ES2964374T3 - Aislamiento de células madre del tejido adiposo - Google Patents
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Abstract
Los métodos proporcionados por la presente divulgación utilizan ondas de choque extracorpóreas, impactos mecánicos y/o principios de litotricia para dividir una muestra de tejido en fragmentos más pequeños (grupos de células y/o células individuales) después de lo cual se puede aislar una fracción celular deseada de la muestra. Los dispositivos proporcionados por la presente divulgación despliegan ondas de choque enfocadas y/o dirigidas, y/o impactos mecánicos enfocados y dirigidos, para romper una muestra de tejido. Los dispositivos mantienen la muestra en un ambiente cerrado y estéril durante la exposición a ondas de choque o impactos mecánicos. Por lo tanto, las ondas de choque y/o impactos mecánicos se generan fuera de un dispositivo cerrado y se transmiten a través de una o más paredes del dispositivo hacia su interior, donde se encuentra la muestra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Aislamiento de células madre del tejido adiposo
Antecedentes
El bioprocesamiento celular es una forma de fabricación biofarmacéutica, cuyo objetivo es establecer procesos de fabricación reproducibles y robustos para el aislamiento y/o producción de células terapéuticas.
Los procesos de fabricación celulares actuales son altamente dependientes del usuario, requiriendo la intervención humana en numerosos puntos. Debido a esa dependencia, los procesos actuales son tediosos, muy variables, costosos y producen bajos rendimientos.
A modo de ejemplo, muchos procesos de fabricación actuales se producen como sigue: una muestra de tejido (lipoaspirado, sangre completa, médula ósea, sangre de cordón, etc.) se obtiene de un paciente. La muestra biológica obtenida se transfiere al laboratorio de bioprocesamiento. En el laboratorio, se emplea una técnica de separación celular para obtener la fracción celular deseada. Luego, la fracción celular se aísla y se transfiere de nuevo al centro de atención para uso del paciente, o se procesa adicionalmente mediante la introducción en un biorreactor para la expansión celular. Algunos métodos conocidos de separación celular incluyen el uso de separación mecánica mediante cavitación ultrasónica, digestión enzimática u otros medios mecánicos que implican poner en contacto la muestra con objetos extraños (p. ej., cuentas) para obtener una fracción celular deseada. Por ejemplo, el documento US2015/231244 se refiere a un sistema de procesamiento de células madre derivadas de tejido adiposo, en donde el tejido adiposo es interrumpido por energía ultrasónica. De manera similar, el documento US2006/051865 se refiere a un método para aislar células del tejido adiposo mediante el sometimiento de dicho tejido a una fuente de energía de las olas, por ejemplo, sonicación. El uso de enzimas da como resultado una mayor carga de cumplimiento normativo, ya que las enzimas deben entrar en contacto directo con la muestra para producir el resultado deseado. Las enzimas también pueden dañar la integridad de las células recolectadas y potencialmente cambiar sus propiedades. El uso de ultrasonidos de alta potencia también tiene fallas. La punta del sonicador tiene una frecuencia fija y debe introducirse en la suspensión de células o tejidos, lo que tiene el potencial de afectar negativamente a la esterilidad. Además, el uso de ondas sonoras de alta energía introduce una gran cantidad de energía en la muestra, que se manifiesta en forma de calor. Esto puede dañar las células, lo que reduce el rendimiento de células utilizables.
Una vez obtenido, el producto celular expandido se mueve entonces desde el biorreactor en donde se purifica y se concentra. Las muestras de prueba se extraen del producto celular lavado y concentrado para realizar pruebas de calidad y, si los resultados de la prueba muestran un producto aceptable, el producto celular diseñado final se prepara para almacenamiento a largo plazo, criopreservación y se administra al paciente del que se obtuvo la muestra, o alguna combinación de los anteriores.
Como se puede apreciar, varios de estos pasos requieren mover la muestra a partir de un recipiente a otro, que requiere la intervención del usuario pesado, lo que no sólo aumenta los riesgos de etiquetado incorrecto o mal manejo de la muestra o muestras durante el procesamiento, sino también potencialmente un impacto negativo en la esterilidad, identidad, pureza o potencia de la muestra. Además, el tiempo requerido para procesar una muestra de esta manera significa que la fracción celular deseada no está lista para ser suministrada al paciente durante horas, si no días, lo que puede tener un impacto negativo en la salud de un paciente. El potencial de esterilidad comprometida y los períodos de tiempo excesivamente largos requeridos para procesar muestras celulares son inaceptables para los pacientes, particularmente aquellos que están inmunodeprimidos o que requieren atención inmediata, y también son inaceptables para los proveedores, que necesitan brindar atención oportuna y de alta calidad para muchos pacientes.
Resumen
Resumen de la invención
En un primer aspecto, se proporciona un método de aislamiento de células madre de tejido adiposo, que comprende:
proporcionar una muestra de tejido adiposo de un sujeto;
colocar la muestra de tejido en un recipiente o cartucho de procesamiento (205);
someter la muestra de tejido a la fuerza de impactos mecánicos para romper el tejido; y
separar una fracción de células madre del tejido adiposo;
en donde:
los impactos mecánicos son generados por un motor (305) que acciona un brazo de impacto (310) que hace contacto físico con el recipiente o cartucho (205) que contiene el tejido adiposo; y
el brazo de impacto (310) no hace contacto físicamente con el tejido adiposo.
En algunas realizaciones, la fuerza de los impactos mecánicos es suministrada al tejido adiposo a través de una pared del depósito de tratamiento o el cartucho (205).
En algunas realizaciones, el motor (305) es un motor de velocidad variable que se puede ajustar para impulsar el brazo de impacto a una velocidad que oscila entre 0 y 30,000 rpm.
En algunas realizaciones, la separación comprende permitir que el tejido adiposo se separe de una solución acuosa de capa, comprendiendo la capa acuosa las células madre.
En algunas realizaciones, la fracción de células madre se separa del tejido adiposo en 30 minutos o menos.
En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un dispositivo adaptado para realizar el método de la invención, que comprende:
un depósito de tratamiento o el cartucho (205) en donde el tejido adiposo se va a colocar;
una plataforma sobre la que se fija el recipiente o cartucho de procesamiento (205);
un brazo de impacto (310), que hace contacto físico con el recipiente de procesamiento (205); y
un motor (305), que es un motor de velocidad variable que acciona el brazo de impacto (310) de manera que el brazo de impacto (310) se articula hacia arriba y hacia abajo, haciendo contacto físico con el recipiente de procesamiento (205);
en donde los impactos mecánicos generados por la articulación están adaptados para romper el tejido adiposo y liberar células madre;
En algunas realizaciones, el motor (305) acciona el brazo de impacto (310) a una velocidad entre 0 y 30.000 rpm. En algunas realizaciones, el depósito de tratamiento (205) es una bolsa.
En algunas realizaciones, la bolsa comprende una salida en conexión de fluido con el interior del recipiente (205). En algunas realizaciones, la bolsa comprende más de una salida en conexión fluida con el interior del recipiente (205). En algunas realizaciones, la bolsa comprende además una entrada en conexión fluida con el interior del recipiente (205).
Resumen de otros aspectos
Por lo tanto, se requiere un método optimizado y escalable de obtener una fracción celular deseada en un corto período de tiempo directamente en el punto de atención, y sin la necesidad de intervención del usuario múltiple. También se necesitan dispositivos capaces de practicar ese método. Tales métodos y dispositivos son proporcionados por la presente divulgación. Los métodos y dispositivos descritos eliminan la necesidad de transferir muestras celulares a un laboratorio para su procesamiento y no ponen en contacto la muestra celular con objetos extraños durante la separación, lo que da como resultado una muestra procesada que proporciona una muestra celular deseada en un período de tiempo muy corto, con menos contactos con los usuarios, lo que permite la optimización de recursos técnicos costosos.
Los dispositivos y métodos descritos en este documento tienen varias características, no siendo responsables de sus atributos deseables ninguna de ellas. Sin limitar el alcance de las reivindicaciones que siguen, se discutirán brevemente ciertas características de los dispositivos y métodos descritos. Después de considerar esta discusión, y particularmente después de leer la sección titulada "Descripción detallada", una persona con conocimientos ordinarios en la técnica comprenderá cómo las características de los dispositivos y métodos proporcionan varias ventajas sobre los sistemas y métodos tradicionales.
En algunas realizaciones, la fuerza de los impactos mecánicos rompe la muestra de tejido en una pluralidad de pequeños grupos de células, una pluralidad de células individuales, o ambos.
En algunas realizaciones, la fracción celular comprende la pluralidad de pequeños grupos de células, la pluralidad de células individuales, o ambos, y el aislamiento de la fracción celular se produce por centrifugación.
En algunas realizaciones, la centrifugación tiene lugar durante 3 a 30 minutos a una velocidad de 500 g a 2000 g. En algunas realizaciones, la centrifugación se produce durante 10 minutos a 1200 g.
En algunas realizaciones, la fracción celular aislada se resuspende después de la centrifugación.
En algunas realizaciones, la fracción celular se aísla en 30 minutos o menos.
En algunas realizaciones, la fuerza de los impactos mecánicos se suministra al tejido adiposo a través de una pared del recipiente o cartucho.
En algunas realizaciones, el motor comprende un diámetro de engranaje de 1,91 cm (0,75 pulgadas) y a una velocidad del motor de 3.000 rpm el brazo de impacto tiene una velocidad de 299,2 cm (117,8 pulgadas) por segundo.
En algunas realizaciones, separar una fracción de células madre comprende permitir que el tejido adiposo se separe de una capa acuosa, comprendiendo la capa acuosa las células madre.
En algunas realizaciones, las células madre se aíslan del tejido adiposo en 30 minutos o menos.
En algunas realizaciones, la centrifugación tiene lugar a 500 g a 1600 g durante 3 a 10 minutos.
Descripción de los dibujos
Las características y ventajas de la presente divulgación pueden estar más lejos explica por referencia a las siguientes descripción detallada y los dibujos que acompañan a la expuesta realizaciones ilustrativas.
FIG. 1 proporciona una descripción general de un método para aislar una fracción celular de una muestra de tejido, según realizaciones proporcionadas por la presente divulgación.
FIG. 2 representa un ejemplo representativo de un dispositivo de ondas de choque extracorpóreo adecuado para su uso en los sistemas y métodos proporcionados por la presente divulgación.
FIG. 3 representa un ejemplo representativo de un dispositivo de impacto mecánico adecuado para su uso en los sistemas y métodos proporcionados por la presente divulgación.
FIG. 4 representa un primer ejemplo representativo de un cartucho rígido autónomo adecuado para su uso con la onda de choque extracorpórea y/o los dispositivos de impacto mecánico proporcionados por la presente divulgación. En la realización representada, varios componentes internos son recipientes flexibles.
FIG. 5 representa un ejemplo representativo de un cartucho rígido autónomo adecuado para su uso con la onda de choque extracorpórea y/o los dispositivos de impacto mecánico proporcionados por la presente divulgación.
Descripción detallada
Como se usa en este documento, "onda de choque extracorpórea", ondas de choque extracorpóreas" y/o "ESW" significa pulsos bruscos, de alta amplitud de la energía mecánica, similar a las ondas sonoras, que son generados externamente a una muestra de interés y transmitida a continuación a esa muestra. En ese sentido, la fuente generadora de la ESW no hace contacto físico con la muestra; las ondas de choque en sí entran en contacto con la muestra, pero la fuente generadora no. Las ondas de choque extracorpóreas son, por lo tanto, generadas por una fuente a cierta distancia de la muestra y luego se transmiten a la muestra. La transmisión puede ocurrir a través del aire y/o a través de la pared de un recipiente en donde se encuentra la muestra. La ESW puede ser enfocada y/o dirigida, para, por ejemplo, concentrar la ESW en un área de interés que puede cubrir la totalidad de la muestra, o sólo una parte de ella.
Como se usa en el presente documento, "sujeto" o "paciente" se refiere a un mamífero, por ejemplo, un ser humano.
