BR112020015297A2 - Anticorpos, molécula de ligação ao antígeno biespecífica, um ou mais polinucleotídeos isolados, um ou mais vetores, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, composição farmacêutica, anticorpo ou molécula de ligação, uso, método de tratamento e invenção - Google Patents

Anticorpos, molécula de ligação ao antígeno biespecífica, um ou mais polinucleotídeos isolados, um ou mais vetores, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, composição farmacêutica, anticorpo ou molécula de ligação, uso, método de tratamento e invenção Download PDF

Info

Publication number
BR112020015297A2
BR112020015297A2 BR112020015297-8A BR112020015297A BR112020015297A2 BR 112020015297 A2 BR112020015297 A2 BR 112020015297A2 BR 112020015297 A BR112020015297 A BR 112020015297A BR 112020015297 A2 BR112020015297 A2 BR 112020015297A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
seq
antigen
amino acid
fab
heavy chain
Prior art date
Application number
BR112020015297-8A
Other languages
English (en)
Inventor
Georg Fertig
Christian Klein
Stefan Lorenz
Alexander BUJOTZEK
Wei Xu
Marie-Luise Bernasconi
Original Assignee
F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F. Hoffmann-La Roche Ag filed Critical F. Hoffmann-La Roche Ag
Publication of BR112020015297A2 publication Critical patent/BR112020015297A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

a presente invenção refere-se de modo geral a anticorpos que se ligam ao gprc5d, incluindo moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, por exemplo, para a ativação de células t. além disso, a presente invenção refere-se a polinucleotídeos que codificam tais anticorpos, e vetores e células hospedeiras que compreendem tais polinucleotídeos. a invenção diz respeito ainda a métodos para produzir os anticorpos, e métodos de uso dos mesmos no tratamento de doenças.

