CN116003598A - 靶向人gprc5d的重组人源化单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及靶向人GPRC5D的特异性重组人源化单克隆抗体及其应用，所述抗体亲和力高，具有良好的特异性，可用于ELISA和流式检测方法中，弥补靶向GPRC5D蛋白的诊断与治疗相关的应用。该单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，且该单克隆抗体的氨基酸序列和核苷酸序列可以单独使用或双链组合使用。此外，靶向人GPRC5D的特异性重组人源化单克隆抗体的序列可以构建成单抗，抗体偶联药，双特异性抗体，CAR‑免疫细胞等生物材料或制剂，可用于GPRC5D相关疾病的科研、诊断和治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及靶向人GPRC5D的重组人源化单克隆抗体及其应用。
背景技术
GPRC5D属于G蛋白偶联受体(GPCRs)的一种孤儿受体，是G蛋白偶联受体C5家族亚型D，为7次跨膜蛋白。孤儿受体(Orphan Receptor)是指与其它已确认的受体结构明显相似，但其内源配体还未发现的受体。GPRC5D在原代多发性骨髓瘤细胞表面高表达，而在正常组织的表达仅限于毛囊区域，有研究表明65％的多发性骨髓瘤患者GPRC5D有超过50％的表达阈值，凭借这一特点，GPRC5D成为了治疗MM的潜在靶标。
由于GPRC5D高表达于浆细胞和多发性骨髓瘤细胞表面，其他正常组织细胞和造血干细胞中均不表达，因此可以作为多发性骨髓瘤(MM)的诊断和治疗用的理想靶点。
发明内容
本发明目的在于提供靶向人GPRC5D的特异性重组人源化单克隆抗体，本发明所提供的靶向人GPRC5D的特异性重组人源化单克隆抗体亲和力高，具有良好的特异性，可以弥补市场上靶向人GPRC5D蛋白的重组人源化单克隆抗体的诊断与治疗相关的应用。另外，该GPRC5D抗体序列可以构建成嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CART)或双特异性抗体或抗体偶联药，可用于后续的肿瘤疾病的治疗。
本发明的第一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区包含以下CDR：
SEQ ID NO:44,78,1,33,67,22,或87所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO:45,59,79,12,34,68,2,23,54或88所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO:46,60,13,35,69,3,24,55或89所示的VH-CDR3；
其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合GPRC5D，优选人GPRC5D。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含以下3个CDR：
SEQ ID NO:44所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO:45所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO:46所示的VH-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含以下3个CDR：
SEQ ID NO:44所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO:59所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO:60所示的VH-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含以下3个CDR：
SEQ ID NO:78所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO:79所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO:60所示的VH-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含以下3个CDR：
SEQ ID NO:1所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO:12所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO:13所示的VH-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含以下CDR：
SEQ ID NO:47,61,80,14,36,70,4,25,47或90所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO:37,15,71,5或26所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO:48,81,16,38,72,6,27,48或91所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含以下3个CDR：
SEQ ID NO:47所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO:37所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO:48所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含以下3个CDR：
SEQ ID NO:61所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO:37所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO:48所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含以下3个CDR：
