胞激活的合适测定是本领域已知的并在本文中描述的。
如本文所用的“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，该靶细胞为例如肿瘤中的细胞(诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)。在一具体实施例中，靶细胞抗原是GPRC5D，特别是根据SEQ ID NO:45的人GPRC5D。
如本文所用，关于Fab分子等的术语“第一”、“第二”或“第三”在每种类型的部分多于一种时用于方便区分。除非明确说明，否则使用这些术语并不旨在赋予所述双特异性抗原结合分子特定的顺序或取向。
所谓“融合”，意指组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)直接地或经由一个或更多个肽连接基通过肽键链接。
“Fab分子”是指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1结构域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL结构域组成的蛋白质。
所谓“交叉”Fab分子(也称为“Crossfab”)，意指以下Fab分子：其中Fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域发生交换(即互相替换)，即交叉Fab分子包含由轻链可变结构域VL和重链恒定结构域1CH1组成的肽链(VL-CH1，在N端至C端方向)，以及由重链可变结构域VH和轻链恒定结构域CL组成的肽链(VH-CL，在N端至C端方向)。为清楚起见，在其中Fab轻链的可变结构域和Fab重链的可变结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链恒定结构域1CH1的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。相反地，在其中Fab轻链的恒定结构域和Fab重链的恒定结构域发生交换的交叉Fab分子中，包含重链可变结构域VH的肽链在本文中称为(交叉)Fab分子的“重链”。
与之相比，所谓“常规”Fab分子，意指处于其天然形式的Fab分子，即，包含由重链可变结构域和恒定结构域组成的重链(VH-CH1，在N端至C端方向)，以及由轻链可变结构域和恒定结构域组成的轻链(VL-CL，在N端至C端方向)。
术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变结构域(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变区)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N-末端到C-末端，每条轻链具有可变结构域(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变区)，接着是一个恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可配属为以下五种类型中的一种：称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而被配属为以下两种类型中的一种：称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。免疫球蛋白实质上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，其包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可能的变异抗体外，该群体中包括的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，所述可能的变异抗体例如含有天然存在的突变或是在单克隆抗体制备物的生产过程中产生的，此类变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中分离出的抗体，即不在其天然环境中的抗体。不需要特定的纯化水平。例如，可以从抗体的天然或自然环境中取出分离的抗体。在宿主细胞中表达的重组产生的抗体被认为是出于本发明的目的而分离的，已经通过任何合适的技术分离、分级或部分或基本上纯化的天然或重组抗体也被认为是出于本发明的目的而分离的。因此，分离了本发明的抗体和双特异性抗原结合分子。在一些实施例中，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)方法测定的，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2，双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)，以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun在The harmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Mooreeds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)中所述；还可参见WO 93/16185；以及美国专利5,571,894和5,587,458。对于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如EP404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA90,6444-6448(1993)。在Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利6,248,516 B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分，该部分包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。具体地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。如本文所用，与可变区序列有关的“Kabat编号”是指由Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)提出的编号系统。
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和恒定结构域的氨基酸位置根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统进行编号，并且在本文中被称为“根据Kabat编号”或“Kabat编号”。具体地讲，将Kabat编号系统(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第647页至第660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且将Kabat EU索引编号系统(参见第661页至第723页)用于重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)，这在本文中通过在此种情况下称为“根据Kabat EU索引编号”来进一步阐明。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指在序列上是高变的抗体可变结构域的每个区域(“互补决定区”或“CDR”；重链可变区/结构域的CDR缩写为例如HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链可变区/结构域的CDR缩写为例如LCDR1、LCDR2和LCDR3)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或包含抗原-接触残基(“抗原触点”)。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处发生的高可变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处发生的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处发生的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，出处同上编号。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常在VH(或VL)中以如下次序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。此类可变结构域在本文中称为“人源化可变区”。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。本发明涵盖的其他形式的“人源化抗体”是这样的抗体，相对于原始抗体，所述抗体中的恒定区已经经过了另外修饰或改变，以产生根据本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的特性。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。在某些实施例中，人抗体来源于非人转基因哺乳动物，例如小鼠、大鼠或兔子。在某些实施例中，人抗体来源于杂交瘤细胞系。在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段也被认为是人抗体或人抗体片段。
抗体或免疫球蛋白的“类”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，以及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管IgG重链Fc区的边界可能略有不同，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230延伸至该重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链的C末端的一个或多个，特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可以包括全长重链，或者该抗体可以包括全长重链的切割变体(在本文中也称为“经切割的变体重链”)。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据Kabat EU索引)的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或可以不存在。如果没有另外指明，则包含Fc结构域(或如本文所定义的Fc结构域的亚基)的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有C末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在本发明的一个实施例中，包括如本文所指定的Fc结构域的亚基的重链包含在根据本发明的抗体或双特异性抗原结合分子中，该重链包含另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，包含如本文所指定的Fc结构域的亚基的重链包含在根据本发明的抗体或双特异性抗原结合分子中，该重链包含另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。本发明的组合物，诸如本文所述的药物组合物，包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子群体。该抗体或双特异性抗原结合分子群体可包含具有全长重链的分子和具有经切割的变体重链的分子。该抗体或双特异性抗原结合分子群体可以由具有全长重链的分子和具有经切割的变体重链的分子的混合物组成，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所述抗体或双特异性抗原结合分子具有经切割的变体重链。在本发明的一个实施例中，包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子群体的组合物包含这样的抗体或双特异性抗原结合分子，所述抗体或双特异性抗原结合分子包含这样的重链，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子群体的组合物包含这样的免疫缀合物，所述抗体或双特异性抗原结合分子包含这样的重链，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，这种组合物包含抗体或双特异性抗原结合分子群体，所述免疫缀合物群体由以下分子构成：包含这样的重链的分子，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基；包含这样的重链的分子，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)；以及包含这样的重链的分子，所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)来编号的，如在Kabat等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991(还可参见上文)中所述。如本文所用的Fc结构域的“亚基”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽，该多肽能够稳定自缔合。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。
“促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰”是对肽骨架的操纵或Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成同源二聚体。如本文所用，“促进缔合的修饰”特别包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一者进行的单独修饰，其中所述修饰彼此互补以促进这两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可以改变所述Fc结构域亚基中的一者或两者的结构或电荷，以便分别使它们的缔合在空间上或静电上有利。因此，(异源)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，这在融合至每个亚基的另外组分(例如抗原结合部分)不相同的意义上可能是不同的。在一些实施例中，促进缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在一个特定实施例中，促进缔合的修饰包括对Fc结构域的两个亚基中的每一个的单独氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。
如本文所用，术语“工程化、工程化的、工程改造”被认为包括对肽骨架的任何操纵，或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程改造包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。
如本文所用的术语“氨基酸突变”表示涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体，前提条件是所述最终构建体具有所需特征，例如减少的与Fc受体的结合，或增加的与另一肽的缔合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和插入。特定的氨基酸突变是氨基酸取代。出于改变例如Fc区域的结合特征的目的，非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸，是特别优选的。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)进行替代。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法来产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。设想通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。本文可使用各种名称来指示相同的氨基酸突变。例如，将Fc结构域的329位处的脯氨酸取代为甘氨酸可以表示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并且引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，用BLOSUM50比较矩阵，使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序产生氨基酸序列一致性％的值。FASTA程序包由W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological Sequence Analysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequence comparison”Meth.Enzymol.266:227-258；以及Pearson等人，(1997)Genomics 46:24-36，并且可公开地从http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml获得。或者，可以使用可在http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)来确保执行全局而非局部比对。在输出的比对标头(alignment header)中给出氨基酸同一性百分比。
术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒来源的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中存在的)。术语“核酸分子”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已从其天然环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被视为分离的。分离的多核苷酸的另外的实施例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或处于溶液中的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含在通常包含多核苷酸分子的细胞中，但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置上。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式及双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
“编码[例如本发明的抗体或双特异性抗原结合分子]的分离的多核苷酸(或核酸)”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种多核苷酸分子，包括在单个载体或单独载体中的此类多核苷酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。
术语“表达盒”是指通过重组或合成生成的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，表达盒包含编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”是指用于将与其可操作地缔合的特定基因引入细胞中并且指导所述特定基因在细胞中表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。表达载体在细胞内之后，就通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可以用于生成本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物的培养细胞，诸如仅举几个示例HEK细胞、CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。
“活化性Fc受体”是这样的Fc受体：其在被抗体的Fc结构域接合后引发刺激携带该受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。人活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是与包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞，该特异性结合通常是通过Fc区的N末端的蛋白质部分。如本文所用，术语“降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量减少，和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度增加。ADCC降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的)，由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如，由在Fc结构域中包含降低ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的降低是相对于由在Fc结构域中没有该氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC。用于测量ADCC的合适测定法是本领域中熟知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT公开号WO 2012/130831)。
药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所需治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。具体地，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指一种制备物，该制备物的形式使得包含在其中的活性成分的生物活性有效，并且该制备物不含对将施用该组合物的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。
“药学上可接受的载体”是指药物组合物中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或在临床病理学过程中执行的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的抗体或双特异性抗原结合分子用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
实施例的具体描述
本发明提供了结合GPRC5D，特别是人GPRC5D的抗体和双特异性抗原结合分子。此外，这些分子具有用于治疗应用的其他有利特性，例如关于功效和/或安全性以及可生产性。
GPRC5D抗体
在第一方面，本发明提供与GPRC5D结合的抗体，其中该抗体包含(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:84的HCDR 2和SEQ IDNO:86的HCDR 3，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ IDNO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:85的HCDR 2和SEQ ID NO:86的HCDR 3，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；(iii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR3；(iv)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:96的LCDR2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；(v)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:92的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ IDNO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；(vi)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3；或(vii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO:8的HCDR 2和SEQ ID NO:9的HCDR 3，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR 3。
在一些实施例中，抗体为人源化抗体。在一个实施例中，VH是人源化VH和/或VL是人源化VL。在一个实施例中，抗体包含任一上述实施例中的CDR，并且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一具体实施例中，(i)VH包含与SEQ ID NO:13的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(ii)VH包含与SEQ ID NO:15的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ IDNO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(iii)VH包含与SEQ ID NO:48的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含氨基酸序列与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(iv)VH包含与SEQ ID NO:49的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(v)VH包含与SEQ IDNO:57的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含氨基酸序列与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(vi)VH包含与SEQ ID NO:58的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一具体实施例中，抗体包含(i)VH，其与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，以及VL，其与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或(ii)VH，其与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，以及VL，其与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或(iii)VH，其与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，以及VL，其与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或(iv)VH，其与SEQ ID NO:49的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，以及VL，其与SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或(v)VH，其与SEQ ID NO:57的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，以及VL，其与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或(vi)VH，其与SEQ ID NO:58的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，以及VL，其与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在另一个实施例中，抗体是IgG，特别是IgG1抗体。在一个实施例中，抗体是全长抗体。在另一个实施例中，抗体是选自Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab')2分子的抗体片段。在一个实施例中，抗体为多特异性抗体。
在某些实施例中，具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH或VL序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但抗体包含保留了与GPRC5D结合的能力的序列。在某些实施例中，在SEQ ID NO:13中总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或删除，和/或在SEQ ID NO:14中总共有1到10个氨基酸被取代、插入和/或删除，和/或在SEQ ID NO:15中总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或删除，和/或在SEQ ID NO:16中总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或删除，和/或在SEQ ID NO:48中总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或删除，和/或在SEQ ID NO:53中总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或删除，和/或在SEQ ID NO:49中总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或删除，和/或在SEQ ID NO:52中总共有1到10个氨基酸已被取代、插入和/或删除，和/或在SEQ ID NO:57中总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失，和/或在SEQ ID NO:64中总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或删除，和/或在SEQ ID NO:58中总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或删除，和/或在SEQ ID NO:63中总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或删除。
在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗体包含SEQ ID NO:13的VH序列和/或SEQ ID NO:14的VL序列，包括那序列的翻译后修饰。任选地，抗体包含SEQ ID NO:15的VH序列和/或SEQ ID NO:16的VL序列，包括那序列的翻译后修饰。任选地，抗体包含SEQ ID NO:448的VH序列和/或SEQ ID NO:53的VL序列，包括那序列的翻译后修饰。任选地，抗体包含SEQ ID NO:49的VH序列和/或SEQ ID NO:52的VL序列，包括那序列的翻译后修饰。任选地，抗体包含SEQ ID NO:57的VH序列和/或SEQ ID NO:64的VL序列，包括那序列的翻译后修饰。任选地，抗体包含SEQ ID NO:58的VH序列和/或SEQ IDNO:63的VL序列，包括那序列的翻译后修饰。
在一个实施例中，该抗体包括VH，其包含选自SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的氨基酸序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一个实施例中，该抗体包含选自SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的VH序列，以及SEQ ID NO:16的VL序列。
在一具体实施例中，第一抗体包括：含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL。在一具体实施例中，第一抗体包含如SEQ ID NO:13的VH序列和如SEQ ID NO:14的VL序列。
在一具体实施例中，第一抗体包括：含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL。在一具体实施例中，第一抗体包含如SEQ ID NO:15的VH序列和如SEQ ID NO:16的VL序列。
在一具体实施例中，第一抗体包括：含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL。在一具体实施例中，第一抗体包含如SEQ ID NO:48的VH序列和如SEQ ID NO:53的VL序列。
在一具体实施例中，第一抗体包括：含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL。在一具体实施例中，第一抗体包含如SEQ ID NO:49的VH序列和如SEQ ID NO:52的VL序列。
在一具体实施例中，第一抗体包括：含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL。在一具体实施例中，第一抗体包含如SEQ ID NO:57的VH序列和如SEQ ID NO:64的VL序列。
在一具体实施例中，第一抗体包括：含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL。在一具体实施例中，第一抗体包含如SEQ ID NO:58的VH序列和如SEQ ID NO:63的VL序列。
在一个实施例中，抗体包含人恒定区。在一个实施例中，抗体是包含人恒定区的免疫球蛋白分子，特别是包含人CH1、CH2、CH3和/或CL结构域的IgG类免疫球蛋白分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38(分别为人κ和λCL结构域)和SEQ IDNO:39(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施例中，抗体包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含的氨基酸序列，与SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施例中，第一抗体包含重链可变恒定区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。特别地，重链恒定区可包含如本文所述的Fc结构域中的氨基酸突变。
在一个实施例中，抗体为单克隆抗体。
在一个实施例中，抗体是IgG，特别是IgG1抗体。在一个实施例中，抗体是全长抗体。
在一个实施例中，抗体包含Fc结构域，特别是IgG Fc结构域，更特别是IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，Fc结构域是人Fc结构域。抗体的Fc结构域可以单独或组合地合并本文描述的与本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域相关的任何特征。
在另一个实施例中，抗体是选自Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab’)2分子的抗体片段；特别是Fab分子。在另一个实施例中，抗体片段是双体抗体、三体抗体或四体抗体。
在又一方面，根据上述实施例中任一项所述的抗体可单独或组合地合并如以下部分所述的特征：
糖基化变体
在某些实施例中，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。糖基化位点向抗体的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
当抗体包含Fc区时，与其相连的寡糖可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具有支链的双触角寡糖，所述双触角寡糖通常通过N-键结连接于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接于双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可以对本发明的抗体中的寡糖进行修饰，以便产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施例中，提供了具有非岩藻糖基化的寡糖的抗体变体，即缺少(直接或间接地)连接在Fc区的岩藻糖的寡糖结构。这样的非岩藻糖基化的寡糖(也称为“去岩藻糖基化”的寡糖)特别是N-连接的寡糖，其缺少在双触角寡糖结构的茎中连接第一GlcNAc的岩藻糖残基。在一个实施例中，提供了与天然或亲本抗体相比在Fc区中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体变体。例如，非岩藻糖基化寡糖的比例可以为至少约20％、至少约40％、至少约60％、至少约80％或甚至约100％(即不存在岩藻糖基化寡糖)。非岩藻糖基化寡糖的百分比，如例如WO 2006/082515中所述，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，是缺少岩藻糖残基的寡糖的(平均)量相对于与Asn 297连接的所有寡糖(例如复杂、杂合和高甘露糖结构)之和。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可以位于297位上游或下游大约±3个氨基酸，即在294位和300位之间。在Fc区中具有非岩藻糖基化寡糖比例增加的此类抗体可具有改善的FcγRIIIa受体结合和/或改善的效应子功能，特别是改善的ADCC功能。参见，例如，US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能够产生岩藻糖基化减少的抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，尤其是在实例11中)，以及敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人.Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)，或具有降低或取消的GDP-岩藻糖合成或转运蛋白活性的细胞(参见，例如，US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在又一实施例中，抗体变体提供了二等分的寡糖，例如，其中连接至抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。如上所述，这样的抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如Umana等人,Nat Biotechnol 17,176-180(1999)；Ferrara等人,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540,WO 2003/011878。