Description

“ANTICORPOS, MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, UM OU MAIS POLINUCLEOTÍDEOS ISOLADOS, UM OU MAIS VETORES, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, ANTICORPO OU MOLÉCULA DE LIGAÇÃO, USO, MÉTODO DE TRATAMENTO E INVENÇÃO” CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se, de modo geral, a anticorpos que se ligam ao GPRC5D, incluindo moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, por exemplo, para a ativação de células T. Além disso, a presente invenção refere-se a polinucleotídeos que codificam tais anticorpos, e vetores e células hospedeiras que compreendem tais polinucleotídeos. A invenção diz respeito ainda a métodos para produzir os anticorpos, e métodos de uso dos mesmos no tratamento de doenças.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Afetando — 75.000 novos pacientes a cada ano na União Europeia e nos EUA o mieloma múltiplo (MM) é uma das doenças hematológicas malignas mais comuns que continua a ser uma necessidade médica não atendida. Em curto prazo, as drogas imunomoduladoras, tais como lenalidomida e pomalidomida, e inibidores de proteassoma, como carfilzomibe ou bortezomibe, podem permanecer a espinha dorsal de uma terapia de primeira linha para o mieloma múltiplo (Moreau, P. e S.V. Rajkumar, multiple myeloma-translation of trial results into reality. Lancet,
2016. 388 (10040): págs. 111-3). Entretanto, esses medicamentos não têm as células tumorais doentes como alvos específicos, por exemplo, células plasmáticas (PC) doentes. Esforços têm sido feitos para depletar seletivamente as células plasmáticas (plasmócitos) no mieloma múltiplo. A falta de proteínas de superfície que marcam especificamente as células plasmáticas dificultou o desenvolvimento de anticorpos ou terapias celulares para o mieloma múltiplo. Até o momento, existem poucos casos de produtos biológicos — bem-sucedidos, como, por exemplo, representados por daratumumabe (anti-CD38) e elotuzumabe (anti-CD319), com a ressalva de que essas duas moléculas não são expressas exclusivamente pelas células plasmáticas. Portanto, novos alvos para células plasmáticas no mieloma múltiplo foram identificados por sequenciamento de RNA, tal como o receptor acoplado à proteína G de classe C, grupo 5, membro D (GPRC5D). O GPRC5D é uma proteína de superfície específica expressa por células plasmáticas no mieloma múltiplo. Foi divulgado que o GPRC5D está associado com prognóstico e carga tumoral em vários pacientes com mieloma (Atamaniuk, J,, et al., Overexpression of G protein-coupled receptor 5D in the bone marrow is associated with poor prognosis in patients with multiple myeloma. Eur J Clin Invest, 2012. 42 (9):. págs 953-60; e Cohen, Y,, et al. GPRCBSD is a promising marker for monitoring the tumor load and to target multiple myeloma cells. Hematology, 2013 18 (6): págs. 348-51).
[003] O GPRC5D é um receptor órfão sem ligante ou função conhecida nos humanos ou câncer humano. O gene codificante de GPRC5D, mapeado no cromossomo 12p13.3 contém três éxons e mede cerca de 9,6 kb (Brauner-Osborne, H., et al., Cloning and characterization of a human orphan family C G-protein coupled receptor GPRC5D. Biochim Biophys Acta, 2001. 1518 (3): págs. 237-48). O primeiro éxon grande codifica o domínio das sete transmembranas. Entretanto, a biologia do GPRC5D é amplamente desconhecida. Foi demonstrado que o GPRC5D está envolvido na formação de queratina nos folículos capilares dos animais (Gao, Y., et al., Comparative Transcriptome Analysis of Fetal Skin Reveals Key Genes Related to Hair Follicte Morphogenesis in Cashmere Goats. PLoS One, 2016. 11(3): pág. e0151118; e Inoue, S., T. Nambu, e T. Shimomura, The RAIG family member, GPRCS5D, is associated with hard-keratinized structures. J Invest Dermatol,
2004. 122(3): págs. 565-73).
[004] O documento WO 2018/017786 A2 divulga anticorpos específicos para GPRC5D ou fragmentos de ligação ao antígeno.
[005] Existe a necessidade de medicamentos adicionais para tratar o câncer, particularmente mieloma múltiplo. Os fármacos particularmente úteis para este fim incluem anticorpos que se ligam ao GPRCS5D, particularmente anticorpos biespecíficos que se ligam ao GPRC5D nas células alvo e um antígeno de ativação de célula T, tal como CD3 em células T. A ligação simultânea de tal anticorpo aos seus alvos irá forçar uma interação temporária entre a célula alvo e as células T, provocando a ativação de qualquer célula T citotóxica e a subsequente lise da célula alvo.
[006] A presente invenção fornece novos anticorpos, incluindo os anticorpos biespecíficos que se ligam especificamente ao GPRC5D humano. Particularmente, os anticorpos biespecíficos de células T de acordo com a invenção visando GPRC5D têm a potência para tratar o mieloma múltiplo.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[007] Os presentes inventores desenvolveram um novo anticorpo com propriedades inesperadas e melhoradas, que se liga ao GPRCS5D. Além disso, os inventores desenvolveram moléculas de ligação a antígenos biespecíficos que se ligam ao GPRC5D e a um antígeno de ativação de célula T, incorporando o novo anticorpo GPRC5D.
[008] Em um primeiro aspecto a presente invenção provê um anticorpo que se liga ao GPRC5D, em que o anticorpo compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 84, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL)
compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89;
(ii) uma região variável! de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 85, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89;
(ili)) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97;
(iv) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 96 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97; ou
(v) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 92, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL)
compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97.
[009] Alternativamente, o anticorpo pode compreender (|) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6; ou (II) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 8, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 9, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 10, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 11 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 12.
[010] Em um exemplo de realização: (i) a VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou (ii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 15, e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; ou (ili))) a VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 48, e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; ou (iv) a VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 49, e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou (v) a VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 57, e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou (vi) a VM compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 58, e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63. Em outro exemplo de realização (i) a VM compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e a VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou (ii) a VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, e a VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; ou (iii) a VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, e a VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; ou (iv) a VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou (v) a VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, e a VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou
(vi) a VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 58, e a VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63.
[011] Em outro exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo IgG, particularmente I9gG1. Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo completo (também referido como anticorpo “de comprimento total”). Em outro exemplo de realização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em uma molécula Fv, uma molécula scFv, uma molécula Fab e uma molécula F(ab')2. Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo multiespeciífico.
[012] Em um aspecto adicional a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno compreende (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 84, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89; (ii) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 85, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89; (iii) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97; (iv) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 96 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97; ou (v) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 92, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97. Alternativamente, a primeira porção de ligação ao antígeno pode compreender (1) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6; ou (Il) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 8, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 9, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 10, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 11 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 12; e (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um segundo antígeno.
Em um exemplo de realização, (i) a VM da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 13, e a VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou (ii) a VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 15, e a VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; ou (iii) a VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 48, e a VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; ou (iv) a VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 49, e a VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou (v) a VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 57, e a VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64;
ou (vi) a VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 58, e a VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63. Em um exemplo de realização, (i) a VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e a VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou (ii) a VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, e a VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; ou (iii) a VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, e a VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; ou (iv) a VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou (v) a VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, e a VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou (vi) a VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, e a VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63. Em outro exemplo de realização, o anticorpo se liga especificamente ao CD3, particularmente ao CD3e.
Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 29, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 30, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 31, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 32, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 33 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 34. Em outro exemplo de realização, a VH da segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; e a VL da segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; Em outro exemplo de realização, a VH da segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; e a VL da segunda porção de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
[013] Em um exemplo de realização, a primeira e/ou segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab. Isto significa que, a primeira porção de ligação ao antígeno pode ser uma molécula Fab, ou a segunda porção de ligação ao antígeno pode ser uma molécula Fab, ou a primeira porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno podem ser moléculas Fab. Em outro exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1, particularmente os domínios variáveis VL e VH, da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si. Em outro exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que no domínio constante, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat); e no domínio constante CH1 o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em outro exemplo de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são fundidas uma à outra, opcionalmente através de um ligante peptídico.
Em outros exemplos de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são, cada uma, uma molécula Fab, e em que (i) a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida pela porção C-terminal da cadeia pesada Fab à porção N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno, Ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida pela porção C- terminal da cadeia pesada Fab à porção N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno.
Em outro exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende uma terceira porção de ligação ao antígeno.
Em outro exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno.
Em outro exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade.
Em outro exemplo de realização, a primeira, a segunda e, quando presente, a terceira porção de ligação ao antígeno são moléculas Fab, e em que (i) a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C- terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc, ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C- terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc; e em que a terceira porção de ligação ao antígeno, quando presente, é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc. Em outro exemplo de realização, o domínio Fc é de uma IgG, particularmente um domínio Fc de I9G1. Em outros exemplos de realização, o domínio Fc é um domínio Fc humano. Em outro exemplo de realização, um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc é substituído por um resíduo de aminoácido que tem um volume de cadeia lateral maior, gerando, assim, uma protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável dentro de uma cavidade no interior do domínio CH3 da segunda subunidade, e um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc é substituído por um resíduo aminoácido que tem um menor volume de cadeia lateral, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade, dentro da qual a protuberância do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável. Em outro exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma ou mais substituição de um aminoácido que reduz a ligação a um receptor de Fc e/ou função efetora. Isto significa que a ligação a um receptor Fc pode estar reduzida ou a função efetora pode estar reduzida ou a ligação a um receptor Fc e função efetora podem estar reduzidas.
[014] Em outro aspecto, a invenção fornece um ou mais polinucleotídeos isolados que codificam o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, como descrito na presente invenção. Em um aspecto adicional, a invenção provê um ou mais vetores, particularmente vetor de expressão, compreendendo o(s) polinucleotídeo(s), como descrito na presente invenção. Em outro aspecto, a invenção fornece uma célula hospedeira compreendendo o(s) polinucleotídeo(s) descrito(s) na presente invenção ou o(s) vetor(es) descrito(s) na presente invenção. Em alguns exemplos de realização a célula hospedeira é uma célula eucariótica, particularmente uma célula de mamífero.
[015] Em outro aspecto, é fornecido um método para produzir um anticorpo que se liga ao GPRC5D, compreendendo as etapas de a) cultivar a célula hospedeira descrita na presente invenção em condições adequadas para a expressão do anticorpo; e opcionalmente b) recuperar o anticorpo. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga ao GPRC5D, produzido pelo método aqui descrito. Outro aspecto da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, como descrito na presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Outro aspecto da invenção refere-se ao anticorpo ou molécula de ligação a antígeno biespecífica conforme descrito na presente invenção ou composição farmacêutica conforme descrita na presente invenção para uso como um medicamento. Outro aspecto da invenção refere-se ao anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, conforme descrito na presente invenção ou a composição farmacêutica descrita na presente invenção para uso no tratamento de uma doença. Em um exemplo de realização, a doença é câncer, particularmente mieloma múltiplo. Alternativamente, a doença é uma doença autoimune, tal como lúpus eritematoso sistêmico e/ou artrite reumatoide.
[016] A invenção provê ainda o uso do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, conforme descrito na presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença, particularmente do câncer, mais particularmente para o tratamento de mieloma múltiplo. Alternativamente, a doença é uma doença autoimune, tal como lúpus eritematoso sistêmico e/ou artrite reumatoide.
[017] Em outro aspecto, a invenção diz respeito a um método de tratamento de uma doença, particularmente câncer, mais particularmente mieloma múltiplo, em um indivíduo, compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo ou a molécula de ligação a antígeno biespecífica, conforme descrito na presente invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável. Alternativamente, a doença é uma doença autoimune, tal como lúpus eritematoso sistêmico e/ou artrite reumatoide. Em qualquer um dos exemplos de realização anteriores o indivíduo é preferencialmente um mamífero, particularmente um humano.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[018] Figuras 1A-Z: Configurações “exemplificativas das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção. (Fig. 1A, Fig. 2D) Ilustração da molécula “1+1 CrossMab”. (Fig. 1B, Fig. 1E) Ilustração da molécula “2+1 IgG CrossFab" com ordem alternativa dos componentes Crossfab e Fab (“invertida”). (Fig. 1C, Fig. 1F) Ilustração da molécula “2+1 IgG CrossFab”. (Fig. 1G, Fig. 1K) Ilustração da molécula “1+1 IgG CrossFab” com ordem alternativa dos componentes Crossfab e Fab (“invertida”). (Fig. 1H, Fig. 1L) Ilustração da molécula “1+1 IgG CrossFab”. (Fig. 11, Fig. 1M) Ilustração da molécula “2+1 IgG CrossFab” com dois CrossFabs. (Fig. 1J, Fig. 1N) Ilustração da molécula “2+1 IgG CrossFab"” com dois CrossFabs e com ordem alternativa dos componentes Crossfab e Fab (“invertido”). (Fig. 10, Fig. 18) Ilustração da molécula “Fab-CrossFab”. (Fig. 1P, Fig. 17) Ilustração da molécula “CrossFab-Fab”. (Fig. 1Q, Fig. 1U) Ilustração da molécula “(Fab)>-CrossFab”. (Fig. 1R, Fig. 1V) Ilustração da molécula “CrossFab- (Fab)2”. (Fig. 1W, Fig. 1Y) Ilustração da molécula “Fab-(CrossFab)2”. (Fig. 1X, Fig. 1Z) Ilustração da molécula “(CrossFab)2-Fab”. Ponto Preto: modificação opcional no domínio Fc que promove a heterodimerização. ++, -— aminoácidos de cargas opostas, introduzidos opcionalmente nos domínios
CH1 e CL. As moléculas CrossFab são representadas como compreendendo uma troca das regiões VH e VL, mas podem - em alguns exemplos de realização nos quais nenhuma modificação de carga é introduzida nos domínios CH1 e CL - compreender alternativamente uma troca dos domínios CH1ecCL.
[019] Figura 2: Análise da expressão gênica do alvo tumoral em células plasmáticas e células B por RNAseq.
[020] Figura 3: Configurações exemplificativas das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas SE11 da invenção. Ponto Preto: modificação opcional no domínio Fc que promove a heterodimerização. ++, --: aminoácidos de cargas opostas, introduzidos opcionalmente nos domínios CH1 e CL.
[021] Figuras 4A-C: Análise de ligação de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas 5F11-TCB (Fig. 4A) e SE11-TCB (Fig. 4B) e anticorpo controle ET150-5-TCB (Fig. 4C) em linhagens de células de mieloma múltiplo AMO-1, L636, NCI- H929, RPMI-8226, OPM-2 e WSU- DLCL?2.
[022] Figuras 5A-E: Análise da citotoxicidade de células T mediada por GPRC5D-TCB em linhagens de células de mieloma múltiplo AMO-1 (Fig. 5 A), NCI-H929 (Fig. 5 B), RPMI-8226 (Fig. 5 C) e L363 (Fig. 5 D). A linhagem de células controle é a linhagem WSU-DL CL?2 (Fig. 5E). Moléculas testadas: 5E11-TCB, 5F11-TCB. Moléculas de controle: DP47-TCB (não direcionado) e ET150 -5-TCB.
[023] Figura 6: Análise do envolvimento de células T ativadas por GPRC5D-TCB com múltiplas linhagens de células de mieloma NCI-H929 e linhagens de células de controle negativo WSU-DLCL2 que regulam positivamente CD25 e CD69.
[024] Figuras 7A-J: Análise do envolvimento de células T ativadas por GPRC5D-TCB com mieloma múltiplo na regulação positiva de CD25 em linhagens de células AMO-1 (Fig. 7 A), NCI-H929 (Fig. 7 B), RPMI- 8226 (Fig. 7 C), L363 (Fig. 7 D) e WSU-DLCL?2 (Fig. 7 E) e regulação positiva de CD69 nas linhagens de células AMO-1 (Fig. 7 F), NCI-H929 (Fig. 7 G), RPMI-8226 (Fig. 7 H), L363 (Fig. 71) e WSU-DLCL?2 (Fig. 7J).
[025] Figuras 8A-B: Visualizaçção da localização e internalização de anticorpos por Microscopia Confocal por Fluorescência (Fig. 8A) e análise das intensidades de sinal da membrana versus citoplasma (Fig. 8B).
[026] Figura 9: A ligação de diferentes anticorpos anti- GPRC5D ao GPRC5D humano, de cinomolgo e murino foi avaliada por ELISA, utilizando clones CHO estavelmente transfectados que expressam GPRC5D humano (clone 12) ou GPRC5D humano (clone 12) ou GPRC5D (clone 13), GPRC5D murino (clone 4) ou GPRC5A humano (clone 30).
[027] Figura 10A-G: A lise mediada por células T de várias linhagens de células de Mieloma Múltiplo (MM) induzidas por diferentes moléculas biespecíficas de células T direcionadas ao GPRC5D ou BCMA durante 20 horas de coincubação (E:T = 10:1, células T pan humanas). São representadas duplicatas com DP.
[028] Figura 11A-F: Ativação de células T induzida por diferentes moléculas biespecíficas de células T direcionadas ao GPRC5D ou BCMA (5E11-TCB na Fig. 11A; 5F11-TCB na Fig. 11B; 10B10-TCB na Fig. 11C; BCMA-TCB na Fig. 11D; BCMA-TCB na Fig. 11E; DP47-TCB na Fig. 11F) durante — 20 horas de coincubação de células pan T humanas alógenas e células da Medula Óssea não processadas a partir de doadores saudáveis (E:T = 10: 1, células T pan humanas). São representados gráficos de pontos de FACS de um doador representativo, mostrando a regulação positiva do marcador de ativação CD69 nas células T CD4 (linha superior) ou CD8 (linha inferior) como células positivas em porcentagem entre todas as células T CD8 respectivas CD4.
[029] Figuras 12A-B: Ativação de células T induzida por diferentes moléculas biespecíficas de células T direcionadas ao GPRC5D ou BCMA durante — 20 horas de coincubação de células T pan humanas alógenas e células da medula óssea não processadas a partir de doadores saudáveis (E:T = 10:1, células T pan humanas). É representado o resumo de todos os quatro doadores avaliados, mostrando a regulação positiva do marcador de ativação CD69 em células T CD8 na dose fixa selecionada de 50 nM (Fig. 12A) ou 5 nM (Fig. 12B) de TCB.
[030] Figura 13A-D: Eficácia in vivo induzida por diferentes moléculas biespecíficas de células T direcionadas ao GPRC5D (5F11-TCB na Fig. 138A; BCMA-TCB na Fig. 13B; B72-TCB na Fig. 13C; Veículo na Fig. 13D), conforme representado pela cinética de crescimento tumoral ao longo do tempo em um modelo de camundongos NSG humanizados, enxertados com células tumorais NCI-H929. São plotados gráficos de radar com cada linha referente a um único camundongo.
[031] Figuras 14A-D: Eficácia in vivo induzida por diferentes moléculas biespecíficas de células T direcionadas ao GPRC5D (5F11-TCB na Fig. 14A; 5E11-TCB na Fig. 14B; B72-TCB na Fig. 14C; veículo na Fig. 14D), conforme representado pela cinética de crescimento tumoral ao longo do tempo em um modelo de camundongos NSG humanizados, enxertados com células tumorais OPM-2. São plotados gráficos de radar com cada linha referente a um único camundongo.
[032] Figuras 15A-B: Ativação do PGLALA-CAR-J após aproximadamente 16 horas de incubação, conforme determinado pela luminescência. O último é induzido por ligação simultânea das IgtGs GPRC5D (SF11-lg9G na Fig. 15A; SE11-lg9G na Fig. 15B) para linhagem de células de mieloma múltiplo L-363 que expressam GPRC5D e do domínio Fc modificado com PGLALA em células repórter Jurkat-NFAT, que foram geneticamente modificadas para expressarem TCR direcionado contra a mutação PGLALA na parte Fc dessas moléculas de IgG. São representadas duplicatas com DP.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES
[033] Os termos são utilizados na presente invenção da forma que geralmente são utilizados no estado da técnica, a menos que de outro modo definido conforme descrito a seguir.
[034] Conforme utilizado no presente, o termo “molécula de ligação ao antígeno” é utilizado no sentido mais amplo para se referir a uma molécula que se liga especificamente a um determinante antigênico. Exemplos de moléculas de ligação ao antígeno são imunoglobulinas e seus derivados, por exemplo, fragmentos das mesmas.
[035] O termo “biespecífico” significa que a molécula de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a, pelo menos, dois determinantes antigênicos distintos. Normalmente, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende dois sítios de ligação ao antígeno, cada um deles é específico para um determinante antigênico diferente. Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é capaz de se ligar, simultaneamente, a dois determinantes antigênicos, em particular dois determinantes antigênicos expressos em duas células distintas.
[036] O termo “valente”, usado no presente pedido denota a presença de um número especificado de sítios de ligação ao antígeno em uma molécula de ligação ao antígeno. Como tal, o termo “ligação monovalente a um antígeno” indica a presença de um (e não mais do que um) sítio de ligação ao antígeno específico para o antígeno na molécula de ligação ao antígeno.
[037] Um “sítio de ligação ao antígeno” refere-se ao sítio (local), ou seja, um ou mais resíduos de aminoácidos de uma molécula de ligação ao antígeno que provê a interação com o antígeno. Por exemplo, o sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo compreende os resíduos de aminoácidos a partir das regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Uma molécula de imunoglobulina nativa geralmente possui dois sítios de ligação ao antígeno, de uma molécula Fab tipicamente tem apenas um único sítio de ligação ao antígeno.
[038] Conforme utilizado no presente, o termo “molécula de ligação ao antígeno” refere-se a uma molécula polipeptídica que se liga especificamente a um determinante antigênico. Em um exemplo de realização, uma porção de ligação ao antígeno é capaz de direcionar a entidade ao qual está ligada (por exemplo, uma segunda molécula de ligação a antígeno) para um local alvo, por exemplo, para um tipo específico de célula tumoral que carrega o determinante antigênico. Em outro exemplo de realização uma porção de ligação ao antígeno é capaz de ativar a sinalização através do seu antígeno alvo, por exemplo, um complexo de antígenos do receptor de células T. As moléculas de ligação ao antígeno incluem anticorpos e fragmentos destes, conforme adicionalmente definido na presente invenção. Moléculas de ligação ao antígeno específicas incluem um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada do anticorpo e uma região variável de cadeia leve do anticorpo. Em determinados exemplos de realização, as moléculas de ligação ao antígeno compreendem regiões constantes de anticorpo, conforme definido adicionalmente no presente pedido e conhecido no estado da técnica. As regiões constantes de cadeia pesada úteis incluem qualquer um dos cinco isotipos: a, 3, e, y, ou uu. As regiões constantes da cadeia leve úteis incluem qualquer um dos dois isotipos: Ke.
[039] Conforme utilizado no presente, o termo “determinante antigênico” é sinônimo de “antígeno” e “epítopo”, e refere-se a um local (por exemplo, um trecho contíguo de aminoácidos ou uma configuração conformacional composta de diferentes regiões de aminoácidos não contíguos) em uma macromolécula polipeptídica ao qual se liga uma porção de ligação ao antígeno, formando um complexo “molécula de ligação ao antígeno-antígeno”. Os determinantes antigênicos úteis podem ser encontrados, por exemplo, sobre as superfícies de células tumorais, sobre as superfícies de células infectadas por vírus, sobre as superfícies de outras células doentes, sobre as superfícies de células do sistema imunológico, livres no soro sanguíneo, e/ou na matriz extracelular (ECM). As proteínas referidas como antígenos na presente invenção (por exemplo, GPRC5D, CD3) podem ser qualquer forma nativa das proteínas a partir de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, humanos), primatas nã humanos (por exemplo, macacos cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma.
Em um exemplo de realização específico, o antígeno é uma proteína humana.
Sempre que se faça referência a uma proteína específica na presente invenção, o termo abrange a referida proteína “completa” ou “de comprimento total”, não processada, bem como qualquer forma da proteína resultante do processamento na célula.
O termo também abrange variantes que ocorrem naturalmente da proteína, por exemplo, as variantes por splicing alternativo ou variantes alélicas.
Uma proteína humana exemplar útil como antígeno é o CD3, particularmente a subunidade épsilon de CD3 (veja UniProt nº.
PO7766 (versão 185), NCBI RefSeq nº.
NP 000724.1, SEQ ID NO: 40 para a sequência humana; ou UniProt nº.
Q95LI5 (versão 69), NCBI GenBank nº.
BAB71849.1; SEQ ID NO: 41 para a sequência de cinomolgo [Macaca fascicularis]), ou GPRC5D (veja UniProt nº.
Q9NZD1 (versão 115); NCBI RefSeq nº.
NP 061124.1, SEQ ID NO:
45 para a sequência humana). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção se liga a um epítopo de CD3 ou GPRC5D que é conservado entre CD3 ou GPRC5D de diferentes espécies. Em exemplos de realização específicos, o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção se liga ao GPRC5D humano.
[040] O termo “ligação específica” significa que a ligação é seletiva para o antígeno e pode ser discriminada a partir de interações não desejadas ou não específicas. A capacidade da porção de ligação ao antígeno se ligar a um determinante antigênico específico pode ser mensurada por meio de um ensaio imunoadsorvente enzima-associado (ELISA) ou por outras técnicas familiares para um técnico hábil no assunto, por exemplo, a técnica de ressonância plasmônica de superfície (SPR) (analisada, por exemplo, em um instrumento BlAcore) (Liljeblad et a/., Glico J 17, 323-329 (2000)), e ensaios de ligação tradicionais (Heeley Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Em um exemplo de realização, o grau de ligação de um antígeno para a porção de ligação a uma proteína não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação da porção de ligação ao antígeno para o antígeno, conforme mensurado, por exemplo, por SPR. Em certos exemplos de realização, a porção de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno, ou a molécula de ligação ao antígeno compreendendo tal porção de ligação ao antígeno, tem uma constante de dissociação (Ko) < 1 UM, € 100nM, € 10NM, € 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 108 M ou menos, por exemplo, de 108 a 103, por exemplo 10º a 10º BM).
[041] “Afinidade” refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um sítio de ligação único de uma molécula (por exemplo, anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um ligante). A expressão “afinidade de ligação” a menos que indicado de outro modo, refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros do par de ligação (por exemplo, uma porção de ligação ao antígeno e um antígeno, ou um receptor e seu ligante). A afinidade de uma molécula X para o seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kp), que é a relação entre a velocidade de dissociação e de associação (kom e kon, respectivamente) Deste modo, as afinidades equivalentes podem compreender diferentes constantes de velocidade, desde que a razão entre as constantes de velocidade continue a ser a mesma. À afinidade pode ser mensurada por meio de métodos bem estabelecidos no estado da técnica, incluindo os métodos descritos na presente invenção. Um método particular para mensurar a afinidade é a ressonância plasmônica de superfície (SPR).
[042] A expressão “ligação reduzida”, por exemplo, uma ligação para um receptor Fc reduzida, refere-se a uma diminuição da afinidade para a respectiva interação, tal como mensurado, por exemplo, por um ensaio SPR. Para maior clareza, o termo inclui também a redução da afinidade para zero (ou abaixo do limite de detecção do método analítico), ou seja, a abolição completa da interação. Por outro lado, “ligação aumentada” refere-se a um aumento na afinidade de ligação para a respectiva interação.
[043] Um “antígeno de ativação de célula T”, conforme utilizado na presente invenção refere-se a um determinante antigênico expresso na superfície de um linfócito T, particularmente, um linfócito T citotóxico, que é capaz de induzir a ativação de célula T mediante a interação com uma molécula de ligação ao antígeno. Especificamente, a interação de uma molécula de ligação ao antígeno com um antígeno de ativação de célula T pode induzir a ativação das células T, desencadeando a cascata de sinalização do complexo “receptor de células T'. Em um exemplo de realização específico o antígeno de ativação de célula T é o CD3, particularmente a subunidade épsilon de CD3 (veja UniProt nº. PO7766 (versão 144), NCBI RefSeq nº. NP 000724.1, SEQ ID NO: 40 para a sequência humana; ou UniProt nº. Q95LI5 (versão 49), NCBI GenBank nº. BAB71849.1; SEQ ID NO: 41 para a sequência de cinomolgo [Macaca fascicularis]).
[044] A expressão “ativação de célula T”, utilizada na presente invenção refere-se a uma ou mais resposta celular de um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico, selecionada a partir de: proliferação, diferenciação, secreção de citocina, liberação de molécula efetora citotóxica, atividade citotóxica, e expressão de marcadores de ativação. Ensaios adequados para mensurar a ativação de célula T são conhecidos no estado da técnica e descritos na presente invenção.
[045] A expressão “antígeno da célula alvo”, utilizada na presente invenção, refere-se a um determinante antigênico apresentado sobre a superfície de uma célula-alvo, por exemplo, uma célula tumoral, tal como uma célula cancerosa ou célula do estroma do tumor. Em um exemplo de realização específico, o antígeno da célula alvo é GPRCB5D, particularmente GPRC5D humano de acordo com a SEQ ID NO: 45.
[046] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “primeiro”, “segundo” ou “terceiro” com relação às moléculas Fab e etc. são usados para de distinguir de modo conveniente quando existe mais do que uma porção de cada tipo. O uso desses termos não tem a intenção de conferir uma ordem ou orientação do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, a menos que seja explicitamente declarado.
[047] “Fundido” significa-se que os componentes (por exemplo, uma molécula Fab e uma subunidade do domínio Fc) estão ligados por meio de ligações peptídicas, seja diretamente ou através de um ou mais ligantes peptídicos.
[048] Uma “molécula Fab” refere-se a uma proteína que consiste no domínio VH e CH1 da cadeia pesada (a “cadeia pesada Fab”) e o domínio VL e CL da cadeia leve (a “cadeia leve Fab”) de uma imunoglobulina.
[049] Por uma molécula Fab crossover (ou Fab cruzada) (também denominada “cross-Fab”) entende-se uma molécula Fab na qual tanto as regiões variáveis quanto as regiões constantes da cadeia pesada e leve do Fab estão trocadas (ou seja, substituídas entre si), isto é, a molécula Fab crossover compreende uma cadeia peptídica constituída pelo domínio variável de cadeia leve VL e o domínio constante de cadeia pesada 1 CH1 (VL-CH1, na direção N- para C-terminal), e uma cadeia peptídica constituída pelo domínio variável de cadeia pesada VH e o domínio constante de cadeia leve CL (VH- CL, na direção N- para C-terminal). Para maior clareza, uma molécula Fab crossover em que os domínios variáveis de cadeia leve Fab e de cadeia pesada Fab estão trocados, a cadeia peptídica que compreende o domínio constante de cadeia pesada 1 CH1 é referia no presente documento como “cadeia pesada” da molécula Fab crossover. Por outro lado, uma molécula Fab crossover em que os domínios constantes de cadeia leve Fab e de cadeia pesada Fab estão trocados, a cadeia peptídica que compreende o domínio variável da cadeia pesada VH é referia no presente documento como “cadeia pesada” da molécula Fab crossover.
[050] Em contrapartida, por uma molécula Fab “convencional” entende-se uma molécula Fab em seu formato natural, ou seja, compreendendo uma cadeia pesada composta pelos domínios variável e constante de cadeia pesada (VH-CH1, na direção N- para C-terminal) e uma cadeia leve composta pelos domínios variável e constante de cadeia leve (VL- CL, na direção N- para C-terminal).
[051] O termo “molécula de imunoglobulina” refere-se a uma proteína que tem a estrutura de um anticorpo que ocorre naturalmente. Por exemplo, imunoglobulihnas da classe IgG nativas são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que são ligadas por ligações de bissulfeto. À partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia pesada tem um domínio variável (VH), também denominado de domínio pesado variável ou região variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), também denominados de região constante de cadeia pesada. Do mesmo modo, a partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia leve tem um domínio variável (VL), também denominado de domínio leve variável ou região variável de cadeia leve, seguido por um domínio constante leve (CL), também denominado de região constante de cadeia leve. A cadeia pesada de uma imunoglobulina pode ser atribuída a um dentre cinco tipos, denominados de a (IgA), 5 (ID), e (IgE), vy (IGG), ou u (IgM), alguns dos quais podem ser ainda divididos em subtipos, por exemplo, y1 (I9G1), y2 (I9G2), va (I9G3), va (I9G4), a1 (IGA1) e a2 (IGgA2). A cadeia leve de uma imunoglobulina pode ser atribuída a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa (K) e lambda (A), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes. Uma imunoglobulina consiste essencialmente de duas moléculas Fab e um domínio Fc, ligados pela região de dobradiça da imunoglobulina.
[052] O termo “anticorpo” na presente invenção é utilizado no sentido mais amplo e abrange diferentes estruturas de anticorpo, incluindo, mas não se limitando, a anticorpos monocilonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.
[053] O termo “anticorpo monocional” conforme utilizado no presente refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, ou seja, os anticorpos individuais compreendidos em uma população são idênticos e/ou se ligam ao(s) mesmo(s)
epíitopo(s), exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou que podem surgir durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estão presentes em pequenas quantidades. Ao contrário das preparações com anticorpo policlonal, que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante sobre um antígeno. Portanto, o adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como uma necessidade de se produzir o anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando aos métodos de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição por fago, e métodos que utilizam animais transgênicos contendo a totalidade ou parte dos /loci de imunoglobulinas humanas, e tais métodos e outros métodos exemplares para produzir anticorpos monoclionais descritos na presente divulgação.
[054] Um anticorpo “isolado” é aquele que foi separado a partir de um componente de seu ambiente natural, ou seja, não está em seu meio natural. Não é necessário qualquer nível particular de purificação. Por exemplo, um anticorpo isolado pode ser removido do seu ambiente nativo ou natural. Os anticorpos produzidos de forma recombinante em células hospedeiras são considerados isolados para a finalidade da invenção, visto que são anticorpos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados, ou parcial ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada. Desse modo, os anticorpos e moléculas de ligação a antígeno biespecíficas da presente invenção são isolados. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo é purificado a mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado, por exemplo, por métodos eletroforéticos (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou cromatográficos (por exemplo, cromatografia de troca iônica ou HPLC de fase inversa). Para uma revisão de métodos para a avaliação da pureza do anticorpo, vide, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
[055] As expressões “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo inteiro”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são utilizadas no presente de forma alternada para se referirem a um anticorpo possuindo uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativa.
[056] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula que não é um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a Fv, Fab, Fab', Fab”- SH, F(ab')2, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv) e anticorpos de domínio único. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpos, vide Hudson et al. Nat. Med. 9:129- 134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv, vide, por exemplo, Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Eds Rosenburg & Moore., (Springer-Verlag, Nova lorque), págs. 269-315 (1994); vide também o WO 93/16185; e as Patentes US 5.571.894 e US 5.587.458. Para uma discussão sobre os fragmentos Fab e F(ab')), compreendendo os resíduos do epítopo de ligação aos receptores de recuperação (salvage) e possuindo uma meia-vida in vivo aumentada, vide a Patente US 5.869.046. Os diacorpos (diabodies) são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Vide, por exemplo, a Patente EP 404.097; o documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448
(1993). Triacorpos (triabodies) e tetracorpos (tetrabodies) também estão descritos em Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia pesada ou a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em determinados exemplos de realização, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc, Waltham, MA, vide, por exemplo, Patente US 6.248.516 B1). Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por diversas técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto bem como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, Escherichia coli ou fagos), conforme descrito na presente invenção.
[057] O termo “domínio de ligação ao antígeno” refere-se à parte de uma molécula de ligação ao antígeno que compreende a área que se liga especificamente e é complementar a parte ou todo o antígeno. Um domínio de ligação ao antígeno pode ser fornecido, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis de anticorpo (também denominado de regiões variáveis). Particularmente, um domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo (VH).
[058] O termo “região variável” ou “domínio variável" refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões conservadas denominadas regiões estruturais ou arcabouços (frameworks - FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Vide, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6º ed., W.H. Freeman & Co., página 91 (2007)). Um único domínio
VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Conforme utilizado na presente invenção em conexão com sequências de regiões variáveis, a expressão “numeração de Kabat” refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologíical Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
[059] Conforme utilizado no presente, as posições de aminoácidos de todas as regiões constantes e os domínios de cadeia pesada e leve são numerados de acordo com o sistema de numeração de Kabat descrito em Kabat, et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) e é referido na presente invenção como “numeração de acordo com Kabat" ou “numeração de Kabat”. Especificamente, o sistema de numeração de Kabat (vide as páginas 647-660 de Kabat, et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) é usado para o domínio constante de cadeia leve CL do isotipo capa e lambda e o sistema de numeração “índice EU' de Kabat (vide as páginas 661-723) é usado para os domínios constantes de cadeia pesada (CH1, dobradiça, CH2 e CH3), que é adicionalmente clarificado no presente referindo-se a “numeração de acordo com índice EU de Kabat”, neste caso.
[060] O termo “região hipervariável” ou “HVR” conforme utilizado no presente refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que é hipervariável na sequência (“região determinante de complementaridade” ou “CDRs”; as CDRs da região/domínio variável de cadeia pesada são abreviadas, por exemplo, como HCDR1, HCDR2 e HCDR3; as CDRs da região/domínio variável de cadeia leve são abreviadas, por exemplo, como LCDR1, LCDR2 e LCDR3) e/ou forma alças (loops) estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”) e/ou contém resíduos de contanto ao antígeno (“contato ao antígeno”). Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs; sendo três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). HVRs exemplares na presente invenção incluem: (a) alças hipervariáveis que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96- 101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), e 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) contatos ao antigênio que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), e 93- 101 (H3) (MacCallum et a/. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996); e (d) combinações de (a), (b) e/ou (c), incluindo resíduos de aminoácidos HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) e 94-102 (H3).
[061] Salvo quando indicado de outra forma, os resíduos HVR e outros resíduos do domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são numerados na presente invenção de acordo com Kabat et al., Supra.
[062] As expressões “região de arcabouço”, “região estrutural” ou “FR” (de framework) referem-se aos resíduos de domínios variáveis que não são resíduos da região hipervariável (HVR) A FR de um domínio variável consiste geralmente em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Assim, as sequências HVR e FR geralmente aparecem na seguinte ordem na VH (ou VL): FR1-H1 (L1)-FR2-H2 (L2)-FR3-H3 (L3)-FRA4.
[063] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos a partir de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas Em alguns exemplos de realização, o anticorpo humanizado compreenderá de substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Tais domínios variáveis são referidos na presente invenção como “região variável humanizada”. Um anticorpo humanizado pode compreender, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivado de um anticorpo humano. Em alguns exemplos de realização, alguns resíduos FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, anticorpo a partir do qual os resíduos da HVR são derivados), por exemplo, para restabelecer ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido à humanização. Outras formas de “anticorpos humanizados” abrangidas pela presente invenção são aquelas em que a região constante foi adicionalmente modificada ou alterada a partir do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação à ligação ao C1q e/ou ligação ao receptor Fc (FCcR).
[064] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde ao de um anticorpo produzido por um ser humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências codificantes de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado, que compreende resíduos não humanos de ligação ao antígeno. Em determinados modalidades, um anticorpo humano é derivado de um mamífero não humano transgênico, por exemplo, um camundongo, rato ou coelho. Em determinados exemplos de realização, um anticorpo humano é derivado de uma linhagem de células de hibridoma. Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo isolados a partir de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos na presente invenção.
[065] A “classe” de um anticorpo ou imunoglobulina refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante presente em sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, I1gD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, I9G2, I9G3, IgG4, IgA: e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados de a, ô, e, y, e uy, respectivamente.
[066] O termo “domínio Fc” ou “região Fc” é usado no presente para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina contendo pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões de Fc de sequências nativas e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de IgG possam variar levemente, a região Fc da cadeia pesada da IgG humana é normalmente definida como se estendendo a partir da Cis226, ou a partir da Pro230 até a região carboxi-terminal da cadeia pesada. Entretanto, os anticorpos produzidos por células hospedeiras podem ser submetidos a clivagem pós-traducional de um ou mais, especialmente um ou dois, aminoácidos a partir da extremidade C-terminal da cadeia pesada. Por esse motivo, um anticorpo produzido por uma célula hospedeira pela expressão de uma molécula de ácido nucleico específica que codifica uma cadeia pesada de comprimento total pode incluir a cadeia pesada de comprimento total, ou pode incluir uma variante clivada da cadeia pesada de comprimento total (também referida no presente como “cadeia pesada variante clivada”). Este pode ser o caso em que os dois aminoácidos C-terminais finais da cadeia pesada são glicina (G446) e lisina (K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Portanto, a lisina C-terminal (Lis447), ou a glicina C- terminal (GIli446) e a lisina (K447) da região Fc, podem ou não estar presentes.
As sequências de aminoácidos das cadeias pesadas, incluindo os domínios Fc (ou uma subunidade de um domínio Fc, conforme definido na presente invenção) são indicadas no presente sem o dipeptídeo glicina-lisina C-terminal, se não indicado de outra forma.
Em um exemplo de realização da invenção, uma cadeia pesada que inclua uma subunidade de um domínio Fc, conforme especificado no presente, compreendida em um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção, compreende um dipeptídeo glicina-lisina C-terminal adicional (G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização da invenção, uma cadeia pesada que inclua uma subunidade de um domínio Fc, conforme especificado no presente, compreendida em um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção, compreende um resíduo glicina C-terminal adicional (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). As composições da invenção, tais como as composições farmacêuticas descritas no presente, compreendem uma população de anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção.
A população de anticorpos ou de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas pode compreender moléculas possuindo uma cadeia pesada de comprimento total (completa) e moléculas com uma cadeia pesada variante clivada.
A população de anticorpos ou de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas pode consistir de uma mistura de moléculas possuindo uma cadeia pesada de comprimento total e moléculas possuindo uma cadeia pesada variante clivada, em que pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas têm uma cadeia pesada variante clivada.
Em um exemplo de realização da invenção, uma composição compreendendo uma população de anticorpos ou de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreende um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende uma cadeia pesada que inclui uma subunidade de um domínio Fc, conforme especificado no presente, com um dipeptídeo glicina-lisina C-terminal adicional (G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização da invenção, uma composição compreendendo uma população de anticorpos ou de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreende um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende uma cadeia pesada que inclui uma subunidade de um domínio Fc, conforme especificado no presente, com um resíduo de glicina C-terminal adicional (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização da invenção, tal composição compreende uma população de anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendidos de moléculas que compreendem uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc conforme especificado na presente invenção; moléculas compreendendo uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc conforme especificado na presente invenção com um resíduo glicina C- terminal adicional (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e moléculas compreendendo uma cadeia pesada incluindo uma subunidade de um domínio Fc conforme especificado na presente invenção com um dipeptídeo glicina-lisina C-terminal adicional (G446 e K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). A menos que especificado de outra maneira, a numeração dos resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado o índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed.
Public Health Service, National Institutes of
Health, Bethesda, MD, 1991 (veja também acima). Uma “subunidade” de um domínio Fc, conforme utilizado no presente, refere-se a um dos dois polipeptídeos que formam o domínio Fc dimérico, ou seja, um polipeptídeo compreendendo as regiões constantes C-terminais de uma cadeia pesada da imunoglobulina, capaz de realizar autoassociação estável. Por exemplo, uma subunidade de um domínio Fc de IgG compreende uma CH2 de IgG e um domínio constante CH3 de IgG.
[067] Uma “modificação que promove a associação da primeira e segunda subunidade do domínio Fc" é uma manipulação da estrutura peptídica ou modificações pós-traducionais de uma subunidade do domínio Fc que reduz ou evita a associação de um polipeptídeo que compreende a subunidade do domínio Fc com um polipeptídeo idêntico para formar um homodímero. Uma modificação que promove a associação, conforme utilizado no presente inclui, particularmente, as modificações feitas em cada uma das duas subunidades de domínio Fc separadamente (ou seja, a primeira e a segunda subunidade do domínio Fc), em que as modificações são complementares entre si, de modo a promover a associação das duas subunidades do domínio Fc. Por exemplo, uma modificação que promove a associação pode alterar a estrutura ou a carga de uma ou ambas as subunidades do domínio Fc de modo a fazer a sua associação estéricamente ou eletrostaticamente favorável, respectivamente. Assim, a (hetero)dimerização ocorre entre um polipeptídeo que compreende a primeira subunidade do domínio Fc e um polipeptídeo que compreende a segunda subunidade do domínio Fc, que devem ser não idênticas no sentido de que outros componentes fundidos a cada uma das subunidades (por exemplo, porções de ligação ao antígeno) não sejam iguais. Em alguns exemplos de realização, a modificação que promove a associação compreende uma mutação de aminoácidos no domínio Fc, especificamente, uma substituição de aminoácidos. Em um exemplo de realização específico, a modificação que promove a associação compreende uma mutação de aminoácidos separada, especificamente uma substituição de aminoácidos em cada uma das duas subunidades do domínio Fc.
[068] O termo “funções efetoras"” refere-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam de acordo com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação de C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP); secreção de citocina; captação de antígeno mediada pelo complexo imune pelas células apresentadoras de antígeno; regulação negativa dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B) e ativação de célula B.
[069] Tal como utilizado na presente invenção, os termos “desenvolvido, manipulado e modificado por engenharia genética” devem ser considerados para incluir qualquer tipo de manipulação da estrutura central do peptídeo ou as modificações pós-traducionais de um polipeptídeo de ocorrência natural ou recombinante ou fragmento deste. A manipulação ou modificação inclui modificações na sequência de aminoácidos, do padrão de glicosilação, ou do grupo de cadeia lateral dos aminoácidos individuais, bem como combinações destas abordagens.
[070] O termo “mutação de aminoácidos” tal como é utilizado na presente invenção pretende abranger substituições, deleções, inserções e modificações de aminoácidos. Qualquer combinação dentre substituição, deleção, inserção e modificação de aminoácidos pode ser feita para se chegar à construção final, desde que a construção final tenha as características desejadas, por exemplo, redução da ligação a um receptor Fc, ou aumento da associação com outro peptídeo. As deleções de sequências de aminoácidos e as inserções incluem deleções e inserções de aminoácidos amino- e/ou carboxi-terminal. Determinadas mutações de aminoácidos são substituições de aminoácidos. Para o propósito de alterar, por exemplo, as características de ligação de uma região Fc, substituições de aminoácidos não conservadoras, ou seja, a substituição de um aminoácido por outro aminoácido que possui propriedades estruturais e/ou químicas diferentes, são particularmente preferidas. As substituições de aminoácidos incluem a substituição por aminoácidos de ocorrência não natural ou por aminoácidos de ocorrência natural derivados dos vinte aminoácidos padrão (por exemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metil-histidina, ornitina, homosserina, S5-hidroxilisina)). As mutações de aminoácidos podem ser geradas usando métodos genéticos ou químicos bem conhecidos no estado da técnica. Os métodos genéticos podem incluir a mutagênese sítio-dirigida, PCR, síntese de genes e técnicas similares. Está contemplado que os métodos de alteração do grupo da cadeia lateral de um aminoácido por outro que não seja por engenharia genética, tal como a modificação química, também pode ser útil. Várias designações podem ser utiizadas na presente invenção para indicar a mesma mutação de aminoácidos. Por exemplo, uma substituição de prolina na posição 329 do domínio Fc por glicina pode ser indicada como 329G, G329, G329, P329G, ou Pro329GIi.
[071] O “percentual (%) de identidade da sequência de aminoácidos” com relação a uma sequencia polipeptídica é definido no presente como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos (gaps), se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequências. O alinhamento para fins de determinação da porcentagem de identidade de sequências de aminoácidos pode ser obtido de diversas formas que estão dentro do conhecimento do estado da técnica, por exemplo, pelo uso de softwares de computador publicamente disponíveis, tais como os programas BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) ou o pacote de programas FASTA. Os técnicos hábeis no assunto podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão sendo comparadas. Entretanto, para os fins aqui mencionados, os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos são gerados usando o programa ggsearch do pacote FASTA versão 36.3.8c ou posterior com a matriz de comparação BLOSUMSB5O0. O pacote do programa FASTA é de autoria de W.R. Pearson e D.J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227- 258; e Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36, e está disponível publicamente em http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta www2/fasta down.shtml. Alternativamente, um servidor público acessível em http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta www2/index.cgi pode ser usado para comparar sequências usando o programa ggsearch (global protein:protein) e as opções padrão (BLOSUMS5O; open: -10; ext: -2; Ktup = 2) para garantir que um alinhamento global, e não local, seja realizado. A porcentagem de identidade de aminoácidos é fornecida no cabeçalho do alinhamento de saída.
[072] O termo “polinucleotídeo” refere-se a uma molécula isolada de ácido nucleico ou a construção, por exemplo, RNA mensageiro (mMRNA), RNA derivado de vírus, ou DNA plasmidial (PDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação amida, tal como encontrado nos ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). O termo “molécula de ácido nucleico”
refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, DNA ou fragmentos de RNA, presente em um polinucleotídeo.
[073] Por molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeo “isolado” entende-se uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA que tenha sido removida do seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo contido em um vetor é considerado isolado para os propósitos da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Um polinucleotídeo isolado inclui um polinucleotídeo — contido em células que normalmente expressam o polinucleotídeo, mas o polinucleotídeo está presente extracromossomalmente ou em um local cromossômico que é diferente de sua localização cromossômica natural. Moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro da presente invenção, bem como formas de fita positiva e negativa, e as formas de dupla fita. Polinucleotídeos ou ácidos nucleicos isolados de acordo com a presente invenção incluem ainda estas moléculas produzidas de maneira sintética. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico que pode ser ou pode incluir um elemento regulador, tal como um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo, ou de terminador da transcrição.
[074] “Polinucleotídeo isolado (ou ácido nucleico) codificante” [por exemplo, de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção] refere-se a uma ou mais moléculas de polinucleotídeos que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos (ou fragmentos das mesmas), incluindo tais moléculas de polinucleotídeos em um único vetor ou em vetores separados, e a(s) referida(s) molécula(s) polinucleotídeo(s) estão presentes em pelo menos um ou mais local(ais) de uma célula hospedeira.
[075] O termo “cassete de expressão” referesse a um polinucleotídeo gerado de forma recombinante ou sintética, com uma série de elementos de ácido nucleico especificados que permite a transcrição de um ácido nucleico específico em uma célula alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA plastidial, vírus, ou fragmento de ácido nucleico. Normalmente, a porção do cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, uma sequência de ácido nucleico a ser transcrita e um promotor. Em determinados exemplos de realização, o cassete de expressão da presente invenção compreende sequências de polinucleotídeos que codificam os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, ou fragmentos de ligação das mesmas.
[076] O termo “vetor” ou “vetor de expressão” refere-se a uma molécula de DNA que é usada para introduzir e direcionar a expressão de um gene específico que está operacionalmente ligado em uma célula alvo. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado ao genoma de uma célula hospedeira na qual ele foi introduzido. O vetor de expressão da presente invenção compreende um cassete de expressão. Os vetores de expressão permitem a transcrição de grandes quantidades de mMRNA estável. Uma vez que o vetor de expressão está dentro da célula alvo, a molécula de ácido ribonucleico ou proteína que é codificada pelo gene é produzida pela transcrição celular e/ou maquinário de tradução. Em um exemplo de realização, o vetor de expressão da presente invenção compreende um cassete de expressão que compreende sequências de polinucleotídeos que codificam os anticorpos ou as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, ou fragmentos de ligação das mesmas.
[077] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem de célula hospedeira” e “cultura de células hospedeiras” são utilizados de maneira alternada e referem-se a células nas quais um ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e progênie dela derivada sem levar em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica quanto a conteúdo de ácido nucleico em relação à célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que possui a mesma função ou atividade biológica, conforme triado ou selecionado na célula transformada inicial, é abrangida pela presente invenção. Uma célula hospedeira é qualquer tipo de sistema celular que pode ser utilizada para gerar os anticorpos ou as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção. As células hospedeiras incluem células de cultura, por exemplo, células de mamíferos cultivadas, tais como células HEK, células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongos P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, células de levedura, células de inseto e células vegetais, para citar apenas algumas, como também células compreendidas dentro de um animal transgênico, planta transgênica ou tecido vegetal ou animal cultivado.
[078] Um “receptor Fc de ativação” é um receptor Fc que, após o acoplamento por uma região Fc de um anticorpo, desencadeia eventos de sinalização que estimulam as células que carregam o receptor a executarem funções efetoras. Os receptores Fc de ativação humanos incluem FeyRilla (CD16a), FcyRI (CD64), FeyRlla (CD32), e FcaRI (CD89).
[079] A citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) é um mecanismo imune que conduz à lise de células-alvo revestidas com anticorpo pelas células efetoras do sistema imune. As células alvo são células às quais os anticorpos ou seus derivados, que compreendem uma região Fc se ligam especificamente, em geral, através da parte da proteína que é N-terminal com a região Fc. Conforme utilizado no presente, o termo “ADCC reduzida” é definido como qualquer uma redução no número de células-alvo que são lisadas em um determinado tempo, em uma dada concentração de anticorpo no meio que circunda as células-alvo por meio do mecanismo de ADCC definido acima, e/ou um aumento na concentração de anticorpo no meio que circunda as células-alvo necessário para atingir a lise de um determinado número de células-allvo em um dado momento pelo mecanismo de ADCC. A redução na ADCC é relativa à ADCC mediada pelo mesmo anticorpo produzido pelo mesmo tipo de células hospedeiras, usando os mesmos métodos-padrão de produção, purificação, formulação e armazenamento (que são conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto), mas que não foram mas que não foram modificadas por engenharia genética. Por exemplo, a redução da ADCC mediada por um anticorpo que compreende no seu domínio Fc uma substituição de aminoácidos que reduz a ADCC, é relativo à ADCC mediada por um mesmo anticorpo sem esta substituição de aminoácidos no domínio Fc. Ensaios adequados para mensurar a ADCC são bem conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, a publicação PCT WO 2006/082515 ou publicação WO 2012/130831).
