ES2295228T3 - Roedores transcromosomicos transgenicos para la preparacion de anticuerpos humanos. - Google Patents

Abstract

Ratón transgénico que comprende dos loci humanos de inmunoglobulina, en el que un locus humano de inmunoglobulina es un locus humano de cadena pesada situado en un transcromosoma, y el otro locus humano de inmunoglobulina es una parte de un transgén de locus humano de cadena ligera integrado de manera estable en el genoma de ratón y que codifica una cadena ligera humana.

Description

Roedores transcromosómicos transgénicos para la preparación de anticuerpos humanos.

Campo técnico

La invención se refiere a los campos técnicos de los animales transgénicos, la inmunología molecular y la medicina.

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos representan una clase de moléculas terapéuticas con aplicaciones en muchas áreas diferentes, que comprenden el trasplante, las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades infecciosas, el cáncer y la autoinmunidad (Goldenberg, M., Clin. Ther. 21:309-318, 1999; Present, D. et al., New Engl. J. Med. 340:1398-1405, 1999; Targan, S. et al., New Engl. J. Med. 337:1029-1035, 1997; Davis, T. et al., Blood 94:88a, 1999; Saez-Llorens, X. et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 17:787-791, 1998; Berar, J. et al., Pharmacotherapy 19:1127-1137, 1999; Glennie, M. et al., Immunol. Today 21:403-410, 2000; Miller, R., New Engl. J. Med. 306:517-522, 1982; Maini, R. et al., Lancet 354:1932-1939, 1999). El desarrollo de la tecnología del hibridoma ha permitido aislar anticuerpos monoclonales de roedor (también denominados MAbs) como moléculas terapéuticas candidatas (Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256:495-497, 1975). Sin embargo, los primeros estudios que implicaban la utilización de anticuerpos monoclonales no humanos para la terapia in vivo en seres humanos, demostraron que las respuestas de anticuerpos humanos antirratón (HAMA) podrían limitar la utilización de dichos agentes (Schroff, R. et al., Cancer Res. 45:879-885, 1985; Shawler, D. et al., J. Immunol. 135:1530-1535, 1985). De esta manera, se reconoce que una reducción de la inmunogenicidad de los anticuerpos terapéuticos resulta deseable. Se han utilizado tecnologías de ADN recombinante para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos no humanos (Boulianne, G. et al., Nature 312:643-646, 1984; Morrison, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855, 1984; Riechmann, L. et al., Nature 332:323-327, 1988; Jones, P. et al., Nature 321:522-525, 1986; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033, 1989). Sin embargo, también se reconoce que los anticuerpos monoclonales totalmente humanos son una fuente potencial de agentes terapéuticos de baja inmunogenicidad para tratar enfermedades humanas (Little, M. et al., Immunol. Today 21:364-370, 2000). La utilización de ratones transgénicos que portan loci de inmunoglobulina (Ig) humana en la configuración de línea germinal de los mismos permiten el aislamiento de anticuerpos monoclonales completamente humanos de alta afinidad dirigidos contra una diversidad de dianas, incluyendo autoantígenos humanos para los que el sistema inmunológico humano normal es tolerante (Lonberg, N. et al., Nature 368:856-859, 1994; Green, L. et al., Nature Genet. 7:13-21; Green, L. & Jakobovits, Exp. Med. 188:483-495, 1998; Lonberg, N. y Huszar, D., Int. Rev. Immunol. 13:65-93, 1995; Bruggemann, M. et al., Eur. J. Immunol. 21:1323-1326, 1991; Fishwild, D. et al., Nat. Biotechnol. 14:845-851, 1996; Mendez, M. et al., Nat. Genet. 15:146-156, 1997; Green, L., J. Immunol. Methods 231:11-23, 1999; Yang, X. et al., Cancer Res. 59:1236-1243, 1999; Brüggemann, M. y Taussig, M.J., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458, 1997). Los anticuerpos humanos se clasifican en una diversidad de clases diferentes basándose en la cadena ligera (kappa y lambda) y en la cadena pesada (IgA_{1}, IgA_{2}, IgD, IgE, IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4} e IgM). Estas diferentes clases proporcionan potencialmente diferentes usos terapéuticos. Por ejemplo, los diferentes isotipos de cadena pesada presentan diferentes interacciones con el complemento y con receptores Fc en células. Algunas de las clases de cadena pesada (IgM e IgA) también pueden formar multímeros, incrementando de esta manera la valencia de Fc y las interacciones de la región V. Por lo tanto, resulta deseable disponer de una plataforma para generar anticuerpos monoclonales humanos de todos los isotipos. Sin embargo, el gran tamaño de los loci de Ig humanos (1 a 2 Mb) ha sido un obstáculo importante para la introducción de loci enteros en ratones transgénicos para reconstituir repertorios diversos completos de anticuerpos humanos debido a que la clonación de fragmentos de ADN de tamaño superior a una megabase que comprenden loci de Ig humanos completos resulta difícil incluso con la utilización de cromosomas artificiales de levadura. Recientemente, un nuevo procedimiento que utilizaba un cromosoma humano como vector para la transgénesis facilitó la transferencia de los loci IgH e Ig\kappa en ratones transgénicos sin necesidad de clonar fragmentos de ADN en vectores de ADN artificiales (Tomizuka, K. et al., Nature Genet. 16:133-143, 1997; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97:722-727, 2000). Tomizuka et al. (Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727, 2000) demostraron la introducción de dos fragmentos transmisibles de cromosoma humano (hCFs), uno que contenía el locus de cadena pesada de inmunoglobulina (Ig) (IgH, \sim1,5 Mb) y el otro el locus de cadena ligera \kappa (Ig\kappa, \sim2 Mb), en una cepa de ratón transgénico cuyos loci IgH e Ig\kappa endógenos habían sido inactivados. En los ratones doble-transcromosómicos (Tc)/de inactivación génica (KO), una proporción sustancial de las células somáticas conservaba ambos hCFs, y el rescate del defecto de producción de Ig se demostró a partir de la expresión de nivel elevado de las cadenas pesada y ligera kappa de Ig humanas en ausencia de cadenas pesada y ligera kappa de ratón. Además, los perfiles de expresión sérica de cuatro subclases de Ig\gamma humanas eran similares a los observados en el ser humano. Los ratones transgénicos desarrollaron una respuesta de anticuerpos humanos antígeno-específicos tras la inmunización con albúmina sérica humana (HSA) y se obtuvieron a partir de ellos anticuerpos monoclonales humanos HSA-específicos con diversos isotipos. El estudio de Tomizuka et al. (ibid.) también demostró la inestabilidad de hCF derivado de hChr.2 que contenía el locus de Ig\kappa (hCF(2-W23)) en ratones. La inestabilidad observada del transcromosoma \kappa podría ser un impedimento para la expresión óptima de cadena ligera kappa humana y para la producción de hibridomas positivos para kappa humana. En efecto, dos tercios de los hibridomas anti-HSA obtenidos a partir de un ratón doble-Tc/KO eran positivos para lambda de ratón (m\lambda^{+}) y la mayoría (83%) de hibridomas IgG/m\lambda se observó que habían perdido el locus hCF(2-W23). Por lo tanto, existe una necesidad de animales transgénicos que conserven las características proporcionadas por los transcromosomas descritos por Tomizuka et al. (ibid.), particularmente de animales que expresen sustancialmente el repertorio completo de isotipos de cadena pesada humana y que también muestren una mejor estabilidad de las secuencias
humanas introducidas, proporcionando una eficiencia incrementada de obtención de anticuerpos humanos completos.

Breve sumario de la invención

La invención proporciona un ratón transgénico que comprende dos loci de inmunoglobulina humana, en el que un locus de inmunoglobulina humana es un locus de cadena pesada humana situada en un transcromosoma, y el otro locus de inmunoglobulina humana es una parte de un transgén de locus de cadena ligera humana de manera estable integrado en el genoma de mamífero no humano.

En algunos ratones transgénicos, el locus de cadena ligera humana se encuentra asociado con un cromosoma de mamífero endógeno. En algunos ratones transgénicos, el locus de cadena pesada humana es de un transcromosoma y el locus de cadena ligera humana se encuentra asociado con un cromosoma de mamífero endógeno. En algunos ratones transgénicos, por lo menos una parte del locus de cadena ligera humana se clona en un vector YAC. En algunos ratones transgénicos, el locus de cadena pesada humana se encuentra comprendido en hCF(SC20) y el locus de cadena ligera humana se encuentra comprendido en el transgén Kco5 de locus de la cadena ligera kappa humana. En los ratones transgénicos, el locus endógeno de cadena pesada de mamífero y por lo menos un locus de cadena ligera de mamífero se encuentran inactivados. En algunos de estos ratones transgénicos, el locus endógeno de cadena pesada de mamífero y el locus de cadena ligera kappa se encuentran inactivados.

En otro aspecto, el ratón transgénico comprende además una mutación de un gen, en el que la mutación incrementa la respuesta inmunológica frente a un autoantígeno. En algunos ratones transgénicos, la mutación es la inactivación del gen Fc\gammaRIIB.

La invención además proporciona procedimientos para generar una pluralidad de células B que expresan secuencias de anticuerpo humano, comprendiendo el procedimiento proporcionar el ratón transgénico de la invención e inmunizar el ratón transgénico para generar una pluralidad de células B que expresan secuencias de anticuerpo humano. En algunos de dichos procedimientos, el transcromosoma es un fragmento del cromosoma humano 14. En algunos de dichos procedimientos, el transcromosoma humano es el fragmento SC20 de cromosoma humano (hCF(SC20)). Algunos de dichos procedimientos comprenden además recoger la pluralidad de células B que expresan secuencias que expresan anticuerpos humanos. Algunos de dichos procedimientos comprenden además fusionar la pluralidad de células B con células inmortalizadas para formar hibridomas. Otros procedimientos de entre dichos procedimientos comprenden recoger las secuencias de anticuerpo humano a partir de los hibridomas. En algunos de dichos procedimientos, se purifican las secuencias de anticuerpo humano. Algunos de dichos procedimientos comprenden además recoger las secuencias codificantes de anticuerpos humanos. En algunos de dichos procedimientos las secuencias codificantes de anticuerpos humanos son de longitud completa. En algunos procedimientos, las secuencias codificantes de anticuerpos humanos se expresan en células transfectadas. En algunos de dichos procedimientos, el locus de cadena ligera humana comprende secuencias no reorganizadas procedentes del locus de cadena ligera kappa humana natural. En algunos de dichos procedimientos, el locus de cadena ligera kappa humana es el transgén KCo5 insertado. En algunos de dichos procedimientos, la pluralidad de células B comprende por lo menos una primera célula B codificante de un anticuerpo con un primer isotipo seleccionado de entre el grupo constituido por IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. En algunos procedimientos el isotipo de IgA es IgA_{1} o IgA_{2}. En algunos procedimientos el isotipo de IgG es IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} o IgG_{4}. En algunos de dichos procedimientos, la pluralidad de células B comprende además por lo menos una segunda célula B codificante de un anticuerpo con un segundo isotipo diferente del primer isotipo, seleccionado de entre el grupo constituido por IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. En algunos procedimientos, la pluralidad de células B comprende por lo menos cinco células B, codificando cada una de ellas un anticuerpo que presenta un isotipo diferente, en el que los isotipos de los anticuerpos son IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente. En otro aspecto, el ratón transgénico comprende además una mutación de un gen, en el que la mutación incrementa la respuesta inmunológica frente a un autoantígeno. En algunos de dichos procedimientos, la mutación es la inactivación del gen Fc\gammaRIIB.

La invención proporciona además un procedimiento para generar un anticuerpo de secuencia humana que se une a un antígeno predeterminado, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes: inmunizar un ratón transgénico de la invención con un antígeno predeterminado, y recoger el anticuerpo de secuencia humana a partir del ratón inmunizado. En otro aspecto, el ratón transgénico comprende además una mutación de un gen, en el que la mutación incrementa la respuesta inmunológica frente a un autoantígeno. En algunos de dichos procedimientos, la mutación es la inactivación del gen Fc\gammaRIIB.

Los anticuerpos de secuencia humana obtenidos llevando a cabo la invención pueden comprender diversos isotipos de anticuerpo, o mezclas de los mismos, tales como IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}, IgM, IgA_{1}, IgA_{2}, IgD e IgE. Los anticuerpos de secuencia humana pueden ser de longitud completa (por ejemplo un anticuerpo IgG_{1}, IgG_{4}, IgA_{1} o IgA_{2}) o pueden incluir únicamente una parte de unión a antígeno (por ejemplo un fragmento Fab, F(ab')_{2}, Fv o Fd). Algunos anticuerpos de secuencia humana son anticuerpos de secuencia humana recombinante. Los anticuerpos de secuencia humana de la invención típicamente pueden unirse a antígenos predeterminados con constantes de asociación en el equilibrio (Ka) de por lo menos 10^{8} M^{-1}, 10^{9} M^{-1}, 10^{10} M^{-1}, 10^{11} M^{-1} y 10^{12} M^{-1}. Algunos anticuerpos de secuencia humana de la invención son monoclonales. Algunos anticuerpos de secuencia humana de la invención son específicos de antígeno.

La invención proporciona además un procedimiento para generar hibridomas específicos de antígeno que secretan anticuerpo de secuencia humana, comprendiendo el procedimiento: inmunizar el ratón transgénico de la invención con un antígeno predeterminado, fusionar linfocitos procedentes del ratón transgénico con células inmortalizadas para formar células hibridoma, y determinar el grado de unión del anticuerpo producido por las células hibridoma al antígeno predeterminado. En algunos de dichos procedimientos, más del 50% de los clones de hibridoma específico de antígeno segregan anticuerpo que presentan cadena pesada humana y cadena ligera humana. En otro aspecto, el ratón transgénico comprende además una mutación de un gen, en el que la mutación incrementa la respuesta inmunológica frente a un autoantígeno. En algunos de dichos procedimientos, la mutación es la inactivación del gen Fc\gammaRIIB.

La invención proporciona además un procedimiento para generar un anticuerpo de secuencia humana que se une a un antígeno predeterminado, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes: inmunizar un ratón transgénico de la invención con un antígeno predeterminado, y cribar células hibridoma formadas para la presencia de anticuerpos reactivos con antígeno. En algunos de dichos procedimientos, las células hibridoma se subclonan con una eficiencia superior al 20%. En algunos de dichos procedimientos, los anticuerpos reactivos con antígeno se secretan a partir del hibridoma en cultivo. En algunos de dichos procedimientos, los anticuerpos reactivos con antígeno son sustancialmente puros. En algunos procedimientos, los anticuerpos sustancialmente puros se formulan para el uso terapéutico. En otro aspecto, el ratón transgénico comprende además una mutación de un gen, en el que la mutación incrementa la respuesta inmunológica frente a un autoantígeno. En algunos de dichos procedimientos, la mutación es la inactivación de un gen Fc\gammaRIIB.

La invención proporciona además un procedimiento para producir secuencias de inmunoglobulina reorganizadas, que comprende: proporcionar un ratón transgénico de la invención y obtener las secuencias de inmunoglobulina humana reorganizadas a partir del ratón transgénico. En algunos procedimientos, la etapa de obtención comprende recoger linfocitos células B que contienen las secuencias de inmunoglobulina humana reorganizadas. En dichos procedimientos, la etapa de obtención comprende aislar y amplificar ARNm de los linfocitos células B para generar ADNc. La invención proporciona además ácidos nucleicos aislados que codifican estas secuencias amplificadas de región variable de cadena pesada del ADNc. Además, la invención proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican las secuencias amplificadas de región variable de cadena ligera del ADNc. En otro aspecto, el ratón transgénico comprende además una mutación de un gen, en el que la mutación incrementa la respuesta inmunológica frente a un autoantígeno. En algunos de dichos procedimientos, la mutación es la inactivación del gen Fc\gammaRIIB.

En otro aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico codificantes de los anticuerpos de secuencia humana o partes ligantes de antígeno, de la invención. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, los vectores de expresión recombinante que incluyen los ácidos nucleicos codificantes de anticuerpo de la invención, y células huésped (o progenie de estas células huésped) transfectadas con dichos vectores, también se encuentran comprendidos por la invención, de la misma manera que los procedimientos de preparación de los anticuerpos de la invención mediante el cultivo de estas células huésped. Algunos de dichos procedimientos comprenden cultivar las células huésped bajo condiciones en las que se expresa el ácido nucleico, y recuperar el ácido nucleico a partir de la célula huésped cultivada o del medio de cultivo de la misma. Algunas células huésped son eucariotas. Algunos de dichos vectores de expresión comprenden un ácido nucleico codificante de las secuencias de región variable de cadena pesada y de cadena ligera de la invención en el que las secuencias de región variable de cadena pesada y de cadena ligera se encuentran ligadas funcionalmente a una secuencia reguladora que controla la expresión del ácido nucleico en una célula huésped.

La invención proporciona además un procedimiento para producir una biblioteca de presentación de anticuerpos humanos, comprendiendo el procedimiento: introducir un inmunógeno en el ratón transgénico de la invención, aislar una población de ácidos nucleicos codificantes de cadenas de anticuerpo humano a partir de células linfáticas del ratón transgénico, y formar una biblioteca de paquetes de presentación que presentan las cadenas de anticuerpo, en las que un elemento de la biblioteca comprende un ácido nucleico codificante de una cadena de anticuerpo, y la cadena de anticuerpo se presenta a partir del paquete. En algunos de dichos procedimientos, el inmunógeno es un ácido nucleico. En algunos de dichos procedimientos, el ácido nucleico codifica un receptor unido a membrana. En otro aspecto, el ratón transgénico comprende además una mutación de un gen, en el que la mutación incrementa la respuesta inmunológica frente a un autoantígeno. En algunos de dichos procedimientos, la mutación es la inactivación del gen Fc\gammaRIIB.

La invención proporciona además un procedimiento para producir un anticuerpo de secuencia humana, o fragmento del mismo, que se une a un antígeno predeterminado, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes: inmunizar un ratón transgénico de la invención con un antígeno predeterminado, recoger las secuencias de región V de anticuerpo del ratón transgénico inmunizado, clonar las regiones V recogidas en un vector de ADN, generando una biblioteca de expresión, expresar la biblioteca para identificar las secuencias de la región V que codifican un anticuerpo, o fragmento del mismo, que se une a un antígeno predeterminado. En otro aspecto, el ratón transgénico comprende además una mutación de un gen, en el que la mutación incrementa la respuesta inmunológica frente a un autoantígeno. En algunos de dichos procedimientos la mutación es la inactivación del gen Fc\gammaRIIB.

La invención proporciona además un procedimiento para generar un anticuerpo de secuencia humana o fragmento del mismo, que se une a un antígeno predeterminado, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes: inmunizar un ratón transgénico de la invención con un antígeno predeterminado, aislar el ADNc codificante de por lo menos una región V de anticuerpo humano a partir de células B del ratón transgénico inmunizado o a partir de hibridomas generados mediante fusión de dichas células B y una célula inmortalizada, clonar dicho ADNc en un vector de expresión, introducir dicho vector en una célula huésped, cultivar dicha célula huésped, y recoger dicho anticuerpo de secuencia humana o fragmento del mismo a partir de dicha célula huésped o medio de cultivo de la misma. En algunos de dichos procedimientos, la etapa de aislamiento se lleva a cabo mediante PCR. En algunos de dichos procedimientos, la etapa de aislamiento se lleva a cabo mediante cribado de una biblioteca de ADNc utilizando por lo menos una sonda de ADN. En algunos de dichos procedimientos la etapa de aislamiento se lleva a cabo mediante cribado de una biblioteca de presentación fágica. En algunos de dichos procedimientos, el ADNc codifica secuencias de anticuerpo humano de longitud completa. En algunos procedimientos el isotipo del anticuerpo de secuencia humana recogido es diferente del isotipo de las células productoras de anticuerpos de dicho ratón transgénico inmunizado. En otro aspecto, el ratón transgénico comprende además una mutación de un gen, en el que la mutación incrementa la respuesta inmunológica frente a un autoantígeno. En algunos de dichos procedimientos, la mutación es la inactivación del gen Fc\gammaRIIB.

La invención proporciona además un procedimiento para mejorar la estabilidad de una célula hibridoma de ratón transcromosómico que expresa un anticuerpo humano que reacciona con un antígeno predeterminado, comprendiendo el procedimiento: reproducir un primer ratón, comprendiendo el primer ratón un primer locus de inmunoglobulina humana en un transcromosoma, conjuntamente con un segundo ratón, comprendiendo el segundo ratón un segundo locus de inmunoglobulina humana insertado en un cromosoma endógeno del ratón, obtener un tercer ratón a partir de la reproducción, comprendiendo el tercer ratón tanto el primer como el segundo locus de inmunoglobulina humana; inmunizar el tercer ratón o la progenie del mismo con un antígeno predeterminado, que conservan tanto el primer como el segundo locus de inmunoglobulina humana, recoger células B del ratón inmunizado, y fusionar las células B con células inmortalizadas para obtener células hibridoma que expresan el anticuerpo humano que reacciona con el antígeno predeterminado. Algunos de dichos procedimientos comprenden además: cultivar las células hibridoma en medio, someter a ensayo el medio para identificar la presencia de células hibridoma que expresan anticuerpos humanos que reaccionan con el antígeno predeterminado, diluir las células hibridoma, y cultivar las células hibridoma diluidas para obtener líneas celulares clonales que expresan un anticuerpo monoclonal humano que reacciona con el antígeno predeterminado. En algunos de dichos procedimientos las líneas celulares clonales se obtienen a partir de por lo menos 50% de las células hibridoma identificadas.

Una célula hibridoma de ratón derivada según la invención puede segregar un anticuerpo de secuencia humana que presenta un isotipo de IgA que se une a un antígeno especificado con una constante de asociación en el equilibrio (Ka) de por lo menos 10^{10} M^{-1}.

Un anticuerpo de secuencia humana derivado según la invención que presenta un isotipo de IgA puede unirse a un antígeno especificado con una constante de asociación en el equilibrio (Ka) de por lo menos 10^{10} M^{-1}.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1. Diseño de un vector dirigido de Cmu. A) ADN genómico de ratón para la región Cmu. B) Vector dirigido de Cmu. C) ADN genómico de ratón homólogo-recombinado con el vector dirigido de Cmu.

Fig. 2. Concentraciones séricas de cadenas \mu, \gamma, \kappa y lambda de Ig humana en los ratones doble TC/KO y en ratones cruzados.

Fig. 3. Concentraciones séricas de Ig \gamma humana anti-CD4 en ratones doble TC/KO y en ratones cruzados inmunizados, el día 34.

Fig. 4. Concentraciones séricas de Ig \kappa humana anti-CD4 en ratones doble TC/KO y en ratones cruzados inmunizados, el día 34.

Fig. 5. Curso temporal de la respuesta a Ig \gamma anti-CD4 humana en ratones doble TC/KO y en ratones cruzados que mostraron el título sérico más alto en cada grupo (N=5), el día 34.

Fig. 6. Curso temporal de la respuesta de Ig \kappa anti-CD4 humana en ratones doble TC/KO y en ratones cruzados que mostraron el título sérico más alto en cada grupo (N=5), el día 34.

Fig. 7. Curva de crecimiento y producción de anticuerpo monoclonal anti-CD4 humano de las células hibridoma KM2-3.

Fig. 8. Concentraciones séricas de Ig \gamma anti-GCSF humana en ratones doble TC/KO y en ratones cruzados inmunizados, el día 34.

Fig. 9. Concentraciones séricas de Ig \kappa anti-GCSF humana en ratones doble TC/KO y en ratones cruzados inmunizados, el día 34.

Fig. 10. Curso temporal de la respuesta de Ig \gamma anti-GCSF humana en ratones doble TC/KO y en ratones cruzados que mostraron el título sérico más alto de cada grupo (N=5), el día 34.

Fig. 11. Curso temporal de la respuesta de Ig \kappa anti-GCSF humana en ratones doble TC/KO y en ratones híbridos que mostraron el título sérico más alto de cada grupo (N=5), el día 34.

Fig. 12. Curvas de dosis-respuesta de los anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 humanos para el bloqueo de actividad.

Fig. 13. Inhibición de la unión de CTLA-4 (biotina) a células B7.2 utilizando anticuerpos monoclonales.

Fig. 14. Respuestas incrementadas a C-IV bovino en el suero de ratones cruzados (Fc).

Descripción detallada de la invención Definiciones

El término "transcromosoma" se refiere a un cromosoma o fragmento del mismo que puede transferirse a una célula de un ratón. Una célula ejemplificativa en la que se introduce el transcromosoma es una célula ES. Un transcromosoma puede comprender un marcador seleccionable y puede derivarse de especies diferentes del ratón. Un transcromosoma puede comprender una parte de un cromosoma humano. El término "transcromosómico" o "transcromosoma" se refiere a "conservar un transcromosoma" o a "pertenecer a un transcromosoma".

