JP2024522092A - Ｆｃ受容体に対する親和性の増強および熱安定性の改善を伴うＦｃバリアント - Google Patents

Ｆｃ受容体に対する親和性の増強および熱安定性の改善を伴うＦｃバリアント Download PDF

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Abstract

本開示は、エフェクター能のあるＦｃドメインバリアントを含むＦｃドメインバリアントを提供する。本開示はさらに、Ｆｃドメインバリアントをコードする核酸、およびＦｃドメインバリアントを生成する宿主細胞を提供する。Ｆｃドメインバリアントの収量を増加させる方法、および疾患を処置するためにＦｃドメインバリアントを使用する方法も提供される。

Description

関連出願
本特許出願は、参照によってその開示の全体が本明細書に組み入れられる、２０２１年５月２７日に出願した米国仮特許出願第６３／１９３６６５号、および２０２１年７月１５日に出願した欧州特許出願第２１３１５１２７．７号の優先権を主張するものである。
抗体のフラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域とＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）との間の特異性エンゲージメントは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）のようなエフェクター機能における初期段階である（Ａｒｎｏｌｄら、２００７年）。ヒトでは、活性化ＦｃγＲＩＩＩａは、ナチュラルキラー細胞の表面上で発現する。ＦｃγＲＩＩＩａは、低親和性受容体であり、抗体抗原免疫複合体中のクラスター化したＦｃ領域のエンゲージメントと同時に起こる、この表面受容体の架橋が、細胞の活性化を引き起こす。Ｆｃ領域は、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）とも相互作用する。この相互作用は、内皮細胞でのリソソーム分解を低下させて、ＩｇＧの半減期を延長させることが示された。
Ｆｃ受容体に対する親和性を増強する、したがって、ＡＤＣＣ活性および／または血清半減期を向上させるＦｃドメインバリアントを同定するために、Ｆｃ操作が広く追求された。新規Ｆｃドメインバリアントが必要である。
本開示は部分的に、変化したエフェクター機能を有するＦｃドメインバリアントは、野生型Ｆｃドメインと比べて低下した熱安定性を有するという発見を対象とする。したがって、本開示はさらに部分的に、上昇した熱安定性および意外なことに上昇したｉｎ ｖｉｖｏ安定性を有する新規Ｆｃドメインバリアントの発見を対象とする。
一態様では、第１の重鎖と第２の重鎖とを含むグリコシル化Ｆｃドメインを含む、単離されたエフェクター能のあるポリペプチド（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を提供し、ただし、少なくとも１つの重鎖は、（ｉ）アミノ酸２４２位のロイシン（Ｌ）およびアミノ酸３３４位のリジン（Ｋ）；（ｉｉ）アミノ酸２８７位のアラニン（Ａ）およびアミノ酸３０６位のロイシン（Ｌ）；または（ｉｉｉ）アミノ酸２９２位のアルギニン（Ｒ）およびアミノ酸３０２位のバリン（Ｖ）を置換する一対のシステイン（Ｃ）により仲介される、操作された鎖内ジスルフィド結合を含み；該アミノ酸位置は、ＥＵナンバリングに従い；該グリコシル化Ｆｃドメインは、抗体エフェクター分子と相互作用でき；該エフェクター能のあるポリペプチドは、操作された鎖内ジスルフィド結合を含まない、抗体エフェクター分子と相互作用できるグリコシル化Ｆｃドメインを有するエフェクター能のあるポリペプチドと比べて増強された熱安定性を有する。
特定の例示的実施形態では、グリコシル化Ｆｃドメインが、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２９７位において天然グリカンを含む。
特定の例示的実施形態では、グリコシル化Ｆｃドメインが、アミノ酸２９７位において、操作されたまたは非天然のグリカンを含む。特定の例示的実施形態では、操作されたまたは非天然のグリカンが、修飾グリカンである。
特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、Ｎ－グリコシル化されている。
特定の例示的実施形態では、グリコシル化Ｆｃドメインが、治療用分子に結合した修飾グリカンを含む。
特定の例示的実施形態では、第１の重鎖が、一対のシステインを含む。特定の例示的実施形態では、第１および第２の重鎖の各々が、一対のシステインを含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１のＦｃドメインである。特定の例示的実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。
特定の例示的実施形態では、抗体エフェクター分子がＦｃＲｎである。特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて増強されたＦｃＲｎに対する結合親和性を有する。
特定の例示的実施形態では、抗体エフェクター分子がＦｃγＲＩＩＩａである。特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインを含むポリペプチドと比べて増強されたＦｃγＲＩＩＩａに対する結合親和性を有する。
特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて変化した血中半減期を有する。特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて向上した血清半減期を有する。特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて改善したｉｎ ｖｉｖｏ安定性を有する。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸３３２位において置換を含む。特定の例示的実施形態では、アミノ酸３３２位での置換がグルタミン酸（Ｅ）である。特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位、２３９位、または３３０位において１つまたはそれ以上の置換を含む。特定の例示的実施形態では、アミノ酸２３６位での置換がアラニン（Ａ）である。特定の例示的実施形態では、アミノ酸２３９位での置換がアスパラギン酸（Ｄ）である。特定の例示的実施形態では、アミノ酸３３０位での置換がロイシン（Ｌ）である。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３０位においてロイシン（Ｌ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２５６位および／または３０７位において置換を含む。
特定の例示的実施形態では、アミノ酸２５６位での置換がアスパラギン酸（Ｄ）である。特定の例示的実施形態では、アミノ酸３０７位での置換がグルタミン（Ｑ）である。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３０位においてロイシン（Ｌ）、アミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む。
他の態様では、第１の重鎖と第２の重鎖とを含むグリコシル化Ｆｃドメインを含む、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドを提供し、ただし、少なくとも１つの重鎖は、（ｉ）アミノ酸２４２位のロイシン（Ｌ）およびアミノ酸３３４位のリジン（Ｋ）；（ｉｉ）アミノ酸２８７位のアラニン（Ａ）およびアミノ酸３０６位のロイシン（Ｌ）；または（ｉｉｉ）アミノ酸２９２位のアルギニン（Ｒ）およびアミノ酸３０２位のバリン（Ｖ）を置換する一対のシステイン（Ｃ）により仲介される、操作された鎖内ジスルフィド結合を含み；該グリコシル化Ｆｃドメインは、抗体エフェクター分子と相互作用でき、アミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含み；該エフェクター能のあるポリペプチドは、抗体エフェクター分子と相互作用でき、アミノ酸３３２位にグルタミン酸（Ｅ）を含む、操作された鎖内ジスルフィド結合を含まないグリコシル化Ｆｃドメインを有するエフェクター能のあるポリペプチドと比べて増強された熱安定性を有し、アミノ酸位置は、ＥＵナンバリングに従う。
特定の例示的実施形態では、グリコシル化Ｆｃドメインが、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２９７位において天然グリカンを含む。
特定の例示的実施形態では、グリコシル化Ｆｃドメインが、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２９７位において天然グリカンを含む。特定の例示的実施形態では、操作されたまたは非天然のグリカンが、修飾グリカンである。
特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、Ｎ－グリコシル化されている。特定の例示的実施形態では、修飾グリカンが、治療用分子に結合している。
特定の例示的実施形態では、第１の重鎖が、一対のシステインを含む。特定の例示的実施形態では、第１および第２の重鎖の各々が、一対のシステインを含む。
特定の例示的実施形態では、修飾Ｆｃドメインが、ヒトの修飾Ｆｃドメインである。特定の例示的実施形態では、修飾Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１の修飾Ｆｃドメインである。
特定の例示的実施形態では、抗体エフェクター分子がＦｃＲｎである。特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて増強されたＦｃＲｎに対する結合親和性を有する。
特定の例示的実施形態では、抗体エフェクター分子がＦｃγＲＩＩＩａである。特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインを含むポリペプチドと比べて増強されたＦｃγＲＩＩＩａに対する結合親和性を有する。
特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて変化した血清半減期を有する。特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて向上した血清半減期を有する。特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて改善したｉｎ ｖｉｖｏ安定性を有する。
特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドがさらに、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸３３０位においてロイシン（Ｌ）、アミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、および／またはアミノ酸３０位においてグルタミン（Ｑ）を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３０位においてロイシン（Ｌ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む。
特定の例示的実施形態では、１つまたはそれ以上の置換が、操作されたジスルフィド結合と同じ重鎖上にある。
特定の例示的実施形態では、１つまたはそれ以上の置換が、操作されたジスルフィド結合とは異なる重鎖上にある。
特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドがさらに、結合ドメインを含む。特定の例示的実施形態では、結合ドメインが、１つまたはそれ以上の抗原結合ドメインを含む。特定の例示的実施形態では、１つまたはそれ以上の抗原結合ドメインが、腫瘍抗原に特異的に結合する。特定の例示的実施形態では、１つまたはそれ以上の抗原結合ドメインが、免疫細胞上の抗原に特異的に結合する。特定の例示的実施形態では、結合ポリペプチドが、治療用ポリペプチドを含む。特定の例示的実施形態では、治療用ポリペプチドが、受容体、リガンド、または酵素であり得る。
特定の例示的実施形態では、ポリペプチドが抗体である。特定の例示的実施形態では、ポリペプチドがモノクローナル抗体である。特定の例示的実施形態では、抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。特定の例示的実施形態では、抗体が全長抗体である。
特定の例示的実施形態では、ポリペプチドが単一ドメイン抗体である。特定の例示的実施形態では、単一ドメイン抗体がＶＨＨ抗体である。
特定の例示的実施形態では、抗体が多重特異性抗体である。特定の例示的実施形態では、多重特異性抗体が、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＣＯＤＶ－ＩｇのようなＣＯＤＶベースフォーマット、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＭａｂ－Ｆａｂ、およびタンデムＦａｂからなる群から選択されるフォーマットである。ＣＲＯＳＳＯＤＩＬＥＳ（登録商標）ＣＯＤＶプラットフォームに基づく多重特異性抗体は、特に、国際公開第２０１２１３５３４５号、国際公開第２０１６１１６６２６号、国際公開第２０１７１８０９１３号に記載される。ＣＲＯＳＳＯＤＩＬＥＳ（登録商標）は、Ｓａｎｏｆｉ社の登録商標である。特定の例示的実施形態では、多重特異性抗体が、Ｔ細胞エンゲージャーである。特定の例示的実施形態では、多重特異性抗体が、ＮＫ細胞エンゲージャーである。
特定の例示的実施形態では、結合ポリペプチドが、ＦｃドメインのＮ末端および／またはＣ末端に連結している。
特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）により、標的細胞を除去できる。
特定の例示的実施形態では、標的細胞ががん細胞である。
特定の例示的実施形態では、標的細胞が免疫細胞である。
特定の例示的実施形態では、ポリペプチドがＦｃ融合ポリペプチドである。
他の態様では、前記の単離されたエフェクター能のあるポリペプチドをコードする核酸を含む、単離された核酸分子を提供する。
特定の例示的実施形態では、ベクターが、単離された核酸分子を含む。特定の例示的実施形態では、ベクターが発現ベクターである。
他の態様では、ベクターを含む宿主細胞を提供する。
特定の例示的実施形態では、宿主細胞が、真核生物起源または原核生物起源である。特定の例示的実施形態では、宿主細胞が哺乳類起源である。特定の例示的実施形態では、宿主細胞は細菌起源である。
他の態様では、前記の単離されたエフェクター能のあるポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
他の態様では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドの収量を増加させる方法であって、本方法は、第１の重鎖と第２の重鎖とを含むグリコシル化Ｆｃドメインを発現させることを含み、ここで、少なくとも１つの重鎖は、（ｉ）アミノ酸２４２位のロイシン（Ｌ）およびアミノ酸３３４位のリジン（Ｋ）；（ｉｉ）アミノ酸２８７位のアラニン（Ａ）およびアミノ酸３０６位のロイシン（Ｌ）；または（ｉｉｉ）アミノ酸２９２位のアルギニン（Ｒ）およびアミノ酸３０２位のバリン（Ｖ）を置換する一対のシステイン（Ｃ）により仲介される、操作された鎖内ジスルフィド結合を含み；該アミノ酸位置は、ＥＵナンバリングに従い；該グリコシル化Ｆｃドメインは、抗体エフェクター分子と相互作用でき；該エフェクター能のあるポリペプチドは、操作された鎖内ジスルフィド結合を含まない、抗体エフェクター分子と相互作用できるグリコシル化Ｆｃドメインを有するエフェクター能のあるポリペプチドと比べて増強された熱安定性を有し、さらに、本方法は、エフェクター能のあるポリペプチドを精製することを含み、ここで、前記ポリペプチドの収量は、野生型グリコシル化Ｆｃドメインを含むポリペプチドと比べて増加する、方法を提供する。
特定の例示的実施形態では、グリコシル化Ｆｃドメインが、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２９７位において天然グリカンを含む。特定の例示的実施形態では、グリコシル化Ｆｃドメインが、アミノ酸２９７位において、場合により修飾グリカンである、操作されたまたは非天然のグリカンを含む。特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、Ｎ－グリコシル化されている。特定の例示的実施形態では、修飾グリカンが、治療用分子に結合し得る。
特定の例示的実施形態では、第１の重鎖が、一対のシステインを含む。
特定の例示的実施形態では、第１および第２の重鎖の各々が、一対のシステインを含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインが、ヒトのＦｃドメインである。特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１のＦｃドメインである。
特定の例示的実施形態では、抗体エフェクター分子がＦｃＲｎである。特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて増強されたＦｃＲｎに対する結合親和性を有する。
特定の例示的実施形態では、抗体エフェクター分子がＦｃγＲＩＩＩａである。特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインを含むポリペプチドと比べて増強されたＦｃγＲＩＩＩａに対する結合親和性を有する。
特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて変化した血清半減期を有する。特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて向上した血清半減期を有する。
特定の例示的実施形態では、単離されたポリペプチドがさらに、１つまたはそれ以上の、エフェクター機能を増強するアミノ酸置換、場合により、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸３３２位における置換を含む。特定の例示的実施形態では、アミノ酸３３２位での置換がグルタミン酸（Ｅ）である。特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位、２３９位、または３３０位において１つまたはそれ以上の置換を含む。特定の例示的実施形態では、アミノ酸２３６位での置換がアラニン（Ａ）である。特定の例示的実施形態では、アミノ酸２３９位での置換がアスパラギン酸（Ｄ）である。特定の例示的実施形態では、アミノ酸３３０位での置換がロイシン（Ｌ）である。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３０位においてロイシン（Ｌ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む。
特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２５６位および／または３０７位において置換を含む。特定の例示的実施形態では、アミノ酸２５６位での置換がアスパラギン酸（Ｄ）である。特定の例示的実施形態では、アミノ酸３０７位での置換がグルタミン（Ｑ）である。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３０位においてロイシン（Ｌ）、アミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む。特定の例示的実施形態では、１つまたはそれ以上の置換が、操作されたジスルフィド結合と同じ重鎖上にある。特定の例示的実施形態では、１つまたはそれ以上の置換が、操作されたジスルフィド結合とは異なる重鎖上にある。
特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドがさらに、結合ポリペプチドを含む。特定の例示的実施形態では、結合ポリペプチドが、１つまたはそれ以上の抗原結合ドメインを含む。特定の例示的実施形態では、１つまたはそれ以上の抗原結合ドメインが、腫瘍抗原に特異的に結合する。特定の例示的実施形態では、１つまたはそれ以上の抗原結合ドメインが、免疫細胞上の抗原に特異的に結合する。
特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが抗体である。特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、モノクローナル抗体である。特定の例示的実施形態では、抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。特定の例示的実施形態では、抗体が全長抗体である。
特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、単一ドメイン抗体である。特定の例示的実施形態では、単一ドメイン抗体がＶＨＨ抗体である。特定の例示的実施形態では、抗体が多重特異性抗体である。特定の例示的実施形態では、多重特異性抗体が、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＣＯＤＶ－ＩｇのようなＣＯＤＶベースフォーマット、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＭａｂ－Ｆｂ、およびタンデムＦａｂからなる群から選択されるフォーマットである。特定の例示的実施形態では、多重特異性抗体が、Ｔ細胞エンゲージャーである。特定の例示的実施形態では、多重特異性抗体が、ＮＫ細胞エンゲージャーである。
特定の例示的実施形態では、結合ポリペプチドが、治療用ポリペプチドを含む。特定の例示的実施形態では、治療用ポリペプチドが、受容体、リガンド、または酵素であり得る。
特定の例示的実施形態では、結合ポリペプチドが、ＦｃドメインのＮ末端および／またはＣ末端に連結している。
特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）により、標的細胞を除去できる。特定の例示的実施形態では、標的細胞ががん細胞である。特定の例示的実施形態では、標的細胞が免疫細胞である。
特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドがＦｃ融合ポリペプチドである。
他の態様では、前記の、エフェクター能のあるポリペプチドの有効量を対象に投与することを含む、処置を必要とする対象において疾患または障害を処置する方法を提供する。
特定の例示的実施形態では、疾患または障害ががんである。特定の例示的実施形態では、疾患または障害が炎症性疾患である。特定の例示的実施形態では、疾患または障害が自己免疫疾患である。
本発明の前記および他の特徴および利点は、添付図面と合わせた例示的実施形態の以下の詳細な説明から、より十分に理解される。
３００Ｋおよび３７０Ｋでの疎水性接触頻度の平均を示す。図１Ａは、アミノ酸３３２位におけるグルタミン酸（Ｅ）の疎水性接触の平均頻度を示す。図１Ｂは、３００Ｋでのアルファ炭素の根平均二乗揺らぎ（オングストローム）を示す。 ３００Ｋおよび３７０Ｋでの疎水性接触頻度の平均を示す。図１Ａは、アミノ酸３３２位におけるグルタミン酸（Ｅ）の疎水性接触の平均頻度を示す。図１Ｂは、３００Ｋでのアルファ炭素の根平均二乗揺らぎ（オングストローム）を示す。 Ｉ３３２Ｅ（緑色ＣＰＫレンダリング）、および構造的に近接する、Ｌ２４２Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ操作されたジスルフィド結合（オレンジ色ＣＰＫレンダリング）による、Ｆｃ ＣＨ２ドメイン上のＤＳＢグラフティングの一例（線－リボン）を示す。 非共有結合ネットワークの一例を、Ｉ３３２（左パネル、疎水性接触を点線で強調）およびＩ３３２Ｅ（右パネル、静電接触（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｃｏｎｔａｃｔ）を点線で強調）に関して示す。 ＤＳＢ変異用に選ばれた位置の一例を示す。左パネルのＬ２４２＋Ｋ３３４（円内の棒）。右パネルのＲ２９２およびＶ３０２（円内の棒）。 陰性対照として選ばれたＡ２８７およびＬ３０６（下方の黄色棒）の位置を示す。この２つの残基はＦｃＲｎ結合表面に近接し、ＩｇＧのＣＨ２ドメインの境界にあり、２つの先行するＤＳＢスキームよりも予測される構造的な衝撃は低い。 ｍＡｂ１ ＡＤＬＥおよびＤＳＢ変異体によるジスルフィド結合の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）ペプチド定量プロファイルを示す。ＡＤＬＥでは、デッドボリューム中に溶出した２１８ＬＣ－２２３ＨＣを除き、８つのジスルフィド結合が検出された。ＡＤＬＥ＿ＤＱ＿Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃでは、デッドボリューム中に溶出した２１８ＬＣ－２２３ＨＣを除き、９つのジスルフィド結合が検出された。ＡＤＬＥ＿ＤＱ＿Ｌ２４２Ｃ＿Ｋ３３４Ｃでは、デッドボリューム中に溶出した２１８ＬＣ－２２３ＨＣを除き、８つのジスルフィド結合が、１つの共通ペプチド（変異およびヒンジに対して同じ）と共に検出された。 図６－１の続き。 図６－２の続き。 ｍＡｂ１ ＤＥおよびＤＳＢ変異体（図７Ａ）ならびにｍＡｂ１ ＡＤＥおよびＤＳＢ変異体（図７Ｂ）によるジスルフィド結合のＸＩＣペプチド定量プロファイルを示す。ＤＥでは、デッドボリューム中に溶出した２１８ＬＣ－２２３ＨＣを除き、８つのジスルフィド結合が検出された。ＤＥ＿ＤＱ＿Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃでは、デッドボリューム中に溶出した２１８ＬＣ－２２３ＨＣを除き、９つのジスルフィド結合が検出された。ＤＥ＿ＤＱ＿Ｌ２４２Ｃ＿Ｋ３３４Ｃでは、デッドボリューム中に溶出した２１８ＬＣ－２２３ＨＣを除き、９つのジスルフィド結合が、１つの共通ペプチド（変異およびヒンジに対して同じ）と共に検出された。 図７Ａ－１の続き。 図７Ａ－２の続き。 ｍＡｂ１ ＤＥおよびＤＳＢ変異体（図７Ａ）ならびにｍＡｂ１ ＡＤＥおよびＤＳＢ変異体（図７Ｂ）によるジスルフィド結合のＸＩＣペプチド定量プロファイルを示す。ＤＥでは、デッドボリューム中に溶出した２１８ＬＣ－２２３ＨＣを除き、８つのジスルフィド結合が検出された。ＤＥ＿ＤＱ＿Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃでは、デッドボリューム中に溶出した２１８ＬＣ－２２３ＨＣを除き、９つのジスルフィド結合が検出された。ＤＥ＿ＤＱ＿Ｌ２４２Ｃ＿Ｋ３３４Ｃでは、デッドボリューム中に溶出した２１８ＬＣ－２２３ＨＣを除き、９つのジスルフィド結合が、１つの共通ペプチド（変異およびヒンジに対して同じ）と共に検出された。 図７Ｂ－１の続き。 図７Ｂ－２の続き。 ナノ示差走査蛍光定量法（ナノＤＳＦ）により決定した、ｍＡｂ１ ＡＤＬＥバリアントに関するジスルフィド安定化の熱安定性効果を示す。 ナノＤＳＦにより決定した、ｍＡｂ１ ＤＥバリアント（図９Ａ）およびＡＤＥバリアント（図９Ｂ）に関するジスルフィド安定化の熱安定性効果を示す。 ナノＤＳＦにより決定した、ｍＡｂ１ ＤＥバリアント（図９Ａ）およびＡＤＥバリアント（図９Ｂ）に関するジスルフィド安定化の熱安定性効果を示す。 ナノ示差走査蛍光定量法（ナノＤＳＦ）により決定した、ｍＡｂ３ならびにｍＡｂ４のＤＥ、ＡＤＥ、ＤＥ＋ＤＳＢ（Ｒ２９２Ｃ－Ｖ３０２Ｃ）、およびＡＤＥ＋ＤＳＢ（Ｒ２９２Ｃ－Ｖ３０２Ｃ）バリアントに関するジスルフィド安定化の熱安定性効果を示す。左パネルはｍＡｂ３バリアントを示し、右パネルはｍＡｂ４バリアントを示し、カラーコードは以下のとおり：ＤＥ（緑色）、ＡＤＥ（赤色）、ＤＥ＋ＤＳＢ（紫色）、ＡＤＥ ＤＳＢ（青色）、ＷＴ（黒色）。 図１０－１の続き。 ＡＤＬＥバリアント、ＤＥバリアント、およびＡＤＥバリアントのＣＤＣ活性を、ｍＡｂ１＋／－ＡＤＬＥ、ＤＥ、またはＡＤＥ＋／－ＤＳＢ（Ｌ２４２Ｃ＿Ｋ３３４ＣもしくはＲ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃ）に関して、ＩｇＧ１野生型と比べて示す。 図１１－１の続き。 ＡＤＬＥバリアント、ＤＥバリアント、およびＡＤＥバリアントのＣＤＣ活性を、ｍＡｂ１＋／－ＡＤＬＥ、ＤＥ、またはＡＤＥ－／＋ＤＱ＋／－Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃに関して、ＩｇＧ１野生型と比べて示す。 図１２－１の続き。 ＡＤＬＥバリアント、ＤＥバリアント、およびＡＤＥバリアントのＣＤＣ活性を、ｍＡｂ１＋ＡＤＬＥ、ＤＥ、またはＡＤＥ－／＋ＤＱ＋／－Ｌ２４２Ｃ＿Ｋ３３４Ｃに関して、ＩｇＧ１野生型と比べて示す。 図１３－１の続き。 ＡＤＬＥバリアント、ＤＥバリアント、およびＡＤＥバリアントのＡＤＣＣ活性を、ｍＡｂ１＋／－ＡＤＬＥ、ＤＥ、またはＡＤＥ＋／－Ｌ２４２Ｃ＿Ｋ３３４ＣもしくはＲ２９４Ｃ＿Ｖ３０４Ｃに関して、ＩｇＧ１野生型と比べて示す。 図１４－１の続き。 ＡＤＬＥバリアント、ＤＥバリアント、およびＡＤＥバリアントのＡＤＣＣ活性を、ｍＡｂ１＋／－ＡＤＬＥ、ＤＥ、またはＡＤＥ－／＋ＤＱ＋／－Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃに関して、ＩｇＧ１野生型と比べて示す。 図１５－１の続き。 ＡＤＬＥバリアント、ＤＥバリアント、およびＡＤＥバリアントのＡＤＣＣ活性を、ｍＡｂ１＋／－ＡＤＬＥ、ＤＥ、またはＡＤＥ－／＋ＤＱ＋／－ＤＳＢ Ｌ２４２Ｃ＿Ｋ３３４Ｃに関して、ＩｇＧ１野生型と比べ示す。 図１６－１の続き。 Ｒ２９２Ｃ－Ｖ３０２Ｃ ＤＳＢ置換の有無での、ＡＤＥバリアントおよびＤＥバリアントの細胞毒性活性を示す。ｙ軸が特異的溶解率であり、ｘ軸がｎＭで示すｍＡｂ３濃度である。 Ｔｇ３２マウスにおけるｍＡｂ１抗体の平均ＰＫプロファイルを示す（対数スケール）。 図１８－１の続き。 図１８－２の続き。 Ｔｇ３２マウスにおけるさらなるｍＡｂ１抗体の平均ＰＫプロファイルを示す（対数スケール）。 図１９－１の続き。 図１９－２の続き。 Ｔｇ３２マウスにおけるｍＡｂ３抗体の平均ＰＫプロファイルを示す（対数スケール）。
本開示は、改善された熱安定性を有する新規Ｆｃドメインバリアント（例えば、Ｆｃドメインバリアントを含む新規結合ポリペプチド）を提供する。本開示はさらに、Ｆｃ受容体に対する改善された結合を有する新規Ｆｃドメインバリアント（例えば、Ｆｃドメインバリアントを含む新規結合ポリペプチド）を提供する。本開示はさらに、野生型（例えば、非修飾）Ｆｃドメインと比べて、抗体エフェクター分子との相互作用を増強させるグリコシル化Ｆｃドメインを含む新規Ｆｃドメインバリアント（例えば、Ｆｃドメインバリアントを含む結合ポリペプチド）を提供する。本開示はさらに、Ｆｃドメインバリアント（例えば、Ｆｃドメインバリアントを含む新規結合ポリペプチド）をコードする核酸、Ｆｃドメインバリアント（例えば、Ｆｃドメインバリアントを含む新規結合ポリペプチド）を生成する組換え発現ベクターおよび宿主細胞、ならびに単離されたＦｃドメインバリアント（例えば、Ｆｃドメインバリアントを含む新規結合ポリペプチド）を含む医薬組成物を提供する。１つまたはそれ以上の疾患または障害を処置するために、本開示のＦｃドメインバリアント（例えば、Ｆｃドメインバリアントを含む新規結合ポリペプチド）を使用する方法が、さらに提供される。
