KR102313628B1

KR102313628B1 - 충격파 또는 기계적 충격을 사용한 세포의 분리, 해리 및/또는 탈응집

Info

Publication number: KR102313628B1
Application number: KR1020187029577A
Authority: KR
Inventors: 존 치; 벤-천 치
Original assignee: 시노바 라이프 사이언시즈 인코포레이티드
Priority date: 2016-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2021-10-15
Also published as: EP3872164B1; BR112018068820B1; MX2018011181A; MX2021006967A; KR102419230B1; AU2023226696A1; CA3056209A1; JP2023116738A; CO2018011074A2; EP3872164A1; EP4324915A2; KR20210126154A; CN115011555A; KR20220103186A; JP7300486B2; AU2022201872A1; BR112018068820A2; US20240076622A1; KR20190016937A; US20190071644A1

Abstract

본 개시에 의해 제공되는 방법은, 체외 충격파, 기계적 충격 및/또는 쇄석술의 원리를 이용하여, 조직 샘플을 작은 단편 - 세포의 클러스터 및/또는 단일 세포 - 으로 파쇄한 후, 목적하는 세포 분획을 샘플로부터 단리할 수 있다. 본 개시에 의해 제공되는 장치는 집속 및/또는 유향성 충격파, 및/또는 집속 및 유향성 기계적 충격을 전개하여, 조직 샘플을 분해시킨다. 장치는 충격파 또는 기계적 충격에 노출되는 동안, 샘플을 멸균된, 밀폐된 환경에서 유지시킨다. 따라서, 충격파 및/또는 기계적 충격이 밀폐된 장치의 외부에서 발생하여, 장치의 하나 이상의 벽을 통해 샘플이 위치하는 이의 내부로 전달된다.

Description

충격파 또는 기계적 충격을 사용한 세포의 분리, 해리 및/또는 탈응집

세포 바이오프로세싱은 생물약학적 제조의 형태이고, 이의 목표는 치료적 세포의 단리 및/또는 생산을 위한 재현가능하고 강건한 제조 공정을 확립하는 것이다.

현행 세포 제조 공정은 고도로 사용자 의존적이고 수많은 지점에서 인간 중재를 요구한다. 그러한 의존성때문에, 현행 공정은 지루하고, 매우 가변적이며, 값비싸고, 저수율로 생산된다.

예로서, 많은 현행 제조 공정은 다음과 같이 발생된다: 조직 샘플 (지질흡인물, 전혈, 골수, 제대혈 등)을 환자로부터 수득한다. 수득된 생물학적 샘플은 바이오프로세싱을 위한 실험실로 수송된다. 실험실에서, 바람직한 세포 분획을 수득하기 위해 세포 분리 기술이 적용된다. 이어서, 세포 분획을 단리하고 환자 사용을 위해 현장 진단 시설로 다시 전달하거나, 또는 세포 확장을 위해 생물반응기에 도입시켜 추가로 프로세싱한다. 세포 분리에 관한 일부 기지의 방법들은 초음파 캐비테이션(ultrasonic cavitation), 효소적 분해, 또는 바람직한 세포 분획을 수득하기 위해 샘플을 외부 물체 (예를 들어, 비드)와 접촉시키는 것을 포함하는 다른 기계적 수단을 통한 기계적 분리의 사용을 포함한다. 효소의 사용은 결과적으로 증가한 규제 준수 부담을 야기하는데, 효소가 바람직한 결과를 낳기 위해 샘플과 직접 접촉되어야만 하기 때문이다. 효소는 또한 채취되는 세포의 무결성을 손상시킬 수 있고 잠재적으로 그들 특성을 변화시킬 수 있다. 고성능 초음파처리의 사용도 유사하게 결점이 있다. 초음파처리기 첨단은 주파수가 고정되어 있고 세포 또는 조직 현탁액에 도입되어야만 하는데, 이것은 멸균성에 부정적인 영향을 미칠 가능성이 있다. 추가적으로, 이러한 고에너지 음파의 사용은 샘플에 대량의 에너지를 유입시켜서, 열로서 나타나게 된다. 이것은 세포를 손상시킬 수 있어서, 이용가능한 세포의 수율을 감소시킨다.

수득되면, 확장된 세포 생성물은 그것이 정제되고 농축되는 생물반응기로부터 이송된다. 검사 샘플은 품질 검사를 위해 세척되고 농축된 세포 생성물로부터 제거되어지며, 검사 결과가 허용가능한 생성물로 확인되면, 최종 조작된 세포 생성물은 샘플이 유래된 환자에게 투여되는, 장기간 저장, 냉동보존, 또는 전술한 것들의 일부 조합을 위해 제조된다.

이해할 수 있듯이, 몇몇 이들 단계는 한 용기에서 다른 것으로 샘플의 이송 단계를 필요로 하여, 과중한 사용자 중재가 요구되어, 프로세싱 동안 샘플 또는 샘플들을 잘못 표기하거나 또는 잘못 취급할 위험성이 증가될뿐만 아니라, 샘플의 멸균성, 정체성, 순도 또는 역가에 잠재적으로 부정적으로 영향을 미치게 된다. 추가적으로, 이러한 방식으로 샘플을 프로세싱하는데 요구되는 시간은, 바람직한 세포 분획이 환자의 건강에 부정적인 영향을 줄 수 있는 수 일이 아니라 수 시간 동안 환자에게 전달될 준비가 되지 않았다는 것을 의미한다. 세포 샘플을 프로세싱하는데 요구되는 불합리하게 긴 기간 및 손상된 멸균성에 대한 가능성은 환자, 특히 면역손상되었거나 또는 즉각적 치유가 요구되는 환자들에게는 허용될 수 없으며, 또한 많은 환자들에게 적시에, 고품질 의료를 제공할 필요가 있는 공급자에게도 허용될 수 없다.

따라서, 다수 사용자의 중재가 필요없고, 현장 진단에서 직접적으로 단기간 내에 바람직한 세포 분획을 수득하는 최적화되고 규모조절가능한 방법이 필요하다. 또한 그 방법을 실시할 수 있는 장치가 필요하다. 그러한 방법 및 장치가 본 개시에 의해 제공된다. 개시된 방법 및 장치는 프로세싱을 위해 실험실로 세포 샘플을 수송해야 하는 필요성을 제거하며 분리 동안 외부 물체와 세포 샘플을 접촉시키지 않아서, 그 결과로 소수의 사용자 접촉으로, 매우 단기간 내에 바람직한 세포 샘플을 제공하는 프로세싱된 샘플을 생성시키고, 그럼으로써 값비싼 기술적 자원의 최적화를 가능하게 한다.

본 명세서에서 개시하는 장치 및 방법은 몇몇 특성을 가지며, 이들 중 하나가 단독으로 이의 바람직한 속성을 책임지는 것이 아니다. 하기의 청구항의 범주를 한정하지 않으면서, 개시된 장치 및 방법의 일부 특성을 간략하게 설명할 것이다. 이러한 설명을 고려한 후에, 특히 "구체적인 설명" 부문을 읽고 난 후에, 당업자는 장치 및 방법의 특성이 어떻게 전통적인 시스템 및 방법보다 몇몇의 장점을 제공하게 되는지에 대해 이해하게 될 것이다.

일 양상에서, 본 개시는 자가 줄기 세포 요법을 위해 프로세싱되는 세포 샘플, 예를 들어 지방 조직 샘플의 바이오프로세싱에 적합한 완전하게 밀폐된 시스템을 제공한다. 시스템은 공기에 개방되지 않고, 따라서 전체 바이오프로세싱 내내 멸균된 샘플 프로세싱 및 샘플의 수송을 가능하게 한다.

제1 양상에서, 조직 샘플로부터 세포 분획을 단리하는 방법을 제공하고, 이 방법은 대상체로부터 조직 샘플을 수득하는 단계; 조직 샘플을 충격파, 기계적 충격력, 또는 둘 모두와 접촉시키는 단계; 및 조직 샘플로부터 세포 분획을 단리시키는 단계를 포함하고; 여기서 충격파의 공급원 및/또는 기계적 충격력은 조직 샘플과 물리적으로 접촉하지 않는다.

일부 구체예에서, 조직은 지방 조직, 뇌조직, 인두 조직, 후두 조직, 심장 조직, 동맥 조직, 근육 조직, 간 조직, 담낭 조직, 신장 조직, 소장 조직, 대장 조직, 림프절 조직, 폐 조직, 비장 조직, 골수 조직, 위 조직, 정맥 조직, 췌장 조직, 방광 조직, 뼈, 치아, 상아질 조직, 잇몸 조직, 피부 조직, 송과선 조직, 뇌하수체 조직, 갑상선 조직, 부신 조직, 췌장 조직, 난소 조직 및 고환 조직으로부터 선택된다.

일부 구체예에서, 조직은 지방 조직이다.

일부 구체예에서, 조직 샘플은 충격파와 접촉하고 충격파의 공급원은 충격파 발생기에 의해 동력공급되는 충격파 적용기이다.

일부 구체예에서, 조직 샘플은 기계적 충격력과 접촉하고 기계적 충격력의 공급원은 모터에 의해 동력공급되는 충격식 팔대(impact arm) 이다.

일부 구체예에서, 조직 샘플은 충격파 및/또는 기계적 충격력과 접촉 이전에 1회 이상 세척된다.

일부 구체예에서, 충격파는 조직 샘플을 다수의 소형 세포 클러스터, 다수의 개별 세포, 또는 둘 모두로 파쇄시킨다.

일부 구체예에서, 기계적 충격력은 조직 샘플을 다수의 소형 세포 클러스터, 다수의 개별 세포, 또는 둘 모두로 파쇄시킨다.

일부 구체예에서, 세포 분획은 다수의 소형 세포 클러스터, 다수의 개별 세포, 또는 둘 모두를 포함하고, 세포 분획의 단리는 원심 분리에 의해 일어난다.

일부 구체예에서, 원심분리는 3 내지 30분 동안 500 g 내지 2,000 g의 속도에서 일어난다.

일부 구체예에서, 원심분리는 10분 동안 1,200 g에서 일어난다.

일부 구체예에서, 단리된 세포 분획은 원심분리 이후에 재현탁된다.

일부 구체예에서, 세포 분획은 30분 또는 그 이내에 단리된다.

제2 양상에서, 지방 조직으로부터 줄기 세포를 단리하는 방법이 제공되고, 이 방법은 대상체로부터 지방 조직 샘플을 수득하는 단계; 조직 샘플을 용기 또는 카트리지에 위치시키는 단계; 조직 샘플에 대해 기계적 충격력을 가하여 줄기 세포를 방출시키는 단계; 지방 조직으로부터 줄기 세포 분획을 분리하는 단계; 및 줄기 세포 분획을 원심분리하는 단계를 포함하고; 여기서 기계적 충격력의 공급원은 지방 조직과 물리적으로 접촉하지 않는다.

일부 구체예에서, 지방 조직은 기계적 충격력이 가해지기 이전에 1회 이상 세척된다.

일부 구체예에서, 기계적 충격력의 공급원은 모터에 의해 동력공급되는 충격식 팔대이고, 모터는 모터가 전속력으로 작동될 때 충격식 팔대의 속도를 감속시킬 수 있는 기어 장치를 포함한다.

일부 구체예에서, 기계적 충격력은 용기 또는 카트리지의 벽을 통해서 지방 조직으로 전달된다.

일부 구체예에서, 기어 장치는 충격식 팔대의 속도를 10분의 1로 감속시키는 것이 가능하다.

일부 구체예에서, 모터는 0.75 인치의 기어 직경을 포함하고 3,000 rpm의 모터 속도에서 충격식 팔대는 초당 117.8 인치의 속도를 갖는다.

일부 구체예에서, 줄기 세포 분획을 분리하는 단계는 지방 조직이 수성층으로부터 분리될 수 있게 하는 단계를 포함하고, 수성층은 줄기 세포를 포함한다.

일부 구체예에서, 줄기 세포는 지방 조직으로부터 30분 또는 그 이내에 단리된다.

일부 구체예에서, 원심분리는 500 g 내지 1,600 g에서 3분 내지 10분 동안 일어난다.

제3 양상에서, 지방 조직으로부터 줄기 세포를 단리하는 방법이 제공되고, 이 방법은 대상체로부터 지방 조직 샘플을 수득하는 단계; 조직 샘플을 용기 또는 카트리지에 위치시키는 단계; 조직 샘플에 대해 충격파를 가하여 줄기 세포를 방출시키는 단계; 지방 조직으로부터 줄기 세포 분획을 분리하는 단계; 및 줄기 세포 분획을 원심분리하는 단계를 포함하고; 여기서 충격파의 공급원은 지방 조직과 물리적으로 접촉하지 않는다.

일부 구체예에서, 지방 조직은 충격파가 가해지기 이전에 1회 이상 세척된다.

일부 구체예에서, 충격파의 공급원은 충격파 발생기에 의해 동력공급되는 충격파 적용기이다.

일부 구체예에서, 충격파는 용기 또는 카트리지의 벽을 통해서 지방 조직으로 전달된다.

일부 구체예에서, 지방 조직에는 0.5 내지 5.0 bar의 동력을 갖는 충격파가 가해진다.

일부 구체예에서, 용기는 0.25 ㎜ 두께인 벽을 구비한 비닐 백이고 지방 조직에는 2.0 내지 2.5 bar의 동력을 갖는 충격파가 가해진다.

일부 구체예에서, 임의의 한 시점에 충격파가 가해지는 지방 조직의 총면적은 1 ㎠ 내지 100 ㎠ 범위이다.

일부 구체예에서, 용기는 0.25 ㎜ 두께인 벽을 구비한 19 oz.의 비닐 백이고, 지방 조직 샘플의 총량은 30 cc이고, 임의의 한 시점에 충격파가 가해지는 지방 조직의 총면적은 5 ㎠이다.

일부 구체예에서, 지방 조직은 5,000 내지 100,000 범위의 다수 충격파가 가해진다.

