CN103484365B - 一种从组织中获取干细胞的装置及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从组织中获取干细胞的装置，包括组织消化罐，试剂瓶，蠕动泵及收集装置，所述获取干细胞的装置还包括有三通阀，所述组织消化罐通过管道与三通阀进液口相连接，所述试剂瓶与收集装置通连接管别与三通阀的两个出液口相连接，所述试剂瓶内还设有出液管，所述出液管夹于蠕动泵上并与组织消化罐相连接。本发明还包括运用该装置经酶与无酶两种提取组织干细胞的方法，本发明装置结构合理，可以装置可以适用于不同组织来源，不同分离方法（经酶或无酶消化），可安全、方便、快捷、有效地从不同组织中获取干细胞。

Description

一种从组织中获取干细胞的装置及其方法

技术领域

本发明涉及一种从组织中获取干细胞的装置及其方法。

背景技术

干细胞是具有自我更新能力、在特定的条件下可以分化成不同类型功能细胞的一类细胞。干细胞研究及应用能够突破传统医学发展的限制，有望解决人类面临的重大医学难题，现今已为移植治疗、神经系统疾病治疗、基因治疗、研究胚胎发育和疾病发生以及药物筛选和开发等提供了可行的方法。成体干细胞可以取自患者自身，在应用时不存在组织相容性的问题，避免了移植排斥反应。

研究者发现，干细胞可以来源于众多组织中，如骨髓、脂肪、脐带、胎盘、蜕膜、羊膜、羊水、皮肤，肌肉，牙髓、血管、心脏、脾、肾周脂肪、肠上皮组织等。而干细胞的分离主要采用经胶原酶、胰蛋白酶、中性组织分散酶等一种或几种组合酶消化的方式，从组织中分离出干细胞，进行进一步的培养扩增。然而现有的干细胞分离方法都是基于试验研究的方式，尚还缺乏一套完整的，适用于各种组织来源的干细胞分离装置。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种从组织中分离干细胞的装置及其使用方法，该装置的结构合理，并结合该装置的使用方法，可以安全、方便、快捷、有效地从不同组织中获取干细胞。

本发明的第一技术方案是：一种从组织中获取干细胞的装置，包括组织消化罐，试剂瓶，蠕动泵及收集装置，所述获取干细胞的装置还包括有三通阀，所述组织消化罐通过管道与三通阀进液口相连接，所述试剂瓶与收集装置通连接管别与三通阀的两个出液口相连接，所述试剂瓶内还设有出液管，所述出液管夹于蠕动泵上并与组织消化罐相连接。

进一步的，所述出液管包括前段出液管与后段出液管，所述前段输液管与后段输液管之间通过不锈钢弯管连接，所述的不锈钢弯管放置于可调节温度装置(水浴锅)中。

进一步的，所述组织消化罐包括罐体与盖于罐体上方的旋盖，所述罐体开口处设有第一滤网，所述旋盖上设有用于连接管道的通孔，所述的组织消化罐罐底设有一磁力发生装置，所述磁力发生装置上放置有若干个磁珠，所述组织消化罐侧壁上还延伸有用于与后段出液管相连接的插孔。

进一步的，所述的收集装置包括一漏斗状瓶体，所述瓶体瓶颈设有第二滤网，瓶底漏斗状尖口处设有开口，所述瓶体下方设有收集瓶。

进一步的，所述可调节温度装置为水浴锅。

进一步的，所述组织消化罐罐体与旋盖间还设有防止消化罐液体外漏的密封圈。

本发明的第二技术方案是：一种从组织中获取干细胞的方法，包括如上述权利要求1所述一种从组织中获取干细胞的装置，并按以下步骤进行：

（1）将待分离的组织放入组织消化罐内；

（2）在试剂瓶中加入磷酸盐缓冲液或生理盐水；

（3）三通阀旋至使组织消化罐与收集装置相连通的状态，启动蠕动泵，将试剂瓶中的试剂泵入组织消化罐中清洗组织，并将组织消化罐内清洗后的试剂排入收集装置中；

（4）待消化罐中内清洗试剂完全泵入收集装置后，更换新的收集装置，同时三通阀旋至使组织消化罐与试剂瓶相连通的状态；

（5）在试剂瓶中加入消化酶，将消化酶经出液管泵入组织消化罐中，机械震荡组织消化罐，使组织消化罐中的组织在消化酶及机械力的作用下分解；

（6）在步骤（5）持续20～60分钟后，将三通阀旋至与收集装置相连接，将组织消化罐中的干细胞输入至收集装置中。

进一步的，在步骤（5）中所述出液管包括前段出液管与后段出液管，所述前段输液管与后段输液管之间通过不锈钢弯管连接，所述的不锈钢弯管放置水浴锅中，所述的水浴锅温度为37℃。

