TW201936641A - 結合gprc5d之抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明大體上係關於結合GPRC5D之抗體，包括(例如)針對活化T細胞的雙特異性抗原結合分子。此外，本發明係關於編碼此等抗體之聚核苷酸及包含此等聚核苷酸之載體及宿主細胞。本發明進一步關於製備該等抗體之方法、及使用其等治療疾病之方法。

Description

結合GPRC5D之抗體
本發明大體上係關於結合GPRC5D之抗體，包括(例如)針對活化T細胞之雙特異性抗原結合分子。另外，本發明係關於編碼此類抗體之聚核苷酸、及包含此類聚核苷酸之載體及宿主細胞。本發明還關於用於製備該等抗體之方法，及關於將其等用於治療疾病之方法。
在歐盟及美國，每年影響~75,000例新病患，多發性骨髓瘤(MM)係最常見血液性惡性病中的一種，其保持高度未滿足的醫療需求。多發性骨髓瘤之特徵在於末端分化之漿細胞，其分泌非功能性單株免疫球蛋白。在短期內，免疫調節藥物(諸如來那度胺(lenalidomide)及泊馬度胺(pomalidomide))及蛋白酶體抑制劑(諸如卡非佐米(carfilzomib)或硼替佐米(bortezomib))可能仍然係多發性骨髓瘤之第1線療法的支柱 (Moreau, P.及S.V. Rajkumar，multiple myeloma-translation of trial results into reality. Lancet，2016. 388(10040): 第111-3頁)。然而，此等藥物並不特異性靶向患病腫瘤細胞，例如患病漿細胞(PC)。已努力選擇性地耗盡多發性骨髓瘤中的漿細胞。缺乏特異性標記漿細胞之表面蛋白質阻礙多發性骨髓瘤之抗體或細胞療法之開發。迄今，以諸如(例如)達雷木單抗(daratumumab) (抗-CD38)及埃羅妥珠單抗(elotuzumab) (抗CD319)為代表之成功的生物製劑類別很少，但需要注意的係此兩種分子不係由漿細胞獨特表現的。因此，使用RNA定序，諸如G蛋白偶聯受體C類5族成員D (GPRC5D)，來鑑定多發性骨髓瘤中來自漿細胞之新穎標靶。GPRC5D係藉由漿細胞在多發性骨髓瘤中表現之特異性表面蛋白。據報導，GPRC5D與多發性骨髓瘤患者之預後及腫瘤負載相關聯(Atamaniuk, J.等人，Overexpression of G protein-coupled receptor 5D in the bone marrow is associated with poor prognosis in patients with multiple myeloma. Eur J Clin Invest，2012. 42(9): 第953-60頁；及Cohen, Y.等人，GPRC5D is a promising marker for monitoring the tumor load and to target multiple myeloma cells. Hematology，2013. 18(6): 第348-51頁)。
GPRC5D係在人類及人類癌症中沒有已知配位體或功能之孤兒受體。定位於染色體12p13.3上的GPRC5D編碼基因含有三個外顯子並跨越約9.6 kb (Brauner-Osborne, H.等人，Cloning and characterization of a human orphan family C G-protein coupled receptor GPRC5D. Biochim Biophys Acta，2001. 1518(3): 第237-48頁)。大的第一外顯子編碼七個跨膜域。然而，GPRC5D之生物學在很大程度上係未知的。已顯示GPRC5D參與動物毛囊中角蛋白之形成(Gao, Y.等人，Comparative Transcriptome Analysis of Fetal Skin Reveals Key Genes Related to Hair Follicle Morphogenesis in Cashmere Goats. PLoS One，2016. 11(3)：第e0151118頁；及Inoue, S.、T. Nambu及T. Shimomura，The RAIG family member, GPRC5D, is associated with hard-keratinized structures. J Invest Dermatol，2004. 122(3)：第565-73頁)。
WO 2018/017786 A2揭示GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段。
仍需要額外藥物來治療癌症(特定言之多發性骨髓瘤)。用於此目的尤其有用的藥物包括結合GPRC5D之抗體，特定言之結合靶細胞上的GPRC5D及TCD上的活化T細胞抗原(諸如CD3)之雙特異性抗體。此種抗體同時結合其兩種靶標將迫使靶細胞與T細胞之間的臨時相互作用，引起任何細胞毒性T細胞之活化及靶細胞之隨後裂解。
本發明提供特異性結合人類GPRC5D之新穎抗體，包括雙特異性抗體。特定言之，靶向GPRC5D的根據本發明之T細胞雙特異性抗體具有治療多發性骨髓瘤的效力。
本發明人已開發具有意外改善之性質的結合GPRC5D之新穎抗體。此外，本發明人已開發結合GPRC5D及活化T細胞抗原之雙特異性抗原結合分子，其併入新穎GPRC5D抗體。
在第一態樣中，本發明提供結合GPRC5D之抗體，其中該抗體包含(i)包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 84之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO:87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；(ii)包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 85之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO:87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)，(iii)包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；(iv)包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 96之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；或(v)包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 92之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)。或者，該抗體可包含(I)包含SEQ ID NO:1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 2之HCDR 2及SEQ ID NO: 3之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 5之LCDR 2及SEQ ID NO: 6之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；或(II)包含SEQ ID NO: 7之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 8之HCDR 2及SEQ ID NO: 9之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 10之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 11之LCDR 2及SEQ ID NO: 12之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)。在一個實施例中，(i)該VH包含與SEQ ID NO:13之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 14之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或
(ii)該VH包含與SEQ ID NO: 15之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或(iii)該VH包含與SEQ ID NO: 48之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 53之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或(iv)該VH包含與SEQ ID NO: 49之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 52之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或(v)該VH包含與SEQ ID NO: 57之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或(vi)該VH包含與SEQ ID NO: 58之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 63至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。在另一個實施例中，(i)該VH包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，及該VL包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列；或(ii)該VH包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，及該VL包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列；或(iii)該VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，及該VL包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列；或(iv)該VH包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列，及該VL包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列；或(v)該VH包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列，及該VL包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列；或(vi)該VH包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列，及該VL包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列。在另一個實施例中，該抗體為IgG，特定言之IgG1抗體。在一個實施例中，該抗體為全長抗體。在另一個實施例中，該抗體為選自Fv分子、scFv分子、Fab分子及F(ab')2 分子之群之抗體片段。在一個實施例中，該抗體為多特異性抗體。
在另一個態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含(a)結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D且該第一抗原結合部分包含(i)包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 84之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；(ii)包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 85之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；(iii)包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；(iv)包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 96之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；或(v)包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 92之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)。或者，該第一抗原結合部分可包含(I)含有)SEQ ID NO: 1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 2之HCDR 2及SEQ ID NO: 3之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 5之LCDR 2及SEQ ID NO: 6之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；或(II)包含SEQ ID NO: 7之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 8之HCDR 2及SEQ ID NO: 9之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 10之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 11之LCDR 2及SEQ ID NO: 12之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；及(b)特異性結合第二抗原之第二抗原結合部分。在一個實施例中，(i)第一抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 13之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及第一抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO: 14之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或(ii)第一抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 15之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及第一抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或(iii)第一抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 48之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及第一抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO: 53之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或(iv)第一抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 49之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及第一抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO: 52之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或(v)第一抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 57之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及第一抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO: 64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或(vi)第一抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 58之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及第一抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO: 63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。在一個實施例中，(i)第一抗原結合部分之該VH包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，及第一抗原結合部分之該VL包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列；或(ii)第一抗原結合部分之該VH包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，及第一抗原結合部分之該VL包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列；或(iii)第一抗原結合部分之該VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，及第一抗原結合部分之該VL包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列；或(iv)第一抗原結合部分之該VH包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列，及第一抗原結合部分之該VL包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列；或(v)第一抗原結合部分之該VH包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列，及第一抗原結合部分之該VL包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列；或(vi)該第一抗原結合部分之該VH包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列，及第一抗原結合部分之該VL包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列。在另一個實施例中，該第二抗原為CD3，特定言之CD3ε。在一個實施例中，該第二抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 29之HCDR 1、SEQ ID NO: 30之HCDR 2及SEQ ID NO: 31之HCDR 3之VH及包含SEQ ID NO: 32之LCDR 1、SEQ ID NO: 33之LCDR 2及SEQ ID NO: 34之LCDR 3之VL。在另一個實施例中，第二抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 35之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及第二抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO: 36之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。在另一個實施例中，第二抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 35之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及第二抗原結合部分之該VL包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列。
在一個實施例中，該第一及/或第二抗原結合部分為Fab分子。此意指，該第一抗原結合部分可為Fab分子，或該第二抗原結合部分可為Fab分子，或該第一抗原結合部分及第二抗原結合部分可為Fab分子。在另一個實施例中，該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1，特別是可變域VL及VH彼此替換。在另一個實施例中，第一抗原結合部分為Fab分子，其中在恆定域中在位置124處的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)且在位置123處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，及在恆定域CH1中在位置147處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據在Kabat EU索引編號)且在位置213處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。在另一個實施例中，該第一及第二抗原結合部分視需要經肽連接子彼此融合。在另一個實施例中，該第一及第二抗原結合部分各為Fab分子且其中(i)該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與該第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，或(ii)該第一抗原結合部分在Fab重鏈的C端處與該第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。在另一個實施例中，雙特異性抗原結合分子包含第三抗原結合部分。在另一個實施例中，該第三抗原部分與該第一抗原結合部分相同。在另一個實施例中，雙特異性抗原結合分子包含由第一及第二亞單元所組成之Fc域。在另一個實施例中，該第一、第二及第三(若存在的話)抗原結合部分各為Fab分子；且其中(i)該第二抗原結合部分在Fab重鏈的C端處與該第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合且該第一抗原結合部分在Fab重鏈的C端處與Fc域之第一亞單元的N端融合，或(ii)該第一抗原結合部分在Fab重鏈的C端處與該第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合且該第二抗原結合部分在Fab重鏈的C端處與Fc域之第一亞單元的N端融合；且其中該第三抗原結合部分(若存在的話)在Fab重鏈的C端處與Fc域之第二亞單元的N端融合。在另一個實施例中，該Fc域為IgG，特定言之IgG1 ，Fc域。在又另一個實施例中，該Fc域為人類Fc域。在另一個實施例中，Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸殘基係經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，藉此在該第一亞單元之CH3域內產生突起，該突起可定位在第二亞單元之CH3域內的空腔中，且Fc域之該第二亞單元之CH3域中的胺基酸殘基係經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，藉此在該第二亞單元之CH3域內產生空腔，該第一亞單元之CH3域內的突起係可定位於該空腔中。在另一個實施例中，該Fc域包含降低結合Fc受體及/或效應功能之一或多處胺基酸取代。此意指，可減少結合Fc受體，或可減少效應功能，或可減少結合Fc受體及效應功能。
在另一個態樣中，本發明提供編碼如本文所述的抗體或雙特異性抗原結合分子之一或多種分離的聚核苷酸。在另一個態樣中，本發明提供一或多種載體，特定言之表現載體，其包含如本文所述的聚核苷酸。在另一個態樣中，本發明提供宿主細胞，其包含如本文所述的聚核苷酸或如本文所述的載體。在一些實施例中，該宿主細胞為真核細胞，特定言之哺乳動物細胞。
在本發明之另一個態樣中，提供產生結合GPRC5D之抗體之方法，該方法包括以下步驟：a)在適於表現抗體的條件下培養如本文所述的宿主細胞及b)視需要回收抗體。在另一個態樣中，本發明提供藉由如本文所述的方法產生的結合GPRC5D之抗體。本發明之另一個態樣係關於醫藥組合物，其包含如本文所述的抗體或雙特異性抗原結合分子及醫藥上可接受之載劑。本發明之另一個態樣係關於如本文所述的抗體或雙特異性抗原結合分子或如本文所述的醫藥組合物，其係用作藥物。本發明之另一個態樣係關於如本文所述的抗體或雙特異性抗原結合分子或如本文所述的醫藥組合物，其係用於治療疾病。在一個實施例中，該疾病為癌症，特定言之多發性骨髓瘤。或者，該疾病為自體免疫疾病，諸如全身性紅斑狼瘡及/或類風濕關節炎。
本發明進一步提供如本文所述的抗體或雙特異性抗原結合分子於製造用於治療疾病，特定言之癌症，更特定言之多發性骨髓瘤的藥物中之用途。或者，該疾病為自體免疫疾病，諸如全身性紅斑狼瘡及/或類風濕關節炎。
在另一個態樣中，本發明係關於治療個體之疾病，特定言之癌症，更特定言之多發性骨髓瘤之方法，該方法包括對該個體投與治療有效量之包含如本文所述的抗體或雙特異性抗原結合分子的呈醫藥上可接受之形式之組合物。或者，該疾病為自體免疫疾病，諸如全身性紅斑狼瘡及/或類風濕關節炎。在任何上述實施例中，該個體較佳為哺乳動物，特定言之人類。
定義
除非在下文中另外定義，否則本文所用的術語一般用於本技術中。
如本文所用，術語「抗原結合分子」在其最寬廣意義上係指特異性結合抗原決定子之分子。抗原結合分子之實例為免疫球蛋白及其衍生物(例如片段)。
術語「雙特異性」意指抗原結合分子能夠特異性結合少兩個不同的抗原決定子。通常，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合位點，該等抗原結合位點各對不同抗原決定子具有特異性。在某些實施例中，該雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩個抗原決定子，特定言之在兩種不同細胞上表現之兩個抗原決定子。
如本文所用術語「價數」表示抗原結合分子中存在指定數量之抗原結合位點。因此，術語「單價結合抗原」表示抗原結合分子中存在對抗原具有特異性之一個(且不超過一個)抗原結合位點。
「抗原結合位點」係指提供與抗原相互作用的抗原結合分子之位點，即一或多個胺基酸殘基。例如，抗體之抗原結合位點包含來自互補決定區(CDR)之胺基酸殘基。未處理之免疫球蛋白分子通常具有兩個抗原結合位點，Fab分子通常具有單個抗原結合位點。
如本文所用，術語「抗原結合部分」係指特異性結合抗原決定子之多肽分子。在一個實施例中，抗原結合部分能夠將其所附著的實體(例如第二抗原結合部分)導引至靶位點，例如導引至載有抗原決定子的特定類型之腫瘤細胞。在另一個實施例中，抗原結合部分能夠藉由其靶抗原(例如T細胞受體複合體抗原)活化信號傳導。抗原結合部分包括如本文進一步定義的抗體及其片段。特定抗原結合部分包括抗體之抗原結合域，其包含抗體重鏈可變區及抗體輕鏈可變區。在某些實施例中，抗原結合部分可包括如本文進一步定義及本技術中已知之抗體恆定區。可用之重鏈恆定區包括五種同型物中之任一者：α、δ、ε、γ或μ。可用之輕鏈恆定區包括兩種同型物中之任一者：κ及λ。
如本文所用，術語「抗原決定子」與「抗原」及「抗原決定基」同義，且係指抗原結合部分結合的多肽大分子上的形成抗原結合部分-抗原複合體之位點(例如，胺基酸之連續延伸或由非連續胺基酸之不同區域構成的構象構型)。例如，可用之抗原決定子可存在於腫瘤細胞之表面上、受病毒感染之細胞之表面上、其他患病細胞之表面上、免疫細胞的表面上，不存在於血清中，且/或存在於細胞外基質(ECM)中。本文稱為抗原的蛋白質(例如GPRC5D、CD3)可為源自任何脊椎動物(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類的靈長類動物(例如食蟹獼猴)及囓齒動物(例如小鼠及大鼠))之蛋白質之任何天然形式，除非另有說明。在特定實施例中，該抗原為人類蛋白質。在本文中提及特定蛋白質的情況下，該術語涵蓋「全長」、未處理之蛋白質及由在細胞中處理所產生之任何蛋白質形式。該術語亦涵蓋天然生成之蛋白質變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。適用作抗原之示例性人類蛋白質為CD3，特定言之CD3之ε亞單元(參見UniProt編號P07766(第185版)、NCBI RefSeq編號NP_000724.1，就人類序列而言，SEQ ID NO: 40；或UniProt編號Q95LI5 (第69版)、NCBI GenBank編號BAB71849.1，就食蟹獼猴序列而言，SEQ ID NO: 41)或GPRC5D (參見UniProt編號Q9NZD1 (第115版)；NCBI RefSeq編號NP_061124.1，就人類序列而言，SEQ ID NO: 45)。在某些實施例中，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子結合CD3或GPRC5D之抗原決定基，其在來自不同物種之CD3或GPRC5D抗原中係保守的。在特定實施例中，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子結合人類GPRC5D。
「特異性結合」意指結合對抗原具有選擇性且可區分出非所欲或非特定之相互作用。抗原結合部分結合特異性抗原決定基之能力可藉由酶聯免疫吸附檢定(ELISA)或熟習此項技術者熟悉的其他技術，例如表面電漿子共振(SPR)技術(例如於BIAcore儀器上分析) (Liljeblad等，Glyco J 17，323-329(2000))及傳統的結合檢定 (Heeley，Endocr Res 28，217-229 (2002))來測定。在一個實施例中，抗原結合部分結合不相關的蛋白質之程度小於抗原結合部分結合抗原的約10%，例如藉由SPR測定。在某些實施例中，結合抗原之抗原結合部分或包含該抗原結合部分之抗原結合分子具有≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10-8 M或更小，例如10-8 M至10-13 M，例如，10-9 M至10-13 M)之解離常數(KD )。
「親和力」係指分子(例如受體)之單個結合站點與其結合搭配物(例如配位體)之間的非共價相互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映结合對成員(例如，抗原結合部分及抗原或受體及其配位體)之間1:1相互作用之內在結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力通常可以解離常數(KD )表示，其係解離速率常數與結合速率常數(分別為koff 及kon )之比。因此，等效親和力可包括不同速率常數，只要速率常數比保持相同即可。可藉由此項技術中已知的既定方法測定親和力，包括彼等本文所述之方法。用於測定親和力之特定方法為表面電漿子共振(SPR)。
「減少結合」，例如減少結合Fc受體，係指(例如)藉由SPR測得各自相互作用之親和力降低。為清楚起見，該術語亦包括將親和力降低至零(或低於分析方法的檢測限度)，即相互作用完全廢除。相反，「增加結合」係指各自相互作用之結合親和力增加。
如本文所用，「活化T細胞抗原」係指在T淋巴細胞(特定言之細胞毒性T淋巴細胞)之表面上表現之抗原決定子，其能夠在與抗原結合分子相互作用時誘導T細胞活化。具體言之，抗原結合分子與活化T細胞抗原之相互作用可藉由觸發T細胞受體複合體之信號級聯來誘導T細胞活化。在一個特定實施例中，該活化T細胞抗原為CD3，特定言之CD3之ε亞單元(參見UniProt編號P07766(第144版)，NCBI RefSeq編號NP_000724.1，就人類序列而言，SEQ ID NO: 40；或UniProt編號Q95LI5 (第49版)，NCBI GenBank編號BAB71849.1，就食蟹獼猴序列而言，SEQ ID NO: 41)。
如本文所用，「T細胞活化」係指T淋巴細胞(特定言之細胞毒性T淋巴細胞)之一或多種細胞反應，選自：增殖、分化、細胞激素分泌、細胞毒性效應子分子釋放、細胞毒性活性及活化標記之表現。測定T細胞活化之適宜分析係本技術中已知的並在本文中描述。
如本文所用，「靶細胞抗原」係指存在於靶細胞(例如腫瘤中的細胞，諸如癌細胞或腫瘤基質之細胞)之表面上之抗原決定子。在一個特定實施例中，該靶細胞抗原為GPRC5D，特定言之根據SEQ ID NO: 45之人類GPRC5D。
如本文所用，關於Fab分子等的術語「第一」、「第二」或「第三」係用於方便區分每一類型之部分何時存在一個以上。除非明確說明，否則使用此等術語並非旨在賦予雙特異性抗原結合分子特定之順序或方向。
「融合」意指組分(例如Fab分子及Fc域亞單元)經肽鍵直接或經由一或多個肽連接子連接。
「Fab分子」係指由重鏈(「Fab重鏈」)之VH及CH1域及免疫球蛋白之輕鏈(「Fab輕鏈」)之VL及CL域組成之蛋白質。
「交換型」Fab分子(亦稱為「Crossfab」)意指Fab分子，其中Fab重鏈及輕鏈之可變域或恆定域被交換(即彼此替換)，即，交換型Fab分子包含由輕鏈可變域VL及重鏈恆定域1 CH1組成之肽鏈(VL-CH1，在N端至C端方向中)、及由重鏈可變域VH及輕鏈恆定域CL組成之肽鏈(VH-CL，在N端至C端方向中)。為清楚起見，在Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域被交換之交換型Fab分子中，包含重鏈恆定域1 CH1之肽鏈在本文中稱為(交換型)Fab分子之「重鏈」。相反，在Fab輕鏈及Fab重鏈之恆定域被交換之交換型Fab分子中，包含重鏈可變域VH之肽鏈在本文中稱為(交換型)Fab分子之「重鏈」。
與此相反，「習知」Fab分子意指其自然形式(即包含由重鏈可變域及恆定域組成之重鏈(VH-CH1，在N端至C端方向中)及由輕鏈可變域及恆定域組成之輕鏈(VL-CL，在N端至C端方向中))之Fab分子。
術語「免疫球蛋白分子」係指具有天然生成之抗體之結構之蛋白質。例如，IgG類的免疫球蛋白為約150,000道耳頓、由兩個輕鏈及兩個重鏈經二硫鍵鍵合所組成之異四聚糖蛋白。從N端至C端，每條重鏈具有可變域(VH)，亦稱為重鏈可變域或重鏈可變區，接著係三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，從N端至C端，每條輕鏈具有可變域(VL)，亦稱為輕鏈可變域或輕鏈可變區，接著係輕鏈恆定(CL)域，亦稱為輕鏈恆定區。免疫球蛋白之重鏈可被歸類為五種類型中的一種，稱為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG)或μ (IgM)，其中一些可進一步分為亞型，例如γ1 (IgG1 )、γ2 (IgG2 )、γ3 (IgG3 )、γ4 (IgG4 )、α1 (IgA1 )及α2 (IgA2 )。基於其恆定域之胺基酸序列，免疫球蛋白之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕(κ)及蘭姆達(λ)。免疫球蛋白基本上係由經由免疫球蛋白鉸鏈區連接的兩個Fab分子及一個Fc域組成。
本文中術語「抗體」在最寬廣意義上使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其等展示出所需抗原結合活性即可。
如本文所用，術語「單株抗體」係指獲自實質上同源抗體群體之抗體，即群體中包含的個別抗體係相同的且/或結合相同抗原決定基，但不包括(例如)含有天然生成之突變或產生於單株抗體製劑生產過程中的可能的變異體抗體，此等變異體通常係以少量存在。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定子。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，意欲根據本發明使用的單株抗體可藉由多種技術來製造，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法、及利用包含全部或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法，本文描述此類方法及用於製備單株抗體之其他示例性方法。
「分離的」抗體係與其自然環境之組分分離之分離的抗體，即不在其天然環境中之分離的抗體。不需要特定純化水平。例如，可自其天然或自然環境中移除分離的抗體。出於本發明之目的，在宿主細胞中表現的重組產生之抗體被視作分離的，視為係已藉由任何適宜技術分離、分級或部分或實質上純化之天然或重組抗體。因此，分離本發明之抗體及雙特異性抗原結合分子。在一些實施例中，將抗體純化至大於95%或99%純度，藉由(例如)電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)方法測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見，例如，Flatman等人，J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構實質上類似的結構之抗體。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2 、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及單域抗體。關於某些抗體片段的綜述，參見Hudson等人，Nat Med 9，129-134 (2003)。關於scFv片段的綜述，參見(例如) Plückthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag，New York，第269頁至第315頁(1994)；亦可參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含補救受體結合抗原決定基殘基且具有增加的體內半衰期之Fab及F(ab')2 片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點(其可係二價或雙特異性的)之抗體片段。參見，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9，129-134 (2003)；及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90，6444-6448 (1993)。Hudson等人，Nat Med 9，129-134 (2003)中亦描述三功能抗體及四功能抗體。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或部分或抗體之輕鏈可變域之全部或部分之抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc.，Waltham, MA；參見(例如)美國專利第6,248,516 B1號)。抗體片段可藉由各種技術製造，包括(但不限於)完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)之產生，如本文所述。
術語「抗原結合域」係指抗體之部分，其包含特異性結合抗原之部分或全部且與其互補之區域。抗原結合域可由(例如)一或多個抗體可變域(亦稱為抗體可變區)提供。特定言之，抗原結合域包含抗體輕鏈可變域(VL)及抗體重鏈可變結構域(VH)。
術語「可變區」或「可變域」係指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性框架區(FR)及三個超變區(HVR)。參見，例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H. Freeman and Co.，第91頁 (2007)。單個VH或VL域可能足以賦予抗原結合特異性。如在本文中結合可變區序列所用，「Kabat編號」係指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版 Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda, MD (1991)描述的編號系統。
如本文所用，重鏈及輕鏈之所有恆定區及域之胺基酸位置係根據描述於Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991)的Kabat編號系統(在本文中稱為「根據Kabat之編號」或「Kabat編號」)編號。具體言之，Kabat編號系統(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991)的第647-660頁)係用於卡帕及蘭姆達同型物之輕鏈恆定域CL及Kabat及 EU索引編號系統(參見第661-723頁)係用於重鏈恆定域(CH1、鉸鏈、CH2及CH3)，在此情況中，其於本文中藉由參考「根據Kabat EU索引之編號」進一步闡明。
如本文所用，術語「超變區」或「HVR」係指抗體可變域之每個區，其在序列中係超變的(「互補決定區」或「CDR」；重鏈可變區/域之CDR縮寫為例如HCDR1、HCDR2及HCDR3；輕鏈可變區/域之CDR縮寫為(例如)LCDR1、LCDR2及LCDR3)且/或形成結構上限定之環(「超變環」)且/或含有抗原接觸殘基(「抗原接觸」)。一般而言，抗體包含六個HVR；三個在VH中(H1、H2、H3)，及三個在VL中(L1、L2、L3)。此處示例性HVR包括：
(a) 超變環存在於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處(Chothia及Lesk，J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))；
(b) CDR存在於胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)處(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda, MD (1991))；
(c) 抗原接觸存在於胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)及93-101 (H3)處(MacCallum等人 J. Mol.Biol.262: 732-745 (1996))；及
(d) (a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)及94-102 (H3)。
除非另有說明，否則可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人(同前述)編號。
「框架」或「FR」係指除超變區(HVR)殘基之外的可變域殘基。可變域之FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列通常以如下順序出現在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)CDR1-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包括實質上所有至少一個(且通常兩個)可變域，其中所有或實質上所有HVR (例如CDR)對應於非人類抗體之其等，及所有或實質上所有FR對應對於人類抗體之其等。此等可變域在本文中稱為「人類化可變區」。人類化抗體可視需要包含衍生自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中的一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，衍生HVR殘基之抗體)之對應殘基取代，例如，以恢復或改善抗體特異性或親和力。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已經歷人類化之抗體。本發明所涵蓋的「人類化抗體」之其他形式為彼等其中恆定區已自原始抗體之形式另外修飾或改變以產生根據本發明之尤其關於C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合之性質的形式。
