CN104403004B - 抗体‑干扰素异二聚体的制备和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新型异二聚体蛋白，包含其的组合物/试剂盒、以及它们的制备方法和用途。特别地，本发明涉及抗体‑干扰素异二聚体的制备和用途。本发明的新型异二聚体具有显著的抗肿瘤活性、并且由于优异的高表达量和较长的体内半衰期而特别适合于工业生产。

Description

抗体-干扰素异二聚体的制备和用途
技术领域
本发明涉及肿瘤学领域。特别地，本发明提供了具有显著抗肿瘤活性、高表达量和较长的体内半衰期的异二聚体蛋白。
背景技术
尽管肿瘤相关的抗原可能引起免疫反应(Hrouda等人，1999，Semin.Oncol.26：455-471；Disis等人，1997，J.Clin.Oncol.15：3363-3367)，但是引起疾病的致癌性细胞不能引起免疫反应从而被免疫系统消灭。许多研究已表明，有可能通过向肿瘤细胞中引入免疫刺激分子，例如干扰素，来增强肿瘤细胞的免疫原性(Dranoff和Mulligan，1995，Adv.Immunol.58：417-454；Hrouda等人，1999，Semin.Oncol.26：455-471；Hurford等人，1995，Nat.Genet.10：430-435)然而，如何将特定的免疫刺激因子靶向所针对的癌细胞，并且实现高效且准确的靶向是本领域技术人员面临的巨大挑战。此外，要治疗肿瘤需要根除残余的癌细胞，而这些细胞可能因为数量极少、位置分散、隐蔽等多种原因而难以被有效地靶向。
为了抵抗病原性细菌的感染和/或抵抗肿瘤，需要引发受试者的先天性免疫反应和获得性免疫反应。先天免疫系统中的细胞所产生的细胞因子可以直接或间接地激活获得性免疫反应中的细胞，并且在引发保护性抗肿瘤免疫中发挥重要作用(Belardelli和Ferrantini，2002，Trends Immunol.23：201-208)。在这方面，促炎性细胞因子(例如干扰素)的释放对于激活先天免疫系统起重要的作用。
目前通常将干扰素分为三种主要的类型，即Ⅰ型、II型和III型。其中，Ⅰ型干扰素包括IFN-α和IFN-β，其中IFN-α又包括IFN-α2、IFN-α4等亚型。Ⅰ型干扰素具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性、参与免疫调节、抗肿瘤等作用。Ⅱ型和III型干扰素包括IFN-γ，IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28a)和IFN-λ3(IL-28b)。人们已发现，干扰素具有抗病毒、调节免疫系统、抗细胞增殖等作用。
然而，尽管干扰素具有各种在癌症治疗中有益的作用，其较短的半衰期和系统毒性大大限制了它在肿瘤治疗和预防中的应用。
中国专利申请CN200880117225.8中提供了一种将干扰素附着于肿瘤特异性抗体C端的融合蛋白，其被用于杀死肿瘤细胞或抑制其增殖。然而，此种融合蛋白在体内环境中不稳定，并且其表达产量不高，并不适合用于大规模工业生产。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种异二聚体蛋白，其包含第一多肽和不同于所述第一多肽的第二多肽，所述第一多肽包含能够结合肿瘤相关抗原的靶向部分和/或能够结合癌细胞表面标记物或癌细胞相关标记物的靶向部分，所述第二多肽包含免疫球蛋白的Fc区和干扰素。
在另外的方面，本发明提供制备异二聚体蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：
1)提供第一多肽，其包含能够结合肿瘤相关抗原的靶向部分和/或能够结合癌细胞表面标记物或癌细胞相关标记物的靶向部分；
2)提供第二多肽，其包含免疫球蛋白的Fc区和干扰素；以及
3)获得所述异二聚体蛋白。
任选地，所述方法还包括分离和纯化所述异二聚体蛋白的步骤。
在具体的实施方式中，可选地，在本发明的异二聚体蛋白的第二多肽中，所述免疫球蛋白的Fc区和所述干扰素是化学偶联的，例如是通过连接子相连的。所述连接子可以为多肽，其可包含几个至几十个氨基酸，例如所述连接子可包含1-10个氨基酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸，如1-15(如1-11、12、13、14、15)个氨基酸，1-20个氨基酸，1-30个或更多个氨基酸。在具体的实施方式中，所述连接子可包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述连接子可以是抗蛋白质水解或者基本上抗蛋白质水解的连接子。
在本发明的所述异二聚体蛋白中，所述干扰素选自I型干扰素、II型干扰素和/或III型干扰素，例如干扰素α，干扰素β和/或干扰素λ。特别地，所述干扰素可以是小鼠干扰素β、人干扰素β、小鼠干扰素α4、人干扰素α2或人干扰素λ。
在本发明的异二聚体蛋白中，所述能够结合肿瘤相关抗原的靶向部分和/或能够结合癌细胞表面标记物或癌细胞相关标记物的靶向部分可以是能够结合肿瘤相关抗原的抗体。例如，所述靶向部分可以为能够特异性结合EGFR家族成员的抗体，如特异性结合EGFR的抗体(如西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、Necitumumab,ABT-806、Sym004等)；特异性结合Her-2的抗体(如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、margetuximab，MAGE-101等)；或者其它能够结合肿瘤相关抗原的抗体，例如patritumab、利妥昔单抗、ofatumumab、obinutuzumab、ocrelizumab、ibritumoma、托西莫单抗、ocaratuzumab、veltuzumab、RTXM-83、Campath-1H(阿仑珠单抗)、MylotargTM(吉妥珠单抗)、daratumumab、epratuzumab、brentuximab、ri lotumumab、ranibizumab、ramucirumab、贝伐珠单抗(AvastinTM)、catumaxomab、Dalotuzumab、Ganitumab、Gemtuxumab(针对CD33)girentuximab(针对G250)、WX-G250(针对G250)、CC49(针对TAG-72)、T84.66(针对CEA)、labetuzumab(针对CEA)、anetumab(针对mesothelin)、hu7D9.v3(mesothelin)、YYP-218、YP-223、YP-3、SD1、SD2、111In-SS1-scFvSA、MDX-1382、RG-7787、MDX-1459、TF-10、m170(针对MUC1)、PankoMab(针对MUC1)、HmAb16(针对MUC1)或Elotuzumab(针对CS1)等。
在具体的实施方式中，作为所述靶向部分的抗体可以包含西妥昔单抗或者曲妥珠单抗中VH区的3个CDR(即CDR1、CDR2和CDR3)和/或VL区的3个CDR(即CDR1、CDR2和CDR3)；或者所述抗体包含西妥昔单抗或者曲妥珠单抗的VH和/或VL区。曲妥珠单抗VL区的序列如SEQID NO:29所示，曲妥珠单抗VH区的序列如SEQ ID NO:30所示，曲妥珠单抗轻链可变区CDR的序列分别如SEQ ID NO:31(CDR-L1)、SEQ ID NO:32(CDR-L2)、SEQ ID NO:33(CDR-L3)所示，曲妥珠单抗重链可变区CDR的序列分别如SEQ ID NO:34(CDR-H1)、SEQ ID NO:35(CDR-H2)、SEQ ID NO:36(CDR-H3)所示。西妥昔单抗VL区的序列如SEQ ID NO:37所示，西妥昔单抗VH区的序列如SEQ ID NO:38所示，西妥昔单抗轻链可变区CDR的序列分别如SEQ ID NO:39(CDR-L1)、SEQ ID NO:40(CDR-L2)、SEQ ID NO:41(CDR-L3)所示，西妥昔单抗重链可变区CDR的序列分别如SEQ ID NO:42(CDR-H1)、SEQ ID NO:43(CDR-H2)、SEQ ID NO:44(CDR-H3)所示。
任选地，作为所述靶向部分的抗体在对应于西妥昔单抗或曲妥珠单抗重链的第354位和/或第366位的位置包含点突变S354C和/或T366W，所述突变位于抗体的重链Fc结构域中。
在一个具体的实施方式中，作为所述靶向部分的抗体包含轻链和重链，所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示。特别地，所述轻链包含CDR-L1，CDR-L2和CDR-L3，它们的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:31(CDR-L1)、SEQ ID NO:32(CDR-L2)和SEQ ID NO:33(CDR-L3)所示；和/或所述重链包含CDR-H1，CDR-H2和CDR-H3，它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:34(CDR-H1)、SEQ ID NO:35(CDR-H2)和SEQ ID NO:36(CDR-H3)所示。
在另一个具体实施方式中，作为所述靶向部分的抗体包含轻链和重链，所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示。特别地，所述轻链包含CDR-L1，CDR-L2和CDR-L3，它们的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:39(CDR-L1)、SEQ ID NO:40(CDR-L2)和SEQ ID NO:41(CDR-L3)所示；和/或所述重链包含CDR-H1，CDR-H2和CDR-H3，它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:42(CDR-H1)、SEQ ID NO:43(CDR-H2)和SEQ ID NO:44(CDR-H3)所示。
在本发明的情境中，可用作所述靶向部分的抗体包括单链Fv(ScFv)、Fab、(Fab’)2、(ScFv)2和全长IgG。
在一个具体的实施方式中，可用作所述靶向部分的抗体的轻链氨基酸序列如SEQID NO:11所示，且其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
在另一个具体的实施方式中，可用作所述靶向部分的抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，且其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