还提供了在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。这样的抗体变体描述于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764。
在一个实施例中，通过在Fc区中引入一个或多个氨基酸突变来工程化第二抗体。在一个具体实施例中，所述氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中，通过修饰Fc区中的糖基化来工程化第二抗体。在一个具体实施例中，与非工程化的抗体相比，Fc区中糖基化的修饰是Fc区中非岩藻糖基化寡糖的比例增加。在一个甚至更具体的实施例中，Fc区中非岩藻糖基化寡糖的增加比例为Fc区中非岩藻糖基化寡糖的至少20％，优选至少50％，最优选至少70％。在另一个具体的实施例中，与非工程化的抗体相比，Fc区中糖基化的修饰是Fc区中二等分寡糖的比例增加。在一个甚至更具体的实施例中，Fc区中二等分寡糖的增加比例是Fc区中二等分寡糖的至少约20％，优选至少50％，最优选至少70％。在又一个具体的实施例中，与非工程化的抗体相比，Fc区中糖基化的修饰是Fc区中二等分的非岩藻糖基化的寡糖的比例增加。优选地，第二抗体在Fc区具有至少约25％、至少约35％或至少约50％的二等分的非岩藻糖基化的寡糖。在一具体实施例中，与非工程化的抗体相比，第二抗体被工程化以在Fc区具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖。抗体Fc区中非岩藻糖基化寡糖的比例增加导致抗体具有增加的效应子功能，特别是增加的ADCC。在一具体实施例中，非岩藻糖基化寡糖是二等分的非岩藻糖基化寡糖。
在一具体实施例中，抗体包含轻链和重链，所述轻链包含SEQ ID NO:98的序列，所述重链包含SEQ ID NO:99的序列。在一具体实施例中，抗体包含SEQ ID NO:98的轻链和SEQID NO:99的重链。在一具体实施例中，抗体包含轻链和重链，所述轻链包含SEQ ID NO:100的序列，所述重链包含SEQ ID NO:101的序列。在一具体实施例中，抗体包含SEQ ID NO:100的轻链和SEQ ID NO:101的重链。
在一具体的实施例中，抗体包含轻链和重链，轻链包含SEQ ID No:98序列，重链包含SEQ ID NO:99序列，其中该抗体是糖工程化抗体。在一具体实施例中，抗体包含SEQ IDNO:98的轻链和SEQ ID NO:99的重链，其中所述抗体是糖工程化抗体。在一具体的实施例中，抗体包含轻链和重链，轻链包含SEQ ID No:100序列，重链包含SEQ ID NO:101序列，其中该抗体是糖工程化抗体。在一具体实施例中，抗体包含SEQ ID NO:100的轻链和SEQ IDNO:101的重链，其中所述抗体是糖工程化抗体。
在一具体的实施例中，抗体包含轻链和重链，轻链包含SEQ ID NO:98的序列，重链包含SEQ ID NO:99的序列，其中该抗体被工程化为与非工程抗体相比在Fc区具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖。在一具体实施例中，抗体包含SEQ ID NO:98的轻链和SEQ ID NO:99的重链，其中该抗体被工程化为与非工程抗体相比在Fc区具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖。在一具体的实施例中，抗体包含轻链和重链，轻链包含SEQ ID NO:100的序列，重链包含SEQ ID NO:101的序列，其中该抗体被工程化为与非工程抗体相比在Fc区具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖。在一具体实施例中，抗体包含SEQ ID NO:100的轻链和SEQ ID NO:101的重链，其中该抗体被工程化为与非工程抗体相比在Fc区具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖。
经半胱氨酸工程改造的抗体变体
在某些实施例，可期望产生经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如“thioMAbs”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基存在于抗体的可接近位点。如本文进一步描述的，通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性硫醇基团定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或连接基-药物部分)缀合，以产生免疫缀合物。半胱氨酸工程化的抗体可以如例如在美国专利号7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130或WO2016040856中所述产生。
抗体衍生物
在某些实施例中，本文提供的抗体可以被进一步修饰以包含本领域已知的并且容易获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接于抗体的聚合物的数目可变化，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素测定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
在另一个实施例中，提供了抗体和可通过暴露于辐射而选择性地加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施例中，非蛋白质性部分为碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于对普通细胞没有伤害、但是将非蛋白质性部分加热至抗体-非蛋白质性部分近端的细胞被杀死的温度的波长。
免疫缀合物
本发明还提供了免疫缀合物，其包含本文公开的抗GPRC5D抗体，该抗体缀合(化学键合)至一种或多种治疗剂，例如细胞毒性剂、化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一个实施例中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至上述一种或多种治疗剂。通常使用连接基将抗体连接至一种或多种治疗剂。Pharmacol Review68:3-19(2016)中列出了ADC技术的概述，其包括治疗剂、药物和连接基的实例。
在另一个实施例中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白质A链、相思豆毒蛋白质A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹黄素蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、姜黄素、巴豆素、肥皂草抑制剂、明胶、米托菌素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。
在另一个实施例中，免疫缀合物包括与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于制备放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可能包含用于闪烁显像研究的放射性原子，例如，tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备抗体和细胞毒剂的缀合物。例如，可以如Vitetta等人，Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至抗体。参见WO94/11026。连接基可以为促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割连接基”。例如，可以使用对酸不稳定的连接基、肽酶敏感的连接基、对光不稳定的连接基、二甲基连接基或含二硫键的连接基(Chari等人，Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于市售的(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
多特异性抗体
在某些实施例中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点(即，不同抗原上的不同表位或相同抗原上的不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。在某些实施例中，结合特异性中的一种是针对GPRC5D的，并且另一种(两种或更多种)特异性是针对任何其他抗原的。在某些实施例中，双特异性抗体可与GPRC5D的两个(或更多个)不同的表位结合。多特异性(例如，双特异性)抗体还可用于将细胞毒性剂或细胞定位到表达GPRC5D的细胞。可以将多特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983))及“杵臼结构”工程化(参见例如，美国专利5,731,168，以及Atwell等人，J.Mol.Biol.270:26(1997))。多特异性抗体还可以通过以下方式来制备：工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电操纵效应(参见例如，WO 2009/089004)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如，美国专利号4,676,980，以及Brennan等人，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用用于避免轻链错配问题的常用轻链技术(参见例如，WO 98/50431)；使用用于制备双特异性抗体片段的“双体抗体”技术(参见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化抗体，包括例如“章鱼抗体”或者DVD-Ig(参见例如，WO 2001/77342和WO 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其他示例可以在WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO2010/145792和WO 2013/026831中找到。双特异性抗体或其抗原结合片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含与GPRC5D以及另一种不同抗原结合或与GPRC5D的两个不同表位结合的抗原结合位点(参见例如，US 2008/0069820和WO 2015/095539)。
多特异性抗体也可以以不对称形式提供，其中在具有相同抗原特异性的一个或多个结合臂中有结构域互换，即通过交换VH/VL结构域(参见例如，WO 2009/080252和WO2015/150447)、CH1/CL结构域(参见例如，WO 2009/080253)或完整的Fab臂(参见例如，WO2009/080251、WO 2016/016299，还参见Schaefer等人，PNAS,108(2011)1187-1191，以及Klein等人，MAbs 8(2016)1010-20)。还可以通过将荷电或非荷电的氨基酸突变引入结构域界面以指导正确的Fab配对，以对不对称Fab臂进行工程化。参见例如WO 2016/172485。
多特异性抗体的各种其他分子形式是在本领域中已知的并且包括在本文中(参见例如Spiess等人，Mol Immunol 67(2015)95-106)。
本文还包括的一种特定类型的多特异性抗体是这样的双特异性抗体，该双特异性抗体设计用于同时结合靶细胞(例如，肿瘤细胞)上的表面抗原和T细胞受体(TCR)复合物的活化不变组分(诸如CD3)，以用于再靶向T细胞以杀伤靶细胞。因此，在某些实施例中，本文提供的抗体是多特异性抗体，特别是双特异性抗体，其中结合特异性之一针对GPRC5D而另一个针对CD3。
可用于此目的的双特异性抗体形式的示例包括但不限于所谓的“BiTE”(双特异性T细胞接合子)分子，其中两个scFv分子通过柔性连接基融合(参见例如，WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261，以及WO2008/119567；Nagorsen和
Figure BDA0003492810530000351
Exp Cell Res317,1255-1260(2011))；双体抗体(Holliger等人，Prot Eng 9,299-305(1996))及其衍生物，诸如串联双体抗体(“TandAb”；Kipriyanov等人，J Mol Biol 293,41-56(1999))；“DART”(双重亲和力再靶向)分子，其基于双体抗体形式但特征是具有用于实现额外稳定化的C-末端二硫桥(Johnson等人，J Mol Biol 399,436-449(2010))，以及所谓的三功能抗体(triomab)，其是全杂交小鼠/大鼠IgG分子(综述于Seimetz等人，Cancer Treat Rev 36,458-467(2010)中)。本文包括的特定T细胞双特异性抗体形式描述于WO 2013/026833、WO2013/026839、WO 2016/020309；Bacac等人，Oncoimmunology 5(8)(2016)e1203498中。
与GPRC5D和第二抗原结合的双特异性抗原结合分子
本发明提供了双特异性抗原结合分子，即包含至少两个能够特异性结合两种不同抗原决定簇(第一和第二抗原)的抗原结合部分的抗原结合分子。
根据本发明的特定实施例，包含在双特异性抗原结合分子中的抗原结合部分是Fab分子(即由重链和轻链组成的抗原结合结构域，每个抗原结合结构域包含可变结构域和恒定结构域)。在一个实施例中，第一和/或第二抗原结合部分是Fab分子。在一个实施例中，所述Fab分子是人。在一个特定实施例中，所述Fab分子是人源化的。在另一个实施例中，所述Fab分子包含人重链和轻链恒定结构域。
优选地，所述抗原结合部分中的至少一个抗原结合部分是交叉Fab分子。这种修饰减少了来自不同Fab分子的重链和轻链的错配，从而提高了重组生产中本发明的双特异性抗原结合分子的产率和纯度。在可用于本发明的双特异性抗原结合分子的特定交叉Fab分子中，Fab轻链和Fab重链的可变结构域(分别为VL和VH)交换。然而，即使进行该结构域交换，由于错配的重链与轻链之间的所谓Bence Jones型相互作用，双特异性抗原结合分子的制备可能包含某些副产物(参见Schaefer等人，PNAS,108(2011)11187-11191)。为了进一步减少来自不同Fab分子的重链和轻链的错配并由此提高所需双特异性抗原结合分子的纯度和产率，可以在与第一抗原(GPRC5D)结合的Fab分子或与第二抗原(例如活化性T细胞抗原诸如CD3)结合的Fab分子中的任一者的CH1和CL结构域的特定氨基酸位置处引入带相反电荷的荷电氨基酸，如本文进一步描述的。在包含在双特异性抗原结合分子中的常规Fab分子中(诸如例如在图1A-C、G-J中所示)或在包含在双特异性抗原结合分子中的VH/VL交叉Fab分子中(诸如例如在图1D-F、K-N中所示)(而不是在两者中)进行荷电改性。在具体实施例中，在包含在双特异性抗原结合分子中的常规Fab分子(其在具体实施例中与第一抗原即GPRC5D结合)中进行荷电改性。
在一根据本发明的具体实施例中，双特异性抗原结合分子能够与第一抗原(即GPRC5D)和第二抗原(例如活化性T细胞抗原，特别是CD3)同时结合。在一个实施例中，双特异性抗原结合分子能够通过同时结合GPRC5D和活化性T细胞抗原来交联T细胞和靶细胞。在一甚至更具体的实施例中，这种同时结合导致靶细胞，特别是表达GPRC5D的肿瘤细胞的裂解。在一个实施例中，这种同时结合导致T细胞的活化。在其它实施例中，这种同时结合导致T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的细胞应答，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。在一个实施例中，双特异性抗原结合分子与活化性T细胞抗原，特别是CD3的结合，而不同时与GPRC5D结合不会导致T细胞活化。
在一个实施例中，双特异性抗原结合分子能够将T细胞的细胞毒活性重新导向靶细胞。在一具体实施例中，所述重新导向不依赖于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。
特别地，根据本发明的任何实施例的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施例中，T细胞是CD4+或CD8+T细胞，特别是CD8+T细胞。
第一抗原结合部分
本发明的双特异性抗原结合分子包含至少一个与GPRC5D(第一抗原)结合的抗原结合部分，特别是Fab分子。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子包含与GPRC5D结合的两个抗原结合部分，特别是Fab分子。在一特定的此类实施例中，这些抗原结合部分中的每一个都与相同的抗原决定簇结合。在一甚至更具体的实施例中，所有这些抗原结合部分都是相同的，即它们包含相同的氨基酸序列，包括如本文所述的CH1和CL结构域中的相同氨基酸取代(如果有的话)。在一个实施例中，双特异性抗原结合分子包含不超过两个与GPRC5D结合的抗原结合部分，特别是Fab分子。
在具体实施例中，与GPRC5D结合的抗原结合部分是常规Fab分子。在此类实施例中，结合第二抗原的抗原结合部分是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。
在替代实施例中，结合GPRC5D的抗原结合部分是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。在此类实施例中，结合第二抗原的抗原结合部分是常规Fab分子。
GPRC5D结合部分能够将双特异性抗原结合分子导向靶位点，例如导向表达GPRC5D的特定类型的肿瘤细胞。
双特异性抗原结合分子的第一抗原结合部分可以单独或组合地合并本文关于结合GPRC5D的抗体描述的任何特征，除非科学上明显不合理或不可能。
因此，在一个方面，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分包含重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:84的HCDR 2和SEQ IDNO:86的HCDR 3，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；以及(b)结合第二抗原的第二抗原结合部分。在另一个方面，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分包含重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:85的HCDR 2和SEQ ID NO:86的HCDR 3，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ IDNO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；以及(b)结合第二抗原的第二抗原结合部分。在另一个方面，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分包含重链可变区(VH)，其包含SEQID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:95的LCDR2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；以及(b)结合第二抗原的第二抗原结合部分。在另一个方面，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分包含重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:96的LCDR 2和SEQ IDNO:97的LCDR 3；以及(b)结合第二抗原的第二抗原结合部分。在另一个方面，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分包含重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:92的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；以及(b)结合第二抗原的第二抗原结合部分。在另一个方面，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分包含重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3；以及(b)结合第二抗原的第二抗原结合部分。在另一个方面，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分包含重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO:8的HCDR 2和SEQ ID NO:9的HCDR 3，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR 3；以及(b)结合第二抗原的第二抗原结合部分。
在一些实施例中，第一抗原结合部分是(来源于)人源化抗体。在一个实施例中，VH是人源化VH和/或VL是人源化VL。在一个实施例中，第一抗原结合部分包含任一上述实施例中的CDR，并且还包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个实施例中，第一抗原结合部分的VH包含与选自下组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58；第一抗原结合部分的VL包含与选自下组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64。
在一个实施例中，第一抗原结合部分包含与选自下组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58；以及与选自下组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的的VL序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64。
在一个实施例中，第一抗原结合部分包括VH，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:57、SEQID NO:58；以及VL，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64。
在一个实施例中，第一抗原结合部分包括VH序列，其选自由以下项组成的组：SEQID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58；以及VL序列，其选自由以下项组成的组：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64。
在一个特定实施例中，第一抗原结合部分包括：含有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的VH和含有如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的VL。在一个特定实施例中，第一抗原结合部分包含如SEQ ID NO:13所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:14所示的VL氨基酸序列。
在一个具体实施例中，第一抗原结合部分包括：含有SEQ ID NO:15氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:16氨基酸序列的VL。在一个具体实施例中，第一抗原结合部分包含SEQID NO:15的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列。
在一个具体实施例中，第一抗原结合部分包括：含有SEQ ID NO:48氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:53氨基酸序列的VL。在一个具体实施例中，第一抗原结合部分包含SEQID NO:48的VH序列和SEQ ID NO:53的VL序列。
在一个具体实施例中，第一抗原结合部分包括：含有SEQ ID NO:49氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:52氨基酸序列的VL。在一个具体实施例中，第一抗原结合部分包含SEQID NO:49的VH序列和SEQ ID NO:52的VL序列。
在一个具体实施例中，第一抗原结合部分包括：含有SEQ ID NO:57氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:64氨基酸序列的VL。在一个具体实施例中，第一抗原结合部分包含SEQID NO:57的VH序列和SEQ ID NO:64的VL序列。
在一个具体实施例中，第一抗原结合部分包括：含有SEQ ID NO:58氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:63氨基酸序列的VL。在一个具体实施例中，第一抗原结合部分包含SEQID NO:58的VH序列和SEQ ID NO:63的VL序列。在一个实施例中，第一抗原结合部分包含人恒定区。在一个实施例中，第一抗原结合部分是包含人恒定区，特别是人CH1和/或CL结构域的Fab分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38(分别为人κ和λCL结构域)和SEQ ID NO:39(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施例中，第一抗原结合部分包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含的氨基酸序列，与SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:37的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。具体地，轻链恒定区可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变和/或如果在交叉Fab分子中则可以包含对一个或多个(特别是两个)N末端氨基酸的缺失或取代。在一些实施例中，第一抗原结合部分包含重链恒定区，该重链恒定区包含的氨基酸序列，与包含在SEQ ID NO:39氨基酸序列中的CH1结构域序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。具体地，重链恒定区(特别是CH1结构域)可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变。
第二抗原结合部分
本发明的双特异性抗原结合分子包含至少一个结合第二抗原(不同于GPRC5D)的抗原结合部分，特别是Fab分子。
在具体实施例中，结合第二抗原的抗原结合部分是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。在此类实施例中，结合第一抗原(即GPRC5D)的抗原结合部分优选为常规Fab分子。在双特异性抗原结合分子中存在多于一个结合GPRC5D的抗原结合部分，特别是Fab分子的实施例中，结合第二抗原的抗原结合部分优选是交叉Fab分子，并且结合GPRC5D的抗原结合部分是常规的Fab分子。
在替代实施例中，结合第二抗原的抗原结合部分是常规Fab分子。在具体实施例中，结合第一抗原(即GPRC5D)的抗原结合部分是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。在双特异性抗原结合分子中存在多于一个结合第二抗原的抗原结合部分，特别是Fab分子的实施例中，结合GPRC5D的抗原结合部分优选是交叉Fab分子，并且结合第二抗原的抗原结合部分是常规的Fab分子。
在一些实施例中，第二抗原是活化性T细胞抗原(本文也称为“活化性T细胞抗原结合部分，或活化性T细胞抗原结合Fab分子”)。在一具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含不超过一个能够特异性结合活化性T细胞抗原的抗原结合部分。在一个实施例中，双特异性抗原结合分子提供与活化性T细胞抗原的单价结合。
在具体实施例中，第二抗原是CD3，特别是人CD3(SEQ ID NO：40)或食蟹猴CD3(SEQID No:41)，最特别是人CD3。在一个实施例中，第二抗原结合部分与人和食蟹猴CD3交叉反应(即特异性结合)。在一些实施例中，第二抗原是CD3的ε亚基(CD3ε)。
在一个实施例中，第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:29的HCDR1、SEQ ID NO:30的HCDR 2、SEQ ID NO:31的HCDR 3、SEQ ID NO:32的LCDR 1、SEQ ID NO:33的LCDR 2和SEQ IDNO:34的LCDR 3。
在一个实施例中，第二抗原结合部分包括VH，其包含SEQ ID NO:29的HCDR 1、SEQID NO:30的HCDR 2、SEQ ID NO:31的HCDR 3；以及VL，其包含SEQ ID NO:32的LCDR 1、SEQID NO:33的LCDR 2和SEQ ID NO:34的LCDR 3。
在一些实施例中，第二抗原结合部分是(来源于)人源化抗体。在一个实施例中，VH是人源化VH和/或VL是人源化VL。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含任一上述实施例中的CDR，并且还包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个实施例中，第二抗原结合部分包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VL序列。
在一个实施例中，第二抗原结合部分包含VH序列，该VH序列与SEQ ID NO:35氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，以及VL序列，该VL序列与SEQ IDNO:36氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一个实施例中，第二抗原结合部分的VH包含与SEQ ID NO:35氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且第二抗原结合部分的VL包含与SEQ ID NO:36氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，第二抗原结合部分包括：含有如SEQ ID NO:35氨基酸序列的VH和含有如SEQ ID NO:36氨基酸序列的VL。
在一个实施例中，第二抗原结合部分包含如SEQ ID NO:35的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:36的VL氨基酸序列。
在一个实施例中，第二抗原结合部分包含人恒定区。在一个实施例中，第二抗原结合部分是包含人恒定区，特别是人CH1和/或CL结构域的Fab分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38(分别为人κ和λCL结构域)和SEQ ID NO:39(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施例中，第二抗原结合部分包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含的氨基酸序列，与SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的氨基酸序列，特别是SEQID NO:37的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。具体地，轻链恒定区可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变和/或如果在交叉Fab分子中则可以包含对一个或多个(特别是两个)N末端氨基酸的缺失或取代。在一些实施例中，第二抗原结合部分包含重链恒定区，该重链恒定区包含的氨基酸序列，与包含在SEQ ID NO:39氨基酸序列中的CH1结构域序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。具体地，重链恒定区(特别是CH1结构域)可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变。
在一些实施例中，第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1，特别是可变结构域VL和VH互相交换(即根据这样的实施例，第二抗原结合部分是交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域或恒定结构域被交换)。在一个这样的实施例中，第一(和第三，如果有的话)抗原结合部分是常规的Fab分子。
在一个实施例中，在双特异性抗原结合分子中存在不超过一个结合第二抗原(例如活化性T细胞抗原诸如CD3)的抗原结合部分(即双特异性抗原结合分子提供与第二抗原的单价结合)。
荷电改性
本发明的双特异性抗原结合分子可以在其中所包含的Fab分子中包含氨基酸取代，所述氨基酸取代特别有效地减少轻链与不匹配重链的错配(Bence-Jones型副产物)，所述错配可以发生在基于Fab的双/多特异性抗原结合分子的产生中，所述双/多特异性抗原结合分子在其结合臂中的一个(或在分子包含多于两个抗原结合Fab分子的情况下为多个)结合臂中具有VH/VL交换(同样参见PCT公开号WO 2015/150447，特别是其中的实例，该PCT公开的全部内容通过引用并入本文)。所需的双特异性抗原结合分子与不期望的副产物，特别是在双特异性抗原结合分子的结合臂中的一个结合臂中具有VH/VL结构域交换的双特异性抗原结合分子中出现的Bence Jones型副产物的比率，可以通过在CH1和CL结构域中的特定氨基酸位置处引入带相反电荷的荷电氨基酸(有时在本文中称为“荷电改性”)来提高。
因此，在一些实施例中，其中双特异性抗原结合分子的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分都是Fab分子，并且在抗原结合部分中的一个抗原结合部分(特别是第二抗原结合部分)中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换，
i)在所述第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号)，并且其中在所述第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)；或者
ii)在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号)，并且其中在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。
双特异性抗原结合分子不包含i)和ii)中提到的两种修饰。具有VH/VL交换的抗原结合部分的恒定结构域CL和CH1不互相替换(即保持未交换)。
在一个更具体的实施例中，
i)在所述第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)；或者
ii)在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个此类实施例中，在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在另一实施例中，在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一具体实施例中，在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个更具体实施例中，在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个甚至更具体实施例中，在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在具体实施例中，如果根据上述实施例的氨基酸取代是在第一抗原结合部分的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行的，则第一抗原结合部分的恒定结构域CL为κ同种型的。
可替代地，根据上述实施例的氨基酸取代可以在第二抗原结合部分的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行，而不是在第一抗原结合部分的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行。在具体的此类实施例中，第二抗原结合部分的恒定结构域CL为κ同种型的。