「人類抗體」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人類或人體細胞產生或自利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源衍生之抗體之胺基酸序列。人類抗體的該定義明確地排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。在某些實施例中，人類抗體係衍生自非人類轉殖基因哺乳動物，例如小鼠、大鼠或兔。在某些實施例中，人類抗體係衍生自融合瘤細胞系。從人類抗體庫分離的抗體或抗體片段在本文中亦被視作人類抗體或人類抗體片段。
抗體或免疫球蛋白之「類別」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中的幾種可進一步分為亞類(同型物)，例如，IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
本文中術語「Fc域」或「Fc區」係用於定義包含恆定區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈之C端區域。該術語包括天然序列Fc區及可變Fc區。雖然IgG重鏈之Fc區之邊界可能略有不同，但人類IgG重鏈Fc區通常被定義為自Cys226或自Pro230延伸至該重鏈的羧基端。然而，由宿主細胞產生之抗體可自重鏈的C端經歷一或多個(特定言之一或兩個)胺基酸之轉譯後裂解。因此，藉由表現編碼全長重鏈之特異性核酸分子由宿主細胞產生之抗體可包括全長重鏈，或其可包括全長重鏈之裂解變異體(在本文中亦稱為「裂解之變異體重鏈」)。此可係重鏈的最後兩個C端胺基酸為甘胺酸(G446)及離胺酸(K447，根據Kabat EU索引編號)之情況。因此，可存在或不存在Fc區之C端離胺酸(Lys447)、或C端甘胺酸(Gly446)及離胺酸(K447)。若未另外說明，則本文表示包括Fc域(或如本文所定義的Fc域之亞單元)之重鏈之胺基酸序列，不包括C端甘胺酸-離胺酸二肽。在本發明之一個實施例中，包含根據本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子中所包含的如本文所述的Fc域之亞單元之重鏈包含額外的C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在本發明之一個實施例中，包含根據本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子中所包含的如本文所述的Fc域之亞單元之重鏈包含額外的C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。本發明之組合物(諸如本文所述之醫藥組合物)包含本發明之抗體群體或雙特異性抗原結合分子群體。抗體群體或雙特異性抗原結合分子群體可包括具有全長重鏈之分子及具有經裂解之變異體重鏈之分子。抗體群體或雙特異性抗原結合分子群體可由具有全長重鏈之分子及具有經裂解之變異體重鏈之分子之混合物組成，其中該等抗體或雙特異性抗原結合分子之至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%具有經裂解之變異體重鏈。在本發明之一個實施例中，包含本發明之抗體群體或雙特異性抗原結合分子群體之組合物包含抗體或雙特異性抗原結合分子，其包含重鏈，該重鏈包括如本文所述的具有額外的C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)之Fc域之亞單元。在本發明之一個實施例中，包含本發明之抗體群體或雙特異性抗原結合分子群體之組合物包含抗體或雙特異性抗原結合分子，其包含重鏈，該重鏈包括如本文所述的具有額外的C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)之Fc域之亞單元。在本發明之一個實施例中，該組合物包含抗體群體或雙特異性抗原結合分子群體，其由包含含有如本文所述的Fc域之亞單元的重鏈之分子；包含含有如本文所述的Fc域之亞單元、具有額外的C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)的重鏈之分子；及包含含有如本文所述的Fc域之亞單元及額外的C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)的重鏈之分子組成。除非本文另有說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據欧洲編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版 Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda, MD，1991中所述(亦可參見上述)。如本文所用，Fc域之「亞單元」係指形成二聚Fc域之兩種多肽之一，即包含能夠穩定自締合的免疫球蛋白重鏈之C端恆定區之多肽。例如，IgG Fc域之亞單元包括IgG CH2及IgG CH3恆定域。
「促進Fc域之第一及第二亞單元締合之修飾」係對肽主鏈之操作或Fc域亞單元之轉譯後修飾，其減少或防止包含Fc域亞單元之多肽與相同多肽締合以形成同二聚體。如本文所用，促進締合之修飾尤其包括對期望締合的兩個Fc域亞單元(即Fc域之第一及第二亞單元)中的每一個進行的單獨修飾，其中該等修飾彼此互補以促進兩個Fc域亞單元締合。例如，促進締合之修飾可改變Fc域亞單元中一者或兩者之結構或電荷，以便分別使得其等之締合空間上或靜電上有利。因此，在包含第一Fc域亞單元之多肽與包含第二Fc域亞單元之多肽之間發生(異)二聚合，其在融合至每個亞單元(例如抗原結合部分)的其他組分不相同的意義上可能係不相同的。在一些實施例中，促進締合之修飾包括Fc域中之胺基酸突變，特定言之胺基酸取代。在特定實施例中，促進締合之修飾包括Fc域之兩個亞單元中的每一個中的單獨胺基酸突變，特定言之胺基酸取代。
術語「效應功能」係指歸屬於抗體之Fc區的彼等生物活性，其隨抗體同型物而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、由抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、細胞激素分泌、由免疫複合體介導抗原呈現細胞攝入抗原、細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調、及B細胞活化。
如本文所用，術語「工程化(engineer/engineered/engineering)」被認為包括對肽主鏈之任何操作或天然生成或重組多肽或其片段之轉譯後修飾。工程化包括胺基酸序列、醣基化模式或單個胺基酸之側鏈基之修飾及此等方式之組合。
如本文所用，術語「胺基酸突變」意欲包涵胺基酸取代、缺失、插入及修飾。可使取代、缺失、插入及修飾之任何組合達到最終構築體，但其條件係最終構築體具有所需特性，例如減少結合Fc受體或增加與另一肽締合。胺基酸序列缺失及插入包括胺基酸之胺基端及/或羧基端缺失及插入。特定之胺基酸突變係胺基酸取代。為達改變(例如) Fc區之結合特性之目的，非保守性胺基酸取代(即一個胺基酸用具有不同結構及/或化學性質之另一胺基酸置換)尤其佳。胺基酸取代包括藉由非天然生成之胺基酸或藉由二十種標準胺基酸之天然生成之胺基酸衍生物(例如4-羥基脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥基離胺酸)置換。可使用本技術熟知的遺傳或化學方法來產生胺基酸突變。遺傳方法可包括定點誘變、PCR、基因合成及類似。預期藉由除基因工程化之外的方法(諸如化學修飾)改變胺基酸之側鏈基的方法亦可係可用的。本文中可使用各種名稱來表示相同胺基酸突變。例如，從Fc域位置329處的脯胺酸至甘胺酸之取代可表示為329G、G329、G329 、P329G或Pro329Gly。
與參考多肽序列相關的「胺基酸序列同一性百分比(%)」定義為候選序列中與參考多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基之百分比，在比對該等序列且引入缺口(視需要)後，可達成最大序列同一性百分比，而任何保守性取代並不視作序列同一性之部分。用於確定胺基酸序列同一性百分比目的之比對可以本領域技術範圍內的各種方式來達成，例如，使用公開可用的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign (DNASTAR)軟體或FASTA程式包。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適宜參數，包括在所比較的序列的全長上達成最大比對所需的任何算法。然而，出於本文之目的，使用具有BLOSUM50比較矩陣之FASTA程式包第36.3.8c版或更新版本的ggsearch程式生成胺基酸序列同一性值%。該FASTA程式包授權給W. R. Pearson及D. J. Lipman (1988)，「Improved Tools for Biological Sequence Analysis」，PNAS 85:2444-2448；W. R. Pearson (1996) 「Effective protein sequence comparison」 Meth. Enzymol. 266:227- 258；及Pearson等人(1997) Genomics 46:24-36，且可自以下公開獲得：http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml。或者，使用ggsearch(總蛋白質：蛋白質)程式及預設選項(BLOSUM50；開放：-10；ext：-2；Ktup = 2)，使用在http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi下訪問的公共服務器，可比較序列，以確保執行全局而非局部比對。胺基酸同一性百分比係在輸出比對標頭中給出。
術語「聚核苷酸」係指分離的核酸分子或構築體，例如，信使RNA(mRNA)、病毒衍生之RNA或質體DNA(pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非保守鍵(例如，諸如發現於肽核酸(PNA)中之醯胺鍵)。術語「核酸分子」係指存在於聚核苷酸中之任何一或多個核酸片段，例如DNA或RNA片段。
「分離的」核酸分子或聚核苷酸意指核酸分子、DNA或RNA，其已從其天然環境中被除去。例如，出於本發明之目的，編碼包含於載體中之多肽之重組聚核苷酸被視作係分離的。分離的聚核苷酸之其他實例包括維持於異源宿主細胞中之重組聚核苷酸或於溶液中純化(部分或實質上)之聚核苷酸。分離的聚核苷酸包括包含於通常含有聚核苷酸分子的細胞中之聚核苷酸分子，但聚核苷酸分子係存在於染色體外或存在於不為其天然染色體位置之染色體位置處。分離的RNA分子包括本發明之體內或體外RNA轉錄本以及陽性及陰性鏈形式及雙鏈形式。根據本發明之分離的聚核苷酸或核酸進一步包括合成產生的此類分子。另外，聚核苷酸或核酸可係或可包括調節元件，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。
「編碼[例如本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子]的分離的聚核苷酸(或核酸)」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)的一或多個聚核苷酸分子，包括在單個載體或單獨載體中的此類聚核苷酸分子及存在於宿主細胞的一或多個位置處的此類核酸分子。
術語「表現盒」係指重組或合成產生之聚核苷酸，其中一系列特定核酸元件允許在靶細胞中轉錄特定核酸。該重組表現盒可被引入至質體、染色體、粒線體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現盒部分包括意欲轉錄之核酸序列及啟動子之其他序列。在某些實施例中，表現盒包含編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子或其片段之聚核苷酸序列。
術語「載體」或「表現載體」係指DNA分子，其用於引入並導引在細胞中以可操作方式相關之特定基因之表現。該術語包括作為自複制核酸結構之載體以及併入至已併入基因組的宿主細胞之基因組中之載體。本發明之表現載體包括表現盒。表現載體允許轉錄大量的穩定mRNA。一旦表現載體位於細胞內，藉由細胞轉錄及/或轉譯機制產生由該基因編碼之核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現盒，其包含編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子或其片段之聚核苷酸序列。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養」可互換使用且係指其中已引入外源核酸的細胞，包括此類細胞之繼代。宿主細胞包括「轉化體」及「轉化細胞」，其包括初級轉化細胞及由其衍生之繼代，無需考慮繼代的數量。子代之核酸含量可與親本細胞不完全相同，但可包含突變。本文包括具有與如在最初轉化的細胞中所篩選或選擇相同的功能或生物活性之突變體繼代。宿主細胞為可用於產生本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子之任何類型的細胞系統。宿主細胞包括培養的細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如HEK細胞、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞，僅舉幾例，但亦包括包含於轉殖基因動物、轉殖基因植物或培養的植物或動物組織中之細胞。
「活化Fc受體」為於被抗體之Fc域接合後引起刺激攜帶受體之細胞執行效應功能之信號傳導事件之Fc受體。人類活化Fc受體包括FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)及FcαRI (CD89)。
由抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)係免疫效應細胞導致塗佈抗體之靶細胞裂解之免疫機制。該等靶細胞為包含Fc區之抗體或其衍生物通常經由為Fc區的N端之蛋白質部分特異性結合的細胞。如本文所用，術語「降低ADCC」定義為在靶細胞周圍的介質中的給定的抗體濃度下，藉由上文所定義的ADCC機制，在給定的時間裂解的靶細胞的數量減少，及/或藉由ADCC機制，達成給定數量的靶細胞在給定的時間裂解所需的靶細胞周圍的介質中抗體濃度增加。ADCC的降低係相對於採用相同的標準生產、純化、調配及儲存方法(為熟習此項技術者已知) (但尚未設計該等方法)由相同類型之宿主細胞產生的相同抗體介導之ADCC。例如，由Fc域中包含降低ADCC之胺基酸取代之抗體介導之ADCC的降低係相對於由Fc域中無該胺基酸取代之相同抗體介導之ADCC。測定ADCC之適宜檢定係本技術中熟知的(參見(例如)PCT公開案第WO 2006/082515號或PCT公開案第WO 2012/130831號)。
藥劑之「有效量」係指在投與其的細胞或組織中產生生理變化所需要的量。
藥劑(例如醫藥組合物)之「治療有效量」係指在給藥且持續必要的時間段下可有效達成所需治療或預防結果的量。「治療有效量」之藥劑(例如)消除、減少、延遲、最小化或防止疾病之不良效應。
「個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類的靈長類動物，諸如猴)、兔及囓齒動物(例如小鼠及大鼠)。特定言之，個體或受試者為人類。
術語「醫藥組合物」係指一種製劑，其形式使得包含於其中的活性成分的生物活性有效，且其不含對投與該組合物的受試者具有不可接受之毒性的其他組分。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥組合物中除了活性成分之外的對受試者無毒之成分。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩沖劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其語法變化，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體中疾病的自然過程之臨床干預，且可針對於預防目的執行或在臨床病理學過程期間執行。治療之理想效果包括(但不限於)預防疾病之發生或複發，症狀緩解，疾病之任何直接或間接病理後果減少，防止轉移，降低疾病進展速率，改善或緩解疾病狀態，及緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子係用於延遲疾病之發展或減緩疾病之進展。
術語「包裝插頁」用於指通常包括在治療性產品之商業包裝中的說明書，其包含關於適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或關於使用此等治療性產品之警告之資訊。
實施例之詳細描述
本發明提供結合GPRC5D(特定言之人類GPRC5D)之抗體及雙特異性抗原結合分子。此外，該等分子具有就治療應用而言(例如)在功效及/或安全性以及可生產性方面之其他有利的性質。
GPRC5D 抗體
在第一態樣中，本發明提供結合GPRC5D之抗體，其中該抗體包含(i)包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 84之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；(ii)包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 85之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；(iii)包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR) 190之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；(iv)包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR) 190之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 96之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；或(v)包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 92之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)。
在一些實施例中，該抗體為人類化抗體。在一個實施例中，該VH為人類化VH及/或該VL為人類化VL。在一個實施例中，該抗體包含如上述實施例中任一實施例之CDR，且進一步包含受體人類框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類一致框架。
在一個特定實施例中，(i)該VH包含與SEQ ID NO: 13之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 14之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或(ii)該VH包含與SEQ ID NO: 15之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或(iii)該VH包含與SEQ ID NO: 48之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 53之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或(iv)該VH包含與SEQ ID NO: 49之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 52之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或(v)該VH包含與SEQ ID NO: 57之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或(vi)該VH包含與SEQ ID NO: 58之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。
在一個特定實施例中，該抗體包含(i)與SEQ ID NO: 13之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之VH及與SEQ ID NO: 14之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之VL；或(ii)與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之VH及與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之VL；或(iii)與SEQ ID NO: 48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之VH及與SEQ ID NO: 53之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之VL；或(iv)該VH係與SEQ ID NO: 49之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同，及該VL係與SEQ ID NO: 52之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同；或(v)該VH係與SEQ ID NO: 57之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同，及該VL係與SEQ ID NO: 64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同；或(vi)該VH係與SEQ ID NO: 58之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同，及該VL係與SEQ ID NO: 63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
在另一個實施例中，該抗體為IgG，特定言之IgG1(抗體)。在一個實施例中，該抗體為全長抗體。在另一個實施例中，該抗體為選自Fv分子、scFv分子、Fab分子及F(ab')2 分子之群之抗體片段。在一個實施例中，該抗體為多特異性抗體。
在某些實施例中，具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之VH或VL序列含有相對於參考序列之取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗體保留結合GPRC5D之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 13中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失且/或在SEQ ID NO: 14中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失且/或在SEQ ID NO: 15中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失且/或在SEQ ID NO: 16中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失且/或在SEQ ID NO: 48中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失且/或在SEQ ID NO: 53中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失且/或在SEQ ID NO: 49中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失且/或在SEQ ID NO: 52總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失且/或在SEQ ID NO: 57中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失且/或在SEQ ID NO: 64中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失且/或在SEQ ID NO: 58中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失且/或在SEQ ID NO: 63中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。
在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部的區域(即FR中)。視需要，該抗體包含SEQ ID NO:13之VH序列及/或SEQ ID NO: 14之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。視需要，該抗體包含SEQ ID NO: 15之VH序列及/或SEQ ID NO: 16之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。視需要，該抗體包含SEQ ID NO: 448之VH序列及/或SEQ ID NO: 53之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。視需要，該抗體包含SEQ ID NO: 49之VH序列及/或SEQ ID NO: 52之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。視需要，該抗體包含SEQ ID NO: 57之VH序列及/或SEQ ID NO: 64之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。視需要，該抗體包含SEQ ID NO: 58之VH序列及/或SEQ ID NO: 63之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。
在一個實施例中，該抗體包含含有選自SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 15之群之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列之VL。
在一個實施例中，該抗體包含選自SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 12之群之VH序列及SEQ ID NO: 16之VL序列。
在一個特定實施例中，該抗體包含包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該抗體包含SEQ ID NO: 13之VH序列及SEQ ID NO: 14之VL序列。
在一個特定實施例中，該抗體包含包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該抗體包含SEQ ID NO: 15之VH序列及SEQ ID NO: 16之VL序列。
在一個特定實施例中，該抗體包含包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之VL。在一個實施例中，該抗體包含SEQ ID NO: 48之VH序列及SEQ ID NO: 53之VL序列。
在一個特定實施例中，該抗體包含包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該抗體包含SEQ ID NO: 49之VH序列及SEQ ID NO: 52之VL序列。
在一個特定實施例中，該抗體包括包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該抗體包含SEQ ID NO: 57之VH序列及SEQ ID NO: 64之VL序列。
在一個特定實施例中，該抗體包含包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該抗體包含SEQ ID NO: 58之VH序列及SEQ ID NO: 63之VL序列。
在一個實施例中，該抗體包含人類恆定區。在一個實施例中，該抗體為包含人類恆定區之免疫球蛋白分子，特定言之包含人類CH1、CH2、CH3及/或CL域之IgG類免疫球蛋白分子。人類恆定域之示例性序列以SEQ ID NO 37及38 (分別為人類卡帕及蘭姆達CL域)及SEQ ID NO: 39(人類IgG1重鏈恆定域CH1-CH2-CH3)表示。在一些實施例中，該抗體包含含有與SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 39之胺基酸序列，特定言之SEQ ID NO: 38之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列之輕鏈恆定區。在一些實施例中，該抗體包含與SEQ ID NO: 39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列之重鏈恆定區。特定言之，重鏈恆定區可包括如本文所述的Fc域中之胺基酸突變。
在一個實施例中，該抗體為單株抗體。
在一個實施例中，該抗體為IgG，特定言之IgG1 (抗體)。在一個實施例中，該抗體為全長抗體。
在一個實施例中，該抗體包含Fc域，特定言之IgG Fc域，更特定言之IgG1 Fc域。在一個實施例中，該Fc域為人類Fc域。抗體之該Fc域可單獨地或以組合方式併入本文所述的與本發明之雙特異性抗原結合分子之Fc域相關的任何特徵。
在另一個實施例中，該抗體為選自Fv分子、scFv分子、Fab分子及F(ab’)2 分子；特定言之Fab分子之群之抗體片段。在另一個實施例中，該抗體片段為雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體。
在另一個態樣中，根據上述實施例中任一實施例之抗體可單獨地或以組合方式併入如以下部分中所述的任何特徵。
醣基化變異體
在某些實施例中，改變本文所提供的抗體以增加或降低抗體醣基化的程度。藉由改變胺基酸序列可方便地完成對抗體新增或刪除醣基化位點，從而建立或去除一或多個醣基化位點。
在抗體包含Fc區的情況下，可改變連接至其之寡糖。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含支化、雙觸寡糖，其通常係藉由N-鍵結連接至Fc區之CH2域之Asn297。參見，例如，Wright等人 TIBTECH 15:26-32 (1997)。該寡糖可包括各種碳水化合物(例如，甘露糖、N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸)、及連接至雙觸寡糖結構之「主幹」中的GlcNAc之岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明之抗體中的寡糖進行修飾以建立具有某些改良的性质之抗體變異體。
在一個實施例中，提供具有非岩藻醣基化寡糖(即缺乏連接至(直接或間接)Fc區之岩藻糖之寡糖結構)之抗體變異體。此種非岩藻醣基化寡糖(亦稱為「非岩藻醣基化寡糖」)特定言之為經N連接之寡糖，其缺乏連接至雙觸寡糖結構之主幹中的第一GlcNAc之岩藻糖殘基。在一個實施例中，提供與天然或親本抗體相比在Fc區中非岩藻醣基化寡糖之比例增加之抗體變異體。例如，非岩藻醣基化寡糖之比例可係至少約20%、至少約40%、至少約60%、至少約80%或甚至約100%(即不存在岩藻醣基化寡糖)。非岩藻醣基化寡糖之百分比係缺乏岩藻糖殘基之寡糖相對於藉由如(例如) WO 2006/082515中所述的MALDI-TOF質譜法測得的連接至Asn 297之所有寡糖(例如複合體、雜交體及高甘露糖結構)的總和之(平均)量。Asn297係指位於Fc區中約位置297處的天冬醯胺酸殘基(Fc區殘基之EU編號)；然而，由於抗體中的次要序列變化，Asn297亦可位於位置297上游或下游的約±3個胺基酸之處，即位置294與300之間。在Fc區中具有增加比例之非岩藻醣基化寡糖之此類抗體可具有改良之FcγRIIIa受體結合及/或改良之效應功能，特定言之改良之ADCC功能。參見，例如，US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能夠產生具有減少之岩藻醣基化之抗體的細胞系之實例包括蛋白質岩藻醣基化中缺乏的Lec13 CHO細胞(Ripka等人 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；US 2003/0157108；及WO 2004/056312，尤其在實例11下)、及基因剔除(knockout)細胞系，諸如α-1,6-岩藻糖轉移酶基因、FUT8、基因剔除CHO細胞(參見，例如，Yamane-Ohnuki等人 Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004)；Kanda, Y.等人，Biotechnol. Bioeng.，94(4):680-688 (2006)；及WO2003/085107)、或GDP-岩藻糖合成或轉運體蛋白質之活性減小或被廢除之細胞(參見，例如，US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在另一個實施例中，抗體變異體提供有一分為二的寡聚醣，例如，其中連接至抗體之Fc區之雙觸寡糖被GlcNAc二等分。此類抗體變異體可具有如上所述之降低之岩藻醣基化及/或改良之ADCC功能。此類抗體變異體之實例描述於(例如) Umana等人，Nat Biotechnol 17，176-180 (1999)；Ferrara等人，Biotechn Bioeng 93，851-861 (2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO 2003/011878中。
亦提供寡糖中的至少一個半乳糖殘基連接至Fc區之抗體變異體。此類抗體變異體可具有改良之CDC功能。此類抗體變異體描述於(例如)WO 1997/30087；WO 1998/58964；及WO 1999/22764中。
半胱胺酸工程化抗體變異體 在某些實施例中，可能需要建立半胱胺酸工程化抗體，例如，「硫基MAb」，其中該抗體之一或多個殘基係經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於抗體之可到達之位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，因此反應性硫醇基位於抗體之可到達之位點處且可用於將抗體共軛至其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)以建立免疫共軛物，如本文進一步描述。可如(例如)美國專利第7,521,541號、第8,30,930號、第7,855,275號、第9,000,130號或WO2016040856中所述產生半胱胺酸工程化抗體。
抗體衍生物 在某些實施例中，可進一步修飾本文所提供的抗體以包含本技術中已知且容易獲得之額外的非蛋白質部分。適於衍生的抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中的穩定性而可在製造方面具有優勢。該聚合物可係任何分子量，且可係分支鏈或直鏈的。連接至抗體之聚合物的數量可改變，且若連接超過一個聚合物，則其等可係相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物之數量及/或類型可基於以下考慮來確定，包括(但不限於)特定性質或待改善之抗體之功能、抗體衍生物是否將用於限定條件下之治療等等。
在另一個實施例中，提供可藉由暴露於輻射而選擇性加熱的抗體及非蛋白質部分之共軛物。在一個實施例中，該非蛋白質部分為碳奈米管(Kam等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。該輻射可係任何波長，且包括(但不限於)不損害尋常細胞但其將非蛋白質部分加熱至抗體-非蛋白質部分附近的細胞被殺死的溫度之波長。
免疫共軛物
本發明亦提供免疫共軛物，其包含如本文所述的共軛(化學結合)至一或多種治療劑(諸如細胞毒性劑、化療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物来源之酶活性毒素、或其片段)或放射性同位素)之抗GPRC5D抗體。
在一個實施例中，免疫共軛物為其中抗體共軛至上述治療劑中之一或多者的抗體-藥物共軛物(ADC)。該抗體通常使用連接子連接至該等治療劑中之一或多者。ADC技術之概述包括將治療性藥劑及藥物及連接子之實例述於Pharmacol Review 68:3-19 (2016)中。
在另一個實施例中，免疫共軛物包含如本文所述的共軛至酶促活性毒素或其片段之抗體，包括(但不限於)白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、莫迪素(modeccin) A鏈，α-帚曲菌素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、線菌毒素(mitogellin)、局限麯菌素(restrictocin)、酚毒素(phenomycin)、伊諾毒素(enomycin)及單端孢黴菌烯醇(tricothecenes)。
在另一個實施例中，免疫共軛物包含如本文所述的共軛至放射性原子形成放射性共軛物之抗體。有多種放射性同位素可用於產生放射性共軛物。實例包括At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu之放射性同位素。當放射性共軛物用於檢測時，其可包含用於閃爍掃描研究之放射性原子(例如tc99m或I123)，或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之旋轉標籤，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體及細胞毒性劑之共軛物可使用多種雙功能蛋白偶聯劑製備，諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二醯亞胺酸二甲酯HCl)、活性酯(諸如二琥珀醯亞胺基辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮鎓衍生物(諸如雙-(對-重氮鎓苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可如在Vitetta等人，Science 238:1098 (1987)中所述製備蓖麻毒素免疫毒素。經碳-14-標記之1-異硫氰酸基苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於將放射性核苷酸共軛至抗體之例示性螯合劑。參見WO94/11026。連接子可為促進細胞中細胞毒性藥物釋放之「可裂解之連接子」。例如，可使用酸不穩定之連接子、對肽酶敏感之連接子、光不穩定之連接子、二甲基連接子或含二硫化物之連接子(Chari等人，Cancer Res. 52:127-131 (1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文中的免疫共軛物或ADC明確地涵蓋(但不限於)用交聯劑試劑製備的此類共軛物，包括(但不限於) BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB、及SVSB(琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，其等係市售的(例如，自Pierce Biotechnology, Inc.，Rockford, IL.，U.S.A)。
多特異性抗體
在某些實施例中，本文所提供的抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為單株抗體，其具有針對於至少兩個不同位點(即位於不同抗原上的不同抗原決定基或位於相同抗原上的不同抗原決定基)之結合特異性。在某些實施例中，該多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。在某些實施例中，該等結合特異性中的一種係針對於GPRC5D，而另外(兩種或更多種)特異性係針對於任何其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合GPRC5D之兩個(或更多個)不同抗原決定基。多特異性(例如雙特異性)抗體亦可用於將細胞毒性劑或細胞定位於表現GPRC5D之細胞。多特異性抗體可準備為全長抗體或抗體片段。
用於製造多特異性抗體之技術包括(但不限於)具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein及Cuello，Nature 305: 537 (1983))及「結入孔(knob-in-hole)」工程化(參見，例如，美國專利第5,731,168號，及Atwell等人，J. Mol. Biol. 270:26 (1997))。多特異性抗體亦可藉由工程化靜電轉向效應來製備，以用於製造抗體Fc-異二聚分子(參見(例如)WO 2009/089004)；交聯兩個或更多個抗體或片段(參見，例如，美國專利第4,676,980號，及Brennan等人，Science，229: 81(1985))；使用白胺酸拉鍊以產生雙特異性抗體(參見，例如，Kostelny等人，J. Immunol.，148(5):1547-1553 (1992)及WO 2011/034605)；使用常見的輕鏈技術來規避輕鏈失配配對問題(參見，例如，WO 98/50431)；使用「雙功能抗體」技術來製造雙特異性抗體片段(參見，例如，Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90:6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv (sFv)二聚物(參見(例如)Gruber等人，J. Immunol.，152:5368 (1994))；及製備三特異性抗體，如(例如)Tutt等人 J. Immunol. 147: 60 (1991)中所述。
本文亦包括具有三個或更多個抗原結合位點之工程化抗體，包括(例如)「章魚(Octopus)抗體」或DVD-Ig (參見(例如) WO 2001/77342及WO 2008/024715)。具有三個或更多個抗原結合位點之多特異性抗體之其他實例可見於WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792及WO 2013/026831。該雙特異性抗體或其抗原結合片段亦包括「雙重作用FAb」或「DAF」，其包含結合GPRC5D之抗原結合位點及另一不同抗原、或GPRC5D之兩個不同抗原決定基(參見(例如) US 2008/0069820及WO 2015/095539)。
多特異性抗體亦可以不對稱形式提供，在具有相同抗原特異性之一或多個结合臂中具有域交換，即藉由交換VH/VL域(參見(例如) WO 2009/080252及WO 2015/150447)、CH1/CL域(參見(例如) WO 2009/080253)或完整Fab臂(參見(例如) WO 2009/080251、WO 2016/016299，亦可參見Schaefer等人，PNAS，108 (2011) 1187-1191，及Klein等人，MAbs 8 ( 2016) 1010-20)。不對稱之Fab臂亦可藉由將帶電或不帶電之胺基酸突變引入至域界面中以導引正確的Fab配對來設計。參見(例如)WO 2016/172485。
用於多特異性抗體之各種其他分子形式係本技術中已知的且包括在本文中(參見(例如)Spiess等人，Mol Immunol 67 (2015) 95-106)。
亦包括在本文中的特定類型之多特異性抗體為雙特異性抗體，其被設計為同時結合靶細胞(例如腫瘤細胞)上的表面抗原且結合T細胞受體(TCR)複合體之活化不變組分(例如CD3)以用於再靶向T細胞來殺死靶細胞因此，在某些實施例中，本文所提供的抗體為多特異性抗體，特定言之雙特異性抗體，其中該等結合特異性中之一種特異性係針對於GPRC5D及另一種特異性係針對於CD3。
