CN107670113A - 一种细胞三维扩增培养用微载体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种细胞三维扩增培养用微载体的制备方法属于组织工程材料领域，以左旋聚乳酸PLLA为基体、明胶为分散剂，制备复合微球；并通过控制PLLA二氯甲烷溶液的浓度、纳米羟基磷灰石nHAp和PLLA质量比、明胶用量等，调控微球的粒径大小。以PLLA为基体保证支架的机械强度和生物降解性；复合nHAp在提高支架的骨诱导性和传导性的同时，协助PLLA提高细胞的成骨能力，防止细胞在过酸性环境下受损；nHAp的存在使PLLA微球表面形成了大量小孔，小孔的存在增强了支架的传质能力并为细胞提供更丰富的附着位点。本发明制备的微载体对成骨细胞表现出良好的生物学性能，适用于骨组织工程领域。

Description

一种细胞三维扩增培养用微载体的制备方法
技术领域
本发明属于组织工程材料领域，特别涉及一种左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石两种材料复合、构建组织工程细胞微载体的方法。
背景技术
组织工程是通过细胞生物学、材料分子学和工程原理在体外制备培养出人工的组织替代品。替代产品具有生物活性，在临床上发挥很多功能，主要表现在修复和改善人体内的组织和器官，并对它们进行维护等方面。其方法之一是通过制备生物支架，在支架上细胞与生长因子结合，通过一种新的方式对受损的组织器官进行修复，这种替代方法目前在临床上得到了广泛的应用。组织工程的三要素为支架材料、生长因子和种子细胞，它们之间相互协调作用、配合紧密。近年来，经过不断的研究探索，组织工程在生物学、医学等各个领域都有着明显的进步，特别是在临床医学方面，给众多患者带来了福音。
聚乳酸(Polylactic acid，PLA)是一种无毒、可代谢的高分子材料，是生物医学领域中最广泛使用的人工合成聚合物之一，具有机械强度高、可塑性好、细胞相容性高、生物可降解性等优点，使其成为制备组织工程支架材料的首选材料，适于大规模生产。羟基磷灰石(Nano-Hydroxyapatite，nHAp)是天然骨的主要成分之一，具有良好的骨传导性和诱导性，研究发现其能够促进新骨的生成，并会随着新骨的生成和发育而被吸收利用。基于两种材料的优点，聚乳酸、羟基磷灰石的复合支架在组织工程领域已得到充分的认可和广泛的研究。
近年来，细胞微球在组织工程方面得到了广泛的应用，技术取得了显著的进步，方法也更加成熟，细胞微球具有以下优点：第一，制备的原料经济易得，制备过程简单快捷；第二，微球具有很好的机械抗压能力，并且其内部相对致密，空间体积较小；第三，微球具有很好的生物相容性和降解性。传统细胞培养最常用的方法是单层培养法，现今通过微载体培养可实现细胞的大规模扩增，其优势在于不仅可以增大培养的比表面积，短时间细胞可以在微球表面大量增殖,并且培养过程中添加微载体可以完成细胞的传代，避免了传统培养方法中使用胰酶消化对细胞的损害；还能与生物反应器无缝结合，为细胞培养提供模拟体内的动态生存环境；另外也可将微载体注射到生物体内，修复缺损组织。目前根据细胞生长环境划分，组织工程用微载体主要分为两类：一类是可使细胞附着生长在其表面或者多孔壁面内，另一类是可将细胞包埋于内部，通过微球表面的细微孔道与外界进行物质交换。前者更有利于细胞的大规模扩增和无损收获，且微球还可以再利用。在在众多的合成材料微球研究中，有以聚乳酸为代表的聚合物材料微球，这类微球的特点是能够与生物体内细胞进行很好的相容且生物降解性良好；还有一类是以脱乙酰甲壳素、明胶为主的细胞外基质微球，它们的结构与细胞外基质相似，属于多糖类，其生物性能良好。专利CN1586704 A“一种制备聚乳酸多孔微球的方法”，以聚乙烯醇水溶液为分散剂，制备聚乳酸多孔微球。但将聚乳酸复合以羟基磷灰石构建微载体还未见报道。
聚乳酸和羟基磷灰石两种材料在组织工程领域表现出优异性能，本发明将聚乳酸和纳米羟基磷灰石复合制备微球，可有效结合两种材料的优点，同时实现材料功能互补。加入纳米羟基磷灰石后不仅可以协助聚乳酸提高细胞的成骨能力，还能将聚乳酸降解的酸性产物部分中和，使细胞的生长环境达到酸碱平衡状态，防止细胞在过酸性的环境下受损。
发明内容