因此，在一个实施例中，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在另一实施例中，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在又一个实施例中，在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)并且位置123处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)并且位置213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在另一实施例中，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一具体实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:84的HCDR 2和SEQ ID NO:86的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3，和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个具体实施例中由赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个具体实施例中被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)；并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一具体实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:85的HCDR 2和SEQ ID NO:86的HCDR3，轻链可变区包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3，和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个具体实施例中由赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个具体实施例中被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)；并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一具体实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3，和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个具体实施例中由赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个具体实施例中被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)；并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一具体实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3，和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个具体实施例中由赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个具体实施例中被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)；并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一具体实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:92的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3，和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个具体实施例中由赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个具体实施例中被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)；并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一具体实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3，和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个具体实施例中由赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个具体实施例中被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)；并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一具体实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:8的HCDR 2和SEQ ID NO:9的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR3，和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个具体实施例中由赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个具体实施例中被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)；并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
双特异性抗原结合分子形式
根据本发明的双特异性抗原结合分子的组分可以以各种构型彼此融合。示例性构型在图1A-Z中描述。
在特定实施例中，包含在双特异性抗原结合分子中的抗原结合部分是Fab分子。在此类实施例中，第一、第二、第三抗原结合部分等在本文中可分别称为第一、第二、第三Fab分子等。
在一个实施例中，双特异性抗原结合分子的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分彼此融合，任选地经由肽连接基融合。在具体实施例中，第一和第二抗原结合部分各自是Fab分子。在一个此类实施例中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合部分的Fab重链的N末端。在另一个此类实施例中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合部分的Fab重链的N末端。在其中(i)第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合部分的Fab重链的N末端或(ii)第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合部分的Fab重链的N末端的实施例中，另外地第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链可以任选地通过肽连接基彼此融合。
具有能够特异性结合靶细胞抗原例如GPRC5D(例如如图1A、1D、1G、1H、1K、1L中所示)的单个抗原结合部分的双特异性抗原结合分子(例如Fab分子)是有用，特别是在结合高亲和力抗原结合部分后预期靶细胞抗原内化的情况下。在这种情况下，存在一个以上对靶细胞抗原特异的抗原结合部分可能会增强靶细胞抗原的内化，从而降低其可用性。
然而，在其他情况下，具有包含两个或更多个对靶细胞抗原特异的抗原结合部分的双特异性抗原结合分子(例如Fab分子)将是有利的(参见图1B、1C、1E、1F、1I、1J、1M或1N所示实例)，例如优化对靶位点的靶向或允许靶细胞抗原的交联。
因此，在具体实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含第三抗原结合部分。
在一个实施例中，第三抗原结合部分结合第一抗原，即GPRC5D。在一个实施例中，第三抗原结合部分是Fab分子。
在一个实施例中，第三抗原部分与第一抗原结合部分相同。
双特异性抗原结合分子的第三抗原结合部分可以单独或组合地合并本文关于结合GPRC5D的第一抗原结合部分和/或抗体描述的任何特征，除非科学上明显不合理或不可能。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:84的HCDR2和SEQID NO:86的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ IDNO:88的LCDR2和SEQ ID NO:89的LCDR3。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:85的HCDR2和SEQID NO:86的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ IDNO:88的LCDR2和SEQ ID NO:89的LCDR3。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR2和SEQID NO:93的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ IDNO:95的LCDR2和SEQ ID NO:97的LCDR3。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR2和SEQID NO:93的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ IDNO:96的LCDR2和SEQ ID NO:97的LCDR3。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:92的HCDR2和SEQID NO:93的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ IDNO:95的LCDR2和SEQ ID NO:97的LCDR3。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR2和SEQ IDNO:4的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:5的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:6的LCDR2和SEQ ID NO:7的LCDR3。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:8的HCDR2和SEQ IDNO:9的HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:11的LCDR2和SEQ ID NO:12的LCDR3。
在一些实施例中，第三抗原结合部分是(来源于)人源化抗体。在一个实施例中，VH是人源化VH和/或VL是人源化VL。在一个实施例中，第三抗原结合部分包含任一上述实施例中的CDR，并且还包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个实施例中，第三抗原结合部分的VH包含与选自下组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58；第三抗原结合部分的VL包含与选自下组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包括VH序列，其与选自下组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58；以及VL序列，其与选自下组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包括VH，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:57、SEQID NO:58；以及VL，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包括VH序列，其选自由以下项组成的组：SEQID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58；以及VL序列，其选自由以下项组成的组：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64。
在一个具体实施例中，第三抗原结合部分包括：含有如SEQ ID NO:13氨基酸序列的VH和含有如SEQ ID NO:14氨基酸序列的VL。在一个具体实施例中，第三抗原结合部分包含如SEQ ID NO:13的VH序列和如SEQ ID NO:14的VL序列。
在一个具体实施例中，第三抗原结合部分包括：含有SEQ ID NO:15氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:16氨基酸序列的VL。在一个具体实施例中，第三抗原结合部分包含SEQID NO:15的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列。
在一个具体实施例中，第三抗原结合部分包括：含有SEQ ID NO:48氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:53氨基酸序列的VL。在一个具体实施例中，第三抗原结合部分包含SEQID NO:48的VH序列和SEQ ID NO:53的VL序列。
在一个具体实施例中，第三抗原结合部分包括：含有SEQ ID NO:49氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:52氨基酸序列的VL。在一个具体实施例中，第三抗原结合部分包含SEQID NO:49的VH序列和SEQ ID NO:52的VL序列。
在一个具体实施例中，第三抗原结合部分包括：含有SEQ ID NO:57氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:64氨基酸序列的VL。在一个具体实施例中，第三抗原结合部分包含SEQID NO:57的VH序列和SEQ ID NO:64的VL序列。
在一个具体实施例中，第三抗原结合部分包括：含有SEQ ID NO:58氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:63氨基酸序列的VL。在一个具体实施例中，第三抗原结合部分包含SEQID NO:58的VH序列和SEQ ID NO:63的VL序列。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含人恒定区。在一个实施例中，第三抗原结合部分是包含人恒定区，特别是人CH1和/或CL结构域的Fab分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38(分别为人κ和λCL结构域)和SEQ ID NO:39(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施例中，第三抗原结合部分包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含的氨基酸序列，与SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的氨基酸序列，特别是SEQID NO:37的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。具体地，轻链恒定区可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变和/或如果在交叉Fab分子中则可以包含对一个或多个(特别是两个)N末端氨基酸的缺失或取代。在一些实施例中，第三抗原结合部分包含重链恒定区，该重链恒定区包含的氨基酸序列，与包含在SEQ ID NO:39氨基酸序列中的CH1结构域序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。具体地，重链恒定区(特别是CH1结构域)可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变。
在具体实施例中，第三和第一抗原结合部分各自是Fab分子并且第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同。因此，在这些实施例中，第一和第三抗原结合部分包含相同的重链和轻链氨基酸序列并且具有相同的结构域排列(即常规或交叉))。此外，在这些实施例中，第三抗原结合部分包含与第一抗原结合部分相同的氨基酸取代(如果有的话)。例如，本文描述为“电荷修饰”的氨基酸取代将在第一抗原结合部分和第三抗原结合部分各自的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行。可替代地，所述氨基酸取代可在第二抗原结合部分(其在具体实施例中也是Fab分子)的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行，但不在第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行。
与第一抗原结合部分一样，第三抗原结合部分特别是常规的Fab分子。然而，其中第一和第三抗原结合部分是交叉Fab分子(并且第二抗原结合部分是常规Fab分子)的实施例也被考虑。因此，在具体实施例中，第一和第三抗原结合部分各自是常规Fab分子，并且第二抗原结合部分是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他实施例中，第一和第三抗原结合部分各自是交叉Fab分子并且第二抗原结合部分是常规Fab分子。
如果存在第三抗原结合部分，在具体实施例中第一和第三抗原部分结合GPRC5D，并且第二抗原结合部分结合第二抗原，特别是活化性T细胞抗原，更特别是CD3，最特别是CD3ε。
在特定实施例中，所述双特异性抗原结合分子包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。Fc结构域的第一亚基和第二亚基能够稳定缔合。
根据本发明的双特异性抗原结合分子可以具有不同的构型，即第一和第二(以及任选地第三)抗原结合部分可以以不同方式彼此融合和与Fc结构域融合。组分可以直接彼此融合，或优选地通过一种或多种合适的肽连接基融合。当Fab分子与Fc结构域的亚基的N末端融合时，该融合通常是经由免疫球蛋白铰链区。
在一些实施例中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自是Fab分子，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在此类实施例中，第一抗原结合部分可以在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合部分的Fab重链的N末端或融合至Fc结构域的另一个亚基的N末端。在此类具体实施例中，所述第一抗原结合部分是常规Fab分子，并且第二抗原结合部分是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他此类实施例中，所述第一Fab分子是交叉Fab分子，并且第二Fab分子是常规Fab分子。
在一个实施例中，第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分各自是Fab分子，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合部分的Fab重链的N末端。在一具体实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二Fab分子、第一和第二亚基构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽连接基组成，其中第一Fab分子融合在Fab重链的C末端融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域第一或第二亚基的N末端。这种构型在图1G和1K中示意性地描绘(在这些实例中第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子)。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在另一实施例中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自是Fab分子，并且第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的一个亚基的N末端。在一具体实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一Fab分子和第二Fab分子、由第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域，以及任选地一个或多个肽连接基组成，其中该第一Fab分子和该第二Fab分子各自在Fab重链的C末端处与Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端融合。这种构型在图1A和1D中示意性地描绘(在这些实例中，第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子并且第一抗原结合部分是常规Fab分子)。第一Fab分子和第二Fab分子可以直接或通过肽连接基与Fc结构域融合。在一个特定实施例中，所述第一Fab分子和所述第二Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在一个具体实施例中，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在Fc结构域是IgG1 Fc结构域的情况下。
在一些实施例中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自是Fab分子，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在此类实施例中，第二抗原结合部分可以在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合部分的Fab重链的N末端或(如上所述)融合至Fc结构域的另一个亚基的N末端。在此类具体实施例中，所述第一抗原结合部分是常规Fab分子，并且第二抗原结合部分是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他此类实施例中，所述第一Fab分子是交叉Fab分子，并且第二Fab分子是常规Fab分子。
在一个实施例中，第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分各自是Fab分子，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合部分的Fab重链的N末端。在一具体实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二Fab分子、第一和第二亚基构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽连接基组成，其中第二Fab分子融合在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且第一Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域第一或第二亚基的N末端。这种构型在图1H和1L中示意性地描绘(在这些实例中，第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子并且第一抗原结合部分是常规Fab分子)。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在一些实施例中，第三抗原结合部分，特别是第三Fab分子，在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。在此类具体实施例中，所述第一和第三Fab分子各自是常规Fab分子，并且第二Fab分子是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他此类实施例中，所述第一和第三Fab分子各自是交叉Fab分子，并且第二Fab分子是常规Fab分子。
在此类具体实施例中，第二和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的一个亚基的N末端，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端。在一具体实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一、第二和第三Fab分子、第一和第二亚基构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽连接基组成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第一亚基，并且其中第三Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第二亚基的N末端。这种构型示意性地描述于图1B和1E(在这些实例中，第二抗原结合部分是VH/VL交叉Fab分子，第一和第三抗原结合部分是常规Fab分子)，和图1J和1N(在这些实例中，第二抗原结合部分是常规Fab分子，第一和第三抗原结合部分是VH/VL交叉Fab分子)。第二和第三Fab分子可以直接或通过肽连接基融合至Fc结构域。在一个具体实施例中，第二和第三Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在一个具体实施例中，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在Fc结构域是IgG1 Fc结构域的情况下。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在另一此类实施例中，第一和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的一个亚基的N末端，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合部分的Fab重链的N末端。在一具体实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一、第二和第三Fab分子、第一和第二亚基构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽连接基组成，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且第一Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第一亚基，并且其中第三Fab分子在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第二亚基的N末端。这种构型示意性地描述于图1C和1F(在这些实例中，第二抗原结合部分是VH/VL交叉Fab分子，第一和第三抗原结合部分是常规Fab分子)，和图1I和1M(在这些实例中，第二抗原结合部分是常规Fab分子，第一和第三抗原结合部分是VH/VL交叉Fab分子)。第一和第三Fab分子可以直接或通过肽连接基融合至Fc结构域。在一个具体实施例中，第一Fab分子和第三Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在一个具体实施例中，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在Fc结构域是IgG1 Fc结构域的情况下。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在双特异性抗原结合分子的构型中，其中Fab分子在Fab重链的C末端处通过免疫球蛋白铰链区融合至Fc结构域的亚基中的每个的N末端，所述两个Fab分子、铰链区和Fc结构域基本上形成了免疫球蛋白分子。在一个特定实施例中，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更特定的实施例中，免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施例中，免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在另一具体实施例中，免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其他实施例中，免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个实施例中，免疫球蛋白包含人恒定区，特别是人Fc区。
在本发明的一些双特异性抗原结合分子中，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合，任选地通过肽连接基融合。根据第一和第二Fab分子的构型，第一Fab分子的Fab轻链可以在其C末端融合至第二个Fab分子的Fab轻链的N末端，或第二Fab分子的Fab轻链可以在其C末端融合至第一Fab分子的Fab轻链的N末端。第一和第二Fab分子的Fab轻链的融合进一步减少了未匹配Fab重链和轻链的错配，并且还减少了表达本发明的一些双特异性抗原结合分子所需的质粒数量。
抗原结合部分可以直接或通过肽连接基与Fc结构域融合(或彼此融合)，所述肽连接基包含一个或多个氨基酸，通常为约2-20个氨基酸。肽连接基是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性肽连接基包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽连接基。“n”通常为1至10的整数，通常为2至4。在一个实施例中，所述肽连接基的长度为至少5个氨基酸，在一个实施例中长度为5至100个氨基酸，在另一实施例中为10至50个氨基酸。在一个实施例中，所述肽连接基是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且(x＝3、n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4、n＝2、3、4或5并且m＝0、1、2或3)，在一个实施例中，x＝4并且n＝2或3，在另一实施例中，x＝4并且n＝2。在一个实施例中，所述肽连接基是(G4S)2。用于使第一Fab分子和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合的特别合适的肽连接基是(G4S)2。适于连接第一Fab片段和第二Fab片段的Fab重链的一种示例性肽连接基包含序列(D)-(G4S)2(SEQ ID NO 43和44)。另一种合适的此类连接基包含序列(G4S)4。另外，连接基可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，在Fab分子与Fc结构域亚基的N末端融合的情况下，可以在具有或没有另外的肽连接基的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，所述Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))，以及这样的多肽，在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在某些实施例中，多肽例如通过二硫键共价连接。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，所述Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4))，以及这样的多肽，在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在某些实施例中，多肽例如通过二硫键共价连接。
在一些实施例中，双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，所述Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，所述第一Fab分子的Fab重链继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其他实施例中，双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，所述Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。
在一些这样的实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含第二Fab分子的交叉Fab轻链多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在其他这样的实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含一种多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VL(1)-CL(1))，或其中第一Fab分子的Fab轻链多肽与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))，视情况而定。
根据这些实施例的双特异性抗原结合分子可进一步包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中第三Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，和第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些实施例中，多肽例如通过二硫键共价连接。
在一些实施例中，双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，所述Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，所述第一Fab分子的Fab重链继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其他实施例中，双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，所述Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4))。
在一些这样的实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含第二Fab分子的交叉Fab轻链多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在其他这样的实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含一种多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1))，或其中第一Fab分子的Fab轻链多肽与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1)-VL(2)-CH1(2))，视情况而定。
根据这些实施例的双特异性抗原结合分子可进一步包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中第三Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，和第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些实施例中，多肽例如通过二硫键共价连接。
在某些实施例中，双特异性抗原结合分子不包含Fc结构域。在此类具体实施例中，所述第一和第三Fab分子(如果存在)各自是常规Fab分子，并且第二Fab分子是如本文所述的交叉Fab分子，即这样的Fab分子，在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他此类实施例中，所述第一和第三Fab分子(如果存在)各自是交叉Fab分子，并且第二Fab分子是常规Fab分子。
在一个此类实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合部分以及任选地一个或多个肽连接基组成，其中第一和第二抗原结合部分都是Fab分子，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合部分的Fab重链的N末端。这种构型在图1O和1S中示意性地描绘(在这些实例中，第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子并且第一抗原结合部分是常规Fab分子)。
在另一此类实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一和第二抗原结合部分以及任选地一个或多个肽连接基组成，其中第一和第二抗原结合部分都是Fab分子，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合部分的Fab重链的N末端。这种构型在图1P和1T中示意性地描绘(在这些实例中，第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子并且第一抗原结合部分是常规Fab分子)。
在一些实施例中，第一Fab分子在Fab重链的C末端融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且双特异性抗原结合分子进一步包含第三抗原结合部分，特别是第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端。在某些此类实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一、第二和第三Fab分子以及任选地一个或多个肽连接基组成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端融合至第二Fab分子的Fab重链的N末端，并且第三Fab分子在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端。这种构型示意性地描述于图1Q和1U(在这些实例中，第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子，第一和第三抗原结合部分各自是常规Fab分子)，和图1X和1Z(在这些实例中，第二抗原结合结构域是常规Fab分子，第一和第三抗原结合部分各自是VH/VL交叉Fab分子)。