可用於此目的之雙特異性抗體形式之實例包括(但不限於)所謂的「BiTE」(雙特異性T細胞接合)分子，其中兩個scFv分子係經撓性連接子融合(參見，例如，WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261及WO2008/119567，Nagorsen及Bäuerle，Exp Cell Res 317，1255-1260 (2011))；雙功能抗體(Holliger等人，Prot Eng 9，299-305 (1996))及其衍生物，諸如串聯式雙功能抗體(「TandAb」；Kipriyanov等人，J Mol Biol 293，41-56 (1999))；「DART」(雙重親和力再靶向)分子，其係基於雙功能抗體形式，但特徵係用於額外穩定化之C端二硫橋(Johnson等人，J Mol Biol 399，436-449 (2010))及所謂的三功能抗體(triomab)，其等為全雜交小鼠/大鼠IgG分子(參見Seimetz等人，Cancer Treat Rev 36，458-467 (2010))。本文包括的特定T細胞雙特異性抗體形式描述於WO 2013/026833、WO2013/026839、WO 2016/020309；Bacac等人，Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498中。
結合 GPRC5D 及第二抗原之雙特異性抗原結合分子
本發明亦提供雙特異性抗原結合分子，即包含能夠特異性結合兩個不同抗原決定子(第一及第二抗原)之至少兩個抗原結合部分之抗原結合分子。
根據本發明之特定實施例，包含於雙特異性抗原結合分子中的抗原結合部分為Fab分子(即由各包含可變域及恆定域之重鏈及輕鏈組成之抗原結合域)。在一個實施例中，該第一及/或第二抗原結合部分為Fab分子。在一個實施例中，該Fab分子係人類的。在一個特定實施例中，該Fab分子係人類化的。在又另一個實施例中，該Fab分子包含人類重鏈及輕鏈恆定域。
較佳地，該等抗原結合部分中之至少一者為交換型Fab分子。此種修飾減少來自不同Fab分子之重鏈及輕鏈之錯配，藉此提高重組生產中本發明雙特異性抗原結合分子之產率及純度。在可用於本發明之雙特異性抗原結合分子之特定交換型Fab分子中，交換Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域(分別為VL及VH)。然而，即使利用該域交換，由於錯配的重鏈及輕鏈之間的所謂的本瓊氏(Bence Jones)相互作用，雙特異性抗原結合分子之製備可包括某些副產物(參見Schaefer等人，PNAS，108 (2011) 11187-11191)。為進一步減少不同Fab分子中重鏈及輕鏈的錯配且藉此增加所需雙特異性抗原結合分子之純度及產率，可在結合第一抗原(GPRC5D)之Fab分子或結合第二抗原之Fab分子(例如活化T細胞抗原，諸如CD3)之Fab分子之CH1及CL域中的特定胺基酸位置處引入具有相反電荷之帶電胺基酸，如本文進一步描述。在包含於雙特異性抗原結合分子中之習知Fab分子中(諸如，例如圖1 A-C、G-J中所示)或在包含於雙特異性抗原結合分子中之VH/VL交換型Fab分子中(諸如，例如圖1D-F、K-N中所示) (但不會同時在兩者中)進行電荷修飾。在特定實施例中，在包含於雙特異性抗原結合分子中之習知Fab分子(其在特定實施例中結合第一抗原，即GPRC5D)中進行電荷修飾。
在根據本發明之一個特定實施例中，該雙特異性抗原結合分子能夠同時結合第一抗原(即GPRC5D)及第二抗原(例如活化T細胞抗原，特定言之CD3)。在一個實施例中，該雙特異性抗原結合分子能夠藉由同時結合GPRC5D及活化T細胞抗原而交聯T細胞及靶細胞。在甚至更多的特定實施例中，此種同時結合會導致裂解靶細胞，特定言之GPRC5D表現腫瘤細胞。在一個實施例中，此種同時結合會導致活化T細胞。在其他實施例中，此種同時結合導致T淋巴細胞(特定言之細胞毒性T淋巴細胞)之細胞反應，該細胞反應係選自如下之群：增殖、分化、細胞激素分泌、細胞毒性效應子分子釋放、細胞毒性活性及活化標記之表現。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子結合活化T細胞抗原(特定言之CD3)，而未同時結合GPRC5D，不會導致T細胞活化。
在一個實施例中，該雙特異性抗原結合分子能夠將T細胞之細胞毒性活性再導引至靶細胞。在一個特定實施例中，該再導引係獨立於靶細胞之由MHC介導之肽抗原呈現及/或T細胞之特異性。
特定言之，根據本發明任一實施例之T細胞為細胞毒性T細胞。在一些實施例中，該T細胞為CD4+ 或CD8+ T細胞，特定言之CD8+ T細胞。
第一抗原結合部分
本發明之雙特異性抗原結合分子包含結合GPRC5D(第一抗原)之至少一個抗原結合部分，特定言之Fab分子。在某些實施例中，該雙特異性抗原結合分子包含結合GPRC5D之兩個抗原結合部分，特定言之Fab分子。在一個特定的此種實施例中，此等抗原結合部分中的每一個均結合相同抗原決定子。在甚至更特定的實施例中，所有此等抗原結合部分係相同的，即其等包含相同的胺基酸序列，包括如本文所述的CH1及CL域中之相同胺基酸取代(若有的話)。在一個實施例中，該雙特異性抗原結合分子包含結合GPRC5D之不超過兩個抗原結合部分，特定言之Fab分子。
在特定實施例中，結合GPRC5D之抗原結合部分為習知Fab分子。在此等實施例中，結合第二抗原之抗原結合部分為如本文所述之交換型Fab分子，即Fab分子，其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL彼此交換/置換。
在替代實施例中，結合GPRC5D之抗原結合部分為如本文所述之交換型Fab分子，即Fab分子，其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL彼此交換/置換。在此等實施例中，結合第二抗原之抗原結合部分為習知Fab分子。
GPRC5D結合部分能夠將雙特異性抗原結合分子導引至靶位點，例如導引至表現GPRC5D之特定類型之腫瘤細胞。
該雙特異性抗原結合分子之第一抗原結合部分可包含本文所述的與結合GPRC5D之抗體相關之任何特徵(單獨或以組合方式)，除非在科學上明顯不合理或不可能。
因此，在一個態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含(a)結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 84之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)、及(b)結合第二抗原之第二抗原結合部分。在另一個態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含(a)結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D且該第一抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 85之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)、及(b)結合第二抗原之第二抗原結合部分。在另一個態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含(a)結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D且該第一抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)、及(b)結合第二抗原之第二抗原結合部分。在另一個態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含(a)結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D且該第一抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 96之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)、及(b)結合第二抗原之第二抗原結合部分。在另一個態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含(a)結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D且該第一抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 92之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)、及(b)結合第二抗原之第二抗原結合部分。在另一個態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含(a)結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D且該第一抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 2之HCDR 2及SEQ ID NO: 3之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 5之LCDR 2及SEQ ID NO: 6之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)、及(b)結合第二抗原之第二抗原結合部分。在另一個態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含(a)結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D且該第一抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 7之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 8之HCDR 2及SEQ ID NO: 9之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 10之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 11之LCDR 2及SEQ ID NO: 12之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)、及(b)結合第二抗原之第二抗原結合部分。
在一些實施例中，該第一抗原結合部分係(衍生自)人類化抗體。在一個實施例中，該VH為人類化VH及/或該VL為人類化VL。在一個實施例中，該第一抗原結合部分包含如任一上述實施例中之CDR，且進一步包含受體人類框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類一致框架。
在一個實施例中，第一抗原結合部分之該VH包含與選自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57及SEQ ID NO: 58之群之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及第一抗原結合部分之該VL包含與選自SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63及SEQ ID NO: 64之群之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。
在一個實施例中，該第一抗原結合部分包含與選自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57及SEQ ID NO: 58之群之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之VH序列、及與選自SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63及SEQ ID NO: 64之群之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之VL序列。
在一個實施例中，該第一抗原結合部分包含含有選自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57及SEQ ID NO: 58之群之胺基酸序列之VH及含有選自SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63及SEQ ID NO: 64之群之胺基酸序列之VL。
在一個實施例中，該第一抗原結合部分包含選自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57及SEQ ID NO: 58之群之VH序列及選自SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63及SEQ ID NO: 64之群之VL序列。
在一個特定實施例中，該第一抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該第一抗原結合部分包含SEQ ID NO: 13之VH序列及SEQ ID NO: 14之VL序列。
在一個特定實施例中，該第一抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該第一抗原結合部分包含SEQ ID NO: 15之VH序列及SEQ ID NO: 16之VL序列。
在一個特定實施例中，該第一抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該第一抗原結合部分包含SEQ ID NO: 48之VH序列及SEQ ID NO: 53之VL序列。
在一個特定實施例中，該第一抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該第一抗原結合部分包含SEQ ID NO: 49之VH序列及SEQ ID NO: 52之VL序列。
在一個特定實施例中，該第一抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該第一抗原結合部分包含SEQ ID NO: 57之VH序列及SEQ ID NO: 64之VL序列。
在一個特定實施例中，該第一抗原結合部分包包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該第一抗原結合部分包含SEQ ID NO: 58之VH序列及SEQ ID NO: 63之VL序列。在一個實施例中，該第一抗原結合部分包含人類恆定區。在一個實施例中，該第一抗原結合部分為包含人類恆定區(特定言之人類CH1及/或CL域)之Fab分子。人類恆定域之示例性序列以SEQ ID NO 37及38(分別為人類卡帕及蘭姆達CL域)及SEQ ID NO: 39(人類IgG1 重鏈恆定域CH1-CH2-CH3)。在一些實施例中，該第一抗原結合部分包含含有與SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列(特定言之SEQ ID NO: 37之胺基酸序列)至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列之輕鏈恆定區。特定言之，該輕鏈恆定區可包含如本文中在「電荷修飾」下方所述的胺基酸突變且/或若在交換型Fab分子中可包括一或多個(特定言之兩個) N端胺基酸之缺失或取代。在一些實施例中，該第一抗原結合部分包含含有與包含於SEQ ID NO: 39之胺基酸序列中之CH1域序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列之重鏈恆定區。特定言之，該重鏈恆定區(尤其係CH1域)可包含如本文中在「電荷修飾」下方所述之胺基酸突變。
第二抗原結合部分
本發明之雙特異性抗原結合分子包含結合第二抗原(不同於GPRC5D)之至少一個抗原結合部分，特定言之Fab分子。
在特定實施例中，結合第二抗原之抗原結合部分為如本文所述之交換型Fab分子，即Fab分子，其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL彼此交換/置換。在此等實施例中，結合第一抗原(即GPRC5D)之抗原結合部分較佳為習知Fab分子。在存在結合包含於雙特異性抗原結合分子中之GPRC5D之超過一個抗原結合部分(特定言之Fab分子)之實施例中，結合第二抗原之抗原結合部分較佳為交換型Fab分子及結合GPRC5D之抗原結合部分為習知Fab分子。
在替代實施例中，結合第二抗原之抗原結合部分為習知Fab分子。在此等實施例中，結合第一抗原(即GPRC5D)之抗原結合部分為如本文所述之交換型Fab分子，即Fab分子，其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL彼此交換/置換。在存在結合包含於雙特異性抗原結合分子中之第二抗原之超過一個抗原結合部分(特定言之Fab分子)之實施例中，結合GPRC5D之抗原結合部分較佳為交換型Fab分子及結合第二抗原之抗原結合部分為習知Fab分子。
在一些實施例中，該第二抗原為活化T細胞抗原(本文亦稱為「活化T細胞抗原結合部分或活化T細胞抗原結合Fab分子」)。在一個特定實施例中，該雙特異性抗原結合分子包含能夠特異性結合活性T細胞抗原之不超過一個抗原結合部分。在一個實施例中，該雙特異性抗原結合分子可單價結合活化T細胞抗原。
在特定實施例中，該第二抗原為CD3，特定言之人類CD3 (SEQ ID NO: 40)或食蟹獼猴CD3 (SEQ ID NO: 41)，最特定言之人類CD3。在一個實施例中，該第二抗原結合部分係針對(即特異性結合)人類及食蟹獼猴CD3之交叉反應。在一些實施例中，該第二抗原為CD3之ε亞單元(CD3 ε)。
在一個實施例中，該第二抗原結合部分包含SEQ ID NO: 29之HCDR 1、SEQ ID NO: 30之HCDR 2、SEQ ID NO: 31之HCDR 3、SEQ ID NO: 32之LCDR 1、SEQ ID NO: 33之LCDR 2及SEQ ID NO: 34之LCDR 3。
在一個實施例中，該第二抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 29之HCDR 1、SEQ ID NO: 30之HCDR 2及SEQ ID NO: 31之HCDR 3之VH及包含SEQ ID NO: 32之LCDR 1、SEQ ID NO: 33之LCDR 2及SEQ ID NO: 34之LCDR 3之VL。
在一些實施例中，該第二抗原結合部分係(衍生自)人類化抗體。在一個實施例中，該VH為人類化VH及/或該VL為人類化VL。在一個實施例中，該第二抗原結合部分包含如任一上述實施例中之CDR，且進一步包含受體人類框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類一致框架。
在一個實施例中，該第二抗原結合部分包含與SEQ ID NO: 35之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之VH序列。在一個實施例中，該第二抗原結合部分包含與SEQ ID NO: 36之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之VL序列。
在一個實施例中，該第二抗原結合部分包含與SEQ ID NO: 35之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之VH序列及與SEQ ID NO: 36之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之VL序列。
在一個實施例中，第二抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 35之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列及第二抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO: 36之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。
在一個實施例中，該第二抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之VL。
在一個實施例中，該第二抗原結合部分包含SEQ ID NO: 35之VH序列及SEQ ID NO: 36之VL序列。
在一個實施例中，該第二抗原結合部分包含人類恆定區。在一個實施例中，該第二抗原結合部分為包含人類恆定區(特定言之人類CH1及/或CL域)之Fab分子。人類恆定域之示例性序列以SEQ ID NO 37及38(分別為人類卡帕及蘭姆達CL域)及SEQ ID NO: 39(人類IgG1 重鏈恆定域CH1-CH2-CH3)表示。在一些實施例中，該第二抗原結合部分包含含有與SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列(特定言之SEQ ID NO: 37之胺基酸序列)至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列之輕鏈恆定區。特定言之，該輕鏈恆定區可包含如本文中在「電荷修飾」下方所述的胺基酸突變且/或若在交換型Fab分子中可包括一或多個(特定言之兩個) N端胺基酸之缺失或取代。在一些實施例中，該第二抗原結合部分包含含有與包含於SEQ ID NO: 39之胺基酸序列中之CH1域序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列之重鏈恆定區。特定言之，該重鏈恆定區(尤其係CH1域)可包含如本文中在「電荷修飾」下方所述之胺基酸突變。
在一些實施例中，該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1(特定言之可變域VL及VH)彼此置換(即根據此實施例，該第二抗原結合部分為交換型Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域或恆定域係經交換)。在此一實施例中，該第一(及第三，若有的話)抗原結合部分為習知Fab分子。
在一個實施例中，該雙特異性抗原結合分子中存在結合第二抗原(例如活化T細胞抗原，諸如CD3)之不超過一個抗原結合部分(即該雙特異性抗原結合分子可單價結合第二抗原)。
電荷修飾
本發明之雙特異性抗原結合分子可包含包含於其中之Fab分子中之胺基酸取代，其等尤其有效地減少輕鏈與不匹配的重鏈之錯配(本瓊氏副產物)，該錯配可在基於Fab之雙/多特異性抗原結合分子之產生中發生，在其结合臂(亦可參見PCT公開案第WO 2015/150447號，特定言之其中的實例，該案之全文係以引用的方式併入本文中)之一者(或多者，就包含超過兩個抗原結合Fab分子而言)中具有VH/VL交換。藉由在CH1及CL域中的特定胺基酸位置處引入帶有相反電荷的帶電胺基酸(在本文中有時稱為「電荷修飾」)，可提高所需雙特異性抗原結合分子與非所欲副產物(特定言之產生於在其結合臂中之一者中具有VH/VL域交換之雙特異性抗原結合分子中之本瓊氏副產物)之比。
因此，在其中雙特異性抗原結合分子之第一及第二抗原結合部分均為Fab分子之一些實施例中，且在該等抗原結合部分(特定言之第二抗原結合部分)中之一者中，Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換，
i) 在第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸被帶正電荷之胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處之胺基酸或在位置213處之胺基酸係經帶負電荷之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)；或
ii) 在第二抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸被帶正電荷之胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處之胺基酸或在位置213處之胺基酸係經帶負電荷之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。
該雙特異性抗原結合分子不包括i)及ii)中提及的兩種修飾。具有VH/VL交換的抗原結合部分之恆定域CL及CH1不彼此置換(即保持不交換)。
在一個更特定的實施例中，
i) 在第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，及在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸或在位置213處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或
ii) 在第二抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，及在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸或在位置213處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在此一實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，及在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸或在位置213處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一個實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，及在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個特定實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，及在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個更特定的實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個甚至更特定的實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在特定實施例中，若根據以上實施例之胺基酸取代係在第一抗原結合部分之恆定域CL及恆定域CH1中進行，則第一抗原結合部分之該恆定域CL係卡帕同型物。
或者，根據以上實施例之胺基酸取代可在第二抗原結合部分之恆定域CL及恆定域CH1中進行，而不是在第一抗原結合部分之恆定域CL及的恆定域CH1中進行。在此等特定實施例中，第二抗原結合部分之恆定域CL係卡帕同型物。
因此，在一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，及在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸或在位置213處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，及在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在又另一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，及在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，及在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，及在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 84之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)，及
(b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
其中在第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，係獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)及在位置123處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號) (在一個特定實施例中，係獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，及在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 85之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)，及
(b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
其中在第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，係獨立地經離胺酸(K)或天冬胺酸(R)取代)及在位置123處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，係獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，及在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)，及
(b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
其中在第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，係獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)及在位置123處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，係獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，及在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 96之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)，及
(b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
其中在第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號) (在一個特定實施例中，係獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)及在位置123處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，係獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，及在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 92之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)，及
(b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
其中在第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號) (在一個特定實施例中，係獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)及在位置123處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，係獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，及在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 2之HCDR 2及SEQ ID NO: 3之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 5之LCDR 2及SEQ ID NO: 6之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)，及
(b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
其中在第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，係獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)及在位置123處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，係獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，及在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 7之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 8之HCDR 2及SEQ ID NO: 9之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 10之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 11之LCDR 2及SEQ ID NO: 12之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)，及
(b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
其中在第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，係獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)及在位置123處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，係獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，及在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
雙特異性抗原結合分子形式
根據本發明之雙特異性抗原結合分子之組分可呈各種構型彼此融合。示例性構型描繪於圖1A-Z中。
在特定實施例中，包含於雙特異性抗原結合分子中的抗原結合部分為Fab分子。在此等實施例中，該第一、第二、第三，等等抗原結合部分在本文中可分別稱為第一、第二、第三，等等Fab分子。
在一個實施例中，該雙特異性抗原結合分子之第一及第二抗原結合部分視需要經肽連接子彼此融合。在特定實施例中，該第一及第二抗原結合部分各為Fab分子。在此一實施例中，該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。在此另一實施例中，該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。在其中(i)第二抗原結合部分在Fab重鏈的C端處與第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合或(ii)第一抗原結合部分在Fab重鏈的C端處與第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合之實施例中，另外，第一抗原結合部分之該Fab輕鏈及第二抗原結合部分之該Fab輕鏈可視需要經肽連接子彼此融合。
尤其在期望靶細胞抗原與高親和力抗原結合部分結合後會內化之情況下，能夠特異性結合靶細胞抗原(諸如GPRC5D) (例如，如圖1A、1D、1G、1H、1K、1L中所顯示)的具有單個抗原結合部分之雙特異性抗原結合分子(諸如Fab分子)則適用。在此等情況中，存在超過一個對靶細胞抗原具有特異性之抗原結合部分即可以增強靶細胞抗原之內化，藉此降低其可利用性。
然而，在其他情況中，若雙特異性抗原結合分子包含對靶細胞抗原具有特異性之兩個或更多個抗原結合部分(諸如Fab分子) (參見顯示於圖1B、1C、1E、1F、1I、1J、1M或1N中之實例)則會有利，例如，可以最佳化靶向靶位點或允許靶細胞抗原交聯。
因此，在特定實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含第三抗原結合部分。
在一個實施例中，該第三抗原結合部分與第一抗原結合，即GPRC5D。在一個實施例中，該第三抗原結合部分為Fab分子。
在一個實施例中，該第三抗原部分與第一抗原結合部分相同。
該雙特異性抗原結合分子之第三抗原結合部分可包含本文所述的與結合GPRC5D之第一抗原結合部分及/或抗體相關之任何特徵(單獨或以組合方式)，除非在科學上明顯不合理或不可能。
在一個實施例中，該第三抗原結合部分包含重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 84之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3；及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3。
在一個實施例中，該第三抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 85之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)。
在一個實施例中，該第三抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)。
在一個實施例中，該第三抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 96之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)。
在一個實施例中，該第三抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 92之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)。
在一個實施例中，該第三抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 2之HCDR 2及SEQ ID NO: 4之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 5之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 6之LCDR 2及SEQ ID NO: 7之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)。
在一個實施例中，該第三抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 7之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 8之HCDR 2及SEQ ID NO: 9之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 10之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 11之LCDR 2及SEQ ID NO: 12之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)。
在一些實施例中，該第三抗原結合部分係(衍生自)人類化抗體。在一個實施例中，該VH為人類化VH及/或該VL為人類化VL。在一個實施例中，該第三抗原結合部分包含如任一上述實施例中之CDR，且進一步包含受體人類框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類一致框架。
在一個實施例中，第三抗原結合部分之該VH包含與選自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57及SEQ ID NO: 58之群之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及第三抗原結合部分之該VL包含選自SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63及SEQ ID NO: 64之群之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。
在一個實施例中，該第三抗原結合部分包含與選自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57及SEQ ID NO: 58之群之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之VH序列及與選自SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63及SEQ ID NO: 64之群之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之VL序列。
在一個實施例中，該第三抗原結合部分包含含有選自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57及SEQ ID NO: 58之群之胺基酸序列之VH及含有選自SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63及SEQ ID NO: 64之群之胺基酸序列之VL。
在一個實施例中，該第三抗原結合部分包含選自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 57及SEQ ID NO: 58之群之VH序列及SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 63及SEQ ID NO: 64之VL序列。
在一個特定實施例中，該第三抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該第三抗原結合部分包含SEQ ID NO: 13之VH序列及SEQ ID NO: 14之VL序列。
在一個特定實施例中，該第三抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該第三抗原結合部分包含SEQ ID NO: 15之VH序列及SEQ ID NO: 16之VL序列。
在一個特定實施例中，該第三抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該第三抗原結合部分包含SEQ ID NO: 48之VH序列及SEQ ID NO: 53之VL序列。
在一個特定實施例中，該第三抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該第三抗原結合部分包含SEQ ID NO: 49之VH序列及SEQ ID NO: 52之VL序列。
在一個特定實施例中，該第三抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該第三抗原結合部分包含SEQ ID NO: 57之VH序列及SEQ ID NO: 64之VL序列。
在一個特定實施例中，該第三抗原結合部分包含包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列之VL。在一個特定實施例中，該第三抗原結合部分包含SEQ ID NO: 58之VH序列及SEQ ID NO: 63之VL序列。
在一個實施例中，該第三抗原結合部分包含人類恆定區。在一個實施例中，該第三抗原結合部分為含有人類恆定區(特定言之人類CH1及/或CL域)之Fab分子。人類恆定域之示例性序列以SEQ ID NO 37及38(分別為人類卡帕及蘭姆達CL域)及SEQ ID NO: 39(人類IgG1 重鏈恆定域CH1-CH2-CH3)表示。在一些實施例中，該第三抗原結合部分包含含有與SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列(特定言之SEQ ID NO: 37之胺基酸序列)至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列之輕鏈恆定區。特定言之，該輕鏈恆定區可包含如本文中在「電荷修飾」下方所述的胺基酸突變且/或若在交換型Fab分子中可包括一或多個(特定言之兩個) N端胺基酸之缺失或取代。在一些實施例中，該第三抗原結合部分包含含有與包含於SEQ ID NO: 39之胺基酸序列中之CH1域序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列之重鏈恆定區。特定言之，該重鏈恆定區(尤其係CH1域)可包含如本文中在「電荷修飾」下方所述之胺基酸突變。
