TW202035460A - 抗ｉｌ－３６抗體及其使用方法 - Google Patents

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TW202035460A TW108147052A TW108147052A TW202035460A TW 202035460 A TW202035460 A TW 202035460A TW 108147052 A TW108147052 A TW 108147052A TW 108147052 A TW108147052 A TW 108147052A TW 202035460 A TW202035460 A TW 202035460A
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路易斯 沙夫
埃里克 卡勒
嘉敏 傅
蒂娜 泰
阿什卡 帕特爾
沙申克 巴里爾
卿瑋 李
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美商２３與我有限公司
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Abstract

本發明提供結合蛋白，諸如抗體及抗原結合片段，所述結合蛋白特異性結合至人類IL-36細胞介素IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ，且阻斷IL-36刺激之信號傳導路徑。亦提供包括此類結合蛋白之組合物，及製造及使用此類結合蛋白之方法。

Description

抗IL-36抗體及其使用方法
本揭示案大體上係關於結合至IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ之結合蛋白，諸如抗體及抗原結合片段，及使用此類結合蛋白之方法。
【對序列表之參考】
序列表之正式複本以ASCII格式化正文檔案經由EFS-Web與說明書同時提交，其中檔案名稱為「09402-004WO1_SeqList_ST25.txt」，創建日期為2019年11月30日，且大小為1,386,547個位元組。經由EFS-Web申請之序列表為說明書之一部分且以全文引用之方式併入本文中。
介白素-1(IL-1)家族細胞介素配位體及受體與發炎、自體免疫、免疫調節、細胞增殖及宿主防禦相關，且促成發炎、自體免疫、免疫調節、退化性及細胞增殖性(例如，癌症)疾病及病症之病理學，且其細胞介素及受體充當此類疾病及病症之病原性介體。參見例如Cecilia Garlanda等人，《免疫(Immunity)》,39：1003-1018(2013)。IL-1家族細胞介素包含促發炎細胞介素介白素-36 α(IL-36 α或IL-36α)、介白素-36 β(IL-36β或IL-36b)及介白素-36 γ(IL-36 γ或IL-36γ)。此等IL-36細胞介素中之每一者充當能夠結合至在某些細胞表面上表現之同源受體IL-36R(亦稱為「IL1RL2」)的配位體，所述細胞包含皮膚、食道、扁桃體、肺、腸道、大腦細胞及包含T細胞之免疫細胞。在IL-36細胞介素與IL-36R結合後，輔助蛋白輔受體IL1RAP經募集，形成包括IL-36 細胞介素、IL-36R及IL1RAP之三元複合物。此三元複合物促進細胞內信號轉導及一組轉錄因子(包含NF-κB及AP-1)及促分裂原活化蛋白激酶之活化，其觸發發炎反應及免疫反應之級聯，包含在下游產生大量細胞介素、趨化介素、酶及黏著分子，包含IFN-γ、TNFα、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-23、CXCL1、CXCL8及CCL20。
已知IL-36細胞介素IL-36α、IL-36β及IL-36y在數種組織中高度表現，包含已暴露於病原體之皮膚及內部上皮組織。舉例而言，IL-36α、IL-36β及IL-36y之表現在TNF-α刺激之人類角質細胞中顯著上調(Carrier等人(2011)《皮膚病學研究雜誌(Journal of Investigative Dermatology)》)，且IL-36γ mRNA在牛皮癬皮膚病變中過度表現(D'Erme等人(2015)《皮膚病學研究雜誌》)。在慢性腎病中亦已觀測到升高的IL-36α mRNA及蛋白質表現(Ichii等人，《實驗室研究(Lab Invest.)》,90(3)：459-475(2010))。另外，鼠類骨髓源性樹突狀細胞(BMDC)及CD4+ T細胞藉由產生促發炎細胞介素(例如，IL-12、IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-23)對IL-36α、IL-36β及IL-36y起反應，藉此比其他IL-1細胞介素更有效力地誘導促發炎效應(Vigne等人，《血液(Blood)》,118(22)：5813-5823(2011))。
在角質細胞中過度表現IL-36α之轉殖基因小鼠在出生時展現短暫的發炎性皮膚病症，其使小鼠高度易感類似於人類牛皮癬的12-0-十四醯基佛波醇13-乙酸酯誘導之皮膚病變(Blumberg等人，《實驗醫學雜誌(J.Exp.Med.)》,204(1 1)：2603-2614(2007)；及Blumberg等人，《免疫學雜誌(J.Immunol)》,755(7)：4354-4362(2010))。此外，IL-36R缺陷型小鼠經保護免受咪喹莫特(imiquimod)誘導之牛皮癬樣皮炎(Tortola等人，《臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.)》,122(11)：3965-3976(2012))。此等結果強烈暗示IL-36在某些皮膚發炎性病症中之作用。
IL-36細胞介素涉及某些嚴重形式之牛皮癬，包含膿皰型牛皮癬、全身性膿皰型牛皮癬(GPP)及掌-膿皰病(PPP))(參見例如Town,IE.及Sims,IE.，《藥理學新見(Curr.Opin.Pharmacol)》,12(4)：486-90(2012)；及Naik,H.B.及Cowen,E.W.，《皮膚病學臨床(Dermatol Clin.)》,31(3)：405-425(2013))。膿皰型牛皮癬為一種罕見形式之牛皮癬，其特徵在於由紅色皮膚包圍之白色膿皰。全身性膿皰型牛皮癬為嚴重的全身性形式之膿皰型牛皮癬，其具有高死亡風險，而掌-蹠膿皰病為慢性形式之膿皰型牛皮癬，其影響手掌及足底。膿皰型牛皮癬、GPP及PPP之當前治療包含經口類視黃素及局部類固醇，但此等治療展現不良功效及嚴重副作用。
本揭示案提供以高親和力特異性結合至IL-36細胞介素之抗體。抗體能夠減少、抑制及/或完全阻斷由IL-36α、IL-36β或IL-36γ與其同源受體IL-36R結合刺激之信號傳導。本揭示案亦提供抗IL-36抗體在治療IL-36介導之疾病的方法中之用途，所述疾病諸如發炎性疾病、自體免疫疾病及癌症，包含但不限於急性全身性發疹性膿皰病(AGEP)、慢性阻塞性肺病(COPD)、兒童膿皰型皮膚病、濕疹、全身性膿皰型牛皮癬(GPP)、發炎性腸病(IBD)、掌蹠膿皰型牛皮癬(PPP)、牛皮癬、克羅恩氏病(Crohn's)患者中TNF誘導之牛皮癬形式皮膚病變、休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)及葡萄膜炎。
在一些實施例中，本揭示案提供一種抗IL-36抗體，其包括(i)一第一輕鏈高變區(HVR-L1)、一第二輕鏈高變區(HVR-L2)及一第三輕鏈高變區(HVR-L3)，及/或(ii)一第一重鏈高變區(HVR-H1)、一第二重鏈高變區(HVR-H2)及一第三重鏈高變區(HVR-H3)，其中：
(a)HVR-L1包括一選自以下之胺基酸序列：TGSSSNIGAHYDVH(SEQ ID NO：18)、TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO：22)、RASQSVSSNYLA(SEQ ID NO：38)或RASQTIYKYLN(SEQ ID NO：42)；
(b)HVR-L2包括一選自以下之胺基酸序列：SNNNRPS(SEQ ID NO：15)、GNDNRPS(SEQ ID NO：19)、GNTNRPS(SEQ ID NO：23)、GNRNRPS(SEQ ID NO：27)、SASSLQS(SEQ ID NO：39)或AASSLQS(SEQ ID NO：43)；
(c)HVR-L3包括一選自以下之胺基酸序列：QSYDYSLRGYV(SEQ ID NO：16)、QSYDYSLSGYV(SEQ ID NO：20)、QSYDYSLRVYV(SEQ ID NO：28)、QSYDYSLKAYV(SEQ ID NO：32)、QSYDISLSGWV(SEQ ID NO：36)、QQTYSYPPT(SEQ ID NO：40)或QQSSIPYT(SEQ ID NO：44)；
(d)HVR-H1包括一選自以下之胺基酸序列：SAYAMHW(SEQ ID NO：46)、STSSYYW(SEQ ID NO：50)、SSTSYYW(SEQ ID NO：54)、GSRSYYW(SEQ ID NO：58)、STYAMSW(SEQ ID NO：62)、TSSNYYW(SEQ ID NO：66)、SSYGMH(SEQ ID NO：70)、SNYAIS(SEQ ID NO：74)、TSTNYYW(SEQ ID NO：82)、TSSNAYW(SEQ ID NO：86)、TASNYYW(SEQ ID NO：90)、TASNTYW(SEQ ID NO：106)、SDSSYYW(SEQ ID NO：122)、SESSYYW(SEQ ID NO：126)、STSSDYW(SEQ ID NO：130)、SNSSYYW(SEQ ID NO：134)、STSSYHW(SEQ ID NO：142)、SRSSYYW(SEQ ID NO：146)、XXXNXYX(SEQ ID NO：251)，其中位置1處之X係T、D、E或N；位置2處之X係S、A、E、G、K、Q、R或T；位置3處之X係S、A、D、E、G、N、P、Q或T；位置5處之X係Y、A、E、G、H、M、N、Q、S、T或V；位置7處之X係W、F、I、V或Y，或XXXXXXW(SEQ ID NO：336)，其中位置1處之X係S或D；位置2處之X係T、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R或S；位置3處之X係S、D、E、G、K、N、P或R；位置4處之X係S、G、K、N或P；位置5處之X係Y、A、D、E、G、H、M、N、Q、S、T、V或W；位置6處之X係Y、A、F、G、H、M、N或Q；
(e)HVR-H2包括一選自以下之胺基酸序列：VISYDGTNEYYAD(SEQ ID NO：47)、SIYYTGNTYYNP(SEQ ID NO：51)、SIHYSGNTYYNP(SEQ ID NO：55)、SIHYSGTTYYNP(SEQ ID NO：59)、GISGGSGYTYYAD(SEQ ID NO：63)、SIDYTGSTYYNP(SEQ ID NO：67)、VISYGGSERYYAD(SEQ ID NO：71)、GILPILGTVDYAQ(SEQ ID NO：75)、NIDYTGSTYYNA(SEQ ID NO：83)、SIDYTGSTAYNP(SEQ ID NO：87)、SIDYTGSTYYNT(SEQ ID NO：91)、SIDYTGSTYYEP(SEQ ID NO：99)、SIDYTGSTYYEP(SEQ ID NO：103)、SIDYTGSTYYQP(SEQ ID NO：119)、SIYYTGNTYYNS(SEQ ID NO：123)、SIYYTGNTYYLP(SEQ ID NO：131)、SIYYTGNTYYMP(SEQ ID NO：143)、SIYYTGNTYYWP(SEQ ID NO：147)、SIYYTGETYYAP(SEQ ID NO：151)、XXDXXXXXXYXX(SEQ ID NO：284)，其中位置1處之X係S、N或T；位置2處之X係I、M或V；位置4處之X係Y或H；位置5處之X係T、H、L或N；位置6處之X係G、A、D、E、H、K、N、Q、R、S或T；位置7處之X係S、A、D、Q或T；位置8處之X係T、A、D或E；位置9處之X係Y、A、F、Q、S或W；位置11處之X係N、D、E、H、P或Q；位置12處之X係P、A或E，或XXXXXXXXXYXP(SEQ ID NO：379)，其中位置1處之X係S、F、I、M或Q；位置2處之X係I、A、G、L、R、S、T或V；位置3處之X係Y、A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或W；位置4處之X係Y、A、D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、T或W；位置5處之X係T、D、E、K、N、P或Q；位置6處之X係G或Q；位置7處之X係N、D、E、G、H、I、K、M、P、R或S；位置8處之X係T、A、E、F、G、H、K、P、Q、R、S、V、W或Y；位置9處之X係Y或W；位置11處之X係N、A、D、E、K、L、M、P、Q、S或T；
(f)HVR-H3包括一選自以下之胺基酸序列：ARGIRIFTSYFDS(SEQ ID NO： 48)、ARVRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：52)、ARVHYGGYIPRRFDH(SEQ ID NO：56)、ARVAPSYPRVFDY(SEQ ID NO：60)、ARVVTYRDPPASFDY(SEQ ID NO：64)、ARGKYYETYLGFDV(SEQ ID NO：68)、AREPWYSSRGWTGYGFDV(SEQ ID NO：72)、AREPWYRLGAFDV(SEQ ID NO：76)、ATGKYYETYLGFDV(SEQ ID NO：84)、AHGKYYETYLGFDV(SEQ ID NO：88)、ATGSYYETYLGFDV(SEQ ID NO：100)、ATGNYYETYLGFDV(SEQ ID NO：104)、ASGKYYETYLGFDV(SEQ ID NO：112)、ARGNYYETYLGFDV(SEQ ID NO：120)、AGVRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：128)、SRVRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：132)、VRVRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：144)、TRVRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：148)、ARLRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：152)、ARVKYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：156)、ARVRYGVGVPRHFDP(SEQ ID NO：160)、AXGXYYXTYLGFDV(SEQ ID NO：322)，其中位置2處之X係R、A、E、G、H、M、N、Q、S、T或Y；位置4處之X係K、A或S；位置7處之X係E或T，或XXXXXGXXVPRXFDP(SEQ ID NO：462)，其中位置1處之X係A或V；位置2處之X係R、A、G、N、Q或T；位置3處之X係V、A、F、I、K、L、M、Q或S；位置4處之X係R、A、I、K、L、M、P、Q、S、T或V；位置5處之X係Y、H、I、L或V；位置7處之X係V、A、F、G、K、M、N、Q、R、S、T、W或Y；位置8處之X係G、N、R、S或T；位置12處之X係Y、F、H、I、L、M、Q或R。
在一些實施例中，抗IL-36抗體包括：
(a)HVR-L1，其包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列；
(b)HVR-L2，其包括SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及
(c)HVR-L3，其包括SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗IL-36抗體包括：
(d)HVR-H1包括選自SEQ ID NO：66、82、86、90或252-283之胺基酸序列；
(e)HVR-H2包括選自SEQ ID NO：67、83、87、91、99、103、119或285-321之胺基酸序列；及
(f)HVR-H3包括選自SEQ ID NO：68、84、88、100、104、112、120或323-335之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗IL-36抗體包括：
(d)HVR-H1包括一選自SEQ ID NO：50、122、126、130、134、138、142、146或337-378之胺基酸序列；
(e)HVR-H2包括一選自SEQ ID NO：51、123、131、143、147、151或380-461之胺基酸序列；及
(f)HVR-H3包括一選自SEQ ID NO：52、128、132、144、148、152、156、160或463-513之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗IL-36抗體包括：
(a)HVR-L1包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列；
(b)HVR-L2包括SEQ ID NO：19之胺基酸序列；
(c)HVR-L3包括SEQ ID NO：20之胺基酸序列；
(d)HVR-H1包括選自SEQ ID NO：66、82、86、90或252-283之胺基酸序列；
(e)HVR-H2包括選自SEQ ID NO：67、83、87、91、99、103、119或285-321之胺基酸序列；及
(f)HVR-H3包括選自SEQ ID NO：68、84、88、100、104、112、120或323-335之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗IL-36抗體包括：
(a)HVR-L1包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列；
(b)HVR-L2包括SEQ ID NO：19之胺基酸序列；
(c)HVR-L3包括SEQ ID NO：20之胺基酸序列；
(d)HVR-H1包括一選自SEQ ID NO：50、122、126、130、134、138、142、146或337-378之胺基酸序列；
(e)HVR-H2包括一選自SEQ ID NO：51、123、131、143、147、151或380-461之胺基酸序列；及
(f)HVR-H3包括一選自SEQ ID NO：52、128、132、144、148、152、156、160或463-513之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗IL-36抗體包括與選自SEQ ID NO：13、17、21、25、29、33、37、41、77或78之序列具有至少90%一致性的輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或與選自SEQ ID NO：45、49、53、57、61、65、69、73、79、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之序列具有至少90%一致性的重鏈可變域(VH)胺基酸序列。在一些實施例中，抗IL-36抗體包括選自SEQ ID NO：13、17、21、25、29、33、37、41、77或78之輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或選自SEQ ID NO：45、49、53、57、61、65、69、73、79、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
在一些實施例中，抗IL-36抗體包括與SEQ ID NO：17或77具有至少90%一致性的輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或與選自SEQ ID NO：49、65、79、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之序列具有至少90%一致性的重鏈可變域(VH)胺基酸序列。在一些實施例中，抗IL-36抗體包括SEQ ID NO： 17或77之輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或選自SEQ ID NO：49、65、79、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
在一些實施例中，抗IL-36抗體包括與SEQ ID NO：17或77具有至少90%一致性的輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或與選自SEQ ID NO：65、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113或117之序列具有至少90%一致性的重鏈可變域(VH)胺基酸序列。在一些實施例中，抗IL-36抗體包括SEQ ID NO：17或77之輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或選自SEQ ID NO：65、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113或117之重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
在一些實施例中，抗IL-36抗體包括與SEQ ID NO：17或77具有至少90%一致性的輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或與選自SEQ ID NO：49、79、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之序列具有至少90%一致性的重鏈可變域(VH)胺基酸序列。在一些實施例中，抗IL-36抗體包括SEQ ID NO：17或77之輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或選自SEQ ID NO：49、79、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
在一些實施例中，抗IL-36抗體包括與SEQ ID NO：169或242具有至少90%一致性的輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或與選自SEQ ID NO：170-202、248、249或250之序列具有至少90%一致性的重鏈(HC)胺基酸序列。在一些實施例中，抗IL-36抗體包括SEQ ID NO：169或242之輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或選自SEQ ID NO：170-202、248、249或250之重鏈(HC)胺基酸序列。
在一些實施例中，抗IL-36抗體包括與SEQ ID NO：169或242具有至少90%一致性的輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或與選自SEQ ID NO：518-616 及743-751之序列具有至少90%一致性的重鏈(HC)胺基酸序列。在一些實施例中，抗IL-36抗體包括SEQ ID NO：169或242之輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或SEQ ID NO：518-616及743-751之重鏈(HC)胺基酸序列。
在一些實施例中，抗IL-36抗體包括與SEQ ID NO：169或242具有至少90%一致性的輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或與選自SEQ ID NO：203-241之序列具有至少90%一致性的重鏈(HC)胺基酸序列。在一些實施例中，抗IL-36抗體包括SEQ ID NO：169或242之輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或選自SEQ ID NO：203-241之重鏈(HC)胺基酸序列。
在一些實施例中，抗IL-36抗體包括與SEQ ID NO：169或242具有至少90%一致性的輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或與選自SEQ ID NO：617-733之序列具有至少90%一致性的重鏈(HC)胺基酸序列。在一些實施例中，抗IL-36抗體包括SEQ ID NO：169或242之輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或選自SEQ ID NO：617-733之重鏈(HC)胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭示案提供抗IL-36抗體，其中所述抗體為多特異性抗體，其包括：
(a)一對輕鏈，其各自包括：SEQ ID NO：18之HVR-L1序列；SEQ ID NO：19之HVR-L2序列；及SEQ ID NO：20之HVR-L3序列；
(b)重鏈，其包括：選自SEQ ID NO：66、82、86、90或106之HVR-H1序列；選自SEQ ID NO：67、83、87、91、99、103或119之HVR-H2序列；及選自SEQ ID NO：68、84、88、100、104、112或120之HVR-H3序列；及
(c)重鏈，其包括：選自SEQ ID NO：50、122、126、130、134、142或146之HVR-H1序列；選自SEQ ID NO：51、123、127、131、135、139、143、147、或151之HVR-H2序列；及HVR-H3包括選自SEQ ID NO：52、128、132、144、148、152、156或160之胺基酸序列。
在一些實施例中，多特異性抗體包括：
包括胺基酸取代T366W的重鏈中之一者，及包括胺基酸取代T366S、L368A及Y407V之另一重鏈。
在一些實施例中，多特異性抗體包括：
(a)一對輕鏈，其各自包括SEQ ID NO：17或77之輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；
(b)一重鏈，其包括一選自SEQ ID NO：65、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113或117之重鏈可變域(VH)胺基酸序列；及
(c)一重鏈，其包括一選自SEQ ID NO：49、79、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
在一些實施例中，多特異性抗體包括：
(a)一對SEQ ID NO：169及242之輕鏈(LC)胺基酸序列；
(b)重鏈(HC)胺基酸序列，其選自SEQ ID NO：171、174,177、180、183、186、189、192、195、198、201、249、521、522、523、530、531、532、539、540、541、548、549、550、557、558、559、566、567、568、575、576、577、584、585、586、593、594、595、602、603、604、611、612及613；及
(c)重鏈(HC)胺基酸序列，其選自SEQ ID NO：208、211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、632、633、634、641、642、643、650、651、652、659、660、661、668、669、670、677、678、679、686、687、688、695、696、697、704、705、706、713、714、715、722、723、724、731、732及733。
在一些實施例中，多特異性抗體包括：
(a)一對SEQ ID NO：169及242之輕鏈(LC)胺基酸序列；
(b)重鏈(HC)胺基酸序列，其選自SEQ ID NO：172、175、178、181、184、 187、190、193、196、199、202、250、524、525、526、533、534、535、542、543、544、551、552、553、560、561、562、569、570、571、578、579、580、587、588、589、596、597、598、605、606、607、614、615、616、749、750及751；及
(c)重鏈(HC)胺基酸序列，其選自SEQ ID NO：207、210、213、216、219、222、225、228、231、234、237、240、629、630、631、638、639、640、647、648、649、656、657、658、665、666、667、674、675、676、683、684、685、692、693、694、701、702、703、710、711、712、719、720、721、728、729及730。
在一些實施例中，本揭示案內容提供多特異性抗IL-36抗體，其中所述抗體包括一對SEQ ID NO：169之輕鏈(LC)胺基酸序列；及選自SEQ ID NO：192、584、585及586之重鏈(HC)胺基酸序列；及選自SEQ ID NO：235、713、714及715之重鏈(HC)胺基酸序列。
在本揭示案所提供之抗IL-36抗體之各種實施例中，所述抗體之特徵在於以下特性中之一或多者：
(a)以1×10-8M或更低、1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之結合親和力結合至hu-IL-36α、hu-IL-36-β及/或hu-IL-36-γ；視情況，其中所述抗體為多特異性的；
(b)以1×10-8M或更低、1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之結合親和力結合至hu-IL-36α及hu-IL-36-γ；
(c)以1×10-8M或更低、1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之結合親和力結合至hu-IL-36-β；
(d)為多特異性的，且在一條臂中包括對IL-36α及/或IL-36γ之特異性，且在另一臂中包括對IL-36β之特異性；視情況，其中一條臂以1×10-8M或更低、 1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之結合親和力結合至hu-IL-36α及hu-IL-36-γ，且另一臂以1×10-8M或更低、1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之結合親和力結合至hu-IL-36-β；
(e)將由IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之細胞內信號降低至少90%、至少95%、至少99%或100%；視情況，其中在約EC50之IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ濃度下，抗體之EC50為10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低；視情況，其中抗體為多特異性的；
(f)抑制由IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之來自初代人類角質細胞(PHK)的IL-8釋放，視情況，其中在約EC50之IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ濃度下，抗體之EC50為10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低；視情況，其中抗體為多特異性的；及/或
(g)與SEQ ID NO：5、6或7之食蟹獼猴的IL-36α、IL-36β或IL-36γ交叉反應；視情況，其中抗體為多特異性的。
本揭示案亦提供抗IL-36抗體之實施例，其中：(i)所述抗體為單株抗體；(ii)所述抗體為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體；(iii)所述抗體為IgG類全長抗體，視情況，其中所述IgG類抗體具有選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之同型；(iv)所述抗體為Fc區變異體，視情況，改變效應功能之Fc區變異體(例如，產生無效應抗體之變異體)或改變抗體半衰期之Fc區變異體；(v)所述抗體為抗體片段，視情況選自由F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、單域抗體(VHH)及scFv組成之群組；(vi)所述抗體為免疫綴合物，視情況，其中所述免疫綴合物包括用於治療IL-36介導之疾病之治療劑；(vii)所述抗體為多特異性抗體，視情況多特異性抗體；及(viii)所述抗體為合成抗體，其中HVR接枝至除免疫球蛋白支架或構架外之支架或構架上；視情況，選自替代性蛋白質支架及人工聚合物支架之支架上。
