CN107074966A - 具有改变的FCRN‑和蛋白A‑结合性质的Fc区变体 - Google Patents

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Abstract

本文报道一种异源二聚体多肽，其包含第一多肽，所述第一多肽在N‑端至C‑端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的免疫球蛋白铰链区的至少一部分、免疫球蛋白CH2‑结构域和免疫球蛋白CH3‑结构域；和第二多肽，所述第二多肽在N‑端至C‑端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的免疫球蛋白铰链区的至少一部分、免疫球蛋白CH2‑结构域和免疫球蛋白CH3‑结构域，其中所述第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V(孔洞链)和所述第二多肽包含突变S354C和T366W(凸起链)，和其中所述第一多肽(孔洞链)包含突变i)I253A或I253G，和ii)L314A或L314G或L314D，和其中所述第一多肽和第二多肽通过一个或多个二硫桥连接，和其中所述第一多肽的CH3‑结构域和所述第二多肽的CH3‑结构域都结合或都不结合蛋白A(根据Kabat EU索引编号)。

Description

具有改变的FCRN-和蛋白A-结合性质的Fc区变体
技术领域
在本文中报道，就与Fc-受体以及蛋白A的结合而言已经改变的IgG Fc区。
发明背景
对成本有效的生产方法的需求已经导致了对下游纯化(包括一个或多个亲和色谱步骤)进行优化的必要性。处理更大的体积和对原位清洗(CIP)方案的更为苛刻的要求，是需要解决的一些问题(Hober，S.，J.Chrom.B.848(2007)40-47)。
借助于选择性的Fc区亲和性配体来纯化单克隆抗体，是最有希望用于大规模生产治疗性单克隆抗体的方法。实际上，该程序不需要建立与抗体的抗原特异性部分(即Fab结构域)的任何相互作用，因而所述抗原特异性部分可以保持完整且可以保留其性质(参见Salvalaglio，M.，等，J.Chrom.A 1216(2009)8678-8686)。
由于其选择性，亲和性纯化步骤在早期被用在链纯化中，且由此可以减少连续单元操作的数量(参见Hober，出处同上；MacLennan，J.，Biotechnol.13(1995)1180；Harakas，N.K.，BioprocessTechnol.18(1994)259)。
最常用于选择性结合IgG的配体是葡萄球菌蛋白A和蛋白G，它们能够在被称作“共有结合位点”(CBS)的区域中建立与大多数IgG的Fc区的高度选择性相互作用(DeLano，W.L.，等人，Science 287(2000)1279)，所述区域位于Fc区的CH2和CH3结构域之间的铰链区。
葡萄球菌蛋白A(SPA)是革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌表面上暴露的细胞壁相关的蛋白结构域。SPA对来自多种物种的IgG(例如人、兔子和豚鼠IgG)具有高亲和性，但是对牛和小鼠IgG仅具有弱相互作用(参见下表)(参见Hober，出处同上；Duhamel，R.C.，等人，J.Immunol.Methods 31(1979)211；L.和Kronvall，G.，Immunol.J.133(1984)969；Richman，D.D.，等，J.Immunol.128(1982)2300；Amersham Pharmacia Biotech，Handbook，Antibody Purification(2000))。
++：强结合 /+：中等结合 /-：弱或没有相互作用
IgG的CH2和CH3结构域之间的重链铰链区能够结合除了蛋白A以外的几种蛋白，如新生儿Fc受体(FcRn)(参见DeLano和Salvalaglio，出处同上)。
SPA CBS包括在抗体表面上的疏水口袋。组成IgG CBS的残基是Ile 253、Ser 254、Met 252、Met 423、Tyr 326、His 435、Asn 434、His 433、Arg 255和Glu 380(IgG重链残基根据Kabat EU索引编号系统编号)。带电荷的氨基酸(Arg 255，Glu 380)被放置在由Ile253和Ser 254形成的疏水凸起周围。这(可以)导致极性和亲水性相互作用的建立(参见Salvalaglio，出处同上)。
一般而言，可以使用两个主要结合位点，描述蛋白A-IgG相互作用：第一个位于重链CH2结构域中，且特征在于(蛋白A的)Phe 132、Leu 136、Ile 150与由Ile 253和Ser 254构成的IgG疏水凸起之间的疏水性相互作用，以及特征在于Lys 154(蛋白A)和Thr 256(IgG)之间的一个静电相互作用。第二个位点位于重链CH3结构域中，且由Gln 129和Tyr133(蛋白A)与His 433、Asn 434和His 435(IgG)之间的静电相互作用占支配地位(参见Salvalaglio，出处同上)。
Lindhofer，H.，等(J.Immunol.155(1995)219-225)报道了在大鼠/小鼠四源杂交瘤(quadroma)中的优先物种限制的重/轻链配对。
Jedenberg，L.，等(J.Immunol.Meth.201(1997)25-34)报道了，两种Fc变体(Fc13和Fc31，各自含有来自相应的另一种同种型的同种型二肽置换)的SPA-结合分析表明，Fc1和Fc31可以与SPA相互作用，而Fc3和Fc13缺少可检测的SPA结合。Fc区变体Fc31被赋予的SPA结合被总结为由引入的二肽置换R435H和F436Y引起。
现在，关于治疗性单克隆抗体的焦点是，制备和应用特异性结合两种或更多种靶标(抗原)的双特异性抗体或甚至多特异性抗体。
在一个表达细胞系中从四种抗体链(两种不同重链和两种不同轻链)产生多特异性的异源二聚体IgG抗体的一个基本挑战是，所谓的链结合问题(参见Klein，C.，等，mAbs 4(2012)653-663)。由于要求不同链作为多特异性抗体的左臂和右臂，从而导致在一个细胞中表达后的抗体混合物：两种重链(理论上)能够以四种不同的组合方式结合(其中的两种是相同的)，且其中的每一种都可以以随机方式与轻链结合，从而产生24(＝共计16)种在理论上可能的链组合。在16种在理论上可能的组合中，可以发现10种中仅一种对应于期望的功能性双特异性抗体(De Lau，W.B.，等，J.Immunol.146(1991)906-914)。从复杂混合物中分离出该期望的双特异性抗体的困难和在理论上最大12.5％的固有低收率，使得在一个表达细胞系中产生双特异性抗体是非常有挑战性的。
为了克服链结合问题和加强两种不同重链的正确结合，在二十世纪九十年代后期，来自Genentech的Carter等人发明了被称作“凸起-进入-孔洞(knobs-into-holes)”(KiH)的方案(参见Carter，P.，J.Immunol.Meth.248(2001)7-15；Merchant，A.M.，等，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；Zhu，Z.，等人，Prot.Sci.6(1997)781-788；Ridgway，J.B.，等人，Prot.Eng.9(1996)617-621；Atwell，S.，等，J.Mol.Biol.270(1997)26-35；和US7,183,076)。基本上，所述概念依赖于抗体的两个重链的两个CH3结构域之间的界面的修饰，在所述界面处发生大多数相互作用。将大残基引入一个抗体重链的CH3结构域中，并以类似钥匙(“凸起”)的方式起作用。在另一个重链中，模仿锁，形成能够容纳该大残基的“孔洞”。通过引入/形成人工二硫键，可以进一步稳定得到的异源二聚体Fc区。值得注意的是，所有KiH突变都被埋在CH3结构域内，且是免疫系统不“可见的”。另外，具有KiH突变的抗体的性质诸如(热)稳定性、FcγR结合和效应子功能(例如，ADCC、FcRn结合)和药代动力学(PK)行为不受影响。
通过引入六个突变，：“凸起”重链中的S354C、T366W，和“孔洞”重链中的Y349C、T366S、L368A、Y407V，可以实现具有高于97％的异源二聚化收率的正确重链结合(参见Carter，出处同上；残基的编号根据Kabat EU索引编号系统)。尽管孔洞-孔洞同源二聚体可能出现，通常不会观察到凸起-凸起同源二聚体。通过选择性的纯化程序或通过下面所述的程序，可以除去孔洞-孔洞二聚体。
尽管已经解决了随机重链结合的问题，还必须确保正确的轻链结合。类似于KiHCH3结构域方案，已经尝试研究可能最终导致完整双特异性IgG的不对称轻链-重链相互作用。
Roche最近开发了CrossMab方案，当将其与KiH技术组合时，可以强化双特异性异源二聚体IgG抗体中的正确轻链配对(参见Klein，出处同上；Schaefer.W.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2011)11187-11192；Cain，C.，SciBX 4(2011)1-4)。这使得可以以通用方式制备双特异性抗体或甚至多特异性抗体。在这种形式中，预期的双特异性抗体的一个臂保持不变。在第二个臂中，通过重链和轻链之间的结构域交叉，交换整个Fab区域或VH-VL结构域或CH1-CL结构域。结果，新形成的“交叉”轻链不再与双特异性抗体的另一臂的(正常的，即未交叉的)重链Fab区结合。因而，通过结构域排列的这种小变化，可以强化正确的“轻链”结合(参见Schaefer，出处同上)。
Zhu等在双体(diabody)变体的两个VL/VH界面中引入了几种空间上互补的突变、以及二硫键。当将突变VL Y87A/F98M和VH V37F/L45W引入抗-p185HER2VL/VH界面中时，以＞90％收率回收了异源二聚体双体，同时与亲本双体相比维持了总收率和亲和性(参见Zhu，出处同上)。
来自Chugai的研究人员已经如下类似地设计了双特异性双体：将突变引入VH-VL界面(主要是VH中的Q39和VL中的Q38向带电荷残基的转化)中以促进正确的轻链结合(WO2006/106905；Igawa，T.，等，Prot.Eng.Des.Sel.23(2010)667-677)。
在WO2011097603中，报道了一种共同轻链小鼠。
在WO2010151792中，提供了一种容易分离的双特异性抗体形式，其包含在CH3结构域中差别修饰的(即异源二聚体的)免疫球蛋白重链可变结构域，其中就该CH3修饰而言所述差别修饰是非免疫原性的或基本上非免疫原性的，并且所述修饰中的至少一个导致双特异性抗体对亲和试剂，如蛋白A的差别亲和性，所述双特异性抗体可以基于它对蛋白A的亲和性而从破碎的细胞、从培养基或从抗体的混合物中分离。
新生儿Fc-受体(FcRn)对于体内IgG类抗体的代谢命运而言是重要的。FcRn行使功能以从溶酶体降解途径营救IgG，从而导致降低的清除率和增加的半衰期。它是一种由2个多肽组成的异二聚体蛋白：50kDa I类主要组织相容性复合物-样蛋白(α-FcRn)和15kDaβ2-微球蛋白(β2m)。FcRn以高亲和性结合至IgG类抗体的Fc区的CH2-CH3部分。IgG类抗体和FcRn之间的相互作用是pH依赖性的，并且以1:2化学计量发生，即一个IgG抗体分子可以经由它的两个重链Fc区多肽与两个FcRn分子相互作用(参见，例如Huber，A.H.，等，J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。
因此，IgG体外FcRn结合性质/特征指示它在血液循环中的体内药代动力学性质。
在FcRn和IgG类抗体的Fc区之间的相互作用中，重链CH2-和CH3-结构域的不同氨基酸残基参与其中。
影响FcRn结合并由此影响在血液循环中的半衰期的不同突变是已知的。已经通过定位诱变鉴别出对于小鼠Fc区-小鼠FcRn相互作用至关重要的Fc区残基(参见，例如Dall'Acqua，W.F.，等，J.Immunol 169(2002)5171-5180)。残基I253、H310、H433、N434和H435(根据Kabat EU索引编号系统编号)参与相互作用(Medesan，C.，等，Eur.J.Immunol.26(1996)2533-2536；Firan，M.，等，Int.Immunol.13(2001)993-1002；Kim，J.K.，等，Eur.J.Immunol.24(1994)542-548)。发现残基I253、H310和H435对于人Fc区与鼠FcRn的相互作用是至关重要的(Kim，J.K.，等，Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2885)。
已经通过突变Fc区中的不同氨基酸残基来执行增加Fc区(和同样IgG)与FcRn结合的方法：Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His 433和Asn434(参见，Kuo，T.T.，等，J.Clin.Immunol.30(2010)777-789；Ropeenian，D.C.，等，Nat.Rev.Immunol.7(2007)715-725)。
Dall'Acqua等通过蛋白质-蛋白质相互作用研究，已经描述了突变组合M252Y、S254T、T256E可以提高FcRn结合(Dall'Acqua，W.F.，等，J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。人Fc区-人FcRn复合物的研究已经证实，残基I253、S254、H435和Y436对于相互作用是至关重要的(Firan，M.，等，Int.Immunol.13(2001)993-1002；Shields，R.L.，等，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在Yeung，Y.A.，等(J.Immunol.182(2009)7667-7671)中，已经报道和检查了残基248至259和301至317和376至382和424至437的多种突变体。
在US 2012/0009182中，报道了具有改变的蛋白A结合的免疫球蛋白变体。在WO2004/035752中，报道了通过诱变改变抗体的FcRn结合亲和性或血清半衰期。
发明概述
在本文中报道了特异性结合葡萄球菌属蛋白A且结合或不结合人FcRn的变体Fc区。这些变体Fc区在CH2结构域中含有特定的氨基酸突变，而CH3结构域就蛋白A结合而言没有变化。已经发现，这些突变用于异源二聚体Fc区的孔洞链中时可以允许异源二聚体Fc区的纯化，即从同源二聚体Fc区副产物(孔洞链-孔洞链二聚体)分离异源二聚体Fc区。
本文中报道的一个方面是异源二聚体多肽，其包含
第一多肽，所述第一多肽在N-端至C-端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的免疫球蛋白铰链区的至少一部分、免疫球蛋白CH2-结构域和免疫球蛋白CH3-结构域；和第二多肽，所述第二多肽在N-端至C-端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的免疫球蛋白铰链区的至少一部分、免疫球蛋白CH2-结构域和免疫球蛋白CH3-结构域，
其中所述第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V(孔洞链)和所述第二多肽包含突变S354C和T366W(凸起链)，
和
其中所述第一多肽(孔洞链)包含突变
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，
和
其中所述第一多肽和第二多肽通过一个、两个或两个以上的二硫桥连接，和
其中所述第一多肽的CH3-结构域和所述第二多肽的CH3-结构域都结合或都不结合蛋白A(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，所述第一多肽(孔洞链)包含突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，和
iii)T250Q，和/或
iv)T256E或T256A。
在一个实施方案中，所述第一多肽(孔洞链)包含突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，和
iii)任选地a)T250Q，和/或T256E或T256A，和
iv)a)L251A或L251G或L251D，和/或b)H310A或H310G。
在一个实施方案中，所述第一多肽(孔洞链)包含突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，和
iii)a)T250Q，和/或T256E或T256A，和
iv)a)L251A或L251G或L251D，和/或b)H310A或H310G，
v)任选a)T307A或T307H或T307Q或T307P，和/或b)Q311H，和/或c)M252Y，和/或d)S254T。
在一个实施方案中，所述第二多肽(凸起链)包含突变：
i)T250Q，和/或
ii)M252Y，和/或
iii)S254T，和/或
iv)T256E或T256A，和/或
v)T307A或T307H或T307Q或T307P，和/或
vi)Q311H。
在一个实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽的免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2-结构域和免疫球蛋白CH3-结构域是人IgG1亚类的。在一个实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽各自还包含突变L234A和L235A。在一个实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽各自还包含突变P329G。在一个实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽各自还包含突变L234A、L235A和P329G。
在一个实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽的免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2-结构域和免疫球蛋白CH3-结构域是人IgG4亚类的。在一个实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽各自还包含突变S228P和L235E。在一个实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽各自还包含突变P329G。在一个实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽各自还包含突变S228P、L235E和P329G。
在一个实施方案中，异源二聚体多肽是Fc-区融合多肽。
在一个实施方案中，异源二聚体多肽是全长抗体。
在一个实施方案中，全长抗体包含除了孔洞突变外还具有突变I253A和L314A的第一多肽(孔洞链)和具有凸起突变的第二多肽(凸起链)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，全长抗体包含除了孔洞突变外还具有突变L251A和L314A的第一多肽(孔洞链)和具有凸起突变的第二多肽(凸起链)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，全长抗体包含除了孔洞突变外还具有突变L251A的第一多肽(孔洞链)和具有凸起突变的第二多肽(凸起链)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，全长抗体包含除了孔洞突变外还具有突变I253A的第一多肽(孔洞链)和具有凸起突变的第二多肽(凸起链)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，全长抗体包含除了孔洞突变外还具有突变L314A的第一多肽(孔洞链)和具有凸起突变的第二多肽(凸起链)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，全长抗体包含除了孔洞突变外还具有突变H310A的第一多肽(孔洞链)和具有凸起突变的第二多肽(凸起链)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，全长抗体包含除了孔洞突变外还具有突变L251A、I253A和L314A的第一多肽(孔洞链)和具有凸起突变的第二多肽(凸起链)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，全长抗体包含除了孔洞突变外还具有突变L251A、I253A和L314A的第一多肽(孔洞链)和除了凸起突变外还具有突变M252Y、S254T和T256E的第二多肽(凸起链)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，全长抗体包含除了孔洞突变外还具有突变I253A、L314A、M428L和N434H的第一多肽(孔洞链)和除了凸起突变外还具有突变M252Y、S254T和T256E的第二多肽(凸起链)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，全长抗体在重链可变结构域中还另外包含一个或多个选自S17A、R19A、T57A、T57K、R66A、S70A、Y79A、Q81A、N82aA和S82bA的突变(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，全长抗体在重链可变结构域中包含一个或多个选自S17A、R19A、T57A、T57K、R66A、Q81A和N82aA的突变并且与不具有这些突变但具有另外相同氨基酸序列的抗体相比具有降低的蛋白A结合(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，全长抗体在重链可变结构域中包含一个或多个选自S70A、Y79A和S82bA的突变并且与不具有这些突变但具有另外相同氨基酸序列的抗体相比具有提高的蛋白A结合(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，全长抗体是单特异性抗体。在一个实施方案中，所述单特异性抗体是单价单特异性抗体。在一个实施方案中，所述单特异性抗体是二价单特异性抗体。
在一个实施方案中，全长抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是二价双特异性抗体。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价双特异性抗体。
在一个实施方案中，全长抗体是三特异性抗体。在一个实施方案中，所述三特异性抗体是三价三特异性抗体。在一个实施方案中，所述三特异性抗体是四价三特异性抗体。
在一个实施方案中，异源二聚体多肽是双特异性全长抗体，其包含
第一多肽，其在N-端至C-端方向包含第一重链可变结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白CH1-结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白铰链区、亚类IgG1的免疫球蛋白CH2-结构域和亚类IgG1的免疫球蛋白CH3-结构域，
第二多肽，其在N-端至C-端方向包含第二重链可变结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白CH1-结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白铰链区、亚类IgG1的免疫球蛋白CH2-结构域和亚类IgG1的免疫球蛋白CH3-结构域，
第三多肽，其在N-端至C-端方向包含第一轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
第四多肽，其在N-端至C-端方向包含第二轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中所述第一重链可变结构域和所述第一轻链可变结构域形成特异性结合第一抗原的第一结合位点，
其中所述第二重链可变结构域和所述第二轻链可变结构域形成特异性结合第二抗原的第二结合位点，
其中所述第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V、L234A、L235A和P329G，且所述第二多肽包含突变S354C和T366W、L234A、L235A和P329G，
和
其中所述第一多肽(孔洞链)包含突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，
和
其中所述第一多肽和所述第二多肽通过一个或多个二硫桥连接，
和
其中第一多肽的CH3-结构域和第二多肽的CH3-结构域都结合或都不结合蛋白A(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，异源二聚体多肽是双特异性全长抗体，其包含
第一多肽，其在N-端至C-端方向包含第一重链可变结构域、免疫球蛋白轻链恒定结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白铰链区、亚类IgG1的免疫球蛋白CH2-结构域和亚类IgG1的免疫球蛋白CH3-结构域，
第二多肽，其在N-端至C-端方向包含第二重链可变结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白CH1-结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白铰链区、亚类IgG1的免疫球蛋白CH2-结构域和亚类IgG1的免疫球蛋白CH3-结构域，
第三多肽，其在N-端至C-端方向包含第一轻链可变结构域和亚类IgG1的免疫球蛋白CH-1结构域，
第四多肽，其在N-端至C-端方向包含第二轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中所述第一重链可变结构域和所述第一轻链可变结构域形成特异性结合第一抗原的第一结合位点，
其中所述第二重链可变结构域和所述第二轻链可变结构域形成特异性结合第二抗原的第二结合位点，
其中所述第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V、L234A、L235A和P329G，且所述第二多肽包含突变S354C和T366W、L234A、L235A和P329G，
和
其中所述第一多肽(孔洞链)包含突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，
和
其中所述第一多肽和所述第二多肽通过一个或多个二硫桥连接，
和
其中第一多肽的CH3-结构域和第二多肽的CH3-结构域都结合或都不结合蛋白A(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，异源二聚体多肽是双特异性全长抗体，其包含
第一多肽，其在N-端至C-端方向包含第一重链可变结构域、亚类IgG4的免疫球蛋白CH1-结构域、亚类IgG4的免疫球蛋白铰链区、亚类IgG4的免疫球蛋白CH2-结构域和亚类IgG4的免疫球蛋白CH3-结构域，
第二多肽，其在N-端至C-端方向包含第二重链可变结构域、亚类IgG4的免疫球蛋白CH1-结构域、亚类IgG4的免疫球蛋白铰链区、亚类IgG4的免疫球蛋白CH2-结构域和亚类IgG4的免疫球蛋白CH3-结构域，
第三多肽，其在N-端至C-端方向包含第一轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
第四多肽，其在N-端至C-端方向包含第二轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中所述第一重链可变结构域和所述第一轻链可变结构域形成特异性结合第一抗原的第一结合位点，
其中所述第二重链可变结构域和所述第二轻链可变结构域形成特异性结合第二抗原的第二结合位点，
其中所述第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V、S228P、L235E和P329G，且所述第二多肽包含突变S354C和T366W、S228P、L235E和P329G，
和
其中所述第一多肽(孔洞链)包含突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，
和
其中所述第一多肽和所述第二多肽通过一个或多个二硫桥连接，
和
其中第一多肽的CH3-结构域和第二多肽的CH3-结构域都结合或都不结合蛋白A(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，异源二聚体多肽是双特异性全长抗体，其包含
第一多肽，其在N-端至C-端方向包含第一重链可变结构域、免疫球蛋白轻链恒定结构域、亚类IgG4的免疫球蛋白铰链区、亚类IgG4的免疫球蛋白CH2-结构域和亚类IgG4的免疫球蛋白CH3-结构域，
第二多肽，其在N-端至C-端方向包含第二重链可变结构域、亚类IgG4的免疫球蛋白CH1-结构域、亚类IgG4的免疫球蛋白铰链区、亚类IgG4的免疫球蛋白CH2-结构域和亚类IgG4的免疫球蛋白CH3-结构域，