Los métodos proporcionados por la presente divulgación utilizan ondas de choque extracorpóreas, impactos mecánicos, vibraciones y/o principios de litotricia para dividir una muestra de tejido en fragmentos más pequeños (grupos de células y/o células individuales), después de lo cual se puede aislar una fracción celular deseada de la muestra. Los métodos divulgados en el presente documento pero no reivindicados comprenden aislar una muestra de un sujeto, comprendiendo la muestra un tipo de célula de interés, poner en contacto esa muestra con ondas de choque extracorpóreas, pero no el dispositivo utilizado para generar la ESW, dividir la muestra en pequeños grupos de células y/o células individuales, y luego aislar el tipo de célula de interés de la muestra rota.
Los dispositivos proporcionados por la presente divulgación utilizan ondas de choque enfocadas y/o dirigidas, y/o impactos mecánicos enfocados y dirigidos para romper una muestra de interés. En varios aspectos, los dispositivos proporcionados por la presente divulgación mantienen la muestra en un ambiente cerrado y estéril durante la exposición a las ondas de choque o impactos mecánicos. Por lo tanto, las ondas de choque y/o los impactos mecánicos se generan fuera del recipiente estéril cerrado y se transmiten a través de una o más paredes del recipiente hacia su interior, donde se encuentra la muestra. Téngase en cuenta que la invención reivindicada se refiere a impactos mecánicos como medio para romper el tejido adiposo.
Mediante el mantenimiento de la fuente de la ESW a una distancia de la muestra de interés, la fuente de la ESW (el dispositivo que los genera) no haga contacto físico con la muestra. Esto mejora en gran medida la esterilidad de la muestra y cualquier fracción celular que se aísle de la muestra. Desde el punto de vista de un proveedor de atención médica, esto también mejora en gran medida los requisitos de esterilidad y ayuda a garantizar que la fracción celular de interés derivada de la muestra sea estéril para el uso del paciente. Además, mantener la fuente generadora de ESW a partir de la muestra de interés asegura que el generador no agregará energía o calor a la muestra de interés, lo que puede dañar o matar células, dañar el ADN y disminuir drásticamente el rendimiento. A ese respecto, los dispositivos proporcionados por la presente divulgación son una mejora con respecto a otros sistemas conocidos, como los ultrasonidos.
Los métodos y dispositivos proporcionados por la presente descripción son capaces de aislar una fracción celular deseada a partir de una muestra de tejido de forma rápida, en algunas realizaciones en 30 minutos o menos. La velocidad a la que se pueden usar los métodos y dispositivos descritos imparte una ventaja significativa en el sentido de que la fracción celular deseada que se aísla de la muestra puede estar disponible para su uso inmediatamente.
Métodos
La Figura 1 presenta un método para aislar una fracción celular de interés de una muestra de tejido, según realizaciones proporcionadas por la presente divulgación.
Divulgado en el presente documento pero no reivindicado, el método comienza por primer tejido de extracción de un sujeto (100). El tejido es tejido adiposo o graso. También se describe en el presente documento pero no se reivindica, el tejido es de un órgano interno, por ejemplo el cerebro, faringe, laringe, corazón, arterias, músculo, hígado, vesícula biliar, riñón, intestino delgado, intestino grueso, ganglios linfáticos, pulmones, bazo, médula ósea, estómago, venas, páncreas, vejiga urinaria, hueso, dientes, dentina, encía o piel. También descrito aquí, pero no reivindicado, el tejido es de un componente del sistema endocrino, por ejemplo, la glándula pineal, glándula pituitaria, glándula tiroides, glándula suprarrenal, páncreas, ovario o testículo.
La extracción puede producirse mediante varios métodos conocidos.
El tejido se transfiere a continuación en un depósito de tratamiento o el cartucho 105. Aunque algunos de los componentes de los métodos y/o dispositivos descritos son separables entre sí, están configurados para conectarse entre sí de una manera completamente estéril, permitiendo así la transferencia de la muestra de un componente a otro durante el procesamiento. En ese sentido, la totalidad de la muestra se procesa en un solo sistema, lo que garantiza la esterilidad.
La transferencia estéril se realiza sin exponer la muestra al ambiente exterior. En ese sentido, la transferencia puede ocurrir a través de varias formas que mantendrán el ambiente cerrado y estéril. En algunas realizaciones, la transferencia se logra uniendo conectores de cierre luer macho y hembra entre sí entre el primer recipiente, que contiene la muestra extraída del sujeto, y el recipiente o cartucho de procesamiento. En algunas realizaciones, la transferencia se realiza acoplando de forma estéril el primer recipiente y el recipiente de procesamiento o cartucho usando un dispositivo de conexión estéril. La muestra se transfiere, ya sea mecánicamente o por gravedad, desde el primer recipiente al recipiente o cartucho de procesamiento.
En algunas realizaciones, el primer recipiente se inserta en el cartucho y se acopla de modo estéril usando un dispositivo de conexión estéril para convertirse en el recipiente de procesamiento dentro del cartucho. El primer recipiente como cámara de procesamiento ya contiene la muestra.
A este respecto, en esta descripción cada vez que una muestra de tejido y/o celular se da a conocer como se mueva de un recipiente a otro, tal movimiento puede ocurrir a fin de mantener la integridad del sistema cerrado, con lo cual no se expone la muestra al ambiente exterior.
Una vez que la muestra se transfiere al recipiente de procesamiento o cartucho, la muestra de tejido se lava una o más veces 110. El lavado se puede producir como se describe en el presente documento, mediante el uso de solución salina estéril. El lavado asegura que la muestra esté libre de tantas impurezas como sea posible antes del procesamiento, aumentando así el nivel de pureza de la fracción celular a aislar de la misma.
En algunas realizaciones, el lavado se realiza por agitación mecánica del depósito de tratamiento o cartucho. Si se desean y/o son necesarios múltiples pasos de lavado, la solución salina estéril se drena del recipiente o cartucho de procesamiento después de que se completa un único lavado, y se introduce una nueva solución salina estéril en el recipiente o cartucho para cada lavado posterior. A ese respecto, cada vez que se drena la solución salina estéril y se introduce una nueva solución salina estéril en el recipiente o cartucho, se hace para mantener el entorno estéril cerrado, como se describe en el presente documento.
Después del lavado, la muestra de tejido se procesa 115. Como se ha indicado, el procesamiento puede ocurrir a través de la utilización de ESW, impacto mecánico, la vibración y el cizallamiento, o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el procesamiento se produce a través de impacto mecánico y cizallamiento y la muestra de tejido se rompe hacia abajo en una pluralidad de pequeños grupos de células. En algunas realizaciones, el procesamiento se produce mediante impacto mecánico y cizallamiento y la muestra de tejido se divide en una pluralidad de pequeños grupos de células y una pluralidad de células individuales. En algunas realizaciones, el procesamiento se produce mediante impacto mecánico y cizallamiento y la muestra de tejido se descompone completamente en una pluralidad de células individuales.
Después del procesamiento, la suspensión celular que representa lo que queda de la muestra, que puede ser una pluralidad de pequeños grupos de células, una pluralidad de células individuales, o ambos, se filtra y se centrifugó 120. El filtrado puede ocurrir ya sea en un dispositivo separado del recipiente de procesamiento o cartucho, o dentro del recipiente de procesamiento o cartucho mismo. En algunas realizaciones, el filtrado se produce en un dispositivo separado, en cuyo caso la suspensión celular se transfiere al filtro mediante medios estériles, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el filtrado se produce cuando la suspensión celular se mueve desde el recipiente o cartucho a uno o más tubos de centrífuga.
En algunas realizaciones, la transferencia al dispositivo de filtrado se lleva a cabo mediante la unión de conectores de bloqueo luer macho y hembra entre sí entre el depósito de tratamiento o el cartucho y el dispositivo de filtración. En algunas realizaciones, la transferencia se realiza acoplando de forma estéril el recipiente o cartucho de procesamiento y el dispositivo de filtrado utilizando un dispositivo de conexión estéril. La muestra se transfiere, ya sea mecánicamente o por gravedad, desde el recipiente de procesamiento o cartucho al dispositivo de filtrado.
En algunas realizaciones, el filtrado se produce dentro del recipiente de procesamiento o cartucho, tal como se describe en el presente documento.
En varios aspectos, la centrifugación se produce fuera del depósito de tratamiento o cartucho. En algunas realizaciones, la suspensión celular se transfiere a uno o más tubos de centrífuga ubicados dentro del recipiente o cartucho de procesamiento. Cuando están llenos, los tubos de centrífuga se mueven desde el recipiente de procesamiento o cartucho a una centrífuga mediante medios estériles, como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, la suspensión celular se transfiere a uno o más tubos de centrífuga ubicados fuera del recipiente de procesamiento o cartucho a través de medios estériles, como se describe en este documento. Cuando están llenos, los tubos de centrífuga se mueven desde el recipiente de procesamiento o cartucho a una centrífuga mediante medios estériles, como se describe en el presente documento.
La duración y la velocidad de centrifugación pueden variar, dependiendo del tipo de tejido que se está procesando. En algunas realizaciones, la suspensión celular se centrifuga durante un período de 3 a 30 minutos y a una velocidad de 500 g a 2000 g. En algunas realizaciones, la suspensión celular se centrifuga durante 10 a 25 minutos a una velocidad de 1000 g a 1800 g. En algunas realizaciones, la suspensión celular se centrifuga durante 10 minutos a 1200 g. En algunas realizaciones, la suspensión celular se centrifuga durante 7 minutos a 1200 g. En algunas realizaciones, la suspensión celular se centrifuga durante 5 minutos a 1200 g. En algunas realizaciones, la suspensión celular se centrifuga durante 3 minutos a 1200 g. En algunas realizaciones, la suspensión celular se centrifuga durante 10 minutos a 900 g. En algunas realizaciones, la suspensión celular se centrifuga durante 7 minutos a 900 g. En algunas realizaciones, la suspensión celular se centrifuga durante 5 minutos a 900 g. En algunas realizaciones, la suspensión celular se centrifuga durante 3 minutos a 900 g. En algunas realizaciones, la suspensión celular se centrifuga durante 10 minutos a 600 g. En algunas realizaciones, la suspensión celular se centrifuga durante 7 minutos a 600 g. En algunas realizaciones, la suspensión celular se centrifuga durante 5 minutos a 600 g. En algunas realizaciones, la suspensión celular se centrifuga durante 3 minutos a 600 g.
Existen numerosos medios por los que múltiples tipos de células presentes en la suspensión de células pueden ser separados entre sí mediante centrifugación. Por ejemplo, se puede utilizar un gradiente de densidad de modo que, durante la centrifugación, las células se separen en bandas de acuerdo con sus densidades específicas. Además, los protocolos de exclusión de tamaño se pueden utilizar para separar células por tamaño. Además, la separación puede comenzar antes de la centrifugación, por ejemplo, permitiendo que la muestra de tejido procesada se asiente y separando los desechos celulares no deseados de la fracción celular deseada antes de la centrifugación. El tipo de técnica de separación utilizada puede variar en función de la fracción celular deseada a aislar.
Una vez se aísla la fracción de células deseada, se puede resuspender para la administración al sujeto de la que se derivó 125. En algunas realizaciones, la fracción celular deseada se resuspende en un pequeño volumen de líquido obtenido desde el tubo de centrífuga. En algunas realizaciones, la fracción celular deseada se resuspende en solución salina estéril.
En un aspecto, la fracción celular deseada es las células y el tejido del que se derivan las células madre es la grasa.
A continuación se muestra un método divulgado, pero no reivindicado para procesar células madre a partir de grasa:
La grasa se obtiene de un paciente mediante liposucción. La liposucción se puede realizar mediante una jeringa, donde se extrae la grasa del paciente directamente mediante una aguja, o mediante una máquina de liposucción. La cantidad de grasa eliminada durante la liposucción puede variar, dependiendo de la cantidad de células madre deseadas. La liposucción también divulgada en el presente documento, pero no reivindicada, es una miniliposucción, en donde se extraen del paciente de aproximadamente 30 cc a aproximadamente 50 cc de grasa. En algunas realizaciones, la liposucción es una micro-liposucción, en donde se eliminan del paciente de aproximadamente 5 cc a aproximadamente 29 cc de grasa. La liposucción también divulgada en el presente documento, pero no reivindicada, es una liposucción clínica típica, en cuyo caso se extraen del paciente 300 cc de grasa o más.