SEQ ID NO:80所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO:37所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO:81所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含以下3个CDR：
SEQ ID NO:14所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO:15所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO:16所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的重链可变区CDR和轻链可变区CDR：
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:49、62、82、17、39、73、7、28、56或92具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:51、64、84、19、41、75、9、30或94具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的重链可变区和轻链可变区：
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列的重链可变区，和如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列的重链可变区，和如SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列的重链可变区，和如SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的重链可变区，和如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体包括单链抗体(scFv)、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、动物源抗体、全人抗体或人源化抗体。
在另一优选例中，所述抗体为人源化抗体。
在另一优选例中，所述抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中，所述抗体的轻链恒定区为κ链，重链恒定区为IgG型。
在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。
本发明的第二方面，提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白包含：
(i)如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；和
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列选自下组：6×His标签、GGGS序列、FLAG标签。
本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；或
(2)如本发明第二方面所述的重组蛋白。
本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒载体或其他载体。
本发明的第五方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的载体，或基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。
本发明的第六方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包含：
(a)如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或如本发明第二方面所述的重组蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明的第七方面，提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包含如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第八方面，提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
在另一优选例中，所述免疫细胞包括T细胞，NK细胞或巨噬细胞。
在另一优选例中，所述免疫细胞为CAR-T细胞。
本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(z1)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第六方面所述的免疫偶联物或如本发明第八方面所述的免疫细胞、或其组合；以及
(z2)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述药物组合物用于制备治疗与GPRC5D高表达相关的疾病的药物。
在另一优选例中，所述与GPRC5D高表达相关的疾病为肿瘤，例如多发性骨髓瘤。
本发明的第十方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第六方面所述的免疫偶联物或如本发明第八方面所述的免疫细胞、或其组合，用于制备诊断试剂或试剂盒，或用于制备治疗与GPRC5D高表达相关的疾病的药物。
在另一优选例中，所述与GPRC5D高表达相关的疾病为肿瘤，例如多发性骨髓瘤。
本发明的第十一方面，提供了一种体外非诊断性检测样品中GPRC5D蛋白的方法，包括步骤：
(s1)在体外，将所述样品与如本发明的第一方面所述的抗体接触；