[080] Uma “quantidade eficazr de um agente refere-se à quantidade que é necessária para provocar uma alteração do estado fisiológico da célula ou do tecido ao qual é administrado.
[081] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente, por exemplo, uma composição farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado — profilático ou terapêutico “desejado. “Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente, por exemplo, elimina, diminui, atrasa, minimiza ou evita os efeitos adversos de uma doença.
[082] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas,
ovelhas, gatos, cachorros e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Particularmente, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.
[083] O termo “composição farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em uma forma que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo contida nela seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a composição deveria ser administrada.
[084] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma composição farmacêutica que não seja um ingrediente ativo e que não seja tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.
[085] Conforme utilizado no presente, o termo “tratamento” (e variações gramaticais deste como “tratar ou “tratando”) refere-se a intervenções clínicas em uma tentativa de alterar o curso natural de uma doença em um indivíduo que está sendo tratado, e pode ser realizado para profilaxia ou durante o desenvolvimento da patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem, mas não estão limitados a, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de qualquer consequência patológica direta ou indireta da doença, prevenção de metástase, redução da velocidade de progressão da doença, melhora ou alívio do estado da doença, e remissão ou prognóstico melhorado. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença, ou retardar a progressão de uma doença.
[086] O termo “bula” da forma como é utilizado no presente refere-se a instruções habitualmente incluídas nos recipientes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização, posologia, “administração, terapia combinada, contraindicações e/ou advertências relativas à utilização de tais produtos terapêuticos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DOS EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO
[087] A invenção fornece anticorpos e moléculas de ligação a antígeno biespecíficas que se ligam ao GPRC5D, particularmente o GPRC5D humano. Além disso, as moléculas têm outras propriedades favoráveis para aplicação terapêutica, por exemplo, no que diz respeito à eficácia e/ou segurança, bem como a produtibilidade.
AnTICORPO GPRC5D
[088] Em um primeiro aspecto a presente invenção provê um anticorpo que se liga ao GPRC5D, em que o anticorpo compreende (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 84, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89; (ii) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 85, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89, (iji) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97; (iv) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 96 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97; ou (v) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 92, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97.
[089] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em alguns exemplos de realização, a VH é uma VH humanizada e/ou a VL é uma VL humanizada. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização anteriores, e compreende ainda uma região de arcabouço humana aceptora, por exemplo, um arcabouço (framework) de imunoglobulina humana ou arcabouço de consenso humano.
[090] Em um exemplo de realização particular, (i) a VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 13,e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou (ii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 15, e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; ou (li) a VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 48, e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; ou (iv) a VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 49, e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou (v) a VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 57, e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou (vi) a VM compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 58, e a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63.
[091] Em um exemplo de realização particular, o anticorpo compreende (i) uma VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e uma VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou (ii) uma VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, e uma VL que é pelo menos cerca de 95%,
96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; ou (iii) uma VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, e a VL é pelos menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; ou (iv) e uma VH é pelos menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 49, e a VL é pelos menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou (v) e uma VH é pelos menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 57, e a VL é pelos menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; Ou (vi) e uma VH é pelos menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 58, e a VL é pelos menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63.
[092] Em outro exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo IgG, particularmente IgG1. Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo completo (também referido como anticorpo “de comprimento total”). Em outro exemplo de realização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em uma molécula Fv, uma molécula scFv, uma molécula Fab e uma molécula F(ab')r. Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico.
[093] Em determinados exemplos de realização, uma sequência VH ou VL possuindo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções em relação à sequência de referência mas o anticorpo compreendendo tal sequência ainda mantém a capacidade de se ligar ao GPRC5D. Em determinados exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 13 e/ou um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 14 e/ou um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 15 e/ou um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 16 e/ou um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 48 e/ou um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 53 e/ou um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ |D NO: 49 e/ou um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 52 e/ou um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 57 e/ou um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 64 e/ou um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 58 e/ou um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 63.
[094] Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 13 e/ou a sequência VL na SEQ ID NO: 14, incluindo modificações pós- traducionais dessa sequência. Opcionalmente, o anticorpo compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 15 e/ou a sequência VL na SEQ ID NO: 16, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Opcionalmente, o anticorpo compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 448 e/ou a sequência VL na SEQ ID NO: 53, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Opcionalmente, o anticorpo compreende a sequência VH na SEQ
ID NO: 49 e/ou a sequência VL na SEQ ID NO: 52, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Opcionalmente, o anticorpo compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 57 e/ou a sequência VL na SEQ ID NO: 64, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Opcionalmente, o anticorpo compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 58 e/ou a sequência VL na SEQ ID NO: 63, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência.
[095] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
[096] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende a sequência VH selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 12, e a VL sequência de SEQ ID NO: 16.
[097] Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 13 e uma sequência VL de SEQ ID NO:
14.
[098] Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO:
16.
[099] Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ
ID NO: 48, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53. Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 48 e uma sequência VL de SEQ ID NO:
53.
[100] Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52. Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 49 e uma sequência VL de SEQ ID NO:
52.
[101] Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64. Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 57 e uma sequência VL de SEQ ID NO:
64.
[102] Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63. Em um exemplo de realização específico, o anticorpo compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 58 e uma sequência VL de SEQ ID NO:
63.
[103] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende uma região constante humana. Em um exemplo de realização, o anticorpo é uma molécula de imunoglobulina compreendendo uma região constante humana, particularmente uma molécula de imunoglobulina da classe IgG compreendendo um domínio CH1, CH2, CH3 e/ou CL humano. Sequências exemplificativas de domínios constantes humanos são fornecidas nas SEQ ID
NOs 37 e 38 (domínios CL kappa e lambda humanos, respectivamente) e SEQ ID NO: 39 (domínios constantes de cadeia pesada CH1-CH2-CH3 de I9gG1 humana). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 39, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. De modo específico, a região constante de cadeia pesada pode compreender mutações de aminoácidos no domínio Fc conforme descrito na presente invenção.
[104] Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
[105] Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo IgG, particularmente IgG. Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo completo (também referido como anticorpo “de comprimento total”).
[106] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende um domínio Fc, particularmente um domínio Fc de IgG, mais particularmente um domínio Fc de IgG1. Em um exemplo de realização, o domínio Fc é um domínio Fc humano. O domínio Fc do anticorpo pode incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, descritas na presente invenção em relação ao domínio Fc da molécula de ligação a antígeno biespecífica da invenção.
[107] Em outro exemplo de realização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo de uma molécula Fv, uma molécula scFvy, uma molécula Fab e uma molécula F(ab');
particularmente uma molécula Fab. Em outro exemplo de realização, o fragmento de anticorpo é um diabody (diacorpo), um triabody ou tetrabody.
[108] Em outro aspecto, o anticorpo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima pode incorporar qualquer uma das características, de forma isolada ou em combinação, conforme descrito nas seções abaixo.
VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO
[109] Em determinadas realizações, um anticorpo previsto na invenção é alterado para aumentar ou diminuir o grau em que o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação em um anticorpo pode ser convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de modo que um ou mais sítios de glicosilação é criado ou removido.
[110] Quando o anticorpo compreende uma região Fc, os oligossacarídeos ligados a estes podem ser alterados. Anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos geralmente compreendem um oligossacarídeo ramificado, biantenário que geralmente está ligado por uma ligação N a um Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Os oligossacarídeos podem incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetilglicosamina (GICNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GIcNAc no “tronco” da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em alguns exemplos de realização, as modificações dos oligossacarídeos em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas.
[111] Em um exemplo de realização, são fornecidos variantes de anticorpos possuindo um oligossacarídeo não fucosilado, ou seja, uma estrutura de oligossacarídeo que carece de fucose anexada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Tal oligossacarídeo não fucosilados (também referida como oligossacarídeo “afucosilado”) é particulammente um oligossacarídeo N-ligado que carece de um resíduo de fucose ligado ao primeiro GIcNAc no tronco da estrutura biantenária do oligossacarídeo. Em um exemplo de realização, as variantes de anticorpo são fornecidas com uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados na região Fc em comparação com um anticorpo nativo ou parental. Por exemplo, a proporção de oligossacarídeos não fucosilados pode ser de pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 80% ou mesmo cerca de 100% (ou seja, não há oligossacarídeos fucosilados). À porcentagem de oligossacarídeos não fucosilados é a quantidade (média) de oligossacarídeos sem resíduos de fucose, em relação à soma de todos os oligossacarídeos ligados ao Asn297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e com alto teor de manose), medida por espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito, por exemplo, na publicação WO 2006/082515. Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado na posição 297 na região Fc (numeração EU dos resíduos da região Fc), no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de + 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, ou seja, entre as posições 294 e 300, devido a variações menores de sequência nos anticorpos. Tais anticorpos possuindo uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados na região Fc podem ter ligação melhorada ao receptor de FcyRllla e/ou função efetora melhorada, em particular função ADCC melhorada. Consulte, por exemplo, as publicações US 2003/0157108; US 2004/0093621.
[112] Exemplos de linhagens de células capazes de produzir anticorpos com fucosilação reduzida incluem células CHO Lec13 deficientes da fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108; e documento WO 2004/056312, especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares nocauteadas (knockout), como células CHO nocautes para o gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8 (consulte, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614-622 (2004); Kanda, Y. et al. Biotechnol. Bioeng., 94 (4): 680-688 (2006); e documento WO2003/085107), ou células com atividade reduzida ou abolida da síntese de GDP-fucose ou proteína — transportadora — (consulte, por exemplo, US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282).
[113] Em um exemplo de realização adicional, variantes de anticorpo são fornecidos adicionalmente com oligossacarídeos birramificados, por exemplo, onde um oligossacarídeo biantenário anexado a região Fc do anticorpo é birramificado por GICcNAc. Tais variantes de anticorpos podem possuir fucosilação reduzida e/ou função ADCC melhorada, conforme descrito acima. Exemplos de tais variantes de anticorpos são descritos, por exemplo, em Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006) WO 99/54342. WO 2004/065540, WO 2003/011878.
[114] Também são fornecidos variantes de anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Essas variantes de anticorpos podem ter a função CDC melhorada. Tais variantes de anticorpo estão descritos, por exemplo, no documento WO 1997/30087; WO 1998/58964; e WO 1999/22764.
VARIANTES DE ANTICORPO MODIFICADOS COM CISTEÍNA
[115] Em determinados exemplos de realização, pode ser desejável a criação de anticorpos modificados com cisteína, por exemplo, “thioMAbsS”, no qual um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em exemplos de realização específicos, os resíduos substituídos ocorrer em sítios acessíveis do anticorpo. Pela substituição de tais resíduos com cisteína, os grupos tióis reativos são assim posicionados em locais acessíveis do anticorpo e podem ser utilizados para conjugar o anticorpo a outras moléculas, tais como moléculas de droga ou moléculas ligante-droga, para criar um imunoconjugado, conforme descrito na presente invenção.-Os anticorpos modificados com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, nas Patentes US 7.521.541, US 8.30.930, US 7.855.275, US
9.000.130 ou na WO2016040856.
DERIVADOS DE ANTICORPOS
[116] Em determinados exemplos de realização, um anticorpo da fornecido na presente invenção pode ser adicionalmente modificado para conter moléculas adicionais não proteináceas que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. As moléculas adequadas para a derivatização do anticorpo incluem, mas não estão limitadas a polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros hidrossolúveis incluem, mas não se limitando a, polietilenoglicol (PEG), copolímeros “de etileno- glicol/propilenoglicol, — carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, policloreto pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero etileno/maleico anidrido, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli (n-vinil pirrolidona) polietileno-glicol, homopolímeros de propropileno glicol, co-polímeros de óxido de prolipropileno óxido de etileno, poliálcoo!l polióis (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e misturas dos mesmos. O propionaldeído polietilenoglicol pode ter vantagens no processo de fabricação devido à sua estabilidade na água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramíificado ou não ramiíficado. O número de polímeros acoplados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero encontra-se anexo, os polímeros podem ser da mesma molécula ou de moléculas diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros utilizado para derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo, mas não se limitando a, propriedades específicas ou funções do anticorpo a ser melhorado, se o anticorpo derivado será utilizado em uma terapia sob condições definidas, etc.
[117] Em outro exemplo de realização, são fornecidos conjugados de anticorpo e porção não proteinácea que podem ser seletivamente aquecida por exposição à radiação. Em um exemplo de realização, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda, e inclui, mas não se limita a, comprimento de ondas que não prejudicam células normais, mas que aquece a porção não proteinácea a uma temperatura no qual as células próximas ao conjugado anticorpo-porção não proteinácea são mortas.
IMUNOCONJUGADOS
[118] A invenção também provê imunoconjugados que compreendem um anticorpo anti-GPRC5D conforme descrito na presente invenção conjugado (quimicamente ligado) com um ou mais agentes citotóxicos, tais como agentes quimioterápicos ou fármacos, agentes inibidores do crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimaticamente ativas de origem vegetal, bacteriana, fúngica ou animal, ou fragmentos destes), ou isótopos radioativos.
[119] Em um exemplo de realização, um imunoconjugado é um conjugado anticorpo-droga (ADC) no qual um anticorpo é conjugado com um ou mais dos agentes terapêuticos mencionados acima. O anticorpo é tipicamente conectado a um ou mais dos agentes terapêuticos pelo uso de ligantes. Uma visão geral da tecnologia ADC, incluindo exemplos de agentes terapêuticos, drogas e ligantes, é apresentada em Pharmacol Review 68: 3-19 (2016).
[120] Em outro exemplo de realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo tal como descrito na presente invenção conjugado com uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento desta, incluindo, mas não se limitando a, cadeia A da toxina diftérica, fragmentos ativos não ligantes da toxina diftérica, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia À de rícina, cadeia A da abrina, cadeia A da modeccina, alfa-sarcina, proteínas da Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas da Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor da Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor da Sapaonaria "officinalis, gelonina,y mitogellina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.
[121] Em outro exemplo de realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito na presente invenção conjugado a um átomo radioativo, para formar um radioconjugado. Uma série de isótopos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Exemplos incluem At21, [131, [125, yo, Ret%6, Rets, sm'153, Bj212, p32, ph??? e isótopos radioativos de Lu. Quando o radioconjugado for utilizado para diagnóstico, ela pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, tcº*” ou 1123, ou um marcador de spin para formação de imagem através de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagem por ressonância magnética, MRI), tal como iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[122] Os conjugados de um anticorpo e agentes citotóxicos podem ser feitos pela utilização de uma série de agentes de acoplamento proteicos bifuncionais, tais com propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), — cicloexano-1-carboxilato — de — succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoesteres (tais como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tais como 2,6-
diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro- 2, 4-dinitrobenzeno). Pode-se preparar, por exemplo, uma imunotoxina ricina, conforme descrito em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). O ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Consulte o documento WO94/11026. O ligante pode ser um “ligante clivável” que facilita a liberação de uma droga citotóxica na célula. Pode-se utilizar, por exemplo, um ligante ácido lábil, ligante sensível à peptidase, ligante foto-lábel, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992); patente US 5.208.020).
[123] Os imunoconjugados ou ADCs da presente invenção contemplam expressamente, mas não se limitam a, conjugados preparados com reagentes de reticulação, incluindo, mas não se limitando a; BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que são comercialmente disponíveis (por exemplo, pela Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EUA).
ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS
[124] Em determinados exemplos de realização, um anticorpo fornecido na presente invenção é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois sítios diferentes, ou seja, epítopos diferentes em antígenos diferentes ou epítopos diferentes no mesmo antígeno. Em determinados exemplos de realização, o anticorpo multiespecífico tem três ou mais especificidades de ligação. Em exemplos de realização específicos, uma das especificidades de ligação é para GPRC5D e a outra (duas ou mais) especificidade é para qualquer outro antígeno. Em certas realizações, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois (ou mais) epítopos diferentes de GPRC5D. Os anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos) também podem ser utilizados para localizar agentes citotóxicas ou células nas células que expressam GPRC5D. Os anticorpos multiespecíficos podem ser preparados como anticorpos completos (de comprimento total) ou fragmentos de anticorpo.
[125] As técnicas para produzir anticorpos multiespecífico incluem, mas não estão limitadas a, coexpressão recombinante de dois pares cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulihna possuindo diferentes especificidades (vide Milstein e Cuello, Nature 305:537(1983)), e a engenharia “knob-in-hole” (vide, por exemplo, a Patente US 5.731.168 e Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)). Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos; pela manipulação de efeitos de orientação eletrostática para a produção de moléculas heterodiméricas de Fc-anticorpo (consulte, por exemplo, o documento WO 2009/089004); pela reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (consulte, por exemplo, a Patente US 4.676.980, e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); pelo uso de zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992) e o documento WO 2011/034605); pelo uso da tecnologia comum da cadeia leve para contornar o problema de pareamento de cadeia leve (consulte, por exemplo, WO 98/50431); utilizando a tecnologia de “diabody' (diacorpo) para produzir fragmentos de anticorpo biespecíficos (consulte, por exemplo, Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA, 90: 6444-6448 (1993)); e pelo uso de dímeros de Fv (sFv) de cadeia única (consulte, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)); e preparação de anticorpos triespecíficos como descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
[126] Os anticorpos manipulados com três ou mais sítios de ligação ao antígeno, incluindo, por exemplo, “Anticorpos polvo” (octopus antibodies) ou DVD-lg também estão incluídos no presente documento (consulte, por exemplo, os documentos WO 2001/77342 e WO 2008/024715). Outros exemplos de anticorpos multiespecíficos com três ou mais sítios de ligação ao antígeno podem ser encontrados nos documentos WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO2010/145792 e WO 2013/026831. O anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação ao antígeno também inclui um “FAb de ação dupla” ou “DAF” compreendendo um sítio de ligação ao antígeno que se liga ao GPRC5D, bem como outro antígeno diferente ou dois epítopos diferentes do GPRC5D (consulte, por exemplo, US 2008/0069820 e WO 2015/095539).
[127] Os anticorpos multiespecíficos também podem ser fomecidos em uma forma assimétrica com um cruzamento de domínio em um ou mais braços de ligação da mesma especificidade de antígeno, ou seja, trocando os domínios VH/VL (consulte, por exemplo, WO 2009/080252 e WO 2015/150447), os domínios CH1/CL (consulte, por exemplo, WO 2009/080253) ou os braços Fab completos (consulte, por exemplo, WO 2009/080251, WO 2016/016299, vide também Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191, e Klein et al, MAbs 8 (2016) 1010- 20). Os braços Fab assimétricos também podem ser projetados através da introdução de mutações de aminoácidos carregadas ou não carregadas em interfaces de domínio para direcionar o pareamento correto de Fab. Vide, por exemplo, o documento WO 2016/172485.
[128] Vários formatos moleculares adicionais para anticorpos multiespecíficos são conhecidos no estado da técnica e estão incluídos no presente documento (consulte, por exemplo, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106).
[129] Um tipo particular de anticorpos multiespecíficos também incluídos na presente invenção são anticorpos biespecíficos projetados para se ligarem simultaneamente a um antígeno de superfície em uma célula alvo, por exemplo, uma célula tumoral e a um componente ativador e invariante do complexo receptor de célula T (TCR), como o CD3, para redirecionar as células T para matar as células alvo. Portanto, em determinados exemplos de realização, um anticorpo fornecido na presente invenção é um anticorpo multiespecífico, particularmente um anticorpo biespecífico, em que uma das especificidades de ligação é para GPRC5D e a outra é para CD3.
[130] Exemplos de formatos de anticorpos biespecíficos que podem ser úteis para essa finalidade incluem, mas não se limitam, as moléculas chamadas “BITE” (do inglês “bispeciífic T-cell engager), em que duas moléculas scFv são fundidas por um ligante flexível (consulte, por exemplo, WO2004/106381, WO2005/061547, WO2007/042261 e WO2008/119567, Nagorsen e Bâuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)); diabodies (Holliger et al, Prot Eng 9, 299-305 (1996)) e seus derivados, tais como diabodies em tandem (“TandAb”; Kipriyanov et al., J. Mol Biol 293, 41-56 (1999)); Moléculas “DART” (redirecionamento de dupla afinidade) que são baseadas no formato de diabody, mas apresentam uma ponte de dissulfeto C-terminal para estabilização adicional (Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)) e os chamados triomabs, que são moléculas de IgG híbridas inteiras de camundongo/rato (revisadas em Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)). Formatos específicos de anticorpos biespecíficos para células T incluídos na presente invenção são descritos nos documentos WO 2013/026833, WOZ2013/026839, WO 2016/020309; Bacac et al, Oncoimmunology 5 (8) (2016) €1203498.
MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENOS BIESPECÍFICOS QUE SE LIGAM AO GPRCS5D E A UM SEGUNDO ANTÍGENO
[131] A invenção também provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, isto é, uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos duas porções de ligação ao antígeno capazes de ligar especificamente a dois determinantes antigênicos distintos (um primeiro e um segundo antígeno).
[132] De acordo com exemplos de realização específicos da invenção, as porções de ligação ao antígeno compreendidas na molécula de ligação ao antígeno biespecífica são moléculas Fab (ou seja, domínios de ligação ao antígeno composto de uma cadeia pesada e uma cadeia leve, cada uma compreendendo um domínio variável e um domínio constante). Em um exemplo de realização, a primeira e/ou segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab. Em um exemplo de realização, a referida molécula Fab é humana. Em um exemplo de realização, a referida molécula Fab é humanizada. Em outro exemplo de realização adicional, a referida molécula Fab compreende domínios constantes de cadeia pesada e leve humana.
[133] De modo preferido, pelo menos uma das porções de ligação ao antígeno é uma molécula Fab crossover (cruzada). Tais modificações reduzem o pareamento incorreto de cadeias leves e pesadas entre diferentes moléculas Fab, melhorando assim o rendimento e a pureza da molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção na produção recombinante. Em uma molécula Fab crossover particular útil para a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção, os domínios variáveis de cadeia leve Fab e de cadeia pesada Fab (VL e VH, respectivamente) são trocados. Entretanto, mesmo com essa troca de domínio a preparação da molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode compreender determinados subprodutos devido a uma interação do tipo Bence Jones entre cadeias pesadas e leves incorretamente pareadas (vide Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191). Para reduzir ainda mais o desalinhamento (pareamento incorreto) das cadeias pesadas e leves de diferentes moléculas Fab e, assim, aumentar a pureza e o rendimento da molécula de ligação ao antígeno biespecífica desejada, podem ser introduzidos aminoácidos carregados com cargas opostas em posições específicas de aminoácidos nos domínios CH1 e CL da(s) molécula(s) Fab que se ligam ao primeiro antígeno (GPRC5D), ou a molécula Fab que se liga ao segundo antígeno (por exemplo, um antígeno de células T de ativação, tal como CD3) conforme descrito na presente invenção. As modificações de carga são feitas nas moléculas Fab convencionais compreendidas na molécula de ligação ao antígeno biespecífica (como mostrado, por exemplo, nas Figuras 1 A-C, G-J), ou nas moléculas Fab crossover VH/VL compreendidas na molécula de ligação ao antígeno biespecífica (como mostrado por exemplo, nas Figuras 1 D-F, K-N) (mas não em ambas). Em exemplos de realização específicos, as modificações de carga são feitas na(s) molécula(s) Fab convencional(is) compreendida(s) na molécula de ligação ao antígeno biespecífica (que em exemplos de realização específicos se ligam especificamente ao primeiro antígeno, ou seja, GPRC5D).
[134] Em um exemplo de realização específica de acordo com a invenção, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é capaz de se ligar simultaneamente ao primeiro antígeno (ou seja, GPRC5D) e ao segundo antígeno (por exemplo, um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3). Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é capaz de reticular com uma célula T e uma célula alvo pela ligação simultânea ao GPRC5D e a um antígeno de ativação de célula T. Em um exemplo de realização ainda mais específico, tal ligação simultânea resulta na lise da célula-alvo, particularmente uma célula tumoral expressando GPRC5D. Em um exemplo de realização, tal ligação simultânea resulta na ativação da célula T. Em outros exemplos de realização, essa ligação simultânea resulta em uma resposta celular de um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico, selecionado a partir do grupo de: proliferação, diferenciação, secreção de citocinas, liberação de moléculas efetoras citotóxicas, atividade citotóxica e expressão de marcadores de ativação. Em um exemplo de realização, a ligação da molécula de ligação ao antígeno biespecífica ao antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, sem ligação simultânea ao GPRC5D não resulta na ativação da célula T.
[135] Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é capaz de redirecionar a atividade citotóxica de uma célula T para uma célula alvo. Em um exemplo de realização específico, a referida reorientação é independente da apresentação de antígeno mediada por MHC pela célula-alvo e/ou da especificidade da célula T.
[136] Particularmente, uma célula T, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização da invenção, é uma célula T citotóxica. Em alguns exemplos de realização a célula T é uma célula T CD4* ou uma célula T CD8*, em particular é uma célula T CD8*.
PRIMEIRA PORÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
[137] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende pelo menos uma porção de ligação ao antígeno, particularmente uma molécula Fab, que se liga ao GPRC5D (primeiro antígeno). Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende duas porções de ligação ao antígeno, particularmente moléculas Fab, que se ligam ao GPRC5D. Em tal exemplo de realização específico, cada uma destas porções de ligação ao antígeno se liga ao mesmo determinante antigênico. Em um exemplo de realização ainda mais específico, todas estas porções de ligação ao antígeno são idênticas, ou seja, compreendem as mesmas sequências de aminoácidos, incluindo as mesmas substituições de aminoácidos no domínio CH1 e CL, conforme descrito na presente invenção (se houver). Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende mais do que duas porções de ligação ao antígeno, particularmente moléculas Fab, que se ligam ao GPRC5D.
[138] Em exemplos de realização particulares, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) a um GPRC5D é(são) uma molécula(s) Fab convencional(ais). Em tais exemplos de realização, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) a um segundo antígeno é(são) molécula(s) Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, ou seja, molécula(s) Fab na(s) qualíquais) os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si.
[139] Em tais exemplos de realização alternativos, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) ao GPRC5D é(são) uma molécula(s) Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre sii Em tais exemplos de realização, a(s) porção(ões) que se liga(m) a um segundo antígeno é(são) preferencialmente molécula(s) Fab convencional(ais).
[140] A porção de ligação ao GPRC5D é capaz de direcionar a molécula de ligação ao antígeno biespecífica para um sítio alvo, por exemplo, para um tipo específico de célula tumoral que expressa GPRC5D.
[141] A primeira porção de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode incorporar qualquer um dos recursos, isoladamente ou em combinação, descritos na presente invenção em relação ao anticorpo que se liga ao GPRC5D, a menos que seja cientificamente claramente irracional ou impossível.
[142] Assim, em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 84, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89, e (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRCB5D e a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 85, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89, e (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespeciífica, compreendendo (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97, e (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 96 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97, e (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 92, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97, e (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRCS5D e a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6, e (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno. Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespeciífica, compreendendo (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 8, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 9, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 10, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 11 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 12, e (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno.
[143] Em alguns exemplos de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno é (derivada de) um anticorpo humanizado. Em alguns exemplos de realização, a VH é uma VH humanizada e/ou a VL é uma VL humanizada. Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização anteriores, e compreende ainda uma região de arcabouço humana aceptora, por exemplo, um arcabouço (framework) de imunoglobulina humana ou arcabouço de consenso humano.
[144] Em um exemplo de realização, a VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 e SEQID NO: 58, e a VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%,
99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64.
[145] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58, e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64.
[146] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64.
[147] Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58, e a VL sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64.
[148] Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14. Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 13 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 14.
[149] Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16.
[150] Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53. Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 48 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 53.
[151] Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52. Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 49 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 52.
[152] Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 64. Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 57 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 64.
[153] Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 63. Em um exemplo de realização específico, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 58 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 63. Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante humana.
Em um exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região constante humana, particularmente um domínio CH1 e/ou CL humano.
Sequências exemplares de domínios constantes humanos são fornecidas nas SEQ ID NOs: 37 e 38 (domínios CL kappa e lambda humanos, respectivamente) e SEQ ID NO: 39 (domínios constantes de cadeia pesada CH1-CH2-CH3 de I9G1 humana). Em alguns exemplos de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Particularmente, a região constante de cadeia leve pode compreender mutações de aminoácidos tal como descrito na presente invenção na seção “modificações de carga” e/ou pode compreender deleção ou substituições de um ou mais (particularmente dois) aminoácidos N-terminais se presente em uma molécula Fab crossover.
Em alguns exemplos de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de domínio CH1 compreendida em a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. Particularmente, a região constante de cadeia pesada (especificamente domínio CH1) pode compreender mutações de aminoácidos conforme descrito na presente invenção em “modificações de carga”.
SEGUNDA PORÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
[154] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende pelo menos uma porção de ligação ao antígeno, particularmente uma molécula Fab, que se liga a um segundo antígeno, (diferente do GPRC5D).
[155] Em exemplos de realização específicos, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) ao segundo antígeno é(são) uma molécula(s) Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, ou seja, molécula(s) Fab na(s) qual(quais) os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre sii Em tais exemplos de realização, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) ao primeiro antígeno (ou seja, GPRC5D) é(são) preferencialmente molécula(s) Fab convencional(ais). Em exemplos de realização em que há mais de uma porção de ligação ao antígeno, particularmente a molécula Fab, que se liga ao GPRC5D compreendido na molécula de ligação ao antígeno biespecífica, a porção de ligação ao antígeno que se liga ao segundo antígeno é preferencialmente uma molécula de Fab crossover e as porções de ligação ao antígeno que se ligam ao GPRC5D são moléculas Fab convencionais.
[156] Em exemplos de realização alternativos, a(s) porção(ões) que se liga(m) ao segundo antígeno é(são) preferencialmente uma molécula(s) Fab convencional(ais). Em tais exemplos de realização, a(s) porção(ões) de ligação ao antígeno que se liga(m) ao primeiro antígeno (ou seja, GPRC5D) é(são) uma molécula(s) Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si. Em exemplos de realização em que há mais de uma porção de ligação ao antígeno, particularmente a molécula Fab, que se liga ao segundo antígeno compreendido na molécula de ligação ao antígeno biespecífica, a porção de ligação ao antígeno que se liga ao ao GPRC5D é preferencialmente uma molécula Fab crossover e as porções de ligação ao antígeno que se ligam ao segundo antígeno são moléculas Fab convencionais.
[157] Em alguns exemplos de realização, o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T (também referido como uma “porção de ligação ao antígeno de ativação de célula T" ou “molécula Fab de ligação ao antígeno de ativação de célula T”). Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende não mais do que uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno de ativação de célula T. Em um exemplo de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica provê a ligação monovalente ao antígeno de ativação de célula T.
[158] Em exemplos de realização específicos, o segundo antígeno é o CD3, particularmente o CD3 humano (SEQ ID NO: 40) ou CD3 de cinomolgo (SEQ ID NO: 41), sendo mais particularmente o CD3 humano. Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno reage cruzadamente (ou seja, se liga especificamente) com CD3 humano e CD3 de cinomolgo. Em alguns exemplos de realização, o segundo antígeno é a subunidade épsilon do CD3 (CD3 épsilon).
[159] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 29, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 30, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 31, e uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 32, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 33 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 34.
[160] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 29, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 30, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 31, e uma VL compreendendo uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 32, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 33 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 34.
[161] Em alguns exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno é (derivada de) um anticorpo humanizado. Em alguns exemplos de realização, a VH é uma VH humanizada e/ou a VL é uma VL humanizada. Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização anteriores, e compreende ainda uma região de arcabouço humana aceptora, por exemplo, um arcabouço (framework) de imunoglobulina humana ou arcabouço de consenso humano.
[162] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35. Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
[163] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
36.
[164] Em um exemplo de realização, a VH da segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; e a VL da segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
[165] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
[166] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 35 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 36.
[167] Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante humana. Em um exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região constante humana, particularmente um domínio CH1 e/ou CL humano. Sequências exemplares de domínios constantes humanos são fornecidas nas SEQ ID NOs: 37 e 38 (domínios CL kappa e lambda humanos, respectivamente) e SEQ ID NO: 39 (domínios constantes de cadeia pesada CH1-CH2-CH3 de IgG1 humana). Em alguns exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Particularmente, a região constante de cadeia leve pode compreender mutações de aminoácidos tal como descrito na presente invenção na seção “modificações de carga” e/ou pode compreender deleção ou substituições de um ou mais (particularmente dois) aminoácidos N-terminais se presente em uma molécula Fab crossover. Em alguns exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de domínio CH1 compreendida em a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. Particularmente, a região constante de cadeia pesada (especificamente domínio CH1) pode compreender mutações de aminoácidos conforme descrito na presente invenção em “modificações de carga”.
[168] Em alguns exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1, particularmente os domínios variáveis VL e VH, da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si (ou seja, de acordo com tal exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab crossover em que os domínios variáveis ou constantes da cadeia leve Fab e cadeia pesada Fab estão trocados) Em um desses exemplos de realização, a primeira (e a terceira se houver) porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional.
[169] Em um exemplo de realização, não mais de uma porção de ligação ao antígeno que se liga ao segundo antígeno (por exemplo, um antígeno de ativação de célula T, como CD3) está presente na molécula de ligação ao antígeno biespecífica (ou seja, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica fornece ligação monovalente ao segundo antígeno).
MODIFICAÇÕES DE CARGA
[170] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem compreender substituições de aminoácidos nas moléculas Fab compreendidas nelas que são particularmente eficientes na redução do pareamento incorreto de cadeias leves com cadeias pesadas não correspondentes (subprodutos do tipo Bence - Jones), que pode ocorrer na produção de moléculas de ligação ao antígeno bi-/multiespecíficas baseadas em Fab com uma troca VH/VL em um (ou mais, no caso de moléculas que compreendem mais de duas moléculas Fab de ligação ao antígeno) de seus braços de ligação (veja também a Publicação PCT WO 2015/150447, particularmente os exemplos aí descritos, integralmente incorporada ao presente como referência). A proporção de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica desejada em comparação com subprodutos indesejados, em particular subprodutos do tipo Bence Jones que ocorrem em moléculas de ligação ao antígeno biespecífica com uma troca de domínio VH/VL em um de seus braços de ligação, pode ser melhorada pela introdução de aminoácidos carregados com cargas opostas em posições específicas de aminoácidos nos domínios CH1 e CL (às vezes referidos como “modificações de carga”).
[171] Assim, em alguns exemplos de realização, quando a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno biespecífica são, ambas, moléculas Fab, e em uma das porções de ligação ao antígeno (particularmente a segunda porção de ligação ao antígeno) os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e cadeia pesada Fab são substituídos entre si: i) no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por um aminoácido carregado positivamente (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído por um aminoácido carregado negativamente (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); ou ii) no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por um aminoácido carregado positivamente (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído por um aminoácido carregado negativamente (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[172] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica não compreende as duas modificações mencionadas em i) e ii). Os domínios constantes CL e CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno possuindo a troca VH/VL não são substituídos um pelo outro (ou seja, permanecem inalterados).
[173] Em um exemplo de realização mais específico: () no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); ou (ii) no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[174] Em tal exemplo de realização, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[175] Em um exemplo de realização adicional, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[176] Em um exemplo de realização específico, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat); e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[177] Em um exemplo de realização mais específico, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição
213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[178] Em outro exemplo de realização particular, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[179] Em exemplos de realização específicos, se as substituições de aminoácidos de acordo com os exemplos de realização acima forem feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno é do isotipo kappa.
[180] Alternativamente, as substituições de aminoácidos de acordo com os exemplos de realização acima podem ser feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno ao invés de serem feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno. Em tais exemplos de realização, o domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno é do isotipo kappa.
[181] Consequentemente, em um exemplo de realização, no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[182] Em um exemplo de realização adicional, no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[183] Ainda em outro exemplo de realização específico, no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat); e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[184] Em um exemplo de realização mais específico, no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição
213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[185] Em outro exemplo de realização, no domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[186] Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende: (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 84 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89, e (b) uma segunda molécula de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno e em que a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab na qual os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si; em que, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)),) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização particular, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)); e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[187] Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende: (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 85 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89, e (b) uma segunda molécula de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno e em que a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab na qual os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si; em que, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)),) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização particular, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)); e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[188] Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende: (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97, e (b) uma segunda molécula de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno e em que a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab na qual os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si; em que, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)),) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização particular, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)); e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[189] Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende: (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 96 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97, e (b) uma segunda molécula de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno e em que a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab na qual os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si; em que, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)),) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização particular, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)); e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[190] Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende: (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 92 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97, e (b) uma segunda molécula de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno e em que a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab na qual os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si; em que, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)),) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização particular, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)); e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[191] Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende: (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6, e (b) uma segunda molécula de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno e em que a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab na qual os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si; em que, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)),) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização particular, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)); e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[192] Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende: (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D, e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 8 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 9; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 10, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 11 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 12, e (b) uma segunda molécula de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno e em que a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab na qual os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos entre si; em que, no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização preferido, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)),) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um exemplo de realização particular, é independentemente substituído por lisina (K) ou arginina (R)); e no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
FORMATOS DAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICAS
[193] Os componentes da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção, podem ser fundidos entre si em uma variedade de configurações. Configurações exemplares são apresentadas nas Figuras 1A-Z.
[194] Em exemplos de realização específicos, as porções de ligação ao antígeno compreendidas na molécula de ligação ao antígeno são moléculas Fab. Em tais exemplos de realização, a primeira, segunda, terceira etc. porção de ligação ao antígeno pode ser referida no presente como primeira, segunda, terceira etc. molécula Fab, respectivamente.
[195] Em um exemplo de realização, a primeira e a segunda porção de ligação da molécula de ligação ao antígeno biespecífica estão fundidas uma à outra, opcionalmente através de um peptídeo ligante. Em exemplos de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são, cada uma, uma molécula Fab. Em tal exemplo de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno. Em outro exemplo de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno. Em exemplos de realização em que (i) a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno, ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C- terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno, adicionalmente, a cadeia leve do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno e a cadeia leve do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno podem estar fundidas entre si, opcionalmente por meio de um peptídeo ligante.
[196] Uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica com uma única porção de ligação ao antígeno (tal como uma molécula Fab) capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo, como o GPRC5D (por exemplo, conforme mostrado na Figura 1A, 1D, 1G, 1H, 1K, 1L) é útil, particularmente nos casos onde se espera a internalização do antígeno da célula alvo após a ligação de uma porção de ligação ao antígeno de alta afinidade. Em tais casos, a presença de mais do que uma porção de ligação ao antígeno específica para o antígeno de células-alvo pode aumentar a internalização do antígeno das células-alvo, reduzindo deste modo a sua disponibilidade.
[197] Entretanto, em outros casos será vantajoso dispor de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo duas ou mais porções de ligação ao antígeno (tal como moléculas Fab) específicas para um antígeno da célula alvo (veja os exemplos mostrados nas Figuras 1B, 1C, 1E, 1F, 11, 1J. 1M ou 1N), por exemplo, para otimizar o direcionamento para o sítio alvo ou para permitir a reticulação de antígenos da célula alvo.
[198] Consequentemente, em exemplos de realização específicos, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende uma terceira porção de ligação ao antígeno.
[199] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno se liga ao primeiro antígeno, isto é, GPRC5D. Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab.
[200] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno.
[201] A terceira porção de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode incorporar qualquer um dos recursos, isoladamente ou em combinação, descritos na presente invenção em relação a primeira porção de ligação ao antígeno e/ou ao anticorpo que se liga ao GPRC5D, a menos que cientificamente seja claramente irracional ou impossível.
[202] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 84 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 89.
[203] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 85 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL)
compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 89.
[204] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 97.
[205] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 96 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 97.
[206] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 92 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 97.
[207] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 4, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 5, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 6 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 7.
[208] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 8 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 9, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 10, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 11 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 12.
[209] Em alguns exemplos de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno é (derivada de) um anticorpo humanizado. Em alguns exemplos de realização, a VH é uma VH humanizada e/ou a VL é uma VL humanizada. Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende CDRs como em qualquer um dos exemplos de realização anteriores, e compreende ainda uma região de arcabouço humana aceptora, por exemplo, um arcabouço (framework) de imunoglobulina humana ou arcabouço de consenso humano.
[210] Em um exemplo de realização, a VH da terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID
NO: 58, e a VL da terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64.
[211] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58, e uma sequência VL que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64.
[212] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64.
[213] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58, e a VL sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 64.
[214] Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14. Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 13 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 14.
[215] Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16.
[216] Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53. Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 48 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 53.
[217] Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52. Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 49 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 52.
[218] Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 64. Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ
ID NO: 57 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 64.
[219] Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 63. Em um exemplo de realização específico, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 58 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 63.
[220] Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante humana. Em um exemplo de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região constante humana, particularmente um domínio CH1 e/ou CL humano. Sequências exemplares de domínios constantes humanos são fornecidas nas SEQ ID NOs: 37 e 38 (domínios CL kappa e lambda humanos, respectivamente) e SEQ ID NO: 39 (domínios constantes de cadeia pesada CH1-CH2-CH3 de IgG1 humana). Em alguns exemplos de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Particularmente, a região constante de cadeia leve pode compreender mutações de aminoácidos tal como descrito na presente invenção na seção “modificações de carga” e/ou pode compreender deleção ou substituições de um ou mais (particularmente dois) aminoácidos N-terminais se presente em uma molécula Fab crossover. Em alguns exemplos de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de domínio
CH1 compreendida em a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. Particularmente, a região constante de cadeia pesada (especificamente domínio CH1) pode compreender mutações de aminoácidos conforme descrito na presente invenção em “modificações de carga”.
[221] Em exemplos de realização específicos, a terceira e a primeira porção de ligação ao antígeno são uma molécula Fab e a terceira porção de ligação ao antígeno é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno. Assim, nestes exemplos de realização, a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno compreendem as mesmas sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve e têm o mesmo arranjo de domínios (isto é, convencional ou cruzado (crossover)). Além disso, nestes exemplos de realização, a terceira porção de ligação ao antígeno compreende as mesmas substituições de aminoácidos (se presentes), que a primeira porção de ligação ao antígeno. Por exemplo, as substituições de aminoácidos descritas na presente invenção como “modificações de carga” serão feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 de cada uma das primeiras porções de ligação ao antígeno e a terceira porção de ligação ao antígeno. Alternativamente, as referidas substituições de aminoácidos podem ser feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 da segunda porção de ligação ao antígeno (que em exemplos de realização específicos também é uma molécula Fab), mas não no domínio constante CL e no domínio constante CH1 de a primeira porção de ligação ao antígeno e terceira porção de ligação ao antígeno.
[222] Como a primeira porção de ligação ao antígeno, a terceira porção de ligação ao antígeno é particularmente uma molécula Fab convencional. Exemplos de realização em que a primeira e a terceira porções de ligação ao antígeno são moléculas Fab crossover (e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional) também são, no entanto, contempladas. Assim, em exemplos de realização específicos, a primeira e a terceira porções de ligação ao antígeno são uma molécula Fab convencional e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constante CL e CH1 das cadeias pesada e leve do Fab são trocados/substituídos um pelo outro. Em outros exemplos de realização, a primeira e a terceira porções de ligação ao antígeno são, cada uma, uma molécula Fab crossover, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional.
[223] Se uma terceira porção de ligação ao antígeno estiver presente, em um exemplo de realização específico, a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno se ligam ao GPRC5D, e a segunda porção de ligação ao antígeno se liga a um segundo antígeno, particularmente um antígeno de ativação de célula T, mais particularmente o CD3, mais particularmente o CD3 épsilon.
[224] Em exemplos de realização específicos, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade. A primeira e a segunda subunidade do domínio Fc são capazes de desempenhar associação estável.
[225] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção pode ter configurações diferentes, ou seja, a primeira, segunda (e opcionalmente terceira) porção de ligação ao antígeno pode ser fundida entre si e com o domínio Fc de diferentes maneiras. Os componentes podem ser fundidos entre si diretamente ou, preferencialmente, através de um ou mais ligantes peptídicos adequados. Quando a fusão de uma molécula Fab está na extremidade N-terminal de uma subunidade do domínio Fc, ela tipicamente é via região de dobradiça de imunoglobulina.
[226] Em alguns exemplos de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são moléculas Fab e a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Em tais exemplos de realização, a primeira porção de ligação ao antígeno pode ser fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno ou ao N- terminal da outra subunidade do domínio Fc. Em particular, em tais exemplos de realização, a referida primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, isto é, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si. Em outros exemplos de realização, a referida primeira molécula Fab é uma molécula Fab crossover (cruzada) e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab convencional.