Una vez que la grasa se elimina del paciente, que se transfiere a un recipiente de procesamiento estéril o cartucho.
La transferencia se produce por medios estériles, como se describe en el presente documento. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la grasa se extrae del paciente mediante una jeringa y se transfiere de la jeringa al recipiente o cartucho de procesamiento uniendo conectores de cierre luer macho y hembra entre sí entre la jeringa y el recipiente o cartucho de procesamiento. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la grasa se extrae del paciente mediante una jeringa y la jeringa se acopla de forma estéril dentro del recipiente o cartucho de procesamiento uniendo conectores cierre luer macho y hembra entre sí entre la jeringa y el recipiente o cartucho. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la grasa se extrae del paciente mediante una jeringa y se transfiere de la jeringa al recipiente o cartucho de procesamiento uniendo conectores cierre luer macho y hembra entre sí entre la jeringa y el recipiente o cartucho de procesamiento dentro del cartucho. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la grasa se extrae del paciente mediante un dispositivo de liposucción y se transfiere desde el dispositivo de liposucción al recipiente o cartucho de procesamiento acoplando estérilmente el dispositivo de liposucción y el recipiente o cartucho de procesamiento utilizando un dispositivo de conexión estéril.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la transferencia puede ocurrir a través de flujo por gravedad. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la transferencia puede ocurrir mecánicamente, por ejemplo, presionando físicamente el émbolo de una jeringa y forzando la grasa del interior de la jeringa al interior del recipiente de procesamiento o cartucho. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la transferencia puede ocurrir a través de un dispositivo, como una bomba.
El volumen del recipiente o cartucho utilizado para recibir la grasa puede variar con la cantidad de grasa obtenida del paciente. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que se transfieren 30 cc a 50 cc de grasa, extraídos mediante una miniliposucción, a un recipiente o cartucho que tiene un volumen de 255,7 ml (9 onzas líquidas) a 539,8 ml (19 onzas líquidas).
Un volumen de solución salina estéril igual a la cantidad de grasa extraída del paciente se transfiere entonces al recipiente o cartucho con el fin de lavar la grasa. A modo de ejemplo, si se extraen 30 cc de grasa del paciente, se utilizan 30 mL de solución salina estéril para lavar la muestra. En algunas realizaciones, se transfiere luego al recipiente o cartucho un volumen de solución salina estéril mayor que la cantidad de grasa extraída del paciente para lavar la grasa. A modo de ejemplo, si se extraen 30 cc de grasa del paciente, se utilizan 35 mL de solución salina estéril para lavar la muestra. En algunas realizaciones, luego se transfiere al recipiente o cartucho un volumen de solución salina estéril menor que la cantidad de grasa extraída del paciente para lavar la grasa. A modo de ejemplo, si se extraen 30 cc de grasa del paciente, se utilizan 25 mL de solución salina estéril para lavar la muestra. En algunas realizaciones, se añade una combinación de volúmenes de solución salina estéril a la cantidad de grasa para lavar la grasa. La transferencia de la solución salina al recipiente o cartucho se realiza para mantener la esterilidad del sistema, como se describe aquí. En algunas realizaciones, la solución salina estéril se transfiere al recipiente o cartucho uniendo conectores de cierre luer macho y hembra entre sí entre el recipiente que contiene la solución salina estéril y el recipiente o cartucho de procesamiento. En algunas realizaciones, la solución salina estéril se transfiere al recipiente o cartucho acoplando estérilmente el recipiente de solución salina estéril y el recipiente de procesamiento o cartucho usando un dispositivo de conexión estéril.
El lavado se realiza agitando o agitando suavemente el recipiente o cartucho que contiene la grasa y la solución salina estéril.
El recipiente o cartucho se posiciona entonces de tal manera a fin de permitir la grasa (ahora lavada) para separar la solución salina estéril. Debido a que la grasa es menos densa que la solución salina, se elevará y flotará sobre la solución salina. El tiempo necesario para que se produzca la separación variará dependiendo de la composición individual de la muestra de grasa. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 30 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 15 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 10 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 5 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 10 segundos a 1 minuto.
A continuación, la solución salina se drena del recipiente o cartucho lo más completamente posible, por lo que solo queda la grasa. El drenaje puede ocurrir por varios medios, dependiendo del tipo de recipiente o cartucho utilizado en el método. En algunas realizaciones, la solución salina se drena del recipiente o cartucho a través de un tubo ubicado en la parte inferior del recipiente o cartucho. El drenaje puede proceder de forma activa, utilizando una jeringa o una bomba, o de forma pasiva a través del flujo por gravedad. En algunas realizaciones, el drenaje se produce para mantener la integridad del sistema estéril, como se describe en el presente documento.
El lavado se repitió hasta que la grasa es un color dorado y la solución salina es sólo ligeramente nublada después de la finalización de un lavado. En algunas realizaciones, el lavado se produce de 1 a 5 veces, en algunas realizaciones de 1 a 4 veces, en algunas realizaciones de 1 a 3 veces, en algunas realizaciones de 1 a 2 veces y en algunas realizaciones 1 vez.
Una vez que el lavado se haya completado, la grasa está lista para su procesamiento.
Opcionalmente, se añade solución salina estéril a la bolsa para el procesamiento, aunque esto no es necesario. La adición de solución salina proporcionará espacio para que las células y/o pequeños grupos de células se muevan libremente entre sí durante el procesamiento, lo que ayudará a descomponer la grasa en células individuales. Si se agrega solución salina, se agrega de una manera que mantendrá la integridad del sistema estéril, como se describe en este documento.
El volumen de solución salina opcionalmente añadido puede variar. En algunas realizaciones, el volumen de solución salina añadida oscila entre cero y dos veces el volumen de grasa extraído del paciente. En algunas realizaciones, se usa una cantidad igual de solución salina (p. ej., 30 ml de solución salina por 30 cc de grasa).
El exceso de aire se elimina del recipiente o cartucho usando una bomba o jeringa. En algunas realizaciones, el exceso de aire se elimina del mismo tubo ubicado en el fondo del recipiente o cartucho del que se drena el lavado de solución salina estéril. En algunas realizaciones, el aire se drena de una manera que mantenga la integridad del sistema cerrado y estéril, como se describe en el presente documento.
El depósito de tratamiento o el cartucho se mueve entonces a un aparato de procesamiento. En la figura 2 se muestra un ejemplo de un aparato 200 de procesamiento adecuado que no es parte de la invención reivindicada. El recipiente o cartucho 205 de procesamiento puede estar asegurado sobre una plataforma 210 rígida para su procesamiento. La plataforma 210 controla el movimiento del recipiente o cartucho 205 durante el procesamiento de ESW.
La plataforma 210 puede estar hecha de cualquier material rígido adecuado, incluyendo madera, metal, plástico, acrílico y similares. En algunas realizaciones, la plataforma 210 está hecha de madera.
El aparato de procesamiento 200 aloja un aplicador de onda de choque 215 capaz de suministrar ondas de choque al interior del recipiente o cartucho 205. El aplicador de la onda de choque 215 puede estar alojado en el aparato de procesado 200 a través de una plataforma de aplicación 220. La plataforma de aplicación 220 y el aplicador de onda de choque 215 se mantiene a una distancia de la grasa contenida dentro del recipiente o cartucho 205 de manera que el aplicador de ondas de choque 215 nunca entre en contacto directo con la grasa. Esto asegura que las ondas de choque suministradas a la grasa sean extracorpóreas o ESW.
El movimiento de la plataforma del aplicador 220, y el aplicador de ondas de choque 215, puede ocurrir en tres planos direccionales, X, Y y Z, cada uno de los cuales está controlado por su propio motor: un motor plano X 230, un motor plano Y 235 y un motor plano Z 240. Estos motores pueden ser motores paso a paso NEMA 17. Cada uno de los motores 230, 235 y 240 está controlado por un controlador de motor 225, que permite el movimiento de la plataforma del aplicador 220 y el aplicador de ondas de choque 215 en tres dimensiones sobre y alrededor del recipiente o cartucho 205. Los motores pueden ser controlados por una placa de microprocesador Arduino v6 programada con firmware Marlin. Los motores pueden ser controlados por una placa Arduino v6 con firmware Marlin. En algunas divulgaciones, solo se usa el motor plano X 230. En algunas divulgaciones, solo se usa el motor plano Y 235. En algunas divulgaciones, solo se usa el motor plano Z 240. En algunas divulgaciones, solo se usa el motor plano X 230. En algunas divulgaciones, solo se utilizan el motor plano X 230 y el motor plano Y 235. En algunas divulgaciones, solo se utilizan el motor plano X 230 y el motor plano Z 240. En algunas divulgaciones, solo se utilizan el motor plano Y 235 y el motor plano Z 240. En algunas divulgaciones, se utilizan el motor plano X 230, el motor plano Y 235 y el motor plano Z 240.
Este movimiento tridimensional de la plataforma de aplicador 220 y el aplicador de ondas de choque 215 permite que toda la grasa en la muestra extraída para ser expuesta a las ondas de choque extracorporales durante el procesamiento.
Las ondas de choque se administran luego desde el aplicador de ondas de choque 215, a través de un gel de transmisión o membrana que contiene un gel de transmisión, a través de las paredes del recipiente o cartucho 205, y a la muestra de grasa para romper la grasa, liberando pequeños racimos de células y células individuales de la grasa. El gel de transmisión puede ser REF 4248 Conductor Transmission Gel fabricado para Chattanooga por DJO, LLC, 1430 Decision Street, Vista, CA 92081, EE. UU.
El aplicador de la onda de choque 215 es alimentado por un generador de onda de choque 245, que produce el ESW que se transmite a la grasa a través del aplicador de onda de choque 215. El generador de onda de choque puede ser un MASTERPULS MP100 hecho por Storz Medical AG, 8274 Tagerwilen, Suiza. El generador de ondas de choque puede ser el BS-SWT2X fabricado por Lumsail Industrial Inc., 4/F, No. 9Yi, Lane 2, Suide Road, Shanghai, 200331, China.
La potencia de la ESW suministrada a la grasa puede variar. Por ejemplo, puede ser necesario aumentar la potencia de la ESW para penetrar las paredes de un recipiente o cartucho 205 de paredes gruesas. Generalmente, la potencia de la ESW suministrada a la grasa puede variar dependiendo del grosor de las paredes del recipiente o cartucho 205 y/o el material del que está hecho el recipiente o cartucho 205. La potencia de la ESW suministrada a la grasa puede variar de 0,5 a 5,0 barras. La potencia de la ESW suministrada a la grasa puede variar de 1,0 a 4,5 bares. La potencia de la ESW suministrada a la grasa puede variar de 1,5 a 4,0 bares. La potencia de la ESW suministrada a la grasa puede variar de 2,0 a 3,5 bares. El recipiente 205 puede ser una bolsa de vinilo que tiene paredes de 0,25 mm de espesor y el nivel de potencia de la ESW varía de 2,0 a 2,5 bares.
El área cubierta por la ESW suministrada por el aplicador de la onda de choque 215 puede variar. Cuanto mayor sea el área cubierta por el aplicador de ondas de choque 215, mayor será el área de superficie de la grasa que está expuesta a ESW. El área total cubierta por el aplicador de ondas de choque 215 puede variar de 1 cm2 a 100 cm2, de 1 cm2 a 90 cm2, de 1 cm2 a 80 cm2, de 1 cm2 a 70 cm2, en algunas divulgaciones de 1 cm2 a 60 cm2, de 1 cm2 a 50 cm2, de 1 cm2 a 40 cm2, de 1 cm2 a 30 cm2, de 1 cm2 a 20 cm2, de 1 cm2 a 10 cm2, y de 1 cm2 a 5 cm2. El área total cubierta por el aplicador de ondas de choque 215 puede ser de 5 cm2.
En una realización, el recipiente 205 es una bolsa de vinilo 19 oz que tiene paredes 0,25 mm de espesor, la cantidad total de grasa obtenida del paciente es de 30 cc, y una adición opcional de 30 ml de solución salina (un volumen igual de la muestra de grasa) a la bolsa de vinilo antes del procesamiento. El área total de la bolsa, y por lo tanto la cantidad total de muestra de grasa, expuesta a la ESW puede ser de aproximadamente 5 cm2.