本開示に記載される方法は、本明細書に開示される特定の方法および実験条件に限定されず、それ自体、方法および条件は変わり得ると理解されるものである。同じく、本明細書で使用する術語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、限定することは意図しないと理解されるべきである。
さらに、本明細書に記載される実験は、異なる指定がない限り、当該分野の技術範囲内にある従来の分子細胞生物学的および免疫学的な技術を使用する。そのような技術は、熟練作業者には周知であり、文献中で十分に説明されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．（１９８７～２００８年）（すべての補遺を含む）、ＭＲ ＧｒｅｅｎおよびＪ． ＳａｍｂｒｏｏｋによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第４版）、ならびにＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第１４章、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（２０１３年、第２版）を参照。
異なる定義がない限り、本明細書で使用する科学用語および技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有する。万一の潜在的な多義性の場合、本明細書で提供する定義が、辞書の定義または外的定義に優先する。文脈上他の解釈が要求される場合を除き、単数表現は複数を含み、複数表現は単数を含むものとする。「または（ｏｒ）」の使用は、異なる指定がない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」のような他の形の使用は、限定的ではない。
一般的に、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションとの関連で使用する専門用語は、周知であり、当該分野では一般的に使用される。本明細書で提供される方法および技術は、異なる指定がない限り、当該分野で周知の従来の方法に従って、本明細書を通じて引用および考察される様々な一般的参考文献およびより具体的な参考文献に記載されるように一般的に行われる。酵素反応および精製技術は、メーカ仕様書に従って、当該分野で一般的に実現されるように、または本明細書に記載されるように行う。本明細書に記載される、分析化学、合成有機化学、および創薬化学（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）との関連で使用する専門用語、ならびに検査方法ならびに実験技術は、周知のものであり、当該分野では一般的に使用される。化学合成、化学分析、医薬調製、調合、および送達、ならびに患者の処置には、標準的技術を使用する。
本開示がより容易に理解されるよう、選択用語を以下で定義する。
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のいずれかの高分子鎖に関し、文脈により矛盾しない限り、天然タンパク質または人工タンパク質、ポリペプチド類似体、またはタンパク質配列のバリアント、またはそれらの断片を含む。ポリペプチドは、単量体または重合体であり得る。ポリペプチド断片は、例えば、少なくとも約５個の連続アミノ酸、少なくとも約１０個の連続アミノ酸、少なくとも約１５個の連続アミノ酸、または少なくとも約２０個の連続アミノ酸を含む。
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、その起源または派生元により、その天然状態では付随する天然関連成分を伴わない；同じ種に由来する他のタンパク質を実質的に含まない；異なる種に由来する細胞によって発現される；または自然界に存在しないタンパク質またはポリペプチドに関する。したがって、化学合成されるか、または天然での由来元である細胞とは異なる細胞系で合成されるタンパク質またはポリペプチドは、その天然関連成分から「単離状態」である。タンパク質またはポリペプチドは同じく、当該分野で周知のタンパク質精製技術を使用した単離により、天然関連成分を実質的に含まなくさせ得る。
本明細書で使用する用語「結合タンパク質」または「結合ポリペプチド」は、目的の標的抗原（例えば、ヒト標的抗原）に対する選択的な結合を担う少なくとも１つの結合部位を含有するタンパク質またはポリペプチド（例えば、抗体またはイムノアドヘシン）に関するものとする。例示的結合部位は、抗体可変ドメイン、受容体のリガンド結合部位、またはリガンドの受容体結合部位を含む。特定の態様では、結合タンパク質または結合ポリペプチドが、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の結合部位を含む。特定の態様では、結合タンパク質または結合ポリペプチドが、治療用酵素である。
用語「リガンド」は、他の物質に結合できるか、または結合されるいずれかの物質に関する。同様に、用語「抗原」は、それに対して抗体が生成されるいずれかの物質に関する。「抗原」は一般的に、抗体結合物質に関して使用され、「リガンド」は、受容体結合物質に関する場合に頻繁に使用されるものの、これらの用語は、両者を区別せず、広範囲の重複する化学実体を含む。誤解を避けるために、抗原およびリガンドは、本明細書を通じて交換可能に使用する。抗原／リガンドは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アプタマー、多糖、糖分子、炭水化物、脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成分子、無機分子、有機分子、およびそれらの任意の組合せであり得る。
結合タンパク質の解離定数（ＫＤ）は、例えば、表面プラズモン共鳴により決定できる。一般的に、表面プラズモン共鳴分析は、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ社；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、リガンド（バイオセンサマトリクス上の標的抗原）と分析物（溶液中の結合タンパク質）との間のリアルタイム結合相互作用を測定する。表面プラズモン分析はさらに、分析物（バイオセンサマトリクス上の結合タンパク質）の固定化およびリガンド（標的抗原）の提示により行える。本明細書で使用する用語「ＫＤ」は、特定の結合タンパク質と標的抗原との間の相互作用の解離定数に関する。
本明細書で使用する用語「特異的に結合する」は、抗体またはイムノアドへシンが、最高で約１×１０－６Ｍ、約１×１０－７Ｍ、約１×１０－８Ｍ、約１×１０－９Ｍ、約１×１０－１０Ｍ、約１×１０－１１Ｍ、約１×１０－１２Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で標的（例えば、抗原）に結合する能力、および／または非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍高い親和性で抗原に結合する能力に関する。抗体の特異的結合は、ＣＤＲ配列を介して、標的抗原に対し得る。抗体はさらに、Ｆｃ領域を介して、ＦｃＲｎまたはＦｃγＲＩＩＩａのようなＦｃＲに特異的に結合できる。
本明細書で使用する用語「抗体」は、目的の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に対する公知の著しい特異的免疫反応活性を有するようなアセンブリ（例えば、インタクト抗体分子、イムノアドへシン、またはそれらのバリアント）に関する。抗体および免疫グロブリンは、軽鎖および重鎖を含み、それらの間に鎖間共有結合を含む、または含まない。脊椎動物系での基本免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。
下記でより詳細に考察するように、総称「抗体」は、生化学的に区別できる、５つの異なるクラスの抗体を含む。５クラスすべての抗体が、明らかに本開示の範囲内である一方、以下の考察は、一般的に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスを対象とする。ＩｇＧに関して、免疫グロブリンは、分子量およそ２３，０００ダルトンの２つの同一軽鎖、および分子量５３，０００～７０，０００の２つの同一重鎖を含む。４つの鎖は、ジスルフィド結合により「Ｙ」形状に結合されており、軽鎖が、重鎖を、「Ｙ」の口状部を起点として可変領域を通し継続して取り囲む。
免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ（κ）またはラムダ（λ）のいずれか一方に分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダの軽鎖のいずれか一方に結合し得る。一般的に、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかにより生成される場合、軽鎖と重鎖とは互いに共有結合されており、２つの重鎖の「尾」部分は、共有ジスルフィド結合または非共有結合により、互いに結合している。重鎖では、アミノ酸配列が、Ｙ形状のフォーク端のＮ末端から各鎖の底部のＣ末端へと及ぶ。当業者は、重鎖が、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、またはエプシロン（ε）として分類され、それらの中にいくつかのサブクラス（例えば、γｌ～γ４）を含むことを理解する。この鎖の性質が、抗体の「クラス」を、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥと決定する。免疫グロブリンアイソタイプサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等）は、よく特徴づけられており、機能特化を与えることが公知である。これらのクラスおよびアイソタイプの各々の修飾型は、本開示を考慮して当業者は容易に認識でき、したがって、本開示の範囲内である。
軽鎖および重鎖の両方とも、構造的および機能的相同性の領域に分割される。用語「領域」は、免疫グロブリンまたは抗体鎖の一部または部分に関し、定常領域または可変領域、ならびに前記領域のより個別的な一部または部分を含む。例えば、軽鎖可変領域は、本明細書に定義されるように、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」の間に散在する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」を含む。
免疫グロブリン重鎖または軽鎖の領域は、「定常」（Ｃ）領域または「可変」（Ｖ）領域と定義され、「定常領域」の場合は、様々なクラスメンバーの領域内での配列の変動の相対的欠如に基づき、「可変領域」の場合は、様々なクラスメンバーの領域内での著しい変動に基づく。用語「定常領域」および「可変領域」は、機能的にも使用できる。これに関して、免疫グロブリンまたは抗体の可変領域は、抗原の認識および特異性を決定すると理解される。逆に、免疫グロブリンまたは抗体の定常領域は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合等などの重要なエフェクター機能、を与える。様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元コンフィギュレーションは周知である。
免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常および可変領域は、ドメインへと折り畳まれている。用語「ドメイン」は、例えば、βひだ折れシートおよび／または鎖内ジスルフィド結合により安定化されたペプチドループを含む（例えば、３～４つのペプチドループを含む）、重鎖または軽鎖の球状領域に関する。免疫グロブリンの軽鎖上の定常領域ドメインは、交換可能に「軽鎖定常領域ドメイン」、「ＣＬ領域」、または「ＣＬドメイン」と呼ばれる。重鎖上の定常領域（例えば、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメイン）は、交換可能に「重鎖定常領域ドメイン」、「ＣＨ領域ドメイン」、または「ＣＨドメイン」と呼ばれる。軽鎖上の可変ドメインは、交換可能に「軽鎖可変領域ドメイン」、「ＶＬ領域ドメイン」、または「ＶＬドメイン」と呼ばれる。重鎖上の可変ドメインは、交換可能に「重鎖可変領域ドメイン」、「ＶＨ領域ドメイン」、または「ＶＨドメイン」と呼ばれる。
慣例では、可変定常領域ドメインのアミノ酸のナンバリングは、免疫グロブリンまたは抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるほど増加する。各免疫グロブリン重鎖および軽鎖のＮ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である。ＣＨ３およびＣＬドメインは、それぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。したがって、軽鎖免疫グロブリンのドメインは、ＶＬ－ＣＬ配向で配置されており、重鎖のドメインは、ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３配向で配置されている。
各可変領域ドメインに対するアミノ酸の割当ては、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９８７年および１９９１年）の定義に従う。Ｋａｂａｔはさらに、異なる重鎖可変領域間または異なる軽鎖可変領域間での対応する残基に同じ番号を割り当てる、広く使用されているナンバリング慣習（Ｋａｂａｔナンバリング）を提供する。ＶＬドメインのＣＤＲ１、２、および３は同じく、本明細書では、それぞれ、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３と呼ばれる。ＶＨドメインのＣＤＲ１、２、および３は同じく、本明細書では、それぞれ、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３と呼ばれる。そのように承知する場合、ＣＤＲの割当ては、Ｋａｂａｔの代わりに、ＩＭＧＴ（登録商標）（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ＆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２７：５５～７７頁；２００３年）に従い得る。重鎖定常領域のナンバリングは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９８７年および１９９１年）に記載されるようにＥＵインデックスを介する。
本明細書で使用する用語「ＶＨドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、用語「ＶＬドメイン」は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ末端可変ドメインを含む。
本明細書で使用する用語「ＣＨ１ドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでの約１１４～２２３位（ＥＵ位の１１８～２１５位）に及ぶ、免疫グロブリン重鎖の最初の（アミノ最末端）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに、および免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端に隣接し、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の一部を形成しない。
本明細書で使用する用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合する、重鎖分子の部分を含む。ヒンジ領域は、およそ２５残基を含み、柔軟性であるため、２つのＮ末端抗原結合領域を独立に動かせる。ヒンジ領域は、３つの別個のドメイン：上部、中央、下部ヒンジドメインに細分できる（Ｒｏｕｘら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８年、１６１ ：４０８３）。
本明細書で使用する用語「ＣＨ２ドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでの約２４４～３６０位（ＥＵ位の２３１～３４０位）に及ぶ、重鎖免疫グロブリン分子の部分を含む。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接に対になっていないという点で独特である。むしろ、２つのＮ－結合型分岐炭水化物鎖が、インタクト天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に挟まれている。一実施形態では、本開示の結合ポリペプチドが、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ２ドメインを含む。
本明細書で使用する用語「ＣＨ３ドメイン」は、ＣＨ２ドメインのＮ末端からおよそ１１０残基、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステムでの約３６１～４７６位（ＥＵ位の３４１～４４５位）に及ぶ、重鎖免疫グロブリン分子の部分を含む。ＣＨ３ドメインは、典型的に、抗体のＣ末端を形成する。しかしながら、一部の免疫グロブリンでは、さらなるドメインが、ＣＨ３ドメインから延びて、分子のＣ末端部分を形成する（例えば、ＩｇＭのμ鎖およびＩｇＥのｅ鎖におけるＣＨ４ドメイン）。一実施形態では、本開示の結合ポリペプチドが、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ３ドメインを含む。
本明細書で使用する用語「ＣＬドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔの約１０７Ａ位からＫａｂａｔの約２１６位に及ぶ、免疫グロブリン軽鎖の定常領域ドメインを含む。ＣＬドメインは、ＶＬドメインに隣接する。一実施形態では、本開示の結合ポリペプチドが、カッパ軽鎖（例えば、ヒトカッパ軽鎖）に由来するＣＬドメインを含む。
抗体の可変領域は、抗体が、抗原上のエピトープを選択的に認識して特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインは合体して、三次元抗原結合部位を定義する可変領域（Ｆｖ）を形成する。この抗体四次構造が、「Ｙ」形状の各アームの末端に提示される抗原結合部位を形成する。特に、抗原結合部位は、各々の重鎖および軽鎖可変領域上にある３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により定義される。本明細書で使用する用語「抗原結合部位」は、抗原（例えば、細胞表面または可溶性抗原）に特異的に結合する部位を含む。抗原結合部位は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域を含み、それらの可変領域により形成される結合部位が、抗体の特異性を決定する。抗原結合部位は、抗体ごとに異なる可変領域により形成される。本開示の変化した抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を含む。
特定の実施形態では、本開示の結合ポリペプチドが、選択された抗原と結合ポリペプチドの会合を実現する、少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む。その抗原結合ドメインは、同じ免疫グロブリン分子に由来する必要はない。これに関して、可変領域は、体液性応答の準備および所望の抗原に対する免疫グロブリンの生成が誘導可能である任意の種類の動物に由来し得る、あるいは、由来する。そういうものとして、結合ポリペプチドの可変領域は、例えば、哺乳類起源、例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル、マカク等）、オオカミ、またはラクダ類（例えば、ラクダ、ラマ、および近縁種）であり得る。
抗体は、水性環境中でその三次元コンフィギュレーションをとることから、天然型抗体中では、各単量体抗体上に存在する６つのＣＤＲは、抗原結合部位を形成するために特異的に配置された、アミノ酸の短い非連続配列である。重鎖および軽鎖可変領域の残部は、アミノ酸配列における低い分子間多様性を示し、フレームワーク領域と呼ばれる。フレームワーク領域は、主としてβシート立体配座を採用し、ＣＤＲは、βシート構造を連結する、およびいくつかの場合はβシート構造の一部を形成する、ループを形成する。したがって、それらのフレームワーク領域は、鎖間非共有相互作用により、６つのＣＤＲの正しい配向での配置を実現する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲにより形成される抗原結合ドメインが、免疫反応抗原上のエピトープに対して相補的である表面を定義する。この相補的表面が、免疫反応抗原エピトープに対する、抗体の非共有結合を促進する。
例示的結合ポリペプチドは、抗体バリアントを含む。本明細書で使用する用語「抗体バリアント」は、天然起源でないように変化している、合成型および操作型の抗体、例えば、少なくとも２つの重鎖部分を含むものの、２つの完全な重鎖は含まない抗体（例えばドメインを欠く抗体またはミニボディ）；２つもしくはそれ以上の異なる抗原、または単一抗原上の異なるエピトープに結合するように変化させた多重特異性型の抗体（例えば、二重特異性、三重特異性等）；ｓｃＦｖ分子に結合した重鎖分子等を含む。さらに、用語「抗体バリアント」は、多価型の抗体（例えば、三価、四価等、同じ抗原の３つ、４つ、またはそれ以上のコピーに結合する抗体）を含む。
本明細書で使用する用語「結合価」は、ポリペプチド中にある潜在的な標的結合部位の数に関する。各標的結合部位は、１つの標的分子、または標的分子上の特異的部位に特異的に結合する。ポリペプチドが、２つ以上の標的結合部位を含む場合、各標的結合部位は、同じまたは異なる分子に特異的に結合し得る（例えば、異なるリガンドまたは異なる抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープに結合し得る）。対象結合ポリペプチドは、典型的に、ヒト抗原分子に対して特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。例えば、典型的ＩｇＧ１モノクローナル抗体は、１つの標的抗原に対して特異的である。二価抗体は、２つの異なる抗原を標的とする抗原結合ドメイン、または１つの抗原を標的とする２つの抗原結合ドメインを含む抗体である。同様に、三価抗体は、単一抗体に対する３つの標的化ドメインを含む単一特異性抗体であり得る。三価抗体は、２つの結合ドメインにより第１の抗原に結合し、他の結合ドメインにより第２の抗原に結合する場合、二重特異性であり得る。三価抗体は、三重特異性であり得て、３つの異なる標的に結合し得る。
用語「特異性」は、所定の標的抗原（例えば、ヒト標的抗原）と特異的に結合する（例えば、免疫反応する）能力に関する。結合ポリペプチドは、単一特異性であり得て、１つの標的に特異的に結合する１つもしくはそれ以上の結合部位を含有し得るか、またはポリペプチドは、多重特異性であり得て、同じもしくは異なる標的に特異的に結合する２つもしくはそれ以上の結合部位を含有し得る。特定の実施形態では、結合ポリペプチドが、同じ標的の２つの異なる（例えば、非重複）部分に対して特異的である。特定の実施形態では、結合ポリペプチドが、２つ以上の標的に対して特異的である。腫瘍細胞上で発現する抗原に結合する抗原結合部位を含む例示的結合ポリペプチド（例えば、抗体）が当該分野で公知であり、そのような抗体に由来する１つまたはそれ以上のＣＤＲが、本明細書に記載される抗体に含まれる。
本明細書で使用する用語「抗原」または「標的抗原」は、結合ポリペプチドの結合部位が結合できる、分子または分子の部分に関する。標的抗原は、１つまたはそれ以上のエピトープを有し得る。
用語「約」または「およそ」は、所定の値または範囲の約２０％以内、例えば、約１０％以内、約５％以内、または約１％以下以内を意味する。
本明細書で使用する「投与する」または「投与」は、体外に存在する物質（例えば、本明細書で提供される、単離された結合ポリペプチド）を、患者に注入する、または他のやり方で物理的に送達する行為に関し、例えば、肺（例えば、吸入）、粘膜（例えば、鼻腔内）、皮内、静脈内、筋肉内送達、および／または本明細書に記載されるまたは当該分野で公知の任意の他の物理的送達の方法によるが、それらに限定されない。疾患またはその症状を管理または処置する場合、物質の投与は、典型的に、疾患またはその症状の発現後に行われる。疾患またはその症状を予防する場合、物質の投与は、典型的に、疾患またはその症状の発現前に行われ、疾患関連症状の出現または規模を延期するまたは低下させるために、慢性的に継続し得る。
本明細書で使用する用語「組成物」は、指定成分（例えば、本明細書で提供される、単離された結合ポリペプチド）を、場合により、指定量で含有する製品、ならびに指定成分の、場合により、指定量での組合せから直接的または間接的に生じる任意の製品を含むと意図される。
「有効量」は、薬剤を必要とする個体における所望の生理的帰結をもたらすために十分な、活性薬剤（例えば、本開示の単離された結合ポリペプチド）の量を意味する。有効量は、処置されるべき個体の健康状態および体調、処置されるべき個体の分類群、組成物の調合、個体の医学的状態の評価、および他の関連因子に応じて、個体間で変わり得る。
本明細書で使用する用語「対象」および「患者」は、交換可能に使用される。本明細書で使用する対象は、哺乳類、例えば、非霊長類（例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等）、または霊長類（例えば、サルおよびヒト）であり得る。特定の実施形態では、本明細書で使用する用語「対象」が、哺乳類などの脊椎動物に関する。哺乳類は、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、野生動物、野生化した動物、家畜、スポーツ動物、ペットを含む。
本明細書で使用する用語「療法」は、疾患またはそれに関連する症状の予防、管理、処置、および／または改善において使用できる任意のプロトコル、方法、および／または薬剤に関する。いくつかの実施形態では、用語「療法」は、対象における感染またはそれに関連する症状に対する免疫応答の調節において使用できる任意のプロトコル、方法、および／または薬剤に関する。いくつかの実施形態では、用語「療法」は、生物学的療法、支持療法、ならびに／または、医療関係者などの当業者には公知の、疾患またはそれに関連する症状の予防、管理、処置、および／もしくは改善において有用である他の療法に関する。他の実施形態では、用語「療法」は、生物学的療法、支持療法、ならびに／または、医療関係者などの当業者には公知の、対象における感染またはそれに関連する症状に対する免疫応答の調節において有用である他の療法に関する。
本明細書で使用する用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、１つまたはそれ以上の療法の適用（１つもしくはそれ以上の、本明細書で提供される、単離された結合ポリペプチドなどの予防剤または治療剤の投与を含むがそれらに限定されない）がもたらす、疾患またはそれに関連する症状の進行、重症度、および／または持続期間の短縮または改善に関する。本明細書で使用する用語「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」はさらに、処置される対象の疾患経過の変化に関し得る。処置の治療効果は、限定されないが、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の軽減、疾患の進行速度の低下、病態の改善または緩和、および寛解または予後の改善を含む。
Ｆｃドメイン
本開示の特定の態様では、Ｆｃドメイン、例えば、Ｆｃドメインバリアントが提供される。本明細書で使用する用語「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域（すなわち、重鎖定常領域の第１残基が１１４であると見なすと、ＩｇＧの２１６残基）で始まり抗体のＣ末端で終わる、重鎖定常領域の部分に関する。したがって、完全なＦｃ領域は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。
抗体のＦｃ領域は、非抗原結合に関与し、Ｆｃ受容体への結合によりエフェクター機能を仲介できる。いくつかの異なる種類のＦｃ受容体が存在し、それらの受容体が認識する抗体の種類に基づいて分類される。例えば、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、ＩｇＧクラス抗体に結合し、Ｆｃアルファ受容体（ＦｃαＲ）はＩｇＡクラス抗体に結合し、Ｆｃエプシロン受容体（ＦｃεＲ）は、ＩｇＥクラス抗体に結合する。胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体のＦｃ領域と相互作用して、正常のリソソーム分解からの救助を介して抗体のリサイクルを促進する。ＦｃγＲは、いくつかのメンバー、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂを含むファミリーに属する。
本明細書で使用する用語「天然Ｆｃ」または「野生型Ｆｃ」は、単量体型であろうと多量体型であろうと、抗体の分解から生じるか、または他の手段により産生される非抗原結合断片の配列に対応する分子に関し、ヒンジ領域を含有し得る。天然Ｆｃの免疫グロブリン提供源は、典型的にヒト起源であり、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２などの免疫グロブリンのいずれかであり得る。天然Ｆｃ分子は、共有結合性会合（すなわちジスルフィド結合）および非共有結合性会合により、二量体型または多量体型へと連結される単量体ポリペプチドからなる。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、およびＩｇＧＡ２）に応じて、１～４つに及ぶ。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン分解から生じる、ジスルフィド結合された二量体である。本明細書で使用する用語「天然Ｆｃ」は、単量体型、二量体型、および多量体型に対する総称である。