在其他實施例中，本揭示案提供編碼本文所揭示之抗IL-36抗體的經分離核酸。在一些實施例中，本揭示案亦提供一種宿主細胞，其包括編碼如本文所揭示之抗IL-36抗體之核酸。本揭示案亦提供一種產生抗IL-36抗體之方法，其中所述方法包括培養包括編碼抗IL-36抗體之核酸(或載體)的宿主細胞以使得抗體產生。
在一些實施例中，本揭示案提供一種醫藥組合物，其包括如本文所揭示之抗IL-36抗體及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥組合物包括抗IL-36抗體作為唯一活性劑；視情況，其中抗IL-36抗體為多特異性抗體，其在一條臂中包括對IL-36α及/或IL-36γ之特異性，且在另一臂中包括對IL-36β之特異性。在一些實施例中，所述醫藥組合物進一步包括用於治療IL-36介導之疾病或病狀的治療劑。
在一些實施例中，本揭示案提供一種治療個體之IL-36介導之疾病或病狀的方法，所述方法包括向個體投與治療有效量之如本文所揭示之抗IL-36抗體，或治療有效量之如本文所揭示之抗IL-36抗體之醫藥組合物。在一些實施例中，用途及治療方法包括投與包括抗IL-36抗體作為唯一活性劑之醫藥組合物；視情況，其中抗IL-36抗體為多特異性抗體，其在一條臂中包括對IL-36α及/或IL-36γ之特異性，且在另一臂中包括對IL-36β之特異性。
在本文所揭示之用途及治療方法的一些實施例中，IL-36介導之疾病選自發炎性疾病、自體免疫疾病及癌症。在一些實施例中，IL-36介導之疾病選自：由表皮生長因子受體抑制劑所致之痤瘡、痤瘡及化膿性汗腺炎(PASH)、急性全身性發疹性膿皰病(AGEP)、皺褶部位無微生物性膿皰病(amicrobial pustulosis of the folds)、頭皮/腿部無微生物性膿皰病、無微生物性角膜下膿皰病、無菌膿腫症候群、白塞氏病(Behçet's disease)、腸分流症候群、慢性阻塞性肺病(COPD)、兒童膿皰型皮膚病、克羅恩氏病、介白素-1受體拮抗劑缺乏 (DIRA)、介白素-36受體拮抗劑缺乏(DITRA)、濕疹、全身性膿皰型牛皮癬(GPP)、持久隆起性紅斑(erythema elevatum diutinum)、化膿性汗腺炎、IgA天疱瘡、發炎性腸病(IBD)、嗜中性白血球性脂層炎、掌蹠膿皰型牛皮癬(PPP)、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、膿皰型牛皮癬(DIRA、DITRA)、壞疽性膿皮病、化膿性關節炎壞疽性膿皮病及痤瘡(PAPA)、化膿性關節炎壞疽性膿皮病痤瘡及化膿性汗腺炎(PAPASH)、類風濕性嗜中性白血球性皮膚病、滑膜炎痤瘡膿皰病骨肥厚及骨炎(SAPHO)、克羅恩氏病患者中之TNF誘導之牛皮癬形式皮膚病變、休格連氏症候群、史維德氏症候群(Sweet's syndrome)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、潰瘍性結腸炎及葡萄膜炎。在一些實施例中，IL-36介導之疾病選自全身性膿皰型牛皮癬(GPP)、掌蹠膿皰型牛皮癬(PPP)及牛皮癬。在一些實施例中，IL-36介導之疾病為癌症；視情況，選自乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌及胰臟癌之癌症。
圖1A、圖1B及圖1C描繪來源於酵母展示之抗hu-IL-36抗體mAb2.0及mAb6.0在HaCat人類角質細胞細胞株中對IL-36刺激之細胞內信號傳導之抑制分析之結果的曲線。圖1A：mAb2.0對HaCat細胞之IL-36α刺激([IL-36α]=1.2nM)的抑制；IC50=0.28nM。圖1B：mAb6.0對HaCat細胞之IL-36β刺激([IL-36β]=0.175nM)的抑制；IC50=0.082nM。圖1C：mAb2.0對HaCat細胞之IL-36γ刺激([IL-36γ]=4nM)的抑制；IC50=1.23nM。所有分析均在約EC50之促效劑濃度下進行；所顯示之誤差槓表示與重複樣品之標準差。陰性對照(NC，顯示為灰色點線)表示僅暴露於生長培養基之細胞，而陽性對照(PC，顯示為灰色虛線)表示僅暴露於促效劑之細胞(在不存在拮抗性或對照抗體的情況下)。
圖2A、圖2B及圖2C描繪來源於酵母展示之抗hu-IL-36抗體mAb2.0及mAb6.0在初代人類新生兒合併角質細胞(HEKn)中對IL-36刺激之細胞內信號傳導之抑制分析之結果的曲線。圖2A：mAb2.0對HEKn細胞之IL-36α刺激([IL-36α]=1.2nM)的抑制；IC50=0.33nM。圖2B：mAb6.0對HEKn細胞之IL-36β刺激([IL-36β]=0.3nM)的抑制；IC50=1.75nM。圖2C：mAb2.0對HEKn細胞之IL-36γ刺激([IL-36γ]=7nM)的抑制；IC50=2.27nM。所有分析均在約EC50之促效劑濃度下進行；所顯示之誤差槓表示與重複樣品之標準差。陰性對照(NC，顯示為灰色點線)表示僅暴露於生長培養基之細胞，而陽性對照(PC，顯示為灰色虛線)表示僅暴露於促效劑之細胞(在不存在拮抗性或對照抗體的情況下)。
圖3A、圖3B及圖3C描繪抗hu-IL-36多特異性抗體mAb2.10/mAb6_2.7在HaCat人類角質細胞細胞株中對IL-36刺激之細胞內信號傳導之抑制分析之結果的曲線。圖3A：mAb2.10/mAb6_2.7對HaCat細胞之IL-36α刺激([IL-36α]=0.8nM)的抑制；IC50=0.38nM。圖3B：mAb2.10/mAb6_2.7對HaCat細胞之IL-36β刺激([IL-36β]=0.15nM)的抑制；IC50=0.13nM。圖3C：mAb2.10/mAb6_2.7對HaCat細胞之IL-36γ刺激([IL-36γ]=2nM)的抑制；IC50=1.1nM。所有分析均在約EC50之促效劑濃度下進行；所顯示之誤差槓表示與重複樣品之標準差。陰性對照(NC，顯示為灰色點線)表示僅暴露於生長培養基之細胞，而陽性對照(PC，顯示為灰色虛線)表示僅暴露於促效劑之細胞(在不存在拮抗性或對照抗體的情況下)。
圖4A、圖4B及圖4C描繪抗hu-IL-36多特異性抗體mAb2.10/mAb6_2.7在初代人類成人角質細胞(HEKa)中對IL-36刺激之細胞內信號傳導之抑制分析之結果的曲線。圖4A：mAb2.10/mAb6_2.7對HEKa細胞之IL-36α刺激([IL-36α]=1.1nM)的抑制；IC50=0.56nM。圖4B：mAb2.10/mAb6_2.7 對HEKa細胞之IL-36β刺激([IL-36β]=0.15nM)的抑制；IC50=0.11nM。圖4C：mAb2.10/mAb6_2.7對HEKa細胞之IL-36γ刺激([IL-36γ]=3.6nM)的抑制；IC50=2.7nM。所有分析均在約EC50之促效劑濃度下進行；所顯示之誤差槓表示與重複樣品之標準差。陰性對照(NC，顯示為灰色點線)表示僅暴露於生長培養基之細胞，而陽性對照(PC，顯示為灰色虛線)表示僅暴露於促效劑之細胞(在不存在拮抗性或對照抗體的情況下)。
本揭示案提供以高親和力特異性結合人類hu-IL-36細胞介素IL-36α、IL-36β及IL-36γ之抗體，包含多特異性抗體。所揭示之抗IL-36抗體能夠減少、抑制及/或完全阻斷藉由IL-36介導之路徑進行的細胞內信號傳導，包含藉由IL-36α、IL-36β或IL-36γ與其同源受體IL-36R結合刺激之信號傳導。本揭示案亦提供抗IL-36抗體在治療IL-36介導之疾病的方法中之用途，所述疾病諸如發炎性疾病、自體免疫疾病及癌症，具體而言包含但不限於急性全身性發疹性膿皰病(AGEP)、慢性阻塞性肺病(COPD)、兒童膿皰型皮膚病、濕疹、全身性膿皰型牛皮癬(GPP)、發炎性腸病(IBD)、掌蹠膿皰型牛皮癬(PPP)、牛皮癬、克羅恩氏病患者中TNF誘導之牛皮癬形式皮膚病變、休格連氏症候群、葡萄膜炎。
術語及技術之概述
對於本文及隨附申請專利範圍中之描述，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a)」及「一個(an)」包含複數個指示物。因此，例如，提及「一蛋白質」包含超過一種蛋白質，且提及「一化合物」係指超過一種化合物。應進一步注意，申請專利範圍可撰寫成排除任何視情況存在之要素。因此，此陳述意欲與對所主張要素之引述結合充當使用如「僅僅(solely)」、「僅(only)」及其類似術語之此類排他性術語或使用「負性」限制之前提基礎。 「包括(comprise/comprises/comprising)」及「包含(include/includes/including)」之使用為可互換的且並不意欲為限制性的。更應理解在各種實施例之描述使用術語「包括」之情況下，所屬領域中熟習此項技術者將理解在一些特定情況中，可使用專門用語「基本上由......組成」或「由......組成」替代地描述實施例。
在提供值範圍之情況下，除非上下文另外明確指示，否則應理解，本發明內涵蓋所述值之各介於其間的整數，及除非上下文另外明確指示，否則本發明涵蓋所述值之各介於其間的整數之在所述範圍之上限與下限之間的各十分之一，及所陳述範圍中之任何其他所陳述的或介於其間的值。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包含於更小的範圍內，且亦涵蓋於本發明內，在所陳述範圍內受到任何特別排除的限制。在所陳述之範圍包含此等限制中之一者或兩者之情況下，排除彼等所包含之限制中之(i)任一者或(ii)兩者之範圍亦包含於本發明中。舉例而言，「1至50」包含「2至25」、「5至20」、「25至50」、「1至10」等。
一般而言，本文所用之命名法及本文所描述之技術及程序包含本領域中之一般技術者充分理解且通常所採用的命名法與技術及程序，諸如以下文獻中所描述之常見技術及方法：Sambrook等人，《分子選殖實驗室手冊(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)》(第2版)，第1-3卷，紐約州冷泉港之冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.),1989(下文「Sambrook」)；《分子生物學當前方案(Current Protocols in Molecular Biology)》,F.M.Ausubel等人編，Current Protocols，格林出版聯合公司(Greene Publishing Associates,Inc.)與約翰．威利父子出版公司(John Wiley & Sons,Inc.)之合資公司(增刊至2011年)(下文「Ausubel」)；《抗體工程改造(Antibody Engineering)》，第1卷及第2卷，R.Kontermann及S.Dubel編，施普林格出版社(Springer-Verlag)，柏林(Berlin)及海德堡(Heidelberg)(2010)；《單株抗體： 方法及方案(Monoclonal Antibodies：Methods and Protocols)》,V. Ossipow及N.Fischer編，第2版，胡馬納出版社(Humana Press)(2014)；《治療性抗體：自實驗室至臨床(Therapeutic Antibodies：From Bench to Clinic)》,Z.An編，新澤西州荷波肯之約翰．威利父子出版公司(J.Wiley & Sons,Hoboken,N.J.)(2009)；及《噬菌體呈現(Phage Display)》,Tim Clackson及Henry B.Lowman編，英國牛津大學出版社(Oxford University Press,United Kingdom)(2004)。
本揭示案中所引用之所有公開案、專利、專利申請案及其他文獻均出於所有目的以全文引用之方式併入本文中，引用程度就如同各個別公開案、專利、專利申請案或其他文獻經個別地指示出於所有目的以引用之方式併入本文中一樣。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解相同的含義。應理解，本文所用之術語僅用於描述特定實施例且不意欲為限制性的。出於解釋本揭示案之目的，將應用以下術語說明，且在適當的情況下，以單數形式使用之術語亦將包含複數形式，且反之亦然。
如本文所用，「IL-36」係指介白素-36細胞介素IL-36α、IL-36β及IL-36γ統稱。
如本文所用，「IL-36α」或「IL-36a」係指來自其存在之任何物種的介白素-36α細胞介素。「hu-IL-36α」及「cy-IL-36α」分別係指來自人類及食蟹獼猴之IL-36α細胞介素。
如本文所用，「IL-36β」或「IL-36b」係指來自其存在之任何物種的介白素-36β細胞介素。「hu-IL-36β」及「cy-IL-36β」分別係指來自人類及食蟹獼猴之IL-36β細胞介素。
如本文所用，「IL-36γ」或「IL-36g」係指來自其存在之任何物種 的介白素-36γ細胞介素。「hu-IL-36γ」及「cy-IL-36γ」分別係指來自人類及食蟹獼猴之IL-36γ細胞介素。
如本文所用，「IL-36介導之病狀」或「IL-36介導之疾病」涵蓋與由IL-36細胞介素IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之任一者與其同源受體IL-36R結合介導之信號傳導路徑之異常功能相關的任何醫學病狀，所述路徑包含但不限於已知由IL-36細胞介素刺激之下游路徑，其引起產生細胞介素、趨化介素、酶及黏著分子，包含但不限於IFN-γ、TNFα、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-23、CXCL1、CXCL8及CCL20。舉例而言，IL-36介導之疾病可包含但不限於由IL-36信號傳導路徑介導及/或對所述路徑之拮抗劑或抑制劑起反應的疾病，包含發炎性疾病、自體免疫疾病及癌症。更具體而言，IL-36介導之疾病可包含但不限於由表皮生長因子受體抑制劑所致之痤瘡、痤瘡及化膿性汗腺炎(PASH)、急性全身性發疹性膿皰病(AGEP)、皺褶部位無微生物性膿皰病、頭皮/腿部無微生物性膿皰病、無微生物性角膜下膿皰病、無菌膿腫症候群、白塞氏病、腸分流症候群、慢性阻塞性肺病(COPD)、兒童膿皰型皮膚病、克羅恩氏病、介白素-1受體拮抗劑缺乏(DIRA)、介白素-36受體拮抗劑缺乏(DITRA)、濕疹、全身性膿皰型牛皮癬(GPP)、持久隆起性紅斑、化膿性汗腺炎、IgA天疱瘡、發炎性腸病(IBD)、嗜中性白血球性脂層炎、掌蹠膿皰型牛皮癬(PPP)、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、膿皰型牛皮癬(DIRA、DITRA)、壞疽性膿皮病、化膿性關節炎壞疽性膿皮病及痤瘡(PAPA)、化膿性關節炎壞疽性膿皮病痤瘡及化膿性汗腺炎(PAPASH)、類風濕性嗜中性白血球性皮膚病、滑膜炎痤瘡膿皰病骨肥厚及骨炎(SAPHO)、克羅恩氏病患者中之TNF誘導之牛皮癬形式皮膚病變、休格連氏症候群、史維德氏症候群、全身性紅斑狼瘡(SLE)、潰瘍性結腸炎及葡萄膜炎。
如本文所用，「IL-36刺激之信號」係指藉由IL-36細胞介素 IL-36α、IL-36β或IL-36γ中之任一者與其同源受體IL-36R結合引發的細胞內信號。例示性IL-36刺激之信號包含來自HaCat細胞及/或初代人類成人或新生兒角質細胞(HEKn或HEKa)的IL-8釋放，以及使用替代的基於細胞之阻斷分析，諸如本文實例中所揭示之基於HEK-BLUETM IL-36反應性細胞之分析來量測的信號。
「基於細胞之阻斷分析」係指可量測抗體抑制或降低其所結合之抗原之生物活性的能力的分析。舉例而言，基於細胞之阻斷分析可用於量測抑制特定生物或生物化學功能所需之抗體濃度，所述功能諸如IL-36細胞介素介導之細胞內信號傳導。在一些實施例中，使用基於細胞之阻斷分析來量測抗體(例如，本揭示案之抗IL-36抗體)之半數最大抑制濃度(IC50)及/或90%抑制濃度(IC90)。在一些實施例中，基於細胞之阻斷分析用於確定抗體是否阻斷促效劑(例如，IL-36α、IL-36β、IL-36γ)與其同源受體之間的相互作用。適用於本揭示案之抗體的基於細胞之阻斷分析可包含基於細胞株之分析(例如，HaCat細胞)或初代細胞分析(例如，初代人類角質細胞)以及報導或感測細胞分析(例如，HEK-BLUETM報導細胞分析)。例示性的IL-36信號傳導路徑之基於細胞之阻斷分析描述於本文所提供之實例中。
如本文所用，「抗體」係指包括一或多條特異性結合至特定抗原或可與特定抗原發生免疫反應之多肽鏈的分子。例示性本揭示案抗體包含單株抗體、多株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、多特異性(或異結合)抗體(例如，三特異性抗體、雙特異性抗體等)、單價抗體(例如，單臂抗體)、多價抗體、抗原結合片段(例如，Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG及scFv片段)、抗體融合物及合成抗體(或抗體模擬物)。
「抗IL-36抗體」或「結合IL-36之抗體」係指一種抗體，其以足夠的親和力結合IL-36(包含IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之一或多者)，使得所 述抗體適用作靶向IL-36(亦即IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之一或多者)的診斷及/或治療劑。在一些實施例中，如例如藉由放射免疫分析(RIA)、藉由表面電漿子共振(SPR)或類似分析所量測，抗IL-36抗體與不相關的非IL-36抗原之結合程度低於抗體與IL-36之結合的約10%。在一些實施例中，結合至IL-36之抗體具有<1μM、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<1pM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)之解離常數(KD)。
「全長抗體」、「完整抗體」或「完全抗體」在本文中可互換使用，以指結構實質上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。
「抗體片段」係指能夠與全長抗體結合相同抗原的全長抗體之部分。抗體片段之實例包含但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單價或單臂抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。存在五種主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、γ及μ。
「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原之結合的域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別為VH及VL)通常具有類似結構，其中各域包括四個保守性構架區(FR)及三個高變區(HVR)(參見例如Kindt等人，《Kuby免疫學(Kuby Immunology)》，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁)。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合所述抗原之抗體的VH或VL域分別篩選互補VL或 VH域之文庫而分離(參見例如Portolano等人，《免疫學雜誌(J.Immunol.)》,150：880-887(1993)；Clarkson等人，《自然(Nature)》,352：624-628(1991))。
如本文所用，「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中在序列上具有高變性及/或形成結構上限定之環(「高變環」)的各區。一般而言，天然抗體包括四條鏈，具有六個HVR；三個在重鏈可變域VH中(HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3)，且三個在輕鏈可變域VL中(HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)。HVR一般包括來自高變環及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基。本文中使用且涵蓋多種高變區描述。Kabat互補決定區(CDR)係基於序列可變性且為最常用的(Kabat等人，《免疫學感興趣的蛋白質之序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，第5版，馬里蘭州貝塞斯達國立衛生研究院公共衛生處(Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md)(1991))。Chothia提及結構環之位置(Chothia及Lesk，《分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)》196：901-917(1987))。AbM高變區表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體使用。「接觸」高變區係基於對可用複雜晶體結構之分析。以下表中標示來自此等高變區中之每一者的殘基。
Figure 108147052-A0202-12-0023-113
除非另外指示，否則在本文中，根據Kabat等人，同前文獻對可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)進行編號。
如本文所用，高變區可包含如下擴展或替代高變區：在VL域中，24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)及89-97或89-96(L3)；及在VH域中，26-35、30-35、30-35A、30-35B或31-35B(H1)，50-61、50-65或49-65(H2)及93-102、94-102或95-102(H3)。可變域殘基根據Kabat等人，同前文獻，關於此等定義中之每一者編號。
如本文所用，「互補決定區」或「CDR」係指可變域之HVR內具有最高序列變異性及/或參與抗原識別之區。一般而言，天然抗體包括四條鏈，具有六個CDR；三個在重鏈可變域VH中(H1、H2、H3)，且三個在輕鏈可變域VL中(L1、L2、L3)。本揭示案之例示性抗IL-36抗體之CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基24-34、L2之胺基酸殘基50-56、L3之胺基酸殘基89-97、H1之胺基酸殘基30-35A、H2之胺基酸殘基50-61及H3之胺基酸殘基93-102處。(根據Kabat等人，同前文獻編號)。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基外之可變域殘基。可變域之FR一般由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，在VH(或VL)中，HVR及FR序列一般按以下序列出現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
「天然抗體」係指天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體為約150,000道爾頓(Dalton)之雜四聚體醣蛋白，其由以二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，接著為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈 可變域，接著為恆定輕鏈(CL)域。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種，稱為卡帕(κ)及拉姆達(λ)。
如本文所用，「單株抗體」係指自實質上同質的抗體群體獲得之抗體，亦即，除可能的變異抗體(例如，含有天然存在或在單株抗體之產生期間出現且一般以少量存在之突變的變異抗體)以外，構成所述群體之個別抗體為相同的及/或結合相同抗原決定基。相比於通常包含針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，術語「單株」指示抗體之特徵為自實質上同質的抗體群體獲得，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，待使用之單株抗體可藉由多種技術製得，所述技術包含但不限於融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有人類免疫球蛋白基因座之全部或部分之基因轉殖動物的方法，此類方法及用於製造單株抗體之其他例示性方法描述於本文中。
「嵌合抗體」係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種的抗體。
「人類化抗體」係指包括來自非人類HVR之胺基酸序列及來自人類FR之胺基酸序列的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包括大體上所有的至少一個且通常兩個可變域，其中所有或實質上所有HVR(例如，CDR)均與非人類抗體之HVR對應，且所有或實質上所有FR均與人類抗體之FR對應。人類化抗體視情況可包括來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。例如非人類抗體之抗體的「人類化形式」係指已經歷人類化之抗體。
「人類抗體」係指具有與由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體譜系或其他編碼人類抗體之序列的非人類來源之抗體的胺基酸序列所對應之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義特別排除包括非人類抗原結合殘基之人 類化抗體。
「人類共同構架」為表示人類免疫球蛋白VL或VH構架序列選擇中最常出現之胺基酸殘基的構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之亞群。一般而言，序列亞群為如Kabat等人，《免疫學感興趣的蛋白質之序列》，第五版，NIH Publication 91-3242，馬里蘭州貝塞斯達(1991)，第1-3卷中之亞群。在一個實施例中，對於VL，亞群為如Kabat等人，同前文獻中之亞群κ I。在一個實施例中，對於VH，亞群為如Kabat等人，同前文獻中之亞群III。
如本文所用，「接受體人類構架」為包括來源於人類免疫球蛋白構架或人類共同構架的輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包括人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列改變。在一些實施例中，胺基酸改變之數目為10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少或2個或更少。在一些實施例中，VL接受體人類構架與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列在序列上一致。
「Fc區」係指包括免疫球蛋白重鏈之C端多肽序列之二聚體複合物，其中C端多肽序列為可藉由木瓜蛋白酶消化完整抗體獲得的序列。Fc區可包括天然或變異Fc序列。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc序列之邊界可變化，但通常將人類IgG重鏈Fc序列定義為自約位置Cys226或自約位置Pro230處之胺基酸殘基延伸至Fc序列之羧基端。然而，Fc序列之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。免疫球蛋白之Fc序列一般包括兩個恆定域，即CH2域及CH3域，且視情況包括CH4域。
「Fc受體」或「FcR」係指結合至抗體之Fc區之受體。在一些實 施例中，FcR為天然人類FcR。在一些實施例中，FcR為結合IgG抗體之受體(γ受體)且包含FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類之受體，包含彼等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式。FcγRII受體包含FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，其具有類似之胺基酸序列，不同之處主要在於其細胞質域。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(ITIM)(參見例如Daeron，《免疫學年鑒(Annu.Rev.Immunol.)》15：203-234(1997))。如本文所用，FcR亦包含新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，《免疫學雜誌》1 17：587(1976)及Kim等人，《免疫學雜誌》24：249(1994))及調節免疫球蛋白之穩態。FcR綜述於例如Ravetch及Kinet，《免疫學年鑒》，9：457-92(1991)；Capel等人，《免疫方法(Immunomethods)》4：25-34(1994)；及de Haas等人，《實驗室與臨床醫學雜誌(J.Lab.Clin.Med.)》126：330-41(1995)中。
如本文所用，「多價抗體」為包括三個或更多個抗原結合位點之抗體。多價抗體較佳經工程改造為具有三個或更多個抗原結合位點且一般不為天然序列IgM或IgA抗體。
「多特異性抗體」為具有至少兩個不同結合位點之抗體，各位點具有不同結合特異性。多特異性抗體可為全長抗體或抗體片段，且不同結合位點可各自結合至不同抗原，或不同結合位點可結合至相同抗原之兩種不同抗原決定基。
「Fv片段」係指含有完整抗原識別及結合位點之抗體片段。此區由緊密締合的一個重鏈及一個輕鏈可變域之二聚體組成，所述緊密締合在性質上可為共價的，例如在scFv中。在此組態中，各可變域之三個HVR相互作用以界定VH-VL二聚體表面上之抗原結合位點。六個HVR或其亞組一起賦予抗體抗 原結合特異性。然而，即使單一可變域(或僅包括三個對抗原具有特異性之HVR的半個Fv)亦具有識別及結合抗原之能力，儘管親和力通常低於整個結合位點。
「Fab片段」係指含有輕鏈之可變域及恆定域及重鏈之可變域及第一恆定域(CH1)的抗體片段。「F(ab')2片段」包括一對Fab片段，其一般在其羧基端附近由在其之間的鉸鏈半胱胺酸共價鍵聯。本領域中亦已知抗體片段之其他化學偶合。
如本文所用，「抗原結合臂」係指具有特異性結合感興趣之目標分子的能力的抗體組分。通常，抗原結合臂為免疫球蛋白多肽序列之複合物，例如免疫球蛋白輕鏈及重鏈之HVR及/或可變域序列。
「單鏈Fv」或「scFv」係指包括抗體之VH及VL域的抗體片段，其中此等域存在於單一多肽鏈中。一般而言，Fv多肽進一步包括在VH與VL域之間的多肽連接子，其使得scFv能夠形成所期望的抗原結合結構。
「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，所述片段包括連接至同一多肽鏈(VH及VL)中之輕鏈可變域(VL)的重鏈可變域(VH)。藉由使用過短以使得同一鏈上之兩個域之間不能配對的連接子，迫使域與另一條鏈之互補域配對，且產生兩個抗原結合位點。
「線性抗體」係指Zapata等人，《蛋白質工程改造(Protein Eng.)》,8(10)：1057-1062(1995)中所描述之抗體。簡言之，此等抗體包括串聯Fd區(VH-CH1-VH-CH1)對，其與互補輕鏈多肽一起形成抗原結合區對。線性抗體可為多特異性(例如，三特異性或雙特異性)或單特異性的。
「裸抗體」係指未與異源部分(例如，細胞毒性部分)或放射性標記結合之抗體。
「親和力」係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如，抗原)之間的非共價相互作用的總和的強度。「結合親和力」係指 內在結合親和力，其反映結合對(例如，抗體及抗原)之成員之間的1：1相互作用。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由平衡解離常數(KD)表示。親和力可藉由本領域中已知之常用方法，包含本文所描述之方法來量測。用於量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例描述於下文中。
「特異性地結合」或「特異性結合」係指抗體與抗原以不超過約1×10-7M之親和力值結合。
「親和力成熟」抗體係指相比於親本抗體，在一或多個HVR中存在一或多種改變的抗體，親本抗體不具有此類改變，此類改變引起抗體對抗原之親和力改良。
抗體之「功能性抗原結合位點」為能夠結合目標抗原之抗原結合位點。抗原結合位點之抗原結合親和力不一定與衍生出抗原結合位點之親本抗體一樣強，但結合抗原之能力必須可使用已知用於評估抗體與抗原之結合的多種方法中之任一者量測。
