CN115322953A

CN115322953A - 一种用于细胞三维培养的高效接种方法及其应用

Info

Publication number: CN115322953A
Application number: CN202210974999.4A
Authority: CN
Inventors: 周志敏; 李宸; 郭传家; 高畅
Original assignee: Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Priority date: 2022-08-15
Filing date: 2022-08-15
Publication date: 2022-11-11

Abstract

本发明公开了一种用于细胞三维培养的高效接种方法及其应用。所述方法包括如下步骤：将含有细胞的溶液加入至含有微载体的接种容器中，离心，得到载有细胞的微载体。该接种方法借鉴凝胶色谱的原理，将PLGA或PLLA多孔微球置于接种容器中作为微载体，在一定条件下将多孔微球与细胞混匀并离心灌注，达到在多孔微球内高效接种细胞的效果。本发明操作流程简单，便捷且高效，使用成本低廉，在细胞三维培养及组织修复重建、人工器官再生领域具有潜在的应用与转化价值。

Description

一种用于细胞三维培养的高效接种方法及其应用

技术领域

本发明属于细胞培养与再生医学技术领域，具体涉及一种用于细胞三维培养的高效接种方法及其应用。

背景技术

目前在体外细胞培养技术中，二维(2D)培养由于具备成本低廉、培养条件易于控制、细胞便于收集、细胞能在平面高效扩增等优点广泛应用于细胞生物学、组织工程学、肿瘤学等多个学科。然而，二维培养环境无法模拟体内天然细胞外基质与组织特异性的物理结构，往往使得细胞在形态、增殖、分化和功能等方面具有不同于在体内的表现。与二维培养技术相比，三维培养技术最大程度地模拟了体内实际环境，可为细胞的增殖、分化与迁移提供立体空间优势，并更好地创造了细胞间相互作用的条件，从而具有在体外创造组织样结构的能力，在组织修复重建与药物筛选中具有很大的应用价值。

在三维培养系统中，根据是否为细胞提供支撑材料大体可分为基于支架的培养体系与无支架培养体系。无支架三维培养体系实现细胞聚合的主要途径为细胞自发聚集、旋转生物反应法以及悬滴法。然而，在无支架三维培养技术的球体培养中，球体结构缺乏控制、球体中心细胞易因氧气与营养物质匮乏而死亡等缺陷限制了无支架三维培养技术的进一步应用。而基于三维培养模型的培养系统能够为细胞提供物理支撑与生长因子的交换媒介，为细胞创造了粘附、迁移、增殖、分化以及长期生存的良好微环境，解决了上述痛点问题。当前应用于三维培养系统的模型主要分为微载体、水凝胶和3D整体式支架。

作为一类新型的细胞微载体，多孔微球由于具有较大的比表面积、较低的密度以及优良的吸附与缓释性能，逐渐成为药物/细胞递送载体、高速色谱与组织再生修复领域的研究热点。除具有一定的力学性能外，多孔微球内外互联的多孔结构与较大的孔径、孔隙率，可为细胞的粘附、迁移与增殖提供适宜的位点。其开放的内外互联孔结构提供了细胞在多孔微球内部充分和多向性的细胞间相互作用，使得载体内部有充分的氧气与营养供应。近年来，随着对多孔微球的不断开发，多孔微球已在骨、软骨、牙、肌肉、脂肪等多个组织工程领域扮演着重要的角色。

然而，在利用多孔微球构建细胞微载体的研究中，以旋转培养法为代表的传统细胞接种方法虽能使多孔微球达到一定的细胞负载量，但是接种时间长，细胞也大多分布在多孔微球的表面，限制了以聚合物多孔微球为基础的组织工程平台技术的开发。此外，在一些需要多种细胞构建工程化组织的研究中，研究者往往会设计不同或者单一微载体负载不同的细胞，然后按比例混合培养以研究细胞间相互作用以及协同组织修复的效果，使用该细胞接种方法进行接种无疑会造成大量时间与培养资源的浪费。因此，开发高效的细胞接种方法，并利用多孔微球高效负载种子细胞构建细胞微载体以及人工器官在组织修复重建领域具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于细胞三维培养的高效接种方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种将细胞接种(或灌注)于微载体的方法。