本明細書で使用する用語「Ｆｃドメインバリアント」、「Ｆｃバリアント」または「修飾Ｆｃ」は、天然／野生型Ｆｃから修飾されたものの、ＦｃＲに対する結合部位を依然として含む、分子または配列に関する。したがって、用語「Ｆｃバリアント」は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化させた、分子または配列を含み得る。さらに、天然Ｆｃは、本明細書に記載される抗体様結合ポリペプチドには必要とされない、構造特徴または生物学的活性を提供するため除去できる領域を含む。したがって、用語「Ｆｃバリアント」は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との非適合性、（３）選択された宿主細胞中での発現時のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、もしくは（７）抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、に影響を与えるか、もしくは関与する、１つもしくはそれ以上の天然Ｆｃ部位もしくは残基を欠くか、または１つもしくはそれ以上のＦｃ部位もしくは残基が修飾されている、分子または配列を含む。
本明細書で使用する「エフェクター能のあるＦｃバリアント」または「エフェクター能のあるポリペプチド」は、本明細書にさらに記載される１つまたはそれ以上のＦｃエフェクター機能を有するＦｃドメインに関する。
特定の例示的実施形態では、本明細書で特徴づけられるＦｃバリアントが、野生型Ｆｃと比べて、血清半減期の延長、ＦｃＲｎ結合親和性の増強、酸性ｐＨでのＦｃＲｎ結合親和性の増強、ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性の増強、および／または同様の熱安定性の１つまたはそれ以上を有する。
ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８、またはヒトＣＤ１６ａ－Ｖ受容体、またはＣＤ１６ａＶは、自然抗体のＦｃ領域に結合するＣＤ１６ヒト受容体の断片を含む、抗体依存性細胞傷害性を仲介する、１５８位にバリン（Ｖ）を担持するポリペプチド構築物に関し、アロタイプＣＤ１６ａ Ｖ１５８として、同じく文献中で報告されている。
ＦｃγＲＩＩＩａ Ｆ１５８、またはヒトＣＤ１６ａ－Ｆ受容体、またはＣＤ１６ａＦは、自然抗体のＦｃ領域に結合するＣＤ１６ヒト受容体の断片を含む、抗体依存性細胞傷害性を仲介する、１５８位にフェニルアラニン（Ｆ）を担持するポリペプチド構築物に関し、アロタイプＣＤ１６ａ Ｆ１５８として、同じく文献中で報告されている。
本明細書で使用する用語「Ｆｃドメイン」は、本明細書に定義される、天然／野生型ＦｃおよびＦｃバリアントならびに配列を含む。Ｆｃバリアントおよび天然Ｆｃ分子と同様に、用語「Ｆｃドメイン」は、全抗体から分解されようと他の手段により産生されようと、単量体型または多量体型の分子を含む。
特定の例示的実施形態では、本明細書に記載されるＦｃドメインが、熱安定化されている。
特定の例示的実施形態では、本明細書に記載されるＦｃドメインが、グリコシル化されている（例えば、Ｎ－結合型グリコシル化により）。特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインが、Ｎ－結合型グリコシル化、例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳ（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸残基）を含有するＮ－結合型グリコシル化モチーフを含む。特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインが、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２９７位においてグリコシル化されている。
特定の例示的実施形態では、本明細書に記載されるＦｃドメインが、エフェクター能を有する。
特定の例示的実施形態では、本明細書に記載されるＦｃドメインが、熱安定化、グリコシル化、およびエフェクター能の任意の組合せである。
熱安定化されたＦｃドメインバリアント
抗体定常ドメインの構造は、ループおよび短いヘリックスで連結されたβストランドからなる可変ドメインの構造に類似する。重鎖定常領域のＣＨ２ドメインは、他のドメインで示される広範囲な鎖間相互作用とは対照的に、炭水化物が仲介する弱い鎖間タンパク質間相互作用を示す。単離されたマウスＣＨ２ドメインは、生理的温度において比較的不安定であるが（Ｆｅｉｇｅら、２００４年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３４４：１０７～１１８頁）、以前の取組みは、鎖内ジスルフィド結合の付加により、ＣＨ２ドメインの熱安定性が高まり得ること、およびそれが、バインダの足場として使用可能であることを実証する（Ｇｏｎｇら、２００９年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８４：１４２０３～２１０頁）。
野生型Ｆｃドメインに対して熱不安定性が上昇した（すなわち、熱安定性が低下した）エフェクターを増強するＦｃドメインバリアントが公知である。例えば、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌバリアントは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析における融解温度（Ｔｍ）の低下により示されるように、ＣＨ２ドメインの安定性の低下をもたらす。Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅは、野生型と比べて低下したタンパク質サーマルシフト測定を有し、ｈＦｃγＲトランスジェニックマウスにおいて、相当に短縮した半減期を有する（Ｌｉｕら（２０１４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８９（６）：３５７１頁、および概説にはＬｉｕら（２０２０） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ９（４）：６４頁を参照）。
野生型と比べて安定性が著しくは低下していない、改善されたＦｃγＲ結合を有するエフェクターを増強するＦｃドメインバリアントが公知である（例えば、Ｉｇａｗａら、欧州特許出願公開第２９４０１３５号明細書、例えば、実施例１０を参照）。
さらに、熱安定化されたＦｃドメインバリアントは、Ｆｃドメインにおける、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合の導入により産生できることが発見された。したがって、一態様では、本開示は、１つまたはそれ以上の操作された（例えば非天然の）ジスルフィド結合、例えば、１つまたはそれ以上の対のシステインにより仲介される、例えば、鎖内ジスルフィド結合を含むＦｃドメインバリアントを提供する。
特定の例示的実施形態では、ジスルフィド結合が、Ｆｃドメインの２つのＣＨ２領域間の鎖内ジスルフィド結合である。特定の例示的実施形態では、ジスルフィド結合が、Ｆｃドメインの２つのＣＨ３領域間の鎖内ジスルフィド結合である。特定の例示的実施形態では、２つもしくはそれ以上の鎖内ジスルフィド結合が、Ｆｃドメインの２つのＣＨ２領域の間に、および／またはＦｃドメインの２つのＣＨ２領域の間に存在する。
Ｆｃドメイン（例えば、結合ポリペプチドを含む、または含まないＦｃドメイン）の熱安定性またはアンフォールド傾向は、当該分野で公知の様々な方法を使用して決定できる。例えば、アンフォールディングまたは変性温度は、ナノ型示差走査熱量測定（ナノＤＳＣ）またはナノ型示差走査蛍光定量法（ナノＤＳＦ）により測定できる（Ｗｅｎら、２０２０年、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９３：１１３５８１頁）。タンパク質のアンフォールディング開始が検出可能な温度が変性開始温度（Ｔｏｎｓｅｔ）である。本明細書で使用する用語「Ｔｍ」は、分子の融解温度に関する。本明細書で使用する用語「Ｔｍ１」は、本開示のＦｃドメインのアンフォールディング温度、特に、ＣＨ２ドメインのアンフォールディング温度に関する。
特定の例示的実施形態では、熱安定化されたＦｃドメインバリアント（例えば、１つまたはそれ以上の操作されたジスルフィド結合を有する）の変性開始温度が、熱安定化されていないＦｃドメインバリアントに対して上昇している。特定の例示的実施形態では、熱安定化されたＦｃドメインバリアントの変性開始温度が、熱安定化されていないＦｃドメインバリアントに対して、約１．０℃、約１．５℃、約２．０℃、約２．５℃、約３．０℃、約３．５℃、約４．０℃、約４．５℃、約５．０℃、約５．５℃、約６．０℃、約６．５℃、約７．０℃、約７．５℃、約８．０℃、約８．５℃、約９．０℃、約９．５℃、約１０．０℃、約１０．５℃、約１１．０℃、約１１．５℃、約１２．０℃、約１２．５℃、約１３．０℃、約１３．５℃、約１４．０℃、約１４．５℃、約１５．０℃、約１５．５℃、約１６．０℃、約１６．５℃、約１７．０℃、約１７．５℃、約１８．０℃、約１８．５℃、約１９．０℃、約１９．５℃、約２０．０℃、約２０．５℃、約２１．０℃、約２１．５℃、約２２．０℃、約２２．５℃、約２３．０℃、約２３．５℃、約２４．０℃、約２４．５℃、または約２５．０℃だけ上昇している。
特定の例示的実施形態では、熱安定化されたＦｃドメインバリアントが、ＥＵナンバリングに従う：アミノ酸２４２位および３３４位；アミノ酸２４０位および３３４位；アミノ酸２８７位および３０６位；アミノ酸２９２位および３０２位；アミノ酸３２３位および３３２位；アミノ酸２５９位および３０６位；アミノ酸３５０位および４４１位；アミノ酸３４３位および４３１位；アミノ酸３７５位および４０４位；アミノ酸３７５位および３９６位；ならびにアミノ酸３４８位および４３９位でのシステイン置換からなる群から選択される、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換対を有する（概説には、Ｗｏｚｎｉａｋ－Ｋｎｏｐｐら、２０１２年、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７： ｅ３００８３；Ｊａｃｏｂｓｅｎら、２０１７年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２０２：１８６５～７５頁；国際公開第２０１４１５３０６３号を参照）。
特定の例示的実施形態では、熱安定化されたＦｃドメインバリアントが、ＥＵナンバリングに従う（ｉ）アミノ酸２４２位のロイシン（Ｌ）およびアミノ酸３３４位のリジン（Ｋ）；（ｉｉ）アミノ酸２８７位のアラニン（Ａ）およびアミノ酸３０６位のロイシン（Ｌ）；または（ｉｉｉ）アミノ酸２９２位のアルギニン（Ｒ）およびアミノ酸３０２位のバリン（Ｖ）を置換する一対のシステインにより仲介される、操作された（例えば非天然の）鎖内ジスルフィド結合を含む。
特定の例示的実施形態では、熱安定化されたＦｃドメインバリアントが、アミノ酸２４２位のロイシン（Ｌ）およびアミノ酸３３４位のリジン（Ｋ）を置換する一対のシステインにより仲介される、操作された（例えば非天然の）鎖内ジスルフィド結合を含む。特定の例示的実施形態では、熱安定化されたＦｃドメインバリアントが、アミノ酸２８７位のアラニン（Ａ）およびアミノ酸３０６位のロイシン（Ｌ）を置換する一対のシステインにより仲介される、操作された（例えば非天然の）鎖内ジスルフィド結合を含む。特定の例示的実施形態では、熱安定化されたＦｃドメインバリアントが、アミノ酸２９２位のアルギニン（Ｒ）およびアミノ酸３０２位のバリン（Ｖ）を置換する一対のシステインにより仲介される、操作された（例えば非天然の）鎖内ジスルフィド結合を含む。特定の例示的実施形態では、熱安定化されたＦｃドメインバリアントが、少なくとも１つの操作された鎖内ジスルフィド結合を含み得る。特定の例示的実施形態では、熱安定化されたＦｃドメインバリアントが、２つ以上の操作された鎖内ジスルフィド結合を含み得る。
エフェクターを増強するＦｃドメインバリアント
一態様では、本開示が、エフェクターを増強するアミノ酸置換を含むＦｃドメインバリアントを提供する。
一実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩａ結合を変化させたＦｃドメインバリアントが、本明細書に開示される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を増強させたＦｃドメインバリアントが、本明細書に開示される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する。一実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を増強させたＦｃドメインバリアントが、本明細書に開示される２つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を増強させたＦｃドメインバリアントが、本明細書に開示される３つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を増強させたＦｃドメインバリアントが、本明細書に開示される４つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、ＦｃＲｎ結合を変化させたＦｃドメインバリアントが、本明細書に開示される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。一実施形態では、ＦｃＲｎ結合親和性を増強させたＦｃドメインバリアントが、本明細書に開示される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。一実施形態では、ＦｃＲｎ結合親和性を増強させたＦｃドメインバリアントが、本明細書に開示される２つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。一実施形態では、ＦｃＲｎ結合親和性を増強させたＦｃドメインバリアントが、本明細書に開示される３つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、種特異的なＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。一実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、ヒトＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。一実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、ｃｙｎｏ（カニクイザル）ＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、異種間ＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。そのようなＦｃドメインバリアントは、１つまたはそれ以上の異なる種にわたり交差反応性であると言われる。一実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、ヒトおよびカニクイザルのＦｃＲｎ結合親和性の両方を示し得る。
胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体のＦｃ領域と相互作用して、正常のリソソーム分解からの救助を介してリサイクルを促進する。このプロセスは、酸性ｐＨのエンドソーム中（例えば、ｐＨ６．５未満）では起こるが、生理学的ｐＨ条件下の血流中（例えば、非酸性ｐＨ）では起こらないｐＨ依存性プロセスである。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、酸性ｐＨにおいて、野生型Ｆｃドメインと比べて増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、ｐＨ７未満、例えば、ｐＨ約６．５、ｐＨ約６．０、ｐＨ約５．５、ｐＨ約５．０において、野生型Ｆｃドメインと比べて増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、ｐＨ７未満、例えば、ｐＨ約６．５、ｐＨ約６．０、ｐＨ約５．５、ｐＨ約５．０において、野生型Ｆｃドメインの、高い非酸性ｐＨでのＦｃＲｎ結合親和性と比べて増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。高い非酸性ｐＨは、例えば、ｐＨ７超、ｐＨ約７、ｐＨ約７．４、ｐＨ約７．６、ｐＨ約７．８、ｐＨ約８．０、ｐＨ約８．５、ｐＨ約９．０であり得る。
特定の実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、非酸性ｐＨにおいて、野生型Ｆｃドメインとおよそ同じＦｃＲｎ結合親和性を示すことが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、非酸性ｐＨにおいて、ＥＵナンバリングに従う二重アミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを有する修飾Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドよりも低いＦｃＲｎ結合親和性を示すことが望ましい場合がある（米国特許第８，０８８，３７６号明細書を参照）。したがって、Ｆｃドメインバリアントが、ｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合に対する最低限の撹乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を示すことが望ましい場合がある。
いくつかの実施形態では、酸性ｐＨにおいて増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃドメインバリアントが、野生型Ｆｃドメインと比べて低下した（すなわち低速の）ＦｃＲｎのｏｆｆ速度を有する。いくつかの実施形態では、高い非酸性ｐＨにおける、結合ポリペプチドのＦｃＲｎ結合親和性と比べて、酸性ｐＨにおいて増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃドメインバリアントが、高い非酸性ｐＨでの野生型ＦｃドメインのＦｃＲｎのｏｆｆ速度と比べて遅い、酸性ｐＨでのＦｃＲｎのｏｆｆ速度を有する。
特定の実施形態は、およそ同じ免疫原性の未変化の全抗体と比べて、エフェクター機能の低下または増強、非共有結合的に二量化する能力、腫瘍の部位に局在する能力の上昇、血清半減期の短縮、または血清半減期の延長などの所望の生化学的特徴を提供するように、定常領域ドメインのうちの１つまたはそれ以上において少なくとも１つのアミノ酸を、欠失または他のやり方で変化させたＦｃドメインバリアントを含む。
特定の他の実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、異なる抗体アイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の２つまたはそれ以上に由来する定常領域）に由来する定常領域を含む。他の実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、キメラヒンジ（すなわち、異なる抗体アイソタイプのヒンジドメインに由来するヒンジ部分、例えば、ＩｇＧ４分子からの上部ヒンジドメインおよびＩｇＧ１中央ヒンジドメインを含むヒンジ）を含む。特定の実施形態では、当該分野で公知の技術を使用して、エフェクター機能を上昇または低下させるために、Ｆｃドメインを変異させてもよい。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、Ｆｃ受容体に対する変化した結合親和性を有する。いくつかの異なる種類のＦｃ受容体が存在し、それらの受容体が認識する抗体の種類に基づいて分類される。例えば、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、ＩｇＧクラス抗体に結合し、Ｆｃアルファ受容体（ＦｃαＲ）はＩｇＡクラス抗体に結合し、Ｆｃエプシロン受容体（ＦｃεＲ）は、ＩｇＥクラス抗体に結合する。ＦｃγＲは、いくつかのメンバー、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂを含むファミリーに属する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、野生型Ｆｃドメインと比べて変化したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、野生型Ｆｃドメインと比べて低下したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、野生型Ｆｃドメインと比べて増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアント修飾Ｆｃドメインが、野生型Ｆｃドメインと比べておよそ同じＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
特定の実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、１つまたはそれ以上のエフェクター機能を仲介する抗体定常領域（例えば、ＩｇＧ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域）を含む。例えば、抗体定常領域への、Ｃ１複合体の結合が、補体系を活性化し得る。補体系の活性化は、オプソニン化および細胞病原体の溶解において重要である。補体系の活性化はさらに、炎症反応を刺激し、自己免疫過敏症に関与し得る。さらに、抗体は、Ｆｃドメインを介して、様々な細胞上の受容体に結合する（抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体結合部位が、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する）。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（エプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）、およびＩｇＭ（ミュー受容体）を含む、異なるクラスの抗体に対して特異的である複数のＦｃ受容体が存在する。細胞表面上のＦｃ受容体への抗体の結合は、抗体被覆粒子の貪食および破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞介在性細胞傷害性、またはＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性メディエータの放出、胎盤通過、ならびに免疫グロブリン産生の管理を含む、複数の重要かつ多様な生体応答を誘発する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアント、例えば、結合ポリペプチド（例えば、抗体またはイムノアドへシン）が、Ｆｃガンマ受容体に結合する。代替的実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、１つまたはそれ以上のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ活性）を欠いた、および／またはＦｃγ受容体に結合できない定常領域を含んだ。
特定の例示的実施形態では、エフェクターを増強するＦｃドメインバリアントが、ＥＵナンバリングに従う：アミノ酸２２１位でのアスパラギン酸（Ｄ）；アミノ酸２２２位でのシステイン（Ｃ）；アミノ酸２３４位でのチロシン（Ｙ）；アミノ酸２３６位でのアラニン（Ａ）；アミノ酸２３６位でのトリプトファン（Ｗ）；アミノ酸２３９位でのアスパラギン酸（Ｄ）；アミノ酸２４３位でのロイシン（Ｌ）；アミノ酸２６７位でのグルタミン酸（Ｅ）；アミノ酸２６８位でのフェニルアラニン（Ｆ）；アミノ酸２９２位でのプロリン（Ｐ）；アミノ酸２９８位でのアラニン（Ａ）；アミノ酸３００位でのロイシン（Ｌ）；アミノ酸３０５位でのイソロイシン（Ｉ）；アミノ酸３２４位でのスレオニン（Ｔ）；アミノ酸３２６位でのトリプトファン（Ｗ）；アミノ酸３２６位でのアラニン（Ａ）；アミノ酸３３０位でのロイシン（Ｌ）；アミノ酸３３２位でのグルタミン酸（Ｅ）；アミノ酸３３３位でのアラニン（Ａ）；アミノ酸３３３位でのセリン（Ｓ）；アミノ酸３３４位でのアラニン（Ａ）；アミノ酸３３６位でのアラニン（Ａ）；アミノ酸３４５位でのアルギニン（Ｒ）；およびアミノ酸３９６位でのロイシン（Ｌ）からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する（概説にはＳａｕｎｄｅｒｓ、２００９年、Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ｄｏｉ： １０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１９．０１２９６を参照）。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位、２３９位、３３０位、および３３２位から選択される位置でのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、置換が、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位でのアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位でのアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３０位でのロイシン（Ｌ）、およびアミノ酸３３２位でのグルタミン酸（Ｅ）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、アミノ酸２３６位でのアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位でのアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３０位でのロイシン（Ｌ）、およびアミノ酸３３２位でのグルタミン酸（Ｅ）から選択されるいずれか２つのアミノ酸位置での二重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、アミノ酸２３６位でのアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位でのアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３０位でのロイシン（Ｌ）、およびアミノ酸３３２位でのグルタミン酸（Ｅ）から選択されるいずれか３つのアミノ酸位置での三重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、アミノ酸２３６位でのアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位でのアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３０位でのロイシン（Ｌ）、およびアミノ酸３３２位でのグルタミン酸（Ｅ）から選択されるいずれか４つのアミノ酸位置での四重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、アミノ酸２３９位でのアスパラギン酸（Ｄ）およびアミノ酸３３２位でのグルタミン酸（Ｅ）を含む、アミノ酸置換の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、アミノ酸２３６位でのアラニン（Ａ）、アミノ酸位置でのアスパラギン酸（Ｄ）およびアミノ酸３３２位でのグルタミン酸を含む、アミノ酸置換の組合せを含み得る。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２５６位および／または３０７位でのアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、アミノ酸２５６位でのアスパラギン酸（Ｄ）およびアミノ酸３０７位でのグルタミン（Ｑ）を含む、アミノ酸置換の組合せを含み得る（参照によってその全体が本明細書に組み入れられるＭａｃｋｎｅｓｓら、２０１９年、ＭＡｂｓ １１：１２７６～８８頁；国際公開第２０１９１４７９７３号を参照）。
グリコシル化Ｆｃドメインバリアント
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインバリアントがグリコシル化されている。抗体の定常領域中の保存された位置でのグリコシル化は、抗体機能、特に、前記したようなエフェクター機能に対する重大な効果を有することが公知である、例えば、Ｂｏｙｄら（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ、３２：１３１１～１３１８頁、１９９６年）を参照。１つまたはそれ以上の炭水化物部分が、付加、置換、欠失、または修飾された、本発明のＦｃドメインバリアントのグリコシル化が予定される。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインのグリコシル化が、Ｎ－結合型グリコシル化である。アスパラギン－Ｘ－セリンまたはアスパラギン－Ｘ－スレオニンモチーフの導入は、炭水化物部部分の酵素的付着に適した潜在的部位を創出し、したがって、Ｆｃドメインバリアントのグリコシル化を操作されるために使用し得る。Ｒａｊｕら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：８８６８～８８７６頁、２００１年）では、ＴＮＦＲ－ＩｇＧイムノアドへシンの末端シアリル化が、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／またはアルファ，２，３シアリルトランスフェラーゼを使用した、再ガラクトシル化および／または再シアリル化のプロセスにより上昇した。末端シアリル化の上昇は、免疫グロブリンの半減期を延長すると見られている。
