JP2016028614A - 生体組織から単離できる多能性幹細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、生体の中胚葉系組織又は間葉系組織由来細胞をトリプシン処理し生き残った細胞を回収することにより得られる、SSEA-3陽性及びCD105陽性の多能性幹細胞を含む細胞画分である。
【選択図】なし
Description
[1] 生体組織から単離できるSSEA-3陽性の多能性幹細胞。
該多能性幹細胞は、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞等の生体組織の培養物からも単離することができ、また単一細胞として単離することができる。
[2] CD105陽性の[1]の多能性幹細胞。
[4] CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性の[1]又は[2]の多能性幹細胞。
[6] テロメラーゼ活性が低いか又は無い、[1]〜[5]のいずれかの多能性幹細胞。
本発明の多能性幹細胞は、in vitroの接着培養で三胚葉に分化する能力を有し、in vitroで誘導培養することにより、皮膚、肝、神経、筋、骨、脂肪等に分化し得る。また、in vivoで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を有する。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器(皮膚、脊髄、肝、筋肉等)に生着し分化する能力を有する。
本発明の多能性幹細胞は、浮遊培養で増殖速度約1.3日で増殖するが10日間程度で増殖が止まるという性質を有し、さらに精巣に移植した場合少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。
本発明の多能性幹細胞は、浮遊培養と接着培養の操作を繰り返すことにより増殖させることができる。また、本発明の多能性幹細胞は他の体性幹細胞と同じく、非対称分裂をする。
[10] ストレス耐性である、[1]〜[9]のいずれかの多能性幹細胞。
[11] 貪食能が高い、[1]〜[10]のいずれかの多能性幹細胞。
olfactory receptor, family 8, subfamily G, member 2 (OR8G2);
olfactory receptor, family 7, subfamily G, member 3 (OR7G3);
olfactory receptor, family 4, subfamily D, member 5 (OR4D5);
olfactory receptor, family 5, subfamily AP, member 2 (OR5AP2);
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 4 (OR10H4);
olfactory receptor, family 10, subfamily T, member 2 (OR10T2);
olfactory receptor, family 2, subfamily M, member 2 (OR2M2);
olfactory receptor, family 2, subfamily T, member 5 (OR2T5);
olfactory receptor, family 7, subfamily D, member 4 (OR7D4);
olfactory receptor, family 1, subfamily L, member 3 (OR1L3);
olfactory receptor, family 4, subfamily N, member 4 (OR4N4);
olfactory receptor, family 2, subfamily A, member 7 (OR2A7);
guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha activating activity polypeptide, olfactory type (GNAL);
olfactory receptor, family 6, subfamily A, member 2 (OR6A2);
olfactory receptor, family 2, subfamily B, member 6 (OR2B6);
olfactory receptor, family 2, subfamily C, member 1 (OR2C1);
olfactory receptor, family 52, subfamily A, member 1 (OR52A1);
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 3 (OR10H3);
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 2 (OR10H2);
olfactory receptor, family 51, subfamily E, member 2 (OR51E2);
olfactory receptor, family 5, subfamily P, member 2 (OR5P2);及び
olfactory receptor, family 10, subfamily P, member 1 (OR10P1)。
chemokine (C-C motif) receptor 5(CCR5);
chemokine (C-X-C motif) receptor 4(CXCR4);
chemokine (C-C motif) receptor 1(CCR1);
Duffy blood group, chemokine receptor(DARC);及び
chemokine (C-X-C motif) receptor 7(CXCR7)。
[15] [1]〜[14]のいずれかの多能性幹細胞を含む細胞塊または細胞画分。
(i) SSEA-3陽性;
(ii) CD105陽性;
(iii) CD117陰性及びCD146陰性;
(iv) CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性;
(v) CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性;並びに
(vi) テロメラーゼ活性が低いか又は無い。
[18] 細胞ストレスが、プロテアーゼ処理、低酸素条件下での培養、低リン酸条件下での培養、血清飢餓状態での培養、糖飢餓状態での培養、放射線曝露下での培養、熱ショックへの曝露下での培養、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養及び圧力処理下での培養から選択される、[17]の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