基于聚乳酸、纳米羟基磷灰石两种材料良好的生物相容性、生物降解性和力学性能，发明一种细胞三维扩增培养用聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球的构建方法，制备具有良好生物相容性和物化特性的微载体，以支持成骨细胞的体外增殖和功能实现，是本发明的主要目的。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种细胞三维扩增培养用聚乳酸/纳米羟基磷灰石微载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)室温下，将左旋聚乳酸PLLA加入到二氯甲烷溶液中，搅拌3～5h得到PLLA二氯甲烷溶液。其中，PLLA质量浓度为5～15g/mL。
(2)室温下，将纳米羟基磷灰石nHAp加入到步骤(1)制备的PLLA二氯甲烷溶液中，密封后，在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，再在超声波振荡器中进一步超声分散混合30～40min至nHAp均匀分散在溶液中，得到PLLA/nHAp二氯甲烷溶液。所述的左旋聚乳酸与纳米羟基磷灰石的质量比为5:1～10:1，混合搅拌转速为150～300rpm/min/min。
(3)室温下，将明胶加入蒸馏水中，密封搅拌2～4h至明胶溶解，得到明胶分散剂。其中，明胶的质量浓度为0.25～1g/mL。
(4)室温下，将步骤(2)制得的PLLA/nHAp二氯甲烷溶液加入到步骤(3)制备的明胶分散剂中，在通风橱中快速搅拌至nHAp分布均匀，继续搅拌5～7h得到PLLA/nHAp二氯甲烷/明胶溶液。所述的搅拌速度为150～300rpm/min/min；所述的明胶、左旋聚乳酸的质量比为1:60～1:10。
(5)将步骤(4)制备的PLLA/nHAp二氯甲烷/明胶溶液，静置0.5～1h分相；分相结束后分离上清液，得到底部固相，用去离子水清洗底部固相5～6次后，将底部固相物放置于真空干燥箱中干燥，即可制得左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石(PLLA/nHAp)复合微球。所述的真空干燥温度为30～40℃，真空干燥时间为40～50h。
所述的PLLA/nHAp复合微球中左旋聚乳酸与纳米羟基磷灰石的质量比为5:1～10:1，PLLA/nHAp复合微球的平均直径为275.69±30.62μm，且球形度很好。
本发明制备得到的PLLA/nHAp复合微球，对成骨细胞表现出良好的生物学性能，适用于骨组织工程领域。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点和有益效果：
本发明根据乳化分散溶剂挥发法，选用左旋聚乳酸为微载体基体，明胶为分散剂，设计制备了左旋聚乳酸(PLLA)、左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石(PLLA/nHAp)两种微载体。通过控制聚乳酸二氯甲烷溶液的浓度、羟基磷灰石与聚乳酸的质量比、明胶的用量、以及混合搅拌转速，调控微球的粒径大小。
左旋聚乳酸复合纳米羟基磷灰石制备微球，实现了材料功能的优势互补。首先以左旋聚乳酸为基体以保证支架的机械强度和生物降解性；复合nHAp以纳米羟基磷灰石在提高支架的骨诱导性和骨传导性的同时，还可以协助左旋聚乳酸提高细胞的成骨能力，并且将左旋聚乳酸降解的酸性产物部分中和，使细胞的生长环境达到酸碱平衡状态，防止细胞在过酸性的环境下受损。
本发明将材料制备成微球，利用微载体进行悬浮培养。该方法为细胞提供一个更加接近于生物体内的生长环境，不仅能使细胞正常健康的生长防止结构受到破坏，还解决了部分贴壁细胞不能在生物反应器内直接生长的问题。
本发明获得的PLLA/nHAp复合微球平均直径为275.69±30.62μm，能够为细胞提供足够的增殖空间并适宜于实体骨组织的生成和发育；由于纳米羟基磷灰石的存在改变了左旋聚乳酸微球的表面形貌，使其表面形成了大量小孔，小孔的存在能够增强支架的传质能力并为细胞提供更丰富的附着位点。
附图说明
图1为倒置相差显微镜观察PLLA微球(实施例1)形貌，×40；
