CN108715833B - 一种负载血小板裂解液的微球制备方法 - Google Patents

Abstract

一种负载血小板裂解液的微球制备方法，本发明涉及一种负载血小板裂解液的微球制备方法，本发明的目的是为了解决现有细胞培养中血小板裂解液消耗大或微载体吸附效果差的问题，本发明包括血小板裂解液的制备、微球组分的配制、负载血小板因子和微囊的微球的制备。本发明制备的微球承载成骨细胞能力非常强，在成骨细胞：微球＝500:1的情况下，绝大部分细胞贴服在微球上，只有极个别细胞散落在培养液中。间充质干细胞在微球上生长状况好，细胞活率均超过95％，倍增时间短，纯度上阳性表达率均超过95％，本发明应用于生物技术领域。

Description

一种负载血小板裂解液的微球制备方法

技术领域

本发明涉及一种负载血小板裂解液的微球制备方法。

背景技术

血小板在很长时间内被看作是血液中的无功能的细胞碎片，直到1882年意大利医师Bizzozero发现它们在血管损伤后的止血过程中起着重要作用，才首次提出血小板的命名也从此开启了探究血小板凝血、止血、维护毛细血管壁完整性历程。现在人们已经认识到，血小板具有重要的功能。

血小板从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质，体积小，直径为2-3微米，无细胞核。血小板具有特定的形态结构和生化组成，在正常血液中有较恒定的数量(如人的血小板数为每立方毫米10～30万)。血小板在生理状态的血小板成静息状态，其胞内溶酶体、致密颗粒和α颗粒含有大量凝血因子、细胞因子、趋化因子、粘附因子、免疫蛋白、呈现一种平衡状态。当血管受损害或破裂时，血小板受刺激，由静止相变为机能相，迅即发生变形，表面粘度增大，凝聚成团；同时在表面第Ⅲ因子的作用下，使血浆内的凝血酶原变为凝血酶，从而实现病理状态的血小板激活。大量的细胞因子，包括血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子β(TGF-β)，类胰岛素生长因子(IGF)，表皮生长因子(EGF)，血管内皮生长因子(VEGF)等150多种因子和胞外微囊，在激活的过程中从血小板α颗粒中释放出来，起到刺激细胞扩增、伤口愈合、炎症反应、血栓形成、免疫调节等作用。近20年来血小板的作用已被应用于多学科临床实践，包括颌面外科，骨科，心胸外科、神经外科，妇产科、眼科、普外整形美容科等等。

血小板激活以及血小板内的细胞因子、胞外微囊释放，可以通过采用胶原，凝血酶，氯化钙，机械损伤，体外裂解等多种形式。在体外细胞培养过程中，很多的研究发现，采用反复冻融裂解方式获得的血小板裂解液由于其含有大量促进生长的细胞因子，因此可以作为血清替代物，在干细胞、成纤维细胞、免疫细胞培养中起到良好的促进细胞增殖的作用，减少对异种血清对人临床细胞培养的依赖。血小板裂解液也在骨科、皮肤等损伤修复中起到重要作用。

血小板内的细胞因子、胞外微囊可以通过采用胶原，凝血酶，氯化钙，机械损伤，体外裂解等多种形式从血小板中释放出来，而且释放效率和数量因方法不同而结果不同，在未来的应用效果也不尽相同，由于胞外微囊由于其载药能力、富含生长因子在临床应用前景越来越受到科学界的重视。血小板分泌的胞外微囊(EV)直径在30-500nm范围，其中30-140nm大小的也称为外泌体(exosomes)，体积150nm以上的也被成为血小板微粒(MPs)，均有组织再生修复功能。目前常用在临床的方法为采用凝血酶和钙离子进行激活，而这种方法对血小板分泌物，特别是有再生修复能力的微囊的释放量有限，并未发挥出血小板的再生修复功能的最佳状态。

