CN117736980A - 脂肪间充质干细胞转化成软骨细胞的诱导分化培养基及其应用 - Google Patents
脂肪间充质干细胞转化成软骨细胞的诱导分化培养基及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了脂肪间充质干细胞转化成软骨细胞的诱导分化培养基及其应用；该诱导分化培养基的基础培养基中，含有营养液和诱导剂；营养液包括血替、非必要氨基酸、β‑巯基乙醇、青霉素/链霉素、地塞米松、丙酮酸钠、抗坏血酸、亚硒酸钠、转铁蛋白、重组人胰岛素、β‑甘油磷酸盐及TGF‑β1；诱导剂包括氰胺、氯化翠雀啶及脂肪间充质干细胞来源的细胞外基质。诱导剂的组分氰胺和氯化翠雀啶，能通过上调聚集蛋白聚糖和胶原蛋白II的表达而达到刺激软骨细胞生成；诱导剂的组分细胞外基质(ADSC‑ECM)能增加软骨细胞之间的粘连性，增强软骨细胞之间的信号联系，促进软骨细胞的生长和代谢，大大提高了脂肪间充质干细胞分化软骨细胞的效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物细胞培养技术领域，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞转化成软骨细胞的诱导分化培养基及其应用。
背景技术
关节软骨损伤引起的病变，在临床上较为常见，软骨创伤极难修复，因为软骨组织没有血管和神经，也就决定了软骨不可再生。关节软骨的损伤会导致患者的关节反复疼痛和活动受限，严重影响患者的日常生活。现阶段，对于关节软骨疾病的治疗，其一是，关节冲洗、微裂缝等手术治疗；其二是，自身其他部位采集软骨组织移植到缺损部分进行修复；其三，将软骨种子细胞接种到合适的生物支架材料上形成复合物植入软骨缺损出，实现软骨组织结构和功能再生。然而，治疗软管疾病的第一种方法，只适合于短期改善患者的临床症状，长期疗效不理想；第二种方法，自身可提供采集软骨组织的部位和数量有限；第三中方法，属于软骨组织工程技术，其生物支架材料、种子细胞等的选取有限，且成软骨细胞分化效率低。
发明内容
基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种可以将脂肪间充质干细胞转化成软骨细胞的诱导分化培养基，这种培养基，成本低、转化效果好等。
本发明的技术方案之一如下：
一种脂肪间充质干细胞转化成软骨细胞的诱导分化培养基，包括DMEM高糖或DMEM/F12组分的基础营养基；在所述基础培养基中含有营养液和诱导剂；其中：
所述营养液包含终浓度30~40v/v%血替、浓度1.8~2.6v/v%的非必要氨基酸、终浓度0.1~0.4v/v%的β-巯基乙醇、终浓度0.5~2v/v%的青霉素/链霉素、终浓度8~18μM的地塞米松、终浓度2~4.5mM的丙酮酸钠、终浓度0.4~2mg/L的抗坏血酸、终浓度2~8μg/L的亚硒酸钠、终浓度4~16mg/L的转铁蛋白、终浓度3~10mg/L的重组人胰岛素、终浓度5~12mM 的β-甘油磷酸盐及终浓度10~20μg/L的 TGF-β1；
所述诱导剂包含终浓度50~250μM氰胺、终浓度30~1200μM的氯化翠雀啶和终浓度10~20μg/L的脂肪间充质干细胞来源的细胞外基质。
一实施例，所述诱导分化培养基，在所述基础培养基中：
所述营养液包含终浓度25~35v/v%的血替、终浓度2~2.4v/v%的非必要氨基酸、终浓度0.2~0.3v/v%的β-巯基乙醇、终浓度1v/v%的青霉素/链霉素、终浓度10~15μM的地塞米松、终浓度2.5~4mM的丙酮酸钠、终浓度0.8~1.6mg/L的抗坏血酸、终浓度3~7μg/L的亚硒酸钠、终浓度6~12mg/L的转铁蛋白、终浓度4~8mg/L的重组人胰岛素、终浓度7~10mM 的β-甘油磷酸盐及终浓度12~16μg/L TGF-β1；