[227] Em um exemplo de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são, cada uma, uma molécula Fab, a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc, e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada do Fab ao N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno. Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira e na segunda molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira molécula Fab é fundida no C-Terminal da cadeia pesada Fab ao N- terminal da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, e a segunda molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Essa configuração é representada esquematicamente nas Figuras 1G e 1K (com o segundo domínio de ligação ao antígeno nesses exemplos sendo uma molécula Fab crossover VH/VL). Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.
[228] Em outro exemplo de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são uma molécula Fab e a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc. Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira e na segunda molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira e a segunda molécula Fab são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc. Essa configuração é esquematicamente representada nas Figuras 1A e 1D (nesses exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional). À primeira e a segunda molécula Fab podem estar fundidas ao domínio Fc diretamente ou através de um ligante peptídico. Em um exemplo de realização particular, a primeira e a segunda molécula Fab estão fundidas ao domínio Fc por uma região de dobradiça de imunoglobulina. Em um exemplo de realização específico, a região de dobradiça de imunoglobulina é uma região de dobradiça de IgG: humana, particularmente quando o domínio Fc é um domínio Fc de IgG.
[229] Em alguns exemplos de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são moléculas Fab e a primeira porção de ligação ao antígeno está fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc. Em tais exemplos de realização, a segunda porção de ligação ao antígeno pode ser fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno ou (conforme descrito acima) ao N-terminal da outra subunidade do domínio Fc. Em particular, em tais exemplos de realização, a referida primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, isto é, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve do Fab estão trocados/substituídos entre si. Em outros exemplos de realização, a referida primeira molécula Fab é uma molécula Fab crossover (cruzada) e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab convencional.
[230] Em um exemplo de realização, a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são, cada uma, uma molécula Fab, a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc, e a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada do Fab ao N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno. Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira e na segunda molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a segunda molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N- terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, e a primeira molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc. Essa configuração é esquematicamente representada nas Figuras 1H e 1L (nesses exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional). Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.
[231] Em alguns exemplos de realização, a terceira porção de ligação, particularmente uma terceira molécula Fab, é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Em particular, em tais exemplos de realização, as referidas primeira e terceira moléculas Fab são, cada uma, uma molécula Fab convencional, e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, isto é, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve do Fab estão trocadas/substituídas entre si. Em outros exemplos de realização, as referidas primeira e terceira moléculas Fab são, cada uma, uma molécula Fab crossover e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab convencional.
[232] Em um exemplo de realização específico, a segunda e a terceira porção de ligação ao antígeno são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc, e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab. Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira, na segunda e na terceira molécula Fab, no domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-
terminal da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, e a segunda molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc, e em que a terceira molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc. Essa configuração é esquematicamente representada na Figura 1B e 1E (nesses exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional) e na Figura 1J e 1N (nestes exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL). À segunda e a terceira molécula Fab podem ser fundidas ao domínio Fc diretamente ou através de um ligante peptídico. Em um exemplo de realização particular, a segunda e a primeira molécula Fab estão fundidas ao domínio Fc por uma região de dobradiça de imunoglobulina. Em um exemplo de realização específico, a região de dobradiça de imunoglobulina é uma região de dobradiça de IgG: humana, particularmente quando o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1. Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.
[233] Em outro exemplo de realização, a primeira e terceira porção de ligação ao antígeno são cada uma fundida na extremidade C- terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc, e a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida com a extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab com a extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno. Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira, na segunda e na terceira molécula Fab, no domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a segunda molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N- terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, e a primeira molécula Fab é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc, e em que a terceira molécula Fab é fundida no C- terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc. Essa configuração é esquematicamente representada na Figura 1C e 1F (nesses exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional) e na Figura 1l e 1M (nestes exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL). A primeira e a terceira molécula Fab podem ser fundidas ao domínio Fc diretamente ou através de um ligante peptídico. Em um exemplo de realização particular, a primeira e a terceira molécula Fab estão fundidas ao domínio Fc por uma região de dobradiça de imunoglobulina. Em um exemplo de realização específico, a região de dobradiça de imunoglobulina é uma região de dobradiça de IgG humana, particularmente quando o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1. Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem ser adicionalmente fundidas entre si.
[234] Em configurações da molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que uma molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de cada uma das subunidades do domínio Fc através de uma região de dobradiça de imunoglobulina, as duas moléculas Fab, as regiões de dobradiça e o domínio Fc formam essencialmente uma molécula de imunoglobulina. Em um exemplo de realização específico, a molécula de imunoglobulina é uma imunoglobulina da classe IgG. Em um exemplo de realização ainda mais específico, a imunoglobulina é uma imunoglobulina da subclasse IgG. Em outro exemplo de realização, a imunoglobulina é uma imunoglobulina da subclasse IgG1a. Em um exemplo de realização adicional, a imunoglobulina é uma imunoglobulina humana. Em outros exemplos de realização, a imunoglobulina é uma imunoglobulina quimérica ou uma imunoglobulina humanizada. Em um exemplo de realização, a imunoglobulina compreende uma região constante humana, particularmente uma região Fc humana.
[235] Em algumas das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab estão fundidas entre si, opcionalmente através de um ligante peptídico. Dependendo da configuração da primeira e da segunda porção de ligação ao antígeno, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab pode estar fundida em sua extremidade C-terminal com a extremidade N-terminal da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab, ou a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab pode estar fundida em sua extremidade C-terminal com a extremidade N-terminal da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab. A fusão das cadeias leves Fab da primeira e da segunda molécula Fab reduz ainda mais o pareamento errôneo de cadeias pesadas e leves Fab sem correspondência, e também reduz o número de plasmídeos necessários para a expressão das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção.
[236] As porções de ligação ao antígeno podem ser fundidas com o domínio Fc ou diretamente entre si ou através de um peptídeo ligante, que compreende um ou mais aminoácidos, tipicamente cerca de 2-20 aminoácidos. Os ligantes peptídicos são conhecidos no estado da técnica e estão descritos na presente invenção. Os ligantes peptídicos adequados não imunogênicos incluem, por exemplo, os ligantes peptídicos (GaS)n, (SGa4)n, (GaS)n ou Ga(SGa)n. “Nº é geralmente um número inteiro de 1 a 10, normalmente de 2 a 4. Em um exemplo de realização, o referido ligante peptídico tem um comprimento de pelo menos 5 aminoácidos, em um exemplo de realização, um comprimento de 5 a 100, em outro exemplo de realização de a 50 aminoácidos. Em um exemplo de realização, o referido ligante peptídico é (GxS)n ou (GXS)hGm com G = glicina, S = serina; e (x=3,n=3,4,5 ou 6, em = 0, 1, 20u 3) ou (x=4,n=2,3,4o0u5em=0,1,20uU3), em um exemplo de realização x = 4 e n= 2 ou 3, e em um exemplo de realização adicional x = 4, n= 2. Em um exemplo de realização, o ligante peptídico mencionado é (G4S)2. Um peptídeo de ligação particularmente adequado para a fusão das cadeias leve Fab entre a primeira e segunda molécula Fab é o (G4S)2. Um peptídeo de ligação exemplar apropriado para ligar as cadeias pesadas Fab do primeiro e segundo fragmentos Fab compreende a sequência (D)-(G1S)2 (SEQ ID NOs 43 e 44). Outro ligante adequado compreende a sequência (G1S)1. Além disso, os ligantes podem compreender (uma porção de) uma região de dobradiça de imunoglobulina. Particularmente quando uma molécula Fab está fundida com a porção N-terminal de uma subunidade do domínio Fc, ela pode ser fundida por uma região de dobradiça de imunoglobulina ou uma porção da mesma, com ou sem um peptídeo de ligação adicional.
[237] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com uma subunidade do domínio Fc (VL(2)-CH1(2)--CH2-CH3(-CH4)) e um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH1)-CH1(11)-CH2-CH3(-CH4)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH6-CLr)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VLa)-CL6)). Em determinados exemplos de realização, os polipeptídeos estão ligados de forma covalente, por exemplo, por uma ligação de bissulfeto.
[238] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(- CH4)) e um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VHa-CH11)-CH2-CH3(-CH4)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VLe-CH1i6) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL1-CLm)). Em determinados exemplos de realização, os polipeptídeos estão ligados de forma covalente, por exemplo, por uma ligação de bissulfeto.
[239] Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VL(2)- CH12-VH1-CH1(11)-CH2-CH3(-CH4)). Em outros exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH1-CH11)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)).
[240] Em alguns destes exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno compreende adicionalmente um polipeptídeo de cadeia leve Fab crossover da segunda molécula Fab em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VHr-CL'3) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL1)CL6). Em outros destes exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VH(2)-CL(2)-VLA)-CLa)), ou um polipeptídeo em que o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(1)-CL(n1)-VH(2)-CL(2)), conforme apropriado.
[241] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com estes exemplos de realização pode compreender ainda; (|) um polipeptídeo da subunidade do domínio Fc (CH2-CH3(-CH4)); ou (ii) um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha um ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(3-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) e o polipeptídeo de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VL(3-CL'). Em determinados exemplos de realização, os polipeptídeos estão ligados de forma covalente, por exemplo, por uma ligação de bissulfeto.
[242] Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(2)-CL(2)-VHa-CH16)- CH2-CH3(-CH4)). Em outros exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH1)-CH111)-VH2)-CLey- CH2-CH3(-CH4)).
[243] Em alguns destes exemplos de realização, a molécula de ligação a antígeno compreende adicionalmente um polipeptídeo de cadeia leve Fab crossover da segunda molécula Fab, em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VLe-CH16) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL1)-CL6). Em outros destes exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL-CH1g&-VLa-CLn1)) ou um polipeptíideco em que o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(1)-CL(1)-VL(2)-CH1(2)), conforme apropriado.
[244] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com estes exemplos de realização pode compreender ainda; (1) um polipeptídeo da subunidade do domínio Fc (CH2-CH3(-CH4)); ou (ii) um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha um ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VHa-CH1(3-CH2-CH3(-CH4)) e o polipeptídeo de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VL3-CL)). Em determinados exemplos de realização, os polipeptídeos estão ligados de forma covalente, por exemplo, por uma ligação de bissulfeto.
[245] Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica não compreende um domínio Fc. Em particular, em tais exemplos de realização, as referidas primeira e (se presente) terceira molécula(s) Fab é(são), cada uma, uma molécula Fab convencional, e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab crossover, conforme descrito na presente invenção, isto é, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve do Fab estão trocadas/substituídas entre si. Em outros exemplos de realização, as referidas primeira e (se presente) terceira molécula(s) Fab é(são), cada uma, uma molécula Fab crossover e a segunda molécula Fab é uma molécula Fab convencional.
[246] Em uma destes exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira e na segunda porção de ligação ao antígeno, e opcionalmente um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são moléculas Fab e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C- terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno: Essa configuração é esquematicamente representada nas Figuras 10 e 18 (nesses exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional).
[247] Em outro exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira e na segunda porção de ligação ao antígeno, e opcionalmente um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são moléculas Fab e a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C- terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno Essa configuração é esquematicamente representada nas Figuras 1P e 1T (nesses exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional).
[248] Em alguns exemplos de realização, a primeira molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, e a molécula de ligação ao antígeno compreende ainda uma terceira porção de ligação ao antígeno, particularmente uma terceira molécula Fab em que a referida terceira molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab. Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira, na segunda e na terceira molécula Fab e, opcionalmente, em um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira molécula Fab está fundida no C- terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab e a terceira molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab. Essa configuração é esquematicamente representada na Figura 1Q e 1U (nesses exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional) e na Figura 1X e 1Z (nestes exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL).
[249] Em alguns exemplos de realização, a segunda molécula Fab está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, e a molécula de ligação ao antígeno compreende ainda uma terceira porção de ligação ao antígeno, particularmente uma terceira molécula Fab em que a referida terceira molécula Fab está fundida no N-terminal da cadeia pesada Fab ao C-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab. Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste essencialmente na primeira, na segunda e na terceira molécula Fab e, opcionalmente, em um ou mais ligantes peptídicos, em que a segunda molécula Fab está fundida no C- terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab e a terceira molécula Fab está fundida no N-terminal da cadeia pesada Fab ao C-terminal da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab. Essa configuração é esquematicamente representada na Figura IR e IV (nesses exemplos, com a segunda porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional) e na Figura 1W e 1Y (nestes exemplos, com o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional e a primeira e a terceira porção de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab crossover VH/VL).
[250] Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção compreende um polipeptíideo em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve) (VHA6-CH11)- VLe-CH16). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VLa)-CL(1)).
[251] Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL2)-CH12-VH6-CH16)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VHr2)-CL(2)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL6)-CL(1)).
[252] Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VH(2)-CLy-VHay CH16). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL(2-CH1(2)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL(1)-CL()).
[253] Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL62)-CH12-VH6-CH16)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL1)-CLa)).
[254] Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve) (VH-CH16)-VHa-CH11)-VLe-CH162)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH(2)-CL'2)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL1)-CLm). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda o polipeptídeo da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VL3)-CLç)).
[255] Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve) (VH3-CH16)-VH(1)-CH11)-VHe-CL6e). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL-CH16) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL6)-CL()). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda o polipeptídeo da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CL(3)).
[256] Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VL-CH162-VHa-CH11)-VHe-CH16). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VHr2)-CL(2)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL1)-CLH)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda o polipeptídeo da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CL(3)).
[257] Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VH2)-CL(ay-VHa-CH11)-VHe6-CH16). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VLe-CH16) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VLa)--CL6). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda o polipeptídeo da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CLç3)).
[258] Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção compreende um polipeptíideo em que a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (ou seja, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve) (VHy- CH12-VL1)-CH111)-VLi-CH16)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VH6-CL6) e o polipeptídeo Fab da cadeia leve da segunda molécula Fab (VLey-CL6)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VH3)-CLça)).
[259] Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região variável de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (ou seja, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve) (VH(2-CH1(2)-VH61)-CL(1)-VH63y-CLa). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL(1)--CH16)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2-CL')). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CH13)).
[260] Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (ou seja, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região variável de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região variável de cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL(3-CH16y VLa-CH164)-VHe-CH16)). Em alguns exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VHa4y-CL(1)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CL(2)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VHçay- CL).
[261] Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (ou seja, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi- terminal com a região variável de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada de Fab crossover, em que a região constante de cadeia pesada é substituída por uma região constante de cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VHy- CLa-VH1)-CLay-VHe-CH16)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL1-CH16)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CL(2)). Em alguns exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável de cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica do carboxi-terminal com a região constante de cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VLy- CH16).
[262] Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 84, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro;
Cc) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que:
(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 85, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro;
c) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que:
(1) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro;
c) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que:
(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 96 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro;
c) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que:
(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 92, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro;
c) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que:
(1) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro;
c) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que:
(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-
terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 8, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 9, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 10, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 11 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 12;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro;
c) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que:
() a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 84, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89; b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro; Cc) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que: (i) a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).
[263] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 85, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89; b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro; c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que: () a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).
[264] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97; b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro; c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; e em que: (i) a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).
[265] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 96 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97; b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro; c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; e em que:
(i) a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).
[266] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 92, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97; b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro; c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; e em que: (i) a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).
[267] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6; b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro; c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; e em que: (i) a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).
[268] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 8, e uma HCDR 3 de SEQIDNO: 9, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 10, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 11 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 12; b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve do Fab e da cadeia pesada do Fab são substituídos um pelo outro; c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; e em que: (1) a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).
[269] Em todas as diferentes configurações da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção, as substituições de aminoácidos aqui descritas, se presentes, podem estar nos domínios CH1 e CL do primeiro e (se presente) do terceiro grupo de ligação ao antígeno/Molécula Fab, ou nos domínios CH1 e CL da segunda porção de ligação ao antiígeno/molécula Fab. Preferencialmente, eles estão nos domínios CH1 e CL da primeira e (se presente) da terceira porção de ligação ao antígeno/molécula Fab. De acordo com o conceito da invenção, se as substituições de aminoácidos aqui descritas forem feitas na primeira (e, se presente, na terceira) porção de ligação ao antígeno/molécula Fab, nenhuma substituição de aminoácidos será feita na segunda porção de ligação ao antígeno/Molécula Fab. Por outro lado, se as substituições de aminoácidos aqui descritas forem feitas na segunda porção de ligação ao antígeno/molécula Fab, nenhuma substituição de aminoácidos será feita na primeira (e, se presente, na terceira) porção de ligação ao antígeno/molécula Fab. As substituições de aminoácidos são particularmente feitas em moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendendo uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH1 da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro.
[270] Em exemplos de realização particulares da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção, particularmente em que as substituições de aminoácidos aqui descritas são feitas na primeira (e, se presente, na terceira) porção de ligação ao antígeno/molécula Fab, o domínio constante CL da primeira (e, se presente, da terceira) molécula Fab é do isotipo kappa. Em outros exemplos de realização da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção, particularmente em que as substituições de aminoácidos aqui descritas são feitas na segunda porção de ligação ao antígeno/molécula Fab, o domínio constante CL da segunda molécula Fab é do isotipo kappa. Em alguns exemplos de realização, o domínio constante CL da primeira (e, se presente, da terceira) porção de ligação ao antígeno/molécula Fab e o domínio constante CL da segunda porção de ligação ao antígeno/molécula Fab são do isotipo kappa.
[271] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 84, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:
(1) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou
Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 85, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:
() a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou
Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID
NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
Cc) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:
(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou
Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 96 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
Cc) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:
() a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou
Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 92, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
Cc) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:
(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-
terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou
Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
Cc) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:
(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou
Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 8, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 9, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 10, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 11 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 12;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:
(1) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c), ou
Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 84, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
Cc) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 124 é substituído pela lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:
(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID
NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 85, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
Cc) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 124 é substituído pela lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:
(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-
terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
c) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 124 é substituído pela lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:
(1) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 96 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
Cc) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 124 é substituído pela lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:
(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 92, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
Cc) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 124 é substituído pela lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:
(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
c) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 124 é substituído pela lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:
(1) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
Em um exemplo de realização específico, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 8, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 9, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 10, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 11 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 12;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
Cc) uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro antígeno e é idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno; e d) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 124 é substituído pela lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e da terceira porção de ligação ao antígeno em (c) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que:
(i) a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
(ii) a segunda porção de ligação ao antígeno do item (b) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N- terminal da cadeia pesada do Fab da primeira porção de ligação ao antígeno do item (a); e a primeira porção de ligação ao antígeno de (a) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (c) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (d), ou
Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 84, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89; b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro; c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).
Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo:
a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 85, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 89;
b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade;
em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).
[272] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97; b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro; Cc) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).
[273] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 96 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97; b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro; c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K)
(numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (o).
[274] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 92, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 97; b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro;
c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).
[275] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 2, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 6; b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro; c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).
[276] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo: a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e a primeira porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 8, e uma HCDR 3 de SEQID NO: 9, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 10, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 11 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 12; b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo antígeno é um antígeno de ativação de célula T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon, e a segunda porção de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro; Cc) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que a primeira porção de ligação ao antígeno em (a) e a segunda porção de ligação ao antígeno em (b) são fundidas no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc em (c).
[277] De acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima, os componentes da molécula de ligação ao antígeno biespecífica (por exemplo, moléculas Fab, domínio Fc) podem ser fundidas diretamente, ou pelo uso de vários ligantes, em particular ligantes peptídicos compreendendo um ou mais aminoácidos, tipicamente cerca de 2-20 aminoácidos, que estão descritos na presente invenção ou são conhecidos no estado da técnica. Os ligantes peptídicos adequados não imunogênicos incluem, por exemplo, os ligantes peptídicos (G4S)n, ou Ga(SGa4)n, em que n é geralmente um número inteiro de 1 a 10, tipicamente de 2a 4.
[278] Em outro aspecto particular, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo: a) uma primeira e uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno; em que o primeiro antígeno é GPRCB5D, e em que a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são uma molécula Fab (convencional) compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno; em que o segundo antígeno é CD3 e em que a segunda porção de ligação ao antígeno é a molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; Cc) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que: no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira e da terceira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que, adicionalmente, a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (a) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (c).
[279] Em outro aspecto particular, a invenção provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo: a) uma primeira e uma terceira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno; em que o primeiro antígeno é GPRC5D, e em que a primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno são uma molécula Fab (convencional) compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16; b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno; em que o segundo antígeno é CD3 e em que a segunda porção de ligação ao antígeno é a molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36;
c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade; em que: no domínio constante CL da primeira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais particularmente por arginina (R)), e em que no domínio constante CH1 da primeira e da terceira porção de ligação ao antígeno em (a) o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que, adicionalmente, a primeira porção de ligação ao antígeno do item (a) é fundida na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal da cadeia pesada do Fab da segunda porção de ligação ao antígeno do item (b); e a segunda porção de ligação ao antígeno de (b) e a terceira porção de ligação ao antígeno de (a) são fundidas na extremidade C-terminal da cadeia pesada do Fab à extremidade N-terminal de uma das subunidades do domínio Fc do item (c).
[280] Em um exemplo de realização de acordo com este aspecto da invenção, na primeira subunidade do domínio Fc, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de triptofano (T366W), e na segunda subunidade do domínio Fc, o resíduo de tirosina na posição 407 é substituído por um resíduo de valina (Y407V) e, opcionalmente, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de serina (T366S) e o resíduo de leucina na posição 368 é substituído por um resíduo de alanina (L368A) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).
[281] Em um exemplo de realização adicional de acordo com este aspecto da invenção, na primeira subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C) ou o resíduo ácido glutâmico na posição 356 é substituído por um resíduo cisteína (E356C) (particularmente o resíduo serina na posição 354 é substituído pelo resíduo de cisteína), e na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteína (Y349C) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).
[282] Em um exemplo de realização adicional de acordo com este aspecto da invenção, em cada uma da primeira e segunda subunidade do domínio Fc, o resíduo de leucina na posição 234 é substituído por um resíduo de alanina (L234A), o resíduo de leucina na posição 235 é substituído por um resíduo de alanina (L235A) e o resíduo de prolina na posição 329 é substituído por um resíduo de glicina (P329G) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[283] Ainda em outro exemplo de realização adicional de acordo com este aspecto da invenção, o domínio de Fc é um domínio de Fc de IgG1 humana.
[284] Em um exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 17, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 18, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 19 e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%,
97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 20. Em outro exemplo de realização específico, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
[285] Em outro exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 21, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 22, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 23 e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 24. Em outro exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
Domínio Fc
[286] Em exemplos de realização particulares, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade. Entende-se que as características do domínio Fc descritas na presente invenção em relação à molécula de ligação ao antígeno biespecífica podem se aplicar igualmente a um domínio Fc compreendido em um anticorpo da invenção.
[287] O domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica consiste de um par de cadeias polipeptídicas que compreendem domínios de cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina. Por exemplo, o domínio de Fc de uma molécula de imunoglobulina G (IgG) é um dímero, e cada subunidade compreende domínios constantes de cadeia pesada de IgG - CH2 e CH3. As duas subunidades do domínio de Fc são capazes de realizar associação estável entre si. Em um exemplo de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção compreende não mais do que um domínio Fc.
[288] Em um exemplo de realização, o domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica é um domínio Fc de IgG. Em um exemplo de realização particular, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1. Em outro exemplo de realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG... Em um exemplo de realização mais específico, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG« que compreende uma substituição de aminoácido na posição S228 (numeração do índice EU de Kabat), particularmente a substituição de aminoácido S228P. Esta substituição de aminoácidos reduz in vivo a troca braço Fab de anticorpos IgG (vide Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). Em um exemplo de realização particular adicional, o domínio Fc é um domínio Fc humano. Em um exemplo de realização ainda mais específico, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG: humana. Uma sequência exemplar de uma região Fc de IgG: humana é fornecida na SEQ ID NO: 42.
MopiFIcAÇÕES Do Domínio Fc PARA PROMOÇÃO DA HETERODIMERIZAÇÃO
[289] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas de acordo com a invenção compreendem diferentes porções de ligação ao antígeno, que podem estar fundidas a uma ou outra das duas subunidades do domínio Fc, assim, as duas subunidades do domínio Fc são tipicamente compostas por duas cadeias polipeptídicas não idênticas. A coexpressão recombinante desses polipeptídeos e a subsequente dimerização conduzem a várias combinações possíveis dos dois polipeptídeos. Para melhorar o rendimento e a pureza da molécula de ligação ao antígeno biespecífica na produção recombinante, será, portanto, vantajoso introduzir no domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica uma modificação que promova a associação dos polipeptídeos desejados.
[290] Consequentemente, em exemplos de realização específicos do domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção, compreende uma modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc. O sítio de interação proteína-proteína mais amplo entre as duas subunidades de um domínio Fc da IgG humana está no domínio CH3 do domínio Fc. Assim, em um exemplo de realização, a referida modificação é no domínio CH3 do domínio Fc.
[291] Existem diversas abordagens para modificações no domínio CH3 do domínio Fc com o intuito a impor a heterodimerização, que são bem descritas, por exemplo, nas publicações WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Tipicamente, em todas essas abordagens, o domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e o domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc são ambos modificados de uma maneira complementar, de modo que cada domínio CH3 (ou a cadeia pesada compreendendo tal domínio) não mais se homodimeriza consigo, mas é forçado a se heterodimerizar com o outro domínio CH3 complementarmente modificado (de modo que o primeiro e o segundo domínio CH3 se heterodimerizam e não são formados homodímeros entre os dois primeiros ou os dois segundos domínios CH3). Estas diferentes abordagens para melhorar a heterodimerização da cadeia pesada são contempladas como alternativas diferentes em combinação com as modificações da cadeia pesadas - leve (por exemplo, troca/substituição VH e VL em um braço de ligação e introdução de substituições de aminoácidos carregados com cargas opostas na interface CH1/CL) nas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, que reduzem o pareamento incorreto da cadeia leve/pesada e os subprodutos tipo Bence - Jones.
[292] Em um exemplo de realização específico, a referida modificação que promove a associação da primeira e segunda subunidade do domínio Fc é uma modificação do tipo “Knob-into-hole", compreendendo uma modificação “Knob” (protuberância) em uma das duas subunidades do domínio Fc e uma modificação “hole” (cavidade) na outra subunidade do domínio Fc.
[293] A tecnologia knob-into-hole está descrita, por exemplo, nas Patentes US 5.731.168; US 7.695.936; e em Ridgway et al, Prot Eng. 9, 617- 621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). De modo geral, o método envolve a introdução de uma protuberância (“knob”) na interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade/orifício (“hole”) correspondente na interface de um segundo polipeptídeo, de tal modo que a protuberância pode ser posicionada na cavidade a fim de promover a formação de heterodímero e impedir a formação de homodímero. As protuberâncias são construídas pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais pequenas na interface do primeiro polipeptídeo por aminoácidos com cadeias laterais maiores (por exemplo, a tirosina ou triptofano). As “cavidades” (hole) compensatórias de tamanho idêntico ou similar ao das protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais grandes por aminoácidos com cadeias laterais menores (por exemplo, alanina ou treonina).
[294] Consequentemente, em um exemplo de realização específico, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica um resíduo aminoácido é substituído por um resíduo aminoácido que possui um volume de cadeia lateral maior, gerando, assim, uma protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade que pode ser posicionada dentro de uma cavidade no interior do domínio CH3 da segunda subunidade; e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo aminoácido que possui um volume de cadeia lateral menor, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade dentro da qual a protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade pode ser posicionada.
[295] Preferencialmente o dito resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral de volume maior é selecionado a partir do grupo que consiste de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W).
[296] Preferencialmente o dito resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral de volume menor é selecionada a partir do grupo que consiste de alanina (A), serina (S), treonina (T) e valina (V).
[297] A protuberância e a cavidade podem ser feitas através da alteração de ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese sítio-específica, ou por síntese peptídica.
[298] Em um exemplo de realização específico, (no domínio CH3 da) na primeira subunidade do domínio Fc (a subunidade “knob”), o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de triptofano (T366W), e (no domínio CH3 da) na segunda subunidade do domínio Fc (a subunidade “hole”), o resíduo tirosina na posição 407 é substituído por um resíduo de valina (Y407V). Em um exemplo de realização, na segunda subunidade do domínio
Fc, adicionalmente, o resíduo treonina na posição 366 é substituído por um resíduo serina (T366S) e o resíduo leucina na posição 368 é substituído por um resíduo de alanina (L368A) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[299] Em um exemplo de realização adicional, na primeira subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C) ou o resíduo ácido glutâmico na posição 356 é substituído por um resíduo cisteína (E356C) (particularmente o resíduo serina na posição 356 é substituído pelo resíduo de cisteína), e na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteína (Y349C) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). A introdução destes dois resíduos de cisteína resulta na formação de uma ponte de bissulfeto entre as duas subunidades do domínio Fc, estabilizando adicionalmente o dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
[300] Em um exemplo de realização específico, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W, e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S, L368A e Y407V (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[301] Em um exemplo de realização específico, a porção de ligação ao antígeno que se liga ao segundo antígeno (por exemplo, um antígeno de ativação de célula T) é fundida (opcionalmente através da primeira porção de ligação ao antígeno, que se liga ao GPRC5D e/ou a um ligante peptídico) à primeira subunidade do domínio Fc (que compreende a modificação “knob”). Sem pretender ser limitar a teoria, a fusão da porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno, tal como um antígeno de ativação de célula T, na subunidade contendo a modificação knob do domínio Fc irá minimizar (ainda mais) a geração de moléculas de ligação ao antígeno compreendendo duas porções de ligação ao antígeno capazes de ligar a um antígeno de células T de ativação (choque estérico de dois polipeptídeos contendo a modificação knob).
[302] São contempladas outras técnicas como alternativas para a modificação de CH3 a fim de realizar a heterodimerização de acordo com a presente invenção que estão descritas, por exemplo, nas publicações WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.
[303] Em um exemplo de realização, a abordagem para a heterodimerização descrita no documento EP 1870459 é alternativamente utilizada. Esta abordagem se baseia na introdução de aminoácidos carregados com cargas opostas em posições específicas de aminoácidos na interface do domínio CH3/CH3 entre as duas subunidades do domínio Fc. Um exemplo de realização preferido para a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção são as mutações de aminoácidos R409D; K370E em um dos dois domínios CH3 (do domínio Fc) e as mutações de aminoácidos D399K; E357K no outro domínio CH3 do domínio Fc (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[304] Em outro exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende a mutação de aminoácidos T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e as mutações de aminoácidos T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc e adicionalmente mutações de aminoácidos R409D; K370E no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos D399K; E357K no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[305] Em outro exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende as mutações de aminoácidos S354C, T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e as mutações de aminoácidos Y349C, T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, ou a referida molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende mutações de aminoácidos Y349C, T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos S354C, T366S, L368A, Y407V nos domínios CH3 da segunda subunidade do domínio Fc e adicionalmente mutações de aminoácidos R409D; K370E no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos D399K; E357K no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc (todas as numerações de acordo com o índice EU de Kabat).
[8306] Em um exemplo de realização, a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2013/157953 é alternativamente utilizada. Em um exemplo de realização um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos T366K e o segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos L351D (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em outro exemplo de realização o primeiro domínio CH3 compreende ainda a mutação de aminoácido L351K. Em um exemplo de realização adicional o segundo domínio CH3 compreende adicionalmente uma mutação de aminoácido selecionada a partir de Y349E, Y349D e L368E (preferencialmente L368E) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).
[807] Em um exemplo de realização, a abordagem de heterodimerização descrita no WO 2012/058768 é alternativamente utilizada. Em um exemplo de realização, um primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido L351Y, Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido T366A, K409F. Em outro exemplo de realização, o segundo domínio CH3 compreende adicionalmente uma mutação de aminoácidos na posição T411, D399, S400, F405, N390 ou K392, por exemplo, selecionada a partir de a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E ou T411W, b) D399R, D399W, D399Y ou D399K, c) S400E, S400D, S400R, ou S400K, d) F405Il, F405M, F405T, F405S, F405V ou F405W, e) N390R, N390K ou N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F ou K392E (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização adicional, um primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido L351Y, Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido T366V, K409F. Em um exemplo de realização adicional, um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido T366A, K409F. Em um exemplo de realização adicional, o segundo domínio CH3 compreende adicionalmente as mutações de aminoácido K392E, T411E, D399R e S400R (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).
[308] Em um exemplo de realização, a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2011/143545 é alternativamente utilizada, por exemplo, com a modificação de aminoácido em uma posição selecionada a partir das posições 368 e 409 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).
[8309] Em um exemplo de realização, a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2011/090762, que também usa a tecnologia knobs-into-holes descrita acima é alternativamente utilizada. Em um exemplo de realização, um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido T366W e o segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácido Y407A. Em um exemplo de realização um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos T366Y e o segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos Y407T (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).
[310] Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou seu domínio Fc é da subclasse IgG? e a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2010/129304 é alternativamente utilizada.
[311] Em um exemplo de realização alternativo, uma associação que promove a modificação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc compreende uma modificação que medeia efeitos de direcionamento eletrostático, por exemplo, conforme descrito na publicação PCT WO 2009/089004. Em geral, este método envolve a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na interface das duas subunidades do domínio Fc por resíduos de aminoácidos carregados de modo que a formação de homodímeros se torna eletrostaticamente desfavorável mas a heterodimerização eletrostaticamente favorável. Em tal exemplo de realização um primeiro domínio CH3 compreende a substituição do aminoácido K392 ou N392 por um aminoácido de carga negativa (por exemplo, ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), de preferência K392D ou N392D) e um segundo domínio CH3 compreende uma substituição de aminoácido D399, E356, D356, ou E357 por um aminoácido de carga positiva (por exemplo, lisina (K) ou arginina (R), de preferência, D399K, E356K, D356K, ou E357K e mais preferencialmente D399K e E356K). Em outro exemplo de realização o primeiro domínio CH3 compreende ainda a substituição do aminoácido K409 ou R409 por um aminoácido negativamente carregado (por exemplo, ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D), de preferência K409D ou R409D). Em outro exemplo de realização o primeiro domínio CH3 compreende adicionalmente ou alternativamente a substituição do aminoácido K439 e/ou K370 por um aminoácido de carga negativa (por exemplo, ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D)) (todas as numerações de acordo com o índice EU de Kabat).
[312] Em um exemplo de realização adicional, a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2007/147901 é alternativamente utilizada.
Em um exemplo de realização um primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido K253E, D282K, e K322D e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácido D239K, E240K, e K292D (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).
[313] Em outro exemplo de realização, a abordagem de heterodimerização descrita na WO 2007/110205 pode ser alternativamente utilizada.
[314] Em um exemplo de realização, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos K392D e K409D, e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos D356K e D399K (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).
MopiIFICcAÇÕES Do Domínio Fc QUE REDUZEM A LIGAÇÃO Ao RECEPTOR Fc E/Ou
A FUNÇÃO EFETORA
[315] O domínio Fc confere propriedades farmacocinéticas favoráveis à molécula de ligação ao antígeno biespecífica (ou ao anticorpo), incluindo uma meia-vida sérica prolongada que contribui para a boa acumulação no tecido alvo e uma relação de distribuição tecido/sangue favorável. Ao mesmo tempo, ele pode, no entanto, levar ao direcionamento indesejável das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas (ou o anticorpo) para células que expressam receptores Fc ao invés de direcionar para as células contendo antígenos preferenciais. Além disso, a coativação das vias de sinalização do receptor Fc pode levar à liberação de citocinas que, em combinação com as propriedades de ativação das células T (por exemplo, nos exemplos de realização da molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que a segunda porção de ligação ao antígeno se liga a um antígeno de ativação de célula T) e a meia-vida prolongada da molécula de ligação ao antígeno biespeciífica, resulta em ativação excessiva de receptores de citocinas e efeitos colaterais graves na administração sistêmica. A ativação de células imunes (portadoras de receptor Fc) que não são células T pode até reduzir a eficácia da molécula de ligação ao antígeno biespecífica (particularmente uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica em que a segunda porção de ligação ao antígeno se liga a um antígeno da célula T de ativação) devido à destruição potencial de células T, por exemplo, células NK.
[316] Consequentemente, em exemplos de realização específicos, o domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção exibe afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou uma função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgG: nativo. Em tal exemplo de realização, o domínio Fc (ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo o referido domínio Fc) exibe menos do que 50%, de preferência menos do que 20%, mais preferivelmente menos do que 10% e mais preferivelmente ainda menos do que 5% da afinidade de ligação para um receptor Fc quando comparado com um domínio Fc de IgG: nativo (ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um domínio Fc de IgG1 nativo), e/ou menos do que 50%, de preferência menos do que 20%, mais preferencialmente menos do que 10% e mais preferivelmente menos do que 5% da função efetora, em comparação com a função efetora de um domínio Fc de IgG nativo (ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um domínio Fc de IgG' nativo). Em um exemplo de realização, o domínio Fc (ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo o referido domínio Fc) não se liga substancialmente a um receptor Fc e/ou induz a função efetora. Em um exemplo de realização específico, o receptor Fc é um receptor Fcy. Em um exemplo de realização, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em um exemplo de realização, o receptor Fc é um receptor Fc de ativação. Em um exemplo de realização específico, o receptor Fc é um receptor Fcy humano de ativação, mais especificamente FcyRllla, FcyRI ou FeyRlila humanos, mais especificamente FcyRlilla humano. Em um exemplo de realização, a função efetora é uma ou mais selecionada dentre o grupo de CDC, ADCC, ADCP, e secreção de citocina. Em um exemplo de realização particular, a função efetora é a ADCC. Em um exemplo de realização, o domínio Fc exibe uma afinidade de ligação substancialmente semelhante ao receptor Fc neonatal (FCRn), em comparação com um domínio Fc da IgG nativa. Uma ligação substancialmente semelhante ao FcRn é alcançada quando o domínio Fc (ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo o referido domínio Fc) exibe mais do que cerca de 70%, particularmente mais do que cerca de 80%, particularmente mais do que cerca de 90% da afinidade de ligação do domínio Fc da IgG1 nativa (ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um domínio Fc de IgG' nativa) para o FcRn.
[317] Em determinados exemplos de realização, o domínio Fc é projetado para ter uma afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio de Fc não modificado. Em exemplos de realização específicos, o domínio de Fc da molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende uma ou mais mutações de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor de Fc e/ou a função efetora. Normalmente, a mesma uma ou mais mutações de aminoácidos está presente em cada uma das duas subunidades do domínio Fc. Em um exemplo de realização, a mutação de aminoácidos reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor de Fc. Em um exemplo de realização, a mutação de aminoácidos reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc em pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes. Em exemplos de realização em que há mais do que uma mutação de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do domínio de Fc ao receptor Fc, a combinação destas mutações de aminoácidos pode reduzir a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc em pelo menos vezes, pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 50 vezes.
Em um exemplo de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um domínio Fc modificado exibe menos do que 20%, particularmente menos do que 10%, e mais particularmente menos do que 5% da afinidade de ligação para um receptor Fc em comparação com uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende um domínio Fc não modificado.
Em um exemplo de realização específico, o receptor Fc é um receptor Fcy.
Em alguns exemplos de realização, o receptor Fc é um receptor Fc humano.
Em alguns exemplos de realização, o receptor Fc é um receptor Fc de ativação.
Em um exemplo de realização específico, o receptor Fc é um receptor Fey humano de ativação, mais especificamente FcyRllla, FcyRI ou FeyRlila humanos, mais especificamente FeyRllla humano.
Preferencialmente, a ligação a cada um destes receptores é reduzida.
Em alguns exemplos de realização, a afinidade de ligação a um componente do complemento, especificamente a afinidade de ligação ao Ciq, também está reduzida.
Em um exemplo de realização, a afinidade de ligação ao receptor Fc neonatal (FCRn) não está reduzida.
Uma ligação substancialmente similar ao FcRn, ou seja, a manutenção da afinidade de ligação do domínio Fc para o referido receptor, é obtida quando o domínio Fc (ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo o referido domínio Fc) exibe mais do que cerca de 70% de afinidade de ligação de uma forma não modificada do domínio Fc (ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo a referida forma não modificada do domínio Fc ) para o FcRn.
O domínio Fc, ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção compreendendo o referido domínio de ligação ao Fc, pode apresentar mais do que cerca de 80% e mesmo mais do que cerca de 90% de tal afinidade.
Em determinados exemplos de realização, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é modificada para ter uma redução da função efetora em comparação com um domínio Fc não modificado. A função efetora reduzida pode incluir, mas não está limitada a, uma ou mais das seguintes: redução da citotoxicidade dependente de complemento (CDC), redução da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), redução da fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP), redução da secreção de citocinas, redução da captação de antígeno mediada por complexo imune pelas células apresentadoras de antígeno, redução da ligação de células NK, redução da ligação aos macrófagos, redução da ligação aos monócitos, redução da ligação as células polimorfonucleares, redução do sinal de indução de apoptose direta, redução da reticulação aos anticorpos ligados ao alvo, redução da maturação de células dendríticas, ou redução do priming de células T. Em um exemplo de realização, a função efetora reduzida é uma ou mais selecionada de entre o grupo de redução da CDC, redução da ADCC, redução da ADCP, e redução da secreção de citocinas. Em um exemplo de realização específico, a função efetora reduzida é a ADCC. Em um exemplo de realização, a ADCC reduzida é inferior a 20% da ADCC induzida por um domínio Fc não modificado (ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um domínio Fc não modificado).
[318] Em um exemplo de realização, a mutação de aminoácidos, que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc e/ou a função efetora é uma substituição de aminoácidos. Em um exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de um aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo de E233, L234, L235, N297, P331 e P329 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização mais específico, o domínio Fc compreende uma substituição de um aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo de L234, 1235 e P329 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em alguns exemplos de realização, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos
L234A e L235A (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em tal exemplo de realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1, particularmente um domínio Fc de IgG: humana. Em um exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição P329. Em um exemplo de realização mais específico, a substituição de aminoácido é a P329A ou P329G, particularmente a P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição P329 e adicionalmente uma substituição de aminoácidos na posição selecionada dentre E233, L234, L235, N297 e P331 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização mais específico, a outra substituição de aminoácidos é a E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ou P331S. Em exemplos de realização específicos, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos nas posições P329, L234 e L235 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em exemplos de realização específicos, o domínio Fc compreende as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (“P329G LALA”, “PGLALA” ou “LALAPG”). Especificamente, em exemplos de realização específicos, cada subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração pelo índice EU de Kabat), ou seja, em cada uma das primeira e segunda subunidades do domínio Fc, o resíduo de leucina na posição 234 é substituído por um resíduo de alanina (L234A), o resíduo de leucina na posição 235 é substituído por um resíduo de alanina (L235A) e o resíduo de prolina na posição 329 é substituído por um resíduo de glicina (P329G) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[319] Em tal exemplo de realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1, particularmente um domínio Fc de IgG: humana. A combinação “P329G LALA" de substituições de aminoácidos elimina quase completamente a ligação ao receptor Fcy (bem como ao complemento) de um domínio Fc de