[19] 細胞ストレスが、トリプシン処理である、[18]の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
該派生細胞又は誘導細胞として、例えば、遺伝子の導入や、化合物を添加により誘導した細胞が挙げられる。また、本発明の幹細胞由来のiPS細胞が挙げられる。
[21] [1]〜[14]のいずれかの多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である分化した細胞。
[22] [1]〜[14]及び[20]のいずれかの多能性幹細胞を含む医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎である米国仮出願61/213,788号及び米国仮出願61/290,159号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
本発明は、生体の生体組織から直接得ることができる多能性(pluripotent)幹細胞又は多能性幹細胞画分及び該多能性幹細胞又は該多能性幹細胞画分を単離する方法、並びに該方法により得られた生体組織由来の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分である。本発明の多能性幹細胞をMuse細胞(multilineage differentiating stress enduring cells)という。
(1) Nanog、Oct3/4、SSEA-3、PAR-4及びSox2等の多能性マーカー(Pluripotent marker)を発現する。
(2) 1細胞から増殖し、自己のクローンを作り続けるクローナリティー(Clonality)を有する。
(3) 自己複製(セルフリニューアル)能を有する。
(4) 3胚葉系(内胚葉系、中胚葉系及び外胚葉系)へin vitro及びin vivoで分化し得る。
(5) マウスの精巣や皮下に移植した場合、3胚葉系への分化を呈する。
(6) アルカリフォスファターゼ染色で陽性となる。
(i) 増殖速度が比較的緩やかで、分裂周期が1日以上、例えば1.2〜1.5日である。ただし、ES細胞やiPS細胞が示すような無限増殖は示さない。
(ii) 免疫不全マウスに移植した場合に内胚葉系、中胚葉系及び外胚葉系への分化を示す。ES細胞やiPS細胞ではテラトーマが短期間で癌化するのに比べ、半年以上癌化しないことを特徴とする。
(iii) 浮遊培養により胚様体様細胞塊を形成する。
(iv) 浮遊培養にて胚様体様細胞塊を形成し、10日程度で増殖が停止する。その後、接着培養に移動させることにより再増殖する。
(v) 増殖の際に非対称分裂を伴う。
(vii) テロメラーゼ活性が無いか又は低い。ここで、テロメラーゼ活性が無いか又は低いとは、例えばTRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore社)を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に検出できないか又は低いことをいう。テロメラーゼ活性が低いとは、例えば、ヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、あるいはHela細胞に比べて1/5以下、好ましくは1/10以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。
(viii) メチル化の状態については、Muse細胞から誘導したiPS細胞に関してはNanogおよびOct3/4のプロモータ領域のメチル化レベルが低い。
(ix) 貪食能が高い。
(x) 腫瘍性増殖を示さない。ここで、腫瘍性増殖を示さないとは、浮遊培養を行った場合、一定の大きさの細胞塊(クラスター)に達すると増殖が止まり、無限増殖しないことをいう。また免疫不全マウスの精巣に移植しても奇形腫を形成しないことである。なお、上記(i)〜(iv)等も腫瘍性増殖を示さないことに関連する。
(A) 生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等から得られる細胞であって、当該細胞内に化学物質、外来遺伝子又は外来タンパク質を導入することなく直接得ることができる多能性幹細胞。
(B) 生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等が、骨髄、皮膚、血液、臍帯、脂肪などからなる群から選択される上記(1)の特性を有する多能性幹細胞。
(C) リプログラミングまたは脱分化を誘導することなく得ることができる、上記(A)又は(B)の多能性幹細胞。
(D) 精巣へ移植した場合に、少なくとも半年間は癌化しない、上記(A)又は(B)の多能性幹細胞。
(E) ES細胞、iPS細胞のように無限増殖を示さない、上記(A)又は(B)の多能性幹細胞。
(F) 生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等由来の多能性幹細胞であって、生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等の細胞をプロテアーゼで処理したときに生き残る、プロテアーゼに耐性である多能性幹細胞。
本発明の細胞は、これらの細胞表面の抗原特性に基づいて単離することができる。
又は11個のマーカーの非発現を指標に単離することができる。例えば、CD117及びCD146の非発現を指標に単離することができ、さらに、CD117、CD146、NG2、CD34、vWF及びCD271の非発現を指標に単離することができ、さらに、上記の11個のマーカーの非発現を指標に単離することができる。
(i) SSEA-3
(ii) v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog
(iii) solute carrier family 16, member 6 (monocarboxylic acid transporter 7)
(iv) tyrosinase-related protein 1
(v) Calcium channel, voltage-dependent, P/Q type, alpha 1A subunit
(vi) chromosome 16 open reading frame 81
(vii) chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(viii) protease, serine, 35
(ix) kynureninase (L-kynurenine hydrolase)
(x) solute carrier family 16, member 6 (monocarboxylic acid transporter 7)
(xi) apolipoprotein E
(xii) synaptotagmin-like 5
(xiii) chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(xiv) ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 13