所述诱导剂包含终浓度80~220μM氰胺、终浓度100~800μM的氯化翠雀啶和终浓度12~18μg/L的脂肪间充质干细胞来源的细胞外基质。
本发明还提供一种脂肪间充质干细胞转化成软骨细胞的培养方法，包括如下步骤：
在PBS溶液中加入聚乙二醇2000、胶原蛋白与透明质酸的混合物，得到PBS混合溶液；40~50℃加热搅拌PBS混合溶液30~60min，得到包被凝胶；
将所述包被凝胶加入到培养器中，并在所述培养器的内壁形成一层凝胶膜，室温冷却并固化定型所述凝胶膜；
取P2~P5代脂肪间充质干细胞，用上述诱导分化培养基重悬所述脂肪间充质干细胞，得到细胞悬液；
将细胞悬液以滴液的形式逐滴加入到培养器中的所述凝胶膜上，形成类球状构造的细胞液珠；
将包裹培养基以接触式滴加在所述细胞液珠上，并使所述包裹培养基与细胞液珠充分融合后得到细胞混合液；其中，所述包裹培养基与细胞液珠的体积比为1:1；
将所述细胞混合液静置5min后倒置反扣所述培养器，使所述细胞液珠悬挂在所述培养器中的凝胶膜上；
将培养器放置培养箱中培养12~16天，得到诱导分化的软骨细胞。
一实施例，所述培养方法中，所述包被凝胶制备步骤中，所述聚乙二醇2000的浓度为1~5w/w%；所述胶原蛋白与透明质酸的混合物中，胶原蛋白与透明质酸的总浓度为5~10w/w%，且所述胶原蛋白和透明质酸的质量比为1：5~10。
一实施例，所述培养方法中，所述凝胶膜的厚度为0.5~1mm。
一实施例，所述培养方法中，重悬所述脂肪间充质干细胞时，细胞密度维持4×105~10×105个/mL。
一实施例，所述培养方法中，所述包裹培养基由下述工艺制得：
首先，往1000mL的DMEM高糖或DMEM/F12基础营养基中加入甲基纤维素并使甲基纤维素的含终浓度为30~50g/L；随后，于70~90℃加热搅拌20~40min；接着，停止加热后并继续搅拌冷却至20~50℃，制得所述包裹培养基。
一实施例，所述培养方法中，所述培养箱中，环境氛围为37℃、5v/v%CO2及2~8v/v%O2。
一实施例，所述培养方法中，获得诱导分化的软骨细胞后，还包括如下处理步骤：
将软骨细胞转移至培养体系中，进行细胞扩增培养。
本发明还提供上述制得的成软骨细胞在制备治疗骨关节炎药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优势：
1、诱导剂的组分氰胺，在脂肪间充质干细胞诱导转化软骨细胞过程中，产生更高的钙沉积，起到上调软骨细胞特异性基因BMP-2和Runx-2的表达，从而诱导分泌更多的BMP-2蛋白；
2、诱导剂的组分氰胺和氯化翠雀啶，能通过上调聚集蛋白聚糖和胶原蛋白II的表达而达到刺激软骨细胞生成；
3、诱导剂的组分细胞外基质(ADSC-ECM)能增加软骨细胞之间的粘连性，增强软骨细胞之间的信号联系，促进软骨细胞的生长和代谢；
4、在ADSC-ECM与凝胶膜共同作用下，脂肪间充质干细胞诱导过程中将形成一张三维结构网，该结构网可以促进脂肪间充质干细胞向软骨细胞的分化，并为软骨细胞增殖提供三维组织空间，从而提高了脂肪间充质干细胞的分化效率；
4、成软骨细胞培养方法中，诱导培养基以滴液形式逐滴加入到培养瓶中的悬滴培养法，可保持脂肪间充质干细胞在无需补液和换液的情况下保持较高的细胞活性，从而节省了细胞接种的后续补液换液操作，减少细胞接种量和培养基的使用量；同时悬滴的形式更容易使细胞聚集形成三维结构网，大大提高了脂肪间充质干细胞分化软骨细胞的效率。