(s2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在GPRC5D蛋白。
本发明的第十二方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白的方法，包括步骤：(si)在适合表达蛋白的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞；(sii)从细胞培养物中分离出如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白。
本发明的第十三方面，提供了一种治疗与GPRC5D高表达相关的疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第六方面所述的免疫偶联物、如本发明第七方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第八方面所述的免疫细胞或如本发明第九方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述与GPRC5D高表达相关的疾病为肿瘤，例如多发性骨髓瘤。
在另一优选例中，所述有需要的受试者为人类或非人类哺乳动物。
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了人源化抗体的两种结构：天然结构和scFv-hFc结构。
图2显示了天然结构人源化抗体与K562-GPRC5D细胞的亲和性。
图3显示了scFv-hFc结构人源化抗体与K562-GPRC5D(图3a)和RPMI 8226细胞(图3b)的亲和性。
图4显示了scFv-hFc结构人源化抗体与MM.1S(图4a)和NCI-H929(图4b)的结合活性。
图5显示了GPRC5D CAR的载体插入序列结构。
图6显示了GPRC5D CAR jurkat nfat luc细胞与K562-GPRC5D(图6a)或RPMI 8226细胞(图6b)共培养后的自激活和抗原依赖激活。
图7显示了GPRC5D CAR-T细胞的转染效率流式检测结果。
图8显示了GPRC5D CAR-T细胞杀伤RPMI 8226细胞产生的炎症因子浓度检测结果；其中图8a为IL-2浓度检测结果，图8b为TNF-α浓度检测结果，图8c为IFN-γ浓度检测结果。
图9显示了GPRC5D CAR-T细胞与MM.1S或K562细胞共培养，以及CAR-T细胞单独培养产生的炎症因子浓度检测比较结果；其中图9a为IL-2浓度检测结果，图9b为TNF-α浓度检测结果，图9c为IFN-γ浓度检测结果。
图10显示了GPRC5D CAR-T细胞与NCI-H929或K562细胞共培养，以及CAR-T细胞单独培养产生细胞增殖流式检测结果。
图11显示了不同效靶比的GPRC5D CAR-T细胞分别与K562-luc(图11a)、K562-GPRC5D-luc(图11b)、NCI-H929-luc(图11c)、MM.1S-luc(图11d)、RPMI8226-luc(图11e)靶细胞共培养24h后的杀伤效果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的实验筛选和人源化改造，首次意外地获得了一组具有全新氨基酸序列的特异性结合人GPRC5D的人源化单克隆抗体。实验结果表明，本发明的人源化抗体与细胞表面的GPRC5D蛋白具有较强的亲和力，且具有很好的刺激T细胞激活的活性；基于本发明的人源化抗体序列制备的CAR-T细胞表现出优异的靶细胞特异性杀伤活性；各方面性能均显著优于现有的抗GPRC5D抗体。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明提供的靶向人GPRC5D的重组人源化单克隆抗体，选自以下重组人源化单克隆抗体中的一种或多种：
命名为G01的单克隆抗体：其重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；且轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；其人源化重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7；其人源化重链可变区核酸序列为SEQID NO:8；其人源化轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9；其人源化轻链可变区核酸序列为SEQ ID NO:10；其人源化scFv氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
命名为G02的单克隆抗体：其重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；且轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；其人源化重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17；其人源化重链可变区核酸序列为SEQ ID NO:18；其人源化轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:19；其人源化轻链可变区核酸序列为SEQ ID NO:20；其人源化scFv氨基酸序列为SEQ ID NO:21；
命名为G03的单克隆抗体：其重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；且轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；其人源化重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:28；其人源化重链可变区核酸序列为SEQ ID NO:29；其人源化轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:30；其人源化轻链可变区核酸序列为SEQ ID NO:31；其人源化scFv氨基酸序列为SEQ ID NO:32；