「經分離抗體」係指已與其天然環境之組分分離之抗體。在一些實施例中，將抗體純化至大於95%或99%之純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析方法(例如，離子交換或逆相HPLC)所測定。關於用於評定抗體純度之方法的綜述，參見例如Flatman等人，《層析雜誌B輯(J.Chromatogr.B)》848：79-87。
如本文所用，「實質上相似」或「實質上相同」係指兩個數值(例如，一個與測試抗體相關且另一個與參考抗體相關)之間的相似度足夠高，使得本領域中之熟習此項技術者將認為，在由所述值(例如，KD值)量測之生物學特徵的背景下，兩個值之間的差異具有很小的或沒有生物及/或統計顯著性。
如本文所用，「實質上不同」係指兩個數值(通常，一個與分子相關且另一個與參考分子相關)之間的差異度足夠高，使得本領域中之熟習此 項技術者將認為，在由所述值(例如，KD值)量測之生物學特徵的背景下，兩個值之間的差異具有統計顯著性。
「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包含：Clq結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
「免疫綴合物」係指與一或多個異源分子綴合之抗體，所述異源分子包含但不限於細胞毒性劑。
「治療(treatment/treat/treating)」係指試圖改變待治療個體之病症之自然過程的臨床干預，且可為了預防而進行或在臨床病理學過程中進行。所期望的治療結果可包含但不限於預防病症發生或復發、緩解症狀、減輕病症之任何直接或間接病理性結果、預防轉移、降低進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改善預後。舉例而言，治療可包含向個體投與治療有效量之包括抗IL-36抗體的醫藥調配物，以延遲以下之發展或減慢其進展：由IL-36介導之疾病或病狀，或其中IL-36或由IL-36細胞介素刺激之下游路徑可能在發病機制及/或進展中起作用的疾病或病狀。
「醫藥調配物」係指呈一種形式的製劑，所述形式允許(多種)活性成分之生物活性有效，且不含對投與所述調配物之個體有毒的額外組分。醫藥調配物可包含一或多種活性劑。舉例而言，醫藥調配物可包含抗IL-36抗體作為調配物之唯一活性劑，或可包含抗IL-36抗體及一或多種額外活性劑。
如本文所用，「唯一活性劑」意謂所提及的藥劑為存在於調配物中或用於療法中的唯一藥劑，其提供或將預期提供治療個體之病狀的相關藥理作用，與本文所提供之「治療」的描述一致。包括唯一活性劑之醫藥調配物不排除調配物中存在一或多種非活性劑，例如醫藥學上可接受之載劑。「非活性 劑」係指預期不會提供或以其他方式顯著促進意欲治療個體之病狀之相關藥理作用的藥劑。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外之對其所投與之個體無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包含但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
「治療有效量」係指活性成分或藥劑(例如，醫藥調配物)達成所期望的治療或預防結果，例如治療或預防個體之疾病、病症或病狀的量。在IL-36介導之疾病或病狀之情況下，治療劑之治療有效量為在一定程度上降低、預防、抑制及/或減輕與疾病、病症或病狀相關的症狀中之一或多者的量。對於發炎性病狀，諸如皮膚發炎性病狀(例如，濕疹、牛皮癬、紅斑痤瘡、脂溢性皮炎)之治療，活體內功效可例如藉由評定症狀之持續時間、嚴重程度及/或復發、反應率(RR)、反應持續時間及/或生活品質來量測。
如本文所用，「同時」係指兩種或更多種治療劑之投與，其中至少一部分投與在時間上重疊。因此，同時投與包含在中斷投與一或多種其他藥劑之後繼續投與一或多種藥劑時的給藥方案。
「個體(individual)」或「個體(subject)」係指哺乳動物，包含但不限於家畜(例如，牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如，小鼠及大鼠)。
各種實施例之詳細描述
I.IL-36細胞介素
促效劑細胞介素IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之每一者藉由結合至同源受體IL-36R(或IL1RL2)而誘導細胞內信號傳導。由此等IL-36細胞介素中之任一者與IL-36R受體結合造成輔受體IL1RAP之募集及接合，引起包括IL-36R、IL1RAP及引發信號傳導事件之各別IL-36細胞介素的三元信號傳導複 合物之形成。由IL-36α、IL-36β或IL-36γ刺激之信號轉導引起目標細胞中之NK-κB轉錄因子及AP-1路徑之活化且誘導各種發炎、增殖及病原性免疫反應。參見例如Jennifer Towne等人，《生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)》279(14)：13677-13688(2004)；Sebastian Gunther等人，《免疫學雜誌》。193(2)：921-930(2014)。
IL-36細胞介素IL-36α、IL-36β及IL-36γ為相對短的蛋白質，其結合至受體IL-36R且充當其促效劑。在活體內，IL-36細胞介素經歷蛋白水解加工，其導致N端截短。此截短對於IL-36α、IL-36β及IL-36γ達成其對IL-36R之完全促效活性係必需的。類似地，IL-36R拮抗劑IL-36Ra需要N端截短以便達成其完全拮抗活性。人類形式IL-36α、IL-36β、IL-36γ(在本文中亦稱為「hu-IL-36α」、「hu-IL-36β」及「hu-IL-36γ」)及IL-36Ra之胺基酸及核苷酸序列及標註為可公開獲得的。參見例如，分別在UniProt條目號Q9UHA7、Q9NZH7-2、Q9NZH8及Q9UBH0處之全胺基酸序列。類似地，在本文中稱為「cy-IL-36α」、「cy-IL-36β」及「cy-IL-36γ」的來自食蟹獼猴之三種IL-36細胞介素之形式的胺基酸及核苷酸序列，亦可在UniProt條目號A0A2K5UTG0、A0A2K5UV63-1及A0A2K5VYV6處公開獲得。
對應於hu-IL-36及cy-IL-36細胞介素蛋白質之部分的多肽構築體可用作抗原，以誘發抗IL-36抗體對特定IL-36細胞介素IL-36α、IL-36β及IL-36γ之人類及/或食蟹獼猴形式的結合親和力。如本文別處所揭示，此等抗IL-36抗體能夠部分或完全阻斷特定細胞介素IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之一或多者與其同源受體之結合，且藉此減少由此結合引發之細胞內信號。藉由用IL-36抗原免疫接種產生之抗體可經修飾，例如，如本文所描述，以調節(增強或減弱)抗體之某些特性，包含但不限於例如增強對IL-36抗原之親和力、增強對另一IL-36抗原之親和力、增強交叉反應性、減弱交叉反應性等。
以下表1提供用於產生本揭示案之抗IL-36抗體的人類及食蟹獼猴IL-36多肽構築體之序列之概述及其序列識別符。亦包含蛋白質之UniProt資料庫條目標識符，以及構築體序列相對於全長蛋白質之域邊界。IL-36α、IL-36β、IL-36γ或IL-36Ra多肽構築體中之每一者的序列對應於具有最高促效活性，或在IL-36Ra之情況下，具有最高拮抗活性之N端截短形式。舉例而言，表1中所提供之N端截短IL-36α、IL-36β及IL-36γ胺基酸序列分別在N端位置K6、R5及S18開始。另外，如本文別處所描述，純化標籤序列用於製造可容易純化形式之IL-36蛋白。所述序列亦包含於隨附序列表中。
表1：IL-36序列及純化標籤
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II.抗IL-36抗體
在一些實施例中，本揭示案按照各種熟知免疫球蛋白特徵(例如，CDR、HVR、FR、VH及VL域)之胺基酸及編碼核苷酸序列提供抗IL-36抗體之結構。以下表2提供本揭示案之例示性抗IL-36抗體序列之概述及其序列識別符。此等序列及其他序列包含於隨附序列表中。
表2：抗IL-36抗體序列
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1.抗IL-36抗體之結合親和力及細胞信號傳導抑制
在一些實施例中，本文所提供之抗IL-36抗體對於與人類細胞介素hu-IL-36α、hu-IL-36β及/或hu-IL-36γ之結合具有<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<0.001nM(例如，10-8M或更低、10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M之平衡解離常數(KD)。更具體而言，在一些實施例中，本揭示案之抗IL-36抗體以1×10-8M或更低、1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之結合親和力結合至hu-IL-36α、hu-IL-36β及/或hu-IL-36γ。在一些實施例中，結合親和力按照結合至分別SEQ ID NO：1、2及3之hu-IL-36α、hu-IL-36β或hu-IL-36γ多肽構築體之平衡解離常數(KD)來量測。
一般而言，配位體與其受體之結合親和力可使用多種分析中之任一者測定且根據多種定量值表示。適用於測定抗體親和力之特異性IL-36結合分析揭示於本文實例中。另外，本領域中已知且本文中可使用的抗原結合分析包含但不限於使用諸如西方墨點法(western blots)之技術的任何直接或競爭性結合分析、放射免疫分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、「夾心」免疫分析、基於表面電漿子共振之分析(諸如如WO2005/012359中所描述之BIAcore分析)、免疫沈澱分析、螢光免疫分析及蛋白A免疫分析。
在一些實施例中，結合親和力表示為KD值且反映內在結合親和力(例如，具有最小化的親合效應)。本揭示案之抗IL-36抗體展現對分別SEQ ID NO：1、2及3之hu-IL-36α、hu-IL-36β及/或hu-IL-36γ多肽構築體的強結合親和力，例如展現在10nM與1pM之間的KD值。
在一些實施例中，本文所提供之抗IL-36抗體降低、抑制及/或完全阻斷由IL-36介導之路徑進行的細胞內信號傳導，具體而言，所述路徑為由IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ結合至IL-36R刺激之信號傳導路徑。抗體抑制此等由IL-36介導之信號傳導路徑的能力可使用已知基於細胞之阻斷分析進行活體 外分析，所述基於細胞之阻斷分析包含本揭示案之實例中所描述的HEK-BLUETM報導細胞分析及基於初代細胞之阻斷分析。在一些情況下，IL-8表現可用作經由IL-36介導之路徑進行信號傳導的指示物，包含例如其中降低之IL-8水準指示一或多種IL-36介導之路徑的阻斷。
在一些實施例中，抗體降低、抑制及/或完全阻斷IL-36刺激之信號傳導之能力按照抗體之IC50，使用基於報導細胞之阻斷分析，用濃度為約EC50之促效劑細胞介素IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ來測定。促效劑EC50在分析之前常常只能估計且在使用資料之非線性回歸分析完成分析之後確定。在此類分析中，約EC50之值通常將在EC40-45至EC55-60之範圍內。
因此，在一些實施例中，本揭示案之IL-36抗體之特徵在於以下功能特性中之一或多者：基於降低、抑制及/或完全阻斷藉由IL-36介導之路徑的細胞內信號傳導的能力。
在抗IL-36抗體之一些實施例中，所述抗體將由IL-36α、IL-36β或IL-36γ中之任一者刺激(或引發)之信號減少至少90%、至少95%、至少99%或100%。在一些實施例中，可使用基於細胞之分析來量測信號降低。一般技術者可選擇已知用於測定IL-36刺激之路徑之細胞信號傳導之抑制的已知基於細胞之分析中之任一者。一般而言，本揭示案之抗IL-36抗體減少藉由濃度為約EC50(例如，EC40至EC60)之促效劑細胞介素IL-36α、IL-36β或IL-36γ之結合引發的IL-36介導之細胞內信號，其中抗體之IC50值為10nM或更低、5nM或更低、或1nM。
在一些實施例中，抗IL-36抗體使IL-36刺激之信號減少至少95%或至少99%；視情況，其中IL-36刺激之信號由選自IL-36α、IL-36β及IL-36γ之促效劑細胞介素刺激；視情況，其中在約EC50之促效劑細胞介素濃度下，抗體具有10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低之IC50。
在一些實施例中，抗IL-36抗體使藉由IL-36α、IL-36β及IL-36γ促效劑中之一或多者與其同源受體結合引發之細胞內信號減少至少90%、至少95%、至少99%或100%。
在一些實施例中，抗IL-36抗體抑制由IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之來自初代人類角質細胞及/或HaCAT細胞的IL-8釋放；視情況，其中在約EC50之IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ濃度下，所述抗體具有10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低之IC50。
2.抗體片段
在一些實施例中，本揭示案之抗IL-36抗體可為抗體片段。可與本揭示案之結合決定子一起使用的抗體片段包含但不限於Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、單價一臂(或單臂)抗體、scFv片段及本文所描述且本領域中已知之其他片段。關於各種抗體片段之綜述，參見例如Hudson等人，《自然．醫學(Nat.Med.)》,9：129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Pluckthun，《單株抗體之藥理學(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)》，第113卷，Rosenburg及Moore編，(紐約施普林格出版社)，第269-315頁(1994)；亦參見WO93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包括救助受體結合抗原決定基殘基且具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的描述，參見美國專利第5,869,046號。其他單價抗體形式描述於例如WO2007/048037、WO2008/145137、WO2008/145138及WO2007/059782中。單價單臂抗體描述於例如WO2005/063816中。雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可為二價或雙特異性的(參見例如EP0404097；WO93/01161；Hudson等人，《自然．醫學》9：129-134(2003)；及Holliger等人，《美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》90：6444-6448(1993))。
在一些實施例中，抗體片段為單域抗體，其包括抗體之全部或部 分重鏈可變域或全部或部分輕鏈可變域。在一些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(馬薩諸塞州沃爾珊(Waltham,MA)之Domantis,Inc.；參見例如美國專利第6,248,516號)。
抗體片段可藉由各種技術製得，所述技術包含但不限於蛋白分解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如，大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產生，如本文所描述。
預期本揭示案之抗IL-36抗體中之任一者可使用本領域中已知及/或本文所描述之方法及技術製備為抗體片段。舉例而言，本揭示案之各種抗IL-36抗體之Fab形式之製備及分析描述於以下實例中。
3.嵌合抗體及人類化抗體
在一些實施例中，本揭示案之抗IL-36抗體可為嵌合抗體。(參見例如如美國專利第4,816,567號中所描述之嵌合抗體；及Morrison等人，《美國國家科學院院刊》，81：6851-6855(1984)中所描述之嵌合抗體)。在一個實施例中，嵌合抗體包括非人類可變區(例如，來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或諸如猴之非人類靈長類動物的可變區)及人類恆定區。在一些實施例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或亞類已自親本抗體之類別或亞類改變。預期嵌合抗體可包含其抗原結合片段。
在一些實施例中，本揭示案之抗IL-36抗體為人類化抗體。通常，對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包括一或多個可變域，其中HVR，例如CDR(或其部分)來源於非人類抗體，且FR(或其部分)來源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包括人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，衍生出CDR殘基之抗體)之對應殘基取代，以恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro及Fransson，《生物科學前沿(Front.Biosci.)》13：1619-1633(2008)，且在例如以下中進一步描述：Riechmann等人，《自然》332：323-329(1988)；Queen等人，《美國國家科學院院刊(Proc.Nat'I Acad.Sci.)》86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，《方法(Methods)》36：25-34(2005)(描述SDR(a-HVR)接枝)；Padlan，《分子免疫學(Mol.Immunol.)》28：489-498(1991)(描述「表面再塑(resurfacing)」)；Dall'Acqua等人，《方法(Methods)》36：43-60(2005)(描述「FR換移」)；及Osbourn等人，《方法》36：61-68(2005)及Klimka等人，《英國癌症雜誌(Br.J.Cancer)》83：252-260(2000)(描述FR換移之「引導選擇」方法)。
適用於人類化之人類構架區包含但不限於：使用「最佳擬合」方法選擇之構架區(參見例如Sims等人，《免疫學雜誌》，151：2296(1993))；來源於輕鏈或重鏈可變區之特定亞群之人類抗體之共同序列的構架區(參見例如Carter等人，《美國國家科學院院刊》，89：4285(1992)；及Presta等人，《免疫學雜誌》，151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson，《生物科學前沿(Front.Biosci.)》13：1619-1633(2008))；及來源於篩選FR文庫之構架區(參見例如Baca等人，《生物化學雜誌》272：10678-10684(1997)；及Rosok等人，《生物化學雜誌》271：2261 1-22618(1996))。
預期本揭示案之抗IL-36抗體中之任一者可使用本領域中已知及/或本文所描述之方法及技術製備為人類化抗體。
4.人類抗體
在一些實施例中，本揭示案之抗IL-36抗體可為人類抗體。人類抗體可使用本領域中已知之各種技術產生。人類抗體大體上描述於van Dijk及 van de Winkel，《藥理學新見》5：368-74(2001)及Lonberg，《免疫學新見(Curr.Opin.Immunol.)》20：450-459(2008)中。人類抗體可藉由向已經修飾以響應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的基因轉殖動物投與免疫原來製備。此類動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，其置換內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此類基因轉殖小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座一般已失活。關於自基因轉殖動物獲得人類抗體之方法之綜述，參見Lonberg，《自然．生物技術(Nat.Biotech.)》23：1117-1125(2005)。亦參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號中之XENOMOUSETM技術；美國專利第5,770,429號中之HUMAB®技術；美國專利第7,041,870號中之K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號中之VELOCIMOUSE®技術。來自由此類動物產生之完整抗體之人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合而進一步修飾。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製得。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨髓瘤細胞株。參見例如Kozbor,《免疫學雜誌》，133：3001(1984)；Brodeur等人，《單株抗體生產技術及應用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)》，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,紐約，1987)；及Boerner等人，《免疫學雜誌》，147：86(1991)。經由人類B細胞融合瘤技術產生的人類抗體亦描述於Li等人，《美國國家科學院院刊》，103：3557-3562(2006)中。描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體之額外方法包含例如美國專利第7,189,826號中所描述之方法。人類融合瘤技術(亦即，三源融合瘤技術(Trioma technology))描述於例如Vollmers等人，《組織學及組織病理學(Histology and Histopathology)》,20(3)：927-937(2005)及Vollmers等人，《實驗及臨床藥理學中之方法及發現(Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology)》,27(3)：185-91(2005)中。
人類抗體亦可藉由分離選自由人類源噬菌體呈現庫之Fv純系可變域序列而產生。此類可變域序列隨後可與所期望的人類恆定域組合。下文描述用於自抗體文庫選擇人類抗體之技術。
預期本揭示案之抗IL-36抗體中之任一者可使用本領域中已知及/或本文所描述(包含實例中)之方法及技術製備為人類抗體。
5.源於文庫之抗體
在一些實施例中，本揭示案之抗IL-36抗體可藉由針對具有所期望的一或多種活性之抗體篩選組合庫而分離。舉例而言，可使用一種方法來產生噬菌體呈現庫，且可針對具有所期望的結合特徵之抗體篩選庫。本文所揭示之實例中描述使用噬菌體呈現來製備本揭示案之抗IL-36抗體之人類化形式之親和力成熟變異體。用於產生此類源於文庫之抗體之其他方法可見於以下各者中：例如Hoogenboom等人，《分子生物學方法(Methods in Molecular Biology)》178：1-37(O'Brien等人編，新澤西州特圖瓦市之胡馬納出版社(Human Press,Totowa,NJ),2001)；McCafferty等人，《自然》348：552-554；Clackson等人，《自然》352：624-628(1991)；Marks等人，《分子生物學雜誌》222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，《分子生物學方法》248：161-175(Lo編，新澤西州特圖瓦市之胡馬納出版社，2003)；Sidhu等人，《分子生物學雜誌》338(2)：299-310(2004)；Lee等人，《分子生物學雜誌》340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，《美國國家科學院院刊》101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，《免疫學方法雜誌(J.Immunol.Methods)》284(1-2)：1 19-132(2004)。
預期可使用組合庫篩選，使用本領域中已知之方法及技術及/或用本文所描述之方法及技術改編本領域中已知之方法及技術，產生本揭示案之抗IL-36抗體之變異體。舉例而言，實例中描述使用噬菌體呈現庫產生及篩選以製備廣泛範圍之本揭示案之抗IL-36抗體之親和力成熟變異體。
6.多特異性抗體
在一些實施例中，本揭示案之抗IL-36抗體為多特異性抗體，例如三特異性或雙特異性抗體。在一些實施例中，多特異性抗體為具有至少兩個不同結合位點之單株抗體，各結合位點具有針對不同抗原之結合特異性，其中之至少一者特異性結合IL-36。一般而言，預期可將本文所揭示之抗IL-36抗體中之任一者的結合特異性併入至適用於治療IL-36介導之疾病的多特異性抗體中。舉例而言，在一些實施例中，多特異性抗體結合位點中之至少一者特異性結合IL-36(例如，IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ)，且多特異性抗體之另一結合位點結合至與治療IL-36介導之疾病相關的不同抗原。
在一些實施例中，如本文別處所描述，預期以高結合親和力(例如，3nM或更低)結合至人類IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之每一者的多特異性抗體。此類結合親和力可按與SEQ ID NO：1之hu-IL-36α、SEQ ID NO：2之hu-IL-36β及SEQ ID NO：3之hu-IL-36γ的平衡解離常數(KD)來量測。進一步預期，在一些實施例中，多特異性抗體可在一條臂中包括對IL-36α及/或IL-36γ之特異性，且在另一臂中包括對IL-36β之特異性。
用於製造多特異性抗體之技術包含但不限於重組共表現具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見例如Milstein及Cuello，《自然》305：537(1983)；WO 93/08829；及Traunecker等人，《歐洲分子生物學學會雜誌(EMBO J.)》10：3655(1991))。亦可使用「杵-臼(knob-in-hole)」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。
多特異性抗體亦可如下製造：藉由工程改造有利於形成Fc-異源二聚抗體分子而非同源二聚體之「靜電導向(electrostatic steering)」效應(WO 2009/089004A1)；使兩個或更多個抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人，《科學(Science)》，229：81(1985))；使用白胺 酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，《免疫學雜誌》，148(5)：1547-1553(1992))；使用用於製造雙特異性抗體片段之「雙功能抗體」技術(參見例如Hollinger等人，《美國國家科學院院刊》，90：6444-6448(1993))；使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等人，《免疫學雜誌》，152：5368(1994))；或三特異性抗體(參見例如Tutt等人，《免疫學雜誌》147：60(1991)。
預期本揭示案之抗IL-36抗體中之任一者可使用本領域中已知及/或本文所描述之方法及技術製備為多特異性抗體。
在本揭示案之一些實施例中，預期包括針對更相異的IL-36細胞介素IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之一或多者之獨立結合特異性的多特異性IL-36抗體。舉例而言，所述多特異性抗體可以3nM或更低之親和力結合IL-36α、IL-36β及IL-36γ，及/或使由IL-36α、IL-36β及IL-36γ刺激之細胞內信號降低至少90%，及/或在約EC50之IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ濃度下，IC50為10nM或更低。如本文別處所描述，分離出對IL-36α及IL-36γ具有高親和力但對IL-36β具有較低親和力之人類IL-36抗體，且分離出對IL-36β具有高親和力但對IL-36α及IL-36γ具有較低親和力之其他抗體。對此等不同人類IL-36細胞介素之此等特異性經親和力成熟，且組合於單一多特異性IL-36抗體中。因此，在一些實施例中，本揭示案提供一種多特異性抗IL-36抗體，其在一條臂中具有對IL-36α/IL-36γ之目標特異性及高親和力(例如，1nM或更低)，且在另一臂中具有對IL-36β之目標特異性及高親和力(例如，1nM或更低)。實例中詳述此種多特異性抗IL-36抗體之製備及用途。
7.抗體變異體
在一些實施例中，亦涵蓋本揭示案之抗IL-36抗體之變異體。舉例而言，具有改良之結合親和力及/或抗體之其他生物特性之抗體可藉由將適當修飾引入編碼抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包含例如抗 體之胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。可產生缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為所述最終構築體具有所期望的IL-36抗原結合特徵。預期本揭示案之抗IL-36抗體之廣泛範圍之變異體可使用本領域中已知及/或本文所描述之方法及技術製備，包含但不限於：(i)胺基酸取代、插入及/或缺失變異體；(ii)醣基化變異體；(iii)Fc區變異體；(iv)半胱胺酸工程改造變異體；及(v)衍生化變異體。
本揭示案之實例、表2及序列表提供兩種特異性抗IL-36抗體「mAb2」及「mAb6_2」之大量例示性變異體。例示變異體包括以下各者中之一或多者：在HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3中之一系列單、雙、三胺基酸取代，其增加對IL-36α/γ或IL-36β之特異性親和力，及/或與IL-36介導之信號傳導相關的基於細胞之阻斷活性；賦予無效應功能之Fc區變異體(例如，N297G)；及產生允許多特異性抗體形成之「杵」及「臼」結構的重鏈取代。舉例而言，表2中所揭示之重鏈抗體序列可進一步包含羧基端離胺酸(亦即，「C端Lys」或「C端K」)，位置252、254及256處之YTE突變(亦即，M252Y/S254T/T256E)或C端K及YTE突變兩者。SEQ ID NO：170-241、243-245、248-250之重鏈序列的此類變異體在表2(及隨附序列表)中以SEQ ID NO：518-751提供。
A.取代、插入及缺失變異體
在一些實施例中，提供具有一或多個除本文所描述之胺基酸取代外之胺基酸取代的抗IL-36抗體變異體。突變誘發位點可包含HVR及FR。典型的「保守」胺基酸取代及/或基於共同側鏈類別或特性之取代為本領域中熟知的且可用於本揭示案之實施例中。本揭示案亦涵蓋基於非保守胺基酸取代之變異體，其中用其中一個胺基酸側鏈類別之成員更換另一類別之胺基酸。
胺基酸側鏈通常根據以下類別或共同特性分組：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile、正白胺酸；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)鏈取向影響：Gly、Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
用於抗體中之胺基酸取代及隨後針對所期望的功能篩選之技術為本領域中熟知的，所述功能例如保留/改良之抗原結合、減小之免疫原性或改良之ADCC或CDC。
胺基酸取代變異體可包含取代親本抗體(例如，人類化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選擇用於進一步研究之所得(多種)變異體相對於親本抗體將在某些生物特性方面具有修飾(例如，提高之親和力、減小之免疫原性)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物特性。例示性取代變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文實例中所描述之技術)便利地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基發生突變，且在噬菌體上呈現變異抗體且針對特定生物活性(例如，結合親和力)進行篩選。