El número de ondas de choque suministradas a la muestra de grasa puede variar. El número total de ondas de choque puede variar de 5.000 a 100.000, de 10.000 a 50.000, de 10.000 a 25.000 y de 10.000 a 20.000. El número total de ondas de choque puede ser de 25.000.
Las células madre pueden ser separadas de la muestra de grasa obtenida del paciente. Usando una punta de aplicador de 5 cm2 en el aplicador de ondas de choque 215, un rango de número de ondas de choque de 10,000 a 50,000 en un rango de barras de 2,0 a 2,5 puede ser suficiente para separar tanto las células madre como una fracción vascular estromal de la grasa. Como se usa en el presente documento, "fracción vascular estromal" significa una fracción celular obtenida de muestras de tejido de procesos que comprende las células obtenidas de la separación y disociación de la fracción celular, que en algunas realizaciones es grasa. La fracción vascular estromal comprende, sin limitación, células madre, factores de crecimiento y células progenitoras, entre otras cosas.
Después de aplicarse la ESW a la muestra de grasa, el recipiente o cartucho se somete a agitación mecánica para un período breve de tiempo. La agitación mecánica puede estar temblando. La agitación mecánica se puede invertir el recipiente o cartucho 205 una o más veces. El corto período de tiempo puede variar de 1 a 30 segundos, de 1 a 15 segundos y de 1 a 10 segundos. El corto período de tiempo puede ser de aproximadamente 10 segundos. La agitación permite que las células madre y la fracción vascular del estroma que han sido liberadas de la grasa se separen de los restos celulares grasos y cualquier tejido graso persistente de que todavía puede estar presente en el recipiente o cartucho 205.
El recipiente o cartucho 205 es entonces colocado de tal manera que permita que la grasa (ahora procesada) se separe de la solución salina estéril que ahora contiene células madre y la fracción vascular estromal que puede haber sido separada de la grasa por la<e>S<w>. Debido a que la grasa es menos densa que la solución salina que contiene células madre, se elevará y flotará sobre la solución salina. El tiempo necesario para que se produzca la separación variará dependiendo de la composición individual de la muestra de grasa. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 30 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 15 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 10 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 5 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 10 segundos a 1 minuto. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir en menos de 1 minuto.
Las células madre han sido separadas de la muestra de grasa y ahora se suspenden en la capa de solución salina estéril.
A continuación, la capa de solución salina que contiene células madre se retira del recipiente o cartucho 205 lo más completamente posible, de modo que solo queda la grasa. La extracción puede ocurrir por varios medios, dependiendo del tipo de recipiente o cartucho 205 utilizado en el método. En algunas realizaciones, la solución salina se drena fuera del recipiente o cartucho 205 a través de un tubo ubicado en el fondo del recipiente o cartucho 205. El drenaje puede proceder activamente, usando una jeringa o una bomba, o pasivamente mediante flujo por gravedad. En algunas realizaciones, la capa que contiene células madre se elimina de una manera que mantendrá la integridad del entorno cerrado y estéril, como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, la capa de solución salina que contiene células madre se pasa a través de un filtro durante la extracción desde el recipiente o cartucho 205. El tamaño del filtro puede variar. En algunas realizaciones, el tamaño del filtro varía de 40 pm a 100 pm. En algunas realizaciones, el tamaño del filtro es de 70 pm. En varias formas de realización, el filtro es de nailon.
Ya sea después o durante la extracción del recipiente o cartucho 205, la solución salina que contiene células madre se mueve en uno o más tubos de centrífuga. En algunas realizaciones, el movimiento se produce de una manera que mantiene la integridad del entorno cerrado y estéril, como se describe en el presente documento. A continuación, se realiza la centrifugación para concentrar las células madre en un sedimento en el fondo del tubo de centrífuga.
Las células madre se concentran mediante centrifugación de 500 g a 1.600 g durante 3 a 10 minutos. En algunas realizaciones, las células madre se concentran mediante centrifugación durante 10 minutos a 1200 g.
El fluido se retira del tubo, dejando sólo las células madre en el fondo. El fluido puede eliminarse mediante decantación, aspiración o medios similares.
Se pone una pequeña cantidad de fluido en los tubos de centrífuga para resuspender las células madre. En algunas realizaciones, la cantidad de fluido agregado a los tubos de centrífuga varía de 1 ml a 5 ml. En algunas realizaciones, el fluido es solución salina, plasma rico en plaquetas, hialuronano, un gel fijador, hidrogel, andamio, fibrina, pegamento o combinaciones de cualquiera de los anteriores. En algunas realizaciones, las células se resuspenden en el aspirado de centrifugación.
Con las células madre flotando en suspensión, están listas para su uso. Dicho uso puede incluir, sin limitación, la reintroducción en el paciente del que se derivaron, criopreservación, expansión y similares. Las células madre concentradas y resuspendidas se pueden trasladar a una jeringa, mediante una aguja hipodérmica, para uso del paciente. Las células madre concentradas y resuspendidas se pueden sembrar en un armazón de tejido para crecer en estructuras cardíacas, musculares, óseas, cartilaginosas, hepáticas, renales u otras estructuras de tejidos y órganos. Las células madre concentradas y resuspendidas pueden transformarse en células madre pluripotentes inducidas haciéndolas expresar factores de transcripción de pluripotencia.
A continuación se muestra una realización de un método para procesar células madre a partir de grasa:
La grasa se obtiene de un paciente mediante liposucción. La liposucción se puede realizar mediante una jeringa, donde la grasa se extrae del paciente directamente mediante una aguja, o mediante una máquina de liposucción. La cantidad de grasa extraída durante la liposucción puede variar, dependiendo de la cantidad de células madre deseadas. Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía o métodos de diagnósticoin vivoen esta descripción deben interpretarse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en esos métodos. La grasa se puede extraer del paciente mediante una jeringa y la jeringa se acopla de forma estéril dentro del cartucho conectando conectores luer lock macho y hembra entre sí entre la jeringa y el cartucho. La grasa se puede extraer del paciente mediante una jeringa y se puede transferir desde la jeringa al recipiente o cartucho de procesamiento uniendo conectores luer lock macho y hembra entre sí entre la jeringa y el recipiente o cartucho de procesamiento dentro del cartucho. La liposucción puede ser una miniliposucción, en la que se extraen del paciente entre 30 cc y 50 cc de grasa. La liposucción puede ser una microliposucción, en la que se extraen del paciente entre 5 cc y 29 cc de grasa. La liposucción puede ser una liposucción clínica típica, en cuyo caso se extraen del paciente 300 cc de grasa o más.
Una vez que se retira la grasa del paciente, se transfiere a un recipiente o cartucho de procesamiento estéril. La transferencia se produce a través de medios estériles, como se describe en el presente documento. La grasa se puede extraer del paciente mediante una jeringa y se puede transferir desde la jeringa al recipiente o cartucho de procesamiento uniendo conectores de bloqueo luer macho y hembra entre sí entre la jeringa y el recipiente o cartucho de procesamiento. La grasa se puede extraer del paciente mediante un dispositivo de liposucción y se puede transferir desde el dispositivo de liposucción al recipiente o cartucho de procesamiento acoplando de forma estéril el dispositivo de liposucción y el recipiente o cartucho de procesamiento usando un dispositivo de conexión estéril.
La transferencia puede realizarse mediante flujo por gravedad. La transferencia puede ocurrir mecánicamente, por ejemplo presionando físicamente el émbolo de una jeringa y forzando la grasa desde el interior de la jeringa hacia el interior del recipiente o cartucho de procesamiento. La transferencia puede realizarse a través de un dispositivo, tal como una bomba.
El volumen del recipiente o cartucho utilizado para recibir la grasa puede variar con la cantidad de grasa obtenida del paciente. En algunas realizaciones, se transfieren de 30 cc a 50 cc de grasa, eliminada mediante una miniliposucción, a un recipiente o cartucho que tiene un volumen de 255,7 ml (9 onzas líquidas) a 539,8 ml (19 onzas líquidas).
Luego se transfiere un volumen de solución salina estéril igual a la cantidad de grasa extraída del paciente al recipiente o cartucho para lavar la grasa. A modo de ejemplo, si al paciente se le retiraron 30 cc de grasa, entonces se utilizan 30 mL de solución salina estéril para lavar la muestra. La grasa se puede extraer del paciente mediante una jeringa y la jeringa se puede acoplar de forma esterilizada dentro del cartucho conectando conectores de bloqueo luer macho y hembra entre sí entre la jeringa y el cartucho. La grasa se puede extraer del paciente mediante una jeringa y se puede transferir desde la jeringa al recipiente o cartucho de procesamiento uniendo conectores de bloqueo luer macho y hembra entre sí entre la jeringa y el recipiente o cartucho de procesamiento dentro del cartucho. La transferencia de la solución salina al recipiente o cartucho se realiza para mantener la esterilidad del sistema, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la solución salina estéril se transfiere al recipiente o cartucho uniendo conectores de bloqueo luer macho y hembra entre sí entre el recipiente que contiene la solución salina estéril y el recipiente o cartucho de procesamiento. En algunas realizaciones, la solución salina estéril se transfiere al recipiente o cartucho acoplando de forma estéril el recipiente de solución salina estéril y el recipiente o cartucho de procesamiento usando un dispositivo de conexión estéril.
El lavado se realiza agitando o haciendo girar suavemente el recipiente o cartucho que contiene la grasa y la solución salina estéril.
Luego se coloca el recipiente o cartucho de tal manera que permita que la grasa (ahora lavada) se separe de la solución salina estéril. Debido a que la grasa es menos densa que la solución salina, se elevará y flotará sobre la solución salina. La cantidad de tiempo necesaria para que se produzca la separación variará dependiendo de la composición individual de la muestra de grasa. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 30 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 15 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 10 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 5 minutos.
Luego se drena la solución salina del recipiente o cartucho lo más completamente posible, de modo que solo quede la grasa. El drenaje puede ocurrir a través de varios medios, dependiendo del tipo de recipiente o cartucho utilizado en el método. En algunas realizaciones, la solución salina se drena del recipiente o cartucho a través de un tubo ubicado en el fondo del recipiente o cartucho. El drenaje puede realizarse de forma activa, utilizando una jeringa o una bomba, o de forma pasiva mediante flujo por gravedad. En algunas realizaciones, el drenaje se produce para mantener la integridad del sistema estéril, como se describe en el presente documento.
Se repite el lavado hasta que la grasa adquiere un color dorado y la solución salina está sólo ligeramente turbia después de completar el lavado. En algunas realizaciones, el lavado se produce de 1 a 5 veces, en algunas realizaciones de 1 a 4 veces, en algunas realizaciones de 1 a 3 veces, en algunas realizaciones de 1 a 2 veces y en algunas realizaciones 1 vez.
Una vez que se completa el lavado, la grasa está lista para su procesamiento.
Opcionalmente, se añade solución salina estéril a la bolsa para su procesamiento, aunque esto no es necesario. La adición de solución salina proporcionará espacio para que las células y/o pequeños grupos de células se alejen libremente unas de otras durante el procesamiento, ayudando así a descomponer la grasa en células individuales. Si se agrega solución salina, se agrega de una manera que mantenga la integridad del sistema estéril, como se describe en el presente documento.
El volumen de solución salina opcionalmente añadido puede variar. En algunas realizaciones, el volumen de solución salina agregada varía de nada a 2 veces el volumen de grasa extraída del paciente. En algunas realizaciones, se usa una cantidad igual de solución salina (por ejemplo, 30 ml de solución salina por 30 cc de grasa).
El exceso de aire se elimina del recipiente o cartucho usando una bomba o jeringa. En algunas realizaciones, el exceso de aire se elimina del mismo tubo ubicado en el fondo del recipiente o cartucho desde el cual se drena el lavado salino estéril. El aire se puede drenar de una manera que mantenga la integridad del sistema cerrado estéril, como se describe en el presente documento.
A continuación, el recipiente o cartucho de procesamiento se traslada a un aparato de procesamiento. En la figura 3 se muestra un ejemplo de un aparato de procesamiento adecuado 300 que muestra una realización de la invención reivindicada. En la realización representada, el recipiente o cartucho de procesamiento 205 está asegurado sobre una plataforma rígida 315 para su procesamiento. La plataforma 315 controla el movimiento del recipiente o cartucho 205 durante el procesamiento.