第三多肽，其在N-端至C-端方向包含第一轻链可变结构域和亚类IgG4的免疫球蛋白CH1-结构域，
第四多肽，其在N-端至C-端方向包含第二轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中所述第一重链可变结构域和所述第一轻链可变结构域形成特异性结合第一抗原的第一结合位点，
其中所述第二重链可变结构域和所述第二轻链可变结构域形成特异性结合第二抗原的第二结合位点，
其中所述第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V、S228P、L235E和P329G，且所述第二多肽包含突变S354C和T366W、S228P、L235E和P329G，
和
其中所述第一多肽(孔洞链)包含突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，
和
其中所述第一多肽和所述第二多肽通过一个或多个二硫桥连接，
和
其中第一多肽的CH3-结构域和第二多肽的CH3-结构域都结合或都不结合蛋白A(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，异源二聚体多肽是双特异性全长抗体，其包含
第一多肽，其在N-端至C-端方向包含第一重链可变结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白CH-1结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白铰链区、亚类IgG1的免疫球蛋白CH2-结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白CH3-结构域、肽接头和第一scFv，
第二多肽，其在N-端至C-端方向包含第二重链可变结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白CH1-结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白铰链区、亚类IgG1的免疫球蛋白CH2-结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白CH3-结构域、肽接头和第二scFv，
第三多肽，其在N-端至C-端方向包含第一轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
第四多肽，其在N-端至C-端方向包含第二轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中所述第一重链可变结构域和所述第一轻链可变结构域形成特异性结合第一抗原的第一结合位点，且所述第二重链可变结构域和所述第二轻链可变结构域形成特异性结合第一抗原的第二结合位点，且第一和第二scFv特异性结合第二抗原，
其中所述第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V、L234A、L235A和P329G，且所述第二多肽包含突变S354C和T366W、L234A、L235A和P329G，
和
其中所述第一多肽(孔洞链)包含突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，
和
其中所述第一多肽和所述第二多肽通过一个或多个二硫桥连接，
和
其中第一多肽的CH3-结构域和第二多肽的CH3-结构域都结合或都不结合蛋白A(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，异源二聚体多肽是双特异性全长抗体，其包含
第一多肽，其在N-端至C-端方向包含第一重链可变结构域、免疫球蛋白轻链恒定结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白铰链区、亚类IgG1的免疫球蛋白CH2-结构域和亚类IgG1的免疫球蛋白CH3-结构域、肽接头和第一scFv，
第二多肽，其在N-端至C-端方向包含第二重链可变结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白CH1-结构域、亚类IgG1的免疫球蛋白铰链区、亚类IgG1的免疫球蛋白CH2-结构域和亚类IgG1的免疫球蛋白CH3-结构域、肽接头和第二scFv，
第三多肽，其在N-端至C-端方向包含第一轻链可变结构域和亚类IgG1的免疫球蛋白CH-1结构域，
第四多肽，其在N-端至C-端方向包含第二轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中所述第一重链可变结构域和所述第一轻链可变结构域形成特异性结合第一抗原的第一结合位点，且所述第二重链可变结构域和所述第二轻链可变结构域形成特异性结合第一抗原的第二结合位点，且第一和第二scFv特异性结合第二抗原，
其中所述第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V、L234A、L235A和P329G，且所述第二多肽包含突变S354C和T366W、L234A、L235A和P329G，
和
其中所述第一多肽和所述第二多肽通过一个或多个二硫桥连接。
如本文中报道的一个方面是一种用于生产如本文中报道的异源二聚体多肽的方法，其包括以下步骤：
a)培养哺乳动物细胞，其包含一个或多个编码异源二聚体多肽的核酸，
b)从培养基回收异源二聚体多肽，和
c)用蛋白A亲和色谱纯化异源二聚体多肽并由此生产该二聚体多肽。
如本文中报道的一个方面是突变组合
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，
用于从同源二聚体多肽分离异源二聚体多肽的用途。
如本文中报道的一个方面是治疗患有眼血管疾病的患者的方法，包括将本文中报道的异源二聚体多肽施用于需要这种治疗的患者。
本文中报道的一个方面是本文中报道的异源二聚体多肽用于玻璃体内应用。
本文中报道的一个方面是本文中报道的异源二聚体多肽用作药物。
本文中报道的一个方面是本文中报道的异源二聚体多肽用于治疗血管性眼病。
本文中报道的一个方面是包含本文中报道的异源二聚体多肽和任选药物学上可接受载体的药物制剂。
就使用靶向/结合不仅存在于眼中而且存在于身体其余部分的抗原的抗体而言，从眼穿过血眼屏障进入血液后短的全身性半衰期是有益的，可以避免全身性副作用。
另外，对于特异性结合受体配体的抗体，该抗体可以仅在抗体-抗原复合物从眼中被除去，即所述抗体充当受体配体向眼外输出的运输载体并由此抑制受体信号传递时，才在眼病的治疗中是有效的。
本文中报道的一个方面是，本文中报道的异源二聚体多肽用于从眼运输可溶性受体配体跨血眼屏障进入血液循环的用途。
本文中报道的一个方面是，本文中报道的异源二聚体多肽用于从眼中去除一种或多种可溶性受体配体的用途。
本文中报道的一个方面是，本文中报道的异源二聚体多肽用于治疗眼病(尤其是眼血管疾病)的用途。
本文中报道的一个方面是，本文中报道的异源二聚体多肽用于将一种或多种可溶性受体配体从玻璃体内空间运输至血液循环中的用途。
本文中报道的一个方面是，用于治疗眼病的本文中报道的异源二聚体多肽。
本文中报道的一个方面是，用于从眼运输可溶性受体配体跨血眼屏障进入血液循环的本文中报道的异源二聚体多肽。
本文中报道的一个方面是，用于从眼去除一种或多种可溶性受体配体的本文中报道的异源二聚体多肽。
本文中报道的一个方面是，用于治疗眼病(尤其是眼血管疾病)的本文中报道的异源二聚体多肽。
本文中报道的一个方面是，用于将一种或多种可溶性受体配体从玻璃体内空间运输至血液循环中的本文中报道的异源二聚体多肽。
本文中报道的一个方面是，治疗患有眼血管疾病的个体的方法，包括将有效量的本文中报道的异源二聚体多肽施用于个体。
本文中报道的一个方面是，用于将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障运输至个体的血液循环中的方法，包括将有效量的本文中报道的异源二聚体多肽施用于个体，以将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障运输至血液循环中。
本文中报道的一个方面是，从个体眼中去除一种或多种可溶性受体配体的方法，包括将有效量的本文中报道的异源二聚体多肽施用于个体，以从眼中去除一种或多种可溶性受体配体。
本文中报道的一个方面是，用于将一种或多种可溶性受体配体从玻璃体内空间运输至个体血液循环中的方法，包括将有效量的本文中报道的异源二聚体多肽施用于个体，以将一种或多种可溶性受体配体从玻璃体内空间运输至血液循环中。
本文中报道的一个方面是，用于将可溶性受体配体从玻璃体内空间或眼跨血眼屏障运输至个体血液循环中的方法，包括将有效量的本文中报道的异源二聚体多肽施用于个体，以将可溶性受体配体从眼跨血眼屏障运输至血液循环中。
在一个实施方案中，异源二聚体多肽是双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体是二价双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体是四价双特异性抗体。
在一个实施方案中，异源二聚体多肽是三特异性抗体。在一个实施方案中，三特异性抗体是三价三特异性抗体。在一个实施方案中，三特异性抗体是四价三特异性抗体。
在一个实施方案中，异源二聚体多肽是CrossMab。
在一个实施方案中，异源二聚体多肽是Fc-区融合多肽。
在一个实施方案中，第一多肽进一步包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V和第二多肽进一步包含突变S354C和T366W。
在一个实施方案中，抗体或Fc-区融合多肽是亚类IgG1。在一个实施方案中，抗体或Fc-区融合多肽进一步包含突变L234A和L235A。在一个实施方案中，抗体或Fc-区融合多肽进一步包含突变P329G。
在一个实施方案中，抗体或Fc-区融合多肽是亚类IgG4。在一个实施方案中，抗体或Fc-区融合多肽进一步包含突变S228P和L235E。在一个实施方案中，抗体或Fc-区融合多肽进一步包含突变P329G。
发明实施方案详述
I.定义
术语“约”表示后接数值的+/-20％的范围。在一个实施方案中，术语约表示后接数值的+/-10％的范围。在一个实施方案中，术语约表示后接数值的+/-5％的范围。
为了本文的目的，“受体人框架”是包含源自如下文定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含与其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸改变的数量为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力成熟的”抗体表示，在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有这种改变的亲本抗体相比，这种改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。
术语“改变”表示，亲本抗体或融合多肽(例如至少包含Fc区的FcRn结合部分的融合多肽)中的一个或多个氨基酸残基的突变(置换)、插入(添加)、或缺失，以获得修饰的抗体或融合多肽。术语“突变”表示，所指的氨基酸残基被不同的氨基酸残基置换。例如突变L234A表示，抗体Fc区(多肽)中在位置234处的氨基酸残基赖氨酸被氨基酸残基丙氨酸置换(用丙氨酸置换赖氨酸)(根据Kabat EU索引编号系统编号)。
“天然存在的氨基酸残基”是指选自以下的氨基酸残基：丙氨酸(三字母代码：Ala，单字母代码：A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。
术语“氨基酸突变”表示，至少一个既有氨基酸残基被另一个不同的氨基酸残基(＝替代氨基酸残基)置换。所述替代氨基酸残基可以是“天然存在的氨基酸残基”，并且可以选自：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。替代氨基酸残基可以是“非天然存在的氨基酸残基”。参见例如US6,586,207、WO 98/48032、WO 03/073238、US 2004/0214988、WO 2005/35727、WO 2005/74524、Chin，J.W.，等，J.Am.Chem.Soc.124(2002)9026-9027；Chin，J.W.和Schultz，P.G.，ChemBioChem 11(2002)1135-1137；Chin，J.W.，等，PICAS United States of America 99(2002)11020-11024；和Wang，L.和Schultz，P.G.，Chem.(2002)1-10(全部完整地通过引用并入本文中)。
术语“氨基酸缺失”表示，在氨基酸序列中预定位置处的至少一个氨基酸残基的移除。
本文中的术语“抗体”以最宽的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括、但不限于单克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体)和抗体片段，只要它们呈现期望的抗原-和/或蛋白A和/或FcRn-结合活性即可。
术语“不对称Fc区”表示，根据Kabat EU索引编号系统在对应位置处具有不同氨基酸残基的Fc区多肽对。
术语“就FcRn结合而言不对称的Fc区”表示，由在对应位置处具有不同氨基酸残基的两条多肽链组成的Fc区，其中所述位置根据Kabat EU索引编号系统确定，其中所述不同的位置影响Fc区与人新生儿Fc-受体
(FcRn)的结合。为了本文的目的，在“就FcRn结合而言不对称的Fc区”中，所述Fc区的两条多肽链之间的差异不包括为了促进异二聚体Fc区的形成(例如为了生产双特异性抗体)而已经引入的差异。这些差异也可以是不对称的，即所述两条链在根据Kabat EU索引编号系统的非对应氨基酸残基处具有差异。这些差异可以促进异源二聚化和减少同源二聚化。这样的差异的实例是所谓“凸起进入孔洞”置换(参见，例如，US7,695,936和US2003/0078385)。已经发现，在IgG1亚类的IgG抗体的Fc区的两条多肽链中，以下凸起和孔洞置换可以增加异源二聚体形成：1)一条链中的Y407T和另一条链中的T366Y；2)一条链中的Y407A和另一条链中的T366W；3)一条链中的F405A和另一条链中的T394W；4)一条链中的F405W和另一条链中的T394S；5)一条链中的Y407T和另一条链中的T366Y；6)一条链中的T366Y和F405A以及另一条链中的T394W和Y407T；7)一条链中的T366W和F405W以及另一条链中的T394S和Y407A；8)一条链中的F405W和Y407A以及另一条链中的T366W和T394S；和9)一条链中的T366W以及另一条链中的T366S、L368A和Y407V，其中最后列出的是特别适宜的。另外，在两条Fc区多肽链之间形成新二硫桥的变化也可以促进异二聚体形成(参见，例如，US2003/0078385)。已经发现，在IgG1亚类的IgG抗体的Fc区的两条多肽链中，以下置换可以增加异二聚体形成，这些置换导致用于形成新的链内二硫键的适当间隔的半胱氨酸残基：一条链中的Y349C和另一条链中的S354C；一条链中的Y349C和另一条链中的E356C；一条链中的Y349C和另一条链中的E357C；一条链中的L351C和另一条链中的S354C；一条链中的T394C和另一条链中的E397C；或一条链中的D399C和另一条链中的K392C。促进异源二聚化的氨基酸改变的其它实例还有所谓的“电荷对置换”(参见，例如，WO 2009/089004)。已经发现，在IgG1亚类的IgG抗体的Fc-区的两条多肽链中，以下电荷对置换可以增加异二聚体形成：1)一条链中的K409D或K409E和另一条链中的D399K或D399R；2)一条链中的K392D或K392E和另一条链中的D399K或D399R；3)一条链中的K439D或K439E和另一条链中的E356K或E356R；4)一条链中的K370D或K370E和另一条链中的E357K或E357R；5)一条链中的K409D和K360D加上另一条链中的D399K和E356K；6)一条链中的K409D和K370D加上另一条链中的D399K和E357K；7)一条链中的K409D和K392D加上另一条链中的D399K、E356K和E357K；8)一条链中的K409D和K392D以及另一条链中的D399K；9)一条链中的K409D和K392D以及另一条链中的D399K和E356K；10)一条链中的K409D和K392D以及另一条链中的D399K和D357K；11)一条链中的K409D和K370D以及另一条链中的D399K和D357K；12)一条链中的D399K以及另一条链中的K409D和K360D；和13)一条链中的K409D和K439D以及另一条链上的D399K和E356K。
术语“结合(抗原)”表示，在体外测定中抗体与其抗原的结合，在一个实施方案中，在结合测定中，将抗体结合至表面并且通过表面等离子体共振(SPR)测量抗原对所述抗体的结合。结合是指10-8M或更小的结合亲和力(KD)值，在一些实施方案中为10-13至10-8M，在一些实施方案中为10-13至10-9M。
可以通过BIAcore测定(GE Healthcare Biosensor AB，Uppsala，Sweden)来研究结合。结合亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体结合速率常数)、kd(解离常数)和KD(kd/ka)定义。
术语“嵌合”抗体是指，其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种的抗体。
术语“CH2-结构域”表示，大约从EU位置231延伸至EU位置340(根据Kabat的EU编号系统)的抗体重链多肽的部分。在一个实施方案中，CH2结构域具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列：APELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQ ESTYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAK。
术语“CH3-结构域”表示，大约从EU位置341延伸至EU位置446的抗体重链多肽的部分。在一个实施方案中，CH3结构域具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列：GQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG。
抗体的“类型”表示其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要的抗体类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“可比较的长度”表示，两个多肽包含相等数目的氨基酸残基，或可以在长度上相差一个或多个并且至多不超过10个氨基酸残基。在一个实施方案中，(Fc-区)多肽包含相等数目的氨基酸残基，或氨基酸残基的数目相差1至10。在一个实施方案中，(Fc-区)多肽包含相等数目的氨基酸残基，或氨基酸残基的数目相差1至5。在一个实施方案中，(Fc-区)多肽包含相等数目的氨基酸残基，或氨基酸残基的数目相差1至3。
“效应子功能”表示可归因于抗体Fc-区的那些生物活性，其随抗体类型而不同。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B-细胞激活。
试剂(例如，药物制剂)的“有效量”表示，以所需的剂量和持续时间使用时，有效地实现期望的治疗或预防结果的量。
术语“Fc-融合多肽”表示，结合结构域(例如，抗原结合结构域如单链抗体，或多肽如受体的配体)与呈现期望的靶标-、蛋白A-和FcRn-结合活性的抗体Fc-区的融合。
术语“人源Fc区”表示人来源的免疫球蛋白重链的C-端区域，其含有铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中，人IgG重链Fc-区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。在一个实施方案中，Fc-区具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列。但是，Fc-区的C-端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。
如本文使用的，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置根据Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号，并且在本文中被称作“根据Kabat编号”。具体地，Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)的Kabat编号系统(参见第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且该Kabat EU索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)。
术语“FcRn”表示人新生儿Fc-受体。FcRn起到从溶酶体降解途径营救IgG的作用，从而导致降低的清除率和增加的半衰期。FcRn是一种由两个多肽组成的异源二聚体蛋白：50kDa的I类主要组织相容性复合物-样蛋白(α-FcRn)和15kDa的β2-微球蛋白(β2m)。FcRn以高亲和力结合IgG的Fc-区的CH2-CH3部分。IgG和FcRn之间的相互作用是严格pH依赖性的，并且以1∶2化学计量学发生，其中一个IgG通过它的两条重链结合两个FcRn分子(Huber，A.H.等，J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。FcRn结合发生在内体(endosome)中在酸性pH(pH＜6.5)下，并在中性细胞表面(约7.4的pH)释放IgG。所述相互作用的pH-敏感性质，利于FcRn介导的对胞饮进入细胞的IgG的保护作用，通过在内体的酸性环境内结合受体，使IgG免于细胞内降解。FcRn随后促进IgG再循环到细胞表面，并随后在FcRn-IgG复合物暴露于细胞外的中性pH环境后释放IgG到血流中。
术语“Fc-区的FcRn结合部分”表示，大约从EU位置243延伸至EU位置261、和大约从EU位置275延伸至EU位置293、和大约从EU位置302延伸至EU位置319、和大约从EU位置336延伸至EU位置348、和大约从EU位置367延伸至EU位置393、和EU位置408、以及大约从EU位置424延伸至EU位置440的抗体重链多肽的部分。在一个实施方案中，根据Kabat的EU编号，以下氨基酸残基中的一个或多个被改变：F243，P244，P245P，K246，P247，K248，D249，T250，L251，M252，I253，S254，R255，T256，P257，E258，V259，T260，C261，F275，N276，W277，Y278，V279，D280，V282，E283，V284，H285，N286，A287，K288，T289，K290，P291，R292，E293，V302，V303，S304，V305，L306，T307，V308，L309，H310，Q311，D312，W313，L314，N315，G316，K317，E318，Y319，I336，S337，K338，A339，K340，G341，Q342，P343，R344，E345，P346，Q347，V348，C367，V369，F372，Y373，P374，S375，D376，I377，A378，V379，E380，W381，E382，S383，N384，G385，Q386，P387，E388，N389，Y391，T393，S408，S424，C425，S426，V427，M428，H429，E430，A431，L432，H433，N434，H435，Y436，T437，Q438，K439，和S440(EU编号)。
“框架”或“FR”表示除了高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以下面的顺序出现在VH(或VL)中：
FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”表示这样的抗体：其与包含4个多肽的天然抗体结构具有基本上类似的结构，或具有包含如本文中定义的Fc-区的重链。全长抗体可以包含其它结构域，例如与全长抗体的一个或多个链缀合的scFv或scFab。这些缀合物也被包括在术语全长抗体中。
术语“二聚多肽”表示包含至少两个共价结合的多肽的复合物。所述复合物也可以包含与别的多肽共价地或非共价地结合的其它多肽。在一个实施方案中，所述二聚多肽包含两个或四个多肽。
术语“异源二聚体”或“异源二聚体的”表示包含两个多肽(例如具有可比较的长度)的分子，其中所述两个多肽包含在对应位置具有至少一个不同氨基酸残基的氨基酸序列，其中所述对应位置根据Kabat的EU索引编号系统来确定。
术语“同源二聚体”和“同源二聚体的”表示包含两个具有可比较长度的多肽的分子，其中所述两个多肽具有在对应位置相同的氨基酸序列，其中所述对应位置根据Kabat的EU索引编号系统来确定。
本文报道的异二聚体多肽，相对于所关注的突变或性质，被确定为是异二聚体的。例如，就FcRn和/或蛋白A结合(即所关注的性质)而言，相对于突变H310A、H433A和Y436A(对于该二聚体多肽的FcRn和/或蛋白A结合性质，这些突变是所关注的)，二聚体多肽可以是同二聚体的(即，二聚体多肽的两个多肽都包含这些突变)，但同时相对于突变Y349C、T366S、L368A和Y407V(因为这些突变涉及的是二聚体多肽的异二聚化而非FcRn/蛋白A结合性质，故这些突变并非所关注的突变)以及突变S354C和T366W，可以是异二聚体的(第一组仅包含在第一多肽中，而第二组仅包含在第二多肽中)。再如，本文报道的二聚体多肽，相对于突变I253A、H310A、H433A、H435A和Y436A(即，这些突变全部涉及二聚体多肽的FcRn和/或蛋白A结合性质)，可以是异二聚体的，即一个多肽包含突变I253A、H310A和H435A，而另一个多肽包含突变H310A、H433A和Y436A。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可以互换使用，且表示其中已经引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和由其衍生的后代，不考虑传代数。后代在核酸内容方面可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。具有如下功能或生物活性的突变体后代被包括在本文中，所述突变体后代的该功能或生物活性与针对最初转化的细胞所筛选或选择的功能或生物活性相同。
“人抗体”是具有与如下抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体，其中所述抗体由人或人细胞产生，或源自利用人抗体组库或其它人抗体编码序列的非人来源。人抗体的该定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是代表在选择的人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常出现的氨基酸残基的框架。通常，从可变结构域序列亚组，选择人免疫球蛋白VL或VH序列。通常，序列亚组是如Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Bethesda MD(1991)，NIH Publication 91-3242，第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，所述亚组是如在Kabat等(出处同上)中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，所述亚组是如在Kabat等(出处同上)中的亚组III。
术语“源自/衍生自”表示，通过在至少一个位置处引入改变而从亲本氨基酸序列得到的氨基酸序列。因此，衍生的氨基酸序列与对应的亲本氨基酸序列在至少一个对应位置(根据抗体Fc-区的Kabat EU索引编号)处不同。在一个实施方案中，从亲本氨基酸序列衍生的氨基酸序列在对应位置处具有一至十五个氨基酸残基的差异。在一个实施方案中，从亲本氨基酸序列衍生的氨基酸序列在对应位置处具有一至十个氨基酸残基的差异。在一个实施方案中，从亲本氨基酸序列衍生的氨基酸序列在对应位置处具有一至六个氨基酸残基的差异。同样，衍生的氨基酸序列可以与其亲本氨基酸序列具有高氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，从亲本氨基酸序列衍生的氨基酸序列具有80％或更高的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，从亲本氨基酸序列衍生的氨基酸序列具有90％或更高的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，从亲本氨基酸序列衍生的氨基酸序列具有95％或更高的氨基酸序列同一性。
