CN111471642B - 一种基于牵张力作用高效促进滑膜细胞增殖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于牵张力作用高效促进滑膜原代细胞增殖的方法。本发明所述高效促进滑膜细胞增殖的方法，通过在滑膜细胞培养过程中，以周期性机械应力对滑膜细胞进行加力培养的方式，可以在保持滑膜原代细胞原有特性的基础上，能够促进滑膜细胞增殖，显著提高组织工程滑膜细胞的活性和生长状态，有效提高了滑膜细胞的增殖性能，只需少量的滑膜组织即可高效培养滑膜细胞；且培养的滑膜细胞活性强，形态完整，更接近体内滑膜细胞的生物学特性，为最终提升组织工程骨关节的研究及样本的高效利用提供了一条很好的途径。

Description

一种基于牵张力作用高效促进滑膜细胞增殖的方法
技术领域
本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于牵张力作用高效促进滑膜细胞增殖的方法。
背景技术
滑膜(synovium)是关节囊的内层，呈淡红色，薄而柔软，由疏松结缔组织组成。滑膜可以分泌滑液，在关节活动中起重要作用。滑膜组织是位于关节腔内面的内衬结构，各种关节内疾病都会累及滑膜，同时，近年研究发现，滑膜也参与了骨关节炎/类风湿性关节炎等疾病的整个病变过程。滑膜细胞的体外培养是研究其形态及功能的常用手段，通过体外培养滑膜细胞，并检测其功能，在骨关节炎发病机制、临床疗效作用机制、抗风湿等新型药物筛选及药理机制方面具有重要意义，而体外培养滑膜细胞也是研究其形态、结构和功能，及其在关节病中的作用和影响的前提和基础。
目前，滑膜细胞培养法有组织块培养法和酶消化法等。组织块培养法是在无菌的条件下取出滑膜组织，用无菌的PBS溶液冲洗3遍，然后用眼科剪分离滑膜周围的脂肪组织并将滑膜剪碎成1-2mm3的碎块，将碎块在细胞培养瓶底部均匀铺展，加入2ml DMEM完全培养液，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，每3-5d更换培养基并小心除去非贴壁组织块，当成纤维样滑膜细胞铺满70％-80％的瓶底时传代。酶消化法是在超净台内取出滑膜组织，用无菌PBS溶液冲洗3遍，分离滑膜组织，然后将滑膜组织充分剪碎后放入培养瓶中，用0.25％胰蛋白酶消化30min，离心弃胰酶，再加入胶原酶消化2h，最后过滤加入2ml DMEM完全培养液，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，每24h换液1次，细胞长满瓶底时进行传代。
但是，在临床应用中，组织块培养法通过体外分离培养获得的滑膜细胞生长周期长，细胞传代次数少，不利于OA的研究；酶消化法缺点是酶浓度过高或者酶消化时间过长都会对细胞造成损伤，降低细胞传代活性，而且由于酶消化时间过短，组织块消化不充分，消化分离的细胞比较少，此外，细胞过筛网时组织块容易堵塞筛孔而导致滤过的细胞量比较少，且细胞容易被污染。因此，如何在分离的滑膜细胞基础上促进滑膜原代细胞的增殖性能一直是本领域的研究热点和难点。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于牵张力作用高效促进滑膜细胞增殖的方法，该方法在保持滑膜原代细胞原有特性的基础上，能有效地增强滑膜细胞增殖能力，提高滑膜细胞活性及生长状态，为最终提升组织工程骨关节的研究及样本的高效利用提供了一条很好的途径。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种基于牵张力作用高效促进滑膜原代细胞增殖的方法，包括如下步骤：
(1)取分离的滑膜原代细胞进行传代处理，得到第二代滑膜细胞，备用；
(2)将得到的第二代滑膜细胞加胰蛋白酶液进行消化，消化结束后离心弃上清；收集沉淀物并加入含FBS的DMEM培养液重悬，形成细胞悬液，用计数板计数；
(3)将所述细胞悬液铺于细胞力学加载仪的加力硅胶板中，每孔加入含FBS的DMEM培养液，并将铺好板的细胞力学加载仪置于CO2培养箱中进行培养；