たいていの糖タンパク質と同じように、抗体は、典型的に、グリコ型の混合物として産生される。その混合物は、真核細胞、特に哺乳類細胞中で抗体が産生される場合に特に明らかである。定められたグリコ型を製造するために、様々な方法が開発された（Ｚｈａｎｇら、２００４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：３７１頁；Ｓｅａｒｓら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３４４頁；Ｗａｃｋｅｒら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：１７９０頁；Ｄａｖｉｓら、２００２年、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １０２：５７９頁；Ｈａｎｇら、２００１年、Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ３４：７２７頁を参照）。いくつかの実施形態では、グリコシル化Ｆｃドメインが、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２９７位において天然グリカンを含む。ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン中のアミノ酸２９７位におけるアスパラギンのグリコシル化は、ＦｃドメインとＦｃγＲとの間の相互作用を促進することが公知である。このグリコシル化部位の除去は、エフェクター機能を除去する（Ｌｅａｂｍａｎら、２０１３年、ＭＡｂｓ ５：８９６～９０３頁）。特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインが、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２９７位での、野生型レベル、またはほぼ野生型レベルのグリコシル化を含む。
いくつかの実施形態では、グリコシル化Ｆｃドメインバリアントが、操作されたまたは非天然のグリカンを含む。いくつかの実施形態では、操作されたまたは非天然のグリカンが、治療用分子（例えば、抗体薬物複合体）に結合可能である修飾グリカンである。
Ｉｎ Ｖｉｖｏ安定性が向上したＦｃドメインバリアント
一態様では、本開示が、向上したｉｎ ｖｉｖｏ安定性（例えば、向上した血清半減期または低下したクリアランス）を含む、単離されたＦｃドメインバリアントを提供する。本明細書で使用する用語「ｉｎ ｖｉｖｏ安定性」は、本開示のエフェクター能のあるポリペプチドが無傷（例えば、限られた分解および／またはアンフォールディング）、機能性（例えば、結合活性を保持）であり続けるため、測定可能な活性（例えば、標的腫瘍細胞の殺滅）の誘発に十分な血清中濃度を保持するための安定性に関する。特定の実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて改善したｉｎ ｖｉｖｏ安定性を有する。特定の実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて低下したｉｎ ｖｉｖｏクリアランスを有する。
本明細書で使用する用語「血清半減期」は、物質（例えば、単離されたＦｃドメインバリアント）が、最高血清中濃度からその最高血清中濃度の半分になるために要する時間に関する。血清半減期は、ＦｃＲｎの結合親和性の増強により、部分的に向上し得る。特定の例示的実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて増強されたＦｃＲｎに対する結合親和性を有する。
Ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、血清半減期、およびクリアランスは、当該分野で公知の任意の方法により決定できる（Ｖａｌｅｎｔｅら、２０２０ ＭＡｂｓ １２：１３頁、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８０／１９４２０８６２．２０２０．１８２９３３７を参照）。例として、薬物動態（ＰＫ）分析を行う実施例７で記載する方法が利用可能である。
Ｆｃ含有結合ポリペプチド
一態様では、本開示が、少なくとも１つの結合ドメイン（例えば、少なくとも１つの結合ポリペプチド）を含むか、または少なくとも１つの結合ドメイン（例えば、少なくとも１つの結合ポリペプチド）と複合体形成した（例えば、融合した）、単離されたＦｃドメインバリアントを提供する。特定の実施形態では、結合ドメインが、１つまたはそれ以上の抗原結合ドメインを含む。その抗原結合ドメインは、親Ｆｃドメインと同じ分子に由来する必要はない。特定の実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、抗体中に存在する。
一実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、抗体中に存在するか、または抗体と複合体形成している。いずれかの起源または種からの任意の抗体が、本明細書に開示されるＦｃドメインバリアントと共に利用可能である。適切な抗体は、限定されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を含む。適切な抗体は、限定されないが、全長抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはＶＨＨ抗体などの単一ドメイン抗体を含む。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、抗体の抗原結合断片に結合しているか、または抗体の抗原結合断片と複合体形成している。用語「抗原結合断片」は、抗原に結合するか、またはインタクト抗体（すなわち、由来元のインタクト抗体）と抗原結合（すなわち、特異的結合）を競合する、免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片に関する。抗原結合断片は、当該分野で周知の組換え方法または生化学的方法により産生可能である。例示的な抗原結合断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、および（Ｆａｂ’）２を含む。特定の例示的実施形態では、本開示の結合ポリペプチドが、少なくとも１つの抗原結合断片およびＦｃドメインバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドが、単鎖可変領域配列（ＳｃＦｖ）を含む。単鎖可変領域配列は、１つまたはそれ以上の抗原結合部位を有する単一ポリペプチド、例えば、フレキシブルリンカーによりＶＨドメインに連結されたＶＬドメインを含む。ＳｃＦｖ分子は、ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向またはＶＬ－リンカー－ＶＨ配向で構築可能である。抗原結合部位を構成するＶＬおよびＶＨドメインを連結するフレキシブルヒンジは、約１０個～約５０個のアミノ酸残基を含む。連結ペプチドは、当該分野で公知である。結合ポリペプチドは、少なくとも１つのｓｃＦｖおよび／または少なくとも１つの定常領域を含み得る。一実施形態では、本開示の結合ポリペプチドが、Ｆｃドメインバリアントに連結または融合した少なくとも１つのｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の結合ポリペプチドが、ＳｃＦｖ分子（例えば、変化させたＳｃＦｖ分子）を含む抗体をコードするＤＮＡ配列の融合により産生される多価（例えば、四価）抗体である。例えば、一実施形態では、ＳｃＦｖ分子（例えば、変化させたＳｃＦｖ分子）が、そのＮ末端またはＣ末端で、フレキシブルリンカー（例えば、ｇｌｙ／ｓｅｒリンカー）を介してＦｃドメインバリアントに連結されるように、それらの配列が組み合わされている。他の実施形態では、本開示の四価抗体が、連結ペプチドに融合させたＳｃＦｖ分子を、Ｆｃドメインバリアントに融合させてＳｃＦｖ－Ｆａｂ四価分子を構築することにより作製可能である。
他の実施形態では、本開示の結合ポリペプチドが、変化させたミニボディである。本開示の、変化させたミニボディは、各々が、連結ペプチドを介してＦｃドメインバリアントに融合したＳｃＦｖ分子を含む、２つのポリペプチド鎖からなる二量体分子である。ミニボディは、当該分野で記載される方法（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号明細書または国際公開第９４／０９８１７号を参照）を使用して、ＳｃＦｖ成分および連結ペプチド成分を構築することにより作製できる。他の実施形態では、四価ミニボディが構築可能である。四価ミニボディは、フレキシブルリンカーを使用して２つのＳｃＦｖ分子が連結されること以外は、ミニボディと同じやり方で構築できる。次いで、連結したｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ構築物を、Ｆｃドメインバリアントに結合する。
他の実施形態では、本開示の結合ポリペプチドが、ダイアボディを含む。ダイアボディは、二量体四価分子であり、各々が、ｓｃＦｖ分子と類似するポリペプチドを有するものの、通常は、両可変ドメインを連結する短い（１０未満、例えば、約１つ～約５つの）アミノ酸残基リンカーを有するため、同じポリペプチド鎖上のＶＬおよびＶＨドメインが相互作用できない。その代わりに、１つのポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨドメインが、第２のポリペプチド鎖上の（それぞれ）ＶＨおよびＶＬドメインと相互作用する（例えば、国際公開第０２／０２７８１号を参照）。本開示のダイアボディは、Ｆｃドメインバリアントと融合させたｓｃＦｖ様分子を含む。
他の実施形態では、本開示の結合ポリペプチドが、ＶＨＨまたはナノボディとも呼ばれる単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、Ａｂｌｙｎｘ社の登録商標である。ＶＨＨは、軽鎖を欠いた可変重鎖ドメインを含む。従来のＶＨドメインと同様に、ＶＨＨは、４つのＦＲおよび３つのＣＤＲを含有する。ＶＨＨは、従来の抗体に勝る利点を有する。ＶＨＨは、ＩｇＧ分子よりも約１０倍小さいため、適切に折り畳まれた機能性ＶＨＨを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現により、高収量を達成しつつ産生できる。さらに、ＶＨＨは、非常に安定であり、プロテアーゼの作用に対して耐性である。ＶＨＨの特性および産生は、ＨａｒｍｓｅｎおよびＤｅ Ｈａａｒｄ Ｈ Ｊ（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００７年１１月；７７（１）：１３～２２頁）により概説されている。
特定の例示的実施形態では、Ｆｃドメインを、１つまたはそれ以上のＶＨＨと融合させる。
他の実施形態では、結合ポリペプチドが、同じポリペプチド鎖上に直列する１つまたはそれ以上の可変ドメイン、例えば、タンデム可変ドメイン（ＴＶＤ）ポリペプチドを含む、多重特異性または多価の抗体を含む。例示的ＴＶＤポリペプチドは、米国特許第５，９８９，８３０号明細書に記載される「ダブルヘッド」または「二重Ｆｖ」コンフィギュレーションを含む。二重Ｆｖコンフィギュレーションでは、２つの異なる抗体の可変ドメインが、２つの別個の鎖（１つの重鎖および１つの軽鎖）上にタンデム配向で発現され、一方のポリペプチド鎖は、ペプチドリンカーによって分離された２つのＶＨドメインを直列に有し（ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２）、他方のポリペプチド鎖は、ペプチドリンカーにより直列に連結された相補的ＶＬドメインからなる（ＶＬ１－リンカー－ＶＬ２）。交差ダブルヘッドコンフィギュレーションでは、２つの異なる抗体の可変ドメインが、２つの別個のポリペプチド鎖（１つの重鎖および１つの軽鎖）上にタンデム配向で発現され、一方のポリペプチド鎖は、ペプチドリンカーによって分離された２つのＶＨドメインを直列に有し（ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２）、他方のポリペプチド鎖は、ペプチドリンカーにより逆配向に直列に連結された相補的ＶＬドメインからなる（ＶＬ２－リンカー－ＶＬ１）。「二重Ｆｖ」フォーマットに基づくさらなる抗体バリアントは、二重可変ドメインＩｇＧ（ＤＶＤ－ＩｇＧ）二重特異性抗体を含む（米国特許第７，６１２，１８１号明細書を参照、およびＴＢＴＩフォーマット（米国特許出願公開第２０１０／０２２６９２３号明細書を参照）。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドが、Ｆｃドメインバリアントに融合させた同じポリペプチド鎖上に直列する１つまたはそれ以上の可変ドメインを含む、多重特異性または多価の抗体を含む。
他の実施形態では、結合ポリペプチドが、「ダブルヘッド」コンフィギュレーションに基づく交差二重可変ドメインＩｇＧ（ＣＯＤＶ－ＩｇＧ）二重特異性抗体を含む（参照によってその開示の全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１２０２５１５４１号明細書を参照）。
他の実施形態では、結合ポリペプチドが、ＣｒｏｓｓＭａｂまたはＣｒｏｓｓＭａｂ－Ｆａｂ多重特異性フォーマットを含む（国際公開第２００９０８０２５３号およびＳｃｈａｅｆｅｒら、ＰＮＡＳ（２０１１）、１０８：１１１８７～１１９１頁を参照）。ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマットに基づく抗体バリアントは、二重特異性ＩｇＧ抗体のワンアーム内に抗体ドメインの交差を有し、正しい鎖会合を可能にする。
他の実施形態では、グリコシル化されたエフェクター能のあるポリペプチドが、Ｔ細胞エンゲージャーフォーマットの多重特異性抗体を含む。「Ｔ細胞エンゲージャー」は、宿主の免疫系、特に、Ｔ細胞の細胞毒性活性を対象とした、ならびに腫瘍標的タンパク質を対象とした結合タンパク質に関する。いくつかの実施形態では、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、ＮＫ細胞エンゲージャーフォーマットの多重特異性抗体を含む。「ＮＫ細胞エンゲージャー」は、活性化ＮＫ細胞受容体、抗原特異的標的化領域、およびＦｃ領域を標的とするモノクローナル抗体断片を含む結合タンパク質に関する（Ｇａｕｔｈｉｅｒら、Ｃｅｌｌ （２０１９）、１７７：１７０１～１３頁）。
本明細書に記載されるＦｃドメインバリアントを含む本開示の結合ポリペプチドは、公知の「親」抗体のＣＤＲ配列または可変ドメイン配列を含み得る。いくつかの実施形態では、親抗体および本開示の抗体が、本明細書に開示される、Ｆｃドメインに対する修飾以外は同様または同一の配列を共有し得る。
他の実施形態では、結合ポリペプチドが、治療用ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドが、受容体、リガンド、または酵素であり得る。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドが、凝固因子であり得る。いくつかの実施形態では、凝固因子が、ＦＩ、ＦＩＩ、ＦＩＩＩ、ＦＩＶ、ＦＶ、ＦＶＩ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ、ＶＷＦ、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、フィブロネクチン、抗トロンビンＩＩＩ、ヘパリンコファクターＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、アルファ２抗プラスミン因子、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－２（ＰＡＩ２）、それらのいずれかの酵素前駆体、それらのいずれかの活性型、およびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドが、成長因子であり得る。成長因子は、当該分野で公知の任意の成長因子から選択可能である。いくつかの実施形態では、成長因子がホルモンであり、他の実施形態では、成長因子がサイトカインである。いくつかの実施形態では、成長因子がケモカインである。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドが、本発明のＦｃドメインのＮ末端および／またはＣ末端に連結された治療用分子または治療用ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドがＦｃ融合ポリペプチドである。
核酸およびベクター
一態様では、本明細書に開示されるＦｃドメインバリアントおよび／または結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。それらのポリヌクレオチドを発現させることを含む、Ｆｃドメインバリアントおよび／または結合ポリペプチドの作製方法も提供される。
本明細書に開示されるＦｃドメインバリアントおよび／または結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、典型的に、特許請求の抗体、治療用ポリペプチド、およびＦｃ融合タンパク質の所望の量を産生するために使用できる、宿主細胞への導入用の発現ベクターに挿入される。したがって、特定の態様では、本発明が、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびにそれらのベクターおよびポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、明細書および特許請求の範囲の目的で、所望の遺伝子を細胞内に導入して発現するために使用するベクターを意味するために本明細書で使用する。当業者には公知であるように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から容易に選択可能である。一般的に、ベクターは、選択マーカ、所望の遺伝子のクローニングを容易にするために適切な制限部位、ならびに真核細胞または原核細胞に侵入および／または複製する能力を含む。
多数の発現ベクター系が利用可能である。例えば、ベクターの一種は、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、もしくはＭＯＭＬＶ）などの動物ウイルス、またはＳＶ４０ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。他のものは、内部リボソーム結合部位を含むポリシストロン系の使用を含む。さらに、自身の染色体内にＤＮＡを組み込んだ細胞は、トランスフェクト宿主細胞の選択を可能にする１つまたはそれ以上のマーカの導入により選択できる。マーカは、栄養要求性の宿主に原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅などの重金属に対する耐性を供与し得る。選択マーカ遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ配列に直接に連結されるか、または共形質転換により、同じ細胞内に導入されるかのいずれか一方である。ｍＲＮＡの最適な合成には、さらなる要素が、同じく必要であり得る。それらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモータ、エンハンサ、および終結シグナルを含み得る。いくつかの実施形態では、クローニングした可変領域遺伝子を、前記で考察したように合成した、重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（例えばヒト遺伝子）と共に、発現ベクター内に挿入する。
他の実施形態では、ポリシストロン構築物を使用して、本明細書に記載される、グリコシル化されたエフェクター能のあるポリペプチドを発現できる。そのような発現系では、目的の、抗体の重鎖および軽鎖などの複数遺伝子産物を、単一ポリシストロン構築物から産生できる。この系は、有利には、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用して、真核宿主細胞中において比較的高レベルのポリペプチドをもたらす。適合性のＩＲＥＳ配列は、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，１９３，９８０号明細書において開示される。当業者は、そのような発現系が、本出願に開示されるポリペプチドの全範囲を効果的に産生するために使用できることを理解する。
より一般的に、本開示のＦｃドメインバリアントおよび／または結合ポリペプチドをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が準備できたら、その発現ベクターを、適切な宿主細胞内に導入できる。すなわち、宿主細胞を形質転換できる。宿主細胞内へのプラスミドの導入は、当業者に周知の様々な技術により実現可能である。それらの技術は、トランスフェクション（電気泳動およびエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡによる細胞融合、マイクロインジェクション、およびインタクトなウイルスによる感染を含むがそれらに限定されない。例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ、Ａ． Ａ．Ｇ．「Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ」、第２４．２章、４７０～４７２頁Ｖｅｃｔｏｒｓ、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ １９８８年を参照。形質転換細胞を、軽鎖および重鎖の産生に適切な条件下で増殖させて、重鎖および／または軽鎖のタンパク質合成をアッセイする。例示的アッセイ技術は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化セルソータ分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学等を含む。
本明細書で使用する用語「形質転換」は、遺伝子型を変化させて結果的にレシピエント細胞での変化をもたらす、レシピエント宿主細胞内へのＤＮＡの導入に関する、広い意味で使用するものとする。
同様に、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築された、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターで形質転換させた細胞に関する。組換え宿主からポリペプチドを単離する工程の記載では、用語「細胞」および「細胞培養」は、明らかに特に指定しない限り、抗体の起源を示すために交換可能に使用する。言い換えると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心沈殿全細胞からか、または培地および懸濁細胞の両方を含有する細胞培養からのいずれか一方を意味し得る。
一実施形態では、Ｆｃドメインバリアントおよび／または結合ポリペプチドの発現に使用する宿主細胞株が、真核生物起源または原核生物起源である。一実施形態では、Ｆｃドメインバリアントおよび／または結合ポリペプチドの発現に使用する宿主細胞株が、細菌起源である。一実施形態では、Ｆｃドメインバリアントおよび／または結合ポリペプチドの発現に使用する宿主細胞株が、哺乳類起源である。当業者は、所望の遺伝子産物をその中で発現させるために最も適切である特定の宿主細胞株を決定できる。例示的宿主細胞株は、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系統、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎系統）、ＣＯＳ（ＳＶ４０ Ｔ抗原を含むＣＶＩの派生体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎系統）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ－１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、２９３（ヒト腎臓）を含むがそれらに限定されない。一実施形態では、細胞株が、自身が発現する抗体の、変化したグリコシル化、例えば、アフコシル化を実現する（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６．ＲＴＭ．（Ｃｒｕｃｅｌｌ社）またはＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞株（ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴＴＭ細胞）（Ｂｉｏｗａ社、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ））。一実施形態では、ＮＳ０細胞を使用し得る。宿主細胞株は、典型的に、商用サービス、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）または公開された文献から入手可能である。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生は、多量の所望のＦｃドメインバリアントおよび／または結合ポリペプチドをもたらすスケールアップを可能にする。組織培養条件下での哺乳類細胞培養の技術は、当該分野で公知であり、例えば、エアリフトリアクタもしくは連続スターラリアクタ内での均一懸濁培養、または例えば、中空繊維、マイクロカプセル内、アガロースミクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上での固定化細胞培養もしくは包括細胞培養を含む。必要であれば、および／または望ましければ、ポリペプチドの溶液を、通例のクロマトグラフィ法、例えば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィ、および／または（イムノ）アフィニティクロマトグラフィにより精製できる。
グリコシル化されたＦｃドメインバリアントおよび／または結合ポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子はさらに、細菌または酵母細胞または植物細胞などの非哺乳類細胞中で発現させてもよい。これに関して、様々な単細胞非哺乳類微生物、例えば、細菌、すなわち、培養または発酵において増殖できるものも形質転換できると理解される。形質転換されやすい細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）などの腸内細菌科の一員、の株；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）などのバチルス科；連鎖状球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）を含む。さらに、細菌中で発現させた場合、Ｆｃドメインバリアントおよび／または結合ポリペプチドは、封入体の一部になり得ると理解される。Ｆｃドメインバリアントおよび／または結合ポリペプチドは、単離し、精製してから、機能分子へとアセンブリさせる必要がある。
原核生物に加えて、真核微生物も使用可能である。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または広く知られたパン酵母が、真核微生物の中では最も一般的に使用されるが、複数の他の株が一般的に利用可能である。サッカロマイセスでの発現には、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９頁（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ、７：１４１頁（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ、１０：１５７頁（１９８０））が、一般的に使用される。このプラスミドは、トリプトファン上で増殖する能力を欠く、酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４－１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：１２（１９７７））に対する選択マーカを与えるＴＲＰ１遺伝子をすでに含有する。その場合、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ損傷の存在が、トリプトファンの不在下での増殖により、形質転換の検出用の効果的な環境を提供する。
使用／処置の方法
一態様では、本発明が、本明細書に開示されるＦｃドメインバリアントの有効量を対象に投与することを含む、処置を必要とする対象において疾患または障害を処置する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示が、そのような処置を必要とする哺乳類対象において、疾患または障害、例えば、がんを処置するためのキットおよび方法を提供する。
本開示のＦｃドメインバリアントは、複数の異なる適用において有用である。例えば、一実施形態では、主題のＦｃドメインバリアントが、Ｆｃドメインバリアントの結合ドメインにより認識されるエピトープを有する細胞の減少または除去にとって有用である。他の実施形態では、主題のＦｃドメインバリアントが、循環中の可溶性抗原の、濃度の低下または除去において効果的である。他の実施形態では、主題のＦｃドメインバリアントが、Ｔ細胞エンゲージャーとして効果的である。一実施形態では、Ｆｃドメインバリアントが、腫瘍サイズを低下させ、腫瘍増殖を阻害し、および／または担腫瘍動物の生存期間を延長し得る。したがって、本開示はさらに、ヒトまたは他の動物において、Ｆｃドメインバリアントの無毒性有効量をそのようなヒトまたは動物に投与することにより腫瘍を処置する方法に関する。
他の実施形態では、主題のＦｃドメインバリアントが、限定されないが、感染症、自己免疫障害、炎症性障害、肺疾患、神経疾患または神経変性疾患、肝疾患、脊椎の疾患、子宮の疾患、うつ病性障害等を含む他の障害の処置に有用である。感染症の非限定的例は、ＲＮＡウイルス（例えばオルソミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、パラミクソウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス）、ラブドウイルス（例えば狂犬病ウイルス）、コロナウイルス（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、アルファウイルス（例えばチクングニアウイルス）、レンチウイルス（例えばＨＩＶ）等）、またはＤＮＡウイルスに起因するものを含む。感染症の例はさらに、限定されないが、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖状球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に起因する細菌感染症、および例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）に起因するものを含む他の感染症を含む。他の感染症は、限定されないが、マラリア、ＳＡＲＳ、黄熱病、ライムボレリア症、リーシュマニア症、炭疽、および髄膜炎を含む。例示的な自己免疫障害は、乾癬およびループスを含むがそれらに限定されない。したがって、本開示は、例えば、向上した半減期を有する主題のエフェクター能のあるポリペプチドの使用から利益を得る様々な状態を処置する方法に関する。
