TW201932142A - 自單特異性抗體產生多特異性抗體之方法 - Google Patents

Abstract

本文中報導一種藉由半抗體交換反應來產生多特異性抗體的方法，該半抗體交換反應在兩個2/3-IgG之間進行，該兩個2/3-IgG的一半藉由不對稱的擾動突變而失去穩定，從而促進正確組裝的全長雙特異性抗體產生。該方法可在還原劑不存在下執行且不需要初始2/3-IgG中存在鉸鏈區二硫鍵。

Description

自單特異性抗體產生多特異性抗體之方法

本文中報導一種容易且可擴展的方法，其利用新穎的半抗體交換方法產生雙特異性及多特異性抗體。

用於單特異性抗體衍生物生物化學轉化為經組裝之雙特異性抗體的當前技術方法係應用(i)半抗體互補反應及(ii) IgG-IgG交換反應。

此等技術揭示於例如WO 2015/046467；Rispens等人，J. BIOL. CHEM.第289卷, 第9期, 第6098-6109頁；US 9,409,989；WO 2013/060867；WO 2011/131746；WO 2011/133886；WO 2011/143545；WO 2010/151792；Gunasekaran等人，J. BIOL. CHEM.第285卷, 第25期, 第19637-19646頁；WO 2009/041613、WO 2009/089004、WO 2008/119353、WO 2007/114325、US 8,765,412、US 8,642,745、WO 2006/047340、WO 2006/106905、WO 2005/042582、WO 2005/062916、WO 2005/000898、US 7,183,076、US 7,951,917；Segal等人，Current Opinion in Immunology 1999, 11:558-562；WO 98/50431、WO 98/04592；Merchant等人，Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681；WO 96/27011；Carter等人，Immunotechnol. 2 (1996) 73-73；WO 93/11162，及Kostelny等人，J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553。

用於單特異性抗體或抗體衍生物轉化為bsAbs的當前技術方法有缺點，諸如關於組裝後bsAb製備之方法及組合物的限制。

舉例而言，半抗體技術係在二價IgG的側面組裝單特異性及單價抗體。輸入分子的表現以及交換反應本身不僅產生半抗體，而且產生IgG樣二價(單特異性)抗體衍生物。聚集體亦存在於組裝反應的輸入材料以及輸出物中。兩者(二價單特異性抗體與聚集體)需要經由精巧的純化途徑自所組裝的bsAb中定量地移除或(因為定量移除難以高通量方式達成)，其在某種程度上『污染』bsAb製劑。

舉例而言，Fab-臂交換技術係自單特異性二價IgG衍生物組裝雙特異性二價IgG。因此，交換反應的輸入物為二價的，亦即藉由預設值實現親合力。為了確保應經歷親合力或促效抗體篩選的剩餘二價單特異性輸入材料完全不存在於交換反應中，必須保證任何剩餘二價輸入物以及在交換反應期間可能形成的任何聚集體被完全移除。由於輸入物與bsAb的相似性高，因此需要用於定量移除的精密程序(極難以高通量達成)，或剩餘的二價輸入物及聚集體在某種程度上污染最終bsAb製劑。

Labrijn, A. F.等人揭示藉由可控的Fab-臂交換來有效產生穩定的雙特異性IgG1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150)。

WO 2014/081955揭示雜二聚抗體及使用方法。

WO 2009/089004揭示利用靜電轉向效應製備抗體Fc-雜二聚分子的方法。其中揭示在涉及結構域-結構域相互作用的四個獨特電荷殘基對(Asp356---Lys439'、Glu357--Lys370'、Lys392---Asp399'、Asp399---Lys409')中，僅Lys409---Asp399'因兩個殘基在結構上保守並且內埋而適於工程改造。在其他三對情況下，至少一個搭配物暴露於溶劑(%ASA＞10)。

WO 2018/155611揭示不藉由共價鍵結結合的第一抗原結合分子與第二抗原結合分子之組合，雜二聚體比同二聚體更容易形成液體形式。

本文中報導一種藉由半抗體交換反應來產生多特異性抗體的方法。已發現，作為初始材料，不完全抗體為有利的，諸如包含抗體輕鏈、抗體重鏈及抗體重鏈Fc區片段的2/3-IgG，其中重鏈-重鏈相互作用因不對稱擾動突變(較佳位於Fc區片段中)而失去穩定。已發現該擾動突變促進初始不完全抗體解離及正確組裝(例如全長)的雙特異性抗體產生。

本發明之方法可在還原劑存在以及不存在下執行。在後一種情況下，在初始抗體(諸如2/3-IgG或完全抗體)中，不需要且因此不存在重鏈-重鏈二硫鍵，諸如鉸鏈區二硫鍵。因此，根據本發明的鏈交換反應及方法亦允許雙特異性抗體在無需初始還原的情況下進行活體外組裝。因此，初始分子(2/3-IgG)之重鏈之間的分子內二硫鍵可藉由例如突變誘發PCR移除。2/3-IgG純化可以利用蛋白質L/SEC方法操作，該方法可定義為此等分子的標準純化策略。儘管重鏈之間缺乏所有分子間二硫鍵，但正確形成穩定(亦即可分離)的2/3-IgG。因此，利用該等初始分子，有可能經由無還原的鏈交換反應來實現雙特異性抗體的活體外產生。鏈交換反應之後，所形成雙特異性抗體的純化可以藉由例如鎳吸收層析(若使用組胺酸標籤)實現。使用該無還原鏈交換反應，可以形成的經純化雙特異性抗體之蛋白質產量高於依賴於還原型鏈交換反應的當前技術程序。總體而言，根據本發明的無還原鏈交換方法實現純功能性雙特異性抗體的更高效產生。

一般而言，本文中報導一種用於產生(多特異性)結合子/多聚體多肽的方法，包含以下步驟：
- 培育
第一結合子(其為單或雙特異性的及雜聚的)/多聚體多肽，其包含均含有人類免疫球蛋白(IgG1) CH3域的第一(單體)多肽與第二(單體)多肽，
其中第一多肽之CH3域相對於其野生型序列包含一或多種突變且第二多肽之CH3域相對於其野生型序列包含一或多種突變，其中第一及第二CH3域中的兩種或超過兩種突變引起雜二聚體形成，
其中第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
其中第二多肽的CH3域中包含至少一種/第一擾動突變，該第一擾動突變不同於雜二聚化所需的突變(且選自由以下組成的突變群組：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S及W366T)，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽彼此間共價或非共價結合/形成共價或非共價二聚體/彼此間共價或非共價結合/為共價或非共價二聚體，(其中當第二多肽與第一多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)
及
第二結合子(其為單或雙特異性的及雜聚的)/多聚體多肽，其包含均含有人類免疫球蛋白(IgG1) CH3域的第三(單體)多肽與第四(單體)多肽，
其中第三多肽之CH3域相對於其野生型序列包含一或多種突變且第四多肽之CH3域相對於其野生型序列包含一或多種突變，其中第一及第二CH3域中的兩種或超過兩種突變引起雜二聚體形成，
其中第四多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
其中第三多肽的CH3域中包含至少一種/第二擾動突變，該擾動突變不同於雜二聚化所需的突變(且選自由以下組成的突變群組：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S及W366T)，其中第四多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，其中第三多肽中的突變與第二多肽中的突變位於不同位置，
其中第三多肽與第四多肽彼此間共價或非共價結合/形成共價或非共價二聚體/彼此間非共價或共價結合/為非共價或共價二聚體，(其中當第三多肽與第四多肽形成雜二聚體時，第三多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)
其中當第二多肽與第三多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的(第一)擾動突變及第三多肽中的(第二)擾動突變引起吸引性相互作用，
及
- 回收包含第一多肽及第四多肽的結合子且藉此產生(多特異性)結合子。

本文中報導一種用於產生(多特異性)結合子/多聚體多肽的方法，包含以下步驟：
- 培育
第一結合子(其為單或雙特異性的及雜聚的)/多聚體多肽，其包含均含有人類免疫球蛋白(IgG1) CH3域的第一(單體)多肽與第二(單體)多肽，
其中i)第一多肽的CH3域包含突變杵且第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一多肽的CH3域包含突變臼且第二多肽的CH3域包含突變杵，
其中第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
其中第二多肽的CH3域中包含至少一種/第一擾動突變(選自由以下組成的突變群組：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S及W366T)，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽彼此間共價或非共價結合/形成共價或非共價二聚體/彼此間共價或非共價結合/為共價或非共價二聚體，(其中當第二多肽與第一多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)
及
第二結合子(其為單或雙特異性的及雜聚的)/多聚體多肽，其包含均含有人類免疫球蛋白(IgG1) CH3域的第三(單體)多肽與第四(單體)多肽，
其中i)第三多肽的CH3域包含突變杵且第四多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第三多肽的CH3域包含突變臼且第四多肽的CH3域包含突變杵，其中i)在第一多肽包含突變臼的情況下，第四多肽包含突變杵，或ii)在第一多肽包含突變杵的情況下，第四多肽包含突變臼，
其中第四多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
其中第三多肽的CH3域中包含至少一種/第二擾動突變(選自由以下組成的突變群組：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S及W366T)，其中該第四多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，其中第三多肽中的突變與第二多肽中的突變位於不同位置，
其中第三多肽與第四多肽彼此間共價或非共價結合/形成共價或非共價二聚體/彼此間非共價或共價結合/為非共價或共價二聚體，(其中當第三多肽與第四多肽形成雜二聚體時，第三多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)
其中當第二多肽與第三多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的(第一)擾動突變及第三多肽中的(第二)擾動突變引起吸引性相互作用，
及
- 回收包含第一多肽及第四多肽的結合子且藉此產生(多特異性)結合子。

根據本發明之一種方法為用於產生多聚體多肽的方法，其包含以下步驟：
- 培育
第一多聚體初始多肽，其包含均含有免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中
a-1) i)第一多肽的CH3域包含突變杵且第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一多肽的CH3域包含突變臼且第二多肽的CH3域包含突變杵，
b-1)第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
c-1)第二多肽的CH3域中包含與a-1)項下之突變不同的第一擾動突變，其中第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與第一擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，
d-1)第一多肽與第二多肽為二聚體，
及
第二多聚體初始多肽，其包含均含有免疫球蛋白G CH3域的第三多肽及第四多肽，其中
a-2) i)第三多肽的CH3域包含突變杵且第四多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第三多肽的CH3域包含突變臼且第四多肽的CH3域包含突變杵，其中i)在第一多肽包含突變臼的情況下，第四多肽包含突變杵，或ii)在第一多肽包含突變杵的情況下，第四多肽包含突變臼，
b-2)第四多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
c-2)第三多肽的CH3域中包含與a-2)項下之突變不同的第二擾動突變，其中第四多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與第二擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，
d-2)第二擾動突變與第一擾動突變處於不同的位置，
e-2)第三多肽及第四多肽為二聚體，
f-2)當第二多肽與第三多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的第一擾動突變及第三多肽中的第二擾動突變引起吸引性相互作用，
及
- 回收包含第一多肽及第四多肽的多聚體多肽，且藉此產生多聚體多肽。

在一個實施例中，第一至第四多肽在N端至C端方向上各自包含源於人類IgG1 CH2域(變異型人類IgG1 CH2域)的CH2域及源於人類IgG1 CH3域(變異型人類IgG1 CH3域)的CH3域。

在一個實施例中，第一至第四多肽在N端至C端方向上彼此獨立地各自包含i)胺基酸序列DKTHTCPPC (SEQ ID NO: 65)或胺基酸序列DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66)，ii)源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及iii)源於人類IgG1 CH3域的CH3域。

在一個實施例中，i)第一及第四多肽各自進一步包含源於人類IgG1 CH1域((變異型)人類IgG1 CH1域)的CH1域及(彼此獨立地)(重鏈或輕鏈)可變域，或ii)第一或第四多肽包含源於人類IgG1 CH1域((變異型)人類IgG1 CH1域)的CH1域且相應其他多肽包含源於輕鏈恆定域((變異型)人類κ或λ CL域)的域且各多肽進一步包含可變域。在一個實施例中，第一多肽之可變域與第四多肽之可變域為(不同)重鏈可變域。在一個實施例中，第一多肽之可變域為重鏈可變域且第四多肽之可變域為輕鏈可變域，或反之亦然。

在一個實施例中，第一及第四多肽可以具有相同或不同的N端至C端序列且在第一與第四多肽不同的情況下，其彼此獨立地選自如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
ix) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
x) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及輕鏈可變域，
xiii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
xiv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，
xv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第二重鏈可變域，
xvi) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中(同一多肽之)結合域的第一部分與結合域的第二部分(結合且)形成特異性結合至標靶的功能性結合位點；在一個實施例中結合域的第一部分為抗體重鏈Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)且結合域的第二部分為輕鏈Fab片段(VL-CL或CL-VL)，或反之亦然。

在一個實施例中，第一及第四多肽之一在N端至C端方向上包含第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、第二重鏈可變域、第一輕鏈恆定域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域之CH2域，及源於人類IgG1 CH3域之CH3域，且第一及第四多肽中之另一者在N端至C端方向上包含第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域。在一個實施例中，包含含有兩個重鏈可變域之多肽的結合子進一步包含含有第一輕鏈可變域及第二輕鏈恆定域(與第一重鏈可變域配對)的第一輕鏈及含有第二輕鏈可變域及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)(與第二重鏈可變域配對)的(域交換)第二輕鏈，且另一結合子進一步包含第一輕鏈。

在一個實施例中，第一及第四多肽之一在N端至C端方向上包含第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、第一輕鏈可變域、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，且第一及第四多肽中之另一者在N端至C端方向上包含第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域。在一個實施例中，包含含有兩個可變域之多肽的結合子進一步包含含有第一輕鏈可變域及第二輕鏈恆定域(與第一重鏈可變域配對)的第一輕鏈及含有第二重鏈可變域及第二輕鏈恆定域(與第一輕鏈可變域配對)的(域交換)第二輕鏈，且另一結合子進一步包含第一輕鏈。

在一個實施例中，第一及第二結合子/多聚體初始多肽各自進一步包含抗體輕鏈。

在一個實施例中，
第一結合子/多聚體初始多肽包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中(同一多肽之)結合域的第一部分與結合域的第二部分(結合且)形成特異性結合至標靶的功能性結合位點；在一個實施例中，結合域的第一部分為抗體重鏈Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)且結合域的第二部分為輕鏈Fab片段(VL-CL或CL-VL)，或反之亦然，
包含突變杵或突變臼，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
若第一多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第一多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含選自由以下組成之突變群組的第一擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S及W366T，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽彼此間非共價或共價結合/形成非共價或共價二聚體，(其中當第二多肽與第一多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，
其中第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽，
及
第二結合子/多聚體初始多肽包含
選自如下多肽群組之多肽作為第四多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
若第二多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第二多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含第二擾動突變，該第二擾動突變選自由以下組成的突變群組：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S及W366T，其中第五多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，其中第四多肽中的擾動突變與第二多肽中的擾動突變處於不同位置，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第五多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及源於人類IgG1 CH1域的CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、源於人類IgG1 CH1域的CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及源於人類IgG1 CH1域的第二CH1域，
v) 第一重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、源於人類IgG1 CH1域的第二CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中(同一多肽之)結合域的第一部分與結合域的第二部分(結合且)形成特異性結合至標靶的功能性結合位點；在一個實施例中，結合域的第一部分為抗體重鏈Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)且結合域的第二部分為輕鏈Fab片段(VL-CL或CL-VL)，或反之亦然，
若第四多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第四多肽包含突變杵，則包含突變臼，
其中第四多肽與第五多肽彼此間非共價或共價結合/形成非共價或共價二聚體，(其中當第四多肽與第五多肽形成雜二聚體時，第四多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第六多肽，
其中第六多肽藉由二硫鍵共價結合至第四多肽。

在一個實施例中，培育步驟係在還原劑存在下進行。

在一個實施例中，培育步驟係在還原劑不存在下進行。

在一個實施例中，i)第二多肽及第三多肽，或ii)第二多肽及第五多肽進一步包含(C端)標籤。在一個實施例中，標籤具有胺基酸序列HHHHHH (SEQ ID NO: 67)或HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68)且回收係藉由金屬(鎳)螯合劑親和層析管柱層析來進行。在一個實施例中，標籤具有胺基酸序列EPEA (SEQ ID NO: 87)且回收係藉由C標籤親和層析管柱層析來進行。

在一個實施例中，
第一結合子/多聚體初始多肽包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中(同一多肽之)結合域的第一部分與結合域的第二部分(結合且)形成特異性結合至標靶的功能性結合位點；在一個實施例中，結合域的第一部分為抗體重鏈Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)且結合域的第二部分為輕鏈Fab片段(VL-CL或CL-VL)，或反之亦然，
包含突變杵或突變臼，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
若第一多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第一多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含選自由D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的第一擾動突變，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽彼此間非共價或共價結合/形成非共價或共價二聚體，(其中當第二多肽與第一多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，
其中第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽，
及
第二結合子/多聚體初始多肽包含
選自如下多肽群組之多肽作為第四多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
若第二多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第二多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含選自由以下組成之突變群組的第二擾動突變：D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K370E及K439E，其中該第五多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，其中第四多肽中之擾動突變與第二多肽中之擾動突變處於不同位置，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第五多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及源於人類IgG1 CH1域的CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、源於人類IgG1 CH1域的CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及源於人類IgG1 CH1域的第二CH1域，
v) 第一重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、源於人類IgG1 CH1域的第二CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中(同一多肽之)結合域的第一部分與結合域的第二部分(結合且)形成特異性結合至標靶的功能性結合位點；在一個實施例中，結合域的第一部分為抗體重鏈Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)且結合域的第二部分為輕鏈Fab片段(VL-CL或CL-VL)，或反之亦然，
若第四多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第四多肽包含突變杵，則包含突變臼，
其中第四多肽與第五多肽彼此間非共價或共價結合/形成非共價或共價二聚體，(其中當第四多肽與第五多肽形成雜二聚體時，第四多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第六多肽，
其中第六多肽藉由二硫鍵共價結合至第四多肽。

如本文所報導之一個態樣為一種鑑別(雙特異性)結合子組合的方法，包含以下步驟：
- 藉由對選自第一多種(單特異性)結合子之第一(單特異性)結合子與選自第二(但與第一多種單特異性結合子不同)多種(單特異性)結合子之第二(單特異性)結合子的各種組合進行本發明之方法來產生多種(雙特異性)結合子，
- 在結合分析(諸如ELISA或SPR分析)中，個別地量測所產生之多種結合子中的各種結合子對至少兩種抗原的同時結合(的量)，及
- 基於結合分析(諸如ELISA或SPR分析)的結果而自多種結合子中選擇結合子，且藉此鑑別出(雙特異性)結合子組合。

如本文所報導之一個態樣為包含第一多肽及第二多肽的多聚體多肽
其中兩種多肽均包含人類免疫球蛋白(IgG1) CH3域，
其中i)第一多肽的CH3域包含突變杵且第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一多肽的CH3域包含突變臼且第二多肽的CH3域包含突變杵，
其中第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
其中第二多肽的CH3域中包含至少一種擾動突變(選自由以下組成的突變群組：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S及W366T)，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽彼此間非共價或共價結合/形成非共價或共價二聚體，(其中當第二多肽與第一多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)。

在一個實施例中，
第一多肽為選自如下多肽群組之多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及源於人類IgG1 CH1域的CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、源於人類IgG1 CH1域的CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及源於人類IgG1 CH1域的第二CH1域，
v) 第一重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、源於人類IgG1 CH1域的第二CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，及
vii) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中(同一多肽之)結合域的第一部分與結合域的第二部分(結合且)形成特異性結合至標靶的功能性結合位點；在一個實施例中，結合域的第一部分為抗體重鏈Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)且結合域的第二部分為輕鏈Fab片段(VL-CL或CL-VL)，或反之亦然，
且包含突變杵或突變臼，
及
第二多肽為選自如下多肽群組之多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域，其包含突變杵或突變臼，
包含選自由以下組成之突變群組的擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S及W366T，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基。

在一個實施例中，多聚體多肽進一步包含含有輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，該第三多肽藉由至少一個二硫鍵共價結合至第一多肽。

如本文所報導之一個態樣為一種組合物，其包含
第一雜三聚多肽，其包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及源於人類IgG1 CH1域的CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、源於人類IgG1 CH1域的CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及源於人類IgG1 CH1域的第二CH1域，
v) 第一重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、源於人類IgG1 CH1域的第二CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，及
vii) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中(同一多肽之)結合域的第一部分與結合域的第二部分(結合且)形成特異性結合至標靶的功能性結合位點；在一個實施例中，結合域的第一部分為抗體重鏈Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)且結合域的第二部分為輕鏈Fab片段(VL-CL或CL-VL)，或反之亦然，
包含突變杵或突變臼，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
若第一多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第一多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含選自由以下組成之突變群組的擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S及W366T，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第三多肽，該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽，
及
第二雜三聚多肽，其包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一(第四)多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
若第一雜三聚體中的第二多肽包含突變臼，則包含突變杵，若第一雜三聚體中的第二多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含選自由以下組成之突變群組的第二擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S及W366T，其中第二(第五)多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，其中第一(第四)多肽中的擾動突變與第一雜三聚體之第二多肽中的擾動突變處於不同位置，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二(第五)多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及源於人類IgG1 CH1域的CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、源於人類IgG1 CH1域的CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及源於人類IgG1 CH1域的第二CH1域，
v) 第一重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、源於人類IgG1 CH1域的第二CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中(同一多肽之)結合域的第一部分與結合域的第二部分(結合且)形成特異性結合至標靶的功能性結合位點；在一個實施例中，結合域的第一部分為抗體重鏈Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)且結合域的第二部分為輕鏈Fab片段(VL-CL或CL-VL)，或反之亦然，
若第一(第四)多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第一(第四)多肽包含突變杵，則包含突變臼，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第三(第六)多肽，該多肽共價藉由二硫鍵結合至第一(第四)多肽，
其中i)第一雜三聚體中之第一多肽的CH3域包含突變杵且第一雜三聚體中之第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一雜三聚體中之第一多肽的CH3域包含突變臼且第一雜三聚體中之第二多肽的CH3域包含突變杵，其中i)在第一雜三聚體中之第一多肽包含突變臼的情況下，第二雜三聚體中之第一多肽(第四)多肽包含突變杵，或ii)在第一雜三聚體中之第一多肽包含突變杵的情況下，第二雜三聚體中之第一多肽(第四)多肽包含突變臼，
其中第一雜三聚體中的第二多肽及第二雜三聚體中之第一多肽(第四)多肽在相同位置不包含擾動突變/在不同位置包含擾動突變。

本發明至少部分地基於以下發現：多特異性抗體可以使用不完全(亦即，非雙特異性結合)抗體作為初始材料、藉由半抗體交換反應來獲得。例示性不完全抗體為所謂的2/3-IgG。例示性2/3-IgG包含抗體輕鏈、抗體重鏈(該重鏈與輕鏈彼此間共價結合且藉由其VH與VL域對來形成結合位點)，及抗體重鏈Fc區片段。該重鏈Fc區片段本身可為例如完全或延長或變異型抗體重鏈的一部分。存在於2/3-IgG中的重鏈::重鏈Fc區片段對及(功能性)結合位點界定根據本發明之交換反應所必需的最小結構元件。在不完全抗體中，諸如在該2/3-IgG中，Fc區域之間的相互作用藉由不對稱的擾動突變(較佳存在於Fc區片段中)而失去穩定。在存在較佳匹配互補性不完全抗體的情況下，該擾動突變促進初始不完全抗體解離及正確組裝之完全雙特異性抗體產生。

本發明至少部分地基於以下進一步的發現：藉由使用如上文所概述之起始化合物可執行本發明之方法，甚至在還原劑不存在下。亦即，Fc區片段與重鏈之間不需要二硫鍵。因此，可以自初始不完全抗體中移除鉸鏈區二硫鍵以及其他重鏈-重鏈二硫鍵。已發現，無該等重鏈-重鏈二硫鍵之初始不完全抗體的產生以及多特異性抗體的交換反應及產生仍然有效地起作用。

I. 定義
如本文所用，重鏈及輕鏈之所有恆定區及恆定域中的胺基酸位置均根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國公眾衛生服務署(Public Health Service), 國家衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991)中所述之Kabat編號系統編號且在本文中稱為「根據Kabat編號」。具體而言，κ及λ同型之輕鏈恆定域CL使用Kabat編號系統(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版之第647-660頁, 美國公眾衛生服務署, 國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991))且重鏈恆定域(CH1、鉸鏈、CH2及CH3，在此情況下，藉由參考「根據Kabat EU索引編號」來進一步闡明)使用Kabat EU索引編號系統(參見第661-723頁)。

二價雙特異性抗體之重鏈Fc區中的CH3域可以藉由「臼包杵」技術改變，該技術詳細描述於以下文獻的若干實例中：WO 96/027011；Ridgway, J .B.等人，Protein Eng. 9 (1996) 617-621；及Merchant, A. M.等人，Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681。在此方法中，改變兩個CH3域之相互作用表面以增加含有此兩個CH3域之兩條重鏈的雜二聚。(兩條重鏈之)兩個CH3域中之每一者可為「杵」，而另一者為「臼」。引入二硫橋鍵進一步使雜二聚體穩定(Merchant, A.M.等人，Nature Biotech 16 (1998) 677-681；Atwell, S.等人，J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)且提高產量。

抗體重鏈之CH3域中的突變T366W係以「杵突變」表示且抗體重鏈之CH3域中的突變T366S、L368A、Y407V係以「突變臼」表示(根據Kabat EU索引編號)。CH3域之間亦可使用另一鏈間二硫橋鍵(Merchant, A. M.等人，Nature Biotech. 16 (1998) 677-681)，例如藉由將S354C突變引入具有「杵突變」(以「杵-cys突變」或「突變杵-cys」表示)之重鏈CH3域中及將Y349C突變引入具有「臼突變」(以「臼-cys突變」或「突變臼-cys」表示)之重鏈CH3域中(根據Kabat EU索引編號)，或反之亦然。

關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊提供於Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國公眾衛生服務署, 國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991)中。

用於實施本發明的適用方法及技術描述於例如Ausubel, F.M. (編), Current Protocols in Molecular Biology, 第I至III卷(1997)；Glover, N.D., 及Hames, B.D.編, DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1985), Oxford University Press；Freshney, R.I. (編), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press Limited (1986)；Watson, J.D.等人，Recombinant DNA, 第二版, CHSL Press (1992)；Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987)；Celis, J.編, Cell Biology, 第二版, Academic Press (1998)；Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 第二版, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987)。

使用重組DNA技術能夠產生核酸衍生物。此類衍生物可以例如在個別或若干核苷酸位置藉由取代、改變、交換、缺失或插入而修飾。修飾或衍生化可以例如藉助於定點突變誘發來實施。此類修飾可以容易地由熟習此項技術者實施(參見例如Sambrook, J.等人，Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA；Hames, B.D., 及Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England)。

亦必須注意，除非上下文另有明確規定，否則如本文中及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及「一個細胞」包括多個此類細胞及熟習此項技術者已知之其等效物，諸如此類。同樣，術語「一(a)」(或「一(an)」)、「一或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。亦應注意，術語「包含」、「包括」及「具有」可互換使用。

術語「約」表示其後數值之+/-20%範圍。在一個實施例中，術語約表示其後數值之+/-10%範圍。在一個實施例中，術語約表示其後數值之+/-5%範圍。

術語「胺基酸取代」或「胺基酸突變」表示預定親本胺基酸序列中的至少一個胺基酸殘基經不同「置換」胺基酸殘基置換。該或該等置換殘基可為「天然存在之胺基酸殘基」(亦即，由遺傳密碼編碼)且選自由以下組成之群：丙胺酸(Ala)；精胺酸(Arg)；天冬醯胺(Asn)；天冬胺酸(Asp)；半胱胺酸(Cys)；麩醯胺酸(Gln)；麩胺酸(Glu)；甘胺酸(Gly)；組胺酸(His)；異白胺酸(Ile)：白胺酸(Leu)；離胺酸(Lys)；甲硫胺酸(Met)；苯丙胺酸(Phe)；脯胺酸(Pro)；絲胺酸(Ser)；蘇胺酸(Thr)；色胺酸(Trp)；酪胺酸(Tyr)；及纈胺酸(Val)。在一個實施例中，置換殘基不為半胱胺酸。本文中之胺基酸取代定義亦涵蓋一或多個非天然存在之胺基酸殘基取代。「非天然存在之胺基酸殘基」表示除上文所列之天然存在之彼等胺基酸殘基之外的殘基，其能夠共價結合多肽鏈中之相鄰胺基酸殘基。非天然存在之胺基酸殘基之實例包括正白胺酸、鳥胺酸、正纈胺酸、高絲胺酸、aib及其他胺基酸殘基類似物，諸如Ellman等人，Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336中所述的彼等物。為了產生非天然存在之此類胺基酸殘基，可以使用Noren等人(Science 244 (1989) 182)及/或Ellman等人(同上)之程序。簡言之，此等程序包括在化學上用非天然存在之胺基酸殘基活化抑制因子tRNA，隨後活體外轉錄及轉譯RNA。非天然存在之胺基酸亦可經由化學肽合成及隨後使此等肽與重組產生的多肽(諸如抗體或抗體片段)融合而併入肽中。

