CN111788231A - 结合gprc5d的抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明一般涉及结合GPRC5D的抗体,包括双特异性抗原结合分子,例如用于活化T细胞。另外,本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸,以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成该抗体的方法,和在疾病的治疗中使用它们的方法。
Description
发明领域
本发明一般涉及结合GPRC5D的抗体,包括双特异性抗原结合分子,例如用于活化T细胞。另外,本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸,以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成该抗体的方法,和在疾病的治疗中使用它们的方法。
发明背景
在欧盟和美国每年影响～75,000名新患者,多发性骨髓瘤(MM)是最常见的血液学恶性之一,其仍然有高度未满足的医疗需求。多发性骨髓瘤特征在于分泌非功能性单克隆免疫球蛋白的终末分化的浆细胞。在短期内,免疫调控性药物诸如来那度胺和泊马度胺,和蛋白酶体抑制剂诸如卡非佐米或硼替佐米可能仍然是多发性骨髓瘤的一线疗法的骨干(Moreau,P.and S.V.Rajkumar,multiple myeloma-translation of trial results intoreality.Lancet,2016.388(10040):p.111-3)。然而,这些药物并不特异性靶向患病肿瘤细胞,例如患病浆细胞(PC)。已经做出努力以选择性消减多发性骨髓瘤中的浆细胞。特异性标记浆细胞的表面蛋白质的缺乏阻碍了用于多发性骨髓瘤抗体或细胞疗法的开发。迄今,成功生物制剂的案例很少,如例如由达雷木单抗(抗CD38)和埃罗妥珠单抗(抗CD319)代表的,需要注意的是这两种分子并非由浆细胞唯一表达。因此,使用RNA测序鉴定来自多发性骨髓瘤中的浆细胞的新颖靶,诸如G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)。GPRC5D是由多发性骨髓瘤中的浆细胞表达的特异性表面蛋白质。已经报告GPRC5D与多发性骨髓瘤患者中的预后和肿瘤负荷有关(Atamaniuk,J.,et al.,Overexpression of G protein-coupledreceptor 5D in the bone marrow is associated with poor prognosis in patientswith multiple myeloma.Eur J Clin Invest,2012.42(9):p.953-60；和Cohen,Y.,etal.,GPRC5D is a promising marker for monitoring the tumor load and to targetmultiple myeloma cells.Hematology,2013.18(6):p.348-51)。
GPRC5D是一种孤儿受体,在人和人癌症中没有已知的配体或功能。定位于染色体12p13.3的GPRC5D编码基因含有三个外显子且跨越约9.6kb(Brauner-Osborne,H.,et al.,Cloning and characterization of a human orphan family C G-protein coupledreceptor GPRC5D.Biochim Biophys Acta,2001.1518(3):p.237-48)。较大的第一外显子编码七次跨膜域。然而,GPRC5D的生物学很大程度上是未知的。已经显示GPRC5D牵涉动物中的毛囊中的角蛋白形成(Gao,Y.,et al.,Comparative Transcriptome Analysis ofFetal Skin Reveals Key Genes Related to Hair Follicle Morphogenesis inCashmere Goats.PLoS One,2016.11(3):p.e0151118；和Inoue,S.,T.Nambu,andT.Shimomura,The RAIG family member,GPRC5D,is associated with hard-keratinizedstructures.J Invest Dermatol,2004.122(3):p.565-73)。
WO 2018/017786A2公开GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段。
存在对另外的药物以治疗癌症,特别是多发性骨髓瘤的需求。对此目的特别有用的药物包括结合GPRC5D的抗体,特别是结合靶细胞上的GPRC5D和T细胞上的活化性T细胞抗原诸如CD3的双特异性抗体。此类抗体对它的两种靶物的同时结合会迫使靶细胞和T细胞之间的暂时相互作用,引起任何细胞毒性T细胞活化和随后靶细胞裂解。
本发明提供新颖的特异性结合人GPRC5D的抗体,包括双特异性抗体。特别是,依照本发明的靶向GPRC5D的T细胞双特异性抗体具有治疗多发性骨髓瘤的效力。
发明概述
本发明人开发了新颖的具有出乎意料的,改善的特性的结合GPRC5D的抗体。而且,发明人开发了并入了该新颖的GPRC5D抗体的结合GPRC5D和活化性T细胞抗原的双特异性抗原结合分子。
在第一个方面,本发明提供一种结合GPRC5D的抗体,其中该抗体包含(i)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:84的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；(ii)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:85的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR3,该轻链可变区(VL)包含SEQ IDNO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3,(iii)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；(iv)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；或(v)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:92的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ IDNO:97的LCDR 3。或者,该抗体可包含(I)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR 2,和SEQ ID NO:3的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3；或(II)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:8的HCDR 2,和SEQ ID NO:9的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR 3。在一个实施方案中,(i)该VH包含与SEQ ID NO:13的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ IDNO:14的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或(ii)该VH包含与SEQ ID NO:15的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或(iii)该VH包含与SEQ ID NO:48的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或(iv)该VH包含与SEQ IDNO:49的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或(v)该VH包含与SEQ ID NO:57的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或(vi)该VH包含与SEQ ID NO:58的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。在另一个实施方案中,(i)该VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列,且该VL包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或(ii)该VH包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列,且该VL包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；或(iii)该VH包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列,且该VL包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；或(iv)该VH包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列,且该VL包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；或(v)该VH包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列,且该VL包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；或(vi)该VH包含SEQID NO:58的氨基酸序列,且该VL包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在另一个实施方案中,该抗体是IgG,特别是IgG1,抗体。在一个实施方案中,该抗体是全长抗体。在另一个实施方案中,该抗体是选自Fv分子,scFv分子,Fab分子,和F(ab')2分子的组的抗体片段。在一个实施方案中,该抗体是多特异性抗体。
在又一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中该第一抗原是GPRC5D且该第一抗原结合模块包含(i)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:84的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；(ii)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:85的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；(iii)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；(iv)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:96的LCDR 2和SEQ IDNO:97的LCDR 3；或(v)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ IDNO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:92的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQID NO:97的LCDR 3。或者,该第一抗原结合模块可包含(I)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR2,和SEQ ID NO:3的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3；或(II)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:8的HCDR2,和SEQ ID NO:9的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR 3；和(b)特异性结合第二抗原的第二抗原结合模块。在一个实施方案中,(i)该第一抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:13的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该第一抗原结合模块的VL包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或(ii)该第一抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:15的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该第一抗原结合模块的VL包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或(iii)该第一抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:48的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该第一抗原结合模块的VL包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或(iv)该第一抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:49的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该第一抗原结合模块的VL包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或(v)该第一抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:57的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该第一抗原结合模块的VL包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或(vi)该第一抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:58的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该第一抗原结合模块的VL包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。在一个实施方案中,(i)该第一抗原结合模块的VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列,且该第一抗原结合模块的VL包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或(ii)该第一抗原结合模块的VH包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列,且该第一抗原结合模块的VL包含SEQID NO:16的氨基酸序列；或(iii)该第一抗原结合模块的VH包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列,且该第一抗原结合模块的VL包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；或(iv)该第一抗原结合模块的VH包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列,且该第一抗原结合模块的VL包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；或(v)该第一抗原结合模块的VH包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列,且该第一抗原结合模块的VL包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；或(vi)该第一抗原结合模块的VH包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列,且该第一抗原结合模块的VL包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在另一个实施方案中,该第二抗原是CD3,特别是CD3ε。在一个实施方案中,该第二抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:29的HCDR 1,SEQ ID NO:30的HCDR 2,和SEQ ID NO:31的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:32的LCDR 1,SEQ ID NO:33的LCDR 2和SEQ ID NO:34的LCDR 3的VL。在另一个实施方案中,该第二抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该第二抗原结合模块的VL包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。在另一个实施方案中,该第二抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该第二抗原结合模块的VL包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
在一个实施方案中,该第一和/或该第二抗原结合模块是Fab分子。这意味着或是该第一抗原结合模块可以是Fab分子,或该第二抗原结合模块可以是Fab分子,或是该第一抗原结合模块和该第二抗原结合模块可以是Fab分子。在另一个实施方案中,该第二抗原结合模块是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1,特别是可变域VL和VH是彼此替换的。在另一个实施方案中,该第一抗原结合模块是Fab分子,其中在恒定域中位置124处的氨基酸是用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代的(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸是用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代的(编号方式依照Kabat),且在恒定域CH1中位置147处的氨基酸是用谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立替代的(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸是用谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立替代的(编号方式依照Kabat EU索引)。在另一个实施方案中,该第一和该第二抗原结合模块是彼此融合的,任选经由肽接头。在另一个实施方案中,该第一和该第二抗原结合模块每个是Fab分子且其中或是(i)该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端,或是(ii)该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合模块的Fab重链的N端。在另一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含第三抗原结合模块。在另一个实施方案中,该第三抗原模块与该第一抗原结合模块相同。在另一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含由第一和第二亚基构成的Fc域。在另一个实施方案中,该第一,该第二和,在存在时,该第三抗原结合模块每个是Fab分子；且其中或是(i)该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端且该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端,或是(ii)该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合模块的Fab重链的N端且该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端；且其中该第三抗原结合模块,在存在时,在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。在另一个实施方案中,该Fc域是IgG,特别是IgG1,Fc域。在还有另一个实施方案中,该Fc域是人Fc域。在另一个实施方案中,该Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换,由此生成该第一亚基的CH3域内的隆起,其可放置在该第二亚基的CH3域内的空腔中,且该Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换,由此生成该第二亚基的CH3域内的空腔,其内可放置该第一亚基的CH3域内的隆起。在另一个实施方案中,该Fc域包含降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的一处或多处氨基酸替代。这意味着对Fc受体的结合可以是降低的,或效应器功能可以是降低的,或对Fc受体的结合和效应器功能可以是降低的。
在另一个方面,本发明提供一种或多种分离的多核苷酸,其编码如本文中描述的抗体或双特异性抗原结合分子。在又一个方面,本发明提供一种或多种载体,特别是表达载体,其包含如本文中描述的一种或多种多核苷酸。在另一个方面,本发明提供一种宿主细胞,其包含如本文中描述的一种或多种多核苷酸或如本文中描述的一种或多种载体。在一些实施方案中,该宿主细胞是真核细胞,特别是哺乳动物细胞。
在本发明的另一个方面,提供了一种生成结合GPRC5D的抗体的方法,其包含下述步骤:a)在适合于该抗体表达的条件下培养如本文中描述的宿主细胞和b)任选回收该抗体。在另一个方面,本发明提供通过如本文中描述的方法生成的结合GPRC5D的抗体。本发明的另一个方面涉及一种药学组合物,其包含如本文中描述的抗体或双特异性抗原结合分子和药学可接受载剂。本发明的另一个方面涉及如本文中描述的抗体或双特异性抗原结合分子或如本文中描述的药学组合物,其供作为药物使用。本发明的另一个方面涉及如本文中描述的抗体或双特异性抗原结合分子或如本文中描述的药学组合物,其供疾病的治疗中使用。在一个实施方案中,该疾病是癌症,特别是多发性骨髓瘤。或者,该疾病是自身免疫疾病,诸如系统性红斑狼疮和/或类风湿性关节炎。
本发明进一步提供如本文中描述的抗体或双特异性抗原结合分子在制造用于治疗疾病,特别是癌症,更加特别是多发性骨髓瘤的药物中的用途。或者,该疾病是自身免疫疾病,诸如系统性红斑狼疮和/或类风湿性关节炎。
在另一个方面,本发明涉及一种治疗个体中的疾病,特别是癌症,更加特别是多发性骨髓瘤的方法,其包含对所述个体施用治疗有效量的包含药学可接受形式的如本文中描述的抗体或双特异性抗原结合分子的组合物。或者,该疾病是自身免疫疾病,诸如系统性红斑狼疮和/或类风湿性关节炎。在任何上述实施方案中,该个体优选是哺乳动物,特别是人。
附图简述
图1A-Z。本发明的双特异性抗原结合分子的例示性构造。(图1A,图2D)“1+1CrossMab”分子的示图。(图1B,图1E)“2+1IgG Crossfab”分子的示图,其具有备选(alternative)次序的Crossfab和Fab构件(“倒转的”)。(图1C,图1F)“2+1IgG Crossfab”分子的示图。(图1G,图1K)“1+1IgG Crossfab”分子的示图,其具有备选(alternative)次序的Crossfab和Fab构件(“倒转的”)。(图1H,图1L)“1+1IgG Crossfab”分子的示图。(图1I,图1M)“2+1IgG Crossfab”分子的示图,其具有两个CrossFab。(图1J,图1N)“2+1IgGCrossfab”分子的示图,其具有两个CrossFab和备选(alternative)次序的Crossfab和Fab构件(“倒转的”)。(图1O,图1S)“Fab-Crossfab”分子的示图。(图1P,图1T)“Crossfab-Fab”分子的示图。(图1Q,图1U)“(Fab)2-Crossfab”分子的示图。(图1R,图1V)“Crossfab-(Fab)2”分子的示图。(图1W,图1Y)“Fab-(Crossfab)2”分子的示图。(图1X,图1Z)“(Crossfab)2-Fab”分子的示图。黑点:任选的Fc域中促进异二聚化的修饰。++,--:CH1和CL域中任选引入的相反电荷的氨基酸。Crossfab分子描绘为包含VH和VL区交换,但是在其中在CH1和CL域中没有引入电荷修饰的实施方案中可以备选地包含CH1和CL域的交换。
图2。通过RNAseq对浆细胞和B细胞上的肿瘤靶物的基因表达的分析。
图3。本发明的5E11双特异性抗原结合分子的例示性构造。黑色点:任选的Fc域中促进异二聚化的修饰。++,--:任选引入CH1和CL域中的相反电荷的氨基酸。
图4A-C。双特异性抗原结合分子5F11-TCB(图4A)和5E11-TCB(图4B)和对照抗体ET150-5-TCB(图4C)对多发性骨髓瘤细胞系AMO-1,L636,NCI-H929,RPMI-8226,OPM-2和WSU-DLCL2的结合分析。
图5A-E。GPRC5D-TCB介导的对多发性骨髓瘤细胞系AMO-1(图5A),NCI-H929(图5B),RPMI-8226(图5C)和L363(图5D)的T细胞细胞毒性的分析。对照细胞系是WSU-DL CL2(图5E)。测试分子:5E11-TCB,5F11-TCB。对照分子:DP47-TCB(非靶向性的)和ET150-5-TCB。
图6。上调CD25和CD69的GPRC5D-TCB活化的T细胞啮合多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929和阴性对照细胞系WSU-DLCL2的分析。
图7A-J。上调细胞系AMO-1(图7A),NCI-H929(图7B),RPMI-8226(图7C),L363(图7D)和WSU-DLCL2(图7E)中的CD25和上调细胞系AMO-1(图7F),NCI-H929(图7G),RPMI-8226(图7H),L363(图7I)和WSU-DLCL2(图7J)中的CD69的GPRC5D-TCB活化的T细胞啮合多发性骨髓瘤的分析。
图8A-B。通过荧光共焦显微术的抗体定位和内在化的显现(图8A)和膜对胞质的信号强度的分析(图8B)。
图9。使用表达人GPRC5D(克隆12)或食蟹猴GPRC5D(克隆13),鼠GPRC5D(克隆4)或人GPRC5A(克隆30)的稳定转染CHO克隆,通过ELISA评估不同抗GPRC5D抗体对人,食蟹猴和鼠GPRC5D的结合。
图10A-G。共温育(E:T＝10:1,人泛T细胞)20小时期间由不同GPRC5D或BCMA靶向性T细胞双特异性分子诱导的T细胞介导的各种多发性骨髓瘤(MM)细胞系裂解。描绘的是一式两份及SD。
图11A-F。同种异基因泛人T细胞和来自健康供体的未加工骨髓细胞(E:T＝10:1,人泛T细胞)共温育约20小时期间由不同GPRC5D或BCMA靶向性T细胞双特异性分子(图11A中5E11-TCB；图11B中5F11-TCB；图11C中10B10-TCB；图11D中BCMA-TCB；图11E中BCMA-TCB；图11F中DP47-TCB)诱导的T细胞活化。描绘的是来自一名代表性供体的FACS点图,作为所有CD4或CD8 T细胞中的阳性细胞百分比,显示CD4(上面的行)或CD8 T细胞(下面的行)上活化标志物CD69的上调。
图12A-B。同种异基因泛人T细胞和来自健康供体的未加工骨髓细胞(E:T＝10:1,人泛T细胞)共温育约20小时期间由不同GPRC5D或BCMA靶向性T细胞双特异性分子诱导的T细胞活化。描绘的是所有四名评估供体的汇总,显示在选定的固定剂量50nM(图12A)或5nM(图12B)TCB时CD8 T细胞上活化标志物CD69的上调。
图13A-D。由不同GPRC5D靶向性T细胞双特异性分子(图13A中5F11-TCB；图13B中BCMA-TCB；图13C中B72-TCB；图13D中媒介)诱导的体内功效,如通过植入有NCI-H929肿瘤细胞的人源化NSG小鼠模型中随时间的肿瘤生长动力学描绘的。绘制的是蜘蛛图,每条线指一只小鼠。
图14A-D。由不同GPRC5D靶向性T细胞双特异性分子(图14A中5F11-TCB；图14B中5E11-TCB；图14C中B72-TCB；图14D中媒介)诱导的体内功效,如通过植入有OPM-2肿瘤细胞的人源化NSG小鼠模型中随时间的肿瘤生长动力学描绘。绘制的是蜘蛛图,每条线指一只小鼠。
图15A-B。温育大致16小时后的PGLALA-CAR-J活化,如通过发光测定的。后者在GPRC5D IgG(图15A中5F11-IgG；图15B中5E11-IgG)对GPRC5D表达性多发性骨髓瘤细胞系L-363和PGLALA修饰的Fc域对经遗传工程而表达针对这些IgG分子的Fc部分中的PGLALA突变的TCR的Jurkat-NFAT报告细胞的同时结合后被诱导。描绘的是一式两份及SD。
发明详述
定义
除非在下文另外定义,术语在本文中如本领域中一般使用的那样使用。
如本文中使用的,术语“抗原结合分子”在其最广义上指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是免疫球蛋白及其衍生物,例如片段。
术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同的抗原性决定簇。通常,双特异性抗原结合分子包含两种抗原结合位点,其中每种特异于不同的抗原性决定簇。在某些实施方案中,所述双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇,特别是在两种不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。
如本文中使用的,术语“价”指抗原结合分子中规定数目的抗原结合位点的存在。因而,术语“对抗原的单价结合”指抗原结合分子中一个(且不超过一个)特异于抗原的抗原结合位点的存在。
“抗原结合位点”指抗原结合分子上提供与抗原相互作用的位点,即一个或多个氨基酸残基。例如,抗体的抗原结合位点包含来自互补性决定区(CDR)的氨基酸残基。天然的免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点,Fab分子通常具有单个抗原结合位点。
如本文中使用的,术语“抗原结合模块”指特异性结合抗原性决定簇的多肽分子。在一个实施方案中,抗原结合模块能够将与其附接的实体(例如第二抗原结合模块)引导至靶部位,例如至特定类型的携有抗原性决定簇的肿瘤细胞。在另一个实施方案中,抗原结合模块能够经由其靶抗原例如T细胞受体复合物抗原来激活信号传导。抗原结合模块包括如本文中另外定义的抗体及其片段。具体的抗原结合模块包括抗体的抗原结合域,其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方案中,抗原结合模块可以包含抗体恒定区,如本文中另外定义和本领域中已知的。可用的重链恒定区包括以下5种同种型中的任何一种:α,δ,ε,γ或μ。可用的轻链恒定区包括以下2种同种型中的任何一种:κ和λ。
如本文中使用的,术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义,并且指多肽大分子上与抗原结合模块结合,从而形成抗原结合模块-抗原复合物的位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区构成的构象性构造)。可用的抗原性决定簇可以在例如肿瘤细胞表面上,病毒感染的细胞的表面上,其它患病细胞的表面上,免疫细胞的表面上,游离在血液血清中和/或在胞外基质(ECM)中找到。除非另外指示,本文中称作抗原的蛋白质(例如GPRC5D,CD3)可以是来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然形式的蛋白质。在一个特定实施方案中,抗原是人蛋白。在对本文中的具体蛋白质进行提述的情况下,该术语涵盖“全长”,未加工的蛋白质以及起因于细胞中加工的蛋白质的任何形式。该术语还涵盖蛋白质的天然存在变体,例如剪接变体或等位变体。可用作抗原的一种例示性人蛋白是CD3,特别是CD3的ε亚基(对于人序列,参见UniProt no.P07766(版本185),NCBI RefSeq no.NP_000724.1,SEQ ID NO:40；或对于食蟹猴[Macaca fascicularis]序列,参见UniProtno.Q95LI5(版本69),NCBI GenBank no.BAB71849.1,SEQ ID NO:41),或GPRC5D(对于人序列,参见UniProt no.Q9NZD1(版本115)；NCBI RefSeq no.NP_061124.1,SEQ ID NO:45)。在某些实施方案中,本发明的抗体或双特异性抗原结合分子结合在来自不同物种的CD3或GPRC5D抗原间保守的CD3或GPRC5D的表位。在特定的实施方案中,本发明的抗体或双特异性抗原结合分子结合人GPRC5D。
“特异性结合”意指结合对于抗原是选择性的,并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。抗原结合模块结合特定抗原性决定簇的能力能经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术,例如表面等离振子共振(SPR)技术(例如在BIAcore仪上分析)(Liljeblad等,Glyco J 17,323-329(2000)),以及传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施方案中,抗原结合模块对无关蛋白质的结合程度是该抗原结合模块对抗原结合的小于约10％,如例如通过SPR测量的。在某些实施方案中,结合抗原的抗原结合模块,或包含该抗原结合模块的抗原结合分子具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更少,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。
“亲和力”指分子(例如受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗原结合模块和抗原,或受体及其配体)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以以解离常数(KD)来表述,其为解离与结合速率常数(分别为K解离和K结合)的比率。如此,相等的亲和力可能包含不同的速率常数,只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的确立方法来测量,包括本文中描述的那些方法。用于测量亲和力的一种具体方法是表面等离振子共振(SPR)。
“降低的结合”,例如降低的对Fc受体的结合,指相应相互作用的亲和力降低,如例如通过SPR测量的。为了清楚,该术语还包括亲和力降低至0(或低于分析方法的检测限),即完全消除相互作用。相反,“升高的结合”指相应相互作用的结合亲和力升高。
如本文中使用的,“活化性T细胞抗原”指在T淋巴细胞,特别是细胞毒性T淋巴细胞的表面上表达的抗原性决定簇,其在与抗原结合分子相互作用后能诱导T细胞活化。特定地,抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可诱导T细胞活化,其通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联进行。在一个具体的实施方案中,所述活化性T细胞抗原是CD3,特别是CD3的ε亚基(对于人序列,参见UniProt no.P07766(版本144),NCBI RefSeq no.NP_000724.1,SEQ ID NO:40；或对于食蟹猴[Macaca fascicularis]序列,参见UniProtno.Q95LI5(版本49),NCBI GenBank no.BAB71849.1,SEQ ID NO:41)。
如本文中使用的,“T细胞活化”指T淋巴细胞,特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答,其选自:增殖,分化,细胞因子分泌,细胞毒性效应分子释放,细胞毒性活性和活化标志物的表达。合适的测量T细胞活化的测定法是本领域已知的且在本文中有描述。
如本文中使用的,“靶细胞抗原”指靶细胞表面上呈现的抗原性决定簇,所述靶细胞例如肿瘤中的细胞如癌细胞或肿瘤基质的细胞。在一个特别的实施方案中,所述靶细胞抗原是GPRC5D,特别是依照SEQ ID NO:45的人GPRC5D。
如本文中使用的,术语“第一”,“第二”或“第三”就Fab分子等而言为了在有超过一个每类模块时便于区分而使用。除非明确如此陈述,这些术语的使用不意图赋予双特异性抗原结合分子的特定次序或取向。
“融合”意指构件(例如Fab分子和Fc域亚基)直接地或经由一种或多种肽接头通过肽键连接。
“Fab分子”指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL域组成的蛋白质。
“交换”Fab分子(也称作“Crossfab”)意指其中Fab重链和轻链的可变域或恒定域交换(即彼此替换)的Fab分子,即交换Fab分子包含由轻链可变域VL和重链恒定域1CH1构成的肽链(VL-CH1,N至C端方向),和由重链可变域VH和轻链恒定域CL构成的肽链(VH-CL,N至C端方向)。为了清楚,在其中Fab轻链和Fab重链的可变域交换的交换Fab分子中,包含重链恒定域1CH1的肽链在本文中称作(交换)Fab分子的“重链”。相反,在其中Fab轻链和Fab重链的恒定域交换的交换Fab分子中,包含重链可变域VH的肽链在本文中称作(交换)Fab分子的“重链”。
与之相反,“常规”Fab分子意指处于它的天然型式的Fab分子,即包含由重链可变和恒定域构成的重链(VH-CH1,N至C端方向),和由轻链可变和恒定域构成的轻链(VL-CL,N至C端方向)。
术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如,IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从N端至C端,每条重链具有可变域(VH),也称作可变重域或重链可变区,接着是3个恒定域(CH1,CH2和CH3),也称作重链恒定区。类似地,从N端至C端,每条轻链具有可变域(VL),也称作可变轻域或轻链可变区,接着是恒定轻(CL)域(也称作轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入称作α(IgA),δ(IgD),ε(IgE),γ(IgG)或μ(IgM)的5类之一,其中一些可以进一步分成亚类,例如γ1(IgG1),γ2(IgG2),γ3(IgG3),γ4(IgG4),α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列,免疫球蛋白的轻链可以归入称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc域组成。
术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体,多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现出期望的抗原结合活性。
在用于本文时,术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体,即群体中包含的各个抗体是相同的和/或结合相同表位,除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外,此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同,单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此,修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特征,而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如,可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体,包括但不限于杂交瘤方法,重组DNA方法,噬菌体展示方法,和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开,即并不处于它的天然环境中的抗体。不需要特定水平的纯化。例如,分离的抗体可以从其天然或自然环境中取出。就本发明的目的而言,在宿主细胞中表达的重组生成的抗体被视为分离的,已通过任何合适的技术分开,分级,或部分或基本上纯化的天然的或重组的抗体也是如此。因此,本发明的抗体和双特异性抗原结合分子是分离的。在一些实施方案中,抗体纯化至大于95％或99％的纯度,如通过例如电泳(例如SDS-PAGE,等电聚焦(IEF),毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)方法测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述,见例如Flatman et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
术语“全长抗体”,“完整抗体”,和“全抗体”在本文中可互换使用,指与天然抗体结构具有基本上类似的结构的抗体。
“抗体片段”指完整抗体以外的分子,其包含完整抗体中结合与完整抗体结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2,双抗体,线性抗体,单链抗体分子(例如scFv),和单域抗体。对于某些抗体片段的综述,参见Hudson等,Nat Med 9,129-134(2003)。对于scFv片段的综述,参见例如Plückthun,于ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；亦参见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的论述,参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger等,Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat Med 9,129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域,或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。可以通过各种技术来制备抗体片段,包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生,如本文中描述的。
术语“抗原结合域”指包含特异性结合部分或整个抗原且与其互补的区域的抗体部分。抗原结合域可由例如一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供。具体地,抗原结合域包含抗体轻链可变域(VL)和抗体重链可变域(VH)。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构,每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。参见例如Kindt等,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freemanand Co.,第91页(2007)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。如本文中结合可变区序列使用的,“Kabat编号方式”指由Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)提出的编号系统。
如本文中使用的,所有重和轻链的恒定区和域的氨基酸位置是依照Kabat,etal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号的,在本文中称作“依照Kabat的编号方式”或“Kabat编号方式”。具体而言,将Kabat编号系统(参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第647-660页)用于卡帕和拉姆达同种型的轻链恒定域CL并将Kabat EU索引编号系统(参见第661-723页)用于重链恒定域(CH1,铰链,CH2和CH3),在这种情况中在本文中通过提到“依照Kabat EU索引的编号方式”来进一步澄清。