一種適用於鑑別可經靶向用於突變誘發之抗體殘基或區的方法為「丙胺酸掃描突變誘發」(參見例如Cunningham及Wells(1989)《科學》，244：1081-1085)。在此方法中，鑑別殘基或一組目標殘基(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且將其由中性或帶負電胺基酸(例如，Ala或聚丙胺酸)置換，以確定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可在對初始取代展現功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。可替代地或另外，可測定抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選者而經靶向或消除。可篩選變異體以確定其是否含有所期望的特性。
胺基酸序列插入包含在一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽的長度範圍內的胺基及/或羧基端融合物，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包含具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其 他插入變異體包含抗體之N端或C端融合至使抗體血清半衰期延長的酶或多肽。
可在HVR中進行取代以改良抗體親和力。可在「熱點」中進行此類改變，所述熱點亦即由在體細胞成熟過程期間經歷高頻率突變之密碼子所編碼之殘基(參見例如Chowdhury，《分子生物學方法(Methods Mol.Biol.)》,207：179-196(2008))，其中測試所得變異VH或VL之結合親和力。在一個實施例中，親和力成熟可藉由構築及自二級文庫再選擇而進行(參見例如Hoogenboom等人，《分子生物學方法》，178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa，新澤西州特圖瓦市之胡馬納出版社，(2001))。另一種引入多樣性之方法涉及將若干HVR殘基(例如，一次4個至6個殘基)隨機分組之HVR引導方法。可特異性地鑑別抗原結合所涉及之HVR殘基，例如使用丙胺酸掃描突變誘發或建立模型。常常尤其靶向CDR-H3及CDR-L3。
在一些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守改變(例如，如本文所提供之保守取代)。此類改變可在HVR「熱點」外部。在上文所提供之變異VH及VL序列之一些實施例中，各HVR未改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
B.醣基化變異體
在一些實施例中，改變本揭示案之抗IL-36抗體以提高或降低抗體之醣基化程度。向抗體添加醣基化位點或使抗體缺失醣基化位點可藉由改變胺基酸序列以使得一或多個醣基化位點經產生或移除來進行。
在抗體包括Fc區之實施例中，可改變與Fc區連接之碳水化合物。通常，由哺乳動物細胞產生之天然抗體包括藉由N鍵與Fc區之CH2域之Asn297連接的分支鏈雙觸角寡醣(參見例如Wright等人，《生物技術趨勢(TIBTECH)》15：26-32(1997))。寡醣可包含各種碳水化合物，諸如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺 (GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及與雙觸角寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc連接的岩藻糖。在一些實施例中，對抗體Fc區之寡醣之修飾可產生具有某些改良特性之變異體。
在一些實施例中，本揭示案之抗IL-36抗體可為親本抗體之變異體，其中所述變異體包括缺少岩藻糖與Fc區連接(直接或間接)的碳水化合物結構。舉例而言，此類抗體中之岩藻糖之量可為約1%至約80%、約1%至約65%、約5%至約65%或約20%至約40%。岩藻糖之量可藉由相對於如藉由MALDI-TOF質譜法(參見例如WO 2008/077546)所量測的與Asn297連接之所有醣結構(例如，複合、混雜及高甘露糖結構)之總和，計算糖鏈內在Asn297處之岩藻糖之平均量來測定。Asn297係指位於Fc區中約位置297之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，歸因於抗體中微小的序列變異，Asn297亦可位於位置297之上游或下游約±3個胺基酸處，亦即介於位置294與300之間。
在一些實施例中，岩藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號或第US 2004/0093621號。「去岩藻糖基化」或「缺乏岩藻糖」之抗體及其相關製備方法之實例揭示於以下各者中：例如US2003/0157108；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2000/61739；WO2001/29246；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，《分子生物學雜誌》336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，《生物技術與生物工程(Biotech.Bioeng.)》87：614(2004)。
適用於產生去岩藻糖基化抗體之細胞株包含缺乏蛋白質岩藻糖基化之Led 3 CHO細胞(參見例如Ripka等人，《生物化學與生物物理學集刊(Arch.Biochem.Biophys.)》249：533-545(1986)；US2003/0157108；及WO2004/056312)， 及基因剔除(knockout)細胞株，諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人，《生物技術與生物工程》87：614(2004)；Kanda,Y.等人，《生物技術與生物工程》，94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
C.Fc區變異體
在一些實施例中，本揭示案之抗IL-36抗體可在Fc區中包括一或多個胺基酸修飾(亦即，Fc區變異體)。Fc區變異體可包括在一或多個胺基酸殘基位置包括胺基酸取代之人類Fc區序列(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區)。下文描述本領域中已知的可與本揭示案之抗IL-36抗體一起使用的廣泛範圍的Fc區變異體。
在一些實施例中，抗IL-36抗體為具有改變的效應功能之Fc區變異體。在一些實施例中，具有改變的效應功能之抗體具有親本抗體之一些(而非所有)效應功能、降低的效應功能或沒有效應功能(例如，無效應)。對於某些應用，其中效應功能(諸如ADCC)係不必要的或有害的及/或抗體之活體內半衰期係重要的，無效應Fc區變異體為更期望的。
具有降低的效應功能或無效應的Fc區變異抗體可在以下Fc區位置中之一或多者處包含胺基酸取代：238、265、269、270、297、327及329。(參見例如美國專利第6,737,056號)。此類Fc區變異體可在位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處包含胺基酸取代。此類Fc區變異體亦可包含丙胺酸對殘基265及297之取代(參見例如美國專利第7,332,581號)。如本文實例及別處所揭示，在一些實施例中，本揭示案之抗IL-36抗體為無效應Fc區變異體。在一些實施例中，抗IL-36抗體之無效應Fc區變異體包括胺基酸取代N297G。
與FcR之結合改良或減弱的Fc區變異體揭示於例如美國專利第 6,737,056號；WO 2004/056312；及Shields等人，《生物化學雜誌》9(2)：6591-6604(2001)中。具有改良ADCC之Fc區變異體可在例如Fc區之位置298、333及/或334(基於EU編號)處包括一或多個胺基酸取代。具有改變的(亦即，改良或減弱的)Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)之Fc區變異體如例如美國專利第6,194,551號；WO99/51642；及Idusogie等人，《免疫學雜誌》164：4178-4184(2000)中所描述。半衰期延長且與新生兒Fc受體(FcRn)之結合改良之Fc區變異體揭示於例如US2005/0014934A1(Hinton等人)中。此類Fc區變異體在以下位置中之一或多者處包括胺基酸取代：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424及434。其他具有延長之半衰期之Fc區變異體包含例如US 7658921B2(Dall’Acqua等人)中所描述之位置252、254及256處之YTE突變集合(亦即，M252Y/S254T/T256E)。Fc區變異體之其他實例可見於例如美國專利第5,648,260號及第5,624,821號；及WO94/29351中。
一般而言，可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以證實Fc區變異體中CDC及/或ADCC活性之降低/耗竭。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初代細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。用以評定感興趣的分子之ADCC活性之活體外分析之非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom等人，《美國國家科學院院刊》83：7059-7063(1986))及Hellstrom等人，《美國國家科學院院刊》82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，《實驗醫學雜誌》166：1351-1361(1987))中。可替代地，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流動式細胞量測術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(加利福尼亞州山景城之細胞科技公司(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA))；及CytoTox96® 非放射性細胞毒性分析(威斯康星州麥迪遜之普洛麥格(Promega,Madison,WI))。適用於此類分析之效應細胞包含周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。可替代地或另外，可例如在動物模型中，諸如Clynes等人《美國國家科學院院刊》95：652-656(1998)中所揭示之動物模型中活體內評定感興趣的分子之ADCC活性。亦可進行Clq結合分析以確認抗體不能結合Clq且因此缺乏CDC活性。參見例如WO2006/029879及WO2005/100402中之Clq及C3c結合ELISA。為了評定補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，《免疫學方法雜誌》202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，《血液》101,1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,SW 103：2738-2743(2004))。可使用本領域中已知之方法進行FcRn結合及活體內消除率/半衰期測定(參見例如Petkova等人，《國際免疫學(Int.Immunol.)》18(12)：1759-1769(2006)。
預期本揭示案之抗IL-36抗體之廣泛範圍的Fc區變異體可使用本領域中已知及/或本文所描述之方法及技術製備。舉例而言，如實例2、3及8中所描述，用N297G胺基酸取代製備之Fc區變異體賦予抗IL-36抗體無效應功能，且保留基於細胞之阻斷活性。
D.半胱胺酸工程改造變異體
在一些實施例中，預期本文所描述之抗IL-36抗體可在特定的非CDR位置經半胱胺酸殘基取代以便產生反應性硫醇基。此類工程改造「thioMAb」可用於使抗體與例如藥物部分或連接子-藥物部分綴合且藉此產生免疫綴合物，如本文別處所描述。半胱胺酸工程改造抗體可如例如美國專利第7,521,541號中所描述產生。在一些實施例中，以下抗體殘基中之任一者或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。
E.衍生化變異體
在一些實施例中，本揭示案之抗IL-36抗體可經非蛋白質部分進一步修飾(亦即，衍生化)。適合於衍生抗體之非蛋白質部分包含但不限於水溶性聚合物，諸如：聚乙二醇(PEG)、乙二醇與丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚-胺基酸均聚物或無規共聚物、及聚葡萄糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。在一些實施例中，可使用甲氧基-聚乙二醇丙醛對抗體進行修飾。聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或未分支鏈的。與抗體連接之聚合物的數目可變化，且若連接超過一個聚合物，則所述聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物的數目及/或類型可基於以下考慮因素來確定：包含但不限於抗體之特定特性或功能，例如是否將在限定條件下之療法中使用抗體衍生物。
8.免疫綴合物
在一些實施例中，本揭示案之抗IL-36抗體亦可為免疫綴合物，其中免疫綴合物包括與一或多種細胞毒性劑結合之抗IL-36抗體。本揭示案所涵蓋之適合細胞毒性劑包含化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白質毒素，細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素。
在一些實施例中，免疫綴合物為抗體-藥物綴合物(ADC)，其中如本文所描述之抗IL-36抗體與一或多種藥物結合。
在一些實施例中，本揭示案之免疫綴合物包括與藥物或治療劑結合的如本文所描述之抗IL-36抗體以用於治療由IL-36介導之疾病或病狀。
在一些實施例中，如本文所描述之抗IL-36抗體可以與酶促活性毒素或其片段結合，所述酶促活性毒素或其片段包含但不限於白喉A鏈 (diphtheria A chain)、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈(ricin A chain)、相思子毒素A鏈(abrin A chain)、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨(dianthin)蛋白、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白、苦瓜(Momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecenes)。
在一些實施例中，本揭示案之免疫綴合物包括與放射性同位素綴合的如本文所描述之抗IL-36抗體(亦即，放射性綴合物)。多種放射性同位素可用於產生此類放射性綴合物。實例包含211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb及Lu之放射性同位素。在一些實施例中，免疫綴合物可包括用於閃爍攝影偵測之放射性同位素或用於NMR偵測或MRI之自旋標記。適合的放射性同位素或自旋標記可包含123I、131I、111In、13C、19F、15N、17O、Gd、Mn及Fe之各種同位素。
抗IL-36抗體與細胞毒性劑之免疫綴合物可使用各種熟知的雙官能試劑及適合與蛋白質綴合之化學物質製得。此類試劑包含但不限於：N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺基酯之雙官能衍生物(例如，二亞胺代己二酸二甲酯HQ)、活性酯(例如，辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(例如，戊二醛)、雙疊氮基化合物(例如，雙(對疊氮基苄醯基)-己二胺)、雙重氮衍生物(例如，雙(對重氮苄醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如，甲苯-2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(例如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
用於製備本揭示案之免疫綴合物的試劑亦可包含市售「交聯」試劑，諸如：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB及SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)(參見例如，美國伊利諾伊州洛克福之皮爾斯生物技術公司(Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A))。
9.合成抗體
在一些實施例中，本揭示案之抗IL-36抗體可為合成抗體，其包括來自抗IL-36免疫球蛋白之一組CDR(例如，CDR-L1等)，所述CDR接枝至除免疫球蛋白支架或構架外之支架或構架上，諸如替代性蛋白質支架或人工聚合物支架。
預期用於製備本發明之合成抗體的例示性替代性蛋白質支架可包含但不限於：纖維結合蛋白(fibronectin)、新制癌菌素(neocarzinostatin)CBM4-2、脂質運載蛋白(lipocalins)、T細胞受體、蛋白A域(蛋白Z)、Im9、TPR蛋白、鋅指域、pVIII、禽類胰臟多肽、GCN4、WW域Src同源域3、PDZ域、TEM-1 β-內醯胺酶、硫氧還蛋白(thioredoxin)、葡萄球菌核酸酶、PHD指域、CL-2、BPTI、APPI、HPSTI、大腸桿菌素(ecotin)、LACI-D1、LDTI、MTI-II、蠍毒素、昆蟲防禦素-A肽、EETI-II、Min-23、CBD、PBP、細胞色素b-562、Ldl受體域、γ-晶體蛋白、泛蛋白、運鐵蛋白及/或C型類凝集素域。
適用於合成抗體之例示性人工聚合物(非蛋白質)支架描述於例如Fiedler等人，(2014)「作為替代性治療劑之非抗體支架(Non-Antibody Scaffolds as Alternative Therapeutic Agents)」，《治療性抗體手冊(Handbook of Therapeutic Antibodies)》(S.Dübel及J.M.Reichert編)，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.；Gebauer等人，《化學生物學新見(Curr.Opin.Chem.Biol.)》,13：245-255(2009)； Binz等人，《自然．生物技術(Nat.Biotech.)》,23(10)：1257-1268(2005)中。
IV.重組方法及組合物
本揭示案之抗IL-36抗體可使用抗體製造領域中熟知的重組方法及材料產生。在一些實施例中，本揭示案提供一種編碼抗IL-36抗體之經分離核酸。所述核酸可以編碼包括抗體之VL之胺基酸序列及/或包括抗體之VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在一些實施例中，提供一或多種載體(例如，表現載體)，其包括編碼本揭示案之抗IL-36抗體之核酸序列。在一些實施例中，提供一種宿主細胞，其包括編碼本揭示案之抗IL-36抗體之核酸序列。在一個實施例中，宿主細胞已經載體轉形，所述載體包括一種核酸，所述核酸編碼包括抗體之VL之胺基酸序列及包括抗體之VH之胺基酸序列。在另一實施例中，宿主細胞已經第一載體及第二載體轉形，所述第一載體包括編碼包括抗體之VL之胺基酸序列的核酸，所述第二載體包括編碼包括抗體之VH之胺基酸序列的核酸。
在重組方法之一些實施例中，所用宿主細胞為真核細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，或淋巴細胞(例如，Y0、NS0、Sp20)。在一個實施例中，提供一種製造抗IL-36抗體之方法，其中所述方法包括在適合於表現抗體之條件下培養如上文所提供之包括編碼抗體之核酸的宿主細胞且視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
簡言之，抗IL-36抗體之重組產生係藉由分離編碼抗體(例如，如本文所描述)之核酸且將此核酸插入一或多個載體中以便在宿主細胞中進一步選殖及/或表現而進行。使用本領域中熟知的習知程序(例如，藉由使用能夠與編碼所期望的抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)，容易對此類核酸進行分離及定序。適合選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞及培養方法為本領域中熟知的且包含原核或真核細胞。通常，在表現之後，抗體可 以可溶性餾分自細胞糊狀物分離且進一步經純化。除原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物亦為適合編碼抗體之載體之選殖或表現宿主，包含醣基化路徑已經「人類化」之真菌及酵母株，從而產生具有部分或完全人類醣基化型態的抗體(參見例如，Gerngross，《自然．生物技術》22：1409-1414(2004)；及Li等人，《自然．生物技術》24：210-215(2006))。
適合表現本揭示案之醣基化抗IL-36抗體之宿主細胞亦可來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包含植物細胞及昆蟲細胞。已鑑別眾多可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。植物細胞培養物亦可用作宿主(參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號及第7,125,978號)。
適用於產生本揭示案之抗IL-36抗體之哺乳動物宿主細胞株的實例包含中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包含DHFR-CHO細胞(參見例如Urlaub等人，《美國國家科學院院刊》77：4216(1980))；骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0；經SV40轉形之猴腎CVl細胞株(COS-7)；人類胚腎細胞株(293或293細胞，如例如Graham等人，《普通病毒學雜誌(J.Gen Virol.)》36：59(1977)中所描述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse Sertoli cell)(TM4細胞，如例如Mather，《生殖生物學(Biol.Reprod.)》23：243-251(1980)中所描述)；猴腎細胞(CVl)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK；水牛鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TR1細胞(參見例如Mather等人，《紐約科學院年鑒(Annals N Y.Acad.Sci.)》383：44-68(1982)及US 6,235,498)；醫學研究委員會(Medical Research Council)5(MRC 5)細胞(例如可獲自ATCC且被稱作CCL-171之細胞)；及包皮4(FS4)細 胞(參見例如Vilcek等人《紐約科學院年鑒》284：703-710(1977)，Gardner及Vilcek.《普通病毒學雜誌(J.Gen.Virol.)》44：161-168(1979)及Pang等人《美國國家科學院院刊》77：5341-5345(1980))。關於適合於產生抗體之適用哺乳動物宿主細胞株的一般綜述，參見例如Yazaki及Wu，《分子生物學方法》，第248卷(B.K.C.Lo編，新澤西州特圖瓦市之胡馬納出版社)，第255-268頁(2003)。
V.抗IL-36抗體之醫藥組合物及調配物
本揭示案亦提供包括抗IL-36抗體之醫藥組合物及醫藥調配物。在一些實施例中，本揭示案提供一種醫藥調配物，其包括如本文所描述之抗IL-36抗體及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，抗IL-36抗體為醫藥組合物之唯一活性劑。此類醫藥調配物可藉由將具有所期望的純度之抗IL-36抗體與一或多種醫藥學上可接受之載劑混合而製備。通常，此類抗體調配物可製備為水溶液(參見例如美國專利第6,171,586號及WO2006/044908)或製備為凍乾調配物(參見例如美國專利第6,267,958號)。
亦預期包括如本文所揭示之抗IL-36抗體之組合物及調配物除了抗IL-36之外，可進一步含有適用於所述調配物所投與之個體所治療的特定適應症的其他活性成分(亦即，治療劑)。較佳地，任何額外治療劑具有與抗IL-36抗體活性互補之活性且所述活性不會不利地互相影響。因此，在一些實施例中，本揭示案提供一種醫藥組合物，其包括如本文所揭示之抗IL-36抗體及醫藥學上可接受之載劑，且進一步包括適用於治療IL-36介導之疾病或病狀的治療劑。在一些實施例中，例如其中所述疾病適應症為癌症，所述治療劑為適合特定癌症的化學治療劑。在一些實施例中，組合物中之其他治療劑為IL-1、IL-33、IL-36信號傳導路徑之拮抗劑。
在一些實施例中，本揭示案之組合物或調配物包括抗IL-36抗體作為唯一活性劑，其中抗IL-36抗體為多特異性抗體，其以3nM或更低之結合 親和力結合至人類IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之每一者，視情況，其中結合親和力藉由與SEQ ID NO：1之hu-IL-36α、SEQ ID NO：2之hu-IL-36β及SEQ ID NO：3之hu-IL-36γ的平衡解離常數(KD)來量測。在一些實施例中，所述多特異性抗體在一條臂中包括對IL-36α及/或IL-36γ之特異性，且在另一臂中包括對IL-36β之特異性；視情況，其中一條臂以1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之結合親和力結合至hu-IL-36α及hu-IL-36-γ，且另一臂以1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之結合親和力結合至hu-IL-36-β。
在一些實施例中，本揭示案之組合物或調配物包括單一多特異性抗體，其以3nM或更低之結合親和力結合至人類IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之每一者，且不包含任何其他抗IL-36抗體或任何其他能夠結合IL-36之抗體。
醫藥學上可接受之載劑在所採用之劑量及濃度下一般對接受者無毒。本領域中熟知廣泛範圍的此類醫藥學上可接受之載劑(參見例如《雷明頓氏醫藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)》第16版，Osol,A.編(1980))。適用於本揭示案之調配物中之例示性醫藥學上可接受之載劑可包含但不限於：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包含抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化六羥季銨(hexamethonium chloride)；氯苄烷銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨 糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如，Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。
適用於本揭示案之調配物中之醫藥學上可接受之載劑亦可包含間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)(參見例如美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號)，諸如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白(例如，rHuPH20或HYLENEX®，Baxter International,Inc.)。
額外治療劑及活性成分可包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊中，例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；包埋於膠態藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或巨乳液中。此類技術揭示於《雷明頓氏醫藥科學》第16版，Osol,A.編(1980)中。
在一些實施例中，調配物可為抗體及/或其他活性成分之持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包含含有抗體之固體疏水性聚合物之半滲透基質，所述基質呈成形物品形式，例如膜或微膠囊。
通常，待向個體投與之本揭示案之調配物為無菌的。無菌調配物可使用熟知技術，例如藉由經由無菌過濾膜過濾容易地製備。
IV.用途及治療方法
預期包括本揭示案之抗IL-36抗體的組合物或調配物中之任一者可用於任何方法或用途，諸如治療方法，其利用所述組合物或調配物特異性結合至IL-36/或阻斷IL-36之活性的能力，尤其阻斷IL-36介導由細胞介素IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ進行之細胞內信號傳導之能力。由IL-36介導之細胞內信號傳導路徑包含至少由細胞介素促效劑IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之信號傳導路徑。由IL-36介導之信號傳導路徑的抑制可使用已知基於細胞之阻斷分析進 行活體外分析，所述基於細胞之阻斷分析包含本揭示案之實例中所描述的HEK-BLUETM報導細胞分析及基於初代細胞之阻斷分析。
IL-36介導之疾病可包含與IL-36R充當受體之IL-1家族細胞介素(包含IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ)之異常功能相關的任何疾病或病狀。在一些情況下，此類異常功能與體液或組織中IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ之升高含量相關，且可包含例如超過特定細胞或組織中通常所發現之含量的含量，或可為通常不表現此等細胞介素之細胞或組織中的任何可偵測含量。通常，IL-36介導之病狀或疾病展現以下特徵：(1)與病狀或疾病相關之病理學可藉由投與IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ及/或藉由上調IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ之表現而在動物中以實驗方式誘導；及(2)在實驗動物模型中產生的與病狀或疾病相關之病理學可藉由已知抑制IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ之作用的藥劑抑制。
IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ已知為促發炎細胞介素，然而，如由IL-36R介導之藉由此等細胞介素刺激之IL-36信號傳導路徑之異常功能已知與廣泛範圍的疾病及病狀相關，所述疾病及病狀大體上包含但不限於發炎性疾病、自體免疫疾病、呼吸道疾病、代謝失調、感染及癌症。舉例而言，與IL-36信號轉導功能異常相關之病狀及疾病的範圍包含但不限於：急性全身性發疹性膿皰病(AGEP)、慢性阻塞性肺病(COPD)、兒童膿皰型皮膚病、克羅恩氏病、濕疹、全身性膿皰型牛皮癬(GPP)、發炎性腸病(IBD)、掌蹠膿皰型牛皮癬(PPP)、牛皮癬、牛皮癬關節炎、克羅恩氏病患者中之TNF誘導之牛皮癬形式皮膚病變、休格連氏症候群、全身性紅斑狼瘡(SLE)、潰瘍性結腸炎及葡萄膜炎。
藉由阻斷IL-36R靶向IL-36信號傳導路徑之藥劑正在臨床開發中，以用於治療一系列疾病及病狀，包含但不限於以下：GPP、PPP及潰瘍性結腸炎。
預期包括本揭示案之抗IL-36抗體之組合物或調配物中之任一者可用於用於治療以上所列之與IL-36信號傳導路徑之異常功能相關之疾病或病狀中之任一者的方法或用途中。一般而言，此等病狀及疾病包含但不限於發炎性疾病、自體免疫疾病、呼吸道疾病、代謝失調、感染及癌症。