본 개시의 특징 및 장점은 예시적인 구체예를 기술하는 첨부된 도면 및 하기 구체적인 설명을 참조하여 추가로 설명할 수 있다.
도 1은 본 개시에 의해 제공되는 구체예에 따라, 조직 샘플로부터 세포 분획을 단리하는 방법에 관한 개략도를 제공한다.
도 2는 본 개시에 의해 제공되는 시스템 및 방법에서 사용을 위해 적합한 체외 충격파 장치의 대표적인 예를 도시한다.
도 3은 본 개시에 의해 제공되는 시스템 및 방법에서 사용을 위해 적합한 기계적 충격 장치의 대표적인 예를 도시한다.
도 4는 본 개시에 의해 제공되는 체외 충격파 및/또는 기계적 충격 장치에서 사용을 위해 적합한 강성(rigid), 자립형(self-contained) 카트리지의 첫번째 대표적인 예를 도시한다. 도시된 구체예에서, 몇몇 내부 구성품은 가요성 용기이다.
도 5는 본 개시에 의해 제공되는 체외 충격파 및/또는 기계적 충격 장치에서 사용을 위해 적합한 강성, 자립형 카트리지의 대표적인 예를 도시한다.

본 개시의 구체예를 설명하기 전에, 이러한 구체예는 단지 예로서 제공되는 것이며, 본 명세서에 기술된 개시 내용의 구체예에 대한 다양한 대안이 본 개시 내용을 실시하는데 적용될 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 다양한 변동, 변화, 및 치환이 본 개시 내용을 벗어나지 않고 당업자에게 가능하게 될 것이다.

달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 개시 내용이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 또는 균등한 방법 및 재료가 본 개시 내용의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료를 하기에서 설명한다. 분쟁이 있는 경우에, 정의를 포함하여, 본 특허 명세서가 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시이며 한정하려는 의도가 아니다. 다양한 변동, 변화, 및 치환이 본 개시 내용을 벗어나지 않고 당업자에게 가능할 것이다.

명세서 및 청구항에서 사용시, 단수형 "한", "하나" 및 "그"는 달리 명확하게 명시하지 않으면 복수 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 "한 세포"는 이의 혼합물을 포함하는 복수의 세포를 포함한다.

본 명세서에서 사용시, "체외 충격파", "체외 충격파들" 및/또는 "ESW"는 관심 샘플의 외부에서 발생되어서 그 샘플에 전달되는, 음파와 유사한, 기계적 에너지의 돌연한, 고진폭 펄스를 의미한다. 그러한 측면에서, ESW의 발생원은 샘플과 물리적 접촉을 하지 않고, 충격파가 그 자체로 샘플과 접촉하지만, 발생원은 그렇지 않다. 따라서, 체외 충격파는 샘플로부터 일정 거리의 공급원에 의해 발생되고 그리고 나서 샘플에 전달된다. 전달은 공기를 통하고/통하거나 샘플이 위치된 용기의 벽을 통해서 일어날 수 있다. ESW는, 예를 들어, 전체 샘플을 포괄할 수 있거나, 또는 오직 그의 일부분만을 포괄할 수 있는 관심 영역으로 ESW를 집중시키기 위해서, 집속될 수 있고/있거나 유향(directed)될 수 있다.

본 명세서에서 사용시, "대상체" 또는 "환자"는 포유동물, 예를 들어 인간을 의미한다.

본 개시 내용에 의해 제공되는 방법은 조직 샘플을 보다 작은 단편 - 세포의 클러스터 및/또는 단일 세포 - 으로 파쇄시키기 위해 체외 충격파, 기계적 충격, 진동 및/또는 쇄석술의 원리를 이용하고, 그 이후에 바람직한 세포 분획을 샘플로부터 단리할 수 있다. 다양한 양상에서, 방법은 대상체로부터 샘플을 단리하는 단계로서, 샘플은 관심 세포 유형을 포함하는 것인 단계, 샘플을 소형 세포 클러스터 및/또는 개별 세포로 파쇄하기 위해서, ESW를 발생시키는데 사용되는 장치가 아닌, 체외 충격파와 샘플을 접촉시키는 단계, 및 그리고 나서 파쇄된 샘플로부터 관심 세포 유형을 단리시키는 단계를 포함한다.

본 개시 내용에 의해 제공되는 장치는 관심 샘플을 파쇄시키기 위해서 집속 및/또는 유향 충격파, 및/또는 집속 및 유향 기계적 충격을 이용한다. 다양한 양상에서, 본 개시 내용에 의해 제공되는 장치는 충격파 또는 기계적 충격에 노출 동안 멸균된, 밀폐 환경에 샘플을 유지시킨다. 그러므로, 충격파 및/또는 기계적 충격은 밀폐되고, 멸균된 용기의 외부에서 발생되고, 샘플이 위치된 그 내부로 용기의 하나 이상의 벽을 통해서 전달된다.

ESW의 공급원을 관심 샘플로부터 일정 거리로 유지시킴으로써, ESW의 공급원 (그들을 발생시키는 장치)은 샘플과 물리적 접촉을 하지 않는다. 이것은 샘플 및 샘플로부터 단리된 임의 세포 분획의 멸균성을 상당히 개선시킨다. 의료인의 관점에서, 이것은 또한 멸균성에 관한 요건을 개선시키고 샘플로부터 유래된 관심 세포 분획이 환자 사용을 위해 멸균인 것을 보장하도록 돕는다. 추가적으로, 관심 샘플로부터 ESW 발생원을 유지시키는 것은 발생기가 세포를 손상시키거나 또는 사멸시킬 수 있고, DNA를 손상시켜서 수율을 급격하게 감소시킬 수 있는, 관심 샘플로 에너지 또는 열이 첨가되지 않게 하는 것을 보장한다. 그러한 측면에서, 본 개시 내용에 의해 제공되는 장치는 초음파와 같은 기지의 다른 시스템에 대한 개선이다.

본 개시 내용에 의해 제공되는 방법 및 장치는 조직 샘플로부터 신속하게, 일부 구체예에서, 30분 또는 그 이내에, 바람직한 세포 분획을 단리할 수 있다. 개시된 방법 및 장치가 사용할 수 있는 속도는 샘플로부터 단리되는 바람직한 세포 분획이 즉각적으로 사용에 이용될 수 있다는 점에서 상당한 장점을 부여한다.

방법

도 1은 본 개시 내용에 의해 제공되는 구체예에 따라, 조직 샘플로부터 관심 세포 분획을 단리하는 방법을 제시한다.

도시된 구체예에서, 방법은 먼저 대상체 (100)로부터 조직을 추출하는 것으로 시작된다. 조직은 그 조직이 체외 충격파가 가해질 때 파쇄되어진다면, 임의 유형의 것일 수 있다. 일부 구체예에서, 조직은 지방 조직, 또는 지방이다. 일부 구체예에서, 조직은 내부 장기, 예를 들어 뇌, 인두, 후두, 심장, 동맥, 근육, 간, 담낭, 신장, 소장, 대장, 림프절, 폐, 비장, 골수, 위, 정맥, 췌장, 방광, 뼈, 치아, 상아질, 잇몸 또는 피부에서 유래된다. 일부 구체예에서 조직은 내분비계, 예를 들어 송과선, 뇌하수체, 갑상선, 부신, 췌장, 난소 또는 고환의 성분에서 유래된다.

추출은 임의 수의 기지 방법을 통해서 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 조직 추출은 시린지를 통해 일어난다. 일부 구체예에서, 조직 추출은 외과적으로 일어나서 조직 샘플이 대상체로부터 제거 시 제1 용기에 위치된다.

다음으로, 조직을 프로세싱 용기 또는 카트리지 (105)로 이송한다. 본 개시 내용에 의해 제공되는 장치는 신속하고 사용이 용이한 ESW 세포 바이오프로세싱에 요구되는 모든 구성품을 제공한다. 개시된 방법 및/또는 장치의 구성품의 일부가 서로 분리가능하지만, 그들은 완전하게 멸균된 방식으로 서로 연결되도록 구성되어 있어서, 프로세싱 동안 한 구성품에서 다른 것으로 샘플의 수송을 가능하게 한다. 그러한 측면에서, 전체 샘플을 단일 시스템에서 프로세싱하고, 그리하여 멸균성이 보장된다.

멸균 이송은 샘플을 외부 환경에 노출시키지 않고 수행된다. 그러한 측면에서, 이송은 밀폐된, 멸균 환경을 유지시키게 되는 임의 수의 방식을 통해 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 이송은 대상체로부터 추출된 샘플을 함유하는 제1 용기와 프로세싱 용기 또는 카트리지 사이에 암수 루어 락(male and female luer lock) 연결기를 서로에게 부착시킴으로써 수행된다. 일부 구체예에서, 이송은 멸균된 연결 장치를 사용하여 제1 용기와 프로세싱 용기 또는 카트리지를 멸균-도킹함으로써 수행된다. 샘플은 기계적으로 또는 중력류에 의해서, 제1 용기로부터 프로세싱 용기 또는 카트리지로 이송된다.

일부 구체예에서, 제1 용기는 카트리지에 삽입되고 멸균 연결 장치를 사용해 멸균-도킹되어서 카트리지 내 프로세싱 용기가 된다. 프로세싱 챔버로서 제1 용기는 이미 샘플을 함유하고 있다.

그러한 측면에서, 본 개시에서는, 조직 및/또는 세포 샘플이 한 용기에서 다른 것으로 이동되는 것으로 개시될 때마다, 이러한 이동은 밀폐 시스템의 무결성을 유지시키기 위해 일어날 수 있고, 그리하여 샘플을 외부 환경에 노출시키지 않는다.

샘플을 프로세싱 용기 또는 카트리지에 이송하게 되면, 조직 샘플은 1회 이상 세척된다 (110). 세척 단계는 멸균 염수 용액의 사용을 통해서, 본 명세서에 기술된 바와 같이 일어날 수 있다. 세척은 샘플이 프로세싱 이전에 가능한 많은 불순물이 없어지도록 보장하고, 그에 따라 그로부터 단리하려는 세포 분획의 순도가 증가된다.

일부 구체예에서, 세척은 프로세싱 용기 또는 카트리지의 기계적 교반에 의해 수행된다. 다수 세척 단계가 바람직하고/하거나 필요하면, 멸균 염수는 1회 세척이 완료된 이후에 프로세싱 용기 또는 카트리지로부터 배수하고, 새로운 멸균 염수가 각각의 후속 세척을 위해 용기 또는 카트리지에 유입된다. 그러한 측면에서, 멸균 염수가 배수되어 새로운 멸균 염수가 용기 또는 카트리지에 유입될 때 마다, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 밀폐된, 멸균 환경을 유지시키도록 수행된다.

세척 이후, 조직 샘플이 프로세싱된다 (115). 표시된 바와 같이, 프로세싱은 ESW, 기계적 충격, 진동 및 전단, 또는 이의 조합의 사용을 통해 일어날 수 있다.

일부 구체예에서, 프로세싱은 ESW를 통해 일어나고 조직 샘플은 다수의 소형 세포 클러스터로 파쇄된다. 일부 구체예에서, 프로세싱은 ESW를 통해서 일어나고 조직 샘플은 다수의 소형 세포 클러스터 및 다수의 개별 세포로 파쇄된다. 일부 구체예에서, 프로세싱은 ESW를 통해 일어나고 조직 샘플은 다수의 개별 세포로 완전하게 파쇄된다.

일부 구체예에서, 프로세싱은 기계적 충격 및 전단을 통해 일어나고 조직 샘플은 다수의 소형 세포 클러스터로 파쇄된다. 일부 구체예에서, 프로세싱은 기계적 충격 및 전단을 통해 일어나고 조직 샘플은 다수의 소형 세포 클러스터 및 다수의 개별 세포로 파쇄된다. 일부 구체예에서, 프로세싱은 기계적 충격 및 전단을 통해 일어나고 조직 샘플은 다수의 개별 세포로 완전하게 파쇄된다.

일부 구체예에서, 프로세싱은 ESW 및 기계적 충격 및 전단의 조합을 통해 일어나고 조직 샘플은 다수의 소형 세포 클러스터로 파쇄된다. 일부 구체예에서, 프로세싱은 ESW 및 기계적 충격 및 전단의 조합을 통해 일어나고 조직 샘플은 다수의 소형 세포 클러스터 및 다수의 개별 세포로 파쇄된다. 일부 구체예에서, 프로세싱은 ESW 및 기계적 충격 및 전단의 조합을 통해서 일어나고 조직 샘플은 다수의 개별 세포로 완전하게 파쇄된다.

프로세싱 이후에, 세포 현탁액은 다수의 소형 세포 클러스터, 다수의 개별 세포, 또는 둘 모두일 수 있는, 샘플에 남아있는 것을 의미하는 세포 현탁액을 여과하고 원심분리한다 (120). 여과는 프로세싱 용기 또는 카트리지로부터 분리되어진 장치에서, 또는 프로세싱 용기 또는 카트리지 그 자체 내부에서 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 여과는 별개의 장치에서 일어나고, 이러한 경우에 세포 현탁액은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 멸균 수단을 통해 필터로 이송된다. 일부 구체예에서, 여과는 세포 현탁액이 용기 또는 카트리지로부터 하나 이상의 원심분리 튜브로 이동됨에 따라 일어난다.

일부 구체예에서, 여과 장치로의 이송은 프로세싱 용기 또는 카트리지와 여과 장치 사이의 암수 루어 락 연결기를 서로에게 부착시킴으로써 수행된다. 일부 구체예에서, 이송은 멸균된 연결 장치를 사용하여 프로세싱 용기 또는 카트리지와 여과 장치를 멸균-도킹함으로써 수행된다. 샘플은 기계적으로 또는 중력류에 의해서, 프로세싱 용기 또는 카트리지로부터 여과 장치로 이송된다.

일부 구체예에서, 여과는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 프로세싱 용기 또는 카트리지에서 일어난다.

다양한 양상에서, 원심분리는 프로세싱 용기 또는 카트리지의 외부에서 일어난다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 프로세싱 용기 또는 카트리지의 내부에 위치된 하나 이상의 원심분리 튜브로 이송된다. 충전되면, 원심분리 튜브는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 멸균 수단을 통해서 프로세싱 용기 또는 카트리지로부터 원심분리기로 이동된다.

일부 구체예에서, 세포 현탁액은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 멸균 수단을 통해서 프로세싱 용기 또는 카트리지의 외부에 위치된 하나 이상의 원심분리 튜브로 이송된다. 충전되면, 원심분리 튜브는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 멸균 수단을 통해서 프로세싱 용기 또는 카트리지로부터 원심분리기로 이동된다.