(4)培养结束后，取出细胞力学加载仪，并将所述加力硅胶板中的培养液吸出，另加入含FBS的DMEM培养液；将所述细胞力学加载仪的控制箱连接电脑，读取设备，设置力学控制参数并写入设备，将其与加力硅胶板连接并通电后，放入CO2培养箱中进行培养，即得。
具体的，所述步骤(2)中，所述胰蛋白酶液中胰蛋白酶的质量含量为0.2-0.3wt％。
具体的，所述步骤(2)中，所述DMEM培养液中FBS的质量含量为9-12wt％。
具体的，所述步骤(3)中，控制所述加力硅胶板中，每孔含2×105个细胞。
具体的，所述步骤(3)中，所述DMEM培养液中FBS的质量含量为9-12wt％。
具体的，所述步骤(3)中，所述培养步骤为35-40℃、3-8％CO2培养箱中进行培养20-30h。
具体的，所述步骤(4)中，所述DMEM培养液中FBS的质量含量为4-6wt％。
具体的，所述步骤(4)中，所述力学控制参数包括：5-8％拉伸幅度，0.4-0.6Hz，21000-22000个循环周期。
具体的，所述步骤(4)中，所述培养步骤为35-40℃、3-8％CO2培养箱中进行培养20-30h。
优选的，所述步骤(1)中，所述滑膜原代细胞按照如下步骤进行分离：
(a)取人体新鲜滑膜组织置于无菌培养皿中，采用Hank′s平衡盐混合液反复冲洗，并将清洗后的滑膜组织转移至无菌培养瓶中，以无菌剪刀剪碎，移入EP管并加入Hank′s平衡盐混合液混匀，离心并弃上清；
(b)收集离心后的沉淀物，加入含有青链霉素混合液的DMEM培养液重悬，并加入含Ⅱ型胶原酶和糖苷酶的消化液，置于CO2培养箱中进行消化培养；
(c)培养结束后，取出培养物并加入胰蛋白酶，吹打成浆状，随后用无菌细胞过滤筛过滤，收集滤液并离心，弃上清；
(d)收集离心后的沉淀物，用DMEM高糖培养液重悬沉淀物，置于细胞培养瓶于CO2细胞培养箱中，进行细胞培养，待细胞贴壁，即得所需人滑膜原代细胞。
具体的，所述步骤(a)中，所述Hank′s平衡盐包括如下成分：
Figure BDA0002423912980000031
Figure BDA0002423912980000041
具体的，所述步骤(a)中，所述剪碎步骤为将所述滑膜组织剪碎至呈泥状、无颗粒感，且体积不大于1mm3。
具体的，所述步骤(b)中，所述青链霉素在所述DMEM培养液中的质量浓度为0.5-1.5wt％。
具体的，所述步骤(b)中，所述消化液中，所述Ⅱ型胶原酶的含量为0.1-1U/mL。
具体的，所述步骤(b)中，所述消化液中，所述糖苷酶的含量为0.1-1U/mL。
具体的，所述步骤(b)中，所述消化培养步骤为35-40℃、3-8％CO2培养箱消化培养6h。
具体的，所述步骤(c)中，控制所述胰蛋白酶的含量为0.2U/每mL培养物。
具体的，所述步骤(d)中，所述DMEM高糖培养液中还包括0.5-1.5wt％青链霉素和8-12wt％澳洲胎牛血清。
具体的，所述步骤(d)中，所述细胞培养步骤为置于35-40℃、3-8％CO2恒温培养。
具体的，所述步骤(d)中，还包括在培养48h后进行更换培养液的步骤。
本发明所述基于牵张力作用高效促进滑膜细胞增殖的方法，通过在滑膜细胞培养过程中，以周期性机械应力对滑膜细胞进行加力培养的方式，可以在保持滑膜原代细胞原有特性的基础上，能够促进滑膜细胞增殖，显著提高组织工程滑膜细胞的活性和生长状态，有效提高了滑膜细胞的增殖性能，只需少量的滑膜组织即可高效培养滑膜细胞；且培养的滑膜细胞活性强，形态完整，更接近体内滑膜细胞的生物学特性，避免传统胶原酶消化法中随着传代次数增加，细胞活性逐渐降低，细胞生长周期逐渐延长等缺点，为最终提升组织工程骨关节的研究及样本的高效利用提供了一条很好的途径。
本发明所述基于牵张力作用高效促进滑膜细胞增殖的方法，操作简单，污染率低，成功率高，是一种高效、稳定、便捷的滑膜细胞增殖培养方法，具有较好的工业应用前景。