目前的血小板裂解液都是以液体形式添加到培养瓶中进行细胞培养，或者将微载体浸泡在血小板裂解液中吸附裂解液因子后，前者血小板裂解液占培养液体积比例的5-15％，消耗量大；后者因为简单的吸附包被，当微球悬浮在液体培养基后血小板因子仍然会扩散到培养基中，降低了血小板因子的局部浓度，减少了细胞的贴壁和扩增。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有细胞培养中血小板裂解液消耗大或微载体吸附效果差的问题，提供了一种负载血小板裂解液的微球制备方法。

本发明一种负载血小板裂解液的微球制备方法，按以下步骤进行：

一、向富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液中加入基底膜蛋白聚糖溶液，边加边搅拌均匀，得到组合物A；其中富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液和基底膜蛋白聚糖溶液的体积比为(3.7-5.5):(0.8-2.4)；

二、室温下，将海藻酸钠溶液加入到组合物A中，充分混匀，形成组合物B；其中海藻酸钠溶液和富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液的体积比为(3.0-5.0):(3.7-5.5)；

三、将组合物B加入到装有多孔喷嘴的喷枪中，以氮气为动力、1～30m/s的速度，喷入以90rpm磁搅拌中的4℃的3-10％CaCl₂水溶液中，形成粒径90-110μm的微球；

四、将微球进行漂洗，离心，形成负载血小板裂解液的微球。

本发明的有益效果：

本发明通过微球的制备过程，可将血小板因子以及微囊有效固定在微球中间，在细胞培养过程中，(一)不仅可有效促进贴壁细胞的附着，而且因为局部高浓度的因子和微囊与细胞近距离接触，增加了扩增信号的向细胞内的传导，实现了贴服细胞在微球上的有效增殖。(二)这种方式克服了向液体培养基中添加促进扩增物质这种以整体高浓度来达到细胞局部微环境有足够营养的弊端，有效地利用了营养，降低了成本；(三)因为微球这种立体培养方式增加了单位培养体系的比表面积，实现了规模化贴壁细胞高效扩增；(四)同时微球可以作为移植物直接在临床进行移植，由于微球的生物相容性好，其携带的细胞因子和微囊可以对机体的损伤起到修复作用，因而成为极有临床前景的生物材料。(五)本发明利用了基底膜蛋白聚糖侧链上的HSPG的硫酸化的基团对bFGF、VEGF、TGF-β、PDGF等细胞因子的亲和吸附能力，将血小板裂解液中的多种细胞因子和微囊固定在微球上。此方法没有采用戊二醛等交联剂，没有化学物质的引入和复杂的洗涤去除化学物质残留过程，既成本节约又实现了未来应用的安全性。

(六)本发明微球承载成骨细胞能力非常强，在成骨细胞：微球＝500:1的情况下，绝大部分细胞贴服在微球上，只有极个别细胞散落在培养液中。间充质干细胞在微球上生长状况好，细胞活率均超过95％，倍增时间短，纯度上阳性表达率(CD90、CD105、CD73)均超过95％，阴性表达率(CD45、CD34)均低于<2％，符合国际ISCT对间充质干细胞的纯度要求。

附图说明

图1为实施例一微球内部空隙；

图2为滴入法制备的微球；

图3为实施例一制备的负载血小板裂解液的微球；

图4为实施例一制备的负载血小板裂解液的微球和滴入法制备的微球的粒径分布；其中a为实施例一制备的负载血小板裂解液的微球、b为滴入法制备的微球；

图5为实施例一中细胞因子和微囊在微球上的固定效率；

图6为实施例一中微球对成骨细胞的贴附作用；

图7为实施例一中间充质干细胞在微球上的扩增。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式一种负载血小板裂解液的微球制备方法，按以下步骤进行：

一、向富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液中加入基底膜蛋白聚糖溶液，边加边搅拌均匀，得到组合物A；其中富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液和基底膜蛋白聚糖溶液的体积比为(3.7-5.5):(0.8-2.4)；

二、室温下，将海藻酸钠溶液加入到组合物A中，充分混匀，形成组合物B；其中海藻酸钠溶液和富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液的体积比为(3.0-5.0):(3.7-5.5)；