图2为倒置相差显微镜观察PLLA/nHAP微球(实施例3)形貌，×40；
图3为扫描电镜观察PLLA微球(实施例1)和PLLA/nHAp微球(实施例3)表面及横截面形貌图；A1、A2、A3为PLLA微球表面形貌图，(A1×200，A2×800，A3×3000)；A4为PLLA微球横截面形貌图，(×800)；B1、B2、B3为PLLA/nHAP微球表面形貌图，(B1×100，B2×800，B3×1600)；B4为PLLA/nHAP微球横截面形貌图，(×800)；
图4为PLLA微球(实施例1)和PLLA/nHAP微球(实施例3)细胞相容性检测(×100)Scale:250μm；A1、B1分别为PLLA微球、PLLA/nHAP微球Calcein-AM染色；A2、B2分别为PLLA微球、PLLA/nHAP微球PI染色；A3、B3分别为PLLA微球、PLLA/nHAP微球Hoechst33258染色；A4、B4分别为PLLA微球、PLLA/nHAP微球三重复合染色；两种微球分别培养MC3T3-E1细胞24h；
图5为PLLA微球(实施例1)和PLLA/nHAP微球(实施例3)细胞相容性检测Scale:250μm；A1、B1分别为PLLA微球、PLLA/nHAP微球Hoechst33258染色(×100)；A2、B2分别为PLLA微球、PLLA/nHAP微球Calcein-AM染色(×200)；A3、B3分别为PLLA微球、PLLA/nHAP微球PI染色(×200)；A4、B4分别为PLLA微球、PLLA/nHAP微球Hoechst33258染色(×200)；两种微球分别培养MC3T3-E1细胞120h；
图6为MC3T3-E1细胞在微载体表面的粘附、铺展过程：接触、吸附、铺展、增殖阶段；最初细胞呈球形附着在微载体表面，后逐渐变为椭圆形、扁平化并拉伸出丝以扩展到微载体的表面，最后开始增殖；Scale:250μm；接种密度为1×105/mL；A1～A3为MC3T3-E1细胞在PLLA微球(实施例1)上随时间进程的黏附、铺展过程，(A1×100，A2、A3×200)；B1～B3为MC3T3-E1细胞在PLLA/nHAP微球(实施例3)上随时间进程的黏附、铺展过程，(B1×100，B2、B3×200)；
图7为扫描电镜观察MC3T3-E1细胞在微载体表面的粘附、铺展、增殖；A1为扫描电镜观察MC3T3-E1细胞在PLLA微球(实施例1)上的粘附、铺展、增殖情况，细胞培养24h，×2000；A2为扫描电镜观察MC3T3-E1细胞在PLLA微球(实施例1)上的粘附、铺展、增殖情况，细胞培养72h，×2000；B1为扫描电镜观察MC3T3-E1细胞在PLLA/nHAP微球(实施例3)上的粘附、铺展、增殖情况，细胞培养24h，×4000；B2为扫描电镜观察MC3T3-E1细胞在PLLA/nHAP微球(实施例3)上的粘附、铺展、增殖情况，细胞培养72h，×3000；
图8为PLLA/nHAP微球表面形貌图，(×800)。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明。
实施例1左旋聚乳酸微球的制备及生物相容性检测(对比实施例，左旋聚乳酸二氯甲烷溶液中左旋聚乳酸的浓度为10g/mL，明胶用量为：明胶/左旋聚乳酸质量比1:40，混合搅拌转速150rpm/min/min)
首先，称取10.0g左旋聚乳酸(PLLA)加入到100mL二氯甲烷溶液中，在通风橱中搅拌4h至PLLA溶解，得到PLLA二氯甲烷溶液；然后称取0.25g明胶加入到100mL蒸馏水中，密封、搅拌3h得到明胶分散剂；将PLLA二氯甲烷溶液加入明胶分散剂溶液中，在通风橱内搅拌7h，转速为150rpm/min，搅拌过程中随着有机溶剂的挥发，液体微球逐渐固化、成球、沉淀于烧杯底部；静置30min分相，分相结束后分离上清液，用去离子水清洗底部固相5～6次后，将固相置于37℃真空干燥箱中干燥40h，即可制得左旋聚乳酸微球。
对优选方法制备的聚乳酸微球进行生物相容性检测，细胞在微球载体上随时间粘附铺展的过程表明，在30min左右细胞已粘附到微球表面，12h内已经迅速铺展，而在3天后，细胞大量扩增后已将微球包裹，通过粘附观察，可体现出所制备的微载体具有一定的细胞相容性，适用于细胞体外三维粘附扩增。另外，对细胞-微载体进行死活染色，可发现微载体表面已有较多细胞粘附其上，且保持较高的细胞活性，未见大量死细胞出现，再次说明本发明制备的微载体具有良好的生物相容性，能够用于骨组织工程支架的制备。