在一些实施例中，第二Fab分子在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且双特异性抗原结合分子进一步包含第三抗原结合部分，特别是第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的N末端融合至第一Fab分子的Fab重链的C末端。在某些此类实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一、第二和第三Fab分子以及任选地一个或多个肽连接基组成，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端融合至第一Fab分子的Fab重链的N末端，并且第三Fab分子在Fab重链的N末端融合至第一Fab分子的Fab重链的C末端。这种构型示意性地描述于图1R和1V(在这些实例中，第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子，第一和第三抗原结合部分各自是常规Fab分子)，和图1W和1Y(在这些实例中，第二抗原结合结构域是常规Fab分子，第一和第三抗原结合部分各自是VH/VL交叉Fab分子)。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，所述Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，所述Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，所述Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中，第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，所述第一Fab分子的Fab重链继而与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中，第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，所述第一Fab分子的Fab重链继而与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，所述第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，所述Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，所述第一Fab分子的Fab重链继而与第三Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，所述Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，所述第一Fab分子的Fab重链继而与第三Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，而第一Fab分子的Fab轻链可变区继而与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，第一Fab分子的Fab重链恒定区继而与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-VL(3)-CH1(3))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))并且与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含这样的多肽，在所述多肽中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3))。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，而第一Fab分子的Fab重链可变区继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，第一Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-VH(3)-CL(3))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))并且与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3))。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，第三Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，第一Fab分子的Fab轻链可变区继而与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，第一Fab分子的Fab重链恒定继而与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3)-VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))并且与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含这样的多肽，在所述多肽中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3))。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含这样的多肽，在所述多肽中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，第三Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，第一Fab分子的Fab重链可变区继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，第一Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3)-VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))并且与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽，在所述多肽中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3))。
在一具体实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:84的HCDR 2和SEQ ID NO:86的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；
c)结合第一抗原并且与第一抗原结合部分相同的第三抗原结合部分；和
d)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成，
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一具体实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:85的HCDR 2和SEQ ID NO:86的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；
c)结合第一抗原并且与第一抗原结合部分相同的第三抗原结合部分；和
d)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成，
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一具体实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；
c)结合第一抗原并且与第一抗原结合部分相同的第三抗原结合部分；和
d)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成，
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一具体实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；
c)结合第一抗原并且与第一抗原结合部分相同的第三抗原结合部分；和
d)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成，
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一具体实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:92的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；
c)结合第一抗原并且与第一抗原结合部分相同的第三抗原结合部分；和
d)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成，
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一具体实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；
c)结合第一抗原并且与第一抗原结合部分相同的第三抗原结合部分；和
d)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成，
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一具体实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:8的HCDR 2和SEQ ID NO:9的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；
c)结合第一抗原并且与第一抗原结合部分相同的第三抗原结合部分；和
d)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成，
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在另一实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:84的HCDR 2和SEQ ID NO:86的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分和依据b)的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
在另一实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:85的HCDR 2和SEQ ID NO:86的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分和依据b)的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
在另一实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分和依据b)的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
在另一实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分和依据b)的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
在另一实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:92的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分和依据b)的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
在另一实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分和依据b)的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
在另一实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:8的HCDR 2和SEQ ID NO:9的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分和依据b)的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
在根据本发明的双特异性抗原结合分子的所有不同构型中，本文所述的氨基酸取代(如果存在的话)可以在第一和(如果存在)第三抗原结合部分/Fab分子的CH1和CL结构域中，或者在第二抗原结合部分/Fab分子的CH1和CL结构域中。优选地，它们在第一和(如果存在)第三抗原结合部分/Fab分子的CH1和CL结构域中。根据本发明的概念，如果在第一(和如果存在的第三)抗原结合部分/Fab分子中进行如本文所述的氨基酸取代，则在第二抗原结合部分/Fab分子中不进行此类氨基酸取代。相反地，如果在第二抗原结合部分/Fab分子中进行如本文所述的氨基酸取代，则在第一(和如果存在的第三)抗原结合部分/Fab分子中不进行此类氨基酸取代。氨基酸取代特别地在包含这样的Fab分子的双特异性抗原结合分子中进行，在所述Fab分子中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH1彼此替换。
在根据本发明的双特异性抗原结合分子的具体实施例中，特别地其中如本文所述的氨基酸取代是在第一(和如果存在的第三)抗原结合部分/Fab分子中进行的，并且第一(和如果存在的第三)Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型的。在根据本发明的双特异性抗原结合分子的其他实施例中，特别地其中如本文所述的氨基酸取代是在第二抗原结合部分/Fab分子中进行的，并且第二抗原结合部分/Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型的。在一些实施例中，第一(和如果存在的第三)抗原结合部分/Fab分子的恒定结构域CL和第二抗原结合部分/Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型的。
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:84的HCDR 2和SEQ ID NO:86的HCDR 3；轻链可变区包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:85的HCDR 2和SEQ ID NO:86的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:92的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:8的HCDR 2和SEQ ID NO:9的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一具体实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:84的HCDR 2和SEQ ID NO:86的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)结合第一抗原并且与第一抗原结合部分相同的第三抗原结合部分；和
d)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成，
其中在依据a)的第一抗原结合部分和依据c)的第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在依据a)的第一抗原结合部分和依据c)的第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一具体实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:85的HCDR 2和SEQ ID NO:86的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)结合第一抗原并且与第一抗原结合部分相同的第三抗原结合部分；和
d)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成，
其中在依据a)的第一抗原结合部分和依据c)的第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在依据a)的第一抗原结合部分和依据c)的第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一具体实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)结合第一抗原并且与第一抗原结合部分相同的第三抗原结合部分；和
d)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成，
其中在依据a)的第一抗原结合部分和依据c)的第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在依据a)的第一抗原结合部分和依据c)的第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一具体实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)结合第一抗原并且与第一抗原结合部分相同的第三抗原结合部分；和
d)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成，
其中在依据a)的第一抗原结合部分和依据c)的第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在依据a)的第一抗原结合部分和依据c)的第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一具体实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:92的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)结合第一抗原并且与第一抗原结合部分相同的第三抗原结合部分；和
d)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成，
其中在依据a)的第一抗原结合部分和依据c)的第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在依据a)的第一抗原结合部分和依据c)的第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一具体实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)结合第一抗原并且与第一抗原结合部分相同的第三抗原结合部分；和
d)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成，
其中在依据a)的第一抗原结合部分和依据c)的第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在依据a)的第一抗原结合部分和依据c)的第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在一具体实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:8的HCDR 2和SEQ ID NO:9的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)结合第一抗原并且与第一抗原结合部分相同的第三抗原结合部分；和
d)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成，
其中在依据a)的第一抗原结合部分和依据c)的第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在依据a)的第一抗原结合部分和依据c)的第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中
(i)依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
(ii)依据b)的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据a)的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据a)的第一抗原结合部分b)和依据c)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据d)的Fc结构域的一个亚基的N末端，或
在另一实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:84的HCDR 2和SEQ ID NO:86的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中依据a)的第一抗原结合部分和依据b)的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
在另一实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:85的HCDR 2和SEQ ID NO:86的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中依据a)的第一抗原结合部分和依据b)的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
在另一实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中依据a)的第一抗原结合部分和依据b)的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
在另一实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:91的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中依据a)的第一抗原结合部分和依据b)的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
在另一实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:92的HCDR 2和SEQ ID NO:93的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中依据a)的第一抗原结合部分和依据b)的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
在另一实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:2的HCDR 2和SEQ ID NO:3的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中依据a)的第一抗原结合部分和依据b)的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
在另一实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一抗原结合部分，其中第一抗原是GPRC5D，并且第一抗原结合部分是Fab分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:8的HCDR 2和SEQ ID NO:9的HCDR 3，轻链可变区包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR3；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分，其中第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，特别是CD3ε，并且第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；并且
其中依据a)的第一抗原结合部分和依据b)的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
根据以上实施例中的任一个，双特异性抗原结合分子的组分(例如Fab分子、Fc结构域)可以直接融合或通过在本文中描述或在本领域中已知的各种连接基融合，特别是包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸的肽连接基。合适的非免疫原性肽连接基包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽连接基，其中“n”通常是1至10的整数，通常是2至4。
在一个具体方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一和第三抗原结合部分；其中第一抗原是GPRC5D并且其中第一和第二抗原结合部分各自是(常规)Fab分子，其包括包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分；其中第二抗原是CD3，并且其中第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换，包括包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链可变区；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中
在根据a)的第一和第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中根据a)的第一和第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；
并且其中进一步地
依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据a)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
在一个具体方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：
a)结合第一抗原的第一和第三抗原结合部分；其中第一抗原是GPRC5D并且其中第一和第二抗原结合部分各自是(常规)Fab分子，其包括包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区；
b)结合第二抗原的第二抗原结合部分；其中第二抗原是CD3，并且其中第二抗原结合部分是Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换，包括包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链可变区；
c)Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成；
其中
在根据a)的第一和第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代)，并且其中根据a)的第一和第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)；
并且其中进一步地
依据a)的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至依据b)的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且依据b)的第二抗原结合部分b)和依据a)的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至依据c)的Fc结构域的一个亚基的N末端。
在根据本发明的这方面中的一个实施例中，在所述Fc结构域的所述第一亚基中，366位的苏氨酸残基被替换为色氨酸残基(T366W)；而在所述Fc结构域的所述第二亚基中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替代，并且任选地，366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替代并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替代(根据Kabat的EU索引编号)。
在根据本发明的这方面中的另一实施例，在所述Fc结构域的第一亚基中，除此之外，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换)，并且在所述Fc结构域的第二亚基中，除此之外，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。
在根据本发明的这方面中的又一实施例中，在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中，234位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替代(L234A)，235位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替代(L235A)，并且329位的脯氨酸残基被用甘氨酸残基替代(P329G)(根据Kabat的EU索引编号)。
在根据本发明的这方面中的又一实施例中，Fc结构域是人IgG1 Fc结构域。
在特定的具体实施例中，双特异性抗原结合分子包括：含有与SEQ ID NO:17氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ IDNO:18氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:19氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:20氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽。在另一特定的具体实施例中，双特异性抗原结合分子包括：含有如SEQ IDNO:17所示氨基酸序列的多肽、含有如SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的多肽、含有如SEQ IDNO:19所示氨基酸序列的多肽和含有如SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的多肽。
在另一特定的实施例中，双特异性抗原结合分子包括：含有与SEQ ID NO:21氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ IDNO:22氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:23氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽，以及含有与SEQ ID NO:24氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽。在另一特定的实施例中，双特异性抗原结合分子包括：含有如SEQ ID NO:21氨基酸序列的多肽、含有如SEQ ID NO:22氨基酸序列的多肽、含有如SEQ ID NO:23氨基酸序列的多肽和含有如SEQ ID NO:24氨基酸序列的多肽。
Fc结构域
在具体实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。应理解，本文描述的与双特异性抗原结合分子相关的Fc结构域的特征可同样适用于包含在本发明抗体中的Fc结构域。
双特异性抗原结合分子的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。在一个实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含不超过一个Fc结构域。
在一个实施例中，双特异性抗原结合分子的Fc结构域是IgG Fc结构域。在一个特定实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个实施例中，Fc结构域是IgG4 Fc结构域。在一个更具体的实施例中，Fc结构域是IgG4 Fc结构域，所述结构域包含S228位的氨基酸取代(Kabat EU索引编号)，特别是氨基酸取代S228P。该氨基酸取代减少了IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在另一特定实施例中，Fc结构域是人Fc结构域。在一个甚至更特定的实施例中，Fc结构域是人IgG1 Fc结构域。人IgG1 Fc区的示例性序列以SEQ ID NO:42给出。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
根据本发明的双特异性抗原结合分子包含与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合部分，因此所述Fc结构域的两个亚基通常包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高双特异性抗原结合分子的产率和纯度，因此将有利的是在双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰。
因此，在具体实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个实施例中，所述修饰位于Fc结构域的CH3结构域中。
存在几种对Fc结构域的CH3结构域进行修饰以实施异二聚化的方法，这些方法例如在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO2013157954、WO 2013096291中详细描述。通常，在所有此类方法中，Fc结构域的第一亚基的CH3结构域和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域都以互补的方式工程化，使得每个CH3结构域(或包含其的重链)可以不再与其自身同源二聚化，而是被迫与互补工程化的其他CH3结构域异源二聚化(使得第一和第二CH3结构域异源二聚化并且在两个第一或两个第二CH3结构域之间不形成同源二聚体)。这些用于实现改善的重链异源二聚化的不同方法被认为是与双特异性抗原结合分子中的重-轻链修饰(例如在一个结合臂中进行VH和VL交换/替换并且在CH1/CL界面中引入带有相反电荷的荷电氨基酸的取代)组合的不同替代方案，所述不同替代方案减少重链/轻链错配和Bence Jones型副产物。
在一个具体实施例中，所述促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰是所谓的“突出物入孔”修饰，所述修饰包含在Fc结构域的两个亚基中的一个亚基中进行“突出物”修饰并且在Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中进行“孔”修饰。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得所述突起可以定位在所述空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一个特定实施例中，在双特异性抗原结合分子的Fc结构域的所述第一亚基的所述CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在所述第一亚基的所述CH3结构域内产生突起，所述突起可定位在所述第二亚基的所述CH3结构域内的空腔中，并且在所述Fc结构域的所述第二亚基的所述CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在所述第二亚基的所述CH3结构域内产生空腔，所述第一亚基的所述CH3结构域内的所述突起可定位在所述空腔内。
优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组。
优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。
突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。
在一个具体实施例中，在Fc结构域的第一亚基(“突出物”亚基)(的CH3结构域)中，366位的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替代，并且在Fc结构域的第二亚基(“孔”亚基)(的CH3结构域)中，407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替代。在一个实施例中，在Fc结构域的第二亚基中，另外地366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替代，并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替代(根据Kabat的EU索引编号)。
在又一个实施例中，在Fc结构域的第一亚基中，另外地354位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替代或356位的谷氨酸残基被半胱氨酸残基(E356C)替代(特别地354位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基取代)，并且在Fc结构域的第二亚基中，另外地349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替代(根据Kabat的EU索引编号)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定所述二聚体(Carter,JImmunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个特定实施例中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat的EU索引编号)。
在一具体实施例中，结合第二抗原(例如活化性T细胞抗原)的抗原结合部分融合(任选地通过结合GPRC5D的第一抗原结合部分和/或肽连接基)至Fc结构域的第一亚基(包含“杵”修饰)。不希望受理论束缚，结合第二抗原(例如活化性T细胞抗原)的抗原结合部分与Fc结构域的含杵亚基的融合将(进一步)最小化包含两个结合活化性T细胞抗原的抗原结合部分的抗原结合分子的产生(两个含杵多肽的空间冲突)。
用于实施异源二聚化的其他CH3修饰技术被设想为根据本发明的替代方案，并且描述于例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO2013/157954、WO 2013/096291中。