因此，在一些實施例中，包括本揭示案之抗IL-36抗體的組合物或調配物可在用於治療選自以下之病狀或疾病之方法、療法、藥劑、診斷或用途中使用：由表皮生長因子受體抑制劑所致之痤瘡、痤瘡及化膿性汗腺炎(PASH)、急性全身性發疹性膿皰病(AGEP)、皺褶部位無微生物性膿皰病、頭皮/腿部無微生物性膿皰病、無微生物性角膜下膿皰病、無菌膿腫症候群、白塞氏病、腸分流症候群、慢性阻塞性肺病(COPD)、兒童膿皰型皮膚病、克羅恩氏病、介白素-1受體拮抗劑缺乏(DIRA)、介白素-36受體拮抗劑缺乏(DITRA)、濕疹、全身性膿皰型牛皮癬(GPP)、持久隆起性紅斑、化膿性汗腺炎、IgA天疱瘡、發炎性腸病(IBD)、嗜中性白血球性脂層炎、掌蹠膿皰型牛皮癬(PPP)、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、膿皰型牛皮癬(DIRA、DITRA)、壞疽性膿皮病、化膿性關節炎壞疽性膿皮病及痤瘡(PAPA)、化膿性關節炎壞疽性膿皮病痤瘡及化膿性汗腺炎(PAPASH)、類風濕性嗜中性白血球性皮膚病、滑膜炎痤瘡膿皰病骨肥厚及骨炎(SAPHO)、克羅恩氏病患者中之TNF誘導之牛皮癬形式皮膚病變、休格連氏症候群、史維德氏症候群、全身性紅斑狼瘡(SLE)、潰瘍性結腸炎及葡萄膜炎。
如本文所揭示，包含在以下實例中，本揭示案之抗IL-36抗體具有降低、抑制及/或阻斷由IL-36介導之細胞內信號傳導的能力。因此，在一些實施例中，本揭示案提供一種治療個體之IL-36介導之疾病或病狀的方法，所述方法包括向個體投與治療有效量之本揭示案之抗IL-36抗體或向有需要之個體投與治療有效量之包括本揭示案之抗IL-36抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫 藥組合物。
如本文別處所揭示，本揭示案之抗IL-36抗體具有降低、抑制及/或阻斷IL-36信號傳導路徑的能力。因此，本揭示案亦提供治療對IL-36信號傳導路徑之降低、抑制及/或阻斷起反應的疾病及病狀的方法。
另外，本揭示案之抗IL-36抗體具有降低、抑制及/或阻斷藉由促效劑IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之細胞內信號傳導的能力。因此，本揭示案亦提供治療對藉由促效劑IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之細胞內信號傳導之降低、抑制及/或阻斷起反應的疾病及病狀的方法。
IL-1家族細胞介素，包含IL-36細胞介素IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ，參與影響腫瘤形成及許多形式之癌症發展的發炎性免疫反應。因此，在一些實施例中，本揭示案提供一種治療個體之癌症之方法，所述方法包括向有需要之個體投與治療有效量之本揭示案之抗IL-36抗體，或向個體投與治療有效量之包括本揭示案之抗IL-36抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
IL-36信號傳導路徑與牛皮癬有關。因此，在一些實施例中，本揭示案提供一種治療個體之牛皮癬之方法，所述方法包括向有需要之個體投與治療有效量之本揭示案之抗IL-36抗體，或向個體投與治療有效量之包括本揭示案之抗IL-36抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
在一些實施例中，本揭示案提供一種治療及/或預防IL-36介導之疾病、IL-36信號傳導路徑介導之疾病及/或由藉由促效劑IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之細胞內信號傳導介導之疾病的方法。在此類治療方法實施例中，所述方法包括向有需要之個體投與治療有效量之抗IL-36抗體，或包括如本文所描述之抗IL-36抗體的組合物或醫藥調配物。根據所述治療方法投與抗體、組合物或醫藥調配物提供抗體誘導之治療作用，其保護個體及/或治療個體之IL-36介導之疾病的進展。
在一些實施例中，抗IL-36抗體為向個體投與之唯一活性劑。在其中抗IL-36抗體為唯一活性劑之一些實施例中，所述抗IL-36抗體為多特異性抗體，其以3nM或更低之結合親和力結合至人類IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之每一者。使用單一抗IL-36抗體作為唯一活性劑之此種方法提供優於需要使用多種抗IL-36抗體(例如，包括兩種或更多種結合至IL-36α、IL-36-β及/或IL-36γ之不同抗體之混合物的組合物)及/或結合至其他抗原之其他抗體之方法的優勢。用單一抗體使用所有三種IL-36抗原之能力允許向個體投與單次劑量之單一組合物或調配物。另外，預期所投與之劑量數目少於投與抗IL-36及/或其他抗體之混合物時的劑量數目。
在一些實施例中，所述治療方法可進一步包括投與一或多種本領域中熟習此項技術者已知預防及/或治療IL-36介導之疾病或病狀的額外治療劑或治療。此類包括投與一或多種額外藥劑的方法可涵蓋組合投與(其中在同一種或分開的調配物中包含兩種或更多種治療劑)，及分開投與，在此情況下，抗體組合物或調配物之投與可在額外治療劑投與之前、同時及/或之後發生。
在本揭示案之治療方法之一些實施例中，抗IL-36抗體或包括抗IL-36抗體之醫藥調配物係藉由全身性遞送藥劑或將藥劑遞送至所期望的目標組織的任何投與模式向個體投與。全身性投與一般指抗體進入個體之部位，而非直接進入所期望的目標部位、組織或器官的任何投與模式，所述投與模式使得抗體或其調配物進入個體之循環系統，且因此經歷代謝及其他類似過程。
因此，適用於本揭示案之治療方法的投與模式可包含但不限於注射、輸注、滴注及吸入。藉由注射投與可包含靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、室內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊柱內、腦脊髓內及胸骨內注射及輸注。
在一些實施例中，將抗IL-36抗體之醫藥調配物調配成使得抗體 受保護而不會在腸道中失活。因此，治療方法可包括經口投與調配物。
在一些實施例中，亦提供包括本揭示案之抗IL-36抗體的組合物或調配物作為藥劑的用途。另外，在一些實施例中，本揭示案亦提供包括抗IL-36抗體之組合物或調配物在製造或製備藥劑，尤其用於治療、預防或抑制IL-36介導之疾病的藥劑中之用途。在另一實施例中，所述藥劑係用於治療、預防或抑制IL-36介導之疾病的方法中，所述方法包括向患有IL-36介導之疾病之個體投與有效量之藥劑。
在一些實施例中，適用作藥劑或適用於製備藥劑之組合物及調配物包括抗IL-36抗體作為唯一活性劑。在一些實施例中，適用作藥劑或適用於製備藥劑之抗IL-36抗體為多特異性抗體，其以3nM或更低之結合親和力結合至人類IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之每一者。在此類實施例中，單一多特異性抗IL-36抗體作為藥劑或藥劑製備中之唯一活性劑的用途提供優於需要多種抗IL-36或其他抗體之用途的明顯優勢。使用包括對IL-36α、IL-36β及IL-36γ之結合特異性的單一多特異性抗IL-36抗體允許簡化使用，因為只有單一活性劑包含於所使用之組合物或調配物中。
在某些實施例中，藥劑進一步包括有效量之至少一種額外治療劑或治療。
在另一實施例中，藥劑係用於治療、抑制或預防個體之IL-36介導之疾病，包括向個體投與有效量之藥劑以治療、抑制或預防IL-36介導之疾病。
對於IL-36介導之疾病或病狀之預防或治療，本揭示案之組合物及調配物中所含有的抗IL-36抗體之適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視以下而定：所治療之特定疾病或病狀、疾病之嚴重程度及病程、抗體係出於預防目的抑或治療目的而投與、先前向患者投與之療法、患者之臨床病史及對抗體之反應及主治醫師之判斷。本文所描述之組合物及調 配物中所包含的抗IL-36抗體可適當地一次性或經一系列治療向患者投與。本文涵蓋各種給藥時程，包含但不限於單次投與或經各個時間點多次投與、快速投與及脈衝式輸注。
視疾病之類型及嚴重程度而定，本揭示案之調配物中約1μg/kg至15mg/kg之抗IL-36抗體為向人類個體投與之初始候選劑量，無論例如藉由一或多次分開投與抑或藉由連續輸注。一般而言，所投與之抗體劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg範圍內。在一些實施例中，可向患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg中之一或多個劑量(或其任何組合)。
視個體病狀而定，劑量投與可以維持數天或更久，例如可持續投與，直至如藉由本領域中已知之方法所測定，IL-36介導之疾病得到充分治療為止。在一些實施例中，可投與初始較高起始劑量，接著投與一或多個較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。劑量投與之治療作用之進展可藉由習知技術及分析監測。
因此，在本揭示案方法之一些實施例中，抗IL-36抗體之投與包括約1mg/kg至約100mg/kg之日劑量。在一些實施例中，抗IL-36抗體之劑量包括至少約1mg/kg、至少約5mg/kg、至少約10mg/kg、至少約20mg/kg或至少約30mg/kg之日劑量。
另外，本揭示案之抗IL-36抗體可用於偵測IL-36之分析方法中。本文所揭示之抗IL-36抗體由於其以高親和力結合人類IL-36之能力而適合於廣泛範圍的分析方法及格式。預期本揭示案之抗IL-36抗體可用於任何已知分析方法中，諸如競爭性結合分析、直接及間接夾心分析、免疫沈澱分析及酶聯免疫吸附分析(ELISA)(參見Sola,1987，《單株抗體：技術手冊(Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques)》，第147-158頁，CRC出版公司(CRC Press,Inc.))，以便進行IL-36之偵測及定量。因此，在一些實施例中，本揭示案提供一種用於 偵測生物樣品中之IL-36含量的方法，所述方法包括使樣品與如本文所揭示之抗IL-36抗體接觸之步驟。此外，在一些實施例中，預期偵測生物樣品中之IL-36含量的方法可用於偵測及/或診斷例如來自人類個體之生物樣品中之IL-36介導之病狀或疾病。
實例
在以下代表性實例中說明本揭示案之各種特徵及實施例，所述實例意欲為說明性的，而非限制性的。本領域中熟習此項技術者將容易瞭解，具體實例僅說明本發明，如隨後的申請專利範圍中更充分地描述。本申請案中所描述之每一實施例及特徵應理解為與其中所含的每一實施例係可互換且可組合的。
實例1：IL-36多肽之產生
此實例說明在引發及篩選本揭示案之抗IL-36抗體時用作抗原之各種IL-36多肽構築體的製備。
根據Towne等人(2011)中之資訊，以重組方式產生人類IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36Ra(hu-IL-36α、hu-IL-36β、hu-IL-36γ、hu-IL-36Ra)及食蟹獼猴IL-36α、IL-36β、IL-36γ(cy-IL-36α、cy-IL-36β、cy-IL-36γ)的活性N端截短形式。表現構築體之胺基酸序列邊界提供於以上表1及隨附序列表中。出於純化目的，所有重組IL-36α及IL-36β多肽構築體均具有N端「12×His-SUMO」標籤(SEQ ID NO：8)。出於純化目的，IL-36γ之構築體具有以下「12×His-TEV」N端標籤：HHHHHHHHHHHHENLYFQS(SEQ ID NO：9)。出於純化目的，IL-36Ra之構築體具有以下C端「GS-TEV-GS-huIgG1Fc-FLAG」標籤(SEQ ID NO：12)，以及用於哺乳動物細胞表現之N端分泌信號序列：MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：11)。如本文別處所提及，對於一些應用，出於偵測或捕獲目的，IL-36構築體包含以下C端「GS-AviTag」 (IL-36-Avi)：GGGGSGLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO：10)。
根據製造商之方案，將IL-36構築體蛋白在One Shot BL21(DE3)化學勝任型大腸桿菌(美國馬薩諸塞州沃爾珊之賽默飛世爾(Thermo Fisher,Waltham,MA,USA))中表現。在LB培養液中用康黴素(25ug/mL)選擇進行標準IPTG(1mM)誘導方案。誘導後，使細胞在25攝氏度下生長20至24小時，且以沈澱形式收穫。在溶菌酶(100ug/mL)及蛋白酶抑制劑中進行標準音波處理程序，以自大腸桿菌沈澱中提取可溶性蛋白。澄清上清液補充有20mM咪唑pH 7.5且施加至HisTrap FF粗製物管柱(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療(GE Healthcare,Chicago,IL,USA))，所述管柱在20mM Tris-HCl、150mM NaCl(TBS)、20mM咪唑pH 7.5中平衡。用10CV梯度至100% TBS、500mM咪唑pH 7.5溶離蛋白質。根據具有以下修改之製造商之方案，在用His-SUMO蛋白酶(美國馬薩諸塞州沃爾珊之賽默飛世爾)或His-TEV蛋白酶(美國加利福尼亞州紐瓦克(Newark,CA,USA)之ATUM)切割N端融合標籤後，產生成熟形式之IL-36蛋白構築體：SUMO蛋白酶用10mM DTT預處理5分鐘，且隨後在25攝氏度下與含有含10mM DTT之TBS pH 7.5的反應(約0.02單位/微克受質)中使用18至24小時；在25攝氏度下，將TEV蛋白酶用於反應(50μg/mL)2小時。蛋白酶處理後，使用HisTrap FF管柱進行親和純化以移除裂解標籤，且保留流通過之餾分，且隨後將其負載至Superdex 75增加管柱(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療)上。將含有單體蛋白質之波峰餾分合併且儲存於25mM HEPES、150mM NaCl(HBS)，pH 7.5、0.02% NaN3中。
根據製造商之方案，使C端Fc融合IL-36Ra蛋白在Expi293F細胞(美國馬薩諸塞州沃爾珊之賽默飛世爾科技)中表現。6天後收穫細胞，且將澄清上清液施加至在TBS中平衡之MabSelect SuRe管柱(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療)上。將蛋白質在20mM檸檬酸鹽pH 2.95、150mM NaCl(CBS) 中溶離，且立即用1/25體積1.5M Tris-HCl pH 8.8中和。如先前所描述，使用His-TEV蛋白酶移除C端Fc標籤，接著使用HisTrap FF與MabSelect SuRe管柱之組合進行親和純化，以移除純化標籤及His-TEV蛋白酶。如先前針對IL-36蛋白所描述，進行流通過之餾分的後續純化。
對於一些應用，IL-36蛋白經隨機或位點特異性地生物素標記。對於IL-36蛋白之隨機生物素標記，根據製造商之說明書使用NHS-PEG4-生物素(美國馬薩諸塞州沃爾珊之賽默飛世爾)。對於IL-36-Avi蛋白之位點特異性生物素標記，將大腸桿菌用表現IL-36-Avi之質體及BirA生物素連接酶(來自美國科羅拉多州奧羅拉(Aurora,CO,USA)之Avidity的pBirAcm質體)共轉形。如先前所描述，在起始培養步驟中添加氯黴素(10ug/mL)進行IPTG誘導，以便在活體內生物素標記之誘導步驟期間用BirA基因及50uM d-生物素進行雙重選擇。
實例2：使用酵母展示方法產生抗人類IL-36抗體，篩選且選擇以進行進一步定性
A.藉由酵母展示進行抗hu-IL-36抗體之選擇
人類IL-36α(BioLegend)、人類IL-36β(Novus)及人類IL-36γ(Novus)以N端截短(活性)形式商業上獲得。出於酵母選擇及篩選目的，此等IL-36蛋白使用NHS-PEG4-生物素(皮爾斯)進行生物素標記，或根據製造商之方案，使用NHS-4×PEG-Dylight-650(Thermo Scientific)用DyLight-650標記，目標為標記：蛋白質之比率在1至3比1之間。
使用呈現於酵母表面上之人類抗體庫產生識別hu-IL-36的抗體(美國專利第10,011,829號)。根據美國專利第10,011,829號中所描述之方法，產生酵母展示庫以呈現基於5個VH、4個Vκ及一個Vλ基因區段的Fab片段，所述專利以全文引用之方式併入本文中。合理設計25個子庫，以便改良CDR 中之胺基酸多樣性，同時在抗體構架區中保留生殖系序列。經工程改造之CDR中的胺基酸使用與在人類抗體資料庫中觀測到之彼等可變區亞家族的胺基酸使用相匹配，所述人類抗體資料庫由具有超過350,000個天然存在之人類抗體純系的深度定序資料集產生。使用文庫鑑別能夠結合hu-IL-36之抗體的方法，包含用於擴增文庫或自富集或分選過程中收穫之酵母細胞，及誘導酵母表面上的抗體表現以用於用抗原進行FACS分選的方法，如美國專利第10,011,829號中所描述進行。
將包括基於不同VH-Vκ或VH-Vλ組合之個別庫的主人類抗體庫分成兩個池(庫1至13及庫14至25)，以使得能夠藉由磁性活化細胞分選(MACS)對識別hu-IL-36之純系進行高效初始富集。庫生長至多3倍原始庫效價，且藉由在20℃下用含有2%半乳糖之誘導培養基生長酵母誘導抗體表現。進行三輪MACS，且自每一輪收穫之細胞經擴增，使得所收穫之酵母細胞之數目的10倍用於下一輪MACS。
為了進行MACS選擇，將經生物素標記之hu-IL-36α、hu-IL-36β及hu-IL-36γ蛋白合併在一起。在三輪連續MACS富集中，各庫酵母細胞池均與300nM經生物素標記之hu-IL-36α、hu-IL-36β及hu-IL-36γ中之每一者一起培育。在4℃下伴隨旋轉培育2小時後，洗滌細胞，且將3mL抗生蛋白鏈菌素塗佈之磁珠(加利福尼亞州奧本之美天旎生物技術(Miltenyi Biotec,Auburn,CA))添加至各池中。在4℃下伴隨旋轉培育1小時後，使用LS管柱(加利福尼亞州奧本之美天旎生物技術)藉由磁性活化珠粒分選抗原結合細胞。收集來自兩個庫池之收穫細胞，合併，擴增10倍隔夜，且隨後使其經歷第二輪MACS選擇，所述選擇包含用桿狀病毒及抗生蛋白鏈菌素塗佈之珠粒進行預清除耗乏，隨後將剩餘的酵母細胞與300nM之3種經生物素標記之hu-IL-36細胞介素中之每一者一起培育。自第三輪MACS收穫之輸入池的百分比為9.7%。
在進行FACS分選實驗以鑑別hu-IL-36蛋白的高親和力酵母純系之前，測試不同結合緩衝液以使非特異性結合減至最少。hu-IL-36α及hu-IL-36β之最佳結合緩衝液為含0.5%牛血清白蛋白之PBS(美國賓夕法尼亞州拉德諾(Radnor,PA,USA)之VWR Life Science)，而利用hu-IL-36γ之實驗需要含經過濾、溶解之5%乳粉之PBS(美國新澤西州海蘭茲(Highlands,NJ,USA)之LabScientific)以使背景結合減至最少。
使用含有所選結合緩衝液之單獨等分試樣中之150nM之各PEG4-生物素-IL-36細胞介素，且使用抗生蛋白鏈菌素-PE作為二級偵測試劑進行FACS1。收集抗原陽性細胞，擴增10倍，且使用經PEG-Dylight-650標記之hu-IL-36蛋白及與FACS1中相同的緩衝液條件，用於額外兩輪FACS(FACS2及FACS3)。FACS3中所收穫之抗原陽性細胞百分比對於hu-IL-36α為2.3%，對於hu-IL-36β為1.0%，且對於hu-IL-36γ為11.4%。接種0.2%之具有最高平均螢光強度之抗原陽性細胞，且將個別純系選取至深孔培養盤中，且與誘導培養基一起培養48小時，以誘導Fab片段分泌至培養物上清液中。收穫酵母培養物，藉由離心移除細胞，且隨後藉由ELISA測試含Fab之上清液與其各別抗原之結合活性。
對於利用酵母培養物上清液之ELISA，將96孔ELISA盤以每孔250毫微克(ng)之中性親和素塗佈，用含0.5% BSA之PBS(「阻斷緩衝液」)阻斷，且隨後每孔添加250ng經生物素標記之hu-IL-36α、hu-IL-36β或hu-IL-36γ。洗滌後，添加20μL培養基及30μL阻斷緩衝液，將培養盤在室溫下搖動培育1小時，洗滌且結合用抗人類Fab HRP偵測到之Fab。來自此等單一細胞介素分選之大多數純系在此一級ELISA中展現與其經選擇所針對之hu-IL-36細胞介素的結合活性。在測試對所有三種hu-IL-36細胞介素之結合活性的二級ELISA中，觀測到結合至hu-IL-36α及hu-IL-36γ兩者(但不結合至hu-IL-36β) 的純系。因此，實行兩種FACS分選策略來鑑別hu-IL-36α/γ交叉反應性純系。
hu-IL-36α/hu-IL-36γ交叉反應性抗體之鑑別及選擇
在用於選擇能夠識別hu-IL-36α及hu-IL-36γ兩者之純系的第一分選策略中，在FACS3中用150nM PEG-Dylight-650-huIL-36α獲得之細胞(2.3%抗原陽性)擴增10倍且用100nM PEG4-生物素-IL-36α分選，產生15.5%抗原陽性細胞(FACS4)。擴增此等細胞且用100nMPEG-Dylight-650-huIL-36γ染色，產生29.1%抗原陽性細胞(FACS5AG)。將FACS5AG中所收集之細胞擴增10倍，且用10nM PEG-Dylight-650-huIL-36γ及10nM PEG4-生物素-IL-36α(用抗生蛋白鏈菌素-PE偵測)染色，產生7.3% IL-36α/γ雙陽性細胞(FACS6AG)。將FACS6AG中所收集之細胞擴增10倍，且用10nM PEG-Dylight-650-huIL-36α及10nM PEG4-生物素-IL-36γ(用抗生蛋白鏈菌素-PE偵測)染色，產生1.0% IL-36α/γ雙陽性細胞(FACS7AG)。
在用於選擇能夠識別hu-IL-36α及hu-IL-36γ兩者之純系的第二分選策略中，將在FACS3中用150nM PEG-Dylight-650-huIL-36γ獲得之細胞(11.4%抗原陽性)擴增10倍，且用100nM PEG4-生物素-IL-36α分選，選擇抗原陽性細胞(FACS4GA)。將此等細胞擴增且用100nM PEG-Dylight-650-huIL-36α及100nM PEG4-生物素-IL-36γ(用抗生蛋白鏈菌素-PE偵測)染色，產生1.0% IL-36α/γ雙陽性細胞(FACS5GA)。將FACS5GA中所收集之細胞擴增10倍，且用100nM PEG4-生物素-huIL-36α(用抗生蛋白鏈菌素-PE偵測)及100nM PEG-Dylight-650-huIL-36γ染色，產生8.0% IL-36α/γ雙陽性細胞(RFACS6GA)。將RFACS6GA中所收集之細胞擴增10倍，且用100nM PEG-Dylight-650-huIL-36α及100nM PEG4-生物素-IL-36γ(用抗生蛋白鏈菌素-PE偵測)染色，產生1.3% IL-36α/γ雙陽性細胞(RFACS7GA)。
接種來自FACS7AG及RFACS7GA，具有最高平均螢光強度之 0.2%的IL-36α/γ雙陽性細胞，選取且培養個別純系，且隨後如上文所描述藉由ELISA測試含Fab之上清液與hu-IL-36α及hu-IL-36γ的結合活性。結合hu-IL-36α及hu-IL-36γ兩者之87個純系經選擇用於定序。
為了獲得所選酵母純系之抗體序列，自酵母純系中提取質體DNA，且使用結合至酵母啟動子區之正向引子，及對於重鏈結合至人類IgG1-CH1區之恆定區，且對於輕鏈結合至κ或λ鏈之恆定區的反向引子進行PCR。隨後使用用於PCR反應之相同引子藉由桑格定序(Sanger sequencing)對PCR產物進行定序。
87個hu-IL-36α/γ交叉反應性純系代表30個在序列上獨特之純系。
hu-IL-36β反應性抗體之鑑別及選擇
在用於選擇能夠識別huIL-36β之純系的分選策略中，將在FACS3中用150nM PEG-Dylight-650-huIL-36β獲得之細胞(1.0%抗原陽性)擴增10倍，且用100nM PEG4-生物素-IL-36β分選，且用抗生蛋白鏈菌素-PE偵測，產生13.1%抗原陽性細胞(FACS4B)。將此等細胞擴增且用20nM PEG-Dylight-650-huIL-36β染色，產生5.8% IL-36β陽性細胞(FACS5B)。
接種來自FACS5B，具有最高平均螢光強度之0.2% IL-36β陽性細胞，選取且培養個別純系，且隨後如上文所描述藉由ELISA測試含Fab之上清液與其各別抗原之結合活性。來自此分選之大多數純系展現與IL-36β之結合活性。
如上文所描述，對總共83個IL36BS7純系進行定序，產生8個獨特純系。
B.含有抗hu-IL-36抗體之酵母細胞上清液的活體外篩選
如上文所描述，藉由ELISA測試來自感興趣的酵母純系之細胞上清液與人類IL-36的結合。為了比較此等上清液與人類及食蟹獼猴IL-36之結 合，將IL-36蛋白以2.5μg/mL塗佈於96孔Nunc MaxiSorp培養盤(賽默飛世爾)上，且用含5%山羊血清之PBS阻斷培養盤。將酵母上清液用含1% w/v BSA之PBST 1：1稀釋，且在攪拌下添加至ELISA盤中持續1至1.5小時。藉由將培養盤與F(ab')2-HRP(Jackson ImmunoResearch)一起培育偵測結合Fab。藉由添加50微升/孔之四甲基聯苯胺(TMB)微孔過氧化物酶受質(美國猶他州洛根(Logan,UT,USA)之Scytek Laboratories,Inc.)將ELISA顯色3至10分鐘，且藉由用50微升/孔之2N H2SO4(美國密蘇里州聖路易斯(St.Louis,MO,USA)之西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich Corporation))的酸化作用停止酶顯色。用SpectraMax i3X盤式讀取器(美國加利福尼亞州聖荷西(San Jose,CA,USA)之Molecular Devices LLC)分析樣品在450nm之波長下的光密度(OD450)。為了估計此分析中各純系對食蟹獼猴IL-36及人類IL-36之相對親和力，對各純系及IL-36細胞介素計算OD 450之比率(OD450cyIL-36/OD450huIL-36)。八個抗IL-36Fab純系(mAb1.0-mAb8.0)經選擇用於進一步定性且結果展示於表3中。
表3：藉由ELISA測定之所選抗IL-36 Fab與hu-IL-36及cy-IL-36之結合。
Figure 108147052-A0202-12-0142-84
C.測定Fab上清液之阻斷效力的基於細胞之分析
此實例及以下實例中所描述之HEK-Blue細胞株使用HEK-293細胞株(人類胚腎上皮細胞)作為原始親本譜系。HEK-Blue IL-1/IL-33感測細胞獲自InvivoGen(美國加利福尼亞州聖地亞哥(San Diego,CA,USA)之InvivoGen；目錄號hkb-il33)。此等IL-1/IL-33感測細胞藉由用表現IL-33受體ST2之人類ST2基因穩定轉染HEK-Blue IL-1β感測細胞(InvivoGen；目錄號hkb-il1b)而產生。HEK-Blue IL-1β細胞表現NF-κB/AP-1 SEAP(分泌性胚胎鹼性磷酸酶)報導基因且含有不活化TNF-α反應以確保SEAP產生代表IL-1或IL-33路徑活化。HEK-Blue IL-1/IL-33反應細胞根據製造商準則維持。簡言之，在標準生長培養基中維持細胞，所述培養基由DMEM(美國紐約州康寧之康寧公司(Corning,Inc.,Corning,NY,USA))組成，補充有10%胎牛血清(FBS)(美國佐治亞州弗羅爾布萊什(Flowery Branch,GA,USA)之Atlanta Biologicals,Inc.)、100IU/mL青黴素及100μg/mL鏈黴素。所述生長培養基進一步補充有100μg/mL用以維持編碼SEAP之質體的吉歐黴素(zeocin)、200μg/mL用以維持IL-1特異性之潮黴素B及100μg/mL用以維持編碼ST2之質體的殺稻瘟菌素(blasticidin)。由AvantGen(定製)產生含有編碼IL-36受體之人類IL1RL2基因的質體。使用LyoVec(InvivoGen)根據製造商準則短暫轉染HEK-Blue IL-1/IL-33感測細胞。簡言之，將LyoVec-DNA複合物以將在轉染後24小時產生最小80%匯合度之濃度直接添加至懸浮於標準生長培養基中之細胞中，且立即接種於96孔平底培養盤上。轉染後24小時，將細胞在標準HEK-Blue SEAP分析內使用。
產生由連續稀釋系列組成之促效劑劑量-反應曲線，以提供對分析中待使用之促效劑之半數最大有效濃度(EC50)的估計。在一些HEK-Blue分析中將以下可商購之人類細胞介素用作促效劑：IL-36α(BioLegend)、IL-36β(Novus Biologicals)及IL-36γ(Novus Biologicals)。在實驗使用前24小時，將經短暫 轉染之細胞以一濃度接種於96孔平底培養盤上，在使用時產生最小80%之匯合度。向細胞中添加所期望的促效劑至最終體積200μL且將細胞在37℃下在5% CO2下培育24小時。使用SEAP偵測分析定量SEAP產量。使用SEAP偵測培養基QUANTI-Blue(InvivoGen)，在各種指定條件下且根據一般製造商準則，測定SEAP之含量。具體而言，向130μL QUANTI-Blue偵測培養基中添加20μL細胞培養物上清液(在添加促效劑後24小時收集)。使反應在37℃下進行一小時，此時使用SpectraMax(Molecular Devices)分光光度計聯合SoftMax Pro軟體(Molecular Devices)量測650nm波長下之吸光度。使用GraphPad Prism 7軟體分析原始分析資料，對分析中之促效劑EC50值進行非線性回歸測定。
如上文所描述，但採用以下修改，對酵母細胞培養物上清液(SN)中之非純化抗hu-IL-36 Fab片段進行HEK-Blue SEAP分析。將含有抗hu-IL-36 Fab片段之非純化酵母細胞培養物SN濃縮20倍，且緩衝液交換至PBS(1：20)中，以減少HEK-Blue SEAP分析中之背景噪音。將40μL PBS及10μL含有抗hu-IL-36 Fab片段之濃縮及緩衝液交換的酵母細胞培養物SN添加至經IL-36R轉染的HEK-Blue IL-1/IL-33細胞中。將細胞及含抗體之融合瘤細胞培養物SN在37℃下在5% CO2下培育一小時。在一小時抗體培育後，以4×所期望的濃度且以在200μL之總體積內產生1×最終所期望的濃度的方式向含有細胞及抗體之孔中添加促效劑。藉由相對於陽性對照(僅在含有不相關Fab之酵母細胞培養物SN中暴露於促效劑的細胞)，確定自樣品(在此情況下，含抗hu-IL-36抗體之酵母細胞培養物SN)獲得之吸光度值的比率，且將此比率乘以100來計算抑制百分比。
經選擇用於進一步定性之8個抗IL-36 Fab純系(mAb1.0-mAb8.0)之結果展示於以下表4中。表2及隨附序列表中亦揭示所選純系之序列。
表4.基於HEK Blue細胞之分析中所選抗IL-36酵母純系Fab上清 液之阻斷活性
Figure 108147052-A0202-12-0145-85
根據表3及表4中概述之所觀測到的結合及阻斷活性，產生呈重組人類IgG1及裂解Fab片段形式之五種IL-36α/IL-36γ交叉反應性抗體(mAb1.0-mAb5.0)及三種IL-36β反應性抗體(mAb6.0-mAb8.0)，以便進一步定性。藉由根據製造商之說明書，在Expi293或ExpiCHO細胞(賽默飛世爾科技)中短暫共轉染編碼其重鏈及輕鏈的哺乳動物表現質體產生IgG。5至7天後收穫細胞，將澄清上清液施加至在TBS中平衡之MabSelect SuRe管柱(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療)。將蛋白質在20mM檸檬酸鹽pH 2.95、150mM NaCl(CBS)中溶離，且立即用1/25體積1.5M Tris-HCl pH 8.8中和。Fab片段藉由離胺醯基-C(Wako Chemicals)裂解產生。簡言之，在37℃下在輕柔攪拌下，在含有100mM Tris pH 8.0之PBS中進行離胺醯基-C裂解1小時，且藉由將反應物稀釋10倍至50mM乙酸鈉pH 5.2中而停止。藉由將樣品施加至在10mM乙酸鈉pH 5.2中平衡之SP-HP陽離子交換管柱(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療)，且用30管柱體積梯度溶離至100% 10mM乙酸鈉pH 5.2、1M NaCl來純化Fab餾分。合併含有Fab之餾分，濃縮且緩衝液交換至PBS中。
D.所選抗IL-36抗體之結合動力學分析