实施例2左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石(质量比5:1)复合微球制备(聚乳酸二氯甲烷溶液浓度5g/mL，明胶用量为：明胶/左旋聚乳酸质量比1:20，混合搅拌转速200rpm/min)
称取5.0g左旋聚乳酸(PLLA)，加入到100mL二氯甲烷中，水浴条件下磁力搅拌3h，直至PLLA在二氯甲烷中完全溶解至澄清，得到PLLA二氯甲烷溶液；称取1.0g纳米羟基磷灰石(nHAp)，将其加入到上述PLLA二氯甲烷溶液中，密封、在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，超声波振荡器中进一步超声分散混合30min至nHAp均匀地分散在溶液中，得到PLLA/nHAp二氯甲烷溶液；称取0.25g明胶，加入到100mL蒸馏水中，密封搅拌2h至明胶溶解，制得明胶分散剂；将制得的PLLA/nHAp二氯甲烷溶液加入到明胶分散剂中，在通风橱中快速搅拌，转速为200rpm/min搅拌至nHAp分布均匀后继续搅拌5h，随着有机溶剂的挥发，液体微球逐渐固化、成球沉淀于烧杯底部；将制备的PLLA/nHAp二氯甲烷/明胶溶液，静置30min分相，分相结束后分离上清液，用去离子水清洗底部固相5～6次后，置固相于30℃真空干燥箱中干燥50h，即可制得左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球。
实施例3左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石(质量比5:1)复合微球制备(聚乳酸二氯甲烷溶液浓度10g/mL，明胶用量为：明胶/左旋聚乳酸质量比1:40，混合搅拌转速200rpm/min)
称取10.0g左旋聚乳酸(PLLA)，加入到100mL二氯甲烷中，水浴条件下磁力搅拌4h，直至PLLA在二氯甲烷中完全溶解至澄清，得到PLLA二氯甲烷溶液；称取2.0g纳米羟基磷灰石(nHAp)，将其加入到上述PLLA二氯甲烷溶液中，密封、在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，超声波振荡器中进一步超声分散混合50min至nHAp均匀分散在溶液中，得到PLLA/nHAp二氯甲烷溶液；称取0.25g明胶，加入到100mL蒸馏水中，密封搅拌2h至明胶溶解，制得明胶分散剂；将制得的PLLA/nHAp二氯甲烷溶液加入到明胶分散剂中，在通风橱中快速搅拌，转速为200rpm/min搅拌至nHAp分布均匀后继续搅拌6h，随着有机溶剂的挥发，液体微球逐渐固化、成球、沉淀于烧杯底部；将制备的PLLA/nHAp二氯甲烷/明胶溶液，静置30min分相，分相结束后分离上清液，用去离子水清洗底部固相5～6次后，置底部固相于37℃真空干燥箱中干燥42h，即可制得左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球。
实施例4左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石(质量比5:1)复合微球制备(聚乳酸二氯甲烷溶液浓度15g/mL，明胶用量为：明胶/左旋聚乳酸质量比1:60，混合搅拌转速300rpm/min)
称取15.0g左旋聚乳酸(PLLA)，加入到100mL二氯甲烷中，水浴条件下磁力搅拌5h，直至PLLA在二氯甲烷中完全溶解至澄清，得到PLLA二氯甲烷溶液；称取3.0g纳米羟基磷灰石(nHAp)，将其加入到上述PLLA二氯甲烷溶液中，密封、在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，超声波振荡器中进一步超声分散混合1h至nHAp均匀地分散在溶液中，得到PLLA/nHAp二氯甲烷溶液；称取0.25g明胶，加入到100mL蒸馏水中，密封搅拌2h至明胶溶解，制得明胶分散剂；将制得的PLLA/nHAp二氯甲烷溶液加入到明胶分散剂中，在通风橱中快速搅拌，转速为300rpm/min搅拌至nHAp分布均匀后继续搅拌7h，随着有机溶剂的挥发，液体微球逐渐固化、成球、沉淀于烧杯底部；将制备的PLLA/nHAp二氯甲烷/明胶溶液，50min分相，分相结束后分离上清液，用去离子水清洗底部固形5～6次后，置固相于38℃真空干燥箱中干燥45h，即可制得左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球。