Los anticuerpos de secuencia humana de la invención se producen en un ratón transgénico, pueden producir múltiples isotipos de anticuerpos humanos (por ejemplo monoclonales o policlonales) (por ejemplo IgM, IgD, IgG, IgA y/o IgE) contra una diversidad de antígenos experimentando recombinación V-D-J y, para los anticuerpos no IgM/no IgD, cambio de isotipo. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, diversos aspectos de la invención incluyen anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, y composiciones farmacéuticas de los mismos, así como ratones transgénicos, y células B e hibridomas para preparar dichos anticuerpos monoclonales.

Excepto cuando se indique lo contrario, los términos "paciente" o "sujeto" se utilizan intercambiablemente y se refieren a mamíferos, tales como pacientes humanos y primates no humanos, así como a animales experimentales, tales como conejos, ratas y ratones, y otros animales.

El término "tratar" incluye la administración de compuestos o agentes de la presente invención para prevenir o retrasar la aparición de los síntomas, complicaciones o indicios bioquímicos de una enfermedad, aliviar los síntomas, o detener o inhibir el desarrollo posterior de la enfermedad, afección o trastorno (por ejemplo una enfermedad autoinmunológica). El tratamiento puede ser profiláctico (para prevenir o retrasar la aparición de la enfermedad, o para prevenir la manifestación de síntomas clínicos o subclínicos de la misma) o la supresión o alivio terapéutico de los síntomas tras la manifestación de la enfermedad.

En general, la expresión "bien tolerado" se refiere a la ausencia de cambios negativos en el estado de salud que se producen como resultado del tratamiento y que afectarían a las decisiones de tratamiento.

El término "linfocito" tal como se utiliza en la presente memoria presenta el significado normal de la técnica, y se refiere a cualquier leucocito mononuclear no fagocítico que se encuentra en la sangre, linfa y tejidos linfoides, es decir, linfocitos B y T.

La expresión "subpoblaciones de linfocitos T" o "subconjunto o subconjuntos de células T" se refiere a linfocitos T o células T caracterizadas por la expresión de marcadores particulares de superficie celular (ver Barclay, A.N. et al. (editores), The leukocyte antigen facts book, 2a edición, Academic Press, London, Reino Unido, 1997; la referencia se incorpora a la presente memoria como referencia a todos los fines).

Las expresiones "antígeno 4 asociado a linfocito T citotóxico", "CTLA-4", "CTLA4", "antígeno CTLA-4" y "CD152" (ver, por ejemplo, Murata, Am. J. Pathol. 155:453-460, 1999) se utilizan intercambiablemente e incluyen variantes, isoformas, homólogos específicos de la CTLA-4 humana y los análogos que presentan por lo menos un epítopo común con CTLA-4 (ver, por ejemplo, Balzano, Int. J. Cancer Suppl. 7:28-32, 1992).

La secuencia de ADNc completa de la CTLA-4 humana presenta el número de acceso Genbank nº L15006. La región de los aminoácidos 1 a 37 es el péptido líder; 38 a 161 es el dominio extracelular similar a V; 162 a 187 es el dominio transmembranal; y 188 a 223 es el dominio citoplasmático. Se ha informado de variantes de la secuencia de nucleótidos, incluyendo una transición de G a A en la posición 49, una transición de C a T en la posición 272, y una transición de A a G en la posición 439. La secuencia de ADN completa de la CTLA-4 de ratón presenta el número de acceso EMBL nº X05719 (Brunet et al., Nature 328:267-270, 1987). La región de los aminoácidos 1 a 35 es el péptido líder.

El término "epítopo" se refiere a un determinante de proteína que puede unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos están habitualmente constituidos por agrupamientos superficiales de moléculas químicamente activos, tales como cadenas laterales de aminoácidos o sacáridas y habitualmente presentan características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión de los primeros, aunque no de los segundos, se pierde en presencia de solventes desnaturalizantes.

Un "anticuerpo" intacto comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente memoria como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente invención como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones de marco (FR). Cada VH y VL está compuesto de tres CDR y cuatro FR, dispuestos de extremo amino-terminal a extremo carboxilo-terminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunológico (por ejemplo células efectoras) mediante receptores celulares, tales como receptores de Fc (por ejemplo Fc\gammaRI, Fc\gammaRIIa, Fc\gammaRIIb, Fc\gammaRIII y FcR\eta) y el primer componente (Clq) del sistema clásico del complemento. El término anticuerpo incluye partes de unión a antígeno de un anticuerpo intacto que conservan la capacidad de unirse al antígeno. Entre los ejemplos de partes de unión a antígeno se incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente constituido por los dominios VL, VH, CL y CH1, (ii) un fragmento F(ab')_{2}, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región bisagra, (iii) un fragmento Fd constituido por los dominios VH y CH1, (iv) un fragmento Fv que constituido por los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), constituido por un dominio VH, y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se encuentran codificados por genes separados, pueden unirse, utilizando procedimientos de recombinación, con un enlazador sintético que permite unirlos en forma de una sola cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se aparean formando moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv), ver, por ejemplo, Bird et al., Science 242:423-426, 1988, y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883, 1988). Dichos anticuerpos monocatenarios se incluyen como referencia en el término "anticuerpo". Pueden prepararse fragmentos mediante técnicas de recombinación o mediante corte enzimático o químico de anticuerpos intactos.

La expresión "anticuerpo de secuencia humana" incluye anticuerpos que presentan regiones variables y regiones constantes (si se encuentran presentes) derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos de secuencia humana de la invención pueden incluir residuos aminoácidos no codificados por secuencias humanas de línea germinal de inmunoglobulina (por ejemplo mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o mutagénesis sitio-específica in vitro o mediante mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión "anticuerpo de secuencia humana", tal como se utiliza en la presente memoria, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias completas de CDR suficientes para proporcionar especificidad de antígeno y derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como el ratón, han sido injertadas en secuencias humanas de marco (es decir, anticuerpos humanizados).

Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una sola especificidad de unión y afinidad para un epítopo particular. De acuerdo con lo expuesto antecedente, la expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que muestran una sola especificidad de unión que presentan regiones variables y regiones constantes (si se encuentran presentes) derivadas de las secuencias de línea germinal humana de inmunoglobulina. En una forma de realización, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal transgénico no humano, por ejemplo un ratón transgénico, que presenta un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionado con una célula inmortalizada.

La expresión "anticuerpo diclonal" se refiere a una preparación de 3 a 100 anticuerpos diferentes contra un antígeno. Típicamente los anticuerpos en dicha preparación se unen a un conjunto de epítopos diferentes.

La expresión "anticuerpo oligoclonal" se refiere a una preparación de 3 a 100 anticuerpos diferentes para un antígeno. Dicha preparación comprende anticuerpos que se unen a una gama de epítopos diferentes.

La expresión "anticuerpo policlonal" se refiere a una preparación de más de 1 (dos o más) anticuerpos diferentes contra un antígeno. Dicha preparación incluye anticuerpos que se unen a una gama de epítopos diferentes.

La invención proporciona la base para la producción de anticuerpos de secuencia humana contra una diversidad de antígenos, incluyendo anticuerpos humanos contra CTLA-4 humano, G-CSF humano, HSA humano, CD4 humano y EGFR humano. Los anticuerpos humanos de la presente invención incluyen anticuerpos que bloquean o antagonizan señales transducidas por receptores de superficie celular, tales como el receptor de CTLA-4 humano y el correceptor de CD4 humano. Algunos de dichos anticuerpos pueden unirse a un epítopo sobre CTLA-4 humano de manera que inhiben la interacción de CTLA-4 con un contrarreceptor de B7 humano. De manera similar, algunos de los anticuerpos pueden unirse a un epítopo sobre CD4 humana, de manera que inhiben la interacción de CD4 con el MHC de clase II humano. Debido a que la interacción de CTLA-4 humano con B7 humano transduce una señal que conduce a la inactivación de las células T que portan el receptor de CTLA-4 humano, el antagonismo de la interacción induce, incrementa o prolonga efectivamente la activación de las células T que portan el receptor de CTLA-4 humano, prolongando o incrementando de esta manera una respuesta inmunológica. La expresión "anticuerpo bloqueante" se refiere a un anticuerpo que reduce la unión del CTLA-4 humano soluble a ligando B7 humano expresado por la célula por lo menos en 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% o 99,9% bajo condiciones en las que la proporción entre sitios de unión a anticuerpo y sitio de unión de ligando CTLA-4 humano es superior a 1:1 y la concentración de anticuerpo es superior a 10^{-8} M.

La invención proporciona además anticuerpos IgA de secuencia humana contra una diversidad de antígenos humanos. Entre los anticuerpos IgA ejemplificativos se incluyen CD4, G-CSF, CTLA-4 y EGFR. Debido a que los anticuerpos IgA pueden formar dímeros, dichos anticuerpos IgA pueden presentar propiedades de entrecruzamiento mejoradas.

Otras preparaciones de anticuerpo, en ocasiones denominadas preparaciones multivalentes, se unen a receptores de superficie celular, tales como CTLA-4 humano de manera que entrecruzan múltiples receptores de CTLA-4 humano en la misma célula.

El entrecruzamiento también puede conseguirse mediante la unión de anticuerpos divalentes solubles que presentan diferentes especificidades de epítopo. Estas preparaciones de anticuerpo policlonal comprenden por lo menos dos pares de cadena pesada y cadena ligera que se unen a diferentes epítopos en el antígeno de manera que puede transducirse una señal como resultado del entrecruzamiento mediado por anticuerpo.

La expresión "anticuerpo humano recombinante" incluye todos los anticuerpos de secuencia humana de la invención que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo un ratón) que es transgénico para los genes de inmunoglobulina humana (descritosa continuación adicionalmente), anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, anticuerpos aislados a partir de una biblioteca combinatorial humana de anticuerpos, o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos recombinantes humanos presentan regiones variables y constantes (si se encuentran presentes) derivadas de secuencias de línea germinal humanas de inmunoglobulina. Sin embargo, dichos anticuerpos pueden someterse a mutagénesis in vitro (o, en el caso de que se utilice un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y de esta manera las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas y relacionadas con la secuencias VH y VL de línea germinal humana, pueden no existir naturalmente en el repertorio de la línea germinal humana de anticuerpos in vivo.

Se define "anticuerpo heterólogo" en relación al ratón transgénico que produce dicho anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que presenta una secuencia de aminoácidos o una secuencia codificante de ácidos nucleicos correspondiente a la que se encuentra en un organismo que no consiste en el ratón transgénico, y de manera general de una especie que no es el ratón transgénico.

La expresión "anticuerpo heterohíbrido" se refiere a un anticuerpo que presenta una cadena pesada y una cadena ligera de diferente origen de organismos. Por ejemplo, un anticuerpo que presenta una cadena pesada humana asociada a una cadena ligera murina es un anticuerpo heterohíbrido.

La expresión "sustancialmente puro" o "aislado" se refiere a que una especie objeto (por ejemplo un anticuerpo de la invención) ha sido identificada y separada y/o recuperada de un componente del ambiente natural de la misma de manera que la especie objeto es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición); una composición "sustancialmente pura" o "aislada" también se refiere a que la especie objeto comprende por lo menos aproximadamente 50 por ciento (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Una composición sustancialmente pura o aislada también puede comprender más de aproximadamente 80 a 90 por ciento en peso de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. Una especie objeto aislada (por ejemplo anticuerpos de la invención) también puede purificarse hasta esencialmente la homogeneidad (no pueden detectarse especies contaminantes en la composición mediante procedimientos de detección convencionales), en la que la composición consiste esencialmente de derivados de una sola especie macromolecular. Por ejemplo, un anticuerpo aislado contra CTLA-4 humano puede encontrarse sustancialmente libre de otros anticuerpos que no se unen a CTLA-4 humano y se unen a un antígeno diferente. Además, un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de CTLA-4 humano puede, sin embargo, presentar reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo de otras especies (por ejemplo homólogos de especies de CTLA-4). Además, un anticuerpo aislado de la invención puede encontrarse sustancialmente libre de otros materiales celulares (por ejemplo proteínas asociadas no inmunoglobulinas) y/o compuestos químicos.

La expresión "unión específica" se refiere a la unión preferida de un anticuerpo a un antígeno especificado, preferido relativamente a otros antígenos no especificados. La expresión "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo se refiere a una reacción de unión que determina la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y de otros elementos biológicos. Típicamente el anticuerpo se une con una constante de asociación (Ka) de por lo menos aproximadamente 1 x 10^{6} M^{-1} o 10^{7} M^{-1}, o de aproximadamente 10^{8} M^{-1} a 10^{9} M^{-1}, o de aproximadamente 10^{10} M^{-1} a 10^{11} M^{-1} o superior, y se une al antígeno especificado con una afinidad que es por lo menos dos veces superior a su afinidad de unión a un antígeno no especificado (por ejemplo BSA o caseína) que no es el antígeno especificado o un antígeno estrechamente relacionado. Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan intercambiablemente en la presente invención con la expresión "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno". Un antígeno predeterminado es un antígeno que se selecciona antes de la selección de un anticuerpo que se une a dicho antígeno.

La expresión "se une específicamente" en referencia a un péptido se refiere a una molécula péptido que presenta afinidad de unión intermedia o elevada, exclusiva o predominantemente, por una molécula diana. La expresión "específicamente se une a" se refiere a una reacción de unión que determina la presencia de una proteína diana en una población heterogénea de proteínas y de otros elementos biológicos. De esta manera, bajo condiciones de ensayo designadas, las grupos de unión especificados se unen preferentemente a una proteína diana particular y no se unen en una cantidad significativa a otros componentes presentes en una muestra de ensayo. La unión específica a una proteína diana bajo dichas condiciones puede requerir un grupo de unión que se selecciona por su especificidad para un antígeno diana particular. Puede utilizarse una diversidad de formatos de ensayo para seleccionar ligandos que son específicamente reactivos con una proteína particular. Por ejemplo, se utilizan inmunoensayos ELISA en fase sólida, inmunoprecipitación, Biacore y transferencia western para identificar péptidos que reaccionan específicamente con el antígeno. Típicamente una reacción específica o selectiva presentará una señal por lo menos dos veces superior a la de fondo o de ruido y más típicamente de 10 veces superior.

La expresión "afinidad elevada" para un anticuerpo se refiere a una constante de asociación de equilibrio (Ka) de por lo menos 10^{7} M^{-1}, de por lo menos aproximadamente 10^{8} M^{-1}, de por lo menos aproximadamente 10^{9} M^{-1}, de por lo menos aproximadamente 10^{10} M^{-1}, de por lo menos aproximadamente 10^{11} M^{-1}, o de por lo menos aproximadamente 10^{12} M^{-1} o superior, por ejemplo de hasta 10^{13} M^{-1} o 10^{14} M^{-1} o superior. Sin embargo, la unión "de afinidad elevada" puede variar para otros isotipos de anticuerpo.

El término "Ka", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende referirse a la constante de asociación de equilibrio de una interacción particular de anticuerpo-antígeno. Esta constante presenta unidades de 1/M.

El término "K_{d}", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende referirse a la constante de disociación de equilibrio de una interacción particular anticuerpo-antígeno. Esta constante presenta unidades de M.

El término "k_{a}", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende referirse a la constante de asociación cinética de una interacción particular de anticuerpo-antígeno. Esta constante presenta unidades de 1/Ms.

El término "k_{d}", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende referirse a la constante de disociación cinética de una interacción particular de anticuerpo-antígeno. Esta constante presenta unidades de 1/s.

La expresión "interacciones particulares de anticuerpo-antígeno" se refiere a las condiciones experimentales bajo las que se miden las constantes de equilibrio y cinética.

El término "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo que se encuentra codificada por los genes de la región constante de cadena pesada. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Las variaciones estructurales adicionales caracterizan los diferentes subtipos de IgG (por ejemplo IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} e IgG_{4}) e IgA (por ejemplo IgA_{1} e IgA_{2}).

La expresión "cambio de isotipo" se refiere al fenómeno por el que la clase, o isotipo, de un anticuerpo cambia de una clase de Ig a una de las demás clases de Ig.

La expresión "isotipo no cambiado" se refiere a la clase isotípica de cadena pesada que se produce cuando no ha tenido lugar ningún cambio de isotipo, el gen CH codificante del isotipo no modificado típicamente es el primer gen CH situado inmediatamente corriente abajo del gen VDJ funcionalmente reorganizado. Se ha clasificado el cambio de isotipo como cambio de isotipo clásico o no clásico. El cambio de isotipo clásico puede producirse mediante, por ejemplo, recombinación homóloga entre \sigma_{\mu} humana y \Sigma_{\mu} humana (deleción \delta-asociada). Pueden producirse mecanismos de cambio no clásicos alternativos, tales como la recombinación intertransgén y/o intercromosómica, entre otros, y llevar a cabo el cambio de isotipo.

La expresión "secuencia de cambio" se refiere a las secuencias de ADN responsables de la recombinación de cambio. Una secuencia "donante de cambio", típicamente una región de cambio \mu, se encuentra en posición 5' (es decir, corriente arriba) de la región del constructo que debe delecionarse durante la recombinación por cambio. La región "aceptora de cambio" se encuentra entre la región de constructo que debe delecionarse y la región constante de sustitución (por ejemplo \gamma, \varepsilon y similar). Debido a que no existe ningún sitio específico en el que se produzca siempre la recombinación, la secuencia génica final no es típicamente predecible a partir del constructo.

Se define "patrón de glucosilación" como el patrón de unidades carbohidrato que se encuentran unidas covalentemente a una proteína, más específicamente a una proteína inmunoglobulina. Puede caracterizarse un patrón de glucosilación de un anticuerpo heterólogo como sustancialmente similar a los patrones de glucosilación que se producen naturalmente en anticuerpos producidos por la especie del animal transgénico no humano, cuando el experto ordinario en la materia reconocería el patrón de glucosilación del anticuerpo heterólogo como más similar a dicho patrón de glucosilación en la especie del animal transgénico no humano que a la especie a partir de la que se derivaron los genes CH del transgén.

La expresión "de origen natural" tal como se aplica a un objeto se refiere a que puede encontrarse el objeto en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia polinucleótida que se encuentra presente en un organismo (incluyendo los virus) que puede aislarse a partir de una fuente en la Naturaleza y que no ha sido intencionadamente modificado por el ser humano en el laboratorio es de origen natural.

La expresión "locus de inmunoglobulina" se refiere a un elemento genético o un conjunto de elementos genéticos ligados que comprende información que puede ser utilizada por una célula B o precursor de célula B para expresar un péptido inmunoglobulina. Este péptido puede ser un péptido de cadena pesada, un péptido de cadena ligera, o la fusión de un péptido de cadena pesada y un péptido de cadena ligera. En el caso de un locus reorganizado, los elementos genéticos son ensamblados por un precursor de célula B para formar el gen codificante de un péptido inmunoglobulina. En el caso de un locus reorganizado, el locus contiene un gen codificante de un péptido inmunoglobulina.

El término "reorganizado" se refiere a una configuración de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina o de cadena ligera de inmunoglobulina en el que un segmento V se encuentra situado en posición inmediatamente contigua a un segmento D-J o J en una conformación que codifica un dominio VH o VL esencialmente completo, respectivamente. Puede identificarse un locus de gen de inmunoglobulina reorganizado mediante comparación con el ADN de línea germinal; un locus reorganizado presenta por lo menos un elemento heptámero/nonámero recombinado de homología.

El término "no reorganizado" o "configuración de línea germinal" en referencia a un segmento V se refiere a la configuración en la que el segmento V no se encuentra recombinado de manera que sea inmediatamente contiguo a un segmento D o J.

Los términos "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" es refiere a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma de cadena única o doble, y a menos que se encuentre limitado de otra manera, puede comprender análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de manera similar a nucleótidos de origen natural.

La expresión "ácido nucleico aislado" en referencia a ácidos nucleicos codificantes de anticuerpos o partes de anticuerpos (por ejemplo VH, VL, CDR3) que se unen al antígeno, pretende referirse a un ácido nucleico en el que las secuencias de nucleótidos codificantes del anticuerpo o parte de anticuerpo se encuentran libres de otras secuencias de nucleótidos codificantes de anticuerpos o partes de anticuerpo que se unen a antígenos que no son, por ejemplo, CTLA-4, otras secuencias que pueden flanquear naturalmente el ácido nucleico en el ADN genómico humano.

La expresión "sustancialmente idéntico" en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que presentan una identidad de residuos aminoácidos o de nucleótidos de por lo menos aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o superior cuando se comparan y se alinean para la máxima correspondencia, medida utilizando el procedimiento de comparación de secuencias siguiente y/o mediante inspección visual. Dichas secuencias "sustancialmente idénticas" típicamente se consideran homólogas. La "identidad sustancial" puede existir a lo largo de una región de secuencia que presenta una longitud de por lo menos aproximadamente 50 residuos, a lo largo de una región de por lo menos aproximadamente 100 residuos, o a lo largo de una región de por lo menos aproximadamente 150 residuos, o a lo largo de la longitud completa de las dos secuencias que deben compararse. Tal como se describe posteriormente, sólo pueden alinearse dos secuencias cualesquiera de anticuerpo de una única manera, mediante la utilización del esquema de numeración de Kabat. Por lo tanto, para los anticuerpos, el porcentaje de identidad presenta un significado único y bien definido.

Los aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas se denominan Hx y Lx, respectivamente, en los que x es el número que designa la posición de un aminoácido según el esquema de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991). Kabat presenta muchas secuencias de aminoácidos para los anticuerpos de cada subgrupo, y presenta los aminoácidos de aparición más común en cada posición de residuo en dicho subgrupo para generar una secuencia de consenso. Kabat utiliza un procedimiento para asignar un número de residuo a cada aminoácido en una secuencia presentada, y este procedimiento para asignar números de residuo se ha convertido en el estándar en la técnica. El esquema de Kabat es extensible a otros anticuerpos no incluidos en su compendio, mediante la alineación del anticuerpo en cuestión con una de las secuencias de consenso en Kabat como referencia a los aminoácidos conservados. La utilización del sistema de numeración de Kabat identifica con facilidad los aminoácidos en posiciones equivalentes en diferentes anticuerpos. Por ejemplo, un aminoácido en la posición L50 de un anticuerpo humano ocupa la posición equivalente a la posición aminoácido L50 de un anticuerpo de ratón. De manera similar, los ácidos nucleicos codificantes de cadenas de anticuerpo se encuentran alineadas cuando las secuencias de aminoácidos codificadas por los ácidos nucleicos respectivos se encuentran alineados según la convención de numeración de Kabat. Una definición estructural alternativa ha sido propuesta por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989, y Chothia et al., J. Mol. Biol. 186:651-663, 1989, que se incorpora a la presente memoria como referencia a todos los
fines.

La expresión "se hibrida selectivamente (o específicamente" se refiere a la unión, duplexación o hibridación de una molécula a una secuencia de nucleótidos particular bajo condiciones de hibridación restrictivas cuando dicha secuencia se encuentra presente en una mezcla compleja (por ejemplo ADN o ARN celular total o biblioteca de ADN o de ARN), en la que la secuencia de nucleótidos particular se detecta con un nivel por lo menos aproximadamente 10 veces superior al de fondo. En una forma de realización, puede determinarse que un ácido nucleico se encuentra comprendido dentro del alcance de la invención por su capacidad de hibridarse bajo condiciones restrictivas a un ácido nucleico que de otra manera se ha determinado que se encuentra comprendido dentro del alcance de la invención (tal como las secuencias ejemplificativas indicadas en la presente memoria).

La expresión "condiciones de hibridación restrictivas" se refiere a condiciones bajo las que se hibrida una sonda con la subsecuencia diana de la misma, típicamente en una mezcla compleja de ácidos nucleicos, pero no a otras secuencias en cantidades significativas (una señal positiva, por ejemplo la identificación de un ácido nucleico de la invención) presenta un nivel de aproximadamente 10 veces el nivel de hibridación de fondo). Las condiciones restrictivas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Puede encontrarse una guía extensa de la hibridación de ácidos nucleicos en, por ejemplo, Sambrook, editor, Molecular Cloning: A laboratory manual (2a edición), vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Current protocols in molecular biology, Ausubel, editor John Wiley & Sons, Inc., New York, 1997; Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology: hybridization with nucleic acid probes, part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, editor Elsevier, N.Y., 1993.