원심분리의 기간 및 속도는 프로세싱하려는 조직 유형에 따라서 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 3분 내지 30분의 기간 동안 500 g 내지 2,000 g의 속도에서 원심분리된다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 10 내지 25분 동안 1,000 g 내지 1,800 g의 속도에서 원심분리된다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 10분 동안 1,200 g에서 원심분리된다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 7분 동안 1,200 g에서 원심분리된다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 5분 동안 1,200 g에서 원심분리된다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 3분 동안 1,200 g에서 원심분리된다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 10분 동안 900 g에서 원심분리된다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 7분 동안 900 g에서 원심분리된다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 5분 동안 900 g에서 원심분리된다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 3분 동안 900 g에서 원심분리된다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 10분 동안 600 g에서 원심분리된다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 7분 동안 600 g에서 원심분리된다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 5분 동안 600 g에서 원심분리된다. 일부 구체예에서, 세포 현탁액은 3분 동안 600 g에서 원심분리된다.

세포 현탁액에 존재하는 다수의 세포 유형을 원심분리를 통해서 서로 분리시킬 수 있는 수많은 수단이 존재한다. 예를 들어, 밀도 구배가 이용될 수 있는데, 그리하여 원심분리 동안, 세포가 그들의 특별한 밀도에 따라 밴드로 분리될 수 있게 된다. 추가적으로, 크기 배제 프로토콜이 크기를 통해 세포를 분리시키는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 분리는 예를 들어 프로세싱된 조직 샘플을 가라앉히고 원심분리 이전에 바람직한 세포 분획으로부터 바람직하지 않은 세포 찌꺼기를 분리시킴으로써, 원심분리 전에 시작될 수 있다. 사용되는 분리 기술의 유형은 단리하려는 바람직한 세포 분획에 따라 가변적일 수 있다.

바람직한 세포 분획이 단리되면, 그것이 유래된 대상체에게 투여를 위해 재현탁될 수 있다 (125). 일부 구체예에서, 바람직한 세포 분획은 원심분리 튜브로부터 수득된 적은 부피의 유체에 재현탁된다. 일부 구체예에서, 바람직한 세포 분획은 멸균 염수에 재현탁된다.

일 양상에서, 바람직한 세포 분획은 줄기 세포이고 줄기 세포가 유래된 조직은 지방이다.

지방로부터 줄기 세포를 프로세싱하는 방법의 제1 구체예는 다음과 같다:

지방은 지방흡입술을 통해 환자로부터 수득된다. 지방흡입술은 시린지를 통해서 수행될 수 있으며, 여기서 지방은 지방흡입 기계를 통해서, 또는 바늘을 통해서 직접적으로 환자로부터 제거된다. 지방흡입 동안 제거되는 지방의 양은 바람직한 줄기 세포의 수에 따라서 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 지방흡입술은 미니-지방흡입술로서, 약 30 cc 내지 약 50 cc의 지방이 환자로부터 제거된다. 일부 구체예에서, 지방흡입술은 마이크로-지방흡입술로서, 약 5 cc 내지 약 29 cc의 지방이 환자로부터 제거된다. 일부 구체예에서, 지방흡입술은 전형적인 임상적 지방흡입술로서, 이 경우에 300 cc의 지방 또는 그 이상이 환자로부터 제거된다.

지방이 환자로부터 제거되면, 멸균 프로세싱 용기 또는 카트리지로 이송된다. 이송은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 멸균 수단을 통해서 일어난다. 일부 구체예에서, 지방은 시린지를 통해 환자로부터 제거되고 시린지와 프로세싱 용기 또는 카트리지 사이에서 암수 루어 락 연결기를 서로에게 부착시킴으로써 시린지로부터 프로세싱 용기 또는 카트리지로 이송된다. 일부 구체예에서, 지방은 시린지를 통해서 환자로부터 제거되고 시린지는 시린지와 용기 또는 카트리지 사이에서 암수 루어 락 연결기를 서로에게 부착시킴으로써 프로세싱 용기 또는 카트리지 내에서 멸균-도킹된다. 일부 구체예에서, 지방은 시린지를 통해 환자로부터 제거되고 카트리지 내 카트리지 또는 프로세싱 용기와 시린지 사이에서 암수 루어 락 연결기를 서로에게 부착시킴으로써 시린지로부터 프로세싱 용기 또는 카트리지로 이송된다. 일부 구체예에서, 지방은 지방흡입술 장치를 통해 환자로부터 제거되고 멸균 연결 장치를 사용하여 지방흡입술 장치 및 프로세싱 용기 또는 카트리지를 멸균-도킹함으로써 지방흡입술 장치로부터 프로세싱 용기 또는 카트리지로 이송된다.

일부 구체예에서, 이송은 중력류를 통해 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 이송은 기계적으로, 예를 들어 시린지의 플런저를 물리적으로 누르고 시린지의 내부로부터 프로세싱 용기 또는 카트리지의 내부로 지방을 강제로 밀어넣어서 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 이송은 장치, 예컨대 펌프를 통해 일어날 수 있다.

지방을 수용하는데 사용되는 용기 또는 카트리지의 부피는 환자로부터 수득되는 지방의 양에 따라 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 미니-지방흡입술을 통해 제거되는, 30 cc 내지 50 cc의 지방은 9 액량 온스 내지 19 액량 온스의 부피를 갖는 용기 또는 카트리지로 이송된다.

이어서, 환자로부터 제거된 지방의 양과 균등한 멸균 염수의 부피를 지방을 세척하기 위해 용기 또는 카트리지로 이송한다. 예로서, 30 cc의 지방이 환자로부터 제거되었으면, 30 mL의 멸균 염수를 사용하여 샘플을 세척한다. 일부 구체예에서, 환자로부터 제거된 지방의 양보다 큰 멸균 염수의 부피가 지방을 세척하기 위해 용기 또는 카트리지로 이송된다. 예로서, 30 cc의 지방이 환자로부터 제거되었으면, 35 mL의 멸균 염수를 사용하여 샘플을 세척한다. 일부 구체예에서, 환자로부터 제거된 지방의 양보다 적은 멸균 염수의 부피가 지방을 세척하기 위해 용기 또는 카트리지로 이송된다. 예로서, 30 cc의 지방이 환자로부터 제거되면, 25 mL의 멸균 염수를 사용하여 샘플을 세척한다. 일부 구체예에서, 멸균 염수 부피의 조합이 지방을 세척하기 위해서 지방의 양에 첨가된다. 용기 또는 카트리지로 염수의 이송은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 시스템의 멸균성을 유지하도록 수행된다. 일부 구체예에서, 멸균 염수는 멸균 염수를 수용하는 용기와 프로세싱 용기 또는 카트리지 사이에서 암수 루어 락 연결기를 서로에게 부착시킴으로써 용기 또는 카트리지로 이송된다. 일부 구체예에서, 멸균 염수는 멸균된 연결 장치를 사용하여 프로세싱 용기 또는 카트리지와 멸균 염수 용기를 멸균-도킹함으로써 용기 또는 카트리지로 이송된다.

세척은 지방 및 멸균 염수를 함유하는 용기 또는 카트리지를 가볍게 진탕시키거나 또는 소용돌이치게 하여 수행된다.

이후에 용기 또는 카트리지는 (이제 세척된) 지방이 멸균 염수로부터 분리될 수 있게 하는 방식으로 위치된다. 지방이 염수보다 덜 조밀하므로, 상승되어서 염수의 상층부에 부유될 것이다. 분리가 일어나는데 요구되는 시간량은 지방 샘플의 개별 구성에 따라 가변적일 것이다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 30분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 15분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 10분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 5분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 10초 내지 1분 간 일어날 수 있다.

다음으로, 염수는 오직 지방만 남도록 가능한 완전하게 용기 또는 카트리지로부터 배수된다. 배수는 방법에서 이용하는 용기 또는 카트리지의 유형에 따라서, 다양한 수단을 통해 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 염수는 용기 또는 카트리지의 바닥에 위치된 튜브를 통해서 용기 또는 카트리지 밖으로 배수된다. 배수는 시린지 또는 펌프를 사용해서 능동적으로, 또는 중력류를 통해 수동적으로 처리될 수 있다. 일부 구체예에서, 배수는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 멸균된 시스템의 무결성을 유지하도록 일어난다.

세척은 지방이 금색이 될 때까지 반복되며 염수는 세척 완료 후에 단지 약하게만 탁하다. 일부 구체예에서, 세척은 1회 내지 5회, 일부 구체예에서, 1회 내지 4회, 일부 구체예에서 1회 내지 3회, 일부 구체예에서, 1회 내지 2회, 및 일부 구체예에서 1회 일어난다.

세척이 완료되면, 지방은 프로세싱 준비가 된다.

임의로, 멸균 염수는 프로세싱을 위한 백에 첨가되는데, 이것은 필수적이지 않다. 염수의 첨가는 프로세싱 동안 서로 자유롭게 이동하도록 세포 및/또는 세포의 소형 클러스터를 위한 공간을 제공하게 되어서, 지방이 개별 세포로 파쇄되도록 돕는다. 염수가 첨가되는 경우, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 멸균 시스템의 무결성이 유지되는 방식으로 첨가된다.

임의로 첨가되는 염수의 부피는 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 첨가되는 염수의 부피는 0 내지 환자로부터 제거되는 지방 부피의 2배 범위이다. 일부 구체예에서, 동일량의 염수가 사용된다 (예를 들어, 30 cc의 지방의 경우 30 mL의 염수).

펌프 또는 시린지를 사용하여 용기 또는 카트리지로부터 과량의 공기를 제거한다. 일부 구체예에서, 과량의 공기는 멸균 염수 세척물이 배수되는 용기 또는 카트리지의 바닥에 위치된 동일한 튜브로부터 제거된다. 일부 구체예에서, 공기는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 멸균, 밀폐된 시스템의 무결성을 유지하는 방식으로 배수된다.

다음으로, 프로세싱 용기 또는 카트리지는 프로세싱 장비로 이동된다. 적합한 프로세싱 장비 (200)의 예가 도 2에 도시되어 있다. 도시된 구체예에서, 프로세싱 용기 또는 카트리지 (205)는 프로세싱을 위해 강성 플랫폼 (210) 상에 고정된다. 플랫폼 (210)은 ESW 프로세싱 동안 용기 또는 카트리지 (205)의 이동을 제어한다.

플랫폼 (210)은 나무, 금속, 플라스틱, 아크릴 등을 포함하는 임의의 적합한, 강성 재료로 만들어질 수 있다. 일부 구체예에서, 플랫폼 (210)은 나무로 만들어진다.

프로세싱 장비 (200)는 용기 또는 카트리지 (205)의 내부에 충격파를 전달할 수 있는 충격파 적용기 (215)를 수용한다. 충격파 적용기 (215)는 적용기 플랫폼 (220)을 통해서 프로세싱 장비 (200) 상에 수용된다. 적용기 플랫폼 (220) 및 충격파 적용기 (215)는 용기 또는 카트리지 (205) 내부에 함유된 지방로부터 일정 거리를 유지하여서 충격파 적용기 (215)가 결코 지방과 직접 접촉하지 않는다. 이것은 지방로 전달되는 충격파가 체외이거나, 또는 ESW인 것을 보장한다. 일부 구체예에서, 충격파 적용기 (215)는 프로세싱 용기 또는 카트리지 (205)와 직접 접촉하여 위치될 수 있다. 이러한 구체예에서, 용기 또는 카트리지 (205)의 벽은 충격파 적용기 (215)가 결코 지방과 직접 접촉하지 않도록 보장한다.

적용기 플랫폼 (220), 및 이 충격파 적용기 (215)의 움직임은 3방향면, X, Y 및 Z로 일어날 수 있고, 이들 각각은 그 자체의 모터에 의해 제어된다: X 면 모터 (230), Y 면 모터 (235) 및 Z 면 모터 (240). 일부 구체예에서, 이들 모터는 NEMA 17 스테퍼 모터이다. 각각의 모터 (230, 235 및 240)는 용기 또는 카트리지 (205) 주변 및 위에서 3차원으로 적용기 플랫폼 (220) 및 충격파 적용기 (215)를 움직이게 할 수 있는, 모터 제어기 (225)에 의해 제어된다. 일부 구체예에서, 모터는 Marlin 펌웨어가 프로그래밍한 Arduino 마이크로프로세서 v6 보드에 의해 제어된다. 일부 구체예에서, 모터는 Marlin 펌웨어에 의한 Arduino v6 보드에 의해 제어된다. 일부 구체예에서, 오직 X 면 모터 (230)만이 사용된다. 일부 구체예에서, 오직 Y 면 모터 (235)만이 사용된다. 일부 구체예에서, 오직 Z 면 모터 (240)만 사용된다. 일부 구체예에서, 오직 X 면 모터 (230)만 사용된다. 일부 구체예에서, 오직 X 면 모터 (230) 및 Y 면 모터 (235)만 사용된다. 일부 구체예에서, 오직 X 면 모터 (230) 및 Z 면 모터 (240)만 사용된다. 일부 구체예에서, 오직 Y 면 모터 (235) 및 Z 면 모터 (240)만 사용된다. 일부 구체예에서, X 면 모터 (230), Y 면 모터 (235) 및 Z 면 모터 (240)만 사용된다.

적용기 플랫폼 (220) 및 충격파 적용기 (215)의 3차원 움직임은 프로세싱 동안 추출된 샘플 중 모든 지방이 체외 충격파에 노출될 수 있게 한다.

이어서, 충격파는 지방을 파쇄하여, 지방로부터 소형 세포 클러스터 및 개별 세포를 유리시키기 위해, 충격파 적용기 (215)로부터, 전송 겔 또는 전송 겔을 함유하는 멤브레인을 통해, 용기 또는 카트리지 (205)의 벽을 통해서, 지방 샘플로 전달된다. 일부 구체예에서, 전송 겔은 Chattanooga (DJO, LLC, 1430 Decision Street, Vista, CA 92081, USA)가 제조한 REF 4248 컨덕터 전송 겔이다. 멸균 염수가 프로세싱 이전에 지방에 첨가되는 구체예에서, 지방로부터 유리된 소형 세포 클러스터 및/또는 개별 세포는 염수로 이동하게 될 것이다.

충격파 적용기 (215)는 충격파 적용기 (215)를 통해서 지방로 전송되는 ESW를 생성하는, 충격파 발생기 (245)에 의해 동력공급된다. 일부 구체예에서, 충격파 발생기는 Storz Medical AG (8274 Tagerwilen, Switzerland)가 제조한 MasterPuls MP100이다. 일부 구체예에서, 충격파 발생기는 Lumsail Industrial Inc. (4/F, No. 9Yi, Lane 2, Suide Road, Shanghai, 200331, China)가 제조한 BS-SWT2X이다.