实施例5左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石(质量比5:1)复合微球制备(聚乳酸二氯甲烷溶液浓度10g/mL，明胶用量为：明胶/左旋聚乳酸质量比1:10，混合搅拌转速200rpm/min)
称取10.0g左旋聚乳酸(PLLA)，加入到100mL二氯甲烷中，水浴条件下磁力搅拌4h，直至PLLA在二氯甲烷中完全溶解至澄清，得到PLLA二氯甲烷溶液；称取2.0g纳米羟基磷灰石(nHAp)，将其加入到上述PLLA二氯甲烷溶液中，密封、在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，超声波振荡器中进一步超声分散混合50min至nHAp均匀地分散在溶液中，得到PLLA/nHAp二氯甲烷溶液；称取1.0g明胶，加入到100mL蒸馏水中，密封搅拌4h至明胶溶解，制得明胶分散剂；将制得的PLLA/nHAp二氯甲烷溶液加入到明胶分散剂中，在通风橱中快速搅拌，转速为200rpm/min搅拌至nHAp分布均匀后继续搅拌7h，随着有机溶剂的挥发，液体微球逐渐固化、成球、沉淀于烧杯底部；将制备的PLLA/nHAp二氯甲烷/明胶溶液，静置40min分相，分相结束后分离上清液，用去离子水清洗底部固相5～6次后，置固相于37℃真空干燥箱中干燥48h后，即可制得左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球。
实施例6左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石(质量比10:1)复合微球制备(聚乳酸二氯甲烷溶液浓度10g/mL，明胶用量为：明胶/左旋聚乳酸质量比1:40，混合搅拌转速200rpm/min)
称取10.0g左旋聚乳酸(PLLA)，加入到100mL二氯甲烷中，水浴条件下磁力搅拌4h，直至PLLA在二氯甲烷中完全溶解至澄清，得到PLLA二氯甲烷溶液；称取1.0g纳米羟基磷灰石(nHAp)，将其加入到上述PLLA二氯甲烷溶液中，密封、在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，超声波振荡器中进一步超声分散30min至nHAp均匀地分散在溶液中，得到PLLA/nHAp二氯甲烷溶液；称取0.25g明胶，加入到100mL蒸馏水中，密封搅拌2h至明胶溶解，制得明胶分散剂；将制得的PLLA/nHAp二氯甲烷溶液加入到明胶分散剂中，在通风橱中快速搅拌，转速为200rpm/min搅拌至nHAp分布均匀后继续搅拌6h，随着有机溶剂的挥发，液体微球逐渐固化、成球、沉淀于烧杯底部；将制备的PLLA/nHAp二氯甲烷/明胶溶液，静置30min分相，分相结束后分离上清液，用去离子水清洗底部固相5～6次后，置固相于40℃真空干燥箱中干燥40h后，即可制得左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球。
实施例7左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石(质量比8:1)复合微球制备(聚乳酸二氯甲烷溶液浓度10g/mL，明胶用量为：明胶/左旋聚乳酸质量比1:40，混合搅拌转速300rpm/min)