(xv) angiopoietin-like 4
(xvi) prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase)
(xvii) stanniocalcin 1
(xviii) coiled-coil domain containing 102B
(a)matrix metallopeptidase 1 (interstitial collagenase)
(b)epiregulin
(c)chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(d)Transcribed locus
(e)chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(f)serglycin
(g)MRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE 1913076
(h) Ras and Rab interactor 2
(i) lumican
(j) CLCA family member 2, chloride channel regulator
(k) interleukin 8
(l) Similar to LOC166075
(m) dermatopontin
(n) EGF, latrophilin and seven transmembrane domain containing 1
(o) insulin-like growth factor binding protein 1
(p) solute carrier family 16, member 4 (monocarboxylic acid transporter 5)
(q) serglycin
(r) gremlin 2, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis)
(s) insulin-like growth factor binding protein 5
(t) sulfide quinone reductase-like (yeast)
olfactory receptor, family 8, subfamily G, member 2 (OR8G2);
olfactory receptor, family 7, subfamily G, member 3 (OR7G3);
olfactory receptor, family 4, subfamily D, member 5 (OR4D5);
olfactory receptor, family 5, subfamily AP, member 2 (OR5AP2);
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 4 (OR10H4);
olfactory receptor, family 10, subfamily T, member 2 (OR10T2);
olfactory receptor, family 2, subfamily M, member 2 (OR2M2);
olfactory receptor, family 2, subfamily T, member 5 (OR2T5);
olfactory receptor, family 7, subfamily D, member 4 (OR7D4);
olfactory receptor, family 1, subfamily L, member 3 (OR1L3);
olfactory receptor, family 4, subfamily N, member 4 (OR4N4);
olfactory receptor, family 2, subfamily A, member 7 (OR2A7);
guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha activating activity polypeptide, olfactory type (GNAL);
olfactory receptor, family 6, subfamily A, member 2 (OR6A2);
olfactory receptor, family 2, subfamily B, member 6 (OR2B6);
olfactory receptor, family 2, subfamily C, member 1 (OR2C1);
olfactory receptor, family 52, subfamily A, member 1 (OR52A1);
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 3 (OR10H3);
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 2 (OR10H2);
olfactory receptor, family 51, subfamily E, member 2 (OR51E2);
olfactory receptor, family 5, subfamily P, member 2 (OR5P2);及び
olfactory receptor, family 10, subfamily P, member 1 (OR10P1)
chemokine (C-C motif) receptor 5(CCR5);
chemokine (C-X-C motif) receptor 4(CXCR4);
chemokine (C-C motif) receptor 1(CCR1);
Duffy blood group, chemokine receptor(DARC);及び
chemokine (C-X-C motif) receptor 7(CXCR7)
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、上記の嗅覚受容体の少なくとも1個を発現しており、あるいは、上記のケモカイン受容体の少なくとも1個を発現している。
実施例1 富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊の調製並びに特性分析
材料及び方法
本実施例において、以下の細胞を用いた。
マウスES細胞(TT2細胞)及びヒトES細胞(KhES-1)はC57BL/6マウスの12.5日胚より確立したマウス由来フィーダー細胞存在下で維持した。
1.間葉系細胞のストレス刺激
ストレス刺激として低栄養条件での培養、低血清濃度での培養、低酸素濃度での培養、繰返しトリプシン処理、長時間トリプシン処理を行うため以下の培養条件を採用した。
(1)無血清培地(STEMPRO MSC SFM(Invitrogen社)を用いた2日間の培養(無血清)
(2)Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)バッファー(Invitrogen社)を用いた2日間の培養(HBSS)