La plataforma 315 puede estar hecha de cualquier material rígido adecuado, incluyendo madera, plástico y similares. En algunas realizaciones, la plataforma 315 está hecha de madera.
En esta realización, se utilizan impactos mecánicos para romper el tejido adiposo y liberar células madre.
Los impactos mecánicos son generados por un motor 305 que acciona un brazo de impacto 310 que hace contacto físico con el recipiente o cartucho 205 que contiene la grasa que se va a procesar. En esta realización, el motor 305 acciona el brazo de impacto 310 de manera que el brazo de impacto 310 se articule hacia arriba y hacia abajo, haciendo contacto con el recipiente o cartucho 205 en la parte inferior de su rango de movimiento. En algunas realizaciones, el motor es un motor de 4,5 amperios del modelo BDEJS300C fabricado por Black and Decker, 1000 Stanley Drive, New Britain, CT 06053, EE. UU.
En algunas realizaciones, el motor 305 es un motor de velocidad variable que es ajustable para impulsar el brazo de impacto a una velocidad que varía de 0 a 30.000 rpm, en algunas realizaciones de 0 a 20.000 rpm, en algunas realizaciones de 0 a 10.000 rpm. , y en algunas realizaciones de 0 a 5.000 rpm.
La velocidad a la que el brazo de impacto 310 es capaz de hacer contacto con el recipiente o cartucho 205 permite tiempos de procesamiento muy reducidos. Esto confiere una ventaja significativa sobre las técnicas de procesamiento de tejidos conocidas o existentes, que requieren tiempos de procesamiento muy prolongados.
El tejido se expone a los impactos mecánicos hasta que la grasa se descompone a un nivel deseado, o hasta que la cantidad deseada de células madre se haya liberado de la grasa. En algunas realizaciones, la muestra de grasa se procesa en 30 minutos o menos. En algunas realizaciones, la muestra de grasa se procesa entre 30 segundos y 30 minutos, en algunas realizaciones entre 30 segundos y 20 minutos, en algunas realizaciones entre 30 segundos y 10 minutos y en algunas realizaciones entre 30 segundos y 5 minutos.
El movimiento de la plataforma 315 se produce en tres planos direccionales, X, Y y Z, cada uno de los cuales está controlado por su propio motor: un motor plano X 230, un motor plano Y 235 y un motor plano Z 240. En algunos En algunas realizaciones, sólo se utiliza el motor plano X 230. En algunas realizaciones, sólo se utiliza el motor plano Y 235. En algunas realizaciones, sólo se utiliza el motor plano Z 240. En algunas realizaciones, sólo se utiliza el motor plano X 230. En algunas realizaciones, sólo se utilizan el motor plano X 230 y el motor plano Y 235. En algunas realizaciones, sólo se utilizan el motor plano X 230 y el motor plano Z 240. En algunas realizaciones, sólo se utilizan el motor plano Y 235 y el motor plano Z 240. En algunas realizaciones, se utilizan el motor plano X 230, el motor plano Y 235 y el motor plano Z 240. Cada uno de los motores 230, 235 y 240 está controlado por un controlador de motor 225, que permite el movimiento de la plataforma 315 en tres dimensiones.
Este movimiento hasta tridimensional de la plataforma 315 permite que toda la grasa en la muestra extraída quede expuesta a los impactos mecánicos durante el procesamiento, y para el posicionamiento óptimo de la muestra y el aparato de procesamiento.
La longitud, el área de la superficie de impacto, el número de superficies de impacto y la forma del brazo de impacto 310 pueden variar. En algunas realizaciones, aumentar el área total de la superficie de impacto y/o el número total de superficies de impacto reduce la cantidad de tiempo necesario para procesar una muestra de grasa.
El recipiente o cartucho 205 se coloca entonces de tal manera que permita que la grasa (ahora procesada) se separe de la solución salina estéril que ahora contiene células madre que se han separado de la grasa mediante los impactos mecánicos. Debido a que la grasa es menos densa que la solución salina, se elevará y flotará sobre la solución salina. La cantidad de tiempo necesaria para que se produzca la separación variará dependiendo de la composición individual de la muestra de grasa. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 30 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 15 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 10 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 5 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir en menos de 1 minuto. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir desde 10 segundos hasta 1 minuto. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir en menos de 1 minuto.
Las células madre y la fracción vascular estromal ahora se han separado de la muestra de grasa y ahora se suspenden en solución salina.
La capa salina que contiene células madre se retira entonces del recipiente o cartucho 205 lo más completamente posible, de modo que solo quede la grasa. La eliminación puede ocurrir a través de varios medios, dependiendo del tipo de recipiente o cartucho 205 utilizado en el método. En algunas realizaciones, la solución salina se drena del recipiente o cartucho 205 a través de un tubo ubicado en el fondo del recipiente o cartucho 205. El drenaje puede realizarse de forma activa, usando una jeringa o una bomba, o pasivamente mediante flujo por gravedad. En algunas realizaciones, la capa que contiene células madre se elimina de una manera que mantendrá la integridad del entorno cerrado y estéril, como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, la solución salina que contiene células madre se pasa a través de un filtro durante la extracción del recipiente o cartucho 205. El tamaño del filtro puede variar. En algunas realizaciones, el tamaño del filtro oscila entre 40 pm y 100 pm. En algunas realizaciones, el tamaño del filtro es de 70 pm. En diversas realizaciones, el filtro es nailon.
Ya sea después o durante la extracción del recipiente o cartucho 205, la solución salina que contiene células madre se mueve a uno o más tubos de centrífuga. En algunas realizaciones, el movimiento se produce de una manera que mantiene la integridad del entorno cerrado y estéril, como se describe en el presente documento. A continuación se realiza la centrifugación para concentrar las células madre en un sedimento en el fondo del tubo de centrífuga.
Las células madre se concentraron por centrifugación a 500 g a 1600 g durante 3 a 10 minutos. En algunas realizaciones, las células madre se concentran mediante centrifugación durante 10 minutos a 1200 g.
El fluido se extrae del tubo, dejando solo las células madre en la parte inferior. El fluido puede eliminarse por decantación, aspiración o medios similares.
Una pequeña cantidad de fluido se pone en el tubo de centrífuga con el fin de resuspender las células madre. En algunas realizaciones, la cantidad de fluido añadida a los tubos de centrífuga varía de 1 ml a 5 ml. En algunas realizaciones, el fluido es solución salina, plasma rico en plaquetas, hialuronano, un gel de fijación, hidrogel, andamio, fibrina, pegamento o combinaciones de cualquiera de los anteriores. En algunas realizaciones, las células se resuspenden en el aspirado de centrifugación.
Con las células madre en suspensión, están listas para su uso. Tal uso puede incluir, sin limitación, reintroducción en el paciente del que se derivaron, crioconservación, expansión y similares. Las células madre concentradas resuspendidas se pueden mover a una jeringa, a través de una aguja hipodérmica, para uso del paciente. Las células madre concentradas resuspendidas se pueden sembrar en un andamio de tejido para crecer en estructuras cardíacas, musculares, óseas, cartilaginosas, hepáticas, renales u otras estructuras de tejidos y órganos. Las células madre concentradas resuspendidas se pueden transformar en células madre pluripotentes inducidas haciendo que expresen factores de transcripción de pluripotencia.
En los métodos primero y segundo descritos anteriormente, las fuentes de recipientes o cartuchos y de energía mecánica son móviles. La grasa se puede bombear a través de una cámara que se coloca debajo de la superficie de impacto. Tanto la bolsa como las fuentes de energía mecánica se pueden fijar en su lugar y el tejido se puede pasar a través de la cámara para exponerse a la fuente de energía mecánica.
A continuación se muestra otra realización de un método para procesar células madre a partir de grasa:
La grasa se obtiene de un paciente mediante liposucción. La liposucción se puede realizar mediante una jeringa, donde se extrae la grasa del paciente directamente mediante una aguja, o mediante una máquina de liposucción. La cantidad de grasa eliminada durante la liposucción puede variar, dependiendo de la cantidad de células madre deseadas. La liposucción puede ser una miniliposucción, en donde se extraen del paciente entre 30 cc y 50 cc de grasa. La liposucción puede ser una micro-liposucción, en donde se extraen del paciente entre 5 cc y 29 cc de grasa. La liposucción puede ser una liposucción clínica típica, en cuyo caso se extraen del paciente 300 cc de grasa o más.
Una vez que la grasa se ha eliminado del paciente, se transfiere en un cartucho de procesamiento estéril. La transferencia se produce por medios estériles, como se describe en el presente documento. La grasa se puede extraer del paciente mediante una jeringa y se puede transferir de la jeringa al cartucho de procesamiento uniendo conectores de cierre luer macho y hembra entre sí entre la jeringa y el cartucho de procesamiento. La grasa se puede extraer del paciente mediante una jeringa y la jeringa se acopla de forma estéril dentro del cartucho uniendo conectores de cierre luer macho y hembra entre sí entre la jeringa y el cartucho. La grasa se puede extraer del paciente mediante una jeringa y se transfirió de la jeringa al recipiente o cartucho de procesamiento uniendo conectores de cierre luer macho y hembra entre sí entre la jeringa y el recipiente o cartucho de procesamiento dentro del cartucho. La grasa se puede extraer del paciente mediante un dispositivo de liposucción y se puede transfer desde el dispositivo de liposucción al cartucho de procesamiento acoplando estérilmente el dispositivo de liposucción y el cartucho de procesamiento utilizando un dispositivo de conexión estéril.
En algunas realizaciones, la transferencia puede ocurrir a través de flujo por gravedad. En algunas realizaciones, la transferencia puede ocurrir mecánicamente, por ejemplo presionando físicamente el émbolo de una jeringa y forzando la grasa del interior de la jeringa a una cámara interior del cartucho de procesamiento. En algunas realizaciones, la transferencia puede ocurrir a través de un dispositivo, como una bomba.
El volumen de la cámara interior del cartucho 400, 500 que recibe la grasa (véase, por ejemplo, el cartucho de realizaciones proporcionado en las Figs 4 y 5) puede variar con la cantidad de grasa obtenida del paciente. En algunas realizaciones, 30 cc a 50 cc de grasa, eliminado a través de una mini-liposucción, se transfiere a una cámara adiposa 405, 505 de un cartucho 400, 500.
En esta realización, la grasa se inyecta en un componente específico 405, 505 de un cartucho autónomo 400, 500, el cartucho 400, 500 diseñado para acomodar el procesamiento de la muestra de grasa completamente dentro del cartucho 400, 500, sin exponer la muestra al ambiente exterior. En algunas realizaciones, la cámara adiposa 405, 505 ubicada dentro del cartucho 400, 500 que recibe la grasa es una bolsa flexible que tiene un volumen de 255,7 ml (9 onzas líquidas) a 539,8 ml (19 onzas líquidas).
En varios aspectos, el cartucho 400, 500 está diseñado para su uso con cualquiera de las ESW o dispositivos de impacto mecánicos y métodos descritos en este documento. En algunas realizaciones, el procesamiento lo realiza una máquina que ejecuta automáticamente varios de los pasos de procesamiento descritos a continuación. En algunas realizaciones, el procesamiento lo realiza un usuario, que realiza manualmente los pasos que se describen a continuación. En ambas realizaciones, el procesamiento se controla externamente, de modo que el procesamiento interno del cartucho 400, 500 se realiza de manera estéril, sin que la muestra se exponga nunca al entorno exterior.
En las realizaciones representadas, la muestra de grasa se introduce en la cámara adiposa 405, 505 haciéndola pasar a través de una primera válvula de una vía 410, 510. La dirección de la válvula de flujo primero de una sola vía 410, 510 es tal como se representa - en el interior de la cámara adiposa 405, 505. En algunas realizaciones, la grasa se introduce en la cámara interior de la cámara adiposa 405, 505 uniendo conectores cierre luer macho y hembra entre sí entre el recipiente que contiene la grasa después de la extracción del paciente y la primera válvula unidireccional 410, 510 del cartucho de procesamiento 400, 500. La grasa se puede extraer del paciente mediante un dispositivo de liposucción y se puede transfer desde el dispositivo de liposucción al cartucho de procesamiento mediante acoplamiento estéril del dispositivo de liposucción y del cartucho de procesamiento mediante un dispositivo de conexión estéril.