術語「抗體依賴性細胞毒性(ADCC)」為藉由Fc受體結合介導之功能且指抗體Fc區在效應細胞存在下介導靶細胞溶解。在一個實施例中，藉由在效應細胞(諸如剛分離的PBMC (周邊血液單核細胞)或自白血球層純化之效應細胞(如單核球或NK (自然殺手)細胞))存在下，用如本文所報導之包含Fc區之2/3-IgG處理表現標靶之紅血球系細胞(例如表現重組標靶之K562細胞)的製劑來量測ADCC。靶細胞經Cr-51標記且隨後與2/3-IgG一起培育。將經標記細胞與效應細胞一起培育且分析上清液中的所釋放Cr-51。對照組包括將標靶內皮細胞與效應細胞一起、但不與2/3-IgG一起培育。藉由量測對Fcγ受體表現細胞(諸如重組表現FcγRI及/或FcγRIIA的細胞或NK細胞(基本上表現FcγRIIIA))的結合來探究2/3-IgG誘導初始介導ADCC步驟的能力。在一個較佳實施例中，量測對NK細胞上之FcγR的結合。

術語「CH1域」表示抗體重鏈多肽之一部分，其自EU位置118大約延伸至EU位置215 (EU編號系統)。在一個實施例中，CH1域具有胺基酸序列：ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSC (SEQ ID NO: 27)。

術語「CH2域」表示抗體重鏈多肽之一部分，其自EU位置231大約延伸至EU位置340 (根據Kabat的EU編號系統)。在一個實施例中，CH2域具有胺基酸序列：APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK (SEQ ID NO: 28)。CH2域的獨特之處在於其不與另一域緊密配對。實情為，兩個N連接分支鏈碳水化合物鏈插入完整原生Fc區之兩個CH2域之間。已推測碳水化合物可為域-域配對提供替代物且有助於CH2域穩定化。Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206。

術語「CH3域」表示抗體重鏈多肽之一部分，其自EU位置341大約延伸至EU位置446。在一個實施例中，CH3域具有胺基酸序列：GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID NO: 29)。

術語「包含」亦包括術語「由……組成」。

術語「補體依賴性細胞毒性(CDC)」係指如本文所報導之抗體Fc區在補體存在下誘導細胞溶解。在一個實施例中，藉由在補體存在下，用如本文所報導之2/3-IgG處理表現標靶之人類內皮細胞來量測CDC。在一個實施例中，細胞經鈣黃綠素標記。若2/3-IgG在30 µg/ml濃度下誘導20%或超過20%之靶細胞溶解，則發現CDC。可在ELISA中量測對補體因子C1q之結合。在此類分析中，原則上，用一定濃度範圍之添加有經純化人類C1q或人類血清的2/3-IgG塗佈ELISA盤。藉由針對C1q之抗體，隨後藉由過氧化酶標記之結合物偵測C1q結合。偵測結合(最大結合Bmax)係以405 nm光學密度(OD405)、針對過氧化酶受質ABTS® (2,2'-次偶氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸鹽])量測。

「效應功能」係指可歸因於抗體Fc區的彼等生物活性，其因其來源之抗體類別而異。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。

抗體Fc區與Fc受體(FcR)(其為造血細胞上的專門化細胞表面受體)的相互作用可以介導Fc受體結合依賴性效應功能。Fc受體屬於免疫球蛋白超家族，且已顯示介導以下作用：藉由免疫複合物吞噬來移除經抗體塗佈之病原體，及經由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)而使紅血球及呈現Fc區的各種其他細胞標靶(例如腫瘤細胞)溶解(參見例如Van de Winkel, J.G.及Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524)。FcR係根據其對免疫球蛋白同型之特異性定義：針對IgG型Fc區之Fc受體稱為FcγR。Fc受體結合描述於例如Ravetch, J.V.及Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492；Capel, P.J.等人，Immunomethods 4 (1994) 25-34；de Haas, M.等人，J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341；Gessner, J.E.等人，Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248。

受體與IgG型抗體Fc區的交聯(FcγR)觸發多種效應功能，包括吞噬、抗體依賴性細胞毒性，及炎性介體釋放，以及免疫複合物清除及抗體產生調控。人類中的三類FcγR已表徵，其為：
− FcγRI (CD64)以高親和力結合單體IgG且在巨噬細胞、單核球、嗜中性球及嗜酸性細胞上表現。在Fc區IgG中之胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327及P329 (根據Kabat之EU索引編號)中之至少一者修飾使得對FcγRI的結合減少。位置233-236處之IgG2殘基取代至IgG1及IgG4中使對FcγRI的結合減少10³倍，且消除人類單核球對抗體敏化紅血球的反應(Armour, K.L.等人，Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624)。
− FcγRII (CD32)以中至低親和力結合複合的IgG且受到廣泛表現。此受體可分為兩種子類型：FcγRIIA及FcγRIIB。FcγRIIA發現於涉及殺死作用之許多細胞(例如巨噬細胞、單核球、嗜中性球)上且似乎能夠活化殺死過程。FcγRIIB似乎在抑制過程中起作用且發現於B細胞、巨噬細胞上及肥大細胞及嗜酸性球上。在B細胞上，其作用似乎為抑制免疫球蛋白進一步產生及同型轉換為例如IgE類別。在巨噬細胞上，FcγRIIB用以抑制如經由FcγRIIA介導的吞噬。在嗜酸性球及肥大細胞上，B形式可以經由IgE結合至其各別受體而有助於活化此等細胞。發現包含IgG Fc區的抗體例如對FcγRIIA的結合減少，該IgG Fc區至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292及K414 (根據Kabat EU索引編號)之一處具有突變。
− FcγRIII (CD16)係以中至低親和力結合IgG且作為兩種類型存在。FcγRIIIA發現於NK細胞、巨噬細胞、嗜酸性球及一些單核球及T細胞上且介導ADCC。FcγRIIIB高度表現於嗜中性球上。發現包含IgG Fc區三抗體例如對FcγRIIIA的結合減少，該IgG Fc區至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338及D376 (根據Kabat EU索引編號)之一處具有突變。

人類IgG1上之針對Fc受體之結合位點的定位、上述突變位點及用於量測對FcγRI及FcγRIIA之結合的方法描述於Shields, R.L.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604中。

術語「鉸鏈區」表示抗體重鏈多肽的一部分，其使CH1域與CH2域在野生型抗體重鏈中連接，例如約位置221至約位置230 (根據Kabat EU編號系統)，或約位置226至約位置230 (根據Kabat EU編號系統)。其他IgG亞類的鉸鏈區可以藉由與IgG1子類序列之鉸鏈區半胱胺酸殘基比對來確定。

鉸鏈區通常為由具有一致胺基酸序列之兩個多肽組成的二聚合分子。在一個實施例中，鉸鏈區具有胺基酸序列DKTHTCPXCP (SEQ ID NO: 30)，其中X為S或P。在一個實施例中，鉸鏈區具有胺基酸序列HTCPXCP (SEQ ID NO: 31)，其中X為S或P。在一個實施例中，鉸鏈區具有胺基酸序列CPXCP (SEQ ID NO: 32)，其中X為S或P。在一個實施例中，鉸鏈區不具有內部二硫鍵。此如下達成：用絲胺酸殘基取代SEQ ID NO: 32 (及同樣SEQ ID NO: 30及31)之序列中的半胱胺酸殘基，或使SEQ ID NO: 30、31或32之鉸鏈區中的CPXC片段(SEQ ID NO: 89)缺失。

術語「肽連接子」表示天然及/或合成來源的連接子。肽連接子由胺基酸直鏈組成，其中20種天然存在之胺基酸為藉由肽鍵連接的單體結構單元。該鏈的長度為1至50個胺基酸殘基，較佳在1與28個胺基酸殘基之間，尤其較佳在3與25個胺基酸殘基之間。肽連接子可以含有重複胺基酸序列或天然存在之多肽序列。肽連接子的作用在於確保2/3-IgG的結構域可以執行其生物活性，此藉由使該等結構域正確摺疊且適當呈現來達成。肽連接子較佳為「合成肽連接子」，其指定富含甘胺酸、麩醯胺酸及/或絲胺酸殘基。此等殘基排列成例如至多五個胺基酸的小重複單元，諸如GGGS (SEQ ID NO: 69)、GGGGS (SEQ ID NO: 70)、QQQG (SEQ ID NO: 71)、QQQQG (SEQ ID NO: 72)、SSSG (SEQ ID NO: 73)或SSSSG (SEQ ID NO: 74)。此小重複單元可以重複兩次至五次以形成多聚體單元，諸如(GGGS)2 (SEQ ID NO: 75)、(GGGS)3 (SEQ ID NO: 76)、(GGGS)4 (SEQ ID NO: 77)、(GGGS)5 (SEQ ID NO: 78)、(GGGGS)2 (SEQ ID NO: 79)、(GGGGS)3 (SEQ ID NO: 80)，或(GGGGS)4 (SEQ ID NO: 81)。在一個實施例中，肽連接子選自SEQ ID NO: 69至82之連接子群組。在一個實施例中，肽連接子中之每一者彼此獨立地選自由SEQ ID NO: 69至82組成的連接子群組。在一個較佳實施例中，肽連接子/各種肽連接子(彼此獨立地)選自由SEQ ID NO: 75至81組成之連接子群組。在多聚體單元之胺基端及/或羧基端，可以添加至多六個天然存在之其他任意胺基酸。其他合成肽連接子由單一胺基酸重複10至20次而構成且可以在胺基端及/或羧基端包含至多六個天然存在之其他任意胺基酸，諸如連接子GSSSSSSSSSSSSSSSG (SEQ ID NO: 82)中的絲胺酸。所有肽連接子可以由核酸分子編碼且因此可以重組表現。由於連接子本身為肽，因此抗基因融合肽經由肽鍵連接至連接子，該肽鍵在兩個胺基酸之間形成。

「抗體片段」係指除完整抗體之外的分子，其包含完整抗體之一部分，該部分結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段之實例包括(但不限於) 2/3-IgG、Fv、scFv、Fab、scFab、Fab'、Fab-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。關於某些抗體片段的評述，參見Hudson, P.J.等人，Nat. Med. 9 (2003) 129-134。關於scFv片段之評述，參見例如Plueckthun, A., 於; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore (編), Springer-Verlag, New York (1994), 第269-315頁；亦參見WO 93/16185；US 5,571,894及US 5,587,458。

雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點的抗體片段，該兩個抗原結合位點可為二價或雙特異性的。參見例如EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson, P.J.等人，Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及Holliger, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson, P.J.等人，Nat. Med. 9 (20039 129-134)中。

單域抗體為包含抗體重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如US 6,248,516)。

抗體片段可以藉由各種技術製得，包括(但不限於)完整抗體的蛋白水解消化以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生。

術語「抗體片段」亦包括「雙重作用型Fab」或「DAF」，其包含結合至兩種不同抗原的抗原結合位點(參見例如US 2008/0069820)。

「單特異性抗體」表示對一種抗原具有單一結合特異性的抗體。單特異性抗體可以作為全長抗體或抗體片段(例如2/3-IgG、F(ab')2)或其組合(例如全長抗體加上其他scFv或Fab片段)製備。

「多特異性抗體」表示對相同抗原或兩種不同抗原上之至少兩種不同抗原決定基具有結合特異性的抗體。多特異性抗體可以作為全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)或其組合(例如全長抗體加上其他scFv或Fab片段)製備。具有兩個、三個或超過三個(例如四個)功能性抗原結合位點的工程化抗體亦已有報導(參見例如US 2002/0004587 A1)。一種多特異性抗體為雙特異性抗體。多特異性抗體亦可藉由用於製備抗體Fc-雜二聚分子的工程化靜電轉向效應(WO 2009/089004)來製成。

術語「結合至」表示結合位點對其標靶的結合，諸如包含抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域之抗體結合位點對相應抗原的結合。此結合可以使用例如BIAcore®分析(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)測定。亦即，術語「結合(至抗原)」表示抗體在活體外分析中結合至其抗原。在一個實施例中，在結合分析中測定結合，其中該抗體結合至表面且藉由表面電漿子共振(SPR)量測抗原對抗體的結合。結合意謂例如結合親和力(K_D )為10^{- 8} M或小於10^{- 8} M，在一些實施例中為10^{- 13} 至10^{- 8} M，在一些實施例中為10^{- 13} 至10^{- 9} M。術語「結合」亦包括術語「特異性結合」。

舉例而言，在BIAcore®分析之一個可能實施例中，抗原結合至表面且藉由表面電漿子共振(SPR)量測抗體結合位點的結合。結合親和力係藉由術語ka (結合常數：用於結合形成複合物的速率常數)、kd (解離常數；用於複合物解離的速率常數)及KD (kd/ka)定義。或者，SPR感測圖中的結合信號可以在共振信號高度及解離特性方面，直接與參考物的反應信號加以比較。

可以藉由BIAcore分析(GE Healthcare Biosensor AB, Uppsala, Sweden)探究結合。結合親和力係藉由術語k_a (來自抗體/抗原複合物之抗體結合的速率常數)、k_d (解離常數)及K_D (k_d /k_a )定義。

術語「結合位點」表示對標靶顯示結合特異性的任何蛋白質實體。此可為例如受體、受體配位體、抗運載蛋白、親和抗體、抗體等。因此，如本文所用，術語「結合位點」表示可以特異性結合至或可以被第二多肽特異性結合的多肽。在一個實施例中，結合位點係選自由以下組成的多肽群組：抗體重鏈可變域、抗體輕鏈可變域、抗體重鏈與抗體輕鏈可變域對、受體或其功能片段、受體配位體或其功能片段、酶或其受質。

在抗體情況下，結合位點包含至少三個HVR (例如在VHH情況下)或六個HVR (例如在天然存在之(亦即習知)抗體情況下)。一般而言，負責抗原結合之抗體的胺基酸殘基形成結合位點。此等殘基通常包含於一對抗體重鏈可變域與同源抗體輕鏈可變域中。抗體之抗原結合位點包含來自「高變區」或「HVR」的胺基酸殘基。「構架」或「FR」區為除如本文所定義之高變區殘基之外的彼等可變域區域。因此，抗體之輕鏈及重鏈可變域自N端至C端包含區域FR1、HVR1/CDR1、FR2、HVR2/CDR2、FR3、HVR3/CDR3，及FR4 (免疫球蛋白構架)。具體言之，重鏈可變域之HVR3/CDR3區為對抗原結合貢獻最大且限定抗體結合特異性的區域。「功能性結合位點」能夠特異性結合至其標靶。術語「特異性結合至」表示結合位點在活體外分析(在一個實施例，在一個結合分析中)中結合至其標靶。此類結合分析可為任何分析，只要可以偵測到結合事件。舉例而言，其中抗體結合至表面且藉由表面電漿子共振(SPR)量測抗原與抗體之結合的分析。或者，可以使用橋式ELISA。結合意謂抗體(結合子)對其標靶的結合親和力(K_D )為10^-8 M或小於10^-8 M，在一些實施例中為10^-13 M至10^-8 M，在一些實施例中為10^-13 至10^-9 M。

抗體的「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。抗體存在五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干者可以進一步分成子類(同型)，例如IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 、IgG₄ 、IgA₁ 及IgA₂ 。對應於免疫球蛋白不同類別的重鏈恆定域分別稱為a、d、e、g及µ。

術語「Fc區」表示免疫球蛋白重鏈的C端區域，其含有鉸鏈區、CH2域及CH3域的至少一部分。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Asp221或自Cys226或自Pro230延伸至重鏈羧基端。然而，Fc區的C端離胺酸(Lys447)可或可不存在。Fc區係由兩條重鏈Fc區多肽構成，其彼此間可以經由形成鏈間二硫鍵的鉸鏈區半胱胺酸殘基共價連接。

如本文所報導之方法中產生的抗體在一個實施例中包含源於人類來源之Fc區作為Fc區。在一個實施例中，Fc區包含人類恆定區的所有部分。抗體的Fc區直接涉及補體活化、C1q結合、C3活化及Fc受體結合。雖然抗體對補體系統的影響依賴於某些條件，但對C1q的結合係由Fc區中的限定結合位點引起。此類結合位點在當前技術中為已知的且描述於例如Lukas, T.J.等人，J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560；Brunhouse, R.,及Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917；Burton, D.R.等人，Nature 288 (1980) 338-344；Thommesen, J.E.等人，Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004；Idusogie, E.E.等人，J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184；Hezareh, M.等人，J. Virol. 75 (2001) 12161-12168；Morgan, A.等人，Immunology 86 (1995) 319-324；及EP 0 307 434。此類結合位點為例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及P329 (根據Kabat EU索引編號)。子類IgG1、IgG2及IgG3的抗體通常顯示補體活化、C1q結合及C3活化，而IgG4不活化補體系統，不結合C1q且不活化C3。「抗體Fc區」為熟習此項技術者熟知且基於木瓜蛋白酶使抗體裂解而定義的術語。在一個實施例中，Fc區為人類Fc區。在一個實施例中，Fc區屬於包含突變S228P及/或L235E (根據Kabat EU索引編號)的人類IgG4子類。在一個實施例中，Fc區屬於包含突變L234A及L235A及視情況存在之P329G (根據Kabat EU索引編號)的人類IgG1子類。

術語「全長抗體」表示結構與原生抗體結構基本上類似的抗體。全長抗體包含兩個各包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的全長抗體輕鏈，及兩個各包含重鏈可變域、第一恆定域、鉸鏈區、第二恆定域及第三恆定域的全長抗體重鏈。全長抗體可以包含與全長抗體之一或多條鏈結合的其他結構域，諸如其他scFv或scFab。術語全長抗體亦涵蓋此等結合物。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指其中已引入外源核酸的細胞，包括此類細胞之後代。宿主包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括轉型的初代細胞及其衍生的後代(就繼代次數而言)。後代可以在核酸含量上與親本細胞不完全相同，但可以含有突變。本文中包括所篩選或選擇之與最初轉型之細胞具有相同功能或生物活性的突變體後代。

術語「衍生」表示藉由在至少一個位置引入變化/突變而自親本胺基酸序列獲得變異型胺基酸序列。因此，衍生的胺基酸序列與相應的親本胺基酸序列在至少一個相應位置不同。在一個實施例中，源於親本胺基酸序列的胺基酸序列在相應位置處有一至十五個胺基酸殘基的差異。在一個實施例中，源於親本胺基酸序列的胺基酸序列在相應位置處有一至十個胺基酸殘基的差異。在一個實施例中，源於親本胺基酸序列的胺基酸序列在相應位置處有一至六個胺基酸殘基的差異。同樣，衍生的胺基酸序列與其親本胺基酸序列具有較高的胺基酸序列一致性。在一個實施例中，源於親本胺基酸序列的胺基酸序列具有80%或大於80%的胺基酸序列一致性。在一個實施例中，源於親本胺基酸序列的胺基酸序列具有90%或大於90%的胺基酸序列一致性。在一個實施例中，源於親本胺基酸序列的胺基酸序列具有95%或大於95%的胺基酸序列一致性。

在一個實施例中，一或兩種重鏈Fc區多肽源於SEQ ID NO: 01的Fc區多肽且相較於SEQ ID NO: 01的Fc區多肽具有至少一個胺基酸突變。在一個實施例中，Fc區多肽包含/具有約一至約十個胺基酸突變，且在一個實施例中，Fc區多肽包含/具有約一至約五個胺基酸突變。在一個實施例中，Fc區多肽與SEQ ID NO: 01之人類Fc區多肽具有至少約80%同源性。在一個實施例中，Fc區多肽與SEQ ID NO: 01之人類Fc區多肽具有至少約90%同源性。在一個實施例中，Fc區多肽與SEQ ID NO: 01之人類Fc區多肽具有至少約95%同源性。

源於SEQ ID NO: 01或02或03或04之人類Fc區多肽的Fc區多肽進一步藉由所含的胺基酸變化來限定。因此，舉例而言，術語P329G表示源於人類Fc區多肽的Fc區多肽，該Fc區多肽相對於SEQ ID NO: 01或02或03或04之人類Fc區多肽，在胺基酸位置329的脯胺酸突變為甘胺酸。

人類IgG1 Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

以下Fc區為源於野生型人類IgG1 Fc區的變異體。

源於人類IgG1 Fc區之具有突變L234A、L235A的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：


。

源於人類IgG1 Fc區之具有Y349C、T366S、L368A及Y407V突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有S354C、T366W突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有L234A、L235A突變及Y349C、T366S、L368A、Y407V突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有L234A、L235A及S354C、T366W突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有P329G突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有L234A、L235A突變及P329G突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有P329G突變及Y349C、T366S、L368A、Y407V突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有P329G突變及S354C、T366W突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有L234A、L235A、P329G及Y349C、T366S、L368A、Y407V突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有L234A、L235A、P329G突變及S354C、T366W突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

人類IgG4 Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

以下Fc區為源於野生型人類IgG4 Fc區的變異體。

源於人類IgG4 Fc區之具有S228P及L235E突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有S228P、L235E突變及P329G突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有S354C、T366W突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有Y349C、T366S、L368A、Y407V突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有S228P、L235E及S354C、T366W突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有S228P、L235E及Y349C、T366S、L368A、Y407V突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：


。

源於人類IgG4 Fc區之具有P329G突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有P329G及Y349C、T366S、L368A、Y407V突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有P329G及S354C、T366W突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有S228P、L235E、P329G及Y349C、T366S、L368A、Y407V突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有S228P、L235E、P329G及S354C、T366W突變的Fc區多肽具有以下胺基酸序列：

。

「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含基本上所有的至少一個且典型兩個可變域，其中所有或基本上所有HVR (例如CDR)對應於非人類抗體的彼等HVR，且所有或基本上所有FR對應於人類抗體的彼等對應於人類抗體的彼等FR。人類化抗體視情況可以包含源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體的「人類化形式」，例如非人類抗體，係指已經歷人類化的抗體。

如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域的每個區域，其包含序列高度可變的胺基酸殘基片段(「互補決定區」或「CDR」)且/或形成結構上確定的環(「高變環」)，且/或含有抗原接觸殘基(「抗原接觸點」)。一般而言，抗體包含六個HVR；三個存在於重鏈可變域VH (H1、H2、H3)中，且三個存在於輕鏈可變域VL (L1、L2、L3)中。

HVR包括
(a) 存在於胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)的高變環(Chothia, C.及Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917)；
(b) 存在於胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)的CDR (Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國公眾衛生服務署, 國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991), NIH公告91-3242.)；
(c) 存在於胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)及93-101 (H3)的抗原接觸點(MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；及
(d) (a)、(b)及/或(c)之組合，包括胺基酸殘基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)及94-102 (H3)。

除非另有說明，否則可變域中的HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人(同上)編號。

術語「輕鏈」表示原生IgG抗體之較短多肽鏈。抗體輕鏈基於其恆定域之胺基酸序列可歸為兩種類型之一，稱為kappa (κ)及lambda (λ)。關於人類κ輕鏈恆定域，參見SEQ ID NO: 33且關於人類λ輕鏈恆定域，參見SEQ ID NO: 34。

術語「互補位」係指所指定抗體分子的一部分，其為標靶與結合位點之間特異性結合所必需的。互補位可為連續的，亦即，由存在於結合位點中的相鄰胺基酸殘基形成，或可為不連續的，亦即，由位於初始序列(諸如HVR/CDR之胺基酸序列)中之不同順序位置、但在結合位點所採用之三維結構中緊鄰著的胺基酸殘基形成。

「分離」的抗體為一種抗體，其已與其天然環境中的組分分離。在一些實施例中，抗體經純化至大於95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電點聚焦(IEF)、毛細管電泳、CE-SDS)或層析(例如尺寸排阻層析或離子交換或逆相HPLC)所測定。關於評估抗體純度之方法的評述，參見例如Flatman, S.等人，J. Chrom. B 848 (2007) 79-87。

「分離」的核酸係指一種核酸分子，其已與其天然環境分離。分離的核酸包括通常含有該核酸分子之細胞中所含的核酸，但該核酸分子存在於染色體外或位於與其天然染色體位置不同的染色體位置。

如本文所用，術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體群獲得的抗體，亦即，構成該群體的個別抗體相同且/或結合相同抗原決定基，但可能的變異型抗體(例如含有天然存在之突變或在單株抗體製劑製備期間產生)除外，此類變異體通常少量存在。與典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相比，單株抗體製劑中的各種單株抗體係針對抗原上的單一決定子。因此，修飾語「單株」表示自實質上均質抗體群獲得之抗體特徵，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，根據本發明使用的單株抗體可藉由多種技藝製備，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法，及使用含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分之轉殖基因動物的方法，本文中描述了此類方法及用於製備單株抗體的其他例示性方法。

「原生抗體」係指天然存在的具有不同結構之免疫球蛋白分子。舉例而言，原生IgG抗體為約150,000道爾頓的雜四聚醣蛋白，其由二硫鍵鍵結的兩條相同輕鏈與兩條相同重鏈構成。各重鏈自N端至C端，具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，繼之為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，各輕鏈自N端至C端，具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，繼之為恆定輕鏈(CL)域。抗體輕鏈基於其恆定域的胺基酸序列，可歸為兩種類型之一，稱為kappa (κ)及lambda (λ)。

術語「醫藥調配物」係指一種製劑，其所呈形式可允許其中所含活性成分的生物活性有效，且其不含毒性對調配物將投與之受試者不可接受的其他組分。

「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中之除活性成分之外的成分，其對於受試者而言無毒。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

如本文所用，術語「重組抗體」表示藉由重組方式製備、表現、形成或分離的所有抗體(嵌合體、人類化及人類)。此包括自宿主細胞(諸如NS0、HEK、BHK或CHO細胞)中分離的抗體，或自轉殖人類免疫球蛋白基因之動物(例如小鼠)中分離的抗體，或使用轉染至宿主細胞內之重組表現質體所表現的抗體。此類重組抗體具有可變區與恆定區的重排形式。如本文所報導的重組抗體可以進行活體內體細胞超變。因此，重組抗體之VH及VL區的胺基酸序列為儘管源於人類生殖系VH及VL序列且與其有關、但天然可能不存在於活體內人類抗體生殖系譜系內的序列。

如本申請案中所用，術語「價」表示(抗體)分子內存在特定數目個結合位點。因此，術語「二價」、「四價」及「六價」表示(抗體)分子內分別存在兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。如本文所報導的雙特異性抗體(如本文所報導)在一個較佳實施例中為「二價」或「三價」的。

術語「可變區」或「可變域」係指涉及抗體結合至其抗原的抗體重鏈或輕鏈結構域。抗體重鏈與輕鏈可變域(分別為VH及VL)通常具有類似的結構，其中每個結構域包含四個構架區(FR)及三個超變區(HVR) (參見例如Kindt, T.J.等人，Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman及Co., N.Y. (2007), 第91頁)。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。另外，結合特定抗原的抗體可以利用來自結合抗原之抗體的VH或VL域加以分離，以分別篩選出互補VL或VH域的文庫。參見例如Portolano, S.等人，J. Immunol. 150 (1993) 880-887；Clackson, T.等人，Nature 352 (1991) 624-628)。

術語「變異體」表示胺基酸序列與親本分子之胺基酸序列不同的分子。典型地，此類分子具有一或多種變化、插入或缺失。在一個實施例中，經修飾的抗體或經修飾的融合多肽包含含有非天然存在之Fc區之至少一部分的胺基酸序列。此類分子與親本結構域或Fc區具有小於100%的序列一致性。在一個實施例中，變異體的胺基酸序列與親本結構域或Fc區的胺基酸序列具有約75%至小於100% (特定言之，約80%至小於100%，特定言之，約85%至小於100%，特定言之，約90%至小於100%，且特定言之，約95%至小於100%)的胺基酸序列一致性。在一個實施例中，親本結構域或Fc區與變異型結構域或Fc區相差一個(或單一)、兩個或三個胺基酸殘基。

如本文所用，術語「域互換」表示在一對抗體重鏈VH-CH1片段及其相應同源抗體輕鏈中，亦即，在抗體結合臂(亦即，在Fab片段中)，抗體序列偏離天然序列之處在於至少一個重鏈域被其相應輕鏈域取代，且反之亦然。域互換一般存在三種類型：(i) CH1與CL域的互換，其產生具有VL-CH1域序列的域互換輕鏈及具有VH-CL域序列的域互換重鏈片段(或具有VH-CL-鉸鏈-CH2-CH3域序列的全長抗體重鏈)；(ii) VH與VL域的域互換，其產生具有VH-CL域序列的域互換輕鏈及具有VL-CH1域序列的域互換重鏈片段；及(iii)完整輕鏈(VL-CL)與完整VH-CH1重鏈片段的域互換(「Fab crossover」)，其產生具有VH-CH1域序列的域互換輕鏈及具有VL-CL域序列的域互換重鏈片段(所有上述域序列均依N端至C端方向指示)。

如本文所用，術語「彼此間置換」結合相應的重鏈與輕鏈域而言，係指上述域互換。因此，當CH1與CL域「彼此間置換」時，其係指(i)項下所提及的域互換，及所得重鏈及輕鏈域序列。因此，當VH與VL「彼此間置換」時，其係指(ii)項下所提及的域互換；且當CH1與CL域「彼此間置換」且VH1與VL域「彼此間置換」時，其係指(iii)項下所提及的域互換。包括域互換的雙特異性抗體報導於例如WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254及Schaefer, W.等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 108 (2011) 11187-11192。

利用本文所報導方法產生的多特異性抗體亦可包含Fab片段，該等片段包括如在上述(i)項下所提及之CH1與CL域的域互換，或在上述(ii)項下所提及之VH與VL域的域互換。特異性結合至相同抗原的Fab片段經構築具有相同的域序列。因此，在超過一個具有域互換之Fab片段包含於多特異性抗體中的情況下，該(等) Fab片段特異性結合至相同抗原。

II. 本發明之實施例
為了鑑別出用於多特異性抗體(例如雙特異性或三特異性抗體)中之最佳結合子組合，需要儘可能多地測試許多組合。因此，需要允許將各具有不同結合特異性之多個不同結合位點(亦即結合子)彼此間組合且在結合或功能分析中篩選出最佳組合的方法。