术语“人Fc-区多肽”表示与“天然的”或“野生型”人Fc-区多肽相同的氨基酸序列。术语“变体(人)Fc-区多肽”表示由于至少一个“氨基酸改变”而从“天然的”或“野生型”人Fc-区多肽衍生出的氨基酸序列。“人Fc区”由两个人Fc-区多肽组成。“变体(人)Fc-区”由两个Fc区多肽组成，其中二者可以都是变体(人)Fc-区多肽，或者一个是人Fc-区多肽并且另一个是变体(人)Fc-区多肽。
在一个实施方案中，人Fc-区多肽具有SEQ ID NO：03的人IgG1 Fc-区多肽，或SEQID NO：04的人IgG2Fc-区多肽，或SEQ ID NO：06的人IgG4 Fc-区多肽的氨基酸序列，具有本文报道的突变。在一个实施方案中，所述变体(人)Fc-区多肽源自SEQ ID NO：03或04或06的Fc-区多肽，并且与SEQ ID NO：03或04或06的人Fc-区多肽相比具有至少一个氨基酸突变。在一个实施方案中，所述变体(人)Fc-区多肽包含/具有约一至约十个氨基酸突变，并且在一个实施方案中，包含/具有约一至约五个氨基酸突变。在一个实施方案中，所述变体(人)Fc-区多肽与SEQ ID NO：03或04或06的人Fc区多肽具有至少约80％同源性。在一个实施方案中，所述变体(人)Fc-区多肽与SEQ ID NO：03或04或06的人Fc-区多肽具有至少约90％同源性。在一个实施方案中，所述变体(人)Fc-区多肽与SEQ ID NO：03或04或06的人Fc区多肽具有至少约95％同源性。
源自SEQ ID NO：03或04或06的人Fc-区多肽的变体(人)Fc区多肽由包含的氨基酸改变来定义。因此，例如，术语P329G表示，与SEQ ID NO：03或04或06的人Fc-区多肽相比，在氨基酸位置329处具有脯氨酸至甘氨酸突变的、衍生自人Fc区多肽的变体(人)Fc-区多肽。
人IgG1 Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：03).
具有突变L234A、L235A的人IgG1 Fc-区衍生的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：07).
具有Y349C、T366S、L368A和Y407V突变的人IgG1 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：08).
具有S354C、T366W突变的人IgG1 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：09).
具有L234A、L235A突变和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的人IgG1 Fc区衍生的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：10).
具有L234A、L235A和S354C、T366W突变的人IgG1 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：11).
具有P329G突变的人IgG1 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRFEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIFKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：12).
具有L234A、L235A突变和P329G突变的人IgG1 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：13).
具有P239G突变和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的人IgG1 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：14).
具有P329G突变和S354C、T366W突变的人IgG1 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：15).
具有L234A、L235A、P329G和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的人IgG1 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：16).
具有L234A、L235A、P329G突变和S354C、T366W突变的人IgG1 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：17).
人IgG4 Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：06).
具有S228P和L235E突变的人IgG4 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：18).
具有S228P、L235E突变和P329G突变的人IgG4 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：19).
具有S354C、T366W突变的人IgG4 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
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具有Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的人IgG4 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
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具有S228P、L235E和S354C、T366W突变的人IgG4 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
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具有S228P、L235E和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的人IgG4 Fc-区衍生的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
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具有P329G突变的人IgG4 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
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具有P239G和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的人IgG4 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
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具有P329G和S354C、T366W突变的人IgG4 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
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具有S228P、L235E、P329G和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的人IgG4 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
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具有S228P、L235E、P329G和S354C、T366W突变的人IgG4 Fc-区衍生的Fc-区多肽具有以下氨基酸序列：
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“人源化”抗体表示，包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个和通常两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”表示已经经历人源化的抗体。
本文中使用的术语“高变区”或“HVR”表示，抗体可变结构域中在序列上高变(“互补性决定区”或“CDR”)并且形成在结构上确定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的各区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL(L1、L2、L3)中。本文中提及的HVR包括
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处存在的高变环(Chothia，C.和Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处存在的CDR(Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242)；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处存在的抗原接触点(MacCallum等，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat EU索引编号系统(Kabat等，出处同上)编号。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括、但不限于，驯养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物，如猴)，兔和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已经与其天然环境中的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，尺寸排阻色谱法、离子交换或反相HPLC)确定。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman，S.等，J.Chrom.B 848(2007)79-87。
“分离的”核酸表示已经与其天然环境中的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括在通常含有该核酸分子的细胞中包含的该核酸分子，但是所述核酸分子在所述细胞中存在于染色体外或位于不同于其天然染色体位置的染色体位置。
本文中使用的术语“单克隆抗体”表示，得自基本上同质的一群抗体的抗体，即，除了可能的变体抗体以外(所述变体抗体，例如，含有天然存在的突变，或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，其中所述变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品中的所有单克隆抗体都针对抗原上的一个决定簇。因而，修饰语“单克隆”表示，所述抗体得自基本上同质的一群抗体的特征，而不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。
“天然抗体”表示天然存在的具有各种结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000Da的异源四聚体糖蛋白，由二硫键连接的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N-端至C-端，每个重链具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N-端至C-端，每个轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，接着是恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列归入两种类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。
术语“包装说明书”用于指，治疗性产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有与该治疗性产品的使用相关的、适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌和/或警告的信息。
相对于参考多肽序列，“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为，比对所述序列并且如果必要的话引入空位以实现最大序列同一性百分比后，不考虑任何保守置换为序列相同的部分，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术中的多种方式实现，例如，使用公众可得到的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括实现在要对比的序列的全长上的最大对齐所需的任何算法。但是，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创造，并且源代码已经在美国版权局，Washington D.C.，20559与用户文档一起提交，其在美国版权登记号TXU510087下登记。ALIGN-2程序可以从Genentech，Inc.，South San Francisco，California公开获得，或可以从源代码编译。应该编译ALIGN-2程序以在UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不改变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，如下计算给定氨基酸序列A相对、与、或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以可替换地表述为相对、与、或针对给定氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)：
100×分数X/Y
其中X是通过序列比对程序ALIGN-2(在该程序的A和B的比对中)评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A相对B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别说明，本文使用的所有％氨基酸序列同一性值如在紧邻的上一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”表示这样的制品：其采取的形式允许包含在其中的活性成分的生物活性是有效的，并且其不含有对所述制剂要施用的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。
“药物学上可接受的载体”表示药物制剂中除了活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药物学上可接受的载体包括、但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文中使用的术语“肽接头”表示具有氨基酸序列的肽，在一个实施方案中，其是合成来源的。在一个实施方案中，肽接头是具有至少30个氨基酸长度的氨基酸序列的肽，在一个实施方案中，具有32至50个氨基酸长度。在一个实施方案中，所述肽接头是具有32至40个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸(x＝3，n＝8、9或10)或(x＝4且n＝6、7或8)，在一个实施方案中，x＝4，n＝6或7，在一个实施方案中，x＝4，n＝7。在一个实施方案中，肽接头是(G4S)6G2。
本文中使用的术语“重组抗体”表示通过重组方式制备、表达、构建或分离的所有抗体(嵌合的、人源化的和人的)。这包括分离自宿主细胞(如NS0或CHO细胞)或分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体、或使用转染进宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这样的重组抗体具有重排形式的可变区和恒定区。可以对重组抗体进行体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列可以是这样的序列：其尽管源自人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列相关，但是可以不是天然存在于体内人抗体种系组库内的序列。
本文中使用的“治疗(treatment)”(及其语法变体，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)表示试图改变治疗的个体的天然进程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学进程中执行。期望的治疗效果包括、但不限于：防止疾病的发生或复发，减轻症状，减少疾病的任何直接或间接病理学后果，防止转移，降低疾病进展的速度，改善或减轻疾病状态，以及缓解、或提高预后。在一些实施方案中，本文报道的抗体或Fc-区融合多肽用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
本申请中使用的术语“价”表示，在(抗体)分子中存在指定数目的结合位点。由此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示，在(抗体)分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在一个优选实施方案中，本文报道的双特异性抗体是“二价的”。
术语“可变区”或“可变结构域”表示，抗体重链或轻链中参与所述抗体与其抗原的结合的结构域。抗体的重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有类似的结构，每个结构域包含四个框架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见，例如，Kindt，T.J.等，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，N.Y.(2007)，第91页)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原-结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合所述抗原的抗体的VH或VL结构域，筛选互补VL或VH结构域的文库，而分离(参见，例如，Portolano，S.等，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson，T.等，Nature 352(1991)624-628)。
术语“眼血管疾病”包括，但不限于，眼内新生血管性综合征，如糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、早产儿视网膜病变、新生血管性青光眼、视网膜静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、黄斑变性、年龄相关的黄斑变性、色素性视网膜炎、视网膜血管瘤样增生、黄斑毛细血管扩张症、缺血性视网膜病变、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成、和视网膜变性(参见例如Garner，A.，Vascular diseases，见：Pathobiology of ocular disease，A dynamic approach，Garner，A.，和Klintworth，G.K.(主编)，第2版，Marcel Dekker，New York(1994)，第1625-1710页)。
本文中使用的术语“载体”表示，能够扩增与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体、以及整合进已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文被称为“表达载体”。
本文中使用的术语“具有(所述)突变IHH-AAA”表示突变I253A(Ile253Ala)、H310A(His310Ala)和H435A(His435Ala)的组合，并且本文中使用的术语“具有(所述)突变HHY-AAA”表示突变H310A(His310Ala)、H433A(His433Ala)和Y436A(Tyr436Ala)的组合，并且本文中使用的术语“具有(所述)突变YTE”表示IgG1或IgG4亚类的恒定重链区中突变M252Y(Met252Tyr)、S254T(Ser254Thr)和T256E(Thr256Glu)的组合，其中所述编号根据Kabat EU索引编号系统进行。
本文中使用的术语“具有(所述)突变P329G LALA”表示IgG1亚类的恒定重链区中突变L234A(Leu234Ala)、L235A(Leu235Ala)和P329G(Pro329Gly)的组合，其中根据KabatEU索引编号系统编号。本文中使用的术语“具有(所述)突变SPLE”表示IgG4亚类的恒定重链区中突变S228P(Ser228Pro)和L235E(Leu235Glu)的组合，其中根据Kabat EU索引编号系统编号。本文中使用的术语“具有(所述)突变SPLE和P329G”表示IgG4亚类的恒定重链区中突变S228P(Ser228Pro)、L235E(Leu235Glu)和P329G(Pro329Gly)的组合，其中根据Kabat EU索引编号系统编号。
II.组合物和方法
在一个方面中，本发明部分地基于以下发现：用于异源二聚体Fc-区的孔洞链中时特异性结合葡萄球菌蛋白A且结合或不结合人FcRn的变体Fc-区允许异源二聚体Fc-区的纯化。这些变体Fc-区在CH2-结构域中含有特定氨基酸突变，而CH3-结构域就蛋白A结合而言没有改变。已经发现，这些突变用于异源二聚体Fc-区的孔洞链中时，允许异源二聚体Fc-区的纯化，即，异源二聚体Fc-区与同源二聚体Fc-区副产物(孔洞链-孔洞链二聚体)分离。
已经发现，可以通过在第一多肽(孔洞链)中使用以下突变组合来实现：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D。
下表总结，在Fc-区中参与相互作用或已经被改变以调整相互作用的氨基酸残基的示例。
本文中报道的修饰可以改变与葡萄球菌蛋白A的结合。突变的残基全部位于CH2-结构域中。尽管也有CH3-结构域中的残基确实与蛋白A相互作用，但CH2-结构域中的残基突变足以影响蛋白A结合。因此，在本文中报道的异源二聚体分子和抗体中，两个CH3-结构域相对于蛋白A具有相同(同一)结合性质/特征。因此，如本文中报道的异源二聚体分子相对于CH2-结构域中的蛋白A结合是异源二聚体的，但就CH3-结构域中的蛋白A结合是同源二聚体的。
在一个实施方案中，本文中报道的突变组合，与缺乏这种突变组合的相应异源二聚体多肽相比，确实改变或确实实质性地改变该异源二聚体多肽的血清半衰期。
在一个实施方案中，突变组合，与缺乏这种突变组合的相应异源二聚体多肽相比，确实没有改变或确实没有实质性地改变该异源二聚体多肽的血清半衰期。
A.新生儿Fc-受体(FcRn)
新生儿Fc-受体(FcRn)对于体内IgG类抗体的代谢命运而言是重要的。FcRn行使功能以从溶酶体降解途径营救野生型IgG，从而导致降低的清除率和增加的半衰期。FcRn是一种由2个多肽组成的异源二聚体蛋白：50kDa I类主要组织相容性复合物-样蛋白(α-FcRn)和15kDa β2-微球蛋白(β2m)。FcRn以高亲和力结合至IgG类抗体的Fc区的CH2-CH3部分。IgG类抗体和FcRn之间的相互作用是pH依赖性的，并且以1∶2化学计量学发生，即一个IgG抗体分子可以经由它的两个重链Fc区多肽与两个FcRn分子相互作用(参见，例如Huber，A.H.，等，J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。
因而，IgG体外FcRn结合性质/特征指示它在血液循环中的体内药代动力学性质。
在FcRn和IgG类抗体的Fc-区之间的相互作用中，重链CH2-和CH3-结构域的不同氨基酸残基参与其中。与FcRn相互作用的氨基酸残基位于大约EU位置243和EU位置261之间、大约EU位置275和EU位置293之间、大约EU位置302和EU位置319之间、大约EU位置336和EU位置348之间、大约EU位置367和EU位置393之间、EU位置408、以及大约EU位置424和EU位置440之间。更具体地，根据Kabat的EU编号，以下氨基酸残基参与Fc-区和FcRn之间的相互作用：
F243，P244，P245P，K246，P247，K248，D249，T250，L251，M252，I253，S254，R255，T256，P257，E258，V259，T260，C261，F275，N276，W277，Y278，V279，D280，V282，E283，V284，H285，N286，A287，K288，T289，K290，P291，R292，E293，V302，V303，S304，V305，L306，T307，V308，L309，H310，Q311，D312，W313，L314，N315，G316，K317，E318，Y319，I336，S337，K338，A339，K340，G341，Q342，P343，R344，E345，P346，Q347，V348，C367，V369，F372，Y373，P374，S375，D376，I377，A378，V379，E380，W381，E382，S383，N384，G385，Q386，P387，E388，N389，Y391，T393，S408，S424，C425，S426，V427，M428，H429，E430，A431，L432，H433，N434，H435，Y436，T437，Q438，K439，和S440。
定位诱变研究已经表明，IgG的Fc区中FcRn的关键结合位点是组氨酸310、组氨酸435和异亮氨酸253，以及在较低程度上组氨酸433和酪氨酸436(参见例如Kim，J.K.，等，Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2825；Raghavan，M.，等人，Biochem.34(1995)14649-14657；Medesan，C.，等，J.Immunol.158(1997)2211-2217)。
已经通过在多个氨基酸残基处突变IgG来执行增加IgG与FcRn结合的方法：苏氨酸250、甲硫氨酸252、丝氨酸254、苏氨酸256、苏氨酸307、谷氨酸380、甲硫氨酸428、组氨酸433和天冬酰胺434(参见Kuo，T.T.，等，J.Clin.Immunol.30(2010)777-789)。
在一些情况下，需要在血液循环中具有减小的半衰期的抗体。例如，用于玻璃体内应用的药物应当在患者的眼中具有长半衰期并且在患者的血液循环中具有短半衰期。这样的抗体还具有增加的疾病位点(例如，在眼中)暴露的优点。
影响FcRn结合和随之影响在血液循环中的半衰期的不同突变是已知的。已经通过定位诱变鉴定了对于小鼠Fc区-小鼠FcRn相互作用关键的Fc区残基(参见，例如Dall’Acqua，W.F.等，J.Immunol 169(2002)5171-5180)。残基I253、H310、H433、N434和H435(根据Kabat的EU编号)参与所述相互作用(Medesan，C.，等人，Eur.J.Immunol.26(1996)2533-2536；Firan，M.等，Int.Immunol.13(2001)993-1002；Kim，J.K.等，Eur.J.Immunol.24(1994)542)。发现残基I253、H310和H435对于人Fc与鼠FcRn的相互作用是关键的(Kim，J.K.，等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2855)。Dall’Acqua等人通过蛋白-蛋白相互作用研究描述了残基M252Y、S254T、T256E可以提高FcRn结合(Dall′Acqua，W.F.等，J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。人Fc-人FcRn复合物的研究已经证实，残基I253、S254、H435和Y436对于所述相互作用是关键的(Firan，M.等，Int.Immunol.13(2001)993-1002；Shields，R.L.等，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在Yeung，Y.A.等(J.Immunol.182(2009)7667-7671)中已经报道和检查了残基248-259和301-317和376-382和424-437的各种突变体。示例性突变及其对FcRn结合的影响列在下表中。
表.