三、将组合物B加入到装有多孔喷嘴的喷枪中，以氮气为动力、1～30m/s的速度，喷入以90rpm磁搅拌中的4℃的3-10％CaCl₂水溶液中，形成粒径90-110μm的微球；

四、将微球进行漂洗，离心，形成负载血小板裂解液的微球。

本实施方式的有益效果：

本实施方式通过微球的制备过程，可将血小板因子以及微囊有效固定在微球中间，在细胞培养过程中，(一)不仅可有效促进贴壁细胞的附着，而且因为局部高浓度的因子和微囊与细胞近距离接触，增加了扩增信号的向细胞内的传导，实现了贴服细胞在微球上的有效增殖。(二)这种方式克服了向液体培养基中添加促进扩增物质这种以整体高浓度来达到细胞局部微环境有足够营养的弊端，有效地利用了营养，降低了成本；(三)因为微球这种立体培养方式增加了单位培养体系的比表面积，实现了规模化贴壁细胞高效扩增；(四)同时微球可以作为移植物直接在临床进行移植，由于微球的生物相容性好，其携带的细胞因子和微囊可以对机体的损伤起到修复作用，因而成为极有临床前景的生物材料。(五)本发明利用了基底膜蛋白聚糖侧链上的HSPG的硫酸化的基团对bFGF、VEGF、TGF-β、PDGF等细胞因子的亲和吸附能力，将血小板裂解液中的多种细胞因子和微囊固定在微球上。此方法没有采用戊二醛等交联剂，没有化学物质的引入和复杂的洗涤去除化学物质残留过程，既成本节约又实现了未来应用的安全性。

(六)本发明微球承载成骨细胞能力非常强，在成骨细胞：微球＝500:1的情况下，绝大部分细胞贴服在微球上，只有极个别细胞散落在培养液中。间充质干细胞在微球上生长状况好，细胞活率均超过95％，倍增时间短，纯度上阳性表达率(CD90、CD105、CD73)均超过95％，阴性表达率(CD45、CD34)均低于<2％，符合国际ISCT对间充质干细胞的纯度要求。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液的制备方法为：

一、用聚焦式体外冲击波仪以频率15Hz，能流密度0.15～0.20mJ/mm²，冲击富含血小板血浆或富含血小板生理盐水200-500次后，在37℃的CO₂培养箱中孵育10-15分钟；再以频率15Hz，能流密度0.20～0.25mJ/mm²，冲击700-1000次，在37℃的CO₂培养箱中孵育20-30分钟；然后以频率15Hz，能流密度0.25～0.30mJ/mm²，冲击1500-2000次，在37℃的CO₂培养箱中孵育10分钟，得到悬液；

二、将步骤一的悬液放入密封的冷冻管中，放入液氮冷冻20-40分钟，取出后放入水浴摇荡融解，重复操作4-6次，然后在4℃、2500x g条件下离心20min，取上清液，再用针头过滤器过滤上清液，收集滤液，得到富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液。其他与具体实施方式一或二相同。

本实施方式通过血小板采集机、外周血多次离心浓缩、或者外周血淋巴细胞分离液浓缩获得的富含血小板血浆或者富含血小板生理盐水。血小板来自成人的静脉血、动脉血、脐带血、胎盘血或者动物的血液。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：富含血小板血浆或者富含血小板生理盐水中血小板浓度为(6～15)×10⁵个/μl。与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中基底膜蛋白聚糖溶液是将基底膜蛋白聚糖溶解在pH7.4、浓度为150mM的NaCl溶液中，其中基底膜蛋白聚糖的分子量大于400kD。其他与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一中基底膜蛋白聚糖溶液的浓度为400-800μg/ml。其他与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤一中富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液中含有的微囊浓度为120μg/mL，微囊总蛋白为7-9μg/mL。其他与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤二中海藻酸钠溶液中质量体积百分比为2.2-3.1％。其他与具体实施方式一至六之一相同。