如本文中使用的,术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的(“互补决定区”或“CDR”；重链可变区/域的CDR缩写为例如HCDR1,HCDR2和HCDR3；轻链可变区/域的CDR缩写为例如LCDR1,LCDR2和LCDR3)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)的每个区。一般地,抗体包含6个HVR:三个在VH中(H1,H2,H3),且三个在VL中(L1,L2,L3)。本文中的例示性HVR包括:
(a)高变环,存在于氨基酸残基26-32(L1),50-52(L2),91-96(L3),26-32(H1),53-55(H2),和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)CDR,存在于氨基酸残基24-34(L1),50-56(L2),89-97(L3),31-35b(H1),50-65(H2),和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)抗原接触,存在于氨基酸残基27c-36(L1),46-55(L2),89-96(L3),30-35b(H1),47-58(H2),和93-101(H3)(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a),(b),和/或(c)的组合,包括HVR氨基酸残基46-56(L2),47-56(L2),48-56(L2),49-56(L2),26-35(H1),26-35b(H1),49-65(H2),93-102(H3),和94-102(H3)。
除非另有指示,可变域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等,见上文编号。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。可变域的FR一般由4个FR域组成:FR1,FR2,FR3和FR4。因而,HVR和FR序列一般以下列次序出现在VH(或VL)中:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体会包含至少一个,通常两个基本上整个可变域,其中所有或基本上所有HVR(例如,CDR)对应于非人抗体的那些,且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。此类可变域在本文中称作“人源化可变区”。任选地,人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。在一些实施方案中,将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代,例如为了恢复或改善抗体特异性或亲和力。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是那些其中的恒定区已经另外自初始抗体的恒定区进行过修饰或改变以生成依照本发明的特性(特别地关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合)的。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。在某些实施方案中,人抗体衍生自非人转基因哺乳动物,例如小鼠,大鼠,或家兔。在某些实施方案中,人抗体衍生自杂交瘤细胞系。自人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中也认为是人抗体或人抗体片段。
抗体或免疫球蛋白的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5种主要的类:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM,并且这些中数种可以进一步分成亚类(同种型),例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ和μ。
本文中术语“Fc域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化,但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而,由宿主细胞生成的抗体可能经历翻译后切割,自重链的C端切除一个或多个,特别是一个或两个氨基酸。因此,通过表达编码全长重链的特定核酸分子由宿主细胞生成的抗体可包括全长重链,或者它可包括全长重链的切割变体(在本文中也称作“切割变体重链”)。当重链的最终两个C端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447,编号方式依照Kabat EU索引)时可能就是这种情况。因此,Fc区的C端赖氨酸(Lys447),或C端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或不存在。如果没有另外指明的话,包括Fc域(或本文中定义的Fc域的亚基)的重链的氨基酸序列在本文中表示无C端甘氨酸-赖氨酸二肽的。在本发明的一个实施方案中,依照本发明的抗体或双特异性抗原结合分子中包含的包括本文中规定的Fc域的一个亚基的重链包含另外的C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447,编号方式依照Kabat的EU索引)。在本发明的一个实施方案中,依照本发明的抗体或双特异性抗原结合分子中包含的包括本文中规定的Fc域的一个亚基的重链包含另外的C端甘氨酸残基(G446,编号方式依照Kabat的EU索引)。本发明的组合物,诸如本文所述药学组合物,包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的群体。抗体或双特异性抗原结合分子的群体可包含具有全长重链的分子和具有切割变体重链的分子。抗体或双特异性抗原结合分子的群体可以由具有全长重链的分子和具有切割变体重链的分子的混合物组成,其中至少50％,至少60％,至少70％,至少80％或至少90％的抗体或双特异性抗原结合分子具有切割变体重链。在本发明的一个实施方案中,包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的群体的组合物包含如下的抗体或双特异性抗原结合分子,其包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447,编号方式依照Kabat的EU索引)的重链。在本发明的一个实施方案中,包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的群体的组合物包含如下的抗体或双特异性抗原结合分子,其包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸残基(G446,编号方式依照Kabat的EU索引)的重链。在本发明的一个实施方案中,此类组合物包含由如下分子构成的抗体或双特异性抗原结合分子的群体:包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基的重链的分子；包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸残基(G446,编号方式依照Kabat的EU索引)的重链的分子,和包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447,编号方式依照Kabat的EU索引)的重链的分子。除非本文中另外指定,Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统,也称作EU索引,如记载于Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991(也参见上文)。如本文中使用的,Fc域的“亚基”指形成二聚体Fc域的两个多肽之一,即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的多肽。例如,IgG Fc域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定域。
“促进Fc域的第一亚基和第二亚基联合的修饰”是降低或防止包含Fc域亚基的多肽与相同多肽联合以形成同二聚体的肽主链操作或Fc域亚基的翻译后修饰。如本文中使用的,具体地,促进联合的修饰包括对期望联合的两个Fc域亚基(即Fc域的第一亚基和第二亚基)中的每一个进行的分开的修饰,其中所述修饰彼此互补,从而促进两个Fc域亚基的联合。例如,促进联合的修饰可以改变一种或两种Fc域亚基的结构或电荷,从而在立体或静电上分别促进它们的联合。如此,(异)二聚化在包含第一Fc域亚基的多肽和包含第二Fc域亚基的多肽之间发生,其在融合至每个亚基的别的构件(例如抗原结合模块)不同这一意义上讲可能是不相同的。在一些实施方案中,促进联合的修饰包含在Fc域中的氨基酸突变,具体为氨基酸替代。在一个具体的实施方案中,促进联合的修饰包含Fc域的两个亚基的每一个中分开的氨基酸突变,具体为氨基酸替代。
术语“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC),Fc受体结合,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP),细胞因子分泌,免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取,细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞活化。
如本文中使用的,术语“工程化”视为包括对肽主链的任何操作或对天然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列,糖基化模式或各氨基酸侧链基团的修饰,以及这些办法的组合。
如本文中使用的,术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸替代,缺失,插入和修饰。可以进行替代,缺失,插入和修饰的任意组合来实现最终构建体,只要最终构建体拥有期望的特性,例如降低的对Fc受体的结合,或与另一种肽的增加的联合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸插入。具体的氨基酸突变是氨基酸替代。为了改变例如Fc区的结合特征,特别优选非保守性的氨基酸替代,即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸替代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸,3-甲基组氨酸,鸟氨酸,高丝氨酸,5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变,PCR,基因合成等。认为通过遗传工程以外的方法如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也可能可用。本文中可使用各种名称来指示同一氨基酸突变。例如,从Fc域第329位脯氨酸到甘氨酸的替代可指示为329G,G329,G329,P329G或Pro329Gly。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后,且不将任何保守性替代视为序列同一性的一部分时,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行,例如使用公众可得到的计算机软件,诸如BLAST,BLAST-2,Clustal W,Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数,包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而,为了本文中的目的,％氨基酸序列同一性值是使用36.3.8c或更晚的版本FASTA包的ggsearch程序及BLOSUM50比较矩阵生成的。FASTA程序包由W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)“Improved Tools for Biological SequenceAnalysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequencecomparison”Meth.Enzymol.266:227-258；和Pearson et al.(1997)Genomics 46:24-36撰写且自http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml公众可得。或者,可使用在http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处可及的公共服务器来比较序列,使用ggsearch(全局蛋白质:蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；打开:-10；延伸:-2；Ktup＝2)以确保实施全局而非局部比对。百分比氨基酸同一性在输出比对标题中给出。
术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建体,例如信使RNA(mRNA),病毒衍生的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如酰胺键,如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸分子”指任何一种或多种存在于多核苷酸中的核酸区段,例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已从其天然环境取出的核酸分子,DNA或RNA。例如,就本发明的目的而言,包含在载体中的编码多肽的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中保持的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括在普遍含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子,但该多核苷酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录本,以及正链和负链形式,和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成生成的此类分子。另外,多核苷酸或核酸可以为或可以包括调节元件如启动子,核糖体结合位点或转录终止子。
“分离的编码[例如本发明的抗体或双特异性抗原结合分子]多核苷酸(或核酸)”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种多核苷酸分子,包括在单一载体或分开的载体中的此类多核苷酸分子,和在宿主细胞中的一个或多个位置处存在的此类核酸分子。
术语“表达盒”指重组或合成生成的,具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的指定核酸元件的多核苷酸。可以将重组表达盒掺入质粒,染色体,线粒体DNA,质体DNA,病毒或核酸片段中。通常,表达载体的重组表达盒部分包含要转录的核酸序列和启动子等。在某些实施方案中,表达盒包含编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”指用于在细胞中导入与其可操作联合的特定基因及指导其表达的DNA分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入到已经接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体在细胞内,就通过细胞转录和/或翻译装置生成由基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中,本发明的表达载体包含表达盒,其包含编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”,其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同,但可以含有突变。本文中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是能用于生成本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞,例如哺乳动物培养细胞如HEK细胞,CHO细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞和植物细胞等,而且还包括在转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。
“激活Fc受体”是一种在抗体的Fc域衔接后,引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。人激活Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a),FcγRI(CD64),FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是一种导致通过免疫效应器细胞对抗体包被的靶细胞裂解的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体或其衍生物一般经由Fc区的N端的蛋白质部分特异性结合的细胞。如本文中使用的,术语“降低的ADCC”定义为通过上文定义的ADCC机制,以靶细胞周围介质中给定浓度的抗体,在给定的时间内裂解的靶细胞数目的降低,和/或通过ADCC机制,实现给定时间内给定数目的靶细胞裂解需要的靶细胞周围介质中抗体浓度的增加。ADCC的降低相对于使用相同的标准生产,纯化,配制和贮存方法(其是本领域技术人员已知的),由同一类型的宿主细胞生成但尚未工程化改造的相同抗体介导的ADCC。例如,由在其Fc域包含降低ADCC的氨基酸替代的抗体所介导的ADCC中的降低,是相对于由在Fc域中无此氨基酸替代的相同抗体介导的ADCC而言。测量ADCC的合适测定法是本领域中公知的(参见例如PCT公开文本No.WO 2006/082515或PCT公开文本No.WO2012/130831)。
药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化必需的量。
药剂例如药学组合物的“治疗有效量”指有效实现期望的治疗或预防结果的量(以必要的剂量且持续必要的时间)。治疗有效量的药剂例如消除,降低,延迟,最小化或预防疾病的不良作用。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛,绵羊,猫,犬和马),灵长类(例如人和非人灵长类如猴),家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。特别地,所述个体或受试者是人。
术语“药学组合物”指其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性有效,且不含对会接受组合物施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载体”指药学组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂,赋形剂,稳定剂或防腐剂。
如本文中使用的,“治疗/处理”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程,并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,降低疾病的任何直接或间接病理学后果,预防转移,减缓疾病进展速率,改善或减轻疾病状态,及消退或改善的预后。在一些实施方案中,本发明的抗体或双特异性抗原结合分子用于延迟疾病的形成或延缓疾病的进展。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业化包装中通常含有的说明书,其含有关于适应症,使用,剂量,施用,组合疗法,禁忌症的信息和/或关于使用此类治疗产品的警告。
实施方案的详细描述
本发明提供结合GPRC5D,特别是人GPRC5D的抗体和双特异性抗原结合分子。另外,该分子具有其它对于治疗性应用有利的特性,例如就功效和/或安全性以及生产力而言。
GPRC5D抗体
在第一个方面,本发明提供一种结合GPRC5D的抗体,其中该抗体包含(i)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:84的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；(ii)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:85的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR3,该轻链可变区(VL)包含SEQ IDNO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；(iii)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；(iv)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；或(v)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:92的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ IDNO:97的LCDR 3。
在一些实施方案中,该抗体是人源化抗体。在一个实施方案中,该VH是人源化VH和/或该VL是人源化VL。在一个实施方案中,该抗体包含如任何上述实施方案中的CDR,且进一步包含受体人框架,例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个特定实施方案中,(i)该VH包含与SEQ ID NO:13的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或(ii)该VH包含与SEQ IDNO:15的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或(iii)该VH包含与SEQ ID NO:48的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或(iv)该VH包含与SEQ ID NO:49的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或(v)该VH包含与SEQ IDNO:57的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或(vi)该VH包含与SEQ ID NO:58的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。
在一个特定实施方案中,该抗体包含(i)与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH,和与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL；或(ii)与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH,和与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL；或(iii)与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH,和与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL；或(iv)与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH,和与SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL；或(v)与SEQ ID NO:57的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH,和与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL；或(vi)与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH,和与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL。
在另一个实施方案中,该抗体是IgG,特别是IgG1,抗体。在一个实施方案中,该抗体是全长抗体。在另一个实施方案中,该抗体是选自Fv分子,scFv分子,Fab分子,和F(ab')2分子的组的抗体片段。在一个实施方案中,该抗体是多特异性抗体。
在某些实施方案中,具有至少95％,96％,97％,98％,或99％同一性的VH或VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代),插入,或删除,但是包含该序列的抗体保留结合GPRC5D的能力。在某些实施方案中,在SEQ ID NO:13中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸和/或在SEQ ID NO:14中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸和/或在SEQ IDNO:15中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸和/或在SEQ ID NO:16中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸和/或在SEQ ID NO:48中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸和/或在SEQ ID NO:53中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸和/或在SEQ IDNO:49中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸和/或在SEQ ID NO:52中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸和/或在SEQ ID NO:57中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸和/或在SEQ ID NO:64中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸和/或在SEQ IDNO:58中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸和/或在SEQ ID NO:63中替代,插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。
在某些实施方案中,替代,插入,或删除在HVR以外的区域中(即在FR中)发生。任选地,该抗体包含SEQ ID NO:13中的VH序列和/或SEQ ID NO:14中的VL序列,包括该序列的翻译后修饰。任选地,该抗体包含SEQ ID NO:15中的VH序列和/或SEQ ID NO:16中的VL序列,包括该序列的翻译后修饰。任选地,该抗体包含SEQ ID NO:48中的VH序列和/或SEQ ID NO:53中的VL序列,包括该序列的翻译后修饰。任选地,该抗体包含SEQ ID NO:49中的VH序列和/或SEQ ID NO:52中的VL序列,包括该序列的翻译后修饰。任选地,该抗体包含SEQ IDNO:57中的VH序列和/或SEQ ID NO:64中的VL序列,包括该序列的翻译后修饰。任选地,该抗体包含SEQ ID NO:58中的VH序列和/或SEQ ID NO:63中的VL序列,包括该序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中,该抗体包含包含选自SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的组的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中,该抗体包含选自SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:12的组的VH序列,和SEQ ID NO:16的VL序列。
在一个特定实施方案中,该抗体包含包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,该抗体包含SEQ ID NO:13的VH序列和SEQ ID NO:14的VL序列。
在一个特定实施方案中,该抗体包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,该抗体包含SEQ ID NO:15的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列。
在一个特定实施方案中,该抗体包含包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,该抗体包含SEQ ID NO:48的VH序列和SEQ ID NO:53的VL序列。
在一个特定实施方案中,该抗体包含包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,该抗体包含SEQ ID NO:49的VH序列和SEQ ID NO:52的VL序列。
在一个特定实施方案中,该抗体包含包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,该抗体包含SEQ ID NO:57的VH序列和SEQ ID NO:64的VL序列。
在一个特定实施方案中,该抗体包含包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,该抗体包含SEQ ID NO:58的VH序列和SEQ ID NO:63的VL序列。
在一个实施方案中,该抗体包含人恒定区。在一个实施方案中,该抗体是包含人恒定区的免疫球蛋白分子,特别是包含人CH1,CH2,CH3和/或CL域的IgG类免疫球蛋白分子。人恒定域的例示性序列见SEQ ID NO:37和38(分别是人卡帕和拉姆达CL域)和SEQ ID NO:39(人IgG1重链恒定域CH1-CH2-CH3)。在一些实施方案中,该抗体包含包含与SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链恒定区。在一些实施方案中,该抗体包含包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链恒定区。特别是,该重链恒定区可包含如本文中描述的Fc域中的氨基酸突变。
在一个实施方案中,该抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中,该抗体是IgG,特别是IgG1,抗体。在一个实施方案中,该抗体是全长抗体。
在一个实施方案中,该抗体包含Fc域,特别是IgG Fc域,更加特别是IgG1 Fc域。在一个实施方案中,该Fc域是人Fc域。该抗体的Fc域可以单一地或组合地并入本文中关于本发明的双特异性抗原结合分子的Fc域描述的任何特征。
在另一个实施方案中,该抗体是选自Fv分子,scFv分子,Fab分子,和F(ab’)2分子的组的抗体片段；特别是Fab分子。在另一个实施方案中,该抗体片段是双抗体,三抗体或四抗体。
在又一个方面,依照任何上述实施方案的抗体可以单一地或组合地并入如下文各节中描述的任何特征。
糖基化变体
在某些实施方案中,改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列,使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗体包含Fc区的情况中,可以改变附着于它的寡糖。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的,双触角的寡糖,其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright et al.,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物,例如甘露糖,N-乙酰葡糖胺(GlcNAc),半乳糖,和唾液酸,以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中,可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中,提供了抗体变体,其具有附着(直接或间接)于Fc区的非岩藻糖基化寡糖,即缺乏岩藻糖的寡糖结构。此类非岩藻糖基化寡糖(也称作“无岩藻糖基化”寡糖)特别是缺乏附着于双触角寡糖结构的主干中的第一个GlcNAc的岩藻糖残基的N连接的寡糖。在一个实施方案中,提供了具有Fc区中与天然或亲本抗体相比升高比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体变体。例如,非岩藻糖基化寡糖的比例可以是至少约20％,至少约40％,至少约60％,至少约80％,或甚至约100％(即不存在岩藻糖基化寡糖)。非岩藻糖基化寡糖的百分比是相对于附着于Asn297的所有寡糖(例如复合的,杂合的和高甘露糖的结构)的总和,缺乏岩藻糖残基的寡糖的(平均)量,如通过MALDI-TOF质谱术测量的,例如如记载于WO2006/082515的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的EU编号方式)的天冬酰胺残基；然而,Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸,即在第294位和第300位之间。此类具有Fc区中升高比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体可以具有改善的FcRγIIIa受体结合和/或改善的效应器功能,特别是改善的ADCC功能。见例如US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能够生成具有降低的岩藻糖基化的抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US2003/0157108；和WO 2004/056312,尤其在实施例11),和敲除细胞系,诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO 2003/085107),或GDP-岩藻糖合成或转运蛋白活性降低或消除的细胞(见例如US2004259150,US2005031613,US2004132140,US2004110282)。
在又一个实施方案中,提供了具有两分型寡糖的抗体变体,例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有如上所述降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如Umana et al.,Nat Biotechnol17,176-180(1999)；Ferrara et al.,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540,WO 2003/011878。
还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764。
经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中,可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体,例如,“thioMAb”,其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中,替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基,反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点,并且可以用于将抗体与其它模块,诸如药物模块或接头-药物模块缀合,以创建免疫缀合物,如本文中进一步描述的。可以如例如美国专利No.7,521,541,8,30,930,7,855,275,9,000,130,或WO2016040856所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
抗体衍生物
在某些实施方案中,可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG),乙二醇/丙二醇共聚物,羧甲基纤维素,右旋糖苷,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,聚-1,3-二氧戊环,聚-1,3,6-三噁烷,乙烯/马来酸酐共聚物,聚氨基酸(均聚物或随机共聚物),和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇,丙二醇均聚物,环氧丙烷/环氧乙烷共聚物,聚氧乙烯化多元醇(例如甘油),聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性,聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量,而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化,而且如果附着了超过一个聚合物,那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言,可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型,包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能,抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中,提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中,非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的,并且包括但不限于对普通细胞没有损害,但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
免疫缀合物
本发明还提供了包含与一种或多种治疗剂,诸如细胞毒剂,化疗剂,药物,生长抑制剂,毒素(例如蛋白质毒素,细菌,真菌,植物或动物起源的酶活性毒素,或其片段),或放射性同位素缀合(成化学键)的如本文中描述的抗GPRC5D抗体的免疫缀合物。
在一个实施方案中,免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC),其中抗体与一种或多种上文提到的治疗剂缀合。典型地使用接头将抗体与一种或多种治疗剂连接。ADC技术(包括治疗剂和药物和接头的例子)的综述见Pharmacol Review 68:3-19(2016)。
在另一个实施方案中,免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所描述的抗体,酶活性毒素包括但不限于白喉A链,白喉毒素的非结合活性片段,外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)),蓖麻毒蛋白(ricin)A链,相思豆毒蛋白(abrin)A链,蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链,α-帚曲霉素(sarcin),油桐(Aleuritesfordii)毒蛋白,香石竹(dianthin)毒蛋白,美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI,PAPII和PAP-S),苦瓜(Momordica charantia)抑制物,麻疯树毒蛋白(curcin),巴豆毒蛋白(crotin),肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂,白树毒蛋白(gelonin),丝林霉素(mitogellin),局限曲菌素(restrictocin),酚霉素(phenomycin),依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。
在另一个实施方案中,免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中所描述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括At211,I131,I125,Y90,Re186,Re188,Sm153,Bi212,P32,Pb212和Lu的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时,它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子,例如tc99m或I123,或供核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像,mri)用的自旋标记物,诸如再一次的碘-123,碘-131,铟-111,氟-19,碳-13,氮-15,氧-17,钆,锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的缀合物,诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP),琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC),亚氨基硫烷(IT),亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯),活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯),醛类(诸如戊二醛),双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺),双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺),二异硫氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯),和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如,可以如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如,可使用酸不稳定接头,肽酶敏感性接头,光不稳定接头,二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Res 52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖,但不限于用交联试剂制备的此类缀合物,交联试剂包括但不限于BMPS,EMCS,GMBS,HBVS,LC-SMCC,MBS,MPBH,SBAP,SIA,SIAB,SMCC,SMPB,SMPH,sulfo-EMCS,sulfo-GMBS,sulfo-KMUS,sulfo-MBS,sulfo-SIAB,sulfo-SMCC,和sulfo-SMPB,及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯),它们是商品化的(例如,来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
多特异性抗体