Una vez dentro de la cámara adiposa 405, 505, la grasa se lava antes del procesamiento. El cartucho 400, 500 contiene un depósito de fluido 415, 515 lleno de solución salina estéril, en algunas realizaciones solución salina tamponada con fosfato 1x estéril, que se usa para lavar el tejido. Para introducir la solución salina estéril en el interior de la cámara adiposa 405, 505, la solución salina se hace pasar a través de una segunda válvula unidireccional 420, 520 al interior de la cámara adiposa 405, 505. La dirección del flujo es la indicada. La solución salina se mueve hacia el interior de la cámara adiposa 405, 505 mediante el uso de un actuador externo 425, 525 que mueve un primer émbolo 430, 530 para forzar la solución salina a través de la primera válvula unidireccional 420, 520. En algunas realizaciones, el actuador externo 425, 525 es operado manualmente por un usuario, que presiona el actuador 425, 525 hasta que una cantidad deseada de solución salina pasa a través de la segunda válvula unidireccional 420, 520 al interior de la cámara adiposa 405, 505. En algunas realizaciones, el movimiento del actuador externo 425, 525 está automatizado y una máquina externa hace que el actuador externo 425, 525 se mueva en la dirección mostrada, midiendo así una cantidad deseada de solución salina a través de la segunda válvula unidireccional 420, 520 hacia el interior de la cámara adiposa 405, 505.
El lavado se realiza agitando o agitando suavemente el cartucho 400, 500 que contiene la grasa y la solución salina estéril.
El cartucho 400, 500 se posiciona entonces de tal manera a fin de permitir que la grasa (ahora lavada) se separe de la solución salina estéril. En esta realización, el cartucho 400, 500 tiene dos variaciones. En algunas realizaciones, el cartucho 400, 500 tiene una orientación vertical fija de modo que el lavado de grasa y solución salina contenida en la cámara adiposa 405, 505 siempre se separará naturalmente entre sí por gravedad, con la grasa flotando hacia la parte superior de la cámara adiposa. 405, 505. En algunas realizaciones, el cartucho 400, 500 tiene una orientación horizontal y se gira verticalmente para permitir que la grasa flote y se separe del lavado de solución salina. Debido a que la grasa es menos densa que la solución salina, se elevará y flotará sobre la solución salina. El tiempo necesario para que se produzca la separación variará dependiendo de la composición individual de la muestra de grasa. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 30 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 15 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 10 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 1 a 5 minutos. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir de 10 segundos a 1 minuto. En algunas realizaciones, la separación puede ocurrir en menos de 1 minuto.
A continuación, la solución salina se drena de la cámara adiposa 405, 505 tan completamente como sea posible, por lo que solo queda la grasa. El drenaje puede ocurrir por varios medios, dependiendo del tipo de cartucho 400, 500 utilizado en el método. En algunas realizaciones, la solución salina se drena fuera de la cámara adiposa 405, 505 y fuera del cartucho 400, 500 a través de un tubo ubicado en la parte inferior de la cámara adiposa 405, 505 que conduce al exterior del cartucho 400, 500. El drenaje puede proceder de forma activa, utilizando una jeringa o una bomba, o de forma pasiva a través del flujo por gravedad. En algunas realizaciones, el drenaje se produce para mantener la integridad del sistema estéril, como se describe en el presente documento.
El lavado se repitió hasta que la grasa sea de un color dorado y la solución salina es sólo ligeramente nublada después de la finalización de un lavado. En algunas realizaciones, el lavado se produce de 1 a 5 veces, en algunas realizaciones de 1 a 4 veces, en algunas realizaciones de 1 a 3 veces, en algunas realizaciones de 1 a 2 veces y en algunas realizaciones 1 vez.
En algunas realizaciones, el lavado se repite hasta que la solución salina estéril se agota desde el depósito de fluido 415, 515. En algunas realizaciones, el lavado se repite hasta que el lavado de solución salina en la cámara adiposa 405, 505 sea lo suficientemente claro, después de lavado, para que del 50% al 100% de la luz pase a través de la solución salina, lo que indica un alto grado de claridad. En algunas realizaciones, el lavado se repite hasta que se ha completado un número determinado de ciclos de lavado que, en algunas realizaciones, es de 1 a 5, en algunas realizaciones 1 a 4, en algunas realizaciones 1 a 3, en algunas realizaciones 1 a 2, en algunas realizaciones 1, en algunas realizaciones 2 y en algunas realizaciones 3 lavados.
Una vez que el lavado se haya completado, la grasa está lista para su procesamiento.
La grasa en la cámara adiposa 405, 505 se procesa de acuerdo con uno de los métodos descritos anteriormente, sometiendo la grasa a impactos mecánicos, con el fin de liberar las células madre de la grasa. En algunas realizaciones, el cartucho 400, 500 tiene una abertura sobre la cámara adiposa 405, 505 para permitir un proceso óptimo, de modo que la fuerza de los impactos mecánicos no pase a través del exterior de plástico rígido del cartucho 400, 500. En tales realizaciones, la pared de la cámara adiposa flexible 405, 505 está expuesta para su procesamiento.
Después de completarse el procesamiento de tejido, se deja que la grasa se separe del fluido y la altura de la parte superior. Como se señaló anteriormente, en esta realización el cartucho 400, 500 tiene dos variaciones. En algunas realizaciones, el cartucho 400, 500 tiene una orientación vertical fija de modo que la grasa procesada y la solución salina contenidas en la cámara adiposa 405, 505 siempre se separarán naturalmente entre sí por gravedad, con la grasa flotando hacia la parte superior de la cámara adiposa. 405, 505. En algunas realizaciones, el cartucho 400, 500 tiene una orientación horizontal y se gira verticalmente para permitir que la grasa flote y se separe de la solución salina. Debido a que la grasa es menos densa que la solución salina, se elevará y flotará sobre la solución salina. Las células madre que se han liberado de la grasa ahora están contenidas en la capa salina.
La solución salina que contiene células madre se desplaza entonces desde la cámara adiposa 405, 505 a un depósito de células 435, 535 situado dentro del cartucho 400, 500, lejos de la grasa, a través de una tercera válvula de una vía 440, 540. La solución salina se mueve al interior del depósito de células 435, 535 mediante el uso de un segundo actuador externo 445, 545 que mueve un segundo émbolo 450, 550 para forzar la solución salina a través de la tercera válvula unidireccional 440, 540. En el depósito de células 435, 535, el segundo émbolo 450, 550 está orientado en una configuración completamente cerrada, de manera que el depósito de células 435, 535 está completamente cerrado. De esta manera, al mover el segundo actuador 445, 545 se aleja el segundo émbolo 450, 550 de la tercera válvula unidireccional 440, 540, creando un vacío suave dentro del depósito de células 435, 535 que extrae la capa de solución salina que contiene las células madre. La cámara adiposa 405, 505, a través de la tercera válvula unidireccional 440, 540 y hacia el interior del depósito de células 435, 535. En algunas realizaciones, el segundo actuador externo 445, 545 es operado manualmente por un usuario, que tira del segundo actuador 445, 545 hasta que la totalidad de la solución salina que contiene las células madre pase a través de la tercera válvula unidireccional 440, 540 hacia el interior del depósito de células 435, 535. En algunas realizaciones, el movimiento del segundo actuador externo 445, 545 es automatizado y una máquina externa tira del segundo actuador externo 445, 545 para mover la solución salina que contiene células madre en el depósito de células 435, 535.
En algunas realizaciones, la célula madre que contiene solución salina se extrae a través de una malla con el fin de filtrar restos celulares no deseados que quedan del tejido graso procesado. En algunas realizaciones, la malla está ubicada en la cámara adiposa 405, 505 donde cubre la abertura de la tercera válvula unidireccional 440, 540. En algunas realizaciones, la malla está ubicada en el interior del depósito de células 435, 535 donde cubre la salida de la tercera válvula unidireccional 440, 540. En algunas realizaciones, la malla se ubica en el interior del depósito de células donde cubre la apertura de una cuarta válvula unidireccional 455, 555. En algunas realizaciones, los poros en la malla varían en tamaño de 40 pm a 100 pm y en algunas realizaciones los poros tienen un tamaño de 70 pm. En algunas realizaciones, la malla es de nailon.
En la realización representada en la Fig. 4, la fracción que contiene la célula madre se transfiere desde el interior del depósito de células 435, a través de la cuarta válvula de un solo sentido 455 en un tubo de centrífuga de 460 contenido dentro del cartucho 400. La fracción de célula madre se mueve al tubo de centrífuga 460 mediante el uso del segundo actuador externo 445 que mueve el segundo émbolo 450 para forzar la solución salina a través de la tercera válvula unidireccional 440 y dentro del tubo de centrífuga 460. Este movimiento se puede realizar manualmente o se puede automatizar, como se describe en este documento. A continuación, el tubo de centrífuga 460 se retira del cartucho 400 para su centrifugación. La centrifugación procede como se describe en cualquiera de las dos realizaciones descritas anteriormente; una pastilla de restos de células madre permanece en la parte inferior del tubo de centrífuga 460.
En la realización representada en la Fig. 5, la fracción que contiene la célula madre se transfiere desde el interior del depósito de células 535, a través de la cuarta válvula de una sola vía 555 en un componente de centrifugación 560 contenido dentro del cartucho 500. El componente de centrifugación 560 es una cámara triangular que actúa como componente centrífugo; hace girar las células fuera de la solución salina de modo que las células se concentran en un solo punto en el borde exterior de la cámara. Un puerto de acceso 565 permite al usuario acceder al sedimento de células madre, para resuspender el sedimento y/o retirarlo del componente de centrifugación 560. En algunas realizaciones, el funcionamiento del componente de centrifugación 560 está automatizado y controlado por un aparato externo, donde el aparato externo se acopla con la cámara de giro a través de un motor y un engranaje que se inserta en el cartucho en el centro de la cámara. A ese respecto, el componente de centrifugación 560 puede ser de accionamiento directo o de engranajes. La capa/infranadante que contiene células madre se carga en el componente de centrifugación como se describió anteriormente y el otro lado se equilibra antes de la centrifugación. Una vez introducidas en el componente de centrifugación, las células madre se centrifugan a 500 g a 1600 g durante 3 a 10 minutos. En algunas realizaciones, la centrifugación se produce durante 10 minutos a 1200 g.
Se coloca una pequeña cantidad de líquido en el tubo para resuspender las células. Suele ser de 1 ml a 5 ml. El fluido puede ser solución salina, plasma rico en plaquetas, hialuronano o un gel fijador, hidrogel, andamio o fibrina o pegamento u otro compuesto.
Con las células en suspensión, que caigan en una jeringa a través de una aguja hipodérmica para su uso posterior. Esto lo hace automáticamente la máquina de procesamiento o manualmente un operador.
Una pequeña cantidad de fluido se utiliza para resuspender las células madre. En algunas realizaciones, la cantidad de líquido añadido para resuspender las células varía de 1 ml a 5 ml. En algunas realizaciones, el fluido es solución salina, plasma rico en plaquetas, hialuronano, un gel de fijación, hidrogel, andamio, fibrina, pegamento o combinaciones de cualquiera de los anteriores. En algunas realizaciones, las células se resuspenden en el aspirado de centrifugación.
Al flotar las células madre en suspensión, están listas para su uso. Dicho uso puede incluir, sin limitación, la reintroducción en el paciente del que proceden, la crioconservación, la expansión y similares. Las células madre concentradas resuspendidas se pueden mover a una jeringa, a través de una aguja hipodérmica, para uso del paciente. Las células madre concentradas resuspendidas se pueden sembrar en un andamio de tejido para crecer en estructuras cardíacas, musculares, óseas, cartilaginosas, hepáticas, renales u otras estructuras de tejidos y órganos. Las células madre concentradas resuspendidas se pueden transformar en células madre pluripotentes inducidas haciendo que expresen factores de transcripción de pluripotencia.