本发明提供的将细胞接种于微载体的方法包括如下步骤：将含有细胞的溶液加入至含有微载体的接种容器中，离心，得到载有细胞的微载体。

上述方法中，所述离心的条件可为50-500g离心1-6min或50-280g离心1-3min或280-500g离心1-3min或50-280g离心3-6min或280-500g离心3-6min，具体可为280g离心1min或280g离心2min或280g离心3min或280g离心4min或280g离心5min或280g离心6min，优选280g离心3min。

上述方法中，所述离心的次数大于一次，具体可为2次或3次，优选3次。

上述方法中，所述微载体可为用于细胞三维培养的多孔微球。所述多孔微球可为包含左旋聚乳酸(PLLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)原料来源的多孔微球，也可为包含其他无机或有机高分子原料来源的多孔微球，如羟基磷灰石多孔微球、胶原多孔微球、聚乳酸多孔微球、聚己内酯多孔微球、聚羟基脂肪酸酯多孔微球等。

进一步的，所述微载体为PLLA多孔微球或PLGA多孔微球。

所述PLLA多孔微球的孔径可为19-31μm，粒径可为220-310μm。

所述PLGA多孔微球的孔径可为5-44μm，粒径可为65-172μm。

再进一步的，所述PLLA多孔微球可按照如下方法进行制备：将200mg左旋聚乳酸充分溶解在二氯甲烷中制备成油相；在搅拌条件下滴加1％的NH₄HCO₃溶液形成初乳；将初乳转移至0.1％的PVA水溶液中，形成复乳，搅拌4h；收集左旋聚乳酸多孔微球，去离子水洗涤3次，0.1M的NaOH洗涤10min后去离子水洗涤3次，经Co⁶⁰辐照灭菌后于超净台内用无菌PBS溶液复洗三次，分装，用封口膜封好，4℃保存。

所述PLGA多孔微球可按照如下方法进行制备：将200mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物充分溶解在二氯甲烷中制备成油相；在搅拌条件下滴加1％的NH₄HCO₃溶液形成初乳；将初乳转移至0.1％的PVA水溶液中，形成复乳，搅拌4h；收集聚乳酸-羟基乙酸共聚物多孔微球，去离子水洗涤3次，0.1M的NaOH洗涤5min后去离子水洗涤3次，经Co⁶⁰辐照灭菌后于超净台内用无菌PBS溶液复洗三次，分装，用封口膜封好，4℃保存。

更进一步的，上述多孔微球还可按照各种常规方法进行修饰改性，由于表面所修饰材料不同，修饰方法有所不同，以多孔微球表面修饰纤维蛋白原为例说明具体修饰方法：取1mL多孔微球(湿球体积)置于15mL离心管中，离心弃除上层清液后，将其分散于5mL的PAH溶液(溶剂为0.9％NaCl溶液，PAH浓度为2mg/mL)中，置于混悬仪，旋转混合过夜，离心并用0.9％NaCl溶液洗三次，以除去过量的PAH，即为第一层；将上述所得微球悬液分散于5mL纤维蛋白原溶液(溶剂为0.9％NaCl溶液，纤维蛋白原浓度为2mg/mL)中，置于混悬仪上旋转混合6h，离心并用0.9％NaCl溶液洗三次，以除去过量的纤维蛋白原，即为第二层，重复上述步骤至第六层，得到纤维蛋白原修饰的多孔微球，将样品用6％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液交联并混悬1.5h，0.9％NaCl洗三次，除去过量的EDC，即可得到纤维蛋白原修饰的多孔微球，可冻干备用。