进一步的，所述的消化酶为胶原酶、胰蛋白酶或混合酶。

本发明的第三技术方案是：一种从组织中获取干细胞的方法，其特征在于，包括如上述权利要求1所述一种从组织中获取干细胞的装置，并按以下步骤进行：

（1）将待分离的组织放入组织消化罐内；

（2）在试剂瓶中加入磷酸盐缓冲液或生理盐水；

（3）三通阀旋至使组织消化罐与收集装置相连通的状态，启动蠕动泵，将试剂瓶中的试剂泵入组织消化罐中清洗组织，并将组织消化罐内清洗后的试剂排入收集装置中；

（4）待组织消化罐中内清洗试剂完全泵入收集装置后，更换新的收集装置；

（5）机械震荡组织消化罐20～60分钟后，将三通阀旋至使组织消化罐与收集装置相连通的状态，将组织消化罐中的干细胞输入至收集装置中。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：该从组织中分离干细胞的装置为可消毒的无菌装置，各组成部分设计合理，组织消化罐的磁珠和磁力发生装置可以充分搅拌消化，并能为组织消化提供非酶的机械力分离方式。具有的不锈钢弯管可以加热消化酶，使酶在最适温度发挥作用。整套系统可形成消化循环回路，使得消化下来的干细胞不需要完全停留在消化罐中，提高已消化的干细胞的活性。另外，通过蠕动泵同一方向蠕动可以不断加压滤过不同的过滤网，达到过滤残留组织和分离单个细胞效果，利用该装置所形成的提取组织干细胞的方法可以适用于不同组织来源与不同分离方法（经酶或无酶消化），为临床提取干细胞提供一套安全、方面、有效的分离方式。

附图说明

图1为本发明结构示意图。

     图中：1-组织消化罐，2-试剂瓶，3-蠕动泵，4-收集装置，5-三通阀，6-出液管，7-调节温度装置，8-收集瓶，11-罐体，12-旋盖，13-第一滤网，14-磁力发生装置，15-磁珠，16-插孔，21-长针管，41-瓶体，42-第二滤网，63-不锈钢弯管，61-前段出液管，62-后段出液管，121-通孔。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。

如图1所示，一种从组织中获取干细胞的装置，包括组织消化罐1，试剂瓶2，蠕动泵3及收集装置4，所述获取干细胞的装置还包括有三通阀5，所述组织消化罐1通过管道与三通阀进液口51相连接，所述试剂瓶2与收集装置通连接管别与三通阀5的两个出液口相连接，所述试剂瓶2内还设有出液管6，所述出液管6夹于蠕动泵3上并与组织消化罐1相连接。

其中，所述出液管6包括前段出液管61与后段出液管62，所述前段输液管与后段输液管之间通过不锈钢弯管63连接，所述的不锈钢弯63放置于可调节温度装置7中。该可调节温度装置7可以是水浴锅。

所述组织消化罐1包括罐体11与盖于罐体11上方的旋盖12，所述罐体11开口处设有第一滤网13，所述旋盖12上设有用于连接管道的通孔121，所述的组织消化罐1罐底设有一磁力发生装置14，所述磁力发生装置14上放置有若干个磁珠15，所述组织消化罐1侧壁上还延伸有用于与后段出液管62相连接的插孔16。组织消化罐罐体11与旋盖12间还设有防止消化罐液体外漏的密封圈17。