在特定實施例中，該第三及第一抗原結合部分各為Fab分子且該第三抗原結合部分係與該第一抗原結合部分相同。因此，在此等實施例中，該第一及第三抗原結合部分包含相同的重鏈及輕鏈胺基酸序列且具有相同的域配置(即習知或交換))。此外，在此等實施例中，該第三抗原結合部分包括與第一抗原結合部分相同之胺基酸取代(若有的話)。例如，本文描述為「電荷修飾」之胺基酸取代將在第一抗原結合部分及第三抗原結合部分中之各者之恆定域CL及恆定域CH1中進行。或者，該胺基酸取代可在第二抗原結合部分(其在特定實施例中亦為Fab分子)之恆定域CL及恆定域CH1中進行，但不在第一抗原結合部分及第三抗原結合部分之恆定域CL及恆定域CH1中進行。
類似於該第一抗原結合部分，特定言之，該第三抗原結合部分為習知Fab分子。然而，亦涵蓋其中該第一及第三抗原結合部分為交換型Fab分子(及該第二抗原結合部分為習知Fab分子)之實施例。因此，在特定實施例中，該第一及第三抗原結合部分各為習知Fab分子，及該第二抗原結合部分為如本文所述的交換型Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1彼此交換/置換。在其他實施例中，該第一及第三抗原結合部分各為交換型Fab分子及該第二抗原結合部分為習知Fab分子。
若存在第三抗原結合部分，則在特定實施例中該第一及第三抗原部分結合GPRC5D，及該第二抗原結合部分結合第二抗原，特定言之活化T細胞抗原，更特定言之CD3，最特定言之CD3 ε。
在特定實施例中，該雙特異性抗原結合分子包含由第一及第二亞單元組成之Fc域。該Fc域之第一及第二亞單元能夠穩定締合。
根據本發明之雙特異性抗原結合分子可具有不同構型，即第一、第二(及視需要第三)抗原結合部分可彼此融合且以不同方式與Fc域融合。該等組分可直接地或較佳經一或多個適宜肽連接子彼此融合。在Fab分子與Fc域之亞單元的N端融合之情況下，通常，融合係經免疫球蛋白鉸鏈區。
在一些實施例中，該第一及第二抗原結合部分各為Fab分子及該第二抗原結合分子係在Fab重鏈的C端處與Fc域之第一或第二亞單元的N端融合。在此等實施例中，該第一抗原結合部分可在Fab重鏈的C端處與第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合或與Fc域之亞單元中之另一者的N端融合。在此等特定實施例中，該第一抗原結合部分為習知Fab分子，及該第二抗原結合部分為如本文所述的交換型Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1彼此交換/置換。在其他此等實施例中，該第一Fab分子為交換型Fab分子及該第二Fab分子為習知Fab分子。
在一個實施例中，該第一及第二抗原結合部分各為Fab分子，該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與Fc域之第一或第二亞單元的N端融合，及該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。在一個特定實施例中，該雙特異性抗原結合分子基本上係由第一及第二Fab分子組成，該Fc域係由第一及第二亞單元、及視需要之一或多個肽連接子組成，其中該第一Fab分子係在Fab重鏈的C端處與第二Fab分子之Fab重鏈的N端融合，及該第二Fab分子係在Fab重鏈的C端處與Fc域之第一或第二亞單元的N端融合。此種構型示意性地描繪於圖1G及1K中(在此等實例中該第二抗原結合域為VH/VL交換型Fab分子)。視需要，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在另一個實施例中，該第一及第二抗原結合部分各為Fab分子及該第一及第二抗原結合部分各在Fab重鏈的C端處與Fc域之亞單元中之一者的N端融合。在一個特定實施例中，該雙特異性抗原結合分子基本上係由第一及第二Fab分子組成，該Fc域係由第一及第二亞單元、及視需要之一或多個肽連接子組成，其中該第一及第二Fab分子各自在Fab重鏈的C端處與Fc域之亞單元中之一者的N端融合。此種構型示意性地描繪於圖1A及1D中(在此等實例中，其中該第二抗原結合部分為VH/VL交換型Fab分子及該第一抗原結合部分為交換型Fab分子)。該第一及第二Fab分子可直接地或藉由肽連接子與Fc域融合。在一個特定實施例中，該第一及第二Fab分子各自藉由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域融合。在一個特定實施例中，特定言之在Fc域為IgG1 Fc域的情況下，該免疫球蛋白鉸鏈區為人類IgG1 鉸鏈區。
在一些實施例中，該第一及第二抗原結合部分各為Fab分子及該第一抗原結合分子係在Fab重鏈的C端處與Fc域之第一或第二亞單元的N端融合。在此等實施例中，該第二抗原結合部分可在Fab重鏈的C端處與第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合或(如以上所述)與Fc域之亞單元中之另一者的N端融合。在此等特定實施例中，該第一抗原結合部分為習知Fab分子，及該第二抗原結合部分為如本文所述的交換型Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1彼此交換/置換。在其他此等實施例中，該第一Fab分子為交換型Fab分子及該第二Fab分子為習知Fab分子。
在一個實施例中，該第一及第二抗原結合部分各為Fab分子，該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與Fc域之第一或第二亞單元的N端融合，及該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。在一個特定實施例中，該雙特異性抗原結合分子基本上係由第一及第二Fab分子組成，該Fc域係由第一及第二亞單元、及視需要之一或多個肽連接子組成，其中該第二Fab分子係在Fab重鏈的C端處與第一Fab分子之Fab重鏈的N端融合，及該第一Fab分子係在Fab重鏈的C端處與Fc域之第一或第二亞單元的N端融合。此種構型示意性地描繪於圖1H及1L中(在此等實例中，其中該第二抗原結合部分為VH/VL交換型Fab分子及該第一抗原結合部分為交換型Fab分子)。視需要，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在一些實施例中，第三抗原結合部分(特定言之第三Fab分子)係在Fab重鏈的C端處與Fc域之第一或第二亞單元的N端融合。在此等特定實施例中，該第一及第三Fab分子各為習知Fab分子，及該第二Fab分子為如本文所述的交換型Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1彼此交換/置換。在其他此等實施例中，該第一及第三Fab分子各為交換型Fab分子及該第二Fab分子為習知Fab分子。
在此一特定實施例中，該第二及第三抗原結合部分各自在Fab重鏈的C端處與Fc域之該等亞單元中之一者的N端融合，且該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與第二Fab分子之Fab重鏈的N端融合。在一個特定實施例中，該雙特異性抗原結合分子基本上係由第一、第二及第三Fab分子組成，該Fc域係由第一及第二亞單元、及視需要之一或多個肽連接子組成，其中該第一Fab分子係在Fab重鏈的C端處與第二Fab分子之Fab重鏈的N端融合，及該第二Fab分子係在Fab重鏈的C端處與Fc域之第一亞單元的N端融合，且其中該第三Fab分子係在Fab重鏈的C端處與Fc域之第二亞單元的N端融合。此種構型示意性地描繪於圖1B及1E中(在此等實例中，其中該第二抗原結合部分為VH/VL交聯Fab分子，及該第一及第三抗原結合部分為習知Fab分子)，且描繪於圖1J及1N中(在此等實例中，其中該第二抗原結合部分為習知Fab分子，及該第一及第三抗原結合分子為VH/VL交換型Fab分子)。該第二及第三Fab分子可直接地或藉由肽連接子與Fc域融合。在一個特定實施例中，該第二及第三Fab分子各自藉由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域融合。在一個特定實施例中，特定言之在Fc域為IgG1 Fc域的情況下，該免疫球蛋白鉸鏈區為人類IgG1 鉸鏈區。視需要，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在此另一實施例中，該第一及第三抗原結合部分各自在Fab重鏈的C端處與Fc域之亞單元中之一者的N端融合，及該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。在一個特定實施例中，該雙特異性抗原結合分子基本上係由第一、第二及第三Fab分子組成，該Fc域係由第一及第二亞單元、及視需要之一或多個肽連接子組成，其中該第二Fab分子係在Fab重鏈的C端處與第一Fab分子之Fab重鏈的N端融合，及該第一Fab分子係在Fab重鏈的C端處與Fc域之第一亞單元的N端融合，且其中該第三Fab分子係在Fab重鏈的C端處與Fc域之第二亞單元的N端融合。此種構型示意性地描繪於圖1C及1F中(在此等實例中，其中該第二抗原結合部分為VH/VL交聯Fab分子，及該第一及第三抗原結合部分為習知Fab分子)且描繪於圖1I及1M中(在此等實例中，其中該第二抗原結合部分為習知Fab分子，及該第一及第三抗原結合分子為VH/VL交換型Fab分子)。該第一及第三Fab分子可直接地或藉由肽連接子與Fc域融合。在一個特定實施例中，該第一及第三Fab分子各自藉由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域融合。在一個特定實施例中，特定言之在Fc域為IgG1 Fc域的情況下，該免疫球蛋白鉸鏈區為人類IgG1 鉸鏈區。視需要，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在雙特異性抗原結合分子之構型中，其中Fab分子係在Fab重鏈的C端處經免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域之亞單元之各者的N端融合，兩個Fab分子、鉸鏈區及Fc域基本上形成免疫球蛋白分子。在一個特定實施例中，該免疫球蛋白分子為IgG類免疫球蛋白。在一個甚至更特定的實施例中，該免疫球蛋白為IgG1 亞類免疫球蛋白。在另一個實施例中，該免疫球蛋白為IgG4 亞類免疫球蛋白。在另一個特定實施例中，該免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。在其他實施例中，該免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。在一個實施例中，該免疫球蛋白包含人類恆定區，特定言之人類Fc區。
在本發明之有些雙特異性抗原結合分子中，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈視需要經肽連接子彼此融合。根據第一及第二Fab分子之構型，第一Fab分子之Fab輕鏈可在其C端處與第二Fab分子之Fab輕鏈的N端融合，或第二Fab分子之Fab輕鏈可在其C端處與第一Fab分子之Fab輕鏈的N端融合。第一及第二Fab分子之Fab輕鏈之融合進一步減少不匹配的Fab重鏈及輕鏈的錯配，且亦減少表現本發明之有些雙特異性抗原結合分子所需的質體的數量。
抗原結合部分可與Fc域融合或直接地或經肽連接子彼此融合，該肽連接子包含一或多個胺基酸，通常，約2-20個胺基酸。肽連接子在本技術中係已知的且描述於本文中。適宜之非免疫原性肽連接子包括(例如)(G4 S)n 、(SG4 )n 、(G4 S)n 或G4 (SG4 )n 肽連接子。「n」通常為1至10(通常2至4)之整數。在一個實施例中，該肽連接子之長度為至少5個胺基酸，在一個實施例中長度為5至100個胺基酸，在另一個實施例中為10至50個胺基酸。在一個實施例中，該肽連接子為(GxS)n 或(GxS)n Gm ，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸，及(x = 3，n = 3、4、5或6，及m = 0、1、2或3)或(x = 4，n = 2、3、4或5及m = 0、1、2或3)，在一個實施例中，x = 4且n = 2或3，在另一個實施例中，x = 4且n = 2。在一個實施例中，該肽連接子為(G4 S)2 。用於將第一及第二Fab分子之Fab輕鏈彼此融合的特別適宜之肽連接子為(G4 S)2 。適於將第一及第二Fab片段之Fab重鏈連接的示例性肽連接子包含序列(D)-(G4 S)2 (SEQ ID NO 43及44)。此另一適宜連接子包含序列(G4 S)4 。另外，連接子可包括免疫球蛋白鉸鏈區(之一部分)。特定言之，在Fab分子與Fc域亞單元的N端融合之情況下，其可在有或無另一肽接子下經免疫球蛋白鉸鏈區或其部分融合。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈可變區係經輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區繼而與Fc域亞單元(VL(2) -CH1(2) -CH2-CH3(-CH4))共用羧基端肽鍵、及一種多肽，其中該第一Fab分子之Fab重鏈與Fc域亞單元(VH(1) -CH1(1) -CH2-CH3(-CH4))共用羧基端肽鍵。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CL(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基端肽。在某些實施例中，該等多肽係藉由(例如)二硫鍵共價連接。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈恆定區係經輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區繼而與Fc域亞單元(VH(2) -CL(2) -CH2-CH3(-CH4))共用羧基端肽鍵、及一種多肽，其中該第一Fab分子之Fab重鏈與Fc域亞單元(VH(1) -CH1(1) -CH2-CH3(-CH4))共用羧基端肽鍵。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(2) -CH1(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基端肽鍵。在某些實施例中，該等多肽係藉由(例如)二硫鍵共價連接。
在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈可變區係經輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區繼而與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈繼而與Fc域亞單元(VL(2) -CH1(2) -VH(1) -CH1(1) -CH2-CH3(-CH4))共用羧基端肽鍵。在其他實施例中，該雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區繼而與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈可變區係經輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區繼而與Fc域亞單元(VH(1) -CH1(1) -VL(2) -CH1(2) -CH2-CH3(-CH4))共用羧基端肽鍵。
在一些此等實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含第二Fab分子之交換型Fab輕鏈多肽，其中該第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CL(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基端肽。在其他此等實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區繼而與第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VH(2) -CL(2) -VL(1) -CL(1) )共用羧基端肽鍵、或一種多肽，其中第一Fab分子之Fab輕鏈多肽與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵，視情況，該第二Fab分子之Fab重鏈可變區繼而與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VL(1) -CL(1) -VH(2) -CL(2) )共用羧基端肽鍵。
根據此等實施例之雙特異性抗原結合分子可進一步包含(i)Fc域亞單元多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)一種多肽，其中第三Fab分子之Fab重鏈與Fc域亞單元(VH(3) -CH1(3) -CH2-CH3(-CH4))及第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3) -CL(3) )共用羧基端肽鍵。在某些實施例中，該等多肽係藉由(例如)二硫鍵共價連接。
在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈恆定區係經輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區繼而與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈繼而與Fc域亞單元(VH(2) -CL(2) -VH(1) -CH1(1) -CH2-CH3(-CH4))共用羧基端肽鍵。在其他實施例中，該雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區繼而與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈恆定區係經輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區繼而與Fc域亞單元(VH(1) -CH1(1) -VH(2) -CL(2) -CH2-CH3(-CH4))共用羧基端肽鍵。
在一些此等實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含第二Fab分子之交換型Fab輕鏈多肽，其中該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(2) -CH1(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基端肽。在其他此等實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區繼而與第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(2) -CH1(2) -VL(1) -CL(1) )共用羧基端肽鍵、或一種多肽，其中第一Fab分子之Fab輕鏈多肽與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵，視情況，該第二Fab分子之Fab重鏈可變區繼而與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VL(1) -CL(1) -VL(2) -CH1(2) )共用羧基端肽鍵。
根據此等實施例之雙特異性抗原結合分子可進一步包含(i)Fc域亞單元多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)一種多肽，其中第三Fab分子之Fab重鏈與Fc域亞單元(VH(3) -CH1(3) -CH2-CH3(-CH4))及第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3) -CL(3) )共用羧基端肽鍵。在某些實施例中，該等多肽係藉由(例如)二硫鍵共價連接。
在某些實施例中，該雙特異性抗原結合分子不包含Fc域。在此等特定實施例中，該第一及(若存在的話)第三Fab分子各為習知Fab分子，且該第二Fab分子為如本文所述的交換型Fab分子，即Fab分子，其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1彼此交換/置換。在此其他實施例中，該第一及(若存在的話)第三Fab分子各為交換型Fab分子及該第二Fab分子為習知Fab分子。
在此一實施例中，該雙特異性抗原結合分子基本上係由第一及第二抗原結合部分及視需要之一或多個肽連接子組成，其中該第一及第二抗原結合部分均為Fab分子及該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。此種構型示意性地描繪於圖1O及1S中(在此等實例中，其中該第二抗原結合部分為VH/VL交換型Fab分子及該第一抗原結合部分為交換型Fab分子)。
在此另一實施例中，該雙特異性抗原結合分子基本上係由第一及第二抗原結合部分及視需要之一或多個肽連接子組成，其中該第一及第二抗原結合部分均為Fab分子及該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。此種構型示意性地描繪於圖1P及1T中(在此等實例中，其中該第二抗原結合部分為VH/VL交換型Fab分子及該第一抗原結合部分為交換型Fab分子)。
在一些實施例中，該第一Fab分子係在Fab重鏈的C端處與第二Fab分子之Fab重鏈的N端融合，且該雙特異性抗原結合分子進一步包含第三抗原結合部分，特定言之第三Fab分子，其中該第三Fab分子係在Fab重鏈的C端處與第一Fab分子之Fab重鏈的N端融合。在某些該等實施例中，該雙特異性抗原結合部分基本上係由第一、第二及第三Fab分子及視需要之一或多個肽連接子組成，其中該第一Fab分子係在Fab重鏈的C端處與第二Fab分子之Fab重鏈的N端融合，及該第三Fab分子係在Fab重鏈的C端處與第一Fab分子之Fab重鏈的N端融合。此種構型示意性地描繪於圖1Q及1U中(在此等實例中，其中該第二抗原結合域為VH/VL交換型Fab分子及該第一及第三抗原結合部分各為習知Fab分子)，或描繪於圖1X及1Z中(在此等實例中，其中該第二抗原結合域為習知Fab分子及該第一及第三抗原結合部分各為VH/VL交換型Fab分子)。
在一些實施例中，該第二Fab分子係在Fab重鏈的C端處與第一Fab分子之Fab重鏈的N端融合，且該雙特異性抗原結合分子進一步包含第三抗原結合部分，特定言之第三Fab分子，其中該第三Fab分子係在Fab重鏈的N端處與第一Fab分子之Fab重鏈的C端融合。在某些該等實施例中，該雙特異性抗原結合部分基本上係由第一、第二及第三Fab分子及視需要之一或多個肽連接子組成，其中該第二Fab分子係在Fab重鏈的C端處與第一Fab分子之Fab重鏈的N端融合，及該第三Fab分子係在Fab重鏈的N端處與第一Fab分子之Fab重鏈的C端融合。此種構型示意性地描繪於圖1R及1V中(在此等實例中，其中該第二抗原結合域為VH/VL交聯Fab分子，及該第一及第三抗原結合部分各為習知Fab分子)，或描繪於圖1W及1Y中(在此等實例中，其中該第二抗原結合域為習知Fab分子，及該第一及第三抗原結合分子各為VH/VL交換型Fab分子)。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區繼而與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區(VH(1) -CH1(1) -VL(2) -CH1(2) )共用羧基端肽鍵(即該第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈可變區係經輕鏈可變區置換)。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CL(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基端肽。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈可變區係經輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區繼而與第一Fab分子之Fab重鏈(VL(2) -CH1(2) -VH(1) -CH1(1) )共用羧基端肽鍵。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CL(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基端肽。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈恆定區係經輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區繼而與第一Fab分子之Fab重鏈(VH(2) -CL(2) -VH(1) -CH1(1) )共用羧基端肽鍵。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(2) -CH1(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基端肽鍵。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈可變區係經輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區繼而與第一Fab分子之Fab重鏈(VL(2) -CH1(2) -VH(1) -CH1(1) )共用羧基端肽鍵。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CL(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基端肽。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中第三Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈繼而與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區繼而與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區(VH(3) -CH1(3) -VH(1) -CH1(1) -VL(2) -CH1(2) )共用羧基端肽鍵(即該第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該輕鏈可變區係經輕鏈可變區置換)。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CL(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基端肽。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3) -CL(3) )。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中第三Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈繼而與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區繼而與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(3) -CH1(3) -VH(1) -CH1(1) -VH(2) -CL(2) )共用羧基端肽鍵(即該第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該輕鏈恆定區係經輕鏈恆定區置換)。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(2) -CH1(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基端肽鍵。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3) -CL(3) )。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈可變區係經輕鏈可變區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區繼而與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈繼而與第三Fab分子之Fab重鏈(VL(2) -CH1(2) -VH(1) -CH1(1) -VH(3) -CH1(3) )共用羧基端肽鍵。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CL(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基端肽。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3) -CL(3) )。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈恆定區係經輕鏈恆定區置換)，該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區繼而與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab重鏈繼而與第三Fab分子之Fab重鏈(VH(2) -CL(2) -VH(1) -CH1(1) -VH(3) -CH1(3) )共用羧基端肽鍵。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(2) -CH1(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共用羧基端肽鍵。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3) -CL(3) )。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab輕鏈可變區繼而與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈可變區係經輕鏈可變區置換)，該第一Fab分子之Fab重鏈恆定區繼而與第三Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第三Fab分子之Fab輕鏈可變區繼而與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區(VH(2) -CH1(2) -VL(1) -CH1(1) -VL(3) -CH1(3) )共用羧基端肽鍵(即該第三Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈可變區係經輕鏈可變區置換)。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中該第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(1) -CL(1) )及第二Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(2) -CL(2) )共用羧基端肽。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中該第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(3) -CL(3) )共用羧基端肽。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中該第二Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab輕鏈可變區繼而與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈恆定區係經輕鏈恆定區置換)，該第一Fab分子之Fab重鏈恆定區繼而與第三Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第三Fab分子之Fab輕鏈可變區繼而與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CH1(2) -VH(1) -CL(1) -VH(3) -CL(3) )共用羧基端肽鍵(即該第三Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈恆定區係經輕鏈恆定區置換)。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(1) -CH1(1) )及第二Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(2) -CL(2) )共用羧基端肽鍵。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(3) -CH1(3) )共用羧基端肽鍵。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中該第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第三Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈可變區係經輕鏈可變區置換)，該第三Fab分子之Fab重鏈恆定區繼而與第一Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab輕鏈可變區繼而與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈可變區係經輕鏈可變區置換)，該第一Fab分子之Fab重鏈恆定區繼而與第二Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵(VL(3) -CH1(3) -VL(1) -CH1(1) -VH(2) -CH1(2) )。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中該第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(1) -CL(1) )及第二Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(2) -CL(2) )共用羧基端肽。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中該第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(3) -CL(3) )共用羧基端肽。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含一種多肽，其中該第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第三Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈恆定區係經輕鏈恆定區置換)，該第三Fab分子之Fab重鏈恆定區繼而與第一Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵，該第一Fab分子之Fab輕鏈可變區繼而與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(即該第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中該重鏈恆定區係經輕鏈恆定區置換)，該第一Fab分子之Fab重鏈恆定區繼而與第二Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵(VH(3) -CL(3) -VH(1) -CL(1) -VH(2) -CH1(2) )。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(1) -CH1(1) )及第二Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(2) -CL(2) )共用羧基端肽鍵。在一些實施例中，該雙特異性抗原結合分子進一步包含一種多肽，其中第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(3) -CH1(3) )共用羧基端肽鍵。
在一個特定實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 84之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此置換；
c) 結合第一抗原之第三抗原結合部分且與第一抗原結合部分相同；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分及c)中的該第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 85之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此置換；
c) 結合第一抗原之第三抗原結合部分且與第一抗原結合部分相同；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分及c)中的該第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此置換；
c) 結合第一抗原之第三抗原結合部分且與第一抗原結合部分相同；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分及c)中的該第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 96之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此置換；
c) 結合第一抗原之第三抗原結合部分且與第一抗原結合部分相同；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分及c)中的該第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 92之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此置換；
c) 結合第一抗原之第三抗原結合部分且與第一抗原結合部分相同；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分及c)中的該第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 2之HCDR 2及SEQ ID NO: 3之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 5之LCDR 2及SEQ ID NO: 6之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此置換；
c) 結合第一抗原之第三抗原結合部分且與第一抗原結合部分相同；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分及c)中的該第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 7之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 8之HCDR 2及SEQ ID NO: 9之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 10之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 11之LCDR 2及SEQ ID NO: 12之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此置換；
c) 結合第一抗原之第三抗原結合部分且與第一抗原結合部分相同；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分及c)中的該第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 84之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
(i) a)中的第一抗原結合部分及b)中的第二抗原結合部分各在Fab重鏈的C端處與c)下的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 85之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
(i) a)中的第一抗原結合部分及b)中的第二抗原結合部分各在Fab重鏈的C端處與c)下的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
(i) a)中的第一抗原結合部分及b)中的第二抗原結合部分各在Fab重鏈的C端處與c)下的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 96之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
(i) a)中的第一抗原結合部分及b)中的第二抗原結合部分各在Fab重鏈的C端處與c)下的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 92之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
(i) a)中的第一抗原結合部分及b)中的第二抗原結合部分各在Fab重鏈的C端處與c)下的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 2之HCDR 2及SEQ ID NO: 3之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 5之LCDR 2及SEQ ID NO: 6之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
(i) a)中的第一抗原結合部分及b)中的第二抗原結合部分各在Fab重鏈的C端處與c)下的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 7之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 8之HCDR 2及SEQ ID NO: 9之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 10之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 11之LCDR 2及SEQ ID NO: 12之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
(i) a)中的第一抗原結合部分及b)中的第二抗原結合部分各在Fab重鏈的C端處與c)下的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在根據本發明之雙特異性抗原結合分子之所有不同構型中，本文所述之胺基酸取代(若存在的話)可在第一及(若存在的話)第三抗原結合部分/Fab分子之CH1及CL域中，或在第二抗原結合部分/Fab分子之CH1及CL域中。較佳地，其等係在第一及(若存在的話)第三抗原結合部分/Fab分子之CH1及CL域中。根據本發明概念，若如本文所述之胺基酸取代係在第一(及若存在，第三)抗原結合部分/Fab分子中進行，則在第二抗原結合部分/Fab分子中不進行如此的胺基酸取代。相反，若如本文所述之胺基酸取代係在第二抗原結合部分/Fab分子中進行，則在第一(及若存在的話，第三)抗原結合部分/Fab分子中不進行如此的胺基酸取代。特定言之，胺基酸取代係在包含Fab分子之雙特異性抗原結合分子中進行，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH1彼此置換。