本发明所述基于牵张力作用高效促进滑膜细胞增殖的方法，进一步采用高效分离人滑膜原代细胞的方法进行细胞的分离获取，即采用Hank′s平衡盐溶液对滑膜进行预处理，并在加入Ⅱ型胶原酶和糖苷酶消化处理后于CO2培养箱中进行消化培养，随后再次加入胰蛋白酶(无需加入酚红、EDTA)进行处理；经两次酶消化后的细胞经DMEM高糖培养液重悬后再次进行CO2培养，即可高效分离人滑膜组织中的滑膜细胞。由于滑膜细胞可分泌透明质酸、粘蛋白等，且滑膜组织具有一定的粘弹性，选用含Ⅱ型胶原酶和糖苷酶的消化液进行处理，可水解糖苷键，降低滑膜组织的粘弹性，促进组织消化，进一步提高消化处理的效果，提高细胞分离的数量和质量，并大大缩短组织块贴壁时间，获得纯度高、数量足的滑膜细胞，且获得的滑膜细胞活性强，形态完整，更接近体内滑膜细胞的生物学特性。所述细胞分离方法，通过提高人滑膜细胞原代培养的得率，可显著提高临床人体滑膜标本的使用效率，并能够后续稳定培养，为骨关节的研究奠定实验基础，提高科研效率；并且，简化传统原代培养方法，操作简单，污染率低，成功率高，有助于降低成本，可得到大量的滑膜细胞，是一种高效、稳定、便捷的分离人滑膜原代细胞的培养方法，具有较好的工业应用前景。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为制备例1中分离培养的滑膜原代细胞的显微镜照片图；
图2为制备例2中分离培养的滑膜原代细胞的显微镜照片图；
图3为制备例3中分离培养的滑膜原代细胞的显微镜照片图；
图4为对比制备例1中分离培养的滑膜原代细胞的显微镜照片图；
图5为所述组织剪碎器皿的结构示意图；
图6为所述组织剪碎器皿的优选结构示意图；
图7为所述组织剪碎器皿适配支物架的结构示意图；
图8为实施例1中加力培养的滑膜细胞的显微镜照片图；
图9为对比例1中传统方法培养滑膜细胞的显微镜照片图；
图10为实施例1和对比例1中培养的滑膜细胞的增殖图；
图11为实施例2和对比例2中培养的滑膜细胞的增殖图；
图12为实施例3和对比例3中培养的滑膜细胞的增殖图。
具体实施方式
制备例
本发明下述制备例中：
所述Hank′s平衡盐混合液包括如下成分：
Figure BDA0002423912980000061
称量上述药品后，准备1000ml的烧杯，加入1000ml超纯水溶解上述药品，以磁力搅拌器助溶，使用前用蒸馏水和超纯水分别洗一次磁珠；上述药品充分溶解后，用50ml的离心管分装，在超净台内用滤膜进行过滤，以封口膜进行保存。
所述DMEM培养液成分包括(mg/L)：无水氯化钙200、硝酸铁.9H2O 0.10、氯化钾400、无水硫酸镁97.67、氯化钠6400、无水磷酸二氢钠125、L-盐酸精氨酸84、L-盐酸胱氨酸63、L-谷氨酰胺584、甘氨酸30、L-盐酸组氨酸42、L-异亮氨酸105、L-亮氨酸105、L-盐酸赖氨酸146、L-加硫氨酸30、L-苯丙氨酸66、L-丝氨酸42、L-苏氨酸95、L-色氨酸16、L-酪氨酸钠盐104、L-缬氨酸94、D-泛酸钙4、氯化胆碱4、叶酸4、肌醇7.20、烟酰胺4、核黄素0.40、盐酸硫胺4、盐酸吡哆辛4、葡萄糖1000、丙酮酸钠110。
所述DMEM高糖培养基成分包括(mg/L)：无水氯化钙200、硝酸铁.9H2O0.10、氯化钾400、无水硫酸镁97.67、氯化钠6400、无水磷酸二氢钠125、L-盐酸精氨酸84、L-盐酸胱氨酸63、L-谷氨酰胺584、甘氨酸30、L-盐酸组氨酸42、L-异亮氨酸105、L-亮氨酸105、L-盐酸赖氨酸146、L-加硫氨酸30、L-苯丙氨酸66、L-丝氨酸42、L-苏氨酸95、L-色氨酸16、L-酪氨酸钠盐104、L-缬氨酸94、D-泛酸钙4、氯化胆碱4、叶酸4、肌醇7.20、烟酰胺4、核黄素0.40、盐酸硫胺4、盐酸吡哆辛4、葡萄糖4500、丙酮酸钠110、青链霉素1wt％、澳洲胎牛血清10wt％。
传统方法中进行组织剪碎时，通常是在平底的培养皿中剪碎，组织剪碎过程中比较分散，效率低，且接触空气面积大，组织容易干。本发明下述各实施例中，所述步骤(1)中的剪碎步骤优选以如附图5-7所示的小型组织剪碎器皿进行剪碎操作。如图5所示结构的组织剪碎器皿，其具有漏斗形状且封底的结构；进一步的，如图6所示的结构，所述组织剪碎皿还可以包括皿盖，方便实验等待消化时盖上盖子，避免污染；优选涉及皿盖直径大于组织剪碎皿直径，使得皿盖具有边沿儿，方便手拿，减少污染率；进一步的，所述组织剪碎器皿还包括如图7所示的支物架，所述支物架上至少设置一排能够放置组织剪碎器皿的插孔，每排设置若干个插孔，方便组织剪碎皿的放置。本发明采用的组织剪碎器皿由于组织剪碎过程中比较集中，剪碎效率高，与空气接触面积小，组织不易发干，且漏斗状方便手拿。