지방에 전달되는 ESW의 동력은 가변적일 수 있다. 예를 들어, 두꺼운 벽으로 된 용기 또는 카트리지 (205)의 벽을 투과하기 위해서 ESW의 동력을 증가시키는 것이 필요할 수 있다. 일반적으로, 지방에 전달되는 ESW의 동력은 용기 또는 카트리지 (205)의 벽 두께 및/또는 용기 또는 카트리지 (205)가 제조된 재료에 따라 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 지방에 전달되는 ESW의 동력은 0.5 내지 5.0 bar 범위이다. 일부 구체예에서, 지방에 전달되는 ESW의 동력은 1.0 내지 4.5 bar 범위이다. 일부 구체예에서, 지방에 전달되는 ESW의 동력은 1.5 내지 4.0 bar 범위이다. 일부 구체예에서, 지방에 전달되는 ESW의 동력은 2.0 내지 3.5 bar 범위이다. 일부 구체예에서, 용기 (205)는 두께가 0.25 ㎜인 벽을 구비하는 비닐 백이고, ESW의 동력 수준은 2.0 내지 2.5 bar 범위이다.

충격파 적용기 (215)가 전달하는 ESW에 의해 포괄되는 면적은 가변적일 수 있다. 충격파 적용기 (215)가 포괄하는 면적이 클수록, ESW에 노출되는 지방의 표면적이 커진다. 일부 구체예에서, 충격파 적용기 (215)가 포괄하는 총면적은 1 ㎠ 내지 100 ㎠, 일부 구체예에서 1 ㎠ 내지 90 ㎠, 일부 구체예에서 1 ㎠ 내지 80 ㎠, 일부 구체예에서 1 ㎠ 내지 70 ㎠, 일부 구체예에서 1 ㎠ 내지 60 ㎠, 일부 구체예에서 1 ㎠ 내지 50 ㎠, 일부 구체예에서 1 ㎠ 내지 40 ㎠, 일부 구체예에서 1 ㎠ 내지 30 ㎠, 일부 구체예에서 1 ㎠ 내지 20 ㎠, 일부 구체예에서 1 ㎠ 내지 10 ㎠, 및 일부 구체예에서 1 ㎠ 내지 5 ㎠ 범위이다. 일부 구체예에서, 충격파 적용기 (215)가 포괄하는 총면적은 5 ㎠이다.

일 구체예에서, 용기 (205)는 0.25 ㎜ 두께의 벽을 구비한 19 oz 비닐 백이고, 환자로부터 수득되는 지방의 총량은 30 cc이며, 30 mL의 염수 (지방 샘플과 동일한 부피)의 선택적 첨가가 프로세싱 이전에 비닐 백에 첨가된다. 이러한 구체예에서, 백의 총면적, 및 그에 따라 ESW에 노출되는 지방 샘플의 총량은 대략 5 ㎠이다.

지방 샘플에 전달되는 충격파의 수는 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 충격파의 총수는 5,000 내지 100,000, 일부 구체예에서 10,000 내지 50,000, 일부 구체예에서 10,000 내지 25,000, 및 일부 구체예에서 10,000 내지 20,000 범위이다. 일부 구체예에서, 충격파의 총 수는 25,000이다.

이러한 구체예에서, 줄기 세포는 환자로부터 수득되는 지방 샘플로부터 분리된다. 충격파 적용기 (215) 상에서 5 ㎠의 적용기 첨단을 사용하여, 2.0 내지 2.5 bar 범위의 10,000 내지 50,000 범위의 충격파수가 지방로부터 줄기 세포 및 기질 혈관 분획 둘 모두를 분리시키는데 충분하다. 본 명세서에서 사용시, "기질 혈관 분획"은 일부 구체예에서 지방인, 분리되고 해리되어진 세포 분획으로부터 수득된 세포를 포함하는 프로세싱된 조직 샘플로부터 수득되는 세포 분획을 의미한다. 기질 혈관 분획은 제한없이, 다른 것들 중에서도, 줄기 세포, 성장 인자 및 전구체 세포를 포함한다.

ESW가 지방 샘플에 적용된 이후에, 용기 또는 카트리지에 대해서 짧은 기간 동안 기계적 교반이 가해진다. 일부 구체예에서, 기계적 교반은 진탕이다. 일부 구체예에서, 기계적 교반은 1회 이상 용기 또는 카트리지 (205)를 반전시킨다. 일부 구체예에서, 단기간은 1초 내지 30초, 일부 구체예에서 1초 내지 15초, 및 일부 구체예에서 1초 내지 10초 범위이다. 일부 구체예에서, 단기간은 대략 10초이다. 교반은 지방로부터 방출된 줄기 세포 및 기질 혈관 분획이 용기 또는 카트리지 (205)에 여전히 존재할 수 있는 임의의 오래 잔존하는 지방 조직 및 지방 세포 찌꺼기로부터 분리될 수 있게 한다.

이후에 용기 또는 카트리지 (205)는 ESW에 의해 지방로부터 분리시킨 줄기 세포 및 기질 혈관 분획을 이제 함유하는 멸균 염수로부터 (이제 프로세싱된) 지방을 분리시킬 수 있게 하는 방식으로 위치된다. 지방은 줄기 세포-함유 염수보다 덜 조밀하므로, 상승되어 염수의 상층부로 부유될 것이다. 분리가 일어나는데 요구되는 시간량은 지방 샘플의 개별 구성에 따라서 다양할 것이다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 30분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 15분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 10분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 5분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 10초 내지 1분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 간 일어날 수 있다.

줄기 세포는 이제 지방 샘플로부터 분리되어 멸균 염수층에 현탁된다.

다음으로 줄기 세포-함유 염수층을 가능한 완전하게 용기 또는 카트리지 (250)로부터 제거하여서, 오직 지방만이 잔류하게 된다. 제거는 방법에서 이용되는 용기 또는 카트리지 (205)의 유형에 따라서, 다양한 수단을 통해 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 염수는 용기 또는 카트리지 (205)의 바닥에 위치된 튜브를 통해서 용기 또는 카트리지 (205) 밖으로 배수된다. 배수는 시린지 또는 펌프를 사용하여 능동적으로 진행될 수 있거나, 또는 중력류를 통해 수동적으로 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 줄기-세포 함유층은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 밀폐된, 멸균 환경의 무결성을 유지하게 되는 방식으로 제거된다.

일부 구체예에서, 줄기 세포-함유 염수층은 용기 또는 카트리지 (205)로부터 제거 동안 필터를 통해 통과한다. 필터의 크기는 다양할 수 있다. 일부 구체예에서, 필터 크기는 40 ㎛ 내지 100 ㎛ 범위이다. 일부 구체예에서, 필터 크기는 70 ㎛이다. 다양한 구체예에서, 필터는 나일론이다.

용기 또는 카트리지 (205)로부터 제거 이후 또는 그 동안에, 줄기 세포-함유 염수는 하나 이상의 원심분리 튜브로 이동된다. 일부 구체예에서, 이동은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 밀폐된, 멸균 환경의 무결성을 유지시키는 방식으로 일어난다. 원심분리 튜브의 바닥에 줄기 세포를 펠렛으로 농축시키기 위해 원심분리가 후속된다.

줄기 세포는 500 g 내지 1,600 g에서 3분 내지 10분 동안 원심분리에 의해 농축된다. 일부 구체예에서, 줄기 세포는 10분 동안 1,200 g에서 원심분리에 의해 농축된다.

유체는 튜브로부터 분리되어, 바닥에 줄기 세포만이 남게된다. 디캔팅, 흡입, 또는 유사한 수단에 의해 제거될 수 있다.

줄기 세포를 재현탁시키기 위해서 소량의 유체가 원심분리 튜브(들)에 넣어진다. 일부 구체예에서, 원심분리 튜브에 첨가되는 유체의 양은 1 mL 내지 5 mL 범위이다. 일부 구체예에서, 유체는 염수, 혈소판-풍부-혈장, 히알루로난, 고정겔, 히드로겔, 스캐폴드, 피브린, 글루 또는 임의의 전술한 것의 조합이다. 일부 구체예에서, 세포는 원심분리 흡입물에 재현탁된다.

줄기 세포가 현탁액에 부유되면, 그들은 사용 준비가 된 것이다. 이러한 사용은 제한없이, 그들이 유래된 환자에게의 재도입, 냉동보존, 확장 등을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 농축되고, 재현탁된 줄기 세포는 환자 사용을 위해, 피하주사침을 통해, 시린지로 이동된다. 일부 구체예에서 농축되고, 재현탁된 줄기 세포는 심장, 근육, 뼈, 연골, 간, 신장 또는 다른 조직 및 장기 구조물로 성장을 위한 조직-스캐폴드에 씨딩된다. 일부 구체예에서, 농축되고, 재현탁된 줄기 세포는 다능성 전사 인자를 발현시킴으로써 유도된-다능성 줄기 세포로 형질전환된다.

지방로부터 줄기 세포를 프로세싱하는 제2 구체예는 다음과 같다:

지방은 지방흡입술을 통해 환자로부터 수득된다. 지방흡입술은 시린지를 통해 수행될 수 있으며, 여기서 지방은 지방흡입술 기계를 통해서, 또는 바늘을 통해 직접적으로 환자로부터 제거된다. 지방흡입술 동안 제거되는 지방의 양은 바람직한 줄기 세포의 수에 따라서 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 지방은 시린지를 통해 환자로부터 제거되고, 시린지는 시린지와 카트리지 사이에서 암수 루어 락 연결기를 서로에게 부착시킴으로써 카트리지 내에서 멸균-도킹된다. 일부 구체예에서, 지방은 시린지를 통해서 환자로부터 제거되고 카트리지 내에서 프로세싱 용기 또는 카트리지와 시린지 사이에 암수 루어 락 연결기를 서로에게 부착시킴으로써 시린지로부터 프로세싱 용기 또는 카트리지로 전달된다. 일부 구체예에서, 지방흡입술은 미니-지방흡입술이고, 여기서 약 30 cc 내지 약 50 cc의 지방이 환자로부터 제거된다. 일부 구체예에서, 지방흡입술은 마이크로-지방흡입술이고, 여기서 약 5 cc 내지 약 29 cc의 지방이 환자로부터 제거된다. 일부 구체예에서, 지방흡입술은 전형적인 임상적 지방흡입술로서, 이 경우에는 300 cc의 지방 또는 그 이상이 환자로부터 제거된다.

지방이 환자로부터 제거되면, 멸균 프로세싱 용기 또는 카트리지로 이송된다. 이송은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 멸균 수단을 통해 일어난다. 일부 구체예에서, 지방은 시린지를 통해 환자로부터 제거되고 시린지와 프로세싱 용기 또는 카트리지 사이에서 암수 루어 락 연결기를 서로에게 부착시킴으로써 시린지로부터 프로세싱 용기 또는 카트리지로 이송된다. 일부 구체예에서, 지방은 지방흡입술 장치를 통해 환자로부터 제거되고 멸균 연결 장치를 사용하여 지방흡입술 장치 및 프로세싱 용기 또는 카트리지를 멸균-도킹함으로써 지방흡입술 장치로부터 프로세싱 용기 또는 카트리지로 이송된다.

일부 구체예에서, 이송은 중력류를 통해 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 이송은 기계적으로, 예를 들어 시린지의 플런저를 물리적으로 눌러서 시린지의 내부로부터 프로세싱 용기 또는 카트리지의 내부로 지방을 강제로 밀어넣어 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 이송은 장치, 예컨대 펌프를 통해 일어날 수 있다.

지방을 수용하는데 사용되는 용기 또는 카트리지의 부피는 환자로부터 수득되는 지방의 양에 따라 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 미니-지방흡입술을 통해 제거된, 30 cc 내지 50 cc의 지방은 9 액량 온스 내지 19 액량 온스의 부피를 갖는 용기 또는 카트리지로 이송된다.

다음으로 환자로부터 제거된 지방의 양과 균등한 멸균 염수의 부피가 지방을 세척하기 위해 용기 또는 카트리지로 이송된다. 예로서, 30 cc의 지방이 환자로부터 제거되면, 30 mL의 멸균 염수가 샘플을 세척하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 지방은 시린지를 통해 환자로부터 제거되고 시린지는 시린지와 카트리지 사이에서 암수 루어 락 연결기를 서로에게 부착시킴으로써 카트리지 내에서 멸균-도킹된다. 일부 구체예에서, 지방은 시린지를 통해서 환자로부터 제거되어 카트리지 내에서 프로세싱 용기 또는 카트리지 및 시린지 사이에 암수 루어 락 연결기를 서로에게 부착시킴으로써 시린지로부터 프로세싱 용기 또는 카트리지로 이송된다. 용기 또는 카트리지로 염수의 이송은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 시스템의 멸균성을 유지시키도록 수행된다. 일부 구체예에서, 멸균 염수는 멸균 염수를 수용하는 용기와 프로세싱 용기 또는 카트리지 사이에서 암수 루어 락 연결기를 서로에게 부착시킴으로써 용기 또는 카트리지로 이송된다. 일부 구체예에서, 멸균 염수는 멸균 연결 장치를 사용하여 프로세싱 용기 또는 카트리지 및 멸균 염수 용기를 멸균-도킹함으로써 용기 또는 카트리지로 이송된다.

세척은 지방 및 멸균 염수를 함유하는 용기 또는 카트리지를 가볍게 진탕하거나 또는 소용돌이치게 하여 수행된다.

다음으로 용기 또는 카트리지는 (이제 세척된) 지방을 멸균 염수로부터 분리되도록 하는 방식으로 위치된다. 지방은 염수보다 덜 조밀하므로, 상승되어 염수의 상층부에 부유된다. 분리가 일어나는데 요구되는 시간량은 지방 샘플의 개별 구성에 따라 가변적이게 될 것이다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 30분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 15분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 10분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 5분 간 일어날 수 있다.

다음으로, 염수는 가능한 완전하게 용기 또는 카트리지로부터 배수되어서, 오직 지방만이 잔존하게 된다. 방법에서 이용되는 용기 또는 카트리지의 유형에 따라서, 다양한 수단을 통해 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 염수는 용기 또는 카트리지의 바닥에 위치된 튜브를 통해서 용기 또는 카트리지의 밖으로 배수된다. 배수는 시린지 또는 펌프를 사용하여 능동적으로, 또는 중력류를 통해 수동적으로 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 배수는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 멸균 시스템의 무결성을 유지하도록 일어난다.

세척은 지방이 금색이 될 때까지 반복되고 염수는 세척 완류 이후에 오직 약하게만 탁하다. 일부 구체예에서, 세척은 1 내지 5회, 일부 구체예에서 1 내지 4회, 일부 구체예에서 1 내지 3회, 일부 구체예에서 1 내지 2회, 및 일부 구체예에서 1회 일어난다.

