CN107475179A - 一种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法 - Google Patents

一种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种小鼠细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：(1)组织处理器械消毒；(2)选取1～2月的雄性BALB/c小鼠，断颈处死，用手术剪分离关节囊的滑膜层和纤维层，然后取出滑膜层组织，将组织放入预冷无菌含双抗的PBS液中洗涤数次除去血渍和脂肪组织；(3)剪碎组织，并用预热的II型胶原酶和胰蛋白酶分别消化；(4)终止消化，离心，弃上清；(5)人工贴壁法接种到包被后的培养瓶；(6)孵育1～2h后，置于37℃、5％CO2环境中培养；(7)细胞形态学观察；(8)细胞传代培养；(9)细胞鉴定。本发明提供的种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法，操作简单，所得细胞数量多，成活率高，是一种理想的小鼠滑膜细胞原代分离与培养方法，为实验提供可靠的细胞资源。

Description

一种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法
技术领域
本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域，具体涉及一种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法。
背景技术
滑膜(synovium)是关节囊的内层，呈淡红色，薄而柔软，由疏松结缔组织组成。滑膜分泌滑液，在关节活动中起重要作用。正常滑膜分为两层，即薄的细胞层(内腔层)和血管层(内膜下层)。
滑膜细胞起源于骨骼胚基中的间充质。滑膜组织内包含多种细胞，如滑膜细胞、白细胞、脂肪细胞等。滑膜细胞又分A型和B型两种。巨噬细胞样A型细胞(MLC)有丝状伪足，具有吞噬功能，不具有增殖能力。B型滑膜细胞(FLC)又称成纤维滑膜细胞，分裂增殖迅速，可以体外传代培养。
滑膜细胞可以分泌多种炎症介质，如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素1(IL-1)等介质参与关节损伤的病理过程。滑膜细胞是维持关节正常功能的重要组织结构，同时也是各种关节疾病疾患时的主要病变部位，特别是内风湿性关节炎中滑膜组织的改变最为明显。体外培养滑膜细胞，检测其功能，在研究抗风湿药物及其作用机理方面具有重要意义。体外培养滑膜细胞也是研究其形态、结构和功能，及其在关节病中的作用和影响的前提和基础。
目前已经建立的小鼠滑膜细胞分离培养方法多以酶消化法为主，分离得到的细胞纯度不高，并且培养时间较长。本发明旨在提供一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的小鼠滑膜细胞的方法，建立一套完善可靠的小鼠滑膜细胞体外培养技术。
发明内容
根据上述问题，本发明提供了一种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法，该方法操作简单，细胞产量和成活率高，是一种较为理想的小鼠滑膜细胞原代培养方法，可以满足多种生理生化实验的要求。
本发明采用的的技术方案如下：
(1)将组织处理器械浸泡于浓度75％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台里晾干；
(2)选取1～2月的雄性BALB/c小鼠，颈椎脱臼法处死，置于体积分数75％的乙醇中浸泡2min；
(3)将小鼠腹面向上固定于板上，膝关节局部乙醇消毒，于膝关节正中纵行切开皮肤，分离肌肉，露出膝盖骨，继续向下分离，可见平滑光亮的滑膜组织，用手术剪分离关节囊的滑膜层和纤维层，然后取出滑膜层组织，再采用同样方法采集另一侧关节滑膜层组织；
(4)将组织放入预冷无菌含双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)PBS液(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)中，培养皿置于冰上洗涤除去血渍、外膜和脂肪组织；