命名为G04的单克隆抗体：其重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；且轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列；其人源化重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:39；其人源化重链可变区核酸序列为SEQ ID NO:40；其人源化轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:41；其人源化轻链可变区核酸序列为SEQ ID NO:42；其人源化scFv氨基酸序列为SEQ ID NO:43；
命名为G05的单克隆抗体：其重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；且轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列；其人源化重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:49；其人源化重链可变区核酸序列为SEQ ID NO:50；其人源化轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:51；其人源化轻链可变区核酸序列为SEQ ID NO:52；其人源化scFv氨基酸序列为SEQ ID NO:53；
命名为G06的单克隆抗体：其重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列；且轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列；其人源化重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:56；其人源化重链可变区核酸序列为SEQ ID NO:57；其人源化轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:51；其人源化轻链可变区核酸序列为SEQ ID NO:52；其人源化scFv氨基酸序列为SEQ ID NO:58；
命名为G07的单克隆抗体：其重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；且轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列；其人源化重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:62；其人源化重链可变区核酸序列为SEQ ID NO:63；其人源化轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:64；其人源化轻链可变区核酸序列为SEQ ID NO:65；其人源化scFv氨基酸序列为SEQ ID NO:66；
命名为G08的单克隆抗体：其重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列；且轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列；其人源化重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:73；其人源化重链可变区核酸序列为SEQ ID NO:74；其人源化轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:75；其人源化轻链可变区核酸序列为SEQ ID NO:76；其人源化scFv氨基酸序列为SEQ ID NO:77；
命名为G09的单克隆抗体：其重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；且轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列；其人源化重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:82；其人源化重链可变区核酸序列为SEQ ID NO:83；其人源化轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:84；其人源化轻链可变区核酸序列为SEQ ID NO:85；其人源化scFv氨基酸序列为SEQ ID NO:86；
命名为G10的单克隆抗体：其重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列；且轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:90，SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列；其人源化重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:92；其人源化重链可变区核酸序列为SEQ ID NO:93；其人源化轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:94；其人源化轻链可变区核酸序列为SEQ ID NO:95；其人源化scFv氨基酸序列为SEQ ID NO:96；
在上述技术方案的基础上，其重组人源化单克隆抗体的轻链恒定区为κ链，重链恒定区为IgG型。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab”)2片段；scFv；抗体重链；抗体轻链。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少约90％同源性，较佳地至少约95％同源性。