세척이 완료되면, 지방은 프로세싱 준비가 된다.

임의로, 멸균 염수가 프로세싱을 위한 백에 첨가되지만, 이것이 필수적이지는 않다. 염수의 첨가는 프로세싱 동안 서로에 대해 자유롭게 이동하도록 세포 및/또는 소형 세포 클러스터에 공간을 제공하게 되고, 그리하여 개별 세포로 지방이 파쇄되는 것을 돕는다. 염수가 첨가되면, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 멸균 시스템의 무결성을 유지하게 되는 방식으로 첨가된다.

임의로 첨가되는 염수의 부피는 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 첨가되는 염수의 부피는 0 내지 환자로부터 제거된 지방 부피의 2배까지의 범위이다. 일부 구체예에서, 동일한 양의 염수가 사용된다 (예를 들어, 30 cc의 지방에 대해 30 mL의 염수).

과량의 공기가 펌프 또는 시린지를 사용하여 용기 또는 카트리지로부터 제거된다. 일부 구체예에서, 과량의 공기는 멸균 염수 세척물이 배수되는 용기 또는 카트리지의 바닥에 위치된 동일한 튜브로부터 제거된다. 일부 구체예에서, 공기는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 멸균된, 밀폐 시스템의 무결성을 유지하는 방식으로 배수된다.

다음으로, 프로세싱 용기 또는 카트리지는 프로세싱 장비로 이동된다. 적합한 프로세싱 장비 (300)의 예가 도 3에 도시되어 있다. 도시된 구체예에서, 프로세싱 용기 또는 카트리지 (205)는 프로세싱을 위해 강성 플랫폼 (315) 상에 고정된다. 플랫폼 (315)은 프로세싱 동안 용기 또는 카트리지 (205)의 이동을 제어한다.

플랫폼 (315)은 나무, 플라스틱 등을 포함하여 임의의 적합한, 강성 재료로 만들어질 수 있다. 일부 구체예에서, 플랫폼 (315)은 나무로 만들어 진다.

이러한 구체예에서, 기계적 충격이 지방 조직을 파쇄하고 줄기 세포를 방출하는데 사용된다.

기계적 충격은 프로세싱하려는 지방이 함유된 용기 또는 카트리지 (205)와 물리적 접촉이 이루어지는 충격식 팔대 (310)를 구동시키는 모터 (305)에 의해 발생된다. 이러한 구체예에서, 모터 (305)는 충격식 팔대 (310)를 구동하여 충격식 팔대 (310)가 아래 위로 관절식으로 연결되어, 이의 운동 범위의 바닥에서 용기 또는 카트리지 (205)와 접촉하게 된다. 일부 구체예에서, 모터는 Black and Decker (1000 Stanley Drive, New Britain, CT 06053, USA)가 제조한 모델 BDEJS300C의 4.5 Amp 모터이다.

일부 구체예에서, 모터 (305)는 0 내지 30,000 rpm, 일부 구체예에서 0 내지 20,000 rpm, 일부 구체예에서 0 내지 10,000 rpm, 및 일부 구체예에서 0 내지 5,000 rpm 범위의 속도로 충격식 팔대를 구동하도록 조정가능한 가변 속도 모터이다.

일부 구체예에서, 모터 (305)는 더 많이 회전력을 발생시키기 위해서 모터 (305)가 전속력 (일부 구체예에서, 30,000 rpm)으로 작동될 때 충격식 팔대 (310)의 속도를 감속시킬 수 있는 기어 장치를 포함한다. 이것이 수행될 때, 충격식 팔대 (310)에 의해 발생되는 운동력은 용기 또는 카트리지 (205) 내 조직에 전달된다. 이것은 지방 조직을 파쇄하고 줄기 세포를 지방 조직으로부터 방출시키는 속도를 상당히 증가시킨다.

일 구체예에서, 모터 (305)는 30,000 rpm에서 3,000 rpm으로 속도를 10분의 1로 감속시킬 수 있게 기어링된다. 이러한 구체예에서, 모터 (305)는 이러한 10분의 1 감속이 가능하게, 0.75 인치의 기어 직경을 포함한다. 3,000 rpm, 및 0.75 인치의 기어 직경에서, 충격식 팔대 (310)는 초 당 117.8 인치의 속도에 도달하고, 그 속도는 충격식 팔대 (310)가 앞뒤로 관절식으로 연결되는 속도이고, 그에 따라 용기 또는 카트리지 (205)와 접촉된다. 충격식 팔대 (310)가 용기 또는 카트리지 (205)와 접촉할 수 있는 속도는 상당히 감소된 프로세싱 시간을 가능하게 한다. 이것은 너무 긴 프로세싱 시간을 요구하는 기지 또는 현행 조직 프로세싱보다 상당한 장점을 부여한다.

조직은 지방이 바람직한 수준으로 파쇄될 때까지, 또는 줄기 세포의 바람직한 양이 지방로부터 방출될 때까지 기계적 충격에 노출된다. 일부 구체예에서, 지방 샘플은 30분 또는 그 이내에 프로세싱된다. 일부 구체예에서, 지방 샘플은 30초 내지 30분, 일부 구체예에서 30초 내지 20분, 일부 구체예에서 30초 내지 10분, 및 일부 구체예에서 30초 내지 5분에 프로세싱된다.

플랫폼 (315)의 움직임은 3차원 면, X, Y 및 Z에서 일어나고, 그 각각의 그 자신의 모터에 의해 제어된다: X 면 모터 (230), Y 면 모터 (235) 및 Z 면 모터 (240). 일부 구체예에서, 오직 X 면 모터 (230)만 사용된다. 일부 구체예에서, 오직 Y 면 모터 (235)만 사용된다. 일부 구체예에서, 오직 Z 면 모터 (240)만 사용된다. 일부 구체예에서, 오직 X 면 모터 (230)만 사용된다. 일부 구체예에서, 오직 X 면 모터 (230) 및 Y 면 모터 (235)만 사용된다. 일부 구체예에서, 단지 X 면 모터 (230) 및 Z 면 모터 (240)만 사용된다. 일부 구체예에서, 오직 Y 면 모터 (235) 및 Z 면 모터 (240)만 사용된다. 일부 구체예에서, X 면 모터 (230), Y 면 모터 (235) 및 Z 면 모터 (240)가 사용된다. 각각의 모터 (230, 235 및 240)는 3차원으로 플랫폼 (315)의 움직임을 가능하게 하는 모터 제어기 (225)에 의해 제어된다.

플랫폼 (315)의 이러한 3차원 까지의 움직임은 추출된 샘플 중 모든 지방이 프로세싱 동안 기계적 충격에 노출될 수 있게 하고, 샘플 및 프로세싱 장비의 최적 위치화를 가능하게 한다.

충격식 팔대 (310)의 길이, 충격면 면적, 충격면의 수, 및 형상은 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 충격면의 총 수 및/또는 충격면의 총 면적의 증가는 지방 샘플을 프로세싱하는데 요구되는 시간량을 감소시킨다.

용기 또는 카트리지 (205)는 (이제 프로세싱된) 지방을 기계적 충격에 의해 지방로부터 분리시킨 줄기 세포를 이제 함유하는 멸균 염수로부터 분리될 수 있게 하는 방식으로 위치된다. 지방은 염수보다 덜 조밀하므로, 상승되어 염수의 상층부에 부유될 것이다. 분리가 일어나는데 요구되는 시간량은 지방 샘플의 개별 구성에 따라 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 30분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 15분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 10분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 5분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 이내에 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 10초 내지 1분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 이내에 일어날 수 있다.

줄기 세포 및 기질 혈관 분획은 이제 지방 샘플로부터 분리되어 이제 염수에 현탁된다.

다음으로, 줄기 세포-함유 염수층을 가능한 완전하게 용기 또는 카트리지 (205)로부터 제거하여서, 오직 지방만이 잔류하게 된다. 제거는 방법에서 이용되는 용기 또는 카트리지 (205)의 유형에 따라서, 다양한 수단을 통해 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 염수는 용기 또는 카트리지 (205)의 바닥에 위치된 튜브를 통해서 용기 또는 카트리지 (205)의 밖으로 배수된다. 배수는 시린지 또는 펌프를 사용해 능동적으로, 또는 중력류를 통해 수동적으로 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 줄기 세포 함유층은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 밀폐된, 멸균 환경의 무결성을 유지하게 되는 방식으로 제거된다.

일부 구체예에서, 줄기 세포-함유 염수는 용기 또는 카트리지 (205)로부터 제거 동안 필터를 통해 통과된다. 필터의 크기는 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 필터 크기는 40 ㎛ 내지 100 ㎛ 범위이다. 일부 구체예에서, 필터 크기는 70 ㎛이다. 다양한 구체예에서, 필터는 나일론이다.

용기 또는 카트리지 (205)로부터 제거 이후에 또는 그 동안에, 줄기 세포-함유 염수는 하나 이상의 원심분리 튜브로 이동된다. 일부 구체예에서, 이동은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 밀폐된, 멸균 환경의 무결성을 유지시키는 방식으로 일어난다. 원심분리 튜브의 바닥에 펠렛으로 줄기 세포를 농축시키기 위해 원심분리가 후속된다.

유체는 튜브로부터 제거되어, 바닥에는 오직 줄기 세포만이 남게된다. 유체는 디캔팅, 흡입, 또는 유사한 수단에 의해 제거될 수 있다.

줄기 세포를 재현탁하기 위해서, 소량의 유체가 원심분리 튜브(들)에 넣어진다. 일부 구체예에서, 원심분리 튜브에 첨가되는 유체의 양은 1 mL 내지 5 mL 범위이다. 일부 구체예에서, 유체는 염수, 혈소판-풍부-혈장, 히알루로난, 고정 겔, 히드로겔, 스캐폴드, 피브린 글루, 글루, 또는 임의의 전술한 것의 조합이다. 일부 구체예에서, 세포는 원심분리 흡인물에 재현탁된다.

줄기 세포가 현탁되면, 그들은 사용이 준비된다. 이러한 사용은 제한없이, 그들이 유도된 환자에게의 재도입, 냉동보존, 확장 등을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 농축되고, 재현탁된 줄기 세포는 환자 사용을 위해, 피하주사침을 통해 시린지로 이동된다. 일부 구체예에서, 농축되고, 재현탁된 줄기 세포는 심장, 근육, 뼈, 연골, 간, 신장, 또는 다른 조직 및 장기 구조물로 성장을 위한 조직-스캐폴드에 씨딩된다. 일부 구체예에서, 농축되고, 재현탁된 줄기 세포는 다능성 전사 인자를 발현시킴으로써, 유도된-다능성 줄기 세포로 형질전환된다.

상기에 기술된 제1 및 제2 방법에서, 용기 또는 카트리지 및 기계적 에너지원은 가동성이다. 일부 구체예에서, 지방은 ESW 또는 충격면 하에 위치된 챔버를 통해 펌핑된다. 이들 구체예에서, 백 및 기계적 에너지원 둘 모두는 제자리에 고정되고 조직은 ESW 및/또는 기계적 에너지원에 노출되도록 챔버를 통해서 통과된다.

지방으로부터 줄기 세포를 프로세싱하는 제3 구체예는 다음과 같다:

지방은 지방흡입술을 통해 환자로부터 수득된다. 지방흡입술은 시린지를 통해 수행될 수 있고, 여기서 지방은 지방흡입술 기계를 통해서, 또는 바늘을 통해 직접적으로 환자로부터 제거된다. 지방흡입술 동안 제거되는 지방의 양은 바람직한 줄기 세포의 수에 따라서, 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 지방흡입술은 미니-지방흡입술로서, 약 30 cc 내지 약 50 cc의 지방이 환자로부터 제거된다. 일부 구체예에서, 지방흡입술은 마이크로-지방흡입술로서, 약 5 cc 내지 약 29 cc의 지방이 환자로부터 제거된다. 일부 구체예에서, 지방흡입술은 전형적인 임상적 지방흡입술로서, 이 경우에서 300 cc의 지방 또는 그 이상이 환자로부터 제거된다.

지방이 환자로부터 제거되면, 멸균 프로세싱 카트리지로 이송된다. 이송은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 멸균 수단을 통해 일어난다. 일부 구체예에서, 지방은 시린지를 통해 환자로부터 제거되고 시린지와 프로세싱 카트리지 사이에서 암수 루어 락 연결기를 서로에게 부착시킴으로써 시린지로부터 프로세싱 카트리지로 이송된다. 일부 구체예에서, 지방은 시린지를 통해서 환자로부터 제거되고 시린지는 시린지와 카트리지 사이에서 암수 루어 락 연결기를 서로에게 부착시킴으로써 카트리지 내에서 멸균-도킹된다. 일부 구체예에서, 지방은 시린지를 통해서 환자로부터 제거되고, 카트리지 내 프로세싱 용기 또는 카트리지와 시린지 사이에서 암수 루어 락 연결기를 서로에게 부착시킴으로써 시린지로부터 프로세싱 용기 또는 카트리지로 이송된다. 일부 구체예에서, 지방은 지방흡입술 장치를 통해 환자로부터 제거되고 멸균 연결 장치를 사용하여 지방흡입술 장치와 프로세싱 카트리지를 멸균-도킹함으로써 지방흡입술 장치로부터 프로세싱 카트리지로 이송된다.

일부 구체예에서, 이송은 중력류를 통해 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 이송은 기계적으로, 예를 들어 시린지의 플런저를 물리적으로 눌러서, 시린지의 내부로부터 프로세싱 카트리지의 내부 챔버로 지방을 강제로 밀어넣어서 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 이송은 장치, 예컨대 펌프를 통해 일어날 수 있다.

지방을 수용하는 카트리지 (400, 500)의 내부 챔버의 부피 (예를 들어, 도 4 및 5에 제공된 카트리지 구체예 참조)는 환자로부터 수득된 지방의 양에 따라 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 미니-지방흡입술을 통해 제거된, 30 cc 내지 50 cc의 지방은 카트리지 (400, 500)의 지방 챔버 (405, 505)로 이송된다.

이러한 구체예에서, 지방은 자립형 카트리지 (400, 500)의 특별한 구성품 (405, 505)으로 주사되고, 카트리지 (400, 500)는 외부 환경으로 샘플을 노출시키지 않고, 카트리지 (400, 500) 내부에서 전체 지방 샘플의 프로세싱을 수용하도록 디자인된다. 일부 구체예에서, 지방을 수용하는 카트리지 (400, 500) 내에 위치된 지방 챔버 (405, 505)는 9 액량 온스 내지 19 액량 온스 부피를 갖는 가요성 백이다.