下表中显示了，IgG1 Fc-区的对称性工程化影响FcRn结合的结果(突变的比对和在FcRn-亲和色谱柱上的停留时间)。
表.
低于3分钟的保留时间对应于无结合，因为物质在穿流液中(空隙峰)。
单突变H310A是缺失任何FcRn-结合的最沉默的对称突变。
对称的单突变I253A和H435A导致0.3-0.4min的保留时间的相对位移。这通常可以被视作不可检测的结合。
单突变Y436A导致与FcRn亲和柱可检测的相互作用强度。不受理论约束，该突变可能对FcRn介导的体内半衰期具有影响，可以区别于零相互作用(诸如I253A、H310A和H435A突变组合，IHH-AAA突变)。
用对称修饰的抗-HER2抗体得到的结果提供在下表中(参见用于参考的WO 2006/031370)。
表.
B.眼血管疾病
眼血管疾病是，特征在于眼组织结构(如视网膜或角膜)中改变的或失调的新血管增生和侵入的任何病理学状况。
在一个实施方案中，眼血管疾病选自湿性年龄相关的黄斑变性(湿性AMD)、干性年龄相关的黄斑变性(干性AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、囊样黄斑水肿(cystoid macularedema，CME)、非增生性糖尿病性视网膜病变(NPDR)、增生性糖尿病性视网膜病变(PDR)、囊样黄斑水肿、血管炎(vasculitis)(例如，视网膜中央静脉阻塞)、视盘水肿(papilloedema)、视网膜炎(retinitis)、结膜炎(conjunctivitis)、葡萄膜炎(uveitis)、脉络膜炎(choroiditis)、多病灶性脉络膜炎(multifocal choroiditis)、眼组织胞浆菌病(ocular histoplasmosis)、睑缘炎(blepharitis)、干眼症(舍格伦病)和其它眼科疾病，其中所述眼疾病或病症与眼新生血管形成、血管渗漏和/或视网膜水肿相关。
包含本文中报道的异源二聚体多肽的抗体可用于预防和治疗湿性AMD、干性AMD、CME、DME、NPDR、PDR、睑缘炎、干眼症和葡萄膜炎，在一个优选实施方案中，可用于预防和治疗湿性AMD、干性AMD、睑缘炎和干眼症，还在一个优选的实施方案中，可用于预防和治疗CME、DME、NPDR和PDR，还在一个优选的实施方案中，可用于预防和治疗睑缘炎和、干眼症，特别是湿性AMD和干性AMD，以及特别是湿性AMD。
在一些实施方案中，眼血管疾病选自湿性年龄相关的黄斑变性(湿性AMD)、黄斑水肿、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变和糖尿病性视网膜病变。
与角膜新生血管形成相关的其它疾病包括、但不限于，流行性角膜结膜炎(epidemic keratoconjunctivitis)、维生素A缺乏(Vitamin A deficiency)、接触镜片佩带过度(contact lens overwear)、特应性角膜炎(atopic keratitis)、上角膜缘角膜炎(superior limbic keratitis)、翼状胬肉干燥性角膜炎(pterygium keratitis sicca)、舍格伦病(Sjogren’s disease)、红斑痤疮(acne rosacea)、phylectenulosis、梅毒(syphilis)、分枝杆菌感染(Mycobacteria infections)、脂质变性(lipiddegeneration)、化学灼伤(chemical burns)、细菌性溃疡(bacterial ulcers)、真菌性溃疡(fungal ulcers)、单纯疱疹感染(Herpes simplex infections)、带状疱疹感染(Herpeszoster infections)、原虫感染(protozoan infections)、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、莫伦溃疡(Mooren ulcer)、Terrien氏角膜边缘变性(Terrien's marginaldegeneration)、边缘性角质层分离(mariginal keratolysis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、全身性狼疮(systemic lupus)、多动脉炎(polyarteritis)、创伤(trauma)、韦格纳结节病(Wegener’s sarcoidosis)、巩膜炎(Scleritis)、Steven′sJohnson病、periphigoid放射状角膜切开(radial keratotomy)和角膜移植排斥(cornealgraph rejection)。
与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病包括，但不限于，糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy)、黄斑变性(macular degeneration)、镰状细胞性贫血(sicklecell anemia)、类肉瘤(sarcoid)、梅毒(syphilis)、弹性假黄瘤(pseudoxanthomaelasticum)、佩吉特病(Paget’s disease)、静脉阻塞(vein occlusion)、动脉阻塞(arteryocclusion)、颈动脉阻塞性疾病(carotid obstructive disease)、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎(chronic uveitis/vitritis)、分枝杆菌感染(mycobacterial infections)、莱姆病(Lyme's disease)、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosis)、早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity)，色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)、视网膜水肿(retina edema)(包括黄斑水肿(macular edema))、伊耳斯氏病(Eale's disease)、白塞氏病(Bechet's disease)、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染、拟眼组织胞浆菌病(presumedocular histoplasmosis)、贝斯特病(Best's disease)、近视(myopia)、视盘小凹(opticpits)、Stargart氏病(Stargart's disease)、睫状体扁平部炎(pars planitis)、慢性视网膜脱离(chronic retinal detachment)、高粘滞综合征(hyperviscosity syndromes)、弓形体病(toxoplasmosis)、创伤和激光后并发症。
其它疾病包括，但不限于，与发红(角的新生血管形成)相关的疾病和由纤维血管或纤维组织的异常增生引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜病变。
早产儿视网膜病变(ROP)是一种影响早产儿的眼部疾病。据认为，其由视网膜血管的紊乱生长引起，可导致瘢痕形成和视网膜剥离。ROP可以是轻度的，并且可以自发地消退，但是在严重的情况下可能导致失明。因此，所有早产儿都有ROP的危险，并且极低出生体重是另一个危险因素。氧中毒和相对缺氧都可能促成ROP的发展。
黄斑变性是一种主要在老年人中发现的医学病症，眼睛的内衬中心(被称为视网膜的黄斑区域)变薄、萎缩，并且在一些情形中，出血。这可能导致中央视觉的丧失，这使得不能看到细微的细节，不能阅读，或者不能辨识面部。根据美国眼科学会，它是当代美国超过五十岁的人中中央视觉丧失(失明)的首要原因。尽管一些影响年轻个体的黄斑营养不良有时也称为黄斑变性，但是该术语通常表示年龄相关的黄斑变性(AMD或ARMD)。
年龄相关的黄斑变性起始于，视网膜色素上皮与其下的脉络膜之间黄斑(提供细节分辨的中央视觉的视网膜中央区域，称为中央凹(foveal))中的特征性黄色沉积物(称为玻璃疣)。大部分具有这些早期改变(被称作年龄相关的黄斑病变)的人具有良好的视力。具有玻璃疣的人可以继续发展为晚期AMD。当玻璃疣变大、变多并且与黄斑下的色素细胞层中的紊乱相关时，危险是相当高的。大且软的玻璃疣与升高的胆固醇沉积相关，并且可对胆固醇降低剂或Rheo术作出响应。
晚期AMD(其导致深远的视觉丧失)具有两种形式：干性的和湿性的。中央地图样萎缩(即干性形式的晚期AMD)由视网膜下的视网膜色素上皮层的萎缩导致，其通过眼睛中央部分中光感受器(视杆和视锥)的丧失而引起视觉丧失。尽管这种病症没有可用的治疗，但是国家眼科研究所和其它机构已经证实，维生素补充和高剂量的抗氧化剂，叶黄素和玉米黄质，可以减慢干性黄斑变性的进展，并且在一些患者中提高视敏度。
色素性视网膜炎(RP)是一组遗传性眼病。在RP症状的进展中，夜盲症通常发生在视野狭窄之前数年或甚至几十年。许多患有RP的人直至其四十多岁或五十多岁才会成为法定意义上的失明，并且终生保留些许视力。其他人由RP发展至完全失明，在一些情形中，早在儿童期就发展至完全失明。RP的进展在每个病例中是不同的。RP是一类遗传性视网膜营养不良，一组遗传性病症，其中光感受器(视杆和视锥)或视网膜的视网膜色素上皮(RPE)的异常导致进行性视觉丧失。受影响的个体首先经历缺陷性暗适应或夜盲(夜盲症)，之后是周边视野减小(称为视野狭窄)，并且有时在该疾病过程的晚期丧失中央视觉。
当流体和蛋白沉积集中在眼睛的黄斑(视网膜的黄色中央区域)上面或下面使其变厚和肿胀时，发生黄斑水肿。肿胀可以使人的中央视觉扭曲，因为黄斑在眼球后部视网膜中心附近。该区域容纳紧密堆叠的视锥，提供敏锐的、清楚的中央视觉，允许人看到直接在视线上的形状、颜色和细节。囊样黄斑水肿是一类包括囊形成的黄斑水肿。
C.本发明
已经发现，在一个FC-区多肽中单侧的一个突变就足以显著影响结合。越多突变引入Fc-区中，越多地改变(即，削弱或增强)与葡萄球菌蛋白A和/或FcRn的结合。
本文中报道，通过CH2结构域设计，消除凸起-进入-孔洞(KiH)双特异性抗体生产中出现的孔洞-孔洞错配副产物。
CH2结构域中的氨基酸位置L251、I253、H310、L314与蛋白A和人新生儿Fc受体(FcRn)相互作用。
通过在称作KiH双特异性抗体的孔洞-链中在这些位置之一个或多个引入至A、G或D的氨基酸交换，可以沉默与蛋白A和FcRn的结合特性。
在一个优选的实施方案中，CH2结构域包含突变i)I253A或I253G，和ii)L314A或L314G或L314D。
通过这种设计，孔洞-孔洞错配副产物不再结合蛋白A和FcRn(不可以与两条重链相互作用)。由此，孔洞-孔洞错配副产物将不结合蛋白A和/或FcRn亲和色谱柱。因此，孔洞-孔洞错配副产物将至少更早地洗脱，即，在分开的洗脱峰中，或根本不结合蛋白A或FcRn亲和柱并可以在蛋白A或FcRn亲和柱的穿流物中找到。
为了补偿受损的FcRn结合特性，可以通过将T250Q和/或T256E和/或T307H突变引入孔洞侧来改善周围的氨基酸，所述突变可以单独或单个、两个或三个组合地引入。
下表中提供了对FcRn结合工程化的综述：
本文中报道的一个方面是异源二聚体多肽，其包含
第一多肽，所述第一多肽在N-端至C-端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的免疫球蛋白铰链区的至少一部分、免疫球蛋白CH2-结构域和免疫球蛋白CH3-结构域；和第二多肽，所述第二多肽在N-端至C-端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的免疫球蛋白铰链区的至少一部分、免疫球蛋白CH2-结构域和免疫球蛋白CH3-结构域，
其中所述第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V(孔洞链)和所述第二多肽包含突变S354C和T366W(凸起链)，
和
其中所述第一多肽(孔洞链)包含突变
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，
和
其中所述第一多肽和第二多肽通过一个或多个二硫桥连接，和
其中所述第一多肽的CH3-结构域和所述第二多肽的CH3-结构域都结合或都不结合蛋白A(编号根据Kabat EU索引)。
在一个实施方案中，所述第一多肽(孔洞链)包含突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，和
iii)T250Q，和/或
iv)T256E或T256A。
在一个实施方案中，所述第一多肽(孔洞链)包含突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，和
iii)任选地a)T250Q，和/或T256E或T256A，和
iv)a)L251A或L251G或L251D，和/或b)H310A或H310G。
在一个实施方案中，所述第一多肽(孔洞链)包含突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，和
iii)a)T250Q，和/或T256E或T256A，和
iv)a)L251A或L251G或L251D，和/或b)H310A或H310G，
v)任选a)T307A或T307H或T307Q或T307P，和/或b)Q311H，和/或c)M252Y，和/或d)S254T。
在一个实施方案中，所述第二多肽(凸起链)包含突变：
i)T250Q，和/或
ii)M252Y，和/或
iii)S254T，和/或
iv)T256E或T256A，和/或
v)T307A或T307H或T307Q或T307P，和/或
vi)Q311H。
在一个实施方案中，第一和第二多肽的免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2-结构域和免疫球蛋白CH3-结构域是人IgG1亚类的。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自进一步包含突变L234A和L235A。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自进一步包含突变P329G。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自进一步包含突变L234A、L235A和P329G。
在一个实施方案中，第一和第二多肽的免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2-结构域和免疫球蛋白CH3-结构域是人IgG4亚类的。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自进一步包含突变S228P和L235E。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自进一步包含突变P329G。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自进一步包含突变S228P、L235E和P329G。
在一个实施方案中，异源二聚体多肽是Fc-区融合多肽。
在一个实施方案中，异源二聚体多肽是全长抗体。
在一个实施方案中，全长抗体是单特异性抗体。在一个实施方案中，单特异性抗体是单价单特异性抗体。在一个实施方案中，单特异性抗体是二价单特异性抗体。
在一个实施方案中，全长抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体是二价双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体是三价双特异性抗体。
在一个实施方案中，全长抗体是三特异性抗体。在一个实施方案中，三特异性抗体是三价三特异性抗体。在一个实施方案中，三特异性抗体是四价三特异性抗体。
本文中报道的一个方面是包含本文中报道的异源二聚体多肽(变体人IgG类Fc-区)的抗体。
本文中报道的Fc-区(异源二聚体多肽)包含在全长抗体中时赋予该分子上述特征。
抗体，例如，全长抗体或CrossMabs，可以包含本文中报道的变体(人)人IgG类Fc-区。
异源二聚体多肽可以由于突变具有在一条链(孔洞链)中不结合葡萄球菌蛋白A而在另一条链(凸起链)中结合葡萄球菌蛋白A的性质。
因此，通过使用常规蛋白A亲和材料，如MabSelectSure，可以纯化这些抗体，即与不需要的孔洞链二聚体副产物分离。不要求使用高度复杂而物类受限的亲和材料，例如KappaSelect——其仅可与包含κ亚类轻链的抗体一起使用。另外，在进行轻链亚类的修饰/交换的情况下，也不需要采用该纯化方法。
本文中报道的一个方面是，用于生产本文中报道的异源二聚体多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)培养哺乳动物细胞，所述细胞包含一个或多个编码本文中报道的异源二聚体多肽的核酸，
b)从培养基回收所述异源二聚体多肽，和
c)用蛋白A亲和色谱纯化异源二聚体多肽并由此生产所述二聚体多肽。
本文中报道的一个方面是突变组合i)I253A或I253G和ii)L314A或L314G或L314D用于从同源二聚体多肽分离异源二聚体多肽的用途。
本文中报道的一个方面是，易于分离/纯化的双特异性抗体，其包含差异修饰的免疫球蛋白重链Fc-区，其中至少一个修饰导致i)双特异性抗体对蛋白A的不同亲和性，从而异源二聚体双特异性抗体可以基于其对蛋白A的亲和性而从破碎的细胞、从培养基或从抗体混合物分离。
在一个实施方案中，双特异性抗体在高于pH4.0的pH值下洗脱。
在一个实施方案中，使用蛋白A亲和色谱和pH梯度或pH阶梯，分离双特异性抗体，其中所述pH梯度或pH阶梯包括盐的添加。在一个具体实施方案中，所述盐以约0.5摩尔至约1摩尔的浓度存在。在一个实施方案中，所述盐选自：乙酸的锂、钠和钾盐；碳酸氢钠和碳酸氢钾；碳酸锂、碳酸钠和碳酸钾；氯化锂、氯化钠、氯化钾和氯化镁；氟化钠和氟化钾；硝酸钠、硝酸钾和硝酸钙；磷酸钠和磷酸钾；和硫酸钙和硫酸镁。在一个实施方案中，所述盐是碱金属或碱土金属的卤化物盐。在一个优选实施方案中，所述盐是氯化钠。
在一个方面中，所述二聚体多肽包含就蛋白A或FcRn结合而言修饰过的本文中报道的第一多肽和没有修饰过的第二多肽，从而形成异源二聚体多肽，其中所述差别修饰导致所述二聚体多肽在比缺少所述差别修饰的对应二聚体多肽高0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.3或1.4个pH单位处从蛋白A亲和材料洗脱。在一个实施方案中，所述差别修饰的二聚体多肽在4或更高的pH处洗脱，而未修饰的二聚体多肽在3.5或更低的pH处洗脱。在一个实施方案中，所述差别修饰的二聚体多肽在约4的pH处洗脱，而未修饰的二聚体多肽在约2.8-3.5、2.8-3.2或2.8-3的pH处洗脱。在这些实施方案中，“未修饰的”是指两个多肽中均缺乏修饰i)I253A和I253G，和ii)L314A和L314G和L314D(Kabat EU索引编号系统)。
对于色谱运行，0.5摩尔至1摩尔盐(例如NaCl)的添加可提高同源二聚体多肽和异源二聚体多肽(特别是如果源自人IgG1亚类)的分离。向提高pH值的洗脱溶液中添加盐可以扩大用于洗脱的pH范围，使得例如pH阶梯梯度可以成功地分离两种物质。
因此，在一个实施方案中，用于分离包含异源二聚体IgG Fc区(其具有一个包含本文报道的突变的链)的双特异性抗体的方法包括，在有盐存在下采用pH梯度的步骤。在一个实施方案中，所述盐以一定浓度存在，所述浓度足以使IgG Fc区同源二聚体和IgG Fc区异源二聚体从蛋白A色谱材料上洗脱时的pH差异最大化。在一个实施方案中，所述盐以约0.5摩尔至约1摩尔的浓度存在。在一个实施方案中，所述盐是碱金属或碱土金属和卤素的盐。在一个实施方案中，所述盐是碱金属或碱土金属的盐酸盐，例如NaCl、KCl、LiCl、CaCl2或MgCl2。在一个实施方案中，所述pH梯度是约pH 4至约pH 5。在一个实施方案中，所述梯度是线性梯度。在一个实施方案中，所述pH梯度是阶梯梯度。在一个实施方案中，所述方法包括向平衡过的蛋白A亲和柱施加约pH 4的溶液。在一个实施方案中，就本文中报道的修饰而言包含异源二聚体IgG Fc区的双特异性抗体在一个或多个基本上不含有非-异源二聚体双特异性抗体的级分中从蛋白A亲和色谱材料上洗脱。
本文中报道的异源二聚体多肽可以通过重组方式来产生。因此，本发明的一个方面是编码本文中报道的异源二聚体多肽的核酸，并且再一个方面是包含编码本文中报道的异源二聚体多肽的核酸的细胞。
用于重组生产的方法是现有技术广泛已知的，且包括在原核和真核细胞中表达蛋白，随后分离异源二聚体多肽并通常纯化至药用纯度。关于在宿主细胞中表达如前所述的异源二聚体多肽，可以通过标准方法将编码相应第一和第二多肽的核酸插入表达载体中。在适合的原核或真核宿主细胞，如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达，并从细胞(培养上清液或裂解以后的细胞)回收异源二聚体多肽。
用于重组生产抗体的一般方法是现有技术中公知的，且描述于，例如，Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.等，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-160；Werner，R.G.，DrugRes.48(1998)870-880的综述文章中。
因此，本文中报道的一个方面是一种用于生产本文中报道的异源二聚体多肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)用包含编码异源二聚体多肽的核酸分子的一个或多个载体转化宿主细胞，
b)培养宿主细胞以表达异源二聚体多肽，和
c)从培养物回收异源二聚体多肽和由此产生该异源二聚体多肽。
在一个实施方案中，c)的回收步骤包括使用免疫球蛋白Fc区特异性捕获试剂。在一个实施方案中，这种Fc区特异性捕获试剂以结合-和-洗脱模式使用。这样的Fc区特异性捕获试剂的实例是例如基于葡萄球菌蛋白A的亲和色谱柱，其基于高刚性的琼脂糖基的基质，允许大规模和高流速和低反压。这些材料含有结合异源二聚体多肽，即其Fc区，的配体。配体通过长的亲水性间隔臂连接基质，使其容易地可用于结合靶标分子。
可以通过常规的免疫球蛋白纯化程序，例如，蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱，凝胶电泳、渗析或亲和色谱，从培养基合适地分离本文报道的异源二聚体多肽。
使用常规操作，可以容易地分离编码单克隆抗体的DNA和RNA并测序。一旦被分离，可以将DNA插入表达载体中，然后将所述表达载体转染至原本不产生异源二聚体多肽的宿主细胞中，如HEK 293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞，以在所述宿主细胞中获得重组单克隆异源二聚体多肽的合成。