上述从组织中获取干细胞的装置形成包括消化循环回路和收集通道。

消化循环回路主要由组织消化罐1、三通阀5、试剂瓶2、蠕动泵3构成。

组织消化罐1主要用于放入提取干细胞的组织，罐体12内可设计为放入磁珠15在磁力发生装置14的作用下可以充分搅拌消化，为组织消化提供非酶的机械力分离方式。组织消化罐罐体11底部的磁力发生装置14可与组织消化罐1为一整体，也可分体为单独装置。磁力发生装置14通过电路控制可分为柔和，中等，强，超强几档。该磁力发生装置也可以是其他可实现消化罐1震荡的装置或方法，如采用振动器手摇等。组织消化罐1的直径为2～30cm，优选的有3cm, 5cm, 8cm, 10cm, 15cm或20cm。所述罐体11开口处的第一滤网13的孔径可以为100～200目，达到过滤残留组织和分离单个细胞效果。

三通阀5用于改变流液输送至试剂瓶2或收集装置。当三通阀5旋至使组织消化罐1与收集装置4相连通的状态时，试剂瓶2与组织消化罐1无法连通，反之，当三通阀5旋至使组织消化罐1与试剂瓶2相连通的状态时，收集装置与组织消化罐无法连通。

试剂瓶2用于添加磷酸盐缓冲液、生理盐水或如胶原酶、胰蛋白酶或混合酶等消化酶。以实现对组织中的细胞进行分解或清洗。另外，试剂瓶2可直接置换为试剂袋或生理盐水袋。

蠕动泵3为液体的循环提供驱动动力。使用时，蠕动泵3设置于组织消化罐1与试剂瓶2之间，出液管夹于蠕动泵3内，利用蠕动泵3交替进行挤压和释放来泵送出流体，实现组织循环。

消化循环回路的连接方式：组织消化罐1通过插入旋盖顶部通孔的管道与三通阀进液口相连接，三通阀的一个出液口通过连接管与试剂瓶2连接，该连接管可在与试剂瓶2连接的管端部连接针管，以方便插入试剂瓶2中。试剂瓶2内还插入有用于排除试剂瓶2液体的排液管，同样地，为了方便插入试剂瓶2中，也可以在管端部连接插至试剂瓶2底长针管21，所述的长针管直径可以为22#，材料为硬质塑料材质或不锈钢材质(针管使用前需配有盖帽)，上述连接管材料为医用级硅胶管。

为了使酶在最适温度发挥作用，所述出液管中间连接有置于温度调节装置7内的不锈钢弯管63，使出液管6分割为前段出液管61与后段出液管62，所述的不锈钢弯63放置于可调节温度装置7中以使消化酶保证在最适温度。

形成的消化循环回路，使得消化下来的干细胞不需要完全停留在组织消化罐1中，提高已消化下来干细胞的活性，并且通过蠕动泵3同一方向蠕动可以不断加压滤过不同的过滤网，达到过滤残留组织和分离单个细胞效果。

收集通道包括组织消化罐1、三通阀5、与收集装置4，收集装置4与三通阀5的一个出液口通过管道相连接，所述的收集装置为一漏斗状瓶体41，所述瓶体瓶颈设有第二滤网42，所述第二滤网42孔径为200～300目。瓶底漏斗状尖口处设有开口，所述瓶体下方设有收集瓶8。漏斗型瓶体可方便细胞收集，所述开口可与收集瓶通过管道相连接，所述收集瓶还可以是干细胞收集袋。

一种从组织中获取干细胞的方法，包括如上述权利要求1所述一种从组织中获取干细胞的装置，并按以下步骤进行：

（1）将待分离的组织放入组织消化罐1内；

（2）在试剂瓶2中加入磷酸盐缓冲液或生理盐水；

（3）三通阀5旋至使组织消化罐1与收集装置4相连通的状态，启动蠕动泵3，将试剂瓶中的试剂泵入组织消化罐1中清洗组织，并将组织消化罐1内清洗后的试剂排入收集装置4中；

（4）待消化罐1中内清洗试剂完全泵入收集装置4后，更换新的收集装置4，同时三通阀5旋至使组织消化罐1与试剂瓶2相连通的状态；

（5）在试剂瓶2中加入消化酶，将消化酶经出液管6泵入组织消化罐1中，机械震荡组织消化罐使组织消化罐1中的组织在消化酶及机械力的作用下分解；

（6）在步骤（5）持续20～60分钟后，将三通阀5旋至与收集装置4相连接，将组织消化罐1中的干细胞输入至收集装置4中。

进一步的，在步骤（5）中所述出液管6包括前段出液管61与后段出液管62，所述前段输液管61与后段输液管63之间通过不锈钢弯管63连接，所述的不锈钢弯管63放置水浴锅7中，所述的水浴锅7的温度为37℃。