在本发明的异二聚体蛋白中，包含于所述第二多肽中的免疫球蛋白Fc区可包含选自下列免疫球蛋白的恒定区氨基酸序列：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。优选地，包含于所述第二多肽中的免疫球蛋白Fc区与所述靶向部分的抗体的Fc区源自具有相同亚型的免疫球蛋白。在具体的实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列如SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48所示。
在一个具体的实施方式中，包含于所述第二多肽中的免疫球蛋白Fc区包含免疫球蛋白γ1(IgG1)的恒定区氨基酸序列。优选地，所述IgG1可以为人IgG1。
任选地，所述免疫球蛋白Fc区在相应于人IgG1的第349、366、368和/或407位的位置包含点突变Y349C,T366S,L368A和/或Y407V(这些突变位于IgG1的Fc区中)。
在一个具体的实施方式中，所述第二多肽包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明还提供分离的核酸分子，其编码本发明的异二聚体蛋白、所述第一多肽、所述第二多肽或者它们的片段。
在又一个方面，本发明提供一种组合物(例如药物组合物)，其包含本发明的异二聚体蛋白或本发明的分离的核酸分子，以及任选地药学上可接受的赋形剂。
在具体的实施方式中，本发明的组合物可被配制为适于口服或肠胃外施用的制剂形式，例如可被配制为适于通过选自口服、静脉内给药、肌内给药、肿瘤处原位给药、吸入、直肠给药、阴道给药、透皮给药和皮下储库给药的方式来施用的制剂。
本发明还涉及所述异二聚体蛋白、分离的核酸分子或本发明的组合物用于制备药物和/或试剂盒的用途，所述药物和/或试剂盒用于抑制癌细胞的生长和/或增殖；所述药物和/或试剂盒还可用于特异性和/或优先抑制或杀伤靶细胞(例如癌细胞)的生长或分化。
在另外的方面，本发明提供抑制癌细胞的生长和/或增殖的方法，所述方法包括使所述方法一般包括使所述癌细胞与本发明的异二聚体蛋白、本发明的组合物或本发明的药物进行接触。在具体的实施方式中，所述接触包括将本发明的异二聚体蛋白、本发明的组合物或本发明的药物全身或局部地施用给哺乳动物。在某些实施方式中，所述接触包括将本发明的异二聚体蛋白、本发明的组合物或本发明的药物直接施用于肿瘤部位。在具体的实施方式中，所述施用可以是通过选自口服、静脉内给药、肌内给药、肿瘤处原位给药、吸入、直肠给药、阴道给药、透皮给药和皮下储库给药的方式来进行的。
在本发明的情境中，所述癌细胞可以是转移性癌细胞，例如实体肿瘤中的癌细胞，例如乳腺癌、肝癌细胞或黑色素瘤癌细胞。特别地，所述癌细胞可以是由选自下列的肿瘤产生的癌细胞：B细胞淋巴瘤、肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、外周神经系统癌症、食道癌、宫颈癌、黑素瘤、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或喉癌、肝癌、肾癌、胆管癌、小肠癌或阑尾癌、唾液腺癌、胸腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、脂肪瘤、睾丸癌以及恶性纤维组织细胞瘤。
在具体的实施方式中，所述癌细胞可以是受试者体内的癌细胞；例如人或非人哺乳动物体内的癌细胞。
在又一个方面，本发明还提供细胞(例如宿主细胞)，其包含或能够表达本发明的异二聚体蛋白或者本发明的分离的核酸分子。在具体的实施方式中，所述宿主细胞可以是例如大肠杆菌、其他细菌宿主、酵母和各种高等真核细胞，比如COS、CHO、HeLa细胞系，以及骨髓瘤细胞系。通常可操作地将重组蛋白基因连接至适合各宿主的表达调控序列。
本发明的异二聚体蛋白具有显著的抗肿瘤活性。另一方面，本发明的异二聚体蛋白具有高表达量。在又一个方面，本发明的异二聚体蛋白具有较长的体内半衰期。在另外的方面，本发明的异二聚体蛋白特别适合于工业大规模生产。
附图说明
图1：显示了本申请中描述的Erb-muIFNb异二聚体与作为对照的C端融合蛋白ErbHC-muIFNb的表达量比较结果。可以看到，本发明的异二聚体的表达量显著提高。
图2：显示了本发明的Erb-huIFNb异二聚体的药代动力学测定结果。其中使用了Balb/C小鼠，以2.5mg/kg的浓度向所述小鼠静脉注射所述Erb-huIFNb异二聚体，测得了平均C-t曲线，并且计算得出所述Erb-huIFNb异二聚体的体内半衰期为T1/2＝27.468小时。
图3：显示了本发明的Erb-huIFNL异二聚体的药代动力学测定结果。其中使用了Balb/C小鼠，以10mg/kg的浓度向所述小鼠静脉注射所述Erb-huIFNL异二聚体，测得了平均C-t曲线，并且计算得出所述Erb-huIFNL异二聚体的体内半衰期为T1/2＝55.29小时。
图4：显示了本发明的异二聚体特异性结合抗原的能力。由图4的结果可以看出，本发明的异二聚体Erb-muIFNb、Erb-huIFNb以及Erb-huIFNL与对应的单克隆抗体Erb特异性结合抗原的能力相当。
图5：显示了本发明的异二聚体的抗病毒活性。由图5A和5B的结果可以看出，本发明的异二聚体保留了干扰素的活性而能够有效地保护细胞免受病毒感染。
图6：显示了本发明的异二聚体在体内良好的抗肿瘤活性。对野生型C57BL/6小鼠皮下接种7x105表达人EGFR抗原和SIY抗原肽的小鼠黑色素瘤细胞B16-EGFR-SIY以建立小鼠肿瘤模型，从肿瘤接种后14天开始给予肿瘤内抗体注射治疗，每次25μg，每两天一次连续进行三次。每三天对肿瘤进行一次测量，计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。其中显示了，与单独的单克隆抗体相比，本发明的包含IFNλ或IFNβ的异二聚体具有显著更强的抗肿瘤活性。此外，本发明的异二聚体与相应的N端或C端融合蛋白在抗肿瘤活性方面相当。
图7：显示了本发明的异二聚体在体内良好的抗肿瘤活性。本实验采用EGFR转基因小鼠皮下接种5x105高表达人EGFR抗原和SIY抗原肽的小鼠黑色素瘤细胞B16-EGFR-SIY建立小鼠肿瘤模型，从肿瘤接种后14天开始给予腹腔抗体注射治疗，每次200μg，每两天注射一次、连续进行两次。每三天测量肿瘤一次，计算肿瘤体积并制备肿瘤生长曲线。图7的结果显示，与单独的单克隆抗体相比，本发明的包含IFNα的异二聚体具有显著更强的抗肿瘤活性。此外，由于在本实施例中，采用腹腔注射的方式进行全身给药而不是仅在肿瘤生长部位给药，这表明包含IFNα的异二聚体具有很好的肿瘤靶向作用。
图8：显示了曲妥珠单抗、本发明的异二聚体Tmab-huIFNa2和IFNα在体外对肿瘤细胞的抑制效果。其结果显示，本发明的异二聚体蛋白在体外能够有效地抑制肿瘤细胞增殖,其抑制作用显著优于曲妥珠单抗。
图9：显示了西妥昔单抗、本发明的异二聚体Erb-huIFNb在体外对肿瘤细胞的抑制效果。其结果显示，本发明的异二聚体蛋白在体外能够有效地抑制肿瘤细胞增殖,作用显著优于西妥昔单抗。
具体实施方式
术语定义
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于描述氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中的一个或多个氨基酸残基是相应的天然氨基酸的人工化学类似物的那些氨基酸聚合物，也适用于天然的氨基酸聚合物。此术语还包括将构成多肽的氨基酸连接起来的常规肽连接子的变体。优选的“肽”、“多肽”和“蛋白质”是α碳通过肽键连接的氨基酸链。因此链的一端(氨基端)的末端氨基酸带有游离的氨基，而链的另一端(羧基端)的末端氨基酸带有游离羧基。术语“氨基端”(缩写为N端)在本申请中是指肽氨基末端的氨基酸上的游离α-氨基基团或者肽内其他位置上的氨基酸的α-氨基基团(参与肽键形成时是亚氨基基团)。类似地，术语“羧基端”是指肽的羧基端上的游离羧基基团或者肽内其他位置上的氨基酸的羧基基团。肽还包括基本上任何多聚氨基酸，包括但不限于拟肽，比如通过醚键而不是酰胺键连接的氨基酸。
在本申请的情境中，术语“抗体”是指基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一或多个多肽所构成的蛋白质。公知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及数种免疫球蛋白可变区基因。轻链被划分为κ或λ。重链被划分为γ、μ、α、δ或ε。它们继而又分别限定了免疫球蛋白的种类：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
抗体的存在方式包括完整的免疫球蛋白，或者是通过用多种肽酶消化或者重新表达产生的许多已被良好表征的片段。因此，例如胰蛋白酶消化抗体铰链区中的二硫键产生F(ab)’2，Fab二聚体，其自身是通过二硫键与VH_CH1连接的轻链。在本申请的情境中，术语抗体也包括通过对完整的抗体进行修饰或者利用重组DNA技术重新合成所产生的抗体片段，其包括但不限于Fab’2、IgG、IgM、IgA、IgE、scFv、dAb、纳米抗体、unibodies和diabodies等。在具体的实施方式中，优选的抗体包括但不限于Fab’2、IgG、IgM、IgA、IgE和单链抗体,特别优选的是单链Fv(scFv)抗体，其中重链可变区和轻链可变区被(直接或经由肽连接子)连接在一起形成连续的多肽。
某些实施方式中，用于构建本发明的抗体和片段的可以是双特异性的。双特异性抗体或其片段可以具有对至少两种不同表位(其中至少一个是肿瘤相关抗原)的结合特异性。
术语“抗原结合位点”是指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。抗原结合位点是由重链(H)和轻链(L)的N末端可变区(V)的氨基酸残基构成的。重链和轻链V区内的三个高度变异的片段被称为“高变区”(CDR)，该区介于更为保守的、被称为“框架区”或“FRs”的侧翼片段之间。因此，术语“FR”是指免疫球蛋白中天然存在于高变区之间的、与高变区邻近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中彼此相对地形成抗原结合“表面”。这个表面介导靶抗原的识别和结合。每个重链和轻链的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDRs”,并通过例如Kabat et al.Sequences of proteinsof immunological interes t,第四版ed.U.S.Dept.Heal th andHuman Services,Public Heal th Services,Bethesda,MD(1987)中描述的方法被鉴别和表征。
