CN107185047A - 组织工程化软骨移植物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于组织工程技术领域，尤其涉及一种组织工程化软骨移植物及其制备方法。该组织工程化软骨移植物包括三维支架材料和分散在所述三维支架材料中的脐带间充质干细胞，所述三维支架材料由I型胶原蛋白和II型胶原蛋白制备。该组织工程化软骨移植物的制备方法包括如下步骤：分别获得脐带间充质干细胞悬液和三维支架材料；将脐带间充质干细胞悬液接种于三维支架材料中吸收后，得细胞‑支架复合物，并将细胞‑支架复合物初始恒温孵育3‑5h；然后置于旋转式生物反应器中旋转恒温孵育3‑7天。该组织工程化软骨移植物既促细胞增殖又促软骨基质分泌的，可满足透明软骨的完全修复，尤其是对大面积软骨缺损中心区域的修复。

Description

组织工程化软骨移植物及其制备方法
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，尤其涉及一种组织工程化软骨移植物及其制备方法。
背景技术
根据国家老龄工作委员会《中国老龄事业发展报告》，我国老年性骨关节疾病发病率高达55％，总患病人数超过1亿；因运动及交通意外等原因引起的关节软骨缺损及骨组织损伤也越来越高发。由于软骨细胞迁徙能力有限，再生能力低下，关节组织一旦受损，尤其是大面积软骨缺损及软骨下骨破坏，依靠自身组织修复再生能力难以自愈。传统手术、细胞治疗及组织工程化软骨为软骨缺损治疗的主要方法，而传统手术及单纯细胞治疗对大面积软骨缺损治疗效果有限，且远期效果下降，因此结合细胞与支架材料的组织工程化软骨是当今研发及应用的重点，现有研发的组织工程化软骨(如使用软骨细胞、I型胶原支架、PLGA支架等)对软骨修复效果有所提升，但也未能实现透明软骨的完全修复，尤其是对大面积软骨缺损中心区域的修复。
软骨细胞具有取材困难、来源有限、体外培养困难等问题，而间充质干细胞因其具有来源广泛、方便取材、分离容易、增殖能力强等优点，得到越来越广泛的应用，成为组织工程细胞研究领域的热点。脐带间充质干细胞(Umbilical cord Mesenchymal Stem Cells，UC-MSCs)具有来源广泛、增殖快、分化能力强等特点，既克服软骨细胞的缺点，又比成体骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)等在取材及细胞增殖分化方面具有一定优势，尤其对年龄较大患者优势更为明显。软骨外基质主要由II型胶原蛋白和蛋白聚糖等组成，II型胶蛋白为软骨细胞特异基质，其微环境更利于软骨特异基质的产生与分泌，利于透明软骨的生成，但II型胶原蛋白促细胞增殖能力较弱。I型胶原蛋白支架是长期以来应用较广的软骨组织工程支架材料，其在促细胞增殖方面表现优异，然而对大面积软骨缺损其仍难达到透明软骨的完全修复。
在上世纪80年代，美国宇航局生命科学部开始研究太空微重力对细胞组织的影响，为模拟微重力而设计开发出旋壁式生物反应器。培养液处于旋转流动状态，置身其中的细胞会受到流体应力，后期实验证实使用该反应器进行3D培养的细胞组织特性和基因表达更接近于正常体内组织细胞，与传统贴壁培养有显著区别，学者们纷纷将其应用在神经、肝脏、肾脏、肿瘤等方面进行研究，结果皆支持该生物反应器的优势。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中透明软骨不能完全修复的缺陷，提供一种综合了细胞与支架材料的组织工程化软骨移植物及其制备方法，旨在解决现有组织工程化软骨材料不能同时满足既促细胞增殖又促软骨基质分泌等问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供一种组织工程化软骨移植物，所述组织工程化软骨移植物包括三维支架材料和分散在所述三维支架材料中的脐带间充质干细胞，所述三维支架材料由I型胶原蛋白和II型胶原蛋白制备。
