KR20170076697A - 개질된 FCRN-결합 특성 및 단백질 A-결합 특성을 가진 Fc-영역 변이체 - Google Patents

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Abstract

본원에 보고되는 것은 하나 이상의 시스테인 잔기, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는, 적어도 면역글로불린 힌지 영역의 일부를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제 1 폴리펩티드, 및 하나 이상의 시스테인 잔기, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는, 적어도 면역글로불린 힌지 영역의 일부를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제 2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체성 폴리펩티드로서, 제 1 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 를 포함하고 (홀-사슬), 제 2 폴리펩티드는 돌연변이 S354C 및 T366W 을 포함하고 (놉-사슬), 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함하고: i) I253A 또는 I253G, 및 ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 하나 이상의 디술피드 가교에 의해 연결되고, 제 1 폴리펩티드의 CH3-도메인 및 제 2 폴리펩티드의 CH3-도메인은 둘다 단백질 A 에 결합하거나 또는 둘다 결합하지 않는, 이종이량체성 폴리펩티드 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정) 이다.

Description

개질된 FCRN-결합 특성 및 단백질 A-결합 특성을 가진 Fc-영역 변이체 {FC-REGION VARIANTS WITH MODIFIED FCRN- AND PROTEIN A-BINDING PROPERTIES}
본원에는 Fc-수용체 뿐 아니라 단백질 A 결합에 대해 개질된 IgG Fc-영역이 보고된다.
비용 효율적 생산 과정에 대한 요구는 하나 이상의 친화성 크로마토그래피 단계를 포함하는 다운스트림 정제의 최적화의 필요성을 이끌어내었다. 프로세싱될 보다 더 큰 부피 및 제자리 세정 (CIP) 프로토콜에 대한 보다 더 엄격한 요구는 해결될 필요가 있는 특징들의 일부이다 (Hober, S., J. Chrom. B. 848 (2007) 40-47).
선택적 Fc-영역 친화성 리간드에 의한 모노클로날 항체의 정제는 치료 모노클로날 항체의 대규모 생산을 위한 가장 기대되는 방법이다. 사실상, 이 절차는 온전한 상태로 남아 그의 성질을 보유할 수 있는 항체의 항원 특이적 부분, 즉 Fab 도메인과의 어떠한 상호작용의 확립을 요구하지 않는다 (문헌 (Salvalaglio, M., et al., J. Chrom. A 1216 (2009) 8678-8686) 참조).
친화성 정제 단계는 그의 선택성으로 인해 정제 사슬에서 초기에 사용됨으로써, 연속적 유닛 작업들의 수가 감소될 수 있다 (상기 문헌 (Hober); 문헌 (MacLennan, J., Biotechnol. 13 (1995) 1180); 및 문헌 (Harakas, N.K., Bioprocess Technol. 18 (1994) 259) 참조).
IgG 에 선택적으로 결합하도록 가장 많이 채택된 리간드는 Fc-영역의 CH2-도메인과 CH3-도메인 사이의 힌지 (hinge) 영역에 위치하는 "컨센서스 결합 부위" (CBS) (DeLano, W.L., et al., Science 287 (2000) 1279) 로서 공지된 영역에서 대다수의 IgG 들의 Fc-영역과의 고도로 선택적인 상호작용을 확립할 수 있는 스타필로코커스 단백질 A 및 단백질 G 이다.
스타필로코커스 단백질 A (SPA) 는 그람 양성 박테리아 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 의 표면 상에 노출된 세포벽 관련 단백질 도메인이다. SPA 는 다양한 종들로부터의 IgG, 예를 들어, 인간, 토끼 및 기니 피그 IgG 에 대한 높은 친화성을 갖되, 소 및 마우스 IgG 와의 단지 약한 상호작용을 갖는다 (하기 표 참조) (상기 문헌 (Hober); 문헌 (Duhamel, R.C., et al., J. Immunol. Methods 31 (1979) 211); 문헌 (Bjork, L. and Kronvall, G., Immunol. J. 133 (1984) 969); 문헌 (Richman, D.D., et al., J. Immunol. 128 (1982) 2300); 및 문헌 (Amersham Pharmacia Biotech, Handbook, Antibody Purification (2000)) 참조).
Figure pct00001
IgG 의 CH2-도메인과 CH3-도메인 사이의 중쇄 힌지 영역은 단백질 A 이외의 여러 단백질들, 예컨대, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 결합할 수 있다 (상기 문헌 (DeLano and Salvalaglio) 참조).
SPA CBS 는 항체의 표면 상의 소수성 포켓 (pocket) 을 포괄한다. IgG CBS 를 구성하는 잔기들은 Ile 253, Ser 254, Met 252, Met 423, Tyr 326, His 435, Asn 434, His 433, Arg 255 및 Glu 380 (Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따른 IgG 중쇄 잔기들의 번호지정) 이다. 하전된 아미노산 (Arg 255, Glu 380) 은 Ile 253 및 Ser 254 에 의해 형성된 소수성 놉 (knob) 주변에 배치되어 있다. 이것은 극성 및 친수성 상호작용의 확립을 초래한(할 수 있)다 (상기 문헌 (Salvalaglio) 참조).
일반적으로, 단백질 A-IgG 상호작용은 2 개의 주요 결합 부위들을 사용함으로써 기술될 수 있다: 제 1 부위는 중쇄 CH2-도메인에 위치하고 (단백질 A 의) Phe 132, Leu 136, Ile 150 과 Ile 253 및 Ser 254 에 의해 구성된 IgG 소수성 놉 사이의 소수성 상호작용, 및 Lys 154 (단백질 A) 와 Thr 256 (IgG) 사이의 한 정전기 상호작용을 특징으로 한다. 제 2 부위는 중쇄 CH3-도메인에 위치하고 Gln 129 및 Tyr 133 (단백질 A) 과 His 433, Asn 434 및 His 435 (IgG) 사이의 정전기 상호작용을 특징으로 한다 (상기 문헌 (Salvalaglio) 참조).
문헌 (Lindhofer, H., et al., J. Immunol. 155 (1995) 219-225) 은 래트/마우스 쿠아드로마스 (quadromas) 에서 우세한 종-제한된 중쇄/경쇄 페어링을 보고한다.
문헌 (Jedenberg, L., et al., J. Immunol. Meth. 201 (1997) 25-34) 은 2 개의 Fc 변이체들 (각각의 다른 동종형 (isotype) 으로부터의 동종형성 다이펩티드 치환을 각각 함유하는 Fc13 및 Fc31) 의 SPA 결합 분석이, Fc1 및 Fc31 이 SPA 와 상호작용하는 반면, Fc3 및 Fc13 이 검출가능한 SPA 결합을 결여한다는 것을 보여주었다고 보고하였다. Fc-영역 변이체 Fc31 의 만들어진 SPA 결합은 도입된 다이펩티드 치환 R435H 및 F436Y 로부터 비롯된 것으로 결론지어진다.
오늘날, 치료 모노클로날 항체에 대한 초점은 2 개 이상의 표적들 (항원들) 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 심지어 다중특이적 항체의 발생 및 사용이다.
한 발현 세포주에서 4 개의 항체 쇄들 (2 개의 상이한 중쇄들 및 2 개의 상이한 경쇄들) 로부터 다중특이적 이종이량체성 IgG 항체를 생성하는 데 있어서 기본 도전과제는 소위 쇄 관련 문제이다 (문헌 (Klein, C., et al., mAbs 4 (2012) 653-663) 참조). 다중특이적 항체의 좌측 및 우측 아암 (arm) 으로서 상이한 쇄들의 요구된 사용은 한 세포에서의 발현 시 항체 혼합물을 유발한다: 2 개의 중쇄들은 (이론적으로) 4 개의 상이한 조합들 (이들 중 2 개는 동일함) 로 회합할 수 있고, 이들 각각은 경쇄와 확률론적 (stochastic) 방식으로 회합하여 24 개 (= 총 16 개) 의 이론적으로 가능한 쇄 조합들을 야기할 수 있다. 16 개의 이론적으로 가능한 조합들 중 10 개의 조합들이 발견될 수 있고, 이들 중 1 개만이 원하는 기능성 이중특이적 항체에 상응한다 (De Lau, W.B., et al., J. Immunol. 146 (1991) 906-914). 복합 혼합물로부터 이 원하는 이중특이적 항체를 단리하는 데 있어서의 어려움 및 이론상 최대 12.5% 의 본질적인 낮은 수율은 한 발현 세포주에서의 이중특이적 항체의 생산을 극도로 어렵게 만든다.
쇄 관련 문제를 극복하고 2 개의 상이한 중쇄들의 정확한 회합을 강제하기 위해, 1990 년대 후반 제넨테크 (Genentech) 의 카터와 그의 동료들 (Carter et al.) 은 "놉-인투-홀 (knobs-into-holes)" (KiH) 로서 지칭된 방법을 발명하였다 (문헌 (Carter, P., J. Immunol. Meth. 248 (2001) 7-15); 문헌 (Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681); 문헌 (Zhu, Z., et al., Prot. Sci. 6 (1997) 781-788); 문헌 (Ridgway, J.B., et al., Prot. Eng. 9 (1996) 617-621); 문헌 (Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270(1997) 26-35); 및 미국 특허 제7,183,076호 참조). 기본적으로, 상기 개념은 대다수의 상호작용들이 일어나는, 항체의 2 개 중쇄들의 2 개 CH3-도메인들 사이의 계면의 변형에 의존한다. 벌키 (bulky) 잔기가 한 항체 중쇄의 CH3-도메인 내로 도입되고 열쇠 ("놉") 와 유사하게 작용한다. 다른 중쇄에서, 자물쇠와 유사하게 이 벌키 잔기를 수용할 수 있는 "홀" 이 형성된다. 생성된 이종이량체성 Fc-영역은 인공 디술피드 가교의 도입/형성에 의해 더 안정화될 수 있다. 특히, 모든 KiH 돌연변이들이 CH3-도메인 내에 묻히고 면역 시스템에 "보일 수" 없다. 추가로, KiH 돌연변이를 갖는 항체의 성질, 예컨대, (열) 안정성, FcγR 결합 및 효과기 기능 (예를 들어, ADCC, FcRn 결합) 및 약동학적 (PK) 거동은 영향을 받지 않는다.
97% 초과의 이종이량체화 수율을 갖는 정확한 중쇄 회합은 6 개의 돌연변이들을 도입함으로써 달성될 수 있다: "놉" 중쇄에서의 S354C, T366W, 및 "홀" 중쇄에서의 Y349C, T366S, L368A, Y407V (상기 문헌 (Carter) 참조; Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따른 잔기의 번호지정). 홀-홀 단독이량체가 발생될 수 있는 반면, 놉-놉 단독이량체는 전형적으로 관찰되지 않는다. 홀-홀 이량체는 선택적 정제 절차 또는 하기 요약된 절차에 의해 고갈될 수 있다.
무작위 중쇄 회합의 문제가 다루어지고 있지만, 정확한 경쇄 회합도 보장되어야 한다. KiH CH3-도메인 방법과 유사하게, 궁극적으로 전체 이중특이적 IgG 를 이끌어낼 비대칭 경쇄-중쇄 상호작용을 조사하기 위한 노력이 시도되었다.
로슈 (Roche) 는 최근에 KiH 기술로 조합할 때 이중특이적 이종이량체성 IgG 항체에서 정확한 경쇄 페어링을 강제하기 위한 가능한 방법으로서 크로스맙 (CrossMab) 방법을 개발하였다 (상기 문헌 (Klein); 문헌 (Schaefer. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 11187-11192); 및 문헌 (Cain, C., SciBX 4 (2011) 1-4) 참조). 이것은 이중특이적 또는 심지어 다중특이적 항체를 일반적인 방식으로 생성할 수 있게 한다. 이 포맷에서, 의도된 이중특이적 항체의 한 아암은 본래의 상태로 남아있다. 제 2 아암에서, 전체 Fab 영역, 또는 VH-VL 도메인 또는 CH1-CL 도메인은 중쇄와 경쇄 사이의 도메인 교차 (crossover) 에 의해 교환된다. 결과로서, 새로 형성된 "교차된" 경쇄는 이중특이적 항체의 다른 아암의 (정상, 즉 교차되지 않은) 중쇄 Fab 영역과 더 이상 회합되지 않는다. 따라서, 정확한 "경쇄" 회합은 도메인 정렬에서 이 최소한의 변화에 의해 강제될 수 있다 (상기 문헌 (Schaefer) 참조).
주와 그의 동료들 (Zhu et al.) 은 다이아바디 (diabody) 변이체의 2 개 VL/VH 계면들에서 디술피드 가교뿐만 아니라 여러 입체적으로 상보적인 돌연변이들을 도입하였다. 돌연변이 VL Y87A/F98M 및 VH V37F/L45W 가 항-p185HER2 VL/VH 계면 내로 도입될 때, 모 다이아바디에 비해 전체 수율 및 친화성을 유지하면서 90% 초과의 수율로 이종이량체성 다이아바디가 회수되었다 (상기 문헌 (Zhu) 참조).
추가이 (Chugai) 의 연구자들은 올바른 경쇄 회합을 촉진하기 위해 돌연변이를 VH-VL 계면 (주로 VH 에서 Q39 및 VL 에서 Q38 이 하전된 잔기로 전환됨) 내로 도입함으로써 이중특이적 다이아바디를 유사하게 디자인하였다 (국제 특허출원 공개 제WO 2006/106905호; 및 문헌 (Igawa, T., et al., Prot. Eng. Des. Sel. 23 (2010) 667-677)).
국제 특허출원 공개 제WO 2011/097603호에는 공통된 경쇄 마우스가 보고되어 있다.
국제 특허출원 공개 제WO 2010/151792호에는 단리의 용이성을 제공하는 이중특이적 항체 포맷으로서, CH3-도메인에서 상이하게 변형된, 즉 이종이량체성을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 항체 포맷이 제공되어 있는데, 이때 상기 상이한 변형은 CH3 변형에 대한 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성 변형이고, 상기 변형들 중 하나 이상은 친화성 시약, 예컨대, 단백질 A 에 대한 이중특이적 항체에 대한 상이한 친화성을 야기하고, 이중특이적 항체는 단백질 A 에 대한 그의 친화성에 근거하여 파괴된 세포, 배지, 또는 항체들의 혼합물로부터 단리될 수 있다.
신생아 Fc-수용체 (FcRn) 는 생체내 IgG 계열의 항체들의 대사적 운명을 위해 중요하다. FcRn 은 라이소좀 분해 경로로부터 IgG 를 구제하여 제거를 감소시키고 반감기를 증가시키는 기능을 한다. 이것은 2 개의 폴리펩티드들, 즉 50 kDa 계열 I 주조직적합성 복합체-유사 단백질 (α-FcRn) 및 15 kDa β2-마이크로글로불린 (β2m) 으로 이루어지는 이종이량체성 단백질이다. FcRn 은 계열 IgG 의 항체의 Fc-영역의 CH2-CH3 부분에 높은 친화성으로 결합한다. 계열 IgG 의 항체와 FcRn 사이의 상호작용은 pH 의존적이고 1:2 화학양론적으로 일어난다 (즉, 1 개의 IgG 항체 분자가 그의 2 개의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티들을 통해 2 개의 FcRn 분자들과 상호작용할 수 있다) (예를 들어, 문헌 (Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083) 참조).
따라서, IgG 시험관내 FcRn 결합 성질/특성은 혈액 순환계에서의 그의 생체내 약동학적 성질을 표시한다.
중쇄 CH2-도메인 및 CH3-도메인의 상이한 아미노산 잔기들이 FcRn 과 IgG 계열의 항체의 Fc-영역 사이의 상호작용에 참여한다.
FcRn 결합에 영향을 미치는 상이한 돌연변이들 및 이와 더불어 혈액 순환계에서의 반감기는 공지되어 있다. 마우스 Fc-영역-마우스 FcRn 상호작용에 매우 중요한 Fc-영역 잔기들은 부위-지정된 돌연변이생성에 의해 확인되었다 (예를 들어, 문헌 (Dall'Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180) 참조). 잔기 I253, H310, H433, N434 및 H435 (Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따른 번호지정) 는 상호작용에 관여한다 (Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533-2536; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542-548). 잔기 I253, H310 및 H435 는 인간 Fc-영역과 뮤린 (murine) FcRn 의 상호작용에 매우 중요한 것으로 발견되었다 (Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2885).
FcRn 에 결합하는 Fc-영역 (및 마찬가지로 IgG) 을 증가시키는 방법은 Fc-영역에서 다양한 아미노산 잔기들을 돌연변이시킴으로써 수행되어 왔다: Thr 250, Met 252, Ser 254, Thr 256, Thr 307, Glu 380, Met 428, His 433 및 Asn 434 (문헌 (Kuo, T.T., et al., J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777-789); 및 문헌 (Ropeenian, D.C., et al., Nat. Rev. Immunol. 7 (2007) 715-725) 참조).
단백질-단백질 상호작용 연구로 FcRn 결합을 개선하기 위한 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E 의 조합은 문헌 (Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524) 의 저자들 (Dall'Acqua et al.) 에 의해 기재되어 있다. 인간 Fc-영역-인간 FcRn 복합체의 연구는 잔기 I253, S254, H435 및 Y436 이 상호작용에 매우 중요하다는 것을 보여주었다 (Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). 문헌 (Yeung, Y.A., et al., J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) 에는 잔기 248 내지 259 및 301 내지 317 및 376 내지 382 및 424 내지 437 의 다양한 변이체들이 보고되었고 조사되었다.
US 2012/0009182 호에서, 단백질 A 에 대한 변형된 결합을 갖는 면역글로불린 변이체가 보고된다. 돌연변이생성에 의한 항체의 FcRn 결합 친화성 또는 혈청 반감기의 변화는 WO 2004/035752 호에 보고된다.
본원에는 스타필로코커스 (Staphylococcus) 단백질 A 에 특이적으로 결합하고 인간 FcRn 에 결합하거나 결합하지 않는 변이체 Fc-영역이 보고된다. 상기 변이체 Fc-영역은 CH2-도메인 내에 특이적 아미노산 돌연변이를 함유하는 반면, CH3-도메인은 단백질 A 결합에 대해 변화하지 않는다. 상기 돌연변이는 이종이량체성 Fc-영역의 홀-사슬에서 사용되는 경우 이종이량체성 Fc-영역의 정제, 즉, 단독이량체성 Fc-영역 부산물로부터 (홀-사슬-홀-사슬 이량체) 이종이량체성 Fc-영역의 분리를 허용하는 것으로 밝혀졌다.
본원에 보고되는 하나의 양상은,
하나 이상의 시스테인 잔기, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는, 적어도 면역글로불린 힌지 영역의 일부를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제 1 폴리펩티드, 및 하나 이상의 시스테인 잔기, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는, 적어도 면역글로불린 힌지 영역의 일부를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제 2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체성 폴리펩티드로서:
제 1 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 를 포함하고 (홀-사슬), 제 2 폴리펩티드는 돌연변이 S354C 및 T366W 을 포함하고 (놉-사슬),
제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함하고:
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D,
제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 하나, 2 개 또는 그 이상의 디술피드 가교에 의해 연결되고,
제 1 폴리펩티드의 CH3-도메인 및 제 2 폴리펩티드의 CH3-도메인은 둘다 단백질 A 에 결합하거나 또는 둘다 결합하지 않는, 이종이량체성 폴리펩티드 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정) 이다.
하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함한다:
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D, 및
iii) T250Q, 및/또는
iv) T256E 또는 T256A.
하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함한다:
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D, 및
iii) 임의로 a) T250Q, 및/또는 T256E 또는 T256A, 및.
iv) a) L251A 또는 L251G 또는 L251D, 및/또는 b) H310A 또는 H310G.
하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함한다:
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D, 및
iii) a) T250Q, 및/또는 T256E 또는 T256A, 및.
iv) a) L251A 또는 L251G 또는 L251D, 및/또는 b) H310A 또는 H310G.
v) 임의로 a) T307A 또는 T307H 또는 T307Q 또는 T307P, 및/또는 b) Q311H, 및/또는 c) M252Y, 및/또는 d) S254T.
하나의 구현예에서, 제 2 폴리펩티드 (놉-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함한다:
i) T250Q, 및/또는
ii) M252Y, 및/또는
iii) S254T, 및/또는
iv) T256E 또는 T256A, 및/또는
v) T307A 또는 T307H 또는 T307Q 또는 T307P, 및/또는
vi) Q311H.
하나의 구현예에서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인은 인간 IgG1 하위계열의 것이다. 하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 각각 돌연변이 L234A 및 L235A 를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 각각 돌연변이 P329G 를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 각각 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인은 인간 IgG4 하위계열의 것이다. 하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 각각 돌연변이 S228P 및 L235E 를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 각각 돌연변이 P329G 를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 각각 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G 를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩티드는 Fc-영역 융합 폴리펩티드이다.
하나의 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩티드는 전체 길이 항체이다.
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 홀-돌연변이 외에 돌연변이 I253A 및 L314A 를 갖는 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 및 놉-돌연변이를 갖는 제 2 폴리펩티드 (놉-사슬) (Kabat 에 따른 번호지정) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 홀-돌연변이 외에 돌연변이 L251A 및 L314A 를 갖는 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 및 놉-돌연변이를 갖는 제 2 폴리펩티드 (놉-사슬) (Kabat 에 따른 번호지정) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 홀-돌연변이 외에 돌연변이 L251A 를 갖는 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 및 놉-돌연변이를 갖는 제 2 폴리펩티드 (놉-사슬) (Kabat 에 따른 번호지정) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 홀-돌연변이 외에 돌연변이 I253A 를 갖는 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 및 놉-돌연변이를 갖는 제 2 폴리펩티드 (놉-사슬) (Kabat 에 따른 번호지정) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 홀-돌연변이 외에 돌연변이 L314 A 를 갖는 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 및 놉-돌연변이를 갖는 제 2 폴리펩티드 (놉-사슬) (Kabat 에 따른 번호지정) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 홀-돌연변이 외에 돌연변이 H310A 를 갖는 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 및 놉-돌연변이를 갖는 제 2 폴리펩티드 (놉-사슬) (Kabat 에 따른 번호지정) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 홀-돌연변이 외에 돌연변이 L251A, I253A 및 L314A 를 갖는 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 및 놉-돌연변이를 갖는 제 2 폴리펩티드 (놉-사슬) (Kabat 에 따른 번호지정) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 홀-돌연변이 외에 돌연변이 L251A, I253A 및 L314A 를 갖는 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 및 놉-돌연변이 외에 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E 를 갖는 제 2 폴리펩티드 (놉-사슬) (Kabat 에 따른 번호지정) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 홀-돌연변이 외에 돌연변이 I253A, L314A, M428L 및 N434H 를 갖는 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 및 놉-돌연변이 외에 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E 를 갖는 제 2 폴리펩티드 (놉-사슬) (Kabat 에 따른 번호지정) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 부가적으로 중쇄 가변 도메인 내에 S17A, R19A, T57A, T57K, R66A, S70A, Y79A, Q81A, N82aA 및 S82bA 를 포함하는 군으로부터 선택되는 돌연변이 중 하나 이상 (Kabat 에 따른 번호지정) 을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 중쇄 가변 도메인 내에 S17A, R19A, T57A, T57K, R66A, Q81A 및 N82aA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 돌연변이 중 하나 이상을 포함하고 상기 돌연변이를 갖지 않으나 다르게는 일치하는 아미노산 서열을 갖는 항체와 비교하여 단백질 A 에 대한 결합이 감소한다 (Kabat 에 따른 번호지정). 하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 중쇄 가변 도메인 내에 S70A, Y79A 및 S82bA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 돌연변이 중 하나 이상을 포함하고 상기 돌연변이를 갖지 않으나 다르게는 일치하는 아미노산 서열을 갖는 항체와 비교하여 단백질 A 에 대한 결합이 증가한다 (Kabat 에 따른 번호지정).