称取10.0g左旋聚乳酸(PLLA)，加入到100mL二氯甲烷中，水浴条件下磁力搅拌4h，直至PLLA在二氯甲烷中完全溶解至澄清，得到PLLA二氯甲烷溶液；称取2.0g纳米羟基磷灰石(nHAp)，将其加入到上述PLLA二氯甲烷溶液中，密封、在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，超声波振荡器中进一步超声分散50min至nHAp均匀地分散在溶液中，得到PLLA/nHAp二氯甲烷溶液；称取0.25g明胶，加入到100mL蒸馏水中，密封搅拌2h至明胶溶解，制得明胶分散剂；将制得的PLLA/nHAp二氯甲烷溶液加入到明胶分散剂中，在通风橱中快速搅拌，转速为300rpm/min搅拌至nHAp分布均匀后继续搅拌5h，随着有机溶剂的挥发，液体微球逐渐固化、成球、沉淀于烧杯底部；将制备的PLLA/nHAp二氯甲烷/明胶溶液，静置30min分相，分相结束后分离上清液，用去离子水清洗底部固相5～6次后，置固相于37℃真空干燥箱中干燥45h后，即可制得左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球。
实施例8左旋聚乳酸微球(实施例1)与左旋聚乳酸/羟基磷灰石复合微球(实施例3)形貌观察
(1)微球材料倒置显微镜形貌观察
使用75％的酒精溶液分别将左旋聚乳酸(PLLA)微球与左旋聚乳酸/羟基磷灰石(PLLA/nHAp)复合微球分散于孔板中，置于倒置相差显微镜下分别观察两种微球的形貌。
结果表明，在40倍倒置相差显微镜下观察PLLA微球和PLLA/nHAp微球的形状图貌，PLLA/nHAp微球的球形度要优于PLLA微球；利用Image Pro Plus软件，随机测量100个微球的球径，计算其平均直径，PLLA微球的平均直径是291.88±30.74μm，掺入一定量nHAp后微球的平均直径为275.69±30.62μm。
(2)微球材料扫描电镜形貌观察
将两种微球分别用导电胶固定在载物台上，用氮气吹扫样品表面，吹去表面杂质，真空喷金，置于钨丝灯扫描电子显微镜下观察微球形貌。
结果表明，纳米羟基磷灰石的存在改变了聚乳酸微球的表面形貌，使其表面形成了大量小孔，这可能是因为羟基磷灰石使微球在固化的过程中粘度增大，结构更致密，阻碍了有机溶剂二氯甲烷挥发的速度，形成诸多小气孔。内部结构观察也可以看出PLLA/nHAp微球结构更致密，突出的白色亮点为掺入的纳米羟基磷灰石部分因未分散均匀而团聚在一起。PLA/nHAp支架具有通透的孔结构，为成骨细胞的黏附、增殖和向骨分化提供了充足的空间，适宜于实体骨组织的生长。放大观察后发现，在大孔的孔壁上有微孔结构，这些微孔结构能够提高支架材料的传质性能，利于营养物质和代谢废物的传递，为细胞提供平衡的生长环境。
实施例9左旋聚乳酸微球(实施例1)左旋聚乳酸/羟基磷灰石复合微球(实施例3)细胞相容性检测
本发明使用在含有抗坏血酸和3-4mM无机磷酸盐的培养基中培养的MC3T3-E1细胞，该细胞生长状态良好，呈多边形和长梭形，细胞之间存在突触相连，且具有良好的体外成骨能力和矿化能力。
细胞-微球复合物的体外构建：称取35mg微球置于24孔板中，共加入6个孔，每孔35mg，同时称取15mg微球，置于96孔板中，共加入18个孔，分别用于增殖及粘附测定，加入约90％孔体积的75％乙醇溶液浸泡5h,后用同等体积的PBS冲洗3次，紫外线照射5h,后继续用PBS冲洗3次，吸去上清液，准备用于细胞实验；取P13代细胞，进行细胞消化后计数，每孔1×105cells/mL接种密度，将50μL细胞接种于微球上，超净台内静置30min后补全培养基至1mL。细胞在微球上培养5天，分别于30min、12h、72h，于倒置相差显微镜观察细胞在微载体上的粘附情况。同时在24h、72h、140h对细胞微载体进行死活染色，观察细胞在微球上的存活情况。
经过Calcein-AM染色、PI染色、Hoechst 33258染色发现，细胞在复合支架上分布均匀，细胞大量存活且具有良好的活性，其中细胞在PLLA/nHAp微球上的活性要高于PLLA微球。
对细胞-微球进行扫描电镜观察发现，成骨细胞在微球上贴壁良好，且观察到细胞间存在细胞突触的连接。细胞在微球表面培养1天及3天后，进行戊二醛固定，喷金后于扫描电镜下观察，发现细胞在微球表面逐渐开始扩增，突触明显，通过伸出突触在微球表面粘附铺展。