IgG: humana, tal como descrito na publicação PCT WO 2012/130831, que é integralmente incorporada ao presente pela referência. A publicação WO 2012/130831 também descreve métodos de preparação de tais domínios Fc mutantes e métodos para a determinação de suas propriedades, tal como funções de ligação aos receptores Fc ou funções efetoras.
[320] Anticorpos IgG4 exibem afinidade de ligação aos receptores Fc reduzida e funções efetoras reduzidas, em comparação com os anticorpos IgG1. Assim, em alguns exemplos de realização o domínio Fc das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção é um domínio Fc de IgGa, particularmente um domínio Fc de IgGa humana. Em um exemplo de realização, o domínio Fc de IgG4 compreende as substituições de aminoácidos na posição S228, especialmente a substituição de aminoácido S228P (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Para reduzir ainda mais a sua afinidade de ligação a um receptor Fc e/ou a sua função efetora, em um exemplo de realização o domínio Fc da IgG compreende uma substituição de aminoácido na posição L235, especificamente a substituição de aminoácido L235E (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em outro exemplo de realização, o domínio Fc da IgG4 compreende uma substituição de aminoácido na posição P329, especificamente a substituição de aminoácido P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um exemplo de realização particular, o domínio Fc da IgGa compreende as substituições de aminoácidos nas posições S228, L235 e P329, especificamente as substituições de aminoácidos S228P, L235E e P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Tal domínio Fc de IgG4 mutante e suas propriedades de ligação aos receptores Fcy encontram-se descritos na publicação de Patente PCT WO 2012/130831, integralmente incorporada ao presente pela referência.
[321] Em um exemplo de realização particular, o domínio Fc que exibe afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativa, é um domínio Fc de IgG: humana compreendendo as substituições de aminoácidos L234A, L235A e opcionalmente P329G, ou um domínio Fc de IgGa humana compreendendo as substituições de aminoácidos S228P, L235E e opcionalmente P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).
[322] Em determinados exemplos de realização, a N-glicosilação do domínio Fc foi eliminada. Em tal exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma mutação de aminoácidos na posição N297, particularmente uma substituição de aminoácido que substitui a asparagina por alanina (N297A) ou por ácido aspártico (N297D) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).
[323] Além dos domínios Fc descritos acima e na Publicação PCT WO 2012/130831, os domínios Fc com ligação reduzida para o receptor Fc e/ou com função efetora reduzida incluem também aqueles com substituição de um ou mais resíduos do domínio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente US 6.737.056) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Tais Fc mutantes incluem Fc mutantes com substituições em duas ou mais das seguintes posições de aminoácidos: 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o Fc mutante então denominado de “DANA” com substituições dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente US 7.332.581).
[324] Os domínios Fc mutantes podem ser preparados por deleção, substituição, inserção ou modificação de aminoácidos usando métodos genéticos ou químicos bem conhecidos no estado da técnica. Os métodos genéticos podem incluir a mutagênese sítio-especiífica da sequência de DNA codificante, PCR, síntese gênica, e similares. As alterações de nucleotídeos — corretas podem ser verificadas, por exemplo, por sequenciamento.
[825] A ligação aos receptores Fc pode ser facilmente determinada, por exemplo, por ELISA, ou por ressonância plasmônica de superfície (SPR), utilizando instrumentos convencionais, tais como um instrumento BlAcore (GE Healthcare), e os receptores Fc podem ser obtidos por expressão recombinante. Alternativamente, a afinidade de ligação dos domínios Fc ou das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendendo um domínio Fc aos receptores Fc pode ser avaliada utilizando linhagens de células que expressam receptores Fc específicos, tais como as células NK humanas que expressam o receptor Fcyllla.
[326] A função efetora de um domínio Fc, ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um domínio Fc, pode ser mensurada por métodos conhecidos no estado da técnica. Exemplos de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse encontram-se descritos na Patente US 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) e Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); Patente US 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Alternativamente, podem ser utilizados métodos de ensaios não radioativos (vide, por exemplo, o ensaio de citotoxicidade não radioativo ACTIº para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA), e o ensaio de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96º (Promega, Madison, WI!)). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (Natural Killer ou NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como divulgado em Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).
[327] Em alguns exemplos de realização, a ligação do domínio Fc a um componente do sistema complemento, especificamente a ligação ao
C19g, é reduzida. Assim, em alguns exemplos de realização, quando o domínio Fc é projetado para ter função efetora reduzida, a referida função efetora reduzida inclui redução da CDC. Ensaios de ligação de Ciq podem ser realizados para determinar se o domínio Fc, ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo o domínio Fc, é capaz de se ligar ao C1q e, portanto, ter atividade CDC. Vide, por exemplo, ELISA de ligação ao C1qg e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio CDC pode ser executado (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro et al, J] Immunol Methods 202, 163 (1996), Cragg et al, Blood 101, 1045-1052 (2003); e Cragg e Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
[328] A determinação da ligação de FcRn e a depuração/meia vida in vivo também pode ser realizada utilizando métodos conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Intl. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929).
POLINUCLEOTÍDEOS
[329] A invenção fornece ainda polinucleotídeos isolados que codificam um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, tal como descrito na presente invenção ou um fragmento da mesma. Em alguns exemplos de realização, o referido fragmento é um fragmento de ligação ao antígeno.
[330] Os polinucleotídeos que codificam anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecífica da invenção podem ser expressos como um polinucleotídeo único que codifica todo o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou na forma de múltiplos polinucleotídeos (por exemplo, dois ou mais) que são coexpressos. Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeos que são coexpressos podem associar-se por meio de, por exemplo, pontes de bissulfeto ou outros meios para formar um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica funcional. Por exemplo, a porção da cadeia leve de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode ser codificada por um polinucleotídeo separado a partir da porção do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo a cadeia pesada do anticorpo ou da molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Quando coexpressos, os polipeptídeos de cadeia pesada irão se associar com os polipeptídeos de cadeia leve de modo a formar o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Em outro exemplo, a porção do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende uma das duas subunidades de domínio Fc e, opcionalmente, (parte de) uma ou mais moléculas Fab, pode ser codificada por um polinucleotídeo separado a partir da porção do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende a molécula as outras duas subunidades de domínio Fc e, opcionalmente, (parte de) uma molécula Fab. Quando coexpressas, as subunidades do domínio Fc irão se associar para formar o domínio Fc.
[331] Em alguns exemplos de realização, o polinucleotídeo isolado codifica todo o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção conforme descrito na presente invenção. Em outros exemplos de realização, o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo compreendido no anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção conforme descrito na presente invenção.
[332] Em determinados exemplos de realização, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA. Em outros exemplos de realização, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, sob a forma de RNA mensageiro (mMRNA). O RNA da presente invenção pode ser de fita simples ou de fita dupla.
MÉTODOS RECOMBINANTES
[333] Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser obtidos, por exemplo, pela síntese peptídica em estado sólido (por exemplo, pela síntese em fase sólida de Merrífield) ou pela produção recombinante. Para a produção recombinante um ou mais polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou a molécula de ligação ao antígeno biespeciífica (fragmento), por exemplo, conforme descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem adicional e/ou para a expressão em uma célula hospedeira. Tal polinucleotídeo pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais. Em um exemplo de realização é fornecido um vetor, de preferência um vetor de expressão, que compreende um ou mais polinucleotídeos da invenção. Os métodos que são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto podem ser usados para construir vetores de expressão contendo a sequência codificante de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica (fragmento) juntamente com os sinais de controle transcricional/traducional apropriados. Estes métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação in vivo/recombinação genética. Vide, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY. (1989) e Ausubel et a/l., Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY (1989) O vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus, ou pode ser um fragmento de ácido nucleico. O vetor de expressão inclui um cassete de expressão em que o polinucleotídeo codificante do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica (fragmento) (ou seja, a região codificante) é clonado em associação operativa com um promotor e/ou outros elementos de controle da transcrição ou da tradução. Conforme utilizado na presente invenção, uma “região codificante” ou “região de codificação” é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons que são traduzidos em aminoácidos.
Embora um “códon de parada” ou “códon de terminação” (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado como parte de uma região codificante, se presente, mas quaisquer sequências flanqueadoras, por exemplo, promotores, sítios de ligação ao ribossomo, terminadores da transcrição, íntrons, regiões 5' e 3' não traduzidas, e similares, não são parte de uma “região codificante”. Duas ou mais regiões codificantes podem estar presentes em uma única construção de polinucleotídeos, por exemplo, em um único vetor, ou em construções polinucleotídicas separadas, por exemplo, em (diferentes) vetores separados.
Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região codificante, ou pode compreender duas ou mais regiões codificantes, por exemplo, um vetor da presente invenção pode codificar um ou mais polipeptídeos, que são separados pós- ou cotraducionalmente nas proteínas finais pela clivagem proteolítica.
Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões codificantes heterólogas, fundidas ou não fundidas com um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica (fragmento), ou uma forma variante ou um derivado do mesmo.
As regiões codificantes heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados tal como um peptídeo sinal de secreção ou um domínio funcional heterólogo.
Uma associação operável é quando uma região codificante de um produto gênico, por exemplo, um polipeptídeo, é associado a uma ou mais sequências reguladoras, de tal maneira que coloca a expressão do produto do gene sob a influência ou controle da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (tal como uma região codificante do polipeptídeo e um promotor associado a esta) estão “operacionalmente associados”, se a indução da função promotora resulta na transcrição de mMRNA que codifica o produto do gene desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere com a capacidade das sequências reguladoras de expressão no controle da expressão do produto do gene, ou não interfere com a capacidade do DNA molde de ser transcrito.
Assim, uma região promotora estaria operacionalmente associada com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição do referido ácido nucleico.
O promotor pode ser um promotor “célula-específico', que controla a transcrição substancial do DNA apenas em células pré-determinadas.
Outros elementos de controle da transcrição, além de um promotor, por exemplo, facilitadores/acentuadores (enhancers), operadores, repressores, e sinais de terminação da transcrição, podem estar operacionalmente associados com o polinucleotídeo para controlar a transcrição célula-específica.
Os promotores adequados e outras regiões de controle da transcrição são divulgados na presente invenção.
Diversas regiões de controle da transcrição são conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto.
Dentre estas podemos citar, sem se limitar, as regiões de controle da transcrição que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas não se limitando a, promotor e segmentos enhancers de citomegalovírus (por exemplo, o promotor precoce imediato, em conjunto com o íntron-A), vírus símio 40 (por exemplo, o promotor precoce), e retrovírus (por exemplo, vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle da transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados como a actina, proteína de choque térmico, hormônio do crescimento bovino e B-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão de genes em células eucarióticas.
Regiões de controle da transcrição adequadas adicionais incluem promotores e facilitadores tecido-específicos, bem como promotores indutíveis (por exemplo, promotores indutíveis por tetraciclinas). De forma similar, uma variedade de elementos de controle da tradução é conhecida pelos técnicos hábeis no assunto.
Estes incluem, mas não se limitam a, sítios de ligação ao ribossomo e de início da tradução, códons de terminação e elementos derivados de sistemas virais (em particular, um sítio interno de entrada de ribossomo, ou IRES, também referido como sequência CITE). O cassete de expressão também pode incluir outros recursos, como uma origem de replicação, e/ou elementos de integração cromossômica, tal como as repetições terminais longas retrovirais (LTRs) ou repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV).
[334] O polinucleotídeo e as regiões codificantes de ácido nucleico da presente invenção podem ser associados com regiões codificantes adicionais que codificam peptídeos de secreção ou de sinal, que direcionam a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, se é desejada a secreção do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, o DNA que codifica uma sequência sinal pode ser colocado a montante do ácido nucleico codificante do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção ou de um fragmento de ligação da mesma. De acordo com a hipótese de sinal, proteínas secretadas por células de mamíferos têm um peptídeo sinal ou sequência de comando de secreção, que é clivada a partir da proteína madura, quando a exportação da cadeia de proteína em crescimento através do retículo endoplasmático rugoso é iniciada. Os técnicos hábeis estão cientes de que polipeptídeos secretados por células de vertebrados têm, em geral, um peptídeo de sinal fundido com a extremidade N- terminal do polipeptídeo, e que é clivado a partir do polipeptídeo traduzido para produzir uma forma secretada ou “madura” do polipeptídeo. Em determinados exemplos de realização, o peptídeo de sinal nativo, por exemplo, um peptídeo de sinal da cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina é utilizado, ou um derivado funcional desta sequência que retenha a capacidade de direcionar a secreção do polipeptídeo ao qual está operacionalmente associada. Alternativamente, um peptídeo sinal heterólogo de mamífero, ou um derivado funcional do mesmo, pode ser utilizado. Por exemplo, a sequência líder tipo-selvagem pode ser substituída pela sequência líder do ativador de plasminogênio tecidual humano (TPA) ou o B-glucuronidase de camundongo.
[335] O DNA codificante de uma sequência de proteína curta que pode ser utilizado para facilitar a posterior purificação (por exemplo, um marcador histidina) ou auxiliar na marcação do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, pode ser incluído dentro ou nas extremidades do polinucleotídeo codificante do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica (fragmento).
[336] Em um exemplo de realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um ou mais polinucleotídeos da invenção. Em determinados exemplos de realização, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um ou mais vetores da invenção. Os polinucleotídeos e vetores podem incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, descritas na presente invenção em relação aos polinucleotídeos e vetores, respectivamente. Em tal exemplo de realização uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada ou transfectada com) um ou mais vetores compreendendo um ou mias polinucleotídeos codificantes de (parte de) um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção. Conforme utilizado no presente, o termo “célula hospedeira” refere-se a qualquer tipo de sistema celular que pode ser manipulada para gerar o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção ou fragmentos dos mesmos. As células hospedeiras adequadas para a replicação e para suportar a expressão dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas são bem conhecidas no estado da técnica. Tais células podem ser transfectadas ou transduzidas, conforme apropriado, com o vetor de expressão particular, e grandes quantidades de células contendo vetor podem ser cultivadas em fermentadores de larga escala para se obter quantidades suficientes de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica para aplicações clínicas.
As células hospedeiras adequadas incluem micro-organismos procarióticos, como E. coli, ou várias células eucarióticas, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), células de insetos, ou similares.
Por exemplo, os polipeptídeos podem ser produzidos em bactérias, em particular, quando a glicosilação não é necessária.
Após a expressão, o polipeptídeo pode ser isolado a partir da pasta celular de bactérias em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado.
Além dos procariotos, os micróbios eucariotos como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros adequados para clonagem ou expressão de vetores codificantes de polipeptídeos, incluindo as cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um polipeptídeo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano.
Vide, Gerngross, Nat.
Biotech. 22:1409-1414 (2004), e Li et al., Nat.
Biotech. 24:210-215 (2006). Células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos (glicosilados) podem ser derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados) Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos.
Foram identificadas numerosas cepas de baculovírus que podem ser utilizadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células Spodoptera frugiperda.
Culturas de células vegetais podem também ser utilizadas como hospedeiros.
Consulte, por exemplo, as Patentes US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 e US 6.417.429 (que descrevem a tecnologia PLANTIBODIESº para produção de anticorpos em plantas transgênicas). As células de vertebrados também podem ser utilizadas como hospedeiros.
Por exemplo, a linhagem de células de mamíferos que são adaptadas para crescerem em suspensão pode ser útil.
Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são; linhagem CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (293 ou células 293 conforme descrito em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células rim de hamster neonato (BHK), células de Sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod 23:243- 251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células humanas de carcinoma cervical (HeLa); células de rim de cão (MDCK); células do fígado de rato búfalo (BRL 3A); células pulmonares humanas (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562);. células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al, Annals NY Acad.Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem a célula de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR- (Urlaub et al, Proc Acad Nat. Sci USA 77:4216 (1980)) e linhagem de células de mieloma, como a NSO e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de proteína, vide, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, Ed., Humana Press, Fairfield, NJ, págs 255-268 (2003). As células hospedeiras incluem células de cultura, por exemplo, células de mamíferos cultivadas, células de leveduras, células de insetos, células bacterianas e células vegetais, para citar apenas algumas, mas também células compreendidas dentro de um animal transgênico, ou planta transgênica ou cultura ou tecido de planta ou animal. Em um exemplo de realização, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, de preferência uma célula de mamífero, tal como uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), célula de rim embrionário humano (HEK) ou célula linfoide (por exemplo, célula YO, NSO, SP20).
[337] As tecnologias-padrão para expressar genes exógenos em tais sistemas são conhecidas no estado da técnica. As células que expressam um polipeptídeo compreendendo a pesada ou cadeia leve de um domínio de ligação ao antígeno tal como um anticorpo, podem ser manipuladas de modo a expressarem também a outra cadeia de anticorpo de tal modo que o produto expresso é um anticorpo que tem tanto a cadeia pesado quanto a cadeia leve.
[338] Em um exemplo de realização, é fornecido um método de produção de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção, em que o método compreende o cultivo de uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, conforme fornecido no presente, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica e, opcionalmente, a recuperação do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica a partir da célula hospedeira (ou a partir do meio de cultura da célula hospedeira).
[339] Os componentes da molécula de ligação ao antígeno biespecífica (ou o anticorpo) da invenção podem ser fundidos geneticamente entre si. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode ser concebida de tal forma que os seus componentes estejam fundidos diretamente entre si ou indiretamente por meio de uma sequência ligante. A composição e o comprimento do ligante podem ser determinados de acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica e a eficácia do mesmo pode ser testada. Exemplos de sequências ligantes entre os diferentes componentes de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas são fornecidos na presente invenção. Sequências adicionais podem também ser incluídas para incorporar um sítio de clivagem para separar os componentes individuais da fusão, se desejado, por exemplo, uma sequência de reconhecimento de endopeptidase.
[340] O anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção geralmente compreende pelo menos uma região variável de anticorpo capaz de se ligar a um determinante antigênico. As regiões variáveis podem formar parte de, e serem derivadas de anticorpos de ocorrência natural ou de anticorpos que não ocorrem naturalmente e fragmentos dos mesmos. Os métodos para produzir anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais são bem conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Harlow e Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Os anticorpos de ocorrência não natural podem ser construídos utilizando a síntese de peptídeo em fase-sólida, podem ser produzidos de forma recombinante (por exemplo, conforme descrito na Patente US 4.186.567) ou podem ser obtidos, por exemplo, por rastreio de bibliotecas combinatórias que compreendem cadeias pesadas variáveis e cadeias leves variáveis (vide, por exemplo, a Patente US 5.969.108 de McCafferty).
[341] Qualquer espécie animal de anticorpo, fragmento de anticorpo, domínio de ligação ao antígeno ou região variável pode ser usada no anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção. Os anticorpos, fragmentos de anticorpos, domínios de ligação ao antígeno ou regiões variáveis não limitantes úteis na presente invenção podem ser de origem murina, primata, ou de origem humana. Se o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica é pretendido para uso humano, uma forma quimérica do anticorpo pode ser utilizada onde as regiões constantes do anticorpo são humanas. A forma humanizada ou totalmente humana de anticorpo também pode ser preparada de acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, a Patente US 5.565.332 — de Winter). A humanização pode ser obtida por meio de vários métodos, incluindo, mas não se limitando a: (a) enxertar CDRs não humanas (por exemplo, anticorpo doador) na região de arcabouço (framework) humana (por exemplo, anticorpo receptor) e regiões constantes com ou sem retenção de resíduos da estrutura central críticos (por exemplo, aqueles que são importantes para manter boa afinidade de ligação ao antígeno ou funções do anticorpo), (b) enxertar apenas as regiões determinantes de especificidade não humanas (SDRs ou a-CDRs, os resíduos críticos para a interação anticorpo- antígeno) na região do arcabouço (framework) humana e regiões constantes, ou (c) transplantando os domínios variáveis não humanos inteiros, mas “camuflando” eles com uma seção semelhante à humana pela substituição de resíduos de superfície.
Os anticorpos humanizados e métodos para produzi-los são revistos, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front.
Biosci. 13:1619- 1633 (2008), e são adicionalmente descritos, por exemplo, em Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al, Proc.
Nat.
Acad.
Sci.
USA 86:10029-10033 (1989); Patentes US 5.821.337, US 7.527.791, US 6.982.321 e US 7.087.409; Kashmiri et al, Methods 36:25-34 (2005) (descrevendo o enxerto da região determinante de especificidade (SDR)).; Padlan, Mol.
Immunol. 28:489-498 (1991) (descrevendo o “resurfacing”); Dall'Acqua et al, Métodos 36:43-60 (2005) (descrevendo o “shuffling de FR”); e Osbourn et al, Methods 36:61-68 (2005) e Klimka et al., Br.
J.
Cancer, 83:252-260 (2000) (que descrevem a abordagem de “seleção guiada” para o shufflihg de FR). Os arcabouços (ou regiões estruturais - framework) humanos que podem ser utilizados para a humanização incluem, mas não estão limitados a: arcabouços selecionados usando o método de “melhor ajuste” (best-fit) (vide, por exemplo, Sims et al.
J.
Immunol 151:2296 (1993)); arcabouços derivados da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de arcabouços de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter et al.
Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA, 89:4285 (1992); e Presta et al.J.
Immunol, 151:2623 (1993)); arcabouços humanos maduros (somaticamente mutados) ou arcabouços humanos da linhagem germinativa (vide, por exemplo, Almagro e Fransson, Front.
Biosci. 13:1619-1633 (2008)), e arcabouços derivados a partir da triagem de bibliotecas de FR (vide, por exemplo, Baca et al, J.
Biol..Chem.
272:10678-10684 (1997) e Rosok et al, J. Biol.Chem. 271:22611-22618 (1996)).
[342] Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas no estado da técnica. Anticorpos humanos estão descritos de modo geral em van Dijk e van Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008). Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração de um imunógeno a um animal transgênico, que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico. Tais animais contêm tipicamente a totalidade ou uma porção dos /oci de imunoglobulinas humanas, que substituem os /oci de imunoglobulinas endógenas, ou que estão presentes extracromossomicamente ou integrados aleatoriamente nos cromossomos do animal. Em tais camundongos transgênicos, os /oci de imunoglobulinas endógenas geralmente foram inativados. Para uma revisão dos métodos para a obtenção de anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, vide Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Vide também, por exemplo, as Patentes US 6.075.181 e US 6.150.584 que descrevem a tecnologia XENOMOUSES,; a Patente US 5.770.429 que descreve a tecnologia HUMABº; a Patente US 7.041.870 que descreve a tecnologia K-M MOUSES, e o Pedido de Patente US 2007/0061900, que descreve a tecnologia VELOCIMOUSES). As regiões variáveis humanas a partir de anticorpos intactos gerados por esses animais podem ser ainda modificadas, por exemplo, por combinação com uma região constante humana diferente.
[343] Os anticorpos humanos podem ser preparados por métodos baseados em hibridoma. Linhagens de células de mieloma humano e heteromieloma — humano-camundongo para a produção de anticorpos monoclonais humanos também foram descritas. (Consulte, por exemplo,
Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova lorque, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)). Os anticorpos humanos gerados pela tecnologia de hibridoma de células B humanas são também descritos em Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Métodos adicionais incluem os descritos, por exemplo, na Patente US 7.189.826 (que descreve a produção de anticorpos IgM monoclonais humanos a partir de linhagem de células de hibridoma) e Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que descreve hibridomas humano- humano). A tecnologia de hibridoma humano (tecnologia de Trioma) também é descrita em Vollmers e, Brandlein Histology and Histopathology, 20 (3):927-937 (2005) e Vollmers e Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
[344] Os anticorpos humanos também podem ser gerados por isolamento de bibliotecas de anticorpos humanos, como descrito na presente invenção.
[345] Os anticorpos úteis da presente invenção podem ser isolados pela triagem de bibliotecas combinatórias para selecionar anticorpos com a atividade ou as atividades desejada(s). Os métodos para rastrear bibliotecas combinatórias são revisados, por exemplo, em Lerner et al. em Nature Reviews 16: 498-508 (2016). Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida no estado arte para a produção de bibliotecas de exibição por fago e a seleção tais bibliotecas para anticorpos que possuam as características de ligação desejadas. Tais métodos são revisados, por exemplo, em Frenzel et al. em mÃAbs 8: 1177-1194 (2016); Bazan et al. em Human Vaccines and Immunotherapeutics 8: 1817-1828 (2012) e Zhao et al. em Critical Reviews in Biotechnology 36: 276-289 (2016), bem como em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press,
Totowa, NJ, 2001) e em Marks e Bradbury em Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed. Human Press, Totowa, NJ, 2003).
[346] Em determinados métodos de exibição em fagos, os repertórios de genes VH e VL são separadamente clonados por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados de forma aleatória em bibliotecas de fagos, que podem ser triados em busca de clones que se ligam ao antígeno, conforme descrito em Winter et al, em Annual Review of Immunology. 12: 433-455 (1994). O fago normalmente exibe fragmentos de anticorpo, como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab. As bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade para o imunógeno, sem a necessidade de construção de hibridomas. Alternativamente, o repertório inicial (naíve) pode ser clonado (por exemplo, a partir de humano) para fornecer uma única fonte de anticorpos humanos, para uma ampla faixa de antígenos não próprios (non-self) e também próprios (self), sem qualquer imunização, conforme descrito por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, bibliotecas iniciais (naíves) podem também ser produzidas sinteticamente por meio de clonagem dos segmentos de genes V não rearranjados a partir de células-tronco, e utilizando primers de PCR que contém sequências aleatórias para codificar as regiões CDR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, conforme descrito por Hoogenboom e Winter em Journal of Molecular Biology, 227: 381-388 (1992). As Publicações de patentes que descrevem bibliotecas fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: as patentes US 5.750.373; US 7.985.840; US
7.785.903 e US 8.679.490 bem como as publicações US 2005/0079574, US 2007/0117126, US 2007/0237764 e 2007/0292936. Outros exemplos de métodos conhecidos no estado da técnica para rastrear bibliotecas combinatórias para anticorpos com uma atividade ou atividades desejadas incluem exibição em ribossomo e mMRNA, bem como métodos para exibição e seleção de anticorpos em bactérias, células de mamíferos, células de insetos ou células de levedura. Os métodos para exibição na superfície de levedura são revisados, por exemplo, em Scholler et al. em Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012) e em Cherf et al. em Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015), bem como em Zhao et al. em Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012). Os métodos para exibição de ribossomos são descritos, por exemplo, em He et al. em Nucleic Acids Research 25: 5132-5134 (1997) e em Hanes et al. em PNAS 94:4937-4942 (1997).
[347] Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas descritos na presente invenção podem ser purificados por técnicas conhecidas pelos especialistas no assunto, tal como a cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia de troca iônica, eletroforese em gel, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão por tamanho, e técnicas similares. As condições reais utilizadas para purificar uma proteína particular dependerão, em parte, de fatores como a carga líquida, a hidrofobicidade, a hidrofilicidade, e etc, e serão evidentes para os especialistas no assunto. Para a purificação usando a cromatografia de afinidade, pode ser usado um anticorpo, ligante, receptor ou antígeno ao qual o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica se liga. Por exemplo, para a purificação do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção por cromatografia de afinidade, uma matriz com a proteína A ou proteína G pode ser usada. A cromatografia de afinidade em Proteína A ou G sequencial e a cromatografia de exclusão por tamanho podem ser usadas para isolar o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica essencialmente conforme descrito nos Exemplos. A pureza do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode ser determinada por qualquer um dentre uma variedade de métodos bem conhecidos, incluindo a análise por eletroforese em gel, cromatografia líquida de alta pressão, e ensaios similares.
ENSAIOS
[348] Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidos na presente invenção podem ser identificados, rastreados, ou caracterizados por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos no estado da técnica.
ENSAIOS DE AFINIDADE
[349] A afinidade do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica para um receptor Fc ou antígeno alvo pode ser determinada por ressonância plasmônica de superfície (SPR), utilizando a instrumentação convencional, tal como um instrumento BlAcore (GE Healthcare), e receptores ou proteínas alvo, tal como pode ser obtido pela expressão recombinante. Alternativamente, a ligação dos anticorpos ou das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas aos diferentes receptores ou antígenos-alvo pode ser avaliada utilizando linhagens de células que expressam o receptor ou antígeno-alvo em particular, por exemplo, por citometria de fluxo (FACS). Um exemplo de realização específico ilustrativo e exemplar para mensurar a afinidade de ligação é descrito a seguir.
[350] De acordo com um exemplo de realização, a Ko é mensurada pela ressonância plasmônica de superfície utilizando um dispositivo BIACORES T100 (GE Healthcare), a 25ºC.
[351] Para analisar a interação entre a porção Fc e os receptores de Fc, um receptor Fc recombinante marcado com His-tag é capturado por um anticorpo anti-Penta His (Qiagen) imobilizado em chips CM5 e as construções biespecíficas são usadas como analitos. Resumidamente, chips biossensores de dextrano carboximetilados (CM5, GE Healthcare) são ativados com cloridrcato de —N-etil-V-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N hidroxisucinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O anticorpo anti- Penta-His é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 5,0,
para 40 ug/mL antes de ser injetado a uma velocidade de fluxo de 5 uL/minuto para atingir aproximadamente 6500 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção do ligante, etanolamina 1M é injetada para bloquear grupos que não reagiram. Subsequentemente o receptor Fc é capturado por 60 s, a 4 ou 10 nM. Para medições cinéticas, quatro diluições seriadas do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecifica (variação entre 500 NM e 4000 nM) são injetadas em HBS-EP (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensoativo P20 0,05%, pH 7,4) em 25ºC a uma velocidade de fluxo de 30 mL/min durante 120 segundos.
[352] Para determinar a afinidade ao antígeno alvo, os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas são capturados por um anticorpo humano anti Fab específico (GE Healthcare), que está imobilizado sobre uma superfície do chip sensor CM5 ativado, tal como descrito para o anticorpo anti Penta-His. A quantidade final da proteína acoplada é de aproximadamente 12000 RU. Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas são capturados durante 90 seg. a 300 nM. Os antígenos alvo são passados através de células de fluxo por 180 s em um intervalo de concentração de 250-1000 nM, em uma velocidade de fluxo de 30 ulL/min. À dissociação é monitorada durante 180 s.
[353] As diferenças no índice de refração em massa são corrigidas subtraindo a resposta obtida na célula de fluxo de referência. À resposta em estado estacionário foi utilizada para derivar a constante de dissociação Kp pelo ajuste de curva não linear da isotérmica de ligação de Langmuir. A velocidade de associação (Kon) e a velocidade de dissociação (Kotr) são calculadas utilizando um modelo de ligação simples um-para-um de Langmuir (BIACORE T100 Evaluation Software version 1.1.1) pelo ajuste simultâneo de sensorgramas de associação e dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (Kp) é calculada como a relação Kot/Kon. Vide, por exemplo., Chen, et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999).
ENSAIOS DE ATIVIDADE
[354] A atividade biológica das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas (ou anticorpos) da invenção pode ser mensurada por meio de vários ensaios, tal como descrito nos Exemplos. As atividades biológicas podem, por exemplo, incluir a indução da proliferação de células T, indução da sinalização nas células T, indução da expressão de marcadores de ativação em células T, indução da secreção de citocinas por células T, indução da lise de células-alvo, tal como células tumorais, e indução da regressão de tumores e/ou melhora da sobrevida.
CoMPOSIÇÕES, FORMULAÇÕES E VIAS DE ADMINISTRAÇÃO
[355] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem qualquer um dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidos na presente invenção, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos descritos abaixo. Em um exemplo de realização, uma composição farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidos na presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outro exemplo de realização, uma composição farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidos na presente invenção e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo.
[356] Adicionalmente, é fornecido um método de produção de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção em uma forma adequada para administração in vivo, compreendendo o referido método: (a) a obtenção de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a invenção, e (b) a formulação do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável, em que uma preparação do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica é formulada para administração in vivo.
[357] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica dissolvido ou disperso em um excipiente farmaceuticamente aceitável. As frases “farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitáveis” refere-se a entidades moleculares e composições que são geralmente atóxicas para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas, ou seja, não produzem uma reação adversa nociva, alérgica ou outra quando administrada a um animal, por exemplo, um humano, quando apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contém pelo menos um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica e, opcionalmente, um ingrediente ativo adicional será do conhecimento dos técnicos hábeis no assunto à luz da presente divulgação, conforme exemplificado em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18º Ed. Mack Printing Company, 1990, incorporado ao presente pela referência. Além disso, para a administração animal (por exemplo, humana), deve-se entender que as preparações devem cumprir as normas de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza conforme exigido pelas diretrizes do Escritório de Padrões Biológicos da FDA ou autoridades correspondentes em outros países. As composições preferidas são formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Tal como utilizado no presente, “veículo farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer e todos os solventes, tampões, meios de dispersão, revestimentos, agentes tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes de retardamento da absorção, sais, conservantes, antioxidantes, proteínas, drogas, estabilizantes de drogas, polímeros, géis, ligantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, corantes, tais como os materiais e combinações dos mesmos, como seria do conhecimento de um técnico hábil no assunto (vide, por exemplo, Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18º ed. Mack Printing Company, 1990, págs 1289- 1329, incorporado ao presente pela referência). Exceto na medida em que qualquer veículo convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, a sua utilização nas composições terapêuticas ou farmacêuticas é contemplada.
[358] Um imunoconjugado da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer via apropriada, que inclui a via parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A administração pode ser feita por qualquer via de administração adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica.
[359] As composições parenterais incluem aquelas que foram concebidas para a administração por injeção, por exemplo, por via subcutânea, intradérmica, intralesional, administração intravenosa, intramuscular, intra- arterial, intratecal ou intraperitoneal. Para injeção, os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser formulados em soluções — aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis, tal como a solução de Hanks, solução de Ringer, ou tampão salino fisiológico. A solução pode conter agentes de formulação, tais como suspensões, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas podem estar na forma de pó para a constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril livre de pirogênicos, antes do uso. As soluções injetáveis estéreis são preparadas pela incorporação dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção na quantidade requerida em solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados a seguir, conforme necessário.
A esterilização pode ser facilmente obtida, por exemplo, por meio da filtragem através de membranas de filtração estéreis.
Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação dos diversos ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e/ou outros ingredientes.
No caso de pó estéril para a preparação de soluções injetáveis estéreis, suspensões ou emulsões, os métodos preferidos de preparação são secagem à vácuo ou técnicas de liofiização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de um meio líquido previamente esterilizado por filtração.
O meio líquido deve ser adequadamente tamponado se necessário e o diluente líquido de primeiro ser tornado isotônico antes da injeção com solução salina ou glicose suficiente.
A composição deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento, e protegida contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos.
Será apreciado que a contaminação com endotoxinas deve ser mantida minimamente a um nível seguro, por exemplo, menos que 0,5 ng/mg de proteína.
Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a: tampões como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzilíco; alquil parabenos tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo a glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açucares tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tal como sódio; complexos metálicos (tal como, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos como polietileno glicol (PEG).
[360] As suspensões para injeção aquosas podem conter compostos que aumentam a viscosidade da suspensão, como a carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, dextrano, ou outros compostos similares. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes ou agentes que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas de modo adequado. Além disso, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas apropriadas. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, tal como óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como cleats de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas.
[361] Os ingredientes ativos podem ser retidos (encapsulados) em microcápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de coacervação ou por meio de polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli- (metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, (18º Edição, Mack Printing Company 1990). Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o polipeptídeo, que se encontram na forma de artigos moldados, por exemplo,
filmes ou microcápsulas. Em exemplos de realização específicos, a absorção prolongada de uma composição injetável pode ser provocada pela utilização de agentes que atrasam a absorção nas composições, tais como, por exemplo, monoestearato de alumínio, gelatina ou combinações dos mesmos.
[362] Além das composições descritas anteriormente, os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas também podem ser formulados como uma preparação de depósito (depot). Tais formulações de ação prolongada podem ser administradas pela implantação (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou pela injeção intramuscular. Assim, por exemplo, os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas podem ser formulados com materiais poliméricos apropriados ou materiais hidrofóbicos (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados fracamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.
[3863] As composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser produzidas por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, emulsão, encapsulação, aprisionamento ou liofiização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de modo convencional usando um ou mais veículos, diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis que facilitem o processamento das proteínas em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação adequada é dependente da via de administração escolhida.
[364] Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas podem ser formulados em uma composição livre de ácido ou base, neutra ou na forma de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são sais que retêm substancialmente a atividade biológica do ácido ou base livre. Estes incluem os sais de adição de ácido, por exemplo, aqueles formados com os grupos amino livres de uma composição proteica, ou que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como o ácido acético, oxálico, tartárico ou mandélico. Os sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, ou de bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína. Os sais farmacêuticos tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos e solventes próticos do que as formas de base livre correspondentes. ComPOSIÇÕES E MÉTODOS TERAPÊUTICOS
[365] Qualquer um dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidos na presente invenção podem ser usados nos métodos terapêuticos. Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser usados como agentes imunoterapêuticos, por exemplo, no tratamento de cânceres.
[366] Para o uso em métodos terapêuticos, os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser formulados, dosados, e administrados de um modo consistente com a boa prática médica. Os fatores que devem ser considerados neste contexto incluem o distúrbio específico a ser tratado, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica do paciente, a causa do distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, o esquema de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos.
[367] Em um aspecto, são fornecidos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção para uso como um medicamento. Em aspectos adicionais, são fornecidos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção para uso no tratamento de uma doença. Em determinados aspectos, são fornecidos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção para uso em um método de tratamento.
Em um exemplo de realização, a invenção fornece um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica conforme descrito na presente invenção para o uso no tratamento de uma doença em um indivíduo com necessidade de tal tratamento.
Em determinados exemplos de realização, a invenção fornece um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica para o uso em um método de tratamento de um indivíduo que tem uma doença, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica ao indivíduo.
Em certos exemplos de realização, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo.
Em um exemplo de realização específico da doença é o câncer.
Em certos exemplos de realização, o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente anticâncer, ao indivíduo se a doença a ser tratada é o câncer.
Em outros exemplos de realização, a invenção provê um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica tal como descrito na presente invenção para uso na indução de lise de uma célula-alvo, em particular uma célula tumoral.
Em determinados exemplos de realização, a invenção provê um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica para uso em um método de induzir a lise de uma célula-alvo, em particular uma célula tumoral, em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica para induzir a lise de uma célula-alvo.
Um “indivíduo”, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima é um mamífero, e preferencialmente um ser humano.
Em alguns exemplos de realização, a doença a ser tratada é uma doença autoimune, particularmente lúpus eritematoso sistêmico e/ou artrite reumatoide.
A produção de autoanticorpos patogênicos por células plasmáticas autorreativas é uma marca registrada de doenças autoimunes. Portanto, o GPRCS5D pode ser usado para direcionar células plasmáticas autorreativas em doenças autoimunes.
[368] Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica na fabricação ou preparação de um medicamento. Em um exemplo de realização o medicamento é para o tratamento de uma doença em um indivíduo que necessite de tal medicamento. Em um exemplo de realização adicional, o medicamento é para uso em um método de tratamento de uma doença, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do medicamento a um indivíduo possuindo a doença. Em certos exemplos de realização, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo. Em um exemplo de realização específico da doença é o câncer. Em um exemplo de realização, o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente anticâncer, ao indivíduo se a doença a ser tratada é o câncer. Em outro exemplo de realização, o medicamento é para induzir a lise de uma célula-alvo, em particular uma célula tumoral. Em outro exemplo de realização, o medicamento é para uso em um método de induzir a lise de uma célula-alvo, em particular uma célula tumoral, em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do medicamento para induzir a lise da célula-alvo. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima pode ser um mamífero, preferencialmente um ser humano.
[369] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para o tratamento de uma doença. Em um exemplo de realização, o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica a um indivíduo possuindo tal doença. Em um exemplo de realização, é administrada uma composição ao referido indivíduo, que compreende o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável. Em certos exemplos de realização, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo. Em um exemplo de realização específico da doença é o câncer. Em certos exemplos de realização, o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente anticâncer, ao indivíduo se a doença a ser tratada é o câncer. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima pode ser um mamífero, preferencialmente um ser humano.
[870] Em um aspecto adicional, a invenção provê um método para induzir a lise de uma célula-alvo, particularmente uma célula tumoral. Em um exemplo de realização, o método compreende o contato de uma célula-alvo com um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção na presença de uma célula T, particularmente uma célula T citotóxica. Em um aspecto adicional, é fornecido um método para induzir a lise de uma célula- alvo, em particular uma célula tumoral, em um indivíduo. Em tal exemplo de realização, o método compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica a um indivíduo para induzir a lise da célula alvo. Em um exemplo de realização, um “indivíduo” é um humano.
[3871] Em certos exemplos de realização, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo, particularmente o câncer. Exemplos não limitantes de câncer incluem o câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de útero, câncer do colo uterino, câncer de endométrio, câncer de esôfago, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer retal, câncer gástrico,
câncer de próstata, câncer hematológico, câncer de pele, carcinoma de células escamosas, câncer nos ossos e câncer renal. Outros distúrbios da proliferação celular que podem ser tratados utilizando um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção incluem, mas não estão limitados a neoplasias localizadas no: abdômen, osso, mama, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritônio, glândulas endócrinas (adrenal, paratireoide, hipófise, testículos, ovários, timo, tireoide), olho, cabeça e pescoço, sistema nervoso (central e periférico), sistema linfático, pelve, pele, tecidos moles, baço, região torácica e sistema urogenital. Também estão incluídas as condições ou lesões pré-cancerosas e metástases de cânceres. Em determinados exemplos de realização o câncer é escolhido a partir do grupo que consiste em câncer renal, câncer de bexiga, câncer de pele, câncer pulmonar, câncer colorretal, câncer de mama, câncer cerebral, câncer de cabeça e pescoço e câncer de próstata. Em um exemplo de realização, o câncer é câncer de próstata. Um técnico hábil no assunto reconhece facilmente que, em muitos casos, o anticorpo ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode não proporcionar uma cura, mas pode proporcionar um benefício parcial. Em alguns exemplos de realização, uma alteração fisiológica possuindo algum benefício também é considerada terapeuticamente benéfica. Assim, em alguns exemplos de realização, uma quantidade de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica que fornece uma alteração fisiológica é considerada uma “quantidade eficaz” ou uma “quantidade terapeuticamente eficaz”. O sujeito, paciente ou indivíduo que necessita de tratamento é tipicamente um mamífero, mais especificamente um ser humano.
[372] Em alguns exemplos de realização, uma quantidade eficaz de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrada a uma célula. Em outros exemplos de realização, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção é administrada a um indivíduo para o tratamento da doença.
[373] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção (quando utilizada isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) irá depender do tipo de doença a ser tratada, da via de administração, da massa corporal do paciente, do tipo de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, da gravidade e curso da doença, se o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, se houve intervenções terapêuticas anteriores ou concomitantes, do histórico clínico do paciente e a resposta ao anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, e o critério do médico atendente. O médico responsável pela administração irá, em qualquer evento, determinar a concentração de ingrediente(s) ativo(s) em uma composição e a(s) dose(s) apropriada(s) para o sujeito individual. Vários esquemas de dosagem, incluindo, mas não se limitando a administrações únicas ou múltiplas ao longo do tempo, em vários pontos de tempo, administração em bolus, e infusão pulsada são contempladas pela presente invenção.
[874] O anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífico é adequadamente administrado ao paciente em uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 ug/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg — 10 mg/kg) de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma possível dose candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderá variar em cerca de 1 ug/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento pode ser mantido até que ocorra supressão desejada dos sintomas da doença.
Uma dosagem exemplar de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespeciífica estaria no intervalo de cerca de 0,005 mg/kg a cerca de mg/kg.
Em outros exemplos não limitativos, uma dose pode também compreender de cerca de 1 micrograma/kg de peso corporal, cerca de 5 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 10 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 50 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 100 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 200 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 350 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 500 microgramas/kg de peso corporal, cerca de 1 miligrama/kg de peso corporal, cerca de 5 miligrama/kg de peso corporal, cerca de 10 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 50 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 100 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 200 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 350 miligramas/kg de peso corporal, cerca de 500 miligramas/kg de peso corporal, a cerca de 1000 mg/kg de peso corporal ou mais por administração, e qualquer intervalo de valores derivável destes.
Em exemplos não limitativos de um intervalo derivável a partir dos números indicados na presente invenção, um intervalo de cerca de 5 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 5 microgramas/kg de peso corporal a cerca de 500 miligramas/kg de peso corporal, etc, pode ser administrado com base nos números descritos acima.
Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação destas dosagens) podem ser administradas ao paciente.
Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, tal como cerca de seis doses de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica). Pode ser administrada uma dose de ataque inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. Entretanto, outros regimes de dosagens podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e ensaios convencionais.
[375] Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção serão utilizados, em geral, em uma quantidade eficaz para atingir o objetivo pretendido. Para uso no tratamento ou prevenção de uma doença, os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, ou suas composições farmacêuticas, são administrados ou aplicados em uma quantidade terapeuticamente eficaz. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro das capacidades dos especialistas no assunto, especialmente à luz da divulgação detalhada fornecida no presente.
[376] Para a administração sistêmica, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios in vitro, tais como os ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração na circulação que inclui a ICso conforme determinado na cultura celular. Tal informação pode ser utilizada para determinar com maior precisão as doses úteis em seres humanos.
[377] As doses iniciais podem também ser estimadas a partir de dados in vivo, por exemplo, modelos de animais, utilizando técnicas que são bem conhecidas no estado da técnica. Um perito no estado da técnica pode prontamente otimizar a administração para seres humanos com base nos dados obtidos em animais.
[378] A quantidade da dosagem e o intervalo podem ser ajustados individualmente para proporcionar níveis plasmáticos de anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que são suficientes para manter o efeito terapêutico. As dosagens habituais nos pacientes para a administração por injeção variam de cerca de 0,1 a 50 mg/kg/dia, normalmente de cerca de 0,5 a 1 mg/kg/dia. Os níveis plasmáticos terapeuticamente eficazes podem ser alcançados pela administração de doses múltiplas todos os dias. Os níveis no plasma podem ser mensurados, por exemplo, por HPLC.
[379] Nos casos da administração local ou absorção seletiva, a concentração local eficaz dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas pode não estar relacionada com a concentração plasmática. Um especialista hábil na técnica será capaz de otimizar dosagens locais terapeuticamente eficazes sem experimentação indevida.
[380] Uma dose terapeuticamente eficaz dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas aqui descritos geralmente proporcionará benefícios terapêuticos sem causar toxicidade substancial. A toxicidade e a eficácia terapêutica de um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou em animais experimentais. Os ensaios com cultura celular e estudos em animais podem ser utilizados para determinar a LDso (dose letal para 50% da população) e a EDso (dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A relação de dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico que pode ser expresso como a relação LDso/EDso. São preferidos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que exibem grandes índices terapêuticos. Em um exemplo de realização, o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com a presente invenção apresenta um elevado índice terapêutico. Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser utilizados na formulação de um intervalo de dosagem adequado para a utilização em seres humanos. A dosagem situa-se preferencialmente dentro de um intervalo de concentrações que inclui a EDso com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro deste intervalo, dependendo de uma variedade de fatores como, por exemplo, a forma de dosagem utilizada, a via de administração utilizada, a condição do sujeito, e assim por diante. A formulação, a via de administração e a dosagem exata podem ser escolhidas pelo médico, tendo em vista a condição do paciente (vide, por exemplo, Fingi et al, 1975, em: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Capitulo 1, p 1, integralmente incorporado ao presente pela referência).
[381] O médico que atende os pacientes tratados com os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas saberia como e quando terminar, interromper ou ajustar a administração devido à toxicidade, à disfunção de órgão, e etc. Inversamente, o médico também saberia como ajustar o tratamento para níveis mais elevados, se a resposta clinica não fosse adequada (impedindo a toxicidade). A magnitude de uma dose administrada no controle do distúrbio de interesse variará com a gravidade da condição a ser tratada, com a via de administração, e outros fatores semelhantes. A gravidade da condição pode, por exemplo, ser avaliada, em parte, por métodos de avaliação de prognóstico padrão. Além disso, a dose e talvez a frequência da dose, também variarão de acordo com a idade, peso corporal, e resposta do paciente individual.
OUTROS AGENTES E TRATAMENTOS
[382] Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser administrados em combinação com um ou mais agente(s) adicional(ais) na terapia. Por exemplo, um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção pode ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional. O termo “agente terapêutico” compreende qualquer agente administrado para tratar um sintoma ou doença em um indivíduo que necessite de tal tratamento. Tal agente terapêutico adicional pode compreender quaisquer ingredientes ativos adequados para a indicação particular a ser tratada, de preferência aqueles que têm atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro. Em determinados exemplos de realização, um agente terapêutico adicional é um agente imunomodulador, um agente citostático, um inibidor de adesão celular, um agente citotóxico, um ativador da apoptose celular, ou um agente que aumenta a sensibilidade das células para indutores apoptóticos. Em um exemplo de realização específico, o agente terapêutico adicional é um agente anticâncer, por exemplo, um desestabilizador de microtúbulos, um antimetabolito, um inibidor da topoisomerase, um intercalante de DNA, um agente alquilante, uma terapia hormonal, um inibidor da quinase, um antagonista de receptor, uma ativador da apoptose de células tumorais, ou um agente antiangiogênico.