附图说明
图1为软骨球阿利辛蓝染色后观察到的图片；
图2为实施例1至3及对比例1的软骨分化前后MSC分泌的BMP-2百分比柱状图；
图3为实施例1至3及对比例1的软骨分化聚集蛋白聚糖的表达率柱状图；
图4为实施例1至3及对比例1的软骨分化胶原蛋白II的表达率柱状图；
图5为实施例1至3及对比例1的相对基因表达AGG表示为log2倍变化（-ΔΔCt）率图；
图6为实施例1至3及对比例1的相对基因表达Col-Ⅱ表示为log2倍变化（-ΔΔCt）率图；
图7为实施例1至3及对比例1的相对基因表达Sox9表示为log2倍变化（-ΔΔCt）率图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
本发明提供的脂肪间充质干细胞转化成软骨细胞的诱导分化培养基，包括DMEM高糖基础培养基或DMEM/F12基础培养基，在基础培养基中包含有营养液及诱导剂；其中，基础培养基及营养液是脂肪间充质干细胞转化成软骨细胞过程中的常规培养组分，而诱导剂则对快速提升脂肪间充质干细胞转化成软骨细胞起到刺激、诱导作用。
基础培养基中，营养液包含终浓度30~40v/v%的血替、终浓度1.8~2.6v/v%的非必要氨基酸、终浓度0.1~0.4v/v%的β-巯基乙醇、终浓度0.5~2v/v%的青霉素/链霉素、终浓度8~18μM的地塞米松、终浓度2~4.5mM的丙酮酸钠、终浓度0.4~2mg/L的抗坏血酸、终浓度2~8μg/L的亚硒酸钠、终浓度4~16mg/L的转铁蛋白、终浓度3~10mg/L的重组人胰岛素、终浓度5~12mM 的β-甘油磷酸盐及终浓度10~20μg/L的TGF-β1；诱导剂则包含终浓度50~250μM的氰胺、终浓度30~1200μM的氯化翠雀啶和终浓度10~20μg/L的脂肪间充质干细胞来源的细胞外基质。
较好地，一实施例中，基础培养基中，营养液包含终浓度25~35v/v%的血替、终浓度2~2.4v/v%的非必要氨基酸、终浓度0.2~0.3v/v%的β-巯基乙醇、终浓度1v/v%的青霉素/链霉素、终浓度10~15μM的地塞米松、终浓度2.5~4mM的丙酮酸钠、终浓度0.8~1.6mg/L的抗坏血酸、终浓度3~7μg/L的亚硒酸钠、终浓度6~12mg/L的转铁蛋白、终浓度4~8mg/L的重组人胰岛素、终浓度7~10mM 的β-甘油磷酸盐及终浓度12~16μg/L TGF-β1；诱导剂则包含终浓度80~220μM的氰胺、终浓度100~800μM的氯化翠雀啶和终浓度12~18μg/L的脂肪间充质干细胞来源的细胞外基质。
本发明提供的一种脂肪间充质干细胞转化成软骨细胞的培养方法，包括如下步骤：
S1、制备包被凝胶：首先，在PBS溶液中加入聚乙二醇2000、胶原蛋白与透明质酸的混合物，得到PBS混合溶液；其次，40~50℃加热搅拌PBS混合溶液30~60min，得到包被凝胶；
S2、凝胶膜的定型与固化：将包被凝胶加入到培养器中，缓慢转动培养器并在培养器的内壁形成一层薄膜层，室温冷却后在培养器内壁固化定型形成凝胶膜，备用；
S3、制备细胞悬液：取P2~P5代新鲜收集的脂肪间充质干细胞，用上述配制的诱导分化培养基重悬脂肪间充质干细胞，得到细胞悬液；
S4、制备细胞液珠：将细胞悬液以滴液的形式逐滴加入到培养器中的凝胶膜上，形成类球状构造的细胞液珠；
S5、制备细胞混合液：将包裹培养基以接触式缓慢滴加在细胞液珠上，并使包裹培养基与细胞液珠充分融合，得到细胞混合液；
S6、软骨细胞获取：将所述细胞混合液静置5min后倒置反扣所述培养器，以悬挂细胞液珠形式将培养器放置培养箱中培养5~7天，得到诱导分化的软骨细胞；