本发明提供的组织工程化软骨移植物，综合了脐带间充质干细胞来源广泛、取材方便、增殖快、分化能力强的特点，以及由I型胶原蛋白和II型胶原蛋白制备的三维支架材料的孔隙率大、孔径均匀的特点，最终使组织工程化软骨移植物既促细胞增殖又促软骨基质分泌的，可满足透明软骨的完全修复，尤其是对大面积软骨缺损中心区域的修复。
本发明另一方面提供一种组织工程化软骨移植物的制备方法，该方法包括如下步骤：
分别获得脐带间充质干细胞悬液和三维支架材料，所述三维支架材料由I型胶原蛋白和II型胶原蛋白制备；
将所述脐带间充质干细胞悬液接种于所述三维支架材料中吸收后，得细胞-支架复合物，并将所述细胞-支架复合物初始恒温孵育3-5h；
将初始恒温孵育后的所述细胞-支架复合物置于旋转式生物反应器中旋转恒温孵育3-7天，得所述组织工程化软骨移植物。
本发明提供的组织工程化软骨移植物的制备方法，利用脐带间充质干细胞增殖快、分化能力强的特点，以及由I型胶原蛋白和II型胶原蛋白制备的特有三维支架材料，结合3D动态旋转式生物反应器培养系统；方法简单易行，条件容易控制，成本低，最终得到的产品既克服了软骨细胞取材困难、来源有限、体外培养困难等问题，又能优化其促软骨基质分泌的特点，可使修复软骨组织更贴近天然软骨特性，从而实现软骨的完全修复。
附图说明
图1为本发明实施例1获得的人脐带间充质干细胞培养结果示意图；
图2为本发明实施例2制备的三维支架材料结果图；
图3为本发明实施例3制备的组织工程化软骨移植物结果图；
图4为本发明实施例3制备的组织工程化软骨移植物组织学DAPI染色效果图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一方面，本发明实施例提供了一种组织工程化软骨移植物。该组织工程化软骨移植物包括三维支架材料和分散在所述三维支架材料中的脐带间充质干细胞，所述三维支架材料由I型胶原蛋白和II型胶原蛋白制备。
上述组织工程化软骨移植物，综合了脐带间充质干细胞增殖快、分化能力强的特点，以及三维支架材料生物力学性能和生物相容性等特点，最终使组织工程化软骨移植物既可以很好地促细胞增殖又促软骨基质分泌的，可满足透明软骨的完全修复，尤其是对大面积软骨缺损中心区域的修复。
具体地，上述三维支架材料中的I型胶原蛋白和II型胶原蛋白的质量比为：(99:1)-(1:99)。I型胶原蛋白和II型胶原蛋白的质量比可以为：99:1，50:1，20:1，10:1，1:1，1:10，1:20，1:50，1:99中任意一种，本实施例中优选质量比为：1:1。在本发明提供的I型胶原蛋白和II型胶原蛋白的质量比范围内获得的三维支架材料，可显著提高其柔韧性，改善生物力学性能，更有利于脐带间充质干细胞的吸附生长。
具体地，上述三维支架材料的制备过程为：
S011：获得I型胶原蛋白和II型胶原蛋白原料；
S012：将上述I型胶原蛋白和II型胶原蛋白溶于水中得混合液，并将该混合液放置于模具中依次进行第一次冷冻、第一次真空干燥得初始支架材料；
S013：将上述初始支架材料加入交联剂溶液中进行交联反应，将交联反应后的初始支架材料中的剩余交联剂清洗干净后，依次进行第二次冷冻、第二次真空干燥得三维支架材料。
本发明实施例中利用I型胶原蛋白和II型胶原蛋白制备的三维支架材料，其孔径范围为550μm-150μm，孔隙率在85％-95％之间。孔径大小、孔隙率对接种细胞孵育有非常大的影响，本实施例制备的三维支架材料所具有的孔径范围和孔隙率，既保持材料的生物力学性能，又有效提高脐带间充质干细胞吸附渗透，使其更好孵育生长，最终得到的组织工程化软骨移植物可满足透明软骨的完全修复。
具体地，上述步骤S012中，混合液放置模具前，可先将该混合液于4-5℃条件下，冷存24-48h。在该冷存条件下，更有利于去除混合液中的气泡，最终提高三维支架材料中的微孔分布均匀性。同时，模具的大小和形状都无限制，根据临床需要的三维支架材料大小而定。本实施例中，模具可为实验室用的6孔板、12孔板、24孔板等试验器材。
