CN101955884B - 一种从组织中分离原代细胞的装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从组织中分离原代细胞的装置，包括有细胞分离容器，其特征在于：所述的细胞分离容器还通过第一管道连接设置有酶液容器，所述的细胞分离容器还通过第二管道连接设置有细胞回收容器；所述细胞分离容器的内部，连通所述第二管道的开口处还设置有滤网；所述酶液容器和细胞分离容器之间的所述第一管道上设置有第一限速开关。本发明能保护细胞免受长时间胰酶损伤。由于细胞分离容器消化下来的细胞可迅速通过管道进入细胞回收容器，而脱离胰酶接触并得到胎牛血清的保护，故心肌细胞的损伤较传统方法减少，有助于增强细胞活力，提高细胞产量。另外，还减少了操作步骤与劳动强度，降低了污染的风险。

Description

一种从组织中分离原代细胞的装置

技术领域

本发明涉及一种未分化的人类、动物或植物细胞，如细胞系、组织的培养或维持的技术领域，具体涉及一种从组织中分离原代细胞的装置。

背景技术

细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。由于医学科学迅猛发展，细胞培养技术现已广泛应用于基础医学和临床医学的各个领域。机体组织是细胞的重要来源。从机体组织中获得细胞进行原代培养是一项重要的实验技术。

目前从机体组织中获得细胞进行原代培养主要是通常使用酶消化方法。胰蛋白酶和胶原酶是生物医学相关领域细胞培养最常用到的酶，其主要作用是使细胞间的蛋白质或胶原水解，使细胞相互离散。将一定浓度的酶溶解于缓冲液中，在合适温度(一般是37度)下，对剪碎的组织块进行消化，继而通过过量血清(一般为10％胎牛血清)中止消化反应，然后低速离心等步骤收集细胞进行原代培养。

下面以从大鼠心肌组织中获得心肌细胞培养为例，对酶消化方法作一说明：

心肌培养方法主要包括如下步骤：

1.无菌超净台内无菌分离胎鼠(出生后1-3天)的心脏，剪成1mm3的碎块，清洗后倒入一个小烧杯中。

2.抽取预先配制的0.1％胰酶溶液5ml，倒入小烧杯。心脏组织碎块完全充分浸没于胰酶溶液中。放入一个大小合适的磁力搅拌子。

3.预先准备一个带有温度计大小合适的温控装置(一般为水浴装置)，使温度稳定于37度。将盛有心脏碎块和胰酶溶液及磁力搅拌子的小烧杯放于水浴装置中，打开磁力搅拌器电源，调整转速为60-80转/分钟。使磁力搅拌子在磁力搅拌子在小烧杯内自由转动，以充分打散组织碎块，阻止粘连。此时，胰酶溶液中的酶开始对组织进行消化，随着磁力搅拌子的转动，不断有心肌细胞从组织块中分离进入胰酶溶液中。消化时间一般设定为8-10分钟。

4.到达消化时间后，取下小烧杯，关闭磁力搅拌器，用一个吸管轻轻吹打使消化下来的细胞后，加入10％血清中和胰酶以中止消化反应，防止细胞损伤。

5.将消化来的细胞离心后，收集于另外一个离心管中，低速离心(1200转/分钟，约5分钟)后，收集细胞。

6.此时小烧杯中仍有较多量未被消化的组织，再在小烧杯中加入胰酶溶液，重复2-5步骤操作(一般需要重复6-8次方能将组织充分消化)。

7.收集细胞静置2小时后，移至培养瓶或培养皿进行培养。

但是，上述步骤中存在如下缺点：

1.细胞无谓损伤，影响细胞活力及生存。在步骤3中，较早从组织块中分离下来的心肌细胞仍然持续暴露于胰酶作用下。由于胰酶接触时间的长短与心肌细胞的损伤直接相关，故多余时间的胰酶接触直接造成细胞无谓损伤，影响细胞活力和生存，减少细胞产量，影响后续研究。

2.操作繁琐，耗时长。实践中，步骤2-5需要重复6到8次，才能将组织充分消化。每次均需要重复关闭磁力搅拌器电源，对消化下来的细胞进行吹打、转移、离心及收集等步骤，操作繁琐。一个熟练技术人员一般需要2-3小时方能全部完成，劳动强度较大，费时费力。

3.增加细胞污染的机会。由于操作步骤繁多，细胞需要反复进出超净台，增加了污染的机率。如果下一步进行干预实验，因为不能加入抗生素对抗细菌，则可能导致本次细胞培养完全失败。

发明内容

本发明的目的是针对现有细胞分离培养装置操作繁琐、细胞损伤率高及细胞污染机率高等不足，提供了一种操作简单、细胞损伤率低、细胞污染机率低、能持续进行组织消化的细胞分离装置。