[383] Tais outros agentes estão adequadamente presentes na combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. À quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica usado, do tipo de distúrbio ou tratamento, e de outros fatores discutidos anteriormente. Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descrito acima ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente, ou em qualquer dosagem e por qualquer via de administração descrita que é empiricamente/ clinicamente determinada como sendo apropriada.
[384] Tais terapias combinadas referidas acima abrangem a administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma composição ou em composições distintas), e a administração separada, nesse caso a administração do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção, pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante. Os anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção também podem ser usados em combinação com a radioterapia.
ARTIGOS DE FABRICAÇÃO
[385] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de manufatura que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos anteriormente. O artigo de manufatura compreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou associado a ele. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas de soluções para administração |.V. e etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente guarda uma composição que é por si só, ou em combinação com outra composição, eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou uma ampola que contém uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição de escolha. Além disso, o artigo de manufatura pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição ali contida, em que a composição compreende um anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção, e (b) um segundo recipiente com uma segunda composição ali contida, em que a segunda composição compreende um agente citotóxico adicional ou outro agente terapêutico. O artigo de manufatura neste exemplo de realização pode compreender ainda uma bula indicando que a composição pode ser usada para tratar uma condição específica. Alternativamente ou adicionalmente, o artigo de manufatura pode compreender ainda um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA DIAGNÓSTICO E DETECÇÃO
[386] Em alguns exemplos de realização, qualquer um dos anticorpos anti-GPRC5D fornecidos na presente invenção são úteis para detectar a presença de GPRC5D em uma amostra biológica. O termo “detecção”, conforme utilizado no presente abrange a detecção quantitativa ou qualitativa. Em certos exemplos de realização, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido, tal como tecido da próstata.
[387] Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo anti-GPRC5D para uso em um método diagnóstico ou de detecção. Em outro aspecto, é fornecido um método para detectar a presença de GPRC5D em uma amostra biológica. Em certos exemplos de realização, o método compreende o contato da amostra biológica com um anticorpo anti- GPRCB5D descrito na presente invenção sob condições permissivas para a ligação do anticorpo anti-cGPRC5D ao GPRC5D, e detectar se é formado um complexo entre o anticorpo anti-GPRC5D e GPRC5D. Tal método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em um exemplo de realização, um anticorpo anti-GPRC5D é utilizado para selecionar sujeitos elegíveis para a terapia com um anticorpo anti-GPRC5D, por exemplo, onde o GPRC5D é um biomarcador para a seleção dos pacientes.
[388] Distúrbios exemplares que podem ser diagnosticados utilizando um anticorpo da invenção inclui o câncer, particularmente o mieloma múltiplo.
[389] Em determinados exemplos de realização, são fornecidos anticorpos anti-cGPRC5D marcados. Os marcadores incluem, mas não estão limitados a, marcadores ou moléculas que são detectados diretamente — (tals como marcadores fluorescentes, cromóforos, eletrodensos, quimioluminescentes e radioativos), bem como moléculas, tais como enzimas ou ligantes, que são detectadas indiretamente, por exemplo, por meio de uma reação enzimática ou interação molecular. Marcadores exemplares incluem, mas não se limitam a, radioisótopos P*?, 82, C11, 1125, H3, e 1131, fluoróforos tais como quelatos terrosos raros ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferases, por exemplo, a luciferase do vaga-lume e luciferase — bacteriana — (Patente US 4.737.456), luciferinay 2,3- dihidroftalazinadionas, peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, B-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo-oxidases, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase, oxidases heterocíclicas como uricase e xantina-oxidase, acoplados com uma enzima que emprega o peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor de corante, tal como a HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, marcadores de spin, mercadores de bacteriófagos, radicais livres estáveis, e similares.
[390] Um aspecto adicional da invenção refere-se a um anticorpo (10B10) que se liga ao GPRC5D compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VL), em que a VL pode compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 81. O anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia leve (VL), em que a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 82. O anticorpo pode compreender uma VH e uma VL, em que a VL pode compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 81; e em que a VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO:
82. Preferencialmente, o anticorpo compreende uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81, e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82.
[391] Outro aspecto da invenção refere-se a um anticorpo (10B10-TCB). O anticorpo pode compreender uma primeira cadeia leve, em que a primeira cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 67. O anticorpo pode compreender uma segunda cadeia leve, em que a segunda cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 68. O anticorpo pode compreender uma primeira cadeia pesada, em que a primeira cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO:
69. O anticorpo pode compreender uma segunda cadeia pesada, em que a segunda cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 70. Em um exemplo de realização preferido, o anticorpo compreende uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência aminoácido de SEQ ID NO: 70.
SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS d Sequência de Aminoácidos
D a 5E11- |GFTFSKYAMA vH- 1 HCDR1 5E11- |STGGVNTYYRDSVKA vH- 2 HCDR2 5E11- |HTGDYFDY vH- 3 HCDR3 5E11- |ASQSVSISGINLMN VL- 4 LCDR1 S5E11- |HASILAS VL- 5| LCDR2 5E11- JQQTRESPLT VL- 6 LCDR3 5F11- / |GFSFSNYGMA vH- 7 HCDR1 5F11- / |STGGGNTYYRDSVKG vH- HCDR2 5F11- / |HDRGGLY vH- HCDR3 5F11- |RSSKSLLHSNGITYVY 1 VL- o| LCDR1 5F11- / |RMSNLAS 1 VL- 1 LCDR2 5F11- / |GQLLENPYT 1 VL- 2 LCDR3 5E11- |ELQLEQSGGGLVQPGGSLTLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPTKGLEWVASISTGG |, VvH VNTYYRDSVKARFTISRDNAKNTQYLQMDSLRSEDTATYYCATHTGDYFDYWGQG 3
VMVTVSS 5E11- |DIVLTASPALAVSPGORATISCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILA |1 VvL SGIPTRFSGSGSGTDFTLTIDPVQADDIATYYCQQTRESPLTFGSGTNLEIK É q Sequência de Aminoácidos
D a vH GNTYYRDSVKGRFIVSRDNAKNTQOYLQMDSLRSEDTATYYCTRHDRGGLYWGQG 5)
VMVTVSS 5F11- /DIVMTQAPLSVSVTPGESASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYFQKPGKSPQVLIYRMS |1 VvL NLASGVPDRFSGSGSETDFTLKISRVEAEDVGIYHCGQLLENPYTFGAGTELELK 6 5E11- |DIVLTASPALAVSPGQRATISCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILA TCB- |SGIPTRFESGSGSGTDFTLTIDPVQADDIATYYCQQTRESPLTFGSGTNLEIKRTVAAP |1 LC1(GP|SVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK |7| RC5D) |DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC 5E11- / |EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKY TCB- - |NNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVS 1 LC2(CD WFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ 8 3) WKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQOGLS
SPVTKSFNRGEC 5E11-/ ELOLEQOSGGGLVQPGGSLTLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPTKGLEWVASISTGG TCB- — |VNWNTYYRDSVKARFTISRDNAKNTQYLQMDSLRSEDTATYYCATHTGDYFDYWGQG HC hole NMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVWNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKT 1 HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV 9
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKT ISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K 5E11-/ ELOLEQSGGGLVQPGGSLTLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPTKGLEWVASISTGG TCB- - |VNWNTYYRDSVKARFTISRDNAKNTQYLQMDSLRSEDTATYYCATHTGDYFDYWGQOG
HC VMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSG knob — IVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDG
GGGSCGGGEGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQA FRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVF 2 GGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA o
LTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALGA, PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK 5F11- |DIVMTQAPLSVSVTPGESASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYFQKPGKSPQVLIYRMS TCB- - INLASGVPDRFSGSGSETDFTLKISRVEAEDVGIYHCGQLLENPYTFGAGTELELKRT |2) LC1(GP |VAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE |1 RC5D) JADSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC 5F11- / [EVOLLESGGGLVAQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKY TCB- — INNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVS 2 LC2(CD|WFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ 2 3) WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLS
SPVTKSFNRGEC q Sequência de Aminoácidos
D a 5F11- / JEVOLVESGGGLVOQPGRSLKLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAATKGLEWVASISTGG TCB- - |GNTYYRDSVKGRFIVSRDNAKNTQYLQMDSLRSEDTATYYCTRHDRGGLYWGQG HC hole MNMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKT 2 HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV 3
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKT ISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K 5F11-/ EVOLVESGGGLVOPGRSLKLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAATKGLEWVASISTGG TCB- - |GNTYYRDSVKGRFIVSRDNAKNTQYLQMDSLRSEDTATYYCTRHDRGGLYWGQG
HC VMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSG knob VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDG
GGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQA FRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVF 2 GGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA 4
LTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA, PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK ET150- JASVLTAPPSASGTPGQRVTISCSGSRSNVGGNYVFWYQQVPGATPKLLIYRSNOQR 5-TCB- [PSGVPDRFAGSKSGSSASLAISGLRSEDEADYYCATWDDSLSGFVFGTGTKVTVLG |2| LC1(GP|QPKAAPSVTLFPPSSKKLQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTP |5| RC5D) |SKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS ET150- |EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKY 5-TCB- |NNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVS 2 LC2(CD WFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ 6 3) WKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLS
SPVTKSFNRGEC ET150- |EVOQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSG 5-TCB- |[STIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGKAYDQWGQG HC hole TLVTIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVWNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKT 2 HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV 7
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKT ISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K d Sequência de Aminoácidos
D
Q ET150- |EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSG 5-TCB- |STIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGKAYDQWGQOG
HC TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSG knob VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDG
GGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQA FRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVF 2
GGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA F LTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA,) PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQOKSL
SLSPGK CD3- |TYAMN 2 vH- 9 HCDR1 CD3- |RIRSKYNNYATYYADSVKG 3 vH- à HCDR2 CD3- — [HGNFGNSYVSWFAY 3 VvH- 1 HCDR3 CD3- |GSSTGAVTTSNYAN 3 LH- 2 LCDR1 CD3- — [GTNKRAP 3 LH- 3 LCDR2 CD3- — JALWYSNLWV 3 LH- 4 LCDR3 CD3- —J|EVOQLLESGGGLVAQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKY 3 VvH NNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVS 5
WFAYWGOQOGTLVTVSS CD3-VL |AAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNK |3| RAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 6 Domíni |RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQOSGNSQESV o — CLITEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 3 kappa 7 humano Domíni |APKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTP o CLISKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 3 lambda 8 humano d Sequência de Aminoácidos
D a Região |ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV constan LOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC te — de PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH cadeia |NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG pesada |APREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV |3| de I9G1 LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 9 humana (CH1- cH2- cH3) hcD3 |MOSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQATPYKVSISGTTVILTCPQYPGS EILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQOSGYYVCYPRGSKPEDANFY |4 LYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGA |o|
GGRORGONKERPPPVPNPDYEPIRKGORDLYSGLNORRI CD3cyn MOSGTRWRVLGLCLLSIGVWGQDGNEEMGSITOATPYQVSISGTTVILTCSQHLGSE o AQWQHNGKNKEDSGDRLFLPEFSEMEQSGYYVCYPRGSNPEDASHHLYLKARVOC |4 (cinomo JENCMEMDVMAVATIVIVDICITLGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVYTRGAGAGGRORGO |1 Igo) — INKERPPPVPNPDYEPIRKGQQDLYSGLNORRI Região |DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN Fe — deWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP |,| hlgG1 IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE |;
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL sP ligante jescasaçõass Hg 3 [igante IpessGsAGESs 4 GPRC5 |MYKDCIESTGDYFLLCDAEGPWGIILESLAILGIVVTILLLLAFLELMRKIQDCSQWNVL
D PTQLLFLLSVLGLFGLAFAFIIELNQQTAPVRYFLFGVLFALCFSCLLAHASNLVKLVR humano |GCVSFSWTTILCIAIGCSLLQIIATEYVTLIMTRGMMFVNMTPCQLNVDFVVLLVYVLF|4| LMALTFFVSKATFCGPCENWKQHGRLIFITVLFESIIIWVVWISMLLRGNPQFORQPQ |5
WDDPVVCIALVTNAWVFLLLYIVPELCILYRSCRQECPLQGNACPVTAYQHSFQVEN
QELSRARDSDGAEEDVALTSYGTPIQPQTVDPTQECFIPQAKLSPQQDAGGV 5E11 V|EVOLLESGGGLVAPGESLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGG |, Hia — |VWNWNTYYRDSVKARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQG 6
TMVTVSS 5E11 V|ELQLLESGGGLVAPGGESLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGG |, H1b — |VNTYYRDSVKARFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQG 7
TMVTVSS 5E11 V|EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGG |, Hic — |VNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGOG 8
TMVTVSS 5E11 V|ELQLLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGG |, H1d — |VWNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGOG |)
TMVTVSS q Sequência de Aminoácidos
D a 5E11 VIDIVMTASPDSLAVSLGERATINCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASIL |5| Lia ASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCQAQTRESPLTFGQAGTRLEIK o 5E11 VIDIVMTASPDSLAVSLGERATINCKSSQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASIL |5| Lic ASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCAQTRESPLTFGQGTRLEIK 1 5E11 VIEIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPRLLIYHASIL |5| L2a ASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQAGTRLEIK 2 5E11 VEIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQAKPGQQPKLLIYHASIL |5| L2b ASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQAGTRLEIK 3 5E11 VIDIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGKQPKLLIYHASIL |5| L3a ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 4 5E11 V|DIQMTAOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASIL |5| L3b ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLAPEDFATYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 5) 5F11 V/QVALVESGGGVVAPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTG 5 Hia GGNTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQG 6
TMVTVSS 5F11 V/EVOLVESGGGVVAQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTG 5 Hib GGNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQG 7
TMVTVSS 5F11 V/QVALVESGGGVVAPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTG 5 Hic GGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQG 8
TMVTVSS 5F11 V/EVOLVESGGGVVAQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTG 5 H1d GGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQG 9
TMVTVSS 5F11 V/EVOLVESGGGLVOQPGGSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTG H2b GGNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQG
TMVTVSS 5F11 V /EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTG 6 H2d GGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQG 1
TMVTVSS 5F11 V|DIVMTAOSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGQSPQVLIYRMS |6| Lia NLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQOGTKLEIK |2 5F11 V|DIVMTAOSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGKSPQVLIYRMS |6] Lib NLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 3 5F11 V|DIVMTAOSPLSLPVYTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGQSPAQLLIYRMS |6] L2a NRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK |4| 5F11 V|DIVMTAOSPDSLAVSLGERATINCKSSKSLLHSNGITYVYWYQQKPGQPPKLLIYRMS |6) L2b NLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 5) 5F11 V EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASKSLLHSNGITYVYWYQQKPGQAPRLLIYRMS |6| L2c NLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 6) 10B10 IDIQLTASPHSLSASLGETVSIECLASEGISNYLAWFHQKPGKSPQLLIYYASSLQODGV TCB L |PSRFSGSGSGTQOYSLKISNMQPEDEGVYYCQAQQAGYKYPLTFGSGTKLEIKRTVAAPS |6| Cc1 VFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKD |7|
STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC q Sequência de Aminoácidos
D a 10B10 |EVOQLLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKY TCB L |NNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVS c2 WFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ
WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQOGLS
SPVTKSFNRGEC 10B10 JEVOQLVESGGGLVAPGRSMKLSCAASGFTFTNFYMAWVRQAPTKALEWVASINTGG TCB H |GYTYYRDSVKGRFTVSRDNTRSTLYLQMDSLRSEETATYYCARHLTYYGRYYYFDY C(Fc — WGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSG hole) ALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPK 6 SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK 9
FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALG APIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQOKSL
SLSPGK 10B10 J|EVOLVESGGGLVAQPGRSMKLSCAASGFTFTNFYMAWVRQAPTKALEWVASINTGG TCB H |GYTYYRDSVKGRFTVSRDNTRSTLYLQMDSLRSEETATYYCARHLTYYGRYYYFDY C(Fce — WGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSG knob) |ALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPK 'SCDGGGGSCGGGGESQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEK PGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNL 7 WVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN o 'SGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE
PKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHOQDWLNGKEYKCKVSNKA LGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOK
SLSLSPGK 07A04 |DVQMTOSPYNLAASPGESVSINCKASKSISKYLAWYQQKPGKANKLLIYDGSTLOS IgG LC |GIPSRFSGSGSGTDFTLTIRSLEPEDFGLYYCQQHNEYPLTFGSGTKLEIKRTVAAPS 7 VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD/1
STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC 07A04 |QVTLKESGPGILQPSHTLSLTCSFSGFSLSTYGMGVNWIRQPSGKGLEWLAS|/WWN IgG HC/|GNTYNNPSLKSRLTVSKDTSNNQAFLKVTSVDTADTATYYCVHTRGIIRGRGLFFDY
WGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK 7 SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK 2
FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALG APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK B72- QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNK TCB H |RAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLS c1 SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP |7| ICPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV |3|
HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK q Sequência de Aminoácidos
D a B72- EVOQLVESGGGLVAQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKY TCB L |NNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVS 7 c1 WFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ 4
WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQOGLS
SPVTKSFNRGEC B72- QVALVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPY TCB H |NSDTNYAQKLAGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARVALRVALDYWG c2 QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSC 7 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN 5
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK B72- DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVATHVGWYQQKPGKAPKRLIYSASYRYS TCB L |GVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLOPEDFATY YCAQYNRYPYTFGQGTKLEIKRTVAARP |7| c2 SVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK |6|
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC BCMA- JEVOQLLESGGGLVAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAITASG TCB- |GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMSLWGQGTL HC1 VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH (hole) |TFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHT |7| CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDSG |7| VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISK,)
AKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK BCMA- |EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSAYYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRA TCB- |TGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYERWPLTFGQGTKVEIKRTVAA |7| LC1 — |PSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS |&
KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC BCMA- JEVQLLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAITASG TCB- - |GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMSLWGQGTL HC2 VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH (knob) |TFPAVLASSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGG
GSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFR GLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGG 7 GTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT 9
SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHOQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKGAQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPGK BCMA- |EVOQLLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKY TCB- — INNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVS LC2 WFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ
WKVDNALQASGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS
SPVTKSFNRGEC q Sequência de Aminoácidos
D a 10B10 |DIQLTASPHSLSASLGETVSIECLASEGISNYLAWFHQKPGKSPQLLIYYASSLQDGV |8) vH PSRFSGSGSGTQYSLKISNMQPEDEGVYYCQAQAGYKYPLTFGSGTKLEIK 1 VvL GYTYYRDSVKGRFTVSRDNTRSTLYLQMDSLRSEETATYYCARHLTYYGRYYYFDY 2
WGQGVMVTVSS 5E11 P/GFTFSKYAMA 1AE570 6 PAR 8 ENT- 3 vH- HCDR1 5E11 P/SISTGGVNTYYRDSVKA 1AE570 6 PAR 8 ENT- 4 vH- HCDR2 5E11 P/SISTGGVNTYYADSVKG 1AE572 3 PIA 8 E5728 5 vH- HCDR2 5E11 P|HTGDYFDY 1AE570 6 PAR ENT- vH- HCDR3 5E11 P|RASQSVSISGINLMN 1AE570 6 PAR 8 ENT- 7 VvL- LCDR1 5E11. P[HASILAS 1AE570 6 PAR 8 ENT- 8 vL- LCDR2 5E11 P[QQTRESPLT 1AE570 6 PAR ENT- VvL- LCDR3 q Sequência de Aminoácidos
D a 5F11 P/GFSFSNYGMA 1AE573 3 PAR ENT- vH- HCDR1 5F11 P ISISTGGGNTYYRDSVKG 1AE573 3 PAR 9 ENT- 1 vH- HCDR2 PF11 PISISTGGGNTYYADSVKG 1AE574 9 VL- 2 HCDR2 5F11 P/HDRGGLY 1AE573 3 PAR 9 ENT- 3 vH- HCDR3 5F11 P |RSSKSLLHSNGITYVY 1AE573 3 PAR 9 ENT- 4 vL- LCDR1 5F11 P)|RMSNLAS 1AE573 3 PAR 9 ENT- 5 VvL- LCDR2 5F11 PRMSNRAS 1AE574 9 1VLL 6 CDR2 5F11 P/GQLLENPYT 1AE573 3 PAR 9 ENT- 7 VvL- LCDR3
EXEMPLOS
[392] A seguir são fornecidos exemplos de métodos e composições da presente invenção. Entende-se que diversos outros exemplos e realizações podem ser praticados, dada a descrição geral fornecida acima. EXEMPLO 1
EXPRESSÃO DE ALVOS TUMORAIS
[393] Para identificar os genes diferencialmente expressos em mieloma múltiplo entre os plasmócitos normais, foi realizado um RNASeq em amostras derivadas de pacientes com mieloma múltiplo (MM) e 10 plasmócitos (PCs) derivadas de medula óssea de doadores saudáveis. O RNA foi extraído usando o kit de extração RNeasy Micro kit (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. O DNA genômico foi removido usando o RNase free DNase set (Qiagen) durante a extração de RNA. A qualidade do RNA extraído foi controlada nos chips Agilent Eukaryote Total RNA pico (Agilent Technologies). O kit SMARTer de RNA ultra baixo para sequenciamento Illumina (Clontech) foi usado para preparar e amplificar o CDNA a partir de 1,6 ng de RNA total, de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, 1 ng de cDNA amplificado foi submetido à preparação de bibliotecas Nextera XT (lllumina) de acordo com as instruções do fabricante. As bibliotecas de sequenciamento foram quantificadas usando o kit Kapa Library Quantification (Kapa Biosystems) e a qualidade foi controlada por eletroforese capilar em um bioanalisador usando chips de alta sensibilidade (Agilent Technologies). As bibliotecas foram sequenciadas em um sequenciador HiSeg2500 (lllumina) por 2 x 50 ciclos usando kits de geração de cluster versão 4 e reagentes de sequenciamento versão 4 (lIllumina).
[394] O antígeno de maturação de células B (BCMA) é uma proteína de superfície celular que é expressa em células plasmáticas malignas e, portanto, reconhecida como alvo no mieloma múltiplo (Tai Y.T. & Anderson K.C., Targeting B-cell maturation antigen in multiple myeloma, Immunotherapy; 7 (11): 1187-1199). Usando a tecnologia RNASegq, a análise detalhada indicou que GPRC5D é expresso em níveis tão altos quanto BCMA nas células plasmáticas (plasmócitos) em diversos pacientes com mieloma (Figura 2). Mais importante ainda, a expressão diferencial de GPRC5D entre células plasmáticas a partir de pacientes com mieloma múltiplo e células plasmáticas de pacientes saudáveis é de aproximadamente 20 vezes. Em contraste, a expressão diferencial de BCMA entre as células plasmáticas de pacientes com mieloma múltiplo e células plasmáticas de pacientes saudáveis é de apenas 2 vezes. A expressão geral de GPRC5D é muito mais alta do que a expressão de outras moléculas alvo conhecidas para o mieloma múltiplo, como SLAM7, CD138 e CD38. Além disso, GPRC5D é fortemente expresso por células B de memória e naives saudáveis. EXEMPLO 2 GERAÇÃO DE LIGANTES DE GPRC5D E PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T (TCB)
[395] Os ligantes de GPRC5D foram gerados por imunização com DNA de ratos, seguido pela geração de hibridomas, triagem e sequenciamento de hibridomas. A triagem de ligação específica foi medida por ELISA através da ligação ao transfectante que expressa GPRC5D. Dois ligantes de GPRC5D foram identificados e referidos a seguir como 5E11 (SEQ ID NOs: 13 e 14) e 5111 (SEQ ID NOs: 15 e 16). Uma vez que os ligantes específicos foram identificados, as IgGs foram convertidas em anticorpos biespecíficos de células T. Os princípios da conversão de ligantes em anticorpos biespecíficos de células T são exemplificados e descritos no estado da técnica, por exemplo, na publicação PCT WO 2014/131712 A1, que é integralmente incorporada ao presente pela referência. Os anticorpos biespecíficos de células T compreendem duas porções de ligação ao GPRC5D e uma porção de ligação a CD3 (anticorpos biespecíficos de células T anti- GPRCS5D/anti-CD3), tal como ilustrado na Figura 3. Os seguintes anticorpos biespecíficos de células T anti-GPRC5D/anti-CD3 foram preparado: i) 5E11- TCB (SEQ ID NOs 17, 18, 19 e 20); ii) SF11-TCB (SEQ ID NOs 21, 22,23 e 24); iji) ET150-5-TCB (SEQ ID NOs 25, 26, 27 e 28); iv) B72-TCB (SEQ ID NOs: 73, 74, 75 e 76); e v) BOMA-TCB (SEQ ID NOs: 77, 78, 79 e 80). À porção de ligação ET150-5 GPRC5D é descrita na publicação PCT WO 2016/090329A2. O termo “ET-150-5" é usado sinonimamente para o termo “ET150-5” no presente pedido e vice-versa. Como controle negativo, foi preparado o DP47-TCB não direcionado (sem alvo). O DP47-TCB é um anticorpo biespecífico de células T não direcionado, que se liga apenas ao CD3, mas não ao GPRC5D. O DP47-TCB é descrito na publicação PCT WO 2014/131712 A1, que é integralmente incorporada ao presente por referência. O B72-TCB deriva do anticorpo GCDB72 divulgado na Tabela 23 da publicação WO 2018/0117786 A2 e compreende a fração de ligação de GPRC5D do GCDB72. O B72-TCB foi gerado no formato CrossMab 1+1 (SEQ ID NOs: 73, 74, 75 e 76). O BCMA-TCB deriva do documento WO 2016/166629 A1 e compreende a fração de ligação GPRC5D de A02 Rd4 6nM CO, tal como aí divulgado. O BCMA-TCB foi gerado no formato CrossMab 2+1 (SEQ ID NOs: 77,78,79 e 80). EXEMPLO 3
LIGAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T EM LINHAGENS DE CÉLULAS DE MIELOMA MÚLTIPLO
[396] Para medir a ligação ao GPRC5D, realizamos o ensaio de ligação com FACS nas linhagens de células de mieloma múltiplo relatadas (Lombardi et al., Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics: insights into the biology of the diseas; Genes Chromosomes Cancer. 2007 Mar; 46 (3): 226-38). As linhagens de células AMO-1, L363 e OPM-2 foram cultivadas em meio RPMI 1640 + Glutamax (Gibco) suplementado com 20% de soro bovino fetal inativado por calor (SBF, Gibco) e 1% de penicilina - estreptomicina 100X (Gibco). A linhagem de células WSU-DLCL?2 (controle negativo) foi cultivada com o mesmo meio suplementado com apenas 10% de SBF. As linhagens de células NCI-H929 e RPMI-8226 foram também cultivadas com o mesmo meio suplementado com 50 uM de mercaptoetanol (Gibco) e 1 mM de piruvato de sódio (Gibco). As linhagens de células foram cultivadas em frascos de 75 cm? (TPP) com duas passagens por semana.
[397] A ligação de diferentes anticorpos TCBs anti-GPRC5D humano (5E11-TCB, 5F11-TCB e ET150 -5 TCB) foi avaliada utilizando uma coloração indireta. As células foram incubadas as construções TCB anti- GPRC5D humano 5E11-TCB, 5F11-TCB ou ET150 -5 TCB no intervalo de pug/mL a 0,00064 pug/mL usando diluição seriada com um fator de diluição de 0,2, ou nenhuma construção em 100 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS; Gibco) por 1 hora a 4ºC. Os grupos foram corados com corante azul vivo (Life Technologies) diluído 1:800 em PBS por 20 min a 4ºC antes da coloração com anti-lgG humano de cabra conjugado com PE, específico para o fragmento Fcy (Jackson Laboratories) diluído 1/3800 em tampão de coloração para citometria de fluxo (eBioscience) incubado por 30 min a 4ºC. A aquisição da citometria de fluxo foi realizada em um instrumento customizado BD Biosciences Fortessa e analisada usando o software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR) e o software GraphPad Prism.
[398] Figura s 4 A-C mostram que ambos TCBs, 5E11 e 5F11, se ligam a todas as linhagens de células de mieloma múltiplo testadas de um modo dependente da dose (dose-dependente). Em contraste, o ET150-
5-TCB se liga de forma muito mais fraca às linhagens de células testadas. Não houve ligação às células WSU-DLCL?2 (linhagens de células de linfoma não-Hodgkin GPRC5D) observados pelos TCBs anti-GPRC5D. EXEMPLO 4 CITOTOXICIDADE DE CÉLULAS T MEDIADA POR ANTI-GPRC5D-TCB
[399] Para medir a funcionalidade dos anticorpos anti- GPRCS5D-TCB, foi realizado um ensaio in vitro de citotoxicidade de células T. Resumidamente, as linhagens de células AMO-1, L363 e OPM-2 foram cultivadas em meio RPMI 1640 + Glutamax (Gibco) suplementado com 20% de soro bovino fetal inativado por calor (SBF, Gibco) e 1% de penicilina - estreptomicina 100X (PS, Gibco). A linhagem de células WSU-DLCL?2 foi cultivada com o mesmo meio suplementado com apenas 10% de SBF. As linhagens de células NCI-H929 e RPMI-8226 foram cultivadas no mesmo meio suplementado com 50 UM de mercaptoetanol (Gibco) e 1 mM de piruvato de sódio (Gibco). As linhagens de células foram cultivadas em frascos de 75 cm? (TPP) com duas passagens por semana.
[400] As linhagens de células foram cocultivadas a uma razão alvo:efetora de 1:10 com 3.105 células T alogênicas isoladas a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) (camada leuco- plaquetária de Blutspende Schlieren) utilizando um kit de isolamento de células humanas T Pan (Miltenyi Biotec) em meio IMDM (Gibco) suplementado com 10% de SBF (Gibco) + 1% de PS (Gibco). Anticorpos TCB anti-GPRC5D humano (5E11-TCB, 5F11-TCB, ET150-5 TCB ou DP47- TCB) foram adicionadas à cocultura em diferentes concentrações, no intervalo de 1 ug/mL a 0,000001 ug/mL com diluição seriada do fator 0,1 ou O pug/mL. Após 20 horas de incubação a 37ºC com 5% de CO,>2, 75 ul do sobrenadante por poço foram transferidos para uma placa de 96 poços brancos (Greiner bio-one) com 25 ul por poço de reagente do ensaio de citotoxicidade CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay (Promega). A aquisição da luminescência foi realizada no instrumento PerkinElmer EnVision após 15 minutos de incubação à temperatura ambiente e analisada usando o software GraphPad Prism e XL fit. Os dados são plotados como o sinal de luminescência para liberação de LDH.
[401] As Figuras 5A-E mostram que tanto 5E11-TCB quanto 5F11-TCB medeiam uma forte citotoxicidade de células T em diversas linhagens de células de mieloma múltiplo, particularmente NCI-H929 (Fig. 5B), RPMI-8226 (Fig. 5C), L363 e (Fig. 5D) AMO-1 (Fig. 5A), enquanto que nenhuma morte foi observada na linhagem de controle negativo, WSU- DLCL?2 (Fig. 5E). Em contraste, ET150-5-TCB medeia pouco ou em um nível significativamente inferior a morte de células das linhagens de mieloma múltiplo testadas. A Tabela 1 resume os valores de ECr5o derivados dos dados mostrados na Figura 5 A-E. O valor EC5o foi calculado usando o recurso adicional XLfit no Excel, plotando os dados brutos dos sinais contra os TCBs titulados.
TABELA 1 EC50 DA MORTE MEDIADA POR ANTI-GPRC5D-TCB 5F11-TCB EXEMPLO 5 ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T MEDIADA POR ANTI-GPRC5D-TCB
[402] Para abordar mecanísticamente os modos de ação dos TCBs anti-GPRC5D, foi mensurada a ativação de células T após cocultura com linhagens de células alvos de mieloma múltiplo na presença de anti-GPRC5D- TCBs. Semelhante ao experimento descrito no Exemplo 4 e Figuras 5A-E, as linhagens de células foram cocultivadas a uma razão alvo:efetora de 1:10 com
3.105 células T alogênicas isoladas a partir de PBMCs (camada leuco- plaquetária de Blutspende Schlieren) utilizando um Kit de isolamento de células humanas T Pan (Miltenyi Biotec) em meio IMDM (Gibco) suplementado com 10% de SBF (Gibco) + 1% de PS (Gibco). Anticorpos TCB anti-GPRC5D humano (5E11-TCB, 5F11-TCB, ETI150-5 TCB ou DP47-TCB) foram adicionadas à cocultura em diferentes concentrações, no intervalo de 1 pg/ml a 0,0000001 pug/mL com diluição seriada do fator 0,1 ou O ug/mL. Após 20 horas de incubação a 37ºC com 5% de CO;, as células foram coradas para avaliar a ativação das células T. As células primeiramente foram coradas com corante azul Live blue dye (Life Technologies) diluído 1:800 em PBS (Gibco) por 20 minutos a 4ºC. Posteriormente, as células foram coradas com anti-CD7 humano AF700 (clone OKT4), anti-CD8 humano BV711 (clone SK1), anti-CD25 humano BV605 (clone BC96), anti-CD69 humano APC-Cy7 (clone FN50), todos da BioLegend e anti-CD3 humano PE-Cy5.5 (clone SK7; eBioscience) em tampão de coloração para citometria de fluxo (eBioscience) por 30 min a 4ºC. A aquisição da citometria de fluxo foi realizada em um instrumento customizado BD Biosciences Fortessa e analisada usando o software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR) e o software GraphPad Prism.
[403] A Figura 6 mostra que 5F11-TCB induz a ativação de células T em cocultura com células NCI-H929 por regulação positiva do marcador de ativação CD25 e CD69, enquanto que ensaios com controles, por exemplo, DP47-TCB sem alvo (não direcionado) ou sem qualquer TCB, não induzem a ativação de células T. Como outro controlo negativo, células T tratadas com 5F11-TCB foram cocultivadas com células WSU-DLCL2, de modo que as células T também não foram ativadas. Estes perfis de ativação foram consistentes em várias linhagens de células estudadas, por exemplo, AMO-1, NCI-H929, RPMI-8226, L363 (Figuras 7A-J). Na linhagem com pobre capacidade de destruição (morte), o ET150-5-TCB não induziu a ativação de células T, exceto na concentração mais alta testada de 1 mg/kg. EXEMPLO 6 LOCALIZAÇÃO E INTERNALIZAÇÃO DE ANTI-GPRC5D-TCB
[404] As células NCI-H929 foram coradas com CMFDA (Invitrogen) e semeadas em lamínulas redondas revestidas com Poli-L-Lisina (Sigma) em placas de 24 poços. Os anticorpos (5E11-lgG, 5E11-TCB, 5F11- IgG, 5F11-TCB) foram marcados com um éster de Succinimidil Alexa Fluor 647 (InVitrogen, cat. nº A201106) a uma razão molar de 2,5. As células foram deixadas aderir durante a noite a 37ºC antes que os anticorpos marcados com fluorescência (Alexa Fluor 647-5E11-IgG, -5E11-TCB, -5E11-TCB, -5F11-l9G, - 5F11-TCB) fossem adicionados diretamente ao meio de crescimento por diferentes durações e temperaturas (30 minutos em gelo, 1 hora a 37ºC e 3 horas a 37ºC). PBS frio (Lonza) foi usado para extinguir a ação e lavar os anticorpos não ligados após cada ponto no tempo. As células então foram fixadas com Cytofix (BD) por 20 minutos a 4ºC e lavadas duas vezes com PBS. As lamínulas foram então transferidas e montadas em lâminas de vidro com Fluoromount G (eBioscience) e mantidas no escuro a 4ºC durante a noite antes da captura das imagens. A microscopia confocal de fluorescência foi realizada com um microscópio LSM 700 invertido da Zeiss com uma objetiva de imersão de 60x. As imagens foram coletadas no software Zen (Zeiss) acoplado ao microscópio e visualizadas no software IMARIS (Bitplane). A Figura 8a mostra que todos os anticorpos marcaram a superfície (membrana plasmática) das linhagens de células de mieloma múltiplo a 4ºC ou 37ºC. Se os anticorpos são internalizados pelas células, a coloração fluorescente aparecerá no citoplasma quando cultivada a 37ºC. Não foi observada internalização das IgGs de ligação ao GPRC5D ou TCBs de ligação ao GPRC5D pelas linhagens de células GPRC5D*. Isto foi adicionalmente confirmado pela aplicação da soma da intensidade das regiões de membrana e citoplasma definidas de interesse das células (em três horas). O software IMARIS foi utilizado para análise e quantificação da razão do sinal membrana/citoplasma. Figura 8B indica que após 3 horas de incubação com os diferentes anticorpos, a razão entre a intensidade da membrana citoplasmática foi inalterada em — 4, ou seja, os sinais fluorescentes se concentram na superfície, e não no citoplasma. EXEMPLO 7 CARACTERIZAÇÃO DE LIGANTES GPRC5D: LIGAÇÃO DE CÉLULA RECOMBINANTE Por ELISA
[405] Foram utilizados clones CHO transfectados estáveis que expressam GPRC5D humano ou GPRC5D de cinomolgo (GPRC5Dcyno) ou GPRC5D murino ou GPRC5A humano para analisar a ligação de potenciais candidatos a anticorpos como IgGs. Em detalhe, 10º células (viabilidade > 98%) foram semeadas em placas de microtitulação de 384 poços (BD Poly D- Lisina, 356662, volume: 25 yuL/poço) usando meio de cultura fresco. Após a incubação durante a noite a 37ºC, foram adicionadas diluições de 25 uL/poço de anticorpos (diluições de 15 x 1:3 em 1xPBS, o ensaio começa com 30 Vg/mL) às células por 2 horas a 4ºC. Após uma etapa de lavagem usando 90 ul/poço de PBST (10x PBS, Roche, t 11666789001 + 0,1% de Tween 20), as células foram subsequentemente fixadas pela adição de 50 ul/poço de glutaraldeído a 0,05% (Sigma Cat. No: G5882 em PBS 1x) por 10 minutos em temperatura ambiente (RT). Após três etapas adicionais de lavagem usando 90 ul/poço de PBST, foram adicionados anticorpos secundários para detecção: para anticorpos humanos foram usados anticorpo de cabra anti-cadeia « de lg humana conjugado com HRP (Millipore ft AP502P) diluído 1: 2000 em tampão de bloqueio (PBS 1x (Roche f 11666789001) + BSA a 2% (Fração V de Albumina de Soro Bovino, isento de ácidos graxos, Roche, ff 10735086001) + Tween 20 a 0,05%) (25 ul/poço). Para anticorpos de rato, uma mistura de anticorpo de cabra anti-lgG1 de rato conjugado com HRP (Bethyl ft A110-
106P), anticorpo de cabra anti-lgG2a de rato conjugado com HRP (Bethyl & A110-109P) e anticorpo de cabra anti-lgG2b de rato conjugado com HRP (Bethyl %& A110 -111P) foi utilizada na diluição 1:10000 de cada anticorpo em tampão de bloqueio (25 ul/poço). Após a incubação durante 1 h em temperatura ambiente e três etapas de lavagem adicionais usando 90 ulL/poço de PBST, foi adicionado 25 ul/poço de substrato TMB (pedido Roche nº 11835033001) por 10 min e o desenvolvimento da cor nos ODs finais foi determinado por medição a 370 nm/492 nm.
[406] Todos os anticorpos testados mostraram ligação positiva ao GPRC5D humano com valores de ECs5o (refletindo a avidez) no intervalo pM. Apenas as IgG de rato 10B10 e 07A04 mostraram reatividade cruzada em células CHO que expressam GPRC5D de cinomolgo (GPRC5Dcyno) com valores ECso comparáveis com o da versão humana do receptor (Figura 9). A reatividade cruzada para Cinomolgo também foi detectada para todos os outros anticorpos, mas em níveis mais baixos em comparação com 10B10 e 07A04 (Figura 9). Não foi detectada ligação significativa em células CHO que expressam GPRC5D murino e não foi detectada ligação em células CHO que expressam a versão humana de GPRC5A (Figura 9). Os valores de ECs5o da ligação estão resumidos na Tabela 2.
TABELA 2 PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO AO GPRC5D ENTRE ESPÉCIES BASEADAS Em ELISA
EXEMPLO 8 LIGANTES DE GPRC5D: GPRC5D-TCB RECOMBINANTE MEDEIA À CITOTOXICIDADE
DE CÉLULAS T EM LINHAGENS DE CÉLULAS DE MM
[407] Para comparar a funcionalidade do GPRC5D-TCB ou outros TCBs direcionados, realizamos um ensaio de citotoxicidade de células T in vitro em várias linhagens de células de MM: MOLP-2 (Fig. 10 B), AMO-1 (Fig. 10 C), EJM (Fig. 10D) e NCI-H929 (Fig. 10G). Resumidamente, as linhagens de células foram cultivadas em meio RPMI 1640 + Glutamax (Gibco) suplementado com 20% de soro bovino fetal inativado por calor (SBF, Gibco) e 1% de penicilina - estreptomicina 100X (PS, Gibco). A linhagem MOLP-?2 foi cultivada com este meio suplementado com GlutaMax 1X (Gibco). As linhagens de células OPM-2 (Fig. 10 A), RPMI-8226 (Fig. 10 E) e L-363 (Fig. 10F) foram cultivadas com este meio suplementado com apenas 10% de SBF. NCI-H929 foi cultivado com este meio suplementado com 50 uM mercaptoetanol (Gibco), 1 mM de piruvato de sódio (Gibco) e GlutaMax 1X (Gibco). EJM foi cultivada em IMDM (Gibco) + 10% de SBF (Gibco) e 1% de PS (Gibco). Todas as linhagens de células foram cultivadas em garrafas de cultura de 75 cm? (TPP) com duas passagens por semana.
[408] As linhagens de células foram cocultivadas a uma razão alvo:efetora de 1:10 com 0,3 milhão de células T alogênicas isoladas a partir de PBMC's (camada leuco-plaquetária de Blutspende Schlieren) utilizando um kit de isolamento de células humanas T Pan (Miltenyi Biotec) em meio RPMI (Gibco) suplementado com 10% de SBF (Gibco) + 1% de PS (Gibco). As construções TCB anti-GPRC5D humano (5E11-TCB, 5F11-TCB, 10B10-TCB, B72-TCB, BCMA-TCB e DP47-TCB) foram adicionadas à cocultura em diferentes concentrações, de 12,5 nM a 0,0000125 nM com diluição seriada 1/10 e comparadas com amostras não tratadas. Após 20 horas de incubação a 37ºC com 5% de CO», 75 ul. do sobrenadante por poço foram transferidos para uma placa de 96 poços branca (Greiner bio-one) com 25 ul por poço de reagente do ensaio de citotoxicidade CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay (Promega). A aquisição da luminescência foi realizada no instrumento PerkinElmer EnVision após 15 minutos de incubação à temperatura ambiente e analisada usando o software GraphPad Prism e XL fit Os dados foram plotados como o sinal de luminescência para liberação de LDH (Figura 10). As Figuras 10A-G resumem os dados que mostram que 5E11-TCB e 5F11-TCB medeiam uma citotoxicidade de células T nas linhagens de células de MM mais forte do que BCMA-TCB, 10B10-TCB e B72-TCB. O ECso da morte mediada por TCB é mostrada na tabela 3 e é calculada como média a partir de diferentes experimentos com diferentes células T doadoras (n=20un=3).
TABELAS VALORES DE EC50 NO ENSAIO DE MORTE /N VITRO Linhagem de |[NCI-H929| AMO-1 | MOLP-2 |L363 (Fig.| EJM (Fig. | OPM-2 |RPM! (Fig. ee | [e [5 [Ts] [5 Gee 7 e De [Gee [e [e e Ds e qr] EXEMPLO 9
ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T IN VITRO EM CÉLULAS SAUDÁVEIS DA MEDULA ÓSSEA HUMANA
[409] A medula óssea não processada fresca de quatro doadores saudáveis diferentes (Lonza % 1M-105, lote 0000739254; 0000739255; 0000739256 e 0000734008) foi processada 1 ou 2 dias após a amostragem. Após uma lise com um tampão de lise rápida de células vermelhas utilizando o BD Pharm Lysis buffer
(BD * 555899; 1X em água estéril) por 5 minutos em temperatura ambiente; as células foram lavadas 2 vezes por centrifugação e troca de tampão a 126 ge 443 9, respectivamente. As células foram contadas e ressuspensas a 300.000 células/mL em RPM! 1640 Glutamax + 20% de soro fetal bovino HI + 2% de soro humano + 1% de soro humano + 1% de penicilina/estreptomicina (todas da Gibco) e 100 ul. de suspensão de células foram semeados por poço uma placa de 96 poços de fundos redondos (TPP). 50 ul de meio ou meio suplementado com B72-TCB, 5F11-TCB, 5E11-TCB, BCMA-TCB, 10B10-TCB ou DP47-TCB de 200 nM (4X) a 20 pM com diluição em série 1/10 foram adicionados por poço. Finalmente, 50 ul de células T alogênicas isoladas utilizando células Pan-T (Miltenyi Biotec, ff 130-096-535) a partir de PBMCs de doadores saudáveis foram adicionados a 6 Mio/mL (proporção de T efetora para célula alvo de medula óssea saudável de 10:1). Após incubação durante a noite a 37ºC em uma incubadora umidificada, as células foram lavadas uma vez com PBS e coradas por 20 minutos a 4ºC com 50 uL de corante azul vivo (Live blue)(Invitrogen, % L23105) diluído 1/800 em PBS. Após a lavagem, as células foram incubadas por 30 minutos a 4ºC com a seguinte mistura de anticorpos diluídos em tampão FACs (PBS 1X, soro bovino fetal a 2%; 1% 0,5 m de EDTA pH 8; 0,25% de azida sódica NaN3 (20%)): CD25 BV605, CD69 APC-Cy7, BCMA BV421, CD38 BV510, CD138 FITC, FcRH5 PE diluído 1/100 e CD8 BV711, CD3 PE-Cy5 e CD4 AlexaFluor 700 diluído 1/3800 (todos da BioLegend) e GPRC5D AlexaFluor 647 (feito em nosso laboratório (in-house), IgG clone 5E11). Após uma lavagem, as células foram ressuspensas em 100 uL de tampão FACs e adquiridas com citômetro Fortessa (BD Biosciences).
[410] Os dados apresentados nas Figuras 11 A-F ilustram que o B72-TCB induziu a ativação inespecífica das células T (tal como medido por regulação positiva de CD69) na medula óssea saudável, mas não por qualquer um dos outros TCBs testados. Conforme indicado, a ativação inespecífica induzida pelo B72-TCB foi um efeito dependente da concentração e mais pronunciado a 50 nM do que a 5 nM (Figuras 12A e 12B). EXEMPLO 10 EFICÁCIA /N Vivo DE TCBs
[411] No estudo de eficácia, diferentes construções de TCB (GPRC5D 5F110-TCB, 5E11-TCB, BCMA-TCB e B72-TCB) foram comparadas em termos de regressão tumoral em mieloma múltiplo com camundongos NSG totalmente humanizados. As células NCI-H929 foram originalmente obtidas de células ATCC e OPM-2 da DSMZ. Ambas as linhagens de células foram expandidas. As células foram cultivadas em RPMI contendo SBF a 10% e L- glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 MM. As células foram cultivadas a 37ºC em atmosfera saturada de água com 5% de CO». 2,5 x 10º células NCI-H929 e 5 x10º células OPM-2 por animal foram injetadas subcutaneamente no flanco direito dos animais em meio de cultura celular RPMI (Gibco) e GFR Matrigel (1:1, volume total de 100 uL) a uma viabilidade > 95,0%.
[412] Camundongos NSG fêmeas (NOD.Cg-Prkdcscid 1I12rgtm 1WiV/SzJ) com 4-5 semanas de idade no início do experimento (criados em Charles River, Lyon, França) foram mantidos sob condições livres de patógenos- específicos com ciclos diários de 12 h luz/12 h escuro de acordo com as diretrizes compromissadas (GV-Solas ; Felasa; TierschG) O protocolo do estudo experimental foi analisado e aprovado pelo governo local (ROB-55.2-2532.Vet 03- 16-10). Após a chegada os animais foram mantidos por uma semana para se habituarem ao novo ambiente e para a observação. Foi realizado o monitoramento contínuo da saúde regularmente.
[413] De acordo com o protocolo, os camundongos NSG fêmeas receberam injeções i.p. (intraperitoneal) com 15 mg/kg de bussulfano seguido um dia mais tarde por uma injeção i.v. de 1x10º células-tronco hematopoiéticas humanas isoladas a partir de sangue do cordão umbilical. Na semana 16-20 após a injeção das células-tronco, os camundongos foram sangrados e o sangue foi analisado por citometria de flixo para humanização bem-sucedida. Os camundongos enxertados com eficiência foram randomizados de acordo com suas frequências de células T humanas nos diferentes grupos de tratamento (n=10/grupo). Nesse momento, os camundongos foram injetados com células tumorais por via subcutânea, tal como descrito acima e tratados uma vez por semana com os compostos ou PBS (veículo), quando o tamanho do tumor atingiu aproximadamente 200 mm?. Todos os camundongos foram injetados por via intravenosa com diferentes doses de moléculas de TCB (consulte as Figuras 13A-D e 14A-D).
[414] Para obter a quantidade apropriada de compostos, as soluções estoque foram diluídas com tampão Histidina (histidina 20 mM, NaCl 140 MM, pH 6,0). O crescimento tumoral foi medido duas vezes por semana usando um paquímetro e o volume tumoral foi calculado da seguinte forma: Tv: (L2/2) x C (L: largura, C: comprimento)
[415] O estudo foi finalizado e todos os camundongos foram sacrificados após quatro injeções dos compostos e os tumores foram explantados e pesados.
[416] As Figuras 13A-D mostram a cinética do crescimento tumoral em todos os animais, que haviam recebido injeções NCI-H929, após o tratamento. 5F11-TCB induziu a completa remissão do tumor em todos os animais a 1 mg/kg ou 0,1 mg/kg (Fig. 13A), enquanto B72-TCB induziu apenas uma remissão parcial do tumor quando usado a 1 mg/kg, e não exibiu efeito a 0,1 mg/kg (Fig. 13C). O BCMA-TCB também induziu remissão parcial do tumor a 1 mg/kg (Fig. 13B).
[417] As Figuras 14A-D mostram a cinética do crescimento tumoral em todos os animais, que haviam recebido injeções de OPM-2, após o tratamento. 5F11-TCB (Fig. 14A, painel superior) e SE11-TCB (Fig. 14B, painel superior) induziram a remissão completa do tumor na maioria dos animais a 0,1 mg/kg, enquanto B72-TCB (Fig. 14C, painel superior) a 0,1 mg/kg foi menos potente no controle do crescimento tumoral. Em uma concentração de 0,01 mg/kg, o 5F11- TCB (Fig. 14A, painel inferior) e SE11-TCB (Fig. 14B, painel inferior) foram mais potentes na inibição do crescimento tumoral quando comparados com B72-TCB (Fig. 14C, painel inferior). EXEMPLO 11 HUMANIZAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-GPRC5D
[418] As estruturas aceptoras humanas adequadas foram identificadas consultando uma base de dados BLASTp de sequências humanas das regiões V e J para as sequências de entrada murinas (cortadas na parte variável). Os critérios seletivos para a escolha da estrutura aceptora humana foram; homologia de sequência, comprimentos iguais ou semelhantes de CDR e frequência estimada da linhagem germinativa humana, além da conservação de certos aminoácidos na interface do domínio VH-VL. Após a etapa de identificação da linhagem germinativa, as CDRs das sequências de entrada murinas foram enxertadas nas regiões de arcabouço (framework) aceptoras humanas. Cada diferença de aminoácidos entre esses enxertos iniciais de CDR e os anticorpos parentais foi classificada como possível impacto na integridade estrutural da respectiva região variável, e foram introduzidas “mutações reversas” na sequência parental sempre que julgado apropriado. A avaliação estrutural foi baseada nos modelos de homologia da região Fv do anticorpo parental e das variantes de humanização, criados com um protocolo interno de modelagem de homologia da estrutura de anticorpos implementado usando o BIOVIA Discovery Studio Environment, versão 17R2. Em algumas variantes de humanização, foram incluídas “mutações diretas”, isto é, trocas de aminoácidos que alteram o aminoácido original que ocorre em uma determinada posição da CDR do ligante parental para o aminoácido encontrado na posição equivalente da linhagem germinativa aceptora humana. O objetivo é aumentar o caráter humano geral das variantes de humanização (além das regiões estruturais) para reduzir ainda mais o risco de imunogenicidade.
[419] Uma ferramenta in silico desenvolvida internamente foi utilizado para prever a orientação de domínio VH-VL da VH e VL pareadas das variantes de humanização (como no documento WO 2016/062.734 A1, que é integralmente incorporado ao presente por referência). Os resultados foram comparados com a orientação do domínio VH-VL prevista dos ligantes parentais para selecionar combinações de arcabouço que são próximas na geometria em relação aos anticorpos originais. O racional é detectar possíveis trocas de aminoácidos na região da interface VH-VL que podem levar a alterações perturbadoras no pareamento dos dois domínios que, por sua vez, podem ter efeitos prejudiciais nas propriedades de ligação.
ESCOLHA DA ESTRUTURA ACEPTORA E SUAS ADAPTAÇÕES PARA O LIGANTE GPRC5D 5E11
[420] As regiões de arcabouço (framework) foram escolhidas de acordo com a tabela 4 a seguir. TABELA 4 FRAMEWORKS ACEPTORES PARA O LIGANTE DE GPRCS5D, 5E11 Linhagem germinativa da|Escolha da linhagem região-V murina (Rattus|germinativa da região-V VH1abcd Vr2ab
[421] As regiões de arcabouço (framework) pós-CDR3 foram adaptadas da linhagem germinativa IGHJ humana IGHJ3*02 (DAFDIWGQGTMVTVSS) e da linhagem germinativa IGKJ humana IGKJ5*01 (ITEGQGTRLEIK). A parte relevante para a região de arcabouço (framework) aceptora é indicada em negrito.
[422] Com base em considerações estruturais, mutações reversas do framework aceptor humano para o aminoácido no ligante parental foram introduzidas em determinadas posições das variantes de humanização 5E11 (Tabela 5 e 6). Além disso, algumas posições foram identificadas como candidatas promissoras para mutações diretas, onde o aminoácido em uma CDR do ligante parental é substituído pelo aminoácido que se encontra na linhagem germinativa aceptora humana. As alterações estão detalhadas na tabela abaixo.
[423] Nota: As mutação reversa (back mutation) são prefixadas com b, as mutações diretas (forward mutations) com f, por exemplo, bS49A refere- se a uma mutação reversa (aminoácido da linhagem germinativa humana para aminoácido do anticorpo parental) de serina para alanina na posição 49. Todos os índices de resíduos são apresentados no sistema de numeração de Kabat.
TABELA 5 LISTA DE VARIANTES DE HUMANIZAÇÃO VH/VL 5E11 Identidade com a linhagem Nome da Variante igerminativa da região V humana (BLASTp) SET Via (9SA9A PROAT) 5E11 VH1b (bv2L bS49A bS74A bK94T) 5E11 VH1c (bS49A fR60A fAGSG bK94T) 5E11 VH1d (bV2L bS49A fR60A fAGSG bS74A bK94T) 5E11 VL1a (bP430) 5E11 VL 1 (R24K fA25S, bP430) 5E11 VL2a (DA430) SETT VEZ (DA43A BRASA) 5E11 VL3a (bA430) 5ETT. VLS (6K420 BAASO) TABELA 6 SEQUÊNCIAS DE VARIANTES DE HUMANIZAÇÃO VH/VL 5E11 Nom |Sequência de aa e 5E11 |EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGG |4 | VH1 |VNTYYRDSVKARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGT |6 a MVTVSS
A 5E11 |ELOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGV|4 | VH1 |NTYYRDSVKARFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTM |7 b —|vVTvsSS 5E11 |EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGG |4 | VH1 |VNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGT |8 c MVTVSS 5E11 |ELQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGV|4 | VH1 |NTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTM |9g d |vTvssS 5E11 |DIVMTASPDSLAVSLGERATINCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILA|5 —VL1 |SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQOAEDVAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK o a 5E11 |DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILA|5 —VL1 |SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCQQATRESPLTFGQGTRLEIK 1 Cc 5E11 |EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPRLLIYHASILA|5 | VL2 |SGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 2 a 5E11 |EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILA |5 | VL2 |SGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 3 b 5E11 |DIQMTAOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGKQPKLLIYHASILA|5 | VL3 |SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 4 a 5E11 |DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASIL |5 | VL3 |ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK 5 b
ESCOLHA DA ESTRUTURA ACEPTORA E SUAS ADAPTAÇÕES PARA O LIGANTE GPRCS5D 5F11
[424] As regiões de arcabouço (framework) foram escolhidas de acordo com a tabela 7 a seguir. TABELA7 FRAMEWORKS ACEPTORES PARA O LIGANTE DE GPRC5D, 5F11 Linhagem germinativa da região-V Escolha da linhagem germinativa da murina (Rattus norvegicus) região-V aceptora humana VH1abcd IGHV5S13*01 IGHV3-30*03 VH2bd IGHV3-23*04 VL1ab, VL2a — IGKV2S17*01 IGKV2-28*01 VL2b IGKV4-1*01 1GKV3-20"01
[425] As regiões de arcabouço (framework) pós-CDR3 foram adaptadas da linhagem germinativa IGHJ humana IGHJ3*02 (DAFDIWGQGTMVTVSS) e da linhagem germinativa IGKJ humana IGKJ2*01 (YTFGQGTKLEIK). A parte relevante para a região de arcabouço (framework) aceptora é indicada em negrito.
[426] Com base em considerações estruturais, mutações reversas do framework aceptor humano para o aminoácido no ligante parental foram introduzidas em determinadas posições das variantes de humanização 5F11 (Tabela 8 e 9). Além disso, algumas posições foram identificadas como candidatos promissores para mutações diretas, onde o aminoácido em uma CDR do ligante parental é substituído pelo aminoácido que se encontra na linhagem germinativa aceptora humana. As alterações estão detalhadas na tabela abaixo.
[427] Nota: As mutação reversa (back mutation) são prefixadas com b, as mutações diretas (fonward mutations) com f, por exemplo, bA93T refere- se a uma mutação reversa (aminoácido da linhagem germinativa humana para aminoácido do anticorpo parental) de alanina para treonina na posição 93. Todos Os Índices de resíduos são apresentados no sistema de numeração de Kabat.
TABELA 8 LISTA DE VARIANTES DE HUMANIZAÇÃO VH/VL 5F11 ; Identidade com a linhagem germinativa 5F11 VH1b (DOTE bS74A bAS3T) SF11VH1c (R6OA bA9ST) 5F11. VH1d (DOTE fR6O0A bS74A bASST) 5F11, VH2b (bS49A bS74A bA93T bK94R) 5F11 VH2d 87,8 (bS49A fR60A bS74A bA93T bK94R) 5F11VL1b (BQO42K bL46V bY87H) 5F11 VL2e (fS25A bY87H)
TABELA 9 SEQUÊNCIAS DE VARIANTES DE HUMANIZAÇÃO VH/VL 5F11 ses» — 5F11 [QVOLVESGGGVVAQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGG |, | VH1 |GNTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGT |: a —|MVTVSS 5F11 [EVOLVESGGGVVAPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGG |, | VH1 |GNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGT |> b —|MVTVSS 5F11 [QVOLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGG |, | VH1 |GNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQOGT |? c —|MvTvsS 5F11 [EVQLVESGGGVVAQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGG |, | VH1 |GNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGT |, d —|MvTvsSS 5F11 |EVQLVESGGGLVAQPGGSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGG | VH2|GNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGT b —|MVTVSS 5F11 |EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGG |, | VH2|GNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGT |; d —|MvTvSS P5L1 |oivMTOSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGASPQVLIVRMSN 6 2 — |LASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 2 seu DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGKSPQVLIYRMSN |6 — |LASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 3
NE DIVMTOSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGOSPQLLIYRMSN 1a — |RASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK so DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSKSLLHSNGITYVYWYQQKPGQPPKLLIYRMSN |6 5 — |LASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK 5
EL EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASKSLLHSNGITYVYWYQQKPGQAPRLLIYRMSN ke — |LASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK
CARACTERIZAÇÃO DE VARIANTES DE HUMANIZAÇÃO POR ELISA
[428] Para a caracterização das variantes de humanização dos domínios VH e VL dos ligantes GPRC5D, foi utilizado o protocolo ELISA conforme descrito acima (consulte o Exemplo 7). Os dados estão resumidos na tabela 10 para as variantes de humanização de 5E11 e na tabela 11 para as variantes de humanização de 5F11. A Tabela 12 mostra sequências de CDR dos parentais 5E11 e parentais 5F11 e das variantes de humanização selecionadas.
TABELA 10 CARACTERIZAÇÃO DAS VARIANTES DE HUMANIZAÇÃO DE 5E11 e SS oito | CHOhu GPCR5Dcyno (ng/mL) meme ela FAS fuma [vas [107 ms fun sr fo | 5 FAST 5 [ve [vis [ 6 [ma [o mo om | mm FAST s [ve [we [ me [ua [mo [sa on | mo FAST a ve ue | sue e | e ar [o FAS io ve vas [e [ea [6 [rn on | mo FPS n [ums va | sua [5501 fee] 50 om |
GPCRSD - cHO CHOhu GPCR5Dcyno Tac Vel vw | vo | vn | ve de ECNER [ECNCSo| — ECNCso re! o hulD | hulD | hulD (ng/ml) rel (nM) (ng/mL) PIAEST | 20| vH1d | vita | 89,7 | 80,2 |84,95] 7,6 | 005 | | PIAESTa 21 | VH1d | vL1e | 89,7 | 822 |8595] 87 | 006 | | PIAESTA | 23 vH1d | vL2b | 89,7 | 85,1 104 | 007 | | PIAESTS | 24 VH1d | vLãa | 89,7 | 83,8 | 86,75] 80 | 005 | | PIAESTS | 25 vH1d | vLab | 89,7 | 82,8 |8625] 52 | 003 | | TABELA 10
CONTINUAÇÃO LT Humano cHO GPCR5A hucAR-J2 ECs, : EC/ICso rel Tapir meo] vi | e forja melo (ng/ml) [ng/ml] PrAESTOS ras | ma soa P1AES710| 5 | vH1a | vL26 87,4 na 35 PraESTIA| 6. | vero 5 ra ss P1AES715| 9 | vH1L 84,9 na 3,6 P1AES717| 11 | vH1b | vL26 86,35 na 79,9 P1AES718| 12 | vH1D 85,7 na 105,4 P1AES719| 13 | VH1b | vL3b 85,2 na 2,8 PraESTRA| 17 | Vinte | Vcs as] ma P1AES725| 19 | VH1c | VL3b 87,3 na 10,9 P1AES726| 20 | vH1A 84,95 na 37,8
LL fumo ro ereRsamlcaRIa Ecs) P1AESTS1 TABELA 11 CARACTERIZAÇÃO DAS VARIANTES DE HUMANIZAÇÃO DE 5F11 EL amar Cro crersor | (ng/mL) [PinESTSa | 2 | vma | voa | 608 | 8 [eo] 55 | om] [PraESTas [6 | vata [ve [898 [| 8 [so | 21 [00 PiAESTAO | 5 | vmb | vem | sos [ss [eos ss | oo) [PragsTa [9 [| vam [ves | 908 [88 [8a | 67 [00 [PragSTas [19 [| va [vom | 508 [ss [so | s7 [oo PASTO [27 | vma | vita | 898 | 86 [879 | 40 | 00 |
| | Humano CHO GPCR5Dhu EC/NICso Tipol| VH VL | VHhulD |VLhulD! FvhuiD| rer | ES/ICso rel (nM) (ng/mL) P1AE5761 vH2d VL1b 874 | 37 TABELA 11
CONTINUAÇÃO cHO cHO CAR-J2 GPCR5Dcyno | GPCR5Ahu EC5so Tip VH | VL | Fv | EC/Csorel | EC/Csorel e e [5 o [não Emo Como | emu P1AES57 1 parent parent 33 al al so Pa sm ua [e fes e e Pisa ve un ea e e] = [e fes ii eee ea e [ss] e e Des
LO eee o antro [En [E GPCR5Dcyno | GPCR5Ahu | ECso a e Lo o [ão RS ES nana FE ema fuera 00 [ 16 fer nn | am Pesa ua es 6 8] mo | m [6
E Faso fue as a fe] [e [| FS A me vas ne 6 e] mo | [em] Fo
E
E Fa me fa aos [o fu [sr Pa e ve ua es e e sm | [es]
E Fe ves a ee 0 fu] o mo ra TABELA 12
SEQUÊNCIAS CDR DE UMA SELEÇÃO DE VARIANTES DE HUMANIZAÇÃO CO es ie es em os Lia]
[es pes [e [1 [06 [6] EXEMPLO 12 ATIVAÇÃO IN VITRO DE CÉLULAS CAR-J NA PRESENÇA DE DIFERENTES VARIANTES DE HuUmMANIZAÇÃO DE IGGs ANTI-GPRC5D SELECIONADAS
[429] A capacidade das diferentes IgG anti-GPRC5D humanizadas ativar células efetoras PGLALA-CAR-J foi avaliada conforme descrito a seguir. As células alvo de mieloma múltiplo L363 que expressam GPRC5D (Diehl et a/., Blut 36: 331-338 (1978)) foram cocultivadas com células efetoras anti-PGLALA-CAR-J (linhagem de células repórteres de leucemia linfoide aguda humana Jurkat-NFAT expressando um TCR direcionado contra a mutação PGLALA (P329G L234A L235A) na parte Fc de moléculas IgG e contendo um promotor NFAT, tal como revelado no pedido PCT EP2018/086038 e pedido PCT EP2018/086067. Após a ligação simultânea da molécula de IgG ao GPRC5D em células L363 e células PGLALA-CAR-J, o promotor NFAT é ativado e leva à expressão da luciferase de vaga-lume ativa.
[430] Para o ensaio, as variantes de IgG humanizadas foram diluídas em meio RPMI 1640 (contendo Glutamax, soro bovino fetal inativado por calor (HI) a 15%, penicilina-estreptomicina a 1%; todas da GIBCO) e foram transferidas para placas de 96 poços com fundos redondos (intervalo de concentração final de 0,2 pg/mL até 10 ug/mL). 20.000 células L363 por poço e células efetoras anti-PGLALA-CAR-J foram adicionadas para obter uma proporção final de células efetoras (anti:-PGLALA-CAR-J) para células alvo (L363) de 5:1 e um volume final de 200 uL por poço. As células foram incubadas por aproximadamente 16 horas a 37ºC em uma incubadora umidificada. No final do tempo de incubação, 100 ul/poço do sobrenadante foram transferidos para uma placa branca de 96 poços de fundo plano (Costar) e incubados com outros 100 ul/poço de substrato
ONE-GlIo luciferase (Promega) por 5 minutos antes a luminescência ser lida usando um instrumento PerkinElmer Envision. Os dados da linha foram plotados como sinais de luminescência relativa (RLUs) em relação à concentração de IgG usando o programa estatístico GraphPad Prism e o valor de EC5o foi calculado usando o programa XL-fit.
[431] Como mostrado nas Figuras 15A-B e na Tabela 13, todas as lgGs GPRC5D avaliadas induzem a ativação de CAR-J após ligação simultânea às células-alvo que expressam GPRCB5D e células anti=-PGLALA-CAR-J. Para ambos os ligantes anti-GPRC5D, 5F11 e 5E11, as variantes de humanização podem ser identificadas com valores de ECso semelhantes ou mesmo aprimorados em comparação com os valores obtidos para os anticorpos parentais pré-humanização. Para o ligante 5F11, a ativação mais forte pode ser induzida pela molécula P1AES5741 (Fig. 15A). Para o ligante 5E11, a ativação mais forte pode ser induzida pelas moléculas P1AE5730 e P1AE5723 (Fig. 15B).
TABELA 13 VALORES DE EC50 DA ATIVAÇÃO DE CAR-J Tem Po esmo SE) x | 2|/T|/8|/8g|&8|&|8|&ZE [A a a a a [A a o a a
[432] Embora a invenção divulgada acima tenha sido descrita em detalhes por meio de ilustrações e exemplos com o intuito de elucidar seu entendimento, as descrições e os exemplos não devem ser interpretados como limitantes do escopo da presente invenção. As divulgações de todas as patentes e literaturas científicas citadas são expressamente e integralmente incorporadas ao presente pela referência.