具体地，上述步骤S012中，第一次冷冻的条件为：在等于或低于负20℃的温度下，冷冻24h；第一次真空干燥的时间为3-5天。上述步骤S013中的第二次冷冻的条件为：在等于或低于负20℃的温度下，冷冻24h；第二次真空干燥时间为3-5天。冷冻温度和时间影响三维支架材料的孔径，在该优选的冷冻、真空干燥条件下，得到孔径合适、生物力学性能更加稳定的三维支架材料。
具体地，上述步骤S013中的交联剂溶液为碳化二亚胺酒精溶液；交联反应的时间为12h。在该交联剂处理的时间范围内，可使I型胶原蛋白和II型胶原蛋白结合更加稳固，最终提高三维支架材料的生物力学性能。
另一方面，本发明实施例提供了一种组织工程化软骨移植物的制备方法。该制备方法包括如下步骤：
S01：分别获得脐带间充质干细胞悬液和三维支架材料，且该三维支架材料由I型胶原蛋白和II型胶原蛋白制备；
S02：将上述脐带间充质干细胞悬液接种于三维支架材料中吸收后，得细胞-支架复合物，并将该细胞-支架复合物初始恒温孵育3-5h；
S03：将初始恒温孵育后的细胞-支架复合物置于旋转式生物反应器中旋转恒温孵育3-7天，即得组织工程化软骨移植物。
上述组织工程化软骨移植物的制备方法，利用脐带间充质干细胞以及由I型胶原蛋白和II型胶原蛋白制备的特有三维支架材料，在3D动态旋转式生物反应器培养系统中制备；方法简单易行，条件容易控制，成本低，最终得到的产品可使修复软骨组织更贴近天然软骨特性，从而实现软骨的完全修复。
具体地，上述步骤S01中，取离体的脐带组织样本进行UC-MSCs的分离及鉴定获得脐带间充质干细胞悬液；而三维支架材料制备过程上面已经说明，这里不再阐述。
具体地，上述步骤S02中，脐带间充质干细胞悬液接种于三维支架材料的细胞个数为：(5-7)×106个。本实施例中，脐带间充质干细胞接种个数为5×106，在该优选的接种细胞个数范围内，更有利于脐带间充质干细胞在三维支架材料中的孵育增殖。
具体地，上述步骤S03中，初始恒温孵育的条件为：温度为37℃，CO2浓度为5％，相对湿度为95％；旋转恒温孵育的条件为：转速为10-50rpm/min，温度为37℃、CO2浓度为5％CO2，相对湿度为95％。其中，以使细胞-支架复合物悬浮最佳转速为优选转速，本实施例中优选速度为15rpm/min；在该优选的初始恒温孵育的条件和旋转恒温孵育条件下，最终得到组织工程化软骨移植物生物性能更加稳定，更有利于软骨的修复。
本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
本发明中下列实施例用到的仪器设备有：
生物安全柜：苏州净化二级安全柜；
细胞培养箱：Thermal Scientific Series II；
倒置显微镜：Leica DMIL LED；
化学发光仪：Thermal Scientific Multiscan GO；
PCR仪：Applied Biosystems Veriti 96-well Thermal Cycler；
荧光定量PCR仪：Applied Biosystems ViiA7；
离心机：Eppendorf 5804R；
流式细胞仪：BD FACSAria；
旋转式生物反应器：Synthecon；
真空冷冻干燥仪：LGJ-10C；
磁力搅拌器：KEEZO KMS151E；
-20℃冰箱：海尔；
-80℃冰箱：Thermal Scientific。
实施例1 脐带间充质干细胞分离培养
1、提供脐带间充质干细胞样品(沃顿胶分离)。
准备高压灭菌器械三套(每套配备一把剪刀和一只镊子)。将脐带样本转入10cm培养皿中，以无菌含P/S生理盐水冲洗2次。使用注射器插入血管，对脐带内的血进行冲洗。将脐带剪成2-3cm小段，分别对血管内的血液进行冲洗。沿着动脉剪开脐带，再分别剔除两条动脉和一条静脉。取沃顿胶(避开外皮)，剪至1-2mm3大小，均匀贴布于10cm培养皿底部(间隔约1cm)，再加入2-3mL培养基，至润湿所有组织块，于37℃、5％CO2条件下过夜培养，继续加入培养基盖过组织块，继续培养7-10天，可见细胞从组织块周围爬出。
2、脐带间充质干细胞培养