(3)10%FBS含有α-MEMを用いての低酸素濃度(1%)での2日間の培養(10%FBS+LowO2)
(4)トリプシン中(0.25%トリプシン-HBSS)での1時間インキュベーション3回の処理(トータル3時間のトリプシン処理)(Try 3× 1hr)
(5)トリプシン中での8時間インキュベーション(LTT 8hr)
(6)トリプシン中での16時間インキュベーション(LTT 16hr)
陰性対照として、ヒト末梢血単核細胞画分を用いた。
本実施例においては、細胞をメチルセルロース含有培地中で浮遊培養した。メチルセルロース含有培地中での培養をMC培養と呼ぶ。MC培養については、Nakahata, T. et al., Blood 60, 352-361 (1982)に記載されている。
96ウェルディッシュを上記の方法でpoly-HEMAでコートし、10%FBS含有α-MEMを用いて限界希釈法にて、単一細胞をそれぞれのウェルに播き、位相差顕微鏡にてウェル中の実際の細胞数を計数し、細胞が入っていないウェル、あるいは複数入っているウェルは計測から除外した。培養10日目に胚様体(EB)(Muse細胞由来胚様体様細胞塊)形成を計数した。それぞれの細胞株に対して3回の実験を行い、一回の実験では最低250ウェル以上の観察を行った。
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来のMuse細胞由来胚様体様細胞塊を集め生理食塩水で数回洗浄し、Leukocyte Alkaline Phosphatase kit(sigma社)を用いて染色した。
MC培養又は単一細胞浮遊培養の7〜10日後、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の胚様体様細胞塊をガラスマイクロピペットにより採取し、ゼラチンコート培養ディッシュ又はカバーガラス上に移しさらに7日間培養すると細胞塊から細胞が広がる。かかる細胞における分化の有無を免疫組織化学分析及びRT-PCR分析に供した。
細胞を0.01M PBS中4%パラホルムアルデヒドで固定し、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分又はMuse細胞由来胚様体様細胞塊を遠心分離により集め、OCTコンパウンド中に埋め込み8μmの凍結切片を作製した。細胞塊は、ゼラチンコートスライドガラス上で固定し、免疫組織化学分析に供した。
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来のMuse細胞由来胚様体様細胞塊(Muse細胞由来胚様体様細胞塊から単一細胞を取り再度Muse細胞由来胚様体様細胞塊を形成させることを1〜3回繰り返したもの)からの増殖細胞(clonally expanded cells)の核型をquinacrine-Hoechst染色により決定した。
無処理細胞画分、並びにH-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊を用いた。富Muse細胞画分の場合、長時間トリプシン処理後血清を添加し、0.01M PBSで3回洗浄した。Muse細胞由来胚様体様細胞塊もMC培養から採取後に同PBSで3回洗浄した。1×105個の細胞をPBSに浮遊し、NOGマウス(登録商標)(NOD/Shi-scid, IL-2RγKO Jic、8週齢、財団法人 実験動物中央研究所より入手)の精巣にガラスマイクロチューブを用いて注入した。Muse細胞由来胚様体様細胞塊を用いた場合、レーザ共焦点顕微鏡の3Dグラフィック分析手法を用いて、50個のMuse細胞由来胚様体様細胞塊を取り、Muse細胞由来胚様体様細胞塊のトータル体積を測定し核の数で除することにより、それぞれの構成細胞の平均体積を測定した。測定の結果、1.5×105細胞/μlであることが算定され、この算定にしたがって上記数の細胞を集め、NOGマウス精巣に注入した。マウスは注入6ヵ月後に実験に供した。
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊について、安定な高解像度光学顕微鏡を用いてヒトMSC、線維芽細胞及び神経細胞などの細胞タイプの観察を行った。
Muse細胞由来胚様体様細胞塊、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来のSSEA-3陽性細胞及びSSEA-3陰性細胞、並びにヒトES細胞の細胞塊を遠心分離により集め、100mMリン酸バッファー(pH7.2)中2.5%グルタルアルデヒドで30分間固定し、1%寒天中に包埋し、1mm3に切り、PBSで洗浄後、100mMリン酸バッファー(pH7.2)中2%OsO4で4℃で10分間染色した。サンプルを蒸留水で洗浄後、5滴の2%酢酸ウラニルで4℃で20分間染色した。蒸留水で洗浄後、染色サンプルを50%、70%又は90%エタノールを用いて4℃で10分間脱水し、次いで100%エタノールを3回交換することにより完全に脱水した。得られたサンプルを酸化プロピレンで5分間置換し、酸化プロピレン中50%エポキシレジン中に60分間包埋した。これを純粋なエポキシレジンに包埋し、60℃オーバーナイトで硬化させた。超薄切片は70〜80nmの厚さで作製し、CCDカメラ付きの100kV 電子顕微鏡で観察した。
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来のMuse細胞由来胚様体様細胞塊について細胞群の倍化時間を測定するために、それぞれのMuse細胞由来胚様体様細胞塊をひとつずつ96ウェルプレートに移し、15分間のトリプシン処理を行った後にガラスマイクロピペットを用いてピペッティングを行った。細胞の数を計測し、所定の時間後ごとに少なくとも20〜30個のMuse細胞由来胚様体様細胞塊について分析した。
無処理細胞画分(24ウェルスケール中の約10,000細胞)及びH-fibroblast画分及びH-MSC画分(24ウェルスケール中の約10,000細胞)由来のin vitroで単一Muse細胞由来胚様体様細胞塊から分化した細胞(1〜3サイクル)を用いた。トータルRNAを、NucleoSpin RNA XS(Macherey-Nagel社)を用いて抽出、精製し、第1鎖cDNAをSuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)を用いて調製した。PCR反応は適切なプライマーを設計し、Ex Taq DNA polymerase (タカラバイオ社)を用いて行った。用いたプライマーは以下のとおりであった。
陽性対照としては、α-フェトプロテインプライマーについてはヒト胎児肝臓(Clonetech社)を用い、それ以外はヒト完全胚(Clonetech社)を用いた。