当業者は、日常的実験により、悪性腫瘍を処置する目的のためのＦｃドメインバリアントの無毒性有効量がどれほどであるかを決定できる。例えば、本開示のＦｃドメインバリアントの治療上活性量は、対象の病期（例えば、ステージＩに対するステージＩＶ）、年齢、性別、医学的合併症（例えば、免疫抑制の状態または疾患）、および体重、ならびに修飾抗体が、対象において所望の応答を誘発するような要因に従って変わり得る。投与レジメンは、最適治療応答をもたらすために調整可能である。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与してもよく、または治療状況の要件によって指示されるように、用量を比例的に低下させてもよい。
一般的に、本開示で提供される組成物は、Ｆｃドメインバリアントによる、癌細胞の標的化を可能にする抗原マーカを含む任意の新生物を予防的または治療的に処置するために使用できる。
医薬組成物およびその投与
本開示のＦｃドメインバリアントを調製して、対象に投与する方法は、当業者に周知であり、当業者によって容易に決定される。本開示の結合ポリペプチドの投与経路は、経口、非経口、吸入または局所であり得る。本明細書で使用する用語の非経口は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、または膣内投与を含む。これらすべて投与形態が、明らかに本開示の範囲内であると予定されるが、投与の一形態は、注射用、特に静脈内注射もしくは動脈内注射用の溶液または点滴である。通常、適切な注射用医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸、またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、場合により安定剤（例えばヒトアルブミン）等を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインバリアントを、有害細胞集団の部位に直接に送達してもよく、その際に、治療剤に対する疾患組織の曝露が高まる。
非経口投与用の調製物は、無菌、水性もしくは非水性の溶液、懸濁液および乳液を含む。水性キャリアは、水、アルコール溶液／水溶液、乳液、または懸濁液を含み、塩水および緩衝培地を含む。本開示の組成物および方法では、薬学的に許容可能なキャリアが、０．０１～０．１Ｍ、例えば０．０５Ｍのリン酸緩衝液、または０．８％塩水を含むがそれらに限定されない。他の一般的な非経口ビヒクルは、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、ブドウ糖・塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、流体・栄養補液、電解質補液（例えばリンゲルデキストロースベースのもの）等を含む。防腐剤および他の添加物も存在し得て、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等である。特に、注射用に適切な医薬組成物は、無菌、水性の溶液（水溶性）または分散液、および無菌注射溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末を含む。そのような場合、組成物は無菌である必要があり、容易なシリンジ通過性が存在する程度に流動性である。医薬組成物は、製造および貯蔵の条件下に安定であり、典型的に、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されている。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、ならびにそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合は、必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持できる。
多くの場合、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、または塩化ナトリウムなどの等張剤が、組成物中に含まれる。注射組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることにより起こり得る。
いずれにせよ、無菌注射溶液は、本明細書で列挙した一成分または成分の組合せを含む適切な溶媒中に、活性化合物（例えば、Ｆｃドメインバリアント単独または他の活性剤との組合せ）を必要量で組み込み、必要に応じて、続いてろ過滅菌することにより調製可能である。一般的に、分散液は、塩基性分散媒、および前記で列挙したものからの、他の必要な成分を含有する無菌ビヒクル中に、活性化合物を組み込むことにより調製される。無菌注射溶液の調製用の無菌粉末の場合、例示的な調製方法は、任意の所望の付加的成分を加えた活性成分の、予め滅菌ろ過した溶液から、その粉末をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥を含む。注射用調製物は、当該分野で公知方法に従って、処理し、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジまたはバイアルのようなコンテナに充填して、無菌条件下で密封する。さらに、調製物は、包装して、キットの形で販売してもよい。そのような製品は、典型的には、関連組成物が、自己免疫または新生物性障害を患うか、またはかかりやすい対象の処置に有用であることを示す、ラベルまたは添付文書を有する。
前記の状態の処置に対する、本開示の組成物の有効用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理状態、患者がヒトであるか動物であるか、他の投薬、および処置が予防的であるか治療的であるかを含む、多くの異なる要因に応じて変わる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳類も処置可能である。安全性および効果を最適化するために、当業者に公知の日常的方法を使用して、処置用量を滴定できる。
本開示のＦｃドメインバリアントは、複数回投与可能である。単一用量間の間隔は、１週間、１か月間、または１年間であり得る。間隔は、患者におけるＦｃドメインバリアントまたは抗原の血中レベルの測定によって指示されるように変則的でもよい。いくつかの方法では、修飾された結合ポリペプチドの約１～１０００μｇ／ｍｌの、いくつかの方法では約２５～３００μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するために用量を調整する。代替的に、Ｆｃドメインバリアントは、徐放性製剤として投与してもよく、その場合は低頻度の投与が必要である。抗体の場合、患者における抗体の半減期に応じて、用量および頻度は変わる。一般的に、ヒト化抗体は、最長の半減期を示し、キメラ抗体および非ヒト抗体がそれに続く。
投与の用量および頻度は、処置が予防的または治療的であるかに応じて変わり得る。予防的適用では、患者の耐性を増強するために、本ポリペプチドまたはそれらのカクテルを含有する組成物を、まだ疾患状態にない患者に投与する。そのような量は、「予防上有効用量」と定義される。この使用では、正確な量は、再び、患者の健康状態および全身免疫に依存するが、一般的に、用量当たり約０．１～約２５ｍｇ、特に、用量当たり約０．５～約２．５ｍｇに及ぶ。比較的低用量が、長期にわたる比較的まれな間隔で投与される。一部の患者は、その先の生涯にわたり、処置を受け続ける。治療的適用では、疾患の進行が低減もしくは終結するまで、または患者が、疾患症状の部分的もしくは完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的高用量（例えば、用量当たり約１～４００ｍｇ／ｋｇの抗体、放射性免疫複合体では約５～２５ｍｇの用量がより一般的に使用され、細胞毒性薬物修飾された抗体ではより高用量）が、必要とされることがある。その後は、患者に予防レジメを投与し得る。
本開示のＦｃドメインバリアントは、場合により、処置（例えば、予防的または治療的）を必要とする障害または状態の処置に効果的である他の薬剤と組み合わせて投与できる。本開示の９０Ｙ－標識修飾抗体の有効単回処置用量（すなわち、治療上有効量）は、約５～約７５ｍＣｉの間、例えば約１０～約４０ｍＣｉの間に及ぶ。１３１Ｉ－修飾抗体の有効単回処置非骨髄切除用量（ｎｏｎ－ｍａｒｒｏｗ ａｂｌａｔｉｖｅ ｄｏｓａｇｅ）は、約５～約７０ｍＣｉの間、または約５～約４０ｍＣｉの間に及ぶ。１３１Ｉ－標識抗体の有効単回処置切除用量（すなわち、自家骨髄移植を必要とし得る）は、約３０～約６００ｍＣｉの間、例えば約５０～約５００ｍＣｉ未満の間に及ぶ。キメラ抗体と関連して、マウス抗体に対して長い循環半減期ゆえ、ヨウ素－１３１標識キメラ抗体の有効単回処置非骨髄切除用量は、約５～約４０ｍＣｉの間に及び、例えば約３０ｍＣｉ未満である。例えば、１１１Ｉｎ標識の画像基準は、典型的に、約５ｍＣｉ未満である。
Ｆｃドメインバリアントは、直前に記載のように投与できる一方、他の実施形態では、ポリペプチドを、他の点では健康な患者への第一選択治療として投与できることを強調する必要がある。そのような実施形態では、正常または平均的な赤色骨髄予備能を有する患者、および／または有さない患者、および処置を受けていない患者に、Ｆｃドメインバリアントを投与してもよい。本明細書で使用する、補助療法と合わせたまたは組み合わせた、ポリペプチドの投与は、療法と開示される抗体との、連続、同時、同延（ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）、併用、付随、同時存在の投与または適用を意味する。当業者は、併用治療レジメンの様々な成分の投与または適用は、処置の全体的有効性を高めるためにタイミングを合わせられることを理解する。
前記で考察したように、本開示のＦｃドメインバリアント、抗体、治療用ポリペプチド、またはそれらのＦｃドメインバリアント融合ポリペプチドは、哺乳類障害のｉｎ ｖｉｖｏ処置に関する薬学上有効量で投与し得る。これに関して、開示のＦｃドメインバリアントは、投与を容易にするため、および活性剤の安定性を促進するために調合されると理解される。
本開示に従う医薬組成物は、生理食塩水、無毒性緩衝液、防腐剤等などの薬学的に許容可能な無毒性無菌キャリアを含み得る。本出願の目的で、治療剤に結合したまたは非結合のＦｃドメインバリアントの薬学上有効量は、抗体への効果的な結合を達成するため、および利益を獲得するため、例えば、疾患もしくは障害の症状を改善するため、または物質もしくは細胞を検出するために十分な量を意味すると見なされる。腫瘍細胞の場合、ポリペプチドは、新生細胞または免疫反応性細胞上の、選択された抗原と相互作用でき、それらの細胞の死亡の上昇をもたらす。当然のことながら、本開示の医薬組成物は、修飾された結合ポリペプチドの薬学上有効量を与えるために、単一用量または複数用量で投与可能である。
本開示の範囲を踏まえて、本開示のＦｃドメインバリアントは、前記の処置方法に従って、治療または予防の効果を生み出すために十分な量で、ヒトまたは他の動物に投与可能である。本開示のＦｃドメインバリアントは、そのようなヒトまたは他の動物に、本開示の抗体を、薬学的に許容可能な従来のキャリアまたは希釈剤と、公知の技術に従って組み合わせることにより調製された従来の剤形で投与できる。当業者は、薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤の形態および特徴は、それが組み合わされる活性成分の量、投与の経路、および他の周知の変数によって決まることを認識する。当業者はさらに、１つまたはそれ以上の種類の本開示に記載される結合ポリペプチドを含むカクテルが、特に効果的であると判明し得ることを理解する。
本明細書で言及または引用した、論文、特許、および特許出願、および他のすべての文書、および電子的に入手可能な情報の内容は、個々の刊行物が、具体的かつ個別に、参照によって組み入れられると示されるのと同程度に、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。出願人は、そのような任意の論文、特許、特許出願、または他の物理文書および電子文書からのあらゆる材料および情報を本出願に物理的に組み入れる権利を留保する。
本発明を、その具体的な実施形態に関連して記載したが、当業者は、本発明の本来の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、等価物を置換できることを理解する。当業者には、本明細書に開示される実施形態の範囲から逸脱することなく、適切な等価物を使用して、本明細書に記載される方法の他の適切な修正および適合を行えることが容易に明らかである。さらに、特定の状況、材料、組成物、工程、工程段階を、本発明の目的、趣旨および範囲に適合させるために、多くの修正を行い得る。そのような修正すべてが、本明細書に添付の特許請求の範囲内である意図される。特定の実施形態を詳細に記載したところで、同じことが、単に説明する目的でのみ含まれて限定的であるとは意図されない以下の実施例に関連させてより明らかに理解される。
本発明を、さらなる限定と解釈されるべきでない次の実施例によりさらに説明する。
Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏモデルおよび安定性を上昇させるジスルフィド結合の同定
ＦｃドメインのＣＨ２領域内にある操作されたジスルフィド結合の潜在的な安定化効果を特徴づけるために、ＰＤＢ構造１ＨＺＨから獲得したＦｃドメインに対して、分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを行った。熱ショックがドメインに与える影響を見積もり、ドメイン上での潜在的な弱い相互作用を決定するために、すべての系は、３００Ｋおよび３７０Ｋにおいてシミュレートした。次のＦｃバリアント：ＷＴ ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、ＤＥ＋ＤＱ、ＡＤＬＥ＋ＤＱ、ＤＥ＋ＤＱ＋Ｌ２４２Ｃ／Ｋ３３４Ｃ、ＤＥ＋ＤＱ＋Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ、ＡＤＬＥ＋ＤＱ＋Ｌ２４２Ｃ／Ｋ３３４Ｃ、およびＡＤＬＥ＋ＤＱ＋Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃに対してシミュレーションを行った。結果は、３００Ｋまたは３７０Ｋのいずれか一方の温度での、残基Ｉ３３２Ｅに関する疎水性接触の平均頻度（図１Ａ）、ならびに対応する炭素アルファの根平均二乗揺らぎ（ＲＭＳＦ）指数により表される、変異を含有する領域の柔軟性（図１Ｂ）として報告した。
結果
ＣＨ２ドメイン内での負電荷（Ｉ３３２Ｅ）の導入は、ドメインの疎水性コアの潜在的な破壊により、疎水性接触平均頻度の損失をもたらす（例えば、ＤＱ＋ＤＥ系およびＤＱ＋ＡＤＬＥ系－図１Ａ）。Ｒ２９２Ｃ＋Ｖ３０２Ｃ変異またはＬ２４２Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ変異の導入は、この接触を部分的に回復または改善する。
すべてのバリアントでの半減期延長に与える潜在的な影響を見積もるために、ＤＱ変異の柔軟性指数（ＲＭＳＦ－図１Ｂ）を、すべての系に関して監視した。ＤＱ変異の背景でＩ３３２Ｅ変異を含有する系は、２５６位および３０７位において、ＷＴに対してより高い柔軟性を示すようである。ＤＳＢ安定化の導入は、ＷＴ挙動に対して、柔軟性指数を部分的に改善するようである（例えば、ＤＱ ＤＥ Ｌ２４２Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ－図１Ｂ）。
図２は、Ｉ３３２Ｅ（緑色ＣＰＫレンダリング）、および構造的に近接する、Ｌ２４２Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ操作されたジスルフィド結合（オレンジ色ＣＰＫレンダリング）による、Ｆｃ ＣＨ２ドメイン上のＤＳＢグラフティングの一例（線－リボン）を示す。
図３は、非共有結合ネットワークの一例を、Ｉ３３２（左パネル、疎水性接触を点線で強調）およびＩ３３２Ｅ（右パネル、静電接触を点線で強調）に関して示す。
図３中の２つの画像間の構造比較は、Ｉ３３２Ｅ変異が、ＣＨ２ドメインの疎水性コア内に負電荷を導入したことを指摘する。この変異は、疎水性コア内の疎水性接触の損失をもたらすため、不十分な熱安定性に関する潜在的な駆動現象であると同定された。
Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ試験の理論的根拠は、疎水性ネットワーク破壊に起因するエンタルピー損失を回復して、正常にＮ－グリコシル化されたＣＨ２ドメインフォールドの根底にある疎水性ネットワークを救助するために、新規共有結合イオウ－イオウ接触を創出するジスルフィド安定化の可能な位置を見出すことであった。アグリコシル化ＩｇＧ１を安定化させるために、いくつかのジスルフィド結合が以前に試験された（Ｇｏｎｇら、２００９年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８４、１４２０３～１４２１０頁；Ｊａｃｏｂｓｅｎら、２０１７年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２９２、１８６５～１８７５頁を参照）。それらの中で、２つのジスルフィドスキームが、前記の仮説に適合し、その位置および変異は、Ｌ２４２Ｃ＋Ｋ３３４ＣおよびＲ２９２Ｃ＋Ｖ３０２Ｃであった（図４を参照）。
陰性対照として、ジスルフィド結合を導入するために、３３２位から遠く離れて２つの残基を選び、その位置および変異は、Ａ２８７Ｃ＋Ｌ３０６Ｃであった。このジスルフィド安定化は、疎水性コアに隣接し、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインを特徴づけるベータフォールドの境界に位置する（図５を参照）。共有結合性イオウ－イオウ結合の導入は、アグリコシル化ＩｇＧ１足場を安定化させ得るとはいえ、Ｉ３３２Ｅ変異からの距離が、Ｉ３３２Ｅ変異を含有する増強されたエフェクター機能足場内では、このジスルフィド安定化を非効率的であると見なさせる。
図４は、ＤＳＢ変異用に選ばれた位置の一例を示す。左パネルのＬ２４２＋Ｋ３３４（円内の棒）。右パネルのＲ２９２およびＶ３０２（円内の棒）。
図５は、陰性対照として選ばれたＡ２８７およびＬ３０６（下方の黄色棒）の位置を示す。この２つの残基はＦｃＲｎ結合表面に近接し、ＩｇＧのＣＨ２ドメインの境界にあり、先行する２つのＤＳＢスキームよりも予測される構造的な衝撃は低い。
Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏモデルならびにＣ１ｑ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、およびＦｃＲｎへの結合に及ぼすジスルフィド結合の影響
Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏモデルを使用して、Ｃ１ｑ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、およびＦｃＲｎへの結合に及ぼすジスルフィド結合の影響を決定した。
材料および方法
この解析は、入手可能な結晶構造、ＰＤＢ ＩＤ：６ＦＣＺ－Ｃ１ｑ、５Ｄ６Ｄ－ＧＡＳＤＡＬＩＥ Ｆｃとの複合体中のＦｃγＲＩＩＩａ、３ＲＹ６－ＦｃγＲＩＩａ、および４Ｎ０Ｕ－ＦｃＲｎを用いて行った。構造のうちの２つの低分解能（６ＦＣＺ－Ｃ１ｑとの複合体中のＦｃのクライオＥＭ構造に基づくモデル、および３ＲＹ６－ＦｃγＲＩＩａとの複合体中のＦｃの、分解能が３．８０ÅのＸ線構造）を考慮する必要があり、結論は、不十分な分解能ゆえ、バイアスを有し得る。受容体から５Å以内のすべてのＦｃ残基を選択することにより、相互作用する残基を決定し、エフェクター機能を増強する変異およびＤＳＢ変異と交差点検した。選んだ相互作用距離は、前記の２つの結晶構造の分解能よりも大きいため（それぞれ、５Åおよび３．８０Å）、それはバイアスを低下させることになり、そのバイアスは、残基間直接相互作用の評価を決定する場合に限り決定的であり、本ケースの全相互作用表面を決定する場合には決定的でない。
Ｃ１ｑとの接触残基
この解析は、２つのＣＨ２ドメイン中に見出された最も近い残基は、Ｆｃ鎖１および鎖２に関して、それぞれ、次のとおりである。
Ｆｃ鎖１：Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｋ３２２、Ｓ３２４、Ｎ３２５、Ｋ３２６、Ａ３２７、Ｌ３２８、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｐ３３１、Ｅ３３３。残基Ｇ２３６およびＡ３３０は、ＡＤＬＥおよびＡＤＥスキームにおいて、それぞれ、変異Ｇ２３６ＡおよびＡ３３０Ｌを有する。Ａ３３０（ＡＤＬＥ中のＬ）は、Ｃ１ｑ受容体と直接接触しており、ロイシンに変異させると、結合に直接に与える影響を有し得る。さらに、Ｐ３３１は、Ｃ１ｑと直接接触しており、Ｉ３３２の直前である（ＡＤＥ／ＤＥ／ＡＤＬＥ中のＥ）。
Ｆｃ鎖２：Ｈ２６８、Ｅ２６９、Ｅ２９４、Ｓ２９８、Ｙ３００。これらの位置は、操作された変異の、エフェクター機能増強も安定化も、いずれも含有しない。
この解析に基づき、ＤＥ、ＡＤＥ、およびＡＤＬＥ変異は、Ｃ１ｑ受容体と接触するか、または近接する残基ゆえ、Ｃ１ｑへの結合に影響を与え得る。ＤＳＢ位置は、Ｃ１ｑに最も近い残基内には見出されず、Ｃ１ｑへの結合に影響を与えないはずである。Ｔ２５６ＤおよびＴ３０７Ｑ変異は、相互作用表面から遠く、したがって、Ｃ１ｑとの結合に影響を与えないはずである。
ＦｃγＲＩＩＩａとの接触残基
この解析は、２つのＣＨ２ドメイン中に見出された最も近い残基は、Ｆｃ鎖１および鎖２に関して、それぞれ、次のとおりである。
Ｆｃ鎖１：Ａ２３６、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｄ２３９、Ｄ２６５、Ｖ２６６、Ｓ２６７、Ｈ２６８、Ｄ２７０、Ｙ２９６、Ｎ２９７、Ｓ２９８、Ｔ２９９、およびＡ３２７。
Ｆｃ鎖２：Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｓ２３９、Ｋ３２６、Ａ３２７、Ｌ３２８、Ｐ３２９、Ａ３３０、Ｉ３３２。
太字の残基は、ＤＥ、ＡＤＥ、およびＡＤＬＥエフェクター機能を増強する変異に属する。それが、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を上昇させることを説明し、報告された。ところが、前記の位置のいずれも、ＤＳＢ変異のどちらも含有せず、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合に影響を与えないはずである。Ｔ２５６ＤおよびＴ３０７Ｑ変異は、相互作用表面から遠く、したがって、ＦｃγＲＩＩＩａとの結合に影響を与えないはずである。
ＦｃγＲＩＩａとの接触残基
この解析は、２つのＣＨ２ドメイン中に見出された最も近い残基は、Ｆｃ鎖１および鎖２に関して、それぞれ、次のとおりである。
Ｆｃ鎖１：Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｋ３２６、Ａ３２７、Ｌ３２８、Ｐ３２９。残基Ｇ２３６は、ＡＤＬＥおよびＡＤＥスキームにおける変異Ｇ２３６Ａを有する。
Ｆｃ鎖２：Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｓ２３９、Ｖ２６４、Ｄ２６５、Ｖ２６６、Ｓ２６７、Ｎ２９７、Ｓ２９８、Ｔ２９９。
残基Ｇ２３６およびＳ２３９は、ＡＤＬＥ、ＡＤＥおよびＤＥスキームにおいて、それぞれ、変異Ｇ２３６ＡおよびＳ２３９Ｄを有する。この解析に基づき、ＡＤＬＥ変異は、ＦｃγＲＩＩａへの結合に影響を与え得る。一方、ＤＳＢ位置は、ＦｃγＲＩＩａに最も近い残基内に見出されず、ＦｃγＲＩＩａへの結合に影響を与えないはずである。Ｔ２５６ＤおよびＴ３０７Ｑ変異は、相互作用表面から遠く、したがって、ＦｃγＲＩＩａとの結合に影響を与えないはずである。
ＦｃＲｎとの接触残基
構造解析に基づき、ＤＳＢ位置は、ＦｃＲｎ結合表面に対する影響を有さないはずである。ＤＳＢ変異の位置は、ＦｃＲｎ結合表面の一部でなく、結合表面が含有されるＣＨ２－ＣＨ３エルボの近傍に存在しない。
ノブ・イントゥ・ホール（Ｋｎｏｂ－Ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ（ＫＩＨ））およびＲＦ変異に対するＤＳＢの影響
構造解析に基づき、ＲＦまたはＫＩＨスキームは、Ｆｃ鎖の異なるＩｇＧドメインに属するため、それらに対してＤＳＢは、いかなる影響も与えないはずである（ＤＳＢに対するＣＨ２ドメイン、ならびにＫＩＨおよびＲＦ変異に対するＣＨ３ドメイン）。
安定化バリアントの構築および特徴づけ
点変異の導入により、増強されたエフェクター能のあるＦｃ骨格を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）をフォーマットした（Ｌａｚａｒら、ＰＮＡＳ、１０３：４００５～１０頁（２００６））。Ｆｃドメインに導入された変異は、１）アミノ酸２３９位でのアスパラギン酸（Ｄ）およびアミノ酸３３２位でのグルタミン酸（Ｅ）（「ＤＥ」バリアント）；２）アミノ酸２３６位でのアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位でのアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３３２位でのグルタミン酸（Ｅ）（「ＡＤＥ」バリアント）；または３）アミノ酸２３６位でのアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位でのアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３０位でのロイシン（Ｌ）、およびアミノ酸３３２位でのグルタミン酸（Ｅ）（「ＡＤＬＥ」バリアント）であった（Ｓｍｉｔｈら、ＰＮＡＳ、１０９：６１８１～８６頁（２０１２）を参照）。Ｆｃ担持ポリペプチドの半減期を延長するために、さらなる変異を導入した。アスパラギン酸（Ｄ）を、アミノ酸２５６位において導入し、グルタミン（Ｑ）を、アミノ酸３０７位において導入した。アミノ酸位置ナンバリングは、ＥＵナンバリングに基づいた。
より高い熱安定性を有するＤＥ、ＡＤＥ、およびＡＤＬＥバリアントを産生するために、システイン置換を導入して鎖内ジスルフィド結合を操作した。対のシステインが、次の位置：１）アミノ酸２４２位でのロイシン（Ｌ）およびアミノ酸３３４位でのリジン（Ｋ）；ならびに２）アミノ酸２９２位でのアルギニン（Ｒ）およびアミノ酸３０２位でのバリン（Ｖ）を置換した。アミノ酸位置ナンバリングは、ＥＵナンバリングに基づいた。
ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインをコードする核酸配列に点変異を導入した。次いで、その核酸配列を、ｍＡｂ１（免疫細胞の表面に存在するタンパク質抗原に対するＩｇＧ１抗体）の可変ドメインのコード配列と融合し、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサ／プロモータおよびＳＶ４０ポリＡシグナルを含有する哺乳類発現プラスミドにクローニングした。得られたプラスミドを、メーカ説明書に従って、ＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトした。
ｍＡｂ１バリアントのヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインのアミノ酸配列
ｍＡｂ１
ｍＡｂ１（ｗｔ）（ＩｇＧ１）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
ｍＡｂ１－ＤＥ（残基Ｄ２３９およびＥ３３２に下線）
Figure 2024522092000001
ｍＡｂ１－ＤＥ－ＤＱ（残基Ｄ２３９、Ｅ３３２、Ｄ２５６、Ｑ３０７に下線）
Figure 2024522092000002
ｍＡｂ１－ＤＥ－ＤＱ－Ｌ２４２Ｃ－Ｋ３３４Ｃ（残基Ｄ２３９、Ｅ３３２、Ｄ２５６、Ｑ３０７、Ｃ２４２、およびＣ３３４に下線）
Figure 2024522092000003
ｍＡｂ１－ＤＥ－ＤＱ－Ｒ２９２Ｃ－Ｖ３０２Ｃ（残基Ｄ２３９、Ｅ３３２、Ｄ２５６、Ｑ３０７、Ｃ２９２、およびＣ３０２に下線）
Figure 2024522092000004
ｍＡｂ１－ＤＥ－Ｒ２９２Ｃ－Ｖ３０２Ｃ（残基Ｄ２３９、Ｅ３３２、Ｃ２９２、およびＣ３０２に下線）
Figure 2024522092000005
ｍＡｂ１－ＤＥ－Ｌ２４２Ｃ－Ｋ３３４Ｃ（残基Ｄ２３９、Ｅ３３２、Ｃ２４２、およびＣ３３４に下線）
Figure 2024522092000006
ｍＡｂ１－ＡＤＥ（残基Ａ２３６、Ｄ２３９、およびＥ３３２に下線）
Figure 2024522092000007
ｍＡｂ１－ＡＤＥ－ＤＱ（残基Ａ２３６、Ｄ２３９、Ｅ３３２、Ｄ２５６、およびＱ３０７に下線）
Figure 2024522092000008
ｍＡｂ１－ＡＤＥ－ＤＱ－Ｒ２９２Ｃ－Ｖ３０２Ｃ（残基Ａ２３６、Ｄ２３９、Ｅ３３２、Ｄ２５６、Ｑ３０７、Ｃ２９２、およびＣ３０２に下線）
Figure 2024522092000009
ｍＡｂ１－ＡＤＥ－ＤＱ－Ｌ２４２Ｃ－Ｋ３３４Ｃ（残基Ａ２３６、Ｄ２３９、Ｅ３３２、Ｄ２５６、Ｑ３０７、Ｃ２４２、およびＣ３３４に下線）
Figure 2024522092000010
ｍＡｂ１－ＡＤＥ－Ｒ２９２Ｃ－Ｖ３０２Ｃ（残基Ａ２３６、Ｄ２３９、Ｅ３３２、Ｃ２９２、およびＣ３０２に下線）
Figure 2024522092000011
ｍＡｂ１－ＡＤＥ－Ｌ２４２Ｃ－Ｋ３３４Ｃ（残基Ａ２３６、Ｄ２３９、Ｅ３３２、Ｃ２４２、およびＣ３３４に下線）
Figure 2024522092000012
ｍＡｂ１－ＡＤＬＥ（残基Ａ２３６、Ｄ２３９、Ｌ３３０、Ｅ３３２に下線）
Figure 2024522092000013
ｍＡｂ１－ＡＤＬＥ－ＤＱ（残基Ａ２３６、Ｄ２３９、Ｌ３３０、Ｅ３３２、Ｄ２５６、Ｑ３０７に下線）
Figure 2024522092000014
ｍＡｂ１－ＡＤＬＥ－ＤＱ－Ｌ２４２Ｃ－Ｋ３３４Ｃ（残基Ａ２３６、Ｄ２３９、Ｌ３３０、Ｅ３３２、Ｄ２５６、Ｑ３０７、Ｃ２４２、およびＣ３３４に下線）
Figure 2024522092000015
ｍＡｂ１－ＡＤＬＥ－ＤＱ－Ｒ２９２Ｃ－Ｖ３０２Ｃ（残基Ａ２３６、Ｄ２３９、Ｌ３３０、Ｅ３３２、Ｄ２５６、Ｑ３０７、Ｃ２９２、およびＣ３０２に下線）
Figure 2024522092000016
ｍＡｂ１－ＡＤＬＥ－Ｒ２９２Ｃ－Ｖ３０２Ｃ（残基Ａ２３６、Ｄ２３９、Ｌ３３０、Ｅ３３２、Ｃ２９２、およびＣ３０２に下線）
Figure 2024522092000017
ｍＡｂ１－ＡＤＬＥ－Ｌ２４２Ｃ－Ｋ３３４Ｃ（残基Ａ２３６、Ｄ２３９、Ｌ３３０、Ｅ３３２、Ｃ２４２、およびＣ３３４に下線）
Figure 2024522092000018