舉例而言，將具有第一結合特異性(例如不同輕鏈可變域及重鏈可變域對、Fv片段)之第一多個結合位點的各結合子與具有第二結合特異性(例如結合至相同抗原上的不同抗原決定基或結合至不同抗原)之第二多個位點的各結合子組合。此可以製備涵蓋該第一多個結合位點與該第二多個結合位點中之每一者之各組合的組合矩陣。另外，且較佳地，就價數及功能而言，此組合矩陣亦包括不同形式。接著對所產生的多特異性抗體進行分析以鑑別出具有所要功能的彼等組合及形式(例如根據藥物開發所需要且重要的功能效能及/或參數來評級)。兩種特異性之組合矩陣的大小在輸入分子數目線性增加(例如100『A-結合子』及100『B-結合子』)的情況下以指數方式生長產生了10.000種不同『A+B-bsAb』(bsAb = 雙特異性抗體)。經由個別設計產生此較大數目個不同A+B bsAb及產生表現卡匣、隨後進行表現及純化可為繁瑣的且對可以評估的矩陣大小構成限制。

至少兩種任務受益於許多不同輸入實體的產生及篩選組合(不同特異性、抗原決定基、幾何構型、親和力及/或價數)：親合力介導的結合改良及促效性bsAb的產生。

親合力介導的結合改良係基於呈單價形式之結合功能不良至無此功能的抗體衍生物，結合功能僅藉由兩個(不同)單價結合位點與二價(或甚至多價) bsAb的實體連接而達成。二價或多價產生特異性依賴於兩個不同結合位點結合的親合力。

雙特異性或多特異性促效抗體的原理相似：經由不同抗原的同時結合(此可以包括交聯)誘發功能，而僅一個單價結合實體的結合不具有活性。

上述原理的共同特性為(不具有個別單價結合實體的功能或至多功能不良及)二價或多價組合的所要功能。所要結合位點組合的鑑別係基於親合力介導之結合或促效性bsAb (由二價或多價介導)之結合及/或功能的評估。因此，此篩選需要測試抗體(亦即例如經由根據本發明之交換反應產生的bsAb)不含有任何剩餘(二價)單特異性分子，原因為彼等分子可能產生假陽性結果。相同原因引起的同等或甚至更多干擾為多價反應副產物，諸如聚集體。

A) 使單特異性單價IgG衍生物轉化為雙特異性二價IgG的方法
根據本發明的方法達成單特異性(單價)抗體或抗體片段向二價bsAb的轉化。該等方法容易移除未轉化之初始材料以及二價但非單特異性副產物以及在反應期間形成的聚集體。亦即，本發明之方法尤其解決了至少兩個問題：避免最終製劑中存在二價單特異性抗體以及非所要聚集體。

為了達成此目的，使用兩種非功能性半抗體(僅單特異性)作為初始材料。所謂的例示性2/3-IgG可以用作初始材料。2/3-IgG係由具有第一組臼包杵(KiH)突變的重鏈、與其互補的輕鏈以及Fc區構成，該Fc區藉由相應互補的第二組臼包杵突變而與重鏈的Fc區互補。互補Fc區可為例如Fc區重鏈片段或第二重鏈。為了進一步促進所要雙(多)特異性抗體正確組裝，互補Fc區除包含第二組互補KiH突變之外，亦包含額外的引入排斥電荷之擾動(去穩定化)突變。另外，互補Fc區可以包含親和標籤(例如His6或C標籤)用於在反應之後有效移除非所要離析物及產物。第二2/3-IgG包含互補的擾動突變，其在抗體的兩半彼此間交換(例如混合)後變成吸引性突變。

根據本發明的交換反應/方法包含以下步驟
- 將包含第一多肽及第二多肽的第一(初始)雜二聚多肽與包含第三多肽及第四多肽的第二(初始)雜二聚多肽一起培育，以使第二與第三多肽發生交叉交換，從而形成第三及第四雜二聚多肽，及
- 回收包含第一多肽及第四多肽的第四(交換)雜二聚多肽，
其中
i) 該第二多肽包含(第一擾動)突變，相較於與第一雜二聚多肽相同、除該第二多肽中之該突變之外的(雜二聚)多肽，該突變引起該第一雜二聚多肽失去穩定，
ii) 該第三多肽包含(第二擾動)突變，相較於與第二(雜二聚)多肽相同、除該第三多肽中之該突變之外的雜二聚多肽，該突變引起該第二雜二聚多肽失去穩定，
iii) 相較於第一(初始)雜二聚多肽及/或第二(初始)雜二聚多肽，該第二多肽中之(第一擾動)突變及該第三多肽中之(第二擾動)突變引起包含該第二多肽及該第三多肽之第三(交換)雜二聚多肽穩定，及
iv) 第四(交換)雜二聚多肽比第一(初始)雜二聚多肽及/或第二(初始)雜二聚多肽更穩定。

因此，本發明至少部分地基於如下發現：在雜二聚多肽中添加單一(單側、不成對)去穩定化(擾動)突變足以促進多肽鏈與亦包含一個單一(單側、不成對)去穩定化(擾動)突變的第二雜二聚多肽交換，原因為相較於初始雜二聚多肽，兩種新形成的所得交換雜二聚多肽具有改良的穩定性(亦即，更低的CH3-CH3結合自由能)。必須遵循的唯一限制條件為，在相應多肽彼此間結合後，在彼此間相互作用的位置處引入去穩定化(擾動)突變。

此方法可應用於滿足如上文所概述之準則的任何雜二聚多肽。

然而，根據本發明的方法尤其適用於醫藥領域。

若在交換反應期間彼此間結合之各種雜二聚初始多肽的相應多肽包含一或多個結合位點，則利用本發明之方法，可容易產生大型雙特異性結合子文庫。因此，利用本發明方法獲得的交換雜二聚多肽之一將包含此等結合位點。

此項技術中已知用於產生雜二聚多肽的不同方法。可以使用此等方法中之任一者，只要形成初始雜二聚多肽所必需的突變不干擾根據本發明之交換反應所必需的(擾動)去穩定化突變或與該等突變重疊。

轉回至醫藥領域，抗體為使用類別最廣泛的結合子。抗體經由其恆定區中、尤其重鏈之CH3域之間的相互作用而二聚。

因此，本發明至少部分地基於如下發現：在一對CH3域中之一個CH3域中引入單一去穩定化突變足以用於執行本發明的方法。更詳細而言，已發現在兩種初始雜二聚多肽培育後，在第一初始雜二聚多肽之唯一一個CH3域中的位置357處引入第一去穩定化突變及在第二初始多肽之唯一一個CH3域中的370位置處引入第二去穩定化突變促進多肽鏈在此等初始多肽之間自發交換。所得交換多肽之一包含分別在位置357及370具有突變的CH3域對，該等突變引起交換的雜二聚體穩定。類似情形可以經由位置356及439處的突變達成。所有位置根據Kabat EU索引編號。一對較佳突變為E357K及K370E。另一對較佳突變為D356K及K439E。根據本發明的方法可應用於任何IgG子類，亦即IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，原因為所討論的殘基為高度保守的。在一個較佳實施例中，CH3域屬於IgG1子類。

本發明至少部分地基於如下發現：初始雜二聚多肽的多肽鏈不需要彼此間共價連接，例如經由二硫鍵共價連接，以便於形成及分離初始雜二聚多肽。更詳細而言，由於初始多肽已為雜二聚體，因此此等多肽包含用於雜二聚化的其他突變。已發現，此等突變足以使初始雜二聚體穩定，即使在單一、單側的去穩定化(擾動)突變存在下。從而不再需要初始雜二聚多肽中之鏈共價鍵聯。因此，在一個實施例中，在含有鉸鏈區之初始雜二聚多肽情況下，此等鉸鏈區包含突變C226S及C229S，或整個CPXC (SEQ ID NO: 89)序列的缺失(根據Kabat EU索引編號)。

藉由將雜二聚初始多肽之包含Fc區之鏈之間的二硫鍵省去，不必為了起始交換反應而添加還原劑。由此允許反應條件更溫和。另外，二硫鍵可以存在於初始雜二聚多肽中，諸如存在於Fab片段中。

本發明至少部分地基於如下發現：交換的雜二聚多肽，例如包含結合位點的彼等多肽，可以藉由僅在交換反應之後形成二硫鍵來進一步穩定化。舉例而言，為了雜二聚抗體形成而良好確立的突變為臼包杵突變。此等突變存在於兩種變異體中：不具有及具有額外的二硫鍵。因此，一種替代初始雜二聚多肽包含用於形成初始雜二聚多肽的臼包杵突變，且僅在具有結合位點的多肽鏈中提供臼包杵半胱胺酸殘基。從而僅在包含結合位點之交換雜二聚多肽中存在為了在相應匹配位置形成二硫鍵所必需的兩個半胱胺酸殘基。因此，僅在該交換產物中形成二硫鍵。由此引起標靶交換雜二聚多肽的進一步穩定。

本發明至少部分地基於如下發現：亦包含(擾動)去穩定化突變之各多肽鏈中存在標籤使得包含結合位點之交換雜二聚多肽的純化改良。諸如可與未反應的初始材料以及非標靶交換雜二聚多肽分離，因為僅有包含結合位點的交換雜二聚多肽不包含該標籤。

如本文所用，術語「雜二聚」表示一種包含至少兩條多肽鏈的多肽，該等多肽鏈在胺基酸序列上部分地或完全地不一致且滿足本發明的需要。術語亦涵蓋包含三個或超過三個多肽鏈的多肽，只要其中的至少兩者根據本發明為雜二聚的。因此，術語「多聚體」表示包含至少三個多肽鏈的多肽，其中至少兩者為雜二聚且滿足本發明的需要。

術語「擾動突變」表示引起(雜)二聚多肽失去穩定的突變。此去穩定化通常藉由改變胺基酸殘基電荷來達成，諸如使帶正電胺基酸殘基與帶負電胺基酸殘基交換，或反之亦然。此類交換在相互作用位置產生相似電荷且從而產生電荷排斥。一對較佳突變為E357K及K370E。另一對較佳突變為D356K及K439E。另外，根據本發明的方法可應用於任何IgG子類，亦即IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，原因為所討論的殘基為高度保守的。在一個較佳實施例中，CH3域屬於IgG1子類。

WO 2009/089004 (以引用之方式併入本文中)中揭示一種評估CH3域突變對二聚體穩定性之影響的方法。其中概述EGAD軟體如何可以用於估算CH3-CH3域結合自由能(亦參見Pokala, N.及Handel, T.M., J. Mol. Biol. 347 (2005) 203-227)：

EGAD可以用於大致比較在CH3域界面所產生之各種突變的結合自由能。突變體的結合自由能定義為ΔΔGmut = μ (ΔGmut - ΔGwt)(mut = 突變體，wt = 野生型)。其中，μ (=0.1，一般而言)為使結合親和力之預測變化歸一化而使用的比例因子，與實驗能量相比，其斜率為1。解離自由能(ΔG)定義為複合狀態(ΔG結合)與自由狀態(ΔG自由)之間的能量差。

本發明在下文中以特定的例示性初始材料(亦即2/3-IgG)為例說明。此以潛在大體構思之範例呈現且不應理解為對本發明的限制。本發明的真實範疇闡述於申請專利範圍中。

圖1顯示作為例示性初始化合物用於本發明方法中之2/3-IgG的設計及模組化組成。2/3-IgG係由三條個別鏈構成：一條輕鏈(通常為包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的全長輕鏈)、一條重鏈(通常為包含重鏈可變域及所有重鏈恆定域(包括鉸鏈區)的全長重鏈)，及一條互補重鏈Fc區多肽(通常為包含鉸鏈及CH2-CH3之至少一個片段的重鏈Fc區片段)。輕鏈與重鏈的可變域形成功能結合位點，亦即VH-VL對。重鏈(通常為人類IgG1子類的重鏈)含有i)杵突變或臼突變(抗體重鏈CH3域中的突變T366W表示為「杵突變」且抗體重鏈CH3域中的突變T366S/L368A/Y407V組合表示為「臼突變」(根據Kabat EU索引編號))，或ii)抗體重鏈CH3域中的杵-cys突變或臼-cys突變(突變T366W/S354C組合)表示為「杵-cys突變」且抗體重鏈CH3域中的突變T366S/L368A/Y407V/Y349C組合表示為「臼-cys突變」；CH3域中同樣可存在反向配置：T366W/Y349C及T366S/L368A/Y407V/S354C (根據Kabat EU索引編號)，以允許臼包杵型Fc區雜二聚體形成。互補的重鏈Fc區多肽亦可表示為『假Fc』，亦即，缺少VH及CH1的IgG1衍生物在N端以鉸鏈區序列(或其片段)開始且在其C端具有純化標籤，例如His6或His8或C標籤。另外，2/3-IgG的互補重鏈Fc區多肽在其CH3域中含有杵突變或臼突變，此視重鏈中的突變而定。除杵突變或臼突變之外，重鏈Fc區多肽亦包含相對於野生型序列引入一個(亦即，額外單個)排斥電荷的至少一個擾動(亦即，去穩定化)突變：例如分別為D356K或E357K，其分別與K370E或K439E組合(SEQ ID NO: 35、36、37及38，其亦為本發明之態樣)(參見圖2)。此類突變的重鏈 Fc 區 多肽 在下文中表示為MHCFcRP。

重鏈與MHCFcRP可以形成兩種類型的雜二聚體，此視其中臼包杵突變的分佈而定：
i) 重鏈-杵(-cys)::MHCFcRP-臼，及
ii) 重鏈-臼(-cys)::MHCFcRP-杵。

因此，2/3-IgG為與輕鏈結合的雜二聚體，亦即，雜三聚體。然而，此等雜三聚體因MHCFcRP中之電荷突變與重鏈中的配對物不匹配而稍微『有瑕疵』，且若存在於重鏈中，則MHCFcRP缺少為了與重鏈形成鏈間二硫鍵而必需的額外CH3半胱胺酸。

2/3-IgG為單價、非二聚/聚集、單臂抗體衍生物，其可以表現且純化至與正常IgG相似的產量(參見圖3)。此確保初始材料為一價。若使用二價2/3-IgG，則其可為單特異性以及雙特異性的。

然而，構成彼等有瑕疵之2/3-IgG的多肽能夠重排成雙特異性抗體，如圖4中所示。

兩種初始分子之間的交換反應係由KiH (臼包杵)重鏈(H鏈)彼此間的較佳互補性(無電荷排斥及視情況形成二硫鍵(若存在自由半胱胺酸殘基))驅動以及由兩個MHCFcRP彼此間的較佳互補性驅動。在反應中，兩種初始分子的Fc區複合物解離且發生多肽交換而形成兩種更有利的複合物。此如下驅動反應：
2/3-IgG(A)-標籤 + 2/3-IgG(B)-標籤
(初始雜二聚多肽)
→
bsAb(AB) + MHCFcRP(A)-MHCFcRP(B)-標籤
(交換的雜二聚多肽)

在如圖4所描繪之實例中，初始2/3-IgG之重鏈(杵-cys)(A)與初始2/3-IgG之重鏈(臼-cys)(B)形成匹配的雙特異性抗體雜四聚體(2xHC + 2xLC)。

交換反應藉由還原步驟起始(在存在鉸鏈區/重鏈間二硫鍵的情況下)以使二硫鍵斷裂。若使用不含鉸鏈區-二硫鍵的2/3-IgG，則可以省去還原步驟(參見下文)。隨後自發地發生鏈重排。

所有2/3-IgG初始分子、所有二聚MHCFcRP副產物以及在交換反應期間可以形成的所有聚集體均包含至少一個親和標籤(例如His6或His8或C標籤)。因此，可以利用單一且簡單且高處理量的相容性吸收(親和層析)步驟移除所有非所需分子，包括聚集體。舉例而言，在His6標籤情況下，此步驟為金屬螯合劑親和層析(參見圖6及7)。所得純化bsAb可以直接應用於篩選程序以鑑別具有所要功能的bsAb (參見圖8)。

參見下述實例，尤其實例1至5。

B)使一價及/或二價單特異性或雙特異性IgG衍生物轉化成二價、三價或四價雙特異性、三特異性或四特異性抗體的方法
使用本發明的方法，不僅可以將不同結合特異性組合，而且可以使此等組合在不同形式內以不同價數同時產生。此係藉由擴增方法中所使用之起始材料來達成，如前述章節中所概述。

舉例而言，如前述章節中所概述，以2/3-IgG為起始物，維持MHCFcRP不變，但使用不同形式的重鏈。此類形式可為例如在C端或在N端具有一個結合位點的鏈，或具有兩個結合位點(每一端有一個)的鏈(一個位於N端且一個位於C端)(參見圖9及10)。

在此實例中，利用本發明之方法將三種不同初始形式(N端結合位點、C端結合位點、N端與C端結合位點)彼此間組合，從而產生9種不同bsAb形式，其具有不同結合位點、不同價數、不同幾何構型及個別結合位點的不同三維配置/位置(參見圖11)。

舉例而言，50個「結合子-A」及50個「結合子-B」初始分子可各自以三種形式表現(N端結合位點、C端結合位點、N端與C端結合位點)，從而產生2/3-IgG的150 (3*50)種製劑(各結合子作為初始分子)。此等製劑隨後可以改組且與本發明的方法組合。由此產生22.500 (50*3x50*3)種不同bsAb。

產生bsAb時，交換驅動原理(將有瑕疵的輸入分子轉化為匹配的輸出分子)不變。MHCFcRP亦保留。因此，僅重鏈發生變化/多樣化。

圖1及9至10顯示三種不同初始分子(具有N端、C端、N端與C端結合位點的2/3-IgG)可以在根據本發明的交換反應中彼此間組合，從而產生九種不同雙特異性形式。此等形式的不同之處在於個別結合位點的價數、幾何構型及不同位置。

不受此理論束縛，假設基於兩種不同2/3-IgG之有瑕疵雜多聚體之臨時分離的交換反應應產生較佳含有匹配型Fc區雜二聚體的產物。交換因此使單特異性2/3-IgG轉化成雙特異性IgG (呈不同形式)，以及相應的Fc區雜二聚體。

為了舉例說明交換反應，如下稱呼輸入分子：
- 「nA或nB」用於在重鏈(H鏈)之正常N端具有Fab臂的分子，
- 「cA或cB」用於在H鏈之C端具有Fab臂的分子，
- 「ncA或ncB」用於在H鏈之N端以及C端具有Fab臂的分子。

不同的形式交換反應如下：
2/3-IgG(nA)-標籤 + 2/3-IgG(nB)-標籤 → bsAb(nAnB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(nA)-標籤 + 2/3-IgG(cB)-標籤 → bsAb(nAcB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(nA)-標籤 + 2/3-IgG(ncB)-標籤 → bsAb(nAncB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(cA)-標籤 + 2/3-IgG(cB)-標籤 → bsAb(cAcB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(cA)-標籤 + 2/3-IgG(nB)-標籤 → bsAb(cAnB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(cA)-標籤 + 2/3-IgG(ncB)-標籤 → bsAb(cAncB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(ncA)-標籤 + 2/3-IgG(nB)-標籤 → bsAb(ncAnB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(ncA)-標籤 + 2/3-IgG(cB)-標籤 → bsAb(ncAcB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(ncA)-標籤 + 2/3-IgG(ncB)-標籤 → bsAb(ncAncB) + (MHCFcRP)₂ -標籤

若存在鉸鏈區二硫鍵，則藉由使鏈間鉸鏈區二硫鍵斷裂的還原步驟起始交換反應。自發地發生鏈交換及重排。所有輸入分子、所有副產物以及在交換反應期間可能潛在形成的所有聚集體具有親和標籤(例如His6)。然而，交換反應中所產生的所要bsAb不攜帶親和標籤且因此經由NiNTA親和層析(吸收)加以移除。剩餘bsAb (呈不同形式)可以直接應用於篩選程序及分析中以鑑別及評定具有最佳功能的bsAb形式。

參見實例6及7。

為了顯示本發明之方法的一般適用性，已經製備其他形式且使其經歷根據本發明的交換反應。

非抗體結合子：
在另一種形式中，一個2/3-IgG之Fab區已經親和抗體置換(參見圖19及實例13)。交換反應亦發揮作用(參見圖23、ELISA結果)。

在 Fab 區域中添加第三結合位點 ( VH / VL 對 ) ：
在另一種形式中，2/3-IgG之一包含第二Fab區域(Fab延長的2/3-IgG；參見圖26及實例9及15至16)。交換反應亦發揮作用(參見圖27)。

為了說明交換反應，如下稱呼輸入分子：
- 「dA」用於在重鏈之正常N端具有兩個Fab臂的分子(Fab延長的2/3-IgG)
- 「nB」用於在重鏈(H鏈)之正常N端具有Fab臂的分子，
- 「cB」用於在H鏈之C端具有Fab臂的分子，
- 「ncB」用於在H鏈之N端以及C端具有Fab臂的分子。

不同的形式交換反應如下：
2/3-IgG(dA)-標籤 + 2/3-IgG(nB)-標籤 → bsAb(dAnB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(dA)-標籤 + 2/3-IgG(cB)-標籤 → bsAb(dAcB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(dA)-標籤 + 2/3-IgG(ncB)-標籤 → bsAb(dAncB) + (MHCFcRP)₂ -標籤

受限制的結合子 ：
在另一種形式中，2/3-IgG之一包含如WO 2017/191101 (以引用之方式併入本文中)中所述之受限制的結合子(受限制的2/3-IgG、conA、conB；參見圖31及實例21)，而非Fab區域。交換反應亦發揮作用(參見圖32)。

為了說明交換反應，如下稱呼輸入分子：
- 「conA或conB」用於具有受限制之結合位點的分子，該受限制的結合位點包含Fc區N端之結合位點的第一部分及Fc區C端之結合位點的第二部分，其中第一與第二部分彼此間結合且形成結合位點，此等分子為圓形的，
- 「nA或nB」用於在重鏈(H鏈)之正常N端具有Fab臂的分子，
- 「cA或cB」用於在H鏈之C端具有Fab臂的分子，
- 「ncA或ncB」用於在H鏈之N端以及C端具有Fab臂的分子。

不同的形式交換反應如下：
2/3-IgG(conA)-標籤 + 2/3-IgG(nB)-標籤 → bsAb(nAnB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(conA)-標籤 + 2/3-IgG(cB)-標籤 → bsAb(nAcB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(conA)-標籤 + 2/3-IgG(ncB)-標籤 → bsAb(nAncB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(conA)-標籤 + 2/3-IgG(conB)-標籤 → bsAb(conAconB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(nA)-標籤 + 2/3-IgG(nB)-標籤 → bsAb(nAnB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(nA)-標籤 + 2/3-IgG(cB)-標籤 → bsAb(nAcB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(nA)-標籤 + 2/3-IgG(ncB)-標籤 → bsAb(nAncB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(nA)-標籤 + 2/3-IgG(conB)-標籤 → bsAb(nAconB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(cA)-標籤 + 2/3-IgG(cB)-標籤 → bsAb(cAcB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(cA)-標籤 + 2/3-IgG(nB)-標籤 → bsAb(cAnB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(cA)-標籤 + 2/3-IgG(ncB)-標籤 → bsAb(cAncB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(cA)-標籤 + 2/3-IgG(conB)-標籤 → bsAb(cAconB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(ncA)-標籤 + 2/3-IgG(nB)-標籤 → bsAb(ncAnB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(ncA)-標籤 + 2/3-IgG(cB)-標籤 → bsAb(ncAcB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(ncA)-標籤 + 2/3-IgG(ncB)-標籤 → bsAb(ncAncB) + (MHCFcRP)₂ -標籤
2/3-IgG(ncA)-標籤 + 2/3-IgG(conB)-標籤 → bsAb(ncAconB) + (MHCFcRP)₂ -標籤

參見實例21及圖31至34。

C) Fc-Fc鏈間二硫鍵的消去及還原步驟
重鏈鏈間二硫鍵使抗體穩定且限定連接至鉸鏈之Fab臂的柔性。包含初始抗體之鉸鏈區的交換途徑需要在交換反應之前或期間還原此等二硫化物以及在交換反應完成後移除還原劑(參見實例3及7)。其可為一些途徑所需的且促進交換產物的下游處理以避免此類還原步驟。

因此，作為本發明之另一態樣，本文中報導具有鉸鏈區、但不具有鏈間鉸鏈區二硫鍵之初始分子的交換反應。

為了對此進行舉例說明，已產生其中Fc區中之所有二硫鍵已消去的2/3-IgG。已發現可以有效方式產生及純化此類二硫鍵耗乏的2/3-IgG，甚至無此等鏈間二硫鍵(參見圖15)。當在本發明方法中使用此類二硫鍵耗乏的2/3-IgG作為初始分子時，交換反應之後進行的初始分子還原及還原劑移除可以省去。藉此提供經改良的用於產生bsAb之程序(處理步驟更少且副產物更少)。由此等二硫鍵耗乏之2/3-IgG產生的bsAb具有功能性且藉由非共價Fc-Fc相互作用而非鏈間二硫鍵穩定地結合在一起(參見圖16及17)。

因此，Fc-Fc/鉸鏈區鏈間二硫鍵的移除消除了還原步驟起始交換反應的必要性。所得bsAb為功能性雙特異性分子，藉由非共價Fc-Fc相互作用而非Fc區鏈間二硫鍵結合在一起。Fc-Fc鏈間二硫化物的消去從而允許相應的Fc區錯配驅動交換反應，而無需還原及再氧化(亦即在生理條件下)。此有助於製備及(高處理量)篩選程序。

在一個實施例中，鉸鏈區不含二硫鍵。不含二硫鍵的鉸鏈區在SEQ ID NO: 32序列中包含絲胺酸殘基替代半胱胺酸殘基。反應在鉸鏈區二硫鍵存在或不存在下均為有效的(參見圖24，根據實例3或12之ELISA)。

除移除二硫鍵之外，另外可以縮短鉸鏈區。藉由使用此類經修飾之鉸鏈區，可以獲得在個別結合位點之間提供不同距離的雙特異性抗體(參見圖25)。因此，在一個實施例中，鉸鏈區具有SEQ ID NO: 31 (HTCPXCP，X=S或P)或SEQ ID NO: 85 (HTSPXSP，X=S或P)或SEQ ID NO: 86 (HTPAPE；SEQ ID NO. 31之CPXC已缺失)的胺基酸序列。

參見實例10、11、18及19。

已發現2/3-IgG之組裝濃度影響鏈交換反應的效率且藉此影響所形成之雙特異性抗體的量。在確保有效鏈交換反應的一個實施例中，2/3-IgG的濃度為至少0.1 μM，亦即0.1 µM或高於0.1 µM (直至1 M)，在一個較佳實施例中，為1 µM或高於1 µM。

參見實例20及圖30。

在一個較佳實施例中，初始化合物以等莫耳濃度混合。

D) Fc區變異體
在某些實施例中，可以在本文所提供之2/3-IgG之Fc區中引入一或多個其他胺基酸修飾，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可以包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，該序列在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)。

在某些實施例中，本發明涵蓋2/3-IgG變異體，其具有一些但非所有效應功能，使得其成為其中活體內抗體半衰期重要、而某些效應功能(諸如補體及ADCC)不必要或有害之應用的所需候選物。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以證實CDC及/或ADCC活性之減小/耗乏。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保2/3-IgG缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn結合能力。用於介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch, J.V.及Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492第464頁之表3中。評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例描述於US 5,500,362 (參見例如Hellstrom, I.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；及Hellstrom, I.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502)；US 5,821,337 (參見Bruggemann, M.等人，J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361)中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流式細胞術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96^® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI)。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。替代地或另外，可以評估所關注之分子在活體內的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes, R.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656中所揭示。亦可進行C1q結合分析以確認抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性(參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA)。為評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro, H.等人，J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171；Cragg, M.S.等人，Blood 101 (2003) 1045-1052；及Cragg, M.S.及M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743)。亦可使用此項技術中已知之方法進行FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(參見例如Petkova, S.B.等人，Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769)。

包含效應功能減少之Fc區的2/3-IgG包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者具有取代的彼等物(US 6,737,056)。此類Fc區突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或超過兩者處具有取代的Fc區突變體，包括殘基265及297經丙胺酸取代的所謂「DANA」Fc區突變體(US 7,332,581)。

某些2/3-IgG包含對FcR之結合改良或減弱的Fc區變異體(參見例如US 6,737,056；WO 2004/056312；及Shields, R.L.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。

在某些實施例中，2/3-IgG包含具有一或多個使得ADCC改良之胺基酸取代(例如Fc區之位置298、333及/或334之取代(殘基EU編號))的Fc區變異體。

在一些實施例中，在Fc區中產生變化，從而引起C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即，改良或減弱)，例如如US 6,194,551、WO 99/51642及Idusogie, E.E.等人，J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184中所述。

半衰期延長且對新生兒Fc受體(FcRn)之結合改良的抗體描述於US 2005/0014934中，該新生兒Fc受體負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer, R.L.等人，J. Immunol. 117 (1976) 587-593；及Kim, J.K.等人，J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434)。彼等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，該等取代改良Fc區與FcRn的結合。此類Fc區變異體包括在Fc區殘基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中之一或多者處具有取代的彼等變異體，例如Fc區殘基434之取代(US 7,371,826)。

關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan, A.R.及Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351。