在根據本發明之雙特異性抗原結合分子之特定實施例中，特定言之，其中如本文所述中胺基酸取代係在第一(及若存在的話，第三)抗原結合部分/Fab分子中進行，第一(及若存在的話，第三)Fab分子之恆定域CL係卡帕同型物。在根據本發明之雙特異性抗原結合分子之其他實施例中，特定言之，其中如本文所述中胺基酸取代係在第二抗原結合部分/Fab分子中進行，第二抗原結合部分/Fab分子之恆定域CL係卡帕同型物。在一些實施例中，第一(及若存在的話，第三)抗原結合部分/Fab分子之恆定域CL及第二抗原結合部分/Fab分子之恆定域CL係卡帕同型物。
在一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 84之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與c)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與c)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 85之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與c)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與c)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號) (最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與c)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與c)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 96之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與c)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與c)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 92之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與c)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 2之HCDR 2及SEQ ID NO: 3之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 5之LCDR 2及SEQ ID NO: 6之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與c)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與c)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 7之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 8之HCDR 2及SEQ ID NO: 9之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 10之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 11之LCDR 2及SEQ ID NO: 12之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與c)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii)b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與c)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 84之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 結合第一抗原之第三抗原結合部分且與第一抗原結合部分相同；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分及c)中的該第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 85之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 結合第一抗原之第三抗原結合部分且與第一抗原結合部分相同；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分及c)中的該第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 結合第一抗原之第三抗原結合部分且與第一抗原結合部分相同；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分及c)中的該第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 96之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 結合第一抗原之第三抗原結合部分且與第一抗原結合部分相同；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分及c)中的該第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 92之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 結合第一抗原之第三抗原結合部分且與第一抗原結合部分相同；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分及c)中的該第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 2之HCDR 2及SEQ ID NO: 3之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 5之LCDR 2及SEQ ID NO: 6之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 結合第一抗原之第三抗原結合部分且與第一抗原結合部分相同；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分及c)中的該第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 7之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 8之HCDR 2及SEQ ID NO: 9之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 10之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 11之LCDR 2及SEQ ID NO: 12之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 結合第一抗原之第三抗原結合部分且與第一抗原結合部分相同；及
d) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中
(i) a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及c)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合，或
(ii) b)中的該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與a)中的第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及a)中的該第一抗原結合部分及c)中的該第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與d)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 84之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中a)中的第一抗原結合部分及b)中的第二抗原結合部分各在Fab重鏈的C端處與c)下的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 85之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中a)中的第一抗原結合部分及b)中的第二抗原結合部分各在Fab重鏈的C端處與c)下的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中a)中的第一抗原結合部分及b)中的第二抗原結合部分各在Fab重鏈的C端處與c)下的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 96之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH(VL)彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中a)中的第一抗原結合部分及b)中的第二抗原結合部分各在Fab重鏈的C端處與c)下的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 92之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中a)中的第一抗原結合部分及b)中的第二抗原結合部分各在Fab重鏈的C端處與c)下的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 2之HCDR 2及SEQ ID NO: 3之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 5之LCDR 2及SEQ ID NO: 6之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中a)中的第一抗原結合部分及b)中的第二抗原結合部分各在Fab重鏈的C端處與c)下的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
(a) 結合第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分為Fab分子，其包含包含SEQ ID NO: 7之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 8之HCDR 2及SEQ ID NO: 9之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 10之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 11之LCDR 2及SEQ ID NO: 12之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化T細胞抗原，特定言之CD3，更特定言之CD3 ε，及該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號) (最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及
其中a)中的第一抗原結合部分及b)中的第二抗原結合部分各在Fab重鏈的C端處與c)下的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
根據任何上述實施例，雙特異性抗原結合分子之組分(例如Fab分子、Fc域)可直接地或經述於本文中或本技術中已知的各種連接子(特定言之包含一或多個胺基酸(通常約2-20個胺基酸)之肽連接子)融合。適宜之非免疫原性肽連接子包括(例如)(G4 S)n 、(SG4 )n 、(G4 S)n 或G4 (SG4 )n 肽連接子，其中n通常為1至10 (通常2至4)之整數。
在一個特定態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
a) 結合第一抗原之第一及第三抗原結合部分；其中該第一抗原為GPRC5D及其中該第一及第二抗原結合部分各自為包含包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列之輕鏈可變區之(習知)Fab分子；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分；其中該第二抗原為CD3且其中該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換，其包含包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之輕鏈可變區；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
在a)中的第一及第三抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號) (最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一及第三抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；
且其中，此外
a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及a)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與c)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在一個特定態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其包含
a) 結合第一抗原之第一及第三抗原結合部分；其中該第一抗原為GPRC5D及其中該第一及第二抗原結合部分各為包含包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列之輕鏈可變區之(習知)Fab分子；
b) 結合第二抗原之第二抗原結合部分；其中該第二抗原為CD3及其中該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此置換，其包含包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之輕鏈可變區；
c) 由第一及第二亞單元組成之Fc域；
其中
在a)中的第一及第三抗原結合部分之恆定域CL中，在位置124處的胺基酸係經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最尤其地，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)中的第一及第三抗原結合部分之恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；
及其中，此外
a)中的該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與b)中的該第二個抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，及b)中的該第二抗原結合部分及a)中的第三抗原結合部分各自係在Fab重鏈的C端處與c)中的Fc域之亞單元中之一者的N端融合。
在根據本發明該態樣之一個實施例中，在Fc域之第一亞單元中，在位置366處的蘇胺酸殘基係經色胺酸殘基(T366W)置換，及在Fc域之第二亞單元中，在位置407處的酪胺酸殘基係經纈胺酸殘基(Y407V)置換，及視情況，在位置366處的蘇胺酸殘基係經絲胺酸殘基(T366S)置換及在位置368處的白胺酸殘基係經丙胺酸殘基(L368A)置換(根據Kabat EU索引編號)。
在根據本發明該態樣之另一個實施例中，在Fc域之第一亞單元中，另外，在位置354處的絲胺酸殘基係經半胱胺酸殘基(S354C)置換或在位置356處的麩胺酸殘基係經半胱胺酸殘基(E356C)置換(特定言之，在位置354處的絲胺酸係經半胱胺酸殘基置換)，及在Fc域之第二亞單元中，另外，在位置349處的酪胺酸殘基係經半胱胺酸殘基(Y349C)置換(根據Kabat EU索引編號)。
在根據本發明該態樣之又另一個實施例中，在Fc域之第一及第二亞單元中之各者中，在位置234處的白胺酸殘基係經丙胺酸殘基(L234A)置換，在位置235處的白胺酸殘基係經丙胺酸殘基(L235A)置換及在位置329處的脯胺酸殘基係經甘胺酸殘基(P329G)置換(根據Kabat EU索引編號)。
在根據本發明該態樣之又另一個實施例中，該Fc域為人類IgG1 Fc域。
在特定的具體實施例中，該雙特異性抗原結合分子包含含有與SEQ ID NO: 17之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽、含有與SEQ ID NO: 18之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽、含有與SEQ ID NO: 19之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽及含有與SEQ ID NO: 20之序列至少至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽。在另一個特定的具體實施例中，該雙特異性抗原結合分子包含包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列之多肽、包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列之多肽、包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列之多肽及包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列之多肽。
在另一個特定實施例中，該雙特異性抗原結合分子包含含有與SEQ ID NO: 21之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽、含有與SEQ ID NO: 22之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽、含有與SEQ ID NO: 23之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽及含有與SEQ ID NO: 24之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽。在另一個特定實施例中，該雙特異性抗原結合分子包含包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列之多肽、包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列之多肽、包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之多肽及包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之多肽。
Fc 域
在特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含由第一及第二亞單元組成之Fc域。應理解，本文所述之與雙特異性抗原結合分子有關之Fc域之特徵可同樣適用於包含於本發明之抗體中之Fc域。
該雙特異性抗原結合分子之Fc域係由包含免疫球蛋白分子之重鏈域之一對多肽鏈組成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子之該Fc域為二聚物，其每個亞單元包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定域。該Fc域之兩個亞單元能夠彼此穩定締合。在一個實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含不超過一個Fc域。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子之該Fc域為IgG Fc域。在一個特定實施例中，該Fc域為IgG1 Fc域。在另一個實施例中，該Fc域為IgG4 Fc域。在一個更特定的實施例中，該Fc域為包含在位置S228(Kabat EU索引編號)處的胺基酸取代(特定言之胺基酸取代S228P)之IgG4 Fc域。該胺基酸取代減少IgG4 抗體之體內Fab臂交換(參見Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38，84-91 (2010))。在另一個特定實施例中，該Fc域為人類Fc域。在一個甚至更特定的實施例中，該Fc域為人類IgG1 Fc域。人類IgG1 Fc區之示例性序列以SEQ ID NO: 42給出。
促進異二聚化之 Fc 域修飾
根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含不同抗原結合部分，其可與Fc域之兩個亞單元中之一者或另一者融合，藉此該Fc域之兩個亞單元通常包含於兩個不相同的多肽鏈中。此等多肽之重組共表現及隨後之二聚化導致兩個多肽之若干可能的組合。為提高重組生產中雙特異性抗原結合分子之產率及純度，因此有利的係在雙特異性抗原結合分子之Fc域中引入促進所需多肽締合之修飾。
因此，在特定實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子之Fc域包括促進Fc域之第一及第二亞單元締合之修飾。人類IgG Fc域之兩個亞單元之間的最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用的位點係在Fc域之CH3域中。因此，在一個實施例中，該修飾係在Fc域之CH3域中。
存在用於在Fc域之CH3域中進行修飾以實施異二聚化的幾種方法，該等方法詳述於(例如) WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291中。通常，在所有此等方法中，Fc域之第一亞單元之CH3域及Fc域之第二亞單元之CH3域均以互補方式工程化，使得每個CH3域(或包含其之重鏈)不能再與其自身同源二聚化，但強制與經互補工程化之其他CH3域進行異二聚化(使得該第一及第二CH3域異二聚化且在兩個第一或第二CH3域之間不形成同源二聚物)。用於改良重鏈異二聚化之此等不同方法被認為係與雙特異性抗原結合分子中之重鏈-輕鏈修飾(例如在一個结合臂中之VH及VL交換/置換及在CH1/CL介面中引入具有相反電荷之帶電胺基酸之取代)組合之不同替代物，該等修飾減少重鏈/輕鏈失配及本瓊氏副產物。
在一個特定實施例中，促進Fc域之第一及第二亞單元之締合之修飾係所謂的「結入孔」修飾，包括在Fc域之兩個亞單元中之一者中之「結」修飾及在Fc域之兩個亞單元中之另一者中之孔修飾。
結入孔技術描述於(例如)US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9，617-621 (1996)及Carter，J Immunol Meth 248，7-15 (2001)中。一般而言，該方法係關於在第一多肽之介面處引入突起(「結」)及在第二多肽之介面中引入對應之空腔(「孔」)，使得突起可定位在空腔中以促進異二聚物之形成但阻礙同二聚物之形成。藉由從具有較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)之第一多肽之介面置換小型胺基酸側鏈來建構突起。藉由以較小者(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大型胺基酸側鏈，在第二多肽之介面中產生與突起相同或類似尺寸之補償腔。
因此，在一個特定實施例中，在雙特異性抗原結合分子之Fc域之第一亞單元之CH3域中，某一胺基酸殘基係經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，藉此在第一亞單元之CH3域內產生突起，該突起可定位在第二亞單元之CH3域內的空腔中，及在Fc域之第二亞單元之CH3域中，某一胺基酸殘基係經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，藉此在第二亞單元之CH3域內產生空腔，第一亞單元之CH3域內的突起係可定位於該空腔中。
較佳地，具有較大側鏈體積之該胺基酸殘基係選自由精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)組成之群。
較佳地，具有較小側鏈體積之該胺基酸殘基係選自由丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)組成之群。
突起及空腔可藉由改變編碼多肽之核酸來製備，例如，藉由定點誘變或藉由肽合成。
在一個特定實施例中，在Fc域之第一亞單元(「結」亞單元)的(CH3域)中，在位置366處的蘇胺酸殘基係經色胺酸殘基(T366W)置換，及在Fc域之第二亞單元(「孔」亞單元)的(CH3域)中，在位置407處的酪胺酸殘基係經纈胺酸殘基(Y407V)置換。在一個實施例中，在Fc域之第二亞單元中，另外，在位置366處的蘇胺酸殘基係經絲胺酸殘基(T366S)置換及在位置368處的白胺酸殘基係經丙胺酸殘基(L368A)置換(根據Kabat EU索引編號)。
在又另一個實施例中，在Fc域之第一亞單元中，另外，在位置354處的絲胺酸殘基係經半胱胺酸殘基(S354C)置換或在位置356處的麩胺酸殘基係經半胱胺酸殘基(E356C)置換(特定言之，在位置354處的絲胺酸係經半胱胺酸殘基置換)，及在Fc域之第二亞單元中，另外，在位置349處的酪胺酸殘基係經半胱胺酸殘基(Y349C)置換(根據Kabat EU索引編號)。引入此兩個半胱胺酸殘基導致在Fc域之兩個亞單元之間形成二硫橋，進一步穩定化二聚物(Carter，J Immunol Methods 248，7-15 (2001))。
在一個特定實施例中，該Fc域之第一亞單元包含胺基酸取代S354C及T366W，及該Fc域之第二亞單元包含胺基酸取代Y349C、T366S、L368A及Y407V(根據Kabat EU索引編號)。
在一個特定實施例中，結合第二抗原(例如活化T細胞抗原)之抗原結合部分係融合(視需要藉由結合GPRC5D之第一抗原結合部分、及/或肽連接子)至Fc域之第一亞單元(包含「結」修飾)。在不希望受理論約束下，將結合第二抗原(例如活化T細胞抗原)之抗原結合部分與Fc域之含結亞單元融合將(進一步)使得包含結合活化T細胞抗原之兩個抗原結合部分之抗原結合分子之產生(兩個含結多肽之空間衝突)最小化。
用於實施異二聚化之CH3-修飾之其他技術被認為係根據本發明之替代技術且描述於(例如) WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中。
在一個實施例中，替代地使用描述於EP 1870459中之異二聚化方法。該方法係基於在Fc域之兩個亞單元之間的CH3/CH3域介面中在特定胺基酸位置處引入具有相反電荷之帶電胺基酸。用於本發明雙特異性抗原結合分子之一個較佳實施例為在兩個CH3域中之一者(Fc域)中之胺基酸突變R409D；K370E及在Fc域之CH3域中之另一者中之胺基酸突變D399K；E357K(根據Kabat EU索引編號)。
在另一個實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含在Fc域之第一亞單元之CH3域中之胺基酸突變T366W及在Fc域之第二亞單元之CH3域中之胺基酸突變T366S、L368A、Y407V，及另外，在Fc域之第一亞單元之CH3域中之胺基酸突變R409D；K370E及在Fc域之第二亞單元之CH3域中之胺基酸突變D399K；E357K(根據Kabat EU索引編號)。
在另一個實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含在Fc域之第一亞單元之CH3域中之胺基酸突變S354C、T366W及在Fc域之第二亞單元之CH3域中之胺基酸突變Y349C、T366S、L368A、Y407V，或該雙特異性抗原結合分子包含在Fc域之第一亞單元之CH3域中之胺基酸突變Y349C、T366W及在Fc域之第二亞單元之CH3域中之胺基酸突變S354C、T366S、L368A、Y407V，及另外，在Fc域之第一亞單元之CH3域中之胺基酸突變R409D；K370E及在Fc域之第二亞單元之CH3域中之胺基酸突變D399K；E357K(根據Kabat EU索引進行所有編號)。
在一個實施例中，替代地使用描述於WO 2013/157953中之異二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變T366K及第二CH3域包含胺基酸突變L351D(根據Kabat EU索引編號)。在另一個實施例中，該第一CH3域包含進一步的胺基酸突變L351K。在另一個實施例中，該第二CH3域包含選自Y349E、Y349D及L368E(較佳L368E) (根據Kabat EU索引編號)之另一胺基酸突變。
在一個實施例中，替代地使用描述於WO 2012/058768中之異二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變L351Y、Y407A及第二CH3域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一個實施例中，該第二CH3域進一步包含在位置T411、D399、S400、F405、N390或K392處的胺基酸突變，該等突變(例如)係選自a) T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W，b) D399R、D399W、D399Y或D399K，c) S400E、S400D、S400R或S400K，d) F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W，e) N390R、N390K或N390D，f) K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E(根據Kabat EU索引編號)。在另一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變L351Y、Y407A及第二CH3域包含胺基酸突變T366V、K409F。在另一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變Y407A及第二CH3域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一個實施例中，該第二CH3域進一步包含胺基酸突變K392E、T411E、D399R及S400R(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，替代地使用描述於WO 2011/143545中之異二聚化方法，例如，在選自由368及409(根據Kabat EU索引編號)組成之群之位置處進行胺基酸修飾。
在一個實施例中，替代地使用描述於WO 2011/090762中之異二聚化方法，其亦使用以上所述之結入孔技術。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變T366W及第二CH3域包含胺基酸突變Y407A。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變T366Y及第二CH3域包含胺基酸突變Y407T(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，該雙特異性抗原結合分子或其Fc域為IgG2 亞類且替代地使用描述於WO 2010/129304中之異二聚化方法。
在一個替代實施例中，促進Fc域之第一及第二亞單元之締合之修飾包括介導靜電轉向效應之修飾，例如，如PCT公開案WO 2009/089004中所述。通常，該方法係關於藉由帶電胺基酸殘基在兩個Fc域亞單元之介面處置換一或多個胺基酸殘基，使得同二聚物之形成變得靜電上係不利的，但異二聚化係靜電上有利的。在此一實施例中，第一CH3域包含K392或N392之藉由帶負電荷的胺基酸之胺基酸取代(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，較佳地，K392D或N392D)及第二CH3域包含D399、E356、D356或E357之藉由帶帶正電荷的胺基酸之胺基酸取代(例如離胺酸(K)或精胺酸(R)，較佳地，D399K、E356K、D356K或E357K，且更佳地，D399K及E356K)。在另一個實施例中，該第一CH3域進一步包含K409或R409之藉由帶負電荷的胺基酸之胺基酸取代(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，較佳地，K409D或R409D)。在另一個實施例中，該第一CH3域進一步或替代性地包含K439及/或K370之藉由帶負電荷的胺基酸之胺基酸取代(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D))(所有編號均係根據Kabat EU索引)。
在又另一個實施例中，替代地使用描述於WO 2007/147901中之異二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變K253E、D282K及K322D及第二CH3域包含胺基酸突變D239K、E240K及K292D(根據Kabat EU索引編號)。
在又另一個實施例中，可替代地使用描述於WO 2007/110205中之異二聚化方法。
在一個實施例中，該Fc域之第一亞單元包含胺基酸取代K392D及K409D，及該Fc域之第二亞單元包含胺基酸取代D356K及D399K(根據Kabat EU索引編號)。
Fc 域修飾減少 Fc 受體結合及 / 或效應功能
Fc域賦予雙特異性抗原結合分子(或抗體)有利之藥物動力學性質，包括有助於在靶組織中良好累積之長血清半衰期及有利的組織-血液分配比。然而，同時，其可導致雙特異性抗原結合分子(或抗體)非所欲靶向表現Fc受體之細胞，而不係攜帶較佳抗原之細胞。此外，Fc受體信號傳導途徑之共活化可導致細胞激素釋放，其與T細胞活化性質(例如，在其中第二抗原結合部分結合活化T細胞抗原之雙特異性抗原結合分子之實施例中)及雙特異性抗原結合分子之長半衰期組合，導致細胞激素受體之過度活化及對全身投與之嚴重副作用由於T細胞(例如)被NK細胞潛在地破壞，除T細胞之外(攜帶Fc受體之)的免疫細胞之活化可甚至降低雙特異性抗原結合分子(特定言之，其中第二抗原結合部分結合活化T細胞抗原之雙特異性抗原結合分子)之功效。
因此，在特定實施例中，與天然IgG1 Fc域相比，根據本發明之雙特異性抗原結合分子之Fc域展示對Fc受體之結合親和力降低及/或效應功能減少。在此一實施例中，該Fc域(或包含該Fc域之雙特異性抗原結合分子)展示與天然IgG1 Fc域(或包含天然 IgG1 Fc域之雙特異性抗原結合分子)相比小於50%，較佳小於20%，更佳小於10%且最佳小於5%之對Fc受體之結合親和力，且/或與天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域之雙特異性抗原結合分子)相比小於50%，較佳小於20%，更佳小於10%且最佳小於5%之效應功能。在一個實施例中，該Fc域(或包含該Fc域之雙特異性抗原結合分子)實質上不結合Fc受體且/或誘導效應功能。在一個特定實施例中，該Fc受體為Fcγ受體。在一個實施例中，該Fc受體為人類Fc受體。在一個實施例中，該Fc受體為活化Fc受體。在一個特定實施例中，該Fc受體為活化人類Fcγ受體，更特定言之人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之人類FcγRIIIa。在一個實施例中，該效應功能為選自CDC、ADCC、ADCP及細胞激素分泌之群之一者或多者。在一個特定實施例中，該效應功能為ADCC。在一個實施例中，與天然IgG1 Fc域相比，該Fc域展示實質上類似的對新生兒Fc受體(FcRn)之結合親和力。當Fc域(或包含該Fc域之雙特異性抗原結合分子)展示天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域之雙特異性抗原結合分子)對FcRn之結合親和力的大於約70%、特定言之大於約80%，更特定言之大於約90%時，達成對FcRn之實質上類似的結合。
在某些實施例中，與非工程化Fc域相比，Fc域被設計為具有減小的對Fc受體之結合親和力及/或減少的效應功能。在特定實施例中，該雙特異性抗原結合分子之Fc域包括一或多處氨基酸突變，該等突變減小Fc域對Fc受體之結合親和力及/或效應功能。通常，該相同的一或多處胺基酸突變存在於Fc域之兩個亞單元中之各者中。在一個實施例中，該胺基酸突變減小Fc域對Fc受體之結合親和力。在一個實施例中，該胺基酸突變減小Fc域對Fc受體之結合親和力至少2倍、至少5倍或至少10倍。在因超過一處胺基酸突變而減小Fc域對Fc受體之結合親和力之實施例中，此等胺基酸突變之組合可減小Fc域對Fc受體之結合親和力至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一個實施例中，與包含非工程化Fc域之雙特異性抗原結合分子相比，包含工程化Fc域之雙特異性抗原結合分子展示對Fc受體之結合親和力小於20%、特定言之小於10%、更特定言之小於5%。在一個特定實施例中，該Fc受體為Fcγ受體。在一些實施例中，該Fc受體為人類Fc受體。在一些實施例中，該Fc受體為活化Fc受體。在一個特定實施例中，該Fc受體為活化人類Fcγ受體，更特定言之人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之人類FcγRIIIa。較佳地，減少對此等各受體之結合。在一些實施例中，亦降低對補體組分之結合親和力，特定言之對C1q之結合親和力。在一個實施例中，並未降低對新生兒Fc受體(FcRn)之結合親和力。當Fc域(或包含該Fc域之雙特異性抗原結合分子)展示對FcRn之結合親和力為Fc域之非工程化形式(或包含Fc域之該非工程化形式之雙特異性抗原結合分子)的約70%以上時，即達成對FcRn之實質上類似的結合性，亦即保留Fc域對該受體之結合親和力。Fc域或包含該Fc域之本發明之雙特異性抗原結合分子可展示大於約80%及甚至大於約90%之此種親和力。在某些實施例中，與非工程化Fc域相比，雙特異性抗原結合分子之該Fc域經工程改造成為具有降低之效應功能。降低之效應功能可包括(但不限於)以下一或多者：減少補體依賴性細胞毒性(CDC)、減少由抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、減少抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、減少細胞激素分泌、減少免疫複合體所介導呈現抗原之細胞攝入抗原、減少與NK細胞結合、減少與巨噬細胞結合、減少與單核細胞結合、減少與多形核細胞結合、減少直接信號傳導誘導之細胞凋亡、減少靶結合的抗體之交聯、減少樹突細胞成熟、或減小T細胞激發作用。在一個實施例中，減少之效應功能係選自減小CDC、減小ADCC、減小ADCP及減小細胞激素分泌之群之一或多者。在一個特定實施例中，減小之效應功能係減小ADCC。在一個實施例中，減小之ADCC係小於由非工程化Fc域(或包含非工程化Fc域之雙特異性抗原結合分子)誘導之ADCC之20%。
在一個實施例中，減小Fc域對Fc受體之結合親和力及/或降低效應功能之胺基酸突變係胺基酸取代。在一個實施例中，該Fc域包含在選自E233、L234、L235、N297、P331及P329(根據Kabat EU索引的編號)之群之位置處的胺基酸取代。在一個更特定的實施例中，該Fc域包含在選自L234、L235及P329(根據Kabat EU索引編號)之群之位置處的胺基酸取代。在一些實施例中，該Fc域包含胺基酸取代L234A及L235A(根據Kabat EU索引編號)。在此一實施例中，該Fc域為IgG1 Fc域，特定言之人類IgG1 Fc域。在一個實施例中，該Fc域包含在位置P329處的胺基酸取代。在一個更特定的實施例中，該胺基酸取代為P329A或P329G，特定言之P329G(根據Kabat EU索引編號)。在一個實施例中，該Fc域包含在位置P329處的胺基酸取代及在選自E233、L234、L235、N297及P331(根據Kabat EU索引編號)之群之位置處的另一胺基酸取代。在一個更特定的實施例中，該另一胺基酸取代為E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定實施例中，該Fc域包括在位置P329、L234及L235(根據Kabat EU索引編號)處的胺基酸取代。在更特定的實施例中，該Fc域包括胺基酸突變L234A、L235A及P329G(「P329G LALA」、「PGLALA」或「LALAPG」)。具體而言，在特定實施例中，該Fc域之每個亞單元包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G(Kabat EU索引編號)，即在Fc域之第一及第二亞單元之各者中，在位置234處的白胺酸殘基係經丙胺酸殘基(L234A)置換，在位置235處的白胺酸殘基係經丙胺酸殘基(L235A)置換，在位置329處的脯胺酸殘基係經甘胺酸殘基(P329G)置換(根據Kabat EU索引編號)。
在此一實施例中，該Fc域為IgG1 Fc域，特定言之人類IgG1 Fc域。胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全消除人類IgG1 Fc域之Fcγ受體(及補體)結合，如PCT公開案第WO 2012/130831號中所述，該案之全文係以引用的方式併入本文中。WO 2012/130831亦描述製備此等突變體Fc域之方法及用於確定其性質(諸如Fc受體結合或效應功能)之方法。
與IgG1 抗體相比，IgG4 抗體展示減小的對Fc受體之結合親和力及降低的效應功能。因此，在一些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子之Fc域為IgG4 Fc域，特定言之人類IgG4 Fc域。在一個實施例中，該IgG4 Fc域包含在位置S228處的胺基酸取代，特定言之胺基酸取代S228P(根據Kabat EU索引編號)。為進一步減小其對Fc受體之結合親和力及/或其效應功能，在一個實施例中，IgG4 Fc域包含在位置L235處的胺基酸取代，特定言之胺基酸取代L235E(根據Kabat EU索引編號)。在另一個實施例中，IgG4 Fc域包含在位置P329處的胺基酸取代，特定言之胺基酸取代P329G(根據Kabat EU索引編號)。在一個特定實施例中，IgG4 Fc域包含在位置S228、L235及P329處的胺基酸取代，特定言之胺基酸取代S228P、L235E及P329G(根據Kabat EU索引編號)。此等IgG4 Fc域突變體及其Fcγ受體結合性質描述於PCT公開案第WO 2012/130831中，該案之全文係以引用的方式併入本文中。
在一個特定實施例中，與天然IgG1 Fc域相比，展示降低的對Fc受體之結合親和力及/或降低的效應功能之Fc域為包含胺基酸取代L234A、L235A及視需要之P329G之人類IgG1 Fc域、或包含胺基酸取代S228P、L235E及視需要之P329G之人類IgG4 Fc域(根據Kabat EU索引的編號)。
在某些實施例中，已消除Fc域之N-醣基化。在此一實施例中，該Fc域包含在位置N297處的胺基酸突變，特定言之藉由丙胺酸(N297A)或天冬胺酸(N297D)置換天冬醯胺酸之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。