本实施方式“质量体积百分比”的意思为：海藻酸钠溶液是海藻酸钠和水按质量体积比为(2.2-3.1)g：100mL的比例混合而成。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中多孔喷嘴的孔径为80μm。其他与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤四中用DMEM/F12培养液漂洗微球。其他与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤四的离心是在4℃，200x g下离心10min。其他与具体实施方式一至九之一相同。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例一：一种负载血小板裂解液的微球制备方法，按以下步骤进行：

一、向5mL富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液中加入2.2mL基底膜蛋白聚糖溶液，边加边搅拌均匀，得到组合物A；

二、室温下，将4.8mL海藻酸钠溶液加入到组合物A中，充分混匀，形成组合物B；

三、将组合物B加入到装有孔径为80μm的多孔喷嘴的喷枪中，以氮气为动力、10m/s的速度，喷入以90rpm磁搅拌中的4℃的8％CaCl₂水溶液中，形成粒径90-110μm的微球；

四、将微球采用DMEM/F12培养液进行漂洗，在4℃，200x g下离心10min，形成负载血小板裂解液的微球。

其中富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法按以下步骤进行：

一、用聚焦式体外冲击波仪以频率15Hz，能流密度0.18mJ/mm²，冲击富含血小板血浆400次后，在37℃的CO₂培养箱中孵育12分钟；再以频率15Hz，能流密度0.22mJ/mm²，冲击800次，在37℃的CO₂培养箱中孵育25分钟；然后以频率15Hz，能流密度0.26mJ/mm²，冲击1500次，在37℃的CO₂培养箱中孵育10分钟，得到悬液；

二、将步骤一的悬液放入密封的冷冻管中，放入液氮冷冻30分钟，取出后放入38℃水浴摇荡融解，重复操作5次，然后在4℃、2500g条件下离心20min，取上清液，再用0.22μm针头过滤器过滤上清液，收集滤液，得到富含CD41⁺、CD81⁺微囊的血小板裂解液。

本实施例通过血小板采集机获得的富含血小板血浆，其来源于动物的血液。步骤一中富含血小板血浆或者富含血小板生理盐水中血小板浓度为(6～15)×10⁵个/μl。

本实施例中海藻酸钠溶液是海藻酸钠和水按质量体积比为2.2g：100mL的比例混合而成。

本实施例在微球形成的过程中，采用N₂为推动力，可以控制液体经过多孔喷头的推动的速度，从而控制微球的直径的同时，微球制备过程中进入微球的N₂形成自然的内部空隙(图1)。此过程形成颗粒均匀(图3)且不用乳化剂、分散剂等溶剂，比滴入法微球直径分布不均(图2)有了显著的改善。从图4可以看出，本发明方法85％的微球直径分布集中在直径90-110μm，而传统的滴入法制作的微球在直径90-110μm范围内的仅为39％，而分布在120-130nm的有20％，直径分布在40-60μm有21％。

通过ELISA方法，分析成微球前血小板裂解液中的细胞因子浓度A，同时分析剩余在成微球液中的相应细胞因子浓度B，将微球在PBS中浸泡过夜后，离心1000x g将微球去掉，测其中的渗出的细胞因子含量为C，利用下面的公式分析其中细胞因子的固定效率：固定效率％＝(A*Va-B*Vb-C*Vc)/(A*Va)X 100％，其中Va，Vb，Vc分别为相应检测液体的体积。

通过NTA方法，分析成微球前血小板裂解液中的总微囊浓度X，同时分析剩余在成微球液中的相应微囊浓度Y，将微球在PBS中浸泡过夜后，离心1000x g将微球去掉，测其中的游离的微囊浓度为Z，利用下面的公式分析其微囊的固定效率：固定效率％＝(X*Vx-Y*Vy-Z*Vz)/(X*Vx)X 100％，其中Vx，Vy，Vz分别为相应检测液体的体积。细胞因子和微囊的固定效率结果见图5，由图5可知，本发明制作的微球过程对细胞因子(包括PDGF-AB，TGF-β，VEGF，bFGF)和微囊的固定效率均为80％-95％，说明本实施例可将血小板因子以及微囊有效固定在微球中间。