制备例1
取人体新鲜滑膜组织6.7g(观察疏松结缔组织，淡红色，表面平滑闪光，薄而柔润，边缘有绒毛刷状)放于直径为10cm的无菌培养皿中，采用Hank′s平衡盐混合液反复冲洗4-5次，直至残留血液漂洗干净。将组织转移到直径为3.5cm的无菌培养瓶中，采用无菌剪刀剪碎滑膜组织40-60min，剪碎呈泥状、无颗粒感且体积尺寸不大于1mm3；用3ml无菌巴氏管移入EP管中，再用Hank′s平衡盐混合液冲洗培养皿后移入EP管中，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min。离心后的沉淀去上清，加入3ml含有1％青链霉素混合液的DMEM培养液，并加入300μl含0.5U/ml II型胶原酶和0.5U/ml糖苷酶的消化液，用无菌巴氏管重悬滑膜细胞沉淀，将培养皿盖无菌消毒后盖上，置于37℃、5％CO2培养箱中消化反应6h。消化结束后取出培养物，在超净台内加入3ml胰蛋白酶(0.25％，无酚红无EDTA)，使胰蛋白酶的含量为0.2U/每mL组织，吹打成浆状(约20min左右)。用70μm孔径的无菌细胞过滤筛过滤，滤液收集至10ml离心管中，1500rpm离心5min，弃上清。收集沉淀用DMEM高糖培养基重悬沉渣，并均匀分至细胞培养瓶中，每瓶不超过5ml，置于37℃、5％CO2且湿度适宜的恒温细胞孵育箱中，待细胞贴壁，并于48h后做换液处理。
本制备例中分离得到的滑膜原代细胞的显微镜照片图见附图1所示，可见，分离的细胞生长状态良好，形态以长梭形为主，形态典型且、数量较多且细胞较纯。
本制备采用方法可有效去除非滑膜细胞，得到大数量的滑膜细胞，并可进行细胞传代、冻存、复苏，而后续研究也表明，高效分离的滑膜细胞不仅生长状态良好，数量较多，且增殖较快，较易达到实验所需数量。
制备例2
取人体新鲜无菌滑膜组织5.2g(观察疏松结缔组织，淡红色，表面平滑闪光，薄而柔润，边缘有绒毛刷状)放于直径为10cm的无菌培养皿中，采用Hank′s平衡盐混合液反复冲洗45次，至残留血液漂洗干净。将组织转移到直径为3.5cm的无菌培养瓶中，用无菌剪刀剪碎滑膜组织40-60min，呈泥状、无颗粒感，且体积尺寸不大于1mm3；用3ml无菌巴氏管移入EP管中，再用Hank′s平衡盐混合液冲洗培养皿后移入EP管中，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min。离心后的沉淀去上清，沉淀物加入3ml含有1％青链霉素混合液的DMEM培养液，并加入300μl含0.1U/ml II型胶原酶和1U/ml糖苷酶的消化液，用无菌巴氏管重悬滑膜细胞沉淀，将培养皿盖无菌消毒后盖上，置于37℃、5％CO2培养箱中消化培养6h。培养结束后取出培养物在超净台内加入3ml胰蛋白酶(0.25％，无酚红无EDTA)，使胰蛋白酶的含量为0.2U/每mL组织，吹打成浆状(约20min左右)。用70μm孔径的无菌细胞过滤筛过滤，滤液收集至10ml离心管中，1500rpm离心5min，弃上清。收集沉淀物用DMEM高糖培养基重悬沉渣，并均匀分至细胞培养瓶中，每瓶不超过5ml，置于37℃、5％CO2且湿度适宜的恒温细胞孵育箱中，待细胞贴壁，并于48h后换液处理。
本制备例中分离得到的滑膜原代细胞的显微镜照片图见附图2所示，可见，分离的细胞生长状态良好，形态以长梭形为主，形态典型、数量较多且细胞较纯。
本制备例所述细胞分离方法可有效去除非滑膜细胞，得到大数量的滑膜细胞，并可进行细胞传代、冻存、复苏，而后续研究也表明，高效分离的滑膜细胞不仅生长状态良好，数量较多，且增殖较快，较易达到实验所需数量。
制备例3