使用表面電漿子共振(SPR)分析，用BIACORETM 8K儀器(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療)測定純化mAb2.0 Fab對hu-IL-36α及hu-IL-36γ之結合親和力；及純化mAb6.0 Fab對hu-IL-36β之結合親和力。簡言之，以2μL/min流動速率向CAP感測器晶片施加生物素捕獲試劑(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療)於HBS-EP緩衝液(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療；0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性劑P20)中之1：4稀釋液。對於動力學量測，以10μL/min捕獲12.5nM經生物素標記之hu-IL-36α及hu-IL-36γ；6nM經生物素標記之hu-IL-36β，以在第二流量槽(FC2)中達成25至40個響應單位。FC1保持作為參考。接下來，在25℃或37℃下自低(0.78nM mAb2.0 Fab，1.56nM mAb6.0 Fab)至高(100nM mAb2.0 Fab，200nM mAb6.0 Fab)注射(流動速率：30μL/min)Fab蛋白於HBS-P緩衝液(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療；0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005%界面活性劑P20)中之2倍連續稀釋液。記錄感測器圖譜且在用BIACORE® 8K評估軟體(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療；1.1.1.7442版)進行資料分析之前進行參考及緩衝減除。使用簡單的一對一朗格繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model)計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)按比率koff/kon來計算。
mAb2.0 Fab及mAb6.0 Fab之Biacore親和力結果概述於以下表5中。
表5：所選抗IL-36抗體在25℃及37℃下之結合親和力(KD、kon、koff)
Figure 108147052-A0202-12-0147-86
E.基於細胞之分析中重組抗IL-36抗體的功能活性
HEK Blue報導分析中抗體阻斷hu-IL-36之活性
使用經IL-36受體IL1RL2短暫轉染之HEK-Blue IL-1/IL-33感測細胞，測試來源於八個親本酵母純系mAb1.0-mAb8.0之重組抗hu-IL-36抗體，以確定其阻斷hu-IL-36α、hu-IL-36β及hu-IL-36γ介導之IL1RL2/IL1RAP路徑活化的能力。
使用重組抗hu-IL-36抗體之HEK-Blue SEAP分析與上文所描述之利用酵母細胞培養物SN的分析類似地進行。簡言之，將抗體與細胞一起在不存在促效劑的情況下在標準生長培養基內在37℃下在5% CO2下培育一小時。在一小時培育後，以所估計的EC50濃度添加所期望的促效劑至最終體積200μL且使實驗再進行24小時。陰性對照(NC)表示僅暴露於生長培養基之細胞，而陽性對照(PC)表示僅暴露於促效劑之細胞(在不存在拮抗性或對照抗體的情況下)。
為了測定抗體(包含如以下實例中所描述之Fab)之半數最大抑制濃度(IC50)，使用七點連續稀釋系列(以指定濃度開始)。與本文所描述之促效劑劑量反應曲線一樣，使用GraphPad Prism 7軟體進行非線性回歸分析以由分析結果確定IC50值。
Hu-IL-36α(SEQ ID NO：1)、hu-IL-36β(SEQ ID NO：2)及hu-IL-36γ(SEQ ID NO：3)用作以下HEK-Blue分析中之促效劑。對所有mAb進行劑量反 應。此等HEK Blue分析之結果展示於以下表6中。
表6：HEK Blue分析中重組抗hu-IL-36抗體之IL-36抑制
Figure 108147052-A0202-12-0148-89
如由表6之HEK Blue分析結果所示，在所有測試抗體中，mAb2.0展現對hu-IL-36α及hu-IL-36γ兩者最有效的阻斷活性，而mAb6.0展現對hu-IL-36β之強效阻斷活性。
HEK Blue報告分析中抗體之Cy-IL-36阻斷活性
使用經人類IL-36受體IL1RL2短暫轉染之HEK-Blue IL-1/IL-33感測細胞，測試重組抗hu-IL-36抗體mAb2.0及mAb6.0，以測定其阻斷食蟹獼猴IL-36(cy-IL-36α、cy-IL-36β及cy-IL-36γ)介導之IL1RL2/IL1RAP路徑活化的能力。使用食蟹獼猴IL-36之HEK-Blue SEAP分析與上文所描述之利用人類IL-36細胞介素的分析類似地進行。在此HEK-Blue分析中，將Cy-IL-36α、cy-IL-36β及cy-IL-36γ用作促效劑。產生由十二點連續稀釋系列組成之促效劑劑量-反應曲線，以展現通過人類IL1RL2/IL1RAP路徑之cy-IL-36細胞介素的強效信號傳導，且提供待用於分析中之促效劑之半數最大有效濃度(EC50)的估計值。為測定抗體之半數最大抑制濃度(IC50)，使用十一個點連續稀釋系列。與先前提及之促效劑劑量反應曲線一樣，使用GraphPad Prism 7軟體進行非線性回歸分 析以自分析結果確定IC50值。
對所有mAb進行劑量反應。mAb2.0展現對cy-IL-36α及cy-IL-36γ之強效阻斷活性(分別地，IC50 0.56nM及1.71nM)，而mAb6.0展現對cy-IL-36β之強效阻斷活性(IC50 1.96nM)。
抗hu-IL-36抗體對HaCat細胞之IL-36刺激之IL-8分泌的阻斷活性
人類角質細胞株HaCat來源於來自組織學正常皮膚之活體外自發轉形角質細胞。HaCat細胞株為可商購的，且獲自AddexBio(目錄號T002000)。使用製造商推薦的一般準則解凍及維持低溫保藏細胞。將HaCat細胞維持在由DMEM以及L-麩醯胺酸、4.5g/L葡萄糖及丙酮酸鈉(康寧)組成之生長培養基中，所述培養基補充有在使用前熱滅活(56℃ 30分鐘)之10%胎牛血清(Atlanta Biologicals)、100IU/mL青黴素及100μg/mL鏈黴素、1mM丙酮酸鈉(康寧)。實驗使用前一天，將HaCat細胞以10,000個細胞/孔接種於平底96孔培養盤，以在使用當天處於約80%至85%匯合度。
在用於抗體阻斷分析中之前，藉由以如實例2中針對HEK Blue細胞所描述之類似方式，但伴隨以下修改，進行促效劑劑量-反應曲線以測定促效劑EC50。在向僅含有HaCat細胞生長培養基之孔中之HaCat細胞中添加促效劑(最終體積200μL)後，將細胞返回至組織培養培育箱中(37℃，5% CO2)，持續24小時。隨後收集組織培養物上清液且將其於-20℃下儲存。
如上針對HEK Blue細胞但以有助於獲得IC50值之方式進行抗體阻斷分析，伴隨專門考慮到HaCat細胞使用之修改。簡言之，將抗hu-IL-36 IgG抗體、天然IL-36拮抗劑IL-36Ra或適當抗體對照(例如，Hu IgG1對照)與HaCat細胞在37℃下培育1小時，接著添加促效劑(IL-36α、IL-36β或IL-36γ)。使實驗再進行24小時(37℃，5% CO2)，收集細胞培養物上清液且如下文所描述 進行IL-8定量。
根據製造商準則，使用人類IL-8 ELISA套組(賽默飛世爾科技)定量上清液內之IL-8水準。使用GraphPad Prism軟體分析所獲得之原始資料，內插使用線性回歸分析進行。隨後使用非線性回歸3參數分析法分析內插資料，以得出促效劑EC50及抗體IC50值。
在人類HaCat角質細胞細胞株中，如圖1A及圖1C中之結果所示，mAb2.0展現對hu-IL-36α及hu-IL-36γ之強效阻斷活性(IC50分別為0.28nM及1.23nM)，而如圖1B中所示，mAb6.0展現對hu-IL-36β之強效阻斷活性(IC500.082nM)。mAb2.0對hu-IL-36α及hu-IL-36γ之阻斷效力優於天然拮抗劑IL-36Ra(分別為100倍及12倍)，且mAb6.0對hu-IL-36β之阻斷效力優於IL-36Ra(1000倍)。
抗IL-36抗體阻斷初代人類角質細胞之IL-36刺激之IL-8分泌的活性
初代人類新生兒合併角質細胞(HEKn)為市售的，且獲自賽默飛世爾(目錄號A13401)。自正常(無疾病)捐贈的人類組織分離細胞且由製造商低溫保藏所述細胞。使用製造商推薦的一般準則解凍及維持細胞。將HEKn細胞維持在由EpiLife培養基(賽默飛世爾)以及人類角質細胞生長補充物(賽默飛世爾)、100IU/mL青黴素及100μg/mL鏈黴素組成的生長培養基中。在實驗使用的前一天，將HEKn細胞以10,000個細胞/孔接種於平底96孔培養盤，以在使用當天處於約80%至85%匯合度。
在用於抗體阻斷分析中之前，藉由以如實例2中針對HaCat細胞所描述之類似方式，但伴隨以下修改，進行促效劑劑量-反應曲線以測定促效劑EC50。在向僅含有細胞生長培養基之孔中之HEKn細胞中添加促效劑(最終體積200μL)後，將細胞返回至組織培養培育箱中(37℃，5% CO2)，持續24 小時。隨後收集組織培養物上清液且將其於-20℃下儲存。
如上文所描述對HaCat細胞進行抗體阻斷分析。簡言之，將xIL-36 IgG或適當抗體對照(例如，Hu IgG1對照)與HEKn細胞一起如所指示在37℃下培育1小時，接著添加促效劑(IL-36α、IL-36β或IL-36γ)。使實驗再進行24小時(37℃，5% CO2)，收集細胞培養物上清液且如下文所描述進行IL-8定量。
根據製造商準則，使用人類IL-8 ELISA套組(賽默飛世爾科技)定量上清液內之IL-8水準。使用GraphPad Prism軟體分析所獲得之原始資料，內插使用線性回歸分析進行。隨後使用標準非線性回歸3參數分析來分析內插資料，以得出促效劑EC50及抗體IC50值。
在初代人類成人角質細胞中，如圖2A及圖2C中之HEKn分析結果所示，mAb2.0展現對hu-IL-36α及hu-IL-36γ之強效阻斷活性(IC50分別為0.33nM及2.27nM)，而如圖2B中所示，mAb6.0展現對hu-IL-36β之強效阻斷活性(IC50 1.75nM)。
實例3：mAb6.0 HC/mAb2.0 LC嵌合體mAb6.0_2.0結合及阻斷hu-IL-36β之活性
類似於以上實例2中所描述之其他IgG，產生mAb6.0_2.0，除藉由共轉染mAb6.0之重鏈及mAb2.0之輕鏈進行以外。
使用表面電漿子共振(SPR)分析，BIACORETM 8K儀器(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療)測定mAb6.0_2.0 IgG之hu-IL-36β結合親和力。簡言之，以10μL/min在蛋白質感測器晶片(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療)上捕獲HBS-P緩衝液(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療；0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005%界面活性劑P20)中之6nM mAb6.0_2.0 IgG或mAb6.0 IgG，以在第二流量槽(FC2)中達成50至60個響應單位。FC1保持作為參考。 接下來，在37℃下自低(0.046nM hu-IL-36β)至高(100nM hu-IL-36β)注射(流動速率：30μL/min)hu-IL-36β於HBS-P緩衝液中之3倍連續稀釋液。記錄感測器圖譜且在用BIACORE® 8K評估軟體(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療；1.1.1.7442版)進行資料分析之前進行參考及緩衝減除。使用簡單的一對一朗格繆爾結合模型計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)按比率koff/kon來計算。
mAb6.0_2.0 IgG以6.7nM之KD(kon=3.20×105 1/Ms，koff=2.14×10-3 1/s)結合hu-IL-36β，而mAb6.0 IgG以0.42nM之KD(kon=3.62×105 1/Ms，koff=1.15×10-4 1/s)結合hu-IL-36β。因此，mAb6.0_2.0結合hu-IL-36β之親和力比mAb6.0低16倍。
為了測定mAb6.0_2.0 IgG之活體外阻斷效力及功效，吾人評估其抑制HaCat細胞之hu-IL-36β刺激之IL-8分泌的能力。如實例2中所描述進行HaCat細胞分析。簡言之，將mAb6.0_2.0 IgG、mAb6.0 IgG或適當抗體對照(例如，Hu IgG1對照)與HaCat細胞一起在37℃下培育1小時，接著添加hu-IL-36β促效劑。使實驗再進行24小時(37℃，5% CO2)，收集細胞培養物上清液且如實例2中所描述進行IL-8定量。隨後在GraphPad Prism軟體中使用標準非線性回歸分析來分析內插資料，以得出抗體IC50值。
發現mAb6.0_2.0 IgG抑制HaCat角質細胞細胞株由hu-IL-36β刺激之IL-8分泌的效力比mAb6.0 IgG低16倍(mAb6.0_2.0 IC50=12.7nM；mAb6.0 IC50=0.8nM)。
實例4：使用噬菌體庫淘選，抗IL-36抗體之親和力成熟
此實例說明對IL-36β及IL-36α/γ具有改良親和力之mAb6.0_2.0及mAb2.0抗體之親和力成熟形式的製備。
A.防止焦麩胺酸轉化之突變
為了防止焦麩胺酸變異體之形成，麩醯胺酸(Q或Gln)可突變為麩胺酸(E或Glu)(Amphlett,G.等人，《醫藥生物技術(Pharm.Biotechnol.)》9：1-140(1996))。藉由基因合成將mAb2.0及mAb6.0之重鏈可變域及輕鏈可變域中的位置1(根據Kabat編號)由麩醯胺酸(Q)突變為麩胺酸(E)，產生抗體mAb2、mAb6及mAb6_2。將可變域選殖至含有8×His標籤之哺乳動物Fab表現構築體中，以產生Fab蛋白。亦可在mAb1.0、mAb3.0、mAb4.0、mAb5.0、mAb7.0及mAb8.0中進行位置1處之類似突變。
B.mAb6_2親和力成熟NNK庫構築及淘選
為了改良mAb6重鏈與mAb2輕鏈配對(mAb6_2，一條臂用於共同輕鏈雙特異性分子)針對人類IL-36β之親和力，由呈用於單價Fab噬菌體呈現之Fab-琥珀格式的mAb6_2構築噬菌體庫，其中重鏈HVR殘基(亦即，HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3)使用NNK簡併密碼子隨機化，所述簡併密碼子用32個密碼子編碼所有20種胺基酸(Brenner等人，1992)(其中mAb2輕鏈殘基保持不變)。庫經設計以允許三個重鏈HVR中之每一個中發生一個NNK突變。隨後使用孔克爾突變誘發(Kunkel mutagenesis)(Kunkel等人，1987)，使用合成突變誘發寡核苷酸構築重鏈庫。將所得庫DNA電穿孔至大腸桿菌XL1細胞中，得到大致4×109個轉形體。將噬菌體庫在SUPERBLOCKTM PBS緩衝液(皮爾斯)及0.05% TWEEN® 20中培育30分鐘，且隨後施加至人類IL-36β塗佈之培養盤上進行第一輪淘選。在後續兩到三輪中，將噬菌體庫在溶液中與濃度逐漸降低之經生物素標記之人類IL-36β以及作為競爭者之1000×未經生物素標記人類IL-36β一起培育，以提高選擇嚴格性。
C.來自親和力成熟NNK庫之mAb6_2噬菌體變異體的表徵
純化具有最高結合信號之所選噬菌體以進行噬菌體競爭ELISA。最佳噬菌體濃縮物與ELISA緩衝液(PBS中之0.5% BSA及0.05% TWEEN®20) 中之連續稀釋人類IL-36β在NUNC F培養盤中一起培育兩小時。將80μl的混合物轉移至人類IL-36β塗佈之孔中15分鐘，以捕獲未結合噬菌體。將培養盤用洗滌緩衝液(PBS中之0.05% TWEEN®20)，且向ELISA緩衝液中添加HRP綴合抗M13抗體(Sino biological，目錄號11973-MM05-H-50)，持續30分鐘。將培養盤在室溫下在攪拌下培育一小時，用洗滌緩衝液洗滌六次且藉由添加100微升/孔之1步Turbo TMB受質(賽默飛世爾，目錄#34022)顯色15分鐘。酶反應用50微升/孔之2N H2S04停止。使用珀金埃爾默(Perkin Elmer)盤讀取器(Envision 2103多標記讀取器)在450nm處分析培養盤。450nm處之吸光度作為溶液中之抗原濃度的函數繪製，以確定噬菌體IC50。此用作在噬菌體表面上呈現之Fab純系的親和力估計值。亦使用Biacore量測純化Fab分子對噬菌體變異體之真實親和力(方法在以下E章節詳細描述)。以下表7中展示變異HVR序列、噬菌體IC50概述及KD值。
表7. mAb6_2變異HVR序列，針對hu-IL-36β之IC50及KD值
Figure 108147052-A0202-12-0154-90
D.mAb6_2親和力成熟庫之下一代定序
為了進一步改良mAb6_2之親和力，進行mAb6_2親和力成熟庫之下一代定序(NGS)。自攜帶來自初始噬菌體庫(未分選庫)及第二輪及第三輪溶液選擇(分選庫)之噬質體的大腸桿菌XL-1細胞分離噬質體雙股DNA。使用經純化DNA作為模板，用Illumina 16s庫製備方案產生VH區之擴增子。 使用Illumina Nextera XT索引套組添加定序銜接子及雙索引條碼。準備在Illumina MiSeq儀器上定序時，使用MiSeq試劑套組v3(600個循環)，使銜接子連接之擴增子經歷標準Illumina庫變性及樣品負載方案。進行配對末端定序以覆蓋擴增子之整個長度，插入大小為200bp至300bp。
首先使用配對末端組譯器PANDAseq(Masella等人，2012)組譯配對末端定序資料以獲得完整擴增子。隨後對經鑑別擴增子進行品質控制(QC)，其中檢查各擴增子不具有序列插入或缺失及終止密碼子，且允許各CDR序列攜帶至多僅一個NNK突變且沒有非NNK突變。藉由計算每一個隨機化位置之所有突變之頻率產生位置權重矩陣。藉由分選樣品中在給定位置之給定突變之頻率除以未分選樣品中完全相同突變之頻率來計算各突變之富集比率，如先前所描述(Koenig等人，2015)。以下表8中概述支持mAb6_2與hu-IL-36β結合改良之HVR中的預測突變。
表8.支持hu-IL-36β結合之mAb6_2中的預測突變
Figure 108147052-A0202-12-0156-91
E.mAb6_2親和力改良之NGS變異體的表徵
mAb6_2親和力改良之NGS Fab變異體之產生
根據來自NGS分析之預測突變(如以上表8所示)，合成具有變異HVR序列(如以下表9所示)之所選mAb6_2 NGS Fab，以便選殖至含有8×His標籤之哺乳動物Fab表現構築體中以產生Fab蛋白。根據製造商之方案，使用1：1之HC：LC比率，將編碼重鏈或輕鏈之質體短暫轉染至Expi293F細胞(賽默飛世 爾)中。藉由用1×磷酸鹽緩衝鹽水pH 7.2(PBS)稀釋上清液1.5×，添加10mM咪唑，且以分批模式與樹脂結合2小時，用HisPur Ni-NTA管柱純化Fab。使樹脂流過管柱，且用20CV PBS+20mM咪唑洗滌，且用5CV PBS+250mM咪唑溶離。使用PD10管柱(GE)將樣品緩衝液交換至PBS中。
使用SPR進行mAb6_2親和力改良之NGS Fab變異體之親和力測定
為了測定重組mAb6_2 NGS Fab變異體在37℃下對人類IL-36β的結合親和力，使用BIACORETM 8K儀器進行SPR量測。簡言之，以2μL/min流動速率向CAP感測器晶片施加生物素捕獲試劑(GE)於HBS-EP緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性劑P20)中之1：4稀釋液。對於動力學量測，以10uL/min捕獲6nM經生物素標記之IL-36β，以在第二流量槽(FC2)中達成約50個反應單位。FC1保持作為參考。接下來，在37℃下自低(3.125nM)至高(200nM)注射(流動速率：10uL/min)Fab於HBS-P緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005%界面活性劑P20)中之3倍連續稀釋液。記錄感測器圖譜且在藉由BIACORE® 8K評估軟體(1.1.1.7442版)評估之前進行參考及緩衝減除。使用簡單的一對一朗格繆爾結合模型計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)按比率koff/kon來計算，在表9中概述。
表9. mAb6_2變異HVR序列，其對hu-IL-36β之kon、koff及KD值
Figure 108147052-A0202-12-0158-178
F.mAb2親和力成熟NNK庫構築及淘選
為了進一步改良抗IL-36 mAb2之人類IL-36α及人類IL-36γ親和力，由呈用於單價Fab噬菌體呈現之Fab-琥珀格式的mAb2構築噬菌體庫，其中重鏈HVR殘基(亦即，HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3)使用NNK簡併密碼子隨機化，所述簡併密碼子用32個密碼子編碼所有20種胺基酸(Brenner等人，1992)(其中mAb2輕鏈殘基保持不變)。庫經設計以允許三個重鏈HVR中之每一個中發生一個NNK突變。隨後使用孔克爾突變誘發(Kunkel等人，1987)，使用合成突變誘發寡核苷酸構築重鏈庫。將所得庫DNA電穿孔至大腸桿菌XL1細胞中，得到大致4×109個轉形體。將噬菌體庫在SUPERBLOCKTM PBS緩衝液(皮爾斯)及0.05% TWEEN® 20中培育30分鐘，且隨後施加至人類IL-36α或人類IL-36γ塗佈之培養盤上進行第一輪淘選。在後續兩到三輪中，將噬菌體庫在溶液中與濃度逐漸降低之經生物素標記之人類人類IL-36α或人類IL-36γ以及作為競爭者之1000×未經生物素標記人類IL-36α或人類IL-36γ一起培育，以提高選擇嚴格性。
G.來自親和力成熟NNK庫之mAb2噬菌體變異體的表徵
純化具有最高結合信號之所選噬菌體以進行噬菌體競爭ELISA。將最佳噬菌體濃縮物與ELISA緩衝液中之連續稀釋人類IL-36α或人類IL-36γ在NUNC F培養盤中一起培育兩小時。將80μl混合物轉移至人類IL-36α或人類IL-36γ塗佈之孔中15分鐘，以捕獲未結合噬菌體。將培養盤用洗滌緩衝液(PBS中之0.05% TWEEN®20)，且向ELISA緩衝液中添加HRP綴合抗M13抗體(Sino biological，目錄號11973-MM05-H-50)，持續30分鐘。如文上所描述洗滌培養盤且顯色。450nm處之吸光度作為溶液中之抗原濃度的函數繪製，以確定噬菌體IC50。此用作在噬菌體表面上呈現之Fab純系的親和力估計值。參見以下表10，以獲得變異HVR序列及噬菌體IC50之概述。
表10：mAb2變異HVR序列及其針對hu-IL-36α及hu-IL-36γ之IC50值。
Figure 108147052-A0202-12-0160-179
H.mAb2親和力成熟庫之下一代定序
為了進一步改良mAb2之親和力，進行mAb2親和力成熟庫之下一代定序(NGS)。自攜帶來自初始噬菌體庫(未分選庫)及第二輪及第三輪溶液選擇(分選庫)之噬質體的大腸桿菌XL-1細胞分離噬質體雙股DNA。使用經純化DNA作為模板，使用Illumina 16s庫製備方案產生VH區之擴增子。使用Illumina Nextera XT索引套組添加定序銜接子及雙索引條碼。準備在Illumina MiSeq儀器上定序時，使用MiSeq試劑套組v3(600個循環)，使銜接子連接之擴增子經歷標準Illumina庫變性及樣品負載方案。進行配對末端定序以覆蓋擴增子之整個長度，插入大小為200bp至300bp。
首先使用配對末端組譯器PANDAseq(Masella等人，2012)組譯配對末端定序資料以獲得完整擴增子。隨後對經鑑別擴增子進行品質控制(QC)，其中檢查各擴增子沒有序列插入或缺失及沒有終止密碼子，允許各CDR序列攜帶至多僅一個NNK突變且沒有非NNK突變。藉由計算每一個隨機化位置之所有突變之頻率產生位置權重矩陣。藉由分選樣品中在給定位置之給定突變之頻率除以未分選樣品中完全相同突變之頻率來計算各突變之富集比率，如先前所描述(Koenig等人，2015)。表11中概述支持mAb2與hu-IL-36α或hu-IL-36γ之結合改良的HVR中之預測突變。
表11.支持人類IL-36α及IL-36γ結合之mAb2中之預測突變
Figure 108147052-A0202-12-0162-92
I.mAb2親和力改良之NGS變異體的表徵
mAb2親和力改良之NGS Fab變異體之產生
根據來自NGS分析之預測突變(如以上表11所示)，合成所選mAb2 NGS Fab HVR變異序列(如以下表12所示)，以便選殖至含有8×His標籤之哺乳動物Fab表現構築體中以產生Fab蛋白。使用1：1之HC：LC比率，將編碼重鏈或輕鏈之質體轉染至Expi293F細胞(賽默飛世爾)中。藉由用1×磷酸鹽緩衝鹽水pH 7.2(「PBS」)稀釋上清液1.5×，添加10mM咪唑，且以分批模式與樹脂結合2小時，用HisPur Ni-NTA管柱純化Fab。使樹脂流過管柱，且用20CV PBS+20mM咪唑洗滌，且用5CV PBS+250mM咪唑溶離。使用PD10管柱(GE)將樣品緩衝液交換至PBS中。
表12：mAb2 NGS Fab變異HVR序列
Figure 108147052-A0202-12-0163-94
使用SPR進行mAb2親和力改良之NGS Fab變異體之親和力測定
為了測定重組mAb2 NGS Fab變異體在37℃下對人類IL-36α及人類IL-36γ的結合親和力，使用BIACORETM 8K儀器進行SPR量測。簡言之，以2μL/min流動速率向CAP感測器晶片施加生物素捕獲試劑(GE)於HBS-EP緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性劑P20)中之1：4稀釋液。對於動力學量測，以10uL/min捕獲3nM經生物素標記之人類IL-36α及人類IL-36γ，以在第二流量槽(FC2)中達成約50個反應單位。FC1保持作為參考。接下來，在37℃下自低(3.125nM)至高(200nM)注射(流 動速率：10uL/min)Fab於HBS-P緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005%界面活性劑P20)中之3倍連續稀釋液。記錄感測器圖譜且在藉由BIACORE® 8K評估軟體(1.1.1.7442版)評估之前進行參考及緩衝減除。使用簡單的一對一朗格繆爾結合模型計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)按比率koff/kon來計算，在以下表13中概述。
表13：mAb2 NGS Fab變異體針對hu-IL-36α及hu-IL-36γ之kon、koff及KD值
Figure 108147052-A0202-12-0164-95
實例5：抗IL-36抗體變異體對HaCat細胞之hu-IL-36刺激之IL-8分泌中之阻斷活性的活體外評定
為了活體外測定親和力成熟mAb2及mAb6_2變異體之阻斷效力及功效，吾人評估其以重組方式產生之Fab片段抑制HaCat細胞之hu-IL-36刺激之IL-8分泌的能力。如實例2中所描述進行HaCat細胞分析，例外之處在於使用以重組方式表現之抗IL-36或對照抗體Fab片段代替IgG作為拮抗劑。簡言之，將抗IL-36 Fab或適當抗體Fab對照(例如，Hu IgG1對照)與HaCat細胞在37℃下一起培育1小時，接著添加促效劑(hu-IL-36α、hu-IL-36β或hu-IL-36γ)。使實驗再進行24小時(37℃，5% CO2)，收集細胞培養物上清液且如實例2中所描述進行IL-8定量。隨後在GraphPad Prism軟體中使用標準非線性回歸分 析來分析內插資料，以得出抗體IC50值。
表14：親和力成熟抗IL-36抗體變異體對HaCat細胞之IL-36刺激之IL-8分泌的阻斷活性
Figure 108147052-A0202-12-0165-96
如表14所示，mAb2.10 Fab展現對HaCat細胞中hu-IL-36α及hu-IL-36γ介導之IL-8產生的最強效阻斷活性，IC50分別為大致0.38nM及1.09nM。如表14中進一步所示，mAb6_2.7 Fab展現對HaCat細胞中IL-36β介導之IL-8產生的改良阻斷活性，IC50為大致0.2nM。
實例6：抗IL-36多特異性抗體mAb2.10/mAb6_2.7之產生
將mAb2.10及mAb6_2.7重鏈以二步驟選殖方法以「臼包杵」格式(Ridgway等人，1996)選殖至pRK表現載體中。在步驟1中，將mAb2.10合成且選殖至已含有臼突變(T366S、L368A及Y407V)及8×His標籤之pRK載體中(使用AgeI及BstEII)。將mAb6_2.7合成且選殖至已含有杵突變(T366W)及Flag標籤之pRK載體中(使用AgeI及BstEII)。亦將mAb2輕鏈選殖至不含額外突變之pRK表現載體中。在成功初始測試具有加標籤構築體之多特異性抗 體的表現及純化後，在選殖方法之步驟2中，自mAb2.10及mAb6_2.7重鏈中移除標籤。使用一組引子(正向引子：5'Phos-TAAGCTTGGCCGCCATGGCC-3'(SEQ ID NO：514)及反向引子：5'Phos-ACCCGGAGACAGGGAGAGGC-3'(SEQ ID NO：515))完全移除來自mAb2.10之8×His標籤，而使用一組引子將終止密碼子TAA插人mAb6_2.7重鏈與Flag標籤之間(正向引子：5'-CTGTCTCCGGGTTAAGATTACAAGG-3'(SEQ ID NO：516)及反向引子：5'-CCTTGTAATCTTAACCCGGAGACAG-3'(SEQ ID NO：517))。
藉由以1：1：2之質量比共轉染編碼含有臼突變及N297G之mAb2.10的重鏈(SEQ ID NO：235)、含有杵突變及N297G之mAb6_2.7的重鏈(SEQ ID NO：192)及mAb2之輕鏈(SEQ ID NO：169)的質體，根據製造商之方案在Expi293F細胞(美國馬薩諸塞州沃爾珊之賽默飛世爾科技)中表現多特異性共同輕鏈抗體mAb2.10/mAb6_2.7。在4天後收穫細胞且將澄清上清液施加至在PBS pH 7.5中平衡之MabSelect SuRe管柱(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療)。用100mM檸檬酸鈉pH 3溶離蛋白質，且藉由添加1.5M Tris-HCl pH 8.8中和pH。將含蛋白質之餾分合併且緩衝液交換至50mM Tris pH 8，10mM NaCl中。隨後將蛋白質負載至在50mM Tris pH 8，10mM NaCl中平衡之Capto S Impact管柱(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療)上，且用50mM Bis-Tris pH 6.5，10mM NaCl之30CV梯度溶離。
純化多特異性抗體分子之完整質量使用Q Exactive(Thermo Scientific)質譜儀與Ultimate-3000(Thermo Scientific)液相層析系統之組合確認。將純化抗體注入連接至液相層析系統之PLRP-S管柱(安捷倫(Agilent))上。完整質譜分析證實，觀測質量與雜二聚體之預測質量相符。亦藉由使用產生F(ab')2及Fc/2片段之同質池之Fabricator酶(Genovis)來證實不存在均二聚體物種。各片段與預測質量相符。
如完整質譜所鑑別，含有mAb2.10/mAb6_2.7之Capto S溶離餾分經合併，且負載至Superdex 200pg管柱(美國伊利諾伊州芝加哥之GE醫療)上。合併含有單分散蛋白之波峰餾分，且存儲於1×PBS pH 7.5中。
實例7：抗IL-36多特異性抗體mAb2.10/mAb6_2.7之非特異性結合評定
多特異性分子mAb2.10/mAb6_2.7 IgG之非特異性結合使用桿狀病毒ELISA評定(Hotzel等人，2012)。簡言之，在4℃下將桿狀病毒粒子以3%懸浮液塗佈於96孔Maxisorp培養盤上隔夜。隨後將培養盤用含1% BSA及0.05% Tween-20之PBS在室溫下阻斷一小時。將含0.5% BSA及0.05% Tween 20之1×PBS(ELISA緩衝液)中之300nM、100nM及33nM的mAb2.10/mAb6_2.7 IgG添加至培養盤中持續1小時，且將培養盤用含0.05% Tween 20之1×PBS(洗滌緩衝液)洗滌。在ELISA緩衝液中用綴合至辣根過氧化物酶之山羊抗人類IgG(Jackson ImmunoResearch)偵測結合抗體。將培養盤在室溫下在攪拌下培育一小時，用洗滌緩衝液洗滌六次且藉由添加100微升/孔之1步Turbo TMB受質(賽默飛世爾，目錄#34022)顯色15分鐘。使用50微升/孔之2N H2S04停止酶反應。使用珀金埃爾默盤讀取器(Envision 2103多標記讀取器)在450nm處分析培養盤且與參考抗體進行比較。與陽性對照相比，多特異性分子mAb2.10/mAb6_2.7 IgG不展示可偵測之桿狀病毒ELISA信號，表明不存在與桿狀病毒粒子之非特異性結合(表15)。
表15：評估多特異性抗IL-36抗體mAb2.10/mAb6_2.7 IgG之非特異性結合的桿狀病毒ELISA
Figure 108147052-A0202-12-0167-97
實例8：抗hu-IL-36多特異性抗體mAb2.10/mAb6_2.7 IgG之活性的活體外評定
抗IL-36多特異性抗體mAb2.10/mAb6_2.7之結合動力學14]