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 단일특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 단일특이적 항체는 1원자가 단일특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 단일특이적 항체는 2원자가 단일특이적 항체이다.
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 이중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 2원자가 이중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 4원자가 이중특이적 항체이다.
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 삼중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 삼중특이적 항체는 3원자가 삼중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 삼중특이적 항체는 4원자가 삼중특이적 항체이다.
하나의 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩티드는 하기:
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 1 중쇄 가변 도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH1-도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 힌지 영역, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH2-도메인 및 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는 제 1 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 중쇄 가변 도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH1-도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 힌지 영역, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH2-도메인 및 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는 제 2 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 1 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 3 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 4 폴리펩티드
를 포함하는 이중특이적 전체 길이 항체이며,
제 1 중쇄 가변 도메인 및 제 1 경쇄 가변 도메인은 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 부위를 형성하고,
제 2 중쇄 가변 도메인 및 제 2 경쇄 가변 도메인은 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 부위를 형성하고,
제 1 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V, L234A, L235A 및 P329G 를 포함하고, 제 2 폴리펩티드는 돌연변이 S354C, 및 T366W, L234A, L235A 및 P329G 를 포함하고,
제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함하고:
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D,
제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 하나 이상의 디술피드 가교에 의해 연결되고,
제 1 폴리펩티드의 CH3-도메인 및 제 2 폴리펩티드의 CH3-도메인은 둘다 단백질 A 에 결합하거나 또는 둘다 결합하지 않는 이중특이적 전체 길이 항체이다
(Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).
하나의 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩티드는 하기:
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 1 중쇄 가변 도메인, 면역글로불린 경쇄 불변 도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 힌지 영역, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH2-도메인 및 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는 제 1 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 중쇄 가변 도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH1-도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 힌지 영역, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH2-도메인 및 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는 제 2 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 하위계열 IgG1 의 제 1 경쇄 가변 도메인 및 면역글로불린 CH1-도메인을 포함하는 제 3 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 4 폴리펩티드
를 포함하는 이중특이적 전체 길이 항체로서,
제 1 중쇄 가변 도메인 및 제 1 경쇄 가변 도메인은 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 부위를 형성하고,
제 2 중쇄 가변 도메인 및 제 2 경쇄 가변 도메인은 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 부위를 형성하고,
제 1 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V, L234A, L235A 및 P329G 를 포함하고, 제 2 폴리펩티드는 돌연변이 S354C, 및 T366W, L234A, L235A 및 P329G 를 포함하고,
제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 은 하기 돌연변이를 포함하고:
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D,
제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 하나 이상의 디술피드 가교에 의해 연결되고,
제 1 폴리펩티드의 CH3-도메인 및 제 2 폴리펩티드의 CH3-도메인은 둘다 단백질 A 에 결합하거나 또는 둘다 결합하지 않는 이중특이적 전체 길이 항체이다
(Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).
하나의 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩티드는 하기:
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 1 중쇄 가변 도메인, 하위계열 IgG4 의 면역글로불린 CH1-도메인, 하위계열 IgG4 의 면역글로불린 힌지 영역, 하위계열 IgG4 의 면역글로불린 CH2-도메인 및 하위계열 IgG4 의 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는 제 1 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 중쇄 가변 도메인, 하위계열 IgG4 의 면역글로불린 CH1-도메인, 하위계열 IgG4 의 면역글로불린 힌지 영역, 하위계열 IgG4 의 면역글로불린 CH2-도메인 및 하위계열 IgG4 의 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는 제 2 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 1 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 3 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 4 폴리펩티드
를 포함하는 이중특이적 전체 길이 항체로서,
제 1 중쇄 가변 도메인 및 제 1 경쇄 가변 도메인은 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 부위를 형성하고,
제 2 중쇄 가변 도메인 및 제 2 경쇄 가변 도메인은 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 부위를 형성하고,
제 1 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V, S228P, L235E 및 P329G 를 포함하고, 제 2 폴리펩티드는 돌연변이 S354C, 및 T366W, S228P, L235E 및 P329G 를 포함하고,
제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함하고:
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D,
제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 하나 이상의 디술피드 가교에 의해 연결되고,
제 1 폴리펩티드의 CH3-도메인 및 제 2 폴리펩티드의 CH3-도메인은 둘다 단백질 A 에 결합하거나 또는 둘다 결합하지 않는 이중특이적 전체 길이 항체이다
(Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).
하나의 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩티드는 하기:
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 1 중쇄 가변 도메인, 면역글로불린 경쇄 불변 도메인, 하위계열 IgG4 의 면역글로불린 힌지 영역, 하위계열 IgG4 의 면역글로불린 CH2-도메인 및 하위계열 IgG4 의 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는 제 1 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 중쇄 가변 도메인, 하위계열 IgG4 의 면역글로불린 CH1-도메인, 하위계열 IgG4 의 면역글로불린 힌지 영역, 하위계열 IgG4 의 면역글로불린 CH2-도메인 및 하위계열 IgG4 의 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는 제 2 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 하위계열 IgG4 의 제 1 경쇄 가변 도메인 및 면역글로불린 CH1-도메인을 포함하는 제 3 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 4 폴리펩티드
를 포함하는 이중특이적 전체 길이 항체로서,
제 1 중쇄 가변 도메인 및 제 1 경쇄 가변 도메인은 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 부위를 형성하고,
제 2 중쇄 가변 도메인 및 제 2 경쇄 가변 도메인은 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 부위를 형성하고,
제 1 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V, S228P, L235E 및 P329G 를 포함하고, 제 2 폴리펩티드는 돌연변이 S354C, 및 T366W, S228P, L235E 및 P329G 를 포함하고,
제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함하고:
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D,
제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 하나 이상의 디술피드 가교에 의해 연결되고,
제 1 폴리펩티드의 CH3-도메인 및 제 2 폴리펩티드의 CH3-도메인은 둘다 단백질 A 에 결합하거나 또는 둘다 결합하지 않는 이중특이적 전체 길이 항체이다
(Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).
하나의 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩티드는 하기:
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 1 중쇄 가변 도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH1-도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 힌지 영역, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH2-도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH3-도메인, 펩티드성 링커 및 제 1 scFv 를 포함하는 제 1 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 중쇄 가변 도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH1-도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 힌지 영역, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH2-도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH3-도메인, 펩티드성 링커 및 제 2 scFv 를 포함하는 제 2 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 1 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 3 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 4 폴리펩티드
를 포함하는 이중특이적 전체 길이 항체로서,
제 1 중쇄 가변 도메인 및 제 1 경쇄 가변 도메인은 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 부위를 형성하고, 제 2 중쇄 가변 도메인 및 제 2 경쇄 가변 도메인은 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 부위를 형성하고, 제 1 및 제 2 scFv 는 제 2 항원에 특이적으로 결합하고,
제 1 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V, L234A, L235A 및 P329G 를 포함하고, 제 2 폴리펩티드는 돌연변이 S354C, 및 T366W, L234A, L235A 및 P329G 를 포함하고,
제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함하고:
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D,
제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 하나 이상의 디술피드 가교에 의해 연결되고,
제 1 폴리펩티드의 CH3-도메인 및 제 2 폴리펩티드의 CH3-도메인은 둘다 단백질 A 에 결합하거나 또는 둘다 결합하지 않는 이중특이적 전체 길이 항체이다
(Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).
하나의 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩티드는 하기:
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 1 중쇄 가변 도메인, 면역글로불린 경쇄 불변 도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 힌지 영역, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH2-도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH3-도메인, 펩티드성 링커 및 제 1 scFv 를 포함하는 제 1 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 중쇄 가변 도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH1-도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 힌지 영역, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH2-도메인, 하위계열 IgG1 의 면역글로불린 CH3-도메인, 펩티드성 링커 및 제 2 scFv 를 포함하는 제 2 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 하위계열 IgG1 의 제 1 경쇄 가변 도메인 및 면역글로불린 CH1-도메인을 포함하는 제 3 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 4 폴리펩티드
를 포함하는 이중특이적 전체 길이 항체로서,
제 1 중쇄 가변 도메인 및 제 1 경쇄 가변 도메인은 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 부위를 형성하고, 제 2 중쇄 가변 도메인 및 제 2 경쇄 가변 도메인은 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 부위를 형성하고, 제 1 및 제 2 scFv 는 제 2 항원에 특이적으로 결합하고,
제 1 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V, L234A, L235A 및 P329G 를 포함하고, 제 2 폴리펩티드는 돌연변이 S354C, 및 T366W, L234A, L235A 및 P329G 를 포함하고,
제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 하나 이상의 디술피드 가교에 의해 연결되는, 이중특이적 전체 길이 항체이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드의 제조 방법이다:
a) 이종이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 포유류 세포를 배양하는 단계,
b) 이종이량체성 폴리펩티드를 배양 배지로부터 회수하는 단계, 및
c) 이종이량체성 폴리펩티드를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제함으로써 이량체성 폴리펩티드를 제조하는 단계.
본원에 보고된 하나의 양상은 단독이량체성 폴리펩티드로부터 이종이량체성 폴리펩티드를 분리하기 위한, 하기 돌연변이:
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D,
의 조합의 용도이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함에 의한 안구 혈관 질환을 앓고 있는 환자의 치료 방법이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 유리체내 적용을 위한 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 의약으로서 사용하기 위한 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 안구 혈관 질환의 치료를 위한 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드 및 임의로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형이다.
눈 뿐 아니라 나머지 신체에도 존재하는 항원을 표적하는/항원에 결합하는 항체를 사용하기 위해, 눈으로부터 혈액 내로 혈액-안구-장벽의 통과 후 짧은 전신적 반감기가 전신적 부작용을 피하기 위해 유리하다.
부가적으로 수용체의 리간드에 특이적으로 결합하는 항체는 항체-항원 복합체가 눈으로부터 제거되는 경우, 즉, 항체가 눈 외부로 수용체 리간드에 대한 수송 비히클로서 작용함으로써 수용체 신호전달을 억제하는 경우에만, 눈-질환의 치료에 효과적이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 눈으로부터 혈액-안구-장벽을 넘어 혈액 순환 내로 가용성 수용체 리간드의 수송을 위한 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드의 용도이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 눈으로부터 하나 이상의 가용성 수용체 리간드의 제거를 위한 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드의 용도이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 안 질환, 특히 안구 혈관 질환의 치료를 위한 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드의 용도이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 유리체내 공간으로부터 혈액 순환으로의 하나 이상의 가용성 수용체 리간드의 수송을 위한 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드의 용도이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 안 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 눈으로부터 혈액-안구-장벽을 넘어 혈액 순환 내로 가용성 수용체 리간드의 수송에 사용하기 위한 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 눈으로부터 하나 이상의 가용성 수용체 리간드의 제거에 사용하기 위한 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 안 질환, 특히 안구 혈관 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 유리체내 공간으로부터 혈액 순환까지 하나 이상의 가용성 수용체 리간드의 수송에 사용하기 위한 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 개체에게 유효량의 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 안구 혈관 질환을 갖는 개체의 치료 방법이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 눈으로부터 혈액-안구-장벽을 넘어 혈액 순환 내로 가용성 수용체 리간드를 수송하기 위해 유효량의 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체에서의 눈으로부터 혈액-안구-장벽을 넘어 혈액 순환 내로 가용성 수용체 리간드를 수송하기 위한 방법이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 눈으로부터 하나 이상의 가용성 수용체 리간드를 제거하기 위해 유효량의 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체에서의 눈으로부터 하나 이상의 가용성 수용체 리간드의 제거 방법이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 유리체내 공간으로부터 혈액 순환까지 하나 이상의 가용성 수용체 리간드의 수송을 위해 유효량의 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 개체에서의 유리체내 공간으로부터 혈액 순환까지 하나 이상의 가용성 수용체 리간드의 수송 방법이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 눈으로부터 혈액-안구-장벽을 넘어 혈액 순환 내로 가용성 수용체 리간드를 수송하기 위해 유효량의 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체에서의 유리체내 공간 또는 눈으로부터 혈액-안구-장벽을 넘어 혈액 순환 내로 가용성 수용체 리간드를 수송하기 위한 방법이다.
하나의 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩티드는 이중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 2원자가 이중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 4원자가 이중특이적 항체이다.
하나의 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩티드는 삼중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 삼중특이적 항체는 3원자가 삼중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 삼중특이적 항체는 4원자가 삼중특이적 항체이다.
하나의 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩티드는 크로스맙 (CrossMab) 이다.
하나의 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩티드는 Fc-영역 융합 폴리펩티드이다.
하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 를 추가로 포함하고, 제 2 폴리펩티드는 돌연변이 S354C 및 T366W 를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 하위계열 IgG1 의 것이다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 돌연변이 L234A 및 L235A 를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 돌연변이 P329G 를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 하위계열 IgG4 의 것이다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 돌연변이 S228P 및 L235E 를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 돌연변이 P329G 를 추가로 포함한다.
본 발명의 구현예의 상세한 설명
I. 정의
용어 "약" 은 그 후에 이어지는 수치 값의 +/- 20 % 의 범위를 나타낸다. 하나의 구현예에서 용어 "약" 은 그 후에 이어지는 수치 값의 +/- 10 % 의 범위를 나타낸다. 하나의 구현예에서 용어 "약" 은 그 후에 이어지는 수치 값의 +/- 5 % 의 범위를 나타낸다.
본원의 목적을 위해 "수용체 인간 프레임워크" 는 하기 정의되는 바와 같이, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래되는 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크 "로부터 유래되는" 수용체 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 이것은 아미노산 서열 변경을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 변경의 수는 10 개 이하, 9 개 이하, 8 개 이하, 7 개 이하, 6 개 이하, 5 개 이하, 4 개 이하, 3 개 이하, 또는 2 개 이하이다. 일부 구현예에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열이 일치한다.
"친화성 성숙된" 항체는 변경을 가지지 않는 모체 항체와 비교하여, 하나 이상의 과가변 영역 (HVR) 내에 하나 이상의 변경을 가진 항체를 말하며, 이러한 변경은 항원에 대한 항체의 친화성에 개선을 산출한다.
용어 "변경" 은 개질된 항체 또는 융합 폴리펩티드를 수득하기 위한, 모체 항체 또는 융합 폴리펩티드, 예를 들어, Fc-영역의 FcRn 결합 부분을 적어도 포함하는 융합 폴리펩티드 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이 (치환), 삽입 (부가), 또는 결실을 나타낸다. 용어 "돌연변이" 는 특정화된 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 잔기에 대해 치환되는 것을 나타낸다. 예를 들어 돌연변이 L234A 는 항체 Fc-영역 (폴리펩티드) 내의 위치 234 에서의 아미노산 잔기 라이신이 아미노산 잔기 알라닌 (라이신의 알라닌으로의 치환) (EU 인덱스 번호지정 시스템에 따른 번호지정) 에 의해 치환되는 것을 나타낸다.
"자연 발생적 아미노산 잔기" 는, 알라닌 (3 글자 코드: Ala, 1 글자 코드: A), 아르기닌 (Arg, R), 아스파라긴 (Asn, N), 아스파르트산 (Asp, D), 시스테인 (Cys, C), 글루타민 (Gln, Q), 글루탐산 (Glu, E), 글리신 (Gly, G), 히스티딘 (His, H), 이소류신 (Ile, I), 류신 (Leu, L), 라이신 (Lys, K), 메티오닌 (Met, M), 페닐알라닌 (Phe, F), 프롤린 (Pro, P), 세린 (Ser, S), 트레오닌 (Thr, T), 트립토판 (Trp, W), 티로신 (Tyr, Y), 및 발린 (Val, V) 으로 이루어지는 군으로부터의 아미노산 잔기를 나타낸다.
용어 "아미노산 돌연변이" 는 하나 이상의 기존 아미노산 잔기의 또다른 상이한 아미노산 잔기 (= 대체 아미노산 잔기) 로의 치환을 나타낸다. 대체 아미노산 잔기는 "자연 발생적 아미노산 잔기" 일 수 있고, 알라닌 (3 글자 코드: Ala, 1 글자 코드: A), 아르기닌 (Arg, R), 아스파라긴 (Asn, N), 아스파르트산 (Asp, D), 시스테인 (Cys, C), 글루타민 (Gln, Q), 글루탐산 (Glu, E), 글리신 (glee, G), 히스티딘 (his, H), 이소류신 (ile, I), 류신 (Leu, L), 라이신 (lees, K), 메티오닌 (met, M), 페닐알라닌 (phe, F), 프롤린 (pro, P), 세린 (ser, S), 트레오닌 (Thr, T), 트립토판 (Trp, W), 티로신 (tyr, Y), 및 발린 (Val, V) 으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 대체 아미노산 잔기는 "비-자연 발생적 아미노산 잔기" 일 수 있다. 예를 들어, US 6,586,207, WO 98/48032, WO 03/073238, US 2004/0214988, WO 2005/35727, WO 2005/74524, Chin, J.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9026-9027; Chin, J.W. and Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024; 및, Wang, L. and Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10 (모두 본원에 참조로서 전체적으로 인용됨) 을 참조한다.
용어 "아미노산 결실" 은 아미노산 서열 내의 미리 결정된 위치에의 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 나타낸다.
용어 "항체" 는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 이들이 요망되는 항원- 및/또는 단백질 A 및/또는 FcRn-결합 활성을 나타내도록, 모노클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체), 및 항체 절편을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
용어 "비대칭 Fc-영역" 은 Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따라 상응하는 위치에서 상이한 아미노산 잔기를 갖는 Fc-영역 폴리펩티드의 쌍을 나타낸다.
용어 "FcRn 결합과 관련된 비대칭 Fc-영역" 은 상응하는 위치에 상이한 아미노산 잔기를 갖는 2 개의 폴리펩티드 사슬로 이루어지는 Fc-영역을 나타내고, 이에 의해 위치는 Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따라 결정되고, 이에 의해 상이한 위치가 Fc-영역의 인간 신생아 Fc-수용체 (FcRn) 에 대한 결합에 영향을 준다. 본원에서의 목적을 위해, "FcRn 결합과 관련된 비대칭 Fc-영역" 내의 Fc-영역의 2 개의 폴리펩티드 사슬 사이의 차이는 예를 들어, 이중특이적 항체의 제조를 위해, 이종이량체성 Fc-영역의 형성을 용이하기 위해 도입된 차이를 포함하지는 않는다. 상기 차이는 또한 비대칭일 수 있다, 즉, 2 개의 사슬은 Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따라 비-상응하는 아미노산 잔기에서 차이를 갖는다. 상기 차이는 이종이량체화를 용이하게 하고 단독이량체화를 감소시킨다. 이러한 차이의 예는 소위 "놉 인투 홀 (knobs into holes)" 치환이다 (예를 들어, US 7,695,936 및 US 2003/0078385 참조). 하위계열 IgG1 의 IgG 항체의 Fc-영역의 개별적인 폴리펩티드 사슬 내의 하기 놉 및 홀 치환이 이종이량체 형성을 증가시키는 것으로 발견되었고: 1) 하나의 사슬 내에 Y407T 및 다른 사슬 내에 T366Y; 2) 하나의 사슬 내에 Y407A 및 다른 사슬 내에 T366W; 3) 하나의 사슬 내에 F405A 및 다른 사슬 내에 T394W; 4) 하나의 사슬 내에 F405W 및 다른 사슬 내에 T394S; 5) 하나의 사슬 내에 Y407T 및 다른 사슬 내에 T366Y; 6) 하나의 사슬 내에 T366Y 및 F405A 및 다른 사슬 내에 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 사슬 내에 T366W 및 F405W 및 다른 사슬 내에 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 사슬 내에 F405W 및 Y407A 및 다른 사슬 내에 T366W 및 T394S; 및 9) 하나의 사슬 내에 T366W 및 다른 사슬 내에 T366S, L368A, 및 Y407V, 이때 마지막에 나열된 것이 특히 적합하다. 또한, 2 개의 Fc-영역 폴리펩티드 사슬 사이에 새로운 디술피드 가교를 형성하는 변화는 이종이량체 형성을 용이하게 한다 (예를 들어, US 2003/0078385 참조). 하위계열 IgG1 의 IgG 항체의 Fc-영역의 개별적인 폴리펩티드 사슬 내에 신규한 사슬-내 디술피드 결합의 형성을 위한 적합하게 간격을 두고 있는 시스테인 잔기를 산출하는 하기 치환이 이종이량체 형성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다: 하나의 사슬 내에 Y349C 및 다른 사슬 내에 S354C; 하나의 사슬 내에 Y349C 및 다른 사슬 내에 E356C; 하나의 사슬 내에 Y349C 및 다른 사슬 내에 E357C; 하나의 사슬 내에 L351C 및 다른 사슬 내에 S354C; 하나의 사슬 내에 T394C 및 다른 사슬 내에 E397C; 또는 하나의 사슬 내에 D399C 및 다른 사슬 내에 K392C. 아미노산 변화를 용이하게 하는 이종이량체화의 추가의 예는 소위 "전하 쌍 치환" 이다 (예를 들어, WO 2009/089004 참조). 하위계열 IgG1 의 IgG 항체의 Fc-영역의 개별적인 폴리펩티드 사슬 내의 하기 전하 쌍 치환이 이종이량체 형성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다: 1) 하나의 사슬 내에 K409D 또는 K409E 및 다른 사슬 내에 D399K 또는 D399R; 2) 하나의 사슬 내에 K392D 또는 K392E 및 다른 사슬 내에 D399K 또는 D399R; 3) 하나의 사슬 내에 K439D 또는 K439E 및 다른 사슬 내에 E356K 또는 E356R; 4) 하나의 사슬 내에 K370D 또는 K370E 및 다른 사슬 내에 E357K 또는 E357R; 5) 하나의 사슬 내에 K409D 및 K360D 및 다른 사슬 내에 D399K 및 E356K; 6) 하나의 사슬 내에 K409D 및 K370D 및 다른 사슬 내에 D399K 및 E357K; 7) 하나의 사슬 내에 K409D 및 K392D 및 다른 사슬 내에 D399K, E356K, 및 E357K; 8) 하나의 사슬 내에 K409D 및 K392D 및 다른 사슬 내에 D399K; 9) 하나의 사슬 내에 K409D 및 K392D 및 다른 사슬 내에 D399K 및 E356K; 10) 하나의 사슬 내에 K409D 및 K392D 및 다른 사슬 내에 D399K 및 D357K; 11) 하나의 사슬 내에 K409D 및 K370D 및 다른 사슬 내에 D399K 및 D357K; 12) 하나의 사슬 내에 D399K 및 다른 사슬 내에 K409D 및 K360D; 및 13) 하나의 사슬 내에 K409D 및 K439D 및 다른 사슬 내에 D399K 및 E356K.