S7、软骨细胞扩增培养：将软骨细胞转移至培养体系中，进行细胞常规扩增培养。
上述培养方法的步骤S1中，聚乙二醇2000的浓度为1~5w/w%；胶原蛋白与透明质酸的混合物中，胶原蛋白与透明质酸的总浓度为5~10w/w%，且胶原蛋白和透明质酸的质量比为1：5~10。
上述培养方法的步骤S2中，凝胶膜的厚度优选为0.5~1mm。
上述培养方法的步骤S3中，重悬所述脂肪间充质干细胞时，细胞密度维持4×105~10×105个/mL。
上述培养方法的步骤S5中，包裹培养基由下述工艺制得：
往1000mL基础培养基中加入浓度30~50g/L甲基纤维素，并于70~90℃加热搅拌20~40min，停止加热后并持续搅拌冷却至20~50℃，制得所述包裹培养基。
优选地，包裹培养基由下述工艺制得：
首先，往1000mL的DMEM高糖或DMEM/F12基础营养基中加入甲基纤维素并使甲基纤维素的终浓度为30~50g/L；随后，于70~90℃加热搅拌20~40min；接着，停止加热后并继续搅拌冷却至20~50℃，制得所述包裹培养基。
上述培养方法的步骤S5中，包裹培养基与细胞液珠的体积比为1:1。
上述培养方法的步骤S6中，培养箱中的环境氛围为37℃、5 v/v%CO2、2~8v/v%O2。
上述培养方法的步骤S7中，软骨细胞转移培养瓶中常规扩增培养工艺如下：
将接种后反扣的培养器放置37℃、5% CO2培养箱培养48h，取出正放，开盖，按每个细胞液珠滴加0.5mL新鲜的诱导分化培养基，盖盖，正放在37℃、5% CO2培养箱进行培养，后续每个2-3天显微镜观察并换液；其中，换液操作为：将正放培养器取出开盖，轻轻倾斜将液体汇在底部，吸出液体，加入等量诱导分化培养基，轻轻晃匀，继续正放培养到第12~16天后，轻拍培养器，使软骨球脱落，收集细胞，备用，如进行固定、石蜡包埋和染色等处理。
本发明上述制得的成软骨细胞可以被应用在制备治疗骨关节炎药物，或者用于制备治疗骨关节炎药物的组分。
下面通过具体实施例进行详细说明。
一、成软骨细胞制备
实施例1
配制诱导分化培养基：取1000mL DMEM高糖基础培养基，在DMEM培养基中分散有35v/v%血替、2v/v%非必要氨基酸、0.3v/v%β-巯基乙醇、1v/v%青霉素/链霉素、12μM地塞米松、3mM丙酮酸钠、1mg/L抗坏血酸、5μg/L亚硒酸钠、10mg/L转铁蛋白、7mg/L重组人胰岛素、8mM β-甘油磷酸盐、15μg/L TGF-β1、100μM氰胺、500μM氯化翠雀啶和14μg/L脂肪间充质干细胞来源的细胞外基质，配制得到诱导分化培养基；
配制包被凝胶：在100mL PBS中加入3w/w%聚乙二醇2000、7w/w%胶原蛋白(1g)与透明质酸(6g)的混合物，45℃加热40min，得到包被凝胶；其中，胶原蛋白与透明质酸的质量比为1:7；
包裹培养基制备：往1000mL DMEM高糖基础培养基中加入40g甲基纤维素并使甲基纤维素的终浓度为40g/L，并于80℃加热搅拌30min，搅拌冷却至40℃备用，并持续搅拌，制得包裹培养基；
将包被凝胶加入到培养器中并转动，在培养器内壁形成一层0.6mm厚度的凝胶膜，室温冷却固化成型；
取P2代新鲜收集的脂肪间充质干细胞，加入20mL诱导分化培养基重悬脂肪间充质干细胞，并维持细胞密度为7×105个/mL，得到细胞悬液；
将细胞悬液以滴液的形式逐滴加入到培养器内壁的凝胶膜上，形成0.2mL类球状细胞液珠；
将0.2mL包裹培养基按照缓慢接触滴加方式，在细胞液珠的正上方进行接触滴加，并使包裹培养基与细胞液珠融合，得到细胞混合液；