成骨细胞的贴服实验：

取新生小鼠颅骨培养获得的P2代成骨细胞按照细胞：微球比例＝10：1，50:1，100:1，500:1，1000:1，10000:1分组进行贴服实验，以获得每个微球的承载细胞极限。在非TC包被的培养皿中，将首先将微球加入到L-DMEM培养基中，再将细胞悬液滴入含有微球的培养皿中，边滴入边摇匀，使得细胞和微球重复接触。经过60min后，吸取细胞悬液，采用血球计数板计算游离成骨细胞数量，从而计算出接种后成骨细胞在培养体系中贴服在微球上的细胞占比(表一)，可见，微球承载成骨细胞能力非常强。如图6所见，在成骨细胞：微球＝500:1的情况下，绝大部分细胞贴服在微球上，只有极个别细胞散落在培养液中。

表一

成骨细胞：微球比例	微球上细胞占比％
		10:1	96.5±3.1％
50:1	98.3±1.5％
		100:1	90.8±8.1％
500:1	95.6±3.4％
		1000:1	70.2±8.9％
10000:1	13.7±5.1％

间充质干细胞在微球上的扩增：

将悬浮于无血清DMEM/F12培养中的P3代人脐带间充质干细胞5*10⁶/ml与制备完成的5*10⁵个负载血小板裂解液微球轻柔混合，使得二者重复接触30min后，将其接种致非TC处理的培养瓶中，在37度5％CO₂培养环境中进行旋转摇动培养，转速40rpm。根据培养中根据培养基颜色确定是否需要换液。显微镜观察微球，可见明显的细胞团覆盖在微囊上逐渐增殖直至长满(图7)。利用0.25％TrypLE Express将细胞从不同培养时间的微球上消化下来，采用台盼蓝染色法检查间充质干细胞活率和细胞数量，采用BD Canto II分析间充质干细胞表型CD90、CD105、CD73、CD45、CD34以鉴别细胞的纯度。表二可见，间充质干细胞在微球上生长状况好，细胞活率均超过95％，倍增时间短，纯度上阳性表达率(CD90、CD105、CD73)均超过95％，阴性表达率(CD45、CD34)均低于<2％，符合国际ISCT对间充质干细胞的纯度要求。

表二

实施例二：一种负载血小板裂解液的微球制备方法，按以下步骤进行：

一、向5.5mL富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液中加入2.4mL基底膜蛋白聚糖溶液，边加边搅拌均匀，得到组合物A；

二、室温下，将5.0mL海藻酸钠溶液加入到组合物A中，充分混匀，形成组合物B；

三、将组合物B加入到装有孔径为80μm的多孔喷嘴的喷枪中，以氮气为动力、10m/s的速度，喷入以90rpm磁搅拌中的4℃的8％CaCl₂水溶液中，形成粒径90-110μm的微球；

四、将微球采用DMEM/F12培养液进行漂洗，在4℃，200x g下离心10min，形成负载血小板裂解液的微球。

其中富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法按以下步骤进行：

一、用聚焦式体外冲击波仪以频率15Hz，能流密度0.18mJ/mm²，冲击富含血小板血浆400次后，在37℃的CO₂培养箱中孵育12分钟；再以频率15Hz，能流密度0.22mJ/mm²，冲击800次，在37℃的CO₂培养箱中孵育25分钟；然后以频率15Hz，能流密度0.26mJ/mm²，冲击1500次，在37℃的CO₂培养箱中孵育10分钟，得到悬液；

二、将步骤一的悬液放入密封的冷冻管中，放入液氮冷冻30分钟，取出后放入38℃水浴摇荡融解，重复操作5次，然后在4℃、2500g条件下离心20min，取上清液，再用0.22μm针头过滤器过滤上清液，收集滤液，得到富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液。