进一步的，所述的消化酶为胶原酶、胰蛋白酶或混合酶。

一种从组织中获取干细胞的方法，其特征在于，包括如上述权利要求1所述一种从组织中获取干细胞的装置，并按以下步骤进行：

（1）将待分离的组织放入组织消化罐内；

（2）在试剂瓶中加入磷酸盐缓冲液或生理盐水；

（3）三通阀旋至使组织消化罐与收集装置相连通的状态，启动蠕动泵，将试剂瓶中的试剂泵入组织消化罐中清洗组织，并将组织消化罐内清洗后的试剂排入收集装置中；

（4）待组织消化罐中内清洗试剂完全泵入收集装置后，更换新的收集装置；

（5）机械震荡组织消化罐20～60分钟后，将三通阀旋至使组织消化罐与收集装置相连通的状态，将组织消化罐中的干细胞输入至收集装置中。

下面结合集中组织提取干细胞的实施例进行具体说明：

实施例1

从胎盘中获取造血干细胞、间充质干细胞、亚全能干细胞，包括以下步骤：

（1）  无菌收集胎盘组织，剪成小块1cm*1cm，放入组织消化罐1内；

打开组织消化罐1，组织消化罐1直径为20cm，放入剪好的胎盘组织，放入磁珠15，盖上滤网及密封圈17，旋紧旋盖12。检查各装置部分的连接，将出液管6夹于蠕动泵3上。

（2）  在试剂瓶2中加入生理盐水，或者将连接管直接插入生理盐水袋中；

（3）  三通阀5旋至使组织消化罐1与收集装置4相连通的状态，启动蠕动泵3，将试剂瓶2中的试剂泵入组织消化罐1中清洗组织，并将组织消化罐1内清洗后的试剂排入收集装置4中。

将组织消化罐1内的磁力发生装置14设定为柔和挡，开启蠕动泵3向组织消化罐1泵入生理盐水，这样将胎盘组织中的红细胞和造血干细胞等洗脱下来。清洗后的洗脱液经300目的第二过滤网42过滤，收集于的含有羟乙基淀粉的收集瓶中。收集瓶自然沉淀或离心10分钟，分离成熟红细胞即获得富含造血干细胞的有核细胞。

（4）  待消化罐1中内清洗试剂完全泵入收集装置4后，将装有红细胞的收集装置4更换，将三通阀5旋至使组织消化罐1与试剂瓶2相连通的状态；

（5）在试剂瓶2中加入消化酶，将不锈钢弯管63放在37℃水浴锅中，将消化酶经出液管6泵入组织消化罐1中，使组织消化罐1中的组织在消化酶的作用下分解；

将组织消化罐1内的磁力发生装置14调至中档或强档，使组织消化罐1中的组织在消化酶与磁珠15碰撞组织机械力的作用下分解。

（6）在步骤（5）持续30分钟后，将三通阀5旋至与收集装置4相连通，将组织消化罐1中的将胎盘间充质干细胞、内皮祖细胞、胎盘亚全能干细胞等混合细胞群通过滤网过滤，收集于收集袋或收集瓶中。

实施例2

从脂肪组织中经酶消化法获取脂肪干细胞, 包括以下步骤：

（1）无菌抽取皮下脂肪组织，放入组织消化罐1内；

打开组织消化罐1，组织消化罐1直径为5cm，放入剪好的脂肪组织，放入磁珠15，盖上滤网及密封圈17，旋紧旋盖12。检查各装置部分的连接，将出液管6夹于蠕动泵3上。

（2）   在试剂瓶2中加入磷酸盐缓冲液；

（3）   三通阀5旋至使组织消化罐1与收集装置4相连通的状态，启动蠕动泵3，将试剂瓶2中的试剂泵入组织消化罐1中清洗组织，并将组织消化罐1内清洗后的试剂排入收集装置4中；