無処理細胞画分、H-fibroblast-1、H-fibroblast-2、H-MSC-1及びH-MSC-2由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊からのトータルRNAをRneasy Mini Kit(Qiagen GmbH社)により集め、cDNAをRT2 First Strand Kit(SA Biosciences社)を用いて合成した。プライマーはSA Biosciences社より特注し、7300 real time PCRシステム(Applied Biosystems社)を用いて定量的PCRを行った。得られたデータはΔΔCT方法(Livak KJ et al., Methods 25: 402-408, 2001)により解析した。
無処理細胞画分、H-fibroblast-1、H-fibroblast-2、H-MSC-1及びH-MSC-2由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊、並びに4名の健常者由来ヒト末梢血単核細胞画分混合物を用いた。totalRNAをRneasy Mini Kit(Qiagen GmbH社)により集め、DNAマイクロアレイにより分析した(タカラバイオ社)。アレイシグナルは、Affimetrix Expression Console V1.1ソフトウェア)により処理しノーマライズした。Pathway Studio 6.0(Ariadne genomics社)を用いて発現変動が認められた遺伝子を遺伝子オントロジーの機能的カテゴリーに割り当てた。階層的クラスタリングは、MeV4による群平均クラスタリングの手法を用いて、遺伝子の発現変動に基づいてユークリッド距離を用いて行った(Saeed AI et al., Biotechniques 34(2):374-378, 2003)。
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分、Muse細胞由来胚様体様細胞塊及びHela細胞を用いた。テロメラーゼ活性は、TRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore社)とEx Taqポリメラーゼ(タカラバイオ社)を用いて検出した。蛍光強度はマイクロプレートリーダー(TECAN社)を用いて測定した。
無処理細胞画分、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊由来の1μgのゲノムDNAをCpGenome DNA modification kit(chemicon社)で処理した。DNAをQIAquick column(Qiagen社)で精製した。ヒトOct3/4及びNanog遺伝子のプロモータ領域をPCRにより増幅し、PCR産物をpCR2.1-TOPO中にサブクローニングしそれぞれのサンプルについて10クローンまでをM13ユニバーサルプライマーを用いて配列決定し、プロモータ領域のメチル化の状態を調べた。PCR増幅には、Shimazaki T et al., EMBO J, 12:4489-4498, 1993に記載のプライマーを用いた。
3人の健常人からのヒト骨髄穿刺液(ALLCELLS社より入手)から単核細胞画分をLymphoprep Tube(Axis-Shield PoC AS社)を用いて集め、8時間の長時間トリプシン処理を行った後にMC培養を行った。またトリプシン処理をせずに直接そのままでMC培養にも持って行った。7日目に細胞数を測定した。
3人の健常人からのヒト骨髄穿刺液(ALLCELLS社より入手)由来の単核細胞画分を抗CD105抗体とマイクロビーズのコンジュゲートと反応させ、MSカラム(Miltenyi Biotech社)を用いてソーティングした。CD105陽性細胞をフラクション1(間葉系細胞群)として集め、さらにCD105陰性細胞を抗CD34抗体及び抗CD117抗体の混合物とマイクロビーズのコンジュゲートとインキュベートし、再度ソーティングし、CD34陽性・CD117陽性細胞(フラクション2;造血幹細胞群にあたる)及びCD105陰性・CD34陰性・CD117陰性細胞(フラクション3)を得た(図4)。集めたサンプルを8時間の長時間トリプシン処理を行った後にMuse細胞由来胚様体様細胞塊の形成を測定した。
マウス精巣を0.02MPBS中4%パラホルムアルデヒドを用いて固定した。切片は凍結切片として10μmの厚さで作製した。サンプルを0.02MPBSで洗浄し、20%BlockAce(雪印社)含有バッファーを用いてブロッキングした後に免疫組織化学分析用の1次抗体とインキュベートした。用いた1次抗体は、抗平滑筋アクチン抗体(1:200、Lab Vision社)、抗MAP-2抗体(1:200、Biogenesis社)及び抗α-フェトプロテイン抗体(1:10、DAKO社)であった。
細胞をフィコエリトリン標識抗CD11c抗体、抗CD29抗体、抗CD34抗体、抗CD44抗体、抗CD45抗体、抗CD49f抗体、抗CD54抗体、抗CD71抗体、抗CD90抗体、抗CD105抗体、抗CD166抗体、抗CD271抗体又は抗vWF抗体(Beckton Dickinson社)又は抗SSEA-3抗体(Millipore社)とインキュベートした。抗SSEA-3抗体を用いる場合、細胞をさらにFITC結合抗ラットIgM抗体と反応させた。2mM EDTA及び0.5%ウシ血清アルブミンを添加したカルシウム及びマグネシウムを含まない0.02M PBSをFACS抗体希釈液として用いた。FACSCalibur(Becton Dickinson)によりCellQuestソフトウェア又はFACSAriaによりDIAソフトウェアを用いてデータ解析を行った。細胞をFACS抗体希釈液中で抗SSEA-3抗体とインキュベートしFACSAria(Becton Dickinson)により低流速及び4 way purityソーティングモードでソーティングし、細胞のソーティングを行った。
データは、平均±SEMで表す。データは、Bonferroni法による一対比較によりANOVAを用いて比較した。
A.H-fibroblast画分及びH-MSC画分のストレス刺激
H-fibroblast画分とH-MSC画分のストレス刺激の結果の一例を表1に示す。
本実施例において、Muse細胞由来胚様体様細胞塊の判定基準を設けた。H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分中の単一細胞の平均直径は10〜13μmであった(図6a)。これらの細胞をMC培養すると、細胞は分裂を開始した。分裂するとそれぞれの細胞のサイズは小さくなり、8〜10μmの細胞から構成される多細胞塊が徐々に形成された(図7e及び7f)。それぞれの細胞のサイズと外観は、MC培養したヒトES細胞に類似していた(図6b及び6c)。7日目に、ほとんどの多細胞塊は25μmより大きくなり、直径100〜150μmになった。該細胞塊はES細胞と類似した外観を有していた。Φ25μmのフィルターを用いることにより、25μmより大きい塊を回収した(図6b)。H-fibroblast画分及びH-MSC画分の100個のMuse細胞由来胚様体様細胞塊までの免疫細胞化学によりほとんどのMuse細胞由来胚様体様細胞塊は多能性マーカーNanog、Oct3/4、Sox2、PAR4及びSSEA-3が陽性であることがわかり、アルカリフォスファターゼ染色でも陽性であった(図6e-g)。25μmより小さい細胞塊の場合、マーカーは検出される場合とされない場合があり、また多能性マーカーの局在はこれらのマーカーに典型的なパターンを示さない場合もあった。さらに、細胞の外観はむしろ富Muse細胞画分に類似している場合があった。