静置细胞混合液5min后倒置反扣培养器，以在包被凝胶表面悬挂细胞液珠形式将培养器放置培养箱中培养5~7天，培养箱中的环境为37℃、5 v/v%CO2、5v/v%O2；得到诱导分化的软骨细胞。
将获得软骨细胞转移至培养体系中，进行细胞常规扩增培养。
实施例2
配制诱导分化培养基：取1000mL DMEM/F12基础培养基，在DMEM/F12培养基中分散有30v/v%血替、1.8v/v%非必要氨基酸、0.1v/v%β-巯基乙醇、2v/v%青霉素/链霉素、18μM地塞米松、2mM丙酮酸钠、1.6mg/L抗坏血酸、3μg/L亚硒酸钠、6mg/L转铁蛋白、10mg/L重组人胰岛素、5mM β-甘油磷酸盐、12μg/L TGF-β1、250μM氰胺、100μM氯化翠雀啶和18μg/L脂肪间充质干细胞来源的细胞外基质，配制得到诱导分化培养基；
配制包被凝胶：在100mL PBS中加入1w/w%聚乙二醇2000、5w/w%胶原蛋白(1.7g)与透明质酸(3.4g)的混合物，30℃加热60min，得到包被凝胶；其中，胶原蛋白与透明质酸的质量比为1:5;
包裹培养基制备：往1000mL DMEM/F12基础培养基中加入30g甲基纤维素并使甲基纤维素的终浓度为30g/L，并于70℃加热搅拌40min，搅拌冷却至20℃备用，并持续搅拌，制得包裹培养基；
将包被凝胶加入到培养器中并转动，在培养器内壁形成一层0.5mm厚度的凝胶膜，室温冷却固化成型；
取P2代新鲜收集的脂肪间充质干细胞，加入20mL诱导分化培养基重悬脂肪间充质干细胞，并维持细胞密度为4×105个/mL，得到细胞悬液；
将细胞悬液以滴液的形式逐滴加入到培养器内壁的凝胶膜上，形成0.2mL类球状细胞液珠；
将0.2mL包裹培养基按照缓慢接触滴加方式，在细胞液珠的正上方进行接触滴加，并使包裹培养基与细胞液珠融合，得到细胞混合液；
静置细胞混合液5min后倒置反扣培养器，以在包被凝胶表面悬挂细胞液珠形式将培养器放置培养箱中培养5~7天，培养箱中的环境为37℃、5 v/v%CO2、5v/v%O2；得到诱导分化的软骨细胞。
将获得软骨细胞转移至培养体系中，进行细胞常规扩增培养。
实施例3
配制诱导分化培养基：取1000mL DMEM高糖基础培养基，在DMEM培养基中分散有40v/v%血替、2.6v/v%非必要氨基酸、0.4v/v%β-巯基乙醇、2v/v%青霉素/链霉素、15μM地塞米松、4mM丙酮酸钠、2mg/L抗坏血酸、8μg/L亚硒酸钠、16mg/L转铁蛋白、10mg/L重组人胰岛素、12mM β-甘油磷酸盐、20μg/L TGF-β1、80μM氰胺、1200μM氯化翠雀啶和10μg/L脂肪间充质干细胞来源的细胞外基质，配制得到诱导分化培养基；
配制包被凝胶：在100mL PBS中加入5w/w%聚乙二醇2000、10w/w%胶原蛋白（0.9g）与透明质酸（1.1g）的混合物，50℃加热30min，得到包被凝胶；其中，胶原蛋白与透明质酸的质量比为1:10；
包裹培养基制备：往1000mL DMEM高糖基础培养基中加入50g甲基纤维素并使甲基纤维素的终浓度为50g/L，并于90℃加热搅拌20min，搅拌冷却至50℃备用，并持续搅拌，制得包裹培养基；
将包被凝胶加入到培养器中并转动，在培养器内壁形成一层1mm厚度的凝胶膜，室温冷却固化成型；
取P5代新鲜收集的脂肪间充质干细胞，加入20mL诱导分化培养基重悬脂肪间充质干细胞，并维持细胞密度为10×105个/mL，得到细胞悬液；
将细胞悬液以滴液的形式逐滴加入到培养器内壁的凝胶膜上，形成0.2mL类球状细胞液珠；
将0.2mL包裹培养基按照缓慢接触滴加方式，在细胞液珠的正上方进行接触滴加，并使包裹培养基与细胞液珠融合，得到细胞混合液；