取人体新鲜无菌滑膜组织5.6g(观察疏松结缔组织，淡红色，表面平滑闪光，薄而柔润，边缘有绒毛刷状)放于直径为10cm的无菌培养皿中，采用Hank′s平衡盐混合液反复冲洗4-5次，至残留血液漂洗干净。将组织转移到直径为3.5cm的无菌培养瓶中，用无菌剪刀剪碎滑膜组织40-60min，呈泥状、无颗粒感，且体积尺寸不大于1mm3；用3ml无菌巴氏管移入EP管中，再用Hank′s平衡盐混合液冲洗培养皿后移入EP管中，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min。离心后的沉淀去上清，沉淀物加入3ml含有1％青链霉素混合液的DMEM培养液，并加入300μl含1U/ml II型胶原酶和0.1U/ml糖苷酶的消化液，用无菌巴氏管重悬滑膜细胞沉淀，将培养皿盖无菌消毒后盖上，置于37℃、5％CO2培养箱中消化培养6h。培养结束后取出在超净台内加入3ml胰蛋白酶(无酚红无EDTA)，使胰蛋白酶的含量为0.2U/每mL组织，吹打成浆状(约20min左右)。用70μm孔径的无菌细胞过滤筛过滤，滤液收集至10ml离心管中，1500rpm离心5min，弃上清。收集沉淀物用DMEM高糖培养基重悬沉渣，并均匀分至细胞培养瓶中，每瓶不超过5ml，置于37℃、5％CO2且湿度适宜的恒温细胞孵育箱中，待细胞贴壁，并于48h后换液处理。
本制备例中分离得到的滑膜原代细胞的显微镜照片图见附图3所示，可见，分离的细胞生长状态良好，形态以长梭形为主，形态典型、数量较多且细胞较纯。
本制备例所述细胞分离方法可有效去除非滑膜细胞，得到大数量的滑膜细胞，并可进行细胞传代、冻存、复苏，而后续研究也表明，高效分离的滑膜细胞不仅生长状态良好，数量较多，且增殖较快，较易达到实验所需数量。
对比制备例1
本对比制备例所述细胞的分离方法同制备例1，其区别仅在于，在所述消化液中不添加糖苷酶。本对比制备例分离得到的滑膜原代细胞的显微镜照片图见附图4所示(与附图1-3相同倍数)，可见分离细胞比较少，且分离细胞也并不纯。
实施例
本发明下述实施例中：
所述DMEM培养液成分包括(mg/L)：无水氯化钙200、硝酸铁.9H2O 0.10、氯化钾400、无水硫酸镁97.67、氯化钠6400、无水磷酸二氢钠125、L-盐酸精氨酸84、L-盐酸胱氨酸63、L-谷氨酰胺584、甘氨酸30、L-盐酸组氨酸42、L-异亮氨酸105、L-亮氨酸105、L-盐酸赖氨酸146、L-加硫氨酸30、L-苯丙氨酸66、L-丝氨酸42、L-苏氨酸95、L-色氨酸16、L-酪氨酸钠盐104、L-缬氨酸94、D-泛酸钙4、氯化胆碱4、叶酸4、肌醇7.20、烟酰胺4、核黄素0.40、盐酸硫胺4、盐酸吡哆辛4、葡萄糖1000、丙酮酸钠110。
所述细胞力学加载仪为MechanoCulture FX2，按照说明组装完毕，并安装加力板，进行紫外灭菌。
实施例1
取按照上述制备例1中方法分离后的滑膜原代细胞(鱼群样的，梭形形态)长满培养瓶后进行常规传代培养(0.25％胰酶消化1-2min)，获得第二代滑膜细胞，将第二代滑膜细胞每瓶用1ml、0.25％胰蛋白酶液进行消化处理，消化结束后，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后去上清。用1ml含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液将收集的滑膜细胞沉淀物重悬，直到看不到组织团块为止，形成细胞悬液，用计数板进行细胞计数。将所述细胞悬液铺于细胞力学加载仪的加力硅胶板中，控制每孔2×105个细胞，并每孔加入200ul含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液，共16孔。将铺好板的细胞力学加载仪置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养24h。培养结束后，取出细胞力学加载仪，将加力硅胶板中培养液吸出，并加入含5％FBS(Gibco)的DMEM培养液。将细胞力学加载仪的Control Box连接电脑，读取设备，设置参数为：6％拉伸幅度，0.5Hz，21600个循环周期，写入设备后，将ControlBox与加力板连接并通电，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。培养结束后，倒置显微镜下观察细胞形态。
本实施例经加力培养后的滑膜细胞的显微镜照片见附图8所示，可见，按照上述方法可有效去除软骨细胞等非滑膜细胞，得到大数量的滑膜细胞，并可进行细胞传代、冻存、复苏；而且，加力培养的滑膜细胞生长状态良好，细胞形态以梭形为主，两级胞突细长，末端多与邻近细胞连接并交织成网状。
对比实施例1