如實例2中所描述，使用表面電漿子共振(SPR)分析，用BIACORETM 8K儀器測定對人類及食蟹獼猴IL-36(分別「hu-IL-36」及「cy-IL-36」)之結合親和力。分別地分析活體內生物素標記hu-IL-36α-Avi、hu-IL-36β-Avi、hu-IL-36γ-Avi、cy-IL-36α-Avi、cy-IL-36β-Avi或cy-IL-36γ-Avi與mAb2.10/mAb6_2.7之結合。簡言之，以2μL/min流動速率向CAP感測器晶片施加生物素捕獲試劑(GE Healthcare)於HBS-EP緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性劑P20)中之1：4稀釋液。對於動力學量測，以10μL/min捕獲1nM生物素標記人類及食蟹獼猴IL-36α-Avi、IL-36γ-Avi；0.8nM生物素標記人類及食蟹獼猴IL-36β-Avi，以在第二流量槽(FC2)中達成15至25個反應單位。FC1保持作為參考。接下來，在25℃或37℃下自低(1.56nM)至高(200nM)注射(流動速率：30μL/min)mAb2.10/mAb6_2.7蛋白於HBS-P緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005%界面活性劑P20)中之2倍連續稀釋液。記錄感測器圖譜且在用BIACORE® 8K評估軟體(1.1.1.7442版)進行資料分析之前進行參考及緩衝減除。由於各多特異性IgG抗體僅含有一條能夠與一種所分析之IL-36蛋白結合的Fab臂，因此結合相互作用為單價的。使用簡單的一對一朗格繆爾結合模型計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)按比率koff/kon來計算。
mAb2.10/mAb6_2.7之Biacore親和力結果概述於以下表16中。mAb2.10/mAb6_2.7以高及可比親和力結合至所有人類及食蟹獼猴IL-36細胞介素。
表16：mAb2.10/mAb6_2.7多特異性抗體對hu-IL-36及cy-IL-36 之親和力
Figure 108147052-A0202-12-0169-99
多特異性抗體mAb2.10/mAb6_2.7對HaCat細胞之IL-36刺激之IL-8分泌的阻斷活性
為了測定多特異性抗體mAb2.10/mAb6_2.7之阻斷效力及功效，吾人評估其抑制HaCat細胞之hu-IL-36刺激之IL-8分泌的能力。亦分析人類IgG同型對照(「Hu IgG1對照」)以充當陰性對照。如實例2中所描述進行HaCat細胞分析，例外之處在於使用以重組方式表現之mAb2.10/mAb6_2.7或Hu IgG1對照作為拮抗劑。簡言之，將mAb2.10/mAb6_2.7或適當抗體對照(例如，Hu IgG1對照)與HaCat細胞一起在37℃下培育1小時，接著添加促效劑(hu-IL-36α、hu-IL-36β或hu-IL-36γ)。使實驗再進行24小時(37℃，5% CO2)，收集細胞培養物上清液。
使用Cisbio Bioassay之基於HTRF技術的人類IL-8分析進行上清液中IL-8之定量。根據製造商準則進行分析。使用兼容HTRF之Spectramax(Molecular Devices)來獲得原始資料，且結合SoftMax Pro軟體(Molecular Devices)來計算分別在665nm及620nm處受體與供體發射信號之比率。使用GraphPad Prism軟體分析所獲得之資料，內插使用線性回歸分析進行，且權重由「按1/Y2之權重」定義。隨後使用標準非線性回歸3參數分析來分析內插資料， 以得出促效劑EC50及抗體IC50值。
如圖3A、圖3B及圖3C所示，mAb2.10/mAb6_2.7展現對HaCat細胞之IL-36α、IL-36β及IL-36γ介導之IL-8產生的強效阻斷活性，IC50值分別大致為0.38nM、0.13nM及1.1nM。在8nM mAb2.10/mAb6_2.7下，HaCat細胞中100%之IL-36α、IL-36β及IL-36γ介導之IL-8產生受抑制。
多特異性抗體mAb2.10/mAb6_2.7對初代人類角質細胞之IL-36刺激之IL-8分泌的阻斷活性
為了測定多特異性抗體mAb2.10/mAb6_2.7對初代人類細胞之阻斷效力及功效，吾人評估其抑制初代成年人類角質細胞之hu-IL-36刺激之IL-8分泌的能力。亦分析人類IgG同型對照(「Hu IgG1對照」)以充當陰性對照。成年正常人類表皮角質細胞獲自Lonza。自正常(無疾病)捐贈的人類組織分離細胞且由製造商低溫保藏所述細胞。使用製造商推薦的一般準則解凍及維持細胞。HEKa細胞維持在由來自Gold BulletKit(Lonza)之補充角質細胞生長培養基組成之生長培養基中。在實驗使用的前一天，將HEKa以10,000個細胞/孔接種於平底96孔培養盤，以在使用當天處於約80%至85%匯合度。如實例2中所描述，用成年人類角質細胞(HEKa)進行初代角質細胞分析，例外之處在於使用以重組方式表現之mAb2.10/mAb6_2.7或Hu IgG1對照作為拮抗劑。簡言之，將mAb2.10/mAb6_2.7或適當抗體對照(例如，Hu IgG1對照)與HEKa細胞一起在37℃下培育1小時，接著添加促效劑(hu-IL-36α、hu-IL-36β或hu-IL-36γ)。使實驗再進行24小時(37℃，5% CO2)，收集細胞培養物上清液且如上文所描述使用Cisbio Bioassay之基於HTRF技術的人類IL-8分析進行IL-8之定量。隨後在GraphPad Prism軟體中使用標準非線性回歸分析來分析內插資料，以得出抗體IC50值。
如圖4A、圖4B及圖4C所示，mAb2.10/mAb6_2.7展現對成年人 類角質細胞中IL-36α、IL-36β及IL-36γ介導之IL-8產生的強效阻斷活性，IC50值分別大致為0.56nM、0.11nM及2.7nM。在8nM mAb2.10/mAb6_2.7下，初代人類成年角質細胞中100%之IL-36α、IL-36β及IL-36γ介導之IL-8產生受抑制。此實例展現mAb2.10/mAb6_2.7對初代人類細胞之效力類似於在人類角質細胞細胞株HaCat上所觀測到之效力。
為了展現Fab臂在多特異性抗體mAb2.10/mAb6_2.7中之獨立阻斷活性，吾人使用類似於上文所描述，具有以下修改之方法，評估其抑制初代成年人類角質細胞由hu-IL-36α及hu-IL-36β之混合物刺激之IL-8分泌的能力。將mAb2.10/mAb6_2.7或適當抗體對照(例如，Hu IgG1對照)與HEKa細胞在37℃下一起培育1小時，接著添加促效劑(分別地添加hu-IL-36α，分別地添加hu-IL-36β，或以各細胞介素之大致EC50添加hu-IL-36α與hu-IL-36β之混合物)。mAb2.10/mAb6_2.7展現IL-36α與IL-36β之混合物的強效阻斷活性，IC50值大致為0.44nM。mAb2.10/mAb6_2.7針對IL-36α及IL-36β之IC50值分別地與此實例中以上針對初代人類成年角質細胞報導之阻斷IC50值一致，展現mAb2.10/mAb6_2.7之靶向IL-36α/IL-36γ及IL-36β的Fab臂強效且獨立地中和IL-36α、IL-36β及IL-36γ。
為了確定多特異性抗體mAb2.10/mAb6_2.7針對IL-36促效劑細胞介素之混合物的效力及功效，吾人評估抗體阻斷初代細胞上由IL-36α、IL-36β及IL-36γ之混合物引起之信號傳導的能力。使用類似於上文所描述，具有以下修改之方法，評定mAb2.10/mAb6_2.7抑制初代成年人類角質細胞由hu-IL-36α、hu-IL-36β及IL-36γ之混合物刺激之IL-8分泌的能力。將mAb2.10/mAb6_2.7或適當抗體對照(例如，Hu IgG1對照)與HEKa細胞在37℃下一起培育1小時，接著添加促效劑之混合物。促效劑細胞介素之混合物如下製備。大致以各細胞介素之EC50添加兩種細胞介素(例如，hu-IL-36α及hu-IL-36β)，且以各種濃 度(大致細胞介素之EC10、EC30、EC50、EC70、EC90)添加第三細胞介素(例如，hu-IL-36γ)，以在固定濃度之其餘兩種促效劑的背景下達成細胞介素的滴定。藉由在所描述之細胞介素混合物的存在下滴定mAb2.10/mAb6_2.7測定其IC50值。mAb2.10/mAb6_2.7展現含有IL-36α、IL-36β及IL-36γ之混合物的強效阻斷活性。mAb2.10/mAb6_2.7針對IL-36α、IL-36β及IL-36γ之IC50值分別地與此實例中以上針對初代人類成年角質細胞報導之阻斷IC50值一致，展現mAb2.10/mAb6_2.7強效阻斷人類初代角質細胞上IL-36α、IL-36β及IL-36γ之混合物的信號傳導。
儘管存在所附申請專利範圍，但本文所闡述之揭示內容亦由以下條項界定，單獨或呈與一或多種其他條項或實施例組合形式之所述條項可為有益的。在不限制前述描述之情況下，提供如下編號之本揭示案的某些非限制性條項，其中分別編號之條項中之每一者可與之前或之後條項中之任一者一起使用或組合。因此，此意欲為所有此類組合提供支持，且不必限於明確提供於下文中之特定組合：
1.一種抗IL-36抗體，其包括：(i)一第一輕鏈高變區(HVR-L1)、一第二輕鏈高變區(HVR-L2)及一第三輕鏈高變區(HVR-L3)，及/或(ii)一第一重鏈高變區(HVR-H1)、一第二重鏈高變區(HVR-H2)及一第三重鏈高變區(HVR-H3)；其中：
(a)HVR-L1包括一選自以下之胺基酸序列：TGSSSNIGAHYDVH(SEQ ID NO：18)、TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO：22)、RASQSVSSNYLA(SEQ ID NO：38)或RASQTIYKYLN(SEQ ID NO：42)；
(b)HVR-L2包括一選自以下之胺基酸序列：SNNNRPS(SEQ ID NO：15)、GNDNRPS(SEQ ID NO：19)、GNTNRPS(SEQ ID NO：23)、GNRNRPS(SEQ ID NO：27)、SASSLQS(SEQ ID NO：39)或AASSLQS(SEQ ID NO：43)；
(c)HVR-L3包括一選自以下之胺基酸序列：QSYDYSLRGYV(SEQ ID NO：16)、QSYDYSLSGYV(SEQ ID NO：20)、QSYDYSLRVYV(SEQ ID NO：28)、QSYDYSLKAYV(SEQ ID NO：32)、QSYDISLSGWV(SEQ ID NO：36)、QQTYSYPPT(SEQ ID NO：40)或QQSSIPYT(SEQ ID NO：44)；
(d)HVR-H1包括一選自以下之胺基酸序列：SAYAMHW(SEQ ID NO：46)、STSSYYW(SEQ ID NO：50)、SSTSYYW(SEQ ID NO：54)、GSRSYYW(SEQ ID NO：58)、STYAMSW(SEQ ID NO：62)、TSSNYYW(SEQ ID NO：66)、SSYGMH(SEQ ID NO：70)、SNYAIS(SEQ ID NO：74)、TSTNYYW(SEQ ID NO：82)、TSSNAYW(SEQ ID NO：86)、TASNYYW(SEQ ID NO：90)、TASNTYW(SEQ ID NO：106)、SDSSYYW(SEQ ID NO：122)、SESSYYW(SEQ ID NO：126)、STSSDYW(SEQ ID NO：130)、SNSSYYW(SEQ ID NO：134)、STSSYHW(SEQ ID NO：142)、SRSSYYW(SEQ ID NO：146)、XXXNXYX(SEQ ID NO：251)，其中位置1處之X係T、D、E或N；位置2處之X係S、A、E、G、K、Q、R或T；位置3處之X係S、A、D、E、G、N、P、Q或T；位置5處之X係Y、A、E、G、H、M、N、Q、S、T或V；位置7處之X係W、F、I、V或Y，或XXXXXXW(SEQ ID NO：336)，其中位置1處之X係S或D；位置2處之X係T、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R或S；位置3處之X係S、D、E、G、K、N、P或R；位置4處之X係S、G、K、N或P；位置5處之X係Y、A、D、E、G、H、M、N、Q、S、T、V或W；位置6處之X係Y、A、F、G、H、M、N或Q；
(e)HVR-H2包括一選自以下之胺基酸序列：VISYDGTNEYYAD(SEQ ID NO：47)、SIYYTGNTYYNP(SEQ ID NO：51)、SIHYSGNTYYNP(SEQ ID NO：55)、SIHYSGTTYYNP(SEQ ID NO：59)、GISGGSGYTYYAD(SEQ ID NO：63)、SIDYTGSTYYNP(SEQ ID NO：67)、VISYGGSERYYAD(SEQ ID NO： 71)、GILPILGTVDYAQ(SEQ ID NO：75)、NIDYTGSTYYNA(SEQ ID NO：83)、SIDYTGSTAYNP(SEQ ID NO：87)、SIDYTGSTYYNT(SEQ ID NO：91)、SIDYTGSTYYEP(SEQ ID NO：99)、SIDYTGSTYYEP(SEQ ID NO：103)、SIDYTGSTYYQP(SEQ ID NO：119)、SIYYTGNTYYNS(SEQ ID NO：123)、SIYYTGNTYYLP(SEQ ID NO：131)、SIYYTGNTYYMP(SEQ ID NO：143)、SIYYTGNTYYWP(SEQ ID NO：147)、SIYYTGETYYAP(SEQ ID NO：151)、XXDXXXXXXYXX(SEQ ID NO：284)，其中位置1處之X係S、N或T；位置2處之X係I、M或V；位置4處之X係Y或H；位置5處之X係T、H、L或N；位置6處之X係G、A、D、E、H、K、N、Q、R、S或T；位置7處之X係S、A、D、Q或T；位置8處之X係T、A、D或E；位置9處之X係Y、A、F、Q、S或W；位置11處之X係N、D、E、H、P或Q；位置12處之X係P、A或E，或XXXXXXXXXYXP(SEQ ID NO：379)，其中位置1處之X係S、F、I、M或Q；位置2處之X係I、A、G、L、R、S、T或V；位置3處之X係Y、A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或W；位置4處之X係Y、A、D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、T或W；位置5處之X係T、D、E、K、N、P或Q；位置6處之X係G或Q；位置7處之X係N、D、E、G、H、I、K、M、P、R或S；位置8處之X係T、A、E、F、G、H、K、P、Q、R、S、V、W或Y；位置9處之X係Y或W；位置11處之X係N、A、D、E、K、L、M、P、Q、S或T；
(f)HVR-H3包括一選自以下之胺基酸序列：ARGIRIFTSYFDS(SEQ ID NO：48)、ARVRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：52)、ARVHYGGYIPRRFDH(SEQ ID NO：56)、ARVAPSYPRVFDY(SEQ ID NO：60)、ARVVTYRDPPASFDY(SEQ ID NO：64)、ARGKYYETYLGFDV(SEQ ID NO：68)、AREPWYSSRGWTGYGFDV(SEQ ID NO：72)、AREPWYRLGAFDV(SEQ ID NO：76)、ATGKYYETYLGFDV(SEQ ID NO：84)、AHGKYYETYLGFDV(SEQ ID NO：88)、ATGSYYETYLGFDV(SEQ ID NO：100)、ATGNYYETYLGFDV(SEQ ID NO：104)、ASGKYYETYLGFDV(SEQ ID NO：112)、ARGNYYETYLGFDV(SEQ ID NO：120)、AGVRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：128)、SRVRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：132)、VRVRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：144)、TRVRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：148)、ARLRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：152)、ARVKYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：156)、ARVRYGVGVPRHFDP(SEQ ID NO：160)、AXGXYYXTYLGFDV(SEQ ID NO：322)，其中位置2處之X係R、A、E、G、H、M、N、Q、S、T或Y；位置4處之X係K、A或S；位置7處之X係E或T，或XXXXXGXXVPRXFDP(SEQ ID NO：462)，其中位置1處之X係A或V；位置2處之X係R、A、G、N、Q或T；位置3處之X係V、A、F、I、K、L、M、Q或S；位置4處之X係R、A、I、K、L、M、P、Q、S、T或V；位置5處之X係Y、H、I、L或V；位置7處之X係V、A、F、G、K、M、N、Q、R、S、T、W或Y；位置8處之X係G、N、R、S或T；位置12處之X係Y、F、H、I、L、M、Q或R。
2.如條項1之抗體，其中：
(a)HVR-L1包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列；
(b)HVR-L2包括SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及
(c)HVR-L3包括SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
3.如條項1至2中任一項之抗體，其中：
(a)HVR-H1包括選自SEQ ID NO：66、82、86、90或252-283之胺基酸序列；
(b)HVR-H2包括選自SEQ ID NO：67、83、87、91、99、103、119或285-321之胺基酸序列；及
(c)HVR-H3包括選自SEQ ID NO：68、84、88、100、104、112、120或323-335之胺基酸序列。
4.如條項1至2中任一項之抗體，其中：
(a)HVR-H1包括一選自SEQ ID NO：50、122、126、130、134、138、142、146或337-378之胺基酸序列；
(b)HVR-H2包括一選自SEQ ID NO：51、123、131、143、147、151或380-461之胺基酸序列；及
(c)HVR-H3包括一選自SEQ ID NO：52、128、132、144、148、152、156、160或463-513之胺基酸序列。
5.如條項1之抗體，其中：
(a)HVR-L1包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列；
(b)HVR-L2包括SEQ ID NO：19之胺基酸序列；
(c)HVR-L3包括SEQ ID NO：20之胺基酸序列；
(d)HVR-H1包括選自SEQ ID NO：66、82、86、90或252-283之胺基酸序列；
(e)HVR-H2包括選自SEQ ID NO：67、83、87、91、99、103、119或285-321之胺基酸序列；及
(f)HVR-H3包括選自SEQ ID NO：68、84、88、100、104、112、120或323-335之胺基酸序列。
6.如條項1之抗體，其中：
(a)HVR-L1包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列；
(b)HVR-L2包括SEQ ID NO：19之胺基酸序列；
(c)HVR-L3包括SEQ ID NO：20之胺基酸序列；
(d)HVR-H1包括一選自SEQ ID NO：50、122、126、130、134、138、142、 146或337-378之胺基酸序列；
(e)HVR-H2包括一選自SEQ ID NO：51、123、131、143、147、151或380-461之胺基酸序列；及
(f)HVR-H3包括一選自SEQ ID NO：52、128、132、144、148、152、156、160或463-513之胺基酸序列。
7.如條項1至6中任一項之抗體，其中所述抗體包括與一選自SEQ ID NO：13、17、21、25、29、33、37、41、77或78之序列具有至少90%一致性的一輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：45、49、53、57、61、65、69、73、79、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之序列具有至少90%一致性的一重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
8.如條項1至6中任一項之抗體，其中所述抗體包括與SEQ ID NO：17或77具有至少90%一致性的一輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或與選自SEQ ID NO：49、65、79、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之序列具有至少90%一致性的一重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
9.如條項1至6中任一項之抗體，其中所述抗體包括與SEQ ID NO：17或77具有至少90%一致性的一輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：65、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113或117之序列具有至少90%一致性的一重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
10.如條項1至6中任一項之抗體，其中所述抗體包括與包括與SEQ ID NO：17或77具有至少90%一致性的一輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：49、79、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之序列具有至少90%一致性的一重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
11.如條項1至10中任一項之抗體，其中所述抗體包括與SEQ ID NO：169或242具有至少90%一致性的一輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：170-202、248-250、518-616及743-751之序列具有至少90%一致性的一重鏈(HC)胺基酸序列。
12.如條項1至10中任一項之抗體，其中所述抗體包括與SEQ ID NO：169或242具有至少90%一致性的一輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：203-241及617-733之序列具有至少90%一致性的一重鏈(HC)胺基酸序列。
13.一種抗IL-36抗體，其包括與一選自SEQ ID NO：13、17、21、25、29、33、37、41、77或78之序列具有至少90%一致性的一輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：45、49、53、57、61、65、69、73、79、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之序列具有至少90%一致性的一重鏈可變域(VH)胺基酸序列
14.一種抗IL-36抗體，其包括選自SEQ ID NO：13、17、21、25、29、33、37、41、77或78之一輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或選自SEQ ID NO：45、49、53、57、61、65、69、73、79、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之一重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
15.一種抗IL-36抗體，其包括與SEQ ID NO：17或77具有至少90%一致性的一輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：49、65、79、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之序列具有至少90%一致性的一重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
16.一種抗IL-36抗體，其包括SEQ ID NO：17或77之輕鏈可變域(VL) 胺基酸序列；及/或一選自SEQ ID NO：49、65、79、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
17.一種抗IL-36抗體，其包括與SEQ ID NO：17或77具有至少90%一致性的一輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：65、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113或117之序列具有至少90%一致性的一重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
18.一種抗IL-36抗體，其包括SEQ ID NO：17或77之輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或一選自SEQ ID NO：65、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113或117之重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
19.一種抗IL-36抗體，其包括與SEQ ID NO：17或77具有至少90%一致性的一輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：49、79、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之序列具有至少90%一致性的一重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
20.一種抗IL-36抗體，其包括SEQ ID NO：17或77之輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或選自SEQ ID NO：49、79、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之一重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
21.一種抗IL-36抗體，其包括與SEQ ID NO：169或242具有至少90%一致性的一輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：170-202、248、249-250、518-616及743-751之序列具有至少90%一致性的一重鏈(HC)胺基酸序列。
22.一種抗IL-36抗體，其包括SEQ ID NO：169或242之輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或一選自SEQ ID NO：170-202、248-250、518-616及743-751之重鏈(HC)胺基酸序列。
23.一種抗IL-36抗體，其包括與SEQ ID NO：169或242具有至少90%一致性的一輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：203-241及617-733之序列具有至少90%一致性的一重鏈(HC)胺基酸序列。
24.一種抗IL-36抗體，其包括SEQ ID NO：169或242之輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或一選自SEQ ID NO：206-241之重鏈(HC)胺基酸序列。
25.一種抗IL-36抗體，其中所述抗體為一多特異性抗體，其包括：
(a)一對輕鏈，其各自包括：SEQ ID NO：18之HVR-L1序列；SEQ ID NO：19之HVR-L2序列；及SEQ ID NO：20之HVR-L3序列；
(b)一重鏈，其包括：選自SEQ ID NO：66、82、86、90或106之HVR-H1序列；選自SEQ ID NO：67、83、87、91、99、103或119之HVR-H2序列；及選自SEQ ID NO：68、84、88、100、104、112或120之HVR-H3序列；及
(c)一重鏈，其包括：選自SEQ ID NO：50、122、126、130、134、142或146之HVR-H1序列；選自SEQ ID NO：51、123、127、131、135、139、143、147或151之HVR-H2序列；及HVR-H3包括選自SEQ ID NO：52、128、132、144、148、152、156或160之胺基酸序列。
26.如條項25之抗體，其中所述重鏈中之一者包括胺基酸取代T366W，且另一重鏈包括胺基酸取代T366S、L368A及Y407V。
27.一種抗IL-36抗體，其中所述抗體為一多特異性抗體，其包括：
(a)一對輕鏈，其各自包括SEQ ID NO：17或77之輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；
(b)一重鏈，其包括一選自SEQ ID NO：65、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113或117之重鏈可變域(VH)胺基酸序列；及
(c)一重鏈，其包括一選自SEQ ID NO：49、79、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
28.一種抗IL-36抗體，其中所述抗體為一多特異性抗體，其包括：
(a)一對SEQ ID NO：169及242之輕鏈(LC)胺基酸序列；
(b)一重鏈(HC)胺基酸序列，其選自SEQ ID NO：171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201及249；及
(c)一重鏈(HC)胺基酸序列，其選自SEQ ID NO：208、211、214、217、220、223、226、229、232、235、238及241。
29.一種抗IL-36抗體，其中所述抗體為一多特異性抗體，其包括：
(a)一對SEQ ID NO：169及242之輕鏈(LC)胺基酸序列；
(b)一重鏈(HC)胺基酸序列，其選自SEQ ID NO：172、175、178、181、184、187、190、193、196、199、202、250；及
(c)一重鏈(HC)胺基酸序列，其選自SEQ ID NO：207、210、213、216、219、222、225、228、231、234、237及240。
30.一種多特異性抗IL-36抗體，其中所述抗體包括一對SEQ ID NO：169之輕鏈(LC)胺基酸序列；SEQ ID NO：192之重鏈(HC)胺基酸序列；及SEQ ID NO：235之重鏈(HC)胺基酸序列。
31.如條項1至30中任一項之抗體，其中所述抗體為一多特異性抗體，其在一條臂中包括對IL-36α及IL-36γ之特異性，且在另一臂中包括對IL-36β之特異性。
32.如條項1至31中任一項之抗體，其中所述抗體以1×10-8M或更低、1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之一結合親和力結合至hu-IL-36α、hu-IL-36-β及/或hu-IL-36-γ。
33.如條項1至32中任一項之抗體，其中所述抗體以1×10-8M或更低、1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之一結合親和力結合至hu-IL-36α及hu-IL-36-γ。
34.如條項1至33中任一項之抗體，其中所述抗體以1×10-8M或更低、1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之一結合親和力結合至hu-IL-36-β。
35.如條項1至34中任一項之抗體，其中所述抗體將由IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之一細胞內信號降低至少90%、至少95%、至少99%或100%；視情況，其中在一約為EC50之IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ濃度下，所述抗體之IC50為10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低。