将组织消化罐1内的磁力发生装置14设定为柔和挡，开启蠕动泵3向组织消化罐1泵入生理盐水，洗涤脂肪组织的红细胞。清洗后的洗脱液经200目的第二过滤网过滤，收集于收集瓶中。

（4）   待消化罐1中内清洗试剂完全泵入收集装置4后，将装有红细胞的收集装置4更换，将三通阀5旋至使组织消化罐1与试剂瓶2相连通的状态；

（5）在试剂瓶2中加入消化酶，将不锈钢弯管63放在37℃水浴锅中，将消化酶经出液管6泵入组织消化罐1中，使组织消化罐1中的组织在消化酶的作用下分解；

将组织消化罐1内的磁力发生装置14调至中档或强档，使组织消化罐1中的组织在消化酶与磁珠15的作用下分解。

（6）在步骤（5）持续25分钟后，将三通阀5旋至与收集装置4相连通，将组织消化罐1中的脂肪干细胞泵入收集瓶中进行冻存、治疗或培养。

实施例3

从脂肪组织中经无酶法获取脂肪血管干细胞组分，包括以下步骤：

（1）无菌抽取皮下脂肪组织，放入组织消化罐1内；

打开组织消化罐1，组织消化罐1直径为20cm，放入剪好的脂肪组织，放入磁珠15，盖上滤网及密封圈17，旋紧旋盖12。检查各装置部分的连接，将出液管6夹于蠕动泵3上。

（2）在试剂瓶2中加入生理盐水，或者将连接管直接插入生理盐水袋中；

（3）开启蠕动泵3泵入生理盐水，开启磁力发生装置至柔和挡。洗涤脂肪组织的红细胞。

三通阀5旋至使组织消化罐1与收集装置4相连通的状态，启动蠕动泵3，将试剂瓶2中的试剂泵入组织消化罐1中清洗皮下脂肪组织。

（4）将组织消化罐1内清洗后的试剂排入收集装置4中；收集洗涤的红细胞，并弃去。

（5）将磁力发生装置调至强档或用力机械震摇消化罐20~30分钟，将三通阀旋至连接收集装置。将磁力发生装置调至强档或用力机械震摇消化罐，将三通阀旋至连接收集装置，通过200-300目第二滤网4过滤，收集脂肪干细胞于收集瓶中。以便干细胞后续进行冻存、治疗或培养。

 实施例4 从脐带中分离间充质干细胞，包括以下步骤：

（1）无菌收集分离脐带沃顿胶，放入组织消化罐1内；

打开组织消化罐1，组织消化罐1直径为10cm，放入剪好的脐带组织，盖上滤网及密封圈17，旋紧旋盖12。检查各装置部分的连接，将出液管6夹于蠕动泵3上。

（2）  在试剂瓶2中加入生理盐水，或者将连接管直接插入生理盐水袋中；

（3）  三通阀5旋至使组织消化罐1与收集装置4相连通的状态，启动蠕动泵3，将试剂瓶2中的试剂泵入组织消化罐1中清洗组织，并将组织消化罐1内清洗后的试剂排入收集装置4中；

将组织消化罐1内放置于机械振动器的上方，开启机械振动器，开启蠕动泵3，向组织消化罐1泵入生理盐水，这样将脐带组织中的红细胞和造血干细胞等洗脱下来。清洗后的洗脱液经300目的第二过滤网过滤，收集于的收集瓶中。收集瓶自然沉淀或离心10分钟，分离成熟红细胞即获得富含造血干细胞的有核细胞。

（4）  待消化罐1中内清洗试剂完全泵入收集装置4后，将装有红细胞的收集装置4更换，将三通阀5旋至使组织消化罐1与试剂瓶2相连通的状态；

（5）开启机械振动器，在试剂瓶2中加入胰蛋白酶，终浓度为0.05%将弯管放在37℃水浴锅中，将胰蛋白酶经出液管6泵入组织消化罐1中，使组织消化罐1中的组织在消化酶与机械力的作用下分解；