용어 "(항원에 대한) 결합" 은 시험관 내 어세이에서, 하나의 구현예에서 항체가 표면에 결합되고, 항체에 대한 항원의 결합이 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 에 의해 측정되는 결합 어세이에서, 항체의 이의 항원에 대한 결합을 나타낸다. 결합은 10-8 M 이하의, 일부 구현예에서 10-13 내지 10-8 M 의, 일부 구현예에서 10-13 내지 10-9 M 의 결합 친화성 (KD) 을 의미한다.
결합은 BIAcore 어세이 (GE Healthcare Biosensor AB, Uppsala, Sweden) 에 의해 조사될 수 있다. 결합의 친화성은 용어 ka (항체/항원 복합체로부터의 항체의 연합을 위한 속도 상수), kd (해리 상수), 및 KD (kd/ka) 에 의해 정의된다.
용어 "키메라성" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 말한다.
용어 "CH2-도메인" 은 대략 EU 위치 231 에서 EU 위치 340 까지 확장되는 항체 중쇄 폴리펩티드의 일부를 나타낸다 (Kabat 에 따른 EU 번호지정 시스템). 하나의 구현예에서 CH2 도메인은 SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열을 갖는다: APELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQ E STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAK.
용어 "CH3-도메인" 은 대략 EU 위치 341 에서 EU 위치 446 까지 확장되는 항체 중쇄 폴리펩티드의 일부를 나타낸다. 하나의 구현예에서 CH3 도메인은 SEQ ID NO: 02 의 아미노산 서열을 갖는다: GQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG.
항체의 "계열" 은 이의 중쇄에 의해 소유되는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 5 가지 주요 계열의 항체가 있고: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 이들 중 여러 개는 또다시 하위계열 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 나뉠 수 있다. 상이한 계열의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 로 불린다.
용어 "필적하는 길이" 는 2 개의 폴리펩티드가 일치하는 수의 아미노산 잔기를 포함하거나 또는 하나 이상의 및 최대 10 개까지의 아미노산 잔기의 길이가 상이할 수 있는 것을 나타낸다. 하나의 구현예에서 (Fc-영역) 폴리펩티드는 일치하는 수의 아미노산 잔기를 포함하거나 1 내지 10 개의 아미노산 잔기의 수가 상이하다. 하나의 구현예에서 (Fc-영역) 폴리펩티드는 일치하는 수의 아미노산 잔기를 포함하거나 1 내지 5 개의 아미노산 잔기의 수가 상이하다. 하나의 구현예에서 (Fc-영역) 폴리펩티드는 일치하는 수의 아미노산 잔기를 포함하거나 1 내지 3 개의 아미노산 잔기의 수가 상이하다.
"효과기 작용" 은 항체의 Fc-영역에 기인하는 상기 생물학적 활성을 말하고, 이것은 항체 계열마다 상이하다. 항체 효과기 작용의 예에는: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B-세포 수용체) 의 하향 조절; 및 B-세포 활성화가 포함된다.
작용제, 예를 들어, 약학 제형의 "유효량" 은 요망되는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해, 효과적인 양, 투여량 및 필요한 시간 기간을 말한다.
용어 "Fc-융합 폴리펩티드" 는 결합 도메인 (예를 들어, 항원 결합 도메인, 예컨대 단일 사슬 항체, 또는 폴리펩티드, 예컨대 수용체의 리간드) 과 요망되는 표적- 및/또는 단백질 A 및/또는 FcRn-결합 활성을 나타내는 항체 Fc-영역과의 융합을 나타낸다.
용어 "인간 기원의 Fc-영역" 은 힌지 영역의 일부, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 적어도 함유하는 인간 기원의 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226 으로부터, 또는 Pro230 으로부터, 중쇄의 카르복실-말단까지 확장된다. 하나의 구현예에서 Fc-영역은 SEQ ID NO: 03 의 아미노산 서열을 갖는다. 그러나, Fc-영역의 C-말단 라이신 (Lys447) 이 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 모든 불변 영역 및 도메인의 아미노산 위치는 문헌 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 에 기재된 Kabat 번호지정 시스템에 따라 번호지정되고, 본원에서 "Kabat 에 따른 번호지정" 으로 언급된다. 구체적으로는 문헌 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 의 Kabat 번호지정 시스템 (페이지 647-660 참조) 이 카파 및 람다 이소형의 경쇄 불변 도메인 CL 에 대해 사용되고, Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템 (페이지 661-723 참조) 이 불변 중쇄 도메인 (CH1, 힌지, CH2 및 CH3) 에 대해 사용된다.
용어 "FcRn" 은 인간 신생아 Fc-수용체를 나타낸다. FcRn 은 리소좀 분해 경로로부터 IgG 를 구제하기 위해 작용하여, 감소된 소거율 및 증가된 반감기를 산출한다. FcRn 은 2 개의 폴리펩티드로 이루어지는 이종이량체성 단백질: 50 kDa 계열 I 주 조직적합 복합체-유사 단백질 (α-FcRn) 및 15 kDa β2-마이크로글로불린 (β2m) 이다. FcRn 은 IgG 의 Fc-영역의 CH2-CH3 부분에 대해 높은 친화성으로 결합한다. IgG 와 FcRn 사이의 상호작용은 엄격하게 pH 의존적이며, 1 개의 IgG 가 이의 2 개의 중쇄를 통해 2 개의 FcRn 분자에 대해 결합하는 1:2 화학량론으로 발생한다 (Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083). FcRn 결합은 산성 pH (pH < 6.5) 에서 엔도좀에서 발생하며, IgG 는 중성 세포 표면 (약 7.4 의 pH) 에서 방출된다. 상호작용의 pH-민감성 특성은 엔도좀의 산성 환경 내의 수용체에 대한 결합에 의해 세포내 분해로부터 세포 내로 음세포작용된 (pinocytosed) IgG 의 FcRn-매개 보호를 용이하게 한다. FcRn 은 이후 IgG 의 세포 표면에 대한 재활용 및, FcRn-IgG 복합체의 세포 외부의 중성 pH 환경에 대한 노출 시 혈류 내로의 후속 방출을 용이하게 한다.
용어 "Fc-영역의 FcRn 결합 부분" 은 대략 EU 위치 243 에서 EU 위치 261 까지, 대략 EU 위치 275 에서 EU 위치 293 까지, 대략 EU 위치 302 에서 EU 위치 319 까지, 대략 EU 위치 336 에서 EU 위치 348 까지, 대략 EU 위치 367 에서 EU 위치 393 및 EU 위치 408 까지, 대략 EU 위치 424 에서 EU 위치 440 까지 확장되는 항체 중쇄 폴리펩티드의 일부를 나타낸다. 하나의 구현예에서 Kabat 의 EU 번호지정에 따른 하기 아미노산 잔기 중 하나 이상은 F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439, 및 S440 (EU 번호지정) 로 변경된다.
"프레임워크 (framework)" 또는 "FR" 이란, 과가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다. 가변 도메인의 FR 은 일반적으로 4 개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4 로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL) 에서 다음 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전체 길이 항체 (전체 길이 항체)" 는 4 개의 폴리펩티드를 포함하는 고유의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc-영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타낸다. 전체 길이 항체는 추가의 도메인, 예컨대 예를 들어, 전체 길이 항체의 하나 이상의 사슬에 컨쥬게이션된 scFv 또는 scFab 를 포함할 수 있다. 상기 컨쥬게이트는 또한 용어 전체 길이 항체에 포함된다.
용어 "이량체성 폴리펩티드" 는 공유 연관된 적어도 2 개의 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 나타낸다. 복합체는 또한 다른 폴리펩티드와 공유 또는 비-공유적으로 연관되는 추가의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 이량체성 폴리펩티드는 2 개 또는 4 개의 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "이종이량체" 또는 "이종이량체성" 은 (예를 들어, 필적하는 길이의) 2 개의 폴리펩티드를 포함하고, 상기 2 개의 폴리펩티드가 상응하는 위치 내에 하나 이상의 상이한 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 갖는 분자를 나타내며, 이때 상응하는 위치는 Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따라 결정된다.
용어 "단독이량체" 및 "단독이량체성" 은 필적하는 길이의 2 개의 폴리펩티드를 포함하고, 상기 2 개의 폴리펩티드가 상응하는 위치 내에 일치하는 아미노산 서열을 갖는 분자를 나타내며, 이때 상응하는 위치는 Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따라 결정된다.
본원에 보고되는 이종이량체성 폴리펩티드는 초점을 두고 있는 돌연변이 또는 특성과 관련하여 결정된 이종이량체성이다. 예를 들어, FcRn 및/또는 단백질 A 결합 (즉, 특성에 초점을 두면) 과 관련해서, 이량체성 폴리펩티드는 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A (상기 돌연변이는 이량체성 폴리펩티드의 FcRn 및/또는 단백질 A 결합 특성과 관련하여 초점을 둠) 와 관련해서는 단독이량체성 (즉, 이량체성 폴리펩티드의 두 폴리펩티드가 상기 돌연변이를 포함함) 이지만, 동시에 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V (상기 돌연변이는 상기 돌연변이가 이량체성 폴리펩티드의 이종이량체화에 지정되는 것이고 FcRn/단백질 A 결합 특성에 지정되는 것이 아니라서 초점을 두지 않음) 뿐 아니라 돌연변이 S354C 및 T366W, 각각 (제 1 세트는 오직 제 1 폴리펩티드에만 포함되는 반면, 제 2 세트는 오직 제 2 폴리펩티드에만 포함됨) 에 관련해서는 이종이량체성이다. 추가로 예를 들어, 본원에 보고되는 바와 같은 이량체성 폴리펩티드는 돌연변이 I253A, H310A, H433A, H435A 및 Y436A 와 관련하여 이종이량체성 (즉, 상기 돌연변이는 이량체성 폴리펩티드의 FcRn 및/또는 단백질 A 결합 특성 모두에 지정됨) 일 수 있다, 즉, 하나의 폴리펩티드는 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A 를 포함하는 반면, 다른 폴리펩티드는 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A 를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양" 은 상호교환적으로 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포를, 이러한 세포의 자손을 포함하여 말한다. 숙주 세포에는 일차 형질전환된 세포 및 계대 수와 관계 없이 그로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 가 포함된다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지는 않을 수 있고, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝되거나 또는 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
"인간 항체" 는 인간 또는 인간 세포에 의해 제조된 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 것과 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 항체이다. 상기 인간 항체의 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체는 제외한다.
"인간 공통 프레임워크" 는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선별시 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선별은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터이다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 문헌 Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3 에서와 같은 하위그룹이다. 하나의 구현예에서, VL 의 경우, 하위그룹은 문헌 Kabat et al., supra 에서와 같은 하위그룹 카파 I 이다. 하나의 구현예에서, VH 의 경우, 하위그룹은 Kabat et al., supra 에서와 같은 하위그룹 III 이다.
용어 "~ 로부터 유래되는" 은 하나 이상의 위치에 변형을 도입함으로써 아미노산 서열이 모체 아미노산 서열로부터 유래되는 것을 나타낸다. 따라서 유래된 아미노산 서열은 상응하는 모체 아미노산 서열과 적어도 하나의 상응하는 위치 (항체 Fc-영역에 대해 Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정) 에서 상이하다. 하나의 구현예에서 모체 아미노산 서열로부터 유래되는 아미노산 서열은 상응하는 위치에서 1 내지 15 개의 아미노산 잔기가 상이하다. 하나의 구현예에서 모체 아미노산 서열로부터 유래되는 아미노산 서열은 상응하는 위치에서 1 내지 10 개의 아미노산 잔기가 상이하다. 하나의 구현예에서 모체 아미노산 서열로부터 유래되는 아미노산 서열은 상응하는 위치에서 1 내지 6 개의 아미노산 잔기가 상이하다. 마찬가지로 유도된 아미노산 서열은 이의 모체 아미노산 서열에 대해 높은 아미노산 서열 일치성을 갖는다. 하나의 구현예에서 모체 아미노산 서열로부터 유래되는 아미노산 서열은 80 % 이상 아미노산 서열 일치성을 갖는다. 하나의 구현예에서 모체 아미노산 서열로부터 유래되는 아미노산 서열은 90 % 이상 아미노산 서열 일치성을 갖는다. 하나의 구현예에서 모체 아미노산 서열로부터 유래되는 아미노산 서열은 95 % 이상 아미노산 서열 일치성을 갖는다.
용어 "인간 Fc-영역 폴리펩티드" 는 "고유의" 또는 "야생형" 인간 Fc-영역 폴리펩티드와 일치하는 아미노산 서열을 나타낸다. 용어 "변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드" 는 하나 이상의 "아미노산 변경" 에 의해 "고유의" 또는 "야생형" 인간 Fc-영역 폴리펩티드로부터 유래된 아미노산 서열을 나타낸다. "인간 Fc-영역" 은 2 개의 인간 Fc-영역 폴리펩티드로 이루어진다. "변이체 (인간) Fc-영역" 은 2 개의 Fc-영역 폴리펩티드로 이루어지며, 이때 둘다 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드일 수 있거나, 또는 하나는 인간 Fc-영역 폴리펩티드이고 다른 것은 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드이다.
하나의 구현예에서, 인간 Fc-영역 폴리펩티드는 본원에 보고된 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 03 의 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 04 의 인간 IgG2 Fc-영역 폴리펩티드의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 06 의 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 구현예에서 변이체 (인간) Fc 영역 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 03, 또는 04, 또는 06 의 Fc-영역 폴리펩티드로부터 유래되고, SEQ ID NO: 03, 또는 04, 또는 06 의 Fc 영역 폴리펩티드와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 갖는다. 하나의 구현예에서 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드는 약 1 개 내지 약 10 개의 아미노산 돌연변이, 및 하나의 구현예에서는 약 1 개 내지 약 5 개의 아미노산 돌연변이를 포함한다/갖는다. 하나의 구현예에서 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 03, 또는 04, 또는 06 의 인간 Fc-영역 폴리펩티드와 적어도 약 80 % 상동성을 갖는다. 하나의 구현예에서 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 03, 또는 04, 또는 06 의 인간 Fc-영역 폴리펩티드와 적어도 약 90 % 상동성을 갖는다. 하나의 구현예에서 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 03, 또는 04, 또는 06 의 인간 Fc-영역 폴리펩티드와 적어도 약 95 % 상동성을 갖는다.
SEQ ID NO: 03, 또는 04, 또는 06 의 인간 Fc-영역 폴리펩티드 유래의 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드는 함유되어 있는 아미노산 변형에 의해 정의된다. 따라서, 예를 들어, 용어 P329G 는 SEQ ID NO: 03, 또는 04, 또는 06 의 인간 Fc-영역 폴리펩티드에 대해 아미노산 위치 329 에서 프롤린의 글리신으로의 돌연변이를 가진 변이체 (인간) Fc-영역 폴리펩티드 유래된 인간 Fc-영역 폴리펩티드를 나타낸다.
인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 03).
돌연변이 L234A, L235A 를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 07).
Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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L234A, L235A 돌연변이 및 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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L234A, L235A 및 S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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P329G 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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L234A, L235A 돌연변이 및 P329G 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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P239G 돌연변이 및 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14).
P329G 돌연변이 및 S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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L234A, L235A, P329G 및 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 16).
L234A, L235A, P329G 돌연변이 및 S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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S228P 및 L235E 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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S228P, L235E 돌연변이 및 P329G 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 20).
Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 21).
S228P, L235E 및 S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 22).
S228P, L235E 및 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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P329G 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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P239G 및 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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P329G 및 S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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S228P, L235E, P329G 및 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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S228P, L235E, P329G 및 S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
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"인간화된" 항체는 비-인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라성 항체를 말한다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 하나 이상의, 및 전형적으로 2 개의, 가변 도메인을 포함할 것이며, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR) 은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화된 형태" 는, 인간화를 겪은 항체를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "과가변 영역" 또는 "HVR" 은 서열 내에서 과가변성이고 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR"), 구조적으로 정의된 루프 ("과가변 루프") 를 형성하고, 및/또는 항원-접촉 잔기 ("항원 접촉부") 를 함유하는 항체 가변 도메인의 영역 각각을 말한다. 일반적으로, 항체는 6 개의 HVR 을 포함한다; VH 내에 3 개 (H1, H2, H3), 및 VL 내에 3 개 (L1, L2, L3). 본원에 표시된 HVR 은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3) 에서 발생하는 과가변 루프 (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3) 에서 발생하는 CDR (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3) 에서 발생하는 항원 접촉부 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3) 를 포함하는, 상기 (a), (b), 및/또는 (c) 의 조합.
다르게 명시되지 않는다면, HVR 잔기 및 가변 도메인 내의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기) 는 Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템 (Kabat et al., supra) 에 따라 본원에서 번호지정된다.
"개인" 또는 "대상" 은 포유류이다. 포유류는 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트) 를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 개인 또는 대상은 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 자연적인 환경의 성분으로부터 단리된 것이다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어, 전기영동적 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 크기-배제 크로마토그래피, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 에 의해 측정되는 바와 같이 95 % 또는 99 % 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 측정 방법의 리뷰를 위해, 예를 들어, Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87 을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 자연적인 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 말한다. 단리된 핵산은 통상 핵산 분자를 함유하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 포함하나, 핵산 분자는 염색체 외적으로 또는 그의 자연적인 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 동종의 항체의 집단로부터 수득된 항체, 즉, 집단에 포함되는 개별적인 항체가, 예를 들어, 자연 발생적 돌연변이를 함유하는 또는 모노클로날 항체 제제의 생성 동안 발생하는 가능한 변이체 항체를 제외하고, 동일한 에피토프와 일치하는 및/또는 결합하는 것을 말하고, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정소 (에피토프) 에 대항하는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정소에 대항하여 지정된다. 따라서, 수식어 "모노클로날" 은 항체의 실질적으로 동종의 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하는 것으로서 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 좌의 전부 또는 일부를 함유하는 유전자도입 동물의 사용 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있고, 모노클로날 항체의 제조를 위한 이러한 방법 및 기타 예시적인 방법은 본원에 기재된다.
"고유의 항체" 는 다양한 구조를 가진 자연 발생적 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들어, 고유의 IgG 항체는 디술피드-결합된 2 개의 동일한 경쇄 및 2 개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체성 당단백질이다. N- 에서 C-말단까지, 각각의 중쇄는 또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VH) 뒤에, 3 개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3) 을 갖는다. 유사하게, N- 에서 C-말단까지, 각각의 경쇄는 또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VL) 뒤에, 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반해, 카파 (κ) 및 람다 (λ) 로 불리는 2 가지 유형 중 하나로 배정될 수 있다.
용어 "패키지 삽입물" 은 지시, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 사용금지사유에 대한 정보 및/또는 이러한 치료 제품의 사용과 관련된 주의사항을 담고 있는, 치료 제품의 상업적 패키지에 관례상 포함되는 지침을 말하기 위해 사용된다.
참조 폴리펩티드 서열과 관련하는 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 일치성" 은, 서열을 나란히 정렬시키고, 필요에 따라, 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 일치성을 달성하고, 임의의 보존적 치환을 서열 일치성의 일부로서 고려하지 않은 후, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 일치성을 측정하기 위한 정렬은 당업계 내에 있는 각종 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교할 전체 길이의 서열에 대하여 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적상, % 아미노산 서열 일치성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2 를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램의 저작자는 Genentech, Inc. 이었고, 소스 코드는 사용자 문서와 함께 미국 저작권청 (U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559) 에 제출되었는데, 여기서, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 South San Francisco, California 의 Genentech, Inc. 로부터 공개적으로 입수가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D 를 포함한 UNIX 운영 체제 상에서 사용하기 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 다르지 않다.
ALIGN-2 를 아미노산 서열 비교에 이용하는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B 에 대한, 이와의 또는 이에 대항하는 주어진 아미노산 서열 A 의 % 아미노산 서열 일치성 (이것은 주어진 아미노산 서열 B 에 대한, 이와의 또는 이에 대항하는 특정 % 아미노산 서열 일치성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A 로서 대체하여 표현될 수 있다) 은 하기와 같이 계산된다:
100 × 분수 X/Y
여기서, X 는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 에 의해 그 프로그램의 A 와 B 의 정렬에서 동일한 매치 (match) 로서 채점된 아미노산 잔기의 수이고, Y 는 B 내의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A 의 길이가 아미노산 서열 B 의 길이와 동일하지 않은 경우, B 에 대한 A 의 % 아미노산 서열 일치성은 A 에 대한 B 의 % 아미노산 서열 일치성과 동일하지 않은 것으로 인식될 것이다. 구체적으로 달리 명시되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 % 아미노산 서열 일치성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 직전 단락에서 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형" 은 그곳에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 그러한 형태로 있고, 제형이 투여될 대상에 대해 용납할 수 없게 독성인 부가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용가능한 담체" 는 대상에게 무독성인, 활성 성분 이외의 약학 제형 내의 성분을 말한다. 약학적으로 허용가능한 담체에는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "펩티드 링커" 는 하나의 구현예에서 합성 기원의 것인, 아미노산 서열을 가진 펩티드를 나타낸다. 펩티드 링커는 하나의 구현예에서 30 개 이상의 아미노산 길이, 하나의 구현예에서 32 내지 50 개의 아미노산 길이의 아미노산 서열을 가진 펩티드이다. 하나의 구현예에서 펩티드 링커는 32 내지 40 개의 아미노산 길이의 아미노산 서열을 가진 펩티드이다. 하나의 구현예에서 상기 펩티드 링커는 (GxS)n (식 중, G = 글리신, S = 세린이고, (x = 3, n = 8, 9 또는 10) 또는 (x = 4 및 n= 6, 7 또는 8) 이고, 하나의 구현예에서 x = 4, n = 6 또는 7 이고, 하나의 구현예에서 x = 4, n = 7 임) 이다. 하나의 구현예에서 상기 펩티드 링커는 (G4S)6G2 이다.
용어 "재조합 항체" 는 재조합 수단에 의해 제조되고, 발현되고, 창출되거나 단리된 모든 항체 (키메라성, 인간화된 및 인간) 를 말한다. 이것은 숙주 세포, 에컨대 NS0 또는 CHO 세포로부터 또는 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자도입된 동물 (예를 들어, 마우스) 로부터 단리된 항체, 또는 숙주 세포 내로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 항체는 재배열된 형태의 가변 및 불변 영역을 갖는다. 재조합 항체는 생체 내 체세포 과돌연변이에 적용될 수 있다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식 계통 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되는 반면, 생체 내에서 인간 항체 생식 계통 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료" (및 이의 문법적 변형, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하기") 는 치료되는 개인에서 질환의 자연적 경과를 변형하기 위한 시도로의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상적 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 원하는 치료 효과에는, 제한 없이, 질환의 발병 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접 병리학적 결과의 소멸, 전이 방지, 질환 전개 속도 감소, 질환 상태의 개량 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후가 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 보고되는 바와 같은 항체 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추는데 사용된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "원자가" 는 (항체) 분자 내의 결합 부위의 구체적인 수의 존재를 나타낸다. 이와 같이, 용어 "이원자가", "4-원자가", 및 "6-원자가" 는 (항체) 분자 내에 각각, 2 개의 결합 부위, 4 개의 결합 부위, 및 6 개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 본원에 보고되는 바와 같은 이특이적 항체는 하나의 바람직한 구현예에서 "이원자가" 이다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 이란, 항체를 이의 항원에 결합시키는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL) 은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4 개의 프레임워크 영역 (FR) 및 3 개의 과가변 영역 (HVR) 을 포함한다 (예를 들어, 문헌 Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), 페이지 91 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크린하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628) 을 참조한다.