上記結果より、直径25μを超える多細胞塊を、Muse細胞由来胚様体様細胞塊とした。
生体がストレスに曝されたり、傷害を受けると休眠状態の組織幹細胞が活性化されることが知られている。本実施例において、H-MSC画分及びH-fibroblast画分に種々の方法でストレスをかけ(無血清処理、Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)による処理、低酸素処理、トータル3時間、8時間若しくは16時間のトリプシン処理等)、生存した細胞を集め、その後メチルセルロース(MC)含有培地中で浮遊培養(MC培養という)を行い、さらに8000細胞/mLの密度で7日間MC培養を行った(図7-1d)。その結果、最大で約直径150μmまでの種々の大きさの細胞塊の生成が認められた(図7-1e及びf)。図7-1cはH-fibroblast-1画分のMC培養の0日目の状態を、図7-1dは7日目の状態を示す。16時間のトリプシン処理を行ったH-fibroblast画分及び8時間のトリプシン処理を行ったH-MSC画分において、最も多くの細胞塊の形成が認められた。図7-1e及びfにH-fibroblast-1画分から形成された細胞塊(Muse細胞由来胚様体様細胞塊)の状態を示す。図7-1eはMC培養7日目の状態であり、図7-1fは単一細胞の浮遊培養10日目の状態である。細胞塊をサイズごとにフィルターを用いて分画し、免疫細胞化学分析を行った。直径25μmを超える細胞塊中に、Nanog、Oct3/4、SSEA-3、PAR-4及びSox2の多能性幹細胞マーカーが陽性であり(図7-2g-l)、さらにアルカリフォスファターゼ染色で陽性の細胞(図7-3m-o)が検出された。これらの細胞について電子顕微鏡を用いて観察したところ、H-fibroblast画分及びH-MSC画分から形成した細胞塊において、ES細胞と同様の核/細胞質比、細胞内器官の減少、核中の1つ若しくは2つの巨大な核小体の存在という特徴が認められた(図7-4p-r)。
分化能を確かめるため、単一のMuse細胞由来胚様体様細胞塊をゼラチンでコートしたディッシュに移し分化させた。7日目にα平滑筋アクチン(中胚葉マーカー)、デスミン(中胚葉マーカー)、神経フィラメント-M(外胚葉マーカー)、αフェトプロテイン(内胚葉マーカー)及びサイトケラチン7(内胚葉マーカー)が検出された(図9-1a-c)。RT-PCRにより、1から3サイクルの培養を行ったMuse細胞由来胚様体様細胞塊(第1から3cycle)はαフェトプロテイン及びGATA6(内胚葉マーカー)、微小管結合タンパク質2:MAP-2(中胚葉マーカー)及びNkx2.5(中胚葉マーカー)を発現していることが確認されたが、無処理のH-fibroblast又はMSC群はゼラチンコートしたディッシュ上での培養でも分化が認められなかった(図9-2)。
多能性及び分化状態に関連したマーカーの発現を図10に示す。Nanogの発現は、富Muse細胞画分及び細胞クラスターにおいては、無処理細胞に比べそれほど高くなかった。多能性幹細胞の幾つかにおいては、Nanogはそれほど発現しない(Chou YF et al., Cell 135, 449-461 (2008); Bui HT et al., Development. 135(23):3935-3945 (2008))。Nanogと同様に、Q-PCRでのOct-4はマウスES細胞に比較するとリプログラミング体細胞において低い(Bui HT et al., Development. 135(23):3935-3945 (2008))。従って、Nanog及び他の多能性(pluripotency)マーカーの発現量はpluripotencyにとってそれほど重要ではない。
定量PCRにより多能性及び非分化状態に関連するいくつかのマーカーが富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊でアップレギュレートされていることが示された。富Muse細胞画分は上記のように9〜10%のMuse細胞を含んでいるに過ぎないが、Rex1(ZFP42)、Sox2、KLF-4、c-Myc、DPPA2(developmental pluripotency associated 2)、ERAS、GRB7(Growth factor receptor-bound protein 7)、SPAG9(Sperm associated antigen)、TDGF1(teratocarucinoma-derived growth factor1が、無処理細胞画分に比べて高度に又は適度にアップレギュレートされていた。Muse細胞由来胚様体様細胞塊においては、DAZL(azoospermia-like)、DDX4(VASA)、DPPA4(developmental pluripotency associated 4)、Stella、Hoxb1、PRDM1及びSPRY2(sprouty homolog2)が無処理細胞に比べてアップレギュレートされていた(図10a)。
108プローブのピアソン相関分析を、ヒト末梢血単核細胞(陰性対照)、無処理細胞画分、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊について行った(図11)。
また、DNAマイクロアレイにより、発現しているオドラント受容体及びケモカイン受容体をピックアップした。
上記に示した検討は、安定な培養細胞を用いて行った。細胞を成体から取り出して培養した場合、生体内とは異なる特性を持ち得るので、Muse細胞やMuse細胞由来胚様体様細胞塊がアーティファクトな産物である可能性は否定できない。そこで、ヒト生体すなわちヒト骨髄細胞から培養を経ないで直接Muse細胞由来胚様体様細胞塊を得ることを試みた。ヒト骨髄穿刺液から単核細胞画分を単離し、直接MC培養に供するか(naive hBM-MC)、あるいは8時間のトリプシン処理を行った後にMC培養に供した(8hr-hBM-MC、トリプシン処理後の単核細胞画分の生存率は約3.5%であった)。7日後、Muse細胞由来胚様体様細胞塊の形成が無処理のnaive hBM-MCでは約0.004%の効率で認められ、8hr-hBM-MCでは約0.3%すなわち約75倍の効率であった(図12a)。これらのMuse細胞由来胚様体様細胞塊はアルカリフォスファターゼ染色陽性であった(図12b)。無処理のnaive hBM-MC及び8hr-hBM-MC由来の単一Muse細胞由来胚様体様細胞塊からクローン増殖した細胞のRT-PCRにより、α-フェトプロテイン、GATA6、MAP-2及びNkx2.5の発現が認められた(図13)。これらの結果は、ヒト骨髄中にin vivoにおいてもMuse細胞が存在し、8時間のトリプシン処理で富化しMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成させることができることを示している。さらに、骨髄の多くのタイプの細胞中で、Muse細胞がCD105陽性間葉系細胞画分に属していることが確認された。