静置细胞混合液5min后倒置反扣培养器，以在包被凝胶表面悬挂细胞液珠形式将培养器放置培养箱中培养5~7天，培养箱中的环境为37℃、5 v/v%CO2、5v/v%O2；得到诱导分化的软骨细胞。
将获得软骨细胞转移至培养体系中，进行细胞常规扩增培养。
对比例1（培养基中不含诱导剂）
该对比例中，诱导分化培养基中不含组分氰胺、氯化翠雀啶和细胞外基质的成分。
配制诱导分化培养基：取1000mL DMEM高糖基础培养基，在DMEM培养基中分散有40v/v%血替、2.6v/v%非必要氨基酸、0.4v/v%β-巯基乙醇、2v/v%青霉素/链霉素、15μM地塞米松、4mM丙酮酸钠、2mg/L抗坏血酸、8μg/L亚硒酸钠、16mg/L转铁蛋白、10mg/L重组人胰岛素、12mM β-甘油磷酸盐和20μg/L TGF-β1，配制得到诱导分化培养基；
取P5代新鲜收集的脂肪间充质干细胞，加入20mL诱导分化培养基重悬脂肪间充质干细胞，并维持细胞密度为10×105个/mL，得到细胞悬液；
将细胞悬液以滴液的形式逐滴加入到培养器内壁的凝胶膜上，形成0.2mL类球状细胞液珠；
将接种后的培养器正放在37℃、5% CO2培养箱培养48h，取出开盖，按每个细胞液珠滴加0.5mL新鲜的诱导分化培养基，盖盖，正放在37℃、5% CO2培养箱进行培养，后续每个2-3天显微镜观察并换液；其中，换液操作为：将培养器取出正放开盖，轻轻倾斜将液体汇在底部，吸出液体，小心操作不要吸出细胞，加入等量诱导分化培养基，轻轻晃匀，继续正放培养到第12~16天后，轻拍培养器，收集细胞，进行固定、石蜡包埋和染色等处理。
将0.2mL包裹培养基按照缓慢接触滴加方式，在细胞液珠的正上方进行接触滴加，并使包裹培养基与细胞液珠融合，得到细胞混合液；
将培养器连同细胞混合液放置培养箱中静置培养，培养箱中的环境为37℃、5 v/v%CO2、5v/v%O2；得到分化阶段的软骨细胞。
二、成软骨细胞的检测试验
1、阿利辛蓝染色分析
为了方便观察和表征，分别对实施例1至3、对比例1中的软骨球进行阿利辛蓝染色观察。
1.1、阿利辛蓝染色观察具体实施步骤如下：
1)、软骨球经石蜡包埋后切片;
2)、染色步骤：
a）脱蜡和脱水；
b）阿利辛蓝染色液染色30分钟；
c）去离子水冲洗2分钟。
1.2、显微镜下观察阿利辛蓝染色效果
显微镜：倒置显微镜；型号：XD；生成商家：宁波舜宇。
如图1为显微镜下阳性对照样、实施例1至3及对比例1中的软骨球阿利辛蓝染色后观察到的图片; 其中，图1中a图片为阳性对照样的牛关节软骨组织细胞显微镜放大200倍图;图1中b图片为实施例1中制得的软骨细胞显微镜放大200倍图；图1中c图片实施例2制得软骨细胞显微镜放大200倍图；图1中d图片实施例3制得的软骨细胞显微镜放大200倍图；图1中e图片为对比例1制得软骨细胞显微镜放大200倍图。
阿利辛蓝染料用于鉴定软骨细胞负载微载体（CL + MCs）中糖胺聚糖（GAG）的存在。如上所述，对实施例样品进行组织学制备。诱导软骨形成的第12天，在制备的载玻片上评估软骨结节的形成。
如图1中b、c、d图片所示，培养到第12天，实施例1~3制得的软骨分化细胞显示出软骨形成图，钙蓝染色阳性；图1中a图为牛关节软骨组织细胞作为阳性对照，图1中e图显示对比例1制得的软骨分化细胞钙蓝染色基本为阴性，显示软骨组织未分化。因此说明：本发明提供的诱导分化培养基组分中的氰胺和氯化翠雀啶以及包被悬滴法的成软骨细胞培养方法，能有效促进脂肪间充质干细胞向成软骨细胞的分化，还能缩短诱导培养时间。
2、BMP-2的分泌量检测