ｍＡｂ１バリアントを、１．５リットルスケールで産生し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィ（ＨＩ Ｓｃｒｅｅｎ ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｃｙｔｉｖａ社）およびサイズ排除クロマトグラフィ（ＨＩ Ｌｏａｄ ２６／６００ ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ、Ｃｙｔｉｖａ社）（ＰＢＳで平衡化）を含む２ステップ工程により精製した。Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｖｉｖａｓｐｉｎ １０ＫＤａを使用して、画分のプールを、１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。次いで、サンプルをろ過滅菌して、使用まで４℃において保管した。ＵＶ、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ ｔｏｕｃｈ ＨＴ（還元および非還元条件下のタンパク質）、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、およびＬＣ－ＭＳにより、定量、純度、および性質に関して、バッチを解析した。操作したジスルフィド結合を、ペプチドマッピング用のＬｙｓ－Ｃ、トリプシン、またはトリプシン＋Ｇｌｕ－Ｃセリンプロテアーゼミックスによる酵素消化後、ＬＣ＿ＭＳ（Ｑ－Ｔｏｆ）を含む抽出イオンクロマトグラフィ（ＸＩＣ）を介して解析した。
結果
Figure 2024522092000019
バッチを産生し、予想されるプロファイルで特徴づけた。Ａ２８７Ｃ＋Ｌ３０６Ｃ構築物のサンプル収量は、他のいずれかの構築物と比べて非常に低かった。ＸＩＣにより、ジスルフィド結合を決定し、図６（ｍＡｂ１ ＡＤＬＥ ＤＱ＆ＤＳＢ変異体によるジスルフィド結合のＸＩＣプロファイル）ならびに図７Ａおよび図７Ｂ（ｍＡｂ１＿ＤＥ＆ＤＳＢ変異体およびｍＡｂ１＿ＡＤＥ＆ＤＳＢ変異体によるジスルフィド結合のＸＩＣプロファイル）により示され、予想されたように、さらなるジスルフィド結合が存在した。
Ｆｃバリアントを有するｍＡｂの熱安定性を試験するために、ｍＡｂをＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍＬで希釈した。熱安定性は、標準キャピラリーを使用したＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ４８を用いて、ナノ型の示差走査蛍光定量法（ｎａｎｏＤＳＦ）により決定し、１分当たり１℃の加熱速度で２０℃～９５℃まで、温度の直線勾配を適用した。
ナノＤＳＦは、タンパク質の自家蛍光の変化を使用して、温度上昇に伴うタンパク質のアンフォールディングを監視する。２６６ｎｍの波長の光源を使用してタンパク質溶液を励起し、３３０ｎｍおよび３５０ｎｍにおいて、チロシンおよびトリプトファン残基の蛍光発光。チロシンおよびトリプトファン残基の発光極大および強度は、その直近の環境に著しく依存し、熱変性中にタンパク質がアンフォールドすると変化し得る。３３０ｎｍおよび３５０ｎｍにおける蛍光強度比の変化の、温度の関数としてのモニタリングは、タンパク質のアンフォールディング遷移を表すシグモイド形曲線をもたらす。シグモイド曲線の中間点が、融解温度（Ｔｍ）を表す。タンパク質のアンフォールディング開始が検出可能な温度が変性開始温度である。３つの変曲点（ＩＰ）が存在し、２つは、ＦｃドメインのＣＨ２およびＣＨ３に対応し、３つ目はＦａｂドメインに対応する。Ｔａｇｇは、タンパク質が凝集傾向を示す温度である。
ＡＤＥ、ＤＥ、およびＡＤＬＥバリアントの熱安定性試験の結果は、表２ならびに図８および図９Ａ～図９Ｂに見られる。ナノＤＳＦは、タンパク質の自家蛍光の変化を使用して、温度上昇に伴うタンパク質のアンフォールディングを監視する。３３０ｎｍおよび３５０ｎｍにおける蛍光強度比の変化の、温度の関数としてのモニタリングは、タンパク質のアンフォールディング遷移を表すシグモイド曲線をもたらす。シグモイド曲線の中間点が、融解温度（Ｔｍ）を表す。タンパク質のアンフォールディング開始が検出可能な温度が変性開始温度である。３つの変曲点（ＩＰ）が記録される：２つは、ＦｃドメインのＣＨ２およびＣＨ３に対応し、３つ目はＦａｂドメインに対応する。Ｔａｇｇは、タンパク質が凝集し始める温度である。
Figure 2024522092000020
すべてのＦａｂは、８２℃～８３℃の間のＴｍを伴い非常に安定であった。
ＷＴ ＩｇＧ１（ｍＡｂ１）の変性開始温度は６５℃であり、ＤＱ変異の有無にかかわらず、ｍＡｂ１ ＡＤＬＥ、ＡＤＥ、およびＤＥでは５０℃未満であった。他方、Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２ＣまたはＬ２４２Ｃ＿Ｋ３３４Ｃ ＤＳＢを導入した場合、変性開始温度は、野生型ＩｇＧ１分子と同様に十分に５０℃を上回った。ＩＰ Ｆｃは、Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２ＣまたはＬ２４２Ｃ＿Ｋ３３４Ｃ ＤＳＢを含有する分子では、野生型ＩｇＧ１と同様に６０℃を上回る。Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２ＣまたはＬ２４２Ｃ＿Ｋ３３４Ｃ ＤＳＢの導入は、ＡＤＣＣが増強されたＦｃ ＡＤＬＥ、ＡＤＥ、またはＤＥの背景で、半減期向上ＤＱ変異の有無にかかわらず、熱安定性を回復した。
Ａ２８７Ｃ＿Ｌ３０６Ｃ ＤＳＢは、半減期向上ＤＱ変異を含まない、ＡＤＣＣが増強されたＦｃ ＡＤＬＥ、ＡＤＥ、またはＤＥにおいて、熱安定性を回復しなかった。
ｍＡｂ２
以下のさらなるＦｃバリアントを、ｍＡｂ２（免疫細胞の表面にあるＧタンパク質共役型受容体（ＧＣＰＲ）に対するＩｇＧ１モノクローナル抗体）：ｍＡｂ２（ｗｔ）（野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ）、ｍＡｂ２－ＤＥ（付加的な置換Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅを有するｍＡｂ２に相当）、ｍＡｂ２－ＤＥ－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ（付加的な置換Ｒ２９２ＣおよびＶ３０２Ｃを有するｍＡｂ２－ＤＥに相当）、ならびにｍＡｂ２－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ（置換Ｒ２９２ＣおよびＶ３０２Ｃを有するｍＡｂ２ ｗｔに相当）に基づいて作製した。
ｍＡｂ１に関して前記した方法と同じ方法により、ｍＡｂ２ｗｔ、ｍＡｂ２－ＤＥ、ｍＡｂ２－ＤＥ－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ、およびｍＡｂ２－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃの熱安定性を試験し、結果を表３に提供する。
Figure 2024522092000021
この結果は、ｍＡｂ２中のＤＥ変異は低い熱安定性をもたらすこと（ｍＡｂ２ ｗｔの７１．９℃のＴｍに対するｍＡｂ２－ＤＥの５１．０℃のＴｍ）、およびジスルフィド結合の導入は熱安定性を回復したこと（Ｔｍ ６７．９℃）を示す。
ｍＡｂ３
以下のさらなるＦｃバリアントを、ｍＡｂ３（免疫細胞の表面に存在するタンパク質抗原、およびがん細胞の表面に存在するタンパク質抗原に対する二価二重特異性ＩｇＧ１モノクローナルＣＯＤＶ－ＯＬ１抗体）：ｍＡｂ３（ｗｔ）（野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ）、ｍＡｂ３－ＤＥ（付加的な置換Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅを有するｍＡｂ３に相当）、ｍＡｂ３－ＤＥ－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ（付加的な置換Ｒ２９２ＣおよびＶ３０２Ｃを有するｍＡｂ３－ＤＥに相当）、ｍＡｂ３－ＡＤＥ（付加的な置換Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅを有するｍＡｂ３に相当）、ならびにｍＡｂ３－ＡＤＥ－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ（付加的な置換Ｒ２９２ＣおよびＶ３０２Ｃを有するｍＡｂ３－ＡＤＥに相当）に基づいて作製した。
ｍＡｂ３抗体は、次のように産生した：
対応する構築物の異なる鎖をコードする発現プラスミドを、大腸菌ＤＨ５ａ中で増殖させた。トランスフェクションに使用するプラスミドは、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して、大腸菌から調製した。ポリエチレンイミントランスフェクション試薬を使用して、Ｆ１７無血清懸濁培養（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で増殖させたＨＥＫ２９３－ＦＳ細胞を、表示のプラスミドでトランスフェクトした。３７℃、８％ＣＯ２での６日間の培養後、遠心分離により細胞を除去し、０．２２μｍのフィルタを通して上清から粒子を除去した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｃｙｔｉｖａ社）上にタンパク質を捕捉し、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．０で抽出して、１ＭトリスｐＨ９で中和した。タンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ２６／６０（Ｃｙｔｉｖａ社）を使用したサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、０．２２μｍろ過、およびＵＶ２８０濃度定量により仕上げた後、さらなる特徴づけに使用した。収量は、以下の表４中で報告する。
Figure 2024522092000022
正常なＩｇＧ１ Ｆｃ骨格を有する抗体は、２０ｍｇ／Ｌ超のサンプル収量を実証し、一方、Ｆｃ骨格中にＡＤＥまたはＤＥ変異を有する抗体は、１０ｍｇ／Ｌ未満へのサンプル収量の低下を示す。ＡＤＥまたはＤＥ変異に加えてジスルフィド結合を有するＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体は、ＷＴと同様のサンプル収量、およびサンプル収量の４～６倍の増加を実証し、ｍＡｂ３－ＤＥ－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２ＣおよびｍＡｂ３－ＡＤＥ－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃは、２０ｍｇ／Ｌ超のサンプル収量を示した。
ｍＡｂ１に関して前記した方法と同じ方法により、ｍＡｂ３の熱安定性を試験し、結果を表５に提供する。
Figure 2024522092000023
正常なＩｇＧ１ Ｆｃ骨格を有するｍＡｂ３は、６４．３℃のＴｍ１および５８．５℃の変性開始温度により、安定であった。ＩｇＧ１ Ｆｃ中にＡＤＥまたはＤＥ変異を有するｍＡＢ３分子は、５０℃未満のＴｍ１および変性開始温度を示す。ＡＤＥまたはＤＥ変異に加えてジスルフィド結合を有するＩｇＧ１ Ｆｃを有する分子は、熱安定性の上昇を示す。ｍＡｂ３－ＤＥ－ＤＳＢ分子は、６５．９℃のＴｍ１および５７．８℃の変性開始温度を示し、ｍＡｂ３－ＡＤＥ－ＤＳＢは、６５．９℃のＴｍ１および５７．５℃の変性開始温度を示す。
ｍＡｂ３内のジスルフィド結合Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃの化学的健全性
Ｆｃ ＣＨ２ドメイン上でのジスルフィド結合（ＤＳＢ）の操作は、安定性を上昇させる。ｍＡｂ３内の、操作されたＤＳＢであるＲ２９２Ｃ＿Ｖ３０２ＣおよびＡＤＥ変異（Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）が、ＤＳＢ還元挙動に異常に影響を及ぼさないことを確保するために、ＤＴＴおよび続くトリプシンペプチドマッピングにより還元率を測定した。
材料および方法
還元感受性アッセイ
ＰＢＳ－Ｅ中でのＤＴＴの段階希釈を行った（アッセイにおける最終ＤＴＴ濃度：２０、１０、５、２、１、０．５、０．２、および０．１ｍＭ）。還元中ｐＨ７．２が得られることを確保するために、スピン脱塩カラムを使用して、タンパク質バッチＦＦ－２０－８１９－１、ＦＦ－２０－８２１－１、およびＦＦ－２１－１７０－５を、ＰＢＳ－Ｅ緩衝液中に透析した。ＰＢＳ－Ｅ中で、タンパク質サンプルを１．５ｍｇ／ｍＬに正規化した。正規化したサンプルの２部を、ＰＣＲプレート内の各ＤＴＴ希釈の１部へと添加し、添加後に混合した。このステップは、最低から最高の濃度のＤＴＴ濃度へと１分以内に行った。サーモスタットＣサーモブロック上の２５℃での１０分間のインキュベーションにより還元した。すべてのウェルにＮＥＭストック溶液の３部を添加して、反応をクエンチした。アッセイ一貫性を確保するために、ＮＥＭの添加は、最低から最高のＤＴＴ濃度へと１分以内に行い、添加後に混合した。準備したプレートは、キャピラリーゲル電気泳動（ｃＧＥ）および質量分析法（ペプチドマッピング）による測定まで、室温で保管した。
以下の表６Ａおよび表６Ｂは、それぞれ、還元感受性アッセイおよびキャピラリーゲル電気泳動用の試薬・材料リストを含む。
Figure 2024522092000024
Figure 2024522092000025
還元感受性アッセイを行った後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｌｅａｒ ＨＲアッセイの非還元プロトコルを使用して、メーカ説明書に従って、サンプルを測定した。
チップを準備するために、すべてのアッセイ成分を室温へと平衡化させた。メーカ説明書に従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｌｅａｒ ＨＲゲルマトリクスを、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｌｅａｒ ＨＲ色素溶液と混合し、ろ過してから、すすいだチップウェルに添加した。
提供されたアッセイ対照ＶｅｒｉＭＡｂ標準を、メーカ説明書に従って、非還元サンプル緩衝液中に希釈し、７０℃において１０分間変性させてから、水と混合し、アッセイ較正のためにＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ装置内に配置した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｌｅａｒ ＨＲラダーを水中に１：１０希釈後、指示される体積のラダー溶液およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｃｌｅａｒ ＨＲ洗浄緩衝液を、対応するチューブに移し、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ装置内に配置した。較正工程がうまく終了してから、サンプルを測定した。
サンプルを調製するために、還元感受性アッセイに由来する各サンプル５μＬを、ＰＣＲプレート中の非還元サンプル緩衝液１８μＬに添加して密封し、サーモスタットＣサーモブロック上の７０℃において１０分間変性させた。変性後、サンプルを水３５μＬで希釈した。準備したアッセイプレートを、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ装置で測定するまで、室温で保管した。
測定後、ＬａｂＣｈｉｐレビューアソフトウェアを使用して解析した。相対ピーク面積の≧０．８５％を有する全ピークを積分した。残りのインタクト分子の相対ピーク面積［％］を、ＤＴＴ濃度に対してプロットし、４パラメータロジスティックモデル／シグモイド型用量反応モデル（ＸＬｆｉｔ、１部位用量反応（Ｄｏｓｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｏｎｅ Ｓｉｔｅ）、モデル２０５）により、曲線をフィットさせた。ＤＴＴ添加を伴わないサンプルの面積を、標準化に使用し、１００％に設定した。還元に対する分子の感受性を評価するために、インタクト分子の５０％が残存している各サンプルのＤＴＴ濃度を、ＥＣ５０値として使用した。
還元アッセイ後の、トリプシンペプチドマッピング実験用の抗体サンプル調製
還元感受性アッセイを行った後、サンプルを消化法にさらした。０．２ｍｏｌ／Ｌの塩化ヒスチジン、５．６ｍｍｏｌ／Ｌのグアニジウム塩酸塩ｐＨ６を使用して、Ｚｅｂａスピン脱塩カラム０．５ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号８９８８３）による緩衝液交換により、抗体サンプル当たり１００μｇを変性させた。ＮＥＭの完全除去を確保するために、緩衝液交換を一回繰り返した。次いで、１０ｍｍｏｌ／ＬのＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号Ｔ２５５６）の添加により、サンプルを、３７℃において１ｈ、還元した。続いて、Ｚｅｂａスピン脱塩カラム０．５ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号８９８８３）を用いて、緩衝液を、２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ヒスチジン、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＴＣＥＰ、ｐＨ６へと交換した。酵素と基質との比１：２０で３７℃において一晩、抗体をトリプシンで消化した。１０％ギ酸溶液７μＬの添加により、消化を停止させ、さらなる分析まで、サンプルを－８０℃において凍結した。
液体クロマトグラフィタンデム質量分析法による、修飾ペプチドの検出
ＥＡＳＹ－ＥＴＤイオン源を装備した、ｏｒｂｉｔｒａｐ ＦＵＳＩＯＮ（商標）ＬＵＭＯＳ（商標）ＴＲＩＢＲＩＤ（商標）質量分析計と連結されたＶＡＮＱＵＵＩＳＨ（商標）Ｆｌｅｘ ＵＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ペプチドを分析した。
ペプチド分離には、二元溶媒システム：（Ａ）０．１％ギ酸、および（Ｂ）９０％アセトニトリル、０．１％ギ酸を使用した。ＨＹＰＥＲＳＩＬ ＧＯＬＤ（商標）Ｃ１８ ＬＣカラム（１．９μｍの粒子サイズを有する１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号２５００３－１５２１３０－Ｖ）を用いて、５０分間かけて溶媒Ｂの濃度を直線的に増加させた後、９５％のＢで５分間洗浄し、５％の溶媒Ｂへと５分間再平衡化する１ｈの勾配により、トリプシン消化サンプル２μｇを分離した。カラム上で分離したペプチドは、次の重要な設定により検出した：フルＭＳスペクトルは、３７５～２０００に設定した質量範囲、自動ゲイン制御（ＡＧＣ）ターゲット４．０ｅ５、最大許容注入時間５０ｍｓ、および１μスキャンにより、分解能１２０，０００（２００ｍ／ｚにおいて確定）で取得した。データ依存性（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルは、トップ５データ依存性モードにおいて、注入時間２００ｍｓ以内に、ＡＧＣターゲット５．０ｅ４の蓄積後、分解能１５，０００（２００ｍ／ｚにおいて確定）を使用して取得した。イオンを、１．６Ｔｈ単離ウィンドウで単離して、３０％の正規化衝突エネルギーでＨＣＤ、ＥＴｈｃＤまたはＥＴｃｉＤを使用して断片化した。ダイナミックエクスクルージョンは、１０ｓに設定した。
データ処理
取得したＭＳデータを、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔソフトウェア（ＧｅｎｅＤａｔａバージョン１３．５）を使用して処理し、手作業で検査して、正しい割当ておよび相対定量精度を確保した。マススペクトルを、サンプル分子のアミノ酸配列に対して検索した。重要な設定は、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルの質量許容差であり、それぞれ、１０ｐｐｍに設定した。検索パラメータ範囲内と見なされた翻訳後修飾は、システイン上のＮＥＭ修飾、およびＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔからのＩｇＧ Ｎ－グリカンライブラリを使用した一般的なＮ末端グリコシル化であった。
結果
以下の表６Ｃ中に示すＥＣ５０値は、用量反応曲線から計算した。キャピラリー電気泳動（ｃＧＥ）により測定した、非還元サンプルの主ピークのＤＤＴによる還元は、ｍＡｂ３ ｗｔ、ｍＡｂ３ＡＤＥ、およびｍＡｂ３ ＡＤＥ－ＤＳＢに関して同一であり、ＣＨ２ドメイン中のＡＤＥ変異も操作されたジスルフィド結合も、タンパク質の還元感受性に対する影響を有さないことを示す。
ペプチドマッピングにより解析した、還元感受性アッセイからのタンパク質、ｍＡｂ３ ｗｔ、ｍＡｂ３ ＡＤＥ、およびｍＡｂ３ ＡＤＥ－ＤＳＢは、還元に敏感な分子間ジスルフィド結合（ＤＳＢ）に関して同様の還元挙動を示す。用量反応曲線に基づき、ＥＣ５０値は、３つのタンパク質に関して、１．２～１．５ｍＭ ＤＴＴの範囲にあると見積もられ、操作されたＤＳＢが、典型的分子間ＤＳＢと同様に還元安定性であることを示す。
Figure 2024522092000026
ｍＡｂ４
以下のさらなるＦｃバリアントを、ｍＡｂ４（免疫細胞の表面に存在するタンパク質抗原、およびがん細胞の表面に存在するタンパク質抗原に対する四価二重特異性ＩｇＧ１モノクローナルＣＯＤＶ抗体）：ｍＡｂ４（ｗｔ）（野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ）、ｍＡｂ４－ＤＥ（付加的な置換Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅを有するｍＡｂ４に相当）、ｍＡｂ４－ＤＥ－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ（付加的な置換Ｒ２９２ＣおよびＶ３０２Ｃを有するｍＡｂ４－ＤＥに相当）、ｍＡｂ４－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ（置換Ｒ２９２ＣおよびＶ３０２Ｃを有するｍＡｂ４ ｗｔに相当）、ｍＡｂ４－ＡＤＥ（付加的な置換Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅを有するｍＡｂ４に相当）、ならびにｍＡｂ４－ＡＤＥ－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ（付加的な置換Ｒ２９２ＣおよびＶ３０２Ｃを有するｍＡｂ４－ＡＤＥに相当）に基づいて作製した。
ｍＡｂ４抗体は、次のように産生した：
対応する構築物の異なる鎖をコードする発現プラスミドを、大腸菌ＤＨ５ａ中で増殖させた。トランスフェクションに使用するプラスミドは、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して、大腸菌から調製した。ポリエチレンイミントランスフェクション試薬を使用して、Ｆ１７無血清懸濁培養（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で増殖させたＨＥＫ２９３－ＦＳ細胞を、表示のプラスミドでトランスフェクトした。３７℃、８％ＣＯ２での６日間の培養後、遠心分離により細胞を除去し、０．２２μｍのフィルタを通して上清から粒子を除去した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｃｙｔｉｖａ社）上にタンパク質を捕捉し、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．０で抽出して、１ＭトリスｐＨ９で中和した。タンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ２６／６０（Ｃｙｔｉｖａ社）を使用したサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、０．２２μｍろ過、およびＵＶ２８０濃度定量により仕上げた後、さらなる特徴づけに使用した。収量は、以下の表７中で報告する。
Figure 2024522092000027
正常なＩｇＧ１ Ｆｃを有するｍＡｂ４分子は、３０．６ｍｇ／Ｌのサンプル収量を実証し、一方、Ｆｃ部中にＡＤＥまたはＤＥ変異を有するｍＡｂ４分子は、５ｍｇ／Ｌ未満の値によりサンプル収量の著しい低下を示す。ＡＤＥまたはＤＥ変異に加えてジスルフィド結合を有するＩｇＧ１ Ｆｃを有するｍＡｂ４分子は、サンプル収量の増加を実証した。ｍＡｂ４－ＤＥ－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃは、１７．９ｍｇ／Ｌのサンプル収量を示し、ｍＡｂ４－ＡＤＥ－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃは、１９．４ ｍｇ／Ｌのサンプル収量を示す。
ｍＡｂ１に関して前記した方法と同じ方法により、ｍＡｂ４の熱安定性を試験し、結果を表８に提供する。
Figure 2024522092000028
正常なＩｇＧ１ Ｆｃを有するｍＡｂ４は、６６．４℃のＴｍ１および５９℃の変性開始温度により、安定である。ＩｇＧ１ Ｆｃ中にＡＤＥまたはＤＥ変異を有するｍＡｂ４分子は、５０℃以下のＴｍ１および変性開始温度を示す。ＡＤＥまたはＤＥ変異に加えてジスルフィド結合を有するＩｇＧ１ Ｆｃを有するｍＡｂ４分子は、熱安定性の上昇を示す。ｍＡｂ４－ＤＥ－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ分子は、６７．２℃のＴｍ１および５９．４℃の変性開始温度を示し、ｍＡｂ４－ＡＤＥ－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃは、６６．６℃のＴｍ１および５８．２℃の変性開始温度を示す。
図１０は、ナノ示差走査蛍光定量法（ナノＤＳＦ）により決定した、ＤＥ、ＡＤＥ、ＤＥ＋ＤＳＢ、およびＡＤＥ＋ＤＳＢに対する、ジスルフィド安定化の熱安定性効果を示す。左パネルはｍＡｂ３を示し、右パネルはｍＡｂ４を示す。Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃによる安定化は、約１０℃だけ熱安定性の増加をもたらす。
安定化ｍＡｂ１バリアントの結合パラメータ
方法および材料
フローサイトメトリを使用して、標的抗原を発現するいくつかの組換え細胞株：ヒトプレＢ－３００．１９細胞、カニクイザルプレＢ－３００．１９細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＦｃγＲＩＩＩａ Ｆ１５８、ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８、およびＣＨＯ－ヒトＦｃＲｎ発現細胞（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社；Ｍ００６０３）に対するｍＡｂ１の二価ＥＣ５０結合を決定した。９６ウェルプレート中で、４０，０００細胞／ウェルの密度に達するまで細胞を培養した。ｍＡｂｓ（１００μＬ／ウェル）を、４℃で４５分間にわたり添加した。インキュベーション後、ウェルを、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで３回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８抗体を、４℃で４５分間にわたり添加して、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで３回洗浄した。抗体結合は、細胞を遠心分離して、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ＋１％ＢＳＡの添加により細胞を再懸濁後に評価し、結合は、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴフローサイトメトリシステムを使用して評価した。見かけのＫＤおよびＥＣ５０値は、それぞれ、ＢＩＯＳＴ＠Ｔ－ＢＩＮＤＩＮＧおよびＢＩＯＳＴ＠Ｔ－ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して見積もった。
ｈｕＦｃγＲＩＩＩａタンパク質への抗体結合の動力学は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにより、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％ｖ／ｖのＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ７．４）中、２５℃で測定した。ヒトＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｈｉｓタンパク質（ｈｕＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８；ｈｕＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８）は、抗Ｈｉｓ表面（抗Ｈｉｓ抗体を固定化したＣＭ５センサチップ）上に０．０５ｕｇ／ｍＬで捕捉された。２．５μＭを起点とする抗体濃度の系列を、１分間にわたり注入し、３．５分間にわたり解離を監視した（３０μＬ／分）。１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ ｐＨ１．５の１分パルスにより（１０μＬ／分）、抗Ｈｉｓ表面を再生させた。
ヒトＦｃＲｎ（ｈｕＦｃＲｎ）タンパク質への抗体結合の動力学は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を用いたＳＰＲにより、ＰＢＳＴ緩衝液（１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４－７Ｈ２Ｏ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０）中、２５℃で測定した。ｈｕＦｃＲｎは、センサチップ＿ＣＡＰ－ストレプトアビジン上に捕捉された。２μＭを起点とする抗体濃度の系列を、１分間にわたり注入し１．５分間にわたり解離を監視した（３０μＬ／分）。６Ｍ グアニジウム塩酸塩、０．２５Ｍ ＮａＯＨの２分パルスにより（１０μＬ／分）、表面を再生させた。
抗体結合（ＦＡＣＳ）
ヒトおよびカニクイザルの両標的抗原に対するｍＡｂ１バリアント結合の結果は、表９中に見られる。Ｆｃドメイン内に導入された変異と無関係に、標的抗原への結合は同様であった。ＥＣ５０値は、ヒト標的抗原に関しては０．６５～０．８５ｎＭの間であり、ＥＣ５０値は、カニクイザル標的抗原に関しては１．３６～１．７８の間であった。操作されたジスルフィド結合の導入は、標的抗原への結合に影響を与えなかった。
Figure 2024522092000029
ｈｕＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ／Ｆ１５８の動力学およびＦＡＣＳ
