JP7037510B2 - 衝撃波または機械的衝撃を使用する、細胞の分離、解離、および/または脱凝集 - Google Patents
衝撃波または機械的衝撃を使用する、細胞の分離、解離、および/または脱凝集 Download PDFInfo
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Description
[1]細胞画分を組織サンプルから単離する方法であって、上記方法は、
対象から組織サンプルを取得するステップと、
衝撃波、機械的衝撃からの力、または、その両方に、上記組織サンプルを接触させるステップと、
上記組織サンプルから細胞画分を単離するステップと、
を含み、
上記衝撃波および/または上記機械的衝撃からの上記力の供給源は、上記組織サンプルと物理的な接触をしない、方法。
[2]上記組織は、脂肪組織、脳組織、咽頭組織、喉頭組織、心臓組織、動脈組織、筋肉組織、肝臓組織、胆嚢組織、腎臓組織、小腸組織、大腸組織、リンパ節組織、肺組織、脾臓組織、骨髄組織、胃組織、静脈組織、膵臓組織、膀胱組織、骨、歯、象牙質組織、歯肉組織、皮膚組織、松果腺組織、下垂体組織、甲状腺組織、副腎組織、膵臓組織、卵巣組織および睾丸組織から選択される、上記[1]に記載の方法。
[3]上記組織は脂肪組織である、上記[1]または上記[2]に記載の方法。
[4]上記組織サンプルは、衝撃波と接触させられ、上記衝撃波の上記供給源は、衝撃波発生器によって動力を与えられる衝撃波アプリケーターである、上記[1]から[3]のいずれか一項に記載の方法。
[5]上記組織サンプルは、機械的衝撃からの力と接触させられ、上記機械的衝撃からの上記力の上記供給源は、モーターによって動力を与えられるインパクトアームである、上記[1]から[3]のいずれか一項に記載の方法。
[6]上記組織サンプルは、上記衝撃波および/または上記機械的衝撃からの上記力と接触する前に、1回または複数回洗浄される、上記[1]から[5]のいずれか一項に記載の方法。
[7]上記衝撃波は、上記組織サンプルを、複数の小さい細胞群、複数の個々の細胞、または、その両方に分解する、上記[1]から[4]または[6]のいずれか一項に記載の方法。
[8]上記機械的衝撃からの上記力は、上記組織サンプルを、複数の小さい細胞群、複数の個々の細胞、または、その両方に分解する、上記[1]から[3]、[5]または[6]のいずれか一項に記載の方法。
[9]上記細胞画分は、上記複数の小さい細胞群、複数の個々の細胞、または、その両方を含み、上記細胞画分の単離は、遠心分離によって行われる、上記[7]または上記[8]に記載の方法。
[10]遠心分離は、3分から30分間、500gから2,000gの速度で行われる、上記[9]に記載の方法。
[11]遠心分離は、10分間1,200gで行われる、上記[10]に記載の方法。
[12]上記単離された細胞画分は、遠心分離の後に再懸濁させられる、上記[9]から[11]のいずれか一項に記載の方法。
[13]上記細胞画分は、30分以内に単離される、上記[1]から[3]、[5]、[6、]または[8]から[12]のいずれか一項に記載の方法。
[14]幹細胞を脂肪組織から単離する方法であって、上記方法は、
対象から脂肪組織サンプルを取得するステップと、
上記組織サンプルを容器またはカートリッジの中へ置くステップと、
上記組織サンプルを機械的衝撃からの力にさらし、上記幹細胞を解放するステップと、
上記脂肪組織から幹細胞画分を分離するステップと、
上記幹細胞画分を遠心分離するステップと、
を含み、
上記機械的衝撃からの上記力の供給源は、上記脂肪組織に物理的に接触しない、方法。
[15]上記脂肪組織は、上記機械的衝撃からの上記力にさらされる前に、1回または複数回洗浄される、上記[14]に記載の方法。
[16]上記機械的衝撃の上記力の上記供給源は、モーターによって動力を与えられるインパクトアームであり、上記モーターは、ギヤリングを含み、上記ギヤリングは、上記モーターが全速力で動作しているときに、上記インパクトアームの上記速度を低減させることができる、上記[14]または上記[15]に記載の方法。