在所有態樣之一個實施例中，2/3-IgG包含(所有位置根據Kabat EU索引)
i) 兩種Fc區多肽中具有突變P329G、L234A及L235A之人類IgG1子類的Fc區，或
ii) 兩種Fc區多肽中具有突變P329G、S228P及L235E之人類IgG4子類的Fc區，或
iii) 兩種Fc區多肽中具有突變P329G、L234A、L235A、I253A、H310A及H435A或兩種Fc區多肽中具有突變P329G、L234A、L235A、H310A、H433A及Y436A之人類IgG1子類的Fc區，或
iv) 人類IgG1子類之雜二聚Fc區，其中兩種Fc區多肽均包含突變P329G、L234A及L235A，及
a) 一種Fc區多肽包含突變T366W，且另一種Fc區多肽包含突變T366S、L368A及Y407V，或
b) 一種Fc區多肽包含突變T366W及Y349C，且另一種Fc區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V及S354C，或
c) 一種Fc區多肽包含突變T366W及S354C，且另一種Fc區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V及Y349C，
或
v) 人類IgG4子類之雜二聚Fc區，其中兩種Fc區多肽均包含突變P329G、S228P及L235A，及
a) 一種Fc區多肽包含突變T366W，且另一種Fc區多肽包含突變T366S、L368A及Y407V，或
b) 一種Fc區多肽包含突變T366W及Y349C，且另一種Fc區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V及S354C，或
c) 一種Fc區多肽包含突變T366W及S354C，且另一種Fc區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V及Y349C，
或
vi) i)、ii)及iii)之一與iv)及v)之一的組合。

在如本文所報導之所有態樣的一個實施例中，包含CH3域的2/3-IgG包含另一個C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在如本文所報導之所有態樣的一個實施例中，包含CH3域的2/3-IgG包含另一個C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。

在一個實施例中，如本文所報導之2/3-IgG包含Fc區，該Fc區的特徵為屬於具有突變PVA236、L234A/L235A及/或GLPSS331 (根據Kabat EU索引編號)的人類子類IgG1，或屬於子類IgG4。在另一實施例中，2/3-IgG的特徵為所包含的Fc區屬於任何IgG類別，在一個實施例中屬於IgG1或IgG4子類，在E233、L234、L235、G236、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331及/或P329 (根據Kabat EU索引編號)中含有至少一個突變。另外在一個實施例中，2/3-IgG包含人類IgG4子類之Fc區，該Fc區含有突變S228P，或突變S228P及L235E (Angal, S.等人，Mol. Immunol. 30 (1993) 105-108)(根據Kabat EU索引編號)。

如本文所報導之2/3-IgG中所包含之Fc區多肽的C端可為終止於胺基酸殘基PGK的完整C端。C端可為縮短的C端，其中C端胺基酸殘基中之一或兩個已移除。在一個較佳實施例中，C端為終止於胺基酸殘基PG的縮短C端。

E)雜二聚化
用於CH3修飾以便支持雜二聚之若干種方法已描述於例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中，該等文獻均以引用的方式包括於本文中。

典型地，在此項技術中已知之方法中，第一重鏈之CH3域與第二重鏈之CH3域均以互補方式經工程改造，使得包含一個工程化CH3域的重鏈可以不再與相同結構之另一重鏈發生均二聚(例如CH3工程化第一重鏈可以不再與另一CH3工程化第一重鏈發生均二聚；且CH3工程化第二重鏈可以不再與另一CH3工程化第二重鏈發生均二聚)。藉此，包含一個工程化CH3域的重鏈與另一個包含CH3域的重鏈發生雜二聚，此以互補方式進行工程改造。在此實施例中，第一重鏈Fc區多肽的CH3域與第二重鏈Fc區多肽的CH3域係以互補方式藉由胺基酸取代進行工程改造，以便第一重鏈Fc區多肽與第二重鏈Fc區多肽發生雜二聚，而第一重鏈Fc區多肽與第二重鏈Fc區多肽不再發生均二聚(例如因空間原因)。

上文所引述且包括的已知在此項技術中用於支持重鏈雜二聚化的不同方法作為用於提供如本文所報導之雜二聚/多聚體多肽(例如2/3-IgG)的不同替代方式涵蓋在內。

如本文所報導之2/3-IgG的CH3域可藉由「臼包杵」技術改變，該技術以若干個實例詳細描述於例如WO 96/027011；Ridgway, J.B.等人，Protein Eng. 9 (1996) 617-621；及Merchant, A.M.等人，Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681中。在此方法中，兩個CH3域之相互作用表面經改變以增加含有此兩個CH3域之兩種重鏈Fc區多肽的雜二聚化。(兩種重鏈Fc區多肽之)兩個CH3域中之每一者可為「杵」，而另一者為「臼」。另外可以引入二硫橋鍵以使雜二聚體進一步穩定(Merchant, A.M.等人，Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S. 等人，J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)且在根據本發明的交換反應中增加產量。

在一個較佳實施例中，如本文所報導之2/3-IgG在「杵鏈」之CH3域中包含T366W突變且在「臼鏈」之CH3域中包含T366S、L368A、Y407V突變(根據Kabat EU索引編號)。CH3域之間亦可使用額外的鏈間二硫橋鍵(Merchant, A.M.等人，Nature Biotech. 16 (1998) 677-681)，例如藉由將Y349C突變引入杵鏈之CH3域之一及將E356C突變或S354C突變引入臼鏈之CH3域之一(在根據本發明的交換反應中，使用兩種多聚體作為初始材料，該等多聚體之CH3域中僅一者包含額外的半胱胺酸殘基，因此僅在交換產物中形成額外的二硫鍵)。因此，在另一個較佳實施例中，如本文所報導之2/3-IgG在第一多聚體之CH3域之一中包含Y349C及T366W突變且在第二多聚體之相應互補CH3域中包含E356C、T366S、L368A及Y407V突變；或如本文所報導之2/3-IgG在第一多聚體之CH3域之一中包含Y349C及T366W突變且在第二多聚體之相應互補CH3域中包含S354C、T366S、L368A及Y407V突變(存在於一個CH3域中的額外Y349C突變及存在於相應CH3域中的額外E356C或S354C突變形成鏈間二硫橋鍵)(根據Kabat EU索引編號)。

或者或另外，而且可使用如EP 1 870 459 A1所述之其他臼包杵技術。在一個實施例中，如本文所報導之2/3-IgG在「杵鏈」之CH3域中包含R409D及K370E突變且在「臼鏈」之CH3域中包含D399K及E357K突變(根據Kabat EU索引編號)。

在一個實施例中，如本文所報導之2/3-IgG在「杵鏈」之CH3域中包含T366W突變且在「臼鏈」之CH3域中包含T366S、L368A及Y407V突變，且另外，在「杵鏈」之CH3域中包含R409D及K370E突變且在「臼鏈」之CH3域中包含D399K及E357K突變(根據Kabat EU索引編號)。

在一個實施例中，如本文所報導之2/3-IgG在CH3域之一中包含突變Y349C及T366W，且在互補CH3域中包含突變S354C、T366S、L368A及Y407V突變，或如本文所報導之2/3-IgG在CH3域之一中包含Y349C及T366W突變，且在互補CH3域中包含S354C、T366S、L368A及Y407V突變，且另外在「杵鏈」之CH3域中包含R409D及K370E突變，且在「臼鏈」之CH3域中包含D399K及E357K突變(根據Kabat EU索引編號)。

除「臼包杵技術」之外，此項技術中已知用於修飾2/3-IgG重鏈CH3域以加強雜二聚化的其他技術。本文涵蓋此等技術，具體言之，WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954及WO 2013/096291中所述之技術，作為「臼包杵技術」之替代方案與如本文所報導之2/3-IgG組合。

在如本文所報導之2/3-IgG的一個實施例中，使用EP 1 870 459 A1中所述的方法支持2/3-IgG之第一重鏈與第二重鏈的雜二聚化。此方法係基於在第一與第二重鏈之間的CH3/CH3域界面中之特定胺基酸位置處引入帶相反電荷之帶電胺基酸。

因此，此實施例係關於如本文所報導之2/3-IgG，其中在多聚體之三級結構中，第一重鏈Fc區多肽之CH3域與第二重鏈Fc區多肽之CH3域形成的界面位於相應的CH3域之間，其中第一重鏈Fc區多肽之CH3域及第二重鏈Fc區多肽之CH3域的胺基酸序列各自在2/3-IgG之三級結構中包含一組位於該界面內的胺基酸，其中在一條重鏈Fc區多肽之CH3域之位於該界面中的該組胺基酸中，第一胺基酸被帶正電胺基酸取代，且在另一重鏈Fc區多肽之CH3域之位於該界面中的該組胺基酸中，第二胺基酸被帶負電胺基酸取代。根據此實施例的2/3-IgG在本文中亦稱為「CH3 (+/-)工程化2/3-IgG」(其中縮寫「+/-」表示引入相應CH3域中的帶相反電荷胺基酸)。

在如本文所報導之該CH3(+/-)工程化2/3-IgG之一個實施例中，帶正電胺基酸係選自K、R及H，且帶負電胺基酸係選自E或D。

在如本文所報導之該CH3(+/-)工程化2/3-IgG的一個實施例中，帶正電胺基酸係選自K及R，且帶負電胺基酸係選自E或D。

在如本文所報導之該CH3(+/-)工程化2/3-IgG的一個實施例中，帶正電胺基酸為K，且帶負電胺基酸為E。

在如本文所報導之該CH3(+/-)工程化2/3-IgG的一個實施例中，在一條重鏈之CH3域中，位置409處之胺基酸R經D取代且位置370處之胺基酸K經E取代，且在另一條重鏈之CH3域中，位置399處之胺基酸D經K取代且位置357處之胺基酸E經K取代(根據Kabat EU索引編號)。

在如本文所報導之2/3-IgG的一個實施例中，WO 2013/157953中所述的方法用於支持2/3-IgG之第一重鏈Fc區多肽與第二重鏈Fc區多肽的雜二聚化。在如本文所報導之該2/3-IgG的一個實施例中，在一條重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置366處的胺基酸T經K取代，且在另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置351處的胺基酸L經D取代(根據Kabat EU索引編號)。在如本文所報導之該2/3-IgG的另一個實施例中，在一條重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置366處的胺基酸T經K取代且位置351處的胺基酸L經K取代，且在另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置351處的胺基酸L經D取代(根據Kabat EU索引編號)。

在如本文所報導之該2/3-IgG的另一個實施例中，在一條重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置366處的胺基酸T經K取代且位置351處的胺基酸L經K取代，且在另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置351處的胺基酸L經D取代(根據Kabat EU索引編號)。另外，另一重鏈Fc區多肽之CH3域中包含以下取代中之至少一者：位置349處的胺基酸Y經E取代，位置349處的胺基酸Y經D取代且位置368處的胺基酸L經E取代(根據Kabat EU索引編號)。在一個實施例中，位置368處之胺基酸L經E取代(根據Kabat EU索引編號)。

在如本文所報導之2/3-IgG的一個實施例中，WO 2012/058768中所述的方法用於支持2/3-IgG之第一Fc區多肽與第二Fc區多肽的雜二聚化。在如本文所報導之該2/3-IgG的一個實施例中，在一條重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置351處的胺基酸L經Y取代且位置407處的胺基酸Y經A取代，且在另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置366處的胺基酸T經A取代且位置409處的胺基酸K經F取代(根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，除前述取代之外，在另一重鏈Fc區多肽之CH3域中，位置411 (最初為T)、399 (最初為D)、400 (最初為S)、405 (最初為F)、390 (最初為N)及392 (最初為K)之胺基酸中之至少一者經取代(根據Kabat EU索引編號)。較佳取代為：
- 位置411之胺基酸T經選自N、R、Q、K、D、E及W之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)，
- 位置399處之胺基酸D經選自R、W、Y及K之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)，
- 位置400處之胺基酸S經選自E、D、R及K之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)，
- 位置405處之胺基酸F經選自I、M、T、S、V及W之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)；
- 位置390處之胺基酸N經選自R、K及D之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)；及
- 位置392處之胺基酸K經選自V、M、R、L、F及E之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。

在如本文所報導之該2/3-IgG的另一個實施例(根據WO 2012/058768經工程改造)中，在一條重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置351處的胺基酸L經Y取代且位置407處的胺基酸Y經A取代，且在另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置366處的胺基酸T經V取代且位置409處的胺基酸K經F取代(根據Kabat EU索引編號)。在如本文所報導之該2/3-IgG的另一個實施例中，在一條重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置407處的胺基酸Y經A取代，且在另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置366處的胺基酸經A取代且位置409處的胺基酸K經F取代(根據Kabat EU索引編號)。在該前述最後一個實施例中，在該另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置392處的胺基酸K經E取代，位置411處的胺基酸T經E取代，位置399處的胺基酸D經R取代且位置400處的胺基酸S經R取代(根據Kabat EU索引編號)。

在如本文所報導之2/3-IgG的一個實施例中，使用WO 2011/143545中所述的方法支持2/3-IgG之第一Fc區多肽與第二Fc區多肽的雜二聚化。在如本文所報導之該2/3-IgG的一個實施例中，兩種重鏈Fc區多肽之CH3域中的胺基酸修飾係在位置368及/或409引入(根據Kabat EU索引編號)。

在如本文所報導之2/3-IgG的一個實施例中，使用WO 2011/090762中所述的方法支持2/3-IgG之第一Fc區多肽與第二Fc區多肽的雜二聚化。WO 2011/090762係關於根據「臼包杵」技術進行胺基酸修飾。在如本文所報導之該CH3(KiH)工程化2/3-IgG的一個實施例中，在一條重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置366處之胺基酸T經W取代，且在另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置407處之胺基酸Y經A取代(根據Kabat EU索引編號)。在如本文所報導之該CH3(KiH)工程化2/3-IgG的另一個實施例中，在一條重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置366處之胺基酸T經Y取代，且在另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置407處之胺基酸經T取代(根據Kabat EU索引編號)。

在如本文所報導之2/3-IgG (其為IgG2同型)的一個實施例中，使用WO 2011/090762中所述的方法支持2/3-IgG之第一重鏈Fc區多肽與第二重鏈Fc區多肽的雜二聚化。

在如本文所報導之2/3-IgG的一個實施例中，使用WO 2007/147901中所述的方法支持2/3-IgG之第一Fc區多肽與第二Fc區多肽的雜二聚化。在如本文所報導之該2/3-IgG的一個實施例中，在一條重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置253處之胺基酸K經E取代，位置282處之胺基酸D經K取代且位置322處之胺基酸K經D取代，且在另一重鏈Fc區多肽之CH3域中，位置239處之胺基酸D經K取代，位置240處之胺基酸E經K取代且位置292處之胺基酸K經D取代(根據Kabat EU索引編號)。

在如本文所報導之2/3-IgG的一個實施例中，使用WO 2007/110205中所述的方法支持2/3-IgG之第一多肽與第二多肽的雜二聚化。

在如本文所報導之所有態樣的一個實施例中，2/3-IgG具有IgG型抗體的恆定域結構。在如本文所報導之所有態樣的另一實施例中，2/3-IgG的特徵在於，該2/3-IgG包含人類子類IgG1或具有突變L234A及L235A及視情況存在之P329G之人類子類IgG1的Fc區。在如本文所報導之所有態樣的另一實施例中，2/3-IgG的特徵在於，該2/3-IgG包含人類子類IgG2的Fc區。在如本文所報導之所有態樣的另一實施例中，2/3-IgG的特徵在於，該2/3-IgG包含人類子類IgG3的Fc區。在如本文所報導之所有態樣的另一實施例中，2/3-IgG的特徵在於，該2/3-IgG包含人類子類IgG4或具有額外突變S228P及L235E及視情況存在之P329G之人類子類IgG4的Fc區。

在所有態樣之一個實施例中，2/3-IgG包含第一Fc區多肽及第二Fc區多肽，其中
i) 該第一及第二Fc區多肽包含突變Y436A，或
ii) 該第一及第二Fc區多肽包含突變I253A、H310A及H435A，或
iii) 該第一及第二Fc區多肽包含突變H310A、H433A及Y436A，或
iv) 該第一及第二Fc區多肽包含突變L251D、L314D及L432D，或
v) 該第一Fc區多肽包含突變Y436A且該第二Fc區多肽包含
a)突變I253A、H310A及H435A，或
b)突變H310A、H433A及Y436A，或
c)突變L251D、L314D及L432D，
或
vi) 該第一Fc區多肽包含突變I253A、H310A及H435A且該第二Fc區多肽包含
a)突變H310A、H433A及Y436A，或
b)突變L251D、L314D及L432D，
或
vii) 該第一Fc區多肽包含突變H310A、H433A及Y436A且該第二Fc區多肽包含
a)突變L251D、L314D及L432D。

III. 本發明之例示性實施例集合
第 1 集合 ：
1. 一種用於產生多聚體多肽的方法，包含以下步驟：
- 培育
包含均含有免疫球蛋白G CH3域之第一多肽與第二多肽的第一多聚體多肽，
其中i)第一多肽的CH3域包含突變杵且第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一多肽的CH3域包含突變臼且第二多肽的CH3域包含突變杵，
其中第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
其中第二多肽的CH3域中包含第一擾動突變，其中第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與該第一擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應的免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽為二聚體，
及
包含均含有免疫球蛋白G CH3域之第三多肽與第四多肽的第二多聚體多肽，
其中i)第三多肽的CH3域包含突變杵且第四多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第三多肽的CH3域包含突變臼且第四多肽的CH3域包含突變杵，其中i)在第一多肽包含突變臼的情況下，第四多肽包含突變杵，或ii)在第一多肽包含突變杵的情況下，第四多肽包含突變臼，
其中第四多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
其中第三多肽的CH3域中包含第二擾動突變，其中第四多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與該第二擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應的免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，
其中第二擾動突變與第一擾動突變處於不同的位置，
其中第三多肽與第四多肽為二聚體，
其中當第二多肽與第三多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的第一擾動突變及第三多肽中的第二擾動突變引起吸引性相互作用，
及
- 回收包含第一多肽及第四多肽的結合子且藉此產生(多特異性)結合子。
2. 根據實施例1之方法，其中第一至第四多肽在N端至C端方向上各自包含源於IgG1 CH2域的CH2域及源於IgG1 CH3域的CH3域。
3. 根據實施例1至2中任一例之方法，其中第一至第四多肽在N端至C端方向上彼此獨立地各自包含i)胺基酸序列DKTHTCPPC (SEQ ID NO: 65)或胺基酸序列DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66)，ii)源於IgG1 CH2域的CH2域，及iii)源於IgG1 CH3域的CH3域。
4. 根據實施例1至3中任一例之方法，其中i)第一及第四多肽各自進一步包含源於IgG1 CH1域的CH1域及可變域，或ii)其中第一或第四多肽包含源於IgG1 CH1域的CH1域且另一多肽包含源於輕鏈恆定域的結構域且各多肽進一步包含可變域。
5. 根據實施例4之方法，其中第一多肽之可變域為重鏈可變域且第四多肽之可變域為輕鏈可變域，或反之亦然，且當第一與第四多肽形成二聚體時，此等結構域形成結合位點。
6. 根據實施例1至4中任一例之方法，其中第一與第四多肽彼此獨立地選自如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
ix) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
x) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
xiii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
xiv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xvi) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點。
7. 根據實施例1至6中任一例之方法，其中第一及第二結合子進一步包含抗體輕鏈。
8. 根據實施例1至7中任一例之方法，其中
第一結合子包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二CH1人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點，
包含突變杵或突變臼，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
若第一多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第一多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含選自由以下組成之突變群組的擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S及W366T，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白IgG1中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白IgG1野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽為二聚體，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，
其中第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽，
及
第二結合子包含
選自如下多肽群組之多肽作為第四多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
若第二多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第二多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含第二擾動突變，該第二擾動突變選自由以下組成的突變群組：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S及W366T，其中第五多肽的胺基酸序列在野生型IgG1中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類IgG1野生型胺基酸殘基，其中第四多肽中的擾動突變與第二多肽中的擾動突變處於不同位置，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第五多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點，
若第四多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第四多肽包含突變杵，則包含突變臼，
其中第四多肽與第五多肽為二聚體，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第六多肽，
其中第六多肽藉由二硫鍵共價結合至第四多肽。
9. 根據實施例1至8中任一例之方法，其中培育步驟係在還原劑存在下進行。
10. 根據實施例1至9中任一例之方法，其中i)第二多肽與第三多肽，或ii)第二多肽與第五多肽進一步包含(C端)標籤。
11. 根據實施例10之方法，其中該標籤具有胺基酸序列HHHHHH (SEQ ID NO: 67)或HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68)且回收係藉由金屬(鎳)螯合劑親和層析管柱層析進行。
12. 一種用於鑑別結合子組合的方法，包含以下步驟
- 藉由對選自第一多個結合子之第一結合子與選自第二多個結合子之第二結合子的各種組合執行根據實施例1至11中任一例之方法來產生多種結合子，
- 在ELISA分析中個別地量測所產生之多個結合子中之各種結合子對至少兩種抗原的同時結合，及
- 基於ELISA結果自多個結合子中選擇結合子且藉此鑑別結合子組合。
13. 一種包含第一多肽及第二多肽的多聚體多肽，
其中兩種多肽均包含人類免疫球蛋白CH3域，
其中i)第一多肽的CH3域包含突變杵且第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一多肽的CH3域包含突變臼且第二多肽的CH3域包含突變杵，
其中第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
其中第二多肽的CH3域中包含至少一個擾動突變，其中第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與該擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應的免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽為二聚體。
14. 根據實施例13之多聚體多肽，其中
第一多肽為選自如下多肽群組之多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點，
且包含突變杵或突變臼，
及
第二多肽為選自如下多肽群組之多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域，其包含突變杵或突變臼，
包含選自由以下組成之突變群組的擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S及W366T，其中第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白IgG1中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應的免疫球蛋白IgG1野生型胺基酸殘基，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽。
15. 一種組合物，包含
第一雜三聚多肽，其包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點，
包含突變杵或突變臼，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
若第一多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第一多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含選自由以下組成之突變群組的擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S及W366T，其中第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白IgG1中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應的免疫球蛋白IgG1野生型胺基酸殘基，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽，
及
第二雜三聚多肽，其包含
選自如下多肽群組之多肽作為第四多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
若第一雜三聚體中的第二多肽包含突變臼，則包含突變杵，若第一雜三聚體中的第二多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含第二擾動突變，該第二擾動突變選自由以下組成的突變群組：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S及W366T，其中第五多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白IgG1中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應的免疫球蛋白IgG1野生型胺基酸殘基，其中第四多肽中的擾動突變與第二多肽中的擾動突變處於不同位置，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第五多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點，
若第一(第四)多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第一(第四)多肽包含突變杵，則包含突變臼，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第六多肽，該第六多肽藉由二硫鍵共價結合至第四多肽，
其中i)第一多肽的CH3域包含突變杵且第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一多肽的CH3域包含突變臼且第二多肽的CH3域包含突變杵，其中i)在第一多肽包含突變臼的情況下，第四多肽包含突變杵，或ii)在第一多肽包含突變杵的情況下，第四多肽包含突變臼，
其中第二及第四多肽在相同位置不包含擾動突變。