(5)无菌条件下，在预冷的PBS(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)中用眼科剪将滑膜组织剪成1mm×1mm×1mm的碎块；
(6)用37℃预热的II型胶原酶和胰蛋白酶分别消化，每隔10min吹打一次；
(7)用10ml含10％大鼠血清、双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)、4～6μg/ml胰岛素的DMEM/F12(1∶1)混合培养基(简称混合培养基)终止消化，所得滤液300～400g离心10min，去掉上清液，保留沉淀；
(8)人工贴壁法接种细胞至铺多聚赖氨酸包被的的培养瓶中；
(9)倒置在37℃、5％CO2培养箱中培养1～2h，使其贴壁，沿孔边缓慢加入混合培养基，置于37℃、5％CO2环境中继续培养；
(10)细胞形态及生长情况观察；
(11)细胞传代培养：弃去培养基，用PBS(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)洗涤2～3次，用0.08％的胰蛋白酶消化3～5min，倒置显微镜下观察，当细胞脱壁，回缩呈圆形，折光度降低时加入混合培养基终止消化，用吸管轻轻吹打，制成细胞悬液，按1∶3比例进行传代，记为P1；
(12)细胞计数及存活率的测定，锥虫蓝排斥实验计算P1代细胞活细胞百分比；
(13)取P1代细胞，Giemsa染色法进行细胞纯度鉴定。
其中，步骤(2)所选的小鼠体重35±5g，1～2月雄性BALB/c小鼠。
其中，步骤(4)(5)所述的PBS已4℃预冷，PBS浓度为0.01M，PH为7.2～7.4，培养皿置于无菌操作台内的冰上，是为了使组织处于无菌、低温的环境。
其中，步骤(6)所述消化环境为37℃，5％CO2培养箱，0.1％～0.2％的II型胶原酶消化1～2h和0.1％～0.2％的胰蛋白酶消化30～40min。
其中，步骤(6)所用的胰蛋白酶含0.01％的二乙烯四乙酸二钠以吸收组织中的Ca2 +、Mg2+，从而进一步促进细胞分离。
其中，步骤(7)所述培养基为DMEM/F12(1∶1)培养基，含10％大鼠血清，100u/ml的青霉素、100u/ml的链霉素的双抗，5μg/ml的胰岛素。
其中，步骤(8)所述人工贴壁法是将组织均匀铺在培养瓶中。
其中，步骤(9)所述加入培养基过程应缓慢，勿使组织块漂起。
有益效果
本发明建立了一种简单、高效的分离培养小鼠滑膜细胞的方法，所得原代细胞经细胞形态学观察与鉴定：数量多、纯度高、活性好，细胞成活率达95％以上，细胞纯度达96％以上。
本发明采用BALB/c小鼠为材料，来源广泛。采用酶消化法和人工贴壁法相结合的分离方法，与单独贴壁法相比，其细胞迁出的速度更快，与单独的酶消化法细胞，其细胞纯度更高。两种酶分别消化，使组织得到充分消化，对细胞的损伤降到最低，有利于滑膜细胞贴壁和后期生长。
与自然贴壁法相比较，人工贴壁法能够使滑膜细胞更均匀更牢固的贴附在培养瓶壁，增强了其成活能力。自然贴壁的滑膜细胞容易脱离培养瓶，或分散不均匀造成细胞失活。
本发明采用多聚赖氨酸包被培养瓶，细胞生长状态好，可满足小鼠滑膜细胞实验的要求，多聚赖氨酸包被比APES包被制作更简单，更易保存；本方法经济实用，简便易行，有利于建立体外实验模型细胞，研究滑膜细胞的特性，为后续的实验提供可靠的细胞资源，并且为临床开展不同类型关节炎时滑膜细胞、功能结构变化以及治疗、诊断等方面的研究提供基础。
附图说明
图1培养7d的小鼠滑膜细胞图片，200×
图2培养7d的小鼠滑膜细胞图片，400×
图3培养14d的小鼠滑膜细胞图片，200×
图4培养14d的小鼠滑膜细胞图片，400×
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合附图和实例对本发明进行详细说明，本发明的保护内容不限于下述实施例。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
本实验所用的实验仪器与试剂如下：