Dispositivos
Como se ha indicado anteriormente, la presente descripción proporciona métodos y sistemas para muestras de tejido de bioprocesamiento. En varios aspectos, la presente divulgación también proporciona dispositivos fáciles de usar adecuados para usar con los métodos descritos, estando dichos dispositivos cerrados al entorno exterior y diseñados para un solo uso. Dichos dispositivos incluyen cartuchos de un solo uso que permiten un procesamiento completo dentro de un solo dispositivo.
Recipientes
Las realizaciones descritas anteriormente utilizan uno o más recipientes como receptáculos de muestras de tejido, muestras de grasa, fracciones que contienen fracciones celulares deseadas, fracciones que contienen células madre, o combinaciones de cualquiera de los anteriores. Dichos recipientes incluyen el recipiente utilizado en el paso 105 de la figura 1; recipiente 205; cámaras adiposas 405, 505; depósito de fluido 415, 515; y depósito de células 435, 535. Estos recipientes, que son adecuados para su uso con los sistemas y métodos proporcionados por la presente divulgación, pueden ser flexibles, rígidos o semirrígidos. En algunas realizaciones, un recipiente es una jeringa.
Cada uno de los recipientes utilizados en el paso 105 de la Fig. 1; recipiente 205; cámaras adiposas 405, 505; depósito de fluido 415, 515; y el depósito de células 435, 535, está cerrado al entorno exterior, ya sea por sí mismo o como parte de un cartucho cerrado, y es desechable.
En algunas realizaciones, cada uno de los recipientes utilizados en el paso 105 de la Fig. 1; recipiente 205; cámaras adiposas 405, 505; depósito de fluido 415, 515; y el depósito de células 435, 535 es un recipiente flexible, por ejemplo, una bolsa flexible. En tales realizaciones, cada recipiente puede estar hecho de acetato de etileno-vinilo (EVA), cloruro de poli(vinilo) (PVC), acetato de etileno-vinilo (EVA), nailon u otros plásticos.
Cada uno de los recipientes flexibles puede ser moldeado por soplado. En algunas realizaciones, cada uno de los recipientes flexibles puede ser soldado por radiofrecuencia, alta frecuencia o soldado dieléctrico y puede ser moldeado por soplado.
En algunas realizaciones, cada uno de los recipientes flexible es una bolsa tridimensional que tiene al menos una salida que está en conexión fluida con la cámara interior del recipiente flexible. En algunas realizaciones, un solo recipiente puede tener más de una salida que está en conexión de fluido con la cámara interior del recipiente. Tales salidas se pueden usar para, por ejemplo, drenar fluido de la cámara interior del recipiente, o mover fluido desde el interior del recipiente a otro recipiente.
En algunas realizaciones, un recipiente puede comprender uno o más orificios situados en el exterior del recipiente, a lo largo de un borde, que se pueden utilizar para colgar el recipiente en el espacio.
El volumen total de un recipiente puede ser de 142,1 ml a 1.420,7 ml (5 a 50 onzas de fluido), en algunas realizaciones de 255,7 ml a 539,8 ml (9 a 19 onzas de fluido).
En algunas realizaciones, para recibir entrada, en forma de muestra de tejido, solución salina estéril o de otro modo, se configura un recipiente para recibir una línea de entrada o conexión en un punto discreto, que se conecta a una entrada que está en conexión de fluido con el interior del recipiente. Para mantener la integridad de un ambiente cerrado y estéril, la línea de entrada o conexión comprende una conexión luer hembra que permite que el recipiente se conecte a un dispositivo externo, ya sea una jeringa que contenga una muestra de tejido, otro recipiente del que se extraiga materia para ser transferido al recipiente en cuestión, o de otro modo. En otras realizaciones, la línea de entrada o conexión comprende una base estéril para la conexión a un dispositivo externo usando un dispositivo de conexión estéril.
En varias realizaciones, un recipiente puede ser una bolsa plana, que tiene un borde superior, borde inferior, y dos bordes laterales sustancialmente similares. El borde inferior incluye una salida que está en conexión de fluido con el interior de la bolsa, para drenar el fluido de la bolsa. La bolsa plana también tiene una entrada que permite la introducción estéril de material en el interior de la bolsa.
En varias realizaciones, el recipiente es una bolsa tridimensional que es de forma rectangular, tiene una parte superior del borde, borde inferior, y dos bordes laterales sustancialmente similares. El borde inferior incluye una salida que está en conexión de fluido con el interior del recipiente, para drenar el fluido fuera del recipiente. El borde superior incluye una entrada que está en conexión fluida con el interior del recipiente, para la introducción de material en el recipiente.
En algunas realizaciones, un recipiente está conectado a uno o más otros recipientes a través de líneas. Las líneas son tubos que pueden estar hechos de cloruro de poli(vinilo) (PVC), acetato de etileno-vinilo (EVA) u otros materiales.
En algunas realizaciones, el recipiente puede ser semi-rígido. En tales realizaciones, el recipiente comprende una carcasa de plástico rígido que mantiene su forma y es capaz de contener un recipiente flexible dentro de la carcasa durante el procesamiento del tejido. El alojamiento está configurado de forma que contenga un punto de unión a la plataforma 210 o 315.
La carcasa de plástico rígido puede estar hecha de cualquier material rígido-plástico adecuado incluyendo, por ejemplo, polietileno de alta densidad (HDPE) o polipropileno (PÁGINAS). El material plástico rígido no exhibe deformación elástica, ni muestra ninguno de los comportamientos elásticos típicamente exhibidos por plásticos flexibles. La carcasa de plástico rígido puede moldearse por inyección o troquelarse.
En algunas realizaciones, un recipiente flexible está contenido dentro de la carcasa de plástico rígido, que puede o no puede encerrar completamente el recipiente flexible. En algunas realizaciones, el recipiente flexible no está completamente encerrado dentro de la carcasa de plástico rígido; más bien, la carcasa encierra parcialmente el recipiente flexible, manteniéndolo en su lugar durante el procesamiento del tejido.
Cartuchos
En varios aspectos, los cartuchos adecuados para su uso con la presente descripción son recipientes tridimensionales capaces de una vivienda o más recipientes dentro de su interior. Los recipientes internos pueden estar conectados por una o más líneas y/o válvulas. Ejemplos de cartuchos adecuados son los cartuchos 400, 500 representados en las Figs. 4 y 5.
En algunas realizaciones, los cartuchos están hechos de un material plástico rígido que mantiene su forma y es capaz de contener al menos uno, y preferiblemente una pluralidad, de recipientes flexibles en el interior de los cartuchos durante tejido de procesamiento. Los recipientes están configurados de tal manera que contienen uno o más puntos de unión a la plataforma 210 o 315.
El plástico rígido puede estar hecho de cualquier material plástico rígido adecuado incluyendo, por ejemplo, polietileno de alta densidad (HDPE) o polipropileno (PP). El material plástico rígido no exhibe deformación elástica, ni muestra ninguno de los comportamientos elásticos típicamente exhibidos por plásticos flexibles. Los cartuchos de plástico rígido se pueden moldear por inyección o troquelar.
Anteriormente se han descrito otros aspectos de los recipientes.
Tubos de centrífuga
Tubos de centrífuga adecuados para su uso con los métodos y dispositivos de la presente descripción están hechos a medida con precisión, tubos de alta resistencia de vidrio o de plástico diseñados para encajar exactamente en un rotor centrífugo. La capacidad de los tubos de centrífuga puede variar, dependiendo del volumen total de la muestra de tejido a procesar. En algunas realizaciones, los tubos de centrífuga tienen una capacidad de entre 1 ml a 50 ml, en algunas realizaciones de 0,5 ml a 20 ml, y en algunas realizaciones de 250 pL a 2,0 mL.
En algunas realizaciones, los tubos de centrífuga son tubos Eppendorf, en algunos tubos de microfuga de realizaciones, y en algunas realizaciones tubos de microcentrífuga.
El material de los tubos de centrifugación puede variar. En algunas realizaciones, los tubos de centrífuga están hechos de vidrio. En algunas realizaciones, los tubos de centrífuga son de plástico. En cada realización, los tubos de centrífuga están diseñados para un solo uso y son desechables. En algunas realizaciones, los tubos de centrífuga están hechos de un plástico transparente flexible, tal como polietileno, son de forma semicónica y comprenden tapas de sellado integrales con bisagras.
Válvulas de una sola vía
Una válvula de una sola vía es una válvula que permite que el fluido fluya a través de ella en una única dirección.
En varios aspectos, válvulas de una vía adecuadas para el uso con los dispositivos y métodos de la presente descripción comprenden válvulas de dos puertos, que tienen dos aberturas - una para que entre fluido, y la otra para que salga fluido. Las válvulas unidireccionales funcionan para proporcionar un flujo unidireccional de fluido automáticamente y no requieren la intervención o el control del usuario. En algunas realizaciones, las válvulas unidireccionales útiles para los métodos y dispositivos de la presente divulgación están hechas de un plástico rígido, tal como poli(propileno).
En algunas realizaciones, las válvulas de una vía adecuadas para el uso con los dispositivos y métodos de la presente descripción son válvulas de retención de bola, en donde el componente que evita el reflujo de fluido es una bola esférica. En algunas realizaciones, la bola está cargada por resorte para ayudar a mantener cerrada la válvula unidireccional.
En algunas realizaciones, válvulas de una vía adecuadas para el uso con los dispositivos y métodos de la presente descripción son válvulas de retención de diafragma que comprenden un diafragma de caucho de flexión posicionado para crear el cierre de la válvula. En tales realizaciones, la presión creada en el lado de corriente arriba, ya sea por la intervención del usuario o mediante un proceso automatizado, hace que el diafragma se abra y el fluido fluya a través de la válvula. Al cesar la presión positiva, el diafragma se cierra, interrumpiendo el flujo de fluido.
En algunas realizaciones, válvulas de una vía adecuadas para el uso con los dispositivos y métodos de la presente descripción son válvulas de retención de oscilación o válvulas de retención de inclinación de disco. En tales realizaciones, un disco es la parte móvil de la válvula que se usa para permitir que el fluido fluya en una dirección y bloquear la regresión del fluido en la dirección opuesta.
Ejemplos
Los materiales, métodos, y realizaciones descritos en el presente documento se definen adicionalmente en los siguientes Ejemplos. Ciertas realizaciones también se definen en los Ejemplos de este documento. Debe entenderse que estos Ejemplos, aunque indican ciertas realizaciones, se dan únicamente a modo de ilustración.
Ejemplo 1
Protocolo general para el procesado de tejido de ESW
Un lipoaspirado se obtiene de un sujeto, siendo el lipoaspirado aproximadamente 30 cc en volumen. Antes del procesamiento, el lipoaspirado se transfiere a una bolsa de acetato de etileno-vinilo (EVA), cloruro de poli(vinilo) (PVC), etilenvinilacetato (EVA) o nailon estéril y flexible que tiene paredes laterales de aproximadamente 0,64 cm (0,25 pulgadas) de grosor. Una bolsa de catéter estéril es suficiente.
El lipoaspirado se lava usando un volumen igual de solución salina estéril introducido en la bolsa flexible mediante la conexión de un conector de cierre luer macho de una bolsa de solución salina a un conector de cierre luer hembra situado en la bolsa flexible y de forma manual la dispensación de la solución salina en el bolsa flexible. El lavado de lipoaspirado y solución salina se agita luego mecánicamente agitando suavemente la bolsa flexible.
La mezcla de lavado de muestra de tejido/solución salina se dejó sedimentar durante al menos 10 minutos para permitir que el lipoaspirado flote a la parte superior de la solución salina.
El infranadante, o lavado de solución salina, se retira de la bolsa flexible a través de una línea de drenaje situada en la parte inferior de la bolsa flexible. La extracción puede producirse conectando una jeringa a la línea y extrayendo el infranadante de la bolsa, o mediante el flujo por gravedad.
El lavado se repite 3-4 veces, dejando el lavado con solución salina estéril en la bolsa en el lavado final.
El siguiente paso es aplicar ondas de choque extracorporales al lipoaspirado usando un generador de ondas de choque extracorpóreas Masterpuls MP100.
El generador puede tomar contacto con la pared de la bolsa flexible, pero se debe tener cuidado para asegurar que el generador de ondas de choque no contacte con el lipoaspirado en sí.
Si es necesario, el gel de ultrasonido se puede aplicar a un lado de la bolsa flexible antes de la aplicación de las ondas de choque al lipoaspirado.