용어 "안구 혈관 질환" 에는 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 황반 부종, 미숙아의 망막증, 혈관신생성녹내장, 막망 정맥 폐색, 중심 막망 정맥 폐색, 황반 변성, 노화-관련 황반 변성, 색소성 망막염, 막망 혈관종 증식, 황반 모세혈관확장증, 허혈성 망막병증, 홍채 신혈관형성, 안구내 신혈관형성, 각막 신혈관형성, 막망 신혈관형성, 맥락막 신혈관형성, 및 막망 변성과 같은 안구내 신생혈관 증후군이 포함되나 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710 참조).
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "벡터" 는 이에 연결된 또다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐 아니라 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 도입된 벡터를 포함한다. 특정한 벡터는 이들이 작동적으로 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터" 로서 언급된다.
본원에 사용되는 용어 "(상기) 돌연변이 IHH-AAA 를 갖는" 은 IgG1 또는 IgG4 하위계열의 불변 중쇄 영역 내의 돌연변이 I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala), 및 H435A (His435Ala) 의 조합을 말하고, 본원에 사용되는 용어 "(상기) 돌연변이 HHY-AAA 를 갖는" 은 IgG1 또는 IgG4 하위계열의 불변 중쇄 영역 내의 돌연변이 H310A (His310Ala), H433A (His433Ala), 및 Y436A (Tyr436Ala) 의 조합을 말하고, 본원에 사용되는 용어 "(상기) 돌연변이 YTE 를 갖는" 은 IgG1 또는 IgG4 하위계열의 불변 중쇄 영역 내의 돌연변이 M252Y (Met252Tyr), S254T (Ser254Thr), 및 T256E (Thr256Glu) 의 조합을 말하며, 상기 번호지정은 Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따른다.
본원에 사용되는 용어 "(상기) 돌연변이 P329G LALA 를 갖는" 은 IgG1 하위계열의 불변 중쇄 영역 내의 돌연변이 L234A (Leu234Ala), L235A (Leu235Ala) 및 P329G (Pro329Gly) 의 조합을 말하며, 상기 번호지정은 Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따른다. 본원에 사용되는 용어 "(상기) 돌연변이 SPLE 를 갖는" 은 IgG4 하위계열의 불변 중쇄 영역 내의 돌연변이 S228P (Ser228Pro) 및 L235E (Leu235Glu) 의 조합을 말하며, 상기 번호지정은 Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따른다. 본원에 사용되는 용어 "(상기) 돌연변이 SPLE 및 P239G 를 갖는" 은 IgG4 하위계열의 불변 중쇄 영역 내의 돌연변이 S228P (Ser228Pro), L235E (Leu235Glu) 및 P329G (Pro329Gly) 의 조합을 말하며, 상기 번호지정은 Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따른다.
II. 조성물 및 방법
하나의 양상에서, 본 발명은 부분적으로, 스타필로코커스 (Staphylococcus) 단백질 A 에 특이적으로 결합하고 인간 FcRn 에 결합하거나 결합하지 않는 변이체 Fc-영역이, 이종이량체성 Fc-영역의 홀-사슬 내에서 사용되는 경우, 이종이량체성 Fc-영역의 정제를 가능하게 한다는 발견을 기반으로 한다. 상기 변이체 Fc-영역은 CH2-도메인 내에 특이적 아미노산 돌연변이를 함유하는 반면, CH3-도메인은 단백질 A 결합에 대해 변화하지 않는다. 상기 돌연변이는 이종이량체성 Fc-영역의 홀-사슬에서 사용되는 경우 이종이량체성 Fc-영역의 정제, 즉, 단독이량체성 Fc-영역 부산물로부터 (홀-사슬-홀-사슬 이량체) 이종이량체성 Fc-영역의 분리를 허용하는 것으로 밝혀졌다.
이것은 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 내에 하기 돌연변이의 조합을 사용함으로써 달성될 수 있다는 것이 밝혀졌다:
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D.
하기 표는 상호작용에 수반되는 또는 상호작용을 개질하기 위해 변경된 Fc-영역 내의 아미노산 잔기의 예시적인 개관을 나타낸다.
표
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005

본원에 보고된 개질은 스타필로코커스 (Staphylococcal) 단백질 A 에 대한 결합을 변경시킨다. 돌연변이된 잔기는 모두 CH2-도메인 내에 위치한다. 비록 또한 CH3-도메인 내의 잔기는 단백질 A 와 상호작용하지 않지만, CH2-도메인 내의 잔기의 돌연변이는 단백질 A 결합에 영향을 주기에 충분하다. 따라서, 본원에 보고된 이종이량체성 분자 및 항체에서 두 CH3-도메인은 단백질 A 에 대해 동일한 (일치하는) 결합 특성/특징을 갖는다. 따라서, 본원에 보고된 이종이량체성 분자는 CH2-도메인 내의 단백질 A 결합과 관련해서는 이종이량체성이나, CH3-도메인 내의 단백질 A 결합과 관련해서는 단독이량체성이다.
하나의 구현예에서, 본원에 보고된 돌연변이의 조합은 상기 돌연변이의 조합이 결여되는 상응하는 이종이량체성 폴리펩티드와 비교하여 이종이량체성 폴리펩티드의 혈청 반감기를 변경하거나 또는 실질적으로 변경한다.
하나의 구현예에서, 돌연변이의 조합은 상기 돌연변이의 조합이 결여되는 상응하는 이종이량체성 폴리펩티드와 비교하여 이종이량체성 폴리펩티드의 혈청 반감기를 추가로 변경하지 않거나 또는 실질적으로 변경하지 않는다.
A. 신생아 Fc-수용체 (FcRn)
신생아 Fc-수용체 (FcRn) 는 생체 내 IgG 계열의 항체의 대사 경로에 중요하다. FcRn 은 리소좀 분해 경로로부터 야생형 IgG 를 구제하기 위해 작용하여, 소거율을 감소시키고 반감기를 증가시킨다. 이것은 2 개의 폴리펩티드: 50 kDa 계열 I 주 조직적합 복합체-유사 단백질 (α-FcRn) 및 15 kDa β2-마이크로글로불린 (β2m) 으로 이루어지는 이종이량체성 단백질이다. FcRn 은 계열 IgG 의 항체의 Fc-영역의 CH2-CH3 부분에 대해 높은 친화성으로 결합한다. 계열 IgG 의 항체와 FcRn 사이의 상호작용은 pH 독립적이고, 1:2 화학량론으로 발생한다, 즉, 1 개의 IgG 항체 분자가 이의 2 개의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 통해 2 개의 FcRn 분자와 상호작용할 수 있다 (예를 들어, Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083 참조).
따라서, IgG 시험관 내 FcRn 결합 특성/특징은 혈액 순환 내 이의 생체 내 약동학 특성의 지표이다.
FcRn 과 IgG 계열의 항체의 Fc-영역 사이의 상호작용에서 중쇄 CH2- 및 CH3-도메인의 상이한 아미노산 잔기가 참여하고 있다. FcRn 과 상호작용하는 아미노산 잔기는 대략 EU 위치 243 과 EU 위치 261 사이, 대략 EU 위치 275 와 EU 위치 293 사이, 대략 EU 위치 302 와 EU 위치 319 사이, 대략 EU 위치 336 과 EU 위치 348 사이, 대략 EU 위치 367 과 EU 위치 393 사이, EU 위치 408 에, 및 대략 EU 위치 424 와 EU 위치 440 사이에 위치한다. 더욱 구체적으로는 Kabat 의 EU 번호지정에 따른 하기 아미노산 잔기는 Fc-영역과 FcRn 사이의 상호작용에 포함된다: F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439, 및 S440.
부위-지정 돌연변이생성 연구는 FcRn 에 대한 IgG 의 Fc-영역 내의 결정적인 결합 부위가 히스티딘 310, 히스티딘 435, 및 이소류신 253 이고 보다 적게는 히스티딘 433 및 티로신 436 이라는 것을 입증하였다 (예를 들어, Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825; Raghavan, M., et al., Biochem. 34 (1995) 14649-14657; Medesan, C., et al., J. Immunol. 158 (1997) 2211-2217 참조).
FcRn 에 대한 IgG 결합을 증가시키기 위한 방법은 다양한 아미노산 잔기: 트레오닌 250, 메티오닌 252, 세린 254, 트레오닌 256, 트레오닌 307, 글루탐산 380, 메티오닌 428, 히스티딘 433, 및 아스파라긴 434 에서 IgG 를 돌연변이시킴으로써 수행되었다 (참조, Kuo, T.T., et al., J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777-789).
일부 경우에서, 혈액 순환 내에서 감소된 반감기를 가진 항체가 요망된다. 예를 들어, 유리체내 적용을 위한 약물은 눈에서는 긴 반감기 및 환자의 혈액 순환 내에서는 짧은 반감기를 가져야만 한다. 이러한 항체는 또한 질환 부위에 대한, 예를 들어 눈에서 증가된 노출이라는 장점을 갖는다.
FcRn 결합 및 그것과 함께 혈액 순환 내의 반감기에 영향을 주는 상이한 돌연변이가 공지된다. 마우스 Fc-영역 마우스 FcRn 상호작용에 결정적인 Fc-영역 잔기는 부위-지정 돌연변이생성에 의해 확인되었다 (예를 들어, Dall'Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180 참조). 잔기 I253, H310, H433, N434, 및 H435 (Kabat 에 따른 EU 번호지정) 는 상호작용에 관여한다 (Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533-2536; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542-548). 잔기 I253, H310, 및 H435 는 쥣과 FcRn 와 인간 Fc 와의 상호작용에 결정적인 것으로 밝혀졌다 (Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825). 잔기 M252Y, S254T, T256E 는 단백질-단백질 상호작용 연구에 의해 FcRn 결합을 개선하기 위해 Dall'Acqua et al. 에 의해 기술된다 (Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524). 인간 Fc-인간 FcRn 복합체의 연구는 잔기 I253, S254, H435, 및 Y436 이 상호작용에 결정적인 것을 보여준다 (Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). 문헌 Yeung, Y.A., et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) 에서 잔기 248 내지 259 및 301 내지 317 및 376 내지 382 및 424 내지 437 의 다양한 돌연변이체가 보고되고 시험되었다. 예시적인 돌연변이 및 이들의 FcRn 결합에 대한 영향은 하기 표에 나열된다.
표.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009

FcRn 결합에 영향을 주기 위한 IgG1 Fc-영역의 비대칭 조작의 결과는 하기 표에 제시된다 (돌연변이의 정렬 및 FcRn-친화성 크로마토그래피 컬럼 상의 체류 시간).
표.
Figure pct00010
3 분 미만의 체류 시간은 성분이 관류 (flow-through) 내에 있으므로 결합이 없는 (공백 피크) 것과 상응한다.
단일 돌연변이 H310A 가 임의의 FcRn-결합을 결실하기 위한 최고 침묵의 대칭 돌연변이이다.
대칭 단일 돌연변이 I253A 및 H435A 는 0.3 - 0.4 분의 체류 시간의 상대적인 이동을 산출한다. 이것은 일반적으로 비-검출가능한 결합으로서 간주될 수 있다.
단일 돌연변이 Y436A 는 FcRn 친화성 컬럼에 대해 검출가능한 상호작용 세기를 산출한다. 본 이론에 구애되지 않으면서, 상기 돌연변이는 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이의 조합 (IHH-AAA 돌연변이) 과 같은 0 상호작용과는 차별될 수 있는 FcRn 매개된 생체 내 반감기를 가질 수 있다.
대칭적으로 개질된 항-HER2 항체로 수득된 결과는 하기 표에 제시된다 (참조를 위해 WO 2006/031370 참조).
표.
Figure pct00011

B. 안구 혈관 질환
안구 혈관 질환은 눈 조직의 구조물, 예컨대, 망막 또는 각막 내로의 새로운 혈관의 변형된 또는 조절되지 않은 증식 및 침습을 특징으로 하는 임의의 병리학적 상태이다.
하나의 구현예에서, 안구 혈관 질환은 습성 연령 관련 황반 변성 (습성 AMD), 건성 연령 관련 황반 변성 (건성 AMD), 당뇨병성 황반 부종 (DME), 낭포 황반 부종 (CME), 비-증식성 당뇨병성 망막병증 (NPDR), 증식성 당뇨병성 망막병증 (PDR), 낭포 황반 부종, 혈관염 (예를 들어, 중심 망막 정맥 폐색), 유두부종, 망막염, 결막염, 포도막염, 맥락막염, 다초점 맥락막염, 눈 히스토플라스마증, 안검염, 건성안 (쇼그렌병) 및 기타 안과 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 이때 상기 안 질환 또는 장애는 눈 신생혈관형성, 혈관 누출 및/또는 망막 부종과 관련되어 있다.
본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 포함하는 항체는 습성 AMD, 건성 AMD, CME, DME, NPDR, PDR, 안검염, 건성안 및 포도막염, 하나의 바람직한 구현예에서 습성 AMD, 건성 AMD, 안검염 및 건성안, 또한 하나의 바람직한 구현예에서 CME, DME, NPDR 및 PDR, 또한 하나의 바람직한 구현예에서 안검염 및 건성안, 특히 습성 AMD 및 건성 AMD, 또한 특히 습성 AMD 의 예방 및 치료에 유용하다.
일부 구현예에서, 안구 혈관 질환은 습성 연령 관련 황반 변성 (습성 AMD), 황반 부종, 망막 정맥 폐색, 미숙아의 망막병증 및 당뇨병성 망막병증으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
각막 신생혈관형성과 관련된 다른 질환들은 유행성 각막결막염, 비타민 A 결핍, 접촉 렌즈 과다착용, 아토피성 각막염, 상윤부 각막염, 익상편 건조각막염, 쇼그렌병, 여드름 장미증, 필렉테눌로시스 (phylectenulosis), 매독, 마이코박테리아 감염, 지질 변성, 화학적 화상, 박테리아성 궤양, 진균성 궤양, 헤르페스 심플렉스 (Herpes simplex) 감염, 헤르페스 조스터 (Herpes zoster) 감염, 원생동물 감염, 카포시 육종, 무렌 (Mooren) 궤양, 테리엔 (Terrien) 변연부 퇴화, 변연부 각질용해증, 류마티스 관절염, 전신 루푸스, 다발동맥염, 외상, 베게너 육아종증, 공막염, 스티븐스 존슨병 (Steven's Johnson disease), 유사천포창, 방사상 각막절개, 및 각막 이식 거부를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
망막/맥락막 신생혈관형성과 관련된 질환은 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 겸상적혈구 빈혈, 사르코이드, 매독, 탄력섬유가성황색종, 파게트병 (Paget's disease), 정맥 폐색, 동맥 폐색, 경동맥 폐쇄성 질환, 만성 포도막염/유리체염, 마이코박테리아 감염, 라임병 (Lyme's disease), 전신홍반루푸스, 미숙아의 망막병증, 색소성 망막염, 망막 부종 (황반 부종을 포함함), 일스병 (Eale's disease), 베체트병 (Bechet's disease), 망막염 또는 맥락막염을 야기하는 감염, 추정된 눈 히스토플라스마증, 베스트병 (Best's disease), 근시, 시신경유두, 스타가르트병 (Stargart's disease), 평면부염, 만성 망막 탈착, 과다점성 증후군, 톡소플라스마증, 외상 및 레이저 후 합병증을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
다른 질환은 피부홍조와 관련된 질환 (각의 신생혈관형성), 및 모든 형태의 증식성 유리체망막병증을 포함하는 섬유혈관성 또는 섬유성 조직의 비정상적인 증식에 의해 야기된 질환을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
미숙아의 망막병증 (ROP) 은 조산된 신생아에게 영향을 미치는 안 질환이다. 이 질환은 흉터형성 및 망막 탈착을 초래할 수 있는 망막 혈관의 무질서한 성장에 의해 야기되는 것으로 생각된다. ROP 는 경미할 수 있고 자발적으로 해소될 수 있으나, 심각한 경우 실명을 유발할 수 있다. 따라서, 모든 미숙아들은 ROP 에 대한 위험을 갖고 매우 낮은 출생 체중은 추가 위험 인자이다. 산소 독성 및 상대적인 저산소 둘 다가 ROP 의 발생에 기여할 수 있다.
황반 변성은 노인에서 주로 발견되는 의학적 상태이고, 이때 망막의 황반 영역으로서 공지되어 있는 눈의 내층 중심이 얇아짐, 위축 및 일부 경우 출혈을 겪는다. 이것은 미세한 세부사항을 보거나, 글을 읽거나 얼굴을 인식하는 능력의 상실을 수반하는 중심 시력의 상실을 초래할 수 있다. 미국 안과 학회에 따르면, 이 질환은 오늘날 미국에서 50 세 이상의 연령을 갖는 사람들에서 중심 시력 상실 (실명) 의 주된 원인이다. 보다 더 젊은 개체에게 영향을 미치는 일부 황반 퇴행위축은 종종 황반 변성으로서 지칭되지만, 상기 용어는 일반적으로 연령 관련 황반 변성 (AMD 또는 ARMD) 을 지칭한다.
연령 관련 황반 변성은 망막 색소 상피와 기저 맥락막 사이의 황반 (상세화된 중심 시력을 제공하는 망막의 중심 영역, 안와로 불림) 에서 드루젠 (drusen) 으로서 지칭되는 특징적인 황색 침착물로 시작된다. 이 초기 변화 (연령 관련 황반병증으로서 지칭됨) 를 갖는 대다수의 사람들은 우수한 시력을 갖는다. 드루젠을 갖는 사람들은 진행된 AMD 를 발생시킬 수 있다. 드루젠이 크고 많고 황반 아래의 착색된 세포 층에서의 장애와 관련되어 있을 때 위험은 상당히 더 높다. 크고 부드러운 드루젠은 상승된 콜레스테롤 침착물과 관련되어 있고 콜레스테롤 강하제 또는 Rheo 절차에 반응할 수 있다.
심각한 시력 상실의 원인이 되는 진행된 AMD 는 2 가지 형태를 갖는다: 건성 및 습성. 진행된 AMD 의 건성 형태인 중심 지도모양 위축은 눈의 중심 부분에서 광수용체 (막대 및 원뿔) 의 상실을 통해 시력 상실을 야기하는, 망막 아래의 망막 색소 상피 층까지의 위축으로부터 발생한다. 이 질환에 대한 이용가능한 치료는 없지만, 고용량의 항산화제, 루테인 (lutein) 및 제아잔틴 (zeaxanthin) 과 함께 비타민 보충이 건성 황반 변성의 진행을 늦추고 일부 환자들에서 시력을 개선한다는 것이 국립 눈 연구소 등에 의해 입증되었다.
색소성 망막염 (RP) 은 일군의 유전성 안 질환이다. RP 에 대한 증상의 진행에서, 야맹증은 일반적으로 수년 또는 심지어 수십년까지 터널 시력에 앞선다. RP 를 갖는 많은 사람들이 그들의 40 대 또는 50 대까지 법률적으로 맹인이 되지 않고 그들의 인생 전체에서 약간의 시력을 보유한다. 다른 일부 사람들은 RP 로부터 완전히 실명하고, 일부 경우 어린 시절만큼 이른 시기에 실명한다. RP 의 진행은 각각의 경우에서 상이하다. RP 는 일군의 유전 장애인 유전성 망막 퇴행위축의 일종이고, 이때 망막의 광수용체 (막대 및 원뿔) 또는 망막 색소 상피 (RPE) 의 비정상이 진행성 시력 상실 유발한다. 영향받은 개체는 먼저 암 (dark) 적응의 결함 또는 밤소경증 (야맹증) 을 경험한 후, 주변 시야의 감소 (터널 시력으로서 공지되어 있음) 및 종종 질환의 경과에서 후기에 중심 시력의 상실을 경험한다.
황반 부종은 망막의 황색 중심 영역인 눈의 황반 위에서 또는 아래에서 유체 및 단백질 침착물이 모아짐으로써 상기 황반이 두꺼워지고 팽창될 때 일어난다. 황반이 안구 후방에서 망막의 중심 근처에 있기 때문에 상기 팽창은 사람의 중심 시력을 왜곡시킬 수 있다. 이 영역은 사람이 직접적으로 시선에 있는 형태, 색채 및 세부사항을 볼 수 있도록 날카롭고 선명한 중심 시력을 제공하는 조밀하게 팩킹된 원뿔을 유지한다. 낭포 황반 부종은 낭포 형성을 포함하는 황반 부종의 일종이다.
C. 현행 발명
하나의 Fc-영역 폴리펩티드 내 한 면의 하나의 돌연변이가 결합에 상당히 영향을 주는데 충분하다는 것이 밝혀졌다. Fc-영역 내에 돌연변이가 좀더 도입되면, 스타필로코커스 (Staphylococcal) 단백질 A 및/또는 FcRn 에 대한 결합이 좀더 변화된다, 즉 약화되거나 강화된다.
본원에는 CH2 도메인 디자인에 의한 놉-인투-홀 (KiH) 이중특이적 항체의 제조시 발생하는 홀-홀 미스페어링 부산물을 감소시키기 위한 방법이 보고된다.
CH2 도메인 내의 아미노산 위치 L251, I253, H310, L314 는 단백질 A 및 인간 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 와 상호작용하고 있다.
A, G 또는 D 에 대한 KiH 이중특이적 항체의 소위 홀-사슬 내의 상기 위치 중 하나 이상에 아미노산 교환을 도입함으로써, 단백질 A 및 FcRn 에 대한 결합 특성이 침묵될 수 있다.
하나의 바람직한 구현예에서, CH2 도메인은 돌연변이 i) I253A 또는 I253G, 및 ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D 를 포함한다.
상기 디자인에 의해, 홀-홀 미스페어링 부산물은 더이상 단백질 A 및 FcRn 에 결합하지 못한다 (두 중쇄와 함께 가능한 상호작용이 없음). 이에 의해, 홀-홀 미스페어링 부산물은 단백질 A 및/또는 FcRn 친화성 크로마토그래피 컬럼에 결합하지 않을 것이다. 그러므로, 홀-홀 미스페어링 부산물은 적어도 초기에 용출되거나, 즉, 분리된 떨어져나온 피크로, 또는 전혀 결합하지 않을 것이며, 단백질 A 또는 FcRn 친화성 컬럼의 관류에서 발견될 수 있다.
손상된 FcRn 결합 특성을 보상하기 위해, 주변 아미노산은 홀 면에 T250Q 및/또는 T256E 및/또는 T307H 돌연변이를, 단독으로 또는 단일, 이중 또는 삼중 조합으로 도입함으로써 개선될 수 있다.
Figure pct00012

FcRn 결합 조작에 대한 개관을 하기 표에 제공한다:
Figure pct00013
본원에 보고되는 하나의 양상은,
하나 이상의 시스테인 잔기, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는, 적어도 면역글로불린 힌지 영역의 일부를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제 1 폴리펩티드, 및 하나 이상의 시스테인 잔기, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는, 적어도 면역글로불린 힌지 영역의 일부를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제 2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체성 폴리펩티드로서:
제 1 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 를 포함하고 (홀-사슬), 제 2 폴리펩티드는 돌연변이 S354C 및 T366W 을 포함하고 (놉-사슬),
제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함하고:
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D,
제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 하나 이상의 디술피드 가교에 의해 연결되고,
제 1 폴리펩티드의 CH3-도메인 및 제 2 폴리펩티드의 CH3-도메인은 둘다 단백질 A 에 결합하거나 또는 둘다 결합하지 않는, 이종이량체성 폴리펩티드 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정) 이다.