在一个实施例中，可替代地使用EP 1870459中描述的异源二聚化方法。该方法基于在Fc结构域的两个亚基之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨基酸位置处引入带有相反电荷的荷电氨基酸。本发明的双特异性抗原结合分子的一个优选实施例是氨基酸突变R409D；在(Fc结构域的)两个CH3结构域中的一个中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的另一个CH3结构域中的E357K(编号根据Kabat EU索引)。
在另一个实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366S、L368A、Y407V，以及另外地氨基酸突变R409D；在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(编号根据Kabat EU索引)。
在另一个实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366S、L368A、Y407V，或者所述双特异性抗原结合分子包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366S、L368A、Y407V，以及另外地氨基酸突变R409D；在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E，以及氨基酸突变D399K；在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(所有根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2013/157953中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366K，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变L351D(编号根据Kabat EU索引)。在另一实施例中，第一CH3结构域包含另外的氨基酸突变L351K。在另一实施例中，第二CH3结构域还包含选自由Y349E、Y349D和L368E(优选L368E)组成的组的氨基酸突变(编号根据Kabat EU索引)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2012/058768中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一实施例中，第二CH3结构域包含在T411、D399、S400、F405、N390或K392位的进一步氨基酸突变，例如选自由以下项组成的组：a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W，b)D399R、D399W、D399Y或D399K，c)S400E、S400D、S400R或S400K，d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W，e)N390R、N390K或N390D，f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E(编号根据Kabat EU索引)。在另一实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366V、K409F。在另一实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一实施例中，第二CH3结构域还包含氨基酸突变K392E、T411E、D399R和S400R(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2011/143545中描述的异源二聚化方法，例如在选自由368和409组成的组的位置处进行氨基酸修饰(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施例中，替代地使用WO 2011/090762中描述的异源二聚化方法，该异源二聚化方法也使用上述突出物入孔技术。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366W，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407A。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366Y，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407T(编号根据Kabat EU索引)。
在一个实施例中，双特异性抗原结合分子或其Fc结构域为IgG2亚类，并且替代地使用在WO 2010/129304中描述的异源二聚化方法。
在一个替代实施例中，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。在一个此类实施例中，第一CH3结构域包含用带负电荷的氨基酸对K392或N392进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选K392D或N392D)，并且第二CH3结构域包含用带正电荷的氨基酸对D399、E356、D356或E357进行的氨基酸取代(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R)，优选D399K、E356K、D356K或E357K，更优选D399K和E356K)。在另一实施例中，第一CH3结构域还包含用带负电荷的氨基酸对K409或R409进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选K409D或R409D)。在另一实施例中，第一CH3结构域进一步或替代地包含用带负电荷的氨基酸对K439和/或K370进行的氨基酸取代，(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))(所有根据Kabat的EU索引编号)。
在又一实施例中，替代地使用WO 2007/147901中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变K253E、D282K和K322D，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变D239K、E240K和K292D(根据Kabat的EU索引编号)。
在又一实施例中，可替代地使用WO 2007/110205中描述的异源二聚化方法。
在一个实施例中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代K392D和K409D，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代D356K和D399K(根据Kabat编号EU指数)。
减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
Fc结构域赋予双特异性抗原结合分子(或抗体)有利的药代动力学性质，包括有助于在靶组织中良好积累的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，与此同时它可能导致将双特异性抗原结合分子(或抗体)不希望地靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的携带抗原的细胞。此外，Fc受体信号传导通路的共活化可导致细胞因子释放，这与T细胞活化特性(例如在双特异性抗原结合分子的实施例中，其中第二抗原结合部分与活化性T细胞抗原结合)以及双特异性抗原结合分子的长半衰期相组合，导致细胞因子受体的过度活化和全身给药时的严重副作用。由于T细胞潜在的破坏(例如被NK细胞)，T细胞以外的(带有Fc受体的)免疫细胞的活化甚至可能降低双特异性抗原结合分子(特别是其中第二抗原结合部分与活化T细胞抗原结合的双特异性抗原结合分子)的功效。
因此，在具体实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比，根据本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个此类实施例中，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子)表现出与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的双特异性抗原结合分子)相比小于50％，优选小于20％，更优选小于10％并且最优选小于5％的结合亲和力，和/或与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的双特异性抗原结合分子)相比小于50％，优选小于20％，更优选小于10％并且最优选小于5％的效应子功能。在一个实施例中，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子)基本上不结合Fc受体和/或诱导效应子功能。在一个特定实施例中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施例中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别地是人FcγRIIIa。在一个实施例中，效应子功能是选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的组中的一种或多种效应子功能。在一个特定实施例中，效应子功能是ADCC。在一个实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比，Fc结构域对新生Fc受体(FcRn)表现出基本相似的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子)表现出天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％，特别地大于约80％，更特别地大于约90％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合。
在某些实施例中，Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在特定实施例中，双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含一个或多个氨基酸突变，该一个或多个氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。在一个实施例中，氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施例中，氨基酸突变将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在存在多于一个降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施例中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍，或甚至至少50倍。在一个实施例中，与包含非工程化的Fc结构域的双特异性抗原结合分子相比，包含工程化的Fc结构域的双特异性抗原结合分子表现出对Fc受体的结合亲和力的小于20％，特别地小于10％，更特别地小于5％。在一个特定实施例中，Fc受体是Fcγ受体。在一些实施例中，Fc受体是人Fc受体。在一些实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别地是人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中的每一个的结合降低。在一些实施例中，对补体组分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力也降低。在一个实施例中，对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当所述Fc结构域(或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子)表现出非工程化形式的所述Fc结构域(或包含非工程化形式的所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合，即保持了Fc结构域对所述受体的结合亲和力。Fc结构域或包含该Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子可表现出这种亲和力的大于约80％或甚至大于约90％。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子的Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可包括但不限于以下项中的一种或多种：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导的细胞凋亡、减少的靶结合抗体的交联、减少的树突细胞成熟，或减少的T细胞致敏。在一个实施例中，降低的效应子功能是选自降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和减少的细胞因子分泌的组中的一种或多种降低的效应子功能。在一个特定实施例中，降低的效应子功能是降低的ADCC。在一个实施例中，降低的ADCC为由非工程化的Fc结构域(或包含所述非工程化的Fc结构域的双特异性抗原结合分子)诱导的ADCC的小于20％。
在一个实施例中，降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中，Fc结构域包含在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329的组的位置处的氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号)。在一个更具体的实施例中，Fc结构域包含在选自L234、L235和P329的组的位置处的氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号)。在一些实施例中，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat的EU索引编号)。在一个此类实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别地是人IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，Fc结构域包含在P329位的氨基酸取代。在一个更具体的实施例中，氨基酸取代是P329A或P329G，特别地是P329G(根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施例中，Fc结构域包含在P329位的氨基酸取代，以及在选自E233、L234、L235、N297和P331位的进一步氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号)。在一个更具体的实施例中，所述进一步氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定实施例中，Fc结构域包含在P329、L234和L235位的氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号)。在更特定的实施例中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”、“PGLALA”或“LALAPG”)。具体地，在特定实施例中，Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)，即在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中，234位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替代(L234A)，235位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替代(L235A)，并且329位的脯氨酸残基被用甘氨酸残基替代(P329G)(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个此类实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别地是人IgG1Fc结构域。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体(以及补体)结合，如在PCT公开号WO 2012/130831中所述，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。WO2012/130831还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和确定其性质(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。
与IgG1抗体相比，IgG4抗体表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。因此，在一些实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域是IgG4 Fc结构域，特别地是人IgG4 Fc结构域。在一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含在S228位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代S228P(根据Kabat的EU索引编号)。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应子功能，在一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含L235位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代L235E(根据Kabat的EU索引编号)。在另一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含P329位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代P329G(根据Kabat的EU索引编号)。在一个特定实施例中，IgG4 Fc结构域包含S228、L235和P329位的氨基酸取代，特别地是氨基酸取代S228P、L235E和P329G(根据Kabat的EU索引编号)。这种IgG4 Fc结构域突变体以及它们的Fcγ受体结合性质描述于PCT公开号WO 2012/130831中，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。
在一个特定实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的Fc结构域是包含氨基酸取代L234A、L235A和任选地P329G的人IgG1 Fc结构域，或包含氨基酸取代S228P、L235E和任选地P329G的人IgG4 Fc结构域(根据Kabat的EU索引编号)。
在某些实施例中，已消除了Fc结构域的N糖基化。在一个此类实施例中，Fc结构域包含N297位的氨基酸突变，特别地是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替代天冬酰胺的氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号)。
除了上文和PCT公开号WO 2012/130831中所述的Fc结构域外，具有减少的Fc受体结合和/或降低的效应子功能的Fc结构域还包括具有对Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些Fc结构域(美国专利号6,737,056)(根据Kabat的EU索引编号)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸中两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
可以使用本领域熟知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。或者，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)，来评估Fc结构域或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。
Fc结构域或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子的效应子功能可通过本领域已知的方法测量。用于评定感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)中。另选地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0003492810530001161
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应物细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的ADCC活性。
在一些实施例中，Fc结构域与补体组分，特别是C1q的结合减少。因此，在一些实施例中，其中Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定Fc结构域或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。
FcRn结合和体内清除率/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929)。
多核苷酸
本发明还提供了编码如本文所述的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸。在一些实施例中，所述片段是抗原结合片段。
编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的分离的多核苷酸可以表达为编码完整抗体或双特异性抗原结合分子的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他手段缔合以形成功能性抗体或双特异性抗原结合分子。例如，抗体或双特异性抗原结合分子的轻链部分可由与包含抗体或双特异性抗原结合分子重链的抗体或双特异性抗原结合分子部分分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成抗体或双特异性抗原结合分子。在另一实例中，包含两个Fc结构域亚基之一和任选地一个或多个Fab分子(部分)的抗体或双特异性抗原结合分子的部分可以由与抗体或双特异性抗原结合分子的包含两个Fc结构域亚基中的另一个和任选地Fab分子(部分)的部分分开的多核苷酸编码。当共表达时，Fc结构域亚基将缔合以形成Fc结构域。
在一些实施例中，分离的多核苷酸编码如本文所述的根据本发明的整个抗体或双特异性抗原结合分子。在其它实施例中，分离的多核苷酸编码包含在如本文所述的根据本发明的抗体或双特异性抗原结合分子中的多肽。
在某些实施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
本发明的抗体或双特异性抗原结合分子可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。对于重组生产，将例如如上所述的编码抗体或双特异性抗原结合分子(片段)的一种或多种多核苷酸分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在一个实施例中，提供了一种载体，优选为表达载体，该载体包含本发明的多核苷酸中的一种或多种多核苷酸。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有抗体或双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如以下文献所述的技术：Maniatis等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y(1989)。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码抗体或双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，该异源编码区与编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的键结性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，所述附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌抗体或双特异性抗原结合分子，可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的核酸的上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与所述多肽的N末端融合的信号肽，所述信号肽被从翻译的多肽上切割下来以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施例中，使用天然信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留指导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。另选地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。
编码可用于促进后续纯化的短蛋白质序列(例如组氨酸标签)或帮助标记抗体或双特异性抗原结合分子的DNA可包含在抗体或双特异性抗原结合分子(片段)编码多核苷酸的内部或末端。
在另一实施例中，提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施例中，提供了包含一种或多种本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个此类实施例中，宿主细胞包含一种或多种载体(例如已经用一种或多种载体转化或转染)，该一种或多种载体包含编码本发明抗体或双特异性抗原结合分子(部分)的一种或多种多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持抗体或双特异性抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的抗体或双特异性抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,Nat Biotech22,1409-1414(2004)和Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J GenVirol 36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci383,44-68(1982)中所述)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，ProcNatl Acad Sci USA 77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methodsin Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。
用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。可以对表达包含抗原结合结构域例如抗体的重链或轻链的多肽的细胞进行工程化，以便也表达另一条抗体链，使得表达的产物为具有重链和轻链的抗体。
在一个实施例中，提供一种制备根据本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的方法，其中该方法包括在适于表达抗体或双特异性抗原结合分子的条件下培养本文所提供的包含编码抗体或双特异性抗原结合分子的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该抗体或双特异性抗原结合分子。
本发明的双特异性抗原结合分子(或抗体)的组分可以彼此遗传融合。可以设计双特异性抗原结合分子以使其组分彼此直接融合或通过连接基序列间接融合。连接基的组成和长度可以根据本领域熟知的方法测定，并且可以测试连接基的功效。本文提供了双特异性抗原结合分子的不同组分之间的连接基序列的实例。如果需要的话，还可包括另外的序列(例如内肽酶识别序列)以掺入切割位点来分离融合的各个组分。
本发明的抗体或双特异性抗原结合分子通常至少包含能够结合抗原决定簇的抗体可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分并由其衍生。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane，"Antibodies,alaboratory manual",Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如在美国专利号4,186,567中所述)，或者可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如McCafferty的美国专利号5,969,108)。
任何动物种类的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可用于本发明的抗体或双特异性抗原结合分子中。可用于本发明的非限制性抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可以是鼠、灵长类动物或人来源的。如果抗体或双特异性抗原结合分子旨在用于人类使用，则可以使用嵌合形式的抗体，其中该抗体的恒定区来自人。也可以根据本领域熟知的方法来制备人源化或完全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可通过各种方法实现，所述各种方法包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)架构和恒定区上，所述架构和恒定区有或没有保留关键架构残基(例如对于保持良好的抗原结合亲和力或抗体功能来说重要的关键架构残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人架构和恒定区上，或者(c)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基而用人样区段“隐藏”它们。人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳匹配”方法选择的框架区(参见例如Sims等人，J.Immunol.151:2296(1993))；来源于具有轻链或重链可变区的特定子组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人，J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人类种系框架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol20,450-459(2008)中。可以通过以下方式来制备人抗体：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座，或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述
Figure BDA0003492810530001231
技术的美国专利号5,770,429；描述K-M
Figure BDA0003492810530001232
技术的美国专利号7,041,870，以及描述
Figure BDA0003492810530001233
技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。可以进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人，J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。
如本文所述，还可以通过从人抗体文库中分离来产生人抗体。
可以通过筛选组合文库中具有一种或多种所需活性的抗体来分离可用于本发明的抗体。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner等人，Nature Reviews 16:498-508(2016)中。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有所需结合特征的抗体。此类方法综述于例如Frenzel等人，mAbs 8:1177-1194(2016)；Bazan等人，Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828(2012)和Zhao等人，Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289(2016)中，以及Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编辑，Human Press,Totowa,NJ,2001)中和Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编辑，Human Press,Totowa,NJ,2003)中。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全部集合通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以从所述噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体，如在Winter等人，Annual Review of Immunology 12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。可替代地，可以克隆所有天然组成成分(例如，来自人的所有天然组成成分)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的抗体的单一来源，而无需任何免疫，如由Griffiths等人在EMBO Journal 12:725-734(1993)中所描述的。最后，还通过以下方式来合成天然文库：克隆来自干细胞的未重排的V基因区段；以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并完成体外重排，如由Hoogenboom和Winter在Journal of Molecular Biology 227:381-388(1992)中所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373；7,985,840；7,785,903和8,679,490以及美国专利公开号2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764和2007/0292936。本领域已知用于筛选具有一种或多种所需活性的抗体的组合文库的方法的其他实例包括核糖体和mRNA展示，以及对细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞进行抗体展示和选择的方法。用于酵母表面展示的方法综述于例如Scholler等人，Methods in MolecularBiology 503:135-56(2012)和Cherf等人，Methods in Molecular biology 1319:155-175(2015)以及Zhao等人，Methods in Molecular Biology 889:73-84(2012)中。用于核糖体展示的方法描述于例如He等人，Nucleic Acids Research 25:5132-5134(1997)和Hanes等人，PNAS 94:4937-4942(1997)中。
如本文所述制备的抗体或双特异性抗原结合分子可通过本领域已知的技术纯化，这些技术为诸如高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱法纯化，可以使用抗体或双特异性抗原结合分子结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明抗体或双特异性抗原结合分子的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离抗体或双特异性抗原结合分子。抗体或双特异性抗原结合分子的纯度可以通过各种熟知的分析方法中任一者来确定，所述熟知的分析方法包括凝胶电泳法、高压液相色谱法等。
测定
本文所提供的抗体或双特异性抗原结合分子的物理/化学性质和/或生物学活性可通过本领域中已知的各种测定法进行鉴定、筛选或表征。
亲和力测定
抗体或双特异性抗原结合分子对Fc受体或靶抗原的亲和力可以例如使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)以及可通过重组表达获得的受体或靶蛋白，通过表面等离子体共振(SPR)来确定。可替代地，抗体或双特异性抗原结合分子与不同受体或靶抗原的结合可以使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估，例如通过流式细胞术(FACS)。下文描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。
根据一个实施例，在25℃下使用
Figure BDA0003492810530001251
T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振来测量KD。
为了分析Fc部分和Fc受体之间的相互作用，His标记的重组Fc受体被固定在CM5芯片上的抗五组氨酸抗体(Qiagen)捕获，双特异性构建体用作分析物。简而言之，根据供应商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物感测器芯片(CM5,GE Healthcare)。将抗五-组氨酸抗体用10mM醋酸钠pH 5.0稀释至40μg/ml，之后以5μl/min的流速进行注射以获得大约6500响应单位(RU)的偶联蛋白。注射配体之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。随后Fc受体在4或10nM下被捕获60秒。对于动力学测量，将抗体或双特异性抗原结合分子的四倍系列稀释液(范围在500nM和4000nM之间)在25℃下以30μl/min的流速持续120秒注射到HBS-EP(GEHealthcare，10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)中。