Generalmente las condiciones restrictivas son seleccionadas de manera que sean aproximadamente 5ºC a 10ºC inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica definida. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica, pH y concentración nucleica definidas) a la que el 50% de las sondas complementarias a la diana se hibridan con la secuencia diana en el equilibrio (debido a que las secuencias diana se encuentran presentes en exceso, a la Tm, el 50% de las sondas se encuentran ocupadas en el equilibrio). Las condiciones restrictivas son aquéllas en las que la concentración de salines es inferior a aproximadamente 1,0 M de ion sodio, típicamente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de ion sodio (u otras sales) a un pH de entre 7,0 y 8,3, y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo de 10 a 50 nucleótidos) y de por lo menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo mayores de 50 nucleótidos). También pueden conseguirse condiciones restrictivas añadiendo agentes desestabilizantes, tales como la formamida, tal como se describe en Sambrook (citado posteriormente). Para la hibridación de alta astringencia, una señal positiva es de por lo menos dos veces el nivel de fondo, preferentemente de 10 veces el nivel de hibridación de fondo. Entre las condiciones de hibridación ejemplares de alta astringencia o restrictivas se incluyen: formamida al 50%, 5x SSC y SDS al 1% incubando a 42ºC, o 5x SSC y SDS al 1% incubando a 65ºC, con un lavado en 0,2x SSC y SDS al 0,1% a 65ºC. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva (por ejemplo la identificación de un ácido nucleico de la invención) es de aproximadamente 10 veces el nivel de hibridación de fondo. Entre las condiciones restrictivas de hibridación que se utilizan para identificar ácidos nucleicos comprendidos dentro del alcance de la invención se incluyen, por ejemplo, la hibridación en un tampón que comprenden formamida al 50%, 5x SSC y SDS al 1% a 42ºC, o la hibridación en un tampón que comprende 5x SSC y SDS al 1% a 65ºC, ambos con un lavado de 0,2x SSC y SDS al 0,1% a 65ºC. En la presente invención puede identificarse ADN genómico o ADNc que comprende ácidos nucleicos de la invención en transferencias southern estándar bajo condiciones restrictivas utilizando las secuencias de ácidos nucleicos dadas a conocer en la presente memoria. Las condiciones restrictivas adicionales para dichas hibridaciones (para identificar los ácidos nucleicos comprendidos dentro del alcance de la invención) son las que incluyen una hibridación en un tampón de formamida al 40%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC.

Sin embargo, la selección de un formato de hibridación no resulta crítico: es la astringencia de las condiciones de lavado que llevan a las condiciones que determinan si un ácido nucleico se encuentra comprendido dentro el alcance de la invención. Entre las condiciones de lavado utilizadas para identificar ácidos nucleicos comprendidos dentro del alcance de la invención se incluyen, por ejemplo, una concentración salina de aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y una temperatura de por lo menos aproximadamente 50ºC o de entre aproximadamente 55ºC y aproximadamente 60ºC, o una concentración salina de aproximadamente 0,15 M de NaCl a 72ºC durante aproximadamente 15 minutos, o una concentración salina de aproximadamente 0,2X SSC a una temperatura de por lo menos aproximadamente 50ºC o de entre aproximadamente 55ºC y aproximadamente 60ºC durante aproximadamente 15 a aproximadamente 20 minutos, o el complejo de hibridación se lava dos veces con una solución con una concentración salina de aproximadamente 2X SSC que contiene SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos y después se lavó dos veces con 0,1X SSC que contenía SDS al 0,1% a 68ºC durante 15 minutos, o condiciones equivalentes (ver Sambrook, Tijssen y Ausubel para una descripción del tampón SSC y condiciones equivalentes).

La expresión "identidad de secuencia" se refiere a una medida de similitud entre las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos, y puede medirse utilizando procedimientos conocidos de la técnica, tales como aquellos descritos posteriormente.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que presentan un porcentaje especificado de residuos aminoácidos o de nucleótidos que son iguales (es decir una identidad de 60%, preferentemente de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% a lo largo de una región especificada, cuando se compara y se alinea para la máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación o de una región designada mediante la medición con uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o mediante alineación manual e inspección visual.

La expresión "sustancialmente idéntico" en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que presentan por lo menos 60%, con frecuencia por lo menos 70%, preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad de residuos aminoácidos o de nucleótidos, cuando se compara y se alinea para la máxima correspondencia, según medición con uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o según la inspección visual. Preferentemente, la identidad sustancial existe a lo largo de una región de las secuencias que presenta una longitud aproximada de 50 bases o residuos, más preferentemente a lo largo de una región de por lo menos aproximadamente 100 bases o residuos, y más preferentemente las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de por lo menos aproximadamente 150 bases o residuos. En una forma de realización más preferida, las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de la longitud completa de las regiones codificantes.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Al utilizar un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen en un ordenador las secuencias de ensayo y de referencia, se designan coordenadas de subsecuencias, si resulta necesario, y se fijan los parámetros de programa del algoritmo de secuencias. Pueden utilizarse parámetros de programa por defecto, o pueden fijarse parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula los porcentajes de identidad de secuencias para las secuencias de ensayo respecto a la secuencia de referencia basándose en los parámetros del programa. Para la comparación de secuencias de ácidos nucleicos y de proteínas, pueden utilizarse los algoritmos BLAST y BLAST 2.0 y los parámetros por defecto comentados a continuación.

Una "ventana de comparación", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye una referencia a un segmento de cualquiera de entre varias posiciones contiguas seleccionadas de entre el grupo constituido por 20 a 600, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en la que puede compararse una secuencia con una secuencia de referencia que presente el mismo número de posiciones contiguas tras la alineación óptima de las dos secuencias. Los procedimientos de alineación de secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica. Puede llevarse a cabo la alineación óptima de secuencias para la comparación, por ejemplo mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981), mediante el algoritmo de alineación de homologías de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988, mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information), GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante alineación manual e inspección visual (ver, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1987 (1999 supl.).

Un ejemplo preferido de algoritmo que resulta adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y la similitud de secuencias es el algoritmo FASTA, que se describe en Pearson, W.R. y Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988, ver también W.R. Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258, 1996. Se optimizan los parámetros preferidos utilizados en una alineación FASTA de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad, BL50 Matrix 15: -5, k-tuplo=2, penalización de unión=40, optimización=28, penalización de hueco=-12, penalización de longitud de hueco=-2, y anchura=16.

Otro ejemplo preferido de algoritmo que resulta adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977, y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990, respectivamente. Se utilizan BLAST y BLAST 2.0, con los parámetros indicados en la presente memoria, para determinar el porcentaje de identidad de secuencias para los ácidos nucleicos y proteínas de la invención. El software para llevar a cabo los análisis de BLAST se encuentra disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda, que corresponden o satisfacen una puntuación umbral T positiva cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. "T" se denomina puntuación umbral de vecindad de palabra (Altschul et al., supra). Estas palabras comunes ("word hits") vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que contengan las mismas. Las palabras comunes se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta la posición en que se pueda incrementar la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de premio para un par de residuos comunes, siempre >0) y N (puntuación de penalización para residuos no comunes; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. Se detiene la extensión de las palabras comunes en cada dirección en la posición en que: la puntuación de alineación acumulativa cae en la cantidad X respecto al valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa alcanza el valor de 0 o menor, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o cuando se alcanza el final de cualquiera de las dos secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) utiliza como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, un valor esperado (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como valores por defecto una longitud de palabra de 3, y un valor esperado (E) de 10, y alineaciones (B) de la matriz de puntuaciones BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915, 1989) de 50, valor esperado (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la suma de probabilidades más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con la que se produciría al azar una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la suma de probabilidades más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo y el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01, y todavía más preferentemente inferior a aproximadamente 0,001.

Otro ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones apareadas progresivas para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencias. También proporciona un árbol o dendrograma que muestra las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del procedimiento de alineación progresiva de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360, 1987. El procedimiento utilizado es similar al procedimiento descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989. El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple se inicia con la alineación apareada de las dos secuencias más similares, produciendo un agrupamiento de dos secuencias alineadas. Este agrupamiento se alinea a continuación con la siguiente secuencia más relacionada o agrupamiento de secuencias alineadas. Se alinean dos agrupamientos de secuencias mediante una simple extensión de la alineación por pares de dos secuencias individuales. La alineación final se consigue mediante una serie de alineaciones por pares progresiva. El programa se lleva a cabo designando secuencias específicas y las coordenadas de aminoácidos o nucleótidos de las mismas para regiones de comparación de secuencias y fijando los parámetros del programa. Utilizando PILEUP, se compara una secuencia de referencia con otras secuencias de ensayo para determinar el porcentaje de identidad de secuencias utilizando los parámetros siguientes: peso por defecto de hueco (3,00), peso por defecto de longitud de hueco (0,10) y huecos terminales ponderados. PILEUP puede obtenerse en el paquete de software de análisis de secuencias GCG, por ejemplo la versión 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395, 1984).

Otro ejemplo preferido de un algoritmo que resulta adecuado para alineaciones de múltiples secuencias de ADN y de aminoácidos es el programa CLUSTALW (Thompson, J.D. et al., Nucl. Acids. Res. 22:4673-4680, 1994). ClustalW lleva a cabo múltiples comparaciones por pares entre grupos de secuencias y ensambla las mismas en una alineación múltiple basada en homologías. Las penalizaciones de hueco abierto y de extensión de hueco eran de 10 y 0,05, respectivamente. Para las alineaciones de aminoácidos, puede utilizarse el algoritmo BLOSUM como matriz de pesos de la proteína (Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919, 1992).

Los ácidos nucleicos de la invención pueden encontrarse presentes en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o es "sustancialmente puro" cuando se purifica separándolo de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo de otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándares, entre ellas el tratamiento con álcali/SDS, ligadura CsCl, cromatografía en columna, electroforesis por gel de agarosa y otras bien conocidas en la técnica, por ejemplo Sambrook, Tijssen y Ausubel expuestos en la presente memoria e incorporados como referencia a todos los fines). Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención y otros ácidos nucleicos utilizados para la práctica de la presente invención, sean ARN, ADNc, ADN genómico o híbridos de los mismos, pueden aislarse a partir de una diversidad de fuentes, manipularse genéticamente, amplificarse y/o expresarse recombinantemente. Puede utilizarse cualquier sistema de expresión recombinante, incluyendo, además de sistemas bacterianos, sistemas, por ejemplo, de levadura, de insecto o de mamífero. Alternativamente, dichos ácidos nucleicos pueden sintetizarse químicamente in vitro. Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, la subclonación en vectores de expresión, sondas de marcaje, secuenciación e hibridación, se encuentran bien descritas en la literatura científica y de patentes, ver por ejemplo Sambrook, Tijssen y Ausubel. Pueden analizarse y cuantificarse los ácidos nucleicos mediante cualquiera de entre varios medios generales bien conocidos por los expertos en la materia. Entre ellos se incluyen, por ejemplo, procedimientos bioquímicos analíticos, tales como RMN, espectrofotometría, radiografía, electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía en capa fina (TLC) y cromatografía por hiperdifusión, diversos procedimientos inmunológicos, tales como reacciones de precipitina en fluido o en gel, inmunodifusión (única o doble), inmunoelectroforesis, radioinmunoensayos (RIA), ensayos de inmunosorción ligada a enzima (ELISA), ensayos de inmunofluorescencia, análisis de transferencia southern, análisis de transferencia northern, análisis de transferencia de puntos, electroforesis en gel (por ejemplo SDS-PAGE), PCR-RT, PCR cuantitativa, otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos o diana o de señal, marcaje radioactivo, recuento de centelleo y cromatografía por afinidad.

Las composiciones de ácidos nucleicos de la presente invención, aunque con frecuencia en una secuencia nativa (excepto por sitios de restricción modificados y similares), procedentes de ADNc, genómicas o mezclas, pueden encontrarse mutadas, de acuerdo con técnicas estándares para proporcionar secuencias génicas. Para las secuencias codificantes, estas mutaciones pueden afectar la secuencia de aminoácidos según se desee. En particular, se encuentran contempladas secuencias de ADN sustancialmente homólogas o derivadas de secuencias V, D, J nativas, constantes, con cambios y otras secuencias similares descritas en la presente invención (en la que "derivadas" indica que una secuencia es idéntica o se encuentra modificada respecto a otra secuencia).

Un ácido nucleico se encuentra "ligado funcionalmente" cuando se sitúa en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia. Con respecto a las secuencias reguladoras de la transcripción, ligado funcionalmente se refiere a que las secuencias de ADN que se ligan son contiguas y, en el caso de que resulten necesarias para unir dos regiones codificantes de proteína, se refiere a que son contiguas y se encuentran en el mismo marco de lectura. Para las secuencias de cambio, operablemente ligado indica que las secuencias pueden llevar a cabo una recombinación por cambio.

El término "vector" pretende referirse a una molécula de ácidos nucleicos capaz ce transportar otro ácido nucleico al que ha sido unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN circular de doble cadena en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo vectores bacterianos con un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Pueden integrarse otros vectores (por ejemplo vectores de mamífero no episómicos) en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y de esta manera se replican conjuntamente con el genoma del huésped. Además, determinados vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que se encuentran ligados funcionalmente. Dichos vectores se denominan en la presente memoria "vectores de expresión recombinante" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante con frecuencia se encuentran en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse intercambiablemente debido a que el plásmido es la forma de vector utilizada más comúnmente. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vector de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo retrovirus defectivos en replicación, adenovirus y virus adenoasociados), con funciones equivalentes.

La expresión "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped") se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que dichos términos pretenden referirse no sólo a la célula sujeto particular sino a la progenie de la célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones posteriores debido a mutación o a influencias ambientales, la progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula parental, aunque todavía se incluye dentro del alcance del término "célula huésped" tal como se utiliza en la presente memoria.

Un "marcaje" es una composición detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, entre los marcajes útiles se incluyen ^{32}P, pigmentos fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (por ejemplo tales como los utilizados comúnmente en una ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos y proteínas para los que se encuentran disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales (por ejemplo los polipéptidos de la invención pueden hacerse detectables, por ejemplo mediante la incorporación de un marcaje radioactivo en el péptido, y se utilizan para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el péptido).

El término "separación" en el contexto de células tal como se utiliza en la presente memoria se refiere tanto a la separación física de las células, tal como puede conseguirse utilizando, por ejemplo, un separador celular activado por fluorescencia, así como al análisis de células basado en la expresión de marcadores de superficie celular, por ejemplo el análisis FACS en ausencia de separación.

La expresión "respuesta de células inmunológicas" se refiere a la respuesta de las células del sistema inmunológico a estímulos externos o internos (por ejemplo antígenos, citoquinas, quimoquinas y otras células) que produce cambios bioquímicos en las células inmunológicas que resultan en la migración de células inmunológicas, la eliminación de células diana, la fagocitosis, la producción de anticuerpos, otros efectores solubles de la respuesta inmunológica y similares.

Las expresiones "respuesta de linfocitos T" y "actividad de linfocitos T" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para referirse al componente de la respuesta inmunológica que depende de los linfocitos T (es decir, la proliferación y/o diferenciación de linfocitos T en linfocitos T ayudantes, asesinos citotóxicos o supresores, el suminiostro de señales mediante linfocitos T adyudantes a linfocitos B que causan o impiden la producción de anticuerpo, la eliminación de células diana específicas por parte de los linfocitos T citotóxicos y la liberación de factores solubles, tales como citoquinas que modulan la función de otras células inmunológicas).

La expresión "respuesta inmunológica" se refiere a la acción concertada de linfocitos, células presentadoras de antígeno, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células indicadas anteriormente o el hígado (incluyendo anticuerpos, citoquinas y el complemento) que resulta en el daño selectivo, la destrucción o la eliminación del cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados por patógenos, células cancerosas o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

Pueden detectarse in vitro componentes de una respuesta inmunológica mediante diversos procedimientos que son bien conocidos por los expertos ordinarios en la materia. Por ejemplo, (1) pueden incubarse linfocitos T citotóxicos con células diana marcadas radioactivamente y detectar la lisis de estas células diana mediante la liberación de radioactividad, (2) pueden incubarse linfocitos T ayudantes con antígenos y células presentadoras de antígeno y medirse la síntesis y secreción de citoquinas mediante procedimientos estándares (Windhagen, A. et al., Immunity 2:373-80, 1995), (3) pueden incubarse células presentadoras de antígeno con antígeno proteína completa y detectarse la presentación de ese antígeno sobre el MHC mediante ensayos de activación de los linfocitos T o mediante procedimientos biofísicos (Harding et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:4230-4, 1989), (4) pueden incubarse mastocitos con reactivos que entrecruzan los receptores Fc-epsilon de los mismos y medirse la liberación de histamina mediante inmunoensayo enzimático (Siraganian et al., TIPS 4:432-437, 1983).

De manera similar, también pueden detectarse productos de una respuesta inmunológica en un organismo modelo (por ejemplo el ratón) o en un paciente humano mediante diversos procedimientos que son bien conocidos por los expertos ordinarios en la materia. Por ejemplo, (1) puede detectarse con facilidad la producción de anticuerpos en respuesta a la vacunación mediante procedimientos estándares utilizados actualmente en laboratorios clínicos, por ejemplo una ELISA, (2) la migración de células inmunológicas a sitios de inflamación puede detectarse arañando la superficie de la piel y disponiendo un recipiente estéril para capturar las células migratorios sobre el sitio de arañado (Peters et al., Blood 72:1310-1315, 1988), (3) la proliferación de células mononucleares sanguíneas periféricas en respuesta a mitógenos o reacción mixta de linfocitos puede medirse utilizando 3H-timidina, (4) puede medirse la capacidad fagocítica de granulocitos, macrófagos y otros fagocitos en PBMCs introduciendo los PMBC en pocillos junto con partículas marcadas (Peters et al., 1988), y (5) puede medirse la diferenciación de células del sistema inmunológico marcando los PBMCs con anticuerpos contra moléculas de CD, tales como CD4 y CD8 y midiendo la fracción de las PBMCs que expresan dichos marcadores.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ruta de transducción de señales" o "suceso de transducción de señales" se refiere a por lo menos una reacción bioquímica, aunque más comúnmente se refiere a una serie de reacciones bioquímicas, que resultan de la interacción de una célula con un compuesto o agente estimulante. De esta manera, la interacción de un compuesto estimulante con una célula genera una "señal" que se transmite a través de la ruta de transducción de señales, resultando finalmente en una respuesta celular, pro ejemplo en la respuesta inmunológica indicada anteriormente.

Una ruta de transducción de señales se refiere a la relación bioquímica entre una diversidad de moléculas de transducción de señales que desempeñan un papel en la transmisión de una señal de una parte de una célula a otra parte de una célula. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "receptor de superficie celular" incluye moléculas y complejos de moléculas que pueden recibir una señal y la transmisión de dicha señal a través de la membrana plasmática de una célula. Un ejemplo de un "receptor de superficie celular" de la presente invención es el receptor de células T (TCR) o los ligandos B7 de CTLA-4.

Una ruta de transducción de señales en una célula puede iniciarse mediante la interacción de una célula con un estimulante que se encuentra en el interior o en el exterior de la célula. Si es un estimulador exterior (es decir, se encuentra fuera de la célula) (por ejemplo un complejo de MHC-antígeno sobre una célula presentadora de antígeno) interacciona con un receptor de superficie celular (por ejemplo un receptor de células T), una ruta de transducción de señales puede transmitir una señal a través de la membrana de la célula, a través del citoplasma de la célula, y en algunos casos hacia el interior del núcleo. Si un estimulante interior (es decir, dentro de la célula) interacciona con una molécula intracelular de transducción de señales, una ruta de transducción de señales puede resultar en la transmisión de una señal a través del citoplasma de la célula, y en algunos casos hacia el interior del núcleo de la célula.

Puede producirse la transducción de señales mediante, por ejemplo, la fosforilación de una molécula, interacciones alostéricas no covalentes, el acomplejamiento de moléculas, el cambio conformacional de una molécula, la liberación de calcio, la producción de inositol fosfato, el corte proteolítico, la producción de nucleótido cíclico y la producción de diacilglicérido. Típicamente, se produce la transducción de señales mediante la fosforilación de una molécula de transducción de señales.

La expresión "activación de células T no específicas" se refiere a la estimulación de células T independiente de la especificidad antigénica de las mismas.

Problema y solución

Con el fin de conseguir una estabilidad mejorada del locus de cadena ligera kappa humana, se combinó la tecnología transcromosómica con tecnología anterior de microinyección pronuclear para generar animales transgénicos. El transgén Kco5 de locus de cadena ligera kappa humana (Fishwild, D. et al., Nat. Biotechnol. 14:845-851, 1996, patente US nº 5.770.429) incluye una parte sustancial del locus de kappa humana, y se mantiene de manera estable en la línea germinal de ratón y en células B, y en células hibridoma que expresan cadenas kappa humanas derivadas del transgén. Este transgén se combinó con el transcromosoma hCF(SC20) estable, conjuntamente con mutaciones de inactivación funcional de los loci endógenos de cadenas pesada y ligera kappa de ratón, generando animales que expresaban un amplio repertorio de anticuerpos humanos, incluyendo múltiples isotipos de cadena pesada humana. De esta manera, la estabilidad mejorada del transgén de cadena ligera, respecto a los ratones doble TC/KO (Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:722-727, 2000) permite la recuperación de un gran número de hibridomas a partir de cada fusión.

La invención proporciona la base para el aislamiento de anticuerpos completamente humanos de cualquier isotipo de cadena pesada deseado, incluyendo IgA_{1}, IgA_{2}, IgD, IgE, IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4} e IgM. En particular, pueden aislarse varios anticuerpos diferentes que presentan una afinidad elevada para antígenos predeterminados a partir de un solo ratón transgénico. En este contexto, pueden resultar útiles las consideraciones siguientes.

Fuentes de material

También puede generarse un ratón transgénico de la presente invención utilizando material depositado. Se han depositado células DT40 de pollo que conservan hCF(SC20) bajo el Tratado de Budapest el 9 de mayo de 2001 en el International Patent Organism Depository, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japón. El número de depósito es FERM BP-7583. El nombre de la línea celular asignado es SC20.

Las células DT40 de pollo que conservaban hCF(SC20) también han sido depositadas en el Food Industry Research and Development Institute (FIRDI) en Taiwan el 18 de agosto de 1999. El número de depósito es CCRC 960099. El nombre de línea celular asignado es SC20(D) en el depósito de Taiwán. hCF(SC20) retenido en células DT-40 de pollo puede transferirse a células ES de ratón tal como se describe en la patente WO nº 00/10383 (patente EP nº 1106061). Brevemente, se generan microcélulas a partir de células DT-40 de pollo y se fusionan con células CHO. Después, pueden seleccionarse células CHO que retienen hCF(SC20) basándose en la resistencia a G418. La retención de hCF(SC20) puede confirmarse mediante PCR o análisis FISH utilizando ADN de COT1 disponible comercialmente o sonda específica para cromosoma 14 humano. A continuación, se generan microcélulas a partir de las células CHO que retienen hCF(SC20) y se fusionan con células ES de ratón. Las células ES que retienen hCF(SC20) pueden seleccionarse de la misma manera que las células CHO.

Las células que retienen el ADN del transgén KCo5 han sido depositadas en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 bajo el Tratado de Budapest con los números de acceso indicados el 8 de noviembre de 2001: 17E1 en levadura (YAC y17, Medarex KCo5) asignado el nº ATCC PTA-3842 (el material genético es un cromosoma artificial de levadura que contiene una inserción del locus del gen de región variable de la cadena kappa de inmunoglobulina humana), pKV4 en E. coli (Medarex KCo5), asignado el nº ATCC PTA-3843 (plásmido que contiene los genes de región variable de inmunoglobulina humana), pKCIB en E. coli (Medarex KCo5), asignado el nº ATCC PTA-3844 (plásmido que contiene los genes de región constante de cadenas kappa y kappa J de inmunoglobulina humana).

Las células que retienen los ADNs del transgén KCo5 también han sido depositadas en la Food Industry Research and Development Institute (FIRDI), en Taiwán, el 22 de noviembre de 2001. Los números de depósito para pKV4, YACy17 y pKCIB son: CCRC 940383, CCRC 940385 y CCRC 940386, respectivamente.

El transgén KCo5 puede transferirse a células de ratón tal como se ha indicado anteriormente (Fishwild, D., ibid, ver también el Ejemplo 38 de la patente US nº 5.770.429, ver también el Ejemplo 2 posteriormente).

Características generales de las inmunoglobulinas

La unidad estructural básica del anticuerpo es conocido que comprende un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, presentando cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50 a 70 kDa). La parte aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento de antígeno. La parte carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora.

Las cadenas ligeras se clasifican en kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican en gamma, mu, alfa, delta o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante se encuentran unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 1 a 10 aminoácidos más (ver generalmente, Fundamental Immunology (Paul, W., editor, 2a edición, Raven Press, N.Y., 1989), capítulo 7 (incorporado como referencia en su totalidad a todos los fines).

Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión de antígeno. De esta manera, un anticuerpo intacto presenta dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son los mismos. Todas las cadenas muestran la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDRs. Las CDRs de las dos cadenas de cada par se encuentran alineadas por las regiones marco, permitiendo la unión a un epítopo específico. De extremo N-terminal a extremo C-terminal, tanto las cadenas ligera como pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio se realiza de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991), o Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987, Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989.