术语“干扰素”是指全长干扰素，或者基本保持全长野生型干扰素的生物活性(例如保持全长干扰素序列的至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、98％或99％)的干扰素片段(截短的干扰素)或干扰素变体。干扰素包括I型干扰素(例如，干扰素α和干扰素β)、II型干扰素(例如，干扰素γ)和I I I型干扰素(例如，干扰素λ)。所述干扰素(例如IFNα)可来自几乎任何哺乳动物物种。在某些优选的实施方式中，所述干扰素来自选自人、马类、牛类、啮齿类动物、猪、兔、猫、犬、鼠、山羊、绵羊、非人灵长类等的物种。在具体的实施方式中，干扰素变体包含一个或多个氨基酸的取代、插入和/或缺失。
抗-HER2/neu抗体是特异性或优先结合HER2/neu受体的抗体。
EGFR抗体是特异性或优先结合EFGR的抗体。
在本申请中，术语“受试者”是指人或非人动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、牛、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠或猴等。
“抗-EGFR家族成员的抗体”是指特异性结合表皮生长因子受体家族成员的抗体(例如，结合ErbB-1(又称为EGFR)、ErbB_2(在人中又称为HER2，在啮齿类动物中称为neu)、ErbB_3(又称为HER3)和/或ErbB-4(又称为HER4)的抗体)。示例性的抗-EGFR家族成员的抗体包括但不限于，例如C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6-B1D2、F5、HER3.A5、HER3.F4、HER3.H1、HER3.H3、HER3.E12、HER3.B12、EGFR.El2、EGFR.C10、EGFR.B11、EGFR.E8、HER4.B4、HER4.G4、HER4.F4、HER4.A8、HER4.B6、HER4.D4、HER4.D7、HER4.D11、HER4.D12、HER4.E3、HER4.E7、HER4.F8以及HER4.C7等抗体。在这方面，参见例如美国专利申请US2006/0099205A1和US2004/0071696A1，将它们通过引用而并入本文。
单链Fv(“sFv”)多肽是指通过共价连接的VH与VL，在某些实施方案中可以由包含直接或者通过肽编码连接子连在一起的VH和VL编码序列的核酸表达产生。
“CD20”是成熟B细胞表面上的非糖基化磷酸蛋白(参见例如Cragg等人，(2005)Curr.Dir.Autoimmun.，8:140-174)。该蛋白还可见于B细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、皮肤/黑素瘤癌干细胞等。
术语“抑制癌细胞的生长和/或增殖”是指降低癌细胞的生长速度和/或扩增速度。在某些实施方式中，其包括癌细胞的死亡(例如通过细胞凋亡)。某些实施方式中，该术语还指抑制实体肿瘤的生长和/或增殖，和/或引发肿瘤体积减少或者消除肿瘤。
术语“癌细胞表面标记物或癌细胞相关标记物”指这样一些生物分子，例如蛋白质、碳水化合物、糖蛋白等。所述生物分子专门或者优选或者差异性地在癌细胞上表达，和/或被发现与癌细胞相关，因此可以作为癌症的优选或特异性靶标。在具体的实施方式中，优势表达可以是与生物体中其他细胞相比的优势表达，或者是生物体中特定区域内的优势表达(例如，在特定器官或组织中)。
靶向部分
在本发明的某些实施方式中，所述靶向部分能够特异性结合肿瘤相关抗原和/或能够结合癌细胞表面标记物或癌细胞相关标记物。特别地，所述靶向部分为抗体，其能够特异性结合EGFR家族的成员。在具体的实施方式中，所述抗体可特异性结合选自下列的抗原：EGFR、HER4、HER3、HER2/neu、MUC-1、G250、间皮素、gp100、CS1、酪氨酸酶和MAGE的标记物。在某些实施方式中，所述靶向部分是结合EGFR或Her-2的抗体。在某些实施方式中，所述靶向部分是单链抗体，所述单链抗体包含来自选自下述的抗体的CDRs和/或可变区，例如：西妥昔单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、Neci tumumab、ABT-806、Sym004、帕妥珠单抗、margetuximab、MAGE-101、patritumab、ofatumumab、obinutuzumab、ocrel izumab、ibri tumoma、托西莫单抗、ocaratuzumab、vel tuzumab、RTXM-83、Campath-1H(阿仑珠单抗)、MylotargTM(吉妥珠单抗)、daratumumab、epratuzumab、brentuximab、ri lotumumab、ranibizumab、ramucirumab、贝伐珠单抗(Avas t inTM)、catumaxomab、Dalotuzumab、Gani tumab、Gemtuxumab(针对CD33)girentuximab(针对G250)、WX-G250(针对G250)、CC49(针对TAG-72)、T84.66(针对CEA)、labetuzumab(针对CEA)、anetumab(针对mesothelin)、hu7D9.v3(mesothelin)、YYP-218、YP-223、YP-3、SD1、SD2、111In-SS1-scFvSA、MDX-1382、RG-7787、MDX-1459、TF-10、m170(针对MUC1)、PankoMab(针对MUC1)、HmAb16(针对MUC1)或Elotuzumab(针对CS1)等。
在具体的实施方式中，作为靶向部分的所述抗体是IgG(例如IgGl、IgG3等)、IgE、单链Fv(scFv)、FAB、(Fab’)2、(ScFv)2等。在某些实施方式中，作为靶向部分的所述抗体选自Ri tuxan、IF5、B1、1H4、CD19、B4、B43、FVS191、hLL2、LL2、RFB4、M195、HuM195、AT13/5、赫赛汀4D5、HuCC49等。在某些实施方式中，作为靶向部分的抗体是能够结合EGF受体家族成员的抗体。在某些实施方式中，所述抗体选自C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6-B1D2、F5、HER3.A5、HER3.F4、HER3.HI、HER3.H3、HER3.E12、HER3.B12、EGFR.E12、EGFR.C10、EGFR.Bll、EGFR.E8、HER4.B4、HER4.G4、HER4.F4、HER4.A8、HER4.B6、HER4.D4、HER4.D7、HER4.D1UHER4.D12、HER4.E3、HER4.E7、HER4.F8和HER4.C7。在某些实施方式中，作为靶向部分的所述抗体为西妥昔单抗或曲妥珠单抗。任选地，所述抗体在对应于西妥昔单抗或曲妥珠单抗重链的第354位和/或第366位的位置包含点突变S354C和/或T366W，所述突变位于抗体的重链Fc结构域中。
在具体的实施方式中，靶向部分是这样的分子，其与靶细胞所表达的(例如表达在靶细胞表面的)标记物或者和靶细胞相关的标记物特异性地或优先地结合。虽然靶细胞几乎可以是任何细胞，某些优选的细胞包括那些与特征在于细胞过度增殖的病态(即过度增殖病)相关的细胞。示例性的过度增殖病包括但不限于银屑病、中性白细胞增多症、红细胞增多症、血小板增多症和癌症。
在本申请中，被称为癌症的过度增殖性疾病包括但不限于实体瘤，例如发生在乳腺、呼吸道、脑、生殖器官、消化道、尿道、眼、肝脏、皮肤、头颈、甲状腺、甲状旁腺的癌症，以及它们的远端转移。这类疾病还包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。乳腺癌的实例包括但不限于浸润性导管癌、浸润性小叶癌、乳腺导管原位癌和乳腺小叶原位癌。呼吸道癌症的实例包括但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌，以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤。脑癌的实例包括但不限于脑干和下丘脑角质瘤、小脑和大脑星状细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤，以及神经外胚层和松果体肿瘤。男性生殖器肿瘤包括但不限于前列腺和睾丸癌。女性生殖器肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌，以及子宫瘤。消化道肿瘤包括但不限于肛门、结肠、结肠直肠、食管、胆囊、胃、胰腺、直肠、小肠和唾液腺癌。尿道肿瘤包括但不限于膀胱、阴茎、肾、肾盂、输尿管和尿道癌。眼癌包括但不限于眼球内黑素瘤和视网膜母细胞瘤。肝癌的实例包括但不限于肝细胞癌(有或没有纤维板层变异的肝细胞瘤)、胆管癌(肝内胆管癌)和混合型肝细胞胆管细胞癌。皮肤癌包括但不限于鳞状细胞癌、卡波西(Kaposi’s)肉瘤、恶性黑素瘤、Merkel细胞皮肤癌和非黑素瘤型皮肤癌。头颈癌包括但不限于喉/下咽/鼻咽/口咽癌，和嘴唇和口腔癌。淋巴癌包括但不限于AIDS相关的淋巴癌、非霍奇金淋巴癌、皮肤T细胞淋巴癌、霍奇金氏病，以及中枢神经系统淋巴癌。肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。白血病包括但不限于急性髓样白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病和毛细胞白血病。
在某些实施方式中，本申请所述的靶向部分是能够结合癌症标记物(例如，肿瘤相关抗原)的部分。有大量癌症标记物是本领域技术人员已知的。这些标记物不需要是癌细胞特有的，而是在以下情况中也是有效的，即所述标记物在癌细胞中的表达提高(相比正常的健康细胞)或者周边组织不存在可比水平的标记物。
示例性的癌症标记物包括，例如ND4单克隆抗体识别的肿瘤标记物。该标记物可见于低度分化的结肠直肠癌，以及胃神经内分泌肿瘤(参见例如Tobi et al.(1998)CancerDetect ion and Prevent ion,22(2):147-152)。其他重要的癌症免疫疗法目标是膜结合补体调控糖蛋白：CD46、CD55和CD59，这些蛋白已被发现在体内和体外在多数肿瘤细胞上都有表达。CS1是癌细胞表达的一种糖蛋白，不会在正常组织中被检测到。人纤粘蛋白(例如MUC1)与在黑素瘤中发现的gp100、酪氨酸酶和MAGE都是已知的肿瘤标记物。野生型Wi lms'瘤基因WT1不仅在多数急性髓细胞、急性淋巴细胞和慢性髓细胞白血病中，而且在包括肺癌的多种类型的实体瘤中高水平表达。