하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함한다:
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D, 및
iii) T250Q, 및/또는
iv) T256E 또는 T256A.
하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함한다:
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D, 및
iii) 임의로 a) T250Q, 및/또는 T256E 또는 T256A, 및.
iv) a) L251A 또는 L251G 또는 L251D, 및/또는 b) H310A 또는 H310G.
하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함한다:
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D, 및
iii) a) T250Q, 및/또는 T256E 또는 T256A, 및.
iv) a) L251A 또는 L251G 또는 L251D, 및/또는 b) H310A 또는 H310G.
v) 임의로 a) T307A 또는 T307H 또는 T307Q 또는 T307P, 및/또는 b) Q311H, 및/또는 c) M252Y, 및/또는 d) S254T.
하나의 구현예에서, 제 2 폴리펩티드 (놉-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함한다:
i) T250Q, 및/또는
ii) M252Y, 및/또는
iii) S254T, 및/또는
iv) T256E 또는 T256A, 및/또는
v) T307A 또는 T307H 또는 T307Q 또는 T307P, 및/또는
vi) Q311H.
하나의 구현예에서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인은 인간 IgG1 하위계열의 것이다. 하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 각각 돌연변이 L234A 및 L235A 를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 각각 돌연변이 P329G 를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 각각 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드의 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인은 인간 IgG4 하위계열의 것이다. 하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 각각 돌연변이 S228P 및 L235E 를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 각각 돌연변이 P329G 를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 각각 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G 를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩티드는 Fc-영역 융합 폴리펩티드이다.
하나의 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩티드는 전체 길이 항체이다. 하나의 구현예에서,
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 단일특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 단일특이적 항체는 1원자가 단일특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 단일특이적 항체는 2원자가 단일특이적 항체이다.
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 이중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 2원자가 이중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 4원자가 이중특이적 항체이다.
하나의 구현예에서, 전체 길이 항체는 삼중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 삼중특이적 항체는 3원자가 삼중특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 삼중특이적 항체는 4원자가 삼중특이적 항체이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드 (변이체 인간 IgG 계열 Fc-영역) 를 포함하는 항체이다.
본원에 보고된 Fc-영역 (이종이량체성 폴리펩티드) 은 전체 길이 항체에 함유되는 경우 상기 기재된 특징을 분자에 부여한다.
항체, 예를 들어, 전체 길이 항체 또는 크로스맙 (CrossMab) 은, 본원에 보고된 변이체 (인간) 인간 IgG 계열 Fc-영역을 포함할 수 있다.
이종이량체성 폴리펩티드는 돌연변이로 인해 하나의 사슬 (홀-사슬) 내의 스타필로코커스 (Staphylococcal) 단백질 A 에 결합하지 않는 특성 및 다른 사슬 (놉-사슬) 내의 스타필로코커스 (Staphylococcal) 단백질 A 에 결합하는 특성을 갖는다.
그러므로, 상기 항체는 통상의 단백질 A 친화성 재료, 예컨대 MabSelectSure 를 사용함으로써 원치 않는 홀-사슬 이량체성 부산물로부터 정제 즉, 분리될 수 있다. 카파 하위계열의 경쇄를 포함하는 항체로 오직 사용가능한, 고도로 섬세하나, 종 제한되는 친화성 재료, 예컨대 예를 들어 KappaSelect 를 사용할 필요가 없다. 부가적으로 경쇄 하위계열의 개질/교환이 이루어진다면 정제 방법을 채택할 필요가 없다.
본원에 보고된 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드의 제조 방법이다:
a) 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 포유류 세포를 배양하는 단계,
b) 이종이량체성 폴리펩티드를 배양 배지로부터 회수하는 단계, 및
c) 이종이량체성 폴리펩티드를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제함으로써 이량체성 폴리펩티드를 제조하는 단계.
본원에 보고된 하나의 양상은 단독이량체성 폴리펩티드로부터 이종이량체성 폴리펩티드를 분리하기 위한, 하기 돌연변이: i) I253A 또는 I253G, 및 ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D 의 조합의 용도이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 상이하게 변형되어 있는 면역글로불린 중쇄 Fc-영역을 포함하는, 단리/정제의 용이성을 제공하는 이중특이적 항체로서, 이때 하나 이상의 상기 변형이 i) 단백질 A 에 대한 이중특이적 항체의 상이한 친화성을 야기하고, 상기 이종이량체 이중특이적 항체가 단백질 A 에 대한 그의 친화성에 근거하여 파괴된 세포, 배지 또는 항체들의 혼합물로부터 단리될 수 있는, 이중특이적 항체이다.
하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 pH 4.0 초과의 pH 값에서 용출된다.
하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 pH 구배 또는 pH 단계를 이용함으로써 단리되고, 이때 pH 구배 또는 pH 단계는 염의 추가를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 염은 약 0.5 몰 내지 약 1 몰의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 염은 아세테이트의 리튬, 나트륨 및 칼륨 염; 나트륨 및 칼륨 바이카보네이트; 리튬, 나트륨 및 칼륨 카보네이트; 리튬, 나트륨, 칼륨 및 마그네슘 클로라이드; 나트륨 및 칼륨 플루오라이드; 나트륨, 칼륨 및 칼슘 니트레이트; 나트륨 및 칼륨 포스페이트; 및 칼슘 및 마그네슘 술페이트로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 염은 알칼리성 금속 또는 알칼리성 토금속의 할라이드 염이다. 하나의 바람직한 구현예에서, 염은 염화나트륨이다.
하나의 양상에서, 이량체성 폴리펩티드는 본원에 보고된 바와 같이 변형된 제 1 폴리펩티드, 및 단백질 A 또는 FcRn 결합에 대하여 변형되지 않은 제 2 폴리펩티드를 포함함으로써 이종이량체성 폴리펩티드를 형성하는데, 이때 상이한 변형은 상이한 변형을 결여하는 상응하는 이량체성 폴리펩티드보다 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.3 또는 1.4 pH 유닛(들) 만큼 더 높은 pH 에서 상기 이량체성 폴리펩티드가 단백질 A 친화성 물질로부터 용출되게 한다. 하나의 구현예에서, 상이하게 변형된 이량체성 폴리펩티드는 4 이상의 pH 에서 용출되는 반면, 변형되지 않은 이량체성 폴리펩티드는 3.5 이하의 pH 에서 용출된다. 하나의 구현예에서, 상이하게 변형된 이량체성 폴리펩티드는 약 4 의 pH 에서 용출되는 반면, 변형되지 않은 이량체성 폴리펩티드는 약 2.8 내지 3.5, 2.8 내지 3.2, 또는 2.8 내지 3 의 pH 에서 용출된다. 이 구현예들에서, "변형되지 않은" 은 상기 폴리펩티드들 둘 다에서 변형 i) I253A 및 I253G, 및 ii) L314A 및 L314G 및 L314D (Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템) 의 결여를 지칭한다.
크로마토그래피 실시의 경우, 0.5 몰 내지 1 몰 염 (예를 들어, NaCl) 의 첨가는 특히 인간 IgG1 하위계열로부터 유래된 경우 단독이량체성 폴리펩티드와 이종이량체성 폴리펩티드의 분리를 개선할 수 있다. pH 값을 증가시키는, 용출 용액에의 염의 첨가는 예를 들어, pH 단계 구배가 상기 2 개의 종들을 성공적으로 분리시킬 수 있도록 용출을 위한 pH 범위를 넓힐 수 있다.
따라서, 하나의 구현예에서, 본원에 보고된 돌연변이를 포함하는 한 쇄를 갖는 이종이량체성 IgG Fc-영역을 포함하는 이중특이적 항체를 분리하는 방법은 염의 존재 하에 pH 구배를 사용하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 염은 IgG Fc-영역 단독이량체의 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터의 용출과 IgG Fc-영역 이종이량체의 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터의 용출 사이의 pH 차이를 최대화하기에 충분한 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 염은 약 0.5 몰 내지 약 1 몰의 농도로 존재한다. 하나의 구현예에서, 염은 알칼리성 금속 또는 알칼리성 토금속 및 할로겐의 염이다. 하나의 구현예에서, 염은 알칼리성 금속 또는 알칼리성 토금속의 클로라이드 염, 예컨대, NaCl, KCl, LiCl, CaCl2 또는 MgCl2이다. 하나의 구현예에서, pH 구배는 약 pH 4 내지 약 pH 5 이다. 하나의 구현예에서, 구배는 선형 구배이다. 하나의 구현예에서, pH 구배는 단계 구배이다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 약 pH 4 의 용액을 평형화된 단백질 A 친화성 컬럼에 적용하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본원에 보고된 변형에 대하여 이종이량체성 IgG Fc-영역을 포함하는 이중특이적 항체는 비-이종이량체성 이중특이적 항체를 실질적으로 함유하지 않는 하나 이상의 분획으로 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질로부터 용출된다.
본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드는 재조합 수단에 의해 제조된다. 따라서, 본 발명의 하나의 양상은 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이고, 추가 양상은 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포이다.
재조합 제조 방법은 최신기술 수준에서 널리 공지되어 있고 원핵 세포 및 진핵 세포에서 단백질을 발현하는 단계 및 이종이량체성 폴리펩티드를 단리하고 통상적으로 약학적으로 허용가능한 순도까지 정제하는 후속 단계를 포함한다. 숙주 세포에서 전술된 이종이량체성 폴리펩티드를 발현하기 위해, 각각의 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 표준 방법으로 발현 벡터 내로 삽입한다. 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포, 예컨대, CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, 효모 또는 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 세포에서 발현을 수행하고, 세포 (배양 상청액 또는 용해 후 세포) 로부터 이종이량체성 폴리펩티드를 회수한다.
일반적인 항체 재조합 제조 방법은 최신기술 수준에서 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 (Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202), 문헌 (Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282), 문헌 (Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160) 및 문헌 (Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880) 에 기재되어 있다.
따라서, 본원에 보고된 하나의 양상은 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서,
a) 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키는 단계,
b) 상기 이종이량체성 폴리펩티드를 발현하도록 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
c) 배양물로부터 상기 이종이량체성 폴리펩티드를 회수하여 이종이량체성 폴리펩티드를 제조하는 단계
를 포함하는 방법이다.
하나의 구현예에서, 회수 단계 c) 는 면역글로불린 Fc-영역 특이적 포획 시약의 사용을 포함한다. 하나의 구현예에서, 이 Fc-영역 특이적 포획 시약은 결합-및-용출-모드로 사용된다. 이러한 Fc-영역 특이적 포획 시약의 예는 예를 들어, 대규모에서 높은 유속 및 낮은 배압을 허용하는 고도 강성 아가로스 베이스 매트릭스를 기제로 한 스타필로코커스 단백질 A-기제 친화성 크로마토그래피 컬럼이다. 이것은 이종이량체성 폴리펩티드, 즉 그의 Fc-영역에 결합하는 리간드를 특징으로 한다. 상기 리간드는 그가 표적 분자와의 결합에 용이하게 사용될 수 있게 하기 위해 긴 친수성 스페이서 아암을 통해 매트릭스에 부착된다.
본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드는 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지로부터 적절하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA 및 RNA 는 통상적인 절차를 이용함으로써 용이하게 단리되고 서열결정된다. 일단 단리되면, DNA 를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를, 이종이량체성 폴리펩티드를 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대, HEK 293 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포 내로 트랜스펙션시켜 상기 숙주 세포에서 재조합 모노클로날 이종이량체성 폴리펩티드의 합성을 수득한다.
세포 성분 또는 다른 오염물질들, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당분야에서 잘 공지되어 있는 다른 방법으로 항체의 정제를 수행한다 (문헌 (Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)) 참조). 다양한 방법들, 예컨대, 미생물 단백질을 사용한 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 양이온 교환 (카복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합 방식 교환), (예를 들어, β-머캡토에탄올 및 다른 SH 리간드를 사용한) 티오친화성 (thiophilic) 흡착, (예를 들어, 페닐-세파로스, 아자-아레노친화성 (arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐보론산을 사용한) 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피, (예를 들어, Ni(II)-친화성 및 Cu(II)-친화성 물질을 사용한) 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 전기영동 방법 (예컨대, 겔 전기영동, 모세관 전기영동) 이 잘 확립되어 있고, 단백질 정제를 위해 널리 사용된다 (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).
본 발명의 하나의 양상은 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 포함하는 약학 제형이다. 본 발명의 또 다른 양상은 약학 제형의 제조를 위한 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드의 용도이다. 본 발명의 추가 양상은 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 포함하는 약학 제형의 제조 방법이다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 약학 담체와 함께 제형화된, 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 함유하는 제형, 예를 들어, 약학 제형을 제공한다.
본원에 보고된 제형은 당분야에서 공지되어 있는 다양한 방법들에 의해 투여될 수 있다. 당업자가 인식할 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 화합물을 특정 투여 경로로 투여하기 위해, 상기 화합물의 불활성화를 방지하는 물질로 상기 화합물을 코팅하거나 이러한 물질과 함께 상기 화합물을 공-투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 적절한 담체, 예를 들어, 리포좀 또는 희석제 중의 화합물을 대상체에게 투여할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제는 식염수 및 완충제 수용액을 포함한다. 약학 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 성분을 위한 이러한 매질 및 물질의 사용은 당분야에서 공지되어 있다.
눈내 적용 또는 국소 적용을 포함하나 이들로 한정되지 않는 많은 가능한 전달 방식이 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 적용은 눈내 적용이고, 결막하 주입, 전방내 주입, 측두 윤부를 통한 전방 내로의 주입, 간질내 주입, 각막내 주입, 망막하 주입, 수성 체액 주입, 테논낭하 (subtenon) 주입 또는 지속 전달 장치, 유리체내 주입 (예를 들어, 전방, 중간 또는 후방 유리체 주입) 을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 하나의 구현예에서, 적용은 국소 적용이고, 각막으로의 점안제를 포함하나 이것으로 한정되지 않는다.
하나의 구현예에서, 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드 또는 본원에 보고된 약학 제형은 유리체내 적용, 예를 들어, 유리체내 주입을 통해 투여된다. 이것은 당분야에서 공지되어 있는 표준 절차에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276), 문헌 (Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206) 및 문헌 (Wray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185) 을 참조한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 치료 키트는 본원에 기재된 약학 제형에 존재하는 1회 이상 용량의 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드, 약학 제형의 유리체내 주입에 적합한 장치, 및 주입을 수행하기에 적합한 대상체 및 프로토콜을 상세히 설명하는 설명서를 함유할 수 있다. 이 구현예에서, 제형은 전형적으로 유리체내 주입을 통해 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 이것은 당분야에서 공지되어 있는 표준 절차에 따라 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276), 문헌 (Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206), 및 문헌 (Wray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185) 참조).
제형은 보조제, 예컨대, 방부제, 습윤화제, 유화제 및 분산제도 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 상기 멸균 절차 및 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 등장제, 예컨대, 당, 염화나트륨 등을 제형 내에 포함시키는 것도 바람직할 수 있다. 추가로, 주입가능한 약학 제형의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 달성될 수 있다.
적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본원에 보고된 화합물, 및/또는 본원에 보고된 약학 제형은 선택된 투여 경로와 관계없이 당업자에게 공지되어 있는 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 투약 형태로 제형화된다.
본원에 보고된 약학 제형 중의 활성 성분의 실제 용량 수준은 환자에게 독성을 나타내지 않으면서 구체적인 환자, 조성물 및 투여 방식에 대한 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변형될 수 있다. 선택된 용량 수준은 사용되는 본 발명의 구체적인 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 구체적인 화합물의 배출 속도, 치료의 지속시간, 사용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 과거 병력, 및 의학 분야에서 잘 공지되어 있는 다른 인자들을 포함하는 다양한 약동학적 인자들에 의해 좌우될 것이다.
제형은 제형이 주사기에 의해 전달될 수 있는 정도까지 멸균성 및 유동성을 가져야 한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 담체는 물 이외에 등장성 완충 식염수 용액이다.
적절한 유동성은 예를 들어, 코팅제, 예컨대, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 요구된 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장제, 예를 들어, 당, 다가알코올, 예컨대, 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다.
제형은 결막하 투여를 위한 활성 성분을 포함하는 안과 데포 (depot) 제형을 포함할 수 있다. 안과 데포 제형은 본질적으로 순수한 활성 성분, 예를 들어, 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드의 마이크로입자를 포함한다. 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 포함하는 마이크로입자는 약학적으로 허용가능한 생체적합성 중합체 또는 지질 캡슐화제 내에 묻혀있을 수 있다. 상기 데포 제형은 연장된 기간에 걸쳐 모든 활성 성분들을 전부 또는 실질적으로 전부 방출시키도록 개조될 수 있다. 존재하는 경우 중합체 또는 지질 매트릭스는 모든 또는 실질적으로 모든 활성 성분의 방출 후 투여 부위로부터 수송되기 위해 충분히 분해되도록 개조될 수 있다. 상기 데포 제형은 약학적으로 허용가능한 중합체 및 용해된 또는 분산된 활성 성분을 포함하는 액체 제형일 수 있다. 주입 시, 상기 중합체는 예를 들어, 겔화 또는 침전에 의해 주입 부위에서 데포를 형성한다.
본 발명의 또 다른 양상은 안구 혈관 질환의 치료에 사용되는 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드이다.
본 발명의 하나의 구현예는 안구 혈관 질환의 치료에 사용되는 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드이다.
본 발명의 또 다른 양상은 안구 혈관 질환의 치료에 사용되는 약학 제형이다.
본 발명의 또 다른 양상은 안구 혈관 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양상은 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를, 안구 혈관 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 안구 혈관 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이다.
본원에서 사용된 용어 "포함하는" 은 용어 "구성된" 을 포함한다는 것이 본원에 명확히 언급되어 있다. 따라서 용어 "포함하는" 을 함유하는 모든 양상들 및 구현예들은 마찬가지로 용어 "구성된" 으로 개시된다.
D. 변형
추가 양상에서, 상기 구현예들 중 임의의 구현예에 따른 이종이량체성 폴리펩티드는 하기 단락 1 내지 6 에 기재된 특징들 중 임의의 특징을 단독으로 또는 조합으로 포함할 수 있다:
1. 항체 친화성
하나의 구현예에서, BIACORE® 표면 플라스몬 공명 어세이로 Kd 를 측정한다. 예를 들어, 약 10 반응 유닛 (RU) 에서 고정된 결합 파트너 CM5 칩을 사용하여 25℃ 에서 BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 (GE Healthcare Inc., Piscataway, NJ) 을 이용한 어세이를 수행한다. 하나의 구현예에서, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, GE Healthcare Inc.) 을 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시석신이미드 (NHS) 로 활성화시킨다. 약 10 반응 유닛 (RU) 의 커플링된 결합 파트너를 달성하기 위해 5 ㎕/분의 유속으로 주입하기 전에 결합 파트너를 10 mM 나트륨 아세테이트 (pH 4.8) 로 5 ㎍/㎖ (약 2 μM) 까지 희석한다. 결합 파트너의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 비-반응된 기를 차단한다. 동역학적 측정을 위해, 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20™) 계면활성제를 갖는 PBS (PBST) 중의 융합 폴리펩티드 또는 항체를 함유하는 이량체성 폴리펩티드의 2 배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM) 을 25℃에서 약 25 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 결합 센서그램 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1-대-1 랭뮤어 결합 모델 (BIACORE® 평가 소프트웨어 버전 3.2) 을 이용하여 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff) 를 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd) 를 비 koff/kon 로서 계산한다 (예를 들어, 문헌 (Chen, Y. et al., J Mol Biol 293, (1999) 865-881) 참조). 상기 표면 플라스몬 공명 어세이에 의해 측정된 결합 속도가 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 분광계, 예컨대, 정지-유동 장착된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광광도계 (ThermoSpectronic) 에서 측정된 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 25℃ 에서 PBS (pH 7.2) 중의 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태) 의 형광 방사 강도 (여기 = 295 nm; 방사 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스 (band-pass)) 의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기법을 이용함으로써 결합 속도를 측정할 수 있다.
2. 키메라 항체 및 인간화된 항체
특정 구현예에서, 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드는 키메라 항체에 포함된다. 특정 키메라 항체는 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 및 문헌 (Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855) 에 기재되어 있다. 하나의 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가 예에서, 키메라 항체는 계열 또는 하위계열이 모 항체의 계열 또는 하위계열로부터 변형되어 있는 "계열 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들어, CDR (또는 이들의 부분) 이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR (또는 이들의 부분) 이 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부도 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기들은 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복시키거나 개선하기 위해 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기의 기원이 되는 항체) 로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화된 항체 및 이를 제조하는 방법은 예를 들어, 문헌 (Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633) 에서 검토되어 있고, 예를 들어, 하기 문헌들에 더 기재되어 있다: 문헌 (Riechmann, I., et al., Nature 332 (1988) 323-329); 문헌 (Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033); 미국 특허 제5,821,337호; 미국 특허 제7,527,791호; 미국 특허 제6,982,321호; 미국 특허 제7,087,409호; 문헌 (Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34) (특이성 결정 영역 (SDR) 이식이 기재됨); 문헌 (Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498) ("재표면화" 가 기재됨); 문헌 (Dall'Acqua, W.F., et al., Methods 36 (2005) 43-60) ("FR 셔플링" 이 기재됨); 문헌 (Osbourn, J., et al., Methods 36 (2005) 61-68); 및 문헌 (Klimka, A., et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260) (FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 방법이 기재됨).
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "베스트-피트 (best-fit)" 방법을 이용함으로써 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 (Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308) 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 (Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289) 및 문헌 (Presta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632) 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식세포주 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 (Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633) 참조); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 (Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684) 및 문헌 (Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618) 참조) 을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
3. 인간 항체
특정 구현예에서, 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드는 인간 항체로부터 유래된다. 인간 항체는 당분야에서 공지되어 있는 다양한 기법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 (van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374) 및 문헌 (Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459) 에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원성 챌린지에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 유전자이식 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 면역글로불린 좌위를 교체하거나, 염색체 외부에 존재하거나 동물의 염색체 내로 무작위적으로 삽입되는 인간 면역글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 유전자이식 마우스에서, 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 불활성화되어 있다. 유전자이식 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해서는 문헌 (Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125) 을 참조한다. 예를 들어, XENOMOUSE™ 기술이 기재되어 있는 미국 특허 제6,075,181호 및 미국 특허 제6,150,584호; HUMAB® 기술이 기재되어 있는 미국 특허 제5,770,429호; K-M MOUSE® 기술이 기재되어 있는 미국 특허 제7,041,870호; 및 VELOCIMOUSE® 기술이 기재되어 있는 미국 특허출원 공개 제 2007/0061900호도 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역을 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 더 변형시킬 수 있다.