在某些实施方案中,本文中提供的抗体是多特异性抗体,例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点(即不同抗原上的不同表位或相同抗原上的不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中,多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。在某些实施方案中,结合特异性之一针对GPRC5D,而其它(两种或更多种)特异性针对任何其它抗原。在某些实施方案中,双特异性抗体可以结合GPRC5D的两种(或更多种)不同表位。也可以使用多特异性(例如双特异性)抗体来将细胞毒性药剂或细胞定位于表达GPRC5D的细胞。多特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(见Milstein and Cuello,Nature 305:537(1983)),和“节-入-穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168和Atwell et al.,J.Mol.Biol.270:26(1997))。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(见例如WO 2009/089004)；交联两种或更多种抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980,和Brennan etal.,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny etal.,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用共同轻链技术来规避轻链错配问题(见例如WO 98/50431)；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber et al.,J.Immunol.,152:5368(1994))；和如例如Tutt etal.J.Immunol.147:60(1991)中所描述的,制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化改造抗体,包括例如“章鱼抗体”或DVD-Ig(见例如WO 2001/77342和WO 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其它例子可以在WO 2010/115589,WO 2010/112193,WO 2010/136172,WO2010/145792,和WO 2013/026831中找到。双特异性抗体或其抗原结合片段还包括包含结合GPRC5D和另一种不同抗原,或GPRC5D的两种不同表位的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US 2008/0069820和WO 2015/095539)。
多特异性抗体还可以以不对称形式提供,其具有一个或多个具有相同抗原特异性的结合臂中的域交换,即通过交换VH/VL域(见例如WO 2009/080252和WO 2015/150447),CH1/CL域(见例如WO 2009/080253)或整个Fab臂(见例如WO 2009/080251,WO 2016/016299,还见Schaefer et al.,PNAS,108(2011)1187-1191,和Klein et al.,MAbs 8(2016)1010-20)。还可以通过将带电荷的或不带电荷的氨基酸突变引入域界面以指导正确的Fab配对来改造不对称Fab臂。见例如WO 2016/172485。
多特异性抗体的各种别的分子型式是本领域知道的且包括在本文中(见例如Spiess et al.,Mol Immunol 67(2015)95-106)。
本文中还包括的一种特定类型的多特异性抗体是设计成同时结合靶细胞,例如肿瘤细胞上的表面抗原和T细胞受体(TCR)复合物的激活性的,不变的构件,诸如CD3,从而再靶向T细胞以杀死靶细胞的双特异性抗体。因此,在某些实施方案中,本文中提供的抗体是多特异性抗体,特别是双特异性抗体,其中结合特异性之一针对GPRC5D且另一针对CD3。
对于这个目的可能有用的双特异性抗体型式的例子包括但不限于所谓的“BiTE”(双特异性T细胞啮合剂)分子,其中通过柔性接头融合两个scFv分子(见例如WO2004/106381,WO2005/061547,WO2007/042261,和WO2008/119567,Nagorsen and
ExpCell Res 317,1255-1260(2011))；双抗体(Holliger et al.,Prot Eng 9,299-305(1996))及其衍生物,诸如串联双抗体(“TandAb”；Kipriyanov et al.,J Mol Biol 293,41-56(1999))；“DART”(双重亲和力再靶向)分子,它们基于双抗体型式但特征在于实现额外稳定化的C端二硫桥(Johnson et al.,J Mol Biol 399,436-449(2010)),和所谓的triomab,它们是完整杂合小鼠/大鼠IgG分子(综述见Seimetz et al.,Cancer Treat Rev36,458-467(2010))。本文中包括的特定T细胞双特异性抗体型式描述于WO 2013/026833,WO2013/026839,WO 2016/020309；Bacac et al.,Oncoimmunology 5(8)(2016)e1203498。
结合GPRC5D和第二抗原的双特异性抗原结合分子
本发明还提供一种双特异性抗原结合分子,即包含能够特异性结合两种截然不同抗原性决定簇(第一和第二抗原)的至少两种抗原结合模块的抗原结合分子。
依照本发明的特定实施方案,双特异性抗原结合分子中包含的抗原结合模块是Fab分子(即由各自包含可变和恒定域的重和轻链构成的抗原结合域)。在一个实施方案中,第一和/或第二抗原结合模块是Fab分子。在一个实施方案中,所述Fab分子是人的。在一个特定实施方案中,所述Fab分子是人源化的。在还有另一个实施方案中,所述Fab分子包含人重和轻链恒定域。
优选地,抗原结合模块中至少一个是交换Fab分子。此类修饰减少来自不同Fab分子的重链和轻链的错误配对,由此改进了重组生产中本发明的双特异性抗原结合分子的产量和纯度。在可用于本发明的双特异性抗原结合分子的一种具体的交换Fab分子中,Fab轻链和Fab重链的可变域(分别是VL和VH)是交换的。然而,甚至在有这种域交换的情况下,由于错配的重和轻链之间所谓的Bence Jones型相互作用,双特异性抗原结合分子的制备物可能包含某些副产物(参见Schaefer et al,PNAS,108(2011)11187-11191)。为了进一步减少来自不同Fab分子的重和轻链的错配及由此提高想要的双特异性抗原结合分子的纯度和产量,可以在结合第一抗原(即GPRC5D)的Fab分子或结合第二抗原(例如活化性T细胞抗原,诸如CD3)的Fab分子的CH1和CL域中的特定氨基酸位置引入具有相反电荷的带电荷的氨基酸,如本文中进一步描述的。在双特异性抗原结合分子中包含的常规Fab分子中(诸如例如图1A-C,G-J中所示)或在双特异性抗原结合分子中包含的VH/VL交换Fab分子中(诸如例如图1D-F,K-N中所示)(但并不在二者中都)进行电荷修饰。在具体的实施方案中,在双特异性抗原结合分子中包含的常规Fab分子(它在具体的实施方案中结合第一抗原,即GPRC5D)中进行电荷修饰。
在依照本发明的一个具体的实施方案中,双特异性抗原结合分子能够同时结合第一抗原(即GPRC5D)和第二抗原(例如活化性T细胞抗原,特别是CD3)。在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子能够通过同时结合GPRC5D和活化性T细胞抗原来交联T细胞和靶细胞。在一个甚至更具体的实施方案中,此类同时结合导致靶细胞(特别是GPRC5D表达性肿瘤细胞)的裂解。在一个实施方案中,此类同时结合导致T细胞的活化。在其它实施方案中,此类同时结合导致T淋巴细胞(特别是细胞毒性T淋巴细胞)的细胞应答,其选自下组:增殖,分化,细胞因子分泌,细胞毒性效应分子释放,细胞毒性活性,和活化标志物的表达。在一个实施方案中,在没有同时结合GPRC5D的情况下双特异性抗原结合分子对活化性T细胞抗原,特别是CD3的结合不导致T细胞活化。
在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子能够将T细胞的细胞毒性活性重定向于靶细胞。在一个具体的实施方案中,所述重定向不依赖于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。
具体地,依照本发明任何实施方案的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方案中,T细胞是CD4+或CD8+T细胞,特别是CD8+T细胞。
第一抗原结合模块
本发明的双特异性抗原结合分子包含至少一个结合GPRC5D(第一抗原)的抗原结合模块,特别是Fab分子。在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子包含两个结合GPRC5D的抗原结合模块,特别是Fab分子。在一个特定此类实施方案中,每个这些抗原结合模块结合相同的抗原性决定簇。在一个甚至更加特定实施方案中,所有这些抗原结合模块是相同的,即它们包含相同的氨基酸序列,包括与本文中描述的相同的CH1和CL域中氨基酸替代(如果有的话)。在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子包含不超过两个结合GPRC5D的抗原结合模块,特别是Fab分子。
在特定实施方案中,结合GPRC5D的抗原结合模块是常规Fab分子。在此类实施方案中,结合第二抗原的抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CH1和CL是彼此交换/替换的Fab分子。
在备选实施方案中,结合GPRC5D的抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CH1和CL是彼此交换/替换的Fab分子。在此类实施方案中,结合第二抗原的抗原结合模块是常规Fab分子。
GPRC5D结合模块能够将双特异性抗原结合分子指导至靶部位,例如特定类型的表达GPRC5D的肿瘤细胞。
双特异性抗原结合分子的第一抗原结合模块可单一地或组合地并入本文中涉及结合GPRC5D的抗体描述的任何特征,除非在科学上明显不合理或不可能。
如此,在一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:84的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3,和(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块。在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:85的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3,和(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块。在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ IDNO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQID NO:97的LCDR 3,和(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块。在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3,和(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块。在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:92的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3,和(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块。在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ IDNO:2的HCDR 2,和SEQ ID NO:3的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3,和(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块。在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:8的HCDR 2,和SEQ ID NO:9的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR 3,和(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块。
在一些实施方案中,第一抗原结合模块是(衍生自)人源化抗体。在一个实施方案中,VH是人源化VH且/或VL是人源化VL。在一个实施方案中,第一抗原结合模块包含如任何上述实施方案中的CDR,而且进一步包含受体人框架,例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个实施方案中,第一抗原结合模块的VH包含与选自SEQ ID NO:13,SEQ IDNO:15,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且第一抗原结合模块的VL包含与选自SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:63和SEQID NO:64的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中,第一抗原结合模块包含与选自SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与选自SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在一个实施方案中,第一抗原结合模块包含包含选自SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的组的氨基酸序列的VH,和包含选自SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的组的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中,第一抗原结合模块包含选自SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的组的VH序列,和选自SEQ IDNO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的组的VL序列。
在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含SEQ ID NO:13的VH序列和SEQ ID NO:14的VL序列。
在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含SEQ ID NO:15的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列。
在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含SEQ ID NO:48的VH序列和SEQ ID NO:53的VL序列。
在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含SEQ ID NO:49的VH序列和SEQ ID NO:52的VL序列。
在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含SEQ ID NO:57的VH序列和SEQ ID NO:64的VL序列。
在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,第一抗原结合模块包含SEQ ID NO:58的VH序列和SEQ ID NO:63的VL序列。
在一个实施方案中,第一抗原结合模块包含人恒定区。在一个实施方案中,第一抗原结合模块是包含人恒定区,特别是人CH1和/或CL域的Fab分子。人恒定域的例示性序列在SEQ ID NO:37和38(分别是人卡帕和拉姆达CL域)和SEQ ID NO:39(人IgG1重链恒定域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施方案中,第一抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:37或SEQID NO:38的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:37的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链恒定区。特别地,轻链恒定区可包含如本文中在“电荷修饰”下描述的氨基酸突变且/或可包含一个或多个(特别是两个)N端氨基酸的删除或替代,如果在交换Fab分子中的话。在一些实施方案中,第一抗原结合模块包含包含与SEQ IDNO:39的氨基酸序列中包含的CH1域序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链恒定区。特别地,重链恒定区(具体是CH1域)可包含如本文中在“电荷修饰”下描述的氨基酸突变。
第二抗原结合模块
本发明的双特异性抗原结合分子包含至少一个结合第二抗原(不同于GPRC5D)的抗原结合模块,特别是Fab分子。
在特定实施方案中,结合第二抗原的抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CH1和CL是彼此交换/替换的Fab分子。在此类实施方案中,结合第一抗原(即GPRC5D)的抗原结合模块优选是常规Fab分子。在双特异性抗原结合分子中包含超过一个结合GPRC5D的抗原结合模块,特别是Fab分子的实施方案中,结合第二抗原的抗原结合模块优选是交换Fab分子且结合GPRC5D的抗原结合模块是常规Fab分子。
在备选实施方案中,结合第二抗原的抗原结合模块是常规Fab分子。在此类实施方案中,结合第一抗原(即GPRC5D)的抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CH1和CL是彼此交换/替换的Fab分子。在双特异性抗原结合分子中包含超过一个结合第二抗原的抗原结合模块,特别是Fab分子的实施方案中,结合GPRC5D的抗原结合模块优选是交换Fab分子且结合第二抗原的抗原结合模块是常规Fab分子。
在一些实施方案中,第二抗原是激活性T细胞抗原(在本文中也称作“激活性T细胞抗原结合模块,或激活性T细胞抗原结合Fab分子”)。在一个特定实施方案中,双特异性抗原结合分子包含不超过一个能够特异性结合激活性T细胞抗原的抗原结合模块。在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子提供对激活性T细胞抗原的单价结合。
在特定实施方案中,第二抗原是CD3,特别是人CD3(SEQ ID NO:40)或食蟹猴CD3(SEQ ID NO:41),最特别是人CD3。在一个实施方案中,第二抗原结合模块对人和食蟹猴CD3是交叉反应的(即特异性结合)。在一些实施方案中,第二抗原是CD3的厄普西隆亚基(CD3ε)。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含SEQ ID NO:29的HCDR 1,SEQ ID NO:30的HCDR 2,SEQ ID NO:31的HCDR 3,SEQ ID NO:32的LCDR 1,SEQ ID NO:33的LCDR 2和SEQ ID NO:34的LCDR 3。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:29的HCDR 1,SEQ IDNO:30的HCDR 2,和SEQ ID NO:31的HCDR 3的VH,和包含SEQ ID NO:32的LCDR 1,SEQ IDNO:33的LCDR 2和SEQ ID NO:34的LCDR 3的VL。
在一些实施方案中,第二抗原结合模块是(衍生自)人源化抗体。在一个实施方案中,VH是人源化VH且/或VL是人源化VL。在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含如任何上述实施方案中的CDR,而且进一步包含受体人框架,例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列。在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与SEQ ID NO:36的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且第二抗原结合模块的VL包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含SEQ ID NO:35的VH序列,和SEQ IDNO:36的VL序列。
在一个实施方案中,第二抗原结合模块包含人恒定区。在一个实施方案中,第二抗原结合模块是包含人恒定区,特别是人CH1和/或CL域的Fab分子。人恒定域的例示性序列在SEQ ID NO:37和38(分别是人卡帕和拉姆达CL域)和SEQ ID NO:39(人IgG1重链恒定域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施方案中,第二抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:37或SEQID NO:38的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:37的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链恒定区。特别地,轻链恒定区可包含如本文中在“电荷修饰”下描述的氨基酸突变且/或可包含一个或多个(特别是两个)N端氨基酸的删除或替代,如果在交换Fab分子中的话。在一些实施方案中,第二抗原结合模块包含包含与SEQ IDNO:39的氨基酸序列中包含的CH1域序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链恒定区。特别地,重链恒定区(具体是CH1域)可包含如本文中在“电荷修饰”下描述的氨基酸突变。
在一些实施方案中,第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1,特别是可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子(即依照此类实施方案,第二抗原结合模块是交换Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定域是交换的)。在一个此类实施方案中,第一(和第三,如果有的话)抗原结合模块是常规Fab分子。
在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子中存在不超过一个结合第二抗原(例如激活性T细胞抗原诸如CD3)的抗原结合模块(即双特异性抗原结合分子提供对第二抗原的单价结合)。
电荷修饰
本发明的双特异性抗原结合分子可以在其中包含的Fab分子中包含如下的氨基酸替代,其特别有效地减少轻链与非匹配重链的错配(Bence-Jones型副产物),在它们的一个(或多个,在分子包含超过两个抗原结合Fab分子的情况中)结合臂具有VH/VL交换的基于Fab的双/多特异性抗原结合分子的生产中可发生错配(还可参见PCT公开文本No.WO 2015/150447,特别是其中的实施例,通过援引完整收入本文)。在它们的结合臂之一中具有VH/VL域交换的双特异性抗原结合分子中发生的想要的双特异性抗原结合分子与不想要的副产物,特别是Bence Jones型副产物相比的比率可以通过在CH1和CL域中的特定氨基酸位置处引入具有相反电荷的带电荷的氨基酸来改善(在本文中有时称作“电荷修饰”)。
因而,在其中双特异性抗原结合分子的第一和第二抗原结合模块均是Fab分子,且在抗原结合模块(特别是第二抗原结合模块)之一中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的一些实施方案中,
i)在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用带正电荷的氨基酸替代(编号方式依照Kabat),且其中在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用带负电荷的氨基酸替代(编号方式依照Kabat EU索引)；或
ii)在第二抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用带正电荷的氨基酸替代(编号方式依照Kabat),且其中在第二抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用带负电荷的氨基酸替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
双特异性抗原结合分子没有同时包含i)和ii)下提到的修饰。具有VH/VL交换的抗原结合模块的恒定域CL和CH1没有彼此替换(即保持不交换)。
在一个更加具体的实施方案中,
i)在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)；或
ii)在第二抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第二抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个此类实施方案中,在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在又一个实施方案中,在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个特定实施方案中,在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个更加具体的实施方案中,在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个甚至更加具体的实施方案中,在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在特定实施方案中,如果在第一抗原结合模块的恒定域CL和恒定域CH1中进行依照上述实施方案的氨基酸替代的话,第一抗原结合模块的恒定域CL是卡帕同种型的。
或者,依照上文实施方案的氨基酸替代可以在第二抗原结合模块的恒定域CL和恒定域CH1中进行,代替在第一抗原结合模块的恒定域CL和恒定域CH1中进行。在特定的此类实施方案中,第二抗原结合模块的恒定域CL是卡帕同种型的。
因而,在一个实施方案中,在第二抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第二抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在又一个实施方案中,在第二抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第二抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在仍有另一个实施方案中,在第二抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat),且在第二抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,在第二抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat),且在第二抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在另一个实施方案中,在第二抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat),且在第二抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)。
在一个特定实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:84的HCDR 2,和SEQID NO:86的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子,和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
其中在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个特定实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:85的HCDR 2,和SEQID NO:86的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子,和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
其中在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个特定实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQID NO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子,和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
其中在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个特定实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQID NO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子,和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
其中在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个特定实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:92的HCDR 2,和SEQID NO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子,和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
其中在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个特定实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR 2,和SEQ IDNO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ IDNO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子,和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
其中在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个特定实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:8的HCDR 2,和SEQ IDNO:9的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ IDNO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子,和
(b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
其中在第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个特定实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代),且在第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E),或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
双特异性抗原结合分子型式
依照本发明的双特异性抗原结合分子的各构件可以以多种构造彼此融合。例示性的构造绘于图1A-Z中。
在具体的实施方案中,双特异性抗原结合分子中包含的抗原结合模块是Fab分子。在此类实施方案中,第一,第二,第三等抗原结合模块在本文中分别可以称作第一,第二,第三等Fab分子。
在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子的第一和第二抗原结合模块彼此融合,任选经由肽接头。在特定实施方案中,第一和第二抗原结合模块各自是Fab分子。在一个此类实施方案中,第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端。在另一个此类实施方案中,第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端。在其中或是(i)第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端或是(ii)第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端的实施方案中,另外地第一抗原结合模块的Fab轻链且第二抗原结合模块的Fab轻链可以彼此融合,任选经由肽接头。
具有单一能够特异性结合靶细胞抗原诸如GPRC5D的抗原结合模块(诸如Fab分子)的双特异性抗原结合分子(例如如图1A,1D,1G,1H,1K,1L中显示的)是有用的,特别是在预期靶细胞抗原在高亲和力抗原结合模块的结合后内在化的情况中。在此类情况中,存在超过一个对靶细胞抗原特异性的抗原结合模块可增强靶细胞抗原的内在化,由此降低它的利用度。
然而,在其它情况中,包含两个或更多个对靶细胞抗原特异性的抗原结合模块(诸如Fab分子)的双特异性抗原结合分子会是有利的(见图1B,1C,1E,1F,1I,1J,1M或1N中显示的例子),例如为了优化对靶部位的靶向或容许靶细胞抗原的交联。
因而,在特定实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含第三抗原结合模块。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块结合第一抗原,即GPRC5D。在一个实施方案中,第三抗原结合模块是Fab分子。
在一个实施方案中,第三抗原模块与第一抗原结合模块相同。
双特异性抗原结合分子的第三抗原结合模块可单一地或组合地并入本文中涉及第一抗原结合模块和/或结合GPRC5D的抗体描述的任何特征,除非在科学上明显不合理或不可能。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:84的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:85的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:92的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR 2,和SEQ ID NO:4的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:5的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:6的LCDR 2和SEQ ID NO:7的LCDR 3。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:8的HCDR 2,和SEQ ID NO:9的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR 3。
在一些实施方案中,第三抗原结合模块是(衍生自)人源化抗体。在一个实施方案中,VH是人源化VH且/或VL是人源化VL。在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含如任何上述实施方案中的CDR,而且进一步包含受体人框架,例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块的VH包含与选自SEQ ID NO:13,SEQ IDNO:15,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且第三抗原结合模块的VL包含与选自SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:63和SEQID NO:64的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含与选自SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VH序列,和与选自SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的组的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的VL序列。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含包含选自SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的组的氨基酸序列的VH,和包含选自SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的组的氨基酸序列的VL。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含选自SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的组的VH序列,和选自SEQ IDNO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的组的VL序列。
在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含SEQ ID NO:13的VH序列和SEQ ID NO:14的VL序列。
在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含SEQ ID NO:15的VH序列和SEQ ID NO:16的VL序列。
在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含SEQ ID NO:48的VH序列和SEQ ID NO:53的VL序列。
在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含SEQ ID NO:49的VH序列和SEQ ID NO:52的VL序列。
在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含SEQ ID NO:57的VH序列和SEQ ID NO:64的VL序列。
在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL。在一个特定实施方案中,第三抗原结合模块包含SEQ ID NO:58的VH序列和SEQ ID NO:63的VL序列。
在一个实施方案中,第三抗原结合模块包含人恒定区。在一个实施方案中,第三抗原结合模块是包含人恒定区,特别是人CH1和/或CL域的Fab分子。人恒定域的例示性序列在SEQ ID NO:37和38(分别是人卡帕和拉姆达CL域)和SEQ ID NO:39(人IgG1重链恒定域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施方案中,第三抗原结合模块包含包含与SEQ ID NO:37或SEQID NO:38的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:37的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链恒定区。特别地,轻链恒定区可包含如本文中在“电荷修饰”下描述的氨基酸突变和/或可包含一个或多个(特别是两个)N端氨基酸的删除或替代,如果在交换Fab分子中的话。在一些实施方案中,第三抗原结合模块包含包含与SEQ IDNO:39的氨基酸序列中包含的CH1域序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链恒定区。特别地,重链恒定区(具体是CH1域)可包含如本文中在“电荷修饰”下描述的氨基酸突变。
在特定实施方案中,第三和第一抗原结合模块各自是Fab分子且第三抗原结合模块与第一抗原结合模块相同。如此,在这些实施方案中,第一和第三抗原结合模块包含相同的重和轻链氨基酸序列且具有相同的域排列(即常规的或交换的)。而且,在这些实施方案中,第三抗原结合模块包含与第一抗原结合模块相同的氨基酸替代,如果有的话。例如,会在第一抗原结合模块和第三抗原结合模块中每个的恒定域CL和恒定域CH1中进行本文中作为“电荷修饰”描述的氨基酸替代。或者,可以在第二抗原结合模块(其在特定实施方案中还是Fab分子)的恒定域CL和恒定域CH1中进行,但是在第一抗原结合模块和第三抗原结合模块的恒定域CL和恒定域CH1中不进行所述氨基酸替代。
像第一抗原结合模块一样,第三抗原结合模块特别是常规Fab分子。然而,还涵盖其中第一且第三抗原结合模块是交换Fab分子(且第二抗原结合模块是常规Fab分子)的实施方案。如此,在特定实施方案中,第一和第三抗原结合模块各自是常规Fab分子,且第二抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CL和CH1是彼此交换/替换的Fab分子。在其它实施方案中,第一和第三抗原结合模块各自是交换Fab分子且第二抗原结合模块是常规Fab分子。
如果存在第三抗原结合模块的话,在一个特定实施方案中,第一和第三抗原模块结合GPRC5D,且第二抗原结合模块结合第二抗原,特别是激活性T细胞抗原,更加特别是CD3,最特别是CD3ε。
在特定实施方案中,双特异性抗原结合分子包含由第一和第二亚基构成的Fc域。Fc域的第一和第二亚基能够稳定联合。
依照本发明的双特异性抗原结合分子可具有不同的构造,即第一,第二(和任选地第三)抗原结合模块可以以不同方式彼此和与Fc域融合。各构件可以直接或优选地经由一个或多个合适的肽接头彼此融合。在Fab分子融合至Fc域的亚基的N端的情况中,它典型地经由免疫球蛋白铰链区。
在一些实施方案中,第一和第二抗原结合模块各自是Fab分子且第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。在此类实施方案中,第一抗原结合模块可以在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端或Fc域的另一亚基的N端。在特定此类实施方案中,所述第一抗原结合模块是常规Fab分子,且第二抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CL和CH1是彼此交换/替换的Fab分子。在其它此类实施方案中,所述第一Fab分子是交换Fab分子且第二Fab分子是常规Fab分子。
在一个实施方案中,第一和第二抗原结合模块各自是Fab分子,第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端,且第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一和第二Fab分子,由第一和第二亚基构成的Fc域,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端,且第二Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。此类构造示意性地在图1G和1K中描绘(这些例子中的第二抗原结合域是VH/VL交换Fab分子)。任选地,第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在另一个实施方案中,第一和第二抗原结合模块各自是Fab分子且第一和第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至Fc域的亚基之一的N端。在一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一和第二Fab分子,由第一和第二亚基构成的Fc域,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一和第二Fab分子各自在Fab重链的C端融合至Fc域的亚基之一的N端。此类构造示意性地在图1A和1D中描绘(在这些例子中第二抗原结合域是VH/VL交换Fab分子且第一抗原结合模块是常规Fab分子)。第一和第二Fab分子可以直接或经由肽接头融合至Fc域。在一个特定实施方案中,第一和第二Fab分子各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体实施方案中,免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区,特别是在Fc域是IgG1 Fc域的情况中。