Los loci naturales de las inmunoglobulinas humanas

Las inmunoglobulinas humanas se encuentran naturalmente codificadas por tres loci diferentes: cadena pesada, cadena ligera kappa y cadena ligera lambda. Estos loci naturales se encuentran situados en los cromosomas 14, 2 y 22, respectivamente. El locus natural de cadena pesada humana, situado en 14q32.3, próximo al telómero del brazo largo del cromosoma 14 humano, se extiende a lo largo de aproximadamente 1,3 megabases y codifica aproximadamente 45 segmentos expresados del gen V, 27 segmentos del gen D, 6 segmentos del gen J y 9 segmentos del gen de región constante (C). El locus natural de la cadena ligera kappa humana, situado en 2p11.12 en el cromosoma 2, se extiende a lo largo de aproximadamente 1,8 megabases y comprende aproximadamente 34 segmentos expresados del gen V, 5 segmentos del gen J y un solo segmento del gen de la región C. El locus natural de lambda humano, situado en 22q11.2, se extiende a lo largo de aproximadamente 0,9 megabases y codifica aproximadamente 30 segmentos de gen V y 4 pares J-C funcionales, comprendiendo cada uno un solo segmento de gen J y un solo segmento de gen C. Cada uno de estos loci naturales también puede comprender deleciones, inserciones y polimorfismos de un solo nucleótido.

Producción de anticuerpos monoclonales mediante fusión de hibridoma

La producción de anticuerpos monoclonales puede conseguirse mediante, por ejemplo, la inmunización del animal con un antígeno (por ejemplo un antígeno de proteína humana, tal como CD4, G-CSF, HSA, EGFR o CTLA-4, un antígeno codificado por patógeno, una toxina u otro antígeno). También puede utilizarse un polipéptido más largo que comprende el antígeno o un fragmento inmunogénico del antígeno o anticuerpos antiidiotípicos contra un anticuerpo del antígeno (ver Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, CSHP New York, NY, 1988) y Mishell y Shiigi, Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co. New York, NY, 1980)) (ambas referencias se incorporan como referencia a todos los fines). Dicho inmúnogeno puede obtenerse a partir de una fuente natural, mediante síntesis peptídica o mediante expresión recombinante. Opcionalmente, el inmunógeno puede administrarse unido o, de otra manera, acomplejado, con una proteína portadora, tal como se describe posteriormente. Opcionalmente, el inmunógeno puede administrarse con un adyuvante. Pueden utilizarse varios tipos de adyuvante, tal como se indica posteriormente. Resulta preferido el adyuvante completo de Freund seguido de adyuvante incompleto para la inmunización de los animales de laboratorio. Típicamente se utilizan conejos o cobayas para preparar anticuerpos policlonales. Típicamente se utilizan roedores (por ejemplo ratones, ratas y hámsters) para preparar los anticuerpos monoclonales. Estos ratones pueden ser transgénicos, y pueden comprender secuencias de gen de inmunoglobulina humana, tal como se indica posteriormente. Tras la inmunización, los animales inmunizados desarrollan una respuesta sérica frente al inmunógeno introducido. Esta respuesta sérica puede medirse mediante titulación del suero recogido utilizando una diversidad de ensayos diferentes. Un ejemplo de un ensayo utilizado comúnmente es una ELISA. La magnitud de la respuesta sérica se denomina comúnmente título. Por ejemplo, un título de 1.000 indica que la presencia de anticuerpos reactivos puede detectarse mediante ensayo de una dilución de 1.000 veces del suero. Típicamente la inmunización resulta en una respuesta sérica varios órdenes de magnitud superior a la observada en animales no inmunizados. Las respuestas séricas de sólo uno o dos órdenes de magnitud se consideran débiles, y típicamente indican la presencia de pocas células B que expresan anticuerpos reactivos con el antígeno. Los anticuerpos monoclonales se obtiene rutinariamente fusionando linfocitos con células inmortalizadas (por ejemplo células de mieloma) para formar células híbridas, denominadas células hibridoma. Las células hibridoma recién formadas poseen propiedades de expresión de anticuerpo a partir de los linfocitos parentales, y propiedades de crecimiento a partir de las células inmortalizadas parentales. Las células hibridoma nuevamente formadas se cultivan en placas de cultivo (por ejemplo placas de 96 pocillos) que comprenden medio de cultivo. El sobrenadante de cultivo se somete a ensayo (típicamente entre una y dos semanas después de la fusión) para la presencia de anticuerpos de los isotipos deseados de cadena pesada y ligera, que son reactivos con el antígeno. Las células en este cultivo primario se diluyen a continuación y se siembran en placa nuevamente para aislar clones individuales de células hibridoma que segregan una sola especie de anticuerpo monoclonal. Este cultivo secundario puede subclonarse adicionalmente para obtener cultivos terciarios, y de esta manera sucesivamente. La fracción de cultivos primarios reactivos con el antígeno que puede utilizarse para obtener clones de hibridoma mediante dicho procedimiento de subclonación proporciona una medida de la eficiencia de subclonación. Si todos los cultivos de hibridoma primario positivos para el antígeno pueden utilizarse para derivar líneas celulares clonadas, la eficiencia de subclonación es del 100%. Si los loci de inmunoglobulina que codifican los anticuerpos expresados son inestables, por ejemplo se pierden con facilidad durante la división celular debido a la pérdida de un cromosoma, fragmento de cromosoma o transcromosoma, o mediante recombinación por deleción de una serie insertada, o mediante algún otro mecanismo, en este caso la eficiencia de subclonación es más reducida (es decir, inferior al 100%). Resulta particularmente útil disponer de un plataforma para derivar anticuerpos monoclonales en los que la eficiencia de subclonación resulte elevada (por ejemplo superior a 20%, preferentemente superior a 50%, más preferentemente superior a 80%, todavía más preferentemente superior a 90% o 95%). Se criban anticuerpos para la unión específica al antígeno. Opcionalmente, los anticuerpos se criban adicionalmente para la unión a una región específica del antígeno. Para los antígenos proteínas, este tipo de cribado puede conseguirse determinando la unión de un anticuerpo a una colección de mutantes por deleción del antígeno péptido y determinando qué mutantes por deleción se unen al anticuerpo. La unión puede evaluarse, por ejemplo, mediante transferencia western o ELISA. El fragmento más pequeño que muestra unión específica al anticuerpo define el epítopo del mismo. Sin embargo, algunos epítopos comprenden elementos estructurales no contiguos que pueden perderse mediante deleción de elementos fuera del epítopo actual. Alternativamente, puede determinarse la especificidad del epítopo mediante un ensayo de competición, en el que el anticuerpo de ensayo y de referencia compiten para la unión con el antígeno. Si los anticuerpos de ensayo y de referencia compiten, se unen al mismo epítopo o a epítopos suficientemente próximos para que la unión de un anticuerpo interfiera con la unión del otro.

Clonación de ácidos nucleicos codificantes de anticuerpos de hibridomas de células B

Los ácidos nucleicos que codifican por lo menos las regiones variables de cadenas pesada y ligera pueden clonarse en ratones inmunizados o transgénicos no inmunizados. Pueden clonarse los ácidos nucleicos como ADN genómico o ADNc en células linfáticas de dichos animales. No resulta necesaria la inmortalización de dichas células previamente a la clonación de las secuencias de inmunoglobulina. Habitualmente el ARNm se aísla y se amplifica mediante transcripción inversa con cebadores oligo-dT. A continuación, el ADNc se amplifica utilizando cebadores en regiones conservadas de inmunoglobulinas humanas. Las bibliotecas pueden enriquecerse con facilidad en isotipos no mu utilizando un cebador 3' específico para secuencias no mu (por ejemplo IgG o IgA). Típicamente la población amplificada de cadenas ligeras comprende por lo menos 100, 1.000, 10.000, 100.000 ó 1.000.000 cadenas ligeras diferentes. De manera similar, la población amplificada de cadenas pesadas comprende por lo menos 100, 1.000, 10.000, 100.000 ó 1.000.000 cadenas pesadas diferentes. Por ejemplo, utilizando cebadores de IgG, típicamente por lo menos 90%, 95% o 99% de las cadenas pesadas amplificadas son de isotipo de IgG. Los ácidos nucleicos que codifican por lo menos las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras también pueden subclonarse a partir de los hibridomas indicados anteriormente, mediante diversos procedimientos bien conocidos, tales como PCR o cribado de una biblioteca de ADNc mediante una sonda de ADN específica para regiones conservadas de los anticuerpos humanos. Los ácidos nucleicos codificantes de las cadenas de anticuerpo que deben subclonarse pueden extraerse mediante digestión de restricción de secuencias flanqueantes o pueden amplificarse mediante PCR utilizando cebadores en sitios que flanquean las secuencias codificantes. Ver generalmente PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (editor H.A. Erlich, Freeman Press, NY, NY, 1992), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (editores Innis et al., Academic Press, San Diego, CA, 1990), Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991, Eckert et al. 1991, PCR Methods and Applications 1:17, PCR (editores McPherson et al., IRL Press, Oxford). Estas referencias y las referencias citadas en las mismas se incorporan en la presente memoria como referencia a todos los fines.

Expresión recombinante de anticuerpos

Los ácidos nucleicos codificantes de las regiones variables de cadenas ligera y pesada, opcionalmente ligados a regiones constantes, se insertan en vectores de expresión. Las cadenas ligera y pesada pueden clonarse en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión diferentes. Los segmentos de ADN codificantes de cadenas de anticuerpo se encuentran ligados funcionalmente a secuencias de control en el vector o vectores de expresión que garantizan la expresión de cadenas de anticuerpo. Entre estas secuencias de control se incluyen una secuencia de señal, un promotor, un intensificador y una secuencia de terminación de transcripción. Los vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos huésped en forma de episomas o como parte integral del cromosoma del huésped.

E. coli es un huésped procariótico para expresar anticuerpos de la presente invención. Entre otros huéspedes microbianos para la utilización se incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilus y otras enterobacteriáceas, tales como Salmonella, Serratia y diversas especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procarióticos, también pueden prepararse vectores de expresión, que típicamente contienen secuencias de control de expresión compatibles con la célula huésped (por ejemplo un origen de replicación) y secuencias reguladoras, tales como un sistema promotor lactosa, un sistema promotor triptófano (trp), un sistema promotor beta-lactamasa o un sistema promotor de fago lambda.

También pueden utilizarse otros microorganismos, tales como levaduras, para la expresión. Saccharomyces es un huésped preferido, con vectores adecuados que presentan secuencias de control de expresión, tales como promotores, incluyendo la 3-fosfoglicerato quinasa u otros enzimas glucolíticos, y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee.

También puede utilizarse el cultivo celular de tejido de mamífero para expresar y para producir los anticuerpos de la presente invención (ver Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, N.Y., 1987)). Resultan preferidas las células eucarióticas, debido a que se han desarrollado varias líneas de células huésped adecuadas capaces de segregar anticuerpos intactos. Entre las células huésped adecuadas preferidas para expresar ácidos nucleicos codificantes de las inmunoglobulinas de la invención se incluyen: la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), la línea de riñón embrionario humano (293) (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59, 1977), células renales de hámster neonato (BHK, ATCC CCL 10), células de ovario de hámster chino-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:4216, 1980), células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980), células de riñón de mono (CV1, ATCC CCL 70), células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATTC CRL 1587), células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2), células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442), células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75), células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065), tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) y células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-46, 1982), células de baculovirus.

Los vectores que contienen las secuencias polinucleótidas de interés (por ejemplo, las secuencias codificantes de cadenas pesada y ligera y secuencias de control de expresión) pueden transferirse al interior de la célula huésped. Se utiliza la transfección con cloruro de calcio para las células procarióticas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación pueden utilizarse para otros huéspedes celulares (ver generalmente Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2a edición, 1989) (incorporada como referencia en su totalidad a todos los fines). Cuando se clonan cadenas pesada y ligera en vectores de expresión separados, los vectores se cotransfectan para obtener la expresión y ensamblaje de inmunoglobulinas intactas. Tras la introducción del ADN recombinante, se seleccionan las líneas celulares que expresan productos inmunoglobulina. Las líneas celulares capaces de expresión estable resultan preferentes (es decir, los niveles de expresión no se reducen tras cincuenta pasajes de cultivo de la línea celular).

Tras expresarse, los anticuerpos completos, los dímeros de los mismos, las cadenas ligera y pesada individuales, u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándares de la técnica, incluyendo la precipitación con sulfato amónico, columnas de afinidad, columna de cromatografía, electroforesis en gel y similares (ver generalmente Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982). Resultan preferidas las inmunoglobulinas sustancialmente puras de por lo menos 90% a 95% de homogeneidad, y resultan más preferentes las de 98% a 99% de homogeneidad.

Anticuerpos quiméricos y humanizados

Los anticuerpos quiméricos y humanizados presentan la misma o similar especificidad y afinidad de unión que un anticuerpo de ratón u otro anticuerpo no humano que proporciona el material de partida para la construcción de un anticuerpo quimérico o humanizado. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyos genes de cadena ligera y pesada han sido construidos, típicamente mediante ingeniería genética, a partir de segmentos de gen de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables (V) de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a segmentos constantes (C) humanos, tales como IgG_{1} e IgG_{4}. Resulta preferidos el isotipo IgG_{1} humano. Un anticuerpo quimérico típico de esta manera es una proteína híbrida constituida por el dominio V o de unión a antígeno de un anticuerpo de ratón y el dominio C o efecto de un anticuerpo humano.

Los anticuerpos humanizados presentan residuos de marco de región variable sustancialmente procedentes de un anticuerpo humano (denominado anticuerpo aceptor) y regiones determinantes de complementariedad sustancialmente procedentes de un anticuerpo de ratón (denominado inmunoglobulina donante) (ver Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033 y el documento WO nº 90/07861, patentes US nº 5.693.761, nº 5.693.761, nº 5.585.089, nº 5.530.101 y Winter, patente US nº 5.225.539 (incorporada como referencia en su totalidad para todos los fines)). La región o regiones constantes, si se encuentran presentes, también son sustancial o completamente procedentes de una inmunoglobulina humana. Los dominios variables humanos habitualmente se seleccionan de entre anticuerpos humanos cuyas secuencias marco muestran un elevado grado de identidad de secuencia con los dominios de región variable murina a partir de la que se derivaron las CDR. Los residuos de marco de región variable de cadena pesada y ligera pueden derivarse de la misma o de diferente secuencia humana de anticuerpo. Las secuencias humanas de anticuerpo pueden ser las secuencias de anticuerpos humanos de origen natural o pueden ser secuencias de consenso de varios anticuerpos humanos (ver Carter et al., patente WO nº 92/22653). Determinados aminoácidos de los residuos de marco de región variable humana se seleccionan para la sustitución basada en la posible influencia de los mismos sobre la conformación y/o unión de CDR al antígeno. La investigación de dichas posibles influencias se realiza mediante modelado, examen de las características de los aminoácidos en localizaciones particulares o la observación empírica de los efectos de la sustitución o la mutagénesis de aminoácidos particulares.

Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere en un residuo de marco de región variable murina y un residuo de marco de región variable humana seleccionada, el aminoácido de marco humano habitualmente debe sustituirse por el aminoácido de marco equivalente del anticuerpo de ratón, cuando se espera razonablemente que el aminoácido:

(1) liga el antígeno no covalentemente de manera directa,

(2) es contiguo a una región CDR,

(3) interacciona de otra manera con una región CDR (por ejemplo se encuentra a aproximadamente 6 A de una región CDR), o

(4) participa en la interfase VL-VH.

Otros candidatos para la sustitución son aminoácidos de marco humano aceptores que son poco habituales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos pueden sustituirse por aminoácidos de la posición equivalente del anticuerpo donante de ratón o de posiciones equivalentes de inmunoglobulinas humanas más típicas. Otros candidatos para la sustitución son aminoácidos de marco humano aceptores que son poco habituales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Los marcos de región variable de inmunoglobulinas humanizadas habitualmente muestran una identidad de secuencia del 85% con una secuencia de marco de región variable humana o secuencia de consenso de dichas secuencias.

Anticuerpos humanos

Se proporcionan anticuerpos humanos dirigidos contra antígenos específicos mediante una diversidad de técnicas indicada posteriormente. Se seleccionan algunos anticuerpos humanos mediante experimentos de unión competitiva, o de otra manera, que presentan la misma especificidad de epítopo que un anticuerpo particular de ratón, tal como uno de los anticuerpos monoclonales de ratón indicados en los Ejemplos. También pueden cribarse anticuerpos humanos para una especificidad particular de epítopo mediante la utilización de únicamente un fragmento del antígeno como inmunógeno y/o en el caso de los antígenos de proteína, mediante cribado de anticuerpos contra una colección de mutantes por deleción del antígeno.

Metodología del trioma

El enfoque básico y una pareja de fusión celular ejemplar, SPAZ-4, para la utilización en el presente enfoque, han sido descritos por Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367, 1983; Oestberg, patente US nº 4.634.664, y Engleman et al., patente US nº 4.634.666 (cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad a todos los fines). Las líneas celulares productoras de anticuerpo obtenidas mediante el presente procedimiento se denominan triomas debido a que descienden de tres células, dos humanas y una de ratón. Inicialmente, se fusiona una línea de mieloma de ratón con un linfocito B humano, obteniendo una célula híbrida xenogeneica no productora de anticuerpos, tal como la línea celular SPAZ-4 descrita por Oestberg, supra. La célula xenogeneica se fusiona a continuación con un linfocito B humano inmunizado, obteniendo una línea celular de trioma productora de anticuerpo. Se ha observado que los triomas producen anticuerpos más de manera estable que los hibridomas ordinarios construidos a partir de células humanas.

Aunque los triomas son genéticamente estables, no producen anticuerpos a niveles muy elevados. Pueden incrementarse los niveles de expresión mediante clonación de genes de anticuerpo a partir del trioma en uno o más vectores de expresión, y transformando el vector en líneas celulares estándares de mamífero, bacteria o levadura.

Ratones transgénicos

Los anticuerpos humanos contra una diversidad de antígenos también pueden producirse a partir de ratones transgénicos que comprenden loci de inmunoglobulina humana. Típicamente estos loci de inmunoglobulina pueden codificar anticuerpos de secuencia sustancialmente humana, preferentemente 95% o más idénticos a secuencias humanas, más preferentemente 98%-99% o más idénticos, y más preferentemente 100% idénticos. Los loci de inmunoglobulina pueden estar reorganizados o no, y pueden comprender deleciones o inserciones respecto a los loci de inmunoglobulina humanos naturales. Los loci pueden incluir elementos genéticos (por ejemplo elementos no codificantes, tales como intensificadores, promotores y secuencias de cambio, o elementos codificantes, tales como segmentos génicos de región constante mu) de otras especies, y de loci de inmunoglobulina, que no contribuyen sustancialmente a la parte codificante de anticuerpos del repertorio secundario (no IgM). Los loci de inmunoglobulina humana preferidos experimentan alteraciones de la secuencia de ADN, incluyendo unión de V(D)J, cambio de clase de cadena pesada y mutación somática en células linfoides y/o precursores de células linfoides en el ratón transgénico para producir anticuerpos humanos de elevada afinidad contra antígenos predeterminados. Los loci de inmunoglobulina humana contenidos en estos ratones transgénicos preferentemente incluyen secuencias no reorganizados de loci de cadena pesada y de cadena ligera humanas. Habitualmente, el locus de inmunoglobulina endógena de dichos ratones transgénicos se encuentra funcionalmente inactivado (patente US nº 5.589.369; Takeda, S. et al., EMBO J. 12:2329-22366, 1993; Jakobovits, A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:2551-2555, 1993; Kitamura, D. y Rajewsky, K., Nature 356:154-156, 1992; Gu, H. et al., Cell 65:47-54, 1991; Chen, J. et al., EMBO J. 12:821-830,; Sun, W. et al., J. Immunol. 152:695-704, 1994; Chen, J. et al., Intl. Immunology 5:647-656, 1993; Zou, X. et al., Eur. J. Immunol. 25:2154-2162, 1995; Chen, J. et al., Intl. Immunology 5:647-656, 1993; Boudinot, P. et al., Eur. J. Immunol. 25:2499-2505, 1995; Chen, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:4528-4532, 1993; Roes, J. y Rajewsky, K., Intl. Immunology 3:1367-1371, 1991; Gu, H. et al., Cell 73:1155-1165, 1993; Taki, S. et al., Science 262:1268-1271, 1993; Kitamura, D. et al., Nature 350:423-6, 1991; Lutz, C. et al., Nature 393:797-801, 1998; Zou, Y. et al., Current Biology 4:1099-1103, 1994; Chen, J. et al., EMBO J. 12:4635-4645, 1993; Serwe, M. y Sablitzky, F., EMBO J. 12:2321-2327, 1993; Sanchez, P. et al., Intl. Immunology 6:711-719, 1994; Zou, Y. et al., EMBO J. 12:811-820, 1993). Los loci exógenos de inmunoglobulina humana pueden asociarse a los cromosomas endógenos de ratón o pueden pertenecer a (por ejemplo formando parte, estando insertados o unidos) un transcromosoma introducido. Los transcromosomas se introducen en una célula en forma de cromosoma no endógeno o fragmento de cromosoma con un centrómero y dos telómeros. Estos transcromosomas comúnmente comprenden secuencias de telómero y de centrómero y pueden comprender deleciones respecto al cromosoma intacto parental. Los transcromosomas también pueden comprender secuencias insertadas adicionales. Por ejemplo, pueden combinarse dos loci de inmunoglobulina humana en un solo transcromosoma mediante inserción de secuencias de un primer locus de inmunoglobulina (por ejemplo de un clon YAC, un transcromosoma o un cromosoma intacto) en un transcromosoma que comprende un segundo locus de inmunoglobulina. Este procedimiento también puede repetirse para combinar los tres loci humanos de inmunoglobulina en un solo transcromosoma. Un solo transcromosoma que comprende dos o tres loci de inmunoglobulina diferentes permite el ligamiento genético de estos loci, incrementando la fracción de progenie transgénica que resulta útil para preparar anticuerpos humanos. Son formas preferidas de transcromosomas las descritas en detalle en Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:722-727, 2000; Tomizuka, K. et al., Nature Genetics 16:133-143, 1997 y patentes WO nº 97/07671, nº WO 98/37757 y nº WO 00/10383, cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad a todos los fines. Los transcromosomas también pueden incluir marcadores seleccionables integrados (por ejemplo genes de resistencia a la neomicina) y otras secuencias que no se encuentran en el cromosoma parental intacto. En el caso de que se produzca recombinación entre un transcromosoma y un cromosoma endógeno de ratón, se insertan o se añaden secuencias del transcromosoma al cromosoma endógeno de ratón. Los transcromosomas pueden modificarse mediante deleción, traslocación, sustitución y similar, tal como se describe en la patente WO nº 98/37757, patente EP nº 0972445 y patente WO nº 00/10383, que se incorporan en la presente invención como referencia a todos los fines. Por ejemplo, los transcromosomas pueden fragmentarse espontáneamente durante el curso de la introducción en células madre (ES) embrionarias de ratón, fragmentadas mediante truncado dirigido por telómeros y/o translocadas mediante recombinación Cre/loxP específica de sitio o procedimientos similares. Dichos sucesos de recombinación o de translocación pueden promoverse específicamente insertando sitios de recombinación (por ejemplo secuencias loxP y otros; ver, por ejemplo, Abuin, A. y Bradley, A., Mol. Cell. Bio. 16:1851-1856, 1996; Mitani, K. et al., Somat. Cell. Mol. Genet. 21:221-231, 1995; Li, Z.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:6158-6162, 1996, Smith, A.J. et al., Nat. Genet. 9:376-385, 1995; Trinh, K.R. y Morrison, S.L., J. Immunol. Methods 244:185-193, 2000; Sunaga, S. et al., Mol. Reprod. Dev. 46:109-113, 1997; Dymecki, S.M., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:6191-6196, 1996; Zou, Y.R. et al., Curr. Biol. 4:1099-1103, 1994; Rudolph, U. et al., Transgenic Res. 2:345-355, 1993; Rickert, R.C. et al., Nucleic Acids Res. 25:1317-1318, 1997). En el caso de sitios loxP introducidos, la expresión de un transgén codificante de la recombinasa cre promoverá la recombinación entre los dos sitios loxP. El transcromosoma también puede ser un cromosoma de fusión constituido por diferentes fragmentos de cromosoma como resultado de la translocación descrita anteriormente. Los transcromosomas pueden ser autónomos. Los transcromosomas autónomos, respecto a los cromosomas endógenos de ratón, son diferentes, no contiguos y no han sido insertados en los mismos. Estos transcromosomas autónomos comprenden secuencias de telómero y de centrómero que permiten la replicación autónoma. Alternativamente, las secuencias de transcromosoma pueden translocarse en cromosomas de ratón tras la introducción en núcleos de células de ratón. Los cromosomas de ratón endógenos incluyen 19 pares de cromosomas autosómicos y los cromosomas X e Y.