本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有人GPRC5D蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约60个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与例如SEQ ID NO:50、52,所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与例如SEQ IDNO:50、52所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与例如SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可偶联的治疗剂包括但不限于：胰岛素、IL-2、干扰素、降钙素、GHRH肽、肠肽类似物、白蛋白、抗体片段、细胞因子、和激素。
此外还可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明还提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向人GPRC5D的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
如本文所用，“抗原结合结构域”、“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述抗原结合结构域包含特异性识别人GPRC5D的抗体，较佳地为单链抗体。
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
在本发明的一个优选实施方式中，本发明利用人源化抗GPRC5D的scFv构建的CAR-T细胞，可以进一步提高其杀伤效果和肿瘤清除能力。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或表达所述抗体的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、呼吸道、瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的抗体还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明还提供了如本发明的抗体或其抗原结合片段，本发明的嵌合抗原受体以及表达所述嵌合抗原受体的工程化免疫细胞，或本发明的药物偶联物或药物组合物在预防和/或治疗含有表达GPRC5D的肿瘤细胞的癌症(例如多发性骨髓瘤)中的用途。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明利用B细胞克隆技术提供靶向人GPRC5D的重组人源化单克隆抗体，重要的是靶向人GPRC5D的特异性重组人源化单克隆抗体亲和力高，具有良好的特异性，可以弥补市场上靶向人GPRC5D蛋白的重组人源化单克隆抗体的诊断与治疗相关的应用。另外，该GPRC5D抗体序列可以构建成CAR-T或双特异性抗体或抗体偶联药，可用于后续的肿瘤疾病的治疗。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1天然结构人源化抗体的亲和性流式检测
设置Eureka公司开发的抗GPRC5D抗体(MCARH109)为对照抗体G00，其scFv序列来自Eureka公司的专利(CN107428829B)，并根据实验需要将该对照抗体构建成人源化抗体，scFv-hFc抗体，CAR-T，CAR-jurkat-Nfat-Luc细胞等形式。
为了获得靶向人GPRC5D蛋白的人重组单克隆抗体，本发明构建表达了人GPRC5D N端胞外区的哺乳动物细胞表达的重组蛋白作为免疫原，利用新西兰大白兔进行免疫，免疫完成后，用抗原包被的磁珠进行筛选B淋巴细胞，将单B淋巴细胞扩大培养后，流式检测GPRC5D抗体的表达，阳性克隆进行基因测序，即可获得兔单克隆抗体的基因序列，之后通过兔抗人源化改造工程得到10株人源化GPRC5D单克隆抗体，分别命名为G01、G02、G03、G04、G05、G06、G07、G08、G09和G10。
将G00～G09构建成人源化IgG1型抗体载体质粒，将重组的载体质粒转染293细胞，收获上清纯化浓缩抗体(结构如图1左图所示)，定量后用于流式检测实验。
流式检测按照以下步骤进行：
(1)将G00～G09人源化抗体进行等浓度稀释：40ug/ml，20ug/ml，10ug/ml，5ug/ml,2.5ug/ml,1.25ug/ml,0.625ug/ml,0.375ug/ml,0ug/ml,
(2)将培养着的K562-GPRC5D稳转细胞系(稳定表达GPRC5D的K562细胞)取出使用PBS洗涤一次后，去除上清，加入PBS重悬细胞取样计数，将细胞密度调整为3*10^6个/ml,将细胞悬液以每孔50ul加入到标记好的96孔板中；
(3)向96孔板中加入稀释的各浓度人源化抗体稀释液孵育30min,
(4)向孔板中加入PBS洗涤2次，离心去除上清，
(5)向孔板中加入50ul二抗进行孵育30min,孔板细胞再次洗涤后加入PBS重悬，将孔板放流式仪上进行检测分析。
如图2所示，G02,G05,G07,G09对K562-GPRC5D有良好的结合活性，优于对照抗体G00。
实施例2 scFv-hFc结构人源化抗体的亲和性流式检测
将G00～G09构建成scFv-hFc人源化IgG1构型的载体质粒，将重组的载体质粒转染293细胞，收获上清纯化浓缩抗体(结构如图1右图所示)，定量后用于流式检测实验。
流式检测按照以下步骤进行：
(1)将G00～G09 scFv-hFc IgG1构型人源化抗体进行等浓度稀释：40ug/ml，20ug/ml，10ug/ml，5ug/ml,2.5ug/ml,1.25ug/ml,0.625ug/ml,0.375ug/ml,0ug/ml,
(2)将培养着的K562-GPRC5D稳转细胞和RPMI 8226细胞(天然的多发性骨髓瘤细胞，表达GPRC5D)取出使用PBS洗涤一次后，去除上清，加入PBS重悬细胞取样计数，将细胞密度调整为3*10^6个/ml,将细胞悬液以每孔50ul加入到标记好的96孔板中；
(3)向96孔板中加入稀释的各浓度抗体稀释液孵育30min,
(4)向孔板中加入PBS洗涤2次，离心去除上清，
(5)向孔板中加入50ul二抗进行孵育30min,孔板细胞再次洗涤后加入PBS重悬，将孔板放流式仪上进行检测分析。