다양한 양상에서, 카트리지 (400, 500)는 본 명세서에 개시된 임의의 ESW 또는 기계적 충격 장치 및 방법에 사용을 위해 디자인된다. 일부 구체예에서, 프로세싱은 하기에 자동적으로 기술되는 몇몇 프로세싱 단계를 실행하는 기계에 의해 수행된다. 일부 구체예에서, 프로세싱은 하기에 기술된 방법을 수동으로 수행하는, 사용자에 의해 수행된다. 양쪽 구체예에서, 프로세싱은 외부적으로 제어되어서, 카트리지 (400, 500)의 내부 프로세싱은, 샘플이 전혀 외부 환경에 노출되지 않고, 멸균된 방식으로 수행된다.

도시된 구체예에서, 지방 샘플은 그것을 제1 원-웨이 밸브 (410, 510)를 통해서 통과시킴으로서 지방 챔버 (405, 505)로 도입된다. 제1 원-웨이 흐름 밸브 (410, 510)의 방향은 지방 챔버 (405, 505)의 내부로 도시된 바와 같다. 일부 구체예에서, 지방은 환자로부터 추출 후 지방을 수용하는 용기와 프로세싱 카트리지 (400, 500)의 제1 원-웨이 밸브 (410, 510) 사이에서 암수 루어 락 연결기를 서로에게 부착시킴으로서, 지방 챔버 (405, 505)의 내부 챔버로 도입된다. 일부 구체예에서, 지방은 지방흡입술 장치를 통해서 환자로부터 제거되어 멸균 연결 장치를 사용하여 지방흡입술 장치와 프로세싱 카트리지를 멸균-도킹함으로써 지방흡입술 장치로부터 프로세싱 카트리지로 이송된다.

지방 챔버 (405, 505)에 있으면, 지방은 프로세싱 이전에 세척된다. 카트리지 (400, 500)는 멸균 염수, 일부 구체예에서 조직을 세척하는데 사용되는, 멸균 1x 포스페이트 완충 염수가 채워진 유체 리저버 (415, 515)를 함유한다. 지방 챔버 (405, 505)의 내부로 멸균 염수를 도입시키기 위해서, 염수는 제2 원-웨이 밸브 (420, 520)를 통해 지방 챔버 (405, 505)의 내부로 통과된다. 흐름의 방향은 표시된 바와 같다. 염수는 제1 원-웨이 밸브 (420, 520)를 통해서 염수를 강제하기 위해서, 제1 플런저 (430, 530)를 움직이는 외부 액추에이터(actuator) (425, 525)의 사용을 통해 지방 챔버 (405, 505)의 내부로 이동된다. 일부 구체예에서, 외부 액추에이터 (425, 525)는 바람직한 양의 염수가 제2 원-웨이 밸브 (420, 520)를 통해서 지방 챔버 (405, 505)의 내부로 통과될 때까지 액추에이터 (425, 525)를 누르는 사용자에 의해 수동으로 작동된다. 일부 구체예에서, 외부 액추에이터 (425, 525)의 움직임은 자동화되어 있고, 외부 기계는 외부 액추에이터 (425, 525)가 표시된 방향으로 움직이게 하여서, 제2 원-웨이 밸브 (420, 520)를 통해서 지방 챔버 (405, 505)의 내부로 바람직한 양의 염수를 계량한다.

세척은 지방 및 멸균 염수를 함유하는 카트리지 (400, 500)를 가볍게 진탕하거나 또는 소용돌이치게 하여 수행된다.

다음으로, 카트리지 (400, 500)는 (이제 세척된) 지방이 멸균 염수로부터 분리될 수 있게 하는 방식으로 위치된다. 이러한 구체예에서, 카트리지 (400, 500)는 2 가지 변형을 갖는다. 일부 구체예에서, 카트리지 (400, 500)는 고정된 수직 배향성을 가져서 지방 챔버 (405, 505)에 함유된 지방 및 염수 세척물이 중력을 통해 서로 항상 자연적으로 분리될 것이고, 지방은 지방 챔버 (405, 505)의 상층부에 부유된다. 일부 구체예에서, 카트리지 (400, 500)는 수평 배향성을 가지고 수직으로 회전하여 지방이 부유되고 염수 세척물로부터 분리될 수 있게 한다. 지방이 염수보다 덜 조밀하여서, 상승되어 염수의 상층부에 부유될 것이다. 분리가 일어나는데 요구되는 시간량은 지방 샘플의 개별 구성에 따라 가변적일 것이다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 30분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 15분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 10분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 내지 5분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 10초 내지 1분 간 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 1분 이내에 일어날 수 있다.

다음으로, 염수는 가능한 완전하게 지방 챔버 (405, 505)로부터 배수되어서, 오직 지방만이 잔존하게 된다. 배수는 방법에서 이용되는 카트리지 (400, 500)의 유형에 따라서, 다양한 수단을 통해 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 염수는 카트리지 (400, 500)의 외부로 유도되는 지방 챔버 (405, 505)의 바닥에 위치된 튜브를 통해서 지방 챔버 (405, 505) 밖으로 카트리지 (400, 500)로부터 멀리 배수된다. 배수는 시린지 또는 펌프를 사용하여 능동적으로, 또는 중력류를 통해 수동적으로 진행될 수 있다. 일부 구체예에서, 배수는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 멸균 시스템의 무결성을 유지하도록 일어난다.

세척은 지방이 금색이 될 때까지 반복되고 염수는 세척 완료 이후에 오직 약하게만 탁하다. 일부 구체예에서, 세척은 1 내지 5회, 일부 구체예에서 1 내지 4회, 일부 구체예에서 1 내지 3회, 일부 구체예에서 1 내지 2회, 및 일부 구체예에서 1회 일어난다.

일부 구체예에서, 세척은 멸균 염수가 유체 리저버 (415, 515)로부터 고갈될 때까지 반복된다. 일부 구체예에서, 세척은 지방 챔버 (405, 505) 내 염수 세척물이 세척 이후에, 높은 투명도를 의미하는, 염수를 통해서 통과하는 빛의 50% 내지 100%에 대해 충분히 투명할 때까지 반복된다. 일부 구체예에서, 세척은 일부 구체예에서, 1 내지 5회, 일부 구체예에서 1 내지 4회, 일부 구체예에서 1 내지 3회, 일부 구체예에서 1 내지 2회, 일부 구체예에서 1회, 일부 구체예에서 2회, 및 일부 구체예에서 3회 세척되는, 설정된 세척 주기 횟수가 완료될 때까지 반복된다.

세척이 완료되면, 지방은 프로세싱 준비가 된다.

지방 챔버 (405, 505) 내 지방은 지방로부터 줄기 세포를 방출시키기 위해서, 지방에 대해서 ESW 및/또는 기계적 충격을 가함으로써, 방법 1 및 2로 상기에 기술된 방법 중 하나에 따라 프로세싱된다. 일부 구체예에서, 카트리지 (400, 500)는 ESW 및/또는 기계적 충격력이 카트리지 (400, 500)의 강성 플라스틱 외부를 통해 통과하지 않도록, 최적 프로세싱을 가능하게 지방 챔버 (405, 505) 위에 개방구를 구비한다. 이러한 구체예에서, 가요성 지방 챔버 (405, 505) 벽은 프로세싱을 위해 노출된다.

조직 프로세싱이 완료된 이후에, 지방은 유체로부터 분리되어 상부로 상승될 수 있게 한다. 상기에서 언급한 바와 같이, 이러한 구체예에서, 카트리지 (400, 500)는 2 가지 변형을 갖는다. 일부 구체예에서, 카트리지 (400, 500)는 고정된 수직 배향성을 가져서 지방 챔버 (405, 505)에 함유된 프로세싱된 지방 및 염수가 중력을 통해서 서로 항상 자연적으로 분리될 것이고, 지방은 지방 챔버 (405, 505)의 상부로 부유될 것이다. 일부 구체예에서, 카트리지 (400, 500)는 수평 배향성을 가지고 수직으로 회전하여 지방이 부유되어 염수로부터 분리될 수 있게 한다. 지방은 염수보다 덜 조밀하므로, 상승되어서 염수의 상층부에 부유될 것이다. 지방로부터 방출된 줄기 세포가 이제 염수층에 함유된다.

다음으로, 줄기-세포 함유 염수는 지방로부터 멀리, 제3 원-웨이 밸브 (440, 540)를 통해서, 지방 챔버 (405, 505)로부터 세포 리저버 (435, 535)로 이동된다. 염수는 제3 원-웨이 밸브 (440, 540)를 통해서 염수를 강제로 밀기 위해서, 제2 플런저 (450, 550)를 움직이는 제2 외부 액추에이터 (445, 545)의 사용을 통해 세포 리저버 (435, 535)의 내부로 이동된다. 세포 리저버 (435, 535)에서, 제2 플런저 (450, 550)는 완전하게 밀폐된 구성으로 배향되어서, 세포 리저버 (435, 535)가 완전하게 밀폐된다. 이러한 방식으로, 제2 액추에이터 (445, 545)의 움직임은 제3 원-웨이 밸브 (440, 540)로부터 멀리 제2 플런저 (450, 550)를 이동시켜서, 줄기 세포 함유 염수층을 지방 챔버 (405, 505) 밖으로 밀어내어, 제3 원-웨이 밸브 (440, 540)를 통해서 세포 리저버 (435, 535)의 내부로 보내게, 세포 리저버 (435, 535)의 내부에 약한 진공을 생성시킨다. 일부 구체예에서, 제2 외부 액추에이터 (445, 545)는 제3 원-웨이 밸브 (440, 540)를 통해서 세포 리저버 (435, 535)의 내부로 줄기 세포-함유 염수의 전체를 끌어당길 때까지 제2 액추에이터 (445, 545)를 당기는 사용자에 의해 수동으로 작동된다. 일부 구체예에서, 제2 외부 액추에이터 (445, 545)의 이동은 자동화되고, 외부 기계는 제2 외부 액추에이터 (445, 545)를 당겨서 줄기 세포 함유 염수를 세포 리저버 (435, 535)로 이동시킨다.

일부 구체예에서, 줄기 세포 함유 염수는 프로세싱된 지방 조직으로부터 남겨진 원치않는 세포 찌꺼기를 여과해 버리기 위해서, 메쉬를 통해 배수된다. 일부 구체예에서, 메쉬는 제3 원-웨이 밸브 (440, 540)의 개방구를 덮고 있는 지방 챔버 (405, 505)에 위치된다. 일부 구체예에서, 메쉬는 제3 원-웨이 밸브 (440, 540)의 배출구를 덮고 있는 세포 리저버 (435, 535)의 내부에 위치된다. 일부 구체예에서, 메쉬는 제4 원-웨이 밸브 (455, 555)의 개방구를 덮고 있는 세포 리저버의 내부에 위치된다. 일부 구체예에서, 메쉬의 포어는 그 크기가 40 ㎛ 내지 100 ㎛ 범위이고, 일부 구체예에서 포어는 크기가 70 ㎛이다. 일부 구체예에서, 메쉬는 나일론이다.

도 4에 도시된 구체예에서, 줄기 세포 함유 분획은 세포 리저버 (435)의 내부로부터, 제4 원-웨이 밸브 (455)를 통해 카트리지 (400) 내에 함유된 원심분리 튜브 (460)로 이송된다. 줄기 세포 분획은 제3 원-웨이 밸브 (440)를 통해서 원심분리 튜브 (460)로 염수를 강제로 밀어넣기 위해서, 제2 플런저 (450)를 이동시키는 제2 외부 액추에이터 (445)의 사용을 통해 원심분리 튜브 (460)로 이동된다. 이러한 이동은 수동으로 수행될 수 있거나, 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 자동일 수 있다. 다음으로, 원심분리 튜브 (460)는 원심분리를 위해 카트리지 (400)로부터 제거된다. 원심분리는 상기 기술된 2 가지 구체예 중 하나에 따라서 진행되며, 줄기 세포의 펠렛이 원심분리 튜브 (460)의 바닥에 잔존하게 된다.

도 5에 도시된 구체예에서, 줄기 세포 함유 분획은 세포 리저버 (535)의 내부로부터 제4 원-웨이 밸브 (555)를 통해서 카트리지 (500) 내에 함유된 원심분리 구성품 (560)으로 이송된다. 원심분리 구성품 (560)은 원심분리 구성품으로서 작용하는 삼각형 챔버이고, 이것은 염수 밖으로 세포를 스피닝하여서, 세포가 챔버의 외부 모서리에서 단일 지점에 농축되게 한다. 접근 포트 (565)는 펠렛을 재현탁시키고/시키거나 그것을 원심분리 구성품 (560)으로부터 제거하기 위해서, 줄기 세포 펠렛에 사용자가 접근할 수 있게 한다. 일부 구체예에서, 원심분리 구성품 (560)의 작동은 자동화되어 있고 외부 장비에 의해 제어되는데, 외부 장비는 챔버의 중심에서 카트리지로 삽입되는 기어 및 모터를 통해 스핀 챔버와 맞물리게 된다. 그러한 측면에서, 원심분리 구성품 (560)은 직접 구동될 수 있거나 또는 기어링될 수 있다. 줄기 세포 함유층/하층액은 상기 기술된 바와 같이 원심분리 구성품에 적재되고 다른 면은 원심분리 이전에 균형맞춰진다. 원심분리 구성품에 도입되면, 줄기 세포는 500 g 내지 1600 g에서 3분 내지 10분 동안 원심분리된다. 일부 구체예에서, 원심분리는 10분 동안 1200 g에서 일어난다.

세포를 재현탁시키기 위해서 소량의 유체가 튜브에 넣어진다. 이것은 전형적으로 1 mL 내지 5 mL이다. 유체는 염수, 혈소판-풍부-혈장, 히알루로난, 또는 고정 겔, 히드로겔, 스캐폴드, 또는 피브린 또는 글루, 또는 다른 화합물일 수 있다.

세포가 현탁되면, 그들은 추가 사용을 위해 피하주사침을 통해 시린지로 흡입된다. 이것은 프로세싱 기계에 의해 자동으로, 또는 작동자에 의해 수동으로 수행된다.

소량의 유체가 줄기 세포를 재현탁시키는데 사용된다. 일부 구체예에서, 세포를 재현탁시키기 위해 첨가되는 유체의 양은 1 mL 내지 5 mL의 범위이다. 일부 구체예에서, 유체는 염수, 혈소판-풍부-혈장, 히알루로난, 고정 겔, 히드로겔, 스캐폴드, 피브린, 글루, 또는 임의의 전술한 것의 조합이다. 일부 구체예에서, 세포는 원심분리 흡인물에 재현탁된다.