骨髄単核細胞画分からのそれぞれのフラクションの収率は、フラクション1(CD105陽性フラクション)で1.8%、フラクション2(CD34陽性・CD117陽性フラクション)で8.5%、フラクション3(CD34陰性・CD117陰性・CD105陰性フラクション)で89.7%であった。フラクション1、2及び3の細胞塊形成率は、それぞれ0.5%、0%及び0.01%であった。従って、フラクション1の細胞塊形成率はフラクション3の約50倍であった。
一例として、SSEA-3をマーカーとしてFACSソーティングを行った。
H-fibroblast及びHMSCの両方について、SSEA-3陽性細胞及びSSEA-3陰性細胞をFACSソーティングにより分離し、単一細胞懸濁培養に供した。SSEA-3陽性細胞の約50〜60%がMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成した。一方、SSEA-3陰性細胞ではMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成しなかった。
FACS分析により、無処理H-fibroblast画分及びH-MSC画分は間葉系細胞に発現するCD44、CD49f、CD54、CD90、CD105陽性の画分を含むことがわかった。しかし、CD11c、CD34、CD45、CD71、CD166、CD271及びフォンビルブランド(vWF)因子は陰性であった。富Muse細胞画分においては、CD44及びCD54が陰性となったSSEA-3陽性画分は約0.7〜1.9%であった(図14)。
通常、Muse細胞は不活性休眠状態にあり生体が、危機的状態に陥ったり、あるいは重篤な傷害を被り、又は飢餓若しくは虚血状態等のストレス過多状態が維持されるとある種のシグナルが伝達されて活性化すると考えられる。その後、Muse細胞は組織再生に貢献し、細胞間相互作用や組織化に貢献する。
実施例1の検討において、FACSにより得たSSEA-3陽性細胞画分が多能性幹細胞の特性を有していること、すなわちMuse細胞であることが判明したが(上記J、K等)、さらに、単離したSSEA-3陽性細胞を用いて、in vitroでの分化能及びin vivoでの分化能を検討し、さらにMuse由来iPS細胞の確立を行った。
GFP(緑色蛍光タンパク質)-レンチウイルスで標識したSSEA-3陽性Muse細胞を単離し、脊髄(圧迫損傷)、肝臓(CCl4を腹腔内注射、劇症肝炎モデル)又は腓腹筋(cardiotoxin注射)に損傷を与えた免疫不全マウス(NOGマウス)に静脈注射により移植した。ヒト皮膚細胞由来のMuse細胞をGFP(緑色蛍光タンパク質)-レンチウイルスで標識し(Hayase M et al., J Cereb Blood Flow Metab. 29(8): 1409-20, 2009)、Muse細胞由来胚様体様細胞塊が標識細胞由来であることをGFPにより確認した。脊髄損傷はNOGマウスに対してレベルTh9で行い(Farooque M et al., Acta Neuropathol., 100; 13-22, 2000)、NOGマウスの腓腹筋にcardiotoxinを投与し筋肉変性を誘発し、四塩化炭素をNOGマウスに腹腔内投与し、肝臓変性を誘発した。筋肉及び肝臓については2日後、脊髄については7日後に1×105のMuse細胞を静脈注射により移植した(各6頭のマウスを使用)。コントロールとして、GFP標識MEC集団を静脈注射したマウスを用いた。移植の3又は4週間後に、マウスをパラホルムアルデヒドで固定し、免疫組織化学及び共焦点レーザ顕微鏡観察に供した。
Muse細胞の分化調節に誘導システムが有効かどうかを検討した。単一SSEA-3陽性Muse細胞由来のMuse細胞由来胚様体様細胞塊を接着培養に供し、増殖させた。単一Muse細胞由来の増殖細胞を回収し、4つの群に分け、それぞれの群に対して、神経、骨細胞、脂肪細胞及び幹細胞への分化誘導を行った(n=5)。
培養細胞を培養したり、Muse細胞由来胚様体様細胞塊を形成させることなく、ヒト成人皮膚から直接Muse細胞を単離することを試みた。
iPS細胞は、Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、Klf4遺伝子、c-Myc遺伝子、Nanog遺伝子、Lin28遺伝子等を導入し作製されている。Muse細胞は、多能性(pluripotency)マーカーを発現し、外胚葉、内胚葉及び中胚葉系細胞に分化し得るという点で、iPS細胞と類似した特性を有している。そこで、Muse細胞がiPS細胞のよい材料となり得るかを検討した。
H-fibroblast画分由来のSSEA-3陽性細胞及び陰性細胞に、Takahashi et al., Cell, 131, 861-872(2007)の記載に従って、レトロウイルスベクターを用いて、Nanog、Oct3/4、KLF4及びc-Mycの4つの因子を導入し、培養した。以下に、方法の詳細を示す。
pMXsレトロウイルスベクター(Cell Biolabs)にヒトOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycのopen reading frameを組み込んだ。
PLAT-A細胞を100mm dishに5×106細胞の密度でまき、一晩培養した。次の日に、Fugene HDを用いてトランスフェクションをを行った。トランスフェクションから24時間後、新しい培地に交換した。3日後に上清を回収し、0.45μmのフィルターに通し、4μg/mlのポリブレンを加えた。60mm dishに1×105細胞の密度でまいたNHDF(皮膚線維芽細胞)にウイルス溶液を感染させた。24時間後、ウイルスの入っていない新しい培地に交換した。ウイルス感染から4日後にトリプシンにより剥がした細胞を、MEF(フィーダー細胞)の上に3×104細胞の密度でまいた。翌日、培地を4ng/ml bFGFを加えたPrimate ES mediumに交換した。その後2日に1回培地交換を行い、30日後、コロニーをピックアップし、24ウェルプレートにまいた。
RNeasy mini kit(QIAGEN)によりRNAを精製した。500ngのRNAをSuperScriptIIを用いて逆転写した。内因性のOct、Sox2、Klf4、Myc、NanogのプライマーとPCRの条件等はakahashi et al., Cell, 131, 861-872(2007)に記載の通りで行った。
コラゲナーゼによりiPS細胞を採取した。細胞の塊をPoly-HEMAでコーティングしたdishに、20% Knockout serum replacement(Invitrogen)、2mM L-Glutamine、1×10-4M nonessential amino acid、1×10-4M 2-mercaptoethanol(Nacalai)、0.5%Penicillin/Streptomycinを含むDMEM/F12培地にて培養した。培地は2日に一回交換した。7日後、EBをゼラチンコートしたdishにまき、同じ培地で一週間培養した。