在一些实施方案中,第一和第二抗原结合模块各自是Fab分子且第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。在此类实施方案中,第二抗原结合模块可以在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端或(如上文描述的)Fc域的亚基之另一的N端。在特定此类实施方案中,所述第一抗原结合模块是常规Fab分子,且第二抗原结合模块是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CL和CH1是彼此交换/替换的Fab分子。在其它此类实施方案中,所述第一Fab分子是交换Fab分子且第二Fab分子是常规Fab分子。
在一个实施方案中,第一和第二抗原结合模块各自是Fab分子,第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端,且第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一和第二Fab分子,由第一和第二亚基构成的Fc域,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端,且第一Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。此类构造示意性地在图1H和1L中描绘(在这些例子中第二抗原结合域是VH/VL交换Fab分子且第一抗原结合模块是常规Fab分子)。任选地,第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在一些实施方案中,第三抗原结合模块,特别是第三Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。在特定此类实施方案中,所述第一和第三Fab分子各自是常规Fab分子,且第二Fab分子是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CL和CH1是彼此交换/替换的Fab分子。在其它此类实施方案中,所述第一和第三Fab分子各自是交换Fab分子且第二Fab分子是常规Fab分子。
在一个特定此类实施方案中,第二且第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至Fc域的亚基之一的N端,且第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端。在一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一,第二和第三Fab分子,由第一和第二亚基构成的Fc域,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端,且第二Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一亚基的N端,且其中第三Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第二亚基的N端。此类构造示意性地在图1B和1E(在这些例子中第二抗原结合模块是VH/VL交换Fab分子,且第一且第三抗原结合模块是常规Fab分子),和图1J和1N(在这些例子中第二抗原结合模块是常规Fab分子,且第一和第三抗原结合模块是VH/VL交换Fab分子)中描绘。第二和第三Fab分子可以直接或经由肽接头融合至Fc域。在一个特定实施方案中,第二和第三Fab分子各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体实施方案中,免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区,特别是在Fc域是IgG1 Fc域的情况中。任选地,第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在另一个此类实施方案中,第一和第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至Fc域的亚基之一的N端,且第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一,第二和第三Fab分子,由第一和第二亚基构成的Fc域,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端,且第一Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一亚基的N端,且其中第三Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第二亚基的N端。此类构造示意性地在图1C和1F(在这些例子中第二抗原结合模块是VH/VL交换Fab分子,且第一且第三抗原结合模块是常规Fab分子)和图1I和1M(在这些例子中第二抗原结合模块是常规Fab分子,且第一和第三抗原结合模块是VH/VL交换Fab分子)中描绘。第一和第三Fab分子可以直接或经由肽接头融合至Fc域。在一个特定实施方案中,第一和第三Fab分子各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体实施方案中,免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区,特别是在Fc域是IgG1 Fc域的情况中。任选地,第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。
在其中Fab分子在Fab重链的C端经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域的每个亚基的N端的双特异性抗原结合分子的构造中,两个Fab分子,铰链区和Fc域本质上形成免疫球蛋白分子。在一个特定实施方案中,免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定实施方案中,免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中,免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个特定实施方案中,免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其它实施方案中,免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个实施方案中,免疫球蛋白包含人恒定区,特别是人Fc区。
在本发明的一些双特异性抗原结合分子中,第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合,任选经由肽接头。取决于第一和第二Fab分子的构造,第一Fab分子的Fab轻链可以在它的C端融合至第二Fab分子的Fab轻链的N端,或者第二Fab分子的Fab轻链可以在它的C端融合至第一Fab分子的Fab轻链的N端。第一和第二Fab分子的Fab轻链的融合进一步降低不匹配Fab重和轻链的错配,而且还减少表达本发明的一些双特异性抗原结合分子需要的质粒的数目。
抗原结合模块可以直接或经由肽接头融合至Fc域或彼此融合,肽接头包含一个或多个氨基酸,通常约2-20个氨基酸。肽接头是本领域中已知且本文中记载的。合适的,非免疫原性的肽接头包括例如(G4S)n,(SG4)n,(G4S)n或G4(SG4)n肽接头。“n”一般是1至10,通常是2至4的整数。在一个实施方案中,所述肽接头具有至少5个氨基酸的长度,在一个实施方案中5至100个氨基酸的长度,在又一个实施方案中10至50个氨基酸的长度。在一个实施方案中,所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm,其中G＝甘氨酸,S＝丝氨酸,且(x＝3,n＝3,4,5或6,和m＝0,1,2或3)或(x＝4,n＝2,3,4或5和m＝0,1,2或3),在一个实施方案中,x＝4和n＝2或3,在又一个实施方案中,x＝4和n＝2。在一个实施方案中,所述肽接头是(G4S)2。一种特别适合于将第一和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合的肽接头是(G4S)2。一种适合于连接第一和第二Fab片段的Fab重链的例示性肽接头包含序列(D)-(G4S)2(SEQ ID NO:43和44)。另一种合适的此类接头包含序列(G4S)4。另外,接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地,当Fab分子融合至Fc域亚基的N端时,其可以在有或无另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其部分融合。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)),和如下多肽,其中第一Fab分子的Fab重链与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在某些实施方案中,多肽是共价连接的,例如通过二硫键。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4)),和如下多肽,其中第一Fab分子的Fab重链与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在某些实施方案中,多肽是共价连接的,例如通过二硫键。
在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键,其继而与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其它实施方案中,双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。
在一些这些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含第二Fab分子的交换Fab轻链多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)),和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在其它这些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键,其继而与第一Fab分子的Fab轻链多肽分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VL(1)-CL(1)),或如下多肽,其中第一Fab分子的Fab轻链多肽与第二Fab分子的Fab重链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2)),在适宜时。
依照这些实施方案的双特异性抗原结合分子可进一步包含(i)Fc域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4)),或(ii)如下多肽,其中第三Fab分子的Fab重链与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))和第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些实施方案中,多肽是共价连接的,例如通过二硫键。
在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键,其继而与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其它实施方案中,双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab重链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4))。
在一些这些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含第二Fab分子的交换Fab轻链多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)),和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在其它这些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键,其继而与第一Fab分子的Fab轻链多肽分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1)),或如下多肽,其中第一Fab分子的Fab轻链多肽与第二Fab分子的Fab重链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1)-VL(2)-CH1(2)),在适宜时。
依照这些实施方案的双特异性抗原结合分子可进一步包含(i)Fc域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4)),或(ii)如下多肽,其中第三Fab分子的Fab重链与Fc域亚基分享羧基末端肽键(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))和第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些实施方案中,多肽是共价连接的,例如通过二硫键。
在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子不包含Fc域。在特定此类实施方案中,所述第一和,如果存在的话第三Fab分子各自是常规Fab分子,且第二Fab分子是如本文中描述的交换Fab分子,即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL或恒定域CL和CH1是彼此交换/替换的Fab分子。在其它此类实施方案中,所述第一和,如果存在的话第三Fab分子各自是交换Fab分子且第二Fab分子是常规Fab分子。
在一个此类实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一和第二抗原结合模块,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一和第二抗原结合模块均是Fab分子且第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端。此类构造示意性地在图1O和1S中描绘(在这些例子中第二抗原结合域是VH/VL交换Fab分子且第一抗原结合模块是常规Fab分子)。
在另一个此类实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一和第二抗原结合模块,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一和第二抗原结合模块均是Fab分子且第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端。此类构造示意性地在图1P和1T中描绘(在这些例子中第二抗原结合域是VH/VL交换Fab分子且第一抗原结合模块是常规Fab分子)。
在一些实施方案中,第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端,且双特异性抗原结合分子进一步包含第三抗原结合模块,特别是第三Fab分子,其中所述第三Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。在某些此类实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一,第二和第三Fab分子,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端,且第三Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。此类构造示意性地在图1Q和1U(在这些例子中第二抗原结合域是VH/VL交换Fab分子且第一和第三抗原结合模块各自是常规Fab分子),或图1X和1Z(在这些例子中第二抗原结合域是常规Fab分子且第一和第三抗原结合模块各自是VH/VL交换Fab分子)中描绘。
在一些实施方案中,第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端,且双特异性抗原结合分子进一步包含第三抗原结合模块,特别是第三Fab分子,其中所述第三Fab分子在Fab重链的N端融合至第一Fab分子的Fab重链的C端。在某些此类实施方案中,双特异性抗原结合分子本质上由第一,第二和第三Fab分子,和任选地一个或多个肽接头组成,其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端,且第三Fab分子在Fab重链的N端融合至第一Fab分子的Fab重链的C端。此类构造示意性地在图1R和1V(在这些例子中第二抗原结合域是VH/VL交换Fab分子且第一和第三抗原结合模块各自是常规Fab分子),或图1W和1Y(在这些例子中第二抗原结合域是常规Fab分子且第一和第三抗原结合模块各自是VH/VL交换Fab分子)中描绘。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab轻链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab重链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键,其继而与第三Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含其中重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键,其继而与第三Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab轻链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第一Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与第三Fab分子的Fab轻链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第三Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链)(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-VL(3)-CH1(3))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))和第二Fab分子的Fab轻链多肽(VL(2)-CL(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含其中重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与第三Fab分子的Fab重链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第三Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含其中重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链)(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-VH(3)-CL(3))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))和第二Fab分子的Fab轻链多肽(VL(2)-CL(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab轻链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第一Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含其中重链可变区用轻链可变区替换的交换Fab重链),其继而与第二Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3)-VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))和第二Fab分子的Fab轻链多肽(VL(2)-CL(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3))。
在某些实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含其中重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与第一Fab分子的Fab重链可变区分享羧基末端肽键,其继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区分享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含其中重链恒定区用轻链恒定区替换的交换Fab重链),其继而与第二Fab分子的Fab重链分享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3)-VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))和第二Fab分子的Fab轻链多肽(VL(2)-CL(2))。在一些实施方案中,双特异性抗原结合分子进一步包含如下多肽,其中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区分享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3))。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:84的HCDR 2,和SEQ IDNO:86的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:85的HCDR 2,和SEQ IDNO:86的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ IDNO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ IDNO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:92的HCDR 2,和SEQ IDNO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR 2,和SEQ IDNO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ IDNO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:8的HCDR 2,和SEQ IDNO:9的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ IDNO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:84的HCDR 2,和SEQ IDNO:86的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:85的HCDR 2,和SEQ IDNO:86的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ IDNO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ IDNO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:92的HCDR 2,和SEQ IDNO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR 2,和SEQ IDNO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ IDNO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:8的HCDR 2,和SEQ IDNO:9的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ IDNO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在依照本发明的双特异性抗原结合分子的所有不同构造中,本文中描述的氨基酸替代,如果存在的话,可以在第一和(如果存在的话)第三抗原结合模块/Fab分子的CH1和CL域中,或在第二抗原结合模块/Fab分子的CH1和CL域中。优选地,它们在第一和(如果存在的话)第三抗原结合模块/Fab分子的CH1和CL域中。依照本发明的概念,如果在第一(和,如果存在的话,第三)抗原结合模块/Fab分子中进行如本文中描述的氨基酸替代的话,在第二抗原结合模块/Fab分子中不进行此类氨基酸替代。相反,如果在第二抗原结合模块/Fab分子中进行如本文中描述的氨基酸替代的话,在第一(和,如果存在的话,第三)抗原结合模块/Fab分子中不进行此类氨基酸替代。特别是在包含其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH1是彼此替换的Fab分子的双特异性抗原结合分子中进行氨基酸替代。
在依照本发明的双特异性抗原结合分子的特定实施方案中,特别是其中在第一(和,如果存在的话,第三)抗原结合模块/Fab分子中进行如本文中描述的氨基酸替代,第一(和,如果存在的话,第三)Fab分子的恒定域CL是卡帕同种型的。在依照本发明的双特异性抗原结合分子的其它实施方案中,特别是其中在第二抗原结合模块/Fab分子中进行如本文中描述的氨基酸替代,第二抗原结合模块/Fab分子的恒定域CL是卡帕同种型的。在一些实施方案中,第一(和,如果存在的话,第三)抗原结合模块/Fab分子的恒定域CL和第二抗原结合模块/Fab分子的恒定域CL是卡帕同种型的。
在一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:84的HCDR 2,和SEQ IDNO:86的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别是通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:85的HCDR 2,和SEQ IDNO:86的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ IDNO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ IDNO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个实施方案在中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:92的HCDR 2,和SEQ IDNO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端,或(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR 2,和SEQ IDNO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ IDNO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:8的HCDR 2,和SEQ IDNO:9的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ IDNO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:84的HCDR 2,和SEQ IDNO:86的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:85的HCDR 2,和SEQ IDNO:86的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ IDNO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ IDNO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:92的HCDR 2,和SEQ IDNO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR 2,和SEQ IDNO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ IDNO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:8的HCDR 2,和SEQ IDNO:9的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ IDNO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)结合第一抗原且与第一抗原结合模块相同的第三抗原结合模块；和
d)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中
(i)在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端,或
(ii)在b)下的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在a)下的第一抗原结合模块的Fab重链的N端,且在a)下的第一抗原结合模块和在c)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在d)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:84的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:85的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ IDNO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:92的HCDR 2,和SEQ IDNO:93的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:1的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:2的HCDR 2,和SEQ IDNO:3的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:4的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ IDNO:5的LCDR 2和SEQ ID NO:6的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在另一个实施方案中,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,其中第一抗原是GPRC5D且第一抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:7的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:8的HCDR 2,和SEQ IDNO:9的HCDR 3的重链可变区(VH),和包含SEQ ID NO:10的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ IDNO:11的LCDR 2和SEQ ID NO:12的LCDR 3的轻链可变区(VL)的Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块,其中第二抗原是激活性T细胞抗原,特别是CD3,更加特别是CD3ε,且第二抗原结合模块是其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；且
其中在a)下的第一抗原结合模块和在b)下的第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
依照任何上述实施方案,双特异性抗原结合分子的各构件(例如Fab分子,Fc域)可直接或经由本文中描述的或本领域已知的各种接头(特别是包含一个或多个氨基酸,通常约2-20个氨基酸的肽接头)融合。合适的,非免疫原性的肽接头包括例如(G4S)n,(SG4)n,(G4S)n或G4(SG4)n肽接头,其中n一般是1至10,典型地2至4的整数。
在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一和第三抗原结合模块；其中第一抗原是GPRC5D且其中第一和第二抗原结合模块各自是包含包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区的(常规)Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块；其中第二抗原是CD3且其中第二抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链可变区的其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
在a)下的第一和第三抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一和第三抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；
且其中进一步地
在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在a)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含
a)结合第一抗原的第一和第三抗原结合模块；其中第一抗原是GPRC5D且其中第一和第二抗原结合模块各自是包含包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区的(常规)Fab分子；
b)结合第二抗原的第二抗原结合模块；其中第二抗原是CD3且其中第二抗原结合模块是包含包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链可变区的其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的Fab分子；
c)由第一和第二亚基构成的Fc域；
其中
在a)下的第一和第三抗原结合模块的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)(最特别通过精氨酸(R)),且其中在a)下的第一和第三抗原结合模块的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照Kabat EU索引)；
且其中进一步地
在a)下的第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至在b)下的第二抗原结合模块的Fab重链的N端,且在b)下的第二抗原结合模块和在a)下的第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至在c)下的Fc域的亚基之一的N端。
在一个实施方案中,依照本发明的这个方面,在Fc域的第一亚基中位置366处的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W),且在Fc域的第二亚基中位置407处的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)且任选地位置366处的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且位置368处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照Kabat EU索引)。
在又一个实施方案中,依照本发明的这个方面,在Fc域的第一亚基中另外地位置354处的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基用半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换),且在Fc域的第二亚基中另外地位置349处的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)(编号方式依照Kabat EU索引)。
在依照本发明的这个方面的仍有又一个实施方案中,在Fc域的第一和第二亚基每个中位置234处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L234A),位置235处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L235A)且位置329处的脯氨酸残基用甘氨酸残基替换(P329G)(编号方式依照Kabat EU索引)。
在依照本发明的这个方面仍有又一个实施方案中,Fc域是人IgG1 Fc域。
在特定具体实施方案中,双特异性抗原结合分子包含包含与SEQ ID NO:17的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽,包含与SEQ ID NO:18的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽,包含与SEQ ID NO:19的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽,和包含与SEQ ID NO:20的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽。在又一个特定具体实施方案中,双特异性抗原结合分子包含包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的多肽,包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列的多肽,包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的多肽和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽。
在另一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子包含包含与SEQ ID NO:21的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽,包含与SEQ ID NO:22的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽,包含与SEQ ID NO:23的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽,和包含与SEQ ID NO:24的序列至少95％,96％,97％,98％,或99％同一的氨基酸序列的多肽。在又一个具体实施方案中,双特异性抗原结合分子包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的多肽,包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的多肽,包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的多肽和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的多肽。
Fc域
在特定实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含由第一和第二亚基构成的Fc域。理解的是,本文中涉及双特异性抗原结合分子描述的Fc域的特征可同等应用于本发明的抗体中包含的Fc域。
双特异性抗原结合分子的Fc域由一对包含免疫球蛋白分子重链域的多肽链组成。例如,免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体,其每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定域。Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。在一个实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含不超过一个Fc域。
在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子的Fc域是IgG Fc域。在一个具体的实施方案中,Fc域是IgG1 Fc域。在另一个实施方案中,Fc域是IgG4 Fc域。在一个更加具体的实施方案中,Fc域是包含位置S228(Kabat EU索引编号方式)处的氨基酸替代,特别是氨基酸替代S228P的IgG4 Fc域。此氨基酸替代降低IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等,Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在又一个具体的实施方案中,Fc域是人Fc域。在一个甚至更加具体的实施方案中,Fc域是人IgG1 Fc域。人IgG1 Fc区的一种例示性序列在SEQ ID NO:42中给出。
促进异二聚化的Fc域修饰
依照本发明的双特异性抗原结合分子包含不同的抗原结合模块,其可以融合至Fc域的两个亚基之一个或另一个,如此Fc域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后二聚化导致两种多肽的数种可能组合。为了改进重组生产中双特异性抗原结合分子的产量和纯度,如此在双特异性抗原结合分子的Fc域中引入促进期望多肽联合的修饰会是有利的。
因而,在具体的实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子的Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人IgG Fc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此,在一个实施方案中,所述修饰在Fc域的CH3域中。
有数种办法来修饰Fc域的CH3域以加强异二聚化,它们详细记载于例如WO 96/27011,WO 98/050431,EP 1870459,WO 2007/110205,WO 2007/147901,WO 2009/089004,WO2010/129304,WO 2011/90754,WO 2011/143545,WO 2012058768,WO 2013157954,WO2013096291。典型地,在所有此类办法中,Fc域的第一亚基的CH3域和Fc域的第二亚基的CH3域二者以互补方式进行工程化改造使得每个CH3域(或包含它的重链)不再能与其自身同二聚化但被迫与互补工程化改造的其它CH3域异二聚化(使得第一和第二CH3域异二聚化且两个第一CH3域或两个第二CH3域之间不形成同二聚体)。涵盖这些用于改善重链异二聚化的不同办法作为不同备选,与双特异性抗原结合分子中的减少重/轻链错配和Bence Jones型副产物的重-轻链修饰(例如一个结合臂中的VH和VL交换/替换及在CH1/CL界面中引入具有相反电荷的带电荷的氨基酸的替代)组合。
在一个特定的实施方案中,所述促进Fc域的第一亚基和第二亚基联合的修饰是所谓的“节-入-穴”修饰,其包含在Fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和在Fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。
节-入-穴技术记载于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等,Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)。一般地,方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得隆起可以置于空腔中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽的界面中创建具有与隆起相同或相似大小的互补性空腔,其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换进行。