准备MesenGro培养液：MesenGro培养基(StemRD，MGro-500B)；另加入10％胎牛血清替代物(Compass Biomedical，PLS6)、100U/mL的青霉素/链霉素双抗(Gibco，15140-122)、7.5mg/L的阿米卡星(sigma，37517-28-5)、10μg/L的成纤维细胞生长因子(PeproTech，100-31)。
用胰蛋白酶(Gibco，25200-072)消化离心，置于T25培养瓶进行传代培养，待细胞长至80％-90％融合时，继续进行传代。培养的细胞部分用于鉴定，部分用于后续三维支架材料进行3D动态旋转式生物反应器培养。图1为人脐带间充质干细胞培养结果图，从图1可以看出，该脐带间充质干细胞成梭形贴壁培养，大小均一，形态规则，细胞完整。
进行流式鉴定：胰酶消化后，离心收集细胞，用生理盐水洗2-3次。分别进行抗体染色，阳性抗体为CD90、CD105、CD73，阴性抗体为CD34、CD45(细胞悬浮于100ML PBS中)。避光染色1h，生理盐水洗一次，悬浮于500uL PBS中，过膜，置于流式管中。通过流式细胞仪鉴定检测了软骨细胞特异分子的表达情况，结果显示阳性标志分子均检测达95％以上。本实验获取的UC-MSCs符合间充质干细胞标准。
实施例2 三维支架材料的制备
一种三维支架材料的制备方法，包括如下步骤：
S111：获得0.5g的I型胶原蛋白和0.5g的II型胶原蛋白原料。
S112：将上述I型胶原蛋白和II型胶原蛋白溶于水中得混合液，并将该混合液放置模具中依次进行第一次冷冻、第一次真空干燥，得到初始支架材料。具体过程如下：
将上述I型胶原蛋白溶于10mL去离子水中，然后搅拌过夜，使胶原蛋白完全溶解；将上述II型胶原蛋白加入到I胶原蛋白溶液中，过夜混合均匀后得混合液，并放入4℃冰箱中冷存24-48h，去除气泡。用5mL针管吸取配制好的混合液，把1mL混合液注入24孔板中的一个孔中，放入-20℃冰箱中冷冻过夜(24h)；把冷冻好的样品放入预冻好的真空冷冻干燥仪内冷冻干燥3天，得初始支架材料。
S113：将上述初始支架材料加入交联剂溶液中进行交联反应，将交联反应后的初始支架材料中的剩余交联剂清洗干净后，依次进行第二次冷冻、第二次真空干燥，得到三维支架材料。具体过程如下：
在冷冻干燥好的初始支架材料中加入1.5mL 20mM碳化二亚胺(EDC，该溶液以酒精为溶剂)，对初始支架材料进行交联12小时后，吸出交联液，以PBS浸泡清洗三遍后放入-20℃冰箱内冷冻过夜(24h)，然后放入真空冷冻干燥仪内冷冻干燥3天后制备得到三维支架材料。
该三维支架材料的宏观和微观结构如图2所示：图2(a)为三维支架材料的外观图，图2(b)为三维支架材料的微观扫描电镜图。该三维支架材料的孔径范围为550μm-150μm，孔隙率在85％-95％之间。
实施例3 组织工程化软骨移植物的制备
一种组织工程化软骨移植物的制备方法，包括如下步骤：
S11：利用实施例1培养的细胞液制备用于接种于三维支架材料中的脐带间充质干细胞悬液，利用实施例2的方法获得三维支架材料。
脐带间充质干细胞悬液的制备过程为：消化实施例1培养的重悬细胞，收集脐带间充质干细胞悬液至15ml的离心管中，在温度4℃、转速1500rpm条件下，进行离心10min，随后弃上清液，运用移液枪加入1ml的培养基，轻轻吹打，取10ul的脐带间充质干细胞悬液滴加至细胞计数板中进行计数，调整脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/ml。
S12：将上述脐带间充质干细胞悬液接种于实施例2的三维支架材料中吸收后，得细胞-支架复合物，并将该细胞-支架复合物初始恒温孵育3-5h。具体过程为：
将获得的三维支架材料置于10ml培养皿上，吸取100ul的脐带间充质干细胞悬液滴定于支架上，待三维支架材料充分吸收细胞悬液后，再按上述程序重复一次，一共重复5次，一共500ul，细胞数量可达5×106个，操作过程注意避免细胞悬液流至支架外，接种完毕后将细胞-支架复合物置于37℃、5％CO2、95％湿度的恒温细胞培养箱中孵育3h。
S13：将初始恒温孵育后的细胞-支架复合物置于旋转式生物反应器中旋转恒温孵育3-7天，即得组织工程化软骨移植物。具体过程为：