60mm dishのiPS細胞をRock inhibitorにより処理し、Accutase(登録商標)により採取しチューブに集めて遠心後、PBSに浮遊させた。これをNOG mouse(登録商標)(財団法人 実験動物中央研究所)の精巣に注射した。12週後に4%パラホルムアルデヒドにより固定した。パラフィン切片はHE(Hematoxylin & Eosin)染色を行った。
H-fibroblast画分由来のSSEA-3陽性細胞及び陰性細胞に、Takahashi et al., Cell, 131, 861-872(2007)の記載に従って、レトロウイルスベクターを用いて、Nanog、Oct3/4、KLF4及びc-Mycの4つの因子を導入し、5日後にMEF上に再度まきなおし、培養した。colony pickupを行う直前、すなわちMEF上での培養30日目においては、SSEA-3陰性細胞中で形成されたコロニーは非ES細胞様コロニーであり、ES細胞のマーカーであるTra-1-80陽性のコロニーはまったく見られなかった。一方、多くのSSEA-3陽性細胞においては陰性の細胞群の約7倍ほどの数のコロニーを形成し、それらはTra-1-80は陽性であった。注目すべきは、SSEA-3陰性細胞(コロニーやコロニーを形成していない細胞すべてを回収)では、RT-PCRで測定したところ、MEF上30日目のcolony pick up直前でもNonog、Sox2などの多能性に密接に関連した重要な遺伝子は陰性であった。一方、SSEA-3陽性細胞において、内因性のOct3/4、KLF4及びRex1がアップレギュレーションされており、さらにNanog、Sox2が発現していた。予測されていたとおり、SSEA-3陽性細胞をcolony pickupし、新たなMEF(フィーダー細胞)上に移した場合、無処理H-fibroblast画分細胞を用いた場合よりも30倍ほど高い効率でiPSを作製することができた。これらのiPS細胞において、免疫細胞化学、RT-PCR及びQ-PCRにより、Tra-1-60、Tra-a-80、Rex1、UTF-1、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)及びヒトES細胞において発現している因子がアップレギュレーションしており、あるいは新たに発現していた(図19、21)。また、得られたMuse細胞由来iPS細胞において、Nanog、Oct3/4、Sox2及びTRA-1-81が発現していた(図19)。RT-PCRにより、Muse細胞由来iPS細胞ではNanog、Oct3/4及びSox2が発現しているが、SSEA-3陰性細胞由来コロニーでは発現していないことがわかった(図21)。
Claims (12)
- 生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞を、外的ストレス刺激を行い、当該外的ストレスに耐性の細胞以外の細胞を死滅させ、生き残った細胞を回収することを含む、以下の性質のすべてを有する、SSEA-3陽性及びCD105陽性の多能性幹細胞が濃縮された画分を製造する方法:
(i) SSEA-3陽性;
(ii) CD105陽性;
(iii) テロメラーゼ活性が低いか又は無い;
(iv) 三胚葉に分化する能力を持つ;
(v) 腫瘍性増殖を示さない;及び
(vi) セルフリニューアル能を持つ。 - 外的ストレスが、プロテアーゼ処理、低酸素濃度での培養、低リン酸条件下での培養、低血清濃度での培養、低栄養条件での培養、熱ショックへの暴露下での培養、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養、圧力処理下での培養又は物理的衝撃から選択される、請求項1に記載の多能性幹細胞が濃縮された画分を製造する方法。
- 外的ストレスが、プロテアーゼ処理、低酸素濃度での培養、低リン酸条件下での培養、低血清濃度での培養、低栄養状態での培養、熱ショックへの暴露下での培養、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養、圧力処理下での培養又は物理的衝撃から2つ以上選択される、請求項1に記載の多能性幹細胞が濃縮された画分を製造する方法。
- 外的ストレスが、プロテアーゼ処理、低酸素濃度での培養、低血清濃度での培養、低栄養状態での培養又は物理的衝撃から選択される請求項2又は3に記載の多能性幹細胞が濃縮された画分を製造する方法。
- 生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞を、プロテアーゼ処理下で培養を行い、生き残った細胞を回収することを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の多能性幹細胞が濃縮された画分を製造する方法。
- プロテアーゼ処理を細胞に外的ストレスを与えるために合計3〜36時間行う、請求項5記載の多能性幹細胞が濃縮された画分を製造する方法。
- プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ又はN末端スレオニンプロテアーゼである、請求項5又は6に記載の多能性幹細胞が濃縮された画分を製造する方法。
- プロテアーゼが、接着細胞の培養において、培養容器に接着した細胞を剥がすとき、細胞塊を単一細胞にばらばらにするとき又は組織から単一細胞を回収するときに用いられるプロテアーゼである、請求項5〜7のいずれか1項に記載の多能性幹細胞が濃縮された画分を製造する方法。
- プロテアーゼがトリプシン、コラゲナーゼ又はジスパーゼである、請求項5〜8のいずれか1項に記載の多能性幹細胞が濃縮された画分を製造する方法。
- プロテアーゼ処理下での培養を、培養容器に接着した細胞を剥がすとき、細胞塊を単一細胞にばらばらにするとき又は組織から単一細胞を回収するときに用いられるプロテアーゼ濃度存在下で、合計3〜36時間行う、請求項5〜9のいずれか1項に記載の多能性幹細胞が濃縮された画分を製造する方法。
- プロテアーゼ処理下での培養を、0.1〜1%のトリプシン濃度存在下で行う、請求項5〜10のいずれか1項に記載の多能性幹細胞が濃縮された画分を製造する方法。
- 以下の性質のすべてを有する、SSEA-3陽性及びCD105陽性の多能性幹細胞を9%以上含む画分を製造する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の多能性幹細胞が濃縮された画分を製造する方法:
(i) SSEA-3陽性;
(ii) CD105陽性;
(iii) テロメラーゼ活性が低いか又は無い;
(iv) 三胚葉に分化する能力を持つ;
(v) 腫瘍性増殖を示さない;及び
(vi) セルフリニューアル能を持つ。
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