除了上文及PCT公開案第WO 2012/130831號中所述的Fc域外，具有降低的Fc受體結合及/或效應功能之Fc域亦包括彼等具有Fc域殘基238、265、269、270、297、327及329中之一者或多者之取代之Fc域(美國專利第6,737,056號)(根據Kabat EU索引編號)。此等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變體，包括將殘基265及297取代為丙胺酸之所謂的「DANA」 Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
可使用本技術中熟知的遺傳或化學方法藉由胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備突變體Fc域。遺傳方法可包括編碼DNA序列之定點誘變、PCR、基因合成及類似。可(例如)藉由定序來驗證正確的核苷酸變化。
例如，藉由ELISA，或藉由表面電漿子共振(SPR)，使用標準儀器(諸如BIAcore儀器(GE Healthcare))及Fc受體(諸如可藉由重組表現獲得)，可容易地確定對Fc受體之結合。或者，可使用已知可表現特定Fc受體之細胞系(諸如表現FcγIIIa受體之人類NK細胞)評估Fc域或包含Fc域之雙特異性抗原結合分子對Fc受體之結合親和力。
Fc域或包含Fc域之雙特異性抗原結合分子之效應功能可藉由本技術中已知的方法測定。用於評估所述分子之ADCC活性之體外分析之實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人 Proc Natl Acad Sci USA 83，7059-7063 (1986)及Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82，1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人，J Exp Med 166，1351-1361 (1987)中。或者，可使用非放射性分析方法(參見，例如，ACTI™ non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96® non-radioactive cytotoxicity assay (Promega，Madison, WI))。用於此等分析的可用之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可體內評估所述分子之ADCC活性，例如，在(諸如)揭示於Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95，652-656 (1998)中之動物模型中。
在一些實施例中，降低Fc域對補體組分(特定言之C1q)之結合。因此，在其中Fc域被設計為具有降低的效應功能之一些實施例中，該減少的效應功能包括減小的CDC。可進行C1q結合分析以確定Fc域或包含Fc域之雙特異性抗原結合分子是否能夠結合C1q且因此具有CDC活性。參見(例如)WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可進行CDC分析(參見，例如，Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202，163 (1996)；Cragg等人，Blood 101，1045-1052 (2003)；及Cragg及Glennie，Blood 103，2738-2743 (2004))。
亦可使用本技術中已知的方法進行FcRn結合及體內清除率/半衰期測定(參見，例如，Petkova, S.B.等人，Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929)。
聚核苷酸
本發明進一步提供編碼如本文所述的抗體或雙特異性抗原結合分子或其片段之分離的聚核苷酸。在一些實施例中，該片段為抗原結合片段。
編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子之聚核苷酸可表現為編碼整個抗體或雙特異性抗原結合分子之單個聚核苷酸或表現為經共表現之多個(例如，兩個或更多個)聚核苷酸。藉由經共表現之聚核苷酸編碼之多肽可藉由(例如)二硫鍵或其他方式締合以形成功能性抗體或雙特異性抗原結合分子。例如，抗體或雙特異性抗原結合分子之輕鏈部分可藉由來自抗體或雙特異性抗原結合分子之部分之包含該抗體或雙特異性抗原結合分子之重鏈之單個聚核苷酸編碼。當共表現時，該等重鏈多肽將與輕鏈多肽締合以形成抗體或雙特異性抗原結合分子。在另一個實例中，包含兩個Fc域亞單元中之一者及視需要之一或多個Fab分子(之部分)之抗體或雙特異性抗原結合分子之部分可藉由來自抗體或雙特異性抗原結合分子之部分之包含兩個Fc域亞單元中之另一者及視需要之Fab分子(之部分)之單個聚核苷酸編碼。當共表現時，該等Fc域亞單元將締合以形成Fc域。
在一些實施例中，分離的聚核苷酸編碼如本文所述的根據本發明之整個抗體或雙特異性抗原結合分子。在其他實施例中，分離的聚核苷酸編碼包含於如本文所述的根據本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子中之多肽。
在某些實施例中，該聚核苷酸或核酸為DNA。在其他實施例中，本發明之聚核苷酸為(例如)呈信使RNA(mRNA)形式之RNA。本發明之RNA可係單鏈或雙鏈的。
重組方法
可(例如)藉由固態肽合成(例如Merrifield固相合成)或重組生產獲得本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子。就重組生產而言，分離編碼(例如)如上文所述之抗體或雙特異性抗原結合分子(片段)之一或多種聚核苷酸且插入至用於在宿主細胞中進一步選殖及/或表現之一或多個載體中。可使用習知程序容易地分離此種聚核苷酸並定序。在一個實施例中，提供包含一或多個本發明聚核苷酸之載體(較佳表現載體)。可使用熟習此項技術者熟知的方法以構建包含抗體或雙特異性抗原結合分子(片段)之編碼序列及適宜轉錄/轉譯控制信號之表現載體。此等方法包括體外重組DNA技術、合成技術及體內重組/遺傳重組。參見，例如，描述於Maniatis等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y. (1989)；及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y (1989)中之技術。表現載體可為質體、病毒之部分，或可為核酸片段。該表現載體包含基因表現盒，於該基因表現盒中，編碼抗體或雙特異性抗原結合分子(片段)之聚核苷酸(即編碼區)係以與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件以可操作方式締合之方式選殖。如本文所用，「編碼區」為核酸之一部分，其係由轉譯成胺基酸之密碼子組成。雖然「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)未轉譯成胺基酸，但其可被認為係編碼區之部分(若存在的話)，但任何側懸序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'非轉譯區及類似)不係編碼區之部分。兩個或更多個編碼區可存在於單個聚核苷酸構築體中，例如，在單個載體上或存在於各別聚核苷酸構築體中，例如在各別(不同)載體上。此外，任何載體可包含單個編碼區，或可包含兩個或更多個編碼區，例如，本發明之載體可編碼一或多個多肽，其係藉由蛋白水解裂解後轉譯或共轉譯分離成最終蛋白質。另外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼融合或未融合至編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子(片段)之聚核苷酸或其變異體或衍生物之異源編碼區。異源編碼區包括(但不限於)特定元件或基元，諸如分泌信號肽或異源功能域。可操作之締合係在基因產物(例如多肽)之編碼區與一或多個調節序列締合使得該基因產物之表現置於該(等)調節序列之影響或控制下之時。若啟動子功能之誘導導致編碼所需基因產物之mRNA之轉錄及若兩個DNA片段之間之連接之性質不干擾表現調節序列導引基因產物之表現之能力或干擾DNA模板被轉錄之能力，則該等兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其締合之啟動子)係「以可操作方式締合」的。因此，若啟動子能夠影響核酸之轉錄，則啟動子區將與編碼多肽之該核酸以可操作方式締合。該啟動子可為細胞特異性啟動子，其僅在預定細胞中導引DNA之實質轉錄。除啟動子外，其他轉錄控制元件(例如增強子、操作子、抑制子及轉錄終止信號)可與聚核苷酸以可操作方式締合以導引細胞特異性轉錄。本文揭示適宜之啟動子及其他轉錄控制區。熟習此項技術者已知各種轉錄控制區。此等包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用之轉錄控制區，例如(但不限於)來自巨細胞病毒(例如，與內含子-A締合之立即早期啟動子)、猿猴病毒40(例如早期啟動子)及逆轉錄病毒(諸如(例如)勞氏(Rous)肉瘤病毒)之啟動子及增強子區段。其他轉錄控制區包括彼等衍生自脊椎動物基因(諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β-球蛋白)之轉錄控制區以及能夠控制真核細胞中基因表現之其他序列。其他適宜之轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子以及誘導型啟動子(例如啟動子可誘導之四環素)。類似地，熟習此項技術者已知各種轉譯控制元件。此等包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子及衍生自病毒系統(特定言之內部核糖體進入位點(或IRES)，亦稱為CITE序列)之元件。基因表現盒亦可包含其他特徵，諸如複製起點、及/或染色體整合元件(諸如逆轉錄病毒長末端重複序列(LTR)或腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR))。
本發明之聚核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌肽或信號肽之額外編碼區締合，該等額外編碼區係導引藉由本發明之聚核苷酸編碼之多肽之分泌。例如，若需要分泌抗體或雙特異性抗原結合分子，則可將編碼信號序列之DNA置於編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子或其片段之核酸的上游。根據信號假設，藉由哺乳動物細胞分泌之蛋白質具有信號肽或分泌前導序列，一旦開始跨過粗內質網輸出生長蛋白質鏈，其立刻裂解自成熟蛋白。熟習此項技術者知曉藉由脊椎動物細胞分泌之多肽通常具有與多肽的N端融合之信號肽，其自經轉譯之多肽裂解以產生多肽之分泌或「成熟」形式。在某些實施例中，使用天然信號肽(例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽)或該序列之功能性衍生物(其保留導引與其以可操作方式締合之多肽之分泌之能力)。或者，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能性衍生物。例如，野生型前導序列可經人類組織纖溶酶原活化物(TPA)或小鼠β-葡萄糖苷酸酶之前導序列取代。
編碼可用於促進後來的純化(例如組胺酸標籤)或協助標記抗體或雙特異性抗原結合分子之短蛋白質序列之DNA可包含於編碼聚核苷酸之抗體或雙特異性抗原結合分子(片段)的內部或末端。
在另一個實施例中，提供包含本發明之一或多種聚核苷酸之宿主細胞。在某些實施例中，提供包含本發明之一或多種載體之宿主細胞。該等聚核苷酸及載體可分別包含文所述的與聚核苷酸及載體相關之任何特徵(單獨地或呈組合形式)。在此一實施例中，宿主細胞包含一或多種載體(例如已藉由其轉化或轉染)，該載體包含編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子(之部分)之一或多種聚核苷酸。如本文所用，術語「宿主細胞」係指可經工程化以產生本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子或其片段之任何類型之細胞系統。本技術中熟知適於複製且適於支持抗體或雙特異性抗原結合分子之表現之宿主細胞。可視需要藉由特定表現載體轉染或轉導此等細胞且可生長包含細胞之大量載體以用於接種大型發酵罐來獲得足夠數量之抗體或雙特異性抗原結合分子以用於臨床應用。適宜之宿主細胞包括原核微生物，諸如大腸桿菌(E. coli )或各種真核細胞(諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或類似)。例如，在細菌中，特定言之在不需要醣基化時，可產生多肽。表現後，可在可溶性部分中從細菌細胞糊分離多肽且可進一步純化。除了原核生物之外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)為用於編碼多肽之載體之適宜選殖或表現宿主，包括其醣基化途徑已經「人類化」導致產生具有部分或完全人體醣基化形式之多肽之真菌及酵母菌株。參見Gerngross，Nat Biotech 22，1409-1414 (2004)，Li等人，Nat Biotech 24，210-215 (2006)。用於表現(經醣基化之)多肽之適宜宿主細胞亦係衍生自多細胞生物(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑定可與昆蟲細胞結合使用(特定言之用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞)之許多桿狀病毒株。植物細胞培養亦可用作宿主。參見(例如)美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述用於在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM 技術)。脊椎動物細胞亦可用作宿主。例如，適於生長在懸浮液中之哺乳動物細胞系可係有用的。可用之哺乳動物宿主細胞系之其他實例為藉由SV40轉化之猴腎CV1細胞系(COS-7)；人胚腎細胞系(293或293T細胞，如(例如)Graham等人，J Gen Virol 36，59 (1977)中所述)、幼倉鼠腎細胞(BHK)、小鼠sertoli細胞(TM4細胞，如(例如)Mather，Biol Reprod 23，243-251 (1980)中所述)、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人子宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK)、水牛大鼠肝細胞(BRL 3A)、人肺細胞(W138)、人肝細胞(Hep G2)、小鼠乳腺腫瘤細胞(MMT 060562)、TRI細胞(如(例如)Mather等人，Annals N.Y. Acad Sci 383，44-68 (1982)中所述)、MRC 5細胞及FS4細胞。其他可用之哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr- CHO細胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77，4216 (1980))；及骨髓瘤細胞系，諸如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。關於適用於蛋白質生產之某些哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見，例如，Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷 (B.K.C. Lo編，Humana Press，Totowa, NJ)，第255頁至第268頁(2003)。宿主細胞包括培養的細胞，例如，哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞，僅舉幾例而言，但亦包括包含於轉殖基因動物、轉殖基因植物或培養的植物或動物組織中之細胞。在一個實施例中，該宿主細胞為真核細胞，較佳係哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。
本技術中已知在此等系統中表現外源基因之標準技術。表現包含抗原結合域之重鏈或輕鏈之多肽(例如抗體)之細胞可經工程化以便亦表現該等抗體鏈中之另一者，使得經表現之產物為同時具有重鏈及輕鏈之抗體。
在一個實施例中，提供產生根據本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子之方法，其中該方法包括在適於表現抗體或雙特異性抗原結合分子之條件下培養包含編碼如本文所提供的抗體或雙特異性抗原結合分子之聚核苷酸之宿主細胞，且視需要自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體或雙特異性抗原結合分子。
本發明之雙特異性抗原結合分子(或抗體)之組分可彼此以遺傳方式融合。可設計雙特異性抗原結合分子使得其組分彼此直接融合或藉由連接子序列間接融合。該連接子之組成及長度可根據本技術中熟知的方法測定且可測試功效。本文提供雙特異性抗原結合分子之不同組分之間的連接子序列之實例。若需要，亦可包含額外序列以併入裂解位點來分離融合之個別組分，例如肽鏈內切酶識別序列。
本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子通常至少包含能夠結合抗原決定子之抗體可變區。可變區可形成天然或非天然生成之抗體及其片段之部分且衍生自其。本技術中熟知產生多株抗體及單株抗體之方法(參見(例如)Harlow及Lane，「Antibodies, a laboratory manual」，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。非天然生成之抗體可使用固相-肽合成進行構建，可重組地產生(例如，如美國專利第4,186,567號中所述)，或可(例如)藉由篩選包含可變重鏈及可變輕鏈之組合庫來獲得(參見(例如)美國專利第5,969,108號，McCafferty)。
抗體、抗體片段、抗原結合域或可變區之任何動物物種可用於本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子中。可用於本發明中之非限制性抗體、抗體片段、抗原結合域或可變域可係鼠類、靈長類動物或人類來源。若該抗體或雙特異性抗原結合分子意欲用於人類，則可使用抗體之嵌合形式，其中該抗體之恆定區係來自人類。可根據本技術中熟知的方法來製備抗體之人類化或完全人類形式亦(參見(例如)美國專利第5,565,332號，Winter)。可藉由各種方法達成人類化，包括(但不限於) (a)將非人類(例如，供體抗體)CDR移植至保留或不保留關鍵框架殘基(例如，彼等對於保留良好的抗原結合親和力或抗體功能具有重要意義之框架殘基)之人類(例如受體抗體)框架及恆定區上，(b)僅將非人類特異性決定區(SDR或a-CDR；對於抗體-抗原相互作用具有關鍵性之殘基)移植至人體框架及恆定區上，或(c)移植整個非人類可變域，但藉由置換表面殘基而以類人類部份「覆蓋」其等。人類化抗體及製造其等之方法可參見(例如)Almagro及Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)，且進一步描述於(例如)Riechmann等人，Nature 332:323-329 (1988)；Queen等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36:25-34 (2005) (描述特異性決定區(SDR)移植)；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (描述「表面重塑」)；Dall’Acqua等人，Methods 36:43-60 (2005) (描述「FR重排」)；及Osbourn等人，Methods 36:61-68 (2005)及Klimka等人，Br. J. Cancer，83:252-260 (2000) (描述FR重排之「導引選擇」方法)中。可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(參見，例如，Sims等人 J. Immunol 151:2296 (1993))；衍生自輕鏈或重鏈可變區之特定子集之人類抗體之一致序列之框架區(參見，例如，Carter等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89:4285 (1992)；及Presta等人 J. Immunol.，151:2623 (1993))；人類成熟(體細胞突變)框架區或人類生殖系框架區(參見，例如，Almagro及Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))；及藉由篩選FR庫衍生之框架區(參見，例如，Baca等人，J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及Rosok等人，J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996))。
可使用本技術中已知的各種技術生產人體抗體。人體抗體大體上描述於van Dijk及van de Winkel，Curr Opin Pharmacol 5，368-74 (2001)及Lonberg，Curr Opin Immunol 20，450-459 (2008)中。人體抗體可藉由將免疫原投與轉殖基因動物來製備，該轉殖基因動物已經修飾以響應抗原攻毒產生具有人類可變區之完整人體抗體或完整抗體。此等動物通常包含人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，其等置換內源性免疫球蛋白基因座，或其等係在染色體外存在或隨機整合至動物染色體中。在此等轉殖基因小鼠中，該內源性免疫球蛋白基因座通常已經失活。關於自轉殖基因動物獲得人體抗體之方法的綜述，參見Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。亦可參見(例如)美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，描述XENOMOUSETM 技術；美國專利第5,770,429號，描述HuMab®技術；美國專利第7,041,870號，描述K-M MOUSE®技術，及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，描述VelociMouse®技術)。可進一步修飾由此等動物產生的完整抗體之人類可變區，(例如)藉由與不同人類恆定區組合。
人體抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。已描述用於生產人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系。(參見，例如，Kozbor J. Immunol.，133: 3001 (1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51頁至第63頁(Marcel Dekker, Inc.，New York，1987)；及Boerner等人，J. Immunol.，147: 86 (1991)。)藉由人類B細胞融合瘤技術產生的人體抗體亦描述於Li等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，103:3557-3562 (2006)。其他方法包括彼等描述於(例如)美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞系生產人類單株IgM抗體)及Ni，Xiandai Mianyixue，26(4):265-268 (2006) (描述人類-人類融合瘤)中之方法。人類融合瘤技術(Trioma technology)亦描述於Vollmers及Brandlein，Histology and Histopathology，20(3):927-937 (2005)以及Vollmers及Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3):185-91 (2005)中。
如本文所述，人體抗體亦可藉由自人抗體庫分離來產生。
可藉由篩選組合庫分離可用於本發明中之抗體中的具有所需活性或活性之抗體。用於篩選組合庫之方法在(例如)Lerner等人 Nature Reviews 16:498-508 (2016)中進行綜述。例如，本技術中已知多種方法用來產生噬菌體展示庫且篩選此等庫中的具有所需結合特性之抗體。此等方法在(例如)Frenzel等人，mAbs 8:1177-1194 (2016)；Bazan等人 Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012)及Zhao等人，Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016)以及Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien等人編，Human Press，Totowa, NJ，2001)及Marks及Bradbury Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo編，Human Press，Totowa, NJ，2003)中進行綜述。
在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)分別選殖VH及VL基因之譜系且在噬菌體庫中隨機重組，然後可篩選該等噬菌體中的抗原結合噬菌體，如Winter等人 Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994)中所述。噬菌體通常展示呈單鏈Fv (scFv)片段或Fab片段之抗體片段。來自免疫化來源之庫提供對免疫原具有高親和力之抗體，而無需構建融合瘤。或者，可(例如，自人類)選殖天然譜系以提供多種非自身亦及自身抗原之抗體之單一來源，而無需任何免疫化，如Griffiths等人 EMBO Journal 12: 725-734 (1993)中所述。最後，亦可藉由選殖來自幹細胞之未經重排之V基因片段，且使用包含隨機序列之PCR引物以編碼高度可變CDR3區並完成體外重排，來合成製備天然庫，如Hoogenboom及Winter，Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992)中所述。描述人類抗體噬菌體庫之專利公開案包括(例如)：美國專利第5,750,373號；第7,985,840號；第7,785,903號及第8,679,490號以及美國專利公開案第2005/0079574號、第2007/0117126號、第2007/0237764號及第2007/0292936號。用於篩選具有所需活性或活性之抗體之組合庫的本技術中已知的方法之其他實例包括核糖體及mRNA展示、以及用於細菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞上之抗體展示及篩選之方法。用於酵母表面展示之方法在(例如)Scholler等人，Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012)及Cherf等人 Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015)以及Zhao等人 Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012)中進行綜述。用於核糖體展示之方法描述於(例如)He等人，Nucleic Acids Research 25:513.2-5134 (1997)及Hanes等人 PNAS 94:4937-4942 (1997)中。
如本文所述製備的抗體或雙特異性抗原結合分子可藉由本技術已知的技術純化，諸如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、尺寸排除層析及類似。用於純化特定蛋白質之實際條件將部分地取決於諸如以下之因素：淨電荷、疏水性、親水性等，且對於熟習此項技術者而言係顯而易見的。就親和層析純化而言，可使用抗體或雙特異性抗原結合分子所結合的抗體、配位體、受體或抗原。例如，就本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子之親和層析純化而言，可使用具有蛋白質A或蛋白質G之基質。連續蛋白質A或G親和層析及尺寸排除層析可用於分離大體上如實施例中所述之抗體或雙特異性抗原結合分子。抗體或雙特異性抗原結合分子之純度可藉由任何多種熟知的分析方法來確定，包括凝膠電泳、高壓液相層析及類似。
檢定
本文所提供的抗體或雙特異性抗原結合分子可藉由本技術中已知的各種檢定識別、篩選或表徵其物理/化學性質及/或生物活性。
親和力檢定
抗體或雙特異性抗原結合分子對Fc受體或靶抗原之親和力可(例如)藉由表面電漿子共振(SPR)，使用標準儀器(諸如BIAcore儀器(GE Healthcare))及受體或靶蛋白(諸如可藉由重組表現獲得)來確定。或者，可使用表現特定受體或靶抗原之細胞系，例如藉由流式細胞術(FACS)，來評估抗體或雙特異性抗原結合分子對不同受體或靶抗原之結合。以下描述用於測量結合親和力之特定說明性及示例性實施例。
根據一個實施例，在25℃下，藉由表面電漿子共振，使用BIACOREâ T100機器(GE Healthcare)，來測定KD 。
為分析Fc-部分與Fc受體之間的相互作用，經His標記之重組Fc受體被固定在CM5晶片上之抗-Penta His抗體(Qiagen)捕獲且雙特異性構築體係用作分析物。簡言之，根據供應商說明書，藉由N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5，GE Healthcare)。用10 mM乙酸鈉(pH 5.0)稀釋抗Penta-His抗體至40 μg/ml，然後以5 μl/min之流速注射，以獲得約6500反應單位(RU)之偶聯蛋白質。注射配位體後，注入1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。隨後，以4或10 nM捕獲Fc受體60秒。就動力學測定而言，在25°C下將抗體或雙特異性抗原結合分子之四倍連續稀釋液(範圍在500 nM與4000 nM之間)以30 μl/min之流速歷時120秒注入HBS-EP(GE Healthcare，10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%表面活性劑P20，pH 7.4)中。
為確定對靶抗原之親和力，抗體或雙特異性抗原結合分子被固定在如針對抗Penta-His抗體所述的經活化之CM5-感測器晶片表面上之抗人類Fab特異性抗體(GE Healthcare)捕獲。偶聯蛋白質之最終量為約12000 RU。歷時90秒以300 nM捕獲抗體或雙特異性抗原結合分子。該等靶抗原在250至1000 nM之濃度範圍下以30 μl/min之流速通過流動細胞180秒。監測解離180秒。
藉由減去在參考流動細胞上獲得之反應來校正體積折射率差。穩態反應用於藉由朗繆爾(Langmuir)結合等溫線之非線性曲線擬合推導出解離常數KD 。藉由同時擬合締合及解離感應圖，使用簡單一對一朗繆爾結合模型(BIACORE® T100 Evaluation Software version 1.1.1)，計算得締合速率(kon )及解離速率(koff )。平衡解離常數(KD )經計算為比率koff /kon 。參見，例如，Chen等人，J Mol Biol 293，865-881 (1999)。
活性檢定
如實例中所述，可藉由各種檢定測量本發明之雙特異性抗原結合分子(或抗體)之生物活性。生物活性可(例如)包括誘導T細胞之增殖、誘導T細胞中之信號傳導、誘導T細胞中活化標記之表現、藉由T細胞誘導細胞激素分泌、誘導靶細胞(諸如腫瘤細胞)之裂解、及誘導腫瘤消退及/或改善存活期。
組合物、調配物及投藥途徑
在另一個態樣中，本發明提供(例如)用於任何下述治療方法中的包含本文所提供的任何抗體或雙特異性抗原結合分子之醫藥組合物。在一個實施例中，醫藥組合物包含本文所提供的任何抗體或雙特異性抗原結合分子及醫藥上可接受之載劑。在另一個實施例中，醫藥組合物包含本文所提供的任何抗體或雙特異性抗原結合分子及(例如)如下文所述的至少一種額外治療劑。
進一步提供產生呈適於體內投與之形式的本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子之方法，該方法包括(a)獲得根據本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子，及(b)用至少一種醫藥上可接受之載劑調配抗體或雙特異性抗原結合分子，藉此調配得用於體內投與之抗體或雙特異性抗原結合分子之製劑。
本發明之醫藥組合物包含溶解或分散在醫藥上可接受之載劑中的治療有效量之抗體或雙特異性抗原結合分子。詞語「醫藥或藥理學上可接受」係指在所用劑量及濃度下通常對接受者無毒(即當視情況投與動物(諸如(例如)人類)時不產生不利、過敏或其他不良反應)之分子實體及組合物。熟習此項技術者根據本發明已知包含抗體或雙特異性抗原結合分子及視需要之額外活性成分之醫藥組合物之製劑，如Remington之Pharmaceutical Sciences，第18版Mack Printing Company，1990中所列舉，該案係以引用的方式併入本文中。此外，就動物(例如人類)投與而言，應理解該等製劑應滿足FDA生物標準辦公室或其他國家相應權威機構所要求的無菌、致熱原性、一般安全性及純度標準。較佳之組合物為凍乾調配物或水溶液。如本文所用，「醫藥上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、緩沖劑、分散介質、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、抗氧化劑、蛋白質、藥物、藥物穩定劑、聚合物、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、嬌味劑、染料、諸如此類之物質及其組合，如熟習此項技術者將已知(參見，例如，Remington之Pharmaceutical Sciences，第18版Mack Printing Company，1990，第1289頁至第1329頁，其以引用的方式併入本文中)。除非任何習知載劑與活性成分不相容，否則考慮其在治療性或醫藥組合物中之用途。
本發明之免疫共軛物(及任何額外治療劑)可藉由任何適宜方法投與，包括非經腸、肺內及鼻內、及若需要用於局部治療之病灶內投與。非經腸輸註包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。給藥可藉由任何適宜途徑，例如藉由注射，諸如靜脈內注射或皮下注射，部分取決於投藥係短暫或長期性的。
非經腸式組合物包括彼等設計用於藉由注射(例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹腔內注射)投與之組合物。就注射而言，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子可在水溶液中，較佳在生理上可相容之緩衝液(例如漢克氏溶液(Hanks' solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理鹽水緩衝液)中調配。該溶液可包含調配劑，例如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，該等抗體或雙特異性抗原結合分子可呈粉末形式，適於在使用前用適宜媒劑(例如無菌無熱原水)復水。視需要，藉由將本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子以所需量與下文所列舉的各種其他成分併入適宜溶劑中，來製備無菌可注射溶液。例如，藉由濾過無菌過濾膜可容易地達成無菌性。通常，藉由將各種無菌化活性成分併入至包含基础分散介質及/或其他成分之無菌媒劑中來製備分散液。就用於製備無菌可注射溶液、懸浮液或乳液之無菌粉末而言，較佳之製備方法係真空乾燥或冷凍乾燥技術，該等技術產生活性成分加上來自其先前經無菌過濾之液體培養基之任何額外所需成分之粉末。若需要，應適當地緩衝液體培養基，且在註射前用足量的鹽水或葡萄糖先使液體稀釋劑等滲。該組合物在製造及儲存之條件下必須係穩定的，且防止微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用。應理解，內毒素污染應保持在安全水平的最低限度，例如，低於0.5 ng/mg蛋白質。適宜之醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)：緩沖液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；氯化苄二甲烴銨；氯化本索寧；酚醇、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)之多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如鋅-蛋白質複合體)；及/或非離子表面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可包含增加懸浮液黏度之化合物，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、葡聚糖或類似。視情況，該懸浮液亦可包含適宜之穩定劑或增加化合物溶解度以允許製備高度濃縮溶液之試劑。另外，活性化合物之懸浮液可製備成適宜之油性注射懸浮液。適宜之親油性溶劑或媒劑包括脂肪油(諸如芝麻油)或合成性脂肪酸酯(諸如油酸乙酯或三酸甘油酯)或脂質體。
活性成分可包埋在(例如)藉由凝聚技術或藉由介面聚合製備的微膠囊中，例如，分別在膠態藥物遞送系統中或在粗乳液中之羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)。此等技術揭示於Remington之Pharmaceutical Sciences (第18版Mack Printing Company，1990)中。可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適宜實例包括包含多肽之固體疏水性聚合物之半透性基質，該基質係呈成型物件(例如膜或微膠囊)形式。在特定實施例中，可注射之組合物之吸收之延長可藉由在延遲吸收之試劑(例如(例如)單硬脂酸鋁、明膠或其組合)之組合物中使用來達成。
除了前面所述的組合物之外，該等抗體或雙特異性抗原結合分子亦可調配成儲積製劑。此等長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內)或藉由肌肉內注射投與。因此，例如，該等抗體或雙特異性抗原結合分子可用適宜聚合性或疏水性材料(例如，呈乳液形式，含於可接受之油中)或離子交換樹脂調配，或調配成微溶性衍生物，例如，調配成微溶性鹽。
可通過習知混合、溶解、乳化、囊封、包埋或冷凍乾燥製程來製備包含本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子之醫藥組合物。可依習知方法使用一或多種生理上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑(其等有助於將蛋白質加工成可醫藥上使用之製劑)來調配醫藥組合物。恰當之調配係取決於所選擇的投藥途徑。
可將抗體或雙特異性抗原結合分子調配成呈游離酸或鹼、中性或鹽形式之組合物。醫藥上可接受之鹽為實質上保留游離酸或鹼之生物活性之鹽。此等包括酸加成鹽，例如，彼等與蛋白質組合物之游離胺基形成之鹽，或其等係與無機酸(諸如(例如)鹽酸或磷酸、或有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸))形成。與游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼，諸如(例如)氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)。與對應之游離鹼形式相比，醫藥用鹽傾向於更易溶於水性溶劑及其他質子溶劑中。
治療方法及組合物
本文所提供的任何抗體或雙特異性抗原結合分子可用於治療方法中。本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子可(例如)在治療癌症中用作免疫治療劑。
就在治療方法中使用而言，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子將以與良好醫療實踐一致之方式調配、給藥並投與。在此情況中應考慮的因素包括所治療之特定疾病、所治療之特定哺乳動物、個別病患之臨床條件、疾病之病因、藥劑之遞送位置、投藥方法、投藥計劃及醫師已知之其他因素。
在一個態樣中，提供本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子，其係用作藥物。在其他態樣中，提供本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子，其係用於治療疾病。在某些實施例中，提供本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子，其係用於治療方法中。在一個實施例中，本發明提供如本文所述之抗體或雙特異性抗原結合分子，其係用於治療有此需要的個體之疾病。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有疾病的個體之方法中之抗體或雙特異性抗原結合分子，該方法包括對個體投與治療有效量之抗體或雙特異性抗原結合分子。在某些實施例中，待治療的疾病為增生性疾病。在一個特定實施例中，該疾病為癌症。在某些實施例中，該方法進一步包括對個體投與治療有效量之至少一種額外治療劑，例如，抗癌劑，在待治療的疾病為癌症之情況下。在其他實施例中，本發明提供如本文所述的抗體或雙特異性抗原結合分子，其係用於誘導靶細胞(特定言之腫瘤細胞)裂解。在某些實施例中，本發明提供抗體或雙特異性抗原結合分子，其係用於誘導個體之靶細胞(特定言之腫瘤細胞)裂解之方法中，該方法包括對該個體投與有效量之抗體或雙特異性抗原結合分子以誘導靶細胞裂解。根據任何上述實施例之「個體」為哺乳動物，較佳係人類。在某些實施例中，待治療的疾病為自體免疫疾病，特定言之全身性紅斑狼瘡及/或類風濕關節炎。由自反應漿細胞產生致病性自身抗體係自身免疫疾病之標誌。因此，GPRC5D可用於靶向自身免疫疾病中之自反應漿細胞。
在另一個態樣中，本發明提供一種以本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子於製造或製備藥物中之用途。在一個實施例中，該藥物係用於治療有此需要的個體之疾病。在另一個實施例中，該藥物係用於治療疾病之方法中，該方法包括對患有該疾病的個體投與治療有效量之藥物。在某些實施例中，待治療的疾病為增生性疾病。在一個特定實施例中，該疾病為癌症。在一個實施例中，該方法進一步包括對個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑，例如，抗癌劑，在待治療的疾病為癌症的情況下。在另一個實施例中，該藥物係用於誘導靶細胞(特定言之腫瘤細胞)裂解。在又另一個實施例中，該藥物係用於誘導個體靶細胞(特定言之腫瘤細胞)裂解之方法中，該方法包括對個體投與有效量之藥物以誘導靶細胞裂解。根據任何上述實施例之「個體」可為哺乳動物，較佳係人類。
在另一個態樣中，本發明提供治療疾病之方法。在一個實施例中，該方法包括對患有此種疾病的個體投與治療有效量之本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，對該個體投與包含呈醫藥上可接受形式之本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子之組合物。在某些實施例中，待治療的疾病為增生性疾病。在一個特定實施例中，該疾病為癌症。在某些實施例中，該方法進一步包括對個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑，例如，抗癌劑，在待治療的疾病為癌症的情況下。根據任何上述實施例之「個體」可為哺乳動物，較佳係人類。
在另一個態樣中，本發明提供用於誘導靶細胞(特定言之腫瘤細胞)裂解之方法。在一個實施例中，該方法包括在T細胞(特定言之細胞毒性T細胞)之存在下使靶細胞與本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子接觸。在另一個態樣中，提供一種用於誘導個體中靶細胞(特定言之腫瘤細胞)裂解之方法。在此一實施例中，該方法包括對個體投與有效量之抗體或雙特異性抗原結合分子以誘導靶細胞裂解。在一個實施例中，「個體」為人。