36.如條項1至35中任一項之抗體，其中所述抗體抑制由IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之來自初代人類角質細胞(PHK)的IL-8釋放，視情況，其中在一約為EC50之IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ濃度下，所述抗體之IC50為10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低。
37.如條項1至36中任一項之抗體，其中所述抗體與SEQ ID NO：5、6或7之食蟹獼猴的IL-36α、IL-36β或IL-36γ交叉反應。
38.如條項1至37中任一項之抗體，其中所述抗體為一單株抗體。
39.如條項1至38中任一項之抗體，其中所述抗體為一重組抗體。
40.如條項1至39中任一項之抗體，其中所述抗體為一嵌合抗體。
41.如條項1至39中任一項之抗體，其中所述抗體為一人類化或人類抗體。
42.如條項1至41中任一項之抗體，其中所述抗體為一抗體片段，視情況選自由以下組成之群組：F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、單域抗體(VHH)、單臂抗體及scFv。
43.如條項1至42中任一項之抗體，其中所述抗體為一IgG類全長抗體；視情況，其中所述IgG類抗體具有一選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之同型。
44.如條項43之抗體，其中所述抗體為一Fc區變異體；視情況其中所述Fc區變異體改變效應功能或改變半衰期。
45.如條項44之抗體，其中所述Fc區變異體降低效應功能及/或產生一無效應抗體；視情況，其中所述Fc區變異體在位置297處包括一胺基酸取代，導致無效應功能。
46.如條項1至45中任一項之抗體，其中所述抗體為一免疫綴合物；視情況，其中所述免疫綴合物包括用於治療IL-36介導之病狀或疾病之一治療劑；視情況，其中所述治療劑為用於治療癌症之一化學治療劑或細胞毒性劑。
47.如條項1至47中任一項之抗體，其中所述抗體為一合成抗體，其包括接枝至除一免疫球蛋白支架或免疫球蛋白構架外之一支架，視情況選自一替代性蛋白質支架及一人工聚合物支架之一支架上的CDR。
48.一種抗IL-36抗體，其與如條項1至48中任一項之抗體特異性結合同一種抗原決定基。
49.一種多特異性抗體，其結合至人類IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之每一者，其中所述抗體係以3nM或更低之結合親和力結合至人類IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之每一者；視情況其中所述結合親和力由對SEQ ID NO：1之hu-IL-36α、SEQ ID NO：2之hu-IL-36β及SEQ ID NO：3之hu-IL-36γ的平衡解離常數(KD)量測；視情況，其中：
(a)在一條臂中包括對IL-36α及/或IL-36γ之特異性，且在另一臂中包括對IL-36β之特異性；視情況，其中一條臂以1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之結合親和力結合至hu-IL-36α及hu-IL-36-γ，且另一臂以1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之結合親和力結合至hu-IL-36-β；
(b)將由IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之一細胞內信號降低至少90%、至少95%、至少99%或100%；視情況，其中在一約為EC50之IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ濃度下，所述抗體之IC50為10nM或更低、5nM或更低、或1nM 或更低；
(c)抑制由IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之來自初代人類角質細胞(PHK)的IL-8釋放，視情況，其中在一約為EC50之IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ濃度下，所述抗體之IC50為10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低；
(d)所述抗體與食蟹獼猴之IL-36α、IL-36β及IL-36γ交叉反應；及/或
(e)所述抗體以3nM或更低之結合親和力結合至食蟹獼猴IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之每一者；視情況其中所述結合親和力由對SEQ ID NO：5之cy-IL-36α、SEQ ID NO：6之cy-IL-36β及SEQ ID NO：7之cy-IL-36γ的平衡解離常數(KD)量測。
50.一種經分離多核苷酸，其編碼如條項1至49中任一項之抗體。
51.如條項50之多核苷酸，其進一步包括編碼一信號肽(SP)之一核苷酸序列。
52.如條項50之多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼一輕鏈及一重鏈。
53.如條項50之多核苷酸，其中所述多核苷酸包括一多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括一或多個針對所述抗體在一哺乳動物細胞中之最佳表現選擇的密碼子。
54.如條項50之多核苷酸，其中所述多核苷酸序列包括一或多個針對所述抗體在一中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中之最佳表現選擇的密碼子。
55.一種載體，其包括一如條項50至54中任一項之多核苷酸。
56.一種經分離宿主細胞，其包括如條項55之載體。
57.一種宿主細胞，其包括一如條項50至54中任一項之多核苷酸。
58.一種經分離宿主細胞，其表現如條項1至49中任一項之抗體。
59.如條項56之宿主細胞，其中所述宿主細胞選自中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、骨髓瘤細胞(例如，Y0、NS0、Sp2/0)、猴腎細胞(COS-7)、人類胚 腎細胞株(293)、幼倉鼠腎細胞(BHK)、小鼠塞特利氏細胞(例如，TM4)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人類子宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞、人類肺細胞(W138)、人類肝細胞(Hep G2)、小鼠乳房腫瘤細胞、TR1細胞、醫學研究委員會5(MRC 5)細胞及一包皮4(FS4)細胞。
60.一種產生一抗體之方法，所述方法包括培養條項56至59中任一項之宿主細胞，以使得產生一抗體。
61.一種融合瘤，其產生一如條項1至49中任一項之抗體。
62.一種醫藥組合物，其包括一如條項1至49中任一項之抗體及一醫藥學上可接受之載劑。
63.如條項62之醫藥組合物，其中所述組合物進一步包括用於治療一IL-36介導之疾病或病狀之一治療劑；視情況，其中所述治療劑為一化學治療劑。
64.一種治療一個體之IL-36介導之疾病的方法，所述方法包括向所述個體投與一治療有效量之一如條項1至49中任一項之抗體或一治療有效量之一如條項62之醫藥組合物。
65.一種治療一個體之由IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之信號傳導介導之一疾病的方法，所述方法包括向所述個體投與一治療有效量之一如條項1至49中任一項之抗體或一治療有效量之一如條項62之醫藥組合物。
66.如條項64至65中任一項之方法，其中所述疾病選自：由表皮生長因子受體抑制劑所致之痤瘡、痤瘡及化膿性汗腺炎(PASH)、急性全身性發疹性膿皰病(AGEP)、皺褶部位無微生物性膿皰病、頭皮/腿部無微生物性膿皰病、無微生物性角膜下膿皰病、無菌膿腫症候群、白塞氏病、腸分流症候群、慢性阻塞性肺病(COPD)、兒童膿皰型皮膚病、克羅恩氏病、介白素-1受體拮抗劑缺乏(DIRA)、介白素-36受體拮抗劑缺乏(DITRA)、濕疹、全身性膿皰型牛皮癬(GPP)、持久隆起性紅斑、化膿性汗腺炎、IgA天疱瘡、發炎性腸病(IBD)、 嗜中性白血球性脂層炎、掌蹠膿皰型牛皮癬(PPP)、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、膿皰型牛皮癬(DIRA、DITRA)、壞疽性膿皮病、化膿性關節炎壞疽性膿皮病及痤瘡(PAPA)、化膿性關節炎壞疽性膿皮病痤瘡及化膿性汗腺炎(PAPASH)、類風濕性嗜中性白血球性皮膚病、滑膜炎痤瘡膿皰病骨肥厚及骨炎(SAPHO)、克羅恩氏病患者中之TNF誘導之牛皮癬形式皮膚病變、休格連氏症候群、史維德氏症候群、全身性紅斑狼瘡(SLE)、潰瘍性結腸炎及葡萄膜炎。
67.如條項66之方法，其中所述疾病選自：全身性膿皰型牛皮癬(GPP)、掌蹠膿皰型牛皮癬(PPP)及牛皮癬。
68.一種治療一個體之牛皮癬之方法，所述方法包括向所述個體投與一治療有效量之一如條項1至49中任一項之抗體或一治療有效量之一如條項62之醫藥組合物。
69.一種治療一個體之癌症之方法，所述方法包括向所述個體投與一治療有效量之一如條項1至49中任一項之抗體或一治療有效量之一如條項62之醫藥組合物；視情況，其中所述癌症選自乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、胰臟癌。
雖然出於清晰性及理解之目的，本發明之前述揭示內容已藉由舉例及圖解說明相當詳細地描述，但本揭示案，包含本文所描述之實例、描述及實施例，係出於說明的目的，意欲為例示性的，且不應被解釋為限制本揭示案。本領域中熟習此項技術者將清楚，可對本文所描述之實例、描述及實施例作出各種修改或改變，且所述修改或改變包含於本揭示案及隨附申請專利範圍之精神及範圍內。此外，本領域中熟習此項技術者將想到數種與本文所描述之方法及程序等效的方法及程序。所有此類等效物應理解為在本揭示案之範疇內且由隨附申請專利範圍所涵蓋。
本發明之其他實施例闡述於以下申請專利範圍中。
本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利或其他文獻之揭示內容均出於所有目的明確以其全文引用之方式併入本文中，引用程度如同各此類個別公開案、專利、專利申請案或其他文獻經個別地特定指示出於所有目的以全文引用之方式併入本文中且在本文中完整地闡述。在有衝突之情況下，將以本說明書為準，包含指定術語。
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<400> 1
Figure 108147052-A0202-12-0189-100

Claims (15)

  1. 一種抗IL-36抗體，其包括：(i)一第一輕鏈高變區(HVR-L1)、一第二輕鏈高變區(HVR-L2)及一第三輕鏈高變區(HVR-L3)，及/或(ii)一第一重鏈高變區(HVR-H1)、一第二重鏈高變區(HVR-H2)及一第三重鏈高變區(HVR-H3)；其中：
    (a)HVR-L1包括一選自以下之胺基酸序列：TGSSSNIGAHYDVH(SEQ ID NO：18)、TGSSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO：22)、RASQSVSSNYLA(SEQ ID NO：38)或RASQTIYKYLN(SEQ ID NO：42)；
    (b)HVR-L2包括一選自以下之胺基酸序列：SNNNRPS(SEQ ID NO：15)、GNDNRPS(SEQ ID NO：19)、GNTNRPS(SEQ ID NO：23)、GNRNRPS(SEQ ID NO：27)、SASSLQS(SEQ ID NO：39)或AASSLQS(SEQ ID NO：43)；
    (c)HVR-L3包括一選自以下之胺基酸序列：QSYDYSLRGYV(SEQ ID NO：16)、QSYDYSLSGYV(SEQ ID NO：20)、QSYDYSLRVYV(SEQ ID NO：28)、QSYDYSLKAYV(SEQ ID NO：32)、QSYDISLSGWV(SEQ ID NO：36)、QQTYSYPPT(SEQ ID NO：40)或QQSSIPYT(SEQ ID NO：44)；
    (d)HVR-H1包括一選自以下之胺基酸序列：SAYAMHW(SEQ ID NO：46)、STSSYYW(SEQ ID NO：50)、SSTSYYW(SEQ ID NO：54)、GSRSYYW(SEQ ID NO：58)、STYAMSW(SEQ ID NO：62)、TSSNYYW(SEQ ID NO：66)、SSYGMH(SEQ ID NO：70)、SNYAIS(SEQ ID NO：74)、TSTNYYW(SEQ ID NO：82)、TSSNAYW(SEQ ID NO：86)、TASNYYW(SEQ ID NO：90)、TASNTYW(SEQ ID NO：106)、SDSSYYW(SEQ ID NO：122)、SESSYYW(SEQ ID NO：126)、STSSDYW(SEQ ID NO：130)、SNSSYYW(SEQ ID NO：134)、STSSYHW(SEQ ID NO：142)、SRSSYYW(SEQ ID NO：146)、XXXNXYX(SEQ ID NO：251)，其中位置1處之X係T、D、E或N；位置2處之X係S、A、E、G、K、 Q、R或T；位置3處之X係S、A、D、E、G、N、P、Q或T；位置5處之X係Y、A、E、G、H、M、N、Q、S、T或V；位置7處之X係W、F、I、V或Y，或XXXXXXW(SEQ ID NO：336)，其中位置1處之X係S或D；位置2處之X係T、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R或S；位置3處之X係S、D、E、G、K、N、P或R；位置4處之X係S、G、K、N或P；位置5處之X係Y、A、D、E、G、H、M、N、Q、S、T、V或W；位置6處之X係Y、A、F、G、H、M、N或Q；
    (e)HVR-H2包括一選自以下之胺基酸序列：VISYDGTNEYYAD(SEQ ID NO：47)、SIYYTGNTYYNP(SEQ ID NO：51)、SIHYSGNTYYNP(SEQ ID NO：55)、SIHYSGTTYYNP(SEQ ID NO：59)、GISGGSGYTYYAD(SEQ ID NO：63)、SIDYTGSTYYNP(SEQ ID NO：67)、VISYGGSERYYAD(SEQ ID NO：71)、GILPILGTVDYAQ(SEQ ID NO：75)、NIDYTGSTYYNA(SEQ ID NO：83)、SIDYTGSTAYNP(SEQ ID NO：87)、SIDYTGSTYYNT(SEQ ID NO：91)、SIDYTGSTYYEP(SEQ ID NO：99)、SIDYTGSTYYEP(SEQ ID NO：103)、SIDYTGSTYYQP(SEQ ID NO：119)、SIYYTGNTYYNS(SEQ ID NO：123)、SIYYTGNTYYLP(SEQ ID NO：131)、SIYYTGNTYYMP(SEQ ID NO：143)、SIYYTGNTYYWP(SEQ ID NO：147)、SIYYTGETYYAP(SEQ ID NO：151)、XXDXXXXXXYXX(SEQ ID NO：284)，其中位置1處之X係S、N或T；位置2處之X係I、M或V；位置4處之X係Y或H；位置5處之X係T、H、L或N；位置6處之X係G、A、D、E、H、K、N、Q、R、S或T；位置7處之X係S、A、D、Q或T；位置8處之X係T、A、D或E；位置9處之X係Y、A、F、Q、S或W；位置11處之X係N、D、E、H、P或Q；位置12處之X係P、A或E，或XXXXXXXXXYXP(SEQ ID NO：379)，其中位置1處之X係S、F、I、M或Q；位置2處之X係I、A、G、L、R、S、T或V；位置3處 之X係Y、A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或W；位置4處之X係Y、A、D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、T或W；位置5處之X係T、D、E、K、N、P或Q；位置6處之X係G或Q；位置7處之X係N、D、E、G、H、I、K、M、P、R或S；位置8處之X係T、A、E、F、G、H、K、P、Q、R、S、V、W或Y；位置9處之X係Y或W；位置11處之X係N、A、D、E、K、L、M、P、Q、S或T；
    (f)HVR-H3包括一選自以下之胺基酸序列：ARGIRIFTSYFDS(SEQ ID NO：48)、ARVRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：52)、ARVHYGGYIPRRFDH(SEQ ID NO：56)、ARVAPSYPRVFDY(SEQ ID NO：60)、ARVVTYRDPPASFDY(SEQ ID NO：64)、ARGKYYETYLGFDV(SEQ ID NO：68)、AREPWYSSRGWTGYGFDV(SEQ ID NO：72)、AREPWYRLGAFDV(SEQ ID NO：76)、ATGKYYETYLGFDV(SEQ ID NO：84)、AHGKYYETYLGFDV(SEQ ID NO：88)、ATGSYYETYLGFDV(SEQ ID NO：100)、ATGNYYETYLGFDV(SEQ ID NO：104)、ASGKYYETYLGFDV(SEQ ID NO：112)、ARGNYYETYLGFDV(SEQ ID NO：120)、AGVRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：128)、SRVRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：132)、VRVRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：144)、TRVRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：148)、ARLRYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：152)、ARVKYGVGVPRYFDP(SEQ ID NO：156)、ARVRYGVGVPRHFDP(SEQ ID NO：160)、AXGXYYXTYLGFDV(SEQ ID NO：322)，其中位置2處之X係R、A、E、G、H、M、N、Q、S、T或Y；位置4處之X係K、A或S；位置7處之X係E或T，或XXXXXGXXVPRXFDP(SEQ ID NO：462)，其中位置1處之X係A或V；位置2處之X係R、A、G、N、Q或T；位置3處之X係V、A、F、I、K、L、M、Q或S；位置4處之X係R、A、I、K、L、M、P、Q、S、T或V；位置5處之X係Y、H、I、L或V；位置 7處之X係V、A、F、G、K、M、N、Q、R、S、T、W或Y；位置8處之X係G、N、R、S或T；位置12處之X係Y、F、H、I、L、M、Q或R。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中：
    (a)HVR-L1包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列；
    (b)HVR-L2包括SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及
    (c)HVR-L3包括SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項至第2項中任一項所述之抗體，其中：
    (a)HVR-H1包括選自SEQ ID NO：66、82、86、90或252-283之胺基酸序列；
    (b)HVR-H2包括選自SEQ ID NO：67、83、87、91、99、103、119或285-321之胺基酸序列；及
    (c)HVR-H3包括選自SEQ ID NO：68、84、88、100、104、112、120或323-335之胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1項至第2項中任一項所述之抗體，其中：
    (a)HVR-H1包括一選自SEQ ID NO：50、122、126、130、134、138、142、146或337-378之胺基酸序列；
    (b)HVR-H2包括一選自SEQ ID NO：51、123、131、143、147、151或380-461之胺基酸序列；及
    (c)HVR-H3包括一選自SEQ ID NO：52、128、132、144、148、152、156、160或463-513之胺基酸序列。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之抗體，其中所述抗體包括與一選自SEQ ID NO：13、17、21、25、29、33、37、41、77或78之序列具有至少90%一致性的一輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：45、49、53、57、61、65、69、73、79、80、81、85、89、93、97、101、105、109、 113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之序列具有至少90%一致性的一重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之抗體，其中所述抗體包括與SEQ ID NO：17或77具有至少90%一致性的一輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；及/或
    與一選自SEQ ID NO：49、65、79、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之序列具有至少90%一致性的一重鏈可變域(VH)胺基酸序列；
    與一選自SEQ ID NO：65、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113或117之序列具有至少90%一致性的一重鏈可變域(VH)胺基酸序列；或
    與一選自SEQ ID NO：49、79、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之序列具有至少90%一致性的一重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述之抗體，其中所述抗體包括：
    與SEQ ID NO：169或242具有至少90%一致性的一輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：170-202、248-250、518-616及743-751之序列具有至少90%一致性的一重鏈(HC)胺基酸序列；或
    與SEQ ID NO：169或242具有至少90%一致性的一輕鏈(LC)胺基酸序列；及/或與一選自SEQ ID NO：203-241及617-733之序列具有至少90%一致性的一重鏈(HC)胺基酸序列。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中所述抗體係一多特異性抗體，其包括：
    (a)一對輕鏈，其各自包括：SEQ ID NO：18之HVR-L1序列；SEQ ID NO：19之HVR-L2序列；及SEQ ID NO：20之HVR-L3序列；
    (b)一重鏈，其包括：選自SEQ ID NO：66、82、86、90或106之HVR-H1序列；選自SEQ ID NO：67、83、87、91、99、103或119之HVR-H2序列；及選自SEQ ID NO：68、84、88、100、104、112或120之HVR-H3序列；及
    (c)一重鏈，其包括：選自SEQ ID NO：50、122、126、130、134、142或146之HVR-H1序列；選自SEQ ID NO：51、123、127、131、135、139、143、147或151之HVR-H2序列；及HVR-H3包括選自SEQ ID NO：52、128、132、144、148、152、156或160之胺基酸序列；視情況，其中：
    所述重鏈中之一者包括胺基酸取代T366W，且另一重鏈包括胺基酸取代T366S、L368A及Y407V；及/或
    所述抗體包括：
    (a)一對輕鏈，其各自包括SEQ ID NO：17或77之輕鏈可變域(VL)胺基酸序列；
    (b)一重鏈，其包括一選自SEQ ID NO：65、80、81、85、89、93、97、101、105、109、113或117之重鏈可變域(VH)胺基酸序列；及
    (c)一重鏈，其包括一選自SEQ ID NO：49、79、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161或165之重鏈可變域(VH)胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述之抗體，其中所述抗體以1×10-8M或更低、1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之一結合親和力結合至hu-IL-36α、hu-IL-36-β及/或hu-IL-36-γ；
    所述抗體以1×10-8M或更低、1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之一結合親和力結合至hu-IL-36α及hu-IL-36-γ；
    所述抗體以1×10-8M或更低、1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之一結合親和力結合至hu-IL-36-β；
    所述抗體將由IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之一細胞內信號降低至少 90%、至少95%、至少99%或100%；視情況，其中在一約為EC50之IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ濃度下，所述抗體之IC50係10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低；
    所述抗體抑制由IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之來自初代人類角質細胞(PHK)的IL-8釋放，視情況，其中在一約為EC50之IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ濃度下，所述抗體之IC50係10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低；及/或
    所述抗體與SEQ ID NO：5、6或7之食蟹獼猴之IL-36α、IL-36β或IL-36γ交叉反應。
  10. 一種多特異性抗體，其結合至人類IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之每一者，其中所述抗體係以3nM或更低之一結合親和力結合至人類IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之每一者；視情況其中所述結合親和力由對SEQ ID NO：1之hu-IL-36α、SEQ ID NO：2之hu-IL-36β及SEQ ID NO：3之hu-IL-36γ的平衡解離常數(KD)量測；視情況，其中所述抗體：
    (a)在一條臂中包括一對IL-36α及/或IL-36γ之特異性，且在另一臂中包括一對IL-36β之特異性；視情況，其中一條臂以1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之一結合親和力結合至hu-IL-36α及hu-IL-36-γ，且另一臂以1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、或1×10-11M或更低之一結合親和力結合至hu-IL-36-β；
    (b)將由IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之一細胞內信號降低至少90%、至少95%、至少99%或100%；視情況，其中在一約為EC50之IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ濃度下，所述抗體之IC50係10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低；
    (c)抑制由IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ刺激之來自初代人類角質細胞 (PHK)的IL-8釋放，視情況，其中在一約為EC50之IL-36α、IL-36β及/或IL-36γ濃度下，所述抗體之IC50係10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低；
    (d)與食蟹獼猴之IL-36α、IL-36β及IL-36γ交叉反應；及/或
    (e)所述抗體以3nM或更低之一結合親和力結合至食蟹獼猴IL-36α、IL-36β及IL-36γ中之每一者；視情況其中所述結合親和力由對SEQ ID NO：5之cy-IL-36α、SEQ ID NO：6之cy-IL-36β及SEQ ID NO：7之cy-IL-36γ的平衡解離常數(KD)量測。
  11. 一種經分離多核苷酸或載體，其編碼如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述之抗體；或一種包括所述多核苷酸或載體之經分離宿主細胞；視情況其中所述宿主細胞選自中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、骨髓瘤細胞(例如，Y0、NS0、Sp2/0)、猴腎細胞(COS-7)、人類胚腎細胞株(293)、幼倉鼠腎細胞(BHK)、小鼠塞特利氏細胞(例如，TM4)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人類子宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞、人類肺細胞(W138)、人類肝細胞(Hep G2)、小鼠乳房腫瘤細胞、TR1細胞、醫學研究委員會5(MRC 5)細胞及包皮4(FS4)細胞。
  12. 一種產生一抗體之方法，所述方法包括培養如申請專利範圍第11項所述之宿主細胞，以使得產生一抗體。
  13. 一種醫藥組合物，其包括一如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述之抗體及一醫藥學上可接受之載劑。
  14. 一種治療一個體的方法，所述方法包括向所述個體投與一治療有效量之如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述之抗體，或一治療有效量之如申請專利範圍第13項所述之醫藥組合物；視情況，其中疾病選自：由表皮生長因子受體抑制劑所致之痤瘡、痤瘡及化膿性汗腺炎(PASH)、急性全身性發疹性膿皰病(AGEP)、皺褶部位無微生物性膿皰病、頭皮/腿部無微生物性膿皰病、無微 生物性角膜下膿皰病、無菌膿腫症候群、白塞氏病、腸分流症候群、慢性阻塞性肺病(COPD)、兒童膿皰型皮膚病、克羅恩氏病、介白素-1受體拮抗劑缺乏(DIRA)、介白素-36受體拮抗劑缺乏(DITRA)、濕疹、全身性膿皰型牛皮癬(GPP)、持久隆起性紅斑、化膿性汗腺炎、IgA天疱瘡、發炎性腸病(IBD)、嗜中性白血球性脂層炎、掌蹠膿皰型牛皮癬(PPP)、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、膿皰型牛皮癬(DIRA、DITRA)、壞疽性膿皮病、化膿性關節炎壞疽性膿皮病及痤瘡(PAPA)、化膿性關節炎壞疽性膿皮病痤瘡及化膿性汗腺炎(PAPASH)、類風濕性嗜中性白血球性皮膚病、滑膜炎痤瘡膿皰病骨肥厚及骨炎(SAPHO)、克羅恩氏病患者中之TNF誘導之牛皮癬形式皮膚病變、休格連氏症候群、史維德氏症候群、全身性紅斑狼瘡(SLE)、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎及癌症；視情況，其中所述癌症選自乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、胰臟癌。
  15. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述之抗體，其用作一藥劑；視情況，用於治療一發炎性病狀。
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