인간 항체는 하이브리도마-기반 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 (Kozbor, D.,J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005); 문헌 (Brodeur, B.R., et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63); 및 문헌 (Boerner, P., et al., J. Immunol.147 (1991) 86-95) 참조). 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 문헌 (Li, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562) 에도 기재되어 있다. 추가 방법은 예를 들어, (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 제조가 기재되어 있는) 미국 특허 제7,189,826호 및 (인간-인간 하이브리도마가 기재되어 있는) 문헌(Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268) 에 기재된 방법들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트라이오마 (Trioma) 기술) 도 문헌 (Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937) 및 문헌 (Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191) 에 기재되어 있다.
인간 항체는 인간으로부터 유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수도 있다. 그 다음, 이러한 가변 도메인 서열은 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기법은 후술되어 있다.
4. 라이브러리 유래의 항체
특정 구현예에서, 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드는 라이브러리 유래의 항체에 포함된다. 라이브러리 유래의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 원하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법들이 당분야에서 공지되어 있다. 이러한 방법들은 예를 들어, 문헌 (Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37) 에서 검토되어 있고 예를 들어, 하기 문헌들에도 기재되어 있다: 문헌 (McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554); 문헌 (Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628); 문헌 (Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597); 문헌 (Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175); 문헌 (Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; 문헌 (Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093); 문헌 (Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472); 및 문헌 (Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132).
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 유전자 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 에 의해 별도로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위적으로 재조합된 후, 문헌 (Winter, G., et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455) 에 기재된 바와 같이 항원 결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 단일 쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마의 구축을 요구하지 않으면서 면역원에 대한 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 문헌 (Griffiths, A.D., et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734) 에 기재된 바와 같이 무자극 (naive) 레퍼토리를 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝하여 임의의 면역화 없이 매우 다양한 비-자가 항원 및 자가-항원에 대한 항체들의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 무자극 라이브러리는 문헌 (Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388) 에 기재된 바와 같이 비-재배열된 V 유전자 분절을 줄기 세포로부터 클로닝하고 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도 가변 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성함으로써 합성적으로 제조될 수도 있다. 인간 항체 파지 라이브러리가 기재되어 있는 특허 공개문헌들은 예를 들어, 미국 특허 제5,750,373호, 미국 특허출원 공개 제 2005/0079574호, 미국 특허출원 공개 제 2005/0119455호, 미국 특허출원 공개 제 2005/0266000호, 미국 특허출원 공개 제 2007/0117126호, 미국 특허출원 공개 제 2007/0160598호, 미국 특허출원 공개 제 2007/0237764호, 미국 특허출원 공개 제 2007/0292936호 및 미국 특허출원 공개 제 2009/0002360호를 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로서 간주된다.
5. 다중특이적 항체
특정 구현예에서, 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체에 포함된다. 다중특이적 항체는 2 개 이상의 상이한 부위들에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 제 1 항원에 대한 결합 특이성이고, 나머지 하나는 상이한 제 2 항원에 대한 결합 특이성이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 동일한 항원의 2 개의 상이한 에피토프들에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 세포독성제를, 하나 이상의 항원을 발현하는 세포에 위치시키는 데 사용될 수도 있다. 이중특이적 항체는 전체 길이 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하는 기법은 상이한 특이성을 갖는 2 개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 (Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540), 국제 특허출원 공개 제WO 93/08829호, 및 문헌 (Traunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659) 참조), 및 "놉-인-홀 (knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호 참조) 을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다중특이적 항체는 항체 Fc-이종이량체성 분자를 제조하기 위한 정전기 조종 효과의 조작 (국제 특허출원 공개 제WO 2009/089004호); 2 개 이상의 항체들 또는 단편들의 가교연결 (예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호 및 문헌 (Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83) 참조); 이중특이적 항체를 제조하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 (Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553) 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술의 이용 (예를 들어, 문헌 (Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448) 참조); 단일 쇄 Fv (scFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 (Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374) 참조); 및 예를 들어, 문헌 (Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69) 에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수도 있다.
3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체 ("옥토퍼스 (Octopus) 항체" 를 포함함) 도 본원에 포함된다 (예를 들어, 미국 특허출원 공개 제 2006/0025576호 참조).
본원의 항체 또는 단편은 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF" 도 포함한다 (예를 들어, 미국 특허출원 공개 제 2008/0069820호 참조).
본원의 항체 또는 단편은 국제 특허출원 공개 제WO 2009/080251호, 제WO 2009/080252호, 제WO 2009/080253호, 제WO 2009/080254호, 제WO 2010/112193호, 제WO 2010/115589호, 제WO 2010/136172호, 제WO 2010/145792호 및 제WO 2010/145793호에 기재된 다중특이적 항체도 포함한다.
6. 항체 변이체
특정 구현예에서, 본원에서 보고되는 이종이량체성 폴리펩티드는 항체에 포함된다. 추가의 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 요망될 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적합한 개질을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 개질에는 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및/또는 그 내로의 삽입 및/또는 그의 치환이 포함된다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 구성물에 도착하도록 제조될 수 있고, 단, 최종 구성물은 원하는 특징, 예를 들어, 항원-결합을 보유한다.
a) 치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이생성을 위한 관심있는 부위는 HVR 및 FR 을 포함한다. 보존적 치환은 "바람직한 치환" 이라는 표제 하에 하기 표에 제시되어 있다. 보다 더 실질적인 변형은 "예시적 치환" 이라는 표제 하에 하기 표에 제공되어 있고 아미노산 측쇄 계열와 관련하여 이하에 더 기재되어 있다. 아미노산 치환은 관심의 항체 내로 도입되고 생성물을 요망되는 활성, 예를 들어, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC 에 대해 스크리닝할 수 있다.
표
Figure pct00014
아미노산은 공통의 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 상기 계열 중 하나의 일원을 또다른 계열로 교환하는 것을 수반할 것이다.
하나의 유형의 치환 변이체는 모체 항체 (예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체) 의 하나 이상의 과가변 영역 잔기의 치환을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구에 대해 선택된 산출되는 변이체(들) 은 모체 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가된 친화성, 감소된 면역원성) 에 개질 (예를 들어, 개선) 이 있을 것이고/거나 실질적으로 보유된 모체 항체의 특정 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체이며, 이것은 예를 들어, 파지 디스플레이-기반 친화성 성숙 기술, 예컨대 본원에 기재된 것들을 사용하여 통상적으로 생성될 수 있다. 간략하게는, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화성) 에 대해 스크리닝된다.
예를 들어, 항체 친화성을 개선하기 위해 HVR 에서 변경 (예를 들어, 치환) 이 일어날 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟 (hotspot)" 즉, 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기 (예를 들어, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196 참조), 및/또는 항체와 접촉하는 잔기 (산출되는 변이체 VH 또는 VL 은 결합 친화성에 대해 시험됨) 내에 일어날 수 있다. 2 차 라이브러리를 구축하고 재선택함에 의한 친화성 성숙은 예를 들어, 문헌 Hoogenboom, H.R. et al.. Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37 에 기재되어 있다. 친화성 성숙의 일부 구현예에서, 다양성을 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이생성) 에 의해 성숙에 대해 선택된 가변 유전자 내로 도입한다. 이후 2 차 라이브러리가 제작된다. 라이브러리는 이후 요망되는 친화성을 가진 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 스크리닝된다. 다양성을 도입하기 위한 또다른 방법은 여러 개의 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6 개의 잔기) 가 랜덤화되는 HVR-지정 접근법을 수반한다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는 예를 들어, 알라닌 스캔 돌연변이생성 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3 이 특히 종종 표적화된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 그러한 변형이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는다면 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공되는 바와 같은 보존적 치환) 이 HVR 에서 일어날 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어, HVR 내 항원 접촉 잔기의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각각의 HVR 은 비변형되거나, 1 개, 2 개 또는 3 개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이생성에 표적할 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 문헌 Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085 에 기재되는 바와 같이 "알라닌 스캔 돌연변이생성" 이라고 불린다. 본 방법에서, 표적 잔기의 잔기 또는 그룹 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu) 을 확인하고 중성 또는 음전하 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌) 에 의해 대체되어 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지를 결정한다. 추가의 치환이 초기 치환에 대한 기능적인 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉 점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조가 사용될 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환에 대한 후보자로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 요망되는 특성을 함유하는 지를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입에는 하나의 잔기에서 100 개 또는 그 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 까지의 길이의 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합 뿐 아니라, 단일 또는 복합 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된다. 말단 삽입의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 가진 항체가 포함된다. 항체 분자의 기타 삽입 변이체에는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (예를 들어, ADEPT 의 경우) 또는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합이 포함된다.
b) 글리코실화 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 범위를 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 제작되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc-영역을 포함하는 경우, 그곳에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생성되는 고유의 항체는 전형적으로 Fc-영역의 CH2 도메인의 Asn297 에 대한 N-연결에 의해 일반적으로 부착된 분지형, 2-안테나 올리고당을 포함한다. 예를 들어, 문헌 Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32 를 참조한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스, 및 시알산 뿐 아니라, 2-안테나 올리고당 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc 에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 내의 올리고당의 개질은 특정의 개선된 특성을 가진 항체 변이체를 제작하기 위해 일어날 수 있다.
하나의 구현예에서, Fc-영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코오스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체 내의 푸코오스의 양은 1 % 내지 80 %, 1 % 내지 65 %, 5 % 내지 65 % 또는 20 % 내지 40 % 일 수 있다. 푸코오스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546 에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 측정된 바와 같은 Asn 297 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고 만노오스 구조) 에 부착된 모든 당구조의 합에 대해, Asn297 에서 당 사슬 내의 푸코오스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297 은 Fc-영역 내 약 위치 297 (Fc-영역 잔기의 EU 번호지정) 에 위치한 아스파라긴 잔기를 말하나, 항체 내의 미미한 서열 변화로 인해 Asn297 은 또한 위치 297 의 약 ± 3 아미노산 업스트림 또는 다운스트림, 즉, 위치 294 와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, US 2003/0157108; US 2004/0093621 을 참조한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코오스-결핍" 항체 변이체와 관련된 공개문헌의 예에는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622 이 포함된다. 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108; 및 WO 2004/056312, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스페라아제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y.et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; 및 WO 2003/085107 참조) 가 포함된다.
항체 변이체는, 예를 들어, 항체의 Fc-영역에 부착된 2-안테나 올리고당이 GlcNAc 에 의해 이등분되는 이등분된 올리고당과 함께 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어, WO 2003/011878; US 6,602,684; 및 US 2005/0123546 에 기재된다. Fc-영역에 부착된 올리고당 내에 하나 이상의 갈락토오스 잔기를 가진 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764 에 기재된다.
c) Fc-영역 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 추가의 아미노산 개질이 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드 내로 도입되어, 이에 의해 Fc-영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc-영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 개질 (예를 들어, 치환/돌연변이) 을 포함하는 인간 Fc-영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc-영역) 으로부터 유래될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 일부의 효과기 작용을 가지나 모든 효과기 작용을 갖지는 않은 이종이량체성 폴리펩티드를 고려하고, 이것은 생체 내 상기 이량체성 폴리펩티드의 반감기가 중요하지만 특정한 효과기 작용 (예컨대 CDC 및 ADCC) 이 불필요하거나 유해한 적용을 위한 바람직한 후보자로 만든다. 시험관 내 및/또는 생체 내 세포독성 어세이가 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 어세이는 이종이량체성 폴리펩티드 항체에 FcγR 결합이 결핍되나 (따라서 아마도 ADCC 활성이 결핍), FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 확보하기 위해 수행될 수 있다. ADCC 를 매개하기 위한 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492 의 464 페이지에 있는 표 3 에 요약된다. 관심의 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관 내 어세이의 비-제한적인 예는 US 5,500,362 (예를 들어, Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; 및 Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502 참조); US 5,821,337 (참조, Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361) 에 기재된다. 대안적으로는, 비-방사능 어세이 방법이 사용될 수 있다 (참조, 예를 들어, 유세포분석을 위한 ACTI™ 비-방사능 세포독성 어세이 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 및 CytoTox 96® 비-방사능 세포독성 어세이 (Promega, Madison, WI). 이러한 어세이에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (Natural Killer: NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 관심의 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어, 문헌 Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656 에 기재된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. C1q 결합 어세이는 또한 이량체성 폴리펩티드가 C1q 에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여된 것을 확인하기 위해 실시될 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402 에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA 를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 어세이가 수행될 수 있다 (예를 들어, Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743 참조). FcRn 결합 및 생체 내 소거/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769 참조).
감소된 효과기 작용을 가진 이종이량체성 폴리펩티드에는 Fc-영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 가진 것이 포함된다 (US 6,737,056). 이러한 Fc-영역 변이체에는 잔기 265 및 297 의 알라닌으로의 치환을 가진 소위 "DANA" Fc-영역 돌연변이체를 포함하는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2 개 이상에서의 치환을 가진 Fc-영역이 포함된다 (US 7,332,581).
FcRs 에 대한 결합이 개선된 또는 소실된 특정 항체 변이체가 기재된다 (예를 들어, US 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 참조).
특정 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩티드 변이체는 ADCC 를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc-영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 EU 번호지정) 에서의 치환을 가진 Fc-영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, US 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184 에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 소실된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 을 산출하는, Fc-영역 내의 변경을 일으킨다.
태아에 대한 모체 IgG 의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 증가된 반감기 및 개선된 결합을 가진 항체 (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, 및 Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434) 는 US 2005/0014934 에 기재된다. 상기 항체는 Fc-영역의 FcRn 에 대한 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 가진 Fc-영역을 포함한다. 이러한 Fc-영역 변이체에는 Fc-영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어, Fc-영역 잔기 434 의 치환을 가진 것이 포함된다 (US 7,371,826).
또한 Fc-영역 변이체의 다른 예를 다루는 문헌 Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; 및 WO 94/29351 을 참조한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 구현예에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된, 예를 들어, "thioMAb" 와 유사한, 시스테인 조작된 이종이량체성 폴리펩티드를 제작하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 치환된 잔기는 이종이량체성 폴리펩티드의 접근가능한 부위에서 일어난다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기가 이에 의해 이종이량체성 폴리펩티드의 접근가능한 부위에 위치하고, 본원에 추가로 기재되는 바와 같이 면역콘쥬게이트를 제작하기 위해, 이종이량체성 폴리펩티드를 다른 부분, 예컨대 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 콘쥬게이션하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 하기 잔기 중 임의의 하나 이상은 시스테인: 경쇄의 V205 (Kabat 번호지정); 중쇄의 A118 (EU 번호지정); 및 중쇄 Fc-영역의 S400 (EU 번호지정) 으로 치환될 수 있다. 시스테인 조작된 이량체성 폴리펩티드는, 예를 들어, US 7,521,541 에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
e) 유도체
특정 구현예에서, 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드는 당업계에 공지되고 쉽게 이용가능한 부가적인 비-단백질성 부분을 함유하도록 추가로 개질될 수 있다. 이종이량체성 폴리펩티드의 유도체화에 적합한 부분은 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체의 비-제한적인 예에는 제한 없이, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 프롤리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공-중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이의 혼합물이 포함된다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드가 물 중의 이의 안정성으로 인해 제조에 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량의 것일 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 이량체성 폴리펩티드에 부착된 중합체의 수는 달라질 수 있고, 1 개 초과의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일한 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 제한 없이, 개선하고자 하는 이량체성 폴리펩티드의 특정한 특성 또는 기능, 이량체성 폴리펩티드 유도체가 정의된 조건 하에서 요법에 사용될지의 여부, 등을 포함하여 고려해서 결정될 수 있다.
또다른 구현예에서, 방사능에 대한 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드 및 비-단백질성 부분의 콘쥬게이트가 제공된다. 하나의 구현예에서, 비-단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다 (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). 방사능은 임의의 파장의 것일 수 있고, 제한 없이, 보통 세포에 유해를 가하지 않지만, 비-단백질성 부분을 이량체성 폴리펩티드-비-단백질성 부분과 근접한 세포가 치사되는 온도로 가열하는 파장이 포함된다.
f) 이종이량체화
예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO 96/27011호, 국제 특허출원 공개 제WO 98/050431호, 유럽 특허 제 1870459호, 국제 특허출원 공개 제WO 2007/110205호, 국제 특허출원 공개 제WO 2007/147901호, 국제 특허출원 공개 제WO 2009/089004호, 국제 특허출원 공개 제WO 2010/129304호, 국제 특허출원 공개 제WO 2011/90754호, 국제 특허출원 공개 제WO 2011/143545호, 국제 특허출원 공개 제WO 2012/058768호, 국제 특허출원 공개 제WO 2013/157954호 및 국제 특허출원 공개 제WO 2013/096291호에 잘 기재되어 있는, 이종이량체화하도록 CH3 을 변형시키는 여러 방법들이 존재한다. 전형적으로 모든 이러한 방법들에서, 각각의 CH3-도메인 (또는 이를 포함하는 중쇄) 이 그 자신과 더 이상 단독이량체화할 수 없으나 상보적인 조작된 다른 CH3-도메인과 이종이량체화하도록 (즉, 제 1 CH3-도메인 및 제 2 CH3-도메인이 이종이량체화하고 2 개의 제 1 CH3-도메인들 또는 2 개의 제 2 CH3-도메인들 사이에 단독이량체가 형성되지 않도록) 상보적인 방식으로 제 1 CH3-도메인 및 제 2 CH3-도메인 둘 다가 조작된다. 개선된 중쇄 이종이량체화를 위한 이 다양한 방법들은 본 발명에 따른 다중특이적 항체에서 중쇄-경쇄 변형 (1개의 결합 아암에서 VH 및 VL 교환/교체, 및 CH1/CL 계면에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 치환의 도입)과 함께 경쇄 미스페어링 (mispairing) 벤스-존스 (Bence-Jones) 유형 부산물을 감소시키는 다양한 대안으로서 고려된다.
본 발명의 하나의 바람직한 구현예에서 (다중특이적 항체가 중쇄에서 CH3-도메인을 포함하는 경우), 본 발명에 따른 상기 이종이량체성 폴리펩티드의 CH3-도메인은 예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO 96/027011호, 문헌 (Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621), 문헌 (Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681) 및 국제 특허출원 공개 제WO 98/050431호에 여러 예로 상세히 기재되어 있는 "놉-인투-홀" 기술에 의해 변경될 수 있다. 이 방법에서, 2 개의 CH3-도메인들의 상호작용 표면은 이 2 개의 CH3-도메인들을 함유하는 2 개의 중쇄들의 이종이량체화를 증가시키도록 변경된다. (2 개의 중쇄들의) 2 개의 CH3-도메인들 각각은 "놉" 일 수 있는 반면, 나머지 CH3-도메인은 "홀" 이다. 디술피드 가교의 도입은 이종이량체를 더 안정화시키고 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) 수율을 증가시킨다.
따라서, 본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 이종이량체성 폴리펩티드는 (각각의 중쇄에서 CH3-도메인을 포함하고)
a) 의 항체의 제 1 중쇄의 제 1 CH3-도메인 및 b) 의 항체의 제 2 중쇄의 제 2 CH3-도메인 각각이 항체 CH3-도메인들 사이의 원래 계면을 포함하는 계면에서 만나는 것을 추가 특징으로 하고,
이때 상기 계면은 다중특이적 항체의 형성을 촉진하도록 변경되고, 이때 상기 변경은
i) 다중특이적 항체 내의 다른 중쇄의 CH3-도메인의 원래 계면과 만나는 한 중쇄의 CH3-도메인의 원래 계면 내에서 아미노산 잔기가 보다 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 다른 중쇄의 CH3-도메인의 계면 내의 캐비티에 위치할 수 있는 돌출부를 한 중쇄의 CH3-도메인의 계면 내에서 발생시키도록 한 중쇄의 CH3-도메인이 변경되고,
ii) 다중특이적 항체 내의 제 1 CH3-도메인의 원래 계면과 만나는 제 2 CH3-도메인의 원래 계면 내에서 아미노산 잔기가 보다 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 제 1 CH3-도메인의 계면 내의 돌출부가 위치할 수 있는 캐비티를 제 2 CH3-도메인의 계면 내에서 발생시키도록 다른 중쇄의 CH3-도메인이 변경되는 것을 추가 특징으로 한다.
바람직하게는, 보다 더 큰 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 트립토판 (W) 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 보다 더 작은 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T) 및 발린 (V) 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 양상에서, 2 개의 CH3-도메인들은 2 개의 CH3-도메인들 사이의 디술피드 가교가 형성될 수 있도록 각각의 CH3-도메인의 상응하는 위치에서 시스테인 (C) 을 아미노산으로서 도입함으로써 더 변경된다.
하나의 바람직한 구현예에서, 상기 이종이량체성 폴리펩티드는 "놉 쇄" 의 제 1 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 T366W 를 포함하고 "홀 쇄" 의 제 2 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 를 포함한다. 예를 들어, 아미노산 돌연변이 Y349C 를 "홀 쇄" 의 CH3-도메인 내로 도입하고 아미노산 돌연변이 E356C 또는 아미노산 돌연변이 S354C 를 "놉 쇄" 의 CH3-도메인 내로 도입함으로써 CH3-도메인들 사이의 추가 쇄간 디술피드 가교도 사용할 수 있다 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681).
하나의 바람직한 구현예에서, (각각의 중쇄에서 CH3-도메인을 포함하는) 상기 이종이량체성 폴리펩티드는 2 개의 CH3-도메인들 중 하나에서 아미노산 돌연변이 S354C 및 T366W 를 포함하고 2 개의 CH3-도메인들 중 나머지 하나에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 를 포함한다 (한 CH3-도메인에서의 추가 아미노산 돌연변이 S354C 및 다른 CH3-도메인에서의 추가 아미노산 돌연변이 Y349C 는 쇄간 디술피드 가교를 형성함) (Kabat 에 따른 번호지정).
이종이량체화하도록 CH3 을 변형시키는 다른 기법은 본 발명의 대안으로서 고려되고, 예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO 96/27011호, 국제 특허출원 공개 제WO 98/050431호, 유럽 특허 제 1870459호, 국제 특허출원 공개 제WO 2007/110205호, 국제 특허출원 공개 제WO 2007/147901호, 국제 특허출원 공개 제WO 2009/089004호, 국제 특허출원 공개 제WO 2010/129304호, 국제 특허출원 공개 제WO 2011/90754호, 국제 특허출원 공개 제WO 2011/143545호, 국제 특허출원 공개 제WO 2012/058768호, 국제 특허출원 공개 제WO 2013/157954호 및 국제 특허출원 공개 제WO 2013/096291호에 기재되어 있다.
하나의 구현예에서, 유럽 특허 제 1 870 459A1호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다. 이 방법은 2 개의 중쇄들 사이의 CH3/CH3-도메인 계면의 특정 아미노산 위치에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 치환/돌연변이의 도입에 근거한다. 상기 이종이량체성 폴리펩티드에 대한 하나의 바람직한 구현예는 다중특이적 항체의 제 1 CH3-도메인 내의 아미노산 돌연변이 R409D 및 K370E; 및 다중특이적 항체의 제 2 CH3-도메인 내의 아미노산 돌연변이 D399K 및 E357K (Kabat 에 따른 번호지정)이다.