通过BMP-2 ELISA试剂盒测定软骨分化前后MSC分泌的BMP-2水平。分别收集成软骨细胞培养到第12天的上清液，使用Tecan Infinite 200 PRO平板读取器和i-control软件在450nm处测量吸光度。检测数据如图2所示。
从图2结果显示，实施例1~3（已分化出软骨）的BMP-2浓度在120~140 pg/mL，为对比例1（未分化出软骨）的6倍左右；这也就从因子水平印证了氰胺和氯化翠雀啶的添加以及包被悬滴培养法对脂肪间充质干细胞向成软骨细胞的分化有效促进。
3、聚集蛋白聚糖和胶原蛋白II含量检测
采集成软骨细胞培养到第6、9、12、15天的细胞，用PBS洗涤细胞两次，并在室温下用含4%甲醛的PBS固定15min。用PBS洗涤三次后，将细胞在室温下用含0.5%皂苷和1% BSA的PBS中透化15min，然后用含3% BSA的 PBS封闭30min。然后将细胞与针对成软骨细胞的聚集蛋白聚糖和胶原蛋白II的一级抗体在4℃孵育过夜。第二天，细胞用PBS冲洗5min，并在室温下与第二抗体（FITC的驴抗山羊抗体）在黑暗中孵育1h，使用CytoFLEX流式细胞仪上样检测分析，每个样本运行两次，每次运行10000个颗粒。将数据选通在 200 和 800 的前向散射(FSC-H) 之间，以分别排除细胞碎片和细胞团；对照样仅用二抗染色。聚集蛋白聚糖的表达率详检测结果如图3所示，胶原蛋白II表达率检测结果如图4所示。图3和4显示，实施例1~3的聚集蛋白聚糖和胶原蛋白II的表达率在培养过程中均高于对比例1，且对比例1在15天的检测结果均比实施例1~3第6天的都低。实施例1~3第12和15天基本持平，说明实施例1~3在第12天后的干细胞分化软骨水平已达到较高值，远高于对比例1。
4、荧光定量PCR分析
收集第12天的软骨细胞，使用 cDNA 合成试剂盒将提取的 RNA 用于合成 cDNA，并根据人GAPDH（内参基因）、Col-Ⅱ、AGG和Sox9基因序列设计引物并合成。根据制造商的说明，使用荧光定量PCR试剂盒进行实时 RT-PCR 进行定量基因表达分析。
检测第12天的软骨细胞Col-Ⅱ、AGG和Sox9的mRNA相对表达量。将Ct值标准化为内参基因GAPDH的平均Ct值。实施例1至3及对比例1的相对基因表达表示为log2倍变化（-ΔΔCt），并与对照组的表达进行比较，其中相对基因表达设置为零，得出各组Col-Ⅱ、AGG和Sox9的mRNA相对表达量，如图5、6、7所示。图5、6、7显示，第12天实施例1~3的Col-Ⅱ、AGG和Sox9 mRNA相对表达量均高于对比例1，且Col-Ⅱ、AGG的结果与聚集蛋白聚糖和胶原蛋白II含量检测的结果相对应。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种脂肪间充质干细胞转化成软骨细胞的诱导分化培养基，其特征在于，所述诱导分化培养基包括DMEM高糖或DMEM/F12组分的基础营养基；在所述基础培养基中含有营养液和诱导剂；其中：
所述营养液包含终浓度30~40v/v%的血替、终浓度1.8~2.6v/v%的非必要氨基酸、终浓度0.1~0.4v/v%的β-巯基乙醇、终浓度0.5~2v/v%的青霉素/链霉素、终浓度8~18μM的地塞米松、终浓度2~4.5mM的丙酮酸钠、终浓度0.4~2mg/L的抗坏血酸、终浓度2~8μg/L的亚硒酸钠、终浓度4~16mg/L的转铁蛋白、终浓度3~10mg/L的重组人胰岛素、终浓度5~12mM 的β-甘油磷酸盐及终浓度10~20μg/L 的TGF-β1；
所述诱导剂包含终浓度50~250μM的氰胺、终浓度30~1200μM的氯化翠雀啶及终浓度10~20μg/L的脂肪间充质干细胞来源的细胞外基质。