La introducción de loci humanos exógenos de inmunoglobulina puede conseguirse mediante una diversidad de procedimientos, incluyendo, por ejemplo, la microinyección de pronúcleos de embrión de medio día, la transfección de células madre embrionarias o la fusión de células madre embrionarias con esferoplastos de levadura o micronúcleos que comprenden transcromosomas. Los ratones transgénicos resultantes de los procedimientos descritos anteriormente pueden reorganizar funcionalmente las secuencias componente de inmunoglobulina exógenas introducidas, y expresar un repertorio de anticuerpos de diversos isotipos codificados por genes humanos de inmunoglobulina sin expresar los genes endógenos de inmunoglobulina. La producción y propiedades de los ratones que presentan estas propiedades se describen en detalle en, por ejemplo, Lonberg et al., documento WO nº 93/12227, 1993, patentes US nº 5.877.397, nº 5.874.299, nº 5.814.318, nº 5.789.650, nº 5.770.429, nº 5.661.016, nº 5.633.425, nº 5.625.126, nº 5.569.825, nº 5.545.806, Nature 48:1547-1553, 1994, Nature Biotechnology 14:826, 1996, Kucherlapati, documentos WO nº 91/10741, 1991, WO 94/02602 (1993), WO 96/34046 (1995), WO 96/33735 (1996), WO 98/24893 (1997), patentes us nº 5.939.598, nº 6.075.181, nº 6.114.598, Tomizuka, K. et al., 2000, Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 97:722-727, Tomikuza, K et al., 1997, Nature Genetics 16: 133-143, y Tomikuza, K., documentos WO nº 97/07671, nº 98/37757, nº 00/10383 y JP nº 2000-42074 (cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad a todos los fines). Los ratones transgénicos resultan particularmente adecuados. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales, por ejemplo mediante fusión de células B de dichos ratones con líneas celulares inmortales adecuadas utilizando tecnología convencional de Kohler-Milstein. Los anticuerpos monoclonales también pueden accederse directamente a partir de células B individuales, aislarse a partir del medio, utilizando amplificación por PCR de las regiones V (Schrader et al., patente US nº 5.627.052, 1997). Alternativamente, pueden utilizarse preparaciones de células B separadas mediante FACS o enriquecidas de otra manera como fuente de ARN o de ADN para la amplificación por PCR de secuencias de región V. También pueden utilizarse procedimientos de presentación fágica (descritos a continuación) para obtener secuencias humanas de anticuerpos a partir de ratones transgénicos inmunizados que comprenden loci humanos de inmunoglobulina. Las secuencias humanas de región V de anticuerpo obtenidas mediante estos procedimientos pueden utilizarse a continuación para generar anticuerpos intactos que conservan las características de unión de los anticuerpos parentales originales. Este procedimiento se describe a continuación.

Procedimientos de presentación fágica

Un enfoque adicional para obtener anticuerpos humanos es cribar una biblioteca de ADNc a partir de células B de acuerdo con el protocolo general descrito de manera general por Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989. Estas células B pueden obtenerse a partir de un ser humano inmunizado con el antígeno deseado, fragmentos, polipéptidos más largos que contienen el antígeno o fragmentos o anticuerpos antiidiotípicos. Opcionalmente, dichas células B se obtienen a partir de un individuo que no ha sido expuesto al antígeno. Las células B también pueden obtenerse a partir de ratones transgénicos que expresan las secuencias humanas de inmunoglobulina. Los ratones transgénicos pueden inmunizarse con un antígeno o colección de antígenos. Los animales también pueden no inmunizarse. Las secuencias de ARNm de células B codificantes de anticuerpos humanos se utilizan para generar ADNc utilizando transcriptasa inversa. Los segmentos de las secuencias de ADNc codificantes de la región V se clonan a continuación en un vector de ADN que dirige la expresión de las regiones V de anticuerpo. Típicamente las secuencias de región V se amplifican específicamente mediante PCR previamente a la clonación. También típicamente, se clonan las secuencias de región V en un sitio dentro del vector de ADN que ha sido construido de manera que la región V se expresa en forma de una proteína de fusión. Entre los ejemplos de dichas proteínas de fusión se incluyen el gen 3 del colifago m13 y las proteínas de fusión del gen 8. La colección de secuencias clonadas de región V a continuación se utiliza para generar una biblioteca de expresión de las regiones V de anticuerpo. Con el fin de generar una biblioteca de expresión, el vector de ADN que comprende las secuencias clonadas de región V se utiliza para transformar células huésped eucarióticas o procarióticas. Además de las regiones V, el vector opcionalmente puede codificar la totalidad o parte de un genoma vírico, y puede comprender secuencias de empaquetamiento vírico. En algunos casos, el vector no comprende un genoma vírico completo, y el vector a continuación se utiliza conjuntamente con un virus ayudante o con secuencias de ADN de virus ayudante. Las regiones V de anticuerpo expresadas se encuentran en el interior o en la superficie de células transformadas o de partículas víricas procedentes de las células transformadas. Dicha biblioteca de expresión, que comprende las células o partículas víricas, a continuación se utiliza para identificar secuencias de región V que codifican anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo que reaccionan con antígenos predeterminados. Con el fin de identificar estas secuencias de región V, la biblioteca de expresión se criba o se selecciona para la reactividad de las regiones V expresadas con los antígenos predeterminados. Las células o partículas víricas que comprenden las secuencias clonadas de región V, y que presentan las regiones V expresadas, se criban o se seleccionan mediante un procedimiento que identifica o que enriquece para células o partículas víricas que presentan regiones V reactivas (por ejemplo de unión o actividad catalítica) con un antígeno predeterminado. Por ejemplo, puede detectarse antígeno marcado por fluorescencia o con radioactividad que a continuación se une a las regiones V expresadas, y utilizarse para identificar o separar células o partículas víricas. El antígeno unido a una matriz sólida o perla también puede utilizarse para seleccionar las células o partículas víricas que presentan regiones V reactivas sobre la superficie. Las secuencias de región V identificadas de esta manera a partir de la biblioteca de expresión a continuación pueden utilizarse para dirigir la expresión, en una célula huésped transformada, de un anticuerpo o fragmento del mismo, que presenta reactividad con el antígeno predeterminado. El protocolo descrito por Huse resulta más eficiente en combinación con la tecnología de expresión fágica. Ver, por ejemplo, Dower et al., patente WO nº 91/17271 y McCafferty et al., patente WO nº 92/01047, patentes US nº 5.871.907, nº 5.858.657, nº 5.837.242, nº 5.733.743 y nº 5.565.332 (cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad a todos los fines). En estos procedimientos, se producen bibliotecas fágicas en las que los elementos (paquetes de presentación) expresan diferentes anticuerpos sobre las superficies exteriores de los mismos. Los anticuerpos habitualmente se expresan en forma de fragmentos Fv o Fab. Pueden seleccionarse los fagos que expresan anticuerpos con una especificidad deseada mediante enriquecimiento por afinidad para el antígeno o fragmento del mismo. La expresión fágica en combinación con ratones transgénicos inmunizados que expresan genes humanos de inmunoglobulina pueden utilizarse para obtener anticuerpos específicos de antígeno incluso cuando la respuesta inmunológica contra el antígeno es débil.

En una variación del procedimiento de presentación fágica, pueden producirse anticuerpos humanos que presentan la especificidad de unión de un anticuerpo murino seleccionado. Ver, por ejemplo, Winter, patente WO nº 92/20791. En este procedimiento, se utiliza la región variable de cadena pesada o de cadena ligera del anticuerpo murino seleccionado como el material de partida. Si, por ejemplo, se selecciona una región variable de cadena ligera como el material de partida, se construye una biblioteca fágica en la que los elementos expresan la misma región variable de cadena ligera (es decir, el material de partida murino) y una región variable de cadena pesada diferente. Las regiones variables de cadena pesada se obtienen a partir de una biblioteca de regiones variables de cadena pesada humanas reorganizadas. Se selecciona un fago que muestra una fuerte unión específica para CTLA-4 (por ejemplo por lo menos 10^{8} y preferentemente por lo menos 10^{9} M^{-1}). La región variable de cadena pesada humana procedente de dicho fago sirve a continuación como material de partida para construir una biblioteca fágica adicional. En esta biblioteca, cada fago expresa la misma región variable de cadena pesada (es decir, la región identificada a partir de la primera biblioteca de expresión) y una diferente región variable de cadena ligera. Las regiones variables de cadena ligera se obtienen a partir de una biblioteca de regiones variables de cadena ligera reorganizadas. Nuevamente, se seleccionan los fagos que muestran una unión específica fuerte con los anteriormente seleccionados. Pueden obtenerse anticuerpos artificiales que son similares a anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de presentación fágica que incorporan secuencias aleatorias o sintéticas, por ejemplo en regiones CDR.

Selección de región constante

Las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera de anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos pueden ligarse a por lo menos una parte de una región constante humana mediante diversos procedimientos bien conocidos (ver, por ejemplo, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033, 1989, y patente WO nº 90/07861; estas referencias y las referencias citadas en las mismas se incorporan a la presente invención como referencia a todos los fines). La elección de región constante depende, en parte, de si se desea complemento dependiente de anticuerpo y/o toxicidad mediada por células. Por ejemplo, los isotipos IgG_{1} e IgG_{3} habitualmente presentan mayor actividad de unión del complemento que los isotipos IgG_{2} o IgG_{4}. La elección de isotipo también puede afectar al paso de anticuerpo hacia el interior del cerebro. Las regiones constantes de cadena ligera pueden ser lambda o kappa. Los anticuerpos pueden expresarse en forma de tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en forma de cadenas pesadas o cadenas ligeras separadas, de Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv, o en forma de anticuerpos de una cadena en los que los dominios variables de cadena pesada y ligera se encuentran unidos mediante un espaciador.

Para algunas aplicaciones, pueden resultar útiles los anticuerpos no IgG. Por ejemplo, en el caso de que se deseen complejos de anticuerpo multivalente, pueden utilizarse anticuerpos IgM e IgA.

Utilización de secuencias parciales de anticuerpo para expresar anticuerpos intactos

Los anticuerpos interaccionan con antígenos diana predominantemente mediante residuos aminoácidos que se encuentran situados en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadenas pesada y ligera. Por ello, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, resulta posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos de origen natural específicos mediante la construcción de vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR procedentes del anticuerpo específico de origen natural injertado en las secuencias marco de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (ver, por ejemplo, Riechmann, L. et al., Nature 332:323-327, 1988; Jones, P. et al., Nature 321:522-525, 1986; y Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033, 1989). Dichas secuencias marco pueden obtenerse a partir de bases de datos de ADN públicas que incluyen secuencias génicas de línea germinal de anticuerpo. Estas secuencias de línea germinal difieren de las secuencias génicas maduras de anticuerpo debido a que no incluyen genes variables completamente ensamblados, que se forman mediante unión de V(D)J durante la maduración de las células B. Las secuencias génicas de línea germinal también difieren de la secuencia de un anticuerpo secundario de alta afinidad del repertorio en nucleótidos individuales debido a mutaciones somáticas. Sin embargo, las mutaciones somáticas no se encuentran distribuidas uniformemente en la región variable. Por ejemplo, las mutaciones somáticas son relativamente infrecuentes en la parte amino-terminal de la región marco 1 y en la parte carboxi-terminal de la región marco 4. Además, muchas mutaciones somáticas no alteran significativamente las propiedades de unión del anticuerpo. Por este motivo, no resulta necesario obtener la secuencia de ADN completa de un anticuerpo particular con el fin de recrear un anticuerpo recombinante intacto que presente propiedades de unión similares a las del anticuerpo original (ver el documento PCT/US99/05535, presentado el 12 de marzo de 1999, que se incorpora a la presente invención como referencia a todos los fines). Las secuencias parciales de cadena pesada y de cadena ligera que comprenden las regiones de CDR típicamente resultan suficiente para este fin. La secuencia parcial se utiliza para determinar qué segmentos génicos de línea germinal variables y de unión contribuyen a los genes variables recombinados de anticuerpo. La secuencia de línea germinal a continuación se utiliza para rellenar partes faltantes de la región variable. Las secuencias líder de cadena pesada y de cadena ligera se cortan durante la maduración de la proteína y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Por este motivo no resulta necesario utilizar la secuencia líder de línea germinal correspondiente para los constructos de expresión. Para añadir secuencias faltantes, pueden combinarse secuencias clonadas de ADNc con oligonucleótidos sintéticos mediante ligación o amplificación por PCR. Alternativamente, la región variable completa puede sintetizarse en forma de un conjunto de oligonucleótidos cortos solapantes y combinarse mediante amplificación por PCR para crear un clon de región variable completamente sintético. Este procedimiento presenta ciertas ventajas, tales como la eliminación o la inclusión de sitios de restricción particulares o la optimización de codones particulares.

Las secuencias de nucleótidos de transcritos de cadena pesada y de cadena ligera de un hibridoma se utilizan para diseñar un conjunto solapante de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias V sintéticas con capacidades idénticas de codificación de aminoácidos a las de las secuencias naturales. Las secuencias de cadena pesada y ligera kappa sintéticas pueden diferir de las secuencias naturales de tres maneras: se encuentran interrumpen series de bases nucleótidas repetidas para facilitar la síntesis de oligonucleótidos y la amplificación por PCR; los sitios de inicio de traducción óptimos se incorporan siguiendo las reglas de Kozak (Kozak, J. Biol. Chem. 266:19867-19870, 1991) y se introducen sitios HindIII corriente arriba de los sitios de inicio de traducción.

Para las regiones variables tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera, las secuencias optimizadas de cadena codificante, y no codificante correspondiente, se rompen en segmentos de 30 a 50 nucleótidos, de manera que las roturas entre los nucleótidos de la secuencia de la cadena codificante se encuentran aproximadamente en el punto medio de los oligonucleótidos no codificantes correspondientes. De esta manera, para cada cadena, los oligonucleótidos pueden ensamblarse formando conjuntos de doble cadena solapantes que abarcan por completo la secuencia deseada. Estos oligonucleótidos se combinan en grupos que comprenden segmentos de 150 a 400 nucleótidos. Los grupos se utilizan a continuación como moldes para producir productos de amplificación por PCR de 150 a 400 nucleótidos. Típicamente se rompe un solo conjunto de oligonucleótidos de región variable en dos conjuntos que se amplifican separadamente para generar dos productos de PCR solapantes. Estos productos solapantes se combinan a continuación mediante amplificación por PCR para formar la región variable completa. También puede resultar deseable incluir un fragmento solapante de la región constante de cadena pesada o de cadena ligera (incluyendo el sitio BbsI de la cadena ligera kappa o el sitio AgeI de la cadena pesada gamma) en la amplificación por PCR para generar fragmentos que pueden clonarse fácilmente en los constructos de vector de expresión.

Las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera reconstruidas se combinan a continuación con secuencias de promotor clonado, de inicio de traducción, de región constante, 3' no traducidas, de poliadenilación y de terminación de transcripción, para formar constructos vectores de expresión. Los constructos de expresión de cadena pesada y de cadena ligera pueden combinarse en un solo vector, cotransfectarse, transfectarse en serie o transfectarse separadamente en células huésped que a continuación se fusionan para formar una célula huésped que expresa ambas cadenas.

Se describen posteriormente plásmidos para la utilización en la construcción de vectores de expresión para la IgG\kappa humana. Los plásmidos se construyeron de manera que pudiesen utilizarse secuencias de ADNc de cadena pesada V y de cadena ligera kappa V amplificadas mediante PCR para reconstruir minigenes completos de cadena pesada y de cadena ligera. Estos plásmidos pueden utilizarse para expresar anticuerpos IgG_{1}\kappa o IgG_{4}\kappa completamente humanos o quiméricos. Pueden construirse para la expresión de otros isotipos de cadena pesada, o para la expresión de anticuerpos que comprenden cadenas ligeras lambda.

El plásmido de cadena ligera kappa, pCK7-96 (SEC ID nº 1) presentado a continuación, incluye la región constante kappa y el sitio de poliadenilación, de manera que las secuencias kappa amplificadas con cebadores 5' que incluyen sitios HindIII corriente arriba del iniciador metionina pueden digerirse con HindIII y BbsI, y clonarse en pCK7-96 digerido con HindIII y BbsI para reconstruir una secuencia codificante de cadena ligera completa conjuntamente con un sitio de poliadenilación. Este casete puede aislarse en forma de fragmento HindIII/NotI y ligarse a secuencias promotoras de transcripción para crear un minigén funcional para la transfección de células.

El plásmido de cadena pesada gamma1, pCG7-96 (SEC ID nº 2) incluye la región constante gamma1 humana y un sitio de poliadenilación, de manera que las secuencias gamma amplificadas con cebadores 5' que incluyen sitios HindIII corriente arriba del iniciador metionina pueden digerirse con HindIII y AgeI, y clonarse en pCG7-96 con HindIII y AgeI para reconstruir una secuencia codificante de cadena pesada gamma1 completa conjuntamente con un sitio de poliadenilación. Este casete puede aislarse en forma de fragmento HindIII/Sa1I y ligarse a secuencias promotoras de transcripción, creando un minigén funcional para la transfección de células.

El plásmido de cadena pesada gamma4, pG4HE (SEC ID nº 3) incluye la región constante gamma4 humana y un sitio de poliadenilación, de manera que las secuencias gamma amplificadas con cebadores 5' que incluyen sitios HindIII corriente arriba del iniciador metionina, pueden digerirse con HindIII y AgeI, y clonarse en pG4HE digerido con HindIII y AgeI para reconstruir una secuencia codificante de cadena pesada gamma4 completa conjuntamente con un sitio de poliadenilación. Este casete puede aislarse en forma de fragmento HindIII/EcoRI y ligarse a secuencias promotoras de transcripción, creando un minigén funcional para la transfección de células.

Pueden utilizarse varios promotores diferentes (incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, CMV, ubiquitina, SRalfa y beta-actina) para expresar los genes reconstruidos de cadena pesada y de cadena ligera. Por ejemplo, el vector pCDNA3.1+ (Invitrogen, Carlsbad, CA) puede cortarse con HindIII y NotI, XhoI o EcoRI, para la ligación con los casetes kappa, gamma1 o gamma4 indicados anteriormente, para formar vectores de expresión que pueden transfectarse directamente en células de mamífero.

pCK7-96 (SEC ID nº 1)

1

2

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pCG7-96 (SEC ID nº 2)

3

4

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pG4HE (SEC ID nº 3)

5

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7

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Expresión de anticuerpos recombinantes

Los anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos típicamente se producen mediante expresión recombinante. Los constructos polinucleótidos recombinantes incluyen una secuencia de control de expresión ligada funcionalmente a las secuencias codificantes de cadenas de anticuerpo, incluyendo regiones promotoras naturalmente asociadas o heterólogas. Preferentemente, las secuencias de control de expresión son sistemas promotores eucarióticos en vectores que pueden transformar o transfectar células huésped eucarióticas. Tras incorporar el vector en el huésped apropiado, el huésped se mantiene bajo condiciones adecuadas para la expresión de nivel elevado de las secuencias de nucleótidos, y la recolección y purificación de los anticuerpos de reacción cruzada.

Estos vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos huésped, en forma de episomas o como parte integral del ADN cromosómico huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección, por ejemplo resistencia a la ampicilina o resistencia a la higromicina, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

E. coli es un huésped procariótico particularmente útil para clonar las secuencias de ADN de la presente invención. Los microbios, tales como las levaduras, también resultan útiles para la expresión. Saccharomyces es un huésped levadura preferido, presentando los vectores adecuados secuencias de control de la expresión, un origen de replicación, secuencias de terminación y similares, según se desee. Entre los promotores típicos se incluyen la 3-fosfoglicerato quinasa y otros enzimas glucolíticos. Entre los promotores inducibles de levadura se incluyen, entre otros, promotores de la alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables para la utilización de maltosa y galactosa.

Las células de mamífero son un huésped preferido para expresar segmentos de nucleótidos codificantes de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (ver Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, 1987). Se han desarrollado en la técnica varias líneas celulares huésped adecuadas capaces de secretar proteínas heterólogas intactas, incluyendo líneas celulares CHO, diversas líneas celulares COS, células HeLa, células L y líneas celulares de mieloma. Preferentemente las células son no humanas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un intensificador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49, 1986) y sitios de procesamiento de la información necesarios, tales como sitios de unión ribosómica, sitios de procesamiento del ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminador de transcripción. Son secuencias de control de expresión preferidas los promotores derivados de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus, papilomavirus bovino y similares (ver Co et al., J. Immunol. 148:1149, 1992).

Alternativamente, pueden incorporarse secuencias codificantes de anticuerpo a transgenes para la introducción en el genoma de un animal transgénico y la expresión posterior en la leche del animal transgénico (ver, por ejemplo, las patentes US nº 5.741.957, nº 5.304.489 y nº 5.849.992). Entre los transgenes adecuados se incluyen secuencias codificantes para las cadenas ligera y/o pesada en ligamiento operable con un promotor y un intensificador de un gen específico de glándula mamaria, tal como la caseína o la beta-lactoglobulina.

Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés pueden transferirse a la célula huésped mediante procedimientos bien conocidos, dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para las células procarióticas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio, la electroporación, la lipofección, la biobalística o la transfección basada en virus puede utilizarse para otros huéspedes celulares. Entre otros procedimientos utilizados para transformar células de mamífero se incluyen la utilización de polibreno, fusión de protoplasto, liposomas, electroporación y microinyección (ver generalmente Sambrook et al., supra). Para la producción de animales transgénicos, los transgenes pueden microinyectarse en oocitos fertilizados o puede incorporarse al genoma de células madre embrionarias y los núcleos de dichas células transferidas a oocitos enucleados.

Tras la expresión, los anticuerpos pueden purificarse siguiendo procedimientos estándares de la técnica, incluyendo la purificación mediante HPLC, la cromatografía de columna, la electroforesis en gel y similares (ver generalmente Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).

Anticuerpos modificados

Los anticuerpos obtenidos siguiendo la presente invención pueden modificarse. La expresión "anticuerpo modificado" incluye anticuerpos, tales como anticuerpos modificados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados que se han modificado mediante, por ejemplo, deleción, adición o sustitución de partes del anticuerpo. Por ejemplo, puede modificarse un anticuerpo mediante deleción de la región constante y la sustitución de la misma por una región constante destinada a incrementar la vida media, por ejemplo la vida media sérica, la estabilidad o la afinidad del anticuerpo.

El anticuerpo obtenido de acuerdo con la invención puede conjugarse y utilizarse para modificar una respuesta biológica dada o para crear una respuesta biológica (por ejemplo para reclutar células efectoras). El grupo farmacológico no debe interpretarse como limitado a los agentes terapéuticos químicos. Por ejemplo, el grupo farmacológico puede ser una proteína o un polipéptido con una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa o un fragmento activo del mismo, tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina diftérica; una proteína, tal como factor de necrosis tumoral o interferón alfa, o modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfoquinas, interleuquina 1 ("IL-1"), interleudina-2 ("IL-2"), interleuquina-6 ("IL-6"), factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos ("GM-CSF"), factor estimulador de colonias de granulocitos ("G-CSF") u otros factores de crecimiento.

Las técnicas para conjugar dicho grupo terapéutico con anticuerpos son bien conocidas, ver, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs in Cancer Therapy", en: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (editores), páginas 243-256 (Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en: Controlled Drug Delivery (2a edición), Robinson et al. (editores), páginas 623-653 (Marcel Dekker, Inc., 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy:A Review", en: Monoclonal Antibodies '84:Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (editores), páginas 475-506, 1985; "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", en: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (editores), páginas 303-16 (Academic Press, 1985) y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-158, 1982.

Regímenes de tratamiento

La invención facilita la provisión de composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo monoclonal o una combinación de anticuerpos monoclonales (intactos o fragmentos de unión de los mismos) formulados conjuntamente con un portador farmacéuticamente aceptable. Algunas composiciones incluyen una combinación de múltiples (es decir, dos o más) anticuerpos monoclonales o partes ligantes de antígeno de los mismos. En algunas composiciones, cada uno de los anticuerpos o partes ligantes de antígeno de los mismos de la composición es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo de secuencia humana que se une a un epítopo preseleccionado diferente de un antígeno.

En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o medicamentos se administran en el paciente susceptible o bajo riesgo de una enfermedad o condición (es decir, una enfermedad inmunológica) en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, rebajar la severidad o retrasar la aparición de la enfermedad, incluyendo los síntomas bioquímicos, histológicos y/o comportamentales de la enfermedad, las complicaciones de la misma y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones o medicamentos se administran en un paciente que se sospecha que sufre o que ya sufre dicha enfermedad, en una cantidad suficiente para curar, o por lo menos parcialmente detener, los síntomas de la enfermedad (bioquímicos, histológicos y/o comportamentales), incluyendo las complicaciones de la misma y fenotipos patológicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad. Una cantidad adecuada para conseguir un tratamiento terapéutico o profiláctico se define como una dosis terapéutica o profilácticamente efectiva. En los regímenes tanto profilácticos como terapéuticos, habitualmente se administran agentes en varias dosis hasta alcanzar una respuesta inmunológica suficiente. Típicamente se realiza un seguimiento de la respuesta inmunológica y se administran dosis repetidas si la respuesta inmunológica empieza a disminuir.

Dosis efectivas

Las dosis efectivas de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de afecciones y enfermedades de tipo inmunológico descritas en la presente memoria varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente, de si éste es un ser humano o un animal, otras medicaciones administradas, y de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Habitualmente el paciente es un ser humano, aunque también pueden tratarse mamíferos no humanos, incluyendo mamíferos transgénicos. Las dosis de tratamiento deben titularse con el fin de optimizar la seguridad y la eficacia.