[17]上記機械的衝撃からの上記力は、上記容器またはカートリッジの壁部を通して上記脂肪組織へ送達される、上記[14]または上記[15]に記載の方法。
[18]上記ギヤリングは、上記インパクトアームの中での速度の1/10の減速を可能にする、上記[15]から[17]のいずれか一項に記載の方法。
[19]上記モーターは、0.75インチのギヤ直径を含み、3,000rpmのモーター速度において、上記インパクトアームは、毎秒117.8インチの速度を有している、上記[16]から[18]のいずれか一項に記載の方法。
[20]幹細胞画分を分離するステップは、上記脂肪組織が、水性層から分離することを可能にするステップを含み、上記水性層は、上記幹細胞を含む、上記[14]から[19]のいずれか一項に記載の方法。
[21]上記幹細胞は、30分以内に上記脂肪組織から単離される、上記[14]から[20]のいずれか一項に記載の方法。
[22]遠心分離は、3分から10分間、500gから1,600gで行われる、上記[14]から[21]のいずれか一項に記載の方法。
[23]幹細胞を脂肪組織から単離する方法であって、上記方法は、
対象から脂肪組織サンプルを取得するステップと、
上記組織サンプルを容器またはカートリッジの中へ置くステップと、
上記組織サンプルを衝撃波にさらし、上記幹細胞を解放するステップと、
上記脂肪組織から幹細胞画分を分離するステップと、
上記幹細胞画分を遠心分離するステップと、
を含み、
上記衝撃波の供給源は、上記脂肪組織に物理的に接触しない、方法。
[24]上記脂肪組織は、上記衝撃波にさらされる前に、1回または複数回洗浄される、上記[23]に記載の方法。
[25]上記衝撃波の上記供給源は、衝撃波発生器によって動力を与えられる衝撃波アプリケーターである、上記[23]または上記[24]に記載の方法。
[26]上記衝撃波は、上記容器またはカートリッジの壁部を通して上記脂肪組織へ送達される、上記[23]から[25]のいずれか一項に記載の方法。
[27]上記脂肪組織は、0.5barから5.0barのパワーを有する衝撃波にさらされる、上記[23]から[26]のいずれか一項に記載の方法。
[28]上記容器は、0.25mm厚の壁部を有するビニールバッグであり、上記脂肪組織は、2.0barから2.5barのパワーを有する衝撃波にさらされる、上記[23]から[27]のいずれか一項に記載の方法。
[29]任意の1つの時点において上記衝撃波にさらされる上記脂肪組織の合計面積は、1cm 2 から100cm 2 の範囲にある、上記[23]から[28]のいずれか一項に記載の方法。
[30]上記容器は、0.25mm厚の壁部を有する19オンスのビニールバッグであり、上記脂肪組織サンプルの合計量は、30ccであり、任意の1つの時点において上記衝撃波にさらされる上記脂肪組織の合計面積は、5cm 2 である、上記[23]に記載の方法。
[31]上記脂肪組織は、5,000から100,000の範囲にあるいくつかの衝撃波にさらされる、上記[23]から[30]のいずれか一項に記載の方法。
[32]幹細胞画分を分離するステップは、上記脂肪組織が、水性層から分離することを可能にするステップを含み、上記水性層は、上記幹細胞を含む、上記[23]から[31]のいずれか一項に記載の方法。
[33]遠心分離は、3分から10分間、500gから1,600gで行われる、上記[23]から[32]のいずれか一項に記載の方法。
したがって、ポイントオブケアにおいて、複数のユーザー介入に対する必要性なしに、短い時間の期間で直接的に所望の細胞画分を取得する、最適化された拡張性のある方法が必要とされている。また、その方法を実施することができるデバイスも必要とされている。そのような方法およびデバイスが、本開示によって提供される。開示されている方法およびデバイスは、プロセッシングのために細胞サンプルを研究所へ移送する必要性を排除し、また、分離の間に細胞サンプルを異物と接触させず、ユーザーの接触がほとんどない状態で、非常に短い時間の期間に所望の細胞サンプルを提供する、プロセッシングされたサンプルを結果として生じさせ、それによって、高価な技術的資源の最適化を可能にする。