因而,在一个具体的实施方案中,在双特异性抗原结合分子的Fc域的第一亚基的CH3域中,一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第一亚基的CH3域内生成隆起,其可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中,而且在Fc域的第二亚基的CH3域中,一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第二亚基的CH3域内生成空腔,其中可安置第一亚基的CH3域内的隆起。
优选地,所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自下组:精氨酸(R),苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),和色氨酸(W)。
优选地,所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自下组:丙氨酸(A),丝氨酸(S),苏氨酸(T),和缬氨酸(V)。
可以通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来生成隆起和空腔。
在一个特定的实施方案中,在Fc域第一亚基(的CH3域)(“节”亚基)中,第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W),而在Fc域第二亚基(的CH3域)(“穴”亚基)中,第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施方案中,在Fc域第二亚基中,另外,第366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照Kabat EU索引)。
在还有又一个实施方案中,在Fc域的第一亚基中,另外,第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)或第356位的谷氨酸残基用半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是,第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换),而在Fc域的第二亚基中,另外,第349位的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)(编号方式依照Kabat EU索引)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在Fc域的两个亚基之间形成二硫桥,进一步稳定了二聚体(Carter,JImmunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个具体的实施方案中,Fc域的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W,且Fc域的第二亚基包含氨基酸替代Y349C,T366S,L368A和Y407V(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个具体的实施方案中,将结合第二抗原(例如激活性T细胞抗原)的抗原结合模块融合(任选地经由结合GPRC5D的第一抗原结合模块和/或肽接头)至Fc域的第一亚基(其包含“节”修饰)。不希望受理论束缚,结合第二抗原,诸如激活性T细胞抗原的抗原结合模块与Fc域的含节的亚基的融合会(进一步)使包含两个结合激活性T细胞抗原的抗原结合模块的抗原结合分子的生成最小化(两条含节的多肽的空间碰撞)。
涵盖修饰CH3以增强异二聚化的其它技术作为依照本发明的备选,它们记载于例如WO 96/27011,WO 98/050431,EP 1870459,WO 2007/110205,WO 2007/147901,WO 2009/089004,WO 2010/129304,WO 2011/90754,WO 2011/143545,WO 2012/058768,WO 2013/157954,WO 2013/096291。
在一个实施方案中,备选地使用EP 1870459中记载的异二聚化办法。这种办法基于在Fc域的两个亚基之间的CH3/CH3域界面中的特定氨基酸位置引入具有相反电荷的带电荷的氨基酸。本发明的双特异性抗原结合分子的一个优选的实施方案是(Fc域的)两个CH3域之一中的氨基酸突变R409D；K370E和Fc域的CH3域之另一中的氨基酸突变D399K；E357K(编号方式依照Kabat EU索引)。
在另一个实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变T366W和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变T366S,L368A,Y407V,和另外的Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变R409D；K370E和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变D399K；E357K(编号方式依照Kabat EU索引)。
在另一个实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子包含Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变S354C,T366W和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变Y349C,T366S,L368A,Y407V,或所述双特异性抗原结合分子包含Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变Y349C,T366W和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变S354C,T366S,L368A,Y407V和另外的Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变R409D；K370E和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变D399K；E357K(所有编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,备选地使用WO 2013/157953中记载的异二聚化办法。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变T366K且第二CH3域包含氨基酸突变L351D(编号方式依照Kabat EU索引)。在又一个实施方案中,第一CH3域进一步包含氨基酸突变L351K。在又一个实施方案中,第二CH3域进一步包含选自Y349E,Y349D和L368E的氨基酸突变(优选L368E)(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,备选地使用WO 2012/058768中记载的异二聚化办法。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变L351Y,Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366A,K409F。在又一个实施方案中,第二CH3域进一步包含位置T411,D399,S400,F405,N390,或K392处的氨基酸突变,例如选自a)T411N,T411R,T411Q,T411K,T411D,T411E或T411W,b)D399R,D399W,D399Y或D399K,c)S400E,S400D,S400R,或S400K,d)F405I,F405M,F405T,F405S,F405V或F405W,e)N390R,N390K或N390D,f)K392V,K392M,K392R,K392L,K392F或K392E(编号方式依照Kabat EU索引)。在又一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变L351Y,Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366V,K409F。在又一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366A,K409F。在又一个实施方案中,第二CH3域进一步包含氨基酸突变K392E,T411E,D399R和S400R(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,备选地使用WO 2011/143545中记载的异二聚化办法,例如进行选自下组的位置处的氨基酸修饰:368和409(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,备选地使用WO2011/090762中记载的异二聚化办法,它也使用上文所述节-入-穴技术。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变T366W且第二CH3域包含氨基酸突变Y407A。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变T366Y且第二CH3域包含氨基酸突变Y407T(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,双特异性抗原结合分子或它的Fc域是IgG2亚类的且备选地使用WO 2010/129304中记载的异二聚化办法。
在一个备选的实施方案中,促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰包含介导静电操纵效应(electrostatic steering effect)的修饰,例如如记载于PCT公开文本WO 2009/089004的。一般地,此方法涉及将在两个Fc域亚基界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基,从而在静电上不利于同二聚体形成而在静电上有利于异二聚化。在一个此类实施方案中,第一CH3域包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E),或天冬氨酸(D))对K392或N392的氨基酸替代(优选K392D或N392D)且第二CH3域包含带正电荷的氨基酸(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R))对D399,E356,D356,或E357的氨基酸替代(优选D399K,E356K,D356K,或E357K,更优选D399K和E356K)。在又一个实施方案中,第一CH3域进一步包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E),或天冬氨酸(D))对K409或R409的氨基酸替代,优选K409D或R409D。在又一个实施方案中,第一CH3域进一步或二选一地包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E),或天冬氨酸(D))对K439和/或K370的氨基酸替代(所有编号方式依照Kabat EU索引)。
在还有又一个实施方案中,备选地使用WO 2007/147901中记载的异二聚化办法。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变K253E,D282K,和K322D且第二CH3域包含氨基酸突变D239K,E240K,和K292D(编号方式依照Kabat EU索引)。
在仍有另一个实施方案中,可以备选地使用WO 2007/110205中记载的异二聚化办法。
在一个实施方案中,Fc域的第一亚基包含氨基酸替代K392D和K409D,且Fc域的第二亚基包含氨基酸替代D356K和D399K(编号方式依照Kabat EU索引)。
降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰
Fc域赋予双特异性抗原结合分子(或抗体)以有利的药动学特性,包括长血清半衰期,其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。然而,同时它可能导致不想要的双特异性抗原结合分子(或抗体)对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。此外,Fc受体信号传导途径的共激活可能导致细胞因子释放,其与双特异性抗原结合分子的T细胞活化特性(例如在其中第二抗原结合模块结合激活性T细胞抗原的双特异性抗原结合分子的实施方案中)和长半衰期组合,在系统性施用后引起细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。(携带Fc受体的)免疫细胞而非T细胞的活化甚至可能降低双特异性抗原结合分子(特别是其中第二抗原结合模块结合激活性T细胞抗原的双特异性抗原结合分子)的功效,原因是例如通过NK细胞对T细胞的潜在破坏。
因而,在具体的实施方案中,依照本发明的双特异性抗原结合分子的Fc域展现出与天然IgG1 Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个此类实施方案中,Fc域(或包含所述Fc域的双特异性抗原结合分子)展现出与天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域的双特异性抗原结合分子)相比少于50％,优选少于20％,更优选少于10％且最优选少于5％的对Fc受体的结合亲和力,和/或与天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1Fc域的双特异性抗原结合分子)相比少于50％,优选少于20％,更优选少于10％且最优选少于5％的效应器功能。在一个实施方案中,Fc域(或包含所述Fc域的双特异性抗原结合分子)没有实质性结合Fc受体和/或诱导效应器功能。在一个具体的实施方案中,Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中,Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中,Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中,Fc受体是活化性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最具体地是人FcγRIIIa。在一个实施方案中,效应器功能是选自下组的一项或多项:CDC,ADCC,ADCP,和细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中,效应器功能是ADCC。在一个实施方案中,Fc域展现出与天然IgG1 Fc域相比基本相似的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc域(或包含所述Fc域的双特异性抗原结合分子)展现出超过约70％,特别是超过约80％,更特别是超过约90％的天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力时,实现基本相似的对FcRn的结合。
在某些实施方案中,Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在具体的实施方案中,双特异性抗原结合分子的Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常,Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个实施方案中,氨基酸突变降低Fc域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中,氨基酸突变将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍,至少5倍,或至少10倍。在有超过一处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中,这些氨基酸突变的组合可以将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍,至少20倍,或甚至至少50倍。在一个实施方案中,包含工程化Fc域的双特异性抗原结合分子展现出与包含非工程化Fc域的双特异性抗原结合分子相比少于20％,特别是少于10％,更特别是少于5％的对Fc受体的结合亲和力。在一个具体的实施方案中,Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中,Fc受体是人Fc受体。在一些实施方案中,Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中,Fc受体是活化性人Fcγ受体,更特别是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最特别是人FcγRIIIa。优选地,对这些受体的每一种的结合是降低的。在一些实施方案中,对补体成分的结合亲和力,特别是对C1q的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中,对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当Fc域(或包含所述Fc域的双特异性抗原结合分子)展现出非工程化形式的Fc域(或包含所述非工程化形式的Fc域的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的超过约70％时,实现基本相似的对FcRn的结合,即保留Fc域对所述受体的结合亲和力。Fc域或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗原结合分子可以展现出超过约80％和甚至超过约90％的此类亲和力。在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子的Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的效应器功能。降低的效应器功能可包括但不限于下列一项或多项:降低的补体依赖性细胞毒性(CDC),降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP),降低的细胞因子分泌,降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取,降低的对NK细胞的结合,降低的对巨噬细胞的结合,降低的对单核细胞的结合,降低的对多形核细胞的结合,降低的诱导凋亡的直接信号传导,降低的靶物结合的抗体的交联,降低的树突细胞成熟,或降低的T细胞引发。在一个实施方案中,降低的效应器功能是选自下组的一项或多项:降低的CDC,降低的ADCC,降低的ADCP,和降低的细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中,降低的效应器功能是降低的ADCC。在一个实施方案中,降低的ADCC是小于20％的由非工程化Fc域(或包含非工程化Fc域的双特异性抗原结合分子)诱导的ADCC。
在一个实施方案中,降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变是氨基酸替代。在一个实施方案中,Fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代:E233,L234,L235,N297,P331和P329(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个更特定的实施方案中,Fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代:L234,L235和P329(编号方式依照KabatEU索引)。在一些实施方案中,Fc域包含氨基酸替代L234A和L235A(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个此类实施方案中,Fc域是IgG1 Fc域,特别是人IgG1 Fc域。在一个实施方案中,Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代。在一个更加特定的实施方案中,氨基酸替代是P329A或P329G,特别是P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个实施方案中,Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代和又一处在选自以下位置处的氨基酸替代:E233,L234,L235,N297和P331(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个更加特定的实施方案中,又一处氨基酸替代是E233P,L234A,L235A,L235E,N297A,N297D或P331S。在具体的实施方案中,Fc域包含在位置P329,L234和L235处的氨基酸替代(编号方式依照Kabat EU索引)。在更具体的实施方案中,Fc域包含氨基酸突变L234A,L235A和P329G(“P329G LALA”,“PGLALA”或“LALAPG”)。具体而言,在具体的实施方案中,Fc域的每个亚基包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(Kabat EU索引编号方式),即在Fc域的第一和第二亚基每个中,第234位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L234A),第235位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L235A)且第329位的脯氨酸残基用甘氨酸残基替换(P329G)(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个此类实施方案中,Fc域是IgG1 Fc域,特别是人IgG1 Fc域。氨基酸替代组合“P329G LALA”几乎完全消除了人IgG1 Fc域的Fcγ受体(以及补体)结合,如记载于PCT公开文本no.WO 2012/130831,其通过提述完整并入本文。WO 2012/130831还描述了制备此类突变体Fc域的方法和用于测定其特性(诸如Fc受体结合或效应器功能)的方法。
IgG4抗体展现出与IgG1抗体相比降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因此,在一些实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子的Fc域是IgG4 Fc域,特别是人IgG4 Fc域。在一个实施方案中,IgG4 Fc域包含在位置S228处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代S228P(编号方式依照Kabat EU索引)。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应器功能,在一个实施方案中,IgG4 Fc域包含在位置L235处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代L235E(编号方式依照Kabat EU索引)。在另一个实施方案中,IgG4 Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个具体的实施方案中,IgG4 Fc域包含在位置S228,L235和P329处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代S228P,L235E和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。此类IgG4 Fc域突变体及其Fcγ受体结合特性记载于PCT公开文本No.WO 2012/130831,其通过提述完整并入本文。
在一个具体的实施方案中,展现出与天然IgG1 Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能的Fc域是包含氨基酸替代L234A,L235A和任选地P329G的人IgG1 Fc域,或包含氨基酸替代S228P,L235E和任选地P329G的人IgG4 Fc域(编号方式依照Kabat EU索引)。
在某些实施方案中,已消除Fc域的N-糖基化。在一个此类实施方案中,Fc域包含在位置N297处的氨基酸突变,特别是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替换天冬酰胺的氨基酸替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在上文和PCT公开文本no.WO 2012/130831中描述的Fc域以外,具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有Fc域残基238,265,269,270,297,327和329中一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)(编号方式依照Kabat EU索引)。此类Fc突变体包括具有在氨基酸位置265,269,270,297和327的两个或更多个处的替代的Fc突变体,包括所谓的“DANA”Fc突变体,其具有残基265和297到丙氨酸的替代(美国专利No.7,332,581)。
可以使用本领域中公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除,替代,插入或修饰来制备突变体Fc域。遗传方法可以包括编码DNA序列的位点特异性诱变,PCR,基因合成等。正确的核苷酸变化可以通过例如测序来验证。
可以容易地测定对Fc受体的结合,例如通过ELISA或通过使用标准仪器诸如BIAcore仪(GE Healthcare)的表面等离振子共振(SPR)进行,并且Fc受体诸如可通过重组表达获得。或者,可使用已知表达特定Fc受体的细胞系,如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来估测Fc域或包含Fc域的双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。
可通过本领域中已知的方法来测量Fc域或包含Fc域的双特异性抗原结合分子的效应器功能。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的例子记载于美国专利No.5,500,362；Hellstrom等,Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等,ProcNatl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann等,J ExpMed 166,1351-1361(1987)。或者,可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox
非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可体内评估感兴趣分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如披露于Clynes等,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)的。
在一些实施方案中,Fc域对补体成分(特别是对C1q)的结合是降低的。因而,在其中Fc域工程化为具有降低的效应器功能的一些实施方案中,所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可实施C1q结合测定法来测定Fc域或包含Fc域的双特异性抗原结合分子是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活,可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro等,J ImmunolMethods 202,163(1996)；Cragg等,Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
还可以使用本领域已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929)。
多核苷酸
本发明还提供分离的多核苷酸,其编码如本文中描述的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段。在一些实施方案中,所述片段是抗原结合片段。
可以将编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的多核苷酸以编码完整抗体或双特异性抗原结合分子的单一多核苷酸表达,或以共表达的多种(例如两种或更多种)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性抗体或双特异性抗原结合分子。例如,抗体或双特异性抗原结合分子的轻链部分可以与抗体或双特异性抗原结合分子中包含抗体或双特异性抗原结合分子重链的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时,重链多肽会与轻链多肽联合以形成抗体或双特异性抗原结合分子。在另一个例子中,抗体或双特异性抗原结合分子中包含两个Fc域亚基之一和任选地(部分的)一个或多个Fab分子的部分可以与抗体或双特异性抗原结合分子中包含两个Fc域亚基中另一个和任选地(部分的)Fab分子的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时,Fc域亚基会联合以形成Fc域。
在一些实施方案中,分离的多核苷酸编码整个依照本文所述发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在其它实施方案中,分离的多核苷酸编码依照本文所述发明的抗体或双特异性抗原结合分子中包含的多肽。
在某些实施方案中,多核苷酸或核酸是DNA。在其它实施方案中,本发明的多核苷酸是RNA,例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
可以获得本发明的抗体或双特异性抗原结合分子,例如通过固相肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生成进行。对于重组生成,分离一种或多种编码抗体或双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸(例如如上文描述的),并将其插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程容易分离并测序此类多核苷酸。在一个实施方案中,提供包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体(优选为表达载体)。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有抗体或双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列以及适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术,合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如记载于Maniatis等,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等,CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)的技术。表达载体可以是质粒,病毒的一部分或可以是核酸片段。表达载体包含表达盒,其中在与启动子和/或其它转录或翻译控制元件的可操作联合中克隆编码抗体或双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸(即编码区)。如本文中使用的,“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。尽管“终止密码子”(TAG,TGA或TAA)不翻译成氨基酸,但可将其视为编码区的一部分(若存在的话),但任何侧翼序列例如启动子,核糖体结合位点,转录终止子,内含子,5’和3’非翻译区等,不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中(例如单一载体上),或存在于分开的多核苷酸构建体中,例如在分开的(不同的)载体上。此外,任何载体可含有单个编码区,或可包含两个或更多个编码区,例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽,其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译分开成最终蛋白质。另外,本发明的载体,多核苷酸或核酸可以编码异源编码区,其与编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子(片段)或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于特殊化的元件或基序,如分泌信号肽或异源功能域。当基因产物例如多肽的编码区与一种或多种调节序列以某种方式联合从而使得基因产物的表达置于调节序列的影响或控制下时,即为可操作联合。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mRNA的转录并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力,则两个DNA片段(如多肽编码区和与其联合的启动子)为“可操作联合的”。如此,如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录,那么启动子区将是与该核酸可操作联合。启动子可以是细胞特异性启动子,其仅在预先确定的细胞中指导DNA的实质性转录。除启动子以外,其它转录控制元件例如增强子,操纵基因,阻遏物和转录终止信号能与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区,如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子,以及内含子-A),猿病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因如肌动蛋白,热休克蛋白,牛生长激素和家兔β-珠蛋白衍生的,以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地,多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点,翻译起始和终止密码子以及自病毒系统衍生的元件(具体地,内部核糖体进入位点或IRES,也称作CITE序列)。表达盒还可以包含其它特征,如复制起点和/或染色体整合元件,如逆转录病毒长末端重复(LTR)或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外的编码区联合,分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如,如果期望分泌抗体或双特异性抗原结合分子,那么可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的核酸上游。依照信号假说,由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列,一旦启动将生长的蛋白质链跨越粗面内质网输出,就将信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽N端的信号肽,其从所翻译的多肽切去以生成分泌性或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中,使用天然的信号肽,例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽,或序列的保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者,可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如,可以将野生型前导序列用人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列替代。
可以将编码能用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记抗体或双特异性抗原结合分子的短蛋白序列的DNA纳入抗体或双特异性抗原结合分子(片段)编码多核苷酸内或其末端。
在一个别的实施方案中,提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中,提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独地或组合地掺入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个此类实施方案中,宿主细胞包含一种或多种载体(例如已用载体转化或转染),一种或多种载体包含编码本发明抗体或双特异性抗原结合分子(的部分)的一种或多种多核苷酸。如本文中使用的,术语“宿主细胞”指任何能工程化以生成本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的细胞系统种类。适用于复制并支持抗体或双特异性抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适当时,可用特定的表达载体转染或转导此类细胞,并且可以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐,从而获得充足量的抗体或双特异性抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物如大肠杆菌,或各种真核细胞,如中国仓鼠卵巢细胞(CHO),昆虫细胞等。例如,可以在细菌中生成多肽,尤其在不需要糖基化时。在表达后,可以将多肽在可溶性级分中从细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外,真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合编码多肽的载体的克隆或表达宿主,包括其糖基化途径已被“人源化”,导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004),和Li等,Nat Biotech 24,210-215(2006)。适用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆状病毒株,特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如,适应于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞,如例如记载于Graham等,J Gen Virol 36,59(1977)),幼仓鼠肾细胞(BHK),小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞,如例如记载于Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)的),猴肾细胞(CV1),非洲绿猴肾细胞(VERO-76),人宫颈癌细胞(HELA),犬肾细胞(MDCK),牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A),人肺细胞(W138),人肝细胞(Hep G2),小鼠乳房肿瘤细胞(MMT 060562),TRI细胞(如例如记载于Mather等,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)的),MRC 5细胞和FS4细胞。其它可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等,Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO,NS0,P3X63和Sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞,例如哺乳动物培养细胞,酵母细胞,昆虫细胞,细菌细胞和植物细胞等,但还包括在转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中,宿主细胞是真核细胞,优选为哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0,NS0,Sp20细胞)。
本领域中已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。可以将表达包含抗原结合域如抗体的重链或轻链的多肽的细胞工程化改造为使得还表达另一抗体链,从而使得表达的产物是具有重链和轻链两者的抗体。
在一个实施方案中,提供了生成依照本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的方法,其中方法包括在适合于抗体或双特异性抗原结合分子表达的条件下培养包含编码抗体或双特异性抗原结合分子的多核苷酸的宿主细胞(如本文中提供的),并任选从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体或双特异性抗原结合分子。
本发明的双特异性抗原结合分子(或抗体)的各构件可以彼此遗传融合。双特异性抗原结合分子可设计为使其构件直接彼此融合或经由接头序列间接融合。可依照本领域中公知的方法测定接头的组成和长度,并可以测试功效。双特异性抗原结合分子不同构件之间的接头序列的例子在本文中提供。还包含另外的序列以纳入切割位点来分开融合的各个构件(若期望的话),例如内肽酶识别序列。
本发明的抗体或双特异性抗原结合分子一般至少包含能结合抗原性决定簇的抗体可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分和自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域中公知的(参见例如Harlow和Lane,“Antibodies,alaboratory manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成构建,可以重组生成(例如如记载于美国专利No.4,186,567的)或可通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库获得(参见例如McCafferty的美国专利No.5,969,108)。
可以将任何动物种类的抗体,抗体片段,抗原结合域或可变区用于本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。可用于本发明的非限制性抗体,抗体片段,抗原结合域或可变区可以是鼠,灵长类或人起源的。如果抗体或双特异性抗原结合分子意图供人使用,那么可以使用嵌合形式的抗体,其中抗体的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化或完全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现,包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上,保留或不保留关键的框架残基(例如那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基),(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上,或(c)移植完整的非人可变域,但通过替换表面残基用人样部分来“掩饰(cloak)”它们。人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro andFransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008),并且进一步记载于例如Riechmann etal.,Nature332:323-329(1988)；Queen et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri etal.,Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua et al.,Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；和Osbourn et al.,Methods 36:61-68(2005)和Klimkaet al.,Br.J.Cancer 83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。可以用于人源化的人框架区包括但不限于:使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta et al.,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosoket al.,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地,人抗体记载于vanDijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体,转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座,其替换内源免疫球蛋白基因座,或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中,一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述,见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584,其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429,其描述了