急性淋巴细胞白血病已通过TAAs HLA-Dr、CD1、CD2、CD5、CD7、CD19和CD20表征。急性髓细胞白血病已通过TAAs HLA-Dr、CD7、CD13、CD14、CD15、CD33和CD34表征。乳腺癌已通过标记物EGFR、HER2、MUC1和Tag-72表征。多种癌可通过标记物MUC1、TAG-72和CEA进行表征。慢性淋巴细胞白血病可通过标记物CD3、CD19、CD20、CD21、CD25和HLA-DR进行表征。霍奇金症可通过Leu-M1标记物进行表征。多种黑色素瘤可通过HMB45标记物进行表征。非霍奇金淋巴瘤可通过CD20、CD19和Ia标记物进行表征。多种前列腺癌已通过PSMA和SE10标记物进行了表征。
在具体的情形中，肿瘤细胞展示一些是健康细胞表面罕见或者不存在的细胞表面受体，这些受体负责细胞信号传导途径的激活，导致肿瘤细胞不受控制的生长和分裂。实例包括(ErbB2).HER2/neu，这种组成性活化细胞表面受体在乳腺癌肿瘤细胞表面上异常高水平地产生。其他有用的靶标包括但不限于CD20、CD52、CD33、表皮生长因子受体等。
以上所讨论的任何标记物都可以作为包含在本发明的异二聚体蛋白中的靶向部分的靶标。在某些实施方式中，所述靶标包括但不限于表皮生长因子家族成员(例如HER2、HER3、EGF、HER4)、CD1、CD2、CD3、CD5、CD7、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD33、CD34、CD38、5E10、CEA、HLA-DR,HM 1.24、HMB 45、la、Leu-M1、MUC1、PMSA、TAG-72磷脂酰丝氨酸抗原、CS1等。
以上标记物仅作为示例而非限制性的，本领域技术人员也可根据需要选择其他的肿瘤相关抗原。
组合使用
本发明的异二聚体蛋白、组合物、药物或试剂盒可以用于抑制靶细胞(例如癌细胞)的生长和/或增殖。在具体的实施方式中，其可抑制疾病的发展、缩小肿瘤大小和/或稳定病情的衰退/缓解。
特别地，在癌症的治疗中，本发明的异二聚体蛋白、组合物、药物或试剂盒和方法还可以包括其他治疗上和/或药物学可接受的试剂。例如，所述组合物和方法可以包括其他治疗癌症的试剂。这类试剂包括但不限于烷化剂(例如，二氯甲基二乙酸、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、雌氮芥、噻替派、白消安、罗氮芥、卡氮芥、链服霉素、达卡巴嗪、顺铂、卡铂、六甲蜜胺等)；抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、5氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、5氟脱氧尿苷、卡培他滨、氟达拉滨、阿糖胞苷、6疏基嘌呤、6硫鸟嘌呤、吉西他滨、脱氧考福霉素、喷司他丁等)；抗生素(例如多柔比星、Rubex、Doxi l、柔红霉素脂质体制品)、正定霉素、诺肖林、更生霉素、光辉霉素、普卡霉素、丝裂霉素、博来霉素等)；有丝分裂抑制剂(例如紫杉醇、多烯紫杉醇、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春瑞滨等)；染色质功能抑制剂(例如拓扑替康、伊立替康、依托泊苷、替尼泊苷等)；激素和激素抑制剂(例如，雌二醇、雌激素、酯化雌激素、雌氮芥、它莫西芬、托瑞米芬、瑞宁得、来曲唑、甲轻孕酮、醋酸甲地孕酮、戈舍瑞林、亮脑利特、辜丸酮、甲基辜丸丽等)；合成抑制剂(例如，氨鲁米特、酮康唑等)；免疫调节剂(例如，利妥昔单抗、曲妥珠单抗、左旋咪唑、卡介苗、干扰素、白介素2、阿地白介素等)以及其它试剂，比如卜天冬酰胺酶、培门冬酶、轻基服、甲酸四氢叶酸、米托坦、维A酸等。
组合物
本发明的异二聚体蛋白、组合物、药物和/或试剂盒可以用于胃肠外、外用、口腔、鼻(或者吸入)、直肠施用，或者通过例如气雾剂或跨膜的局部给药，对本文描述的一或多种病症进行预防和/或治疗性处置。根据给药方法，可以以多种单位剂量形式施用本发明的(药物)组合物。合适的单位剂量形式包括但不限于粉末、片剂、药丸、胶囊、锭剂、栓剂、贴片、鼻腔喷雾、注射剂、植入式缓释制剂、脂类复合体等。
本发明的异二聚体蛋白、组合物、药物和/或试剂盒任选地包含药物可接受的载体(赋形剂)。所述药物可接受的载体含有一种或多种生理可接受的化合物，所述化合物可以例如稳定药物组合物或者增加或减少活性成分(例如本发明的异二聚体蛋白)的吸收。生理可接受的化合物可以包括例如，碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或右旋糖)；抗氧化剂(例如抗坏血酸或谷胱甘肽)；螯合剂；低分子量蛋白；保护剂和摄取增强剂(例如脂类)；减少活性试剂的清除或水解的组合物；或者赋形剂或其他稳定剂和/或缓冲液。
其他生理可接受的化合物包括湿润剂、乳化剂、分散剂，或者对防止微生物的生长或作用特别有用的防腐剂。各种防腐剂是已知的，包括例如酚和抗坏血酸。本领域技术人员了解，药物可接受载体，包括生理可接受的化合物的选择取决于例如活性成分的给药途径和活性成分的具体生理化学特性。
赋形剂优选是无菌的，并且通常不含不需要的物质。这类组合物可以通过常规的已知灭菌技术来灭菌。
在治疗应用中，将本发明的组合物/药物以能够有效地防止和/或治愈或者至少部分防止或遏制疾病和/或其并发症的量给予患有例如癌症或者有患癌症风险(例如在手术切除原发肿瘤)的患者。足够实现这一效果的量被定义为“治疗有效剂量”。这类用途的有效量取决于疾病的严重程度和患者的整体健康情况。根据患者需要的并且能够耐受的剂量和频率，可以将组合物/药物单次或多次施用。无论如何，组合物/药物都应当提供足够量的本发明所述制剂中的活性成分(例如本发明的异二聚体蛋白)，以便有效治疗患者(缓解一种或多种症状)。
活性成分(例如本发明的异二聚体蛋白)的浓度可能有很大的不同，主要根据所选的具体给药方式和患者的需求，基于液体体积、粘性和体重等来选择。但是一般选择的浓度能够提供约0.1或lmg/kg/天到约50mg/kg/天，或者有时更高的剂量。典型的剂量在约3mg/kg/天到约3.5mg/kg/天的范围内，优选约3.5mg/kg/天到约7.2mg/kg/天，更优选约7.2mg/kg/天到约11.0mg/kg/天，最优选约11.0mg/kg/天到约15.0mg/kg/天的范围内。在某些优选实施方式中，剂量处于约10mg/kg/天到约50mg/kg/天的范围内。某些实施方式中，剂量为约20mg到约50mg，每天口服两次。应当理解，这些剂量是可以根据具体的情况进行合理调整的，从而优化具体个体的治疗方案。
本申请中引用的全部出版物、专利申请文件和专利文献均通过引用而以其整体并入本文。
实施例
以下实施例仅为了示例性地阐述本发明的技术方案，而不代表对其的限制。
实施例1、多肽的改造和制备
1.1西妥昔单抗的改造
获取西妥昔单抗(Erbi tux，也称为Cetuximab，Erb，其为抗表皮生长因子受体EGFR的一种抗体)的重链和轻链的全长氨基酸序列，利用DNAworks在线工具(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列，并通过常规的人工合成方法获得编码西妥昔单抗轻链的核酸分子(Erb-LC)。Erb-LC的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，而编码它的多核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。同时，利用分子生物学技术，在西妥昔单抗重链基因中编码Fc结构域的部分引入点突变(S354C,T366W)，并通过人工合成的方法获得编码经改造的西妥昔单抗重链的核酸分子(称为erb-knob)，将其编码的蛋白质命名为Erb-knob。Erb-knob的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，而编码它的多核苷酸序列如SEQ IDNO:14所示。
1.2抗Her-2抗体的改造
根据美国专利US7879325公开的内容，获得曲妥珠单抗的重链和轻链的全长氨基酸序列。然后，利用DNAworks在线工具(http://hel ixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列，并通过人工合成方法获得编码曲妥珠单抗轻链的核酸分子(T-LC)。T-LC的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，而编码它的多核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。在曲妥珠单抗的重链Fc结构域中引入点突变(S354C,T366W)，将所得到的经改造的曲妥珠单抗重链命名为T-knob。通过人工合成方法获得编码T-knob的核酸分子。T-knob的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，而编码它的多核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
1.3muIFNa4-Fc-hole的制备
首先，从美国国立生物技术信息中心(NCBI)获得小鼠干扰素α4(IFNa4)的基因信息(NM_010504.2)，并得到其全长编码序列。根据蛋白质数据库Uniprot上人免疫球蛋白γ1(IgG1)的恒定区氨基酸序列(P01857)，得到人IgG1-Fc的结构域氨基酸序列(即P01857中第104位残基至330位残基)。之后，利用分子生物学技术，在所述IgG1-Fc中引入点突变(Y349C,T366S,L368A,Y407V)，将得到的多肽称为Fc-hole。然后，在所获得的Fc-hole的N端添加为“GSGGG”的连接子序列(SEQ ID NO:27)从而获得Fc-hole-连接子，再利用DNAworks在线工具(http://hel ixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列。将小鼠IFNa4的DNA编码序列添加于编码所述Fc-hole-连接子的多核苷酸序列的5’端，得到编码muIFNa4-Fc-hole融合蛋白的多核苷酸序列，并通过人工合成的方式得到相应的DNA片段。muIFNa4-Fc-hole的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，而编码它的多核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
1.4huIFNa2-Fc-hole的制备