可以通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl分带(CsCl banding)、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和其它本领域公知的技术，进行抗体的纯化从而消除细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质(参见Ausubel，F.等编辑，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987))。不同的方法已经充分建立并且广泛用于蛋白质纯化，如用微生物蛋白进行的亲和色谱(例如，蛋白A或蛋白G亲和色谱)、离子交换色谱(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)、亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其它SH配体)，疏水相互作用或芳族吸附色谱(aromatic adsorption chromatography)(例如用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂，或间氨基苯基硼酸)，金属螯合亲和色谱(例如，用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、尺寸排阻色谱和电泳方法(如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
本发明的一个方面是一种药物制剂，其包含本文报道的异源二聚体多肽。本发明的另一个方面是本文报道的异源二聚体多肽用于制备药物制剂的用途。本发明的再一个方面是一种用于制备药物制剂的方法，所述药物制剂包含本文报道的异源二聚体多肽。在另一个方面中，提供了一种制剂，例如药物制剂，其含有与药用载体一起配制的本文报道的异源二聚体多肽。
可以通过本领域已知的多种方法来施用本文报道的制剂。如本领域技术人员已知的，施用途径和/或方式将随所期望的结果而变化。为了通过某些施用途径施用本发明的化合物，可能需要用物质包被所述化合物，或与物质一起共同施用所述化合物，以防止所述化合物失活。例如，所述化合物可以在适当的载体(例如，脂质体或稀释剂)中施用于受试者。药用稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。药用载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液剂或分散体的无菌粉末。此类介质和物质用于药学活性物质的用途是本领域已知的。
可以使用许多可能的递送方式，包括，但不限于眼内施用或局部施用。在一个实施方案中，所述施用是眼内施用，并且包括，但不限于，结膜下注射、颅内注射、通过颞叶边缘(termporai limbus)注射入前房、基质内注射、角膜内注射、视网膜下注射、房水注射、眼球筋膜下注射或持久递送装置、玻璃体内注射(例如，玻璃体前部、中部或后部注射)。在一个实施方案中，所述施用是局部的，并且包括，但不限于滴眼至角膜上。
在一个实施方案中，通过玻璃体内施用，例如通过玻璃体内注射，来施用本文中报道的异源二聚体多肽或药物制剂。这可以根据本领域已知的标准程序来进行(参见，例如，Ritter等，J.Clin.Invest.116(2006)3266-3276；Russelakis-Carneiro等，Neuropathol.Appl.Neurobiol.25(1999)196-206；和Wray等人，Arch.Neurol.33(1976)183-185)。
在一些实施方案中，本发明的治疗药盒可以含有一个或多个剂量的存在于如本文中所述的药物制剂中的、本文报道的异源二聚体多肽，用于玻璃体内注射该药物制剂的合适装置，和详述合适受试者及用于实施注射的方案的说明书。在这些实施方案中，通常将制剂通过玻璃体内注射施用于需要治疗的受试者。这可以根据本领域已知的标准程序来进行(参见，例如，Ritter等，J.Clin.Invest.116(2006)3266-3276；Russelakis-Carneiro等，Neuropathol.Appl.Neurobiol.25(1999)196-206；和Wray等，Arch.Neurol.33(1976)183-185)。
所述制剂还可以含有助剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过上文的灭菌操作和通过包括多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯化丁醇、苯酚、山梨酸等)，可以确保防止微生物的存在。还可能期望在制剂中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，通过包含延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射的药物形式的延长吸收。
无论选择的施用途径如何，均可以通过本领域技术人员已知的常规方法，将本文报道的化合物(其可以以合适的水合形式)和/或本文报道的药物制剂配制成药用剂型。
可以改变本文中报道的药物制剂中的活性成分的实际剂量水平，以便获得针对特定患者、组合物和施用方式而言可以有效实现所需治疗应答、且对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于多个药代动力学因素，包括使用的本发明特定组合物的活性、施用途径、施用时间、正在使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和先前医疗史，和医学领域中众所周知的类似因素。
制剂必须是无菌的并且是可通过注射器递送程度的流体。除水之外，在一个优选实施方案中，载体是等渗缓冲盐水溶液。
可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣，如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持要求的粒度，和通过使用表面活性剂。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如，糖、多元醇(如甘露醇或山梨醇)以及氯化钠。
制剂可以包括用于结膜下施用的包含活性剂的眼科贮库制剂。眼科贮库制剂包含基本上纯的活性剂(例如，本文中报道的异源二聚体多肽)的微粒。包含本文中报道的异源二聚体多肽的微粒可以嵌入生物相容的药用聚合物或脂质包囊剂中。贮库制剂可以经调整以适于在延长的时间段释放全部或基本上全部活性物质。聚合物或脂质基质，如果存在的话，可以经调整以适于充分地降解，以便在释放全部或基本上全部活性剂后从施用部位被转运出来。贮库制剂可以是液体制剂，其包含药用聚合物和溶解或分散的活性剂。注射后，聚合物在注射部位处形成储库，例如通过胶化或沉淀。
本发明的另一个方面是本文报道的异源二聚体多肽用于治疗眼血管疾病。
本发明的一个实施方案是，本文报道的异源二聚体多肽用于治疗眼血管疾病。
本发明的另一个方面是本发明的药物制剂用于治疗眼血管疾病。
本发明的另一个方面是本文报道的异源二聚体多肽用于制造用于治疗眼血管疾病的药物的用途。
本发明的另一个方面是通过将本文报道的异源二聚体多肽施用于需要这种治疗的眼血管疾病患者来治疗该患者的方法。
这里明确说明，本文中使用的术语“包含”涵盖术语“由……组成”。因而，含有术语“包含”的全部方面和实施方案同样以术语“由……组成”进行了公开。
D.修饰
在再一方面中，根据以上任一个实施方案的异源二聚体多肽可以包含以下章节1-6中所述的任何单个的特征或任何特征的组合：
1.抗体亲和力
在一个实施方案中，使用表面等离子体共振测定，测量Kd。例如，使用-2000或-3000(GE Healthcare Inc.，Piscataway，NJ)的测定，在25℃用固定化的结合伙伴CM5芯片以～10个应答单位(RU)进行。在一个实施方案中，根据供应商的说明书，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，GE HealthcareInc.)。将结合伙伴用10mM醋酸钠(pH 4.8)稀释至5μg/mL(～0.2μM)，随后以5μl/分钟的流速注射以实现大约10个应答单位(RU)的偶联的结合伙伴。注射结合伙伴以后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将含有融合多肽或抗体的二聚体多肽的两倍系列稀释物(0.78nM至500nM)在具有0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中在25℃以大约25μL/min的流速注射。使用简单的一对一Langmuir结合模型(评价软件3.2版)，通过同时拟合结合和解离传感图(sensorgram)，计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比值(参见，例如，Chen，Y.，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。如果通过以上表面等离子体共振测定的结合速率超过106M-1s-1，那么可以使用荧光淬灭技术确定结合速率，所述荧光淬灭技术在有递增抗原浓度存在下在25℃测量在PBS(pH 7.2)中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，所述抗原浓度在光谱仪(如配备有停流(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌型比色杯的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中测量。
2.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文报道的异源二聚体多肽包含在嵌合抗体中。某些嵌合抗体描述于例如US 4,816,567；和Morrison，S.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(如猴)的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是“类型转换的”抗体，其中类或亚类已经相对于亲本抗体发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含这样的一个或多个可变结构域：其中HVR(例如CDR)(或其部分)源自非人抗体并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地也可以包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人抗体(例如，HVR残基所来源的抗体)的相应残基，例如，以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制造方法综述于例如Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，并且进一步描述于例如Riechmann，I.，等，Nature332(1988)323-329；Queen，C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321和US 7,087,409；Kashmiri，S.V.等，Methods 36(2005)25-34(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan，E.A.，Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑(resurfacing)”)；Dall’Acqua，W.F.人，Method 36(2005)43-60(描述“FR改组”)；Osbourn，J.等，Method 36(2005)61-68；和Klimka，A.等，Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述针对FR改组的“导向选择”方案)。
可以用于人源化的人框架区包括，但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims，M.J.等，J.Immunol.151(1993)2296-2308)；从具有特定亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列衍生出的框架区(参见，例如，Carter，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.US 89(1992)4285-4289)；和Presta，L.G.等，J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和从筛选FR文库衍生的框架区(参见，例如，Baca，M.等，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok，M.J.等，J.Biol.Chem.271(1996)922611-22618)。
3.人抗体
在某些实施方案中，本文报道的二聚体多肽源自人抗体。可以使用本领域已知的多种技术生产人抗体。人抗体通常描述于van Dijk，M.A.和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374和Lonberg，N.，Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中。
可以通过将免疫原施用于转基因动物来制备人抗体，所述转基因动物已经经过修饰以响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这样的动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或其在染色体外存在或随机整合进动物的染色体中。在这样的转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，N.，Nat.Biotech.23(2005)1117-1125。也参见，例如，描述XENOMOUSETM技术的US 6,075,181和US 6,150,584；描述技术的US 5,770,429；描述K-M技术的US7,041,870，和描述技术的US2007/0061900。可以进一步修饰自这类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，通过与不同的人恒定区组合。
还可以通过基于杂交瘤的方法制备人抗体。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源性骨髓瘤细胞系(参见，例如，Kozbor，D.，J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur，B.R.等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，Marcel Dekker，Inc.，New York(1987)，第51-63页；和Boerner，P.等，J.Immunol.147(1991)86-95)。在Li，J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)3557-3562中也描述了借助人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体。其他方法包括例如在以下文献中描述的那些方法：US 7,189,826(描述从杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)和Ni，J.，XiandaiMianyixue 26(2006)265-268(描述人-人杂交瘤)。在Vollmers，H.P.和Brandlein，S.，Histology and Histopathology 20(2005)927-937以及Vollmers，H.P.和Brandlein，S.，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(2005)185-191中也描述了人杂交瘤技术(Trioma技术)。
通过分离从人-衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变结构域序列，也可以产生人抗体。这样的可变结构域序列随后可以与期望的人恒定结构域组合。下文描述了用于从抗体文库选择人抗体的技术。
4.文库衍生的抗体
在某些实施方案中，本文报道的异源二聚体多肽包含在文库来源的抗体中。通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体，可以分离文库来源的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库并对这类文库筛选拥有期望的结合特征的抗体的多种方法。这类方法综述于，例如，Hoogenboom，H.R.等，Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37，且进一步描述于，例如，McCafferty，J.等人，Nature 348(1990)552-554；Clackson，T.等，Nature 352(1991)624-628；Marks，J.D.等，J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks，J.D.和Bradbury，A.，Methods in Molecula Biology 248(2003)161-175；Sidhu，S.S.等，J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee，C.V.等，J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse，F.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467-12472；和Lee，C.V.等，J.Immunol.Methods 284(2004)119-132。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的组库分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机地重组，随后可以从中筛选抗原结合性噬菌体，如在Winter，G.，等人，Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455中所述。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。来自经免疫的来源的文库可以提供对免疫原具有高亲和力的抗体，而无需构建杂交瘤。可替换地，可以不经任何免疫，(例如，从人)克隆幼稚组库(repertoire)，以提供单个抗体来源来针对广泛类型的非自身抗原以及自身抗原，如Griffiths，A.D.，等，EMBO J.12(1993)725-734所述。最后，还可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段并使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区和实现体外重排，以合成地产生幼稚文库，参见如Hoogenboom，H.R.和Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括例如US 5,750,373和US 2005/0079574、US 2005/0119455、US 2005/0266000、US 2007/0117126、US 2007/0160598、US 2007/0237764、US 2007/0292936和US 2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被认为是本文中的人抗体或人抗体片段。
5.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文报道的异源二聚体多肽包含在多特异性抗体，例如双特异性抗体中。多特异性抗体是对至少两个不同部位具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一个结合特异性针对第一抗原，而另一结合特异性针对不同的第二抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体也可以用来使细胞毒性剂定位至表达至少一种抗原的细胞。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括，但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein，C.和Cuello，A.C.，Nature 305(1983)537-540，WO93/08829，和Traunecker，A.等，EMBO J.10(1991)3655-3659)和“凸起-进入-孔洞”工程化(参见，例如，US 5,731,168)。也可以通过以下方式制备多特异性抗体：工程化改造静电牵引效应(electrostatic steering effects)以制备抗体Fc-异源二聚体分子(WO 2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(参见，例如，US 4,676,980，和Brennan，M.等，Science229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链生产双特异性抗体(参见，例如，Kostelny，S.A.等，J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双体抗体(diabody)”技术以制备双特异性抗体片段(参见，例如，Holliger，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(scFv)二聚体(参见，例如Gruber，M等，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt，A.等，J.Immunol.147(1991)60-69中所述。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibodies)”(参见，例如US 2006/0025576)。
本文的抗体或片段还包括“双重作用Fab”或“DAF”(参见，例如，US 2008/0069820)。
本文中的抗体或片段也包括WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2010/145793中描述的多特异性抗体。
6.抗体变体
在某些实施方案中，本文报道的异源二聚体多肽包含在抗体中。在进一步实施方案中，本发明考虑本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望，提高抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成，可以制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如，从抗体的氨基酸序列缺失残基和/或将残基插入所述氨基酸序列中和/或置换所述氨基酸序列内的残基。可以制备缺失、插入和置换的任意组合以获得最终构建体，前提条件是，所述最终构建体具有期望的特征，例如，抗原结合。
a)置换、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目标位点包括HVR和FR。在下表中在“优选置换”的标题下显示了保守置换。在下表中在“示例性置换”的标题下提供了更实质的变化，并且参考氨基酸侧链类别在下面进一步描述。可以将氨基酸置换引入目标抗体中并且针对期望的活性(例如，保留的/提高的抗原结合、降低的免疫原性、或提高的ADCC或CDC)来筛选产物。
表.