上述方法中，所述接种容器可为管状容器(上端开口，下端闭合)，且所述管状容器下端直径小于上端开口直径。

进一步的，所述接种容器为倒喇叭状并能承受一定强度的离心力。

更进一步的，所述接种容器为离心管，如常用的无菌离心管。

上述方法中，所述细胞可为一种细胞或两种细胞或多种细胞。

所述细胞可为常见的各种原代细胞或干细胞，如胰岛内皮细胞、胰岛素瘤细胞、单核巨噬细胞白血病细胞、耳软骨细胞、牙龈间充质细胞、牙周膜间充质细胞、成骨细胞等等。

进一步的，所述细胞为小鼠胰岛内皮细胞或小鼠胰岛素瘤细胞或小鼠单核巨噬细胞白血病细胞或耳软骨细胞，或，所述细胞为小鼠胰岛内皮细胞和小鼠胰岛素瘤细胞。

更进一步的，所述胰岛内皮细胞具体可为小鼠胰岛内皮细胞MS1。

所述胰岛素瘤细胞具体可为小鼠胰岛素瘤细胞MIN6。

所述单核巨噬细胞白血病细胞具体可为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7。

所述耳软骨细胞具体可为兔耳软骨细胞。

上述方法中，所述含有细胞的溶液的浓度可为(1-10)×10⁶个细胞/mL，具体可为1×10⁶个细胞/mL、2×10⁶个细胞/mL或4×10⁶个细胞/mL。

进一步的，所述含有细胞的溶液与所述微载体的体积比可为(1-2)mL：15μL，具体可为1mL：15μL或2mL：15μL。

更进一步的，所述含有细胞的溶液具体可为细胞培养液。所述细胞培养液可按照如下方法进行制备：在细胞培养基中培养细胞，取生长至80％融合的细胞，消化、离心、重悬，计数后用细胞培养基将细胞浓度稀释至(1-10)×10⁶个细胞/mL，得到的浓度为(1-10)×10⁶个细胞/mL的细胞悬液即为所述含有细胞的溶液。所述细胞培养基具体可为由1％双抗、10％FBS和89％DMEM培养基组成的完全培养基。

上述方法具体可包括如下步骤：

1)在接种容器中装入微载体，得到含有微载体的接种容器；

2)在所述含有微载体的接种容器中加入含有细胞的溶液，离心，重悬；

3)重复步骤2)若干次，得到载有细胞的微载体。

进一步的，所述步骤3)后还包括将载有细胞的微载体置于细胞培养容器中进行培养的步骤。

更进一步的，所述细胞培养容器可为细胞培养皿(如3.5cm细胞培养皿)。所述培养的方法可包括如下步骤：最后一次重悬后吸除细胞培养基，然后加入细胞培养基吹匀混悬，再转移至细胞培养皿中进行培养。

按照上述方法制备得到的载有细胞的微载体也属于本发明的保护范围。

为了实现上述目的，本发明还提供了如下X1)-X12)中任一种应用：

X1)上述方法在细胞三维培养中的应用；

X2)上述方法在体外细胞三维模型构建中的应用；

X3)上述方法在制备载有细胞的微载体或人工器官或注射或植入式修复材料或复合支架增强材料中的应用；

X4)上述方法在组织修复或重建中的应用；

X5)上述方法在人工器官再生中的应用；

X6)按照上述方法制备得到的载有细胞的微载体在细胞三维培养中的应用；

X7)按照上述方法制备得到的载有细胞的微载体在体外细胞三维模型构建中的应用；

X8)按照上述方法制备得到的载有细胞的微载体在制备人工器官或注射或植入式修复材料或复合支架增强材料中的应用；

X9)按照上述方法制备得到的载有细胞的微载体在组织修复或重建中的应用；

X10)按照上述方法制备得到的载有细胞的微载体在制备组织修复或重建的产品中的应用；

X11)按照上述方法制备得到的载有细胞的微载体在人工器官再生中的应用；

X12)按照上述方法制备得到的载有细胞的微载体在制备人工器官再生的产品中的应用。

本发明的有益效果：

1、节省时间：现有技术中以旋转培养法为代表的传统细胞接种方法的接种时间为20-30min，而本发明的细胞接种方法的接种时间为10-15min。

2、降低染菌风险：现有技术中以旋转培养法为代表的传统细胞接种方法需要使用器械，有接触染菌风险，细胞状态会变差，而本发明的细胞接种方法是封闭体系，较低了染菌风险。

3、操作步骤更加简单、便捷：与现有技术中以旋转培养法为代表的传统细胞接种方法相比，本发明的细胞接种方法不依靠重力，操作步骤更加简单、便捷。

4、成本低廉：本发明的细胞接种方法所使用的接种容器可为市售的离心管耗材，便宜易得，成本低廉。

本发明提供了一种简单、便捷、高效的可用于细胞三维培养的细胞接种方法，该接种方法借鉴凝胶色谱的原理，在离心力的作用下可将细胞在短时间内接种于多孔微球内部，并最大程度的减小了接种过程的染菌风险，在细胞三维培养及再生医学领域具有潜在的应用前景；且该接种方法所使用的接种容器(或装置)可为市售的离心管耗材，便宜易得，成本低廉，在科学研究与临床转化上具有很强的实用性。