如图3所示，G02,G05,G07,G09对K562-GPRC5D(图3a)和8226细胞(图3b)有良好的亲和性，优于对照抗体G00。
实施例3 scFv-hFc结构人源化抗体对MM.1S和H929细胞结合活性流式检测
检测实施例2中制备的scFv-hFc结构人源化抗体对MM.1S和NCI-H929细胞(MM.1S与NCI-H929均是天然的多发性骨髓瘤细胞，表达GPRC5D)的结合活性。按照以下步骤进行：
(1)将G00～G09 scFv-hFc IgG1构型人源化抗体进行浓度稀释至20ug/ml；
(2)将培养着的MM.1S细胞和NCI-H929细胞取出使用PBS洗涤一次后，去除上清，加入PBS重悬细胞取样计数，将细胞密度调整为3*10^6个/ml,将细胞悬液以每孔50ul加入到标记好的96孔板中；
(3)向96孔板中加入稀释的抗体稀释液孵育30min,
(4)向孔板中加入PBS洗涤2次，离心去除上清，
(5)向孔板中加入50ul二抗进行孵育30min,孔板细胞再次洗涤后加入PBS重悬，将孔板放流式仪上进行检测分析；
如图4所示，G02,G05,G07,G09对MM.1S细胞(图4a)和NCI-H929细胞(图4b)有良好的结合活性，显著优于对照抗体G00。
实施例4 CAR-jurkat-nfat-luc细胞自激活和抗原依赖的激活检测
如图5所示，将G00～G09的scFv分别构建到CAR的慢病毒载体中，将载体用于慢病毒包装，得到慢病毒上清进行浓缩纯化，然后感染jurkat-nfat-luc细胞，从而获得感染后的jurkat-nfat-luc细胞，即CAR-jurkat-nfat-luc细胞。将各CAR-jurkat-nfat-luc细胞与分别与K562、K562-GPRC5D、RPMI 8226细胞进行共培养48h后检测生物发光值。
如图6所示，图6a显示了CAR-jurkat-nfat-luc细胞与K562-GPRC5D或K562细胞共培养的结果，图6b显示了CAR-jurkat-nfat-luc细胞与RPMI 8226或K562共培养的结果；可见，CAR-jurkat-nfat-luc细胞有较低的自激活背景和较高的抗原依赖激活信号，尤其是表达G02、G05、G07和G09的scFv的CAR-jurkat-nfat-luc细胞。
实施例5 CAR-T细胞制备
用肝素钠抗凝采血管抽取人外周血30ml，离心600g*10min，吸取上层黄色血浆灭活备用，将剩余血液成分加PBS混匀后铺到含淋巴细胞分离液的离心管中，离心1000g*10min，小心吸取白膜层细胞，白膜层细胞悬液用PBS洗涤后离心去除上清，加PBS重悬计数；离心去除上清，加入分选buffer重悬细胞，根据细胞计数结果使用抗人CD3纳米磁珠和美天旎磁珠分选系统分选得到CD3阳性细胞群，将得到的CD3阳性细胞计数后使用CD3/CD28磁珠进行激活培养24h后分别感染G00～G09的CAR慢病毒，感染过夜后洗涤细胞，48h后流式检测CAR的表达效率。
如图7所示，G00～G09 CAR-T细胞均有高的转染效率。
实施例6 CAR-T细胞杀伤RPMI-8226细胞因子检测
将培养的实施例5中制备的G00～G09 CAR-T细胞和T细胞分别用PBS洗涤后使用培养基重悬取样计数，根据细胞浓度将CAR-T细胞浓度和T细胞浓度调整为1*10E5个/ml，将CAR-T细胞和T细胞分别加入到标记好的96孔板中，每孔100ul细胞悬液。
将培养中的RPMI-8226细胞用PBS洗涤后使用培养基重悬，取样计数，将细胞浓度调整为1*10E5个/ml，将RPMI-8226细胞悬液加入到96孔板对应孔中，每孔100ul细胞悬液。
将CAR-T细胞与RPMI-8226细胞混合悬液混匀后放二氧化碳培养箱过夜培养24h；将共培养的孔板取出，离心300g*10min，取出150ul上清转到新的96孔板中，使用ELISA试剂盒检测上清中的IL-2、TNF-α、IFN-γ浓度。
如图8所示，分别显示了上清中IL-2(图8a)，TNF-α(图8b)，IFN-γ(图8c)的浓度；可见G02、G05、G07、G09 CAR-T细胞能够特异杀伤RPMI-8226细胞并产生较高水平的炎症因子。
实施例7 CAR-T细胞杀伤MM.1S和K562细胞因子检测
将培养的实施例5中制备的G00～G09 CAR-T细胞和T细胞分别用PBS洗涤后使用培养基重悬取样计数，根据细胞浓度将CAR-T浓度和T细胞浓度调整为1*10E5个/ml,将CAR-T细胞和T细胞分别加入到标记好的96孔板中，每孔100ul细胞悬液。
将培养中的MM.1S和K562细胞分别用PBS洗涤后使用培养基重悬，取样计数，将细胞浓度调整为1*10E5个/ml，将MM.1S和K562细胞分别加入到96孔板对应孔中，每孔100ul细胞悬液。
将CAR-T细胞或T细胞与MM.1S或K562细胞混合液混匀后放二氧化碳培养箱过夜培养24h；将共培养的孔板取出，离心300g*10min，取出150ul培养上清转到新的96孔板中，使用ELISA试剂盒检测上清中的IL-2,TNF-α,IFN-γ浓度。
如图9所示，分别显示了上清中IL-2(图9a),TNF-α(图9b),IFN-γ(图9c)的浓度；可见G02，G04，G05，G07，G08，G09 CAR-T细胞能够特异杀伤MM.1S细胞并产生较高水平的炎症因子,所有CAR-T或T细胞都不能杀伤K562细胞，说明CAR-T细胞杀伤的特异性。
实施例8 CAR-T细胞特异增殖实验
24孔板标记设置4个反应条件组：
A：CAR-T/T+NCI-H929，CAR-T细胞或T细胞与多发性骨髓瘤细胞NCI-H929共培养
B：CAR-T/T+K562，CAR-T细胞或T细胞与K562细胞共培养
C：CAR-T/T only，CAR-T细胞或者T细胞单独培养
D：CAR-T/T+IL-2，CAR-T细胞或T细胞添加300U/ml IL-2培养。
将培养的实施例5中制备的G00～G09 CAR-T细胞和T细胞分别用PBS洗涤后使用培养基重悬取样计数，根据细胞浓度将CAR-T细胞浓度和T细胞浓度调整为5～10*10E6个/ml,向细胞悬液中加入CFSE染色10min后加入FBS终止染色，离心去除上清后加入完全培养基多次洗涤细胞，加入培养基重悬细胞，取样计数，将细胞悬液CAR阳性细胞或T细胞浓度调整为1*10E6个/ml；将CAR-T细胞和T细胞分别加入到标记好的24孔板中，每孔100ul细胞悬液。