本发明的目的是通过以下技术手段实现的：一种从组织中分离原代细胞的装置，包括有细胞分离容器，其特征在于：所述的细胞分离容器还通过第一管道连接设置有酶液容器，所述的细胞分离容器还通过第二管道连接设置有细胞回收容器；所述细胞分离容器的内部，连通所述第二管道的开口处还设置有滤网；所述酶液容器和细胞分离容器之间的所述第一管道上设置有第一限速开关。

进一步地，所述酶液容器的外围还设置有第一温控装置。

进一步地，所述细胞分离容器的外围还设置有第二温控装置。

进一步地，所述细胞分离容器底部还设置有磁力搅拌仪，细胞分离容器的内部则相应的设置有磁力搅拌子。

进一步地，所述细胞分离容器和细胞回收容器之间的所述第二管道上设置有第二限速开关。

进一步地，所述细胞回收容器的底部设置有基座。

与现有技术相比本发明具有以下明显的优点：

1、有助于增强细胞活力，提高细胞产量。由于细胞分离容器消化下来的细胞可迅速通过管道进入细胞回收容器，而脱离胰酶接触并得到血清的保护，故心肌细胞的损伤较传统方法减少，细胞活力增强。

2.避免了反复操作动作，减少操作强度。传统方法中需要反复对消化下来的细胞进行吹打、转移、离心及收集等步骤，操作繁琐。由于本发明能持续进行组织消化，得到的细胞可及时脱离胰酶，得到细胞回收容器中血清的保护，故可收集较多量细胞集中进行上述操作，故减少了劳动强度。

3.降低污染风险。由于本发明能收集较多量细胞集中进行吹打、转移、离心及收集等步骤，减少了细胞进出超净台的次数，降低了污染的机率。

4.本发明所获得的细胞，其均质性优于传统方法。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为使用本装置和传统方法获得的细胞形态及数量图片；

图3为两种分离方法的细胞活力比较曲线图；

图1中，1-酶液容器，2a-第一温控装置，2b-第二温控装置，3a-第一管道，3b-第二管道，4a-第一限速开关，4b-第二限速开关，5-细胞分离容器，6-磁力搅拌子，7-滤网，8-磁力搅拌仪，9-细胞回收容器，10-基座；

图2中，左图为使用本装置获得的心肌细胞数量及贴壁情况，右图为使用传统方法获得的心肌细胞数量及贴壁情况。可见，使用本装置获得的心肌细胞数量较传统方法更高，折光性更强，贴壁情况更理想(胎鼠心肌细胞为贴壁细胞，两图均为静置贴壁36小时后拍摄)。

图3中，I为使用本发明分离获得的细胞活力曲线，II为传统方法分离获得的细胞活力曲线。图3中，I为使用本发明分离获得的细胞活力曲线，II为传统方法分离获得的细胞活力曲线。可见，采用本发明装置收集的细胞活力(OD值)明显优于传统方法收集的细胞活力。

具体实施方式

以下结合附图说明和具体实施方式对本发明作进一步的详细描述：如图1所示的一种从组织中分离原代细胞的装置，包括有细胞分离容器5，所述的细胞分离容器5还通过第一管道3a分别连接设置有酶液容器1，所述的细胞分离容器5还通过第二管道3b连接设置有细胞回收容器9。这样设置，细胞回收容器9内放有高浓度血清，一般为10％的培养基，用以回收从细胞分离容器5中消化下来的细胞，高浓度血清可迅速中和胰酶，阻断细胞损伤。

所述酶液容器1的外围还设置有第一温控装置2a。酶液容器1内盛有适合浓度胰酶溶液。第一温控装置2a可以为小型水浴或者其它能保证酶液容器1内溶液温度稳定于37度的加温装置。

细胞分离容器5的外围还设置有第二温控装置2b。第二温控装置2b可以为小型水浴或者其它能保证细胞分离容器5内溶液温度稳定于37度的加温装置。

所述细胞分离容器5底部还设置有磁力搅拌仪8，细胞分离容器5的内部则相应的设置有磁力搅拌子6。这样设置，磁力搅拌子6可在磁力搅拌仪8的作用下自由转动，用以打散细胞分离容器5内的组织碎块，与酶液充分接触，并防止粘连。

所述细胞分离容器5的内部，连通所述第二管道3b的开口处还设置有滤网7。滤网7的网眼大小合适，既能防止组织碎块堵塞第二管道3b，又能保证分离的单个细胞的通过。

所述酶液容器1和细胞分离容器5之间的第一管道3a上设置有第一限速开关4a。所述细胞分离容器5和细胞回收容器9之间的第二管道3b上设置有第二限速开关4b。这样设置，用以调节胰酶溶液以合适的速度依次由酶液容器1进入细胞分离容器5，再进入细胞回收容器9。