为了确定对靶抗原的亲和力，抗体或双特异性抗原结合分子被固定在活化的CM5传感器芯片表面上的抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare)捕获，如针对抗五组氨酸抗体所述。偶联蛋白的最终量约为12000RU。抗体或双特异性抗原结合分子在300nM下被捕获90秒。靶抗原以250到1000nM的浓度范围以30μl/min的流速通过流动池持续180秒。监控解离180秒。
通过减去在参考流动池获得的应答来校正本体折射率差异。稳态响应用于通过朗缪尔结合等温线的非线性曲线拟合导出解离常数KD。使用简单的一对一朗缪尔结合模型(
Figure BDA0003492810530001261
T100 Evaluation Software 1.1.1版)，通过同时拟合缔合与解离感测器图来计算缔合速率(kon)与解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。参见例如Chen等人，J Mol Biol 293,865-881(1999)。
活性测定
本发明的双特异性抗原结合分子(或抗体)的生物活性可以通过如实例中所述的各种测定法来测量。生物活性可以例如包括T细胞增殖的诱导、T细胞中信号传导的诱导、T细胞中活化标志物表达的诱导、T细胞细胞因子分泌的诱导、靶细胞(例如肿瘤细胞)裂解的诱导，以及肿瘤消退的诱导和/或提高生存。
组合物、配方和施用途径
在进一步方面，本发明提供了包含本文提供的抗体或双特异性抗原结合分子中任一者的药物组合物，其例如用于以下治疗方法中的任一者中。在一个实施例中，药物组合物包含本文提供的抗体或双特异性抗原结合分子中任一者以及药用载体。在另一实施例中，药物组合物包含本文提供的抗体或双特异性抗原结合分子中任一者以及如下文所述的至少一种附加治疗剂。
还提供了一种以适于体内施用的形式产生本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的方法，该方法包括(a)获得根据本发明的抗体或双特异性抗原结合分子，以及(b)用至少一种药用载体配制该抗体或双特异性抗原结合分子，由此配制抗体或双特异性抗原结合分子制剂以用于体内施用。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的溶于或分散于药用载体中的抗体或双特异性抗原结合分子。术语“药用”或“药理学可接受”(pharmaceutical orpharmacologically acceptable)是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。含有抗体或双特异性抗原结合分子和任选地附加活性成分的药物组合物的制备将是鉴于本公开而为本领域的技术人员已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990所示例的，该文献通过引用并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应理解制备物应满足FDA生物标准办公室或其他国家/地区相应当局所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所使用的，“药用载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲液、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料，类似物质以及它们的组合，如本领域普通技术人员应已知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990，第1289-1329页，该文献通过引用并入本文)。除了任何常规载体与活性成分不相容的情况之外，所述载体在治疗或药物组合物中的用途是可预期的。
本发明的免疫缀合物(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。投配可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。
肠胃外组合物包括设计用于注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)的那些组合物。为了注射，可在水溶液中配制本发明的抗体或双特异性抗原结合分子，优选在生理相容性缓冲剂诸如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水中配制。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，抗体或双特异性抗原结合分子可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)构建。根据需要，通过将本发明的抗体或双特异性抗原结合分子以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中，来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，所述真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白的安全水平保持最低。合适的药学上可接受的载体包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。
除了先前描述的组合物之外，抗体或双特异性抗原结合分子也可以配制成长效制备物。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，抗体或双特异性抗原结合分子可以用合适的聚合或疏水材料配制(例如作为可接受油中的乳液)或用离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如配制为微溶盐。
包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的药物组合物可借助于常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干工艺进行生产。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。适当的配方取决于所选择的施用途径。
抗体或双特异性抗原结合分子可以配制成以游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药用盐是基本上保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
治疗方法和组合物
本文提供的抗体或双特异性抗原结合分子中任一者可用于治疗方法中。本发明的抗体或双特异性抗原结合分子可用作免疫治疗剂，例如用于治疗癌症。
为了用于治疗方法中，本发明的抗体或双特异性抗原结合分子将按照符合良好医学实践的方式配制、投配和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
在一个方面，将本发明的抗体或双特异性抗原结合分子提供为用作药物。在其它方面，将本发明的抗体或双特异性抗原结合分子提供用于治疗疾病。在某些实施例中，提供了用于治疗方法中的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在一个实施例中，本发明提供了如本文所述的抗体或双特异性抗原结合分子，其用于治疗有此需要的个体的疾病。在某些实施例中，本发明提供了一种用于治疗患有疾病的个体的方法中的抗体或双特异性抗原结合分子，该方法包括向个体施用治疗有效量的抗体或双特异性抗原结合分子。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。在某些实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在进一步的实施例中，本发明提供如本文所述的抗体或双特异性抗原结合分子用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。在某些实施例中，本发明提供了用于在个体中诱导靶细胞特别是肿瘤细胞裂解的方法中使用的抗体或双特异性抗原结合分子，所述方法包括向个体施用有效量的抗体或双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞的裂解。根据任何上述实施例的“个体”是哺乳动物，优选人。在某些实施例中，待治疗的疾病是自身免疫性疾病，特别是系统性红斑狼疮和/或类风湿性关节炎。自身反应性浆细胞产生致病性自身抗体是自身免疫性疾病的标志。因此，GPRC5D可用于靶向自身免疫性疾病中的自身反应性浆细胞。
在另一方面，本发明提供了本发明的抗体或双特异性抗原结合分子在制造或制备药物中的用途。在一个实施例中，所述药物用于治疗有此需要的个体的疾病。在另一实施例中，所述药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向具有所述疾病的个体施用治疗有效量的所述药物。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。在一个实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在进一步的实施例中，药物用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。在又一实施例中，药物用于在个体中诱导靶细胞特别是肿瘤细胞裂解的方法中，包括向个体施用有效量的药物以诱导靶细胞裂解。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
在另一方面，本发明提供了治疗疾病的方法。在一个实施例中，所述方法包括向患有这种疾病的个体施用治疗有效量的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在一个实施例中，向所述个体施用组合物，所述组合物包含药用形式的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。在某些实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
在另一方面，本发明提供了一种用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解的方法。在一个实施例中，该方法包括在存在T细胞，特别是细胞毒性T细胞的情况下，使靶细胞与本发明的抗体或双特异性抗原结合分子接触。在另一方面，提供了一种在个体中诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个这样的实施例中，该方法包括向个体施用有效量的抗体或双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞的裂解。在一个实施例中，个体是人。
在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病，特定是癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌，以及肾癌。可以使用本发明的抗体或双特异性抗原结合分子治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于以下部位中的肿瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经系统(中枢和外周神经系统)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部，以及泌尿生殖系统。还包括癌前病症或病变和癌转移。在某些实施例中，癌症选自由以下项组成的组：肾癌、膀胱癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌和前列腺癌。在一个实施例中，癌症为前列腺癌。本领域技术人员容易认识到，在许多情况下，抗体或双特异性抗原结合分子可能无法提供治愈，而仅可以提供部分益处。在一些实施例中，具有一些益处的生理变化也被认为是治疗上有益的。因此，在一些实施例中，提供生理变化的抗体或双特异性抗原结合分子的量被视为“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是哺乳动物，更特别地是人。
在一些实施例中，将有效量的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子施用于细胞。在其他实施例中，将治疗有效量的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子施用于个体以治疗疾病。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂联合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用途径、患者体重、抗体或双特异性抗原结合分子的类型、疾病的严重程度和进程、抗体或双特异性抗原结合分子是出于预防还是治疗目的施用、先前或同时进行的治疗性干预、患者的临床病史和对抗体或双特异性抗原结合分子的应答以及主治医师的酌处权。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
抗体或双特异性抗原结合分子适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体或双特异性抗原结合分子可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。抗体或双特异性抗原结合分子的一种示例性剂量的范围为约0.005mg/kg至约10mg/kg。在其他非限制性实例中，剂量还可包括每次施用约1微克/kg体重、约5微克/kg体重、约10微克/kg体重、约50微克/kg体重、约100微克/kg体重、约200微克/kg体重、约350微克/kg体重、约500微克/kg体重、约1毫克/kg体重、约5毫克/kg体重、约10毫克/kg体重、约50毫克/kg体重、约100毫克/kg体重、约200毫克/kg体重、约350毫克/kg体重、约500毫克/kg体重，至约1000mg/kg体重或更多，以及从其中推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的非限制性实例中，约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5微克/kg体重至约500毫克/kg体重等的范围可以基于上述数值施用。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约二至约二十或例如约六个剂量的抗体或双特异性抗原结合分子)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
本发明的抗体或双特异性抗原结合分子将通常以有效实现预期目的量使用。为用于治疗或预防病症，将本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
对于全身施用，治疗有效剂量可以最初根据体外测定(诸如细胞培养物测定)来进行估计。可以随后在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC50循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。
初始剂量也可以使用本领域公知的技术，根据体内数据(例如动物模型)来估计。本领域的普通技术人员可以基于动物数据来容易地优化对人的施用。
剂量和间隔可以单独地调节，以提供足以维持疗效的抗体或双特异性抗原结合分子的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量的范围是约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。通过每天施用多个剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC来测量血浆中的水平。
在局部施用或选择性摄入的情况下，抗体或双特异性抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文所述的治疗有效剂量的抗体或双特异性抗原结合分子通常将提供治疗益处而不会引起显著的毒性。抗体或双特异性抗原结合分子的毒性和治疗功效可通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，所述治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的抗体或双特异性抗原结合分子是优选的。在一个实施例中，根据本发明的抗体或双特异性抗原结合分子表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化，所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个别医生根据患者的病症来选择(参见例如Fingl等人，1975，在：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1页中，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。
用本发明的抗体或双特异性抗原结合分子治疗的患者的主治医师将知道如何以及何时由于毒性、器官功能障碍等终止、中断或调节施用。相反地，如果临床应答不充分(排除毒性)，则主治医师也会知道将治疗调节到更高水平。在目标疾患的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。
其他药剂和治疗
本发明的抗体或双特异性抗原结合分子可在治疗中与一种或多种其他药剂联合施用。例如，本发明的抗体或双特异性抗原结合分子可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括被施用以治疗需要这种治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些实施例中，另外的治疗剂是免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡激活剂，或增加细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂。在一个特定实施例中，另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂，或抗血管生成剂。
此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用抗体或双特异性抗原结合分子的量、病症或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。抗体或双特异性抗原结合分子通常以与如本文所述相同的剂量和施用途径，或本文所述剂量的约1％至99％，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的途径使用。
上述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂被包含在同一组合物或分开的组合物中)，以及分开施用，在分开施用的情况下，本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。本发明的抗体或双特异性抗原结合分子也可与放疗联合使用。
制品
在本发明的另一方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。该制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。所述容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合能够有效地用于治疗、预防和/或诊断病症，并且所述容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是具有能够被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括(a)含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子；以及(b)含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含进一步的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明该实施例中的制品还可包含包装插页，所述包装插页指示所述组合物可用于治疗特定病症。可替代地或另外地，所述制品还可包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包括药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品还可以包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施例中，本文提供的抗GPRC5D抗体中的任一种可用于检测生物样品中GPRC5D的存在。如本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施例中，生物样品包括细胞或组织，诸如前列腺组织。
在一个实施例中，提供了用于诊断或检测方法中的抗GPRC5D抗体。在另一方面，提供了检测生物样品中GPRC5D的存在的方法。在某些实施例中，该方法包括在允许抗GPRC5D抗体和GPRC5D两者结合的条件下使生物样品与抗GPRC5D抗体接触，以及检测是否在抗GPRC5D抗体与GPRC5D之间形成了复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施例中，抗GPRC5D抗体用于选择能够用抗GPRC5D抗体进行治疗的受试者，例如其中GPRC5D是用于选择患者的生物标志物。
可以使用本发明的抗体诊断的示例性病症包括癌症，特别是多发性骨髓瘤。
在某些实施例中，提供了标记的抗GPRC5D抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(诸如荧光标记、发色标记、电子致密标记、化学发光标记，以及放射性标记)，以及间接(例如通过酶促反应或分子相互作用)检测的部分(诸如酶或配体)。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I；荧光团，诸如稀土螯合物或荧光素(fluorescein)及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮；萤光素酶(luciferase)，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)；萤光素(luciferin)；2,3-二氢二氮杂萘二酮(2,3-dihydrophthalazinedione)；辣根过氧化物酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，诸如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶；与采用过氧化氢来氧化染料前体的酶(诸如HRP、乳过氧化物酶，或微过氧化物酶)偶联；生物素/抗生物素蛋白；纺丝标记；噬菌体标记；稳定自由基等。
本发明的另一方面涉及结合GPRC5D的抗体(10B10)，其包含可变重链区(VL)，其中VL可包含与SEQ ID NO:81的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。抗体可包含轻链可变区(VL)，其中VL包含与SEQ ID NO:82的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。抗体可包含VH和VL，其中VL可包含与SEQ ID NO:81的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中VL包含与SEQID NO:82的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。优选地，抗体包括：含有如SEQ ID NO:81氨基酸序列的VH和含有如SEQ ID NO:82氨基酸序列的VL。
本发明的另一方面涉及抗体(10B10-TCB)。抗体可包含第一轻链，其中第一轻链包含与SEQ ID NO:67的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。抗体可包含第二轻链，其中第二轻链包含与SEQ ID NO:68的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。抗体可包含第一重链，其中第一重链包含与SEQ ID NO:69的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。抗体可包含第二重链，其中第二重链包含与SEQ ID NO:70的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一优选实施例中，抗体包含第一轻链、第二轻链、第一重链和第二重链，所述第一轻链包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，所述第二轻链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，所述第一重链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，所述第二重链包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
氨基酸序列
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实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
实例1
肿瘤靶标的表达
为了鉴定多发性骨髓瘤与正常浆细胞表达的差异基因，对来自多发性骨髓瘤(MM)患者的10个样品和来自健康供体骨髓的10个浆细胞(PC)进行了RNAseq。根据制造商的说明，使用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen)提取RNA。在RNA提取过程中，使用RNase free DNaseset(Qiagen)去除基因组DNA。在Agilent真核生物总RNA pico芯片(AgilentTechnologies)上控制提取的RNA的质量。根据制造商的说明，使用用于Illumina测序的SMARTer ultra low RNA试剂盒(Clontech)从1.6ng总RNA中制备和扩增cDNA。然后，根据制造商的说明，对1ng扩增的cDNA进行Nextera XT文库制备(Illumina)。使用Kapa文库定量试剂盒(Kapa Biosystems)对测序文库进行量化，并使用高灵敏度芯片(AgilentTechnologies)在生物分析仪上通过毛细管电泳进行质量控制。使用第4版簇生成试剂盒和第4版测序试剂(Illumina)在HiSeq2500测序仪(Illumina)上对文库进行2x50个循环的测序。
B细胞成熟抗原(BCMA)是一种细胞表面蛋白，它在恶性浆细胞上表达，因此被认为是多发性骨髓瘤的靶标(Tai YT&Anderson KC,Targeting B-cell maturation antigenin multiple myeloma,Immunotherapy.2015Nov；7(11):1187–1199)。使用RNAseq技术，深入分析表明GPRC5D在多发性骨髓瘤患者的浆细胞中的表达与BCMA一样高(图2)。更重要的是，多发性骨髓瘤患者的浆细胞与健康浆细胞之间GPRC5D的差异表达约为20倍。相比之下，多发性骨髓瘤患者的浆细胞与健康浆细胞之间BCMA的差异表达仅为2倍。GPRC5D的整体表达远高于其他已知的多发性骨髓瘤靶分子如SLAM7、CD138和CD38的表达。此外，GPRC5D几乎不会被健康的幼稚或记忆B细胞表达。
实例2
GPRC5D结合物的产生和T细胞双特异性(TCB)抗体的制备
GPRC5D结合物是通过对大鼠进行DNA免疫而产生的，然后是杂交瘤的产生、杂交瘤的筛选和测序。特异性结合的筛选通过ELISA通过其与表达GPRC5D的转染子的结合来测量。两种GPRC5D结合物在下文中被鉴定为5E11(SEQ ID NO 13和14)和5F11(SEQ ID NO 15和16)。一旦确定了特异性结合物，IgG就会转化为T细胞双特异性抗体。将结合物转化为T细胞双特异性抗体的原理在本领域中举例说明和描述，例如在PCT公开号WO 2014/131712 A1，其通过引用整体并入本文。T细胞双特异性抗体包含两个GPRC5D结合部分和一个CD3结合部分(抗GPRC5D/抗CD3 T细胞双特异性抗体)，如图3所示。制备了以下抗GPRC5D/抗CD3 T细胞双特异性抗体：i)5E11-TCB(SEQ ID NO 17、18、19和20)；ii)5F11-TCB(SEQ ID NO 21、22、23和24)；iii)ET150-5-TCB(SEQ ID NO 25、26、27和28)；iv)B72-TCB(SEQ ID NO:73、74、75和76)；和v)BCMA-TCB(SEQ ID NO:77、78、79和80)。ET150-5 GPRC5D结合部分描述于PCT公开号WO 2016/090329A2。术语“ET-150-5”在本文中与术语“ET150-5”同义，反之亦然。制备非靶向的DP47-TCB作为阴性对照。DP47-TCB是一种非靶向T细胞双特异性抗体，仅与CD3结合，但不与GPRC5D结合。DP47-TCB描述于PCT公开号WO 2014/131712 A1中，该专利全文通过引用并入本文。B72-TCB源自WO 2018/0117786 A2的表23中公开的GCDB72抗体并且包含GCDB72的GPRC5D结合部分。B72-TCB以crossmab 1+1形式(SEQ ID NO：73、74、75和76)产生。BCMA-TCB源自WO 2016/166629 A1并包含其中公开的A02_Rd4_6nM_C01的GPRC5D结合部分。BCMA-TCB以crossmab 2+1形式(SEQ ID NO：77、78、79和80)产生。
实例3
T细胞双特异性抗体与多发性骨髓瘤细胞系的结合
为了测量与GPRC5D的结合，我们对报道的多发性骨髓瘤细胞系进行了基于FACS的结合测定(Lombardi et al.,Molecular characterization of human multiple myelomacell lines by integrative genomics:insights into the biology of the disease；Genes Chromosomes Cancer.2007Mar；46(3):226-38.)。细胞系AMO-1、L363和OPM-2在补充有20％热灭活胎牛血清(FBS,Gibco)和1％青霉素–链霉素100X(Gibco)的RPMI 1640+Glutamax培养基(Gibco)中培养。细胞系WSU-DLCL2(阴性对照)用仅补充10％FBS的相同培养基培养。细胞系NCI-H929和RPMI-8226也用补充有50μM巯基乙醇(Gibco)和1mM丙酮酸钠(Gibco)的相同培养基进行培养。细胞系在75cm2烧瓶(TPP)中培养，每周传代两次。
使用间接染色评估不同抗人GPRC5D-TCB抗体(5E11-TCB、5F11-TCB和ET150-5TCB)的结合。将细胞与使用0.2的连续稀释因子的范围为10μg/ml至0.00064μg/ml的抗人GPRC5D-TCB构建体5E11-TCB、5F11-TCB或ET150-5 TCB一起或没有构建体在100μL磷酸盐缓冲盐水(PBS；Gibco)中4℃孵育1小时。细胞用Live blue染料(Life Technologies)在PBS中以1:800稀释，在4℃染色20分钟，然后用1/300稀释在流式细胞术染色缓冲液(eBioscience)中的PE缀合的山羊抗人IgG、Fcγ片段特异性(Jackson Laboratories)在4℃孵育30分钟染色。流式细胞术采集在定制设计的BD Biosciences Fortessa上进行，并使用FlowJo软件(Tree Star,Ashland,OR)和GraphPad Prism软件进行分析。
图4A-C显示5E11-TCB和5F11-TCB均以剂量依赖性方式结合所有测试的多发性骨髓瘤细胞系。相比之下，ET150-5-TCB与测试细胞系的结合要弱得多。抗GPRC5D-TCB没有观察到与WSU-DLCL2细胞(非霍奇金淋巴瘤的GPRC5D-细胞系)的结合。
实例4
抗GPRC5D-TCB介导的T细胞细胞毒性
为了测量抗GPRC5D-TCB抗体的功能，进行了体外T细胞细胞毒性测定。简而言之，AMO-1、L363和OPM-2细胞系在补充有20％热灭活胎牛血清(FBS；Gibco)和1％青霉素–链霉素100X(PS；Gibco)的RPMI1640+Glutamax培养基(Gibco)中培养。细胞系WSU-DLCL2用仅补充有10％FBS的相同培养基培养。细胞系NCI-H929和RPMI-8226在补充有50μM巯基乙醇(Gibco)和1mM丙酮酸钠(Gibco)的相同培养基中培养。细胞系在75cm2烧瓶(TPP)中培养，每周传代两次。
将细胞系以1:10的靶标：效应子比率与使用人泛T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)从外周血单核细胞(PBMC)(来自Blutspende Schlieren的血沉棕黄层)中分离的3.105个同种异体T细胞共培养于补充有10％FBS(Gibco)+1％PS(Gibco)的IMDM培养基(Gibco)中。将抗人GPRC5D-TCB抗体(5E11-TCB、5F11-TCB、ET150-5 TCB或DP47-TCB)以不同浓度(0.1的连续稀释因子的1μg/ml至0.000001μg/ml范围或0μg/ml)添加到共培养物中。在37℃和5％CO2下孵育20小时后，将每孔75μl上清液转移到96孔白板(Greiner bio-one)中，每孔加入25μl CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay(Promega)。在室温下孵育15分钟后，在PerkinElmer EnVision上进行发光采集，并使用GraphPad Prism和XL fit软件进行分析。数据绘制为LDH释放的发光信号。
图5A-E显示5E11-TCB和5F11-TCB均介导了对多发性骨髓瘤细胞系的强T细胞细胞毒性，特别是NCI-H929(图5B)、RPMI-8226(图5C)、L363和(图5D)AMO-1(图5A)，而在阴性对照系WSU-DLCL2(图5E)上没有观察到杀伤。相比之下，ET150-5-TCB对测试的多发性骨髓瘤细胞系介导的杀伤作用很小或显著降低。表1总结了从图5A-E中显示的数据得出的EC50值。EC50值是使用Excel中的XLfit附加功能通过将信号的原始数据与滴定的TCB作图来计算的。
表1.抗GPRC5D-TCB介导的杀伤的EC50
NCI-H929 RPMI-8226 L363 AMO-1 WSI-DLCL2
5E11-TCB 0.007nM 0.024nM 0.012nM 0.014nM /
5F11-TCB 0.001nM 0.002nM 0.001nM 0.003nM /
ET150-5-TCB 0.833nM 0.797nM 0.768nM 0.0835nM /
实例5
抗GPRC5D-TCB介导的T细胞活化
为了从机制上解决抗GPRC5D-TCB的作用模式，测量了在抗GPRC5D-TCB存在下与靶标多发性骨髓瘤细胞系共培养后T细胞的活化。与实例4和图5A-E中描述的实验相似，将细胞系以1:10的靶标：效应子比率与使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从PBMC(来自献血记录的血沉棕黄层)中分离的3.105个同种异体T细胞共培养于补充有10％FBS(Gibco)+1％PS(Gibco)的IMDM培养基(Gibco)中。将抗人GPRC5D-TCB抗体(5E11-TCB、5F11-TCB、ET150-5-TCB或DP47-TCB)以不同浓度(0.1的连续稀释因子的1μg/ml至0.000001μg/ml范围或0μg/ml)添加到共培养物中。在37℃和5％CO2下孵育20小时后，对细胞进行染色以评估T细胞活化。细胞首先用在PBS(Gibco)中按1:800稀释的Live blue染料(LifeTechnologies)在4℃染色20分钟。之后，将细胞用来自BioLegend的AF700抗人CD4(克隆OKT4)、BV711抗人CD8(克隆SK1)、BV605抗人CD25(克隆BC96)、APC-Cy7抗人CD69(克隆FN50)，和PE-Cy5.5抗人CD3(克隆SK7；eBioscience)在流式细胞术染色缓冲液(eBioscience)中在4℃染色30分钟。流式细胞术采集在定制设计的BD BiosciencesFortessa上进行，并使用FlowJo软件(Tree Star,Ashland,OR)和GraphPad Prism软件进行分析。
图6显示5F11-TCB通过上调活化标志物CD25和CD69在与NCI-H929细胞的共培养中诱导T细胞活化，而对照，例如非靶向的DP47-TCB和没有任何TCB，不诱导T细胞活化。作为另一个阴性对照，5F11-TCB处理的T细胞与WSU-DLCL2细胞共培养，其中T细胞也未活化。这些活化谱在我们研究的多个细胞系中是一致的，例如AMO-1、NCI-H929、RPMI-8226、L363(图7A-J)。与较差的杀伤效力一致，ET150-5-TCB不诱导T细胞活化，除非在1mg/kg的最高测试浓度下。
实例6
抗GPRC5D-TCB的定位和内化
NCI-H929细胞用CMFDA(Invitrogen)染色并接种在24孔板中的聚-L-赖氨酸(Sigma)包被的圆形盖玻片上。抗体(5E11-IgG、5E11-TCB、5F11-IgG、5F11-TCB)用AlexaFluor 647琥珀酰亚胺酯(InVitrogen，cat#A201106)以2.5的摩尔比率标记。允许细胞在37℃粘附过夜，再以不同持续时间和温度(冰上30分钟，37℃1小时，37℃3小时)将荧光标记抗体(Alexa Fluor 647标记的-5E11-IgG、-5E11-TCB、-5F11-IgG、-5F11-TCB)直接添加到生长培养基中。在每个时间点后，用冷的PBS(Lonza)猝灭反应并洗掉未结合的抗体。然后将细胞与Cytofix(BD)在4℃下混合20分钟并用PBS洗涤两次。接着将盖玻片转移并安装在具有Fluoromount G(eBioscience)的玻璃载玻片上，并且在成像之前在4℃、黑暗中保持过夜。使用60×油物镜，利用来自Zeiss的倒置LSM 700进行荧光共焦显微术。使用与显微镜耦合的Zen软件(Zeiss)收集图像，并在IMARIS软件(Bitplane)上进行可视化。图8A显示所有抗体在4℃或37℃染色多发性骨髓瘤细胞系的表面(质膜)。如果抗体被细胞内化，则在37℃培养时，细胞质中会出现荧光染色。没有观察到GPRC5D+细胞系对GPRC5D结合IgG或GPRC5D结合TCB的内化。通过应用来自膜和细胞质限定的细胞目标区域(三小时)的强度总和进一步证实了这一点。IMARIS软件用于分析和量化膜与细胞质的信号比。图8B表明，与不同抗体孵育3小时后，膜与细胞质强度的比率在～4不变，这意味着荧光信号集中在表面，而不是在细胞质中。