将培养中的NCI-H929细胞和K562细胞用PBS洗涤后使用培养基重悬，取样计数，将细胞浓度调整为1*10E6个/ml，将NCI-H929细胞悬液加入到24孔板A组CAR-T/T细胞对应孔中，每孔200ul细胞悬液，将K562细胞悬液加入到24孔板B组CAR-T/T细胞对应孔中，每孔200ul细胞悬液，将CAR-T/T细胞C组每孔补加不含IL-2的培养基200ul，CAR-T/T细胞D组每孔补加含IL-2的培养基200ul，将孔板中各细胞孔悬液混匀后放二氧化碳培养箱过夜培养120h。
将培养的孔板中细胞悬液取出，用PBS洗涤细胞后分别进行流式染色，流式染色CD3和CAR，CAR-T细胞选中CD3阳性细胞，选中其中CAR阳性细胞，对FITC峰进行叠加；T细胞选中CD3阳性细胞，对FITC峰进行叠加。
如图10所示，分别显示了各CAR-T细胞与靶细胞共培养后的CFSE荧光减弱情况，说明G02、G04、G05、G07、G09 CAR-T细胞能够特异识别NCI-H929细胞并发生特异性增殖；G01CAR-T和T细胞不能特异识别NCI-H929细胞，也就不能产生特异增殖，G08 CAR-T细胞在培养过程中，无论培养基中有无IL-2，无论与K562细胞还是与NCI-H929细胞共培养后，均发生增殖，G08 CAR-T细胞中scFv导致的细胞自激活程度很高。
实施例9 CAR-T细胞特异杀伤实验
将培养的G00～G09的CAR-T细胞和T细胞分别用PBS洗涤后使用培养基重悬取样计数，根据细胞浓度将CAR阳性细胞浓度和T细胞浓度调整为3*10E5个/ml、1*10E5个/ml、0.3*10E5个/ml、0.1*10E5个/ml，将稀释后的CAR-T细胞或T细胞加入到96孔板对应孔中，每孔100ul。
将培养中的靶细胞：K562-luc、K562-GPRC5D-luc、NCI-H929-luc、RPMI8226-luc、MM.1S-luc用PBS洗涤后使用培养基重悬，取样计数，将细胞浓度调整为1*10E5个/ml,将靶细胞悬液加入到96孔板应孔中，每孔100ul细胞悬液，将孔板放二氧化碳培养箱过夜培养24h。
取出各孔板加入荧光素钾盐溶液，将孔板放多功能酶标仪进行生物发光值检测。
结果如图11所示，G00～G09 CAR-T中的G00、G02、G05、G07、G09 CAR-T细胞可以很好地对GPRC5D阳性靶细胞进行杀伤。
本发明的序列
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，其特征在于，所述重链可变区包含以下CDR：
SEQ ID NO:44,78,1,33,67,22,或87所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO:45,59,79,12,34,68,2,23,54或88所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO:46,60,13,35,69,3,24,55或89所示的VH-CDR3；
其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合GPRC5D，优选人GPRC5D。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含以下CDR：
SEQ ID NO:47,61,80,14,36,70,4,25,47或90所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO:37,15,71,5或26所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO:48,81,16,38,72,6,27,48或91所示的VL-CDR3。
3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:49、62、82、17、39、73、7、28、56或92具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
4.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:51、64、84、19、41、75、9、30或94具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
5.一种重组蛋白，所述重组蛋白包含：
(i)如权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段；和
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
6.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段；或
(2)如权利要求5所述的重组蛋白。
7.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包含：
(a)如权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或如权利要求5所述的重组蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
9.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包含如权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
10.一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求5所述的重组蛋白、如权利要求8所述的免疫偶联物或如权利要求9所述的嵌合抗原受体、或其组合，用于制备诊断试剂或试剂盒，或用于制备治疗与GPRC5D高表达相关的疾病的药物。
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