또 다른 구현예에서, 상기 이종이량체성 폴리펩티드는 "놉 쇄" 의 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 T366W 를 포함하고 "홀 쇄" 의 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 를 포함하고, "놉 쇄" 의 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 R409D 및 K370E 를 추가로 포함하고 "홀 쇄" 의 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 D399K 및 E357K 를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 이종이량체성 폴리펩티드는 2 개의 CH3-도메인들 중 하나에서 아미노산 돌연변이 S354C 및 T366W 를 포함하고 2 개의 CH3-도메인들 중 나머지 하나에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 를 포함하거나, 상기 다중특이적 항체는 2 개의 CH3-도메인들 중 하나에서 아미노산 돌연변이 Y349C 및 T366W 를 포함하고 2 개의 CH3-도메인들 중 나머지 하나에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 를 포함하고, "놉 쇄" 의 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 R409D 및 K370E 를 추가로 포함하고 "홀 쇄" 의 CH3-도메인에서 아미노산 돌연변이 D399K 및 E357K 를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 국제 특허출원 공개 제WO 2013/157953호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 제 1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 T366K 를 포함하고, 제 2 CH3-도메인 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 L351D 를 포함한다. 추가 구현예에서, 제 1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 L351K 를 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 제 2 CH3-도메인은 Y349E, Y349D 및 L368E 로부터 선택된 아미노산 돌연변이(바람직하게는 L368E) 를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 국제 특허출원 공개 제WO 2012/058768호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 제 1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y 및 Y407A 를 포함하고, 제 2 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 T366A 및 K409F 를 포함한다. 추가 구현예에서, 제 2 CH3-도메인은 위치 T411, D399, S400, F405, N390 또는 K392 에서 예를 들어, a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E 또는 T411W, b) D399R, D399W, D399Y 또는 D399K, c) S400E, S400D, S400R 또는 S400K; d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V 또는 F405W; e) N390R, N390K 또는 N390D; 또는 f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F 또는 K392E 로부터 선택된 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다. 추가 구현예에서, 제 1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y 및 Y407A 를 포함하고, 제 2 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 T366V 및 K409F 를 포함한다. 추가 구현예에서, 제 1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A 를 포함하고, 제 2 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 T366A 및 K409F 를 포함한다. 추가 구현예에서, 제 2 CH3-도메인은 추가 아미노산 돌연변이 K392E, T411E, D399R 및 S400R 을 포함한다.
하나의 구현예에서, 국제 특허출원 공개 제WO 2011/143545호에 기재된 이종이량체화 방법을 예를 들어, 368 및 409 로 이루어지는 군으로부터 선택된 위치에서의 아미노산의 변형과 함께 대안적으로 이용할 수 있다.
하나의 구현예에서, 전술된 놉-인투-홀 기술도 이용하는 국제 특허출원 공개 제WO 2011/090762호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 제 1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 T366W 를 포함하고 제 2 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A 를 포함한다. 하나의 구현예에서, 제 1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 T366Y 를 포함하고 제 2 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 Y407T 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 다중특이적 항체는 IgG2 동종형의 항체이고, 국제 특허출원 공개 제WO 2010/129304호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다.
하나의 구현예에서, 국제 특허출원 공개 제WO 2009/089004호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 제 1 CH3-도메인은 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D)) 에 의한 K392 또는 N392 의 아미노산 치환, 바람직하게는 K392D 또는 N392D 를 포함하고, 제 2 CH3-도메인은 양으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 라이신 (K) 또는 아르기닌 (R)) 에 의한 D399, E356, D356 또는 E357 의 아미노산 치환, 바람직하게는 D399K, E356K, D356K 또는 E357K, 보다 바람직하게는 D399K 및 E356K 를 포함한다. 추가 구현예에서, 제 1 CH3-도메인은 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D)) 에 의한 K409 또는 R409 의 아미노산 치환, 바람직하게는 K409D 또는 R409D 를 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 제 1 CH3-도메인은 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D)) 에 의한 K439 및/또는 K370 의 아미노산 치환을 추가로 또는 대안적으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 국제 특허출원 공개 제WO 2007/147901호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 제 1 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 K253E, D282K 및 K322D 를 포함하고, 제 2 CH3-도메인은 아미노산 돌연변이 D239K, E240K 및 K292D 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 국제 특허출원 공개 제WO 2007/110205호에 기재된 이종이량체화 방법을 대안적으로 이용할 수 있다.
E. 재조합 방법 및 조성물
항체는 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물의 사용을 통해 제조될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산(들)이 제공된다. 이러한 핵산은 이종이량체성 폴리펩티드의 제 1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 이종이량체성 폴리펩티드의 제 2 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 추가 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 가 제공된다. 추가 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 (1) 이종이량체성 폴리펩티드의 제 1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열 및 이종이량체성 폴리펩티드의 제 2 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 이종이량체성 폴리펩티드의 제 1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 이종이량체성 폴리펩티드의 제 2 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 상기 (1) 또는 (2) 의 벡터로 형질전환되어 있다). 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포) 이다. 하나의 구현예에서, 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 제공된 이종이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 상기 이종이량체성 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 임의적으로 상기 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드의 재조합 제조를 위해, 예를 들어, 전술된 바와 같은 이종이량체성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 단리하고 추가 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 변이체 Fc-영역 폴리펩티드(들), 및 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 이러한 핵산을 용이하게 단리할 수 있고 서열결정할 수 있다.
이종이량체성 폴리펩티드 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우 이종이량체성 폴리펩티드를 박테리아에서 제조할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는 예를 들어, 미국 특허 제5,648,237호, 미국 특허 제5,789,199호 및 미국 특허 제5,840,523호를 참조한다 (에스케리치아 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 (Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254) 또한 참조). 발현 후, 이종이량체성 폴리펩티드를 가용성 분획 중의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리할 수 있고 더 정제할 수 있다.
원핵 세포 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 있어 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 이량체성 폴리펩티드를 생성하는 진균 및 효모 균주를 포함하는 진핵 미생물, 예컨대, 사상 진균 또는 효모가 이량체성 폴리펩티드 코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌 (Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414); 및 문헌 (Li, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215) 을 참조한다.
글리코실화된 이종이량체성 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 로부터도 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 세포 및 곤충 세포가 포함된다. 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는, 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주들이 확인되어 있다.
식물 세포 배양물도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,959,177호, 미국 특허 제6,040,498호, 미국 특허 제6,420,548호, 미국 특허 제7,125,978호 및 미국 특허 제6,417,429호 (유전자이식 식물에서 항체를 제조하는 PLANTIBODIES™ 기술이 기재되어 있음) 를 참조한다.
척추동물 세포도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 생장하도록 개조된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 (Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74)) 에 기재된 HEK293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 (Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252)에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유선 종양 (MMT 060562); 예를 들어, 문헌 (Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68) 에 기재된 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포 (Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220) 를 포함하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대, Y0, NS0 및 Sp2/0 을 포함한다. 항체 제조에 적합한 일부 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는 예를 들어, 문헌 (Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268) 을 참조한다.
F. 조합 치료
특정 구현예에서, 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드 또는 본원에 보고된 약학 제형은 본원에 기재된 하나 이상의 안구 혈관 질환의 치료를 위해 (추가 치료제 없이) 단독으로 투여된다.
다른 구현예에서, 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드 항체 또는 약학 제형은 본원에 기재된 하나 이상의 안구 혈관 질환의 치료를 위해 하나 이상의 추가 치료제 또는 치료 방법과 함께 투여된다.
다른 구현예에서, 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드 또는 약학 제형은 하나 이상의 추가 치료제와 함께 제형화되고 본원에 기재된 하나 이상의 안구 혈관 질환의 치료를 위해 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 조합 치료는 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드 또는 약학 제형이 본원에 기재된 하나 이상의 안구 혈관 질환의 치료를 위해 하나 이상의 추가 치료제와 순차적으로 투여되는 것을 포함한다.
추가 치료제는 하기 치료제들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 트립토파닐-tRNA 신테타아제 (TrpRS), EyeOO1 (항-VEGF PEG화된 앱타머), 스쿠알라민, RETAANE™ (데포 현탁액을 위한 아네코르타브 (anecortave) 아세테이트; 알콘 인코포레이티드 (Alcon, Inc.)), 콤브레타스타틴 A4 전구약물 (CA4P), MACUGEN™, MIFEPREX™ (미페프리스톤-ru486), 수브테논 (subtenon) 트라이암시놀론 아세토나이드, 유리체내 결정질 트라이암시놀론 아세토나이드, 프리노마스타트 (Prinomastat) (AG3340-합성 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 화이자 (Pfizer)), 플루오시놀론 아세토나이드 (플루오시놀론 눈내 이식재를 포함함, 바슈 앤드 롬/콘트롤 딜리버리 시스템스 (Bausch & Lomb/Control Delivery Systems)), VEGFR 억제제 (수젠(Sugen)), VEGF-Trap (리제네론/아벤티스 (Regeneron/Aventis)), VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제, 예컨대, 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린 (ZD6474), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)퀴나졸린 (AZD2171), 바탈라닙 (PTK787) 및 SU1 1248 (수니티닙), 리노마이드, 및 인테그린 v.베타.3 기능의 억제제 및 안지오스타틴.
본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드 또는 약학 제형과 함께 사용될 수 있는 다른 약학 요법은 하기 요법들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 비-열 레이저의 사용과 함께 VISUDYNE™, PKC 412, 엔도비온 (Endovion) (뉴로서치 (NeuroSearch) A/S), 신경영양 인자 (예를 들어, 아교세포 유래의 신경영양 인자 및 섬모 신경영양 인자를 포함함), 다이아타젬 (diatazem), 도르졸라마이드 (dorzolamide), 포토트롭 (Phototrop), 9-시스-레티날 (cis-retinal), 포스폴린 요오다이드 또는 에코티오페이트 또는 카보닉 안하이드라제 (carbonic anhydrase) 억제제를 비롯한 안약 (에코 요법을 포함함), AE-941 (애터나 라보라토리스 인코포레이티드 (AEterna Laboratories, Inc.)), 시르나(Sirna)-027 (시마 쎄라퓨틱스 인코포레이티드 (Sima Therapeutics, Inc.)), 페갑타닙 (pegaptanib) (넥스스타 파마슈티칼스 (NeXstar Pharmaceuticals)/길리드 사이언시스(Gilead Sciences)), 뉴로트로핀 (예를 들어, NT-4/5를 포함함 (제넨테크 (Genentech)), Cand5 (액큐어티 파마슈티칼스 (Acuity Pharmaceuticals)), INS-37217 (인스파이어 파마슈티칼스 (Inspire Pharmaceuticals)), 인테그린 길항제 (제리니 아게 (Jerini AG) 및 애보트 라보라토리스 (Abbott Laboratories) 의 인테그린 길항제를 포함함), EG-3306 (아크 쎄라퓨틱스 리미티드 (Ark Therapeutics Ltd.)), BDM-E (바이오다이엠 리미티드 (BioDiem Ltd.)), 탈리도마이드 (thalidomide) (예를 들어, 엔트레메드 인코포레이티드 (EntreMed, Inc.) 에 의해 사용된 바와 같음), 카디오트로핀(cardiotrophin)-1 (제넨테크), 2-메톡시에스트라다이올 (알레르간(Allergan)/오큘렉스(Oculex)), DL-8234 (토레이 인더스트리스 (Toray Industries)), NTC-200 (뉴로텍(Neurotech)), 테트라티오몰리브데이트 (미시간 대학), LYN-002 (린케우스 바이오텍 (Lynkeus Biotech)), 마이크로알갈 (microalgal) 화합물 (아쿠아서치(Aquasearch)/알바니(Albany), 메라 파마슈티칼스 (Mera Pharmaceuticals)), D-9120 (셀텍 그룹 피엘씨(Celltech Group plc)), ATX-S10(하마마쓰 포토닉스 (Hamamatsu Photonics)), TGF-베타 2 (젠자임(Genzyme)/셀트릭스(Celtrix)), 티로신 키나제 억제제 (알레르간, 수젠, 화이자), NX-278-L (넥스스타 파마슈티칼스/길리드 사이언시스), Opt-24 (옵티스 프랑스 에스에이(OPTIS France SA)), 망막 세포 신경절 신경보호제 (코젠트 뉴로사이언시스 (Cogent Neurosciences)), N-니트로피라졸 유도체 (텍사스 A&M 유니버시티 시스템), KP-102 (크레니트스카이 파마슈티칼스 (Krenitsky Pharmaceuticals)), 사이클로스포린 A, 티미티드 (Timited) 망막 전위, 광역학 요법 (예를 들어, 수용체-표적화된 PDT (브리스톨-메이어스 스퀴브 컴파니 (Bristol-Myers Squibb, Co.)); PDT와 함께 주사될 포피머 (porfimer) 나트륨; 베르테포핀 (verteporfin) (큐엘티 인코포레이티드 (QLT Inc.)); PDT와 함께 로스타포핀 (rostaporfin) (미라벤트 메디칼 테크놀로지스 (Miravent Medical Technologies)); PDT 와 함께 탈라포핀 (talaporfin) 나트륨 (니폰 페트롤레움 (Nippon Petroleum)); 및 모텍사핀 루테티움 (motexafin lutetium) (파마사이클릭스 인코포레이티드 (Pharmacyclics, Inc.))을 포함함), 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 노바갈리 파마 에스에이 (Novagali Pharma SA) 에 의해 시험된 제품, 및 ISIS-13650 (이이시스 파마슈티칼스 (Isis Pharmaceuticals)) 을 포함함), 레이저 광응고, 드루젠 레이저링, 황반 원공 수술, 황반 전위 수술, 이식가능한 소형 망원경, 파이-모션 (Phi-Motion) 혈관조영술 (마이크로레이저 치료 및 영양세포 혈관 치료로서도 공지되어 있음), 양성자 광선 요법, 마이크로자극 요법, 망막 탈착 및 유리체 수술, 공막돌륭술, 황반하 수술, 경동공 온열요법, 광시스템 I 요법, RNA 간섭 (RNAi) 의 이용, 체외 혈액분리반출 (막 분별 여과 및 유동치료로서도 공지되어 있음), 마이크로칩 이식, 줄기세포 요법, 유전자 대체 요법, 리보자임 유전자 요법 (저산소증 반응 요소를 위한 유전자 요법 (옥스포드 바이오메디카 (Oxford Biomedica)); 렌티팍 (Lentipak) (제네틱스 (Genetix)); 및 PDEF 유전자 요법 (젠벡 (GenVec)) 를 포함함), 광수용체/망막 세포 이식 (이식가능한 망막 상피세포 (다이아크린 인코포레이티드 (Diacrin, Inc.)); 및 망막 세포 이식물 (셀 제네시스 인코포레이티드 (Cell Genesys, Inc.)) 을 포함함) 및 침술.
문헌 (Carmeliet and Jain, Nature 407: (2000) 249-257) 에 나열된 항-혈관신생 물질들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 항-혈관신생 물질이 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드 또는 약학 제형과 함께 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 항-혈관신생 물질은 또 다른 VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제, 예컨대, VEGF 변이체, 가용성 VEGF 수용체 단편, VEGF 또는 VEGFR 을 차단할 수 있는 앱타머, 중화 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제의 저분자량 억제제 및 이들의 임의의 조합물이고, 이들은 항-VEGF 앱타머 (예를 들어, 페갑타닙) 및 가용성 재조합 유인 수용체 (예를 들어, VEGF 트랩) 을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-혈관신생 물질은 코르티코스테로이드, 혈관신생억제성 스테로이드, 아네코르타브 아세테이트, 안지오스타틴, 엔도스타틴, VEGFR 또는 VEGF 리간드의 발현을 감소시키는 작은 간섭 RNA, 티로신 키나제 억제제를 사용한 후-VEGFR 차단, MMP 억제제, IGFBP3, SDF-1 차단제, PEDF, 감마-세크레타제, 델타 유사 리간드 4, 인테그린 길항제, HIF-1 알파 차단, 단백질 키나제 CK2 차단, 및 혈관 내피 캐드헤린 (CD-144) 및 간질 유래의 인자 (SDF)-I 항체를 사용한 신생혈관형성 부위로 향하는 줄기세포 (즉, 내피 전구세포) 의 억제를 포함한다. VEGF 수용체를 표적화하는 소분자 RTK 억제제 (PTK787 을 포함함) 도 사용될 수 있다. 반드시 항-VEGF 화합물은 아니지만 신생혈관형성에 대한 활성을 갖는 물질도 사용될 수 있고 소염 약물, m-Tor 억제제, 라파마이신, 에버롤리무스, 템시롤리무스, 사이클로스포린, 항-TNF 물질, 항-보체 물질 및 비-스테로이드성 소염제를 포함할 수 있다. 신경보호성을 나타내고 건성 황반 변성의 진행을 잠재적으로 감소시킬 수 있는 물질, 예컨대, "뉴로스테로이드(neurosteroid)" 로서 지칭되는 부류의 약물도 사용될 수 있다. 이들은 디히드로에피안드로스테론 (DHEA) (상표명: 프라스테라 (Prastera)(R) 및 피델린 (Fidelin)(R)), 디히드로에피안드로스테론 술페이트 및 프레그네놀론 술페이트와 같은 약물을 포함한다. 단독으로 사용되거나 임의의 조합물로 PDT, 페갑타닙 나트륨, 아연 또는 항산화제(들)와 함께 사용되는 베르테포린을 포함하나 이것으로 한정되지 않는 임의의 AMD (연령 관련 황반 변성) 치료제가 본원에 보고된 이량체성 폴리펩티드 또는 약학 제형과 함께 사용될 수 있다.
G. 약학 제형
본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드의 약학 제형은 원하는 순도를 갖는 이러한 이종이량체성 폴리펩티드를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)) 와 혼합함으로써, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 일반적으로 무독성이고, 제한 없이: 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10 개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 이 포함된다. 본원에서 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체에는 추가로 사이질 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.) 이 포함된다. rhuPH20 을 포함하여, 특정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968 에 기재되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP 는 하나 이상의 부가적인 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형은 US 6,267,958 에 기재되어 있다. 수성 항체 제형에는 US 6,171,586 및 WO 2006/044908 에 기재된 것에 포함되고, 마지막에 기재된 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료하고자 하는 특정 징후에 필수적인 1 개 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로에게 부작용을 주지 않는 상보적 활성을 가진 것들을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도되는 목적에 대해 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸 셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980) 에 기재된다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 형상을 가진 제품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체 내 투여에 사용하고자 하는 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
VI. 치료 방법 및 조성물
본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드들 중 임의의 이종이량체성 폴리펩티드가 치료 방법에서 사용될 수 있다.
하나의 양상에서, 약제로서 사용되는 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드가 제공된다. 추가 양상에서, 안구 혈관 질환의 치료에 사용되는 이종이량체성 폴리펩티드가 제공된다. 특정 구현예에서, 치료 방법에서 사용되는 이종이량체성 폴리펩티드가 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 유효량의 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를, 안구 혈관 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에서 사용되는 이종이량체성 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 하나의 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어, 상기 단락 D 에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제를 상기 개체에게 유효량으로 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 본 발명은 눈에서 혈관신생을 억제하는 데 사용하기 위한 이종이량체성 폴리펩티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 유효량의 이종이량체성 폴리펩티드를 개체에게 투여하여 혈관신생을 억제하는 단계를 포함하는, 개체에서 혈관신생을 억제하는 방법에서 사용되는 이종이량체성 폴리펩티드를 제공한다. 상기 구현예들 중 임의의 구현예에 따른 "개체" 는 하나의 바람직한 구현예에서 인간이다.
추가 양상에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에 있어서 이종이량체성 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 하나의 구현예에서, 약제는 안구 혈관 질환의 치료를 위한 약제이다. 추가 구현예에서, 약제는 유효량의 약제를, 안구 혈관 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 안구 혈관 질환의 치료 방법에서 사용되는 약제이다. 이러한 하나의 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어, 전술된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제를 상기 개체에게 유효량으로 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 약제는 혈관신생의 억제를 위한 약제이다. 추가 구현예에서, 약제는 유효량의 약제를 개체에게 투여하여 혈관신생을 억제하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 혈관신생을 억제하는 방법에서 사용되는 약제이다. 상기 구현예들 중 임의의 구현예에 따른 "개체" 는 인간일 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 안구 혈관 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 유효량의 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를, 이러한 안구 혈관 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 하나의 구현예에서, 상기 방법은 후술된 바와 같이 유효량의 하나 이상의 추가 치료제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 구현예들 중 임의의 구현예에 따른 "개체" 는 인간일 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 개체의 눈에서 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 유효량의 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드를 개체에게 투여하여 혈관신생을 억제하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, "개체" 는 인간이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 예를 들어, 상기 치료 방법 중 임의의 것에 사용하기 위한, 본원에 보고되는 이종이량체성 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함하는 약학 제형을 제공한다. 하나의 구현예에서, 약학 제형은 본원에 보고되는 이종이량체성 폴리펩티드 중 임의의 것 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또다른 구현예에서, 약학 제형은 본원에 보고되는 이종이량체성 폴리펩티드 중 임의의 것 및 예를 들어, 하기에 기재되는 바와 같은 하나 이상의 부가적인 치료제를 포함한다.
본원에 보고되는 이종이량체성 폴리펩티드는 요법에서 단독으로 또는 다른 작용제와 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 보고되는 이종이량체성 폴리펩티드는 하나 이상의 부가적인 치료제와 공동-투여될 수 있다.
본원에 보고되는 이종이량체성 폴리펩티드 (및 임의의 부가적인 치료제) 는 비경구, 폐내, 및 비강내 및, 국부 치료가 요망되는 경우, 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 부분적으로, 투여가 간략한지 또는 만성인지에 따라, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주입과 같은 주입에 의해 임의의 적합한 경로에 의해 투약될 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 복합 투여, 볼루스 (bolus) 투여, 및 펄스 투입을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.
본원에 보고되는 이종이량체성 폴리펩티드는 양호한 의료적 실시와 일관되는 방식으로 제형화되고, 투약되고, 투여될 것이다. 본 문맥에서 고려 인자에는 치료하고자 하는 특정 장애, 치료하고자 하는 특정 포유류, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료인에게 공지된 다른 인자가 포함된다. 이종이량체성 폴리펩티드는 논의의 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제일 필요는 없으나, 임의로 제형화된다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 이종이량체성 폴리펩티드의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 인자에 따라 다르다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투약량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투약량의 약 1 내지 99 % 로, 또는 적합한 것으로 경험적으로/임상적으로 결정된 임의의 투약량 또는 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드의 적합한 투약량 (단독으로 또는 하나 이상의 기타 부가적인 치료제와 조합으로 사용되는 경우) 은 치료하고자 하는 질환의 유형, 이종이량체성 폴리펩티드의 유형, 질환의 심각도 및 경과, 이종이량체성 폴리펩티드가 예방적 또는 치료적 목적에 따라 투여되는 지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상적 이력 및 이종이량체성 폴리펩티드에 대한 반응, 및 참여하는 의사의 재량에 따라 다를 것이다. 이종이량체성 폴리펩티드는 1 회로 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 심각도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.5 mg/kg - 10 mg/kg) 의 이종이량체성 폴리펩티드가, 예를 들어, 하나 이상의 개별적 투여에 의한 것인지, 또는 연속 투입에 의한 것인지에 따라, 환자에 대한 투여를 위한 초기 후보 투약량일 수 있다. 하나의 전형적인 일일 투약량은 상기 언급된 인자에 따라, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수 일 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 조건에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 이종이량체성 폴리펩티드의 하나의 예시적인 투약량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이의 임의의 조합) 의 하나 이상의 투약량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투약량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 매 3 주 (예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어, 약 6 투약량의 이량체성 폴리펩티드를 수여받는 식으로) 투여될 수 있다. 초기의 높은 적재 투약량 후, 하나 이상의 적은 투약량이 투여될 수 있다. 상기 요법의 진행은 통상의 기술 및 어세이에 의해 쉽게 모니터링된다.