外科手术器械一套，倒置显微镜(XDS-1A，上海)，荧光显微镜(Leica，美国)，低温离心机(TD24B-WS，上海)，超低温冰箱(中科美菱)，移液枪(Eppendorf，美国)，电子分析天平(Sartorius，美国)，超净工作台(HJ-CJ-1D，上海)，CO2细胞培养箱(SANYO MCO-17AI，日本)。
DMEM/F12(1∶1)购于Corning公司，EDTANa2购于Sigma公司，青霉素-链霉素双抗于Gibco购买，大鼠血清购买于Bioind公司，多聚赖氨酸共买于美国Gibco公司，Giemsa粉购于Sigma公司，PBS自制(8.0gNal、0.2gKCl、0.2gKH2PO4、1.44gNa2HPO4溶于1000ml去离子水中，调整PH为7.2～7.4，非特殊指出，本专利所用的PBS皆为此配方)，II型胶原酶和胰蛋白酶购买于德国Serva公司，细胞培养瓶、离心管购于美国Corning公司，锥虫蓝购买于美国Biofer。
本发明提供的技术方案包括如下步骤：
1.将组织处理器械浸泡于体积分数75％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台里晾干，选取1～2月的雄性BALB/c小鼠，颈椎脱臼法处死，置于体积分数75％的乙醇中浸泡2min；
2.将小鼠腹面向上固定于板上，膝关节局部乙醇消毒，于膝关节正中纵行切开皮肤，分离肌肉，露出膝盖骨，继续向下分离，可见平滑光亮的滑膜组织，用手术剪分离关节囊的滑膜层和纤维层，然后取出滑膜层组织，然后采用同样方法采集另一侧关节滑膜层组织；
3.将组织放入预冷无菌含双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)PBS液(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)中，培养皿置于冰上洗涤除去血渍，去除外膜和脂肪组织；
4.在无菌条件下，在预冷的PBS(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)中用眼科剪将滑膜组织剪成1mm×1mm×1mm的碎块；
5.用37℃预热的0.15g/l的II型胶原酶于37℃，CO2培养箱消化1.5h，胶原酶消化过程中每隔15min吹打一次，再用含二乙烯四乙酸二钠(0.01％EDTANa2)的0.15g/l的胰蛋白酶消化35min，胰蛋白酶消化过程中每隔10min吹打一次；
6.加入10ml含10％大鼠血清、双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)、5μg/ml胰岛素、pH为7.4的DMEM/F12(1∶1)混合培养基(简称混合培养基)终止消化，所得滤液350g离心10min，去掉上清液，保留沉淀；
7.人工贴壁法将沉淀细胞接种至铺多聚赖氨酸包被的的培养瓶中，用玻璃棒将组织细胞均匀贴于培养瓶底部，使之牢固的黏附在培养瓶底部；
8.在37℃、5％CO2培养箱中培养1～2h，使其贴壁，沿孔边缓慢加入DMEM/F12(1∶1)混合培养基，置于37℃、5％CO2环境中继续培养，每隔2～3d换一次培养液，通过换液去除未贴壁的组织块；
9.细胞形态及生长情况观察：用倒置显微镜观察滑膜细胞原代培养后的形态及生长状况，原代滑膜细胞贴壁前为圆形，6小时后开始贴壁，24小时后，均贴壁并伸出生长突，48h后细胞呈纺锤形；
10.细胞传代培养：当滑膜细胞连续成片时可进行传代，弃去培养基，用PBS(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)洗涤2～3次，用0.08％的胰蛋白酶消化3～5min，倒置显微镜下观察，当细胞脱壁，回缩呈圆形，折光度降低时加入混合培养基终止消化，用吸管轻轻吹打，制成细胞悬液，按1∶3比例进行传代，记为P1，以后同样方法进行传代；
11.细胞计数及成活率测定：锥虫蓝排斥实验，吸取0.2ml P1代细胞悬液加入0.2ml的0.4％锥虫蓝溶液，吹打均匀，然后吸取少量悬液沿细胞计数板上盖片边缘缓缓滴入，至盖片下刚好充满悬液，在倒置显微镜下观察，若细胞核未被染色则提示滑膜细胞存活，如细胞核被染蓝，提示滑膜细胞死亡，计数四个大格子细胞数(四大格细胞总数/4×104)，计算细胞成活率：活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％；