实例7
表征GPRC5D结合物：通过ELISA进行重组细胞结合
表达人GPRC5D或食蟹猴GPRC5D或鼠GPRC5D或人GPRC5A的稳定转染CHO克隆用于分析潜在作为IgG的先导候选抗体的结合。具体而言，将104个细胞(活力≥98％)接种到384孔微量滴定板(BD Poly D-Lysin，#356662，体积：25μl/孔)使用新鲜培养基。在37℃孵育过夜后，将25μl/孔的抗体稀释液(在1xPBS中稀释为15x1:3，测定浓度从30μg/ml开始)在4℃培养2小时。使用90μl/孔PBST(10x PBS，Roche，#11666789001+0.1％Tween 20)洗涤一个步骤后，随后通过添加50μl/孔0.05％戊二醛(Sigma Cat.No:G5882 in 1xPBS)在室温(RT)固定细胞10分钟。在使用90μl/孔PBST进行三个额外的洗涤步骤后，添加二抗进行检测：对于人抗体，使用山羊抗人Igκ链抗体HRP缀合物(Millipore#AP502P)按1:2000稀释于封闭缓冲液(1x PBS(Roche#11666789001)+2％BSA(牛血清白蛋白组分V，不含脂肪酸，Roche，#10735086001)+0.05％Tween 20)中(25μl/孔)。对于大鼠抗体，山羊抗大鼠IgG1抗体HRP缀合(Bethyl#A110-106P)、山羊抗大鼠IgG2a抗体HRP缀合(Bethyl#A110-109P)和山羊抗大鼠IgG2b抗体HRP缀合(Bethyl#A110-111P)的混合物用于在封闭缓冲液中以1:10000稀释每种抗体(25μl/孔)。在室温下孵育1小时并使用90μl/孔PBST进行三个额外的洗涤步骤后，加入25μl/孔TMB底物(Roche订单号11835033001)10分钟，并显色通过在370nm/492nm处测量来确定最终OD。
所有测试的抗体都显示出与人GPRC5D的阳性结合，EC50值(反映亲合力)在pM范围内。只有大鼠IgG 10B10和07A04对表达食蟹猴GPRC5D的CHO细胞显示出交叉反应性，EC50值与人类版本的受体相当(图9)。对于所有其他抗体也检测到食蟹猴交叉反应性，但与10B10和07A04相比水平较低(图9)。未检测到与表达鼠GPRC5D的CHO细胞的显著结合，也未检测到与表达人版GPRC5A的CHO细胞的结合(图9)。结合的EC50值总结于表2中。
表2.基于ELISA的跨种类的对GPRC5D的结合特性
Figure BDA0003492810530001541
实例8
GPRC5D结合物：重组GPRC5D-TCB介导对MM细胞系的T细胞毒性
为了比较GPRC5D-TCB或其他靶向TCB的功能，我们对多种MM细胞系进行了体外T细胞细胞毒性测定：MOLP-2(图10B)、AMO-1(图10C)、EJM(图10D)和NCI-H929(图10G)。简而言之，细胞系在补充有20％热灭活胎牛血清(FBS；Gibco)和1％青霉素-链霉素100X(PS；Gibco)的RPMI 1640+Glutamax培养基(Gibco)中培养。MOLP-2用这种补充有GlutaMax 1X(Gibco)的培养基进行培养。OPM-2(图10A)、RPMI-8226(图10E)和L-363(图10F)细胞系用仅补充10％FBS的培养基培养。NCI-H929用补充有50μM巯基乙醇(Gibco)、1mM丙酮酸钠(Gibco)和GlutaMax 1X(Gibco)的培养基培养。EJM在IMDM(Gibco)+10％FBS(Gibco)和1％PS(Gibco)中培养。所有细胞系均在75cm2烧瓶(TPP)中培养，每周传代两次。
将细胞系以10比1的效应子靶标比率与使用人泛T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)从PBMC(来自Blutspende Schlieren的血沉棕黄层)中分离的0.3百万个同种异体T细胞共培养于补充有10％FBS(Gibco)+1％PS(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中。将抗人GPRC5D TCB构建体(5E11-TCB、5F11-TCB、10B10-TCB、B72-TCB、BCMA-TCB和DP47-TCB)以不同浓度(1/10连续稀释的12.5nM至0.0000125nM范围)添加到共培养物中，并与未处理的样品进行比较。在37℃和5％CO2孵育20小时后，将每孔75μl上清液转移到96孔白板(Greinerbio-one)中，每孔加入25μl CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay(Promega)。在室温下孵育15min后，在PerkinElmer EnVision上进行发光采集，并使用GraphPad Prism和XL fit软件进行分析。数据绘制为LDH释放的发光信号(图10)。图10A-G总结了数据，显示5E11-TCB和5F11-TCB介导对MM细胞系的T细胞毒性比BCMA-TCB、10B10-TCB和B72-TCB更强。TCB介导的杀伤的EC50显示在表3中，并计算为来自不同供体T细胞(n＝2或n＝3)的不同实验的平均值。
表3.体外杀伤测定的EC50值
Figure BDA0003492810530001551
实例9
健康人骨髓细胞的体外T细胞活化
在采样后1或2天处理四个不同健康供体(Lonza#1M-105，批次0000739254；0000739255；0000739256和0000734008)的新鲜未加工骨髓。使用BD Pharm裂解缓冲液(BD#555899；1X在无菌水中)在室温下快速裂解红细胞5分钟后；通过离心和缓冲液交换分别以126g和443g洗涤细胞2次。将细胞计数并以300 000个细胞/mL重悬于RPMI 1640Glutamax+20％HI胎牛血清+2％人血清+1％青霉素/链霉素(均来自Gibco)中，每孔接种100μL细胞悬液在96孔板圆底(TPP)中。每孔加入50μL培养基或补充有1/10连续稀释的从200nM(4X)到20pM的B72-TCB、5F11-TCB、5E11-TCB、BCMA-TCB、10B10-TCB或DP47-TCB的培养基。最后，使用泛T细胞(Miltenyi Biotec，#130-096-535)从健康供体PBMC中分离出50μL同种异体T细胞，以6Mio/mL浓度添加(效应T与健康骨髓靶细胞的比率为10:1)。在加湿培养箱中在37℃孵育过夜后，用PBS洗涤细胞一次，并在4℃用50μL 1/800稀释于PBS中的Live blue(Invitrogen，#L23105)染色20分钟。洗涤后，将细胞与以下在FAC缓冲液(PBS 1X，2％胎牛血清；1％0.5m EDTA PH 8；0.25％NaN3叠氮化钠(20％))中稀释的抗体混合物在4℃孵育30分钟：CD25 BV605、CD69 APC-Cy7、BCMA BV421、CD38 BV510、CD138 FITC、FcRH5 PE(1/100稀释)和CD8 BV711、CD3 PE-Cy5和CD4 AlexaFluor 700(1/300稀释)(均来自BioLegendAlexa)和GPRC5D AlexaFluor 647(内部，克隆5E11 IgG)。洗涤后，将细胞重新悬浮在100μLFAC缓冲液中，并用Fortessa(BD Biosciences)采集。
图11A-F中呈现的数据说明B72-TCB在健康骨髓中诱导了T细胞的非特异性活化(通过CD69的上调测量)，但没有被任何其他测试的TCB诱导。如所示，B72-TCB诱导的非特异性活化是浓度依赖性效应，并且在50nm处比在5nm处更明显(图12A和12B)。
实例10
TCB的体内功效
在功效研究中，不同的TCB构建体(GPRC5D 5F110-TCB、5E11-TCB、BCMA-TCB和B72-TCB)在携带多发性骨髓瘤的完全人源化NSG小鼠的肿瘤消退方面进行了比较。NCI-H929细胞最初来自DSMZ的ATCC和OPM-2细胞。两种细胞系都被扩增。细胞在含有10％FCS和2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠的RPMI中培养。在5％CO2下，在水饱和的气氛中于37℃下培养细胞。每只动物同时在动物右胁皮下注射RPMI细胞培养基(Gibco)和GFR基质胶(1:1，总体积为100ul)中的2.5x106NCI-H929和5x106OPM-2细胞，存活率>95.0％。
根据规定指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，将实验开始时为4-5周龄的雌性NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠(喂养于Charles River,Lyon,France)维持在不含特定病原体的条件下，日循环为12h光照/12h黑暗。实验研究方案经过地方政府的审查和批准(ROB-55.2-2532.Vet_03-16-10)。到达之后，将动物维持一周以适应新环境并进行观察。定期进行连续健康状态监测。
根据协议，雌性NSG小鼠被i.p.(腹膜内)注射15mg/kg的白消安，接着在一天后i.v.注射从脐带血中分离的1x105个人造血干细胞。在干细胞注射后第16-20周，对小鼠进行放血并且通过流式细胞术针对成功的人源化对血液进行分析。将有效移植的小鼠根据它们的人T细胞频率随机化为不同的处理组(n＝10/组)。当时，小鼠如上所述皮下注射肿瘤细胞，当肿瘤大小达到约200mm3时，每周用化合物或PBS(媒介物)处理一次。所有小鼠都静脉注射不同剂量的TCB分子(见图13A-D和14A-D)。
为了获得适量的化合物，用组氨酸缓冲液(20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0)稀释储备溶液。使用卡尺每周测量肿瘤生长两次，并按下式计算肿瘤体积：
Tv：(W2/2)×L(W：宽度，L：长度)
研究终止，在注射四次化合物后处死所有小鼠，取出肿瘤并称重。
图13A-D显示了所有接受NCl-H929注射的动物在治疗后的肿瘤生长动力学。5F11-TCB以1mg/kg或0.1mg/kg诱导所有动物的肿瘤完全缓解(图13A)，而B72-TCB在以1mg/kg使用时仅诱导部分肿瘤缓解，在0.1mg/kg时没有影响(图13C)。BCMA-TCB还在1mg/kg时诱导部分肿瘤缓解(图13B)。
图14A-D显示了所有接受OPM-2注射的动物在治疗后的肿瘤生长动力学。5F11-TCB(图14A，上图)和5E11-TCB(图14B，上图)在0.1mg/kg时诱导大多数动物的肿瘤完全缓解，而B72-TCB(图14C，上图)在0.1mg/kg时在控制肿瘤生长方面的效力较低。与B72-TCB(图14C，下图)相比，0.01mg/kg 5F11-TCB(图14A，下图)和5E11-TCB(图14B，下图)在抑制肿瘤生长方面更有效。
实例11
抗GPRC5D抗体的人源化
通过查询人V区和J区序列的BLASTp数据库来鉴定鼠输入序列(裁剪至可变部分)的合适的人受体框架。选择人受体框架的选择标准是序列同源性、相同或相似的CDR长度和人种系的估计频率，而且还有VH-VL结构域界面上某些氨基酸的保守性。在种系鉴定步骤之后，将鼠输入序列的CDR移植到人受体框架区上。这些初始CDR移植物和亲本抗体之间的每个氨基酸差异被评估对相应可变区的结构完整性的可能影响，并且在认为适当时引入对亲本序列的“回复突变”。结构评估基于亲代抗体和人源化变体两者的Fv区同源性模型，该模型通过内部抗体结构同源性建模方案创建得到，其使用BIOVIA Discovery StudioEnvironment版本17R2实现。在一些人源化变体中，包括“正向突变”，即，将亲本结合物的给定CDR位置上发生的原始氨基酸改变为人受体种系的等效位置上发现的氨基酸的氨基酸交换。目的是增加人源化变体的总体人特征(在框架区之外)，以进一步降低免疫原性风险。
内部开发的经由电脑模拟的工具用于预测配对的VH和VL人源化变体的VH-VL结构域方向(WO 2016/062734A1，其通过引用整体并入本文)。将结果与亲本结合物的预测VH-VL结构域取向进行比较，以选择在几何结构上与原始抗体接近的构架组合。基本原理是检测VH-VL界面区中可能的氨基酸交换，这些交换可能导致两个结构域的配对发生破坏性变化，进而对结合特性产生不利作用。
GPRC5D结合物5E11受体框架的选择及其调整
根据下表4选择受体框架。
表4.GPRC5D结合物5E11的受体框架
Figure BDA0003492810530001581
后CDR3框架区改编自人IGHJ种系IGHJ3*02
Figure BDA0003492810530001593
和人IGKJ种系IGKJ5*01
Figure BDA0003492810530001594
与受体框架相关的部分以粗体显示。
基于结构上的考虑，在5E11人源化变体的某些位置引入从人受体框架到亲代结合物中的氨基酸的回复突变(表5和6)。此外，一些位置被确定为有希望的正向突变候选者，其中亲本结合物的CDR中的氨基酸被人类受体种系中发现的氨基酸取代。下表详细说明了这些更改。
注：回复突变冠以前缀b，正向突变冠以前缀f，例如bS49A是指在49位从丝氨酸到丙氨酸的回复突变(人种系氨基酸到亲本抗体氨基酸)。所有残基索引以Kabat编号给出。
表5.VH/VL 5E11人源化变体列表
Figure BDA0003492810530001591
表6.VH/VL 5E11人源化变体的序列
Figure BDA0003492810530001592
Figure BDA0003492810530001601
GPRC5D结合物5F11受体框架的选择及其调整
根据下表7选择受体框架。
表7.GPRC5D结合物5F11的受体框架
Figure BDA0003492810530001602
后CDR3框架区改编自人IGHJ种系IGHJ3*02
Figure BDA0003492810530001604
和人IGKJ种系IGKJ2*01
Figure BDA0003492810530001605
与受体框架相关的部分以粗体显示。
基于结构上的考虑，在5F11人源化变体的某些位置引入从人受体框架到亲代结合物中的氨基酸的回复突变(表8和9)。此外，一些位置被确定为有希望的正向突变候选者，其中亲本结合物的CDR中的氨基酸被人类受体种系中发现的氨基酸取代。下表详细说明了这些更改。
注：回复突变冠以前缀b，正向突变冠以前缀f，例如bA93T是指在93位(Kabat)上从丙氨酸到苏氨酸的回复突变(人种系氨基酸到亲本抗体氨基酸)。所有残基索引以Kabat编号给出。
表8.VH/VL 5F11人源化变体列表
Figure BDA0003492810530001603
Figure BDA0003492810530001611
表9.VH/VL 5F11人源化变体的序列
Figure BDA0003492810530001612
通过ELISA表征人源化变体
为了表征GPRC5D结合物的VH和VL结构域的人源化变体，使用如上所述的ELISA方案(参见实例7)。5E11的人源化变体的数据汇总在表10中，5F11的人源化变体的数据汇总在表11中。表12显示了亲本5E11和亲本5E11以及选择的人源化变体的CDR序列。
表10. 5E11的人源化变体的表征
Figure BDA0003492810530001621
Figure BDA0003492810530001631
表10.继续
Figure BDA0003492810530001632
Figure BDA0003492810530001641
表11. 5F11的人源化变体的表征
Figure BDA0003492810530001642
表11.续
Figure BDA0003492810530001643
Figure BDA0003492810530001651
表12.选择的人源化变体的CDR序列
Figure BDA0003492810530001652
实例12
在选定的抗GPRC5D IgG的不同人源化变体存在下体外活化CAR-J细胞
如下所述评估不同人源化抗GPRC5D IgG激活PGLALA-CAR-J效应细胞的能力。表达GPRC5D的多发性骨髓瘤靶细胞L363(Diehl et al.,Blut 36:331-338(1978))与抗PGLALA-CAR-J效应细胞(表达针对IgG分子的Fc部分中的PGLALA(P329G L234A L235A)突变的TCR并含有NFAT启动子的Jurkat-NFAT人急性淋巴白血病报告细胞系进行共培养，如PCT申请号PCT/EP2018/086038和PCT申请号PCT/EP2018/086067中所公开的。当IgG分子同时与L363细胞和PGLALA-CAR-J细胞上的GPRC5D结合时，NFAT启动子被活化并导致活性萤火虫荧光素酶的表达。
对于该测定，人源化IgG变体在RPMI 1640培养基(含有Glutamax、15％HI胎牛血清、1％青霉素-链霉素；均来自GIBCO)中稀释并转移到圆底96孔板(最终浓度范围为0.2pg/ml至10μg/ml)。加入每孔20000个L363细胞和抗PGLALA-CAR-J效应细胞以获得5:1的最终效应细胞(抗PGLALA-CAR-J)与靶标(L363)细胞比例，最终体积为200μl每孔。将细胞在湿润培养箱中于37℃下孵育大约16小时。在孵育时间结束时，将100μl/孔的上清液转移至白色平底96孔板(Costar)并与另外100μl/孔的ONE-Glo荧光素酶底物(Promega)孵育5分钟，然后再使用PerkinElmer Envision读取发光。使用GraphPad Prism将行数据绘制为相对于IgG浓度的相对发光信号(RLU)，并使用XL-fit软件计算EC50。
如图15A-B和表13所示，所有评估的GPRC5D IgG在与表达GPRC5D的靶细胞和抗PGLALA-CAR-J细胞同时结合时诱导CAR-J活化。对于抗GPRC5D结合物5F11和5E11，与人源化前的亲本抗体相比，可以鉴定出具有相似甚至改进的EC50值的人源化变体。对于结合物5F11，最强的活化可以由分子P1AE5741诱导(图15A)。对于结合物5E11，最强的活化可以由分子P1AE5730和P1AE5723诱导(图15B)。
表13.CAR-J活化的EC50值
Figure BDA0003492810530001661
实例13
糖工程化IgG的克隆和生产
使用常规(非基于PCR的)克隆技术将相应的cDNA克隆到Evitria的载体系统中。Evitria载体质粒是基因合成的。基于阴离子交换色谱法，在低内毒素条件下制备质粒DNA。DNA浓度是通过测量260nm波长处的吸收来确定的。序列的正确性通过Sanger测序验证(每个质粒最多两个测序反应，取决于cDNA的大小)。悬浮调整的CHO K1细胞(最初从ATCC接收并适应Evitria悬浮培养中的无血清生长)用于生产。种子在eviGrow培养基中生长，这是一种化学成分明确、无动物成分、无血清的培养基。用eviFect转染细胞，eviFect是evitria定制的专有转染试剂，转染后细胞在eviMake2(一种不含动物成分的无血清培养基)中生长。重链、轻链和对应于Man II和GNTiii的两个质粒之间的质粒比例为9:9:1:1(GlycoMab技术)。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收集上清液。产生了5E11g2(SEQ ID NO 98和99)和5F11g2(SEQ ID NO 100和101)。
使用MabSelectTMSuReTM纯化抗体，其中Dulbecco的PBS(Lonza BE17-512Q)作为洗涤缓冲液，0.1M甘氨酸pH 3.5作为洗脱缓冲液，1M Tris HCl作为中和缓冲液(pH 9)。随后的尺寸排阻色谱在HiLoad Superdex200pg柱上进行，使用最终缓冲液作为运行缓冲液。使用截留分子量为2K的Pierce Slide-A-LyzerTMG2透析盒进行透析(如果需要)。使用截留分子量为30kD的
Figure BDA0003492810530001671
超离心过滤器进行抗体浓缩(如果需要)。
通过测量在280nm波长处的吸收来确定浓度。消光系数是使用evitria的专有算法计算的。纯度通过分析尺寸排阻色谱法确定，使用Agilent AdvanceBio SEC色谱柱(300A2.7um 7.8x300mm)，DPBS作为运行缓冲液，流速为0.8ml/min。内毒素含量是用CharlesRiver Endosafe PTS系统测量的。
如下测定糖工程化抗体的无岩藻糖基化程度。通过与0.005U PNGase F(QAbio，美国)和EndoH(QAbio，美国)在20mM Tris pH 8.0中在37℃孵育16小时，将N联寡糖从纯化的IgG上切割下来。这导致游离寡糖，其由质谱(Autoflex,Bruker Daltonics GmbH)在阳离子模式根据Papac等人来分析(D.I.Papac,A.Wong,A.J.Jones,Analysis of acidicoligosaccharides and glycopeptides by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,Analytical chemistry,68(1996)3215-3223)。MALDI-TOF-MS方法用于测定纯化IgG抗体的非岩藻糖含量。可接受的糖工程化抗体的临界值通常设置为50％，即具有至少50％无岩藻糖基化的抗体被认为是可接受的糖工程化IgG抗体。两种抗体都达到了具有至少50％无岩藻糖基化含量的阈值。5E11g2的无岩藻糖基化度确定为59.1％。5F11g2的无岩藻糖基化度确定为50.0％。
实例14
GPRC5D IgG与多发性骨髓瘤细胞系的结合
为了测量与GPRC5D的结合，我们对报道的多发性骨髓瘤细胞系进行了基于流式细胞术的结合测定(Lombardi et al.,Molecular characterization of human multiplemyeloma cell lines by integrative genomics:insights into the biology of thedisease；Genes Chromosomes Cancer.2007Mar；46(3):226-38.)。细胞系NCI-H929(
Figure BDA0003492810530001681
CRL-9068)在RPMI 1640中培养，其中含有补充10％FBS、1x青霉素/链霉素(Gibco)、1x丙酮酸钠(Gibco)和50μMβ-巯基乙醇(Gibco)的Glutamax培养基(Gibco)。
96圆底孔板的每孔0.1Mio细胞与150nM至15fM(1:10的连续稀释)的指定GPRC5DIgG构建体5E11g2和5F11g2或无构建体在4℃孵育30分钟。细胞用FACS缓冲液(PBS，2％胎牛血清；1％0.5m EDTA pH8；0.25％NaN3叠氮化钠(20％))洗涤两次，并用1/100稀释在FACS缓冲液中的PE缀合的山羊抗人IgG、Fcγ片段特异性染色(Jackson实验室，109-606-008)在4℃再染色30分钟。经过两个最后的洗涤步骤后，流式细胞仪采集在定制设计的BDBiosciences Fortessa上进行，并使用BD Diva进行分析。使用GraphPad Prism软件计算EC50值。
图16显示两种IgG均以浓度依赖性方式与人GPRC5D结合，其中5F11g2显示出明显强于5E11g2的结合。在评估的浓度范围内，没有抗体达到饱和。
表14：指定的GPRC5D分子与在NCI-H929细胞上表达的人GPRC5D结合的EC50值(nM)。
EC50(nM) 5E11g2 5F11g2
NCI-H929 ～69.5 n.c.
n.c.：曲线形状拟合不允许合适的EC50计算
实例15
ADCC，由不同的GPRC5D IgG介导
测试对肿瘤靶标的抗体介导的肿瘤细胞裂解，例如在以下PBMC共培养测定中测试了NK细胞、GPRC5D IgG的糖工程化版本。测定原理如下：
通过同时的抗体的Fc部分与NK细胞表面的FcγRIII受体的结合以及抗体的抗原靶向部分与肿瘤靶标的结合(在这种情况下与GPRC5D，在AMO-1或NCI-H929细胞上表达)，交联NK细胞。交联后，NK细胞被活化并脱粒，导致附着的肿瘤靶细胞被分泌的颗粒酶、穿孔素和蛋白酶裂解。
简而言之，通过标准的组织透明质酸密度梯度从健康供体的新鲜血液中分离人PBMC，重新悬浮在AIM V培养基中，并在96圆底孔板的每孔中接种0.75Mio细胞。收获并加入靶悬浮细胞以获得最终的PBMC效应物与肿瘤靶标的25:1比率。以50nM至0.05pM的终浓度范围分别添加5E11g2和5F11g2 IgG。作为确定最大细胞裂解的阳性参考，添加含有4％triton-x的AIM-V培养基以具有1％triton-x-100的终浓度。作为阴性参考，PBMC效应物和肿瘤靶细胞在没有抗体的情况下孵育。在加湿培养箱中在37℃孵育4小时后，根据制造商的建议，使用LDH细胞毒性测定试剂盒(Roche)对LDH进行定量。
确定细胞裂解百分比，参考阳性(MR，最大释放)和阴性(SR，自发释放)参考值和以下公式：％ab依赖性杀伤＝((平均Vmax样品-平均Vmax自发释放)/(平均Vmax最大释放-平均Vmax自发释放))*100。根据以下公式计算偏差：％偏差＝(ABS(1/(平均MR-SR)*SQRT((平均样品-平均MR)^2/(平均MR-SR)^2*stdev SR^2+stdev样品^2+(平均样品-平均SR)^2/平均MR^2*stdev MR^2)))*100。图X显示了裂解的百分比，基于SD技术三次重复。EC50值由GraphPad Prism计算。
两种分子均以浓度依赖性方式诱导有效的肿瘤细胞裂解，其中5F11g2是更有效的分子(参见图17A和17B，以及表15)。
表15：GPRC5D-IgG诱导的肿瘤细胞裂解的EC50，由在4小时后从凋亡/坏死细胞中释放的LDH确定
EC50 pM AMO-1 NCI-H929
5E11g2 405 84
5F11g2 96 48
***
尽管为了清楚理解的目的既往已经通过说明和实例相当详细地描述了发明，但是所述说明和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容的全部内容以引用方式明确地并入。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> 与 GPRC5D 结合的抗体
<130> P35621
<160> 101
<170> PatentIn 3.5 版
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Ala Met Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
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<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
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<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
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1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
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1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
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<210> 7
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
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<220>
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<210> 11
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
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<210> 13
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Glu Leu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
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Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln
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Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly
20 25 30
Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Thr Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro
65 70 75 80
Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg Glu
85 90 95
Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Leu Ser Val Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr His Cys Gly Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly
20 25 30
Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Thr Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro
65 70 75 80
Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg Glu
85 90 95
Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 18
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 19
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Glu Leu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 20
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Glu Leu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser
225 230 235 240
Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser
245 250 255
Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys
260 265 270
Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala
275 280 285
Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala
290 295 300
Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr
305 310 315 320
Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
325 330 335
Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
340 345 350
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
355 360 365
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
370 375 380
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
385 390 395 400
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
405 410 415
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
420 425 430
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
435 440 445
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
450 455 460
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
465 470 475 480
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
485 490 495
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
500 505 510
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
515 520 525
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
530 535 540
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
545 550 555 560
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
565 570 575
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
580 585 590
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
595 600 605
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
610 615 620
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
625 630 635 640
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
645 650 655
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 21
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Leu Ser Val Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr His Cys Gly Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg
115 120 125
Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 22
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 23
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 24
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu
225 230 235 240
Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr
245 250 255
Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro
260 265 270
Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
275 280 285
Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala
290 295 300
Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys
305 310 315 320
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
325 330 335
Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
340 345 350
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
355 360 365
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
370 375 380
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
385 390 395 400
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
405 410 415
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
420 425 430
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
435 440 445
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
450 455 460
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
465 470 475 480
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
485 490 495
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
500 505 510
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
515 520 525