将细胞-支架复合物转移至旋转式生物反应器的单体容器中，并加入适量的软骨诱导培养基，连接生物反应器体部与控制装置，接上电源，启动反应器，调整转速为15rpm/min，再次检查仪器转态，观察复合物是否处于悬浮状态，最后将生物反应器主体部分置于37℃、5％CO2、95％湿度的恒温细胞培养箱中孵育3-7天，得组织工程化软骨移植物。该组织工程化软骨移植物的外观如图3所示。
DAPI染色检测：
取出三组样品，PBS清洗后切薄片，往样品上滴加DAPI染色液，避光室温下染色5min，吸掉染色液，置于多孔板内，放置于荧光显微镜下观察被染色的细胞在支架材料内部的分布情况。其结果过图4所示，图4显示细胞在支架内分布均匀，支架具有良好的细胞相容性。
总之，本实施例制备的组织工程化软骨移植物，既保持材料的生物力学性和生物相容性，能又保持脐带间充质干细胞增殖分化快的特点，最终可满足透明软骨的完全修复。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种组织工程化软骨移植物，其特征在于，所述组织工程化软骨移植物包括三维支架材料和分散在所述三维支架材料中的脐带间充质干细胞，所述三维支架材料由I型胶原蛋白和II型胶原蛋白制备。
2.如权利要求1所述的组织工程化软骨移植物，其特征在于，所述三维支架材料中的I型胶原蛋白和II型胶原蛋白的质量比为：(99:1)-(1:99)。
3.如权利要求2所述的组织工程化软骨移植物，其特征在于，所述I型胶原蛋白和II型胶原蛋白的质量比为：1:1。
4.如权利要求1所述的组织工程化软骨移植物，其特征在于，所述三维支架材料的制备过程为：
获得所述I型胶原蛋白和II型胶原蛋白原料；
将所述I型胶原蛋白和II型胶原蛋白溶于水中得混合液，并将所述混合液放置于模具中依次进行第一次冷冻、第一次真空干燥，得到初始支架材料；
将所述初始支架材料加入交联剂溶液中进行交联反应，将交联反应后的所述初始支架材料中的剩余交联剂清洗干净后，依次进行第二次冷冻、第二次真空干燥，得到所述三维支架材料。
5.如权利要求4所述的组织工程化软骨移植物，其特征在于，所述混合液放置所述模具前，先将所述混合液于4-5℃条件下，冷存24-48h。
6.如权利要求4所述的组织工程化软骨移植物，其特征在于，所述第一次冷冻的条件为：在等于或低于负20℃的温度下，冷冻24h；所述第一次真空干燥的时间为3-5天；和/或
所述第二次冷冻的条件为：在等于或低于负20℃的温度下，冷冻24h；所述第二次真空干燥的时间为3-5天。
7.如权利要求4-6任一所述的组织工程化软骨移植物，其特征在于，所述交联剂溶液为碳化二亚胺酒精溶液；和/或
所述交联反应的时间为12h。
8.一种组织工程化软骨移植物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
分别获得脐带间充质干细胞悬液和三维支架材料，所述三维支架材料由I型胶原蛋白和II型胶原蛋白制备；
将所述脐带间充质干细胞悬液接种于所述三维支架材料中吸收后，得细胞-支架复合物，并将所述细胞-支架复合物初始恒温孵育3-5h；
将初始恒温孵育后的所述细胞-支架复合物置于旋转式生物反应器中旋转恒温孵育3-7天，得所述组织工程化软骨移植物。
9.如权利要求8所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞悬液接种于所述三维支架材料的细胞个数为：(5-7)×106个。
10.如权利要求8所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，其特征在于，所述初始恒温孵育的条件为：温度为37℃，CO2浓度为5％，相对湿度为95％；和/或
所述旋转恒温孵育的条件为：转速为10-50rpm/min，温度为37℃、CO2浓度为5％CO2，相对湿度为95％。
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