首先，从NCBI获得人干扰素α2(IFNa2)的基因信息(NM_000605.3)，并得到其全长编码序列。根据蛋白质数据库Uniprot上人免疫球蛋白γ1(IgG1)的恒定区氨基酸序列(P01857)，得到人IgG1-Fc的结构域氨基酸序列(即P01857中第104位残基至330位残基)。之后，利用分子生物学技术，在所述IgG1-Fc中引入点突变(Y349C,T366S,L368A,Y407V)，将得到的多肽称为Fc-hole。然后，在所获得的Fc-hole的N端添加为“GSGGG”的连接子序列从而获得Fc-hole-连接子，再利用DNAworks在线工具(http://hel ixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列。将人IFNa2的DNA编码序列添加于编码所述Fc-hole-连接子的多核苷酸序列的5’端，得到编码huIFNa2-Fc-hole融合蛋白的多核苷酸序列，并通过人工合成的方式得到相应的DNA片段。huIFNa2-Fc-hole的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，而编码它的多核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
1.5muIFNb-Fc-hole的制备
首先，从NCBI获得小鼠干扰素β(IFNβ)的基因信息(NM_005018.2)，并得到其全长编码序列。根据蛋白质数据库Uniprot上人免疫球蛋白γ1(IgG1)的恒定区氨基酸序列(P01857)，得到人IgG1-Fc的结构域氨基酸序列(即P01857中第104位残基至330位残基)。之后，利用分子生物学技术，在所述IgG1-Fc中引入点突变(Y349C,T366S,L368A,Y407V)，将得到的多肽称为Fc-hole。然后，在所获得的Fc-hole的N端添加为“GSGGG”的连接子序列从而获得Fc-hole-连接子，再利用DNAworks在线工具(http://hel ixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列。将小鼠IFNβ的DNA编码序列添加于编码所述Fc-hole-连接子的多核苷酸序列的5’端，得到编码muIFNb-Fc-hole融合蛋白的多核苷酸序列，并通过人工合成的方式得到相应的DNA片段。muIFNb-Fc-hole的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，而编码它的多核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示。
1.6huIFNb-Fc-hole的制备
首先，从NCBI获得人干扰素β(IFNβ)的基因信息(EF064725.1)，并得到其全长编码序列。根据蛋白质数据库Uniprot上人免疫球蛋白γ1(IgG1)的恒定区氨基酸序列(P01857)，得到人IgG1-Fc的结构域氨基酸序列(即P01857中第104位残基至330位残基)。之后，利用分子生物学技术，在所述IgG1-Fc中引入点突变(Y349C,T366S,L368A,Y407V)，将得到的多肽称为Fc-hole。然后，在所获得的Fc-hole的N端添加为“GSGGG”的连接子序列从而获得Fc-hole-连接子，再利用DNAworks在线工具(http://hel ixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列。将人IFNβ的DNA编码序列添加于编码所述Fc-hole-连接子的多核苷酸序列的5’端，得到编码huIFNb-Fc-hole融合蛋白的多核苷酸序列，并通过人工合成的方式得到相应的DNA片段。huIFNb-Fc-hole的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，而编码它的多核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
1.7huIFNL-Fc-hole的制备
首先，从NCBI获得人干扰素λ(IFNL)的基因信息(BC117482.1)，并得到其全长编码序列。根据蛋白质数据库Uniprot上人免疫球蛋白γ1(IgG1)的恒定区氨基酸序列(P01857)，得到人IgG1-Fc的结构域氨基酸序列(即P01857中第104位残基至330位残基)。之后，利用分子生物学技术，在所述IgG1-Fc中引入点突变(Y349C,T366S,L368A,Y407V)，将得到的多肽称为Fc-hole。然后，在所获得的Fc-hole的N端添加为“GSGGG”的连接子序列从而获得Fc-hole-连接子，再利用DNAworks在线工具(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列。将人IFNL的DNA编码序列添加于编码所述Fc-hole-连接子的多核苷酸序列的5’端，得到编码huIFNL-Fc-hole融合蛋白的多核苷酸序列，并通过人工合成的方式得到相应的DNA片段。huIFNL-Fc-hole的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，而编码它的多核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
1.8对照C端或N端融合蛋白的制备
获取西妥昔单抗的重链和轻链的全长氨基酸序列；再利用DNAworks在线工具(http://hel ixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列，并通过人工合成方法获得分别编码西妥昔单抗的轻链和重链的核酸分子。在所述重链的C端添加“SGGGGSGGGGSGGGGSGGGG”的连接子序列(SEQ ID NO:28)，得到西妥昔单抗重链-连接子。然后，利用DNAworks在线工具(http://hel ixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应小鼠IFNβ(NM_005018.2)的编码DNA序列。将小鼠IFNβ的DNA编码序列添加于所得到的西妥昔单抗重链-连接子编码序列的3’端，得到编码融合蛋白ErbHC-muIFNb的多核苷酸序列，并通过人工合成的方式得到其DNA片段。ErbHC-muIFNb的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，而编码它的多核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
类似地，获取西妥昔单抗的重链和轻链的全长氨基酸序列；再利用DNAworks在线工具(http://hel ixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列，并通过人工合成方法获得分别编码西妥昔单抗的轻链和重链的核酸分子。在所述重链的N端添加“GSGGG”的连接子序列，得到连接子-西妥昔单抗重链。然后，利用DNAworks在线工具(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应人IFNλ(BC117482.1)的编码DNA序列。将人IFNL的DNA编码序列添加于所得到的连接子-西妥昔单抗重链编码序列的5’端，得到编码N端融合蛋白IFNL-ErbHC的多核苷酸序列，并通过人工合成的方式得到其DNA片段。IFNL-ErbHC的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，而编码它的多核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。
获取西妥昔单抗的重链和轻链的全长氨基酸序列；再利用DNAworks在线工具(http://hel ixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列，并通过人工合成方法获得分别编码西妥昔单抗的轻链和重链的核酸分子。在所述重链的C端添加“SGGGGSGGGGSGGGGSGGGG”的连接子序列，得到西妥昔单抗重链-连接子。然后，利用DNAworks在线工具(http://hel ixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应人IFNβ(EF064725.1)的编码DNA序列。将人IFNβ的DNA编码序列添加于所得到的西妥昔单抗重链-连接子编码序列的3’端，得到编码C端融合蛋白ErbHC-huIFNb的多核苷酸序列，并通过人工合成的方式得到其DNA片段。ErbHC-huIFNb的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，而编码它的多核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
获取西妥昔单抗的重链和轻链的全长氨基酸序列；再利用DNAworks在线工具(http://hel ixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列，并通过人工合成方法获得分别编码西妥昔单抗的轻链和重链的核酸分子。在所述重链的N端添加“GSGGG”的连接子序列，得到连接子-西妥昔单抗重链。然后，利用DNAworks在线工具(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应人IFNβ(EF064725.1)的编码DNA序列。将人IFNβ的DNA编码序列添加于所得到的连接子-西妥昔单抗重链编码序列的5’端，得到编码N端融合蛋白huIFNb-ErbHC的多核苷酸序列，并通过人工合成的方式得到其DNA片段。huIFNb-ErbHC的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，而编码它的多核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。
实施例2、重组载体的构建
将根据实施例1获得的，编码huIFNb-ErbHC、ErbHC-huIFNb、IFNL-ErbHC、ErbHC-muIFNb、T-knob、曲妥珠单抗轻链(标记为T-LC)、Erb-knob、西妥昔单抗轻链(标记为Erb-LC)、muIFNa4-Fc-hole、huIFNa2-Fc-hole、muIFNb-Fc-hole、huIFNb-Fc-hole以及huIFNL-Fc-hole的核酸分子，分别经Takara公司的HindI I I与EcoRI双酶切而亚克隆到商业化载体pcDNA4/myc-HisA(Invi trogen，V863-20)中，测序验证构建质粒的准确性，获得重组质粒DNA，分别命名为：pcDNA4-huIFNb-ErbHC、pcDNA4-ErbHC-huIFNb、pcDNA4-huIFNL-ErbHC、pcDNA4-ErbHC-muIFNb、pcDNA4-T-knob、pcDNA4-TLC、pcDNA4-Erb-knob，pcDNA4-ErbLC，pcDNA4-muIFNa4-Fc-hole，pcDNA4-huIFNa2-Fc-hole，pcDNA4-muIFNb-Fc-hole，pcDNA4-huIFNb-Fc-hole以及pcDNA4-huIFNL-Fc-hole。