对细胞-微球复合物进行细胞在微载体表面的粘附情况测定，检测之后发现，细胞在各组支架上均能保持较好的增殖活性。称取15mg微球，置于96低粘附孔板中，每组微载体设置6个复孔，微载体灭菌。取P7代细胞，每孔5×105cells/mL接种密度，将100μL细胞悬液接种于微球上，以含相同细胞悬液的孔作为对照，因为MC3T3-E1细胞在30min内即可贴附，并且仍然会有部分细胞粘附到孔板底部，故分别在10min、20min、30min吸走微载体，后加入100μL完全培养基，再加入10μL/孔CCK-8试剂，于37℃培养箱中孵育3h，后分别从每孔中吸出100μL，于495nm及630nm波长处通过酶标仪内检测各孔吸光度，微载体的粘附率可相对通过对照组与实验组的吸光度差来衡量。观测细胞在微球载体上随时间变化粘附铺展的过程，在30min左右细胞已粘附到微球表面，12h内已经迅速铺展，而在3天后，细胞大量扩增后已将微球包裹，在微球之间架桥。通过粘附观察，可体现出所制备的微载体具有一定的细胞相容性，适用于细胞体外三维粘附扩增。

Claims (10)

1.一种细胞三维扩增培养用聚乳酸/纳米羟基磷灰石微载体的构建方法，其特征在于以下步骤：
(1)室温下，将左旋聚乳酸PLLA加入到二氯甲烷溶液中，搅拌得到PLLA二氯甲烷溶液；
(2)室温下，将纳米羟基磷灰石nHAp加入到步骤(1)制备的PLLA二氯甲烷溶液中，密封搅拌预混后，进行超声分散至nHAp均匀分散在溶液中，得到PLLA/nHAp二氯甲烷溶液；
(3)室温下，将明胶加入蒸馏水中，密封搅拌至明胶溶解得到明胶分散剂；
(4)室温下，将步骤(2)制得的PLLA/nHAp二氯甲烷溶液加入到步骤(3)制备的明胶分散剂中，搅拌至nHAp分布均匀后，继续搅拌5～7h得到的PLLA/nHAp二氯甲烷/明胶溶液；所述的明胶、左旋聚乳酸的质量比为1:60～1:10；
(5)将步骤(4)制备的PLLA/nHAp二氯甲烷/明胶溶液静置分相后分离上清液，底部固相清洗后，放置于真空干燥箱中干燥处理，得到适用于骨组织工程领域的左旋聚乳酸/纳米羟基磷灰石复合微球，其中，左旋聚乳酸与纳米羟基磷灰石的质量比为5:1～10:1。
2.根据权利要求1所述的一种细胞三维扩增培养用聚乳酸/纳米羟基磷灰石微载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述的PLLA的质量浓度为5～15g/mL。
3.根据权利要求1或2所述的一种细胞三维扩增培养用聚乳酸/纳米羟基磷灰石微载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中明胶的质量浓度为0.25～1g/mL。
4.根据权利要求1或2所述的一种细胞三维扩增培养用聚乳酸/纳米羟基磷灰石微载体的构建方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的搅拌转速为150～300rpm/min；所述的步骤(4)中的搅拌速度为150～300rpm/min。
5.根据权利要求3所述的一种细胞三维扩增培养用聚乳酸/纳米羟基磷灰石微载体的构建方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的搅拌转速为150～300rpm/min；所述的步骤(4)中的搅拌速度为150～300rpm/min。
6.根据权利要求1或2或5所述的一种细胞三维扩增培养用聚乳酸/纳米羟基磷灰石微载体的构建方法，其特征在于，步骤(5)所述的真空干燥温度为30～40℃，真空干燥时间为40～50h。
7.根据权利要求3所述的一种细胞三维扩增培养用聚乳酸/纳米羟基磷灰石微载体的构建方法，其特征在于，步骤(5)所述的真空干燥温度为30～40℃，真空干燥时间为40～50h。
8.根据权利要求1或2或5或7所述的一种细胞三维扩增培养用聚乳酸/纳米羟基磷灰石微载体的构建方法，其特征在于，步骤(5)所述的静置分相时间为0.5～1h。
9.根据权利要求3所述的一种细胞三维扩增培养用聚乳酸/纳米羟基磷灰石微载体的构建方法，其特征在于，步骤(5)所述的静置分相时间为0.5～1h。
10.根据权利要求6所述的一种细胞三维扩增培养用聚乳酸/纳米羟基磷灰石微载体的构建方法，其特征在于，步骤(5)所述的静置分相时间为0.5～1h。
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