第 2 集合 ：
1. 一種用於產生多聚體多肽的方法，包含以下步驟：
- 培育
第一多聚體初始多肽，其包含均含有免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中
a-1) i)第一多肽的CH3域包含突變杵-cys且第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一多肽的CH3域包含突變臼-cys且第二多肽的CH3域包含突變杵，
b-1)第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
c-1)第二多肽的CH3域中包含與a-1)項下之突變不同的第一擾動突變，其中第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與第一擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，
d-1)第一多肽與第二多肽形成二聚體，
及
第二多聚體初始多肽，其包含均含有免疫球蛋白G CH3域的第三多肽及第四多肽，其中
a-2) i)第三多肽的CH3域包含突變杵且第四多肽的CH3域包含突變臼-cys，或ii)第三多肽的CH3域包含突變臼且第四多肽的CH3域包含突變杵-cys，其中i)在第一多肽包含突變臼-cys的情況下，第四多肽包含突變杵-cys，或ii)在第一多肽包含突變杵-cys的情況下，第四多肽包含突變臼-cys，
b-2)第四多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
c-2)第三多肽的CH3域中包含與a-2)項下之突變不同的第二擾動突變，其中第四多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與第二擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，
d-2)第二擾動突變與第一擾動突變處於不同的位置，
e-2)第三多肽與第四多肽形成二聚體，
f-2)當第二多肽與第三多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的第一擾動突變及第三多肽中的第二擾動突變(經設計以)引起吸引性相互作用，
及
- 回收包含第一多肽及第四多肽的多聚體多肽，且藉此產生多聚體多肽，
其中編號係根據Kabat EU索引。
2. 根據實施例1之方法，其中第一擾動突變為E357K，第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K，第二擾動突變為K370E，且第四多肽包含位置357處之胺基酸殘基E。
3. 根據實施例1之方法，其中第一擾動突變為D356K，第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K，第二擾動突變為K439E，且第四多肽包含位置356處之胺基酸殘基D。
4. 一種用於產生多聚體多肽的方法，包含以下步驟：
- 培育
第一多聚體初始多肽，其包含均含有免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中
a-1) i)第一多肽的CH3域包含突變杵且第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一多肽的CH3域包含突變臼且第二多肽的CH3域包含突變杵，
b-1)第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
c-1)第二多肽的CH3域中包含與a-1)項下之突變不同的第一擾動突變，其中第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與第一擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，
d-1)第一多肽與第二多肽形成二聚體，
e-1)第一多肽在鉸鏈區中包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)替代IgG1野生型胺基酸序列HTCPPCP (SEQ ID NO: 31)，
及
第二多聚體初始多肽，其包含均含有免疫球蛋白G CH3域的第三多肽及第四多肽，其中
a-2) i)第三多肽的CH3域包含突變杵且第四多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第三多肽的CH3域包含突變臼且第四多肽的CH3域包含突變杵，其中i)在第一多肽包含突變臼的情況下，第四多肽包含突變杵，或ii)在第一多肽包含突變杵的情況下，第四多肽包含突變臼，
b-2)第四多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
c-2)第三多肽的CH3域中包含與a-2)項下之突變不同的第二擾動突變，其中第四多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與第二擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，
d-2)第二擾動突變與第一擾動突變處於不同的位置，
e-2)第三多肽與第四多肽形成二聚體，
f-2)當第二多肽與第三多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的第一擾動突變及第三多肽中的第二擾動突變引起吸引性相互作用，
g-2)第二多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)替代IgG1野生型鉸鏈區胺基酸序列HTCPPCP (SEQ ID NO: 31)或包含胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 85)替代IgG1野生型鉸鏈區序列HTCPPCPAPE (SEQ ID NO: 90)，
及
- 回收包含第一多肽及第四多肽的多聚體多肽，且藉此產生多聚體多肽，
其中編號係根據Kabat EU索引。
5. 根據實施例4之方法，其中第一擾動突變為E357K，第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K，第二擾動突變為K370E，且第四多肽包含位置357處之胺基酸殘基E。
6. 根據實施例4之方法，其中第一擾動突變為D356K，第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K，第二擾動突變為K439E，且第四多肽包含位置356處之胺基酸殘基D。
7. 一種用於產生多聚體多肽的方法，包含以下步驟：
- 培育
第一多聚體初始多肽，其包含均含有免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中
a-1) i)第一多肽的CH3域包含突變杵且第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一多肽的CH3域包含突變臼且第二多肽的CH3域包含突變杵，
b-1)第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
c-1)第二多肽的CH3域中包含突變E357K作為第一擾動突變且第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K，
d-1)第一多肽與第二多肽形成二聚體，
及
第二多聚體初始多肽，其包含均含有免疫球蛋白G CH3域的第三多肽及第四多肽，其中
a-2) i)第三多肽的CH3域包含突變杵且第四多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第三多肽的CH3域包含突變臼且第四多肽的CH3域包含突變杵，其中i)在第一多肽包含突變臼的情況下，第四多肽包含突變杵，或ii)在第一多肽包含突變杵的情況下，第四多肽包含突變臼，
b-2)第四多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
c-2)第三多肽的CH3域中包含突變K370E作為第二擾動突變且第四多肽包含位置357處之胺基酸殘基E，
d-2)第三多肽與第四多肽形成二聚體，
f-2)當第二多肽與第三多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的第一擾動突變及第三多肽中的第二擾動突變引起吸引性相互作用，
及
- 回收包含第一多肽及第四多肽的多聚體多肽，且藉此產生多聚體多肽，
其中編號係根據Kabat EU索引。
8. 一種用於產生多聚體多肽的方法，包含以下步驟：
- 培育
第一多聚體初始多肽，其包含均含有免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中
a-1) i)第一多肽的CH3域包含突變杵且第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一多肽的CH3域包含突變臼且第二多肽的CH3域包含突變杵，
b-1)第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
c-1)第二多肽的CH3域中包含突變D356K作為第一擾動突變且第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K，
d-1)第一多肽與第二多肽形成二聚體，
及
第二多聚體初始多肽，其包含均含有免疫球蛋白G CH3域的第三多肽及第四多肽，其中
a-2) i)第三多肽的CH3域包含突變杵且第四多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第三多肽的CH3域包含突變臼且第四多肽的CH3域包含突變杵，其中i)在第一多肽包含突變臼的情況下，第四多肽包含突變杵，或ii)在第一多肽包含突變杵的情況下，第四多肽包含突變臼，
b-2)第四多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
c-2)第三多肽的CH3域中包含突變K439E作為第二擾動突變且第四多肽包含位置356處之胺基酸殘基D，
d-2)第三多肽與第四多肽形成二聚體，
e-2)當第二多肽與第三多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的第一擾動突變及第三多肽中的第二擾動突變引起吸引性相互作用，
及
- 回收包含第一多肽及第四多肽的多聚體多肽，且藉此產生多聚體多肽，
其中編號係根據Kabat EU索引。
9. 根據實施例4至8中任一例之方法，其中第一多肽包含突變杵，第二多肽包含突變臼，第三多肽包含突變杵，且第四多肽包含突變臼。
10. 根據實施例4至8中任一例之方法，其中第一多肽包含突變杵-cys，第二多肽包含突變臼，第三多肽包含突變杵，且第四多肽包含突變臼-cys。
11. 根據實施例1至10中任一例之方法，其中第一至第四多肽在N端至C端方向上各自包含IgG1 CH2域及IgG1 CH3域。
12. 根據實施例1至3及7至11中任一例之方法，其中第一至第四多肽在N端至C端方向上彼此獨立地各自包含i)胺基酸序列DKTHTCPPC (SEQ ID NO: 65)或胺基酸序列DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66)或胺基酸序列DKTHT (SEQ ID NO: 91)，ii) IgG1 CH2域，及iii) IgG1 CH3域。
13. 根據實施例1至12中任一例之方法，其中i)第一及第四多肽各自進一步包含IgG1 CH1域及可變域，或ii)其中第一或第四多肽包含IgG1 CH1域且另一多肽包含輕鏈恆定域且各種多肽進一步包含可變域。
14. 根據實施例13之方法，其中第一多肽之可變域為重鏈可變域且第四多肽之可變域為輕鏈可變域，或反之亦然，且當第一與第四多肽形成二聚體時，此等結構域形成結合位點。
15. 根據實施例1至13中任一例之方法，其中第一及第四多肽彼此獨立地選自
A)如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
ix) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
x) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
xiii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
xiv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xvi) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點，
或
B)
如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
ix) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
x) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
xiii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
xiv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xvi) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點。
16. 根據實施例1至15中任一例之方法，其中第一及第二初始多聚體多肽進一步包含抗體輕鏈。
17. 根據實施例1至16中任一例之方法，其中
A)
第一初始多聚體多肽包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點，
包含突變杵或突變臼，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
若第一多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第一多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含擾動突變D356K、E357K、K370E或K439E，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白IgG1中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白IgG1野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽形成二聚體，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，
其中第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽，
及
第二初始多聚體多肽包含
選自如下多肽群組之多肽作為第四多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
若第二多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第二多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含第二擾動突變D356K、E357K、K370E或K439E，其中第五多肽的胺基酸序列在野生型IgG1中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類IgG1野生型胺基酸殘基，其中第四多肽中的擾動突變與第二多肽中的擾動突變處於不同的位置，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第五多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點，
若第四多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第四多肽包含突變杵，則包含突變臼，
其中第四多肽與第五多肽形成二聚體，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第六多肽，
其中第六多肽藉由二硫鍵共價結合至第四多肽，
或
B)
第一初始多聚體多肽包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點，
包含突變杵或突變臼，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
若第一多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第一多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含擾動突變D356K、E357K、K370E或K439E，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白IgG1中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白IgG1野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽形成二聚體，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，
其中第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽，
及
第二初始多聚體多肽包含
選自如下多肽群組之多肽作為第四多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
若第二多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第二多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含第二擾動突變D356K、E357K、K370E或K439E，其中第五多肽的胺基酸序列在野生型IgG1中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類IgG1野生型胺基酸殘基，其中第四多肽中的擾動突變與第二多肽中的擾動突變處於不同的位置，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第五多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點，
若第四多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第四多肽包含突變杵，則包含突變臼，
其中第四多肽與第五多肽形成二聚體，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第六多肽，
其中第六多肽藉由二硫鍵共價結合至第四多肽。
18. 根據實施例1至17中任一例之方法，其中培育步驟係在還原劑存在下進行。
19. 根據實施例1至18中任一例之方法，其中i)第二多肽與第三多肽，或ii)第二多肽與第五多肽進一步包含(C端)標籤。
20. 根據實施例19之方法，其中
i)該標籤具有胺基酸序列HHHHHH (SEQ ID NO: 67)或HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68)且回收係藉由金屬(鎳)螯合劑親和層析管柱層析進行，
或
ii)該標籤具有胺基酸序列EPEA (SEQ ID NO: 87)且回收係藉由C標籤親和層析管柱層析來進行。
21. 一種用於鑑別多聚體多肽組合的方法，包含以下步驟
a) 藉由對選自第一多個多聚體多肽的第一初始多聚體多肽與選自第二多個多聚體多肽之第二初始多聚體多肽的各種組合執行根據實施例1至20中任一例之方法來產生多個多聚體多肽，
b) 在結合分析中個別地量測在步驟a)中所產生之多個多聚體多肽中的各種多聚體多肽對至少兩種抗原的同時結合，及
c) 基於結合結果，自多個多聚體多肽中選擇多聚體多肽，且藉此鑑別多聚體多肽組合。
22. 根據實施例21之方法，其中結合分析為ELISA或SPR方法。
23. 一種多聚體多肽，其包含突變杵
a) 均包含免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中
a-1) i)第一多肽的CH3域包含突變杵-cys且第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一多肽的CH3域包含突變臼-cys且第二多肽的CH3域包含突變杵，
a-2)第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
a-3)第二多肽的CH3域中包含與a-1)項下之突變不同的擾動突變，其中第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，
a-4)第一多肽與第二多肽形成二聚體，
或
b) 均包含免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中
b-1) i)第二多肽的CH3域包含突變杵且第一多肽的CH3域包含突變臼-cys，或ii)第二多肽的CH3域包含突變臼且第一多肽的CH3域包含突變杵-cys，
b-2)第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
b-3)第二多肽的CH3域中包含與b-1)項下之突變不同的擾動突變，其中第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，
b-4)第一多肽與第二多肽形成二聚體，
其中編號係根據Kabat EU索引。
24. 根據實施例23之多聚體多肽，其中擾動突變為E357K，且第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K；或擾動突變為K370E，且第一多肽包含位置357處之胺基酸殘基E。
25. 根據實施例23之多聚體多肽，其中第一擾動突變為D356K，且第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K；或擾動突變為K439E，且第一多肽包含位置356處之胺基酸殘基D。
26. 一種多聚體多肽，包含
a) 均包含免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中
a-1) i)第一多肽的CH3域包含突變杵且第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一多肽的CH3域包含突變臼且第二多肽的CH3域包含突變杵，
a-2)第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
a-3)第二多肽的CH3域中包含與a-1)項下之突變不同的擾動突變，其中第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，
a-4)第一多肽與第二多肽形成二聚體，
a-5)第一及/或第二多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)替代IgG1野生型鉸鏈區胺基酸序列HTCPPCP (SEQ ID NO: 31)或包含胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 85)替代IgG1野生型鉸鏈區序列HTCPPCPAPE (SEQ ID NO: 90)，
或
b) 均包含免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中
b-1) i)第二多肽的CH3域包含突變杵且第一多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第二多肽的CH3域包含突變臼且第一多肽的CH3域包含突變杵，
b-2)第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
b-3)第二多肽的CH3域中包含與a-2)項下之突變不同的擾動突變，其中第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，
b-4)第一多肽與第二多肽形成二聚體，
b-5)第一及/或第二多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)替代IgG1野生型鉸鏈區胺基酸序列HTCPPCP (SEQ ID NO: 31)或包含胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 85)替代IgG1野生型鉸鏈區序列HTCPPCPAPE (SEQ ID NO: 90)。
27. 根據實施例26之多聚體多肽，其中擾動突變為E357K，且第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K；或擾動突變為K370E，且第一多肽包含位置357處之胺基酸殘基E。
28. 根據實施例26之多聚體多肽，其中第一擾動突變為D356K，且第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K；或擾動突變為K439E，且第一多肽包含位置356處之胺基酸殘基D。
29. 一種多聚體多肽，包含
a) 均包含免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中
a-1) i)第一多肽的CH3域包含突變杵且第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一多肽的CH3域包含突變臼且第二多肽的CH3域包含突變杵，
a-2) 第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
a-3) 第二多肽的CH3域中包含突變E357K且第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K，
a-4) 第一多肽與第二多肽形成二聚體，
或
b) 均包含免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中
b-1) i)第二多肽的CH3域包含突變杵且第一多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第二多肽的CH3域包含突變臼且第一多肽的CH3域包含突變杵，
b-2) 第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
b-3) 第二多肽的CH3域中包含突變K370E且第一多肽包含位置357處之胺基酸殘基E，
b-4) 第一多肽與第二多肽形成二聚體，
其中編號係根據Kabat EU索引。
30. 一種多聚體多肽，包含
a) 均包含免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中
a-1) i)第一多肽的CH3域包含突變杵且第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一多肽的CH3域包含突變臼且第二多肽的CH3域包含突變杵，
a-2) 第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
a-3) 第二多肽的CH3域中包含突變D356K且第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K，
a-4) 第一多肽與第二多肽形成二聚體，
或
b) 均包含免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中
b-1) i)第二多肽的CH3域包含突變杵且第一多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第二多肽的CH3域包含突變臼且第一多肽的CH3域包含突變杵，
b-2)第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
b-3)第二多肽的CH3域中包含突變K439E且第一多肽包含位置356處之胺基酸殘基D，
b-4)第三多肽與第四多肽形成二聚體，
其中編號係根據Kabat EU索引。
31. 根據實施例26至30中任一例之多聚體多肽，其中第一多肽包含突變杵且第二多肽包含突變臼；或第二多肽包含突變杵且第一多肽包含突變臼。
32. 根據實施例26至30中任一例之多聚體多肽，其中第一多肽包含突變杵-cys且第二多肽包含突變臼；或第二多肽包含突變杵且第一多肽包含突變臼-cys。
33. 根據實施例29至32中任一例之多聚體多肽，其中第一多肽及/或第二多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)替代IgG1野生型鉸鏈區胺基酸序列HTCPPCP (SEQ ID NO: 31)或胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 85)替代IgG1野生型鉸鏈區序列HTCPPCPAPE (SEQ ID NO: 90)。
34. 根據實施例22至33中任一例之多聚體多肽，其中
A)
第一多肽為選自如下多肽群組之多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點，
及
第二多肽為選自如下多肽群組之多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域，
若第一多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第一多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含選自突變D356K、E357K、K370E或K439E的突變，其中第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白IgG1中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白IgG1野生型胺基酸殘基，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽；
或
B)
第一多肽為選自如下多肽群組之多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點，
及
第二多肽為選自如下多肽群組之多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
若第一多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第一多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含選自突變D356K、E357K、K370E或K439E的突變，其中第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白IgG1中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白IgG1野生型胺基酸殘基，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽。

第 3 集合 ：
1. 一種用於產生多肽的方法，包含以下步驟：
- 培育
第一多聚體，其包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
及
ii)至少一個功能性結合位點或其一部分，
及
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3域，
其中
a-1) 第一多肽之CH3域包含突變杵-cys且第二多肽之CH3域包含突變臼，
或
第一多肽之CH3域包含突變臼-cys且第二多肽之CH3域包含突變杵，
a-2) 第二多肽的CH3域中包含與a-1)項下之突變不同的第一突變，且第一突變的引入使第一多聚體的CH3-CH3結合自由能增加，
及
第二多聚體，其包含
第三多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
及
第四多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
及
ii)至少一個功能性結合位點或其一部分
其中
b-1) 在第一多肽包含突變臼-cys的情況下，第四多肽包含突變杵-cys且第三多肽包含突變臼，
或
在第一多肽包含突變杵-cys的情況下，第四多肽包含突變臼-cys且第三多肽包含突變杵，
b-2) 第三多肽的CH3域中包含與a-1)、a-2)及b-1)項下之突變不同的第二突變，且第二突變的引入使第二多聚體的CH3-CH3結合自由能增加，
從而形成包含第二及第三多肽的第三多聚體及包含第一及第四多肽的第四多聚體，
及
- 回收第四多聚體且藉此產生多肽。
2. 根據實施例1之方法，其中a-2)項下的突變為E357K，第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K，b-2)項下的突變為K370E，且第四多肽包含位置357處之胺基酸殘基E，其中位置根據Kabat EU索引編號。
3. 根據實施例1之方法，其中a-2)項下的突變為D356K，第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K，b-2)項下的突變為K439E，且第四多肽包含位置356處之胺基酸殘基D，其中位置根據Kabat EU索引編號。
4. 根據實施例1至3中任一例之方法，其中第一及/或第二多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)或胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)，且其中第四及/或第三多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)或胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)。
5. 一種用於產生多肽的方法，包含以下步驟：
- 培育
第一多聚體，其包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
及
ii)至少一個功能性結合位點或其一部分，
及
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3域，
其中
a-1) 第一多肽之CH3域包含突變杵且第二多肽之CH3域包含突變臼，
或
第一多肽之CH3域包含突變臼且第二多肽之CH3域包含突變杵，
a-2) 第二多肽的CH3域中包含與a-1)項下之突變不同的第一突變，且第一突變的引入使第一多聚體的CH3-CH3結合自由能增加，
a-3) 第一及/或第二多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)或胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)，
及
第二多聚體，其包含
第三多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
及
第四多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
及
ii)至少一個功能性結合位點或其一部分
其中
b-1) 在第一多肽包含突變臼的情況下，第四多肽包含突變杵且第三多肽包含突變臼，
或
在第一多肽包含突變杵的情況下，第四多肽包含突變臼且第三多肽包含突變杵，
b-2) 第三多肽的CH3域中包含與a-1)、a-2)及b-1)項下之突變不同的突變，且第二突變的引入使第二多聚體的CH3-CH3結合自由能增加，
b-3) 第四及/或第三多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)或胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)，
從而形成包含第二及第三多肽的第三多聚體及包含第一及第四多肽的第四多聚體，
及
- 回收第四多聚體且藉此產生多肽。
6. 根據實施例5之方法，其中a-2)項下的突變為E357K，第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K，b-2)項下的突變為K370E，且第四多肽包含位置357處之胺基酸殘基E，其中位置根據Kabat EU索引編號。
7. 根據實施例6之方法，其中a-2)項下的突變為D356K，第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K，b-2)項下的突變為K439E，且第四多肽包含位置356處之胺基酸殘基D，其中位置根據Kabat EU索引編號。
8. 根據實施例1或5中任一例之方法，其中第一多肽的CH3域在與第二多肽中之突變胺基酸殘基相互作用的位置處包含相應的免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，且其中第四多肽的CH3域在與第三多肽中之突變胺基酸殘基相互作用的位置處包含相應的免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基。
9. 一種用於產生多肽的方法，包含以下步驟：
- 培育
第一多聚體，其包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
及
ii)至少一個功能性結合位點或其一部分，
及
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3域，
其中
a-1) 第一多肽之CH3域包含突變杵且第二多肽之CH3域包含突變臼，
或
第一多肽之CH3域包含突變臼且第二多肽之CH3域包含突變杵，
a-2) 第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K且第二多肽包含突變E357K，
及
第二多聚體，其包含
第三多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
及
第四多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
及
ii)至少一個功能性結合位點或其一部分
其中
b-1) 在第一多肽包含突變臼的情況下，第四多肽包含突變杵且第三多肽包含突變臼，
或
在第一多肽包含突變杵的情況下，第四多肽包含突變臼且第三多肽包含突變杵，
b-2) 第三多肽包含突變K370E且第四多肽包含位置357處之胺基酸殘基E，
從而形成包含第二及第三多肽的第三多聚體及包含第一及第四多肽的第四多聚體，
及
- 回收第四多聚體且藉此產生多肽，
其中位置係根據Kabat EU索引編號。
10. 一種用於產生多肽的方法，包含以下步驟：
- 培育
第一多聚體，其包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
及
ii)至少一個功能性結合位點或其一部分，
及
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3域，
其中
a-1) 第一多肽之CH3域包含突變杵且第二多肽之CH3域包含突變臼，
或
第一多肽之CH3域包含突變臼且第二多肽之CH3域包含突變杵，
a-2) 第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K且第二多肽包含突變D356K，
及
第二多聚體，其包含
第三多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
及
第四多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
及
ii)至少一個功能性結合位點或其一部分
其中
b-1) 在第一多肽包含突變臼的情況下，第四多肽包含突變杵且第三多肽包含突變臼，
或
在第一多肽包含突變杵的情況下，第四多肽包含突變臼且第三多肽包含突變杵，
b-2) 第三多肽包含突變K439E且第四多肽包含位置356處之胺基酸殘基D，
從而形成包含第二及第三多肽的第三多聚體及包含第一及第四多肽的第四多聚體，
及
- 回收第四多聚體且藉此產生多肽，
其中位置係根據Kabat EU索引編號。
11. 根據實施例1至10中任一例之方法，其中包含第二多肽及第三多肽之第三多聚體的CH3-CH3結合自由能低於第一多聚體及/或第二多聚體的CH3-CH3結合自由能。
12. 根據實施例1至11中任一例之方法，其中第一多肽與第二多肽形成(可分離)二聚體，且第三多肽與第四多肽形成(可分離)二聚體。
13. 根據實施例4至12中任一例之方法，其中第一及/或第二多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)替代IgG野生型鉸鏈區胺基酸序列HTCPPCP (SEQ ID NO: 31)，且/或其中第一及/或第二多肽包含胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)替代IgG野生型鉸鏈區胺基酸序列HTCPPCPAPE (SEQ ID NO: 90)，且/或其中第三及/或第四多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)替代IgG野生型鉸鏈區胺基酸序列HTCPPCP (SEQ ID NO: 31)，且/或其中第三及/或第四多肽包含胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)替代IgG野生型鉸鏈區胺基酸序列HTCPPCPAPE (SEQ ID NO: 90)。
14. 根據實施例5至13中任一例之方法，其中第一多肽包含突變杵，第二多肽包含突變臼，第三多肽包含突變杵，且第四多肽包含突變臼。
15. 根據實施例5至13中任一例之方法，其中第一多肽包含突變杵-cys，第二多肽包含突變臼，第三多肽包含突變杵，且第四多肽包含突變臼-cys。
16. 根據實施例1至15中任一例之方法，其中第一至第四多肽在N端至C端方向上各自包含IgG1 CH2域及IgG1 CH3域。
17. 根據實施例1至16中任一例之方法，其中第一至第四多肽在N端至C端方向上彼此獨立地各自包含i)胺基酸序列DKTHTCPPC (SEQ ID NO: 65)或胺基酸序列DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66)或胺基酸序列DKTHT (SEQ ID NO: 91)，ii) IgG1 CH2域，及iii) IgG1 CH3域。
18. 根據實施例1至17中任一例之方法，其中i)第一及第四多肽各自進一步包含IgG1 CH1域及可變域，或ii)其中第一或第四多肽包含IgG1 CH1域且另一多肽包含輕鏈恆定域且各種多肽進一步包含可變域。
19. 根據實施例18之方法，其中第一多肽之可變域為重鏈可變域且第四多肽之可變域為輕鏈可變域，或反之亦然，且此等結構域在多肽中形成結合位點。
20. 根據實施例1至19中任一例之方法，其中第一與第四多肽彼此獨立地選自如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
ix) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
x) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
xiii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
xiv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xvi) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點。
21. 根據實施例1至20中任一例之方法，其中第一及第二多聚體進一步包含與第一多肽及第四多肽分別結合的抗體輕鏈。
22. 根據實施例1至21中任一例之方法，其中
第一多聚體包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點，
包含突變杵或突變臼，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
若第一多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第一多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含擾動突變D356K、E357K、K370E或K439E，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白IgG1中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白IgG1野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽形成二聚體，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第五多肽，
其中第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽，
及
第二多聚體包含
選自如下多肽群組之多肽作為第三多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
若第二多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第二多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含第二擾動突變D356K、E357K、K370E或K439E，其中第五多肽的胺基酸序列在野生型IgG1中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類IgG1野生型胺基酸殘基，其中第四多肽中的擾動突變與第二多肽中的擾動突變處於不同的位置，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第四多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點，
若第四多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第四多肽包含突變杵，則包含突變臼，
其中第四多肽與第五多肽形成二聚體，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第六多肽，
其中第六多肽藉由二硫鍵共價結合至第四多肽。
23. 根據實施例1至3及9至12中任一例之方法，其中培育步驟係在還原劑存在或不存在下進行。
24. 根據實施例4至8及13至22中任一例之方法，其中培育步驟係在還原劑不存在下進行。
25. 根據實施例1至24中任一例之方法，其中i)第二多肽及第三多肽進一步包含(C端)標籤。
26. 根據實施例25之方法，其中
i)該標籤具有胺基酸序列HHHHHH (SEQ ID NO: 67)或HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68)且回收係藉由金屬(鎳)螯合劑親和層析管柱層析進行，
或
ii)該標籤具有胺基酸序列EPEA (SEQ ID NO: 87)且回收係藉由C標籤親和層析管柱層析來進行。
27. 一種用於鑑別多特異性多肽的方法，包含以下步驟
a) 藉由對選自特異性結合至第一標靶之第一多個多聚體之第一多聚體與選自特異性結合至第二標靶(不同於第一標靶)之第二多個多聚體之第二多聚體的各種組合執行根據實施例1至26中任一例的方法來產生多個多特異性多肽，
b) 在結合分析中個別地量測在步驟a)中所產生之多個多特異性多肽中的各成員對兩個標靶的同時結合，及
c) 基於結合分析的結果，自多個多聚體多肽中選擇多聚體多肽，且藉此鑑別多特異性多肽。
28. 根據實施例27之方法，其中結合分析為ELISA或SPR方法。
23. 一種經分離的多聚體多肽，包含
a) 均包含免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中
a-1) i)第一多肽的CH3域包含突變杵-cys且第二多肽的CH3域包含突變臼，或ii)第一多肽的CH3域包含突變臼-cys且第二多肽的CH3域包含突變杵，
a-2)第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
a-3)第二多肽的CH3域中包含與a-1)項下之突變不同的擾動突變，其中第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，
a-4)第一多肽與第二多肽形成二聚體，
或
b) 均包含免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中
b-1) i)第二多肽的CH3域包含突變杵且第一多肽的CH3域包含突變臼-cys，或ii)第二多肽的CH3域包含突變臼且第一多肽的CH3域包含突變杵-cys，
b-2)第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分，
b-3)第二多肽的CH3域中包含與b-1)項下之突變不同的擾動突變，其中第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，
b-4)第一多肽與第二多肽形成二聚體，
其中編號係根據Kabat EU索引。
24. 根據實施例23之多聚體多肽，其中擾動突變為E357K，且第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K；或擾動突變為K370E，且第一多肽包含位置357處之胺基酸殘基E。
25. 根據實施例23之多聚體多肽，其中第一擾動突變為D356K，且第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K；或擾動突變為K439E，且第一多肽包含位置356處之胺基酸殘基D。
26. 一種經分離的多聚體多肽，包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
或
ii)至少一個功能性結合位點或其一部分，
及
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3域，
其中
a-1) 第一多肽之CH3域包含突變杵-cys且第二多肽之CH3域包含突變臼，
或
第一多肽之CH3域包含突變臼-cys且第二多肽之CH3域包含突變杵，
a-2) 第二多肽的CH3域中包含與a-1)項下之突變不同的另一突變，且另一突變的引入使第一多聚體的CH3-CH3結合自由能增加。
27. 根據實施例26之經分離多聚體多肽，其中a-2)項下的突變為E357K，且第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K；或其中a-2)項下的突變為K370E，且第一多肽包含位置357處之胺基酸殘基E，其中位置係根據Kabat EU索引編號。
28. 根據實施例26之經分離多聚體多肽，其中a-2)項下的突變為D356K，第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K；或其中a-2)項下的突變為K439E，且第一多肽包含位置356處之胺基酸殘基D，其中位置係根據Kabat EU索引編號。
29. 根據實施例26至28中任一例之經分離多聚體多肽，其中第一及/或第二多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)或胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)。
30. 一種經分離的多聚體多肽，包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
及
ii)至少一個功能性結合位點或其一部分，
及
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3域，
其中
a-1) 第一多肽之CH3域包含突變杵且第二多肽之CH3域包含突變臼，
或
第一多肽之CH3域包含突變臼且第二多肽之CH3域包含突變杵，
a-2) 第二多肽的CH3域中包含與a-1)項下之突變不同的另一突變，且另一突變的引入使第一多聚體的CH3-CH3結合自由能增加，
a-3) 第一及/或第二多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)或胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)。
31. 根據實施例30之經分離多聚體多肽，其中a-2)項下的突變為E357K，且第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K；或其中a-2)項下的突變為K370E，且第一多肽包含位置357處之胺基酸殘基E，其中位置係根據Kabat EU索引編號。
32. 根據實施例30之經分離多聚體多肽，其中a-2)項下的突變為D356K，且第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K；或其中a-2)項下的突變為K439E，且第一多肽包含位置356處之胺基酸殘基D，其中位置係根據Kabat EU索引編號。
33. 根據實施例26至30中任一例之經分離多聚體多肽，其中第一多肽的CH3域在與第二多肽中之突變胺基酸殘基相互作用的位置處包含相應的免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基。
34. 一種經分離的多聚體多肽，包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
及
ii)至少一個功能性結合位點或其一部分，
及
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3域，
其中
a-1) 第一多肽之CH3域包含突變杵且第二多肽之CH3域包含突變臼，
或
第一多肽之CH3域包含突變臼且第二多肽之CH3域包含突變杵，
a-2) 第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K且第二多肽包含突變E357K，
或
第二多肽包含突變K370E且第一多肽包含位置357處之胺基酸殘基E。
35. 一種經分離的多聚體多肽，包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3域，
及
ii)至少一個功能性結合位點或其一部分，
及
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3域，
其中
a-1) 第一多肽之CH3域包含突變杵且第二多肽之CH3域包含突變臼，
或
第一多肽之CH3域包含突變臼且第二多肽之CH3域包含突變杵，
a-2) 第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K且第二多肽包含突變D356K，
或
第二多肽包含突變K439E且第一多肽包含位置356處之胺基酸殘基D。
36. 根據實施例25至36中任一例之經分離多聚體多肽，其中第一多肽係選自如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
ix) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
x) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
xiii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
xiv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xvi) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點。
37. 根據實施例26至36中任一例之經分離多聚體多肽，進一步包含與第一多肽結合的抗體輕鏈。
38. 根據實施例37之經分離多聚體多肽，包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域，
若第一多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若第一多肽包含突變杵，則包含突變臼，
包含擾動突變D356K、E357K、K370E或K439E，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白IgG1中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白IgG1野生型胺基酸殘基，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第三多肽，
其中第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽。
39. 根據實施例26至38中任一例之經分離多聚體多肽，其中第二多肽進一步包含(C端)標籤。
40. 根據實施例39之經分離多聚體多肽，其中
i)該標籤具有胺基酸序列HHHHHH (SEQ ID NO: 67)或HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68)，
或
ii)該標籤具有胺基酸序列EPEA (SEQ ID NO: 87)。

提供以下實例、序列及圖式以有助於理解本發明，其真實範疇闡述於隨附申請專利範圍中。應理解，可以對所述程序進行潤飾而不悖離本發明的精神。

實例
實例 1
2 / 3 - IgG 的設計及模組化組成
一般批註
圖1顯示根據本發明之方法中所用之2/3-IgG的設計及模組化組成。此等2/3-IgG係由三條個別鏈構成：一條輕鏈(通常為包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的全長輕鏈)、一條重鏈(通常為包含重鏈可變域及所有重鏈恆定域(包括鉸鏈區)的全長重鏈)及一條重鏈Fc區多肽(通常為包含鉸鏈-CH2-CH3的重鏈Fc區片段)。輕鏈及重鏈的可變域形成功能性結合位點。重鏈(通常源於人類IgG1子類)在CH3中含有杵-cys突變或臼-cys突變(抗體重鏈CH3域中的突變T366W及S354C表示為「杵-cys突變」且抗體重鏈CH3域中的突變T366S、L368A、Y407V、Y349C表示為「臼-cys突變」(根據Kabat EU索引編號))以允許形成臼包杵Fc區二聚體。重鏈Fc區多肽為所謂的「假Fc」/HCFcRP (參見下文)，亦即缺乏VH及CH1的IgG1衍生物，其在N端以鉸鏈區序列開始且在其C端具有His6標籤。另外，2/3-IgG之重鏈Fc區多肽在其CH3域中含有杵突變或臼突變(抗體重鏈CH3域中的突變T366W表示為「杵突變」且抗體重鏈CH3域中的突變T366S、L368A、Y407V表示為「臼突變」(根據Kabat EU索引編號))。除杵突變或臼突變之外，重鏈Fc區多肽相對於野生型序列包含引入一個(亦即，額外單個)排斥電荷的去穩定化突變：D356K或E357K或K370E或K439E；SEQ ID NO: 35至38；此突變的重鏈Fc區多肽在下文中表示為MHCFcRP。

重鏈與MHCFcRP可以形成兩種類型的雜二聚體，此視其中臼包杵突變的分佈而定：
i) 重鏈-杵::MHCFcRP-臼，及
ii) 重鏈-臼::MHCFcRP-杵。

然而，彼等雜二聚體稍微「有瑕疵」，原因為互補Fc區缺乏為與重鏈形成鏈間二硫化鍵所需要的額外CH3半胱胺酸，且此等物亦含有與重鏈配對物不匹配的電荷突變。

實例 2
根據本發明進行的 2 / 3 - IgG 表現及純化
藉由當前技術將編碼輕鏈、重鏈(具有杵或臼突變)且與MHCFcRP (臼或杵)匹配的質體共轉染至哺乳動物細胞(例如HEK293)中來達成2/3-IgG表現。

更詳言之，舉例而言，藉由短暫轉染(例如在HEK293細胞中)產生2/3-IgG時，應用基於具有或不具有CMV內含子A啟動子之cDNA組織或基於具有CMV啟動子之基因組組織的表現質體。

除抗體表現卡匣之外，質體含有：
- 允許此質體在大腸桿菌中複製的複製起點，
- β-內醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌安比西林(ampicillin)抗性，及
- 來自小家鼠之二氫葉酸還原酶基因作為真核細胞中的可選標記物。

各抗體基因之轉錄單元由以下元件構成：
- 位於5'端的獨特限制位點
- 來自人類細胞巨大病毒之即刻早期增強子及啟動子，
- 在cDNA組織之情況下，繼之為內含子A序列，
- 人類抗體基因之5'非轉譯區，
- 免疫球蛋白重鏈信號序列，
- 作為cDNA或存在於基因組組織中的抗體鏈(維持免疫球蛋白外顯子-內含子組織)，
- 具有聚腺苷酸化信號序列之3'非轉譯區，及
- 位於3'端的獨特限制位點。

包含抗體鏈的融合基因係藉由PCR及/或基因合成來產生且藉由已知重組方法及技術、藉由連接相應核酸區段(例如利用相應質體中的獨特限制位點)來組裝。藉由DNA定序來驗證次選殖的核酸序列。為了短暫轉染，藉由質體製備、自轉型之大腸桿菌培養物(Nucleobond AX, Macherey-Nagel)製備大量質體。

標準細胞培養技術如以下文獻中所述來使用：Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.及Yamada, K.M. (編), John Wiley & Sons, Inc.