技术；美国专利No.7,041,870,其描述了K-M
技术,和美国专利申请公开文本No.US 2007/0061900,其描述了
技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner et al.,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可以通过自人抗体文库分离来生成人抗体,如本文中描述的。
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离在本发明中有用的抗体。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner et al.,Nature Reviews 16:498-508(2016)。例如,用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Frenzel et al.,mAbs 8:1177-1194(2016)；Bazan et al.,Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828(2012)和Zhao et al.,Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289(2016)和Hoogenboom et al.,于Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,2001)和Marks and Bradbury,于Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)。
在某些噬菌体展示方法中,将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆,并在噬菌体文库中随机重组,然后可以对噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体,如记载于Winter et al.,Annual Review of Immunology 12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体,而不需要构建杂交瘤。或者,可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫接种的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源,如由Griffiths et al.,EMBO Journal 12:725-734(1993)描述的。最后,也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段,并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库,如由Hoogenboom and Winter,Journal of MolecularBiology 227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如:美国专利No.5,750,373；7,985,840；7,785,903和8,679,490和美国专利公开文本No.2005/0079574,2007/0117126,2007/0237764和2007/0292936。本领域知道的用于对组合文库筛选具有一种或多种期望活性的抗体的方法的别的例子包括核糖体和mRNA展示,以及用于在细菌,哺乳动物细胞,昆虫细胞或酵母细胞上展示和选择抗体的方法。用于酵母表面展示的方法的综述见例如Scholler et al.,Methods in Molecular Biology 503:135-56(2012)和Cherf et al.,Methods in Molecular biology 1319:155-175(2015)以及Zhao etal.,Methods in Molecular Biology 889:73-84(2012)。用于核糖体展示的方法记载于例如He et al.,Nucleic Acids Research 25:5132-5134(1997)和Hanes et al.,PNAS 94:4937-4942(1997)。
可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的抗体或双特异性抗原结合分子,技术如高效液相层析,离子交换层析,凝胶电泳,亲和层析,大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于因素,如净电荷,疏水性,亲水性等,而且对于本领域中的技术人员将是明显的。对于亲和层析纯化,能使用抗体或双特异性抗原结合分子结合的抗体,配体,受体或抗原。例如,对于本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的亲和层析纯化,可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以使用连续的蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析来分离抗体或双特异性抗原结合分子,基本如实施例中描述的。可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定抗体或双特异性抗原结合分子的纯度,包括凝胶电泳,高压液相层析等。
测定法
通过本领域中已知的各种测定法,可以对本文中提供的抗体或双特异性抗原结合分子鉴定,筛选或表征它们的物理/化学特性和/或生物学活性。
亲和力测定法
可以例如使用标准的仪器诸如BIAcore仪(GE Healthcare)通过表面等离振子共振(SPR)测定抗体或双特异性抗原结合分子对Fc受体或靶抗原的亲和力,而且可以诸如通过重组表达获得受体或靶蛋白。或者,可以例如通过流式细胞术(FACS),使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估抗体或双特异性抗原结合分子对不同受体或靶抗原的结合。一个用于测量结合亲和力的特定的说明性和例示性实施方案记载于下文。
依照一个实施方案,通过表面等离振子共振使用
T100仪(GEHealthcare)于25℃测量KD。
为了分析Fc部分与Fc受体之间的相互作用,通过固定化于CM5芯片上的抗五His抗体(Qiagen)来捕捉带His标签的重组Fc受体并将双特异性构建物用作分析物。简言之,将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GE Healthcare)依照供应商的说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗五His抗体用10mM乙酸钠pH 5.0稀释至40μg/ml,接着以5μl/分钟的流速注射以实现大约6500个响应单位(RU)的偶联蛋白质。在注射配体后,注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。随后,在4或10nM捕捉Fc受体60秒。对于动力学测量,将抗体或双特异性抗原结合分子的4倍连续稀释液(范围为500nM至4000nM)在HBS-EP(GE Healthcare,10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％表面活性剂P20,pH 7.4)中于25℃以30μl/分钟的流速注射120秒。
为了测定对靶抗原的亲和力,通过固定化于活化CM5传感器芯片表面上的抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare)来捕捉抗体或双特异性抗原结合分子,如对于抗五-His抗体所描述的。偶联蛋白质的最终量为大约12000RU。抗体或双特异性抗原结合分子在300nM捕捉90秒。使靶抗原在从250至1000nM的浓度范围以30μl/分钟的流速通过流动池达180秒。监测解离达180秒。
通过减去在参照流动池上获得的响应来校正本体折射率(bulk refractiveindex)差异。使用稳定态响应通过Langmuir结合等温线的非线性曲线拟合来推导解离常数KD。使用简单1对1Langmuir结合模型(
T100评估软件版本1.1.1)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(k结合)和解离速率(k解离)。平衡解离常数(KD)计算为比率k解离/k结合。参见例如Chen et al.,J Mol Biol 293,865-881(1999)。
活性测定法
可以通过各种测定法来测量本发明的双特异性抗原结合分子(或抗体)的生物学活性,如实施例中描述的。生物学活性可例如包括诱导T细胞的增殖,诱导T细胞中的信号传导,诱导T细胞中活化标志物的表达,诱导通过T细胞的细胞因子分泌,诱导靶细胞诸如肿瘤细胞的裂解,和诱导肿瘤消退和/或改善存活。
组合物,配制剂和施用路径
在一个别的方面,本发明提供包含本文中提供的任一种抗体或双特异性抗原结合分子的药学组合物,例如用于以下任一种治疗方法。在一个实施方案中,药学组合物包含本文中提供的任一种抗体或双特异性抗原结合分子以及药学可接受载体。在另一个实施方案中,药学组合物包含本文中提供的任一种抗体或双特异性抗原结合分子以及至少一种另外的治疗剂,例如如下文描述的。
还提供以适于体内施用的形式生成本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的方法,方法包括(a)获得依照本发明的抗体或双特异性抗原结合分子,并(b)将抗体或双特异性抗原结合分子与至少一种药学可接受载体配制在一起,由此配制成用于体内施用的抗体或双特异性抗原结合分子制剂。
本发明的药学组合物包含治疗有效量的在药学可接受载体中溶解或分散的抗体或双特异性抗原结合分子。短语“药学或药理学可接受的”指在所采用的剂量和浓度一般对接受者无毒性,即在适当时对动物如例如人施用时不产生不利,变应性或其它不当反应的分子实体和组合物。根据本公开,制备含有抗体或双特异性抗原结合分子以及任选地另外的活性成分的药学组合物将是本领域技术人员已知的,如由Remington’s PharmaceuticalSciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990例示的,其通过提述并入本文。此外,对于动物(例如人)施用,会理解制剂应当满足FDA生物标准部门(FDA Office of BiologicalStandards)或其它国家的相应机构要求的无菌性,热原性(pyrogenicity),一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干配制剂或水性溶液。如本文中使用的,“药学可接受载体”包括任何和所有的溶剂,缓冲剂,分散介质,涂料材料,表面活性剂,抗氧化剂,防腐剂(例如抗细菌剂,抗真菌剂),等张剂,吸收延缓剂,盐,防腐剂,抗氧化剂,蛋白质,药物,药物稳定剂,聚合物,凝胶,粘合剂,赋形剂,崩解剂(disintegration agent),润滑剂,甜味剂,芳香剂,染料,此类类似的材料及其组合,如本领域普通技术人员将已知的(参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329,通过提述并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容,涵盖其在治疗或药学组合物中的使用。
可以通过任何合适的手段,包括胃肠外,肺内,和鼻内,及若期望用于局部治疗的话,损伤内施用来施用本发明的抗体或双特异性抗原结合分子(和任何别的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内,静脉内,动脉内,腹膜内,或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的,剂量给药可以通过任何合适的路径,例如通过注射,诸如静脉内或皮下注射进行。
胃肠外组合物包括那些设计用于通过注射施用,例如皮下,皮内,损伤内,静脉内,动脉内,肌内,鞘内或腹膜内注射施用的组合物。对于注射,可以将本发明的抗体或双特异性抗原结合分子在水性溶液,优选地在生理学相容的缓冲液中配制,生理学相容的缓冲液如汉克(Hanks)氏溶液,林格(Ringer)氏溶液或生理学盐水缓冲液。溶液可以含有配制剂如悬浮剂,稳定剂和/或分散剂。或者,抗体或双特异性抗原结合分子可以为粉末形式,用于在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水构成。根据需要,通过将本发明的抗体或双特异性抗原结合分子以需要的量掺入到具有下文列举的各种其它成分的合适溶剂中来制备无菌可注射溶液。可以容易地实现无菌,例如通过过滤流过无菌过滤膜进行。一般地,通过将各种无菌活性成分掺入到无菌媒介物中来制备分散剂,无菌媒介物含有基础分散介质和/或其它成分。在制备无菌可注射溶液,悬液或乳剂的无菌粉末的情况中,优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术,其将活性成分以及任何另外的期望成分的粉末从其先前无菌过滤的液体介质产生。液体介质在必要时应当是适当缓冲的,并且在用充足的盐水或葡萄糖注射前首先使液体稀释液等张。组合物在制备和贮存条件下必须是稳定的,并且针对微生物如细菌和真菌的污染作用提供保护。会领会的是,应当将内毒素污染最少保持于安全水平,例如低于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学可接受载体包括但不限于:缓冲剂如磷酸盐,柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵(hexamethonium chloride)；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚,丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质,如血清清蛋白,明胶,或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸或赖氨酸；单糖,二糖,和其它碳水化合物,包括葡萄糖,甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬液可以含有提高悬液粘度的化合物,如羧甲基纤维素钠,山梨糖醇,葡聚糖等。任选地,悬液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。另外,可以将活性化合物的悬液制备为合适的油性注射悬液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油或合成的脂肪酸酯,如乙基cleats或甘油三酯或脂质体。
可以将活性成分在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合作用制备的微囊剂,例如羟甲基纤维素或明胶微囊剂和聚-(甲基丙烯酸酯)微囊剂中,在胶体药物投递系统(例如脂质体,清蛋白微球,微乳剂,纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液(macroemulsion)中包载。此类技术披露于Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Ed.Mack PrintingCompany,1990)。可以制备持续释放的制剂。合适的持续释放制剂的例子包括含多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质,基质为成形制品例如膜或微囊剂的形式。在具体的实施方案中,可以通过在组合物中使用吸收延迟剂如例如单硬脂酸铝,明胶或其组合,来产生可注射组合物的延长吸收。
在先前描述的组合物外,抗体或双特异性抗原结合分子还可以配制为贮存(depot)制剂。可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用此类长效配制剂。如此,例如抗体或双特异性抗原结合分子可以用合适的聚合或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制,或配制为微溶性衍生物,例如微溶性盐。
可以通过常规的混合,溶解,乳化,包囊,包载或冻干过程来制备包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的药学组合物。可以以常规方式配制药学组合物,其使用一种或多种有助于将蛋白质加工成可药学使用的制剂的生理学可接受载体,稀释剂,赋形剂或辅助剂。合适的配制剂依赖于选择的施用路径。
可以将抗体或双特异性抗原结合分子以游离酸或碱,中性或盐形式配制成组合物。药学可接受盐是基本保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐(acidaddition salt),例如与蛋白质性质组合物的游离氨基基团形成的那些,或与无机酸(如例如氢氯酸或磷酸)或与有机酸如乙酸,草酸,酒石酸或扁桃酸形成的。与游离羧基基团形成的盐还可以自无机碱如例如氢氧化钠,钾,铵,钙或铁；或有机碱如异丙胺,三甲胺,组氨酸或普鲁卡因(procaine)衍生。药用盐倾向于比相应的游离碱形式更可溶于水性溶剂和其它质子溶剂中。
治疗方法和组合物
可以将本文中提供的任一种抗体或双特异性抗原结合分子用在治疗方法中。本发明的抗体或双特异性抗原结合分子可用作免疫治疗剂,例如在癌症的治疗中。
对于在治疗方法中的使用,将以与优良医学实践一致的方式配制,给药和施用本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在此背景中考虑的因素包括治疗的特定病症,治疗的特定哺乳动物,个体患者的临床状况,病症的起因,药剂的投递部位,施用方法,施用时间安排以及医学从业人员已知的其它因素。
在一个方面,提供用作药物的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在别的方面,提供用于治疗疾病的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中,提供用于治疗方法的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中,本发明提供如本文中描述的抗体或双特异性抗原结合分子,用于治疗有此需要的个体中的疾病。在某些实施方案中,本发明提供抗体或双特异性抗原结合分子,用于治疗患有疾病的个体的方法,方法包括对个体施用治疗有效量的抗体或双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中,待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中,疾病是癌症。在某些实施方案中,方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。在别的实施方案中,本发明提供如本文中描述的抗体或双特异性抗原结合分子,用于诱导靶细胞,特别是肿瘤细胞的裂解。在某些实施方案中,本发明提供抗体或双特异性抗原结合分子,用于在个体中诱导靶细胞,特别是肿瘤细胞裂解的方法,方法包括对个体施用有效量的抗体或双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞的裂解。依照上文任何实施方案的“个体”是哺乳动物,优选是人。在某些实施方案中,要治疗的疾病是自身免疫疾病,特别是系统性红斑狼疮和/或类风湿性关节炎。由自身反应性浆细胞生成致病性自身抗体是自身免疫疾病的一个标志。因此,GPRC5D可用于靶向自身免疫疾病中的自身反应性浆细胞。
在一个别的方面,本发明提供本发明的抗体或双特异性抗原结合分子在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中,药物用于治疗有此需要的个体中的疾病。在一个别的实施方案中,药物用于治疗疾病的方法,方法包括对患疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中,待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中,疾病是癌症。在一个实施方案中,方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。在一个别的实施方案中,药物用于诱导靶细胞,特别是肿瘤细胞的裂解。仍在别的实施方案中,药物用于在个体中诱导靶细胞,特别是肿瘤细胞裂解的方法,方法包括对个体施用有效量的药物以诱导靶细胞的裂解。依照上文任何实施方案的“个体”可以是哺乳动物,优选是人。
在一个别的方面,本发明提供用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中,方法包括对患有此类疾病的个体施用治疗有效量的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中,对所述个体施用组合物,其包含药学可接受的形式的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中,待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中,疾病是癌症。在某些实施方案中,方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。依照上文任何实施方案的“个体”可以是哺乳动物,优选是人。
在一个别的方面,本发明提供一种用于诱导靶细胞,特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个实施方案中,方法包括在存在T细胞,特别是细胞毒性T细胞的情况下使靶细胞与本发明的抗体或双特异性抗原结合分子接触。在一个别的方面,提供一种用于在个体中诱导靶细胞,特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个此类实施方案中,方法包括对个体施用有效量的抗体或双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞裂解。在一个实施方案中,“个体”是人。
在某些实施方案中,待治疗的疾病是增殖性病症,特别是癌症。癌症的非限制性例子包括膀胱癌,脑癌,头和颈癌,胰腺癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,子宫癌,宫颈癌,子宫内膜癌,食道癌,结肠癌,结肠直肠癌,直肠癌,胃癌,前列腺癌,血液癌,皮肤癌,鳞状细胞癌,骨癌和肾癌。其它可使用本发明的抗体或双特异性抗原结合分子治疗的细胞增殖病症包括但不限于位于下列各项中的新生物:腹部,骨,乳房,消化系统,肝,胰,腹膜,内分泌腺(肾上腺,副甲状腺,垂体,睾丸,卵巢,胸腺,甲状腺),眼,头和颈,神经系统(中枢和外周),淋巴系统,骨盆,皮肤,软组织,脾,胸区,和泌尿生殖系统。还包括癌症前期状况或损伤以及癌症转移。在某些实施方案中,癌症选自由肾癌,膀胱癌,皮肤癌,肺癌,结肠直肠癌,乳腺癌,脑癌,头和颈癌和前列腺癌组成的组。在一个实施方案中,癌症是前列腺癌。熟练技术人员容易地认可在许多情况下,抗体或双特异性抗原结合分子可能不提供治愈而仅可以提供部分益处。在一些实施方案中,具有一些益处的生理学变化也被视为治疗有益的。如此,在一些实施方案中,提供生理学变化的抗体或双特异性抗原结合分子的量被视为“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者,患者或个体通常为哺乳动物,更特定地为人。
在一些实施方案中,对细胞施用有效量的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在其它实施方案中,对个体施用治疗有效量的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子以治疗疾病。
为了预防或治疗疾病,本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的合适剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型,施用路径,患者的体重,抗体或双特异性抗原结合分子的类型,疾病的严重程度和进程,施用抗体或双特异性抗原结合分子是为了预防还是治疗目的,先前或同时的治疗干预,患者的临床史和对抗体或双特异性抗原结合分子的响应,以及主治医师的判断。负责施用的从业人员将在任何事件中确定组合物中活性成分的浓度和用于个体受试者的合适剂量。本文中涵盖各种给药进度表,包括但不限于在各个时间点的单次或多次施用,推注施用,和脉冲输注。
抗体或双特异性抗原结合分子适宜地在一次或一系列治疗里对患者施用。根据疾病的类型和严重程度,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体或双特异性抗原结合分子可以是用于对患者施用的起始候选剂量,不管是例如通过一次或多次分开的施用,还是通过连续输注进行。根据上文提及的因素,一种典型的每日剂量的范围可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在数天或更长时间里的重复施用,根据状况,治疗一般将持续直至发生对疾病症状的期望的抑制。抗体或双特异性抗原结合分子的一种例示性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其它非限制性例子中,剂量还可包括每次施用从约1微克/kg体重,约5微克/kg体重,约10微克/kg体重,约50微克/kg体重,约100微克/kg体重,约200微克/kg体重,约350微克/kg体重,约500微克/kg体重,约1毫克/kg体重,约5毫克/kg体重,约10毫克/kg体重,约50毫克/kg体重,约100毫克/kg体重,约200毫克/kg体重,约350毫克/kg体重,约500毫克/kg体重,至约1000mg/kg体重或更多,以及其中可导出的任何范围。在从本文列出的数量可导出的范围的非限制性例子中,基于上文描述的数目,可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重的范围,约5微克/kg体重至约500毫克/kg体重的范围等。如此,可以对患者施用一剂或多剂的约0.5mg/kg,2.0mg/kg,5.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。可以间歇地施用此类剂量,例如每周或每3周(例如使得患者接受约2至约20,或例如约6剂的抗体或双特异性抗原结合分子)。可以施用起始较高的加载剂量,继之以一剂或多剂较低剂量。然而,可以使用其它剂量方案。通过常规技术和测定法容易监测此疗法的进展。
本发明的抗体或双特异性抗原结合分子一般将以对于实现意图的目的有效的量使用。对于治疗或预防疾病状况的用途,以治疗有效量施用或应用本发明的抗体或双特异性抗原结合分子,或其药学组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力以内,尤其根据本文中提供的详细公开内容。
对于系统性施用,能从体外测定法如细胞培养测定法初步估算出治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包含如在细胞培养中测定的IC50的循环浓度范围。可以将此类信息用于更准确地确定人中的可用剂量。
使用本领域中公知的技术,还能从体内数据例如动物模型估算出初始剂量。本领域中的普通技术人员能容易地基于动物数据优化对人的施用。
可以分别调整剂量量和时间间隔以提供足以维持治疗效果的抗体或双特异性抗原结合分子的血浆水平。通过注射施用的可用患者剂量的范围为从约0.1至50mg/kg/天,通常约0.5至1mg/kg/天。可以通过每日施用多剂实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC测量血浆中的水平。
在局部施用或选择性摄取的情况中,抗体或双特异性抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员会能够在无需过度实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文中描述的抗体或双特异性抗原结合分子的治疗有效剂量一般将提供治疗益处,而不导致实质性毒性。可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学规程来测定抗体或双特异性抗原结合分子的毒性和治疗功效。可以使用细胞培养测定法和动物研究来测定LD50(对50％的群体致命的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率为治疗指数,其可以表述为LD50/ED50比。优选展现出较大治疗指数的抗体或双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中,依照本发明的抗体或双特异性抗原结合分子展现出高治疗指数。可以将从细胞培养测定法和动物研究获得的数据用来制定适用于人的剂量范围。优选地,剂量处于具有很小或无毒性的循环浓度(包含ED50)的范围内。剂量在此范围内可以随多种因素,例如采用的剂量形式,利用的施用路径,受试者的状况等而变化。鉴于患者的状况,各个内科医生可以选择确切的配制剂,施用路径和剂量(参见例如Fingl等,1975,于:The Pharmacological Basis of Therapeutics,Ch.1,p.1,通过提述完整并入本文)。
用本发明的抗体或双特异性抗原结合分子治疗的患者的主治内科医生将知晓如何及何时终止,中断或调整施用(由于毒性,器官功能障碍等)。相反,如果临床应答不适当(排除毒性),主治内科医生还将知晓将治疗调整至更高水平。在感兴趣的病症的管理中的施用剂量的量级将随待治疗的状况的严重程度,施用路径等而变化。可以例如部分地通过标准的预后评估方法来评估状况的严重程度。另外,剂量以及可能的给药频率也将随个体患者的年龄,体重和应答而变化。
其它药剂和治疗
本发明的抗体和双特异性抗原结合分子可以与一种或多种其它药剂在疗法中组合施用。例如,本发明的抗体或双特异性抗原结合分子可以与至少一种另外的治疗剂共施用。术语“治疗剂”涵盖施用以治疗需要此类治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。此类另外的治疗剂可以包含任何适用于所治疗的特定适应征的活性成分,优选地具有不会彼此不利影响的互补活性的那些活性成分。在某些实施方案中,另外的治疗剂是免疫调控剂,细胞抑制剂,细胞粘着的抑制剂,细胞毒剂,细胞凋亡的激活剂,或提高细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂。在一个具体的实施方案中,另外的治疗剂是抗癌剂,例如微管破坏物,抗代谢物,拓扑异构酶抑制剂,DNA嵌入剂,烷化剂,激素疗法,激酶抑制剂,受体拮抗剂,肿瘤细胞凋亡的激活剂,或抗血管生成剂。
此类其它药剂以对意图目的有效的量适宜地组合存在。此类其它药剂的有效量取决于使用的抗体或双特异性抗原结合分子的量,病症或治疗的类型以及上文讨论的其它因素。抗体或双特异性抗原结合分子一般以与本文中描述的相同的剂量和施用路径,或以本文中描述的剂量的约1至99％,或通过凭经验/临床上确定为合适的任何剂量和任何路径使用。
上文记载的此类组合疗法涵盖组合施用(其中在同一组合物或分开的组合物中包含两种或更多种治疗剂)和分开施用,在该情况中,本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的施用可以在施用另外的治疗剂和/或辅助剂之前,同时和/或之后发生。本发明的抗体或双特异性抗原结合分子还可以与放射疗法组合使用。
制品
在本发明的另一个方面,提供含有可用于治疗,预防和/或诊断上文描述的病症的材料的制品。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶,管形瓶,注射器,IV溶液袋等。容器可从多种材料如玻璃或塑料形成。容器容纳组合物,其自身或与另一组合物组合对于治疗,预防和/或诊断状况是有效的,并且可以具有无菌的存取口(例如,容器可以是具有由皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中至少一种活性成分是本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。标签或包装插页指示组合物用于治疗选择的状况。此外,制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器,其中组合物包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子；和(b)其中含有组合物的第二容器,其中组合物包含另外的细胞毒性或其它方面治疗剂。本发明的这一实施方案中的制品还可以包含包装插页,其指示组合物可用于治疗特定状况。或者/另外,制品还可以包含第二(或第三)容器,其包含药学可接受缓冲液,如抑菌性注射用水(BWFI),磷酸盐缓冲盐水,林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料,包括其它缓冲液,稀释剂,滤器,针,和注射器。
用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中,本文中提供的任何抗GPRC5D抗体可用于检测生物学样品中GPRC5D的存在。在用于本文时,术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中,生物学样品包含细胞或组织,诸如前列腺组织。
在一个实施方案中,提供了在诊断或检测方法中使用的抗GPRC5D抗体。在又一方面,提供了检测生物学样品中GPRC5D的存在的方法。在某些实施方案中,方法包括在容许抗GPRC5D抗体结合GPRC5D的条件下使生物学样品与抗GPRC5D抗体接触,如本文中所描述的,并检测是否在抗GPRC5D抗体与GPRC5D之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中,使用抗GPRC5D抗体来选择适合用抗GPRC5D抗体治疗的受试者,例如其中GPRC5D是用于选择患者的生物标志物。
可使用本发明的抗体来诊断的例示性病症包括癌症,特别是多发性骨髓瘤。
在某些实施方案中,提供了经标记的抗GPRC5D抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光,发色,电子致密,化学发光,和放射性标记物),和例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块,诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P,14C,125I,3H,和131I,荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物,罗丹明(rhodamine)及其衍生物,丹酰,伞形酮,萤光素酶,例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456),萤光素,2,3-二氢酞嗪二酮,辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酶,β-半乳糖苷酶,葡糖淀粉酶,溶菌酶,糖类氧化酶,例如葡萄糖氧化酶,半乳糖氧化酶,和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联),乳过氧化物酶,或微过氧化物酶,生物素/亲合素,自旋标记物,噬菌体标记物,稳定的自由基,等等。
在本发明的又一个方面涉及一种包含可变重链区(VH)的结合GPRC5D的抗体(10B10),其中该VH可包含与SEQ ID NO:81的序列至少95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。该抗体可包含轻链可变区(VL),其中该VL包含与SEQ ID NO:82的序列至少95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。该抗体可包含VH和VL,其中该VH可包含与SEQ ID NO:81的序列至少95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列且其中该VL包含与SEQ ID NO:82的序列至少95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。优选地,该抗体包含包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL。
本发明的又一个方面涉及一种抗体(10B10-TCB)。该抗体可包含第一轻链,其中该第一轻链包含与SEQ ID NO:67的序列至少95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。该抗体可包含第二轻链,其中该第二轻链包含与SEQ ID NO:68的序列至少95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。该抗体可包含第一重链,其中该第一重链包含与SEQ ID NO:69的序列至少95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。该抗体可包含第二重链,其中该第二重链包含与SEQ ID NO:70的序列至少95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。在一个优选实施方案中,该抗体包含包含SEQID NO:67的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的第二轻链,包含SEQID NO:69的氨基酸序列的第一重链和包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的第二重链。
氨基酸序列
实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。理解的是,鉴于上文提供的一般性描述,可以实践各种其它实施方案。
实施例1:肿瘤靶物的表达
为了鉴定超过正常浆细胞由多发性骨髓瘤表达的差异基因,对自具有多发性骨髓瘤(MM)的患者衍生的10份样品和自健康供体的骨髓衍生的10份浆细胞(PC)实施RNAseq。使用RNeasy微级试剂盒(Qiagen)依照制造商的说明书提取RNA。在RNA提取期间使用无RNA酶的DNA酶套组(Qiagen)去除基因组DNA。在Agilent真核生物总RNA皮级芯片(AgilentTechnologies)上控制提取的RNA的质量。使用用于Illumina测序(Clontech)的SMARTer超低RNA试剂盒依照制造商的说明书自1.6ng总RNA制备和扩增cDNA。然后,依照制造商的说明书将1ng扩增的cDNA提交Nextera XT文库制备(Illumina)。使用Kapa文库量化试剂盒(KapaBiosystems)量化测序文库并使用高敏感性芯片(Agilent Technologies)在Bioanalyzer上通过毛细管电泳控制质量。在HiSeq2500测序仪(Illumina)上对文库测序2x50个循环,使用型式4簇生成试剂盒和型式4测序试剂(Illumina)。
B细胞成熟抗原(BCMA)是一种细胞表面蛋白质,其在恶性浆细胞上表达且因而识别为多发性骨髓瘤靶物(Tai YT&Anderson KC,Targeting B-cell maturation antigenin multiple myeloma,Immunotherapy.2015Nov；7(11):1187-1199)。使用RNAseq技术,深入分析指示GPRC5D表达在来自多发性骨髓瘤患者的浆细胞中像BCMA一样高(图2)。更加重要的是,来自多发性骨髓瘤患者的浆细胞和健康浆细胞之间GPRC5D的差异表达是大约20倍。与之对比,来自多发性骨髓瘤患者的浆细胞和健康浆细胞之间BCMA的差异表达仅仅是2倍。GPRC5D的总体表达比其它已知多发性骨髓瘤靶分子诸如SLAM7,CD138和CD38的表达高得多。另外,健康的幼稚或记忆B细胞几乎不表达GPRC5D。
实施例2:GPRC5D结合物的生成和T细胞双特异性(TCB)抗体的制备
如下生成GPRC5D结合物,即通过大鼠的DNA免疫接种,继以杂交瘤生成,杂交瘤的筛选和测序。通过它对GPRC5D表达性转染子的结合通过ELISA测量筛选特异性结合。鉴定出两种GPRC5D结合物,下面称作5E11(SEQ ID NO 13和14)和5F11(SEQ ID NO 15和16)。一旦鉴定出特异性结合物,就将IgG转变成T细胞双特异性抗体。将结合物转变成T细胞双特异性抗体的原理在本领域中有例示和描述,例如PCT公开文本号WO 2014/131712A1,通过援引将其完整收入本文中。T细胞双特异性抗体包含两个GPRC5D结合模块和一个CD3结合模块(抗GPRC5D/抗CD3 T细胞双特异性抗体),如图3中图示的。制备下面的抗GPRC5D/抗CD3 T细胞双特异性抗体:i)5E11-TCB(SEQ ID NO 17,18,19和20)；ii)5F11-TCB(SEQ ID NO 21,22,23和24)；iii)ET150-5-TCB(SEQ ID NO 25,26,27和28)；iv)B72-TCB(SEQ ID NO:73,74,75和76)；和v)BCMA-TCB(SEQ ID NO:77,78,79和80)。ET150-5 GPRC5D结合模块描述于PCT公开文本号WO 2016/090329A2。在本文中术语“ET-150-5”与术语“ET150-5”同义使用,反之亦然。作为阴性对照,制备非靶向性DP47-TCB。DP47-TCB是一种非靶向性T细胞双特异性抗体,其只结合CD3但不结合GPRC5D。DP47-TCB描述于PCT公开文本号WO 2014/131712A1,通过援引将其完整收入本文中。B72-TCB衍生自WO 2018/0117786A2的表23中公开的GCDB72抗体且包含GCDB72的GPRC5D结合模块。B72-TCB是以crossmab 1+1型式生成的(SEQ ID NO:73,74,75和76)。BCMA-TCB衍生自WO 2016/166629A1且包含如其中公开的A02_Rd4_6nM_C01的GPRC5D结合模块。BCMA-TCB是以crossmab 2+1型式生成的(SEQ ID NO:77,78,79和80)。
实施例3:T细胞双特异性抗体对多发性骨髓瘤细胞系的结合
为了测量对GPRC5D的结合,我们对报告的多发性骨髓瘤细胞系实施了基于FACS的结合测定法(Lombardi et al.,Molecular characterization of human multiplemyeloma cell lines by integrative genomics:insights into the biology of thediseas；Genes Chromosomes Cancer.2007Mar；46(3):226-38)。在补充有20％热灭活胎牛血清(FBS,Gibco)和1％青霉素-链霉素100X(Gibco)的RPMI1640+Glutamax培养基(Gibco)中培养细胞系AMO-1,L363和OPM-2。用仅仅补充有10％FBS的相同培养基培养细胞系WSU-DLCL2(阴性对照)。还用补充有50μM巯基乙醇(Gibco)和1mM丙酮酸钠(Gibco)的相同培养基培养细胞系NCI-H929和RPMI-8226。在75cm2烧瓶(TPP)中培养细胞系,每周两代。