在某些實施例中，待治療的疾病為增生性疾病，特定言之癌症。癌症之非限制性實例包括膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌及腎癌。可使用本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子治療的其他細胞增生性疾病包括(但不限於)位於以下部位之腫瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系統、肝臟、胰腺、腹膜、內分泌腺(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭頸部、神經系統(中央及周邊)、淋巴系統、骨盤、皮膚、軟組織、脾臟、胸部及泌尿生殖系統。亦包括癌前條件或病灶及癌症轉移。在某些實施例中，該癌症係選自由腎癌、膀胱癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳腺癌、腦癌、頭頸癌及前列腺癌組成之群。在一個實施例中，該癌症為前列腺癌。熟習此項技術者很容易認識到，在許多情況中，該抗體或雙特異性抗原結合分子可能無法提供治愈，但可僅提供部分益處。在一些實施例中，具有一些益處之生理變化亦被認為係治療上有益的。因此，在一些實施例中，提供生理變化之抗體或雙特異性抗原結合分子的量被認為係「有效量」或「治療有效量」。需要治療之受試者、患者或個體通常為哺乳動物，更特定言之人類。
在一些實施例中，將有效量之本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子投與細胞。在其他實施例中，將治療有效量之本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子投與個體以治療疾病。
為預防或治療疾病，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子之適宜劑量(當單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病之類型、投藥途徑、患者之體重、抗體或雙特異性抗原結合分子之類型、疾病之嚴重度及病程、抗體或雙特異性抗原結合分子是否出於預防性或治療性目的投與、既往或並發治療性干預、患者的臨床病史及對抗體或雙特異性抗原結合分子之反應、及主治醫師之判斷。無論如何，負責投藥之從業人員將確定組合物中活性成分之濃度及用於個別受試者之適宜劑量。本文涵蓋各種給藥方案，包括(但不限於)在不同時間點之單次或多次投藥、推注投藥及脈衝輸註。
該抗體或雙特異性抗原結合分子適於一次性或在一系列治療中投與患者。根據疾病之類型及嚴重度，約1 μg/kg至15 mg/kg(例如0.1 mg/kg至10 mg/kg)抗體或雙特異性抗原結合分子可為用於投與患者之初始候選劑量，例如，不論藉由一或多次單獨投藥或藉由連續輸註。根據以上提及的因素，一個典型日劑量可在約1 µg/kg至100 mg/kg或更大之範圍內。就在數天或更長時間重複投與而言，根據病情，通常將持續治療直至發生所需的疾病症狀抑制。抗體或雙特異性抗原結合分子之一個示例性劑量範圍為約0.005 mg/kg至約10 mg/kg。在其他非限制性實例中，劑量亦可包括每次投與約1微克/kg體重、約5微克/kg體重、約10微克/kg體重、約50微克/kg體重、約100微克/kg體重、約200微克/kg體重、約350微克/kg體重、約500微克/kg體重、約1毫克/kg體重、約5毫克/kg體重、約10毫克/kg體重、約50毫克/kg體重、約100毫克/kg體重、約200毫克/kg體重、約350毫克/kg體重、約500毫克/kg體重，至約1000 mg/kg體重或更大、及其中衍生之任何範圍。在可自本文所列數字導出之範圍之非限制性實例中，可投與約5 mg/kg體重至約100 mg/kg體重、約5 μg/kg體重至約500毫克/kg體重等之範圍(基於以上所述數字計)。因此，可對患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg或10 mg/kg(或其任何組合)之一或多種劑量。此等劑量可間歇地投與，例如，每週或每三週(例如，使患者接受抗體或雙特異性抗原結合分子之約二至約二十次或(例如)約六次給藥)。可投與初始較高的負荷劑量，然後投與一或多種較低的劑量。然而，其他给药方案可係有用的。藉由習知技術及分析可容易地監測該療法之進展。
本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子通常係以可有效達成所欲目的的量使用。就用於治療或預防疾病病情而言，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子或其醫藥組合物係以治療有效量投與或施用。尤其根據本文所提供的詳細揭示內容，治療有效量之確定完全在熟習此項技術者之能力範圍內。
就全身性投與而言，最初可藉由體外分析(諸如細胞培養分析)估計治療有效劑量。然後可在動物模型中調配劑量以達成包括如在細胞培養中測得的IC50 之循環濃度範圍。此資訊可用於更準確地確定人類之可用的劑量。
亦可使用本技術中熟知的技術從體內數據(例如動物模型)估計初始劑量。熟習此項技術者可基於動物數據容易地最佳化對人類之投與。
可單獨調整劑量及時間間隔以提供足以維持治療效益之抗體或雙特異性抗原結合分子之血漿水平。藉由注射投與之常用的患者劑量為約0.1至50 mg/kg/天，通常為約0.5至1 mg/kg/天。治療有效血漿水平可藉由每天投與多個劑量來達成。可(例如)藉由HPLC測定血漿中之水平。
在局部投與或選擇性吸收之情況下，抗體或雙特異性抗原結合分子之有效局部濃度可能與血漿濃度無關。熟習此項技術者將能夠在無需過度實驗下最佳化治療有效局部劑量。
本文所述的抗體或雙特異性抗原結合分子之治療有效劑量通常提供治療效益而不引起實質毒性。抗體或雙特異性抗原結合分子之毒性及治療效力可藉由標準製藥程序在細胞培養或實驗動物中測定。細胞培養分析及動物研究可用於確定LD50 (致死群體之50%的劑量)及ED50 (在群體之50%中治療有效的劑量)。毒性與治療效益之間的劑量比為治療指數，可表示為比率LD50 /ED50 。展示大治療指數之抗體或雙特異性抗原結合分子係較佳的。在一個實施例中，根據本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子展示高治療指數。藉由細胞培養分析及動物研究獲得的數據可用於調配適用於人類之一系列劑量。劑量較佳在包括ED50 之循環濃度範圍內，幾乎沒有或沒有毒性。劑量可在該範圍內變化，此取決於多種因素，例如所使用之劑型、所使用之投藥途徑、受試者之病情及類似。鑑於患者病情，個別醫師可選擇確切的配方、投藥途徑及劑量(參見，例如，Fingl等人，1975，The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1頁，其全文係以引用的方式併入本文中)。
歸因於毒性、器官功能障礙及類似的緣故，用本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子治療的患者的主治醫師將知道如何及何時終止、中斷或調整投與。相反地，若臨床反應不充分(排除毒性)，主治醫師亦將知道將治療調整為更高的水平。管理所述疾病中之投藥劑量的大小將隨著待治療病症之嚴重度、投藥途徑及類似而變化。可(例如)藉由標準預後評估方法部分地評估病情之嚴重度。此外，劑量及可能的劑量頻率亦將根據年齡、體重及個別患者之反應改變。
其他藥劑及治療
在治療中本發明之抗體及雙特異性抗原結合分子可與一或多種其他藥劑組合投與。例如，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子可與至少一種額外治療劑共同投與。術語「治療劑」包涵經投與以治療需要此種治療的個體之症狀或疾病之任何藥劑。此種額外治療劑可包括適用於所治療特定適應症之任何活性成分，較佳係彼等不相互不利影響的具有補體活性之活性成分。在某些實施例中，另一治療劑為免疫調節劑、細胞生長抑制劑、細胞黏附之抑制劑、細胞毒性劑、細胞凋亡之活化劑或增加細胞對凋亡誘導因子敏感性之藥劑。在一個特定實施例中，該額外治療劑為抗癌劑，例如微管破壞劑、抗代謝物、拓撲異構酶抑制劑、DNA嵌入劑、烷基化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡之活化劑或抗血管生成劑。
此等其他試劑適合以對於所欲目的有效之量組合存在。此等其他藥劑之有效量取決於所用抗體或雙特異性抗原結合分子之量、病症或治療之類型及以上所述的其他因素。抗體或雙特異性抗原結合分子通常以如本文所述之相同劑量且藉由如本文所述之投藥途徑、或本文所述劑量之約1%至99%使用、或以任何劑量且藉由經驗上/臨床上確定為合適之任何途徑使用。
以上所述的此等組合療法包涵組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括在相同或單獨組合物中)、及單獨投與，在此種情況中，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子之投與可在投與額外治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後進行。本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子亦可與放射療法組合使用。
製品
在本發明之另一個態樣中，提供含有可用於治療、預防及/或診斷上述疾病之材料之製品。該製品包括容器及在容器上或與容器相關之標籤或包裝插頁。適宜之容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由多種材料(諸如玻璃或塑料)形成。該容器裝有組合物，該組合物本身或與另一組合物有效組合用於治療、預防及/或診斷病情且可具有無菌進入孔(例如該容器可為靜脈內注射溶液袋或具有皮下注射針可刺穿的塞子之小瓶)。該組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子。該標籤或包裝插頁指示該組合物係用於治療所選擇的病情。此外，該製品可包括(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。本發明該實施例中之製品可進一步包含包裝插頁，指示該組合物可用於治療特定病情。或者/另外，該製品可進一步包含第二(或第三)容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及葡萄糖溶液。其可進一步包括從商業及用戶立場來看期望的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭及注射器。
用於診斷及檢測之方法及組合物 在某些實施例中，本文所提供的任何抗-GPRC5D抗體係可用於檢測生物樣品中GPRC5D之存在。如本文所用，術語「檢測」包涵定量或定性檢測。在某些實施例中，生物樣品包括細胞或組織，諸如前列腺組織。
在一個實施例中，提供用於診斷或檢測方法中之抗GPRC5D抗體。在另一個態樣中，提供檢測生物樣品中GPRC5D之存在之方法。在某些實施例中，該方法包括在允許抗GPRC5D抗體結合GPRC5D之條件下使生物樣品與如本文所述的抗GPRC5D抗體接觸，且檢測在抗GPRC5D抗體與GPRC5D之間是否形成複合體。此種方法可係活體外或活體內方法。在一個實施例中，抗GPRC5D抗體用於選擇用於藉由抗GPRC5D抗體治療之入選個體，例如，其中GPRC5D為用於選擇患者之生物標誌物。
可使用本發明之抗體診斷的示例性疾病包括癌症，特定言之多發性骨髓瘤。
在某些實施例中，提供經標記之抗GPRC5D抗體。標記包括(但不限於)直接檢測之標記或部分(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光及放射性標籤)以及(例如)藉由酶促反應或分子相互作用間接檢測之部分(諸如酵素或配位體)。示例性標籤包括(但不限於)放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H及131 I、螢光團(諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物)、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹磺醯基(dansyl)、傘形酮(umbelliferone)、螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號))、螢光素、2,3-二氫吩嗪二酮、辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、醣氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、與使用過氧化氫以氧化染料前驅物(諸如HRP)之酵素偶聯的雜環氧化酶(諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化酶或微過氧化酶、生物素/抗生物素蛋白、旋轉標籤、噬菌體標籤、穩定游離基團等。
本發明之另一個態樣係關於結合GPRC5D的包含重鏈可變區(VL)之抗體(10B10)，其中該VL可包含與SEQ ID NO: 81之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。該抗體可包含輕鏈可變區(VL)，其中該VL包含與SEQ ID NO: 82之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。該抗體可包含VH及VL，其中該VL可包含與SEQ ID NO: 81之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列及其中該VL包含與SEQ ID NO: 82之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。較佳地，該抗體包含包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之VL。
本發明之另一個態樣係關於抗體(10B10-TCB)。該抗體可包含第一輕鏈，其中該第一輕鏈包含與SEQ ID NO: 67之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。該抗體可包含第二輕鏈，其中該第二輕鏈包含與SEQ ID NO: 68之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。該抗體可包含第一重鏈，其中該第一重鏈包含與SEQ ID NO: 69之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。該抗體可包含第二重鏈，其中該第二重鏈包含與SEQ ID NO: 70之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。在一個較佳實施例中，該抗體包含包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之第一輕鏈、包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之第二輕鏈、包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之第一重鏈及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之第二重鏈。
胺基酸序列
實例
以下為本發明之方法及組合物的實例。應理解，鑑於以上所提供的一般描述，可實踐各種其他實施例。
實例1 腫瘤靶標之表現 為識別正常漿細胞上藉由多發性骨髓瘤表現之差異基因，對衍生自患有多發性骨髓瘤(MM)之患者的10個樣品及衍生自健康供體之骨髓的10個漿細胞(PC)進行RNAseq。根據製造商說明書，使用RNeasy Micro套組(Qiagen)提取RNA。在RNA提取期間，使用無RNA酶之DNA酶組(Qiagen)除去基因組DNA。在Agilent真核生物總RNA pico晶片(Agilent Technologies)上控制所提取RNA之品質。根據製造商說明書，使用用於Illumina定序之SMARTer超低RNA套組(Clontech)以自1.6 ng總RNA製備並擴增cDNA。然後，根據製造商說明書，對1 ng之經擴增之cDNA進行Nextera XT庫之製備(Illumina)。使用卡帕庫定量套組(Kapa Biosystems)定量定序庫且使用高靈敏度晶片(Agilent Technologies)在生物分析儀上藉由毛細管電泳控制品質。使用版本4的簇生成套組及版本4的定序試劑(Illumina)，在HiSeq2500定序儀(Illumina)上定序該等庫2×50個週期。
B細胞成熟抗原(BCMA)為細胞表面蛋白，其在惡性漿細胞上表現且因此被識別為多發性骨髓瘤靶標(Tai YT及Anderson KC，Targeting B-cell maturation antigen in multiple myeloma，Immunotherapy. 2015年11月；7(11):1187–1199)。使用RNAseq技術，深入分析指示，多發性骨髓瘤患者之漿細胞中GPRC5D之表現與BCMA一樣高(圖2)。更重要的是，來自多發性骨髓瘤患者之漿細胞及健康漿細胞之間的GPRC5D之差異表現為約20倍。相反地，來自多發性骨髓瘤患者之漿細胞及健康漿細胞之間的BCMA之差異表現僅為2倍。GPRC5D之整體表現遠高於其他已知的多發性骨髓瘤靶分子(諸如SLAM7、CD138及CD38)之表現。此外，健康初始或記憶B細胞幾乎不表現GPRC5D。
實例2 GPRC5D結合劑之產生及T細胞雙特異性(TCB)抗體之製備 藉由大鼠之DNA免疫化，接著融合瘤之產生、融合瘤之篩选及定序，來產生GPRC5D結合劑。藉由ELISA藉由其結合GPRC5D表現轉染子來測量針對特異性結合之篩選。識別出兩種GPRC5D結合劑，在下文中稱為5E11 (SEQ ID No 13及14)及5F11 (SEQ ID NO 15及16)。一旦識別出特異性結合劑，立刻將IgG轉化為T細胞雙特異性抗體。將結合劑轉化為T細胞雙特異性抗體之原理在本技術中舉例說明並描述於(例如) PCT公開案第WO 2014/131712 A1號中，該案之全文係以引用的方式併入本文中。該等T細胞雙特異性抗體包含兩個GPRC5D結合部分及一個CD3結合部分(抗GPRC5D/抗CD3 T細胞雙特異性抗體)，如圖3所說明。製備以下抗GPRC5D/抗CD3 T細胞雙特異性抗體：i) 5E11-TCB (SEQ ID NO 17、18、19及20)；ii) 5F11-TCB (SEQ ID NO 21、22、23及24)；iii) ET150-5-TCB (SEQ ID NO 25、26、27及28)；iv) B72-TCB (SEQ ID NO: 73、74、75及76)；及v) BCMA-TCB (SEQ ID NO: 77、78、79及80)。ET150-5 GPRC5D結合部分描述於PCT公開案第WO 2016/090329A2號中。本文中術語「ET-150-5」與術語「ET150-5」係同義使用的，及反之亦然。作為陰性對照，製備非靶向DP47-TCB。DP47-TCB為非靶向T細胞雙特異性抗體，其僅結合CD3，但不結合GPRC5D。DP47-TCB描述於PCT公開案第WO 2014/131712 A1號中，該案之全文係以引用的方式併入本文中。B72-TCB衍生自揭示於WO 2018/0117786 A2的表23中之GCDB72抗體且包含GCDB72之GPRC5D結合部分。B72-TCB以crossmab 1+1形式產生(SEQ ID NO: 73、74、75及76)。BCMA-TCB衍生自WO 2016/166629 A1且包含如本文所揭示之A02_Rd4_6nM_C01之GPRC5D結合部分。BCMA-TCB以crossmab 2+1形式產生(SEQ ID NO:77、78、79及80)。
實例3 T細胞雙特異性抗體與多發性骨髓瘤細胞系之結合 為測定對GPRC5D之結合，對所報導的多發性骨髓瘤細胞系進行基於FACS之結合檢定(Lombardi等人，Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics: insights into the biology of the diseas；Genes Chromosomes Cancer. 2007年3月；46(3): 226-38)。在補充有20%熱滅活胎牛血清(FBS，Gibco)及1%青黴素-鏈黴素100X (Gibco)之RPMI 1640 + Glutamax培養基(Gibco)中培養細胞系AMO-1、L363及OPM-2。用僅補充有10% FBS之相同培養基培養細胞系WSU-DLCL2(陰性對照)。亦用補充有50 μM巰基乙醇(Gibco)及1 mM丙酮酸鈉(Gibco)之相同培養基培養細胞系NCI-H929及RPMI-8226。在75 cm2 燒瓶(TPP)中培養該等細胞系，每週兩個繼代。
使用間接染色評估不同抗人類GPRC5D-TCB抗體(5E11-TCB、5F11-TCB及ET150-5 TCB)之結合。在4℃下，用在10 μg/ml至0.00064 μg/ml範圍內(使用因子為0.2之連續稀釋)之抗人類GPRC5D-TCB構築體5E11-TCB、5F11-TCB或ET150-5 TCB、或無構築體之100 µL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；Gibco)，培養該等細胞1小時。在4℃下用1:800稀釋於PBS中之活性藍色染料(Life Technologies)染色該等細胞20分鐘，然後用PE共軛山羊抗人IgG染色，在4℃下用1/300稀釋於流式細胞術染色緩衝液(eBioscience)中之特異性Fcγ片段(Jackson Laboratories)培養30分鐘。在定製設計的BD Biosciences Fortessa上進行流式細胞術採集且使用FlowJo軟體(Tree Star，Ashland, OR)及GraphPad Prism軟體進行分析。
圖4A-C顯示5E11-TCB及5F11-TCB以劑量依賴性方式結合所有所測試的多發性骨髓瘤細胞系。相比之下，ET150-5-TCB與所測試細胞系之結合弱得多。未觀察到由抗GPRC5D-TCB結合WSU-DLCL2細胞(非霍奇金淋巴瘤之GPRC5D- 細胞系)。
實例4 抗GPRC5D-TCB介導之T細胞細胞毒性 為測量抗GPRC5D-TCB抗體之功能性，進行活體外T細胞細胞毒性檢定。簡言之，在補充20%熱滅活胎牛血清(FBS；Gibco)及1%青黴素–鏈黴素100X(PS；Gibco)之RPMI 1640 + Glutamax培養基(Gibco)中培養AMO-1、L363及OPM-2細胞系。用僅補充有10% FBS之相同培養基培養細胞系WSU-DLCL2。用補充50 µM巰基乙醇(Gibco)及1 mM丙酮酸鈉(Gibco)之相同培養基培養細胞系NCI-H929及RPMI-8226。在75 cm2 燒瓶(TPP)中培養該等細胞系，每週兩個繼代。
以1:10之標靶:效應子比率，用分離自周邊血液單核細胞(PBMC) (來自Blutspende Schlieren之白血球層(Buffy coat))之3.105同種異體T細胞，使用人類泛T細胞分離套組(Miltenyi Biotec)，在補充有10% FBS (Gibco) + 1% PS (Gibco)之IMDM培養基(Gibco)中，共培養該等細胞系。將抗人類GPRC5D-TCB抗體(5E11-TCB、5F11-TCB、ET150-5 TCB或DP47-TCB)以不同濃度加入至共培養物中，濃度範圍為1 μg/ml至0.000001 μg/ml，連續稀釋因子為0.1或0 μg/ml。在37℃下用5% CO2 培養20小時後，將每孔75 μl上清液轉移至96孔白色板(Greiner bio-one)中，每孔25μl之CytoTox-Glo細胞毒性分析(Promega)。在室溫下培養15分鐘後於PerkinElmer EnVision上進行發光採集且使用GraphPad Prism及XL擬合軟體進行分析。將數據繪製為LDH釋放之發光信號。
圖5A-E顯示5E11-TCB及5F11-TCB均於多發性骨髓瘤細胞系上介導強T細胞細胞毒性，特定言之NCI-H929(圖5B)、RPMI-8226 (圖5C)、L363 (圖5D)及AMO-1 (圖5A)，而在陰性對照系WSU-DLCL2 (圖5E)上未觀察到殺死。相反地，ET150-5-TCB於所測試的多發性骨髓瘤細胞系上介導很少或顯著降低之殺死。表1概述源自顯示於圖5A-E中之數據之EC50 值。使用Excel中的XLfit附加特徵藉由繪製原始信號數據對滴定TCB來計算得EC50 值。
表 1. 抗GPRC5D-TCB介導之殺死之EC50
實例5 抗GPRC5D-TCB介導之T細胞活化 為機理上解決抗GPRC5D-TCB之作用模式，測定在抗GPRC5D-TCB之存在下與靶多發性骨髓瘤細胞系共培養後T細胞之活化。類似於實例4及圖5A-E中所述的實驗，以1:10之標靶:效應子比率，用分離自PBMC (來自Blutspende Schlieren的白血球層)之3.105同種異體T細胞，使用人類泛T細胞分離套組(Miltenyi Biotec)，在補充有10% FBS (Gibco)+ 1% PS (Gibco)之IMDM培養基(Gibco)中，共培養該等細胞系。將抗人類GPRC5D-TCB抗體(5E11-TCB、5F11-TCB、ET150-5-TCB或DP47-TCB)以不同濃度加入至共培養物中，濃度範圍為1 μg/ml至0.000001 μg/ml，連續稀釋因子為0.1或0 μg/ml。在37℃下/5% CO2 培養20小時後，將該等細胞染色以評估T細胞活化。首先在4℃下用1:800稀釋於PBS(Gibco)中之活性藍色染料(Life Technologies)染色該等細胞20分鐘。然後，在4℃下用AF700抗人類CD4 (純系OKT4)、BV711抗人類CD8 (純系SK1)、BV605抗人類CD25 (純系BC96)、APC-Cy7抗人類CD69 (純系FN50) (均來自BioLegend)及PE-Cy5.5抗人CD3 (純系SK7；eBioscience)在流式細胞術染色緩衝液(eBioscience)中染色30分鐘。在定製設計的BD Biosciences Fortessa上進行流式細胞術採集且使用FlowJo軟體(Tree Star，Ashland, OR)及GraphPad Prism軟體進行分析。
圖6顯示5F11-TCB藉由上調活化標記CD25及CD69於與NCI-H929細胞之共培養物中誘導T細胞活化，而對照(例如，非靶向DP47-TCB且無任何TCB)未誘導T細胞活化。作為另一陰性對照，用WSU-DLCL2細胞共培養經5F11-TCB處理之T細胞，其中T細胞亦未被活化。此等活化譜在吾人所研究的多個細胞系中係一致的，例如，AMO-1、NCI-H929、RPMI-8226、L363(圖7A-J)。與不良殺死效力一致，ET150-5-TCB不誘導T細胞活化，例外是1 mg/kg之最高測試濃度。
實例6 抗GPRC5D-TCB之定位及內化 用CMFDA (Invitrogen)染色NCI-H929細胞且將其接種於24孔板中的塗佈聚-L-離胺酸(Sigma)之圓形蓋玻片上。用Alexa Fluor 647琥珀醯亞胺酯(InVitrogen，目錄號A201106)以2.5之莫耳比標記抗體(5E11-IgG、5E11-TCB、5F11-IgG、5F11-TCB)。在37℃下允許細胞黏附過夜，然後將經螢光標記之抗體(經Alexa Fluor 647標記之5E11-IgG、5E11-TCB、5F11-IgG、5F11-TCB)直接加入至生長培養基中持續不同之持續時間及溫度(在冰上30分鐘，在37℃下1小時及在37℃下3小時)。使用冷PBS (Lonza)淬滅反應且在每個時間點後洗掉未結合之抗體。然後在4℃下用Cytofix (BD)固定細胞20分鐘且用PBS洗滌兩次。然後轉移蓋玻片且用Fluoromount G (eBioscience)固定在載玻片上並在成像前於4℃下保持在黑暗中過夜。藉由來自Zeiss的倒置LSM 700以60x油物鏡進行螢光共聚焦顯微鏡分析。使用耦合至顯微鏡之Zen軟體(Zeiss)收集圖像且在IMARIS軟體(Bitplane)上觀察。圖8A顯示在4℃或37℃下所有抗體均染色多發性骨髓瘤細胞系之表面(質膜)。若抗體被細胞內化，則當在37℃下培養時螢光染色將出現在細胞質中。未觀察到GPRC5D結合IgG或GPRC5D結合TCB被GPRC5D+ 細胞系內化。其藉由應用來自細胞之由膜及細胞質限定的所述區域之強度之和(在3小時時)進一步證實。IMARIS軟體用於分析及定量膜對細胞質之信號比。圖8B指示用不同抗體培養3小時後，膜對細胞質強度之比在~4保持不變，意指螢光信號集中在表面處而不是集中於細胞質中。
實例7 藉由ELISA表徵GPRC5D結合劑：重組細胞結合 使用表現人類GPRC5D或食蟹獼猴GPRC5D或鼠類GPRC5D或人類GPRC5A之穩定轉染之CHO純系以分析潛在前導候選抗體作為IgG之結合。詳細而言，使用新製培養基，將104 個細胞(活力≥98%)接種至384孔微量滴定板(BD聚D-離胺酸，#356662，體積：25 μl/孔)。在37℃下培養過夜後，在4℃下將25 μl/孔抗體稀釋液加入(15 x 1:3稀釋於1xPBS中，分析濃度始於30 µg/ml)至該等細胞持續2小時。在使用90 µl/孔PBST(10x PBS，Roche，#11666789001 + 0.1%吐溫20)的一次洗滌步驟後，藉由在室溫(RT)下加入50 μl/孔 0.05%戊二醛(Sigma目錄號G5882，含於1xPBS中)固定細胞10分鐘。在使用90 μl/孔PBST的三次額外洗滌步驟後，加入二級抗體以用於檢測：就人類抗體而言，使用1:2000稀釋於阻斷緩衝液(1x PBS (Roche # 11666789001) + 2% BSA (牛血清白蛋白部分V，無脂肪酸，Roche，# 10735086001) + 0.05%吐溫20)中之山羊抗人類Igκ鏈抗體HRP共軛物(Millipore #AP502P) (25 µl/孔)。就大鼠抗體而言，以每種抗體於阻斷緩衝液中之1:10000稀釋使用共軛山羊抗大鼠IgG1抗體HRP(Bethyl #A110-106P)、共軛山羊抗大鼠IgG2a抗體HRP (Bethyl #A110-109P)及共軛山羊抗大鼠IgG2b抗體HRP (Bethyl #A110-111P)之混合物(25 μl/孔)。在RT下培養1小時並使用90 μl/孔PBST進行三次額外洗滌步驟後，加入25 μl/孔TMB受質(Roche目錄號11835033001)持續10分鐘且藉由在370 nm/492 nm下測量來確定最終OD之顏色顯影。
所有所測試的抗體均顯示陽性結合人類GPRC5D，且EC50 值(反映結合性)係在pM範圍內。僅大鼠IgG 10B10及07A04在表現食蟹獼猴GPRC5D之CHO細胞上顯示交叉反應性，且EC50 值與人類形式之受體相當(圖9)。對於所有其他抗體亦檢測到食蟹獼猴交叉反應性，但與10B10及07A04相比水平較低(圖9)。未檢測到顯著結合表現鼠類GPRC5D之CHO細胞且未檢測到結合表現人類形式之GPRC5A之CHO細胞(圖9)。結合之EC50 值概述於表2中。
表 2. 基於ELISA之跨物種對GPRC5D之結合性質
實例 8
GPRC5D結合劑：重組GPRC5D-TCB介導對MM細胞系之T細胞細胞毒性 為比較GPRC5D-TCB或其他靶向TCB之功能性，在多個MM細胞系上進行活體外T細胞細胞毒性檢定：MOLP-2 (圖10B)、AMO-1 (圖10C)、EJM (圖10D)及NCI-H929 (圖10G)。簡言之，在補充有20%熱滅活胎牛血清(FBS；Gibco)及1%青黴素–鏈黴素100X (PS；Gibco)之RPMI 1640 + Glutamax培養基(Gibco)中培養細胞系。用補充有GlutaMax 1X (Gibco)之該培養基培養MOLP-2。用僅補充有10% FBS之該培養基培養OPM-2 (圖10A)、RPMI-8226 (圖10E)及L-363 (圖10F)細胞系。用補充有50 μM巰基乙醇(Gibco)、1 mM丙酮酸鈉(Gibco)及GlutaMax 1X (Gibco)之該培養基培養NCI-H929。在IMDM (Gibco)+ 10% FBS (Gibco)及1% PS (Gibco)中培養EJM。在75 cm2 燒瓶(TPP)中培養所有細胞系，每週兩個繼代。
以10:1之效應子對標靶比率，使用分離自PBMC (來自Blutspende Schlieren之白血球層)之0.3百萬個同種異體T細胞，使用人類泛T細胞分離套組(Miltenyi Biotec)，在補充有10% FBS (Gibco)+ 1% PS (Gibco)之RPMI培養基(Gibco)中，共培養細胞系。將抗人類GPRC5D TCB構築體(5E11-TCB、5F11-TCB、10B10-TCB、B72-TCB、BCMA-TCB及DP47-TCB)以不同濃度(利用1/10連續稀釋，自12.5 nM至0.0000125 nM)加入至共培養物且與未處理之樣品進行比較。在37℃/5% CO2 下培養20小時後，將每孔75 μl上清液轉移至96孔白色板(Greiner bio-one)中，每孔25 µl的CytoTox-Glo細胞毒性檢定(Promega)。在室溫下培養15分鐘後於PerkinElmer EnVision上進行發光採集且使用GraphPad Prism及XL擬合軟體進行分析。將數據繪製為針對LDH釋放之發光信號(圖10)。圖10A-G匯總顯示5E11-TCB及5F11-TCB相比BCMA-TCB、10B10-TCB及B72-TCB均介導更強的對MM細胞系之T細胞細胞毒性之數據。TCB介導之殺死之EC50 顯示於表3中，且計算為具有不同供體T細胞之不同實驗之平均值(n=2或n=3)。


表 3. 關於活體外殺死檢定之EC50 值
實例 9
健康人類骨髓細胞中之體外T細胞活化 在取樣後1或2天處理四個不同健康供體之新鮮未加工骨髓(Lonza #1M-105，批號0000739254；0000739255；0000739256及0000734008) 。在室溫下使用BD Pharm裂解緩衝液(BD #555899；1X，含於無菌水中)快速裂解紅血球5分鐘後；藉由離心洗滌細胞2次，且分別用126 g及443 g緩衝液交換洗滌。計數細胞且以300,000個細胞/mL再懸浮於RPMI 1640 Glutamax + 20% HI胎牛血清 + 2%人類血清 + 1%青黴素/鏈黴素(均來自Gibco)中且每孔取100 μL細胞懸浮液接種於96孔圓底盤(TPP)中。每孔加入50 μl培養基或補充B72-TCB、5F11-TCB、5E11-TCB、BCMA-TCB、10B10-TCB或DP47-TCB之培養基，自200 nM (4X)連續稀釋1/10至20 pM。最後，以6 Mio/mL(效應子T與健康骨髓靶細胞比為10:1)加入使用泛T細胞(Miltenyi Biotec，# 130-096-535)分離自健康供體PBMC之50 μL同種異體T細胞。在37℃下於加濕培養箱中培養過夜後，用PBS洗滌細胞一次且在4℃下用稀釋1/800於PBS中之50 μL活性藍(Invitrogen，# L23105)染色20分鐘。洗滌後，在4℃下培養細胞30分鐘，且在FAC緩衝液(PBS 1X，2%胎牛血清；1% 0.5m EDTA PH 8；0.25% NaN3 疊氮化鈉(20%))中稀釋如下抗體混合物：CD25 BV605、CD69 APC-Cy7、BCMA BV421、CD38 BV510、CD138 FITC、FcRH5 PE (稀釋1/100)及CD8 BV711、CD3 PE-Cy5及CD4 AlexaFluor 700 (1/300稀釋) (均來自BioLegend)及GPRC5D AlexaFluor 647(內部，純系5E11 IgG)。洗滌後，將細胞再懸於100 μL FAC緩衝液中且用Fortessa (BD Biosciences)採集。
圖11A-F中呈現的數據說明，B72-TCB誘導健康骨髓中T細胞之非特異性活化(藉由CD69之上調測定)，但不由任何其他所測試的TCB誘導。如所指示，由B72-TCB誘導之非特異性活化係濃度依賴性效應且在50 nm下相比在5 nm下更明顯(圖12A及12B)。
實例10 TCB之活體內功效 在功效研究中，不同TCB構築體(GPRC5D 5F110-TCB、5E11-TCB、BCMA-TCB及B72-TCB)在就具有多發性骨髓瘤之完全人類化NSG小鼠之腫瘤消退方面進行比較。NCI-H929細胞最初係來自ATCC及OPM-2細胞係來自DSMZ。兩種細胞系均擴增。在含有10% FCS及2 mM L-麩醯胺酸、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉之RPMI中培養細胞。在37℃下於5% CO2 之水飽和的氛圍中培養細胞。將每隻動物2.5 x106 個NCI-H929及5 x106 個OPM-2細胞於RPMI細胞培養基(Gibco)及GFR基質膠(1:1，總體積為100 μl)中皮下注射至動物右腹部中，存活率＞95.0%。
在實驗開始時根據承諾的指導方針(GV-Solas；Felasa；TierschG)將4-5週大的雌性NSG (NOD scid gamma)小鼠(繁殖於Charles River，Lyon，France)維持在以12小時光照/12小時黑暗之每日循環的特定無病原體條件下。實驗研究方案由當地政府審查並批准(ROB-55.2-2532.Vet_03-16-10)。到達後，將動物維持一週以適應新環境並進行觀察。定期進行連續健康監測。
根據該方案，對雌性NSG小鼠i.p.注射(腹膜內)15 mg/kg白消安，接著一天後藉由i.v.注射分離自臍帶血之1x105 個人類造血幹細胞。在幹細胞注射後第16-20週，將小鼠放血且藉由流式細胞術分析血液之成功的人類化。將經有效移植之小鼠根據其人類T細胞頻率隨機分成不同處理組(n=10隻/組)。彼時，如上所述對小鼠皮下注射腫瘤細胞且當腫瘤尺寸達到約200 mm3 時用化合物或PBS(媒劑)每周處理一次。對所有小鼠靜脈內註射不同劑量之TCB分子(參見圖13A-D及14A-D)。
為獲得適宜量之化合物原液，用組胺酸緩衝液(20 mM組胺酸、140 mM NaCl，pH6.0)稀釋。使用測徑規每週兩次測量腫瘤生長且如下計算腫瘤體積：
Tv ：(W2 /2) x L (W ：寬度， L ：長度 )
在四次注射化合物後終止該研究且殺死所有小鼠並移出腫瘤且稱重。
圖13A-D顯示已接受NCl-H929注射之所有動物在處理後之腫瘤生長動力學。5F11-TCB在1 mg/kg或0.1 mg/kg下誘導所有動物之完全腫瘤緩解(圖13A)，而B72-TCB僅在1 mg/kg下誘導部分腫瘤緩解，在0.1 mg/kg下沒有效應 (圖13C)。BCMA-TCB亦在1 mg/kg下誘導部分腫瘤緩解(圖13B)。
圖14A-D顯示已接受OPM-2注射之所有動物在處理後之腫瘤生長動力學。5F11-TCB (圖14A，上圖)及5E11-TCB (圖14B，上圖)在0.1 mg/kg下誘導大多數動物之完全腫瘤緩解，而B72-TCB(圖14C，上圖)在0.1 mg/kg下於控制腫瘤生長中較不有效。與B72-TCB(圖14C，下圖)相比，在0.01 mg/kg下，kg5F11-TCB(圖14A，下圖)及5E11-TCB(圖14B，下圖)於抑制腫瘤生長中更有效。
實例11 抗GPRC5D抗體之人類化 藉由查詢鼠類輸入序列(裁剪至可變部分)之人類V區及J區序列之BLASTp資料庫來識別適宜之人類受體框架。用於選擇人類受體框架之選擇標準係序列同源性、相同或類似之CDR長度及人類生殖系之頻率估计值，但亦可係在VH-VL域介面處的某些胺基酸之保守性。在生殖系鑒別步驟之後，將鼠類輸入序列之CDR移植至人類受體框架區上。評定此等初始CDR移植物與親本抗體之間的每個胺基酸差異對各自可變區之結構完整性之可能的影響，且只要認為合適，即可引入針對親本序列之「後突變」。結構評估係基於親本抗體及人類化變異體兩者之Fv區同源性模型，利用使用BIOVIA Discovery Studio Environment (版本17R2)實施的內部抗體結構同源性建模方案來建立。在一些人類化變異體中，包括「正向突變」，即將在親本結合劑之所給定的CDR位置處發生之原始胺基酸改變為在人類受體生殖系之等效位置處發現之胺基酸之胺基酸交換。目的係增加人類化變異體之整體人類特徵(超出框架區)以進一步降低免疫原性風險。
內部開發的電腦模擬工具(in silico tool)用於預測配對VH及VL人類化變異體之VH-VL域定向(例如WO 2016/062734A1，該案係以全文引用的方式併入)。將該等結果與親本結合劑之預測VH-VL域定向進行比較以選擇幾何形狀接近原始抗體之框架組合。合理做法係檢測VH-VL介面區中可能的胺基酸交換，該交換可能導致兩個域之配對中之破壞性的變化，繼而可能對結合性質具有有害的效應。
受體框架之選擇及其對 GPRC5D 結合劑 5E11 之改編
根據下表4來選擇受體框架。
表 4 .用於GPRC5D結合劑5E11之受體框架
後CDR3框架區係由人類IGHJ生殖系IGHJ3*02 (DAFDIWGQGTMVTVSS )及人類IGKJ生殖系IGKJ5*01 (ITFGQGTRLEIK )改編而來。與受體框架相關的部分以粗體表示。
基於結構考量，在5E11人類化變異體之某些位置處引入親本結合劑中自人類受體框架至胺基酸之後突變(表5及6)。此外，一些位置經鑒別為正向突變之有前景的候選，其中親本結合劑之CDR中之胺基酸係經在人類受體生殖系中發現的胺基酸取代。該等變化詳述於下表中。
備註：後突變前綴為b ， 正向突變前綴為f ， 例如，bS49A係指在位置49處自絲胺酸至丙胺酸之後突變(人類生殖系胺基酸至親本抗體胺基酸)。所有殘基指數以Kabat編號給出。
表 5 .VH/VL 5E11人類化變異體清單
表6.VH/VL 5E11人類化變異體之序列
GPRC5D 結合劑 5F11 之受體框架之選擇及其改編
根據下表7選擇受體框架。
表7.GPRC5D結合劑5F11之受體框架
後CDR3框架區係由人類IGHJ生殖系IGHJ3*02 (DAFDIWGQGTMVTVSS )及人類IGKJ生殖系IGKJ2*01 (YTFGQGTKLEIK )改編而來。與受體框架相關的部分以粗體表示。
基於結構考量，在5F11人類化變異體之某些位置處引入親本結合劑中自人類受體框架至胺基酸之後突變(表8及9)。此外，一些位置經鑒別為正向突變之有前景的候選，其中親本結合劑之CDR中之胺基酸係經在人類受體生殖系中發現的胺基酸取代。該等變化詳述於下表中。
備註：後突變前綴為b ，正向突變前綴為f ，例如，bA93T係指在位置93處自丙胺酸至蘇胺酸之後突變(人類生殖系胺基酸至親本抗體胺基酸)。所有殘基指數以Kabat編號給出。
表 8 . VH/VL 5F11人類化變異體清單


表 9 . VH/VL 5F11人類化變異體之序列
藉由 ELISA 表徵人類化變異體
為表徵GPRC5D結合劑之VH及VL域之人類化變異體，使用如上所述之ELISA方案(參見實例7)。5E11之人類化變異體之數據匯總於表10中及針對5F11之人類化變異體匯總於表11中。表12顯示親本5E11及親本5E11之CDR序列及所選人類化變異體之CDR序列。
表 10. 5E11之人類化變異體之表徵


表 10. 續表
表 11 .5F11之人類化變異體之表徵
表 11 .續表
表 12. 人類化變異體之選擇的CDR序列
實例 12
在所選抗GPRC5D IgG之不同人類化變異體存在下CAR-J細胞之活體外活化 如以下所述來評估不同人類化抗-GPRC5D IgG活化PGLALA-CAR-J效應細胞之能力。將表現GPRC5D之多發性骨髓瘤靶細胞L363 (Diehl等人，Blut 36: 331-338(1978))與抗PGLALA-CAR-J效應細胞(Jurkat-NFAT人類急性淋巴細胞性白血病受體細胞系，其表現針對於IgG分子之Fc部分中之PGLALA (P329G L234A L235A)突變且含有NFAT啟動子的TCR)共培養，如PCT申請案第PCT/EP2018/086038號及PCT申請案第PCT/EP2018/086067號中所揭示。在IgG分子同時結合L363細胞及PGLALA-CAR-J細胞上之GPRC5D時，NFAT啟動子被活化且導致活性螢火蟲熒光素酶之表現。
就該檢定而言，將人類化IgG變異體稀釋於RPMI 1640培養基(含有Glutamax、15% HI胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素；均來自GIBCO)中且轉移至圓底96孔板(最終濃度範圍為0.2 pg/ml至10 μg/ml)中。每孔加入20 000個L363細胞及抗PGLALA-CAR-J效應細胞以獲得5:1之最終效應子(抗-PGLALA-CAR-J)對靶標(L363)細胞比及200 μl/孔之最終體積。在37℃下在加濕培養箱中培養細胞約16小時。在培養時間結束時，將100 μl/孔之上清液轉移至白色平底96孔板(Costar)且用另一100 μl/孔之ONE-Glo螢光素酶受質(Promega)培養5分鐘，然後使用PerkinElmer Envision讀取發光。使用GraphPad Prism將原始數據繪製為相對發光信號(RLU)對IgG濃度之曲線且使用XL-擬合軟體計算EC50 。