Claims (42)

REIVINDICAÇÕES
1. ANTICORPO que se liga ao GPRC5D, caracterizado por compreender: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 84 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 89; (ii) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 85 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 89; (liii))) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 97; (iv) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL)
compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 96 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 97; e (v) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 92 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 97.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1; caracterizado: (i) pela VH compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; e a VL compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou (ii) pela VH compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e a VL compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; ou (ii) pela VH compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; e a VL compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; ou (iv) pela VH compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; e a VL compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou (v) pela VH compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; e a VL compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou (vi) pela VH compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; e a VL compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63.
3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação | ou 2, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo IgG.
4, ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo IgG.
5. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo completo (de comprimento total).
6. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo anticorpo ser um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em uma molécula Fv, uma molécula scFv, uma molécula Fab e uma molécula F(ab')2.
7. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo multiespecífico.
8. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, caracterizada por compreender:
(a) uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro antígeno é GPRC5D e pela primeira porção de ligação ao antígeno compreender;
(i) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 84 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 89;
(ii) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 83, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 85 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 86, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 87, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 88 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 89;
(ii) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 97;
(iv) uma região variável! de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 91 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 96 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 97; ou (v) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 90, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 92 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 93, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 94, uma LCDR2 de SEQ ID NO: 95 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 97; e; (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um segundo antígeno.
9. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada: (i) pela VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; e pela VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou (ii) pela VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e pela VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; ou
(iii))) pela VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; e pela VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; ou
(iv) pela VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; e pela VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou
(v) pela VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; e pela VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou
(vi) pela VH da primeira porção de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; e pela VL da primeira porção de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63.
10. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo segundo antígeno ser CD3.
11. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo segundo antígeno ser CD3:s;
12. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pela segunda porção de ligação ao antígeno compreender uma VH que compreende uma HCDR 1 de SEQ ID NO: 29, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 30, e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 31, e uma VL que compreende uma LCDR 1 de SEQ ID NO: 32, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 33 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 34.
13. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pela VH da segunda porção de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; e a VL da segunda porção de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
14. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 13, caracterizada pela primeira e/ou segunda porção de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab.
15. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 14, caracterizada pela segunda porção de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1, particularmente os domínios variáveis VL e VH, da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab estão substituídos entre si (trocados).
16. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 14, caracterizada pela primeira porção de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab, na qual no domínio constante o aminoácido na posição 124 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é independentemente substituído por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat); e no domínio constante CH1 o aminoácido na posição 147 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é independentemente substituído por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
17. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 16, caracterizada pela primeira e segunda porção de ligação ao antígeno estarem fundidas entre si, opcionalmente por um peptídeo ligante.
18. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 17, caracterizada pela primeira e a segunda porção de ligação ao antígeno serem, cada uma, uma molécula Fab, e em que (i) a segunda porção de ligação ao antígeno está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno, ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno está fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N- terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno
19. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA,
de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 18, caracterizada por compreender uma terceira porção de ligação ao antígeno.
20. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pela terceira porção de antígeno ser idêntica à primeira porção de ligação ao antígeno.
21. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 20, caracterizada por compreender um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade.
22. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pela primeira, segunda e, quando presente, a terceira porção de ligação ao antígeno serem, cada uma, uma molécula Fab; e em que (i) a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da primeira porção de ligação ao antígeno e a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc, ou (ii) a primeira porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da cadeia pesada Fab da segunda porção de ligação ao antígeno e a segunda porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc; e em que a terceira porção de ligação ao antígeno, quando presente, é fundida no C-terminal da cadeia pesada Fab ao N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc.
23. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo domínio Fc ser um domínio Fc de IgG.
24. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo domínio Fc ser um domínio Fc de IgG.
25. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 24, caracterizada pelo domínio de Fc ser um domínio Fc humano.
26. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 25, caracterizada por um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc ser substituído por um resíduo de aminoácido que tem um volume de cadeia lateral maior, gerando, assim, uma protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável dentro de uma cavidade no interior do domínio CH3 da segunda subunidade, e um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc ser substituído por um resíduo aminoácido que tem um menor volume de cadeia lateral, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade, dentro da qual a protuberância do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável.
27. — MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 26, caracterizada pelo domínio Fc compreender uma ou mais substituição de aminoácidos que reduz a ligação a um receptor de Fc e/ou uma função efetora.
28. UM OU MAIS POLINUCLEOTÍDEOS ISOLADOS, caracterizados por codificarem o anticorpo ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de qualquer uma das reivindicações de 1 a 27.
29. UM OU MAIS VETORES, particularmente vetores de expressão, caracterizados por compreenderem o(s) polinucleotídeo(s) da reivindicação 28.
30. “CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender o(s) polinucleotídeo(s) de acordo com a reivindicação 28 ou o(s) vetor(es) de acordo com a reivindicação 29.
31. MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO que se liga ao GPRCB5D, caracterizado por compreender as etapas de a) cultivo da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 30 em condições adequadas para a expressão do anticorpo; e opcionalmente b) a recuperação do anticorpo.
32. — ANTICORPO que se liga ao GPRCB5D, caracterizado por ser produzido pelo método da reivindicação 31.
33. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 27 ou 32 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
34. — ANTICORPO OU MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ao antígeno biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou 32, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo uso como um medicamento.
35. — ANTICORPO OU MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ao antígeno biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou 32, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo uso no tratamento de uma doença.
36. — ANTICORPO, molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pela doença ser câncer ou uma doença autoimune.
37. — ANTICORPO, molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pela doença ser mieloma múltiplo.
38. USO do anticorpo ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 27 ou 32 caracterizado pela fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença.
39. MÉTODO DE TRATAMENTO de uma doença em um indivíduo, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende o anticorpo ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 27 ou 32 ao referido indivíduo em uma forma farmaceuticamente aceitável.
40. USO, de acordo com a reivindicação 38 ou o método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pela referida doença ser câncer ou uma doença autoimune.
41. USO, de acordo com a reivindicação 38 ou o método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pela referida doença ser mieloma múltiplo.
42. INVENÇÃO, caracterizada por ser descrita no presente pedido.
=. MI 9) = SM A 4) Ro EE > +> dO dido o CP; ? E £ Gi E) E z z Oo u KO * KA e ra O NS o EA PAES >A t LES o LE 2 Mo (EM: O. Cz 3 O = * mo wu
SS SS soa) RR Ka) FD PAPO! & º o ó = << ? a E s > u
SO
SS SS = SEM 5x9) NS EA (EE S = SW : Ox ar SS EO Po ee (2: (>: md — õ ” As E O > = = E) Ne) amoo ie” TA + TA jr. LO ” (1 SED, = ato ÃO = ÃO = = É = Êo ' e CE 5 * Po ESA a a PO Sao O” > ARES E dt 1 ES - fo 3 o: (Ds quo SS = - - É. 5 NE z
DD iz
- x E. Os
NS SMS =D: e, = GQ = DA o
SS ASS NS. = E NE > (20 st Co a -. Ea ma Os E AB, Ex A ” O” A: Oz - = = > Ã Ce 5 > > Age > Ag + o: (E o 3 = 3
GR FA 2 (ÁS = o: RO» O ; O x =>
GA E FR E
E O E XE o & ” z =, - ro SS a Do a ot eDa 0 ÃO AX - DEE 2 DS EAROS, 2 1 — 7 fo
E O õ = É = Pa) - dB = da. > Je (O + DES & Gr BETE a po FR MA o DO: "O : = SS Co = = = = õ W= O > E z u
Ole Om ti x AGE 26: ot SEiDa =/ ME = = LM = LDO x SAS E O 5 Oz = = = E TS 2 AW : O), =, (OO,
E EO E SAN Ss fo. já de Soo : dg O A >: — x X o fã E > uu sê s = 8 S&S <& Este: x & É Ss BZ & % 7 o %
A e o o o o O o o o o O + o a à ca (IWNXdd) eueipaw oessaidxa es
S = .D
LL
7 Si. sw O o Ex CS 2.S 3 & “My z ê E Ss :
SESÇOD É uu ds [ES 3 2x T > & FC = a E 2º” o º = .D a
7II8 |
E o o O 2 n “Oo o o o SS 8 $ . gs É 2
FS o Oo g É É É õe 8 8 8 38 3 8 3 3 S 8 3 3 S 38 S : IpaU EIOUgoSSJONK ap apepisuatul = a e . £ E) 8 22 & 2 u É o cs - oO
E o o gs É E É se 8 8 38 38 a 3 3 s 3 3 s & Elp9uW EiaUgosS JON Sp epepisuatu| es
E > 8 .- & & ET a 8 6 o E QR O 5 SN 2 z ENO 2 OSTEZ>2 o fe) ÚD Dao 282&02 o Tx trio s % = Ss Bs sa Ss B EX > - 8 8 8 = LL E S T e? à Eip9uW El9UgOSS JON Sp SpepIsuaIu| hã a sa mn 3 a 8 : 2 m = Es Ps = P DER 2 TEST í BESL 2 +4tA z de 4 (ng) eseusbosnsep cream ep oeóeicam > = « | & e 2 co Ra z je 8 fe É ê 8 P ? be ” e / 2 « RRº | z 2 e > E E io E E 2 | é 7 o & z (Hg) eseusfopsap orerse, ep ogóeiaam (HQ) esevebosnsep orerae ep ceóeiaanm * Ss o 2 > Es Do te Es 2 a. 28 2 > $ Z 4 $ z id z : E E e 3 ge ? e 8 2 > ç T E 2? Z E de <: ú à o ã z (HQ) esuabospsap oreise; ep ogóeiaqgrm (HO) eseusfospsap orejoe ep ogóeiaar
O
S =
D Ta
3 E "s en Ê se — 8 z m |; ” a s Sl! Oo | “Rs o CERCA 28) " 3| a "o + + nn) mL Í ã ss . — : 2 e "e % CNO % % e f£ao f£ao bx à o 8 s o a 8 = | SEE 8) : o o e . : + = E 3 u E e e un E. > ,
EEE EEE o ss ss * SS |; a 3 e Rr 8 s 8 8 =| Rg e E DN O z2|/& Ed à: — :
FUER EURO & 2 o os a . ": ô EP ; o º “sí º ção ão O S Ss a o o o o º = fo u e LS a es a +? a Ss 38 s ê > e É £ : = 3 2 8 le 3 & = w& ãR => [gq'"MA E E & E q É - (6800 1 "8190 %) +52 ao = (4609 1 io %) +6900 8 . É z .ê SÍ b É s > É ê ê e 6 e 8 E FE Ta CT ETA * e (4809 1 'SI90 %) +5209 = (4800 1 SI199 %) +6909 s 8
E Ê es bs $ 4 | 8 "E 3 nm * . ã 2 F Pê à 3 E 8 + 8 & NS Cs E PE TRE o (r609 1 S160 %0) acao = (6609 1 S0%) t690o a | lu É a Ea o es & HH Ss = ã + É x o. g "e : EE TF FE St Etqr mn (6809 1'SI80 96) +5CA9 o (2809 1 'SI99 %) +6000
E E Es Es É ue 1 SÉ sem + É 2 BSS BE 2 E *i BEGE 3 e 3 sus 2 0. e ss É ET EE O e es us o (+89 1 S160 %) +60a9 He (+905 1 510%) 6800 = .D
LL
8. LL) >, 2 + E LI) ES Ss 4 Ca + LO) % <q o Do o o x E) «e - o % EuWSerdo1n/eUEquiauW apepisualu ep ogóeiouy co [OA 8 alii UE lia. a 4 | Í j B LET AD, SS O Pr mm í y - AS) Ç PRA z mai” Ex — iii TA o | | E | fp EH É XA E. E ês g "o o < Ss =
D u o 6 Ss S Fo É & 2 z 3 % Já th j sa TA * H HW o sã + 4 & as TR Vi PEL 1 8 sa is A o E ASAE du 1d sá : E 1 à H 3 H x |H | É É
ECO 5 LL HA — BIDUBQIOSqy o Ss = > u
É
F + 8
É e É 8 8 8 s 8 ” 2 ss à 2 à Sagsb
E O PEER OQ (Ho) esevebopsep oje1se, ep oeóeiagr À À Fá 3 à p E TE 28 + |eº et EB + |HK ES | * e Ê: ei EFE EF Ee) E FF EF pp Re O (Hg) eseuebospsap oleise ep ordenar (D (Han) esusfoipsap ore ep oróeiean ez | : E sê +8 "” 2 = õ é É ê É - es RE 3 z ? É E EF EF E ? , - s E 3 Sã CA (Ho) eseusbopsap o1ersa; ep ogóeisan 1 | (HO) eseuebosnsep areia ep og Seia : * " a E . s em bd PE 28 8 8 2 E » 2 É s e. ê = 7 = z WS $ $ fg $ 7 1 :$ ê 3 $ t à <T (Ho) esevobospsep oreise ep ogSeiear 1 (HE) eseuafopsap oretoe ep ogóeiaan o = Ss =
D u
8oLLhda + *8IL0180L * Risaiwos 8 8 891 L1AS z obs .º de + 89178 . o «sw e e (809 1 'S190) 6909 % a * 891 Ltda * br 8910180 D to mnwos 8 8 = BOL LIaS $ & ou Las .. | % 8 LE 8 s 8 & ? º e = (809 1 8190) 6909 % s s =
DD u
E
E " o es 8 8 & E E RES Wda 7 eipaww Lunu) jesouna auntoa 8 . 8 & DE . o ê Í j PR o "” = Rã 8: hs R à é é é ê Ê Wd3 Feipaw WNd3 7 IPA [unu] pesou auntoa [uu] jesouwny auntoa 8 8 " N SS. 8 "” & se sz CS | Hj a sí si a o & E E é à é é Bê Wd3 7eipaw Wda 7 8ipoW Lunu] jesowina awntoa [un] jesouny aunjon 8 & o 2 2 : Ss si “z j i o 2 8 * à sã ss SR FP à é é à & E é à = Ind Feio Wá3 7eipouw o Lunu] escuna aunjoa [Ltunu] jesowm auwnton s 91/2wT 91/SWT'0 2 s 2 ? E sa os *j = ” a g 8 8 8 ” s E E s Wd3 Feipaia Lunu] jesouna aunjoa as s
E E o sê É ê Í ! 5% “ À e a g 8 8 8 º g 8 8 8 ” s Ê Ss s s s Ss E Wd3 Feipaw Wd3 Feia [un] jesouna aunjoa [unu] pesouina aunjton ê á i RP x . as “E E = õ sd . 8 3 ai na 3 é do é Es as a Wd3 7eipow Wida FPA [Lunu] pesou auntoa [uu] jesouina aunoa o é e õ E as z s 3 ni E a ê + = " = s $ E à E * & à à à * = é iG io é à é É =D Wd3 Feipow Wda epa
1. [Luna] pesouina auntoa [unu] jesouina aunon F1/SWTO 91/3W TOO o : se
É «o e SS " "Ss. N E = - PR ILE de = â ê ê R sms FÊ e ss lo ão to s E E x Te 2
NNE We ss : DE > ã: sm =
D u
ResuMO “ANTICORPOS, MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, UM OU MAIS POLINUCLEOTÍDEOS ISOLADOS, UM OU MAIS VETORES, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, ANTICORPO OU MOLÉCULA DE LIGAÇÃO, USO, MÉTODO DE TRATAMENTO E INVENÇÃO”
A presente invenção refere-se de modo geral a anticorpos que se ligam ao GPRC5D, incluindo moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, por exemplo, para a ativação de células T.
Além disso, a presente invenção refere-se a polinucleotídeos que codificam tais anticorpos, e vetores e células hospedeiras que compreendem tais polinucleotídeos.
A invenção diz respeito ainda a métodos para produzir os anticorpos, e métodos de uso dos mesmos no tratamento de doenças.
Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas.
Código de Controle Campo 1 Campo 2 Outras Informações: - Nome do Arquivo: 2066-0469 Filing SequenceListing.TXT - Data de Geração do Código: 27/07/2020 - Hora de Geração do Código: 18:38:02 - Código de Controle: - Campo 1: AGSO68986C626CEB - Campo 2: C29A0821A4B7BFCB
BR112020015297-8A 2018-02-09 2019-02-07 Anticorpos, molécula de ligação ao antígeno biespecífica, um ou mais polinucleotídeos isolados, um ou mais vetores, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, composição farmacêutica, anticorpo ou molécula de ligação, uso, método de tratamento e invenção BR112020015297A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18156014.5 2018-02-09
EP18156014 2018-02-09
PCT/EP2019/052962 WO2019154890A1 (en) 2018-02-09 2019-02-07 Antibodies binding to gprc5d