Para la administración con un anticuerpo, los intervalos de dosis se encuentran comprendidos entre aproximadamente 0,0001 y 100 mg/kg, y más habitualmente entre 0,01 y 5 mg/kg de peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o encontrarse comprendidas dentro del intervalo de entre 1 y 10 mg/kg. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración de una cada dos semanas o de una vez al mes o de una vez cada 3 a 6 meses. En algunos procedimientos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado se encuentra comprendida dentro de los intervalos indicados. Habitualmente se administra anticuerpo en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis individuales pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, según indiquen los niveles sanguíneos de anticuerpo en el paciente. En algunos procedimientos, las dosis se ajustan para alcanzar una concentración plasmática de anticuerpo de entre 1 y 1.000 \mug/ml, y en algunos procedimientos, de entre 25 y 300 \mug/ml. Alternativamente, puede administrarse anticuerpo en forma de una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. Las dosis y frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguidos de los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos no humanos. Las dosis y frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En las aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente reducida a intervalos relativamente infrecuentes a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En las aplicaciones terapéuticas, en ocasiones se requiere una dosis relativamente elevada a intervalos relativamente cortos hasta reducir o detener la progresión de la enfermedad, y preferentemente hasta que el paciente muestra una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. A continuación, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico.

Las dosis de ácidos nucleicos codificantes de inmunógenos se encuentran comprendidas dentro del intervalo de 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 \mug a 10 mg o 30 a 300 \mug de ADN por paciente. Las dosis para los vectores víricos infecciosos varían entre 10 y 100, o más, viriones por dosis.

Vías de administración

Los agentes para inducir una respuesta inmunológica pueden administrarse mediante medios parenterales, tópicos, intravenosos, orales, subcutáneos, intraarteriales, intracraneales, intraperitoneales, intranasales o intramusculares para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico. La vía más típica de administración de un agente inmunogénico es subcutánea aunque otras vías pueden resultar igualmente efectivas. La siguiente vía más común es la inyección intramuscular. Este tipo de inyección más típicamente se lleva a cabo en los músculos del brazo o de la pierna. En algunos procedimientos, los agentes se inyectan directamente en un tejido particular en el que se han acumulado depósitos, por ejemplo en la inyección intracraneal. La inyección intramuscular o la infusión intravenosa resultan preferidas para la administración de un anticuerpo. En algunos procedimientos, se inyectan directamente anticuerpos terapéuticos particulares en el cráneo. En algunos procedimientos, los anticuerpos se administran en forma de una composición o dispositivo de liberación sostenida, tal como el dispositivo Medipad^{TM}.

Los agentes derivados de la invención opcionalmente pueden administrarse en combinación con otros agentes que resultan por lo menos parcialmente efectivos en el tratamiento de diversas enfermedades, incluyendo diversas enfermedades de tipo inmunológico. En el caso de la enfermedad de Alzheimer y el síndrome de Down, en los que se producen depósitos amiloides en el cerebro, también pueden administrarse agentes de la invención conjuntamente con otros agentes que incrementan el paso de los agentes de la invención a través de la barrera hematocefálica (BBB).

Formulación

Los agentes derivados de la invención pueden administrarse en forma de composiciones farmacéuticas que comprenden un agente terapéutico activo y una diversidad de otros componentes farmacéuticamente aceptables (ver Remington's Pharmaceutical Science, 15a edición, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980). La forma preferida depende del modo pretendido de administración y de la aplicación terapéutica. Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, portadores o diluyentes no tóxicos farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos utilizados comúnmente para formular composiciones farmacéuticas para la administración animal o humana. El diluyente se selecciona de manera que no afecte a la actividad biológica de la combinación. Son ejemplos de dichos diluyentes el agua destilada, la solución salina fisiológica tamponada con fosfato, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros portadores, adyuvantes o estabilizadores no inmunogénicos no terapéuticos no tóxicos y similares.

Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir macromoléculas grandes metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, tales como quitosano, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (tales como sepharose^{TM} látex funcionalizado, agarosa, celulosa y similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados de lípidos (tales como gotículas de aceite o liposomas). Además, estos portadores pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores (es decir adyuvantes).

Para la administración parenteral, los agentes derivados de la invención pueden administrarse en forma de dosis inyectables de una solución o suspensión de las sustancias en un diluyente fisiológicamente aceptable con un portador farmacéutico que puede ser un líquido estéril, tal como aceites hidrosolubles, solución salina, glicerol o etanol. Además, pueden encontrarse presentes en las composiciones sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, surfactantes, sustancias tamponadas del pH y similares. Otros componentes de las composiciones farmacéuticas son los de origen petroquímico, animal, vegetal o sintético, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de soja y aceite mineral. En general, los glicoles, tales como propilenglicol o polietilenglicol son portadores líquidos preferentes, particularmente para soluciones inyectables. Los anticuerpos pueden administrarse en la forma de una inyección de depósito o preparación de implante que puede formularse de manera que permita una liberación sostenida del ingrediente activo. Una composición ejemplificativa comprende anticuerpo monoclonal a una concentración de 5 mg/ml, formulada en tampón acuoso que consiste de L-histidina 50 mM, NaCl 150 mM, ajustados a pH 6,0 con HCl.

Típicamente, las composiciones se preparan en forma de inyectables, en forma de soluciones o suspensiones líquidas, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en vehículos líquidos previamente a la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas o micropartículas, tales como poliláctido, poliglicólido o copolímero para un efecto adyuvante incrementado, tal como se ha expuesto anteriormente (ver Langer, Science 249:1527, 1990, y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119, 1997). Los agentes derivados a partir de la presente invención pueden administrarse en la forma de una inyección de depósito o preparación de implante que puede formularse de manera que permite una liberación sostenida o pulsátil del ingrediente activo.

Entre las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración se incluyen las formulaciones orales, intranasales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicos.

Para los supositorios, ligantes y portadores se incluyen, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; dichos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0,5% a 10%, preferentemente de 1% a 2%. Entre las formulaciones orales se incluyen excipientes, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones adoptan la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen 10% a 95% de ingrediente activo, preferentemente 25% a 70%.

La aplicación tópica puede resultar en la liberación transdérmica o intradérmica. La administración tópica puede facilitarse mediante coadministración del agente con toxina del cólera o derivados destoxificados o subunidades de los mismos u otras toxinas bacterianas similares (ver Glenn et al., Nature 391:851, 1998). La coadministración puede llevarse a cabo mediante la utilización de los componentes en forma de mezcla o de moléculas unidas obtenidas mediante entrecruzamiento químico o expresión en forma de proteína de fusión.

Alternativamente, la liberación transdérmica puede conseguirse utilizando un parche en la piel o utilizando transferosomas (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25:3521-3524, 1995; Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368:201-215, 1998).

Las composiciones farmacéuticas se formulan generalmente en forma estéril, sustancialmente isotónica y en cumplimiento total de la legislación de buenas prácticas de fabricación (Good Manufacturing Practice, GMP) de la U.S. Food and Drug Administration.

Toxicidad

Preferentemente, una dosis terapéuticamente efectiva de las proteínas indicadas en la presente memoria proporciona un beneficio terapéutico sin causar toxicidad sustancial.

La toxicidad de las proteínas indicada en la presente memoria puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo determinando la LD_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) o la LD_{100} (la dosis letal para el 100% de la población). La proporción entre las dosis con efecto tóxico y con efecto terapéutico es el índice terapéutico. Los datos obtenidos a partir de dichos ensayos de cultivo celular y de los estudios animales pueden utilizarse en la formulación de un intervalo de dosis que no resulta tóxico para la utilización en el ser humano. La dosis de las proteínas indicada en la presente memoria se encuentra comprendida dentro del intervalo de concentraciones circulantes que incluye la dosis efectiva con toxicidad reducida o nula. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación utilizada y la vía de administración utilizada. El médico individual puede seleccionar la formulación exacta, la vía de administración y la dosis en vista de la condición del paciente (ver, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, capítulo 1, página 1).

Kits

También se encuentran comprendidos dentro del alcance de la invención kits que comprenden las composiciones (por ejemplo anticuerpos monoclonales, anticuerpos de secuencia humana, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) derivadas de la invención e instrucciones de utilización. El kit puede contener además por lo menos un reactivo adicional, o uno o más anticuerpos humanos adicionales derivados de la invención (por ejemplo un anticuerpo humano que presenta una actividad complementaria que se une a un epítopo del antígeno diferente al del primer anticuerpo humano). Los kits típicamente incluyen una etiqueta que indica la utilización pretendida del contenido del kit. El término "etiqueta" incluye cualquier material escrito o grabado suministrado sobre el kit o conjuntamente con el mismo, o que acompaña de otra manera el kit.

Ejemplos Ejemplo 1 Generación de ratones con Cmu

Construcción de un vector dirigido de CMD. El plásmido pICEmu contiene un fragmento EcoRI/XhoI del locus de cadena pesada de Ig murino, que comprende el gen mu, que se obtuvo a partir de una biblioteca de fago lambda genómico Balb/C (Marcu et al., Cell 22:187, 1980). Este fragmento genómico se subclonó en los sitios XhoI/EcoRI del plásmido pICEMI9H (Marsh et al., Gene 32:481-485, 1984). Las secuencias de cadena pesada incluidas en pICEmu se extienden corriente abajo del sitio EcoRI situado inmediatamente 3' del intensificador intrónico mu, hasta el sitio XhoI situado aproximadamente 1 kb corriente abajo del último exón transmembranal del gen mu; sin embargo, gran parte de la región repetida de cambio de mu ha sido delecionada por el subcultivo en E. coli.

El vector dirigido se construyó de la manera siguiente (ver la fig. 1). Se cortó un fragmento HindIII/SmaI de 1,3 kb de pICEmu y se subclonó en pBluescript digerido con HindIII/SmaI (Stratagene, La Jolla, CA). Este fragmento pICEmu se extiende desde el sitio HindIII situado aproximadamente 1 kb en dirección 5' respecto a Cmu1 hasta el sitio SmaI situado dentro de Cmu1. El plásmido resultante se digirió con SmaI/SpeI y se insertó el fragmento SmaI/XbaI de aproximadamente 4 kb procedente de pICEmu, que se extiende desde el sitio SmaI en Cmu1 3' respecto al sitio XbaI situado inmediatamente corriente abajo del último exón de Cmu. El plásmido resultante, pTAR1, se linearizó en el sitio SmaI, y se insertó un casete neo de expresión. Este casete consiste del gen neo bajo el control transcripcional del promotor fosfoglicerato quinasa (pgk) de ratón (fragmento XbaI/TaqI; Adra et al., Gene 60:65-74) y que contiene el sitio de poliadenilación pgk (fragmento PvuII/HindIII; Boer et al., Biochemical Genetics 28:299-308, 1990). Este casete se obtuvo a partir del plásmido pKJ1 (descrito por Tybulewicz et al., Cell 65:1153-1163, 1991) del que se extrajo el casete neo en forma de fragmento EcoRI/HindIII y se subclonó en pGEM-7Zf(+) digerido con EcoRI/HindIII, generando pGEM-7 (KJ1). El casete neo se extrajo de pGEM-7 (KJ1) mediante digestión con EcoRI/Sa1I, se formaron extremo romos y se subclonó en el sitio SmaI del plásmido pTAR1, en la orientación opuesta a las secuencias genómicas de Cmu. El plásmido resultante se linearizó con NotI, y se insertó un casete de timidina quinasa (tk) de virus herpes simplex que permitiese el enriquecimiento de clones ES que portan recombinantes homólogos, tal como describen Mansour et al., Nature 336:348-352, 1988. Este casete está constituido por las secuencias codificantes del gen tk flanqueadas por el promotor pgk de ratón y un sitio de poliadenilación, tal como describen Tybulewicz et al., Cell 65:1153-1163, 1991. El vector dirigido de CMD resultante contiene un total de aproximadamente 5,3 kb de homología con el locus de cadena pesada y está diseñado para generar un gen mu mutante en el que se ha insertado un casete neo de expresión en el sitio SmaI único del primer exón Cmu. El vector dirigido se linearizó con PvuI, que corta dentro de las secuencias de plásmido, previamente a la electroporación en células ES.

Generación y análisis de células ES dirigidas. Se cultivaron células ES AB-1 (McMahon, A.P. y Bradley, A., Cell 62:1073-1085, 1990) en capas de células nodriza SNL76/7 mitóticamente inactivas (ibid.) esencialmente tal como se ha descrito (Robertson, E.J., 1987, en: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (E.J. Robertson, editor), Oxford, IRL Press, páginas 71 a 112). El vector dirigido de CMD linearizado se electroporó en célula AB-1 mediante los procedimientos descritos por Hasty et al. (Hasty, P.R. et al., Nature 350:243-246, 1991). Se cultivaron células electroporadas en placas de 100 m a una densidad de 1 a 2 x10^{6} células/placa. Tras 24 horas, se añadieron al medio G418 (200 microgramos/ml de componente activo) y FIAU (5 x 10^{-7} M) y se dejó que se desarrollasen los clones resistentes a fármaco durante 8 a 9 días. Se recogieron los clones, se tripsinizaron, se dividieron en dos partes, y se expandieron adicionalmente. A continuación, se congeló la mitad de las células derivadas de cada clon y la otra mitad se analizó para la recombinación homóloga entre secuencias de vector y secuencias diana.

Se llevó a cabo análisis del ADN mediante hibridación de transferencia southern. Se aisló ADN a partir de los clones tal como describen Laird et al. (Laird, P.W. et al., Nucleic Acids Res. 19:4293, 1991). Se digirió ADN genómico aislado con SpeI y se sondeó con un fragmento SacI de 915 pb, sonda A (fig. 1), que hibrida con una secuencia entre el intensificador intrónico de mu y la región de cambio de mu. La sonda A detecta un fragmento SpeI de 9,9 kb procedente del locus de tipo salvaje, y una banda diagnóstica de 7,6 kb procedente de un locus de mu que se ha recombinado homólogamente con el vector dirigido de CMD (el casete neo de expresión contiene un sitio SpeI). De entre 1.132 clones resistentes a G418 y a FIAU cribados mediante análisis de transferencia southern, 3 mostraron la banda SpeI de 7,6 kb indicativa de recombinación homóloga en el locus mu. Estos 3 clones se digirieron adicionalmente con los enzimas BgII, BstXI y EcoRI para verificar que el vector se integraba homólogamente en el gen mu. Al hibridar con la sonda A, las transferencias southern de ADN de tipo salvaje digerido con BglI, BstXI o EcoRI produjeron fragmentos de 15,7, 7,3 y 12,5 kb, respectivamente, mientras que la presencia de un alelo dirigido de mu se indica por los fragmentos de 7,7, 6,6 y 14,3 kb, respectivamente. La totalidad de los 3 clones positivos detectados por la digestión con SpeI mostró los fragmentos de restricción BglI, BstXI y EcoRI esperados diagnósticos de inserción del casete neo en el exón Cmu1.

Generación de ratones que portan el gen mu mutado. Los tres clones ES dirigidos, designados con los números 264, 272 y 408, se descongelaron y se inyectaron en blastocitos C57BL/6J tal como describe Bradley (Bradley, A., 1987, en: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E.J. Robertson, editor) Oxford:IRL Press, páginas 113 a 151). Los blastocitos inyectados se transfirieron al interior de los úteros de hembras pseudoembarazadas para generar ratones quiméricos que representan una mezcla de células derivadas de las células ES introducidas y el blastocito huésped. El grado de contribución de las células ES a las quimeras puede evaluarse visualmente a partir de la cantidad de coloración de pelaje agouti, derivada de la línea celular ES, sobre el fondo negro de C57BL/6J. Los clones 272 y 408 sólo produjeron un porcentaje reducido de quimeras (es decir, porcentajes reducidos de pigmentación agouti), pero el clon 264 produjo un porcentaje elevado de quimeras macho. Estas quimeras se cruzaron con hembras C57BL/6J y se generó progenie agouti, indicativa de transmisión de línea germinal del genoma de las células ES. El cribado para el gen dirigido mu se llevó a cabo mediante análisis de transferencia southern de ADN digerido con BglI a partir de biopsias de la cola (tal como se ha descrito anteriormente para el análisis del ADN de las células ES). Aproximadamente el 50% de la progenie agouti mostró una banda BglI hibridante de 7,7 kb además de la banda de tipo salvaje de 15,7 kb, demostrando la transmisión de línea germinal del gen dirigido mu.

Análisis de ratones transgénicos para la inactivación funcional del gen mu. Para determinar si la inserción del casete neo en Cmu1 ha inactivado el gen de cadena pesada de Ig, se cruzó un clon quimérico 264 con un ratón homocigótico para la mutación JHD, que inactiva la expresión de la cadena pesada como resultado de la deleción de los segmentos del gen JH (Chen et al., Immunol. 5:646-656, 1993). Se generaron cuatro descendientes agouti. Se obtuvo suero de estos animales a la edad de 1 mes y se sometieron a ensayo mediante ELISA para la presencia de IgM murino. Dos de los cuatro descendientes carecían por completo de IgM (Tabla 1). El genotipado de los cuatro animales mediante análisis de transferencia southern del ADN procedente de biopsias de cola mediante digestión con Bg1I e hibridación con sonda A (fig. 1) y mediante digestión con StuI e hibridación con un fragmento EcoRI/StuI de 475 pb (ibid.) demostró que los animales que no expresaron IgM sérica son aquellos en los que un alelo del locus de cadena pesada porta la mutación JHD, y el otro alelo, la mutación Cmu1. Los ratones heterocigóticos para la mutación JHD muestran niveles de tipo salvaje de Ig sérico. Estos datos demuestran que la mutación Cmu1 inactiva la expresión del gen mu.

TABLA 1

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La Tabla 1 muestra los niveles de IgM sérico, detectados mediante ELISA, de ratones que portan ambas mutaciones, CMD y JHD (CMD/JHD), de ratones heterocigóticos para la mutación JHD (+/JHD), de ratones F1 de tipo salvaje (129Sv x C57BL/6J) (+/+) y de ratones deficientes en células B homocigóticos para la mutación JHD (JHD/JHD).

Ejemplo 2 Transgén Kco5 de la cadena ligera kappa humana

La generación de la línea Kco5-9272 de cadena ligera kappa humana de ratón transgénico ha sido descrita anteriormente como Kco5 (Fishwild, D. et al., Nat. Biotechnol. 14:845-851, 1996; Ejemplo 38 en la patente US nº 5.770.429). Esta línea se generó mediante coinyección de un locus de cadena ligera \kappa humana artificial y un clon YAC que comprende múltiples segmentos de región V de cadena kappa humana. El ADN del clon YAC se aisló a partir de una cepa de levadura que contenía un cromosoma artificial de levadura (YAC) de 450 kb que comprendía una parte del locus de región V de cadena kappa humana (biblioteca YAC ICRF, designación 4x17E1). El análisis de secuencias de ADN de los segmentos del gen V amplificados a partir del ADN de YAC demostró que este clon comprende una parte sustancial de la región distal de la región V de cadena kappa humana, incluyendo aproximadamente 32 segmentos diferentes de la región V de cadena kappa. El análisis de un aislado diferente de dicho clon (Brensing-Kuppers, J. et al., Gene 191:173-181, 1997) confirmó el resultado, y también demostró que dicho clon representa un ejemplo del haplotipo del locus C de cadena kappa humana, en el que la parte 5' de la agrupación distal de la región V es similar a la región homóloga de la agrupación proximal de la región V. De esta manera, los segmentos génicos 5' de la región V de la familia O, presentan una secuencia próxima a los segmentos homólogos proximales de V de la familia Op.

Para obtener el ADN de YAC purificado para la microinyección en pronúcleos de embrión, el ADN genómico total se fraccionó por tamaños en geles de agarosa. Las células de levadura que contenían YAC 4x17E1 se incluyeron en agarosa previamente a la lisis, y se separó el ADN de YAC del ADN cromosómico de levadura mediante electroforesis en gel con campo pulsátil, se aisló y se microinyectó en pronúcleos de embrión de medio día de edad.

Un análisis de transferencia southern del ADN genómico demostró que el gen VkA10 humano (Cox, J. et al., Eur. J. Immunol. 24:827-836, 1994; Schable, K. y Zachau, H., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:1001-1002, 1993) se había incorporado al genoma de ratones KCo5-9272. El análisis de PCR utilizando sondas (Brensing-Kuppers, J. et al., Gene 191:173-181, 1997) específicas para la región situada en dirección 5' respecto a la región V de cadena kappa O1 (m217-1, Genbank X76071; Ab129, ccaccccataaacactgattc (SEC ID nº 4); AB130, ttgatgcatcctacccagggc (SEC ID nº 5) y la región intergénica entre la región V de cadena kappa L24 y L25 (m138-13, Genbank X72824; AB127, cctgccttacagtgctgtag (SEC ID nº 6); AB128, ggacagcaacaggacatggg (SEC ID nº 7), reveló que las regiones 5' y 3' de la agrupación de la región V de cadena kappa del clon YAC 4x17E1 se encuentran incluidas en la integración del transgén KCo5-9272. A continuación se cruzaron ratones de la línea KCo5-9272 con ratones transgénicos de cadena pesada humana mutantes endógenos del locus de inmunoglobulina, con el fin de obtener ratones homocigóticos para alteraciones de los loci endógenos de cadena pesada y de cadena ligera kappa, y hemicigóticos u homocigóticos para los transgenes de cadena pesada humana HC2 o HCo7 (patente US nº 5.770.429) y para el transgén de cadena ligera kappa humana KCo5. Los animales que son homocigóticos para alteraciones de los loci endógenos de cadena pesada y de cadena ligera kappa, y hemicigóticos u homocigóticos para los transgenes humanos de cadena pesada y de cadena ligera \kappa se denominan ratones transgénicos dobles/de doble deleción.

El análisis de secuencia de ADN de clones de ADNc derivados directamente de ratones KCo5 transgénicos dobles/de doble deleción, o de hibridomas generados a partir de estos animales, reveló la expresión de los genes de la región V de la cadena kappa siguientes: L6, A27, O12, O4/O14, A10, L15, L18, L19 y L24.

Ejemplo 3 Cruzamiento

El locus humano de cadena pesada que contiene el fragmento hCF(SC20) del cromosoma 14 y el transgén de la cadena ligera kappa humana se combinaron en una sola cepa mediante cruzamiento. La cepa de ratón transgénico hCF(SC20) era homocigótica para mutaciones de inactivación del locus endógeno de cadena pesada (CM2D) y la cadena ligera kappa (CKD) endógena. Esta cepa también era homocigótica para la mutación \lambda1(nivel bajo) (Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:722-727, 2000). La mutación CM2D comprende una deleción de un segmento BamHI-XhoI de 3,7 kb que cubra parte de Cmu2, Cmu3-Cmu4, y Mmu1 y Mmu2. La mutación CKD comprende una deleción de un segmento SacII-Bg1II de 2 kb que comprende el exón Ckappa. Se ha informado de ambas mutaciones anteriormente (Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:722-727, 2000). Estos ratones se cruzaron con ratones homocigóticos para la inserción del transgén de cadena kappa humana KCo5-9272, y homocigótica para las alteraciones CMD y JKD de los loci endógenos humanos de cadena pesada y de cadena kappa, respectivamente. La mutación CMD se ha descrito en el Ejemplo 1, anteriormente. La mutación JKD se describe en la patente US nº 5.770.429 y en Chen et al., EMBO J. 12:821-830, 1993). La progenie de estos cruzamientos que es positiva para el transcromosoma hCF(SC20) (ratones SC20/KCo5 o ratones cruzados) es hemicigótica para 6 modificaciones genéticas diferentes: SC20, KCo5, CMD, CM2D, JKD y CKD. Sin embargo, debido a que las mutaciones tanto CMD y CM2D del locus endógeno de cadena pesada impiden la expresión del gen mu de ratón, y las mutaciones tanto JKD como CKD del locus endógeno kappa impiden la expresión de kappa de ratón, estos ratones SC20/KCo5 son homocigóticos para alteraciones de cada uno de dichos dos loci. Por lo tanto, los ratones son dependientes de los transgenes SC20 y KCo5 para la expresión de anticuerpos que contienen cadena ligera kappa. También pueden formar anticuerpos híbridos humanos/de ratón debido a que el locus endógeno de cadena ligera lambda de ratón sigue siendo funcional. Los ratones también pueden expresar anticuerpos quiméricos humanos/de ratón que comprenden secuencias de región V de cadena pesada humana y de región constante de isotipo no mu de cadena pesada. Estos anticuerpos quiméricos pudieron formarse mediante translocaciones cromosómicas del locus SC20 humano de IgH al locus IgH de ratón mediado por cambio de clase. Estos sucesos de "trans-cambio" se ha descubierto que se producen en ratones que contienen transgenes del minilocus de cadena pesada (Taylor, L. et al., Int. Immunol. 6:579-591, 1994). El cruzamiento entre 40 ratones macho KCo5/CMD/JKD y 98 ratones hembras hCF(SC20)/CM2D/CKD produjo 305 cachorros. El análisis ELISA (Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:722-727, 2000) de muestras de suero preparadas a partir de dichos cachorros reveló que 125 de los 305 (41%) cachorros eran positivos para la expresión de cadena \mu de Ig humana. El análisis posterior de detección de la cadena \kappa de Ig humana demostró que la totalidad de los individuos h\mu-positivos también eran h\kappa-positivas, indicando que se había retenido el transgén KCo5 (ver el Ejemplo 2). El análisis de PCR de los ADNs de cola utilizando las parejas de cebadores D14S1419 y D14S1420 (Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:722-727, 2000) para la detección del hCF(SC20) mostró que la totalidad de los individuos h\mu-positivos retenían el hCF(SC20) y la totalidad de los individuos h\mu-negativos eran negativos para el hCF(SC20). La eficiencia de transmisión de hCF(SC20) a partir de la hembra hCF(SC20)/CM2D/CKD (41%) concordaba con los datos expuestos anteriormente (Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:722-727, 2000).