図1は、本開示によって提供される実施形態による、関心の細胞画分を組織サンプルから単離する方法を提示している。
上述のように、本開示は、組織サンプルをバイオプロセッシングするための方法およびシステムを提供する。また、さまざまな態様において、本開示は、開示されている方法とともに使用するのに適切な使いやすいデバイスを提供し、そのようなデバイスは、外側の環境に対して閉じられており、単回使用のために設計されている。そのようなデバイスは、単回使用カートリッジを含み、単回使用カートリッジは、単一のデバイスの中での完全なプロセッシングを可能にする。
上記に説明されている実施形態は、しおれた(wither)組織サンプル、脂質サンプル、所望の細胞画分を含有する画分、幹細胞を含有する画分、または、先述のもののいずれかの組み合わせの受容部として、1つまたは複数の容器を利用する。そのような容器は、図1のステップ105において利用される容器;容器205;脂肪チャンバー405、505;流体リザーバー415、515;および細胞リザーバー435、535を含む。これらの容器は、本開示によって提供されるシステムおよび方法とともに使用するのに適切であり、可撓性であるか、リジッドであるか、または半リジッドであることが可能である。いくつかの実施形態では、容器は、シリンジである。
さまざまな態様では、本開示とともに使用するのに適切なカートリッジは、それらの内部の中に1つまたは複数の容器を収容することができる3次元の容器である。内部容器は、1つまたは複数のラインおよび/または弁によって接続され得る。適切なカートリッジの例は、図4および図5に示されているカートリッジ400、500である。
本開示の方法およびデバイスとともに使用するのに適切な遠心チューブは、遠心ローターに正確にフィットするように設計されている、ガラスまたはプラスチックの精密に仕上げられた高強度チューブである。遠心チューブの容量は、プロセッシングされることとなる組織サンプルの合計体積に応じて、変化することが可能である。いくつかの実施形態では、遠心チューブは、1mLから50mLの範囲にある容量、いくつかの実施形態では、0.5mLから20mLの範囲にある容量、およびいくつかの実施形態では、250μLから2.0mLの範囲にある容量を有している。
一方向弁は、流体が単一の方向だけにそれを通って流れることを可能にする弁である。
本明細書で説明されている材料、方法、および実施形態は、以下の例においてさらに定義されている。また、特定の実施形態は、本明細書において例の中に定義されている。これらの例は、特定の実施形態を示しているが、図示目的のためだけに与えられているということが理解されるべきである。本明細書での開示およびこれらの例から、当業者は、本開示の本質的な特徴を確認することが可能であり、また、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな使用法および条件にそれを適合させるように、本発明のさまざまな変形および修正を行うことが可能である。
ESW組織プロセッシングのための一般的プロトコル
脂肪吸引物が、対象から取得され、脂肪吸引物は、体積がおおよそ30ccである。プロセッシングの前に、脂肪吸引物は、おおよそ0.25インチ厚さの側壁部を有する、エチレン酢酸ビニル(EVA)、ポリ(ビニル)クロライド(PVC)、エチレン酢酸ビニル(EVA)またはナイロンの可撓性の無菌のバッグへ移送される。無菌のカテーテルバッグが十分である。
脂肪吸引物プロセッシング方法の比較
要約:この例に関して実施されるテストの目的は、コラゲナーゼ消化を使用して脂肪組織から抽出される間葉系幹細胞からの有核細胞の収率と、対外衝撃波(ESW)破砕のものとを比較することであった。
1,500mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)
35mLの1x赤血球(RBC)溶解バッファー
200mLの0.1%コラゲナーゼタイプI
ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の中の15mLの10%ウシ胎児血清(FBS)