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020015297A2 true BR112020015297A2 (pt) 2020-12-08

Family

ID=61189309

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020015297-8A BR112020015297A2 (pt) 2018-02-09 2019-02-07 Anticorpos, molécula de ligação ao antígeno biespecífica, um ou mais polinucleotídeos isolados, um ou mais vetores, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, composição farmacêutica, anticorpo ou molécula de ligação, uso, método de tratamento e invenção

Country Status (20)

Country Link
US (3) US20210054094A1 (pt)
EP (1) EP3749692A1 (pt)
JP (2) JP2021513334A (pt)
KR (1) KR20200119833A (pt)
CN (1) CN111788231A (pt)
AR (1) AR117392A1 (pt)
AU (1) AU2019219061A1 (pt)
BR (1) BR112020015297A2 (pt)
CA (1) CA3088730A1 (pt)
CL (2) CL2020001854A1 (pt)
CO (1) CO2020008940A2 (pt)
CR (1) CR20200341A (pt)
IL (1) IL276537A (pt)
MA (1) MA51734A (pt)
MX (1) MX2020007012A (pt)
PE (1) PE20201341A1 (pt)
PH (1) PH12020551211A1 (pt)
SG (1) SG11202007578SA (pt)
TW (1) TWI829667B (pt)
WO (1) WO2019154890A1 (pt)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
PE20211696A1 (es) 2018-12-21 2021-09-01 Hoffmann La Roche Moleculas agonistas de union al antigeno cd28 que actuan sobre el tumor
CR20220019A (es) * 2019-07-31 2022-02-11 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se fijan a gprc5d
TW202219065A (zh) * 2020-06-19 2022-05-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 免疫活化 Fc 域結合分子
WO2022148370A1 (en) * 2021-01-05 2022-07-14 Lanova Medicines Development Co., Ltd. Anti-gprc5d monoclonal antibodies and uses thereof
CR20230374A (es) * 2021-01-05 2023-10-05 Lanova Medicines Dev Co Ltd Anticuerpos monoclonales anti-gprc5d y usos de los mismos
CN117279953A (zh) 2021-02-16 2023-12-22 詹森药业有限公司 靶向bcma、gprc5d和cd3的三特异性抗体
AU2022223152A1 (en) 2021-02-19 2023-08-31 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Anti-gprc5d×bcma×cd3 trispecific antibody and use thereof
WO2023030272A1 (zh) * 2021-08-30 2023-03-09 原启生物科技(上海)有限责任公司 抗gprc5d抗原结合蛋白及其用途
WO2023078382A1 (zh) * 2021-11-05 2023-05-11 正大天晴药业集团股份有限公司 结合gprc5d的抗体及其用途
WO2023173272A1 (zh) * 2022-03-15 2023-09-21 上海驯鹿生物技术有限公司 靶向gprc5d的全人源嵌合抗原受体(car)及其应用
WO2023115347A1 (zh) * 2021-12-21 2023-06-29 上海驯鹿生物技术有限公司 靶向gprc5d的全人源抗体
CN116375868A (zh) * 2021-12-31 2023-07-04 康源博创生物科技(北京)有限公司 一种抗cd3的人源化抗体及其在制备双特异性抗体中的应用
WO2023125888A1 (zh) * 2021-12-31 2023-07-06 山东先声生物制药有限公司 一种gprc5d抗体及其应用
WO2023125728A1 (zh) * 2021-12-31 2023-07-06 康源博创生物科技(北京)有限公司 抗gprc5d抗体及其应用
WO2023143537A1 (zh) * 2022-01-29 2023-08-03 恺兴生命科技(上海)有限公司 Gprc5d抗体及其应用
WO2023227062A1 (en) * 2022-05-27 2023-11-30 Antengene (Hangzhou) Biologics Co., Ltd. Novel anti-gprc5d antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind gprc5d and cd3, and uses thereof
WO2024002308A1 (zh) * 2022-06-30 2024-01-04 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种新型多特异肿瘤抑制剂的开发和应用
WO2024031091A2 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for gprc5d and bcma
CN116003598B (zh) * 2022-08-30 2024-04-26 苏州缔码生物科技有限公司 靶向人gprc5d的重组人源化单克隆抗体及其应用
WO2024050797A1 (zh) * 2022-09-09 2024-03-14 北京天广实生物技术股份有限公司 结合bcma、gprc5d和cd3的多特异性抗体及其用途
WO2024079009A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and proteasome inhibitors
WO2024079010A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and cd38 antibodies
WO2024079015A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and imids
CN117924485A (zh) * 2022-10-25 2024-04-26 上海祥耀生物科技有限责任公司 一种抗gprc5d的多特异性抗体
WO2024088987A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for the treatment of cancer
WO2024102954A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Activation induced clipping system (aics)

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR7801185A (pt) 1977-04-18 1978-11-28 Hitachi Metals Ltd Ornato adaptado para ser fixado por pelo menos um ima permanente
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
EP0625200B1 (en) 1992-02-06 2005-05-11 Chiron Corporation Biosynthetic binding protein for cancer marker
PL174721B1 (pl) 1992-11-13 1998-09-30 Idec Pharma Corp Przeciwciało monoklonalne anty-CD20
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
WO1998050431A2 (en) 1997-05-02 1998-11-12 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
PT994903E (pt) 1997-06-24 2005-10-31 Genentech Inc Metodos e composicoes para glicoproteinas galactosiladas
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
BR0014480A (pt) 1999-10-04 2002-06-11 Medicago Inc Método para regular a transcrição de genes estranhos
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
SI2857516T1 (sl) 2000-04-11 2017-09-29 Genentech, Inc. Multivalentna protitelesa in njihove uporabe
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ES2295228T3 (es) 2000-11-30 2008-04-16 Medarex, Inc. Roedores transcromosomicos transgenicos para la preparacion de anticuerpos humanos.
MXPA04001072A (es) 2001-08-03 2005-02-17 Glycart Biotechnology Ag Variantes de glicosilacion de anticuerpos que tienen citotoxicidad celulares dependiente de anticuerpos incrementada.
BR0213761A (pt) 2001-10-25 2005-04-12 Genentech Inc Composições, preparação farmacêutica, artigo industrializado, método de tratamento de mamìferos, célula hospedeira, método para a produção de uma glicoproteìna e uso da composição
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
WO2003085119A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede d'amelioration de l'activite d'une composition d'anticorps de liaison avec le recepteur fc$g(g) iiia
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
WO2003085107A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules à génome modifié
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
RS51318B (sr) 2002-12-16 2010-12-31 Genentech Inc. Varijante imunoglobulina i njihova upotreba
CA2510003A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
ATE475708T1 (de) 2003-01-22 2010-08-15 Glycart Biotechnology Ag Fusionskonstrukte und deren verwendung zur produktion von antikörpern mit erhöhter fc rezeptor bindungsaffinität und effektorfunktion
JP2008501621A (ja) 2003-05-31 2008-01-24 マイクロメット アクツィエン ゲゼルシャフト Ｂ細胞関連疾患を処置するための二重特異性抗ｃｄ３、抗ｃｄ１９抗体構築物を含む薬学的組成物
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
NZ550217A (en) 2004-03-31 2009-11-27 Genentech Inc Humanized anti-TGF-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
EP2374817B1 (en) 2004-04-13 2017-09-06 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
AU2005286607B2 (en) 2004-09-23 2011-01-27 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
KR101569300B1 (ko) 2005-02-07 2015-11-13 로슈 글리카트 아게 Ｅｇｆｒ 에 결합하는 항원 결합 분자, 이를 코딩하는 벡터, 및 그의 용도
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
AU2006301492B2 (en) 2005-10-11 2011-06-09 Amgen Research (Munich) Gmbh Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
EP2465870A1 (en) 2005-11-07 2012-06-20 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
ES2395969T3 (es) 2006-03-24 2013-02-18 Merck Patent Gmbh Dominios de proteínas heterodiméricas genéticamente modificados
EP2016101A2 (en) 2006-05-09 2009-01-21 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
US20080044455A1 (en) 2006-08-21 2008-02-21 Chaim Welczer Tonsillitus Treatment
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
WO2008119567A2 (en) 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific cd3-epsilon binding domain
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
CN102448985B (zh) 2009-05-27 2015-08-05 霍夫曼-拉罗奇有限公司 三或四特异性抗体
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
CN104945509A (zh) 2009-09-16 2015-09-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含卷曲螺旋和/或系链的蛋白质复合体及其用途
EP3112382A1 (en) 2009-12-29 2017-01-04 Emergent Product Development Seattle, LLC Heterodimer binding proteins and uses thereof
JP6022444B2 (ja) 2010-05-14 2016-11-09 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ヘテロ二量体タンパク質ならびにそれを生産および精製するための方法
CN114246952A (zh) 2010-06-08 2022-03-29 基因泰克公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
JP6167040B2 (ja) 2010-11-05 2017-07-19 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計
SG193554A1 (en) 2011-03-29 2013-11-29 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
LT2748201T (lt) 2011-08-23 2018-02-26 Roche Glycart Ag Dvigubai specifinė t ląsteles aktyvinantį antigeną surišanti molekulė
CN107586340B (zh) 2011-08-23 2022-01-21 罗切格利卡特公司 对t细胞活化性抗原和肿瘤抗原特异性的双特异性抗体及使用方法
PL2748202T3 (pl) 2011-08-23 2018-12-31 Roche Glycart Ag Dwuswoiste cząsteczki wiążące antygen
WO2013096291A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
JP6152120B2 (ja) 2012-02-15 2017-06-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｆｃ受容体に基づくアフィニティークロマトグラフィー
PT2838918T (pt) 2012-04-20 2019-08-23 Merus Nv Métodos e meios para a produção de moléculas heterrodiméricas do tipo ig
CN104936986B (zh) * 2013-02-26 2019-08-09 罗切格利卡特公司 双特异性t细胞活化性抗原结合分子
MX2016006529A (es) 2013-12-20 2016-08-03 Genentech Inc Anticuerpos dobles especificos.
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
WO2016016299A1 (en) 2014-07-29 2016-02-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
DK3177643T3 (da) 2014-08-04 2019-07-15 Hoffmann La Roche Bispecifikke T-celle-aktiverende antigenbindende molekyler
BR112017003236A2 (pt) 2014-09-12 2017-11-28 Genentech Inc anticorpos elaborados com cisteína, conjugados de droga e anticorpos, método de preparação de conjugado de droga e anticorpo e composição farmacêutica
WO2016055593A1 (en) * 2014-10-09 2016-04-14 Engmab Ag Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1 for use in the treatment of ovarian cancer
WO2016062734A1 (en) 2014-10-24 2016-04-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Vh-vl-interdomain angle based antibody humanization
IL285101B2 (en) * 2014-12-05 2024-03-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center G protein-coupled receptor-directed antibodies and methods of use
JP6913025B2 (ja) * 2015-04-13 2021-08-04 ファイザー・インク 治療抗体およびその使用
JP6952605B2 (ja) 2015-04-24 2021-10-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多特異性抗原結合タンパク質
TWI781108B (zh) * 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
WO2018117786A1 (es) 2016-12-19 2018-06-28 Campo Y Ramos Juan Carlos Método de moldeo científico autoajustado por aprendizaje recurrente en tiempo real

Also Published As

Publication number Publication date
AR117392A1 (es) 2021-08-04
KR20200119833A (ko) 2020-10-20
IL276537A (en) 2020-09-30
EP3749692A1 (en) 2020-12-16
AU2019219061A1 (en) 2020-08-06
CA3088730A1 (en) 2019-08-15
JP2021513334A (ja) 2021-05-27
CL2023000907A1 (es) 2023-11-17
MX2020007012A (es) 2020-09-07
CN111788231A (zh) 2020-10-16
PH12020551211A1 (en) 2021-05-17
JP2023159115A (ja) 2023-10-31
TWI829667B (zh) 2024-01-21
US20230212308A1 (en) 2023-07-06
PE20201341A1 (es) 2020-11-25
CO2020008940A2 (es) 2020-08-31
TW201936641A (zh) 2019-09-16
US20210054094A1 (en) 2021-02-25
CL2020001854A1 (es) 2020-10-23
US20240067749A1 (en) 2024-02-29
MA51734A (fr) 2021-05-19
SG11202007578SA (en) 2020-09-29
CR20200341A (es) 2020-11-02
RU2020129004A (ru) 2022-03-09
WO2019154890A1 (en) 2019-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI829667B (zh) 結合gprc5d之抗體
AU2020323686B2 (en) Antibodies binding to GPRC5D
US20220411491A1 (en) Antibodies binding to gprc5d
US20210032349A1 (en) Antibodies binding to NKG2D
US11192957B2 (en) Antibodies binding to HLA-A2/WT1
US11180571B2 (en) Antibodies binding to STEAP-1
RU2797268C2 (ru) Антитела, связывающиеся с gprc5d

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]