本对比实施例所述细胞增殖的方法及细胞来源及分离方法均与实施例1相同，其区别仅在于，所述细胞培养的步骤为常规培养，而不进行加力控制。
本对比实施例经常规方法培养后的滑膜细胞的显微镜照片见附图9所示，可见，对照组滑膜细胞呈明显衰老凋亡状态，形态多呈星形及不规则形，细胞体积增大，细胞突起呈树突状，且由次级突起。
实施例2
取按照上述制备例2中方法分离后的滑膜原代细胞长满培养瓶后进行常规传代培养(同实施例1)，获得第二代滑膜细胞，将第二代滑膜细胞每瓶用1ml、0.25％胰蛋白酶液进行消化处理，消化结束后，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后去上清。用1ml含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液将收集的滑膜细胞沉淀物重悬，直到看不到组织团块为止，形成细胞悬液，用计数板进行细胞计数。将所述细胞悬液铺于细胞力学加载仪的加力硅胶板中，控制每孔2×105个细胞，并每孔加入200ul含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液，共16孔。将铺好板的细胞力学加载仪置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养24h。培养结束后，取出细胞力学加载仪，将加力硅胶板中培养液吸出，并加入含5％FBS(Gibco)的DMEM培养液。将细胞力学加载仪的Control Box连接电脑，读取设备，设置参数为：6％拉伸幅度，0.5Hz，21600个循环周期，写入设备后，将Control Box与加力板连接并通电，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。培养结束后，倒置显微镜下观察细胞形态。
对比实施例2
本对比实施例所述细胞增殖的方法及细胞来源及分离方法均与实施例2相同，其区别仅在于，所述细胞培养的步骤为常规培养，而不进行加力控制。
经观察，按照本实施例方法可有效去除软骨细胞等非滑膜细胞，得到大数量的滑膜细胞，并可进行细胞传代、冻存、复苏，而经过加力培养的滑膜细胞生长状态良好，细胞形态以梭形为主，两级胞突细长，末端多与邻近细胞连接并交织成网状。而对比实施例组得到的滑膜细胞呈明显衰老凋亡状态，形态多呈星形及不规则形，细胞体积增大，细胞突起呈树突状，且由次级突起。
实施例3
取按照传统方法分离后的滑膜原代细胞长满培养瓶后进行常规传代培养(同实施例1)，获得第二代滑膜细胞，将第二代滑膜细胞每瓶用1ml、0.25％胰蛋白酶液进行消化处理，消化结束后，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后去上清。用1ml含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液将收集的滑膜细胞沉淀物重悬，直到看不到组织团块为止，形成细胞悬液，用计数板进行细胞计数。将所述细胞悬液铺于细胞力学加载仪的加力硅胶板中，控制每孔2×105个细胞，并每孔加入200ul含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液，共16孔。将铺好板的细胞力学加载仪置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养24h。培养结束后，取出细胞力学加载仪，将加力硅胶板中培养液吸出，并加入含5％FBS(Gibco)的DMEM培养液。将细胞力学加载仪的Control Box连接电脑，读取设备，设置参数为：6％拉伸幅度，0.5Hz，21600个循环周期，写入设备后，将Control Box与加力板连接并通电，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。培养结束后，倒置显微镜下观察细胞形态。
对比实施例3
本对比实施例所述细胞增殖的方法及细胞来源及分离方法均与实施例3相同，其区别仅在于，所述细胞培养的步骤为常规培养，而不进行加力控制。