初始残基 示例性置换 优选置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以根据共同的侧链特性分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守置换涉及将这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。
一类置换变体涉及置换亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体在某些生物学特性上具有修饰(例如，改善)(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)，和/或基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。一种示例性的置换变体是亲和力成熟的抗体，所述抗体可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，如本文中描述的那些，方便地产生。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示和针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可以在HVR中进行改变(例如，置换)，例如，以提高抗体亲和力。这类改变可以在HVR“热点”(即，由体细胞成熟过程中以高频率经历突变的密码子所编码的残基(参见，例如，Chowdhury，P.S.，Methods Mol.Biol.207(2008)179-196))和/或接触抗原的残基中进行，并对得到的变体VH或VL测试结合亲和力。通过构建二级文库和从中重新选择来进行亲和力成熟，已经描述在例如，Hoogenboom，H.R.等，Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37。在亲和力成熟的一些实施方案中，可以通过多种方法(例如，易错PCR、链改组、或寡核苷酸-指导的诱变)的任一种，将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。随后建立二级文库。随后筛选该文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR-指导的方案，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模，特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基。CDR-H3和CDR-L3尤其被经常靶向。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以出现在一个或多个HVR内，只要这类改变不实质上降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行不实质上降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文中提供的保守置换)。这类改变可以例如在HVR的抗原接触残基外进行。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各HVR可以或者未改变或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
一种用于鉴定抗体中可以被靶向诱变的残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham，B.C.和Wells，J.A.，Science 244(1989)1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或一组靶残基(例如，带电荷残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并且用中性的或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对初始置换显示出功能敏感性的氨基酸位置处引入其它置换。可替换地或另外地，可以使用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以将这类接触残基和邻近残基作为置换的候选物，进行靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度从1个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N-或C-端与酶(例如针对ADEPT的酶)或增加所述抗体的血清半衰期的多肽的融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体被糖基化的程度。通过改变氨基酸序列从而建立或除去一个或多个糖基化位点，可以方便地对抗体添加或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc-区的情况下，可以改变与之连接的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双叉寡糖，所述寡糖通常借助N-键连接至Fc-区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright，A.和Morrison，S.L.，TIBTECH 15(1997)26-32。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双叉寡糖结构的“茎部”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰本发明的抗体中的寡糖以便建立具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了具有碳水化合物结构的抗体变体，所述碳水化合物结构缺少与Fc-区(直接地或间接地)连接的岩藻糖。例如，这类抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％、或20％至40％。通过以下方式确定岩藻糖的量：如通过MALDI-TOF质谱法(例如，如WO 2008/077546中所述的)所测量的，相对于与Asn297连接的全部糖结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算在Asn297处的糖链内岩藻糖的平均量。Asn297表示位于Fc-区中约位置297处的天冬酰胺残基(Fc-区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可以位于位置297的上游或下游±3个氨基酸附近，即，在位置294和300之间。这样的岩藻糖基化变体可以具有提高的ADCC功能。参见，例如，US 2003/0157108；US 2004/0093621。与“去岩藻糖基化的”或“岩藻糖-缺陷型”抗体变体相关的出版物实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki，A.等，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki，N.等，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够生产去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括在蛋白岩藻糖基化方面有缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka，J.，等，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，特别是在实施例11)和敲除的细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki，N.等，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO 2003/085107)。
还可以提供具有平分型寡糖的抗体变体，例如，其中与抗体的Fc-区连接的双叉寡糖通过GlcNAc平分。这样的抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。这样的抗体变体的实例例如描述于WO 2003/011878、US 6,602,684和US 2005/0123546中。还提供了在与Fc-区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。这样的抗体变体例如描述于WO 1997/30087、WO 1998/58964；和WO1999/22764中。
c)Fc-区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个其它氨基酸修饰引入本文报道的异源二聚体多肽中，由此产生Fc-区变体。该Fc-区变体可以源自在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换/突变)的人Fc-区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涉及具有一些但并非全部效应子功能的异源二聚体多肽，这使其成为下述应用的合乎需要的候选物：在所述应用中，二聚体多肽的体内半衰期是重要的而某些效应子功能(如CDC和ADCC)是不需要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以证实CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保异源二聚体多肽抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch，J.V.和Kinet，J.P.，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上表3中总结了造血细胞上的FcR表达。评估目标分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例描述于US 5,500,362(参见，例如Hellstrom，I.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom，I.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US5,821,337(参见Bruggemann，M.等，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。可替换地，可以采用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞计的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI)。用于这样的测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可替换地或另外地，可以在体内评估目标分子的ADCC活性，例如，在动物模型中，如在Clynes，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656公开的动物模型中。也可以进行C1q结合测定以证实二聚体多肽不能结合C1q并且因此缺少CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评价补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro，H.等，J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg，M.S.等，Blood 101(2003)1045-1052；和Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood 103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期确定(参见，例如，Petkova，S.B.等，Int.Immunol.18(2006)1759-1769)。
具有减少的效应子功能的异源二聚体多肽包括对Fc-区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个具有置换的那些(US 6,737,056)。这样的Fc-区变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置处具有置换的Fc-区，包括将残基265和297置换成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc区突变体(US 7,332,581)。
描述了具有提高或减少的FcR结合的某些抗体变体(参见，例如，US 6,737,056；WO2004/056312，和Shields，R.L.等，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在某些实施方案中，异源二聚体多肽变体包含具有提高ADCC的一个或多个氨基酸置换的Fc区，例如，在Fc区的位置298、333和/或334处的置换(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，在Fc-区内进行改变，所述改变导致变化的(即提高或减少的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如US 6,194,551、WO 99/51642和Idusogie，E.E.等，J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述。
在US2005/0014934中描述了具有增加的半衰期和提高的新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体，所述新生儿Fc受体负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer，R.L.等，J.Immunol.117(1976)587-593，和Kim，J.K.等，J.Immunol.24(1994)2429-2434)。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc-区，所述置换提高Fc-区与FcRn的结合。这样的Fc-区变体包括在一个或多个以下Fc-区残基具有置换的那些变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc-区残基434的置换(US7,371,826)。
关于Fc-区变体的其它实例，也可参见Duncan，A.R.和Winter，G.，Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；和WO 94/29351。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施方案中，可能期望，形成半胱氨酸工程化的异源二聚体多肽，例如，类似于“硫代MAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在特定实施方案中，置换的残基出现在异源二聚体多肽的可及位点处。通过用半胱氨酸置换那些残基，由此使反应性巯基位于异源二聚体多肽的可及位点处并且可以用于将异源二聚体多肽缀合至其它部分(如药物部分或接头-药物部分)，以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc-区的S400(EU编号)。可以例如US 7,521,541中所述的，来产生半胱氨酸工程化的二聚体多肽。
e)Fc-区和抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文报道的异源二聚体多肽以含有本领域已知且容易得到的其他非蛋白部分。适用于衍生化异源二聚体多肽的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点。所述聚合物可以具有任何分子量，并可以是分支或不分支的。与二聚体多肽连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接超过一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑来确定：包括，但不限于，待提高的二聚体多肽的特定特性或功能，二聚体多肽衍生物是否将用在限定条件下的治疗中，等等。
在另一个实施方案中，提供了本文报道的异源二聚体多肽和可以通过暴露于辐射而被选择性地加热的非蛋白部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白部分是碳纳米管(Kam，N.W.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以是任何波长，并且包括但不限于如下的波长：所述波长不伤害普通细胞，但其可以将非蛋白部分加热至杀伤位于二聚体多肽-非蛋白部分附近的细胞的温度。
f)异源二聚体化
存在几种用于CH3修饰以增强异源二聚体化的方法，所述方法例如在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO2013096291中有充分描述。通常，在所有这样的方案中，第一CH3结构域和第二CH3结构域两者以互补方式工程化，使得每个CH3结构域(或包含其的重链)不再与自身发生同二聚化，而是被迫与互补工程化的另一CH3结构域发生异源二聚体化(由此第一和第二CH3结构域异源二聚体化，并且在两个第一CH3结构域之间或两个第二CH3结构域之间不形成同源二聚体)。考虑将这些用于提高重链异源二聚体化的不同方法作为不同的备选方案，与根据本发明的多特异性抗体中的重链-轻链修饰(在一个结合臂中VH和VL交换/替换，以及在CH1/CL界面中引入相反电荷置换带电荷氨基酸)组合，减少轻链错配的Bence-Jones型副产物。
在本发明的一个优选实施方案中(在多特异性抗体包含重链中的CH3结构域的情况下)，可以通过“凸起-进入-孔洞”技术改变根据本发明所述的异源二聚体多肽的CH3结构域，所述技术与几个实例一起详述于例如WO 96/027011，Ridgway，J.B.等，Protein Eng.9(1996)617-621；和Merchant，A.M.等，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；WO 98/050431中。在这种方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面以增加含有这两个CH3结构域的两条重链的异源二聚体化。(两条重链的)两个CH3结构域之任一可以是“凸起”，而另一可以是“孔洞”。二硫桥的引入可以进一步稳定异源二聚体(Merchant，A.M.等，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell，S.等，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并提高产量。
因此，在本发明的一个实施方案中，所述异源二聚体多肽(在每条重链中包含CH3结构域并且)进一步的特征在于
在a)下的抗体的第一重链的第一CH3结构域和在b)下的抗体的第二重链的第二CH3结构域在界面处相遇，所述界面包含该抗体CH3结构域之间的初始界面，
其中所述界面被改变以促进多特异性抗体的形成，其中所述改变的特征在于：
i)改变一条重链的CH3结构域，
使得在一条重链的CH3结构域的初始界面中(其中该初始界面与多特异性抗体的另一条重链的CH3结构域的初始界面相遇)，
氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一条重链的CH3结构域的界面内产生凸起(protuberance)，所述凸起可以放置在另一条重链的CH3结构域的界面内的空腔中，
和
ii)改变另一条重链的CH3结构域，
使得在第二CH3结构域的初始界面中(其中该初始界面与多特异性抗体内的第一CH3结构域的初始界面相遇)
氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二CH3结构域的界面内产生空腔，在所述空腔内可以放置第一CH3结构域的界面内的凸起。
优选，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
优选，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)。
在本发明的一个方面中，通过在每个CH3结构域的相应位置中引入半胱氨酸残基(C)来进一步改变两个CH3结构域，使得在两个CH3结构域之间可以形成二硫桥。
在一个优选实施方案中，所述异源二聚体多肽在“凸起链”的第一CH3结构域中包含氨基酸T366W突变，并且在“孔洞链”的第二CH3结构域中包含氨基酸T366S、L368A和Y407V突变。也可以使用CH3结构域之间额外的链间二硫桥(Merchant,A.M等，Nature Biotech 16(1998)677-681)，例如，通过将氨基酸Y349C突变引入“孔洞链”的CH3结构域中，并且将氨基酸E356C突变或氨基酸S354C突变引入“凸起链”的CH3结构域中。
在一个优选的实施方案中，所述异源二聚体多肽(其在每条重链中包含CH3结构域)在两个CH3结构域的一个中包含氨基酸S354C、T366W突变并在两个CH3结构域的另一个中包含氨基酸Y349C、T366S、L368A、Y407V突变(在一个CH3域中的该额外氨基酸S354C突变和在另一个CH3域中的该额外氨基酸Y349C突变形成链间二硫桥)(根据Kabat编号)。
用于修饰CH3以增强异源二聚体化的其它技术可以考虑作为本发明的备选方案，并且这些其他技术描述于例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中。
在一个实施方案中，可以备选地使用在EP 1 870 459A1中描述的异源二聚体化方法。该方法基于在两条重链之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨基酸位置处引入相反电荷对带电氨基酸的置换/突变。所述异源二聚体多肽的一个优选实施方案是在该多特异性抗体的第一CH3结构域中的氨基酸R409D；K370E突变和在该多特异性抗体的第二CH3结构域中的氨基酸D399K；E357K突变(根据Kabat编号)。
在另一个实施方案中，所述异源二聚体多肽包含“凸起链”的CH3结构域中的氨基酸T366W突变和“孔洞链”的CH3结构域中的氨基酸T366S、L368A、Y407V突变，以及另外地，“凸起链”的CH3结构域中的氨基酸R409D；K370E突变和“孔洞链”的CH3结构域中的氨基酸D399K、E357K突变。
在另一个实施方案中，所述异源二聚体多肽在两个CH3结构域的一个中包含氨基酸S354C、T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含氨基酸Y349C、T366S、L368A、Y407V突变，或者所述多特异性抗体在两个CH3结构域的一个中包含氨基酸Y349C、T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含氨基酸S354C、T366S、L368A、Y407V突变，以及另外在“凸起链”的CH3结构域中包含氨基酸R409D、K370E突变和在“孔洞链”的CH3结构域中包含氨基酸D399K、E357K突变。
在一个实施方案中，可以备选地使用WO2013/157953中描述的异源二聚体化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366K突变，并且第二CH3结构域多肽包含氨基酸L351D突变。在另一个实施方案中，第一CH3结构域还包含氨基酸L351K突变。在另一个实施方案中，第二CH3结构域还包含选自Y349E、Y349D和L368E(优选L368E)的氨基酸突变。
在一个实施方案中，可以备选地使用WO2012/058768中描述的异源二聚体化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸L351Y、Y407A突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸T366A、K409F突变。在另一个实施方案中，第二CH3结构域还包含在位置T411、D399、S400、F405、N390或K392处的氨基酸突变，所述氨基酸突变例如选自a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W，b)D399R、D399W、D399Y或D399K、c)S400E、S400D、S400R或S400K,F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W,N390R、N390K或N390D,K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E。在另一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸L351Y、Y407A突变，且第二CH3结构域包含氨基酸T366V、K409F突变。在另一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸Y407A突变，且第二CH3结构域包含氨基酸T366A、K409F突变。在另一个实施方案中，第二CH3结构域包含进一步的氨基酸K392E、T411E、D399R和S400R突变。
在一个实施方案中，可以备选地使用WO2011/143545中描述的异源二聚体化方法，例如在选自368和409的位置处的氨基酸修饰。
在一个实施方案中，可以备选地使用WO2011/090762中描述的异源二聚体化方法，其也使用以上所述的凸起-进入-孔洞技术。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366W突变，且第二CH3结构域包含氨基酸Y407A突变。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366Y突变，且第二CH3结构域包含氨基酸Y407T突变。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体是IgG2同种型，并且可以备选地使用WO2010/129304中描述的异源二聚体化方案。
在一个实施方案中，可以备选地使用WO2009/089004中描述的异源二聚体化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含带负电荷氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))对K392或N392的氨基酸置换(优选K392D或N392D)，并且第二CH3结构域包含带正电荷氨基酸(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R))对D399、E356、D356或E357的氨基酸置换(优选D399K、E356K、D356K或E357K和更优选地D399K和E356K)。在另一个实施方案中，第一CH3结构域还包含带负电荷氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))对K409或R409的氨基酸置换(优选地K409D或R409D)。在另一个实施方案中，第一CH3结构域进一步地或替代地包含带负电荷氨基酸(例如谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D))对K439和/或K370的氨基酸置换。
在一个实施方案中，可以备选地使用WO2007/147901中描述的异源二聚体化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸K253E、D282K和K322D突变，且第二CH3结构域包含氨基酸D239K、E240K和K292D突变。
在一个实施方案中，可以备选使用WO2007/110205中描述的异源二聚体化方法。
E.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来生产抗体，例如，如在US 4,816,567中所述的。在一个实施方案中，提供编码本文中所述的异源二聚体多肽的分离核酸。该核酸可以编码包含异源二聚体多肽的第一多肽的氨基酸序列和/或包含异源二聚体多肽的第二多肽的氨基酸序列。在另一个实施方案中，提供一个或多个包含所述核酸的载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供包含所述核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含以下载体(例如，已经用以下载体转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含异源二聚体多肽的第一多肽的氨基酸序列和包含异源二聚体多肽的第二多肽的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码含有异源二聚体多肽的第一多肽的氨基酸序列的核酸，第二载体包含编码含有异源二聚体多肽的第二多肽的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备本文中报道的异源二聚体多肽的方法，其中所述方法包括：在合适表达所述异源二聚体多肽的条件下，培养如上提供的包含编码所述异源二聚体多肽的核酸的宿主细胞，和任选，从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收异源二聚体多肽。
为了重组生产本文报道的异源二聚体多肽，可以分离编码异源二聚体多肽的核酸，例如，如上所述，并将其插入一个或多个载体中用以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规操作容易地对这样的核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码变体Fc-区多肽和抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。
适用于克隆或表达编码异源二聚体多肽的载体的宿主细胞包括本文中描述的原核或真核细胞。例如，异源二聚体多肽可以在细菌中制备，尤其是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于异源二聚体多肽片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，US 5,648,237、US5,789,199和US 5,840,523(也参见Charlton，K.A.，见：Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo，B.K.C.(编辑)，Humana Press，Totowa，NJ(2003)，第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可以将可溶级分中的异源二聚体多肽与细菌细胞糊分离，并且可以进一步纯化。
除了原核生物以外，真核微生物，如丝状真菌或酵母，是异源二聚体多肽编码载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经被“人源化”的真菌和酵母菌株，从而导致具有部分或完全人糖基化模式的二聚体多肽的生产。参见Gerngross，T.U.，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li，H.等，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