줄기 세포가 현탁액에 부유되면, 그들은 사용이 준비된다. 이러한 사용은 제한없이, 그들이 유래된 환자에게의 재도입, 냉동보존, 확장 등을 포함한다. 일부 구체예에서, 농축되고, 재현탁된 줄기 세포는 환자 사용을 위해서, 피하주사침을 통해, 시린지로 이동된다. 일부 구체예에서, 농축되고, 재현탁된 줄기 세포는 심장, 근육, 뼈, 연골, 간, 신장, 또는 다른 조직 및 장기 구조로 성장을 위해 조직-스캐폴드에 씨딩된다. 일부 구체예에서, 농축되고, 재현탁된 줄기 세포는 다능성 전사 인자를 발현시킴으로써, 유도된 다능성 줄기 세포로 형질전환된다.

장치

상기에 명시된 바와 같이, 본 개시 내용은 조직 샘플을 바이오프로세싱하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 다양한 양상에서, 본 개시 내용은 또한, 개시된 방법에서 사용을 위해 적합한 사용이 용이한 장치를 제공하며, 이러한 장치는 외부 환경에 밀폐되고 단일 사용을 위해 디자인된다. 이러한 장치는 단일 장치 내에서 완전한 프로세싱을 가능하게 하는 단일 사용 카트리지를 포함한다.

용기

상기에 기술된 구체예는 마른 조직 샘플, 지방 샘플, 바람직한 세포 분획을 함유하는 분획, 줄기 세포-함유 분획, 또는 임의의 전술한 것의 조합의 용기로서 하나 이상의 용기를 이용한다. 이러한 용기는 도 1의 단계 (105)에서 이용하는 용기, 즉 용기 (205); 지방 챔버 (405, 505); 유체 리저버 (415, 515); 및 세포 리저버 (435, 535)를 포함한다. 본 개시 내용에서 제공하는 시스템 및 방법에서 사용하기 적합한 이들 용기는 가요성, 강성 또는 반강성일 수 있다. 일부 구체예에서, 용기는 시린지이다.

도 1의 단계 (105)에서 이용되는 용기들 각각, 즉 용기 (205); 지방 챔버 (405, 505); 유체 리저버 (415, 515); 및 세포 리저버 (435, 535)는 그 자체로서, 또는 밀봉된 카트리지의 일부로서 외부 환경에 밀폐되고, 일회용이다.

일부 구체예에서, 도 1의 단계 (105)에서 이용되는 각각의 용기들 즉, 용기 (205); 지방 챔버 (405, 505); 유체 리저버 (415, 515); 및 세포 리저버 (435, 535)는 가요성 용기, 예를 들어 가요성 백이다. 이러한 구체예에서, 각각의 용기는 에틸렌 비닐 아세테이트 (EVA), 폴리(비닐) 클로라이드 (PVC), 에틸렌-비닐 아세테이트 (EVA), 나일론, 또는 다른 플라스틱으로 만들어질 수 있다.

각각의 가요성 용기는 블로우-성형될 수 있다. 일부 구체예에서, 각각의 가요성 용기는 무선 주파수, 고주파수 또는 유전체 용접될 수 있고 블로우-성형될 수 있다.

일부 구체예에서, 각각의 가요성 용기는 가요성 용기의 내부 챔버와 유체 연결되는 적어도 하나의 출구를 구비한 3차원 백이다. 일부 구체예에서, 단일 용기는 용기의 내부 챔버와 유체 연결된 하나를 초과하는 출구를 구비할 수 있다. 이러한 출구는 예를 들어, 용기의 내부 챔버로부터 유체를 배수하거나, 또는 용기의 내부로부터 다른 용기로 유체를 이동시키는데 사용될 수 있다.

일부 구체예에서, 용기는 공간에 용기를 매달아 두기 위해 사용할 수도 있는, 모서리를 따라서, 용기의 외부 상에 위치된 하나 이상의 홀을 포함할 수 있다.

용기의 총 부피는 5 내지 50 액량 온스, 일부 구체예에서 9 내지 19 액량 온스일 수 있다.

일부 구체예에서, 조직 샘플, 멸균 염수 또는 다른 형태로, 투입물을 수용하기 위해서, 용기는 용기의 내부와 유체 연결되는 입구에 연결되는, 개별 지점에 입구 라인 또는 연결부를 수용하도록 구성된다. 밀폐된, 멸균 환경의 무결성을 유지하기 위해서, 입구 라인 또는 연결부는 조직 샘플을 함유하는 시린지, 그로부터 물질을 대상 용기로 이송하기 위한 다른 용기 또는 그외 것인, 외부 장치에 용기를 연결시킬 수 있는 암(female) 루어 연결부를 포함한다. 다른 구체예에서, 입구 라인 또는 연결부는 멸균 연결 장치를 사용하여 외부 장치에 연결을 위한 멸균 도크를 포함한다.

몇몇 구체예에서, 용기는 상부 모서리, 하부 모서리, 및 2개의 실질적으로 유사한 측면 모서리를 구비한, 편평한 백일 수 있다. 하부 모서리는 백 밖으로 유체 배수를 위해서, 백의 내부와 유체 연결된 출구를 포함한다. 편평한 백은 또한 백의 내부로 물질의 멸균 도입을 가능하게 하는 입구를 구비한다.

몇몇 구체예에서, 용기는 상부 모서리, 하부 모서리, 및 2개의 실질적으로 유사한 측면 모서리를 구비한, 형상이 직사각형인 3차원 백이다. 하부 모서리는 용기의 밖으로 유체를 배수하기 위해서, 용기의 내부와 유체 연결된 출구를 포함한다. 상부 모서리는 용기로 물질의 도입을 위해서, 용기의 내부와 유체 연결된 입구를 포함한다.

일부 구체예에서, 용기는 라인을 통해서 하나 이상의 다른 용기에 연결된다. 라인은 폴리(비닐) 클로라이드 (PVC), 에틸렌-비닐 아세테이트 (EVA), 또는 다른 재료로 만들어질 수 있는 배관이다.

일부 구체예에서, 용기는 반강성일 수 있다. 이러한 구체예에서, 용기는 이의 형상을 유지하고 조직 프로세싱 동안 내부에 가요성 용기를 수용할 수 있는 강성 플라스틱 하우징을 포함한다. 하우징은 플랫폼 (210 또는 315)에 부착된 지점을 함유하도록 구성된다.

강성 플라스틱 하우징은 예를 들어 고밀도 폴리에틸렌 (HDPE) 또는 폴리프로필렌 (PP)을 포함하는 임의의 적합한 강성-플라스틱 재료로 만들어질 수 있다. 강성 플라스틱 재료는 탄력성 변형을 나타내거나, 또는 가요성 플라스틱에 의해 전형적으로 나타나는 임의의 탄력성 거동을 나타내지 않는다. 강성 플라스틱 하우징은 사출 성형될 수 있거나 또는 다이-컷팅될 수 있다.

일부 구체예에서, 가요성 용기는 가요성 용기를 완전하게 밀봉할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있는 강성 플라스틱 하우징 내에 함유된다. 일부 구체예에서, 가요성 용기는 강성 플라스틱 하우징 내에 완전하게 밀봉되는 것은 아니고, 대신 하우징은 가요성 용기를 부분적으로 밀봉하여, 그것을 조직 프로세싱 동안 제자리에 유지시킨다.

카트리지

다양한 양상에서, 본 개시 내용에서 사용하기 적합한 카트리지는 그들 내부에 하나 이상의 용기를 수용할 수 있는 3차원 용기이다. 내부 용기는 하나 이상의 라인 및/또는 밸브에 의해 연결될 수 있다. 적합한 카트리지의 예는 도 4 및 5에 도시된 카트리지 (400, 500)이다.

일부 구체예에서, 카트리지는 이의 형상을 유지하는 강성 플라스틱 재료로 만들어지고, 조직 프로세싱 동안 카트리지의 내부에 적어도 하나, 및 바람직하게 다수의 가요성 용기를 수용할 수 있다. 용기는 그들이 플랫폼 (210 또는 315)에 하나 이상의 부착점을 함유하도록 구성된다.

강성 플라스틱은 예를 들어, 고밀도 폴리에틸렌 (HDPE) 또는 폴리프로필렌 (PP)을 포함하는 임의의 적합한 강성 플라스틱 재료로 만들어질 수 있다. 강성 플라스틱 재료는 탄력성 변형을 나타내지 않거나, 또는 전형적으로 가요성 플라스틱에 의해 나타나는 임의의 탄력성 거동을 나타내지 않는다. 강성 플라스틱 카트리지는 사출 성형될 수 있거나 또는 다이-컷팅될 수 있다.

용기의 다른 양상은 상기에 기술된다.

원심분리 튜브

본 개시 내용의 방법 및 장치에서 사용을 위해 적합한 원심분리 튜브는 원심분리 로터에 정확하게 맞도록 디자인된, 유리 또는 플라스틱의 정밀-제조된, 고-강도 튜브이다. 원심분리 튜브의 수용능은 프로세싱되는 조직 샘플의 총 부피에 따라서, 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 원심분리 튜브는 1 mL 내지 50 mL, 일부 구체예에서 0.5 mL 내지 20 mL, 및 일부 구체예에서 250 ㎕ 내지 2.0 mL 범위의 수용능을 갖는다.

일부 구체예에서, 원심분리 튜브는 Eppendorf^® 튜브, 일부 구체예에서 마이크로퓨즈 튜브, 및 일부 구체예에서 마이크로원심분리 튜브이다.

원심분리 튜브의 재료는 가변적일 수 있다. 일부 구체예에서, 원심분리 튜브는 유리로 만들어진다. 일부 구체예에서, 원심분리 튜브는 플라스틱이다. 각 구체예에서, 원심분리 튜브는 1회 사용으로 디자인되어서 일회용이다. 일부 구체예에서 원심분리 튜브는 가요성, 투명 플라스틱, 예컨대 폴리텐으로 만들어지고, 형상은 세미-코니칼이며, 일체화, 힌지된 밀봉 캡을 포함한다.

원-웨이 밸브

원-웨이 밸브는 유체가 그를 통해 오직 한 방향으로 흐르게 할 수 있는 밸브이다.

다양한 양상에서, 본 개시 내용의 장치 및 방법에서 사용을 위해 적합한 원-웨이 밸브는 하나는 유체 진입용이고, 다른 하나는 유체 배출용인, 2개 개방구를 구비한, 2-포트 밸브를 포함한다. 원-웨이 밸브는 자동적으로 유체의 단방향 흐름을 제공하도록 기능하고 임의 사용자 중재 또는 제어를 요구하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 개시 내용의 방법 및 장치에 유용한 원-웨이 밸브는 강성 플라스틱, 예컨대 폴리(프로필렌)으로 만들어진다.

일부 구체예에서, 본 개시 내용의 장치 및 방법에 사용을 위해 적합한 원-웨이 밸브는 볼 체크 밸브로서, 여기서는 유체의 역류를 방지하는 구성품이 구형 볼이다. 일부 구체예에서, 볼은 원-웨이 밸브를 밀폐 상태로 유지시키는데 도움이 되도록 스프링-적재된다.

일부 구체예에서, 본 개시 내용의 장치 및 방법에서 사용을 위해 적합한 원-웨이 밸브는 밸브 폐쇄가 되도록 위치된 가요성 고무 다이아프램을 포함하는 다이아프램 체크 밸브이다. 이러한 구체예에서, 사용자 중재에 의해서 또는 자동 프로세스를 통해서, 상류면 상에 생성된 압력은 다이아프램을 개방시켜서 유체가 밸브를 통해 흐르게 한다. 정압의 중단 시, 다이아프램이 폐쇄되어, 유체 흐름이 중단된다.

일부 구체예에서, 본 개시 내용의 장치 및 방법에서 사용을 위해 적합한 원-웨이 밸브는 스윙 체크 밸브이거나 또는 경사 디스크 체크 밸브이다. 이러한 구체예에서, 디스크는 유체를 한 방향으로 흐르게 하고, 반대 방향으로 유체 역행을 방지하는데 사용되는 밸브의 가동성 부분이다.

실시예

본 명세서에서 기술하는 재료, 방법 및 구체예를 하기 실시예에서 추가로 정의한다. 일정 구체예가 또한 본 명세서의 실시예에서 정의된다. 이들 실시예는 일부 구체예를 표시하고 있지만, 오직 예시로서 제공된다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서의 개시 내용 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 개시 내용의 필수 특징을 확신할 수 있으며, 이의 범주 및 사조를 벗어나지 않고, 다양한 용법 및 조건에 이를 적합화하기 위해 본 발명을 다양하게 변화 및 변형시킬 수 있다.

실시예 1

ESW 조직 프로세싱을 위한 일반 프로토콜

지질흡인물은 대상체로부터 수득하였고, 그 지질흡인물은 부피가 대략 30cc이다. 프로세싱 전에, 지질흡인물을 대략 0.25 인치 두께의 측벽을 구비하는 가요성, 멸균 에틸렌 비닐 아세테이트 (EVA), 폴리(비닐) 클로라이드 (PVC), 에틸렌-비닐 아세테이트 (EVA) 또는 나일론 백으로 전달한다. 멸균 카테터 백이면 충분하다.

염수 백의 수(male) 루어-락 연결기를 가요성 백에 위치된 암(female) 루어-락 연결기에 연결하고 수동으로 염수를 가요성 백에 분배하여서 가요성 백에 유입시킨 동일한 부피의 멸균 염수를 사용하여, 지질흡인물을 세척한다. 이어서, 지질흡인물 및 염수 세척물을 가요성 백을 조심스럽게 진탕하면서 기계적으로 교반시킨다.

지질흡인물이 염수의 상층부로 부유될 수 있도록, 조직 샘플/염수 세척 혼합물을 적어도 10분 동안 가라앉을 수 있게 둔다.

하층액, 또는 염수 세척물을 가요성 백의 하부에 위치된 배수관을 통해서 가요성 백으로부터 제거한다. 제거는 시린지를 라인에 연결시켜 하층액이 백 밖으로 배수되게 하거나, 또는 중력류에 의해 일어날 수 있다.

세척을 3 내지 4회 반복하고, 마지막 세척시에 백 내의 멸균 염수 세척물을 남겨둔다.

다음 단계는 Masterpuls MP100 체외 충격파 발생기를 사용하여 지질흡인물에 체외 충격파를 적용하는 것이다.