根據製造商說明書、藉由使用HEK293-F系統(Invitrogen)短暫轉染相應質體來產生2/3-IgG。簡言之，用相應表現質體及293fectin™或費克汀(fectin)(Invitrogen)轉染HEK293-F細胞(Invitrogen)，該等細胞懸浮生長於搖瓶中或攪拌醱酵器中之無血清FreeStyle™ 293表現培養基(Invitrogen)中。對於2 L搖瓶(Corning)而言，在600 mL中以1*10⁶ 個細胞/毫升之密度接種HEK293-F細胞且在120 rpm、8% CO₂ 下培育。次日，使用以下之約42 mL混合物，以約1.5*10⁶ 個細胞/毫升之細胞密度轉染細胞：A) 20 mL Opti-MEM (Invitrogen)，其含有600 µg總質體DNA (1 µg/mL)；及B) 20 ml Opti-MEM + 1.2 mL 293費克汀或費克汀(2 µL/mL)。在醱酵過程中，根據葡萄糖消耗來添加葡萄糖溶液。正確組裝的2/3-IgG類似於標準IgG分泌於培養物上清液中。5-10天之後收集含有所分泌2/3-IgG之上清液，且直接自上清液中純化2/3-IgG，或上清液冷凍且儲存。

由於2/3-IgG含有Fc區，因此藉由應用標準蛋白質A親和層析將其純化。

利用MabSelectSure-Sepharose^TM (GE Healthcare, Sweden)及Superdex 200尺寸排阻(GE Healthcare, Sweden)層析，藉由親和層析而自細胞培養物上清液中純化抗體。

簡言之，在經PBS緩衝液(10 mM Na₂ HPO₄ 、1 mM KH₂ PO₄ 、137 mM NaCl及2.7 mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe樹脂上捕捉無菌過濾的細胞培養物上清液，用平衡緩衝液洗滌且用25 mM檸檬酸鈉(pH 3.0)溶離。將所溶離的抗體溶離份彙集且用2 M Tris (pH 9.0)中和。抗體池藉由尺寸排阻層析進一步純化，該尺寸排阻層析係使用經20 mM組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡的Superdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Sweden)管柱。彙集含有2/3-IgG的溶離份，利用Vivaspin超濾裝置(Sartorius Stedim Biotech S.A., France)濃縮至所需濃度且在-80℃儲存。

各純化步驟之後，使用微流體Labchip技術(Caliper Life Science, USA)、藉由CE-SDS分析純度及完整性。使用HT蛋白質表現試劑套組，根據製造商說明書製備蛋白質溶液(5 µl)供CE-SDS分析用，且在使用HT蛋白質表現晶片的LabChip GXII系統上加以分析。使用LabChip GX軟體分析資料。

以下2/3-IgG已藉由相應L鏈、H鏈及MHCFcRP編碼質體之共表現而產生：

相應的SEC層析圖顯示於圖3中。

除如上文所概述的蛋白質A方法之外，同樣可以使用蛋白質L。

簡言之，在經PBS緩衝液(10 mM Na2HPO4、1 mM KH2PO4、137 mM NaCl及2.7 mM KCl，pH 7.4)平衡的KappaSelect樹脂上捕捉無菌過濾的細胞培養物上清液，用平衡緩衝液洗滌且用50 mM檸檬酸鈉(pH 2.5)溶離。將所溶離的抗體溶離份彙集且用1 M Tris (pH 9.0)中和。抗體池藉由尺寸排阻層析進一步純化，該尺寸排阻層析係使用經20 mM組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡的Superdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Sweden)管柱。彙集含有2/3-IgG的溶離份，利用Vivaspin超濾裝置(Sartorius Stedim Biotech S.A., France)濃縮至所需濃度且在-80℃儲存。

實例 3
藉由 2 / 3 - IgG 交換反應來產生雙特異性抗體 ( bsAb )
含有輕鏈、重鏈及MHCFcRP的2/3-IgG已藉由兩種類型的KiH雜二聚體產生：全長重鏈-杵::MHCFcRP-臼及全長重鏈-臼::MHCFcRP-杵。兩種類型的2/3-IgG均稍微『有瑕疵』，原因為MHCFcRP缺乏為了與重鏈形成鏈間二硫鍵而必需的額外CH3半胱胺酸，且MHCFcRP含有與全長重鏈配對物不匹配的電荷突變。然而，構成彼等有瑕疵之雜二聚體的模組能夠重排成具有匹配電荷的雙特異性雜二聚體，如圖4中所示。2/3-IgG A的全長重鏈(杵-cys)與2/3-IgG B的全長重鏈(臼-cys)形成匹配雜二聚體。當MHCFcRP (臼-電荷)與MHCFcRP (杵-電荷)相互作用時，亦形成匹配雜二聚體。因此，交換反應係基於兩種不同2/3-IgG之初始雜二聚體的暫時分離，從而產生較佳含有(電荷)匹配雜二聚體的產物。交換反應因此將兩個單特異性2/3-IgG轉化成一個雙特異性IgG及一個MHCFcRP雜二聚體：
2/3-IgG(A)-His6(8) + 2/3-IgG(B)-His6(8) → bsAb(AB) + Fc-His6(8)

交換反應藉由尤其使鉸鏈區鏈間二硫鍵斷裂的還原步驟(例如應用各種濃度的2-MEA或TCEP)起始。隨後自發地發生鏈重排。

應用不同的TCEP濃度來起始交換。

因此，抗螢光素-2/3-IgG與抗生物素胺-2/3-IgG輸入分子在100 µg/ml的蛋白質濃度下、在總體積40 µl的1xPBS + 0.05% Tween 20 (具有指定的TCEP濃度)中、以等莫耳量混合於384孔REMP®盤(Brooks, #1800030)上。離心之後，將培養盤密封且在27℃培育一小時。

隨後使用生物素-螢光素橋式ELISA量化雙特異性抗體。

因此，白色Nunc® MaxiSorp™ 384孔盤用1 µg/ml白蛋白-螢光素異硫氰酸鹽結合物(Sigma, #A9771)塗佈且在4℃培育隔夜。用90 µl PBST緩衝液(PBST、再蒸餾水、10xPBS + 0.05% Tween 20)洗滌3次之後，每孔添加90 µl阻斷緩衝液(1xPBS、2%明膠、0.1% Tween-20)且在室溫下培育一小時。用90 µl PBST緩衝液洗滌3次之後，向各孔中添加25 µl各交換反應1:10稀釋液。在室溫下培育一小時之後，用90 µl PBST緩衝液再洗滌盤3次。添加每孔25 µl含生物素-Cy5結合物的0.5% BSA、0.025% Tween-20、1×PBS直至0.1 µg/ml的最終濃度且培養盤在室溫下培育一小時。用90 µl PBST緩衝液洗滌6次之後，向各孔中添加25 µl 1xPBS。在Tecan Safire 2讀取器上量測發射波長為670 nm (在649 nm下激發)的Cy5螢光。

圖5顯示藉由2/3-IgG交換來產生bsAb之氧化還原條件下的分析結果。TCEP用於(部分地)還原重鏈Fc區多肽之間(亦即全長半IgG與MHCFcRP之間)的鉸鏈二硫鍵。可藉由SEC鑑別鏈交換，從而區分2/3-IgG輸入物、bsAb輸出物及MHCFcRP副產物。視2/3-IgG與TCEP之間比率而定的交換反應產量顯示於圖5中(為了比較，所有反應均在相同的反應時間之後加以分析)。

所有2/3-IgG初始分子、所有非所要副產物以及在交換反應期間潛在產生的所有聚集體均具有親和標籤(His6或His8)。交換反應中所產生的所需bsAb僅為不攜帶His標籤的分子。因此，應用簡單的NiNTA吸收步驟來移除所有非所需分子(參見圖6及7)。剩餘bsAb (未藉由NiNTA吸收耗乏)直接應用於篩選程序且加以分析以鑑別具有所需功能的bsAb。

實例 4
對藉由 2 / 3 - IgG 交換反應所產生之雙特異性抗體 ( bsAb ) 進行的 功能性評估
作為2/3-IgG交換反應產物產生之bsAb的雙特異性功能係藉由橋式ELISA分析加以評估。圖8顯示藉由根據本發明之交換反應所產生之抗螢光素/生物素胺雙特異性抗體的結合結果作為實例。反應中使用結合生物素胺(bio)的2/3-IgG及結合螢光素(fluos)的2/3-IgG作為初始分子。抗fluos/bio雙特異性抗體的fluos結合臂結合至經fluos-BSA塗佈的ELISA盤。隨後暴露於bio-Cy5產生信號，此僅在bsAb介導bsAb之生物結合臂捕捉bio-Cy5後發生。由於橋聯介導信號僅發生於bsAb，而非單特異性Fluos或Bio結合子，因此在分析中使用單獨2/3-IgG時觀測不到信號。由於此原因且由於交換反應不迫使分子聚集，因此可以直接對交換反應混合物執行此類橋式ELISA，而無需預先進行NiNTA介導非bsAb分子耗乏。施加反應混合物時觀測到信號表明功能性bsAb成功產生及存在。經由橋式ELISA進行的信號產生視交換反應中所使用之輸入實體的量而定。

實例 5
如本文所報導之交換反應在功能上獨立於初始 2 / 3 - IgG 的 結合特異性或 V 區 組成
若2/3-IgG產生以及交換反應獨立於其結合特異性及V區組成對不同抗體以及對不同抗體組合發揮作用，則產生多種2/3-IgG供評估。

因此，使用對生物素胺(bio)、地高辛(digoxigenin)(dig)、螢光素(fluos)、LeY-碳水化合物(LeY)、VEGF及PDGF具有結合特異性的2/3-IgG。此等物係藉由如上文所述共轉染表現質體來產生，該等質體編碼全長輕鏈、杵-全長重鏈或臼-全長重鏈及突變的重鏈Fc區多肽。

SEQ ID NO: 49-52描述對dig、VEGF、PDGF及LeY具有特異性之2/3-IgG的VH-CH1區域。將彼等區域與SEQ ID NO: 40及41之鉸鏈-CH2-CH3區域融合(亦即，置換bio VH-CH1區域)以產生具有所需特異性的完整H鏈。用於產生此等分子的MHCFcRP係作為SEQ ID NO: 35-38列舉。

所有此等2/3-IgG可以與標準IgG在類似條件下相似的產率產生及純化(參見實例2)。具有不同結合特異性之此等2/3-IgG之表現的實例示於下表中。

在應用於產生不同特異性之bsAb的交換矩陣中，將對螢光素、生物素胺、VEGF、PDGF及地高辛具有結合特異性之2/3-IgG組合使用，所有組合如下表中所示。

藉由橋式ELISA監測初始2/3-IgG的鏈交換及具有所需特異性組合之bsAb的產生(參見實例4)，其中施加與不同bsAb特異性組合匹配的塗佈於盤上之抗原及產生信號的抗原結合物/複合物。

應用於評估不同bsAb組合之功能之橋式ELISA的結果示於下表中。僅識別其同源抗原對(作為捕捉或偵測抗原存在)的bsAb在橋式ELISA中產生信號。在矩陣中，所產生的其他bsAb由於缺乏至少一種特異性而為負值。
表： 橋式ELISA證實所產生之bsAb的功能。所示為在一個分析內、在1.3 µM輸入分子濃度下的相對信號強度。最高值設定為100%作為參考。N.a. = 不適用。

對於含有VEGF的雙特異性抗體而言，已進行相同分析。此等物在相應組合中亦僅顯示高於背景水準的信號。

可見根據本發明的交換反應為普遍適用的方法：交換反應獨立於初始分子的結合特異性或V區組成而產生功能性bsAb。

實例 6
形式變異體之設計、組成及產生
向重鏈C端具有一個結合位點的初始分子或N端以及C端具有結合位點的重鏈擴增實例4之2/3-IgG交換反應。為了產生交換的bsAb，保持交換驅動原理(將有瑕疵的輸入物雜二聚體轉化為匹配的輸出物雜二聚體)不變。如上文所述，亦保持MHCFcRP的組成。

圖1及9至10展示三種2/3-IgG形式的模組化組成，其應用於產生不同bsAb形式。2/3-IgG之一在N端位置具有一個Fab臂。另一2/3-IgG具有Fab臂，該Fab臂經由柔性連接子連接至重鏈C端(亦即，其與鉸鏈區始於N端)。第三2/3-IgG具有C端Fab臂以及N端Fab臂。

此等2/3-IgG變異體的表現係藉由將編碼輕鏈、重鏈(杵或臼)及相應MHCFcRP (臼或杵)的質體共轉染至哺乳動物細胞(例如HEK293)中來達成(參見實例2)。

用於產生不同bsAb形式之經修飾之全長重鏈的序列如下：

2/3-IgG類似於標準IgG分泌於培養物上清液中且藉由標準蛋白質A親和層析加以純化(參見實例2)。尺寸排阻及質譜分析展現經純化之2/3-IgG變異體正確組裝且不存在非所要二聚體及聚集體。2/3-IgG的表現產量類似於標準IgG在相同表現系統中所觀測到的表現產量。相應資料呈現於下表。

實例 7
表徵結合功能以不同價數、化學計量及幾何構型組合的 bsAb
三種不同初始分子(具有N端、C端、N端與C端結合位點的2/3-IgG)可以在根據本發明的方法中彼此組合，從而產生九種不同bsAb形式。此等形式的不同之處在於個別結合位點的價數、幾何構型及位置。產生此等不同bsAb的交換反應係在如實例3中所概述的相同條件下進行。

所有類型的輸入形式由於MHCFcRP缺乏為了與重鏈形成鏈間二硫鍵而必需的額外CH3半胱胺酸且由於其含有排斥電荷突變(亦即，與全長重鏈配對物不匹配的電荷)而「有瑕疵」。在根據本發明的方法中，構成彼等「有瑕疵」雜二聚體的重鏈重排而形成(電荷及二硫鍵)匹配的雜二聚體。不同類型的全長重鏈(杵-cys與臼-cys)形成匹配的雜二聚體。匹配的雜二聚體亦由MHCFcRP (臼電荷與杵電荷)形成。

不受此理論束縛，假設交換反應係基於兩種不同2/3-IgG之有瑕疵雜二聚體的暫時分離，從而產生較佳含有完全匹配之雜二聚體的產物，該等雜二聚體具有匹配的電荷及(若存在)半胱胺酸殘基用於形成二硫鍵。交換因此將單特異性2/3-IgG轉化成雙特異性IgG (不同形式)，以及相應(不含可變區，亦即勝任非標靶結合) Fc區雜二聚體。

為了說明交換反應，如下稱呼輸入分子：
- 「nA或nB」用於在全長重鏈(H鏈)之正常N端具有Fab臂的分子
- 「cA或cB」用於在H鏈之C端具有Fab臂的分子，
- 「ncA或ncB」用於在H鏈之N端以及C端具有Fab的分子。

不同的形式交換反應如下：
2/3-IgG(nA)-His-標籤 + 2/3-IgG(nB)-His-標籤 → bsAb(nAnB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(nA)-His-標籤 + 2/3-IgG(cB)-His-標籤 → bsAb(nAcB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(nA)-His-標籤 + 2/3-IgG(ncB)-His-標籤 → bsAb(nAncB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(cA)-His-標籤 + 2/3-IgG(cB)-His-標籤 → bsAb(cAcB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(cA)-His-標籤 + 2/3-IgG(nB)-His-標籤 → bsAb(cAnB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(cA)-His-標籤 + 2/3-IgG(ncB)-His-標籤 → bsAb(cAncB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(ncA)-His-標籤 + 2/3-IgG(nB)-His-標籤 → bsAb(ncAnB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(ncA)-His-標籤 + 2/3-IgG(cB)-His-標籤 → bsAb(ncAcB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(ncA)-His-標籤 + 2/3-IgG(ncB)-His-標籤 → bsAb(ncAncB) + Fc-His-標籤

藉由使鏈間(鉸鏈區)二硫鍵斷裂的還原步驟起始交換反應，隨後自發地發生鏈重排。所有輸入分子、所有副產物以及在交換反應期間可能潛在形成的所有聚集體具有親和標籤(例如His6或His8標籤)。然而，交換反應的bsAb產物不攜帶親和標籤且因此可以經由親和(例如NiNTA)吸收層析加以分離。bsAb (呈不同形式)可以直接應用於篩選程序及分析中以鑑別及評定具有最佳功能的不同bsAb形式。

雙特異性形式係藉由在384孔MTP形式中交換上述輸入物2/3-IgG而產生，隨後藉由橋式ELISA評估功能性組裝。因此，交換搭配物(由含有臼-cys突變的全長重鏈及MHCFcRP-杵-K370E組成的2/3-IgG分子1；由含有杵-cys突變的全長重鏈及MHCFcRP-臼-E357K組成的2/3-IgG分子2)在總體積100 µl 1xPBS + 0.05% Tween 20中以等莫耳量(4 µM)混合。蛋白質溶液在384深孔盤(Greiner 384 masterblock®)中1:2稀釋11次。在384孔REMP®盤(Brooks, #1800030)上，將20 µl得自一系列稀釋液的各樣品與20 µl 0.5 mM TCEP溶液混合直至200-0.2 µg/ml的最終蛋白質濃度及0.25 mM TCEP。離心之後，將培養盤密封且在37℃培育一小時。

作為對照實例，使用在一側含有bio結合功能且在另一側含有螢光素結合功能的bsAb。所得bsAb的功能藉由生物素-螢光素橋式ELISA評估。因此，白色Nunc® MaxiSorp™ 384孔盤用1 µg/ml白蛋白-螢光素異硫氰酸鹽結合物(Sigma, #A9771)塗佈且在4℃培育隔夜。用90 µl PBST緩衝液(PBST，再蒸餾水，10xPBS Roche #11666789001 + 0.05% Tween 20)洗滌3次之後，添加每孔90 µl阻斷緩衝液(1xPBS、2% BSA、0.1% Tween 20)且在室溫下培育一小時。用90 µl PBST緩衝液洗滌3次之後，向各孔中添加25 µl各交換反應1:4稀釋液。在室溫下培育一小時之後，用90 µl PBST緩衝液再洗滌盤3次。添加每孔25 µl含生物素-Cy5結合物的0.5% BSA、0.025% Tween20、1xPBS直至0.1 µg/ml的最終濃度且培養盤在室溫下培育一小時。用90 µl PBST緩衝液洗滌6次之後，向各孔中添加25 µl 1xPBS。在Tecan Safire 2讀取器上量測發射波長為670 nm (在649 nm下激發)的Cy5螢光。

使用一個螢光素結合實體及一個生物素胺結合實體產生不同形式之2/3-IgG經由交換而產生的不同bsAb形式。輸入分子及交換衍生的輸出分子顯示於圖11中。

使用fluos-BSA (作為捕捉抗原)及bio-Cy5偵測雙特異性橋式結合功能，藉由如圖12中所示的橋式ELISA來評估所產生之bsAb的功能。所有不同形式均產生橋式ELISA信號。

此等結果顯示使用根據本發明之方法、經由鏈交換反應、以穩定的高處理量相容方式產生不同形式的可行性。

實例 8
藉由 2 / 3 - IgG 交換產生功能性 bsAb 及篩選 / 鑑別具有所要功能性的 bsAb 與小型化及高處理量以及自動化技術相容
需要應用高處理量及自動化技術且在許多情況下需要操控結合位點序列及/或形式不同的大量不同bsAb。因此已分析經由根據本發明之2/3-IgG交換方法進行的bsAb產生以及對藉此產生之雙特異性抗體之功能(亦即雙特異性結合)進行的分析/篩選是否能夠小型化，以便與高通量及自動化技術相容。

因此，進行2/3-IgG交換反應且在348孔盤中以小型化規模分析反應產物。

在384孔MTP形式中如下配置矩陣篩選：交換搭配物(由含有臼-cys突變的全長重鏈及MHCFcRP-杵-K370E組成的2/3-IgG分子1；由含有杵-cys突變的全長重鏈及MHCFcRP-臼-E357K組成的2/3-IgG分子2)在總體積30 µl 1xPBS + 0.05% Tween 20中以等莫耳量(4 µM)混合。蛋白質溶液在384深孔盤(Greiner 384 masterblock®)中1:3稀釋四次。在384孔REMP®盤(Brooks, #1800030)上，將20 µl得自一系列稀釋液的各樣品與20 µl 0.5 mM TCEP溶液混合直至2 µM-0.025 µM的最終蛋白質濃度及0.25 mM TCEP。離心之後，將培養盤密封且在37℃培育一小時。

隨後經由橋式ELISA (參見上文)、以小型化高處理量形式評估藉此產生之bsAb的功能：白色Nunc® MaxiSorp™ 384孔盤用1 µg/ml白蛋白-螢光素異硫氰酸鹽結合物(Sigma, #A9771)、1 µg/ml PDGF (CST, #8912)或1 µg/ml VEGF121塗佈且在4℃下培育隔夜。用90 µl PBST緩衝液(PBST、再蒸餾水、10xPBS + 0.05% Tween 20)洗滌3次之後，每孔添加90 µl阻斷緩衝液(1xPBS、2% BSA、0.1% Tween20)且在室溫下培育一小時。用90 µl PBST緩衝液洗滌3次之後，向各孔中添加25 µl各交換反應1:4稀釋液。在室溫下培育1小時之後，用90 µl PBST緩衝液再洗滌盤3次。添加每孔25 µl含有生物素-Cy5結合物或dig-Cy5結合物的0.5% BSA、0.025% Tween 20、1xPBS直至0.1 µg/ml的最終濃度且培養盤在室溫下培育一小時。用90 µl PBST緩衝液洗滌6次之後，向各孔中添加25 µl 1xPBS。在Tecan Safire 2讀取器上量測發射波長為670 nm (在649 nm下激發)的Cy5螢光。交換反應及橋式ELISA在此等分析中利用結合VEGF或PDGF或dig或bio或fluos之2/3-IgG模組的詳情顯示於圖13中。一種例示性此等分析之結果顯示於圖14中且證明可以執行2/3-IgG交換反應及隨後的功能性分析且其與高處理量的自動化技術相容。

實例 9
產生具有三個結合位點的 bsAb ，其中 一個結合位點靶向第一抗原且兩個其他結合位點靶向另一抗原
根據本發明的方法可以用於產生T細胞雙特異性抗體(TCB)。此等抗體可以具有如前所述的形式(參見例如WO 2013/026831)。在TCB交換方法中，一個H鏈(如上文所述具有杵-cys或具有臼-cys)在其鉸鏈的N端含有結合CD3的互換Fab衍生實體，其在N端藉由另一抗體衍生的靶向實體進一步延長。交換反應在上文所述的相同條件下進行且產生具有CD3結合實體及兩個額外結合實體的TCB。此等物可以結合至靶細胞抗原。彼等分子可以同時結合至T細胞上的CD3及靶(例如腫瘤)細胞上的抗原且藉此誘導靶細胞被殺死。

實例 10
設計及產生無 Fc 區 鏈間二硫鍵 ( 鉸鏈區以及 CH3 域中 ) 的 2 / 3 - IgG
與Fc區(鉸鏈區)含二硫鍵之2/3-IgG發生的鏈交換需要還原作為初始步驟以實現鏈分離及所需bsAb的隨後組裝。為了避免還原步驟及移除還原劑的相關需要，產生不具有鉸鏈區二硫鍵的2/3-IgG。原理顯示於圖15中。鉸鏈區中之負責鉸鏈二硫鍵形成的半胱胺酸殘基係藉由突變為絲胺酸來移除。此外，位置354或349處之形成KiH相關二硫鍵的CH3-半胱胺酸已省去。相應胺基酸序列為：

上述2/3-IgG的表現係藉由將編碼輕鏈、全長重鏈(杵或臼)及相應MHCFcRP (臼或杵)的質體共轉染至哺乳動物細胞(例如HEK293)中來達成(參見實例2)。2/3-IgG類似於標準IgG分泌於培養物上清液中且隨後藉由標準蛋白質A親和層析及尺寸排阻層析加以純化(參見實例2)。隨後經由尺寸排阻層析及SDS-PAGE分析所需100 kDa 2/3-IgG表現產物(圖16)。由此證明2/3-IgG正確組裝且不存在非所要的二聚體及聚集體。由於此類分子藉由Fc區(既非鉸鏈區，亦非CH3域)之間的二硫鍵而不穩定，因此此結果令人驚訝。無Fc區鏈間二硫鍵之抗fluos-及抗bio-2/3-IgG的純化產量呈現於下表

實例 11
藉由 2 / 3 - IgG 交換反應而非還原來產生功能性 bsAb
使不含有Fc區鏈間二硫鍵的2/3-IgG進行如上文所述的鏈交換反應(參見實例3)，但其中省去初始還原步驟。2/3-IgG含有fluos結合位點或bio結合位點及全長重鏈與MHCFcRP之間無鏈間二硫鍵的Fc區。此等2/3-IgG的組成及產生描述於實例10中。在交換反應而非起始還原之後，進行橋式ELISA以證明bsAb的雙特異性功能。橋式ELISA包含將交換反應產物添加至經固著的fluos-BSA中，隨後進行洗滌步驟且隨後添加bio-Cy5以探測bsAb之第2結合臂的存在(關於橋式ELISA之詳情，參見前述實例)。僅正確組裝的功能性bsAb可以藉由其fluos結合位點結合至分析盤，被持留且藉由捕捉及持留bio-Cy5來產生信號。不具有雙特異性的分子不產生信號，原因為其不結合至盤(僅bio結合子)或不能捕捉到產生信號的bio-Cy5 (僅fluos結合子)。此等分析的結果(在此實例中，在輸入分子的2.5 µM濃度下，以經純化的bsAb作為陽性對照來進行交換反應)顯示於圖17中。結果證明不具有Fc區鏈間二硫鍵之單特異性2/3-IgG輸入分子經由鏈交換成功地產生bsAb。在無需初始還原的情況下富有成效地發生鏈交換。因此，鏈間Fc區多肽二硫鍵的移除消除了初始還原步驟的必要性。所得bsAb藉由非共價Fc-Fc相互作用結合在一起。Fc-Fc鏈間二硫鍵的消除從而允許相應的Fc區錯配驅動交換反應而無需進行還原。

實例 12
部分去穩定化全長重鏈 - MHCFcRP 界面驅動鏈交換反應。
用於2/3-IgG轉化為bsAb的驅動因素為全長重鏈與MHCFcRP之間所設計的「有瑕疵」界面。此人造排斥界面為引入MHCFcRP之杵-或臼-CH3域中之突變的結果。在2/3 IgG表現期間，MHCFcRP仍與相應(「正常」)杵或臼搭配物結合(參見上述實例)。彼等分子具有足以呈現2/3-IgG以及所運作分子的穩定性，而無非所要的聚集傾向。

不受此理論束縛，當兩個互補2/3-IgG距離接近且全長抗體重鏈::MHCFcRP對部分地、彼此一個接一個地釋放時，發生本發明的交換反應，從而產生bsAb。由於全長抗體重鏈(CH3)界面完美，因此匹配(亦即不帶排斥電荷)的杵-臼全長重鏈在此類條件下之再組裝應為有利的。因此，所形成之bsAb的全長重鏈與部分不完美(電荷錯配)的2/3-IgG分子保持結合優於該等分子的再形成。因此，設計成部分去穩定化(帶排斥電荷)的CH3界面為成功導引鏈交換反應的關鍵參數。

Fc界面(具體言之，CH3-CH3界面)的部分去穩定可以藉由使MHCFcRP的CH3殘基發生突變、同時維持全長抗體重鏈上的相互作用殘基來達成。

可以引入MHCFcRP之CH3域中、從而影響全長抗體重鏈::MHCFcRP界面的例示性突變提供於下表中。

一些突變包括改變界面電荷的交換。電荷突變使先前存在的穩定電荷對減弱或斷裂或引起排斥效應，或兩者。

類似地，可以引入具有不同尺寸側鏈的胺基酸以產生空間排斥效應。此類突變減弱或干擾現存的疏水性界面相互作用或產生空間位阻，或兩者的組合。

經由電荷及/或空間效應而實現部分去穩定的突變亦可彼此組合。

另外，含有引入其MHCFcRP中之電荷及/或空間變化的第一2/3-IgG可以與含有引入其MHCFcRP中之不同電荷及/或空間變化、與來自第一2/3-IgG之MHCFcRP之電荷及/或空間變化匹配的第二2/3-IgG組合。

2/3-IgG以及所得bsAb係以其中成對CH3域在一側具有杵突變且在另一側具有臼突變的方式組裝。因此，『回復突變』為MHCFcRP之相應杵或臼殘基之野生型組成亦產生界面擾動。杵-或臼-CH3-域與野生型域的此類組合列舉於下表中。

此等回復突變可應用於使CH3-CH3界面部分地失去穩定。

此等回復突變亦可與其他擾動突變(包括前述表中所述的彼等擾動突變)組合應用。

所有部分擾動型個別突變或如上文所述之突變組合亦可以如下方式選擇：其使2/3-IgG部分地失去穩定，又使作為交換反應之第2種產物的杵-MHCFcRP::臼-MHCFcRP雜二聚體穩定且藉此使反應平衡進一步轉向產物一側(交換反應)。