实施例3、异二聚体蛋白的瞬时表达及纯化
转染之前两天，准备7X 600mL经悬浮驯化的HEK293(ATCC，CRL-1573TM)细胞用于瞬时转染，接种密度为0.8×106细胞/mL。两天后取三份细胞悬液，离心后分别重悬于600mLFrees tyle293培养基中。
将实施例2中所述的重组表达载体分为以下7组：
组1为：pcDNA4-Erb-knob(200μg)+pcDNA4-ErbLC(200μg)+pcDNA4-muIFNa4-Fc-hole(200μg)；
组2为：pcDNA4-Erb-knob(200μg)+pcDNA4-ErbCL(200μg)+pcDNA4-huIFNa2-Fc-hole(200μg)；
组3为：pcDNA4-Erb-knob(200μg)+pcDNA4-ErbLC(200μg)+pcDNA4-muIFNb-Fc-hole(200μg)；
组4为：pcDNA4-Erb-knob(200μg)+pcDNA4-ErbLC(200μg)+pcDNA4-huIFNb-Fc-hole(200μg)；
组5为：pcDNA4-Erb-knob(200μg)+pcDNA4-ErbLC(200μg)+pcDNA4-huIFNL-Fc-hole(200μg)；
组6为：pcDNA4-T-knob(200μg)+pcDNA4-TLC(200μg)+pcDNA4-huIFNa2-Fc-hole(200μg)；
组7为：pcDNA4-T-knob(200μg)+pcDNA4-TCL(200μg)+pcDNA4-huIFNb-Fc-hole(200μg)。
将每组质粒混合物均用6mL Frees tyle293培养基稀释并加入转化所需的PEI(聚乙烯亚胺)溶液。将每组质粒/PEI混合物分别加入600mL细胞悬液中，放置在37℃，10％CO2，90rpm中培养；同时补加50μg/L IGF-1(insul ine-like growth factor I)。四小时后再补加600mL EX293培养基，2mM谷氨酰胺和50μg/L IGF-1，135rpm培养。二十四小时后加3.8mMVPA。培养5～6天后，收集5X 1200mL的细胞培养上清液，通过ProteinA亲和层析法，初步纯化得到各异二聚体蛋白样品。将得到的蛋白样品利用SDS-PAGE进行初步检测，可以清晰地看到目的条带(数据未显示)。据此，由上述7组瞬时转化样品得到的异二聚体蛋白从组1至组7依次为：Erb-muIFNa4，Erb-huIFNa2，Erb-muIFNb，Erb-huIFNb，Erb-huIFNL，Tmab-huIFNa2和Tmab-huIFNb。
实施例4、本发明的异二聚体具有高表达量
实施例4.1异二聚体Erb-muIFNb与C端融合蛋白ErbHC-muIFNb的同批次同地点表达
在转染之前两天，准备2X 100mL经悬浮驯化的HEK293(ATCC，CRL-1573TM)细胞用于瞬时转染，接种密度为0.8×106细胞/mL。两天后取细胞悬液，离心后分别重悬于100mLFrees tyle293培养基中。将表达载体分为异二聚体组和C端融合蛋白组。其中，异二聚体组包括：pcDNA4-Erb-knob(33μg)+pcDNA4-ErbLC(33μg)+pcDNA4-muIFNa4-Fc-hole(33μg)；C端融合蛋白组包括：pcDNA4-Erb-LC(50μg)+pcDNA4-ErbHC-muIFNb(50μg)。将每组质粒混合物均用1mL Frees tyle293培养基稀释并加入转化所需PEI(聚乙烯亚胺)溶液。将每组质粒/PEI混合物分别加入100mL细胞悬液中，放置在37℃，10％CO2，90rpm中培养；同时补加50μg/L IGF-1。四小时后再补加100mL EX293培养基，2mM谷氨酰胺和50μg/L IGF-1，135rpm培养。二十四小时后加入3.8mM VPA。培养5～6天后，收集瞬时表达的培养上清液，通过ELISA(酶联免疫吸附测定)分别检测异二聚体和C端融合蛋白的表达量。
结果显示，所述Erb-muIFNb异二聚体的表达量为83mg/L，而C端融合蛋白ErbHC-muIFNb的表达量为3mg/L，结果如图1所示。
类似地，检测了本发明的其它异二聚体的表达量，结果显示，Erb-muIFNa4的表达量为50mg/L。Erb-huIFNb的表达量为15.8mg/L，而其相应的对照C端或N端融合蛋白ErbHC-huIFNb和huIFNb-ErbHC均不表达。此外，本发明的异二聚体Erb-huIFNL的表达量为70mg/L，而其相应的对照N端融合蛋白IFNL-ErbHC的表达量仅为42mg/L。另外，本发明的异二聚体Tmab-huIFNa2和Tmab-huIFNb的表达量均为50mg/L。
实施例5、本发明的异二聚体具有良好的稳定性
实施例5.1Erb-huIFNb异二聚体的PK药代动力学
使用Balb/C、雌性、8周龄小鼠，共使用12只小鼠，平均分为A/B/C三组，每组四只。向所有小鼠静脉注射Erb-huIFNb异二聚体蛋白50μg(2.5mg/kg)，给药后分13个时间点分别取血100μl，每个时间点取一组小鼠，三组轮换。分离血清，然后用ELISA方法检测血清中的药物浓度。ELISA检测系统如下：小鼠抗-hIgG包板(Jackson Immuno Research:209-005-082)，加入适当稀释度的血清样品，然后加入小鼠抗-hIFNb-生物素(eBioscience:BMS1044BT),最后加入链霉亲和素-HRP(Sigma：S2438)用TMB显色。将Erb-huIFNb作为标准蛋白做标准曲线。利用WinNol in软件计算药代动力学参数。所得到的的平均C-T曲线如图2所示。经计算，本发明的异二聚体Erb-huIFNb的半衰期为27.468小时，而本领域中已知的Erb与huIFNβ的C端融和蛋白在相同实验条件的半衰期仅为8小时。
实施例5.2Erb-huIFNL异二聚体的PK药代动力学
使用Balb/C、雌性、8周龄小鼠，取12只小鼠，平均分为A/B/C三组，每组四只。向所有的小鼠静脉注射Erb-huIFNL异二聚体蛋白200μg(10mg/kg)，给药后分13个时间点分别取血100μl，每个时间点取一组小鼠，三组轮换。分离血清。用ELISA方法检测血清中受试蛋白的浓度。ELISA采用两个系统分别检测Fc片段和huIFNL水平。Fc检测系统如下：抗-hIgG-Fc片段抗体(Bethyl:A80-104A)包板，加入适当稀释度的血清样品，然后加入抗-人IgG FcHRP(Bethyl:A80-104P),用TMB显色。对于huIFNL的ELISA测定采用huIFNL ELISA试剂盒(eBioscience:88-7296)。使用Erb-huIFNL异二聚体为标准蛋白做标准曲线。利用WinNolin软件计算药代动力学参数。平均C-T曲线如图3所示，经检测，本发明的异二聚体Erb-huIFNL相当稳定，其体内半衰期平均为57.308小时。
实施例5.3本发明的其它异二聚体的PK药代动力学
类似地，检测了本发明的其它异二聚体的体内半衰期，结果显示，Erb-muIFNb异二聚体的体内半衰期为34.5小时，远远高于其相应的C端融合蛋白的体内半衰期(数据未显示)。
实施例6、异二聚体能够结合抗原
利用稳定表达人EGFR抗原的小鼠黑色素瘤细胞系检测所获得的异二聚体中Erb部分对EGFR的结合能力。采用流式细胞术，向细胞中先后加入梯度稀释的本发明的各Erb-干扰素异二聚体蛋白(或加入对照Erb抗体(Merck Erbi tux))和抗人IgG Fc特异性PE(eBioscience:12-4998-82)二抗。进行流式细胞术分析，其中用蛋白浓度和PE通道的平均荧光强度做剂量关系曲线。本发明的各Erb-干扰素异二聚体蛋白都可以和EGFR结合，同对照抗体Erbi tux没有显著差别(参见图4)。
实施例7、对异二聚体干扰素活性的分析
利用干扰素可以增强细胞抗病毒能力的特性，采用带EGFP标记的单纯疱疹病毒VSV感染小鼠成纤维细胞系L929或人肝癌细胞系HepG2，分别检测muIFNb和huIFNL的活性。简要地，将细胞先在梯度稀释抗体-干扰素异二聚体的存在下培养8小时，然后加入适量VSV-EGFP病毒感染细胞，24小时后，通过流式细胞术检测被病毒感染的细胞的比例，并计算药物对细胞感染病毒的保护率。利用保护率和蛋白浓度做量效关系曲线，求得EC50。由图5可知，本发明的异二聚体能够保护细胞免受病毒感染。
实施例8、异二聚体在体内的抗肿瘤活性
利用B16-EGFR小鼠模型评价药效。使用C57BL/6小鼠，雌性，8周龄，对其皮下接种7x105B16-EGFR-SIY细胞。14天肿瘤体积在70立方毫米左右，通过肿瘤原位注射给予Erb-muIFNb异二聚体或Erb-muIFNβC端融合蛋白；Erb-huIFNL异二聚体或N端融合蛋白；25μg每次，两天一次，共三次。每三天测量肿瘤一次，计算肿瘤体积并做肿瘤生长曲线。结果如图6所示，可见，本发明的抗体-干扰素异二聚体具有较好的抗肿瘤效果，不逊于作为对照的融合蛋白。
此外，在人体中，EGFR不仅在肿瘤高表达，在正常组织也保持低水平本底表达。为了建立更接近人体状况的动物模型，还利用了EGFR转基因小鼠接种B16-EGFR肿瘤模型评价药效。EGFR转基因C57BL/6小鼠，雌性，8周龄皮下接种7x105B16-EGFR-SIY细胞。14天肿瘤体积在70立方毫米左右，通过静脉注射给予Erb-muIFNa4异二聚体或对照Erbi tux抗体；200μg每次，3天一次，共2次。每三天测量肿瘤一次，计算肿瘤体积并做肿瘤生长曲线。结果如图7所示，能够看到，本发明的抗体-干扰素异二聚体具有较好的抗肿瘤效果。此外，由于在本实施例中，采用腹腔注射的方式进行全身给药而不是仅在肿瘤生长部位给药，这表明包含IFNα的异二聚体具有很好的肿瘤靶向作用。
实施例9、异二聚体在体外的抗肿瘤活性
利用低水平表达Her2抗原的肿瘤细胞系MCF7来评价Tmab-huIFNa2异二聚体的体外抗肿瘤活性。简要地，将细胞在梯度稀释的抗体(曲妥珠单抗)、干扰素(IFNα)或本发明的异二聚体(Tmab-huIFNa2)的存在下培养72小时，通过CCK8方法检测细胞增殖，计算增殖抑制率并相对于蛋白浓度制作量效关系曲线。通过7AAD染色，流式细胞术检测细胞凋亡。由图8的结果可知，单独的曲妥珠单抗对于肿瘤细胞的增殖没有抑制作用，而本发明的异二聚体蛋白显著地抑制了MCF7细胞的增殖并具有很好的量效关系，其效果与干扰素相当。凋亡检测结果在各组间无显著差异(数据未显示)，表明本发明的异二聚体可以显著抑制肿瘤细胞增殖，且对细胞凋亡没有影响，也即本发明的异二聚体蛋白能够很好地发挥干扰素的作用，而且抑制肿瘤细胞增殖的效果显著强于曲妥珠单抗。