适合用于表达糖基化异源二聚体多肽的宿主细胞也可以源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴别出众多可以与昆虫细胞结合使用的杆状病毒菌株，特别是用于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见，例如，US 5,959,177、US 6,040,498、US6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适应悬浮培养的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK293或293细胞，其描述在例如Graham，F.L.，等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(TM4细胞，其描述于例如Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，其描述于例如Mather，J.P.，等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)，第248卷，Lo，B.K.C.(编辑)HumanaPress，Totowa，NJ(2004)，第255-268页。
F.联合治疗
在某些实施方案中，本文中报道的异源二聚体多肽或本文中报道的药物制剂单独施用(没有另外的治疗剂)，用于治疗本文中描述的一种或多种眼血管疾病。
在其它实施方案中，本文中报道的异源二聚体多肽抗体或药物制剂与一种或多种另外的治疗剂或方法联合施用，用于治疗本文中描述的一种或多种眼血管疾病。
在其它实施方案中，本文中报道的异源二聚体多肽或药物制剂与一种或多种另外的治疗剂联合配制并施用用于治疗本文中描述的一种或多种眼血管疾病。
在某些实施方案中，本文中提供的联合治疗包括，将本文中报道的异源二聚体多肽或药物制剂与一种或多种另外的治疗剂依次施用用于治疗本文中描述的一种或多种眼血管疾病。
所述另外的治疗剂包括，但不限于，色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)、EyeOOl(抗-VEGF聚乙二醇化的适体)、角鲨胺、RETAANE(TM)(用于贮库混悬液的乙酸阿奈可他(anecortaveacetate)；Alcon，Inc.)、考布他汀A4前药(Combretastatin A4 Prodrug，CA4P)、MACUGEN(TM)、MIFEPREX(TM)(米非司酮-ru486，mifepristone-ru486)、眼球筋膜下曲安奈德(subtenon triamcinolone acetonide)、玻璃体内结晶曲安奈德(intravitrealcrystalline triamcinolone acetonide)、普啉司他(Prinomastat)(AG3340-合成的基质金属蛋白酶抑制剂，Pfizer)、氟西奈德(fluocinolone acetonide)(包括氟轻松(fluocinolone)眼内植入物，Bausch&Lomb/Control Delivery Systems)、VEGFR抑制剂(Sugen)、VEGF-Trap(Regeneron/Aventis)、VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、伐他拉尼(vatalanib)(PTK787)和SU1 1248(舒尼替尼)、利诺胺(linomide)和整联蛋白v.β.3功能的抑制剂和血管生成抑制因子。
可以与本文中报道的异源二聚体多肽或药物制剂联合使用的其它药物治疗包括，但不限于，使用非热激光的VISUDYNE(TM)，PKC 412，Endovion(NeuroSearch A/S)，神经营养因子，包括，例如，胶质细胞衍生的神经营养因子和睫状神经营养因子，diatazem，多佐胺(dorzolamide)，Phototrop，9-顺式-视黄醛，眼药(包括Echo治疗)，包括碘磷灵(phospholine iodide)或依可酯(echothiophate)或碳酸酐酶抑制药，AE-941(AEternaLaboratories，Inc.)，Sirna-027(Sima Therapeutics，Inc.)，培加他尼(pegaptanib)(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)，神经营养蛋白(包括，例如，NT-4/5，Genentech)，Cand5(Acuity Pharmaceuticals)，INS-37217(Inspire Pharmaceuticals)，整联蛋白拮抗剂(包括来自Jerini AG和Abbott Laboratories的那些)，EG-3306(ArkTherapeutics Ltd.)，BDM-E(BioDiem Ltd.)，沙立度胺(thalidomide)(例如，由EntreMed，Inc.使用)，心脏营养素-1(cardiotrophin-1，Genentech)，2-甲氧雌二醇(Allergan/Oculex)，DL-8234(Toray Industries)，NTC-200(Neurotech)，四硫钼酸盐(tetrathiomolybdate)(University of Michigan)，LYN-002(Lynkeus Biotech)，微藻化合物(Aquasearch/Albany，Mera Pharmaceuticals)，D-9120(Celltech Group plc.)，ATX-S10(Hamamatsu Photonics)，TGF-β2(Genzyme/Celtrix)，酪氨酸激酶抑制剂(Allergan，SUGEN，Pfizer)，NX-278-L(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)，Opt-24(OPTISFrance SA)，视网膜神经节细胞神经保护剂(Cogent Neurosciences)，N-硝基吡唑衍生物(Texas A&M University System)，KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals)，环孢霉素A(cyclosporine A)，局限性视网膜转位术(timited retinal translocation)，光动力治疗(photodynamic therapy)(包括，例如，靶向受体的PDT，Bristol-Myers Squibb，Co.；卟吩姆钠注射剂(porfimer sodium for injection)与PDT；维替泊芬(verteporfin)，QLTInc.；罗培泊芬(rostaporfin)与PDT，Miravent Medical Technologies；他拉泊芬钠(talaporfin sodium)与PDT，Nippon Petroleum；莫特沙芬镥(motexafin lutetium)，Pharmacyclics，Inc.)，反义寡核苷酸(包括，例如，由Novagali Pharma SA测试的产品，和ISIS-13650，Isis Pharmaceuticals)，激光光凝术(laser photocoagulation)，玻璃疣激光术(drusen lasering)，黄斑裂孔手术(macular hole surgery)，黄斑转位手术(maculartranslocation surgery)，可植入微型望远镜(implantable miniature telescope)，Phi-Motion血管造影术(也称为显微-激光治疗(Micro-Laser Therapy)和Feeder Vessel治疗)，质子束治疗(Proton Beam Therapy)，微刺激治疗(microstimulation therapy)，视网膜剥离和玻璃体手术，巩膜扣带术(Scleral Buckle)，黄斑下手术(Submacular Surgery)，经瞳孔温热疗法(Transpupillary Thermotherapy)，光系统I治疗，应用RNA干扰(RNAi)，体外rheopheresis(也称为膜分化的过滤(membrane differential filtration)和Rheotherapy)，微型芯片植入，干细胞治疗，基因替换治疗，核酶基因治疗(包括针对缺氧响应元件的基因治疗，Oxford Biomedica；Lentipak，Genetix；PDEF基因治疗，GenVec)，光感受器/视网膜细胞移植(包括可移植的视网膜上皮细胞，Diacrin，Inc.；视网膜细胞植入物，Cell Genesys，Inc.)，和针灸。
任何抗血管生成剂均可以与本文中报道的异源二聚体多肽或药物制剂联合使用，包括，但不限于，Carmeliet和Jain(Nature 407(2000)249-257)所列出的那些。在某些实施方案中，所述抗血管生成剂是另一种VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂，如VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和性抗-VEGFR抗体、低分子量的VEGFR酪氨酸激酶抑制剂和它们的任意组合，并且这些包括抗-VEGF适体(例如，培加尼布)，可溶性重组诱饵受体(例如VEGF Trap)。在某些实施方案中，所述抗血管生成剂包括皮质类固醇，血管生成抑制性类固醇(angiostatic steroids)，乙酸阿奈可他，制管张素，内皮他丁(endostatin)，减少VEGFR或VEGF配体表达的小干扰RNA，使用酪氨酸激酶抑制剂的后-VEGFR阻断，MMP抑制剂，IGFBP3，SDF-1阻断剂，PEDF，γ-分泌酶，δ-样配体4，整联蛋白拮抗剂，HIF-1α阻断，蛋白激酶CK2阻断，和使用血管内皮钙粘蛋白(CD-144)和间质衍生因子(SDF)-I抗体抑制干细胞(即，内皮祖细胞)归巢到新生血管生成位点。还可以使用靶向VEGF受体的小分子RTK抑制剂，包括PTK787。还可以使用具有抗新生血管形成活性的试剂(不一定是抗-VEGF化合物)，并且包括抗炎性药物，m-Tor抑制剂，雷帕霉素(rapamycin)，依维莫司(everolismus)，坦罗莫司(temsirolismus)，环孢素(cyclospohne)，抗-TNF试剂，抗-补体试剂，和非类固醇类的抗炎剂。还可以使用神经保护性且能够潜在地减少干性黄斑变性的进展的试剂，诸如称为‘神经类固醇’的药物种类。这些包括下述药物，如脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)(商标名称：Prastera(R)和Fidelin(R))，硫酸脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone sulfate)和硫酸孕烯醇酮(pregnenolone sulfate)。任何AMD(年龄相关的黄斑变性)治疗剂可以与根据本发明的二聚体多肽或药物组合物联合使用，包括，但不限于，与PDT组合的维替泊芬，培加他尼钠，锌或抗氧化剂，单独或以任意组合。
G.药物制剂
通过将具有期望纯度的异源二聚体多肽与一种或多种任选的药用载体(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编辑)(1980)混合，可以制备冻干制剂或水溶液形式的本文报道的异源二聚体多肽的药物制剂。药用载体通常在所用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括，但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚(乙烯基吡咯烷酮)；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性的药用载体还包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20(Baxter International，Inc.)。在US 2005/0260186和US 2006/0104968中描述了某些示例性的sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶，如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体制剂描述于US 6,267,958中。水性抗体制剂包括在US6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后一类制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症的需要而含有超过一种活性成分，优选地是具有互补活性、不会不利地彼此影响的那些活性成分。这样的活性成分适宜地以对于预期目的而言有效的量存在。
活性成分可以截留在，例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、或胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或大乳剂中。这样的技术公开在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编辑)(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质可以呈成形制品(例如薄膜或微胶囊)的形式。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以容易地实现无菌性，例如通过无菌过滤膜过滤。
H.治疗方法和组合物
本文中报道的任何异源二聚体多肽均可以用在治疗方法中。
在一个方面，提供了用作药物的本文中报道的异源二聚体多肽。在其它方面中，提供用于治疗眼血管疾病的异源二聚体多肽。在某些实施方案中，提供用于治疗方法中的异源二聚体多肽。在某些实施方案中，本发明提供用在治疗患有眼血管疾病的个体的方法中的异源二聚体多肽，所述方法包括给所述个体施用有效量的本文中报道的异源二聚体多肽。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括给个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如上面在部分D中所述的。在其它实施方案中，本发明提供用于在眼中抑制血管生成的异源二聚体多肽。在某些实施方案中，本发明提供用在个体中抑制血管生成的方法中的异源二聚体多肽，所述方法包括给所述个体施用有效量的异源二聚体多肽以抑制血管生成。根据任意上述实施方案的“个体”在一个优选实施方案中是人。
在其它方面中，本发明提供异源二聚体多肽在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗眼血管疾病。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗眼血管疾病的方法中，所述方法包括给患有眼血管疾病的个体施用有效量的药物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括给个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如上所述的。在另一个实施方案中，所述药物用于抑制血管生成。在另一个实施方案中，所述药物用于抑制个体中血管生成的方法中，所述方法包括给所述个体施用有效量的药物以抑制血管生成。根据任意上述实施方案的“个体”可以是人。
在再一个方面中，本发明提供用于治疗血管性眼病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括给患有血管性眼病的个体施用有效量的本文中报道的异源二聚体多肽。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括给所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下文所述。根据任意上述实施方案的“个体”可以是人。
在另一个方面中，本发明提供用于抑制个体眼中血管生成的方法。在一个实施方案中，所述方法包括给个体施用有效量的本文中报道的异源二聚体多肽以抑制血管生成。在一个实施方案中，“个体”是人。
在再一个方面中，本发明提供了药物制剂，其包含本文报道的任何异源二聚体多肽，例如，用于任何上述治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文报道的任何异源二聚体多肽和药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文报道的任何异源二聚体多肽和至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述的。
在治疗中，本文中报道的异源二聚体多肽可以单独使用或与其它药剂联合使用。例如，本文中报道的异源二聚体多肽可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。
本文中报道的异源二聚体多肽(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括胃肠外、肺内和鼻内施用，并且，如果需要，可以用于局部治疗，病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。剂量施用可以通过任何适宜的途径，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否是短暂的或长期的。本文中考虑各种剂量施用方案，包括但不限于，经不同时间点单次或多次施用，推注施用和脉冲输注。
以与良好医学实践一致的方式，配制、定剂量和施用本文中报道的异源二聚体多肽。在该背景下考虑的因素包括正在治疗的特定障碍、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、障碍的起因、药剂的递送位点、施用方法、施用进度表和医学从业人员已知的其它因素。异源二聚体多肽不需要，但可以任选地与一种或多种当前用于预防或治疗讨论的障碍的药剂一起配制。这样的其它药剂的有效量取决于存在于所述制剂中的异源二聚体多肽的量，障碍或治疗的类型，和上文讨论的其它因素。这些通常可以以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或可以以本文所述的剂量的约1至99％，或以经验上/临床上确定为合适的任意剂量和任意途径使用。
为了预防或治疗疾病，本文中报道的异源二聚体多肽(当单独地或与一种或多种其它另外的治疗剂联合使用时)的适当剂量将取决于要治疗的疾病的类型、异源二聚体多肽的类型、疾病的严重程度和进程、施用异源二聚体多肽是否为了预防或治疗目的、在前的治疗、患者的临床史和对异源二聚体多肽的应答以及主治医师的判断。适当地将异源二聚体多肽一次性地或经一系列治疗施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg至10mg/kg)的异源二聚体多肽可以是施用于患者的初始候选剂量，例如，通过一次或多次分开施用，或是通过连续输注施用。一个典型的每日剂量可以是从约1μg/kg至100mg/kg或更多，取决于上文提及的因素。对于经数天或更长时间的重复施用，根据状况，治疗通常是持续的，直到出现期望的疾病症状的抑制。异源二聚体多肽的一个示例性剂量是在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以将一个或多个约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的剂量(或其任意组合)施用于患者。这样的剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周一次(例如使得患者接受约二至约二十个，或例如约六个剂量的二聚体多肽)。可以施用初始的较高负荷剂量，随后可以施用一个或多个较低剂量。通过常规技术和测定法，可以容易地监测这种治疗的进展。
III.制成品
在本发明的另一方面，提供了制成品，其含有用于治疗、预防和/或诊断上文所述障碍的材料。制成品包含容器和贴在容器上或与容器结合的标签或包装说明书。适当的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由多种材料如玻璃或塑料制成。所述容器容纳组合物自身或容纳组合物与另一种可有效地治疗、预防和/或诊断病症的组合物的组合，且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的瓶子)。组合物内的至少一种活性剂是本文中报道的异源二聚体多肽。标签或包装说明书指示，所述组合物用于治疗选择的病症。此外，制成品可以包含(a)具有包含在其中的组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文中报道的异源二聚体多肽；和(b)具有包含在其中的组合物的第二容器，其中所述组合物包含其它的治疗剂。在本发明的该实施方案中，制成品还可以包含包装说明书，所述包装说明书指示所述组合物可以用于治疗特定病症。可替换地，或另外地，制成品可以进一步包含第二(或第三)容器，所述容器包含药用缓冲液，如抑制细菌的注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其可以进一步包含从商业和用户角度看合乎需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
应当理解，本文中报道的免疫缀合物，可以替代本文中报道的异源二聚体多肽或加上本文中报道的异源二聚体多肽，包括在任何上述制成品中。
IV.实施例
以下是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于以上提供的一般描述，可以实施多种其它的实施方案。
尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明和实例对前述发明进行了比较详细的描述，但是这些描述和实例不应解释为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用以它们的整体并入本文。
方法
电喷雾电离质谱(ESI-MS)
通过添加0.5μL N-聚糖酶plus(Roche)和磷酸钠缓冲液(0.1M，pH 7.1)以获得115μL的最终样品体积，使蛋白等份试样(50μg)去糖基化。将混合物在37℃温育18h。此后，为了还原和变性，添加60μL在4M胍*HCl(Pierce)中的0.5M TCEP(Pierce)和50μL 8M胍*HCl。将混合物在37℃温育30min。将样品通过尺寸排阻色谱(Sepharos G-25，等度，含有2％甲酸的40％乙腈)脱盐。在配备nano ESI源(TriVersa NanoMate，Advion)的Q-TOF仪器(maXis，Bruker)上记录ESI质谱图(+ve)。MS参数设置如下：转移：漏斗RF，400Vpp；ISCID能量，0eV；多极RF，400Vpp；四极：离子能，4.0eV；低质量，600m/z；源：干燥气体，8L/min；干燥气体温度，160℃；碰撞室：碰撞能，10eV；碰撞RF：2000Vpp；离子冷却器：离子冷却器RF，300Vpp；转移时间：120μs；脉冲前储存(Pre Puls Storage)，10μs；扫描范围m/z 600-2000。为了数据评价，使用内部开发的软件(Mass Analyzer)。
FcRn表面等离子体共振(SPR)分析
使用BIAcore T100仪器(BIAcore AB，Uppsala，瑞典)，通过表面等离子体共振(SPR)技术,分析野生型抗体和突变体对FcRn的结合特性。该系统对于分子相互作用的研究而言是充分确立的。它允许连续实时监测配体/分析物结合，并且由此确定在不同测定设置下的动力学参数。SPR-技术基于：测量靠近金包被的生物传感器芯片表面的折射率。折射率的变化指示由固定化的配体与溶液中注射的分析物的相互作用造成的所述表面上的质量变化。如果分子与表面上固定化的配体结合，则质量增加，在解离的情况下，则质量减小。在当前的测定中，借助胺偶联法将FcRn受体固定在BIAcore CM5-生物传感器芯片(GEHealthcare Bioscience，Uppsala，瑞典)上达到400应答单位(RU)的水平。该测定在室温实施，用PBS、0.05％吐温20pH 6.0(GE Healthcare Bioscience)作为运行和稀释缓冲液。将200nM样品在室温以50μL/min的流速注射。结合时间是180秒，解离阶段耗时360秒。通过短暂注射HBS-P、pH 8.0，实现芯片表面的再生。通过对比注射后180秒和注射后300秒的生物应答信号高度，进行SPR-数据的评价。相应参数是RU最高水平(注射后180秒)和后期稳定性(注射结束后300秒)。
蛋白A表面等离子体共振(SPR)分析
该测定是基于表面等离子体共振光谱法。将蛋白A固定在SPR生物传感器的表面上。通过将样品注射进SPR光谱仪的流动池中，它与固定化的蛋白A形成复合物，导致传感芯片表面上的质量增加，并且因此导致更高的应答(因为1RU定义为1pg/mm2)。此后，通过溶解样品-蛋白A复合物，再生传感器芯片。然后针对信号高度(按应答单位(RU))和解离行为，评价获得的应答。
通过使用GE Healthcare的胺偶联试剂盒，将约3500应答单位(RU)的蛋白A(20μg/mL)在pH 4.0偶联到CM5芯片(GE Healthcare)上。
样品和系统缓冲液是HBS-P+(0.01M HEPES，0.15M NaCl，无菌过滤的0.005％表面活性剂P20，pH 7.4)。将流动池温度设定至25℃，并且将样品区室温度设定至12℃。该系统用运行缓冲液引发。然后，将5nM的样品构建体溶液以30μL/min的流速注射120秒，随后是300秒解离阶段。然后，通过两次30μL/min流速的30秒长的甘氨酸-HCl pH 1.5注射，再生传感器芯片表面。一式三份地测量每个样品。
本文中使用的术语“具有突变IHH-AAA”表示在IgG1或IgG4亚类的恒定重链区中具有突变I253A(Ile253Ala)、H310A(His310Ala)和H435A(His435Ala)的组合(根据Kabat EU索引编号系统编号)，本文中使用的术语“具有突变HHY-AAA”表示在IgG1或IgG4亚类的恒定重链区中具有突变H310A(His310Ala)、H433A(His433Ala)和Y436A(Tyr436Ala)的组合(根据Kabat EU索引编号系统编号)，本文中使用的术语“具有突变P329G LALA”表示在IgG1亚类的恒定重链区中具有突变L234A(Leu234Ala)、L235A(Leu235Ala)和P329G(Pro329Gly)的组合(根据Kabat EU索引编号系统编号)，且本文中使用的术语“具有突变SPLE”表示在IgG4亚类的恒定重链区中具有突变S228P(Ser228Pro)和L235E(Leu235Glu)的组合(根据KabatEU索引编号系统编号)。
一般信息
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出在：Kabat，E.A.，等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)。抗体链的氨基酸残基根据EU编号进行编号和提及(Edelman，G.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85；Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。
重组DNA技术
如在Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)中所述，使用标准方法操作DNA。根据生产商的说明书使用分子生物学试剂。
基因合成
在Geneart(Regensburg，德国)根据给出的说明书订购期望的基因区段。
DNA序列确定
通过在MediGenomix GmbH(Martinsried，德国)或SequiServe GmbH(Vaterstetten，德国)进行的双链测序，确定DNA序列。
DNA和蛋白序列分析和序列数据管理
GCG(遗传学计算机组(Genetics Computer Group)，Madison，威斯康辛州)的软件包第10.2版和Infomax的Vector NTl Advance套装8.0版用于序列生成、作图、分析、注释和说明。
表达载体
为了表达所描述的抗体，使用基于cDNA组织(带有或不带有CMV-内含子A启动子)或基于基因组组织(带CMV启动子)的用于瞬时表达(例如在HEK293-F细胞中)的表达载体。
除了抗体表达盒，载体还含有：
-允许该载体在大肠杆菌中复制的复制起点；
-赋予在大肠杆菌中氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，和
-来自小家鼠(Mus musculus)的二氢叶酸还原酶基因作为真核细胞中的筛选标记。
抗体基因的转录单元由以下元件组成：
-5′末端的独特限制位点，
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
-在cDNA组织的情况下，后接内含子A序列，
-人免疫球蛋白基因的5’-非翻译区，
-编码免疫球蛋白重链信号序列的核酸，
-编码人抗体链(野生型或具有结构域交换)的核酸，所述核酸为cDNA形式或在具有免疫球蛋白外显子-内含子组构的基因组组织中，
-具有多腺苷酸化信号序列的3’非翻译区，和
-3′末端的独特限制位点。
编码抗体链的核酸通过PCR和/或基因合成而生成并如下通过已知的重组方法和技术装配：连接相应的核酸区段，例如使用相应载体中的独特限制位点。通过DNA测序，验证亚克隆的核酸序列。关于瞬时转染，从转化的大肠杆菌培养物(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)，通过载体制备法，制得较大量的载体。
细胞培养技术
按照Current Protocils in Cell Biology(2000)，Bonifacino，J.S.，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.和Yamada，K.M.(编辑)，John Wiley&Sons，Inc.中所述的，使用标准细胞培养技术。
如下文描述，在悬浮培养的HEK29-F细胞中，通过瞬时共转染相应的表达载体，来表达双特异性抗体。
实施例1
表达和纯化
在HEK293-F系统中的瞬时转染
使用HEK293-F系统(Invitrogen)，根据生产商的说明书，通过用相应载体(例如编码重链和修饰的重链以及对应的轻链和修饰的轻链)瞬时转染，产生单特异性和双特异性抗体。简而言之，在摇瓶中或搅拌式发酵罐中在无血清FreeStyleTM293表达培养基(Invitrogen)中悬浮培养的HEK293-F细胞(Invitrogen)，用相应表达载体和293fectinTM或fectin(Invitrogen)的混合物转染。对于2L摇瓶(Corning)，将HEK293-F细胞以1*106个细胞/mL的密度接种在600mL中并且在120rpm、8％CO2温育。次日，将细胞以大约1.5*106个细胞/mL的细胞密度用大约42mL以下混合物转染：A)20mL Opti-MEM(Invitrogen)与600μg总载体DNA(1μg/mL)的混合物，所述载体DNA以等摩尔比编码重链或经修饰的重链和对应的轻链，和B)20ml Opti-MEM与1.2mL 293fectin或fectin(2μL/mL)的混合物。在发酵过程中，根据葡萄糖消耗量添加葡萄糖溶液。5-10天后收获含有分泌的抗体的上清液，并且直接从上清液纯化抗体或将上清液冷冻并储存。
纯化
通过使用MabSelectSure-SepharoseTM的亲和色谱，使用丁基-Sepharose的疏水相互作用色谱(GE Healthcare，瑞典)和Superdex 200尺寸排阻色谱(GE Healthcare，瑞典)，从细胞培养物上清液纯化双特异性抗体。
简而言之，将无菌过滤的细胞培养上清液捕获在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4、1mMKH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelectSure树脂上，用平衡缓冲液洗涤并且用pH 3.0的25mM柠檬酸钠洗脱。将洗脱的抗体级分合并，并用pH 9.0的2M Tris中和。通过添加1.6M硫酸铵溶液至0.8M硫酸铵的终浓度并使用乙酸调节pH至pH 5.0，准备抗体合并物，以用于疏水相互作用色谱。用35mM醋酸钠、0.8M硫酸铵、pH 5.0平衡丁基-Sepharose树脂后，将抗体施加至树脂，用平衡缓冲液洗涤，并且用至35mM醋酸钠pH 5.0的线性梯度洗脱。将含有(单特异性或双特异性的)抗体的级分合并，并且使用以20mM组氨酸、140mMNaCl、pH 6.0平衡的Superdex 200 26/60GL(GE Healthcare，瑞典)柱通过尺寸排阻色谱进一步纯化。将含有(单特异性或双特异性的)抗体的级分合并，使用Vivaspin超滤装置(Sartorius Stedim Biotech S.A.，法国)浓缩至要求的浓度并在-80℃储存。