コントロール
おおよそ250mLの脂肪吸引物が、無菌の60mLカテーテルを使用して、100mLビーカーの中へ移送された。過剰な流体がビーカーの中へほとんど導入されないか全く導入されないことを保証することに注意が払われた。
200mLの脂肪吸引物が、無菌の500mLガラスボトルの中へ堆積させられた。200mLの0.1%コラゲナーゼタイプIが、ボトルに追加された。脂肪吸引物がコラゲナーゼと均一に混合されることを保証するために、ボトルは、それを数回逆さまにすることによって、軽く撹拌された。
200mLの脂肪吸引物が、無菌の60mLカテーテルシリンジを使用して、残りの下澄みのすべてとともに、無菌の500mLレッグカテーテルバッグの中へ移送された。無菌の1xPBSが、200mLの合計流体体積を実現するために追加され、合計体積は、脂肪吸引物を含む400mLであった。おおよそ2mLの超音波ゲルが、カテーテルバッグに塗布された。大きいチップを使用して、2barおよび21Hzにおいて、おおよそ10,000ESWパルスが、バッグの内側のサンプルに投与された。このプロセスは、追加的な10,000ESWパルスに関して、バッグの他方の側において繰り返された。カテーテルバッグの外部が、70%ETOHによってクリーニングされ、それが、ヒュームフードの中へ置かれた。
コントロール懸濁液を含有する3つのチューブ、および、プロセッシングされた懸濁液を含有する3つのチューブが、10分間、1,200gおよび37℃で遠心分離された。上澄みが、すべてのチューブから吸引され、それぞれのペレットを残し、5mLの1xRBC溶解バッファーが、それぞれのチューブに追加された。それぞれのチューブは、ペレットを再懸濁させるために、5秒間ボルテックスされ、チューブは、10分間、37℃水槽の中へ置かれた。
無菌のマイクロピペットチップを使用して、300μLの無菌の1xPBSが、6つの無菌の0.5mLマイクロ遠心チューブの中へ移送された。また、75μLのそれぞれの50mLサンプルチューブが、細胞カウンティングのために、それぞれのマイクロ遠心チューブの中へ移送された。
MoxiZ細胞カウンター
表1は、MoxiZ自動化細胞カウンターを使用した細胞カウントの結果を示している。2つのタイプのカセットが、カウントするために使用された(MおよびS)。サンプル列において、「c」は、コラゲナーゼ消化を表し、「e」は、ESWプロセッシングを表し、「0」は、コントロールを表している。「完了」列の中の「y」を伴うカウントだけが有効である。
表2は、ビジュアルヘモサイトメーターから取得されるカウントを詳述しており、それぞれの象限(quadrant)からの細胞カウント、象限の総計、希釈係数、および、合計の計算された細胞を伴っている。細胞の数は、コントロール群の中の細胞のカウントを参照して考慮されるべきである。プロセッシングされた細胞とコントロール細胞との比率は、収率の重要な指標である。
MoxiZ自動化細胞カウンターを使用した有効なカウントのうち、コントロール、コラゲナーゼ、およびESWに関して、細胞カウントに関する総平均は、表3に示されている通りである。
これらのデータは、高い数の間葉系幹細胞を脂肪組織から作り出すために、ESWが効果的であるということを示している。これらのデータに基づいて、間葉系幹細胞を取得するために、ESWが、脂肪組織の超音波プロセッシングまたはコラゲナーゼプロセッシングのいずれかに対する実行可能な代替例であるということが結論付けられた。ピークを比較すると、ESWは、4.32e+05のコラゲナーゼピークと比較して7.08e+05の細胞収率を作り出し、それは、164%の収率の増加であった。
205 プロセッシング容器またはカートリッジ
210 プラットフォーム
215 衝撃波アプリケーター
220 アプリケータープラットフォーム
225 モーターコントローラー
230 X平面モーター
235 Y平面モーター
240 Z平面モーター
245 衝撃波発生器
300 プロセッシング装置
305 モーター
310 インパクトアーム
315 プラットフォーム
400 カートリッジ
405 脂肪チャンバー
410 第1の一方向弁