12.细胞纯度鉴定：分离的滑膜细胞经涂片和Giemsa染色，取P1代细胞，先用37℃预热的PBS淋洗小室，然后在24孔板每个小室加入1ml浓度为4％的多聚甲醛固定，同定15～20min，取出小室，再次用PBS淋洗，放在实验台上风干，再在每个孔板里加入现配的Giemsa工作液，每孔约0.8ml，染色15～20min，蒸馏水冲洗，去除小室滤膜内面多余染液，高倍下计数300个细胞，其纯度为96％以上。
高倍下计数300个细胞，小鼠滑膜细胞纯度为96％以上。
本发明所得到的小鼠滑膜细胞数量多，P1代细胞成活率达95％以上，细胞纯度达96％以上。
本发明分离所得小鼠滑膜细胞可大量增殖，并且可以原代培养3～5代，为后续的实验提供可靠的细胞资源。
以上所述，仅为本发明较佳的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此实施实例。任何在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将组织处理器械浸泡于浓度75％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台里晾干；
(2)选取1～2月的雄性BALB/c小鼠，颈椎脱臼法处死，置于体积分数75％的乙醇中浸泡2min；
(3)将小鼠腹面向上固定于板上，膝关节局部乙醇消毒，于膝关节正中纵行切开皮肤，分离肌肉，露出膝盖骨，继续向下分离，可见平滑光亮的滑膜组织，用手术剪分离关节囊的滑膜层和纤维层，然后取出滑膜层组织，然后采用同样方法采集另一侧关节滑膜层组织；
(4)将组织放入预冷无菌含双抗PBS液中，培养皿置于冰上洗涤除去血渍，去除外膜和脂肪组织，无菌条件下在预冷的PBS中用眼科剪将滑膜组织剪成1mm×1mm×1mm的碎块；
(5)用37℃预热的II型胶原酶和含二乙烯四乙酸二钠的胰蛋白酶分别消化，每隔10min吹打一次；
(6)用含大鼠血清、双抗、胰岛素的混合培养基(简称混合培养基)终止消化，所得滤液300～400g离心10min，去掉上清液，保留沉淀；
(7)人工贴壁法接种细胞至铺多聚赖氨酸包被的的培养瓶中；
(8)倒置在37℃、5％CO2培养箱中培养1～2h，使其贴壁，沿孔边缓慢加入混合培养基，置于37℃、5％CO2环境中继续培养；
(9)细胞形态及生长情况观察；
(10)细胞传代培养；
(11)细胞计数及存活率的测定；
(12)Giemsa染色法进行细胞纯度鉴定。
2.根据权利要求1所述的小鼠滑膜细胞的分离及培养方法，其特征在于所用预冷的PBS浓度为0.01M，PH为7.2～7.4。
3.根据权利要求1所述的小鼠滑膜细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(5)所述消化环境为37℃，5％CO2培养箱，0.1％～0.2％的II型胶原酶消化1～2h，再用0.1％～0.2％的胰蛋白酶消化30～40min。
4.根据权利要求3所述的小鼠滑膜细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(5)所述0.15％的II型胶原酶消化1.5h，再用含0.15％的胰蛋白酶消化35min。
5.根据权利要求4所述的小鼠滑膜细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(5)所述的0.15％的胰蛋白酶含有0.01％的二乙烯四乙酸二钠(EDTANa2)。
6.根据权利要求1所述的小鼠滑膜细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(6)所述的培养基为含10％大鼠血清、含100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的双抗、4～6μg/ml胰岛素的DMEM/F12(1∶1)培养基，pH为7.4。
7.根据权利要求1所述的小鼠滑膜细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(7)所述的培养瓶用3～4μg/cm2的多聚赖氨酸包被，培养条件为37℃、5％CO2培养箱。
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