附图说明

图1为实施例1所用PLLA多孔微球的扫描电镜照片。

图2为实施例2所用PLGA多孔微球的扫描电镜照片。

图3为以PLLA多孔微球为微载体接种MS1细胞得到的载MS1多孔微球的荧光图片及不同离心次数后的接种效果比较。

图4为以PLGA多孔微球为微载体接种MS1细胞得到的载MS1多孔微球的激光共聚焦图片。

图5为以PLGA多孔微球为微载体接种MIN6细胞得到的载MIN6多孔微球，并在稳定12h后进行活死细胞双染的激光共聚焦图片。

图6为以PLGA多孔微球为微载体接种RAW264.7细胞得到的载RAW264.7多孔微球的荧光图片。

图7为以PLGA多孔微球为微载体同时接种MS1细胞与MIN6细胞得到的载MS1与MIN6两种细胞多孔微球的激光共聚焦图片及MS1细胞与MIN6细胞经灌注7天后胰岛素分泌能力的观察。

图8为以PLGA多孔微球为微载体接种兔耳软骨细胞得到的载兔耳软骨细胞多孔微球的荧光图片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例除实施例1所用多孔微球为左旋聚乳酸(PLLA)多孔微球以外，其余实施例均为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)多孔微球，两种多孔微球可按照如下方法进行制备：

PLLA多孔微球：将200mg左旋聚乳酸充分溶解在二氯甲烷中制备成油相；在搅拌条件下滴加1％的NH₄HCO₃溶液形成初乳；将初乳转移至0.1％的PVA水溶液中，形成复乳，搅拌4h；收集左旋聚乳酸多孔微球，去离子水洗涤3次，0.1M的NaOH洗涤10min后去离子水洗涤3次，经Co⁶⁰辐照灭菌后于超净台内用无菌PBS溶液复洗三次，分装，用封口膜封好，4℃保存。该PLLA多孔微球的孔径在19-31μm范围内，粒径在220-310μm范围内，如图1所示。

PLGA多孔微球：将200mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物充分溶解在二氯甲烷中制备成油相；在搅拌条件下滴加1％的NH₄HCO₃溶液形成初乳；将初乳转移至0.1％的PVA水溶液中，形成复乳，搅拌4h；收集聚乳酸-羟基乙酸共聚物多孔微球，去离子水洗涤3次，0.1M的NaOH洗涤5min后去离子水洗涤3次，经Co⁶⁰辐照灭菌后于超净台内用无菌PBS溶液复洗三次，分装，用封口膜封好，4℃保存。该PLGA多孔微球的聚乳酸多孔微球的孔径在5-44μm范围内，粒径在65-172μm范围内，如图2所示。

下述实施例中涉及的细胞及来源如下：

小鼠胰岛内皮细胞(MS1)：ATCC，CRL-2279。

小鼠胰岛素瘤细胞(MIN6)：AddexBio，Catalog#:C0018008。

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)：普诺赛，CL-0190。

兔耳软骨细胞的制备方法：剪取兔耳置于75％的酒精半小时以进行灭菌，随后剥去表面兔皮，并用手术刀片轻轻刮去软骨膜。将软骨膜剔除干净后，将软骨块剪成细小碎块，用D-Hank's缓冲液冲洗多次后将其转移至15mL的离心管中。离心管中加入3mL胰酶后置于37℃培养箱中消化，每隔5min振荡一次，30min后加入适量的完全培养基终止消化。随后离心并去除上清，利用培养基洗涤3次，随后将15mL离心管中的软骨沉淀碎块颗粒转移至50mL离心管中，加入5mLⅣ型胶原酶并在37℃恒温振荡水浴锅内消化。消化完全后，离心吸弃上清，加入培养基洗3次，重悬离心管细胞沉淀并过200目细胞筛网，将过筛网得到的耳软骨原代细胞转移至培养皿中，37℃无菌培养箱中培养。

实施例1、将小鼠胰岛内皮细胞(MS1)灌注于PLLA多孔微球中及接种后增殖效果检测

一、将小鼠胰岛内皮细胞(MS1)灌注于PLLA多孔微球中

1、在超净台内将分装好的PLLA多孔微球置于15mL离心管内，PLLA多孔微球加入量为20μL，得到装有PLLA多孔微球的离心管。

2、在完全培养基(由1％双抗、10％FBS和89％DMEM培养基组成)中培养MS1细胞，取生长至80％融合的MS1细胞，消化、离心、重悬，细胞计数器计数后用完全培养基将细胞浓度稀释至10⁶个/mL，得到浓度为10⁶个/mL的MS1细胞悬液。