将组织消化罐1下的机械振动器调至中档或强档，使组织消化罐1中的组织在消化酶与机械力的作用下分解。

（6）在步骤（5）持续30分钟后，将三通阀5旋至与收集装置4相连通，将组织消化罐1中的能干细胞等混合细胞群通过滤网过滤，收集于收集袋或收集瓶中。将干细胞进行贴壁培养扩增可获得大量脐带间充质干细胞。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种从组织中获取干细胞的方法，其特征在于，利用一种从组织中获取干细胞的装置，所述从组织中获取干细胞的装置包括组织消化罐，试剂瓶，蠕动泵及收集装置，所述获取干细胞的装置还包括有三通阀，所述组织消化罐通过管道与三通阀进液口相连接，所述试剂瓶与收集装置通过连接管分别与三通阀的两个出液口相连接，所述试剂瓶内还设有出液管，所述出液管夹于蠕动泵上并与组织消化罐相连接，并按以下步骤进行：

（1）将待分离的组织放入组织消化罐内；

（2）在试剂瓶中加入磷酸盐缓冲液或生理盐水；

（3）三通阀旋至使组织消化罐与收集装置相连通的状态，启动蠕动泵，将试剂瓶中的试剂泵入组织消化罐中清洗组织，并将组织消化罐内清洗后的试剂排入收集装置中；

（4）待消化罐内清洗试剂完全泵入收集装置后，更换新的收集装置，同时三通阀旋至使组织消化罐与试剂瓶相连通的状态；

（5）在试剂瓶中加入消化酶，将消化酶经出液管泵入组织消化罐中，机械震荡组织消化罐，使组织消化罐中的组织在消化酶及机械力的作用下分解；

（6）在步骤（5）持续20～60分钟后，三通阀旋至使组织消化罐与收集装置相连通的状态，将组织消化罐中的干细胞输入至收集装置中。

2.根据权利要求1所述的一种从组织中获取干细胞的方法，其特征在于，在步骤（5）中所述出液管包括前段出液管与后段出液管，所述前段输液管与后段输液管之间通过不锈钢弯管连接，所述的不锈钢弯管放置水浴锅中，所述的水浴锅温度为37℃。

3.根据权利要求1所述的一种从组织中获取干细胞的方法，其特征在于，所述的消化酶为胶原酶、胰蛋白酶或混合酶。

4.根据权利要求1所述的一种从组织中获取干细胞的方法，其特征在于，所述组织消化罐包括罐体与盖于罐体上方的旋盖，所述罐体开口处设有第一滤网，所述旋盖上设有用于连接管道的通孔，所述的组织消化罐罐底设有一磁力发生装置，所述磁力发生装置上放置有若干个磁珠，所述消化罐侧壁上还延伸有用于与后段出液管相连接的插孔。

5.根据权利要求1所述的一种从组织中获取干细胞的方法，其特征在于，所述的收集装置包括一漏斗状瓶体，所述瓶体内瓶颈处设有第二滤网，瓶底漏斗状尖口处设有开口，所述瓶体下方设有收集瓶。

6.根据权利要求4所述的一种从组织中获取干细胞的方法，其特征在于，所述组织消化罐罐体与旋盖间还设有防止消化罐液体外漏的密封圈。

7.一种从组织中获取干细胞的方法，其特征在于，利用一种从组织中获取干细胞的装置，所述从组织中获取干细胞的装置包括组织消化罐，试剂瓶，蠕动泵及收集装置，所述获取干细胞的装置还包括有三通阀，所述组织消化罐通过管道与三通阀进液口相连接，所述试剂瓶与收集装置通过连接管分别与三通阀的两个出液口相连接，所述试剂瓶内还设有出液管，所述出液管夹于蠕动泵上并与组织消化罐相连接，并按以下步骤进行：

（1）将待分离的组织放入组织消化罐内；

（2）在试剂瓶中加入磷酸盐缓冲液或生理盐水；

（3）三通阀旋至使组织消化罐与收集装置相连通的状态，启动蠕动泵，将试剂瓶中的试剂泵入组织消化罐中清洗组织，并将组织消化罐内清洗后的试剂排入收集装置中；

（4）待组织消化罐内清洗试剂完全泵入收集装置后，更换新的收集装置；

（5）机械震荡组织消化罐20～60分钟后，将三通阀旋至使组织消化罐与收集装置相连通的状态，将组织消化罐中的干细胞输入至收集装置中。