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
530 535 540
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
545 550 555 560
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
565 570 575
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
580 585 590
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
595 600 605
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
610 615 620
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
625 630 635 640
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
645 650 655
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 25
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Val Gly Gly Asn
20 25 30
Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ala Thr Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Ser Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Phe Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Lys Lys
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 26
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 27
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Tyr Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 28
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Tyr Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser
225 230 235 240
Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser
245 250 255
Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys
260 265 270
Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala
275 280 285
Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala
290 295 300
Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr
305 310 315 320
Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
325 330 335
Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
340 345 350
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
355 360 365
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
370 375 380
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
385 390 395 400
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
405 410 415
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
420 425 430
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
435 440 445
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
450 455 460
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
465 470 475 480
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
485 490 495
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
500 505 510
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
515 520 525
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
530 535 540
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
545 550 555 560
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
565 570 575
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
580 585 590
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
595 600 605
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
610 615 620
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
625 630 635 640
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
645 650 655
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 35
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
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65 70 75 80
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 36
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 38
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
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100 105
<210> 39
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 40
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 41
<211> 198
<212> PRT
<213> 食蟹猕猴
<400> 41
Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys
50 55 60
Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu
65 70 75 80
Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro
85 90 95
Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn
100 105 110
Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp
115 120 125
Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys
130 135 140
Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn
165 170 175
Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly
180 185 190
Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
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1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
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Pro
225
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
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<212> PRT
<213> 智人
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Gly Val Leu Phe Ala Leu Cys Phe Ser Cys Leu Leu Ala His Ala Ser
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115 120 125
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Met Thr Pro Cys Gln Leu Asn Val Asp Phe Val Val Leu Leu Val Tyr
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210 215 220
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<220>
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
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<220>
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100 105 110
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
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<220>
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<400> 56
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<220>
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<400> 57
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
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115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<210> 60
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
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<223> 合成构建体
<400> 62
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
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<220>
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<400> 65
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<211> 112
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
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<220>
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<400> 67
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 68
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65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 69
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Leu Thr Tyr Tyr Gly Arg Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 70
<211> 677
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Leu Thr Tyr Tyr Gly Arg Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val
225 230 235 240
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
245 250 255
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
260 265 270
Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly
275 280 285
Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
290 295 300
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp
305 310 315 320
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe
325 330 335
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
340 345 350
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
355 360 365
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
370 375 380
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
385 390 395 400
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
405 410 415
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
420 425 430
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
435 440 445
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
450 455 460
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
465 470 475 480
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
485 490 495
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
500 505 510
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
515 520 525
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
530 535 540
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala
545 550 555 560
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
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Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
595 600 605
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
610 615 620
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
625 630 635 640
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
645 650 655
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
660 665 670
Leu Ser Pro Gly Lys
675
<210> 71
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Tyr Asn Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Asn Lys Leu Leu Ile
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Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 72
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser His
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Asn Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Ala
65 70 75 80
Phe Leu Lys Val Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val His Thr Arg Gly Ile Ile Arg Gly Arg Gly Leu Phe Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 73
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 74
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 75
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Ser Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ala Leu Arg Val Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 76
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Ala Thr His
20 25 30
Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 77
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 78
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Arg Trp Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 79
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr
225 230 235 240
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly
245 250 255
Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly
260 265 270
Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly
275 280 285
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
290 295 300
Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala
305 310 315 320
Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
325 330 335
Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
340 345 350
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
355 360 365
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
370 375 380
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
385 390 395 400
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
405 410 415
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
420 425 430
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
435 440 445
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
450 455 460
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
465 470 475 480
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
485 490 495
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
500 505 510
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
515 520 525
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
530 535 540
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
545 550 555 560
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
565 570 575
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
580 585 590
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
595 600 605
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
610 615 620
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
625 630 635 640
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
645 650 655
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 80
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 81
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Asn Met Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 82
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Leu Thr Tyr Tyr Gly Arg Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Ala Met Ala
1 5 10
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Ala
<210> 85
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 87
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 87
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly Ile Asn Leu Met Asn
1 5 10 15
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
His Ala Ser Ile Leu Ala Ser
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 89
Gln Gln Thr Arg Glu Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ala
1 5 10
<210> 91
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 91
Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 92
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 92
Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 93
His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr
1 5
<210> 94
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 94
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr
1 5 10 15
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 95
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 96
Arg Met Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 97
Gly Gln Leu Leu Glu Asn Pro Tyr Thr
1 5
<210> 98
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 98
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly
20 25 30
Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Thr Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro
65 70 75 80
Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg Glu
85 90 95
Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 99
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 99
Glu Leu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 100
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 100
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Leu Ser Val Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr His Cys Gly Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 101
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445

Claims (30)

1.一种与GPRC5D结合的抗体，其中所述抗体包含
(A)重链可变结构域(VH)，其包含(a)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1、(b)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变结构域(VL)，其包含(d)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1、(e)含有SEQID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3；或者
(B)重链可变结构域(VH)，其包含(a)含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H1、(b)含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变结构域(VL)，其包含(d)含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L1、(e)含有SEQID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其包含
(A)重链可变结构域(VH)，其包含(a)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1、(b)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变结构域(VL)，其包含(d)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1、(e)含有SEQID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3；或者
(B)重链可变结构域(VH)，其包含(a)含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H1、(b)含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H2和(c)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变结构域(VL)，其包含(d)含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L1、(e)含有SEQID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2和(f)含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L3。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其为结合GPRC5D的抗体片段。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其进一步包含(A)SEQ ID NO:13的重链可变结构域框架序列和/或SEQ ID NO:14的轻链可变结构域框架序列；或者
(B)SEQ ID NO:15的重链可变结构域框架序列和/或SEQ ID NO 16的轻链可变结构域框架序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其包含选自由以下项组成的组的序列：(a)与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；和(c)如(a)中定义的VH序列和如(b)中定义的VL序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其包含选自由以下项组成的组的序列：(a)与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；和(c)如(a)中定义的VH序列和如(b)中定义的VL序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO:13的VH序列和SEQ IDNO:14的VL序列；或包含SEQ ID NO:15的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列。
8.一种与GPRC5D特异性结合的抗体，其包含SEQ ID NO:13的VH序列和SEQ ID NO:14的VL序列；或包含SEQ ID NO:15的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中所述抗体为IgG抗体。
10.根据权利要求9所述的抗体，其中所述抗体为IgG1抗体。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体，其中所述抗体为全长抗体。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体为多特异性抗体。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体，其包含SEQ ID NO:98的轻链和SEQ IDNO:99的重链；或包含SEQ ID NO:100的轻链和SEQ ID NO:101的重链。
14.一种免疫缀合物，其包含根据权利要求1至13中任一项所述的抗体，以及细胞毒性剂。
15.一种或多种分离的核酸，其编码根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或免疫缀合物。
16.一种宿主细胞，其包含根据权利要求15所述的一种或多种核酸。
17.一种产生与GPRC5D结合的抗体或免疫缀合物的方法，其包括在适合表达所述抗体的条件下培养根据权利要求16所述的宿主细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括从所述宿主细胞回收所述抗体或免疫缀合物。
19.一种抗体或免疫缀合物，其通过根据权利要求18所述的方法产生。
20.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至14或权利要求19中任一项所述的抗体或免疫缀合物，以及药用载体。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其进一步包含另外的治疗剂。
22.根据权利要求1至14或权利要求19中任一项所述的抗体或根据权利要求20至21中任一项所述的药物组合物，其用作药物。
23.根据权利要求1至14或权利要求19中任一项所述的抗体或根据权利要求20至21中任一项所述的药物组合物，其用于治疗疾病。
24.根据权利要求1至14或权利要求19中任一项所述的抗体或根据权利要求20至21中任一项所述的药物组合物，其用于治疗疾病，其中所述疾病为癌症或自身免疫性疾病。
25.根据权利要求1至14或权利要求19中任一项所述的抗体或根据权利要求20至21中任一项所述的药物组合物，其用于治疗癌症，其中所述癌症为多发性骨髓瘤。
26.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或免疫缀合物或根据权利要求20至21中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗疾病，特别是癌症或自身免疫性疾病。
27.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或免疫缀合物或根据权利要求20至21中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于诱导对GPRC5D阳性细胞的ADCC/ADCP介导的消耗。
28.一种治疗患有癌症或自身免疫性疾病的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或免疫缀合物或根据权利要求20至21中任一项所述的药物组合物。
29.一种在个体中对GPRC5D阳性细胞的ADCC/ADCP介导的消耗的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或免疫缀合物或根据权利要求20至21中任一项所述的药物组合物以诱导对GPRC5D阳性细胞的ADCC/ADCP介导的消耗。
30.如本文所述的本发明。
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