每个纯化步骤后，可以使用微流控Labchip技术(Caliper Life Science，USA)，通过CE-SDS分析纯度和抗体完整性。根据生产商的说明书，使用HT蛋白表达试剂试剂盒，制备5μL蛋白溶液用于CE-SDS分析，并使用HT蛋白表达芯片在Labchip GXII系统上分析。使用Labchip GX软件分析数据。
可以通过高效SEC，使用Superdex 200分析性尺寸排阻柱(GE Healthcare,Sweden)，在2xPBS(20mM Na2HPO4,2mM KH2PO4,274mM NaCl和5.4mM KCl,pH 7.4)运行缓冲液中，在25℃分析抗体样品的聚集物含量。将25μg蛋白质以0.75mL/min的流速注射到柱上，并经50分钟等度洗脱。
实施例2
FcRn色谱
偶联至链霉亲和素琼脂糖：
将1克链霉亲和素琼脂糖(GE Healthcare)添加至生物素化的并经透析的受体，在振荡下孵育2小时。将受体衍化的Sepharose装填在1mL XK柱(GE Healthcare)中。
使用FcRn亲和柱的色谱：
条件：
柱尺寸：50mm x 5mm
床高度：5cm
载量：50μg样品
平衡缓冲液：20mM MES，含有150mM NaCl，调至pH 5.5
洗脱缓冲液：20mM Tris/HCl，含有150mM NaCl，调至pH 8.8
洗脱：7.5CV平衡缓冲液，在30CV中达到100％洗脱缓冲液，10CV洗脱缓冲液。

Claims (15)

1.一种异源二聚体多肽，其包含
第一多肽，所述第一多肽在N-端至C-端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的免疫球蛋白铰链区的至少一部分、免疫球蛋白CH2-结构域和免疫球蛋白CH3-结构域；和
第二多肽，所述第二多肽在N-端至C-端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的免疫球蛋白铰链区的至少一部分、免疫球蛋白CH2-结构域和免疫球蛋白CH3-结构域，
其中所述第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V(孔洞链)和所述第二多肽包含突变S354C和T366W(凸起链)，
和
其中所述第一多肽(孔洞链)包含突变
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，
和
其中所述第一多肽和第二多肽通过一个或多个二硫桥连接，和
其中所述第一多肽的CH3-结构域和所述第二多肽的CH3-结构域都结合或都不结合蛋白A(根据Kabat EU索引编号)。
2.根据权利要求1的异源二聚体多肽，其包含突变
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，和
iii)T250Q，和/或
iv)T256E或T256A。
3.根据权利要求1至2任一项的异源二聚体多肽，其包含突变
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，和
iii)任选地a)T250Q，和/或T256E或T256A，和
iv)a)L251A或L251G或L251D，和/或b)H310A或H310G。
4.根据权利要求1至3任一项的异源二聚体多肽，其包含突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，和
iii)a)T250Q，和/或T256E或T256A，和
iv)a)L251A或L251G或L251D，和/或b)H310A或H310G，
v)任选a)T307A或T307H或T307Q或T307P，和/或b)Q311H，和/或c)M252Y，和/或d)S254T。
5.根据权利要求1至4任一项的异源二聚体多肽，其包含突变
i)T250Q，和/或
ii)M252Y，和/或
iii)S254T，和/或
iv)T256E或T256A，和/或
v)T307A或T307H或T307Q或T307P，和/或
vi)Q311H。
6.根据权利要求1至5任一项的异源二聚体多肽，其中免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2-结构域和免疫球蛋白CH3-结构域是人IgG1亚类。
7.根据权利要求1至6任一项的异源二聚体多肽，其中第一多肽和第二多肽进一步包含突变L234A和L235A。
8.根据权利要求1至7任一项的异源二聚体多肽，其中第一多肽和第二多肽进一步包含突变P329G。
9.根据权利要求1至5任一项的异源二聚体多肽，其中免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2-结构域和免疫球蛋白CH3-结构域是人IgG4亚类。
10.根据权利要求1至5和9任一项的异源二聚体多肽，其中第一多肽和第二多肽进一步包含突变S228P和L235E。
11.根据权利要求1至5和9至10任一项的异源二聚体多肽，其中第一多肽和第二多肽进一步包含突变P329G。
12.根据权利要求1至11任一项的异源二聚体多肽，其中该二聚体多肽是全长双特异性抗体。
13.一种药物制剂，其包含根据权利要求1至12任一项的异源二聚体多肽和任选的药物学上可接受的载体。
14.根据权利要求1至12任一项的异源二聚体多肽用于制造药物制剂的用途。
15.根据权利要求1至12任一项的异源二聚体多肽用于治疗眼病(优选眼血管疾病)。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111182915A (zh) * 2017-08-15 2020-05-19 金德雷德生物科学股份有限公司 兽药用IgG Fc变体
CN111246885A (zh) * 2017-10-20 2020-06-05 豪夫迈·罗氏有限公司 从单特异性抗体生成多特异性抗体的方法
CN112466390A (zh) * 2020-12-19 2021-03-09 钮雪琴 可用于纯化人免疫球蛋白g的疏水性环状肽配基
CN111246885B (zh) * 2017-10-20 2024-06-11 豪夫迈·罗氏有限公司 从单特异性抗体生成多特异性抗体的方法

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3016563A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
KR102050463B1 (ko) 2016-08-10 2019-11-29 아주대학교산학협력단 항체 중쇄불변부위 이종이중체 (heterodimeric Fc)에 융합된 사이토카인 (heterodimeric Fc-fused cytokine) 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
US20200291089A1 (en) 2017-02-16 2020-09-17 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
WO2018222901A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
WO2018237364A1 (en) * 2017-06-22 2018-12-27 Development Center For Biotechnology BISPECIFIC ANTI-GLOBO H ANTIBODY AND ANTI-CD3 FUSION FC-SCFV ASYMMETRIC HETERODIMER AND ASSOCIATED USES IN ANTICANCER THERAPY
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
EP3743440A1 (en) * 2018-01-24 2020-12-02 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
EP3765517A1 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
EP3765516A2 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
CN112236448A (zh) 2018-04-17 2021-01-15 海德堡生物技术有限公司 用包含NC-1-Fc的蛋白寡聚体治疗血管发生、纤维化和癌症相关疾病的手段和方法
TW202016151A (zh) 2018-06-09 2020-05-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
DE202019005887U1 (de) 2018-07-03 2023-06-14 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR-Antikörpermoleküle und Verwendungen davon
AU2019366956A1 (en) 2018-10-23 2021-05-20 Dragonfly Therapeutics, Inc. Heterodimeric Fc-fused proteins
SG11202109061YA (en) 2019-02-21 2021-09-29 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
GB2597851B (en) 2019-02-21 2024-05-29 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
SG11202109122SA (en) 2019-02-21 2021-09-29 Marengo Therapeutics Inc Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
JP2022522662A (ja) 2019-02-21 2022-04-20 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド Ｔ細胞に結合する多機能性分子および自己免疫障害を処置するためのその使用
JP2022521750A (ja) 2019-02-21 2022-04-12 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用
CN113121677B (zh) * 2019-12-31 2023-06-27 周易 一种得到高纯度异源抗体的方法
EP4084821A4 (en) 2020-01-03 2024-04-24 Marengo Therapeutics Inc CD33-BINDING MULTIFUNCTIONAL MOLECULES AND THEIR USES
CA3180321A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
WO2022047046A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting trbc1 or trbc2
KR20230074144A (ko) 2020-08-26 2023-05-26 마렝고 테라퓨틱스, 인크. NKp30에 결합하는 항체 분자 및 이의 용도
JP2023542080A (ja) 2020-08-26 2023-10-05 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用
CN112480245B (zh) * 2020-12-19 2023-08-18 上海佰君生物科技有限公司 一种疏水性环状肽配基纯化人免疫球蛋白g的应用
CN117597359A (zh) 2021-04-08 2024-02-23 马伦戈治疗公司 与tcr结合的多功能分子及其用途
US20230116446A1 (en) * 2021-09-21 2023-04-13 Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corporation HETERODIMERIC Fc FOR MAKING FUSION PROTEINS AND BISPECIFIC ANTIBODIES

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004035752A2 (en) * 2002-10-15 2004-04-29 Protein Design Labs, Inc. ALTERATION OF FcRn BINDING AFFINITIES OR SERUM HALF-LIVES OF ANTIBODIES BY MUTAGENESIS
CN101124245A (zh) * 2003-11-12 2008-02-13 比奥根艾迪克Ma公司 新生儿Fc受体(FcRn)-结合多肽变体、二聚体Fc结合蛋白及其相关方法
WO2010151792A1 (en) * 2009-06-26 2010-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
CN102746404A (zh) * 2004-11-12 2012-10-24 赞科股份有限公司 对FcRn的结合被改变的Fc变体
WO2014006217A1 (en) * 2012-07-06 2014-01-09 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
WO2014009465A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
WO2014177461A1 (en) * 2013-04-29 2014-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Fcrn-binding abolished anti-igf-1r antibodies and their use in the treatment of vascular eye diseases
WO2014177459A2 (en) * 2013-04-29 2014-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor binding modified asymmetric antibodies and methods of use

Family Cites Families (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
EP0915987A2 (en) 1997-04-21 1999-05-19 Donlar Corporation POLY-($g(a)-L-ASPARTIC ACID), POLY-($g(a)-L-GLUTAMIC ACID) AND COPOLYMERS OF L-ASP AND L-GLU, METHOD FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR USE
ES2246069T3 (es) 1997-05-02 2006-02-01 Genentech, Inc. Procedimiento de preparacion de anticuerpos multiespecificos que tienen componentes comunes y multimericos.
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
EP0994903B1 (en) 1997-06-24 2005-05-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
PT1034298E (pt) 1997-12-05 2012-02-03 Scripps Research Inst Humanização de anticorpo murino
IL138608A0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
ATE303445T1 (de) 1999-10-04 2005-09-15 Medicago Inc Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
US7449443B2 (en) 2000-03-23 2008-11-11 California Institute Of Technology Method for stabilization of proteins using non-natural amino acids
CN101289511A (zh) 2000-04-11 2008-10-22 杰南技术公司 多价抗体及其应用
US6586207B2 (en) 2000-05-26 2003-07-01 California Institute Of Technology Overexpression of aminoacyl-tRNA synthetases for efficient production of engineered proteins containing amino acid analogues
CN103333860B (zh) 2000-10-06 2015-07-08 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
AU3942202A (en) 2000-11-30 2002-06-11 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
EP1355919B1 (en) * 2000-12-12 2010-11-24 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
AU2002339845B2 (en) 2001-08-03 2009-03-26 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
MXPA04003798A (es) 2001-10-25 2004-07-30 Genentech Inc Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7139665B2 (en) 2002-02-27 2006-11-21 California Institute Of Technology Computational method for designing enzymes for incorporation of non natural amino acids into proteins
WO2003085118A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production de composition anticorps
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
EA200401325A1 (ru) 2002-04-09 2005-04-28 Киова Хакко Когио Ко., Лтд. Клетки с модифицированным геномом
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
AU2003239966B9 (en) 2002-06-03 2010-08-26 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7365168B2 (en) * 2002-10-15 2008-04-29 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
SI1572744T1 (sl) 2002-12-16 2010-09-30 Genentech Inc Imunoglobulinske variante in njihove uporabe
US7960512B2 (en) * 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
CA2510003A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
AU2004279742A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Fused protein composition
EP1675620B1 (en) 2003-10-09 2019-05-08 Ambrx, Inc. Polymer derivatives
US20070134759A1 (en) 2003-10-09 2007-06-14 Harue Nishiya Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
TR201809892T4 (tr) 2003-11-05 2018-07-23 Roche Glycart Ag Fc reseptörüne bağlanma afinitesi ve artırılmış efektör fonksiyonu bulunan antijen bağlayan moleküller.
AU2004290070A1 (en) * 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Neonatal Fc receptor (FcRn)-binding polypeptide variants, dimeric Fc binding proteins and methods related thereto
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
US20050249723A1 (en) * 2003-12-22 2005-11-10 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites
JP4889505B2 (ja) 2004-02-02 2012-03-07 アンブレツクス・インコーポレイテツド 被修飾されたヒト成長ホルモンポリペプチドおよびこれらの使用
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
DK1737891T3 (da) 2004-04-13 2013-03-25 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin-antistoffer
WO2006031370A2 (en) 2004-08-19 2006-03-23 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AR060070A1 (es) 2006-03-24 2008-05-21 Merck Patent Gmbh Dominios proteicos heterodimericos obtenidos por ingenieria
JP2009536527A (ja) 2006-05-09 2009-10-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド 最適化されたスキャフォールドを備えた結合ポリペプチド
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
PL2059533T3 (pl) 2006-08-30 2013-04-30 Genentech Inc Przeciwciała wieloswoiste
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
WO2009025354A1 (ja) 2007-08-22 2009-02-26 Lion Corporation シラン変性カチオン化セルロースの製造方法
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
PL2235064T3 (pl) 2008-01-07 2016-06-30 Amgen Inc Sposób otrzymywania cząsteczek przeciwciał z heterodimerycznymi fc z zastosowaniem kierujących efektów elektrostatycznych
US8268314B2 (en) * 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
CA2746330C (en) 2008-12-23 2017-08-29 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants with altered binding to protein a
WO2010112193A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
KR20110124368A (ko) * 2009-04-07 2011-11-16 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항―ｅｒｂｂ―２／항―ｃ―ｍｅｔ 항체
PT2417156E (pt) 2009-04-07 2015-04-29 Roche Glycart Ag Anticorpos trivalentes, biespecíficos
ES2708124T3 (es) 2009-04-27 2019-04-08 Oncomed Pharm Inc Procedimiento para preparar moléculas heteromultiméricas
AU2010252284A1 (en) 2009-05-27 2011-11-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
DK2519543T3 (en) 2009-12-29 2016-09-26 Emergent Product Dev Seattle HETERODIMER BINDING PROTEINS AND USE THEREOF
US10143186B2 (en) 2010-02-08 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
TWI667257B (zh) * 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
EP2635607B1 (en) 2010-11-05 2019-09-04 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
CA2859667C (en) 2011-12-20 2022-05-24 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
WO2013138643A1 (en) * 2012-03-16 2013-09-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Soluble engineered monomeric fc
CN114163530A (zh) 2012-04-20 2022-03-11 美勒斯公司 用于产生免疫球蛋白样分子的方法和手段
JP6388581B2 (ja) * 2012-08-02 2018-09-12 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 単量体および多量体分子を生産するための方法およびその使用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004035752A2 (en) * 2002-10-15 2004-04-29 Protein Design Labs, Inc. ALTERATION OF FcRn BINDING AFFINITIES OR SERUM HALF-LIVES OF ANTIBODIES BY MUTAGENESIS
CN101124245A (zh) * 2003-11-12 2008-02-13 比奥根艾迪克Ma公司 新生儿Fc受体(FcRn)-结合多肽变体、二聚体Fc结合蛋白及其相关方法
CN102746404A (zh) * 2004-11-12 2012-10-24 赞科股份有限公司 对FcRn的结合被改变的Fc变体
WO2010151792A1 (en) * 2009-06-26 2010-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
WO2014006217A1 (en) * 2012-07-06 2014-01-09 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
WO2014009465A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
WO2014177461A1 (en) * 2013-04-29 2014-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Fcrn-binding abolished anti-igf-1r antibodies and their use in the treatment of vascular eye diseases
WO2014177459A2 (en) * 2013-04-29 2014-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor binding modified asymmetric antibodies and methods of use

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIN-KYOO KIM等: ""Mapping the site on human IgG for binding of the MHC class I-related receptor, FcRn"", 《EUR. J. IMMUNOL.》 *
ROBERT L. SHIELDS等: ""High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcΥRI, FcΥRII, FcΥRIII, and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcΥR"", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
W. LANCE MARTIN等: ""Characterization of the 2:1 Complex between the Class I MHC-Related Fc Receptor and Its Fc Ligand in Solution"", 《BIOCHEMISTRY》 *
W. LANCE MARTIN等: ""Crystal Structure at 2.8 A°of an FcRn/Heterodimeric Fc Complex: Mechanism of pH-Dependent Binding"", 《MOLECULAR CELL》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111182915A (zh) * 2017-08-15 2020-05-19 金德雷德生物科学股份有限公司 兽药用IgG Fc变体
CN111246885A (zh) * 2017-10-20 2020-06-05 豪夫迈·罗氏有限公司 从单特异性抗体生成多特异性抗体的方法
CN111246885B (zh) * 2017-10-20 2024-06-11 豪夫迈·罗氏有限公司 从单特异性抗体生成多特异性抗体的方法
CN112466390A (zh) * 2020-12-19 2021-03-09 钮雪琴 可用于纯化人免疫球蛋白g的疏水性环状肽配基
CN112466390B (zh) * 2020-12-19 2023-11-14 广东众源药业有限公司 可用于纯化人免疫球蛋白g的疏水性环状肽配基

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