类似地，利用表达EGFR的肿瘤细胞系A431来评价Erb-huIFNb异二聚体的体外抗肿瘤活性。简要地，将细胞在梯度稀释的抗体(西妥昔单抗)或本发明的异二聚体(Erb-huIFNb)的存在下培养72小时，通过MTT方法检测细胞增殖，计算增殖抑制率并相对于蛋白浓度制作量效关系曲线。可以清楚地观察到，本发明的异二聚体抑制肿瘤细胞增殖的能力显著强于西妥昔单抗，并且呈现出很好的剂量依赖性。

Claims (26)

1.异二聚体蛋白，其包含第一多肽和不同于所述第一多肽的第二多肽，其中：
所述第一多肽包含靶向部分，所述靶向部分是结合肿瘤相关抗原的抗体部分，
所述第二多肽包含免疫球蛋白的Fc区和干扰素，其中包含于所述第二多肽中的免疫球蛋白Fc区包含选自免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定区氨基酸序列，且包含于所述第二多肽中的免疫球蛋白Fc区与所述靶向部分中抗体部分的Fc区源自具有相同亚型的免疫球蛋白；且
所述结合肿瘤相关抗原的抗体部分是西妥昔单抗部分或曲妥珠单抗部分，
所述西妥昔单抗部分包含重链和轻链，其中轻链的可变区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，CDR-L1的序列如SEQ ID NO:39所示，CDR-L2的序列如SEQ ID NO:40所示，且CDR-L3的序列如SEQ ID NO:41所示；其中重链的可变区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，CDR-H1的序列如SEQ ID NO:42所示，CDR-H2的序列如SEQ ID NO:43所示，且CDR-H3的序列如SEQ ID NO:44所示；且
所述曲妥珠单抗部分包含重链和轻链，其中轻链的可变区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，CDR-L1的序列如SEQ ID NO:31所示，CDR-L2的序列如SEQ ID NO:32所示，且CDR-L3的序列如SEQ ID NO:33所示；其中重链的可变区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，CDR-H1的序列如SEQ ID NO:34所示，CDR-H2的序列如SEQ ID NO:35所示，且CDR-H3的序列如SEQ ID NO:36所示。
2.根据权利要求1所述的异二聚体蛋白，其中所述免疫球蛋白的Fc区和所述干扰素是化学偶联的。
3.根据权利要求2所述的异二聚体蛋白，其中所述免疫球蛋白的Fc区和所述干扰素通过连接子相连。
4.根据权利要求3所述的异二聚体蛋白，其中所述连接子的序列如SEQ ID NO:27所示。
5.根据权利要求1所述的异二聚体蛋白，其中所述干扰素选自I型干扰素、II型干扰素和/或III型干扰素。
6.根据权利要求5所述的异二聚体蛋白，其中所述干扰素选自干扰素α，干扰素β和/或干扰素λ。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述西妥昔单抗部分包含重链和轻链，其中轻链的可变区序列如SEQ ID NO:37所示，且重链的可变区序列如SEQ IDNO:38所示。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述曲妥珠单抗部分包含重链和轻链，其中轻链的可变区序列如SEQ ID NO:29所示，且重链的可变区序列如SEQ IDNO:30所示。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述抗体部分在对应于西妥昔单抗或曲妥珠单抗重链的第354位和/或第366位的位置包含点突变S354C和/或T366W。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述抗体部分的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，且其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
11.根据权利要求1-6中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述抗体部分的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，且其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
12.根据权利要求1-6中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第二多肽中免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列如SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ IDNO:48所示。
13.根据权利要求1-6中任一项所述的异二聚体蛋白，其中包含于所述第二多肽中的免疫球蛋白Fc区包含IgG1的恒定区氨基酸序列。
14.根据权利要求13所述的异二聚体蛋白，其中所述IgG1为人IgG1。
15.根据权利要求14所述的异二聚体蛋白，其中所述人IgG1的恒定区氨基酸序列如SEQID NO:45所示。
16.根据权利要求14-15中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区在相应于人IgG1的第349、366、368和/或407位的位置包含点突变Y349C,T366S,L368A和/或Y407V。
17.根据权利要求1-6中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第二多肽包含如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。
18.分离的核酸分子，其编码权利要求1-17中任一项所述的异二聚体蛋白。
19.组合物，其包含权利要求1-17中任一项所述的异二聚体蛋白或权利要求18所述的核酸分子，以及任选地药学上可接受的赋形剂。
20.根据权利要求1-17中任一项所述的异二聚体蛋白、权利要求18所述的核酸分子或权利要求19所述的组合物用于制备药物和/或试剂盒的用途，所述药物和/或试剂盒用于抑制癌细胞的生长和/或增殖。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述癌细胞是转移性癌细胞。
22.根据权利要求20或21所述的用途，其中所述癌细胞是实体肿瘤中的癌细胞。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述实体肿瘤为乳腺癌、肝癌或黑色素瘤。
24.根据权利要求20或21所述的用途，其中所述癌细胞是受试者体内的癌细胞。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述受试者为人或非人哺乳动物。
26.细胞，其包含权利要求1-17中任一项所述的异二聚体蛋白或者权利要求18所述的核酸分子。
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US16/547,158 US11357826B2 (en) 2014-11-24 2019-08-21 IL-10 EGFR antibody fusion protein and uses thereof

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Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104403004B (zh) 2014-11-24 2017-10-13 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗体‑干扰素异二聚体的制备和用途
US20160175458A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Alkermes, Inc. Single chain fc fusion proteins
KR20180089510A (ko) * 2015-12-18 2018-08-08 노파르티스 아게 CD32b를 표적화하는 항체 및 그의 사용 방법
CN109071627B (zh) * 2016-02-05 2023-04-04 奥里尼斯生物科学私人有限公司 Cd8结合剂
EP3474884A4 (en) 2016-06-22 2020-08-19 Alkermes, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING THE IMMUNOSTIMULANT AND ANTI-INFLAMMATORY PROPERTIES OF IL-10
CA3047708A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Kahr Medical Ltd. A sirpalpha-41bbl fusion protein and methods of use thereof
WO2018156180A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
CN108948195B (zh) * 2017-05-23 2022-05-31 胡毅 一种抗egfr/pd-l1双靶向抗体、其制备方法及用途
JP7282383B2 (ja) * 2017-06-14 2023-05-29 ディンフー バイオターゲット カンパニー リミテッド タンパク質性ヘテロ二量体及びその用途
JP7079171B2 (ja) 2017-08-03 2022-06-01 アムジエン・インコーポレーテツド インターロイキン－２１ムテイン及び治療方法
JP7356726B2 (ja) * 2017-09-25 2023-10-05 ディンフー バイオターゲット カンパニー リミテッド タンパク性ヘテロ二量体及びその使用
CN111132998B (zh) * 2017-09-25 2024-01-30 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 用于癌症治疗的方法和组合物