使用间接染色评估不同抗人GPRC5D-TCB抗体(5E11-TCB,5F11-TCB和ET150-5TCB)的结合。使用因子为0.2的连续稀释液将细胞与10μg/ml至0.00064μg/ml范围的抗人GPRC5D-TCB构建物5E11-TCB,5F11-TCB或ET150-5 TCB一起或没有构建物在100μL磷酸盐缓冲液盐水(PBS；Gibco)中于4℃温育1小时。将细胞用在PBS中1:800稀释的活蓝染料(LifeTechnologies)于4℃染色20分钟,之后用在流式细胞术染色缓冲液(eBioscience)中1/300稀释的PE缀合的山羊抗人IgG,Fcγ片段特异性(Jackson Laboratories)于4℃温育30分钟进行染色。在定制设计的BD Biosciences Fortessa上实施流式细胞术采集并使用FlowJo软件(Tree Star,Ashland,OR)和GraphPad Prism软件进行分析。
图4A-C显示5E11-TCB和5F11-TCB均以剂量依赖性方式结合所有测试多发性骨髓瘤细胞系。与之对比,ET150-5-TCB结合测试细胞系弱得多。没有观察到抗GPRC5D-TCB对WSU-DLCL2细胞(GPRC5D-非霍奇金淋巴瘤细胞系)的结合。
实施例4:抗GPRC5D-TCB介导的T细胞细胞毒性
为了测量抗GPRC5D-TCB抗体的功能性,实施体内T细胞细胞毒性测定法。简言之,在补充有20％热灭活胎牛血清(FBS；Gibco)和1％青霉素-链霉素100X(PS；Gibco)的RPMI1640+Glutamax培养基(Gibco)中培养AMO-1,L363和OPM-2细胞系。用仅仅补充有10％FBS的相同培养基培养细胞系WSU-DLCL2。用补充有50μM巯基乙醇(Gibco)和1mM丙酮酸钠(Gibco)的相同培养基培养细胞系NCI-H929和RPMI-8226。在75cm2烧瓶(TPP)中培养细胞系,每周两代。
在补充有10％FBS(Gibco)+1％PS(Gibco)的IMDM培养基(Gibco)中与0.3x106个使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)自外周血单个核细胞(PBMC)(来自BlutspendeSchlieren的血沉棕黄层)分离的同种异基因T细胞一起以1:10的靶:效应比共培养细胞系。以不同浓度将抗人GPRC5D-TCB抗体(5E11-TCB,5F11-TCB,ET150-5 TCB或DP47-TCB)添加至共培养物,因子为0.1的连续稀释的1μg/ml至0.000001μg/ml范围或0μg/ml。以5％CO2于37℃温育20小时后,将75μl上清液每孔转移入装有25μl每孔CytoTox-Glo细胞毒性测定法(Promega)的96孔白色板(Greiner bio-one)。于室温温育15分钟后在PerkinElmerEnVision上实施发光采集并使用GraphPad Prism和XL fit软件进行分析。作为LDH释放的发光信号将数据绘图。
图5A-E显示5E11-TCB和5F11-TCB均对多发性骨髓瘤细胞系介导强T细胞细胞毒性,特别是NCI-H929(图5B),RPMI-8226(图5C),L363和(图5D)AMO-1(图5A),而对阴性对照系WSU-DLCL2没有观察到杀伤(图5E)。与之对比,ET150-5-TCB对测试多发性骨髓瘤细胞系介导较少或显著更低的杀伤。表1汇总自图5A-E中显示的数据推导的EC50值。EC50值是使用Excel中的XLfit附加特征通过将信号的原始数据针对滴定的TCB绘图而计算的。
表1:抗GPRC5D-TCB介导的杀伤的EC50
| NCI-H929 | RPMI-8226 | L363 | AMO-1 | WSI-DLCL2 | |
| 5E11-TCB | 0.007nM | 0.024nM | 0.012nM | 0.014nM | / |
| 5F11-TCB | 0.001nM | 0.002nM | 0.001nM | 0.003nM | / |
| ET150-5-TCB | 0.833nM | 0.797nM | 0.768nM | 0.0835nM | / |
实施例5:抗GPRC5D-TCB介导的T细胞活化
为了在机制上解决抗GPRC5D-TCB的作用模式,测量在抗GPRC5D-TCB存在下与靶多发性骨髓瘤细胞系共培养后T细胞的活化。与实施例4和图5A-E中描述的实验相似,在补充有10％FBS(Gibco)+1％PS(Gibco)的IMDM培养基(Gibco)中与3.105个使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)自PBMC(来自Blutspende Schlieren的血沉棕黄层)分离的同种异基因T细胞一起以1:10的靶:效应比共培养细胞系。以不同浓度将抗人GPRC5D-TCB抗体(5E11-TCB,5F11-TCB,ET150-5-TCB或DP47-TCB)添加至共培养物,因子为0.1的连续稀释的1μg/ml至0.000001μg/ml范围或0μg/ml。以5％CO2于37℃温育20小时后,将细胞染色以评估T细胞活化。首先将细胞用在PBS(Gibco)中1:800稀释的活蓝染料(Life Technologies)于4℃染色20分钟。之后,将细胞用AF700抗人CD4(克隆OKT4),BV711抗人CD8(克隆SK1),BV605抗人CD25(克隆BC96),APC-Cy7抗人CD69(克隆FN50)(均来自BioLegend)和PE-Cy5.5抗人CD3(克隆SK7；eBioscience)在流式细胞术染色缓冲液(eBioscience)中于4℃染色30分钟。在定制设计的BD Biosciences Fortessa上实施流式细胞术采集并使用FlowJo软件(TreeStar,Ashland,OR)和GraphPad Prism软件进行分析。
通过上调活化标志物CD25和CD69,图6显示5F11-TCB在与NCI-H929细胞的共培养物中诱导T细胞活化,而对照(例如非靶向性DP47-TCB和没有任何TCB)不诱导T细胞活化。作为另一种阴性对照,将5F11-TCB处理的T细胞与WSU-DLCL2细胞共培养,其中T细胞也没有活化。这些活化概况在我们研究的多种细胞系间是一致的,例如AMO-1,NCI-H929,RPMI-8226,L363(图7A-J)。与较差的杀伤效力一致,ET150-5-TCB不诱导T细胞活化,除了在最高测试浓度1mg/kg。
实施例6:抗GPRC5D-TCB的定位和内在化
将NCI-H929细胞用CMFDA(Invitrogen)染色并接种到24孔板中聚L-赖氨酸(Sigma)包被的圆形盖片上。将抗体(5E11-IgG,5E11-TCB,5F11-IgG,5F11-TCB)用AlexaFluor 647琥珀酰亚胺基酯(InVitrogen,目录号A201106)以2.5的摩尔比标记。容许细胞于37℃贴壁过夜,之后将带荧光标签的抗体(Alexa Fluor 647标记的5E11-IgG,-5E11-TCB,-5F11-IgG,-5F11-TCB)直接添加到生长培养基中于不同温度达不同持续时间(在冰上30分钟,于37℃1小时和于37℃3小时)。在每个时间点后使用冷的PBS(Lonza)来淬灭反应和清洗掉未结合的抗体。然后将细胞用Cytofix(BD)于4℃固定20分钟并用PBS清洗两次。然后转移盖片并用Fluoromount G(eBioscience)封固在载玻片上并在黑暗中于4℃保持过夜,之后成像。用来自Zeiss的带有60倍油物镜的倒置LSM 700实施荧光共焦显微术。使用与显微镜偶联的Zen软件(Zeiss)收集图像并在IMARIS软件(Bitplane)上显现。图8A显示所有抗体于4℃或37℃使多发性骨髓瘤细胞系的表面(质膜)染色。如果抗体被细胞内在化,那么当于37℃培养时胞质中会出现荧光染色。没有观察到GPRC5D+细胞系对GPRC5D结合性IgG或GPRC5D结合性TCB的内在化。通过应用来自细胞的感兴趣膜和胞质限定区的强度和(3小时时)得到进一步确认。使用IMARIS软件进行膜对胞质信号比的分析和量化。图8B指示与不同抗体一起温育后3小时,膜对胞质强度比不变,为约4,意味着荧光信号集中在表面,而非在胞质中。
实施例7:通过ELISA表征GPRC5D结合物:重组细胞结合
使用表达人GPRC5D或食蟹猴GPRC5D或鼠GPRC5D或人GPRC5A的稳定转染CHO克隆来分析作为IgG的潜在前导候选抗体的结合。详细地说,使用新鲜培养培养基将104个细胞(存活力≥98％)接种入384孔微量滴定板(BD Poly D-Lysin,#356662,体积:25μl/孔)。于37℃温育过夜后,将25μl/孔抗体稀释液(在1xPBS中15次1:3稀释液,测定浓度始于30μg/ml)添加至细胞于4℃达2小时。使用90μl/孔PBST(10xPBS,Roche,#11666789001+0,1％Tween 20)的一个清洗步骤后,随后通过添加50μl/孔0.05％戊二醛(Sigma目录号:G5882,在1xPBS中)于室温(RT)达10分钟来固定细胞。另外三个使用90μl/孔PBST的清洗步骤后,添加二抗进行检测:对于人抗体,使用在封闭缓冲液(1xPBS(Roche#11666789001)+2％BSA(牛血清清蛋白级分V,无脂肪酸,Roche,#10735086001)+0.05％Tween 20)中1:2000稀释的山羊抗人Igκ链抗体HRP缀合物(Millipore#AP502P)(25μl/孔)。对于大鼠抗体,以每种抗体在封闭缓冲液中的1:10000稀释液使用HRP缀合的山羊抗大鼠IgG1抗体(Bethyl#A110-106P),HRP缀合的山羊抗大鼠IgG2a抗体(Bethyl#A110-109P)和HRP缀合的山羊抗大鼠IgG2b抗体(Bethyl#A110-111P)的混合物(25μl/孔)。于室温温育1小时和另外三个使用90μl/孔PBST的清洗步骤后,添加25μl/孔TMB底物(Roche订购号11835033001)达10分钟并通过370nm/492nm处的测量测定最终OD的显色。
所有测试抗体显示阳性的对人GPRC5D的结合,EC50值(反映亲合力)在pM范围中。只有大鼠IgG 10B10和07A04对表达食蟹猴GPRC5D的CHO细胞显示交叉反应性,EC50值与人型式的受体相当(图9)。还对所有其它抗体检测食蟹猴交叉反应性,但是在与10B10和07A04相比更低的水平(图9)。没有检测到对表达鼠GPRC5D的CHO细胞的显著结合和对表达人型式的GPRC5A的CHO细胞的结合(图9)。结合的EC50值在表2中汇总。
表2:物种间对GPRC5D的基于ELISA的结合特性
实施例8:GPRC5D结合物--重组GPRC5D-TCB介导对MM细胞系的T细胞细胞毒性
为了比较GPRC5D-TCB或其它靶向性TCB的功能性,我们对多种MM细胞系实施体外T细胞细胞毒性测定法:MOLP-2(图10B),AMO-1(图10C),EJM(图10D)和NCI-H929(图10G)。简言之,在补充有20％热灭活胎牛血清(FBS；Gibco)和1％青霉素-链霉素100X(PS；Gibco)的RPMI 1640+Glutamax培养基(Gibco)中培养细胞系。用补充有GlutaMax 1X(Gibco)的这种培养基培养MOLP-2。用仅仅补充有10％FBS的这种培养基培养OPM-2(图10A),RPMI-8226(图10E)和L-363(图10F)细胞系。用补充有50μM巯基乙醇(Gibco),1mM丙酮酸钠(Gibco)和GlutaMax 1X(Gibco)的这种培养基培养NCI-H929。在IMDM(Gibco)+10％FBS(Gibco)和1％PS(Gibco)中培养EJM。在75cm2烧瓶(TPP)中培养所有细胞系,每周两代。
在补充有10％FBS(Gibco)+1％PS(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中以10对1的效应对靶比共培养细胞系,使用0.3x106个使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)自PBMC(来自Blutspende Schlieren的血沉棕黄层)分离的同种异基因T细胞。以不同浓度将抗人GPRC5D TCB构建物(5E11-TCB,5F11-TCB,10B10-TCB,B72-TCB,BCMA-TCB和DP47-TCB)添加至共培养物,12.5nM至0.0000125nM,1/10连续稀释,并与未处理样品比较。以5％CO2于37℃温育20小时后,将75μl上清液每孔转移入装有25μl每孔CytoTox-Glo细胞毒性测定法(Promega)的96孔白色板(Greiner bio-one)。于室温温育15分钟后在PerkinElmerEnVision上实施发光采集并使用GraphPad Prism和XL fit软件进行分析。作为LDH释放的发光信号将数据绘图(图10)。图10A-G汇总显示5E11-TCB和5F11-TCB均对MM细胞系介导比BCMA-TCB,10B10-TCB和B72-TCB更强的T细胞细胞毒性的数据。TCB介导的杀伤的EC50显示于表3,而且是作为来自使用不同供体T细胞的不同实验的平均值(n＝2或n＝3)计算的。
表3:体外杀伤测定法的EC50值
实施例9:健康人骨髓细胞中的体外T细胞活化
采样后1或2天加工四名不同健康供体的新鲜未加工骨髓(Lonza#1M-105,批次0000739254；0000739255；0000739256和0000734008)。于室温使用BD Pharm裂解缓冲液(BD#555899；1X,在无菌水中)5分钟的快速红血球裂解后,通过分别以126g和443g的离心和缓冲液交换将细胞清洗2次。对细胞计数并在RPMI 1640Glutamax+20％热灭活胎牛血清+2％人血清+1％青霉素/链霉素(均来自Gibco)中以300,000个细胞/mL重悬浮并将100μL细胞悬浮液接种入96孔圆底板(TPP)中的每个孔。将50μL培养基或补充有B72-TCB,5F11-TCB,5E11-TCB,BCMA-TCB,10B10-TCB或DP47-TCB的培养基添加至每个孔,200nM(4X)至20pM,1/10连续稀释。最后,以6x106/mL(10:1的效应T对健康骨髓靶细胞比)添加50μL使用泛T细胞(Miltenyi Biotec,#130-096-535)自健康供体PBMC分离的同种异基因T细胞。在增湿温箱中于37℃温育过夜后,将细胞用PBS清洗一次并于4℃用50μL在PBS中1/800稀释的活蓝(Invitrogen,#L23105)染色20分钟。清洗后,将细胞与下面的在FACs缓冲液(PBS 1X,2％胎牛血清；1％0.5M EDTA pH 8；0.25％NaN3叠氮化钠(20％))中稀释的抗体的混合物一起于4℃温育30分钟:CD25 BV605,CD69APC-Cy7,BCMA BV421,CD38 BV510,CD138 FITC,FcRH5PE,1/100稀释的和CD8 BV711,CD3 PE-Cy5和CD4 AlexaFluor 700,1/300稀释的(均来自BioLegend)和GPRC5D AlexaFluor 647(内部的,克隆5E11 IgG)。清洗后,在100μL FACs缓冲液中重悬浮细胞并用Fortessa(BD Biosciences)采集。
图11A-F中呈现的数据图示B72-TCB在健康骨髓中诱导T细胞的非特异性活化(如通过CD69上调测量的),但是任何其它测试TCB不然。如指示的,由B72-TCB诱导的非特异性活化是一种浓度依赖性效应,在50nm比在5nm更加突出(图12A和12B)。
实施例10:TCB的体内功效
在功效研究中,就携带多发性骨髓瘤的完全人源化NSG小鼠中的肿瘤消退而言比较不同TCB构建物(GPRC5D 5F110-TCB,5E11-TCB,BCMA-TCB和B72-TCB)。NCI-H929细胞最初自ATCC获得而OPM-2细胞最初自DSMZ获得。扩充这两种细胞系。在含有10％FCS和2mM L-谷氨酰胺,10mM HEPES,1mM丙酮酸钠的RPMI中培养细胞。于37℃在5％CO2的水饱和气氛中培养细胞。在RPMI细胞培养培养基(Gibco)和GFR Matrigel(1:1,总体积100μl)中将2.5x106个NCI-H929和5x106个OPM-2细胞每只动物皮下注射入动物的右体侧,存活力>95.0％。
依照承诺的指导方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小时光照/12小时黑暗的日周期在无特定病原体的条件下维持实验开始时4-5周龄的雌性NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠(Charles River,Lyon,France)。实验性研究方案得到当地政府的审查和批准(ROB-55.2-2532.Vet_03-16-10)。到达后,将动物维持一周以适应新环境和进行观察。定期进行连续健康监测。
依照方案,对雌性NSG小鼠i.p.(腹膜内)注射15mg/kg白消安,继以一天后i.v.注射1x105个自脐带血分离的人造血干细胞。在干细胞注射后第16-20周,对小鼠采血并通过流式细胞术对血液分析成功的人源化。依照它们的人T细胞频率将实现有效植入的小鼠随机化入不同治疗组(n＝10/组)。彼时,如上文所述对小鼠皮下注射肿瘤细胞并当肿瘤尺寸达到大约200mm3时用化合物或PBS(媒介)一周一次处理。对所有小鼠静脉内注射不同剂量的TCB分子(见图13A-D和14A-D)。
为了获得适宜量的化合物,用组氨酸缓冲液(20mM组氨酸,140mM NaCl,pH 6.0)稀释储备溶液。一周两次使用测径器测量肿瘤生长并如下计算肿瘤体积:
Tv:(W2/2)x L(W:宽度,L:长度)
四次注射化合物后终止研究并处死所有小鼠并将肿瘤外植和称重。
图13A-D显示处理后接受NCl-H929注射的所有动物中的肿瘤生长动力学。5F11-TCB在1mg/kg或0.1mg/kg时在所有动物中诱导完全肿瘤消退(图13A),而B72-TCB在以1mg/kg使用时仅仅诱导部分肿瘤消退,在0.1mg/kg时没有效果(图13C)。BCMA-TCB也在1mg/kg时诱导部分肿瘤消退(图13B)。
图14A-D显示处理后接受OPM-2注射的所有动物中的肿瘤生长动力学。5F11-TCB(图14A,顶部小图)和5E11-TCB(图14B,顶部小图)在0.1mg/kg时在大多数动物中诱导完全肿瘤消退而B72-TCB(图14C,顶部小图)在0.1mg/kg时在控制肿瘤生长方面不太有力。在0.01mg/kg时5F11-TCB(图14A,底部小图)和5E11-TCB(图14B,底部小图)在抑制肿瘤生长方面与B72-TCB(图14C,底部小图)相比更加有力。
实施例11:抗GPRC5D抗体的人源化
通过对人V和J区序列的BLASTp数据库查询鼠输入序列(裁剪至可变部分)来鉴定合适的人受体框架。选择人受体框架的选择标准是序列同源性,相同或相似的CDR长度,和人种系的估算频率,还有VH-VL域界面处的某些氨基酸的保守性。种系鉴定步骤后,将鼠输入序列的CDR嫁接到人受体框架区上。对这些初始CDR嫁接物和亲本抗体之间的每处氨基酸差异评估对各自可变区的结构完整性的可能影响,并在认为适宜时引入朝向亲本序列的“回复突变”。结构评估基于用使用BIOVIA Discovery Studio Environment,17R2版执行的内部抗体结构同源性建模方案创建的亲本抗体和人源化变体二者的Fv区同源性模型。在一些人源化变体中,包括“正向突变”,即将亲本结合物的给定CDR位置处存在的原始氨基酸变成在人受体种系的等同位置处发现的氨基酸的氨基酸交换。目的是增加人源化变体的总体人特征(超出框架区)以进一步降低免疫原性风险。
使用内部开发的计算机方案来预测配对VH和VL人源化变体的VH-VL域取向(如WO2016/062734A1,通过援引将其完整收录)。比较结果以预测亲本结合物的VH-VL域取向来选择在几何上接近原始抗体的框架组合。原理是检测VH-VL界面区中可能导致两个域的配对的破坏性变化,继而可能对结合特性具有有害影响的可能氨基酸交换。
GPRC5D结合物5E11的受体框架的选择和其调适
依照下面的表4选择受体框架。
表4:GPRC5D结合物5E11的受体框架
CDR3后框架区调适自人IGHJ种系IGHJ3*02(DAFDIWGQGTMVTVSS)和人IGKJ种系IGKJ5*01(ITFGQGTRLEIK)。受体框架相关的部分以粗体指示。
基于结构考虑,在5E11人源化变体的某些位置引入人受体框架变成亲本结合物中的氨基酸的回复突变(表5和6)。而且,一些位置鉴定为正向突变的有希望候选,其中亲本结合物的CDR中的氨基酸用在人受体种系中找到的氨基酸替代。变化详述于下表。
注意:回复突变的前缀为b,正向突变的前缀为f,例如,bS49A指位置49处丝氨酸变成丙氨酸的回复突变(人种系氨基酸变成亲本抗体氨基酸)。所有残基索引以Kabat编号方式给出。
表5:VH/VL 5E11人源化变体的列表
表6:VH/VL 5E11人源化变体的序列
GPRC5D结合物5F11的受体框架的选择和其调适
依照下面的表7选择受体框架。
表7:GPRC5D结合物5F11的受体框架
CDR3后框架区调适自人IGHJ种系IGHJ3*02(DAFDIWGQGTMVTVSS)和人IGKJ种系IGKJ2*01(YTFGQGTKLEIK)。受体框架相关的部分以粗体指示。
基于结构考虑,在5F11人源化变体的某些位置处引入人受体框架变成亲本结合物中的氨基酸的回复突变(表8和9)。而且,一些位置鉴定为正向突变的有希望候选,其中亲本结合物的CDR中的氨基酸用在人受体种系中找到的氨基酸替代。变化详述于下表。
注意:回复突变的前缀为b,正向突变的前缀为f,例如,bA93T指位置93处丙氨酸变成苏氨酸的回复突变(人种系氨基酸变成亲本抗体氨基酸)。所有残基索引以Kabat编号方式给出。
表8:VH/VL 5F11人源化变体的列表
表9:VH/VL 5F11人源化变体的序列
通过ELISA表征人源化变体
为了表征GPRC5D结合物的VH和VL域的人源化变体,使用如上文描述的ELISA方案(见实施例7)。5E11的人源化变体的数据汇总于表10,5F11的人源化变体的数据汇总于表11。表12显示亲本5E11和亲本5F11和选定人源化变体的CDR序列。
表10:5E11的人源化变体的表征
表10:续
表11:5F11的人源化变体的表征
表11:续
表12:人源化变体选集的CDR序列
实施例12:在选定抗GPRC5D IgG的不同人源化变体存在下CAR-J细胞的体外活化
如下所述评估不同人源化抗GPRC5D IgG活化PGLALA-CAR-J效应细胞的能力。将GPRC5D表达性多发性骨髓瘤靶细胞L363(Diehl et al.,Blut 36:331-338(1978))与抗PGLALA-CAR-J效应细胞(表达针对IgG分子的Fc部分中的PGLALA(P329G L234A L235A)突变的TCR且含有NFAT启动子的Jurkat-NFAT人急性淋巴细胞性白血病报告细胞系,如公开于PCT申请号PCT/EP2018/086038和PCT申请号PCT/EP2018/086067)共培养。在IgG分子对L363细胞上的GPRC5D和PGLALA-CAR-J细胞的同时结合后,NFAT启动子活化并导致活性萤火虫萤光素酶表达。
对于测定法,将人源化IgG变体在RPMI 1640培养基(含有Glutamax,15％热灭活胎牛血清,1％青霉素-链霉素；均来自GIBCO)中稀释并转移入圆底96孔板(终浓度范围0.2pg/ml直至10μg/ml)。添加20,000个L363细胞每孔和抗PGLALA-CAR-J效应细胞以获得5:1的最终效应(抗PGLALA-CAR-J)对靶(L363)细胞比和200μl每孔的最终体积。将细胞在增湿温箱中于37℃温育大致16小时。温育时间结束时,将100μl/孔上清液转移至白色平底96孔板(Costar)并与另一个100μl/孔ONE-Glo萤光素酶底物(Promega)一起温育5分钟,之后使用PerkinElmer Envision读取发光。使用GraphPad Prism作为相对发光信号(RLU)将原始数据针对IgG浓度绘图并使用XL-fit软件计算EC50。
如图15A-B和表13中所示,所有评估GPRC5D IgG均在同时结合GPRC5D表达性靶细胞和抗PGLALA-CAR-J细胞后诱导CAR-J活化。对于抗GPRC5D结合物5F11和5E11二者,能鉴定出具有与人源化前亲本抗体相比相似或甚至改善的EC50值的人源化变体。对于结合物5F11,分子P1AE5741能诱导最强活化(图15A)。对于结合物5E11,分子P1AE5730和P1AE5723能诱导最强活化(图15B)。
表13:CAR-J活化的EC50值
***
尽管为了理解清楚的目的已经通过举例说明较为详细地描述了前述发明,但是该描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提述明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 结合GPRC5D的抗体
<130> P34553
<160> 97
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 1
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<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 2
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<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 3
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 4
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1 5 10
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<211> 7
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
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<213> 人工序列
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<400> 13
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20 25 30
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Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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<220>
<223> 合成构建物
<400> 14
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20 25 30
Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Thr Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro
65 70 75 80
Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg Glu
85 90 95
Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Leu Ser Val Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr His Cys Gly Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 17
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly
20 25 30
Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Thr Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro
65 70 75 80
Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg Glu
85 90 95
Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 18
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 18
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 19
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 19
Glu Leu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
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420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 20
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 20
Glu Leu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser
225 230 235 240
Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser
245 250 255
Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys
260 265 270
Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala
275 280 285
Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala
290 295 300
Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr
305 310 315 320
Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
325 330 335
Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
340 345 350
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
355 360 365
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
370 375 380
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
385 390 395 400
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
405 410 415
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
420 425 430
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
435 440 445
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
450 455 460
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
465 470 475 480
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
485 490 495
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
500 505 510
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
515 520 525
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
530 535 540
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
545 550 555 560
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
565 570 575
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
580 585 590
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
595 600 605
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
610 615 620
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
625 630 635 640
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
645 650 655
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 21
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Leu Ser Val Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr His Cys Gly Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg
115 120 125
Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 22
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 23
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 24
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu
225 230 235 240
Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr
245 250 255
Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro
260 265 270
Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
275 280 285
Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala
290 295 300
Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys
305 310 315 320
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
325 330 335
Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
340 345 350
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
355 360 365
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
370 375 380
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
385 390 395 400
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
405 410 415
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
420 425 430
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
435 440 445
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
450 455 460
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
465 470 475 480
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
485 490 495
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
500 505 510
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
515 520 525
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
530 535 540
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
545 550 555 560
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
565 570 575
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
580 585 590
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
595 600 605
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
610 615 620
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
625 630 635 640
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
645 650 655
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 25
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 25
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Val Gly Gly Asn
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Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ala Thr Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Ser Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala
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Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Phe Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Lys Lys
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 26
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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35 40 45
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50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 27
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Tyr Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 28
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Tyr Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser
225 230 235 240
Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser
245 250 255
Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys
260 265 270
Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala
275 280 285
Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala
290 295 300
Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr
305 310 315 320
Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
325 330 335
Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
340 345 350
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
355 360 365
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
370 375 380
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
385 390 395 400
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
405 410 415
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
420 425 430
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
435 440 445
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
450 455 460
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
465 470 475 480
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
485 490 495
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
500 505 510
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
515 520 525
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
530 535 540
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
545 550 555 560
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
565 570 575
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
580 585 590
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
595 600 605
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
610 615 620
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
625 630 635 640
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
645 650 655
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 29
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 30
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 31
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 32
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 33
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 34
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 35