ヒトＦｃγＲＩＩＩａタンパク質への、ｍＡｂの結合を、ＳＰＲおよびＦＡＣＳにより測定した。結果は、表１０中に見られる。ＤＥ、ＡＤＥ、およびＡＤＬＥ変異を含むＦｃドメインを有するすべてのバリアントに関して、ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８またはＦ１５８への結合は、ＦＡＣＳおよびＳＰＲにより測定して、ＷＴ ＩｇＧ１を有する抗体の、ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８またはＦ１５８への結合と比べて著しく改善した。ＦＡＣＳにより測定して１０～１００倍の改善、およびＦｃγＲＩＩＩＡ Ｖ１５８（ＦｃγＲＩＩＩＡ Ｆ１５８）に関して、ＳＰＲによる、それぞれ、６～２０倍（１８～２９倍）の改善。操作されたジスルフィド結合、Ｌ２４２Ｃ／Ｋ３３４ＣまたはＲ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃのいずれかの導入は、ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８またはＦ１５８への、ｍＡｂ１結合に影響を与えなかった。
Figure 2024522092000030
ｈｕＦｃγＲＩＩａ Ｈ／Ｒ１３１の動力学およびＦＡＣＳ
ヒトＦｃγＲＩＩａタンパク質への、ｍＡｂの結合を、ＳＰＲおよびＦＡＣＳにより測定した。結果は、表１１中に見られる。ＩｇＧ１と比べた、ＩｇＧ１＿ＡＤＥフォーマットでのＦｃｙＲＩＩＡへの親和性の改善は、ＤＱ変異の存在の有無にかかわらず、ＤＳＢ Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２ＣまたはＬ２４２Ｃ＿Ｋ３３４Ｃ変異を導入した場合に消滅した。ＩｇＧ１＿ＡＤＬＥまたはＤＥフォーマットでは、ＦｃｙＲＩＩＡへの親和性は、ＤＳＢ変異の有無の両方で低いままであった。
Figure 2024522092000031
ｈｕＦｃＲｎの動力学およびＦＡＣＳ
ｈｕＦｃＲｎ結合試験の結果は、表１２中に見られる。ＤＱ変異を有するＦｃバリアントを有するすべてのｍＡｂに関して、ｈｕＦｃＲｎへの結合は、ＤＱ変異を有さないＦｃと比べて改善した。ＤＳＢの導入は、ＦｃがＤＱ変異を含有する場合、この改善を維持した。
Figure 2024522092000032
安定化ｍＡｂ２バリアントの結合パラメータ
方法および材料：
表面プラズモン共鳴アッセイ
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用したＦｃγ受容体結合
組換えヒトＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖ１５８への抗体結合の分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置で抗Ｈｉｓキャプチャを使用して行った。抗テトラＨｉｓ（Ｑｉａｇｅｎ社）を、ＰＢＳ ｐＨ７．２（Ｇｉｂｃｏ社）へと緩衝液交換し、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０中で２５μｇ／ｍＬへと希釈し、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社が提供するアミンカップリングキットを使用して、シリーズＳ ＣＭ５チップに約１０，０００ＲＵの表面密度へと直接固定化した。Ｈｉｓタグ付き組換えヒトＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖ１５８（社内で産生）を、ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）中で０．５および１μｇ／ｍＬへと希釈し、１０μＬ／分の流速で３０秒間にわたり注入し、６および１４ＲＵの捕捉レベルを得た。泳動用緩衝液中でｍＡｂ２－ｗｔ抗体を、３０００から３７ｎＭへと３倍段階希釈し、ｍＡｂ２－ＤＥ抗体を、１１１、３７、１２、および４ｎＭへと希釈し、二つ組で、捕捉した受容体上に２分間にわたり注入してから、緩衝液中で２分間解離した。表面は、３０秒間にわたる１０ｍＭグリシンｐＨ１．５で再生させた。センソグラムは、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して処理し、１：１結合モデルへとフィットさせて、動力学定数を得た。報告するＫＤは、両捕捉レベルから平均化した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用したＦｃＲｎ結合
組換えヒト、カニクイザル（ｃｙｎｏ）、およびマウスＦｃＲｎへの抗体結合の分析は、Ｃａｒｔｅｒｒａ ＬＳＡ装置で抗Ｆａｂ捕捉法を使用して行った。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆ（ａｂ’）２特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ社）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５中で２０μｇ／ｍＬへと希釈し、Ｃａｒｔｅｒｒａ社が提供するアミンカップリング試薬を使用して、２５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０泳動用緩衝液中、ＨＣ２００Ｍチップに約９，０００ＲＵの表面密度へと直接固定化した。ｍＡｂ２抗体を、捕捉アレイフォーマット中の抗Ｆａｂ表面に、ＰＢＳＰ＋ｐＨ６．０（２０ｍＭ ＮａＰｉ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）中の６および１５μｇ／ｍＬで、別個の四分円へと二つ組でプリントした。ＦｃＲｎの各種（社内で産生）を、ＰＢＳＰ＋ｐＨ６．０中で２倍段階希釈し、捕捉したｍＡｂ２上に注入し、２分間または３分間会合させてから、５分間解離させて、ｐＨ６．０での親和性を測定した。各濃度系列は、計１０種のＦｃＲｎの濃度を含有し、最高濃度は、ＦｃＲｎ種特異的に：４０００ｎＭ、２０００ｎＭのカニクイザル、および５００ｎＭのマウスＦｃＲｎであった。緩衝液注入は、適切なブランク引き算のために、受容体注入間に均等に分布させた。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合を測定するために、ｍＡｂ２抗体を、前記のように捕捉し、ヒトおよびカニクイザルＦｃＲｎをＰＢＳＰ＋ｐＨ７．４中で１０００ｎＭに希釈する一方で、マウスＦｃＲｎを５００ｎＭに希釈し、捕捉したｍＡｂ２上に注入し、２分間会合させてから、２分間解離させた。センソグラムは、Ｃａｒｔｅｒｒａ Ｋ．Ｉ．Ｔ検査ツールで処理し、１：１結合モデルへとフィットさせて、ｐＨ６．０での動力学定数を得るか、またはｐＨ７．４での会合相の終了時に定常状態応答を計算した。報告する結合親和性は、ヒトＦｃＲｎに関しては２つの別個のアッセイラン、ならびにカニクイザルおよびマウスＦｃＲｎに関しては単一アッセイランに由来するすべてのｍＡｂ２プリントから平均化した。
結果：
Figure 2024522092000033
ｈｕＦｃｇＲＩＩＩａ－Ｖ１５８への結合に関するＳＰＲの結果は、ｍＡｂ２－ｗｔ、ｍＡｂ２－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃに関して匹敵する親和性を示す。ｍＡｂ２－ＤＥおよびｍＡｂ２－ＤＥ－Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃは、ＷＴまたはＷＴバリアントよりも２２～３９倍高い、ｈｕＦｃｇＲＩＩＩａ－Ｖ１５８への結合親和性を示し、互いに匹敵する親和性を有する。
Figure 2024522092000034
結果は、ｍＡｂ２－ｗｔ上またはｍＡｂ２－ＤＥ上でのＲ２９２＿Ｖ３０２Ｃ変異の付加が、ヒト、カニクイザル、またはマウスＦｃＲｎへの結合親和性に対して著しい効果を有さないことを示す。親和性は、各種に対して、すべての分子で匹敵した。
Figure 2024522092000035
結果は、ｍＡｂ２分子のいずれも、試験した条件下の中性ｐＨでは、ヒト、カニクイザル、またはマウスＦｃＲｎに結合しなかったことを示す。
安定化ｍＡｂ３バリアントの、ヒトＣＤ１６ａへの結合パラメータ
ｍＡｂ３およびｍＡｂ４の両方とも、ＣＤ１６ａに結合できるＦｃドメインをもつ。ＤＳＢ置換（Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ）がＣＤ１６ａ結合を除去しないことを実証するために、ＣＤ１６ａへの結合を測定した。表１６に示すように、すべてのＤＳＢバリアントは、ＤＥまたはＡＤＥバリアント単独と比べて、両方のＣＤ１６ａバリアント（Ｖ１５８またはＦ１５８）への、同等あるいはそれ以上の結合を有した。
Figure 2024522092000036
ジスルフィド結合安定化されたバリアントのｉｎ Ｖｉｔｒｏ特徴づけ
ｍＡｂ１
Ａ－バリアントがｉｎ ｖｉｔｒｏ補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を誘導する能力の評価
材料および方法：
ｍＡｂ１のＣＤＣ能力は、標的を発現するＤＮＤ４１細胞株（Ｔ－ＡＬＬ、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８：４２５～４３４頁（１９９４））を使用して評価した。細胞を、ＲＨＢＰ培地（ＲＰＭＩ１６４０フェノールレッド不含、０．１％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン）中に３×１０６個で懸濁する。
細胞を、９６ウェルプレート中にウェル当たり１．５×１０５細胞でプレーティングし、２５μｌの抗体バリアントと、１６７．５ｎＭを起点に０．０８ｎＭまで希釈率２の段階希釈濃度で、４℃において３０分間プレインキュベートした。
第２ステップでは、ウェル当たり２５μＬのヒト補体（Ｓｉｇｍａ社、Ｒｅｆ：Ｓ１７６４－１ｍＬ、１ｍＬのＨ２Ｏ＋４ｍＬのＲＨＢＰ中に懸濁）を添加し、プレートを２時間、５．５％のＣＯ２を含む３７℃においてインキュベートした。ＷＳＴ－１溶液（Ｒｏｃｈｅ社、Ｒｅｆ １１６４４８０７００１；１０μＬ／ウェル）を添加し、プレートを再び２時間、５．５％のＣＯ２を含む３７℃においてインキュベートした。
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて４４０ｎｍで、メーカのプロトコルに従って、吸光度を測定した。各点を三つ組で行った。
生存率の％を次のように計算した：
％生存率＝（（ＯＤ＿サンプル－ＯＤ培地）×１００）／（ＯＤ＿抗体を含まない細胞－ＯＤ培地）。
ＯＤ：光学密度
データは、３つの独立した実験の要約である。
報告する結果は、ＩＣ５０値の幾何平均、ＣＶ、および死亡率のデルタ（表１７～表１９）、ならびにＡＤＥフォーマット、ＡＤＬＥフォーマット、およびＤＥフォーマットのＣＤＣ活性の代表的な例である（図１１、図１２、および図１３）。値は、Ｂｉｏｓｔ＠ｔ－ＳＰＥＥＤ ｖ２．４を使用して計算した。
結果：
Figure 2024522092000037
ＡＤＬＥフォーマット、およびＡＤＬＥフォーマットを含有するすべての付加的な変異により、ＣＤＣ活性は検出されない、表１７および図１１。一方、ＤＥまたはＡＤＥフォーマットでは、ＣＤＣ活性が測定され、ＤＥまたはＡＤＥフォーマットに導入された付加的なジスルフィド結合変異により変化しない。
Figure 2024522092000038
ＡＤＬＥフォーマット、ならびに付加的なＤＱおよびＲ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃジスルフィド結合変異により、ＣＤＣ活性は検出されなかった。一方、ＤＥフォーマットおよびＡＤＥフォーマットでは、ＣＤＣ活性が測定された。付加的なＤＱおよびＲ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃジスルフィド結合変異がＤＥフォーマット中に導入されると、活性は低下した。付加的なＤＱおよびＲ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃジスルフィド結合変異がＡＤＥフォーマット中に導入されると、ＣＤＣ活性は消失した（表１８および図１２）。
Figure 2024522092000039
ＡＤＬＥフォーマット、ならびに付加的なＤＱおよびＬ２４２Ｃ＿Ｋ３３４Ｃジスルフィド結合変異により、ＣＤＣ活性は検出されなかった。一方、ＤＥフォーマットおよびＡＤＥフォーマットでは、ＣＤＣ活性が測定された。付加的なＤＱおよびＬ２４２Ｃ＿Ｋ３３４Ｃジスルフィド結合変異がＤＥフォーマット中に導入されると、活性は低下した。付加的なＤＱおよびＬ２４２Ｃ＿Ｋ３３４Ｃジスルフィド結合変異がＡＤＥフォーマット中に導入されると、ＣＤＣ活性は消失した（表１９および図１３）。
Ｂ－バリアントがｉｎ ｖｉｔｒｏ抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導する能力の評価
材料および方法：
ｍＡｂ１により認識される抗原を発現するＬＰ１細胞株（ＭＭ、ヒト多発性骨髄腫細胞、Ｂｌｏｏｄ． １９８９年３月；７３（４）：１０２０～７頁）を標的細胞として、およびナチュラルキラー細胞株ＮＫ９２ ＦＣＧＲ３Ａ １５８Ｖ（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ社）をエフェクター細胞として、ＡＤＣＣ能力を評価した。
標的細胞を、カルセインアセトキシメチル（２ｍＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｒｅｆ Ｃ３１００ＭＰ）で標識して、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０フェノールレッド不含、１％ ＳＶＦ、０．７７ｍｇ／ｍＬのプロベネシド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｐ３６４００）中に２×１０５個で再懸濁した。
標的細胞（Ｔ）を、９６ウェルプレート中にウェル当たり細胞２×１０４個で播種し、５％のＣＯ２を含む３７℃において、ＩｇＧ野生型では２．３ｎＭを起点に希釈率３の段階希釈濃度で、ＡＤＬＥ、ＡＤＥ、およびＤＥバリアントでは１．２５ｎＭを起点に希釈率７の段階希釈濃度で、５０μｌの抗体バリアントを加えて３０分間プレインキュベートした。
カルセイン放出最高レベルの陽性対照として、標的細胞を、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎとインキュベートした。
エフェクター細胞（Ｅ）を、アッセイ培地中に６×１０５個で再懸濁し、１００μＬまたは６×１０４個のエフェクター細胞を、ウェル当たり標的細胞へと（Ｔ：Ｅ比は１：３）添加する。３７℃、５％ＣＯ２での３時間のインキュベーション後、１００μｌの培養上清を、黒色９６ウェルプレートに移し、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０４プレートリーダ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いた４９２ｎｍの励起および５１５ｎｍの発光での蛍光により、カルセイン放出を測定した。各点を三つ組で行った。
細胞毒性率の％を次のように計算した：
％細胞毒性率＝（（ＲＬＵ＿サンプル－ＲＬＵ培地）×１００）／（ＲＬＵ＿陽性対照トリトン－ＲＬＵ培地）。
ＲＬＵ：相対発光量
データは、少なくとも３つの独立した実験の要約である。各バリアントおよび各実験に関して、ＩＣ５０値、および死亡率のデルタを計算した。報告する結果は、ＩＣ５０値の幾何平均、ＣＶ、および死亡率のデルタ（表２０）、ならびにＡＤＬＥフォーマット、ＡＤＥフォーマット、およびＤＥフォーマットのＡＤＣＣ活性の代表的な例である（図１４～図１６）。値は、Ｂｉｏｓｔ＠ｔ－ＳＰＥＥＤ ｖ２．４を使用して計算した。
結果：
Figure 2024522092000040
ＡＤＬＥフォーマットで測定されたＡＤＣＣ活性は、このフォーマット内にＬ２４２Ｃ＿Ｋ３３４ＣまたはＲ２９２Ｃ＿Ｖ３０２ＣのいずれかのＤＳＢ変異を導入した場合、同じ範囲に維持された。同様に、ＤＥおよびＡＤＥフォーマットで測定されたＡＤＣＣ活性は、それらのフォーマット内に該ＤＳＢ変異を導入した場合に維持された（表２０および図１４）。
Figure 2024522092000041
ＡＤＬＥフォーマットで測定されたＡＤＣＣ活性は、このフォーマット内に、Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃの有無にかかわらず、付加的なＤＱ変異を導入した場合、同じ範囲に維持された。同様に、ＤＥ＆ＡＤＥフォーマットで測定されたＡＤＣＣ活性は、それらのフォーマット内に、Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃの有無にかかわらず、付加的なＤＱ変異を導入した場合、維持された（表２１および図１５）。
Figure 2024522092000042
ＡＤＬＥフォーマットで測定されたＡＤＣＣ活性は、このフォーマット内に、Ｌ２４２Ｃ＿Ｋ３３４Ｃの有無にかかわらず、付加的なＤＱ変異を導入した場合、同じ範囲に維持された。同様に、ＤＥ＆ＡＤＥフォーマットで測定されたＡＤＣＣ活性は、それらのフォーマット内に、Ｌ２４２Ｃ＿Ｋ３３４Ｃの有無にかかわらず、付加的なＤＱ変異を導入した場合、維持された（表２２および図１６）。
ｍＡｂ３
ＡＤＥまたはＤＥ置換と組み合わせたＤＳＢ置換を有する抗体の力価が、消失しなかったことを実証するために、ｍＡｂ３を用いて細胞毒性アッセイを行った。
図１７に示すように、ＤＳＢ置換（Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃ）の包含は、ＡＤＥまたはＤＥバックグラウンドのどちらのｍＡｂ３の活性にも影響を与えなかった。
ジスルフィド結合安定化されたバリアントのＰＫ解析
この実施例は、ＤＳＢ安定化バリアントが、ＰＫプロファイルに与える影響を記載する。
ｍＡｂ１
材料および方法：
マウス実験は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来し、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）から購入したホモ接合型トランスジェニックＴｇ３２（Ｂ６．Ｃｇ－Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ Ｔｇ（ＦＣＧＲＴ）３２Ｄｃｒ／ＤｃｒＪ）マウスにおいて行った。ＦｃＲｎ－／－ ｈＦｃＲｎ（系統３２）Ｔｇマウスは、マウス遺伝子のヌル変異、およびｈＦｃＲｎ α鎖導入遺伝子をその天然ヒトプロモータの制御下に発現する導入遺伝子を有する。
すべてのマウスは、試験開始時に８～１２週齢の間の年齢の処置未経験に雌性であった。投与には、抗体をＤＰＢＳ １×調合緩衝液中で調製し、１ｍｇ／ｋｇの単一静脈内投与として、１０ｍＬ／ｋｇの投与容量で尾静脈に投与した。２８日の試験期間にわたり、逐次サンプリングアプローチを使用して（０．０８時間、４時間、２４時間、７２時間、１６８時間、２４０時間、３３６時間、５０４時間、および６７２時間）、各抗体につき、計３匹のレプリケートを評価した。サンプリング時間に従って、血液サンプル（およそ２０μＬ）を採取した。血液サンプルを４℃において、１５００ｇで１０分間遠心分離し、６μＬの血漿サンプルを、６０μＬのＤＰＢＳ １×中に希釈してから、分析まで－８０℃で保管した。
ｍＡｂ１ ＷＴ抗体に関して、次の一般的方法を使用したボトムアップＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイにより、各時点での各抗体の濃度を決定した。一定分量の血漿を沈殿後、血漿ペレットを、タンパク質変性、還元、アルキル化、トリプシン消化、および固相抽出してから、サロゲートペプチドを分析した。各抗体の定量のために、その選択性および応答因子に応じて、ｍＡｂ１の軽鎖に属する１７アミノ酸残基の配列に対応するサロゲートペプチドを選択した。較正標準は、抗体を１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、および４００μｇ／ｍＬで血漿に添加することにより調製した。ペプチド分離は、逆相ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、３．５μＭ、３００Å、Ｗａｔｅｒｓ社）を用いたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムにより、水中の０．１％ギ酸とアセトニトリル中の０．１％ギ酸との階段状勾配において３００μＬ／分の流速で行った。検出には、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ６５００＋質量分析計を、陽イオンモードで、ソース温度７００℃、イオンスプレー電圧５５００Ｖ、カーテンガスおよびネブライザーガス４０、衝突ガス（ａｔ ｍｉｄ）を使用した。各トランジションにつき、滞留時間は３０ｍｓであり、エントランス電位は１０Ｖであった。デクラスタリング電位は９０Ｖであり、衝突エネルギーは２６Ｖであった。標準および対照に対する濃度定量には、ＡｎａｌｙｓｔソフトウェアのＭＱＩＩＩ積分アルゴリズムからのピーク面積を使用して、抗体のユニークなサロゲートペプチドの多重反応モニタリングトランジション（８０７．４ｍ／ｚでの６２６．０）を使用した。
ｍＡｂ１バリアント（ＡＤＥ、ＤＥ、ＡＤＬＥ、ＤＥ－ＤＱ、およびＡＤＬＥ－ＤＱバリアント）に関して、各時点での各抗体の濃度は、段階的サンドイッチフォーマットであるＧｙｒｏｌａｂプラットフォーム（Ｇｙｒｏｓ社）を使用する一般的イムノアッセイ法により決定した。サンプル（標準、品質管理、および試験サンプル）を、緩衝液中で１００倍希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートに分注した。捕捉試薬および検出試薬は、第２の９６ウェルマイクロタイタープレートに分注した。次いで、９６マイクロタイタープレートおよびｂｉｏａｆｆｙ ＣＤ（ＣＤ２００－１１２個の微細構造化セグメントを含有）を、Ｇｙｒｏｌａｂプラットフォーム上にロードした。以下のステップ：Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙディスク（ＣＤ２００）内のストレプトアビジンビーズカラム上へのビオチン化ロバ抗ｈｕ－ＩｇＧ（捕捉）の添加；次いで、標準、品質管理、および試験サンプルの分配；次いで、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－ヤギ抗ｈｕ－ＩｇＧ（検出）の添加は、Ｇｙｒｏｌａｂプラットフォームにより自動的に誘発された。オンカラム蛍光測定（λｅｘｃ ６３３ｎｍ、λｅｍｍ ６５０ｎｍ）は、１％に設定した光電子増倍を使用して、各微細構造化セグメントにおいて行った。すべての分析は二つ組で行い、定量の範囲は１００～２００，０００ｎｇ／ｍＬであった。
ＰＫパラメータは、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎバージョン８．１（Ｃｅｒｔａｒａ Ｌ．Ｐ．社）のノンコンパートメント解析を使用して、個々の動物データから決定した。
ＡＤＡ干渉の典型である、濃度の急落を示した、ｍＡｂ１－ＡＤＬＥ＿ＤＱ＿Ｌ２４２Ｃ＿Ｋ３３４Ｃを投与した１匹の動物からのＰＫプロファイルは、ＰＫ計算から除外した。ｍＡｂ１－ＤＥ＿ＤＱ＿Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃを投与した１匹の動物も、投与上の問題ゆえ、ＰＫ解析から除外した。
結果：
Figure 2024522092000043
ＤＥ＿ＤＱおよびＡＤＬＥ＿ＤＱに関して、２つのＤＳＢ位置（Ｌ２４２Ｃ－Ｋ３３４ＣおよびＲ２９２Ｃ－Ｖ３０２Ｃ）により同様のＰＫプロファイル＆パラメータが認められた。ＤＳＢ位置は、ＤＥ＿ＤＱ＆ＡＤＬＥ＿ＤＱ変異させた構築物のＰＫ特性を、３～９倍だけ延長した消失半減期、および４～１０倍だけ低下したクリアランスにより改善した。ＡＤＬＥ＿ＤＱ＿ＤＳＢの消失半減期は、ＷＴよりもわずかに長く、一方、ＤＥ＿ＤＱ＿ＤＳＢのｔ１／２ｚは、ＷＴと同様であった（図１８）。
ＤＱ置換を有さないｍＡｂ１に関しても同様に、ＰＫプロファイルを生成した。その結果を表２４および図１９に示す。
どの変異であろうと（ＡＤＥ、ＤＥ、またはＡＤＬＥ）、２つのＤＳＢ位置（Ｌ２４２Ｃ－Ｋ３３４ＣおよびＲ２９２Ｃ－Ｖ３０２Ｃ）により同様のＰＫプロファイル＆パラメータが認められた。ＤＳＢ位置は、ＤＥ＆ＡＤＬＥ変異させた構築物と比べて、消失半減期を２．５～３倍だけ延長させ、クリアランスを２．５～３倍だけ低下させることにより、ＤＥ＆ＡＤＬＥ変異させた構築物のＰＫ特性を明らかに改善した。ＤＳＢの添加によるＰＫ特性の改善は、ＡＤＥ変異させた構築物ではあまり明らかでなかった。それにもかかわらず、ＤＳＢを有する変異構築物のＰＫパラメータは、ＷＴ構築物と同様であり、ＤＳＢは、変異構築物をｉｎ ｖｉｖｏで安定化させる。
Figure 2024522092000044
ｍＡｂ３
材料および方法：
ｍＡｂ３ ＡＤＥおよびＡＤＥ－ＤＳＢ （Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ）バリアントに関して、次の一般的方法：一定分量の血漿を沈殿後、血漿ペレットを、タンパク質変性、還元、アルキル化、トリプシン消化、および固相抽出してから、サロゲートペプチドを分析した、を使用したボトムアップＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイにより、各時点での各抗体の濃度を決定した。各抗体の定量のために、その選択性および応答因子に応じて、Ｆａｂ領域（軽鎖）に属するサロゲートペプチドＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫを選択した。較正標準は、抗体を１、２．８、７、１４、４０、８０および１００μｇ／ｍＬで血漿に添加することにより調製した。ペプチド分離は、逆相ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、３．５μＭ、３００Å、Ｗａｔｅｒｓ社）を用いたＳｈｉｍａｄｚｕ ＵＨＰＬＣシステムにより、水中の０．１％ギ酸とアセトニトリル中の０．１％ギ酸との階段状勾配において６００μＬ／分の流速で行った。検出には、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ６６００ ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ質量分析計を、陽イオンモードで、ソース温度５００℃、イオンスプレー電圧５５００Ｖ、カーテンガス３５、およびネブライザーガス５０で使用した。各実験につき、滞留時間は１５ｍｓであった。デクラスタリング電位は９０Ｖであり、衝突エネルギーは２６Ｖであった。標準および対照に対する濃度定量には、ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔソフトウェアのＭＱ４積分アルゴリズムからのピーク面積を使用して、抗体のユニークなサロゲートペプチドの６２６．０ｍ／ｚ親イオンの８０７．４０９８ｍ／ｚ断片を使用した。
ｍＡｂ３ＤＱ抗体に関して、各時点での濃度は、段階的サンドイッチフォーマットであるＧｙｒｏｌａｂプラットフォーム（Ｇｙｒｏｓ社）を使用する一般的イムノアッセイ法により決定した。サンプル（標準、品質管理、および試験サンプル）を、緩衝液中で１００倍希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートに分注する。捕捉試薬および検出試薬は、第２の９６ウェルマイクロタイタープレートに分注した。次いで、９６マイクロタイタープレートおよびｂｉｏａｆｆｙ ＣＤ（ＣＤ２００－１１２個の微細構造化セグメントを含有）を、Ｇｙｒｏｌａｂプラットフォーム上にロードした。以下のステップ：Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙディスク（ＣＤ２００）内のストレプトアビジンビーズカラム上へのビオチン化ロバ抗ｈｕ－ＩｇＧ（捕捉）の添加；次いで、標準、品質管理、および試験サンプルの分配；次いで、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－ヤギ抗ｈｕ－ＩｇＧ（検出）の添加は、Ｇｙｒｏｌａｂプラットフォームにより自動的に誘発された。オンカラム蛍光測定（λｅｘｃ ６３３ｎｍ、λｅｍｍ ６５０ｎｍ）は、１％に設定した光電子増倍を使用して、各微細構造化セグメントにおいて行った。すべての分析は二つ組で行い、定量の範囲は１００～２００，０００ｎｇ／ｍＬであった。
ｍＡｂ３を用いて同様のＰＫ試験を行った。表２５および図２０に示すように、ｍＡｂ３上のＡＤＥ変異は、ｍＡｂ３ ＷＴと比べて高いＣＬおよび短い消失半減期をもたらした。ｍＡｂ３－ＡＤＥ構築物上でのＤＳＢ（Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ）の付加は、化合物のＰＫ特性を明らかに改善した。ｍＡｂ３ ＷＴおよびｍＡｂ３－ＡＤＥ－ＤＳＢ構築物は、同様のクリアランスおよび消失半減期を示した。
Figure 2024522092000045

Claims (139)

  1. 第１の重鎖と第２の重鎖とを含むグリコシル化Ｆｃドメインを含む、単離されたエフェクター能のあるポリペプチドであって、
    少なくとも１つの重鎖が、
    （ｉ）アミノ酸２４２位のロイシン（Ｌ）およびアミノ酸３３４位のリジン（Ｋ）；
    または
    （ｉｉｉ）アミノ酸２９２位のアルギニン（Ｒ）およびアミノ酸３０２位のバリン（Ｖ）
    を置換する一対のシステイン（Ｃ）により仲介される、操作された鎖内ジスルフィド結合を含み、
    前記アミノ酸位置は、ＥＵナンバリングに従い；
    前記グリコシル化Ｆｃドメインは、抗体エフェクター分子と相互作用でき；