经观察，按照本实施例方法可有效去除软骨细胞等非滑膜细胞，得到大数量的滑膜细胞，并可进行细胞传代、冻存、复苏，而经过加力培养的滑膜细胞生长状态良好，细胞形态以梭形为主，两级胞突细长，末端多与邻近细胞连接并交织成网状。而对比实施例组得到的滑膜细胞呈明显衰老凋亡状态，形态多呈星形及不规则形，细胞体积增大，细胞突起呈树突状，且由次级突起。
实施例4
取按照上述制备例2中方法分离后的滑膜原代细胞长满培养瓶后进行常规传代培养，获得第二代滑膜细胞，将第二代滑膜细胞每瓶用1ml、0.2％胰蛋白酶液进行消化处理，消化结束后，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后去上清。用1ml含9％FBS(Gibco)的DMEM培养液将收集的滑膜细胞沉淀物重悬，直到看不到组织团块为止，形成细胞悬液，用计数板进行细胞计数。将所述细胞悬液铺于细胞力学加载仪的加力硅胶板中，控制每孔2×105个细胞，并每孔加入200ul含9％FBS(Gibco)的DMEM培养液，共16孔。将铺好板的细胞力学加载仪置于35℃、8％CO2培养箱中进行培养24h。培养结束后，取出细胞力学加载仪，将加力硅胶板中培养液吸出，并加入含4％FBS(Gibco)的DMEM培养液。将细胞力学加载仪的Control Box连接电脑，读取设备，设置参数为：5％拉伸幅度，0.6Hz，21000个循环周期，写入设备后，将Control Box与加力板连接并通电，于35℃、8％CO2培养箱中培养24h。培养结束后，倒置显微镜下观察细胞形态。
经观察，按照本实施例方法可有效去除软骨细胞等非滑膜细胞，得到大数量的滑膜细胞，并可进行细胞传代、冻存、复苏，而经过加力培养的滑膜细胞生长状态良好，细胞形态以梭形为主，两级胞突细长，末端多与邻近细胞连接并交织成网状。
实施例5
取按照传统方法分离后的滑膜原代细胞长满培养瓶后进行常规传代培养，获得第二代滑膜细胞，将第二代滑膜细胞每瓶用1ml、0.3％胰蛋白酶液进行消化处理，消化结束后，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后去上清。用1ml含12％FBS(Gibco)的DMEM培养液将收集的滑膜细胞沉淀物重悬，直到看不到组织团块为止，形成细胞悬液，用计数板进行细胞计数。将所述细胞悬液铺于细胞力学加载仪的加力硅胶板中，控制每孔2×105个细胞，并每孔加入200ul含12％FBS(Gibco)的DMEM培养液，共16孔。将铺好板的细胞力学加载仪置于40℃、3％CO2培养箱中进行培养24h。培养结束后，取出细胞力学加载仪，将加力硅胶板中培养液吸出，并加入含6％FBS(Gibco)的DMEM培养液。将细胞力学加载仪的Control Box连接电脑，读取设备，设置参数为：8％拉伸幅度，0.4Hz，22000个循环周期，写入设备后，将Control Box与加力板连接并通电，于40℃、3％CO2培养箱中培养24h。培养结束后，倒置显微镜下观察细胞形态。
经观察，按照本实施例方法可有效去除软骨细胞等非滑膜细胞，得到大数量的滑膜细胞，并可进行细胞传代、冻存、复苏，而经过加力培养的滑膜细胞生长状态良好，细胞形态以梭形为主，两级胞突细长，末端多与邻近细胞连接并交织成网状。
实验例
分别以上述实施例1-3及对比实施例1-3中培养后的滑膜细胞进行增殖实验，具体操作包括：
(1)收集滑膜细胞，调整浓度至2500细胞/ml，接种于96孔培养板，每孔200μl，每组每天5个重复；
(2)贴壁培养12h后，于第一天更换新鲜的200μl培养液，并向细胞内加入20μlCellTiter
Figure BDA0002423912980000151
AQueous One Solution Reagent，37℃、5％CO2培养箱培养4h；空白对照为200μl不含细胞的培养液，直接加入20μl CellTiter
Figure BDA0002423912980000152
AQueous One SolutionReagent；
(3)用酶标仪于490nm读取吸光值(OD490)；
(4)按照(2)和(3)的操作，每24h重复测定一次，连续检测7天，根据OD490绘制细胞增殖曲线。
实施例1及对比实施例1、实施例2及对比实施例2、实施例3及对比实施例3中或的滑膜细胞的增殖曲线图分别见附图10-12。