KR20200036945A (ko) * 2017-09-29 2020-04-07 난트셀, 인크. 항원성 단백질 및 이를 위한 방법(antigenic proteins and methods therefor)
US11548931B2 (en) 2017-11-16 2023-01-10 Xl-Protein Gmbh PASylated VEGFR/PDGFR fusion proteins and their use in therapy
JOP20200172A1 (ar) 2018-01-12 2020-07-12 Amgen Inc الأجسام المضادة لـ pd-1 وطرق العلاج
CN113166220A (zh) * 2018-03-09 2021-07-23 奥美药业有限公司 创新细胞因子前药
CN108727504B (zh) * 2018-04-16 2021-08-27 泉州向日葵生物科技有限公司 一种ifn与抗pd-l1抗体的融合蛋白及其应用
US20210253639A1 (en) * 2018-05-16 2021-08-19 Regents Of The University Of Michigan Heterodimeric peptide reagents and methods
CN108715833B (zh) * 2018-06-01 2021-09-14 天晴干细胞股份有限公司 一种负载血小板裂解液的微球制备方法
KR20210025054A (ko) * 2018-06-21 2021-03-08 샤턱 랩스 인코포레이티드 이형이량체 단백질 및 이의 용도
EA202191656A1 (ru) 2018-12-21 2021-10-26 23Эндми, Инк. Анти-il-36 антитела и способы их применения
KR20210139312A (ko) * 2019-03-06 2021-11-22 데카 바이오사이언시즈, 인크. Il-10 변이체 분자, 및 염증 질환 및 종양학의 치료 방법
US20220227827A1 (en) * 2019-03-25 2022-07-21 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Proteinaceous heterodimer and use thereof
US11512122B2 (en) 2019-05-17 2022-11-29 Xencor, Inc. IL-7-FC-fusion proteins
KR20220020879A (ko) 2019-06-12 2022-02-21 에스크진 파마, 아이엔씨. 새로운 il-15 프로드럭 및 이를 사용하는 방법
WO2020259536A1 (zh) * 2019-06-24 2020-12-30 南京金斯瑞生物科技有限公司 单克隆抗体-细胞因子融合蛋白二聚体及其应用
KR20220044284A (ko) * 2019-07-11 2022-04-07 카 메디컬 리미티드 이종이량체 및 이의 사용방법
CN110256583B (zh) * 2019-07-11 2022-05-20 中国科学院生物物理研究所 一种il-2突变体与抗体的融合蛋白及其应用
WO2021013269A1 (en) * 2019-07-25 2021-01-28 I-Mab Biopharma Co., Ltd. Bifunctional molecules with il-7 activity
CN113429476A (zh) * 2020-03-23 2021-09-24 泰州迈博太科药业有限公司 一种结合冠状病毒的双功能融合蛋白、其制备方法及应用
JP2023515247A (ja) * 2020-03-31 2023-04-12 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 新規な免疫活性インターロイキン２アナログ
WO2021231447A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel il10 agonists and methods of use thereof
WO2022000136A1 (en) * 2020-06-28 2022-01-06 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Methods and compositions for cancer treatment
JP2023531291A (ja) * 2020-07-01 2023-07-21 中国科学院生物物理研究所 融合タンパク質ワクチンプラットフォームの構築と応用
CN114316064A (zh) * 2020-10-10 2022-04-12 广东菲鹏制药股份有限公司 融合蛋白及其应用
WO2023060165A2 (en) * 2021-10-06 2023-04-13 Elixiron Immunotherapeutics (hong Kong) Limited Interleukin-10 muteins and fusion proteins thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1206350A (zh) * 1995-12-28 1999-01-27 泰诺克斯生物系统公司 具有经非免疫原性肽连接在一起的干扰素α和免疫球蛋白Fc的杂合体

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE251181T1 (de) 1998-07-28 2003-10-15 Micromet Ag Heterominikörper
ATE316982T1 (de) 1999-08-09 2006-02-15 Lexigen Pharm Corp Mehrere zytokin-antikörper komplexen
US20020193569A1 (en) * 2001-06-04 2002-12-19 Idec Pharmaceuticals Corporation Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
GB0209893D0 (en) 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
US20030232387A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibodies that bind alphaE integrin
EP1899368A2 (en) * 2005-05-26 2008-03-19 Schering Corporation Interferon-igg fusion
EA200802289A1 (ru) * 2006-05-08 2009-04-28 Филоджен Спа Направляемые к мишени антителами цитокины для терапии
WO2008143954A2 (en) * 2007-05-14 2008-11-27 Biogen Idec Ma Inc. Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
JP5591701B2 (ja) 2007-09-21 2014-09-17 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 強力なアポトーシス活性および抗腫瘍活性を示すターゲティング化インターフェロン
MX2011011044A (es) 2009-04-22 2011-11-04 Merck Patent Gmbh Proteinas de fusion de anticuerpos con sitios de enlace de receptor fc neonatal (fcrn) modificados.
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
JP2014534806A (ja) * 2011-08-23 2014-12-25 ロシュ グリクアート アーゲー 抗ｍｃｓｐ抗体
ES2683844T3 (es) * 2011-11-08 2018-09-28 Umc Utrecht Holding B.V. Proteína de fusión que comprende una interleucina 4 e interleucina 10
KR102041412B1 (ko) * 2011-12-30 2019-11-11 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 Ｆｃ 단편 유도체
WO2014028560A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
NZ711445A (en) 2013-03-12 2018-06-29 Biocon Ltd Fusion immunomodulatory proteins and methods for making same
CN104403004B (zh) 2014-11-24 2017-10-13 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗体‑干扰素异二聚体的制备和用途
KR101928981B1 (ko) * 2016-09-02 2018-12-13 고려대학교 산학협력단 항체 중쇄불변부위 이종이중체 (heterodimeric Fc)에 융합된 IL-21 (heterodimeric Fc-fused IL-21) 및 이를 포함하는 약제학적 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1206350A (zh) * 1995-12-28 1999-01-27 泰诺克斯生物系统公司 具有经非免疫原性肽连接在一起的干扰素α和免疫球蛋白Fc的杂合体

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EP3227342B1 (en) 2019-09-18

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