발생기는 가요성 백의 벽과 접촉될 수 있지만, 충격파 발생기가 지질흡인물 그 자체와 접촉하지 않도록 확실하게 주의를 기울여야만 한다.

필요하다면, 초음파 겔을 지질흡인물에 충격파의 적용 이전에 가요성 백의 측면에 적용할 수 있다.

ESW를 지질흡인물에 1 내지 30분 동안 적용한다.

이후에, 진탕하거나 또는 약하게 와류시켜서 가요성 백을 약하게 교반시킨다.

지방 조직의 잔여물이 염수의 상층부로 부유될 수 있도록, 이제 프로세싱된 지질흡인물이 가라앉을 수 있게 한다.

상기에 기술된 바와 같이, 배수관에 멸균 시린지를 부착시켜서, 가능한 많은 하층액을 밖으로 배수시켜 가요성 백으로부터 하층액을 제거한다. 임의의 잔류하는 지방 조직을 채취하지 않는다.

제거 동안, 하층액은 40 ㎛, 70 ㎛, 또는 100 ㎛의 포어 크기를 갖는 3종의 나일론 메쉬 필터 중 하나를 통해 통과시킨다.

하층액을 하나 이상의 멸균된 원심분리 튜브에 분배한다. 홀수개의 튜브가 사용되면, 멸균 염수를 함유하는, 균형용 튜브가 균형을 위해 로터에 위치되도록 확실히 보장한다.

1,200 g에서 10분 동안 원심분리한다.

선택안: 펠렛을 1 mL RBC 용해 완충액에 재현탁시키고 37℃의 수조에서 10분 동안 인큐베이션시킨다. RBC 완충액을 중화시킨다.

RBC 용해 완충액이 바람직하지 않다면, 세포 펠렛을 1 mL의 멸균 염수에 재현탁시킨다.

세포를 계측한다.

실시예 2

지질흡인물 프로세싱 방법의 비교

개요: 이 실시예에서 수행되는 시험의 목적은 콜라게나제 분해 대 체외 충격파 (ESW) 파괴를 사용하여 지방 조직으로부터 추출된 간엽성 줄기 세포로부터의 유핵 세포 수율을 비교하는 것이었다.

재료:

1,500 mL의 1x 포스페이트 완충 염수 (PBS)

35 mL의 1x 적혈 세포 (RBC) 용해 완충액

200 mL의 0.1% 제I형 콜라게나제

15 mL의 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) 중 10% 태아 소 혈청 (FBS)

방법:

대조군

대략 250 mL의 지질흡인물을 멸균된 60 mL 카테터를 사용하여 100 mL 비이커로 옮겼다. 초과량의 유체가 거의 또는 전혀 비이커로 유입되지 않도록 확실히 주의를 기울였다.

지질흡인물을 대략 동일한 부피의 멸균된 1x PBS로 4회 세척하였다. 각 세척시에, 멸균된 1x PBS를 비이커에 첨가하였고, 둘을 교반하였으며, 혼합물이 가라앉을 수 있게 하였다. 하층액을 흡인을 통해 비이커로부터 제거하였다. 지질흡인물을 총 4회 세척하였다.

4차 세척 이후, 샘플을 10분간 가라앉을 수 있게 두었다.

멸균된 10 mL의 혈청학 파이펫을 사용하여 4차 및 최종 세척물로부터 45 mL의 하층액을 40 ㎛, 70 ㎛ 및 100 ㎛ 튜브 멸균 필터를 통해서 3개의 멸균된 50 mL 코니칼 튜브로 옮겼다. 총 135 mL의 하층액을 대조군으로서 사용을 위해 옮겼다.

콜라게나제 분해

200 mL의 지질흡인물을 멸균된 500 mL의 유리병에 넣어두었다. 200 mL의 0.1% 제I형 콜라게나제를 병에 첨가하였다. 지질흡인물이 균등하게 콜라게나제와 혼합되도록 보장하기 위해서, 병을 수회 뒤집어서 가볍게 휘저어주었다.

이어서, 병을 37℃ 수조에 위치시켰다. 10분 마다, 병을 수조로부터 제거하여서 가라앉은 지질흡인물을 재분포시키기 위해서 수회 뒤집어 주었다. 30분 인큐베이션이후에, 병을 마지막으로 휘저어 주고 수조로부터 제거하였다.

병의 외부에 70% ETOH를 분무하였고 흄 후드에 위치시켰다. 지질흡인물 및 콜라게나제 혼합물을 10분간 가라앉혀주었다.

멸균된 10 mL의 혈청학 파이펫을 사용하여 40 ㎛, 70 ㎛ 및 100 ㎛ 튜브 멸균 필터를 통해서 3개의 멸균된 50 mL 코니칼 튜브로 옮겼다. 총 135 mL의 하층액을 옮겼다. 균형용 45 mL 물을 함유하는 4번째 튜브를 포함하여, 3개 튜브를 1,200 g로 37℃에서 10분 동안 원심분리하여 콜라게나제-분해된 세포 펠렛을 수득하였다.

콜라게나제 현탁액을 함유하는 3개 튜브의 외부를 70% ETOH로 세정하였고 흄 후드에 위치시켰고, 균형용 튜브는 빼두었다. 상청액을 흡인하여, 각 튜브에 세포 펠렛을 남겼다. 25 mL 혈청학 파이펫을 사용하여, 5 mL의 10% FBS를 각 튜브에 분배하였고 각 튜브를 5초간 와류시켜 펠렛을 재현탁시켰다. FBS를 사용하여 임의의 잔류 콜라게나제 활성을 중화시켰다.

3개 튜브를 1,200 g로, 37℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 튜브의 외부를 70% ETOH로 세정하였고 튜브를 흄 후드에 두었다. 상청액을 흡인하여, 세포 펠렛을 남겼다.

ESW 프로세싱

200 mL의 지질흡인물을 모든 잔류 하층액과 함께, 멸균된 60 mL 카테터 시린지를 사용하여 멸균 500 mL의 레그(leg) 카테터 백으로 옮겼다. 멸균된 1x PBS를 첨가하여 200 mL 의 전체 유체 부피를 획득하였고, 전체 부피는 지질흡인물을 포함하여 400 mL이었다. 대략 2 mL의 초음파 겔을 카테터 백에 적용하였다. 큰 팁을 사용하여, 2 bar 및 21 Hz에서 대략 10,000 ESW 펄스를 백 내부의 샘플에 투여하였다. 추가 10,000 ESW 펄스에 대해서 백의 다른 면에서 이 과정을 반복하였다. 카테터 백의 외부를 70% ETOH로 세정하였고 이것을 흄 후드에 위치시켰다.

백을 휘저어주고 500 mL 비이커에 쏟아내었으며 현탁액을 10분 간 가라앉게 두었다. 멸균된 10 mL 혈청학 파이펫을 사용하여, 하층액을 40 ㎛, 70 ㎛ 및 100 ㎛ 튜브 멸균 필터를 통해서 3개의 멸균된 50 mL 코니칼 튜브로 옮겼다. 총 135 mL의 하층액을 옮겼다.

농축 및 용해

대조군 현탁액을 함유하는 3개 튜브 및 프로세싱된 현탁액을 함유하는 3개 튜브를 1,200 g 및 37℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 모든 튜브에서 상청액을 흡인하여, 각 펠렛을 남기고, 5 mL의 1x RBC 용해 완충액을 각 튜브에 첨가하였다. 각 튜브를 5초간 와류시켜서 펠렛을 재현탁시켰고 튜브를 37℃ 수조에 10분간 두었다.

각 튜브의 외부를 70% ETOH로 살균처리하였고 튜브를 흄 후드에 두었다. 25 mL의 멸균된 1x PBS를 각 튜브에 첨가하여 용해 완충액을 희석시키고 중화시켰다.

세포 계측

멸균된 마이크로파이펫 팁을 사용하여, 300 ㎕의 멸균된 1x PBS를 6개의 별균된 0.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮겼다. 각각의 50 mL 샘플 튜브 중 75 ㎕을 또한 세포 계측을 위해서 각각의 마이크로원심분리 튜브로 옮겼다.

각 샘플의 세포수를 M형과 S형 카세트 둘 모두가 구비된 MoxiZ 세포 계측기를 사용해 계측하였다. 계측을 위해서, 100 ㎕의 트립판 블루를 각각의 마이크로원심분리 튜브에 첨가하였고, 10 ㎕의 각 샘플을 혈구계 웰에 적재하고 세포를 계측하였다.

결과:

MoxiZ 세포 계측기

표 1은 MoxiZ 자동 세포 계측기를 사용한 세포 계측 결과를 나타낸다. 2가지 유형의 카세트, M 및 S가 계측에 사용되었다. 샘플 컬럼에서, 'c'는 콜라게나제 분해를 의미하고, 'e'는 ESW 프로세싱을 의미하며 '0'은 대조군을 의미한다. '완료' 컬럼의 'y' 계측치만이 유효하다.

혈구계

표 2는 각 사분면의 세포 계측치, 사분면의 총합, 희석 배율, 및 총 계산된 세포로서, 육안 혈구계로부터 수득된 계측치를 상세하게 표시한다. 세포의 수는 대조군 개체군의 세포 계측치를 기준으로 측정해야 한다. 프로세싱된 세포 대 대조군 세포의 비율은 수율의 핵심 지표이다.

요약

MoxiZ 자동 세포 계측기를 사용한 유효 계측치 중에서, 대조군, 콜라게나제, 및 ESW에 대한 세포 계측치의 집계 평균을 표 3에 나타내었다:

콜라게나제는 일관적으로 약 3.8E+05 세포/mL을 생성시켰다. ESW는 1.67e+05 내지 7.08e+05 세포/mL의 범위였다.

혈구계 계측에서 세포의 비율을 살펴보면, ESW 프로세스는 대조군보다 1.78 내지 9.0배 범위 비율로 최고 비율을 생성하였다. 콜라게나제는 오직 대조군보다 1.29 내지 2.84배 더 높은 범위의 비율을 생성시켰다.

고찰

이들 데이타는 ESW가 지방 조직으로부터 높은 수의 간엽성 줄기 세포를 생성시키는데 효과적이라는 것을 의미한다. 이들 데이타를 기반으로, ESW가 간엽성 줄기 세포를 수득하기 위한 지방 조직의 초음파 또는 콜라게나제 프로세싱에 대한 실행가능한 대안이라고 결론내렸다. 피크를 비교하면, ESW는 4.32e+05의 콜라게나제 피크와 비교하여 7.08e+05의 세포 수율을 생성하였고, 수율이 164% 증가되었다.

상기에 제시된 데이타를 보면, 50 cc 내지 60 cc의 지질흡인물 샘플이 ESW 프로세싱으로부터 약 5백만개 세포를 산출하고 콜라게나제 분해로부터 약 3백만개 세포를 산출한다고 결론내리는 것이 타당하다.

그러므로 지방 조직으로부터 줄기 세포를 방출시키기 위해 ESW의 사용은 기지의 다른 기술보다 상당한 장점을 부여한다는 것이 명백하다.

Claims

지방 조직으로부터 줄기 세포를 단리하는 방법으로서,
지방 조직 샘플을 용기 또는 카트리지에 위치시키는 단계;
지방 조직 샘플에 기계적 충격력을 가하여 조직을 파쇄하는 단계; 및
지방 조직으로부터 줄기 세포 분획을 분리하는 단계를 포함하고,
여기서, 기계적 충격은 지방 조직이 함유된 용기 또는 카트리지와 물리적 접촉이 이루어지는 충격식 팔대를 구동시키는 모터에 의해 발생되고;
충격식 팔대는 지방 조직과 물리적으로 접촉하지 않는 것인, 지방 조직으로부터 줄기 세포를 단리하는 방법.
제1항에 있어서, 기계적 충격력이 용기 또는 카트리지의 벽을 통해서 지방 조직에 전달되는 것인, 지방 조직으로부터 줄기 세포를 단리하는 방법.
제1항에 있어서, 모터가 0 내지 30,000 rpm 범위의 속도로 충격식 팔대를 구동하도록 조정가능한 가변 속도 모터인, 지방 조직으로부터 줄기 세포를 단리하는 방법.
제1항에 있어서, 지방 조직으로부터 줄기 세포 분획을 분리하는 단계가 지방 조직을 수성층으로부터 분리시키는 것을 포함하고, 수성층은 줄기 세포를 포함하는 것인, 지방 조직으로부터 줄기 세포를 단리하는 방법.
제1항에 있어서, 줄기 세포 분획이 30분 또는 그 이내에 지방 조직으로부터 분리되는 것인, 지방 조직으로부터 줄기 세포를 단리하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 모터는, 모터가 전속력으로 작동될 때 충격식 팔대의 속도를 감속시킬 수 있는 기어 장치를 포함하고,
충격식 팔대에 의해 발생되는 운동력은 용기 또는 카트리지 내 지방 조직에 전달되는 것인, 지방 조직으로부터 줄기 세포를 단리하는 방법.
하기를 포함하는, 제1항의 방법을 수행하기 위한 장치:
지방 조직이 위치하는 프로세싱 용기 또는 카트리지;
프로세싱 용기 또는 카트리지가 부착되는 플랫폼;
프로세싱 용기와 물리적 접촉이 이루어지는 충격식 팔대; 및
충격식 팔대가 아래 위로 관절식으로 연결되어, 프로세싱 용기와 물리적 접촉이 이루어질 수 있도록 충격식 팔대를 구동하는 가변 속도 모터인, 모터,
여기서, 관절에 의해 생성되는 기계적 충격은 지방 조직을 파쇄하고 줄기 세포를 방출하기 위한 것임.
제7항에 있어서, 모터가 0 내지 30,000 rpm 의 속도로 충격식 팔대를 구동하는 것인, 장치.
제7항에 있어서, 프로세싱 용기가 백 (bag) 인, 장치.
제9항에 있어서, 백은 용기의 내부와 유체 연결된 출구를 포함하는 것인, 장치.
제9항에 있어서, 백은 용기의 내부와 유체 연결된 하나를 초과하는 출구를 포함하는 것인, 장치.
제9항에 있어서, 백은 용기의 내부와 유체 연결되는 입구를 더 포함하는 것인, 장치.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 모터는, 모터가 전속력으로 작동될 때 충격식 팔대의 속도를 감속시킬 수 있는 기어 장치를 포함하고,
기어 장치는 지방 조직이 파쇄되고 줄기 세포가 지방 조직으로부터 분리되는 속도를 증가시키기 위한 것인, 장치.
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