Ejemplo 4 Expresión de Ig humana en sueros de ratones cruzados

Se examinaron mediante ELISAs muestras de suero preparadas a partir de ratones cruzados de 6 a 12 semanas de edad para determinar las concentraciones de cadenas humanas de Ig \mu, \gamma, \kappa y cadena \lambda de ratón (fig. 2). En comparación con los ratones hemicigóticos para la deleción endógena C\mu, mantenidos bajo condiciones similares, los niveles medios de Ig\mu e Ig\gamma humanos eran más elevados que el nivel de cadena \mu de ratón (273 mg/l) y un tercio del nivel de cadena \gamma de ratón (590 mg/l), respectivamente. Estos niveles de expresión de cadena pesada son similares a los de los ratones doble Tc/doble KO (hCF(SC20)/hCF(2-W23)/CM2D/CKD Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:722-727, 2000). Un cuarto de la progenie F2 producida mediante cruzamiento entre ratones cruzados macho y hembra se esperaba que fuese homocigótica para la mutación m\lambdaC1 (\lambdareducida) debido a que la primera generación de ratones cruzados era heterocigótica para esta mutación. Las concentraciones séricas de cadenas ligeras de Ig humano \kappa y de cadena ligera \lambda de Ig de ratón se determinaron mediante ELISA en veintiún ratones F2 cruzados tal como se ha descrito en un informe anterior (Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:722-727, 2000). De los 21 ratones examinados, seis ratones mostraron una proporción \lambda de ratón/\kappa humana reducida (<0,1), que es característica de ratones homocigóticos para la mutación lenta de \lambda (Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:722-727, 2000). De esta manera, estos seis ratones cruzados podrían ser homocigóticos para la mutación \lambda(reducida), que puede resultar útil para la producción eficiente de hibridomas que segregan anticuerpos que comprenden las cadenas pesada y ligera \kappa humanas.

Ejemplo 5 Producción de anticuerpos monoclonales humanos anti-CD4 humano

Inmunización de antígeno. Se inmunizaron ratones cruzados y ratones doble Tc/KO (n=5) mediante inyección subcutánea de 100 \mug de CD4 soluble humano (sCD4) en adyuvante completo de Freund (Sigma) el día 0, seguido de inmunizaciones en adyuvante incompleto de Freund (Sigma) los días 9, 19 y 27. Se administró una inyección intravenosa final de 40 \mug de sCD4 en PBS el día 37.

Respuestas humorales en ratones. Se recogió suero los días 0, 16, 26, 34 y 40. Se midieron las Ig\gamma e Ig\kappa humanas antígeno-específicas mediante ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) para la producción de anticuerpos monoclonales (MAbs) contra sCD4. Se describe el protocolo detallado para la ELISA en el Ejemplo 4. Se recubrieron placas antígeno-específicas con antígeno a una concentración de 1 \mug/ml en tampón bicarbonato (Sigma) durante la noche. Se cuantificaron las Ig\gamma e Ig\kappa antígeno-específicas utilizando una IgG monoclonal humana antígeno-específica como estándar. Los resultados se muestran en las figs. 3, 4, 5 y 6. Se observaron las respuestas de gamma y kappa humanas 34 días tras el inicio de la inmunizaciones de ratones cruzados y de ratones doble Tc/doble KO.

Generación de hibridomas. Se fusionaron esplenocitos de ratones inmunizados con células Sp2/0-Ag14 el día 40. La suspensión celular se inoculó en placas de 384 pocillos a una densidad de 20.000 esplenocitos por pocillo. Los hibridomas resultantes se cribaron para la producción de anticuerpos monoclonales (MAbs) contra sCD4. Se muestran los resultados en la Tabla 1 a continuación.

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TABLA 1

9

Se subclonaron los hibridomas parentales procedentes de ratón cruzado mediante dos rondas de dilución limitante de eficiencia elevada. La totalidad de los hibridomas procedentes de ratones cruzados segregaron MAbs anti-CD4 \gamma humano/\lambda murino. Estos datos indican que el ratón cruzado es superior a la cepa doble TC/KO en la generación de anticuerpos monoclonales humanos antígeno-específicos. El isotipo de los MAbs segregados por estos hibridomas subclonados se examinó adicionalmente mediante varias ELISAs. Siete pocillos eran h\gamma1^{+} y siete pocillos eran h\gamma4^{+}.

Curva de crecimiento y niveles de secreción de un anticuerpo monoclonal IgG1 anti-CD4 en cultivos a escala reducida. Se utilizó uno de los clones hibridomas productores de IgG_{1}\kappa (KM2-3) humanos anti-CD4 para la determinación de la curva de crecimiento y los niveles de secreción del anticuerpo monoclonal humano en cultivos a escala reducida. Se sembraron células de hibridoma KM2-3 en 4 matraces de agitación (Bellco) a una densidad de 1x10^{5} células/ml el día 0. Para el cultivo se utilizó un litro de medio ERDF provisto de ITS-X (Gibco-BRL) y suero bajo en Ig al 1% (Hyclone). Se recogió un ml de medio cada día y se midió la densidad de células y la concentración de IgG_{1}\kappa mediante ELISA tal como se ha descrito en un informe anterior (Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:722-727, 2000). Los resultados se presentan en la fig. 7. La tasa de producción estimada era de 24,6 pg/célula/día, que se encuentra comprendida en un intervalo similar al esperado para hibridomas murinos excelentes bajo estas condiciones.

Ejemplo 6 Generación de anticuerpos monoclonales humanos anti-GCSF humano

Inmunización de antígeno. Se inmunizaron ratones cruzados y doble Tc/KO (n=5) mediante inyecciones subcutáneas de 100 \mug de G-CSF soluble humano en adyuvante TiterMaxGold (CytTx) los días 0, 9, 19 y 27. Se proporcionó una inyección intravenosa final de 20 \mug de G-CSF en PBS a ratones cruzados y doble Tc/KO el día 37.

Respuestas humorales en cada cepa de ratón. Se recogió suero los días 0, 16, 26, 34 y 40. Se cuantificaron las concentraciones de Igs humanas antígeno-específicas mediante ELISA. Se recubrieron placas antígeno-específicas con antígeno a una concentración de 1 \mug/ml en tampón bicarbonato (Sigma) durante la noche. Se cuantificaron las Ig\gamma e Ig\kappa antígeno-específicas utilizando uno de los anticuerpos monoclonales IgG específicos para G-CSF como estándar. Se muestran los resultados en las figs. 8, 9, 10 y 11. La concentración de h\gamma y de h\kappa antígeno-específicos en el suero de los ratones cruzados era aproximadamente 10 veces superior que la de los ratones doble Tc/KO.

Producción de hibridomas. Se fusionaron los esplenocitos de ratones inmunizados con células Sp2/0-Ag14 el día 40, y los hibridomas resultantes se cribaron mediante ELISA para la producción de anticuerpos monoclonales (MAbs) contra G-CSF. Se muestran los resultados en la Tabla 2 a continuación.

TABLA 2

10

La mitad de los hibridomas productores de IgG anti-G-CSF segregaron MAbs anti-G-CSF \gamma humano/\kappa humano y el resto de hibridomas segregó MAbs anti-G-CSF \gamma humano/\lambda murina. Los hibridomas productores de anticuerpos h\gamma/h\kappa se subclonaron mediante dos rondas de dilución limitante. Los experimentos ELISA adicionales demostraron que 5, 3 y 3 pocillos eran h\gamma1^{+}, h\gamma2^{+} y h\gamma4^{+}, respectivamente.

Ejemplo 7 Generación de anticuerpos monoclonales humanos anti-albúmina sérica humana

Se inmunizaron ratones cruzados mediante inyecciones intraperitoneales con 50 \mug de albúmina sérica humana en adyuvante completo de Freund (Sigma) el día 0, seguido de inmunización en adyuvante incompleto de Freund (Sigma) los días 7, 14 y 21.

Generación de hibridomas. Se fusionaron esplenocitos procedentes de ratones inmunizados con células Sp2/0-Ag14 el día 24, y los hibridomas resultantes se cribaron mediante ELISA para la producción de anticuerpos monoclonales (MAbs) contra antígeno. Se seleccionaron aleatoriamente diez pocillos de hibridomas a partir de hibridomas productores de h\gamma anti-albúmina y se subclonaron. La totalidad de los hibridomas segregaban \gamma humana/\kappa humana anti-albúmina. Estos datos indican que el ratón cruzado es superior al ratón doble Tc/doble KO para la producción de anticuerpos monoclonales antígeno-específicos completamente humanos debido a que dos tercios de los hibridomas de IgG anti-albúmina obtenidos a partir de ratones doble Tc/doble KO eran m\lambda^{+} (Tomizuka, K. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:722-727, 2000).

Ejemplo 8 Generación de anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 humano

Antígeno. Se construyó un segmento de ADN codificante de una proteína de fusión que comprende secuencias de los genes CTLA-4 humano y CD3\xi murino mediante amplificación por PCR de clones de ADNc conjuntamente con oligonucleótidos sintéticos de puente. La proteína de fusión codificada contiene las secuencias siguientes: i) CTLA-4 humano codificante de aminoácidos 1 a 190 (que contiene el péptido de señal, el dominio extracelular de CTLA-4 humano y la totalidad de la secuencia transmembrana putativa de CTLA-4 humano, e ii) CD3\xi murino desde el aminoácido 52 hasta el extremo carboxi-terminal. El producto de PCR amplificado se clonó en un vector plásmido y se determinó la secuencia de ADN. A continuación, la inserción clonada se subclonó en el vector pBABE (que contiene un gen codificante de la resistencia a la puromicina (Morganstern, J.P. y Land, H., Nucl. Acids Res. 18:3587-3596, 1990)) para crear pBABE-huCTLA-4/CD3\xi. Se transfectó pBABE-huCTLA-4/CD3\xi en la línea de empaquetamiento retrovírica, \psi-2, y seleccionó un reservorio de células resistentes a la puromicina. Estas células se cocultivaron con el hibridoma de células T murinas BW5147 (ATCC nº TIB-47). Tras 2 días de cocultivo, se separaron las células BW5147 no adherentes y se seleccionaron para la resistencia a la puromicina. El reservorio de células resistentes a la puromicina se subclonó mediante dilución limitante y se sometió a ensayo para la expresión en superficie de CTLA-4 humano mediante FACS. Se seleccionó un clon que expresaba niveles elevados de CTLA-4 humano en la superficie celular (BW-huCTLA-4CD3\xi-3#12). Se adquirió antígeno recombinante soluble que comprendía el dominio extracelular de CTLA-4 humano de R&D Systems (nº de cat. 325-CT-200).

Inmunización. Se inmunizaron cada uno de tres ratones cruzados SC20/KCo5 (nº ID 22227, 22230 y 22231) mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de 10^{7} células BW-huCTLA-4CD3\zeta-3#12 que expresan el dominio extracelular de CTLA-4 humano. Este procedimiento de inmunización se repitió dos veces más a intervalos de aproximadamente un mes para los ratones nº 22227 y nº 22230. En el mes 3, el ratón nº 22231 recibió una tercera inyección i.p. de células completas lavadas, mientras que los ratones nº 22227 y nº 22230 recibieron cada uno inyecciones i.p. y subcutánea (s.c.) de 20 microgramos de antígeno recombinante soluble en adyuvante MPL+TDM (Sigma, nº de cat. M6536). A continuación, los ratones se sometieron a ensayo nuevamente durante 10 días y después dos días antes de recolectar las células de bazo para la fusión de hibridoma, los ratones nº 22227 y nº 22230 recibieron cada uno inyección (i.v.) en la vena de la cola de 20 microgramos de antígeno recombinante soluble conjuntamente con inyecciones i.p. de 20 microgramos de antígeno recombinante soluble en adyuvante MPL+TDM. Un día antes de la recolección de los esplenocitos, dichos ratones recibieron una inyección i.v. adicional de 20 microgramos de antígeno recombinante soluble. El ratón nº 22231 recibió 10^{7} células BW-huCTLA-4CD3\xi-3#12 en adyuvante MPL+TDM i.p. tres días antes de recolectar las células de bazo, seguido de 10^{7} células BW-huCTLA-4CD3\xi-3#12 lavadas sin adyuvante i.p. dos días antes de la fusión.

Fusión. Se fusionaron células de bazo procedentes de los ratones nº 22227, nº 22230 y nº 22231, en tres experimentos separados, con células de mieloma de ratón (línea P3 X63 Ag8.6.53, ATCC nº CRL 1580 o SP2/0-Ag14, ATCC nº CRL 1581) mediante procedimientos estándares (Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Kennett et al., Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis, Plenum, New York, 1980; Oi y Herzenberg, Immunoglobulin Producing Hybrid Cell Lines, en: Selected Methods in Cellular Immunology, editores Mishell y Shiigi, páginas 357-372, Freeman, San Francisco, 1980; Halk, Methods in Enzymology: Plant Molecular Biology, editores Weissbach y Weissbach, páginas 766-780, Academic Press, Orlando, FL, 1984). Las células se cultivaron en DMEM, FBS al 10%, OPI (Sigma O-5003), BME (Gibco 21985-023) y factor de clonación de hibridoma Origen al 3% (Igen IG50-0615). Se añadió suplemento HAT o HT al medio durante el crecimiento inicial y la selección.

Cribado de hibridoma. Para identificar los hibridomas que segregaban anticuerpos IgG humanos reactivos con el antígeno, se recubrieron placas ELISA (Nunc MaxiSorp) durante la noche a 4ºC con 100 \mul/pocillo de fusión CD152-Ig mu humana (Ancel nº 501-820) a una concentración de 0,2 \mug/ml en PBS. Las placas se lavaron y se bloquearon con 100 \mul/pocillo de PBS-Tween que contenía BSA al 1%. Se añadieron 50 \mul de sobrenadante de cultivo celular seguido de una incubación de 1 a 2 horas. Las placas se lavaron y después se incubaron durante una hora con 100 \mul/pocillo de anticadena pesada gamma humana de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (anti-gamma (fc) humana-FA; Jackson, nº 109-056-098). Las placas se lavaron tres veces en PBS-Tween entre cada etapa. Se identificaron setenta y seis hibridomas que segregaban anticuerpo gamma-positivo reactivo con antígeno. Estos clones se analizaron a continuación adicionalmente para determinar el isotipo de la cadena pesada gamma o de la cadena ligera, así como la presencia de células contaminantes secretoras de IgM (Tabla 3).

TABLA 3

11

Setenta y cinco de los 76 pocillos con IgG antígeno-positivo también eran positivos para anticuerpo reactivo con el antígeno cadena ligera kappa humana, mientras que 7 de los pocillos eran positivos para anticuerpo híbrido que contenía cadena lambda de ratón. Sin embargo, 6 de los 7 pocillos positivos para lambda también contenían cadena ligera kappa, y 3 de estos tres pocillos eran positivos para anticuerpo reactivo con antígeno IgM contaminante. Debido a que estos anticuerpos IgM contaminantes podrían haber contribuido, incluyen cadena ligera lambda, existen entre 3 y 7 clones de IgG\lambda de entre el total de 76 clones de IgG. De esta manera, la cadena lambda endógena de ratón aparentemente contribuye únicamente en un 4% a 9% de los hibridomas positivos para IgG reactivos para un antígeno. Las células procedentes de 22 de los 76 pocillos positivos para hibridoma a continuación se sembraron nuevamente en placas a la dilución limitante para subclonar hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales individuales. Se obtuvieron subclones de IgG humana estables reactivos con antígeno procedentes de 19 de 22 de los hibridomas 1º (ver la Tabla 4 a continuación).

TABLA 4

12

De esta manera se obtuvo una eficiencia de subclonación de 86%. Tras la subclonación, se descubrió que uno de los hibridomas 1º comprendía 2 clones diferentes, con diferentes isotipos de IgG (ver la Tabla 5 a continuación).

TABLA 5

13

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De esta manera, se obtuvieron 20 subclones diferentes. La totalidad de los 20 clones utiliza la cadena ligera \kappa humana, y son completamente humanos.

Se aislaron anticuerpos monoclonales a partir de cinco de los hibridomas subclonados (1H5, 4A9, 4C1, 8H4 y 10E1) y se sometieron a ensayo para su capacidad de bloquear la unión de CTLA-4 a B7.2 (figs. 12 y 13).

Brevemente, se recubrió una placa ELISA con una proteína de fusión B7.2 Ig a una concentración de 0,7 \mug/ml (100 \mul/pocillo) (ver la patente WO nº 01/14424, que se incorpora como referencia en su totalidad a todos los fines). La placa se lavó y se bloqueó en PBS-T + BSA al 1% durante 30 minutos. Se mezcló anticuerpo con un volumen igual de Ig CTLA-4 marcado con biotina (Ancell nº 501-030) a una concentración de 0,2 \mug/ml y se preincubó durante 1 hora a temperatura ambiente, después se transfirió a una placa ELISA recubierta con B7.2 y se incubó durante 1 hora. Las placas se lavaron y se añadieron 100 \mul/pocillo de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Kirkegaard y Perry Labs, 15-30-0) y se incubaron durante 1 hora. Las placas se revelaron con sustrato pnpp. La inhibición de la unión de CTLA-4 marcada con biotina a B7.2 se proporciona en forma de gráfico de concentración de anticuerpo frente a absorbancia a 405 nm. El anticuerpo 10D1 es una IgG_{1} humana específica de CTLA-4 (ver la patente WO nº 01/14424). Los isotipos de anticuerpo son 1H5.1 (\gamma_{1}), 4A9.1 (\gamma_{1}), 4C1.1 (\gamma_{4}), 8H4.4 (\gamma_{4}), 10E1.1 (\gamma_{4}) y 10D1 (\gamma_{1}).

Se descubrió que dos de los anticuerpos (1H5 y 4A9) eran anticuerpos bloqueantes, y tres (4C1, 8H4 y 10E1) se descubrió que eran anticuerpos no bloqueantes (figs. 12 y 13).

La administración de anti-CTLA-4 puede incrementar las respuestas inmunológicas mediadas por células T (Krummel, J. Exp. Med. 182:459-465, 1995; Krummel et al., Int'l Immunol. 8:519-523, 1996). De esta manera, pueden utilizarse los anticuerpos de CTLA-4 como adyuvante para incrementar la inmunogenicidad de otro agente. Al administrarse anticuerpos contra CTLA-4 conjuntamente con otro agente, los dos pueden administrarse en cualquier orden o simultáneamente. Los procedimientos pueden utilizarse para una diversidad de vacunas y tratamientos para los que las respuestas inmunológicas incrementadas resultan beneficiosas. Por ejemplo, las enfermedades infecciosas y los cánceres, incluyendo el melanoma, el cáncer de colon, el cáncer de próstata y el cáncer renal.

También pueden utilizarse los anticuerpos de CTLA-4 para modular negativamente una respuesta inmunológica mediada por células T. Esta actividad puede obtenerse con preparaciones multivalentes de anticuerpo anti-CTLA-4. Por ejemplo, las microesferas de látex recubiertas con anti-CTLA-4 (para incrementar la valencia del anticuerpo) pueden inhibir la proliferación y la activación de las células T. Los agentes que presentan el mismo sitio de combinación de anticuerpo pueden actuar como antagonista de CTLA-4 cuando se presentan en forma de Fab o IgG soluble, y un agonista de CTLA-4 cuando se encuentran altamente entrecruzados. De esta manera, las formas multivalentes de anticuerpos anti-CTLA-4 pueden resultar agentes terapéuticos útiles para la inmunosupresión.

Además de unirse a microesferas de látex o a otras partículas insolubles, los anticuerpos pueden entrecruzarse entre sí o manipularse genéticamente para formar multímeros. El entrecruzamiento pueden ser mediante unión química o mediante unión indirecta, tal como el complejo anticuerpo-biotina-avidina. El entrecruzamiento puede ser covalente, en el que se unen grupos químicos ligantes, o no covalentes, en el caso de que se utilicen interacciones proteína-proteína u otras interacciones proteína-ligando. Entre los enfoques de ingeniería genética se incluyen, por ejemplo, la reexpresión de las regiones variables de anticuerpos IgG de alta afinidad en vectores de expresión IgM o en cualquier grupo de una proteína (por ejemplo polilisina y similares). La conversión de un anticuerpo IgG de alta afinidad para un anticuerpo IgM puede crear un complejo decavalente de muy elevada avidez. También pueden utilizarse vectores de expresión IgA_{2} para producir complejos multivalentes de anticuerpos. IgA_{2} puede formar polímeros conjuntamente con la cadena J y un componente secretorio. IgA_{2} puede presentar la ventaja adicional de que puede entrecruzarse adicionalmente con el receptor CD89 de IgA, que se expresa sobre neutrófilos, macrófagos y monocitos. Alternativamente, debido a que aproximadamente 2% de los hibridomas generados a partir de ratone cruzados C20/KCo5 son IgA, estos animales pueden utilizarse para generar directamente un anticuerpo anti-CTLA-4 isotipo de IgA humano.

También puede obtenerse agonismo utilizando algunas preparaciones de anticuerpos policlonales contra CTLA-4 que comprende anticuerpos contra por lo menos dos epítopos no solapantes sobre CTLA-4. Un anticuerpo en dicha preparación que contiene dos sitios de unión pueden unirse a dos moléculas de CTLA-4 para formar una agrupación pequeña. Después, puede unirse (agregarse) un segundo anticuerpo que posea diferentes sitios de unión puede unir dichas agrupaciones pequeñas para formar agrupaciones grandes, formando de esta manera un complejo de CTLA-4 (sobre la superficie celular) que pueden transducir una señal a la célula T, inhibiendo, reduciendo o previniendo la activación de las células T que portan (expresan) CTLA-4. De esta manera, algunas preparaciones de anticuerpos policlonales muestran un agonismo similar a la de las preparaciones polivalentes descritas anteriormente.

Por lo tanto, resultan útiles preparaciones polivalentes o policlonales de anticuerpos anti-CTLA-4 como agonistas del receptor CTLA-4, suprimiendo de esta manera las respuestas inmunológicas que de otra manera se encontrarían mediadas por células T que portan el receptor CTLA-4. Algunos ejemplos de enfermedades que pueden tratarse utilizando dichas preparaciones polivalentes o policlonales de anticuerpos inducen enfermedades autoinmunológicas, rechazo del trasplante e inflamación.

Ejemplo 9 Generación de anticuerpos anti-EGFR humano

Antígeno. Se obtuvo de Sigma Chemical Co. (E3641) receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) soluble purificado procedente de células de carcinoma humano A431. La línea celular A431 de carcinoma humano se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC nº CRL 1555). Se obtuvo adyuvante MPL+TDM Ribi de Sigma Chemical Co. (M-6536).

Inmunización. Se inmunizó cada uno de dos ratones cruzados SC20/KCo5 (ID nº 22232 y nº 22239) mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de 10^{7} células A431 completas de carcinoma humano lavadas. Este procedimiento de inmunización se repitió un mes después con ambos ratones. El mes 4, se inmunizó el ratón 22239 con 25 \mug de EGFR soluble en adyuvante MPL+TDM i.p., se dejó reposar durante once días y después se inyectó con 10 \mug de EGFR en PBS i.v. más 10 \mug de EGFR en adyuvante MPL+TDM i.p. Dos días después, el ratón 22239 recibió otros 10 \mug de EGFR en PBS i.v. y el día siguiente, se recolectaron esplenocitos del ratón 22239 para la fusión. Tras las dos primeras inyecciones con células A431, el ratón 22232 se dejó reposar durante tres meses y después se inyectó i.p. con 10^{7} células A431 mezcladas con adyuvante MPL+TDM. Cuatro días después, las células de bazo se recolectaron del ratón 22232 para la fusión.

Fusión. Se fusionaron células de bazo de los ratones nº 22232 y nº 22239 en dos experimentos separados, con las líneas celulares de mieloma P3 X63 Ag8.6.53 (ATCC nº CRL 1580; ratón nº 22239) o con SP2/0-Ag14 (ATCC nº CRL 1581; ratón nº 22232). Las fusiones se realizaron mediante procedimientos estándares descritos de manera general en el Ejemplo 8.