    前記エフェクター能のあるポリペプチドは、前記操作された鎖内ジスルフィド結合を含まない抗体エフェクター分子と相互作用可能なグリコシル化Ｆｃドメインを有するエフェクター能のあるポリペプチドと比べて増強された熱安定性を有する、前記単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  2. 前記グリコシル化Ｆｃドメインが、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２９７位において天然グリカンを含む、請求項１に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  3. 前記グリコシル化Ｆｃドメインが、操作されたまたは非天然のグリカンを含む、請求項１に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  4. 前記操作されたまたは非天然のグリカンが、治療用分子に結合し得る修飾グリカンである、請求項３に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  5. Ｎ－グリコシル化されている、請求項１に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  6. 前記第１の重鎖が、前記一対のシステインを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  7. 前記第１および前記第２の重鎖の各々が、前記一対のシステインを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  8. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１のＦｃドメインである、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  9. 前記ＩｇＧ１のＦｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、請求項８に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  10. 前記抗体エフェクター分子がＦｃＲｎである、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  11. 野生型Ｆｃドメインと比べて増強された前記ＦｃＲｎに対する結合親和性を有する、請求項１０に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  12. 前記抗体エフェクター分子がＦｃγＲＩＩＩａである、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  13. 野生型Ｆｃドメインを含むポリペプチドと比べて増強された前記ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合親和性を有する、請求項１２に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  14. 野生型Ｆｃドメインと比べて変化した血清半減期を有する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  15. 野生型Ｆｃドメインと比べて向上した血清半減期を有する、請求項１４に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  16. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸３３２位において置換を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  17. アミノ酸３３２位での前記置換がグルタミン酸（Ｅ）である、請求項１６に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  18. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６、２３９、または３３０位において１つまたはそれ以上の置換を含む、請求項１６または１７に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  19. アミノ酸２３６位での前記置換がアラニン（Ａ）である、請求項１８に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  20. アミノ酸２３９位での前記置換がアスパラギン酸（Ｄ）である、請求項１８に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  21. アミノ酸３３０位での前記置換がロイシン（Ｌ）である、請求項１８に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  22. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  23. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  24. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３０位においてロイシン（Ｌ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  25. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２５６および／または３０７位において置換を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  26. アミノ酸２５６位での前記置換がアスパラギン酸（Ｄ）である、請求項２５に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  27. アミノ酸３０７位での前記置換がグルタミン（Ｑ）である、請求項２５に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  28. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  29. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  30. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  31. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３０位においてロイシン（Ｌ）、アミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  32. 単離されたエフェクター能のあるポリペプチドであって、
    少なくとも１つの重鎖が、
    （ｉ）アミノ酸２４２位のロイシン（Ｌ）およびアミノ酸３３４位のリジン（Ｋ）；
    または
    （ｉｉｉ）アミノ酸２９２位のアルギニン（Ｒ）およびアミノ酸３０２位のバリン（Ｖ）
    を置換する一対のシステイン（Ｃ）により仲介される、操作された鎖内ジスルフィド結合を含む、第１の重鎖と第２の重鎖とを含むグリコシル化Ｆｃドメイン
    を含み、
    前記グリコシル化Ｆｃドメインは、抗体エフェクター分子と相互作用でき、アミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含み；
    前記エフェクター能のあるポリペプチドは、抗体エフェクター分子と相互作用でき、アミノ酸３３２位にグルタミン酸（Ｅ）を含む、前記操作された鎖内ジスルフィド結合を含まないグリコシル化Ｆｃドメインを有する、エフェクター能のあるポリペプチドと比べて増強された熱安定性を有し；
    前記アミノ酸位置は、ＥＵナンバリングに従う、前記単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  33. 前記グリコシル化Ｆｃドメインが、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２９７位において天然グリカンを含む、請求項３２に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  34. 前記グリコシル化Ｆｃドメインが、操作されたまたは非天然のグリカンを含む、請求項３２または３３に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  35. 前記操作されたまたは非天然のグリカンが、治療用分子に結合し得る修飾グリカンである、請求項３４に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  36. Ｎ－グリコシル化されている、請求項３２に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  37. 前記第１の重鎖が、前記一対のシステインを含む、請求項３２～３６のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  38. 前記第１および前記第２の重鎖の各々が、前記一対のシステインを含む、請求項３２～３６のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  39. 前記修飾Ｆｃドメインが、ヒトの修飾Ｆｃドメインである、請求項３２～３８のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  40. 前記修飾Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１の修飾Ｆｃドメインである、請求項３９に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  41. 前記抗体エフェクター分子がＦｃＲｎである、請求項３２～４０のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  42. 野生型Ｆｃドメインと比べて増強された前記ＦｃＲｎに対する結合親和性を有する、請求項４１に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  43. 前記抗体エフェクター分子がＦｃγＲＩＩＩａである、請求項３２～４０のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  44. 野生型Ｆｃドメインを含むポリペプチドと比べて増強された前記ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合親和性を有する、請求項４３に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  45. 野生型Ｆｃドメインと比べて変化した血清半減期を有する、請求項３２～４４のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  46. 野生型Ｆｃドメインと比べて向上した血清半減期を有する、請求項４５に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  47. （ｉ） アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）；
    （ｉｉ） アミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）；
    （ｉｉｉ） アミノ酸３３０位においてロイシン（Ｌ）；
    （ｉｖ） アミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）；および／または
    （ｖ） アミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）
    をさらに含む、請求項３２～４６のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  48. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む、請求項４７に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  49. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む、請求項４７に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  50. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３０位においてロイシン（Ｌ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む、請求項４７に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  51. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む、請求項４７～５０のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  52. 前記１つまたはそれ以上の置換が、前記操作されたジスルフィド結合と同じ重鎖上にある、請求項４７～５１のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  53. 前記１つまたはそれ以上の置換が、前記操作されたジスルフィド結合とは異なる重鎖上にある、請求項４７～５１のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  54. さらに結合ドメインを含む、請求項３２～５３のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  55. 前記結合ドメインが、１つまたはそれ以上の抗原結合ドメインを含む、請求項５４に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  56. 前記１つまたはそれ以上の抗原結合ドメインが、腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項５５に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  57. 前記１つまたはそれ以上の抗原結合ドメインが、免疫細胞上の抗原に特異的に結合する、請求項５５に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  58. 前記ポリペプチドが抗体である、請求項３２～５７のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  59. 前記ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項５８に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  60. 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項５８または５９に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  61. 前記抗体が全長抗体である、請求項５８～６０のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  62. 前記ポリペプチドが単一ドメイン抗体である、請求項３２～５７のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  63. 前記単一ドメイン抗体がＶＨＨ抗体である、請求項６２に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  64. 前記抗体が多重特異性抗体である、請求項３２～５７のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  65. 前記多重特異性抗体が、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＣＯＤＶ－ＩｇであるＣＯＤＶベースフォーマット、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＭａｂ－Ｆａｂ、またはタンデムＦａｂからなる群から選択されるフォーマットである、請求項６４に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  66. 前記多重特異性抗体が、Ｔ細胞エンゲージャーである、請求項６４または６５に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  67. 前記多重特異性抗体が、ＮＫ細胞エンゲージャーである、請求項６４または６５に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  68. 前記結合ポリペプチドが、治療用ポリペプチドを含む、請求項５４に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  69. 前記治療用ポリペプチドが、受容体、リガンド、または酵素であり得る、請求項６８に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  70. 前記結合ポリペプチドが、前記ＦｃドメインのＮ末端および／またはＣ末端に連結している、請求項５４～５９のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  71. 抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）により、標的細胞を除去できる、請求項３２～７０のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  72. 前記標的細胞ががん細胞である、請求項７１に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  73. 前記標的細胞が免疫細胞である、請求項７１に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  74. 前記ポリペプチドがＦｃ融合ポリペプチドである、請求項３２～５７のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチド。
  75. 請求項１～７４のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチドをコードする核酸を含む、単離された核酸分子。
  76. 請求項７５に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
  77. 前記ベクターが発現ベクターである、請求項７６に記載のベクター。
  78. 請求項７６または７７に記載のベクターを含む宿主細胞。
  79. 真核生物起源または原核生物起源である、請求項７８に記載の宿主細胞。
  80. 哺乳類起源である、請求項７８または７９に記載の宿主細胞。
  81. 細菌起源である、請求項７８または７９に記載の宿主細胞。
  82. 請求項１～７４のいずれか１項に記載の単離されたエフェクター能のあるポリペプチドを含む医薬組成物。
  83. 単離されたエフェクター能のあるポリペプチドの収量を増加させる方法であって、
    前記方法は、第１の重鎖と第２の重鎖とを含むグリコシル化Ｆｃドメインを発現させることを含み、ここで、少なくとも１つの重鎖が、
    （ｉ）アミノ酸２４２位のロイシン（Ｌ）およびアミノ酸３３４位のリジン（Ｋ）；
    または
    （ｉｉｉ）アミノ酸２９２位のアルギニン（Ｒ）およびアミノ酸３０２位のバリン（Ｖ）
    を置換する一対のシステイン（Ｃ）により仲介される、操作された鎖内ジスルフィド結合を含み、
    前記アミノ酸位置は、ＥＵナンバリングに従い；
    前記グリコシル化Ｆｃドメインは、抗体エフェクター分子と相互作用でき；
    前記エフェクター能のあるポリペプチドは、前記操作された鎖内ジスルフィド結合を含まない、抗体エフェクター分子と相互作用できるグリコシル化Ｆｃドメインを有するエフェクター能のあるポリペプチドと比べて増強された熱安定性を有し；さらに、
    前記方法は、前記エフェクター能のあるポリペプチドを精製することを含み、ここで、野生型グリコシル化Ｆｃドメインを含むポリペプチドと比べてその収量が増加している、方法。
  84. 前記グリコシル化Ｆｃドメインが、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２９７位において天然グリカンを含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記グリコシル化Ｆｃドメインが、場合により、治療用分子に結合し得る修飾グリカンである、操作されたまたは非天然のグリカンを含む、請求項８３に記載の方法。
  86. 前記単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、Ｎ－グリコシル化されている、請求項８３に記載の方法。
  87. 前記第１の重鎖が、前記一対のシステインを含む、請求項８３～８６のいずれか１項に記載の方法。
  88. 前記第１および前記第２の重鎖の各々が、前記一対のシステインを含む、請求項８３～８６のいずれか１項に記載の方法。
  89. 前記ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、請求項８３～８８のいずれか１項に記載の方法。
  90. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１のＦｃドメインである、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記抗体エフェクター分子がＦｃＲｎである、請求項８３～９０のいずれか１項に記載の方法。
  92. 前記単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて増強された前記ＦｃＲｎに対する結合親和性を有する、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記抗体エフェクター分子がＦｃγＲＩＩＩａである、請求項８３～９０のいずれか１項に記載の方法。
  94. 前記単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインを含むポリペプチドと比べて増強された前記ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合親和性を有する、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて変化した血清半減期を有する、請求項８３～９４のいずれか１項に記載の方法。
  96. 前記単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、野生型Ｆｃドメインと比べて向上した血清半減期を有する、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記単離されたポリペプチドがさらに、１つまたはそれ以上の、エフェクター機能を増強するアミノ酸置換、場合により、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸３３２位における置換を含む、請求項８３～９６のいずれか１項に記載の方法。
  98. アミノ酸３３２位での前記置換がグルタミン酸（Ｅ）である、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６、２３９、または３３０位において１つまたはそれ以上の置換を含む、請求項９８に記載の方法。
  100. アミノ酸２３６位での前記置換がアラニン（Ａ）である、請求項９９に記載の方法。
  101. アミノ酸２３９位での前記置換がアスパラギン酸（Ｄ）である、請求項９９に記載の方法。
  102. アミノ酸３３０位での前記置換がロイシン（Ｌ）である、請求項９９に記載の方法。
  103. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む、請求項８３～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  104. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む、請求項８３～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  105. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３０位においてロイシン（Ｌ）、およびアミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）を含む、請求項８３～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  106. 前記単離されたエフェクター能のあるポリペプチドがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２５６および／または３０７位において置換を含む、請求項８３～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  107. アミノ酸２５６位での前記置換がアスパラギン酸（Ｄ）である、請求項１０６に記載の方法。
  108. アミノ酸３０７位での前記置換がグルタミン（Ｑ）である、請求項１０６に記載の方法。
  109. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む、請求項８３～１０８のいずれか１項に記載の方法。
  110. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む、請求項８３～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  111. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む、請求項８３～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  112. 前記Ｆｃドメインがさらに、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸２３６位においてアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９位においてアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸３３０位においてロイシン（Ｌ）、アミノ酸３３２位においてグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸２５６位においてアスパラギン酸（Ｄ）、およびアミノ酸３０７位においてグルタミン（Ｑ）を含む、請求項８３～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  113. 前記１つまたはそれ以上の置換が、前記操作されたジスルフィド結合と同じ重鎖上にある、請求項９７～１１２のいずれか１項に記載の方法。
  114. 前記１つまたはそれ以上の置換が、前記操作されたジスルフィド結合とは異なる重鎖上にある、請求項９７～１１２のいずれか１項に記載の方法。
  115. 前記単離されたエフェクター能のあるポリペプチドがさらに、結合ポリペプチドを含む、請求項８３～１１４のいずれか１項に記載の方法。
  116. 前記結合ポリペプチドが、１つまたはそれ以上の抗原結合ドメインを含む、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記１つまたはそれ以上の抗原結合ドメインが、腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記１つまたはそれ以上の抗原結合ドメインが、免疫細胞上の抗原に特異的に結合する、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが抗体である、請求項８３～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  120. 前記単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、モノクローナル抗体である、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１１９または１２０に記載の方法。
  122. 前記抗体が全長抗体である、請求項１１９～１２１のいずれか１項に記載の方法。
  123. 前記単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、単一ドメイン抗体である、請求項８３～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  124. 前記単一ドメイン抗体がＶＨＨ抗体である、請求項１２３に記載の方法。
  125. 前記抗体が多重特異性抗体である、請求項１１９～１２４のいずれか１項に記載の方法。
  126. 前記多重特異性抗体が、ＤＶＤ－Ｉｇ、場合によりＣＯＤＶ－ＩｇであるＣＯＤＶベースフォーマット、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＭａｂ－Ｆａｂ、またはタンデムＦａｂからなる群から選択されるフォーマットである、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記多重特異性抗体が、Ｔ細胞エンゲージャーである、請求項１２５または１２６に記載の方法。
  128. 前記多重特異性抗体が、ＮＫ細胞エンゲージャーである、請求項１２５または１２６に記載の方法。
  129. 前記結合ポリペプチドが、治療用ポリペプチドを含む、請求項１１５に記載の方法。
  130. 前記治療用ポリペプチドが、受容体、リガンド、または酵素であり得る、請求項１２９に記載の方法。
  131. 前記結合ポリペプチドが、前記ＦｃドメインのＮ末端および／またはＣ末端に連結している、請求項１１５～１３０のいずれか１項に記載の方法。
  132. 前記単離されたエフェクター能のあるポリペプチドが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）により、標的細胞を除去できる、請求項８３～１３１のいずれか１項に記載の方法。
  133. 前記標的細胞ががん細胞である、請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記標的細胞が免疫細胞である、請求項１３２に記載の方法。
  135. 前記単離されたエフェクター能のあるポリペプチドがＦｃ融合ポリペプチドである、請求項８３～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  136. 請求項１～７４のいずれか１項に記載のエフェクター能のあるポリペプチドの有効量を対象に投与することを含む、処置を必要とする前記対象において疾患または障害を処置する方法。
  137. 前記疾患または障害ががんである、請求項１３６に記載の方法。
  138. 前記疾患または障害が炎症性疾患である、請求項１３６に記載の方法。
  139. 前記疾患または障害が自己免疫疾患である、請求項１３６に記載の方法。
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