實例 13
設計能夠與非抗體部分一起靶向鏈交換反應的 bsAb 前驅分子
根據本發明的交換反應係利用CH3杵實體與臼實體之間的界面突變來驅動鏈交換反應。圖18證明如下原理：兩個分子各自與由『不完美』Fc界面構成之H鏈雜二聚體的相互作用使其H鏈發生交換而形成兩種各具有『完美』H-H鏈界面的新實體。此原理可應用於產生多種多樣的雙特異性抗體及形式，例如用於篩選目的。

莖單元可以與任何結合子(諸如非抗體部分)一起使用。分子設計成含有非抗體結合單元、靶向HER2的親和抗體(ZHER2:342；Orlova等人，Cancer Res. 66 (2006) 4339-4348)，從而置換抗體之習知Fab結合單元。兩種多肽鏈的胺基酸序列為SEQ ID NO: 83及84。相同原理適用於且特別用於圖19中所示的此交換反應。

分子已如實例2中概述所產生且交換反應已如實例3中概述進行。

更詳言之，藉由基因合成或突變誘發來產生用於表現的序列且選殖入基於CMV啟動子的表現質體中。構築體在其結合實體中含有抗原1 (AG1，＜AG1＞)及生物素(Bio=AG2，＜AG2＞)半結合子對，從而變得易發生鏈交換。

根據製造商說明書，在FreeStyle™ 293-F細胞(Invitrogen)中進行短暫表現。簡言之，在搖瓶中之無血清FreeStyle™ 293表現培養基(Invitrogen)中懸浮生長的HEK293-F細胞(Invitrogen)用相應表現質體及293-fectin™ (Invitrogen)轉染。對於2 L搖瓶(Corning)而言，在600 mL中以1*10⁶ 個細胞/毫升之密度接種HEK293-F細胞且在120 rpm、8% CO₂ 下培育。次日，使用以下之約42 mL混合物，以約1.5*10⁶ 個細胞/毫升之細胞密度轉染細胞：20 mL Opti-MEM (Invitrogen)，其含有600 µg總質體DNA (1 µg/mL)及20 ml Opti-MEM + 1.2 mL 293費克汀(2 µL/mL)。在表現過程中，根據製造商方案添加葡萄糖推注溶液及饋料溶液。正確組裝的蛋白質分泌於培養物上清液中。轉染之後第6天收集上清液。

藉由使用cOmplete^TM His標籤純化樹脂(Roche, Switzerland)的親和層析、隨後藉由Superdex 200尺寸排阻(GE Healthcare, Sweden)層析對含有親和抗體的蛋白質進行純化。簡言之，在經50 mM Na₂ HPO₄ 及300 mM NaCl (pH 7.4)平衡的cOmplete^TM His標籤純化樹脂上捕捉無菌過濾的細胞培養物上清液，用平衡緩衝液洗滌且用50 mM Na₂ HPO₄ 、300 mM NaCl及250 mM咪唑(pH 7.4)溶離。彙集所溶離的蛋白質溶離份，使用Vivaspin超濾裝置(Sartorius Stedim Biotech S.A., France)濃縮至2 ml總體積且藉由尺寸排阻層析進一步純化，該尺寸排阻層析使用經20 mM組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡的Superdex 200 16/60 GL (GE Healthcare, Sweden)管柱。彙集含有蛋白質的溶離份，濃縮至所需濃度且在-80℃儲存。

純度及正確組成顯示於圖20 (親和純化之後的SEC特徵曲線)及圖21 (純化材料的SDS-PAGE)中。產物產量類似於其他含Fab抗體衍生物(5.8 mg/L培養物)。

根據本發明的交換反應係使用具有非抗體親和抗體部分的蛋白質進行。因此，將蛋白質與靶向LeY的前藥分子(交換反應方案參見圖19)各自以2 µM、以300 µl的總體積(20 mM組胺酸、140 mM NaCl，pH 6.0)混合，隨後在37℃下培育1小時。

藉由ELISA證明前藥實體成功地發生根據本發明的交換反應而形成功能性結合分子。ELISA分析原理顯示於圖22中。反應物攜帶His標籤，但又不具有功能性抗原結合(亦即，生物素結合)實體。僅在鏈交換後，形成生物素結合位點(VH/VL對，抗生物素Fv)，該生物素結合位點為功能性結合位點且允許進行Bio-Cy5捕捉及螢光信號偵測。在ELISA中，將樣品在具有1% (w/v)牛血清白蛋白的1xPBS中稀釋至1 µM反應物蛋白質濃度，以100 µl施加至黑色Pierce©鍍鎳96孔盤(Thermo Fisher Scientific, USA)上且在室溫下培育一小時。用250 µl 緩衝液(1xPBS + 0.05% Tween 20)洗滌三次之後，添加100 µl含有100 ng/mL生物素-Cy5結合物的PBST。隨後在室溫下培育一小時。用250 µl PBST緩衝液洗滌四次之後，向各孔中添加100 µl PBST。在Tecan Infinite M200 Pro讀取器上，在675 nm之發射波長(在647 nm激發)下量測Cy5螢光。圖23顯示ELISA結果且揭露成功地發生鏈交換及來自非活性前藥實體之結合Fv活化。此證明非抗體部分可以用於根據本發明的交換反應中且藉此用於前藥活化。

實例 14
鎳親和層析 .
未反應之初始材料以及含有組胺酸之交換產物的移除可使用鎳親和層析執行。

鎳親和層析係使用0.2 ml HisPur^TM Ni-NTA離心管柱(ThermoScientific)、根據製造商說明書進行。將交換反應的粗反應混合物施加至經平衡的管柱上。為了增加樣品與瓊脂糖基親和材料之間的接觸，將管柱在室溫下培育一小時。管柱視情況可以在培育期間旋轉。未結合的材料係藉由離心、以流過模式、用洗滌緩衝液溶離。洗滌三次之後，使用溶離緩衝液，根據製造商說明書溶離所結合的材料。

實例 15
根據本發明之經 Fab 延長之 2 / 3 - IgG 的 表現及純化
藉由當前技術將編碼經Fab延長之輕鏈、Fab延長之重鏈(具有杵或臼突變)及匹配MHCFcRP (臼或杵)的質體共轉染至哺乳動物細胞(例如HEK293)中來達成經Fab延長之2/3-IgG的表現。

更詳言之，舉例而言，藉由短暫轉染(例如在HEK293細胞中)產生經Fab延長的2/3-IgG時，應用基於具有或不具有CMV內含子A啟動子之cDNA組織或基於具有CMV啟動子之基因組組織的表現質體。質體含有一個用於經Fab延長之重鏈的表現卡匣及各用於兩條輕鏈的表現卡匣。

除抗體表現卡匣之外，質體含有：
- 允許此質體在大腸桿菌中複製的複製起點，
- β-內醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌安比西林抗性，及
- 來自小家鼠之二氫葉酸還原酶基因作為真核細胞中的可選標記物。

各抗體基因之轉錄單元由以下元件構成：
- 位於5'端的獨特限制位點
- 來自人類細胞巨大病毒之即刻早期增強子及啟動子，
- 在cDNA組織之情況下，繼之為內含子A序列，
- 人類抗體基因之5'非轉譯區，
- 免疫球蛋白重鏈信號序列，
- 作為cDNA或存在於基因組組織中的相應抗體鏈(維持免疫球蛋白外顯子-內含子組織)，
- 具有聚腺苷酸化信號序列之3'非轉譯區，及
- 位於3'端的獨特限制位點。

融合基因係藉由PCR及/或基因合成來產生且藉由已知重組方法及技術、藉由在相應質體中連接相應核酸區段(例如使用獨特限制位點)來組裝。藉由DNA定序來驗證次選殖的核酸序列。為了短暫轉染，藉由質體製備、自轉型之大腸桿菌培養物(Nucleobond AX, Macherey-Nagel)製備大量質體。

標準細胞培養技術如以下文獻中所述來使用：Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.及Yamada, K.M. (編), John Wiley & Sons, Inc.。

根據製造商說明書、藉由使用HEK293-F系統(Invitrogen)短暫轉染相應質體來產生經Fab延長的2/3-IgG。簡言之，用相應表現質體及293fectin™或費克汀(fectin)(Invitrogen)轉染HEK293-F細胞(Invitrogen)，該等細胞懸浮生長於搖瓶中或攪拌醱酵器中之無血清FreeStyle™ 293表現培養基(Invitrogen)中。對於2 L搖瓶(Corning)而言，在600 mL中以1*10⁶ 個細胞/毫升之密度接種HEK293-F細胞且在120 rpm、8% CO₂ 下培育。次日，使用以下之約42 mL混合物，以約1.5*10⁶ 個細胞/毫升之細胞密度轉染細胞：A) 20 mL Opti-MEM (Invitrogen)，其含有600 µg總質體DNA (1 µg/mL)；及B) 10 ml Opti-MEM + 1.2 mL 293費克汀或費克汀(2 µL/mL)。在醱酵過程中，根據葡萄糖消耗來添加葡萄糖溶液。正確組裝的經Fab延長之2/3-IgG類似於標準IgG分泌於培養物上清液中。5-10天之後，收集含有所分泌之經Fab延長之2/3-IgG的上清液，且自上清液直接純化經Fab延長的2/3-IgG或將上清液冷凍且儲存。

由於經Fab延長的2/3-IgG含有Fc區，因此藉由應用標準蛋白質A親和層析將其純化。

利用MabSelectSure-Sepharose^TM (GE Healthcare, Sweden)及Superdex 200尺寸排阻(GE Healthcare, Sweden)層析，藉由親和層析而自細胞培養物上清液中純化抗體。

簡言之，在經PBS緩衝液(10 mM Na₂ HPO₄ 、1 mM KH₂ PO₄ 、137 mM NaCl及2.7 mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe樹脂上捕捉無菌過濾的細胞培養物上清液，用平衡緩衝液洗滌且用25 mM檸檬酸鈉(pH 3.0)溶離。彙集所溶離之經Fab延長的2/3-IgG溶離份且用2 M Tris (pH 9.0)中和。池藉由尺寸排阻層析進一步純化，該尺寸排阻層析係使用經20 mM組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡的Superdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Sweden)管柱。彙集含有經Fab延長之2/3-IgG的溶離份，利用Vivaspin超濾裝置(Sartorius Stedim Biotech S.A., France)濃縮至所需濃度且在-80℃儲存。

各純化步驟之後，使用微流體Labchip技術(Caliper Life Science, USA)、藉由CE-SDS分析純度及完整性。使用HT蛋白質表現試劑套組，根據製造商說明書製備蛋白質溶液(5 µl)供CE-SDS分析用，且在使用HT蛋白質表現晶片的LabChip GXII系統上加以分析。使用LabChip GX軟體分析資料。

以下例示性Fab延長之2/3-IgG已藉由相應L-鏈、H鏈及MHCFcRP編碼質體之共表現而產生：抗螢光素-抗CD3-2/3-IgG-杵-cys + 抗生物素-E357K-臼。相應的SEC層析圖顯示於圖27中。根據SEC的單體含量為93.4%。根據CE-SDS的單體含量為100%。藉由MS確認質量。

實例 16
以 Fab 延長的 2 / 3 - IgG 作為初始材料， 藉由 2 / 3 - IgG 交換反應產生雙特異性抗體 ( bsAb )
含有兩個輕鏈、重鏈及MHCFcRP的經Fab延長之2/3-IgG已作為KiH雜二聚體產生：全長重鏈-杵::MHCFcRP-臼。經Fab延長的2/3-IgG稍微『有瑕疵』，原因為MHCFcRP缺乏為了與重鏈形成鏈間二硫鍵而必需的額外CH3半胱胺酸，且MHCFcRP含有與全長重鏈配對物的電荷不匹配的電荷突變。然而，構成彼等有瑕疵之雜二聚體的模組能夠重排成具有匹配電荷的雙特異性雜二聚體。經Fab延長之2/3-IgG A的全長重鏈(杵-cys)與來自2/3-IgG B的全長重鏈(臼-cys)形成匹配雜二聚體。當MHCFcRP (臼-電荷)與MHCFcRP (杵-電荷)相互作用時，亦形成匹配雜二聚體。因此，交換反應係基於兩種不同2/3-IgG之初始雜二聚體的暫時分離，從而產生較佳含有(電荷)匹配雜二聚體的產物。交換反應因此將兩個單特異性2/3-IgG轉化成一個雙特異性IgG及一個MHCFcRP雜二聚體：
經Fab延長的2/3-IgG-His6(8) + 2/3-IgG-His6(8) → bsAb(AB) + Fc-His6(8)

交換反應藉由尤其使鉸鏈區鏈間二硫鍵斷裂的還原步驟(例如應用各種濃度的2-MEA或TCEP)起始。隨後自發地發生鏈重排。

如圖26中所示之三個交換反應的程序如下：
將1 mg經Fab延長之2/3-IgG (dA)與1 mg相應2/3-IgG形式(nB或cB或ncB)在1x PBS緩衝液中混合，總體積為2 ml。向混合物中添加存在於1xPBS緩衝液中之16x莫耳當量之TCEP。樣品在37℃及350 rpm攪拌下培育一小時。培育時間之後，經由NiNTA層析管柱(HisComplete^TM , Roche, Basel, Switzerland)純化樣品且收集流過物中的經組裝雙特異性抗體。流過物進一步在室溫下培育隔夜。接著藉由分析型SEC、CE-SDS及質譜方法分析樣品。

交換反應之結果呈現於下表中：

使用BIAcore T200儀器(GE Healthcare)、藉由表面電漿子共振來探究對生物素及FITC的結合。所有實驗均在25℃下使用HBS-P (10 mM HEPES、140 mM NaCl、0.05% Tween 20 (pH 7.4))作為操作及稀釋緩衝液來進行。使用標準胺偶合化學方法，將抗人類Fc抗體(GE Healthcare #BR100839)固著於S系列CM5感測晶片(GE Healthcare #29104988)上。雙特異性抗體捕捉於表面上，隨後連續注射生物素或FITC標記之蛋白質(首先注射生物素標記之蛋白質且其次注射FITC標記之蛋白質一次，以及首先注射FITC標記之蛋白質且其次注射生物素標記之蛋白質一次)。各自在10 µg/ml濃度下，監測結合60秒，解離120秒。藉由注射3 M MgCl₂ 60秒而使表面再生。藉由減去自模擬表面獲得之反應來校正整體折射率差異。減去空白注射(雙重參考)。雙特異性抗體＜FITC＞＜CD3＞-杵-HC (dA) + ＜生物素＞-臼-nc-His (ncB)的兩個例示性SPR感測圖譜顯示於圖28中(兩個感測圖譜代表首先添加生物素、其次添加FITC及首先添加FITC、其次添加生物素)。所有組合的結果示於下表中：

所有初始分子、所有非所要副產物以及在交換反應期間潛在產生的所有聚集體均具有親和標籤(His6或His8)。交換反應產生的所需雙特異性抗體僅為不攜帶His標籤的分子。因此，可以應用簡單的NiNTA吸收步驟移除所有非所需分子。可以對流過物中的剩餘雙特異性抗體直接應用篩選程序及分析，以鑑別出具有所需功能的雙特異性抗體。

實例 17
交換反應之後用於純化的替代標籤
在此等實驗中，已使用C標籤 (SEQ ID NO: 87)替代組胺酸標籤，以顯示交換反應不受所用標籤影響。

2/3-IgG (如實例6中的彼等物)已使用相應末端融合有短連接子(SEQ ID NO: 88)的C標籤表現及純化。此等2/3-IgG之產生及純化結果示於下表中。

交換反應如下進行：
將各300 µl的相應初始2/3-IgG (c=1 mg/mL；總共600 µl)混合。以15倍莫耳濃度過量添加TCEP。在37℃及400 rpm下培育樣品。將360 µl樣品與200 µl C標籤樹脂(Thermo Scientific；50%漿液，用1xPBS洗滌，pH 7.4)混合且在旋杯管柱中、在室溫及800 rpm攪拌下培育60分鐘。培育之後，將旋轉管柱在室溫、800 rpm下離心5分鐘且收集流過物。樹脂用1xPBS pH 7.4 (100 µl及隨後離心步驟)洗滌若干次。洗滌之後，將樣品樹脂與100 µl HCl緩衝液(pH 2.6)混合且在室溫及800 rpm攪拌下培育30分鐘。在室溫及800 rpm下藉由離心5分鐘來產生溶離液)。

2/3-IgG A (Fluo-杵-n-HC + 臼-MHCFcRP(E357K)-C標籤)與2/3-IgG B (生物素-臼-n-HC + 杵-MHCFcRP(K370E)-C標籤)之例示性交換反應的非還原CE-SDS層析圖顯示於圖29中。可以發現雙特異性抗體形成且可以在流過物中收集。C標記的MHCFcRP在交換反應之後結合至C標籤樹脂且可以自其溶離。藉此達成分離及純化。

實例 18
藉由 2 / 3 - IgG 交換反應而非還原來產生雙特異性抗體
與含有Fc區二硫鍵之2/3-IgG發生的鏈交換需要還原作為初始步驟以實現鏈分離及隨後的再組裝，從而形成所需雙特異性抗體。為了避免還原步驟及與其相關的副反應(因為2/3-IgG亦含有非鉸鏈二硫鍵(二硫鍵改組))，產生H鏈Fc與MHCFcRP Fc之間無二硫鍵的2/3-IgG。此藉由使杵及臼半抗體中以及杵或臼MHCFcRP鏈中之負責鉸鏈二硫鍵形成之半胱胺酸發生突變來達成。在半抗體之間形成KiH相關鏈間二硫鍵的CH3-半胱胺酸亦加以移除。

為了排除形成H-H鏈間二硫鍵的兩個半胱胺酸，藉由使其H鏈鉸鏈區中的兩個半胱胺酸與絲胺酸交換來產生不含鉸鏈鏈間二硫鍵的IgG1衍生物。藉此改變野生型IgG1...HTCPXCP.. (SEQ ID NO: 31)的鉸鏈區序列以編碼...HTSPXSP.. (SEQ ID NO: 85)。

藉由使鉸鏈區中之導致鏈間二硫鍵形成的整個序列片段缺失來產生不含鉸鏈鏈間二硫鍵的另一實體。因此，使正常IgG1鉸鏈區中的CPPC序列缺失以產生具有序列...HTPAPE... (SEQ ID NO: 86)的較短鉸鏈。

圖25顯示半胱胺酸經絲胺酸置換而產生跨距延長的抗體，原因為原本限制的鉸鏈二硫鍵釋放。

藉由以與上文針對含二硫鍵實體所述相同之方式將CMV啟動子驅動的表現質體共轉染至哺乳動物細胞中來達成不含HC-HC鏈間二硫鍵之2/3 IgG的表現。使表現質體短暫轉染至HEK293細胞中引起CMV啟動子驅動個別2/3-IgG共表現、在分泌性隔室中組裝且隨後分泌至培養物上清液中。

不含HC-HC鏈間二硫鍵的2/3 IgG分泌於細胞培養物上清液中且含有Fc區以及κ L-鏈。因此其如下純化：第一步藉由蛋白質A或藉由KappaSelect樹脂捕捉。隨後藉由尺寸排阻層析(SEC)、根據尺寸執行分離步驟。此2步驟方案能夠以穩定且有效的方式、以類似於使用標準抗體所觀測到之產量的產量自細胞培養物上清液有效回收2/3 IgG衍生物。

實例 19
藉由 2 / 3 - IgG 交換反應而非還原來產生雙特異性抗體
含有輕鏈、重鏈及互補Fc區的2/3-IgG已藉由兩種類型的KiH雜二聚體產生：重鏈-杵::相應Fc區-臼及重鏈-臼::相應Fc區-杵。由於互補Fc區含有與H鏈配對物不匹配的電荷突變，因此兩種類型的2/3 IgG均「有瑕疵」。然而，構成彼等有瑕疵之雜二聚體的模組能夠重排成完美的雜二聚體：2/3-IgG A之重鏈(杵)與2/3-IgG B之重鏈(臼)形成完美的雜二聚體。當互補Fc區(臼電荷)與互補Fc區(杵電荷)相互作用時，亦形成完美的雜二聚體。因此，交換反應係基於兩種不同2/3-IgG類型之初始雜二聚體的暫時分離，從而產生較佳含有完美雜二聚體的產物。交換反應因此將兩個單特異性2/3-IgG轉化為一個雙特異性IgG及一個互補Fc區雜二聚體。

含有CH3杵-臼及/或鉸鏈鏈間二硫鍵之初始2/3-IgG的交換反應必須藉由還原步驟起始，如前述實例所示。添加諸如TCEP之還原劑以使二硫鍵斷裂，隨後發生鏈重排。相比之下，無鏈間HC-HC二硫鍵的2/3-IgG衍生物不需要還原步驟來起始鏈交換，原因為其H鏈不藉由二硫鍵互連。

為了分析2/3-IgG向bsAb的轉化是否依賴於初始還原及該轉化依賴於初始還原的程度，經由及不經由還原來進行2/3-IgG (具有及不具有鏈間二硫鍵)的交換反應。結合Bio或Fluos (上文所述)的單價單特異性2/3-IgG用作輸入分子。因此，交換反應產生結合Bio以及Fluos的二價雙特異性bsAb。藉由橋式ELISA評估所產生bsAb的形成及雙特異性功能，如上文所述。橋式ELISA由以下組成：將交換反應混合物添加至經固著的Fluos-BSA中，隨後執行洗滌步驟且隨後添加Bio-Cy5以探測雙特異性抗體之第2結合臂的存在。僅正確組裝的功能性雙特異性抗體藉由其Fluos結合臂持留於分析盤上且產生捕捉及持留Bio-Cy5的信號且藉此產生分析信號。單特異性輸入分子或不具有雙特異性的「假」分子不產生信號，原因為其不結合至培養盤(僅Bio結合子)或不能捕捉產生信號的Bio-Cy5 (僅Fluos結合子)。

圖24顯示在起始還原步驟存在及不存在下，對親本2/3-IgG (含有鏈間二硫鍵)及缺乏H-H鏈間二硫鍵之2/3-IgG交換反應進行此等橋式ELISA分析的結果。Fluos結合臂存在於分析盤上且產生捕捉及持留Bio-Cy5的信號且藉此產生分析信號。單特異性輸入分子或不具有雙特異性的「假」分子不產生信號，原因為其不結合至培養盤(僅Bio結合子)或不能捕捉產生信號的Bio-Cy5 (僅Fluos結合子)。圖24顯示在起始還原步驟存在及不存在下，對親本2/3-IgG (含有鏈間二硫鍵)及缺乏H-H鏈間二硫鍵之2/3-IgG交換反應進行此等橋式ELISA分析的結果。吾等注意到初始還原係允許含有鉸鏈二硫鍵之2/3-IgG發生鏈交換所必需的。僅當交換藉由還原來起始時，具有鉸鏈二硫鍵的彼等2/3-IgG才轉化成雙特異性抗體。相比之下，應用不含鉸鏈(及CH3)鏈間二硫鍵的2/3-IgG達成有效的雙特異性抗體產生。彼等分子的鏈交換在還原條件下以與上文針對鉸鏈連接之輸入分子所述相同之方式產生雙特異性抗體。然而，起始還原並非此等分子發生富有成效之鏈交換所必需的，原因為富有成效的鏈交換亦在初始還原不存在的情況下發生，亦即在還原劑不存在下發生。因此，移除Fc-Fc鏈間二硫鍵排除起始還原步驟的必要性。所得雙特異性抗體不經由鉸鏈區鏈間二硫鍵而結合在一起。因此，在不含鉸鏈二硫鍵之彼等2/3-IgG以自發方式組合後，雙特異性抗體有效形成，且當使用不含HC-HC鏈二硫鍵的2/3-IgG時，可以分配還原步驟用於起始交換反應。

實例 20
鏈交換反應具有濃度依賴性
用於2/3-IgG轉化為雙特異性抗體的驅動因素為在Fc區之間設計的『部分有瑕疵』之界面。此特殊界面為引入MHCFcRP Fc分子之杵或臼CH3域中之突變的結果。在2/3-IgG表現期間，突變的CH3域仍與相應的正常杵或臼搭配物結合。彼等分子亦具有足以呈現2/3-IgG以及所運作分子的穩定性，而無非所要的聚集傾向。當兩個互補2/3-IgG接近且H鏈::MHCFcRP對部分地一個接一個釋放時，發生富有成效的鏈交換反應，從而產生雙特異性抗體。由於彼等H鏈 (CH3)界面匹配較佳，因此杵-臼H鏈在此類條件下再組裝有利於形成不具有去穩定化突變之雙特異性抗體。因此，雙特異性抗體產物之鏈與部分不完美2/3-IgG輸入分子保持結合優於該等分子再形成。因此，設計成部分去穩定化的CH3界面為成功導引鏈交換反應的關鍵參數。Fc界面的部分去穩定化可以藉由使MHCFcRP鏈之CH3殘基發生突變來達成，如上文所述。

發生交換反應的另一個必需要求(除部分去穩定化界面之外)為兩個互補2/3-IgG必須接近以實現鏈交換。實體接近的機率又應視其在交換反應中的濃度而定。

交換反應係在非還原條件下配置，其應用濃度不同、不含HC-HC鏈間二硫鍵的結合Bio及結合Fluos之2/3-IgG。交換反應完成後，所有反應混合物藉由具有較高離析劑濃度之交換緩衝液樣品稀釋至最低實驗樣品而達成『等效離析劑濃度』。隨後應用橋式ELISA測定功能性bsAb在各實驗樣品中的相對量。由於稀釋度一致的樣品中存在相同量的離析物，因此濃度非依賴性將使得所有樣品的ELISA值相等/相似。反之亦然，反應中具有較高離析劑濃度的信號連續增強表示鏈交換具有濃度依賴性。此等分析的結果揭露ELISA信號在含有濃度＞2 µM之離析劑的反應中達到平穩階段。因此，在彼等濃度下及高於彼等濃度時，離析劑濃度對交換反應的功效僅具有有限的影響。較低離析劑濃度產生的ELISA信號以劑量依賴方式變少。因此，低於某一臨限值時，藉由交換產生bsAb顯著地受離析劑濃度影響，原因為離析劑相互作用發生機率減少。結果顯示於圖30中。

實例 21
以受限制的 2 / 3 - IgG 作為初始材料， 藉由 2 / 3 - IgG 交換反應產生雙特異性抗體 ( bsAb )
受限制的2/3-IgG呈圓形且結合位點係由Fc區N端的第一部分及Fc區C端的第二部分形成，其中第一部分與第二部分彼此間結合且形成結合位點，且MHCFcRP已作為KiH雜二聚體產生：全長圓形重鏈-杵::MHCFcRP-臼。受限制的2/3-IgG稍微『有瑕疵』，原因為MHCFcRP缺乏為了與重鏈形成鏈間二硫鍵而必需的額外CH3半胱胺酸，且MHCFcRP含有與全長重鏈配對物的電荷不匹配的電荷突變。然而，構成彼等有瑕疵之雜二聚體的模組能夠重排成具有匹配電荷的雙特異性雜二聚體。2/3-IgG A之全長或全長受限制的重鏈(杵-cys)與2/3-IgG B之全長或受限制的重鏈(臼-cys)形成匹配雜二聚體。當MHCFcRP (臼-電荷)與MHCFcRP (杵-電荷)相互作用時，亦形成匹配雜二聚體。因此，交換反應係基於兩種不同2/3-IgG之初始雜二聚體的暫時分離，從而產生較佳含有(電荷)匹配雜二聚體的產物。交換反應因此將兩個單特異性2/3-IgG轉化成一個雙特異性IgG及一個MHCFcRP雜二聚體：
受限制的2/3-IgG-His6(8) + 2/3-IgG-His6(8) → bsAb(AB) + Fc-His6(8)

交換反應係藉由尤其使鉸鏈區鏈間二硫鍵斷裂的還原步驟起始。隨後自發地發生鏈重排。

如圖31中所示之交換反應程序如下：
將1 mg「輸入形式A」與1 mg「輸入形式B」在1x PBS緩衝液中混合，總體積為2 ml。向混合物中添加存在於1xPBS緩衝液中之16x莫耳當量之TCEP。樣品在37℃及350 rpm攪拌下培育一小時。培育時間之後，經由NiNTA層析管柱(HisCompleteTM, Roche)純化樣品且收集流過物中的經組裝之雙特異性抗體。流過物進一步在室溫下培育隔夜。接著藉由分析型SEC、CE-SDS及質譜方法分析樣品。

交換反應之結果呈現於下表中：

使用BIAcore T200儀器(GE Healthcare)、藉由表面電漿子共振來探究對c-MET、生物素及FITC的結合。所有實驗均在25℃下使用HBS-P (10 mM HEPES、140 mM NaCl、0.05% Tween 20 (pH 7.4))作為操作及稀釋緩衝液來進行。使用標準胺偶合化學方法，將抗人類His標籤抗體(GE Healthcare #28995056)固著於S系列CM5感測晶片(GE Healthcare #29104988)上。將c-MET-Fc (R&D Systems #358-MT)注射至表面上，隨後注射濃度各為10 µg/ml之經生物素標記之蛋白質或經FITC標記之蛋白質。監測結合期及解離期的各結合事件2分鐘。藉由注射10 mM甘胺酸(pH 1.5) 60秒而使表面再生。藉由減去自模擬表面獲得之反應來校正整體折射率差異。減去空白注射(雙重參考)。