Cribado de hibridomas. Los procedimientos de cribado para los hibridomas de EGFR eran similares a los utilizados para CTLA-4 en el Ejemplo 8. Se recubrieron placas ELISA (Nunc MaxiSorp) durante la noche con 100 \mul/pocillo de antígeno EGFR soluble a 1\mug/ml en PBS. Las placas se lavaron y bloquearon con 100 \mul/pocillo de PBS-Tween que contenía BSA al 1%. Se añadieron cincuenta \mul de sobrenadante de cultivo celular seguido de una incubación de 1 a 2 horas. Las placas se lavaron y después se incubaron durante una hora con 100 \mul/pocillo de anti-cadena pesada gamma humana de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (anti-gamma humano (fc)-FA, Jackson, nº 109-056-098). Las placas se lavaron tres veces en PBS-Tween entre cada etapa. Se subclonaron cinco y dos hibridomas que segregaban anticuerpos específicos IgG\kappa anti-EGFR humanos a partir de las fusiones de los ratones nº 22232 y nº 22239, respectivamente. El análisis isotópico de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos EGFR-específicos mostró que incluían cuatro anticuerpos IgG_{1}\kappa, un anticuerpo IgG_{2}\kappa y un anticuerpo IgG_{4}\kappa.

Ejemplo 10 Constantes de tasa y de equilibrio para anticuerpos monoclonales IgG\kappa humanos purificados

Los hibridomas se cultivaron en eRDF que contenía suero de feto bovino al 1% (bajo en IgG). Se purificaron MAbs humanos utilizando una columna de proteína G. Se determinaron las constantes de asociación en la tasa de equilibrio de los MAbs purificados para G-CSF y para CD4 soluble utilizando un instrumento BIAcore2000. Se inmovilizó G-CSF humano (120 RU) o CD4:Fc (1.600 RU) mediante acoplamiento covalente de grupos aminos a la superficie del chip detector de un BIAcore2000 (BIAcore) siguiendo las instrucciones del fabricante. El anticuerpo monoclonal se hizo fluir sobre los antígenos. El chip se regeneró con tampón de glicina-HCl (pH 1,5) o con MgCl_{2} 4 M para eliminar cualquier MAb residual anti-G-CSF humano o anti-CD4, respectivamente. Este ciclo se repitió utilizando diferentes concentraciones de MAb. La unión y disociación del antígeno se determinaron utilizando software BIAevaluation 3.0. La Ka se derivó dividiendo la k_{asoc} por la k_{disoc}. Tal como se muestra en la Tabla 6 a continuación, estos valores son comparables a los obtenidos para el MAb anti-G-CSF humano, clon 3316.111 (R&D) o MAb anti-CD4 murino, Leu3a (Pharmingen).

TABLA 6

14

Ejemplo 11 Generación de ratones cruzados (Fc)

Es bien conocido que la tolerancia inmunológica evita la reactividad contra los autoantígenos, habitualmente impidiendo la producción de anticuerpos monoclonales de ratón contra antígenos foráneos cuyas secuencias de aminoácidos son similares o idénticas a las de las contrapartidas murinas. Los anticuerpos monoclonales de ratón que se unen a epítopos comunes entre antígenos humanos y las contrapartidas murinas de los mismos pueden resultar útiles debido a que las secuencias de aminoácidos en el sitio activo de los antígenos proteínas tienden a encontrarse bien conservados. Además, cualquier efecto producido por la administración in vivo de dichos anticuerpos puede estudiarse con facilidad en modelos de ratón. Sin embargo, también ha resultado difícil obtener anticuerpos monoclonales de ratón contra dichos epítopos comunes. Tal como se ha descrito anteriormente, los ratones cruzados de la presente invención pueden utilizarse para obtener anticuerpos monoclonales humanos contra diversos antígenos humanos. Sin embargo, en determinadas circunstancias puede resultar difícil obtener anticuerpos monoclonales humanos que presenten la capacidad de unirse a antígenos humanos bien conservados o que reaccionen cruzadamente con contrapartidas murinas. De esta manera, en otro aspecto de la invención, se proporcionan ratones cruzados adicionales de la invención en los que ha sido inactivado el receptor IIB de Fc\gamma. Estos ratones, denominados en la presente invención ratones cruzados (Fc), permiten la generación de anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos bien conservados o que reaccionan cruzadamente con las contrapartidas murinas de los mismos. Los estudios bioquímicos y genéticos indican que el receptor de baja afinidad de tipo IIB para la inmunoglobulina (Ig) G (Fc\gammaRIIB) inhibe la activación celular desencadenada por anticuerpo o por complejos inmunológicos y puede ser un componente importante en la prevención de la emergencia de autoinmunidad (Takai, T. et al., Nature 379:346-349, 1996). Los animales deficientes en Fc\gammaRIIB, el receptor Fc inhibidor, presentan respuestas incrementadas generalizadas de anticuerpos e inflamación elevada en todas las clases mediadas por anticuerpo de reacciones de hipersensibilidad (Takai, T. et al., Nature 379:346-349, 1996). Por ejemplo, los ratones inmunizados con colágeno bovino de tipo IV (C-IV), pero no de ratones de tipo salvaje, mostraron respuestas de autoanticuerpo elevadas frente a C-IV de ratón (Nakamura, A. et al., J. Exp. Med. 191:899-905, 2000). Sin embargo, no existe ningún informe de que puedan utilizarse ratones mutantes para Fc\gammaRIIB para la producción eficiente de anticuerpos monoclonales autorreactivos. Además, no hay ningún informe que demuestre la producción eficiente de anticuerpos monoclonales humanos que se unan tanto a antígenos humanos como a contrapartidas murinas en ratones.

Tal como se describe a continuación, la mutación Fc\gammaRIIB se cruzó con los ratones cruzados de la invención. La inmunización de los ratones cruzados (Fc) resultantes con C-IV bovino indujo respuestas de anticuerpos humanos contra C-IV tanto bovino como murino. También pueden generarse hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales humanos que se unen a C-IV tanto bovino como murino. Por lo tanto, los ratones cruzados (Fc) permiten la producción de anticuerpos monoclonales humanos que pueden unirse tanto a antígenos foráneos inmunizados como a las contrapartidas murinas de los mismos. Los ratones cruzados (Fc) también pueden resultar útiles para obtener anticuerpos monoclonales humanos contra antígenos bien conservados. Los ratones homocigóticos para la ausencia de Fc\gamma-RIIB (Fc(-/-)) (Takai, T. et al., Nature 379:346-349, 1996) fueron proporcionados por Dr. Toshifumi Takai (Tohoku University, Japón). Los ratones macho Fc(-/-) se cruzaron con ratones cruzados hembra (tal como se describe en el Ejemplo 3). La retención del transgén KCo5 y hCF(SC20) en cada individuo de F1 se examinó mediante ELISAs y PCRs tal como se describe en el Ejemplo 3. Los genotipos de los ratones con inactivación génica para Fc\gammaRIIB determinados mediante análisis de PCR utilizando los tres cebadores son los siguientes:

Neo, {}\hskip0.52cm 5'-CTCGTGCTTTACGGTATCGCC

(SEC ID nº 8);

5'EC1, {}\hskip0.2cm 5'-AAACTCGACCCCCCGTGGATC

(SEC ID nº 9), y

3'EC1, {}\hskip0.2cm 5'-TTGACTGTGGCCTTAAACGTGTAG

(SEC ID nº 10).

Se sometieron a PCR muestras de ADN genómico preparadas a partir de biopsias de cola utilizando ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer). En la mezcla de reacción estándar que contenía los tres cebadores indicados anteriormente (0,5 pM cada uno), las muestras se amplificaron durante 35 ciclos: 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 62ºC, 30 segundos a 72ºC (Gene Amp PCR system 9600, Perkin Elmer). Los tamaños de banda proporcionados por el alelo de tipo salvaje y el alelo homocigótico eran de 161 pb y 232 pb, respectivamente. El macho F1 cuyo genotipo es KCo5/CMD o CM2D (-/+)/CKD o JKD (-/+)/Fc(-/+) y la hembra cuyo genotipo es hCF(SC20)/KCo5/CMD o CM2D (-/+)/CKD o JKD (-/+)/Fc(-/+) se seleccionaron y se utilizaron para cruces adicionales. Finalmente, se obtuvieron los ratones (cruzados (Fc)) cuyo genotipo es hCF(SC20)/KCo5/CMD o CM2D(-/-)/CKD o JKD(-/-)/Fc(-/-). Los niveles séricos de expresión de Ig \mu e Ig \kappa humanas en los ratones cruzados (Fc) se confirmó que resultaban comparables a los niveles en ratones cruzados (ver el Ejemplo 4).

Ejemplo 12 Generación de anticuerpos monoclonales humanos anticolágeno de tipo IV de ratón

Inmunización de antígeno. Se obtuvo C-IV bovino (Cellmatrix IV) de Nitta Gellatin, Inc. La solución de C-IV (3,0 mg/ml en HCl 1 mM, pH 3,0) se neutralizó mediante la adición de NaOH 1 mM (concentración final) antes de emulsionar con adyuvante de Freund. Los ratones cruzados y cruzados (Fc) se inmunizaron en la base de la cola con 150 \mug de C-IV emulsionados en CFA que contiene Mycobacterium tuberculosis cepa H_{37}Rv (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Los ratones reciben un refuerzo en la misma localización con 150 \mug de C-IV más IFA (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 26 y 48 días después (Nakamura, A. et al., J. Exp. Med. 191:899-905, 2000).

Respuestas humorales en ratones. Se recogió suero el día 58. Se midió la Ig\gamma humana reactiva con antígeno en el suero mediante ELISA, tal como se describe con modificación (Nakamura, A. et al., J. Exp. Med. 191:899-905, 2000). Se detectaron anticuerpos contra C-IV bovino en un ensayo de microplaca de 96 pocillos (Nunc, MaxiSorp) en el que se recubrieron pocillos con 50 \mul/pocillo de una solución de 20 \mug/ml de C-IV bovino en PBS a 4 grados durante la noche. Se detectaron anticuerpos contra C-IV de ratón mediante la utilización del ensayo de placa de 96 pocillos de C-IV de ratón BIOCOAT Cellware (Becton Dickinson Labware). Se añadió el suero diluido (1:20-1280) a una concentración de 50 \mul/pocillo y se dejó reaccionar durante la noche a 4 grados. Los pocillos se lavaron y se acopló anti-IgG humano (Fc) de cabra con peroxidasa de rábano picante (Sigma, A0170) a 4 grados durante 2 horas, se lavaron y se desarrollaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con 50 \mul de sustrato TMB (Sumitomo Bakelite, ML-1120T). La DO a 450 nm se leyó utilizando un lector de microplacas (Arvo, Wallac Berthold, Japón). Se observó una respuesta específica de autoanticuerpo \gamma humano contra C-IV de ratón en el suero de ratones cruzados (Fc) pero no en ratones cruzados. Se observaron respuestas incrementadas a C-IV bovino en el suero de ratones cruzados (Fc) (fig. 14).

Cribado de fusiones y de hibridomas. Los ratones recibieron una inyecciones intraperitoneal (KM nº 1: cruzado, FC nº 1: cruzado (Fc)) o intravenosa adicionales (KM nº 2: cruzado, FC nº 2: cruzado (Fc)) de 150 \mug de antígeno 66 días después y se recolectaron células de bazo 69 días después. Se fusionaron células de bazo de ratones con células de mieloma de ratón (Sp2/0-Ag14) mediante procedimientos estándares. Se inoculó la suspensión celular en placas de 96 pocillos a una densidad de 200.000 esplenocitos por pocillo. Las células se cultivaron en DMEM, FBS al 10%, insulina e IL-6. Se añadió suplemento HAT o HT al medio durante el crecimiento inicial y la selección. Los hibridomas se cribaron mediante ELISA. Para identificar hibridomas que segregaban C-IV de ratón, se recubrieron placas ELISA (Nunc MaxiSorp) durante la noche a 4 grados con 50 \mul/pocillo de C-IV de ratón (Sigma, C0534) a una concentración de 40 \mug/ml en PBS. Se añadieron cincuenta \mul de sobrenadante de cultivo celular. Se obtuvieron dos hibridomas que segregaban anticuerpo h\gamma-positivo y reactivo para C-IV de ratón a partir de ratones cruzados (Fc) y se subclonaron con éxito mediante dilución limitante (ver la Tabla 7, a continuación).

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TABLA 7

15

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Estos datos demuestran que los ratones cruzados (Fc) resultan útiles para la producción de anticuerpos monoclonales humanos contra antígenos o epítopos bien conservados.

El alcance de la presente invención no se encuentra limitado por las formas de realización ejemplificadas, que pretenden ser ilustraciones de aspectos individuales de la invención.

<110> Tomizuka, Kazuma

\hskip1cm

Ishida, Isao

\hskip1cm

Lonberg, Nils

\hskip1cm

Halk, Ed

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<120> ROEDORES TRANSCROMOSÓMICOS TRANSGÉNICOS PARA LA PREPARACIÓN DE ANTICUERPOS HUMANOS

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<130> 014643-012110US

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<140> No asignado

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<141> No asignado

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<150> US 60/250.340

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<151> 2000-11-30

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<160> 10

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<170> PatentIn ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 3881

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: plásmido de cadena ligera kappa

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<220>

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<223> pCK7-96

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<400> 1

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16

17

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<210> 2

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<211> 4723

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: plásmido de cadena pesada gamma1

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<220>

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<223> pCG7-96

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<400> 2

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18

19

20

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<210> 3

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<211> 4694

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: plásmido de cadena pesada gamma4

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<220>

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<223> pG4HE

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<400> 3

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21

22

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<210> 4

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: sonda para la región 5' respecto a la región V de la cadena kappa O1

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccaccccata aacactgatt c

\hfill

21

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<210> 5

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: sonda para la región 5' respecto a la región V de la cadena kappa O1

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttgatgcatc ctacccaggg c

\hfill

21

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<210> 6

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<211> 20

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<212> AND

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: sonda para las regiones intergénicas L24 y L25 de la región

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\hskip-.1em\dddseqskip

V de la cadena kappa

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

cctgccttac agtgctgtag

\hfill

20

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<210> 7

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: sonda para las regiones intergénicas L24 y L25 de la región

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\hskip-.1em\dddseqskip

V de la cadena kappa

\hfill

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<400> 7

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ggacagcaac aggacatggg

\hfill

20

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<210> 8

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador neo de PCR

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<400> 8

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ctcgtgcttt acggtatcgc c

\hfill

21

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<210> 9

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: EC1 5' de cebador de PCR

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<400> 9

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aaactcgacc ccccgtggat c

\hfill

21

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<210> 10

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: EC1 3' de cebador de PCR

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<400> 10

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ttgactgtgg ccttaaacgt gtag

\hfill

24

Claims (53)

1. Ratón transgénico que comprende dos loci humanos de inmunoglobulina, en el que un locus humano de inmunoglobulina es un locus humano de cadena pesada situado en un transcromosoma, y el otro locus humano de inmunoglobulina es una parte de un transgén de locus humano de cadena ligera integrado de manera estable en el genoma de ratón y que codifica una cadena ligera humana.

2. Ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el transgén de locus humano de cadena ligera comprende un locus humano de cadena ligera kappa.

3. Ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el transgén de locus humano de cadena ligera comprende secuencias no reorganizadas procedentes del locus humano de cadena ligera kappa.

4. Ratón transgénico según la reivindicación 1, en el que por lo menos una parte del transgén de locus humano de cadena ligera se encuentra situado en un vector YAC.

5. Ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el transcromosoma es el transcromosoma SC20.

6. Ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el transgén es el transgén KCo5.

7. Ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el transcromosoma es el transcromosoma SC20 y el transgén es el transgén KCo5.

8. Ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una mutación de un gen que incrementa la respuesta inmunológica a un autoantígeno.

9. Ratón transgénico según la reivindicación 8, en el que la mutación inactiva el gen RIIB de Fc-\gamma.

10. Ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el locus endógeno de cadena pesada de mamífero y por lo menos un locus endógeno de cadena ligera de mamífero se encuentran inactivados.

11. Ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el locus endógeno de cadena pesada de mamífero y el locus endógeno de cadena ligera kappa de mamífero se encuentran inactivados.

12. Procedimiento para generar una pluralidad de células B que expresan secuencias humanas de anticuerpo, comprendiendo el procedimiento inmunizar el ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para generar una pluralidad de células B que expresan anticuerpos de secuencia humana.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, que comprende además aislar la pluralidad de células B que expresan secuencias humanas de anticuerpo procedentes del ratón transgénico.

14. Procedimiento para generar hibridomas específicos de antígeno que segregan anticuerpo de secuencia humana, comprendiendo el procedimiento:

inmunizar un ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 con un antígeno predeterminado y fusionar los linfocitos procedentes del ratón transgénico con células inmortalizadas para formar células hibridoma; o

fusionar las células B generadas según la reivindicación 12 con células inmortalizadas para formar células hibridoma; e

identificar los hibridomas que segregan un anticuerpo de secuencia humana que se une específicamente al antígeno predeterminado.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, que comprende además aislar los anticuerpos de secuencia humana a partir de las células hibridoma.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que son purificados los anticuerpos de secuencia humana.

17. Procedimiento según la reivindicación 12, que comprende además aislar los polinucleótidos que codifican anticuerpos humanos.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que los polinucleótidos que codifican anticuerpos humanos son de longitud completa.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, que comprende además expresar los polinucleótidos en una célula transfectada.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que la pluralidad de células B comprende por lo menos una primera célula B que expresa un anticuerpo con un primer isotipo seleccionado de entre IgA, IgD, IgE, IgG o IgM.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que la pluralidad de células B comprende además por lo menos una segunda célula B que expresa un anticuerpo con un segundo isotipo diferente del primer isotipo seleccionado de entre IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.

22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que la pluralidad de células B comprende por lo menos cinco células B cada una de las cuales expresa un anticuerpo que presenta un isotipo diferente, en el que los isotipos de los anticuerpos son IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que el isotipo de IgA es IgA_{1} o IgA_{2}.

24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que el isotipo de IgG es IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} o IgG_{4}.

25. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que más del 50% de los clones de hibridoma antígeno-específico segregan anticuerpo que presenta cadena pesada humana y cadena ligera humana.

26. Procedimiento para generar un anticuerpo de secuencia humana que se une a un antígeno predeterminado, comprendiendo el procedimiento:

(a) inmunizar un ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 con un antígeno predeterminado, y

aislar el anticuerpo de secuencia humana del ratón transgénico inmunizado; o

(b) fusionar los linfocitos procedentes del ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 con células inmortalizadas para formar células de hibridoma; y

cribar las células hibridoma formadas para la presencia de anticuerpos antígeno-reactivos.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que el anticuerpo de secuencia humana se une a un antígeno predeterminado con una constante de asociación de equilibrio (Ka) de por lo menos 10^{8} M^{-1}, por lo menos 10^{9} M^{-1} o por lo menos 10^{10} M^{-1}.

28. Procedimiento según la reivindicación 25, 26 ó 27, en el que los anticuerpos de secuencia humana son un isotipo IgA o un isotipo IgG.

29. Procedimiento según la reivindicación 25, 26 ó 27, que comprende además aislar y modificar el anticuerpo de secuencia humana para incluir únicamente una parte ligante de antígeno, por ejemplo un fragmento F(ab')_{2}, Fab, Fv o Fd.

30. Procedimiento según la reivindicación 26(b), en el que los anticuerpos antígeno-reactivos se segregan a partir de células hibridoma en cultivo.

31. Procedimiento según la reivindicación 26(b) o 30, en el que los anticuerpos antígeno-reactivos se purifican sustancialmente.

32. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que los anticuerpos sustancialmente purificados se formulan para uso terapéutico.

33. Procedimiento para producir polinucleótidos humanos reorganizados de inmunoglobulina, que comprende obtener polinucleótidos humanos reorganizados de polinucleótidos a partir de un ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

34. Procedimiento según la reivindicación 33, en el que la etapa de obtención comprende recoger células B linfocitos que contienen los polinucleótidos humanos reorganizados de inmunoglobulina a partir del ratón trans-
génico.

35. Procedimiento según la reivindicación 33, en el que la etapa de obtención comprende aislar y amplificar ARNm a partir de células B linfocitos para generar ADNc.

36. Procedimiento según la reivindicación 35, que comprende además aislar y amplificar polinucleótidos de región variable de cadena pesada y de cadena ligera a partir del ADNc.

\newpage

37. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, que comprende además:

cultivar una célula huésped que comprende un polinucléotido que codifica secuencias humanas reorganizadas de inmunoglobulina a partir de un ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, bajo condiciones en las que el polinucleótido se replica, y

recuperar el polinucleótido a partir de la célula huésped cultivada o un medio de cultivo de la misma.

38. Procedimiento para producir una biblioteca de presentación de anticuerpos humanos, comprendiendo el procedimiento:

introducir un inmunógeno en el ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11;

aislar una población de polinucleótidos que codifican de cadenas humanas de anticuerpo a partir de células linfáticas del ratón transgénico; y

formar una biblioteca de paquetes de presentación que presentan las cadenas de anticuerpo, en el que un elemento de la biblioteca comprende un polinucleótido que codifica una cadena de anticuerpo, y la cadena de anticuerpo se presenta a partir del paquete.

39. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que el inmunógeno es una molécula de ácido nucleico.

40. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que la molécula de ácido nucleico codifica un receptor unido a membrana.

41. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40, en el que el ratón transgénico carece de un título detectable respecto al inmunógeno cuando se lleva a cabo la etapa de aislamiento.

42. Procedimiento para generar un anticuerpo de secuencia humana o fragmento del mismo que se une a un antígeno predeterminado, comprendiendo el procedimiento:

(a) aislar las secuencias de la región V del anticuerpo a partir de un ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 inmunizado con un antígeno predeterminado;

clonar las regiones V aisladas en un vector para generar una biblioteca de expresión; y

expresar la biblioteca para identificar las secuencias de la región V que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo que se une al antígeno predeterminado; o

(b) clonar un polinucleótido aislado que codifica por lo menos una región V de anticuerpo humano en un vector de expresión, en el que el polinucleótido aislado es a partir de una célula B del ratón transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 inmunizado con un antígeno predeterminado, o a partir de hibridomas generados mediante fusión de la célula B y una célula inmortalizada;

introducir el vector recombinante en una célula huésped;

cultivar la célula huésped para recoger el anticuerpo de secuencia humana o fragmento del mismo a partir de la célula huésped o su medio de cultivo.

43. Procedimiento según la reivindicación 42, en el que las líneas celulares clonales se obtienen a partir de por lo menos 50% de las células hibridoma identificadas.

44. Procedimiento según la reivindicación 42 ó 43, en el que el polinucleótido codifica secuencias humanas de longitud completa de anticuerpo.

45. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44, en el que el polinucleótido es un ADNc.

46. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 42 a 45, en el que el polinucleótido aislado mediante PCR.

47. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 42 a 45, en el que el polinucleótido aislado mediante cribado de biblioteca de ADNc utilizando por lo menos una sonda molecular de ácido nucleico.

48. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 42 a 45, en el que el polinucleótido aislado mediante cribado de biblioteca de presentación fágica.

49. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 42 a 45, en el que el isotipo del anticuerpo de secuencia humana recogido es diferente del isotipo de las células que producen anticuerpos del ratón transgénico inmunizado.

50. Procedimiento para mejorar la estabilidad de una célula hibridoma de ratón transcromosómico que expresa un anticuerpo humano reactivo con un antígeno predeterminado, comprendiendo el procedimiento:

someter a reproducción un primer ratón, comprendiendo el primer ratón un primer locus humano de inmunoglobulina que es un locus humano de cadena pesada situado en un transcromosoma, junto con un segundo ratón, comprendiendo el segundo ratón un segundo locus humano de inmunoglobulina que es una parte de un transgén de locus humano de cadena ligera de manera estable integrado en el genoma de ratón y que codifica una cadena ligera humana;

obtener un tercer ratón a partir de la reproducción, comprendiendo el tercer ratón tanto el primer como el segundo locus humano de inmunoglobulina;

inmunizar con un antígeno predeterminado el tercer ratón o la progenie del mismo que conserva tanto el primer como el segundo locus humano de inmunoglobulina;

recoger las células B a partir del ratón inmunizado; y

fusionar las células B con células inmortalizadas para obtener las células hibridoma que expresan el anticuerpo humano reactivo con el antígeno predeterminado.

51. Procedimiento según la reivindicación 50, que comprende además:

cultivar las células de hibridoma;

someter a ensayo unos medios de cultivo de células hibridoma para identificar las células hibridoma que expresan anticuerpos humanos reactivos con el antígeno predeterminado;

diluir las células hibridoma; y

cultivar las células hibridoma diluidas para obtener las líneas celulares clonales que expresan un anticuerpo monoclonal humano reactivo con el antígeno predeterminado.

52. Procedimiento según la reivindicación 50 ó 51, en el que dicho primer ratón y dicho segundo ratón comprenden una mutación de un gen que incrementa la respuesta inmunológica a un autoantígeno.

53. Procedimiento según la reivindicación 52, en el que la mutación inactiva el gen Fc\gammaRIIB.