III. 제조품
본 발명의 또다른 양상에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 재료를 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기 및 용기와 연합되거나 용기 위에 있는 라벨 또는 패키지를 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 제형 그 자체 또는 상태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 유효한 또다른 조성물과 조합된 조성물을 담고 있고 멸균 접근 포트 (예를 들어 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 가진 바이알일 수 있음) 를 가질 수 있다. 조성물 중의 하나 이상의 활성제는 본원에 보고되는 이종이량체성 폴리펩티드이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용되는 것을 나타낸다. 게다가, 제조품은 (a) 내부에 함유된 조성물이 있는 제 1 용기로서, 상기 조성물은 본원에 보고되는 이종이량체성 폴리펩티드를 포함하는 제 1 용기; 및 (b) 내부에 함유된 조성물이 있는 제 2 용기로서, 상기 조성물은 추가의 그밖의 치료제를 포함하는 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 본 구현예에서 제조품은 조성물이 특정 상태를 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 제조품은 추가로 약학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대 주사용 박테리아발육저지수 (BWFI), 인산염-완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로오스 용액을 포함하는 제 2 (또는 제 3) 용기를 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
상기 제품들 중 임의의 제품은 본원에 보고된 이종이량체성 폴리펩티드 대신에 또는 이외에 본원에 보고된 면역접합체를 포함할 수 있다는 것이 이해된다.
IV. 실시예
하기 내용은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적인 설명을 고려할 때, 다양한 다른 구현예들이 실시될 수 있다는 것이 이해된다.
상기 발명이 명확한 이해를 목적으로 설명 및 예에 의해 다소 상세히 기재되어 있지만, 설명 및 예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학 문헌들의 개시내용은 전체적으로 명확히 참고로 도입된다.
방법
전기분무 이온화 질량 분광측정 (ESI-MS)
0.5 ㎕ N-글리카나제 플러스 (Glycanase plus) (로슈 (Roche)) 및 나트륨 포스페이트 완충제 (0.1 M, pH 7.1) 를 첨가하여 115 ㎕ 의 최종 샘플 부피를 수득함으로써 단백질 분취물 (50 ㎍) 을 탈글리코실화하였다. 혼합물을 37℃ 에서 18 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 환원 및 변성을 위해, 4 M 구아니딘*HCl (피어스 (Pierce)) 중의 60 ㎕ 0.5 M TCEP (피어스) 및 50 ㎕ 8 M 구아니딘*HCl 을 첨가하였다. 혼합물을 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 크기 배제 크로마토그래피 (세파로스 G-25, 등용매, 2% 포름산을 갖는 40% 아세토니트릴) 로 탈염시켰다. 나노 ESI 공급원 (트라이버사 나노메이트 (TriVersa NanoMate), 애드비온(Advion)) 을 갖춘 Q-TOF 기계 (maXis, 브루커(Bruker)) 상에서 ESI 질량 스펙트럼 (+ve) 을 기록하였다. MS 파라미터 셋팅은 다음과 같았다: 전달: 깔대기 RF, 400 Vpp; ISCID 에너지, 0 eV; 다중극 RF, 400 Vpp; 사중극: 이온 에너지, 4.0 eV; 낮은 질량, 600 m/z; 공급원: 무수 가스, 8 ℓ/분; 무수 가스 온도, 160℃; 충돌 셀: 충돌 에너지, 10 eV; 충돌 RF: 2000 Vpp; 이온 냉각기: 이온 냉각기 RF, 300 Vpp; 전달 시간: 120 μs; Pre Puls 저장, 10 μs; 스캔 범위 m/z 600 내지 2000. 데이터 평가를 위해 사내 개발된 소프트웨어 (매스어날라이저 (MassAnalyzer)) 를 이용하였다.
FcRn 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석
BIAcore T100 기계 (비아코어 아베 (BIAcore AB), 스웨덴 업살라 소재) 를 이용하여 야생형 항체 및 돌연변이체가 FcRn 에 결합하는 성질을 표면 플라스몬 공명 (SPR) 으로 분석하였다. 이 시스템은 분자 상호작용의 연구를 위해 잘 확립되어 있다. 이것은 리간드/분석물 결합의 연속적인 실시간 모니터링 및 이로써 다양한 어세이 설정에서 동역학적 파라미터의 측정을 가능하게 한다. SPR-기술은 금으로 코팅된 바이오센서 칩의 표면 근처에서의 굴절 지수의 측정에 근거한다. 굴절 지수의 변화는 고정된 리간드와 용액에 주입된 분석물의 상호작용에 의해 야기된 표면 상에서의 질량 변화를 표시한다. 분자가 표면 상의 고정된 리간드에 결합하는 경우, 질량이 증가하고, 해리하는 경우 질량이 감소한다. 본 어세이에서, 아민 커플링을 통해 FcRn 수용체를 400 반응 유닛 (RU) 의 수준까지 BIAcore CM5-바이오센서 칩 (GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Sweden) 상에 고정시켰다. 런닝 및 희석 완충제로서 PBS (0.05% Tween20, pH 6.0) (GE Healthcare Bioscience) 를 사용하여 상기 어세이를 실온에서 수행하였다. 200 nM 의 샘플을 실온에서 50 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 결합 시간은 180 초이었고, 해리 단계는 360 초를 소요하였다. HBS-P (pH 8.0) 를 짧게 주입하여 칩 표면의 재생에 도달하였다. 주입 후 180 초에서의 생물학적 반응 신호 높이를 주입 후 300 초에서의 생물학적 반응 신호 높이와 비교하여 SPR-데이터의 평가를 수행하였다. 상응하는 파라미터는 RU 최대 수준 (주입 후 180 초) 및 후기 안정성 (주입의 종결 후 300 초) 이다.
단백질 A 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석
이 어세이는 표면 플라스몬 공명 분광법에 근거한다. 단백질 A 를 SPR 바이오센서의 표면 상에 고정시킨다. 샘플을 SPR 분광계의 유동 셀 내로 주입함으로써 고정된 단백질 A 를 갖는 복합체를 형성하여 센서 칩 표면 상에서의 질량 증가 및 이로써 보다 더 높은 반응 (1 RU 가 1 pg/mm2 로서 정의되기 때문임) 을 야기한다. 그 후, 샘플-단백질 A 복합체를 용해시켜 센서 칩을 재생한다. 그 다음, 획득된 반응을 반응 유닛 (RU) 에서의 높은 신호 및 해리 거동에 대해 평가한다.
지이 헬쓰케어 (GE Healthcare) 의 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 4.0 에서 약 3500 반응 유닛 (RU) 의 단백질 A (20 ㎍/㎖) 를 CM5 칩 (GE Healthcare) 상에 커플링시켰다.
샘플 및 시스템 완충제는 HBS-P+ (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20 멸균-여과됨, pH 7.4) 이었다. 유동 셀 온도를 25℃ 로 설정하고, 샘플 구획 온도를 12℃ 로 설정하였다. 시스템을 런닝 완충제로 프라이밍하였다. 그 다음, 샘플 구축물의 5 nM 용액을 30 ㎕/분의 유속으로 120 초 동안 주입한 후, 300 초의 해리 단계를 수행하였다. 그 다음, 30 ㎕/분의 유속으로 글리신-HCl (pH 1.5) 을 2 회 30 초 동안 길게 주입함으로써 센서 칩 표면을 재생시켰다. 각각의 샘플을 삼중으로 측정하였다.
본원에 사용된 용어 "돌연변이 IHH-AAA 를 갖는" 은 IgG1 또는 IgG4 하위계열의 불변 중쇄 영역 내의 돌연변이 I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala) 및 H435A (His435Ala) 의 조합물 (Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따른 번호지정) 을 지칭하고, 본원에서 사용된 용어 "돌연변이 HHY-AAA 를 갖는" 은 IgG1 또는 IgG4 하위계열의 불변 중쇄 영역 내의 돌연변이 H310A (His310Ala), H433A (His433Ala) 및 Y436A (Tyr436Ala) 의 조합물 (Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따른 번호지정) 을 지칭하고, 본원에서 사용된 용어 "돌연변이 P329G LALA 를 갖는" 은 IgG1 하위계열의 불변 중쇄 영역 내의 돌연변이 L234A (Leu234Ala), L235A (Leu235Ala) 및 P329G (Pro329Gly) 의 조합물 (Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따른 번호지정) 을 지칭하고, 본원에서 사용된 용어 "돌연변이 SPLE 를 갖는" 은 IgG4 하위계열의 불변 중쇄 영역 내의 돌연변이 S228P (Ser228Pro) 및 L235E (Leu235Glu) 의 조합물 (Kabat EU 인덱스 번호지정 시스템에 따른 번호지정) 을 지칭한다.
일반
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 대한 일반 정보는 문헌 (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) 에서 제공되어 있다. 항체 쇄의 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따라 넘버링되고 지칭된다 (Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
재조합 DNA 기법
문헌 (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989)) 에 기재된 바와 같이 표준 방법을 이용하여 DNA 를 조작하였다. 분자생물학 시약을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다.
유전자 합성
원하는 유전자 분절은 진아트 (Geneart) (독일 레겐스부르그 소재) 에서 주어진 요건에 따라 주문되었다.
DNA 서열결정
메디게노믹스 게엠베하 (MediGenomix GmbH) (독일 마르틴스리에드 소재) 또는 세퀴서브 (SequiServe) (독일 바터스테텐 소재) 에서 수행된 이중 가닥 서열결정으로 DNA 서열을 결정하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
GCG (제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 의 소프트웨어 팩키지 버전 10.2 및 인포맥스 (Informax) 의 벡터 NTI 어드밴스 스위트 (Advance suite) 버전 8.0 을 서열 생성, 맵핑, 분석, 해독 및 예증을 위해 사용하였다.
발현 벡터
기재된 항체들의 발현을 위해, CMV-인트론 A 프로모터를 갖거나 갖지 않는 cDNA 조직화 또는 CMV 프로모터를 갖는 게놈 조직화에 근거한 (예를 들어, HEK293-F 세포에서의) 일시적 발현용 발현 벡터를 사용하였다.
벡터는 항체 발현 카세트 이외에 하기 요소들을 함유하였다:
- 에스케리치아 콜라이에서 이 벡터의 복제를 가능하게 하는 복제기점,
- 에스케리치아 콜라이에서 앰피실린 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자, 및
- 진핵 세포에서 선택 마커로서 머스 머스큘러스 (Mus musculus) 로부터의 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자.
항체 유전자의 전사 유닛은 하기 요소들로 구성되었다:
- 5' 말단에서 유일한 제한 부위(들),
- 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- cDNA 조직화의 경우 뒤따르는 인트론 A 서열,
- 인간 면역글로불린 유전자의 5' 비-번역 영역,
- 면역글로불린 중쇄 신호 서열을 코딩하는 핵산,
- cDNA 로서, 또는 면역글로불린 엑손-인트론 조직화를 갖는 게놈 조직화에서 인간 항체 쇄 (야생형 또는 도메인 교환을 가짐) 를 코딩하는 핵산,
- 폴리아데닐화 신호 서열을 갖는 3' 비-번역 영역, 및
- 3' 말단에서의 유일한 제한 부위(들).
항체 쇄를 코딩하는 핵산을 PCR 및/또는 유전자 합성으로 생성하고, 예를 들어, 각각의 벡터 내의 유일한 제한 부위를 사용하여 일치하는 핵산 분절들을 연결함으로써 공지되어 있는 재조합 방법 및 기법으로 조립하였다. 서브클로닝된 핵산 서열을 DNA 서열결정으로 검증하였다. 일시적 트랜스펙션을 위해 보다 더 많은 양의 벡터를 형질전환된 에스케리치아 콜라이 배양물로부터의 벡터 제조로 제조하였다(뉴클레오본드 에이엑스 (Nucleobond AX), 마슈레이-나겔 (Macherey-Nagel)).
세포 배양 기법
표준 세포 배양 기법을 문헌 (Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc) 에 기재된 바와 같이 이용하였다.
이하에 기재된 바와 같이 현탁액으로 생장하는 HEK29-F 세포에서 각각의 발현 벡터를 일시적으로 공동-트랜스펙션 (co-transfection) 시켜 이중특이적 항체를 발현하였다.
실시예 1
발현 및 정제
HEK293-F 시스템에서의 일시적 트랜스펙션
HEK293-F 시스템 (인비트로겐 (Invitrogen)) 을 제조자의 설명서에 따라 사용하여 (예를 들어, 중쇄 및 변형된 중쇄뿐만 아니라 상응하는 경쇄 및 변형된 경쇄를 코딩하는) 각각의 벡터를 사용한 일시적 트랜스펙션으로 단일특이적 항체 및 이중특이적 항체를 생성하였다. 요약하건대, 진탕 플라스크 또는 교반된 발효기 내의 무혈청 프리스타일(FreeStyle)™ 293 발현 배지 (인비트로겐) 에서 현탁액으로 생장하는 HEK293-F 세포 (인비트로겐) 를 각각의 발현 벡터와 293펙틴 (fectin)™ 또는 펙틴 (인비트로겐) 의 혼합물로 트랜스펙션시켰다. 2 ℓ 진탕 플라스크 (코닝 (Corning)) 의 경우, HEK293-F 세포를 600 ㎖ 중의 1x106 개 세포/㎖의 밀도로 시딩하고 120 rpm 및 8% CO2 에서 인큐베이션하였다. 다음 날, 세포를 약 1.5x106 개 세포/㎖ 의 세포 밀도에서 하기 A 와 B 의 약 42 ㎖ 혼합물로 트랜스펙션시켰다: A) 등몰 비로 각각 중쇄 또는 변형된 중쇄 및 상응하는 경쇄를 코딩하는 600 ㎍ 총 벡터 DNA (1 ㎍/㎖) 를 갖는 20 ㎖ Opti-MEM (인비트로겐), 및 B) 1.2 ㎖ 293펙틴 또는 펙틴 (2 ㎕/㎖) 을 갖는 20 ㎖ Opti-MEM. 글루코스 소비에 따라 글루코스 용액을 발현 과정 동안 첨가하였다. 분비된 항체를 함유하는 상청액을 5 일 내지 10 일 후 회수하고 항체를 상청액으로부터 직접적으로 정제하였거나 상청액을 동결하여 저장하였다.
정제
맙셀렉트슈어(MabSelectSure)-세파로스™ 를 사용한 친화성 크로마토그래피, 부틸-세파로스 (지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 수퍼덱스 200 크기 배제 (지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 크로마토그래피로 세포 배양물 상청액으로부터 이중특이적 항체를 정제하였다.
요약하건대, 멸균 여과된 세포 배양물 상청액을 PBS 완충제 (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4) 로 평형화된 맙셀렉트슈어 수지 상에 포획하고 평형화 완충제로 세척하고 pH 3.0 에서 25 mM 나트륨 시트레이트로 용출하였다. 용출된 항체 분획을 풀링하고 2 M Tris (pH 9.0) 로 중화시켰다. 1.6 M 암모늄 술페이트 용액을 0.8 M 암모늄 술페이트의 최종 농도까지 첨가함으로써 소수성 상호작용 크로마토그래피를 위한 항체 풀을 제조하고 아세트산을 사용하여 pH 를 pH 5.0 으로 조절하였다. 부틸-세파로스 수지를 35 mM 나트륨 아세테이트 및 0.8 M 암모늄 술페이트 (pH 5.0) 로 평형화시킨 후, 항체를 상기 수지에 적용하고 평형화 완충제로 세척하고 35 mM 나트륨 아세테이트 (pH 5.0) 까지 선형 구배로 용출하였다. (단일특이적 또는 이중특이적) 항체 함유 분획을 풀링하고, 20 mM 히스티딘 및 140 mM NaCl (pH 6.0) 로 평형화된 수퍼덱스 200 26/60 GL (지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 컬럼을 사용한 크기 배제 크로마토그래피로 더 정제하였다. (단일특이적 또는 이중특이적) 항체 함유 분획을 풀링하고 비바스핀 (Vivaspin) 한외여과 장치 (사르토리우스 스테딤 바이오텍 에스에이 (Sartorius Stedim Biotech S.A.), 프랑스 소재) 를 이용하여 요구된 농도까지 농축하고 -80℃에서 저장하였다.
순도 및 항체 온전성을 각각의 정제 단계 후 마이크로플루이딕 랩칩 기술 (칼리퍼 라이프 사이언스(Caliper Life Science), 미국 소재) 을 이용한 CE-SDS 로 분석하였다. 제조자의 설명서에 따라 HT 단백질 발현 시약 키트를 사용하여 CE-SDS 분석을 위한 5 ㎕의 단백질 용액을 제조하고 HT 단백질 발현 칩을 사용하여 랩칩 GXII 시스템 상에서 분석하였다. 랩칩 GX 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
25℃ 에서 2xPBS (20 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 274 mM NaCl 및 5.4 mM KCl, pH 7.4) 런닝 완충제에서 수퍼덱스 200 분석 크기 배제 컬럼 (지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 을 사용한 고성능 SEC 로 항체 샘플의 응집체 함량을 분석하였다. 25 ㎍의 단백질을 0.75 ㎖/분의 유속으로 상기 컬럼 상에 주입하고 50 분에 걸쳐 등용매 용출하였다.
실시예 2
FcRn 크로마토그래피
스트렙타비딘 세파로스에의 커플링:
1 g 의 스트렙타비딘 세파로스 (지이 헬쓰케어) 를 바이오티닐화되고 투석된 수용체에 첨가하고 진탕하면서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 수용체 유도체화된 세파로스를 1 ㎖ XK 컬럼 (지이 헬쓰케어) 내에 충전시켰다.
FcRn 친화성 컬럼을 사용한 크로마토그래피:
조건:
컬럼 치수: 50 mm x 5 mm
층 높이: 5 cm
적재량: 50 ㎍ 샘플
평형화 완충제: pH 5.5 로 조절된, 150 mM NaCl 을 갖는 20 mM MES
용출 완충제: pH 8.8 로 조절된, 150 mM NaCl 을 갖는 20 mM Tris/HCl
용출: 7.5 CV 평형화 완충제, 30 CV 내지 100% 용출 완충제, 10 CV 용출 완충제
<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> FC-REGION VARIANTS WITH MODIFIED FCRN- AND PROTEIN A-BINDING PROPERTIES <130> P32409 <150> EP14192054.6 <151> 2014-11-06 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Trp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 35 40 45 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 50 55 60 Glu Ser Thr Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 65 70 75 80 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 85 90 95 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 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<210> 8 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG1 Fc-region derived Fc-region polypeptide with Y349C, T366S, L368A and Y407V mutations <400> 8 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 9 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG1 Fc-region derived Fc-region polypeptide with S354C, T366W mutations <400> 9 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu 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<213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG1 Fc-region derived Fc-region polypeptide with a P329G mutation <400> 12 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 15 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG1 Fc-region derived Fc-region polypeptide with a P329G mutation and S354C, T366W mutation <400> 15 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 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<220> <223> human IgG1 Fc-region derived Fc-region polypeptide with L234A, L235A, P329G and Y349C, T366S, L368A, Y407V mutations <400> 16 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 17 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG1 Fc-region derived Fc-region polypeptide with L234A, L235A, P329G mutations and S354C, T366W mutations <400> 17 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr 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Artificial Sequence <220> <223> human IgG4 Fc-region derived Fc-region polypeptide with S354C, T366W mutations <400> 20 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 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<213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG4 Fc-region derived Fc-region polypeptide with a P329G mutation <400> 24 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 28 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG4 Fc-region derived Fc-region polypeptide with a S228P, L235E, P329G and S354C, T366W mutations <400> 28 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 29 <211> 105 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 29 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (15)

  1. 하나 이상의 시스테인 잔기, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는, 적어도 면역글로불린 힌지 영역의 일부를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제 1 폴리펩티드, 및 하나 이상의 시스테인 잔기, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인을 포함하는, 적어도 면역글로불린 힌지 영역의 일부를 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 제 2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체성 폴리펩티드로서:
    제 1 폴리펩티드는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 를 포함하고 (홀-사슬), 제 2 폴리펩티드는 돌연변이 S354C 및 T366W 을 포함하고 (놉-사슬),
    제 1 폴리펩티드 (홀-사슬) 는 하기 돌연변이를 포함하고:
    i) I253A 또는 I253G, 및
    ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D,
    제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 하나 이상의 디술피드 가교에 의해 연결되고,
    제 1 폴리펩티드의 CH3-도메인 및 제 2 폴리펩티드의 CH3-도메인은 둘다 단백질 A 에 결합하거나 또는 둘다 결합하지 않는, 이종이량체성 폴리펩티드 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).
  2. 제 1 항에 있어서, 하기 돌연변이를 포함하는 이종이량체성 폴리펩티드:
    i) I253A 또는 I253G, 및
    ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D, 및
    iii) T250Q, 및/또는
    iv) T256E 또는 T256A.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하기 돌연변이를 포함하는 이종이량체성 폴리펩티드:
    i) I253A 또는 I253G, 및
    ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D, 및
    iii) 임의로 a) T250Q, 및/또는 T256E 또는 T256A, 및
    iv) a) L251A 또는 L251G 또는 L251D, 및/또는 b) H310A 또는 H310G.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 돌연변이를 포함하는 이종이량체성 폴리펩티드:
    i) I253A 또는 I253G, 및
    ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D, 및
    iii) a) T250Q, 및/또는 T256E 또는 T256A, 및
    iv) a) L251A 또는 L251G 또는 L251D, 및/또는 b) H310A 또는 H310G.
    v) 임의로 a) T307A 또는 T307H 또는 T307Q 또는 T307P, 및/또는 b) Q311H, 및/또는 c) M252Y, 및/또는 d) S254T.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 돌연변이를 포함하는 이종이량체성 폴리펩티드:
    i) T250Q, 및/또는
    ii) M252Y, 및/또는
    iii) S254T, 및/또는
    iv) T256E 또는 T256A, 및/또는
    v) T307A 또는 T307H 또는 T307Q 또는 T307P, 및/또는
    vi) Q311H.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이 인간 IgG1 하위계열의 것인 이종이량체성 폴리펩티드.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드가 돌연변이 L234A 및 L235A 를 추가로 포함하는 이종이량체성 폴리펩티드.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드가 돌연변이 P329G 를 추가로 포함하는 이종이량체성 폴리펩티드.
  9. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 CH2-도메인 및 면역글로불린 CH3-도메인이 인간 IgG4 하위계열의 것인 이종이량체성 폴리펩티드.
  10. 제 1 항 내지 제 5 항 및 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드가 돌연변이 S228P 및 L235E 를 추가로 포함하는 이종이량체성 폴리펩티드.
  11. 제 1 항 내지 제 5 항 및 제 9 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드가 돌연변이 P329G 를 추가로 포함하는 이종이량체성 폴리펩티드.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체성 폴리펩티드가 전체 길이 이특이적 항체인 이종이량체성 폴리펩티드.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 이종이량체성 폴리펩티드 및 임의로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형.
  14. 약학 제형의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 이종이량체성 폴리펩티드의 용도.
  15. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 안 질환, 바람직하게는 안구 혈관 질환의 치료에 사용하기 위한 이종이량체성 폴리펩티드.
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