可见，本发明所述促进滑膜细胞增殖的方法，通过对周期性机械应力滑膜细胞进行加力培养的方式，有效提高了滑膜细胞的增殖性能，在保持滑膜原代细胞原有特性的基础上，能够促进滑膜细胞增殖，显著提高组织工程滑膜细胞的活性和生长状态，且培养的滑膜细胞活性强，形态完整，更接近体内滑膜细胞的生物学特性，避免传统胶原酶消化法中随着传代次数增加，细胞活性逐渐降低，细胞生长周期逐渐延长等缺点。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种基于牵张力作用高效促进滑膜细胞增殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取分离的滑膜原代细胞进行传代处理，得到第二代滑膜细胞，备用；
所述滑膜原代细胞按照如下步骤进行分离：
(a)取人体新鲜滑膜组织置于无菌培养皿中，采用Hank′s平衡盐混合液反复冲洗，并将清洗后的滑膜组织转移至无菌培养瓶中，以无菌剪刀剪碎，移入EP管并加入Hank′s平衡盐混合液混匀，离心并弃上清；
(b)收集离心后的沉淀物，加入含有青链霉素混合液的DMEM培养液重悬，并加入含Ⅱ型胶原酶和糖苷酶的消化液，置于CO2培养箱中进行消化培养；
(c)培养结束后，取出培养物并加入胰蛋白酶，吹打成浆状，随后用无菌细胞过滤筛过滤，收集滤液并离心，弃上清；
(d)收集离心后的沉淀物，用DMEM高糖培养液重悬沉淀物，置于细胞培养瓶于CO2细胞培养箱中，进行细胞培养，待细胞贴壁，即得所需人滑膜原代细胞；
(2)将得到的第二代滑膜细胞加胰蛋白酶液进行消化，消化结束后离心弃上清；收集沉淀物并加入含FBS的DMEM培养液重悬，形成细胞悬液，用计数板计数；
(3)将所述细胞悬液铺于细胞力学加载仪的加力硅胶板中，每孔加入含FBS的DMEM培养液，并将铺好板的细胞力学加载仪置于CO2培养箱中进行培养；
(4)培养结束后，取出细胞力学加载仪，并将所述加力硅胶板中的培养液吸出，另加入含FBS的DMEM培养液；将所述细胞力学加载仪的控制箱连接电脑，读取设备，设置力学控制参数并写入设备，所述力学控制参数包括：5-8％拉伸幅度，0.4-0.6Hz，21000-22000个循环周期，将其与加力硅胶板连接并通电后，放入CO2培养箱中进行培养，即得。
2.根据权利要求1所述基于牵张力作用高效促进滑膜细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述胰蛋白酶液中胰蛋白酶的质量含量为0.2-0.3wt％。
3.根据权利要求2所述基于牵张力作用高效促进滑膜细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述DMEM培养液中FBS的质量含量为9-12wt％。
4.根据权利要求3所述基于牵张力作用高效促进滑膜细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，控制所述加力硅胶板中，每孔含2×105个细胞。
5.根据权利要求4所述基于牵张力作用高效促进滑膜细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述DMEM培养液中FBS的质量含量为9-12wt％。
6.根据权利要求5所述基于牵张力作用高效促进滑膜细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述培养步骤为35-40℃、3-8％CO2培养箱中进行培养20-30h。
7.根据权利要求1-6任一项所述基于牵张力作用高效促进滑膜细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述DMEM培养液中FBS的质量含量为4-6wt％。
8.根据权利要求7所述基于牵张力作用高效促进滑膜细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述培养步骤为35-40℃、3-8％CO2培养箱中进行培养20-30h。
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