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 35
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 36
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 36
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 37
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 38
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 38
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 39
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 39
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 40
<211> 207
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 40
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 41
<211> 198
<212> PRT
<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）
<400> 41
Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys
50 55 60
Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu
65 70 75 80
Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro
85 90 95
Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn
100 105 110
Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp
115 120 125
Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys
130 135 140
Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn
165 170 175
Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly
180 185 190
Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195
<210> 42
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 42
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 44
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 345
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 45
Met Tyr Lys Asp Cys Ile Glu Ser Thr Gly Asp Tyr Phe Leu Leu Cys
1 5 10 15
Asp Ala Glu Gly Pro Trp Gly Ile Ile Leu Glu Ser Leu Ala Ile Leu
20 25 30
Gly Ile Val Val Thr Ile Leu Leu Leu Leu Ala Phe Leu Phe Leu Met
35 40 45
Arg Lys Ile Gln Asp Cys Ser Gln Trp Asn Val Leu Pro Thr Gln Leu
50 55 60
Leu Phe Leu Leu Ser Val Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Phe Ala Phe
65 70 75 80
Ile Ile Glu Leu Asn Gln Gln Thr Ala Pro Val Arg Tyr Phe Leu Phe
85 90 95
Gly Val Leu Phe Ala Leu Cys Phe Ser Cys Leu Leu Ala His Ala Ser
100 105 110
Asn Leu Val Lys Leu Val Arg Gly Cys Val Ser Phe Ser Trp Thr Thr
115 120 125
Ile Leu Cys Ile Ala Ile Gly Cys Ser Leu Leu Gln Ile Ile Ile Ala
130 135 140
Thr Glu Tyr Val Thr Leu Ile Met Thr Arg Gly Met Met Phe Val Asn
145 150 155 160
Met Thr Pro Cys Gln Leu Asn Val Asp Phe Val Val Leu Leu Val Tyr
165 170 175
Val Leu Phe Leu Met Ala Leu Thr Phe Phe Val Ser Lys Ala Thr Phe
180 185 190
Cys Gly Pro Cys Glu Asn Trp Lys Gln His Gly Arg Leu Ile Phe Ile
195 200 205
Thr Val Leu Phe Ser Ile Ile Ile Trp Val Val Trp Ile Ser Met Leu
210 215 220
Leu Arg Gly Asn Pro Gln Phe Gln Arg Gln Pro Gln Trp Asp Asp Pro
225 230 235 240
Val Val Cys Ile Ala Leu Val Thr Asn Ala Trp Val Phe Leu Leu Leu
245 250 255
Tyr Ile Val Pro Glu Leu Cys Ile Leu Tyr Arg Ser Cys Arg Gln Glu
260 265 270
Cys Pro Leu Gln Gly Asn Ala Cys Pro Val Thr Ala Tyr Gln His Ser
275 280 285
Phe Gln Val Glu Asn Gln Glu Leu Ser Arg Ala Arg Asp Ser Asp Gly
290 295 300
Ala Glu Glu Asp Val Ala Leu Thr Ser Tyr Gly Thr Pro Ile Gln Pro
305 310 315 320
Gln Thr Val Asp Pro Thr Gln Glu Cys Phe Ile Pro Gln Ala Lys Leu
325 330 335
Ser Pro Gln Gln Asp Ala Gly Gly Val
340 345
<210> 46
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 46
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 47
Glu Leu Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 48
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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<223> 合成构建物
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<223> 合成构建物
<400> 66
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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<220>
<223> 合成构建物
<400> 67
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Tyr
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65 70 75 80
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100 105 110
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165 170 175
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195 200 205
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210
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 68
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
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Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
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Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
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Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Trp Val
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Ala Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
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195 200 205
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
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Ser Pro Gly Lys
450
<210> 70
<211> 677
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe
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100 105 110
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115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
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Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
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Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
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Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
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Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val
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Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
245 250 255
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Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly
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Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
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Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp
305 310 315 320
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe
325 330 335
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
340 345 350
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
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Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
450 455 460
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
465 470 475 480
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
485 490 495
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
500 505 510
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
515 520 525
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
530 535 540
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala
545 550 555 560
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
565 570 575
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
580 585 590
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
595 600 605
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
610 615 620
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
625 630 635 640
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
645 650 655
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
660 665 670
Leu Ser Pro Gly Lys
675
<210> 71
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 71
Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Tyr Asn Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 72
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 72
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser His
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Asn Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Ala
65 70 75 80
Phe Leu Lys Val Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val His Thr Arg Gly Ile Ile Arg Gly Arg Gly Leu Phe Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 73
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 73
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
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115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
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225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
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385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 74
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
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Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
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165 170 175
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195 200 205
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Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 75
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 75
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
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Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Ser Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
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275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 76
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 76
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Ala Thr His
20 25 30
Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 77
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 77
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
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260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
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385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 78
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 78
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Tyr
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
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Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser
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Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 79
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 79
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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130 135 140
Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
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Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
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195 200 205
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Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr
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Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly
245 250 255
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260 265 270
Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly
275 280 285
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290 295 300
Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala
305 310 315 320
Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
325 330 335
Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
340 345 350
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
355 360 365
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
370 375 380
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
385 390 395 400
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
405 410 415
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
565 570 575
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
580 585 590
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
595 600 605
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
610 615 620
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
625 630 635 640
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
645 650 655
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 80
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 80
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 81
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 81
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Asn Met Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 82
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Leu Thr Tyr Tyr Gly Arg Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 83
Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Ala Met Ala
1 5 10
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 84
Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Ala
<210> 85
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 85
Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 86
His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 87
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 87
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly Ile Asn Leu Met Asn
1 5 10 15
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 88
His Ala Ser Ile Leu Ala Ser
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 89
Gln Gln Thr Arg Glu Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 90
Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ala
1 5 10
<210> 91
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 91
Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 92
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 92
Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 93
His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr
1 5
<210> 94
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 94
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr
1 5 10 15
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 95
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
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<211> 7
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<220>
<223> 合成构建物
<400> 96
Arg Met Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 97
Gly Gln Leu Leu Glu Asn Pro Tyr Thr
1 5
Claims (42)
1.一种结合GPRC5D的抗体,其中该抗体包含
(i)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:84的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；
(ii)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:85的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；
(iii)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
(iv)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；或
(v)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:92的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3。
2.权利要求1的抗体,
(i)其中该VH包含与SEQ ID NO:13的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或
(ii)其中该VH包含与SEQ ID NO:15的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或
(iii)其中该VH包含与SEQ ID NO:48的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或
(iv)其中该VH包含与SEQ ID NO:49的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或
(v)其中该VH包含与SEQ ID NO:57的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或
(vi)其中该VH包含与SEQ ID NO:58的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该VL包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的抗体,其中该抗体是IgG抗体。
4.权利要求3的抗体,其中该抗体是IgG抗体。
5.权利要求1至4任一项的抗体,其中该抗体是全长抗体。
6.权利要求1至4任一项的抗体,其中该抗体是选自Fv分子,scFv分子,Fab分子,和F(ab')2分子的组的抗体片段。
7.权利要求1至6任一项的抗体,其中该抗体是多特异性抗体。
8.一种双特异性抗原结合分子,其包含
(a)结合第一抗原的第一抗原结合模块,
其中该第一抗原是GPRC5D且该第一抗原结合模块包含
(i)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:84的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR 3,轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；
(ii)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:83的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:85的HCDR 2,和SEQ ID NO:86的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:87的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:88的LCDR 2和SEQ ID NO:89的LCDR 3；
(iii)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；
(iv)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:91的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:96的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；或
(v)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:90的重链互补决定区(HCDR)1,SEQ ID NO:92的HCDR 2,和SEQ ID NO:93的HCDR 3,该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:94的轻链互补决定区(LCDR)1,SEQ ID NO:95的LCDR 2和SEQ ID NO:97的LCDR 3；和
(b)特异性结合第二抗原的第二抗原结合模块。
9.权利要求8的双特异性抗原结合分子,
(i)其中该第一抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:13的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且其中该第一抗原结合模块的VL包含与SEQID NO:14的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或
(ii)其中该第一抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:15的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且其中该第一抗原结合模块的VL包含与SEQID NO:16的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或
(iii)其中该第一抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:48的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且其中该第一抗原结合模块的VL包含与SEQID NO:53的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或
(iv)其中该第一抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:49的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且其中该第一抗原结合模块的VL包含与SEQID NO:52的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或
(v)其中该第一抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:57的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且其中该第一抗原结合模块的VL包含与SEQID NO:64的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列；或
(vi)其中该第一抗原结合模块的VH包含与SEQ ID NO:58的序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且其中该第一抗原结合模块的VL包含与SEQID NO:63的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。
10.权利要求8或9的双特异性抗原结合分子,其中该第二抗原是CD3。
11.权利要求10的双特异性抗原结合分子,其中该第二抗原是CD3ε。
12.权利要求10或11的双特异性抗原结合分子,其中该第二抗原结合模块包含VH和VL,该VH包含SEQ ID NO:29的HCDR 1,SEQ ID NO:30的HCDR 2,和SEQ ID NO:31的HCDR 3,该VL包含SEQ ID NO:32的LCDR 1,SEQ ID NO:33的LCDR 2和SEQ ID NO:34的LCDR 3。
13.权利要求12的双特异性抗原结合分子,其中该第二抗原结合模块的VH包含与SEQID NO:35的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,且该第二抗原结合模块的VL包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。
14.权利要求8至13任一项的双特异性抗原结合分子,其中该第一和/或该第二抗原结合模块是Fab分子。
15.权利要求8至14任一项的双特异性抗原结合分子,其中该第二抗原结合模块是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1,特别是可变域VL和VH是彼此替换的。
16.权利要求8至15任一项的双特异性抗原结合分子,其中该第一抗原结合模块是Fab分子其中在恒定域中位置124处的氨基酸是用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代的(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸是用赖氨酸(K),精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代的(编号方式依照Kabat),且在恒定域CH1中位置147处的氨基酸是用谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立替代的(编号方式依照Kabat EU索引)且位置213处的氨基酸是用谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立替代的(编号方式依照Kabat EU索引)。
17.权利要求8至16任一项的双特异性抗原结合分子,其中该第一和该第二抗原结合模块是彼此融合的,任选经由肽接头。
18.权利要求8至17任一项的双特异性抗原结合分子,其中该第一和该第二抗原结合模块每个是Fab分子且其中或是(i)该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端,或是(ii)该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合模块的Fab重链的N端。
19.权利要求8至18任一项的双特异性抗原结合分子,其包含第三抗原结合模块。
20.权利要求19的双特异性抗原结合分子,其中该第三抗原模块与该第一抗原结合模块相同。
21.权利要求8至20任一项的双特异性抗原结合分子,其包含由第一和第二亚基构成的Fc域。
22.权利要求21的双特异性抗原结合分子,其中该第一,该第二和,在存在时,该第三抗原结合模块每个是Fab分子；
且其中或是(i)该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合模块的Fab重链的N端且该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端,或是(ii)该第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合模块的Fab重链的N端且该第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端；
且其中该第三抗原结合模块,在存在时,在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。
23.权利要求21或22的双特异性抗原结合分子,其中该Fc域是IgG Fc域。
24.权利要求23的双特异性抗原结合分子,其中该Fc域是IgG1 Fc域。
25.权利要求21至24任一项的双特异性抗原结合分子,其中该Fc域是人Fc域。
26.权利要求21至25任一项的双特异性抗原结合分子,其中该Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换,由此生成该第一亚基的CH3域内的隆起,其可放置在该第二亚基的CH3域内的空腔中,且该Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换,由此生成该第二亚基的CH3域内的空腔,其内可放置该第一亚基的CH3域内的隆起。
27.权利要求21至26任一项的双特异性抗原结合分子,其中该Fc域包含降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的一处或多处氨基酸替代。
28.一种或多种分离的多核苷酸,其编码权利要求1至27任一项的抗体或双特异性抗原结合分子。
29.一种或多种载体,特别是表达载体,其包含权利要求28的一种或多种多核苷酸。
30.一种宿主细胞,其包含权利要求28的一种或多种多核苷酸或权利要求29的一种或多种载体。
31.一种生成结合GPRC5D的抗体的方法,其包含下述步骤:a)在适合于该抗体表达的条件下培养权利要求30的宿主细胞和b)任选回收该抗体。
32.一种结合GPRC5D的抗体,其是通过权利要求31的方法生成的。
33.一种药学组合物,其包含权利要求1至27或32任一项的抗体或双特异性抗原结合分子和药学可接受载剂。
34.权利要求1至27或32任一项的抗体或双特异性抗原结合分子或权利要求33的药学组合物,其供作为药物使用。
35.权利要求1至27或32任一项的抗体或双特异性抗原结合分子或权利要求33的药学组合物,其供疾病的治疗中使用。
36.权利要求35的抗体,双特异性抗原结合分子或药学组合物,其中该疾病是癌症或自身免疫疾病。
37.权利要求35的抗体,双特异性抗原结合分子或药学组合物,其中该疾病是多发性骨髓瘤。
38.权利要求1至27或32任一项的抗体或双特异性抗原结合分子在制造用于治疗疾病的药物中的用途。
39.一种治疗个体中的疾病的方法,其包含对所述个体施用治疗有效量的包含药学可接受形式的权利要求1至27或32任一项的抗体或双特异性抗原结合分子的组合物。
40.权利要求38的用途或权利要求39的方法,其中所述疾病是癌症或自身免疫疾病。
41.权利要求38的用途或权利要求39的方法,其中所述疾病是多发性骨髓瘤。
42.如说明书中描述的发明。
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