本实施例通过血小板采集机获得的富含血小板血浆，其来源于动物的血液。步骤一中富含血小板血浆或者富含血小板生理盐水中血小板浓度为(6～15)×10⁵个/μl。

本实施例通过微球的制备过程，可将血小板因子以及微囊有效固定在微球中间，在细胞培养过程中，(一)不仅可有效促进贴壁细胞的附着，而且因为局部高浓度的因子和微囊与细胞近距离接触，增加了扩增信号的向细胞内的传导，实现了贴服细胞在微球上的有效增殖。(二)这种方式克服了向液体培养基中添加促进扩增物质这种以整体高浓度来达到细胞局部微环境有足够营养的弊端，有效地利用了营养，降低了成本；(三)因为微球这种立体培养方式增加了单位培养体系的比表面积，实现了规模化贴壁细胞高效扩增；(四)同时微球可以作为移植物直接在临床进行移植，由于微球的生物相容性好，其携带的细胞因子和微囊可以对机体的损伤起到修复作用，因而成为极有临床前景的生物材料。

Claims (7)

1.一种负载血小板裂解液的微球制备方法，其特征在于该制备方法按以下步骤进行：

一、向富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液中加入基底膜蛋白聚糖溶液，边加边搅拌均匀，得到组合物A；其中富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液和基底膜蛋白聚糖溶液的体积比为(3.7-5.5):(0.8-2.4)；

二、室温下，将海藻酸钠溶液加入到组合物A中，充分混匀，形成组合物B；其中海藻酸钠溶液和富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液的体积比为(3.0-5.0):(3.7-5.5)；

三、将组合物B加入到装有多孔喷嘴的喷枪中，以氮气为动力、1～30m/s的速度，喷入以90rpm磁搅拌中的4℃的3-10％CaCl₂水溶液中，形成粒径90-110μm的微球；

四、将微球进行漂洗，离心，形成负载血小板裂解液的微球；

其中富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液是由血小板浓度为(6～15)×10⁵个/μl的富含血小板血浆或者富含血小板生理盐水制成；海藻酸钠溶液是海藻酸钠和水按质量体积比为2.2g：100mL的比例混合而成；基底膜蛋白聚糖溶液的浓度为400-800μg/mL。

2.根据权利要求1所述的一种负载血小板裂解液的微球制备方法，其特征在于步骤一中富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液的制备方法为：

一、用聚焦式体外冲击波仪以频率15Hz，能流密度0.15～0.20mJ/mm²，冲击富含血小板血浆或富含血小板生理盐水200-500次后，在37℃的CO₂培养箱中孵育10-15分钟；再以频率15Hz，能流密度0.20～0.25mJ/mm²，冲击700-1000次，在37℃的CO₂培养箱中孵育20-30分钟；然后以频率15Hz，能流密度0.25～0.30mJ/mm²，冲击1500-2000次，在37℃的CO₂培养箱中孵育10分钟，得到悬液；

二、将步骤一的悬液放入密封的冷冻管中，放入液氮冷冻20-40分钟，取出后放入水浴摇荡融解，重复操作4-6次，然后在4℃、2500x g条件下离心20min，取上清液，再用针头过滤器过滤上清液，收集滤液，得到富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液。

3.根据权利要求1所述的一种负载血小板裂解液的微球制备方法，其特征在于步骤一中基底膜蛋白聚糖溶液是将基底膜蛋白聚糖溶解在pH7.4、浓度为150mM的NaCl溶液中，其中基底膜蛋白聚糖的分子量大于400kD。

4.根据权利要求1所述的一种负载血小板裂解液的微球制备方法，其特征在于步骤一中富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液中含有的微囊浓度为120μg/mL，微囊总蛋白为7-9μg/mL。

5.根据权利要求1所述的一种负载血小板裂解液的微球制备方法，其特征在于步骤三中多孔喷嘴的孔径为80μm。

6.根据权利要求1所述的一种负载血小板裂解液的微球制备方法，其特征在于步骤四中用DMEM/F12培养液漂洗微球。

7.根据权利要求1所述的一种负载血小板裂解液的微球制备方法，其特征在于步骤四的离心是在4℃，200x g下离心10min。

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