2.根据权利要求1所述的诱导分化培养基，其特征在于，在所述基础培养基中：
所述营养液包含终浓度25~35v/v%的血替、中浓度2~2.4v/v%的非必要氨基酸、终浓度0.2~0.3v/v%的β-巯基乙醇、终浓度1v/v%的青霉素/链霉素、终浓度10~15μM的地塞米松、终浓度2.5~4mM的丙酮酸钠、终浓度0.8~1.6mg/L的抗坏血酸、终浓度3~7μg/L的亚硒酸钠、终浓度6~12mg/L的转铁蛋白、终浓度4~8mg/L的重组人胰岛素、终浓度7~10mM 的β-甘油磷酸盐及终浓度12~16μg/L 的TGF-β1；
所述诱导剂包含终浓度80~220μM的氰胺、终浓度100~800μM的氯化翠雀啶和终浓度12~18μg/L的脂肪间充质干细胞来源的细胞外基质。
3.一种脂肪间充质干细胞转化成软骨细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
在PBS溶液中加入聚乙二醇2000、胶原蛋白与透明质酸的混合物，得到PBS混合溶液；40~50℃加热搅拌PBS混合溶液30~60min，得到包被凝胶；
将所述包被凝胶加入到培养器中，转动培养器并在所述培养器的内壁固化形成一层凝胶膜；
取P2~P5代脂肪间充质干细胞，用如权利要求1所述的诱导分化培养基重悬所述脂肪间充质干细胞，得到细胞悬液；
将细胞悬液以滴液的形式逐滴加入到培养器中的所述凝胶膜上，形成类球状构造的细胞液珠；
将包裹培养基以接触式滴加在所述细胞液珠上，并使所述包裹培养基与细胞液珠充分融合后得到细胞混合液；其中，所述包裹培养基与细胞液珠的体积比为1:1；
将所述细胞混合液静置5min后倒置反扣所述培养器，使所述细胞液珠悬挂在所述培养器中的凝胶膜上；
将所述培养器放置培养箱中培养12~16天，得到诱导分化的软骨细胞。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述包被凝胶制备步骤中，所述聚乙二醇2000的浓度为1~5w/w%。
5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述包被凝胶制备步骤中，所述胶原蛋白与透明质酸的混合物中，胶原蛋白与透明质酸的总浓度为5~10w/w%，且所述胶原蛋白和透明质酸的质量比为1:5~10。
6.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述凝胶膜的厚度为0.5~1mm。
7.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，重悬所述脂肪间充质干细胞时，细胞密度维持4×105~10×105个/mL。
8.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述包裹培养基由下述工艺制得：
首先，往1000mL DMEM高糖或DMEM/F12组分的基础营养基中加入甲基纤维素并使甲基纤维素的终浓度为30~50g/L；随后，于70~90℃加热搅拌20~40min；接着，停止加热后并继续搅拌冷却至20~50℃，制得所述包裹培养基。
9.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述培养箱中，环境氛围为37℃、5v/v%CO2及2~8v/v%O2。
10.权利要求3至9任一所述培养方法制得的成软骨细胞在制备治疗骨关节炎药物中的应用。
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