Aplicar ESW al lipoaspirado durante 1 a 30 minutos.
A partir de entonces, agitar suavemente la bolsa flexible por agitación o vórtice ligero.
Permita que el lipoaspirado ahora procesado se asiente, de modo que lo que quede del tejido graso pueda flotar hacia la parte superior de la solución salina.
Retire el infranadante de la bolsa flexible uniendo una jeringa estéril para el tubo de drenaje, como se describió anteriormente, y extraer tanto como sea posible del infranadante. No tome nada del tejido adiposo restante.
Durante la extracción, pasar el infranadante a través de uno de los tres filtros de malla de nailon que tienen un tamaño de poro de 40 pm, 70 pm, o 100 pm.
Distribuir el infranadante en uno o más tubos de centrífuga estériles. Si se utiliza un número impar de tubos, asegúrese de colocar en el rotor un tubo de equilibrio que contenga solución salina estéril para mantener el equilibrio.
Se centrifuga a 1200 g durante 10 min.
Opcional: Resuspender el sedimento en 1 ml de tampón de lisis RBC e incubar en baño de agua a 37°C durante 10 min. Neutralizar el tampón de RBC.
Si no se desea tampón de lisis RBC, el sedimento celular se resuspende en 1 ml de solución salina estéril.
Células de recuento.
Ejemplo 2
Comparación de métodos de procesamiento de lipoaspirados
Resumen: el propósito de la prueba realizada para este ejemplo fue comparar el rendimiento celular nucleado de células madre mesenquimales extraídas de tejido adiposo usando digestión con colagenasa versus disrupción por ondas de choque extracorpóreas (ESW).
Materiales:
1500 ml de Ixtampón de fosfato salino (PBS)
35 ml de 1x de glóbulos rojos (RBC) de tampón de lisis
200 ml de 0,1% de colagenasa de tipo I
15 ml de suero bovino fetal al 10% (FBS) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)
Métodos:
Control
Aproximadamente 250 ml de un lipoaspirado se transfirió aun vaso de precipitados de 100 ml usando un catéter estéril de 60 ml. Se tuvo cuidado para asegurar que se introdujera poco o ningún exceso de líquido en el vaso de precipitados. El lipoaspirado se lavó cuatro veces con volúmenes aproximadamente iguales de 1x PBS estéril. Para cada lavado, se añadió al vaso de precipitados 1x PBS estéril, se agitaron los dos y se dejó sedimentar la mezcla. El infranadante se eliminó del vaso de precipitados mediante aspiración. El lipoaspirado se lavó un total de cuatro veces.
Después del cuarto lavado, la muestra se dejó reposar durante 10 minutos.
Se utilizó una pipeta serológica estéril de 10 ml para transferir 45 ml de infranadante desde el cuarto y último lavado en 3 tubos cónicos estériles de 50 ml a través de filtros estériles de tubos de 40 pm, 70 pm y 100 pm. Se transfirió un total de 135 ml de infranadante para su uso como control.
Digestión de colagenasa
200 ml de lipoaspirado se depositó en una botella de vidrio estéril de 500 ml. Se añadieron al frasco 200 ml de colagenasa de tipo I al 0,1%. La botella se agitó ligeramente invirtiéndola varias veces, para asegurar que el lipoaspirado se mezclara uniformemente con la colagenasa.
La botella se colocó en un baño de agua a 37°C. Cada 10 minutos, la botella se sacó del baño de agua y se invirtió varias veces para redistribuir el lipoaspirado, que se había asentado. Después de 30 minutos de incubación, la botella se agitó por última vez y se sacó del baño de agua.
El exterior de la botella se pulverizó con 70% de EtOH y se colocó en una campana de humos. Se dejó sedimentar la mezcla de lipoaspirado y colagenasa durante 10 minutos.
Una pipeta serológica estéril de 10 ml se utilizó para transferir el infranadante en 3 tubos cónicos estériles de 50 ml a través de filtros estériles de tubos de 40 pm, 70 pm y 100 pm. Se transfirió un total de 135 ml de infranadante. Los 3 tubos, incluido un cuarto tubo que contenía 45 ml de agua para equilibrar, se centrifugaron a 1200 g, a 37°C, durante 10 minutos para obtener un sedimento celular digerido con colagenasa.
El exterior de los 3 tubos que contenían la suspensión de colagenasa se limpiaron con 70% de EtOH y se colocaron en una campana de extracción, dejando el tubo de equilibrio fuera. Se aspiró el sobrenadante, dejando un sedimento celular en cada tubo. Usando una pipeta serológica de 25 mL, se dispensaron 5 mL de FBS al 10% en cada tubo y cada tubo se agitó con vórtex durante 5 segundos para resuspender el sedimento. Se usó FBS para neutralizar cualquier actividad de colagenasa restante.
Los 3 tubos se centrifugaron a 1200 g, a 37°C, durante 10 min. El exterior de los tubos de centrífuga se limpió con ETOH al 70% y los tubos se colocaron en una campana extractora. Se aspiró el sobrenadante, dejando los sedimentos celulares.
Procesamiento de ESW
Se transfirieron 200 ml de lipoaspirado a una bolsa de catéter de pierna estéril de 500 ml usando una jeringa de catéter estéril de 60 ml, junto con todo el infranadante restante. Se añadió 1x PBS estéril para lograr un volumen de líquido total de 200 ml, siendo el volumen total de 400 ml, incluido el lipoaspirado. Se aplicaron aproximadamente 2 ml de gel de ultrasonido a la bolsa del catéter. Usando la punta grande, se administraron aproximadamente 10.000 pulsos de ESW a 2 bar y 21 Hz a la muestra dentro de la bolsa. El proceso se repitió en el otro lado de la bolsa durante 10.000 pulsos de ESW adicionales. El exterior de la bolsa del catéter se limpió con ETOH al 70% y se colocó en una campana extractora.
La bolsa se agitó y se vació en un vaso de precipitados de 500 ml y la suspensión se dejó sedimentar durante 10 minutos. Utilizando una pipeta serológica estéril de 10 ml, el infranadante se transfirió a 3 tubos cónicos estériles de 50 ml a través de filtros estériles de tubo de 40 pm, 70 pm y 100 pm. Se transfirió un total de 135 ml de infranadante. Concentración y lisis
Los 3 tubos que contenían la suspensión de control y 3 tubos que contenían la suspensión procesada se centrifugaron a 1.200 g y 37°C durante 10 minutos. Se aspiró el sobrenadante de todos los tubos, dejando cada sedimento y se añadieron a cada tubo 5 ml de tampón de lisis de RBC 1x. Cada tubo se agitó con vórtex durante 5 segundos para volver a suspender el sedimento y los tubos se colocaron en un baño de agua a 37°C durante 10 minutos.
El exterior de cada tubo se sanitizó con 70% de EtOH, y los tubos se colocaron en una campana de humos. Se agregaron 25 ml de 1x PBS estéril a cada tubo para diluir y neutralizar el tampón de lisis.
Recuento de células
Utilizando puntas de micropipeta estériles, se transfirieron 300 pl de 1x PBS estéril a 6 tubos de microcentrífuga estériles de 0,5 ml. También se transfirieron 75 pl de cada tubo de muestra de 50 ml a cada tubo de microcentrífuga para el recuento de células.
El número de células en cada muestra se contó usando un contador de células MoxiZ con casetes tanto de tipo M como de tipo S. Para el recuento, se añadieron 100 pl de azul tripán a cada tubo de microcentrífuga, se cargaron 10 pl de cada muestra en un pocillo de hemocitómetro y se contaron las células.
Resultados:
Contador de células MoxiZ
La Tabla 1 muestra los resultados de los recuentos de células utilizando el contador de células automatizado MoxiZ. Se utilizaron dos tipos de casetes para el recuento, M y S. En la columna Muestra, 'c' significa digestión de colagenasa, 'e' procesamiento de ESW y '0' control. Solo los recuentos con 'y' en la columna 'Completo' son válidos.
Tabla 1
Hemocitómetro
La tabla 2 detalla los recuentos obtenidos del hemocitómetro visual, con recuentos de células de cada cuadrante, la suma de los cuadrantes, el factor de dilución y el total de células calculadas. El número de células debe tomarse en referencia al recuento de células en la población de control. La proporción de células procesadas frente a células de control es un indicador clave del rendimiento.
Tabla 2
Resumen
De los recuentos válidos que utilizan el contador de células automatizado MoxiZ, los promedios agregados para los recuentos de células para control, colagenasa y ESW se muestran en la Tabla 3:
Tabla 3
La colagenasa produjo de forma constante aproximadamente 3,8E+05 células/ml. La ESW osciló entre 1,67e+05 y 7,08e+05 células/ml.
Al observar las proporciones de células en los recuentos del hemocitómetro, el proceso de ESW produjo las proporciones más altas con proporciones que oscilan entre 1,78 y 9,0 veces más altas que el control. La colagenasa solo produjo proporciones que variaron de 1,29 a 2,84 veces más altas que el control.
Discusión
Estos datos indican que ESW es eficaz para producir un alto número de células madre mesenquimales de tejido adiposo. Con base en estos datos, se concluye que ESW es una alternativa viable al procesamiento de ultrasonido o colagenasa del tejido adiposo para obtener células madre mesenquimales. Al comparar los picos, ESW produjo rendimientos celulares de 7,08e+05 en comparación con el pico de colagenasa de 4,32e+05, un aumento en el rendimiento del 164%.
Dados los datos presentados anteriormente, es razonable concluir que una muestra de 50 cc a 60 cc de lipoaspirado produciría aproximadamente 5 millones de células del procesamiento de ESW y aproximadamente 3 millones de células de la digestión con colagenasa.
Por tanto, es evidente que el uso de ESW para liberar las células de tejido adiposo confiere una ventaja significativa con respecto a técnicas conocidas.
Claims (11)
1. Un método para aislar células madre de tejido adiposo, que comprende:
proporcionar una muestra de tejido adiposo de un sujeto;
colocar la muestra de tejido en un recipiente o cartucho de procesamiento (205);
someter la muestra de tejido a la fuerza de impactos mecánicos para romper el tejido; y
separar una fracción de células madre del tejido adiposo;
en donde:
los impactos mecánicos son generados por un motor (305) que acciona un brazo de impacto (310) que hace contacto físico con el recipiente o cartucho (205) que contiene el tejido adiposo; y
el brazo de impacto (310) no hace contacto físicamente con el tejido adiposo.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la fuerza de los impactos mecánicos se aplica al tejido adiposo a través de una pared del recipiente de procesamiento o cartucho (205).
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el motor (305) es un motor de velocidad variable que es ajustable para impulsar el brazo de impacto a una tasa que oscila entre 0 y 30.000 rpm.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la separación comprende permitir que el tejido adiposo se separe de una capa acuosa, comprendiendo la capa acuosa las células madre.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la fracción de células madre se separa del tejido adiposo en 30 minutos o menos.
6. Un dispositivo adaptado para realizar el método de la reivindicación 1, que comprende:
un recipiente de procesamiento o cartucho (205) en donde se va a colocar el tejido adiposo;
una plataforma sobre la que se fija el recipiente o cartucho de procesamiento (205);
un brazo de impacto (310), que hace contacto físico con el recipiente de procesamiento (205); y
un motor (305), que es un motor de velocidad variable que acciona el brazo de impacto (310) de manera que el brazo de impacto (310) se articula hacia arriba y hacia abajo, haciendo contacto físico con el recipiente de procesamiento (205),
en donde los impactos mecánicos generados por la articulación están adaptados para romper el tejido adiposo y liberar células madre.
7. El dispositivo de la reivindicación 6, en donde el motor (305) acciona el brazo de impacto (310) a una velocidad entre 0 y 30.000 rpm.
8. El dispositivo según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde el recipiente de procesamiento (205) es una bolsa.
9. El dispositivo según la reivindicación 8, en el que la bolsa comprende una salida en conexión de fluido con el interior del recipiente (205).
10. El dispositivo según la reivindicación 8, en el que la bolsa comprende más de una salida en conexión fluida con el interior del recipiente (205).
11. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la bolsa comprende además una entrada en conexión fluida con el interior del recipiente (205).
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