如圖15A-B及表13所顯示，所有評估的GPRC5D IgG在同時結合GPRC5D表現靶細胞及抗PGLALA-CAR-J細胞時誘導CAR-J活化。就抗GPRC5D結合劑5F11及5E11而言，經識別人類化變異體具有與親本抗體預人類化相似或甚至提高之EC50 值。就結合劑5F11而言，可由分子P1AE5741誘導最強活化(圖15A)。就結合劑5E11而言，可由分子P1AE5730及P1AE5723誘導最強活化(圖15B)。
表 13 .CAR-J活化之EC50 值
雖然出於清楚理解之目的藉由說明及舉例一定程度詳細地描述了前述發明，但該等描述及實例不應被解釋為限製本發明之範圍。本文引述的所有專利及科學文獻之揭示內容係以全文引用的方式明確併入本文。
圖 1A-Z. 本發明之雙特異性抗原結合分子的示例性構型。(圖1A、圖2D) 「1+1 CrossMab」分子之說明。(圖1B、圖1E) 具有替代順序之Crossfab及Fab組分(倒置)之「2+1 IgG Crossfab」分子之說明。(圖1C、圖1F) 「2+1 IgG Crossfab」分子之說明。(圖1G、圖1K) 具有替代順序之Crossfab及Fab組分(倒置)之「1+1 IgG Crossfab」分子之說明。(圖1H、圖1L) 「1+1 IgG Crossfab」分子之說明。(圖1I、圖1M)具有兩個CrossFab的「2+1 IgG Crossfab」分子之說明。(圖1J、圖1N) 具有兩個CrossFab及替代順序之Crossfab及Fab組分(倒置)之「2+1 IgG Crossfab」分子之說明。(圖1O、圖1S) 「Fab-Crossfab」分子之說明。(圖1P、圖1T) 「Crossfab-Fab」分子之說明。(圖1Q、圖1U) 「(Fab)2 -Crossfab」分子之說明。(圖1R、圖1V) 「Crossfab-(Fab)2 」分子之說明。(圖1W、圖1Y) 「Fab-(Crossfab)2 」分子之說明。(圖1X、圖1Z) 「(Crossfab)2 -Fab」分子之說明。黑點：Fc域中促進異二聚化之視需要的修飾。++、--：視需要引入CH1及CL域中的相反電荷之胺基酸。Crossfab分子被描述為包含VH及VL區之交換，但在於CH1及CL域中不引入電荷修飾之實施例中可替代性地包含CH1及CL域之交換。
圖 2. 藉由RNAseq分析漿細胞及B細胞上腫瘤靶標之基因表現。
圖 3. 本發明之5E11-雙特異性抗原結合分子之示例性構型。黑點：Fc域中促進異二聚化之視需要的修飾。++、--：視需要引入CH1及CL域中的相反電荷之胺基酸。
圖 4A-C. 雙特異性抗原結合分子5F11-TCB (圖4A)及5E11-TCB(圖4B)及對照抗體ET150-5-TCB(圖4C)與多發性骨髓瘤細胞系AMO-1、L636、NCI-H929、RPMI-8226、OPM-2及WSU-DLCL2之結合分析。
圖 5A-E. 於多發性骨髓瘤細胞系AMO-1 (圖5A)、NCI-H929 (圖5B)、RPMI-8226 (圖5C)及L363 (圖5D)上的GPRC5D-TCB介導之T細胞細胞毒性之分析。對照細胞系為WSU-DL CL2(圖5E)。所測試的分子：5E11-TCB、5F11-TCB。對照分子：DP47-TCB (非標靶)及ET150-5-TCB。
圖 6. 經GPRC5D-TCB活化之T細胞與多發性骨髓瘤細胞系NCI-H929及陰性對照細胞系WSU-DLCL2接合而上調CD25及CD69之分析。
圖 7A-J. 經GPRC5D-TCB活化之T細胞與多發性骨髓瘤接合在細胞系AMO-1(圖7A)、NCI-H929(圖7B)、RPMI-8226(圖7C)、L363(圖7D)及WSU-DLCL2(圖7E)中上調CD25，且在細胞系AMO-1(圖7F)、NCI-H929(圖7G)、RPMI-8226(圖7H)、L363(圖7I)及WSU-DLCL2(圖7J)中上調CD69之分析。
圖 8A-B. 藉由螢光共聚焦顯微鏡目測抗體定位及內化(圖8A)及膜對細胞質之信號強度之分析(圖8B)。
圖 9. 使用穩定轉染之表現人類GPRC5D(純系12)或食蟹獼猴GPRC5D(純系13)、鼠類GPRC5D (純系4)或人類GPRC5A(純系30)中之任一者之CHO純系，藉由ELISA評估不同抗GPRC5D抗體與人類、食蟹獼猴及鼠類GPRC5D之結合。
圖 10A-G. 在20小時共培養期間由不同靶向GPRC5D或BCMA之T細胞雙特異性分子誘導之各種多發性骨髓瘤(MM)細胞系之T細胞介導之裂解(E:T=10:1，人類泛T細胞)。描繪的是具有SD之重複。
圖 11A-F. 在同種異體泛人類T細胞及來自健康供體的未處理之骨髓細胞(E:T=10:1，人類泛T細胞)之~20小時共培養期間由不同靶向GPRC5D或BCMA之T細胞雙特異性分子(圖11A中之5E11-TCB；圖11B中之5F11-TCB；圖11C中之10B10-TCB；圖11D中之BCMA-TCB；圖11D中之BCMA-TCB；圖11E中之BCMA-TCB；圖11F中之DP47-TCB)誘導之T細胞活化。描繪的是來自一個代表性供體之FACS點圖，顯示CD4 (上列)或CD8 T細胞(下列)上的活化標記CD69之上調作為所有CD4各自的CD8 T細胞中陽性細胞之百分比。
圖 12A-B. 在同種異體泛人類T細胞及來自健康供體之未處理之骨髓細胞(E:T=10:1，人類泛T細胞)之~約20小時共培養期間由不同靶向GPRC5D或BCMA之T細胞雙特異性分子誘導之T細胞活化。描繪的是所有四個評估的供體之匯總，顯示在50 nM TCB (圖12A)或5 nM (圖12B)之所選固定劑量下CD8 T細胞上的活化標記CD69上調。
圖 13A-D. 由不同靶向GPRC5D之T細胞雙特異性分子(圖13A中之5F11-TCB；圖13B中之BCMA-TCB；圖13C中之B72-TCB；圖13D中之媒劑)誘導之活體內功效，此描繪為在植入NCI-H929腫瘤細胞的人類化NSG小鼠模型中隨時間推移之腫瘤生長動力學。繪製蜘蛛圖，每行指代單隻小鼠。
圖 14A-D. 由不同靶向GPRC5D之T細胞雙特異性分子(圖14A中之5F11-TCB；圖14B中之5E11-TCB；圖14C中之B72-TCB；圖14D中之媒劑)誘導之活體內功效，此描繪為在植入OPM-2腫瘤細胞的人類化NSG小鼠模型中隨時間推移之腫瘤生長動力學。繪製蜘蛛圖，每行指代單隻小鼠。
圖 15A-B. 在培養約16小時後PGLALA-CAR-J之活化，藉由發光測定。於GPRC5D IgG (圖15A中之5F11-IgG；圖15B中之5E11-IgG)與表現GPRC5D之多發性骨髓瘤細胞系L-363及經PGLALA修飾之Fc域與Jurkat-NFAT報導子細胞之同時結合後誘導該活化，該等報導子細胞經遺傳工程改造以表現針對於此等IgG分子之Fc部分中PGLALA突變之TCR。描繪的是具有SD之重複。

Claims (48)

  1. 一種結合GPRC5D之抗體，其中該抗體包含 (i)輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 84之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3； (ii)包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 85之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)， (iii)包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)； (iv)包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 96之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；或 (v)包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 92之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)。
  2. 如請求項1之抗體， (i)其中該VH包含與SEQ ID NO: 13之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 14之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或 (ii)其中該VH包含與SEQ ID NO: 15之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或 (iii)其中該VH包含與SEQ ID NO: 48之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 53之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或 (iv)其中該VH包含與SEQ ID NO: 49之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 52之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或 (v)其中該VH包含與SEQ ID NO: 57之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或 (vi)其中該VH包含與SEQ ID NO: 58之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及該VL包含與SEQ ID NO: 63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為IgG抗體。
  4. 如請求項3之抗體，其中該抗體為IgG抗體。
  5. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為全長抗體。
  6. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為選自Fv分子、scFv分子、Fab分子及F(ab')2 分子之群之抗體片段。
  7. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為多特異性抗體。
  8. 一種雙特異性抗原結合分子，其包含 (a)結合第一抗原之第一抗原結合部分， 其中該第一抗原為GPRC5D及該第一抗原結合部分包含 (i)包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 84之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)； (ii)包含SEQ ID NO: 83之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 85之HCDR 2及SEQ ID NO: 86之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 87之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 88之LCDR 2及SEQ ID NO: 89之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)； (iii)包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)； (iv)包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 91之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 96之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；或 (v)包含SEQ ID NO: 90之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO: 92之HCDR 2及SEQ ID NO: 93之HCDR 3之重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 94之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 95之LCDR 2及SEQ ID NO: 97之LCDR 3之輕鏈可變區(VL)；及 (b)特異性結合第二抗原之第二抗原結合部分。
  9. 如請求項8之雙特異性抗原結合分子， (i)其中第一抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 13之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及其中第一抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO: 14之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或 (ii)其中第一抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 15之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及其中第一抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或 (iii)其中第一抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 48之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及其中第一抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO: 53之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或 (iv)其中第一抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 49之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及其中第一抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO: 52之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或 (v)其中第一抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 57之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及其中第一抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO: 64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或 (vi)其中第一抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 58之序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及其中第一抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO: 63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。
  10. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其中該第二抗原為CD3。
  11. 如請求項10之雙特異性抗原結合分子，其中該第二抗原為CD3ɛ。
  12. 如請求項10之雙特異性抗原結合分子，其中該第二抗原結合部分包含VH，其包含SEQ ID NO: 29之HCDR 1、SEQ ID NO: 30之HCDR 2及SEQ ID NO: 31之HCDR 3；及VL，其包含SEQ ID NO: 32之LCDR 1、SEQ ID NO: 33之LCDR 2及SEQ ID NO: 34之LCDR 3。
  13. 如請求項12之雙特異性抗原結合分子，其中第二抗原結合部分之該VH包含與SEQ ID NO: 35之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及第二抗原結合部分之該VL包含與SEQ ID NO: 36之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。
  14. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其中該第一及/或第二抗原結合部分為Fab分子。
  15. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其中該第二抗原結合分子為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之該等可變域VL及VH或恆定域CL及CH1，特定言之可變域VL及VH係彼此置換。
  16. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其中該第一抗原結合部分為Fab分子，其中在恆定域中，在位置124處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)及在位置123處的胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，及在恆定域CH1中，在位置147處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)及在位置213處的胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  17. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其中該第一及第二抗原結合部分視需要經肽連接子彼此融合。
  18. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其中該第一及第二抗原結合部分各為Fab分子且其中(i)該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與該第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，或(ii)該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與該第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。
  19. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其包含第三抗原結合部分。
  20. 如請求項19之雙特異性抗原結合分子，其中該第三抗原部分係與第一抗原結合部分相同。
  21. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其包含由第一及第二亞單元組成之Fc域。
  22. 如請求項21之雙特異性抗原結合分子，其中該第一、第二及若存在時之第三抗原結合部分各為Fab分子； 且其中(i)該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與該第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合且該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與該Fc域之第一亞單元的N端融合，或(ii)該第一抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與該第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合且該第二抗原結合部分係在Fab重鏈的C端處與該Fc域之第一亞單元的N端融合； 且其中該第三抗原結合部分(在存在的情況下)係在Fab重鏈的C端處與該Fc域之第二亞單元的N端融合。
  23. 如請求項21之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為IgG Fc域。
  24. 如請求項23之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為IgG1 Fc域。
  25. 如請求項21之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為人類Fc域。
  26. 如請求項21之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸殘基係經具有更大側鏈體積之胺基酸殘基置換，藉此在該第一亞單元之CH3域內產生突起，該突起可定位在該第二亞單元之CH3域內的空腔中，且該Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸殘基係經具有更小側鏈體積之胺基酸置換，藉此在該第二亞單元之CH3域內產生空腔，該第一亞單元之CH3域內的突起係可定位於該空腔中。
  27. 如請求項21之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域包含減少結合Fc受體及/或效應功能的一或多個胺基酸取代。
  28. 一或多種分離的聚核苷酸，其編碼如請求項1至27中任一項之抗體或雙特異性抗原結合分子。
  29. 一或多種載體，特定言之表現載體，其包含如請求項28之聚核苷酸。
  30. 一種宿主細胞，其包含如請求項28之聚核苷酸或如請求項29之載體。
  31. 一種產生結合GPRC5D之抗體之方法，該方法包括如下步驟：a)在適於表現該抗體之條件下培養如請求項30之宿主細胞及b)視需要回收該抗體。
  32. 一種結合GPRC5D之抗體，其係藉由如請求項31之方法產生。
  33. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至27或32中任一項之抗體或雙特異性抗原結合分子及醫藥上可接受之載劑。
  34. 2及32中任一項之抗體，其係用作藥物。
  35. 2及32中任一項之抗體，其係用於治療疾病。
  36. 如請求項35之抗體，其中該疾病為癌症或自體免疫疾病。
  37. 如請求項35之抗體，其中該疾病為多發性骨髓瘤。
  38. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其係用作藥物。
  39. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其係用於治療疾病。
  40. 如請求項39之雙特異性抗原結合分子，其中該疾病為癌症或自體免疫疾病。
  41. 如請求項39之雙特異性抗原結合分子，其中該疾病為多發性骨髓瘤。
  42. 如請求項33之醫藥組合物，其係用作藥物。
  43. 如請求項33之醫藥組合物，其係用於治療疾病。
  44. 如請求項43之醫藥組合物，其中該疾病為癌症或自體免疫疾病。
  45. 如請求項43之醫藥組合物，其中該疾病為多發性骨髓瘤。
  46. 一種如請求項1至27或32中任一項之抗體或雙特異性抗原結合分子之用途，其用於製造用於治療疾病的藥物。
  47. 如請求項46之用途，其中該疾病為癌症或自體免疫疾病。
  48. 如請求項46之用途，其中該疾病為多發性骨髓瘤。
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Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
PE20211696A1 (es) 2018-12-21 2021-09-01 Hoffmann La Roche Moleculas agonistas de union al antigeno cd28 que actuan sobre el tumor
CR20220019A (es) * 2019-07-31 2022-02-11 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se fijan a gprc5d
TW202219065A (zh) * 2020-06-19 2022-05-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 免疫活化 Fc 域結合分子
WO2022148370A1 (en) * 2021-01-05 2022-07-14 Lanova Medicines Development Co., Ltd. Anti-gprc5d monoclonal antibodies and uses thereof
CR20230374A (es) * 2021-01-05 2023-10-05 Lanova Medicines Dev Co Ltd Anticuerpos monoclonales anti-gprc5d y usos de los mismos
CN117279953A (zh) 2021-02-16 2023-12-22 詹森药业有限公司 靶向bcma、gprc5d和cd3的三特异性抗体
AU2022223152A1 (en) 2021-02-19 2023-08-31 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Anti-gprc5d×bcma×cd3 trispecific antibody and use thereof
WO2023030272A1 (zh) * 2021-08-30 2023-03-09 原启生物科技(上海)有限责任公司 抗gprc5d抗原结合蛋白及其用途
WO2023078382A1 (zh) * 2021-11-05 2023-05-11 正大天晴药业集团股份有限公司 结合gprc5d的抗体及其用途
WO2023173272A1 (zh) * 2022-03-15 2023-09-21 上海驯鹿生物技术有限公司 靶向gprc5d的全人源嵌合抗原受体(car)及其应用
WO2023115347A1 (zh) * 2021-12-21 2023-06-29 上海驯鹿生物技术有限公司 靶向gprc5d的全人源抗体
CN116375868A (zh) * 2021-12-31 2023-07-04 康源博创生物科技(北京)有限公司 一种抗cd3的人源化抗体及其在制备双特异性抗体中的应用
WO2023125888A1 (zh) * 2021-12-31 2023-07-06 山东先声生物制药有限公司 一种gprc5d抗体及其应用
WO2023125728A1 (zh) * 2021-12-31 2023-07-06 康源博创生物科技(北京)有限公司 抗gprc5d抗体及其应用
WO2023143537A1 (zh) * 2022-01-29 2023-08-03 恺兴生命科技(上海)有限公司 Gprc5d抗体及其应用
WO2023227062A1 (en) * 2022-05-27 2023-11-30 Antengene (Hangzhou) Biologics Co., Ltd. Novel anti-gprc5d antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind gprc5d and cd3, and uses thereof
WO2024002308A1 (zh) * 2022-06-30 2024-01-04 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种新型多特异肿瘤抑制剂的开发和应用
WO2024031091A2 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for gprc5d and bcma
CN116003598B (zh) * 2022-08-30 2024-04-26 苏州缔码生物科技有限公司 靶向人gprc5d的重组人源化单克隆抗体及其应用
WO2024050797A1 (zh) * 2022-09-09 2024-03-14 北京天广实生物技术股份有限公司 结合bcma、gprc5d和cd3的多特异性抗体及其用途
WO2024079009A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and proteasome inhibitors
WO2024079010A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and cd38 antibodies
WO2024079015A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and imids
CN117924485A (zh) * 2022-10-25 2024-04-26 上海祥耀生物科技有限责任公司 一种抗gprc5d的多特异性抗体
WO2024088987A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for the treatment of cancer
WO2024102954A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Activation induced clipping system (aics)

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR7801185A (pt) 1977-04-18 1978-11-28 Hitachi Metals Ltd Ornato adaptado para ser fixado por pelo menos um ima permanente
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
EP0625200B1 (en) 1992-02-06 2005-05-11 Chiron Corporation Biosynthetic binding protein for cancer marker
PL174721B1 (pl) 1992-11-13 1998-09-30 Idec Pharma Corp Przeciwciało monoklonalne anty-CD20
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
WO1998050431A2 (en) 1997-05-02 1998-11-12 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
PT994903E (pt) 1997-06-24 2005-10-31 Genentech Inc Metodos e composicoes para glicoproteinas galactosiladas
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
BR0014480A (pt) 1999-10-04 2002-06-11 Medicago Inc Método para regular a transcrição de genes estranhos
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
SI2857516T1 (sl) 2000-04-11 2017-09-29 Genentech, Inc. Multivalentna protitelesa in njihove uporabe
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ES2295228T3 (es) 2000-11-30 2008-04-16 Medarex, Inc. Roedores transcromosomicos transgenicos para la preparacion de anticuerpos humanos.
MXPA04001072A (es) 2001-08-03 2005-02-17 Glycart Biotechnology Ag Variantes de glicosilacion de anticuerpos que tienen citotoxicidad celulares dependiente de anticuerpos incrementada.
BR0213761A (pt) 2001-10-25 2005-04-12 Genentech Inc Composições, preparação farmacêutica, artigo industrializado, método de tratamento de mamìferos, célula hospedeira, método para a produção de uma glicoproteìna e uso da composição
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
WO2003085119A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede d'amelioration de l'activite d'une composition d'anticorps de liaison avec le recepteur fc$g(g) iiia
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
WO2003085107A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules à génome modifié
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
RS51318B (sr) 2002-12-16 2010-12-31 Genentech Inc. Varijante imunoglobulina i njihova upotreba
CA2510003A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
ATE475708T1 (de) 2003-01-22 2010-08-15 Glycart Biotechnology Ag Fusionskonstrukte und deren verwendung zur produktion von antikörpern mit erhöhter fc rezeptor bindungsaffinität und effektorfunktion
JP2008501621A (ja) 2003-05-31 2008-01-24 マイクロメット アクツィエン ゲゼルシャフト Ｂ細胞関連疾患を処置するための二重特異性抗ｃｄ３、抗ｃｄ１９抗体構築物を含む薬学的組成物
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
NZ550217A (en) 2004-03-31 2009-11-27 Genentech Inc Humanized anti-TGF-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
EP2374817B1 (en) 2004-04-13 2017-09-06 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
AU2005286607B2 (en) 2004-09-23 2011-01-27 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
KR101569300B1 (ko) 2005-02-07 2015-11-13 로슈 글리카트 아게 Ｅｇｆｒ 에 결합하는 항원 결합 분자, 이를 코딩하는 벡터, 및 그의 용도
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
AU2006301492B2 (en) 2005-10-11 2011-06-09 Amgen Research (Munich) Gmbh Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
EP2465870A1 (en) 2005-11-07 2012-06-20 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
ES2395969T3 (es) 2006-03-24 2013-02-18 Merck Patent Gmbh Dominios de proteínas heterodiméricas genéticamente modificados
EP2016101A2 (en) 2006-05-09 2009-01-21 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
US20080044455A1 (en) 2006-08-21 2008-02-21 Chaim Welczer Tonsillitus Treatment
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
WO2008119567A2 (en) 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific cd3-epsilon binding domain
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
CN102448985B (zh) 2009-05-27 2015-08-05 霍夫曼-拉罗奇有限公司 三或四特异性抗体
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
CN104945509A (zh) 2009-09-16 2015-09-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含卷曲螺旋和/或系链的蛋白质复合体及其用途
EP3112382A1 (en) 2009-12-29 2017-01-04 Emergent Product Development Seattle, LLC Heterodimer binding proteins and uses thereof
JP6022444B2 (ja) 2010-05-14 2016-11-09 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ヘテロ二量体タンパク質ならびにそれを生産および精製するための方法
CN114246952A (zh) 2010-06-08 2022-03-29 基因泰克公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
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SG193554A1 (en) 2011-03-29 2013-11-29 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
LT2748201T (lt) 2011-08-23 2018-02-26 Roche Glycart Ag Dvigubai specifinė t ląsteles aktyvinantį antigeną surišanti molekulė
CN107586340B (zh) 2011-08-23 2022-01-21 罗切格利卡特公司 对t细胞活化性抗原和肿瘤抗原特异性的双特异性抗体及使用方法
PL2748202T3 (pl) 2011-08-23 2018-12-31 Roche Glycart Ag Dwuswoiste cząsteczki wiążące antygen
WO2013096291A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
JP6152120B2 (ja) 2012-02-15 2017-06-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｆｃ受容体に基づくアフィニティークロマトグラフィー
PT2838918T (pt) 2012-04-20 2019-08-23 Merus Nv Métodos e meios para a produção de moléculas heterrodiméricas do tipo ig
CN104936986B (zh) * 2013-02-26 2019-08-09 罗切格利卡特公司 双特异性t细胞活化性抗原结合分子
MX2016006529A (es) 2013-12-20 2016-08-03 Genentech Inc Anticuerpos dobles especificos.
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
WO2016016299A1 (en) 2014-07-29 2016-02-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
DK3177643T3 (da) 2014-08-04 2019-07-15 Hoffmann La Roche Bispecifikke T-celle-aktiverende antigenbindende molekyler
BR112017003236A2 (pt) 2014-09-12 2017-11-28 Genentech Inc anticorpos elaborados com cisteína, conjugados de droga e anticorpos, método de preparação de conjugado de droga e anticorpo e composição farmacêutica
WO2016055593A1 (en) * 2014-10-09 2016-04-14 Engmab Ag Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1 for use in the treatment of ovarian cancer
WO2016062734A1 (en) 2014-10-24 2016-04-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Vh-vl-interdomain angle based antibody humanization
IL285101B2 (en) * 2014-12-05 2024-03-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center G protein-coupled receptor-directed antibodies and methods of use
JP6913025B2 (ja) * 2015-04-13 2021-08-04 ファイザー・インク 治療抗体およびその使用
JP6952605B2 (ja) 2015-04-24 2021-10-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多特異性抗原結合タンパク質
TWI781108B (zh) * 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
WO2018117786A1 (es) 2016-12-19 2018-06-28 Campo Y Ramos Juan Carlos Método de moldeo científico autoajustado por aprendizaje recurrente en tiempo real

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