在第二種配置中，將c-MET以及抗人類Fc抗體(GE Healthcare #BR100839)固著於S系列CM5感測晶片上。將單鏈靶結合劑以10 µg/ml之濃度向流動池上注射30秒。藉由注射3 M MgCl₂ 60秒而使表面再生。藉由減去自模擬表面獲得之反應來校正整體折射率差異。減去空白注射(雙重參考)。為了評估，將所得c-MET結合反應相對於源於抗人類Fc抗體結合的反應歸一化。雙特異性抗體＜cMET＞-臼-HC (conA)+＜Fluo＞-杵-c-His (cB)的例示性SPR感測圖譜顯示於圖33中。所有組合的結果示於下表中：

n/a表示相應結合位點不存在於雙特異性抗體中且藉此可以預期無結合。

所有初始分子、所有非所要副產物以及在交換反應期間潛在產生的所有聚集體均具有親和標籤(His6或His8)。交換反應產生的所需雙特異性抗體僅為不攜帶His標籤的分子。因此，可以應用簡單的NiNTA吸收步驟移除所有非所需分子。可以對流過物中的剩餘雙特異性抗體直接應用篩選程序及分析，以鑑別出具有所需功能的雙特異性抗體。

圖 1 ： 2/3-IgG的設計及模組化組合物，其可以用於本發明之方法中。

圖 2 ： 杵-cys與臼-cys重鏈之間(上部)及杵-cys重鏈與MHCFcRP之間(中部及下部)的相互作用。共價二硫鍵係用短劃線表示，吸引性相互作用對係用實心球之間的線描繪，排斥相互作用或所產生的空間位阻係用雙箭頭線表示。

圖 3A-3D ： 具有不同MHCFcRPs之經純化2/3-IgG的SEC層析圖：所示為自細胞培養物上清液中進行蛋白質A萃取之後，2/3-IgG製劑的SEC特徵曲線；各種特徵曲線的主峰代表具有螢光素或生物素特異性的2/3-IgG(參見實例2)。

圖 4 ： 根據本發明、藉由交換反應產生bsAbs (雙特異性抗體)，以2/3-IgG為例說明。

圖 5 ： 施加TCEP (相對於2/3輸入IgG的x莫耳當量)以(部分地)還原鉸鏈二硫鍵。SEC區分2/3-IgG初始分子，產生bsAb及二聚合MHCFcRP。相同培育時間之後，中止不同TCEP濃度下的所有反應(三角形：bsAb；十字形：2/3-IgG，菱形：二聚合MHCFcRP)。

圖 6 ： 自所要bsAb產物中移除非所要的未反應輸入分子及副產物。

圖 7 ： NiNTA之SDS-page - 純化；n.r. = 非還原；r = 還原；所結合的NiNTA (上圖)表示自NiNTA溶離的蛋白質，NiNTA流過(下圖)為不含有His-6或His-8標籤的蛋白質；n.r. = 非還原，r. = 還原；M = 標記物。

圖 8 ： 根據本發明、藉由交換反應產生bsAbs的雙特異性功能。藉由能夠偵測雙特異性抗體之結合位點同時結合的橋式ELISA評估功能。塗佈至ELISA盤的抗原A為螢光素(fluos-BSA)且抗原B為bio-Cy5，其可藉由其螢光偵測到。

圖 9 ： 用於2/3-IgG交換反應的例示性2/3-IgG在重鏈的C端具有結合位點。

圖 10 ： 用於2/3-IgG交換反應的例示性2/3-IgG在重鏈的N端及C端具有結合位點。

圖 11 ： 使用具有不同結合特異性及形式的初始材料進行IgG交換反應，以2/3-IgG為例說明。

圖 12 ： 根據本發明、使用例示性2/3-IgG、經由交換反應產生的不同bsAb形式基質。該基質係使用螢光素結合實體及生物素胺結合實體產生。輸入分子及交換衍生的輸出分子顯示於圖10中。使用fluos-BSA作為捕捉抗原及bio-Cy5偵測雙特異性結合功能，藉由橋式ELISA評估所產生之bsAb的功能。源於橋式ELISA的信號表明所有形式均具有雙特異性結合功效。

圖 13 ： 使用小型化高處理量及自動化相容性方法、根據本發明、經由交換反應產生及表徵bsAb多樣性的基質。

圖 14 ： 根據本發明之方法、利用HTS技術、經由交換來形成雙特異性抗體。所示為例示性橋式ELISA的信號，其顯示指示雙特異性抗體形成的濃度依賴性螢光信號。Fluos-bio橋式ELISA，十字形：fluos [臼/K370E] + bio [杵/E357K]，菱形：bio [臼/K370E] + fluos [杵/E357K]。所有其他曲線：無同源交換搭配物的2/3 IgG輸入分子未顯示橋聯信號。

圖 15 ： 根據本發明的交換反應方案，以無鉸鏈區及CH3域鏈間二硫鍵的2/3-IgG為例說明。此能實現本發明之方法中的鏈交換反應而不需要添加還原劑。

圖 16 ： 使無鏈間二硫橋鍵的2/3-IgG分泌至培養物上清液(如標準IgG)中，藉由標準蛋白質A親和及尺寸排阻層析加以純化，且藉由SDS-PAGE分析，證實所要100 kDa 2/3-IgG為表現產物。此證明經純化之2/3-IgG衍生物得到正確的組裝，該等衍生物無鏈間二硫橋鍵且不存在非所要二聚體及聚集體。以下各者的純化：i)抗bio抗體輕鏈(SEQ ID NO: 39) + 無鉸鏈區半胱胺酸殘基的抗bio抗體重鏈-杵(SEQ ID NO: 57) + 無鉸鏈區半胱胺酸殘基的MHCFcRP-臼-E357K (SEQ ID NO: 62)(左圖)及ii)抗fluos抗體輕鏈(SEQ ID NO: 42) + 無鉸鏈區二硫鍵的抗fluos抗體全長重鏈-臼(SEQ ID NO: 60) + 無鉸鏈區半胱胺酸殘基的MHCFcRP-杵-K370E(SEQ ID NO: 63)(右圖)。

圖 17 ： 使用無鉸鏈區二硫鍵之初始材料、根據本發明之交換反應的結果：以經純化之bsAb作為陽性對照物的2.5 µM濃度之輸入分子表明無Fc區鏈間二硫鍵之單特異性2/3-IgG輸入分子經由鏈交換而成功地產生bsAb。

圖 18 ： 根據本發明、藉由交換反應來產生bsAb (雙特異性抗體)，以2/3 IgG (左圖)及IgG (右圖)為例說明。

圖 19 ： 根據本發明、藉由交換反應來產生bsAb (雙特異性抗體)，以2/3 IgG為例說明，其中Fab已經親和抗體(左圖)及IgG (右圖)置換。

圖 20 ： 經純化之親和抗體構築體的SEC層析圖，該構築體在自細胞培養物上清液中經cOmplete^TM His標籤純化之後，用於根據本發明的交換反應中；水平線指示彙集溶離份用於進一步研究。

圖 21 ： 經SEC純化之親和抗體構築體的SDS-PAGE，該構築體用於根據本發明的交換反應；M = 標記物，S = 樣品。

圖 22 ： ELISA分析方案。反應物攜帶His標籤且能夠結合至鍍Ni盤，但不具有功能性生物素(Bio)結合實體且因此不結合Bio-Cy5。僅在根據本發明之交換反應中發生鏈交換後，才產生功能性抗生物素結合位點，其能夠實現Bio-Cy5捕捉及螢光信號偵測。

圖 23 ： ELISA分析結果。ELISA證實攜帶Fab臂與非抗體結合支架之實體之間發生鏈交換。

圖 24 ： 根據本發明的交換反應係使用具有及不具有鉸鏈區二硫鍵的2/3-IgG進行，亦即在還原(紅色)及非還原(綠色)條件下進行。使用實例中所述的橋式分析來監測交換反應。陰性對照組(灰色)均為單特異性2/3-IgG初始分子。

圖 25 ： 藉由修飾IgG1鉸鏈區，亦即藉由移除二硫鍵或藉由縮短鉸鏈區，可以對個別結合位點之間的不同距離進行工程改造。

圖 26 ： 根據本發明、與包含第二Fab區域之2/3-IgG發生的交換反應。

圖 27 ： 經純化之Fab延長2/3-IgG的SEC層析圖。

圖 28 ： 雙特異性抗體＜FITC＞＜CD3＞-杵-HC (dA)+＜生物素＞-臼-nc-His (ncB)的SPR感測圖，該雙特異性抗體藉由連續注射經生物素標記之蛋白質或經FITC標記之蛋白質而獲得(首先注射經生物素標記之蛋白質且其次注射經FITC標記之蛋白質一次以及首先注射經FITC標記之蛋白質且其次注射經生物素標記之蛋白質一次)。

圖 29 ： 包含C標籤之初始2/3-IgG及根據本發明發生交換反應之後之反應混合物的非還原CE-SDS層析圖。初始2/3-IgG A為Fluo-杵-n-HC + 臼-MHCFcRP(E357K)-C標籤且初始2/3-IgG B為生物素-臼-n-HC + 杵-MHCFcRP(K370E)-C標籤。可以發現雙特異性抗體形成且可以在流過物中收集。C標記的MHCFcRP在交換反應之後結合至C標籤樹脂且可以自其溶離。藉此達成分離及純化。

圖 30 ： 交換反應與濃度相關。

圖 31 ： 根據本發明，與包含受限制結合位點之2/3-IgG發生交換反應。

圖 32 ： 所得conAconB交換反應產物的分析型SEC層析圖。

圖 33 ： 所得conAconB交換反應產物的非還原CE-SDS層析圖。

圖 34 ： 雙特異性抗體＜cMET＞-臼-HC (conA)+＜Fluo＞-杵-c-His (ncB)的SPR感測圖，該雙特異性抗體藉由連續注射經cMET標記之蛋白質及經Fluo標記之蛋白質而獲得。

Claims (49)

1. 一種用於產生多肽的方法，包含以下步驟： 培育 第一多聚體，其包含 a-1) 第一多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 ii)至少一個功能性結合位點或其一部分， 及 a-2) 第二多肽，其包含 免疫球蛋白G CH3域， 其中 a-3) 該第一多肽之該CH3域包含突變杵-cys且該第二多肽之該CH3域包含突變臼， 或 該第一多肽之該CH3域包含突變臼-cys且該第二多肽之該CH3域包含突變杵， a-4) 該第二多肽的該CH3域中包含突變，該突變不同於a-3)項下之該等突變，且使該第一多聚體之CH3-CH3結合自由能增加， 及 第二多聚體，其包含 b-1) 第三多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 b-2) 第四多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 ii)至少一個功能性結合位點或其一部分 其中 b-3) 在該第一多肽包含突變臼-cys的情況下，該第四多肽包含突變杵-cys且該第三多肽包含突變臼， 或 在該第一多肽包含突變杵-cys的情況下，該第四多肽包含突變臼-cys且該第三多肽包含突變杵， b-4) 該第三多肽的該CH3域中包含突變，該突變不同於a-3)、a-4)及b-3)項下之該等突變，且使該第二多聚體之CH3-CH3結合自由能增加， 從而形成包含該第二及第三多肽的第三多聚體及包含該第一及第四多肽的第四多聚體， 及 回收該第四多聚體且藉此產生該多肽。
2. 如請求項1之方法，其中a-4)項下的該突變為E357K，該第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K，b-4)項下的該突變為K370E，且該第四多肽包含位置357處之胺基酸殘基E，其中位置根據Kabat EU索引編號。
3. 如請求項1之方法，其中a-4)項下的該突變為D356K，該第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K，b-4)項下的該突變為K439E，且該第四多肽包含位置356處之胺基酸殘基D，其中位置根據Kabat EU索引編號。
4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該第一及/或第二多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)或胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)，且其中該第四及/或第三多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)或胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)。
5. 一種用於產生多肽的方法，包含以下步驟： 培育 第一多聚體，其包含 a-1) 第一多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 ii)至少一個功能性結合位點或其一部分， 及 a-2) 第二多肽，其包含 免疫球蛋白G CH3域， 其中 a-3) 該第一多肽之該CH3域包含突變杵且該第二多肽之該CH3域包含突變臼， 或 該第一多肽之該CH3域包含突變臼且該第二多肽之該CH3域包含突變杵， a-4) 該第二多肽的該CH3域中包含突變，該突變不同於a-3)項下之該等突變，且使該第一多聚體之CH3-CH3結合自由能增加， a-5) 該第一及/或第二多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)或胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)， 及 第二多聚體，其包含 b-1) 第三多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 b-2) 第四多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 ii)至少一個功能性結合位點或其一部分 其中 b-3) 在該第一多肽包含突變臼的情況下，該第四多肽包含突變杵且該第三多肽包含突變臼， 或 在該第一多肽包含突變杵的情況下，該第四多肽包含突變臼且該第三多肽包含突變杵， b-4) 該第三多肽的該CH3域中包含突變，該突變不同於a-3)、a-4)及b-3)項下之該等突變，且使該第二多聚體之CH3-CH3結合自由能增加， b-5) 該第四及/或第三多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)或胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)， 從而形成包含該第二及第三多肽的第三多聚體及包含該第一及第四多肽的第四多聚體， 及 回收該第四多聚體且藉此產生該多肽。
6. 如請求項5之方法，其中a-4)項下的該突變為E357K，該第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K，b-4)項下的該突變為K370E，且該第四多肽包含位置357處之胺基酸殘基E，其中位置根據Kabat EU索引編號。
7. 如請求項6之方法，其中a-4)項下的該突變為D356K，該第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K，b-4)項下的該突變為K439E，且該第四多肽包含位置356處之胺基酸殘基D，其中位置根據Kabat EU索引編號。
8. 如請求項1或5中任一項之方法，其中該第一多肽的該CH3域在與該第二多肽中之突變胺基酸殘基相互作用的位置處包含相應的免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基，且其中該第四多肽的該CH3域在與該第三多肽中之突變胺基酸殘基相互作用的位置處包含相應的免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基。
9. 一種用於產生多肽的方法，包含以下步驟： 培育 第一多聚體，其包含 a-1) 第一多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 ii)至少一個功能性結合位點或其一部分， 及 a-2) 第二多肽，其包含 免疫球蛋白G CH3域， 其中 a-3) 該第一多肽之該CH3域包含突變杵且該第二多肽之該CH3域包含突變臼， 或 該第一多肽之該CH3域包含突變臼且該第二多肽之該CH3域包含突變杵， a-4) 該第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K且該第二多肽包含突變E357K， 及 第二多聚體，其包含 b-1) 第三多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 b-2) 第四多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 ii)至少一個功能性結合位點或其一部分 其中 b-3) 在該第一多肽包含突變臼的情況下，該第四多肽包含突變杵且該第三多肽包含突變臼， 或 在該第一多肽包含突變杵的情況下，該第四多肽包含突變臼且該第三多肽包含突變杵， b-4) 該第三多肽包含突變K370E且該第四多肽包含位置357處之胺基酸殘基E， 從而形成包含該第二及第三多肽的第三多聚體及包含該第一及第四多肽的第四多聚體， 及 回收該第四多聚體且藉此產生該多肽， 其中位置係根據Kabat EU索引編號。
10. 一種用於產生多肽的方法，包含以下步驟： 培育 第一多聚體，其包含 a-1) 第一多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 ii)至少一個功能性結合位點或其一部分， 及 a-2) 第二多肽，其包含 免疫球蛋白G CH3域， 其中 a-3) 該第一多肽之該CH3域包含突變杵且該第二多肽之該CH3域包含突變臼， 或 該第一多肽之該CH3域包含突變臼且該第二多肽之該CH3域包含突變杵， a-4) 該第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K且該第二多肽包含突變D356K， 及 第二多聚體，其包含 b-1) 第三多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 b-2) 第四多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 ii)至少一個功能性結合位點或其一部分 其中 b-3) 在該第一多肽包含突變臼的情況下，該第四多肽包含突變杵且該第三多肽包含突變臼， 或 在該第一多肽包含突變杵的情況下，該第四多肽包含突變臼且該第三多肽包含突變杵， b-4) 該第三多肽包含突變K439E且該第四多肽包含位置356處之胺基酸殘基D， 從而形成包含該第二及第三多肽的第三多聚體及包含該第一及第四多肽的第四多聚體， 及 回收該第四多聚體且藉此產生該多肽， 其中位置係根據Kabat EU索引編號。
11. 如請求項10之方法，其中該第一及/或第二多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)或胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)，且其中該第四及/或第三多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)或胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)。
12. 如請求項1至3、5至7、9、10及11中任一項之方法，其中包含該第二多肽及該第三多肽之第三多聚體的CH3-CH3結合自由能低於該第一多聚體及/或該第二多聚體的CH3-CH3結合自由能。
13. 如請求項4之方法，其中包含該第二多肽及該第三多肽之第三多聚體的CH3-CH3結合自由能低於該第一多聚體及/或該第二多聚體的CH3-CH3結合自由能。
14. 如請求項1至3、5至7、9、10及11中任一項之方法，其中該第一多肽與該第二多肽形成(可分離)二聚體，且該第三多肽與該第四多肽形成(可分離)二聚體。
15. 如請求項4之方法，其中該第一多肽與該第二多肽形成(可分離)二聚體，且該第三多肽與該第四多肽形成(可分離)二聚體。
16. 如請求項4之方法，其中該第一及/或第二多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)替代IgG野生型鉸鏈區胺基酸序列HTCPPCP (SEQ ID NO: 31)，且/或其中該第一及/或第二多肽包含胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)替代IgG野生型鉸鏈區胺基酸序列HTCPPCPAPE (SEQ ID NO: 90)，且/或其中該第三及/或第四多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)替代IgG野生型鉸鏈區胺基酸序列HTCPPCP (SEQ ID NO: 31)，且/或其中該第三及/或第四多肽包含胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)替代IgG野生型鉸鏈區胺基酸序列HTCPPCPAPE (SEQ ID NO: 90)。
17. 如請求項5至7、9、10及11中任一項之方法，其中該第一多肽包含突變杵，該第二多肽包含突變臼，該第三多肽包含突變杵，且該第四多肽包含突變臼。
18. 如請求項5至7、9、10及11中任一項之方法，其中該第一多肽包含突變杵-cys，該第二多肽包含突變臼，該第三多肽包含突變杵，且該第四多肽包含突變臼-cys。
19. 如請求項1至3、5至7、9、10及11中任一項之方法，其中該第一至第四多肽在N端至C端方向上各自包含IgG1 CH2域及IgG1 CH3域。
20. 如請求項1至3、5至7、9、10及11中任一項之方法，其中該第一至第四多肽在N端至C端方向上彼此獨立地各自包含i)胺基酸序列DKTHTCPPC (SEQ ID NO: 65)或胺基酸序列DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66)或胺基酸序列DKTHT (SEQ ID NO: 91)，ii) IgG1 CH2域，及iii) IgG1 CH3域。
21. 如請求項1至3、5至7、9、10及11中任一項之方法，其中i)該第一及第四多肽各自進一步包含IgG1 CH1域及可變域，或ii)其中該第一或第四多肽包含IgG1 CH1域且另一多肽包含輕鏈恆定域且各多肽進一步包含可變域。
22. 如請求項21之方法，其中該第一多肽中的該可變域為重鏈可變域且該第四多肽中的該可變域為輕鏈可變域，或反之亦然，且此等域在該多肽中形成結合位點。
23. 如請求項1至3、5至7、9、10及11中任一項之方法，其中該第一及第四多肽彼此獨立地選自如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含 i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域， ii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域， iii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域， iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域， v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域， vi) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv， vii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab， viii) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域， ix) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域， x) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv， xi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab， xii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域， xiii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域， xiv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域， xv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及 xvi) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中該結合域的該第一部分與該結合域的該第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點。
24. 如請求項1至3、5至7、9、10及11中任一項之方法，其中該第一及第二多聚體進一步包含分別與該第一多肽及該第四多肽結合的抗體輕鏈。
25. 如請求項1至3、5至7、9、10及11中任一項之方法，其中 該第一多聚體包含 選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含 i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域， ii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域， iii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域， iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在的肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域， v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域， vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv， vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab， viii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域， ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域， x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域， xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域， xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中該結合域的該第一部分與該結合域的的該第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點， 包含突變杵或突變臼， 及 選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含 SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域， 若該第一多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若該第一多肽包含突變杵，則包含突變臼， 包含擾動突變D356K、E357K、K370E或K439E，其中該第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白IgG1中之與該擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白IgG1野生型胺基酸殘基， 其中該第一多肽與該第二多肽形成二聚體， 及 包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第五多肽， 其中該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至該第一多肽， 及 該第二多聚體包含 選自如下多肽群組之多肽作為第三多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含 SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域， 若該第二多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若該第二多肽包含突變杵，則包含突變臼， 包含第二擾動突變D356K、E357K、K370E或K439E，其中該第五多肽的胺基酸序列在野生型IgG1中之與該擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類IgG1野生型胺基酸殘基，其中該第四多肽中的該擾動突變與該第二多肽中的該擾動突變處於不同的位置， 及 選自如下多肽群組之多肽作為第四多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含 i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域， ii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域， iii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域， iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域， v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域及第二重鏈可變域， vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv， vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab， viii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域， ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域， x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域， xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及 xii) 該結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及該結合域的第二部分，其中該結合域的該第一部分與該結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點， 若該第四多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若該第四多肽包含突變杵，則包含突變臼， 其中該第四多肽與該第五多肽形成二聚體， 及 包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第六多肽， 其中該第六多肽藉由二硫鍵共價結合至該第四多肽。
26. 如請求項1至3、9、10及11中任一項之方法，其中該培育步驟係在還原劑存在或不存在下進行。
27. 如請求項4之方法，其中該培育步驟係在還原劑不存在下進行。
28. 如請求項1至3、5至7、9、10及11中任一項之方法，其中i)該第二多肽及該第三多肽進一步包含(C端)標籤。
29. 如請求項28之方法，其中 i)該標籤具有胺基酸序列HHHHHH (SEQ ID NO: 67)或HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68)且該回收係藉由金屬(鎳)螯合劑親和層析管柱層析進行， 或 ii)該標籤具有胺基酸序列EPEA (SEQ ID NO: 87)且該回收係藉由C標籤親和層析管柱層析來進行。
30. 一種用於鑑別多特異性多肽的方法，包含以下步驟 a) 藉由對選自特異性結合至第一標靶之第一多個多聚體之第一多聚體與選自特異性結合至第二標靶(不同於該第一標靶)之第二多個多聚體之第二多聚體的各種組合執行如請求項1至26中任一項之方法來產生多個多特異性多肽， b) 在結合分析中個別地量測在步驟a)中所產生之該多個多特異性多肽中的各成員對該兩個標靶的同時結合，及 c) 基於該結合分析的結果，自該多個多聚體多肽中選擇多聚體多肽，且藉此鑑別多特異性多肽。
31. 如請求項30之方法，其中該結合分析為ELISA或SPR方法。
32. 一種多聚體多肽，其包含突變杵 a) 均包含免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中 a-1) i)該第一多肽的該CH3域包含突變杵-cys且該第二多肽的該CH3域包含突變臼，或ii)該第一多肽的該CH3域包含突變臼-cys且該第二多肽的該CH3域包含突變杵， a-2)該第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分， a-3)該第二多肽的該CH3域中包含與a-1)項下之突變不同的擾動突變，其中該第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與該擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基， a-4)該第一多肽與該第二多肽形成二聚體， 或 b) 均包含免疫球蛋白G CH3域的第一多肽及第二多肽，其中 b-1) i)該第二多肽的該CH3域包含突變杵且該第一多肽的該CH3域包含突變臼-cys，或ii)該第二多肽的該CH3域包含突變臼且該第一多肽的該CH3域包含突變杵-cys， b-2)該第一多肽包含至少一個功能性結合位點或結合位點的至少一部分， b-3)該第二多肽的該CH3域中包含與b-1)項下之突變不同的擾動突變，其中該第一多肽的胺基酸序列在相應野生型免疫球蛋白G中之與該擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含相應免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基， b-4)該第一多肽與該第二多肽形成二聚體， 其中編號係根據Kabat EU索引。
33. 如請求項32之多聚體多肽，其中該擾動突變為E357K，且該第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K；或該擾動突變為K370E，且該第一多肽包含位置357處之胺基酸殘基E。
34. 如請求項32之多聚體多肽，其中該第一擾動突變為D356K，且該第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K；或該擾動突變為K439E，且該第一多肽包含位置356處之胺基酸殘基D。
35. 一種經分離的多聚體多肽，包含 a-1) 第一多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 ii)至少一個功能性結合位點或其一部分， 及 a-2) 第二多肽，其包含 免疫球蛋白G CH3域， 其中 a-3) 該第一多肽之該CH3域包含突變杵-cys且該第二多肽之該CH3域包含突變臼， 或 該第一多肽之該CH3域包含突變臼-cys且該第二多肽之該CH3域包含突變杵， a-4) 該第二多肽的該CH3域中包含突變，該突變不同於a-3)項下之該等突變，且使該第一多聚體之CH3-CH3結合自由能增加，
36. 如請求項35之經分離的多聚體多肽，其中a-4)項下的該突變為E357K，且該第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K；或其中a-4)項下的該突變為K370E，且該第一多肽包含位置357處之胺基酸殘基E，其中位置係根據Kabat EU索引編號。
37. 如請求項35之經分離的多聚體多肽，其中a-4)項下的該突變為D356K，該第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K；或其中a-4)項下的該突變為K439E，且該第一多肽包含位置356處之胺基酸殘基D，其中位置係根據Kabat EU索引編號。
38. 如請求項35至37中任一項之經分離的多聚體多肽，其中該第一及/或第二多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)或胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)。
39. 一種經分離的多聚體多肽，包含 a-1) 第一多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 ii)至少一個功能性結合位點或其一部分， 及 a-2) 第二多肽，其包含 免疫球蛋白G CH3域， 其中 a-3) 該第一多肽之該CH3域包含突變杵且該第二多肽之該CH3域包含突變臼， 或 該第一多肽之該CH3域包含突變臼且該第二多肽之該CH3域包含突變杵， a-4) 該第二多肽的該CH3域中包含突變，該突變不同於a-3)項下之該等突變，且使該第一多聚體之CH3-CH3結合自由能增加， a-5) 該第一及/或第二多肽包含胺基酸序列HTSPPSP (SEQ ID NO: 85)或胺基酸序列HTPAPE (SEQ ID NO: 86)。
40. 如請求項39之經分離的多聚體多肽，其中a-4)項下的該突變為E357K，且該第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K；或其中a-4)項下的該突變為K370E，且該第一多肽包含位置357處之胺基酸殘基E，其中位置係根據Kabat EU索引編號。
41. 如請求項39之經分離的多聚體多肽，其中a-4)項下的該突變為D356K，且該第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K；或其中a-4)項下的該突變為K439E，且該第一多肽包含位置356處之胺基酸殘基D，其中位置係根據Kabat EU索引編號。
42. 如請求項35至37及39中任一項之經分離的多聚體多肽，其中該第一多肽的該CH3域在與該第二多肽中之突變胺基酸殘基相互作用的位置處包含相應免疫球蛋白G野生型胺基酸殘基。
43. 一種經分離的多聚體多肽，包含 a-1) 第一多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 ii)至少一個功能性結合位點或其一部分， 及 a-2) 第二多肽，其包含 免疫球蛋白G CH3域， 其中 a-3) 該第一多肽之該CH3域包含突變杵且該第二多肽之該CH3域包含突變臼， 或 該第一多肽之該CH3域包含突變臼且該第二多肽之該CH3域包含突變杵， a-4) 該第一多肽包含位置370處之胺基酸殘基K且該第二多肽包含突變E357K， 或 該第二多肽包含突變K370E且該第一多肽包含位置357處之胺基酸殘基E。
44. 一種經分離的多聚體多肽，包含 a-1) 第一多肽，其包含 i)免疫球蛋白G CH3域， 及 ii)至少一個功能性結合位點或其一部分， 及 a-2) 第二多肽，其包含 免疫球蛋白G CH3域， 其中 a-3) 該第一多肽之該CH3域包含突變杵且該第二多肽之該CH3域包含突變臼， 或 該第一多肽之該CH3域包含突變臼且該第二多肽之該CH3域包含突變杵， a-4) 該第一多肽包含位置439處之胺基酸殘基K且該第二多肽包含突變D356K， 或 該第二多肽包含突變K439E且該第一多肽包含位置356處之胺基酸殘基D。
45. 如請求項32、34至37、39至41、43及44中任一項之經分離的多聚體多肽，其中該第一多肽係選自如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含 i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域， ii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域， iii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域， iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域， v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域， vi) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv， vii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab， viii) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域， ix) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域， x) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv， xi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab， xii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域， xiii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域， xiv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域， xv) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及 xvi) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中該結合域的該第一部分與該結合域的該第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點。
46. 如請求項32、35至37、39至41、43及44中任一項之經分離的多聚體多肽，進一步包含與該第一多肽結合的抗體輕鏈。
47. 如請求項46之經分離的多聚體多肽，包含 選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含 i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域， ii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域， iii) SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域， iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域， v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域， vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv， vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab， viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域， ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域， x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域， xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域， xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66或91的鉸鏈區、人類IgG1 CH2域、人類IgG1 CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中該結合域的第一部分與該結合域的該第二部分形成特異性結合至標靶的功能性結合位點， 及 選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含 SEQ ID NO: 65或66或91之鉸鏈區、人類IgG1 CH2域，及人類IgG1 CH3域， 若該第一多肽包含突變臼，則包含突變杵，或若該第一多肽包含突變杵，則包含突變臼， 包含擾動突變D356K、E357K、K370E或K439E，其中該第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白IgG1中之與該擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白IgG1野生型胺基酸殘基， 及 包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第三多肽， 其中該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至該第一多肽。
48. 如請求項32、35至37、39至41、43及44中任一項之經分離的多聚體多肽，其中該第二多肽進一步包含(C端)標籤。
49. 如請求項48之經分離的多聚體多肽，其中 i)該標籤具有胺基酸序列HHHHHH (SEQ ID NO: 67)或HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68)， 或 ii)該標籤具有胺基酸序列EPEA (SEQ ID NO: 87)。