所述细胞回收容器9的底部设置有基座10。

下面以从胎鼠心肌组织分离心肌细胞为例，说明本发明装置的使用方法：

一、装置准备

1.本装置所有部件都经过消毒灭菌处理后，安置于无菌超净台内。

2.加液。在酶液容器1中加入适量体积预先配制的合适浓度的消化酶溶液。一般为0.1％胰蛋白酶溶液。由第一管道3a向细胞分离容器5中滴加或者直接向细胞分离容器5内加入适量体积消化酶溶液。细胞回收容器9中加入适量体积的带有10％血清的培养基。

3.调节温度及速度。打开第一温控装置2a，使酶液容器1及细胞分离容器5中消化液的温度稳定于37度。

4.分别调节上下两个第一限速开关4a和第二限速开关4b，液体滴速适当，使由酶液容器1进入细胞分离容器5的液体量与细胞分离容器5进行细胞回收容器9的的液体量保持平衡，从而使细胞分离容器5中的酶液体积保持稳定。

二组织消化

1.无菌超净台内无菌分离出生后1-3天胎鼠的心脏，剪成1mm3的碎块，清洗后加入至细胞分离容器5内，确保组织碎块完全浸没于消化液中。

2.打开磁力搅拌仪8的开关，使磁力搅拌子6在细胞分离容器5内自由转动。通过持续搅拌，可防止组织碎块粘连，确保其与胰酶充分接触。在胰酶作用下，心肌细胞从组织中被消化分离，进入细胞分离容器5内的消化液。由于滤网7的存在，既能防止组织碎块堵塞管道，又能保证分离的单个细胞的通过。

3.带有消化下来的细胞的液体通过第二管道3b滴入细胞回收容器9。由于细胞回收容器9内的高浓度血清可迅速中和胰酶，阻断细胞损伤。

4.根据获得的细胞数量，进一步微调上下两个第一限速开关4a和第二限速开关4b，使液体滴速适当，在保证细胞分离容器5中的消化液体积始终保持稳定前提下，有较多带有细胞的液体进入细胞回收容器9内。等到细胞数量达到要求时，将细胞回收容器9内细胞低速离心，从而收获细胞。

本装置可设置如下几种替代备选方案：

a)酶液容器1，细胞分离容器5及细胞回收容器9之间增加泵装置及其它形式的限速装置，用以调节消化液流动的速度。

b)酶液容器1，细胞分离容器5及细胞回收容器9呈水平安置或者其它形式的空间位置。

c)本装置外部设置空气净化及过滤装置，从而不依赖于超净台可独立作为工作单元进行细胞分离。

为了验证这一装置的效果，我们制作了实物样品，取出生后1天的胎鼠40只分为两组(20只/组)，分别采用传统方法和本发明装置进行心肌细胞的分离，分别重复3次。

对比数据如下表：

上表表明，本发明装置在操作时间上大大缩短，得到的细胞数量多于传统方法，未发生污染，而所消耗的酶溶液体积两者相仿。

图2中，左图为使用本装置获得的心肌细胞数量及贴壁情况，右图为使用传统方法获得的心肌细胞数量及贴壁情况。可见，使用本装置获得的心肌细胞数量传统方法更高，折光性更强，贴壁情况更理想(胎鼠心肌细胞为贴壁细胞，两图均为静置贴壁36小时后拍摄)。

我们进一步采用MTT染色方法比较了采用本装置及传统方法进行分离后细胞活力的差别。图3中，I为使用本发明分享获得的细胞活力曲线，II为传统方法分解获得的细胞活力曲线。可见，采用本发明装置收集的细胞活力(OD值)明显优于传统方法收集的细胞活力。

Claims (6)

1.一种从组织中分离原代细胞的装置，包括有细胞分离容器(5)，其特征在于：所述的细胞分离容器(5)还通过第一管道(3a)连接设置有酶液容器(1)，所述的细胞分离容器(5)还通过第二管道(3b)连接设置有细胞回收容器(9)；

所述细胞分离容器(5)的内部，连通所述第二管道(3b)的开口处还设置有滤网(7)；

所述酶液容器(1)和细胞分离容器(5)之间的所述第一管道(3a)上设置有第一限速开关(4a)。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述酶液容器(1)的外围还设置有第一温控装置(2a)。

3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述细胞分离容器(5)的外围还设置有第二温控装置(2b)。

4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述细胞分离容器(5)底部还设置有磁力搅拌仪(8)，细胞分离容器(5)的内部则相应的设置有磁力搅拌子(6)。

5.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述细胞分离容器(5)和细胞回收容器(9)之间的所述第二管道(3b)上设置有第二限速开关(4b)。

6.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述细胞回收容器(9)的底部设置有基座(10)。