415 流体リザーバー
420 第2の一方向弁
425 外部アクチュエーター
430 第1のプランジャー
435 細胞リザーバー
440 第3の一方向弁
445 第2の外部アクチュエーター
450 第2のプランジャー
455 第4の一方向弁
460 遠心チューブ
500 カートリッジ
505 脂肪チャンバー
510 第1の一方向弁
515 流体リザーバー
520 第2の一方向弁
525 外部アクチュエーター
530 第1のプランジャー
535 細胞リザーバー
540 第3の一方向弁
545 第2の外部アクチュエーター
550 第2のプランジャー
555 第4の一方向弁
560 遠心分離コンポーネント
565 アクセスポート
Claims (13)
- 幹細胞を脂肪組織から単離する方法であって、前記方法は、
対象から脂肪組織サンプルを取得するステップと、
前記組織サンプルを容器またはカートリッジの中へ置くステップと、
前記組織サンプルを機械的衝撃からの力にさらし、前記組織を破壊するステップと、
前記脂肪組織から幹細胞画分を分離するステップと、
を含み、
前記機械的衝撃は、前記脂肪組織を含有する前記容器またはカートリッジと物理的な接触をするインパクトアームを駆動するモーターによって発生させられ、
前記インパクトアームは前記脂肪組織に物理的に接触しない、方法。 - 前記機械的衝撃からの力は、前記容器またはカートリッジの壁部を通して前記脂肪組織へ送達される、請求項1に記載の方法。
- 前記モーターは、0から30,000rpmの範囲のレートで前記インパクトアームを駆動するために調節可能な可変速モーターである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記分離するステップは、前記脂肪組織が、水性層から分離することを可能にするステップを含み、前記水性層は、前記幹細胞を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記幹細胞画分は、30分以内に前記脂肪組織から単離される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記モーターは、前記モーターが全速力で動作しているときに、前記インパクトアームの前記速度を低減させることができるギヤリングを備え、前記インパクトアームによって発生させられる運動量が、前記容器またはカートリッジ内の前記脂肪組織に伝送される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法を実施するために適合された装置であって、
前記脂肪組織がその中に置かれるプロセッシング容器またはカートリッジと、
前記プロセッシング容器またはカートリッジがその上に取り付けられるプラットフォームと、
前記インパクトアームが上下に関節運動し、前記プロセッシング容器に物理的に接触するように前記インパクトアームを駆動する可変速度モーターである、モーターとを備え、
前記関節運動によって発生させられる前記機械的衝撃が、脂肪組織を破壊し、幹細胞を放出するために適合されている、装置。 - 前記モーターが、前記インパクトアームを0から30,000rpmの範囲にあるレートで駆動する、請求項7に記載の装置。
- 前記プロセッシング容器がバッグである、請求項7または8に記載の装置。
- 前記バッグが、前記容器の内部と流体接続している出口部を備える、請求項9に記載の装置。
- 前記バッグが、前記容器の内部と流体接続している2つ以上の出口部を備える、請求項9に記載の装置。
- 前記バッグが、前記容器の内部と流体接続している入口部をさらに備える、請求項9から11のいずれか一項に記載の装置。
- 前記モーターが、前記モーターが全速力で作動しているときに、前記インパクトアームの前記速度を低減することができるギヤリングを備え、前記ギヤリングは、前記脂肪組織が破壊され、前記幹細胞が前記脂肪細胞から分離される速度を増加させるように適合されている、請求項7から12のいずれか一項に記載の装置。
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