3、取1mL MS1细胞悬液于装有PLLA多孔微球的离心管内，然后将离心管放置于离心机内，280g离心3min，离心完毕后于超净台内用枪轻吹混悬。

4、重复2-3次上述步骤3，最后一次，吸除完全培养基，加入2mL完全培养基吹匀混悬，最后转移至3.5cm细胞培养皿。

5、利用5-氯甲基荧光素二醋酸酯(CMFDA)染料进行细胞染色，PBS洗三次后，在倒置荧光显微镜下观察。

结果如图3A所示，可见MS1细胞在多孔微球内部，且接种效果良好。且相比于离心2次，离心3次的接种效果更好(图3B和图3C)。

二、接种后增殖效果

将接种MS1细胞的多孔微球接种于6孔板中，并在倒置显微镜下观察其在0h、12h、24h、48h、72h、96h的增殖情况。

结果如图3D和图3E所示，可见MS1细胞在7天内增殖情况良好，在最初的24h MS1细胞从多孔微球上迁移下来并将多孔微球固定在孔板上。随着时间的增加，在96h已经可以看到多孔微球载体周围被MS1细胞包绕，并紧密地黏附在培养皿底部，迁移的MS1细胞与周围细胞有很高的汇合度，并呈现漩涡状生长状态，细胞活力较好。

实施例2、将MS1细胞灌注于PLGA多孔微球中

1、在超净台内将分装好的PLGA多孔微球置于15mL离心管内，PLGA多孔微球加入量为15μL，得到装有PLGA多孔微球的离心管。

2、在完全培养基中培养MS1细胞，取生长至80％融合的MS1细胞，消化、离心、重悬，细胞计数器计数后用完全培养基将细胞浓度稀释至4×10⁶个/mL，并利用DiI染料标记MS1细胞。

3、同实施例1步骤3。

4、同实施例1步骤4。

5、在共聚焦显微镜下观察。

结果如图4所示，可见细胞在多孔微球内部，并接种效果良好。

实施例3、将小鼠胰岛素瘤细胞(MIN6)灌注于PLGA多孔微球中

2、在完全培养基中培养MIN6细胞，取生长至80％融合的MIN6细胞，消化、离心、重悬，细胞计数器计数后用完全培养基将细胞浓度稀释至4×10⁶个/mL。

3、取1mL MIN6细胞悬液于装有PLGA多孔微球的离心管内，然后将离心管放置于离心机内，280g离心3min，离心完毕后于超净台内混悬。

4、重复3次上述步骤3，最后一次，吸除完全培养基，加入2mL完全培养基吹匀混悬，最后转移至3.5cm细胞培养皿。

5、稳定12h后利用活死细胞染色试剂盒(索莱宝CA1630)进行活死细胞双染并立即于共聚焦显微镜下观察。

结果如图5所示，可见细胞接种效果良好，并具有良好的细胞活力。

实施例4、将小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)灌注于PLGA多孔微球中

2、在完全培养基中培养RAW264.7细胞，取生长至80％融合的RAW264.7细胞，消化、离心、重悬，细胞计数器计数后用完全培养基将细胞浓度稀释至4×10⁶个/mL，并利用DiO染料标记RAW264.7细胞。

3、取1mL RAW264.7细胞悬液于装有PLGA多孔微球的离心管内，然后将离心管放置于离心机内，280g离心3min，离心完毕后于超净台内混悬。

4、重复3次上述步骤3，最后一次，吸除完全培养基，加入2mL完全培养基吹匀混悬，并转移至3.5cm细胞培养皿。

5、在倒置荧光显微镜下观察。

结果如图6所示，可见RAW264.7细胞在多孔微球内部，且接种效果良好。

实施例5、将MS1与MIN6细胞共同灌注于PLGA多孔微球中及接种后胰岛素分泌能力检测

一、将MS1与MIN6细胞共同灌注于PLGA多孔微球中

2、在完全培养基中分别培养MS1细胞与MIN6细胞，取生长至80％融合的MS1细胞与MIN6细胞，消化、离心、重悬，细胞计数器计数后将细胞浓度均稀释至2×10⁶个/mL，并利用DiO染料标记MS1细胞，利用DiI染料标记MIN6细胞。

3、取1mL MS1细胞悬液和1mL MIN6细胞悬液于装有PLGA多孔微球的离心管内，然后将离心管放置于离心机内，280g离心3min，离心完毕后于超净台内混悬。

5、在共聚焦显微镜下观察。

结果如图7所示，可见多孔微球内部分布着两种细胞，且对于两种细胞均接种效果良好。

二、接种后胰岛素分泌能力检测

取出培养第7天的接种MS1+MIN6的多孔微球载体，用PBS润洗两遍后，置于遇冷的4％多聚甲醛中固定。然后将样品浸入预冷的0.5％Triton X-100/PBS中放置15分钟，再用10％山羊血清溶液(Invitrogen，USA)封闭2h，封闭后利用胰岛素一抗及二抗对多孔微球载体中分泌的胰岛素进行染色和标记。最后加入200μLDapi溶液30min进行细胞核染色，并转移至共聚焦显微镜下观察。

结果如图7B所示。结果显示：MS1+MIN6经灌注后7天仍保持良好胰岛素分泌能力。

实施例6、将兔耳软骨细胞灌注于PLGA多孔微球中

2、在完全培养基中培养兔耳软骨细胞，取生长至80％融合的兔耳软骨细胞，消化、离心、重悬，细胞计数器计数后用完全培养基将细胞浓度稀释至4×10⁶个/mL，并利用DiI染料标记兔耳软骨细胞。

3、取1mL兔耳软骨细胞悬液于装有PLGA多孔微球的离心管内，然后将离心管放置于离心机内，280g离心3min，离心完毕后于超净台内混悬。

5、在倒置荧光显微镜下观察。

结果如如图8所示，可见兔耳软骨细胞在多孔微球内部，且接种效果良好。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.一种将细胞接种于微载体的方法，包括如下步骤：将含有细胞的溶液加入至含有微载体的接种容器中，离心，得到载有细胞的微载体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述离心的条件为50-500g离心1-6min。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述离心的次数大于一次。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述微载体为用于细胞三维培养的多孔微球；

或，所述多孔微球为左旋聚乳酸多孔微球或聚乳酸-羟基乙酸共聚物多孔微球；

或，所述左旋聚乳酸多孔微球的孔径为19-31μm，粒径为220-310μm；

或，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物多孔微球的孔径为5-44μm，粒径为65-172μm。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述接种容器为管状容器，且所述管状容器下端直径小于上端开口直径；

或，所述接种容器为倒喇叭状；

或，所述接种容器为离心管。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述含有细胞的溶液的浓度为(1-10)×10⁶个细胞/mL。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述含有细胞的溶液与所述微载体的体积比为(1-2)mL：15μL。

8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

1)在接种容器中装入微载体，得到含有微载体的接种容器；

2)在所述含有微载体的接种容器中加入含有细胞的溶液，离心，混悬；

3)重复步骤2)若干次，得到载有细胞的微载体。

9.按照权利要求1-8任一所述方法制备得到的载有细胞的微载体。

10.如下X1)-X12)中任一种应用：

X1)权利要求1-8任一所述方法在细胞三维培养中的应用；

X2)权利要求1-8任一所述方法在体外细胞三维模型构建中的应用；

X3)权利要求1-8任一所述方法在制备载有细胞的微载体或人工器官或注射或植入式修复材料或复合支架增强材料中的应用；

X4)权利要求1-8任一所述方法在组织修复或重建中的应用；

X5)权利要求1-8任一所述方法在人工器官再生中的应用；

X6)按照权利要求1-8任一所述方法制备得到的载有细胞的微载体在细胞三维培养中的应用；

X7)按照权利要求1-8任一所述方法制备得到的载有细胞的微载体在体外细胞三维模型构建中的应用；

X8)按照权利要求1-8任一所述方法制备得到的载有细胞的微载体在制备人工器官或注射或植入式修复材料或复合支架增强材料中的应用；

X9)按照权利要求1-8任一所述方法制备得到的载有细胞的微载体在组织修复或重建中的应用；

X10)按照权利要求1-8任一所述方法制备得到的载有细胞的微载体在制备组织修复或重建的产品中的应用；

X11)按照权利要求1-8任一所述方法制备得到的载有细胞的微载体在人工器官再生中的应用；

X12)按照权利要求1-8任一所述方法制备得到的载有细胞的微载体在制备人工器官再生的产品中的应用。